CN104293911B - 一种检测scn11a基因第673位碱基突变的试剂盒 - Google Patents

一种检测scn11a基因第673位碱基突变的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种变异的SCN11A基因，即人类周围神经发作性疼痛致病基因SCN11A，其特征在于该变异的SCN11A基因的第673位碱基由野生型的C变异为T；或该变异的SCN11A基因的第2423位碱基由野生型的C变异为G。本发明还提供了一种检测来源于人体生物样本中是否存在所述基因的突变方法及检测试剂盒。本发明提供的变异的人类SCN11A基因可用于制备人类周围神经发作性疼痛基因诊断芯片，变异的人类SCN11A基因所编码的蛋白质可作为治疗人类周围神经发作性疼痛的药物靶点。

Description

一种检测SCN11A基因第673位碱基突变的试剂盒
本申请是201310070553X号专利申请的分案申请。原申请号为201310070553X；原申请日为2013年3月6日；原发明名称为人类周围神经发作性疼痛致病基因及其编码蛋白。
技术领域
本发明涉及一种人体变异的基因，即人类周围神经发作性疼痛致病基因SCN11A。本发明还涉及这种变异基因及其编码的蛋白在检测和作为治疗人类周围神经发作性疼痛疾病的药物靶点中的作用和意义。
背景技术
疼痛是在人体受到各种伤害性刺激时所产生的感觉，是存在于人体内部的警戒与保护系统,它能引起机体产生被动性防御反应以躲避伤害刺激,对机体具有保护作用。但是过度的伤害性刺激不但会引起强烈的疼痛感觉而且还会导致机体生理功能的紊乱,甚至休克。人类疼痛分为急性疼痛和慢性疼痛，急性痛是人体免受伤害，是组织损伤的生理性预警信号。然而慢性疼痛是一种病理状态，依据疼痛病理机制，慢性疼痛可分为伤害性或炎症性疼痛(对疼痛刺激的适当反应)和神经性疼痛(由神经系统损害诱发的不适当反应)。1994国际疼痛研究会将神经性疼痛(neurogenic pain)定义为“周围或中枢神经系统原发性或继发性损害或功能障碍或短暂紊乱引起的疼痛”。神经性疼痛一直是困扰医学界的难题，发病机理不是十分清楚。周围神经性痛常涉及小直径神经纤维的信号传递，目前发现三种钠离子通道蛋白Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9在周围神经中大量表达，2004年中国医学科学院北京协和医学院沈岩院士等研究人员从遗传上将Nav1.7钠离子通道蛋白获得性功能突变与人类疼痛关联起来，随后世界其他研究小组发现30％的小直径神经纤维痛的患者是由该蛋白获得性功能突变所造成的。2012年10月31号美国耶鲁大学医学院Waxman所领导的研究团队，在104例先天性神经痛患者中发现7个Nav1.8钠离子通道蛋白的获得性功能突变，占6.7％。然而还有许多疼痛患者的致病原因不清楚。
发明内容
本发明的任务是提供一种变异的SCN11A基因及其编码的蛋白质。
本发明的另一个任务是提供检测人类SCN11A基因突变的方法及试剂盒。
本发明的又一个任务是提供这种变异的SCN11A基因在制备人类周围神经发作性疼痛基因诊断芯片中的应用。
实现本发明的技术方案是：
本发明提供的变异的SCN11A基因是：
(1)该变异的SCN11A基因的第673位碱基由野生型的C变异为T，其核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示；
(2)该变异的SCN11A基因的第2423位碱基由野生型的C变异为G，其核苷酸序列为SEQ ID NO：5所示。
其所编码的蛋白质的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：4和6所示(p.R225C、p.A808G)。该蛋白质可作为治疗人类周围神经发作性疼痛的药物靶点。本发明提供的变异的人类SCN11A基因可用于制备人类周围神经发作性疼痛基因诊断芯片。
本发明提供的检测人类SCN11A基因突变的试剂盒，含有以下21对引物中的一对或几对或全部：
上述试剂盒还可含有Taq酶、PCR反应缓冲液和/或dNTP。
本发明提供的体外检测SCN11A基因第673位碱基突变的试剂盒，含有以下引物：
F:5'CAAGCCCATGCCTTCCCTGT 3'
R:5'TTGCTTTCAAAGCTCTGAACACCC 3'
该试剂盒还可含有Taq酶、PCR反应缓冲液、dNTP、限制性内切酶Bcn I和/或Hind III。
本发明提供的体外检测SCN11A基因第2423位碱基突变的试剂盒，含有以下引物：
F:5'ATCCCATTCTGCTTTACCCT 3'
R:5'CCGCCGTGAGCAAAGGAAC3'。
该试剂盒还可含有Taq酶、PCR反应缓冲液、dNTP、限制性内切酶Bcn I和/或Hind III。
本发明提供的变异的SCN11A基因，是人类周围神经发作性疼痛致病基因，即发现了该疾病的基因突变位点，利用该疾病的基因突变位点可检测人体中是否存在该突变的基因。同时本发明提供周围神经发作性疼痛致病基因编码的蛋白质序列及其突变导致的神经元动作电位发放次数增高，为阐明该病的致病机制提供了基础，为进一步治疗该病提供了设计药物的靶点。
本发明收集并鉴定了两个周围神经发作性疼痛中国大家系(一个来自吉林通化，一个来自河北-北京)，真对来自吉林通化的疼痛大家系进行微卫星标记全基因组连锁分析，将这个家系的致病基因定位于3号染色体短臂上即3p22.3-22.1位点，大约8Mb物理图距的染色体区段。对来自河北-北京家系连锁分析，该家系的致病基因也连锁在上述区段。
本发明选择吉林通化疼痛家系先证者DNA样本，对其进行外显子组测序，在定位区域内(3p22.3-22.1)发现SCN11A基因一个点突变；对河北-北京家系患者进行Sanger测序，发现该基因另一个点突变。上述的两个突变分别在各自家系中所有患者的DNA样品上均得到验证，在家系正常成员、1021例正常汉族人群中不存在上述突变，排除了单个核苷酸多态性的可能性。同时发现这两个突变造成所编码的氨基酸改变，由此，
本发明提供了2种如SEQ ID NO：3和5所示变异的人类SCN11A基因，其特征分别在于，所述SCN11A基因编码区第673位胞嘧啶被胸腺嘧啶替换(C>T)、2423位胞嘧啶碱基 被鸟嘌呤替换(C>G)。正常的人类SCN11A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明提供了2种如SEQ ID NO：4和6所示变异的人类SCN11A基因所编码的蛋白质序列，其特征分别在于，SCN11A蛋白的氨基酸序列分别是第225位精氨酸变为半胱氨酸(p.R225C)、第808位的丙氨酸变为甘氨酸(p.A808G)。正常的人类SCN11A基因所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供了一种检测来源于人体生物样本中是否存在上述基因突变的方法，其步骤：
(1)从待检测样本中提取DNA样本材料；
(2)选取对应引物(见表1)，对所述DNA样本进行聚合酶链扩增(PCR)反应，获取PCR产物；
(3)对所述PCR产物进行核苷酸序列测定，与SEQ ID NO：1序列比对，以确定所述生物样本中是否含有SCN11A基因突变。
优选地，所述生物样本为体液，该体液包括但不限于：血液、血浆、血清、羊水等。
优选地，所述体液为血液。
优选地，在上述PCR反应中使用的引物对为：SEQ ID NO：7和8；9和10；11和12；13和14；15和16；17和18；19和20；21和22；23和24；25和26；27和28；29和30；31和32；33和34；35和36；37和38；39和40；41和42；43和44；45和46；47和48的引物对扩增相应核苷酸序列。
本发明还提供了检测来源人体的生物样本中是否存在上述两种突变的方法，其步骤包括：
(1)从所述样本中提取DNA；
(2)对所述DNA进行聚合酶链扩增(PCR)反应，获取PCR产物；
(3)对所述PCR产物进行限制性内切酶酶切；
(4)对所述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察和拍照电泳图，与表2相关酶切产物大小比对，确定所述生物样本中是否含有SCN11A基因上述两种突变。
优选地，所述体液为血液或羊水。
优选地，在上述PCR反应中使用的引物对为：SEQ ID NO：49和50；51和52
优选地，上述PCR产物中使用的2种限制性内切酶Bcn I和Hind III。
本发明还提供了变异的人类SCN11A基因功能改变，如附图5所示，该基因编码的蛋白是分布在细胞膜上钠离子通道α亚基11，维持细胞持续电流的产生有重要作用，SCN11A基因突变导致该钠离子通道活性增强，从而导致细胞对刺激的敏感性增高(见实施例4)，引起相关感觉神经元动作电位的快速发放而致痛。因此人类SCN11A变异基因可以作为药物的靶 点，开发相关药物治疗人类痛觉提供了科学依据。
根据本发明提供的SCN11A基因序列变异的位点，应用本发明提供的检测来源于人体的生物样本中是否存在所述基因的突变方法，对两个周围神经发作性疼痛家系所有个体进行突变检测。结果发现两个错义突变，而家系正常成员、1021例正常汉族个体中不存在上述突变。证明本发明提供的方法能够精确诊断由SCN11A基因突变导致的发作性慢性疼痛疾病。同时对该基因突变所编码的蛋白质进行功能分析，发现SCN11A突变会导致细胞膜钠离子通道活性增强，从而导致细胞对刺激的敏感性增高，引起相关感觉神经元动作电位的快速发放而致痛。一方面为疼痛患者是否是该基因突变导致的提供病因诊断依据；另一方面为治疗该类疼痛疾病提供药物靶点。
本发明收集了两个大的中国周围神经发作性疼痛家系，通过连锁分析、外显子组测序、限制性内切酶分析等技术发现第三个钠离子通道基因SCN11A突变是导致周围神经发作性疼痛的原因，该基因编码Nav1.9蛋白，它的发现对周围神经发作性疼痛的遗传诊断、药物的研发和治疗具有十分重要理论和实践意义。
附图说明
以下将通过实施例和附图对本发明作进一步的说明。
图1吉林通化(a)和河北-北京(b)周围神经发作性疼痛家系的系谱，箭头代表先证者。
图2为周围神经发作性疼痛家系致病基因在3号染色体的定位区域。
图3为SCN11A基因2个突变序列SEQ ID NO：3和5与正常序列SEQ ID NO：1在突变位点的对比示意图，箭头表示突变发生开始位置或突变位置：a，突变发生在第673位胞嘧啶被胸腺嘧啶替换(C>T)；b,突变发生在第2423位胞嘧啶碱基被鸟嘌呤替换(C>G)。
图4为吉林通化家系(图a)和河北-北京家系(图b)突变验证图。示相关突变与该家系疾病共分离。
图5发明人发现SCN11A基因野生型和两个突变转染小鼠背侧神经根细胞产生的动作电位变化。表示在相同条件下，两个突变体动作电位发放次数均比野生型多。
具体实施方式
实施例1：周围神经发作性疼痛致病位点的定位
1、家系收集与鉴定：发明人通过对先征者及其家庭进行医学检查和临床诊断，分别在吉林通化和河北-北京采集了两个常染色体显性遗传的周围神经发作性疼痛家系。吉林通化家系五代19名患者如图1a，采集该家系16份外周血样本；河北-北京家系五代10名患者如图1b，采集该家系13份外周血样本。
2、基因组DNA提取：使用美国Promega公司的Wizard Genomic DNA提取试剂盒提取外 周血液样本基因组DNA。
3、周围神经发作性疼痛致病位点连锁分析：选取先证者对已报道的2个疼痛相关的钠离子通道基因SCN9A和SCN10A通过直接测序，未发现这两个基因突变。选取吉林通化家系进行全基因微卫星标记连锁分析，将这个家系致病基因定位在3号染色体短臂上即3p22.3-22.1位点，大约8Mb物理图距的染色体区段，对河北-北京家系连锁分析，也将其致病基因定位在上述区段内。这两个家系在3号染色体上的连锁如图2。
基因的染色体定位技术在分子遗传学领域对于本领域的研究人员而言是已知的技术，本发明是利用该技术发现可能导致人类疾病的变异基因。
实施例2：周围神经发作性疼痛致病基因的识别
1、基因组DNA提取：同实施例1
2、候选基因的外显子组测序
选取吉林通化家系先证者对其进行外显子组测序，在上述区段内发现另一个钠离子通道蛋白基因SCN11A一个突变，Sanger测序验证该突变发生在第5外显子编码区(c.673C>T/p.R225C)(图3a)。该基因在周围神经中大量表达，一些动物实验表明该基因与疼痛有关，推测该基因可能是周围神经发作性疼痛的致病基因。因此对河北-北京家系实施该基因所有外显子及外显子-内含子交界处进行Sanger测序。
发明人根据外显子特异的PCR扩增引物用Primer5软件设计(如表1所示)，并由上海英俊生物有限公司合成这些引物，对样本目标片段进行PCR体外扩增，扩增片段包含了SCN11A基因编码区所有外显子、外显子-内含子交界处序列，序列来源为Ensemble Genome Browser，扩增片段大小如表1所示。测序选择家系先征者以及一名正常个体同时进行，使用ABI公司商品化的试剂盒，在全自动测序仪上完成，所有扩增片段的都会进行双向测序，测序结果与Ensemble Genome Browser数据库中SCN11A基因的正常序列比对分析，在河北-北京家系中，突变发生在第15个外显子编码区(c.2423C>G/p.A808G)(图3b)。成功地鉴定了周围神经发作性疼痛致病基因SCN11A，正是由于该基因发生了突变导致了发作性慢性疼痛疾病的发生。2个突变序列和正常人的序列比对示意图如图3所示。
表1：发作性慢性疼痛家系SCN11A基因编码区所有外显子测序引物
发明人通过PCR扩增、产物纯化、测序等方法获得SCN11A基因编码区所有外显子和外显子与内含子交界处序列，具体方法如下：
(1)PCR反应体系成分：dNTPs、Taq DNA聚合酶和PCR buffer由北京天根生化科技有限公司提供；引物由上海桑尼生物有限公司合成。
(2)PCR反应总体系为40μl：10×PCR buffer 4.0μl，dNTPs 1.0μl，超纯水31.1μl，Taq DNA聚合酶0.4μl，引物1.0μl+1.0μl，DNA1.5μl。
(3)PCR扩增程序是94℃(5min)-94℃(30s)-57.4℃(30s)-72℃(72s)，33个循环， 随后72℃(5min)，15℃终止。
(4)PCR产物电泳检测
PCR反应结束后，取3μlPCR产物加1μl的6×Loading buffer混匀，用1.5％的琼脂糖胶检查紫外灯下观察，电泳结果用佳能相机(Canon PowerShot A490)采集。
(5)PCR扩增产物的回收
采用上海生工生物工程技术服务有限公司的胶回收试剂盒进行PCR产物回收，过程按试剂盒说明书操作。
(6)BigDye末端标记反应(单链扩增PCR)10μl体系：PCR胶回收产物2.0μl，BigDye0.25μl，BigDye buffer 1.875μl，引物0.2μl，超纯水5.675μl。
单链扩增PCR的反应程序96℃(1min)-96℃(10s)-50℃(5s)-60℃(4min),25个循环，随后15℃终止。
(7)BigDye反应产物的纯化
①离心，将BigDye反应产物收集至管底。
②将BigDye反应产物转移至1.5 ml EP管中。
③加入15μl 42 mM的EDTA和75μl无水乙醇，振荡混匀。
④室温避光静置30-60min。
⑤在4℃下132,000 rpm离心30min。
⑥抽滤吸掉上清后，加入500μl 70％的乙醇溶液清洗。
⑦在4℃下132,000 rpm离心15 min。
⑧抽滤去掉上清后，在42℃下用Eppendorf Concentrator 5301旋转真空干燥仪干燥2min。
⑨加入10μl Hi-Di formamide，充分振荡促进溶解。
(8)测序
将Hi-Di formamide溶解的样品，95℃变性5 min，然后置于冰水混合物上迅速冷却，保持单链状态。使用ABI 3730 Genetic Analyzer进行毛细管电泳，用ABI3730 Data Collection Version 2.0收集数据，用Sequence Analysis V5.1.1对测序结果进行分析。
实施例3：周围神经发作性疼痛致病基因突变验证
为了验证本发明的突变，我们对收集的周围神经发作性疼痛家系成员进行临床检查，确定家系中患者和正常人员，同时收集了1021例家系外正常人。所有参加调查和被采集血样的家系成员都了解本研究的目的和意义并知情同意。
1、基因组DNA提取，同前所述。
2、利用错配引物创造酶切位点法检测SCN11A基因突变
发明人在常染色体显性遗传周围神经发作性疼痛家系中发现SCN11A基因的2个错义突变，均不能改变限制性内切酶位点或产生新的限制性内切酶位点，发明人利用错配碱基(CRS)产生酶切位点的方法对患者和正常对照对应的外显子PCR扩增再进行酶切，发现正常对照的样本对应的外显子PCR扩增产物大小和酶切后片段大小如表2所示，小片段(如21bp和24bp)在琼脂糖电泳中均跑出胶外，因此正常对照样本的扩增产物中分别仅看到1条带，而患者扩增产物可以看到两条带(如图4所示)。
在吉林通化家系患者的第5外显子PCR扩增产物被切成114bp、90bp和24bp三个片段，24bp跑出胶外，因此在胶图上看到114bp和90bp两个片段(图4a)。河北-北京家系患者的第15个外显子PCR扩增产物被切成119bp、98bp和21bp三个片段，21bp跑出胶外，因此在胶图上看到117bp和96bp两个片段(见图4b)。利用酶切方法验证1021例正常人样本，均未发现上述两个突变。
利用错配引物创造酶切位点方法检测本发明SCN11A基因的2个突变，详细如下：
(1)组成：错配引物序列(表2)、Taq酶、buffer缓冲液、dNTP、DNA样本(25ng/μl)和2种限制性内切酶Bcn1和Hind III。
表2：2个SCN11A基因突变的错配引物、限制性内切酶、PCR产物和酶切产物大小
(2)方法：
A.先采用上述PCR引物、Taq酶、样本基因组DNA、buffer缓冲液、dNTP等进行PCR扩增反应(程序同上)；
B.取上述PCR产物10μl，检测c.673C>T突变加入Bcn1限制性内切酶0.3μl或检测c.2423C>G突变加入Hind III限制性内切酶0.3μl，双蒸水7.7μl，buffer缓冲液2.0μl在37℃条件下酶切7-12hr；
C.配置4％的琼脂糖凝胶，对上述酶切产物进行电泳，结果胶图上看到114bp和90bp两 个片段(24bp跑出胶外)，证明是c.673C>T突变；胶图上看到119bp和98bp两个片段(21bp跑出胶外)说明是c.2423C>G突变。(参见表2)。
实施例4 SCN11A基因突变体载体构建及其功能分析
1、SCN11A基因突变体载体构建
发明人将正常该基因的cDNA进行定点突变得到2个突变体：设计引物，加酶切位点及保护碱基，将正常该基因的cDNA克隆在pcDNA 3.1(+)载体中。之后再设计定点突变引物，依照pcDNA 3.1-hSCN11A-WT载体用搭桥法构建R225C和A808G突变型载体pcDNA3.1-hSCN11A-R225C和pcDNA 3.1-hSCN11A-A808G，为后续功能研究做准备。
2、转染C57小鼠背侧神经根(DRG)细胞和DRG细胞的电生理影响
分别将野生型(WT)和两类突变体质粒分别电转染小鼠的DRG细胞，37℃下培养36-48个小时，对转染的DRG细胞进行膜片钳记录其动作电位的发放。
实施例5：体外检测周围神经发作性疼痛患者SCN11A基因突变的试剂盒
为了检测其他周围神经疼痛家系该基因的致病突变，发明人设计了该基因编码区所有外显子和外显子与内含子交界处的引物序列，如表1所示。扩增测序条件如具体实施2所示。1、试剂盒组成：
引物：表1所示SCN11A基因的引物共21对42条，每条引物两个OD值；
Taq酶
缓冲液
dNTP
2、使用方法：
(1)基因组DNA提取：如实施例1所述。
(2)先采用上述PCR引物、Taq酶、样本基因组DNA(从待检测的生物体样本中提取和纯化DNA样本)、buffer缓冲液、dNTP等进行PCR扩增反应；
(3)对每对引物的PCR扩增产物进行纯化；
(4)对纯化的PCR产物进行BigDye反应；
(5)对BiyDye反应产物纯化；
(6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。
实施例6：体外检测周围神经发作性疼痛患者中本发明提供的SCN11A基2个突变体试剂盒
1、试剂盒组成：
引物：检测2个突变体错配引物序列如表2所示
Taq酶
PCR反应缓冲液
dNTP
2种限制性内切酶Bcn I和Hind III。
2、使用方法：
(1)基因组DNA提取：如实施例1所述。
(2)先采用上述PCR引物、Taq酶、从待检测的生物体样本中提取和纯化基因材料(DNA样本)、缓冲液、dNTP等进行PCR扩增反应；
(3)取上述PCR产物10μl，加入相关的限制性内切酶0.3μl，双蒸水7.7μl，缓冲液H 2.0μl在37℃条件下酶切7-12小时；
(4)配置4％的琼脂糖凝胶，对上述酶切产物进行电泳，结果与参照表2相关突变的酶切片段大小比较。
实施例7：基因芯片法检测周围神经疼痛患者中SCN11A基因突变
实施过程如下：
1、基因有限公司制备SCN11A基因的寡核苷酸DNA微阵列芯片；
2、提取正常对照和周围神经痛患者的外周血基因组DNA，方法同前所述；
3、利用实施例2中SCN11A基因测序引物，分别PCR扩增正常对照和周围神经痛患者SCN11A基因相应外显子序列；
4、用Cy3荧光标记正常对照SCN11A基因上述扩增产物--正常对照SCN11A基因探针；
5、用FITC荧光标记周围神经痛患者SCN11A基因上述扩增产物—周围神经痛患者SCN11A基因探针；
6、将上述两类探针与SCN11A基因的寡核苷酸DNA微阵列芯片杂交；
7、将诊断芯片用荧光扫描仪扫描，扫描结果显示检测监控系统中荧光信号，判断检测周围神经发作性痛患者中SCN11A基因是否有突变。
以下为本专利申请涉及的核苷酸和氨基酸序列表，表中各序列依次为：
No.1：野生型SCN11A基因序列；
No.2：野生型SCN11A基因编码的蛋白Nav1.9序列；
No.3：SCN11A基因突变型c.673C>T序列；
No.4：SCN11A基因突变型c.673C>T编码的突变蛋白序列；
No.5：SCN11A基因突变型c.2423C>G序列；
No.6：SCN11A基因突变型c.2423C>G编码的突变蛋白序列；
No.7至48：发作性慢性疼痛家系SCN11A基因编码区所有外显子测序引物序列；
No.49至50：SCN11A基因c.673C>T突变的错配引物序列；
No.51至52：SCN11A基因c.2423C>G突变的错配引物序列。

Claims (1)

1.一种体外检测SCN11A基因第673位碱基突变的试剂盒，含有以下引物对：
F:5'CAAGCCCATGCCTTCCCTGT 3'
R:5'TTGCTTTCAAAGCTCTGAACACCC 3'；
还含有Taq酶、PCR反应缓冲液、dNTP、限制性内切酶Bcn I和/或Hind III。
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