CN105442053B - 一种检测诊断离子通道病致病基因的dna文库及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种通过靶向高通量半导体测序技术检测离子通道病致病基因突变的DNA文库及其应用。具体来说，根据74个离子通道病致病基因，设计引物池，对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量半导体测序技术进行测序，寻找致病突变，为临床诊断提供遗传学和分子生物学依据。本发明具有准确、快速、灵活、低成本的特点，本发明涉及的74个基因检测区域能够检测包括长QT综合征、短QT综合征、Brugada综合征、儿茶酚胺敏感性室速、家族性房颤、病态窦房结综合征、心脏传导阻滞等多种常见致死性离子通道病，对离子通道病的诊断和鉴别诊断有着重要的意义和临床价值。

Description

一种检测诊断离子通道病致病基因的DNA文库及其应用
技术领域
本发明涉及一种通过靶向高通量半导体测序技术检测诊断离子通道病致病基因的DNA文库及其应用。具体说是根据离子通道病致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻区域的超多重PCR引物，并对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，明确离子通道病的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据，属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术。
背景技术
离子通道是细胞膜和细胞器上一类特殊的亲水蛋白质，是人体细胞进行生物电活动的物质基础，还参与激素分泌、感受器电位形成等多种生理活动。自1995年确定长QT综合征与离子通道基因突变相关后，近20年来越来越多的心律失常(尤其是可致猝死的恶性心律失常)被证实与心脏离子通道基因突变有关。离子通道病种类众多，几乎所有心脏的重要离子通道(如钠离子通道、钾离子通道、钙离子通道等)都可能通过基因突变导致离子通道病。离子通道病是遗传病，患者通常呈现家族聚集性，并且会把致病突变传递给下一代。离子通道病的临床表现多种多样，有的仅出现非致死性心律失常，有的则可能伴有其它器官的受累或畸形，有的会引起患者晕厥或者猝死，甚至在一些患者首发症状即表现为猝死。在一些国家和地区甚至是中青年猝死的主要原因之一。对离子通道病进行基因诊断，有助于为临床患者提供最合适的治疗策略，包括抗心律失常药物种类的选择、生活方式的干预、植入性器械治疗方案的选择以及预后评估等。
目前，研究发现离子通道病的众多致病基因中，只要任意一种基因发生功能性突变，即可引起疾病表型，即：同一种离子通道病可以由多种遗传因素所导致。并且，不同基因的突变导致的同一种离子通道病，其严重程度和预后有着较大差异(如长QT综合征有13型，每一型对应一个致病基因)。除此之外，同一患者如果携带了一个以上的致病基因突变，其临床表现和预后与只携带单一致病突变的患者相比会有差异。因此，全面、快速、准确地筛查致病基因是离子通道病精确诊断和个性化治疗的必须前提条件。
临床上现有的离子通道病的常规诊断技术，主要是心电图检查。但是，心电图检查不能精确、特异地区别离子通道病的具体种类。对于阵发性和隐匿型心律失常患者，其病态心电表现不是时时都可捕捉到，因此心电图检查不能100％做到确切判断，也不能在早期尚未表现出临床症状的情况下对患者进行诊断。因此，目前仅结合临床症状、心电图检查不能把各种离子通道病精准地区分开来。对于特殊类型的离子通道病，如：Brugada综合征，患者常在床上夜间猝死，猝死前可以没有任何症状和临床表现，对临床的诊断提出了巨大的挑战。因此具有预告性的基因诊断是解决这一难题的唯一解决办法。然而，传统的基于Sanger测序的基因检测方法存在通量低的弊端，一次反应只能检测一个扩增区域，无法满足庞大的基因检测区域和多样本检测时效性的要求。
因此，有必要寻求一种新的检测离子通道病致病基因突变的方法，提高诊断准确率，降低成本和劳动强度并提高时效性。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供一种覆盖包括长QT综合征、短QT综合征、Brugada综合征、儿茶酚胺敏感性室速、家族性房颤、病态窦房结综合征、心脏传导阻滞等多种常见致死性离子通道病，包含74个离子通道病致病相关基因的DNA文库。这74个基因选择基于基于国际已报道和公认的临床致病基因数据库(OMIM数据库、HGMD数据库、ClinVar数据库)以及发明者自己的课题研究内容。这74个基因上的致病突变既可以单独致病，也可以联合致病导致更加严重和复杂的临床表型，本发明首次做到可以一次性全面的对它们进行测序。其中74个基因如下：
本发明根据74个离子通道病致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻调控区域的适用于超多重PCR的引物池，进而对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量半导体测序技术进行测序，寻找致病突变，明确主动脉夹层的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据。为此，本发明还提供以下技术方案：
本发明还提供一种上述DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒用于诊断离子通道病。
本发明还提供一种上述DNA文库在制备诊断装置中的应用，所述诊断装置用于诊断离子通道病。优选的，所述诊断装置是测序芯片。
进一步，所述应用包括下列步骤：
(1)提供受试者样本的基因组DNA；
(2)利用上述的DNA文库从Ion TorrentTM高通量测序平台自动合成覆盖全部74个致病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增；
(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；
(4)对步骤(3)得到的酶切产物加Barcode接头；优选的，所述Barcode接头来自于高通量测序建库试剂盒；
(5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；
(6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增；优选的，该通用引物来自于高通量测序建库试剂盒；
(7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区域扩增文库；
(8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接于ISP珠子，得到反应液；
(9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上Ion TorrentTM高通量测序进行测序；
(10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关的突变位点；
(11)对步骤(10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。优选的，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。
更优选的，所述应用进一步用于指导治疗，例如：通过基因检测确诊的SCN5A基因突变Brugada综合征患者，应考虑ICD植入术等治疗。
本发明还提供一种诊断试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述包含74个离子通道病的致病基因的DNA文库。
本发明还提供一种诊断装置，其中，所述装置包括上述包含74个离子通道病的致病基因的DNA文库。优选的，所述装置为测序芯片。
本发明提供一种使用上述DNA文库、诊断试剂盒或诊断装置对患者进行诊断的方法，所述方法包括下列步骤：
(1)提供受试者样本的基因组DNA；
(2)利用上述的DNA文库从Ion TorrentTM高通量测序平台自动合成覆盖全部74个致病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增；
(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；
(4)对步骤(3)得到的酶切产物加Barcode接头；优选的，所述Barcode接头来自于高通量测序建库试剂盒；
(5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；
(6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增，优选的，该通用引物来自于高通量测序建库试剂盒；
(7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区域扩增文库；
(8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接于ISP珠子，得到反应液；
(9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上Ion TorrentTM高通量测序进行测序；
(10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关的突变位点；
(11)对步骤(10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。
优选的，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。
更优选的，所述应用进一步用于指导治疗，例如：通过基因检测确诊的SCN5A基因突变Brugada综合征患者，应考虑ICD植入术等治疗。
采用本发明的DNA文库对离子通道病患者进行基因诊断有着以下重要意义和效果：
1.及时发现隐匿型和阵发性恶性心律失常患者：多种易发猝死的离子通道病患者可以在发病前毫无临床表现，首发症状即是猝死，尤其是已经有猝死家族史的病人，猝死风险更高。对于这种隐匿型恶性心律失常患者，未发病时传统的检查方法无法对其进行确诊。类似的，有的阵发性心律失常患者，未发病时心电图检查完全正常，传统的检查方法对其进行诊断有很大难度。因此而基因诊断则成为了诊断这些患者的重要手段；
2.基因诊断有助于制定进一步个性化治疗方案：通过基因诊断筛选出已知的恶性心律失常致病突变携带患者，应更加积极地考虑植入性器械治疗，在风险评分达到标准时，哪怕尚无临床表现，应考虑行激发试验进行诊断。如：KCNQ1突变导致的长QT综合征1型患者，有明确的猝死家族史，检测到已知致病突变，临床如果没有表现应行激发试验，激发试验阳性应考虑ICD植入术。同时，基因诊断可以帮助心律失常药物的优化选择。如：基于长期以来的临床经验及致病机制研究，可以知道倍他乐克对KCNQ1突变的长QT综合征1型患者最有效，对KCNH2突变的长QT综合征2型患者效果次之，而对于SCN5A突变的长QT综合征3型患者而言，首选应为普萘洛尔加美西律。
3.本申请的DNA文库是申请人从众多的离子通道病致病基因中选择的74个基因，这些基因尤其适合包括中国人在内的黄色人种患者的检测。国际上缺乏大规模的中国汉族人群致死性离子通道病基因诊断相关信息，绝大多数已知致死性离子通道病基因都主要来自欧美人群的报道，它们对中国人的致病性及特点目前没有详细报道。发明者进行了长期的临床观察和大规模中国汉族人群致死性离子通道病的基因诊断研究。所选基因中的绝大多数基因均为发明人在汉族人群中发现的致病基因。
4.本发明的DNA文库能够检测包括长QT综合征、短QT综合征、Brugada综合征、儿茶酚胺敏感性室速、家族性房颤、病态窦房结综合征、心脏传导阻滞等多种常见致死性离子通道病。本发明提供的DNA文库及基于高通量测序技术的序列检测方法能够检测74种离子通道病的遗传缺陷；
5.本发明中采用基于Ion TorrentTM高通量测序技术对目标区域的扩增产物进行检测，能够在一次测序反应中同时检测本发明中涉及的74个相关致病基因的全部外显子及毗邻区域，并且能根据不同芯片数据量的大小，调整检测样本数量，在保证平均测序深度500×的前提下，检测1到24人不等的样本数量，整个测序反应和数据分析判读能在两天之内完成，大大降低了扩增反应的成本和劳动强度，提高了时效性，同时，该检测区域具有覆盖度广，整体覆盖度达到97.98％；。通过对目标扩增区域的测序和数据判读，能够准确识别与疾病相关的突变，判断疾病种类和病因，为临床提供及时可靠的检测报告。本发明设计的检测方法经过Sanger测序法验证，对二代测序深度达到100×的点突变，本方法的准确度达到100％；
6.基因诊断有助于遗传咨询、产前诊断和新生儿筛查等。因很多离子通道病患者面临猝死的风险，家人非常关注患者的兄弟姐妹或将来下一胎的健康。患者致病基因突变的确诊，可以为孕育健康的下一代提供明确的遗传咨询服务。离子通道病多数为常染色显性遗传病，患者兄弟姐妹有50％的发病可能性。对尚无症状年幼兄弟姐妹或子女进行致病基因检测有助于早期发现疾病、早期治疗，改善预后。
综合来看，本发明中涉及的DNA文库及其应用具有准确、灵活、快速、低成本的特点；经过临床评估，该发明对离子通道病具有很好的辅助诊断价值。
附图说明
图1一次Ion TorrentTM高通量测序反应的数据采集概要图；
图2一次对74个基因的目标区域进行测序，不同标本得到的数据量信息；
图3经过原始数据分析后，得到的不同标本的突变碱基数量；
图4Sanger测序法对本发明检测方法得到的突变位点进行验证。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1
1.该方法中所用到的试剂：
Ion AmpliSeqTM Library Kit 2.0，Ion PGMTM Template OT2 200 Kit v3，IonSequencing 200 Kit v2，Ion Xpress Barcode Adaptors 1-16Kit，Ion 318TM ChipKit v2
2.标本采集和保存
(1)标本采集：标本为患者外周血。血液为常规取静脉血5ml，EDTA抗凝处理。
(2)保存：可立即检测，4℃保存一周，超过一周-80℃保存。
3.检测步骤和结果分析：
(1)标本基因组DNA的提取：标本DNA的提取按照天根生化科技(北京)有限公司的血液DNA提取试剂盒操作说明进行。
(2)目标检测区域的超多重PCR扩增及建库：以本发明中涉及的74个基因全外显子为检测区域，基于Ion AmpliSeqTM Designer自动合成超多重PCR引物，对标本DNA的目标区域进行扩增及建库，具体实施如下:
a.目标区域的扩增：
反应条件：
b.扩增产物二合一，酶切：
反应条件：
c.连接接头：
反应条件：
22℃ 30min
72℃ 10min
10℃ Up to 1h
d.纯化及纯化产物的二次扩增：纯化步骤按照Ion Ampliseq LibraryPreparation操作手册进行，最终产物溶解于52μl反应体系，该反应体系组成为：
反应条件：
e.片段选择：片段选择步骤按照Ion Ampliseq Library Preparation操作手册进行，得到的最终建库产物用Qubit 2.0Fluorometer定量后即建库完成。
(3)高通量测序：测序及前期准备步骤按照Ion PGMTM Template OT2 200Kit v3及IonSequencing 200 Kit v2操作手册进行：
a.油包水PCR反应：
将上述反应体系加入Ion OneTouch 2中进行油包水PCR反应。
b.油包水PCR反应完成后，连接有测序模板的Ion PGM Template OT2 200 IonSphere Particles经过Ion Onetouch ES纯化，加入测序引物及DNA聚合酶：
室温5min后，将得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上Ion TorrentTM高通量测序进行测序。
(4)数据分析：测序数据经过coverage analysis和variant caller分析，得到碱基序列和突变位点，突变位点经过Ion Reporter在线注释后，得到对离子通道病诊断有意义的突变位点。
(5)Sange法验证：对于得到的突变位点，采用Sanger测序法进行验证。
结果说明及分析
通过本发明中涉及的高通量测序技术一次性对3个标本的目标区域进行检测(如图1)，得到的总数据量为888M(Total Base)，能够总共得到6192569的片段读长数据(TotalReads)，每个片段的中位读长为155bp。3个标本平均能够被测到2057465(1931284-2300665)个片段读长Reads(如图2)，以上测序结果为下一步的序列分析提供了充足的数据量。测序结果经过variant Caller分析，每个标本平均有306个变异(Variants)被读出(如图3)。检测区域的变异通过Ion Reporter在线注释后，与疾病相关的突变位点经过Sanger测序法验证(如图4)，如图4例举的那样，图4箭头所指处显示KCNJ5基因c.1159G>C(p.Gly387Arg)杂合突变,最终明确患者的遗传缺陷类型，为临床提供诊断依据。对尚无症状年幼兄弟姐妹或子女进行致病基因检测有助于早期发现疾病、早期治疗，改善预后。
本发明的临床应用例证
利用本发明所提供的方法，对200名患有恶性心律失常但病因不明确的患者进行了基因检测。共诊断出长QT综合征42例、Brugada综合征26例、儿茶酚胺敏感性室速20例、家族性房颤15例、病态窦房结综合征5例、心脏传导阻滞8例。该方法对离子通道病检出的总阳性率达到58％，结合临床心电图检查，实验室检查及医生最终诊断结果，本方法的假阳性率为0，即所有经本方法确认的携带致病突变患者均符合相关遗传疾病的临床特征，并能够给予明确的临床诊断。本发明涉及的检测方法是利用高通量测序技术为突变快速筛选工具，以Sanger测序法为最终确定突变的金标准，因此具有快速，准确的特征。以高通量测序平均深度100×为例，所覆盖的96.22％的目标区域都能够被测序，且筛选得到的点突变能够被Sanger测序法验证，因此对以上区域检测的准确度为100％。根据200名受测患者的临床诊疗结果分析，受测患者未出现假阴性率。基于本发明涉及的检测方法给出的诊断报告得到临床医生的认可和采纳。本发明涉及的检测方法具有准确，快速，低成本的特点，对离子通道病的鉴别诊断有着重要意义和实用价值。
实施例2：
本发明中引物池里包含发明者新发现的离子通道病致病基因15个，如下表：
新发现的15个离子通道病致病基因来自于发明者多年来的研究积累和家系调查。发明者首先在已知的离子通道病致病基因中通过KEGG信号通路检索，同源基因库，寻找已知致病基因的同源基因。然后在多年积累的中国汉族病人大样本量病例样本库中对候选的同源致病基因进行靶向高通量测序，并进行生物信息学分析，筛选和寻找致病突变。对筛选到致病突变的病例进行随访和进一步的家系分析，对患者的整个家族进行致病位点测序验证，计算致病突变的共分离系数。当发现候选基因的致病突变在两个及以上无关联的家系中完全共分离时，即可初步判断该候选致病基因为新的致病基因。本发明发现，上述15个基因的致病突变在两个及以上无关联的家系中均出现完全共分离。
对一系列的筛选到的新致病基因及其致病突变进行分子克隆，通过构建质粒，细胞转染，对相关致病通路进行功能学检测，对受累离子通道进行膜片钳实验，观察致病突变导致的真实电位改变，从而进一步对候选基因的致病性进行评估。本发明发现，患者的白细胞以及转染上述基因的CHO细胞中上述15个基因的表达和功能均降低，最终，筛选出了这15个新的国际上尚未报道的致病基因，并在汉族大样本病例中对其致病性进行了初步评估。同时，建立了600名汉族正常对照人群的所有致病基因的非致病多态性位点库，弥补了国际上通用数据库中汉族人样本少，非致病多态性位点严重不全的漏洞，对未来的基因检测和数据分析提供了坚实基础。

Claims (9)

1.一种基于Ion TorrentTM高通量测序技术诊断离子通道病的DNA文库，其特征在于，该文库包括74个离子通道病相关的致病基因，其中所述74个离子通道病相关的致病基因如下表所示：
2.权利要求1所述的DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒用于诊断离子通道病。
3.权利要求1所述的DNA文库在制备诊断装置中的应用，其特征在于，所述诊断装置用于诊断离子通道病。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述诊断装置是测序芯片。
5.如权利要求2-4任一权利要求所述的应用，其特征在于，所述应用包括下列步骤：
(1)提供受试者样本的基因组DNA；
(2)利用权利要求1所述的DNA文库从Ion TorrentTM高通量测序平台自动合成覆盖全部74个致病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增；
(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；
(4)对步骤(3)得到的酶切产物加Barcode接头；
(5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；
(6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增；
(7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区域扩增文库；
(8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接于ISP珠子，得到反应液；
(9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上Ion TorrentTM高通量测序进行测序；
(10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关的突变位点；
(11)对步骤(10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。
7.一种诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的DNA文库。
8.一种诊断装置，其特征在于，所述装置包括权利要求1所述的DNA文库。
9.如权利要求8的诊断装置，其特征在于，所述诊断装置是测序芯片。
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