CN105543361B - 一种检测诊断多囊肾致病基因的dna文库及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种通过靶向高通量半导体测序技术检测多囊肾致病基因突变的DNA文库及其应用。具体来说，根据6个多囊肾病致病基因，设计引物池，对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量半导体测序技术进行测序，寻找致病突变，明确多囊肾的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据,为多囊肾患者晚期移植手术供体鉴别提供支持，为多囊肾患者进行选择性优生优育提供基础。本发明具有准确、快速、灵活、低成本的特点，本发明涉及的6个基因检测区域能够检测常染色体显性多囊肾和常染色体隐性多囊肾，对多囊肾的诊断和鉴别诊断有着重要的意义和临床价值。

Description

一种检测诊断多囊肾致病基因的DNA文库及其应用
技术领域
本发明涉及一种通过靶向高通量半导体测序技术检测诊断多囊肾致病基因的DNA文库及其应用。具体说是根据多囊肾致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻区域的超多重PCR引物，并对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，明确多囊肾的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据，为多囊肾患者晚期移植手术供体鉴别提供支持，为多囊肾患者进行选择性优生优育提供基础。属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术。
背景技术
多囊肾是一种常见的遗传性肾病，主要表现为双侧肾脏出现多个大小不一的囊肿，囊肿进行性增大占位，挤压正常肾单位，破坏肾脏的结构和功能，最终导致终末期肾病。该病临床常表现为多发性肾脏囊肿、进行性肾功能衰竭、持续性高血压和泌尿系感染等症状,还可合并其他器官囊肿(肝囊肿、胰腺囊、卵巢囊肿等)，脑血管畸形，动脉瘤，心脏瓣膜病变，门脉高压等多种并发症。由于目前缺乏有效治疗手段,多数患者发展为终末期肾衰而不得不进行肾脏替代治疗或肾移植手术。多囊肾根据遗传方式的不同，可以区分为常染色体显性多囊肾(ADPKD)和常染色体隐性多囊肾(ARPKD)两种。常染色体显性多囊肾是最常见的单基因遗传性肾病，发病率约为1:500～1000，发病年龄多在30～50岁。常染色体隐性多囊肾发病率约为1:2000～5000，发病年龄较早，多在婴幼儿期即有表现。
目前，研究发现多囊肾的数个致病基因中，只要任意一种基因发生功能性突变，即可引起疾病表型，即：同一种多囊肾可以由多种遗传因素所导致。并且，不同基因的突变导致的同一种多囊肾，其严重程度和预后不一样(如：PKD1基因突变导致的常染色体显性多囊肾，患者发病年龄相对较早，PKD2基因突变导致的常染色体显性多囊肾，相对而言患者发病年龄较晚)。除此之外，同一患者如果携带了一个以上的致病基因突变，其临床表现和预后与只携带单一致病突变的患者相比会有差异。因此，全面、快速、准确地筛查致病基因是多囊肾精确诊断和个性化治疗的必须前提条件。
临床上现有的多囊肾的常规诊断技术主要是影像学检查，如肾脏彩超。但是，影像学检查特异性不高，不能精确地区别多囊肾的具体种类。对于在早期尚未表现出临床症状的年轻患者也不能进行准确诊断。因此，目前仅结合临床症状、影像学检查不能把各种多囊肾精准地区分开来，具有预告性的基因诊断是解决这一难题的唯一解决办法。然而，传统的基于Sanger测序的基因检测方法存在通量低的弊端，一次反应只能检测一个扩增区域，无法满足多囊肾庞大的基因检测区域和多样本检测时效性的要求。
因此，有必要寻求一种新的检测多囊肾致病基因突变的方法，提高诊断准确率，降低成本和劳动强度并提高时效性。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供一种全面覆盖常染色体显性多囊肾和常染色体隐性多囊肾，包含6个多囊肾致病相关的致病基因的DNA文库。其中6个致病基因如下：
序号 基因名 OMIM编号 关联疾病
1 PKD1 601313 成人发病常染色体显性多囊肾
2 PKD2 173910 成人发病常染色体显性多囊肾
3 PKHD1 606702 幼儿发病常染色体隐性多囊肾
4 TSC1 605284 常染色体显性多囊肾
5 TSC2 191092 常染色体显性多囊肾
6 DKK3 605416 常染色体显性多囊肾
本发明根据6个多囊肾病致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻调控区域的适用于超多重PCR的引物池，进而对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量半导体测序技术进行测序，寻找致病突变，明确主动脉夹层的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据。为此，本发明还提供以下技术方案：
本发明还提供一种上述DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒用于诊断多囊肾。
本发明还提供一种上述DNA文库在制备诊断装置中的应用，所述诊断装置用于诊断多囊肾。优选的，所述诊断装置是测序芯片。
进一步，所述应用包括下列步骤：
(1)提供受试者样本的基因组DNA；
(2)利用上述的DNA文库从Ion TorrentTM高通量测序平台自动合成覆盖全部6个致病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增；
(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；
(4)对步骤(3)得到的酶切产物加Barcode接头；优选的，所述Barcode接头来自于高通量测序建库试剂盒；
(5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；
(6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增；优选的，该通用引物来自于高通量测序建库试剂盒；
(7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区域扩增文库；
(8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接于ISP珠子，得到反应液；
(9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上Ion TorrentTM高通量测序进行测序；
(10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关的突变位点；
(11)对步骤(10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。
优选的，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。
本发明还提供一种诊断试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述包含6个多囊肾的致病基因的DNA文库。
本发明还提供一种诊断装置，其中，所述装置包括上述包含6个多囊肾的致病基因的DNA文库。优选的，所述装置为测序芯片。
本发明提供一种使用上述DNA文库、诊断试剂盒或诊断装置对患者进行诊断的方法，所述方法包括下列步骤：
(1)提供受试者样本的基因组DNA；
(2)利用上述的DNA文库从Ion TorrentTM高通量测序平台自动合成覆盖全部6个致病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增；
(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；
(4)对步骤(3)得到的酶切产物加Barcode接头；优选的，所述Barcode接头来自于高通量测序建库试剂盒；
(5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；
(6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增，优选的，该通用引物来自于高通量测序建库试剂盒；
(7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区域扩增文库；
(8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接于ISP珠子，得到反应液；
(9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上Ion TorrentTM高通量测序进行测序；
(10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关的突变位点；
(11)对步骤(10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。
优选的，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。
采用本发明的DNA文库对离子通道病患者进行基因诊断有着以下重要意义和效果：
1.及时发现尚未发病的多囊肾患者：ADPKD是常染色体显性遗传疾病，家系中后代患病率较高。然而，该病具有遗传外显延迟性，早期隐匿性强，青少年时代常无症状，多数患者在40～60岁才会出现肾功能衰竭。利用本发明，可以快捷准确地对ADPKD家系成员中尚无症状、B超尚无多囊肾的个体及早进行症状前基因诊断,可以使患者提前知道病情，从而加强自我保护，并能及时控制并发症的发生和发展,延缓疾病进程,对减轻家庭和社会的负担都具有重大意义。
2.基因诊断有助于改善肾移植手术后生存率：多囊肾患者大多在疾病晚期发生肾衰竭，面临透析治疗和肾移植手术。国内肾移植供体主要来自家族内亲人，早期多囊肾的基因诊断可应用于供体的选择,它可准确鉴定潜伏期的供体是否有发生ADPKD的危险,从而避免移植肾再发多囊肾的风险，进而增加进行肾移植手术的患者的存活率。
3.本申请的DNA文库是申请人从众多的多囊肾致病基因中选择的6个基因，这些基因尤其适合包括中国人在内的黄色人种患者的检测。发明者通过多大样本中国汉族人群多囊肾患者进行多年的临床观察和基因诊断研究，筛选出了这6个致病基因，对它们在中国人群中的致病性和特点有了初步的了解。
4.本发明的DNA文库能够检测常染色体显性多囊肾和常染色体隐性多囊肾。本发明提供的DNA文库及基于高通量测序技术的序列检测方法能够检测6种多囊肾的遗传缺陷；
5.本发明中采用基于Ion TorrentTM高通量测序技术对目标区域的扩增产物进行检测，能够在一次测序反应中同时检测本发明中涉及的6个相关致病基因的全部外显子及毗邻区域，并且能根据不同芯片数据量的大小，调整检测样本数量，在保证平均测序深度500×的前提下，检测1到96人不等的样本数量，整个测序反应和数据分析判读能在两天之内完成，大大降低了扩增反应的成本和劳动强度，提高了时效性，同时，该检测区域具有覆盖度广，整体覆盖度达到96.90％；。通过对目标扩增区域的测序和数据判读，能够准确识别与疾病相关的突变，判断疾病种类和病因，为临床提供及时可靠的检测报告。本发明设计的检测方法经过Sanger测序法验证，对二代测序深度达到100×的点突变，本方法的准确度达到100％；
6.基因诊断有助于遗传咨询、产前诊断和新生儿筛查等。因多囊肾患者面临肾移植的风险，家人非常关注患者的兄弟姐妹或将来下一胎的健康。患者致病基因突变的确诊，可以为孕育健康的下一代提供明确的遗传咨询服务。多囊肾多数为常染色显性遗传病，患者兄弟姐妹有50％的发病可能性。对尚无症状年幼兄弟姐妹或子女进行致病基因检测有助于早期发现疾病、早期治疗，改善预后。
综合来看，本发明中涉及的DNA文库及其应用具有准确、灵活、快速、低成本的特点；经过临床评估，该发明对离子通道病具有很好的辅助诊断价值。
附图说明
图1一次Ion TorrentTM高通量测序反应的数据采集概要图；
图2一次对6个基因的目标区域进行测序，不同标本得到的数据量信息；
图3经过原始数据分析后，得到的不同标本的突变碱基数量；
图4Sanger测序法对本发明检测方法得到的突变位点进行验证。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1
1.该方法中所用到的试剂：
Ion AmpliSeqTM Library Kit 2.0，Ion PGMTM Template OT2200Kit v3，IonSequencing 200Kit v2，Ion Xpress Barcode Adaptors 1-16Kit，Ion 318TM Chip Kit v2
2.标本采集和保存
(1)标本采集：标本为患者外周血。血液为常规取静脉血5ml，EDTA抗凝处理。
(2)保存：可立即检测，4℃保存一周，超过一周-80℃保存。
3.检测步骤和结果分析：
(1)标本基因组DNA的提取：标本DNA的提取按照天根生化科技(北京)有限公司的血液DNA提取试剂盒操作说明进行。
(2)目标检测区域的超多重PCR扩增及建库：以本发明中涉及的6个基因全外显子为检测区域，基于Ion AmpliSeqTM Designer自动合成超多重PCR引物，对标本DNA的目标区域进行扩增及建库，具体实施如下:
a.目标区域的扩增：
反应条件：
b.扩增产物二合一，酶切：
反应条件：
c.连接接头：
反应条件：
22℃ 30min
72℃ 10min
10℃ Up to 1h
d.纯化及纯化产物的二次扩增：纯化步骤按照Ion Ampliseq LibraryPreparation操作手册进行，最终产物溶解于52μl反应体系，该反应体系组成为：
反应条件：
e.片段选择：片段选择步骤按照Ion Ampliseq Library Preparation操作手册进行，得到的最终建库产物用Qubit 2.0Fluorometer定量后即建库完成。
(3)高通量测序：测序及前期准备步骤按照Ion PGMTM Template OT2200Kit v3及IonSequencing 200Kit v2操作手册进行：
a.油包水PCR反应：
将上述反应体系加入Ion OneTouch 2中进行油包水PCR反应。
b.油包水PCR反应完成后，连接有测序模板的Ion PGM Template OT2200IonSphere Particles经过Ion Onetouch ES纯化，加入测序引物及DNA聚合酶：
室温5min后，将得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上Ion TorrentTM高通量测序进行测序。
(4)数据分析：测序数据经过coverage analysis和variant caller分析，得到碱基序列和突变位点，突变位点经过Ion Reporter在线注释后，得到对多囊肾诊断有意义的突变位点。
(5)Sange法验证：对于得到的突变位点，采用Sanger测序法进行验证。
结果说明及分析
通过本发明中涉及的高通量测序技术一次性对16个标本的目标区域进行检测(如图1)，得到的总数据量为912M(Total Base)，能够总共得到6033186的片段读长数据(TotalReads)，每个片段的中位读长为156bp。16个标本平均能够被测到372738(309375-411091)个片段读长Reads(如图2)，以上测序结果为下一步的序列分析提供了充足的数据量。测序结果经过variant Caller分析，每个标本平均有31个变异(Variants)被读出(如图3)。检测区域的变异通过Ion Reporter在线注释后，与疾病相关的突变位点经过Sanger测序法验证(如图4)，如图4所例举的那样，图4箭头所指处显示PKD2基因p.Leu258fs杂合移码突变,最终明确患者的遗传缺陷类型(样本编号PKD238)，为临床提供诊断依据。
本发明的临床应用例证
利用本发明所提供的方法，对200名患有多囊肾但病因不明确的患者进行了基因检测。共诊断出常染色体显性多囊肾166例，常染色体隐性多囊肾15例。该方法对多囊肾检出的总阳性率达到90.5％，结合临床影像学检查，实验室检查及医生最终诊断结果，本方法的假阳性率为0，即所有经本方法确认的携带致病突变患者均符合相关遗传疾病的临床特征，并能够给予明确的临床诊断。
通过对临床表型类似的患者进行基因诊断，并根据不同的致病基因进行分型，可以对患者的预后做出初步判断，如：PDK1基因受累的患者发病通常比PKD2基因受累的患者晚，预后相对较差。而同时合并一个以上致病基因突变的患者则预后会比只携带一个致病突变的患者更差。对于已经确诊的患者的幼龄亲属，利用本发明可以快速准确判断是否携带致病突变，从而对以后是否会发病作出判断，对日后的生活方式和检查方法做出规划。对晚期多囊肾患者选择移植肾源亲属供体时，可以利用本发明对供体进行筛查，防止供体亦携带致病突变，移植后供体肾脏出现病变的情况。
本发明涉及的检测方法是利用高通量测序技术为突变快速筛选工具，以Sanger测序法为最终确定突变的金标准，因此具有快速，准确的特征。以高通量测序平均深度100×为例，所覆盖的90.1％的目标区域都能够被测序，且筛选得到的点突变能够被Sanger测序法验证，因此对以上区域检测的准确度为100％。根据200名受测患者的临床诊疗结果分析，受测患者未出现假阴性率。基于本发明涉及的检测方法给出的诊断报告得到临床医生的认可和采纳。本发明涉及的检测方法具有准确，快速，低成本的特点，对多囊肾的鉴别诊断有着重要意义和实用价值。
实施例2：
本发明中引物池里包含发明者新发现的多囊肾致病基因3个，如下表：
序号 基因名 OMIM编号 关联疾病
1 TSC1 605284 常染色体显性多囊肾
2 TSC2 191092 常染色体显性多囊肾
3 DKK3 605416 常染色体显性多囊肾
新发现的3个多囊肾致病基因来自于发明者多年来的研究积累和家系调查。发明者首先在已知的多囊肾致病基因中通过KEGG信号通路检索，同源基因库，寻找已知致病基因的同源基因及相同致病通路上的关键基因。然后在多年积累的中国汉族病人大样本量病例样本库中对候选的致病基因进行靶向高通量测序，并进行生物信息学分析，筛选和寻找致病突变。对筛选到致病突变的病例进行随访和进一步的家系分析，对患者的整个家族进行致病位点测序验证，计算致病突变的共分离系数。当发现候选基因的致病突变在两个及以上无关联的家系中完全共分离时，即可初步判断该候选致病基因为新的致病基因。本发明发现，上述3个基因的致病突变在两个及以上无关联的家系中均出现完全共分离。
对一系列的筛选到的新致病基因及其致病突变进行功能学实验，对相关致病通路进行功能学检测，对部分重要受累基因进行大鼠基因敲除建模，观察疾病在动物模型中的再现情况，从而进一步对候选基因的致病性进行评估。本发明发现，患者的白细胞以及转染上述突变基因的293T细胞中上述3个基因的表达和功能均降低，在基因敲除动物中，敲除以上基因可以使患者临床表型得以重现。最终，筛选出了这3个新的国际上尚未报道的致病基因，并在汉族大样本病例中对其致病性进行了初步评估。同时，建立了600名汉族正常对照人群的所有致病基因的非致病多态性位点库，弥补了国际上通用数据库中汉族人样本少，非致病多态性位点严重不全的漏洞，对未来的基因检测和数据分析提供了坚实基础。

Claims (13)

1.一种基于Ion TorrentTM高通量测序技术诊断多囊肾的DNA文库，其特征在于，该文库包括6个多囊肾相关的致病基因，其中6个致病基因如下：
序号 基因名 OMIM编号 关联疾病 1 PKD1 601313 成人发病常染色体显性多囊肾 2 PKD2 173910 成人发病常染色体显性多囊肾 3 PKHD1 606702 幼儿发病常染色体隐性多囊肾 4 TSC1 605284 常染色体显性多囊肾 5 TSC2 191092 常染色体显性多囊肾 6 DKK3 605416 常染色体显性多囊肾
。
2.权利要求1所述的DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒用于诊断多囊肾。
3.权利要求1所述的DNA文库在制备诊断装置中的应用，其特征在于，所述诊断装置用于诊断多囊肾。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述诊断装置是测序芯片。
5.如权利要求2-4任一所述的应用，其特征在于，所述应用包括下列步骤：
(1)提供受试者样本的基因组DNA；
(2)利用权利要求1所述的DNA文库从Ion TorrentTM高通量测序平台自动合成覆盖全部6个致病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增；
(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；
(4)对步骤(3)得到的酶切产物加Barcode接头；
(5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；
(6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增；
(7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区域扩增文库；
(8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接于ISP珠子，得到反应液；
(9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上Ion TorrentTM高通量测序进行测序；
(10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关的突变位点；
(11)对步骤(10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述样本来自受试者的体液、组织器官样本。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述样本来自受试者的外周血。
8.如权利要求2-4任一所述的应用，其特征在于，所述应用进一步用于指导治疗。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用进一步用于指导治疗。
10.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述应用进一步用于指导治疗。
11.一种诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的DNA文库。
12.一种诊断装置，其特征在于，所述装置包括权利要求1所述的DNA文库。
13.如权利要求12的诊断装置，其特征在于，所述诊断装置是测序芯片。
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