CN110923296B

CN110923296B - 一种检测混合体系内各成分含量的方法及装置

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Publication number: CN110923296B
Application number: CN201811100343.XA
Authority: CN
Inventors: 张翀; 陈政霖; 剪兴金; 邢新会
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2018-09-20
Filing date: 2018-09-20
Publication date: 2021-01-26
Anticipated expiration: 2038-09-20
Also published as: WO2020056889A1; CN110923296A

Abstract

本发明涉及一种检测混合体系内各成分含量的方法及装置，该方法包括：设计并合成N种不同的核酸分子；将给定拷贝数的设计好的N种不同的核酸分子分别加入浓度已知M种不同成分中，从而确定每一个拷贝的核酸分子所代表的每一种组分的浓度水平；利用上述浓度已知的M种不同的组分组成混合体系并进行反应；对反应结束后的混合体系中存在的核酸分子进行检测以确定该混合体系中N种不同的核酸分子的拷贝数，以及基于上述检测的拷贝数计算发生反应后的混合体系中存在的各种成分的浓度。

Description

一种检测混合体系内各成分含量的方法及装置

技术领域

本发明涉及一种检测混合体系内各成分含量的方法及装置，具体来说，涉及一种基于核酸标记对混合体系内各成分含量进行检测的方法，以及用于进行所述检测的装置。

背景技术

混合液是液体的自然存在形态。这种液体的存在形态使化学反应得以实现。而生命现象本身也是一系列复杂的化学反应。因此，混合液同时也维持了生命体的生长与繁衍。在确认这些反应的过程中，很多时候需要在反应后，从结果推算出各个组分含量，这是一项复杂的工作。

目前，在检测领域中，经常使用荧光来对某种待检测的物质进行追踪和定量，但使用荧光追踪受限于4个荧光色，使用量子点追踪则限于8个颜色配比。对于比8组分更多的体系则无法有效地进行追踪。另外，使用颜色追踪的方式也同时受限于最低检测浓度，当目标成分的含量过低时，有时无法实现通过荧光或量子点的方法来进行追踪。

微流控技术被广泛应用到生物、化学、医学分析等过程中的样品制备、反应、分离、检测等工作中，是飞速发展的前沿技术和研究最为活跃的领域之一。对液体样品的操作在化学、微生物、生物化学、分子生物学、医学分析等领域是非常重要的。液体样品例如细胞培养液、细胞反应液、蛋白质溶液、DNA溶液、RNA溶液、不同的培养基等等各种生物、化学、医学分析等领域中常用的液体样品。

随着微流控技术的不断发展，从开放体系向微通道体系中转移多种液体样品的需求逐渐凸显，并在很大程度上制约了该技术的应用发展。在本领域中常见的开放体系，例如有在96孔板、离心管、烧瓶、样品管等中反应的各种体系，微通道体系是例如微液滴、微通道、管路、微反应器等。

而液滴微流控技术是微流控技术的一个重要的组成部分。液滴微流控技术是将两种互不相容的流体，以最常见的水和油为例，送入微米尺度的管道中，通过界面张力，使得水相被油相分成一个个大小稳定，尺度在微米级的小液滴，每个小液滴均可以看作独立的反应器，相当于生化反应中一个独立的混合体系。由于这样的微小的混合体系易于构建，并且可以构建大量的微小反应器，因此利用这样的微小液滴可以实现许多常规混合体系无法实现的优点，例如，利用这样的体系可以进行通量高筛选、每个体系的试剂消耗小和背景噪声低的特点，因而具有很好的工业化前景。

但是对于这样的微小混合体系，如果希望对混合体系中的多种复杂的成分进行监控则需要一种准确的方法来进行检测。通常现有技术中采用荧光技术来对于每种成分进行跟踪。

专利文献1提供一种微液滴荧光检测系统，它包括微流控芯片、光路装置、运动控制装置以控制芯片和光路装置运动，使得在芯片中的微液滴荧光扫描检测过程中，芯片与光路装置产生相对运动，而芯片内微液滴与芯片保持相对静止。专利文献1涉及的微液滴荧光检测系统的优点是封闭式检测以避免交叉污染、检测速度快、通量高和灵敏度高。

现有技术文献

专利文献1CN106442443A公开文本

发明内容

但是众所周知，如果需要采用不同的荧光体系和量子点技术来对不同物质进行追踪，其能够追踪的物质的种类是有限的，在现有的技术范围内，通常只有四种至八种不同的荧光体系，因此对于更为复杂的混合体系，本领域还急需开发出一种更为有效的、能够对更多的物质进行检测的方法和系统，尤其是对于微小体系中的混合物质进行检测的方法和系统。此外，在与生物相关的应用中，如果使用荧光或量子点的生理毒性会对样品中的生物造成影响，因此也希望寻找到一种能够对生物反应，生物培养体系等无毒害的检测体系和方法。

本发明意在提供一种能够简便、快速地对混合体系，例如液滴、孔板体系，固体培养器中的多种成分的含量进行定量，且没有任何毒性的方法和装置。

通常针对2种以上的多成分混合液或混合物，液滴内各成分的含量难以被分析。本方法和系统可以被用于解决此类应用问题。

具体来说，本发明涉及如下内容：

1.一种检测混合体系内M种成分含量的方法，其包括：

设计并合成N种不同的核酸分子；

将给定拷贝数的设计好的N种不同的核酸分子分别加入浓度已知M种不同成分中，从而确定每一个拷贝的核酸分子所代表的每一种组分的浓度水平；

利用上述浓度已知的M种不同的组分组成混合体系并进行反应；

对反应结束后的混合体系中存在的核酸分子进行检测以确定该混合体系中N种不同的核酸分子的拷贝数，以及

基于上述检测的拷贝数计算发生反应后的混合体系中存在的各种成分的浓度。

2.根据项1所述的方法，其中，

所述核酸分子选自dsDNA分子、RNA分子、ssDNA分子中的任意。

3.根据项1或2所述的方法，其中，

N大于或等于M。

4.根据项1～3中任一项所述的方法，其中，

设计的核酸分子在混合体系的反应过程中保持稳定。

5.根据项1～4中任一项所述的方法，其中，

所述核酸分子的长度为10bp以上且20,000bp以下，优选20bp以上且10000bp以下，进一步优选30bp以上且5000bp以下。

6.根据项2所述的方法，其中，

所述核酸分子是经修饰的核酸分子。

7.根据项1所述的方法，其中，

对反应结束后的混合体系中存在的核酸分子进行检测以确定该混合体系中N种不同的核酸分子的拷贝数是通过ddPCR方法进行检测。

8.根据项6所述的方法，其中，

对反应结束后的混合体系中存在的核酸分子进行检测以确定该混合体系中N种不同的核酸分子的拷贝数是通过检测经修饰的核酸分子上的标记物来进行检测。

9.根据项1所述的方法，其中，

利用上述浓度已知的M种不同的组分组成数个混合体系，

且所述方法还包括：

从数个混合体系中挑选进行了反应的体系，以及

对经挑选的、反应结束后的混合体系中存在的核酸分子进行检测以确定该混合体系中n种不同的核酸分子的拷贝数。

10.根据项1所述的方法，其中，

在将给定拷贝数的设计好的N种不同的核酸分子分别加入浓度已知M种不同成分中步骤中，核酸分子与已知浓度的成分的比例范围为1拷贝核酸分子/1fmol/mL已知成分～1拷贝核酸分子/1kmol/mL已知成分，优选1拷贝核酸分子/0.01pmol/mL已知成分至1拷贝核酸分子/100mol/mL已知成分，进一步优选1拷贝核酸分子/1pmol/mL已知成分至1拷贝核酸分子/10mol/mL已知成分。

11.一种检测混合体系内M种成分含量的装置，其包括：

核酸分子设计器，其设计并合成N种不同的核酸分子；

核酸分子标定构件，其将给定拷贝数的设计好的N种不同的核酸分子分别加入浓度已知M种不同成分中，从而确定每一个拷贝的核酸分子所代表的每一种组分的浓度水平；

反应构件，在该反应构件中，利用上述浓度已知的M种不同的组分组成混合体系并进行反应；

检测构件，其对反应结束后的混合体系中存在的核酸分子进行检测以确定该混合体系中N种不同的核酸分子的拷贝数，以及，

计算构件，其基于上述检测的拷贝数计算发生反应后的混合体系中存在的各种成分的浓度。

12.根据项11所述的装置，其中，

所述核酸分子选自dsDNA分子、RNA分子、ssDNA分子中的任意。

13.根据项11或12所述的装置，其中，

N大于或等于M。

14.根据项11～13中任一项所述的装置，其中，

设计的核酸分子在混合体系的反应过程中保持稳定。

15.根据项11～14中任一项所述的装置，其中，

16.根据项12所述的装置，其中，

所述核酸分子是经修饰的核酸分子。

17.根据项11所述的装置，其中，

在检测构件中，对反应结束后的混合体系中存在的核酸分子进行检测以确定该混合体系中N种不同的核酸分子的拷贝数是通过ddPCR方法进行检测。

18.根据项16所述的装置，其中，

在计算构件中，对反应结束后的混合体系中存在的核酸分子进行检测以确定该混合体系中N种不同的核酸分子的拷贝数是通过检测经修饰的核酸分子上的标记物来进行检测。

19.根据项11所述的装置，其中：

利用上述浓度已知的M种不同的组分组成数个混合体系，

且该数个混合体系均在反应构件中进行反应，

该装置还包括：

挑选构件，其实现从数个混合体系中挑选进行了反应的体系，以及

并且在检测构件和计算构件中，对经挑选的、反应结束后的混合体系中存在的核酸分子进行检测以确定该混合体系中N种不同的核酸分子的拷贝数。

20.根据项11所述的装置，其中，

发明效果

利用本发明的检测方法和装置，可以实现对M种不同的成分进行定量监控。本领域技术人员完全可以理解，M可以是任意数值，即利用本发明的方法和装置，可以实现对于超过4种组分，甚至于超过8种以上的组分进行有效的监控，只要可以设计了N种有效的核酸分子，既可以实现这样的监控。

此外，由于可以实现对于1个拷贝的核酸分子的定量检测，因此利用本法发明的方法和装置，可以实现对于非常低浓度的已知成分进行检测。

此外，如上所述，本发明的方法和装置没有利用可能对于生物体系或生物反应有毒性的荧光或量子点，因此可以提供一种对于生物反应或生物培养体系等没有任何毒害作用的方法和装置。

具体实施方式

本发明涉及检测混合体系内M种成分含量的方法，其包括：设计并合成N种不同的核酸分子；将给定拷贝数的设计好的N种不同的核酸分子分别加入浓度已知M种不同成分中，从而确定每一个拷贝的核酸分子所代表的每一种组分的浓度水平；利用上述浓度已知的M种不同的组分组成混合体系并进行反应；对反应结束后的混合体系中存在的核酸分子进行检测以确定该混合体系中N种不同的核酸分子的拷贝数，以及基于上述检测的拷贝数计算发生反应后的混合体系中存在的各种成分的浓度。

在本发明的一个具体的实施方式中，核酸分子是指由多个核苷酸聚合成的生物大分子化合物。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸(简称RNA)和脱氧核糖核酸(简称DNA)。在本发明的另一个具体的实施方式中，核酸可以是任意的、已知的核酸分子，例如可以包括单链DNA分子(ssDNA)、双链DNA分子(dsDNA)、RNA分子等各类核酸分子。

首先，在设计并合成N种不同的核酸分子的过程中，本领域技术人员可以根据需要追踪的物质或组分的特性进行设计，设计的该核酸分子可以为dsDNA分子，或者该核酸分子可以为RNA分子，或者该核酸分子可以为ssDNA分子，并且可以理解，该N种不同的核酸分子可以为N个dsDNA分子，或者可以为N个RNA分子，或者N个ssDNA分子，同样该N种不同的核酸分子可以为N1个dsDNA分子、N2个RNA分子，或者N3个ssDNA分子，N1+N2+N3＝N，其中N1，N2或N3不同时为零。

在设计了N种不同的核酸分子之后，将给定拷贝数的设计好的N种不同的核酸分子分别加入浓度已知M种不同成分中，从而确定每一个拷贝的核酸分子所代表的每一种组分的浓度水平。

在本发明的一个具体的实施方式中，可以将如上设计的N种不同核酸分子分别均匀地混入M种不同成分中，例如可以是M种溶液中，其中，N大于或等于M。

在N＝M时，即表示根据设计的需要，将一种核酸分子与一种组分进行混合，在N大于M时，表示针对一种成分或物质，设计了2个或以上的核酸分子来追踪该成分，即将2个或以上的核酸分子与一种组分进行混合。

在一个具体的实施方式中，例如，向溶液A中加入已知的核酸a，向溶液B中加入核酸b，溶液C中加入核酸c，并扩展至M种不同的溶液。

在另一个具体的实施方式中，向溶液A中加入已知的核酸a1和核酸a2，向溶液B中加入核酸b，溶液C中加入核酸c1和c2，并扩展至M种不同的溶液。

在本发明中，对于设计的N种不同的核酸分子没有具体的要求，只要其可以用于对M种成分进行追踪即可，优选设计的核酸分子在混合体系的反应过程中保持稳定。

在本发明中，保持稳定是指在混合体系的整个反应过程中，该核酸分子保持完整且不会被混合体系中的任一种成分降解，也不会被混合体系反应所生成的产物降解，在整个检测的过程中始终可以被后续介绍的方法追踪。

本领域技术人员可以基于所需要追踪的M种成分来设计核酸分子的具体序列，以及其长度，例如所述核酸分子的长度可以为10bp以上，例如可以为20bp，30bp，40bp，50bp，60bp，70bp，80bp，90bp，100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，且可以在20,000bp以下，19,000bp以下，在18,000bp一下，在17,000bp以下，在16,000bp以下，在15,000bp以下，在14,000bp以下，在13,000bp以下，在12,000bp以下，在11,000bp以下，在10,000b以下，在9,000bp以下，在8,000bp以下，在7,000bp以下，在6,000bp以下，在5,000bp以下。

N种核酸分子的长度可以相同，也可以不同，例如，核酸分子a的长度可以为55bp，核酸分子b的长度可以为60bp，核酸分子c的长度可以为150bp，核酸分子d的长度可以为113bp等等。

在本发明中，核酸分子任选为被修饰的核酸分子，例如可以是经纳米颗粒交联的核酸分子，也可以是带有常用的修饰标记物，如经蛋白质、肽修饰的核酸分子。

设计N种不同的核酸分子，并且如上所述，将给定拷贝数的N种不同的核酸分子加入浓度已知M种不同成分中，这样可以确定每一个拷贝的核酸分子所代表的每一种组分的浓度水平。

例如，核酸分子与已知浓度的成分的比例范围为1拷贝核酸分子/1fmol/mL已知成分～1拷贝核酸分子/1kmol/mL已知成分，优选1拷贝核酸分子/0.01pmol/mL已知成分至1拷贝核酸分子/100mol/mL已知成分，进一步优选1拷贝核酸分子/1pmol/mL已知成分至1拷贝核酸分子/10mol/mL已知成分。例如1拷贝核酸分子表征1fmol/mL的已知成分A、1拷贝核酸分子表征1kmol/mL的已知成分A、1拷贝核酸分子表征0.01pmol/mL已知成分A、1拷贝核酸分子表征100mol/mL已知成分A、1拷贝核酸分子表征1pmol/mL已知成分A、1拷贝核酸分子表征10mol/mL已知成分A。

上述含量均是列举的，本领域技术人员完全可以根据需要设计1拷贝核酸分子所需要表征的已知成分的量。每1拷贝核酸分子可以表征上述范围中的任意浓度的已知成分，只要是可以在后续的方法中可以计算即可。

通过这样的方法，利用不同拷贝数的核酸分子表征不同浓度的已知成分，这样的表征方法只要可以检测1个拷贝的核酸分子，即可以对该已知成分进行定量，因此对于需要检测的已知成分浓度的下限没有具体的限定。

具体来说，在溶液(混合液的组成成分)中加入已知浓度的已知序列的核酸。例如，向1mL的物质A中混入不与物质A反应的100拷贝的核酸AA，此时，测得1拷贝的核酸AA表示混合液中含有0.01mL的物质A。依次类推，本领域技术人员可以向M种不同的组分或组分形成的溶液中加入给定拷贝数的核酸分子，并确定每一个拷贝数的核酸分子所表示的组分浓度。

然后，将加入了N种给定拷贝数的核酸分子之后的这M种溶液随机混合，以用于后续的反应。

M种溶液混合后，反应随即开始，并在反应结束后，取出效果优良的反应体系，并检测所含的各个核酸浓度。

当然，上述反应可以是化学反应、生物反应，可以是培养体系，可以是酶催化反应，可以是化学合成等等各种混合体系中可能发生的反应。

在一个具体的实施方式中，将如上所述形成的混合体系，放置在任意的混合液生成装置中生成混合液。然后，向该混合液中包入微生物。对液滴进行培养，培养后，将微生物能够生长的液滴选出。

在一个具体的实施方式中，将如上所述形成的混合体系，放置在96孔板中，并且加入酶溶液开始引发酶催化反应，并在酶催化反应结束之后，挑选出进行了酶催化反应的孔，并进一步进行后续的检测。

在本发明的方法中，利用上述浓度已知的M种不同的组分组成数个混合体系，且所述方法还包括：从数个混合体系中挑选进行了反应的体系，以及对经挑选的、反应结束后的混合体系中存在的核酸分子进行检测以确定该混合体系中n种不同的核酸分子的拷贝数。本发明的方法可用于优化培养基，化学反应等多组分反应。这样的多组分反应体系，可以列举例如，工业上多酶体系的酶量优化，以及微生物的培养，诱导条件优化，不可培养微生物的培养等。

在一个具体的实施方式中，本发明用于微流控领域中的大量的用于生物培养的液滴体系，即每一个混合体系均为一个液滴。可以在微流控芯片中生成包括多个液滴的液滴库。对于库的生成方法，没有具体的限定，可以使用例如液滴微流控，分液机器人等技术，在流体中生成液滴，如在油中或空气中生成液滴。一个液滴即为一个反应体系，被用以反应。

当然，本领域技术人员完全可以理解，上述由多个混合体系形成的库并不局限于流体的形式，也可采用固化剂，如凝胶等，将液滴固化，形成固体反应器。

本方法中涉及的混合体系，并不局限于液滴，也可使用多个孔板，或试管，摇瓶，培养皿，培养琼脂平板等。

在本发明的方法中，在对上述不同已知浓度的M种组分进行混合时，可以通过任何本领域技术人员已知的方法，例如可以通过简单的混合，将M种成分添加的到反应器，例如培养瓶、培养皿中。

也可以通过自动控制进样每种例如液体成分的泵的流量来实现混合体系中各成分的浓度控制。例如可以使用电子控制(一般以波，例如正弦波的形式，但不局限于波)的方式来控制泵的操作，为各成分设定一个周期，然后，以缓冲液或水补充至一定容量。具体如A成分周期为1秒，B成分周期为5秒，C成分周期为7.5秒，D成分周期为13秒，E成分为50秒，F成分为1000秒。然后，从注入缓冲液或水，补充至一定容量。当然不局限于使用电子控制的方法，也可以手动控制等方法实现。

在本发明的方法中，对反应结束后的混合体系中存在的核酸分子进行检测以确定该混合体系中N种不同的核酸分子的拷贝数。检测方法可以为ST-PCR，ddPCR等检测核酸浓度的方法，但并不局限于这些方法。

对于不经修饰的核酸，可以通过直接测序的方法将序列测出，例如ST-PCR，ddPCR等方法；对于携带纳米磁性颗粒的核酸，可以通过测量磁信号的方法将测量，例如通过测量纳米颗粒的磁信号强度判断那么颗粒的数量；对于其他纳米颗粒，如金纳米颗粒等则可测量其发光性质，吸光度等物理性质完成鉴定；对于蛋白质或肽类的修饰，则可以透过使用特定的吸光度等物理手法来检测用于修饰的蛋白质或肽类的浓度，从而可以来定量其修饰的核酸分子的含量。

在本发明一个具体的实施反式中，采用了9种长度不同的核酸分子，例如DNA分子对9种不同的组分进行定量追踪。

在本发明一个具体的实施方式中，设计了9种长度不同的DNA分子来用于追踪已知成分，这9种不同的DNA分子的长度分别为129bp、127bp、90bp、95bp、80bp、93bp、88bp、75bp以及92bp。

在本发明一个具体的实施反式中，采用了9种长度相同的核酸分子，例如RNA分子对9种不同的组分进行定量追踪。

在本发明一个具体的实施方式中，设计了9种长度相同的RNA分子来用于追踪已知成分，9个RNA分子的长度均为60bp。

在本发明一个具体的实施反式中，采用了4种长度不同的核酸分子，例如DNA分子对4种不同的组分进行定量追踪。

在本发明一个具体的实施方式中，设计了4种长度不同的DNA分子来用于追踪已知成分，这4种不同的DNA分子的长度分别为67bp、65bp、66bp以及82bp。

在本发明一个具体的实施反式中，采用了3种长度不同的核酸分子，例如DNA分子对3种不同的组分进行定量追踪。

在本发明一个具体的实施方式中，设计了3种长度不同的DNA分子来用于追踪已知成分，这3种不同的DNA分子的长度分别为58bp、68bp以及61bp。

在本发明一个具体的实施反式中，采用了ddPCR来检测N种不同的核酸分子的拷贝数。

在本发明一个具体的实施反式中，所述核酸分子是经磁性纳米颗粒修饰的核酸分子，并通过磁传感器来监控该经修饰的核酸分子。

实施例

以下基于实施例对本发明进行详细的描述，但是本发明的范围不受这些实施例的限制。

实施例1

首先，设计并合成以下9条基因序列。

序列1(Seq ID No.1)：

TAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAGGTCGTGATGTCGGTAGTGGCTGATGCTGATGCTGATGCTGATGTCGTAGTCGAGAGAGGTTGAAACCT

序列2(Seq ID No.2)：

TTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTTTCCTCTCCTTTTTTCCCCCAAACCCCTTTTTCCCTCCCTACCTTTTTCCCATCACAAATCCTTT

序列3(Seq ID No.3)：

CGATATCCCGCAAGAGGCCCGGCAGTACCGGCATAACCAAGCCTATGCCTACAGCATCCACCGGTGTGGTGTGAGTCGCTAATCATTTGG

序列4(Seq ID No.4)：

AGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTTTAACCCCCCTACTCTCCAATCTGGTTTTAATATT

序列5(Seq ID No.5)：

GTGGCCCGGCTCCATGCACCGCGACGCAACGCGGGGAGGCAGACAAGGTATAGGGCGGCGCTATCTATCATTCTTATCTT

序列6(Seq ID No.6)：

ATGTGGCCCGGCTCCATGCACCGCGAGCTAACGGGGAGGCAGACAAGGTATAGGGCGGCGCCACACACTACTTCGCGCGCCCGTGCCTCGGGG

序列7(Seq ID No.7)：

CTGGCCCAGCTCCGTGCACCGTCACGCAACGCGGGGAATCAGACAATTTATAGGGCGCTGCCGGCTGGTGTGTGTAGTCGATCGATGG

序列8(Seq ID No.8)：

ATGCTTATGCATCATGCACCGCGACGCCTCCCGGGGAATTTGACAAGGTCCCGGGCGGCGCCGGTGGTGCCGTGC

序列9(Seq ID No.9)：

TAAACCAGATCGGCATGCACCGCGACGCCTCCCGGGGAATCCGACAAGGTCCCGCGTAAGAAACCCCGTGTTGGTGGTAGGCTTTAGTGGTT

然后，分别准备2.0g/L缺氨基酸酵母氮源溶液，10％叶酸溶液，10％维生素B溶液，10％葡萄糖溶液，1％硫化铵溶液，0.8g/L缺尿嘧啶，缺色氨酸，缺赖氨酸混合氨基酸，1g/L尿嘧啶，1g/L色氨酸，1g/L赖氨酸和水，放于高压灭菌锅中，在121℃，高压灭菌20分钟。然后，将上述序列1混入到10％缺氨基酸酵母氮源溶液中，序列2混入到10％叶酸溶液中，序列3混入到10％维生素B溶液中，序列4混入到10％葡萄糖溶液中，序列5混入到1％硫化铵溶液中，序列6混入0.8g/L缺尿嘧啶，缺色氨酸，缺赖氨酸混合氨基酸，序列7混入1g/L尿嘧啶，序列8混入1g/L色氨酸，序列9混入1g/L赖氨酸。此时，控制上述9种核酸的浓度为1000拷贝/纳升。

将上述9种溶液每种分别装入1mL的注射器中，将注射器安装到精密进样泵上。将预先培养的10⁶株/毫升的产纤维素酶大肠杆菌菌液(Cloning and characterization oftwo thermostable xylanases from an alkaliphilic Bacillus firmus,Biochemicaland Biophysical Research Communication 319(2004)1017-1025)和β-D-纤维二糖苷-6,8-二氟-7-伞花内酯-4-甲烷磺酸盐荧光底物(按照New Glycosidase Substrates forDroplet-Based Microfluidic Screening,Analytical Chemistry,2013,85,9807-9814合成，加入浓度为0.25mM)装入1mL注射器中，并安装到精密进样泵(Harvard Apparatus,Pump11Elite)上，以0.5pL/秒的速度进样到液滴微流控芯片中。其他样品则以振幅为0.5pL，频率各异的方式操控紧密进样泵进样(振幅为正弦波的峰值，即最多0.5pL，频率表示每秒具有的正弦波循环的个数)。具体来说，2.0g/L缺氨基酸酵母氮源溶液正弦波震动频率为0.1s，10％叶酸溶液的正弦波振动频率为7.0s，10％维生素B溶液正弦波震动频率为10s，10％葡萄糖溶液正弦波震动频率为40s,1％硫化铵溶液正弦波震动频率为85s，0.8g/L缺尿嘧啶，缺色氨酸，缺赖氨酸混合氨基酸溶液正弦波震动频率为130s，1g/L尿嘧啶溶液正弦波震动频率为350s，1g/L色氨酸溶液正弦波震动频率为400s，1g/L赖氨酸溶液正弦波震动频率为500s。然后，加水补至8.0pL。将这9种液体通过液滴微流控系统混合，并生成大小均一的液滴。

此时，所生成的液滴中所含的溶液配比各异。从微流控系统中提取上述产纤维素酶大肠杆菌生长的液滴，具体来说，由于菌在该液滴中生长并生产纤维素酶，因此荧光底物将会被降解成纤维二糖苷和带有蓝色荧光的6,8-二氟-7-伞花内酯-4-甲烷磺酸盐。使用流式细胞仪将含荧光液滴选出从而挑选出菌生长的液滴。

然后，使用ddPCR(Bio-Rad,QX200Droplet Digital PCR System)测量该液滴中的各序列的含量，用以推断各个溶液的配比。检测结果为在该液滴中检测到1个拷贝的序列1、1个拷贝的序列4、以及1个拷贝的序列5、1个拷贝的序列6、1个拷贝的序列7、以及1个拷贝的序列8。

根据上述检测结果可以计算出在该提取的液滴中所含溶液的各成分的含量为1pL2.0g/L缺氨基酸酵母氮源溶液，1pL10％葡萄糖溶液，1pL1％硫化铵溶液，1pL 0.8g/L缺尿嘧啶，缺色氨酸，缺赖氨酸混合氨基酸，1pL 1.0g/L尿嘧啶溶液，1pL 1.0g/L色氨酸和2pL水。

实施例2

首先，设计并合成以下9条基因序列。

序列10(Seq ID No.10)：

TAATAGCGAAGAGGCUCGCACCGATCGCCCUTCCCUACAGUTGCGCAGCCTGAATUGCGA

序列11(Seq ID No.11)：

TTTTTAATTTAUAAGGATCTAUGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAUAATCCC

序列12(Seq ID No.12)：

CGATATUCCGCAAGAGGCCCGGCAGTACCGUCUTUACCAAGUCTATGCCTACAGCATCCA

序列13(Seq ID No.13)：

UGUGCCTGATGCGGTATTTTCTCUUTACGCAUTUTGTGCGGTATTTCACACCGCATUGGT

序列14(Seq ID No.14)：

GTUGUCCGGCTCCATUCACCGCGUCGCAACGCUGGGAGGCUGAUAAGGTAUAGGGUGGCU

序列15(Seq ID No.15)：

ATUTGGCCCGGUTCCATGCACCGCUAGCTAACGGUGAUGCAGAUUAGGTATAUGGCGUCG

序列16(Seq ID No.16)：

CTGGCCCAGCTCCGTGCACCGTCACGCAACGCGUGGAATCAGACAATTTATAGGGCGCTG

序列17(Seq ID No.17)：

AUGCTTAUGCATCUTGCACCUCUACGCCUCCCGGGUUATTTGAUAUGGUCCUUGGCGGUU

序列18(Seq ID No.18)：

TUAUCUAGATCUGCAUGCUGUGUGACUCCTCUCGGUGAUTCUGUUAUGGTUCCUCGTUAG

然后，在每个序列的U碱基上进行修饰，即，将市场上贩卖的磁性纳米颗粒(购自Particle Works公司)结合到U碱基上。分别准备0.5％酵母提取物，0.01％碳酸氢钠溶液，0.6％维生素B溶液，0.7％葡萄糖溶液，0.1％硫化铵溶液，0.2％氯化钠溶液，0.5％柠檬酸铁溶液，0.7％蛋白胨溶液，0.2％氯化钙溶液，2.0％海藻酸钠溶液。放入高压灭菌锅中，121℃灭菌，15分钟。将上述序列10混入0.5％酵母提取物，序列11混入0.01％碳酸氢钠溶液，序列12混入0.6％维生素B溶液，序列13混入0.7％葡萄糖溶液，序列14混入0.1％硫化铵溶液，序列15混入0.2％氯化钠溶液，序列16混入0.5％柠檬酸铁溶液，序列17混入0.7％蛋白胨溶液，序列18混入0.2％氯化钙溶液。此时，控制上述9种核酸的浓度为2000拷贝/纳升。

将上述9种溶液每种分别装入1mL的注射器中，将注射器安装到精密进样泵上。将10⁶株/毫升的海水中取得的微生物样品装入1mL注射器中，并安装到精密进样泵(HarvardApparatus,Pump 11Elite)上，以0.5pL/秒的速度进样到液滴微流控芯片中。将2.0％低融点琼脂糖溶液装入1mL注射器中，并安装到精密进样泵(Harvard Apparatus,Pump11Elite)上，在37℃条件下，以0.5pL/秒的速度进样到液滴微流控芯片中。其他样品则以振幅为0.5pL，频率各异的方式操控紧密进样泵进样(振幅为正弦波的峰值，即最多0.5pL，频率表示每秒具有的正弦波循环的个数)。具体来说，0.5％酵母提取物溶液正弦波震动频率为0.01s，0.01％碳酸氢钠溶液的正弦波振动频率为0.3s，0.6％维生素B溶液正弦波震动频率为7s，0.7％葡萄糖溶液正弦波震动频率为20s,0.1％硫化铵溶液正弦波震动频率为72s，0.2％氯化钠溶液正弦波震动频率为140s，0.5％柠檬酸铁溶液正弦波震动频率为310s，0.7％蛋白胨溶液正弦波震动频率为420s，0.2％氯化钙溶液正弦波震动频率为500s。将这9种液体通过液滴微流控系统混合，并生成大小均一的液滴。生成液滴后，在油中加入1.0mM氯化钙，使液滴固化。

此时，所生成的液滴中所含的溶液配比与容量各异。此时，菌株生长的微球的光散射度将会改变。使用光学镊子将这类微球选出从而挑选出菌生长的液滴。然后，加入EDTA和水，将固体微球稀释1000000倍并液化，然后使用磁传感器，感知该磁分布与大小。如，感应得知含5个磁珠的群信号2个，7个磁珠的群信号4个，7个磁珠的群信号2个，1个磁珠的群信号1个，经过计算可以确认微球内含有：0.5％酵母提取物1pL，0.7％葡萄糖溶液2pL，0.2％氯化钠溶液1pL，0.5％柠檬酸铁溶液0.5pL。

实施例3

首先，设计并合成以下9条基因序列。

序列1(Seq ID No.1)：

序列2(Seq ID No.2)：

序列3(Seq ID No.3)：

序列4(Seq ID No.4)：

AGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTC ACACCGCATATGGTTTAACCCCCCTACTCTCCAATCTGGTTTTAATATT

序列5(Seq ID No.5)：

序列6(Seq ID No.6)：

序列7(Seq ID No.7)：

序列8(Seq ID No.8)：

ATGCTTATGCATCATGCACCGCGACGCCTCCCGGGGAATTTGACAAGGTCCCGGGCGGCGCCGGTGGTGCCGTGC

序列9(Seq ID No.9)：

然后，分别准备2.0g/L缺氨基酸酵母氮源溶液，10％叶酸溶液，10％维生素B溶液，10％葡萄糖溶液，1％硫化铵溶液，0.8g/L缺尿嘧啶，缺色氨酸，缺赖氨酸混合氨基酸，1g/L尿嘧啶，1g/L色氨酸，1g/L赖氨酸，放于高压灭菌锅中，在121℃，高压灭菌20分钟。然后，将上述序列1混入到10％缺氨基酸酵母氮源溶液中，序列2混入到10％叶酸溶液中，序列3混入到10％维生素B溶液中，序列4混入到10％葡萄糖溶液中，序列5混入到1％硫化铵溶液中，序列6混入0.8g/L缺尿嘧啶，缺色氨酸，缺赖氨酸混合氨基酸，序列7混入1g/L尿嘧啶，序列8混入1g/L色氨酸，序列9混入1g/L赖氨酸。此时，控制上述9种核酸的浓度为1000拷贝/纳升。

将上述9种溶液和预先培养的10⁶株/毫升的产纤维素酶大肠杆菌菌液(Cloningand characterization of two thermostable xylanases from an alkaliphilicBacillus firmus,Biochemical and Biophysical Research Communication 319(2004)1017-1025)及β-D-纤维二糖苷-6,8-二氟-7-伞花内酯-4-甲烷磺酸盐荧光底物(按照NewGlycosidase Substrates for Droplet-Based Microfluidic Screening,AnalyticalChemistry,2013,85,9807-9814合成，加入的浓度为0.25mM)装入分液机器人中。使用分液机器人随机在孔板中生成混合液。

此时，所生成的液滴中所含的溶液配比各异。在带有荧光检测装置的培养箱中检测荧光变化，并提取上述产纤维素酶大肠杆菌生长的液体，具体来说，由于菌在该液滴中生长并生产纤维素酶，因此荧光底物将会被降解成纤维二糖苷和带有蓝色荧光的6,8-二氟-7-伞花内酯-4-甲烷磺酸盐。使用流式细胞仪将含荧光液滴选出从而挑选出菌生长的液滴。

然后，使用ddPCR(Bio-Rad,QX200Droplet Digital PCR System)测量该混合液中的各序列的含量，用以推断各个溶液的配比。检测结果为在该也混合滴中检测到3个拷贝的序列1、5个拷贝的序列4、2个拷贝的序列5、1个拷贝的序列6、6个拷贝的序列7、以及2个拷贝的序列8。

根据上述检测结果可以计算出在该提取的混合滴中所含溶液的各成分的含量为3pL 2.0g/L缺氨基酸酵母氮源溶液，5pL10％葡萄糖溶液，2pL1％硫化铵溶液，1pL 0.8g/L缺尿嘧啶，缺色氨酸，缺赖氨酸混合氨基酸，6pL1.0g/L尿嘧啶溶液，2pL 1.0g/L色氨酸。

实施例4

首先，设计并合成以下4条基因序列。

序列19(Seq ID No.19)：

TAATAGCGAAGAGGTACGCCCGCACCGATCGCCCATCCCTACAGTTGCGCAGCCTCATGAATCGCGA

序列20(Seq ID No.20)：

TTTTTAATTTATAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCATAATCATCTACC

序列21(Seq ID No.21)：

CGATATACCGCAGCTACTAGAGGCCCGGCAGTACCGGCTTTACCAAGUCTATGCCTACAGCATCCA

序列22(Seq ID No.22)：

ATGCTTATGCATCTCCGGGATATGGGTTAGGTGCTTCCCGGGGAATTTGACAAGGTCCCGGGCGGCGCCGGTGGTGCCGTGC

然后，准备10％β-D-葡萄糖溶液，1U/mL葡萄糖氧化酶(GOx)溶液，1U/mL辣根过氧化物酶溶液和Amplex UltraRed荧光底物溶液(Invitrogen公司，制备方法与说明书相同)。将10％β-D-葡萄糖置于高压灭菌锅中在115℃条件下，高压灭菌20分钟。将序列19加入10％β-D-葡萄糖溶液，序列20加入1U/mL葡萄糖氧化酶(GOx)溶液，序列21加入1U/mL辣根过氧化物酶溶液，序列22加入1U/mL Amplex Red中。核酸的浓度为10000拷贝/纳升。

使用分液机器人，随机将10％β-D-葡萄糖，1U/mL葡萄糖氧化酶(GOx)，1U/mL辣根过氧化物酶和Amplex UltraRed荧光底物溶液分配到微孔板(使用激光于玻璃上刻蚀，100,000孔)中。置于经改造后带荧光检测装置的恒温培养箱中，与30℃条件下反应48小时，每10分钟检测一次。48小时后，将目标混合液(即背景值低，最终荧光高的混合液)选出。使用ddPCR(Bio-Rad,QX200Droplet Digital PCR System)测量该混合液中的各序列的含量，用以推断各个溶液的配比。如，检测所得序列19为100拷贝，序列20为5拷贝，序列21为3拷贝，序列22为100拷贝时，混合液含有10％β-D-葡萄糖溶液，1U/mL葡萄糖氧化酶(GOx)溶液，1U/mL辣根过氧化物酶溶液和Amplex UltraRed荧光底物溶液各为10pL，0.5pL，0.3pL和10pL。

实施例5

首先，设计并合成以下4条基因序列：

序列23(Seq ID No.23)：

ATGCACCGCGACGCAACGCGGGGAGGCAGACAAGGTATAGGGCGGCGCTATCTATCAT

序列24(Seq ID No.24)：

ATGCTTGTGGATCTACTATCTAGTCTATTTTCGGATCGATCGTACGATGCTAGCTAGTCAGTGTTAGT

序列25(Seq ID No.25):

TCTCGTGTCATCGATGCTAGTCGGATGCTGAGTCGGATTTGGTGACTAGGTCGATCGTAGT

然后，准备10％β-D-葡萄糖溶液，1U/mL葡萄糖氧化酶(GOx)溶液，1U/mL辣根过氧化物酶溶液和Amplex UltraRed荧光底物溶液(Invitrogen公司，制备方法与说明书相同)。将10％β-D-葡萄糖置于高压灭菌锅中在115℃条件下，高压灭菌20分钟。将序列23加入10％β-D-葡萄糖溶液，序列24加入1U/mL葡萄糖氧化酶(GOx)溶液，序列25加入1U/mL辣根过氧化物酶溶液。核酸的浓度为1拷贝/毫升。

使用分液机器人，随机将10％β-D-葡萄糖，1U/mL葡萄糖氧化酶(GOx)，和1U/mL辣根过氧化物酶以5mL为单位，加入500mL摇瓶中。与摇床中反应40小时候加入Amplex Red溶液，至于摇床中继续反应1小时后，检测荧光强度。将目标混合液(最终荧光高的混合液)选出。使用ddPCR(Bio-Rad,QX200Droplet Digital PCR System)测量该混合液中的各序列的含量，用以推断各个溶液的配比。如，检测所得序列23为70拷贝，序列24为10拷贝，序列25为9拷贝，混合液中含有10％β-D-葡萄糖溶液，1U/mL葡萄糖氧化酶(GOx)溶液，1U/mL辣根过氧化物酶溶液各为70mL，10mL，9mL。

本申请接受各种修改和可替换的形式，具体的实施方式已经在附图中借助于实施例来显示并且已经在本申请详细描述。但是，本申请不意在受限于公开的特定形式。相反，本申请意在包括本申请范围内的所有修改形式、等价物、和可替换物，本申请的范围由所附权利要求及其法律等效物限定。

在本发明中列举的数值范围均包括该数值范围的两个端点的数据，也包括该数值范围中具体的每一个数值，并且该数值可以与端点任意组合组成新的小范围。

Claims

1.一种检测混合体系内M种成分含量的方法，其包括：

设计并合成N种不同的核酸分子；

所述N种核酸分子在所述混合体系的反应过程中保持稳定；

所述N种核酸分子不会被所述混合体系中的任一种成分降解，也不会被所述混合体系反应所生成的产物降解；

基于上述检测的拷贝数计算利用上述浓度已知的M种不同的组分组成的混合体系中存在的各种成分的浓度；

其中，N等于M。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，

所述核酸分子选自dsDNA分子、RNA分子、ssDNA分子中的任意。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中，

所述核酸分子的长度为10bp以上且20,000bp以下。

4.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中，

所述核酸分子的长度为20bp以上且10000bp以下。

5.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中，

所述核酸分子的长度为80bp以上且5000bp以下。

6.根据权利要求2所述的方法，其中，

所述核酸分子是经修饰的核酸分子。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，

8.根据权利要求6所述的方法，其中，

9.根据权利要求1所述的方法，其中，

利用上述浓度已知的M种不同的组分组成数个混合体系，

且所述方法还包括：

从数个混合体系中挑选进行了反应的体系，以及

10.根据权利要求1所述的方法，其中，

在将给定拷贝数的设计好的N种不同的核酸分子分别加入浓度已知M种不同成分中步骤中，核酸分子与已知浓度的成分的比例范围为1拷贝核酸分子/1fmol/mL已知成分～1拷贝核酸分子/1kmol/mL已知成分。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，

在将给定拷贝数的设计好的N种不同的核酸分子分别加入浓度已知M种不同成分中步骤中，核酸分子与已知浓度的成分的比例范围为1拷贝核酸分子/0.01pmol/mL已知成分至1拷贝核酸分子/100mol/mL已知成分。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，

在将给定拷贝数的设计好的N种不同的核酸分子分别加入浓度已知M种不同成分中步骤中，核酸分子与已知浓度的成分的比例范围为1拷贝核酸分子/1pmol/mL已知成分至1拷贝核酸分子/10mol/mL已知成分。

13.一种检测混合体系内M种成分含量的装置，其包括：

核酸分子设计器，其设计并合成N种不同的核酸分子；

检测构件，其对反应结束后的混合体系中存在的核酸分子进行检测以确定所述混合体系中N种不同的核酸分子的拷贝数，以及，

计算构件，其基于上述检测的拷贝数计算利用上述浓度已知的M种不同的组分组成的混合体系中存在的各种成分的浓度，

所述N种核酸分子在所述混合体系的反应过程中保持稳定；

其中，N等于M。

14.根据权利要求13所述的装置，其中，

所述核酸分子选自dsDNA分子、RNA分子、ssDNA分子中的任意。

15.根据权利要求13所述的装置，其中，

所述核酸分子的长度为10bp以上且20,000bp以下。

16.根据权利要求13所述的装置，其中，

所述核酸分子的长度为20bp以上且10000bp以下。

17.根据权利要求13所述的装置，其中，

所述核酸分子的长度为80bp以上且5000bp以下。

18.根据权利要求14所述的装置，其中，

所述核酸分子是经修饰的核酸分子。

19.根据权利要求13所述的装置，其中，

20.根据权利要求18所述的装置，其中，

在计算构件中，的反应结束后的混合体系中存在的核酸分子进行检测以确定该混合体系中N种不同的核酸分子的拷贝数是通过检测经修饰的核酸分子上的标记物来进行检测。

21.根据权利要求13所述的装置，其中：

利用上述浓度已知的M种不同的组分组成数个混合体系，

且该数个混合体系均在反应构件中进行反应，

该装置还包括：

22.根据权利要求13所述的装置，其中，

23.根据权利要求13所述的装置，其中，

24.根据权利要求13所述的装置，其中，