CN108588202B - 一种单细胞全基因扩增方法 - Google Patents

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    • C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase

Abstract

本发明公开一种单细胞全基因扩增方法，包括如下步骤：1)细胞样品分离为1‑10个细胞；2)单细胞进行裂解，然后加入基因扩增混合物和突变体Phi29 DNA聚合酶进行扩增反应；3)扩增产物进行片段化，纯化后测序；所述基因扩增混合物中包含5‑8mM MnCl2、0.5‑1mM Na2HPO4、50‑100ng牛血清白蛋白(BSA)或体积百分比0.1‑0.5％甘油中的一种或多种；所述突变体Phi29 DNA聚合酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述方法与传统的MDA扩增体系相比，进一步提高了均一性和覆盖度，可以精确地检测SNP，以及DNA拷贝数变异。可应用于胚胎植入前遗传学诊断和筛查。

Description

一种单细胞全基因扩增方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种单细胞全基因扩增方法。
背景技术
随着二代测序技术的不断发展，测序成本的不断降低，大规模的的全基因组测序技术极大的推进了快速的全基因组DNA序列分析和基因分型，一般的全基因组测序需要大量的起始DNA进行建库，对于例如癌细胞的异质性、细胞行为等的研究，实验结果往往表示的是一个平均值，或者是其中占优势的细胞信息，而单个细胞的特性往往被忽略；对于非常珍贵的临床样本、难以培养的微生物样本其基因组DNA是及其微量的，为了弥补这一局限性，单细胞测序应运而生。
与传统的全基因组测序相比，单细胞全基因组测序能够更加精确的发现突变频率低的SNP，而且对细胞的异质性的研究有更显著的意义，其优势是全方位和多层次的。单细胞测序技术的流程主要包括单细胞分离、细胞裂解、全基因组扩增、测序与分析4个方面。其中细胞分离的方法包括梯度密度离心法、显微操作技术、荧光激活细胞分选、流式细胞分选和激光显微切割技术。而其中的流式细胞分选和激光显微切割技术已经越来越多的应用在临床上。
目前对全基因组进行扩增主要有基于PCR的PEP-PCR(扩增前引物延伸PCR)、DOP-PCR(退变寡核苷酸引物PCR)和MALBAC(多次退火环状循环扩增技术)的方法，基于PCR-free的MDA(多重链转换扩增)法。
由于PCR的扩增具明显的序列偏好性，很多高GC含量以及形成复杂结构序列得不到有效扩增而在最终的扩增产物中得不到体现，导致最终扩增得到的产物基因组覆盖度比较低。MALBAC法是利用Bst酶的链置换活性，以初始基因组为模板，加入MALBAC引物(包含27个核苷酸的共同序列和8个高度可变的核苷酸)，进行扩增。完整的扩增产物(full-amplicon)可以发生自身环化，不会再次作为模板，因而确保准线性的全基因组预扩增。通过后续PCR进行指数式扩增，为下游测序分析提供足够的材料样本。虽然MALBAC法也存在一定的基因偏好性，但偏好性在不同的细胞之间是可重复的，可以通过对参考细胞标准化后，进行CNV的分析；但MALBAC的弱点在于，它使用的Bst聚合酶保真性不如φ29DNA聚合酶，因此MALBAC在检测SNV时将会出现更多的假阳性；另外，由于它可重复性的序列偏好性，基因组上低扩增的区域有时会在扩增过程中丢失；且因为Bst酶没有3'到5'外切酶校正机制，测序错误率较高。
基于PCR-free的MDA是使用随机的六聚体引物和φ29DNA聚合酶进行反应，该聚合酶具有很强的链置换特性，能够在等温的条件下，扩增产生50～100kb的DNA片段。同时由于其3’-5’核酸外切酶活性和校对活性，Phi29DNA聚合酶具有很高的保真性；φ29DNA聚合酶的高效率及高保真性，使得MDA法在对SNV的分析，以及构建大片段文库上有着显著优势。但是MDA和DOP-PCR相同，依然是指数扩增，因此依然存在PCR反应的序列偏好性，特别是显著的非特异扩增，往往空白对照样品也总是“无中生有”地产生大量的DNA，特别当扩增模板起始量少时,其扩增产物的均一性和覆盖度下降，还存在一定的等位基因脱扣率(alleledrop-out，ADO)。
结合单细胞分选技术及全基因组扩增技术，单细胞全基因组扩增已经广泛应用于法医、单基因遗传病诊断、染色体异常遗传学筛查等领域。特别是在胚胎植入前遗传学诊断和筛查方面，其扩增误差直接影响SNP的检测，覆盖的均一性将直接影响到染色体非整倍体结果的判断，因此降低扩增的偏好性、提高扩增产物的覆盖度是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是在目前MDA的基础上提供一种单细胞全基因扩增方法，该方法与传统的MDA扩增体系相比，进一步提高了均一性和覆盖度，可以精确地检测SNP，以及DNA拷贝数变异。可应用于胚胎植入前遗传学诊断和筛查。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明提供一种单细胞全基因扩增方法，包括如下步骤：
1)细胞样品分离为1-10个细胞；
2)将分离的细胞进行裂解，然后加入基因扩增混合物和突变体Phi29DNA聚合酶进行扩增反应；
3)扩增产物进行片段化，纯化后测序；
所述基因扩增混合物中包含5-8mM MnCl2、0.5-1mM Na2HPO4、50-100ng牛血清白蛋白(BSA)或体积百分比0.1-0.5％甘油中的一种或多种；所述突变体Phi29DNA聚合酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明步骤1)细胞样品分离的方法可以用任何现有的用于胚胎细胞、组织切片等常见的临床样本的细胞分离技术，进行单细胞样本的分离，如显微操作、流式细胞仪、激光显微切割技术等。
本发明步骤2)单细胞裂解可以用常规的现有技术进行裂解，本发明提供一种具体的方法：分离的单细胞重悬在PBS中，加入二硫苏糖醇(DTT)和bufferD，60-70℃反应8-12min，再加入buffer N形成单细胞裂解产物；其中bufferD的组分浓度如下：0.15-0.2mM的KOH和1.5-2.0mM的EDTA，buffer N的组分浓度如下：3.5-4.5mM HCl。
本发明步骤2)扩增反应的条件为28-32℃，反应2-7h，反应结束后优选采用60-70℃处理4-6min将酶失活。
本发明步骤2)基因扩增混合物可以在现有常用的扩增混合物中加入5-8mMMnCl2、0.5-1mM Na2HPO4、50-100ng BSA或体积百分比0.1-0.5％的甘油，加入后可明显提高全基因扩增的均一性，优选添加两种以上，更优选为三种以上，最优选添加5-8mM MnCl2、0.5-1mM Na2HPO4、50-100ng BSA和体积百分比0.1-0.5％的甘油。
进一步的，本发明提供一种更为具体的步骤2)基因扩增混合物，包含60-65mMTris-HCl、5-8mM MgCl2、10-15mM NaCl、5-10mM(NH4)2SO4、4-6mM DTT、0.8-1.2mM dNTP、48-52μM随机引物、2-6mM EDTA，还包括5-8mM MnCl2、0.5-1mM Na2HPO4、50-100ng BSA或体积百分比0.1-0.5％的甘油中的一种或多种。
进一步的，本发明的随机引物为NNNNN、NNNNNN、NNNNNNN、NNNNNNNN等摩尔混合而成，N是随机序列，选自A、T、C、G。采用这种随机引物可以有效提高扩展产物的覆盖度。
进一步的，本发明步骤2)突变体Phi29DNA聚合酶加入量为扩增体系体积的3-5％，如通常为1.8-2.2μl。
本发明步骤2)单细胞全基因扩增反应混合物加入量为单细胞裂解产物体积的3.5-4.5倍，优选4倍。
本发明步骤3)扩增产物片段化可以采用雾化打断、酶打断、超声打断；纯化可以用DNA纯化磁珠进行纯化。
本发明还提供一种更为具体的步骤3)的操作方法：步骤2)的扩增产物用灭菌水稀释后，进行浓度测定，取一定量的扩增产物用转座酶法进行片段化并建库，文库经纯化后上机测序。
本发明还提供一种突变体Phi29DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述的突变体Phi29DNA聚合酶相对于野生型Phi29DNA聚合酶主要包含两个突变位点：
突变位点1：R45H，即野生型Phi29DNA聚合酶序列中第45位的精氨酸突变为组氨酸；
突变位点2：G197D，即野生型Phi29DNA聚合酶序列中第197位的甘氨酸突变为天冬氨酸。
本发明所述的突变体Phi29DNA聚合酶可以进一步降低扩增偏好性，提高扩增产物的均一性和覆盖度。
本发明还提供一种基因扩增混合物，包括5-8mM MnCl2、0.5-1mM Na2HPO4、50-100ng BSA或体积百分比为0.1-0.5％的甘油中的一种或多种。优选添加两种以上，更优选为三种以上，最优选添加5-8mM MnCl2、0.5-1mM Na2HPO4、50-100ng BSA和体积百分比0.1-0.5％的甘油。本发明所述的单细胞全基因扩增反应混合物，可以在现有常用的扩增混合物中加入5-8mM MnCl2、0.5-1mM Na2HPO4、50-100ng BSA或体积百分比为0.1-0.5％的甘油，加入后可明显提高全基因扩增的均一性。
本发明还提供一种更为具体的基因扩增混合物，包含60-65mM Tris-HCl、5-8mMMgCl2、10-15mM NaCl、5-10mM(NH4)2SO4、4-6mM DTT、0.8-1.2mM dNTP、48-52μM随机引物、2-6mM EDTA，还包括5-8mM MnCl2、0.5-1mM Na2HPO4、50-100ng BSA或体积百分比0.1-0.5％的甘油中的一种或多种。
进一步的，所述的随机引物为NNNNN、NNNNNN、NNNNNNN、NNNNNNNN等摩尔混合而成，N是随机序列，选自A、T、C、G。采用该随机引物可以有效提高覆盖度。
本发明还提供一种随机引物，为NNNNN、NNNNNN、NNNNNNN、NNNNNNNN等摩尔混合而成，N是随机序列，选自A、T、C、G。本发明所述的随机引物可以有效提高覆盖度。
本发明还提供本发明所述的突变体Phi29DNA聚合酶、扩增反应混合物或随机引物在单细胞全基因组扩增中的应用。
本发明相对于现有技术的有益效果：
本发明在传统的MDA扩增的基础上，进一步提高了覆盖度和均一性。该方法能够精确检测到SNP，在低测序深度下精确的鉴定23条染色体可能出现的非整倍体染色体异常，染色体平衡异位、非平衡异位、倒位等异常，可用于胚胎植入前遗传学诊断/筛查临床应用，如SNP检测、indel检测等。且本发明操作流程短，能够快速得到测序分析结果，且能够对SNP等进行准确判断。
附图说明
图1是单细胞扩增产物示意图；
M为DL15000(南京诺唯赞生物科技有限公司，Vazyme，货号MD103)，1-3为单细胞扩增产物，4为1ng的gDNA为模板的扩增产物，5为阴性对照。
图2为实施例3的3种扩增产物平均覆盖度(均一性)示意图。
图3为实施例3的扩增产物A的染色体非整倍体分析示意图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1、构建含Phi29突变体的载体
合成引物如下：
R45H-F：GTTTATGGCATGGGTGTTGAAGGTACAA
R45H-R：ACACCCATGCCATAAACTCATCCAGGC
G197D-F：GTCTAAAAgatTTCAAGGATATTATAACCACTAAGAAATTC
G197D-R：ATCTTTTAGACTGTCACTGCCTGCTG
以包含野生型Phi29DNA聚合酶基因序列的质粒为模板，利用PCR对野生型Phi29DNA聚合酶进行扩增。PCR扩增分为2个反应，分别以R45H-F和G197D-R，G197D-F和R45H-R为引物，以Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(南京诺唯赞生物有限公司，Vazyme，货号P505)为聚合酶，反应体系为50μl。扩增条件为95℃30s，95℃15s，60℃15s，70℃30s，72℃5min，共30个循环。
扩增结束后，在50μl反应体系中直接加入1μl DpnI，37℃恒温孵育2小时，消化原始质粒模板。以1％-1.5％(W/V)琼脂糖凝胶电泳，得到目的条带后切胶回收。将回收产物利用Mut MultiS Fast Mutagenesis Kit V2(南京诺唯赞生物科技有限公司，Vazyme，货号C215)进行重组反应，37℃恒温孵育0.5小时。取20μl冷却反应液，加入到100μl DH5α感受态细胞(Vazyme)中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激90秒，冰水浴孵育2min。加入500μl LB培养基，37℃孵育10min充分复苏。37℃摇菌45min。取100μl菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。第二天挑取单克隆，测序，Phi29突变体序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2单细胞全基因组扩增方法
1、单细胞分离
收集细胞系样本或组织样本，制备成单细胞悬液，用PBS稀释至5-7×102个/ml，取150μl细胞悬液于载玻片上，置于倒置显微镜载物台，调整焦距，使用移液器在镜头下对准要选取的单细胞，轻轻吸取，体积大约为1μl，将单细胞转移到3μl的PBS溶液中。
2、单细胞全基因组扩增
该步骤所用的BufferD、Buffer N、DTT、phi29DNA聚合酶均由南京诺唯赞(Vazyme)的Discover-sc single cell Kit(N601)试剂盒提供。
所使用的样品为单细胞，重悬在4μl的PBS中，另取1ng的293gDNA作为阳性对照，灭菌水作为阴性对照。
(1)准备bufferD2
(2)加3μl的buffer D2到4μl的细胞样品中，轻弹管壁混匀并短暂离心收集到管底；
(3)65℃孵育10min；
(4)加入3μl的buffer N，轻弹管壁混匀并短暂离心收集到管底，冰上放置，此时总体积为10μl。
(5)配制反应mix
其中单细胞全基因扩增反应混合物为65mM Tris-HCl、5mM MgCl2、13mM NaCl、12mM(NH4)2SO4、5mM DTT、1mM dNTP、50μM随机引物、6mM EDTA，5mM MnCl2、1mM Na2HPO4、80ngBSA和0.1％(v/v)甘油；其中随机引物为NNNNN、NNNNNN、NNNNNNN和NNNNNNNN等摩尔混合，可以为任何序列的随机引物；
(6)将40μl反应mix加入到10μl的裂解产物中，轻弹管壁混匀并短暂离心收集到管底；
(7)30℃反应6h，反应结束后65℃5min失活突变体phi29DNA聚合酶。
扩增产物取1μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，其中1-3为单细胞扩增产物，4为1ng的gDNA为模板的扩增产物，5为阴性对照，说明可正确扩增全基因组。
3、扩增产物浓度测定、测序
扩增产物用灭菌水稀释10倍后，选用Equalbit dsDNA HS Assay Kit(Vazyme，#EQ111)进行浓度测定，取5ng扩增产物用TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for(Vazyme，#TD502)然后进行片段化并建库，文库纯化后上机测序。
实施例3
1、样品准备
囊胚期活检第3天在胚胎透明带上打一个小洞，然后继续培养以便滋养外胚层细胞能够长出来，在第5天时可以获得3-5个细胞用于后续的扩增。
2、全基因组扩增和测序
采用实施例2所述方法、传统的MDA扩增体系、MALBCA体系分别用5个滋养外胚层细胞进行全基因组扩增，扩增产物用灭菌水稀释10倍后选用Equalbit dsDNA HS Assay Kit(Vazyme，#EQ111)进行浓度测定，取5ng扩增产物用TruePrep DNA Library Prep Kit V2for(Vazyme，#TD502)进行片段化并建库，文库用南京诺唯赞(Vazyme)生物科技有限公司生产的VAHTS DNA Clean Beads(N411)吸附DNA文库，80％的乙醇清洗磁珠，Elution Buffer洗脱，最终得到纯化产物，选用Equalbit dsDNA HS Assay Kit(Vazyme，#EQ111)进行浓度测定、Agilent 2100分析片段长度，质控合格后上机测序。
将测序所得的数据与参考基因组进行比对，计算均一度、覆盖度，用胚胎染色体非整倍体检测数据分析系统进行数据分析，得到每个测序样本每条染色体的拷贝数(CopyNumber Variation，简称CNV)数值，根据参考区间的参考范围进行结果判断。
实验结果：
实施例3所述方法、传统的MDA扩增体系、MALBCA体系进行单细胞全基因组扩增，分别得到扩增产物A、扩增产物B、扩增产物C，扩增产物A、B取5ng同时用上述的方法即TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for(Vazyme，#TD502)进行片段化并建库；扩增产物C由于片段本身较短，使用VAHTS Universal DNA Library Prep Kit forIllumina V2(Vazyme，ND606)进行建库，最后将3个文库进行测序反应，测序平台为Illumina X10，测序模式为PE150，预计约10x的测序深度，将测序数据进行比对分析，得到扩增产物的基本信息。
表1：3种扩增产物的基本数据情况
从表1中可以看出，扩增产物A、扩增产物B和扩增产物C在测序数据量相差不大的情况下，比对率及平均测序深度均无明显差异；而在覆盖度上，扩增产物A具有更高的覆盖度；SD值反应了数据的均一性，数值越小说明均一性越好，而扩增产物A具有更好的均一性，具体结果如图2所示。
另外扩增产物A经生物信息学分析染色体非整倍体得出如图3的结果。结果表明本发明提供的方法可以精确的鉴定23条染色体可能出现的非整倍体异常的现象。
以上结果表明本发明提供的单细胞全基因扩增方法的扩增效果比传统的MDA扩增体系及MALBCA扩增体系具有更高的覆盖度和更好的均一性。
序列表
<110> 南京诺唯赞生物科技有限公司
<120> 一种单细胞全基因扩增方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 572
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Pro Arg Lys Met Tyr Ser Cys Asp Phe Glu Thr Thr Thr Lys Val
1 5 10 15
Glu Asp Cys Arg Val Trp Ala Tyr Gly Tyr Met Asn Ile Glu Asp His
20 25 30
Ser Glu Tyr Lys Ile Gly Asn Ser Leu Asp Glu Phe Met Ala Trp Val
35 40 45
Leu Lys Val Gln Ala Asp Leu Tyr Phe His Asn Leu Lys Phe Asp Gly
50 55 60
Ala Phe Ile Ile Asn Trp Leu Glu Arg Asn Gly Phe Lys Trp Ser Ala
65 70 75 80
Asp Gly Leu Pro Asn Thr Tyr Asn Thr Ile Ile Ser Arg Met Gly Gln
85 90 95
Trp Tyr Met Ile Asp Ile Cys Leu Gly Tyr Lys Gly Lys Arg Lys Ile
100 105 110
His Thr Val Ile Tyr Asp Ser Leu Lys Lys Leu Pro Phe Pro Val Lys
115 120 125
Lys Ile Ala Lys Asp Phe Lys Leu Thr Val Leu Lys Gly Asp Ile Asp
130 135 140
Tyr His Lys Glu Arg Pro Val Gly Tyr Lys Ile Thr Pro Glu Glu Tyr
145 150 155 160
Ala Tyr Ile Lys Asn Asp Ile Gln Ile Ile Ala Glu Ala Leu Leu Ile
165 170 175
Gln Phe Lys Gln Gly Leu Asp Arg Met Thr Ala Gly Ser Asp Ser Leu
180 185 190
Lys Asp Phe Lys Asp Ile Ile Thr Thr Lys Lys Phe Lys Lys Val Phe
195 200 205
Pro Thr Leu Ser Leu Gly Leu Asp Lys Glu Val Arg Tyr Ala Tyr Arg
210 215 220
Gly Gly Phe Thr Trp Leu Asn Asp Arg Phe Lys Glu Lys Glu Ile Gly
225 230 235 240
Glu Gly Met Val Phe Asp Val Asn Ser Leu Tyr Pro Ala Gln Met Tyr
245 250 255
Ser Arg Leu Leu Pro Tyr Gly Glu Pro Ile Val Phe Glu Gly Lys Tyr
260 265 270
Val Trp Asp Glu Asp Tyr Pro Leu His Ile Gln His Ile Arg Cys Glu
275 280 285
Phe Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile Pro Thr Ile Gln Ile Lys Arg Ser
290 295 300
Arg Phe Tyr Lys Gly Asn Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Gly Gly Glu Ile
305 310 315 320
Ala Asp Leu Trp Leu Ser Asn Val Asp Leu Glu Leu Met Lys Glu His
325 330 335
Tyr Asp Leu Tyr Asn Val Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Lys Phe Lys Ala
340 345 350
Thr Thr Gly Leu Phe Lys Asp Phe Ile Asp Lys Trp Thr Tyr Ile Lys
355 360 365
Thr Thr Ser Glu Gly Ala Ile Lys Gln Leu Ala Lys Leu Met Leu Asn
370 375 380
Ser Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Ser Asn Pro Asp Val Thr Gly Lys Val
385 390 395 400
Pro Tyr Leu Lys Glu Asn Gly Ala Leu Gly Phe Arg Leu Gly Glu Glu
405 410 415
Glu Thr Lys Asp Pro Val Tyr Thr Pro Met Gly Val Phe Ile Thr Ala
420 425 430
Trp Ala Arg Tyr Thr Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Cys Tyr Asp Arg
435 440 445
Ile Ile Tyr Cys Asp Thr Asp Ser Ile His Leu Thr Gly Thr Glu Ile
450 455 460
Pro Asp Val Ile Lys Asp Ile Val Asp Pro Lys Lys Leu Gly Tyr Trp
465 470 475 480
Ala His Glu Ser Thr Phe Lys Arg Ala Lys Tyr Leu Arg Gln Lys Thr
485 490 495
Tyr Ile Gln Asp Ile Tyr Met Lys Glu Val Asp Gly Lys Leu Val Glu
500 505 510
Gly Ser Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Ile Lys Phe Ser Val Lys Cys Ala
515 520 525
Gly Met Thr Asp Lys Ile Lys Lys Glu Val Thr Phe Glu Asn Phe Lys
530 535 540
Val Gly Phe Ser Arg Lys Met Lys Pro Lys Pro Val Gln Val Pro Gly
545 550 555 560
Gly Val Val Leu Val Asp Asp Thr Phe Thr Ile Lys
565 570

Claims (7)

1.一种单细胞全基因扩增方法，其特征在于包括如下步骤：
1）细胞样品分离为1-10个细胞；
2）将分离的细胞进行裂解，然后加入基因扩增混合物和突变体Phi29 DNA聚合酶进行扩增反应；
3）扩增产物进行片段化，纯化后测序；
所述基因扩增混合物中包含60-65 mM Tris-HCl、5-8 mM MgCl2、10-15 mM NaCl、5-10mM （NH4）2SO4、4-6mM DTT 、0.8-1.2mM dNTP、48-52μM随机引物、2-6mM EDTA、 5-8 mMMnCl2、0.5-1mM Na2HPO4、50-100ng BSA和体积百分比0.1-0.5%甘油；所述突变体Phi29 DNA聚合酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的单细胞全基因扩增方法，其特征在于步骤2）扩增反应的条件为28-32℃，反应2-7h。
3.根据权利要求2所述的单细胞全基因扩增方法，其特征在于步骤2）扩增反应结束后采用60-70℃处理4-6min将酶失活。
4.根据权利要求1所述的单细胞全基因扩增方法，其特征在于随机引物为NNNNN、NNNNNN、NNNNNNN、NNNNNNNN等摩尔混合而成，N是随机序列，选自A、T、C、G。
5.根据权利要求1所述的单细胞全基因扩增方法，其特征在于步骤2）突变体Phi29 DNA聚合酶加入量为扩增反应混合物体积的3-5%；扩增反应混合物加入量为单细胞裂解产物体积的3.5-4.5倍。
6.根据权利要求5所述的单细胞全基因扩增方法，其特征在于步骤2）突变体Phi29 DNA聚合酶加入量为1.8-2.2μl。
7.根据权利要求5所述的单细胞全基因扩增方法，其特征在于扩增反应混合物加入量为单细胞裂解产物体积的4倍。
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