CN112831543B - 单细胞全基因组扩增试剂盒及其应用 - Google Patents

单细胞全基因组扩增试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基因组扩增方法，试剂盒及其应用。本发明公开了一种单细胞全基因组扩增的方法，包括以下步骤：a.将待扩增的单细胞样本重悬于油相中；b.将上述a步骤获得的重悬于油相的细胞进行裂解；c.上述b步骤获得的样本中，提供DNA聚合酶，引物，及其他扩增反应必需的试剂进行扩增反应。本发明还公开了一种扩增试剂盒以及上述扩增方法和扩增试剂盒的应用。本发明公开的扩增方法和试剂盒可以降低扩增过程中造成的偏差，具有高效稳定扩增效果，能够提高单细胞扩增的基因组覆盖度。

Description

单细胞全基因组扩增试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种基因组扩增方法，试剂盒及其应用。
背景技术
DNA测序技术的快速发展使得学术界对包括人类在内的各类物种的基因组有了更全面的认识，下一代测序的全基因组扩增(whole-genome amplification，WGA)在生物学和医学领域都有广泛的应用。随着测序技术、单细胞分离技术和全基因组扩增技术的快速发展，单细胞研究技术被列为未来几年最值得关注的技术之一。在单细胞水平上对基因组进行测序能更好地解决传统技术的局限性问题。单细胞全基因组扩增技术的难点在于单细胞的分离和全基因组的扩增。单细胞全基因组扩增技术是进行单细胞测序的前提，该技术可用于揭示单细胞基因组结构差异。
单细胞基因组测序常见的方法需要使用DNA聚合酶和高通量的短尾DNA测序，对单个细胞的基因组进行广泛的体外扩增。这些方法有两个显著的缺点，一是聚合酶复制错误可能会产生成千上万的假阳性，二是相对较短的序列读取几乎不包含任何单倍类型的信息。此外，单细胞研究技术存在一些问题，如扩增偏倚性、非特异性扩增、灵敏度不高、重复性差、操作失误率高、存在外来污染等。例如，MDA是目前公认的最好的单细胞基因组扩增技术，它能对全基因组进行高保真的均匀扩增，扩增出10～100kb大小的片段，能提供大量均一完整的全基因组序列。但是MDA也有一些缺点，特别是显著的非特异扩增，另外就是仍然存在扩增偏好性[9]。
单细胞分离技术也会对基因组扩增造成影响。研究表明，细菌细胞在单细胞拉曼微谱学分析过程中，直接激光照射后，其膜完整性会丧失，甚至导致大量细胞死亡，拉曼分析分选时的激光辐射对细胞的生理活性会造成一定损伤[10]。此外，由于激光辐射引起胞内核酸损伤等可能原因，弹射后常规细菌单细胞测序的覆盖度一般不超过20％,因此基因组拼装相对困难[11,12]。针对这些问题，如何提高扩增准确性、覆盖率和操作便捷是未来科研工作者的研究方向。
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发明内容
本发明提供了一种单细胞全基因组扩增的方法，试剂盒以及本扩增方法的应用。
一方面，本发明提供了一种单细胞全基因组扩增的方法，其特征在于包括以下步骤：a.将待扩增的单细胞样本重悬于油相中；b.将上述a步骤获得的重悬于油相的细胞进行裂解；c.上述b步骤获得的样本中，提供DNA聚合酶，引物，及其他扩增反应必需的试剂进行扩增反应。
所述方法适用于所有物种的单细胞样本，例如，细菌(革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌)，、植物细胞、动物细胞等。
所述的单细胞样本包括但不限于PBS重悬的细胞，水重悬的细胞，培养基重悬的细胞，乙醛固定的细胞和直接分离的单个细胞。
所述的其他扩增反应必需的试剂包括DTT，DMSO，10*phi29buffer,dNTP，H2O等
本发明中所述的DNA聚合酶包括但不限于vent DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、DNA聚合酶I、(Klenow)大片段、DNA聚合酶I(E.coli)、Sulfolobus DNA聚合酶IV、phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶，Equiphi29DNA聚合酶等，优选的为Phi29DNA聚合酶。
另一方面，本发明提供一种单细胞全基因组扩增的方法，其特征在于包括以下步骤：a.将待扩增的单细胞样本重悬于油相中；b.将上述a步骤获得的重悬于油相的细胞进行裂解；c.上述b步骤获得的样本中，提供DNA聚合酶，引物，及其他必需的试剂进行扩增反应。所述油相包含矿物油，氟碳油，硅烷油中的一种或多种。优选的，油相为矿物油。
另一方面，本发明提供一种单细胞全基因组扩增的方法，其特征在于包括以下步骤：a.将待扩增的单细胞样本重悬于油相中；b.将上述a步骤获得的重悬于油相的细胞进行裂解；c.上述b步骤获得的样本中，提供DNA聚合酶，引物，及其他必需的试剂进行扩增反应。所述油相包含矿物油，氟碳油，硅烷油中的一种或多种。所述油相SCC buffer O主要包括矿物油(轻质矿物油和重质矿物油等)，氟碳油，硅烷类的。所述油相还包含表面活性剂，优选的，表面活性剂是span-80或EM90。
另一方面，本发明提供一种单细胞全基因组扩增的方法，其特征在于包括以下步骤：a.将待扩增的单细胞样本重悬于油相中；b.将上述a步骤获得的重悬于油相的细胞进行裂解；c.上述b步骤获得的样本中，提供DNA聚合酶，引物，及其他必需的试剂进行扩增反应。单细胞样本与油相混合比例为1:0.5至1:20；优选地，单细胞样本与油相混合比例为1:1至1:10；更优选的，单细胞样本与油相混合比例为1:1至1:2。所述油相包含矿物油，氟碳油，硅烷油中的一种或多种。优选的，油相为矿物油。
另一方面，本发明提供一种单细胞全基因组扩增的方法，其特征在于包括以下步骤：a.将待扩增的单细胞样本重悬于油相中；b.将上述a步骤获得的重悬于油相的细胞进行裂解；c.上述b步骤获得的样本中，提供DNA聚合酶，引物，及其他必需的试剂进行扩增反应。所述a中待扩增的单细胞样本为单细胞悬于水或PBS缓冲液。
另一方面，本发明提供一种单细胞全基因组扩增的方法，其特征在于包括以下步骤：a.将待扩增的单细胞样本重悬于油相中；b.将上述a步骤获得的重悬于油相的细胞进行裂解；c.上述b步骤获得的样本中，提供DNA聚合酶，引物，及其他必需的试剂进行扩增反应。所述的单细胞样本是通过激光辐射分选获得的单细胞，优选的，拉曼信号分选获得的单细胞。
另一方面，本发明提供一种单细胞全基因组扩增的方法，其特征在于包括以下步骤：a.将待扩增的单细胞样本重悬于油相中；b.将上述a步骤获得的重悬于油相的细胞进行裂解；c.上述b步骤获得的样本中，提供DNA聚合酶，引物，及其他必需的试剂进行扩增反应。其特征在于，b步骤中，对细胞进行裂解的方式选自化学裂解、酶裂解或机械裂解的任一种或其任意组合。
另一方面，本发明提供一种单细胞全基因组扩增的方法，其特征在于包括以下步骤：a将待扩增的单细胞样本重悬于油相中；b.将上述a步骤获得的重悬于油相的细胞进行裂解；c.上述b步骤获得的样本中，提供DNA聚合酶，引物，及其他必需的试剂进行扩增反应。其特征在于，b步骤中，对细胞进行裂解的方式为化学裂解，优选地，采用碱裂解。更优选的，所述碱裂解液(Lysis buffer A)由Lysis buffer A1和DTT组成；所述Lysis buffer A1由溶质和溶剂组成；溶剂为水；溶质及其浓度为：0.09-0.11mM KOH和0.9-1.1mM EDTA；优选的，所述Lysis buffer A1由溶质和溶剂组成；溶剂为水；溶质及其浓度为：0.1mM KOH和1mMEDTA；所述DTT由溶质和溶剂组成；溶剂为水；溶质及其浓度为：0.1-5M DTT。
另一方面，本发明提供一种单细胞全基因组扩增的方法，其特征在于包括以下步骤：a.将待扩增的单细胞样本重悬于油相中；b.将上述a步骤获得的重悬于油相的细胞进行裂解；c.上述b步骤获得的样本中，提供DNA聚合酶，引物，及其他必需的试剂进行扩增反应，c步骤中DNA聚合酶是Phi29DNA聚合酶，或Equiphi29(Thermo Fisher)。
本发明还提供了一种单细胞全基因组扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括单细胞样本扩增前预处理液，DNA聚合酶，扩增缓冲液，引物；所述单细胞样本扩增前预处理液为油。优选的，DNA聚合酶是Phi29DNA聚合酶，或Equiphi29(Thermo Fisher)。
另一方面，本发明提供了一种单细胞全基因组扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括单细胞样本扩增前预处理液，DNA聚合酶，扩增缓冲液，引物；所述单细胞样本扩增前预处理液为油相，优选的，单细胞样本扩增前样本预处理液中的油选自矿物油，氟碳油，硅烷类的油中的一种或多种。
优选的，单细胞样本扩增前预处理液还包含表面活性剂，优选的，表面活性剂是span-80或EM90。
优选的，试剂盒还包含说明书。
本发明还保护另一种单细胞基因组扩增的方法，包括如下步骤：
(1)将0.5μl细胞材料(PBS重悬)放到微型离心管中,加入1μl油溶液SCC bufferO，充分震荡混匀；
所述油溶液SCC buffer O溶液包含矿物油，氟碳油，硅烷油中的一种或多种；
(2)将1μl变性裂解液Lysis buffer A加入步骤(1)所得溶液，充分震荡混匀，并短暂离心，随后65℃孵育10-15min；
所述变性裂解液Lysis buffer A由Lysis buffer A1和DTT组成；
所述Lysis buffer A1由溶质和溶剂组成；溶剂为水；溶质及其浓度为：0.09-0.11mM KOH和0.9-1.1mM EDTA；
所述DTT由溶质和溶剂组成；溶剂为水；溶质及其浓度为：0.1-5M DTT；
(3)向步骤(2)所得溶液加入1μl中和缓冲液Neutralization buffer B，充分震荡混匀，并短暂离心，得到模板溶液，冰上储存；
所述中和缓冲液Neutralization buffer B由溶质和溶剂组成；溶剂为水；溶质及其浓度为：54-66mM KH2PO4和4.5-5.5mM K2HPO4；
(4)取步骤(3)所得模板溶液3μL，加入10μL反应混合液，30℃孵育8小时，随后65℃静置10min，得到扩增产物；
所述反应混合液由2.25μl水、7.25μl SCC-reaction buffer C1溶液和0.5μl DNA聚合酶组成；
所述SCC-reaction buffer C1溶液由1μl 10×Phi29buffer、4.54μl水、0.75μlDMSO和0.96μl扩增体系甲组成；
单份扩增体系甲由0.06μl dNTP、0.75μl N6primers和0.15μl DTT组成；所述N6primers为随机引物，由6个脱氧核糖核苷酸组成，A、G、C和T随机排列，3′末端两种核苷酸进行磷代硫酸酯修饰；
所述dNTP溶液中，dATP/dTTP/dCTP/dGTP的浓度均为10mM；所述N6primers溶液中，引物总浓度为50μM；
所述DNA聚合酶为0.5μL Phi29DNA聚合酶；
所述Phi29DNA聚合酶的浓度为10U/μL。
本发明还提供了上述任一方法在基因组测序、全息阵列、定量PCR等中的应用。优选的，基因组测序是二代测序。
本发明还提供了以上任一所述试剂盒的在基因组测序，全息阵列，定量PCR等中的应用。优选的，基因组测序是二代测序。
本发明所提供试剂盒可用于所有物种的单细胞样本，例如，细菌(革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌)，分选的或组织培养的动物细胞、植物细胞等。试剂盒可应用于复杂微生物群落和细菌感染等疾病的功能研究，具有重大的应用前景和推广价值。
第一方面，本发明提供了一种能够提高基因组覆盖度的单细胞全基因组扩增方法。该方法对单细胞全基因组的各不同位点进行高保真，高均一的扩增，扩增物可用于高通量测序分析。
第二方面，本发明提供了用于单细胞扩增的试剂盒，现有的扩增方法及单细胞试剂盒(常用Qiagen single cell kit)，拉曼测量后的单细胞扩增得到的基因组覆盖率都比较低，该试剂盒可以显著降低扩增过程中造成的偏差，具有高效稳定扩增效果，从而能显著地提高单细胞扩增的基因组覆盖度，能从单细胞提供出90％以上基因组DNA序列信息。
具体实施方式
以下具体实施例是对本发明提供的方法与技术方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。
实施例1、试剂准备
1.准备充足的裂解液(Lysis buffer A)用于单细胞基因组扩增反应过程(表1)；
表1 Lysis buffer A配制：Lysis buffer A1为0.1mM KOH、1mM EDTA，使用时按下列比例混合
组分 量①
Lysis buffer A1 33μl
DTT 3μl
总量 36μl
2、实验前准备
设置一个65℃的水浴或金属浴加热器；
3.PCR仪的热盖温度设置为70℃。
实施例2、大肠杆菌细胞扩增
1.将0.5μl大肠杆菌细胞材料(所述细胞材料包括但不限于PBS重悬的细胞，水重悬的细胞，培养基重悬的细胞，乙醛固定的细胞，直接分离的单个细胞等)放到微型离心管中,加入样本体积0.5倍～20倍的矿物油(1倍为佳)，充分震荡混匀。
2.加上同上述步骤1中油相预处理的样本等体积的Lysis buffer A，充分震荡混匀，并短暂离心。酶裂解，例如采用溶菌酶裂解，机械裂解与化学裂解的裂解效果一致。所述酶裂解包括但不限于SDS和溶菌酶，所述机械裂解包括热休克和超声裂解，且所述超声裂解的工作方法为在300～400w的裂解功率下，每次工作2～5s后间歇4～10s，总工作时间为6～10min。所述化学裂解液包括但不限于以下任一种：0.1mM KOH、1mM EDTA、1M DTT；50mMKAc、20mM Tris-Ac、10mM MgAc、0.2％Trition X-100；1xPBS、1xThermo polbuffer、30mMTris-HCl；10mM Tris-HCl、25mM EDTA、100mM NaCl；0.5％SDS、10mM Tris-HCl、50mM KCl；10mM Tris-HCl、100mM EDTA、0.5％SDS；30mM Tris-HCl、10mM EDTA、1％SDS；30mM Tris-HCl、2mM KCl、0.2％Triton X-100；尿素、碘乙酰胺和NH4HCO3。)最佳的为0.1mM KOH、1mMEDTA、1M DTT(PH＝7-9)。
3.65℃孵育10-15min。
4.加入同Lysis buffer等体积Neutralization buffer B，Neutralizationbuffer B由60mM KH2PO4和5mM K2HPO4配置。充分震荡混匀，并短暂离心，冰上储存。
5.配制扩增混合液。混匀并短暂离心；
DNA聚合酶包括但不限于vent DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、DNA聚合酶I、(Klenow)大片段、DNA聚合酶I(E.coli)、Sulfolobus DNA聚合酶IV、phi29DNA聚合酶、BstDNA聚合酶，Equiphi29DNA聚合酶等，最佳的为Phi29DNA聚合酶。置于冰上待用；其他试剂使用前需在室温溶解后震荡离心，置于冰上待用；ddH2O置于室温待用；SCC-reaction bufferC1溶液可以由10％体积比的10×Phi29buffer、水、7.5％体积比的DMSO，10mM dNTP、引物总浓度为50μM的N6primers和1M DTT组成。可以按照表2配制扩增混合液。水(ddH2O)，SCC-reaction buffer C1后，震荡混匀并离心后，加入Phi29DNA聚合酶。
表2扩增混合液的配制
6.在每个反应(3μl变性DNA，步骤5)中加入10μl反应混合液。
7.30℃孵育8小时。
8.65℃，10min灭活Phi29DNA聚合酶活性。
9.将扩增DNA稀释20倍，取其中1μl/反应作为模板，进行特定PCR检测分析。
10.将成功扩增的MDA产物进行纯化及二代测序。
11.PCR分析，将扩增DNA稀释20倍，取其中1μl反应作为模板。
为探讨添加样本扩增前经油相预处理对大肠杆菌细胞DNA扩增的影响，在用样本同体积的油相预处理的样本扩增获得的8个样本，及未进行样本油相预处理的8个样本按照标准程序扩增比较，其中每个样本中含有1个大肠杆菌细胞。根据1％的琼脂糖凝胶电泳分析MDA和PCR扩增产物发现，其中进行油相处理的样品中8个样品均呈阳性(即1％凝胶电泳检测出了典型的MDA和PCR条带)，而标准方法扩增的样品只有5个呈阳性。此外，经油相前处理的样本中均成功地扩增了细菌基因片段，且没有发现污染，MDA反应得到了732-3,600ng产物，足够用于后续二代测序的制备。各选取5个成功扩增样品构建文库并用IlluminaHiSeq2500进行测序。通过组装得到了10个单一扩增基因组(5个扩增时含油相，5个不含)(表3)。在无油相预处理样本的标准扩增条件下得到的基因组覆盖率为49.82％-52.60％，而经过油相预处理样本扩增的样品得到的基因组覆盖率明显增高，为89.78％～99.97％。
表3.大肠杆菌单细胞基因组的组装与评价
实施例4、酿酒酵母细胞扩增
1.将0.5μl酿酒酵母细胞材料(PBS重悬)放到微型离心管中,加入0.5μl矿物油充分震荡混匀。
2.加上1μl Lysis buffer A，充分震荡混匀，并短暂离心。
3.65℃孵育10-15min。
4.加入1μl Neutralization buffer B。充分震荡混匀，并短暂离心，冰上储存。
5.按照表4配制扩增混合液。混匀并短暂离心；
Phi29DNA聚合酶置于冰上待用；其他试剂使用前需在室温溶解后震荡离心，置于冰上待用；ddH2O置于室温待用；可以按照表4配制扩增混合液。水(ddH2O)，SCC-reactionbuffer C1后，震荡混匀并离心后，加入Phi29DNA聚合酶。
表4扩增混合液的配制
②准备多个反应混合液,可以根据反应的个数额外多配制10％。
6.在每个反应(3μl变性DNA，步骤5)中加入10μl反应混合液。
7.30℃孵育8小时。
8.65℃，10min灭活Phi29DNA聚合酶活性。
9.将扩增DNA稀释20倍，取其中1μl/反应作为模板，进行特定PCR检测分析。
10.将成功扩增的MDA产物进行纯化及二代测序。
11.PCR分析，将扩增DNA稀释20倍，取其中1μl反应作为模板。
为探讨添加油相预处理样本对酿酒酵母细胞DNA扩增的影响，将8个经预处理的酿酒酵母细胞样本，与另外8个未经油相预处理样本按照标准程序进行扩增，其中每个样本中含有1个大肠杆菌细胞。根据1％的琼脂糖凝胶电泳分析MDA和PCR扩增产物发现，其中经油相预处理的样本中8个样本呈阳性(即1％凝胶电泳检测出了典型的MDA和PCR条带)，而未经油相预处理的样本经标准方法扩增的样本只有7个呈阳性。此外，经油相预处理样本中成功地扩增了细菌基因片段，且没有发现污染，MDA反应得到了998-4,020ng产物，足够用于后续二代测序的制备。接下来构建文库采用5个经油相预处理样本和5个未经油相预处理的样本进行扩增并用Illumina HiSeq2500进行测序。通过组装得到了10个单一扩增基因组(表5)。在未经油相预处理的样本的标准扩增条件下得到的基因组覆盖率为55.67％-67.80％，而经油相预处理样本扩增的样品得到的基因组覆盖率明显增高，为93.19％～99.89％。
表5.酿酒酵母细胞单细胞基因组的组装与评价
实施例5、尿液样品细胞扩增
1.将0.5μl尿液样品细胞材料(PBS重悬)放到微型离心管中,加入0.5μl矿物油充分震荡混匀。
2.加上1μl Lysis buffer A，充分震荡混匀，并短暂离心。
3.65℃孵育10-15min。
4.加入1μl Neutralization buffer B。充分震荡混匀，并短暂离心，冰上储存。
5.冰上溶化Phi29DNA聚合酶。室温溶化其它试剂，震荡混匀并短暂离心。
6.在每个反应(3μl变性DNA，步骤5)中加入10μl反应混合液。
7.30℃孵育8小时。
8.65℃，10min灭活Phi29DNA聚合酶活性。
9.将扩增DNA稀释20倍，取其中1μl/反应作为模板，进行特定PCR检测分析。
10.将成功扩增的MDA产物进行纯化及二代测序。
11.PCR分析，将扩增DNA稀释20倍，取其中1μl反应作为模板。
为探讨添加油相预处理样本对尿液样本细胞DNA扩增的影响，在1μl油相的存在下扩增了8个样本，另外8个样本按照标准程序扩增，其中每个样本中含有1个大肠杆菌细胞。根据1％的琼脂糖凝胶电泳分析MDA和PCR扩增产物发现，其中添加油相的样品中有8个样品呈阳性(即1％凝胶电泳检测出了典型的MDA和PCR条带)，而标准方法扩增的样品只有6个呈阳性。在这些样本中成功地扩增了细菌基因片段，且没有发现污染，MDA反应得到了805-3,430ng产物，足够用于后续二代测序的制备。接下来构建文库并用Illumina HiSeq2500进行测序。通过组装得到了10个单一扩增基因组(5个扩增时含油相，5个不含)(表6)。在无油相的标准扩增条件下得到的基因组覆盖率为49.02％-57.60％，而含油相扩增的样品得到的基因组覆盖率明显增高，为92.18％～99.57％。
实施例6.尿液样品细胞扩增
除了步骤1中，把矿物油换成氟碳油外，其他步骤同实施例5。结果表明，含油扩增的样品得到的基因组覆盖率明显比对照高。
表6.尿液样本细胞单细胞基因组的组装与评价

Claims (10)

1.一种单细胞基因组扩增的方法，其特征在于包括以下步骤：
a.将待扩增的单细胞样本重悬于油相中；
b.将上述a步骤获得的重悬于油相的细胞进行裂解；
c.上述b步骤获得的样本中，提供DNA聚合酶，引物，及其他扩增反应必需的试剂进行扩增反应；
其中，a步骤中，单细胞样本与油相混合体积比例为1:0.5至1:20；
所述油相选自矿物油、氟碳油中的任一种或其任意组合;
b步骤中，所述的裂解选自化学裂解、或酶裂解的任一种或其任意组合。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，a步骤中，将待扩增的单细胞样本放到微型离心管中。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述油相还包含表面活性剂。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，表面活性剂是 span-80或EM90。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，单细胞样本与油相混合体积比例为1:1至1:10。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单细胞样本是通过激光辐射分选获得的样本。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的激光辐射分选为拉曼信号分选。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的化学裂解为碱裂解。
9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，c步骤中所述的DNA聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。
10.权利要求1至9中任一所述方法在基因组测序、全息阵列、定量PCR中的应用。
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