CN115418390A - 甜菜碱在提高dna体外转录效率中的应用 - Google Patents

甜菜碱在提高dna体外转录效率中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及甜菜碱在提高DNA体外转录效率中的应用。并且本发明提供了体外转录的试剂和对核酸的检测方法和试剂。本发明研究发现通过添加适量浓度的甜菜碱能够提高DNA的体外转录效率，从而提高对ssRNA的检测体系中靶标RNA的产量，进而可显著提高对ssRNA检测的灵敏度。特别是将本发明所述的DNA体外转录试剂与CRISPR基因编辑技术联用，有助于推动CRISPR‑Cas13a技术应用于体外诊断检测外源核酸。

Description

甜菜碱在提高DNA体外转录效率中的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及甜菜碱在提高DNA体外转录效率中的应用。
背景技术
转录(transcription)是指以DNA为模板，以ATP、UTP、GTP和CTP为原料，按照碱基互补原则，在RNA聚合酶的作用下合成RNA的过程。转录通常发生在生物体内，在体外无细胞系统中，用DNA作为模板，添加RNA转录酶和NTP，从而模仿体内转录过程生成RNA，这样的技术被称为体外转录。
目前，多种检测方法都需要在检测前将DNA经体外转录形成RNA。例如，在CRISPR-Cas13a技术中，先将样本DNA转录为ssRNA，然后再利用CRISPR-Cas13a检测技术对ssRNA进行检测。如果待测目标物的遗传物质为RNA，则可先经过逆转录过程，再经过转录获得ssRNA，然后进行检测。
CRISPR-Cas13是向导RNA介导的RNA靶向的内切酶系统，是目前CRISPR-Cas家族中唯一的一支靶向ssRNA(单链RNA)的系统，为RNA靶向和RNA编辑奠定了基础。Cas13a-crRNA复合物中的crRNA将精准识别与之互补的序列并匹配后，Cas13a将外源单链RNA剪切，Cas13特异性切割靶标片段后，进入激活状态，可非特异性切割任意ssRNA。根据Cas13a被激活后的非特异性酶切活性，在体系中添加5’端标记荧光基团(FAM)，3’端标记淬灭基团(BHQ1)的报告RNA，可通过检测FAM基团荧光信号将该编辑系统应用于体外诊断中。由于CRISPR-Cas13a检测技术具有低温检测减少气溶胶污染、特异性高以及无需精密仪器检测等优点，且该检测方法原理虽复杂，但操作简便，易上手，将有助于推动CRISPR技术在体外诊断中的应用，如病毒检测，病菌识别和耐药性基因确认，即时检测(POCT)等。
但是CRISPR-Cas13介导的检测方法相较于qPCR检测，其灵敏度存在一定的挑战性，其根本原因是CRISPR检测体系中的靶标RNA浓度较低，导致Cas13a蛋白特异性切割ssRNA后，被激活的侧向切割活性较低，报告RNA被剪切释放的FAM基团过少，从而导致检测灵敏度低。
因此提高检测体系中的靶标RNA浓度或拷贝数，可提高CRISPR-Cas13a检测技术的灵敏度。而这对体外转录的方法提出了更高的要求。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供甜菜碱在提高DNA体外转录效率中的应用，从而获得高丰度的ssRNA，以提高CRISPR-Cas13a技术检测的灵敏度。
本发明提供了甜菜碱在提高DNA体外转录效率中的应用。
本发明中，所述的提高体外转录效率的甜菜碱添加量为0.1～1M，本发明实施例表明，在体外转录体系中添加甜菜碱，能够提高转录效率。并且，在一定的浓度范围内，转录产物ssRNA的检测荧光信号随着甜菜碱浓度的增加而提高。并且，甜菜碱对体外转录效率的促进作用，不受转录酶品质的影响，也不会对其后对于所得转录产物ssRNA的检测效果产生不利的干扰。
所述对RNA的检测需首先进行逆转录，并进行扩增，所述的扩增包括但不限于PCR或恒温扩增，所述恒温扩增包括LAMP、ERA、NERA、NASBA、RCA、HAD、RPA、RAA。对转录产物ssRNA的检测方法包括RT-PCR或CRISPR-Cas13a、CRISPR-Cas13b。
本发明提供的DNA体外转录试剂包括：甜菜碱、RNA转录酶、NTP和缓冲液。
本发明实施例中，所述DNA体外转录试剂包括水和：Tris-HCl、MgCl2、亚精胺、DTT、BSA、NP-40、NTP、无机焦磷酸酶、RNA酶抑制剂、T7 RNA聚合酶和甜菜碱。
本发明所述的DNA体外转录试剂中，甜菜碱的浓度为0.1～1mol/L。
一些实施例中，所述DNA体外转录试剂由水和如下浓度的组分组成：50mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM MgCl2、8mM亚精胺、2mM DTT、50μg/mL BSA、0.03％NP-40、0.5mM NTP、0.02U无机焦磷酸酶、5U/μL RNA酶抑制剂、50U T7 RNA聚合酶、0～1M甜菜碱。
一些具体实施例中，所述甜菜碱在DNA体外转录试剂中的浓度为100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、800mM、900mM或1M。
进一步的，本发明还提供了DNA体外转录方法，其包括：将模板DNA与本发明所述的DNA体外转录试剂混合后进行孵育。
本发明所述的DNA体外转录方法中，所述DNA为人工合成、提取获得或者由RNA逆转录而来。本发明对此不做限定，其皆可应用本发明所述的方法进行体外转录，并获得良好的转录效率。例如：提取获得的DNA或者逆转录的RNA模板来自于生物体或环境样本。所述生物体包括动物、植物或微生物。作为举例，所述动物包括人类、家畜或家禽；所述植物包括粮食作物或经济作物；所述微生物包括工业用微生物、食用微生物或病原微生物。本发明中，所述微生物包括但不限于病毒、噬菌体、原核生物或真核生物。本发明中，所述环境样本包括来自于自然环境或者来自于商超、实验室、酒店、车站、机场等场所的样本。
本发明所述的DNA体外转录方法中，转录体系中包括：水和Tris-HCl、MgCl2、亚精胺、DTT、BSA、NP-40、NTP、无机焦磷酸酶、RNA酶抑制剂、T7 RNA聚合酶、甜菜碱和DNA。
本发明实施例中，所述DNA体外转录体系的体积为20μL，具体实施例中，其由水和如下浓度的组分组成：50mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM MgCl2、8mM亚精胺、2mM DTT、50μg/mLBSA、0.03％NP-40、0.5mM NTP、0.02U无机焦磷酸酶、5U/μL RNA酶抑制剂、50U T7 RNA聚合酶、0～1M甜菜碱、10μL DNA。
本发明所述体外转录中，所述孵育在30～40℃下进行，优选的孵育温度为37℃，孵育的时间为10～30min，优选的，孵育时长为30min。
更进一步的，本发明还提供了核酸检测试剂，其包括：本发明所述的DNA体外转录试剂。其还包括转录产物的CRISPR-Cas13a检测试剂。
本发明所述的核酸检测试剂中，还包括对转录产物ssRNA进行检测的试剂。所述对转录产物ssRNA进行检测的试剂包括但不限于qPCR检测试剂、RT-PCR检测试剂、数字PCR检测试剂、CRISPR-Cas检测试剂，LAMP试剂、ERA试剂、NERA试剂、NASBA试剂、RCA试剂、HAD试剂或RPA试剂。一些实施例中，所述核酸检测试剂中，包括CRISPR-Cas13a检测试剂，所述CRISPR-Cas13a检测试剂包括：HEPES-Na、MgCl2、BSA、KCl、Cas13a蛋白、crRNA、RNA酶抑制剂、Hela细胞RNA和报告RNA。
一些具体实施例中，所述CRISPR-Cas13a检测试剂包括水和如下浓度的组分：40mMHEPES-Na(pH6.8)、4mM MgCl2、10μg/mL BSA、50mM KCl、25nM Cas13a蛋白、120nM crRNA、5U/μL RNA酶抑制剂、100ng Hela细胞RNA、100nM报告RNA。
所述CRISPR-Cas13a检测试剂中的crRNA由一段固定的结构序列(Repeat)和靶向序列(Spacer)构成，其中Spacer是与检测靶标互补的一段序列，Spacer长度是20-30nt，优选的长度为24-26nt。
本发明所述的CRISPR-Cas13检测试剂包括但不限于Cas13a或Cas13b，其中Cas13a与crRNA的摩尔比为(1～5)：(1～3)，一些具体实施例中，所述Cas13a与crRNA的摩尔比为5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5或1:3。
CRISPR检测ssRNA并收集荧光信号是使用Biotek酶标仪检测报告RNA被剪切释放的FAM荧光基团的荧光信号。在本发明实施例中，所述CRISPR-Cas13a检测试剂中，报告RNA的核酸序列为rUrUrUrUmArUrUrUrUmArUrU。所述报告RNA的两端分别修饰荧光基团和淬灭基团。所述荧光基团选自Alexa350、Alexa488、Alexa 532、Alexa 549、Alexa 647、Alexa680、CF350、CF488、CF532、CF594、CF647、CF680、FAM、HEX、VIC、ROX、Cal610、Texas Red、CY5、Quasar670或Quasar705；所述淬灭基团选自BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、MGB或DabCyl。具体的，所述报告RNA为FAM-rUrUrUrUmArUrUrUrUmArUrU-BHQ1。
针对RNA样本，在进行检测前还需包括逆转录的步骤，因此，本发明所述的核酸检测试剂中还包括逆转录试剂。本发明对逆转录的试剂组分不做限定，凡能实现RNA逆转录获得cDNA的方案皆可。在逆转录的过程中，可有目的的对标志物进行特异性扩增，也可以仅进行逆转录。对于仅进行逆转录的方案，其引物为随机引物和/或polyA，而对于同时进行特异性扩增的方案，其引物为特异性引物。在本发明的实施例中，在逆转录步骤中同时对待测物中的标志物进行特异性的扩增。一些实施例中，所述逆转录-恒温扩增试剂购自先达基因，货号为KS102，体系包括：逆转录酶、Bsu聚合酶、T4 UvsX重组蛋白、单链结合蛋白、上游引物、下游引物、二价镁离子、Tris缓冲体系、乙酸钾以及检测靶标RNA等。
更进一步的，本发明还提供了核酸检测方法，其包括将待测DNA与所述的DNA体外转录试剂混合后进行孵育，所得产物经CRISPR-Cas13a检测。
如前所述，所述待测DNA为提取自生物样本的DNA，或由RNA经逆转录获得。一些具体实施例中，所述待测DNA为来自病原微生物的DNA或由病原微生物的RNA逆转录而来。本发明所述的核酸检测包括诊断目的的检测和非诊断目的的检测。例如，本发明实施例中，以对呼吸道病毒的检测为例对本发明所述的核酸检测方法进行验证。作为举例，所述呼吸道病毒包括流感病毒、合孢病毒或冠状病毒。在本发明实施例中，所述呼吸道病毒为甲型流感病毒或乙型流感病毒。
本发明提供了甜菜碱在提高DNA体外转录效率中的应用，并提供了体外转录的试剂和对核酸的检测方法和试剂。本发明研究发现通过添加适量浓度的甜菜碱能够提高DNA的体外转录效率，从而提高对ssRNA的检测体系中靶标RNA的产量，进而可显著提高对ssRNA检测的灵敏度。特别是将本发明所述的DNA体外转化试剂与CRISPR基因编辑技术联用，有助于推动CRISPR-Cas13a技术应用于体外诊断检测外源核酸。
附图说明
图1示不同浓度下甜菜碱对转录效率的促进作用；
图2示不同处理组检测甲型流感病毒RNA的荧光信号强度，其中-甜菜碱示不添加甜菜碱的实验组，+甜菜碱示添加甜菜碱的实验组，阴性示阴性对照组；
图3示不同处理组检测乙型流感病毒RNA的荧光信号强度，其中-甜菜碱示不添加甜菜碱的实验组，+甜菜碱示添加甜菜碱的实验组，阴性示阴性对照组；
图4示荧光信号随着Cas13a与crRNA比例降低而呈现显著增强。
具体实施方式
本发明提供了甜菜碱在提高DNA体外转录效率中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1甜菜碱提高转录效率
使用RT-ERA试剂盒(苏州先达基因)将103Copies甲型流感病毒M基因RNA片段进行逆转录并扩增，具体操作步骤为：
1.添加溶解剂20μL、上游引物0.5μM、下游引物0.5μM、103Copies RNA、激活剂2μL，短暂振荡混匀并快速离心，37℃孵育20min，上游引物序列为TAATACGACTCACTATAGGGGTTTGCAGGGAAGAACGCAGATCTCGAGGCT，下游引物序列为TCTTCAGTTTCTTGTATAATTTAACCGCCT；
2.将扩增产物进行体外转录，转录体系包含50mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM MgCl2、8mM亚精胺、2mM DTT、50μg/mL BSA、0.03％NP-40、0.5mM NTP、0.02U无机焦磷酸酶、5U/μLRNA酶抑制剂、50U T7 RNA聚合酶(厂家1与厂家2)、0～750mM甜菜碱、10μL DNA扩增产物，总反应体系为20μL，反应条件为37℃孵育30min，并对比竞品试剂盒的转录效率；
3.CRISPR-Cas13a检测转录产物ssRNA，体系包含20mM HEPES-Na(pH6.8)、5mMMgCl2、10μg/mL BSA、50mM KCl、30nM Cas13a蛋白、75nM crRNA(GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUCUACGCUGCAGUCCUCGCUCACU)、5U/μL RNA酶抑制剂、100ng Hela细胞RNA、100nM报告RNA、10μL转录产物，总反应体系为50μL，反应条件为37℃孵育30min，使用Biotek酶标仪检测终点荧光信号。
对酶标仪检测结果进行分析，对比不同甜菜碱添加浓度下转录效率的差异对CRISPR-Cas13a检测结果的影响，具体结果如下所示：
表1甜菜碱提高转录效率
Figure BDA0003743657740000061
结果显示荧光信号随着甜菜碱浓度的增加而提高，当甜菜碱浓度为500mM时为最适浓度，再增加浓度无增益作用。不同甜菜碱浓度的转录效率差异对CRISPR-Cas13a检测结果的影响显著(p＜0.05)，表明甜菜碱可通过提高转录产物的产量来提高CRISPR-Cas13a检测体系的信号。
实施例2：甜菜碱对CRISPR-Cas13a检测甲型流感病毒RNA灵敏度的影响
使用RT-ERA试剂盒(苏州先达基因)将略高于检测限的10～102Copies甲型流感病毒M基因RNA片段进行逆转录并扩增，以不含有M基因RNA片段的受试组为阴性对照，具体操作步骤为：
1.添加溶解剂20μL、上游引物0.5μM、下游引物0.5μM、10～102Co-pies RNA、激活剂2μL，短暂振荡混匀并快速离心，37℃孵育20min，上游引物序列为TAATACGACTCACTATAGGGGTTTGCAGGGAAGAACGCAGATCTCGAGGCT，下游引物序列为TCTTCAGTTTCTTGTATAATTTAACCGCCT；
2.将扩增产物进行体外转录，转录体系包含50mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM MgCl2、8mM亚精胺、2mM DTT、50μg/mL BSA、0.03％NP-40、0.5mM NTP、0.02U无机焦磷酸酶、5U/μLRNA酶抑制剂、50U T7 RNA聚合酶、0或500mM甜菜碱、10μL DNA扩增产物，总反应体系为20μL，反应条件为37℃孵育30min；
3.CRISPR-Cas13a检测转录产物ssRNA，体系包含40mMHEPES-Na(pH6.8)、4mMMgCl2、10μg/mL BSA、50mM KCl、25nM Cas13a蛋白、120nM crRNA(GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUCUACGCUGCAGUCCUCGCUCACU)、5U/μL RNA酶抑制剂、100ng Hela细胞RNA、100nM报告RNA、10μL转录产物，总反应体系为50μL，反应条件为37℃孵育30min，使用Biotek酶标仪检测终点荧光信号。
对酶标仪检测结果进行分析，测试甜菜碱对CRISPR-Cas13a检测ssRNA灵敏度结果的影响，具体结果如下所示：
表2甜菜碱对检测ssRNA灵敏度结果的影响
RNA(Copies) 10 10<sup>2</sup>
不含甜菜碱 2578 8126
甜菜碱(浓度500mmol/L) 8546 18524
阴性对照 1687 1845
结果显示相对于未添加甜菜碱的实验，添加了适量的甜菜碱可提高CRISPR-Cas13a检测甲型流感病毒ssRNA的荧光信号，提高了低拷贝靶标RNA的检测灵敏度，10Copies RNA检测限的荧光信号值提升了231％，表明甜菜碱可通过提高转录产物产量来提高CRISPR-Cas13a检测甲型流感病毒ssRNA的灵敏度。
实施例3：甜菜碱对CRISPR-Cas13a检测乙型流感病毒RNA灵敏度的影响
使用RT-ERA试剂盒(苏州先达基因)将略高于检测限的10～102Copies乙型流感病毒RNA片段进行逆转录并扩增，以不含有乙型流感病毒RNA片段的受试组为阴性对照，具体操作步骤为：
1.添加溶解剂20μL、上游引物0.5μM、下游引物0.5μM、10—102Copies乙型流感病毒RNA、激活剂2μL，短暂振荡混匀并快速离心，37℃孵育20min，上游引物序列为TAATACGACTCACTATAGGGGTCACCAACAGAAATAACTGCACCAACAATGC，下游引物序列为TCTATGAGGGCTAATTAGGAGTGCTTTCTGA；
2.将扩增产物进行体外转录，转录体系包含50mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM MgCl2、8mM亚精胺、2mM DTT、50μg/mL BSA、0.03％NP-40、0.5mM NTP、0.02U无机焦磷酸酶、5U/μLRNA酶抑制剂、50U T7 RNA聚合酶、0或500mM甜菜碱、10μL DNA扩增产物，总反应体系为20μL，反应条件为37℃孵育30min；
3.CRISPR-Cas13a检测转录产物ssRNA，体系包含40mM HEPES-Na(pH6.8)、4mMMgCl2、10μg/mL BSA、50mM KCl、25nM Cas13a蛋白、120nM crRNA(GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGUUGCAGAACGGUUCACAGCCUGAAC)、5U/μL RNA酶抑制剂、100ng Hela细胞RNA、100nM报告RNA、10μL转录产物，总反应体系为50μL，反应条件为37℃孵育30min，使用Biotek酶标仪检测终点荧光信号。
对酶标仪检测结果进行分析，测试甜菜碱对CRISPR-Cas13a检测乙型流感病毒RNA灵敏度结果的影响，具体结果如下所示：
表3甜菜碱对检测乙流病毒ssRNA灵敏度结果的影响
RNA(Copies) 10 10<sup>2</sup>
不含甜菜碱 2894 9245
甜菜碱(浓度500mmol/L) 9015 30214
阴性对照 1253 1412
结果显示相对于未添加甜菜碱的实验，添加了适量的甜菜碱可提高CRISPR-Cas13a体系检测低拷贝乙型流感病毒RNA的荧光信号值，10Copies RNA检测限的荧光信号值提升了212％，表明甜菜碱可通过提高转录产物产量来提高CRISPR-Cas13a检测乙型流感病毒RNA的灵敏度。
实施例4：不同Cas13a与crRNA浓度比例对CRISPR-Cas13a检测甲型流感病毒RNA的影响
使用RT-ERA试剂盒(苏州先达基因)将102Copies的甲型流感病毒RNA片段进行逆转录并扩增，具体操作步骤为：
1.添加溶解剂20μL、上游引物0.5μM、下游引物0.5μM、10—102Copies乙型流感病毒RNA、激活剂2μL，短暂振荡混匀并快速离心，37℃孵育20min，甲型流感病毒RNA扩增上游引物序列为TAATACGACTCACTATAGGGGTTTGCAGGGAAGAACGCAGATCTCGAGGCT，下游引物序列为TCTTCAGTTTCTTGTATAATTTAACCGCCT；
2.将扩增产物进行体外转录，转录体系包含50mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM MgCl2、8mM亚精胺、2mM DTT、50μg/mL BSA、0.03％NP-40、0.5mM NTP、0.02U无机焦磷酸酶、5U/μLRNA酶抑制剂、50U T7 RNA聚合酶、500mM甜菜碱、10μL DNA扩增产物，总反应体系为20μL，反应条件为37℃孵育30min；
3.CRISPR-Cas13a检测转录产物ssRNA，体系包含40mM HEPES-Na(pH6.8)、4mMMgCl2、10μg/mL BSA、50mM KCl、50nM Cas13a蛋白、10-150nM crRNA(GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUCUACGCUGCAGUCCUCGCUCACU)、5U/μL RNA酶抑制剂、100ng Hela细胞RNA、100nM报告RNA、10μL转录产物，总反应体系为50μL，反应条件为37℃孵育30min，使用Biotek酶标仪检测终点荧光信号。
对酶标仪检测结果进行分析，测试不同Cas13a与crRNA浓度比例对CRISPR-Cas13a检测甲型流感病毒RNA的影响，具体结果如下所示：
表4不同Cas13a与crRNA浓度比例对检测甲型流感病毒RNA的影响
Figure BDA0003743657740000101
结果表明荧光信号随着Cas13a与crRNA比例降低而呈现显著增强趋势(p＜0.05)，当比例为1:2时达到最佳，再降低比例无增益作用，表明CRISPR体系的Cas13a蛋白与crRNA的浓度比例对CRISPR检测有较大影响。因此在提高转录效率的有同时，可通过Cas13a与crRNA最适比例，同步提高CRISPR-Cas13a检测甲型流感病毒RNA的灵敏度。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.甜菜碱作为提高DNA体外转录效率的制剂的应用。
2.DNA体外转录试剂，包括：甜菜碱、RNA转录酶、NTP和缓冲液。
3.根据权利要求2所述的DNA体外转录试剂，其特征在于，包括水和：Tris-HCl、MgCl2、亚精胺、DTT、BSA、NP-40、NTP、无机焦磷酸酶、RNA酶抑制剂、T7 RNA聚合酶和甜菜碱。
4.根据权利要求2或3所述的DNA体外转录试剂，其特征在于，其中甜菜碱的浓度为0.1~1 mol/L。
5.DNA体外转录方法，其特征在于，包括：将模板DNA与权利要求2~4任一项所述的DNA体外转录试剂混合后进行孵育。
6.核酸检测试剂，其特征在于，包括：权利要求2~4任一项所述的DNA体外转录试剂和CRISPR-Cas13a检测试剂。
7.根据权利要求6所述的核酸检测试剂，其特征在于，所述CRISPR-Cas13a检测试剂包括：HEPES-Na、MgCl2、BSA、KCl、Cas13a蛋白、crRNA、RNA酶抑制剂、荧光报告RNA。
8.核酸检测方法，其特征在于，包括将待测DNA与权利要求2~4任一项所述的DNA体外转录试剂混合后进行孵育获得产物ssRNA，所得产物ssRNA经CRISPR-Cas13a体系检测。
9.根据权利要求8所述的核酸检测方法，其特征在于，所述待测DNA为提取自生物样本的DNA，或由RNA经逆转录获得。
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