CN117402961B - 一种胚胎植入前染色体非整倍体快速检测的引物、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种胚胎植入前染色体非整倍体快速检测的引物，所述引物包括半简并碱基集合和随机碱基N，随机碱基N位于所述半简并碱基集合的核苷酸序列的前端或后端，半简并碱基集合的核苷酸序列为：{N(B)2}n或{N(V)2}n或{N(K)2}n或{N(Y)2}n；其中N=A或C或G或T，B=C或G或T，V=A或C或G，K=G或T，Y=C或T，“2”表示是两个相同碱基，n是选自2~5的正整数。本发明引物是一种新的随机引物，含有7个随机碱基，其中3个随机碱基是完全随机的，这种引物带来的突出优势是扩增产物量高、片段大小均一、可以降低PCR扩增的偏倚使染色体得到较好扩增。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种胚胎植入前染色体非整倍体快速检测的引物、试剂盒和方法。
背景技术
胚胎植入前遗传学检测，又称之为“第三代试管婴儿”，是指在试管助孕过程中对植入子宫前的胚胎进行基因突变或染色体等遗传学检测, 选择正常的胚胎植入宫腔, 以降低家族遗传性疾病、染色体异常及反复流产等风险。主要包括胚胎植入前染色体非整倍体检测(PGT-A)、胚胎植入前单基因遗传病检测(PGT-M) 、胚胎植入前染色体结构异常检测(PGT-SR)三类。
其基本检测流程是从培养的胚胎中取出1-2个卵裂球细胞或2-10个滋养层细胞进行遗传学检测，结合高通量测序技术，通过分析选择正常的胚胎移植。但单个细胞的基因组DNA含量通常在pg级别，无法满足各大测序平台的要求，单细胞全基因组扩增技术（WholeGenome Amplification，WGA）成为了首要解决超低量样本的方式之一。目前的WGA策略主要有三种：简并寡核苷酸引物PCR扩增（DOP-PCR）、多重置换扩增（MDA）以及置换预扩增和PCR扩增的组合的MALBAC技术（multiple annealing and looping-based amplificationcycles，MALBAC），即多次退火环状循环扩增技术。这三种WGA策略采用不同的实验操作和不同的酶，表现出不同的性能和偏向，在辅助生殖领域适合不同的应用。
简并核苷酸引物扩增（degenerate oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR），使用部分简并引物，两端序列是固定的，但在序列中间出现随机序列，例如5′AAGTCGCGGCCGCNNNNNNATG 3′或 5′ CGACTCGAGNNNNNNATGTGG 3′。为了提高引物的结合效率，DOP-PCR有多个退火温度与延伸温度，在最初几个循环中的退火温度较低（~15℃），确保引物尽可能的结合到基因组模板上，而之后的25-35个循环中则采用相对更高的退火温度（~62℃）继而进行PCR反应。
基于DOP PCR方法学目前市面上有多个商品化试剂盒，例如：SurePlex(illumina)、PicoPlex(TaKaRa)以及DOPlify(RHS)等。然而，这些商品化的试剂盒操作步骤大同小异：在第一个步骤中，使用一种高效的蛋白裂解酶，释放细胞里面的DNA用于WGA扩增；在第二个步骤中，往往采用简并随机引物，在低温-高温的逐渐升高的温度条件下进行退火，确保不同序列的简并引物可以结合到全基因组范围内的不同位置，然后进行延伸以获得大量扩增片段；在第三个步骤中，采用特异性引物并在严苛的退火温度下对第二个步骤中产生的片段进行特异性扩增，如果在特异性的引物中加入模板识别的index序列，则扩增产物可以直接用于下游的测序反应。
研究证明，为了提升全基因组扩增的效率和准确性，需要遵循以下原则：①增加引物结合的发生；②在扩增前降低基因组的复杂性（将基因组片段化）；③提高酶活。但是对于胚胎这种来源极其有限的样本，在扩增前通过将基因组片段化来降低基因组的复杂性很显然行不通。因此全基因组扩增效率的主要限制因素是DNA聚合酶和引物。与特异位点PCR不同，DOP-PCR使用随机引物，且使用不同温度来进行退火，所以可能结合到整个基因组上多个位点。因此相同量的引物和DNA聚合酶前几个循环内便达到近百次或更多的PCR循环数，从而饱和进入线性增长期。实验也证明，在一定范围内增加引物和DNA聚合酶的量确实可以提高扩增效率，但过高的引物和酶量会由于引物自连形成过多非模板相关序列。因此酶裂解体系、聚合酶扩增体系、引物序列等均会直接影响扩增的效率和准确度。
随机引物序列的简并多样性在1000-10,000之间，不同的扩增产物的基因组覆盖度会产生显著性的差异，这是因为不同的随机引物优先结合某些特定区域，造成DNA扩增产物中的一些序列相对增多，会在扩增中产生偏好性，有个别loci 拷贝数数量达到3个数量级以上，对于数量极少的胚胎样本，还会导致 locus 的缺失率升高。
因此，获得扩增产物量高且片段大小均一，以及能降低PCR扩增的偏倚使染色体得到较好扩增的用于检测胚胎植入前染色体非整倍体快速检测的随机引物序列成为本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新的随机引物序列，这种随机引物序列含有7个随机碱基，其中3个随机碱基是完全随机的。这种引物序列带来的突出优势是扩增产物量高、片段大小均一、可以降低PCR扩增的偏倚使染色体得到较好扩增。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一个方面，本发明提供一种胚胎植入前染色体非整倍体快速检测的引物，包括半简并碱基集合和随机碱基N，所述随机碱基N位于所述半简并碱基集合的核苷酸序列的前端或后端，所述半简并碱基集合的核苷酸序列为如下的任一种：
（1）{N(B)2}n；
（2）{N(V)2}n；
（3）{N(K)2}n；
（4）{N(Y)2}n；
其中，所述N= A或C或G或T，B= C或G或T，V= A或C或G，K= G或T，Y= C或T；所述A为DNA碱基中的腺嘌呤，所述T为DNA碱基中的胸腺嘧啶，所述C为DNA碱基中的胞嘧啶，所述G为DNA碱基中的鸟嘌呤；“2”表示是两个相同碱基，n是选自2~5的正整数，优选地n=2或3，最优选n=2。
优选地，所述引物的序列为如下序列的任一种：（1）NBBNBB；（2）NVVNVV；（3）NKKNKK；（4）NYYNYY。
优选地，所述引物的序列为如下序列的任一种：（a）NNBBNBB或NBBNBBN；（b）NNVVNVV或NVVNVVN；（c）NNKKNKK或NKKNKKN；（d）NNYYNYY或NYYNYYN。
优选地，所述引物还包括5＇端的固定序列和3＇端的固定序列。
优选地，所述5＇端的固定序列的长度为1-70个碱基；所述3＇端的固定序列的长度为3-4个碱基。
优选地，所述的5＇端的固定序列为：5＇-GCTCTTCCGATCT-3＇；所述的3＇端的固定序列为：5＇-TGGG-3＇或5＇-GTTT-3＇；
优选地，所述引物序列包括如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
第二个方面，本发明提供所述的引物在胚胎植入前染色体非整倍体快速检测试剂盒中的应用。
第三个方面，本发明提供一种胚胎植入前染色体非整倍体快速检测试剂盒，包括上述所述的引物。
优选地，所述试剂盒，包括如下引物组合中的任一种：
组合I：Seq ID NO:1: GCTCTTCCGATCTNNKKNKKTGGG
Seq ID NO:2: GCTCTTCCGATCTNNKKNKKGTTT
组合II：Seq ID NO:7: GCTCTTCCGATCTNNBBNBBTGGG
Seq ID NO:8: GCTCTTCCGATCTNNBBNBBGTTT。
优选地，所述试剂盒，包括含有如下序列的引物：
Seq ID NO:7: GCTCTTCCGATCTNNBBNBBTGGG
Seq ID NO:8: GCTCTTCCGATCTNNBBNBBGTTT。
第四个方面，本发明提供一种扩增基因组DNA的方法，所述方法包括：
S1 将基因组DNA的样本、四种核苷酸混合物、核酸聚合酶、上述任一项所述的引物混合进行PCR扩增；
S2 对扩增产物进行纯化，构建文库；
S3 将纯化得到的文库进行高通量测序，得到测序原始序列，用于后续生物信息分析。
在本发明的方法中将预扩增酶和扩增酶从两种酶减少为一种酶，只使用一种DNA聚合酶，不仅减少了生产的操作步骤，也减少了试验成本。
优选地，所述S3生物信息分析具体步骤如下：
1) 使用比对软件将测序数据比对到人类参考基因组；
2) 将人类参考基因组序列划分为较大的窗口，并计算每个窗口内的读数数量，作为拷贝数的度量；
3) 对窗口内的读数数量进行标准化和校正；
4) 将基因组划分为连续且同质的片段，并为每个片段估计一个平均拷贝数值；
5) 根据片段的平均拷贝数值与正常二倍体状态进行比较，以确定是否存在拷贝数变异，并判断其类型和范围；
6) 使用高斯混合模型对性染色体进行校正和判别，以提高性染色体的判断精度。
本发明的有益效果在于：本发明的胚胎植入前染色体非整倍体快速检测的引物是一种新的随机引物序列NNBBNBB（或NNVVNVV、NNKKNKK、NNYYNYY）或NBBNBBN（或NVVNVVN、NKKNKKN、NYYNYYN）。这种随机引物序列的特征在于由7个随机引物碱基组成，其中3个N随机引物碱基是完全随机的，这种引物序列带来的突出优势是扩增产物量高、片段大小均一、可以降低PCR扩增的偏倚染色体得到较好扩增。传统DNA-Seq检测步骤中，要考虑下游检测的兼容性，预扩增酶和扩增酶使用的是两种不同的DNA聚合酶，其中含有一种保真酶，这样做的目的是提高扩增产物的准确率和扩增产物长度。对于PGT-A检测，我们的最终目的是将大于4Mb的CNV拷贝数变化检测出来，这种拷贝数的变化包括微缺失、微重复以及染色体非整倍体变异，对于单个碱基SNV的准确度要求较低。在本发明提供的扩增基因组DNA的方法中，我们将预扩增酶和扩增酶从两种酶减少为一种酶，只使用一种DNA聚合酶，不仅减少了生产的操作步骤，也减少了试验成本。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1 为本发明扩增基因组DNA的方法步骤示意图；
图2为本发明测序数据分析流程图；
图3-1为小片段(<200bp)污染文库片段分析示例图；图3-2为大片段(>1000bp)聚集文库片段示例图；图3-3为正常片段(200-1000bp)文库片刻分析示例图；
图4-1为引物组合SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2用于检测HFL-1细胞的CNV散点图和箱型图；图4-2为引物组合SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8用于检测HFL-1细胞的CNV散点图和箱型图；图4-3引物组合SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18用于检测HFL-1细胞的CNV散点图和箱型图；
图5-1为GM10401细胞的CNV散点图和箱型图；图5-2为GM00425细胞的CNV散点图和箱型图；图5-3为GM09287细胞的CNV散点图和箱型图；图5-4为GM20912细胞的CNV散点图和箱型图；图5-5为GM07408细胞的CNV散点图和箱型图；图5-6为GM03606细胞的CNV散点图和箱型图；图5-7为GM00325细胞的CNV散点图和箱型图；图5-8为GM01993细胞的CNV散点图和箱型图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种扩增基因组DNA的方法，具体步骤如下（图1）：
1.细胞制备：体外培养细胞系细胞，直接收集使用PBS洗涤3次，制备成细胞悬液，在体视显微镜下，制备成3-5个细胞/管，并冻于-80℃备用。
2.细胞裂解：将细胞裂解液从-20℃取出置于室温解冻至完全溶解，依次加入细胞裂解液4.8μL、细胞裂解酶0.2μL，在PCR仪上75℃ 10min, 95℃ 4min，反应结束后在4℃保存备用。
3. PCR预扩增：上述反应管内依次加入预扩增缓冲液（含随机引物）9.5μL、扩增酶0.5μL轻微离心。在PCR仪上95℃ 3min 1cycle, 接下来95℃ 15sec、15℃ 50sec、25℃40sec、35℃ 30sec、65℃ 40sec、75℃ 40sec 共计16 cycles, 反应结束后在4℃保存备用。
4.PCR扩增建库：依次加入扩增缓冲液26μL、I5端通用标签2μL，再分别加入所需特异性性标签引物2μL，总体积为50μL，轻微离心。在PCR仪上95℃ 3min 1cycle, 接下来95℃30sec、63℃ 25sec、72℃ 1min共计14 cycles, 反应结束后在4℃保存备用。
5.文库磁珠纯化：扩增产物采用磁珠进行纯化，最后采用20μL进行洗脱并转移上清至新的PCR反应管中备用，此即为纯化后的文库。
6.文库定量及质检：
取1μL 纯化后文库使用Qubit进行文库浓度测定，记录文库浓度；取1μL 文库使用Q-Sep 100或者同等类型的仪器试剂进行文库片段长度的测定。
7.高通量测序
将纯化得到的文库，使用华大智造MGI200等测序平台进行高通量测序，得到测序原始序列，用于后续生物信息分析。
8.生物信息流程
在进行测序数之前，需要使用阴性样本建立阴性样本基线，本实施例使用了30例男性和30例女性阴性样本作为阴性样本基线库。图2为测序数据分析流程图；
如图2所示，测序数据分析流程如下：
1) 使用比对软件bwa将测序数据（fastq）比对到人类参考基因组（hg38）；
2) 将人类参考基因组序列划分为较大的窗口，并计算每个窗口内的读数数量，作为拷贝数的度量；
3) 对窗口内的读数数量进行标准化和校正，以消除一些可能影响拷贝数检测的因素，如GC含量、可比对性、重复序列、多态性；
4) 将基因组划分为连续且同质的片段，并为每个片段估计一个平均拷贝数值；
5) 根据片段的平均拷贝数值与正常二倍体状态（阴性样本基线）进行比较，以确定是否存在拷贝数变异，并判断其类型和范围；
6) 使用高斯混合模型对性染色体进行校正和判别，以提高性染色体的判断精度。
实施例2筛选本发明的随机引物序列
对从HFL-1细胞提取的基因组DNA梯度稀释成20pg/μL, 每个反应体系加入1μL,以模拟3-5个细胞提取产生的DNA。
本实施例用于筛选的所用引物序列如下：
SeqID NO:1: GCTCTTCCGATCTNNKKNKKTGGG
Seq ID NO:2: GCTCTTCCGATCTNNKKNKKGTTT
Seq ID NO:3: GCTCTTCCGATCTNBBBBBTGGG
Seq ID NO:4: GCTCTTCCGATCTNBBBBBGTTT
Seq ID NO:5: GCTCTTCCGATCTNBBBBBBTGGG
Seq ID NO:6: GCTCTTCCGATCTNBBBBBBGTTT
Seq ID NO:7: GCTCTTCCGATCTNNBBNBBTGGG
Seq ID NO:8: GCTCTTCCGATCTNNBBNBBGTTT
Seq ID NO:9: GCTCTTCCGATCTNDDDDDTGGG
Seq ID NO:10:GCTCTTCCGATCTNDDDDDGTTT
Seq ID NO:11:GCTCTTCCGATCTBBBBBBTGGG
Seq ID NO:12:GCTCTTCCGATCTBBBBBBGTTT
Seq ID NO:13:GCTCTTCCGATCTNBBNBBTGGG
Seq ID NO:14:GCTCTTCCGATCTNBBNBBGTTT
Seq ID NO:15:GCTCTTCCGATCTNNBNNBTGGG
Seq ID NO:16:GCTCTTCCGATCTNNBNNBGTTT
Seq ID NO:17:GCTCTTCCGATCTKKKKKKNNTGGG
Seq ID NO:18:GCTCTTCCGATCTKKKKKKNNGTTT
以上引物依次两两组合，构建文库，文库多样性，扩增产物量以及片段分析结果如表1、图3-1、图3-2、图3-3所示：
表1：所用引物随机序列多样性、扩增产物量以及片段分析
片段长度是DNA质量的一个重要指标，一般来说DOP-PCR的扩增产物在500-1000bp是比较理想的。
片段大小一个很重要的因素取决于所使用的引物序列，完全随机引物碱基可以提升引物的多样性，但其带来的另外一个后果是，由于是完全随机引物序列，导致扩增过程中引物之间出现发夹、引物二聚体甚至引物自扩增的现象。因此比较理想的引物，应该是既考虑了引物序列的多样性，同时也应考虑如何最大限度的降低引物发生发夹、二聚体和自扩增现象的发生。
如果出现大量大片段和小片段，这是典型的引物扩增偏好性引起的，会导致测序过程中的数据浪费。因此在一个稳定体系下的引物优化和筛选的过程极为重要。
本实施例，测试了9对不同的随机引物，多样性从最少的729种，最高达5184种。综合考虑文库得率及片段分布，选择Seq ID NO:1和Seq ID NO:2，Seq ID NO:7和Seq ID NO:8，Seq ID NO:17和Seq ID NO:18的文库进行上机测序，生信分析3组引物对数据表现均满足基因组分布均一，无染色体掉落情况且结果准确，初步确定该3组引物对均可用于后续分析。
实施例3 对上述筛选出的3对引物进行细胞测试
采用3-5个HFL-1细胞为试验模型，按照细胞裂解、预扩增、PCR扩增以及文库磁珠纯化标准的操作步骤。常规分析中，通常在预扩增步骤结束之后，会增加一个磁珠纯化的环节，以去除裂解步骤和预扩增环节所剩余的裂解酶和随机引物，这些物质会通过干扰Taq酶活性或形成引物二聚体等对下游PCR反应体系造成干扰。在本发明中，我们将预扩增之后的磁珠纯化步骤去除，这样会大大节省操作步骤，但对于引物和试验体系优化提出了更高的要求。发现：上述引物组合1：Seq ID NO:1和Seq ID NO:2与引物组合4：Seq ID NO:7和SeqID NO:8的文库得率均符合要求，引物组合9：Seq ID NO:17和Seq ID NO:18的文库得率明显低于其它两组。具体如表2、图4-1、图4-2、图4-3所示：
表2：三组不同的引物扩增文库得量
将上述三对引物建成的文库进行上机测序，发现：19号染色体在Seq ID NO:17和NO:18引物组合所扩增所得到的文库中存在明显的掉落现象，这与19号染色体存在较高的GC区域不无关系。相反另外两对引物组合扩增的各个染色体效果均较好，尤其是引物组合Seq ID NO:7和NO:8效果更佳，这与该引物组合的简并引物中含有的GC碱基比例较高以及简并引物的多样性较高有一定的关系，这就会使得该引物可以在全基因组区域内结合到更多的区域，尤其是高GC区域，从而使得扩增偏好性降低，扩增效率较高。
结合引物组合1的随机引物序列NNKKNKK与引物组合9的随机引物序列KKKKKKNN，尽管其多样性均在1024种，但从实验结果来看，N{N(K)2}2的组合形式明显优于另外一种方式，可能是N的增加，提供了更多的序列结合可能。此外，从N{N(B)2}2与N{N(K)2}2效果比较来看，进一步验证了这种随机引物结构的可实施性，N{N(B)2}2（组合4）优于N{N(K)2}2（组合1），同时也提示：多样性的增加，会创造更多与模板结合的机会，扩增偏好性大大降低。
实施例4 获得一种胚胎植入前染色体非整倍体快速检测试剂盒
本实施例提供一种胚胎植入前染色体非整倍体快速检测试剂盒，该试剂盒中包含如下试剂，表3所示：
表3：本实施例试剂盒所包含的试剂
注：标签引物1~96使用MGIEasy DNA Adapters-96（板式）试剂盒，货号：1000005282。
本发明试剂盒中的随机引物可以是如下引物组合中的任一种：
组合I：Seq ID NO:1: GCTCTTCCGATCTNNKKNKKTGGG
Seq ID NO:2: GCTCTTCCGATCTNNKKNKKGTTT
组合II：Seq ID NO:7: GCTCTTCCGATCTNNBBNBBTGGG
Seq ID NO:8: GCTCTTCCGATCTNNBBNBBGTTT
优选地，所述试剂盒中随机引物为组合II中的引物序列。
实施例5 试剂盒应用——阳性细胞
选用15个染色体非整倍体阳性细胞系样本模拟真实临床样本对本发明试剂盒（选用组合II引物）进行验证测试，细胞系购自Coriell和ATCC，并在实验室内进行培养，挑选3-5个细胞模拟临床样本，结果如表4显示：15株阳性细胞均得到预期试验结果。
表4：染色体非整倍体阳性细胞系样本检测结果
| 细胞名称 | 来源 | 染色体非整倍体类型 | 检测结果 | 检测结果一致性 |
| GM10401 | Coriell | 47,XX,+2 | 47,XX,T2 | 一致 |
| GM00425 | Coriell | 47,XY,+8 | 47,XY,T8 | 一致 |
| GM09286 | Coriell | 47,XY,+9 | 47,XY,T9 | 一致 |
| GM09287 | Coriell | 47,XY,+9 | 47,XY,T9 | 一致 |
| AG10292 | Coriell | 47,XX,+13 | 47,XX,T13 | 一致 |
| GM07189 | Coriell | 47,XY,+15 | 47,XY,T15 | 一致 |
| GM20912 | Coriell | 47,XY,+18 | 47,XY,T18 | 一致 |
| GM02732 | Coriell | 47,XY,+18 | 47,XY,T18 | 一致 |
| GM07408 | Coriell | 47,XX,+20 | 47,XX,T20 | 一致 |
| CCL-54 | ATCC | 47,XY,+21 | 47,XY,T21 | 一致 |
| GM03606 | Coriell | 47,XX,+21 | 47,XX,T21 | 一致 |
| GM00325 | Coriell | 47,XXY | 47,XXY | 一致 |
| GM01993 | Coriell | 47,XYY | 47,XYY | 一致 |
| GM09326 | Coriell | 47,XYY | 47,XYY | 一致 |
| CCL-65 | ATCC | 45,XO | 45，XO | 一致 |
实施例6试剂盒应用——胚胎样本
测试10例临床废弃的胚胎样本，每个废弃胚胎样本采用激光一分为二，一部分用于测试本发明的试剂盒（选用组合II引物），另一部分采用NMPA批准的胚胎植入前染色体非整倍体检测试剂盒进行检测，检测结果见下表5。
表5：临床样本检测结果
| 样本ID | NMPA试剂盒检测结果 | 本发明试剂盒检测结果 | 检测结果一致性 |
| PF01-L-001 | arr(1-22)×2,(X*)×1 | 46XX | 一致 |
| PF01-L-002 | arr(12)×3,(22)×3, (X*)×1 | 48XY,T12,T22 | 一致 |
| PF01-L-003 | arr(18)×3, (X*)×1 | 47XX,T18 | 一致 |
| PF01-L-004 | arr(1-22)×2,(X*)×1 | 46XX | 一致 |
| PF01-L-005 | arr(1-22)×2,(X*)×1 | 46XX | 一致 |
| PF01-L-006 | arr(1-22)×2,(X*)×1 | 46XY | 一致 |
| PF01-L-007 | arr(1-22)×2,(X*)×1 | 46XX | 一致 |
| PF01-L-008 | arr(1-22)×2,(X*)×1 | 46XY | 一致 |
| PF01-L-009 | arr(1-22)×2,(X*)×1 | 46XY | 一致 |
| PF01-L-010 | arr(1-22)×2,(X*)×1 | 46XY | 一致 |
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (5)
1.一种胚胎植入前染色体非整倍体快速检测的引物，其特征在于，所述引物为引物对一或引物对二，引物对一的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，所述引物对二的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述引物对一和引物对二均包括半简并碱基集合和随机碱基N，引物对一的半简并碱基集合的核苷酸序列为：NBBNBB；引物对二的半简并碱基集合的核苷酸序列为：NKKNKK；
其中，所述N= A或C或G或T，B= C或G或T， K= G或T；
所述A为DNA碱基中的腺嘌呤，
所述T为DNA碱基中的胸腺嘧啶，
所述C为DNA碱基中的胞嘧啶，
所述G为DNA碱基中的鸟嘌呤。
2.如权利要求1所述的引物在非疾病诊断目的的制备胚胎植入前染色体非整倍体快速检测试剂盒中的应用。
3.一种胚胎植入前染色体非整倍体快速检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物。
4.一种非疾病诊断目的的扩增基因组DNA的方法，其特征在于，所述方法包括：
S1 将基因组DNA的样本、四种核苷酸混合物、核酸聚合酶、权利要求1所述的引物混合进行PCR扩增；
S2 对扩增产物进行纯化，构建文库；
S3 将纯化得到的文库进行高通量测序，得到测序原始序列，用于后续生物信息分析。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述S3生物信息分析具体步骤如下：
1) 使用比对软件将测序数据比对到人类参考基因组；
2) 将人类参考基因组序列划分为较大的窗口，并计算每个窗口内的读数数量，作为拷贝数的度量；
3) 对窗口内的读数数量进行标准化和校正；
4) 将基因组划分为连续且同质的片段，并为每个片段估计一个平均拷贝数值；
5) 根据片段的平均拷贝数值与正常二倍体状态进行比较，以确定是否存在拷贝数变异，并判断其类型和范围；
6) 使用高斯混合模型对性染色体进行校正和判别，以提高性染色体的判断精度。
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