CN102628870A - 一种实现蛋白质快速荧光标记的微纳流控芯片及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种实现蛋白质快速荧光标记的微纳流控芯片，根据蛋白质与荧光探针大小尺寸不同设计而成，将纳米结构单元引入微流控系统，构筑微纳流控芯片系统，通过纳米通道对蛋白质进行富集，通过微通道对标记后的蛋白质进行收集。本发明还提供了利用微纳流控芯片实现蛋白质快速荧光标记的方法。本发明可以实现对蛋白质快速荧光标记，特别适用于对微克和纳克级蛋白质、核酸以及其他珍贵生物分子的微型化标记，而且不需要额外的纯化过程和色谱分离来除去过量的未反应染料分子，操作简单、方便。

Description

一种实现蛋白质快速荧光标记的微纳流控芯片及方法

技术领域

本发明属于蛋白质领域，涉及一种实现蛋白质快速荧光标记的微纳流控芯片及方法，特别涉及一种不需要标记产物的额外纯化过程、结构简单的微纳流控芯片及其方法。

背景技术

荧光检测灵敏度极高，可以实现单分子水平分析，因而在生命科学、环境科学、医学、药学，以及在探索生物分子、细胞和生物体的内在功能等方面都有着广泛应用。但是，自然界中只有少部分生物分子具有荧光性质，而大多数生物分子不能直接用荧光分析进行检测。因此，只有采用荧光染料标记生物分子（抗体、蛋白质、氨基酸、多肽）后，才可以实现对生物分子的超高灵敏分析检测。

传统的荧光标记方法均在宏观体系进行，通常需要加入过量的荧光染料来获得较高的标记效率，为得到高纯度的荧光标记物，在标记反应后需要色谱分离纯化技术以除去未反应的染料分子以减小或消除荧光背景，步骤繁琐，时间长，且所需样品量多，不适合于珍贵生物样品(如激素、配体、抗体等)的荧光标记。因此，发展一种微型化、高效率的荧光标记方法，实现对纳克和皮克级生物试剂的标记，对生物分析学科的发展具有重要意义。

微流控技术作为一门新兴学科，由于其独特的尺寸效应，具有显著的微纳米限域空间结构，以及比表面积大、样品消耗量少、易散热、易于实现高通量合成与筛选等优点，在各种蛋白质标记中被广泛使用。如Lee等[I. H. Lee, D. Pinto, E. A. Arriaga, Z. U. Zhang, N. J. Dovichi, Anal. Chem., 1998, 70, 4546-4548.]构建的以电泳为基础的微全分析系统，可用于蛋白质在线荧光标记，但是还需要随后的毛细管区带电泳分离技术对产物进行分离纯化。Wheeler等[T. D. Wheeler, D. X. Zeng, A. V. Desai, B. Önal, D. E. Reichert, P. J. A. Kenis, Lab Chip, 2010, 10, 3387-3396]在微流控芯片上用放射性金属元素对生物分子进行标记，与相同条件下宏观体系本体溶液中的标记反应相比，微观尺度下流体的高混合效率和快的热传递效应使微反应器中的标记反应速率极快，标记产率更高。Abdelgawad等[M. Abdelgawad, M. W. L. Watson, A. R. Wheeler, Lab Chip, 2009, 9, 1046-1051] 将数字微液滴集成在微流控芯片上，用于标记物质和产物分离。尽管这些方法都是在微流控系统中进行，但都需要标记产物的额外纯化过程或者设计结构比较复杂的芯片来实现产物的纯化。因此，需要设计一种不需要标记产物的额外纯化过程、结构简单的装置，对蛋白质进行快速荧光标记。

发明内容

本发明的目的是提供一种实现蛋白质快速荧光标记的微纳流控芯片，解决目前对蛋白质进行荧光标记都需要标记产物的额外纯化过程、且结构复杂的问题。

本发明的另一目的是提供一种利用微纳流控芯片实现蛋白质快速荧光标记的方法。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一种实现蛋白质快速荧光标记的微纳流控芯片，包括基片和盖片，基片和盖片可逆键合；所述的盖片上有微通道、荧光探针储蓄池、蛋白质储蓄池和缓冲液储蓄池，荧光探针储蓄池、蛋白质储蓄池和缓冲液储蓄池分别和微通道相通；所述的基片上有纳米通道，微通道分别和纳米通道的两端相通，纳米通道的真实深度小于蛋白质分子尺寸，而大于荧光探针分子尺寸；缓冲液储蓄池为三个，分别是第一缓冲液储蓄池、第二缓冲液储蓄池、第三缓冲液储蓄池，其中，荧光探针储蓄池、蛋白质储蓄池、第一缓冲液储蓄池和第二缓冲液储蓄池位于纳米通道的上游，第三缓冲液储蓄池则位于纳米通道的下游，第二缓冲液储蓄池位于荧光探针储蓄池、蛋白质储蓄池、第一缓冲液储蓄池的下游，且与第二缓冲液储蓄池相通的微通道位于纳米通道的入口处。

还包括第四缓冲液储蓄池，与第四缓冲液储蓄池相通的微通道位于纳米通道的出口处。

还包括激光诱导荧光检测点，激光诱导荧光检测点位于与第二缓冲液储蓄池相通的微通道上。

所述的激光诱导荧光检测点距离微通道和纳米通道结合处28 mm。

二、一种利用微纳流控芯片实现蛋白质快速荧光标记的方法，该方法包括以下步骤：

（1）在电渗流的作用下，驱使蛋白质通过微通道，在纳米通道的入口处实现对蛋白质的富集；

（2）在电渗流的作用下，驱使荧光探针通过微通道，荧光探针对蛋白质进行荧光标记后通过纳米通道；

（3）在电渗流的作用下，驱使缓冲液通过微通道，对标记后的蛋白质进行纯化；

（4）在与纳米通道入口处相通的微通道上对标记后的蛋白质进行定量检测，在第二缓冲液储蓄池（6）中进行产物的收集。

采用上述技术方案的积极效果：与现有蛋白质标记技术相比，本发明的优点是：

（1） 微纳流控芯片系统的高效富集能力，可实现对超低浓度生物试剂的预富集；

（2） 微纳流控芯片系统独特的物质传输性质和微纳米限域空间效应，使整个荧光标记反应的速度大大加快，标记效率显著提高；

（3） 微纳流控芯片可以以微型化和连续方式实现蛋白质的预富集、标记和纯化，不需要额外的纯化过程和色谱分离来除去过量的未反应染料分子，操作简单、方便；

（4） 该法是一种简单、快速、高效的荧光标记方法，特别适用于对微克和纳克级蛋白质、核酸以及其他珍贵生物分子的微型化标记。

附图说明

图1是微纳流控芯片示意图；

图中：1荧光探针储蓄池，2蛋白质储蓄池，3第一缓冲液储蓄池，4第四缓冲液储蓄池，5第三缓冲液储蓄池，6第二缓冲液储蓄池，7激光诱导荧光检测点。

图2中A是基于微纳流控芯片系统的蛋白质荧光标记原理示意图，以牛血清蛋白 (BSA) 和异硫氰酸荧光素（FITC）为模型体系；B是蛋白质荧光标记产物（FITC-BSA）的激光诱导荧光光谱图。

图3是基于纳米通道独特性质的蛋白质富集，标记和纯化原理示意图。

图4是6 μg•mL^-1 FITC 和100 μg•mL^-1 FITC-BSA 在具有不同深度纳米通道的微纳流控芯片中的富集照片（a-e, 对应的纳米通道紫外光照时间分别为80, 70, 50, 40，30 min），富集时间和电压分别为300 s，400 V。

图5是为微纳流控芯片上荧光标记蛋白质产物FITC-BSA的纯化过程照片，照片拍摄时间分别为缓冲液取代FITC溶液通入纳米通道后30 s、60 s、70 s、90 s。

图6是微纳流控芯片上荧光标记蛋白质产物FITC-BSA的激光诱导荧光检测光谱图，其中蛋白质富集时间为300 s，FITC通入时间为600 s，纯化时间为90 s，分离电压为1000 V。

图7是微纳流控芯片上不同标记反应时间下获得的纯化产物FITC-BSA荧光光谱图，标记反应时间（从下到上）分别为120 s、240 s、360 s、480 s、600 s、720 s；BSA (100 µg/mL) 富集时间为300 s，其它实验条件为溶液pH 9.0, 温度25 ℃, 分离电压1000 V；插图是产物FITC-BSA的荧光强度与 FITC通过时间（反应时间）的关系图。

图8是蛋白质浓度的自然对数（lnC）与反应时间关系图。

图9是微纳流控芯片上免疫球蛋白的FITC荧光标记光谱图，从下到上依次为纯化产物FITC-IgG、FITC、和未纯化的反应产物（包括FITC-IgG和未反应的FITC）。

图10是微纳流控芯片上异硫氰酸罗丹明标记的牛血清白蛋白荧光照片。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的说明：

图1是微纳流控芯片示意图，如图所示，一种实现蛋白质快速荧光标记的微纳流控芯片，包括基片和盖片，基片和盖片可逆键合。图中箭头所示为纳米通道所在位置，由于纳米通道的深度远小于微通道，在图中用空白所示。盖片上有微通道、荧光探针储蓄池1、蛋白质储蓄池2和缓冲液储蓄池，荧光探针储蓄池1、蛋白质储蓄池2和缓冲液储蓄池分别和微通道相通。基片上有纳米通道，微通道分别和纳米通道的两端相通，纳米通道的直径可调，在蛋白质标记过程中，调整纳米通道的真实深度小于蛋白质的分子直径，而大于荧光探针的分子直径。纳米通道的作用主要是对蛋白质进行拦截，使得蛋白质发生富集，但是荧光探针可以自由通过。纳米通道的直径可以根据需要拦截的蛋白质的分子大小进行设计。缓冲液储蓄池为三个，分别是第一缓冲液储蓄池3、第二缓冲液储蓄池6、第三缓冲液储蓄池5，其中，荧光探针储蓄池1、蛋白质储蓄池2、第一缓冲液储蓄池3和第二缓冲液储蓄池6位于纳米通道的上游，第三缓冲液储蓄池5则位于纳米通道的下游，第二缓冲液储蓄池6位于荧光探针储蓄池1、蛋白质储蓄池2、第一缓冲液储蓄池3的下游，且与第二缓冲液储蓄池6相通的微通道位于纳米通道的入口处。由于纳米通道的直径小于蛋白质的分子直径，而大于荧光探针的分子直径，因此，可以根据蛋白质和荧光探针的尺寸差别，使荧光探针能够顺利通过纳米通道，而蛋白质则在纳米通道的入口处发生富集，本发明正是基于上述原理来实现的。

本发明还包括第四缓冲液储蓄池4，与第四缓冲液储蓄池4相通的微通道位于纳米通道的出口处。由于第四缓冲液储蓄池4与第三缓冲液储蓄池5之间为微米通道，在第四缓冲液储蓄池4中装入缓冲液，在负压作用下，使第四缓冲液储蓄池4中的缓冲液经过微米通道，流入第三缓冲液储蓄池5。将高压电源的正负极分别放在第一缓冲液储蓄池3和第三缓冲液储蓄池5中，施加电压，微纳米通道中液体即可在电渗流驱动下顺利流动。

为了对标记后的蛋白质进行检测，本发明还包括激光诱导荧光检测点7，激光诱导荧光检测点7位于与第二缓冲液储蓄池6相通的微通道上。这是因为标记后的蛋白质从第二缓冲液储蓄池6中收集，将激光诱导荧光检测点7设于此处便于对蛋白质的检测。实验中，激光诱导荧光检测点7距离微通道和纳米通道结合处28 mm。

图2的A是基于微纳流控芯片系统的蛋白质荧光标记原理示意图，以牛血清蛋白（BSA）和异硫氰酸荧光素（FITC）为模型体系；图2 的B是蛋白质荧光标记产物（FITC-BSA）的激光诱导荧光光谱图；图3是基于纳米通道独特性质的蛋白质富集，标记和纯化原理示意图，结合图2、图3所示，蛋白质由于分子较大，能够通过微通道，却不能通过纳米通道，因此，在电流的作用下，蛋白质会在纳米通道的入口处发生富集，当荧光探针流过的时候，会对富集的蛋白质进行标记。荧光探针的分子由于直径小，能够顺利通过纳米通道，此时，荧光探针与蛋白质相比，荧光探针处于过量的状态。标记完毕后，在电流的作用下，标记后的蛋白质从与第二缓冲液储蓄池6相通的微通道流出。当通过与第二缓冲液储蓄池6相通的微通道上的激光诱导荧光检测点7时，对标记的蛋白质进行检测，如图3所示，根据激光诱导荧光光谱图的峰面积或峰高即可实现荧光标记蛋白质的定量分析和标记反应动力学研究。如图3所示，纳通道中的物质传输可以分为静电作用区域和自由传输区域。由于纳通道表面带负电，阳离子可以通过纳通道；阴离子由于静电排斥会富集在纳通道前端。这种离子选择性“排斥-富集效应”简称为“电荷效应”。另一方面，如果分子尺寸比自由传输区域小，那么物质在自由传输区域中的传输行为可认为和在本体溶液中相同。否则，物质会由于空间阻碍作用而不能通过。这种效应称为“尺寸效应”。当溶液pH和缓冲液组成保持不变时，可以认为双电层（EDL）厚度是一个常数。所以，纳通道中的物质传输由自由传输区域的纳通道的尺寸决定。

图4是6 μg•mL^-1 FITC 和100 μg·mL^-1 FITC-BSA 在具有不同深度纳米通道的微纳流控芯片中的富集照片（a-e, 对应的紫外光照时间分别为80,70,50,40,30 min），富集时间和电压分别为300 s，400 V，本发明中的纳米通道的深度可以根据所要标记的蛋白质的尺寸任意调节，只要是小于蛋白质的分子尺寸，而大于荧光探针的分子尺寸均可。由于本发明中以牛血清蛋白（BSA）为例进行说明，经过图4的实验结果可知，纳米通道的深度越小，蛋白质的富集效果越好。

图5是为微纳流控芯片上荧光标记蛋白质产物FITC-BSA的纯化过程照片，照片拍摄时间分别为缓冲液取代FITC溶液通入纳米通道后30 s、60 s、70 s、90 s，可见，当纯化时间为90 s时，蛋白质的荧光照片纯化效果最好。图6是微纳流控芯片上荧光标记蛋白质产物FITC-BSA的激光诱导荧光检测光谱图，其中蛋白质富集时间为300 s，FITC通入时间为600 s，纯化时间为90 s，分离电压为1000 V。

图7是微纳流控芯片上不同标记反应时间下获得的纯化产物FITC-BSA荧光光谱图，标记反应时间（从下到上）分别为120 s、240 s、360 s、480 s、600 s、720 s；BSA (100 µg/mL) 富集时间为300 s，其它实验条件为溶液pH 9.0, 温度25 ℃ 分离电压1000 V，如图所示，随着标记反应时间的延长，标记后蛋白质的含量也在增加，但是出现波峰的位置是不变的，插图是产物FITC-BSA的荧光强度与 FITC通过时间（反应时间）的关系图，可以看出，FITC通过时间越长，产物FITC-BSA的荧光强度也随之加大。

图8是蛋白质浓度的自然对数（lnC）与反应时间关系图，从图中可以看出，反应时间越长，剩余蛋白质的浓度呈对数降低。

一种利用微纳流控芯片实现蛋白质快速荧光标记的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

（1）在电渗流的作用下，驱使蛋白质通过微通道，在纳米通道的入口处实现对蛋白质的富集；

（2）在电渗流的作用下，驱使荧光探针通过微通道，荧光探针对蛋白质进行荧光标记后通过纳米通道；

（3）在电渗流的作用下，驱使缓冲液通过微通道，对标记后的蛋白质进行纯化；

（4）在与纳米通道入口处相通的微通道上对标记后的蛋白质进行定量检测，在第二缓冲液储蓄池6中进行产物的收集。

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不应理解为对本发明的限制：

实施例 1 异硫氰酸荧光素（FITC）标记牛血清蛋白（BSA）

（1）微纳流控芯片的制作。微纳流控芯片的整体构型如图1所示，包括单纳米管道的制备；微米管道的制备；微、纳米管道的可逆键合。单纳米管道的制作采用紫外剥离法（具体操作方法参见：C. Wang, J. Ouyang, H. L. Gao, H. W. Chen, J. J. Xu, X. H. Xia, H. Y. Chen, Talanta, 2011, 85, 298-303），纳米管道的深度通过紫外光照时间和强度调控；PDMS微管道制作方法采用模板法（具体操作方法参见：C. Wang, J. Ouyang, H. L. Gao, H. W. Chen, J. J. Xu, X. H. Xia, H. Y. Chen, Talanta, 2011, 85, 298-303；以及C. Wang, S. J. Li, Z. Q. Wu, J. J. Xu, H. Y. Chen, X. H. Xia, Lab Chip, 2010, 10, 639-646）；最后，将带有微通道的PDMS盖片和带有纳通道的基片可逆键合，制作微纳流控芯片。荧光探针储蓄池1加荧光探针溶液，蛋白质储蓄池2加蛋白质溶液（BSA，20 mM 碳酸盐缓冲液配制，pH=9.0），第一缓冲液储蓄池3、第二缓冲液储蓄池6、第三缓冲液储蓄池5、第四缓冲液储蓄池4加缓冲液。

（2）微纳流控芯片上蛋白质的富集、荧光标记和纯化。加入缓冲液后，通过轻轻挤压管道使溶液充满管道。然后，将蛋白质溶液加入到储液池中，在储液池中插入Pt电极。首先在蛋白质储蓄池2和第三缓冲液储蓄池5之间加400V电压，在电流驱使下，BSA开始在微通道中流动，当流动到纳米通道的入口处时，由于蛋白质分子较大，无法通过纳米通道，因此会在纳米通道的入口处发生富集。接着，将电压切换至荧光探针储蓄池1和第三缓冲液储蓄池5之间，让荧光探针FITC通过微通道，进而通过富集的蛋白质，进行荧光标记反应。由于荧光探针的分子较小，因此，标记完成的多余的荧光探针可以通过纳米通道，荧光探针与蛋白质相比，始终处于过量的状态。反应一段时间后，将电压切换到第一缓冲液储蓄池3和第三缓冲液储蓄池5之间，让缓冲液取代荧光探针通过纳米通道进行产物的纯化，冲走多余的荧光探针。纯化完毕以后，在第一缓冲液储蓄池3和第二缓冲液储蓄池6之间施加电压，由于与第二缓冲液储蓄池6相通的微通道位于纳米通道的入口处，因此，标记后的FITC-BSA会进入与第二缓冲液储蓄池6相通的微通道中。与第二缓冲液储蓄池6相通的微通道上有激光诱导荧光检测点7，在这个通道中，FITC-BSA被检测和收集。

实施例 2 异硫氰酸荧光素（FITC）标记免疫球蛋白IgG

本实施例制备方法同实施例1，其中步骤2中蛋白质由牛血清白蛋白换为免疫球蛋白IgG，在其它条件不变情况下，同样得到荧光标记产物FITC-IgG。如图9，图9是微纳流控芯片上免疫球蛋白的FITC荧光标记光谱图，从下到上依次为纯化产物FITC-IgG、FITC、和未纯化的反应产物（包括FITC-IgG和未反应的FITC），可以看出，这种微/纳芯片上标记蛋白质的方法可以成功用于标记其他蛋白质。

实施例 3 异硫氰酸罗丹明（RBITC）标记牛血清蛋白（BSA）

本实施例制备方法同实施例1，其中步骤2中的荧光探针换为正电荷的异硫氰酸罗丹明（RBITC），在其它条件不变情况下，同样得到荧光标记产物RBITC–BSA。如图10，图10是微纳流控芯片上异硫氰酸罗丹明标记的牛血清白蛋白荧光照片，a图为纯化前的照片，b为纯化后的照片，可以看出，微纳流控芯片对牛血清蛋白（BSA）的标记效果较好。

Claims (5)

1. 一种实现蛋白质快速荧光标记的微纳流控芯片，包括基片和盖片，基片和盖片可逆键合，其特征在于：所述的盖片上有微通道、荧光探针储蓄池（1）、蛋白质储蓄池（2）和缓冲液储蓄池，荧光探针储蓄池（1）、蛋白质储蓄池（2）和缓冲液储蓄池分别和微通道相通；所述的基片上有纳米通道，微通道分别和纳米通道的两端相通，，纳米通道的真实深度小于蛋白质的分子尺寸，而大于荧光探针的分子尺寸；缓冲液储蓄池为三个，分别是第一缓冲液储蓄池（3）、第二缓冲液储蓄池（6）、第三缓冲液储蓄池（5），其中，荧光探针储蓄池（1）、蛋白质储蓄池（2）、第一缓冲液储蓄池（3）和第二缓冲液储蓄池（6）位于纳米通道的上游，第三缓冲液储蓄池（5）则位于纳米通道的下游，第二缓冲液储蓄池（6）位于荧光探针储蓄池（1）、蛋白质储蓄池（2）、第一缓冲液储蓄池（3）的下游，且与第二缓冲液储蓄池（6）相通的微通道位于纳米通道的入口处。

2. 根据权利要求1的所述的一种实现蛋白质快速荧光标记的微纳流控芯片，其特征在于：还包括第四缓冲液储蓄池（4），与第四缓冲液储蓄池（4）相通的微通道位于纳米通道的出口处。

3. 根据权利要求1或2的所述的一种实现蛋白质快速荧光标记的微纳流控芯片，其特征在于：还包括激光诱导荧光检测点（7），激光诱导荧光检测点（7）位于与第二缓冲液储蓄池（6）相通的微通道上。

4. 根据权利要求3的所述的一种实现蛋白质快速荧光标记的微纳流控芯片，其特征在于：所述的激光诱导荧光检测点（7）距离微通道和纳米通道结合处28 mm。

5. 一种利用微纳流控芯片实现蛋白质快速荧光标记的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

（1）在电渗流的作用下，驱使蛋白质通过微通道，在纳米通道的入口处实现对蛋白质的富集；

（2）在电渗流的作用下，驱使荧光探针通过微通道，荧光探针对蛋白质进行荧光标记后通过纳米通道；

（3）在电渗流的作用下，驱使缓冲液通过微通道，对标记后的蛋白质进行纯化；

（4）在与纳米通道入口处相通的微通道上对标记后的蛋白质进行定量检测，在第二缓冲液储蓄池（6）中进行产物的收集。

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