CN106471122B - 在遗传上不同的细胞的文库的表型鉴定及原位基因分型 - Google Patents

在遗传上不同的细胞的文库的表型鉴定及原位基因分型 Download PDF

Info

Publication number
CN106471122B
CN106471122B CN201580036764.9A CN201580036764A CN106471122B CN 106471122 B CN106471122 B CN 106471122B CN 201580036764 A CN201580036764 A CN 201580036764A CN 106471122 B CN106471122 B CN 106471122B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
strain
sequence
channel
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201580036764.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106471122A (zh
Inventor
J·逸夫
O·欧曼
G·丘奇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Astor Reggae diagnostics
Original Assignee
Astor Reggae Diagnostics
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Astor Reggae Diagnostics filed Critical Astor Reggae Diagnostics
Publication of CN106471122A publication Critical patent/CN106471122A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106471122B publication Critical patent/CN106471122B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures

Abstract

通过在培养装置(1)中的在空间上界定和分开的位置处培养细胞以及测定每个细胞株在所述培养装置(1)中的表型特征来鉴定细胞株文库。将所述细胞固定在所述培养装置(1)中的所述在空间上界定和分开的位置处，随后对所述培养装置(1)中的所述在空间上界定和分开的位置处的每个细胞株的相应可变区(150)进行原位基因分型。基于所述培养装置(1)中的所述在空间上界定和分开的位置，将每种相应的表型特征与每种相应的基因型相关联。

Description

在遗传上不同的细胞的文库的表型鉴定及原位基因分型
技术领域
本发明的实施方案大体上涉及在遗传上不同的细胞的文库的表型鉴定及原位基因分型。
发明背景
基因组工程的近期发展，例如由多元自动化基因组工程(Multiplex AutomatedGenomic Engineering,MAGE)和成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)相关蛋白9(Cas9)的应用或由工程化核酸酶(诸如锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN))促进的其它类型的基因组编辑的应用，结合DNA寡核苷酸合成成本的降低所例示，使得产生具有绝对优势的遗传多样性的大型细胞文库成为可能。同时，技术的发展已经导致了测定细胞的表型和基因型特征的可能性。例如，Fluidigm Dynamic ArrayTM集成流体通路(IFC)可用于在单个微孔板中进行基因分型。然而，因为必须保持对遗传上不同的细胞进行单独分选和分析，所以可以分析的细胞文库的大小只限于几百个不同的细胞。
另一种能够比Fluidigm Dynamic ArrayTM IFC处理明显更大的株系文库的技术是荧光激活细胞分选术(FACS)。然而，FACS具有局限性，因为细胞文库的表型鉴定限于在单个时间点的荧光读数。类似于FACS，体外区室化(IVC)和基于液滴的技术能够处理大型文库。然而，在IVC中获得的表型信息是有限的，这是因为液滴中成像的光学约束以及不能在液滴中进行长期细胞生长实验的事实。
其它技术依赖于在成像后将条形码化的寡聚体加入细胞中。将寡聚物分布到特定空间位置的需要限制了细胞可生长的条件和可分配的不同条形码的数量。
因此，在细胞文库的表型和基因型鉴定的技术领域内存在改进需要。具体来说，需要一种能够处理大型细胞文库并且能够以高空间和时间分辨率监测表型特征的技术。
发明概要
总目标是提供一种允许对大型细胞文库进行表型和基因型鉴定的技术。
此目标和其它目标是通过如本文所定义的实施方案来满足。
简言之，这些实施方案的一个方面涉及一种用于鉴定多个细胞株的文库的方法，所述细胞株在所述细胞株的遗传物质的至少一部分中具有不同可变区。所述方法包括在培养装置中在空间上界定和分开的位置处培养所述细胞株的细胞。测定每个细胞株在所述培养装置中的表型特征。将所述细胞株的细胞固定在所述培养装置中在空间上界定和分开的位置处。所述方法还包括对培养装置中在空间上界定和分开的位置处的每个细胞株的可变区进行原位基因分型。然后基于所述培养装置中的在空间上界定和分开的位置将每种相应的表型特征与每种相应的基因型相关联。
这些实施方案的另一方面涉及一种用于鉴定多个细胞株的文库的系统，所述细胞株在所述细胞株的遗传物质的至少一部分中具有不同可变区。所述系统包括培养装置，其被配置为在所述培养装置中的在空间上界定和分开的位置处培养细胞株的细胞。所述系统还包括第一试剂盒，所述第一试剂盒包含用于在将细胞固定在培养装置中在在空间上界定和分开的位置处之后对每个细胞株的可变区进行原位基因分型的组分。然后可以基于培养装置中的在空间上界定和分开的位置将每个细胞株的相应的表型特征与每种相应的基因型相关联。
本发明的实施方案可实现对大型细胞文库并行进行表型和基因型鉴定。所述实施方案还允许监测和测定细胞在培养装置中的各种表型。
所述实施方案的系统和培养装置有助于在恒定或可变条件下进行长期单细胞表型分析实验，随后固定以及在不损失细胞的情况下施加原位测序所需的多种试剂。
附图简述
通过结合附图参考以下描述，可以最好地理解所述实施方案以及其其它目标和优点，其中：
图1是根据一个实施方案的培养装置的图示；
图2是图1所示的培养装置沿着线A-A的横截面图；
图3是根据另一个实施方案的培养装置的图示；
图4是图3所示的培养装置沿着线A-A的横截面图；
图5是根据另一实施方案的培养装置的图示；
图6是根据又一实施方案的培养装置的图示；
图7是根据另一实施方案的培养装置的图示；
图8示出根据一个实施方案的细胞株的基因组的一部分；
图9示出从图8所示的基因组的所述部分获得的mRNA序列；以及
图10示出了从图9所示的mRNA序列获得的cDNA序列；
图11示出根据另一实施方案的细胞株的基因组的部分；以及
图12示出从图11所示的基因组的所述部分获得的cDNA序列。
具体实施方式
在所有附图中，相同的附图标记用于类似或对应的元件。
本发明的实施方案大体上涉及细胞株文库的表型鉴定和原位基因分型。具体地，本发明的实施方案允许将所监测的表型特征与经原位测定的基因型以高度并行的方式关联。这意味着可以并行处理具有不同基因型的细胞株的大型文库，以将所监测的表型特征与所述细胞株的不同基因型关联。
如本文所用的细胞株表示来源于通过选择和克隆具有特定基因型的细胞获得的原代培养物或细胞系的细胞。因此，细胞株的细胞都具有相同的基因型。因此，细胞株文库是在遗传上不同的细胞的集合。所述实施方案的文库中的细胞株可以是任何细胞类型，包括细菌菌株，酵母菌株，真核细胞株、细胞系、原代细胞，干细胞，组织或小菌落中的细胞，在其所携带的移动脱氧核糖核酸(DNA)元件、载体或质粒方面不同的等基因细胞。如本文所用的细胞株还包括多细胞复合体、组织等，只要这些可以如本文所公开地在体外培养。
所述实施方案的一个方面涉及一种用于鉴定多个细胞株的文库的方法，所述细胞株在细胞株的遗传物质的至少一部分中具有不同可变区。所述方法包括在培养装置中在空间上界定和分开的位置处培养所述细胞株的细胞。测定每个细胞株在所述培养装置中的表型特征。将所述细胞株的细胞固定在所述培养装置中在空间上界定和分开的位置处。所述方法还包括对培养装置中在空间上界定和分开的位置处的每个细胞株的可变区进行原位基因分型。然后基于所述培养装置中的空间上界定和分开的位置将每种相应的表型特征与每种相应的基因型相关联。
可以根据基因组工程中的各种技术来获得细胞株文库。例如，多元自动化基因组工程(MAGE)可用于每天产生数十亿个不同的突变基因组(Wang等人，Nature，2009，460:894-898)。可用于创建细胞文库的其它技术包括成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白9(Cas9)(Wang等人，Science，2014，343:80-84；Koike-Yusa等人，NatureBiotechnology，2014，32:309-312；Zhou等人，Nature，2014，509:487-491)或大规模RNA干扰(Berns等人，Nature，2004，428:431-437)。
本发明的实施方案使用在其中文库中的每个细胞株的细胞可与其它细胞株和或其它基因型的细胞分开保存和培养的培养装置。因此，每个细胞株在其中可生长和研究细胞的培养装置中具有分别在空间上界定和分开的位置。
可以有利地将一种或多种培养基加入到培养装置中在空间上界定和分开的位置处的细胞中。可以将培养基连续添加到细胞中，或者周期地或在选定时刻补充或更换。培养基更换优选以使得过量的细胞不会附着并污染其它基因型细胞的空间上界定和分开的位置的方式进行。
优选使细胞在培养装置中在空间上界定和分开的位置处培养并以单层生长。单层通常优于3D结构或矩阵，因为如果细胞以单层存在的话，则通常更容易监测细胞和测定细胞的表型特征。然而，如果诸如在分化或发育中监测到与(例如)细胞间相互作用相关的表型，那么细胞可以生长在支持3D生长的结构中。
在培养装置中在空间上界定和分开的位置处培养的细胞可以优选地暴露于各种物理和/或化学刺激或试剂而不被涤除，以便监测细胞对物理和/或化学刺激或试剂的响应。例如，可以将各种化学测试试剂，诸如营养物质、药物、抗生素、基因表达诱导物或阻遏物加入培养基中并由此与细胞接触。然后可以例如使用显微术在不同细胞株的细胞对各种测试试剂的响应方面测定所述细胞株的表型特征。相应地，可以改变细胞所暴露于的温度、pH、压力、流量、气体、曝光量或机械应力，并且可以例如使用显微术测定不同细胞株的细胞对此类不断变化的物理条件的响应。
所述细胞株具有不同的基因型，如在其遗传物质的至少一部分中具有不同的可变区所表现的。所述可变区通常存在于细胞株的基因组中。或者，可变区存在于可移动遗传元件如质粒或载体中，并且因此不一定必须稳定地结合到细胞的基因组中。在下文中，主要讨论了关于基因组中存在的可变区的实施方案。然而，替代实施方案是可能的，其中本文提及的可变区和另外的DNA元件替代地存在于细胞株的质粒或其它可移动遗传元件中。可变区或可变区的部分也可存在于不稳定的遗传元件中，诸如转座子、病毒或噬菌体。此类编码有时将在固定细胞以供原位测序之前扩增可变序列方面具有优势，例如通过在固定细胞之前从dsDNA基因组中特异性切除或环化可变区的部分。
将在本文中进一步描述根据实施方案可使用的各种培养装置。
在一个实施方案中，所述方法还包括在所述培养装置中的空间上界定和分开的位置处随机接种所述细胞株的细胞。优选进行细胞的随机接种，使得每个空间上界定和分开的位置仅包含相同基因型的细胞，即相同细胞株的细胞。
所述实施方案的优点是遗传同一性，即在培养装置中接种细胞之前不需要测定和已知细胞的基因型。因此，不需要在接种前使细胞文库中的细胞保持经分选，因为必须了解每个细胞株的遗传同一性并在整个方法中连续监测每种基因型的位置。这意味着，本发明的实施方案在清晰的对比下首先在不了解基因型的任何知识的情况下并行分析表型特征，然后测定基因型并将它们与表型特征相关联。
通过对个别细胞株进行原位测序，有可能比如果例如特异性的条形码化测序引物将在表型分析之前或之后分配到空间上分开的位置时生长出可能更密集的不同株系。
因此，可以通过使来自文库的个别细胞在空间上界定和分开的位置处以块状沉淀(bulk settle)产生并形成等基因细胞的微菌落来进行随机接种。
在一种替代方法中，可以通过以下方式来进行随机接种：将文库中第一细胞株的细胞加入到培养装置中的第一空间上界定和分开的位置处，将文库中的第二细胞株的细胞加入到培养装置中的第二空间上界定和分开的位置处等等，直至所有待监测的细胞株已经分配到培养装置中的不同空间上界定和分开的位置处。
文库中的每个细胞株的所测定表型特征优选是对应于文库中每种基因型的表型特征。因此，文库中的细胞是具有不同基因型的在遗传上不同的细胞，即每个细胞株具有相应的基因型。基因型差异意味着细胞将具有对应于每种相应基因型的不同表型特征。
在一个实施方案中，使用显微术测定细胞的表型特征。用于监测和测定表型的显微术与现有技术相比具有若干优点。例如，荧光显微术允许对多世代的细胞谱系(celllinages)进行广泛缩时摄影(extensive time laps)，单分子检测灵敏度以及以任何方式监测对不断变化的生长条件的瞬时响应的可能性。因此，可以在延长的时间段内而不是如在FACS中仅在单个时间点处并行地监测细胞系的表型。
可以根据实施方案使用显微术监测和测定的表型特征的非限制性而是说明性的实例包括各种分子(诸如核糖核酸(RNA)或蛋白质)的细胞形态、空间和/或时间表达模式，特定代谢产物的水平，诸如响应于不同的物理或化学刺激或试剂的添加的寿命或生长速率变化，细胞之间的基因表达水平变化，胚胎发育，报告蛋白或RNA适体的亮度等。
因此，如果需要，可以长时间在显微镜下并行地进行对细胞株的表型鉴定。此外，表型鉴定是在不了解文库中各个细胞株的基因型的知识的情况下进行的。在清晰对比下，表型鉴定替代地测定培养装置中的每个空间上界定和分开的位置处的相应的表型特征。例如，假设细胞株的待测定的相关表型特征是在添加测试试剂之后，具有可变基因调控区或编码序列的荧光报告蛋白靶基因的基因表达。在这种情况下，显微术可以用于拍摄培养装置的图像，在所述图像中可以可视地确定相应的基因表达水平。然后可以将每一个别基因表达水平量化，以获得培养装置中的每个空间上界定和分开的位置的相应值。因此，表型鉴定的测定输出可以是培养装置中的每个空间上界定和分开的位置的一个或多个相应值的列表或矩阵。
有利地，如果所述在空间上界定的位置被标记、编号或标示，则易于定义在空间上界定的位置和表型之间的关系，即，哪个在空间上界定的位置对应于哪种表型。还可能在在空间上界定的位置之间的距离或顺序方面来界定空间位置。
例如，列表可以是位置0＝值0，位置1＝值1，位置2＝值2，等等的形式。矩阵可以相应地为位置(x,y)＝值0，位置(x+1,y)＝值1的形式，等等。
在一个实施方案中，测定表型特征包括在培养装置中培养细胞期间使用显微术测定每个细胞株的表型特征。可以在所述实施方案中使用的显微术技术的实例包括例如亮视野显微术、相差显微术、荧光显微术、光片显微术，或任何类型的超分辨率成像模式，诸如受激发射损耗(STED)显微术、光激活定位显微术(PALM)、近场扫描光学显微术(NSOM)、4Pi显微术、结构照明显微术(SIM)、基态损耗(GSD)显微术、光学间距精密显微术(SPDM)、随机光学重建显微术(STORM)。此外，还可以使用细胞内单粒子追踪(SPT)或荧光相关光谱(FCS)。显微镜分析可以在固定时间点或使用延时成像进行。
其它表型测量法也是可能的，诸如使用原子力显微术测量机械性质，使用指示剂染料或微电极测量膜电位，使用质谱成像技术或指定的生物传感器阵列测量小分子分泌。直接连接到培养装置的近场光学阵列检测器也是可能的。
一旦已经测定了细胞株的表型特征，就优选地将细胞固定在培养装置中的空间上界定和分开的位置处。可以根据本领域中熟知的技术进行细胞固定。例如，甲醛可用于细胞固定。在一个非限制性实例中，将细胞用4％的甲醛固定约15分钟或用3％(w/v)的多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液固定约30分钟。
在一个实施方案中，将固定的细胞透化，然后再进行原位基因分型。可以根据实施方案使用传统上用于细胞透化的各种方案。例如，可以使用曲拉通X-100(诸如0.25％曲拉通X-100)或另一种表面活性剂如非离子表面活性剂。或者，可以使用乙醇，诸如70％乙醇，来进行细胞透化。其它实例包括盐酸(诸如0.1M盐酸)任选地与蛋白酶(诸如胃蛋白酶，例如0.01％的胃蛋白酶)或溶菌酶组合来降解细菌细胞壁。
在一个实施方案中，在固定之前，细胞经诱导而表达或激活一种或多种酶来修饰或扩增可变序列或可变序列的部分。非限制性实例包括激活或钝化导致条形码和邻近序列转录成RNA的转录因子或RNA聚合酶，从染色体DNA切割可变序列的限制性内切酶，切除包含可变序列的DNA的转座酶，连接ssDNA或dsDNA以形成用于滚环扩增的模板的连接酶，等等。
原位基因分型包括对培养装置中的空间上界定和分开的位置处的每个细胞株的可变区的至少一部分进行原位基因分型。因此，对每个细胞株的整个可变区进行原位基因型不是绝对必要的。因此，本文所用的原位测序包括对可变区的至少一部分或实际上整个可变区进行原位测序。原位测序优选输出显示不同细胞株之间的任何可变区中核苷酸差异以及在何处这些核苷酸差异产生不同表型的信息。
在一个实施方案中，原位基因分型是基于如在例如Science,2014,343(6177):1360-1363中描述的荧光原位测序(FISSEQ)技术。简言之，在FISSEQ中，在逆转录(RT)期间通过使用逆转录酶和结合氨基烯丙基脱氧尿苷5’-三磷酸盐(dUTP)来在经固定的细胞中产生细胞内的cDNA扩增子。使用BS(PEG)9重新固定cDNA，BS(PEG)9是具有4nm间隔区的胺反应性连接物。然后将cDNA片段环化，之后进行滚环扩增(RCA)。然后使用BA(PEG)9交联含有氨基烯丙基dUTP的RCA扩增子。然后可以使用SOLiD连接法测序来对RCA扩增子中的相关序列进行测序以获得可变区的核苷酸序列。
在一个实施方案中，对可变区进行原位基因分型优选包括对培养装置中的空间上界定和分开的位置处的可变区或可变区的至少一部分进行连接法原位测序。连接法测序依赖于脱氧核糖核酸(DNA)连接酶对碱基对错配的敏感性。通常，待测序的可变区优选为单链DNA序列的形式，其在至少一端侧接有将用作锚定引物结合序列的已知序列。使与已知序列互补的锚定引物与已知序列结合。
然后根据将测序的位置，引入通常用荧光染料标记、通常为八至九个碱基长的探针寡核苷酸的混合池。使这些标记的寡核苷酸与和锚定引物相邻的可变区杂交，并且当一寡核苷酸的序列与所述未知可变区匹配时，DNA连接酶优先将所述寡核苷酸连接到所述锚定引物。基于由分子产生的荧光，可以推断可变区的此位置处的碱基的同一性。
寡核苷酸探针还可以用可切割的连接物来构建，可以在辨识标记后切割所述可切割的连接物。这将去除标记并在所连接探针的末端重新产生5'-磷酸根，从而使新一轮连接成为可能。此连接和切割循环可以重复若干次以读取更长的序列。此技术对可变区中的每N个碱基进行测序，其中N是切割后留下的探针的长度。为了对可变区中的跳过位置进行测序，可以从可变区中去除锚定引物和连接的寡核苷酸，并用缩短一个或多个碱基的锚定引物开始另一轮连接法测序(sequencing by ligation)。
另一种技术是进行重复轮次的单一连接，其中标记对应于探针中的不同位置，随后去除锚定引物和连接的探针。
连接法测序可以在任一方向(5'-3'或3'-5')中进行，具体取决于寡核苷酸探针的哪一端用标记封闭。
在一个实施方案中，所测序的序列优选是通过逆转录从可变区获得的RNA转录物而获得的互补DNA(cDNA)序列。在此实施方案中，可变区侧接有锚定引物将结合至的至少一个已知序列。
可以对固定的细胞进行连接法测序以实现对培养装置中的在空间上界定和分开的位置处的可变区或可变区的至少一部分进行连接法原位测序，参见例如Science 2014,343:1360-1363和Nature Methods 2013,10:857-860，所述文献的教导以引用关于执行连接法原位测序的方式并入本文。
简言之，在一种变形中，通过在逆转录之后使用RNA酶降解mRNA链，来将从可变区获得的RNA或进一步参见下文的条形码复制成cDNA。
在第一实施方案中，锁式探针结合至cDNA，其中探针末端之间的缺口位于靶向用于连接法测序的碱基上。此缺口通过DNA聚合和DNA连接填充以产生DNA环。
在第二实施方案中，仅通过ssDNA连接进行cDNA环化。
在第三实施方案中，用例如限制性内切酶或转座酶从周围DNA中切除包括可变序列的至少一部分和相邻DNA的dsDNA。然后可以用内切核酸酶将切除的dsDNA消化成ssDNA，以便自杂交并连接形成环状DNA。
在任一情况下，通过靶序列引发的滚环扩增(RCA)来扩增所形成的DNA环，从而产生滚环产物(RCP)，所述RCP经受连接法测序。将锚定引物杂交在靶序列紧邻处，然后连接寡核苷酸探针。在一个实施方案中，寡核苷酸探针由具有八个随机位置(N)和一个固定位置(A、C、G或T)的9聚体的四个文库组成。每个文库用四种荧光染料中的一种标记。将在固定位置具有最佳匹配的寡核苷酸探针与其荧光标记一起通过连接并入。将样品成像，并且每个RCP显示出对应于匹配碱基的颜色。涤除所述寡核苷酸探针，然后施加用于下一碱基的寡核苷酸探针。重复连接、洗涤、成像以及去除的步骤，直到已经读取了所需数目的碱基。
在另一实施方案中，原位基因分型包括对培养装置中的在空间上界定和分开的位置处的可变区或可变区的至少一部分进行合成法原位测序。
例如，加入含有阻遏进一步聚合的终止物的四种类型的经修饰dNTP。终止物还含有可以用相机检测到的荧光标记。涤除未并入的核苷酸并拍摄荧光标记的核苷酸的图像。从DNA中化学去除荧光标记以及终止物，以允许进行下一测序循环。
原位基因分型的结果优选是每个细胞株的可变区或可变区的至少一部分的核苷酸序列。此外，每个核苷酸序列连接至培养装置中相应的空间上界定和分开的位置。这是可能的，因为基因分型是作为原位基因分型进行的，诸如连接法或合成法原位测序。原位(insitu)在本文中意味着在原地(on site)或在适当位置(in position)处，即在培养装置中的空间上界定和分开的位置处进行基因分型。
先前描述的表型分析的输出是培养装置中的每个空间上界定和分开的位置的相应测定的表型特征，诸如以列表或矩阵的形式列出在每个空间上界定和分开的位置处所测定的表型特征。
原位基因分型的输出是在培养装置中的每个空间上界定和分开的位置处所测定的可变区的核苷酸序列。此输出还可以是列出在每个空间上界定和分开的位置处所测定的核苷酸序列的列表或矩阵形式。
例如，列表可以是位置0＝序列0，位置1＝序列1，位置2＝序列2，等等的形式。矩阵可以为位置(x,y)＝序列0，位置(x+1,y)＝序列1的形式，等等。
然后，可以基于培养装置中的空间上界定和分开的位置将每种相应的表型特征与每种相应的基因型相关联或相关。例如，在培养装置中位置0处所测定的细胞株的细胞的表型特征是此细胞株的细胞的基因型结果，并且此基因型是从位置0处所测定的核苷酸序列获得的。因此，表型和基因型的关联可以简单地通过匹配在培养装置中的每个空间上界定和分开的位置处测定的表型特征和基因型来实现。
在一个实施方案中，每个细胞株在其遗传物质中，优选在其基因组100中具有相应的株系特异性条形码序列140，参见图8。在这种情况下，原位基因分型优选地包括通过对培养装置1中的空间上界定和分开的位置处的每个细胞株的相应条形码序列140的至少一部分进行原位测序来测定相应的基因型。
因此，条形码序列140提供了测定细胞株中的可变区150的桥梁。具体地，原位基因分型可以通过原位测序来进行，诸如通过对相对短得多的条形码序列140进行连接法或合成法原位测序，而不是对可变区150进行测序。然后可以基于所测序的条形码序列140和如下所述的映射信息获得可变区150的核苷酸序列。
所述方法优选地包括测定指定每个可变区150和相应条形码序列140之间的关联的映射信息。测定相应基因型则优选地包括基于相应条形码序列的经原位测序的至少一部分和映射信息来测定相应基因型。
因此，映射信息可以被视为查找表，所述查找表在给定条形码序列140的至少一部分的输入核苷酸序列的情况下输出可变区150的核苷酸序列。因此，映射信息可以是列出每个可变区150的相应条形码序列140的表格形式。
可以结合细胞株文库的产生来获得所述映射信息。例如，基因组工程可用于产生在可变区150方面具有遗传多样性的大型细胞株文库，如由图8中的各个点突变155所示。此类技术还可以用于针对不同可变区150定制相应条形码序列140。例如，可以设计细胞株文库，使得条形码序列no.1包含在具有可变序列no.1的细胞株的基因组100中，等等。这通常需要将条形码140嵌入在可变区150中或其紧邻处。
在另一个实施方案中，条形码序列140和可变区150不是在相同反应中引入的。则可以通过以下方式测定映射信息：对成批细胞株的文库进行测序，以获得每个细胞株的序列读数(sequence read)，所述序列读数包含可变区150和相应的特异性条形码序列140。这允许如可以在单个测序读取中进行的那样使条形码序列140与可变区150远离。
因此，以成批方式对文库中大部分细胞的基因组或染色体的相关区域进行测序，使得个别读数包含可变区150和条形码序列140。成批测序的结果优选是每个细胞株的序列读数的核苷酸序列。由此，可以将此信息存储并用作映射信息。
还可以将条形码序列140引入染色体中的另一位置中或保持在可移动遗传元件如质粒中。在这些情况下，与此同时通过将可变区150和条形码序列140引入细胞中的方法将条形码序列140连接至可变区150。例如，可以将可变区150作为质粒的一部分递送至细胞，所述质粒还运载相应的条形码序列140。
在一个实施方案中，每个细胞株具有构建体，所述构建体在其基因组100中包含相应的株系特异性条形码序列140和可变区150，所述可变区150侧接有已知核苷酸序列的文库共有引物结合序列160、170。所述文库共有引物结合序列160、170可用于扩增相应的株系特异性条形码序列140。或者，至少一个文库共有引物结合序列160、170可用于对直接来自基因组100或通过将转录的RNA序列200(参见图9)逆转录成cDNA序列300(参见图10)获得的相应株系特异性条形码序列140进行测序。
因此，在此实施方案中，每个细胞株在其基因组100或可移动遗传元件中具有条形码序列140。当创建如本文先前所述的细胞株文库时，有利地与可变区150一起创建条形码序列140。条形码序列140是株系特异性的，这意味着每个细胞株，即每个基因型或版本的可变区150，具有其自身针对条形码序列140的特定核苷酸序列。因此，所述文库优选不含有具有不同可变区150但具有相同条形码序列140的两种不同细胞株。
与株系特异性条形码序列140相反，至少一个引物结合序列160、170优选是文库共有的或株系共有的，这意味着此至少一个引物结合序列160、170优选在文库的所有细胞株中具有相同的核苷酸序列。因此，与引物结合序列160互补或与引物结合序列160、170互补的一个相同的引物或引物对可由此出于扩增或测序目的而用于所有细胞株中。
在第一实施方案中，构建体包含一个文库共有引物结合序列160、170。在这种情况下，文库共有引物结合序列160可以提供在条形码序列140(和可变区150)的上游，或文库共有引物结合序列170位于条形码序列140(和可变区150)的下游。
在第二实施方案中，构建体包含二个文库共有引物结合序列160、170。在这种情况下，一个优选地提供在条形码序列140(和可变区150)的上游，而另一个提供在条形码序列140(和可变区150)的下游，如图8所示。然后，可将这两个文库共有引物结合序列160、170用作条形码序列140周围的锁式探针结合位点。
图8示出了文库中的细胞株中的基因组100的一部分的实例。图9示出了通过对具有株系特异性条形码序列140、可变区150和至少一个文库共有引物结合序列160、170的构建体进行转录而获得的转录RNA序列200或mRNA序列200。图10示出了通过逆转录图9的RNA序列200获得的cDNA序列300。
在图8至图10中，已使用了参考标记1X0、2X0、3X0，其中X＝3-7以表示基因组100中、转录的RNA序列200中或cDNA序列300中的相应核苷酸序列部分。
图8另外示出了用于转录包含株系特异性条形码序列140、可变区150和至少一个文库共有引物结合序列160、170的构建体的启动子序列110。基因组100可任选地包含至少一个调控序列120，其控制启动子序列110和构建体的转录。
在一个实施方案中，文库共有引物结合序列160、170用于例如通过原位聚合酶链式反应(PCR)来扩增株系特异性条形码序列140并且以及任选地扩增可变区150。在对所述株系特异性条形码序列140进行原位测序之前扩增至少所述株系特异性条形码序列140可为有利的，以便获得足够拷贝数的株系特异性条形码序列140来进行原位测序。
可以直接对细胞文库中的基因组序列100进行扩增。然而，可优选地首先执行对转录RNA序列200的原位逆转录，所述转录RNA序列200是通过对基因组100中具有株系特异性条形码序列140、可能的可变区150和至少一个文库共有引物结合序列160、170的构建体进行转录而获得的。在这种情况下，将与RNA序列200中的文库共有引物结合序列260互补的DNA引物360与逆转录酶或RNA依赖性DNA聚合酶一起加入，以原位产生如图9所示意性图示的cDNA序列300。然后对所产生的cDNA序列300进行扩增。
在一个实施方案中，扩增可以是通过在使用单链DNA(ssDNA)连接酶或锁式探针的杂交和连接环化后进行滚环扩增(RCA)来原位扩增cDNA序列300的形式。或者，cDNA序列300的原位扩增可以通过原位PCR进行。
用于从cDNA序列形成环状DNA序列的锁式探针的使用描述于Nature Methods2013,10：857-860中，参见例如该文献中的图1。
然后可以用DNA聚合酶以及与cDNA序列300中的文库共有引物结合序列360互补的DNA引物扩增所得cDNA序列300。然后可以如本文进一步描述的那样进行对所得cDNA序列300中的株系特异性条形码序列360的原位测序。
在一个实施方案中，所述方法包括通过在切除，优选原位或体内切除来自遗传物质100的相应株系特异性条形码序列140后进行滚环扩增，来原位扩增来自遗传物质100的相应株系特异性条形码序列140或对来自遗传物质100的相应株系特异性条形码序列140进行原位测序。
优选地使用消化或转座作用从遗传物质100中切除相应的株系特异性条形码序列140。所述方法优选还包括通过杂交锁式探针，或通过ssDNA连接或通过在自杂交后进行dsDNA连接，来以外切核酸酶反应从所切除的株系特异性条形码序列140形成ssDNA。
所述至少一个文库共有引物结合序列160、170可以替代地或另外用于对来自基因组100的相应株系特异性条形码序列140进行测序。在这种情况下，文库共有引物结合序列160将对应于用于连接法原位测序的锚定引物结合序列或用于合成法原位测序的引物结合序列。
可以直接对如上所述的细胞株的基因组100进行原位测序。然而，一般优选地通过逆转录RNA序列200来产生cDNA序列300，所述RNA序列200是通过对基因组100中包含株系特异性条形码序列140、可变区150和至少一个文库共有引物结合序列160、170的构建体进行转录而获得的。在这种情况下，有可能在开始对株系特异性条形码序列340进行原位测序之前原位扩增cDNA序列300。
还有可能通过使用等温扩增技术，诸如环介导等温扩增技术(LAMP)、链置换扩增技术(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HAD)或切口酶扩增反应(NEAR)来直接扩增包含条形码序列140的基因组区域。
在另一实施方案中，通过使用介导两个末端的杂交和连续连接的逆转录引物使cDNA 300自连接来形成RCA模板。例如，cDNA 300在其已经自杂交后连接至优选地至少6个碱基对以上的带切口的双链DNA。
在一个实施方案中，所述方法包括使用与转录的RNA序列200中的至少一个文库共有引物结合序列260互补的引物360以及逆转录酶或RNA依赖性DNA聚合酶，从转录的RNA序列200合成每个细胞株的cDNA序列300。在这种情况下，原位测序优选地包括对培养装置1中的空间上界定和分开的位置处的每个细胞株的cDNA序列300中的相应株系特异性条形码序列340的至少一部分进行原位测序。
原位测序可以通过对相应的株系特异性条形码序列340的至少一部分进行连接法或合成法原位测序来进行。
株系特异性条形码序列340的原位测序可以使用先前提及的至少一个文库共有引物结合序列360、370来进行。或者，可以在基因组100中，优选直接在条形码序列140的上游，提供专用的测序引物结合序列130。此测序引物结合序列130优选具有已知的核苷酸序列，并且有利地对于文库中所有细胞株是文库共有的。
在此方法中，至少一个文库共有引物结合序列160、170主要用于逆转录和扩增目的，而测序引物结合序列130用于对株系特异性条形码序列140进行原位测序。
在一个具体实施方式中，仅将条形码序列140与侧接序列160、170一起转录，以扩增或环化相应的cDNA，参见图11。在距可变区150一定距离处整合转录的条形码序列140，但是当对细胞文库的相应区域进行成批测序时，可以通过个别序列读数获得可变区150和条形码序列140之间的映射。此实施方式的优点在于，条形码序列140及其侧接区域160、170可以独立于可变区域150的结构来选择，只要条形码序列140具有比可变区域150大得多的多样性。例如，15个碱基对(bp)的随机条形码序列将允许415至109种不同的条形码组合。如果相应的可变区具有106个变体，则一个条形码序列匹配两个不同的可变区的风险仅为0.001。
图12示出从图11所示的基因组100的转录部分获得的cDNA序列300。如先前所述，cDNA序列300中侧接条形码序列或区域340的两个文库共有引物结合序列360、370可用于扩增、锁式探针测量或锚定引物连接。
一旦已测定株系特异性条形码序列140的核苷酸序列，就可以使用映射信息来获得与此特定株系特异性条形码序列140匹配的可变区150的相应核苷酸序列。优选对文库中的每个细胞株进行此举以测定不同的基因型。因此，结果是培养装置中每个空间上界定和分开的位置处的相应基因型。然后将基因型与先前测定的表型特征相匹配或相关联，从而提供关于导致细胞株文库中所测定的表型特征的特定基因型的信息。
在一个实施方案中，细胞株文库的特征在于不同的细胞株从不同条形码化的染色体外遗传元件表达不同的RNA产物。RNA产物可以是例如dCas9的mRNA、iRNA或指导RNA。
所述实施方案的另一方面涉及一种用于鉴定在细胞株的基因组的至少一部分中具有不同可变区的多个细胞株的文库的系统。所述系统包括被配置成在所述培养装置中的空间上界定和分开的位置处培养细胞株的细胞的培养装置。所述系统还包括第一试剂盒，所述第一试剂盒包含用于在将细胞固定在培养装置中的空间上界定和分开的位置处之后对每个细胞株的可变区进行原位基因分型的组分。通过使用此类系统，可以基于培养装置中的空间上界定和分开的位置将每个细胞株的相应表型特征与每种相应基因型关联。
在一个实施方案中，所述系统还包括配置成测定培养装置中的每个细胞株的表型特征和基因型的显微镜。因此，所述系统的显微镜用于监测和测定培养装置中的相应空间上界定和分开的位置处的细胞株的相应表型特征。在原位测序期间优选也使用显微镜，以便读出荧光信号。
在一个实施方案中，所述系统还包括多个细胞株的文库。此细胞株文库可以如前所述使用用于基因组工程的技术产生，以产生具有不同基因型的大型文库。
在此类文库中，将提供可变区和条形码序列之间的映射，使得优选地仅需要对条形码序列进行测序来测定基因型。
所述文库可以例如是基于对来自特定生物体的细胞中的每个基因的活性的有条件抑制或激活。例如，可变区可以编码生物体中每个转录区的一个或几个短指导RNA，使得个别基因的基因活性可以通过dCas9介导的调控来改变。
所述系统的培养装置可以根据各种实施方案构建。在一个实施方案中，所述培养装置是包括多个孔、贴片或区室的培养装置或平板，优选所述文库的每个细胞株至少一个孔、贴片或区室。例如，具有数千个孔(诸如96×96个孔)的细胞板可用于出于细胞培养目的的标记。此类细胞板可以用作所述实施方案中的培养装置。在这种情况下，每个孔对应于培养装置中的空间上界定和分开的位置。
所述培养板优选地是对于成像透明的塑料材料或玻璃，或直接构建在空间上可寻址的生物传感器或光探测器阵列上。
在另一个实施方案中，培养装置是具有多个空间上界定和分开的贴片的基板，其中细胞株的细胞可以粘附和生长在所述贴片处。基板优选由对于成像透明的塑料材料或玻璃制成。在一个实施方案中，所述基板可以是具有多个微孔的显微镜载玻片形式，所述多个微孔构成了培养装置中的空间上界定和分开的位置。可以任选地处理或涂覆微孔的表面以促进细胞粘附。
一种替代方法是使显微镜载玻片或其它基板具有多个贴片，所述多个贴片构成了所述显微镜载玻片或其它基板的已经表面处理或涂覆以助于和促进细胞粘附的相应部分。这意味着文库的细胞将容易粘附并生长在贴片上，但是细胞不能有效地粘附到没有促进粘附的表面处理或涂覆的显微镜载玻片或其它基板的中间表面部分。这意味着通过将培养基加入到显微镜载玻片或其它基板，中间表面部分上存在的任何细胞将被冲洗掉，而在贴片上生长的细胞保持牢固地粘附到所述表面。当稀疏地接种时，这种格式将支持等基因细胞在每个贴片处的生长。
贴片或孔可以用例如聚赖氨酸、胶原、纤连蛋白，层粘连蛋白(lamninin)和/或明胶涂覆。
关于可以根据实施方案使用的培养装置的更多信息可以在Wang等人，CurrentBiology 20,1099-1103,2010中找到。
在一个实施方案中，培养装置是微流体装置1，参见图1至图7。微流体装置1包括对于成像透明的基板10，并且具有多个空间上界定和分开的细胞通道20。细胞通道20具有用于容纳单层细胞的尺寸。多个空间上界定和分开的细胞通道20的相应末端22与流量通道30流体连通，流量通道30在流量通道30的第一端32处具有流体源31并且在流量通道30的第二端34处具有流体槽33。
基板10具有多个细胞通道20，细胞株的细胞在所述多个细胞通道20中培养。细胞通道20可以如图1和图3至图7所示平行布置，其中相应末端22与流量通道30流体连通并从此流量通道30延伸。为了增加细胞通道20的总数量，细胞通道20可以从流量通道30的任一纵向侧延伸，从而与仅在流量通道30的一侧上具有细胞通道20相比，实质上使细胞通道20的数量加倍，参见图6。
此外，细胞通道20和流量通道30在基板10中的更复杂布置也是可能的，以增加流量通道30的数量，参见图7。重要的特征是每个细胞通道20具有与流量通道30流体连通的末端22，并且细胞通道20是分开的，以防止细胞从一个细胞通道20逸出并进入另一个细胞通道20。
细胞通道20的尺寸经设定以用于容纳单层细胞。这意味着，细胞通道20的高度或直径被选择为大约或略大于文库中的细胞的直径。例如，细胞通道20的横截面可以如图2和图4所示是基本上方形的，其中通道侧基本上与细胞的细胞直径匹配。或者，细胞通道可具有直径基本上匹配细胞直径的圆形或U形横截面。其它横截面构造也是可能的，只要细胞可以在细胞通道20中可存活地培养，优选以单层培养。这意味着细胞通道20可以是若干细胞宽，但优选地仅一个细胞高。在这种情况下，细胞可以在细胞通道中生长以形成2D单层，所述2D单层可以比一个细胞更宽，但优选地仍然是单层。与在单行(一个细胞宽)中生长细胞相比，2D单层通常有利于细胞的相衬成像。
流量通道30优选地具有明显大于细胞直径的尺寸。这意味着将通过使培养基从流体源31穿过流量通道30并朝向流动槽33优选连续流动来穿过流量通道30朝向流体槽33冲洗进入流量通道30的任何细胞。
通过在每个细胞通道20中加入相应细胞株的细胞来接种所述文库的细胞。从而允许细胞沿着细胞通道20的长度以单层生长。每个细胞通道20由此包含单一细胞株和基因型的细胞。如果细胞通道20是一个细胞宽，则细胞通道20中的细胞可以被视为一串上的珍珠。如果细胞通道20更宽，则细胞将在细胞通道20中形成2D层。
生长和缓和经过细胞通道20的末端22的细胞将进入流量通道30并因此被冲去。细胞通道20的另一个相对末端28优选地经封闭或尺寸设定以防止细胞从此末端28逸出。或者，细胞通道20的这些末端28可与第二流量通道流体连通。在这种情况下，将从该第二流量通道中的培养基流冲去从细胞通道20逸出的任何细胞。
流体源31用于将培养基输入流量通道30中并进一步进入细胞通道20中。使培养基穿过流动槽33排出。优选地存在从流体槽31穿过流量通道30，进入细胞通道20并从流体槽33流出的培养基的连续流动。
所述培养基优选含有文库中的细胞所需用于支持细胞存活以及任选地细胞生长的成分。所使用的具体培养基取决于细胞文库的类型并且可以由系统的用户选择。
还可以使用流体源31将任何化学试剂或药物作为测试试剂加入细胞通道20中的细胞中，例如通过向进入流体源31的培养基中加入至少一种测试试剂。在这种情况下，可以例如通过显微术测定细胞株对培养装置1中的至少一种测试试剂的表型响应。
细胞通道20的内表面或至少其底表面可以经过表面处理或涂覆以促进细胞粘附和/或减少酶促步骤中的酶和探针结合。
图1和图2示出了图1中的微流体装置1沿着线A-A的横截面图，示出了相对于现有技术显著改善培养基穿过细胞通道20的流动并且还促进在将细胞固定在细胞通道20中之前、期间和之后细胞通道20中的细胞的细胞加载、洗涤和温育步骤的实施方案。
在所示实施方案中，每个细胞通道20沿其纵向侧24、26中的至少一个侧接有相应的洗涤通道40，所述洗涤通道40具有与流量通道30流体连通的第一端42和与洗涤槽50流体连通的第二相对末端44。洗涤通道40的尺寸太小而不能容纳细胞。
在一个实施方案中，每个细胞通道20具有至少一个与细胞通道20流体连通并沿其纵向侧24、26中的一个布置的洗涤通道40。如图1和图2所示的实施例具有沿着每个细胞通道20的两个纵向侧24、26布置的洗涤通道40。
在一个实施例中，洗涤通道40可以互连(诸如)在其末端44中的一个或两个处，从而在细胞通道20周围形成连续洗涤层。
洗涤通道40(或洗涤层)的尺寸，诸如深度、高度和/或宽度，太小而不能容纳细胞。这意味着存在于细胞通道20中的细胞不能进入相邻的洗涤通道40，而是保留在细胞通道20中。图2清楚地示出洗涤通道40与细胞通道20相比深度相对较小。洗涤通道40可具有任何横截面构造，诸如方形、矩形、圆形、U形等。
在一个实施方案中，洗涤通道40形成如图1所示的洗涤层。这意味着，洗涤通道40不仅沿着细胞通道20的纵向侧24、26存在，而且还从细胞通道20的相应第二端28延伸到槽通道52。因此，第一组洗涤通道40沿着细胞通道20行进并从流量通道30延伸到槽通道52。第二组洗涤通道40从细胞通道20的第二端28开始并在槽通道52处结束。第一组和第二组洗涤通道40一起形成洗涤层。
细胞通道20当从其在流量通道30处的第一端22行进至其第二端28时，优选地具有基本相同的深度。此深度优选对应于或稍大于细胞直径，以允许细胞通道20中的单层细胞。当进入从第二28延伸到槽通道52的洗涤通道40时，在细胞通道40的第二端28处，深度将变浅。此更浅的深度，优选小于细胞直径，防止存在于细胞通道20中的细胞进入洗涤通道40。
下面简要描述微流体装置1的操作。
在细胞加载期间，细胞以及培养基进入流体源31并流入流量通道30中。在一个优选实施方案中，流体槽33和洗涤槽40都敞开以允许培养基和细胞被推入细胞通道20中。当洗涤通道40(洗涤层)的深度太浅而不允许细胞进入槽通道52并到达洗涤槽50时，通过流体槽33洗出过量的细胞。培养基从洗涤槽50和流体槽33两者排出微流体装置1。
在微流体装置1的操作期间，培养基如上所述进入流体源31。在第一实施方案中，洗涤槽50和流体槽33是敞开的。这意味着培养基不仅通过流体槽33而且还通过洗涤槽50排出。这意味着用于原位测序的培养基和试剂将有效地到达细胞通道20内的所有细胞。过量的细胞将流入流量通道30并进一步从流体槽33流出，而培养基流经所有细胞并进入槽通道50以及从洗涤槽50流出，以保持向所有细胞供给新鲜培养基。
在第二实施方案中，洗涤槽50闭合，使得培养基和过量细胞都通过流体槽33排出。与第一实施方案相比，此实施方案通常实现流经细胞通道中的细胞的较不有效的细胞培养基流动。
在洗涤和反应步骤中，洗涤槽50优选是敞开的。这意味着洗涤流体或液体或含有反应试剂的溶液进入流体源31，并且朝向洗涤槽50流过流量通道30、细胞通道20以及洗涤通道40。在一个实施方案中，流体槽33在洗涤步骤期间闭合。在另一个实施方案中，流体槽33在洗涤步骤期间敞开。在这种情况下，洗涤流体或液体可以通过洗涤槽50或流体槽33排出。
细胞洗涤可以在将细胞固定在细胞通道20中之前进行以涤除任何培养基，在细胞固定期间和/或在细胞固定之后进行以涤除固定用化学品如甲醛。当需要改变反应组分和反应介质时，还可以结合原位基因分型进行洗涤和反应步骤。
洗涤通道40优选地在其末端44中通过槽通道52互连，所述槽通道52与洗涤槽50流体连通。在图式中，此槽通道52平行于流量通道30，其中洗涤通道40在它们之间延伸。然而，尽管细胞通道20具有与流量通道30流体连通的一个末端22，但是另一末端优选地终止于离开槽通道52一段距离处，以防止细胞从细胞通道20排出到槽通道52中。如果洗涤槽50在细胞培养期间敞开，使得存在从流体源31不仅朝向流体槽33还朝向洗涤槽50的培养基流，则这使得能够在整个细胞通道20中实现均匀的生长条件。
细胞通道20和洗涤通道40优选为敞开通道，如图2所示。这意味着盖板70优选地位于基板10上以形成用于并密封单元通道20和洗涤通道40的盖子。
基板10优选地包括延伸穿过基板10的整个厚度以便增加其稳定性的结构或部分60。图1和图2示出了沿着细胞通道20的纵向长度提供在洗涤通道40的一些之间的柱形式的此类结构60。这些柱可以具有任何形状，只要它们支撑洗涤层并提供流动即可。它们可以例如是矩形、星形、圆形或三角形并且有规则地或不规则地定位。这些结构60可以是如图所示的分开结构，以促进洗涤液体在整个洗涤层中，即在洗涤通道40之间的流动。在一种替代方法中，图中所示的每列柱形成在流量通道30和槽通道52之间的整个长度上延伸的单一结构。此类解决方案可能导致更稳定的基板10，然而代价是效率较低的洗涤。
图5示出了微流体培养装置1的另一个实施方案。此实施方案没有沿着细胞通道20的纵向侧24、26行进的洗涤通道。在清晰的对比之下，支撑结构60存在于相邻的细胞通道20之间并且从流量通道30延伸到槽通道52，如图所示。洗涤通道40优选地存在并且从细胞通道20的第二端28延伸到槽通道52。因此，洗涤通道40的第一端42与细胞通道20的第二端28流体连通并且其第二相对端44与与槽通道52流体连通。与使用如图1所示的柱状结构相比，此实施方案通常提供更稳定的微流体装置1。
细胞通道20的结构可以是多路的，参见例如图6和图7。共同的特征是细胞机械地收缩以在单层中生长，并且它们被培养基、缓冲液、酶等淹没而不被洗掉，因为它们物理上太大而无法被推入洗涤通道40中。还需要用于细胞通道的两个槽，一个用于容纳不配合单层的过量细胞，即流体槽33，以及一个用于容纳流过细胞的培养基，即洗涤槽50。
图6的微流体装置1基本上多路复用两个结构，如图5所示。这意味着，细胞通道20和洗涤通道40的两个结构(图式中的左图和右图)共享共同的流量通道30，流量通道30在其第一端32处连接到流体源31并且在其第二端34连接到流体槽33。细胞通道20和洗涤通道20的各自结构在相应的槽通道52处结束，它们互连并连接到共同的洗涤槽50。
存在于左侧结构的细胞通道20中的细胞将与存在于附图右侧结构的细胞通道中的细胞暴露于在流体源31处输入的相同培养基和试剂以及化学品。
图7示出了微流体装置1的一个实施方案，所述微流体装置1具有多种(即至少两种)结构的细胞通道20和洗涤通道40，所述细胞通道20和洗涤通道40共享共同的流体槽33和洗涤槽50，但具有分开的(即单独的)流体源31。这意味着与存在于一种结构的细胞通道20中的细胞相比，可以将不同的培养基和/或试剂或化学品输入至存在于另一种结构的细胞通道20中的细胞。
在加载期间，细胞和培养基进入流体槽33，其中培养基通过洗涤槽50和单独的流体源31流出，而过量的细胞通过流体源31流出。在另一个实施方案中，细胞进入单独的流体源31，其中过量的细胞离开共用流体槽33。在操作期间，培养基进入单独的流体源31，从而允许不同的培养基进入不同结构的细胞通道20和洗涤通道40。过量的细胞通过流体槽33洗出，并且培养基从洗涤槽50流出并且还通过共用的流体槽33流出。
图3和图4示出了没有洗涤通道、洗涤源和洗涤槽的微流体装置1的另一个实施方案。在清晰的对比下，微流体装置1包括半透膜80，所述半透膜80的平均孔径小于细胞的平均直径。半透膜80布置在基板10上以形成用于多个空间上界定和分开的细胞通道20的盖子。
在此实施方案中，细胞通道20是敞开通道，其在基板10的主表面12的一个主表面中具有开口。然后将半透性阻挡件80安置在此主表面12上以形成用于细胞通道20的盖子。
在洗涤期间，洗涤流体或液体可以有效地从流体源31和流量通道30流过细胞通道20并通过半透性阻挡件80流出。选择半透性阻挡件80的平均孔径以防止细胞穿过半透性阻挡件80，但允许洗涤流体或液体穿过半透性阻挡件80。
基板10可以由任何透明材料制成，诸如塑料材料，其中构成单元通道20、流体源31、流体槽33、流量通道30和任选地洗涤通道40、槽通道52以及洗涤槽50的结构可经界定。合适材料的非限制性实例包括
Figure BDA0001203350470000281
和
Figure BDA0001203350470000282
其是由ZEON Chemicals L.P.销售的环烯烃聚合物(COP)，以及
Figure BDA0001203350470000283
其是由Advanced Polymers市售的环烯烃共聚物(COC)。这些材料在透射和本底荧光方面具有优异的光学特性。它们还在加热时具有良好的流动特性，因此可以折叠小结构，从而允许形成如图1至图7所示的基板10。
基板10的合适材料的其它实例包括玻璃、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，以及聚(对亚苯基硫醚)(PPS)。
半透膜80可以选自透析膜，诸如由Thermo Fisher Scientific公司销售的透析膜。或者，半透膜80可以由上述用于基板10的任何塑料材料制成。
盖板70可以由各种材料制成，这些材料优选地是透明的以允许成像。非限制性实例包括玻璃和塑料材料。
在一个实施方案中，系统还包括流体歧管，所述流体歧管配置成使用至少一个计算机控制的泵将第一试剂盒的组分分配到细胞通道20中。流体歧管优选地配置为使得能够改变用于表型分析的培养基，分配用于细胞固定的化学品，以及使用计算机控制和预编程的泵施加原位测序所需的培养基。在一个具体实施方案中，可在整个实验中使试剂和细胞培养基保持在不同的温度下。
在一个实施方案中，每个细胞株在其基因组或可移动遗传元件中具有相应的株系特异性条形码序列。第一试剂盒则包含用于通过对培养装置中的空间上界定和分开的位置处的每个细胞株的相应特异性条形码序列的至少一部分进行原位测序来测定相应基因型的组分。
所述实施方案的系统可以，例如，用于对细菌进行表型分析和基因分型。在这种情况下，细胞通道20优选具有800-1200nm之间的尺寸，并且洗涤通道40优选小于400nm高。在一个具体实施方案中，微流体装置1优选地包括多于1000个细胞通道20，所述细胞通道20有利地经单独标记并且因此是可识别的。
所述实施方案的微流体装置1非常适合在用于鉴定多个细胞株的文库的系统中使用。然而，微流体装置1可替代地用于除了允许测定细胞株文库的表型和基因型两者外的其它目的，诸如筛选抗生素抗性和其它筛选操作。
因此，所述实施方案的一个方面涉及微流体装置1，所述微流体装置1包括对于成像透明的基板10并且具有多个空间上界定和分开的细胞通道，所述细胞通道具有用于容纳单层细胞的尺寸。所述多个空间上界定和分开的细胞通道20的相应第一端22与流量通道30流体连通，流量通道30的第一端32与流体源31流体连通并且其第二端34与流体槽33流体连通。所述多个空间上界定和分开的细胞通道20的相应第二端28与相应洗涤通道40的第一端42流体连通，所述洗涤通道40的第二端44与槽通道52流体连通，所述槽通道52与洗涤槽50流体连通。洗涤通道40的尺寸太小而不能容纳细胞。
在一个实施方案中，每个细胞通道20沿其纵向侧24、26中的至少一个侧接有相应的第二洗涤通道40，所述第二洗涤通道40的第一端42与流量通道30流体连通并且其第二端44与洗涤通道52流体连通。
在一个实施方案中，第一试剂盒包含用于对培养装置中的在空间上界定和分开的位置处的相应特异性条形码序列的至少一部分进行连接法原位测序的组分。
在此实施方案中，第一试剂盒优选包含DNA连接酶，具有与细胞株基因组中的文库共有引物结合序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列的锚定引物，标记的探测探针寡核苷酸的混合池。第一试剂盒优选还包含含有用于供DNA连接酶(ATP，缓冲液)将标记的探针寡核苷酸接合至锚定引物与文库共有引物结合序列的碱基配对，以及用于在尿嘧啶处切割杂交探针(尿嘧啶-DNA糖基化酶)所需的组分的反应混合物。
在另一个实施方案中，第一试剂盒包含用于对培养装置中的在空间上界定和分开的位置处的相应特异性条形码序列的至少一部分进行合成法原位测序的组分。
在此实施方案中，第一试剂盒优选包含四种类型的经修饰dNTP，所述dNTP含有可逆终止物，所述可逆终止物含有荧光标记。第一试剂盒优选还包含DNA聚合酶以及与细胞株基因组中的文库共有引物结合序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列的测序引物。第一试剂盒还包含含有供DNA聚合酶将经修饰的核苷酸并入测序引物所需的组分的反应混合物。
所述系统优选还包含指定每个可变区和相应的株系特异性条形码序列之间的关联的映射信息。然后基于相应的株系特异性条形码序列的经原位测序的至少一部分和和所述映射信息来测定相应的基因型。
在一个实施方案中，文库中的每个细胞株具有相应的构建体，所述构建体在其基因组中包含相应的株系特异性条形码序列和可变区，所述可变区侧接有已知核苷酸序列的文库共有引物结合序列。因此文库共有引物结合序列可用于扩增来自基因组或通过将转录的RNA序列逆转录成cDNA序列获得的株系特异性条形码序列。
在一个实施方案中，所述系统包含第二试剂盒，所述第二试剂盒包含用于使用与转录的RNA序列中的至少一个文库共有引物结合序列互补的引物以及逆转录酶或RNA依赖性DNA聚合酶从转录的RNA序列合成每个细胞株的cDNA序列的组分。第一试剂盒则优选包含用于对培养装置中的空间上界定和分开的位置处的每个细胞株的cDNA序列中的相应株系特异性条形码序列的至少一部分进行原位测序的组分。
第二试剂盒优选包含与转录的RNA序列中的至少一个文库共有引物结合序列互补的引物序列，以及逆转录酶或RNA依赖性DNA聚合酶。第二试剂盒还包含由酶用来产生cDNA序列的核苷酸。第二试剂盒还包含含有供逆转录酶或RNA依赖性DNA聚合酶引入核苷酸所需的组分的反应混合物，诸如逆转录酶、dNTP、RNA酶抑制剂。第二试剂盒优选还包含RNA酶以降解逆转录后的残留RNA。
在一个实施方案中，所述系统还包含第三试剂盒，所述第三试剂盒包含用于通过在使用ssDNA连接酶或锁式探针环化后进行滚环扩增或通过原位PCR来原位扩增cDNA序列的组分(DNA聚合酶、连接酶、dNTP)。
在一个实施方案中，所述系统还包括第四试剂盒，所述第四试剂盒包含用于在所述培养装置中的空间上界定和分开的位置处固定细胞的组分。此第四试剂盒优选包含可用于固定细胞的甲醛。
所述系统中的试剂盒的组分可以作为分开的组分提供在专用容器中。或者，试剂盒的至少一些组分可以作为存在于同一容器中的混合物提供。
所述实施方案的方法和系统可用于需要对细胞株文库进行表型鉴定并将各种表型与文库中不同基因型关联的各种应用中。
例如，所述实施方案可以用于优化荧光蛋白或RNA适体以选择快速成熟的细胞内信号。在此应用中，报道基因的蛋白质或RNA编码区，即荧光蛋白或适体，将编码在基因组的可变区中。报道基因的表达可以用化学试剂诱导，诸如用lac抑制蛋白调控报道基因的异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)。培养基或细胞还含有报道荧光所需的任何辅因子。通过在诱导后测量荧光随时间推移的变化来监测表型，并且在达到特定荧光水平或在特定时间或用于弛豫到稳态荧光值的时间常数后达到的荧光的时刻对表型进行评分。
在一个实施方案中，细胞株文库可以是其中基因可以用化学信号下调的文库，诸如用于dCAS9的指导RNA的表达。然后可以用条形码和特定基因之间的已知映射信息将细胞株条形码化。
此外，所述实施方案可以用于通过灵敏检测体内调控物的性质来鉴定基因调控RNA序列或蛋白质。因此，可变区然后编码不同的此类基因调控RNA序列或蛋白质。然后可以例如通过显微术监测RNA序列或蛋白质的调控效应，以便检测由基因调控引起的各种表型特征。
所述实施方案还可以用于选择用于抑制或激活细胞中的生物过程的蛋白质或肽。可变区则编码不同形式的蛋白质或肽。表型监测则涉及监测相关生物过程的抑制或激活。
此外，文库的细胞株中的可变区可以是抑制或增强特定基因的表达或调控的一组表达序列。这可以是例如可组成型表达或条件性表达的干扰RNA(iRNA)或短指导mRNA(sgRNA)序列。可以筛选表型的表型差异，诸如在发育、生长、分化中的问题，以及它们对添加的测试试剂的不同响应。
所述实施方案可以进一步用于鉴定哪些基因是分化细胞(诸如干细胞)的特定阶段中所需的或对测试试剂响应的。可变区可以编码抑制不同基因表达的不同sgRNA或iRNA，使得不同基因在不同细胞中有效关闭。表型表征可以是监测响应于化学测试试剂(诸如生长因子或药物)的细胞分化的形式。如果细胞、组织或生物体在一些分化阶段中表现出改变，则在所述细胞株中表达改变的基因与所警报的分化相关。使用非常相似的方法，可以研究和测定对多细胞生物体或组织发育或癌细胞增殖重要的基因。
还可以通过用大量调控序列监测报告蛋白表达来筛选对特异性刺激物响应的调控序列。因此，可变区则对应于调节序列。然后，基于监测细胞中的报告蛋白表达以及在编码报道基因的基因处于调控序列的调控控制下的情况中来进行表型测定。然后将细胞暴露于特定刺激，诸如物理刺激如温度变化，或化学刺激如测试剂添加，并且通过报道基因表达监测对特定刺激的响应。
所述实施方案的方法和系统可以用于通过在选择性地和条件性地敲落其它基因产物的情况下监测文库中的基因或基因产物的定位、扩散或浓缩，来辨识基因或基因产物的相互作用伴侣和调控因子。在这种情况下，可变区可以编码实现选择性和条件性敲落的不同产物，例如iRNA和sgRNA。在类似的应用中，可以使用敲落文库并结合对所关注的荧光标记蛋白进行表型监测，来研究其细胞内扩散、定位或浓缩。在这种情况下，文库筛选可以直接辨识潜在的相互作用伴侣或调控因子。
条形码基因组突变文库可以通过将三种元件引入细胞而平行制备，例如通过将它们置于相同质粒中。所述三种元件包括：(1)对应于期望引入变化的同源但部分突变的DNA序列(可变区)；(2)用于相应未突变DNA序列的CRISPR介导的DNA切割的指导RNA；以及(3)用于原位测序的条形码序列。可以将条形码序列保持在可移动的遗传元件上或者引入染色体上的分开位置处。
当可以在显微镜中或通过整合在培养装置中的生物传感器监测所关注化合物的生物合成时，这可以用作表型读出来优化生物合成途径中的酶或其氨基酸序列的表达水平。
上述应用应当仅被视为所述实施方案的方法和系统的一些但是说明性的用途。
上述实施方案应理解为本发明的一些说明性实施例。本领域中的技术人员将理解的是，可在不脱离本发明的范围的情况下对实施方案做出各种修改、组合和变化。具体地，在技术上可能的情况下，不同实施方案中的不同部分解决方案可以组合在其它构造中。然而，本发明的范围由所附权利要求书界定。

Claims (25)

1.一种鉴定多个细胞株的文库的方法，所述细胞株具有不同基因型且在所述细胞株的遗传物质(100)的至少一部分中具有不同的可变区(150)，所述方法包括：
将所述细胞株的细胞以及培养基加载到微流体装置(1)的流体源(31)中，所述微流体装置(1)包括对于成像透明的基板(10)并且具有多个在空间上界定和分开的细胞通道(20)，所述细胞通道(20)具有用于容纳细胞的尺寸，其中所述多个在空间上界定和分开的细胞通道(20)的相应的第一端(22)与流量通道(30)流体连通，所述流量通道(30)在所述流量通道(30)的第一端(32)处具有所述流体源(31)并在所述流量通道(30)的第二端(34)处具有流体槽(33)，并且所述多个在空间上界定和分开的细胞通道(20)的相应的第二端(28)与相应的洗涤通道(40)的第一端(42)流体连通，所述洗涤通道(40)的第二端(44)与槽通道(52)流体连通，所述槽通道(52)与洗涤槽(50)流体连通，其中所述洗涤通道(40)的尺寸太小而不能容纳细胞；
在所述微流体装置(1)中的在空间上界定和分开的细胞通道(20)处培养所述细胞株的细胞；
测定每个细胞株在所述微流体装置(1)中的所述在空间上界定和分开的细胞通道(20)中的表型特征；
将所述细胞株的所述细胞固定在所述微流体装置(1)中的所述在空间上界定和分开的细胞通道(20)处；
对所述微流体装置(1)中的所述在空间上界定和分开的细胞通道(20)处的每个细胞株的所述可变区(150)进行原位基因分型；以及
基于所述微流体装置(1)中的所述在空间上界定和分开的细胞通道(20)将每种相应的表型特征与每种相应的基因型相关联。
2.根据权利要求1所述的方法，其中原位基因分型包括通过对所述微流体装置(1)中的所述在空间上界定和分开的细胞通道(20)处的所述可变区(150)或其至少一部分进行连接法原位测序。
3.根据权利要求1所述的方法，其中原位基因分型包括对所述微流体装置(1)中的所述在空间上界定和分开的细胞通道(20)处的所述可变区(150)或其至少一部分进行合成法原位测序。
4.根据权利要求1所述的方法，其中每个细胞株在其遗传物质(100)中具有相应的株系特异性条形码序列(140)，并且原位基因分型包括通过对所述微流体装置(1)中的所述在空间上界定和分开的细胞通道(20)处的每个细胞株的所述相应的株系特异性条形码序列(140)的至少一部分进行原位测序来测定所述相应的基因型。
5.根据权利要求4所述的方法，所述方法进一步包括：
测定指定每个可变区(150)与相应的株系特异性条形码序列(140)之间的关联性的映射信息，其中测定所述相应的基因型包括基于所述相应的株系特异性条形码序列(140)的所述原位测序的至少一部分和所述映射信息来测定所述相应的基因型。
6.根据权利要求5所述的方法，其中测定所述映射信息包括对所述细胞株文库整批地进行测序以获得每个细胞株的序列读数，所述序列读数涵盖所述可变区(150)和所述相应的株系特异性条形码序列(140)。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中每个细胞株具有相应的构建体，所述构建体在其遗传物质(100)中包含相应的株系特异性条形码序列(140)和所述可变区(150)，所述可变区侧接有已知核苷酸序列的至少一个文库共有引物结合序列(160、170)，所述文库共有引物结合序列可用于从所述遗传物质(100)或通过转录的核糖核酸RNA序列(200)扩增所述相应的株系特异性条形码序列(140)或对所述相应的株系特异性条形码序列(140)测序，所述转录的核糖核酸RNA序列(200)被逆转录成互补的脱氧核糖核酸cDNA序列(300)。
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法进一步包括使用与转录的RNA序列(200)中的至少一个文库共有引物结合序列(260、270)互补的引物(360)和逆转录酶或RNA依赖性DNA聚合酶来从所述转录的RNA序列(200)合成每个细胞株的cDNA序列(300)，其中原位测序包括对所述微流体装置(1)中的所述在空间上界定和分开的细胞通道(20)处的每个细胞株的所述cDNA序列(300)中的所述相应的株系特异性条形码序列(340)的所述至少一部分进行原位测序。
9.根据权利要求7所述的方法，所述方法进一步包括通过在使用单链DNA即ssDNA、连接酶或锁式探针环化后进行滚环扩增，或者通过原位聚合酶链式反应PCR，或者通过在自杂交后连接所述cDNA序列(300)，来原位扩增所述cDNA序列(300)。
10.根据权利要求7所述的方法，所述方法进一步包括通过在从所述遗传物质(100)切除所述相应的株系特异性条形码序列(140)之后进行滚环扩增来从所述遗传物质(100)原位扩增所述相应的株系特异性条形码序列(140)或对所述相应的株系特异性条形码序列(140)进行原位测序。
11.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中原位测序包括对所述微流体装置(1)中的所述在空间上界定和分开的细胞通道(20)处的所述相应的株系特异性条形码序列(140)的所述至少一部分进行连接法原位测序。
12.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中原位测序包括对所述微流体装置(1)中的所述在空间上界定和分开的细胞通道(20)处的所述相应的株系特异性条形码序列(140)的所述至少一部分进行合成法原位测序。
13.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中测定所述表型特征包括在所述微流体装置(1)中培养所述细胞期间使用显微术。
14.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述微流体装置(1)中的所述细胞添加至少一种测试试剂，其中测定所述表型特征包括测定所述微流体装置(1)中每个细胞株对所述至少一种测试剂的表型反应。
15.一种用于鉴定多个细胞株的文库的系统，所述细胞株具有不同基因型且在所述细胞株的遗传物质(100)的至少一部分中具有不同的可变区(150)，所述系统包括：
微流体装置(1)，其被配置为在所述微流体装置(1)中的在空间上界定和分开的细胞通道(20)处培养所述细胞株的细胞，其中所述微流体装置(1)包括对于成像透明的基板(10)并且具有多个在空间上界定和分开的细胞通道(20)，所述细胞通道(20)具有用于容纳细胞的尺寸，其中所述多个在空间上界定和分开的细胞通道(20)的相应的第一端(22)与流量通道(30)流体连通，所述流量通道(30)在所述流量通道(30)的第一端(32)处具有流体源(31)并在所述流量通道(30)的第二端(34)处具有流体槽(33)，并且所述多个在空间上界定和分开的细胞通道(20)的相应的第二端(28)与相应的洗涤通道(40)的第一端(42)流体连通，所述洗涤通道(40)的第二端(44)与槽通道(52)流体连通，所述槽通道(52)与洗涤槽(50)流体连通，其中所述洗涤通道(40)的尺寸太小而不能容纳细胞；
显微镜，其被布置成测定每个细胞株在所述微流体装置(1)中的所述在空间上界定和分开的细胞通道(20)中的相应的表型特征；
第一试剂盒，其包含用于将所述细胞固定在所述微流体装置(1)中的所述在空间上界定和分开的细胞通道(20)处的组分；以及
第二试剂盒，其包含用于在将所述细胞固定在所述微流体装置(1)中的所述在空间上界定和分开的细胞通道(20)之后对每个细胞株的所述可变区(150)进行原位基因分型的组分，其中可基于所述微流体装置(1)中的所述在空间上界定和分开的细胞通道(20)将每个细胞株的所述相应的表型特征与每种相应的基因型相关联。
16.根据权利要求15所述的系统，所述系统进一步包括所述多个细胞株的所述文库。
17.根据权利要求15或16所述的系统，其中每个细胞通道(20)沿着其纵向侧(24、26)中的至少一个与相应的第二洗涤通道(40)侧接，所述第二洗涤通道(40)具有与所述流量通道(30)流体连通的第一端(42)和与所述槽通道(52)流体连通的相对第二端(44)，所述第二洗涤通道(40)的尺寸太小而不能容纳细胞。
18.根据权利要求15或16所述的系统，所述系统进一步包括流体歧管，其被配置为使用至少一个计算机控制的泵将所述第一试剂盒和所述第二试剂盒的所述组分分配到所述细胞通道(20)。
19.根据权利要求15或16所述的系统，其中每个细胞株在其遗传物质(100)中具有相应的株系特异性条形码序列(140)，并且所述第二试剂盒包含用于通过对所述微流体装置(1)中的所述在空间上界定和分开的细胞通道(20)处的每个细胞株的所述相应的株系特异性条形码序列(140)的至少一部分进行原位测序来测定所述相应的基因型的组分。
20.根据权利要求19所述的系统，所述系统进一步包括映射信息，其指定每个可变区(150)与相应的株系特异性条形码序列(140)之间的关联性，其中基于所述相应的株系特异性条形码序列(140)的所述原位测序的至少一部分和所述映射信息来测定所述相应的基因型。
21.根据权利要求19所述的系统，其中每个细胞株具有相应的构建体，所述构建体在其遗传物质(100)中包含相应的株系特异性条形码序列(140)和所述可变区(150)，所述可变区侧接有已知核苷酸序列的至少一个文库共有序列(160、170)，所述文库共有序列可用于从所述遗传物质(100)或通过转录的核糖核酸RNA序列(200)扩增所述相应的株系特异性条形码序列(140)或对所述相应的株系特异性条形码序列(140)测序，所述转录的核糖核酸RNA序列(200)被逆转录成互补的脱氧核糖核酸cDNA序列(300)。
22.根据权利要求21所述的系统，所述系统进一步包括第三试剂盒，其包含用于使用与转录的RNA序列(200)中的至少一个文库共有引物结合序列(260、270)互补的引物(360)和逆转录酶或RNA依赖性DNA聚合酶来从所述转录的RNA序列(200)合成每个细胞株的cDNA序列(300)的组分，其中所述第二试剂盒包含用于对所述微流体装置(1)中的所述在空间上界定和分开的细胞通道(20)处的每个细胞株的所述cDNA序列(300)中的所述相应的株系特异性条形码序列(340)的所述至少一部分进行原位测序的组分。
23.根据权利要求21所述的系统，所述系统进一步包括：第四试剂盒，其包含用于通过在使用单链DNA即ssDNA、连接酶或锁式探针环化后进行滚环扩增，或者通过原位聚合酶链式反应PCR，或者通过在自杂交后连接所述cDNA序列(300)，来原位扩增所述cDNA序列(300)的组分。
24.根据权利要求19所述的系统，其中所述第二试剂盒包含用于对所述微流体装置(1)中的所述在空间上界定和分开的细胞通道(20)处的所述相应的株系特异性条形码序列(140)的所述至少一部分进行连接法原位测序的组分。
25.根据权利要求19所述的系统，其中所述第二试剂盒包含用于对所述微流体装置(1)中的所述在空间上界定和分开的细胞通道(20)处的所述相应的株系特异性条形码序列(140)的所述至少一部分进行合成法原位测序的组分。
CN201580036764.9A 2014-07-07 2015-02-27 在遗传上不同的细胞的文库的表型鉴定及原位基因分型 Active CN106471122B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE1450860-0 2014-07-07
SE1450860 2014-07-07
PCT/SE2015/050227 WO2016007063A1 (en) 2014-07-07 2015-02-27 Phenotypic characterization and in situ genotyping of a library of genetically different cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106471122A CN106471122A (zh) 2017-03-01
CN106471122B true CN106471122B (zh) 2020-07-03

Family

ID=55064558

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580036764.9A Active CN106471122B (zh) 2014-07-07 2015-02-27 在遗传上不同的细胞的文库的表型鉴定及原位基因分型
CN201580036437.3A Active CN106661530B (zh) 2014-07-07 2015-06-12 微流体装置

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580036437.3A Active CN106661530B (zh) 2014-07-07 2015-06-12 微流体装置

Country Status (11)

Country Link
US (3) US10570437B2 (zh)
EP (2) EP3167061B1 (zh)
JP (3) JP6600349B2 (zh)
CN (2) CN106471122B (zh)
AU (2) AU2015288389B2 (zh)
BR (2) BR112017000168B1 (zh)
CA (2) CA2954360C (zh)
DK (1) DK3167044T3 (zh)
ES (1) ES2762914T3 (zh)
PL (1) PL3167044T3 (zh)
WO (2) WO2016007063A1 (zh)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112017000168B1 (pt) * 2014-07-07 2023-04-18 Astrego Diagnostics Ab Método e sistema de caracterização de uma biblioteca de uma pluralidade de linhagens de células de diferentes genótipos e possuindo regiões variáveis diferentes
WO2016149422A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 The Broad Institute, Inc. Encoding of dna vector identity via iterative hybridization detection of a barcode transcript
JP2018518157A (ja) 2015-05-11 2018-07-12 イラミーナ インコーポレーテッド 治療薬剤の発見および分析のためのプラットフォーム
WO2017222453A1 (en) * 2016-06-21 2017-12-28 Hauling Thomas Nucleic acid sequencing
US20200131557A1 (en) * 2017-03-22 2020-04-30 Astrego Diagnostics Ab Phenotypic characterization of cells
WO2019088904A1 (en) * 2017-10-31 2019-05-09 Astrego Diagnostics Ab Microfluidic device for cell characterization
US11527324B2 (en) 2017-11-10 2022-12-13 Reliant Immune Diagnostics, Inc. Artificial intelligence response system based on testing with parallel/serial dual microfluidic chip
US10930381B2 (en) 2017-11-10 2021-02-23 Reliant Immune Diagnostics, Inc. Microfluidic testing system for mobile veterinary applications
US11124821B2 (en) 2017-11-10 2021-09-21 Reliant Immune Diagnostics, Inc. Microfluidic testing system with cell capture/analysis regions for processing in a parallel and serial manner
US11041185B2 (en) 2017-11-10 2021-06-22 Reliant Immune Diagnostics, Inc. Modular parallel/serial dual microfluidic chip
US10930380B2 (en) 2017-11-10 2021-02-23 Reliant Immune Diagnostics, Inc. Communication loop and record loop system for parallel/serial dual microfluidic chip
US11200986B2 (en) 2017-11-10 2021-12-14 Reliant Immune Diagnostics, Inc. Database and machine learning in response to parallel serial dual microfluidic chip
WO2019160491A1 (en) 2018-02-16 2019-08-22 Astrego Diagnostics Ab Microfluidic device
JP7335249B2 (ja) * 2018-02-16 2023-08-29 アストレゴ ダイアグノスティクス エービー 微小流体装置での細胞捕捉
JP7282327B2 (ja) * 2018-08-23 2023-05-29 株式会社デンソー 細胞固定デバイス、細胞固定方法、及び細胞操作方法
SE542462C2 (en) 2018-09-20 2020-05-12 Astrego Diagnostics Ab Sample loading cartridge for a microfluidic device
US11421273B2 (en) * 2018-12-03 2022-08-23 California Institute Of Technology In situ readout of DNA barcodes
CN109580485A (zh) * 2019-01-18 2019-04-05 大连理工大学 一种用于红细胞超分辨成像的固定装置和使用方法
AU2020354648A1 (en) * 2019-09-26 2022-04-14 Jumpcode Genomics, Inc. Method and system for targeted nucleic acid sequencing
WO2022197490A1 (en) * 2021-03-16 2022-09-22 Scale Biosciences Inc. Method for adding spatially-addressable barcodes to nucleic acids of a cellular sample in situ
CN116640643A (zh) 2022-02-24 2023-08-25 希森美康阿斯特雷戈公司 分析生物样品的卡盒和方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101842159A (zh) * 2007-08-09 2010-09-22 赛路拉公司 关联的多参数单细胞测定及残余生物材料回收的方法和装置
CN106661530A (zh) * 2014-07-07 2017-05-10 J·逸夫 微流体装置

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003085379A2 (en) 2002-04-01 2003-10-16 Fluidigm Corporation Microfluidic particle-analysis systems
EP1525451B1 (en) 2002-04-30 2009-07-15 Gyros Patent Ab Method of analysing a catalytic system using an integrated microfluidic device
DE60328392D1 (de) * 2002-04-30 2009-08-27 Gyros Patent Ab Mittels einer integrierten mikrofluidischen vorrichtung
CN101165161B (zh) * 2007-07-27 2013-10-30 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 一种微流体浓度梯度细胞培养芯片及其制备方法和应用
EP2350652A2 (en) * 2008-10-10 2011-08-03 Cnrs-Dae Cell sorting device
FR2937050A1 (fr) 2008-10-10 2010-04-16 Inst Curie Dispositif de culture cellulaire
US20100102007A1 (en) 2008-10-23 2010-04-29 Abdel Magid Kalo Process for Treatment of Sewage Waste Water
WO2011028818A2 (en) * 2009-09-01 2011-03-10 Trustees Of Boston University High throughput multichannel reader and uses thereof
CN101705179A (zh) * 2009-12-13 2010-05-12 周小棉 肿瘤细胞耐药性检测芯片
US20130115606A1 (en) * 2010-07-07 2013-05-09 The University Of British Columbia System and method for microfluidic cell culture
CN103477222B (zh) * 2010-09-29 2016-08-10 麻省理工学院 用于高通量研究细胞相互作用的装置
AU2012212148B8 (en) * 2011-02-02 2017-07-06 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Massively parallel contiguity mapping
JP5231684B1 (ja) 2011-07-15 2013-07-10 独立行政法人科学技術振興機構 細胞培養装置、細胞培養長期観察装置、細胞長期培養方法、および細胞培養長期観察方法
US9957472B2 (en) 2011-09-22 2018-05-01 Georgia Tech Research Corporation Deterministic high-density single-cell trap array
US9764505B2 (en) * 2011-11-23 2017-09-19 The Governing Council Of The University Of Toronto Devices and methods for producing planar polymeric materials using microfluidics
US9149806B2 (en) * 2012-01-10 2015-10-06 Biopico Systems Inc Microfluidic devices and methods for cell sorting, cell culture and cells based diagnostics and therapeutics
US9494568B2 (en) 2012-02-03 2016-11-15 Neobios Pte Ltd Passive microfluidic device and a method of forming the same
US9304065B2 (en) 2012-02-29 2016-04-05 Fluidigm Corporation Methods, systems and devices for multiple single-cell capturing and processing using microfluidics
JP2015516163A (ja) 2012-05-08 2015-06-11 セレクタ，インク 機能的ゲノム分析のクローン解析、及び該クローン解析を実行するための組成
WO2013185125A1 (en) * 2012-06-08 2013-12-12 Cornell University Microfluidic device, system, and method for tracking single cells and single cell lineages
CA2877962C (en) 2012-06-29 2018-06-05 Massachusetts Institute Of Technology Massively parallel combinatorial genetics
CN102796667B (zh) * 2012-08-21 2014-07-30 北京大学 一种可布置不同细胞密度的微流控芯片及其应用
CN109324190A (zh) 2012-12-11 2019-02-12 艾伯特叶史瓦大学爱因斯坦医学院 高通量受体:配体鉴定方法
EP4134656A1 (en) * 2013-03-14 2023-02-15 Cytonome/ST, LLC Assemblies and methods for reducing optical crosstalk in particle processing systems

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101842159A (zh) * 2007-08-09 2010-09-22 赛路拉公司 关联的多参数单细胞测定及残余生物材料回收的方法和装置
CN106661530A (zh) * 2014-07-07 2017-05-10 J·逸夫 微流体装置

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《Highly Multiplexed Subcellular RNA Sequencing in Situ》;Lee Je Hyuk等;《SCIENCE》;20140421;第343卷(第6177期);第1360-1363页 *
《In situ genotyping of a pooled strain library after characterizing complex phenotypes》;Lawson Michael J.等;《MOLECULAR SYSTEMS BIOLOGY》;20170922;第13卷(第10期);第1-9页 *

Also Published As

Publication number Publication date
PL3167044T3 (pl) 2020-08-24
US10570437B2 (en) 2020-02-25
DK3167044T3 (da) 2019-12-02
US10041104B2 (en) 2018-08-07
JP7066206B2 (ja) 2022-05-13
US10913969B2 (en) 2021-02-09
CN106661530B (zh) 2021-06-04
JP2020054365A (ja) 2020-04-09
EP3167044A4 (en) 2018-06-20
AU2015288329B2 (en) 2020-07-23
CN106661530A (zh) 2017-05-10
BR112017000168B1 (pt) 2023-04-18
CA2954360C (en) 2022-11-22
JP2017519517A (ja) 2017-07-20
AU2015288329A1 (en) 2017-01-12
US20170159048A1 (en) 2017-06-08
JP2017520262A (ja) 2017-07-27
BR112017000167B1 (pt) 2021-08-24
AU2015288389A1 (en) 2017-01-12
BR112017000168A2 (pt) 2018-01-16
EP3167044A1 (en) 2017-05-17
EP3167044B1 (en) 2019-10-09
US20180320216A1 (en) 2018-11-08
EP3167061A1 (en) 2017-05-17
JP6600349B2 (ja) 2019-10-30
CA2954360A1 (en) 2016-01-14
ES2762914T3 (es) 2020-05-26
AU2015288389B2 (en) 2021-05-13
EP3167061B1 (en) 2019-02-20
CA2954378C (en) 2022-11-22
EP3167061A4 (en) 2018-02-28
WO2016007068A1 (en) 2016-01-14
JP6629287B2 (ja) 2020-01-15
US20170137861A1 (en) 2017-05-18
CA2954378A1 (en) 2016-01-14
BR112017000167A2 (pt) 2018-01-16
CN106471122A (zh) 2017-03-01
WO2016007063A1 (en) 2016-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106471122B (zh) 在遗传上不同的细胞的文库的表型鉴定及原位基因分型
CN110268059B (zh) 单细胞全基因组文库及制备其的组合索引方法
US11149260B2 (en) Simultaneous multiplex genome editing in yeast
CN105209639B (zh) 在固相载体扩增核酸的方法
US11274296B2 (en) Simultaneous multiplex genome editing in yeast
US20210381007A1 (en) Methods and compositions for crispr editing of cells and correlating the edits to a resulting cellular nucleic acid profile

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20170516

Address after: uppsala

Applicant after: Astor Reggae diagnostics

Address before: Uppsala, Sweden

Applicant before: J Shaw

SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant