CN1733937A - 耳聋相关基因突变及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有925T→C突变的POU3F4突变基因,此突变基因与人类遗传性耳聋相关,本发明还提供了通过检测患者中是否存在该突变基因而诊断耳聋发生的原因和类型的检测方法。该突变基因和检测方法将有利于临床上开展耳聋患者的POU3F4突变筛查工作,为耳聋患者的诊断和治疗提供服务。
Description
技术领域
本发明涉及应用POU3F4突变基因诊断人类遗传性耳聋的检测方法。
本发明还涉及用于检测POU3F4突变基因的试剂盒。
本发明还涉及新的POU3F4突变基因及其诊断和/或治疗人类遗传性耳聋中的应用。
背景技术
遗传性聋分为非综合征性耳聋(nonsyndromic hearing impairment,NSHI)和综合征性耳聋(syndromic hearing impairment,SHI)。全部NSHI和绝大部分SHI是孟德尔遗传单基因病,极少部分SHI是染色体病。耳聋是导致交流障碍最常见的疾病。估计全世界约有7亿人口听力损失至少达55dB。听力下降达25dB及以上者在青年人中约占1%,60岁人群中约占10%,75岁时上升到50%。学语前聋发病率为1/1000,约半数是遗传因素所致,其中70%是NSHI,30%是SHI。学语后聋基本上是常染色体显性遗传NSHI。遗传性聋的群体发病率已超过27/万。遗传性聋在16世纪就有文献记载,但由于内耳部位深,体积小,研究手段受到限制,因此认识和理解控制听觉系统的基因研究进展很慢。近10多年来,随着现代科学技术的发展及分子生物学、遗传学的飞速发展,人们对遗传性聋的认识不断加深,并取得了显著进步。
X-连锁遗传NSHI以DFN表示,已报道8型(DFN1~DFN8),DFN2、DFN4、DFN63型已基因定位,DFN1和DFN3已基因克隆。DFN1在儿童早期开始进行性听力下降,以后可合并进行性肌张力障碍、痉挛、吞咽困难、精神障碍、偏执狂、皮质盲,该型耳聋实质上属于SHI,因疾病早期仅出现听力受损,遗传性聋分型时被纳入了NSHI。DFN3是X-连锁遗传NSHI最常见的类型,临床表现为伴有镫骨固定的混合性聋,神经性聋呈进行性下降,内耳道和前庭异常扩大,小耳蜗,半规管半径变小,高分辨CT扫描可发现内耳道异常扩大、蜗轴异常、蛛网膜下腔与外淋巴腔直接相通,镫骨底板切除或卵圆窗开窗后发生外淋巴液“井喷”,有导致全聋之虞,为手术禁忌。DFN1和DFN6在儿童期开始出现进行性高频感音神经性聋,成年后可达累及全频率的中~深度聋。X-连锁遗传NSHI女性携带者多表现为不完全显性,成年后可出现轻-中度听力受损,可进行性加重。
X-连锁遗传SHI已基因克隆的有Norrie综合征、X-连锁型Alport综合征2种。基因定位的有肌张力障碍-耳聋综合征、Mondini样发育不良、Juberg-Marsidi综合征等。
根据Shine和Watson在1967年的报道,在一个夏威夷-华裔家系的两代人中,9个个体患有传导性耳聋、前庭系统障碍,术中发现镫骨底板固定。当镫骨底板活动后,大量的外淋巴和脑脊液涌出,提示耳蜗导水管异常开放。Nance et al.(1970,1971)在欧洲观察到一个相似的家系,在这个家系中,听力下降为混合型。Phelps等(1991)研究了7个X连锁形式的耳聋家系,多数患者内听道的末端膨隆和内听道末端与耳蜗基底转之间的骨质缺损。Phelpset al.(1991)认为这是由于内听道蛛网膜下腔间隙和耳蜗外淋巴之间的交通导致了外淋巴“水肿”,如果镫骨受扰,则会出现镫井喷。一些女性携带者表现较为轻微。de Kok等(1995)总结了DFN3的特征,指出耳聋为镫骨固定引起的传导性耳聋和进行性的感音神经性听力下降引起的混合型,有时极重的感音神经性聋会掩蔽传导性成分。CT扫描显示内听道异常扩张和内听道与内耳之间的异常沟通,因此形成了在打开镫骨底板时出现镫井喷的原因。
Bitner-Glindzicz在POU3F4基因发现了特殊的突变,他认为DFN3应以极重的感音神经性聋伴或不伴传导成分,伴随独特的耳发育障碍为特征,极重度的感音神经性聋是这种疾病的必要条件。
Douville等(1994)报道小鼠的基因Brain-4(Pou3f4)编码一种转录因子定位在Plp和DXMit6标记之间,这一区域在小鼠和人类的染色体高度保守,因此提示人类POU3F4基因位于Xq13-q22之间。POU3F4在小鼠中的同源基因——RHS2,在胚胎发育过程中,受孕后15.5~17.5天在脑、神经管和听泡表达,因此胚胎早期它的定位和空间/时间表达模式上都提示是X连锁混合型听力下降伴外淋巴井喷的候选基因。在5位无关的DFN3患者中,de Kok et al发现了2个错义突变和2个无义突变,这些突变导致了蛋白截短或非保守氨基酸替代。而在50位对照者中没有发现POU3F4基因突变。说明POU3F4突变是DFN3的分子基础。
Minowa等培育出的Brn4(Pou3f4)缺陷小鼠,均有极重度耳聋。在电子显微镜下见到耳蜗螺旋韧带纤维细胞有明显的超微结构改变,提示间叶细胞起源的纤维细胞在听觉功能中起到关键作用。
目前尚未有关于在中国耳聋患者中发现POU3F4 925T→C突变的报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供诊断人类遗传性耳聋的方法,通过检测来自患者的待测样本中是否存在POU3F4突变(925T→C)基因,进而为临床诊断和治疗提供参考。
本发明将为在中国耳聋人群,特别是X连锁遗传形式的先天性聋哑患者中开展耳聋基因筛查提供方便确实的方法;并为将来利用这一突变作为靶点开展耳聋的基因治疗提供坚实的基础。
本发明的另一个目的在于提供用于检测POU3F4突变(925T→C)基因的试剂盒。
本发明的再一个目的在于提供与人类X连锁遗传形式的先天性耳聋相关的POU3F4925T→C突变基因,并提供该突变基因在诊断或治疗人类遗传性耳聋中的应用。
根据本发明的一个方面,本发明提供了一种人类遗传性耳聋相关基因的检测方法。
所述检测方法为通过检测来自于患者的待测样本中是否存在POU3F4基因925T→C突变(S309P),而判断该患者的耳聋发生原因及类型。
其中,所述S309P是指POU3F4基因的碱基改变(925T→C)引起表达产物Brn-4蛋白的第309位氨基酸由丝氨酸改变为脯氨酸。
发明人应用候选基因筛查的方法在一个中国X连锁遗传先天性极重度听力下降家系中发现与X连锁遗传性耳聋相关的POU3F4基因新的突变位点——925T→C(S309P)。这个突变在这个X连锁遗传形式的耳聋家系的所有男性患者中以半合子存在,女性携带者没有发病,突变与耳聋共分离,说明该突变位点是导致耳聋的原因。由于这是首次在中国耳聋患者中发现该基因突变,而且是未见文献报道的突变形式,说明了该基因在中国先天性极重度听力下降患者中所具有的重大意义。
图1给出POU3F4编码区氨基酸与核酸碱基的对照图,并示出突变位点,该突变位于DNA结合区。通过对不同连接蛋白氨基酸序列进化研究的结果表明,该突变位点具有保守性。
正常的POU3F4基因的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示,其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,突变的POU3F4基因的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.3所示,其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。如序列表中所示,925T→C的突变导致了密码子由TCC变为CCC,其编码的第309位的丝氨酸变为脯氨酸。
检测该突变可用本领域的任何检测点突变的方法来进行,例如限制性内切酶酶切反应、PCR(聚合酶链反应)-测序法、采用标记的POU3F4基因DNA探针杂交法或用限制性片段长度多态性方法等。
在本发明的一个实施方案中,采用PCR扩增-直接测序法来检测样本,具体包括下述步骤:
1)采集待测个体的样本,例如血液、体液或组织,提取DNA;
2)以该DNA为模板,以针对POU3F4基因或POU3F4基因第925个碱基附近的编码区设计的PCR引物进行PCR反应,得到PCR反应产物;
3)将得到的PCR产物进行直接测序分析,将所得到的序列与POU3F4正常基因的序列进行比较,确定是否存在POU3F4突变位点。
4)根据以上结果判断待测个体是否为POU3F4基因突变925T→C导致的遗传性耳聋。
进一步的,该方法可以选择性的包括如下步骤:
5)按正常阅读框进行翻译以确定是否存在309S→P氨基酸突变位点。
在发明人进行的实验中,收集耳聋遗传资源,建立遗传性耳聋资源库。通过聋病门诊收集各种感音神经性耳聋患者,在患者自愿的前提下,签署知情同意书后,留取5-10ml血样,并建立门诊病历资料库,详细记录患者病情、家系中的发病情况以及联系方式。然后,应用酚氯仿抽提的方法提取基因组DNA,定量后入库,-20℃保存,每份DNA样品均详细对应于登记的患者临床资料。然后,应用在线引物设计软件Primer3设计引物,包含POU3F4整个编码区,应用PCR扩增。PCR产物直接测序:测序引物与PCR扩增引物相同,正反向测序,应用ABI公司3730DNA测序仪。得到的序列与Genbank中的序列(登录号:NT 011651)比较确定POU3F4突变位点。按正常阅读框进行翻译以确定POU3F4的突变位点。
在本发明的另一个具体实施方案中,采用Bgl II限制性内切酶的酶切反应来检测突变基因,将上述步骤2所得到的PCR反应产物用Bgl II进行酶切反应后,琼脂糖电泳检测,正常基因将能被Bgl II切开,而突变基因不能被Bgl II酶切,由此确定是否存在突变位点;根据检测结果判断待测个体是否为POU3F4基因925T→C突变导致的遗传性耳聋。
上述步骤2所得到的PCR反应产物还可以用杂交探针来检测,所用的杂交探针可以是与正常的POU3F4核苷酸序列杂交,或与突变的核苷酸序列杂交,或与它们的互补序列杂交的探针。这些探针可以用放射性同位素、发色物质或荧光物质标记,尤其是可利用等位基因特异探针,以筛查是否存在已被确定的突变。
在上述方法中使用的PCR引物可以依据已知的核苷酸序列设计,通常为15~30个碱基,GC含量为45~50%左右,在适当的温度下与末端特异性结合,其可以利用专门的计算机程序设计。在本发明的一个具体实施例中,应用引物设计软件设计了一对PCR引物,其序列为:
上游引物:PU3-F:5’CATTGACAAGATCGCTGCAC 3’(nt1237-nt1256)
下游引物:PU3-R:5’TGGAGGAAGCGAGGAGGC 3’(nt1521-nt1538)
POU3F4正常基因的标准序列可以参考例如Genbank NT_011651。
根据本发明的另一个方面,本发明进一步提供了用于检测POU3F4基因925T→C突变的试剂盒,试剂盒中可以包含以下试剂
用于扩增样本DNA中POU3F4基因或POU3F4基因第925个碱基附近编码区的PCR引物;以及以下一种或几种试剂的组合:
从待测样品中提取DNA的试剂;
PCR反应试剂;
对PCR扩增产物进行限制性内切酶酶切反应的试剂。
例如,本发明的一个实施方案中提供一个检测POU3F4基因925T→C突变的试剂盒,容器内装有用以检测POU3F4基因925T→C突变的成分,与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。例如,采用PCR扩增后,直接检测样品中POU3F4基因925T→C突变位点的试剂盒,可含有扩增引物、dNTP、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液、酶切反应和/或测序反应所需试剂等的一种或多种。本领域技术人员已知,以上组分仅是示意性的,例如,所述的引物可以采用上述的一对PU3-F和PU3-R引物,所述用于PCR反应的DNA聚合酶是能够用于PCR扩增的酶。
所述试剂盒的使用方法主要包括如下步骤:
(1)提取待测血样的DNA,利用上述的一对PU3-F和PU3-F引物,进行PCR反应;
(2)酶切反应进行突变检测;
(3)PCR反应产物纯化后直接测序,将所得的序列与Genbank中的标准序列比较确定突变位点的存在;
(4)按正常阅读框进行翻译以确定是否存在Brn-4氨基酸突变位点。
该试剂盒可简便快捷地检测POU3F4突变位点,从而应用于耳聋相关基因的检测和耳聋诊断或治疗方法中。
根据本发明的再一个方面,提供了POU3F4突变基因在诊断或治疗人类遗传性耳聋中的应用。通过检测来自患者的待测样本中是否存在POU3F4基因925T→C突变而判断该患者的耳聋发生原因及类型,进而为临床诊断和治疗提供参考;此外,在进一步的临床治疗方面,在检测为发生了POU3F4基因925T→C突变之后,可以将正常基因导入携带突变基因的细胞并在其中表达,它可与内源性突变基因发生重组,从而可以进行基因治疗。
本发明提出了通过检测患者中是否存在POU3F4基因新的突变而诊断耳聋发生的原因和类型的检测方法,这将有利于在临床上开展耳聋患者,特别是X连锁遗传形式的先天性聋哑患者的POU3F4突变筛查工作,为耳聋患者提供诊断和治疗服务。
下面结合附图,通过对本发明较佳实施方式的说明,详细描述但不限制本发明。
附图的简要说明
图1为POU3F4编码区氨基酸与核酸碱基的对照:突变位于POU3F4的DNA结合区,第925个碱基,用方框圈起来的是突变的碱基和氨基酸;
图2为本发明方法中PCR反应过程示意图,示出了反应温度和时间;
图3为本发明方法中,对PCR产物进行电泳定量的琼脂糖凝胶电泳图谱,图中示出了定量Marker的片段位置;
图4为本发明方法中POU3F4基因测序结果,上方为突变序列,下方为正常对照序列,箭头所指为突变位点(925T→C,S309P);
图5为本发明方法中突变位点酶切电泳图,其中,左图是酶切分析图示,右图是突变位点酶切电泳图,右图中由左至右:第一和第五泳道为分子量标准、第二和第三泳道为男性患者的突变基因的酶切图谱、第四泳道为女性携带者的突变基因的酶切图谱;
限制性内切酶Bgl II可以在924和925位碱基切开,而使得PCR产物片段由原来的302bp被切成117bp和185bp两个片段,而突变以后此酶切位点消失,不能切开,由于男性患者为半合子,在胶图上为1条带,正常人为两条带,女性携带者均为杂合突变,故电泳胶图上显示为3条带;
图6为不同物种POU3F4基因序列进化研究,
通过对多种Brn-4氨基酸序列比对,箭头所指为Ser309位点,可见所有POU3F4基因中该位点均为丝氨酸(Ser),说明为保守区,提示925T→C突变位于保守区域。
发明的具体实施方式
本发明所用试验材料,如无特别说明,均为市售购买产品。
待测血样提取与POU3F4基因编码区的PCR扩增
【实施例1】
一、待测对象血样DNA的制备
1、研究对象
一个中国X连锁遗传先天性极重度听力下降021家系表现为先天性极重度听力下降,颞骨CT检查显示内听道膨大,呈X连锁隐性遗传模式。共调查021家系成员31人,其中男性17人,女性14人。患者8人,均为男性,听力学表型一致。按照下述方法对这31名行家系成员进行POU3F4基因突变检测,发现8名男性患者均为突变半合子,在女性中共检测杂合携带者8人。其中15名家系成员未发现突变。另外选取听力正常,没有听力减退遗传背景正常对照110名,进行POU3F4基因突变检测,结果没有发现任何突变。
对所有参加者详细调查其病史以及家族史,并对其进行体格检查,耳科检查包括耳镜检查、听力学评估。在签署知情同意书以后每人采集血样5~10ml。
2、基因组DNA提取
采用酚氯仿抽提法。
第一天
1)抗凝血用PBS作1倍稀释。
2)在离心管中加入2倍体积的淋巴分离液(18℃~28℃),上面铺一层1倍体积已稀释的血液,室温,1000×g,离心20分钟。
3)吸弃上清液,小心吸出中间有核细胞层,转入5ml Ep管中,5000×g,离心10分钟,然后用PBS洗一次。5000×g,离心10分钟。
4)将细胞悬于2ml TE缓冲液(10mM Tris.HCl,1mM EDTA,pH8.0)中,加10%的SDS(十二烷基硫酸)至终浓度0.5%(100μl),蛋白激酶k 100~200μg/ml(10mg/ml),50℃水浴3~5小时。
5)用酚氯仿提取。用等体积的饱和酚,加入混匀,5000×g,离心10分钟。
6)吸上清液至新离心管中,弃下层沉淀,加入等体积酚:氯仿混合物,混匀,5000×g,离心10分钟。
7)吸上清液至新离心管中,弃下层沉淀,加入等体积氯仿:异戊醇混合物,混匀,5000×g,离心10分钟。
8)吸上清液至新离心管中,弃下层沉淀,加入1/10体积的乙酸钠,混匀。
9)加入2.5倍体积的无水乙醇。
10)-20℃沉淀DNA过夜。
第二天
11)高速离心,10000×g,10分钟,4℃。
12)弃上清液,加入75%乙醇2ml,高速离心10000×g,5分钟
13)弃上清液,吹干。
14)用TE缓冲液溶解(200μl TE/5ml全血,400TE/10ml全血)。
15)分装。1%琼脂糖电泳和分光光度计定量。
二、POU3F4基因编码区的PCR扩增
1、引物序列
上游引物:PU3-F:5’CATTGACAAGATCGCTGCAC 3’(nt1237-nt1256)
下游引物:PU3-R:5’TGGAGGAAGCGAGGAGGC 3’(nt1521-nt1538)
注:POU3F4基因序列检索号:NT_011651
2、PCR反应体系的建立(表1)
表1 POU3F4基因的PCR反应体系
名称 | 原液浓度 | 加样量(μl) | 体系终浓度 |
缓冲液 | 10× | 2.5 | 1× |
dNTP | 2.5mM | 3.0 | 400μM |
引物 | 10μM | 1 | 7.5pmol |
Taq酶 | 5units/μl | 1 | 1U/μl |
模板(步骤一中提取的DNA) | 100ng/μl | 1 | 10ng/μl |
总反应体系 | ddH2O补齐至25μl |
其中,缓冲液、Hotstar Taq酶从美国基因公司购得,dNTP从宝生物公司购得,引物由上海生工公司合成。
反应条件:PCR反应在ABI公司9700热循环仪上进行,反应过程(包括温度和时间)如图2所示。
POU3F4基因编码区PCR扩增产物的纯化和定量
【实施例2】
一、PCR产物的纯化——96孔板法
1、向装有PCR产物的96孔板中加入50μl无菌水,混匀。
2、将其转移到Millipore纯化板中,放到真空泵上抽滤约3分钟,看到纯化板中没有水即可。
3、向纯化板中再次加入50μl的去离子水,继续抽滤,直到纯化板中没有水为止。
4、将纯化板从真空泵上取下,向板中加入20μl的去离子水,静止15分钟,再震荡15分钟,然后吸到一新96孔板内。
5、保存在-20℃冰箱中。
二、电泳定量
1、样品准备
取一96孔点样板,每孔先加上样缓冲液6μl,在从装有PCR产物的腔板中,每孔用排枪移出PCR产物(2μl),转移到点样板上、混匀、离心(腔板孔号要与96孔点样板一一对应)。
2、流程
1)配胶(0.8%琼脂糖):称取2.4g琼脂糖,悬浮于300ml 0.5×TBE中(500ml锥形瓶)。
2)溶胶:微波炉中高火加热至沸,持续沸腾数分钟,注意不要沸出,其间取出混匀。
3)凉胶:待胶完全溶解,从微波炉中取出,凉至60℃左右,加入1滴EB(约10μl,10mg/ml),摇匀。
4)铺胶:平板两端用胶布封严,把250ml胶液全部倒入平板,插入梳尺。
5)上胶:将平板放入已盛有电泳液(0.5×TBE,液面距胶面1至2mm)的电泳槽中,拔下梳尺。
6)加样:用排枪按规定格式加样,最后用单枪加入DNA标准品。
7)走胶:盖上电泳槽盖,检查正负级,开启电泳仪,调节电泳电压。
8)定量:当溴酚蓝走离加样孔1.5至2cm处,关闭电泳仪,小心取胶,放入摄相仪照相,进行定量。
定量marker为DL 2000,如图3所示,经过电泳后,有6条带可见,片段长度分别是2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp,DL2000的总浓度是300ng/5μl。电泳时取5μl DL2000,因此每条带的含量为50ng。PCR产物电泳时取3μl(PCR产物)+5μl(上样缓冲液)进行电泳。根据PCR产物电泳后的灰度值与DL2000的灰度值的比较判断PCR产物的含量。
纯化的POU3F4基因编码区PCR扩增产物的直接测序
【实施例3】
一、PCR产物DNA模板的纯度与用量要求
DNA纯度:OD260/OD280=1.6~2.0。
DNA浓度:PCR产物10ng/μl。
DNA用量:
PCR产物
100-200bp 1-3ng
200-500bp 3-10ng
500-1000bp 5-20ng
1000-2000bp 10-40ng
>2000bp 40-100ng
二、测序反应
1、测序反应所需试剂应为新鲜配制,需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使用。测序反应所需的器材(如384孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。
2、为了保证测序样本及反应试剂的新鲜,加样时应在冰上操作。
3、目前的反应体系为5μl,各种试剂加入量如表2所示。
表2 POU3F4基因PCR扩增产物的测序反应体系
模板 | 纯化的PCR产物(实施例2中制备) | 200-500bp | 3-10ng |
500-1000bp | 5-20ng | ||
1000-2000bp | 40-100ng | ||
BigDye v3.1* | 0.25μl |
5×缓冲液(Tris-HCl pH9.0,MgCl2) | 0.875μl(Kit) |
引物 | 3.2pmol |
用无菌水补至5μl |
*BigDye 3.1为美国应用生物系统公司(ABI)生产的一种用于测序反应的荧光染料。
4、样品放于PCR仪上,所作反应的过程见表3。
表3 POU3F4基因PCR扩增产物的测序反应过程
步骤 | 作用 |
1 | 96℃,2min. |
2 | 重复以下过程30个循环:●96℃,10sec;●50℃,5sec;●60℃,4min. |
3 | 保持在4℃,直到纯化 |
5、反应完的样品要及时从PCR仪上取下,短时间内要进行纯化的样品放置于4℃冰箱中,超过一天以上才能纯化的样品放置于-20℃冰箱冷冻。
三、测序反应物的纯化和测序
1、向每孔中加入20μl 80%乙醇,4,000rpm离心30min;将样品板放在折好的纸巾上,在离心机中倒甩,倒甩时速率不能超过1,000rpm;
2、在每孔中加入30μl 70%乙醇,4,000rpm离心10min,倒甩;
3、重复第2步的操作;
4、重复第2步的操作;
5、将样品板放于干净的抽屉中,避光干燥30min;
6、加入5μl甲酰胺,封膜,离心后置于-20℃冰箱中;
7、上机器前95℃变性5分钟,放置冰上2分钟,离心后上样。
测序图如图4所示。
突变位点酶切反应检测
【实施例4】
酶切分析:在此突变位点找到了一个限制性内切酶Bgl II酶切位点,没有发生突变时,限制性内切酶Bgl II可以在第924和925位碱基切开,而使得PCR产物片段由原来的302bp被切成117bp和185bp两个片段,而突变以后此酶切位点消失,不能切开,由于男性患者为半合子,在胶图上为1条带,正常人为两条带,女性携带者均为杂合突变,故电泳胶图上显示为3条带。
酶切反应体系见表4。
表4 酶切反应体系
试剂 | 样品量 |
Bgl II | 1μl |
10×L Buffer | 2μl |
PCR产物 | 5μl |
ddH2O | Up to 20μl |
反应条件:37℃水浴2小时。
琼脂糖电泳检测:参见实施例2中电泳定量。
Bgl II限制性内切酶与10×L Buffer购于宝生物公司,PCR产物为实施例2中的PCR扩增产物。
酶切反应电泳图如图5所示。
突变位点进化研究
【实施例5】
突变分析:应用DNAStar5.0(Lasergene inc.)软件包中的SeqmanTM软件进行序列对比分析。将测序得到的序列与NCBI检索到的标准序列进行比对,找出突变序列,发现了突变位点925T→C(S309P)。该位点位于POU3F4基因的DNA结合区。结果见图6。
检测耳聋相关基因POU3F4-925T→C突变位点试剂盒及其应用
【实施例6】
1、试剂盒的组成
(1)扩增用引物:
上游引物:PU3-F:5’CATTGACAAGATCGCTGCAC 3’(nt1237-nt1256)
下游引物:PU3-R:5’TGGAGGAAGCGAGGAGGC 3’(nt1521-nt1538)
注:POU3F4基因序列检索号:NT_011651
(2)PCR扩增用Taq酶5U/μl
(3)10×缓冲液(含15ml MgCl2)
(4)dNTP 2mM
(5)Bgl II限制性内切酶
(6)10×L Buffer
(7)Big-Dye mix
2、使用方法
主要包括如下步骤:
1)PCR扩增
用软件Primer 3对POU3F4基因的编码区设计PCR引物,反应条件为94℃预变性4分钟,94℃变性1分钟,退火温度50℃分钟,72℃延伸2分钟,35个循环,反应结束后再72℃延伸5分钟,4℃保存。
2)PCR产物纯化
将含有PCR产物的MμltiScreen-PCR板抽真空,加入去离子水,静置,随后将MμltiScreen-PCR板置于混合器上震荡,纯化后的PCR产物重新溶解后转移至另一洁净的96孔板中。
3)酶切反应
应用Bgl II限制性内切酶1μl,10×L Buffer 2μl,PCR产物5μl,加去离子水至20μl,37℃水浴2小时,正常人PCR产物切成两个片段,而出现突变后,酶切位点消失,不能切开。
4)测序反应及验证
以PCR引物作为测序引物进行测序反应,在ABI9700热循环仪上进行测序反应。反应结束后,延伸产物上样于ABI PRISM 3730DNA序列分析仪。将所得到的测序图谱进行分析,与Genbank中的标准序列比较以确定突变位点是否存在。
具体方法参见实施例1、2、3、4。
以上对本发明的详细描述并不限制本发明,本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形,只要不脱离本发明的精神,均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。
051P10~1
SEQUENCE LISTING
<110>中国人民解放军总医院
<120>耳聋相关基因突变及其检测方法
<130>BJ87-04P100156
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1086
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>gene
<222>(1)..(1081)
<223>
<400>1
atggccacag ctgcctcgaa tccctacagc attctcagtt ccacctccct agtccatgcg 60
gactctgcgg gcatgcagca ggggagtcct ttccgcaacc ctcagaaact tctccaaagt 120
gattacttgc agggagttcc cagcaatggg catcccctcg ggcatcactg ggtgaccagt 180
ctgagcgacg ggggcccatg gtcctccaca ctggccacca gccccctgga ccagcaggac 240
gtgaagcccg ggcgcgaaga cctgcaactg ggtgcgatca tccatcaccg ctcgccacac 300
gtagcccacc actcaccgca cactaaccac cccaacgcct ggggggccag cccggcaccg 360
aacccgtcta tcacgtcaag cggccaaccc ctcaacgtgt actcgcagcc tggcttcacc 420
gtgagcggca tgctggaaca cgggggactc accccacctc cagctgccgc ctctgcacag 480
agcctgcacc cggtgctccg agagcccccg gatcacggcg aactgggctc gcaccattgc 540
caggatcact ccgacgagga gacgccaacc tctgatgagt tggaacagtt cgccaaacaa 600
ttcaaacaaa gaagaatcaa gttgggcttc acgcaggccg acgtggggtt ggcgctgggc 660
acactgtatg gtaacgtgtt ctcgcagacc accatctgca ggttcgaagg cttgcagctg 720
agcttcaaaa atatgtgcaa gctgaagccc ctgctgaaca agtggctgga ggaggcggat 780
tcgtccacag ggagcccgac cagcattgac aagatcgctg cacagggccg caagcgcaag 840
aagcggacct ccatcgaggt gagtgtcaag ggcgtactgg agacgcattt cctcaagtgt 900
051P10~1
cccaagcctg ccgcgcagga gatctcctcg ctggcagaca gcctccagtt ggagaaggaa 960
gtggtgcgtg tctggttctg taatcgaaga caaaaagaga aaagaatgac tccgccaggg 1020
gatcagcagc cgcatgaggt ttattcgcac accgtgaaaa cagacacatc ttgccatgat 1080
ctctga 1086
<210>2
<211>361
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(361)
<223>由正常POU3F4基因编码的蛋白
<400>2
Met Ala Thr Ala Ala Ser Asn Pro Tyr Ser Ile Leu Ser Ser Thr Ser
1 5 10 15
Leu Val His Ala Asp Ser Ala Gly Met Gln Gln Gly Ser Pro Phe Arg
20 25 30
Asn Pro Gln Lys Leu Leu Gln Ser Asp Tyr Leu Gln Gly Val Pro Ser
35 40 45
Asn Gly His Pro Leu Gly His His Trp Val Thr Ser Leu Ser Asp Gly
50 55 60
Gly Pro Trp Ser Ser Thr Leu Ala Thr Ser Pro Leu Asp Gln Gln Asp
65 70 75 80
Val Lys Pro Gly Arg Glu Asp Leu Gln Leu Gly Ala Ile Ile His His
85 90 95
Arg Ser Pro His Val Ala His His Ser Pro His Thr Asn His Pro Asn
100 105 110
Ala Trp Gly Ala Ser Pro Ala Pro Asn Pro Ser Ile Thr Ser Ser Gly
115 120 125
Gln Pro Leu Asn Val Tyr Ser Gln Pro Gly Phe Thr Val Ser Gly Met
130 135 140
Leu Glu His Gly Gly Leu Thr Pro Pro Pro Ala Ala Ala Ser Ala Gln
145 150 155 160
Ser Leu His Pro Val Leu Arg Glu Pro Pro Asp His Gly Glu Leu Gly
165 170 175
051P10~1
Ser His His Cys Gln Asp His Ser Asp Glu Glu Thr Pro Thr Ser Asp
180 185 190
Glu Leu Glu Gln Phe Ala Lys Gln Phe Lys Gln Arg Arg Ile Lys Leu
195 200 205
Gly Phe Thr Gln Ala Asp Val Gly Leu Ala Leu Gly Thr Leu Tyr Gly
210 215 220
Asn Val Phe Ser Gln Thr Thr Ile Cys Arg Phe Glu Gly Leu Gln Leu
225 230 235 240
Ser Phe Lys Asn Met Cys Lys Leu Lys Pro Leu Leu Asn Lys Trp Leu
245 250 255
Glu Glu Ala Asp Ser Ser Thr Gly Ser Pro Thr Ser Ile Asp Lys Ile
260 265 270
Ala Ala Gln Gly Arg Lys Arg Lys Lys Arg Thr Ser Ile Glu Val Ser
275 280 285
Val Lys Gly Val Leu Glu Thr His Phe Leu Lys Cys Pro Lys Pro Ala
290 295 300
Ala Gln Glu Ile Ser Ser Leu Ala Asp Ser Leu Gln Leu Glu Lys Glu
305 310 315 320
Val Val Arg Val Trp Phe Cys Asn Arg Arg Gln Lys Glu Lys Arg Met
325 330 335
Thr Pro Pro Gly Asp Gln Gln Pro His Glu Val Tyr Ser His Thr Val
340 345 350
Lys Thr Asp Thr Ser Cys His Asp Leu
355 360
<210>3
<211>1086
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>mutation
<222>(950)..(950)
<223>突变的POU3F4基因925t突变为c
<400>3
atggccacag ctgcctcgaa tccctacagc attctcagtt ccacctccct agtccatgcg 60
gactctgcgg gcatgcagca ggggagtcct ttccgcaacc ctcagaaact tctccaaagt 120
gattacttgc agggagttcc cagcaatggg catcccctcg ggcatcactg ggtgaccagt 180
051P10~1
ctgagcgacg ggggcccatg gtcctccaca ctggccacca gccccctgga ccagcaggac 240
gtgaagcccg ggcgcgaaga cctgcaactg ggtgcgatca tccatcaccg ctcgccacac 300
gtagcccacc actcaccgca cactaaccac cccaacgcct ggggggccag cccggcaccg 360
aacccgtcta tcacgtcaag cggccaaccc ctcaacgtgt actcgcagcc tggcttcacc 420
gtgagcggca tgctggaaca cgggggactc accccacctc cagctgccgc ctctgcacag 480
agcctgcacc cggtgctccg agagcccccg gatcacggcg aactgggctc gcaccattgc 540
caggatcact ccgacgagga gacgccaacc tctgatgagt tggaacagtt cgccaaacaa 600
ttcaaacaaa gaagaatcaa gttgggcttc acgcaggccg acgtggggtt ggcgctgggc 660
acactgtatg gtaacgtgtt ctcgcagacc accatctgca ggttcgaagg cttgcagctg 720
agcttcaaaa atatgtgcaa gctgaagccc ctgctgaaca agtggctgga ggaggcggat 780
tcgtccacag ggagcccgac cagcattgac aagatcgctg cacagggccg caagcgcaag 840
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gatcagcagc cgcatgaggt ttattcgcac accgtgaaaa cagacacatc ttgccatgat 1080
ctctga 1086
<210>4
<211>361
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>VARIANT
<222>(309)..(309)
<223>Ser突变为Pro
<400>4
Met Ala Thr Ala Ala Ser Asn Pro Tyr Ser Ile Leu Ser Ser Thr Ser
1 5 10 15
Leu Val His Ala Asp Ser Ala Gly Met Gln Gln Gly Ser Pro Phe Arg
20 25 30
Asn Pro Gln Lys Leu Leu Gln Ser Asp Tyr Leu Gln Gly Val Pro Ser
35 40 45
Asn Gly His Pro Leu Gly His His Trp Val Thr Ser Leu Ser Asp Gly
50 55 60
Gly Pro Trp Ser Ser Thr Leu Ala Thr Ser Pro Leu Asp Gln Gln Asp
65 70 75 80
051P10~1
Val Lys Pro Gly Arg Glu Asp Leu Gln Leu Gly Ala Ile Ile His His
85 90 95
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100 105 110
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130 135 140
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165 170 175
Ser His His Cys Gln Asp His Ser Asp Glu Glu Thr Pro Thr Ser Asp
180 185 190
Glu Leu Glu Gln Phe Ala Lys Gln Phe Lys Gln Arg Arg Ile Lys Leu
195 200 205
Gly Phe Thr Gln Ala Asp Val Gly Leu Ala Leu Gly Thr Leu Tyr Gly
210 215 220
Asn Val Phe Ser Gln Thr Thr Ile Cys Arg Phe Glu Gly Leu Gln Leu
225 230 235 240
Ser Phe Lys Asn Met Cys Lys Leu Lys Pro Leu Leu Asn Lys Trp Leu
245 250 255
Glu Glu Ala Asp Ser Ser Thr Gly Ser Pro Thr Ser Ile Asp Lys Ile
260 265 270
Ala Ala Gln Gly Arg Lys Arg Lys Lys Arg Thr Ser Ile Glu Val Ser
275 280 285
Val Lys Gly Val Leu Glu Thr His Phe Leu Lys Cys Pro Lys Pro Ala
290 295 300
Ala Gln Glu Ile Pro Ser Leu Ala Asp Ser Leu Gln Leu Glu Lys Glu
305 310 315 320
Val Val Arg Val Trp Phe Cys Asn Arg Arg Gln Lys Glu Lys Arg Met
325 330 335
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340 345 350
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355 360
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<211>20
051P10~1
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>上游引物
<400>5
cattgacaag atcgctgcac 20
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(18)
<223>下游引物
<400>6
tggaggaagc gaggaggc 18
Claims (9)
1、一种检测方法,其特征在于,通过检测来源于待测个体的样本中是否存在POU3F4基因925T→C突变,而诊断该待测个体遗传性耳聋的发生和类型。
2、权利要求1所述的检测方法,其特征在于,包括下述步骤:
1)采集待测个体的血液、体液或组织样本,提取DNA;
2)以该DNA为模板,以针对POU3F4基因或POU3F4基因第925个碱基附近的编码区设计的PCR引物进行PCR扩增,得到PCR反应产物;
3)将得到的PCR反应产物进行直接测序分析,将所得到的序列与POU3F4正常基因的序列进行比较,确定是否存在POU3F4突变位点;
4)根据以上结果判断待测个体是否为POU3F4基因925T→C突变导致的遗传性耳聋。
3、权利要求2所述的检测方法,其特征在于所述检测方法进一步包括下述步骤:
5)按正常阅读框进行翻译以确定是否存在S309P氨基酸突变位点。
4、权利要求1所述的检测方法,其特征在于,包括下述步骤:
1)采集待测个体的血液、体液或组织样本,提取DNA;
2)以该DNA为模板,以针对POU3F4基因或POU3F4基因第925个碱基附近的编码区设计的PCR引物进行PCR反应,得到PCR反应产物;
3)将得到的PCR反应产物采用Bgl II限制性内切酶进行酶切反应,琼脂糖电泳检测,确定是否具有POU3F4突变位点;
4)根据以上结果判断待测个体是否为POU3F4基因925T→C突变导致的遗传性耳聋。
5、权利要求2或4所述的检测方法,其特征在于所述PCR引物序列为:
PU3-F:5’CATTGACAAGATCGCTGCAC 3’
PU3-R:5’TGGAGGAAGCGAGGAGGC 3’
6、一种用于检测POU3F4基因突变的试剂盒,包括:
用于扩增样本DNA中POU3F4基因或POU3F4基因第925位碱基附近编码区的PCR引物;以及下述一种或几种试剂的组合:
PCR反应试剂;
从待测样品中提取DNA的试剂;
对PCR扩增产物进行限制性内切酶酶切反应的试剂;
对PCR扩增产物进行测序所需的测序反应试剂。
7、权利要求1所述的检测方法在诊断人类遗传性耳聋疾病中的应用。
8、一种与人类X连锁遗传形式的先天性耳聋相关的突变基因,其特征在于所述突变基因为POU3F4基因925T→C突变,其具有如SEQ ID NO.3所示的序列。
9、权利要求8所述的突变基因在诊断和/或治疗人类遗传性耳聋疾病中的应用。
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