CN1570138A - 胆石症易感性检测方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诊断胆石症的方法，它包括检测个体的COXI基因、转录本和/或蛋白与正常相比是否存在变异，存在变异就表明该个体患胆石症的可能性大于正常人群。本发明还公开了检测胆石症的试剂盒。

Description

胆石症易感性检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地，本发明涉及利用细胞色素C氧化酶复合物亚基I(COXI)基因及其编码产物诊断和治疗胆石症的方法，以及含有COXI基因和/或蛋白的药物组合物。

背景技术

胆石症是一种常见的疾病，它是由于胆囊或胆总管的结石造成的。一般胆石症按胆石的成分分为三类：胆固醇结石，胆色素结石和混合结石。其中以胆固醇结石最为常见。患有胆石症的病人一般会出现上腹部有闷胀不适，恶心，常伴有消化不良的症状，用手深压上腹部时，有疼痛的感觉。中国人群中胆石症的发病率约为7％-10％，其中女性发病率比男性高2倍以上，以50岁以上老年人发病较普遍。

线粒体疾病是比较特殊的一类遗传疾病，它是由线粒体上基因发生突变而造成的遗传疾病。其特征是母系遗传，即只能由母亲遗传给孩子。由于线粒体基因全部是能量代谢相关的基因，在氧化磷酸化和糖，脂类的代谢中起着至关重要的作用，所以线粒体遗传病大多为与代谢相关的疾病，典型的如非胰岛素依赖型线粒体糖尿病，神经性肌无力等。某些退行性疾病也与线粒体DNA(mtDNA)的突变有关，如Alzeimer综合症、Parkinson综合症、Huntington舞蹈症，衰老等。线粒体疾病可以是由于线粒体基因的突变引起，也可以是由于线粒体所编码的tRNA或相对风险NA发生突变引起的。

迄今为止，本领域还缺乏诊断胆石症的有效方法以及非手术治疗胆石症的有效手段。因此，本领域迫切需要开发新的诊断和治疗胆石症的有效方法，以及相关的治疗药物，诊断技术和试剂。

发明内容

本发明的一个目的就是提供一种新的诊断(尤其是早期诊断)胆石症的方法及检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种新的治疗胆石症的方法。

本发明的再一目的是提供一种治疗胆石症的药物组合物。

在本发明的第一方面，提供了一种检测人细胞色素C氧化酶复合物亚基I基因的单核苷酸多态性的方法，它包括步骤：

(a)确定在人细胞色素C氧化酶复合物亚基I基因的SEQ ID NO：1所示序列的第6024，6217，或6414位的核苷酸；

(b)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性。

在另一优选例中，所述的单核苷酸多态性是在6024位存在A，在6217位存在C，和6414存在C。

在本发明的第二方面，提供了一种核酸引物对，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出含人细胞色素C氧化酶复合物亚基I基因的SEQ ID NO：1所示序列中第6024，6217，和/或6414位单核苷酸多态性的扩增产物。

还提供了一种核酸引物对，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出含人线粒体DNA的SEQ ID NO：1所示序列中第16137、16189和16219位单核苷酸多态性的扩增产物。

在本发明的第三方面，提供了一种等位基因特异性的寡核苷酸探针，其长度为15-500bp，且特异性地杂交并检测含人细胞色素C氧化酶复合物亚基I基因的SEQ ID NO：1所示序列中第6024，6217，和/或6414位单核苷酸多态性。

在本发明的第四方面，提供了一种检测胆石症的试剂盒，它包括特异性扩增COXI基因或转录本的引物；和/或特异性扩增线粒体DNA第一高变区的引物。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有与突变部位结合的探针。

在另一优选例中，所述的突变选自下组：

(a)SEQ ID NO：1中6024 G→A，6217 T→C，和6414 T→C；

(b)线粒体DNA第16137、16189和16219位变为C。

更佳地，所述的突变是同时发生SEQ ID NO：1中6024 G→A，6217 T→C，和6414 T→C的突变。

一种优选的试剂盒包括：

(1)特异性扩增人细胞色素C氧化酶复合物亚基I基因的引物对，

(2)检测扩增产物与正常的细胞色素C氧化酶复合物亚基I基因相比是否存在变化所需的试剂，所述的变化是SEQ ID NO：1所示序列中6024，6217，或6414位的单核苷酸多态性。

较佳地，所述的单核苷酸多态性是在6024位存在A，在6217位存在C，和6414存在C。

另一种优选的试剂盒包括：

(1)特异性扩增含人线粒体DNA的SEQ ID NO：1所示序列中第16137、16189和16219位的引物对，

(2)检测扩增产物是否存在变化所需的试剂，所述的变化是SEQ ID NO：1所示序列中第16137、16189和16219位的核苷酸突变为C。

在本发明的第五方面，提供了一种对个体的胆石症易感性进行诊断的方法，它包括步骤：

(a)检测该个体的COXI基因、转录本和/或蛋白，并与正常的COXI基因、转录本和/或蛋白相比较，

其中，存在差异就表明该个体患胆石症的可能性高于正常人群；或者

(b)检测该个体的SEQ ID NO：1所示线粒体DNA的序列以下位点的核苷酸：16137、16189和16219位；

其中，16137、16189和16219位点的核苷酸为C就表明该个体患胆石症的可能性高于正常人群。

在另一优选例中，在所述的方法中检测的是COXI的基因或转录本，并与正常COXI核苷酸序列比较差异。较佳地，所述的差异选自下组：SEQ ID NO：1中6024 G→A，6217 T→C，和6414 T→C。

在本发明的第六方面，提供了一种治疗胆石症的方法，包括步骤：给需要所述治疗的病人施用安全有效量的正常COXI蛋白。

在本发明第七方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的COXI蛋白以及药学上可接受的载体。

附图说明

图1显示了B4b1的系统演化关系。

具体实施方式

能源物质的氧化磷酸化为类固醇的合成的提供了前体物质NADPH和乙酰辅酶A，而类固醇的代谢产物也要通过氧化磷酸化途径完成彻底的代谢。线粒体基因通过控制氧化磷酸化过程直接或间接的控制着类固醇的代谢。因此，线粒体基因的异常可能会导致包括胆石症在内的许多与类固醇代谢类疾病。本发明人经过多年深入和广泛的研究，首次发现和证明了细胞色素C氧化酶复合物亚基I(COXI)与胆石症密切相关，细胞色素C氧化酶复合物亚基I的改变将直接导致胆石症。在此基础上完成了本发明。

细胞色素C氧化酶复合物亚基I基因(COXI)是参与氧化磷酸化的最后一步，即把电子传递给氧。整个COX复合物由八个亚基组成，其中的三个COXI，COXII和COXIII定位在线粒体上。本发明的研究首先证实，COXI的突变与胆石症密切相关。

如本文所用，术语“本发明蛋白”或“本发明多肽”指细胞色素C氧化酶复合物亚基I，即COXI。

如本文所用，术语“本发明基因”指细胞色素C氧化酶复合物亚基I基因，即COXI基因。COXI的基因序列示于SEQ ID NO：2，对应于SEQ ID NO：1中第5905-7446位。

基于本发明的发现，COXI蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗或辅助胆石症，和用于筛选促进COXI蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人COXI蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能刺激人COXI蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对人COXI DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人COXI基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人COXI蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。一类特别优选的抗体是对正常COXI蛋白和变异的COXI蛋白有不同结合力或结合特性抗体。

抗人COXI蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人COXI蛋白。利用特异性结合于正常COXI蛋白但不结合于变异的COXI蛋白的抗体，或者特异性结合于变异COXI蛋白但不结合于正常的COXI蛋白的抗体，可以快速检测和区分正常和异常的COXI蛋白。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与COXI蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

正常的COXI多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于胆石症方面的治疗。在使用本发明COXI蛋白时，还可同时使用其他治疗胆石症的药剂。

本发明COXI蛋白，当在治疗上进行施用(给药)时，可缓解或消除胆石症。通常，可将COXI蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、皮下、或局部给药。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明COXI蛋白以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如药膏、片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如药膏、针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。

使用药物组合物时，是将安全有效量的COXI蛋白施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明还涉及定量和定位检测人COXI蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。

一种检测样品中是否存在COXI蛋白的方法是利用COXI蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与COXI蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在COXI蛋白。

COXI蛋白的多聚核苷酸可用于COXI蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，COXI蛋白的多聚核苷酸可用于检测COXI蛋白的表达与否或在疾病状态下COXI蛋白的异常表达。

检测COXI基因的突变也可用于诊断COXI蛋白相关的疾病。COXI蛋白突变的形式包括与正常野生型COXI DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

本领域的技术人员知道，有大量的分析技术可用于检测犬尿氨酸水解酶基因中所述位点是否存在单核苷酸多态性。这些技术包括(但并不限于)：DNA测序、杂交测序；酶促错配切割、异源双链分析、点杂交、寡核苷酸阵列(DNA芯片)、Mini-sequencing、Taqman技术、分子信标等，变性高效液相色谱法(DHPLC)。

用于本发明的测试样品没有特别限制，对于检测SNP而言，可以是从血液、组织等样品中抽提出的线粒体DNA或RNA。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

在本发明中，关于COXI序列及其他一些有用信息，可在如下电子数据库信息中找到：

GenBank Overview，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genebank/GenbankOverview.html[NC_001807(gi：17981852)]，具体序列示于SEQ ID NO：1。其中第5905-7446为COX I基因(SEQ ID NO：2)，第16024-16383为第一高变区(SEQ IDNO：3)。

实施例1

COXI与胆石症的相关性

在本实施例中，从上海地区采集了101例胆石症患者血样，并与759个随机抽取的人群样本(上海地区535个，北京地区224个)进行对照，试图进行线粒体DNA与胆石症的相关分析。对照组的759个随机样本，并不知道他们是否是胆石症病人。

在本实施例中检测了细胞色素C氧化酶复合物亚基I基因(COXI)。这个基因参与氧化磷酸化的最后一步，即把电子传递给氧。整个COX复合物由八个亚基组成，其中的三个COXI，COXII和COXIII定位在线粒体上。

通过常规PCR反应扩增和377测序仪测序，在COXI的编码区发现了3个频率比较高的单核苷酸多态(SNP)：6024 G→A，6217 T→C和6414 T→C(见SEQID NO：1)。这3个SNP在胆石症患者中的频率明显高于对照人群。在胆石症病人中频率分别为：6024 A：5/101；6217 C：4/101；6414 C：6/101。而在对照人群中6024 A：8/759；6217 C：7/759；6414 C：7/759(表1)。

经Fisher’s精确检验，两者具有显著性差异(6024 G→A，p＜0.01；6217 T→C，p＜0.05；6414 T→C，p＜0.01。

此外，还发现胆石症病人组中，这三种SNP集中出现在了六个人身上，即拥有6414C的六个人中，五人同时拥有6024A，四人同时拥有6217C。在对照组中情况相似，有六个人同时拥有6024A，6217C和6414C。从而，这三个位点组成了一个单倍型(A-C-C)，在胆石症病人和对照组中的频率分别为5.9％(6/101)和0.8％(6/759)，两组间存在显著性差异(p＜0.01)。

COXI的这三个突变及其组成的单倍型具有明显的地区特异性，759个对照样本中，224个北京所采集的样本没有一个拥有这三种SNP，所有对照样本中的三种SNP和六个COXI A-C-C单倍型都来自上海地区的样本。由于胆石症病人样本都取自上海，我们针对上海地区的对照样本重新计算的结果表明两者之间仍然具有显著性差异(6024 G→A，p＜0.05；6414 T→C，p＜0.01)。

        表1B4b1单倍群和COXI基因突变的频率

        个体数     单倍群        COXI基因突变

                   B4b1     6024A    6217C    6414C

病人    101        8        5        4        6

对照    759                 8**      7*       7**

北京    224                 0**      0**      0**

上海    535        12**     8*       7        7**

Fisher’s精确测验*P＜0.05，**P＜0.01

实施例2

B4b1单倍群和COXI基因突变的相关性

从进化的角度看，任何一个致病的突变都是在一定的遗传背景下产生。如果在人类进化过程中某一女性的mtDNA发生了突变，增加了患某些疾病的可能性，在不影响生殖能力的情况下，这一突变将有可能流传到现代，导致携带该类型mtDNA的个体都具有该疾病的高度易感性。mtDNA在传代过程中不发生重组，因此相对容易追溯某一特定线粒体疾病患者共同祖先的mtDNA序列组合状态。但是由于mtDNA的全序列比较长(16K)，对所有的病人都进行全序列分析将消耗大量的人力和财力。目前一般的做法是对mtDNA的高变区进行测定，通过高变区与致病突变的共同遗传来搜索可能的致病突变和祖先mtDNA的状态。

基于这一策略，在本实施例中，对所有病人以及上海地区的对照样本进行了第一高变区(HVS1)的测序分析。

结果列于表2。数据表明，所有具有以上三个COXI突变的病人均属于一个东亚地区特殊的单倍群(Haplogroup，在进化谱系上相近的一组单倍型)B4b1，其特征是同时具有16137C-16189C-16219C三个高变区位点的突变(SEQ ID NO：1)。这一单倍群在胆石症患者中比例与对照样本相比，具有较显著差异(病人8/101，对照12/535，p＜0.01)。

        表2在B4b1单倍群中COXI基因和HVS1的多态

样本           COXI基因多态          HVS1多态(Minus 16000)

           6024     6217     6414

病人

P13        A        C        C        137C-189C-219C-225C

P20        G        C        C        137C-189C-219C-225C

P46        A        T        C        137C-189C-219C-225C-262T

P79        A        C        C        137C-189C-219C-225C

P92        A        C        C        137C-189C-219C-225C

P93        A        T        C        137C-189C-219C-225C-262T

P74        G        T        T        137C-189C-219C-225C-357T

P83        G        T        T        137C-189C-219C-225C

对照

C01        G        T        T        137C-189C-219C-272T-300C

C02        G        T        T        137C-155C-189C-219C-220T

C03        A        C        C        137C-189C-199T-216T-219C

C04        A        C        C        137C-189C-219C

C05        G        T        T        137C-219C-220T

C06        A        C        C        137C-189C-219C

C07        G        T        T        137C-189C-219C-220T

C08        G        T        T        137C-189C-219C-220T

C09        A        C        C        137C-189C-219C

C10        A        C        C        137C-189C-219C-262T

C11        A        C        C        137C-189C-219C-262T-263T

C12        G        T        T        137C-189C-219C-220T

实施例3

B4b1 mtDNA之间的系统演化关系

为了近一步阐明B4b1 mtDNA之间的系统演化关系，对实施例1获得的测序结果，利用NETWORK软件(Fluxus Technology Ltd.)构建了Median-joining网络图。

结果表明，B4b1可以再分为2支，B4b1a和B4b1b，8个具有B4b1单倍群的病人全部落在B4b1a(如图1)。

实施例4

B4b1单倍群与正常人群患胆石症的相对风险比较

对病人和对照的比较分析表明B4b1和B4b1a的相对风险(Relative risk，相对风险)分别为3.807(x²＝8.910，P＜0.01)和7.405(x²＝15.043，P＜0.001)，即具有B4b1和B4b1a线粒体类型的人群患胆石症的可能性是不具有该类型线粒体人群的3.8倍和7.4倍。

由于本发明人并不清楚对照组是否患有胆石症，所以以上的相对风险的计算是过低估计。本发明人对带有B4b1线粒体的对照进行了电话回访，由于联系方式的限制，只能成功的回访到3个对照个体，其中的一位本身就是胆石症患者，其他的2位具有家族史(C11的2个兄弟和C12的母亲和外婆患有胆石症)。把这3例对照个体放入病人组重新计算的结果显示B4b1的相对风险为6.778(x²＝18.695，P＜0.0001)，B4b1a为13.049(x²＝21.754，P＜0.00001)。提示携带B4b1和B4b1a线粒体的人群患胆石症的可能性分别是其他人群的6.8倍和13倍。

值得注意的是这仍然是过低估计，因为其他具有B4b1的对照还没有回访到。就是说如果本发明人可以知道这些对照的情况，其中还有胆石症患者的话，携带B4b1和B4b1a线粒体的人群患胆结石的可能性将进一步增大。

此外，为了进一步验证胆石症可能的母系遗传特征，本发明人对8个B4b1的胆石症患者进行了家系调查，传递连锁不平衡检验(TransmissionDisequilibrium Test，TDT)。结果表明胆石症在这些家系中的传递具有非常明显的母系遗传偏向(p＝0.0017)，即胆石症在这些家系中大部分在母亲与子女之间传代。

综上所述，中国人中携带B4b1线粒体单倍群的群体患胆石症的危险度有非常明显增高，为胆石症高危人群。通过对HVS1区和COXI基因单倍型的检测，本发明人可以对具有B4b1单倍型的个体及其相关家属提出胆石症的预警，通过注意饮食调理或者医学手段，降低其发病的可能。并且这一发现为最终查清胆石症发生的遗传原因以及发病机理提供了线索和可以进一步研究的方向。线粒体B4b1单倍群(特征为16137C-16189C-16219C突变)可作为胆石症患病危险度的一个有效的预警指标。

实施例5

胆石症易感性的检测试剂盒

如实施例1-4所述，SEQ ID NO：1中6024 G→A，6217 T→C，和6414 T→C的突变以及线粒体DNA第16137、16189和16219位变为C，与胆石症密切相关。因此，可基于这些突变设计引物在以病人的mtDNA为模板进行扩增进行检测，例如SEQ ID NO：4和5，以及SEQ ID NO：6和7。

	序列(5’-3’)	SEQ ID NO：
			引物对1	ATCACCTCGGAGCTGGTAAA	4
	GCAGCTAGGACTGGGAGAGA	5
			引物对2	TCCACCATTAGCACCCAAAG	6
	AGGAACCAGATGTCGGATACAG	7

在一对引物所扩增出的片段中有三个位点，可对扩增产物直接用测序检测。

制备一检测SEQ ID NO：1中6024 G→A，6217 T→C，和6414 T→C的突变试剂盒(100人次)，它含有：

名称                  编号                 数量

正向引物              SEQ ID NO：3         100pmol

反向引物              SEQ ID NO：4         100pmol

PCR缓冲液                                  若干

此外，还制备一检测线粒体DNA第16137、16189和16219位变为C的试剂盒(100人次)，它含有以下组份：

名称                  编号                 数量

正向引物              SEQ ID NO：6         100pmol

反向引物              SEQ ID NO：7         100pmol

PCR缓冲液                                  若干

使用试剂盒时，可以通过扩增产物的有无、与特异性探针的杂交与否，以及对扩增产物的测序等方法，来确定是否存在本发明所述的与胆石症相关的突变。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                        序列表

<110>国家人类基因组南方研究中心

     复旦大学

     上海第二医科大学附属瑞金医院

<120>胆石症易感性检测方法和试剂盒

<130>032850

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>16571

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

gatcacaggt ctatcaccct attaaccact cacgggagct ctccatgcat ttggtatttt    60

cgtctggggg gtgtgcacgc gatagcattg cgagacgctg gagccggagc accctatgtc   120

gcagtatctg tctttgattc ctgcctcatt ctattattta tcgcacctac gttcaatatt   180

acaggcgaac atacctacta aagtgtgtta attaattaat gcttgtagga cataataata   240

acaattgaat gtctgcacag ccgctttcca cacagacatc ataacaaaaa atttccacca   300

aacccccccc tccccccgct tctggccaca gcacttaaac acatctctgc caaaccccaa   360

aaacaaagaa ccctaacacc agcctaacca gatttcaaat tttatcttta ggcggtatgc   420

acttttaaca gtcacccccc aactaacaca ttattttccc ctcccactcc catactacta   480

atctcatcaa tacaaccccc gcccatccta cccagcacac acacaccgct gctaacccca   540

taccccgaac caaccaaacc ccaaagacac cccccacagt ttatgtagct tacctcctca   600

aagcaataca ctgaaaatgt ttagacgggc tcacatcacc ccataaacaa ataggtttgg   660

tcctagcctt tctattagct cttagtaaga ttacacatgc aagcatcccc gttccagtga   720

gttcaccctc taaatcacca cgatcaaaag ggacaagcat caagcacgca gcaatgcagc   780

tcaaaacgct tagcctagcc acacccccac gggaaacagc agtgattaac ctttagcaat   840

aaacgaaagt ttaactaagc tatactaacc ccagggttgg tcaatttcgt gccagccacc   900

gcggtcacac gattaaccca agtcaataga agccggcgta aagagtgttt tagatcaccc   960

cctccccaat aaagctaaaa ctcacctgag ttgtaaaaaa ctccagttga cacaaaatag  1020

actacgaaag tggctttaac atatctgaac acacaatagc taagacccaa actgggatta  1080

gataccccac tatgcttagc cctaaacctc aacagttaaa tcaacaaaac tgctcgccag  1140

aacactacga gccacagctt aaaactcaaa ggacctggcg gtgcttcata tccctctaga  1200

ggagcctgtt ctgtaatcga taaaccccga tcaacctcac cacctcttgc tcagcctata  1260

taccgccatc ttcagcaaac cctgatgaag gctacaaagt aagcgcaagt acccacgtaa  1320

agacgttagg tcaaggtgta gcccatgagg tggcaagaaa tgggctacat tttctacccc  1380

agaaaactac gatagccctt atgaaactta agggtcgaag gtggatttag cagtaaactg  1440

agagtagagt gcttagttga acagggccct gaagcgcgta cacaccgccc gtcaccctcc  1500

tcaagtatac ttcaaaggac atttaactaa aacccctacg catttatata gaggagacaa  1560

gtcgtaacat ggtaagtgta ctggaaagtg cacttggacg aaccagagtg tagcttaaca  1620

caaagcaccc aacttacact taggagattt caacttaact tgaccgctct gagctaaacc  1680

tagccccaaa cccactccac cttactacca gacaacctta gccaaaccat ttacccaaat  1740

aaagtatagg cgatagaaat tgaaacctgg cgcaatagat atagtaccgc aagggaaaga  1800

tgaaaaatta taaccaagca taatatagca aggactaacc cctatacctt ctgcataatg  1860

aattaactag aaataacttt gcaaggagag ccaaagctaa gacccccgaa accagacgag  1920

ctacctaaga acagctaaaa gagcacaccc gtctatgtag caaaatagtg ggaagattta  1980

taggtagagg cgacaaacct accgagcctg gtgatagctg gttgtccaag atagaatctt  2040

agttcaactt taaatttgcc cacagaaccc tctaaatccc cttgtaaatt taactgttag    2100

tccaaagagg aacagctctt tggacactag gaaaaaacct tgtagagaga gtaaaaaatt    2160

taacacccat agtaggccta aaagcagcca ccaattaaga aagcgttcaa gctcaacacc    2220

cactacctaa aaaatcccaa acatataact gaactcctca cacccaattg gaccaatcta    2280

tcaccctata gaagaactaa tgttagtata agtaacatga aaacattctc ctccgcataa    2340

gcctgcgtca gatcaaaaca ctgaactgac aattaacagc ccaatatcta caatcaacca    2400

acaagtcatt attaccctca ctgtcaaccc aacacaggca tgctcataag gaaaggttaa    2460

aaaaagtaaa aggaactcgg caaaccttac cccgcctgtt taccaaaaac atcacctcta    2520

gcatcaccag tattagaggc accgcctgcc cagtgacaca tgtttaacgg ccgcggtacc    2580

ctaaccgtgc aaaggtagca taatcacttg ttccttaaat agggacctgt atgaatggct    2640

ccacgagggt tcagctgtct cttactttta accagtgaaa ttgacctgcc cgtgaagagg    2700

cgggcatgac acagcaagac gagaagaccc tatggagctt taatttatta atgcaaacag    2760

tacctaacaa acccacaggt cctaaactac caaacctgca ttaaaaattt cggttggggc    2820

gacctcggag cagaacccaa cctccgagca gtacatgcta agacttcacc agtcaaagcg    2880

aactactata ctcaattgat ccaataactt gaccaacgga acaagttacc ctagggataa    2940

cagcgcaatc ctattctaga gtccatatca acaatagggt ttacgacctc gatgttggat    3000

caggacatcc cgatggtgca gccgctatta aaggttcgtt tgttcaacga ttaaagtcct    3060

acgtgatctg agttcagacc ggagtaatcc aggtcggttt ctatctactt caaattcctc    3120

cctgtacgaa aggacaagag aaataaggcc tacttcacaa agcgccttcc cccgtaaatg    3180

atatcatctc aacttagtat tatacccaca cccacccaag aacagggttt gttaagatgg    3240

cagagcccgg taatcgcata aaacttaaaa ctttacagtc agaggttcaa ttcctcttct    3300

taacaacata cccatggcca acctcctact cctcattgta cccattctaa tcgcaatggc    3360

attcctaatg cttaccgaac gaaaaattct aggctatata caactacgca aaggccccaa    3420

cgttgtaggc ccctacgggc tactacaacc cttcgctgac gccataaaac tcttcaccaa    3480

agagccccta aaacccgcca catctaccat caccctctac atcaccgccc cgaccttagc    3540

tctcaccatc gctcttctac tatgaacccc cctccccata cccaaccccc tggtcaacct    3600

caacctaggc ctcctattta ttctagccac ctctagccta gccgtttact caatcctctg    3660

atcagggtga gcatcaaact caaactacgc cctgatcggc gcactgcgag cagtagccca    3720

aacaatctca tatgaagtca ccctagccat cattctacta tcaacattac taataagtgg    3780

ctcctttaac ctctccaccc ttatcacaac acaagaacac ctctgattac tcctgccatc    3840

atgacccttg gccataatat gatttatctc cacactagca gagaccaacc gaaccccctt    3900

cgaccttgcc gaaggggagt ccgaactagt ctcaggcttc aacatcgaat acgccgcagg    3960

ccccttcgcc ctattcttca tagccgaata cacaaacatt attataataa acaccctcac    4020

cactacaatc ttcctaggaa caacatatga cgcactctcc cctgaactct acacaacata    4080

ttttgtcacc aagaccctac ttctaacctc cctgttctta tgaattcgaa cagcataccc    4140

ccgattccgc tacgaccaac tcatacacct cctatgaaaa aacttcctac cactcaccct    4200

agcattactt atatgatatg tctccatacc cattacaatc tccagcattc cccctcaaac    4260

ctaagaaata tgtctgataa aagagttact ttgatagagt aaataatagg agcttaaacc    4320

cccttatttc taggactatg agaatcgaac ccatccctga gaatccaaaa ttctccgtgc    4380

cacctatcac accccatcct aaagtaaggt cagctaaata agctatcggg cccatacccc    4440

gaaaatgttg gttataccct tcccgtacta attaatcccc tggcccaacc cgtcatctac    4500

tctaccatct ttgcaggcac actcatcaca gcgctaagct cgcactgatt ttttacctga    4560

gtaggcctag aaataaacat gctagctttt attccagttc taaccaaaaa aataaaccct    4620

cgttccacag aagctgccat caagtatttc ctcacgcaag caaccgcatc cataatcctt    4680

ctaatagcta tcctcttcaa caatatactc tccggacaat gaaccataac caatactacc    4740

aatcaatact catcattaat aatcataatg gctatagcaa taaaactagg aatagccccc    4800

tttcacttct gagtcccaga ggttacccaa ggcacccctc tgacatccgg cctgcttctt    4860

ctcacatgac aaaaactagc ccccatctca atcatatacc aaatctctcc ctcactaaac    4920

gtaagccttc tcctcactct ctcaatctta tccatcatag caggcagttg aggtggatta    4980

aaccaaaccc agctacgcaa aatcttagca tactcctcaa ttacccacat aggatgaata    5040

atagcagttc taccgtacaa ccctaacata accattctta atttaactat ttatattatc    5100

ctaactacta ccgcattcct actactcaac ttaaactcca gcaccacgac cctactacta    5160

tctcgcacct gaaacaagct aacatgacta acacccttaa ttccatccac cctcctctcc    5220

ctaggaggcc tgcccccgct aaccggcttt ttgcccaaat gggccattat cgaagaattc    5280

acaaaaaaca atagcctcat catccccacc atcatagcca ccatcaccct ccttaacctc    5340

tacttctacc tacgcctaat ctactccacc tcaatcacac tactccccat atctaacaac    5400

gtaaaaataa aatgacagtt tgaacataca aaacccaccc cattcctccc cacactcatc    5460

gcccttacca cgctactcct acctatctcc ccttttatac taataatctt atagaaattt    5520

aggttaaata cagaccaaga gccttcaaag ccctcagtaa gttgcaatac ttaatttctg    5580

caacagctaa ggactgcaaa accccactct gcatcaactg aacgcaaatc agccacttta    5640

attaagctaa gcccttacta gaccaatggg acttaaaccc acaaacactt agttaacagc    5700

taagcaccct aatcaactgg cttcaatcta cttctcccgc cgccgggaaa aaaggcggga    5760

gaagccccgg caggtttgaa gctgcttctt cgaatttgca attcaatatg aaaatcacct    5820

cggagctggt aaaaagaggc ctaacccctg tctttagatt tacagtccaa tgcttcactc    5880

agccatttta cctcaccccc actgatgttc gccgaccgtt gactattctc tacaaaccac    5940

aaagacattg gaacactata cctattattc ggcgcatgag ctggagtcct aggcacagct    6000

ctaagcctcc ttattcgagc cgagctgggc cagccaggca accttctagg taacgaccac    6060

atctacaacg ttatcgtcac agcccatgca tttgtaataa tcttcttcat agtaataccc    6120

atcataatcg gaggctttgg caactgacta gttcccctaa taatcggtgc ccccgatatg    6180

gcgtttcccc gcataaacaa cataagcttc tgactcttac ctccctctct cctactcctg    6240

ctcgcatctg ctatagtgga ggccggagca ggaacaggtt gaacagtcta ccctccctta    6300

gcagggaact actcccaccc tggagcctcc gtagacctaa ccatcttctc cttacaccta    6360

gcaggtgtct cctctatctt aggggccatc aatttcatca caacaattat caatataaaa    6420

ccccctgcca taacccaata ccaaacgccc ctcttcgtct gatccgtcct aatcacagca    6480

gtcctacttc tcctatctct cccagtccta gctgctggca tcactatact actaacagac    6540

cgcaacctca acaccacctt cttcgacccc gccggaggag gagaccccat tctataccaa    6600

cacctattct gatttttcgg tcaccctgaa gtttatattc ttatcctacc aggcttcgga    6660

ataatctccc atattgtaac ttactactcc ggaaaaaaag aaccatttgg atacataggt    6720

atggtctgag ctatgatatc aattggcttc ctagggttta tcgtgtgagc acaccatata    6780

tttacagtag gaatagacgt agacacacga gcatatttca cctccgctac cataatcatc    6840

gctatcccca ccggcgtcaa agtatttagc tgactcgcca cactccacgg aagcaatatg    6900

aaatgatctg ctgcagtgct ctgagcccta ggattcatct ttcttttcac cgtaggtggc    6960

ctgactggca ttgtattagc aaactcatca ctagacatcg tactacacga cacgtactac    7020

gttgtagctc acttccacta tgtcctatca ataggagctg tatttgccat cataggaggc    7080

ttcattcact gatttcccct attctcaggc tacaccctag accaaaccta cgccaaaatc    7140

catttcacta tcatattcat cggcgtaaat ctaactttct tcccacaaca ctttctcggc    7200

ctatccggaa tgccccgacg ttactcggac taccccgatg catacaccac atgaaacatc    7260

ctatcatctg taggctcatt catttctcta acagcagtaa tattaataat tttcatgatt    7320

tgagaagcct tcgcttcgaa gcgaaaagtc ctaatagtag aagaaccctc cataaacctg    7380

gagtgactat atggatgccc cccaccctac cacacattcg aagaacccgt atacataaaa    7440

tctagacaaa aaaggaagga atcgaacccc ccaaagctgg tttcaagcca accccatggc    7500

ctccatgact ttttcaaaaa ggtattagaa aaaccatttc ataactttgt caaagttaaa    7560

ttataggcta aatcctatat atcttaatgg cacatgcagc gcaagtaggt ctacaagacg    7620

ctacttcccc tatcatagaa gagcttatca cctttcatga tcacgccctc ataatcattt    7680

tccttatctg cttcctagtc ctgtatgccc ttttcctaac actcacaaca aaactaacta    7740

atactaacat ctcagacgct caggaaatag aaaccgtctg aactatcctg cccgccatca    7800

tcctagtcct catcgccctc ccatccctac gcatccttta cataacagac gaggtcaacg    7860

atccctccct taccatcaaa tcaattggcc accaatggta ctgaacctac gagtacaccg    7920

actacggcgg actaatcttc aactcctaca tacttccccc attattccta gaaccaggcg    7980

acctgcgact ccttgacgtt gacaatcgag tagtactccc gattgaagcc cccattcgta    8040

taataattac atcacaagac gtcttgcact catgagctgt ccccacatta ggcttaaaaa    8100

cagatgcaat tcccggacgt ctaaaccaaa ccactttcac cgctacacga ccgggggtat    8160

actacggtca atgctctgaa atctgtggag caaaccacag tttcatgccc atcgtcctag    8220

aattaattcc cctaaaaatc tttgaaatag ggcccgtatt taccctatag caccccctct    8280

accccctcta gagcccactg taaagctaac ttagcattaa ccttttaagt taaagattaa    8340

gagaaccaac acctctttac agtgaaatgc cccaactaaa tactaccgta tggcccacca    8400

taattacccc catactcctt acactattcc tcatcaccca actaaaaata ttaaacacaa    8460

actaccacct acctccctca ccaaagccca taaaaataaa aaattataac aaaccctgag    8520

aaccaaaatg aacgaaaatc tgttcgcttc attcattgcc cccacaatcc taggcctacc    8580

cgccgcagta ctgatcattc tatttccccc tctattgatc cccacctcca aatatctcat    8640

caacaaccga ctaatcacca cccaacaatg actaatcaaa ctaacctcaa aacaaatgat    8700

agccatacac aacactaaag gacgaacctg atctcttata ctagtatcct taatcatttt    8760

tattgccaca actaacctcc tcggactcct gcctcactca tttacaccaa ccacccaact    8820

atctataaac ctagccatgg ccatcccctt atgagcgggc gcagtgatta taggctttcg    8880

ctctaagatt aaaaatgccc tagcccactt cttaccacaa ggcacaccta caccccttat    8940

ccccatacta gttattatcg aaaccatcag cctactcatt caaccaatag ccctggccgt    9000

acgcctaacc gctaacatta ctgcaggcca cctactcatg cacctaattg gaagcgccac   9060

cctagcaata tcaaccatta accttccctc tacacttatc atcttcacaa ttctaattct   9120

actgactatc ctagaaatcg ctgtcgcctt aatccaagcc tacgttttca cacttctagt   9180

aagcctctac ctgcacgaca acacataatg acccaccaat cacatgccta tcatatagta   9240

aaacccagcc catgacccct aacaggggcc ctctcagccc tcctaatgac ctccggccta   9300

gccatgtgat ttcacttcca ctccataacg ctcctcatac taggcctact aaccaacaca   9360

ctaaccatat accaatggtg gcgcgatgta acacgagaaa gcacatacca aggccaccac   9420

acaccacctg tccaaaaagg ccttcgatac gggataatcc tatttattac ctcagaagtt   9480

tttttcttcg caggattttt ctgagccttt taccactcca gcctagcccc taccccccaa   9540

ctaggagggc actggccccc aacaggcatc accccgctaa atcccctaga agtcccactc   9600

ctaaacacat ccgtattact cgcatcagga gtatcaatca cctgagctca ccatagtcta   9660

atagaaaaca accgaaacca aataattcaa gcactgctta ttacaatttt actgggtctc   9720

tattttaccc tcctacaagc ctcagagtac ttcgagtctc ccttcaccat ttccgacggc   9780

atctacggct caacattttt tgtagccaca ggcttccacg gacttcacgt cattattggc   9840

tcaactttcc tcactatctg cttcatccgc caactaatat ttcactttac atccaaacat   9900

cactttggct tcgaagccgc cgcctgatac tggcattttg tagatgtggt ttgactattt   9960

ctgtatgtct ccatctattg atgagggtct tactctttta gtataaatag taccgttaac  10020

ttccaattaa ctagttttga caacattcaa aaaagagtaa taaacttcgc cttaatttta  10080

ataatcaaca ccctcctagc cttactacta ataattatta cattttgact accacaactc  10140

aacggctaca tagaaaaatc caccccttac gagtgcggct tcgaccctat atcccccgcc  10200

cgcgtccctt tctccataaa attcttctta gtagctatta ccttcttatt atttgatcta  10260

gaaattgccc tccttttacc cctaccatga gccctacaaa caactaacct gccactaata  10320

gttatgtcat ccctcttatt aatcatcatc ctagccctaa gtctggccta tgagtgacta  10380

caaaaaggat tagactgagc cgaattggta tatagtttaa acaaaacgaa tgatttcgac  10440

tcattaaatt atgataatca tatttaccaa atgcccctca tttacataaa tattatacta  10500

gcatttacca tctcacttct aggaatacta gtatatcgct cacacctcat atcctcccta  10560

ctatgcctag aaggaataat actatcgctg ttcattatag ctactctcat aaccctcaac  10620

acccactccc tcttagccaa tattgtgcct attgccatac tagtctttgc cgcctgcgaa  10680

gcagcggtgg gcctagccct actagtctca atctccaaca catatggcct agactacgta  10740

cataacctaa acctactcca atgctaaaac taatcgtccc aacaattata ttactaccac  10800

tgacatgact ttccaaaaag cacataattt gaatcaacac aaccacccac agcctaatta  10860

ttagcatcat ccccctacta ttttttaacc aaatcaacaa caacctattt agctgttccc  10920

caaccttttc ctccgacccc ctaacaaccc ccctcctaat actaactacc tgactcctac  10980

ccctcacaat catggcaagc caacgccact tatccagcga accactatca cgaaaaaaac  11040

tctacctctc tatactaatc tccctacaaa tctccttaat tataacattc acagccacag  11100

aactaatcat attttatatc ttcttcgaaa ccacacttat ccccaccttg gctatcatca  11160

cccgatgagg caaccagcca gaacgcctga acgcaggcac atacttccta ttctacaccc  11220

tagtaggctc ccttccccta ctcatcgcac taatttacac tcacaacacc ctaggctcac  11280

taaacattct actactcact ctcactgccc aagaactatc aaactcctga gccaacaact  11340

taatatgact agcttacaca atagctttta tagtaaagat acctctttac ggactccact  11400

tatgactccc taaagcccat gtcgaagccc ccatcgctgg gtcaatagta cttgccgcag  11460

tactcttaaa actaggcggc tatggtataa tacgcctcac actcattctc aaccccctga  11520

caaaacacat agcctacccc ttccttgtac tatccctatg aggcataatt ataacaagct  11580

ccatctgcct acgacaaaca gacctaaaat cgctcattgc atactcttca atcagccaca  11640

tagccctcgt agtaacagcc attctcatcc aaaccccctg aagcttcacc ggcgcagtca  11700

ttctcataat cgcccacgga ctcacatcct cattactatt ctgcctagca aactcaaact  11760

acgaacgcac tcacagtcgc atcataatcc tctctcaagg acttcaaact ctactcccac  11820

taatagcttt ttgatgactt ctagcaagcc tcgctaacct cgccttaccc cccactatta  11880

acctactggg agaactctct gtgctagtaa ccacgttctc ctgatcaaat atcactctcc  11940

tacttacagg actcaacata ctagtcacag ccctatactc cctctacata tttaccacaa  12000

cacaatgggg ctcactcacc caccacatta acaacataaa accctcattc acacgagaaa  12060

acaccctcat gttcatacac ctatccccca ttctcctcct atccctcaac cccgacatca  12120

ttaccgggtt ttcctcttgt aaatatagtt taaccaaaac atcagattgt gaatctgaca  12180

acagaggctt acgacccctt atttaccgag aaagctcaca agaactgcta actcatgccc  12240

ccatgtctaa caacatggct ttctcaactt ttaaaggata acagctatcc attggtctta  12300

ggccccaaaa attttggtgc aactccaaat aaaagtaata accatgcaca ctactataac  12360

caccctaacc ctgacttccc taattccccc catccttacc accctcgtta accctaacaa  12420

aaaaaactca tacccccatt atgtaaaatc cattgtcgca tccaccttta ttatcagtct  12480

cttccccaca acaatattca tgtgcctaga ccaagaagtt attatctcga actgacactg  12540

agccacaacc caaacaaccc agctctccct aagcttcaaa ctagactact tctccataat  12600

attcatccct gtagcattgt tcgttacatg gtccatcata gaattctcac tgtgatatat  12660

aaactcagac ccaaacatta atcagttctt caaatatcta ctcattttcc taattaccat  12720

actaatctta gttaccgcta acaacctatt ccaactgttc atcggctgag agggcgtagg  12780

aattatatcc ttcttgctca tcagttgatg atacgcccga gcagatgcca acacagcagc  12840

cattcaagca gtcctataca accgtatcgg cgatatcggt ttcatcctcg ccttagcatg  12900

atttatccta cactccaact catgagaccc acaacaaata gcccttctaa acgctaatcc  12960

aagcctcacc ccactactag gcctcctcct agcagcagca ggcaaatcag cccaattagg  13020

tctccacccc tgactcccct cagccataga aggccccacc ccagtctcag ccctactcca  13080

ctcaagcact atagttgtag caggaatctt cttactcatc cgcttccacc ccctagcaga  13140

aaatagccca ctaatccaaa ctctaacact atgcttaggc gctatcacca ctctgttcgc  13200

agcagtctgc gcccttacac aaaatgacat caaaaaaatc gtagccttct ccacttcaag  13260

tcaactagga ctcataatag ttacaatcgg catcaaccaa ccacacctag cattcctgca  13320

catctgtacc cacgccttct tcaaagccat actatttatg tgctccgggt ccatcatcca  13380

caaccttaac aatgaacaag atattcgaaa aataggagga ctactcaaaa ccatacctct  13440

cacttcaacc tccctcacca ttggcagcct agcattagca ggaatacctt tcctcacagg  13500

tttctactcc aaagaccaca tcatcgaaac cgcaaacata tcatacacaa acgcctgagc  13560

cctatctatt actctcatcg ctacctccct gacaagcgcc tatagcactc gaataattct  13620

tctcacccta acaggtcaac ctcgcttccc cacccttact aacattaacg aaaataaccc  13680

caccctacta aaccccatta aacgcctggc agccggaagc ctattcgcag gatttctcat  13740

tactaacaac atttcccccg catccccctt ccaaacaaca atccccctct acctaaaact  13800

cacagccctc gctgtcactt tcctaggact tctaacagcc ctagacctca actacctaac  13860

caacaaactt aaaataaaat ccccactatg cacattttat ttctccaaca tactcggatt  13920

ctaccctagc atcacacacc gcacaatccc ctatctaggc cttcttacga gccaaaacct  13980

gcccctactc ctcctagacc taacctgact agaaaagcta ttacctaaaa caatttcaca  14040

gcaccaaatc tccacctcca tcatcacctc aacccaaaaa ggcataatta aactttactt  14100

cctctctttc ttcttcccac tcatcctaac cctactccta atcacataac ctattccccc  14160

gagcaatctc aattacaata tatacaccaa caaacaatgt tcaaccagta accactacta  14220

atcaacgccc ataatcatac aaagcccccg caccaatagg atcctcccga atcaaccctg  14280

acccctctcc ttcataaatt attcagcttc ctacactatt aaagtttacc acaaccacca  14340

ccccatcata ctctttcacc cacagcacca atcctacctc catcgctaac cccactaaaa  14400

cactcaccaa gacctcaacc cctgaccccc atgcctcagg atactcctca atagccatcg  14460

ctgtagtata tccaaagaca accatcattc cccctaaata aattaaaaaa actattaaac  14520

ccatataacc tcccccaaaa ttcagaataa taacacaccc gaccacaccg ctaacaatca  14580

gtactaaacc cccataaata ggagaaggct tagaagaaaa ccccacaaac cccattacta  14640

aacccacact caacagaaac aaagcataca tcattattct cgcacggact acaaccacga  14700

ccaatgatat gaaaaaccat cgttgtattt caactacaag aacaccaatg accccaatac  14760

gcaaaattaa ccccctaata aaattaatta accactcatt catcgacctc cccaccccat  14820

ccaacatctc cgcatgatga aacttcggct cactccttgg cgcctgcctg atcctccaaa  14880

tcaccacagg actattccta gccatacact actcaccaga cgcctcaacc gccttttcat  14940

caatcgccca catcactcga gacgtaaatt atggctgaat catccgctac cttcacgcca  15000

atggcgcctc aatattcttt atctgcctct tcctacacat cgggcgaggc ctatattacg  15060

gatcatttct ctactcagaa acctgaaaca tcggcattat cctcctgctt gcaactatag  15120

caacagcctt cataggctat gtcctcccgt gaggccaaat atcattctga ggggccacag  15180

taattacaaa cttactatcc gccatcccat acattgggac agacctagtt caatgaatct  15240

gaggaggcta ctcagtagac agtcccaccc tcacacgatt ctttaccttt cacttcatct  15300

tacccttcat tattgcagcc ctagcagcac tccacctcct attcttgcac gaaacgggat  15360

caaacaaccc cctaggaatc acctcccatt ccgataaaat caccttccac ccttactaca  15420

caatcaaaga cgccctcggc ttacttctct tccttctctc cttaatgaca ttaacactat  15480

tctcaccaga cctcctaggc gacccagaca attataccct agccaacccc ttaaacaccc  15540

ctccccacat caagcccgaa tgatatttcc tattcgccta cacaattctc cgatccgtcc  15600

ctaacaaact aggaggcgtc cttgccctat tactatccat cctcatccta gcaataatcc  15660

ccatcctcca tatatccaaa caacaaagca taatatttcg cccactaagc caatcacttt  15720

attgactcct agccgcagac ctcctcattc taacctgaat cggaggacaa ccagtaagct  15780

acccttttac catcattgga caagtagcat ccgtactata cttcacaaca atcctaatcc  15840

taataccaac tatctcccta attgaaaaca aaatactcaa atgggcctgt ccttgtagta  15900

taaactaata caccagtctt gtaaaccgga gacgaaaacc tttttccaag gacaaatcag  15960

agaaaaagtc tttaactcca ccattagcac ccaaagctaa gattctaatt taaactattc  16020

tctgttcttt catggggaag cagatttggg taccacccaa gtattgactc acccatcaac  16080

aaccgctatg tatttcgtac attactgcca gccaccatga atattgtacg gtaccataaa  16140

tacttgacca cctgtagtac ataaaaaccc aacccacatc aaaccccccc cccccatgct  16200

tacaagcaag tacagcaatc aaccttcaac tatcacacat caactgcaac tccaaagcca  16260

cccctcaccc actaggatac caacaaacct acccaccctt aacagtacat agtacataaa  16320

gtcatttacc gtacatagca cattacagtc aaatcccttc tcgtccccat ggatgacccc  16380

cctcagatag gggtcccttg accaccatcc tccgtgaaat caatatcccg cacaagagtg  16440

ctactctcct cgctccgggc ccataacact tgggggtagc taaagtgaac tgtatccgac  16500

atctggttcc tacttcaggg ccataaagcc taaatagccc acacgttccc cttaaataag  16560

acatcacgat g                                                       16571

<210>2

<211>1542

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

atgttcgccg accgttgact attctctaca aaccacaaag acattggaac actataccta     60

ttattcggcg catgagctgg agtcctaggc acagctctaa gcctccttat tcgagccgag    120

ctgggccagc caggcaacct tctaggtaac gaccacatct acaacgttat cgtcacagcc    180

catgcatttg taataatctt cttcatagta atacccatca taatcggagg ctttggcaac    240

tgactagttc ccctaataat cggtgccccc gatatggcgt ttccccgcat aaacaacata    300

agcttctgac tcttacctcc ctctctccta ctcctgctcg catctgctat agtggaggcc    360

ggagcaggaa caggttgaac agtctaccct cccttagcag ggaactactc ccaccctgga    420

gcctccgtag acctaaccat cttctcctta cacctagcag gtgtctcctc tatcttaggg    480

gccatcaatt tcatcacaac aattatcaat ataaaacccc ctgccataac ccaataccaa    540

acgcccctct tcgtctgatc cgtcctaatc acagcagtcc tacttctcct atctctccca    600

gtcctagctg ctggcatcac tatactacta acagaccgca acctcaacac caccttcttc    660

gaccccgccg gaggaggaga ccccattcta taccaacacc tattctgatt tttcggtcac    720

cctgaagttt atattcttat cctaccaggc ttcggaataa tctcccatat tgtaacttac    780

tactccggaa aaaaagaacc atttggatac ataggtatgg tctgagctat gatatcaatt    840

ggcttcctag ggtttatcgt gtgagcacac catatattta cagtaggaat agacgtagac    900

acacgagcat atttcacctc cgctaccata atcatcgcta tccccaccgg cgtcaaagta    960

tttagctgac tcgccacact ccacggaagc aatatgaaat gatctgctgc agtgctctga   1020

gccctaggat tcatctttct tttcaccgta ggtggcctga ctggcattgt attagcaaac   1080

tcatcactag acatcgtact acacgacacg tactacgttg tagctcactt ccactatgtc   1140

ctatcaatag gagctgtatt tgccatcata ggaggcttca ttcactgatt tcccctattc   1200

tcaggctaca ccctagacca aacctacgcc aaaatccatt tcactatcat attcatcggc   1260

gtaaatctaa ctttcttccc acaacacttt ctcggcctat ccggaatgcc ccgacgttac   1320

tcggactacc ccgatgcata caccacatga aacatcctat catctgtagg ctcattcatt   1380

tctctaacag cagtaatatt aataattttc atgatttgag aagccttcgc ttcgaagcga   1440

aaagtcctaa tagtagaaga accctccata aacctggagt gactatatgg atgcccccca   1500

ccctaccaca cattcgaaga acccgtatac ataaaatcta ga                      1542

<210>3

<211>360

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

gttctttcat ggggaagcag atttgggtac cacccaagta ttgactcacc catcaacaac     60

cgctatgtat ttcgtacatt actgccagcc accatgaata ttgtacggta ccataaatac    120

ttgaccacct gtagtacata aaaacccaac ccacatcaaa cccccccccc ccatgcttac    180

aagcaagtac agcaatcaac cttcaactat cacacatcaa ctgcaactcc aaagccaccc    240

ctcacccact aggataccaa caaacctacc cacccttaac agtacatagt acataaagtc    300

atttaccgta catagcacat tacagtcaaa tcccttctcg tccccatgga tgacccccct    360

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>4

atcacctcgg agctggtaaa                                       20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>5

gcagctagga ctgggagaga                                       20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>6

tccaccatta gcacccaaag                                       20

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>引物

<400>7

aggaaccaga tgtcggatac ag                                        22

Claims (10)

1.一种检测人细胞色素C氧化酶复合物亚基I基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，它包括步骤：

(a)确定在人细胞色素C氧化酶复合物亚基I基因的SEQ ID NO：1所示序列的第6024，6217，或6414位的核苷酸；

(b)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单核苷酸多态性是在6024位存在A，在6217位存在C，和6414存在C。

3.一种核酸引物对，其特征在于，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出含人细胞色素C氧化酶复合物亚基I基因的SEQ ID NO：1所示序列中第6024，6217，和/或6414位单核苷酸多态性的扩增产物。

4.一种核酸引物对，其特征在于，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出含人线粒体DNA的SEQ ID NO：1所示序列中第16137、16189和16219位单核苷酸多态性的扩增产物。

5.一种等位基因特异性的寡核苷酸探针，其特征在于，其长度为15-500bp，且特异性地杂交并检测含人细胞色素C氧化酶复合物亚基I基因的SEQ ID NO：1所示序列中第6024，6217，和/或6414位单核苷酸多态性。

6.一种检测胆石症的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增COXI基因或转录本的引物；和/或特异性扩增线粒体DNA第一高变区的引物。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，它还含有与突变部位结合的探针。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，它包括：

(1)特异性扩增人细胞色素C氧化酶复合物亚基I基因的引物对，

(2)检测扩增产物与正常的细胞色素C氧化酶复合物亚基I基因相比是否存在变化所需的试剂，所述的变化是SEQ ID NO：1所示序列中6024，6217，或6414位的单核苷酸多态性。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的单核苷酸多态性是在6024位存在A，在6217位存在C，和6414存在C。

10.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，它包括：

(1)特异性扩增含人线粒体DNA的SEQ ID NO：1所示序列中第16137、16189和16219位的引物对，

(2)检测扩增产物是否存在变化所需的试剂，所述的变化是SEQ ID NO：1所示序列中第16137、16189和16219位的核苷酸突变为C。