CN1073484A

CN1073484A - 用于核酸定型的方法和试剂

Info

Publication number: CN1073484A
Application number: CN92113785A
Authority: CN
Inventors: T·布加旺; H·A·艾尔利希
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1991-11-05
Filing date: 1992-11-04
Publication date: 1993-06-23
Also published as: AU2748592A; NO924246L; KR930010192A; BR9204280A; FI924999A; IL103602A0; US5451512A; ZA928374B; FI924999A0; NO924246D0; NZ244924A; EP0540997A1; JPH0866197A; CA2081582A1

Abstract

在定型来自各种来源的纯合或杂合样品并检测血清学方法不能区别的等位基因变异体的方法中，可以使用用于扩增HLAI型基因第二和第三外显子的特异核酸序列的引物和用于鉴别在扩增的DNA中所含的多形序列的探针。可以在简便、迅速完成的并在几分钟内产生可检测信号的正向或反向斑点印迹法中使用上述HLAI型DNA定型系统，并且该系统可用组织定型，确定个体特征，以及鉴别疾病敏感的个体。

Description

本发明提供用于定型HLA I型核酸DNA的方法和试剂。尤其是本发明涉及确定样品中核酸的HLA I型DNA类型的方法，该方法包括：

（a）扩增样品中含HLA I型等位基因第二或第三外显子序列的任何核酸;

（b）在所述探针仅正好与互补序列杂交的条件下，把步骤（a）中扩增的所述核酸与一组寡核苷酸探针杂交，且

（c）从步骤（b）中探针杂交的图形中确定来自所述样品的核酸含有的HLA I型等位基因。另一方面，本发明涉及一种完成上述方法的药盒。

本发明能使人们定型各种来源的纯合或杂合样品，包括含RNA或cDNA模板的样品，并检测由目前的血清学，细胞学或生物化学方法不能区别的等位基因变异体。本发明的定型系统便于确定移植组织的类型，确定个体特征，以及鉴别对疾病敏感的个体。因此，本发明可用于医药和医学研究以及特殊的诊断领域，并可用于法医科学及分子生物学领域。

主要的组织相容性复合体（MHC）包括大量的编码与T细胞受体（TCR）一起的糖蛋白的基因，在T细胞对外源抗原的应答反应中，该糖蛋白是关键的特异性因素。有两种结构上有区别的但相关的MHC分子家族，它们给两种T细胞子系统提供抗原：I类MHC分子给表达CD8细胞表面糖蛋白的T细胞提供抗原，以及Ⅱ类MHC分子给表达CD4细胞表面糖蛋白的T细胞提供抗原。参见Bjorkman and Parham，1990，Ann.Rev.Biochem.59∶253-288。

HLA Ⅱ型蛋白HLA DR，HLA DQ和HLA DP是由人第6染色体短臂上的巨大的组织相容性复合体（MHC）区域中的基因编码。Ⅱ型蛋白质是由一个约34KDα链和约29KDβ链组成的杂二聚糖蛋白。Ⅱ型蛋白质在巨噬细胞，B-细胞，激活的T-细胞和其它类型细胞的细胞表面上表达，并涉及与辅助T-淋巴细胞粘附并给它提供抗原。参见由Giles和Capra，1985，Adv.Immunol.37∶1提供的题目为“Structure，function and genetics of Human Class Ⅱ molecules”文章。另外，通过在成熟的T-淋巴细胞中，测定表达的T-细胞受体部分可知Ⅱ型蛋白质影响特异性免疫应答。有关HLA Ⅱ型基因及蛋白质的一般论述，参见由Trowsdale et al.，1985Immunal.Rev.85：5提供的题目为“Structure，sequence and polymorphism in the HLA D region”的文章。

人们已进行有大量试验以发展一种基于DNA的定型方法用于测定个体的HLA Ⅱ型的表型。参见美国专利说明书No.4，582，788，该说明书描述了一个基于限制片段长度多形现象（RFLP）的试验。但是，这些以RFLP为基础的分析需要大量高分子量DNA，劳动量巨大，且有限数量的提供信息的限制酶本身又限制了获得的结果。

多聚酶链反应（PCR）的使用有利于对复合基因组DNA分析和操作。利用PCR方法能够扩增一个来自很复杂的核酸混和物的特定的核酸序列，且在美国专利说明书Nos 4，683，195;4，683，202;4，889，818和4，965，188和欧洲专利申请Nos 237，362和258，017中详细描述了该方法。PCR方法也有利于给个体的HLA Ⅱ型DNA进行分类。通过设计的寡核苷酸引物，科学家们已经研究了基因组DNA中DRB座位的多形第二外显子并且使用这些引物扩增所需的序列。参见Scharf et al，1988，Hum.Immunol 22∶61的题目为“Sequence analysis of the HLA DRB和HLA DQB loci from three Pemphigus vulgaris patients”的文章。

当PCR引物含限制酶识别序列时，可以把扩增的DNA直接克隆到测序的载体中并且可以很容易地确定扩增产物的核苷酸序列。参见：Scharf et al.，1986，Science 233∶1076的题目为“Direct cloning and sequence analysis of enzymatically amplified genomic sequence”的文章。通过使用序列特异的寡核苷酸（SSO）探针的检测方法也可以研究扩增的DNA。参见Saiki et al.，1986，Nature.324∶163的题目为“Analysis of enzymatically amplified beta-globin and HLA DQ alpha DNA with allelespecific oligonucleotide probes”的文章。

在HLA Ⅱ型DNA定型领域的许多重要发明导致了用于在特定的HLA Ⅱ型DNA座位确定个体基因型的简便测试的商业开发。包括上述内容的发明在欧洲专利申请No.237，362和在PCT申请Nos.89/04875，89/11547，89/11548和90/03444中进行了描述。

尽管在HLA Ⅱ型DNA定型领域中取得了进展，但有关发展个体的HLA Ⅰ型DNA类型的方法却没有取得什么进步。没有进步的原因之一是HLA Ⅰ型基因的复杂性。这些基因编码Ⅰ型A、B、C、E、F和G蛋白质，虽然目前认为F和G基因不是多形的，但A、B和C基因包括至少65种不同的序列。在群体中E基因存在4种不同的DNA序列变异体。虽然在这些Ⅰ型基因的第四外显子中的序列变异也是已知的，但目前已知的不同主要在这些基因的第二和第三外显子中（参见Zemmour and Parham，1991，Immunogenetics 33∶310-320）。也参见Malissen et al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci USA79∶893-897。

这些不同以及缺乏有关HLA Ⅰ型基因序列先前未知的变异体方面的认识已经阻碍了发展一种有益并有效的确定个体HLA Ⅰ型DNA类型的方法。本发明通过提供新颖的方法和试剂，满足对一种有效、提供信息的Ⅰ型DNA的定型方法的需要。这些新颖的方法和试剂又反过来会导致发现以前未知的Ⅰ型等位基因，并可通过本发明的方法给这些等位基因定型并鉴别它们。

本发明提供扩增和检测方法，属和等位基因或种特异的扩增引物，序列特异的寡核苷酸（SSO）探针，包括在Ⅰ型座位鉴别以前未知的等位基因所用的探针，以及实施该方法的药盒，并同时提供一种迅速，简便及精确的给包括不能由血清学方法鉴别的HLA Ⅰ型基因的等位基因定型的系统。

一方面，本发明提供一种确定样品中核酸的HLA Ⅰ型DNA类型的方法，该方法包括（a）扩增包含具有HLA Ⅰ型基因的第二外显子或第三外显子序列的核酸的样品中的任何核酸;（b）在所述探针正好仅与互补序列杂交的条件下，把步骤（a）中扩增的所述核酸与一组寡核苷酸探针杂交且（c）从步骤（b）中的探针杂交图谱确定来自所述样品中DNA的HLA Ⅰ型的等位基因。按上面所述，存在许多扩增核酸并确定探针与样品中核酸杂交图谱的方法。

另一方面，本发明的方法提供样品中核酸的鉴别，以及鉴别来自样品的与任何一种或任何结合的HLA Ⅰ型基因有关的个体表型。通过选择适当的放大试剂并遵守本发明的方法，人们可以扩增并检测选自于任何HLA Ⅰ型基因的任何特定的第二或第三外显子。本发明的方法也可以用于确定HLA Ⅰ型基因中第四外显子序列变异。

在优选的实施方案中，本发明的方法用于鉴别样品中HLA Ⅰ型A，B和C的核酸。在一个简化的方法中，通过将探针与含HLA Ⅰ型A，B和C基因的第二和/或第三外显子序列的扩增的核酸杂交，可用本发明的方法和试剂鉴别大多数已知的HLA Ⅰ型A、B和C基因的等位基因。

本发明的定型系统可用于给从mRNA合成的cDNA鉴别类型，以及在组织、突变系统、疾病状态以及细胞系中表达的HLA Ⅰ型基因进行定型和研究。能够很容易地对不能表达Ⅰ型抗原或表现不正常血清反应活性的细胞，如肿瘤细胞进行定型。此外，可以定型非正常来源的样品，如古老的DNAs或法医学的样品，甚至当DNA样品降解或仅可获得很少量用于分析的样品时。

由于PCR能够将靶DNA片段扩增一百万倍以上，并且由于本发明的系统使用PCR-产生的核酸，所以不需要放射性标记的探针，由非同位素的SSOs共价耦连的辣根过氧化物酶（HRP）可提供足够的检测敏感性。以少量的显色染料或化学发光底物进行简单的斑点印迹法可检测本发明中存在的HRP标记的特异性结合。

图1表明本发明的一个实施方案，其中，带固定化探针的两对引物和膜带鉴别HLA Ⅰ型A、B和C等位基因。

本发明提供一种用于分析Ⅰ型等位基因的HLA Ⅰ型DNA定型系统和序列特异的寡核苷酸探针（SSOs）。本发明可用于定型来自各种来源的杂合样品，包括cDNA模板，并且本发明可用于检测由血清学方法不能区别的等位基因变异体。该定型系统可利用简便、快速的斑点印迹法完成，在几分钟内产生可检测的信号，并在对组织定型和确定个体特征以及疾病敏感性方面有重要价值。

在一个实施方案中，本发明提供一种区别存在于已在DNA水平经过测序的任何一种HLA Ⅰ型基因的等位基因的方法，所述的等位基因包括22种HLA Ⅰ型等位基因，31种B等位基因，12种C等位基因和4种E等位基因。本领域专业人员认识已知存在50多种不同的HLA B血清型，本发明提供一种鉴别仍未定序的而能提供许多不同血清型的HLA B等位基因的方法。在广泛实施本发明后，不同HLA B等位基因的总数在短时间内可能会超过100，并且发现新的等位基因。同样，通过本发明的实际应用，将会发现先前未知的其他HLA Ⅰ型基因的等位基因。在一个优选的实施方案中，四种PCR引物和几种寡核苷酸探针用于鉴别许多不同的A和B第二和第三外显子有特定区别特征的A和B等位基因。可以用计算机辅助扫描并分析探针杂交图形，有利于鉴别样品中提供的核酸的Ⅰ型等位基因。

在群体中HLA Ⅰ型基因的分散性和这些基因的等位基因数量巨大给从样品中的核酸鉴别特定的HLA Ⅰ型等位基因的方法带来困难。本发明允许人们进行上述有很大特异性的鉴定，因此，本发明能够用于鉴别特定的被采集样品的个体。这种鉴别能力又导致本发明在法医学领域的应用。

由于PCR（或其他扩增方法如连接酶链反应或Q-β复制酶扩增）可用于扩增很少量的DNA（或降解的DNA），所以本发明可用于分析非正常来源的，如漱口水，一根头发，甚至来自古老标本的DNA的HLA DRB DNA的类型。用上述后面的样品，可能分析史前来源，如早期原始人类的等位基因。为了本发明的目的，将“扩增”定义为任何通过核酸复制或转录增加靶核酸数量的方法。

因此，本发明所用的扩增系统包括在欧洲专利公开Nos.368，906;310229;357，789;358，737;329，822;386，228;369，775;373，960和408，295;以及PCT专利公开Nos.90/06376;90/03445;90/02820;90/02819和90/01608中描述的那些系统。

本发明的方法可用于对不表达HLA Ⅰ型基因的细胞的HLA Ⅰ型DNA定型。本方法也适用于对从mRNA合成的cDNA定型。后面的方法有利于研究HLA基因在各种细胞系或组织中的表达，并且可用于确定HLA基因的表达与转化易感性，自身免疫或其他健康条件之间是否有联系。

本发明的研究潜力决不会影响直接临床应用。MHC的基因和基因产物在个体免疫状态中起重要的作用，且特定的MHC基因产物与疾病抗性和敏感性相联系。由于本发明能够确定样品中的MHC Ⅰ型基因，所以本发明在医药领域，特别是医学诊断方法也有应用。

本发明系统的鉴别能力在对潜在的移植供体进行定型是有价值的，在这方面很精确的HLA匹配表现出对与宿主疾病相反的最小的排斥或融合危险是至关重要的。除上述的好处外，本发明也提供鉴别以前未知的HLA Ⅰ型等位基因，和相关的引物，探针的方法，以及鉴别任何Ⅰ型等位基因的方法。

本发明也提供更方便地完成本发明定型方法的药盒。一种类型的药盒包括扩增和定型试剂。另一种药盒仅包含一种或多种本发明的探针。在任意一个药盒中，探针可以是标记的或不标记的或吸附到固体支持物上。存在于药盒中的引物也可以是标记的以便利于检测，即，引物与信号显色试剂结合或固定，或者既标记也固定。药盒也可包含有利于检测探针杂交的试剂，即，显色底物TMB和抗生蛋白链菌素连接的辣根过氧化物酶。总之，可以以促进本发明使用的任何结构包装实施本发明方法中所用的试剂。

在优选的实施方案中，本发明的试剂含有选自由DB308（SEQ IN NO∶1），DB309（SEQ IN NO∶2），DB311（SEQ IN NO∶3），和DB337（SEQ IN NO∶4）的两种或多种不同的PCR引物。这些引物在下面表1中列出。

表1引物序列 Seq.ID NO

DB308 5'-GGCTGCAGCACTCCATGAGGTATTTC 1

DB309 5'-CAGGATCCCCTCGCTCTGGTTGTAGTA 2

DB311 5'-GGCTGCAGTACTACAACCAGAGCGAGG 3

DB337 5'-CAGGATCCCTCCTTCCCGTTCTCCAGGT 4

如下列表2中所示，可用各种方法利用表1中的引物以扩增HLA Ⅰ型DNA序列。

表2引物杂交位置扩增产物大小

带引物

DB308 第二外显子的左边或开始带DB309(SEQ ID NO:2),

(SEQ ID NO:1) 约270碱基对(bp)

带有DB337(SEQ ID NO:4)

约900bp

DB309 第二外显子的右边或末端带有DB308(SEQ ID NO:1),

(SEQ ID NO:2) 约270(bp)

DB311 第二外显子的左边或末端带有DB337(SEQ ID NO:4),

(SEQ ID NO:3) 约500(bp)

DB337 第二外显子的右边或末端带有DB308(SEQ ID NO:1),

(SEQ ID NO:4) 约900(bp)

带有DB311(SEQ ID NO:3)

约500bp

通过选择适当的引物对，人们可以使用表2中的引物扩增任何HLA Ⅰ型基因的第二和/或第三外显子序列。

如上文所述，大量的HLA Ⅰ型基因的等位基因多样性不仅定位在第二外显子，象Ⅱ型β基因的一样，而且也在第三外显子。通常，当在特定的座位上存在时，第二和第三外显子序列多形性图谱是一种混合物，具有在各种不同的等位基因中存在特异的多形片段。原则上，上述在不同等位基因之间共同的抗原表面决定基能够反映出其共同的祖先，基因转变，或者趋同进化。然而，为了达到对寡核苷酸定型的目的，上述多形性混合物图谱意味着许多等位基因不能通过单个寡核苷酸杂交进行鉴别，而可以通过一个由一组探针杂交的图谱进行鉴别。

然而，在一些情况下，人们仅仅想鉴别在样品的核酸中，是否显示出一个特定的HLA Ⅰ型基因的任何等位基因。本发明的方法可用于扩增含HLA Ⅰ型序列的核酸，并用座位特异性探针鉴别核酸中所带的那些基因。本发明这些座位特异性探针将与一特定的HLA Ⅰ型基因的任何等位基因杂交，而不与其它的Ⅰ型基因的等位基因杂交（在适当的条件下）。可以把座位特异性探针制备成不同探针的混合物或者在不需要完全的序列特异性杂交的条件下杂交。

当在适当的杂交和洗涤条件下，用于本发明的方法中时，称作“SSOs”的本发明的序列特异性寡核苷酸探针是极特异的，它能够区别单一核苷酸多形性。与在RFLP方法中所用的探针不同，本发明的SSOs不仅能确定不同的等位基因而且能够确定等位基因哪里以及怎样不同。称作“HRP-SSOs”的本发明的辣根过氧化酶共轭的SSOs提供使用易于使用并迅速产生可检测信号（一般1到10分钟）的显色或化学发光底物的检测方法。当在4℃贮存时，HRP-SSOs可稳定2年以上而没有检测到活性丢失。参见Levenson和Chang，1989，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications（Innis，Gelfand，Sninsky and White ed.，Academic Press，Inc.San Diego），题目为“Nonisotopically labeled probes and primers”。本发明提供的一种重要优点是，为了特别敏感性可以使用放射标记的探针，但不是必要。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法可用一组用于定型HLA Ⅰ型A和B等位基因的探针来完成。在表中，“区域”标明探针所杂交的HLA Ⅰ型A或B等位基因的第二外显子的多形态密码子。区域A包括A和B等位基因第二外显子的9至12密码子。区域B包括A等位基因第二外显子的62和63密码子。区域C包括A等位基因第二外显子的65到67密码子以及B等位基因第二外显子的69到71密码子。区域D包括A等位基因第二外显子的73到77密码子。在下面表3中列出这些探针，区域和等位基因。

表3探针序列等位基因 Seq.ID No.

DB312 5'-GGATGTGAAGAAATACCTC A,A区域 5

DB313 5'-AGGTATTTCTACACCTCC A,A区域 6

DB314 5'-AGGTATTTCTCCACATCC A,A区域 7

DB315 5'-GGATGTGGTGAAATACCTC A,A区域 8

DB316 5'-CGGGACACGGATGTGTAG B,A区域 9

DB317 5'-TTCTACACCTCCGTGTCC B,A区域 10

DB318 5'-GGACATGGCGGTGTCGAA B,A区域 11

DB319 5'-TTCTACACCGCCATGTCC B,A区域 12

DB320 5'-CGGGACACGGCGGTGTA B,A区域 13

DB321 5'-TTTCCACACCTCCGTGTC B,A区域 14

DB322 5'-TTCCACACCGCCATGTCC B,A区域 15

DB323 5'-GTATTGGGACCAGGAGAC A,B区域 16

DB324 5'-GTATTGGGACGGGGAGAC A,B区域 17

DB325 5'-GTATTGGGACGAGGAGAC A,B区域 18

DB326 5'-GTATTGGTACCGGAACAC A,B区域 19

DB327 5'-CGTGTCTGXAGGTCCCAAT A,B区域 20

DB328 5'-TGTCTGXAGGTCCCAAT A,B区域 21

DB329 5'-ACACGGAATATGAAGGCC A,C区域 22

DB330 5'-ACACGGAAAGTGAAGGCC A,C区域 23

DB331 5'-GCCTTCACATTCCGTGTC A,C区域 24

DB332 5'-ACTGACCGACGCAACCTG A,D区域 25

表3(续)

探针序列等位基因 Seq.ID No.

DB333 5'-AGGTCCACTCGGTGAGTC A,D区域 26

DB334 5'-AGGTCCACTCGGTCAGTC A,D区域 27

DB335 5'-ACTGACCGAGCGAACCTG A,D区域 28

DB336 5'-ATCGCGCTCCGCTACTAC A,D区域 29

RAP10 5'-TGTGTTGGTCTTGAAGATC B,C区域 30

RAP11 5'-ATCTCCAAGACCAACACAC B,C区域 31

RAP12 5'-GCCTTGGCCTTGCAGATC B,C区域 32

RAP13 5'-GCGGAGGCCTTCAATTTC B,C区域 33

RAP14 5'-TACAAGGCCCAGGCACAG B,C区域 34

RAP15 5'-AAGTACAAGCGCCAGGCAC B,C区域 35

RAP16 5'-GACCGGAACACACAGATC B,B区域 36

RAP17 5'-GATCTGTGTCTCCCGGTC B,B区域 37

RAP18 5'-CTTCACATTCCGTGTGTTC A,B区域 38

RAP19 5'-TGTGTTGGTCTTGCAGATC B,C区域 39

在上表中，X代表次黄嘌呤核苷酸。

用于检测的斑点印迹方法能迅速定型大量的样品，并可用于确定HLA Ⅰ型基因的等位基因出现频率。最近发展的可替代PCR/SSO定型的方法是固定化的反向斑点印迹方法。参见Saiki et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86∶6230，题目为“Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes”的文章。在该方法中，应用了SSO探针并固定到滤纸上（而不是应用扩增的DNA并固定到滤纸上），因此，叫作“反向斑点印迹”。

反向斑点印迹方法能够用含有固定探针分布的膜进行单个杂交而分析单个样品。当样品数量超过所用的探针量时（如：患者对对照或群体遗传研究），使用常规的斑点印迹法。在样品少于探针的情况下，反向斑点印迹法对于临床，诊断和法医学分析是有价值的。下文中将对反向斑点印迹法作进一步的详细描述。

下列实施例用于说明本发明的优选实施方案。实施例表明在优选的实施方案中本发明提供一种简便，迅速并能够精确定型来自不同来源的各种样品的DNA的用于HLA Ⅰ型DNA定型的非同位素PCR/SSO系统。

实施例1

扩增和检测方法

为了定型样品，用如在Saiki et al，1988，Science239∶487和Scharf et al.，1988Hum.Immunol.22∶61和Scharf et al，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86∶6215，题目为“Primer-directed enzymatic amplifacation of DNA with a thermostable DNA polymerase”的文章中描述的反应条件，扩增约0.5μg的人基因组DNA。在反应混合物中，存在500nM引物，反应体积是100μg。

为了测定HLA等位基因序列，扩增1μg的纯化人基因组DNA，并且，利用Scharf el al.，1988，Hum.Immunol.22∶61和Scharf et al.Hum Immunol.233∶1076描述的方法，把扩增的DNA克隆到M13mp10中。利用Sanger et al.，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74∶5463描述的双脱氧链末端方法测定插入序列。

使用下文所示的反应条件，把样品扩增30到35循环。每100μl反应体积中加入约5单位（而不是2.5单位）的Taq多聚酶。RNA扩增参见Kawasaki，1989，“Amplification of RNA"in PCR Protocols，A Guide to Method and Applications（Innis et al.，eds，Academic Press，San Diego）所述。为了防止蒸发，全部样品用100μl的高级矿物油覆盖。扩增后，用100μl氯仿提取覆盖的油。

每一循环的温度测线包括在下列温度保温培养所指定的时间：在95℃1分钟（DNA链变性），在60℃30秒（引物退火），在72℃1分钟（延伸备好的模板）。最后一次循环后，将温度循环器保持在72℃将样品保温培养10分钟以确保最后的延伸是完全的。应该小心以避免样品的交叉污染;人们必须特别小心，不让PCR产物污染未扩增的样品。

扩增以后，将少量的扩增DNA变性并与一系列尼龙滤器接触，然后，每个滤器与一个标记的探针杂交，每个SSO探针共价结合辣根过氧化物酶（HRP），并提供一种在显色或化学发光底物存在的情况下，非同位素检测方法。

因此，每5μl扩增的DNA样品与100μl含0.4M NaOH和25mM EDTA的混合物混和，使用斑点印迹管（Bio Rad，Richmond，CA）把所得的混和物点到BioDyne B尼龙滤纸（Pall Corp.，Glen Cove，NY）。用100mM Tris-HCl和0.1mMEDTA，PH8.0的混和物漂洗仍存在斑点印迹管中的滤纸，并在Whatman 3MM纸上干燥。用Stratalinker^TM（Stratagene，La Jolla，CA）UV光盒，通过在55mJ/cm²光通量的紫外线照射，把DNA固定在尼龙滤器上。

除非另外说明，所有滤纸在含2皮摩尔HRPSSO探针，2X SSPE（盐水磷酸钠EDTA），5X Denhardt′s溶液，和0.5%SDS的杂交溶液中，在42℃杂交15分钟。按Levenson和Chang，1989，in PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications（Innis et al.，eds，Academic Press，Inc.San Diego）和Saiki et al.，1988，N.Eng.J.Med.319：537的描述制备辣根过氧化物酶共轭的寡核苷酸。每个探针的滤纸在SSPE中冲洗。

冲洗后，将用显色染料底物显色的滤纸在PBS中，室温下漂洗30分钟，然后放在含0.1mg/ml3，3′，5，5′-四甲联苯胺（TMB）和0.0015%过氧化氢的100mM柠檬酸钠，PH5.0中，并在室温下缓慢搅动，保温培养5到15分钟。把显色的滤纸在PBS中漂洗并立刻拍照。把用化学发光检测系统（ECL，Amersham，Arlington Heights，IL）显色的滤器在PBS中漂洗5分钟，并放在ECL溶液中缓慢搅拌1分钟。然后，在室温下，把滤纸在X线胶片下曝光1到5分钟。

实施例2

反向斑点印迹方法

在本发明的该实施方案中，把HLA Ⅰ型探针固定到一膜上，并把扩增的靶DNA与膜结合的探针杂交。设计该组定型探针，以便每个探针如该组中的全部其他探针一样。在同样的温度和盐浓度下与一个特异的靶序列杂交（并且在同样的冲洗条件下停止杂交）。如在PCR Protocol书中描述的，用于扩增的PCR引物是生物素化，以便能够很容易地检测与膜结合的探针进行杂交的任何扩增DNA。本领域专业人员知道除本发明举例的方法外的方法也可用于检测一个探针是否已经与靶核酸杂交。

在一个实施方案中，通过将抗生蛋白链菌素（SA）共轭的辣根过氧化物酶与任何生物素化的，与膜结合的探针杂交的扩增的DNA反应完成检测。因此，通过SA-生物素中间反应，HRP与扩增的DNA反应并用于通过各种已知的方法，产生一个信号如产生有色化合物，例如通过四甲联苯胺的氧化。

虽然通过任何方法，把探针固定在膜上，但一个优选的方法涉及用一个更长的多聚dT序列“加尾”一个长约13到25核苷酸的寡核苷酸探针。然后，所得的多聚dT“尾”与在膜上的氨基反应，以把探针共价地固定到膜上。该反应可有利于UV照射。

虽然人们也能在商业上可获得的DNA合成器上合成加尾的探针，但可以用末端脱氧核苷酸基转移酶（TdT，Ratliff Biochemicals;为了下面的反应，假设一个浓度为100pmol/μl，约120单位/μl）在探针上产生一个多聚dT尾。如果用DNA合成仪合成加尾的探针，则应把尾端放在探针的5′末端，以便最初在尾部区域发生不需要的早期链终止。

应在含1X TdT盐，200pmol寡核苷酸，800M dTT，和60单位TdT的约100μl体积中，完成TdT反应。10X TdT盐是1，000mM K-卡可酸盐，10mM CoCl₂，2mM二硫苏糖醇，250mM TrIs-Cl，PH7.6，并按Roychoudhury和Wu，Meth.Enzymol.65∶43-62所述制备，该文献引入本文作为参考。为了方便，可制备8mM dTTP的10X贮备溶液（用NaOH中和至PH7）。

应在37℃2小时完成TdT反应，然后通过加入100μl10mM EDTA，PH8停止反应。加尾寡核苷酸的最后浓度是1μM（1pmol/μl），同聚物尾的长度是约400个残基。通过调整dTTP与寡核苷酸的摩尔比改变尾长度。可以在-20℃贮存加尾的探针直到使用。

对于反向斑点印迹方法，两种类型的尼龙膜是优选的：由Pall制造的Biodyne^TM尼龙膜，0.45微米微孔大小;和由ICN制造的Biotrans^TM尼龙膜，0.45微米微孔大小。可以用BioRad制造的Bio-Dot^TM斑点印迹装置把探针很方便地点在膜上。把每个探针点在膜上唯一的分散的位置。在用于斑点印迹装置之前，把约5到10皮摩尔的每种加尾探针与60-100μl的TE缓冲液预混和，斑点印迹后，把膜放在吸附纸上一短时间吸掉过多的液体。

然后把膜放在UV光盒内，如由Stratagene制造的Stratalinker^TM光盒，并暴露到50到60毫焦耳的光通量下，以便把加尾的探针固定到尼龙膜上。短暂的漂洗（在杂交溶液中约15分钟）后，除去未结合的探针，然后膜准备与生物素化PCR产物杂交。把二分之一到一皮摩尔（1/4到1/2标准的100μl PCR混合物）的PCR产物加到每组杂交探针中。为了方便，可在此时加入约50μl商业上可获得的抗生蛋白链菌素-辣根过氧化物酶共轭物，在严格冲洗后，如果在室温下分别完成SA-HRP保温培养和洗涤，则会得到更好的信号。

在50至55℃，经30分钟水浴，并用由0.5%SDS和3X到5X SSPE，一般为4X组成的杂交缓冲液完成杂交。在50至55℃经15分钟水浴并用由0.1%SDS和1X SSPE洗涤溶液完成严格的洗涤。在室温下，用1X PBS洗涤30分钟后，能增强信号质量。

在优选的实施方案中，通过用全部四种引物DB308（SEQ ID NO∶1），DB309（SEQ ID NO∶2），DB337（SEQ ID NO∶4）和DB311（SEQ ID NO∶3）扩增而定型样品，导致HLAⅠ型核酸序列第二和第三外显子的共扩增，然后与四组探针杂交，每组在不同的膜带上：A第二外显子组，B第二外显子组，A第三外显子组，B第三外显子组探针。

序列目录

（2）SEQ ID NO∶1的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：26个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶1

GGCTGCAGCA CTCCATGAGG TATTTC 26

（2）SEQ ID NO∶2的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：27个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶2

CAGGATCCCC TCGCTCTGGT TGTAGTA 27

（2）SEQ ID NO∶3的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：27个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶3

GGCTGCAGTA CTACAACCAG AGCGAGG 27

（2）SEQ ID NO∶4的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：28个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶4

CAGGATCCCT CCTTCCCGTT CTCCAGGT 28

（2）SEQ ID NO∶5的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：19个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶5

GGATGTGAAG·AAATACCTC 19

（2）SEQ ID NO∶6的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶6

AGGTATTTCT ACACCTCC 18

（2）SEQ ID NO∶7的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶7

AGGTATTTCT CCACATCC 18

（2）SEQ ID NO∶8的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：19个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶8

GGATGTGGTG AAATACCTC 19

（2）SEQ ID NO∶9的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶9

CGGGACACGG ATGTGTAG 18

（2）SEQ ID NO∶10的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶10

TTCTACACCT CCGTGTCC 18

（2）SEQ ID NO∶11的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶11

GGACATGGCG GTGTCGAA 18

（2）SEQ ID NO∶12的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶12

TTCTACACCG CCATGTCC 18

（2）SEQ ID NO∶13的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：17个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶13

CGGGACACGG CGGTGTA 17

（2）SEQ ID NO∶14的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶14

TTTCCACACC TCCGTGTC 18

（2）SEQ ID NO∶15的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶15

TTCCACACCG CCATGTCC 18

（2）SEQ ID NO∶16的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶16

GTATTGGGAC CAGGAGAC 18

（2）SEQ ID NO∶17的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶18

GTATTGGGAC GGGGAGAC 18

（2）SEQ ID NO∶18的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶19

GTATTGGGAC GGGGAGAC 18

（2）SEQ ID NO∶19的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶19

GTATTGGTAC CGGAACAC 18

（2）SEQ ID NO∶20的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：19个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶20

CGTGTCTGXA GGTCCCAAT 19

（2）SEQ ID NO∶21的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：17个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶21

TGTCTGXAGG TCCCAAT

（2）SEQ ID NO∶22的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶22

ACACGGAATA TGAAGGCC

（2）SEQ ID NO∶23的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶23

ACACGGAAAG TGAAGGCC

（2）SEQ ID NO∶24的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶24

GCCTTCACAT TCCGTGTC

（2）SEQ ID NO∶25的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶25

ACTGACCGAC GCAACCTG

（2）SEQ ID NO∶26的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶26

AGGTCCACTC GGTGAGTC

（2）SEQ ID NO∶27的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶27

AGGTCCACTC GGTCAGTC 18

（2）SEQ ID NO∶28的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶28∶

ACTGACCGAG工CGAACCTG 18

（2）SEQ ID NO∶29的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶29

ATCGCGCTCC GCTACTAC 18

（2）SEQ ID NO∶30的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：19个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶30

TGTGTTGGTC TTGAAGATC 19

（2）SEQ ID NO∶31的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：19个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶31

ATCTCCAAGA CCAACACAC 19

（2）SEQ ID NO∶32的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶32

GCCTTGGCCT TGCAGATC

（2）SEQ ID NO∶33的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶33

GCGGAGGCCT TCAATTTC

（2）SEQ ID NO∶34的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶34

TACAAGGCCC AGGCACAG

（2）SEQ ID NO∶35的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：19个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶34

AAGTACAAGC GCCAGGCAC

（2）SEQ ID NO∶36的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶36

GACCGGAACA CACAGATC

（2）SEQ ID NO∶37的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶37

GATCTGTGTC TCCCGGTC

（2）SEQ ID NO∶38的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：19个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶38

CTTCACATTC CGTGTGTTC

（2）SEQ ID NO∶39的资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：19个碱基

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）结构：线性

（ⅱ）分子类型：其它核酸

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO∶39

TGTGTTGGTC TTGCAGATC

Claims

1、一种确定样品中核酸的HLAI型DNA类型的方法，该方法包括

(a)扩增样品中含HLAⅠ型等位基因第二和/或第三外显子序列的任何核酸；

(b)在所述探针正好与互补序列杂交的条件下，把在步骤(a)中扩增的所述核酸与一组寡核苷酸探针杂交，和；

(c)从步骤(b)中的探针杂交图形，确定来自样品中核酸的HLAI型等位基因。

2、根据权利要求1的方法，其中，所述HLA I型等位基因选自A、B、和C等位基因。

3、根据权利要求2的方法，其中所述的HLA I型等位基因是A和B等位基因。

4、根据权利要求1-3的任一种方法，其中，通过用一对寡核苷酸引物的多聚酶链反应完成步骤（a）中的扩增。

5、根据权利要求4的方法，其中包括扩增所述的第二外显子序列。

6、根据权利要求5的方法，其中，所述的引物是DB308（SEQ ID NO∶1）和DB309（SEQ ID NO∶2）。

7、根据权利要求4的方法，其中包括扩增所述的第三外显子序列。

8、根据权利要求7的方法，其中，所述的引物是DB337（SEQ ID NO∶4）和DB311（SEQ ID NO∶3）。

9、根据权利要求4的方法，其中，扩增所述的第二和第三外显子序列。

10、根据权利要求9的方法，其中，所述引物是DB308（SEQ ID NO∶1），DB309（SEQ ID NO∶2），DB337（SEQ ID NO∶4）和DB311（SEQ ID NO∶3）。

11、根据权利要求1-10的任一种方法，其中把所述的一组寡核苷酸探针固定到一固体支持物上，把每个探针定位在所述固体支持物上分散和不同的位置上。

12、一种完成根据权利要求1-11任一种方法的药盒，该药盒含有所述组的寡核苷酸探针。

13、根据权利要求12的药盒，进一步含有一组扩增所述第二和/或第三外显子序列的寡核苷酸引物。

14、根据权利要求12或13，其中所述的一组探针含有两种或多种选自下列组的探针：DB312（SEQ ID NO∶5），DB313（SEQ ID NO∶6），DB314（SEQ ID NO∶7），DB315（SEQ ID NO∶8），DB316（SEQ ID NO∶9），DB317（SEQ ID NO∶10），DB318（SEQ ID NO∶11），DB319（SEQ ID NO∶12），DB320（SEQ ID NO∶13），DB321（SEQ ID NO∶14），DB322（SEQ ID NO∶15），DB323（SEQ ID NO∶16），DB324（SEQ ID NO∶17），DB325（SEQ ID NO∶18），DB326（SEQ ID NO∶19），DB327（SEQ ID NO∶20），DB328（SEQ ID NO∶21），DB329（SEQ ID NO∶22），DB330（SEQ ID NO∶23），DB331（SEQ ID NO∶24），DB332（SEQ ID NO∶25），DB333（SEQ ID NO∶26），DB334（SEQ ID NO∶27），DB335（SEQ ID NO∶28），DB336（SEQ ID NO∶29），RAP10（SEQ ID NO∶30），RAP11（SEQ ID NO∶31），RAP12（SEQ ID NO∶32），RAP13（SEQ ID NO∶33），RAP14（SEQ ID NO∶34），RAP15（SEQ ID NO∶35），RAP16（SEQ ID NO∶36），RAP17（SEQ ID NO∶37），RAP18（SEQ ID NO∶38），RAP19（SEQ ID NO∶39）。

15、根据权利要求13或14的药盒，其中所述引物是DB308（SEQ ID NO∶1）和DB309（SEQ ID NO∶2）。

16、根据权利要求13或14的药盒，其中所述引物是DB337（SEQ ID NO∶4）和DB311（SEQ ID NO∶3）。

17、根据权利要求13或14的药盒，其中所述引物是DB308（SEQ ID NO∶1）和DB309（SEQ ID NO∶2），DB337（SEQ ID NO∶4）和DB311（SEQ ID NO∶3）。