DE202010003498U1

DE202010003498U1 - Gen codiert für ein MHC-Klasse-I-Molekül, Plasmid, Expressionssystem Protein, Multimer, Reagenz und Kit zum Analysieren einer T-Zellen-Frequenz

Info

Publication number: DE202010003498U1
Application number: DE201020003498
Authority: DE
Original assignee: Jacobs University gGmbH
Current assignee: Constructor University Bremen Ggmbh De
Priority date: 2010-03-11
Filing date: 2010-03-11
Publication date: 2011-07-06
Anticipated expiration: 2020-03-12

Abstract

Gen, welches für ein MHC-Klasse-I Molekül codiert ist, wobei das MHC-Klasse-I Molekül eine ALPHA-1 Helix und eine ALPHA-2 Helix aufweist und das Gen so codiert ist, dass eine Verbindung zwischen der ALPHA-1 Helix und ALPHA-2 Helix in dem MHC-Klasse-I Molekül ausgebildet ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Gen codiert für ein MHC-Klasse-I-Molekül, ein Plasmid und ein Expressionssystem, welche das Gen aufweisen sowie Proteine und Multimere, welche mittels des Explosionssystems hergestellt wurden.
MHC-Klasse I-Moleküle (Major Histocompatibility Complex Class I molecules, Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex-Klasse I-Moleküle) sind Transmembranproteine der zellulären Immunantwort, die Peptide aus dem Zellinneren, wie beispielsweise aus dem Cytosol oder dem Lumen der endocytotischen Organellen, binden und an der Zelloberfläche den zytotoxischen T-Zellen (CTL, cytotoxic T lymphocytes) präsentieren. Dies ist die sogenannte Antigenpräsentation.
Die Bindung eines T-Zell-Rezeptors einer CTL an einen Klasse I-Peptid-Komplex einer antigenpräsentierenden Zelle (APC) führt (abhängig vom Ort der Reaktion im Körper, dem Typ der APC (B-Zelle, dendritische Zelle, etc.) und dem Aktivierungszustand der CTL) zur Aktivation der CTL und/oder zur Induktion des Zelltods (Apoptose) der APC durch die CTL.
Die Immunantwort ist effektiv, weil die CTL, die mit Selbst-Peptiden (die aus körpereigenen Proteinen erzeugt werden) reagieren, im Thymus eliminiert werden. Deswegen bedeutet die Erkennung eines Peptids durch die CTL, dass die APC fremde Proteine produziert, die von Viren oder intrazellulären Parasiten (Bakterien, Protozoen) stammen; auch Überproduktion endogener Peptide in maligne entarteten Tumorzellen kann zu Erkennungsreaktionen führen. Nahezu alle in der Zelle vorhandenen Proteine werden am Ende ihrer Lebensdauer in Peptide zersetzt, die dann im Endoplasmatischen Retikulum (einer membranumgrenzten Organelle im Zellinneren) an MHC-Klasse I-Moleküle binden; anschließend wird der Komplex aus Peptid und MHC-Klasse I-Molekül an die Zelloberfläche transportiert und steht dort für die Erkennung durch CTL zur Verfügung. Wenn nun aufgrund einer tumorigenen malignen Entartung neuartige oder mutierte Proteine produziert werden, oder wenn durch eine virale Infektion virale Proteine aus dem genetischen Material des Virus produziert werden, dann werden diese ,neuartigen' Proteine ebenfalls in Peptide zersetzt, die dann im Komplex mit MHC-Klasse I-Molekülen auf der Zelloberflüche präsentiert werden. Diese ,neuartigen' Peptide sind verschieden von den zelleigenen und lösen eine Erkennung durch die CTL aus.
Präsentation durch MHC-Klasse-I-Moleküle spielt ebenfalls eine Rolle in allergischen Reaktionen, der Abstoßung von Transplantaten und einer Anzahl von Autoimmunkrankheiten wie multipler Sklerose und rheumatoider Arthritis.
Die Untersuchung der Immunantworten, die durch MHC-Klasse-I-Moleküle vermittelt werden, erfordert oft den Nachweis der CTL, die mit einem bestimmten Klasse I-Peptid-Komplex (Epitop) reagieren. Reaktionen auf ein einziges immunodominantes Epitop machen oft 10–20% der gesamten T-Zell-Population in einem Organismus aus, und die Verfolgung der CTL-Frequenz erlaubt es daher, die Immunantwort (und z. B. Gelingen oder Fehlschlagen einer Therapie) genau zu verfolgen. Aus diesem Grund sind Reagenzien, die CTL identifizieren können, die ein bestimmtes definiertes Epitop erkennen, unabdingbar.
Zum Nachweis solcher Epitop-spezifischen CTL bedient man sich bisher rekombinanter MHC-Klasse-I-Moleküle, die in Bakterien hergestellt werden und als unlösliche Einschlusskörper (inclusion bodies) vorliegen, die in einer Lösung eines chaotropen Agens zunächst denaturiert werden. Das Chaotrop wird dann in Gegenwart des gewünschten Peptids entfernt (bspw. Durch Renaturierung und Rückfaltung), und der Peptid-Klasse I-Komplex durch Gelfiltrationschromatographie von dem ungefalteten Protein getrennt. Da die niedrige Affinität eines einzelnen Klasse I-Peptid-Komplexes zu einem einzelnen T-Zell-Rezeptor nicht zu einer festen Bindung führt, verwendet man Multimere von Klasse I-Peptid-Komplexen, die aufgrund des Aviditätseffektes fest genug an die T-Zell-Rezeptoren einer T-Zelle binden, um eine dauerhafte Bindung zu ermöglichen. Solche Multimere werden z. B. durch Streptravidin vermittelte Tetramerisierung von biotinylierten Klasse-I-Peptid-Komplexen (class I tetramers) oder durch Pentamerisierung durch self-assembling coiled coil domain (class I pentamers) erreicht.
Die Klasse-I-Multimere sind im Allgemeinen mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, die ihre mikroskopische oder durchflusszytometrische Detektion ermöglichen. So können epitop-spezifische CTL direkt angefärbt werden.
Andere Anwendungen für rekombinante Klasse I-Peptid-Komplexe sind:

– In vitro-Selektion und Expansion monospezifischer T-Zellen zur Reinfusion bei Krebs und Viruskrankheiten. (Die Selektion kann durch Cytofluorimetrie (Durchflusszytometrie) oder – für erhöhten Durchsatz – in Mikroarrays erfolgen)
– Ex vivo-Isolierung und Expansion von CTL zur adoptiven Therapie nach allogeneischer Stammzell-Transplantation.
– Ex vivo-Entfernung von alloreaktiven T-Zellen nach Transplantation von peripheren Stammzellen. Ebenso interessant ist die Entfernung von autoreaktiven T-Zellen, die Typ I-Diabetes, Arthritis, und andere Autoimmun-Krankheiten hervorrufen, wie für MHC-Klasse II-Reagenzien bereits beschrieben. Der Gebrauch von isotopmarkierten Multimeren ist in US. Pat. US 2003/0228258 A1 ”Suicide tetramers and uses thereof”, David Scheinberg et al., beschrieben.

Die Herstellung rekombinanter Klasse I-Peptid-Komplexe ist kompliziert und teuer. Zum einen existieren mehrere tausend MHC-Klasse-I-Allotypen (von denen allerdings bereits fünf Allele von HLA-A etwa 50% der Welt-Bevölkerung abdecken). Vor allem aber muss für jedes Peptid, das als Epitop untersucht werden soll, ein neues Multimer hergestellt werden, so dass für jeden Patienten oder für jedes Experiment neue Multimere erforderlich sind, die spezifisch hergestellt werden müssen.
Es wäre einfacher, die Multimere ohne die Peptide herzustellen und die jeweils erforderlichen Peptide dann je nach Bedarf zuzugeben, aber das ist bisher nicht möglich, weil die Rückfaltung der Klasse I-Moleküle ohne Peptid extrem ineffizient ist. In der Vergangenheit ist ein Ausweg beschrieben worden. Dabei wurde Gebrauch von einem lichtempfindlichen Peptid gemacht, welches durch UV-Bestrahlung oder Periodat-Behandlung zerfällt und dann durch ein zugegebenes Peptid ersetzt werden kann.
Diese Methodologie ist aber immer noch teuer und funktioniert nicht mit allen Peptiden oder Klasse I-Molekülen.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile des Standes der Technik zu verbessern.
Gelöst wird die Aufgabe durch ein Gen, welches für ein MHC-Klasse-I-Molekül codiert ist, wobei das MHC-Klasse-I-Molekül eine ALPHA-1 Helix und eine ALPHA-2 Helix aufweist und das Gen so codiert ist, dass eine Verbindung zwischen der ALPHA-1 Helix und der ALPHA-2 Helix in dem MHC-Klasse-I-Molekül ausgebildet ist. Dadurch kann vorteilhafter Weise ein Gen bereitgestellt werden, welche eine solche Verbindung ausprägt.
Dabei sei folgendes begrifflich erläutert:
Ein „Gen” ist eine Sequenz von Nukleotiden, die verwendet werden kann, um Zellen (insbesondere Bakterien, Hefezellen, Insektenzellen, oder Sängerzellen) oder ein zellfreies Expressionssystem dahingend zu programmieren, dass die „schwere Kette” (heavy chain) eines MHC-Klasse I-Moleküls synthetisiert wird. Beispiele für solche Gene sind die Gensequenz des murinen MHC-Klasse I-Moleküls H-2K^b
Ein „MHC-Klasse-I-Molekül” ist ein Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex-Klasse-I-Molekül, welche Transmembranproteine der zullulären Immunantwort sind. Diese binden Peptide aus dem Zellinnerem wie beispielsweise aus dem Cytosol oder dem Lumen der endocytotischen Organellen. Zudem präsentieren diese an der Zelloberfläche den zytotoxischen T-Zellen eine Antigenpräsentation. Zudem umfasst der Begriff MHC-Klasse-I-Molekül zu eigentlichen MHC-Klasse-I-Molekülen ähnlichen Moleküle, die im MHC kodiert sind und ebenfalls Peptide binden, wie beispielsweise HLA-E und HLA-G.
Diese „Antigenpräsentation” ist – die Bereitstellung – durch die antigenpräsentierende Zelle – eines Komplexes aus MHC-Klasse I-Molekül und Peptid an der Zelloberfläche zwecks Erkennung durch den T-Zell-Rezeptor einer CTL, und die zellulären Prozesse in der antigenpräsentierenden Zelle, die unmittelbar dazu führen, z. B. Zersetzung (Proteolyse) der zellulären Proteine, Transport der entstehenden Peptide ins Endoplasmatische Retikulum (ein membranumschlossenes Kompartiment innerhalb der Zelle), Bindung der Peptide an die Klasse I-Moleküle, TRansport der Klasse I-Peptid-Komplexe an die Zelloberfläche.
Die „ALPHA-1 Helix” und die „ALPHA-2 Helix” sind helixartigen Strukturen des MHC-Klasse-I-Moleküls, welche im Wesentlichen gegenüber in dem Molekül angeordnet sind und zwischen denen sich die Bindungsstelle des Peptids befindet.
Die „Verbindung” kann insbesondere als eine kovalente Bindung ausgestaltet sein.
In einer weiteren Ausprägungsform ist der Abstand der ALPHA-I Helix und der ALPHA-2 Helix zwischen 2 Angström und 10 Angström, insbesondere zwischen 2 Angeström und 5 Angström, welche die Verbindung überbrücken.
Somit kann gewährleistet werden, dass die ALPHA-1 Helix und die ALPHA-2 Helix über die ausgebildete Verbindung aneinander gekoppelt sind. Dabei kann es vorteilhaft sein, wenn der Abstand möglichst gering ist.
Um die größtmögliche Stabilität der verbundenen Struktur zu gewährleisten und gleichzeitig eine Herstellung des verbundenen Klasse I-Moleküls in Zellen zu ermöglichen, kann die Verbindung als eine Disulfidbrücke ausgestaltet sein.
Als Alternative für die Disulfidbrücke können auch Brücken ausgebildet werden, indem an gegenüberliegenden Stellen der ALPHA-1 und der ALPHA-2-Helix Aminosäuren mit solchen Seitenketten angebracht sind, die entgegengesetzte Ladungen aufweisen, insbesondere negativ geladene Aminosäuren (Aspartat, Glutamat) auf der einen Helix und positiv geladene Aminosäuren (Histidin, Arginin, Lysin) auf der anderen Helix, solcherart dass die entgegengesetzten Ladungen einander elektrostatisch anziehen.
In einer weiteren Ausprägungsform weist das Molekül einen Platzhalter für einen Peptid zwischen der ALPHA-1 Helix und der ALPHA-2 Helix auf und die Verbindung hält den Platzhalter frei, sodass das Peptid in den Platzhalter einbringbar ist.
Die hier aufgeführten Peptide sind insbesondere käufliche Peptide, die je nach dem Anwendungsfall vorgesehen sind, wie beispielsweise für die speziell zu untersuchenden Krankheit.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst durch ein Plasmid, welches ein zuvor beschriebenes Gen aufweist. Somit kann ein Plasmid bereitgestellt werden, das eine Transkription des Gens realisiert.
Um ein Protein bereit zu stellen, kann in einem weiteren Aspekt der Erfindung die Aufgabe gelöst werden, durch ein Expressionssystem, wobei das Expressionssystem das zuvor beschriebene Gen aufweist.
In einer diesbezüglichen Ausführungsform weist das Expressionssystem eine Bakterienzelle, insbesondere eine Escherichia coli-Zelle, eine Hefezelle, insbesondere Saccharomyces Cerevisiae-Zelle, eine Insektenzelle, insbesondere eine Spodoptera Frugiperda-Zelle, Säugerzelle, insbesondere CHO-Zelle, wobei CHO für Chinese hamster ovary steht, ein zellfreies Expressionssystem, insbesondere als Retikulozyten-Lysat aufweist.
Um ein möglichst hohe Ausbeute zu erhalten, weist das Expressionssystem mehrere Zellen auf, insbesondere eine Anzahl von Zellen in einer Größenordnung von 10⁶ Zellen.
In einer weiteren Ausprägung der Erfindung kann die Aufgabe gelöst werden durch ein Protein, welches durch das Verwenden des zuvor beschriebenen Expressionssystems hergestellt wurde.
Um beispielsweise eine spezifische T-Zellenkonzentration in einer Probe zu bestimmen, kann an dem Protein ein Signalgeber angeordnet sein, wobei insbesondere der Signalgeber ein Fluoreszenzfarbstoff ist. Somit können einfache Methoden zur Identifizierung bereitgestellt werden.
In einer diesbezüglichen Ausprägungsform weist das Protein ein Ankerelement auf.
Dieses Ankerelement ist insbesondere ein Biotinmolekül, das entweder durch eine natürliche Biotinylierungssequenz, die in dem Gen genetisch kodiert ist, und ein biotinylierendes Enzym, insbesondere BirA, oder durch chemische Methoden, insbesondere Verwendung eines N-hydroxysuccinimid-Derivats von Biotin, an dem Protein angebracht wird; oder eine Polyhistidin- oder Polyarginin-Sequenz, insbesondere eine Hexahistidin-Sequenz, die in dem Gen genetisch kodiert ist.
Um den Aviditätseffekt auszunutzen, kann die Aufgabe gelöst werden durch ein Multimer, insbesondere ein Tetramer und/oder ein Pentamer, welches mindestens zwei Proteine aufweist, wobei mindestens ein Protein ein zuvor beschriebenes Protein ist.
In einer diesbezüglichen Ausprägungsform ist an dem Multimer ein Signalgeber angeordnet, wobei insbesondere Signalgeber ein Fluoreszenzfarbstoff ist. Somit wird abermals eine einfache Möglichkeit zur Detektion der T-Zellenkonzentration bereitgestellt.
Um das Multimer durch Filtration oder Chromatographie zurück zu erhalten, kann das Multimer ein Ankerelement aufweisen. Zudem können diese Ankerelemente, wie auch bei den Ankerelementen für die Peptide, weitere Moleküle an das Multimer oder an das Peptid angekoppelt werden, um somit physikalisch, chemische oder mechanische Eigenschaften des Multimers oder des Peptids zu beeinflussen.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein Reagenz, insbesondere zu diagnostischen Zwecken, umfassend ein zuvor beschriebenes Protein oder ein zuvor beschriebenes Multimer und ein Peptid, insbesondere ein käufliches Peptid. Somit kann ein Reagenz bereitgestellt werden, in dem über das Peptid gesteuert wird, welcher spezifische T-Zellchip analysierbar sein soll. Zudem ist durch das Multimer und das Protein ein Aufnahmemolekül geschaffen worden, in welches das Peptid einbringbar ist.
Um im Ärzte- oder Krankenhauslabor zügige Analysen in Bezug auf eine T-Zellkonzentration zur Verfügung zu stellen, kann in einem weiteren Aspekt der Erfindung die Aufgabe gelöst werden durch ein Kit, zum Analysieren einer T-Zellen-Frequenz umfassend ein erstes Aufbewahrungsmittel mit einem zuvor beschriebenen Protein und/oder einem zuvor beschriebenen Multimer und einem zweiten Aufbewahrungsmittel mit einem Peptid, wobei die Inhalte der Aufbewahrungsmittel insbesondere händisch zusammenführbar sind. Auch in diesem Falle kann das Peptid ein käufliches Peptid sein.
Weiterhin kann das Kit auch eine Reihe von verschiedener Peptidauswahl bereit stellen. Kann das Kit MHC-Klasse-I Moleküle mit unterchiedlichen Allelen aufweisen.
In einem zusätzlichen Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst, durch ein Verfahren zur Frequenzanalyse von T-Zellen, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist

– ein Zusammenführen eines zuvor beschriebenen Proteins und/oder eines zuvor beschriebenen Multimers mit einem Peptid, sodass sich ein Reagenz ausbildet,
– ein Zusammenführen des Reagenz mit einer Zellprobe, sodass das Reagenz mit spezifischen Elementen der Zellprobe komplexiert.

Dabei können die Zellproben insbesondere Blutproben von Menschen, Tieren, insbesondere Säuger bis zum Knorpelfisch umfassen.
Komplexieren in diesem Zusammenhang bedeutet: die spezifische Bindung des Reagenz durch Wechselwirkungen zwischen den atomaren Elementen von Reagenz und Zellprobe, insbesondere ionische Bindungen, hydrophobe Wechselwirkungen und Wasserstoffbrücken.
In einer diesbezüglichen Ausprägungsform des Verfahrens erfolgt nach dem Zusammenführen der Reagenz mit der Zellprobe ein Detektieren des Signalgebers. Dabei kann das Detektieren des Signalgebers unter anderem mittels Durchflusszytometrie und Mikroskopie geschehen.
Um ein schnelles und effektives Analyseergebnis zu erhalten, kann bei dem Verfahren vor dem Zusammenführen der Reagenz mit der Zellprobe die Zellprobe aufgereinigt werden, wobei dies insbesondere durch eine Dichtegradientenzetrifugation erfolgt.
Um die unterschiedlichen Varianten der in der Probe vorliegenden MHC-Klasse-I-Moleküle zu bestimmen, kann anfänglich ein Bestimmen der MHC-Klasse-I-Moleküle erfolgen, wobei insbesondere Allele der MHC-Klasse-I-Moleküle bestimmt werden. Dieses Bestimmen erfolgt insbesondere durch die Bestimmung der Gensequenzen für MHC-Klasse I-Moleküle durch Polymerase-Kettenreaktion, insbesondere wie beschrieben in US Pat. 5451512 „Methods and reagents for HLA class I A locus DNA typing„, Raymond J. Apple et al, und US Pat. 5550039 , „Oligonucleotide primers for HLA class I B locus DNA typing„, Elizabeth A. Trachtenberg.
Um die T-Zellen als Trennergebnis einer Zellprobe zu erhalten, kann die Aufgabe gelöst werden durch ein Verfahren zum Abtrennen von T-Zellen aus einer Zellprobe umfassend die Schritte

– ein Zusammenführen eines zuvor beschriebenen Peptids und/oder eines zuvor beschriebenen Multimers mit einem Peptid, sodass sich ein Reagenz ausbildet
– ein Zusammenführen der Reagenz mit einer Zellprobe, sodass das Reagenz mit spezifischen Elementen der Zellprobe zu einem Komplex zusammengefügt wird
– ein Abtrennen des Komplexes, insbesondere mittels chromatographischer Verfahren.

Reagenz und Zellprobe entsprechen den zuvor beschriebenen Definitionen, wobei nach Durchführung dieses Verfahrens sowohl die abgetrennten T-Zellen als Trennergebnis als auch der Rest der Zellprobe der zuvor vorgelegten Zellprobe vorliegt.
In einer besondere Ausprägungsform des Verfahrens weist der Komplex ein Ankerelement auf und das Abtrennen erfolgt unter einem Verwenden des Ankerelements. Somit können die Retentionsgeschwindigkeiten beeinflusst werden.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst, durch eine Dialysemaschine, welche so eingerichtet ist, dass das zuvor beschriebene Trennergebnis oder der zuvor beschriebene Rest vorliegt.
Im Weiteren wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen unter Zuhilfenahme der 1 näher erläutert.
Dabei zeigt die einzige 1 eine schematische räumliche Abbildung eines MHC-Klasse-I Moleküls mit eingebrachten Peptid.
Der Gegenstand der Erfindung ist eine neuartige Mutation in MHC-Klasse-I-Molekülen 100, die bisher in der Literatur nicht beschrieben wurde. Sie besteht in der Veränderung der Aminosäuren 139 (gewöhnlich Alanin) einerseits und entweder 84 oder 85 (gewöhnlich Tyrosine) andererseits. Diese Aminosäuren werden durch Veränderung der Gensequenz zu Cysteinen mutiert.
Dadurch bildet sich bei der Faltung des Proteins eine Disulfidbrücke 110 zwischen Cys-139 und Cys-84 bzw. Cys-85. Diese Disulfidbrücke 110 wirkt stabilisierend auf die ALPHA-1 Helix 170 und die ALPHA-2 Helix 150, so dass für die Rückfaltung des Proteins in vitro kein Peptid 190 erforderlich ist, und das peptidfreie Klasse-I-Molekül in Lösung stabil bleibt.
Dadurch können Klasse I-Oligomere ohne Peptid hergestellt und vertrieben werden. Wenn die Oligomere dann gebraucht werden sollen, kann das Peptid direkt zugegeben werden, und man erhält ein gebrauchsfertiges Klasse I-Oligomer-Reagenz mit entsprechendem Peptid. Die Spezifität dieser Disulfid-Oligomere für die T-Zell-Rezeptoren ist identisch der Spezifität der Wildtyp-Oligomere.
Die Erfindung erstreckt sich auf die MHC-Klasse I-Allele, die in den Genloci für HLA-A, HLA-B und HLA-C kodiert sind. Sie erstreckt sich auch auf die Klasse I – ähnlichen Moleküle, die im MHC kodiert sind und ebenfalls Peptide binden, d. h. HLA-E und HLA-G.
Folgende Anwendungen sind mit der Erfindung realisierbar Tetramere, Pentamere, andere Oligomere zur Färbung von spezifischen T-Zellen. MHC-Oligomere zur Isolierung von CTL bestimmter Spezifitäten. Immobilisierung der MHC-Monomere oder Oligomere auf festen Körpern (Kapseln oder Partikeln im Mikro- oder Nanometer-Größenbereich) zwecks spezifischer Stimulation der Immunantwort
Beschreibung der Herstellung eines MHC-Klasse I-Tetramers
1) Mutagenese.

a) Zur Anbringung der Biotinylierungssequenz LAAIFEAQKIEWR an den C-Terminus des rekombinanten Proteins wird von einem Klasse I-Expressionsplasmid eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt. Der Vorwärtsprimer hat die Sequenz 5' x-y 3', wobei x die Schnittsequenz eines Restriktionsenzyms und y den Beginn des Genes des Klasse I-Moleküls (20 Basenpaare) darstellt. Der Rückwärtsprimer hat die Sequenz 5' e-TTAACGATGATTCC-ACACCATTTTCTGTGCATCCAGAATATGATGCAGGGATCC-f 3', wobei e die Schnittsequenz eines Restriktionsenzyms und f eine Sequenz darstellt, die komplementär zum Ende des Gens des Klasse I-Moleküls ist, aber das Stop-Codon nicht beinhaltet.
b) Das PCR-Produkt wird in einen Expressionsvektor kloniert, der einen T7-Promoter enthält, insbesondere durch Zuschneiden der Enden des PCR-Produkts mit Restriktionsenzymen und Zuschneiden der Enden des Expressionsvektors mit Restriktionsenzymen, die zu den Enden des PCR-Produkts passende Überhangsequenzen erzeugen, und anschließende Ligation des PCR-Produkts in den Expressionsvektor mit Hilfe des Enyzms Ligase; oder durch Klonierung des PCR-Produkts in einen Expressionsvektor mit Hilfe eines handelsüblichen PCR-Klonierungskits, insbesondere einen TOPO TA Kit der Firma Invitrogen, oder einen CloneJet Kit der Firma Fermentas. Die Sequenz des Produkts wird dann durch Sequenzieren verifiziert.
c) Um die Disulfid-Mutanten herzustellen, wird zunächst die Aminosäure 139 zu einem Cystein mutiert. Dies geschieht durch sog. QuikChange-Mutagenese (Kit, Stratagene; U.S. Patent No. 5,789,166 , 5,932,419 , 6,391,548 , 7,132,265 , 7,176,004 , 5,286,632 ). Dabei wird das Expressionsplasmid durch zwei überlappende gegenläufige Primer (insbesondere für das murine MHC-Klasse I-Molekül H-2D^b die Primer 5'-tgaaaacgtggacggcagctgacatgtgtgcgcagatcacccgac-3' und 3'-acttttgcacctgccgtcgactgtacacacgcgtctagtgggctg-5'), die am Ort der erwünschten Mutation im Sinne der erwünschten Mutation von der ursprünglichen Gen-Sequenz abweichen, mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert. Das im Reaktionsansatz verbleibende Plasmid mit der ursprünglichen Sequenz wird mit Hilfe des Restriktionsenzyms Dpn1 zersetzt, und das Reaktionsprodukt wird in kompetente E. coli-Zellen transformiert, insbesondere durch Herstellung kompetenter Zellen durch Behandlung von E. coli-Zellen mit Dimethylsulfoxid oder mit Calciumchlorid, Inkubation der behandelten Zellen mit dem Expressionsplasmid, und Selektion der so transformierten Zellen auf Agarplatten, denen das Antibiotikum beigegeben ist, das durch das Enzym, das durch das auf dem Expressionsplasmid vorhandene Resistenzgen kodiert ist, abgebaut wird. Die Sequenz des Produkts wird dann durch Sequenzieren verifiziert.
d) Als zweiten Schritt wird entweder die Aminosäure 84 oder die Aminosäure 85 zu einem Cystein mutiert. Dies geschieht durch sog. QuikChange-Mutagenese (Kit, Stratagene; U.S. Patent No. 5,789,166 , 5,932,419 , 6,391,548 , 7,132,265 , 7,176,004 , 5,286,632 ). Dabei wird das Expressionsplasmid durch zwei überlappende gegenläufige Primer (insbesondere für das murine MHC-Klasse I-Molekül H-2D^b und für die Mutation an Position 85 die Primer 5'-gcctgaggaacctcctaggctactgcaaccagagcgcg-3' und 5'-cgcgctctggttgcagtagcctaggaggttcctcaggc-3'), die am Ort der erwünschten Mutation im Sinne der erwünschten Mutation von der ursprünglichen Gen-Sequenz abweichen, mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert. Das im Reaktionsansatz verbleibende Plasmid mit der ursprünglichen Sequenz wird mit Hilfe des Restriktionsenzyms Dpn1 zersetzt, und das Reaktionsprodukt wird in kompetente E. coli-Zellen transformiert, insbesondere durch Herstellung kompetenter Zellen durch Behandlung von E. coli-Zellen mit Dimethylsulfoxid oder mit Calciumchlorid, Inkubation der behandelten Zellen mit dem Expressionsplasmid, und Selektion der so transformierten Zellen auf Agarplatten, denen das Antibiotikum beigegeben ist, das durch das Enzym, das durch das auf dem Expressionsplasmid vorhandene Resistenzgen kodiert ist, abgebaut wird.. Die Sequenz des Produkts wird dann durch Sequenzieren verifiziert.

2) Herstellung des Expressionsstamms.

a) Das Expressionsplasmid wird in einen E. coli-Expressionsstamm (z. B. BL21DE3(pLysS)) transformiert, insbesondere durch Herstellung kompetenter Zellen durch Behandlung von E. coli-Zellen mit Dimethylsulfoxid oder mit Calciumchlorid, Inkubation der behandelten Zellen mit dem Expressionsplasmid, und Selektion der so transformierten Zellen auf Agarplatten, denen das Antibiotikum beigegeben ist, das durch das Enzym, das durch das auf dem Expressionsplasmid vorhandene Resistenzgen kodiert ist, abgebaut wird.
b) Der Expressionsstamm wird als Flüssigkultur mit 20% Glycerol eingefroren und ist bei –80°C für mehrere Jahre lagerbar.

3) Produktion des Klasse-I-Proteins.

a) 20 ml LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikum (z. B. 100 μg/ml Ampicillin) werden mit 100 μl einer Vorkultur eines Expressionsstamms von Escherichia coli, der ein Plasmid mit einem Klasse-I-Gen (Disulfidmutante) trägt, inokuliert und bei 37°C in einem Schüttelinkubator über Nacht bis zur stationären Phase angezogen.
b) Die Kultur wird zentrifugiert (3000 × g, 10 Minuten, 25°C), der Überstand verworfen, und das Sediment (Zellen) zur Inokulation einer 1-Liter-Kultur desselben Mediums verwendet. Die Kultur wird in einem Schüttelinkubator bei 37°C bis zu einer Extinktion von 0.4–0.5 bei 600 nm Wellenlänge und 1 cm Küvettendurchmesser, die mit einem Spektrophotometer (ThermoSpectronic Genesys 10 UV) gemessen wird, gezogen.
c) Die Kultur wird mit Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) zu einer finalen Konzentration von 0.5 mM versetzt und dann unter den gleichen Bedingungen bis zu einer Extinktion von 1.0 bei 600 nm Wellenlänge und 1 cm Küvettendurchmesser, die mit einem Spektrophotometer (ThermoSpectronic Genesys 10 UV) gemessen wird, gezogen.
d) Die Kultur wird zentrifugiert (13000 × g, 10 Minuten, 25°C), der Überstand verworfen, und das Sediment in 20 ml Saccharoselösung resuspendiert (25 Gew.-% Saccharose, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 10 mM Dithiothreitol (DTT), 10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris), pH 8.0). Dis Suspension wird in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen transferiert und im Gefrierschrank eingefroren.
e) Zell-Lyse: Das Zentrifugenröhrchen mit der Zellsuspension wird im 30°C-Wasserbad unter Schütteln aufgetaut. Nach dem Auftauen wird auf Eis oder im Kühlraum weitergearbeitet.
f) Fragmentierung der DNA: Die Suspension wird mit der Sonde eines Ultraschallgeräts beschallt, solange bis sie nach Anschauung nicht mehr viskos ist.
g) Die Suspension wird zentrifugiert (40000 × g, 15 Minuten, 4°C), der Überstand verworfen, und das Sediment durch Beschallung in 20 ml Detergens-Puffer resuspendiert (25 Gew.-% Saccharose, 1 Vol.-% Triton X-100, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 50 mM Tris, pH 8.0).
h) Die Suspension wird zentrifugiert (40000 × g, 15 Minuten, 4°C), der Überstand verworfen, und das Sediment durch Beschallung in 20 ml Harnstoffpuffer resuspendiert (2 M NaCl, 2 M Harnstoff, 2 mM DTT, 25 mM Tris pH 8.4).
i) Die Suspension wird zentrifugiert (40000 × g, 15 Minuten, 4°C), der Überstand verworfen, und das Sediment durch Beschallung in 20 ml TBS resuspendiert (150 mM NaCl, 0.5 mM PMSF, 20 mM Tris pH 7.5).
j) Die Suspension wird zentrifugiert (40000 × g, 15 Minuten, 4°C), der Überstand verworfen, und das Sediment durch Beschallung in 10 ml Denaturierungslösung resuspendiert (8 M Harnstoff, 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazin-ethansulfonsäure (HEPES), 100 μM β-mercaptoethanol, pH 6.5), und die Suspension für 48 Stunden bei 4°C unter leichtem Schütteln inkubiert.
k) Die Suspension wird zentrifugiert (40000 × g, 15 Minuten, 4°C). Das Sediment wird verworfen und die Zentrifugation wiederholt. Das Sediment wird wiederum verworfen und die klare Lösung durch einen 0.22 μm – Filter filtriert, aliquotiert und bei –20°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Die Proteinkonzentration wird duch Messung der Extinktion bei 280 nm gegen Wasser bestimmt. Der Extinktionskoeffizient ε eines Klasse-I-Moleküls unter diesen Bedingungen beträgt etwa 85000 M^–1cm^–1.
l) Auf die hier beschriebene Weise werden entweder die schwere Untereinheit von MHC Klasse I und die leichte Untereinheit (beta-2 microglobulin, β₂m) getrennt in zwei verschiedenen Ansätzen hergestellt (um später bei der Rückfaltung gemischt zu werden), oder ein Fusionsprotein aus der schweren und der leichten Kette wird entsprechend als einziges Protein hergestellt.

4) Rückfaltung des Klasse-I-Proteins.

a) Ein Liter Rückfaltungspuffer (100 mM Tris-Cl pH 8.0, 0.5 M Arginin, 2 mM EDTA, 0.5 mM oxidiertes Glutathion, 5 mM reduziertes Glutathion) wird unter Rühren bei 4°C tropfenweise mit entweder 10 mg denaturiertem β₂m und 30 mg denaturierter schwerer Untereinheit oder mit 20 mg eines Fusionsproteins aus der schweren und der leichten Kette in Denaturierungslösung versetzt. Die Lösung wird 12 Stunden weiter gerührt.
b) Die Lösung wird in einem Druckfiltrationsgerät auf etwa 100 ml und dann in einem zentrifugalen Konzentrationsgerät (Trenngrenze: 30000 Da) auf etwa 1 ml konzentriert und dann zentrifugiert (16000 × g, 4°C, 15 min); das Sediment wird verworfen.
c) Der Überstand wird filtriert (0.22 μm) und auf eine in TBS (150 mM NaCl, 25 mM Tris-Cl pH 7.5) äquilibrierte Gelfiltrationssäule (z. B. GE Healthcare HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade) aufgetragen. Der Peak des rückgefalteten Klasse I-Moleküls wird durch Analyse der Proben mit SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese identifiziert: er enthält sowohl schwere als auch leichte Kette und weist ein apparentes Molekulargewicht von etwa 60000 Da auf.
d) Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt. Die Proteinkonzentration wird wie oben bestimmt.

5) Herstellung eines Klasse I-Tetramers.

a) Rückgefaltete Klasse I-Proteine werden in einer Konzentration von 5 μM in Biotinylierungspuffer (50 mM Tris-Cl pH 7.4; 150 mM NaCl; 1 mM Biotin; 5 mM Adenosintriphosphat; 5 mM MgCl₂) aufgenommen und mit 0.1 μM rekombinanten BirA-Biotinylierungsenzym versetzt. Die Reaktion wird für 12 Stunden bei 25°C inkubiert.
b) Die Tetramerisierung wird durch Zugabe von 20 μM fluoreszenzmarkiertem Avidin oder Streptavidin (z. B. phycoerythrin-UltraAvidin, Leinco) induziert, und die Reaktion wird für 15 Minuten bei 4°C inkubiert.
c) Die Tetramer-Komplexe werden durch Gelfiltration mit einer Superdex S-200 Säule (in TBS (25 mM Tris-Cl pH 7.4; 150 mM NaCl) äquilibriert) gereinigt.
d) Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt. Die Proteinkonzentration wird wie oben bestimmt.

6) Zugabe des Peptids.

a) Um ein peptidgebundenes Tetramer zu erhalten, wird eine Lösung des Tetramers in TBS mit 10 μM des entsprechenden Peptids versetzt. Die Reaktion wird bei 25°C für 15 Minuten inkubiert.
b) Falls erforderlich, werden die Peptid-Tetramer-Komplexe durch Gelfiltration mit einer Superdex S-200 Säule (in TBS äquilibriert) gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt. Die Proteinkonzentration wird wie oben bestimmt.

7) Reaktion des Tetramers mit T-Zellen und Zytofluorimetrie.

a) 200 000 isolierte T-Zellen (die Zahl wird mit Hilfe einer Neugebauer-Zählkammer unter dem Mikroskop bestimmt) werden in 1 ml FACS-Puffer (TBS plus 2% fötalem Kälberserum und 5 mM NaN₃) mit gereinigtem Peptid-Tetramer-Komplex zu einer finalen Konzentration von 0.5 mg/ml versetzt. Die Reaktion wird bei 4°C für eine Stunde inkubiert.
b) Die Zellen werden zentrifugiert (800 × g, 5 Minuten, 4°C) und der Überstand entfernt. Die Zellen werden zweimal mit FACS-Puffer gewaschen und dann in Fixierungspuffer (PBS, 2% Paraformaldehyd) resuspendiert.
c) Zytofluorimetrie erfolgt mit einem handelsüblichen Gerät (z. B. BectonDickinson FACSAria).

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 2003/0228258 A1 [0009]
US 5451512 [0045]
US 5550039 [0045]
US 5789166 [0056, 0056]
US 5932419 [0056, 0056]
US 6391548 [0056, 0056]
US 7132265 [0056, 0056]
US 7176004 [0056, 0056]
US 5286632 [0056, 0056]

Claims

Gen, welches für ein MHC-Klasse-I Molekül codiert ist, wobei das MHC-Klasse-I Molekül eine ALPHA-1 Helix und eine ALPHA-2 Helix aufweist und das Gen so codiert ist, dass eine Verbindung zwischen der ALPHA-1 Helix und ALPHA-2 Helix in dem MHC-Klasse-I Molekül ausgebildet ist.
Gen nach Anspruch 1, wobei ein Abstand zwischen der ALPHA-1 Helix und der ALPHA-2 Helix zwischen 2 und 10 Angström, insbesondere zwischen 2 und 5 Angström, durch die Verbindung überbrückt wird.
Gen nach Anspruch 1, wobei die Verbindung Disulfidbrücke ist.
Gen, nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Molekül einen Platzhalter für ein Peptid zwischen der ALPHA-1 Helix und der ALPHA-2 Helix aufweist und die Verbindung den Platzhalter freihält, sodass das Peptid in den Platzhalter einführbar ist.
Plasmid, welches ein Gen nach einem der vorherigen Ansprüche aufweist.
Plasmid nach Anspruch 5, wobei das so Plasmid ausgestaltet ist, dass eine Transkription des Gens realisierbar ist.
Expressionssystem, wobei das Expressionssystem das Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 aufweist und das Expressionssystem ein Protein erzeugt.
Expressionssystem nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch eine Bakterienzelle, insbesondere eine E. Coli-Zelle, eine Hefezelle, insbesondere S. Cerevisiae-Zelle, eine Insektenzelle, insbesondere S. Frugiperda-Zelle, Säugerzelle, insbesondere CHO-Zelle, ein zellfreies Expressionssystem, insbesondere als Retikulozyten-Lysat ausgestaltet.
Expressionssystem, welches mehrere Zellen, insbesondere eine Anzahl von Zellen in einer Größenordnung von 10^6 Zellen, aufweist.
Protein, welches durch ein Verwenden des Expressionssystems nach einem der Ansprüche 7 bis 9 hergestellt ist.
Protein nach Anspruch 10, wobei an dem Protein ein Signalgeber angeordnet ist, wobei insbesondere der Signalgeber ein Fluoreszenzfarbstoff ist.
Protein nach einem der Ansprüche 10 bis 11, wobei das Protein ein Ankerelement aufweist.
Multimer, insbesondere Tetramer und/oder Pentamer, welches mindestens zwei Proteine aufweist, wobei wenigstens ein Protein ein Protein nach einem der Ansprüche 10 bis 12 ist.
Multimer nach Anspruch 13, wobei an dem Multimer ein Signalgeber angeordnet ist, wobei insbesondere der Signalgeber ein Fluoreszenzfarbstoff ist.
Multimer nach einem der Anspruch 13 oder 14, wobei das Multimer ein Ankerelement aufweist.
Reagenz, insbesondere zu diagnostischen Zwecken, umfassend ein Protein nach einem der Ansprüche 10 bis 12 und/oder ein Multimer nach einem der Ansprüche 13 bis 15 und ein Peptid, insbesondere ein käufliches Peptid.
Kit zum Analysieren einer T-Zellen-Frequenz umfassen einem ersten Aufbewahrungsmittel mit einem Protein nach einem der Ansprüche 10 bis 12 und/oder ein Multimer nach einem der Ansprüche 13 bis 15 und einem zweiten Aufbewahrungsmittel mit einem Peptid, wobei die Inhalte der Aufbewahrungsmittel insbesondere händisch zusammenführbar sind.
Analyseergebnis erhaltend durch ein Verfahren zur Frequenzanalyse von T-Zellen, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist – ein Zusammenführen eines Proteins nach Anspruch 10 und/oder eines Multimers nach Anspruch 11 mit einem Peptid, sodass sich ein Reagenz ausbildet – ein Zusammenführen der Reagenz mit einer Zellprobe, sodass das Reagenz mit spezifischen Elementen der Zellprobe komplexiert.
Analyseergebnis nach Anspruch 18, wobei nach dem Zusammenführen der Reagenz mit der Zellprobe ein Detektieren des Signalgebers erfolgt, insbesondere durch eine Durchflusszytometrie.
Analyseergebnis nach einem der Ansprüche 18 oder 19, wobei die Zellprobe vor dem Zusammenführen der Reagenz mit der Zellprobe aufgereinigt wird, wobei dies insbesondere durch eine Dichtegradientenzetrifugation erfolgt.
Analyseergebnis nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei anfänglich ein Bestimmen der MHC-Klasse-I-Moleküle erfolgt, wobei insbesondere Allele der MHC-Klasse-I-Moleküle bestimmt werden.
Trennergebnis oder Rest erhaltend durch ein Verfahren zum Abtrennen von T-Zellen aus einer Zellprobe umfassend die Schritte – ein Zusammenführen eines Peptids nach einem der Ansprüche 10 bis 12 und/oder ein Multimer nach einem der Ansprüche 13 bis 15 mit einem Peptid, sodass sich ein Reagenz ausbildet – ein Zusammenführen der Reagenz mit einer Zellprobe, sodass das Reagenz mit spezifischen Elementen der Zellprobe zu einem Komplex zusammenfügt wird, – ein Abtrennen des Komplexes, insbesondere mittels chromatographischer Verfahren.
Trennergebnis oder Rest nach Anspruch 22, wobei der Komplex ein Ankerelement aufweist und das Abtrennen unter einem Verwenden des Ankerelements erfolgt.
Dialysemaschine, welche so eingerichtet ist, dass das Trennergebnis oder der Rest nach einem der Ansprüche 22 oder 23 vorliegt.