DE60319745T2

DE60319745T2 - Modifizierte löslicher t-zellen-rezeptor

Info

Publication number: DE60319745T2
Application number: DE60319745T
Authority: DE
Inventors: Bent Abingdon JAKOBSEN; Meir Glick
Original assignee: Medigene Ltd
Current assignee: Immunocore Ltd
Priority date: 2003-02-22
Filing date: 2003-07-09
Publication date: 2009-04-23
Anticipated expiration: 2023-07-10
Also published as: WO2004074322A1; AU2003254443B2; DE60319745D1; GB0304068D0; CA2516702A1; JP4478034B2; NZ541596A; CA2516702C; EP1594896B1; ATE388964T1; US20070082362A1; CN1745099A; US7666604B2; CN100528897C; JP2007527191A; AU2003254443A1; EP1594896A1; ZA200506516B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft lösliche T-Zell-Rezeptoren (TCR), die CD1-Antigenkomplexe erkennen.
Hintergrund der Erfindung
Native TCRs
Wie zum Beispiel in WO 99/60120 beschrieben wird, vermitteln TCRs die Erkennung von spezifischen Haupt-Histokompatibilitätskomplex (MHC)-Petidkomplexen durch T-Zellen und sind als solche essentiell für das Funktionieren des zellulären Arms des Immunsystems.
Antikörper und TCRs sind die einzigen zwei Molekülarten, die Antigene auf eine spezifische Weise erkennen und daher ist der TCR der einzige Rezeptor für spezielle Peptid-Antigene, die in MHC präsentiert werden, wobei das fremde Peptid oft das einzige Zeichen einer Abnormalität innerhalb einer Zelle ist. T-Zell-Erkennung findet statt, wenn eine T-Zelle und eine Antigen-präsentierende Zelle (APC) in direktem physischen Kontakt stehen und wird durch Ligation von Antigen-spezifischen TCRs mit pMHC-Komplexen iniziiert.
Der native TCR ist ein heterodimeres Zelloberflächenprotein der Immunglobulin-Überfamilie, die mit invarianten Proteinen des CD3-Komplexes, der in die Vermittlung von Signaltransduktion involviert ist, assoziiert ist. TCRs treten in αβ- und γδ-Formen auf, die strukturell ähnlich sind, aber ziemlich unterschiedliche anatomische Lokalisierungen und vermutlich Funktionen aufweisen. Die MHC Klasse I- und Klasse II-Liganden sind auch Immunglobulin-Überfamilien-Proteine, aber sie sind auf die Antigenpräsentation spezialisiert, wobei sie einen hochpolymorphen Peptidbindungsort aufweisen, der es ihnen ermöglicht, eine vielseitige Gruppe von kurzen Peptidfragmenten auf der APC-Zelloberfläche zu präsentieren.
Es ist von zwei weiteren Proteinklassen bekannt, dass sie in der Lage sind, als TCR-Liganden zu wirken. (1) CD 1-Antigene sind MCH Klasse I verwandte Moleküle, deren Gene auf einem anderen Chromosom als die klassischen MHC Klasse I- und Klasse II-Antigene lokalisiert sind. CD1-Moleküle sind in der Lage, Peptid- und Nicht-Peptid-(z. B Lipid, Glycolipid) Anteile für T-Zellen auf eine Weise zu präsentieren, die analog zu konventionellen Klasse I- und Klasse II-MHC-pep-Komplexen ist. Siehe z. B. (Barclay et al. (1997), The Leucocyte Antigen Factsbook, 2. Ausgabe, Academic Press) und (Bauer (1997), Eur. J. Immunol. 27 (6) 1366–1373)). (2) Bakterielle Superantigene sind lösliche Toxine, die in der Lage sind, sowohl Klasse II-MHC-Moleküle wie auch eine Untergruppe von TCRs zu binden (Fraser (1989), Nature 339, 221–223). Viele Superantigene zeigen Spezifität für ein oder zwei V-beta-Segmente, während andere eine wahllosere Bindung zeigen. Auf jeden Fall sind Superantigene in der Lage, aufgrund ihrer Fähigkeit, Untergruppen von T-Zellen auf eine polyklonale Weise zu stimulieren, eine gesteigerte Immunreaktion hervorzurufen.
Der extrazelluläre Anteil von nativen heterodimären αβ-TCR besteht aus zwei Polypeptiden, von denen jedes eine Membranproximale konstante Domäne und eine Membran-distale variable Domäne aufweist (siehe 1). Jede der konstanten und variablen Domänen beinhaltet eine Disulfidbindung innerhalb der Kette. Die variablen Domänen enthalten die hochpolymorphen Schleifen, analog zu den Komplementaritäsbestimmenden Regionen (CDRs) von Antikörpern. CDR3 des TCRs tritt mit dem Peptid, das durch MHC präsentiert wird, in Wechselwirkung und die CDRs 1 und 2 treten mit dem Peptid und dem MHC in Wechselwirkung. Die Vielfältigkeit der TCR-Sequenzen wird über somatische Umordnung von gebundenen variablen (V), Diversitäts-(D), Verbindungs-(J) und konstanten Genen erzeugt. Funktionelle α-Ketten-Polypeptide werden durch umgeordnete V-J-C-Regionen gebildet, während β-Ketten aus V-D-J-C-Regionen bestehen. Die extrazelluläre konstante Domäne besitzt eine Membran-proximale Region und eine Immunglobulin-Region. Es gibt eine einzelne α-Kettenkonstante Domäne, bekannt als TRAC, und zwei verschiedene β-konstante Domänen, bekannt als TRBC1 und TRBC2 (IMGT Nomenklatur). Es gibt vier Aminosäureänderungen zwischen diesen β-konstanten Domänen, von denen drei innerhalb der Domänen liegen, die verwendet werden, um die einkettigen TCRs der vorliegenden Erfindung herzustellen. Diese Änderungen liegen alle innerhalb von Exon 1 von TRBC1 und TRBC2: N₄K₅ → K₄N₅ und F₃₇ → Y (IMGT-Nummerierung, Unterschiede TRBC1 → TRBC2), wobei die letzte Aminosäureänderung zwischen den zwei TCR-β-Ketten konstanten Regionen in Exon 3 von TRBC1 und TRBC2: V₁ → E liegt. Die Ausdehnung von jeder der TCR-extrazellulären Domänen ist etwas variabel. Ein Fachmann mit Bewanderung auf dem Fachgebiet kann jedoch einfach die Position der Domänengrenzen unter Verwendung eines Nachschlagewerkes, wie The T Cell Receptor Facts Book, Lefranc & Lefranc, Publ. Academic Press 2001, bestimmen.
Lösliche TCRs
Lösliche TCRs sind nützlich; nicht nur für den Zweck der Untersuchung spezifischer TCR-pMHC-Wechselwirkungen, sondern auch möglicherweise als ein diagnostisches Werkzeug, um Infektionen nachzuweisen, oder Autoimmunerkrankungsmarker nachzuweisen. Lösliche TCRs finden auch Anwendung bei der Färbung, z. B. um Zellen auf die Gegenwart eines bestimmten Peptid-Antigens, das in dem Kontext des MHC präsentiert wird, zu färben. Ähnlich können lösliche TCRs verwendet werden, um einen therapeutischen Wirkstoff, z. B. eine zytotoxische Verbindung oder eine immunstimulierende Verbindung, an Zellen, die ein bestimmtes Antigen präsentieren, abzugeben. Lösliche TCRs können auch verwendet werden, um T-Zellen zu inhibieren, z. B. diejenigen, die auf ein Autoimmun-Peptid-Antigen reagieren.
Proteine, die aus mehr als einer Polypeptid-Untereinheit bestehen und die eine Transmembran-Domäne aufweisen, können sich bei der Herstellung in löslicher Form als schwierig erweisen, da in vielen Fallen das Protein durch seine Transmembranregion stabilisiert wird. Dies ist der Fall bei den TCRs und es wird in der wissenschaftlichen Literatur wiedergespiegelt, die abgestumpfte Formen von TCR beschreiben, die entweder nur extrazelluläre Domänen oder extrazelluläre und zytoplasmatische Domänen enthalten, die durch TCR-spezifische Antikörper erkannt werden können (was darauf hinweist, dass der Teil des rekombinanten TCRs, der durch den Antikörper erkannt wird, korrekt gefaltet wurde), aber die nicht in einem guten Ertrag hergestellt werden können, die bei niedrigen Konzentrationen nicht stabil sind und/oder die keine MHC-Peptid-Komplexe erkennen können. In WO 99/60120 wird ein Überblick über diese Literatur gegeben.
Eine Anzahl von Papieren beschreibt die Herstellung von TCR-Heterodimeren, die die native Disulfidbrücke beinhalten, die die jeweiligen Untereinheiten verbindet (Garboczi et al. (1996), Nature 384 (6605): 134–41; Garboczi et al. (1996), J. Immunol. 157 (12): 5403–10; Chang et al. (1994), PNAS USA 91: 11408–11412; Davodeau et al. (1993), J. Biol. Chem. 268 (21): 15455–15460; Golden et al. (1997), J. Imm. Meth. 206: 163–169; US Patent Nr. 6080840 ). Obwohl solche TCRs durch TCR-spezifische Antikörper erkannt werden können, wurde jedoch von keinen gezeigt, dass sie ihren nativen Liganden bei irgendwelchen anderen als relativ hohen Konzentrationen erkennen und/oder sie waren nicht stabil.
In WO 99/60120 wird ein löslicher TCR beschrieben, der korrekt gefaltet ist, so dass er in der Lage ist, seinen nativen Liganden zu erkennen, der über einen Zeitraum stabil ist und der in vernünftigen Mengen hergestellt werden kann.
Dieser TCR umfasst eine TCR-α- oder γ-Ketten-extrazelluläre Domäne, die zu einer TCR-β- bzw. δ-Ketten-extrazellulären Domäne mit Hilfe eines Paares von C-terminalen Demerisationspeptiden, wie Leucin-Zippern, dimerisiert wurde. Diese Strategie der Herstellung von TCRs ist allgemein auf alle TCRs anwendbar.
Die Stabilisierung von Antikörper- und TCR-variablen Regionen durch die Einführung von Zwischenketten-Disulfidbindungen wird in US 6147203 diskutiert. Reiter et al., Immunity, 1995, 2: 281-287 , führt die Konstruktion eines löslichen Moleküls aus, das Disulfid-stabilisierte TCR α und β variable Domänen umfasst, von denen eine mit einer abgestumpften Form von Pseudomonas-Exotoxin (PE38) verbunden ist. Einer der angegebenen Gründe für die Herstellung dieses Moleküls war es, die inhärente Instabilität von einkettigen TCRs zu überwinden. Die Position der neuen Disulfidbindung in den TCR-variablen Domänen wurde über Homologie mit den variablen Domänen von Antikörpern identifiziert, in die diese zuvor eingeführt wurden (siehe z. B. Brinkmann et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7538–7542, und Reiter et al. (1994), Biochemistry 33: 5451–5459). Da es jedoch eine solche Homologie zwischen Antikörper- und TCR-konstanten Domänen nicht gibt, konnte eine solche Technik nicht angewendet werden, um geeignete Orte für neue Zwischenketten-Disulfidbingungen zwischen TCR-konstanten Domänen zu identifizieren.
WO 03/020763 offenbart Peptid-MHC-Bindungs-lösliche TCRs des gleichen grundlegenden Designs wie diejenigen der vorliegenden Erfindung und Verfahren für die Herstellung und Verwendung davon.
Die Expression in E. coli und darauf folgende Rückfaltung von löslichen TCR-Ketten aus den Maus UZ3-4 TCR wird in einer weiteren Studie diskutiert. (Pecorari et al. (1999), J. Mol. Biol. 285 (4): 1831–43). Die Ergebnisse dieser Studie legen nahe, dass die Entfernung der nativen zwischenmolekularen Calpha-Cbeta-Disulfid-Brückenbindung erforderlich war, um den Ertrag dieses löslichen TCRs zu verbessern.
Fremont et al. (1996), Curr. Opin. Immunol. 8: 93–100) stellt einen kurzen Überblick der Verfahren und Konstrukte bereit, die verwendet wurden, um lösliche TCRs herzustellen, und fasst die biophysikalischen Daten zusammen, die unter Verwendung dieser löslichen TCR-Konstrukte erzeugt wurden.
Die Wichtigkeit der löslichen PCRs gegeben, wäre es wünschenswert, einen alternativen Weg der Herstellung solcher Moleküle bereitzustellen. Spezifisch würde es wünschenswert sein, alternative lösliche TCRs bereitzustellen, die CD1-Antigenkomplexe, bakterielle Superantigene und Peptid-MHC/Superantigenkomplexe erkennen. Die TCRs der vorliegenden Erfindung stellen stabile, lösliche Polypeptide bereit, die in einer großen Vielzahl von prokaryoten und eukaryoten Expressionssystemen hergestellt werden können. Bakterielle Expression wird aus ökonomischen Gründen besonders bevorzugt.
Gemäß einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen löslichen T-Zell-Rezeptor (sTCR) bereit, der (i) alles oder einen Teil einer TCR-α-Kette mit Ausnahme der Transmembrandomäne davon und (ii) alles oder einen Teil einer TCR-β-Kette mit Ausnahme der Transmembranregion davon umfasst, wobei (i) und (ii) jeweils eine funktionelle variable Domäne und mindestens einen Teil der konstanten Domäne der TCR-Kette umfassen und über eine Disulfidbindung zwischen konstanten Domänen-Cysteinresten verbunden sind, substituiert für:
Thr 48 von Exon 1 von TRAC*01 und Ser 57 von Exon 1 von TRBC1*01 oder TRBC2*01, oder
Thr 45 von Exon 1 von TRAC*01 und Ser 77 von Exon 1 von TRBC1*01 oder TRBC2*01, oder
Tyr 10 von Exon 1 von TRAC*01 und Ser 17 von Exon 1 von TRBC1*01 oder TRBC2*01, oder
Thr 45 von Exon 1 von TRAC*01 und Asp 59 von Exon 1 von TRBC1*01 oder TRBC2*01, oder
Ser 15 von Exon 1 von TRAC*01 und Glu 15 von Exon 1 von TRBC1*01 oder TRBC2*01;
dadurch gekennzeichnet, dass der sTCR einen CD1-Antigenkomplex erkennt.
Die sTCRs der vorliegenden Erfindung haben den Vorteil, dass sie keine heterologen Polypeptide enthalten, die immunogen sein könnten, oder die dazu führen könnten, dass das sTCR schnell aus dem Körper entfernt wird. Darüber hinaus weisen TCRs der vorliegenden Erfindung eine dreidimensionale Struktur auf, die den nativen TCRs, von denen sie stammen, sehr ähnlich ist, und aufgrund dieser strukturellen Ähnlichkeit sind sie wahrscheinlich nicht immunogen.
TCRs der vorliegenden Erfindung sind löslich. In dem Zusammenhang dieser Anmeldung ist Löslichkeit als die Fähigkeit des TCRs definiert, als ein monodisperses Heterodimer in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) (KCL. 2,7 mM, KH₂PO₄ 1,5 mM, NaCl 137 mM und Na₂PO₄ 8 mM, pH 7,1–7,5. Life Technologies, Gibco BRL) in einer Konzentration von 1 mg/ml gereinigt zu werden, wobei über 90 des TCRs als ein monodisperses Heterodimer nach der Inkubation bei 25°C für 1 Stunde verbleibt. Um die Löslichkeit des TCRs zu beurteilen, wird es zuerst wie in Beispiel 2 beschrieben gereinigt. Nach dieser Reinigung werden 100 μg des TCRs durch analytische Größenausschluss-Chromatographie analysiert, z. B. unter Verwendung einer Pharmacia Superdex 75 HR-Säule, äquilibriert in PBS. Weitere 100 μg des TCRs werden bei 25°C für 1 Stunde inkubiert und dann durch Größenausschluss-Chromatographie wie zuvor analysiert. Die Größenausschluss-Spuren werden dann durch Integration analysiert und die Bereiche unter den Peaks, die zu dem monodispersen Heterodimer korrespondieren, werden verglichen. Die relevanten Peaks können durch Vergleich mit der Elutionsposition von Proteinstandards von bekanntem Molekulargewicht identifiziert werden. Das monodisperse, heterodimere, lösliche TCR weist ein Molekulargewicht von ungefähr 50 kDa auf. Wie oben angegeben wurde, sind die TCRs der vorliegenden Erfindung löslich. Wie jedoch detaillierter unten beschrieben wird, können die TCRs an einen Anteil gekoppelt sein, so dass der resultierende Komplex unlöslich ist, oder sie können auf der Oberfläche eines unlöslichen festen Trägers präsentiert werden.
Die Nummerierung der TCR-Aminosäuren, die hier verwendet wird, folgt dem IMGT-System, das in dem The T Cell Receptor Factsbook, 2001, LeFranc & LeFranc, Academic Press, beschrieben wird. In diesem System hat die α-Ketten konstante Domäne die folgende Bezeichnung: TRAC*01, wobei „TR" T-Zell-Rezeptorgen bedeutet; „A" α-Ketten-Gen bedeutet; C konstante Region bedeutet; und „*01" Allel 1 bedeutet. Die β-Ketten konstante Domäne hat die folgende Bezeichnung: TRBC1*01. In diesem Fall gibt es zwei mögliche konstante Region-Gene „C1" und „C2". Die translatierte Domäne, die durch jedes Allel kodiert wird, kann aus dem genetischen Code von verschiedenen Exons hergestellt werden; daher werden diese auch genauer bezeichnet. Aminosäuren werden gemäß dem Exon der speziellen Domäne, in der sie vorliegen, nummeriert.
Der extrazelluläre Anteil von nativen TCR besteht aus zwei Polypeptiden (αβ oder γδ), von denen jedes eine Membranproximale konstante Domäne und eine Membran-distale variable Domäne aufweist (siehe 1). Jede der konstanten und variablen Domänen beinhaltet eine Disulfidbindung innerhalb der Kette. Die variablen Domänen enthalten die hochpolymorphen Schleifen, analog zu den Komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) von Antikörpern. CDR3 des TCRs tritt mit dem Peptid in Wechselwirkung, das durch MHC präsentiert wird, und die CDRs 1 und 2 treten mit dem Peptid und dem MHC in Wechselwirkung. Die Vielfalt der TCR-Sequenzen wird über somatische Umordnung von verbundenen variablen (V), Diversitäts-(D), Verbindungs-(J) und konstanten Genen erzeugt. Funktionelle α-Ketten-Polypeptide werden durch umgeordnete V-J-C-Regionen gebildet, während β-Ketten aus V-D-J-C-Regionen bestehen. Die extrazelluläre konstante Domäne weist eine Membran-proximale Region und eine Immunglobulin-Region auf. Die Membran-proximale Region besteht aus dem Aminosäuren zwischen der Transmembrandomäne und dem Membran-proximalen Zysteinrest. Die konstante Immunglobulindomäne besteht aus dem Rest der konstanten Domänen-Aminosäurereste, wobei sie sich von dem Membranproximalen Cystein zu dem Beginn der Verbindungsregion erstreckt, und sie wird durch die Gegenwart einer Immunglobulin-artigen Faltung charakterisiert. Es gibt eine Einzel-α-Ketten konstante Domäne, bekannt als Cα1 oder TRAC*01, und zwei verschiedene β-konstante Domänen, bekannt als Cβ1 oder TRBC1*01 und Cβ2 oder TRCB2*01. Der Unterschied zwischen diesen zwei verschiedenen β-konstanten Domänen besteht in den Aminosäureresten 4, 5 und 37 von Exon 1. So weist TRBC1*01 4N, 5K und 37 in Exon 1 davon auf, und TRCB2*01 weist 4K, 5N und 37Y in Exon 1 davon auf. Die Ausdehnung von jeder der TCR-extrazellulären Domänen ist etwas variabel.
Bei der vorliegenden Erfindung wird die Disulfidbindung zwischen zwei Resten eingeführt, die in den konstanten Domänen (oder Teilen davon) der jeweiligen Ketten liegen. Die jeweiligen Ketten des TCRs umfassen ausreichend der variablen Domänen davon, um in der Lage zu sein, mit ihrem TCR-Ligand-Gegenstück (CD1-Antigenkomplex, Superantigen oder Superantigen/pMHC-Komplex) in Wechselwirkung zu treten – wenn er bindet. Solche Wechselwirkungen können unter Verwendung von BIAcore 3000^TM- oder BIAcore 2000^TM-Instrument gemessen werden. WO 99/6120 stellt detaillierte Beschreibungen der Verfahren bereit, die für die Analyse von TCR-Bindung an MHC-Peptidkomplexe erforderlich sind, und diese Verfahren sind ähnlich auf die Studien von TCR/CD1 und TCR/Superantigen Wechselwirkungen anwendbar. Um diese Verfahren auf die Studie von TCR/CD1 Wechselwirkungen anzuwenden, sind lösliche Formen von CD1 erforderlich, deren Produktion in (Bauer (1997), Eur. J. Immunol. 27 (6) 1366–1373) beschrieben wird.
Bei einer Ausführungsart umfassen die jeweiligen Ketten des sTCRs der Erfindung auch die Disulfidbindungen innerhalb der Ketten davon. Der TCR der vorliegenden Erfindung kann alles der extrazellulären Konstanten lg-Region der jeweiligen TCR-Ketten, und vorzugsweise alles der extrazellulären Domäne der jeweiligen Ketten, sprich einschließlich der Membranproximalen Region, umfassen. In nativen TCR gibt es eine Disulfidbindung, die die konservierten Membran-proximalen Regionen der jeweiligen Ketten verbindet. In einer Ausführungsart der vorliegenden Erfindung liegt diese Disulfidbindung nicht vor. Dies kann durch Mutation der geeigneten Cysteinreste (Aminosäure 4, Exon 2 des TRAC*01-Gens und Aminosäure 2 von sowohl des TRBC1*01- wie auch des TRBC2*01-Genes) zu einer anderen Aminosäure oder Abstumpfung der jeweiligen Ketten, so dass die Cysteinreste nicht mit eingeschlossen sind, erreicht werden. Ein bevorzugter löslicher TCR gemäß der Erfindung umfasst die nativen α- und β-TCR-Ketten, abgestumpft an dem C-Terminus, so dass die Cysteinreste, die die native Zwischenketten-Disulfidbindung bilden, ausgeschlossen sind, sprich abgestumpft an den Rest 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10-Resten N-terminal zu den Cysteinresten. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die native Zwischenketten-Disulfidbindung in TCRs der vorliegenden Erfindung vorliegen kann, und dass in bestimmten Ausführungsarten nur eine der TCR-Ketten den nativen Cysteinrest aufweist, der die native Interketten-Disulfidbindung bildet. Dieses Cystein kann verwendet werden, um Anteile an dem TCR anzubringen.
Die jeweiligen TCR-Ketten können jedoch kürzer sein. Da die konstanten Domänen nicht direkt in Kontakte mit den Peptid- MHC-Liganden involviert sind, kann der C-terminale Abstumpfungspunkt ohne Verlust der Funktionalität wesentlich verändert werden.
Alternativ kann ein größeres Fragment der konstanten Domänen vorliegen, als hier bevorzugt wird, sprich die konstanten Domänen müssen nicht direkt von den Cysteinen, die die Disulfidbindung zwischen den Ketten bilden, abgestumpft werden.
Zum Beispiel könnte die gesamte konstante Domäne mit Ausnahme der Transmembrandomäne (sprich die extrazellulären und zytoplasmatischen Domänen) mit eingeschlossen werden. Es könnte in diesem Fall vorteilhaft sein, einen oder mehr der Cysteinreste, die die Disulfidbindung zwischen den Ketten bilden, in dem zellulären TCR zu einem anderen Aminosäurerest zu mutieren, der nicht in die Disulfidbindungsbildung involviert ist, oder einen oder mehrere dieser Reste zu deletieren.
Das Signalpeptid kann ausgelassen werden, wenn der lösliche TCR in prokaryoten Zellen, z. B. E. coli, exprimiert werden soll, das in dem reifen TCR für seine Liganden-Bindungsfähigkeit keinen Zweck erfüllt und es kann in einigen Umständen die Bildung eines funktionsfähigen löslichen TCR verhindern. In den meisten Fällen wird der Spaltungsort, an dem das Signalpeptid von den reifen TCR-Ketten entfernt wird, vorhergesagt, aber nicht experimentell bestimmt. Die gentechnische Behandlung der exprimierten TCR-Ketten, so dass sie einige, sprich bis zu 10 zum Beispiel, Aminosäuren länger oder kürzer an dem N-terminalen Ende sind, dürfte keine Signifikanz für die Funktionalität (sprich die Fähigkeit, CD1 zu erkennen) des löslichen TCRs haben. Es könnten bestimmte Additionen, die in der ursprünglichen Proteinsequenz nicht vorliegen, hinzugefügt werden. Zum Beispiel könnte eine kurze Markierungssequenz, die bei der Reinigung der TCR-Ketten helfen kann, hinzugefügt werden, vorausgesetzt, dass sie die korrekte Struktur und Faltung des Antigen-Bindungsortes des TCRs nicht stört.
Für die Expression in E. coli kann ein Methioninrest an dem N-terminalen Ausgangspunkt der vorhergesagten reifen Proteinsequenz gentechnisch angebracht werden, um den Start der Translation zu ermöglichen.
Bei weitem nicht alle Reste in den variablen Domänen der TCR-Ketten sind für die Antigen-Spezifität und -Funktionalität essentiell. So kann eine signifikante Anzahl von Mutationen in diese Domänen eingeführt werden, ohne dass die Antigen-Spezifität und -Funktionalität beeinträchtigt wird. Bei weitem nicht alle Reste in konstanten Domänen von TCR-Ketten sind für die Antigen-Spezifität und -Funktionalität essentiell. So kann eine signifikante Anzahl von Mutationen in diese Region ohne Beeinträchtigung der Antigen-Spezifität eingeführt werden.
Die TCR-β-Kette enthält einen Cysteinrest, der in dem zellulären oder nativen TCR ungepaart ist. Wenn dieser Cysteinrest entfernt oder zu einem anderen Rest mutiert wird, wird es bevorzugt, unkorrekte Paarung innerhalb der Kette oder zwischen den Ketten zu vermeiden. Substitutionen dieses Cysteinrestes durch einen anderen Rest, z. B. Serin oder Alanin, kann einen signifikant positiven Effekt auf die Rückfaltungseffizienz in vitro aufweisen.
Die Disulfidbindung kann durch Mutation von Nicht-Cysteinresten auf den jeweiligen Ketten zu Cystein, und Veranlassung, dass die Bindung zwischen den mutierten Resten gebildet wird, gebildet werden. Reste, deren jeweilige β-Kohlenstoffe ungefähr 6 Å (0,6 nm) oder weniger, und vorzugsweise in dem Bereich 3,5 Å (0,35 nm) bis 5,9 Å (0,59 nm) in dem nativen TCR auseinanderliegen, werden bevorzugt, so dass eine Disulfidbindung zwischen Cysteinresten, die anstelle der nativen Reste eingeführt wurden, gebildet werden kann. Orte, wo Cysteine eingeführt werden können, um die Disulfidbindung zu bilden, sind die folgenden Reste in Exon 1 von TRAC*01 für die TCR-α-Kette und TRBC1*01 oder TRBC2*01 für die TCR-β-Kette:

TCR-α-Kette TCR-β-Kette Native β-Kohlenstoff-Trennung (nm)

Thr 48 Ser 57 0,473

Thr 45 Ser 77 0,533

Tyr 10 Ser 17 0,359

Thr 45 Asp 59 0,560

Ser 15 Glu 15 0,59
In einer Ausführungsart umfasst der sTCR die Gesamtheit der TCR-α-Kette, die N-terminal von Exon 2, Rest 4 von TRAC*01 ist (Aminosäurereste 1–182 der α-Kette gemäß der Nummerierung, die in Garboczi et al. verwendet wird) und die Gesamtheit der TCR-β-Kette, die N-terminal von Exon 2, Rest 2 von sowohl TRBC1*01 wie auch TRCB2*01 ist (Aminosäurereste 1–210 der β-Kette gemäß der Nummerierung, die in Garboczi et al. verwendet wird). Um die Disulfidbindung zu bilden, können Threonin 48 von Exon 1 in TRAC*01 (Threonin 158 der α-Kette gemäß der Nummerierung, die in Garboczi et al. verwendet wird) und Serin 57 von Exon 1 in sowohl TRBC1*01 wie auch TRBC2*01 (Serin 172 der β-Kette gemäß der Nummerierung, die in Garboczi et al. verwendet wird) jeweils zu Cystein mutiert werden. Diese Aminosäuren sind im β-Strang D der konstanten Domäne der α- bzw. β-TCR-Ketten lokalisiert.
Es sollte beachtet werden, dass in den 3a und 3b Rest 1 (gemäß der Nummerierung, die in Garboczi et al. verwendet wird) K bzw. N ist. Der N-terminale Methioninrest liegt nicht im nativen A6 Tax TCR vor und, wie oben erwähnt wurde, liegt manchmal vor, wenn die jeweiligen Ketten in bakteriellen Expressionssystemen hergestellt werden.
Da nun die Reste in menschlichen TCRs, die zu Cysteinresten mutiert werden können, um eine neue Zwischenketten-Disulfidbindung zu bilden, identifiziert wurden, werden diejenigen mit Bewanderung auf dem Fachgebiet in der Lage sein, jeden TCR auf die gleiche Weise in löslicher Form von diesem TCR mit einer neuen Zwischenketten-Disulfidbindung herzustellen. Bei Menschen braucht der Fachmann nur nach den folgenden Motiven in den jeweiligen TCR-Ketten zu schauen, um den Rest, der mutiert werden soll, zu identifzieren (der schattierte Rest ist der Rest für die Mutation zu einem Cystein).
Bei anderen Arten können die TCR-Ketten nicht eine Region haben, die eine 100% Identität zu den obigen Motiven aufweist. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird jedoch in der Lage sein, die obigen Motive zu verwenden, um den äquivalenten Teil der TCR-α- oder β-Kette und so den Rest, der zu Cystein mutiert werden soll, zu identifizieren. In dieser Hinsicht können Anordnungstechniken verwendet werden. Zum Beispiel kann ClustalW, erhältlich von der Europäischen Bioinformatik-Instituts-Webseite (http://www.ebi.ac.uk/index.html) verwendet werden, um die obigen Motive mit einer speziellen TCR-Kettensequenz zu vergleichen, um den relevanten Teil der TCR-Sequenz für die Mutation zu lokalisieren.
Die vorliegende Erfindung umfasst in ihrem Umfang menschliche Disulfid-gebundene αβ-TCRs, wie auch Disulfid-gebundene αβ-TCRs von anderen Säugern, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Maus, Ratte, Schwein, Ziege und Schaf. Wie oben erwähnt wurde, werden diejenigen mit Bewanderung auf dem Fachgebiet in der Lage sein, Orte zu bestimmen, die zu den oben beschriebenen menschlichen Orten, an denen Cysteinreste eingeführt werden können, um eine Disulfidbindung zwischen den Ketten zu bilden, äquivalent sind, zu bestimmen. Zum Beispiel zeigt das Folgende die Aminosäuresequenzen der Maus-Cα- und Cβ-löslichen Domänen, zusammen mit Motiven, die die Mausreste zeigen, die zu den menschlichen Resten äquivalent sind, die oben erwähnt wurden, die zu Cysteinen mutiert werden können, um eine TCR-Disulfidbindung zwischen den Ketten zu bilden (wo die relevanten Reste schattiert sind):
In einer bevorzugten Ausführungsart der vorliegenden Erfindung umfassen (i) und (ii) des TCRs jeweils die funktionelle variable Domäne eines ersten TCRs, fusioniert an die Gesamtheit oder einen Teil der konstanten Domäne eines zweiten TCRs, wobei der erste und zweite TCR von derselben Art stammt und die Disulfidbindung zwischen den Ketten zwischen Resten in der gesamten bzw. dem Teil der konstanten Domäne liegt, die in nativen TCR nicht vorliegen. In einer Ausführungsart sind der erste und zweite TCR menschlich. In anderen Worten wirken die Disulfidbindungs-verbundenen konstanten Domänen als ein Gerüst, an das variable Domänen fusioniert werden können. Der resultierende TCR wird im Wesentlichen identisch zu dem nativen TCR sein, von dem der erste TCR erhalten wird. Solch ein System erlaubt die einfache Expression von irgendeiner funktionellen variablen Domäne auf einem stabilen konstanten Domänengerüst.
Die konstanten Domänen des A6 Tax sTCRs, das oben beschrieben wird, oder tatsächlich die konstanten Domänen von irgendeinem der mutierten αβ-TCRs mit einer neuen Disulfidbindung zwischen den Ketten, die oben beschrieben wurden, können als ein Gerüst verwendet werden, auf das heterologe variable Domänen fusioniert werden können. Es wird bevorzugt, dass das Fusionsprotein so viel wie möglich der Konformation der heterologen variablen Domänen behält. Es wird daher bevorzugt, dass heterologe variable Domänen an die konstanten Domänen an irgendeinem Punkt zwischen den eingeführten Cysteinresten und dem N-Ende der konstanten Domäne gebunden werden. Für den A6 Tax TCR sind die eingeführten Cysteinreste auf den α- und β-Ketten vorzugsweise an Threonin 48 von Exon 1 in TRAC*01 (Threonin 15,8 der α-Kette gemäß der Nummerierung, die in Garboczi et al. verwendet wird) bzw. Serin 57 von Exon 1 in sowohl TRBC1*01 wie auch TRBC2*01 (Serin 172 der β-Kette gemäß der Nummerierung, die in Garboczi et al. verwendet wird) lokalisiert. Es wird daher bevorzugt, dass die heterologen α- und β-Ketten-variable Domänenanbringungspunkte zwischen den Resten 48 (148 gemäß der Nummerierung, die in Garboczi et al. verwendet wird) oder 58 (173 gemäß der Nummerierung, die in Garboczi et al. verwendet wird) und dem N-Terminus der α- bzw. β-konstanten Domänen liegen.
Die Reste in den konstanten Domänen der heterologen α- und β-Ketten, die zu den Anbringungspunkten in dem A6 Tax TCR korrespondieren, können durch Sequenzhomologie identifiziert werden. Das Fusionsprotein wird vorzugsweise so konstruiert, dass es die gesamte heterologe Sequenz N-terminal zu dem Anbringungspunkt beinhaltet.
Wie unten detaillierter diskutiert wird, kann der sTCR der vorliegenden Erfindung mit einem Anteil an seinem C- oder N-Ende derivatisiert oder fusioniert werden. Das C-Ende wird bevorzugt, da dies distal von der Bindungsdomäne liegt. Bei einer Ausführungsart kann eine oder beide der TCR-Ketten mit einem Cysteinrest an ihrem C- und/oder N-Ende mit solch einem Anteil fusioniert werden.
Ein löslicher TCR (der vorzugsweise menschlich ist) der vorliegenden Erfindung kann in im Wesentlichen reiner Form oder als gereinigtes oder isoliertes Präparat bereitgestellt werden. Jeder aus der Vielzahl der löslichen PCRs ist vorzugsweise identisch.
Bei einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren für den Nachweis eines CD1-Antigens bereit, wobei das Verfahren umfasst:

(i) Bereitstellung eines löslichen T-Zell-Rezeptors oder eines multivalenten T-Zell-Rezeptorkomplexes, wie er hier beschrieben wird;
(ii) Kontaktieren des löslichen T-Zell-Rezeptors oder multivalenten TCR-Komplexes mit dem CD1-Antigen und
(iii) Nachweis der Bindung des löslichen T-Zell-Rezeptors oder multivalenten TCR-Komplexes an das CD1-Antigen.

In dem multivalenten Komplex der vorliegenden Erfindung können die TCRs in der Form von Multimeren vorliegen und/oder können auf einer Lipid-Doppelschicht vorliegen oder damit assoziiert sein, z. B. einem Liposom.
In seiner einfachsten Form umfasst ein multivalenter TCR-Komplex gemäß der Erfindung ein Multimer aus zwei oder drei oder vier oder mehr T-Zell-Rezeptormolekülen, assoziiert (z. B. kovalent oder anderweitig gebunden) miteinander, vorzugsweise über ein Linkermolekül. Geeignete Linker-Moleküle beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf, multivalente Anbringungsmoleküle, wie Avidin, Streptavidin, Neutravidin und Extravidin, von denen jedes vier Bindungsorte für Biotin aufweist. So können biotinylierte TCR-Moleküle zu Multimeren von T-Zell-Rezeptoren mit einer Vielzahl von TCR-Bindungsorten geformt werden. Die Anzahl von TCR-Molekülen in dem Multimer wird von der Quantität von TCR im Verhältnis zu der Quantität von Linkermolekül, das verwendet wird, um die Multimere herzustellen, und auch von der Gegenwart oder Abwesenheit von irgendwelchen anderen biotinylierten Molekülen abhängen. Bevorzugte Multimere sind dimere, trimere oder tetramere PCR-Komplexe.
Strukturen, die ein gutes Stück größer sind als TCR-Tetramere, können bei der Verfolgung von oder Zielrichtung auf Zellen, die CD1-Antigenkomplexe exprimieren, verwendet werden. Vorzugsweise liegen die Strukturen in dem Bereich von 10 nm bis 10 μm im Durchmesser. Jede Struktur kann multiple TCR-Moleküle in einer ausreichenden Entfernung voneinander aufweisen, um es zwei oder mehr TCR-Molekülen auf der Struktur zu ermöglichen, simultan an zwei oder mehr CD1- Antigenkomplexe auf einer Zelle zu binden, und dadurch die Avidität des multimeren Bindungsanteils für die Zelle zu steigern.
Geeignete Strukturen für die Verwendung in der Erfindung beinhalten Membranstrukturen, wie Liposome, und feste Strukturen, die vorzugsweise Teilchen wie Kügelchen sind, z. B. Latexkügelchen. Andere Strukturen, die extern mit T-Zell-Rezeptormolekülen beschichtet sein können, sind auch geeignet. Vorzugsweise werden die Strukturen lieber mit T-Zell-Rezeptormultimeren als mit individuellen T-Zell-Rezeptormolekülen beschichtet.
In dem Fall von Liposomen können die T-Zell-Rezeptormoleküle oder Multimere davon an die Membran angebracht oder anders assoziiert werden. Techniken dafür sind demjenigen mit Bewanderung auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Eine Markierung oder ein anderer Anteil, wie ein toxischer oder therapeutischer Anteil, können in einen multivalenten TCR-Komplex der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen werden. Zum Beispiel kann der Marker oder der andere Anteil in ein gemischtes Molekülmultimer mit eingeschlossen sein. Ein Beispiel für ein solches multimeres Molekül ist ein Tetramer, das drei TCR-Moleküle und ein Peroxidasemolekül enthält. Dies könnte durch Mischung des TCRs und des Enzyms in einem molaren Verhältnis von 3:1, um tetramere Komplexe zu erzeugen, und Isolierung des erwünschten Komplexes aus irgendwelchen Komplexen, die nicht das korrekte Molekülverhältnis enthalten, erreicht werden. Diese gemischten Moleküle könnten eine Kombination aus Molekülen enthalten, vorausgesetzt, dass sterische Hinderung nicht oder nicht signifikant die erwünschte Funktion des Moleküls behindert. Die Positionierung der Bindungsorte auf dem Streptavidin-Molekül ist für gemischte Tetramere geeignet, da sterische Hinderung wahrscheinlich nicht auftritt.
Alternative Mittel für die Biotinylierung des TCRS können möglich sein. Zum Beispiel kann chemische Biotinylierung verwendet werden. Alternative Biotinylierungsmarkierungen können verwendet werden, obwohl bestimmte Aminosäuren in der Biotin-Markierungssequenz essentiell sind (Schatz (1993), Biotechnology N Y 11 (10): 1138–43). Die Mischung, die für Biotinylierung verwendet wird, kann auch variiert werden. Das Enzym erfordert Mg-ATP und niedrige ionische Stärke, obwohl diese beiden Bedingungen variiert werden können, z. B. kann es möglich sein, eine höhere ionische Stärke und eine längere Reaktionszeit zu verwenden. Es kann möglich sein, ein anderes Molekül als Avidin oder Streptavidin zu verwenden, um Multimere des PCRs zu bilden. Jedes Molekül, das Biotin auf eine multivalente Weise bindet, könnte geeignet sein. Alternativ könnte eine vollständig andere Bindung angewendet werden (wie Polyhistidin-Markierung an chelatiertes Nickeleisen (Quiagen Product Guide 1999, Kapitel 3 „Protein Expression, Purification, Detection and Assay", S. 35–37). Vorzugsweise ist diese Markierung in Richtung des C-Endes des Proteins lokalisiert, um die Menge an sterischer Hinderung bei der Wechselwirkung mit dem Gegenstück-TCR-Liganden zu minimieren.
Ein oder beide der TCR-Ketten können mit einem nachweisbaren Marker markiert sein, z. B. einem Marker, der für diagnostische Zwecke geeignet ist. So stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines CD1-Antigenkomplexes bereit, wobei das Verfahren das Kontaktieren des CD1-Antigenkomplexes mit einem TCR oder multimeren TCR-Komplex gemäß der Erfindung, der für den CD1-Antigen-Komplex spezifisch ist, und den Nachweis der Bindung des TCRS oder multimeren TCR-Komplexes an den CD1-Antigenkomplex umfasst. In tetrameren TCR, das unter Verwendung von biotinylierten Heterodimeren gebildet wurden, kann fluoreszierendes Streptavidin (kommerziell erhältlich) verwendet werden, um einen nachweisbaren Marker bereitzustellen. Ein fluoreszierend markiertes Tetramer ist für die Verwendung in FACS-Analyse geeignet, z. B. um Antigen-präsentierende Zellen, die das Peptid tragen, für das der TCR spezifisch ist, nachzuweisen.
Eine andere Weise, auf die lösliche TCRs der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden können, ist durch die Verwendung von TCR-spezifischen Antikörpern, insbesondere monoklonalen Antiköpern. Es gibt viele kommerziell erhältliche Anti-TCR-Antikörper, wie αFl und βFl, die die konstanten Regionen der α- bzw. β-Kette erkennen.
Der TCR (oder multivalente Komplex davon) der vorliegenden Erfindung kann alternativ oder zusätzlich mit (z. B. kovalent oder anders gebunden an) einem therapeutischen Wirkstoff assoziiert sein, der z. B. ein toxischer Anteil für die Verwendung bei der Zellabtötung oder ein immunstimulierender Wirkstoff, wie Interleukin oder ein Zytokin sein kann. Ein multivalenter TCR-Komplex der vorliegenden Erfindung kann eine gesteigerte Bindungsfähigkeit für einen TCR-Liganden im Vergleich mit einem nicht-multimeren T-Zell-Rezeptor-Heterodimer aufweisen. So sind die multivalenten TCR-Komplexe gemäß der Erfindung besonders nützlich für die Verfolgung von oder Zielrichtung auf Zellen, die besondere Antigene in vitro oder in vivo präsentieren, und sie sind auch nützlich als Zwischenprodukte für die Herstellung von weiteren multivalenten TCR-Komplexen, die solche Verwendungen aufweisen. Der TCR oder multivalente TCR-Komplex kann daher in einer pharmazeutisch akzeptablen Formulierung für die Verwendung in vivo bereitgestellt werden.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Abgabe eines therapeutischen Wirkstoffes an eine Zielzelle bereit, wobei das Verfahren die Kontaktierung von möglichen Zielzellen mit einem TCR oder multivalenten TCR-Komplex gemäß der Erfindung unter Bedingungen, die die Bindung des TCRs oder multivalenten TCR-Komplexes an die Zielzelle erlauben, umfasst, wobei der TCR oder multivalente TCR-Komplex für den TCR-Liganden spezifisch ist und der therapeutische Wirkstoff damit assoziiert ist.
Insbesondere kann der lösliche TCR oder multivalente TCR-Komplex verwendet werden, um therapeutische Wirkstoffe an den Ort der Zellen, die ein spezielles Antigen präsentieren, abzugeben. Dies wäre in vielen Situationen und insbesondere gegen Tumore nützlich. Ein therapeutischer Wirkstoff könnte so abgegeben werden, dass er seinen Effekt lokal, aber nicht nur auf die Zelle, die er bindet, ausüben würde. So stellt sich eine spezielle Strategie Antitumormoleküle vor, die an T-Zell-Rezeptoren oder multivalente TCR-Komplexe, die für Tumor-Antigene spezifisch sind, gebunden sind.
Viele therapeutische Wirkstoffe könnten für diese Verwendung verwendet werden, z. B. radioaktive Verbindungen, Enzyme (Perforin zum Beispiel) oder chemotherapeutische Wirkstoffe (cis-Platin zum Beispiel). Um sicherzustellen, dass die toxischen Effekte an dem erwünschten Ort ausgeübt werden, könnte das Toxin in einem Liposom sein, das an Streptavidin gebunden ist, so dass die Verbindung langsam freigesetzt wird. Dies wird schädigende Effekte während des Transportes in dem Körper verhindern und sicherstellen, dass das Toxin den maximalen Effekt nach der Bindung des TCRs an die relevanten Antigen-präsentierenden Zellen hat.
Andere geeignete therapeutische Wirkstoffe beinhalten:

• klein-molekulare zytotoxische Wirkstoffe, z. B. Verbindungen mit der Fähigkeit, Säugerzellen zu töten, die ein Molekulargewicht von weniger als 700 Dalton aufweisen. Solche Verbindungen könnten auch toxische Metalle enthalten, die in der Lage sind, einen zytotoxischen Effekt zu haben. Darüber hinaus sollte verstanden werden, dass diese klein-molekularen zytotoxischen Wirkstoffe auch pro-Drugs mit einschließen, sprich Verbindungen, die sich zersetzen oder unter physiologischen Bedingungen konvertiert werden, um zytotoxische Wirkstoffe freizusetzen. Beispiele für solche Wirkstoffe beinhalten cis-Plastin, Maytansinderivate, Rachelmycin, Calicheamicin, Docetaxel, Etoposid, Gemcitabin, Ifosfamid, Irinotecan, Melphalan, Mitoxantron, Sorfimer-Natriumphotofrin II, Temozolmid, Topotecan, Trimetreatglucuronat, Auristatin E Vincrstin und Doxorubicin;
• Peptidzytotoxine, sprich Proteine oder Fragmente davon mit der Fähigkeit, Säugerzellen zu töten. Beispiele beinhalten Ricin, Diphtherietoxin, Pseudomonas bakterielles Exotoxin A, DNAase und RNAase;
• Radionuklide, sprich instabile Isotope von Elementen, die mit der begleitenden Emission von einem oder mehreren α- oder β-Partikeln oder γ-Strahlen zerfallen. Beispiele beinhalten Iod 131, Rhenium 186, Indium 111, Yttrium 90, Bismuth 210 und 213, Actinium 225 und Astatin 213;
• Pro-Drugs, wie Antikörper gerichtete Enzym-Pro-Drugs;
• Immunstimulanzien, sprich Teile, die Immunantwort stimulieren, Beispiele beinhalten Cytokine, wie IL-2, Chemokine, wie IL-8, Thrombozyten-Faktor 4, Melanom-Wachstums-stimulierendes Protein, etc., Antikörper oder Fragmente davon, wie Anti-CD3-Antikörper oder Fragmente davon, Komplementaktivatoren, xenogene Proteindomänen, allogene Proteindomänen, virale/bakterielle Proteindomänen und virale/bakterielle Peptide.

Lösliche TCRs oder multivalente TCR-Komplexe der Erfindung können an ein Enzym gebunden sein, das in der Lage ist, eine Prodrug in ein Medikament umzuwandeln. Dies erlaubt es der Prodrug, nur an dem Ort in das Medikament umgewandelt zu werden, an dem es erforderlich ist (sprich gezielt durch den sTCR).
Eine Vielzahl von Erkrankungsbehandlungen kann möglicherweise durch Lokalisierung des Medikamentes durch die Spezifität von löslichen TCRs gesteigert werden.
Virale Erkrankungen, für die Medikamente existieren, z. B. HIV, SIV, EBV, CMV, würden davon profitieren, dass das Medikament in der näheren Umgebung der infizierten Zellen freigesetzt oder aktiviert wird. Für Krebs würde die Lokalisierung in der Umgebung von Tumoren oder Metastasen den Effekt von Toxinen oder Immunstimulantien steigern. Bei Autoimmunerkrankungen könnten immunsuppressive Medikamente langsam freigesetzt werden, wobei sie einen lokaleren Effekt über eine längere Zeitspanne aufweisen, während sie die gesamte Immunkapazität des Patienten minimal beeinflussen. Bei der Verhinderung von Transplantatabstoßung könnte der Effekt von immunsuppressiven Medikamenten auf die gleiche Weise optimiert werden. Für Impfstoffabgabe könnte das Impfstoff-Antigen in der Umgebung von Antigen-präsentierenden Zellen lokalisiert werden, wodurch die Effizienz des Antigens gesteigert würde. Das Verfahren kann auch für bildgebende Zwecke angewendet werden.
Die löslichen TCRs der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um T-Zell-Aktivierung durch Bindung an spezifischen TCR-Liganden und dadurch Inhibierung der T-Zell-Aktivierung zu modulieren. Autoimmunerkrankungen, die T-Zell-vermittelte Entzündung und/oder Gewebeschaden involvieren, könnten durch diesen Ansatz gelindert werden, z. B. Typ I-Diabetes. Das Wissen um das spezifische Peptidepitop, das durch den relevanten pMHC präsentiert wird, ist für diese Verwendung erforderlich.
Man stellt sich auch die Verwendung der löslichen TCRs und/oder multivalenten TCR-Komplexe der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung einer Zusammensetzung für die Behandlung von Krebs oder Autoimmunerkrankung vor.
Wie es in der Antikrebs- und Autoimmuntherapie häufig ist, können die sTCRs dieser Erfindung in Kombination mit anderen Wirkstoffen für die Behandlung von Krebs und Autoimmunerkrankung und anderen verwandten Zuständen, die in ähnlichen Patientengruppen gefunden werden, verwendet werden.
Medikamente in Übereinstimmung mit der Erfindung werden normalerweise als ein Teil einer sterilen, phamazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt, die normalerweise einen pharmazeutisch akzeptablen Träger beinhalten wird. Diese pharmazeutische Zusammensetzung kann in irgendeiner geeigneten Form (abhängig von dem gewünschten Verfahren der Verabreichung an einen Patienten) vorliegen. Sie kann in Einheitsdosierungsform bereitgestellt werden, aber sie wird im Allgemeinen in einem versiegelten Container bereitgestellt und kann als Teil eines Kits bereitgestellt werden. Ein solches Kit würde normalerweise (obwohl nicht notwendigerweise) Anleitungen für die Verwendung beinhalten. Es kann eine Vielzahl von besagten Einheitsdosierungsformen enthalten.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann für die Verabreichung auf irgendeinem geeigneten Weg adaptiert sein, z. B. auf dem oralen (einschließlich buccal oder sublingual), rektalen, nasalen, topischen (einschließlich buccalen, sublingualen oder transdermalen), vaginalen oder parenteralen (einschließlich subkutanen, intramuskulären, intravenösen oder intradermalen) Weg. Solche Zusammensetzungen können durch jedes Verfahren, das auf dem Fachgebiet der Pharmazie bekannt ist, hergestellt werden, z. B. durch Mischen des aktiven Inhaltsstoffes mit dem Träger/den Trägern oder Arzneiträgern) unter sterilen Bedingungen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die orale Verabreichung adaptiert sind, können als einzelne Einheiten vorgelegt werden, wie als Kapseln oder Tabletten; als Pulver oder Granulate; als Lösungen, Sirups oder Suspensionen (in wässrigen oder nicht wässrigen Flüssigkeiten; oder als essbare Schäume oder Aufschäumungen oder als Emulsionen). Geeignete Arzneiträger für Tabletten oder harte Gelatinekapseln beinhalten Lactose, Maisstärke oder Derivate davon, Stearinsäure oder Salze davon. Geeignete Arzneiträger für die Verwendung mit weichen Gelatinekapseln beinhalten z. B. Pflanzenöle, Wachse, Fette, halbfeste oder flüssige Polyole etc. Für die Herstellung von Lösungen und Sirups, beinhalten Arzneiträger, die verwendet werden können, z. B. Wasser, Polyole und Zucker. Für die Herstellung von Suspensionen können Öle (z. B. Pflanzenöle) verwendet werden, um Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Suspensionen bereitzustellen. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die transdermale Verabreichung adaptiert sind, können als einzelne Pflaster bereitgestellt werden, die in engen Kontakt zu der Epidermis des Empfängers für einen längeren Zeitraum verbleiben sollen. Zum Beispiel kann der aktive Inhaltsstoff aus dem Pflaster durch Iontophorese abgegeben werden, wie allgemein in Pharmaceutical Research, 3 (6): 318 (1986) beschrieben wird. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die topische Verabreichung adaptiert sind, können als Salben, Cremes, Suspensionen, Lotionen, Pulver, Lösungen, Pasten, Gels, Sprays, Aerosole oder Öle formuliert sein. Für Infektionen des Auges oder anderer externer Gewebe, z. B. Mund und Haut, werden die Zusammensetzungen vorzugsweise als eine topische Salbe oder Creme aufgebracht. Wenn er als eine Salbe formuliert ist, kann der aktive Inhaltsstoff mit entweder einer paraffinischen oder Wasser-mischbaren Salbenbasis verwendet werden. Alternativ kann der aktive Inhaltsstoff in einer Creme mit einer Öl-in-Wasser-Cremebasis oder Wasser-in-Öl-Basis formuliert sein. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die topische Verabreichung an das Auge adaptiert sind, beinhalten Augentropfen, worin der aktive Inhaltsstoff in einem geeigneten Träger, insbesondere einem wässrigen Lösungsmittel, aufgelöst oder suspendiert ist. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für topische Verabreichung in den Mund adaptiert sind, beinhalten Halstabletten, Pastillen und Mundspülungen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die rektale Verabreichung adaptiert sind, können als Suppositorien oder Einläufe vorgelegt werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die nasale Verabreichung adaptiert sind, worin der Träger ein Feststoff ist, beinhalten ein grobes Pulver mit einer Teilchengröße von z. B. in dem Bereich 20 bis 500 μm, das auf die Weise verabreicht wird, bei der eingeschnupft wird, z. B. durch schnelle Inhalation durch die Nasenwege aus einem Behälter des Pulvers, der nahe an die Nase gehalten wird. Geeignete Zusammensetzungen, worin der Träger eine Flüssigkeit ist, für die Verabreichung als ein Nasenspray oder Nasentropfen, beinhalten wässrige oder ölige Lösungen des aktiven Inhaltsstoffes. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die Verabreichung durch Inhalation adaptiert sind, beinhalten feine Teilchenstäube oder Nebel, die mit Hilfe von verschiedenen Arten von Abmessdosis-Druckaerosolen, Verneblern oder Insufflatoren erzeugt werden können. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die vaginale Verabreichung adaptiert sind, können in der Form von Pessaren, Tampons, Cremes, Gels, Pasten, Schäumen oder Sprayformulierungen vorgelegt werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die parenterale Verabreichung adaptiert sind, beinhalten wässrige und nicht-wässrige sterile Injektionslösung, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe, die die Formulierung im Wesentlichen isoton zu dem Blut des beabsichtigten Empfängers machen, enthalten können, und wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, die Suspensionsmittel und Verdickungsmittel enthalten können. Arzneiträger, die für injizierbare Lösungen verwendet werden können, beinhalten Wasser, Alkohole, Polyole, Glycerin und z. B. Pflanzenöle. Die Zusammensetzungen können in Einheitsdosis- oder Multidosis-Behältern vorgelegt werden, z. B. versiegelten Ampullen oder Phiolen, und sie können in einem gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand gelagert werden, welcher nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers, z. B. Wasser für Injektionen, direkt vor der Verwendung erforderlich macht. Extemporäre Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten hergestellt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können Konservierungsmittel, Lösungsvermittler, Stabilisatoren, Benetzungsmittel, Emulgatoren, Süßstoffe, Farbstoffe, Duftstoffe, Salze (Substanzen der vorliegenden Erfindung können selber in der Form eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes bereitgestellt werden), Puffer; Beschichtungsmittel oder Antioxidanzien enthalten. Sie können auch therapeutisch aktive Wirkstoffe zusätzlich zu der Substanz der vorliegenden Erfindung enthalten.
Die Dosierungen der Substanzen der vorliegenden Erfindung können innerhalb weiter Grenzen variieren, abhängig von der Erkrankung oder der Störung, die behandelt werden soll, dem Alter und dem Zustand des Individuums, das behandelt werden soll, etc. und ein Arzt wird letztendlich die geeigneten Dosierungen, die verwendet werden sollen, bestimmen. Die Dosierung kann sooft, wie es geeignet ist, wiederholt werden. Wenn Nebenwirkungen auftreten, kann die Menge und/oder Frequenz der Dosierung in Übereinstimmung mit normaler klinischer Praxis reduziert werden.
Gen-Klonierungstechniken können verwendet werden, um einen sTCR der Erfindung bereitzustellen, vorzugsweise in im Wesentlichen reiner Form. Diese Techniken werden z. B. in J. Sambrook et al., Molecular Cloning, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) offenbart. So stellt in einem weiteren Aspekt die vorliegende Erfindung ein Nucleinsäuremolekül bereit, umfassend eine Sequenz, die eine Kette des löslichen TCRs der vorliegenden Erfindung kodiert, oder eine Sequenz, die dazu komplementär ist. Solche Nucleinsäuresequenzen können durch Isolierung von TCR kodierender Nucleinsäure aus T-Zell-Klonen und Herbeiführung geeigneter Mutationen (durch Insertion, Deletion oder Substitution) erhalten werden.
Das Nucleinsäuremolekül kann in isolierter oder rekombinanter Form isoliert werden. Es kann in einen Vektor inkorporiert und der Vektor kann in eine Wirtszelle inkorpiert werden. Solche Vektoren und geeignete Wirte bilden noch weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Erlangung einer TCR-Kette bereit, wobei das Verfahren die Inkubation einer solchen Wirtszelle unter Bedingungen, die Expression der TCR-Kette hervorrufen, und dann Reinigung des Polypeptids umfasst.
Die löslichen TCRs der vorliegenden Erfindung können durch Expression in einem Bakterium, wie E. coli, als Einschlusskörper und darauf folgender Rückfaltung in vitro erhalten werden.
Die Rückfaltung der TCR-Ketten kann in vitro unter geeigneten Rückfaltungsbedingungen stattfinden. In einer speziellen Ausführungsart wird ein TCR mit korrekter Konformation durch Rückfaltung von solubilisierten TCR-Ketten in einem Rückfaltungspuffer, der einen Lösungsvermittler, z. B. Harnstoff, umfasst, erreicht. Vorteilhaft kann der Harnstoff in einer Konzentration von mindestens 0,1 M oder mindestens 1 M oder mindestens 2,5 M oder ungefähr 5 M vorliegen. Ein alternativer Lösungsvermittler, der verwendet werden kann, ist Guanidin in einer Konzentration zwischen 0,1 M und 8 M, vorzugsweise mindestens 1 M oder mindestens 2,5 M. Vor der Rückfaltung wird vorzugsweise ein Reduktionsmittel verwendet, um die komplette Reduktion von Cysteinresten sicherzustellen. Weitere Denaturierungsmittel, wie DTT und Guanidin, können nach Bedarf verwendet werden. Verschiedene Denaturierungsmittel und Reduktionsmittel können vor dem Rückfaltungsschritt verwendet werden (z. B. Harnstoff, β-Mercaptoethanol). Alternative Redoxpaare können während der Rückfaltung verwendet werden, wie Cystamin/Cysteamin-Redoxpaar, DTT oder β-Mercaptoethanol/Luftsauerstoff und Cystein in reduzierten und oxidierten Formen.
Die Rückfaltungseffizienz kann durch die Zugabe von bestimmten anderen Proteinkomponenten, z. B. Chaperonprotein, zu der Rückfaltungsmischung gesteigert werden. Verbesserte Rückfaltung wurde durch Passage von Protein durch Säulen mit immobilisierten Mini-Chaperonen erreicht (Altamirano et al. (1999), Nature Biotechnology 17: 187–191; Altamirano et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (8): 3576–8).
Alternativ können lösliche TCRs der vorliegenden Erfindung durch Expression in einem eukaryonten Zellsystem, wie Insektenzellen, erhalten werden. Zum Beispiel offenbart die gleichzeitig anhängige Anmeldung ( WO 03/020763 ) die Expression von Peptid-MHC-Bindungs-löslichen TCRs des gleichen grundlegenden Designs wie diejenigen der vorliegenden Erfindung, die in Hefe und Insektenzellen exprimiert werden sollen, und die Expression in einer großen Bandbreiten an anderen prokaryoten oder eukaryoten Systemen wird erwartet. Daher gibt es eine Anzahl von Säuger-Expressionssystemen, die für die Herstellung von membrangebundenen TCRs verwendet wurden. Zum Beispiel zeigt eine Studie (Rubinstein (2003), J. Immunol. 170 (3) 1209–1217) die erfolgreiche in vitro Retrovirus-vermittelte Transduktion von reifen T-Zellen mit DNA, die einen nicht-nativen, membrangebundenen TCR kodiert. Dies führte zu der Herstellung von T-Zellen, die in der Lage waren, spezifisch APCs zu töten, die den pMHC-Komplex, der durch den eingeführten TCR erkannt wird, exprimierten. Eine weitere Studie (Pogulis (1998), Hum Gene Ther. 9 (15) 2285–2297) verwendete ein retrovirales System, um Maus-Knochenmarkszellen mit TCR-Genen zu transduzieren. Die transduzierten Knochenmarkszellen wurden dann in Mäuse eingeführt und die Expression des eingeführten TCRs wurde gezeigt.
Es wird auch erwartet, dass TCR der vorliegenden Erfindung auch für die Expression in die Milch von nicht menschlichen transgenen Tieren zugänglich sein würden, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Mäuse, Ratten, Kühe, Schafe und Ziegen, wobei ähnliche Verfahren wie diejenigen, die zuvor für Antikörperproduktion gezeigt wurden, verwendet werden. Zum Beispiel beschreibt (Sola (1998), J. Virol. 72 (5) 3762–3772) die Einführung von DNA, die einen chimären Antikörper (IgA) kodiert, in Mäuse und zeigt, dass Mäuse, die in der Lage sind, das eingeführte IgA in ihrer Milch zu sezernieren, hergestellt werden können.
Die Reinigung des exprimierten TCRs kann durch viele verschiedene Mittel erreicht werden, die dem speziellen Milieu, in das der TCR exprimiert wird, angepasst sind. Es können alternative Verfahren des Ionenaustausches angewendet werden oder andere Verfahren der Proteinreinigung können benutzt werden, wie Gelfiltrations-Chromatographie oder Affinitäts-Chromatographie.
Lösliche TCRs und multivalente TCR-Komplexe der vorliegenden Erfindung finden auch Verwendung bei dem Screening auf Wirkstoffe, wie kleine chemische Verbindungen, die die Fähigkeit aufweisen, die Bindung des TCRs an seinen TCR-Liganden zu inhibieren. Daher stellt in einem weiteren Aspekt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screening auf einen Wirkstoff bereit, der die Bindung eines T-Zell-Rezeptors an einen TCR-Liganden, ausgewählt aus CD1-Antigenkomplexen, bakteriellen Superantigenen und MHC-Peptid/Superantigenkomplexen, inhibiert, bereit, umfassend die Überwachung der Bindung eines löslichen T-Zell-Rezeptors der Erfindung mit einem TCR-Liganden in der Gegenwart eines Wirkstoffes und Auswahl von Wirkstoffen, die eine solche Bindung inhibieren.
Geeignete Techniken für ein solches Screeningverfahren beinhalten das Surface Plasmon Resonance-basierte Verfahren, das in WO 01/22084 beschrieben wird. Andere gut bekannte Techniken, die die Basis dieses Screening-Verfahrens bilden könnten, sind Szintillations-Proximitäts-Analyse (SPA) und amplifizierter Lumineszenz-Proximitäts-Assay.
Wirkstoffe, die durch die Screeningverfahren der Erfindung ausgewählt werden, können als Medikamente oder als die Basis eines Medikamenten-Entwicklungsprogrammes verwendet werden, wobei sie modifiziert oder anders verbessert werden, um Merkmale aufzuweisen, die sie für die Verabreichung als ein Medikament geeigneter machen. Solche Medikamente können für die Behandlung von Zuständen verwendet werden, die eine Komponente einer ungewollten T-Zell-Reaktion beinhalten. Solche Zustände beinhalten Krebs (z. B. Nieren, Eierstock, Darm, Kopf und Hals, Hoden, Lungen, Magen, zervikalen, Blasen, Prostata oder Melanom), Autoimmunerkrankung, Transplantatabstoßung und Graft versus Host-Erkrankung.
Bevorzugte Merkmale von jedem Aspekt der Erfindung gelten für alle anderen Aspekte mit den nötigen Abänderungen.
Beispiele
Die Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen beschrieben, die den Umfang der Erfindung auf keine Weise begrenzen.
In dem Folgenden wird auf die begleitenden Zeichnungen Bezug genommen, in denen:
1 ein schematisches Diagramm eines löslichen TCRs mit einer eingeführten Zwischenketten-Disulfidbindung in Übereinstimmung mit der Erfindung ist;
2a und 2b jeweils die Nucleinsäuresequenzen der α- und β-Ketten eines löslichen CD1-bindenden TCRs zeigen, mutiert, um ein Cysteinkodon einzuführen. Die Schattierung weist auf das eingeführte Cysteinkodon hin;
3a die CD1-bindende TCR-α-Ketten-extrazelluläre Aminosäuresequenz zeigt, einschließlich der T₄₈→C-Mutation (unterstrichen), die verwendet wird, um die neue Disulfid-Zwischenkettenbindung herzustellen, und 3b die CD1-bindende TCR-β-Ketten-extrazelluläre Aminosäuresequenz zeigt, einschließlich der S₅₇→ C-Mutation (unterstrichen), die verwendet wird, um die neue Disulfid-Zwischenkettenbindung herzustellen;
4 eine BIAcore-Antwortkurve auf die spezifische Bindung von Disulfid-verbundenem CDld-bindendem löslichen TCR auf lösliches CD1d ist.
Beispiel 1: Design von Primern und Mutagenese von CD1-bindenden TCR-α- und β-Ketten
Für die Mutation eines CD1-bindenden TCR-Threonins 48 von Exon 1 in TRAC*01 zu Cystein wurden die folgenden Primer designed (Mutation in Kleinbuchstaben gezeigt):
Für die Mutation von CD1-bindendem TCR Serin 57 von Exon 1 in sowohl TRBC1*01 1 und TRBC2*01 zu Cystein, wurden die folgenden Primer designed (Mutation in Kleinbuchstaben gezeigt):
PCR-Mutagenese:
Expressionsplasmide, die Gene für den CD1-bindenden TCR enthielten, wurden aus cDNA erhalten, die aus einem CD1-spezifischen CD1-T-Zell-Klon isoliert wurde. Die TCR-α- oder β-Ketten wurden unter Verwendung der α-Ketten-Primer bzw. der β-Ketten-Primer wie folgt mutiert. 100 ng Plasmid wurde mit 5 μl 10 mM dNTP, 25 μl 10 × Pfu-Puffer (Stratagene), 10 Einheiten Pfu-Polymerase (Stratagene) gemischt und das endgültige Volumen wurde auf 240 μl mit H₂O eingestellt. 48 μl dieser Mischung wurde mit Primern ergänzt, verdünnt, um eine endgültige Konzentration von 0,2 μm in 50 μl endgültigem Reaktionsvolumen zu ergeben. Nach einem anfänglichen Denaturierungsschritt von 30 Sekunden bei 95°C wurde die Reaktionsmischung 15 Runden Denaturierung (95%, 30 Sek.), Annealing (55°C, 60 Sek.) und Verlängerung (73°, 8 Min.) in einer Hybaid PCR-Express PCR-Maschine unterworfen. Das Produkt wurde dann für 5 Stunden bei 37°C mit 10 Einheiten Dpnl-Restriktionsenzym (New England Biolabs) verdaut. 10 μl der verdauten Reaktion wurden in kompetente XL1-Blue-Bakterien transformiert und für 18 Stunden bei 37°C gezüchtet. Eine einzelne Kolonie wurde aufgenommen und über Nacht in 5 ml TYP + Ampicillin (16 g/l Bacto-Trypton, 16 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 2,5 g/l K₂HPO₄, 100 mg/l Ampicillin) gezüchtet. Plasmid-DNA wurde auf einer Quiagen Miniprep-Säule gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt und die Sequenz wurde durch automatisierte Sequenzierung an der Sequenzierungseinrichtung des Departments of Biochemistry, Oxford University, verifiziert. Die jeweilige mutierte Nucleinsäure und die Aminosäuresequenzen werden in den 2a und 3a für die α-Kette und den 2b und 3b für die β-Kette gezeigt.
Beispiel 2: Expression, Rückfaltung und Reinigung von löslichem TCR
Die Expressionsplasmide, die die mutierte α-Kette bzw. β-Kette enthielten, wurden getrennt voneinander in E. coli-Stamm BL21pLysS transformiert und einzelne Ampicillinresistente Kolonien wurden bei 37°C in TYP (Ampicillin 100 μg/ml) Medium auf eine OD₆₀₀ von 0,4 gezüchtet, bevor Proteinexpression mit 0,5 mM IPTG induziert wurde. Die Zellen wurden drei Stunden nach der Induktion durch Zentrifugation für 30 Minuten bei 4.000 UpM in einem Beckman J-6B geerntet. Die Zellpellets wurden in einem Puffer, der 50 mM Tris-HCl, 25% (w/v) Saccharose, 1 mM NaEDTA, 0,1% (w/v) NaAzid, 10 mM DTT, pH 8,0 enthielt, erneut suspendiert. Nach einem Gefrier-Auftau-Schritt über Nacht, wurden die resuspendierten Zellen in einminütigen Bursts für insgesamt ungefähr 10 Minuten in einem Milsonix XL2020 Beschaller unter Verwendung einer Standard-12 mm-Durchmesser-Sonde beschallt. Einschlusskörper-Pellets wurden durch Zentrifugation für 30 Minuten bei 13.000 UpM in einer Beckman J2-21 Zentrifuge gewonnen. Es wurden dann drei Detergenzwaschungen durchgeführt, um Zelldebris und Membranbestandteile zu entfernen. Jedes Mal wurde der Einschlusskörper-Pellet in einem Tritonpuffer (50 mM Tris-HCl, 0,5% Triton-X100, 200 mM NaCl, 10 mM NaEDTA, 0,1% (w/v) NaAzid, 2 mM DTT, pH 8,0) homogenisiert, bevor er durch Zentrifugation für 15 Minuten bei 13.000 UpM in einem Beckman J2-21 pellettiert wurde. Detergenz und Salz wurden dann durch eine ähnliche Waschung in dem folgenden Puffer: 50 mM Tris-HCl, 1 mM NaEDTA, 0,1% (w/v) NaAzid, 2 mM DTT, pH 8,0, entfernt. Schließlich wurden die Einschlusskörper in 30 mg Aliquots aufgeteilt und bei –70°C gefroren. Der Einschlusskörper-Proteinertrag wurde durch Solubilisierung mit 6 M Guanidin-HCl und Messung mit einem Bradford-Farbbindungs-Assay (PerBio) quantifiziert.
Es wurden ungefähr 120 mg (sprich 4 μmol) solubilisierter α-Ketten-Einschlusskörper und 30 mg (sprich 1 μmol) solubiliserter α-Ketten-Einschlusskörper aus gefrorenen Vorräten aufgetaut, die Proben wurden dann gemischt und die Mischung in 15 ml einer Guanidinlösung (6 M Guanidinhydrochlorid, 10 mM Natriumacetat, 10 mM EDTA) verdünnt, um die vollständige Kettendenaturierung sicherzustellen. Die Guanidinlösung, die vollständig reduzierte und denaturierte TCR-Ketten enthielt, wurde dann in 1 Liter des folgenden Rückfaltungspuffers induziert: 100 mM Tris, pH 8,5, 400 mM L-Arginin, 2 mM EDTA, 5 mM reduziertes Glutathion, 0,5 mM oxidiertes Glutathion, 5 M Harnstoff, 0,2 mM PMSF. Die Lösung wurde für 24 Stunden stehen gelassen. Die Rückfaltung wurde dann zweimal dialysiert, erstens gegen 10 l 100 mM Harnstoff, zweitens gegen 10 l 100 mM Harnstoff, 10 mM Tris, pH 8,0. Sowohl Rückfaltungs- wie auch Dialyseschritte wurden bei 6–8°C durchgeführt.
sTCR wurde von Abbauprodukten und Unreinheiten durch Ladung der dialysierten Rückfaltung auf POROS 50 HQ Anionenaustauschsäule und Flution des gebundenen Proteins mit einem Gradienten von 0–500 mM NaCl über 50 Säulenvolumina unter Verwendung eines Akta-Purifikators (Pharmacia) getrennt. Die Peak-Fraktionen wurden bei 4°C gelagert und durch Coomassie-gefärbte SDS-PAGE analysiert, bevor sie gepoolt und konzentriert wurden. Schließlich wurde der sTCR unter Verwendung einer Superdex 200HR Gelfiltrationssäule, prä-äquilibriert in HBS-EP-Puffer (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3,5 mM EDTA, 0,05% Nonidet p40) gereinigt und charakterisiert. Der Peak, der mit einem relativen Molekulargewicht von ungefähr 50 kDa eluierte, wurde gepoolt und vor der Charakterisierung durch BIAcore-Oberflächen-Plasmon-Resonanzanalyse konzentriert.
Beispiel 3: BIAcore Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Charakterisierung von sTCR-Bindung an CD1
Ein Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Biosensor (BIAcore 3000^TM) wurde verwendet, um die Bindung eines sTCRs an seinen CD1-Liganden zu analysieren. Dies wurde durch Herstellung von löslichen CD1-Komplexen, wie in (Bauer (1997), Eur. J. Immunol. 27 (6) 1366–1373) beschrieben, die auf einer Streptavidin-beschichteten Bindungsoberfläche in einer halb orientierten Weise immobilisiert wurden, was die effiziente Testung der Bindung eines löslichen T-Zell-Rezeptors an bis zu vier verschiedene TCR-Liganden (immobilisiert auf verschiedenen Flusszellen) gleichzeitig ermöglicht, erleichtert. Die manuelle Injektion von HLA-Komplex ermöglicht es, den genauen Spiegel an immobilisierten TCR-Ligand einfach zu manipulieren.
Solche immobilisierten Komplexe sind in der Lage, sowohl T-Zell-Rezeptoren wie auch den Corezeptor CD8αα zu binden, von denen beide in die lösliche Phase injiziert werden können. Eine spezifische Bindung von TCR wird sogar bei niedrigen Konzentrationen (mindestens 50 μg/ml) erhalten, was darauf schließen lässt, dass TCR relativ stabil ist. Es wurde beobachtet, dass die CD1-Bindungseigenschaften von TCR qualitativ und quantitativ ähnlich sind, wenn TCR entweder in der löslichen oder immobilisierten Phase verwendet wird. Dies ist eine wichtige Kontrolle für die partielle Aktivität von löslichen Arten und legt auch nahe, dass biotinylierte CD1-Komplexe biologisch so aktiv sind wie nicht-biotinylierte Komplexe.
Die Wechselwirkungen zwischen dem CD1-bindenden sTCR, das eine neue Zwischenkettenbindung enthielt, und löslichem CD1 wurden auf einem BIAcore 3000^TM Oberflächen-Plasmonresonsanz (SPR)-Biosensor analysiert. SPR misst die Änderungen im Refraktionsindex, ausgedrückt in Reaktionseinheiten (RU), nahe einer Sensoroberfläche innerhalb einer kleinen Flusszelle, ein Prinzip, das verwendet werden kann, um Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen nachzuweisen und ihre Affinitäts- und genetischen Parameter zu analysieren. Die Sonden-Flusszellen wurden durch Immobilisierung der CD1-Komplexe in getrennten Flusszellen hergestellt. Der Assay wurde dann durch Passage von sTCR über die Oberflächen der verschiedenen Flusszellen mit einer konstanten Flussgeschwindigkeit durchgeführt, wobei die SPR-Reaktion währenddessen gemessen wurde. Die Injektionen von löslichem sTCR mit einer konstanten Fließgeschwindigkeit und verschiedenen Konzentrationen über den löslichen CD1-Komplex wurden verwendet, um die Hintergrundresonanz zu definieren.
Der Kd-Wert, der für die Wechselwirkung zwischen dem CD1-Bindungs-TCR und löslichem CD1 erhalten wurde, betrug 6,0 ± 0,3 μM.

Claims

Löslicher T-Zellrezeptor (sTCR), der (i) die Gesamtheit oder einen Teil einer TCR-α-Kette umfasst, mit Ausnahme der Transmembrandomäne davon, und (ii) die Gesamtheit oder einen Teil einer TCR-β-Kette, mit Ausnahme der Transmembrandomäne davon, wobei (i) und (ii) jeweils eine funktionale variable Domäne und mindestens einen Teil der konstanten Domäne der TCR-Kette umfassen und durch eine Disulfidbindung zwischen konstanten Domänen-Cysteinresten gebunden sind, substituiert für: Thr 48 von Exon 1 von TRAC*01 und Ser 57 von Exon 1 von TRBC1*01 oder TRBC2*01, oder Thr 45 von Exon 1 von TRAC*01 und Ser 77 von Exon 1 von TRBC1*01 oder TRBC2*01, oder Tyr 10 von Exon 1 von TRAC*01 und Ser 17 von Exon 1 von TRBC1*01 oder TRBC2*01, oder Thr 45 von Exon 1 von TRAC*01 und Asp 59 von Exon 1 von TRBC1*01 oder TRBC2*01, oder Ser 15 von Exon 1 von TRAC*01 und Glu 15 von Exon 1 von TRBC1*01 oder TRBC2*01, dadurch gekennzeichnet, dass der sTCR einen CD1-Antigenkomplex erkennt.
sTCR gemäß Anspruch 1, worin ein oder beide von (i) und (ii) die Gesamtheit der extrazellulären Domänen der TCR-Ketten umfassen.
sTCR gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei eine Interketten-Disulfidbindung im nativen TCR nicht vorliegt.
sTCR gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin ein ungepaarter Cysteinrest, der in der nativen TCR-β-Kette vorliegt, nicht vorliegt.
sTCR gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Disulfidbindung, die im nativen TCR nicht vorliegt, zwischen Cysteinresten vorliegt, substituiert für Thr 48 von Exon 1 von TRAC*01 und Ser 57 von Exon 1 von TRBC1*01 oder TRBC2*01.
sTCR gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei eine oder beide der Ketten mit einem Bestandteil an ihrem C- oder N-Terminus derivatisiert sind oder daran fusioniert sind.
sTCR gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, assoziiert mit einem Therapeutikum.
Multivalenter T-Zellrezeptor(TCR)-Komplex, umfassend eine Vielzahl von sTCRs wie beansprucht in einem der vorstehenden Ansprüche.
Verfahren zum Nachweis eines CD1-Antigenkomplexes, das folgendes umfasst: (i) Bereitstellen eines löslichen TCRs gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 oder eines multivalenten T-Zellrezeptorkomplexes gemäß Anspruch 8; (ii) Kontaktieren des löslichen TCRs oder multivalenten TCR-Komplexes mit dem CD1-Antigenkomplex; und (iii) Nachweis der Bindung des löslichen TCRs oder multivalenten TCR-Komplexes an den CD1-Antigenkomplex.
Pharmazeutische Formulierung, umfassend einen sTCR gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und/oder einen multivalenten TCR-Komplex gemäß Anspruch 8 zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz, codierend (i) oder (ii) eines sTCRs gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 oder eine dazu komplementäre Sequenz.
Verfahren zum Erhalt von (i) oder (ii) wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Verfahren die Inkubation einer Wirtszelle umfasst, umfassend einen Vektor, wobei der Vektor eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 11 umfasst, unter Bedingungen, die eine Expression des Polypeptids auslösen und dann Reinigen des Polypeptids.
Verfahren gemäß Anspruch 12, weiterhin umfassend das Mischen von (i) und (ii) unter geeigneten neuerlichen Faltungsbedingungen.
Verwendung eines sTCRs gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und/oder eines multivalenten TCR-Komplexes gemäß Anspruch 8 bei der Herstellung eines Zusammensetzung für die Behandlung von Krebs oder einer Autoimmunerkrankung.