ES2891321T3 - Receptores de células T - Google Patents
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Abstract
Un receptor de células T (TCR) que tiene la propiedad de unirse a GVYDGREHTV (SEQ ID No: 1) en un complejo con HLA-A*0201 con una constante de disociación de desde aproximadamente 0,05 μM hasta aproximadamente 20,0 μM cuando se mide con resonancia de plasmón superficial a 25ºC y a un pH entre 7,1 y 7,5 empleando una forma soluble del TCR, y tiene al menos una selectividad de unión a SEQ ID No:1 diez veces mayor en complejo con HLA-A*0201 sobre la unión a GVYDGEEHSV (SEQ ID No 2) en complejo con HLA-A*0201 en donde el TCR comprende un dominio variable de la cadena alfa de TCR y un dominio variable de la cadena beta de TCR, y en donde los dominios variables de TCR forman contactos con al menos los restos V2, Y3 y D4 de GVYDGREHTV (SEQ ID No: 1).
Description
DESCRIPCIÓN
Receptores de células T
La presente invención se refiere a receptores de células T (TCRs) que se unen al decapéptido restringido HLA-A*0201 GVYDGREHTV derivado de la proteína A4 del antígeno asociado a melanoma (MAGE) (aminoácidos 230 239). Los TCRs de la invención demuestran excelentes perfiles de especificidad para este epítopo de MAGE.
Antecedentes de la invención
Los antígenos de cáncer de testículo (CTA) son una subclase de antígenos asociados a tumores (TAA) codificados por aproximadamente 140 genes. La expresión de estos antígenos está restringida en sitios inmunológicos privilegiados, tales como los testículos, la placenta y el ovario fetal; normalmente no se expresan en otros tejidos. Se ha observado la expresión de estos genes en tumores malignos. La inmunogenicidad de los CTA ha llevado al desarrollo generalizado de vacunas contra el cáncer dirigidas a estos antígenos en muchos tumores sólidos. Dentro de esta gran clase de TAA, los antígenos asociados a melanoma (MAGE) han surgido como candidatos prometedores para la inmunoterapia contra el cáncer.
Se han descrito más de 30 genes de cáncer de testículo (CT) como miembros de familias de múltiples genes que se organizan en grupos de genes en el cromosoma X (antígenos CT-X). Los grupos de genes de CT se encuentran entre Xq24 y Xq28 e incluyen familias de genes tales como MAGE y NY-ESO-1. Los grupos de genes MAGE de tipo I son los más caracterizados e incluyen las familias MAGE-A, MAGE-B y MAGE-C. Las proteínas MAGE-A están codificadas por 12 miembros diferentes de la familia de genes MAGE-A (MAGE-A1 a MAGE-A12) y se definen por una base de 165-171 aminoácidos conservados, denominada dominio de homología MAGE (MHD). El MHD corresponde a la única región de aminoácidos compartidos por todos los miembros de la familia MAGE-A.
Las células T reconocen e interaccionan con complejos de moléculas de la superficie celular, denominados como antígenos leucocitarios humanos ("HLA"), o complejos mayores de histocompatibilidad ("MHCs"), y péptidos. Los péptidos se derivan de moléculas más grandes, que se procesan por las células que se presentan también en la molécula HLA/MHC. La interacción de las células T y los complejos HLA/péptido está restringida, lo que requiere una célula T específica para una combinación particular de una molécula HLA y un péptido. Si una célula T específica no está presente, no hay respuesta de la célula T incluso si su complejo asociado está presente. De manera similar, no hay respuesta si el complejo específico está ausente, pero la célula T está presente. El mecanismo está implicado en la respuesta del sistema inmunológico a las infecciones, en las enfermedades autoinmunes, y en las respuestas a anomalías, tales como los tumores.
Algunas proteínas de la familia de genes MAGE sólo se expresan en células germinales y en células cancerosas (familias MAGE-A a MAGE-C). Otras se expresan ampliamente en tejidos normales (MAGE-D a MAGE-H). Todas estas familias de proteínas MAGE tienen una región homóloga que coincide estrechamente con la secuencia de las otras proteínas MAGE y comprende péptidos presentados como complejos HLA/péptido en el reconocimiento inmunológico. El documento EP1930433 describe un receptor de células T específico de MAGE-A4 143-151, restringido para HLA-A24. Por tanto, es importante seleccionar candidatos clínicos de TCR que sean altamente específicos para el péptido MAGE/antígeno HLA-A2 deseado.
MAGE A4 es un miembro de CTA de la familia de genes MAGE A. Se desconoce la función, aunque se cree que puede desempeñar un papel en el desarrollo embrionario. En la patogénesis del tumor, parece implicarse en la transformación del tumor o en aspectos de la progresión del tumor. MAGE A4 se ha implicado en un gran número de tumores, incluidos seminoma, disqueratosis congénita, melanoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células renales, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal y cáncer de mama. El péptido GVYDGREHTV (SEQ ID No: 1) corresponde a los números de los restos de aminoácidos 230-239 de la proteína MAGE-A4 conocida.
MAGE B2 es un CTA de la familia de genes MAGE B. MAGE B2 se expresa en testículos y placenta, y en una fracción significativa de tumores de varios tipos histológicos. El péptido GVYDGEEHSV (SEQ ID No: 2) muestra reactividad cruzada con MAGE A4, de modo que determinados TCRs son capaces de unirse a moléculas de HLA que presentan ambos péptidos.
Compendio de la invención
Hemos desarrollado un TCR que se une a moléculas de HLA que muestran el péptido MAGE A4 GVYDGREHTV con preferencia a MAGE B2. En un primer aspecto, la presente invención proporciona un receptor de células T (TCR) que tiene la propiedad de unirse a GVYDGREHTV (SEQ ID No: 1) en complejo con HLA-A*0201 con una constante de disociación de aproximadamente 0,05 pM a aproximadamente 20,0 pM cuando se mide con resonancia de plasmón superficial a 25°C y a un pH entre 7,1 y 7,5 empleando una forma soluble del TCR, en donde el TCR comprende un dominio variable de cadena alfa de TCR y un dominio variable de cadena beta de TCR, y en donde los dominios variables de TCR forman contactos con al menos los restos V2, Y3 y D4 de GVYDGREHTV (SEQ ID No: 1).
En realizaciones, el TCR según la divulgación tiene la propiedad de unirse a GVYDGEEHSV (SEQ ID No: 2) en un complejo con HLA-A*0201 con una constante de disociación de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 50 pM cuando se mide con resonancia de plasmón de superficie a 25°C ya un pH entre 7,1 y 7,5 empleando una forma soluble del TCR, en donde el TCR comprende un dominio variable de la cadena alfa de TCR y un dominio variable de la cadena beta de TCR. En algunas realizaciones, la constante de disociación está por encima de 50 microM, tal como 100 pM, 200 pM, 500 pM o más.
Por consiguiente, un TCR según la divulgación es capaz de unirse eficazmente a un HLA que muestra GVYDGREHTV pero no a un HLA que muestra GVYDGEEHSV.
En algunas realizaciones de la divulgación, el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia de restos de aminoácidos 1-111 de SEQ ID No: 3 (cadena alfa), y/o el dominio variable de la cadena beta comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia de restos de aminoácidos 1-111 de SEQ ID No: 4 (cadena beta).
En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un receptor de células T (TCR) que tiene la propiedad de unirse a GVYDGREHTV (SEQ ID No: 1) en complejo con HLA-A*0201 y que comprende un dominio variable de cadena alfa de TCR y un dominio de variable de la cadena beta de TCR,
el dominio variable de la cadena alfa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad con la secuencia de restos de aminoácidos 1-111 de SEQ ID No: 3, y/o
el dominio variable de la cadena beta que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad con la secuencia de restos de aminoácidos 1-111 de la SEQ ID No: 4.
El complejo GVYDGREHTV HLA-A2 proporciona un marcador canceroso al que se pueden dirigir los TCRs de la invención. La presente invención proporciona tales TCRs útiles con el propósito de administrar agentes efectores citotóxicos o inmunitarios a las células cancerosas y/o útiles para su uso en terapia adoptiva.
Los TCRs se describen empleando la nomenclatura de TCR de inmunogenética internacional (IMGT), y enlaces a la base de datos pública IMGT de secuencias de TCR. Los TCRs heterodiméricos alfa-beta naturales tienen una cadena alfa y una cadena beta. En términos generales, cada cadena comprende regiones variables, de unión y constantes, y la cadena beta también contiene normalmente una región de diversidad corta entre las regiones variables y de unión, pero esta región de diversidad a menudo se considera parte de la región de unión. Cada región variable comprende tres CDRs (regiones determinantes de complementariedad) insertadas en una secuencia marco, siendo una la región hipervariable denominada CDR3. Hay varios tipos de regiones variables de cadena alfa (Va) y varios tipos de regiones variables de cadena beta (Vp) que se distinguen por sus secuencias de la región marco, CDR1 y CDR2, y por una secuencia CDR3 definida parcialmente. Los tipos Va se denominan en la nomenclatura IMGT mediante un número TRAV único. Por lo tanto, "TRAV21" define una región Va de TCR que tiene secuencias únicas de región marco y CDR1 y CDR2, y una secuencia CDR3 que está definida parcialmente por una secuencia de aminoácidos que se conserva de TCR a TCR pero que también incluye una secuencia de aminoácidos que varía de TCR a TCR. De la misma manera, "TRBV5-1" define una región Vp de TCR que tiene un marco único y secuencias de CDR1 y CDR2, pero con sólo una secuencia de CDR3 definida parcialmente.
Las regiones de unión del TCR se definen de manera similar por la nomenclatura única de IMGT TRAJ y TRBJ, y las regiones constantes por la nomenclatura de IMGT TRAC y TRBC.
La región de diversidad de la cadena beta se denomina en la nomenclatura de IMGT mediante la abreviatura TRBD, y, como se mencionó, las regiones TRBD/TRBJ concatenadas a menudo se consideran juntas como la región de unión.
Generalmente, se considera que las cadenas a y p de los TCR ap tienen cada una dos "dominios", en concreto, dominios variables y constantes. El dominio variable consiste en una concatenación de región variable y región de unión. En la presente memoria y reivindicaciones, el término "dominio variable alfa de TCR" se refiere, por lo tanto, a la concatenación de las regiones TRAV y TRAJ, y el término dominio constante alfa de TCR se refiere a la región TRAC extracelular, o a una secuencia TRAC truncada C-terminal. Asimismo, el término "dominio variable beta de TCR" se refiere a la concatenación de las regiones TRBV y TRBD/TRBJ, y el término dominio constante beta de TCR se refiere a la región TRBC extracelular, o a una secuencia TRBC truncada C-terminal.
Las secuencias únicas definidas por la nomenclatura de IMGT son ampliamente conocidas y accesibles para quienes trabajan en el campo de TCR. Por ejemplo, se pueden encontrar en la base de datos pública IMGT. El "T cell Receptor Factsbook", (2001) LeFranc y LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8 también divulga secuencias definidas por la nomenclatura de IMGT, pero debido a su fecha de publicación y el consiguiente desfase de tiempo, la información contenida a veces necesita ser confirmada por referencia a la base de datos IMGT.
Un TCR según la invención comprende un dominio extracelular de cadena alfa como se muestra en SEQ ID No: 3 (TRAV10 TRAC) y un dominio extracelular de cadena beta como se muestra en SEQ ID No: 4 (TRBV24-1
TRBC-2). Los términos "TCR parental", "TCR MAGE-A4 parental", se emplean como sinónimos en la presente memoria para referirse a este TCR que comprende la cadena extracelular alfa y beta de SEQ ID Nos: 3 y 4 respectivamente. Es deseable proporcionar TCRs que estén mutados o modificados en relación con el TCR parental que tenga una mayor afinidad y/o una constante de disociación más lenta por el complejo péptido-HLA que el TCR parental.
Con el fin de proporcionar un TCR de referencia con el que se pueda comparar el perfil de unión de dichos TCRs mutados o modificados, es conveniente emplear un TCR soluble según la invención que tenga la secuencia extracelular de la cadena alfa de TCR MAGE-A4 parental dada en SEQ ID No: 3 y la secuencia extracelular de la cadena beta de TCR MAGE-A4 parental dada en SEQ ID No: 4. Ese TCR se denomina en la presente memoria "el TCR de referencia" o "el TCR de MAGE-A4 de referencia". Obsérvese que SEQ ID No: 5 comprende la secuencia extracelular de la cadena alfa parental de SEQ ID No: 3 y que C162 se ha sustituido por T162 (es decir, T48 de TRAC). Asimismo, SEQ ID No: 6 es la secuencia extracelular de la cadena beta parental de SEQ ID No: 4 y que C169 se ha sustituido por S169 (es decir, S57 de TRBC2), A187 se ha sustituido por C187 y D201 se ha sustituido por N201. Estas sustituciones de cisteína con respecto a las secuencias extracelulares de las cadenas alfa y beta parentales permiten la formación de un enlace disulfuro entre cadenas que estabiliza el TCR soluble replegado, es decir, el TCR formado por el replegado de las cadenas alfa y beta extracelulares. El uso del TCR soluble unido por disulfuro estable como el TCR de referencia permite una evaluación más conveniente de la afinidad de unión y la vida media de unión. Los TCRs de la invención pueden comprender las mutaciones descritas anteriormente.
Los TCRs de la invención pueden ser de origen no natural y/o purificados y/o modificados genéticamente. Los TCRs de la invención pueden tener más de una mutación presente en el dominio variable de la cadena alfa y/o el dominio variable de la cadena beta en relación con el TCR parental. "TCR modificado genéticamente" y "TCR mutante" se emplean como sinónimos en la presente memoria y generalmente significan un TCR que tiene una o más mutaciones introducidas con respecto al TCR parental, en particular en el dominio variable de la cadena alfa y/o el dominio variable de la cadena beta del mismo. Esta(s) mutación/mutaciones puede(n) mejorar la afinidad de unión por GVYDGREHTV (SEQ ID No: 1) en el complejo con HLA-A*020101. En determinadas realizaciones de la divulgación, hay 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 mutaciones en el dominio variable de la cadena alfa, por ejemplo, 4 u 8 mutaciones, y/o 1, 2, 3, 4 o 5 mutaciones en el dominio variable de la cadena beta, por ejemplo 5 mutaciones. En algunas realizaciones de la divulgación, el dominio variable de la cadena a del TCR de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad con la secuencia de restos de aminoácidos 1-111 de SEQ ID No: 3. En algunas realizaciones de la divulgación, el dominio variable de la cadena p del TCR de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad con la secuencia de restos de aminoácidos 1-111 de SEQ ID No: 4.
El dominio variable de la cadena alfa de un TCR de la invención puede tener la siguiente mutación:
con referencia a la numeración mostrada en SEQ ID No: 3, y/o
el dominio variable de la cadena beta puede tener al menos una de las siguientes mutaciones:
con referencia a la numeración mostrada en SEQ ID No: 4.
El dominio variable de la cadena alfa de un TCR de la invención puede comprender la secuencia de aminoácidos de los restos de aminoácidos 1-105 de SEQ ID No: 3, 5 o 7 a 8
o una secuencia de aminoácidos en donde los restos de aminoácidos 1-27, 34-47, y 54-90 de los mismos tienen al menos 90% o 95% de identidad con la secuencia de restos de aminoácidos 1-27, 34-47, y 54-90 respectivamente de SEQ ID No: 3, 5 o 7 a 8 y en donde los restos de aminoácidos 28-33, 48-53 y 91-105 tienen al menos 90% o 95% de identidad con la secuencia de restos de aminoácidos 28-33, 48-53 y 91-105 respectivamente de SEQ ID No: 3, 5 o 7 a 8.
Según la invención, en el dominio variable de la cadena alfa, la secuencia de
(i) los restos de aminoácidos 1-26 de la misma pueden tener (a) al menos 90% de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 1-26 de SEQ ID No: 3 o (b) pueden tener uno, dos o tres restos de aminoácidos insertados o eliminados en relación con la secuencia de (a);
(ii) los restos de aminoácidos 28-33 son VSPFSN
(iii) los restos de aminoácidos 33-49 de la misma pueden tener (a) al menos 90% de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 34-47 de SEQ ID No: 3 o (b) pueden tener uno, dos o tres restos de aminoácidos insertados o eliminados en relación con la secuencia de (a);
(iv) los restos de aminoácidos 48-53 pueden ser LTIMTF o LTRMTF o LTIVTF o LTILTF
(v) los restos de aminoácidos 55-89 de la misma pueden tener al menos 90% de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 54-90 de SEQ ID No: 3 o pueden tener una, dos o tres inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a la misma;
(vi) los aminoácidos 90-93 pueden ser CVVSGGTDSWGKLQF
El dominio variable de la cadena beta de un TCR de la invención puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 4 o 6 o 9
o una secuencia de aminoácidos en donde los restos de aminoácidos 1-45, 51-67, 74-109 de la misma tienen al menos 90% o 95% de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 1-45, 51-67, 74-109 respectivamente de SEQ ID No: 4 o 9 y en donde los restos de aminoácidos 46-50, 68-73 y 109-123 tienen al menos 90% o 95% de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 46-50, 68-73 y 109-123 respectivamente de SEQ ID No: 4 o 9.
En el dominio variable de la cadena beta, la secuencia de
(i) los restos de aminoácidos 1-45 de la misma pueden tener (a) al menos 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de los restos 1-45 de SEQ ID No: 4 o (b) pueden tener uno, dos o tres restos de aminoácidos insertados o eliminados en relación con la secuencia de (a);
(ii) los restos de aminoácidos 46-50 pueden ser KGHDR;
(iii) los restos de aminoácidos 51-67 de la misma pueden tener (a) al menos 90% de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 51-67 de SEQ ID No: 4 o (b) pueden tener uno, dos o tres restos de aminoácidos insertados o eliminados en relación con la secuencia de (a);
(iv) los restos de aminoácidos 68-73 pueden ser SVFDK;
(v) los restos de aminoácidos 54-90 de la misma pueden tener (a) al menos 90% de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 54-90 de SEQ ID No: 4 o (b) pueden tener uno, dos o tres restos de aminoácidos insertados o eliminados en relación con la secuencia de (a);
(vi) los aminoácidos 109-123 son CATSGQGAYNEQFF o CATSGQGAYREQFF;
Un TCR de la invención puede tener una de las siguientes combinaciones de dominios variables de la cadena alfa y beta:
Dentro del alcance de la divulgación están las variantes fenotípicamente silenciosas de cualquier TCR de la invención descrita en la presente memoria. Como se emplea en la presente memoria, el término "variantes fenotípicamente silenciosas" se entiende que se refiere a un TCR que incorpora uno o más cambios de aminoácidos adicionales además de los establecidos anteriormente cuyo TCR tiene un fenotipo similar al TCR correspondiente sin dicho(s) cambio(s). Para los propósitos de esta solicitud, el fenotipo del TCR comprende especificidad de unión al antígeno (Kd y/o semivida de unión) y especificidad de antígeno. Una variante fenotípicamente silenciosa puede tener una Kd y/o semivida de unión para el complejo GVYDGREHTV (SEQ ID No: 1) HLA-A*0201 dentro del 10% del Kd medido y/o de la semivida de unión del TCR correspondiente sin dicho(s) cambio(s), cuando se mide en condiciones idénticas (por ejemplo, a 25°C y en el mismo chip SPR). Las condiciones adecuadas se definen adicionalmente en el Ejemplo 3. La especificidad del antígeno se define adicionalmente a continuación. Como saben los expertos en la técnica, es posible puede producir TCRs que incorporen cambios en los dominios constantes y/o variables de los mismos en comparación con los detallados anteriormente sin alterar la afinidad por la interacción con el complejo de GVYDGREHTV (SEQ ID No: 1) HLA-A*0201. En particular, tales mutaciones silenciosas se pueden incorporar dentro de partes de la secuencia que se sabe que no están implicadas directamente en la unión al antígeno (por ejemplo, fuera de las CDRs). Tales variantes triviales están incluidas en el alcance de esta descripción. Los TCRs en donde se han realizado una o más sustituciones conservadoras también forman parte de esta invención.
Las mutaciones se pueden llevar a cabo empleando cualquier método adecuado que incluye, pero no se limita a, los basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), clonación basada en enzimas de restricción, o procedimientos de clonación independiente de ligado (LIC). Estos métodos se detallan en muchos de los textos de referencia de biología molecular. Para obtener más detalles sobre la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la clonación basada en enzimas de restricción, véase Sambrook y Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3a edición) CSHL Press. Se puede encontrar más información sobre los procedimientos de clonación independiente de ligado (LIC) en Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6 (1): 30-6.
Los TCRs de la invención tienen la propiedad de unirse al péptido MAGE-A4, complejo GVYDGREHTV (SEQ ID No: 1) HLA-A2. Se ha descubierto que los TCRs de la invención son altamente específicos para esos epítopos MAGE en relación con otros epítopos irrelevantes y, por tanto, son particularmente adecuados como vectores diana para la administración de agentes terapéuticos o marcadores detectables a células y tejidos que presentan esos epítopos. La especificidad en el contexto de los TCRs de la invención se refiere a su capacidad para reconocer células diana HLA-A*0201 que son positivas para el péptido GVYDGREHTV, mientras que tienen una capacidad mínima para reconocer células diana HLA-A*0201 que son negativas para el péptido, o células HLA que presentan el péptido GVYDGEEHSV MAGE B2. Para ensayar la especificidad, los TCRs pueden estar en forma soluble y/o se pueden expresar en la superficie de las células T. El reconocimiento se puede determinar midiendo el nivel de activación de las células T en presencia de un TCR y células diana. En este caso, el reconocimiento mínimo de células diana de péptido negativo o MAGE B2 se define como un nivel de activación de células T de menos del 10%, preferiblemente menos del 5%, y más preferiblemente menos del 1%, del nivel producido en presencia de células diana positivas para péptidos, cuando se miden en las mismas condiciones. Para los TCRs solubles de la invención, la especificidad se puede determinar a una concentración de TCR relevante terapéuticamente. Una concentración relevante terapéuticamente se puede definir como una concentración de TCR de 10-9 M o menos, y/o una concentración de hasta 100, preferiblemente hasta 1000, veces mayor que el valor de CE50 correspondiente. Las células positivas para péptidos se pueden obtener pulsando péptidos o, más preferiblemente, se pueden presentar de manera natural en dicho péptido. Preferiblemente, tanto las células positivas como las negativas al péptido son células humanas.
Se ha descubierto que determinados TCRs de la divulgación son muy adecuados para emplear en terapia adoptiva. Dichos TCRs pueden tener una Kd para el complejo menor de 200 pM, por ejemplo, de aproximadamente 0,05 pM a aproximadamente 20 pM o aproximadamente 100 pM y/o tiene una semivida de unión (T1/2) para el complejo en el intervalo de aproximadamente 0,5 segundos a aproximadamente 12 minutos. En algunas realizaciones, los TCRs de la divulgación pueden tener una Kd para el complejo de aproximadamente 0,05 pM a aproximadamente 20 pM, de aproximadamente 0,1 pM a aproximadamente 5 pM o de aproximadamente 0,1 pM a aproximadamente 2 pM. Sin desear estar limitado por la teoría, parece haber una ventana óptima de afinidad para los TCRs con uso terapéutico en la terapia celular adoptiva. Los TCRs de origen natural que reconocen epítopos de antígenos tumorales tienen generalmente muy baja afinidad (20 microM a 50 microM) y los TCRs de afinidad muy alta (en el intervalo nanomolar o superior) sufren problemas de reactividad cruzada (Robbins et al. (2008) J. Immunol. 1806116-6131; Zhao et al. (2007) J. Immunol. 1795845-5854; Scmid et al. (2010) J. Immunol 1844936-4946).
Los TCRs de la invención pueden ser heterodímeros ap o pueden estar en formato de cadena sencilla. Los formatos de cadena única incluyen polipéptidos de TCR ap de los tipos Va-L-Vp, Vp-L-Va, Va-Ca-L-Vp o Va-L-Vp-Cp, en
donde Va y Vp son regiones variables del TCR a y p respectivamente, Ca y Cp son regiones constantes a y p del TCR respectivamente, y L es una secuencia enlazadora. Para su uso como agente de direccionamiento para administrar agentes terapéuticos a la célula presentadora de antígeno, el TCR puede estar en forma soluble (es decir, sin dominios transmembrana o citoplasmático). Para la estabilidad, los TCR heterodiméricos ap solubles tienen preferiblemente un enlace disulfuro introducido entre los restos de los respectivos dominios constantes, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 03/020763. Uno o ambos dominios constantes presentes en un heterodímero ap de la invención pueden estar truncados en el extremo o extremos C terminal, por ejemplo en hasta 15, o hasta 10 o hasta 8 o menos aminoácidos. Para su uso en terapia adoptiva, un TCR heterodimérico ap se puede, por ejemplo, transfectar como cadenas de longitud completa que tienen dominios tanto citoplasmáticos como transmembrana. Los TCRs para uso en terapia adoptiva pueden contener un enlace disulfuro correspondiente al que se encuentra en la naturaleza entre los respectivos dominios constantes alfa y beta, puede estar presente adicional o alternativamente un enlace disulfuro no natural.
Como resultará obvio para los expertos en la técnica, puede ser posible truncar las secuencias proporcionadas en el extremo C-terminal y/o N-terminal del mismo, en 1, 2, 3, 4, 5 o más restos, sin afectar sustancialmente a las características de unión del TCR. Todas estas variantes triviales se engloban en la presente divulgación.
Los TCR heterodiméricos alfa-beta de la invención normalmente comprenden una secuencia de dominio constante TRAC de la cadena alfa y una secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2 de la cadena beta. Las secuencias de dominio constante de las cadenas alfa y beta se pueden modificar por truncado o sustitución para eliminar el enlace disulfuro natural entre Cys4 del exón 2 de TRAC y Cys2 del exón 2 de TRBC1 o TRBC2. Las secuencias de dominio constante de las cadenas alfa y beta también pueden se modificar mediante la sustitución de restos de cisteína por Thr 48 de TRAC y Ser 57 de TRBC1 o TRBC2, formando dichas cisteínas un enlace disulfuro entre los dominios constantes alfa y beta del TCR.
Algunos TCRs de la divulgación tienen una afinidad de unión, y/o una semivida de unión para el complejo GVYDGREHTV-HLA-A2 sustancialmente más alta que la del Tc R MAGE-A4 de referencia. El aumento de la afinidad de unión de un TCR nativo a menudo reduce la especificidad del TCR por su ligando péptido-MHC, y esto se demuestra en Zhao Yangbing et al., The Journal of Immunology, Asociación Estadounidense de Inmunólogos, EE.UU., Vol. 179, N.° 9, 1 de noviembre de 2007, 5845-5854. Sin embargo, los TCRs de la invención que se derivan del TCR parental siguen siendo específicos para el complejo GVYDGREHTV-HLA-A2, a pesar de tener una afinidad de unión sustancialmente mayor que la del TCR parental. Además, son significativamente más selectivos (por ejemplo, al menos diez veces) para MAGE-A4 sobre MAGE-B2 que el TCR parental.
La afinidad de unión (inversamente proporcional a la constante de equilibrio Kd) y la semivida de unión (expresada como T1/2) se puede determinar empleando el método de resonancia de plasmón de superficie (BIAcore) del Ejemplo 3 de la presente memoria. Las mediciones se pueden realizar a 25°C y a un pH entre 7,1 y 7,5 utilizando una versión soluble del TCR. Se apreciará que duplicar la afinidad de un TCR da como resultado la reducción a la mitad de Kd . T / se calcula como In2 dividido por la constante de disociación (koff).Por lo tanto, duplicar T / da como resultado una reducción a la mitad de koff., Los valores de Kd y koff de los TCRs se miden normalmente para las formas solubles del TCR, es decir, aquellas formas que se truncan para eliminar los restos del dominio transmembrana hidrófobo. Por lo tanto, se debe entender que un TCR dado cumple el requisito de tener una afinidad de unión, y/o una semivida de unión para el complejo GVYDGREHTV-HLA-A2 si una forma soluble de ese TCR cumple ese requisito. Preferiblemente, la afinidad de unión o la semivida de unión de un TCR dado se mide varias veces, por ejemplo 3 o más veces, empleando el mismo protocolo de ensayo, y se toma un promedio de los resultados. El TCR MAGE-A4 de referencia tiene una Kd de aproximadamente 65 pM medido por ese método, y su koff es aproximadamente 0,73 s-1 (es decir, T / es aproximadamente 0,95 s).
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica un TCR de la invención. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ADNc. En algunas realizaciones, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un dominio variable de la cadena a de un TCR de la invención. En algunas realizaciones, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un dominio variable de la cadena p de un TCR de la invención. El ácido nucleico puede ser de origen no natural y/o purificado y/o modificado genéticamente.
En otro aspecto, la invención proporciona un vector que comprende el ácido nucleico de la invención. Preferiblemente, el vector es un vector de expresión de TCR.
La invención también proporciona una célula que alberga un vector de la invención, preferiblemente un vector de expresión de TCR. El vector puede comprender el ácido nucleico de la invención que codifica en un único marco de lectura abierto, o dos marcos de lectura abiertos distintos, la cadena alfa y la cadena beta, respectivamente. Otro aspecto proporciona una célula que alberga un primer vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica la cadena alfa de un TCR de la invención, y un segundo vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica la cadena beta de un TCR de la invención. Dichas células son particularmente útiles en la terapia adoptiva. Las células de la invención se pueden aislar y/o ser recombinantes y/o de origen no natural y/o modificarse genéticamente.
Dado que los TCRs de la invención tienen utilidad en la terapia adoptiva, la invención incluye una célula no natural y/o purificada y/o modificada genéticamente, especialmente una célula T, que presenta un TCR de la invención. La divulgación también proporciona una población expandida de células T que presentan un TCR de la invención. Existen varios métodos adecuados para la transfección de células T con ácido nucleico (tal como ADN, ADNc o ARN) que codifican los TCRs de la invención (véase, por ejemplo, Robbins et al., (2008) J Immunol. 180: 6116 6131). Las células T que expresan los TCRs de la invención serán adecuadas para su uso en el tratamiento del cáncer basado en la terapia adoptiva. Como sabrán los expertos en la técnica, existen varios métodos adecuados mediante los cuales se puede llevar a cabo la terapia adoptiva (véase, por ejemplo, Rosenberg et al., (2008) Nat Rev Cáncer 8(4): 299-308).
Los TCRs solubles de la invención son útiles para administrar marcadores detectables o agentes terapéuticos a las células presentadoras de antígenos y a tejidos que contienen las células presentadoras de antígenos. Por lo tanto, se puede asociar (covalentemente o de otro modo) con un marcador detectable (con fines de diagnóstico en donde el TCR se emplea para detectar la presencia de células que presentan el complejo GVYDGREHTV-HLA-A2); un agente terapéutico; o un resto de modificación de PK (por ejemplo, mediante PEGilación).
Los marcadores detectables con fines de diagnóstico incluyen, por ejemplo, marcadores fluorescentes, radiomarcadores, enzimas, sondas de ácido nucleico y reactivos de contraste.
Como se describe en la presente memoria, los agentes terapéuticos que se pueden asociar con los TCRs de la invención incluyen inmunomoduladores, compuestos radiactivos, enzimas (perforina, por ejemplo) o agentes quimioterapéuticos (cisplatino, por ejemplo). Para asegurar que los efectos tóxicos se ejercen en la ubicación deseada, la toxina podría estar dentro de un liposoma unido al TCR para que el compuesto se libere lentamente. Esto evitará efectos dañinos durante el transporte en el organismo y asegurará que la toxina tenga el máximo efecto después de la unión del TCR a las células presentadoras de antígenos relevantes.
Otros agentes terapéuticos adecuados incluyen:
• agentes citotóxicos de molécula pequeña, es decir, compuestos con la capacidad de matar células de mamíferos que tienen un peso molecular menor de 700 Daltons. Dichos compuestos también podrían contener metales tóxicos capaces de tener un efecto citotóxico. Además, se debe entender que estos agentes citotóxicos de molécula pequeña también incluyen profármacos, es decir, compuestos que se descomponen o se convierten en condiciones fisiológicas para liberar agentes citotóxicos. Ejemplos de tales agentes incluyen cis-platino, derivados de maitansina, rachelmicina, caliqueamicina, docetaxel, etopósido, gemcitabina, ifosfamida, irinotecán, melfalán, mitoxantrona, porfímero de sodio-fotofrina II, temozolomida, topotecán, glucuronato de trimetreato, auristatina E, vincristina y doxorrubicina;
• citotoxinas peptídicas, es decir, proteínas o fragmentos de las mismas con capacidad de matar células de mamíferos. Por ejemplo, ricina, toxina diftérica, exotoxina A bacteriana de pseudomonas, DNasa y RNasa;
• radionucleidos, es decir, isótopos inestables de elementos que se desintegran con la emisión simultánea de una o más partículas a o p, o rayos y. Por ejemplo, yodo 131, renio 186, indio 111, itrio 90, bismuto 210 y 213, actinio 225 y astato 213; se pueden emplear agentes quelantes para facilitar la asociación de estos radionucleidos a los TCRs de alta afinidad, o multímeros de los mismos;
• inmunoestimuladores, es decir, moléculas inmunoefectoras que estimulan la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, citoquinas, tales como IL-2 e IFN-y,
• Superantígenos y mutantes de los mismos;
• Fusiones TCR-HLA;
• quimioquinas, tales como IL-8, factor plaquetario 4, proteína estimuladora del crecimiento del melanoma, etc.;
• anticuerpos o fragmentos de los mismos, que incluyen anticuerpos anti-determinantes de linfocitos T o células Nk (por ejemplo, anti-CD3, anti-CD28 o anti-CD16);
• estructuras proteicas alternativas con características de unión similares a anticuerpos
• activadores del complemento;
• dominios de proteínas xenogénicas, dominios de proteínas alogénicas, dominios de proteínas virales/bacterianas, péptidos virales/bacterianos.
Se proporciona una divulgación preferida con un TCR de la invención asociado (normalmente por fusión a un extremo N o C de la cadena alfa o beta) con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento funcional o variante de dicho
anticuerpo anti-CD3. Los fragmentos de anticuerpos y variantes/análogos que son adecuados para emplear en las composiciones y métodos descritos en la presente memoria incluyen minicuerpos, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos dsFv y scFv, Nanobodies™ (estas construcciones, comercializadas por Ablynx (Bélgica), comprenden un dominio pesado variable de inmunoglobulina sintética simple derivado de un anticuerpo de camélido (por ejemplo, camello o llama) y anticuerpos de dominio (Domantis (Bélgica), que comprenden un dominio pesado variable de inmunoglobulina individual madurada por afinidad o dominio ligero variable de inmunoglobulina) o estructuras proteicas alternativas que muestran características de unión similares a anticuerpos, tales como Affibodies (Affibody (Suecia), que comprende la estructura de proteína A modificada) o Anticalins (Pieris (Alemán), que comprende anticalinas modificadas genéticamente) para nombrar sólo algunos.
Para algunos propósitos, los TCRs de la divulgación se pueden añadir en un complejo que comprende varios TCRs para formar un complejo de TCR multivalente. Hay una serie de proteínas humanas que contienen un dominio de multimerización que se puede usar en la producción de complejos de TCR multivalentes. Por ejemplo, el dominio de tetramerización de p53 que se ha utilizado para producir tetrámeros de fragmentos de anticuerpo scFv que presentaban una mayor persistencia en suero y una constante de disociación significativamente reducida en comparación con el fragmento scFv monomérico. (Willuda et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 (17) 14385-14392). La hemoglobina también tiene un dominio de tetramerización que se podría emplear potencialmente para este tipo de aplicación. Un complejo de TCR multivalente de la divulgación puede tener una capacidad de unión mejorada para el complejo GVYDGREHTV HLA-A2 en comparación con un heterodímero de receptor de células T o de tipo natural no multimérico de la divulgación. Por tanto, los complejos multivalentes de los TCRs de la divulgación también se incluyen dentro de la invención. Dichos complejos de TCR multivalentes según la divulgación son particularmente útiles para rastrear o dirigirse a células que presentan antígenos particulares in vitro o in vivo, y también son útiles como productos intermedios para la producción de otros complejos de TCR multivalentes que tienen tales usos. Como es bien conocido en la técnica, los TCRs se pueden someter a modificaciones postraduccionales. La glicosilación es una de tales modificaciones, que comprende la unión covalente de restos oligosacáridos a aminoácidos definidos en la cadena de TCR. Por ejemplo, los restos de asparagina o los restos de serina/treonina son ubicaciones bien conocidas para la unión de oligosacáridos. El estado de glicosilación de una proteína en particular depende de varios factores, que incluyen la secuencia de la proteína, la conformación de la proteína y la disponibilidad de determinadas enzimas. Además, el estado de glicosilación (es decir, tipo de oligosacárido, enlace covalente y número total de uniones) puede influir en la función de la proteína. Por lo tanto, cuando se producen proteínas recombinantes, a menudo es deseable controlar la glicosilación. Se ha utilizado la glicosilación controlada para mejorar la terapia basada en anticuerpos. (Jefferis R., Nat Rev Drug Discov. Marzo de 2009; 8(3): 226-34). Para los TCRs solubles de la invención, la glicosilación puede controlarse in vivo, usando líneas celulares particulares, por ejemplo, o in vitro, mediante modificación química. Tales modificaciones son deseables, ya que la glicosilación puede mejorar la farmacocinética, reducir la inmunogenicidad e imitar más estrechamente una proteína humana natural (Sinclair AM y Elliott S., Pharm Sci. Agosto de 2005; 94(8):1626-35).
Para la administración a pacientes, los TCRs, ácidos nucleicos y/o células de la invención (normalmente asociados con un marcador detectable o agente terapéutico), se pueden proporcionar en una composición farmacéutica junto con un vehículo o excipiente aceptable farmacéuticamente. Los TCRs terapéuticos o de formación de imágenes según la divulgación se suministrarán normalmente como parte de una composición farmacéutica estéril que normalmente incluirá un vehículo aceptable farmacéuticamente. Esta composición farmacéutica puede estar en cualquier forma adecuada, (dependiendo del método deseado para administrarla a un paciente). Se puede proporcionar en forma de dosificación unitaria, generalmente se proporcionará en un recipiente sellado y se puede proporcionar como parte de un kit. Dicho kit normalmente (aunque no necesariamente) incluiría instrucciones de uso. Puede incluir una pluralidad de dichas formas de dosificación unitaria.
La composición farmacéutica se puede adaptar para la administración por cualquier vía adecuada, preferiblemente una vía parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, o preferiblemente intravenosa). Dichas composiciones se pueden preparar mediante cualquier método conocido en la técnica de la farmacia, por ejemplo, mezclando el principio activo con el/los vehículo(s) o excipiente(s) en condiciones estériles.
Las dosis de las sustancias de la presente invención pueden variar entre amplios límites, dependiendo de la enfermedad o trastorno a tratar, la edad y el estado del individuo a tratar, etc. y un médico determinará en última instancia las dosis adecuadas que se utilizarán.
Los TCRs, composiciones farmacéuticas, vectores, ácidos nucleicos y células de la invención se pueden proporcionar en forma sustancialmente pura, por ejemplo, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% puro.
La invención también proporciona:
• Un TCR, ácido nucleico o célula de la invención para uso en medicina, preferiblemente para uso en un método de tratamiento del cáncer, tal como tumores sólidos descritos (por ejemplo, metástasis pulmonar, hepática y gástrica) y/o carcinomas de células escamosas.
• como se describe, el uso de un TCR, ácido nucleico o célula de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer.
• como se describe, un método para tratar el cáncer en un paciente, que comprende administrar al paciente un TCR, ácido nucleico o célula de la invención.
Las características preferidas de cada aspecto de la invención son las mismas que para cada uno de los otros aspectos mutatis mutandis.
La invención se describe además en los siguientes ejemplos no limitantes.
Se hace referencia a las secuencias adjuntas, en las que:
SEQ ID No: 1 es el péptido MAGE A4
SEQ ID No: 2 es el péptido MAGE B2
SEQ ID No: 3 es la secuencia de aminoácidos de la parte extracelular de la cadena alfa de un TCR específico de MAGE-A4 parental, y SEQ ID No: 4 muestra la secuencia de aminoácidos de la parte extracelular de la cadena beta de una secuencia de aminoácidos de la cadena beta de TCR específica de MAGE-A4 parental.
La SEQ ID No: 5 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena alfa de un TCR Lenti natural (denominado en la presente memoria como "TCR de referencia"). La secuencia es la misma que la del TCR parental excepto que una cisteína se sustituye por T162 (es decir, T48 de la región constante de TRAC). SEQ ID No: 6 es la cadena beta de un TCR Lenti natural (denominado en la presente memoria "TCR de referencia). La secuencia es la misma que la del TCR parental, excepto que una cisteína se sustituye por S169 (es decir, S57 de la región constante TRBC2) y A187 se sustituye por C187 y D201 se sustituye por N201.
Las SEQ ID Nos: 7 y 8 muestran las secuencias de cadenas alfa que pueden estar presentes en los TCRs de la invención. Las subsecuencias que forman las regiones CDR, o partes sustanciales de las regiones CDR, están subrayadas.
La SEQ ID No: 9 muestra la secuencia de la cadena beta que puede estar presente en los TCRs de la invención. Las subsecuencias que forman las regiones CDR ,o partes sustanciales de las regiones CDR están subrayadas. Las SED ID Nos: 10 a 15 muestran las secuencias de las cadenas alfa y beta solubles de los TCRs A, B y C. Ninguno de estos TCRs se podría desarrollar en un TCR funcional según la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Clonación de las secuencias de la región variable de la cadena alfa y beta de TCR MAGE-A4 de referencia en plásmidos de expresión basados en pGMT7
Los dominios alfa variable de TCR MAGE-A4 parental y beta variable de TCR de SEQ ID Nos: 3 y 4 respectivamente se clonaron en plásmidos de expresión basados en pGMT7 que contienen Ca o Cp mediante métodos estándar descritos en (Molecular Cloning a Laboratory Manual, Tercera edición, de Sambrook y Russell). Los plásmidos se secuenciaron empleando un analizador de ADN 3730xl de Applied Biosystems. Los dominios alfa variable de TCR MAGE-A4 de referencia y los dominios beta variable de TCR de SEQ ID Nos: 5 y 6 respectivamente se clonaron de la misma manera.
La secuencia de ADN que codifica la región variable de la cadena alfa de TCR se ligó en pEX956, que se cortó con enzimas de restricción. La secuencia de ADN que codifica la región variable de la cadena beta de TCR se ligó en pEXb21, que también se cortó con enzimas de restricción.
Los plásmidos ligados se transformaron en células competentes de la cepa de E. coli XL1-blue y se sembraron en placas de agar/LB que contenían ampicilina 100 pg/ml. Después de la incubación durante la noche a 37°C, se recogieron colonias individuales y se cultivaron en 5 ml de LB que contenía 100 pg/ml de ampicilina durante la noche a 37°C con agitación. Los plásmidos clonados se purificaron empleando un kit Miniprep (Qiagen) y los plásmidos se secuenciaron empleando un analizador de ADN 3730xl de Applied Biosystems.
Ejemplo 2 - Expresión, replegado y purificación de TCR MAGE-A4 de referencia soluble
Los plásmidos de expresión que contienen la cadena a y la cadena p del TCR de referencia respectivamente, como se prepararon en el Ejemplo 1, se transformaron por separado en la cepa E. coli BL21 pLysS, y se cultivaron colonias individuales resistentes a ampicilina a 37°C en medio TYP (ampicilina 100 pg/ml) hasta DO600 de ~0,6-0,8 antes de inducir la expresión de proteínas con IPTG 0,5 mM. Las células se recolectaron tres horas después de la inducción mediante centrifugación durante 30 minutos a 4000 rpm en un Beckman J-6B. Los sedimentos celulares se lisaron con 25 ml de Bug Buster (NovaGen) en presencia de MgCl2 y DNasal. Los sedimentos de cuerpos de inclusión se recuperaron mediante centrifugación durante 30 minutos a 13000 rpm en una centrífuga Beckman J2-21. A
continuación, se llevaron a cabo tres lavados con detergente para eliminar los restos celulares y los componentes de la membrana. El sedimento del cuerpo de inclusión se homogeneizó cada vez en un tampón Triton (Tris-HCl 50 mM a pH 8,0, Triton-X100 al 0,5%, NaCl 200 mM, NaEDTA 10 mM,) antes de sedimentarse por centrifugación durante 15 minutos a 13000 rpm en un Beckman J2-21. Después, el detergente y la sal se eliminaron mediante un lavado similar en el siguiente tampón: Tris-HCl 50 mM a pH 8,0, NaEDTA 1 mM. Finalmente, los cuerpos de inclusión se dividieron en alícuotas de 30 mg y se congelaron a -70°C. El rendimiento de proteína del cuerpo de inclusión se cuantificó solubilizando con guanidina-HCl 6 M y se tomó una medida de DO en un espectrofotómetro Hitachi U-2001.Después se calculó la concentración de proteína usando el coeficiente de extinción.
Aproximadamente 15 mg de la cadena a de TCR y 15 mg de cuerpos de inclusión solubilizados en la cadena p de TCR se descongelaron de las reservas congeladas y se diluyeron en 10 ml de una disolución de guanidina (clorhidrato de guanidina 6 M, Tris HCl 50 mM pH 8,1, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, DTT 10 mM), para asegurar la desnaturalización completa de la cadena. La disolución de guanidina que contenía cadenas de TCR completamente reducidas y desnaturalizadas se inyectó después en 0,5 litros del siguiente tampón de replegado: Tris 100 mM pH 8,1, L-arginina 400 mM, EDTA 2 mM, urea 5 M. El par redox (clorhidrato de cisteamina y diclorhidrato de cistamina) a concentraciones finales de 6,6 mM y 3,7 mM respectivamente, se añadieron aproximadamente 5 minutos antes de la adición de las cadenas de TCR desnaturalizadas. La disolución se dejó durante ~30 minutos. El TCR replegado se dializó en una membrana Spectrapor 1 (Spectrum; Producto N.° 132670) frente a 10 l de H2O durante 18-20 horas. Después de este tiempo, el tampón de diálisis se cambió dos veces por Tris 10 mM fresco a pH 8,1 (10 l) y la diálisis continuó a 5°C ± 3°C durante otras ~8 horas.
El TCR soluble se separó de los productos de degradación y las impurezas cargando el replegado dializado en una columna de intercambio aniónico POROS 50HQ y eluyendo la proteína unida con un gradiente de NaCl 0-500 mM en Tris 10 mM a pH 8,1 sobre 50 volúmenes de columna empleando un purificador Akta (GE Healthcare ). Se agruparon las fracciones de los picos y se añadió un cóctel de inhibidores de proteasa (Calbiochem). A continuación, las fracciones agrupadas se almacenaron a 4°C y se analizaron mediante SDS-PAGE teñida con Coomassie antes de combinarlas y concentrarlas. Finalmente, el TCR soluble se purificó y caracterizó empleando una columna de filtración en gel Ge Healthcare Superdex 75HR preequilibrada en tampón PBS (Sigma). El pico que eluye a un peso molecular relativo de aproximadamente 50 kDa se agrupó y se concentró antes de la caracterización mediante análisis de resonancia de plasmón de superficie BIAcore.
Ejemplo 3 - Caracterización de la unión
Análisis BIAcore
Se puede usar un biosensor de resonancia de plasmón de superficie (BIAcore 3000™) para analizar la unión de un TCR soluble a su ligando péptido-MHC. Esto se facilita produciendo complejos de péptido-HLA biotinilados solubles ("pHLA") que se pueden inmovilizar en una superficie de unión recubierta de estreptavidina (chip de detección). Los chips de detección comprenden cuatro celdas de flujo individuales que permiten la medición simultánea de la unión del receptor de células T a cuatro complejos pHLA diferentes. La inyección manual del complejo pHLA permite manipular fácilmente el nivel preciso de moléculas de clase I inmovilizadas.
Las moléculas HLA-A*0201 de clase I biotiniladas se replegaron in vitro a partir de cuerpos de inclusión expresados en bacterias que contienen las proteínas de la subunidad constituyente y el péptido sintético, seguido de purificación y biotinilación enzimática in vitro (O'Callaghan et al. (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). La cadena pesada HLA-A*0201 se expresó con un marcador de biotinilación C-terminal que reemplaza los dominios transmembrana y citoplásmico de la proteína en una construcción adecuada. Se obtuvieron niveles de expresión de cuerpos de inclusión de cultivo bacteriano de ~75 mg/litro. La cadena ligera del MHC o microglobulina p2 también se expresó como cuerpos de inclusión en E. coli a partir de una construcción adecuada, a un nivel de cultivo bacteriano de ~500 mg/litro.
Las células de E. coli se lisaron y los cuerpos de inclusión se purificaron hasta aproximadamente 80% de pureza. La proteína de los cuerpos de inclusión se desnaturalizó en guanidina-HCl 6 M, Tris 50 mM a pH 8,1, NaCl 100 mM, DTT 10 mM, EDTA 10 mM, y se replegó a una concentración de cadena pesada de 30 mg/litro, 30 mg/litro de p2m en L-Arginina 0,4 M, Tris 100 mM a pH 8,1, dicloruro de cistamina 3,7 mM, clorhidrato de cisteamina 6,6 mM, 4 mg/l del péptido MAGE-A4 GVYDGREHTV o MAGE-B2 GVYDGEEHSV requerido para ser cargado por la molécula HLA-A*02, mediante la adición de un único pulso de proteína desnaturalizada en tampón de replegado a <5°C. Se dejó que el replegado se completara a 4°C durante al menos 1 hora.
El tampón se cambió por diálisis en 10 volúmenes de Tris 10 mM a pH 8,1. Fueron necesarios dos cambios de tampón para reducir suficientemente la fuerza iónica de la disolución. Después, la disolución de proteína se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de 1,5 gm y se cargó en una columna de intercambio aniónico POROS 50HQ (volumen de lecho de 8 ml). La proteína se eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0-500 mM en Tris 10 mM a pH 8,1 empleando un purificador Akta (GE Healthcare). El complejo HLA-A*0201-péptido eluyó con aproximadamente NaCl 250 mM, y se recogieron las fracciones de los picos, se añadió un cóctel de inhibidores de proteasa (Calbiochem) y las fracciones se enfriaron en hielo.
Las moléculas de pHLA marcadas con biotina se intercambiaron con tampón en Tris 10 mM a pH 8,1, NaCI 5 mM empleando una columna de desalación rápida de GE Healthcare equilibrada en el mismo tampón. Inmediatamente después de la elución, las fracciones que contenían proteínas se enfriaron en hielo y se añadió un cóctel inhibidor de proteasas (Calbiochem). Después se añadieron los reactivos de biotinilación: biotina 1 mM, ATP 5 mM (tamponado a pH 8), MgCl27,5 mM y 5 pg/ml de enzima BirA (purificada según O'Callaghan et al. (1999) Anal. Biochem. 266: 9 15). A continuación, se dejó incubar la mezcla a temperatura ambiente durante la noche.
Las moléculas de pHLA-A*0201 biotiniladas se purificaron empleando cromatografía de filtración en gel. Se preequilibró una columna GE Healthcare Superdex 75 HR 10/30 con PBS filtrado y se cargó 1 ml de la mezcla de reacción de biotinilación y la columna se desarrolló con PBS a 0,5 ml/min empleando un purificador Akta (GE Healthcare). Las moléculas de pHLA-A*0201 biotiniladas eluyeron como un pico único a aproximadamente 15 ml. Se agruparon las fracciones que contenían proteína, se enfriaron en hielo, y se añadió un cóctel de inhibidor de proteasa. La concentración de proteína se determinó empleando un ensayo de unión a Coomassie (PerBio) y se almacenaron congeladas a -20°C alícuotas de moléculas de pHLA-A*01 biotiniladas.
Dichos complejos inmovilizados son capaces de unirse tanto a los receptores de células T como al correceptor CD8aa, ambos de los cuales se pueden inyectar en la fase soluble. Se observa que las propiedades de unión a pHLA de los TCR solubles son cualitativa y cuantitativamente similares si el TCR se usa en la fase soluble o inmovilizada. Este es un control importante de la actividad parcial de las especies solubles y también sugiere que los complejos pHLA biotinilados son biológicamente tan activos como los complejos no biotinilados.
El biosensor de resonancia de plasmón de superficie (SPR) BIAcore 3000™ mide los cambios en el índice de refracción expresado en unidades de respuesta (RU) cerca de la superficie del sensor dentro de una celda de flujo pequeña, un principio que se puede emplear para detectar interacciones de ligando y receptor y analizar su afinidad y parámetros cinéticos. Los experimentos de BIAcore se realizaron a una temperatura de 25°C, utilizando tampón PBS (Sigma, pH 7,1 -7,5) como tampón de ejecución y en la preparación de diluciones de muestras de proteínas. La estreptavidina se inmovilizó en las células de flujo mediante métodos convencionales de acoplamiento de amina. Los complejos de pHLA se inmovilizaron mediante el marcador de biotina. A continuación, se realizó el ensayo pasando TCR soluble sobre las superficies de las diferentes celdas de flujo a un caudal constante, midiendo la respuesta de SPR al hacerlo.
Constante de equilibrio de unión
Los métodos de análisis BIAcore anteriores se utilizaron para determinar las constantes de equilibrio de unión. Se prepararon diluciones en serie de la forma heterodimérica soluble unida por disulfuro del TCR MAGE-A4 de referencia y se inyectaron a un caudal constante de 5 plmin-1 en dos celdas de flujo diferentes; una recubierta con ~1000 RU de complejo específico GVYDGREHTV HLA-A*0201, la segunda recubierta con ~1000 RU de complejo no específico. La respuesta se normalizó para cada concentración usando la medición de la celda de control. La respuesta de datos normalizados se representó gráficamente frente a la concentración de la muestra de TCR y se ajustó a un modelo de ajuste de curva no lineal para calcular la constante de equilibrio de unión, Kd . (Price y Dwek, Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists (2a edición) 1979, Clarendon Press, Oxford). La forma soluble unida por disulfuro del TCR MAGE-A4 de referencia (Ejemplo 2) demostró una Kd de aproximadamente 2,00 pM. A partir de los mismos datos de BIAcore, la T1/2 era de aproximadamente 0,95 s.
Parámetros cinéticos
Los métodos de análisis BIAcore anteriores también se utilizaron para determinar las constantes de equilibrio de unión y las constantes de disociación.
Para los TCRs de alta afinidad (véase el Ejemplo 4 de a continuación) Kd se determinó midiendo experimentalmente la constante de velocidad de disociación, koff, y la constante de la velocidad de asociación, kon. La constante de equilibrio Kd se calculó como koff/ kon.
Se inyectó TCR sobre dos celdas diferentes, una recubierta con ~1000 RU de complejo GVYDGREHTV HLA-A*0201 específico, la segunda recubierta con ~1000 RU de complejo no específico. El caudal se fijó en 50 pl/min. Normalmente se inyectaron 250 pl de TCR a una concentración de ~ 1 pM. A continuación, se hizo fluir el tampón hasta que la respuesta volvió al valor inicial o habían transcurrido más de 2 horas. Los parámetros cinéticos se calcularon utilizando el programa informático BIAevaluation. La fase de disociación se ajustó a una única ecuación de disminución exponencial que permite el cálculo de la semivida.
Ejemplo 4 - Preparación de TCRs de alta afinidad de la invención
Los plásmidos de expresión que contienen la cadena a y la cadena p de TCR respectivamente se prepararon como en el Ejemplo 1:
Los plásmidos se transformaron por separado en la cepa de E. coli BL21pLysS, y colonias individuales resistentes a ampicilina cultivadas a 37°C en medio TYP (ampicilina 100 pg/ml) hasta DO600 de ~0,6-0,8 antes de inducir la expresión de proteínas con IPTG 0,5 mM. Las células se recolectaron tres horas después de la inducción mediante centrifugación durante 30 minutos a 4000 rpm en un Beckman J-6B. Los sedimentos celulares se lisaron con 25 ml de Bug Buster (Novagen) en presencia de MgCl2 y DNasal. Los sedimentos de cuerpos de inclusión se recuperaron mediante centrifugación durante 30 minutos a 13000 rpm en una centrífuga Beckman J2-21. A continuación, se llevaron a cabo tres lavados con detergente para eliminar los restos celulares y los componentes de membrana. El sedimento de los cuerpos de inclusión se homogeneizó cada vez que en un tampón Triton (Tris-HCl 50 mM a pH 8,0, Triton-X100 al 0,5%, NaCl 200 mM, NaEDTA 10 mM,) antes de sedimentarse por centrifugación durante 15 minutos a 13000 rpm en un Beckman J2-21. Después, el detergente y la sal se eliminaron mediante un lavado similar en el siguiente tampón: Tris-HCl 50 mM a pH 8,0, NaEDTA 1 mM. Finalmente, los cuerpos de inclusión se dividieron en alícuotas de 30 mg y se congelaron a -70°C. El rendimiento de proteína de los cuerpos de inclusión se cuantificó solubilizando con guanidina-HCl 6 M y se tomó una medida de DO en un espectrofotómetro Hitachi U-2001. Después se calculó la concentración de proteína empleando el coeficiente de extinción.
Aproximadamente 10 mg de cadena a de TCR y 10 mg cadena p de TCR de cuerpos de inclusión solubilizados para cada TCR de la invención se diluyeron en 10 ml de una disolución de guanidina (clorhidrato de guanidina 6 M, Tris HCl 50 mM a pH 8,1, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, DTT 10 mM), para asegurar la desnaturalización completa de la cadena. La disolución de guanidina que contenía cadenas de TCR completamente reducidas y desnaturalizadas se inyectó después en 0,5 litros del siguiente tampón de replegado: Tris 100 mM a pH 8,1, L-arginina 400 mM, EDTA 2 mM, urea 5 M. Se añadió el par redox (clorhidrato de cisteamina y diclorhidrato de cistamina) a concentraciones finales de 6,6 mM y 3,7 mM respectivamente, aproximadamente 5 minutos antes de la adición de las cadenas de TCR desnaturalizadas. La disolución se dejó durante ~30 minutos. El TCR replegado se dializó en una membrana Spectrapor 1 (Spectrum; Producto N.°. 132670) frente a 10 l de H2O durante 18-20 horas. Después de este tiempo, el tampón de diálisis se cambió dos veces por Tris 10 mM fresco a pH 8,1 (10 l) y la diálisis continuó a 5°C ± 3°C durante otras ~8 horas.
El TCR soluble se separó de los productos de degradación y las impurezas cargando el replegado dializado en una columna de intercambio aniónico POROS 50HQ y eluyendo la proteína unida con un gradiente de NaCl 0-500 mM en Tris 10 mM a pH 8,1 sobre 15 volúmenes de columna empleando un purificador Akta (GE Healthcare). A continuación, las fracciones agrupadas se almacenaron a 4°C y se analizaron mediante SDS-PAGE teñida con Coomassie antes de agruparlas y concentrarlas. Finalmente, los TCRs solubles se purificaron y caracterizaron empleando una columna de filtración en gel GE Healthcare Superdex 75HR preequilibrada en tampón PBS (Sigma). El pico que eluye a un peso molecular relativo de aproximadamente 50 kDa se agrupó y se concentró antes de la caracterización mediante análisis de resonancia de plasmón de superficie BIAcore.
Los perfiles de afinidad de los TCRs así preparados para el epítopo MAGE-A4 o el epítopo MAGE-B2 se evaluaron empleando el método del Ejemplo 3, y se compararon con el TCR de referencia. Los resultados se establecen en la siguiente tabla:
También se hicieron intentos para preparar TCRs de alta afinidad basados en combinaciones de SEQ ID Nos 10/11, 12/13, 14/15.
En el caso de TCR A, que combina la cadena alfa de SEQ ID No 10 y la cadena beta de SEQ ID No. 11, se observó reactividad cruzada entre MAGE-A1, MAGE-A10 y PRAME. No fue posible eliminar esta reactividad cruzada mediante mutación y selección.
El TCR B combina la cadena alfa de SEQ ID No 12 y la cadena beta de SEQ ID No. 13. El TCR B no se pudo plegar para formar un TCR soluble, por lo que no fue posible la caracterización de la unión.
El TCR C combina la cadena alfa de SEQ ID NO 14 y la cadena beta de SEQ ID No: 15. Este TCR era soluble cuando se expresaba y se podía unir al antígeno. Sin embargo, cuando se expresa en células T, el TCR C no muestra actividad.
Ejemplo 5 - Transfección de células T con TCR MAGE-A4 parentales y variantes
(a) Preparación del vector lentiviral mediante transfección transitoria mediada por Express-In de células 293T
Se utilizó un sistema de empaquetamiento lentiviral de 3a generación para empaquetar vectores lentivirales que contienen el gen que codifica el TCR deseado. Se transfectaron células 293T con 4 plásmidos (un vector lentiviral que contenía el gen ORF simple de cadena alfa de TCR-P2A-TCR cadena beta descrito en el Ejemplo 5c (a continuación), y 3 plásmidos que contenían los otros componentes necesarios para construir partículas lentivirales infecciosas pero no replicativas ) mediante transfección mediada por Express-In (Open Biosystems).
Para la transfección se tomó un matraz T150 de células 293T en fase de crecimiento exponencial, con las células distribuidas uniformemente en la placa, y algo más del 50% de confluencia. Las alícuotas Express-In se llevaron a temperatura ambiente. Se colocaron 3 ml de medio sin suero (RPMI 1640 HEPES 10 mM) en un tubo cónico estéril de 15 ml. Se añadieron 174 pl de reactivo Express-In directamente al medio sin suero (esto proporciona una relación en peso de 3,6:1 de reactivo a ADN). Esto se mezcló a fondo invirtiendo los tubos 3-4 veces y se incubó a temperatura ambiente durante 5-20 minutos.
En un microtubo separado de 1,5 ml se añadieron 15 pg de ADN plasmídico a alícuotas de mezcla de empaquetamiento premezcladas (que contenían 18 pg de pRSV.REV (plásmido de expresión Rev), 18 pg de pMDLg/p.RRE (plásmido de expresión Gag/Pol), 7 pg de pVSV-G (plásmido de expresión de glicoproteína VSV), normalmente ~22 pl, y se pipeteó hacia arriba y hacia abajo para asegurar la homogeneidad de la mezcla de ADN. Se añadió aproximadamente 1 ml de medio Express-In/sin suero gota a gota a la mezcla de ADN, y después se pipeteó hacia arriba y hacia abajo suavemente antes de transferir de nuevo al resto del medio Express-In/sin suero. El tubo se invirtió 3-4 veces y se incubó a temperatura ambiente durante 15-30 minutos. El medio de cultivo antiguo se retiró del matraz de células. El complejo Express-In/medio/ADN (3 ml) se añadió directamente en el fondo de un matraz vertical de células 293T. Lentamente, el matraz se colocó plano para cubrir las células y se agitó muy suavemente para asegurar una distribución uniforme. Después de 1 minuto, se añadieron 22 ml de medio de cultivo fresco (R10 HEPES: RPMI 1640, FBS inactivado por calor al 10%, Pen/Strep/L-glutamina al 1%, HEPES 10 mM) y el matraz se devolvió cuidadosamente a la incubadora. Este se incubó durante la noche a 37°C/CO2 al 5%. Después de 24 horas, se recogió el medio que contenía los vectores lentivirales empaquetados.
Para recoger los vectores lentivirales empaquetados, el sobrenadante del cultivo celular se filtró a través de un filtro de jeringa de nailon de 0,45 micrómetros, el medio de cultivo se centrifugó a 10.000 g durante 18 horas (o 112.000 g durante 2 horas), la mayor parte del sobrenadante se eliminó (teniendo cuidado de no alterar el sedimento) y el sedimento se resuspendió en los pocos ml restantes de sobrenadante (generalmente aproximadamente 2 ml de un volumen inicial de 31 ml por tubo). Este se congeló instantáneamente en hielo seco en alícuotas de 1 ml y se almacenó a -80°C.
(b) Transducción de células T con vectores lentivirales empaquetados que contienen el gen de interés
Antes de la transducción con los vectores lentivirales empaquetados, se aislaron células T humanas (CD8 o CD4 o ambas, según los requisitos) de la sangre de voluntarios sanos. Estas células se contaron y se incubaron durante la noche en R10 que contenía 50 U/ml de IL-2 con 1x106 células por ml (0,5 ml/pocillo) en placas de 48 pocillos con microperlas recubiertas con anticuerpo anti-CD3/CD28 prelavadas (expansor de células T Dynabeads®, Invitrogen) en una proporción de 3 perlas por célula.
Después de la estimulación durante la noche, se añadieron 0,5 ml de vector lentiviral empaquetado puro a las células deseadas. Esto se incubó a 37°C/CO2 al 5% durante 3 días. 3 días después de la transducción, las células se contaron y se diluyeron a 0,5 x 106 células/ml. Se añadió medio fresco que contenía IL-2 según fuera necesario. Las perlas se retiraron 5-7 días después de la transducción. Se contaron las células y se reemplazó o añadió medio fresco que contenía IL-2 a intervalos de 2 días. Las células se mantuvieron entre 0,5x106 y 1x106 células/ml. Las células se analizaron mediante citometría de flujo desde el día 3 y se usaron para ensayos funcionales (por ejemplo, ELISpot para la liberación de IFNy, véase el Ejemplo 6) desde el día 5. A partir del día 10, o cuando las células
disminuyen la división y reducen su tamaño, las células se congelan en alícuotas de al menos 4x106 células/vial (a 1x107 células/ml en FBS al 90%/DMSO al 10%) para su almacenamiento.
Ejemplo 6 - Activación de células T modificadas genéticamente con TCR MAGE A4
Se llevó a cabo el siguiente ensayo para demostrar la activación de linfocitos T citotóxicos (CTLs) transducidos con TCR en respuesta a líneas de células tumorales. La producción de IFN-y, medida con el ensayo ELISPOT, se empleó como lectura para la activación de linfocitos T citotóxicos (CTL).
ELISPOTs
Reactivos
Medios de ensayo: FCS al 10% (Gibco, N.° Cat 2011-09), 88% RPMI 1640 (Gibco, N.° Cat 42401), 1% de glutamina (Gibco N.° Cat 25030) y 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco N.° Cat 15070-063).
Tampón de lavado: PBS 0,01 M/Tween 20 al 0,05%
PBS (Gibco N.2 Cat 10010)
El kit ELISPOT de IFNy humano (BD Bioscience; N.° Cat 551849) que contiene anticuerpos de captura y detección y placas de 96 pocillos de PVDF ELISPOT de IFN-y humano, con un conjunto de sustrato AEC asociado (BD Bioscience, N.° Cat 551951)
Métodos
Preparación de células diana
Las células diana empleadas en este método eran células presentadoras de epítopos naturales: células de melanoma humano A375 que son tanto HLA-A2+ como MAGE A10+. Se emplearon como control negativo HCT116 de cáncer de colon humano, que son HLA-A2+ MAGE A10-. Se lavaron suficientes células diana (50.000 células/pocillo) mediante centrifugación tres veces a 1200 rpm, 10 minutos en un Megafuge® 1.0 (Heraeus). A continuación, las células se resuspendieron en medio de ensayo a 106 células/ml.
Preparación de células efectoras
Las células efectoras (células T) empleadas en este método eran linfocitos de sangre periférica (PBL), obtenidos por selección negativa utilizando kits de microperlas CD14 y CD25 (Miltenyi Biotech Cat N.° 130-050-201 y 130-092-983 respectivamente) de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) recién aisladas de la sangre venosa de voluntarios sanos. Las células se estimularon con perlas recubiertas con antiCD3/CD28 (expansor de células T Dynabeads®, Invitrogen), se transdujeron con lentivirus que lleva el gen que codifica el TCR ap completo de interés (basado en la construcción descrita en el Ejemplo 5) y se expandieron en un medio de ensayo que contenía 50 U/ml de IL-2 hasta entre 10 y 13 días después de la transducción. A continuación, estas células se colocaron en un medio de ensayo antes de lavarlas mediante centrifugación a 1200 rpm, 10 minutos en un Megafuge® 1.0 (Heraeus). A continuación, las células se resuspendieron en medio de ensayo a 4X la concentración final requerida.
Las placas se prepararon como sigue: se diluyeron 100 gl de anticuerpo de captura anti-IFN-Y en 10 ml de PBS estéril por placa. A continuación, se dispensaron 100 gl del anticuerpo de captura diluido en cada pocillo. A continuación, las placas se incubaron durante la noche a 4°C. Después de la incubación, las placas se lavaron (programa 1, placa tipo 2, lavador de placas de 96 pocillos Ultrawash Plus; Dynex) para eliminar el anticuerpo de captura. A continuación, las placas se bloquearon añadiendo 200 gl de medio de ensayo a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante dos horas. A continuación, se lavó el medio de ensayo de las placas (programa 1, placa tipo 2, lavador de placas de 96 pocillos Ultrawash Plus, Dynex) y se eliminó cualquier medio restante agitando y golpeando ligeramente las placas ELISPOT sobre una toalla de papel.
Después se añadieron los componentes del ensayo a la placa ELISPOT en el siguiente orden:
50 gL de células diana 106 células/ml (dando un total de 50.000 células diana/pocillo)
50 gL de medio (medio de ensayo)
50 gL de células efectoras (20.000 células PBL transducidas con TCR/pocillo)
Después, las placas se incubaron durante la noche (37°C/CO2 al 5%). Al día siguiente, las placas se lavaron tres veces (programa 1, placa tipo 2, lavador de placas de 96 pocillos Ultrawash Plus, Dynex) con tampón de lavado y se secaron dando golpecitos sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de tampón de lavado. A continuación, se añadieron a cada pocillo 100 gl de anticuerpo de detección primario. El anticuerpo de detección primario se diluyó en 10 ml de tampón de dilución (el volumen requerido para una sola placa) usando la dilución especificada en las instrucciones del fabricante. A continuación, las placas se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 2
horas antes de lavarlas tres veces (programa 1, placa tipo 2, lavador de placas de 96 pocilios Ultrawash Plus, Dynex) con tampón de lavado; el exceso de tampón de lavado se eliminó dando golpecitos en la placa sobre una toalla de papel.
La detección secundaria se realizó añadiendo 100 gl de estreptavidina-HRP diluida a cada pocillo e incubando la placa a temperatura ambiente durante 1 hora. La estreptavidina-HRP se diluyó en 10 ml de tampón de dilución (el volumen requerido para una sola placa), usando la dilución especificada en las instrucciones del fabricante. A continuación, las placas se lavaron tres veces (programa 1, placa tipo 2, lavador de placas de 96 pocillos Ultrawash Plus, Dynex) con tampón de lavado y se dieron golpecitos sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de tampón de lavado. A continuación, las placas se lavaron dos veces con PBS añadiendo 200 gl a cada pocillo, retirando el tampón y dando golpecitos sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de tampón. No más de 15 minutos antes de su uso, se añadió una gota (20 ul) de cromógeno AEC a cada 1 ml de sustrato AEC y se mezcló. Se prepararon 10 ml de esta disolución para cada placa; Se añadieron 100 gl por pocillo. A continuación, la placa se protegió de la luz utilizando papel de aluminio, y se controló el desarrollo de las manchas con regularidad, que normalmente se producía en un plazo de 5-20 minutos. Las placas se lavaron con agua del grifo para terminar la reacción de desarrollo, y se sacudieron para secar antes de desmontarlas en tres partes constituyentes. Después, las placas se dejaron secar a temperatura ambiente durante al menos 2 horas antes de contar las manchas empleando un lector de placas Immunospot® (CTL; Cellular Technology Limited).
Ejemplo 7: identificación del motivo de unión por sustitución con todos los aminoácidos alternativos
Se obtuvieron variantes del péptido MAGE-A4 natural en donde el resto de aminoácido en cada posición se reemplazó secuencialmente por los 19 aminoácidos alternativos de origen natural, de modo que se prepararon 171 péptidos en total. Los péptidos con aminoácidos naturales y sustituidos se pulsaron sobre las células presentadoras de antígenos, y la producción de interferón y (IFNy), medida usando el ensayo ELISpot, se empleó como lectura para la activación de células T transducidas con TCR4. Las posiciones esenciales se definieron por una reducción superior al 50% en la actividad de las células T en relación con el péptido natural.
Los ensayos ELISpot se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 6.
Los restos tolerados en cada posición del péptido se muestran a continuación. Los aminoácidos subrayados representan el resto natural en la posición correspondiente en el péptido.
Por tanto, es evidente que MAGE A4 TCR4 hace contacto con al menos V2 Y3 y D4 del péptido (SEQ ID No: 1) cuando está en complejo con HLA-A*0201 en la superficie de las células presentadoras de antígeno.
SEQ ID No. 1 Epítopo MAGE A4
GVVDGREHTV SEQ ID No. 2 Epítopo MAGE B2
GVYDGEEHSV
SEQ ID No. 3 cadena variable alfa MKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQDTGRGPVSLTIMTFSENTKS NGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVSGGTDSWGKLQF SEQ ID No. 4 cadena variable beta MASLLFFCGAFYLLGTGSMDADVTQTPRNRITKTGKRIMLECSQTKGHDRMYWYRQDP GLGLRLIYYSFDVKDINKGEISDGYSVSRQAQAKFSLSLESAIPNQTALYFCATSGQGAYN EQEF SEQ ID No. 5 forma soluble de la cadena alfa MKKHLTTFLVILWLYFYRGNGKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQD TGRGPVSLTIMTFSENTKSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVSGGTDSW GKLQFGAGTQVVVTPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYI TDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS SEQ ID No. 6 forma soluble de la cadena beta MASLLFFCGAFYLLGTGSMDADVTQTPRNRITKTGKRIMLECSQTKGHDRMYWYRQDP GLGLRLIYYSFDVKDINKGEISDGYSVSRQAQAKFSLSLESAIPNQTALYFCATSGQGAYN EQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWV NGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSE N D E WT Q D RAKP VT QIVSAEAWG RA D SEQ ID No. 7 cadena variable alfa mutante MKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQDTGRGPVSLTIVTFSENTKSN GRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVSGGTDSWGKLQF SEQ ID No. 8 cadena variable alfa mutante MKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQDTGRGPVSLTILTFSENTKSN GRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVSGGTDSWGKLQF SEQ ID No. 9 cadena variable beta mutante MASLLFFCGAFYLLGTGSMDADVTQTPRNRITKTGKRIMLECSQTKGHDRMYWYRQDP GLGLRLIYYSFDVKDINKGEISDGYSVSRQAQAKFSLSLESAIPNQTALYFCATSGQGAYE EQFF SEQ ID No. 10 forma soluble de la cadena alfa METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPG KGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVGGYSTLTFG KGTVLLVSPDNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVL DMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTN LNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID No. 11 forma soluble de la cadena beta
MSISLLCCAAFPLLWAGPVNAGVTQTPKFRILKIGQSMTLQCAQDMNHNYMYWYRQDP GMGLKLIYYSVGAGITDKGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLELAAPSQTSVYFCASSYSRW SPLHFGNGTRLTVTEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWW VNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLS ENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVS ALVLMAMVKRKDF SEQ ID No. 12 forma soluble de la cadena alfa MQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKED GRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVKMANQAGTALIFGKGTTLSVSSNIQNP DPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVA WSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS SEQ ID No. 13 forma soluble de la cadena beta MQDGGITQSPKFQVLRTGQSMTLLCAQDM N H EYMYWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITD QGEVPNGYNVSRLNKREFSLRLESAAPSQTSVYFCASLGGLADEQFFGPGTRLTVLEDL KNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP LKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQDPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQI VSAEAWGRAD SEQ ID No. 14 forma soluble de la cadena alfa MKTFAGFSFLFLWLQLDCMSRGEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQE PGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAERNSGAGS YQLTFGKGTKLSVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYIT DKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSF ETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID No. 15 forma soluble de la cadena beta MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHKITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTL GQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSLFS GVNTEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVEL SWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQF YGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYA VLVSALVLMAMVKRKDF
Claims (17)
1. Un receptor de células T (TCR) que tiene la propiedad de unirse a GVYDGREHTV (SEQ ID No: 1) en un complejo con HLA-A*0201 con una constante de disociación de desde aproximadamente 0,05 pM hasta aproximadamente 20,0 pM cuando se mide con resonancia de plasmón superficial a 25°C y a un pH entre 7,1 y 7,5 empleando una forma soluble del TCR, y tiene al menos una selectividad de unión a SEQ ID No:1 diez veces mayor en complejo con HLA-A*0201 sobre la unión a GVYDGEEHSV (SEQ ID No 2) en complejo con HLA-A*0201 en donde el TCR comprende un dominio variable de la cadena alfa de TCR y un dominio variable de la cadena beta de TCR, y en donde los dominios variables de TCR forman contactos con al menos los restos V2, Y3 y D4 de GVYDGREHTV (SEQ ID No: 1).
2. Un TCR según la reivindicación 1, que es un heterodímero alfa-beta, que tiene una secuencia de dominio constante TRAV10 TRAC de la cadena alfa y una secuencia de dominio constante TRBV24-1 TRBC-2 de la cadena beta.
3. Un TCR según la reivindicación 1, que está en formato monocatenario del tipo Va-L-Vp, Vp-L-Va, Va-Ca-L-Vp, o Va-L-Vp-Cp, en donde Va y Vp son regiones variables a y p de TCR respectivamente, Ca y Cp son regiones constantes a y p de TCR respectivamente, y L es una secuencia enlazadora.
4. Un TCR según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se asocia con un marcador detectable, un agente terapéutico o un resto modificador de PK.
5. Un TCR según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el dominio variable de la cadena alfa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad con la secuencia de restos de aminoácidos 1 -105 de SEQ ID No: 3 y tiene la siguiente mutación de CDR:
con referencia a la numeración de las CDRs mostradas en SEQ ID No: 3, y/o el dominio variable de la cadena beta comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad con la secuencia de restos de aminoácidos 1-105 de SEQ ID No: 4 y tiene al menos una de las siguientes mutaciones de CDR:
con referencia a la numeración de las CDRs mostradas en SEQ ID No: 4.
6. Un TCR según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el dominio variable de la cadena alfa es la secuencia del dominio variable de la cadena alfa establecida en SEQ ID No. 3 y el dominio variable de la cadena beta es la secuencia del dominio variable de la cadena beta establecida en SEQ ID No. 9; o el dominio variable de la cadena alfa es la secuencia del dominio variable de la cadena alfa establecida en SEQ ID No. 7 y el dominio variable de la cadena beta es la secuencia del dominio variable de la cadena beta establecida en la SEQ ID No. 9; o el dominio variable de la cadena alfa es la secuencia del dominio variable de la cadena alfa establecida en SEQ ID No. 8 y el dominio variable de la cadena beta es la secuencia del dominio variable de la cadena beta establecida en SEQ ID No. 9.
7. Un TCR según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el dominio variable de la cadena alfa comprende la secuencia de aminoácidos de los restos de aminoácidos 1-105 de SEQ ID No: 3 o 5 o 7 a 8 o una secuencia de aminoácidos en donde los restos de aminoácidos 1-27, 34-47 y 54-90 de la misma tienen al menos el 90% o el 95% de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 1-27, 34-47 y 54-90 respectivamente de SEQ ID No: 3 o 5 o 7 a 8 y en donde los restos de aminoácidos 28-34, 48-53 y 91-105 tienen al menos el 90% o el 95% de identidad con la secuencia de restos de aminoácidos 28-33, 48-53 y 91-105 respectivamente de SEQ ID No 3 o 5 o 7 a 8.
8. Un TCR según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el dominio variable de la cadena alfa comprende la secuencia de aminoácidos de los restos de aminoácidos 1-105 de SEQ ID No: 7 u 8 o una secuencia de aminoácidos en donde los restos de aminoácidos 1-27, 34-47 y 55-89 de los mismos tienen al menos el 90% o el 95% de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 1-27, 34-47 y 55-89 respectivamente de SEQ ID No: 7 u 8 y en la que los restos de aminoácidos 28-33, 48-53 y 91-105 tienen al menos 90% o 95% de identidad con la secuencia de restos de aminoácidos 28-33, 48-53 y 91-105 respectivamente de SEQ ID No: 7 u 8.
9. Un TCR según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde en el dominio variable de la cadena alfa la secuencia de
(i) los restos de aminoácidos 1-27 de la misma tienen (a) al menos el 90% de identidad con la secuencia de restos de aminoácidos 1-26 de SEQ ID No: 3 o (b) tiene uno, dos o tres restos de aminoácidos insertados o eliminados en relación con la secuencia de (a);
(ii) los restos de aminoácidos 28-33 son VSPFSN;
(iii) los restos de aminoácidos 34-47 de la misma tienen (a) al menos el 90% de identidad con la secuencia de restos de aminoácidos 34-47 de SEQ ID NO: 3 o (b) tiene uno, dos o tres restos de aminoácidos insertados o eliminados en relación con la secuencia de (a);
(iv) los restos de aminoácidos 48-53 son LTIMTF o LTRMTF o LTIVTF o LTILTF
(v) los restos de aminoácidos 54-90 de la misma tienen al menos 90% de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 55-89 de SEQ ID No: 3 o tiene una, dos o tres inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a la misma; y
(vi) los aminoácidos 91-105 son CVVSGGTDSWGKLQF.
10. Un TCR según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el dominio variable de la cadena beta comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 4 o 6 o 9 o una secuencia de aminoácidos en la que los restos de aminoácidos 1-45, 51-67 y 74-109 de los mismos tienen al menos el 90% o el 95% de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 1-45, 51-67, y 74-109 respectivamente de SEQ ID No: 4 o 6 o 9 y en la que los restos de aminoácidos 46-50, 68-73 y 109-123 tienen al menos el 90% o el 95% de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 46-50, 68-73 y 109-123 respectivamente de SEQ ID No: 4 o 6 o 9.
11. Un TCR según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde en el dominio variable de la cadena beta la secuencia de
(i) los restos de aminoácidos 1-45 de la misma tienen (a) al menos el 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de los restos 1-26 de SEQ ID No: 4 o (b) tiene uno, dos o tres restos de aminoácidos insertados o eliminados en relación con la secuencia de (a);
(ii) los restos de aminoácidos 46-50 son KGHDR;
(iii) los restos de aminoácidos 51-67 de la misma tienen (a) al menos el 90% de identidad con la secuencia de restos de aminoácidos 51-67 de SEQ ID NO: 4 o (b) tiene uno, dos o tres restos de aminoácidos insertados o eliminados en relación con la secuencia de (a);
(iv) los restos de aminoácidos 68-73 son SFDVK;
(v) los restos de aminoácidos 54-90 de la misma tienen (a) al menos el 90% de identidad con la secuencia de restos de aminoácidos 54-90 de SEQ ID No: 4 o (b) tiene uno, dos o tres restos de aminoácidos insertados o eliminados en relación con la secuencia de (a); y
(vi) los aminoácidos 109-123 son CATSGQGAYNEQFF o CATSGQGAYREQFF.
12. Ácido nucleico que codifica un TCR según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
13. Una célula aislada o de origen no natural, especialmente una célula T, que presenta un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Una célula que alberga
(a) un vector de expresión de TCR que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 13 en un único marco de lectura abierto, o dos marcos de lectura abiertos distintos que codifican la cadena alfa y la cadena beta, respectivamente; o
(b) un primer vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la cadena alfa de un TCR según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y un segundo vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica la cadena beta de un TCR según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
15. Una composición farmacéutica que comprende un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, un ácido nucleico según la reivindicación 12 o una célula según la reivindicación 13 o la reivindicación 14, junto con uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
16. El TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, el ácido nucleico según la reivindicación 14 o la célula según la reivindicación 15 o la reivindicación 16 para su uso en medicina.
17. El TCR, ácido nucleico o célula para su uso según la reivindicación 16, para su uso en un método para tratar el cáncer.
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