JP7437452B2 - T細胞受容体 - Google Patents
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Description
来のHLA-A*0201拘束性デカペプチドGVYDGEEHSVを結合するT細胞受
容体(TCR)に関する。本発明のTCRは、このMAGEエピトープに対する優れた特
異性プロファイルを示す。
AA)のサブクラスである。これらの抗原の発現は、精巣、胎盤および胎児卵巣などの免
疫特権部位に限定されるが、それらは、他の組織内では通常は発現されない。これらの遺
伝子の発現は、悪性腫瘍において認められている。CTAの免疫原性は、多くの固形腫瘍
においてこれらの抗原を標的にするがんワクチンの広範な開発を導いてきた。このTAA
の大きなクラスの中で、黒色腫関連抗原(MAGE)は、がん免疫療法のための有望な候
補として浮かび上がってきている。
れている多遺伝子ファミリーのメンバーとして報告されている(CT-X抗原)。CT遺
伝子クラスターは、Xq24およびXq28の間に位置し、MAGEおよびNY-ESO
-1などの遺伝子ファミリーを含む。I型MAGE遺伝子クラスターは、最も広範囲に特
徴付けされ、MAGE-A、MAGE-BおよびMAGE-Cファミリーを含む。MAG
E-Aタンパク質は、異なる12のMAGE-A遺伝子ファミリーメンバー(MAGE-
A1からMAGE-A12)によってコードされ、MAGE相同ドメイン(MHD)と呼
ばれる、保存された165~171アミノ酸塩基によって定義される。MHDは、すべて
のMAGE-Aファミリーメンバーによって共有されたアミノ酸の領域のみに相当する。
と呼ばれる、細胞表面分子とペプチドとの複合体を認識してそれらと相互作用する。ペプ
チドは、より大きな分子に由来し、これは、細胞によってプロセシングされ、HLA/M
HC分子も示す。T細胞とHLA/ペプチド複合体との相互作用は限定され、HLA分子
およびペプチドの特定の組合せに特異的なT細胞を必要とする。特異的なT細胞が存在し
ない場合には、そのパートナー複合体が存在するとしてもT細胞応答はない。同様に、特
定の複合体がない場合には、応答はないが、T細胞は存在する。このメカニズムは、感染
に対する免疫系の応答に、自己免疫疾患に、かつ腫瘍などの異常に対する応答に関与して
いる。
発現される(MAGE-AからMAGE-Cファミリー)。他は、正常組織において広範
に発現される(MAGE-DからMAGE-H)。これらすべてのMAGEタンパク質フ
ァミリーは、他のMAGEタンパク質の配列と近似した相同領域を有し、かつ免疫認識に
おいてHLA/ペプチド複合体として提示されるペプチドを含む。したがって、所望のM
AGEペプチド/HLA-A2抗原に特異性が高いTCR臨床候補を選択することは重要
である。
発生において役割を果たしうると考えられているが、その機能はまだ知られていない。腫
瘍病因論では、それは、腫瘍形質転換または腫瘍進行の局面に関与するようである。MA
GE-B2は、多数の腫瘍に関与している。ペプチドGVYDGEEHSV(配列番号1
)は、既知のMAGE-B2タンパク質のアミノ酸残基番号231~241に相当する。
SVを提示しているHLA分子に結合するTCRを開発した。第1の態様では、本発明は
、可溶型のT細胞受容体(TCR)を使用して、25℃、pH7.1から7.5の間での
表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約0.05μMから約20.0μMまでの
解離定数で、HLA-A*0201と複合体形成したGVYDGEEHSV(配列番号1
)に結合する特性を有するTCRであって、ここで、TCRは、TCRアルファ鎖可変ド
メインおよびTCRベータ鎖可変ドメインを含み、TCR可変ドメインは、GVYDGE
EHSV(配列番号1)の少なくとも残基V2、Y3およびD4との接触を形成する、T
CRを提供する。
1から7.5の間での表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約20μMから約5
0μMまでの解離定数で、HLA-A*0201と複合体形成したGVYDGEEHSV
(配列番号1)に結合する特性を有し、ここで、TCRは、TCRアルファ鎖可変ドメイ
ンおよびTCRベータ鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、解離定数は、50マ
イクロMを超え、例えば、100μM、200μM、500μMまたはそれ以上などであ
る。
率良く結合する能力があるが、GVYDGREHTVを提示しているHLAに効率良く結
合する能力はない。
のアミノ酸残基1~111の配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配
列を含み、かつ/またはベータ鎖可変ドメインは、配列番号4(ベータ鎖)のアミノ酸残
基1~111の配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
HSV(配列番号1)に結合する特性を有し、かつ、TCRアルファ鎖可変ドメインおよ
びTCRベータ鎖可変ドメインを含む、T細胞受容体(TCR)であって、
アルファ鎖可変ドメインは、配列番号3のアミノ酸残基1~111の配列に対して少な
くとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ/または
ベータ鎖可変ドメインは、配列番号4のアミノ酸残基1~111の配列に対して少なく
とも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、TCRを提供する。
ーカーを提供する。本発明は、がん細胞に細胞傷害剤または免疫エフェクター剤を送達す
る目的に有用な、かつ/または養子療法における使用に有用な、こうしたTCRを提供す
る。
的データベースへのリンクを使用して記載されている。天然のアルファ-ベータヘテロ二
量体TCRは、アルファ鎖およびベータ鎖を有する。概して、それぞれの鎖は、可変領域
、連結領域および定常領域を含み、ベータ鎖は、通常、可変領域と連結領域との間に短い
多様性領域も含むが、この多様性領域は、連結領域の部分とみなされることが多い。それ
ぞれの可変領域は、フレームワーク配列内に埋め込まれた3つのCDR(相補性決定領域
)を含み、1つは、CDR3と命名された超可変領域である。それらのフレームワーク、
CDR1およびCDR2配列、ならびに部分的に定義されたCDR3配列によって、区別
されるいくつかの型のアルファ鎖可変(Vα)領域と、いくつかの型のベータ鎖可変(V
β)領域がある。Vα型は、IMGT命名法において固有のTRAV番号によって称され
る。したがって、「TRAV21」は、固有のフレームワークおよびCDR1およびCD
R2配列、ならびに、TCR間で保存されているアミノ酸配列だけでなくTCRによって
異なるアミノ酸配列をも含むアミノ酸配列によって部分的に定義されるCDR3配列を有
するTCR-Vα領域を定義する。同様の方法で、「TRBV5-1」は、固有のフレー
ムワークおよびCDR1およびCDR2配列を有するTCR-Vβ領域を定義するが、部
分的にのみ定義されたCDR3配列を有する。
領域は、IMGT-TRACおよびTRBC命名法によって、同様に定義される。
ように、連鎖状のTRBD/TRBJ領域は、連結領域と一緒とみなされることが多い。
変ドメインおよび定常ドメインを有するとみなされる。可変ドメインは、可変領域および
連結領域の連鎖からなる。本明細書および特許請求の範囲において、「TCRアルファ可
変ドメイン」という用語は、したがって、TRAVおよびTRAJ領域の連鎖を指し、T
CRアルファ定常ドメインという用語は、細胞外TRAC領域、またはC末端トランケー
ト型TRAC配列を指す。同様に、「TCRベータ可変ドメイン」という用語は、TRB
VおよびTRBD/TRBJ領域の連鎖を指し、TCRベータ定常ドメインという用語は
、細胞外TRBC領域、またはC末端トランケート型TRBC配列を指す。
られており、利用可能である。例えば、それらは、IMGT公的データベースにおいて見
出されうる。“T cell Receptor Factsbook”,(2001)
LeFranc and LeFranc,Academic Press,ISBN
0-12-441352-8も、IMGT命名法によって定義される配列を開示している
が、その公開日および結果として生じる時間のずれのため、その中の情報は、時に、IM
GTデータベースの参照による確認を必要とする。
ようなアルファ鎖細胞外ドメインおよび配列番号3(TRBV24-1+TRBC-2)
に示されているようなベータ鎖細胞外ドメインを含む。「親TCR」、「親MAGE-A
4-TCR」という用語は、本明細書において同義的に使用され、配列番号2および3そ
れぞれの細胞外アルファ鎖およびベータ鎖を含むこのTCRを指す。ペプチド-HLA複
合体に対して親TCRよりも高い親和性および/または遅い解離速度を有する、親TCR
に対して相対的に変異または修飾されたTCRを提供することは望ましい。
参照TCRを提供する目的で、配列番号3に示されている親MAGE-A4-TCRアル
ファ鎖の細胞外配列および配列番号4に示されている親MAGE-A4-TCRベータ鎖
の細胞外配列を有する本発明による可溶性TCRを使用することは都合がいい。そのTC
Rは、本明細書において、「参照TCR」または「参照MAGE-A4-TCR」と称さ
れる。配列番号5は、配列番号3の親アルファ鎖細胞外配列を含み、またT162(すな
わち、TRACのT48)からC162に置換されていることに留意されたい。同様に、
配列番号6は、配列番号4の親ベータ鎖の細胞外配列であって、S169(すなわち、T
RBC2のS57)からC169に置換され、C187からA187に置換され、N20
1からD201に置換されている。親アルファ鎖および親ベータ鎖細胞外配列に対して相
対的なこれらのシステイン置換は、リフォールディングされた可溶性TCR、すなわち、
細胞外アルファ鎖およびベータ鎖をリフォールディングすることによって形成されたTC
Rを安定化する鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする。安定なジスルフィドで連結さ
れた可溶性TCRを参照TCRとして使用することにより、結合親和性および結合半減期
のさらに好都合な評価が可能となる。本発明のTCRは、上記の変異を含んでいてもよい
。
もしくは改変されていてもよい。本発明のTCRは、親TCRに対して相対的なアルファ
鎖可変ドメインおよび/またはベータ鎖可変ドメインに存在する2つ以上の変異を有して
いてもよい。「改変TCR」および「変異体TCR」は、本明細書において同義的に使用
され、親TCRに対して相対的に、特に、そのアルファ鎖可変ドメインおよび/またはベ
ータ鎖可変ドメイン内に、導入された1つまたは複数の変異を有するTCRを一般に意味
する。これらの変異は、HLA-A*020101と複合体を形成したGVYDGEEH
SV(配列番号1)に対する結合親和性を改良しうる。ある特定の実施形態では、アルフ
ァ鎖可変ドメイン内に1、2、3、4、5、6、7つまたは8つの変異、例えば、4つま
たは8つの変異があり、かつ/またはベータ鎖可変ドメイン内に1、2、3、4つまたは
5つの変異、例えば、5つの変異がある。一部の実施形態では、本発明のTCRのα鎖可
変ドメインは、配列番号3のアミノ酸残基1~105の配列に対して少なくとも90%、
少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくと
も95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも9
9%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、本発明の
TCRのβ鎖可変ドメインは、配列番号4のアミノ酸残基1~123の配列に対して少な
くとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも9
4%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%また
は少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
照して
ベータ鎖可変ドメインは、配列番号4に示されている番号付けを参照して
ノ酸残基1~105のアミノ酸配列
またはそのアミノ酸残基1~27、34~47および54~90が、それぞれ配列番号
3もしくは5もしくは7のアミノ酸残基1~27、34~47および54~90の配列に
対して少なくとも90%もしくは95%の同一性を有し、アミノ酸残基28~33、48
~53および91~105が、それぞれ配列番号3もしくは5もしくは7のアミノ酸残基
28~33、48~53および91~105の配列に対して少なくとも90%もしくは9
5%の同一性を有するアミノ酸配列
を含んでいてもよい。
(i)そのアミノ酸残基1~26の配列は、(a)配列番号3のアミノ酸残基1~26
の配列に対して少なくとも90%の同一性を有していてもよく、または(b)(a)の配
列に対して相対的に挿入もしくは欠失された1つ、2つまたは3つのアミノ酸残基を有し
ていてもよく、
(ii)アミノ酸残基28~33の配列は、VSPFSNであり、
(iii)そのアミノ酸残基33~49の配列は、(a)配列番号3のアミノ酸残基3
4~47の配列に対して少なくとも90%の同一性を有していてもよく、または(b)(
a)の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された1つ、2つまたは3つのアミノ酸残
基を有していてもよく、
(iv)アミノ酸残基48~53の配列は、LTIMTFまたはLTRMTFであって
もよく、
(v)そのアミノ酸残基55~89の配列は、配列番号3のアミノ酸残基54~90の
配列に対して少なくとも90%の同一性を有していてもよく、またはそれに対して相対的
に1つ、2つまたは3つの挿入、欠失もしくは置換を有していてもよく、
(vi)アミノ酸90~93の配列は、CVVSGGTDSWGKLQFであってもよ
い。
酸配列
またはそのアミノ酸残基1~45、51~67、74~109が、それぞれ配列番号4
、6もしくは8~10のアミノ酸残基1~45、51~67、74~109の配列に対し
て少なくとも90%もしくは95%の同一性を有し、アミノ酸残基46~50、68~7
3および109~123が、それぞれ配列番号4、6もしくは8~10のアミノ酸残基4
6~50、68~73および109~123の配列に対して少なくとも90%もしくは9
5%の同一性を有するアミノ酸配列
を含んでいてもよい。
(i)そのアミノ酸残基1~45の配列は、(a)配列番号4の残基1~45のアミノ
酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有していてもよく、または(b)(a)の配
列に対して相対的に挿入もしくは欠失された1つ、2つまたは3つのアミノ酸残基を有し
ていてもよく、
(ii)アミノ酸残基46~50の配列は、KGHDRまたはKGRDRであってもよ
く、
(iii)そのアミノ酸残基51~67の配列は、(a)配列番号4のアミノ酸残基5
1~67の配列に対して少なくとも90%の同一性を有していてもよく、または(b)(
a)の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された1つ、2つまたは3つのアミノ酸残
基を有していてもよく、
(iv)アミノ酸残基68~73の配列は、SVFDKであってもよく、
(v)そのアミノ酸残基54~90の配列は、(a)配列番号4のアミノ酸残基54~
90の配列に対して少なくとも90%の同一性を有していてもよく、または(b)(a)
の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された1つ、2つまたは3つのアミノ酸残基を
有していてもよく、
(vi)アミノ酸109~123の配列は、CATSGQGAYNEQFFまたはCA
TSGQGAYREQFFまたはCATSGQGAYKEQFFである。
つを有していてもよい:
ントも本発明の範囲内である。本明細書中で使用される場合、「表現型的にサイレントな
バリアント」という用語は、上記のものに加えて1つまたは複数のさらなるアミノ酸変更
を組み込むTCRであって、前記変更を含まない対応するTCRと類似した表現型を有す
るTCRを指すことが理解される。本出願の目的で、TCR表現型には、抗原結合特異性
(KDおよび/または結合半減期)および抗原特異性が含まれる。表現型的にサイレント
なバリアントは、同一条件下で(例えば、25℃、同じSPRチップ上で)測定されたと
きに、前記変更を含まない対応するTCRの測定されたKDおよび/または結合半減期の
10%以内の、GVYDGEEHSV(配列番号1) HLA-A*0201複合体に対
するKDおよび/または結合半減期を有していてもよい。好適な条件は、実施例3におい
てさらに定義されている。抗原特異性は、以下でさらに定義されている。当業者に知られ
ているように、GVYDGEEHSV(配列番号1) HLA-A*0201複合体との
相互作用のための親和性を変えることなく、上記に詳述されているものと比較して、その
定常ドメインおよび/または可変ドメイン内に変更を組み込むTCRを作製することが可
能でありうる。特に、こうしたサイレントな変異は、抗原結合に直接に関与しないことが
知られている配列の部分内(例えば、CDRの外側)に組み込まれうる。こうした些細な
バリアントは、本発明の範囲内に含まれる。1つまたは複数の保存的置換がなされている
TCRも、本発明の部分を構成する。
ニング、またはライゲーション非依存性クローニング(LIC)手順を含むが、これらに
限定されない、任意の適切な方法を使用して行われうる。これらの方法は、多くの標準的
な分子生物学教科書の中で詳述されている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および制限
酵素に基づいたクローニングに関するさらなる詳細については、Sambrook&Ru
ssell,(2001)Molecular Cloning - A Labora
tory Manual(3rd Ed.)CSHL Pressを参照されたい。ライ
ゲーション非依存性クローニング(LIC)手順についてのさらなる情報は、Rasht
chian,(1995)Curr Opin Biotechnol 6(1):30
-6において見出されうる。
HLA-A2複合体を結合する特性を有する。本発明のTCRは、他の、関連性のないエ
ピトープに対して相対的に、そのMAGEエピトープに対する特異性が高いことが見出さ
れており、したがって、そのエピトープを提示している細胞および組織に治療剤または検
出可能な標識を送達するためのターゲティングベクターとして特に好適である。本発明の
TCRの文脈における特異性は、ペプチドGVYDGEEHSVについて陰性であるHL
A-A*0201標的細胞、またはMAGE-A4ペプチドGVYDGREHTVを提示
するHLA細胞を認識するきわめて低い能力を有するのに対して、該ペプチドについて陽
性であるHLA-A*0201標的細胞を認識する本発明のTCRの能力に関する。特異
性を試験するために、TCRは、可溶型であってもよく、かつ/またはT細胞の表面上で
発現されてもよい。認識は、TCRおよび標的細胞の存在下におけるT細胞活性化のレベ
ルを測定することによって決定されうる。この場合には、ペプチド陰性またはMAGE-
A4標的細胞の最低限の認識は、同じ条件下で測定されたときに、ペプチド陽性標的細胞
の存在下で産生されるレベルの10%未満、好ましくは、5%未満、より好ましくは、1
%未満のT細胞活性化のレベルとして定義される。本発明の可溶性TCRについて、特異
性は、治療的に関連するTCR濃度で決定されうる。治療的に関連する濃度は、10-9
M以下のTCR濃度として、かつ/または対応するEC50値よりも最高100倍、好ま
しくは、最高1000倍高い濃度として定義されうる。ペプチド陽性細胞は、ペプチドを
パルスすることによって得られてもよく、または、より好ましくは、それらは天然に存在
する前記ペプチドであってもよい。好ましくは、ペプチド陽性細胞およびペプチド陰性細
胞の両方がヒト細胞である。
ている。こうしたTCRは、200μM未満、例えば、約0.05μMから約20μMま
たは約100μMまでの、複合体に対するKDを有していてもよく、かつ/または約0.
5秒から約12分までの範囲内の、複合体に対する結合半減期(T1/2)を有していて
もよい。一部の実施形態では、本発明のTCRは、約0.05μMから約20μM、約0
.1μMから約5μMまたは約0.1μMから約2μMまでの、複合体に対するKDを有
しうる。理論に拘束されることを望むものではないが、養子細胞療法における治療的使用
を伴うTCRに対する親和性の最適枠があるようである。腫瘍抗原からエピトープを認識
する天然に存在するTCRは、一般に、親和性が低すぎ(20マイクロMから50マイク
ロM)、(ナノモル範囲内またはそれより高い)きわめて高い親和性のTCRは、交差反
応性の問題を持つ(Robbins et al(2008)J.Immunol.18
0 6116-6131;Zhao et al(2007)J.Immunol.17
9 5845-5854;Scmid et al(2010)J.Immunol 1
84 4936-4946)。
単鎖形式には、Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-VβまたはVα-L
-Vβ-Cβ型のαβTCRポリペプチドが含まれ、VαおよびVβはそれぞれTCRα
可変領域およびTCRβ可変領域であり、CαおよびCβはそれぞれTCRα定常領域お
よびTCRβ定常領域であり、Lはリンカー配列である。治療剤を抗原提示細胞に送達す
るためのターゲティング剤としての使用のために、TCRは、可溶型(すなわち、膜貫通
ドメインまたは細胞質ドメインを有していない)であってもよい。安定性のために、可溶
性αβヘテロ二量体TCRは、例えば、WO03/020763に、記載されているよう
に、それぞれの定常ドメインの残基間に導入されたジスルフィド結合を有することが好ま
しい。本発明のαβヘテロ二量体内に存在する定常ドメインのうちの1つまたは両方は、
例えば、多くとも15個、または多くとも10個もしくは多くとも8個の、またはそれよ
り少ないアミノ酸だけ、C末端がトランケートされていてもよい。養子療法における使用
のために、αβヘテロ二量体TCRは、例えば、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインの
両方を有する完全長の鎖としてトランスフェクトされてもよい。養子療法における使用の
ためのTCRは、自然界においてそれぞれのアルファ定常ドメインとベータ定常ドメイン
との間に見出されるものと一致しているジスルフィド結合を含んでいてもよく、付加的に
または代替的に、天然でないジスルフィド結合が存在していてもよい。
、所与の配列をそのC末端および/またはN末端で、1、2、3、4、5つまたはそれ以
上の残基だけ、トランケートすることも可能でありうる。すべてのこうした些細なバリア
ントは、本発明によって包含される。
イン配列およびベータ鎖TRBC1またはTRBC2定常ドメイン配列を含む。アルファ
鎖およびベータ鎖定常ドメイン配列は、TRACのエクソン2のCys4とTRBC1ま
たはTRBC2のエクソン2のCys2との間の天然のジスルフィド結合を欠失させるた
めのトランケーションまたは置換によって修飾されていてもよい。アルファ鎖およびベー
タ鎖定常ドメイン配列は、TRACのThr48およびTRBC1またはTRBC2のS
er57についてのシステイン残基の置換によっても修飾されていてもよく、前記システ
インは、TCRのアルファ定常ドメインとベータ定常ドメインとの間でジスルフィド結合
を形成する。
GVYDGEEHSV-HLA-A2複合体に対する結合親和性、および/または結合半
減期を有する。天然のTCRの結合親和性を高めると、そのペプチド-MHCリガンドに
対するTCRの特異性が低下することが多く、これは、Zhao Yangbing e
t al.,The Journal of Immunology,The Amer
ican Association of Immunologists,US,vol
.179,No 9,1 November 2007,5845-5854において実
証されている。しかし、親TCRに由来する本発明のTCRは、親TCRよりも実質的に
高い結合親和性を有しているにもかかわらず、GVYDGEEHSV-HLA-A2複合
体に対する特異的を維持している。さらに、それらは、MAGE-A4を超えMAGE-
B2について親TCRよりも顕著に(例えば、少なくとも10倍)選択的である。
、本明細書中の実施例3の表面プラズモン共鳴(BIAcore)法を使用して決定され
うる。測定は、可溶型のTCRを使用して、25℃、pH7.1から7.5の間で行われ
うる。TCRの親和性が2倍になると、結果としてKDは半分になることは理解されよう
。T1/2は、解離速度(koff)によって除算されたln2として算出される。した
がって、T1/2が2倍になると、結果としてkoffは半分になる。TCRについての
KDおよびkoff値は、通常、可溶型、すなわち、トランケートされて疎水性膜貫通ド
メイン残基が除去された形態のTCRについて測定される。したがって、所与のTCRは
、そのTCRの可溶型がその必要条件を満たす場合には、それが、GVYDGREHTV
-HLA-A2複合体に対する結合親和性、および/または結合半減期を有するという必
要条件を満たすことが理解されるべきである。好ましくは、所与のTCRの結合親和性ま
たは結合半減期は、同じアッセイプロトコールを使用して、数回、例えば、3回以上測定
され、結果の平均がとられる。参照TCRは、その方法によって測定されるように、約1
7μMのKDを有し、T1/2は約1.6秒である。
施形態では、核酸は、cDNAである。一部の実施形態では、本発明は、本発明のTCR
のα鎖可変ドメインをコードする配列を含む核酸を提供する。一部の実施形態では、本発
明は、本発明のTCRのβ鎖可変ドメインをコードする配列を含む核酸を提供する。核酸
は、天然に存在しないものであってもよく、かつ/または精製および/もしくは改変され
ていてもよい。
ターは、TCR発現ベクターである。
供する。ベクターは、単一のオープンリーディングフレーム、または2つの異なるオープ
ンリーディングフレームにおいて、アルファ鎖およびベータ鎖をそれぞれコードする本発
明の核酸を含んでいてもよい。別の態様は、本発明のTCRのアルファ鎖をコードする核
酸を含む第1の発現ベクター、および本発明のTCRのベータ鎖をコードする核酸を含む
第2の発現ベクターを宿している細胞を提供する。こうした細胞は、養子療法において特
に有用である。本発明の細胞は、単離されていてもよく、かつ/または組換え体および/
または天然に存在しないものであってもよく、かつ/または改変されていてもよい。
Rを提示している、天然に存在しないかつ/または精製および/もしくは改変された細胞
、特に、T細胞が含まれる。本発明は、本発明のTCRを提示しているT細胞の増殖した
集団も提供する。本発明のTCRをコードする核酸(DNA、cDNAまたはRNAなど
)でのT細胞のトランスフェクションに好適ないくつかの方法がある(例えば、Robb
ins et al.,(2008)J Immunol.180:6116-6131
を参照されたい)。本発明のTCRを発現しているT細胞は、養子療法に基づいたがんの
治療における使用に好適となる。当業者には知られているであろうように、養子療法が行
われうるいくつかの好適な方法がある(例えば、Rosenberg et al.,(
2008)Nat Rev Cancer 8(4):299-308を参照されたい)
。
能な標識または治療剤を送達するのに有用である。したがって、(GVYDGEEHSV
-HLA-A2複合体を提示している細胞の存在を検出するためにTCRが使用される、
診断目的のための)検出可能な標識;治療剤;または(例えば、ペグ化による)PK修飾
部分と(共有結合または他の方法で)結合されていてもよい。
プローブおよびコントラスト試薬が含まれる。
例えばパーフォリン)または化学療法剤(例えばシスプラチン)が含まれる。毒性作用が
望ましい部位において果たされることを確実にするために、毒素は、化合物がゆっくりと
放出されるように、TCRにリンクされたリポソームの中にあってもよい。これは、体内
での輸送中の損傷作用を防止することになり、関連する抗原提示細胞に対するTCRの結
合後に毒素が最も高い効果を有することを確実にする。
・ 小分子細胞傷害剤、すなわち、700ダルトン未満の分子量を有し、哺乳動物細胞
を死滅させる能力を有する化合物。こうした化合物としては、細胞傷害作用を有する能力
のある毒性金属も含まれうる。さらに、これらの小分子細胞傷害剤としては、プロドラッ
グ、すなわち、生理学的な条件下で壊変してまたは変換されて細胞傷害剤を放出する化合
物も含まれることが理解されるべきである。こうした作用剤の例には、シスプラチン、メ
イタンシン誘導体、ラシェルマイシン、カリケアマイシン、ドセタキセル、エトポシド、
ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソル
フィマーソディウムフォトフリンII(sorfimer sodiumphotofr
in II)、テモゾロミド、トポテカン、トリメトレートグルクロネート(trime
treate glucuronate)、オーリスタチンE ビンクリスチンおよびド
キソルビシンが含まれる;
・ ペプチド細胞毒素、すなわち、哺乳動物細胞を死滅させる能力を有するタンパク質
またはその断片。例えば、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素A、DN
アーゼおよびRNアーゼ;
・ 放射性核種、すなわち、α粒子もしくはβ粒子、またはγ線のうちの1つまたは複
数の同時発生的な放出を伴って壊変する元素の不安定同位体。例えば、ヨウ素131、レ
ニウム186、インジウム111、イットリウム90、ビスマス210および213、ア
クチニウム225ならびにアスタチン213;高親和性TCR、またはその多量体に対す
るこれらの放射性核種の結合を促進するためにキレート化剤が使用されてもよい;
・ 免疫刺激剤、すなわち、免疫応答を刺激する免疫エフェクター分子。例えば、IL
-2およびIFN-γなどのサイトカイン、
・ スーパー抗原およびその変異体;
・ TCR-HLA融合体;
・ ケモカイン、例えば、IL-8、血小板第4因子、黒色腫増殖刺激タンパク質など
;
・ 抗T細胞または抗NK細胞決定因子抗体(例えば、抗CD3、抗CD28または抗
CD16)を含む、抗体またはその断片;
・ 抗体様結合特性を有する代替のタンパク質足場
・ 補体活性化因子;
・ 異種のタンパク質ドメイン、同種異系のタンパク質ドメイン、ウイルス/細菌のタ
ンパク質ドメイン、ウイルス/細菌のペプチド
が含まれる。
はバリアントと(通常、アルファ鎖またはベータ鎖のN末端またはC末端への融合によっ
て)結合された本発明のTCRによって提供される。本明細書に記載の組成物および方法
における使用に好適である抗体断片およびバリアント/アナログとしては、ミニボディ、
Fab断片、F(ab’)2断片、dsFvおよびscFv断片、Nanobodies
(商標)(Ablynx(Belgium)によって市販されている、これらのコンスト
ラクトは、ラクダ科動物(例えば、ラクダまたはラマ)抗体に由来する合成単一免疫グロ
ブリン可変重鎖ドメインを含む)ならびにドメイン抗体(Domantis(Belgi
um)、親和性が成熟した単一の免疫グロブリン可変重鎖ドメインまたは免疫グロブリン
可変軽鎖ドメインを含む)または抗体様結合特性を示す代替のタンパク質足場、ほんの少
し例を挙げれば、Affibodies(Affibody(Sweden)、改変され
たプロテインA足場を含む)またはAnticalins(Pieris(German
)、改変されたアンチカリンを含む)などが含まれる。
て多価TCR複合体を形成していてもよい。多価TCR複合体の生成において使用されう
る、多量体化ドメインを含むいくつかのヒトタンパク質がある。例えば、p53の四量体
化ドメイン、これは、単量体scFv断片と比較して、血清残留性の上昇および解離速度
の顕著な低下を示す、scFv抗体断片の四量体を生成するために利用されてきた(Wi
lluda et al.(2001)J.Biol.Chem.276(17)143
85-14392)。ヘモグロビンも、この種類の適用に潜在的に使用されうる四量体化
ドメインを有する。本発明の多価TCR複合体は、多量体でない野生型または本発明のT
細胞受容体ヘテロ二量体と比較して、GVYDGREHTV-HLA-A2複合体に対す
る増強された結合能力を有しうる。したがって、本発明のTCRの多価複合体も本発明の
範囲内に含まれる。本発明によるこうした多価TCR複合体は、in vitroまたは
in vivoで特定の抗原を提示している細胞をトラッキングまたはターゲティングす
るのに特に有用であり、こうした使用を有するさらなる多価TCR複合体の生成のための
中間体としても有用である。
グリコシル化は、1つのこうした修飾であり、これは、TCR鎖における定められたアミ
ノ酸に対するオリゴ糖部分の共有結合的付加を含む。例えば、アスパラギン残基、または
セリン/スレオニン残基は、よく知られているオリゴ糖付加のための部位である。特定の
タンパク質のグリコシル化状態は、タンパク質配列、タンパク質高次構造および特定の酵
素の有用性を含む、いくつかの要因に依存する。さらに、グリコシル化状態(すなわち、
オリゴ糖型、共有結合および付加の総数)は、タンパク質機能に影響しうる。したがって
、組換えタンパク質を製造するとき、グリコシル化を制御するのが望ましいことが多い。
制御されたグリコシル化は、抗体に基づいた療法を改良するために使用されてきた。(J
efferis R.,Nat Rev Drug Discov.2009 Mar;
8(3):226-34.)。本発明の可溶性TCRに対して、グリコシル化は、in
vivoで、例えば、特定の細胞株を使用することによって、またはin vitroで
、化学修飾によって、制御されてもよい。グリコシル化は、薬物動態を改良すること、免
疫原性を低下させること、および天然のヒトタンパク質をより近く模倣することができる
ので、こうした修飾は望ましい(Sinclair AM and Elliott S
.,Pharm Sci.2005 Aug;94(8):1626-35)。
TCR、核酸および/または細胞は、薬学的に許容される担体または添加剤と一緒に医薬
組成物中で提供されてもよい。本発明による治療用またはイメージング用TCRは、通常
、薬学的に許容される担体を通常は含むであろう無菌の医薬組成物の部分として供給され
ることになる。この医薬組成物は、(患者にそれを投与する望ましい方法に依存して)い
かなる好適な形態であってもよい。それは、単位剤形で提供されてもよく、一般には密封
された容器内で提供されることになり、キットの部分として提供されてもよい。こうした
キットには、通常は(必ずではないが)、使用のための説明書が含まれるはずである。そ
れは、複数の前記単位剤形を含んでいてもよい。
くは静脈内を含む)経路による投与用に構成されていてもよい。こうした組成物は、製薬
の分野において知られている任意の方法によって、例えば、無菌条件下で活性成分を担体
または添加剤と混合することによって調製されうる。
などによって広い範囲の間で変化しえ、医師が、使用される適切な用量を最終的に決定す
ることになる。
例えば、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、
少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくと
も96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%純粋
で、提供されてもよい。
・ 医薬における使用のための、好ましくは、がん、例えば、固形腫瘍(例えば、肺、
肝臓および胃の転移巣)および/または扁平上皮がんなどを治療する方法における使用の
ための、本発明のTCR、核酸または細胞。
・ がんを治療するための医薬品の製造における本発明のTCR、核酸または細胞の使
用。
・ 患者に本発明のTCR、核酸または細胞を投与することを含む、患者においてがん
を治療する方法。
ついてのものと同様である。本明細書において言及されている従来技術文献は、法律によ
って許可される最大限の範囲まで組み込まれている。
配列番号1は、MAGE-B2ペプチドであり
配列番号2は、MAGE-A4ペプチドであり
列であり、かつ配列番号4は、親MAGE-A4特異的TCRベータ鎖アミノ酸配列のベ
ータ鎖の細胞外部分のアミノ酸配列を示す。
CRのアルファ鎖のアミノ酸配列を示す。配列は、T162(すなわち、TRAC定常領
域のT48)にシステインが置換されることを除いて親TCRのものと同じである。配列
番号6は、(本明細書において「参照TCR」と称される)天然のLenti TCRの
ベータ鎖である。配列は、S169(すなわち、TRBC2定常領域のS57)にシステ
インが置換され、C187にA187が置換され、N201にD201が置換されること
を除いて親TCRのものと同じである。
形成している部分配列、またはCDR領域の実質的な部分は、下線付きである。
CDR領域を形成している部分配列、またはCDR領域の実質的な部分は下線付きである
。
ったTCRの配列を示す。
ファ鎖およびベータ鎖可変領域配列のクローニング]
それぞれ配列番号3および4の親MAGE-A4-TCR可変アルファドメインおよび
TCR可変ベータドメインは、CαまたはCβのいずれかを含むpGMT7に基づく発現
プラスミド内に、(SambrookおよびRussellによるMolecular
Cloning a Laboratory Manual Third editio
n)に記載されている標準的な方法によってクローニングされた。プラスミドは、App
lied Biosystems 3730xl DNA Analyzerを使用して
シークエンスされた。それぞれ配列番号4および5の参照MAGE-A4-TCR可変ア
ルファドメインおよびTCR可変ベータドメインは、同様の方法でクローニングされた。
956内にライゲーションされた。TCRベータ鎖可変領域をコードするDNA配列は、
同じく制限酵素で切断された、pEXb21内にライゲーションされた。
-blue細胞内に形質転換され、100μg/mLのアンピシリンを含むLB/寒天プ
レート上に播種された。37℃で一晩インキュベーション後、単一コロニーが採取され、
100μg/mLのアンピシリンを含む5mLのLB中で37℃で振盪しながら一晩培養
された。クローニングされたプラスミドは、Miniprepキット(Qiagen)を
使用して精製され、プラスミドは、Applied Biosystems 3730x
l DNA Analyzerを使用してシークエンスされた。
]
実施例1において調製されるような、参照TCRα鎖およびβ鎖をそれぞれ含む発現プ
ラスミドが大腸菌株BL21pLysS内に別々に形質転換され、単一のアンピシリン耐
性コロニーをTYP(アンピシリン100μg/ml)培地中で37℃で約0.6~0.
8のOD600まで培養した後に、0.5mMのIPTGでタンパク質発現を誘発した。
細胞は、導入3時間後に、Beckman J-6B内で4000rpmで30分間の遠
心分離によって回収された。細胞ペレットは、MgCl2およびDNアーゼIの存在下で
25mlのBug Buster(NovaGen)により溶解された。封入体ペレット
は、Beckman J2-21遠心分離機内で13000rpmで30分間の遠心分離
によって回収された。次いで、3回の界面活性剤での洗浄が行われて細胞デブリおよび膜
成分が除去された。封入体ペレットは、毎回、Tritonバッファー(50mMのTr
is-HCl(pH8.0)、0.5%のTriton-X100、200mMのNaC
l、10mMのNaEDTA)中でホモジナイズされた後に、Beckman J2-2
1内で13000rpmで15分間の遠心分離によってペレット化された。次いで、以下
のバッファー(50mMのTris-HCl(pH8.0)、1mMのNaEDTA)中
での同様の洗浄によって界面活性剤および塩が除去された。最終的に、封入体は、30m
gの一定分量に小分けされて-70℃で凍結された。封入体タンパク質の収量は、6Mの
グアニジン-HClで可溶化することによって定量化され、OD測定は、日立U-200
1分光光度計上で行われた。次いで、吸光係数を使用してタンパク質濃度が算出された。
ら解凍され、確実に完全に鎖変性するように、10mlのグアニジン溶液(6Mの塩酸グ
アニジン、50mMのTris-HCl(pH8.1)、100mMのNaCl、10m
MのEDTA、10mMのDTT)中に希釈された。完全に還元および変性されたTCR
鎖を含むグアニジン溶液は、次いで、0.5リットルの以下のリフォールディングバッフ
ァー:100mMのTris(pH8.1)、400mMのL-アルギニン、2mMのE
DTA、5Mの尿素中に注入された。酸化還元対(塩酸システアミンおよび二塩酸シスタ
ミン)がそれぞれ6.6mMおよび3.7mMの最終濃度まで添加され、約5分後に、変
性されたTCR鎖が添加された。溶液は、約30分間放置された。リフォールディングさ
れたTCRは、Spectrapor1メンブレン(Spectrum;製品番号132
670)において10LのH2Oに対して18~20時間透析された。この時間の後に、
透析バッファーは、新しい10mMのTris(pH8.1)(10L)に2回交換され
、透析は、5℃±3℃でさらに約8時間継続された。
換カラム上にロードすることによっておよび結合したタンパク質をAkta精製装置(G
E Healthcare)を使用して、50カラム容量を超える0~500mMのNa
Clの勾配/10mMのTris(pH8.1)で溶出することによって分解産物および
夾雑物から分離された。ピーク画分がプールされ、プロテアーゼ阻害剤のカクテル(Ca
lbiochem)が添加された。プールされた画分は、次いで、4℃で保存され、クマ
シーで染色されたSDS-PAGEによって解析された後にプールおよび濃縮された。最
終的に、可溶性TCRは、PBSバッファー(Sigma)中で予め平衡化されたGE
Healthcare Superdex 75HRゲル濾過カラムを使用して精製およ
び特性評価された。約50kDaの相対分子量で溶出していたピークがプールされ、BI
Acore表面プラズモン共鳴解析による特性評価の前に濃縮された。
<BIAcore解析>
表面プラズモン共鳴バイオセンサー(BIAcore 3000(商標))は、可溶性
TCRの、そのペプチド-MHCリガンドに対する結合を解析するために使用されうる。
これは、ストレプトアビジンでコーティングされた結合表面(センサーチップ)に固定さ
れうる可溶性ビオチン化ペプチド-HLA(「pHLA」)複合体を作製することによっ
て容易になる。センサーチップは、異なる4種のpHLA複合体に対するT細胞受容体の
結合を同時に測定することを可能にする4つの個別のフローセルを含む。pHLA複合体
の手動注入により、固定されたクラスI分子の正確なレベルを容易に操作することが可能
となる。
質および合成ペプチドを含む、細菌で発現された封入体からin vitroでリフォー
ルディングされ、その後、精製されて、in vitroで酵素によりビオチン化された
(O’Callaghan et al.(1999)Anal.Biochem.26
6:9-15)。HLA-A*0201重鎖は、適切なコンストラクトにおいてタンパク
質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを置き換えるC末端ビオチン化タグ付きで発現
された。1リットルの細菌培養液あたり約75mgの封入体発現レベルが得られた。MH
C軽鎖またはβ2-ミクログロブリンも、適切なコンストラクトから大腸菌における封入
体として、1リットルの細菌培養液あたり約500mgのレベルで発現された。
ク質は、6Mのグアニジン-HCl、50mMのTris(pH8.1)、100mMの
NaCl、10mMのDTT、10mMのEDTA中で変性され、0.4MのL-アルギ
ニン、100mMのTris(pH8.1)、3.7mMの二塩酸シスタミン、6.6m
Mの塩酸システアミン、HLA-A*02分子によるロードが必要とされる4mg/Lの
MAGE-A4-GVYDGREHTVまたはMAGE-B2-GVYDGEEHSVペ
プチド中に、30mg/リットルの重鎖、30mg/リットルのβ2mの濃度で、変性タ
ンパク質の単一パルスを<5℃のリフォールディングバッファー中に添加することによっ
てリフォールディングされた。リフォールディングは、4℃で少なくとも1時間で完了に
到達することが可能にされた。
された。バッファーの2回の交換は、溶液のイオン強度を十分に低下させるために必要と
された。次いで、タンパク質溶液は、1.5μmのセルロースアセテートフィルターを通
して濾過され、POROS-50HQ陰イオン交換カラム(8mlのベッド容量)上にロ
ードされた。タンパク質は、Akta精製装置(GE Healthcare)を使用し
て10mMのTris pH8.1中の直線的な0~500mMのNaCl勾配で溶出さ
れた。HLA-A*0201-ペプチド複合体は、約250mMのNaClで溶出され、
ピーク画分が収集されて、プロテアーゼ阻害剤のカクテル(Calbiochem)が添
加され、それらの画分が氷上で冷却された。
Cl中で平衡化されたGE Healthcareの高速脱塩カラムを使用して、同バッ
ファー中にバッファー交換された。溶出されるとすぐに、タンパク質含有分画は氷上で冷
却され、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Calbiochem)が添加された。次いで、
ビオチン化試薬:1mMのビオチン、5mMのATP(pH8に緩衝された)、7.5m
MのMgCl2、および5μg/mlのBirA酵素(O’Callaghan et
al.(1999)Anal.Biochem.266:9-15に従って精製された)
が添加された。次いで、この混合物は、室温で一晩インキュベート可能にされた。
して精製された。GE Healthcare Superdex 75HR 10/3
0カラムは、濾過されたPBSで予め平衡化されて1mlのビオチン化反応混合物がロー
ドされ、そのカラムは、Akta精製装置(GE Healthcare)を使用してP
BSを用いて0.5ml/分で展開された。ビオチン化されたpHLA-A*0201分
子は、約15mlで単一のピークとして溶出された。タンパク質を含む画分は、プールさ
れて、氷上で冷却され、プロテアーゼ阻害剤カクテルが添加された。タンパク質濃度は、
クマシー結合アッセイ(PerBio)を使用して決定され、ビオチン化されたpHLA
-A*01分子の一定分量は、-20℃で凍結保存された。
することができ、その両方が可溶相に注入されうる。可溶性TCRのpHLA結合特性は
、TCRが可溶相または固定相のいずれかにおいて使用される場合、質的にも量的にも類
似していることが認められる。これは、可溶種の部分活性についての重要な対照であり、
ビオチン化pHLA複合体が生物学的に非ビオチン化複合体と同じくらい活性であること
も示唆する。
小さなフローセル内のセンサー表面付近のレスポンスユニット(RU)で表される屈折率
における変化を測定し、受容体リガンド相互作用を検出するためおよびそれらの親和性お
よび動態パラメーターを解析するために使用されうる原理である。BIAcore実験は
、25℃の温度で、ランニングバッファーとしてPBSバッファー(Sigma、pH7
.1~7.5)を使用し、タンパク質試料の希釈物を調製して行われた。ストレプトアビ
ジンは、標準的なアミンカップリング法によってフローセルに固定された。pHLA複合
体は、ビオチンタグを介して固定された。次いで、異なるフローセルの表面上を一定流速
で通過する可溶性TCRによってアッセイが行われ、その際のSPRレスポンスが測定さ
れた。
平衡結合定数を決定するために、上記のBIAcore解析法が使用された。ジスルフ
ィドで連結された可溶性ヘテロ二量体形態の参照MAGE-A4-TCRの段階希釈物が
調製され、1つめは約1000RUの特異的なGVYDGREHTV-HLA-A*02
01複合体でコーティングされ、2つめは約1000RUの非特異的な複合体でコーティ
ングされた、2つの異なるフローセル上に毎分5μlの一定流速で注入された。レスポン
スは、対照細胞からの測定値を使用して各濃度について標準化された。標準化されたデー
タレスポンスは、TCR試料の濃度に対してプロットされ、平衡結合定数KDを算出する
ために非線形曲線適合モデルに適合された。(Price&Dwek,Principl
es and Problems in Physical Chemistry fo
r Biochemists(2nd Edition)1979,Clarendon
Press,Oxford)。ジスルフィドで連結された可溶型の参照MAGE-A4
-TCR(実施例2)は、約2.00μMのKDを示した。同じBIAcoreデータよ
り、T1/2は約0.95秒であった。
上記のBIAcore解析法は、平衡結合定数および解離速度を決定するためにも使用
された。
koff、および結合速度定数、konを実験的に測定することによって決定された。平
衡定数KDは、koff/konとして算出された。
体でコーティングされ、2つめは約1000RUの非特異的な複合体でコーティングされ
た2つの異なるセルにTCRが注入された。流速は、50μl/分に設定された。典型的
には、約1μMの濃度の250μlのTCRが注入された。次いで、レスポンスがベース
ラインに戻るまでまたは>2時間が経過するまでバッファーが流された。動態パラメータ
ーは、BIAevaluationソフトウェアを使用して算出された。解離相は、半減
期の算出を可能にする単一指数関数的減衰方程式に適合された。
TCRα鎖およびβ鎖をそれぞれ含む発現プラスミドは、実施例1におけるように調製
された:
ン耐性コロニーをTYP(アンピシリン100μg/ml)培地中で37℃で約0.6~
0.8のOD600まで培養した後に、0.5mMのIPTGでタンパク質発現を誘発し
た。細胞は、導入3時間後に、Beckman J-6B内で4000rpmで30分間
の遠心分離によって回収された。細胞ペレットは、MgCl2およびDNアーゼIの存在
下で25mlのBug Buster(Novagen)で溶解された。封入体ペレット
は、Beckman J2-21遠心分離機内で13000rpmで30分間の遠心分離
によって回収された。次いで、3回の界面活性剤での洗浄が行われて細胞デブリおよび膜
成分が除去された。封入体ペレットは、毎回、Tritonバッファー(50mMのTr
is-HCl(pH8.0)、0.5%のTriton-X100、200mMのNaC
l、10mMのNaEDTA)中でホモジナイズされた後に、Beckman J2-2
1内で13000rpmで15分間の遠心分離によってペレット化された。次いで、以下
のバッファー:50mMのTris-HCl(pH8.0)、1mMのNaEDTA中で
の同様の洗浄によって界面活性剤および塩が除去された。最終的に、封入体は、30mg
の一定分量に小分けされて-70℃で凍結された。封入体タンパク質の収量は、6Mのグ
アニジン-HClで可溶化することによって定量化され、OD測定は、日立U-2001
分光光度計上で行われた。次いで、吸光係数を使用してタンパク質濃度が算出された。
および10mgのTCRβ鎖の可溶化封入体は、10mlのグアニジン溶液(6Mの塩酸
グアニジン、50mMのTris-HCl(pH8.1)、100mMのNaCl、10
mMのEDTA、10mMのDTT)中に希釈された。完全に還元および変性されたTC
R鎖を含むグアニジン溶液は、次いで、0.5リットルの以下のリフォールディングバッ
ファー:100mMのTris(pH8.1)、400mMのL-アルギニン、2mMの
EDTA、5Mの尿素中に注入された。酸化還元対(塩酸システアミンおよび二塩酸シス
タミン)がそれぞれ6.6mMおよび3.7mMの最終濃度まで添加され、約5分後に、
変性されたTCR鎖が添加された。溶液は、約30分間放置された。リフォールディング
されたTCRは、Spectrapor1メンブレン(Spectrum;製品番号13
2670)において10LのH2Oに対して18~20時間透析された。この時間の後に
、透析バッファーは、新しい10mMのTris(pH8.1)(10L)に2回交換さ
れ、透析は、5℃±3℃でさらに約8時間継続された。
換カラム上にロードすることによっておよび結合したタンパク質をAkta精製装置(G
E Healthcare)を使用して、15カラム容量を超える0~500mMのNa
Clの勾配/10mMのTris(pH8.1)で溶出することによって分解産物および
夾雑物から分離された。プールされた画分は、次いで、4℃で保存され、クマシーで染色
されたSDS-PAGEによって解析された後にプールおよび濃縮された。最終的に、可
溶性TCRは、PBSバッファー(Sigma)中で予め平衡化されたGE Healt
hcare Superdex 75HRゲル濾過カラムを使用して精製および特性評価
された。約50kDaの相対分子量で溶出していたピークがプールされ、BIAcore
表面プラズモン共鳴解析による特性評価の前に濃縮された。
親和性プロファイルは、実施例3の方法を使用して評価され、参照TCRと比較された。
結果は、以下の表に記載されている:
製するために試行も行われた。
合には、MAGE-A1、MAGE-A10およびPRAMEの間で交差反応性が認めら
れた。変異および選択によってこの交差反応性をなくすことは不可能であった。
TCR-Bは、可溶性TCRを形成するようにフォールディングさせることができなかっ
たため、結合特性評価は不可能であった。
このTCRは、発現されたときに可溶性であってかつ抗原に結合することができた。しか
し、T細胞において発現されたときには、TCR-Cは、活性を示さなかった。
T細胞のトランスフェクション]
(a)Express-Inを介した293T細胞の一過的トランスフェクションによる
レンチウイルスベクター調製
望ましいTCRをコードする遺伝子を含むレンチウイルスベクターをパッケージングす
るために、第3世代レンチウイルスパッケージングシステムが使用された。Expres
s-Inを介したトランスフェクション(Open Biosystems)を使用して
、293T細胞は、4種のプラスミド(実施例5c(以下)に記載のTCRアルファ鎖-
P2A-TCRベータ鎖単一ORF遺伝子を含む1種のレンチウイルスベクター、および
感染性であるが複製不可能なレンチウイルス粒子を構築するために必要な他の構成要素を
含む3種のプラスミド)でトランスフェクトされた。
50フラスコが回収され、細胞は、プレート上に均一に分散され、わずかに50%を超え
るコンフルエントであった。Express-Inの一定分量は、室温にされた。3mL
の無血清培地(RPMI1640+10mM HEPES)が無菌の15mlのコニカル
チューブ内に入れられた。174μlのExpress-In試薬が無血清培地中に直接
に添加された(これは、3.6:1の試薬対DNAの重量比を実現する)。これは、3~
4回チューブを逆さにすることによって完全に混合されて、室温で5~20分間インキュ
ベートされた。
量(18μgのpRSV.REV(Rev発現プラスミド)、18μgのpMDLg/p
.RRE(Gag/Pol発現プラスミド)、7μgのpVSV-G(VSV糖タンパク
質発現プラスミド)を含む、通常約22μl)に15μgのプラスミドDNAが添加され
、DNA混合物を確実に均一にさせるために上および下にピペッティングされた。このD
NA混合物に約1mLのExpress-In/無血清培地が滴下で添加され、次いで、
上および下に穏やかにピペッティングされた後に、残りのExpress-In/無血清
培地に移し戻された。チューブは、3~4回逆さにされて、室温で15~30分間インキ
ュベートされた。細胞のフラスコから古い培地が除去された。293T細胞の直立型フラ
スコの底にExpress-In/培地/DNA(3mL)複合体が直接に添加された。
ゆっくりと、フラスコは、細胞を覆うように平らに置かれ、確実に分散するようにきわめ
て穏やかに揺動された。1分後、22mlの新しい培地(R10+HEPES:RPMI
1640、熱失活された10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グル
タミン、10mM HEPES)が添加され、フラスコは、インキュベーターに注意深く
戻された。これは、37℃/5%CO2で一晩インキュベートされた。24時間後、パッ
ケージングされたレンチウイルスベクターを含む培地が回収された。
0.45ミクロンのナイロンシリンジフィルターを通して濾過され、培養液は、10,0
00gで18時間(または112,000gで2時間)遠心分離され、(ペレットを乱さ
ないように注意しながら)上清の大部分が除去され、残りの数mL(チューブあたり31
mlの開始容量から、通常、約2ml)の上清中にペレットが再懸濁された。これは、1
mlずつの一定分量でドライアイス上でスナップ凍結され、-80℃で保存された。
質導入
パッケージングされたレンチウイルスベクターでの形質導入前に、健常な志願者の血液
からヒトT細胞(CD8もしくはCD4または必要条件によっては両方)が単離された。
これらの細胞は、計数され、48ウェルプレート内で、50U/mLのIL-2を含むR
10中、1mlあたり1×106細胞(0.5mL/ウェル)で、1細胞あたり3個のビ
ーズの比率で、予め洗浄された抗CD3/CD28抗体コーティング付きマイクロビーズ
(Dynabeads(登録商標)T cell expander、Invitrog
en)と共に一晩インキュベートされた。
、望ましい細胞に添加された。これは、37℃/5%CO2で3日間インキュベートされ
た。形質導入3日後、細胞は、計数され、0.5×106細胞/mlまで希釈された。I
L-2を含む新しい培地が必要に応じて添加された。ビーズは、形質導入5~7日後に除
去された。2日間隔で、細胞が計数され、IL-2を含む新しい培地が交換または添加さ
れた。細胞は、0.5×106細胞/mLおよび1×106細胞/mLの間で維持された
。細胞は、3日目からフローサイトメトリーによって解析され、5日目から機能アッセイ
(例えば、IFNγ放出についてのELISpot、実施例6を参照されたい)に使用さ
れた。10日目から、または細胞が分裂を遅延させ、大きさが減少したときに、細胞は、
保存のために(90%FBS/10%DMSO中に1×107細胞/mlで)少なくとも
4×106細胞/バイアルの一定分量で凍結される。
腫瘍細胞株に応答した、TCR形質導入した細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の活性化
を実証するために、以下のアッセイを行った。ELISPOTアッセイを使用して測定さ
れるような、IFN-γ産生を、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)活性化についての読み
出しとして使用した。
<試薬>
アッセイ培地: 10%FCS(Gibco、カタログ番号2011-09)、88%R
PMI1640(Gibco、カタログ番号42401)、1%グルタミン(Gibco
カタログ番号25030)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibcoカタ
ログ番号15070-063)。
洗浄バッファー:0.01M PBS/0.05%Tween20
PBS(Gibcoカタログ番号10010)
関連したAEC基質セット(BD Bioscience、カタログ番号551951)
と共に、捕捉抗体および検出抗体ならびにヒトIFN-γ PVDF ELISPOT
96ウェルプレートを含むヒトIFNγ ELISPOTキット(BD Bioscie
nce;カタログ番号551849)
<標的細胞の調製>
この方法において使用される標的細胞は、天然のエピトープ提示細胞:HLA-A2+
かつMAGE-A10+であるA375ヒト黒色腫細胞であった。HLA-A2+であり
MAGE-A10-であるHCT116ヒト結腸がんは、陰性対照として使用された。十
分な標的細胞(50,000細胞/ウェル)は、Megafuge(登録商標)1.0(
Heraeus)内で1200rpmで10分の遠心分離3回によって洗浄された。細胞
は、次いで、アッセイ培地中に106細胞/mlで再懸濁された。
この方法において使用されるエフェクター細胞(T細胞)は、CD14およびCD25
マイクロビーズキット(それぞれMiltenyi Biotechカタログ番号130
-050-201および130-092-983)を使用して、健常な志願者の静脈血か
ら新たに単離された末梢血単核細胞(PBMC)から負の選択によって得られた、末梢血
リンパ球(PBL)であった。細胞は、抗CD3/CD28コーティング付きビーズ(D
ynabeads(登録商標)T cell expander、Invitrogen
)で刺激され、(実施例5に記載のコンストラクトに基づいた)目的の全αβTCRをコ
ードする遺伝子を運ぶレンチウイルスで形質導入され、50U/mLのIL-2を含むア
ッセイ培地中で形質導入10日後および13日後の間まで増殖した。これらの細胞は、次
いで、アッセイ培地中に入れられた後に、Megafuge(登録商標)1.0(Her
aeus)内で1200rpmで10分の遠心分離によって洗浄された。細胞は、次いで
、最終的に必要とされる濃度の4倍の濃度でアッセイ培地中に再懸濁された。
ートあたり10mlの無菌PBS中に希釈された。次いで、各ウェル内に100μLの希
釈された捕捉抗体が分注された。プレートは、次いで、4℃で一晩インキュベートされた
。インキュベーション後、プレートは、洗浄(プログラム1、プレート型2、Ultra
wash Plus 96ウェルプレート洗浄機;Dynex)されて捕捉抗体が除去さ
れた。プレートは、次いで、各ウェルに200μLのアッセイ培地を添加することによっ
てブロッキングされ、室温で2時間インキュベートされた。アッセイ培地は、次いで、プ
レートから洗浄され(プログラム1、プレート型2、Ultrawash Plus 9
6ウェルプレート洗浄機、Dynex)、残りのすべての培地は、ELISPOTプレー
トをペーパータオル上で軽く振り払うことおよび軽く叩くことによって除去された。
50μLの標的細胞106細胞/ml(合計50,000個の標的細胞/ウェルにする
)
50μLの培地(アッセイ培地)
50μLのエフェクター細胞(20,000個のTCR形質導入PBL細胞/ウェル)
ートは、洗浄バッファーで3回洗浄され(プログラム1、プレート型2、Ultrawa
sh Plus 96ウェルプレート洗浄機、Dynex)、ペーパータオル上で軽く叩
かれて乾燥されて余分な洗浄バッファーが除去された。100μlの一次検出抗体は、次
いで、各ウェルに添加された。一次検出抗体は、製造業者の説明書に明記された希釈を使
用して、10mLの希釈バッファー(単一のプレートに必要とされる容量)中に希釈され
た。プレートは、次いで、室温で少なくとも2時間インキュベートされた後に洗浄バッフ
ァーで3回洗浄された(プログラム1、プレート型2、Ultrawash Plus
96ウェルプレート洗浄機、Dynex);余分な洗浄バッファーは、プレートをペーパ
ータオル上で軽く叩くことによって除去された。
てプレートを室温で1時間インキュベートすることによって行われた。ストレプトアビジ
ン-HRPは、製造業者の説明書に明記された希釈を使用して、10mLの希釈バッファ
ー(単一のプレートに必要とされる容量)中に希釈された。プレートは、次いで、洗浄バ
ッファーで3回洗浄され(プログラム1、プレート型2、Ultrawash Plus
96ウェルプレート洗浄機、Dynex)、ペーパータオル上で軽く叩かれて余分な洗
浄バッファーが除去された。プレートは、次いで、PBSで各ウェルに200μLを添加
することによって2回洗浄され、バッファーが軽く振り出され、ペーパータオル上で軽く
叩かれて余分なバッファーが除去された。使用前15分以内に、1滴(20uL)のAE
C色素原が各1mlのAEC基質に添加されて混合された。各プレートについて10ml
のこの溶液が調製された;1ウェルあたり100μLが添加された。プレートは、次いで
、ホイルを使用して光から保護され、通常、5~20分以内に生じる、スポット発色が定
期的にモニターされる。プレートは、発色反応を終了させるために水道水中で洗浄され、
それらが3つの成分に分解される前に振盪乾燥された。プレートは、次いで、室温で少な
くとも2時間乾燥可能にされた後に、Immunospot(登録商標)プレートリーダ
ー(CTL;Cellular Technology Limited)を使用してス
ポットが計数された。
それぞれの位置のアミノ酸残基が19種すべての天然に存在する代替のアミノ酸で順次
置き換えられた天然のMAGE-B2ペプチドのバリアントが得られ、それによって、全
部で171種のペプチドが調製された。天然のペプチドおよびアミノ酸置換されたペプチ
ドが、抗原提示細胞上にパルスされ、ELISpotアッセイを使用して測定されるよう
な、インターフェロンγ(IFNγ)産生が、TCR1で形質導入されたT細胞の活性化
についての読み出しとして使用された。不可欠な位置は、天然のペプチドに対して相対的
に50%を超えるT細胞活性における低下によって定義された。
、ペプチド内の該当位置における天然の残基を表す。
に、MAGE-B2-TCR4が、ペプチド(配列番号1)の少なくともV2、Y3およ
びD4と接触することは明らかである。
Claims (15)
- HLA-A*0201と複合体形成したGVYDGEEHSV(配列番号1)に結合する特性を有する、TCRアルファ鎖可変ドメインおよびTCRベータ鎖可変ドメインを含むT細胞受容体(TCR)であって、
アルファCDR1がVSPFSNであり、
アルファCDR2がLTIMTFまたはLTRMTFであり、
アルファCDR3がCVVSGGTDSWGKLQFであり、
ベータCDR1がKGHDRまたはKGRDRであり、
ベータCDR2がSFDVKであり、かつ
ベータCDR3がCATSGQGAYNEQFFまたはCATSGQGAYREQFFまたはCATSGQGAYKEQFFである、
TCR。 - アルファ鎖TRAV10+TRAC定常ドメイン配列およびベータ鎖TRBV24-1+TRBC-2定常ドメイン配列を有する、アルファ-ベータヘテロ二量体である、請求項1に記載のTCR。
- VαおよびVβが、それぞれTCRα可変領域およびTCRβ可変領域であり、CαおよびCβが、それぞれTCRα定常領域およびTCRβ定常領域であり、Lが、リンカー配列である、Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ、またはVα-L-Vβ-Cβ型の単鎖形式である、請求項1に記載のTCR。
- 検出可能な標識、治療剤または薬物動態修飾部分と結合された、請求項1~3のいずれか1項に記載のTCR。
- 前記TCRアルファ鎖可変ドメインが、配列番号3のアミノ酸残基1~105の配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ/または前記TCRベータ鎖可変ドメインが、配列番号4のアミノ酸残基1~123の配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載のTCR。
- 前記TCRが、
(i)そのアミノ酸残基1~27の配列が、配列番号3のアミノ酸残基1~27の配列に対して少なくとも90%の同一性を有し、
(ii)アミノ酸残基28~33の配列が、VSPFSNであり、
(iii)そのアミノ酸残基34~47の配列が、配列番号3のアミノ酸残基33~47の配列に対して少なくとも90%の同一性を有し、
(iv)アミノ酸残基48~53の配列が、LTIMTFまたはLTRMTFであり、
(v)そのアミノ酸残基54~90の配列が、配列番号3のアミノ酸残基54~90の配列に対して少なくとも90%の同一性を有し、かつ、
(vi)アミノ酸91~105の配列が、CVVSGGTDSWGKLQFである
配列の前記TCRアルファ鎖可変ドメインを含む、請求項1~5のいずれか1項に記載のTCR。 - 前記TCRが、配列番号3または7のアミノ酸配列の前記TCRアルファ鎖可変ドメインを含む、請求項1~6のいずれか1項に記載のTCR。
- 前記TCRが、
(i)そのアミノ酸残基1~45の配列が、配列番号4の残基1~45のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有し、
(ii)アミノ酸残基46~50の配列が、KGHDRまたはKGRDRであり、
(iii)そのアミノ酸残基51~67の配列が、配列番号4のアミノ酸残基51~67の配列に対して少なくとも90%の同一性を有し、
(iv)アミノ酸残基68~72の配列が、SFDVKであり、
(v)そのアミノ酸残基73~109の配列が、配列番号4のアミノ酸残基73~109の配列に対して少なくとも90%の同一性を有し、かつ、
(vi)アミノ酸110~123の配列が、CATSGQGAYNEQFFまたはCATSGQGAYREQFFまたはCATSGQGAYKEQFFである
配列の前記TCRベータ鎖可変ドメインを含む、請求項1~7のいずれか1項に記載のTCR。 - 前記TCRが、配列番号4および8~10からなる群から選択されるアミノ酸配列の前記TCRベータ鎖可変ドメインを含む、請求項1~8のいずれか1項に記載のTCR。
- 前記TCRが、配列番号3のアミノ酸配列の前記TCRアルファ鎖可変ドメインを含み、かつ、配列番号8、9および10からなる群から選択されるアミノ酸配列の前記TCRベータ鎖可変ドメインを含む、または、
前記TCRが、配列番号7のアミノ酸配列の前記TCRアルファ鎖可変ドメインを含み、かつ、前記TCRベータ鎖可変ドメインが、配列番号4および9からなる群から選択されるアミノ酸配列の前記TCRベータ鎖可変ドメインを含む、請求項1~9のいずれか1項に記載のTCR。 - 核酸によりコードされたTCRを提示している、単離されたまたは天然に存在しない細胞であって、前記核酸が、
(A)(i)そのアミノ酸残基1~27の配列が、配列番号3のアミノ酸残基1~27の配列に対して少なくとも90%の同一性を有し、
(ii)アミノ酸残基28~33の配列が、VSPFSNであり、
(iii)そのアミノ酸残基34~47の配列が、配列番号3のアミノ酸残基33~47の配列に対して少なくとも90%の同一性を有し、
(iv)アミノ酸残基48~53の配列が、LTIMTFまたはLTRMTFであり、
(v)そのアミノ酸残基54~90の配列が、配列番号3のアミノ酸残基54~90の配列に対して少なくとも90%の同一性を有し、かつ、
(vi)アミノ酸91~105の配列が、CVVSGGTDSWGKLQFである
TCRアルファ鎖可変ドメイン、および
(B)(i)そのアミノ酸残基1~45の配列が、配列番号4の残基1~45のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有し、
(ii)アミノ酸残基46~50の配列が、KGHDRまたはKGRDRであり、
(iii)そのアミノ酸残基51~67の配列が、配列番号4のアミノ酸残基51~67の配列に対して少なくとも90%の同一性を有し、
(iv)アミノ酸残基68~72の配列が、SFDVKであり、
(v)そのアミノ酸残基73~109の配列が、配列番号4のアミノ酸残基73~109の配列に対して少なくとも90%の同一性を有し、かつ、
(vi)アミノ酸110~123の配列が、CATSGQGAYNEQFFまたはCATSGQGAYREQFFまたはCATSGQGAYKEQFFである
TCRベータ鎖可変ドメイン
を含むTCRをコードし、前記TCRが、HLA-A*0201と複合体形成したGVYDGEEHSV(配列番号1)に結合する特性を有する、細胞。 - 前記核酸が、配列番号3のTCRアルファ鎖可変ドメインおよび配列番号8、9および10からなる群から選択されるTCRベータ鎖可変ドメインを含むTCR、または、配列番号7のTCRアルファ鎖可変ドメインならびに配列番号4および9からなる群から選択されるTCRベータ鎖可変ドメインを含むTCRをコードする、請求項11に記載の細胞。
- 1種または複数の薬学的に許容される担体または添加剤と一緒に、請求項1~10のいずれか1項に記載のTCR、または請求項11もしくは請求項12に記載の細胞を含む医薬組成物。
- 薬における使用のための、請求項1~10のいずれか1項に記載のTCR、または請求項11もしくは請求項12の細胞。
- がんを治療する方法における使用のための、請求項14に記載の使用のためのTCR、または細胞。
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