KR20010085250A - 다가 ｔ 세포 수용체 복합체 - Google Patents

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KR20010085250A
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Abstract

본 발명은 MHC-펩티드 복합체에 결합하는 합성 다가 T 세포 수용체 복합체에 관한 것으로서, 다가 T 세포 수용체 복합체는 MHC-펩티드 복합체에 특이적인 다수의 T 세포 수용체를 포함한다. T 세포 수용체는 리폴딩된 재조합 가용성 T 세포 수용체인 것이 바람직하다. 합성 다가 T 세포 수용체 복합체는 치료제를 전달하는데, 또는 MHC-펩티드 복합체를 검출하는데 사용할 수 있으며, 본 발명은 이러한 사용 방법도 제공한다.

Description

다가 Ｔ 세포 수용체 복합체{MULTIVALENT T CELL RECEPTOR COMPLEXES}
1. 세포 표면에 항원의 제공
MHC 분자는 적응성 면역계의 세포 암(arm)이 세포 표면 상에서 인지하기 위한 펩티드 항원인 짧은 단백질 단편을 제공하는 특수한 단백질 복합체이다.
클래스 I MHC는 가변성 중쇄와 불변성 경쇄로 이루어진 이량체 단백질 복합체인 β2 마이크로글로불린이다. 클래스 I MHC는 세포 내에서 가공되고 MHC 중의 결합용 틈 내에 적재되어 복합체가 MHC 중쇄에 의해 막에 고정되는 세포 표면으로 수송되는 펩티드를 제공한다. MHC에서 결합될 때 펩티드에 아치형이 도입되는 정도에 따라 펩티드는 통상 그 길이가 8 내지 11개 아미노산이다. MHC 중쇄의 막 말단 α1 및 α2 도메인에 의해 형성되는 결합용 틈은 "밀폐된" 말단을 가져서 결합될 수 있는 펩티드의 길이에 매우 엄격한 제한을 부과한다.
클래스 II MHC 역시 α(중쇄) 및 β(경쇄)로 구성되는 이량체 단백질인데,이 α쇄 및 β쇄는 모두 가변성 당단백질이고, 경막 도메인에 의해 세포에 고정된다. 클래스 I MHC와 같이, 클래스 II MHC 분자는 12 내지 24개 아미노산으로 이루어진 보다 긴 펩티드가 삽입되는 결합용 틈을 형성한다. 펩티드는 세포내 이입 작용에 의해 세포외 환경으로부터 흡수되어 가공된 다음, 클래스 II 복합체 내로 적재되고, 이어서 세포 표면으로 수송된다.
각 세포는 펩티드를 최대 6종의 상이한 클래스 I 분자 및 유사한 수의 클래스 II 분자로 제공하는데, 제공된 MHC 복합체의 총수는 세포당 105~106개의 범위에 있다. 클래스 I 분자에 제공된 펩티드의 다양성은 통상 1,000~10,000으로 추정되며, 이 중 90%가 세포당 100~1,000개 사본으로 존재한다(Hunt, Michel 등, 1992; Chicz, Urban 등, 1993; Engelhard, Appella 등, 1993; Huczko, Bodnar 등, 1993). 가장 풍부한 펩티드는 제공된 총 펩티드의 0.4~5%를 구성하는 것으로 생각되는데, 이것은 최대 20,000개의 동일한 복합체가 단일 세포에 존재할 수 있음을 의미한다. 가장 풍부한 단일 펩티드 복합체의 평균수는 세포당 2,000~4,000개의 범위에 있는 것으로 보이며, 인지 가능한 T 세포 에피토프의 통상의 제공 레벨은 세포당 100~500개의 복합체 범위에 있다(상기 Engelhard, 1994의 문헌 참조).
2. 항원 제공 세포의 인지
광범위한 세포가 MHC-펩티드로서 항원을 제공할 수 있고, 그 성질을 갖는 세포들은 항원 제공 세포(APC)로 알려져 있다. 특정 항원을 제공하는 세포 유형은 항원이 면역계의 세포를 어떻게 및 어디에서 최초로 접촉하는 지에 따라 좌우된다. APC로는 림프절 및 비장의 T 세포 영역에서 다수가 발견되는 서로 얽힌 수상 세포;피부 중의 랑겔한스 세포; 림프 조직의 B 세포 영역의 여포 수상 세포; 단핵구, 대식세포 및 단핵구/대식세포 계통의 기타 세포; B 세포 및 T 세포; 및 고전적인 APC가 아니지만, APC의 방식으로 작용할 수 있는 섬유아세포 및 내피 세포와 같은 다양한 기타 세포가 있다.
항원 제공 세포는 자가 펩티드에 반응하는 T 세포가 제거되었는 지를 확인하도록 고안된 선별 과정(음성 선별)을 진행하는 흉선(T 세포)에서 성숙하는 림프구의 아군에 의해 인지된다. 또한, 제공되는 MHC 변형체를 인지하는 능력을 갖지 못한 T 세포(인간에서는 HLA 하플로타입)는 성숙하지 못한다(양성 선별).
T 세포에 의한 특이 MHC-펩티드 복합체의 인지는 T 세포 수용체(TCR)에 의해 매개되는데, 이 수용체는 이황화 결합에 의해 연결된 α쇄 및 β쇄로 구성되는 헤테로이량체 당단백질이다. 상기 쇄는 둘다 경막 도메인에 의해 막에 고정되고, 짧은 세포질 꼬리를 가진다. 항체 유전자에 대해 관찰된 것과 유사한 재조합 과정에서, TCR α쇄 및 β쇄 유전자는 가변 요소, 결합 요소, 다양성 요소 및 불변 요소로부터 재배열되어 세포외 항원 결합 도메인에 엄청난 다양성(1013~1015의 상이한 가능성)을 산출한다. TCR은 또한 γ쇄 및 δ쇄와는 상이한 형태로 존재하나, 이들은 T 세포 중의 약 5%에서만 존재한다.
항체 및 TCR은 특이적 방식으로 항원을 인지하는 단 2개 유형의 분자이다. 따라서, TCR은 MHC에 제공된 특정 펩티드 항원에 특이적인 유일한 수용체이고, 외래 펩티드가 종종 세포 내 이상의 유일한 표시이다.
TCR은 엄청난 다양성으로 발현되는데, 각 TCR은 하나의 또는 몇 개의 MHC-펩티드 복합체에 특이적이다. TCR과 MHC-펩티드 리간드 사이의 접촉은 극히 짧게 이루어지는데, 통상 반감기가 1초 미만이다. T 세포와 표적 세포 사이의 접착은 아마도 TCR/MHC-펩티드를 산출하는 것으로서, TCR/MHC-펩티드간의 다수회 접촉 뿐만 아니라 보조수용체-리간드간의 많은 접촉을 이용하는 것에 좌우된다.
T-세포 및 항원 제공 세포(APC)가 직접 물리적으로 접촉할 때, T 세포 인지가 일어나고, T 세포 인지는 항원 특이 TCR과 pMHC 복합체의 결찰에 의해 개시된다. TCR은 신호 변환을 매개하는 데 관여하는 CD3 복합체의 불변 단백질과 연합된 면역글로불린 대형군의 헤테로이량체 세포 표면 단백질이다. TCR은 αβ 및 γδ형으로 존재하는데, 이들은 구조적으로 유사하나, 서로 구별되는 독특한 해부학적 위치와 기능을 가진다. 수용체의 세포외 부분은 두 개의 막 기부 불변 도메인과 두 개의 막 말단 가변 도메인으로 구성되는데, 말단 가변 도메인은 항체의 상보성 결정 영역(CDR)과 유사한 고도로 다형태성의 루프를 보유한다. TCR 분자의 MHC-결합 부위를 형성하고, 펩티드 특이성을 결정하는 것이 이들 루프이다. MHC 클래스 I 및 클래스 II 리간드는 또한 면역글로불린 대형군 단백질이나, 고도로 다형태성의 펩티드 결합 부위와 함께 항원 제공을 전문으로 하며, 이 때, 상기 펩티드 결합 부위는 상기 리간드가 APC 세포 표면에서 짧은 펩티드 단편의 다양한 배열을 제공할 수 있게 한다.
최근에, 상기 상호 작용의 예가 구조적으로 특성 분석되었다(Garboczi, Ghosh 등, 1996; Garcia, Degano 등, 1996; Ding, Smith 등, 1998). 쥐와 인간의 클래스 I pMHC-TCR 복합체의 결정학적 구조는 그 pMHC 리간드에 대해 TCR의 대각선방향을 나타내며, 경계면에서 불량한 모양 상보성을 나타낸다. CDR3 루프는 오로지 펩티드 잔기와 접촉한다. 리간드형 및 비리간드형 TCR 구조를 비교하면, TCR CDR 루프에는 일정 정도의 가요성이 있는 것으로 시사되어 있다(Garboczi and Biddison 1999).
T 세포 활성화 모델은 T 세포와 항원 제공 세포(APC) 사이의 경계에서의 그러한 단백질-단백질 상호 작용이 어떻게 바이러스에 의해 감염된 표적 세포의 사멸과 같은 반응을 개시하는 지를 설명하려고 시도한다. TCR-pMHC 상호 작용의 물리적 성질은 다수의 상기 모델에서 중대한 매개변수로서 포함된다. 예컨대, TCR 해리 속도에서의 양적 변화는 수용체 결합의 생물학적 결과물, 예컨대, 완전 또는 부분 T 세포 활성화 또는 길항 작용에서의 질적 차이로 전환되는 것으로 확인되어 왔다(Matsui, Boniface 등, 1994; Rabinowitz, Beeson 등, 1996; Davis, Boniface 등, 1998).
TCR-pMHC 상호 작용은 낮은 친화성 및 비교적 느린 동력학적 특성을 갖는 것으로 알려져 있다. 다수의 연구에서는 바이오센서 기술, 예컨대, 바이어코어TM(Willcox, Gao 등, 1999; Wyer, Willcox 등, 1999)를 사용하였는데, 이 기술은 표면 플라스몬 공명(SPR)을 이용하고, 단백질-단백질 상호 작용의 직접적인 친화성 및 실시간 동력학적 측정을 가능하게 한다(Garcia, Scott 등, 1996; Davis, Boniface 등, 1998). 그러나, 연구된 수용체는 인공 면역원에 반응하여 생성된 수용체 또는 동종 반응성 TCR이다.
3. MHC-펩티드 복합체와의 TCR 및 CD8 상호 작용
클래스 I MHC-펩티드 복합체에 의해 제한되는(즉, 이 복합체를 인지하는) 대부분의 T 세포 역시 활성화를 위해 보조수용체 CD8의 결합을 필요로 하는 반면에, 클래스 II MHC에 의해 제한된 T 세포는 CD4의 결합을 필요로 한다. T 세포 활성화에서 보조 수용체의 정확한 기능은 아직 완전히 밝혀지지 않았다. 활성화를 제어하는 중대한 메카니즘이나 매개변수는 없다. 그러나, CD8 및 CD4는 둘다 T 세포 활성화를 특징으로 하는 매우 초기의 티로신 인산화 과정에 관여하는 키나제 p56lck와 연합되는 세포질 도메인을 가진다. CD8은 αα형으로 또는 더 통상적으로는 αβ형으로 표현되는 이량체 수용체이다. CD4는 단량체이다. CD8 수용체에서는 α쇄만이 p56lck와 연합되어 있다.
가용성 형태의 수용체를 사용하여 MHC에의 TCR 및 CD8의 결합을 제어하는 물리적 매개변수에 관한 최근의 측정에서는 TCR에 의한 결합이 인지 과정을 지배하는 것으로 나타났다. TCR은 보조 수용체보다 MHC에 대해 상당히 더 높은 친화성을 가진다 (Willcox, Gao 등, Wyer, Willcox 등, 1999).
MHC와 수용체의 개개의 상호 작용은 생리학적 온도, 즉 37℃에서 매우 단시간 존재한다. TCR/MHC-펩티드 상호 작용의 반감기에 대한 대략적인 수치는 HLA-A*0201 (HLA-A2)에 의해 제공되는 인플루엔자 바이러스 "매트릭스" 펩티드에 대해 특이적인 인간 TCR로 측정할 때 0.7초이다. 상기 MHC/펩티드 복합체와의 CD8αα 상호 작용의 반감기는 0.01초 미만 또는 18배 이상 더 빠르다.
4. 가용성 MHC-펩티드 복합체의 생성
가용성 MHC-펩티드 복합체는 파파인으로 항원 제공 세포의 표면 분자를 절단함으로써 최초로 얻었다(Bjorkman, Strominger 등, 1985). 이 방법은 결정화용 재료를 제공하였지만, 근년에는 클래스 I 분자의 경우 이.콜리 중의 중쇄 및 경쇄의 개개의 발현과 합성 펩티드의 존재 하의 리폴딩에 의해 대체되었다(Garboczi, Hung 등, 1992; Garboczi, Madden 등, 1994; Madden, Garboczi 등, 1993; Reid, McAdam 등, 1996; Reid, Smith 등, 1996; Smith, Reid 등, 1996; Smith, Reid 등, 1996; Gao, Tormo 등, 1997; Gao, Gerth 등, 1998). 상기 방법은 보다 적은 비용으로 보다 양호한 수율이 얻어지고, 펩티드 동일성은 매우 정확히 제어할 수 있으며, 최종 생성물이 보다 균질하다는 점에서 종래의 방법에 비해 몇 가지 장점을 가진다. 또한, 변형된 중쇄 또는 경쇄, 예컨대, 단백질 태그에 융합된 것들의 발현은 용이하게 수행할 수 있다.
5. MHC-펩티드 사량체
펩티드-MHC와 TCR 및 CD8 수용체 사이의 개개의 결합 과정의 짧은 반감기는 상기 상호 작용이 검출 방법의 개발에 사용하기에 부적절하게 만든다. 이 문제는 펩티드-MHC 복합체의 사량체형 분자를 이용하는 신규 기술에 의해 극복되어 왔다 (Altman 등, 1996). 다량체 상호 작용의 화합력이 높을수록 단량체 펩티드-MHC 복합체의 결합으로 얻어지는 것에 비해 T 세포에의 결합에 대한 반감기가 급격히 더 길어진다. 이 기술은 WO 96/26962호에도 개시되어 있다.
사량체 펩티드-MHC 복합체는 합성 펩티드, β2 마이크로글로불린(통상 이. 콜리에서 발현됨) 및 가용성 MHC 중쇄(역시 이. 콜리에서 발현됨)를 사용하여 제조된다. MHC 중쇄는 경막 도메인의 출발부에서 절두되고, 경막 도메인은 박테리아 변형 효소 BirA에 대한 인지 서열을 구성하는 단백질 태그로 대체된다(Barker and Campbell, 1981; Barker and Campbell, 1981; Schatz, 1993). Bir A는 다소 과잉의 인지 서열에서 리신 잔기의 비오티닐화를 촉매하지만(Schatz, 1993), 특이성은 대부분의 단백질이 태그 상의 특이 위치에서만 비오티닐화될 수 있을 만큼 충분히 높다. 그 다음, 비오티닐화된 단백질은 아비딘, 스트렙타비딘 또는 엑스트라비딘(시그마)에 공유 결합할 수 있는데, 이들 각각은 비오틴에 대한 4개의 결합 부위를 가져서 펩티드-MHC 복합체의 사량체 분자를 산출한다(Altman 등, 1996).
6. MHC-펩티드 사량체 및 T 세포의 염색
WO 96/26962호 및 Altman 등(1996)의 문헌은 사량체 분자로서 제조되는 가용성 MHC-펩티드 복합체를 사용하여 특별한 특이성으로 T 세포를 염색하는 기술을 기재하고 있다. 이 기술은 T 세포의 검출 및 정량 분석에서 과학적 중요성을 가지며 (Callan 등, 1998; Dunbar 등, 1988; McHeyzer Williams 등, 1996; Murali Krishna 등, 1998; Ogg 등, 1998), 진단 분야에서 그 잠재력을 지닐 수 있다(McMichael and O'Callaghan, 1988의 문헌 참조). 가용성 단백질로 측정할 경우 MHC와 TCR 및 CD8 사이의 상호 작용의 반감기가 매우 짧지만(즉, 1초 미만), 염색을 검출할 수 있도록 사량체를 사용하여 안정한 결합을 얻는다. 이것은 사량체와 T 세포 사이의 다량체 상호 작용의 화합력이 보다 크기 때문이다.
7. 가용성 TCR
가용성 TCR의 제조에 대해서는 최근에 다수의 그룹에 의해 개시되었다. 일반적으로, 모든 방법은 세포외 도메인만 또는 세포외와 세포질 도메인을 보유하는 절두된 형태의 TCR을 기재하고 있다. 따라서, 모든 경우에, 경막 도메인은 발현 단백질로부터 결실되었다. 다수의 보고는 상기 방법에 따라 제조된 TCR이 TCR-특히 항체에 의해 인지될 수 있음을 나타내고 있지만(항체가 인지하는 재조합 TCR의 일부가 정확히 폴딩되었음을 나타냄), 저농도에서 안정하고 MHC-펩티드 복합체를 인지할 수 있는, 양호한 수율로 가용성 TCR을 제조할 수 있는 방법은 없었다.
결정화 가능한 재료를 산출하는 첫 번째 방법은 진핵 세포에의 발현을 이용하였으나, 그 재료는 제조하기에는 매우 고가이다(Garcia, Degano 등, 1996; Garcia, Scott 등, 1996). 결정화 가능한 재료를 제조한 또 다른 방법은 MHC-펩티드 복합체에 종래 사용되어 온 것과 유사한 이. 콜리 발현계를 사용하였다 (Garboczi, Ghosh 등, 1996; Garboczi, Utz 등, 1996). 쇄간 이황화 브리지를 형성하는 데 관여하는 시스테인 잔기 바로 앞에서 절두된 TCR쇄의 세포외 부분의 발현과, 이어서 시험관 내에세서 리폴딩시키는 후자의 방법은 일반적으로 적용할 수 없는 것으로 판명되었다. 대부분의 헤테로이량체 TCR은 α쇄와 β쇄 사이의 낮은 친화도로 인해 이런 유형으로 제조될 때 불안정한 것으로 보인다.
또한, 가용성 TCR의 조작된 생산과 관련한 다수의 다른 설명이 존재한다. 이들 중 일부는 TCR의 α쇄 또는 β쇄의 발현 만을 설명하고, 따라서, MHC-펩티드 특이 결합을 보유하지 않는 단백질을 산출한다(Calaman, Carson 등, 1993; Ishii, Nakano 등, 1995). β쇄의 결정은 α쇄 없이 단독으로 또는 초항원에 결합된 채로 얻어졌다(Bentley, Boulot 등, 1995; Boulot, Bentley 등, 1994; Fields,Malchiodi 등, 1996).
기타 보고 문헌에는 헤테로이량체 γ/δ 또는 α/βTCR의 발현 방법이 기술되어 있다(Corr, Slanetz 등, 1994; Eilat, Kikuchi 등, 1992; Gregoire, Rebai 등, 1996; Gregoire, Malissen 등, 1991; Ishii, Nakano 등, 1995; Necker, Rebai 등, 1991; Romagne, Pyrat 등, 1996; Weber, Traunecker 등, 1992). 일부 경우에, TCR은 단쇄 융합 단백질로서 발현되었다(Brocker, Peter 등, 1993; Gregoire, Malissen 등, 1996; Schlueter, Schodin 등, 1996). 또 다른 방법은 Ig 힌지 및 불변 도메인에 융합된 키메라 단백질로서 TCR쇄를 발현시키는 것이었다(Eilat, Kikuchi 등, 1992; Weber, Traunecker 등, 1992). 기타 키메라 TCR 단백질은 서로에 대해 높은 친화도 및 특이성을 가져서 TCR α-β접촉을 안정화하고 용해도를 증가시키는 감겨진 코일을 형성하도록 고안된 서열을 사용하여 발현시켰다. 이 방법은 바쿨로바이러스 발현계 및 이. 콜리 둘다로부터 가용성 TCR을 생성시키는 것으로 보고되었다(Chang, Bao 등, 1994; Golden, Khandekar 등, 1997).
TCR 리간드를 인지할 수 있는 가용성 TCR을 제조하는 방법을 본원에 개시한다. 이 방법의 바람직한 양태에 따르면, TCR의 세포외 단편은 c-jun 및 c-fos의 "로이신 지퍼"에의 융합체로서 별도로 발현된 다음, 시험관 내에서 리폴딩된다. TCR쇄는 천연 TCR에서 그 결합을 형성하는 데 관여하는 시스테인 잔기 바로 앞에서 절두되기 때문에 쇄간 이황화 결합을 형성하지 않는다. 대신에, α쇄 및 β의 헤테로이량체 접촉은 그 천연 단백질에서 헤테로이량체화를 매개하는 두 개의 로이신 지퍼 단편에 의해 지지된다.
8. TCR을 사용한 검출
T 세포에 의한 항원 제공 세포의 펩티드 특이적 인지는 저친화도 수용체/리간드의 다중 상호 작용을 통해 얻어지는 화합력에 기초한다. 이들은 TCR/MHC-펩티드 상호 작용과, 다수의 보조 수용체/리간드 상호 작용을 포함한다. 클래스 II 제한형 및 클래스 I 제한형 T 세포의 CD4 및 Cd8 보조수용체 역시 그 리간드로서 그 펩티드가 아니라 MHC를 가진다. 그러나, CD4 및 CD8이 상호 작용하는 MHC 상의 에피토프는 TCR과 상호 작용하는 에피토프와 중첩되지 않는다.
상기 인지 메카니즘은 접촉의 반감기가 치료 용도로 사용할 수 있을 정도로 항원 제공 세포의 펩티드 특이적 인지가 가용성 TCR에 의해 매개될 가능성을 제시한다. 그러나, 보조 수용체로부터의 지지가 부재할 경우에 다중 TCR/MHC-펩티드 상호 작용의 화합력을 통해 얻어진 안정성이 상기 목적에 충분한 지 여부는 명확하지 않다. 가용성 TCR에 의한 항원 제공 세포의 염색은 Plaksin 등(1997)의 문헌에 보고되어 있다. 이 결과는 소위 단쇄 TCR의 경우에 얻어졌는데, 단일 단백질은 TCR로부터 α쇄 및 β의 4개 도메인 중 3개로 구성되어 있다. 그러나, 화학적으로 변형된 TCR과 항원 제공 세포를 항온배양한 다음, 가교시킴으로써 염색하는데, 이 방법은 생체 내에서는 예측할 수 없다. 또한, 상기 방법은 펩티드의 레벨만을 명확히 검출하는데(대략 10 μM 펩티드와 항원 제공 세포를 항온처리), 검출되는 레벨은 생체 내에서 제공되는 펩티드의 레벨보다 훨씬 더 크다.
T 세포의 특이적 염색이 MHC-펩티드 사량체(Altman 등, 1996)를 사용하여 수행할 수 있다는 사실은 "반대의" 상황으로서 다량체 TCR이 표면 상에 관련 펩티드항원을 제공하는 세포에의 비교적 안정한 접촉을 매개한다는 생각을 일부 지지하는 것으로 간주될 수 있다. 그러나, 이것은 실제로 다량체 TCR에 의한 항원 제공 세포의 인지에 비해 다량체 MHC-펩티드에 의한 T 세포의 인지를 선호하는 하기의 중요한 세 가지 조건이 있기 때문에 상기의 경우에 해당될 것으로는 예측되지 않는다:
i) 다량체 MHC-펩티드 복합체는 T 세포 표면 상에서 TCR과 CD4 또는 CD8 보조 수용체에의 접촉을 형성할 수 있다. 다량체 TCR은 TCR/MHC-펩티드 접촉에만 좌우된다.
ii) T 세포 표면 상에서의 TCR의 농도는 항원 제공 세포의 표면 상의 MHC-펩티드의 농도보다 상당히 더 높다(Engelhard, 1994).
iii) 항원 제공 세포는 그 표면 상에 다수의 상이한 MHC-펩티드 복합체를 제공하는 반면에(Engelhard, 1994), T 세포는 정상적으로 하나의 α/β 또는 γ/δ조합체 만을 발현시킨다.
9. 리포좀에의 단백질의 부착
리포좀은 수성 내용물을 봉입하는 지질 분자의 2층 구조로 이루어진 지질 소포이다. 지질 이중층은 막 지질로부터 형성되나, 통상 인지질에만 국한되는 것은 아니다. 인지질 분자는 양쪽성을 나타내므로, 결정 상태로 또는 극성 용매 중에 집합되어 통상의 친액성 유체 결정 대칭 관계로 정돈된 구조를 형성한다. 수용액에서, 인지질 분자는 정상적으로는 하나 또는 몇 개의 인지질 이중층이 그 내부에 용매의 일부를 포집하는 경우에 자가 밀폐형 구형 또는 난형 구조물을 형성한다.
리포좀에 포집된 생물학적으로 활성인 화합물은 외부 환경으로부터 보호되고, 점진적으로 확산되어 지속 효과를 제공한다.
그 표면 상에서 단백질에 의해 특이적 위치로 유도되는 리포좀에 의한 약물 전달법은 엄청난 치료학적 잠재력을 가진다(Allen, 1997; Langer, 1998). 구체적으로, 특정 위치에서의 약물의 느린 방출은 투여할 전체량을 감소시키면서 약물의 효능을 증가시킬 수 있다. 그러한 용도로 리포좀을 사용하는 방법이 급속히 개발되고 있고, 다량의 데이터가 예컨대, 리포좀이 혈류에서 순환하는 능력(Uster 등, 1996) 및 그 생존 시간(Zalipsky 등, 1996)에 관한 데이터가 출현하고 있다. 특히 유용한 특징은 리포좀에 의해 보유된 약물을 경구적으로 투여할 수 있다는 것이다(Chen and Langer, 1997; Chen 등, 1996; Okada 등, 1995).
다수의 보고서가 리포좀에의 항체의 부착을 기술하고 있다(Ahmad and Allen, 1992; Ahmad 등, 1993; Hansen 등, 1995). 미국 특허 제5,620,689호는 소위 "면역 리포좀"을 개시하고 있는데, 이 리포좀에서는 B 림프구 또는 T 림프구 상에 선택된 항원에 결합하기에 효과적인 항체 또는 항체 단편이 폴리에틸렌 글리콜쇄의 표면 코팅을 가진 리포좀내 막 지질의 말단부에 부착된다. 그러나, 항체-항원 상호 작용은 일반적으로 친화도가 매우 높으며, 이러한 이유로 다가 표적화에 적당하지 않을 수 있다.
본 발명은 다가 형태의 T 세포 수용체(TCR)와, 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 환경에서 세포 표면에 제공된 특이 펩티드 항원을 보유하는 세포를 검출하는데 이를 사용하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 다량체 TCR을 사용하여 표적 세포로 전달하는 방법, 특히 치료제를 전달하는 방법에 관한 것이다.
첨부 도면에 대하여 다음을 참조한다.
도 1은 T-세포 수용체-로이신 지퍼 융합 단백질의 개략도이다. 각각의 사슬은 두개의 면역글로불린 대형군 도메인, 즉 하나의 가변부(V)와 하나의 불변부(C)로 이루어져 있다. 일정한 도메인은 사슬간 시스테인 잔기 바로 인접 n-말단에서 절두되어, C-말단에서 약 40 아미노산의 c-Jun(α) 또는 c-Fos(β)로부터의 로이신 지퍼 헤테로이량체화 모티프에 짧은 링커를 통해 융합한다. α-Jun 및 β-Fos 각각은 두개의 사슬간 이황화 결합을 포함하며 비공유 접촉에 의해서만 쌍을 이룬다. 알파쇄는 더 작은 불변부를 보유하기 때문에 베타쇄보다 더 짧다.
도 2는 헤테로이량체 JM22zip 수용체의 환원/비환원 겔 분석의 사진이다. 정제된 TCR-지퍼의 동일한 시료를 환원 조건(레인 2) 및 비환원 조건(레인 4)하의 15% 아크릴아미드 SDS 겔에 적재하였다. 마커 단백질은 레인 1 및 3에 표시된다. 분자량은 킬로달톤으로 표시된다. 양 세트의 조건 하에서 비공유적으로 연합된 헤테로이량체는 알파쇄과 베타쇄로 분리된다. 레인 4에서는 각 사슬은 이동성이 크며 단일한 분리대로 조작하는데, 이는 사슬간 이황화 결합의 단일 종이 존재한다는 것을 나타낸다. 이는 정확한 이황화 결합 형성에 적합하다.
도 3은 JM22zip TCR의 HLA-A2 Flu 매트릭스(M58-66) 복합체에 대한 특이적 결합을 도시하는 그래프이다. 단일 펩티드 부근에서 리폴딩되고 β2-마이크로글로불린 상에 비오티닐화된 HLA-A2 복합체는 스트렙타비딘으로 코팅된 3개의 유동 세포, 즉 HLA-A2 POL 대조군의 3770 공명 단위(RU)로 유동 세포(FC) 3, 2종의 상이한 레벨의 HLA-A2 M58-66 FLU(2970 RU로 FC1 및 4960 RU로 FC2)상에 고정시켰다. JM22zip은 43 μM의 농도로 60초 동안 모두 3종의 유동 세포에 대해 연속적으로 가용성 상에 주입하였다. 주입 과정에서, HLA-A2 FLU 코팅된 유동 세포 둘다의 반응에 있어서 상부 배경 증가가 나타나는데, 유동 세포 1 및 2 각각에 대한 JM22zip의 특이적 결합은 약 1000 RU 및 700 RU이다.
도 4는 c-jun의 "로이신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때, JM22 유래의 가용성 HLA-A2/flu 매트릭스 제한된 TCR 알파쇄의 단백질 서열(한 문자 코드, 상부) 및 DNA 서열(하부)을 도시한다. 이.콜리에서의 유전자의 발현을 향상시키기 위해 DNA 서열의 5' 말단에 도입된 돌연변이는 TCR 및 c-jun 서열 사이의 링커 서열과 같이 소문자로 표시한다.
도 5는 c-fos의 "로이신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때 JM22 유래의 가용성 HLA-A2/flu 매트릭스 제한된 TCR 베타쇄의 단백질 서열(한 문자 코드, 상부) 및 DNA 서열(하부)을 도시한다. TCR과 c-fos 서열 사이의 링커 서열은 소문자로 표시되어 있다. 시스테인 잔기를 세린 잔기로 치환한 DNA 서열의 돌연변이는 굵은 글씨로 밑줄을 그어 표시한다. 이 돌연변이는 TCR의 폴딩 효율을 증가시킨다.
도 6은 c-fos의 "로이신 지퍼" 도메인과 BirA의 기질로 작용하는 비오티닐화 태그(tag)에 융합되었을 때, JM22 유래의 가용성 HLA-A2/flu 매트릭스 제한된 TCR 베타쇄의 단백질 서열(한 문자 코드, 상부) 및 DNA 서열(하부)을 도시한다. TCR과 c-fos 서열 사이의 링커 서열 및 c-fos서열과 비오티닐화 태그 사이의 링커 서열은 소문자로 표시되어 있다. 시스테인 잔기를 세린 잔기로 치환한 DNA 서열의 돌연변이는 굵은 글씨로 밑줄을 그어 표시한다. 이 돌연변이는 TCR의 폴딩 효율을 증가시킨다.
도 7은 TCR-지퍼-비오티닐화 태그 융합 단백질의 개략도이다.
도 8은 염화나트륨의 구배를 이용한 POROS 10HQ 컬럼으로부터 리폴딩된 TCR의 용출 결과를 도시한다. TCR은 약 100 mM NaCl에서 단일 피크로 용출된다. 0.1 이상의 흡광도(280 nm)를 보유한 단백질을 함유하는 분획은 모아서 비오티닐화를 위해 농축시켰다.
도 9는 슈퍼덱스 200HR 10/30 컬럼(파마시아) 상의 겔 여과법에 의해 유리 비오틴으로부터 비오티닐화된 TCR을 분리한 결과를 나타낸다. TCR-비오틴은 약 15 ml정도에서 용출되며, 분자량은 69 kDa에 해당한다. (표준 단백질 및 이들의 용출 부피: 티로글로불린(669 kDa) 10.14 ml, 아포페리틴(443 kDa) 11.36 ml, 베타-아밀라제(200 kDa) 12.72 ml, BSA 이량체(134 kDa) 13.12 ml, BSA 단량체(67 kDa) 14.93 ml, 난알부민(43 kDa) 15.00 ml, 키모트립시노겐 A(25 kDa) 18.09 ml, RNase A(13.7 kDa) 18.91 ml)
도 10은 슈퍼덱스 200HR 10/30 컬럼 상의 TCR 사량체의 겔 여과 결과를 도시한다. 14.61 및 12.74의 피크는 엑스트라비딘을 안정화시키기 위해 사용된 BSA(단량체 및 이량체)에 해당한다. 11.59의 피크는 엑스타라비딘-FITC를 사용하여 사량체화한 경우 황색 FITC의 존재로 판단되는 바와 같이 TCR 사량체를 포함한다. 이 피크는 340 kDa의 분자량에 해당하는데, 이것은 엑스트라비딘 결합된 TCR 사량체와 일치한다.
도 11은 c-jun의 "로이신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때 클론 A6(Garboczi 등, 1996; Garboczi 등, 1996) 유래의 가용성 HTLV-1 Tax/HLA-A2 제한된 TCR 알파쇄의 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. 이.콜리에서의 유전자 발현을 향상시키기 위해 DNA 서열의 5' 말단에 도입된 돌연변이는 TCR과 c-jun 서열 사이의 링커 서열과 같이 소문자로 표시된다.
도 12는 c-fos의 "로이신 지퍼" 도메인과 BirA의 기질로 작용하는 비오티닐화 태그에 융합되었을 때 클론 A6(Garboczi 등, 1996; Garboczi 등, 1996) 유래의 가용성 HTLV-1 Tax/HLA-A2 제한된 TCR 베타쇄의 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)를 도시한다. TCR과 c-fos 서열 사이의 링커 서열은 소문자로 표시된다. 시스테인 잔기를 알라닌 잔기로 치환한 DNA 서열의 돌연변이는 굵은 글씨로 밀줄 그어 표시되어 있다.
도 13은 c-jun의 "로이신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때 클론 M10B7/D3(Ding 등, 1998) 유래의 가용성 HTLV-1 Tax/HLA-A2 제한된 TCR 알파쇄의 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. TCR과 c-jun 서열 사이의 링커 서열은 소문자로 표시된다.
도 14는 c-fos의 "로이신 지퍼" 도메인과 BirA의 기질로 작용하는 비오티닐화 태그에 융합되었을 때, 클론 m10B7/D3(Ding 등, 1998) 유래의 가용성 HTLV-1 Tax/HLA-A2 제한된 TCR 베타쇄의 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. TCR과 c-fos 서열 사이의 링커 서열은 소문자로 표시된다. 시스테인 잔기를 알라닌 잔기로 치환한 DNA 서열의 돌연변이는 굵은 글씨로 밑줄 그어 표시되어 있다. 클로닝을 목적으로 하고 Xmal 제한 위치를 제거하기 위해 도입된 2 개의 침묵 돌연변이(P-G 코돈)도 소문자로 표시한다.
도 15는 TCR 유전자의 "앵커(anchor)" 증폭을 위해 사용된 합성 DNA 프라이머의 서열을 도시한다. 클로닝을 위해 사용된 DNA 제한 효소의 인식 부위에는 밑줄이 그어져 있다. A: 폴리-C "앵커 프라이머". B: TCR α사슬 불변부 특이적 프라이머. C: TCR β사슬 불변부 특이적 프라이머.
도 16은 c-jun 및 c-fos의 40개의 아미노산 감겨진 코일("로이신 지퍼") 영역을 암호화하는 DNA 단편들을 PCR 증폭하는데 사용되는 합성 DNA 프라이머의 서열을 도시한다. 클로닝을 위해 사용된 DNA 제한 효소의 인식 부위에는 밑줄이 그어져 있다. A:c-jun5' 프라이머. B:c-jun3' 프라이머. C:c-fos5' 프라이머. D:c-fos3' 프라이머.
도 17은 TCRs에 융합되었을 때(pBJ107 및 pBJ108내 삽입체) c-fos 및 c-jun 단편 각각의 DNA 서열 및 아미노산 서열(한 문자 코드)을 도시한다다. A: TCR α쇄에 융합되었을 때 c-jun 로이신 지퍼. B: TCR β쇄에 융합되었을 때 c-fos 로이신 지퍼.
도 18은 TCR β사슬에서 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기를 돌연변이 유발시키기 위해 사용된 합성 DNA 프라이머의 서열을 나타낸다. 프라이머는 돌연변이 유발을 위한 "QuickchangeTM" 방법(스트라타젠)에 사용하기 위해 고안되었다. A: 시스테인의 세린으로의 돌연변이, 정방향(센스)프라이머, 아미노산 서열과 돌연변이를 나타냄. B: 시스테인의 세린으로의 돌연변이, 역방향(넌센스)프라이머. C: 시스테인의 알라닌으로의 돌연변이, 정방향(센스)프라이머, 아미노산 서열과 돌연변이를 나타냄. D: 시스테인의 알라닌으로의 돌연변이, 역방향(넌센스)프라이머.
도 19는 TCR-지퍼 융합 단백질의 개략도이다. 4개의 면역글로불린 도메인은돔 처럼 표시되는데, 시스테인 잔기의 정합쌍 사이에 사슬간 이황화 결합이 도시된다. 숫자는 성숙 T-세포 수용체 사슬의 아미노산 위치를 나타낸다; 재조합 후에 사슬 길이가 약간 변할 수 있기 때문에 사슬의 길이는 서로 다른 TCRs 사이에 약간씩 다를 수 있다. 링커 서열에 도입된 잔기는 한 문자 코드로 표시한다.
도 20은 TCR α쇄 및 β쇄의 PCR 증폭을 위해 사용된 합성 DNA 프라이머의 서열을 나타낸다. DNA 제한 효소의 인식 부위에는 밑줄로 표시하고 각각의 TCR 사슬에 해당하는 아미노산 서열은 정방향 프라이머 서열 위에 표시한다. TCR 유전자 서열과 TCR 유전자에 대응하지 않는 다른 DNA 서열에 관련된 침묵 DNA 돌연변이는 소문자로 표시된다. A: JM22 인플루엔자 매트릭스 바이러스 펩티드-HLA-A0201 제한된 TCR 의 인간 Vα10.2 사슬용 5' PCR 프라이머. B: JM22 인플루엔자 매트릭스 바이러스 펩티드-HLA-A0201 제한된 TCR의 인간 Vβ17 사슬용 5' PCR 프라이머. C: 인플루엔자 핵단백질 펩티드-H2-Db제한된 TCR의 마우스 Vα4 사슬용 5' PCR 프라이머. D: 인플루엔자 핵단백질 펩티드-H2-Db제한된 TCR의 마우스 Vβ11 사슬용 5' PCR 프라이머. E: 003 HIV-1 Gag 펩티드-HLA-A0201 제한된 TCR의 인간 Vα23 사슬의 5' PCR 프라이머. F: 003 HIV-1 Gag 펩티드-HLA-A0201 제한된 TCR의 인간 Vβ5.1 사슬의 5' PCR 프라이머. G: HTLV-1 Tax 펩티드-HLA-A0201 제한된 A6 TCR의 인간 Vα2.3 사슬의 5' PCR 프라이머. H: HTLV-1 Tax 펩티드-HLA-A0201 제한된 A6 TCR의 인간 Vβ12.3 사슬의 5' PCR 프라이머. I: HTLV-1 Tax 펩티드-HLA-A0201 제한된 B7 TCR의 인간 Vα17.2 사슬의 5' PCR 프라이머. J: HTLV-1 Tax 펩티드-HLA-A0201 제한된 B7 TCR의 인간 V β12.3 사슬의 5' PCR 프라이머. K: 일반적으로 이용가능한 인간 Cα 사슬의 3' PCR 프라이머. L: 일반적으로 이용가능한 인간 Cβ사슬의 3' PCR 프라이머.
도 21은 c-jun의 "로이신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때 JM22 유래의 가용성 HLA-A2/flu 매트릭스 제한된 TCR α쇄의 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. 이.콜리에서의 유전자 발현을 향상시키기 위해 DNA 서열의 5' 말단에 도입된 돌연변이는 TCR과 c-jun 서열 사이의 링커 서열에서와 같이 소문자로 표시한다.
도 22은 c-fos의 "로이신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때 JM22 유래의 가용성 HLA-A2/flu 매트릭스 제한된 TCR β쇄의 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)를 도시한다. TCR과 c-fos 서열 사이의 링커 서열은 소문자로 표시한다.
도 23은 c-jun의 "로이신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때 쥐 F5 수용체 유래의 가용성 H2-Db/인플루엔자 바이러스 핵단백질 제한된 TCR α쇄의 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. 이.콜리에서의 유전자 발현을 향상시키기 위해 DNA 서열의 5' 말단에 도입된 돌연변이는 TCR과 c-jun 서열 사이의 링커 서열에서와 같이 소문자로 표시한다.
도 24는 c-fos의 "로이신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때 쥐 F5 수용체 유래의 가용성 H2-Db/인플루엔자 바이러스 핵단백질 제한된 TCR β쇄의 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. TCR과 c-fos 서열 사이의 링커 서열은 소문자로 표시한다.
도 25는 c-jun의 "로이신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때 환자 003 유래의 가용성 HLA-A2/HIV-1 Gag 제한된 TCR α쇄 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. 이.콜리에서의 유전자 발현을 향상시키기 위해 DNA 서열의 5' 말단에 도입된 돌연변이는 TCR과 c-jun 서열 사이의 링커 서열에서와 같이 소문자로 표시한다.
도 26은 c-fos의 "로이신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때 환자 003 유래의 가용성 HLA-A2/HIV-1 Gag 제한된 TCR β쇄의 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. TCR과 c-fod 서열 사이의 링커 서열은 소문자로 표시한다.
도 27은 c-jun의 "로이신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때 클론 A6(Garboczi, Utz 등, 1996; Garboczi, Ghosh 등, 1996) 유래의 가용성 HTLV-1 Tax/HLA-A2 제한된 TCR α쇄의 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. 이.콜리에서의 유전자 발현을 향상시키기 위해 DNA 서열의 5' 말단에 도입된 돌연변이는 TCR과 c-jun 서열 사이의 링커 서열에서와 같이 소문자로 표시한다.
도 28은 c-fos의 "로이신 지퍼" 도메인과 BirA(Barker 및 Campbell, 1981; Barker 및 Campbell, 1981; Howard, Shaw 등, 1985; Schatz, 1993; O'Callaghan, Byford, 1999) 대체물로서 작용하는 비오티닐화 태그에 융합되었을 때 클론 A6(Garboczi, Utz 등, 1996; Garboczi, Ghosh 등, 1996) 유래의 가용성 HTLV-1Tax/HLA-A2 제한된 TCR β쇄의 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. TCR과 c-fos 서열 사이의 링커 서열은 소문자로 표시한다. 알라닌 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 돌연변이는 진한 글씨로 밑줄 그어 표시한다.
도 29는 c-jun의 "로이신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때 클론 M10B7/D3(Ding 등, 1998) 유래의 가용성 HTLV-1 Tax/HLA-A2 제한된 TCR α쇄의 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. TCR과 c-jun 서열 사이의 링커 서열은 소문자로 표시한다.
도 30은 c-fos의 "로이신 지퍼" 도메인과 BirA의 대체물로서 작용하는 비오티닐화 태그에 융합되었을 때 클론 M10B7/D3(Ding 등, 1998) 유래의 가용성 HTLV-1 Tax/HLA-A2 제한된 TCR β쇄의 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. TCR과 c-fos 서열 사이의 링커 서열은 소문자로 표시한다. 시스테인 잔기를 알라닌 잔기로 치환한 DNA 서열의 돌연변이는 진한 글씨로 밑줄 그어 표시한다. 클로닝을 목적으로 하고 Xmal 제한 위치를 제거하기 위해 도입된 두개의 침묵 돌연변이(P-G 코돈)도 소문자로 표시한다.
도 31은 c-fos의 "로이신 지퍼" 도메인과 BirA(Barker 및 Campbell, 1981; Barker 및 Campbell, 1981; Howard, Shaw 등, 1985; Schatz, 1993; O'Callaghan, Byford, 1999)의 대체물로 작용하는 비오티닐화 태그에 융합되었을 때 클론 A6(Garboczi, Utz 등, 1996; Garboczi, Ghosh 등, 1996) 유래의 돌연변이된 가용성 HTLV-1 Tax/HLA-A2 제한된 TCR β쇄의 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. TCR과 c-fos 서열 사이의 링커 서열은 소문자로 표시한다. 알라닌 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 DNA 서열의 돌연변이는 진한 글씨로 밑줄 그어 표시한다. 또한, 가용성 TCR상에서 검출가능한 기능적인 효과를 보유하지 않는 불변부내 돌연변이인 아스파르트산을 아스파라긴 잔기로 치환한 것은 굵은 글씨로 밑줄 그어 표시한다.
도 32는 TCR β사슬을 위해 사용된c-fos-비오티닐화 융합 파트너의 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. DNA 제한 효소 인식 부위는 밑줄 그어 표시하고, 2개의 융합 도메인의 경계가 제시되어 있다. 링커 서열은 소문자로 표시한다.
도 33은 인간 JM22 인플루엔자 매트릭스 펩티드-HLA-A0201의 Vβ-c-fos로이신 지퍼 단편의 PCR 증폭을 위한 합성 DNA 프라이머의 서열을 도시한다.
도 34는 한 세트의 겔 사진이다.a.SDS-PAGE에 의해 분석된 003 HIV gag 펩티드-HLA-A2 복합체에 특이적인 TCR을 위한 변성된 단백질의 제조. 레인 1: 광범위한 분자량 마커(바이오라드), 레인 2 및 3: 0.5 mM IPTG로 단백질 발현을 유도시킨 후의 박테리아, 레인 4 및 5: 6M 구아니딘 완충액에 용해된 정제된 봉입체.b.SDS-PAGE에 의해 분석된 인플루엔자 매트릭스 펩티드-HLA-A2 복합체에 특이적인 비오틴 태그된 TCR을 위한 변성된 단백질의 제조. 레인 1: 광범위한 분자량 마커(바이오라드), 레인 2 및 3: 6M 구아니딘 완충액에 용해된 α쇄 및 β쇄 정제된 봉입체.c.SDS-PAGE에 의해 분석된 HTLV tax 펩티드-HLA-A2 복합체에 특이적인 비오틴이 태그된 TCR을 위한 변성된 단백질의 제조. 레인 1 및 5: 광범위한 분자량 마커(바이오라드), 레인 2, 3 및 4: 0.5 mM IPTG로 단백질 발현을 유도시킨 후의 박테리아의 α쇄, β쇄 및 돌연변이 β쇄 발현, 레인 6, 7 및 8: 6M 구아니딘 완충액에 용해된 α쇄, β쇄 및 돌연변이 β쇄 정제된 봉입체.
도 35는 POROS 10HQ 음이온 교환 컬럼으로부터 JM22z 헤테로이량체의 용출을 나타내는 크로마토그램이다. 점선은 염화나트륨 농도를 표시하는 전도성을 나타내고, 실선은 용출물의 단백질 농도를 나타내는 280 nm에서의 광학 밀도를 도시한다. 분획을 포함하는 피크 단백질은 추가의 분석을 위해서 모았다. 삽입 그래프는 슈퍼덱스 200 HR 컬럼으로부터의 정제된 JM22z 용출물의 크로마토그램을 나타낸다. 화살표는 분자량이 알려진 단백질을 가진 컬럼의 눈금을 나타낸다. 이러한 단백질들을 비교하면 리폴딩된 JM22z 단백질의 분자량은 헤테로이량체 단백질에 적합한 약 74 kDA이다.
도 36은 정제된 JM22z 단백질의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(코마씨-염색)을 보여주는 사진이다. 레인 1 및 3: 공지된 분자량의 표준 단백질(표시된 바와 같음), 레인 2: 시료를 적재하기 전에 환원제(DTT)를 포함하는 SDS-시료 완충액으로 처리한 JM22z 단백질, 레인 4: 환원제의 부재하에 SDS-시료 완충액으로 처리한 JM22z 단백질.
도 37.a.인플루엔자 매트릭스 펩티드-HLA-A2 복합체에 대해 특이적인 비오틴이 태그된 리폴딩된 TCR의 정제. i. POROS 10HQ 컬럼으로부터의 단백질의 용출의 크로마토그램. 라인 x는 280 nm에서의 흡광도를 나타내고, 라인 y는 전도성(단백질을 용출시키기 위해 사용된 염화나트륨 농도 기울기의 척도)을 나타낸다. 분획 번호는 세로선에 표시된다. ii. i에서와 같이 컬럼으로부터 용출된 분획의 SDS-PAGE.레인 1은 광범위의 분자량 마커(바이오라드)를 포함한다. 레인 2 내지 13은 분획물 6 내지 15를 각각 5 ㎕ 포함한다. iii. 비오틴이 태그된 flu-TCR을 포함하는 i로부터 모은 분획들의 SDS-PAGE 분석. 레인 1: 광범위한 분자량 마커(바이오라드). 레인 2: 비오틴이 태그된 flu-TCR 단백질.b.HTLV-tax 펩티드-HLA-A2 복합체에 특이적인 리폴딩된 비오틴이 태그된 TCR의 정제. i. POROS 10HQ 컬럼으로부터의 단백질 용출의 크로마토그램. 라인 x는 280 nm에서의 흡광도를 나타내고 라인 y는 전도성(단백질을 용출시키기 위해 사용된 염화나트륨 농도 기울기의 척도)을 나타낸다. 분획 번호는 세로선에 표시한다. ii. i에서 처럼 컬럼으로부터 용출된 분획의 SDS-PAGE. 레인 1은 광범위한 분자량 마커(바이오라드)를 포함하고, 레인 2 내지 10은 분획물 3 내지 11을 각각 5 ㎕ 포함한다. iii. i로부터 모은 비오틴이 태그된 tax-TCR의 분획의 SDS-PAGE 분석. 레인 1: 광범위한 분자량 마커(바이오라드), 레인 2: 비오틴이 태그된 tax-TCR 단백질, 레인 3: 비오틴이 태그된 돌연변이 tax-TCR 단백질.
도 38은 PBS로 평형화된 슈퍼덱스 200 HR 컬럼으로부터 BirA 효소로 비오티닐화 시킨 후 비오틴이 태그된 가용성 TCR의 용출을 나타내는 크로마토그램이다. 비오티닐화된 TCR은 약 15 내지 16분에 용출되고, 유리 비오틴은 약 21분에 용출된다. 비오티닐화된 가용성 TCR을 포함하는 분획은 추가의 사용을 위해 모은다.
도 39는 한 세트의 겔 사진이다. 비오티닐화된 TCRs의 비오티닐화 측정. a. 리폴딩된 TCRs과 봉입체 제제의 SDS-PAGE. 레인 1: 광범위의 분자량 마커(바이오라드), 레인 2: 비오티닐화된 flu-TCR, 레인 3: 비오티닐화된 tax-TCR, 레인 4: 비오티닐화된 돌연변이 tax-TCR, 레인 5: HIV gag-TCR,(비오틴이 태그되지 않음), b. 광범위한 마커가 비오틴 표지(바이오라드)된 것을 제외하면 a와 동일한 겔의 웨스턴 블롯. 아비딘-HRP 접합체로 염색하여 비오티닐화된 단백질을 제시하고 Opti-4CN(바이오라드)으로 가시화하였다.
도 40은 상이한 HLA-A2-펩티드 복합체에 결합하는 JM22z를 도시한다(삽입 그래프) JM22z와 HLA-A2-flu간의 상호작용의 특이성은 TCR을 HLA-A2-flu의 1900 RU로 코팅한 유동 세포를 통과시켜서 얻은 SPR 반응과 TCR을 HLA-A2-pol의 4200 RU로 코팅된 것과 CD5의 4300 RU로 코팅된 것 두 가지의 유동세포를 거치도록 통과시켜 얻은 SPR 반응을 비교함으로써 입증된다. 상이한 JM22z 농도에서의 배경 반응은 HLA-A2-pol(a)의 1700 RU에서 측정되었다. 배경 수치는 1900 RU의 HLA-A2-flu(b)에서 측정된 특이적인 반응에서 공제하였며, 농도(c)에 대해 플롯하였다. 비선형 곡선 맞춤에 의해 측정된 Kd 값, 13 μM은 동일한 데이타로 Scatchard 플롯을 기초로 계산한 Kd 값인 12 μM과 일치한다.
도 41은 야생형 및 돌연변이 가용성 비오티닐화된 tax TCR의 Biacore 2000TM분석의 결과를 나타내는 그래프이다. 5 ㎕의 2.2 mg/ml 농도의 야생형 tax TCR과 2.4 mg/ml 농도의 돌연변이 tax TCR을 차례로 4 종의 유동 세포상에서 유동시켰으며, 상기 세포의 표면에는 하기의 단백질들이 부착되어 있다: A: tax-pMHC 복합체, B/C: flu-pMHC 복합체, D: OX68 대조 단백질. 야생형과 돌연변이 단백질이 모두 특이적 pMHC 복합체에 유사하게 결합한다.
도 42는 동일한 HLA-A2-flu 복합체에 결합하는 가용성 TCR 대한 가용성CD8aa의 결합 효과를 나타낸다. (A) TCR 또는 TCR + 120 μM 가용성 CD8을 4100 RU의 부적절한 단백질(CD5)로 코팅된 대조 유동 세포와 4700 RU의 HLA-A2-flu로 코팅된 프로브 유동 세포로 주입하였다. 배경을 제한 후에, TCR 단독(○) 또는 120 μM의 가용성 CD8과의 조합물(●)의 다양한 농도에서 계산한 평형 반응값을 나타낸다. 또한 CD8 단독(△)의 수치와 TCR + CD8과 TCR 단독(□)사이의 계산상의 차이를 나타낸다. (B) 25℃, 5 ㎕/분의 유속에서 49 μM TCR 단독(○) 또는 120 μM의 CD8과의 혼합물(●)의 4700 RU의 고정된 HLA-A2-flu에 대한 반응의 시간적인 의존도를 나타낸다.(그 값은 4100 RU의 고정된 CD5로 측정한 배경 값에 대해 보정한다); TCR의 해리 속도(off-rate)는 동시에 일어나는 CD8 결합에 의해 영향을 받지 않는다.
도 43. 엑스트라비딘을 이용한 비오티닐화된 TCR의 사량체화. 슈퍼덱스 200 HR 컬럼을 이용한 겔 여과는 비오티닐화된 TCR과 엑스트라비딘이 결합하여 각각의 단백질보다 분자량이 더 큰 하나의 올리고머를 형성한다는 것을 보여준다. 겔 여과 크로마토그램: A. 엑스트라비딘 B. 비오티닐화된 TCR C. TCR 사량체.
도 44는 RPE 변형된 스트렙타비딘을 이용한 비오티닐화된 TCR의 사량체화. 슈퍼덱스 200 HR 컬럼을 이용한 겔 여과는 비오티닐화된 TCR과 스트렙타비딘-RPE가 결합하여 각각의 단백질보다 분자량이 더 큰 하나의 올리고머를 형성한다는 것을 보여준다. 겔 여과 크로마토그램: A. 스트렙타비딘-RPE B.비오티닐화된 TCR C. TCR-RPE 사량체.
도 45A는 비오티닐화된 가용성 flu-TCR의 BIAcore 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 1 mg/ml의 농도로 flu-TCR 5㎕를 3종의 유동 세포상에서 유동시켰으며,하기 단백질은 스트렙타비딘을 통해 세포에 부착되어 있다. i: 비특이적인 대조 단백질, ii: flu 매트릭스 pMHC, iii: tax pMHC. 도 45B는 flu-TCR 사량체의 BIAcore 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 0.05 mg/ml 농도로 flu-TCR 사량체 용액 5㎕를 3종의 유동 세포상에서 유동시켰으며, 하기 단백질은 스트렙타비딘을 통해 세포에 부착되어 있다. i: 비특이적인 대조 단백질, ii. flu 매트릭스 pMHC, iii: tax pMHC.
도 46A는 비오티닐화된 가용성 tax-TCR의 BIAcore 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 1 mg/ml 농도로 flu-TCR 5 ㎕를 3종의 유동 세포상에서 유동시켰으며,하기 단백질은 스트렙타비딘을 통해 세포에 부착되어 있다. i: 비특이적인 대조 단백질, ii. flu 매트릭스 pMHC, iii: tax pMHC. 도 45B는 tax-TCR 사량체의 BIAcore 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 0.05 mg/ml 농도로 flu-TCR 사량체 용액 5㎕를 3종의 유동 세포상에서 유동시켰으며,하기 단백질은 스트렙타비딘을 통해 세포에 부착되어 있다. i: 비특이적인 대조 단백질, ii. flu 매트릭스 pMHC, iii: tax pMHC.
도 47. 각종 레벨의 펩티드로 펄스되고 인플루엔자 매트릭스 펩티드 또는 HTLV tax 펩티드에 특이적인 TCR 사량체로 염색된 T2 세포의 FACS 분석. A. 분석을 위한 세포의 출입(gating). B. "데이타.001"= 0 펩티드; "데이타.007"= 10-4M flu 펩티드; "데이타.009"= 10-5M flu 펩티드; "데이타.010"= 10-6M flu 펩티드; "데이타.003"= 10-4tax 펩티드를 사용하여 펄스된 T2 세포의 염색. 이들 펩티드는 모두RPE로 표지된 5 ㎕의 flu-TCR 사량체로 염색한다. C. "데이타.002"= 0 펩티드; "데이타.004"= 10-4M tax 펩티드; "데이타.005"= 10-5M tax 펩티드; "데이타.006"= 10-6M tax 펩티드; "데이타.008"= 10-4flu 펩티드로 펄스된 T2 세포의 염색. 이들 펩티드는 모두 RPE로 표지된 5 ㎕의 tax-TCR 사량체로 염색한다.
도 48은 각종 레벨의 펩티드로 펄스되고 인플루엔자 매트릭스 펩티드 또는 HTLV tax 펩티드에 특이적인 TCR 사량체로 염색한 .45 세포의 FACS 분석. A. 분석을 위한 세포의 출입. B. "데이타.002"= 0 펩티드; "데이타.004"= 10-4M flu 펩티드; "데이타.006"= 10-5M flu 펩티드; "데이타.010"= 10-4M tax 펩티드로 펄스된 .45 세포의 염색. 이들 펩티드는 모두 RPE로 표지된 5 ㎕의 tax-TCR 사량체로 염색되어 있다. C."데이타.003"= 0 펩티드; "데이타.011"= 10-4M tax 펩티드; "데이타.013"= 10-5M tax 펩티드; "데이타.015"= 10-6M tax 펩티드; "데이타.005"=10-4flu 펩티드로 펄스된 .45 세포의 염색. 이들 펩티드는 모두 RPE로 표지된 5 ㎕의 tax-TCR 사량체로 염색한다.
도 49. 각종 레벨의 펩티드로 펄스되고 적색 형광 표지가 있는 TCR 코팅된 라텍스 비드('Fluospheres'-분자 프로브)로 염색한 T2 세포의 FACS 분석. A. 분석을 위한 염색되지 않은 세포의 출입 B. 분석을 위한 염색된 세포의 출입. 이동은 세포에 결합된 비드의 질량에 의해 일어난 측면 분산(side-scatter)임을 인지할 것C. "데이타.002"= 0 펩티드; "데이타.004"= 10-4M flu 펩티드; "데이타.006"= 10-5M flu 펩티드; "데이타.007"= 10-6M flu 펩티드로 펄스된 T2 세포의 염색. 이들 펩티드는 모두 10 ㎕의 flu-TCR 코팅된 비드로 염색한다. D. "데이타.003"= 0 펩티드; "데이타.009"= 10-4M tax 펩티드; "데이타.010"= 10-5M tax 펩티드; "데이타.011"= 10-6M tax 펩티드로 펄스된 T2 세포의 염색. 이들 펩티드는 모두 10 ㎕의 tax-TCR 코팅된 비드로 염색한다.
본 발명의 제1의 목적은 특이적 MHC-펩티드 복합체를 표적화하는 수단을 제공하는 것이다.
본 발명의 제2의 목적은 특이적 MHC-펩티드 복합체, 특히 한정하는 것은 아니지만 생체 내에서 제공되는 MHC-펩티드 복합체를 검출할 수 있는 형태의 TCR을 제공하는 것이다.
본 발명의 제3의 목적은 시약, 특히 치료제를 생체 내에 특이적 MHC-펩티드 복합체의 발현 부위로 전달할 수 있는 표적화된 전달 매체를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 놀랍게도 TCR을 생체내 표적화 목적에 매우 효과적으로 사용할 수 있음을 알아냈고, 표적화 목적으로 TCR 분자를 사용하는 방법을 고안하는 데 성공하였다.
본 발명은 일 측면에서 MHC-펩티드 복합체에의 결합용으로 합성된 다가 T 세포 수용체(TCR) 복합체를 제공하는데, 이 TCR 복합체는 MHC-펩티드 복합체에 특이적인 다수의 T 세포 수용체를 포함한다.
본 발명은 주로 T 세포의 95%에 존재하는 αβTCR에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 비다량체 T 세포 수용체 헤테로이량체와 비교하여, 결합능이 증가된 다량체화된 재조합 T 세포 수용체 헤테로이량체를 포함하거나 이로 구성되는 다가의 TCR 복합체를 제공한다. 다량체 T 세포 수용체는 2종 이상의 TCR 헤테로이량체를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 MHC-펩티드 복합체를 검출하는 방법을 제공한다:
(i) (a) 다수의 T 세포 수용체를 포함하는 합성된 다가 T 세포 수용체 복합체 및/또는 (b) 비다량체 T 세포 수용체 헤테로이량체에 비해 결합능이 증가된 다량체화된 재조합 T 세포 수용체 헤테로이량체를 포함하는 다가 T 세포 수용체 복합체를 제공하는 단계(상기 T 세포 수용체들은 MHC-펩티드 복합체에 특이적임);
(ii) 다가의 TCR 복합체를 MHC-펩티드 복합체와 접촉시키는 단계; 및
(iii) MHC-펩티드 복합체에의 다가 TCR 복합체의 결합을 검출하는 단계.
또 하나의 측면에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하여 치료제를 표적 세포에 전달하는 방법을 제공한다:
(i) (a) 다수의 T 세포 수용체를 포함하는 합성된 다가 TCR 복합체 및/또는 (b) 비다량체 T 세포 수용체 헤테로이량체에 비해 결합능이 증가된 다량체화된 재조합 T 세포 수용체 헤테로이량체를 포함하는 다가 TCR 복합체를 제공하는 단계(상기 T 세포 수용체들은 MHC-펩티드 복합체에 특이적이고, 다가의 TCR 복합체는 이와 연합된 치료제를 보유함);
(ii) 다가의 TCR 복합체를 T 세포 수용체가 표적 세포에 부착할 수 있는 조건하에 유력한 표적 세포와 접촉시키는 단계.
본 발명에 따른 다가의 TCR 복합체(또는 다가의 결합부)는 그 자신의 권리로 시험관내 또는 생체내에서 특정 항원을 제공하는 세포를 추적 또는 표적화하는 데 유용하고, 그러한 용도를 가진 추가의 다가 TCR 복합체의 생성용 중간체로서도 유용하다. 그러므로, 다가의 TCR 복합체는 생체 내에서 사용하기 위해 약학적으로 허용 가능한 제제로 제공될 수 있다.
본 발명의 내용 중에서, 다가의 TCR 복합체는 생물에서 발견될 수 없거나, 생물에 자연적으로 존재하지 않으면, 예컨대, 그것이 비대사성이고/이거나 무핵인 경우에는 "합성된" 것이다. 따라서, 예컨대, TCR이 다량체 형태이거나 지질 이중층, 예컨대, 리포좀에 존재하는 경우라면, 합성된 복합체가 바람직하다. T 세포를 분리하고 세포내 성분을 제거함으로써, 즉 복합체가 무핵이 되도록 함으로써 TCR 복합체를 형성할 수 있다. 생성된 "고스트" T 세포는 T 세포 수용체를 포함하여 간단히 T 세포막을 가질 수 있다. 그러한 고스트 T 세포는 T 세포를 세제로 용해시키고, 막으로부터 세포내 성분을 분리한(예컨대, 원심 분리법으로) 다음, 세제를 제거하고 막을 재구성함으로써 형성할 수 있다.
그 가장 단순한 형태로, 본 발명에 따른 다가의 TCR 복합체는 서로 바람직하게는 링커 분자를 통해 연합되어 있는(예, 공유 결합 또는 그 외의 결합) 2개 또는 3개 또는 4개 이상의 T 세포 수용체 분자의 다량체를 포함한다. 적합한 링커 분자로는 아비딘, 스트렙타비딘 및 엑스트라비딘(각각 비오틴에 대한 4개의 결합 부위를 가짐)과 같은 다가의 부착 분자를 들 수 있다. 따라서, 비오티닐화된 TCR 분자는 다수의 TCR 결합 부위를 가진 T 세포 수용체의 다량체로 형성될 수 있다. 다량체 중의 TCR 분자의 수는 다량체 제조에 사용된 링커 분자의 양과 관련하여 TCR의 양 및 임의의 기타 비오티닐화된 분자의 존재 또는 부재에 의해 좌우된다. 바람직한 다량체는 삼량체 또는 사량체 TCR 복합체이다.
특이적 MHC-펩티드 복합체를 발현시키는 세포를 추적 또는 표적화하는 데 사용하기 위한 다가의 TCR 복합체가 TCR 삼량체 또는 사량체보다 더 큰 선택인 구조물이 바람직하다. 그 구조물은 직경이 10 ㎚ 내지 10 ㎛의 범위인 것이 바람직하다. 각 구조물은 구조 상의 2개 이상의 TCR 분자가 세포 상의 2개 이상의 MHC-펩티드 복합체에 동시에 결합할 수 있도록 충분한 거리로 이격되게 다중 TCR 분자를 디스플레이하고, 따라서, 세포에 대한 다량체 결합 부위의 화합력을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 구조물은 비드(예컨대, 라텍스 비드)와 같은 입자가 바람직한 고체 구조물과 리포좀 같은 막 구조물을 포함한다. T 세포 수용체 분자로 외부에서 코팅할 수 있는 기타 구조물도 적합하다. 구조물은 개개의 T 세포 수용체 분자로보다는 다량체 T 세포 수용체 복합체로 코팅하는 것이 바람직하다.
리포좀의 경우에, T 세포 수용체 분자는 막의 외부에 부착하거나, 막 내부에 매립될 수 있다. 후자의 경우에, 경막 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 T 세포 수용체 분자를 사용할 수 있다. 전자의 경우에는 가용성 T 세포 수용체 분자가 바람직하다. T 세포 수용체의 가용성 형태가 통상 경막 도메인의 결실에 의해 자연 형태로부터 유도된다. 단백질은 세포질 및 경막 도메인을 제거하여 절두시키거나 또는 보유되는 세포질 도메인의 일부 또는 전부로 경막 도메인을 결실시킬 수 있다. 단백질은 단백질 분해성 절단에 의해 또는 유전자 조작된 절두된 또는 부분적으로 결실된 형태를 발현시킴으로써 목적 형태를 얻을 수 있도록 변형시킬 수 있다.
일반적으로, 가용성 T 세포 수용체는 분자의 모두 4개의 외부 도메인, 즉 α및 β가변 도메인과 α및 β불변 도메인을 보유한다. 그러나, 가변 도메인의 MHC-펩티드 결합 특성을 보유하는 TCR의 임의의 가용성 형태도 있다. 예컨대, 결합 부위를 크게 방해하지 않으면서 불변 도메인의 하나 정도를 생략할 수 있다.
본 발명에 따른 다가의 TCR 복합체가 비다량체 T 세포 수용체 헤테로이량체에 비해 결합능이 향상된 다량체화된 재조합 T 세포 수용체 헤테로이량체를 포함하는 것이 바람직하다. 리폴딩된 재조합 T 세포 수용체는 다음과 같은 도메인을 포함할 수 있다:
i) 제1의 이종성 C-말단 이량체화 펩티드를 가진 재조합 T 세포 수용체 α쇄 또는 γ쇄 세포외 도메인; 및
ii) 제1 이량체화 펩티드와 특이적으로 헤테로이량체화되어 헤테로이량체화 도메인을 형성하는 제2 C-말단 이량체화 펩티드를 가진 재조합 T 세포 수용체 β쇄 또는 δ쇄 세포외 도메인.
그러한 재조합 TCR은 클래스 I MHC-펩티드 복합체 및 클래스 II MHC-펩티드 복합체를 인지할 수 있다.
재조합 TCR의 헤테로이량체화 도메인은 소위 "감겨진 코일(coiled coil)" 또는 "로이신 지퍼"가 바람직하다. 이들 용어는 특이적인 방식으로 서로 상호 작용하여 헤테로이량체를 형성하는 나선형 펩티드 쌍을 설명하는 데 사용된다. 상호 작용은 각 지퍼 펩티드의 한쪽을 따라 상보적인 소수성 잔기가 존재하기 때문에 일어난다. 펩티드의 성질은 헤테로이량체의 형성이 나선체의 호모이량체의 형성보다 훨씬 더 선호된다는 것이다. 로이신 지퍼는 합성된 것이거나, 자연 발생적인 것일 수 있다. 합성 로이신은 자연 발생적 로이신 지퍼보다 결합 친화도를 훨신 크게 만들 수 있는데, 이것이 반드시 장점이 되는 것은 아니다. 실제로, 본 발명에 사용하기에 바람직한 로이신 지퍼는 자연 발생적 로이신 지퍼 또는 유사한 결합 친화도를 가진 로이신 지퍼이다. c-jun 및 c-fos 단백질로부터 유래한 로이신 지퍼는 적합한 결합친화도를 가진 로이신 지퍼의 일례이다. 기타 적합한 로이신 지퍼로는 myc 및 max 단백질로부터 유래한 것들이 있다(Amati, Dalton 등, 1992). 적합한 성질을 가진 기타 로이신 지퍼를 용이하게 설계할 수 있다(O'Shea 등, 1993).
본 발명에 따른 다량체 결합부 중의 가용성 TCR은 c-jun(α쇄) 및 c-fos(β쇄)에서 유래한 헤테로이량체화 도메인에 상응하는 약 40개 아미노산의 로이신 지퍼 융합체를 가지는 것이 바람직하다(O'Shea, Rutkowski 등, 1989, O'Shea, Rutkowski 등, 1992, Glover and Harrison, 1995). 더 긴 로이신 지퍼를 사용할 수도 있다. 헤테로이량체화 특이성은 일부 로이신 지퍼 도메인의 매우 짧은 단편에서도 보유되는 것으로 보이기 때문에(O'Shea, Rutkowski 등, 1992), 더 짧은 c-jun 및 c-fos 단편을 사용하여 유사한 이점을 얻을 수 있다. 그러한 보다 짧은 단편은 예컨대, 8개의 아미노산을 가질 수 있다. 따라서, 로이신 지퍼 도메인은 아미노산 8 내지 60개의 길이를 가질 수 있다. 로이신 지퍼 쌍 형성에서의 특이성의 분자적 원리는 널리 특성 분석되어 있고(Landschulz, Johnson 등, 1988; McKnight, 1991), 로이신 지퍼는 당업자에 의해 설계 및 조작되어 호모이량체, 헤테로이량체 또는 삼량 복합체를 형성할 수 있다(Lumb and Kim, 1995; Nautiyal, Woolfson 등, 1995; Boice, Dieckmann 등, 1996; Chao, Houston 등, 1996). c-jun 및 c-fos 로이신 지퍼보다 더 높은 친화도를 가진 설계된 로이신 지퍼 또는 기타 헤테로이량체화 도메인은 일부 시스템에서 가용성 TCR의 발현에 유익할 수 있다. 그러나, 아래에 상세히 언급하는 바와 같이, 가용성 TCR이 시험관내에서 폴딩될 때, 가용화제를 폴딩 완충제에 포함시켜 비생산성 단백질 집합체의 형성을 감소시키는 것이 바람직하다.이 현상의 한 가지 해석은 로이신 지퍼 도메인의 폴딩 역학이 TCR쇄의 경우보다 더 빨라서 비폴딩된 TCR α쇄 및 β쇄의 이량체화를 일으키고, 다시 단백질 응집을 일으킨다는 것이다. 폴딩 과정을 감속하고 가용화제의 포함에 의한 응집을 억제함으로써, 단백질은 두 융합 도메인의 폴딩이 완료될 때까지 용액 중에 유지될 수 있다. 그러므로, c-fos 및 c-jun 로이신 지퍼보다 더 큰 친화도의 헤테로이량체화 도메인은 가용화제를 보다 고농도로 포함하여 c-iun 및 c-fos에 대한 것과 동등한 가용성 TCR의 수율을 얻을 수 있다.
상이한 생물학적 시스템은 다양한 방법을 사용하여 안정한 동종 단백질 이량체 및 이종 단백질 이량체를 형성하고, 이들 방법은 각각 원칙적으로 이량체화 도메인을 유전적으로 변형된 단백질로 조작하는 선택을 제공한다. 로이신 지퍼 (Kouzarides and Ziff, 1989)는 아마도 가장 대중적인 이량체화 모듈이고, 유전적으로 설계된 이량체 단백질의 생성에 널리 사용되어 왔다. 따라서, 효모 사카로마이세스 세레비자의 전사 활성화 단백질인 GCN4의 로이신 지퍼를 사용하여 다수의 이종성 단백질의 호모이량체화를 유도하여 왔다(Hu, Newell 등, 1993; Greenfield, Montelione 등, 1998). 그러므로, 바람직한 방법은 Jun/Fos 로이신 지퍼쌍과 같은 헤테로이량체 복합체의 직접적인 형성을 유도하는 지퍼를 사용하는 것이다(de Kruif and Logtenberg, 1996; Riley, Ralston 등, 1996).
헤테로이량체화 도메인은 로이신 지퍼에 국한되지 않는다. 따라서, 그것은 이황화 브리지 형성 요소에 의해 제공될 수도 있다. 한편, 그것은 SH3 도메인과 소수성/프롤린 풍부 짝도메인에 의해 제공될 수 있는데, 이들 도메인은 신호 변환에관여하는 단백질 중에서 나타나는 단백질-단백질 상호 작용을 담당한다 (Schlessinger, 1994). 신호 변환 다단계에 관여하는 단백질 중에서 발견되는 기타 천연 단백질-단백질 상호 작용은 해독후 변형 아미노산과 그러한 변형된 잔기를 특이적으로 인지하는 단백질 모듈 사이의 연합에 의해 좌우된다. 그러한 해독후 변형된 아미노산 및 단백질 모듈은 헤테로이량체화 도메인을 형성할 수 있다. 이러한 유형의 단백질 쌍의 예는 표피 성장 인자 수용체 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체와 GRB2의 SH2 도메인과 같은 티로신 인산화된 수용체에 의해 제공된다(Lowenstein, Daly 등, 1992; Buday and Downward, 1993). 모든 과학 분야와 마찬가지로, 새로운 이량체화 모듈이 적극 탐색되고 있고(Chevary and Nathans, 1992), 완전히 인공 모듈을 조작하는 방법이 이제 성공적으로 개발되었다(Zhang, Murphy 등, 1999).
바람직한 재조합 TCR에서는, 천연 α및 βTCR 쇄 중의 두 개의 시스테인 잔기들 사이 및 천연 γ및 δTCR 쇄 사이에 형성되는 쇄간 이황화 결합이 부재한다. 이것은 이량체화 도메인을 시스테인 잔기 위의 TCR 수용체 쇄에 이들 잔기가 재조합 단백질로부터 배제되도록 융합시킴으로써 달성될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 하나 이상의 시스테인 잔기가 이황화 결합 형성에 관여하지 않는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 대체된다. 이들 시스테인 잔기는 기능적 TCR의 시험관내 폴딩에 유해할 수 있기 때문에 도입되지 않을 수도 있다.
본 발명에 따른 다가의 TCR 복합체의 바람직한 리폴딩된 재조합 TCR의 α쇄 및 β쇄 또는 γ쇄 및 δ쇄의 리폴딩은 적합한 리폴딩 조건 하에 시험관 내에서 일어난다. 구체적인 양태에서, 정확한 모양을 가진 재조합 TCR은 우레아와 같은 가용화제를 포함하는 리폴딩 완충제 중에서 용해된 TCR 쇄를 리폴딩함으로써 얻어진다. 우레아는 농도가 0.1M 이상 또는 1M 이상 또는 2.5M 이상 또는 약 5M로 존재할 때 유용하다. 사용할 수 있는 또 다른 가용화제는 농도가 0.1M 내지 8M, 바람직하게는 1M 이상 또는 2.5M 이상인 구아니딘이다. 리폴딩 전에, 환원제를 이용하여 시스테인 잔기를 완전히 환원시키는 것이 바람직할 수 있다. DTT 및 구아니딘과 같은 추가의 변성제를 필요에 따라 사용할 수 있다. 상이한 변성제 및 환원제를 리폴딩 단계 전에 사용할 수 있다(예컨대, 요소, β-머캡토에탄올). 또 다른 산화환원 쌍을 리폴딩 중에 사용할 수 있는데, 예컨대, 시스타민/시스테아민 산화환원 쌍, DTT 또는 β-머캡토에탄올/대기 산소와, 환원형 및 산화형의 시스테인이 있다.
재조합 TCR 쇄는 TCR 도메인과 이량체화 펩티드 사이에 위치한 가요성 링커를 갖는 것이 바람직하다. 적합한 가요성 링커로는 글리신을 함유하는 표준 펩티드 링커, 예컨대, 글리신 및 세린을 함유하는 링커가 있다. 쇄간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기와 가까운 C-말단 절두체는 α쇄 및 β쇄가 세포의 TCR에서 이들 잔기를 통해 매우 근접하기 때문에 유용한 것으로 생각된다. 그러므로, 비교적 짧은 링커 서열만이 TCR 쇄로부터 헤테로이량체화 도메인으로 비변형성 전이를 제공하는 데 필요할 수 있다. 링커 서열 Pro-Gly-Gly 또는 Gly-Gly을 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 링커 서열은 변화시킬 수 있다. 예컨대, 링커는 완전히 생략하거나 또는 단일 잔기로 감소시킬 수 있으며, 이 경우에 바람직한 선택은 단일 글리신 잔기이다. 더 긴 링커 변이형 역시 α-β쇄 안정성의 계속적인 상실과 함께TCR의 세포외 도메인으로부터 이량체화 펩티드의 분리를 초래하는 프로테아제 공격으로부터 보호될 수 있다면, 가용성 TCR에서 허용될 가능성이 있다.
가용성 재조합 TCR은 반드시 α-βTCR인 것은 아니다. γ-δ, α-δ및 γ-βTCr 분자와 같은 분자들 뿐만 아니라, 불변 알파쇄(프리-TCR)를 보유하는 TCR 분자들도 발육 초기 단계에서만 발현되는 것으로서 포함된다. γ-δT 세포 수용체를 발현시키는 상기 세포들과 반대로 프리(pre)-TCR은 α-βT 세포 수용체를 발현시키는 세포 계통을 지정한다(Aifantis, Azogui 등, 1998; von Boehmer, Aifantis 등, 1998; Wurch, Biro 등, 1998). 프리-TCR은 세포를 α-βT 세포 계통에 맡기는 것으로 보이는 불변 프리-TCR α쇄와 쌍을 형성하면서 TCR β쇄와 함께 발현된다 (Saint Ruf, Ungewiss 등, 1994; Wilson and MacDonald, 1995). 그러므로, 프리-TCR은 흉선 발육 중에 중요한 것으로 생각된다(Ramiro, Trigueros 등, 1996).
적당한 경우에는 재조합 TCR에 대한 표준 변형을 수행할 수 있다. 그 예로는 β쇄의 불변 영역의 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기를 변형시켜 부정확한 쇄내 또는 쇄간 쌍 형성을 방지하는 것을 들 수 있다.
신호 펩티드는 성숙 수용체에서 또는 그 리간드 결합능에 대해 어떠한 목적도 수행하지 않기 때문에, 생략할 수 있고, 실제로 TCR이 리간드를 인지하는 것을 방지할 수 있다. 대부분의 경우에, 신호 펩티드가 성숙 TCR 쇄로부터 제거되는 절단 부위는 예측되나, 실험에 의해 측정된 것은 아니다. 발현되는 TCR 쇄가 N-말단부에서 적은 수, 예컨대, 최고 약 10개 전후의 아미노산의 길이를 갖도록 조작하는 것은 가용성 TCR의 기능에 중요하지 않다. 본래의 단백질 서열에 존재하지 않는 특정 조건을 부가할 수 있다. 예컨대, TCR 쇄의 정제를 보조할 수 있는 짧은 태그 서열은 이것이 정확한 구조 및 TCR의 항원 결합 부위의 폴딩을 방해하지 않는다면 첨가할 수 있다.
이. 콜리에서의 발현을 위해, 메티오닌 잔기를 예측된 성숙 단백질 서열의 N-말단 출발점 상으로 도입하여 해독을 개시할 수 있다.
TCR 쇄의 가변 도메인의 모든 잔기는 항원 특이성 및 기능에 필수적인 것은 아니다. 따라서, 항원 특이성 및 기능에 영향을 끼치지 않으면서, 상당수의 돌연변이를 이 영역에 도입할 수 있다.
대조적으로, 펩티드 항원 또는 HLA 중쇄 폴리펩티드에 대한 접촉부 형성에 관여하는 특정 잔기, 즉 TCR 쇄의 CDR 영역을 구성하는 잔기는 리간드에 대한 TCR의 친화도를 증가시키는 잔기를 대체할 수 있다. 그러한 치환은 펩티드-MHC 리간드에 대해 대부분의 TCR의 낮은 친화도를 제공하는 것으로서, 가용성 TCR의 특이성 및 기능 잠재력을 향상시키는 데 유용할 수 있다. 본원의 실시예에서는, 가용성 TCR의 펩티드-MHC 리간드에 대한 친화도를 측정한다. 그러한 측정치를 사용하여 TCR에 도입된 돌연변이의 효과를 분석할 수 있고, 따라서, TCR의 활성을 증가시키는 치환을 포함하는 TCR을 확인할 수도 있다.
TCR 쇄의 불변 도메인의 모든 잔기는 항원 특이성 및 기능에 필수적인 것은 아니다. 따라서, 항원 특이성에 영향을 끼치지 않으면서 상당수의 돌연변이를 그 영역에 도입할 수 있다. 하기 실시예 17에서, 본 발명자들은 TCR β쇄의 불변 도메인의 두 개의 아미노산 치환은 TCR이 HLA-펩티드 리간드에 결합하는 능력에 대해검출 가능한 결과를 가져오지 않았음을 나타냈다.
TCR β쇄는 세포 TCR 또는 천연 TCR에서 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기를 보유한다. 이 잔기의 돌연변이는 가용성 TCR의 시험관내 리폴딩의 효율을 증가시킨다. 상기 시스테인 잔기를 세린 또는 알라닌으로 치환하면, 시험관내 리폴딩 효율에 상당한 양의 효과를 가진다. 다른 아미노산으로 대체할 경우에, 유사한 양의 효과, 즉 훨씬 양호한 효과를 얻을 수 있다.
전술한 바와 같이, 천연 TCR에서 쇄간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기는 리폴딩 문제를 피하기 위해 존재하지 않는 것이 바람직하다. 그러나, 상기 시스테인 잔기의 배열은 TCR에서 자연적인 디자인이고, c-jun 및 c-fos 로이신 지퍼 도메인에 대한 상기 배열의 경우 작용하는 것으로 나타났기 때문에(O'Shea 등, 1989), 상기 시스테인 잔기는 TCR이 리폴딩될 수 있다면 포함될 수 있다.
불변 도메인이 펩티드-MHC 리간드와의 접촉에 직접 관여하지 않기 때문에, C-말단 절두점은 기능의 상실 없이 상당히 변화될 수 있다. 예컨대, 전체 불변 도메인을 배체하는 기능적 가용성 TCR을 생성시킬 수도 있어야 한다. 원칙적으로, 폴리펩티드는 더 짧을 수 있기 때문에, 가변 영역만을 포함하거나, 가변 영역과 불변 영역의 보다 짧은 단편만을 포함하는 가용성 TCR을 발현시키고 폴딩시키는 것이 더 간단하다. 그러나, 이 방법은 바람직하지 않다. 그 이유는 헤테로이량체화 도메인을 통해 α-β쇄 쌍 형성의 추가 안정성의 제공은 두 쇄의 조작된 C-말단이 긴 링커 서열을 필요로 하도록 약간의 거리로 이격되므로 복잡하기 때문이다. 쇄간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 위치 바로 앞에 헤테로이량체화 도메인을 융합시키는장점은 바람직하게도 α쇄 및 β쇄가 세포 수용체와 근접하여 유지된다는 것이다. 그러므로, 이 지점에서의 융합은 TCR 구조에 변형을 덜 부과하는 것 같다.
기능적인 가용성 TCR이 본원에서 바람직한 것보다 더 큰 불변 도메인 단편을 사용하여 생성될 수 있다. 즉, 상기 불변 도메인은 쇄간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 바로 앞에서 절두될 필요가 없다. 예컨대, 경막 도메인을 제외한 전체 불변 도메인이 포함될 수 있다. 이 경우에 세포 TCR의 쇄간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 돌연변이시키는 것이 유용하다.
헤테로이량체화 도메인을 통해 쇄간 안정성을 보조하는 것 외에도, 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기의 도입을 사용할 수 있다. 한 가지 가능성은 정상적인 이황화 결합이 일어날 수 있도록 시스테인 잔기를 제거하지 않으면서 쇄간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기에 가까운 α쇄 및 β쇄를 절두시키는 것이다. 또 다른 가능성은 α쇄 및 β쇄의 경막 도메인 만을 검출하는 것이다. α쇄 및 β쇄의 보다 짧은 단편이 발현되면, 시스테인 잔기는 두 쇄의 폴딩이 이황화 결합 형성에 적합한 근접 위치로 잔기를 유지하는 아미노산 위치에서 치환으로 도입될 수 있다.
TCR의 정제는 다수의 상이한 수단으로 수행할 수 있다. 이온 교환의 또 다른 방식을 이용하거나, 다른 단백질 정제 방식, 예컨대, 겔 여과 크로마토그래피 또는 친화도 크로마토그래피를 사용할 수 있다.
재조합 TCR을 생성시키는 방법에서, 폴딩 효율은 또한 특정의 기타 단백질 성분, 예컨대, 샤페론 단백질을 리폴딩 혼합물에 도입시킴으로써 증가시킬 수 있다. 증가된 리폴딩은 고정화된 미니-샤페론과 함께 칼럼을 통해 단백질을 통과시켜서 달성할 수 있다(Altamirano, Golbik 등, 1997; Altamirano, Garcia 등, 1999).
실시예에 기재한 방법 외에도, TCR을 비오티닐화하는 또 다른 수단이 가능하다. 예컨대, 화학적 비오티닐화 방법을 사용할 수 있다. 비오틴 태그 서열의 특정 아미노산이 필수적이지만, 또 다른 비오티닐화 태그를 사용할 수 있다(Schatz 등, 1993). 비오티닐화에 사용된 혼합물을 변화시킬 수도 있다. 효소는 Mg-ATP 및 낮은 이온 강도를 필요로 하지만, 이들 조건은 둘다 변화시킬 수 있다. 예컨대, 더 높은 이온 강도 및 더 긴 반응 시간을 사용할 수 있다. 아비딘 또는 스트렙타비딘 이외의 분자를 사용하여 TCR의 다량체를 형성할 수 있다. 다가 방식으로 비오틴을 결합시키는 임의의 분자가 적절하다. 한편, 킬레이트화된 니켈 이온에 대한 폴리히스티딘 태그와 같이 완전히 상이한 연결체를 고안할 수 있다 (Quiagen Product Guide 1999, 3장 "Protein Expression, Purification, Detection and Assay", p.35-37). 태그는 단백질의 C-말단을 향해 위치하여 잠재적 펩티드-MHC 복합체와의 상호 작용에서 입체적 간섭 정도를 최소화한다.
다가 TCR 복합체를 검출하기 위해, 예컨대, 진단 목적으로 검출 표지를 포함시킬 수도 있다. 적합한 표지는 다양한 공지의 검출 가능한 표지로부터 선택할 수 있다. 적합한 표지의 유형으로는 형광성 표지, 광활성화성 표지, 효소 표지, 에티토프 표지, 자기 표지 및 입자(예컨대, 금) 표지가 있다. 시험관내 사용에 특히 적합한 표지는 FITC와 같은 형광성 표지이다. 생체내 사용에 특히 적합한 표지로는 포유동물에 투여후의 외부 조영에 특히 적합한 표지, 예컨대, 연질 조직을 통과할수 있는 방사선을 방출하는 방사핵종이 있다. 표지는 임의의 적합한 부위에서 다가 TCR 복합체 내로 부착되거나 도입될 수 있다. 리포좀의 경우에, 표지는 막 내로 부착 또는 도입되거나 막 내부에 포함될 수 있다. 입자 또는 비드의 경우에, 표지는 입자 또는 비드 자체에 위치하거나 또는 외부에, 예컨대, T 세포 수용체 분자에 부착될 수 있다. 편리하게는, 표지는 T 세포 수용체 복합체가 형성되는 다가의 링커 분자에 부착된다. 비오티닐화된 헤테로이량체를 사용하여 형성된 사량체 TCR의 경우에는, 형광성 스트렙타비딘(시판됨)을 사용하여 검출 가능한 표지를 제공할 수 있다. 형광 표지된 사량체는 FACS 분석에 사용하기에, 예컨대, TCR이 특이적인 펩티드를 보유하는 항원 제공 세포의 검출에 적합하다.
다가의 TCR 복합체를 검출할 수 있는 또 다른 방식은 TCR-특이 항체, 특히 모노클론 항체를 사용하는 것이다. βFI 및 αFI와 같은 다수의 시판 항-TCR 항체가 있는데, 이들은 각각 β쇄 및 α쇄의 불변 영역을 인지한다.
치료 용도로, 본 발명에 따른 다가의 TCR 복합체 내로 치료제를 부착하거나 도입시킨다. 바람직한 양태에서, 치료용 다가 TCR 복합체는 T 세포 수용체로 코팅된 리포좀이고, 치료제는 리포좀 내에 포함된다. T 세포 수용체의 특이성은 리포좀 함유된 약물을 종양 또는 바이러스 감염 세포와 같은 목적 표적 부위로 위치시킬 수 있다. 이것은 다수의 상황에 유용하고, 특히 종양에 존재하는 모든 세포가 항원을 제공하지는 않으며, 그러므로, 모든 종양 세포가 면역계에 의해 검출되지는 않기 때문에 종양에 대해 유용하다. 다가 TCR 복합체의 경우, 화합물은 그 효과를 국부적으로 뿐만 아니라 그것이 결합하는 세포에도 나타내도록 전달할 수 있다. 따라서, 한 가지 특별한 방법은 종양 항원에 특이적인 T 세포 수용체를 포함하는 다가 TCR 복합체와 연합되거나 그 복합체에 결합된 항-종양 분자를 고려하는 것이다.
치료제는 예컨대, 세포 사멸에 사용하는 것과 같은 독성 부분이거나, 인터류킨 또는 시토킨과 같은 면역 자극제일 수 있다. 다수의 독소를 이 용도로 이용할 수 있는데, 예컨대, 방사성 화합물, 효소(예컨대, 퍼포린) 또는 화학 치료제(예. cis-플라틴)가 있다.
본 발명에 따른 다가 TCR 복합체의 한 가지 예는 3개의 TCR 분자와 하나의 퍼옥시다제 분자를 보유하는 사량체이다. 이것은 TCR과 효소를 3:1의 몰비로 혼합하여 사량체 복합체를 생성시키고, 정확한 비의 분자를 함유하지 않는 임의의 복합체로부터 목적 다량체를 분리함으로써 얻을 수 있다. 혼합된 분자는 입체적 간섭이 분자의 목적하는 기능을 손상시키거나 상당히 손상시키지 않는다면, 분자들의 어떠한 조합도 포함할 수 있다. 스트렙타비딘 분자 상에 결합 부위를 위치시키는 것이 입체적 간섭이 일어날 것 같지 않기 때문에 혼합된 사량체에 적합하다.
본 발명의 목적은 동일한 특이성을 가진 다수의 T 세포 수용체를 가진 다가의 TCR 복합체를 제공하는 것이지만, 상이한 특이성을 가진 T 세포 수용체가 존재할 가능성을 배제되지 않는다. 실제로, 두 개 이상의 상이한 MHC-펩티드 복합체를 한 번에 표적화할 가능성과 같은 T 세포 수용체의 2종 이상의 상이한 특이성을 갖는 데 유용할 수 있다. 그것은 예컨대, 상이한 HLA 유형을 가진 상이한 개체에서 표적 항원을 검출하는 데 유용할 수 있는데, 동일한 외래 항원이 HLA 유형에 따라 상이하게 처리되고 제시될 수 있기 때문이다.
유사하게, T 세포 수용체의 활성과 상이한 결합 활성을 가지는 분자를 포함시키는 것도 고려한다. 그러한 분자는 표적화능을 개선시키거나, 다가의 TCR 복합체가 일단 그 표적에 도달하면 유용한 기능을 수행할 수 있다. 유용한 보조 분자의 예로는 T 세포 수용체와 면역 조절 효과를 가진 수용체에 의한 MHC-펩티드 복합체의 인지를 지지하는 CD8을 포함한다.
본 발명에 따른 다가의 TCR 복합체에 적합한 MHC-펩티드 표적의 예로는 HTLV-1 에피토프(예컨대, HLA-A2에 의해 제한된 Tax 펩티드; HTLV-1은 백혈병과 관련됨), HIV 에피토프, EBV 에피토프, CMV 에피토프와 같은 바이러스 에피토프; 흑색종 에티토프 및 기타 암 특이적 에피토프; 및 류마티스 관절염과 같은 자가 면역 질환과 관련된 에피토프를 들 수 있으나, 이에 국한된 것은 아니다.
더 상세하게는 본 발명에 따른 T 세포 수용체로 코팅된 리포좀("인공 T 세포"로 언급될 수도 있음)을 다음과 같이 작제할 수 있다.
"인공 T 세포"의 생산
리포좀의 생산에는 다수의 방법이 존재한다. 가장 간단한 방법에서는, 건조한 인지질 피막을 부드럽게 또는 격렬하게 진탕하면서 과량의 용매 중에서 둥근 바닥 플라스크에 넣었다(Bangham 등, 1965). 다른 방법으로는 프렌치 프레스를 통해 MLV의 현탁액을 주입하거나(Barenholzt 등, 1979) 또는 지질의 세제에서의 용해에 의해 다층 소포(MLV)를 초음파 처리하는 방법(Huang, 1969)이 있다. 세제는 투석, 크로마토그래피, 흡착, 한외여과 또는 원심분리에 의해 제거할 수 있다(Brunner 등, 1976).
단백질을 리포좀 표면에 통상 변형된 지질을 통해 연결시키는 다수의 기법이 개시되어 있다. 그러한 한 가지 방법은 비오티닐화된 지질을 사용하는 것이다. 본원에서는 아비딘, 스트렙타비딘 또는 엑스트라비딘과 같은 것을 통해 비오티닐화된 지질에 연결시킬 수 있는 비오티닐화된 T 세포 수용체를 제조하는 방법을 기재한다. 또 다른 커플링 방법은 리포좀에의 항체의 부착용으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용하고(Hansen 등, 1995), S-숙신이미딜-S-티오아세테이트(SATA)를 사용하는 방법도 개시되어 있다(Konigsberg 등).
상기 기술은 크기 범위가 20~100 ㎚인 작은 단층의 소포를 제조한다. 안정성 문제로 인해, 그리고 보다 넓은 범위의 재료를 포함시키기 위해, 더 큰 단층 소포에 대한 제조 방법을 개발하였다. 그 예로는 탈수-재수화 리포좀(Tan and Gregoriadis, 1990), 역상 기화에 의해 제조된 소포(Szoka and Papahadjopoulos, 1978) 또는 동결-해동에 의한 압출법(Mayer 등, 1985)을 들 수 있다. 상기 방법을 사용하여 최고 65~80%의 캡슐화 효율을 얻을 수 있다.
초기 발견시에, 리포좀은 불안정하였으나, 근년에 그러한 문제는 지질 및 유도된 지질의 더 복잡한 형태를 사용하여 극복되었다(Allen, 1994 문헌 참조). 약물, 예컨대, 독소루비신(Ahmad and Allen, 1992; Ahmad 등, 1993), 단백질/항원 (Cohen 등, 1994; Cohen 등, 1991) 또는 인슐린(Edelman 등, 1996)의 포장은 확립된 기술로 간주될 수 있다.
리포좀에 연결된 TCR 다량체의 장점
이 기술에 대한 일반적 장점은 다음과 같이 요약할 수 있다:
-리포좀은 저렴하고, 제조하기가 용이하며, 표준 기법을 사용하여 적재하기가 용이하고, 다수의 치료용 화합물을 적재하기가 용이하다. 리포좀의 제조용 시약 (비오티닐화된 지질을 포함)은 예컨대, 아반티 폴라 리피즈 인코포레이티드(미국)에서 용이하게 입수 가능하다.
-리포좀 및 단백질은 생체에서 분해 가능하다.
-TCR 및 지질은 비면역원성이고, 그러므로, 2차 면역 반응을 유발할 것 같지는 않다.
"인공 T 세포"에 대한 장점
항원 제공 세포를 추적하는 능력과 이 목적으로 사용하는 용도 및 상기 세포로 화합물을 수송하는 용도로, 리포좀에 연결된 TCR 및 리포좀에 연결된 TCR 다량체는 TCR 사량체에 비해 다수의 장점을 가질 것으로 예측된다. 이들 장점은 다음과 같이 요약될 수 있다:
-리포좀에 연결된 TCR의 유리된 측방 운동은 TCR/MHC-펩티드 접촉을 간섭할 수 있는 어떠한 입체적 간섭도 방지한다. 실제로, 리포좀내 지질에 결합된 TCR의 측방 운동성은 T 세포막에서 운동하는 능력과 유사하다.
-리포좀의 표면에서의 유동성은 실제 세포의 막의 유동성과 유사하여 사량체 또는 기타 간단한 복합체로 얻을 수 있는 것보다 더 양호한 표면 접촉을 일으킬 가능성이 있다.
-다수의 TCR이 리포좀에 결합될 수 있고, 그러므로, 높은 화합력의 결합이 보장될 수 있다. TCR 사량체의 경우, 결합은 최대 4개의 TCR/MHC-펩티드 접촉에 의해 얻어지는 충분한 화합력에 의해 좌우된다.
-생체내 및 시험관내 사용의 경우, 리포좀에 연결된 TCR은 사량체 또는 기타 간단한 TCR 복합체의 경우보다 리포좀에 결합될 수 있는 TCR의 수가 훨씬 더 많기 때문에 TCR의 분해를 통한 기능의 상실이 더 적어지는 것 같다.
-지질 상의 TCR의 농도는 비오티닐화 지질 및 비-비오티닐화 지질을 다양한 비율로 혼합하여 조절할 수 있다. 유사하게, 단백질의 결합에 유용하게 하는 기타의 변형을 가진 지질, 예컨대, PEG-유도된 지질(Allen 등, 1995; Hansen 등, 1995) 또는 SATA-유도된 지질(Konigsberg 등, 1998)을 다양한 비율로 혼합할 수 있다. 이로 인해, 상호 작용 강도는 항원 제공 세포가 상이한 친화도로 TCR에 적응되도록 할 수 있는 정도가 되고, 항원 제공 세포 상의 펩티드 에피토프가 우세하게 된다.
-다수의 분자를 리포좀에 연결시키는 잠재력은 하나 이상의 TCR을 사용하여 다가의 MHC-펩티드 특이성을 가진 리포좀을 생성시킬 가능성을 제공한다. 예컨대, 동일한 질병과 관련된 상이한 에피토프에 특이적인 2개 이상의 TCR이 리포좀 상에 연결되어 질병이 발병되는 세포를 검출하기 위한 상기 다중 특이성을 제공한다는 것을 생각할 수 있다.
-유사하게, TCR은 항원 제공 세포 근처에서 다른 목적하는 기능을 수행하는 기타 분자 또는 단백질과 혼합할 수 있다. 예컨대, 시토킨 또는 시토킨 수용체, 특이 항체, 초항원, CD2, CD4, CD8 또는 CD28과 같은 보조수용체 또는 펩티드가 이와 관련하여 유용한 성질을 가질 수 있다. 이 성질은 특정 항원 제공 세포 가까이에 시약을 국부적으로 집중시키는 매우 광범위한 잠재력을 가질 수 있다.
다가 TCR 복합체로 표적할 수 있는 약물 및 질병의 예
많은 질병의 치료는 다가 TCR 복합체의 특이성을 통해 약물을 정위시킴으로써 유효하게 향상시킬 수 있으며, 특히 리포좀에 결합된 TCR을 사용하는 것이 유용하다.
해당 약물이 존재하는 바이러스 질병들, 예를 들면 HIV, SIV, EBV, CMV는 감염된 세포 근처에서 방출되는 약물로부터 이익을 얻게 된다. 암의 경우, 종양 또는 전이암 근처에 위치시키면 독소 또는 면역자극제의 효과를 향상시킨다. 자가면역 질병의 경우, 면역 억제 약물은 서서히 방출되어 장시간 동안 더욱 국부적인 효과를 나타내는 반면에 전체의 면역력에는 최소한의 영향을 미친다. 이식 거부반응 예방에 있어서, 동일한 방식으로 면역 억제 약물의 효과를 최적화할 수 있다. 백신 전달의 경우, 백신 항원은 전업 항원 제공 세포의 부근에 위치하여 항원의 효능을 향상시킬 수 있다. 이 방법은 또한 영상화 용도로도 이용될 수 있다.
본 발명의 각 측면의 바람직한 특징들은 필요한 변경을 가한 다른 측면들 각각에도 적용된다. 본 발명에서 언급한 선행기술의 문헌은 법이 허용하는 최대한의 범위 내에서 본 명세서에 참고 인용한다.
본 발명은 후술하는 실시예에 추가로 설명하지만, 이것이 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.
하기 실시예에서는 아래에 설명하는 일반적인 방법과 재료를 사용하였다.
재료
제한 효소(NdeI, BamHI, HinIII, Bsu36I, XmaI)는 뉴 잉글랜드 바이오랩스에서 입수하였다..
트리스 pH 8.1은 USB에서 입수한 트리스 염기와 트리스-HCl을 동일 부로 섞어 2 M 원액으로 제조하였다.
EDTA(시그마)는 0.5 M 원액을 만들어 5 M NaOH(시그마)를 이용하여 pH를 8.0으로 조정하였다.
산화 및 환원된 형태의 글루타티온은 시그마에서 입수하였다.
시스타민과 시스테아민은 시그마에서 입수하였다.
염화나트륨은 USB로부터 입수하여 4 M 원액을 제조하였다.
플라스미드 정제용 미니프렙 키트는 퀴아젠에서 입수하였다.
PCR 정제 키트는 퀴아겐에서 입수하였다.
DTT는 시그마에서 입수하였다.
구아니딘는 플루카에서 입수하였다.
우레아는 시그마에서 입수하였다.
RPMI 배지는 시그마에서 입수하였다.
PBS는 옥소이드에서 입수가능한 정제로부터 제조하였다.
글리세롤은 BDH에서 입수하였다.
일반적인 방법
박테리아 배지(TYP 배지)는 다음과 같이 제조하였다:
효모 추출물(디프코) 160 g, 트립톤(디프코) 160 g, NaCl(USB) 50 g 및 K2HPO4(BHD) 25 g을 2 L의 증류수에 용해시켰다. 이 용액의 200 ml 분액을 측정하여 10 ×2 L 원뿔형 플라스크에 넣고, 800 ml의 탈염수를 첨가하여 1 L로 채웠다. 플라스크는 알루미늄 호일 4층으로 덮어서 라벨을 붙이고 오트클레이브 처리하였다. 냉각시킨 후, 플라스크는 사용하기 전에 직사광선을 피해서 실온에서 보관하였다.
단백질 농도는 피어스 코싸미 결합 분석법과 표준 단백질로서 BSA를 이용하여 측정하였다. 요약하면, 4 ml 플라스틱 큐벳에 있는 2 mg/ml BSA(Pierce) 원액으로부터 1 ml 부피의 물 중 0 내지 25 ㎍의 BSA 표준물을 제조하였다. 미지의 단백질 약 10 ㎍을 동일한 방법으로 1 ml가 되도록 물로 채웠다. 1 ml의 피어스 코싸미 시약을 각각의 큐벳에 첨가하여 내용물을 철저히 혼합하였다. 광학 밀도는 벡크만DU-530 자외선 분광광도계를 이용하여 15분 내로 595 nm에서 측정하였다. BSA 표준물로부터 얻은 결과에 대해 선형 회귀를 수행하고(선형도는 BSA 25 ㎍까지 우수하다) 미지의 단백질 농도는 이러한 결과를 내삽법을 통해 추정하였다.
겔 여과 크로마토그래피는 컴퓨터 제어기가 장착된 파마시아 FPLC 시스템으로 수행하였다. 단백질의 용출은 280 nm의 파장에서 흡광도를 측정하는 UV-M II 시스템을 이용하여 모니터하였다. 작은 양을 분리할 경우에는 슈퍼덱스 200 HR 10/30 컬럼을 이용하였고, 1 ml의 루프를 이용하여 시료를 적재하였다. 컬럼을 전개시키기 전에 30 ml의 PBS로 평형화시켰으며, 시료는 수집한 1 ml의 분획을 0.5 ml/분의 유속으로 흐르게 하였다. 대규모 분리시 슈퍼덱스 75 또는 200 PG 26/60 컬럼을 10 ml의 슈퍼 루프와 함께 이용하였다. 이 경우에는 5 내지 10 ml의 시료가 모아졌고 컬럼은 4 ml/분의 유속으로 흐르게 하였다. 모든 분리는 실온에서 수행하였다.
이온 교환 크로마토그래피는 바이오카드 스프린트 시스템(퍼킨 엘머)에서 수행하였다. 양이온 교환을 위해서는, 20 HS 또는 50 HS 컬럼을 이용하였다. 음이온 교환을 위해서는 10 HQ, 20 HQ 또는 50 HQ 컬럼을 이용하였다. 컬럼은 6-웨이 혼합기를 부착한 권장되는 완충액을 이용하여 조작하였다. 작은 시료(5 내지 25 ml)는 5 ml의 주입 루프를 이용하여 주입하였다. 더 큰 시료(> 100 ml)는 완충액 라인 중 하나를 이용하여 주입하였다. 컬럼이 작동하는 용출 단계 동안 1 ml의 분획이 모아졌다. 단백질 용출물은 280 nm에서 흡광도를 인라인 방식으로 측정하였다.
SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)은 바이오라드 미니-프로틴 II 겔 세트를 이용하여 수행하였다. 겔을 부은 다음 다음의 절차를 이용하여 사용하였다. 겔 평판 조립체를 제조하여 누출이 없는 지를 확인하였다. 그 다음, 하기 혼합물을 준비하였다: 12% 아크릴아미드/비스아크릴아미드(30% 아크릴아미드/0.8% 비스아크릴아미드 원액(내쇼날 다이아그노스틱스)로부터 제조), 0.375 M 트리스 pH 8.8(동일한 pH의 1.5 M 원액으로부터 제조), 0.1% SDS(10% SDS 원액으로 제조), 0.05% 암모늄 퍼설페이트(동일한 10% 원액으로 제조. 4℃에서 보관) 및 0.1% TEMED(시그마). 혼합물은 즉시 겔 평판 조립체에 부었고, 물-포화된 부탄올을 겔상부에 적층하여 윗면이 평평하게 되도록 하였다. 겔이 굳은 후(최소 10 내지 15분), 스택(stack) 겔을 다음과 같이 혼합하였다. 4% 아크릴아미드(상기 원액으로 제조), 0.125 M 트리스 pH 6.8(동일한 pH의 0.5 M 원액으로 제조), 0.1% SDS, 0.05% 암모늄 퍼설페이트 및 0.2 % TEMED. 분해 겔의 표면으로부터 휴지를 이용해서 부탄올을 흡수 제거하고 스택 겔 혼합물을 분해 겔 위에 부었다. 겔 내로 기포가 들어가지 않도록 주의하면서 겔 소면기를 즉시 삽입하고, 스택 겔은 최소한 5분 이상 두어 경화시켰다.
그 후, 겔을 겔 장치에 넣어 조립하였고, 전개 완충액(3 g/L 트리스-염기, 14.4 g/L 글리신, 1g/L SDS(10배 농축된 원액으로부터 희석함))을 양극과 음극에서 장치에 부었다. 겔 소면기를 제거한 후, 웰은 전개 완충액으로 세척하여 잔여 아크릴아미드 혼합물이 웰 바닥에 침전되지 않게 하였다. 시료는 단백질과 하기 혼합물을 1:1로 섞어서 제조하였다.: 4% SDS, 0.125 M 트리스 pH 6.8, 20% 글리세롤, 10% β-머캅토에탄올, 1% 브로모페놀 블루(시그마). 그 후, 시료를 95℃로 2분 동안 가열한 다음, 냉각시켜서 스택 겔내 웰의 25 ㎕까지 적재하였다. 일반적으로 약 1 내지 10 ㎍의 단백질을 적재하는 것이 겔의 염색 및 전개에 적합하다. 적재 후에 겔은 200V의 일정한 전압으로 약 40분 동안 전개시키거나 또는 브로모페놀 블루 염료가 겔 끝에서 약 5 mm 위로 진행할 때까지 전개하였다.
전기영동이 끝난 후에 겔을 장치로부터 제거하여 아세트산 10%, 메탄올 40%, 물 50% 중 코싸미 R-250(시그마) 0.1% 용액에 조심스럽게 적하하였다. 그런 다음, 겔을 30분 이상 동안 부드럽게 교반하고, 아세트산 10%, 메탄올 40%, 물 50%의 용액을 수회 바꾸어서 겔의 배경이 선명해질 때까지 탈염색하였다. 그 후, 겔은 물에서 보관하였고, 광상자, 디지털 카메라 및 열 프린터로 구성된 UVP 겔 문서화 시스템을 이용하여 기록하였다.
실시예 1
재조합 가용성 TCR
헤테로이량체 TCR 분자의 재조합 가용성 형태는 도 1에 요약된 바와 같이 공학적으로 처리하였다. 각 쇄는 헤테로이량체의 안정화를 보조하는 감겨진 코일 모티프에 짧은 가요성 링커를 통해 융합된 막 말단 면역글로불린 도메인 및 막 기부 면역글로불린 도메인으로 구성된다.
TCR 불변 도메인은 생체내에서 사슬간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기 바로 앞에서 절두되어 있다. 결과적으로, 2개의 사슬은 비공유 4차 접촉에 의해서 쌍을 이루고, 이는 도 2b에서 확인할 수 있다. Fos-Jun 지퍼 펩티드 헤테로이량체는 사용된 링커에 대해 바로 N-말단에 사슬간 이황화 결합을 형성할 수 있기 때문에(O'Shea 등, 1989), 서로에 대한 2개 사슬의 정렬은 최적인 것으로 추정하였다. 융합 단백질은 별도의 성분 각각에 대해 적합한 방식으로 연결시켜, 구조를 방해하는 일이 없도록 하여야 한다.
HLA-A2에서 인플루엔자 매트릭스 단백질 58-66 에피토프에 특이적인 TCR의 알파쇄 및 베타쇄를 암호화하는 cDNA는 전술한 바와 같이 고착된 PCR에 의해 Vβ17+ 인간 CTL 클론(JM22)으로부터 얻었다(Moss 등, 1991).
알파 및 베타 TCR 지퍼 작제물인 pJM22α-Jun 및 pJM22β-Fos는 표준 PCR 기법을 사용하여 각 쇄의 가변 도메인 및 불변 도메인을 증폭시키고, 진핵세포 전사 인자인 Jun 및 Fos 각각으로부터 로이신 지퍼 도메인상에 생성물을 스플라이싱하여 별도로 작제하였다(도 1 참조). 이들 40개의 아미노산 길이 서열은 합성 펩티드로부터 리폴딩되는 경우 특이적으로 헤테로이량체화되지만, 사슬간 공유 결합은 필요하지 않은 것으로 밝혀졌다(O'Shea 등, 1989).
프라이머는 개시 코돈에 대한 바로 인접한 3'에 AT를 고함량으로 도입하도록 고안하고(mRNA 2차 구조를 탈안정화시킴), 이.콜리 코돈을 선택하여 발현을 최대화하였다(Gao 등). TCR 베타 불변 도메인에서 여분의 시스테인을 세린으로 돌연변이시켜 리폴딩 과정에서 부정확한 이황화 결합을 방지한다.
DNA 작제물은 이.콜리 발현 벡터 pGMT7내로 따로 결찰시켰다. 플라스미드 분해 및 DNA 서열 결정으로 작제물이 정확함을 확인하였다.
사용된 절차를 하기에 상세히 설명하였다.
TCR 지퍼쇄의 발현 및 변성된 봉입체의 정제: 각각 JM22α-Jun 및 JM22β-Fos를 함유하는 pGMT7 발현 플라스미드인 GFG020 및 GFG021을 이.콜리 균주BL21pLysS내로 별도로 형질전환시키고, 단일 앰피실린 내성 콜로니를 TYP(앰피실린 100 ㎍/㎖) 배지 중 37℃에서 OD6000.4로 증식시킨 다음 0.5 mM IPTG로 단백질 발현을 유도하였다. 벡크만 J-6B내 4000 rpm에서 30 분 동안 원심분리로 3시간 후-유도 세포를 수거하였다. 세포 펠렛은 50 mM 트리스-HCl, 25%(w/v) 수크로즈, 1 mM NaEDTA, 0.1%(w/v) Na아지드, 10 mM DTT, pH8.0을 함유하는 완충액내에서 재현탁시켰다. 밤새 냉동-해동 단계를 수행한 후, 표준 12 mm 직경 프로브를 사용하여 밀소닉 XL2020 초음파기내에서 초음파 처리로 1분간 파열시키는 과정을 총 약 10분 동안 수행하는 방식으로 재현탁된 세포를 초음파 처리하였다. 봉입체 펠렛은 벡크만 J2-21 원심분리로 13000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 회수하였다. 3종의 세정제 세척을 수행하여 세포 파편 및 막 성분을 제거하였다. 각 회에서 봉입체 펠렛은 트리톤 완충액(50 mM 트리스-HCL, 0.5% 트리톤-X100, 200 mM NaCl, 10 mM NaEDTA, 0.1%(w/v) Na아지드, 2 mM DTT, pH 8.0)내에서 균질화시킨 다음, 벡크만 J2-21내에서 13000 rpm으로 15분 동안 원심분리하여 펠렛화하였다. 세정제 및 염을 완충액(50 mM 트리스-HCl, 1 mM NaEDTA, 0.1%(w/v) Na아지드, 2 mM DTT, pH 8.0)에서 유사한 세척 과정으로 제거하였다. 마지막으로, JM22α-Jun 및 JM22β-Fos 봉입체 펠렛을 3∼4 시간 동안 4℃에서 우레아 용액(50 mM MES, 8M 우레아, 10 mM NaEDTA, 2 mM DTT, pH 6.5)에 별도로 용해시켰다. 불용성 물질은 벡크만 J2-21에서 13000 rpm으로 30분 동안 원심분리하여 펠렛화하고, 상청액은 1 ㎖의 분액으로 나누어 -70℃에서 냉동시켰다. 우레아내에 용해된 봉입체는 브래드포드 염료 결합 분석(바이오라드)으로 정량하였다. 각 사슬에 대하여, 배양물 1 ℓ로부터 정제된 봉입체를 약 100 ㎎의 수율로 얻었다. 각 봉입체(JM22α-Jun, JM22β-Fos)는 약 20 ㎎/㎖의 농도로 우레아 용액에 용해시키고, 겔 분석 결과 이 형태에서 약 90% 순수한 것으로 추정하였다(데이타는 제시하지 않음).
TCR 지퍼 융합 단백질의 동시리폴딩:
표준 리폴딩 완충액(100 mM 트리스 pH 8.5, 1M L-아르기닌, 2mM EDTA, 5 mM 환원된 글루타티온, 0.5 mM 산화된 글루타티온, 0.2 mM PMSF)를 사용하여 초기 리폴딩 실험 결과 일부 단백질 침전물이 생겼으며, 이는 지퍼 도메인의 존재로 인한 것이었다. 이러한 현상이 지퍼 이량체화의 해리 상수 이하의 농도에서 발생하였다는 사실(즉, 대부분의 지퍼 나선형이 단량체인 것으로 추정되는 경우)은 추가의 힘이 잘못 폴딩된 종을 안정화시킨다는 것을 제시하였다. 가장 그럴 듯한 설명은, 완전한 알파 나선형 지퍼 도메인이 먼저 폴딩하고, 그의 일시적인 헤테로이량체화가 더욱 복잡한 면역글로불린 도메인의 부분적으로 폴딩된 중간체의 사슬간 응집을 유도한다는 것이다. 따라서, 리폴딩 완충액은 5M 우레아를 포함하도록 변경하여 부분적으로 폴딩된 면역글로불린 도메인간의 소수성 상호작용을 방지하고, 헤테로이량체화 되기 전에 개개 사슬이 완전히 폴딩되도록 하였다. 이 단계는 침전 발생을 억제하는 데 충분하며, 하기 프로토콜을 사용하여 허용가능한 수율로 정확하게 폴딩된 TCR 지퍼 헤테로이량체를 조립할 수 있다.
TCR 지퍼쇄인 JM22α-Jun 및 JM22β-Fos의 우레아 용해된 원료를 희석 동시 리폴딩으로 재생시켰다. 대략 30 mg(즉, 1 μM)의 각 용해된 봉입체 사슬을 냉동 원료로부터 해동시키고, DTT의 추가 펄스(4 μM/㎖)를 첨가하여 시스테인 잔기를완전히 환원시켰다. 그 다음 시료를 혼합하고, 혼합물을 구아니딘 용액(6M 구아니딘-염화수소, 10 mM 아세트산나트륨, 10 mM EDTA) 15 ㎖내로 희석하여 완전히 사슬 변성시켰다. 완전히 환원되고 변성된 TCR-지퍼쇄를 함유하는 구아니딘 용액을 리폴딩 완충액(100 mM 트리스, pH 8.5, 400 mM L-아르기닌, 2 mM EDTA, 5 mM 환원된 글루타티온, 0.5 mM 산화된 글루타티온, 5M 우레아, 0.2 mM PMSF) 1ℓ에 주입하였다. 용액을 24시간 동안 방치하였다. 그 다음 리폴딩물을 2회 투석하는데, 처음에는 100 mM 우레아 10 ℓ에 대해 투석하고, 두 번째는 100 mM 우레아, 10 mM 트리스 pH 8.0 10 ℓ에 대해 투석하였다. 리폴딩 및 투석 단계는 6∼8℃에서 수행하였다.
리폴딩된 TCR-지퍼의 정제
TCR 지퍼 JM22zip는 7개의 200 ㎖ 분액내 POROS 10HQ 분석적 음이온 교환 컬럼상에 투석된 리폴딩물을 적재하고 바이오카드 워크스테이션(퍼셉티브 바이오시스템스) 상에 0∼400 mM NaCl 구배로 결합 단백질을 용출시켜 분해 생성물 및 불순물로부터 분리하였다. 비공유적으로 연합된 헤테로이량체는 대략 100 mM NaCl에서 단일 피크로 용출되었다. 피크 분획물(통상적으로 100∼300 ㎍/㎖의 농도로 헤테로이량체를 포함)을 4℃에서 저장한 다음 모아서 농축시켰다. 헤테로이량체의 수율은 약 15%이다.
리폴딩된 TCR-지퍼 JM22zip의 특성화
음이온 교환으로 정제된 JM22zip 헤테로 이량체는 슈퍼덱스 200 겔 여과 크기별 컬럼(파마시아)으로부터 대략 70 kDa 단백질로서 용출된다. 정확한 친화도 및 역학 측정은 단량체 상호작용의 발생에 좌우되기 때문에, 표면 플라스몬 공명 결합분석 전에 겔 여과 단계를 포함하는 것이 실질적으로 중요하다. 이러한 방식으로, 더 높은 차수의 응집물은 분석에 사용되는 가용성 단백질 분획으로부터 배제할 수 있다. 특히, 응집물은 인위적으로 느린 결합 및 해리 속도 상수를 검출할 수 있다.
각 사슬의 산화 상태는 도 2의 환원/비환원 겔 분석으로 검사하였다. SDS의 존재하에, 비공유적으로 결합된 헤테로이량체를 알파쇄 및 베타쇄로 해리한다. DTT가 적재 완충액에 사용되는 경우, 2개의 사슬은 31 kD 마커의 어느 한 측면을 통과한다. 이러한 변성제의 부재하에, 양 사슬은 단일 종으로서 행동하지만, 각각의 이동성은 증가하는데, 이는 각 사슬이 단일의 이황화 결합된 종을 형성한다는 것을 제안한다(Garboczi 등, 1996).
리폴딩된 수용체의 항체 반응성은 바이아코어 2000 머신(바이어코어)상에 표면 플라스몬 공명을 사용하여 시험하였다. TCR 지퍼 JM22z은 표준 아민 커플링 방법을 사용하여 pH5.5에서 덱스트란 매트릭스(CM 칩) 결합 표면에 고정시켰다. 베타쇄(Vβ17)에 특이적인 가변부 항체는 고정된 수용체에 특이적으로 결합하는데, 이는 보정된 형태임을 제시하는 것이다.
안정성:
알파-jun 및 베타-fos 로이신 지퍼 융합체로서 발현되는 가용성 TCR은 수 개월 동안 안정하고, 따라서 클래스 I MHC가 제공하는 특이적 항체의 검출에 적절하다.
실시예 2
인간 TCR 바이러스 펩티드 MHC의 역학 및 친화도 연구
펩티드-HMC 복합체에 대한 리폴딩된 TCR-지퍼의 특이적 결합
표면 플라스몬 공명 바이오센서(바이아코어)를 사용하여 TCR-지퍼(JM22zip, HLA-A2 인플루엔자 매트릭스 단백질 M58-66 복합체에 대해 특이적)의 펩티드-MHC 리간드에 대한 결합을 분석하였다(도 3 참조). 본 발명자들은 세미 배향 방식으로 스트렙타비딘 코팅된 결합 표면에 고정할 수 있는 단일 pMHC 복합체(후술)를 생성함으로써 상기 결합을 용이하게 하였으며, 이로서 가용성 T 세포 수용체가 최대 4개의 상이한 pMHC(별도의 유동 세포상에 고정됨)에 동시에 결합하는지를 효과적으로 시험할 수 있게 되었다. HLA 복합체의 수동 주입은 고정된 클래스 I 분자의 정확한 레벨을 쉽게 조작할 수 있다.
이러한 고정된 복합체는 T-세포 수용체(도 3 참조) 및 공동 수용체 CD 8αα를 결합시킬 수 있으며, 이들 양 수용체는 가용성 상으로 주입할 수 있다. TCR-지퍼의 특이적 결합은 낮은 농도(40 ㎍/㎖ 이상)에서도 얻어지는데, 이는 TCR 지퍼가 비교적 안정하다는 것을 의미한다. JM22z의 pMHC 결합 특성은, TCR을 가용성 또는 고정된 상에서 사용한 경우 정량적 및 정성적으로 유사하게 관찰된다. 이는 가용성 종의 부분 활성에 대한 중요한 제어 인자이며, 비오티닐화된 pMHC 복합체가 비오티닐화되지 않은 복합체과 생물학적으로 유사하게 활성이 있음을 제시한다.
화학적으로 비오티닐화된 HLA 복합체의 제조
가용성 재조합 단일 펩티드 클래스 I HLA 복합체의 제조 방법은 이미 기술하였다(Garboczi 등, 1992). 이들을 변형시켜 화학적으로 비오티닐화된 β-2-마이크로글로불린 도메인을 보유하는 HLA 복합체를 생성할 수 있으며, 따라서 스트렙타비딘 코팅된 결합 칩에 고정시키고 표면 플라스몬 결합 연구를 위해 사용할 수 있다.
전술한 바와 거의 유사하게 β-2 마이크로글로불린이 발현되고, 40 mg은 표준 리폴딩 완충액(100 mM 트리스 pH 8.0, 400 mM L-아르기닌, 2 mM EDTA, 5mM 환원된 글루타티돈, 0.5 mM 산화된 글루타티온, 0.1 mM PMSF) 중에서 리폴딩되었다(Garboczi 등, 1992). 필요에 따라 겔 여과 단계를 수행한 후, 단백질을 0.1 M 나트륨 보레이트 pH8.8과 교환하고, 마지막으로 5∼10 ㎎/㎖로 농축하였다. β-2 마이크로글로불린은 브래드포드 분석(바이오라드)을 사용하여 정량하였다. 5 몰 과량의 비오틴 히드록시숙신이미드(시그마)는 DMSO 중 10 ㎎/㎖로 구성된 원료로부터 첨가하였다. 반응을 실온에서 1 시간 동안 정치시키고, 사용된 비오틴 에스테르 250 ㎍ 당 1 M 염화암모늄 20 ㎕로 반응을 종결하였다. 리폴딩된 HLA 복합체는 슈퍼덱스 ×200 겔 여과 크기별 컬럼(파마시아)을 사용하여 유리 비오틴 및 유리 비오티닐화된 베타-2-마이크로글로불린으로부터 분리하였다. 스트렙타비딘은 표준 아민 커플링 방법으로 고정하였다.
결론
따라서, 실시예 1에 개시된 단백질 리폴딩 방법으로 안정하고 정확하게 폴딩된 기능성 재조합 수용체 융합 단백질을 산출하였으며, 이 단백질은 광학 바이오센서를 사용한 생체물리학적 분석에 적합하다. 이는 인간 TCR-pMHC 상호작용의 정밀한 친화도 및 역학 분석을 수행하는데 사용되는 시약을 제공하였다. T 세포 공동 수용체-MHC 및 TCR-pMHC 상호작용의 서로에 대한 영향을 연구하였다. 사용된 재조합 기법은 원칙적으로, 클래스 I 및 클래스 II 제한된 쥐 및 인간 TCR에 이용할 수있으며, TCR의 범위를 유사하게 분석할 수 있다. 이는 각종 문제, 예컨대 항바이러스 반응내 TCR 친화도의 스팬, 우선적으로 선별되는 수용체의 특성, 수용체 촉발에 필요한 역학 조건을 해결할 수 있다. 또한 이 방법은 결정화 시도 전에 TCR의 리간드 특이성을 입증하는 방법을 제공하며, 기타 세포 표면 수용체의 재조합체 생성과 관련이 있을 수 있다.
실시예 3
가용성 T 세포 수용체의 비오티닐화 및 사량체화
실시예 1에 개시된 바와 같이 제조된 정제된 가용성 TCR 2.5 ㎖(∼0.2 ㎎/㎖)는 PD-10 컬럼(파마시아)을 사용하여 비오티닐화 반응 완충액(10 mM 트리스 pH 8.0, 5 mM NaCl, 7.5 mM MgCl2)내에서 완충액 교환하였다. 센트리콘 농축기(아미콘)를 사용하고 10 kDa 분자량 컷오프로 이 용출물(3.5 ㎖)을 1 ㎖로 농축하였다. 이는 원료로부터 ATP 첨가한 5 mM로 구성하였다(pH 7.0으로 조정된 0.1 g/㎖). 프로테아제 억제제의 칵테일, 류펩틴, 펩스타틴 및 PMSF(0.1 mM)를 첨가한 다음 1 mM 비오틴(0.2 M 원료로부터 첨가됨) 및 5 ㎍/㎖ 효소(0.5 ㎎/㎖ 원료)를 첨가하였다. 그 다음 혼합물을 실온에서 밤새 항온배양하였다. 과량의 비오틴은 10 mM 트리스 pH8.0, 5 mM NaCl(200 부피, 4℃에서 2회 교체)에 대해 투석하여 용액으로부터 제거하였다. 단백질은 니트로셀룰로스 상에 블롯팅한 다음 5% 탈지유 분말로 차단하여 결합된 비오틴의 존재에 대해 시험하고, 스트렙타비딘-HRP 접합체(바이오라드)를 사용하여 검출하였다. 비오티닐화된 가용성 TCR의 사량체화는 엡스트라비딘-RPE 또는 엑스트라비딘-FITC 접합체(시그마)를 사용하였다. 비오틴 가용성 TCR의 농도는 코싸미 결합 단백질 분석(피어스)을 사용하여 측정하고, 가용성 TCR에 대한 엑스트라비딘 접합체의 비율이 0.024 ㎎/㎎ TCR임을 계산하여 1:4의 비율에서 비오티닐화된 TCR에 의한 엑스트라비딘의 포화를 달성하였다. 엑스트라비딘 접합체를 얼음상에서 총량의 1/10의 분액으로 첨가하였으며, 분액당 15분 이상 동안 첨가하였다(엑스트라비딘을 포화시킴). 가용성 TCR 사량체를 4℃, 암실에서 보관하였다. 사량체는 수 개월 동안 상당히 안정하다.
실시예 4
가용성 α/β TCR의 발현, 리폴딩 및 부위 특이적 비오티닐화
a) TCR α쇄 및 β쇄의 공학적 처리
헤테로이량체 TCR 분자의 재조합 가용성 형태는 도 7에 요약되어 있는 바와 같이 공학적으로 처리하였다. 각 사슬은 막 말단 및 막 기부 면역글로불린 도메인으로 구성되어 있으며, 이들 도메인은 헤테로이량체의 안정화를 보조하는 감겨진 코일 모티프에 짧은 가요성 링커를 통해 융합된다.
도 4 내지 도 6과 도 11 내지 도 14는 상이한 특이성을 보유한 각종 TCR 알파쇄 및 베타쇄에 대한 DNA 암호화 서열 및 해당 아미노산 서열을 도시한다. TCR 상에 본 실시예의 농축물은 도 4 내지 도 6의 서열에 의해 제시되지만 개시된 방법은 도 11 내지 도 14에 제공된 TCR을 이용하여 유사하게 수행할 수 있다.
TCR 불변 도메인은 생체내에서 사슬간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기 바로 앞에서 절두시켰다. 결과적으로, 2개의 사슬은 비공유 4차 접촉에 의해서 쌍을 형성한다. Fos-Jun 지퍼 펩티드 헤테로이량체는 사용된 링커에 대해 바로 N-말단에 사슬간 이황화 결합을 형성할 수 있기 때문에(O'Shea 등, 1989), 서로에 대한 2개 사슬의 정렬은 최적인 것으로 추정하였다. 융합 단백질은 별도의 성분 각각에 대해 적합한 방식으로 연결시켜, 구조를 방해하는 일이 없도록 하여야 한다.
HLA-A2에서 인플루엔자 매트릭스 단백질 58-66 에피토프에 대해 특이적인 TCR의 알파쇄 및 베타쇄를 암호화하는 cDNA는 전술한 바와 같이 고착된 PCR에 의해 Vβ17+ 인간 CTL 클론(JM22)으로부터 얻었다(Moss 등, 1991).
알파 및 베타 TCR 지퍼 작제물인 pJM22α-Jun 및 pJM22β-Fos는 표준 PCR 기법을 사용하여 각 쇄의 가변 도메인 및 불변 도메인을 증폭시키고, 진핵세포 전사 인자인 Jun 및 Fos 각각으로부터 로이신 지퍼 도메인상에 생성물을 스플라이싱하여 별도로 작제하였다. 이들 40개의 아미노산 길이 서열은 합성 펩티드로부터 리폴딩되는 경우 특이적으로 헤테로이량체화되지만, 사슬간 공유 결합은 필요하지 않은 것으로 밝혀졌다(O'Shea 등, 1989).
프라이머는 개시 코돈에 대한 바로 인접한 3'에 AT를 고함량으로 도입하도록 고안하고(mRNA 2차 구조를 탈안정화시킴), 이.콜리 코돈을 선택하여 발현을 최대화하였다(Gao 등, 1998). TCR 베타 불변 도메인에서 여분의 시스테인을 세린으로 돌연변이시켜 리폴딩 과정에서 부정확한 이황화 결합을 방지하였다.
융합된 DNA 및 단백질 서열은 도 4 및 도 5에 제시되어 있다. 이 TCR의 β쇄의 부위 특이적 비오티닐화를 가능하게 하기 위해서, 소위 말하는 "비오틴 태그"를 암호화하는 DNA 서열을 가용성 Vβ17을 발현하는 유전자의 3' 말단으로 공학적으로 처리하였다. 하기 PCR 프라이머는 DNA 작제물을 공학적으로 처리하는데 사용하였다.
5'-GCTCTAGACATATGGGCCCAGTGGATTCTGGAGTCAC-3'
및
5'-GGGGGAAGCTTAATGCCATTCGATTTTCTGAGCTTCAAAAATATCGTT
CAGACCACCACCGGATCCGTAAGCTGCCAGGATGAACTCTAG-3'
생성 PCR 생성물은 제한 효소 NdeI 및 HindIII(뉴잉글랜드 바이오랩스)로 분해하고, T4 DNA 리가제(뉴잉글랜드 바이오랩스)를 사용하여 벡터 pGMT7(Studier 등, 1990)로 결찰시켰다. 도 6은 이 작제물내 삽입체의 DNA 서열 및 추론된 단백질 서열을 도시한다.
b) TCR 쇄의 발현
HLA-A*0201이 제공하는 인플루엔자 바이러스 매트릭스 펩티드에 대한 특이성이 있는 TCR의 발현 및 리폴딩은 다음과 같이 수행하였다.
TCRα쇄 및 β쇄는 TYP 배지(1.6% 박토-트립톤, 1.6% 효모 추출물, 0.5% NaCl, 0.25% K2HPO4)내 벡터 pGMT7의 제어하에 이.콜리 균주 BL21DE3pLysS내에서 별도로 발현시켰다. 발현은 0.5 mM IPTG로 중간 대수증식기에서 유도하고, 3∼5 시간 후에, 박테리아를 원심분리로 수거하였다. 박테리아 세포는 "용해 완충액"(10 mM EDTA, 2 mM DTT, 10 mM 트리스 pH 8, 150 mM NaCl, 0.5 mM PMSF, 0.1 ㎎/㎖ 리소자임, 10% 글리세롤)내에 재현탁시킨 다음, 10 mM MgCl2및 20 ㎍/㎖ DNaseI을 첨가하고, 얼음상에서 20분 동안 항온처리한 다음 30 초 동안 10 ×파열로 프로브 초음파기를 사용하여 초음파 처리하여 세포 용해시켰다. 봉입체내 단백질은, 봉입체를 펠렛화시키기 위한 20 분 동안 15,000 rpm에서의 원심분리 및 이들을 재현탁시키기 위한 "dounce" 균질기를 사용하여 "트리톤 완충액'(0.5% 트리톤 X-100, 50 mM 트리스 pH 8, 100 mM NaCl, 0.1% 나트륨 아지드, 10 mM EDTA, 2 mM DTT)으로 수회 세척(일반적으로 3회)하여 정제하였다.
세제는 50 mM 트리스 pH 8, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2mM DTT의 단일 세척액으로 제제로부터 제거하고, 단백질은 "우레아 완충액"(20 mM 트리스 pH 8, 8M 우레아, 10% 글리세롤, 500 mM NaCl, 500 mM EDTA, 2 mM DTT)으로 안정화시켰다. 밤새 4℃에서 상하 혼합한 후에, 용액을 원심분리로 맑게하고, 용해된 단백질을 -70℃에서 저장하였다. 단백질 농도는 코싸미 결합 분석(피어스)으로 측정하였다.
c) TCR의 리폴딩
동비율의 우레아 용해된 단백질은 37℃에서 "구아니딘 완충액"(6M 구아니딘-HCl, 10 mM 아세트산나트륨 pH5.5, 10 mM EDTA, 2 mM DTT) 중에서 추가로 변성시켰다. 이 용액은 급속한 혼합을 유지하면서 얼음 위에서 리폴딩 완충액(5M 우레아, 100 mM 트리스 pH 8, 400 mM L-아르기닌, 5 mM 환원된 글루타티온, 0.5 mM 산화된 글루타티온, 0.1 mM PMSF)에 첨가하였다. 4℃에서 >12 시간 후에, 용액을 10 부피의 물에 대해 투석한 다음 10 부피의 10 mM 트리스 pH 8, 100 mM 우레아에 대해 투석하였다. 프로테아제 억제제 PMSF를 모든 단계에서 첨가하여 TCR 상의 비오티닐화 태그의 단백질 분해 손실을 최소화하였다.
d) TCR의 정제
TCR의 묽은 용액을 0.45 미크론 필터를 통해 여과시켜 응집된 단백질을 제거한 다음 POROS 10HQ 컬럼상에 적재하였다. 리폴딩된 TCR을 10 mM 트리스 pH 8 중 염화나트륨 구배로 용출시키고, 1 ㎖ 분획을 수거하고 SDS-PAGE로 분석하였다. TCR을 함유하는 분획을 모으고, 30 kDa 컷오프 원심분리 농축기를 사용하여 1 ㎖로 농축하였다.
e) TCR의 비오티닐화
TCR 용액 1 ㎖는 완충된 ATP, 5 mM MgCl2, 1 mM 비오틴을 사용하여 7.5 mM ATP로 구성되며, PMSF, 류펩틴 및 펩스타틴을 포함하는 프로테아제 억제제 칵테일을 첨가하였다. 마지막으로, 효소 BirA를 최종 농도 5 ㎍/㎖로 첨가하고, 반응을 실온에서 밤새 진행시켰다. 그 다음 겔 여과로 유리 비오틴으로부터 TCR을 분리하였다. 비오티닐화된 TCR을 포함하는 분획을 모으고, 프로테아제 억제제 칵테일을 첨가하였다. 단백질 농도를 측정하였다. 도 7은 가용성 비오티닐화된 TCR의 개략도이다.
실시예 5
TCR 사량체 및 TCR 코팅된 비드의 생성
비오티닐화된 TCR의 사량체화를 위해서, 엑스트라비딘(시그마)을 1:4 몰비로 첨가하였다. 형광 표지된 엑스트라비딘은 세포 표지 실험에 사용하였다. 단계적 방식으로 첨가하여 엑스트라비딘을 포화시켰으며, 비오티닐화 반응에서 일부 불완전함과 단백질 결정에서 일부 부정확함이 있을 수 있다. 결합용 엑스트라비딘의 각 첨가 사이에 얼음상에서 약 15분 동안 두었으며, 최종 첨가 후에 4℃에서적어도 밤새 방치하였다. 사량체화는 눈금을 정한 슈퍼덱스 ×200 컬럼(파마시아)상에서 작은 용액 시료의 겔 여과로 확인하였다. TCR 사량체 용액은 프로테아제 억제제 칵테일 및 0.05% 나트륨 아지드의 존재하에 4℃에서 저장하였다. TCR 사량체 생성의 경우, 도 4∼7 참조.
유사한 방법을 사용하여 각종 유형의 비드 또는 기타 고체 지지체를 가용성 TCR로 코팅할 수 있다. 아비딘/스트렙타비딘 코팅된 비드는 시판품(예, 노르웨이 오슬로에 소재하는 DYNAL에서 입수가능한 다이나비드, 또는 독일 베르기쉬 글라드바흐에 소재하는 밀테니이 비오텍크 리미티드에서 입수가능한 MACS)으로부터 얻었으며, 직경이 대략 4.5㎛∼65 nm인 광범위한 크기 범위에서 이용할 수 있다. 비오틴-스트렙타비딘을 통해 다이나비드상에 MHC-펩티드 복합체를 고정하는 방법은 이미 개시되어 있다(Vessey 등, 1997). 정제된 비오티닐화된 단백질은 적절한 시간, 예컨대 30분 동안 4℃에서 스트렙타비딘 코팅된 비드와 함께 항온처리한 다음, 비드를 세척하여 미결합된 단백질을 제거하였다. 이들 MHC-펩티드 코팅된 비드는 TCR 발현 세포주를 자극하는데 사용되는 경우 항원 특이적 반응을 유발하였다. 유사하게, TCR의 사량체, 또는 단량체 비오티닐화된 TCR을 아비딘/스트렙타비딘 코팅된 비드상에서 고정할 수 있다. 또는 비오티닐화되지 않은 TCR을 항TCR 항체 코팅 수단으로 또는 직접적인 화학적 가교로, 또는 기타 적절한 수단으로 고정할 수 있다.
실시예 6
리포좀 및 약물 패키징 생성
시험된 살균의 내독소의 지질 및 기타 성분은 다수의 공급원, 예컨대 미국의시그마 케미칼 캄파니 또는 아빈티 폴라 리피즈 인코포레이티드로부터 시판된다.
리포좀은 소포 형성 지질 및 비오티닐화된 소포 형성 지질의 혼합물로부터 제조한다. 리포좀 형성용으로 적절한 각종 방법이 공지되어 있다. 비오티닐화된 T 세포 수용체는 아비딘, 스트렙타비딘 또는 엑스트라비딘과 같은 적절한 결합제를 통해 리포좀의 외부에 결합된다. 검출가능한 표지 및/또는 치료제를 막 자체내로 혼입하거나 막내부의 수성 용적내로 포집한다.
실시예 7
기지의 특이성을 보유한 T 세포주 또는 T 세포 클론으로부터 얻은 T 세포 수용체 유전자의 분자 클로닝
세포 유래의 TCR 유전자의 분자 클로닝 방법 및 절차는 모든 α쇄 및 모든 β쇄 각각에 대해 동일하며, 따라서, 본 실시예에서만 그 방법 및 절차를 기재한다.
적절한 수의 T 세포, 통상적으로 1백만∼5백만 세포를 세포 용해 완충액에서 "mRNA 포집 키트"(뵈링거 만하임)로부터 세포 용해시켰다. mRNA는 mRNA의 폴리-A 꼬리에 비오티닐화된 올리고-dT를 하이브리드화하여 키트 반응물로부터 분리하였다. 그 다음 하이브리드화된 복합체는 스트렙타비딘으로 코팅된 PCR 관에 비오틴을 결합시켜 포집하였다. PCR관내 mRAN의 고정화 후에, 개시된 바와 같이("mRNA 포집 키트"의 뵈링거 만하임 사용법) AMV 역전자효소(스트라타젠)를 사용하여 cDNA를 형성하였다.
cDNA는 고정되어 있으면서, 말단 트랜스퍼라제 효소(뵈링거 만하임)를 사용하여 폴리-G 꼬리를 3' 말단에 형성하였다. 고 충실도 열안정성 폴리머라제pfu(클로닝됨, 스트라타젠)를 비롯한 PCR 반응 혼합물을 첨가하여, PCR 생성물의 착오 위험을 최소화하는데 사용하였다. 각 TCR 불변부에서 어닐링시키는 폴리-C "앵커 프라이머"(도 15A)와 α쇄 또는 β쇄 특이적 프라이머(각각 도 15B 및 도 15C)를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 95℃에서 1 분 변성, 50℃에서 1분 어닐링, 및 72℃에서 5분 연장의 30 사이클의 PCR 반응을 수행하여 TCR 유전자 단편을 증폭시켰다.
PCR 생성물은 PCR 프라이머에 함유된 XhoI 및 XmaI 제한 효소 부위(모든 효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩스에서 입수)를 사용하여 블루스크립트 서열 결정 벡터(p블루스크립트 II KS-, 스트라타젠)내로 결찰시켰다. 이.콜리 균주 XL-1블루내 결찰 혼합물의 형질감염 후에, 각 쇄에 대한 일부 클론을 DNA 서열 결정을 위해 선별하고, BigDyeTM종결인자(어플라이드 바이오시스템즈 인코포레이티드)를 사용하여 ABI 377 프리즘 자동 서열 분석기에서 서열 결정하였다.
실시예 8
c-jun 및 c-fos의 40개 아미노산 감겨진 코일("로이신 지퍼") 영역을 암호화하는 DNA 단편의 분자 클로닝
c-jun 및 c-fos의 40개 아미노산 감겨진 코일("로이신 지퍼") 영역을 암호화하는 DNA 단편은 주형으로서 인간 cDNA를 사용하고 도 16에 도시된 프라이머를 사용하여 PCR 반응으로 생성하였다. PCR 반응을 클로닝된pfu폴리머라제(스트라타젠)을 포함하는 반응 완충액에서 95℃ 1분 변성, 58℃에서 1분 프라이머 어닐링,및 72℃에서 2분간 연장으로 구성된 30 사이클로 수행하였다.
c-jun및c-fos단편은 고유 XhoI 및 XmaI 제한 부위를 사용하여 p블루스크립트 II KS-(스트라타젠)내로 결찰시켜 작제물 pBJ107 및 pBJ108을 각각 얻었다(도 17).c-jun및c-fos단편의 DNA 서열은 BigDyeTM종결인자(어플라이드 바이오시스템즈 인코포레이티드)를 사용하여 ABI 377 프리즘 자동 서열 분석기에서 수행된 DNA 서열 결정으로 입증하였다.
서열 결정된c-jun및c-fos단편은 고유 XmaI 및 BamHI 제한 부위를 사용하여 T7 폴리머라제 발현 벡터인 pGMT7의 폴리링커 영역내로 서브클로닝하였다(Studier, Rosenberg 등, 1990).
실시예 9
안정한 가용성 TCR의 생성을 위한 TCR-로이신 지퍼 융합 단백질의 고안
생체내 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 함유하도록 절두시킨 TCR α 및 β쇄의 세포외 단편을 동시 리폴딩시키고자 하는 시도는 한정적으로 성공하였다(데이타는 도시되지 않음, 발현 방법과 리폴딩 조건을 위한 일반적인 방법 및 재료에 대해서 실시예 12 참조). 그러나, TCRα쇄 및 TCRβ쇄를 사슬간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기의 바로 앞, 즉 N-말단면에서 절두시키면, 슈퍼덱스 G-75 컬럼(파마시아) 상의 분석적 크로마토그래피는 리폴딩 반응에서 대략 1∼2% 양으로 사용된 소 분획 단백질이 절두된 α/β헤테로이량체의 경우 추정 분자 크기의 복합체로 리폴딩되었다는 것을 제시한다(방법의 경우 Garboczi, Utz 등, 1996 참조).
부정확한 이황화 결합 형성은 생체내 리폴딩 과정에서 단백질의 비가역적인 폴딩 오류를 유발할 수 있기 때문에, 이것이 발생할 확률은 세포내 TCR에서 쌍을 이루지 않은 TCRβ 불변부에서 시스테인 잔기를 돌연변이시켜 최소화하고자 하였다. 세린 또는 알라닌 잔기를 시스테인 잔기로 치환한다. 이들 돌연변이 단계에서 사용된 합성 DNA 프라이머는 도 18에 도시되어 있다. TCRα 및 돌연변이된 β쇄가 사슬간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기 바로 전에 절두된 이들 양 쇄의 동시 리폴딩은 헤테로 이량체의 수율을 급격히 개선시키며, 이 보정된 분자량의 단백질 분획은 통상적으로 총 단백질의 15∼30%를 구성한다. 그러나, 이들 가용성 TCR을 밤새 보관한 경우, 단백질의 분석 결과 헤테로이량체 TCR에 해당하는 분자량의 분획이 단량체 TCRα쇄 및 β쇄에 해당하는 두 개의 피크로 분할된 것을 확인하였다. 가용성 TCR의 희석시 유사한 관찰 결과를 얻었으며, α/β쇄 안정성은 단백질의 희석 또는 한정된 시간보다 더 긴 시간을 요하는 분석을 하기에는 낮고 불충분하다는 것을 제시한다. 결론적으로, 안정한 TCR을 생성하는 이들 방법은 극도로 제한된 안정성을 보유한 수용체만을 형성하였다.
TCRα/β쇄 안정성을 개선시키고, 리폴딩 과정에서 헤테로이량체 형성을 유효하게 보조하기 위해서, 헤테로이량체를 우선적으로 형성하는 것으로 알려진 c-jun 및 c-fos의 "로이신 지퍼" 도메인에 TCR쇄를 융합시켰다(O'Shea, Rutkowski 등, 1989; Schuermann, Hunter 등, 1991; O'Shea, Rutkowski 등, 1992; Glover 및 Harrison 1995). 융합체 TCR에 대한 2종의 고안물을 시험하였다.
그 하나의 고안물에서는, 로이신 저퍼를 TCRα쇄 및 β쇄내 사슬간 이황화결합을 형성하는 시스테인 잔기 바로 다음, 즉 C-말단에 융합시켰다.c-jun및c-fos로이신 지퍼 펩티드는 사용된 링커의 바로 옆 N-말단에서 사슬간 이황화 결합을 형성할 수 있기 때문에(O'Shea, Rutkowski 등,1989), 서로에 대한 그리고 사슬내 이황화 결합에 대한 2개의 사슬의 정렬은 최적인 것으로 추정하였다.
또 다른 하나에서는, 로이신 지퍼를 TCR α쇄 및 β쇄내 사슬간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기 바로 앞, 즉 N-말단에 융합시켰다(도 19). 따라서, 제2 고안물에서 시스테인 잔기가 재조합 수용체로부터 생략되어 있다.
이들 고안물의 TCR-지퍼(TCR-z)쇄를 사용한 리폴딩 실험에서, 헤테로 이량체이고 가용성인 수용체의 수율은, 도 19에 도시된 고안물에서와 같이 사슬간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기가 TCRα쇄 및 β쇄로부터 생략된 경우, 더 우수하다.
실시예 10
TCR 로이신 지퍼 단백질용 DNA 발현 벡터의 작제
본 실시예는 5개 TCR의 α쇄 및 β쇄용 발현 벡터의 작제를 개시하고 있다. 개시된 방법 및 고안은 임의의 인간 또는 동물 TCR 유전자에 적용가능하다. 여기에 개시된 5개의 TCR은 모두 MHC 클래스 I 에피토프에 의해서 제한되지만, 그 방법은 MHC 클래스 II 제한된 TCR용 발현 벡터의 클로닝 및 작제를 위해서 동일하게 사용할 수 있다. 모든 벡터는 도 19에 도시된 고안물에 따라서 가용성 TCR을 리폴딩시키기 위한 목적으로 단백질을 발현하지만, 단 2개의 TCR은 C-말단에서 비오티닐화할 수 있는 태그 서열과 함께 발현되었다(하기 및 도 28, 29 및 30 참조). 클로닝방법은 각각 모든 TCR α쇄 및 β쇄에 대한 것과 동일하다.
TCR α쇄 및 β쇄의 리더 또는 시그널 펩티드 서열의 범위는 TCR 앵커 PCR 생성물을 함유하는 플라스미드로부터 얻은 서열 데이타의 분석 결과로 추정하였다(실시예 7 참조). 이를 기초로, 리더 서열 없이 TCR쇄를 발현하기 위한 PCR 단편을 형성하는 5' 프라이머를 고안하였다(도 20). 모든 5' 프라이머는 성숙 TCR 단백질 서열 바로 전에 메티오닌 잔기를 암호화하여 이.콜리내에서 번역을 가능하게 한다. A 또는 T 염기를 C 또는 G 염기로 치환한 침묵 돌연변이(도 20)를 다수의 유전자의 5' 기부 코돈내로 도입하여 이.콜리내 발현량을 역으로 억제하는 2차 mRNA 구조 형성 경향을 감소시켰다(PCT/GB98/03235; (Gao, Tormo 등, 1997; Gao, Gerth 등, 1998).
인간 JM22 인플루엔자 매트릭스 펩티드-HLA-A0201(펩티드 서열 GILGFVFTL) 제한된 TCR의 Vα0.2 및 Vβ17쇄, 003 HIV-1 Gag 펩티드-HLA-A0201(펩티드 서열 SLYNTVATL) 제한된 TCR의 인간 Vα23 및 Vβ5.1쇄, 및 F5 NP 펩티드-H2-Db(펩티드 서열 ASNENMDAM)의 쥐 Vα4 및 Vβ11쇄를 암호화하는 유전자는 실시예 7에 개시된 바와 같이 형성된 TCR 앵커 PCR 생성물을 함유하는 플라스미드를 사용하여 PCR로 증폭하였다. HLA-A0201이 제공하는 특이적 HTLV-2 Tax 펩티드(펩티드 서열 LLFGYPVYV)인 인간 A6(Vα2.3/Vβ12.3) TCR 및 B7(Vα17.2/Vβ12.3) TCR에 대한 유전자는 이들 TCR쇄를 위한 발현 벡터의 작제용 PCR 생성물의 형성에 사용되는 플라스미드 형태(Garboczi, Utz 등, 1996; Ding, Smith 등, 1998)로 얻었다. 이들 TCR에 대한 유전자는c-fos로이신 지퍼-비오티닐화 가능한 태그 융합 단편용 서열을함유하는 발현 벡터내로 클로닝하였다(실시예 11 참조).
PCR 반응은 표준 완충 조건(스트라타젠)에서 클로닝된pfu폴리머라제와, 95℃에서 1분 변성, 60℃에서 1분 프라이머 어닐링 및 72℃에서 6분 연장의 25 사이클을 이용하여 수행하였다. PCR 생성물은 효소 NdeI 및 Xmal로 제한 분해하고, c-jun(TCR α쇄) 및 c-fos(TCR β쇄) 삽입체를 함유하는 pGMT7 벡터내로 결찰시켰다(실시예 8 참조).
도 21 내지 도 30은 TCR-z 삽입체의 서열과 pGMT7 벡터가 발현하는 추정된 단백질 서열을 도시한다. 도 31은 불변부내 돌연변이를 함유하지만 가용성 TCR의 폴딩 및 기능에는 검출가능한 영향을 미치지 않는 A6 TCR β쇄의 서열을 도시한다(실시예 12 및 13 참조).
실시예 11
c-fos 로이신 지퍼 비오티닐화 가능한 단편에 융합된 TCR β쇄의 발현용 DNA 벡터 작제
가용성 TCR을 수용체에 고정시키거나 또는 수용체에 검출 또는 부착시키기 위해서, 추가의 기능성 융합 성분을 보유한 단백질이 생성되는 것이 유용하다. 이는 가용성 TCR을 예컨대 다량체로서 생성하는 것과 같이 유도하거나, 또는 고 감도로 검출하거나 또는 수용체/수용체 복합체에 기타 기능을 부속시킬 수 있다.
본 실시예는 이.콜리 생체내에서 특이적으로 비오티닐화하거나 또는 시험관내 효소 BirA와 특이적으로 비오티닐화할 수 있는 융합 폴리펩티드를 공학적으로 처리한 TCRβ쇄용 발현 벡터의 작제를 입증한다(Barker 및 Campbell 1981; Barker및 Campbell 1981; Howard, Shaw 등, 1985; Schatz 1993; O'Callaghan, Byford 등, 1999). 실시예 13 및 실시예 14에 제시된 바와 같이, 이들 가용성 TCR 융합체는 발현되어 동일한 방식으로 α쇄와 함께 리폴딩되고, "비오티닐화 태그"(BT-태그)에 융합하지 않는 TCR β쇄에 대해 유사한 수율로 리폴딩된다. 이들 결과는 본원에 개시된 가용성 TCR이 융합 파트너로서 다수의 상이한 폴리펩티드와 함께 발현하기에 적합함을 입증한다.
T 세포 수용체 β-쇄는 다음과 같이fos로이신 지퍼 서열에 대한 C 말단에 비오틴-태그 서열을 보유한 pGMT7 발현 벡터내로 서브클로닝하였다.
개시-TCRβ쇄-fos지퍼-비오틴-태그-종지
이 작제물의 말단의 정확한 서열은 다음과 같다(도 32 참조).
링커→｜fos 지퍼→｜BamHI｜←링커→｜←비오틴 태그
2가지 접근 방법을 사용하여 비오틴 태그를 보유한 가용성 TCR을 산출하였다. 인간 JM22 인플루엔자 매트릭스 펩티드-HLA-A0201 제한된 TCR의 경우, 클로닝된 β-쇄-c-fos로이신 지퍼 융합체는 도 33에 도시된 합성 DNA 프라이머를 사용하여 3' 말단에서 변형시켜pfu폴리머라제(스트라타젠)와 표준 PCR 반응을 사용하여 HindIII 부위 대신에 BamHI 부위를 도입하였다.
NdeI 부위를 함유하는 본래의 5' 프라이머(도 20 참조)를 정방향 프라이머로 사용하였다. 생성된 PCR 생성물은 비오틴-태그 서열(도 32)을 함유하는 변형된 pGMT7 벡터내로 클로닝하여 전술한 바와 같은 작제물을 형성하였다. 이 플라스미드는 JMB002로서 공지되어 있다.
A6 tax TCR(Vα2.3/Vβ12.3)로서 알려진 HLA-A0201 제한된 HTLA-1 에피토프 LLFGYPVYV에 특이적인 클로닝된 TCR은 도 20에 도시된 정향향 및 역방향 프라이머와 PCR을 사용하여 절두시켰다. 이 TCR β쇄는c-fos-BT 단편을 함유하는 pGMT7 벡터(JMB002)의 NdeI 및 Xmal 부위내로 클로닝시켰다.
융합 발현 벡터의 작제 후에, DNA 서열 결정을 수행하여 서브클로닝 절차 과정에서 도입되는 오류가 없도록 하였다(모든 서열 결정은 ABI 377 프리즘 서열 결정기와 ABI 빅다이 형광 종결자를 사용하여 옥스포드 유니버시티의 생화학과 DNA 서열 결정 시설에서 수행하였다). 공개된 서열과 비교하여 추가의 조사를 한 경우 tax TCR-β쇄내 2개의 오류가 있는 것으로 판명되었으며, 본 발명자들은 이들 오류가 본래의 플라스미드에서도 존재함을 발견하였다. 이들 2개의 오류는 TCR β쇄내 고유 Bsu361 부위의 3'에 존재하기 때문에, 이를 (보정) JMB002 플라스미드내로 클로닝하는데 사용하였다. tax TCR β-쇄의 양 형태는 발현되어 α쇄와 함께 리폴딩시키고, 바이오코어를 사용하여 비교하였다. 단백질의 양 형태는 유사한 겉보기 친화도로 tax 펩티드-MHC 클래스 I 분자에 특이적으로 결합하였다(실시예 20 참조). 후속 실험에서, 오직 β쇄의 보정 형태만을 사용하였다.
실시예 12
이.콜리내 TCR 쇄의 발현 및 봉입체의 정제
600 nm에서 광학 밀도(OD)가 0.2∼0.6에 도달할 때 단백질 생성을 유도하기 위해서 0.5 mM IPTG를 사용하여, TYP 배지내 벡터 pGMT7의 제어하에 이.콜리 균주 BL21DE3pLysS내에서 TCRα쇄 및 β쇄를 별도로 발현하였다. 밤새 유도시켜 벡크만J-6B 원심분리내 4000 rpm으로 원심분리하여 박테리아를 수거하였다.
그 다음 박테리아 세포 펠렛을 "세포 용해 완충액"(10 mM 트리스 pH 8.1, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 10% 글리세롤)내 재현탁시켰다. 혼합물을 얼음에서 냉각하고, 20 ㎍/㎖ 리소자임, 10 mM MgCl2및 20 ㎍/㎖ DNaseI를 첨가하고 최소 1시간 동안 얼음위에서 항온처리하였다.
이어서, 12 mM 프로브 초음파기(Milsonix XL2020)을 30초 간격으로 30초씩 5회 파열시키기 위해서 총 전력으로 사용하여 혼합물을 초음파 처리하여 혼합물을 침전시켰다. 이 절차를 수행하는 동안 얼음-물 혼합물을 사용하여 온도를 유지하였다. 그 다음 혼합물은 "트리톤 세척 완충액"(50 mM 트리스 pH 8.1, 0.5% 트리톤 X-100, 100 mM NaCl, 0.1% 나트륨 아지드, 10 mM EDTA, 2 mM DTT) 5 부피로 희석하였다. 최소 1 시간 동안 얼음위에서 항온처리한 다음, 벡크만 GS-6R 원심분리기내에서 3,500 rpm으로 혼합물을 원시분리하고 상청액을 버렸다. 작은 플라스틱 1회용 피펫을 사용하여 "재현탁 완충액"(50 mM 트리스 pH 8.1, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2mM DTT)내 펠렛을 재현탁시켰다. 그 다음 벡크만 J2-21 원심분리기에서 8,000 rpm으로 원심분리하고 상청액을 버렸다. 그 다음 펠렛을 "구아니딘 완충액"(50 mM 트리스 pH8.1, 6.0 구아니딘-HCl, 100 mM NaCl, 10mM EDTA, 10mM DTT)내에서 수동 균질기를 사용하여 재현탁시켰다. 저속 원심분리로 불용성 물질을 제거한 후에, 상청액을 분액화하고 -70℃에서 보관하였다. 박테리아 배양물 1 ℓ당 대략 100 ㎎의 수율을 일반적으로 얻었다.
정제된 봉입체 제제의 SDS-PAGE 분석은 구아니딘 완충액에서 봉입체 제제 2㎕를 SDS-PAGE 시료 완충액으로 희석한 다음 2 분 동안 100℃로 가열하여 수행할 수 있다. 시료를 가온하면서 겔상에 적재하여 적재 과정에서 구아니딘/SDS 혼합물이 침전되는 것을 방지하였다. 이러한 방식으로 정제된 봉입체 단백질은 이 방식으로 수행한 SDS-PAGE의 코싸미 염색에 의해 순도가 대략 90%인 것으로 판명되었다(도 34 참조).
실시예 13
TCRz 헤테로이량체의 리폴딩 및 정제
동비율의 우레아 용해된 단백질을 "구아니딘 완충액"(6M 구아니딘-HCl, 10 mM 아세트산나트륨 pH 5.5, 10 mM EDTA, 2 mM DTT)을 37℃에서 추가로 변성시켰다. 단백질 혼합물은 급속히 혼합하면서 총 단백질 농도가 60 ㎎/ℓ가 되도록 얼음 냉각된 리폴딩 완충액(100 mM 트리스 pH 8.1, 0.4 M L-아르기닌-HCl, 5.0 M 우레아, 5 mM 환원된 글루타티온, 0.5 mM 산화된 글루타티온)에 주입하였다. 얼음위에서 5시간 이상 동안 항온처리하여 리폴딩시킨 후에, 혼합물을 24 시간 동안 탈염수 10 부피에 대해 투석한 다음 24 시간 동안 10 mM 트리스 pH8.1 10 부피에 대해 투석하였다.
투석된 리폴딩 단백질을 여과하여 0.45 μ니트로-셀룰로스 막(와트만)을 통해 응집된 단백질(리폴딩 과정에서 부산물로서 생성됨)을 제거하였다. 비오틴 태그화된 가용성 TCR은 바이오카드 스프린트 시스템에서 작동하는 POROS 20HQ 컬럼상에 적재하여 정제하였다. 전개 1회당 대략 500 ㎖의 리폴딩된 단백질 용액을 적재하고, 비스-트리스-프로판 완충액 pH 8.0 중 염화나트륨 구배를 사용하여 단백질을용출시켰다. 대략 100 mM 염화나트륨에서 용출된 단백질 및, 관련 분획은 얼음상에서 즉시 냉장하고, 프로테아제 억제제 칵테일을 첨가하였다. 분획은 코싸미 염색된 SDS-PAGE로 분석하였다.
실시예 14
비오티닐화 가능한 β쇄를 이용한 TCRz 헤테로이량체의 리폴딩 및 정제
비오틴 태그된 TCR β쇄를 가용성 T 세포 수용체의 경우와 같이 발현 및 정제된 동량의 α쇄와 혼합하였다. 헤테로이량체 TCRz-β-BT는 TCRz에 대해 실시예 13에 제시된 바와 동일한 절차에 따라 리폴딩시켰다(도 37 참조).
실시예 15
비오틴 태그된 가용성 TCRz-BT의 비오티닐화
단백질 함유 분획은 10 K 컷오프 원심분리 농축기(울트라프리, 밀리포어)를 사용하여 2.5 ㎖로 농축하였다. 10 mM 트리스 pH 8.1, 5 mM NaCl로 평형화시킨 PD-10 탈염 컬럼을 사용하여 완충액을 교환하고, 추가로 프로테아제 억제제 칵테일을 첨가하고, 다시 원심분리 농축기를 사용하여 단백질을 ∼1 ㎖로 농축시켰다. 비오틴 태그된 가용성 TCR 1㎖에 7.5 mM MgCl2, 5mM ATP(pH 8.0), 1 mM 비오틴, 2.5 ㎍/㎖ BirA 비오티닐화 효소를 첨가하였다. 비오티닐화 반응을 밤새 실온(20∼25 ℃)에서 수행하였다.
효소적으로 비오티닐화된 가용성 TCR은 파마시아 FPLC 시스템에서 작동하는 슈퍼덱스 200 HR 컬럼(파마시아)상에서 겔 여과하여 잔여 미반응 비오틴으로부터 분리하였다(도 38 참조). 컬럼을 PBS로 평형화시키고, 얼음위에서 즉시 냉장된 1㎖ 분획을 수거하고, 다시 프로테아제 억제제 컥테일로 보호하였다. 단백질 농도는 코싸미 결합 분석(피어스)를 사용하여 추정하고, 그 다음 비오티닐화된 단백질을 4℃에서 최대 수개월 동안 또는 -20℃에서 더 장기간 동안 저장하였다.
비오티닐화 반응의 효과는 비오티닐화된 단백질의 웨스턴 블롯을 사용하여 검사하였다. SDS-PAGE 겔은 염색 대신에 전술한 방법을 사용하여 전개시키고, 겔은 세미포르 반건조 전기블롯팅 장치(호에퍼)를 사용하여 PVDF 막(바이오라드)상에서 블롯팅하였다. 블롯팅 스택은 겔 크기로 절단되고 전달 완충액(25 mM 트리스 염기, 150 mM 글리신)내 침지된 6층의 여과지(와트만 4M), 메탄올로 미리 적신 다음 전달 완충액 중에 침지한 PVDF 막, 5분 동안 전달 완충액에서 완만하게 교반된 겔, 추가 6층의 침지된 여과지로 구성하였다. 그 스택은 시험관을 사용하여 살짝 압축하여 임의의 공기 기포를 펴고 대략 10 ㎖의 추가의 전달 완충액을 첨가하여 전도를 보조하였다. 양극을 스택의 상부에 높고, 1시간 동안 50 mA의 일정 전류로 장치에 전류를 통과시켰다. 그 다음 막을 PBS-T 완충액(PBS + 0.05% 트윈 20)중 2% 젤라틴 용액(바이오라드)에서 1 시간 이상 동안 실온에서 살짝 교반하면서 항온처리하였다. 밤새 항온처리물은 0.01% 나트륨 아지드를 포함하여 박테리아 성장을 억제하였다. PBS-T를 수회(4∼5회) 교체하여 막을 세척한 다음 살짝 교반하면서 실온에서 >30분 동안 PBS-T 중 1% 젤라틴 용액으로 1:1000으로 희석한 아비딘-HRP 접합체(시그마)로 막을 염색하였다. 그 다음 PBS-T를 수회(4∼5회) 교체하여 막을 세척한 다음 Opti-4CN(바이오라드)로 검출하였다. 이는 HRP의 존재하에서 반응하여 불용성 청색 염료를 형성하는 시약으로서, 관련 단백질이 결합된 HRP의 존재에 의해 제시된 바와 같이 존재하는 장소에서 막을 염색한다. 아비딘-HRP 접합체를 사용하여 염색된 경우, 이는 비오틴 함유 단백질이 존재함을 제시하는 것이다.
도 39는 일부 비오티닐화된 TCR상에서 이러한 방식으로 수행한 블롯이다. 이러한 블롯상에서 조작한 표준물은 비오티닐화된 광범위한 분자량 마커(바이오라드)였다. 블롯은 비오티닐화 태그를 함유하는 TCR의 고 레벨의 비오티닐화가 BirA 효소와 반응함을 분명하게 보여준다.
실시예 16
비오티닐화된 가용성 MHC-펩티드 복합체의 생성
비오티닐화된 가용성 MHC-펩티드 복합체를 실시예 2에 개시된 바와 같이 생성할 수 있다.
실시예 17
가용성 TCR 및 MHC-flu-펩티드간의 특이적 결합에 대한 분석
가용성 TCR 분자인 JM22z는 인플루엔자 매트릭스 단백질의 아미노산 잔기 58-66(GILGFVFTL)로 구성된 면역 우성 항원을 제공하는 HLA-A2 MHC 분자에 대해 특이적이다. JM22z의 클로닝, 발현 및 정제는 실시예 7, 10, 11 및 13과 도 35 및 36에 도시되어 있다. JM22z 및 그의 리간드/MHC 복합체(HLA-A2-flu) 또는 부적절한 HLA-A2 펩티드 조합(그 생성은 실시예 13에 제시되어 있다)간의 상호작용은 바이오코어 2000TM표면 플라스몬 공명(SPR) 바이오센서상에서 분석하였다. SPR은 작은 유동 세포내 센서 표면 부근에 있는 반응 단위체(RU)로 표시되는 굴절률의 변화를 측정하며, 그 원리를 사용하여 수용체 리간드 상호작용을 검출하고 친화도 및 역학변수를 분석할 수 있다. 프로브 유동 세포는 β2m상에 교차 결합된 비오틴 및 유동 세포의 활성화된 표면에 화학적으로 교차 결합된 스트렙타비딘간의 결합을 통해 별개의 유동 세포내 개개 HLA-A2-펩티드 복합체를 고정하여 제조하였다. 이 분석은 일정한 유속으로 상이한 유동 세포의 표면상에 JM22z를 통과시켜 수행하여, SPR 반응을 측정하였다. 초기에, 이 상호작용의 특이성은 3개의 상이한 표면상에 5 ㎕/분의 일정한 유속으로 28 μM의 JM22z를 통과시켜 입증하였는데, 상기 3개의 표면 중 하나의 표면은 HLA-A2-flu의 2800 RU로 코팅하고, 제2 표면은 HIV 역전사 효소에서 유래한 부적절한 펩티드와 함께 폴딩된 HLA-A2의 4200 RU(HLA-A2-폴: ILKEPVHGV)로 코팅하고, 제3 표면은 CD5의 4300RU로 코팅하였다(도 40a 삽입 그래프). 일정한 유속과 상이한 농도로 HLA-A2-pol상에 가용성 JM22z를 주입하여 배경 공명을 정하였다(도 40a). 이들 대조 측정값은 HLA-A2-flu에서 얻은 값(도 40 b)으로부터 공제하고, 해리 상수 Kd(도 40c)로서 표현되는 결합 친화도를 계산하는데 사용하였다. JM22z 및 관련 MHC 분자의 Kd는 37℃에서 15 ±4 μM(n=7)이고 25℃에서 6.6 ±2 μM(n=14)인 것으로 측정되었다. 프로브 유동 세포 및 가용성 MHC-펩티드 복합체내 고정된 TCR을 이용하여 측정하여 25℃에서 5.6 ±4 μM(n=3)의 유사한 Kd를 얻었다. 상호작용의 개시율(on-rate)는 37℃에서 6.7 ×104내지 6.9 ×104M-1s-1인 반면, 정지율(off-rate)는 1.1 초-1였다(Wilcox, Gao 등, 1999).
실시예 18
가용성 쥐 TCR 및 쥐 MHC H2-D b -NP간의 특이적 결합 분석
이 실험에서, 본 발명자들은 쥐 H2-DbMHC 분자(H2-Db-NP)가 제공하는 인플루엔자 바이러스 핵단백질로부터 유래된 펩티드(아미노산 366-374; ASNENMDAM)에 특이적인 쥐 TCR, F5를 사용하였다. 사용된 MHV 중쇄 유전자는 천연 단백질의 아미노산 1∼280과 BirA 효소가 인식하는 13-아미노산 서열만을 암호화하도록 약간 변형시켰다. 생성 단백질은 효소적으로 비오티닐화될 수 있다(Schatz 1993; O'Callaghan, Byford 등, 1999). 고정된 H2-Db-NP에 특이적인 가용성 TCR을 사용하여 바이어코어 2000 SPR 바이오센서상에서 SPR 분석을 수행한 결과, 이것이 리간드 MHC-펩티드 조합물에 특이적으로 결합함을 확인하였다(도시되지 않음).
실시예 19
비오티닐화된 가용성 돌연변이 tax-TCR과 비오티닐화된 가용성 tax-TCR의 결합 비교
비오티닐화된 가용성 tax-TCR을 실시예 12∼14에서와 같이 제조하고, 인플루엔자 매트릭스 펩티드(GILGFVFTL) 또는 HTLV tax 11-19 펩티드(LLFGYPVYV)와 리폴딩된 비오티닐화된 pMHC 복합체를 사용하여 실시예 17에서와 같이 바이어코어 2000 분석을 수행하였다. 비오티닐화된 가용성 TCR을 총 1분 동안 5 ㎕/분의 속도로 모든 세포상에서 유동시켰다. 도 41은 비오티닐화된 가용성 tax-TCR을 먼저 HTLV tax11-19 펩티드-MHC 복합체(A)에 결합시킨 다음 비오티닐화된 가용성 돌연변이 tax-TCR을 결합시킨다는 것을 보여준다. 야생형도 돌연변이 tax-TCR도 인플루엔자 매트릭스 펩티드-MHC 복합체(B/C) 또는 OX68 모노클로날 항체 대조군(D)에 결합하지 않는다는 것을 보여준다. 따라서, 본 발명자들은 야생형 및 돌연변이 비오티닐화된 가용성 TCR이 모두 tax-pMHC 복합체에 효과적, 특이적으로 분명하게 결합하고, 결합 정도에는 거의 차이가 없다는 결론을 내렸다.
실시예 20
고정된 MHC 펩티드 복합체에 대한 TCR- 및 CD8 보조 수용체의 동시 결합 분석
CD8 및 CD4는 TCR과 동일한 MHC 분자에 동시에 결합하여 TCR에 대한 보조 수용체로서 기능하는 것으로 간주되는 표면 당단백질이다. CD8은 세포 독성 T세포에 대한 특성이 있으며 MHC 클래스 I 분자에 결합하는 반면, CD4는 헬퍼 계통의 T 세포에서 발현하고 MHC 클래스 II 분자를 결합시킨다. CD8은 2개의 동일한 α쇄 또는 α쇄 및 β쇄로 구성된 이량체이다. 헤테로이량체 αα-CD8 분자는 전술한 바와 같이 생성되었다(PCT/GB98/03235; Gao, Tormo 등, 1997; Gao, Gerth 등, 1998). 이 실시예에서, 본 발명자들은 고정된 HLA-A2-flu 복합체에 대한 가용성 TCR 및 CD 분자의 동시 결합을 개시하고 있다. 도 42A에서 볼 수 있는 바와 같이, 결합 반응은 단순히 합하면 된다. TCR 반응값(○)을 혼합된 반응값(●)으로부터 공제하면 120 μM CD8 단독(△)의 반응값과 매우 유사한 값(□)을 제공한다. 도 42B는 TCR-MHC-펩티드 상호작용의 역학이 동시 CD8 결합에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 보여준다. 관찰된 부가의 결합은 TCR 및 CD8이 별도의 계면에서 MHC 펩티드 복합체를 결합시킨다는 것을 제시한다. 이 실시예는, 일부 경우 한 분자의 결합이 다른 분자의 특이적 결합에 영향을 미치지 않으며, 이 상황은 분자들의 다른 조합에 대해서가장 상이할 것 같다.
실시예 21
비오티닐화된 가용성 TCR로부터 TCR 사량체 형성
아비딘 또는 스트렙타비딘이나 이의 유도체를 사용하여 TCR 사량체를 형성하였다. 아비딘(달걀 태그)은 여러 다른 단백질 및 표면에 대한 비특이적 결합을 유발하는 중성 pH에서 고 양전하를 초래하는 비정상적으로 높은 등전점을 갖는다. 따라서, 종종 등전점을 낮추도록 상업적으로 변형시켜 스트렙타비딘(박테리아원 유래)과 더욱 유사하게 작용하도록 한다. 이러한 형태로서 엑스트라비딘(시그마) 또는 뉴트라비딘(몰리큘라 프로브)이 공지되어 있다. 이들 각각 또는 스트렙타비딘은 FACS 스캐닝을 사용한 검출용 형광 태그와 같은 표지를 함유하도록 변형시킬 수 있다.
TCR 사량체는 총 비오티닐화된 가용성 TCR 농도의 1/4 농도의 최종 엑스트라비딘/스트렙타비딘을 사용하여 형성하였다. 엑스트라비딘/스트렙타비딘을 얼음위에서 분액으로 첨가하여 농도가 아주 엄밀하지 않은 경우 대부분의 엑스트라비딘/스트렙타비딘을 TCR로 포화시킬 수 있다. TCR 사량체는 슈퍼덱스 200 HR 컬럼(파마시아)상에 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다-도 43 및 도 44. TCR의 아비딘에 대한 결합은 미결합된 TCR 및 엑스트라비딘/스트렙타비딘의 대조 시료를 별도로 작동시켜 확인하였다. TCR 사량체는 더 높은 분자량에 해당하는 체류 부피에서 컬럼으로부터 용출시켰다. 미변형 엑스트라비딘의 경우, 완전한 TCR 사량체에 대한 계산된 분자량이 305,000인 것에 비하여 생성된 TCR 사량체의 대략적인 분자량(기지분자량의 표준 단백질과 비교)은 ∼285,000인 것으로 측정할 수 있다.
실시예 22
비오티닐화된 단량체 TCR 및 TCR 사량체의 MHC 펩티드에 대한 결합 분석
펩티드-MHC 복합체는 인플루엔자 매트릭스 펩티드(GILGFVFTL) 또는 HTLV tax 펩티드(LLFGYPVYV), 재조합체 HLA-A2 중쇄 및 화학적으로 비오티닐화된 β-2-마이크로글로불린을 사용하여 실시예 16에서와 같이 제조하였다. 바이어코어 2000TMSPR 바이오센서를 사용하여 TCR, TCR 사량체 및 pMHC 복합체 사이의 분자 상호작용을 측정하였다. 비오티닐화된 pMHC 복합체는 아민 커플링에 의해서 CM-5 칩 표면에 접합된 스트렙타비딘에 고정하였다. 서 윌리암 둔 스쿨 오브 패쏠로지로부터 Dr. P.Anton van der Merwe가 제공한 비오티닐화된 모노클론 항체인 OX68을 하나의 세포내에서 비특이적 대조 단백질로서 사용하였다.
pMHC 복합체 고정화 후에, 잔여 비오틴 결합 부위를 10 mM 비오틴으로 포화시켰다. 비오티닐화된 TCR이 특이적으로 TCR-pMHC 상호작용을 통해서라기 보다는 비오티닐화를 통해서 스트렙타비딘 코팅된 칩에 결합하는 것을 방지해야 한다. 가용성 비오티닐화된 TCR을 약 1 ㎎/㎖의 농도로 칩상에서 유동시키고, TCR 사량체는 대략 50 ㎍/㎖의 농도로 유동시켰다.
도 45는 pMHC 복합체에 대한 가용성 비오티닐화된 flu-TCR 및 flu-TCR 사량체의 결합을 도시하며, 도 46은 동일한 pMHC 복합체에 대한 가용성 비오티닐화된 tax-TCR 및 tax-TCR 사량체의 결합을 도시한다. 비오티닐화된 TCR 및 TCR 사량체는 모두 완전한 특이성을 나타내어, 특이적 펩티드-MHC 복합체에는 강하게 결합하지만비특이적 펩티드 MHC 복합체에는 전혀 결합하지 않았다. sTCR의 다량체화에 의해 유발되는 친화도 증가는 sTCR의 경우 해리 속도(off-rate), 양 TCR의 경우 TCR 사량체에서 관찰할 수 있다. 양 TCR에 대한 해리 속도는 수 초에서 수 시간으로 증가된다(정확한 해리 속도는 재결합 효과 때문에 측정할 수 없다).
비오티닐화된 가용성 TCR의 일부 더욱 영구적인 결합이 양 경우에 관찰되었는데, 이는 제제내 응집 단백질의 존재에 의해 유발된다. 양 경우에, 강력한 결합의 레벨은 유동 세포상에 주입된 TCR 사량체의 총량이 주입된 비오티닐화된 가용성 TCR 양의 대략 1/4이라는 것을 고려하면 TCR 사량체와 비교하여 매우 낮은 것이었다(5 ㎕ ×1 ㎎/㎖와 비교하여 25 ㎕ ×0.05 ㎎/㎖).
실시예 23
TCR 사량체로 항원 제공 세포 염색
세포 염색 실험은 T2라고 명명되는 B 세포주 상에서 실험하였는데, 이 세포주는 단일 유형의 외부 펩티드로 충전할 수 있는 세포 표면상에 비충전된 MHC 클래스 I 분자의 존재를 초래하는 펩티드 항원을 프로세싱하지 않고 HLA-A2에 대해 동형접합성이다. 37℃ 및 5% CO2대기하에 R-10 배지에서 세포를 증식시켰다. 대략 2백만 세포를 취하고 RPMI 배지(1,500 rpm에서 5분 동안 원심분리)에서 2회 세척하고, 펩티드를 RPMI 중 10% DMSO내에서 농도를 다양하게 하여 첨가하였다. 통상적으로 인플루엔자 매트릭스 펩티드(서열: GILGFVFTL) 및 tax 펩티드(서열: LLFGYPVYV)를 0, 10-4, 10-5및 10-6M의 농도로 사용하였다. 세포를 37℃에서 1 시간 동안 펄스시켜 펩티드가 세포 표면상의 MHC 클래스 I 분자에 결합하도록 하였다. 그 다음 세포를 RPMI 배지로 2회 세척하여 과량의 펩티드를 제거하였다.
펩티드 펄스된 세포를 실온에서 TCR 사량체로 염색하였으며, 1∼10 ㎍의 TCR 사량체를 FITC 또는 RPE 형광 마커로 표지하였다. 세포를 30 분 동안 염색하고 얼음 냉각된 RPMI로 1회 세척한 다음 PBS 용액 중에서 3% 포름 알데히드로 고정하였다. 고정되고 염색된 세포를 암실에서 최대 1주일 동안 보관한 다음 FACS 분석을 수행하였다.
FACS 분석은 벡톤-디킨슨 FACS 스캐너를 사용하여 수행하고, "셀퀘스트" 소프트웨어를 사용하여 데이타를 기록하고 분석하였다. 도 47은 특이적 펩티드에 대한 flu 매트릭스 TCR 또는 tax TCR로 만든 TCR 사량체의 특이적 결합을 도시한다. 배경 및 교차반응성은 낮았다. 흥미롭게도, tax TCR 사량체는 flu 매트릭스 TCR 사량체가 펩티드에 결합하는 것 보다 더욱 우수하게 펩티드에 결합하는 것으로 보이지만, 이는 펩티드 펄싱 과정에서 MHC 클래스 I 분자에 대한 펩티드의 친화도를 다양하게 한 효과일 수도 있다.
또 다른 각종 세포, HLA-A2에 대한 정상 B 세포주 이형접합성인 .45 세포를 TCR 사량체를 사용하여 염색하였다. 세포를 제조하고 펩티드 펄스시킨 다음, T2 세포와 정확히 동일하게 표지하고 FACS 스캐닝하였다. 도 48은 펩티드 펄스된 .45 세포의 TCR 사량체 표지의 결과를 도시한다. 세포의 염색은 T2 세포의 경우보다 현저히 낮은데, 추정한 바와 같이 .45 세포는 HLA-A2에 대해 이형접합성인 반면 T2 세포는 동형접합성이었다. 이러한 효과 외에, .45 세포의 표면상의 MHC 클래스 I 복합체는 펩티드로 초기에 적재되어 있지만, T2 세포의 경우에는 복합체가 비어 있기 때문에 기타 HLA-A2 양성 세포와 비교하여 T2 세포의 표면상에 펩티드 적재 효율이 더 클 수 있다.
실시예 24
TCR 코팅된 라텍스 비드의 제조 및 이를 사용한 염색
항원에 대한 TCR 염색의 감수성을 개선시키기 위해서, 형광 마커로 표지되고 TCR 코팅된 비드를 제조하였다. 형광 표지되고 뉴트라비딘 코팅된 비드는 몰리큘라 프로브로부터 구입하였다. TCR의 포화 농도로 4℃에서 동시 항온처리함으로써 비오티닐화된 가용성 TCR로 비드를 코팅하여, 비드상에 최대 수의 결합 부위를 TCR이 점유하도록 하였다. 그 다음 비드를 사용하여 펩티드 펄스된 항원 제공 세포를 TCR 사량체에 대해 기술된 것과 유사한 방법으로 표지하였으나, 단 차단제를 포함하여 배경 레벨을 감소시켰다. 이 방법은 비펄스된 세포와 부적절한 펩티드로 펄스된 세포에 대한 다량의 염색으로 입증되는 바와 같이 완전히 성공적인 것은 아니었다. 그러나, 실질적인 양의 특이적 표지화가 배경 레벨의 염색에 대해 관찰되었다(도 49). 흥미롭게도, tax TCR 코팅된 비드를 사용한 tax 펩티드 펄스된 T2 세포의 표지가 일부 관찰되었다. 이 표지화는 TCR 사량체를 사용하여 검출할 수 있는 것 보다 더 낮은 범위의 펩티드 농도에서 가능하며, 이는 TCR을 더욱 다량체화시키면 더 낮은 레벨로 제공된 항원에 대해 검출 및 결합 가능하다는 것을 제시한다.
참고 문헌

Claims (33)

  1. MHC-펩티드 복합체에 특이적인 다수의 T 세포 수용체를 포함하는, MHC-펩티드 복합체에 대한 결합용 합성 다가 T 세포 수용체(TCR) 복합체.
  2. 제1항에 있어서, T 세포 수용체가 α쇄 및 β쇄를 보유한 αβ T 세포 수용체인 것이 특징인 TCR 복합체.
  3. 제2항에 있어서, α쇄 및 β쇄가 T 세포 수용체 α쇄 및 β쇄의 가용성 형태인 것이 특징인 TCR 복합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, T 세포 수용체가 2 이상의 T 세포 수용체의 다량체 형태로 존재하는 것이 특징인 TCR 복합체.
  5. 제4항에 있어서, 다량체가 삼량체 또는 사량체인 것이 특징인 TCR 복합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, T 세포 수용체가 링커 분자를 통해 서로 연합되어 있는 것이 특징인 TCR 복합체.
  7. 제6항에 있어서, 링커 분자가 아비딘, 스트렙타비딘 또는 엑스트라비딘과 같은 다가 부착 분자인 것이 특징인 TCR 복합체.
  8. 제7항에 있어서, 하나 이상의 T 세포 수용체 α쇄 또는 β쇄가 비오틴과 같은 변형 효소용 아미노산 인식 서열을 포함하는 융합 단백질로부터 유도되는 것이 특징인 TCR 복합체.
  9. 제8항에 있어서, T 세포 수용체가 비오티닐화되는 것이 특징인 TCR 복합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 비다량체 T 세포 수용체 헤테로이량체와 비교하여 결합능이 증가된 다량체화된 재조합 T 세포 수용체 헤테로이량체를포함하는 것이 특징인 TCR 복합체.
  11. 비다량체 T 세포 수용체 헤테로이량체와 비교하여 결합능이 증가된 다량체화된 재조합 T 세포 수용체 헤테로이량체를 포함하는 다가 TCR 복합체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, T 세포 수용체가
    i) 제1 이종 C 말단 이량체화 펩티드를 보유한 재조합 T 세포 수용체 α쇄 또는 γ쇄 세포외 도메인; 및
    ii) 제1 이량체화 펩티드와 특이적으로 헤테로이량체화하여 헤테로이량체 도메인을 형성하는 제2 C 말단 이량체화 펩티드를 보유한 재조합 T 세포 수용체 β쇄또는 δ쇄 세포외 도메인을 포함하는 리폴딩된 재조합 T 세포 수용체인 것이 특징인 TCR 복합체.
  13. 제12항에 있어서, 세포질 도메인에 인접한 α쇄 및 β쇄 또는 γ쇄 및 δ쇄간의 천연 T 세포 수용체에 존재하는 이황화 결합이 재조합 T 세포 수용체에는 없는 것이 특징인 TCR 복합체.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 헤테로이량체화 도메인이 감겨진 코일 도메인인 것이 특징인 TCR 복합체,
  15. 제14항에 있어서, 이량체화 펩티드가 c-jun 및 c-fos 이량체화 펩티드인 것이 특징인 TCR 복합체.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, T 세포 수용체 사슬과 헤테로이량체화 펩티드 사이에 위치한 가요성 링커를 포함하는 것이 특징인 TCR 복합체.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, T 세포 수용체가 이.콜리 발현계에서 발현되는 것이 특징인 TCR 복합체.
  18. 제10항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, T 세포 수용체가 C 말단에서 비오티닐화되는 것이 특징인 TCR 복합체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, T 세포 수용체가 지질 이중층과 연합되어 있는 것이 특징인 TCR 복합체.
  20. 제19항에 있어서, 지질 이중층이 소포를 형성하는 것이 특징인 TCR 복합체.
  21. 제20항에 있어서, T 세포 수용체가 소포의 외부에 부착되어 있는 것이 특징인 TCR 복합체.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, T 세포 수용체가 소포의 유도된 지질 성분을 통해 소포에 부착되는 것이 특징인 TCR 복합체.
  23. 제19항 또는 제20항에 있어서, T 세포 수용체가 지질 이중층에 매립되어 있는 것이 특징인 TCR 복합체.
  24. 제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, T 세포 수용체가 입자에 부착되어 있는 것이 특징인 TCR 복합체.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 검출가능한 표지를 추가로 포함하는 것이 특징인 TCR 복합체.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역자극제 또는 세포독성제와 같은 치료제를 추가로 포함하는 것이 특징인 TCR 복합체.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생체 내에서 사용하기 위한 약학적 허용 제제로 존재하는 것이 특징인 TCR 복합체.
  28. (i) (a) 다수의 T 세포 수용체를 포함하는 합성된 다가 T 세포 수용체 복합체 및/또는 (b) 비다량체 T 세포 수용체 헤테로이량체에 비해 결합능이 증가된 다량체화된 재조합 T 세포 수용체 헤테로이량체를 포함하는 합성된 다가 T 세포 수용체 복합체를 제공하는 단계(상기 T 세포 수용체들은 MHC-펩티드 복합체에 특이적임);
    (ii) 다가의 TCR 복합체를 MHC-펩티드 복합체와 접촉시키는 단계; 및
    (iii) MHC-펩티드 복합체에 대한 다가 TCR 복합체의 결합을 검출하는 단계를 포함하여 MHC-펩티드 복합체를 검출하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 다가 TCR 복합체가 검출가능한 표지와 함께 제공되는 것이 특징인 MHC-펩티드 복합체를 검출하는 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 특이적 펩티드 항원을 제공하는 세포를 검출하기 위한 것이 특징인 MHC-펩티드 복합체를 검출하는 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 다가 TCR 복합체가 제1항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 기재된 다가 TCR 복합체인 것이 특징인 MHC-펩티드 복합체를 검출하는 방법.
  32. (i) (a) 다수의 T 세포 수용체를 포함하는 합성된 다가 TCR 복합체 및/또는 (b) 비다량체 T 세포 수용체 헤테로이량체에 비해 결합능이 증가된 다량체화된 재조합 T 세포 수용체 헤테로이량체를 포함하는 합성된 다가 TCR 복합체를 제공하는 단계(상기 T 세포 수용체들은 MHC-펩티드 복합체에 특이적이고 다가 TCR 복합체는 이와 연합된 치료제를 보유함);
    (ii) 다가의 TCR 복합체를 T 세포 수용체가 표적 세포에 부착할 수 있는 조건하에 유력한 표적 세포와 접촉시키는 단계를 포함하여 표적 세포에 치료제를 전달하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 다가 TCR 복합체가 제1항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 기재된 다가 TCR 복합체인 것이 특징인 표적 세포에 치료제를 전달하는 방법.
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