JP2002515244A - 可溶性ｔ細胞受容体 - Google Patents

可溶性ｔ細胞受容体

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JP2002515244A JP2000549728A JP2000549728A JP2002515244A JP 2002515244 A JP2002515244 A JP 2002515244A JP 2000549728 A JP2000549728 A JP 2000549728A JP 2000549728 A JP2000549728 A JP 2000549728A JP 2002515244 A JP2002515244 A JP 2002515244A
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ベル，ジョン，イーヴィング
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ボールター，ジョナサン，マイケル
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、組換え可溶性Ｔ細胞受容体に関するものである。該Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、再生されており、第一の異種のＣ末端二量体化ペプチドを有する組換えＴＣＲαまたはγ鎖細胞外ドメイン；および第一の二量体化ペプチドと特異的にヘテロ二量体化されてヘテロ二量体ドメインを形成する第二のＣ末端二量体化ペプチドを有する組換えＴＣＲβまたはδ鎖細胞外ドメインを含み、これらは高次コイルドメインであり得る。本発明はまた、組換えＴＣＲをコードした核酸配列および該組換えＴＣＲを製造する方法も提供する。該ＴＣＲは特異的なＭＨＣ−ペプチド複合体を検出することができるように検出可能な標識で標識され得る。あるいは、それを細胞障害剤または免疫促進剤のような治療剤に結合させ、特異的なＭＨＣ−ペプチド複合体の部位にこのような薬剤を運搬することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 可溶性Ｔ細胞受容体 本発明は、非膜結合組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ならびにそれらを製造する
ための方法および試薬に関するものである。
【０００２】 一般的背景 １．細胞表面での抗原提示 ＭＨＣ分子は、細胞表面での認識のため、適応する免疫系の細胞アームにより
、短いタンパク質フラグメント、ペプチド抗原を提示する特殊化されたタンパク
質複合体である。
【０００３】 クラスＩＭＨＣは、種々の重鎖および一定の軽鎖、β２ミクログロブリンを有
する二量体タンパク質複合体である。細胞内で加工され、ＭＨＣのバインディン
グクレフト（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｌｅｆｔ）にローディングされ、ＭＨＣ重鎖に
より複合体が膜に固定される細胞表面に輸送されるペプチドを、クラスＩＭＨＣ
は提示する。ペプチドは、通常、長さにして８〜１１のアミノ酸であるが、ＭＨ
Ｃに結合された時にペプチドにローディングされる弓なりの程度に依存する。Ｍ
ＨＣ重鎖の膜末端のα１およびα２ドメインで形成されるバインディングクレフ
トは「閉鎖した」末端を有し、結合しうるペプチドの長さに非常に厳しい制限を
賦課する。
【０００４】 クラスIIＭＨＣも、α鎖（重鎖）およびβ鎖（軽鎖）を有する二量体タンパク
質であり、双方ともに可変の糖タンパク質であり、膜貫通ドメインにおいて細胞
内に固定される。クラスＩＭＨＣ同様、クラスII分子も、１２〜２４のアミノ酸
からなるより長いペプチドが内部に挿入されるバインディングクレフトを形成す
る。ペプチドはエンドサイトーシスによって細胞外環境から取り込まれ、後に細
胞表面に輸送されるクラスII複合体内にローディングされる前に加工される。
【０００５】 各細胞は最大６種類のクラスＩ分子および同様の種類のクラスII分子において
ペプチドを提示し、提示されるＭＨＣ複合体の総数は細胞あたり１０5〜１０6の
範囲である。クラスＩ分子で提示されるペプチドの種類は、一般的には１０００
〜１００００であると推定され、これらの９０％は、細胞あたり１０〜１００個
のコピーが存在する（Ｈｕｎｔ，Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｃｈ
ｉｃｚ，Ｕｒｂａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ａｐｐｅ
ｌｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｈｕｃｚｋｏ，Ｂｏｄｎａｒ ｅｔ ａｌ．
， １９９３）。最も多いペプチドは、提示される全ペプチドの０．４〜５％を
構成すると考えられている、即ち最大２００００もの同一の複合体が１つの細胞
に存在しうる。最も多い単一のペプチド複合体の平均数は、細胞あたり２０００
〜４０００の範囲内であるようであり、認識可能なＴ細胞エピトープの典型的な
提示レベルは、細胞あたり１００〜５００複合体の範囲である（概要は（Ｅｎｇ
ｅｌｈａｒｄ，１９９４）参照）。
【０００６】 ２．抗原提示細胞の認識 ＭＨＣ−ペプチドように広範な種類の細胞が抗原を提示することができ、その
特性を有する細胞は抗原提示細胞（ＡＰＣ）として知られる。特定の抗原を提示
する細胞のタイプは、抗原が最初に免疫系の細胞と、何処で、どのように、遭遇
するかに依存する。ＡＰＣには、リンパ節および脾臓のＴ細胞領域に大量に見出
される嵌合性樹状細胞、皮膚中のランゲルハンス細胞、リンパ組織のＢ細胞領域
中の濾胞樹状細胞、単球、マクロファージ、および他の単球／マクロファージ系
列細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞、並びに典型的なＡＰＣではないがＡＰＣにように
作用しうる内皮細胞や線維芽細胞のような種々の他の細胞が含まれる。
【０００７】 抗原提示細胞は、自己ペプチドに反応するＴ細胞を確実に根絶やしにする（陰
性選択）ために設計された選択手段が施される場所である胸腺（Ｔ細胞）中で成
熟したリンパ球亜群によって認識される。また、提示されたＭＨＣ変種を認識す
る能力を有さないＴ細胞は、成熟することができない（陽性選択）。
【０００８】 Ｔ細胞による特異的なＭＨＣ−ペプチド複合体の認識は、αおよびβ鎖を含む
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によって媒介され、その両方は膜に固定されている。抗
体遺伝子において観察されるものと同様の組換えプロセスによって、ＴＣＲα鎖
およびβ鎖遺伝子は、ドメインに結合する細胞外抗原に莫大な多様性（１０13〜
１０15の種々の可能性）を生む、変異（Ｖａｒｉａｂｌｅ）、結合（Ｊｏｉｎｉ
ｎｇ）、多様性（Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）、および定常性（Ｃｏｎｓｔａｎｔ）要
素により再配列される。ＴＣＲはγ鎖およびδ鎖を有する異なる形態でも存在す
る。しかし、これらはＴ細胞の約５％存在するにすぎない。
【０００９】 抗体とＴＣＲは、特異的な手法で抗原を認識するただ２タイプの分子である。
したがって、ＴＣＲはＭＨＣで提示される特定のペプチド抗原に対する唯一の受
容体であり、外来ペプチドはしばしば、細胞内部における唯一の異常のサインで
ある。
【００１０】 ＴＣＲは莫大な多様性をもって発現し、それぞれのＴＣＲは１または２、３の
ＭＨＣ−ペプチド複合体に対して特異的である。ＴＣＲとＭＨＣ−ペプチドリガ
ンドとの接触は極めて短い時間であり、通常１秒の半分未満である。ＴＣＲ／Ｍ
ＨＣ−ペプチドだと推定されるＴ細胞と標的細胞との付着は、補受容体リガンド
接触の数と同様、いくつのＴＣＲ／ＭＨＣ−ペプチド接触が用いられるかに依存
している。
【００１１】 Ｔ細胞認識は、Ｔ細胞及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）が直接物理的に接触してい
る時に起こり、抗原特異的なＴＣＲとｐＭＨＣ複合体との会合によって誘導され
る。ＴＣＲは、シグナル伝達を媒介する際に含まれるＣＤ３複合体の不変タンパ
ク質に会合する、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するヘテロ二量体の細
胞表面タンパク質である。ＴＣＲはαβおよびγδ型で存在し、これらは構造的
に類似であるが解剖学上の位置は全く異なるものであり、おそらく機能も全く異
なる。受容体の細胞外部位は、２つの膜近位の定常ドメイン、および、抗体の相
補性決定領域（ＣＤＲ）に類似する多形性の高いループを形成する２つの膜遠位
の可変ドメインからなる。ＴＣＲ分子のＭＨＣ結合部位を形成し、ペプチド特異
性を決定するのがこれらのループである。ＭＨＣクラスＩおよびクラスIIリガン
ドも免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質であるが、抗原提示のために
分化しており、高い多形性ペプチド結合部位を有し、それらによりＡＰＣ細胞表
面において短いペプチドフラグメントの種々のアレイを提示することが可能にな
る。
【００１２】 近年、これらの相互作用の具体例について、構造的な特性が決定されている（
Ｇａｒｂｏｃｚｉ，Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．１９９６；Ｇａｒｃｉａ，Ｄｅｇ
ａｎｏ ｅｔ ａｌ．１９９６；Ｄｉｎｇ，Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．１９９８
）。ネズミおよびヒトクラスＩｐＭＨＣ−ＴＣＲ複合体の結晶構造は、そのｐＭ
ＨＣリガンド上でのＴＣＲの対角配向を示唆しており、界面での形状相補性が少
ないことを示している。ＣＤＲ３ループは、ペプチド残基と独占的に接触する。
配位されたＴＣＲ構造と配位されていないＴＣＲ構造の比較からも、ＴＣＲ Ｃ
ＤＲループにある程度の可変性があることが提示されている（Ｇａｒｂｏｃｚｉ
ａｎｄ Ｂｉｄｄｉｓｏｎ １９９９）。
【００１３】 Ｔ細胞活性モデルにより、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との界面でのその
ようなタンパク質−タンパク質相互作用が、ウイルス感染した標的細胞の殺傷の
ような反応をどのように発生させるか、を説明しようと試みられている。ＴＣＲ
−ｐＭＨＣ相互作用の物理的特性は、これらのモデルの多くにおいて臨界値とし
て含まれる。例えば、ＴＣＲ解離レートの定量的変化が、完全なまたは部分的な
Ｔ細胞活性や拮抗作用のような受容体進入機構の生物学的結果における定性的な
変化に反映されることが見出されている（Ｍａｔｓｕｉ，Ｂｏｎｉｆａｃｅ ｅ
ｔ ａｌ．１９９４；Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｂｅｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９
９６；Ｄａｖｉｓ，Ｂｏｎｉｆａｃｅ ｅｔ ａｌ．１９９８）。
【００１４】 ＴＣＲ−ｐＭＨＣ相互作用は、低い親和性および比較的遅い反応速度を有する
ことが示されている。多くの研究においては、Ｂａｉｃｏｒｅ（商標）のような
バイオセンサー技術が用いられており（Ｗｉｌｌｃｏｘ，Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．
１９９９；Ｗｙｅｒ，Ｗｉｌｌｃｏｘ ｅｔ ａｌ． １９９９）、それらは表
面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）を利用するものであり、直接タンパク質−タンパク質
相互作用の親和性およびリアルタイムの反応速度測定をすることが可能になる（
Ｇａｒｃｉａ，Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．１９９６；Ｄａｖｉｓ，Ｂｏｎｉｆａ
ｃｅ ｅｔ ａｌ．１９９８）。しかしながら、研究されている受容体は、異反
応性ＴＣＲや人工免疫抗原に対する反応性が高められたものである。
【００１５】 ３．ＭＨＣペプチド複合体とのＴＣＲおよびＣＤ８相互作用 クラスＩＭＨＣ−ペプチド複合体によって制限される（例えば、認識する）Ｔ
細胞の極めて大部分は、活性化のために補受容体ＣＤ８の進入をも必要とし、一
方クラスIIＭＨＣによって制限されるＴ細胞はＣＤ４の進入を必要とする。Ｔ細
胞活性化における補受容体の正確な機能は、まだ完全にははっきりしていない。
活性化を制御する重要なメカニズムおよびパラメーターもまだである。しかしな
がら、ＣＤ８およびＣＤ４の双方は、Ｔ細胞活性化の特性を決定するごく初期の
チロシンリン酸化現象に含まれるキナーゼｐ５６lckと会合する細胞質ドメイン
を有する。ＣＤ８は二量体受容体であり、αα型や、より一般的なαβ型で発現
する。ＣＤ４は単量体である。ＣＤ８受容体においては、α鎖のみがｐ５６lck
と会合する。
【００１６】 ＴＣＲやＣＤ８のＭＨＣへの結合を制御する物理的パラメーターの近年の測定
は、受容体の可溶性変種を用いており、ＴＣＲによる結合が認識現象を支配して
いることを示している。ＴＣＲは、補受容体と比較してＭＨＣに対して非常に高
い親和性を有している（Ｗｉｌｌｃｏｘ，Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，１９９９、Ｗｙ
ｅｒ，Ｗｉｌｌｃｏｘ ｅｔ ａｌ． １９９９）。
【００１７】 ＭＨＣと受容体とのそれぞれの相互作用は、例えば３７℃といった生理的温度
では非常に短時間である。ＴＣＲ／ＭＨＣ−ペプチド相互作用の半減期の大体の
数値は、ＨＬＡ−Ａ*０２０１（ＨＬＡ−Ａ２）によって提示されたインフルエ
ンザウイルス”マトリックス”ペプチドに対して特異的なヒトＴＣＲを用いて測
定したところ、０．７秒である。このＭＨＣ／ペプチド複合体とのＣＤ８αα相
互作用の半減期は０．０１秒未満であるか、少なくとも１８倍は早い。
【００１８】 ４．可溶性ＭＨＣ−ペプチド複合体の生産 可溶性ＭＨＣ−ペプチド複合体は、抗原提示細胞の表面の分子をパパインで開
裂することによってまず得られた（Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９８５）。この取り組みによって結晶化のための物質が提供さ
れたが、クラスＩ分子の場合は、近年、Ｅ．ｃｏｌｉにおける重鎖および軽鎖を
それぞれ発現させ、合成ペプチドの存在下で再生する代用法がある（Ｇａｒｂｏ
ｃｚｉ， Ｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９２； Ｍａｄｄｅｎ， Ｇａｒｂｏ
ｃｚｉ ｅｔ ａｌ． １９９３； Ｇａｒｂｏｃｚｉ， Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ
ａｌ． １９９４；Ｒｅｉｄ ＭｃＡｄａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｒｅ
ｉｄ，Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｓｍｉｔｈ，Ｒｅｉｄ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９６；Ｓｍｉｔｈ，Ｒｅｉｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｇａｏ，Ｔ
ｏｒｍｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｇａｏ，Ｇｅｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９
９８）。この取り組みは従来の方法よりもいくつかの利点を有する、即ち、低コ
ストでより高い収率が得られ、ペプチド同定を非常に正確に制御することができ
、また、最終生成物はより均一である。さらに、例えば、タンパク質標識と融合
させるなどといった、変性された重鎖または軽鎖を容易に発現させることができ
る。
【００１９】 ５．可溶性ＴＣＲ 現在、ヒトＴＣＲ−ｐＭＨＣ相互作用に関する公開データ、および天然（例え
ばウイルス）エピトープに特異的な自然選択されたＴＣＲを解析した研究はない
。このことは、ＳＰＲに対して安定なタンパク質、すなわち相同で、単量体で、
正しく折りたたまれた、ミリグラム分量で使用可能で、かつ濃縮の範囲外でも安
定であるタンパク質を得ることの困難さを反映している。
【００２０】 特異的ＴＣＲ−ｐＭＨＣ相互作用を調査する目的のためだけでなく、感染を検
出する、または自己免疫病マーカーを検出する、またはＴ細胞ワクチンの有効性
を検出するための診断道具としても、非膜結合性（または可溶性）形態の組換え
ＴＣＲが製造できるということは利点となるだろう。可溶性ＴＣＲはまた、染色
に関する応用があり、例えば、ＭＨＣの環境で提示された特別なウイルス抗原の
存在について細胞を染色することである。同様に、可溶性ＴＣＲは、例えば細胞
傷害性化合物または免疫促進性化合物のような治療剤を、特別な抗原を提示して
いる細胞に運搬するために用いられる。
【００２１】 一つ以上のサブユニットおよび膜貫通ドメインからなるタンパク質は、可溶性
の形態で製造することが困難であり、なぜなら多くの場合において、該タンパク
質はその膜貫通領域によって安定されているためである。これはＴＣＲの場合で
ある。
【００２２】 可溶性ＴＣＲの生産は、最近になって幾つかのグループによって開示されたも
のである。一般的には、全ての方法はＴＣＲの切りとられた型を開示するもので
あり、細胞外ドメインまたは細胞外ドメインと細胞質ドメインとのみを含むもの
である。したがって、全てのケースにおいて、膜貫通ドメインは発現したタンパ
ク質から削除される。多くの報告は、それらの方法に従って生産されたＴＣＲは
ＴＣＲ特異的抗体によって認識されることを示しているが（抗体によって認識さ
れる組換えＴＣＲの一部は正確に折りたたまれることを示している）、低い濃度
でも安定で、ＭＨＣ−ペプチド複合体を認識しうる可溶性ＴＣＲを高い収率で生
産しうるものはない。
【００２３】 結晶化しうる物質を生産する最初の取り組みは、真核細胞中での発現を使用し
たものであるが、該物質を生産するのは極めて高価である（Ｇａｒｃｉａ，Ｄｅ
ｇａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｇａｒｃｉａ，Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．
，１９９６）。結晶化しうる物質を生産する他の取り組みは、従来ＭＨＣ−ペプ
チド複合体のために用いられていたものと同様のＥ．ｃｏｌｉ発現系を用いたも
のである（Ｇａｒｂｏｃｚｉ，Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｇａｒｂ
ｏｃｚｉ，Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。後者の方法は、鎖同士のジスル
フィド架橋の形成に関与するシステイン残基の直前で切り取られるＴＣＲ鎖の細
胞外ドメインを発現し、インビトロで再生が生じるが、一般的に適用不可能であ
ることが判明した。殆どのヘテロ二量体ＴＣＲは、このような方法で生産された
場合は、α鎖とβ鎖との間の低い親和性のため不安定なようである。
【００２４】 さらに、可溶性ＴＣＲの技術科された生産に関する幾つかの他の記載もある。
これらの幾つかは、ＴＣＲのαまたはβ鎖の一方の発現を記載しているに過ぎな
い。従って、ＭＨＣ−ペプチド特異性結合を維持しないタンパク質が生成される
（Ｃａｌａｍａｎ，Ｃａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｉｓｈｉｉ，Ｎａ
ｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。β鎖結晶は、α鎖なしに、単独または超
抗原に結合して得られている（Ｂｏｕｌｏｔ， Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．
１９９４；Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｂｏｕｌｏｔ ｅｔ ａｌ．１９９５；Ｆｉｅｌｄ
ｓ，Ｍａｌｃｈｉｏｄｉ ｅｔ ａｌ．１９９６）。
【００２５】 他の報告は、ヘテロ二量体γ／δまたはα／βＴＣＲの発現のための方法を記
載している（Ｇｒｅｇｏｉｒｅ，Ｒｅｂａｉ ｅｔ ａｌ．１９９１；Ｎｅｃｋ
ｅｒ，Ｒｅｂａｉ ｅｔ ａｌ．１９９１；Ｅｉｌａｔ，Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ
ａｌ．１９９２；Ｗｅｂｅｒ，Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９２
；Ｃｏｒｒ，Ｓｌａｎｅｔｚ ｅｔ ａｌ．１９９４；Ｉｓｈｉｉ，Ｎａｋａｎ
ｏ ｅｔ ａｌ．１９９５；Ｇｒｅｇｏｉｒｅ，Ｍａｌｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ
．１９９６；Ｒｏｍａｇｎｅ，Ｐｅｙｒａｔ ｅｔ ａｌ．１９９６）。幾つか
のケースにおいては、ＴＣＲは単鎖融合タンパク質として発現している（Ｂｒｏ
ｃｋｅｒ，Ｐｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｇｒｅｇｏｉｒｅ，Ｍａｌｉ
ｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｓｃｈｌｕｅｔｅｒ，Ｓｃｈｏｄｉｎ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９６）。他の方策は、Ｉｇヒンジおよび一定のドメインに融合
したキメラタンパク質としてＴＣＲ鎖を発現させるものである（Ｅｉｌａｔ，Ｋ
ｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｗｅｂｅｒ，Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９９２）。他のキメラＴＣＲタンパク質は、互いに高い親和性
と特異性を有する高次コイルを形成するように設計された配列で発現しており、
従って、ＴＣＲα−β接触が安定化し、溶解度を高められる。この方策はチャン
（Ｃｈａｎｇ），バオ（Ｂａｏ）等（１９９４年）によって講じられており、彼
等はそのタンパク質の膜貫通領域を、特異的に相互作用してヘテロ二量体高次コ
イルを形成するような二個の合成ペプチド配列、酸ペプチドおよび塩基ペプチド
を含むロイシンジッパータンパク質で置き換えた。その著者は、真核細胞におけ
るバキュロウイルス発現系を用いヘテロ二量体ＴＣＲタンパク質を分泌させた。
人工ロイシンジッパーペプチドは、ＴＣＲαおよびβ鎖のヘテロ二量体化を補助
し、これらはまた鎖同士のジスルフィド結合によってジッパーペプチドとの融合
点の真上で結合されている。しかしながら、これらの技術は、好結果をその後証
明されていないため、説明されている可溶性ＴＣＲはＴＣＲリガンドを認識し得
るという証拠ではない。同様に、ゴードン（Golden）、カンデカー（Khandekar
）等（１９９７年）が、ロイシンジッパー融合タンパク質としてのヘテロ二量体
Ｔ細胞受容体の製造を説明した。チャン等のように、可溶性ＴＣＲは、α−β鎖
同士のジスルフィド結合を有する分泌ヘテロ二量体としてE.coli中で発現された
。また、このすでに折りたたまれたＴＣＲヘテロ二量体がそのリガンドと相互作
用できるという証拠ははい。
【００２６】 それゆえに、その天然のリガンドを認識できるように正しく折りたたまれてい
る膜結合ＴＣＲの可溶性形態が必要である。ある期間を過ぎても安定なＴＣＲの
可溶性形態、および適切な量でそれを製造する方法もまた有用である。本発明の
目的は、これらの必要条件のいくつかまたはすべてを満たすことをねらっている
。
【００２７】 本発明 本発明は、一つの観点において、ｉ）第一の異種のＣ末端二量体化ペプチドを
持つ、組換えＴＣＲαまたはγ鎖細胞外ドメイン；および ii）第一の二量体化ペプチドと特異的にヘテロ二量体化されてヘテロ二量体化
ドメインを形成する第二のＣ末端二量体化ペプチドを持つ、組換えＴＣＲβまた
はδ鎖細胞外ドメイン を含む、再生組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。
【００２８】 本発明のＴＣＲは、ヘテロ二量体として分泌されるというよりむしろ発現され
た後に再生されるものであり、これまでに利用できた可溶性ＴＣＲより立体構造
的に優れている。これは、ＭＨＣ−ペプチド複合体を認識する能力によって示さ
れている。それはまた、比較的低濃度でも安定である。１ｍｇ／ｍｌ以下、好ま
しくは約１０μｇ／ｍｌ以下の濃度でそれは安定である。
【００２９】 さらなる観点において、本発明は、ｉ）第一の異種のＣ末端二量体化ペプチド
を持つ、組換えＴＣＲαまたはγ鎖細胞外ドメイン；および ii）第一の二量体化ペプチドと特異的にヘテロ二量体化されてヘテロ二量体化
ドメインを形成する第二のＣ末端二量体化ペプチドを持つ、組換えＴＣＲβまた
はδ鎖細胞外ドメイン を含む、生物学的に活性な組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。このよう
なＴＣＲは、好ましくは天然のＴＣＲに類似した手法で、特異的にそれから由来
するＭＨＣ−ペプチド複合体と結合する。
【００３０】 他の観点において、本発明は、ここで説明されている組換えＴＣＲをコードし
た組換え核酸配列を提供する。このような核酸配列は、Ｔ細胞クローンから分離
され得る。あるいは、それらは、例えばＴＣＲ鎖をコードしている拡散配列中に
非相同性の核酸配列を挿入することによって、または、ＴＣＲ鎖をコードしてい
る核酸配列を変異させる（挿入、欠失または置換）ことによって、合成的に製造
され得る。このように、本発明は、天然のＴＣＲの活性および／または結合特異
性を持つ合成ペプチドを、その範囲に含む。
【００３１】 本発明は、さらに他の観点において、第一の異種のＣ末端二量体化ペプチドを
持つ、組換えＴＣＲαまたはγ鎖細胞外ドメイン；および 第一の二量体化ペプチドと特異的にヘテロ二量体化してヘテロ二量体化ドメイ
ンを形成する第二のＣ末端二量体化ペプチドを持つ、組換えＴＣＲβまたはδ鎖
細胞外ドメインを発現すること ならびに、インビトロでその鎖を一緒に再生してＴＣＲヘテロ二量体を生産する
こと を含む、組換え非膜結合Ｔ細胞受容体を製造する方法を提供する。
【００３２】 本発明の組換えＴＣＲは、クラスＩＭＨＣ−ペプチド複合体およびクラスIIＭ
ＨＣ−ペプチド複合体を認識しうる。
【００３３】 本発明の組換えＴＣＲのヘテロ二量体ドメインは、好ましくはいわゆる“高次
コイル”または“ロイシンジッパー”である。これらの用語は、ヘテロ二量体を
形成するために特異的に互いに相互作用するらせんペプチド対を説明するのに用
いられている。その相互作用は、それぞれのジッパーペプチドの一端に沿って相
補的な疎水性残基が存在することによって起こる。ペプチドの特性としては、ヘ
テロ二量体の形成がヘリックスのホモ二量体の形成より非常に好ましい、という
ものである。ロイシンジッパーは、合成的にまたは天然的に発生させることがで
きる。合成ロイシンは、天然に生じるロイシンジッパーよりも格段に高い結合親
和性を持つように設計されうるが、これは必ずしも利点とは限らない。実際には
、本発明で用いられる好ましいロイシンジッパーは、天然的に生じたロイシンジ
ッパーまたは類似の結合親和性を持つロイシンジッパーである。ｃ−ｊｕｎおよ
びｃ−ｆｏｓタンパク質からのロイシンジッパーが、好適な結合親和性を有する
ロイシンジッパーの例である。他の適切なロイシンジッパーは、ｍｙｃおよびｍ
ａｘタンパク質からのものが含まれる（Ａｍａｔｉ，Ｄａｌｔｏｎ，ｅｔ ａｌ
，１９９２）。好適な特性を有する他のロイシンジッパーを、容易に設計するこ
ともできる（Ｏ’Ｓｈｅａ，ｅｔ ａｌ，１９９３年）。
【００３４】 本発明の可溶性ＴＣＲは、ｃ−ｊｕｎ（α鎖）およびｃ−ｆｏｓ（β鎖）から
のヘテロ二量体化ドメインに相当する約４０のアミノ酸のロイシンジッパー融合
体を有することが好ましい（Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ
１９８９，Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｇｌｏ
ｖｅｒ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，１９９５）。より長いロイシンジッパーを
使用してもよい。ヘテロ二量体化特異性は、少しのロイシンジッパードメインか
らなる非常に短いフラグメントにおいてでさえも維持されているようであり（Ｏ
’Ｓｈｅａ，Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ，ｅｔ ａｌ，１９９２）、より短いｃ−ｊｕ
ｎおよびｃ−ｆｏｓフラグメントで同様の利益を得ることも可能である。このよ
うなより短いフラグメントは、例えば、少なくとも８個のアミノ酸からなる。従
って、ロイシンジッパードメインは、８〜６０個の範囲のアミノ酸長さを有しう
る。
【００３５】 ロイシンジッパー対における特異性の分子的な原理は、十分に特徴が解かって
おり（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ，Ｊｏｈｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，１９８８；ＭｃＫ
ｎｉｇｈｔ，１９９１）、ロイシンジッパーは、当業者によって設計、加工され
、ホモ二量体、ヘテロ二量体または三量体複合体を形成しうる（Ｌｕｍｂ ａｎ
ｄ Ｋｉｍ，１９９５；Ｎａｕｔｉｙａｌ，Ｗｏｏｌｆｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，１
９９５；Ｂｏｉｃｅ，Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｃｈａｏ，
ｅｔ ａｌ，１９９６）。ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓロイシンジッパーに比べ
てより高い親和性を持つ、設計されたロイシンジッパーまたは他のヘテロ二量体
化ドメインは、いくつかの系において可溶性ＴＣＲを発現するのに有利である。
しかしながら、以下に詳細に述べるように、可溶性ＴＣＲがインビトロで折りた
たまれる場合には、非生産的なタンパク質凝集の形成を減少させるために、折り
たたみ中に可溶化剤が含まれることが好ましい。この現象の一つの解釈は、ロイ
シンジッパードメインの折りたたみの反応速度が、ＴＣＲ鎖に対するものよりも
早く、折りたたまれていないＴＣＲαおよびβ鎖の二量体化を導き、続いてタン
パク質凝集を引き起こす、というものである。可溶化剤を含ませることで折りた
たみ過程を遅らせ、凝集を阻害することによって、両融合ドメインの折りたたみ
が完了するまで溶液中でタンパク質を維持することができる。それゆえ、ｃ−ｆ
ｏｓおよびｃ−ｊｕｎロイシンジッパーと同等の可溶性ＴＣＲの収率を得るため
に、より高い可溶化剤濃度が必要とするかもしれない。
【００３６】 安定なホモおよびヘテロタンパク質二量体を形成するために、種々の生物系に
おいて多様な方法が用いられ、これらの各方法には、基本的には、二量体化ドメ
インを遺伝子的に改変されたタンパク質にするための選択枝が提供される。ロイ
シンジッパー（Ｋｏｕｚａｒｉｄｅｓ ａｎｄ Ｚｉｆｆ １９８９）は、おそ
らく最も一般的な二量体化モジュールであり、遺伝子的に設計されたタンパク質
二量体の製造に広く使われている。従って、酵母のサッカロミセス セレビジエ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの転写活性化タン
パク質であるＧＣＮ４のロイシンジッパーは、多くのヘテロタンパク質の直接的
なホモ二量体化に使用されている（Ｈｕ，Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｔ ａｌ，１９９３
；Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｍｏｎｔｅｌｉｏｎｅ，ｅｔ ａｌ，１９９８）。好
ましい方法は、Ｊｕｎ／Ｆｏｓロイシンジッパー対のような、ヘテロ二量体複合
体の形成をさせるジッパーを用いることである（ｄｅ Ｋｒｕｉｆ ａｎｄ Ｌ
ｏｇｔｅｎｂｅｒｇ，１９９６；Ｒｉｌｅｙ，Ｒａｌｓｔｏｎ．ｅｔ ａｌ，１
９９６）。
【００３７】 本発明の組換えＴＣＲのヘテロ二量体化ドメインは、ロイシンジッパーに限ら
れない。すなわち、それは、ジスルフィド架橋−形成要素を提供することもでき
る。あるいは、ＳＨ３ドメインおよび疎水性／プロリンリッチのカウンタードメ
インを提供することもでき、これらはシグナルローディングに関与するタンパク
質間で見られるタンパク質−タンパク質相互作用を担う（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇ
ｅｒにより再調査（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ １９９４）。シグナルローディ
ングカスケードに関与するタンパク質間で見出される他の天然のタンパク質−タ
ンパク質相互作用は、翻訳後に改変されたアミノ酸とこのような改変された残基
を特異的に認識するタンパク質モジュールとの間の関係に依存している。このよ
うな翻訳後改変アミノ酸およびタンパク質モジュールは、本発明の組換えＴＣＲ
を形成しうる。このタイプのタンパク質対の例としては、上皮成長因子受容体ま
たは血小板由来成長因子のようなチロシンリン酸化受容体およびＧＲＢ２のＳＨ
２ドメイン等が挙げられる（Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｄａｌｙ，ｅｔ ａｌ，１
９９２；Ｂｕｄａｙ ａｎｄ Ｄｏｗｎｗａｒｄ，１９９３）。科学の全分野に
おいて、新規の二量体化分子が活発に探索されており（Ｃｈｅｖｒａｙ ａｎｄ
Ｎａｔｈａｎｓ，１９９２）、完全な人工分子の製造方法が現在開発されてい
る（Ｚｈａｎｇ，Ｍｕｒｐｈｙ，ｅｔ ａｌ，１９９９）。
【００３８】 好ましい本発明の組換えＴＣＲにおいては、天然のαおよびβＴＣＲ鎖におけ
る２つのシステイン残基間および天然のγおよびδ鎖間において形成される鎖内
のジスルフィド結合が欠けている。これは、例えば、二量体化ドメインをシステ
イン残基上でＴＣＲ受容体鎖に融合させ、これらの残基を組換えタンパク質から
遮断することによって達成できる。他の例においては、一またはそれ以上のシス
テイン残基が、ジスルフィド結合形成に関与しない他のアミノ酸残基で置換され
る。機能的ＴＣＲのインビトロにおける折りたたみに有害かもしれないため、こ
れらのシステイン残基は取り入れなくてもよい。
【００３９】 本発明に係る多価ＴＣＲ複合体の、好適な再生された組換えＴＣＲのαおよび
β鎖またはγおよびδ鎖の再生は、適切な再生条件下においてインビトロで起こ
る。特殊な実施形態において、正しいコンホメーションを持つ組換えＴＣＲは、
尿素のような可溶化剤を含む再生バッファー中で可溶化ＴＣＲ鎖を再生すること
によって得られる。尿素は少なくとも０．１Ｍ、少なくとも１Ｍ、少なくとも２
．５Ｍまたは約５Ｍの濃度で存在することが好ましい。使用できる代わりの可溶
化剤は、グアニジンであり、０．１Ｍ〜８Ｍ、好ましくは少なくとも１Ｍまたは
少なくとも２．５Ｍの濃度で存在する。再生の前に、システイン残基の完全な還
元を確実にするため還元剤を使用することが好ましい。さらに、ＤＴＴやグアニ
ジンのような変性剤を必要に応じて使用できる。種々の変性剤および還元剤を再
生段階の前に使用することができる（例えば、尿素、β−メルカプトエタノール
）。例えばシステイン／システアミン酸化還元対、ＤＴＴまたはβ−メルカプト
エタノール／空気の酸素、および還元型および酸化型のシステイン等などの、代
わりの酸化還元対を、再生中に使用してもよい。
【００４０】 ここで説明される単量体ＴＣＲは、例えば診断目的に適した標識のような検出
可能な標識で標識され得る。このようにして、本発明は、ＭＨＣ−ペプチド複合
体に特異的な本発明のＴＣＲでＭＨＣ−ペプチド複合体と接触すること；および
、該ＭＨＣ−ペプチド複合体に該ＴＣＲが結合していることを検出することを含
む、ＭＨＣ−ペプチド複合体を検出する方法を提供する。ビオチン化ヘテロ二量
体を用いて形成された四量体ＴＣＲにおいて、蛍光ストレプトアビジン（商業的
に購入可能）が検出可能な標識を提供するために用いられる。蛍光標識された四
量体は、例えば該ＴＣＲにとって特異的なペプチドを搭載している抗原提示細胞
を検出するための、ＦＡＣＳ分析での使用に適している。
【００４１】 可溶性ＴＣＲが検出され得る他の方法は、ＴＣＲ−特異的抗体、特にモノクロ
ーナル抗体の使用によるものである。多くの商業的に購入可能な抗ＴＣＲ抗体が
あり、例えばβＦ１やαＦ１等であり、これらはそれぞれβ鎖およびα鎖の定常
領域を認識する。
【００４２】 ＴＣＲは、例えば細胞を殺すのに用いる例えば毒性成分である治療剤またはイ
ンターロイキンもしくはサイトカインのような免疫促進剤に、代わりにまたは付
加的に結合し得る。このように、本発明は、標的細胞に治療剤を運搬する方法を
提供するものであり、その方法はＴＣＲが該標的細胞に付着できる条件下で、潜
在的な標的が本発明のＴＣＲと接触することを含み、前記ＴＣＲはＭＨＣ−ペプ
チド複合体に特異的で、それらに会合する治療剤を有している。特に、可溶性Ｔ
ＣＲは、特別な抗原を提示している細胞の部位に治療剤を運搬するために用いら
れる。例えば、毒素が腫瘍に運搬され、それにより腫瘍を根絶することを助ける
。腫瘍におけるすべての細胞が抗原を提示するわけではなく、それゆえにすべて
の腫瘍細胞が免疫系によって検出されることはないことから、これは多くの状況
および特に腫瘍に対して有用であろう。可溶性ＴＣＲを用いて、それが結合する
細胞上だけでなく局地的にその効果を発揮しうるような化合物が運搬されうる。
このように、一つの特別な方法により、腫瘍抗原に特異的なＴ細胞受容体に結合
した抗腫瘍分子を想像することができる。
【００４３】 多くの毒素がこの用途のために使用され、例えば放射活性化合物、酵素（例え
ばパーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ））または化学療法剤（例えばシス−プラス
チン（ｃｉｓ−ｐｌａｔｉｎ））である。毒素の効果が望ましい部位で発揮され
ていることを確実にするために、その化合物がゆっくり放出されるように、毒素
はストレプトアビジンに結合したリポゾームの内側に存在し得る。これは体内で
輸送されている間に効果が失われることを防ぎ、ＴＣＲが適切な抗原提示細胞に
結合した後に毒素が最大の効果を持つことを確実にするだろう。
【００４４】 毒性成分のようなアンカー部位を可溶性ＴＣＲに標識または付着させる代わり
の方法は、混合分子多量体（ｍｉｘｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｍｕｌｔｉｍｅｒ
）において標識または他の成分を含むことである。このような多量体分子の例と
して、３つのＴＣＲ分子および１つのペルオキシダーゼ分子を含む四量体がある
。これは、ＴＣＲおよび酵素をモル比を３：１で混合し、四量体複合体を作成し
、正しい分子比でない任意の複合体から望ましい複合体を分離することによって
達成される。混合分子は、立体傷害が解決していない、または分子の望ましい機
能を顕著に損なわせている場合、分子の任意の組み合わせを含む。ストレプトア
ビジン分子上の結合部位の位置取り（ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ）は、立体傷害が
生じそうにないことから、混合四量体に適切である。
【００４５】 本発明の組換えＴＣＲ鎖は、ＴＣＲドメインと二量体ペプチドとの間に配置さ
れた可変性リンカーを有することが好ましい。適切な可変性リンカーは、グリシ
ンを含む標準的なペプチドリンカーを含み、例えばグリシンまたはセリンを含む
リンカーが挙げられる。鎖内ジスルフィド結合を形成しているシステイン残基に
近いＣ−末端を切りとることが、αおよびβ鎖が細胞性ＴＣＲ中のこれらの残基
を介して近接しているため有益であると思われる。それゆえ、ヘテロ二量体化ド
メインへＴＣＲ鎖からのゆがみのない移行をするためには、相対的に短いリンカ
ー配列のみが必要とされる。リンカー配列はＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＧｌｙまたはＧｌ
ｙ−Ｇｌｙが好適に使用される。しかしながら、リンカー配列は多様である。例
えば、リンカーは完全に省略されるか、または一つの残基に減じられ、この場合
グリシン残基が好ましい。α−β鎖の安定性を低下させ、ＴＣＲの細胞外ドメイ
ンから二量体化ペプチドを分離させるプロテアーゼの攻撃から保護するのであれ
ば、より長い変種のリンカーを可溶性ＴＣＲに用いることもできる。
【００４６】 可溶性組換えＴＣＲは必ずしもα−βＴＣＲではない。発生の初期のみに発現
する不変のα鎖（Ｐｒｅ−ＴＣＲ）を含むＴＣＲ分子に加えて、γ−δ、α−δ
およびγ−βＴＣＲ分子も含まれる。γ−δＴ細胞受容体を発現する細胞と逆に
、Ｐｒｅ−ＴＣＲはα−βＴ細胞受容体を発現する細胞系統を規定する（概要は
、Ａｉｆａｎｔｉｓ，Ａｚｏｇｕｉ，ｅｔ ａｌ，１９９８；ｖｏｎ Ｂｏｅｈ
ｍｅｒ，Ａｉｆａｎｔｉｓ，ｅｔ ａｌ，１９９８；Ｗｕｒｃｈ，Ｂｉｒｏ，ｅ
ｔ ａｌ，１９９８）参照）。Ｐｒｅ−ＴＣＲは、不変のＰｒｅ−ＴＣＲα鎖と
対をなすＴＣＲβ鎖と共に発現され（Ｓａｉｎｔ Ｒｕｆ，Ｕｎｇｅｗｉｓｓ，
ｅｔ ａｌ，１９９４；Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９９５
）、細胞にα−βＴ細胞結合をさせるようである。Ｐｒｅ−ＴＣＲの役割は、そ
れゆえに胸腺発達の間、重要であると考えられている（Ｒａｍｉｒｏ，Ｔｒｉｇ
ｕｅｒｏｓ，ｅｔ ａｌ，１９９６）。
【００４７】 本発明の組換えＴＣＲの標準的な改変を、適切になすことができる。例えば、
誤った鎖間または鎖内のペアリングを防ぐために、β鎖の定常ドメイン中の不対
システイン残基を改変することが含まれる。
【００４８】 シグナルペプチドを削除することができる。なぜなら成熟受容体中で、または
そのリガンド結合能力に対してなんの用途もなく、実際、ＴＣＲがリガンドを認
識することを妨害するからである。多くの場合において、成熟ＴＣＲ鎖からシグ
ナルペプチドが除去された開裂部位を想定できるが、実験的には決定されていな
い。わずかの、例えば１０程度まで、Ｎ−末端のアミノ酸が長いまたは短い発現
ＴＣＲ鎖を製造することは、可溶性ＴＣＲの機能において重要ではないであろう
。オリジナルのタンパク質配列に存在しないある種の付加を加えることができる
。例えば、ＴＣＲの抗原結合部位の正しい構造および折りたたみの妨害をしない
のであれば、ＴＣＲ鎖の精製を補助する短い標識配列を付加できる。
【００４９】 Ｅ．ｃｏｌｉでの発現において、翻訳を開始させるためメチオニン残基を、予
想される成熟タンパク質配列のＮ−末端開始点に付加することができる。
【００５０】 ＴＣＲ鎖の可変ドメインにおけるすべての残基が、抗原の特異性および機能性
に重要というわけではない。従って、かなりの数の変異を、抗原の特異性および
機能性に影響を与えることなく、この領域にローディングすることができる。
【００５１】 一方、ペプチド抗原またはＨＬＡ重鎖ポリペプチド、即ち、ＴＣＲ鎖のＣＤＲ
領域を構成する残基、への接触形成に関与するある種の残基を、リガンドに対す
るＴＣＲの親和性を増強する残基で置換することもできる。ペプチド−リガンド
に対するほとんどのＴＣＲの親和性が低いとすれば、そのような置換は可溶性Ｔ
ＣＲの特異性および機能性の潜在能力を増強させるために非常に有用である。こ
の例においては、ペプチド−ＭＨＣリガンドに対する可溶性ＴＣＲの親和性が決
定される。そのような測定は、ＴＣＲにおいてローディングされる変異の効果を
分析するために使用されうるものであり、従って、ＴＣＲの活性を増強させる置
換を有するＴＣＲの同定のためにも使用されうる。
【００５２】 抗原特異性および機能性のためには、ＴＣＲ鎖の定常ドメインの全ての残基が
必須なわけではない。従って、かなりの変異を抗原特異性に影響を及ぼすこの領
域にローディングすることができる。以下の実施例１４においては、ＴＣＲβ鎖
の定常ドメインにおける２つのアミノ酸を置換しても、ＴＣＲのＨＬＡ−ペプチ
ドリガンドへの結合能力に関しては検出される結果がないことを示している。
【００５３】 ＴＣＲβ鎖は細胞または天然のＴＣＲにおいて対をなしていないシステイン残
基を含む。この残基の変異によりインビトロでの可溶性ＴＣＲの再生効率が増大
する。このシステイン残基をセリンまたはアラニンで置換することは、インビト
ロでの再生効率に対して、著しく正の影響を有する。他のアミノ酸で置換するこ
とで、同様の正の影響、またはより大きな影響を得られる可能性もある。
【００５４】 上述したように、天然のＴＣＲにおいて鎖間ジスルフィド結合を形成するシス
テイン残基は、再生における問題を避けるために存在しないことが好ましい。し
かしながら、これらのシステイン残基配列はＴＣＲにおいては天然の設計であり
、ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓロイシンジッパードメインに対してこの配列が機
能的であることが示されており（Ｏ’Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ，１９８９）、これ
らのシステイン残基は、ＴＣＲが再生されるのであれば、含まれていても構わな
い。
【００５５】 定常ドメインはペプチド−ＭＨＣリガンドとの接触に直接関与しないため、Ｃ
−末端切りとり部位を、機能性を失うことなく相当変更することができる。例え
ば、定常ドメインが完全に削除された機能性を有する可溶性ＴＣＲを生成するこ
とも可能であろう。原理的には、ポリペプチドがより短いほど、可変領域または
可変領域と定常領域のごく短いフラグメントのみからなる可溶性ＴＣＲの発現お
よび折りたたみは容易である。しかしながら、この方策は好適ではない。それは
、２つの鎖の加工されたＣ−末端の距離がいくらか離れるので、ヘテロ二量体化
ドメインにより、α−β鎖対形成に付加的な安定性を供与することが複雑化し、
長いリンカー配列が必要となるからである。鎖間ジスルフィド結合を形成するシ
ステイン部位のすぐ前のヘテロ二量体化ドメインを融合する利点は、αおよびβ
鎖が細胞レセプターにおいて近接して保持されることであり、これは望ましいこ
とである。このように、この部位で融合することにより、ＴＣＲ構造にねじれが
加えられないようになる。
【００５６】 ここで好ましいとされているものよりも大きい定常ドメインのフラグメントを
有する機能的な可溶性ＴＣＲを生成することも可能である。つまり、これらの定
常ドメインは鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインのすぐ前で切りとられ
る必要がない。例えば、膜貫通ドメインを除く定常ドメイン全体が含まれうる。
この場合には、細胞ＴＣＲにおいて鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン
残基を発達させることが有益であろう。
【００５７】 ヘテロ二量体化ドメインによる鎖間安定性の補助に加えて、鎖間ジスルフィド
結合を形成するシステイン残基の結合を用いることもできる。一つの可能性とし
ては、通常のジスルフィド結合を生じさせるために、システイン残基を除去せず
に、鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基に近接するαまたはβ鎖を
切りとることである。他の可能性は、αまたはβ鎖の膜貫通ドメインのみを切除
することである。αおよびβ鎖のより短いフラグメントが発現した場合は、２つ
の鎖の折りたたみにより近接するように残基が運ばれるアミノ酸部位における置
換として加工することが可能であり、ジスルフィド結合に関して好適である。
【００５８】 ＴＣＲの精製は種々の多様な方法を用いて遂行することができる。イオン交換
の代用方法を用いることもでき、ゲルろ過クロマトグラフィーやアフィニティー
クロマトグラフィーなどの他のタンパク質精製法を用いることもできる。
【００５９】 本発明の組換えＴＣＲを生成する方法においては、シャペロンタンパク質など
の他のタンパク質構成要素を再生混合物に添加することによって、折りたたみ効
率を増大させることができる。固定化ミニシャペロンを用い、タンパク質にカラ
ムを通過させることによって、再生の改善を遂行できる（Ａｌｔａｍｉｒａｎｏ
，Ｇｏｌｂｉｋ ｅｔ ａｌ．１９９７；Ａｌｔａｍｉｒａｎｏ，Ｇａｒｃｉａ
ｅｔ ａｌ．１９９９）。
【００６０】 具体例として記載した方法に加えて、ＴＣＲをビオチン化する代用方法も可能
である。例えば、化学的ビオチン化を用いることができる。ビオチン標識配列に
おいてはある種のアミノ酸が必須であるが、他のビオチン化標識を用いることも
可能である（Ｓｃｈａｔｚ ｅｔ ａｌ，１９９３）。ビオチン化にあたり使用
される混合物は多岐に渡る。酵素は、Ｍｇ−ＡＴＰおよび低いイオン強度を必要
とするが、これらの条件の双方は多様であり、例えば高いイオン強度を用いて、
反応時間を長くすることが可能である。ＴＣＲの多量体を形成するために、アビ
ジンまたはストレプトアビジン以外の分子を用いることも可能である。多価形態
でビオチンを結合する分子であれば、いかなるものも好適である。代わりに、完
全に異なる結合を考案してもよい（キレート化されたニッケルイオンに対するポ
リ−ヒスチジン標識のようなもの（Ｑｕｉａｇｅｎ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｇｕｉｄ
ｅ １９９９，Ｃｈａｐｔｅｒ ３ “Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｓｓａｙ”ｐ．
３５−３７）。標識は、潜在的なペプチド−ＭＨＣ複合体との相互作用における
立体傷害量を最低限にするために、タンパク質のＣ−末端方向に配置されること
が好ましい。
【００６１】 本発明に係る多価ＴＣＲ複合体において、好適なＭＨＣ−ペプチド標的の例と
しては、ＨＴＬＶ−１エピトープなどのウイルス性エピトープ（例えば、ＨＬＡ
−Ａ２、ＨＴＬＶ−１によって制限されるＴａｘペプチドは白血病に関連する）
、ＨＩＶエピトープ、ＥＢＶエピトープ、ＣＭＶエピトープ、メラノーマエピト
ープ、および他の腫瘍特異的なエピトープ、並びに、例えばリウマチ性関節炎な
どの自己免疫疾病と関連するエピトープなどが含まれるがこれらに限定されるも
のではない。
【００６２】 可溶性ＴＣＲの特異性を介して薬剤が局在化することによって潜在的に増強さ
れ得る多数の病気治療 例えばＨＩＶ、ＳＩＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶのような、そのための薬剤が存在する
ウイルス性の病気は、感染細胞付近で放出される薬剤が有益であろう。ガンにお
いては、腫瘍または転移の付近での局在化により、毒または免疫増強薬の効果を
増強させることができる。自己免疫病においては、免疫抑制剤が遅々と放出され
、より長い時間に渡り局地的な効果をもつ一方、免疫容量全体への影響は最小限
である。移植の拒否反応を防ぐために、免疫抑制剤の効果を同じ方法で最大限利
用することができる。ワクチンの運搬に関しては、ワクチン抗原は専門化された
抗原提示細胞付近で局在化され、このようにして抗原の有効性を増強することが
できる。この方法はまた、イメージングの目的にも応用することができる。
【００６３】 本発明の各観点の好ましい特徴は、必要であれば変更を加えて他の各観点に合
わせることができる。ここで言及した先行技術文献は、法律によって許容される
最大限の範囲を組み入れている。
【００６４】 さらに本発明は、以下の実施例において説明されるが、これらはいかなる方法
においても本発明の範囲を限定するものではない。
【００６５】 参照は、以下に添付された図面に対して作成された。
【００６６】 実施例 以下の実施例においては、以下に示す一般的な方法および材料が使用された。
【００６７】 材料 制限酵素（ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIII、Ｂｓｕ３６I、ＸｍａI）は
ニューイングランド バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
）より得た。
【００６８】 トリスｐＨ８．１は、いずれもＵＳＢより得られたトリス塩基（Ｔｒｉｓ ｂ
ａｓｅ）およびトリスＨＣｌの等部を用いて２Ｍストック溶液として調製した。
【００６９】 ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）は０．５Ｍストック溶液として調製し、ｐＨは５Ｍ
ＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ）を用いて８．０に調整した。
【００７０】 酸化型および還元型グルタチオンは、シグマより得た。
【００７１】 シスタミンおよびシステアミンは、シグマより得た。
【００７２】 塩化ナトリウムはＵＳＢより得、４Ｍストック溶液として調製した。
【００７３】 プラスミド精製用のミニプレップキットは、キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）より
得た。
【００７４】 ＰＣＲ精製キットは、キアゲンより得た。
【００７５】 ＤＴＴは、シグマより得た。
【００７６】 グアニジンは、フルカ（Ｆｌｕｋａ）より得た。
【００７７】 尿素は、シグマより得た。
【００７８】 ＲＰＭＩ培地は、シグマより得た。
【００７９】 ＰＢＳは、オキソイド（Ｏｘｏｉｄ）より得た錠剤から調製した。
【００８０】 グリセロールはＢＤＨより得た。
【００８１】 一般的な方法 細菌用培地（ＴＹＰ培地）は以下のようにして調製した。
【００８２】 酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）１６０ｇ、トリプトン（ディフコ）１６０ｇ、Ｎａ
Ｃｌ（ＵＳＢ）５０ｇおよびＫ2ＨＰＯ4（ＢＤＨ）２５ｇを、２リットルの脱塩
水に溶解させた。この溶液の２００ｍｌを分取したものを１０×２Ｌ円錐状フラ
スコ中に入れ、１リットルになるまで脱塩水８００ｍｌを加えて調製した。フラ
スコを４層のアルミニウムホイルで覆い、標識して加圧滅菌した。冷却後、その
フラスコを使用前に直射日光を避けて室温で保存した。
【００８３】 タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅクーマシー結合アッセイおよび標準タンパク
質としてＢＳＡを用いて測定した。簡潔にいえば、水１ｍｌ中における０〜２５
μｇＢＳＡ標準を、４ｍｌプラスチックキュベット中に２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（
Ｐｉｅｒｃｅ）のストック溶液を調製した。約１０μｇの未知のタンパク質を、
同じ方法にて水で１ｍｌまで調製した。Ｐｉｅｒｃｅクーマシー剤１ｍｌをそれ
ぞれのキュベットに加え、その内容物を完全に混合した。ベックマンＤＵ−５３
０ＵＶスペクトロフォトメーターを用いて、５９５ｎｍで１５分以内、光学密度
を測定した。ＢＳＡ標準から得られた結果においては、線形回帰が観察され（線
形は、ＢＳＡ２５μｇまで良好であった）、未知タンパク質濃度はこれらの結果
を用いて内挿することによって推定された。
【００８４】 ゲルろ過クロマトグラフィーを、コンピュータコントローラを備えたファルマ
シアＦＰＬＣシステムを用いて行った。タンパク質溶出は、２８０ｎｍの波長に
おける吸収を測定するＵＶ−ＭIIシステムを用いて観察された。小さいスケール
の分離では、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００ＨＲ１０／３０カラ
ムが用いられ、サンプルは１ｍｌループを用いてローディングした。流出する前
にＰＢＳ３０ｍｌでカラムを平衡化し、サンプルを０．５ｍｌ／ｍｉｎで流出さ
せて１ｍｌのフラクションを収集した。大きいスケールの分離では、スーパーデ
ックス７５または２００ＰＧ２６／６０カラムが１０ｍｌスーパーループととも
に用いられた。この場合、５または１０ｍｌのサンプルが収集され、カラムは４
ｍｌ／ｍｉｎで流出させた。すべての分離は室温で行われた。
【００８５】 イオン交換クロマトグラフィーを、バイオキャド スプリント システム（Ｂ
ｉｏｃａｄ Ｓｐｒｉｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）（パーキン−エルマー）を用いて行
った。陽イオン交換では、２０ＨＳまたは５０ＨＳカラムが用いられた。陰イオ
ン交換では、１０ＨＱ、２０ＨＱ、または５０ＨＱカラムが用いられた。カラム
は推奨されるバッファーを６−ウェイミキサーに取り付けて使用された。少量サ
ンプル（５〜２５ｍｌ）は５ｍｌの注入ループを用いて注入した。大量サンプル
（＞１００ｍｌ）はバッファーラインのいずれか一つを用いて注入した。カラム
使用において、溶出相の間に１ｍｌの量を収集した。タンパク質溶出は、２８０
ｎｍにおけるインラインの吸収によって測定された。
【００８６】 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、バイオラッ
ド ミニ−プロテインIIゲルセットを用いて行った。ゲルは以下の方法で実施す
る前に流入した。ゲル板の組み立てが準備され、漏洩について調べた。次に以下
の混合物を調製した：１２％アクリルアミド／ビスアクリルアミド（３０％アク
リルアミド／０．８％ビスアクリルアミドストック溶液（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）由来）、０．３７５ＭトリスｐＨ８．８（同じｐＨの１
．５Ｍストック由来）、０．１％ＳＤＳ（１０％ＳＤＳストック溶液由来）、０
．０５％過硫酸アンモニウム（４℃で保存された、同様のものの１０％ストック
溶液由来）、および０．１％ＴＥＭＥＤ（シグマ）。この混合物を迅速にゲル板
組み立て体に注ぎいれ、水−飽和ブタノールを上部に重層して平坦な上部表面を
確かめた。ゲルをセットし終わった後（最低でも１０〜１５分）、スタッキング
ゲルを以下のように混合した。４％アクリルアミド（前出のストックより）、０
．１２５ＭトリスｐＨ６．８（同じｐＨの０．５Ｍストックより）０．１％ＳＤ
Ｓ、０．０５％過硫酸アンモニウム、および０．２％ＴＥＭＥＤ。ブタノールを
分解ゲルの表面からティッシュで吸収することによって除去し、スタッキングゲ
ル混合物を分解ゲルの上に注ぎいれた。ゲルコームを、空気泡がゲル中に入らな
いように注意しながら即座に挿入し、スタッキングゲルを最低５分固めさせた。
【００８７】 次にそのゲルをゲル装置に取り付け、ランニングバッファー（３ｇ／ｌ トリ
ス−塩基、１４．４ｇ／ｌ グリシン、１ｇ／ｌ ＳＤＳ（１０×濃縮ストック
溶液を希釈））を、陽極および陰極の装置に注ぎいれた。ゲルコームを除去した
後、ウェルをランニングバッファーで洗浄し、残留したアクリルアミド混合物が
ウェルの底部で固まるのを防いだ。サンプルはその一部と、以下の混合物とを１
：１で混合することによって調製した：４％ＳＤＳ、０．１２５Ｍ トリスｐＨ
６．８、２０％グリセロール、１０％ β−メルカプトエタノール、１％ ブロ
モフェノールブルー（シグマ）。次にサンプルは９５℃で２分加熱され、スタッ
キングゲルのウェルに２５μｌまでローディングする前に、冷却した。通常、良
好な染色およびゲルのランニングを確かめるために、約１〜１０μｇのタンパク
質をローディングした。ローディング後、そのゲルを２００Ｖの定電圧で、約４
０分間、またはブロモフェノールブルー染料がゲルの端から約５ｍｍになるまで
泳動した。
【００８８】 電気泳動が完了した後、そのゲルを装置から取り外し、１０％酢酸、４０％メ
タノール、５０％水中のクーマシーＲ−２５０（シグマ）の０．１％溶液へ慎重
に浸した。次に、ゲルを少なくとも３０分穏やかに攪拌し、その後、１０％酢酸
、４０％メタノール、５０％水中のクーマシーＲ−２５０（シグマ）を数回換え
てバックグラウンドが透明になるまで脱色した。次にゲルを水中に保存し、ライ
トボックス、デジタルカメラおよび感熱式プリンターを備えたＵＶＰゲルドキュ
メンティションシステムを用いて記録した。
【００８９】 実施例１−組換え可溶性ＴＣＲ ヘテロ二量体ＴＣＲ分子の組換え可溶性形態を、図１で概説するように製造し
た。それぞれの鎖は膜−遠位、および−近位免疫グロブリンドメインを含み、こ
れらは短い可変性リンカーを介して、ヘテロ二量体の安定性を補助している高次
コイルに融合している。
【００９０】 ＴＣＲ定常ドメインは、インビボで鎖同士の（ｉｎｔｅｒｃｈａｉｎ）ジスル
フィド結合を形成するシステイン残基の前で切りとられた。その結果、非共有結
合の四次的な接触により二つの鎖は対を形成し、これは図２ｂにおいて確認され
る。Ｆｏｓ−Ｊｕｎジッパーペプチドへテロ二量体も、使用されるリンカーに対
してＮ−末端のすぐ近くに鎖同士のジスルフィドを形成することができるように
（Ｏ’Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ，１９８９）、互いに関連する二つの鎖の配列が最
適であることが予期された。融合タンパク質は、それぞれの構造を壊すことを防
ぐために、分離した成分のそれぞれと適合する方法で結合されることが必要であ
る。
【００９１】 ＨＬＡ−Ａ２におけるインフルエンザマトリックスタンパク質５８〜６６エピ
トープに特異的なＴＣＲのアルファおよびベータ鎖をコードするｃＤＮＡは、以
前に述べられているような固定されたＰＣＲ（Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ，１９９１
）によって、Ｖβ１７＋ヒトＣＬＴクローン（ＪＭ２２）から得た。
【００９２】 アルファおよびベータＴＣＲ−ジッパー構成物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ） ｐＪ
Ｍ２２α−ＪｕｎおよびｐＪＭ２２β−Ｆｏｓは、標準的なＰＣＲ技術を用いて
それぞれの鎖の可変および定常ドメインを増幅し、真核性転写因子 Ｊｕｎおよ
びＦｏｓそれぞれから生産物をロイシンジッパードメインにスプライシングする
ことによって、それぞれ構築した（図１参照）。これら４０のアミノ酸長さの配
列は、共有結合的な鎖同士の結合を必要としないで、合成ペプチドから折りたた
まれるときに特異的なヘテロ二量体化をする（Ｏ’Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ，１９
８９）。
【００９３】 プライマーは、３’の近くから開始コドンにおいて高いＡＴ含量を有するよう
に設計され（ｍＲＮＡ二次構造を不安定化させるために）、さらに発現を最小化
するため、Ｅ．ｃｏｌｉコドン選択を用いた（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ）。再生の際
の誤ったジスルフィド結合の防止を確認するため、ＴＣＲベータ定常ドメインに
おける余分なシステインはセリンに変異された。
【００９４】 ＤＮＡ構造物は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＧＭＴ７に別々に結合させた。
プラスミドダイジェストおよびＤＮＡ配列により、構造が正しいことが確認され
た。
【００９５】 詳しくは、以下の方法を用いた。
【００９６】 ＴＣＲジッパー鎖の発現および変性封入体の精製：ＧＦＧ０２０およびＧＦＧ
０２１、ＪＭ２２α−ＪｕｎおよびＪＭ２２−βＦｏｓをそれぞれ含むｐＧＭＴ
７発現プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１ｐＬｙｓＳにそれぞれ形質転換さ
れ、アンピシリン耐性シングルコロニーを、ＴＹＰ（アンピシリン１００μｇ／
ｍｌ）培地で、ＯＤ600０．４まで３７℃で培養し、その後０．５ｍＭ ＩＰＴ
Ｇでタンパク質発現を誘導した。誘導後３時間で、ベックマンＪ−６Ｂを用い、
４０００ｒｐｍで３０分遠心分離することによって、細胞を収集した。細胞の沈
殿を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２５％（ｗ／ｖ）スクロース、１ｍＭ ＮａＥＤ
ＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、１０ｍＭ ＤＴＴを含み、ｐＨ８
．０であるバッファー中に再懸濁した。一晩の凍結−融解過程の後、再懸濁した
細胞を、標準の１２ｍｍ直径プローブを用いたミルソニックス（Ｍｉｌｓｏｎｉ
ｘ）ＸＬ２０２０で、１分間バーストで計１０分、超音波処理した。封入体の沈
殿は、ベックマンＪ２−２１遠心機で、１３０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離す
ることによって回収した。次に３種の界面活性剤の洗浄が行われ、細胞の破片や
細胞膜成分を除去した。その都度、その封入体沈殿はトリトンバッファー（５０
ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．５％トリトン−Ｘ１００、２００ｍＭ ＮａＣｌ、
１０ｍＭ ＮａＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、２ｍＭ ＤＴ
Ｔ、ｐＨ８．０）で均質化し、その後ベックマンＪ２−２１遠心機で、１３００
０ｒｐｍ、１５分間遠心分離することによって沈殿化した。次に、界面活性剤お
よび塩は、以下のバッファー：５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＮａＥＤＴ
Ａ、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、２ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０で同様
の洗浄を行うことによって除去された。最終的に、ＪＭ２２−αＪｕｎおよびＪ
Ｍ２２−βＦｏｓ封入体沈殿が、それぞれ３〜４時間、４℃で、尿素溶液（５０
ｍＭ ＭＥＳ、８Ｍ 尿素、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ６．５
）中に溶解された。不溶性材料は、ベックマンＪ２−２１で、１３０００ｒｐｍ
で３０分間遠心分離することによって沈殿させ、その上清を１ｍｌずつ等分し、
−７０℃で保存した。尿素中に可溶化させた封入体は、ブラッドフォード ダイ
−バインディング アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｄｙｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａ
ｓｓａｙ）（バイオラッド）を用いて定量した。それぞれの鎖に対して、精製さ
れた封入体の約１００ｍｇの収量は、１リットルの培養液から得られたものであ
る。それぞれの封入体（ＪＭ２２α−Ｊｕｎ、ＪＭ２２β−Ｆｏｓ）は約２０ｍ
ｇ／ｍｌの濃度で尿素溶液中に可溶化しており、ゲル解析からこの形態で約９０
％の純度を持つことが推定された。
【００９７】 ＴＣＲジッパー融合タンパク質の共再生（ｃｏ−ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）： 標準再生バッファー（１００ｍＭ トリス ｐＨ８．５、１Ｍ Ｌ−アルギニ
ン、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ 還元グルタチオン、０．５ｍＭ 酸化グルタチ
オン、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ）を用いた初期再生実験により、深刻なタンパク質
沈殿が生じたが、これはジッパードメインの存在に依存していた。この現象がジ
ッパー二量体化の解離定数より低い濃度で生じる（すなわち、ほとんどのジッパ
ーへリックスが単量体であることが期待される）という事実により、付加的な作
用力は誤った折りたたみの種を安定化している、ということが示唆された。もっ
とも考えられ得る説明は、初めにアルファ−ヘリカル ジッパードメインが完全
に折りたたまれ、それらの一時的なヘテロ二量体化により、より複雑な免疫グロ
ブリンドメインの部分的に折りたたまれた中間体の鎖同士の凝集が誘導される、
ということである。それゆえに再生バッファーは、５Ｍ尿素を含むように改変さ
れており、これは部分的に折りたたまれた免疫グロブリンドメイン間の疎水性相
互作用を妨げ、個々の鎖がヘテロ二量体化前に完全に折りたたまれるようにする
ためである。この過程は、沈殿の発生を防ぐには十分なものであり、正しく折り
たたまれたＴＣＲ−ジッパーへテロ二量体を以下の方法を用いて満足のいく収率
で回収することができる。
【００９８】 ＴＣＲ−ジッパー鎖ＪＭ２２α−ＪｕｎおよびＪＭ２２β−Ｆｏｓの尿素−可
溶化ストックは、共再生を薄弱化することによって再生された。それぞれの可溶
化封入体鎖の約３０ｍｇ（すなわち１μモル）を凍結ストックから融解して、さ
らにＤＴＴ（４μモル／ｍｌ）のパルスを加えてシステイン残基の完全な還元を
確かめた。次にサンプルを混合し、その混合物は１５ｍｌのグアニジン溶液（６
Ｍ 塩酸グアニジン，１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）に希釈
し、完全な鎖の変性を確認した。次に、完全に還元および変性したＴＣＲ−ジッ
パー鎖を含むグアニジン溶液を、以下の再生バッファー１リットル中に注入した
：１００ｍＭ トリスｐＨ８．５、４００ｍＭ Ｌ−アルギニン、２ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、５ｍＭ還元グルタチオン、０．５ｍＭ 酸化グルタチオン、５Ｍ 尿素、
０．２ｍＭ ＰＭＳＦ。その溶液を２４時間放置した。次にその再生を２回、す
なわち第一に１０リットルの１００ｍＭ尿素で、第二に１０リットルの１００ｍ
Ｍ 尿素、１０ｍＭ トリスｐＨ８．０で透析を行った。再生および透析のステ
ップ両方は６〜８℃で行った。
【００９９】 再生されたＴＣＲ−ジッパーの精製： 透析された再生物をＰＯＲＯＳ １０ＨＱ分析用陰イオン交換カラム上に７回
の２００ｍｌ分取でローディングし、バイオキャド（ＢｉｏＣａｄ）ワークステ
ーション（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、カラム体
積の５０倍以上で、０〜４００ｍＭ ＮａＣｌ濃度勾配で、結合したタンパク質
を溶出させることによって、ＴＣＲ−ジッパーＪＭ２２ｚｉｐを、分解生産物や
不純物から分離した。非共有結合的に会合したヘテロ二量体は、約１００ｍＭ
ＮａＣｌで単一のピークとして溶出した。ピークフラクション（一般的に１００
〜３００μｇ／ｍｌの濃度でヘテロ二量体を含む）は４℃で保存され、その後貯
めて濃縮された。ヘテロ二量体の収率は約１５％である。
【０１００】 再生ＴＣＲ−ジッパーＪＭ２２ｚｉｐの特徴づけ： 陰イオン交換により精製されたＪＭ２２ｚｉｐヘテロ二量体は、スーパーデッ
クス２００ゲルろ過サイジングカラム（ファルマシア）により約７０ｋＤａのタ
ンパク質として溶出する。ゲルろ過ステップを表面プラスモン共鳴結合解析の前
に行うことが特に重要であり、なぜなら正確な親和性および反応速度測定は単量
体の相互作用が生じることに依存しているからである。この方法において、分析
に用いられる可溶化タンパク質フラクションからより高いオーダーの凝集を排除
することができる。特に、凝集は人為的に遅い会合および解離速度定数が検出さ
れる原因となる。
【０１０１】 それぞれの鎖の酸化状態は、図２に示す還元／非還元ゲル解析によって考察さ
れた。ＳＤＳの存在下で、非共有結合的に会合したヘテロ二量体は、アルファお
よびベータ鎖に解離する。ＤＴＴがローディングバッファーに使用された場合、
その二つの鎖は３１ｋＤａマーカーの前後を泳動する。このような変性が起こら
ない場合、両方の鎖は単一種のように振舞うが、しかしそれぞれの移動度は増加
する。これはそれぞれの鎖が単一の、ジスルフィド結合種を形成したことを示し
ている（Ｇａｒｂｏｃｚｉ ｅｔ ａｌ，１９９６）。
【０１０２】 再生受容体の抗体反応性は、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００マシーン（ビアコア）で
、表面プラスモン共鳴を用いて試験された。ＴＣＲ−ジッパーＪＭ２２ｚは、標
準的なアミンカップリング方法を用いて、ｐＨ５．５でデキストランマトリック
ス（ＣＭチップ）結合表面に固定された。ベータ鎖（Ｖβ１７）に特異的な様々
な領域の抗体は、固定された受容体に特異的に会合し、正確なコンホメーション
を伴う。
【０１０３】 安定性： アルファ−Ｊｕｎおよびベータ−Ｆｏｓロイシンジッパー融合体として発現し
た可溶化ＴＣＲは、数ヶ月を経過しても安定であり、したがってクラスＩ ＭＨ
Ｃによって提示された特異的抗原の検出に対して安定である。
【０１０４】 実施例２−ヒトＴＣＲ−ウイルス性ペプチドＭＨＣのカイネティクスおよび親
和性の研究 再生ＴＣＲ−ジッパーのペプチド−ＭＨＣ複合体への特異的結合： 表面プラスモン共鳴バイオセンサー（ビアコア）を、ＴＣＲ−ジッパー（ＪＭ
２２ｚｉｐ、ＨＬＡ−Ａ２インフルエンザマトリックスタンパク質Ｍ５８−６６
複合体に特異的）のそのペプチド−ＭＨＣリガンドに対する結合を分析するのに
用いた（図３を参照）。我々は単一のｐＭＨＣ複合体（以下に説明した）を製造
することによってこれを促進させた。その複合体は半方向性の方法でストレプト
アビジンで覆われた結合表面に固定することができ、可溶性Ｔ細胞受容体の４個
までの異なるｐＭＨＣ（別々のフローのセル上に固定された）への結合を効果的
に試験することができる。ＨＬＡ複合体の手動注入により、固定化クラスＩ分子
の正確なレベルを簡単に処理することができる。
【０１０５】 このような固定化複合体は、Ｔ細胞受容体（図３を参照）および補受容体ＣＤ
８ααの両方に結合することができ、これらの両方を可溶性相に注入することが
できる。ＴＣＲ−ジッパーの特異的結合は、低濃度（少なくとも４０μｇ／ｍｌ
）でさえ得られ、ＴＣＲジッパーが比較的安定であることを意味している。ＪＭ
２２ｚのｐＭＨＣ結合特性は、ＴＣＲが可溶性相または固定化相のいずれかにお
いて使用されている場合、質的および定量的に類似していることが観察される。
これは可溶性種の部分的な活性に対する重要なコントロールであり、さらに非ビ
オチン化ｐＭＨＣ複合体が生物学的に非ビオチン化複合体と同様な活性を持つこ
とを示唆している。
【０１０６】 化学的にビオチン化されたＨＬＡ複合体の調製 可溶性、組換えシングルペプチドクラスＩＨＬＡ複合体の製造方法は、既に説
明されている（Ｇａｒｂｏｃｚｉ ｅｔ ａｌ，１９９２）。これらは、β−２
−ミクログロブリンドメインを化学的にビオチン化し、そのためストレプトアビ
ジン被覆結合チップに固定化することができ、表面プラスモン結合の研究に用い
られるＨＬＡ複合体を製造するために、改変されてきた。
【０１０７】 β−２−ミクログロブリンが発現し、４０ｍｇが標準再生バッファー（１００
ｍＭ トリス ｐＨ８．０、４００ｍＭ Ｌ−アルギニン、２ｍＭ ＥＤＴＡ、
５ｍＭ 還元グルタチオン、０．５ｍＭ 酸化グルタチオン、０．１ｍＭ ＰＭ
ＳＦ）中で再生し、これらは本質的に説明されている（Ｇａｒｂｏｃｚｉ ｅｔ
ａｌ，１９９２）。任意のゲルろ過ステップの後、タンパク質を０．１Ｍ ホ
ウ酸ナトリウム ｐＨ８．８で交換し、最終的に５〜１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した
。β−２−ミクログロブリンもまた、ブラッドフォードアッセイ（バイオラッド
）を用いて定量された。過量の５Ｍビオチンヒドロキシスクシンイミド（シグマ
）をＤＭＳＯ中で１０ｍｇ／ｍｌに調製されたストックから添加された。反応は
室温で１時間行われ、２０μｌの１Ｍ 塩化アンモニウム／ビオチンエステル２
５０μｇを用いて止めた。再生ＨＬＡ複合体は、スーパーデックス２００ ゲル
ろ過サイジングカラム（ファルマシア）を用いて、遊離ビオチンおよび遊離ビオ
チン化ベータ−２−ミクログロブリンから分離された。ストレプトアビジンは、
標準的なアミンカップリング方法によって固定化された。
【０１０８】 結論： このように、実施例１で説明したタンパク質再生方法によって、安定で、正確
に折りたたまれ、機能的な組換え受容体融合タンパク質を製造することができ、
これらは光学的バイオセンサーを用いる生物物理学的解析に適している。これに
より、ヒトＴＣＲ−ｐＭＨＣ相互作用の詳細な親和性およびカイネティクスの解
析を実行するのに用いられる剤が提供された。Ｔ細胞補受容体ＭＨＣおよびＴＣ
Ｒ−ｐＭＨＣ相互作用のそれぞれにおける効果もまた研究されている。使用され
ている組換え技術は、原則的にはマウスおよびヒトＴＣＲの両方、クラスＩ制限
およびII制限に対して許容されるものであり、ＴＣＲの範囲で類似の解析が可能
となるであろう。これにより、例えば抗ウイルス応答におけるＴＣＲ親和性の期
間、優勢的に選択された受容体の特性、および、受容体の引き金（ｔｒｉｇｇｅ
ｒｉｎｇ）に関する速度論的な必要条件等の、様々な疑問を処理することができ
る。この方法はまた、結晶化の試みより前に、ＴＣＲのリガンド特異性を確かめ
る方法も提供しており、さらに他の細胞表面受容体の組換え体を製造するための
意味も含まれている。
【０１０９】 実施例３−可溶化Ｔ細胞受容体のビオチン化および四量体化 実施例１で説明した精製した可溶性ＴＣＲ２．５ｍｌ（〜０．２ｍｇ／ｍｌ）
は、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア）を用いてビオチン化反応バッファー（１
０ｍＭ トリス ｐＨ８．０、５ｍＭ ＮａＣｌ、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ2）
へバッファー交換した。溶出物（３．５ｍｌ）は、セントリコン コンセントレ
ーター（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ））を用い、１０ｋＤａ分子量を分離して１ｍ
ｌに濃縮した。これにＡＴＰをストック（０．１ｇ／ｍｌ、ｐＨ７．０に調節）
から加えて５ｍＭに調製した。プロテアーゼ阻害剤のカクテル（ロイペプチン、
ペプスタチンおよびＰＭＳＦ（０．１ｍｌ））を添加し、さらに１ｍＭビオチン
（０．２Ｍストックより加えられた）および５μｇ／ｍｌ酵素（０．５ｍｇ／ｍ
ｌストックより）を添加した。次に、この混合物を室温で一晩培養した。１０ｍ
Ｍ トリス ｐＨ８．０、５ｍＭ ＮａＣｌで透析することによって（２００倍
体積、２回の交換、４℃）、過量のビオチンを溶液から除去した。次にそのタン
パク質を、ニトロセルロース上にブロッティングし、続いて５％スキムミルク粉
末でブロッキングされ、ストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体（バイオラッド）を
用いて検出することによって、結合したビオチンの存在を試験した。ビオチン化
可溶性ＴＣＲの四量体化は、エクストラアビジン−ＲＰＥまたはエクストラアビ
ジン−ＦＩＴＣ結合体（シグマ）のいずれかを用いた。ビオチン−可溶性ＴＣＲ
の濃度は、クーマシー結合タンパク質分析（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定し、０
．２２４ｍｇ／ｍｇの可溶性ＴＣＲに対するエクストラアビジン結合体の比率を
計算し、比率１：４でビオチン化ＴＣＲによるエクストラアビジンの飽和を遂行
した。このエクストラアビジン結合体は、全添加量の１０分の１を１分量として
、氷上で少なくとも１分量を１５分間隔で添加した（エクストラアビジンの飽和
を確認するため）。可溶性ＴＣＲ四量体は、暗所、４℃で保存された。その四量
体は数ヶ月を経過しても安定であった。
【０１１０】 実施例４−特異性が既知のＴ細胞系またはＴ細胞クローンからの、Ｔ細胞受容
体遺伝子の分子クローニング 細胞からのＴＣＲ遺伝子の分子クローニングに関する方法および手順は、すべ
てのα鎖およびすべてのβ鎖についてそれぞれ同一であり、それゆえにこの実施
例において一つのみ説明される。
【０１１１】 適切な数のＴ細胞を（一般的には１００万〜５００万個）、‘ｍＲＮＡキャプ
チャーキット（ｍＲＮＡ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ）’（ベーリンガー マンハ
イム）の溶解バッファーで溶解させた。ｍＲＮＡはビオチン化オリゴ−ｄＴをｍ
ＲＮＡのポリＡテールにハイブリダイズすることによって、キット剤を用いて単
離した。次に、ビオチンをストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブに結合
することによって、ハイブリダイズされた複合体を捕獲した。ｍＲＮＡをＰＣＲ
チューブに固定化した後、説明されてあるように（‘ｍＲＮＡキャプチャーキッ
ト’のためのベーリンガー マンハイム マニュアル）、ＡＭＶ逆転写酵素（ス
トラタジーン）を用いてｃＤＮＡを作成した。
【０１１２】 ｃＤＮＡがまだ固定している状態で、ポリ−Ｇテールをターミナルトランスフ
ェラーゼ酵素（ベーリンガー マンハイム）を用いて３’末端に作成した。次に
、高性能熱安定性ポリメラーゼｐｆｕ（クローンされたもの、ストラタジーン）
を含むＰＣＲリアクションミックスを加えるが、これはＰＣＲ産物におけるエラ
ーの危険性を最小化するために用いられる。ＰＣＲ反応は、ポリ−Ｃ‘アンカー
プライマー’（図４Ａ）ならびにそれぞれのＴＣＲ定常領域でアニーリングする
αおよびβ鎖特異的プライマー（それぞれ図４ＢおよびＣ）を用いて行われた。
９５℃で１分の変性、５０℃で１分のアニーリング、および７２℃で５分の伸長
が３０サイクルのＰＣＲ反応を行い、ＴＣＲ遺伝子フラグメントを増幅した。
【０１１３】 ＰＣＲ産物を、ＰＣＲプライマーを含むＸｈｏＩおよびＸｍａＩ制限酵素サイ
ト（すべての酵素はニューイングランド バイオラブスより購入した）を用いて
、ブルースクリプト シークエンシング ベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
II ＫＳ−、ストラタジーン）にライゲーションした。Ｅ．ｃｏｌｉ株のＸＬ−
１Ｂｌｕｅにライゲーションミックスを形質移入させた後、それぞれの鎖の数種
のクローンをＤＮＡ配列解析により選択した。これはビッグダイTMターミネータ
ー（ＢｉｇＤｙｅTM ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）（アプライド バイオシステム
ズ社）を用いてＡＢＩ３７７プリズムオートマチックシーケンサーで行った。
【０１１４】 実施例５−ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓの４０アミノ酸高次コイル（‘ロイシ
ンジッパー’）領域をコードしたＤＮＡフラグメントの分子クローニング ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓの４０アミノ酸高次コイル（‘ロイシンジッパー
’）領域をコードしたＤＮＡフラグメントは、テンプレートとしてヒトＤＮＡを
用いて作成し、プライマーは図５に示される。ＰＣＲ反応は、クローンされたｐ
ｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン）を含む反応バッファー中で、９５℃、１分
の変性、５８℃、１分のプライマーアニーリング、および７２℃、２分の伸長が
３０サイクルの条件で行った。
【０１１５】 ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓフラグメントは、唯一のＸｈｏＩおよびＸｍａＩ
制限部位を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳ−（ストラタジーン）にライ
ゲーションされ、ｐＢＪ１０７およびｐＢＪ１０８をそれぞれ得た（図６）。そ
のｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓフラグメントのＤＮＡ配列は、ビッグダイTMター
ミネーター（アプライド バイオシステムズ社）を用いたＡＢＩ３７７プリズム
オートマチックシーケンサーでなされたＤＮＡ配列解析によって確認した。
【０１１６】 次に、配列解析されたｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓフラグメントは、唯一のＸ
ｍａＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を用いて、Ｔ７ポリメラーゼ発現ベクター、ｐ
ＧＭＴ７（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ、１９９０）のポ
リリンカー領域にサブクローニングされた。
【０１１７】 実施例６−安定な可溶性ＴＣＲの製造のための、ＴＣＲ−ロイシンジッパー融
合タンパク質の設計 ＴＣＲαおよびβ鎖の細胞外フラグメントを共再生させる試みは、インビボで
ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含むように切断されており、限ら
れた成功しか収めていない（データは示さず。発現方法ならびに再生のための一
般的な方法および材料については実施例９を参照）。しかしながら、ＴＣＲαお
よびβ鎖が、鎖同士のジスルフィド結合を形成しているシステイン残基の直前、
すなわちＮ−末端側で切断される場合、スーパーデックスＧ−７５カラム（ファ
ルマシア）による分析クロマトグラフィーによって、再生反応で用いられた量の
約１〜２％タンパク質の少量フラクションは、切りとられたα／βヘテロ二量体
の予想分子サイズを持つ複合体に再生する、ということが示された（方法の参照
として、Ｇａｒｂｏｃｚｉ，Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ．１９９６も参照）。
【０１１８】 不正確なジスルフィド結合の形成は、インビトロでの再生中にタンパク質の不
可逆的な誤った折りたたみの原因となるため、このようなことが生じる可能性は
、細胞ＴＣＲ中で対をなしていないＴＣＲβ定常領域中のシステイン残基を変異
させることによって最小化されるようにした。システイン残基はセリンまたはア
ラニン残基で置換される。これらの変異ステップに用いられた合成ＤＮＡプライ
マーを図７に示す。ＴＣＲαおよび変異β鎖の共折りたたみ（co-folding)は、
いずれも鎖同士のジスルフィド結合を形成するシステイン残基の直前で切断され
ており、ヘテロ二量体、正確な分子量のタンパク質フラクションの収率における
劇的な改善を示し、一般的に総タンパク質量の１５〜３０％を構成する。しかし
ながら、これらの可溶性ＴＣＲが一晩保存される場合、その一部分の分析により
、ヘテロ二量体ＴＣＲに相当する分子量を持つフラクションは、単量体ＴＣＲα
およびβ鎖に相当する分子量の二つのピークに分けられる、ということが示され
た。似たような観察結果が可溶性ＴＣＲの希釈によって生じ、これによって、数
時間より長い時間またはタンパク質の希釈を必要とするような分析に対して、α
／β鎖の安定性が低く、不十分となることが示された。結論としては、可溶性Ｔ
ＣＲを製造するこれらの方法によって、極端に限定された安定性を持つ受容体し
か作成できなかった。
【０１１９】 ＴＣＲα／β鎖の安定性を改良し、再生の際に潜在的にヘテロ二量体形成を補
助するために、優先的にヘテロ二量体を形成することが知られているｃ−ｊｕｎ
およびｃ−ｆｏｓの‘ロイシンジッパー’ドメインにＴＣＲ鎖を融合させた（Ｏ
’Ｓｈｅａ， Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．１９８９；Ｓｃｈｕｅｒｍａ
ｎｎ，Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９１；Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｒｕｔｋｏｗｓｋ
ｉ ｅｔ ａｌ．１９９２；Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，１９９
５）。融合ＴＣＲに関する二つの設計を試験した。
【０１２０】 その一つにおいて、ロイシンジッパーを、システイン残基のちょうど後、ＴＣ
Ｒαおよびβ鎖中で鎖同士のジスルフィド結合を形成するシステイン残基の直後
、すなわちＣ−末端に融合した。ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓロイシンジッパー
ペプチドもまた、使用されたリンカーに対しＮ−末端近傍の鎖同士のジスルフィ
ド結合を形成することができることため（Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ
ｅｔ ａｌ．１９８９）、互いに関連し、かつ鎖同士のジスルフィド結合に関連
している二つの鎖の配列は、最適になるように予期された。
【０１２１】 他の設計において、ロイシンジッパーは、、ＴＣＲαおよびβ鎖中で鎖同士の
ジスルフィド結合を形成するシステイン残基の直前、すなわちＮ−末端で融合さ
れた（図８）。このように、第二の設計において、システイン残基は組換え受容
体からはずされている。
【０１２２】 これらの設計のＴＣＲ−ジッパー（ＴＣＲ−ｚ）鎖を用いた再生実験において
、図８に示した設計のように、鎖同士でジスルフィド結合を形成するシステイン
残基がＴＣＲαおよびβ鎖から除かれている場合に、ヘテロ二量体、可溶性受容
体の収率がより良いことが見出された。
【０１２３】 実施例７−ＴＣＲ−ロイシンジッパータンパク質に関するＤＮＡ発現ベクター
の構築 この実施例は、５個のＴＣＲのαおよびβ鎖に関する発現ベクターの構築を説
明している。説明されている方法および設計は、任意のヒトまたは動物のＴＣＲ
遺伝子に対して適合するべきである。ここで説明した５個のＴＣＲはすべて、Ｍ
ＨＣクラスＩエピトープによって制限されているにもかかわらず、その方法はＭ
ＨＣクラスIIで制限されたＴＣＲのためのクローニングおよび発現ベクター構築
に等しく用いることができる。すべてのベクターは、図１９に示した設計に従っ
て可溶性ＴＣＲの再生をねらったタンパク質を発現するが、ただし二つのＴＣＲ
はＣ−末端にビオチン化可能な標識配列を有して発現することを除く（以下、お
よび図１７、１８および１９を参照）。クローニング方法は、すべてのＴＣＲα
およびβ鎖それぞれに対して同じである。
【０１２４】 ＴＣＲαおよびβ鎖のリーダー、またはシグナル、ペプチド配列の範囲を、Ｔ
ＣＲアンカーＰＣＲ生産物を含むプラスミドから得られた配列データの分析から
推測した（実施例４を参照）。これを基礎にして、リーダー配列を含まないＴＣ
Ｒ鎖の発現に関するＰＣＲフラグメントを作成するための５’プライマーを設計
した（図９）。すべての５’プライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉで翻訳されるように、
成熟ＴＣＲタンパク質配列のすぐ前にメチオニン残基をコードしている。サイレ
ント突然変異、ＣまたはＧ塩基のＡまたはＴへの置換（図９）は、かなりの数の
遺伝子の５’近傍のコドンにローディングされ、これはＥ．ｃｏｌｉでの発現レ
ベルを不利に阻害し得るｍＲＮＡ二次構造を形成する傾向を減少させるためであ
る（ＰＣＴ／ＧＢ ９８／０３２３５；（Ｇａｏ，Ｔｏｒｍｏ ｅｔ ａｌ．１
９９７；Ｇａｏ，Ｇｅｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
【０１２５】 ヒトＪＭ２２インフルエンザ マトリックス ペプチド−ＨＬＡ−Ａ０２０１
（ペプチド配列はＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）のＶα０．２およびＶβ１７鎖で制限さ
れたＴＣＲ、００３ＨＩＶ−１ Ｇａｇペプチド−ＨＬＡ−Ａ０２０１（ペプチ
ド配列は、ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ）のヒトＶα２３およびＶβ５．１鎖で制限され
たＴＣＲ、および、Ｆ５ ＮＰペプチド−Ｈ２−Db（ペプチド配列は、ＡＳＮＥ
ＮＭＤＡＭ）のマウスＶα４およびＶβ１１鎖をコードした遺伝子を、実施例６
で説明したようなＴＣＲアンカーＰＣＲ産物を含むプラスミドを用いて、ＰＣＲ
によって増幅した。ＨＬＡ−Ａ０２０１（ペプチド配列は、ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ
）によって提示されるＨＴＬＶ−１ ｔａｘペプチドに特異的なヒトＡ６（Ｖ(
２．３／Ｖ(１２．３）およびＢ７（Ｖ(１７．２／Ｖ(１２．３）ＴＣＲに関す
る遺伝子は、プラスミドの形態で得られ（Ｇａｒｂｏｃｚｉ，Ｕｔｚ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９６；Ｄｉｎｇ，Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．１９９８）、これらは、
これらのＴＣＲ鎖の発現ベクター構築のためにＰＣＲ産物を作成するのに使用し
た。これらのＴＣＲに関する遺伝子を、ｃ−ｆｏｓロイシンジッパー−ビオチン
化可能な標識融合フラグメントに関する配列を含む発現ベクターにクローニング
した（実施例８参照）。
【０１２６】 ＰＣＲ反応は、標準バッファー条件でｐｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン）
を用い、９５℃で１分の変性、６０℃で１分のプライマーアニーリング、および
７２℃で６分の伸長が２５サイクルで実行した。ＰＣＲ産物は、酵素ＮｄｅＩお
よびＸｍａＩで消化された制限部分であり、ｃ−ｊｕｎ（ＴＣＲα鎖）およびｃ
−ｆｏｓ（ＴＣＲβ鎖）インサートを含むｐＧＭＴ７ベクターに結合させた（実
施例５参照）。
【０１２７】 図１０〜１９は、ＴＣＲ−ｚインサートの配列およびｐＧＭＴ７ベクターによ
って発現する予想タンパク質配列を示している。図２０は、折りたたみおよび可
溶性ＴＣＲの機能に検出可能な影響を及ぼさないような、定常領域における変異
を含むＡ６ＴＣＲβ鎖の配列を示す（実施例９および１０を参照）。
【０１２８】 実施例８−ｃ−ｆｏｓロイシンジッパー−ビオチン化可能フラグメントに融合
したＴＣＲβ鎖の発現のための、ＤＮＡベクターの構築 可溶性ＴＣＲを、固定化すること、または検出もしくは受容体への付着を可能
にするためには、さらなる機能的融合成分を伴ったタンパク質を製造することが
できるかどうかが役に立つ。これにより、例えば多量体として生産されるような
、可溶性ＴＣＲを誘導すること、または、高い選択性を有する検出もしくは受容
体／受容体複合体への他の機能の付加が可能になる。
【０１２９】 この実施例においては、インビボでＥ．ｃｏｌｉ中、またはインビトロで酵素
ＢｉｒＡと共に、特異的にビオチン化されうる融合ポリペプチドを組み込まれた
ＴＣＲβ鎖のための発現ベクターの構築を説明する（Ｂａｒｋｅｒ ａｎｄ Ｃ
ａｍｐｂｅｌｌ １９８１；Ｂａｒｋｅｒ ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ １９８
１；Ｈｏｗａｒｄ，Ｓｈａｗ．，１９８５；Ｓｃｈａｔｚ，１９９３；Ｏ’Ｃａ
ｌｌａｇｈａｎ，Ｂｙｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．１９９９）。実施例１０および１
１で示したように、これらの可溶性ＴＣＲ融合体は、‘ビオチン化標識’（ＢＴ
−標識）と融合していないＴＣＲβ鎖と同じ方法および似たような収率で、α鎖
と共に発現され折りたたむことができる。これらの結果により、ここで説明され
た可溶性ＴＣＲは、多数の異なるポリペプチドと、融合パートナーとして共に発
現することに適しているらしいことが説明される。
【０１３０】 Ｔ細胞受容体β鎖は、下記のように、ｆｏｓロイシンジッパー配列にビオチン
−標識配列Ｃ−末端を有するｐＧＭＴ７発現ベクター中にサブクローニングした
。
【０１３１】
【化１】
【０１３２】 構造の末端の配列は以下のようであった（図２１も参照）。
【０１３３】
【化２】
【０１３４】 二つのアプローチが、ビオチン標識を有する可溶性ＴＣＲを生産するのに用い
られた。ＴＣＲを制限したヒトＪＭ２２インフルエンザマトリックスペプチド−
ＨＬＡ−Ａ０２０１の場合において、クローニングされたβ鎖−ｃ−ｆｏｓロイ
シンジッパー融合体を、図２２に示した合成ＤＮＡプライマーを用いた３’末端
で修飾して、ｐｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン）を用いる標準ＰＣＲ反応を
用いて、ＨｉｎｄIII部位がインサートされたＢａｍＨＩ部位をローディングし
た。
【０１３５】 ＮｄｅＩ部位を有するオリジナルの５’プライマー（図９）を、フォワードプ
ライマーとして用いた。生成したＰＣＲ産物は、ビオチン−標識配列を含む修飾
されたｐＧＭＴ７ベクターにクローニングされ（図２１）、上述した内容の構築
を形成する。このプラスミドはＪＭＢ００２として知られる。
【０１３６】 クローニングされたＴＣＲの、ＨＴＬＶ−１エピトープＬＬＦＧＹＰＶＹＶを
制限されたＨＬＡ−Ａ０２０１に対する特異性は、Ａ６ ｔａｘ ＴＣＲ（Ｖ(
２．３／Ｖ(１２．３）として知られており、図９で示したフォワードおよびリ
バースプライマーを用いたＰＣＲを用いて分離される。このＴＣＲβ鎖は、ｃ−
ｆｏｓ−ＢＴフラグメントを含むｐＧＭＴ７ベクター（ＪＭＢ００２）のＮｄｅ
ＩおよびＸｍａＩ部位にクローニングされた。
【０１３７】 融合発現ベクターを構築した後、サブクローニングが進行している間に間違い
がローディングされていないことを確かめるためにＤＮＡ配列解析を行った（す
べての配列解析はオックスフォード ユニバーシティの生化学部 ＤＮＡシーク
エンシング ファシリティー（ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｐｔ．
ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で、ＡＢＩ３７７プリズム
シーケンサーおよびＡＢＩ ビックダイ蛍光ターミネーターを用いてなされた
）。公開されている配列と比較すると ｔａｘ ＴＣＲβ鎖に二つのエラーがあ
ることがわかり、さらに調査すると、我々は、我々が受け取ったオリジナルのプ
ラスミドにこの両方が存在することを発見した。これら二つのエラーの両方がＴ
ＣＲβ鎖における唯一のＢｓｕ３６Ｉサイトの３’であるため、これを（正しい
）ＪＭＢ００２プラスミドにクローニングするのに用いた。 ｔａｘ ＴＣＲβ
鎖の両方のバージョンは、α鎖と共に発現され折りたたまれ、Ｂｉａｃｏｒｅを
用いて比較された。両方のバージョンのタンパク質は、類似した見かけの親和性
で ｔａｘペプチド−ＭＨＣクラスＩ分子に特異的に結合した（実施例１７参照
）。サブクローニング実験において、β鎖の正しいバージョンのみが用いられた
。
【０１３８】 実施例９−Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＴＣＲ鎖の発現および封入体の精製 ＴＣＲαおよびβ鎖は、ＴＹＰ倍地中、ベクターｐＧＭＴ７の条件下で、Ｅ．
ｃｏｌｉ株ＢＬ２１ＤＥ３ｐＬｙｓＳ中でそれぞれ発現させ、６００ｎｍで０．
２〜０．６の光学濃度（ＯＤ）の時に０．５ｍＭ ＩＰＴＧを用いてタンパク質
生産を誘導した。誘導は一晩続けられ、バクテリアはベックマンＪ−６Ｂ遠心分
離機を用いて、４０００ｒｐｍで遠心分離することによって、収穫された。
【０１３９】 次にバクテリア細胞沈殿を‘溶解バッファー’（１０ｍＭ トリスｐＨ８．１
，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＤＴＴ，１０％グリセ
ロール）中で再懸濁した。その混合物を氷上で冷却し、以下のものを加えた：２
０μｇ／ｍｌリゾチーム，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，および２０μｇ／ｍｌ ＤＮ
アーゼＩ。続いて、最小で１時間、氷上でインキュベーションした。
【０１４０】 次に１２ｍＭプローブソニケーター（ミルソニックス（Ｍｉｌｓｏｎｉｘ）Ｘ
Ｌ２０２０）を用い、混合物を冷やすためにインターバルを３０秒おいて、最大
出力で３０秒を５バースト行って超音波破砕した。その間、氷水を用いて温度を
維持した。次にその混合物は５倍量の‘トリトン洗浄バッファー（Ｔｒｉｔｏｎ
ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ）’（５０ｍＭ トリス ｐＨ８．１，０．５％ ト
リトンＸ−１００，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ アジ化ナトリウム，１０
ｍＭ ＥＤＴＡ， ２ｍＭ ＤＴＴ）で希釈した。最短で１時間、氷上で培養し
た後、次にその混合物を、ベックマンＧＳ−６Ｒ遠心器を用いて３５００ｒｐｍ
で遠心分離し、上清を捨てた。その沈殿を、小さいプラスチックディスポーザブ
ルピペットを用いて‘再懸濁バッファー’（５０ｍＭ トリス ｐＨ８．１，１
００ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，２ｍＭ ＤＴＴ）中で再懸濁した。
次にベックマンＪ２−２１遠心分離器で、８０００ｒｐｍで遠心分離し、その上
清を捨てた。次にその沈殿を、手動ホモジナイザーを用いて、‘グアニジンバッ
ファー’（５０ｍＭ トリス ｐＨ８．１，６．０Ｍ 塩酸グアニジン，１００
ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ＤＴＴ）中で再懸濁した。低
速の遠心分離で不溶性物質を取り除いた後、その上清を等分して−７０℃で保存
した。バクテリア培養液１リットル当り１００ｍｇのおよその収率が、継続的に
得られた。
【０１４１】 精製された封入体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、グアニジンバッファー中の封入
体標品２μlを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーで希釈し、１００℃、２
分間加熱することによってなされた。まだ温かいうちにゲルにローディングし、
グアニジン／ＳＤＳ混合物がローディングの際に沈殿することを防いだ。この方
法で精製された封入体タンパク質は、この方法で行われたＳＤＳ−ＰＡＧＥのク
ーマシー染色により、約９０％の純度と判断された（図２３を参照）。
【０１４２】 実施例１０−ＴＣＲヘテロ二量体の再生および精製 等しい比率を有する尿素−可溶化タンパク質を、さらに３７℃で、‘グアニジ
ンバッファー’（６Ｍ 塩酸グアニジン，１０ｍＭ 酢酸ナトリウム ｐＨ５．
５，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，２ｍＭ ＤＴＴ）中で変性した。タンパク質の混合物
を、総タンパク質濃度が６０ｍｇ／Ｌになるように迅速に混合しながら、氷冷再
生バッファー（１００ｍＭ トリス ｐＨ８．１，０．４Ｍ 塩酸Ｌ−アルギニ
ン，５．０Ｍ 尿素，５ｍＭ 還元グルタチオン，０．５ｍＭ 酸化グルタチオ
ン）に注入した。少なくとも５時間氷上で培養し再生をさせた後、その混合物を
、１０倍量の脱塩水で２４時間、次に１０倍量の１０ｍＭ トリス ｐＨ８．１
で２４時間透析した。
【０１４３】 次に透析した再生タンパク質を、０．４５μニトロセルロースメンブレン(ワ
ットマン)でろ過して凝集タンパク質（再生中に副産物として生産された）を除
去した。次にビオチン−標識された可溶性ＴＣＲの精製は、バイオキャド スプ
リント システム（Ｂｉｏｃａｄ Ｓｐｒｉｎｔ ｓｙｓｔｅｍ）を用いてＰＯ
ＲＯＳ ２０ＱＨカラムにローディングすることによってなされた。約５００ｍ
ｌの再生タンパク質溶液を１ラン当りローディングすることができ、タンパク質
の溶出はビス−トリス−プロパンバッファーｐＨ８．０の塩化ナトリウム濃度勾
配溶液によって実施した。約１００ｍＭの塩化ナトリウム濃度でタンパク質が溶
出し、該当フラクションは即座に氷冷され、プロテアーゼ阻害剤カクテルを加え
た。フラクションはクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１４４】 実施例１１−ビオチン化可能β鎖を有するＴＣＲヘテロ二量体の再生および精
製 ビオチン−標識されたＴＣＲβ鎖は、等量の発現されたα鎖と混合され、可溶
性Ｔ細胞受容体として精製された。ヘテロ二量体ＴＣＲ−β−ＢＴは、実施例１
０でＴＣＲに関して説明されているのと同じ方法に従って再生した（図２６を参
照）。
【０１４５】 実施例１２−ビオチン−標識された可溶性ＴＣＲｚ−ＢＴのビオチン化 タンパク質含有フラクションは、１０Ｋを分離する遠心分離濃縮器（ウルトラ
フリー、ミリポア）を用いて２．５ｍｌに濃縮した。１０ｍＭトリス ｐＨ８．
１、５ｍＭ ＮａＣｌ、で平衡化したＰＤ−１０脱塩カラムバッファーを用いて
バッファーを交換し、さらにプロテアーゼ阻害剤カクテルを加えた。遠心分離濃
縮器を再び用いてタンパク質を１ｍｌまで濃縮した。この１ｍｌのビオチン−標
識された可溶性ＴＣＲに対して、以下のものを加えた：７．５ｍＭ ＭｇＣｌ2
，５ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ビオチン，２．５μｇ／ｍｌ Ｂｉ
ｒＡ ビオチン化酵素。次にビオチン化反応を、室温（２０〜２５℃）で一晩進
行させた。
【０１４６】 次に酵素的にビオチン化された可溶性ＴＣＲを、ファルマシアＰＦＬＣシステ
ムを用いて、スーパーデックス２００ＨＲカラム（ファルマシア）でゲルろ過す
ることによって、残留した未反応ビオチンから分離した（図２７を参照）。カラ
ムはＰＢＳで平衡化され、１ｍｌフラクションは回収され、即座に氷上で冷やさ
れ、再びプロテアーゼ阻害剤カクテルで保護した。タンパク質濃度は、クーマシ
ー結合分析（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて推定され、次にビオチン化タンパク質は４
℃で１ヶ月まで、または−２０℃でより長い期間保存された。
【０１４７】 ビオチン化反応の効率を、ビオチン化タンパク質のウェスタンブロッティング
を用いて調べた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、前述した方法を用いて泳動した。し
かし、染色の代わりに、ゲルは、セミフォア セミ−ドライ エレクトロブロッ
ティング装置（ＳｅｍｉＰｈｏｒ ｓｅｍｉ−ｄｒｙ ｅｌｅｃｔｏｂｌｏｔｔ
ｉｎｇ ａｐｐａｒａｔｕｓ：Ｈｏｅｆｅｒ）を用いてＰＶＤＦメンブレン（バ
イオラッド）上にブロッティングした。６層のフィルターペーパー（ワットマン
４Ｍ）からなるブロッティングスタックをゲルのサイズに切り、トランスファ
ーバッファー（２５ｍＭ トリス塩基，１５０ｍＭ グリシン）に浸し、次に前
もってメタノールで湿らせたＰＶＤＦメンブレン、次にトランスファーバッファ
ーに浸し、さらにゲルをトランスファーバッファー中で５分間、ゆっくり攪拌し
て、次に６層以上の浸されたフィルターペーパーを重ねた。そのスタックはすべ
ての気泡をロールアウトするために試験管を用いてゆっくり圧力をかけられ、約
１０ｍｌの追加のトランスファーバッファーを、導電力を補助するために加えた
。陰極をそのスタックの上部に設置し、装置を介して定電流５０ｍＡで１時間、
電流を流した。次にそのメンブレンを、ＰＢＳ−Ｔバッファー（ＰＢＳ＋０．０
５％トゥイーン−２０）の２％ゼラチン（バイオラッド）溶液中で、１時間以上
、室温で穏やかに攪拌しながら培養した。一晩の培養には、バクテリアの増殖を
防ぐために０．０１％アジ化ナトリウムも含ませた。そのメンブレンをＰＢＳ−
Ｔを数回（４〜５回）換えることで洗浄し、次にＰＢＳ−Ｔの１％ゼラチン溶液
で１：１０００に希釈されたアビジン−ＨＲＰ結合体（シグマ）で、３０分以上
、室温でおだやかに攪拌しながら染色した。次にＰＢＳ−Ｔを数回換えることで
メンブレンを洗浄し、その後Ｏｐｔｉ−４ＣＮ（バイオラッド）で検出した。こ
れはＨＲＰの存在下で、結合したＨＲＰの存在によって示されるように、相関す
るタンパク質が存在する場所でメンブレンを染色する可溶性青色染料を形成する
反応をする剤である。アビジン−ＨＲＰ結合体が染色に使用されている場合には
、ビオチン−含有タンパク質の存在を確かめる。
【０１４８】 図２８は、このような方法でいくつかのビオチン化ＴＣＲに関してなされたブ
ロットを示している。このブロットで使用された標準は、ビオチン化された広範
囲の分子量マーカー（バイオラッド）であった。そのブロットにより、ＢｉｒＡ
酵素と反応したビオチン化標識を含むＴＣＲの、高いレベルのビオチン化がはっ
きり示された。
【０１４９】 実施例１３−ビオチン化された可溶性ＭＨＣ−ペプチド複合体の製造 ビオチン化可溶性ＭＨＣ−ペプチド複合体は、実施例２で説明したように製造
される。
【０１５０】 実施例１４−可溶性ＴＣＲおよびＭＨＣ−ｆｌｕ−ペプチドの特異的結合の分
析 可溶性ＴＣＲのＪＭ２２ｚは、インフルエンザマトリックスタンパク質のアミ
ノ酸残基５８〜６６（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）からなる免疫優勢抗原を提示するＨ
ＬＡ−Ａ２ ＭＨＣ分子に特異的である。ＪＭ２２ｚのクローニング、発現およ
び精製は、実施例４、７、９および１０、ならびに、図２４および２５において
説明されている。ＪＭ２２ｚおよびそのリガンド／ＭＨＣ複合体（ＨＬＡ−Ａ２
−ｆｌｕ）の相互作用、または、重要でないＨＬＡ−Ａ２ペプチド組み合わせ、
実施例１３で説明されている生産物を、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００TM表面プラスモ
ン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーで分析した。ＳＰＲは、スモールフローセル中
のセンサー表面近くで、応答単位（ＲＵ）で発生する屈折率の変化、受容体とリ
ガンドとの相互作用を検出しそれらの親和性とカイネティクスパラメーターを分
析するために用いられる成分を測定する。プローブフローセルは、架橋されたビ
オチン間の結合を介した別々のフローセルにおける個々のＨＬＡ−Ａ２−ペプチ
ド複合体を、フローセルの活性化表面に化学的に架橋されたβ２ｍおよびストレ
プトアビジンへ固定することによって調製した。次に一定流速で、異なるフロー
セルの表面上にＪＭ２２ｚを通過させることによって分析を行い、それに対する
ＳＰＲ応答を測定した。初めは、５μｌ／分の一定流速で、２８μＭのＪＭ２２
ｚが３つの異なる表面上を通過することによって相互作用の特異性を確認した。
第一に、ＨＬＡ−Ａ２−ｆｌｕの２８００ＲＵで被覆されたもの、第二にＨＩＶ
逆転写酵素（ＨＬＡ−Ａ２−ｐｏｌ：ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ）からの無関係なペプ
チドで折りたたまれたＨＬＡ−Ａ２の４２００ＲＵで被覆されたもの、および、
第三にＣＤ５の４３００ＲＵで被覆されたのもの（図２９ａを参照）。ＨＬＡ−
Ａ２−ｐｏｌ上の、一定流速および異なる濃度の可溶性ＪＭ２２ｚの注入は、バ
ックグラウンドの共鳴を定義するために用いられた（図２９ａ）。これらのコン
トロール測定の値は、ＨＬＡ−Ａ２−ｆｌｕで得られた値から差し引かれ（図２
９ｂ）、解離定数Ｋｄとして表現された結合親和性を計算するために用いられた
（図２９ｃ）。ＪＭ２２ｚおよび関連するＭＨＣ分子のＫｄは、３７℃で１５±
４μＭ（ｎ＝７）、２５℃で６．６±２μＭ（ｎ＝１４）と測定された。プロー
ブフローセルに固定化されたＴＣＲおよびＭＨＣ−ペプチド複合体を用いた測定
において、２５℃で５．６±４μＭ（ｎ＝３）のように類似したＫｄが得られた
。相互作用のオン−レイト（ｏｎ−ｒａｔｅ）は、３７℃で、６．７×１０4〜
６．９×１０4Ｍ-1ｓ-1と測定され、一方でオフ−レイト（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）
は１．１ｓ−１であった（Ｗｉｌｌｃｏｘ，Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，１９９９）。
【０１５１】 実施例１５−可溶性マウスＴＣＲおよびマウスＭＨＣ Ｈ２−Ｄb−ＮＰ間の
特異的結合に関する分析 本実験において、我々は、マウスＭＨＣ Ｈ２−Ｄb ＭＨＣ分子（ＭＨＣ
Ｈ２−Ｄb−ＮＰ）によって提示されたインフルエンザウイルス核タンパク質（
ａａ．３６６−３７４：ＡＳＮＥＮＭＤＡＭ）から得られたペプチドに特異的な
マウスＴＣＲ、Ｆ５を用いた。用いられたＭＨＣ重鎖遺伝子は、天然タンパク質
のアミノ酸１〜２８０およびＢｒｉＡ酵素によって認識される１３アミノ酸配列
のみをコードしたセンス鎖において、わずかに修飾されていた。生じるタンパク
質は、酵素的にビオチン化することができる（Ｓｃｈａｔｚ １９９３；Ｏ’Ｃ
ａｌｌａｇｈａｎ，Ｂｙｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．１９９９）。ＳＰＲは、固定化
ＭＨＣ Ｈ２−Ｄb−ＮＰに特異的な可溶性ＴＣＲを用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ２
０００TMＳＰＲバイオセンサーで分析し、リガンドＭＨＣ−ペプチド結合に特異
的に結合することが示された（データは示さず）。
【０１５２】 実施例１６−ビオチン化可溶性ｔａｘ−ＴＣＲと、ビオチン化可溶性変異型ｔ
ａｘ−ＴＣＲとの結合の比較 ビオチン化可溶性ｔａｘ−ＴＣＲは、実施例９〜１１で調製され、Ｂｉａｃｏ
ｒｅ２０００分析を、インフルエンザマトリックスペプチド（ＧＩＬＧＦＶＦＴ
Ｌ）またはＨＴＬＶ ｔａｘ１１〜１９ペプチド（ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ）のいず
れかと再生されたビオチン化ｐＭＨＣ複合体を用いて実施例１４で実施した。ビ
オチン化可溶性ＴＣＲを、計１分間、５μｌ／分で、すべての細胞の上に流した
。図３０は、第一に、ビオチン化可溶性ｔａｘ−ＴＣＲの、次にビオチン化可溶
性変異型ｔａｘ−ＴＣＲの、ＨＴＬＶ ｔａｘ１１〜１９ペプチド−ＭＨＣ複合
体（Ａ）に対する結合を示している。天然型または変異型ｔａｘ−ＴＣＲのいず
れも、インフルエンザマトリックスペプチド−ＭＨＣ複合体（Ｂ／Ｃ）またはＯ
Ｘ６８モノクローナル抗体コントロール（Ｄ）のいずれとも結合しないことが示
された。それゆえ、我々は、天然型および変異型ビオチン化可溶性ＴＣＲの両方
は、ｔａｘ−ｐＭＨＣ複合体に効果的にかつ特異的にはっきり結合し、結合の程
度において非常にわずかな差異しか示さない、ということを結論付けた。
【０１５３】 実施例１７−ＴＣＲ−およびＣＤ８補受容体の、固定化ＭＨＣペプチド複合体
の同時結合の分析 ＣＤ８およびＣＤ４は、表面糖タンパク質であり、ＴＣＲと同じＭＨＣ分子に
同時に結合することによってＴＣＲの補受容体として機能すると考えられる。Ｃ
Ｄ８は細胞傷害性Ｔ細胞に特徴的であり、ＭＨＣクラスＩ分子に結合し、一方で
ＣＤ４はヘルパーリンケージのＴ細胞で発現され、ＭＨＣクラスII分子と結合す
る。ＣＤ８は、二つの同一なα鎖またはαおよびβ鎖のいずれかからなる二量体
である。ホモ二量体のαα−ＣＤ８分子は、ＰＣＴ／ＧＢ９８／０３２３５；（
Ｇａｏ，Ｔｏｒｍｏ ｅｔ ａｌ．１９９７；Ｇａｏ，Ｇｅｒｔｈ ｅｔ ａｌ
．１９９８）で記載されているものに従って製造した。本実施例において、我々
は、可溶性ＴＣＲおよびＣＤ８分子が、固定化ＨＬＡ−Ａ２−ｆｌｕ複合体へ同
時に結合することを説明する。図３１Ａでわかるように、結合応答は単に付加的
である。ＴＣＲ応答の値（白丸）を、結合応答の値（黒丸）から差し引くことで
、１２０μＭ ＣＤ８のみの応答の値（白三角）に非常に近い値（白四角）を得
た。図３１Ｂは、ＴＣＲ−ＭＨＣ−ペプチド相互作用の反応速度は、ＣＤ８の同
時結合によって影響されないことを示している。観察された付加的な結合は、Ｔ
ＣＲおよびＣＤ８は、ＭＨＣペプチド複合体と、別々の界面で結合することを示
している。実施例はまた、いくつかの場合において、一つの分子の特異的結合は
、他の分子の特異的結合に影響を及ぼすものではなく、状況は他の分子の結合に
関して異なると強く思われる。
【０１５４】 実施例１８−可溶性α／βＴＣＲの発現、再生および部位特異的ビオチン化 ａ）ＴＣＲαおよびβ鎖の製造 ヘテロ二量体ＴＣＲ分子の組換え可溶性形態は、図３６の概説のように製造し
た。それぞれの鎖は、膜−遠位および−近位免疫グロブリンドメインを含み、こ
れらは短い可変性リンカーを介して、ヘテロ二量体の安定化を助ける高次コイル
モチーフへ融合している。
【０１５５】 図３２〜３４および３８〜４１は、異なる特異性を持つＴＣＲからの様々なＴ
ＣＲアルファおよびベータ鎖に関するＤＮＡコード配列およびそれに対応するア
ミノ酸配列を示している。この実施例は、図３２〜３４の配列によって表現され
たＴＣＲに焦点を当てているが、開示された方法は図３８〜４１で示されたＴＣ
Ｒを用いて同様に実行することができる。
【０１５６】 ＴＣＲ定常ドメインは、インビボで鎖内のジスルフィド結合を形成するシステ
イン残基の前で切りとられる。その結果、非共有結合の四次的な接触により二つ
の鎖は対になる。Ｆｏｓ−Ｊｕｎジッパーペプチドへテロ二量体も、使用された
リンカーに対してＮ−末端に近接した鎖同士のジスルフィドを形成することがで
きることから（Ｏ’Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ，１９８９）、互いに関連する二つの
鎖の配列が最適であることが予想される。融合タンパク質は、それぞれの構造を
壊すことを防止するために、分離した各成分と適合する手法で結合されることが
必要である。
【０１５７】 ＨＬＡ−Ａ２におけるインフルエンザマトリックスタンパク質５８〜６６エピ
トープに特異的なＴＣＲのアルファおよびベータ鎖をコードするｃＤＮＡは、以
前に述べられているような固定されたＰＣＲ（Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ，１９９１
）によって、Ｖβ１７＋ヒトＣＬＴクローン（ＪＭ２２）から得られた。
【０１５８】 アルファおよびベータＴＣＲ−ジッパー構造、ｐＪＭ２２α−Ｊｕｎおよびｐ
ＪＭ２２β−Ｆｏｓは、標準的なＰＣＲ技術を用いてそれぞれの鎖の可変および
定常ドメインを増幅し、ロイシンジッパードメイン上で、真核性転写因子 Ｊｕ
ｎおよびＦｏｓそれぞれから生産物をスプライシングすることによって、それぞ
れ構築した。これら４０のアミノ酸長さの配列は、共有結合的な鎖内の結合を必
要とすることなく、合成ペプチドから折りたたまれるときに特異的なヘテロ二量
体化を示す（Ｏ’Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ，１９８９）。
【０１５９】 プライマーは、３’の近くから開始コドンにおいて高いＡＴ含量を有するよう
に設計されており（ｍＲＮＡ二次構造を不安定化させるために）、さらにＥ．ｃ
ｏｌｉコドン選択を用いており、これは発現を最小化するためである（Ｇａｏ
ｅｔ ａｌ）。再生の間に誤ったジスルフィド結合が発生することを確認するた
めに、ＴＣＲベータ定常ドメインにおける余分なシステインはセリンに変異され
た。
【０１６０】 融合したＤＮＡおよびタンパク質の配列は、図３２および３３に示される。こ
のＴＣＲのβ鎖の部位特異的ビオチン化を可能にするために、いわゆる“ビオチ
ン−標識”をコードするＤＮＡ配列を、可溶性Ｖβ１７を発現する遺伝子の３’
末端に形成した。以下のＰＣＲプライマーは、このＤＮＡ構築を形成するために
用いられた。
【０１６１】
【化３】
【０１６２】 生じたＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｄｅｌおよびＨｉｎｄIII（ニューイングラ
ンド バイオラブス）で消化され、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランド
バイオラブス）を用いてベクターｐＧＭＴ７７にライゲーションした（Ｓｔｕｄ
ｉｅｒ ｅｔ ａｌ、１９９０）。図３は、この構築において挿入されたＤＮＡ
配列および推測されるタンパク質配列を示す。
【０１６３】 ｂ）ＴＣＲ鎖の発現 ＨＬＡ−Ａ*０２０１によって提示されるインフルエンザウイルスマトリック
スペプチドに特異的なＴＣＲの発現および再生を以下のように行った。
【０１６４】 ＴＣＲαおよびβ鎖を、ＴＹＰ倍地（１．６％ バクト−トリプトン（ｂａｃ
ｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ）、１．６％ 酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ、０．
２５％ Ｋ2ＨＰＯ4）中で、ベクターｐＧＭＴ７の条件下において、それぞれＥ
．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１ＤＥ３ｐＬｙｓＳ中で発現させた。発現は対数期の中間で
、０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導され、３〜５時間後、遠心分離によってバクテリ
アを収穫した。バクテリアの細胞を、“溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆ
ｅｒ）”（１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ トリス ｐＨ８、
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．１ｍｇ／ｍｌ リゾチーム
、１０％グリセロール）で再懸濁することによって溶解し、次に１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2および２０μｇ／ｍｌ ＤＮアーゼＩを添加し、氷上で２０分間培養し、
１０×３０秒のバーストで、プローブソニケーター（ｐｒｏｂｅ ｓｏｎｉｃａ
ｔｏｒ）を用いて超音波破砕した。次に、封入体中のタンパク質を、１５，００
０ｒｐｍ、２０分間の遠心分離によって封入体を沈殿させることにより、“トリ
トンバッファー”（０．５％ トリトンＸ−１００，５０ｍＭ トリス ｐＨ８
，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％アジ化ナトリウム，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，２
ｍＭ ＤＴＴ）で数回（通常３回）洗浄して、ダンス型ホモジナイザーでそれら
を再懸濁することによって精製した。５０ｍＭ トリス ｐＨ８、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴの溶液で一回洗浄することによ
り標品から界面活性剤を除き、そのタンパク質は尿素バッファー（２０ｍＭ ト
リス ｐＨ８，８Ｍ 尿素，１０％グリセロール，５００ｍＭ ＮａＣｌ，１０
ｍＭ ＥＤＴＡ，２ｍＭ ＤＴＴ）で可溶化させた。４℃で一晩、転倒式に混合
した後、その溶液を遠心分離によって清澄させ、可溶化タンパク質を−７０℃で
保存した。そのタンパク質濃度をクーマシー結合分析（Ｐｉｅｒｃｅ）によって
測定した。
【０１６５】 ｃ）ＴＣＲの再生 それぞれ等しい量の尿素−可溶化タンパク質を、さらに‘グアニジンバッファ
ー’（６Ｍ 塩酸グアニジン，１０ｍＭ 酢酸ナトリウム ｐＨ ５．５，１０
ｍＭ ＥＤＴＡ，２ｍＭ ＤＴＴ）中、３７℃で変性させた。この溶液は、氷上
で再生バッファー（５Ｍ 尿素，１００ｍＭ トリス ｐＨ８，４００ｍＭ Ｌ
−アルギニン，５ｍＭ 還元グルタチオン，０．５ｍＭ 酸化グルタチオン，０
．１ｍＭ ＰＭＳＦ）に加えられ、迅速に混合した。４℃で１２時間を超過した
後、その溶液を１０倍量の水、次に１０倍量の１０ｍＭ トリス ｐＨ８，１０
０ｍＭ 尿素で透析した。プロテアーゼ阻害剤のＰＭＳＦをすべての段階で添加
し、ＴＣＲ上のビオチン化標識のタンパク質分解によるロスを最小化した。
【０１６６】 ｄ）ＴＲＣの精製 ＴＣＲの希釈溶液を、０．４５ミクロンフィルターでろ過して凝集タンパク質
を除去し、次にＰＯＲＯＳ １０ＨＱカラム上にローディングした。再生ＴＣＲ
を、１０ｍＭ トリス ｐＨ８中の塩化ナトリウムの勾配で溶出させ、１ｍｌの
フラクションを回収してＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図３６を参照）。ＴＣＲ
を含むフラクションは貯蔵され、３０ｋＤａの分子量を分離する遠心分離濃縮器
を用いて濃縮された。
【０１６７】 ｅ）ＴＣＲのビオチン化 １ｍｌのＴＣＲ溶液を、緩衝化ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ビオチ
ンを用いて７．５ｍＭ ＡＴＰ濃度に調製し、ＰＭＳＦ、ロイペプチン、ペプス
タチンを含むプロテアーゼ阻害剤カクテルを加えた。最終的に、酵素ＢｉｒＡを
最終濃度５μｇ／ｍｌになるように添加し、その反応を室温で一晩行った。次に
ＴＣＲはゲルろ過で遊離ビオチンから分離された（図３７参照）。ビオチン化Ｔ
ＣＲを含むフラクションは貯蔵され、プロテアーゼ阻害剤カクテルを加えられた
タンパク質濃度も測定された。図３５は、可溶性ビオチン化ＴＣＲの概略図を示
す。
【０１６８】 参考文献
【０１６９】
【化４】
【０１７０】
【化５】
【０１７１】
【化６】
【０１７２】
【化７】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、Ｔ細胞受容体−ロイシンジッパー融合タンパク質の模式
図である。それぞれの鎖は、２個の免疫グロブリンスーパーファミリードメイン
、即ち１個の可変ドメイン（Ｖ）、１個の定常ドメイン（Ｃ）からなる。定常ド
メインは、鎖同士のシステイン残基のｎ−末端を即座に切り離し、短いリンカー
を介してｃ−末端で約４０のアミノ酸のｃ−ｊｕｎ（α）およびｃ−ｆｏｓ（β
）からのロイシンジッパーヘテロ二量体モチーフに融合される。α−ｊｕｎおよ
びβ−ｆｏｓはそれぞれ、二個の鎖間ジスルフィド結合、単に非共有的な接触に
よる対からなる。α鎖は、定常ドメインが小さいためβ鎖より短い。
【図２】 図２は、ヘテロ二量体ＪＭ２２ｚｉｐ受容体の、還元／非還元ゲ
ル分析の写真である。精製されたＴＣＲ−ジッパーの同一サンプルが１５％アク
リルアミドＳＤＳゲル上にローディングされ、それぞれは還元条件（レーン２）
および非還元条件（レーン４）である。マーカータンパク質は、レーン１および
３に示される。分子量はキロダルトンで示した。両条件下で、非共有結合的に関
係しているヘテロ二量体は、アルファおよびベータ鎖に切断する。レーン４にお
いて、それぞれの鎖は高い移動度で、単一のバンドとして移動し、一種類の鎖内
のジスルフィド結合が存在することを示している。これは正しいジスルフィド結
合形成と一致している。
【図３】 図３は、ＪＭ２２ｚｉｐ ＴＣＲのＨＬＡ−Ａ２ｆｌｕマトリッ
クス（Ｍ５８−６６）複合体への特異的な結合を示す図である。ＨＬＡ−Ａ２複
合体は、単一ペプチド周辺で再生され、β２−ミクログロブリンでビオチン化さ
れており、３個のストレプトアビジン フローセル上に固定化されている：ＨＬ
Ａ−Ａ２ ＰＯＬの３７７０の共鳴単位（ＲＵ）は、フローセル（ＦＣ）３およ
びＨＬＡ−Ａ２ Ｍ５８−６６ ＦＬＵの二つの異なるレベルを制御している（
ＦＣ１の２９７０ＲＵ、およびＦＣ２の４９６０ＲＵ）。４３μＭの濃度のＪＭ
２２ｚｉｐは、すべての３つのフローセル上に６０秒間連続的に可溶性相中へ注
入された。注入の間、ＨＬＡ−Ａ２ ＦＬＵ−被覆フローセル両方の応答での上
記バックグラウンドの増加は、フローセル１および２それぞれへのＪＭ２２ｚｉ
ｐの特異的結合である約１０００ＲＵおよび７０ＲＵでみられた。
【図４】 図４は、“ＴＣＲ遺伝子のアンカー増幅”のために用いられた合
成ＤＮＡプライマーを示している。クローニングに用いられたＤＮＡ制限酵素の
認識部位は、下線で示されている。Ａ：ポリ−Ｃ“アンカープライマー”。Ｂ：
ＴＣＲα鎖定常領域特異的プライマー。Ｃ：ＴＣＲβ鎖定常領域特異的プライマ
ー。
【図５】 図５は、ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓの４０アミノ酸高次コイル
（“ロイシンジッパー”）領域をコードするＤＮＡフラクションのＰＣＲ増幅に
用いられる合成ＤＮＡプライマーの配列を示している。クローニングに用いられ
たＤＮＡ制限酵素の認識部位は、下線で示している。Ａ：ｃ−ｊｕｎ５’プライ
マー。Ｂ：ｃ−ｊｕｎ３’プライマー。Ｃ：ｃ−ｆｏｓ５’プライマー。Ｄ：ｃ
−ｆｏｓ３’プライマー。
【図６】 図６は、ＴＣＲに融合したｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎフラグメ
ント（ｐＢＪ１０７およびｐＢＪ１０８に挿入）のぞれぞれのＤＮＡおよびアミ
ノ酸（一文字コード）配列を示している。Ａ：ＴＣＲα鎖に融合したｃ−ｊｕｎ
ロイシンジッパー。Ｂ：ＴＣＲβ鎖に融合したｃ−ｆｏｓロイシンジッパー。
【図７】 図７は、ＴＣＲβ鎖で対をなさないシステイン残基を変異させる
のに用いる合成ＤＮＡプライマーの配列を示している。プライマーは、変異誘発
のための“クイックチェンジ（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ）TM”法（ストラタジー
ン）の使用により切れるように設計されている。Ａ：フォワード（センス）プラ
イマーのシステインからセリンへの変異の、アミノ酸配列と変異を示す。Ｂ：バ
ックワード（ナンセンス）プライマーのシステインからセリンへの変異。Ｃ：フ
ォワード（センス）プライマーのシステインからアラニンへの変異の、アミノ酸
配列と変異を示す。Ｄ：バックワード（ナンセンス）プライマーのシステインか
らアラニンへの変異。
【図８】 図８は、ＴＣＲ−ジッパー融合タンパク質の模式的表現である。
４つの免疫グロブリンドメインは、ドーム状に示されており、示されているシス
テイン残基マッチング対間で鎖内のジスルフィド結合を持つ。数は成熟したＴ細
胞受容体鎖でのアミノ酸位置を示している；組換え後の鎖長さにおけるわずかな
変動により、鎖長さは異なるＴＣＲ間で多少変化する。リンカー配列においてロ
ーディングされた残基は、一文字コードで示されている。
【図９】 図９は、ＴＣＲαおよびβ鎖のＰＣＲ増幅に用いる合成ＤＮＡプ
ライマーの配列を示す。ＤＮＡ制限酵素の認識部位は下線で示され、それぞれの
ＴＣＲ鎖に対応するアミノ酸配列は、フォワードプライマー配列の上に示されて
いる。ＴＣＲ遺伝子配列およびＴＣＲ遺伝子に相当しない他のＤＮＡ配列に関連
したサイレントＤＮＡ変異は、小文字で示されている。Ａ：ＪＭ２２インフルエ
ンザマトリックスウイルスペプチド−ＨＬＡ−Ａ０２０１のヒトＶα１０．２鎖
で限定されたＴＣＲの５’ＰＣＲプライマー。Ｂ：ＪＭ２２インフルエンザマト
リックスウイルスペプチドＨＬＡ−Ａ０２０１のヒトＶβ１７鎖で限定されたＴ
ＣＲの５’ＰＣＲプライマー。Ｃ：インフルエンザ核タンパク質ペプチド−Ｈ２
−ＤbのマウスＶα４鎖で限定されたＴＣＲの５’ＰＣＲプライマー。Ｄ：イン
フルエンザ核タンパク質ペプチド−Ｈ２−ＤbのマウスＶβ１１鎖で限定された
ＴＣＲの５’ＰＣＲプライマー。Ｅ：００３ＨＩＶ−１ Ｇａｇペプチド−ＨＬ
Ａ−Ａ０２０１のヒトＶα２３鎖で限定されたＴＣＲの５’ＰＣＲプライマー。
Ｆ：００３ＨＩＶ−１ Ｇａｇペプチド−ＨＬＡ−Ａ０２０１のヒトＶβ５．１
鎖で限定されたＴＣＲの５’ＰＣＲプライマー。Ｇ：ＨＴＬＶ−１ ｔａｘペプ
チド−ＨＬＡ−Ａ０２０１のヒトＶα２．３鎖で限定されたＡ６ ＴＣＲの５’
ＰＣＲプライマー。Ｈ：ＨＴＬＶ−１ ｔａｘペプチド−ＨＬＡ−Ａ０２０１の
ヒトＶβ１２．３鎖で限定されたＡ６ ＴＣＲの５’ＰＣＲプライマー。Ｉ：Ｈ
ＴＬＶ−１ ｔａｘペプチド−ＨＬＡ−Ａ０２０１のヒトＶα１７．２鎖で限定
されたＢ７ ＴＣＲの５’ＰＣＲプライマー。Ｊ：ＨＴＬＶ−１ ｔａｘペプチ
ド−ＨＬＡ−Ａ０２０１のヒトＶβ１２．３鎖で限定されたＢ７ ＴＣＲの５’
ＰＣＲプライマー。Ｋ：一般的に適用できる、ヒトＣα鎖の３’ＰＣＲプライマ
ー。Ｌ：一般的に適用できる、ヒトＣβ鎖の３’ＰＣＲプライマー。
【図１０】 図１０は、ｃ−ｊｕｎの“ロイシンジッパー”ドメインに融合
した、ＪＭ２２からの可溶性ＨＬＡ−Ａ２／ｆｌｕマトリックスで限定されたＴ
ＣＲα鎖の予想されるタンパク質配列（一文字コード、上部）およびＤＮＡ配列
（下部）を示している。Ｅ．ｃｏｌｉでの遺伝子発現を増強するためにＤＮＡ配
列の５’末端にローディングされた変異は、小文字で示されており、ＴＣＲおよ
びｃ−ｊｕｎ配列間のリンカー配列も同様である。
【図１１】 図１１は、ｃ−ｆｏｓの“ロイシンジッパー”ドメインに融合
した、ＪＭ２２からの可溶性ＨＬＡ−Ａ２／ｆｌｕマトリックスで制限されたＴ
ＣＲβ鎖の予想されるタンパク質配列（一文字コード、上部）およびＤＮＡ配列
（下部）を示している。ＴＣＲおよびｃ−ｆｏｓ配列間のリンカー配列は、小文
字で示されている。
【図１２】 図１２は、ｃ−ｊｕｎからの“ロイシンジッパー”ドメインに
融合した、マウスＦ５受容体からの可溶性Ｈ２−Ｄb／インフルエンザウイルス
核タンパク質で制限されたＴＣＲα鎖の予想されるタンパク質配列（一文字コー
ド、上部）およびＤＮＡ配列（下部）を示している。Ｅ．ｃｏｌｉでの遺伝子発
現を増強するためにＤＮＡ配列の５’末端にローディングされた変異は、小文字
で示されており、ＴＣＲおよびｃ−ｊｕｎ配列間のリンカー配列も同様である。
【図１３】 図１３は、ｃ−ｆｏｓの“ロイシンジッパー”ドメインに融合
した、マウスＦ５受容体からの可溶性Ｈ２−Ｄb／インフルエンザウイルス核タ
ンパク質によって制限されたＴＣＲβ鎖の予想されるタンパク質配列（一文字コ
ード、上部）およびＤＮＡ配列（下部）を示したものである。ＴＣＲおよびｃ−
ｆｏｓ配列間のリンカー配列は、小文字で示されている。
【図１４】 図１４は、ｃ−ｊｕｎからの“ロイシンジッパー”ドメインに
融合した、患者００３からの可溶性ＨＬＡ−Ａ２／ＨＩＶ−１ Ｇａｇで制限さ
れたＴＣＲα鎖の、予想されるタンパク質配列（一文字コード、上部）およびＤ
ＮＡ配列（下部）を示している。Ｅ．ｃｏｌｉでの遺伝子発現を増強するために
ＤＮＡ配列の５’末端にローディングされた変異は、小文字で示されており、Ｔ
ＣＲおよびｃ−ｊｕｎ配列間のリンカー配列も同様である。
【図１５】 図１５は、ｃ−ｆｏｓの“ロイシンジッパー”ドメインに融合
した、患者００３からの可溶性ＨＬＡ−Ａ２／ＨＩＶ−１ Ｇａｇで制限された
ＴＣＲβ鎖の予想されるタンパク質配列（一文字コード、上部）およびＤＮＡ配
列（下部）を示している。ＴＣＲおよびｃ−ｆｏｓ配列間のリンカー配列は、小
文字で示されている。
【図１６】 図１６は、ｃ−ｊｕｎの“ロイシンジッパー”ドメインに融合
した、クローンＡ６（Ｇａｒｂｏｃｚｉ，Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｇａ
ｒｂｏｃｚｉ，Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ，１９９６）からの可溶性ＨＴＬＶ−１
Ｔａｘ／ＨＬＡ−Ａ２で制限されたＴＣＲα鎖の予想されるタンパク質配列（
一文字コード、上部）およびＤＮＡ配列（下部）を示している。Ｅ．ｃｏｌｉで
の遺伝子発現を増強するためにＤＮＡ配列の５’末端にローディングされた変異
は、小文字で示されており、ＴＣＲおよびｃ−ｊｕｎ配列間のリンカー配列も同
様である。
【図１７】 図１７は、ｃ−ｆｏｓの“ロイシンジッパー”ドメインおよび
ＢｒｉＡの基質として作用するビオチン化標識に融合した、クローンＡ６（Ｇａ
ｒｂｏｃｚｉ，Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｇａｒｂｏｃｚｉ，Ｇｈｏｓｈ
ｅｔ ａｌ，１９９６）からの可溶性ＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ／ＨＬＡ−Ａ２で
制限されたＴＣＲβ鎖の予想されるタンパク質配列（一文字コード、上部）およ
びＤＮＡ配列（下部）を示している（Ｂａｒｋｅｒ ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ
，１９８１；Ｂａｒｋｅｒ ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ，１９８１；Ｈｏｗａｒ
ｄ，Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ，１９８５；Ｓｃｈａｔｚ，１９９３；Ｏ’Ｃａｌｌ
ａｇｈａｎ，Ｂｙｆｏｒｄ，１９９９）。ＴＣＲおよびｃ−ｆｏｓ配列間のリン
カー配列は、小文字で示されている。システイン残基をアラニン残基に置換した
ＤＮＡ配列の変異は、太文字および下線にて示されている。
【図１８】 図１８は、ｃ−ｊｕｎの“ロイシンジッパー”ドメインに融合
した、クローンＭ１０Ｂ７／Ｄ３（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９８）からの可
溶性ＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ／ＨＬＡ−Ａ２で制限されたＴＣＲα鎖の予想される
タンパク質配列（一文字コード、上部）およびＤＮＡ配列（下部）を示している
。ＴＣＲおよびｃ−ｊｕｎ配列間のリンカー配列は、小文字で示されている。
【図１９】 図１９は、ｃ−ｆｏｓの“ロイシンジッパー”ドメインおよび
ＢｒｉＡの基質として作用するビオチン化標識に融合した、クローンＭ１０Ｂ７
／Ｄ３（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９８）からの可溶性ＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ
／ＨＬＡ−Ａ２で制限されたＴＣＲβ鎖の予想されるタンパク質配列（一文字コ
ード、上部）およびＤＮＡ配列（下部）を示している。ＴＣＲおよびｃ−ｆｏｓ
配列間のリンカー配列は、小文字で示されている。アラニン残基をシステイン残
基に置換したＤＮＡ配列の変異は、太文字および下線にて示されている。クロー
ニング目的、かつＸｍａＩ制限部位を除去するためにローディングされた二つの
サイレント変異（Ｐ−Ｇコドン）もまた小文字で示されている。
【図２０】 図２０は、ｃ−ｆｏｓの“ロイシンジッパー”ドメインおよび
ＢｒｉＡの基質として作用するビオチン化標識に融合した、クローンＡ６（Ｇａ
ｒｂｏｃｚｉ，Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｇａｒｂｏｃｚｉ，Ｇｈｏｓｈ
ｅｔ ａｌ，１９９６）からの変異型可溶性ＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ／ＨＬＡ−
Ａ２で制限されたＴＣＲβ鎖の予想されるタンパク質配列（一文字コード、上部
）およびＤＮＡ配列（下部）を示している（Ｂａｒｋｅｒ ａｎｄ Ｃａｍｐｂ
ｅｌｌ，１９８１；Ｂａｒｋｅｒ ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ，１９８１；Ｈｏ
ｗａｒｄ，Ｓｈａｗ，１９８５；Ｓｃｈａｔｚ，１９９３；Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈ
ａｎ，Ｂｙｆｏｒｄ，１９９９）。ＴＣＲおよびｃ−ｆｏｓ配列間のリンカー配
列は、小文字で示されている。システイン残基をアラニン残基に置換したＤＮＡ
配列の変異は、太文字および下線にて示されている。またアスパラギン残基のア
スパラギン酸への置換、可溶性ＴＣＲに影響を与える検知されうる機能を持たな
い定常領域における変異も太文字および下線で示されている。
【図２１】 図２１は、ＴＣＲβ鎖で使用されるｃ−ｆｏｓビオチン化融合
パートナーの予想されるタンパク質配列（一文字コード、上部）およびＤＮＡ配
列（下部）を示している。ＤＮＡ制限酵素の認識部位は下線で示され、二つの融
合ドメインの太文字が示されている。リンカー配列は小文字で示されている。
【図２２】 図２２は、ヒトＪＭ２２インフルエンザマトリックスペプチド
−ＨＬＡ−Ａ０２０１のＶβ−ｃ−ｆｏｓロイシンジッパーフラグメントのＰＣ
Ｒ増幅に用いる合成ＤＮＡプライマーの配列を示している。
【図２３】 図２３は、ゲルの写真のセットである。ａ．００３ＨＩＶｇａ
ｇペプチド−ＨＬＡ−Ａ２複合体に特異的なＴＣＲの変性タンパク質標品を、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。レーン１：広範囲の分子量マーカー（バイオラッド
）、レーン２および３：０．５ｍＭ ＩＰＴＧでタンパク質発現を誘導させた後
のバクテリア、レーン４および５：６Ｍグアニジンバッファーに可溶化した精製
封入体。ｂ．インフルエンザマトリックスペプチド−ＨＬＡ−Ａ２複合体に特異
的なビオチン−標識されたＴＣＲの変性タンパク質標品を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
分析した。レーン１：広範囲の分子量マーカー（バイオラッド）、レーン２およ
び３：６Ｍグアニジンバッファーに可溶化したα−およびβ鎖の精製封入体。ｃ
．ＨＴＬＶ ｔａｘペプチド−ＨＬＡ−Ａ２複合体に特異的なビオチン−標識さ
れたＴＣＲの変性タンパク質標品を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。レーン１お
よび５：広範囲の分子量マーカー（バイオラッド）、レーン２、３および４：０
．５ｍＭ ＩＰＴＧでタンパク質発現を誘導させた後のバクテリア中のα−、β
−および変異鎖発現、レーン６、７および８：６Ｍグアニジンバッファー中で可
溶化した封入体を精製したα−、β−および変異型β鎖。
【図２４】 図２４は、ＰＯＲＯＳ １０ＨＱ陰イオン交換カラムからのＪ
Ｍ２２ｚヘテロ二量体の溶出を示すクロマトグラフィーである。破線は、塩化ナ
トリウム濃度を示す導電率を表しており、実践は溶出したタンパク質濃度を示す
２８０ｎｍでの光学濃度を表している。ピークのタンパク質を含むフラクション
は、さらなる分析のために貯蔵された。インサートはスーパーデックス２００Ｈ
Ｒカラムからの精製ＪＭ２２ｚの溶出のクロマトグラムを示している。矢印は既
知分子量のタンパク質を用いたカラムの標準メモリを示している。これらのタン
パク質を用いた比較によって、再生ＪＭ２２ｚタンパク質は、約７４ｋＤａの分
子量を持つことがわかり、これはヘテロ二量体タンパク質と一致する。
【図２５】 図２５は、精製ＪＭ２２ｚタンパク質の（クーマシー染色され
た）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す写真である。レーン１およ
び３：既知分子量の標準タンパク質（示した通り）、レーン２：サンプルをロー
ディングする前に還元剤（ＤＴＴ）を含むＳＤＳ−サンプルバッファーで処理し
たＪＭ２２ｚタンパク質、レーン４：還元剤を含まないＳＤＳ−サンプルバッフ
ァーで処理したＪＭ２２ｚタンパク質。
【図２６】 ａ．インフルエンザマトリックスペプチド−ＨＬＡ−Ａ２複合
体に特異的な、再生ビオチン−標識されたＴＣＲの精製。ｉ．ＰＯＲＯＳ １０
ＨＱカラムからのタンパク質の溶出のクロマトグラム。ｘ軸は２８０ｎｍでの吸
収を示し、ｙ軸は導電率（タンパク質溶出に用いられる塩化ナトリウム濃度勾配
の目安）を示す。フラクション数は垂直線で示されている。ii．ｉにおけるカラ
ムから溶出したフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１は広範囲の分子量マ
ーカー（バイオラッド）であり、およびレーン２〜１３はフラクション６〜１５
のそれぞれ５μｌである。iii．ビオチン−標識されたｆｌｕ−ＴＣＲを含むｉ
の貯蔵フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１：広範囲の分子量マーカ
ー（バイオラッド）、レーン２：ビオチン−標識されたｆｌｕ−ＴＣＲタンパク
質。ｂ．ＨＴＬＶ−ｔａｘペプチド−ＨＬＡ−Ａ２複合体に特異的な、再生ビオ
チン−標識されたＴＣＲの精製。ｉ．ＰＯＲＯＳ １０ＨＱカラムからのタンパ
ク質の溶出のクロマトグラム。ｘ軸は２８０ｎｍでの吸収を示し、ｙ軸は導電率
（タンパク質溶出に用いられる塩化ナトリウム濃度勾配の目安）を示す。フラク
ション数は垂直線で示されている。フラクション数は垂直線で示されている。ii
．ｉにおけるカラムから溶出したフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１は
広範囲の分子量マーカー（バイオラッド）であり、およびレーン２〜１０はフラ
クション３〜１１のそれぞれ５μｌである。iii．ビオチン−標識されたｔａｘ
−ＴＣＲを含むｉの貯蔵フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１：広範
囲の分子量マーカー（バイオラッド）、レーン２：ビオチン−標識されたｔａｘ
−ＴＣＲタンパク質。レーン３：変異型ビオチン−標識されたｔａｘ−ＴＣＲタ
ンパク質。
【図２７】 図２７は、ＢｒｉＡ酵素でビオチン化した後のビオチン−標識
された可溶性ＴＣＲの、ＰＢＳで平衡化したスーパーデックス２００ＨＲカラム
からの溶出を示すクロマトグラムである。ビオチン化ＴＣＲは、約１５〜１６分
で溶出し、遊離のビオチンは約２１分で溶出する。ビオチン化可溶性ＴＣＲを含
むフラクションは、将来的な使用のために貯蔵される。
【図２８】 図２８は、ゲルの写真のセットであり、ビオチン化ＴＣＲのビ
オチン化を評価する。ａ．再生ＴＣＲおよび封入体標品のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レ
ーン１：広範囲の分子量マーカー（バイオラッド）、レーン２：ビオチン化ｆｌ
ｕ−ＴＣＲ、レーン３：ビオチン化ｔａｘ−ＴＣＲ、レーン４：ビオチン化変異
型ｔａｘ−ＴＣＲ、レーン５：ＨＩＶｇａｇ−ＴＣＲ（ビオチン化標識を付され
ていない）；ｂ．広範囲のマーカーがビオチン−標識されていること（バイオラ
ッド）を除けばａ．と同一のゲルのウェスタンブロット。染色は、ビオチン化タ
ンパク質を示すためにアビジン−ＨＲＰ接合体を用い、可視化はＯｐｔｉ−４Ｃ
Ｎ（バイオラッド）を用いた。
【図２９】 図２９は、異なるＨＬＡ−Ａ２−ペプチド複合体に結合するＪ
Ｍ２２ｚを説明している。（はめ込み）ＪＭ２２ｚおよびＨＬＡ−Ａ２−ｆｌｕ
間の相互作用の特異性は、ＨＬＡ−Ａ２−ｆｌｕの１９００ＲＵで被覆したフロ
ーセル上でＴＣＲを通過することから得られるＳＰＲ応答と、ＨＬＡ−Ａ２−ｐ
ｏｌの４２００ＲＵで被覆した他の二つのフローセル、ＣＤ５の４３００ＲＵで
被覆した他のものの上でＴＣＲを通過することから得られる応答とを比較するこ
とによって説明される。異なるＪＭ２２ｚ濃度のバックグラウンド応答は、ＨＬ
Ａ−Ａ２−ｐｏｌの１７００ＲＵで測定された（ａ）。バックグラウンド値は、
ＨＬＡ−Ａ２−ｆｌｕの１９００ＲＵで測定された特異的応答から引かれ（ｂ）
、さらに濃度に対してプロットされた（ｃ）。１３μＭのＫｄは、非線形の曲線
のあてはめによって見積もられ、１２μＭのＫｄに従い同じデータのキャッチャ
ードプロットを基礎にして計算された。
【図３０】 図３０は、天然型および変異型可溶性ビオチン化ｔａｘ ＴＣ
ＲのＢｉａｃｏｒｅ２０００TM分析結果を示すグラフである。５μlの、２．２
ｍｇ／ｍｌ濃度の天然型 ｔａｘＴＣＲ、次に２．４ｍｇ／ｍｌ濃度の天然型 ｔ
ａｘＴＣＲを、以下のタンパク質を表面に付着させた４つのフローセル上に流し
た。Ａ：ｔａｘ−ｐＭＨＣ複合体、Ｂ／Ｃ：ｆｌｕ−ｐＭＨＣ複合体、Ｄ：ＯＸ
６８コントロールタンパク質。天然型および変異型タンパク質の両方は、特異的
ｐＭＨＣ複合体に同様に結合した。
【図３１】 図３１は、同じＨＬＡ−Ａ２−ｆｌｕ複合体に結合している可
溶性ＴＣＲ上に結合している可溶性ＣＤ８ａａの効果を示している。（Ａ）ＴＣ
Ｒ、または、ＴＣＲおよび１２０μＭ可溶性ＣＤ８は、無関係なタンパク質（Ｃ
Ｄ５）の４１００ＲＵで被覆したコントロールフローセルおよびＨＬＡ−Ａ２−
ｆｌｕの４７００ＲＵで被覆したプローブフローセルへ注入された。バックグラ
ウンドを差し引いた後、ＴＣＲ単独の異なる濃度（白丸）で、または、１２０μ
Ｍの可溶性ＣＤ８との組み合わせ（黒丸）において計算された平衡応答値が示さ
れる。またＣＤ８単独の値（白三角）およびＴＣＲ＋ＣＤ８とＴＣＲとの間の計
算された差（白四角）も示される。（Ｂ）２５℃における、４９μＭＴＣＲ単独
の固定化ＨＬＡ−Ａ２−ｆｌｕの４７００ＲＵに対する応答の、時間依存性（白
丸）、または、１２０μＭ ＣＤ８との組み合わせ（黒丸）、および５μｌ／分
の流速が示されている（その値は、固定化ＣＤ５の４１００ＲＵで測定されたバ
ックグラウンド寄与率のために測定された）。ＴＣＲのオフ−レイトは同時のＣ
Ｄ８の結合によって影響を受けなかった。
【図３２】 図３２は、ｃ−ｊｕｎの“ロイシンジッパー”ドメインに融合
した、ＪＭ２２からの可溶性ＨＬＡ−Ａ２／ｆｌｕマトリックスで限定されたＴ
ＣＲα鎖の予想されるタンパク質配列（一文字コード、上部）およびＤＮＡ配列
（下部）を示している。Ｅ．ｃｏｌｉでの遺伝子発現を増強するためにＤＮＡ配
列の５’末端にローディングされた変異は、小文字で示されており、ＴＣＲおよ
びｃ−ｊｕｎ配列間のリンカー配列も同様である。
【図３３】 図３３は、ｃ−ｆｏｓの“ロイシンジッパー”ドメインに融合
した、ＪＭ２２からの可溶性ＨＬＡ−Ａ２／ｆｌｕマトリックスで制限されたＴ
ＣＲβ鎖の予想されるタンパク質配列（一文字コード、上部）およびＤＮＡ配列
（下部）を示している。ＴＣＲおよびｃ−ｆｏｓ配列間のリンカー配列は、小文
字で示されている。セリン残基をシステイン残基で置換しているＤＮＡ配列の変
異は、太文字および下線で示される。この変異はＴＣＲの折りたたみ効果を増し
ている。
【図３４】 図３４は、ｃ−ｆｏｓの“ロイシンジッパードメイン”および
ＢｒｉＡの基質として作用するビオチン化標識に融合した、ＪＭ２２からの可溶
性ＨＬＡ−Ａ２／ｆｌｕマトリックスで制限されたＴＣＲβ鎖のタンパク質配列
（一文字コード、上部）およびＤＮＡ配列（下部）を示している。ＴＣＲおよび
ｃ−ｆｏｓ配列間ならびにｃ−ｆｏｓおよびビオチン化標識間のリンカー配列は
、小文字で示されている。セリン残基をシステイン残基に置換したＤＮＡ配列の
変異は、太文字および下線で示される。この変異はＴＣＲの折りたたみ効果を増
している。
【図３５】 図３５は、ＴＣＲ−ジッパー−ビオチン化標識融合タンパク質
の模式図を示している。
【図３６】 図３６は、塩化ナトリウムの勾配で、ＰＯＲＯＳ １０ＨＱカ
ラムから再生ＴＣＲを溶出した結果を示している。ＴＣＲは、約１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌで単一のピークとして溶出した。０．１以上のＯＤ（２８０ｎｍ）値を持
つタンパク質を含むフラクションは、貯蔵され、ビオチン化のために濃縮された
。
【図３７】 図３７は、スーパーデックス２００ＨＲ １０／３０カラム（
ファルマシア）を用いたゲルろ過によってビオチン化ＴＣＲを遊離ビオチンから
分離した結果を示している。ＴＣＲ−ビオチンは、約１５ｍｌで溶出し、６９ｋ
Ｄａの分子量に相当した（標準タンパク質およびそれらの溶出量：サイログロブ
リン（６６９ｋＤａ）１０．１４ｍｌ，アポフェリチン（４４３ｋＤａ）１１．
３６ｍｌ，β−アミラーゼ（２００ｋＤａ）１２．７２ｍｌ，ＢＳＡ二量体（１
３４ｋＤａ）１３．１２ｍｌ，ＢＳＡ単量体（６７ｋＤａ）１４．９３ｍｌ，オ
バルブミン（４３ｋＤａ）１５．００ｍｌ，キモトリプシノーゲンＡ（２５ｋＤ
ａ）１８．０９ｍｌ，ＲＮアーゼＡ（１３．７ｋＤａ）１８．９１ｍｌ）。
【図３８】 図３８は、ｃ−ｊｕｎの“ロイシンジッパー”ドメインと融合
した、クローンＡ６からの可溶性ＨＴＬＶ−１ ｔａｘ／ＨＬＡ−Ａ２で制限さ
れたＴＣＲα鎖のタンパク質配列（一文字コード、上部）およびＤＮＡ配列（下
部）を示している（Ｇａｒｂｏｃｚｉ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｇａｒｂｏｃｚ
ｉ ｅｔ ａｌ，１９９６）。Ｅ．ｃｏｌｉにおける遺伝子発現を増強するため
にＤＮＡ配列の５’末端にローディングされた変異は、ＴＣＲおよびｃ−ｊｕｎ
配列間のリンカー配列のように、小文字で示されている。
【図３９】 図３９は、ｃ−ｆｏｓの“ロイシンジッパー”ドメインおよび
ＢｒｉＡの基質として作用するビオチン化標識に融合した、クローンＡ６（Ｇａ
ｒｂｏｃｚｉ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｇａｒｂｏｃｚｉ ｅｔ ａｌ，１９９
６）からの可溶性ＨＴＬＶ−１ ｔａｘ／ＨＬＡ−Ａ２で制限されたＴＣＲβ鎖
のタンパク質配列（一文字コード、上部）およびＤＮＡ配列（下部）を示してい
る。ＴＣＲおよびｃ−ｆｏｓ配列間のリンカー配列は、小文字で示されている。
アラニン残基をシステイン残基に置換したＤＮＡ配列は、太文字かつ下線で示さ
れている。
【図４０】 図４０は、ｃ−ｊｕｎの“ロイシンジッパー”ドメインと融合
した、クローンＭ１０Ｂ７／Ｄ３（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９８）からの可
溶性ＨＴＬＶ−１ ｔａｘ／ＨＬＡ−Ａ２で制限されたＴＣＲα鎖のタンパク質
の配列（一文字コード、上部）およびＤＮＡ配列（下部）を示している。ＴＣＲ
およびｃ−ｊｕｎ配列間のリンカー配列は、小文字で示されている。
【図４１】 図４１は、ｃ−ｆｏｓの“ロイシンジッパー”ドメインおよび
ＢｒｉＡの基質として作用するビオチン化標識に融合した、ｍ１０Ｂ７／Ｄ３（
Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９８）からの可溶性ＨＴＬＶ−１ ｔａｘ／ＨＬＡ
−Ａ２で制限されたＴＣＲβ鎖のタンパク質配列（一文字コード、上部）および
ＤＮＡ配列（下部）を示している。アラニン残基をシステイン残基で置換したＤ
ＮＡ配列の変異は、太文字および下線で示されている。クローニング目的のため
、かつＸｍａＩ制限部位を除去するためにローディングされた二つのサイレント
変異（Ｐ−Ｇコドン）もまた小文字で示されている。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年８月２日（２０００．８．２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (71)出願人 57Ｃ Ｍｉｌｔｏｎ Ｐａｒｋ，Ｍｉｌｔ ｏｎ，Ｏｘｏｎ，ＯＸ14 ４ＲＸ，Ｇｒｅ ａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ (72)発明者 ベル，ジョン，イーヴィング イギリス国，オックスフォードシャイアー オーエックス３ ９ディーエス，オック スフォード，ジョン ラドクリフェ ホス ピタル，インスティテュート オブ モレ キュラー メディシン，エムアールシー ヒューマン イムノロジー ユニット (72)発明者 ガオ，ジョージ，フー アメリカ合衆国，マサチューセッツ州 02115，ボストン，ロングウッド アベニ ュー 320，チルドレンズ ホスピタル， ハワード ヒューズ メディカル インス ティテュート，ラボラトリー オブ モレ キュラー メディシン (72)発明者 ウィルコックス，ベンジャミン，アーネス ト アメリカ合衆国 カリフォルニア州 91125，パサデナ，カリフォルニア ブラ バード 1200イー．，カリフォルニア イ ンスティテュート オブ テクノロジー， ディビジョン オブ バイオロジー 156 −29，ウェルカム トラスト トラベリン グ フェロー (72)発明者 ボールター，ジョナサン，マイケル イギリス国，オーエックス14 ４アールエ ックス，オキソン，ミルトン，57シー ミ ルトン パーク，アヴィデックス リミテ ッド Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 DA06 EA04 GA11 HA11 4B064 AG20 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA42 DA50 EA22 EA28 FA74

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ｉ）第一の異種のＣ末端二量体化ペプチドを持つ、組換えＴ
    ＣＲαまたはγ鎖細胞外ドメイン；および ii）第一の二量体化ペプチドと特異的にヘテロ二量体化されてヘテロ二量体化
    ドメインを形成する第二のＣ末端二量体化ペプチドを持つ、組換えＴＣＲβまた
    はδ鎖細胞外ドメイン を含む、再生された組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）。
  2. 【請求項２】 ｉ）第一の異種のＣ末端二量体化ペプチドを持つ、組換えＴ
    ＣＲαまたはγ鎖細胞外ドメイン；および ii）第一の二量体化ペプチドと特異的にヘテロ二量体化されてヘテロ二量体化
    ドメインを形成する第二のＣ末端二量体化ペプチドを持つ、組換えＴＣＲβまた
    はδ鎖細胞外ドメイン を含む、生物学的に活性な組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）。
  3. 【請求項３】 細胞質ドメインに隣接するαおよびβまたはγおよびδ鎖間
    に天然のＴＣＲ中に存在する、ジスルフィド結合が存在しない、請求項１または
    ２に記載の組換えＴＣＲ。
  4. 【請求項４】 該ヘテロ二量体化ドメインは高次コイルドメインである、請
    求項１、２または３に記載の組換えＴＣＲ。
  5. 【請求項５】 該二量体化ペプチドは、ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓ二量体
    化ペプチドである、請求項４に記載の組換えＴＣＲ。
  6. 【請求項６】 該ＴＣＲ鎖および該ヘテロ二量体化ペプチドの間に位置する
    可変性リンカーを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えＴＣＲ。
  7. 【請求項７】 E.coli発現系で発現される、請求項１〜６のいずれか一項に
    記載の組換えＴＣＲ。
  8. 【請求項８】 Ｃ末端でビオチン化される、請求項１〜７のいずれか一項に
    記載の組換えＴＣＲ。
  9. 【請求項９】 検出可能な標識で標識される、請求項１〜８のいずれか一項
    に記載の組換えＴＣＲ。
  10. 【請求項１０】 細胞傷害剤（cytotoxic agent）または免疫促進剤（immun
    ostimulating agent）のような治療剤に結合される、請求項１〜９のいずれか一
    項に記載の組換えＴＣＲ。
  11. 【請求項１１】 請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換えＴＣＲの組換
    えＴＣＲ鎖をコードする核酸配列。
  12. 【請求項１２】 E.coli発現ベクター中の、請求項１１に記載の核酸配列。
  13. 【請求項１３】 ｉ）第一の異種のＣ末端二量体化ペプチドを持つ、組換え
    ＴＣＲαまたはγ鎖細胞外ドメイン；および ii）第一の二量体化ペプチドと特異的にヘテロ二量体化してヘテロ二量体化ド
    メインを形成する第二のＣ末端二量体化ペプチドを持つ、組換えＴＣＲβまたは
    δ鎖細胞外ドメイン を発現すること、ならびに、インビトロでその鎖を一緒に再生してＴＣＲヘテロ
    二量体を生産する ことを含む、組換え非膜結合Ｔ細胞受容体を製造する方法。
  14. 【請求項１４】 再生は可溶化剤を含む再生バッファー中で行われる、請求
    項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 該可溶化剤は濃度が少なくとも０．１Ｍの尿素である、請
    求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 該可溶化剤は濃度が約５Ｍの尿素である、請求項１５に記
    載の方法。
  17. 【請求項１７】 該鎖は、再生の前に変性バッファー中で変性される、請求
    項１３〜１６のいずれか一項に記載のに記載の方法。
  18. 【請求項１８】 該変性バッファーは、還元剤としてＤＴＴまたはグアニジ
    ンを含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 該ＴＣＲは、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換え
    ＴＣＲである、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法によって製
    造される組換えＴＣＲ。
  21. 【請求項２１】 請求項２０に記載のＴＣＲの多量体。
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