BG105053A

BG105053A - Разтворим т-клетъчен рецептор

Info

Publication number: BG105053A
Application number: BG105053A
Authority: BG
Inventors: Bent Jakobsen; John Bell; George GAO; Benjamin WILLCOX; Jonathan BOULTER
Original assignee: Avidex Limited
Priority date: 1998-05-19
Filing date: 2000-12-14
Publication date: 2001-09-28
Also published as: NO20005812D0; EE200000697A; WO1999060120A3; CA2327314A1; DK1066380T3; NO20005812L; PT1066380E; HUP0103614A2; EA200001216A1; US20060155115A1; JP2002515243A; CN1306572A; CN1249229C; ID28040A; NO20005811D0; HK1035739A1; AU758949B2; HRP20000790A2; AU746164B2; PL364734A1

Abstract

Изобретението се отнася до рекомбинантен разтворим Т-клетъчен рецептор (TСR), който е вторично огънат и включва рекомбинантна TCR алфа или гама верижна екстрацелуларна област, притежаваща първи хетероложен С-краен димеризационен пептид, и рекомбинантна TCR бета или гама верижна екстрацелуларна област с втори С-краен димеризационен пептид, който е специфично хетеродимеризиран с първия димеризационен пептид за формиране на хетеродимеризационна област, която може да бъде двойно спирализирана. Изобретението се отнася също до аминокиселинни последователности, кодиращи рекомбинантния TCR, и до метод за продуциране на рекомбинантен TCR. Последниятможе да бъде маркиран, така че да позволи откриването на специфични МНС комплекси. Освен това, той може да бъде свързан към терапевтичен агент, например цитотоксичен или имуностимулиращ, така че да бъде доставен до място, специфично за МНС-пептиден комплекс.

Description

Настоящето изобретение се отнася до не- мембранно свързани рекомбинантни Т клетъчни рецептори (TCR) и методи и реагенти за продуцирането им.

Ниво на изобретението

1. Антигенно представяне върху клетъчната повърхност

МНС молекулите са специализирани протеинови комплекси, които представляват къси протеинови фрагменти, пептидни антигени за разпознаване върху клетъчната повърхност от клетъчното въоръжение на адаптивната имунна система.

Клас I МНС е димерен протеинов комплекс, състоящ се от вариабилна тежка верига и константна лека верига, β2 микроглобулин. Клас I МНС представя пептиди, които са получени интрацелуларно, натоварени върху свързващо място в МНС и транспортирани до клетъчната повърхност, където комплекса се прикрепва в мембраната чрез МНС тежката верига. Пептидите са обикновено с дължина от 8- 11 амино киселини, в зависимост от степента на огъване, въведено в пептида когато е свързан в МНС. Свързващата цепнатина, която е формирана от мембранните дистални а1 и а2 области от МНС тежка верига, има “затворени” краища, предлагащи твърде тесни рестрикции по дължината на пептида, който може да бъде свързан.

Клас II МНС е също димерен протеин, състоящ се от една а (тежка) и β (лека) верига, като и двете са вариабилни гликопротеини и прикрепени в клетката чрез трансмембранни области. Както и клас I МНС, молекулата от Клас II формира свързващ процеп, в който са инсертирани по- дълги пептиди от 12- 24 амино киселини. Пептйдите са взети от екстрацелуларното обкръжение чрез ендоцитоза и обработени преди натоварване в комплекса на Клас II, който след това се транспортира до клетъчната повърхност.

Всяка клетка представя пептиди в до шест резлични молекули от Клас I и сходен брой молекули от Клас II, общият брой от представените МНС комплекси е от порядъка на 10⁵ - 10⁶ за клетка. Разнообразието от пептиди, представени в молекулите от Клас I обикновено се определя от 1000 до 10 000, като 90% от тях са представени в 100- 1000 копия за клетка (Hunt, Michel et al. 1992; Chicz, Urban et al. 1993; Engelhard, Apella et al. 1993; Huczko, Bodnar et al. 1993). Повечето останали пептиди се счита, че определят 0.4 до 5% от общото количество пептиди, което означава, че могат да бъдат представени до 20 000 идентични комплекси. Обаче, средния брой на останалите самостоятелни пептидни комплекси е по всяка вероятност от порядъка на 2 000 до 4000 за клетка, и типичното ниво на представяне от разпознаваеми Т клетъчни епитопи е от порядъка на 100 до 500 комплекси за клетка (за преглед на литературата виж Engelhard 1994).

2. Разпознаване на антигенно представени клетки

Широк спектър от клетки могат да представят антиген, като МНС- пептид, и клетките, които имат такова свойство са известни като антиген представящи клетки (АРС). Типът на клетки, които представят определен антиген зависи от това как и къде антигенът най- напред се натъква на клетки от имунната система. АРС включват к, кинййа разклоняващи се дендритни клетки, намерени в Т клетъчните участъци на лимфните възли и спленоцити в голям брой; Лангерхансови клетки в кожата; фоликулярни дендритни клетки в В клетъчни участъци от лимфоцитната тъкан; моноцити, макрофаги и други клетки от моноцит/ макрофаговата линия на произход; В клетки и Т клетки; и множество други клетки, като ендотелни клетки и фибробласти, които не са класически АРС, но могат да действат по маниера на една АРС.

АРС се определят като субгрупа лимфоцити, които съзряват в тимуса (Т клетки), където те претърпяват селекционна процедура предназначена за гарантиране на това, че Т клетки които отговарят на собствени пептиди са изкоренени (негативна селекция). В допълнение, Т клетки които не притежават способността да разпознаят наличните МНС варианти (в човека, HLA хаплотиповете) не успяват да съзреят (позитивна селекция).

Разпознаване на специфични МНС- пептидни комплекси от Т клетки се опосредства от Т клетъчния рецептор (TCR), който се състои от една а- и една β- верига, като и двете са прикрепени в мембраната. В рекомбинантен процес, сходен на наблюдавания за антитяло гени, TCR а и β гените, реорганизирани от вариабилни, свързващи, постоянни и разнородни елементи, създават свръхнормено разнообразие в екстрацелуларните антиген свързващи области (10¹³ до 10¹⁵ различни възможности). TCR също така съществува в различни форми с γ и δ вериги, но такива има само в около 5% от Т клетките.

Антитела и TCR са само двата типа молекули, които разпознават антигени по специфичен начин, и така TCR е само рецептора, специфичен за определени пептидни антигени, представени в МНС, като инородният пептид често е единствения знак за абнорменост в рамките на клетката.

TCR са експресирани в свръхнормено разнообразие, като всеки TCR е специфичен за един или няколко МНС- пептидни комплекси. Контактите между TCR и МНС пептидните лиганди са изключително краткотрайни, обикновено със степен на полу- живот по- малка от секунда. Адхезия между Т клетки и мишенни клетки, вероятно TCR/MHC- пептид, зависи от ангажирането на на множество TCR/MHC- пептидни контакти както и множество корецепторлигандни контакти.

Т клетъчно разпознаване се случва когато Т клетка и антиген представяща клетка (АРС) са в директен физически контакт и се инициира от лигатиране на антиген- специфични TCR с рМНС комплекси. TCR е хетеродимерен клетъчно повърхностен протеин от имуноглобулиновото суперсемейство, който се асоциира с инвариантни протеини от CD₃ комплекса, включен в медиираща сигнална трансдукция. TCR съществува в αβ и γδ форми, които са структурно сходни, но имат твърде отчетливи анатомични локализации и вероятно функции. Екстрацелуларната част от рецептора се състои от два мембранно- проксимални постоянни участъка, и два мембранно- дистални вариабилни участъка, носещи високо полиморфни примки, аналогични на определящите комплементарността участъци (CDR) от антитела. Това са онези примки, които формират МНС- свързващото масто на TCR молекулата и определят пептидната специфика. Класът МНС I и клас

II лиганди са също протеини от имуноглобулиновото семейство, но са специализирани за антигенно представяне, с високо полиморфно място на свързване, което им позволява да представят разнообразно представяне на къси пептидни фрагменти като АРС клетъчната повърхност.

Наскоро са охарактеризирани структурно такива примерни взаимодействия (Garboczi, Ghosh et al. 1996; Garcia, Degano et al. 1996; Ding, Smith et al. 1998). Кристалографски структури на миши и човешки pMHC-TCR комплекси от Клас I показват диагонална ориентация за TCR върху неговия рМНС лиганд и показва слабо кръгова комплементарност на взаимодействието. CDR3 примките контактуват изключително с остатъци. Сравняването на свързани и несвързани TCR структури също предполага, че има степен на гъвкавост в TCR CDR примките (Garboczi and Biddison 1999).

Моделите на Т клетъчно активиране са опит за обяснение на това как такива протеин- протеинови взаимодействия на границата между Т клетка и антиген представяща клетка (АРС) инициират такива отговори, като умъртвяване на инфектирана с вирус мишенна клетка. Физичните свойства на TCR-pMHC взаимодействията са включени като критични параметри в много от тези модели. Например, количествените изменения в степените на TCR дисоциация е установено, че се превеждат в качествени разлики в биологичното заобикаляне на рецепторното ангажиране, като пълно или частично Т клетъчно активиране, или антагонизъм (Matsui, Boniface et al. 1994; Rabinowitz, Beeson et al. 1996; Davis, Boniface et al. 1998).

Показано е, че TCR- рМНС взаимодействията притежават нисък афинитет и относително слаба кинетика. Много изследвания са използвали биосенсорна технология като Biacore™ (Willcox, Gao et al. 1999; Wyer, Willcox et al. 1999), които използват повърхностния плазмон резонанс (SPR) и позволява директен афинитет и кинетични измервания в реално време на протеин- протеиновите взаимодействия (Garcia, Scott et al. 1996; Davis, Boniface et al. 1998). Обаче, изследваните рецептори са или алореактивни TCR или такива, които са възникнали в отговор на изкуствен имуноген.

3. TCR и CD18 взаимодействия с МНС- пептидни комплекси

По- голямата част от Т клетките, рестриктирани с МНСпептидните комплекси от Клас I също изискват ангажирането на корецептора CD8 за активация, докато Т клетки, рестриктирани с МНС от Клас II изисква ангажирането на CD4. Точната функция на корецепторите в Т клетъчното активиране все още не е достатъчно изяснена. Това се отнася и до механизмите и параметрите контролиращи активацията. Обаче както CD8, така и CD4 притежават циплазмени области, които се асоциират с киназата p56^lck, която се включва в най- ранното тирозин фосфорилиране, което характеризира Т клетъчното активиране. CD8 е димерен рецептор, експресиран както в αβ форма, така и (в повечето случаи), в αβ форма. CD4 е мономер. В CD8 рецептора, само а- веригата се асоциира с p56^lck.

Последни определяния на физичните параметри, контролиращи свързването на TCR и CD8 към МНС с помощта на разтворими версии на рецепторите, са показали че свързването на TCR доминира над случаите на разпознаване. TCR има значително по- висок афинитет към МНС спрямо рецепторите (Willcox, Gao et al. 1999; Wyer, Willcox et al. 1999).

Индивидуалните взаимодействия на рецепторите с МНС са с много кратък жимот при физиологична температура, т.е. 37°С. Една приблизителна стойност за полу- живота на TCR-МНС/ пептидно ф взаимодействие, измерено с човешки TCR специфичи за “матриксният” пептид на грипния вирус чрез HLA-A*0201 (HLA-A2), възлиза на 0.7 секунди. Полу- живота на CD8aa взаимодействието с този МНС/пептиден комплекс е по- малък от 0.01 секунди, т.е. наймалко 18 пъти по- бърз.

4. Получаване на разтворими МНС-пептидни комплекси

Разтворими МНС- пептидни комплекси най- напред са получени чрез разграждане на молекулите от повърхността на антиген ф представящи клетки с папаин (Bjorkman, Strominger et al. 1985). Макар този подход да предоставя материал за кристализация, за Клас I молекули в последните години е изместен от индивидуално експресиране на тежка и лека верига в Е. coli, последвано от повторно натоварване в присъствието на синтетичен пептид (Gabroczi, Hung et al. 1992; Madden, Gabroczi et al. 1993; Gabroczi, Madden et al. 1994, Reid et al. 1996; Smith, Reid et al. 1996; Gao, Tormo et al. 1997; Gao, Gerth et al. 1998). Този подход притежава няколко преимущества над предишните методи в това, че се получава подобър добив при ниски стойности, пептидната идентичност може да бъде контролирана много акуратно, и крайният продукт е по8 хомогенен. Нещо повече, експресията на модифицирана тежка или лека верига, например слята към протеиновия край може лесно да бъде осъществена.

5. Разтворими TCR

Понастоящем, няма публикувани данни за човешки TCR-pMHC взаимодействия, и няма изследвания, анализиращи природно избраните TCR специфични за природни (напр. вирусни) епитопи. Това може да доведе до трудности за получаване на протеин, който е подходящ за SPR т. е. протеин който е хомогенен, мономерен, коректно огънат, достъпен в количества в милиграми и стабилен в повисоки концентрации.

Би било предимство възможността за получаване на рекомбинантни TCR в не- мембранно свързана (или разтворима) форма, не само за целите на изследването на специфични TCRpMHC взаимодействия, но също като диагностично средство за установяване ефективността на Т клетъчни ваксини. Разтворимите TCR биха имали приложение още при оцветяване, например оцветяване на клетки за наличие на определен вирусен антиген. По аналогичен начин, разтворимите TCR биха могли да бъдат използвани за доставяне на терапевтичен агент, например цитотоксично съединение или имуностимулиращо съединение, до клетки, представящи определен антиген.

Протеините, които са съставени от повече от една полипептидна субединица и които притежават трансмембранна област, е трудно да бъдат продуцирани в разтворима форма, тъй като в много случаи протеина е стабилизиран от неговия трансмембранен участък. Това е случая за TCR.

Продуциране на разтворими TCR е описано едва наскоро от няколко групи. Най- общо, всички методи описват срязани форми на TCR, съдържащи както само екстрацелуларни области, така и екстрацелуларни и цитоплазмени области. Така, във всички случаи, трансмембранните области са делетирани от експресионния протеин. Макар много доклади да показват, че TCR получени съгласно техните методи да могат да бъдат разпознати от TCR- специфични антитела (показвайки, че частта от рекомбинантните TCR, разпознати от антитялото е коректно огъната), никой не е в състояние да продуцира разтворим TCR при добър добив, който е стабилен при ниски концентрации и който може да разпознава МНС- пептидни комплекси.

Първият подход за добиване на кристализационен материал използва експресия в еукариотични клетки, но материалът е изключително скъп за получаване (Garcia, Degano et al. 1996; Garcia, Scott et al. 1996). Друг подход, който продуцира кристализационен материал, използва една Е. coli експресионна система, сходна на тази, използвана по- рано за МНС- пептидни комплекси (Garboczi et al. 1996; Garboczi, Utz et al. 1996). По- късният метод, който експресира екстрацелулариите порции от TCR веригите, срязани непосредствено преди цистеиновите остатъци, включени във формирането на вътреверижният дисулфиден мост, последвано от повторно огъване in vitro, най- общо се е превърнал в неприложим. Повечето хетеродимерни TCR стават нестабилни когато са продуцирани по този начин, което се дължи на ниския афинитет между а и β веригите.

В допълнение, съществуват множество други описани начини за инженерно получаване на разтворими TCR. Някои от тях описват експресията или само на а, или само на β веригата на TCR, като при това се получава протеин, който не облдава специфично свързване на МНС (Calamari, Carson et al. 1993; Ishii, Nakano et al. 1995). Кристали на β веригата са получени без а верига както самостоятелно, така и свързани към суперантиген (Boulot, bentley et al. 1994; Bentley, Boulot et al. 1995; Fields, Malchiodi et al. 1996).

Други доклади описват мметоди за експресия на хетеродимерни γ/δ или α/β TCR (Gregoire, Rebaiet al. 1991; Necker, Rebai et al. 1991; Eilat, Kikuchi et al. 1992; Weber, Traunecker et al. 1992; Corr, Slanettz et al. 1994; Ishii, nakano et al. 1995; Gregoire, Malissen et al. 1996; Romagne, Peyrat et al. 1996). В някои случаи, TCR са експресирани като едноверижен фузионен протеин (Brocker, peter et al. 1993; Gregoire, malissen et al. 1996; Schlueter, Schodin et al. 1996). Съществува и друга стратегия за експресиране на TCR вериги като химерни протеини, сляти към Ig и константни области (Eilat, Kikichi et al. 1992; Weber, Traunecker et al. 1992). Други химерни TCR протеини са експресирани с конструирани последователности, които формират спирали, притежаващи висок афинитет и специфичност един към друг, като по този начин стабилизират TCR α- β контакти и повишена стабилност. Този подход е възприет от Chang, Bao et al. (1994), който замества трансмембранния участък от протеина с левцинов свързващ (циперов) протеин, състоящ се от две синтетични пептидни последователности, и кисел пептид и основен протеин, които взаимодействат специфично за създаване на хетеродимерна спирала. Авторите използват бакуловирусна експресионна система в еукариотични клетки за секретиране на хетеродимерен TCR протеин. Изкуствените свързващи пептиди асистират хетеродимеризацията на TCR а и β също така са свързани и с интерверижна дисулфидна връзка точно над мястото на сливане със свързващите пептиди. Обаче, тези техники все още не са успешно доказани и все още няма факти в потвърждение на това, че описаните разтворими TCR могат да разпознаят TCR лиганда. По аналогичен начин, Golden, Khandekar et al. (1997) описват продуцирането на хетеродимерните Т клетъчни рецептори като левцинови ципер фузионни протеини. Разтворимите TCR са експресирани в Е. coli като секретиран хетеродимер с α- β интерверижна дисулфидна връзка както в Chang et al. Отново, няма доказателство че този огънат хетеродимер е способен да взаимодейства със своя лиганд.

Ето защо съществува необходимост от разтворима версия на мембранно свързаните TCR, които са правилно огънати така че да са способни да разпознават своя нативен лиганд. Разтворима форма на TCR, която е стабилна за даден период от време, и метод за получаването й в съответни количества, също би била полезна. Настоящето изобретение цели да постигне някои от тези изисквания.

Изобретението

В един аспект изобретението предлага вторично огънат рекомбинантен Т клетъчен рецептор (TCR), който включва:

i) рекомбинантна TCR а или γ верижна екстрацелуларна област, притежаваща един първи хетероложен Скраен димеризационен пептид; и ii) рекомбинантна TCR β или δ екстрацелуларна област, притежаваща втори С- краен димеризационен пептид, който е специфично хетеродимеризиран с първия димеризационен пептид за формиране на хетеродимеризационна област.

TCR съгласно изобретението, който се огъва вторично след експресирането му, вместо да бъде секретиран като хетеродимер, е конформационен супериор за предишен разтворим TCR. Това е 0 видно от неговата способност да разпознава МНС- пептидните комплекси. Освен това той е стабилен при относително ниски концентрации. Той може да бъде стабилен при концентрации под 1 mg/ml и за предпочитане около 10 pg/ml.

В следващ аспект, изобретението предлага биологично активен рекомбинантен Т клетъчен рецептор (TCR), който включва:

i) рекомбинантна TCR α или γ верижна екстрацелуларна област, притежаваща един първи хетероложен С- краен димеризационен пептид; и ф ii) рекомбинантна TCR β или δ екстрацелуларна област, притежаваща втори С- краен димеризационен пептид, който е специфично хетеродимеризиран с първия димеризационен пептид за формиране на хетеродимеризационна област. Такъв TCR ще се свърже специфично към МНС- пептидни комплекси, за предпочитане по начин, аналогичен на нативния TCR, от който е получен.

В друг аспект, изобретението предлага последователности на рекомбинантни нуклеинови киселини, кодиращи рекомбинантните

TCR вериги както са описани тук. Такива последователности от нуклеинови киселини могат да бъдат изолирани от Т- клетъчни клонове. Обратно, те могат да бъдат продуцирани синтетично, например чрез инсертиране на последователност на хетероложна нуклеинова киселина кодираща TCR верига, или чрез мутация (чрез инсертиране, делеция или субституция) на последователност нуклеинова киселина, кодираща TCR верига. Така, изобретението включва в своя обхват синтетични пептиди, които имат активността и/или свързващата специфичност на нативната TCR.

В още един аспект, изобретението предлага метод за създаване на рекомбинантен не мембранен свързан Т клетъчен рецептор, който метод включва:

експресиране на рекомбинантен TCR а или γ верижна екстрацелуларна област, притежаваща първи хетероложен С- краен димеризационен пептид, и рекомбинантна TCR β или δ верижна екстрацелуларна област, притежаваща втори С- краен димеризационен пептид, който се хетеродимеризира специфично с първия димеризационен пептид за формиране на хетеродимеризационна област; и вторично огъване на вериги заедно in vitro за продуциране на TCR хетеродимер.

Рекомбинантните TCR в съответствие с изобретението може да бъдат за разпознаване на МНС- пептидни комплекси от Клас I и на МНС- пептидни комплекси от Клас II.

Хетеродимеризационната област на рекомбинантния TCR съгласно изобретението е за предпочитане така наречената “двойна спирала” или “левцинов ципер”. Тези термини са използвани, за да опишат хеликоидните пептиди, които взаимодействат с всеки от другите по специфичен начин за формиране на хетеродимер. Взаимодействието става поради наличие на комплементарни хидрофобни остатъци по продължение на едната страна от всеки циперен пептид. Природата на пептидите е такава, че формирането на хетеродимери е много по- благоприятно в сравнение с формирането на хомодимери от хеликоидалите. Левциновите ципери могат да са синтетични или природно срещани. Синтетичните левцини могат да бъдат конструирани така, че да имат много- повисок афинитет на свързване в сравнение с природно срещаните левцинови ципери, което не е задължително преимущество. Фактически, предпочитани левцинови ципери за приложение в изобретението са природно срещани левцинови ципери или левцинови ципери със сходен афинитет за свързване. Левцинови ципери от с- jun и с- fos протеин са пример на левцинови ципери с подходящ афинитет за свързване. Други подходящи левцинови ципери включват онези от тух и max протеини (Amati, Dalton, et al. 1992). Други левцинови ципери с подходящи свойства също могат лесно да бъдат създадени (O’Shea et al. 1993).

Предпочита се разтворимите TCR в съответствие с изобретението да притежават циперни сливания от приблизително 40 амино киселини, съответстващи на хетеродимеризационните области от c-jun (аверига) и c-fos (Зверига) (O’Shea, Rutkowski et al. 1989, O’Shea, Rutkowski et al 1992, Glover and Harrison, 1995). Могат да бъдат използвани и по- дълги левцинови ципери. Доколкото хетеродимеризационата специфичност явно може да бъде постигната дори и в твърде кратки фрагменти от някои левцинови циперни области (O'Shea, Rutkowski et al. 1992), възможно е да бъде постигнат сходен благоприятен ефект с по- кратки c-jun и c-fos фрагменти. Такива по- кратки фрагменти могат да притежават много малко амино киселини- например 8. Така, левцин циперните области могат да бъдат с дължина в интервала от 8 до 60 амино киселини.

Молекулните принципи на специфичност в левцин циперното удвояване е добре охарактеризирано (Landschulz, Johnson et al, 1988; McKnight, 1991) и левцинови ципери могат да бъдат конструирани от специалиста в областта за формиране на хомодимери, хетеродимери или тримерни комплекси (Lumb and Kim, 1995; Nautiyal, Woolfson et al, 1995; Boice, Dieckmann et al, 1996, Chao, Houston et al, 1996). Конструирани левцинови ципери, или други хетеродимеризационни области с по- висок афинитет от c-jun и c-fos левцинови ципери, може да бъде благоприятно за експресирането на разтворими TCR в някои системи. Обаче, както е отбелязано в подробности по- долу, когато разтвори TCR е огънат in vitro, за предпочитане се включва солюбилизационен агент в буфера за редуциране формирането на непродуктивни протеинови агрегати. Една интерпретация на този феномен е, че кинетиката на огъването на левцин циперните области са по- висока за TCR веригите, водещо до димеризация на ненагъната TCR а и β верига, на свой ред причиняващи протеинова агрегация. Чрез забавяне на процеса на огъването и инхибиране на агрегацията чрез инклузия на солюбилизиращия агент, протеина може да бъде поддържан в разтвор до завършване нагъването на двете фузионни области. Поради това, хетеродимеризационните области с по- висок афинитет от с- fos и с- jun левциновите ципери може да изисква по-високи концентрации от солюбилизиращия агент за постигане на добив от разтворими TCR, сравним с този за c-jun и сfos.

Различните биологични системи използват разнообразие от методи за формиране на стабилни хомо- и хетеро- протеинови димери, и всеки от тези методи по принцип осигуряват опция за конструиране на димеризационни области в генетично модифицирани протеини. Левцинови ципери (Kouzrides and Ziff 1989) са по всяка вероятност най- популярните димеризационни модули и са широко използвани за получаване на генетично създадени димерни протеини. Така, левциновият ципер на GCN4, траанскрибционен активаторен протеин от дрождите Saccharomyces cerevisiae, е използван да насочи хомодимеризацията на много хетероложни протеини (Ни, Newell et al. 1993; Greenfield, Montelione et al. 1998). Предпочитаната стратегия е да бъдат използвани такива ципери, които насочват формирането на хетеродимерните комплекси като Jun/Fos левцинова циперна двойка (de Kruift and Logtenberg 1996; Riley, Ralston et al. 1996).

Хетеродимеризационната област на рекомбинантния TCR съгласно настоящето изобретение, не се ограничава до левцинови ципери. Така, това може да бъде осигурено от елементи, формиращи дисулфидни мостове. Съответно, това може да се обезпечи от SH3 областите и богати на хидрофобен пролин противоположни области, които са отговорни за протеин- протеинови взаимодействия, наблюдавани измежду протеините, включени в сигнална трансдукция (обсъдено от Schlessinger, (Schlessinger 1994). Други природни протеин- протеинови взаимодействия, установени измежду протени, участващи в сигнални трансдукционни каскади зависят от асоцииране между пост- транслационно модифицирани амино киселини и протеинови модули, които специфично разпознават такива модифицирани остатъци. Подобни пост- транслационно модифицирани амино киселини и протеинови модули могат да формират хетеродимеризационната област на рекомбинантния TCR в съответствие с изобретението. Пример за протеинова двойка от този тип е предложен от тиразин фосфорилирани рецептори като рецептора за епидермалния растежен фактор и SH2 областта на GRB2 (Lowenstein, Daly et al. 1992; Buday and Downward 1993). Както във всички области на науката, активно са потърсени са нови димеризационни модули (Chevreay and Nathans 1992) и са създадени методи за конструиране на напълно изкуствени модули (Zhang, Murphy et al. 1999).

В предпочитан рекомбинантен TCR съгласно изобретението, интерверижна дисулфидна връзка, която се формира между два цистеинови остатъка в нативните а и β TCR вериги и между нативните γ и δ TCR вериги, липсва. Това може да бъде достигнато например чрез фузия на димеризационните области към TCR рецепторните вериги над цистеиновите остатъци, така че тези остатъци са изключени от рекомбинантния протеин. В един алтернативен пример, един или повече от цистеиновите остатъци е заместен от друг амино киселинен остатък, който не е включен в дисулфидната формация. Тези цистеинови остатъци може да не бъдат включени, тъй като те може да бъдат вредни за in vitro огъването на функционални TCR.

Вторичното нагъване на а и β вериги или γ и δ вериги от вторично нагънатите рекомбинантни TCR съгласно изобретението, става in vitro при подходящи условия на вторично нагъване. В определен вариант на изпълнение, се постига рекомбинантен TCR с коректна конформация чрез вторично огъване на солюбилизирани TCR вериги в буфер за нагъване, включващ солюбилизационен агент, например урея. Преимуществено, уреята може да присъства в концентрация от най- малко 0.1 М или поне 1 М или 2.5 М, или около 5 М. Алтернативен солюбилизационен агент, който може да бъде използван е гуанидин, в концентрация от между 0.1 М до 8 М, за предпочитане най- малко 1М или поне 2.5 М. Преди вторичното огъване за предпочитане се използва редукционен агент за осигуряване пълната редукция на цистеиновите остатъци. Ако е необходимо, могат да бъдат използвани и други денатурационни агенти като DTT и гуанидин. Различни денатуранти и редуциращи агенти могат да бъдат използвани преди етапа на вторично нагъване (напр. урея, β- меркаптоетанол). По време на вторичното нагъване могат да бъдат използвани алтернативни рекс двойки като цистамин/ цистеамин редокс двойка, DTT или β- меркаптоетанол/атмосферен кислород, и цистеин в редуцирана и окислена форми.

Мономерните TCR, описани тук могат да бъдат маркирани например с маркер, подходящ за диагностични цели. Така, изобретението предлага метод за установяване на МНС- пептидни комплекси, който метод включва контакт на МНС- пептидните комплекси с TCR в съответствие с изобретението, което е специфично за МНС- пептидните комплекси; и откриване на свързване на TCR към МНС- пептидния комплекс. В тетрамерните TCR, формирани с помощта на биотинилирани хетеродимери, като маркер може да бъде използван флуоресцентен стрептавиридин (търговско достъпен). Флуоресцентно маркиран тетрамер е подходящ за използване в FACS анализ, например за откриване на антиген представящи клетки, носещи пептида за който TCR е специфичен.

Друг начин, по който разтворимите TCR могат да бъдат открити, е чрез използването на TCR- специфични антитела, в частност моноклонални антитела. Има много търговско достъпни анти- TCR антитела, като pF1 и aF1, които разпознават константните участъци на β и а веригата, съответно.

TCR алтернативно или допълнително да бъдат свързани към терапевтичен агент, който може да бъде например токсично количество например за употреба при умъртвяване на клетки, или някакъв имуностимулиращ агент като интерлевкин или цитокин. Така, изобретението предлага метод за доставяне на терапевтичен агент до мишенна клетка, който метод включва поставяне в контакт на потенциални мишенни клетки с TCR в съответствие с изобретението в условия, които да позволят прикрепване на TCR към мишенната клетка, които TCR са специфични за МНС- пептидните комплекси и притежават терапевтичен агент, свързан с тях. По- специално, разтворимият TCR може да бъде използван за доставяне на терапевтични агенти към локализирането на клетки, представящи определен антиген. Например, даден токсин може да бъде доставен до тумор, като по този начин подпомага изкореняването му. Това може да бъде полезно в много ситуации и в частност и в частност срещу тумори, тъй като не всички клетки в тумора представят антигени и поради това не всички туморни клетки се откриват от имунната система. С разтворимите TCR, дадено съединение може да бъде доставено така че да упражни своя ефект локално, но не само върху клетката, към която се свързва. Така, една конкретна стратегия демонстрира анти- туморни молекули, присъединени към Т клетъчни рецептори, специфични за туморни антигени.

Могат да бъдат използвани много токсини за тази цел, например радиоактивни съединения, ензими (перфорин например) или хемотерапевтични агенти (цис- платин например). За подсигуряване на факта, че токсините влияят в желаното място, токсина следва да бъде вътре в липозома, свързана със стрептавидин, така че съединението да се освобождава бавно. Това ще предотврати увреждащите ефекти по време на транспортирането на тялото и осигуряване на това токсина да има максимален ефект след свързването на TCR спрямо релевантните антиген представящи клетки.

Алтернативен начин за маркиране или прикрепяне на друго количество като токсиновото към разтворимия TCR, е чрез включване на маркера или друго количество в смесен молекулен мултимер. Пример за такава мултимерна молекула е тетрамер, съдържащ три TCR молекули и една пероксидазна молекула. Това може да бъде постигнато чрез смесване на TCR и ензима в моларно съотношение от 3:1 за генериране на тетрамерни комплекси и изолиране на желаният комплекс от които и да са други комплекси, които не съдържат коректното съотношение от молекули. Смесените молекули биха могли да съдържат каквато и да е комбинация от молекули, осигурявайки това етеричните примеси не компрометират или не компрометират значимо желаната функция на молекулите. Позиционирането на местата на свързване върху стрептавидиновата молекула е подходяща за смесените тетрамери, доколкото етерични примеси не се срещат.

За предпочитане, рекомбинантните TCR вериги съгласно изобретението притежават гъвкав линкер, локализиран между TCR областта и димеризационния пептид. Подходящите гъвкави линкери включват стандартни пептидни линкери, съдържащи глицин, например линкери съдържащи глицин и серин. С- крайни срязвания, в близост до цистеиновите остатъци които формират вътреверижната дисулфидна връзка, се считат за преимуществени, тъй като а и β веригите са в близко съседство чрез тези остатъци в клетъчни TCRn. Поради само относително къси линкерни последователности може да са необходими за снабдяване на неизкривен (правилен) преход от TCR веригите до областта на хетеродимеризация. Предпочита се да бъдат използвани линкерните последователности Pro- Gly- Gly или Gly- Gly. Обаче, линкерната последователност може да варира. Например, линкера може да бъде заобиколен напълно, или да бъде редуциран до единичен остатък, като предпочитаният избор в този случай е отделен глицинов остатък. По- дълги линкерни вариации като че също се толерират в разтворимия TCR, осигурявайки възможността да бъдат защитени от протеазна атака, която би могла да доведе до сегрегация на димеризационните пептиди от екстрацелуларните области на TCR с последваща загуба на α- β верижна стабилност.

Разтворимият TCR съгласно изобретението не е задължително α- β TCR. Молекули като γ-δ, α-δ и γ-βΤΟΡ молекули (пре- TCR), съдържащи инвариантни алфа вериги, които са експресирани само в ранното развитие, също са включени. Пре- TCR специфицира клетъчната линия, която ще експресира α-β Т рецептор, в противоположност на онези клетки, които ще експресират γ-δ Т клетъчен рецептор (виж например Aifantiss, Azogui et al. 1998; von Boehmer, Aifantis et al. 1998; Wurch, Biro et al. 1998)). Пре- TCR ce експресира c TCR β верига удвоявайки се с инвариантна Пре- TCR а верига (Saint Ruf, Ungewiss et al. 1994; Wilson and MacDonald 1995), което очевидно причислява клетката към α- β Т клетъчната линия. Поради това се приема, че Пре- TCR е особено важна по време на развитието на тимуса (Ramiro, Trigueros et al. 1996).

Могат да бъдат създадени стандартни модификации на рекомбинантните протеини съгласно изобретението. Те включват например подреждане на невключен в двойка цистеинов остатък в константен участък на β веригата за избягване на некоректно вътреверижно образуване на двойки.

Сигналният пептид може да бъде заобиколен доколкото той не служи за никаква цел в зрелия рецептор или за неговата лигандна способност, и фактически може да предотврати разпознаването на лиганда от TCR. В повечето случаи, мястото на разграждане, в което се премества сигналният пептид от зрелите TCR вериги е предсказано, но не е експериментално определено. Конструирайки експресираните TCR вериги така че те да са само няколко, напр. до 10 например, амино киселини по- дълги или по- къси от п- края няма да са от значение за функционалността на разтворимият TCR. Могат да бъдат направени определени добавяния, които не присъстват в оригиналната протеинова последователност. Например, би могла да бъде добавена къса tag последователност, която може да подпомогне пречистването на TCR веригите, като по този начин не повлиява на коректната структура и нагъването на антиген свързващото място от TCR веригата.

За експресия в Е. coli, метионинов остатък може да бъде включен в N- крайна изходна точка от предсказаната зряла протеинова последователност за да позволи иницииране на транслацията.

Далече не всички остатъци във вариабилните области на TCR веригите са есенциални за антигенната специфичност и функционалност. Така, могат да бъдат включени значителен брой мутации в този участък без да се предизвика антигенна специфичност и функционалност.

В противоположност на това, определени остатъци включени във формирането на контакти с пептидния антиген или HLA тежко верижния полипептид, напр. остатъците, определящи CDR участъците от CDR веригите, може да бъдат заместени с остатъци, които биха повишили афинитета на TCR за лиганда. Подобни замествания, дали ниският афинитет на повечето TCR за пептидМНС лиганди, биха могли да бъдат полезни за повишаване спецификата и функционалния потенциал на разтворими TCR. В приведените примери, афинитета на разтворимите TCR към пептидните МНС лиганди е определен. Подобни измервания могат да бъдат използвани за изпитване ефектите на мутации, включени в TCR и така също да идентифицирането на TCR, съдържащ замествания, които повишават активността на ТСИте.

Далече не всички остатъци в постоянните области от TCR веригите са есенциални за антигенната специфичност и функционалност. Така, значителен брой мутации могат да бъдат включени в този участък, повлиявайки антигенната специфичност. В Пример 14 по- долу, сме показали че две амино киселинни замествания в костантната област от TCR β веригите не притежават установими причини за способността на TCR да свързват HLAпептиден лиганд.

TCR β веригата съдържа цистеинов остатък, който е неудвоен в клетъчния или нативен TCR. Мутация на този остатък повишава ефективността на in vitro вторичното огъване на разтворим TCR. Замествания на този цистеинов остатък със серин или аланин притежават значителен позитивен ефект върху ефективността на вторичното огъване in vitro. Сходни позитивни ефекти, или дори подобри ефекти, могат да бъдат получени чрез замествания с други амино киселини.

© Както бе отбелязано по- рано, за предпочитане е цистеиновите остатъци, формиращи интерверижната дисулфидна връзка в нативния TCR да не присъстват, така че да бъдат избегнати проблемите, свързани с огъването. Обаче, доколкото подреждането на тези цистеинови остатъци представлява естествения дизайн в TCRTe, и е показано също, че е функционално с това подреждане за c-jun и c-fos левцин циперни области (O’Shea et al, 1989), тези цистеинови остатъци могат да бъдат включени, осигурявайки това TCR да могат да бъдат вторично огънати.

Тъй като константните области не са директно включени в контакти с пептидните МНС лиганди, С- крайната точка на срязване !

I'aijiKnWa може да бъде променена по същество без загуба на функционалност. Например, следва да бъде възможно продуцирането на функционално разтворими TCR, изключвайки изцяло константната област. По принцип, би било по- просто да бъде експресират и огънат разтворими TCR, включващи само вариабилните участъци или вариабилните участъци и само къс фрагмент от константните участъци, тъй като полипептидите биха били по- къси. Независимо от това, тази стратегия не се предпочита. Дължи се на това, че осигуряването на допълнителна стабилност на α-β верижната двойка чрез хетеро- димеризационната област би била усложнена, тъй като конструираният С- край от двете вериги би бил на известно разстояние, нуждаейки се от дълги линкерни последователности. Преимуществото на сливането на хетеродимеризационните области точно преди мястото на цистеините, формиращи интерверижната дисулфидна връзка, е че α и β веригите са в непосредствена близост от клетъчния рецептор. Поради това, сливането в тази точка като че по- малко предизвиква изкривяване на TCR структурата.

Възможно е функционално разтворими TCR да могат да бъдат продуцирани с по- дълъг фрагмент от константните области спрямо предпочитаните, т. е. техните постоянни области не се нуждаят от срязване точно преди цистеините, формиращи вътреверижната дисулфидна връзка. Например, могат да бъде включена пълната константна област с изключение на трансмембранната област. В този случай, предимство е изменението на цистеиновите остатъци, формиращи вътреверижната дисулфидна връзка в клетъчната TCR.

В допълнение към подпомагането на вътреверижната стабилност посредством хетеродимеризационната област, би могло да се използва включване на цистеинови остатъци, които биха могли

да формират вътреверижна дисулфидна връзка. Една възможност би била срязването на а и β вериги в близост до цистеиновите остатъци, формиращи вътреверижната дисулфидна връзка без отстраняването им, така че да може да протече нормалното дисулфидно свързване. Друга възможност би била да бъдат делетирани само трансмембранните области от а и β веригите. Ако бъдат експресирани по- къси фрагменти от а и β веригите, биха могли да бъдат конструирани цистеинови остатъци като замествания при амино киселинни позиции, където огъването на двете вериги би довело остатъците в непосредствена близост, подходяща за формиране на дисулфидната връзка.

Пречистването на ТСИте може да бъде постигнато чрез много различни средства. Могат да бъдат използвани алтернативни начини на йонен обмен като гел филтрационна хроматография или афинитетна хроматография.

В метода за получаване на рекомбинантен TCR в съответствие с изобретението, ефективността на огъване може също да бъде повишена чрез добавяне на определени други протеинови компоненти, например чаперонови протеини, към сместа за огъването. Подобряване на огъването е постигнато чрез пропескане на протеина през колони с имобилизирани мини- шаперони (Altamirano, Golbiketal. 1997; Altamirano, Garcia et al. 1999).

В допълнение към методите, описани в примерите, са възможни алтернативни средства за биотинилиране на TCR. Например, може да бъде използвано химично биотинилиране. Могат да бъдат използвани алтернативни биотинилационни tag, макар определени амино киселини в биотиновите tag последователности са есенциални (Schatz et al., 1993). Използваната смес за биотинилиране също може да бъде различна. Ензимът изисква Mg-АТФ и ниска йонна сила, макар тези две условия също да варират напр. възможно е използването на по- висока йонна сила и по- дълго реакционно време. Възможно е използването на молекула различна от авидиновата или стрептавидиновата за формиране на мултимери на TCR. Всяка молекула, която свързва биотин по многовалентен начин би била подходяща. Обратно, може да бъде съоръжено едно изцялло различно свързване (като поли- хистидинов tag за хелатиране на никелов йон (Quiagen Product Guide 1999, Chapter 3 “Protein Expression, Purification, Detection and Assay” p. 35- 37). 3a предпочитане, tag е локализиран срещу C- края на протеина така, че да доведе до минимум количеството на етеричния хиндранс във взаимодействието с потенциални пептид- МНС комплекси.

Примерите за подходящи МНС- пептидни мишени за TCR съгласно изобретението включват, но не се ограничават до, вирусни епитопи като HTLV-1 епитопи (напр. Tax пептида, рестриктиран с HLA-A2; HTLV-1 се асоциира с левкимия), HIV епитопи, EBV епитопи, CMV епитопи; меланома епитопи и други раково- специфични епитопи; и епитопи, асоциирани с автономни нарушения, като ревматоиден артрит.

Множество лечения на болести могат потенциално да бъдат подобрени чрез локализиране на лекарството посредством специфичността на разтворимите TCR.

Вирусни заболявания, за които съществуват лекарства, напр. HIV, SIV, EBV, CMV, биха били благоприятно повлияни от лекарството, освободено в непосредствена близост до инфектираните клетки. За рак, локализацията на близостта на туморите или метастазите би повишила ефекта на токсини или имуностимуланти. В автоимунни заболявания, имуносупресивни лекарства биха били освобождавани бавно, имайки по- добър локален ефект в по- продължителен промеждутък от време, минимално повлиявайки общият имуно- капацитет на субекта. За предотвратяване отхвърлянето на трансплантанти, ефекта на имуносупресивни лекарства би било оптимизирано по същия начин. За доставяне на ваксини, ваксинният антиген би бил локализиран в блист на антиген представящите клетки, като по този начин се повишава ефективността на антигена. Методът може да бъде приложен също за други предполагаеми цели.

Предпочитани характеристики на всеки аспект от изобретението са както за всеки от другите аспекти mutates mutandis. Документите от нивото на техниката са включени тук във възможно най- пълния обхват, позволен от закона.

Изобретението по- нататък се описва със следните примери, които по никакъв начин не ограничават обхвата на изобретението.

Референциите, направени по- долу са съпътствани от чертежите, където:

Фигура 1 е схематичен поглед към Т- клетъчния рецепторлевцин ципер фузионен протеин. Всяка верига се състои от области, принадлежащи към две имуноглобулинови суперсемейства, един вариабилен (V) и един константен (С). Константните области са срязани непосредствено η-терминално от интерверижните цистеинови остатъци, и сляти към левцин циперния хетеродимеризационния мотив от с-Jun (а) или c-Fos (β) от около 40 амино киселини в С- края посредством къс линкер. a- Jun или β-Fos всеки съдържа две интраверижни дисулфидни връзки и двойка от нековалентни контакти. Алфа веригата е по- кратка в сравнение с бета веригата благодарение на по- малка константна област.

Фигура 2 е снимка на редукционен/ не-редукционен гел анализ на хетеродимерен JM22zip рецептор. Идентични проби от пречистен TCR-ципер се натоварват върху 15% акриламид SDS гел, или в редуциращи условия (линия 2) и не- редуциращи условия (линия 4). Маркерни протеини са показани на линии 1 и 3. Молекулите тегла са показани в килодалтони. И в двата случая, не- ковалентно асоциираният хетеродимер е дисоцииран в алфа и бета вериги. В линия 4, всяка верига се пропуска с по- висока мобилност и присъства като самостоятелна ивица, показвайки единични образци от интраверижно дисулфидно свързване. Това е конкурентно с формирането на коректна дисулфидна връзка.

Фигура 3 е графика, показваща специфичното свързване на JM22zip TCR към HLA-A2 Flu матриксни (М58-66) комплекси. HLA-A2 комплекси, вторично огънати около отделни пептиди и биотинилиран върху β2- микроглобулин са имобилизирани върху три покрити със стрептавидин обменни клетки: 3770 резонансни единици (RU) HLA-A2 POL контрола върху проточни клетки (FC) 3, и две различни нива на HLA-A2 М58-66 FLU (92970 RU върху FC1 и 4960 RU върху FC2).

JM22zip е инжектиран в разтворимата фаза секвенционално над всички три обменни клетки в концентрация от 43 μΜ за 60 секунди. По време на инжектирането се забелязва едно над- нивото повишаване в отговор на двете HLA-A2 FLU- покрити обменни клетки, с приблизително 1000 RU и 700 RU от специфично свързване на JM22zip към проточните клетки 1 и 2 съответно.

Фигура 4 показва последователностите от синтетични ДНК ф праймери, използвани за “прикрепено” амплифициране на TCR гени.

Местата на разпознаване за ДНК рестрикционните ензими, използвани за клониране са подчертани. А: поли-С “прикрепващ праймер”. В: специфичен праймер за TCR а верижен константен участък. С: специфичен праймер за TCR β верижен константен участък.

Фигура 5 показва последователностите на синтетични ДНК праймери, използвани за PCR амплификация на ДНК фрагменти, кодиращи 40-те амино киселинни “левцин циперни” участъци на c-jun 0 и c-fos. Местата на разпознаване за ДНК рестрикционни ензими, използвани за клониране са подчертани. A: c-jun 5’ праймер. В: c-jun | 3’ праймер.

i j Фигура 6 показва съответните ДНК и амино киселинни

I (еднобуквен код) последователности на c-fos и c-jun фрагменти както са сляти към TCRs (инсерти в pBJ107 pBJ108). A: c-jun левцинов ципер както е слят с TCR а вериги. В: c-fos левцинов ципер както е слят към TCR β вериги.

Фигура 7 показва последователностите на синтетичните ДНК праймери, използвани за изменение на неудвоеният цистеинов остатък в TCR β вериги. Праймерите са конструирани за използване в метода Quickchange™ за мутагенезис (Stratagene). А: Мутация на цистеин в серин, възходящ (смислов) праймер, показвайки амино киселинната последователност и мутацията. В: мутация на цистеин в серин, низходящ (безсмислов) праймер. С: мутация на цистеин в аланин, възходящ (смислов) праймер, като по този начин индикира амино киселинната последователност и мутацията. D: мутация на серин в аланин, низходящ (безсмислов) праймер.

Фигура 8 е схематично представяне на TCR- циперен фузионен протеин. Четирите имуноглобулинови области са означени като куполи, с показани интраверижни дисулфидни мостове между маркиращите двойки от цистеинови остатъци. Номерата означават амино киселинни позиции в зрелите Т- клетъчни рецепторни вериги; благодарение на слаби вариации в дължината на веригата след рекомбинация, дължините на веригите може да варира слабо между различните TCR. Остатъците въведени в линкерните последователности са означени с еднобуквения код.

Фигура 9 показва последователностите на синтетичните ДНК праймери, използвани за PCR амплификация на TCR а и β вериги. Местата на разпознаване за ДНК рестрикционните ензими са подчертани и амино киселинните последователности, съответстващи на съответните TCR вериги са означени върху възходящите праймерни последователности. Затихващи ДНК мутации, релативни на TCR гениите последователности и други ДНК последователности, които не съответстват на TCR гените са показани малки букви. А: 5’

PCR праймер за човешката Va10.2 верига на пептидна HLA-A0201 рестриктирана TCR от грипния матриксен вирус JM22. В: 5’ PCR праймер за човешката V5’ PCR праймер за човешката Va и β17 верига на пептидна HLA-A0201 рестриктирана TCR от грипния матриксен вирус JM22. С: 5’ PCR праймер за мишата Va4 вирусният нуклеопротеин пептид-Н2-О^ь рестриктиран TCR. D: 5’ PCR праймер за мишата νβ11 верига на вирусния нуклеопротеин пептид- Н2-А^ьрестриктиран TCR. Е: 5’ PCR праймер от човешката Va23 верига на ф 003 HIV-1 Gag пептид-Н1_А-А0201 HIV Gag пептид-Н1_А-А0201 рестриктиран TCR. F: 5’ PCR праймер от човешката νβ5.1 верига на 003 HIV-1 Gag пептид-Н1_А-А0201 рестриктиран TCR. G: 5’ PCR праймер на човешката Va2.3 верига на HTLV-1 Tax пептиден HLAА0201 рестриктиран А6 TCR. Н: 5’ PCR праймер на човешкия \/β12.3 верижен от HTLV-1 Tax пептиден HLA-A0201 рестриктиран А6 TCR. I: 5’ PCR праймер на човешката Va17.2 верига на HTLV-1 Tax пептидHLA-A0201 рестриктиран В7 TCR. J: 5’ PCR праймер на човешката νβ12.3 верига на HTLV-1 Tax пептидния HLA-A0201 рестриктиран В7 TCR. К: 3’ PCR праймер на човешки Са вериги, общо приложим. L: 3’ PCR праймер на Cβ вериги, общо приложим.

Фигура 10 показва,/ предполагаемата протеинова последователност (еднобуквен код, горе) и ДНК последователност (долу) от разтворимата HLA-A2/flu матрикс рестриктирана TCR а верига от JM22, както е слят към “левцин циперната” област от c-jun. Мутации, въведени в 5’ края на ДНК последователността за засилване експресията на гена в Е. coli са означени с малки букви, каквато е линкерната последователност между TCR и c-jun f последователности.

I { j

Фигура 11 показва предполагаемата протеинова последователност (еднобуквен код, горе) и ДНК последователност (долу) от разтворимата HLA-A2/flu матрикс рестриктирана верига от JM22, както е слята към “лбвцин циперната” област на c-fos. Линкерната последователност между TCR и c-fos. Линкерната последователност между TCR и c-fos последователности е означена с малки букви.

Фигура 12 показва предполагаемата протеинова последователност (еднобуквен код, горе) и ДНК последователност (долу) от разтворимия Н2-О^ь/грипен вирус нуклеопротеин рестриктирана TCR а верига от миши F5 рецептор, както е слят към “левцин циперната” област на c-jun. Мутации, въведени в 5’ края на ДНК последователността за повишаване експресията на гена в Е. coli са означени с малки букви, както в линкерната последователност между TCR и c-jun последователностите.

Фигура 13 показва предполагаемата протеинова последователност (еднобуквен код, горе) и ДНК последователност (долу) и разтворимият Н2-О^ь/грипен вирус нуклеопротеин рестриктирана TCR β верига от миши F5 рецептор, както е слят към “левцин циперната” област на c-fos. Линкерната последователност между TCR и c-fos последователности са означени с малки букви.

Фигура 14 показва предполагаемата протеинова последователност (еднобуквен код, горе) и ДНК последователност (долу) от разтворимата HLA-A2/HIV-1 Gag рестриктирана а верига от пациент 003, както е слят към “левцин циперната” област на c-jun.

I

Мутации, въведени в 5’ края на ДНК последователността за засилване експресията на гена в Е. coli са означени с малки букви, както в линкерната последователност между TCR и c-jun последователности.

Фигура 15 показва предполагаемата протеинова последователност (еднобуквен код, горе) и ДНК последователност (долу) от разтворимата HLA-A2/HIV-1 Gag рестриктирана TCR β верига от пациент 003, както е слят към “левцин циперната” област на c-fos. Линкерната последователност между TCR и c-fos последователности е означена с малки букви.

Фигура 16 показва предполагаемата протеинова последователност (еднобуквен код, горе) и ДНК последователност (долу) от разтворимия HTLV-1 Tax/HLA-A2 рестриктирана TCR а верижен клон А6 (Gabroczi, Utz et al, 1996), както е слят към “левцин ,ί циперната” област на c-jun. Мутациите, въведени в 5’ края на ДНК последователността за усилване на експресията на гена в Е. coli са означени с малки букви, както в линкерната последователност между TCR и c-jun последователностите.

Фигура 17 показва предполагаемата протеинова последователност (еднобуквен код, горе) и ДНК последователност (долу) от разтворимата HTLV-1 Tax/HLA-A2 рестриктирана TCR β верига от клон А6 (Garboczi, Utz et al, 1996: Garboczi, Glosh et al, 1996), както е слят към “левЦин циперната” област на c-fos и биотинилираният tag, който действа като заместител за BirA (Barker and Campbell, 1981; Barjer and Campbell, 1981; Howard, Shaw et al, 1985; Schatz, 1993; O’Callaghan, Byford, 1999). Линкерната последователност между TCR и c-fos последователности е означена с малки букви. Мутация на ДНК последователността, която замества цистеинов остатък за аланинов остатък е означена с плътни букви и подчертана.

Фигура 18 показва предполагаемата протеинова \ последователност (еднобуквен код, горе) и ДНК последователност (долу) от разтворимата HTLV-1 Tax/HLA-A2 рестриктирана TCR а 0 верига от клон M10B7/D3 (Ding Gt al, 1998), както е слят към “левцин циперната” област на c-jun. Линкерната последователност между TCR и c-jun последователности е означена с малки букви.

Фигура 19 показва предполагаемата протеинова последователност (еднобуквен код, горе) и ДНК последователност (долу) от разтворима HTLV-1 Tax/HLA-A2 рестриктирана TCR β верига от клон M10B7/D3 (Ding et al, 1998), както е слят към “левцин циперната” област на c-fos и биотинилационния tag, който действа като заместител за BirA. Линкерната последователност между TCR и 0 c-fos последователности е означена с малки букви. Мутация в ДНК последователността, която замества аланин с цистеинов остатък е означена с плътни букви и е подчертана. Две затихващи мутации (P-G | кодони), въведени за целите на клонирането и за отстраняване на j мястото на рестрикция Xmal и също са означени с малки букви.

Фигура 20 показва предполагаемата протеинова I последователност (еднобуквен код, горе) и ДНК последователност ΐ (долу) на мутантна разтворима HTLV-1 Tax/ HLA-A2 рестриктирана

TCR β верига от клон А6 (GarbOczi, Ghosh et al, 1996), както е слята към “левцин циперната” област на c-fos и биотинилиран tag , който действа като заместител за BirA (Barker and Campbell, 1981; Barker and Campbell, 1981; Howard, Sfiaw, 1985; Shatz, 1993; O’Callaghan, Byford, 1999). Линкерната последователност между TCR и c-fos последователност. Мутация на ДНК последователността, която замества цистеинов остатък с аланинов, е означена с удебелени букви и е подчертана. С плътни букви и подчертано е заместването на постоянния участък, който няма установен функционален ефект върху разтворимия TCR.

Фигура 21 показва предполагаемата протеинова

I последователност (еднобуквен код, горе) и ДНК последователнност

I (долу) от c-fos-i биотинилирания фузионен партньор, използван за TCR β вериги. Местата на разпознаване за ДНК рестрикционните j ензими са подчертани и границите на фузионните области са j означени. Линкерните последователности са показани с по- дребни | букви.

j i

j Фигура 22 показва последователността на синтетичен ДНК | 0 праймер, използван за PCR амплификация на νβ- c-fos левцин ] циперен фрагмент на човешкия J.M22 грипен матриксен пептид- HLAj А0201.

j Фигура 23 е комплект фотографски гелове. а Изготвяне на денатуриран протеин за TCR, специфичен за 003 HIV дад пептидHLA-A2 комплекс, анализиран с SDS-PAGE. Линия 1: маркери с широк интервал на молекулно тегло (Bio-Rad). Линии 2 и 3: бактерия след индукция на протеинова експресия с 0.5 mM IPTG, линии 4 и 5: пречистени инклузионни тела, солюбилизирани в 6М гуанидинов буфер. Ь. Изготвяне на денатуриран протеин за биотин- tag TCR, специфичен за грипен матриксен пептид - HLA-A2 комплекс, анализиран със SDS-PAGE. Линия 1: Маркери с широк интервал на молекулно тегло (Bio- Rad), линии 2 и 3: а- & β-верижни пречистени инклузионни тела, солюбилизирани в 6М гуанидинов буфер, с. Изготвяне на денатуриран протеин за биотин- tag TCR, специфичен за HTLV tax пептид- HLA-A2 комплекс, анализиран с SDS-PAGE. Линии 1 & 5: маркери с широк интервал на молекулното тегло (BioRad), линии 2, 3 & 4: α-, β- и мутантна β- верижни пречистени инклузионни тела, солюбилизирани в 6М гуанидинов буфер.

Фигура 24 е хроматограма, показваща елуацията на JM22z хетеродимер от PORAS 10HQ анийоно обменна колона. Прекъсната линия показва проводимостта, която е показателна за концентрацията на натриев хлорид, плътната линия показва оптичната плътност при 280 nm, която е показателна за протеиновата концентрация на елуата. Пиковият протеин, съдържащ фракции се отливат за по-нататъшен анализ. Инсерта показва хроматограма на елуация от пречистен JM22z от Superdex 200 HR колона. Стрелки показват калибрацията на колоната с протеини с известно молекулно тегло. Чрез сравняване с тези протеини, вторично огънатият JM22z протеин притежава молекулно тегло с приблизително 74 kDa, което е сравнимо с хетеродимерният протеин.

Фигура 25 е снимка, показваща SDS- полиакриламидна гел електрофореза (оцветяване по Coomassie) на пречистен JM22z протеин. Линии 1 & 3: стандартни протеини с известно молекулно тегло (както е показано), линия 2: JM22z протеин, третиран с SDSбуфер, съдържащ редуциращ агент (DTT) преди натоварването на пробата, линия 4: JM22z протеин, обработен с SDS буфер в отсъствие на редуциращи агенти.

Фигура 26. а_Пречистване на вторично огънат биотин-tag TCR, специфичен за грипен матриксен пептид - HLA-A2 комплекс, i. Хроматограма на елуацията на протеина от POROS 10HQ колона. Линия х означава абсорбция при 280 nm и линия у обозначава проводимостта (измерване на градиента на натриев хлорид, ф използван за елуиране на протеина). Броя на фракциите е означено чрез вертикалните линии ii. SDS-PAGE на фракциите, елуиращи колоната както в i. Линия 1 съдържа маркери с широк интервал на | молекулно тегло (Bio- Rad) и линии 2-13 съдържат 5 μΙ от фракции 6I 15 съответно, iii. SDS-PAGE анализ от отделените фракции от L, j съдържащи биотин-tag flu- TCR. Линия 1: маркери с широк интервал | молекулно тегло (Bio- Rad), линия 2: биотин- tag flu- TCR протеин, b

I Пречистване на вторично огънат биотин- tag TCR специфичен за j HTLV- tax пептид - HLA-A2 комплекс, i. Хроматограма на елуацията

I | на протеина от POROS 10HQ колона. Линия х обозначава i ф абсорбцията при 280 nm и линия у обозначава проводимостта | (измерване на градиента на натриев хлорид, използван за елуиране

I на протеина). Броят на фракциите е означен с вертикални линии, ii.

SDS-PAGE от фракциите, елуиращи колоната както в i. Линия 1 съдържа маркери с широк кръг молекулни тегла (Bio- Rad) и линии 2 10 съдържат 5 μΙ от фракциите 3-11 съответно, iii. SDS- PAGE анализ от отделените фракции от i. От биотин- tag tax- TCR. Линия 1: j маркери с широк интервал на молекулните тегла (Bio- Rad), линия 2:

I

I биотин- tag tax- TCR протеин, линия 3: мутантен биотин- tag tax- TCR

I протеин.

I

Фигура 27 е хроматограма, показваща елуирането на биотинtag разтворим TCR след биотинилиране с BirA ензим от Superdex 200 HR колона, еквилибрирана в PBS. Биотинилираният TCR елуира около 15-16 минути, а трите свободни биотина елуират при около 21 минути. Фракциите, съдържащи биотинилиран разтворим TCR се отливат за по- нататъшна употреба.

·'

Фигура 28 е комплект от фотографски гелове. Преценка на биотинилацията на биотинилираните TCR. a. SDS- PAGE от вторично огънати TCR и препарати на инклузионни тела. Линия 1: маркери с широк интервал на молекулни тегла. (Bio- Rad), линия 2: Биотинилиран flu-TCR, линия 3: Биотинилиран max-TCR, линия 4: Биотинилиран мутантен тах- TCR, линия 5: HIV gag- TCR, (не биотинtag); b. Оцветяване по Western на гел, идентичен с а. С изключение на това, че маркери с широк интервал на молекулно тегло са маркирани с биотин (Bio- Rad). Оцветяването е с авидин- HRP конюгат за демонстриране на биотинилираните протеини и визуализация с Opti4CN (Bio- Rad).

Фигура 29 показва JM22z свързване към различни HLA-A2пептидни комплекси. Спецификата на взаимодействията между JM22z и HLA-A2-flu е показано чрез сравняване на SPR отговора от преминаването на TCR над двете други обменни клетки, едната покрита с 4200 RU от HLA-A2- pol, другата покрита с 4300 RU CD5. Нивото на отговорите при различни концентрации на JM22z са измерени при 1700 RU от HLA-A2-pol (а). Стойността на нивото е извадена от специфичния отговор, измерен при 1900 RU и HLA-A2- flu (b) и нанесена срещу концентрацията (с). Kd от 13 μΜ, оценено чрез не- линеарната крива на съвпадение, е в съответствие с Kd на 12 μΜ, изчислена на базата на Scatchard plot от същите данни.

Фигура 30 е графика, показваща резултата от Biacore 2000™ анализ на див тип и мутантен разтворим биотинилиран max TCR. 5 μΙ див тип tax TCR при концентрация от 2.2 mg/ml и след това мутантен tax TCR при концентрация от 2.4 mg/ml пропускат над четири обменни клетки със следните протеини, прикрепени към повърхността: A: taxрМНС комплекс, В/С: flu- рМНС комплекс, D: 0X68 контролен протеин. Както дивите, така и мутантните протеини се свързват аналогично към специфичният рМНС комплекс.

Фигура 31 показва ефекта на свързване на разтворим CD8aa върху разтворим TCR, свързан към същия HLA-A2- flu комплекс. (А) TCR или TCR плюс 120 μΜ разтворим CD8 се инжектират в контролни обменни клетки, покрити с 4100 RU в нерелевантен протеин (CD5) и сонда обменни клетки, покрити с 4700 RU от HLA-A2flu. След изваждане на нивото, са показани стойностите на ф изчисленият отговор при различни концентрации на TCR самостоятелно (отворени цикли) или в комбинация с 120 μΜ разтворим CD8 (затворени цикли). Показана е също стойността на CD8 самостоятелно (затворени триъгълници) и изчислената разлика между TCR + CD8 и TCR самостоятелно (отворени квадрати). (В) Показана е зависимостта на отговора от времето при 4700 RU от j имобилизиран HI_A-A2-f/u от 49μΜ TCR самостоятелно (отворени | цикли) или в комбинация със 120 μΜ CD8 (затворени цикли) при 25°С и скорост на потока от 5 μΙ/min (стойностите са коригирани за нивото, измерено при 4100 RU на имобилизиран CD5); извънредната степен на TCR не е причинена от сходното CD8 свързване.

Фигура 32 показва протеиновата последователност (еднобуквен код, горе) и ДНК последователност (долу) на разтворимия, HLA-A2/flu матрикс рестриктирана TCR алфа верига от JM22, както е слята към “левцин циперната” област на c-jun. Мутациите, въведени в 5’ края на ДНК последователността за усилване експресията на гена в Е. coli са означени с малки букви, както и линкерната последователност между TCR c-jun последователностите.

Фигура 33 показва протеиновата последователност (еднобуквен код, горе) и ДНК последовталеност (долу) от разтворимия, HI_A-A2/flu матриксна, разградена TCR бета верига от КМ22, както е слята към “левцин циперната” област на c-fos. Линкерната последователност между TCR и c-fos последователностите, е означена с малки букви. Мутация на ДНК последователността, която замества серинов остатък с цистеин остатък, е означена с плътни букви и подчертана. Тази мутация повишава ефективността на вторичното огъване на TCR.

Фигура 34 показва протеиновата последователност (еднобуквен код, горе) и ДНК последователността (долу) на разтворимата, HLAA2/flu матрикс рестриктирана TCR бета верига от JM22, както е слята към “левцин циперната” област на c-fos и биотинилираният tag, който действа като субстрат за BirA. Линкерните последователности между TCR и c-fos последователностите, и между c-fos и биотинилираният tag, са означени с малки букви. Мутация на ДНК последователността, която замества сериновият остатък, е означена с удебелени букви и е подчертана. Тази мутация повишава ефективността на вторично огъване на TCR.

Фигура 35 е схематична диаграма на TCR-циперенбиотинилационен tag фузионен протеин.

Фигура 36. Елуация на вторично огънат TCR от POROS 10HQ колона с градиент на натриев хлорид. TCR елуира като единичен пик при приблизително 100 mM NaCI. Фракции, съдържащи протеин с OD(280nm) от повече от 0л1 се отливат и концентрират за биотинилиране.

Фигура 37. Разделяне на биотинилиран TCR от свободна биотинова гел филтрация върху Superdex 200HR 10/30 колона (Pharmacia). TCR- биотин елуира при около 15 ml, съответстващо на молекулно тегло 69 kDa. (Стандратни протеини и техните елуационни обеми: Тироглобулин (669 kDa) 10.14 ml, Apoferritin (443 kDa) 11.36 ml, бета- амилаза (200 kDa) 12.72 ml, BSA димер (134 kDa) 13.12 ml, BSA мономер (67 kDa) 14.93 ml, овалбумин (43 kDa) 15.00 ml, химотрипсиноген A (25 kDa) 18.09 ml, RN-аза A (13.7kDa) 18.91 ml).

Фигура 38. Протеинова последователност (еднобуквен код, горе) и ДНК последователност (долу) от разтворима, HTLV-1 Тах/Н1_АА2 рестриктирана TCR алфа верига от клон А6 (Garboczi et al., 1996; Garboczi et al., 1996), както е слят към “левцин циперната” област на c-jun. Мутациите, въведени в 5’ края на ДНК последователността за засилване експресията на гена в Е. coli са означени с малки букви както в линкерната последователност между TCR и c-jun последователностите.

Фигура 39. Протеинова последователност (еднобуквен код, горе) и ДНК последователност (долу) от разтворимата, HTLV-1 Tax/HLA-A2 рестриктирана TCR бета верига от клон А6 (Garboczi et al., 1996; Garboczi et al., 1996), както е слята към “левцин циперната” област на c-fos и биотинилираният tag, който действа като субстрат за BirA. Линкерната последователност между TCR и c-fos последователностите е означена с малки букви. Мутация на ДНК последователността, която замества един аланинов остатък с цистеин, е означена с плътни букви и е подчертана.

Фигура 40. Протеинова последователност (еднобуквен код, горе) и ДНК последователност (долу) от разтворимата, HTLV-1 Тах/Н1_А-А2 рестриктирана TCR алфа верига от клон M10B7/D3 (Ding et al., 1998), както е слят към “левцин циперната” област на c-jun. Линкерната последователност между TCR и c-jun последователностите е означена с малки букви.

Фигура 41. Протеиновата последователност (еднобуквен код, горе) и ДНК последователност (долу) от разтворимият, HTLV-1 Tax/HLA-A2 рестриктирана TCR бета верига от клон m10B7/D3 (Ding et al., 1998), както е слят към “левцин циперната” област на c-fos и биотинилираният tag, който действа като субстрат за BirA. Линкерната последователност между TCR и c-fos последователностите е означена с малки букви. Мутация в ДНК последователност, която замества един аланинов остатък с цистеинов остатък е означена с удебелени букви и е подчертана. Две затихващи мутации (P-G кодони), въведени за целите на клонирането и за отстраняване на Xmal рестрикционният сайт също са означени с малки букви.

ПРИМЕРИ

В изложените по- долу примери са описани общите методи и използваните материали.

Материали

Рестрикционни ензими (Ndel, BamHI, Hindlll, Bsu361, Xmal) са получени от New England Biolabs.

Tris pH 8.1 е получен като 2M разтвор от еднакви части Tris база и Tris- HCI и двата от USB.

EDTA (Sigma) е създаден като 0.5М разтвор и pH е доведено до 8.0 с помощта на 5М NaOH (Sigma).

Глутатион в окислена и редуцирана форми са от Sigma.

Цистамин и цистеамин са от Sigma.

Натриев хлорид са от USB и е получчен като 4М разтвор.

Китове за минипрепарати за плазмидно пречистване са от Quiagen.

Китове за пречистване на PCR са от Quiagen.

DTT са от Sigma.

Гуанидинът е от Fluka.

RPMI среда е от Sigma.

PBS е получен от таблетки Oxoid.

Глицеролът е от BDH.

Общи методи

Бактериална среда (среда TYP) се изготвя както следва:

160 g дрождев екстракт (Difco), 160 g Tryptone (Difco), 50 g NaCI (USB) и 25 g K₂HPO₄ (BDH) се разтварят в 2 литра деминерализирана вода. 200 ml равни части от този разтвор се измерват в 10 х 2 L конични епруветки и се допълват до 1 L с добавянето на 800 ml деминерализирана вода. Колбите се покриват с четири слоя алуминиево фолио, маркират се и се автокпавират. След охлаждане, колбите се съхраняват на стайна температура далече от слънчева светлина до употреба.

Протеиновите концентрации се измерват с помощта на свързващата проба Pierce Coomassie и BSA като стандартен протеин. Накратко, 0- 25 pg BSA стандарти в обем от 1 ml вода се изготвят от обем 2 mg/ml BSA (Pierce) в 4 ml пластмасови кювети. Получава се приблизително 10 цд неизвестен протеин с до 10 ml вода по същия начин. Добавя се 1 ml Pierce Coomassi реагент към всяка кювета и съдържимото се смесва внимателно. Оптичната плътност се измерва в рамките на 15 минути при 595 nm с помощта на спектрофотометър Beckman DU- 530 UV. На основата на BSA стандартите е осъществена линеарна регресия (линеарността е добра до 25 цд BSA) и концентрацията на неизвестния протеин се изчислява чрез съпоставяне с тези резултати.

Проведена е гел филтрационна хроматография върху система Pharmacia FPLC, снабдена с компютърен контрольор. Протеиновата елуация се наблюдава със ситема UV-M II, измерваща абсорбцията при 280 nm дължина на вълната. За дребно мащабно разделяне, се използва Superdex 200 HR 10/30 колона и пробата се натоварва с помощта на 1 ml примка. Преди пускането, колоната се еквилибрира с 30 ml PBS и пробата се пропуска при 0.5 ml/min и фракциите се събират. За по- голямомащабно разделяне, се използва колона Superdex 75 или 200 PG 26/60 със 10 ml суперпримка. В този случай 5 или 10 ml проби се събират и колоната се пропуска при 4 ml/min. Всички разделяния се провеждат на стайна температура.

Йонообменна хроматография се провежда върху Biocad Sprint система (Perkin- Elmer). За катийонна обмяна, се използва колона 20 HS или 50 HS колона. За анийонна обмяна, се използва колона 10 HQ, 20HQ или 50HQ. Колоните се пускат използвайки препоръчаните буфери, прикрепени към 6- way миксер. Малки проби се инжектират (5- 25 ml) с помощта на 5 ml с помощта на 5 ml инжекционна бримка. По- големи проби (>100 ml) се инжектират с помощта на една от двете буферни линии. По време на фазата на елуация на пуснатата колона се събират фракции от по 1 ml. Протеиновата елуация се измерва чрез линейна абсорбция при 280 nm.

SDS полиакриламидна гел електрофореза (SDS-PAGE) се провежда с помощта на Bio- Pad Mini- Protean II гел система. Теловете се отливат преди използване с помощта на следната процедура. Събирането на теловете се провежда и изпитва за да се предотврати изтичането. След това се изготвя следната смес: 12% акриламид/ бисакриламид (от 30% акриламид/ 0.8 % бисакриламиден разтвор (National Diagnostics)), 0.375 М Tris pH 8.8 (от 1.5 M щок със същото pH), 0.1 % SDS (от 10% SDS щок разтвор), 0.05 % TEMED (Sigma). Сместа незабавно се отлива в гелната паничка и отгоре се разлива водно- наситен бутанол за получаване на вода над повърхността. След утаяването на гела (10- 15 минути минимум), гелът се утаява както следва. 4% акриламид (от щока по- горе), 0. 125 М Tris pH 6.8 (от 0.5 М щока със същото pH), 0.1% SDS, 0.05 % амониев персулфат и 0.2% TEMED. Бутанолът се отстранява от повърхността на разтварящия гел чрез абсорбция върху тъканта и гелната смес се отлива върху разтварящия гел. Гелният гребен незабавно е включен, като се внимава да не бъдат вкарани въздушни мехурчета в гела и се оставя да се стегне за минимум 5 минути.

Гелът след това се събира в гел апарат и в апарата при анода и катода се налива буфер (3 g/l Tris- база, 14.4 g/L глицин, 1 g/L SDS (разреден от 10х концентриран разтвор). След отстраняване на гелния гребен, кладенчетата се промиват с буфер за предотвратяване утаяването на останалата акриламидна смес на дъното на кладенчетата. Пробите се изготвят чрез смесване на протеин 1: 1 със следната смес: 4% SDS, 0.125 М Tris pH 6.8, 20% глицерол, 10% β- меркаптоетанол, 1% бромофенол блу (Sigma). Пробите след това се нагряват до 95°С за 2 минути и се охлаждат преди поставянето до 25 μΙ в кладенчетата за гела. Приблизително 1 - 10 μΙ от протеина обикновено се натоварва за осигураване на добро оцветяване и пропускане на гела. След натоварването, теловете се пропускат при постоянно напрежение от 200 V за приблизително 40 минути или докато багрилото хромофенол блу достигне приблизително 5 mm от края на гела.

След завършване на електрофорезата, теловете се отстраняват от апарата и внимателно се накапват в 0.1% разтвор на Coomassie R250 (Sigma) в 10% оцетна киселина, 40% метанол, 50% вода. Теловете след това внимателно се разклащат за най- малко 30 минути преди обезцветяване в различни изменения на 10% оцетна киселина, 40% метанол, 50% вода докато гелната основа стане ясна.

Геловете след това се съхраняват във вода и записват с помощта на UVP гел документационна система, състояща се от светлинен бокс, дигитална камера и термален принтер.

Пример 1 - Рекомбинантен разтворим TCR

Рекомбинантна разтворима форма на хетеродимерната TCR молекула се обработва както е описано на Фигура 1. Всяка верига се състои от мембранни дистални и проксимални имуноглобулинови области, които са сляти чрез къс гъвкав линкер към спираловидния мотив, който подпомага стабилизирането на хетеродимера.

TCR постоянните области са срязани непосредствено преди цистеиновите остатъци, които in vivo формират междуверижната дисулфидна връзка. Впоследствие, двете вериги се удвояват чрез не- ковалентни кватернерни контакти и по това е потвърдено на Фигура 2Ь. Тъй като Fos- Jun циперните пептидни хетеродимери са също способни да формират вътреверижен дисулфид непосредствено N- крайно до използвания линкер (O’Shea et al 1989), подреждането на двете вериги една спрямо друга е предопределено оптимално. Фузионните протени следва да бъдат свързани по начин, който е конкурентен на всеки от отделните компоненти, с оглед да се избегне разрушаването на всяка структура.

сДНК кодиращи алфа и бета вериги от TCR специфичен за епитоп на грипния матриксен протеин 58- 66 в HLA-A2, са получени от Vp17 + човешки CTL клон (JM22) чрез прикрепване на PCR както е описано по- рано (Moss et al. 1991).

Алфа и бета TCR- циперни структури pJM22a- Jun и ρύΜ22βFos са конструирани поотделно чрез амплифициране на вариабилата и постоянна област от всяка верига с помощта на стандартна PCR технология и сплисинг продукти върху левцин циперни области от факторите на еукариотната транскрибция Jun и Fos съответно (Виж Фигура 1). Показано е, че тези последователности с дължина 40 амино киселини специфично хетеродимеризират при вторичното огъване от синтетични пептиди, без необходимост от ковалентно вътреверижно свързване (O' Shea et al. 1989).

Създадени са праймери за включване на високо АТ съдържимо непосредствено от 3’ от иницииращия кодон (за дестабилизиране на тРНК вторична структура) и с помощта на Е. coli кодонни предпочитания, с оглед максимална експресия (Gao et al). Свободният цистеин в TCR бета константна област е променена в серин за осигуряване предотвратяване на некоректно дисулфидно свързване по време на вторичното огъване.

ДНК структури са свързани поотделно към Е.coli експресионният вектор pGMT7. Плазмидните разграждания и ДНК съгласуването потвърждават, че структурите са коректни.

В подробности използваните процедури са както следва.

Експресия на TCR циперни вериги и пречистване на денатурирани инклузионни тела: GFG020 и GFG021, pGMT7 експресионни плазмиди, съдържащи JM22a-Jun и JM22p-Fos съответно, са трансформирани поотделно в щам на Е. coli BL21pLysS, и отделни устойчиви на ампицилин колонии сеотглеждат при 37°С в

TYP (ампицилин 100 gg/ml) среда до OD₆₀₀ от 0.4 преди индуциране на протеинова експресия с 0.5 mM IPTG. Теловете се събират три часа пост- индукционно чрез центрофугиране за 30 минути при 4000 rpm в Beckman J-6B. Клетъчните утайки се ресуспендират в буфер, съдържащ 50 mM Tris- HCI, 25% (w/v) захароза, 1 тМ NaEDTA, 0.1% (w/v) NaAzide, ЮтМ DTT, pH 8.0. След етап на размразяване в продължение на една нощ, ресуспендираните клетки се обработват с ултразвук в продължение на 1 минута общо за 10 минути в соникатор Milsonix XL2020 с помощта на стандартна проба от 12 mm в диаметър. Утайки от инклузирннит тела се възстановяват чрез центрофугиране за 30 минути при 13000 rpm в центрофуга на Beckman J2-21. Три промивания на детергента се провеждат след това за отстраняване на клетъчните дебриси и мембранни компоненти. Всеки път утайката от инклузионни тела се хомогенизира в Triton буфер (50 mM Tris- HCI, 0.5% Triton-ХЮО, 200тМ NaCI, ЮтМ NaEDTA, 0.1% (w/v) NaAzide, 2 mM DTT, pH 8.0) преди утаяването на утайката чрез центрофугиране за 15 минути при 13 0000 rpm в Beckman J2-21. Детергента и солта се отстраняват след това чрез сходно промиване в следният буфер: 50 mM Tris - HCI, 1 тМ NaEDTA, 0.1% (w/v) NaAzide, 2 mM DTT, pH 8.0. Накрая, утайките от инклузионни тела JM22a-Jun и JM22p-Fos се разтварят отделно в разтвор на урея (50 mM MES, 8М урея, 10 тМ NaEDTA, 2 тМ DTT, pH 6.5) за 3- 4 часа при 4°С. Неразтворимият материал се утаява чрез центрофугиране за 30 минути при 13000 rpm в Beckman J2-21, и супернатантата се разделя в 1 ml равни части и се замразява при 70°С. Инклузионни проби, солюбилизирани в урея се определят количествено със свързващата багрило проба на Bradford (Biorad). За всяка верига се получава добив от около 100 mg пречистено инклузионно тяло от един литър култура. Всяко инклузионно тяло (JM22a-Jun, JM22p-Fos) се солюбилизира в разтвор на урея при концентрация от около 20 mg/ml, и с гел анализ се установи че е с около 90% чистота в тази форма (данни не са показани).

Повторно вторично огъване на TCR- циперни фузионни протеини

Изходните експерименти за вторично огъване с помощта на стандартен буфер за вторично огъване (100 mM Tris pH 8.5,1 М Lаргинин, 2 тМ EDTA, 5 тМ редуциран глутатион, 0.5 тМ окислен глутатион, 0.2 mM PMSF) водят до преципитация на протеина, които са в зависимост от наличието на циперни области. Фактът, че този феномен се случва в концентрации под константата на дисоциация на циперна димеризация (т. е. когато повечето циперни хелици се очаква да са мономерни) предполага допълнителни усилия, стабилизиращи неогънатите видове. Най- вероятното обяснение е това, че пълните алфа- хеликоидални циперни области се огъват първи и че техните тяхната времена хетеродимеризация индуцира вътреверижното

агрегиране на частично огънатите междинни продукти на повечето комплексни имуноглобулинови области. Буферът за вторично огънаве след това се променя с оглед съдържание на 5 М урея за предотвратяване хидрофобните взаимодействия между частично огънатите имуноглобулинови области и позволява отделни вериги да се огънат напълно преди хетеродимеризацията. Този етап е достатъчен да предотврати случващата се преципитация и позволява коректно огънатите TCR- циперни хетеродимери да се комбинират в приемливи добиви с помощта на следния протокол.

Урея- солюбилизирани щокове от TCR-ципрни вериги JM22a- Jun и ΰΜ22β- Fos се ренатурират чрез дилуционно повторно вторично огъване. Приблизително 30 mg (т.е. 1 μΜοΙβ) от всяка верига солюбилизирано инклузионно тяло се разтопява от замразените щокове и след това се добавя DTT (4цто1ез/т1) за подсигуряване пълната редукция на цистеиновите остатъци. Пробите след това се смесват и сместа се разрежда в 15 ml гуанидинов разтвор (96 М гуанидин- хидрохлорид, 10 тМ натриев ацетат, 10 mM EDTA), за подсигуряване пълното денатуриране на веригата. Гуанидиновият разтвор, съдържащ напълно редуцирани и денатурирани TCRциперни области след това се инжектира в 1 литър от следния буфер за вторично огъване: 100 mM Tris pH 8.5, 400 тМ L- аргинин, 2 тМ EDTA, 5 тМ редуциран глутатион, 0.5 тМ урея, 0.2 тМ PMSF. Вторично огънатото количество след това се диализира двукратно, най- напред срещу 10 литра 100 тМ урея, след това срещу 10 литра 100 тМ урея, 10 тМ Tris pH 8.0. И двата етапа- на вторично огъване и на диализа се провеждат при 6- 8°С.

Пречистване на вторично огънат TCR- ципер·.

TCR- ципер JM22zip се разделя от продуктите на разграждане и замърсяванията чрез натоварване на диализираният вторично огънат продукт върху POROS 10HQ аналитична анийонообменна колона в седем 200 ml равни части и елуиращият свързан протеин с градиент от 0- 400 mM NaCI над 50 обема на колоната, BioCad (Perseptive Biosystems). Не- ковалентно свързаният хетеродимер е елуиран в отделен пик при приблизително 100 mM NaCI. Пиковите фракции (обикновено съдържащи хетеродимер в концентрация от 100- 300 gg/ml) се съхраняват при 4°С преди да бъде отделен и концентриран. Добивът на хетеродимер е приблизително 15%.

Охарактеризиране на вторично огънатият TCR- циперен JM22zip:

JM22zip хетеродимер се пречиства чрез анийонообменни елуати като един приблизително 70 kDa протеин от Superdex 200 гел филтрационна колона (Pharmacia). Специално следва да се обърне внимание на това, че е важно включването на гел филтрационни етапи преди повърхностния плазмон резонанс свързващ анализ доколкото точните афинитетни и кинетични измервания зависят от състоялите се мономерни взаимодействия. По този начин, агрегати от по- висок ред могат да бъдат изключени от разтворимата протеинова фракция, използвана за анализ. По- специално,могат да бъдат установени агрегатите причинили изкуствено малки константи на скорост на асоциация и дисоциация.

Състоянието на окисление на всяка верига се изпитва чрез редукционен/ не- редукционен гел анализ на Фигура 2. В присъствието на SDS, не- ковалентно свързаният хетеродимер е дисоцииран в алфа и бета вериги. Ако DTT се използва в буфера за натоварване, двете вериги пропускат всяка страна на 31 kDa маркера. В отсъствие на такива денатуранти двете вериги все още се държат като единични видове, но подвижността на всяка се повишава, което предполага че всяка верига е формирала единични, дисулфидносвързани видове (Garboczi et al. 1996).

Реактивността на антитялото на вторично огънатият рецептор е тестван с помощта на повърхностния плазмон резонанс върху машина Biacore 2000 (Biacore). TCR- циперът JM22z се имобилизира към декстранов матрикс (СМ чип) свързваща повърхност при pH 5.5 с

МйМИ помощта на стандартни амино куплиращи методи. Антитяло с вариабилен участък, специфично за бета веригата (νβ17) специфично се свързва към имобилизираният рецептор, предполагайки коректна конформация.

Стабилност:

Разтворимите TCR, експресирани като алфа- jun и бета- fos левцин циперни фузии са стабилни за периоди повече от месец и поради това са подходящи за установяване на специфични антигени, представени от клас I МНС.

Пример 2- Кинетично и афинитетно изследване на човешки TCRвирусни пептидни МНС

Специфично свързване на вторично огънат TCR- ципер към пептид- МНС комплекси

Повърхностен плазмон- резонансен биосенсор (Biacore) се използва за анализиране на свързването на TCR- ципер (JM22zip, специфичен за HLA-A2 грипен матриксен протеинов М58-66 комплекс) към неговия пептид- МНС лиганд (виж Фигура 3). Ние улеснихме това чрез продуциране на отделни рМНС комплекси (описани по- долу) които могат да бъдат имобилизирани към покрити със стрептавидин свързваща повърхност по полу- ориентиран начин, позволяващ ефективно тестване на свързването на разтворим Т- клетъчен рецептор към четири различни рМНС (имобилизирани върху отделни обменни клетки) едновременно. Ръчно инжектиране на HLA комплекс позволява точното ниво на имобилизирани молекули от клас I да бъде лесно манипулирано.

Такива имобилизирани комплекси могат да свързват както Тклетъчни рецептори (виж Фиг. 3), така и рецептора CDaa, като и двата могат да бъдат инжектирани в разтворима фаза. Специфично свързване на TCR-ципер е получено дори при ниски концентрации (най- малко 40pg/ml), предполагайки, че TCR ципера е относително стабилен. Наблюдавано е, че свойствата на свързване на рМНС са количествено и качествено сходни ако TCR се използват както в разтворима, така и в имобилизирана фаза. Това е важен контрол за частична активност на разтворими видове и също предполага, че биотинилирани рМНС комплекси са биологично толкова активни, колкото не- биотинилираните комплекси.

Изготвяне на химично биотинилирани комплекси:

Вече е описан метод за получаване на комплекси от разтворими рекомбинантни самостоятелни пептиди от клас I HLA (Garboczi et al., 1992). Той е модифициран с оглед продуциране на HLA комплекси, които притежават химично биотинилирани β-2-микроглобулинови области и поради това могат да бъдат имобилизирани към покрит със стрептавидин свързващ чип и използвани за изследване на повърхностно плазмон свързване, β-2-микроглобулин се експресира и 40 mg се огъва вторично в стандартен буфер (100 mM Tris pH 8.0, 400 тМ L-аргинин, 2тМ EDTA, 5 тМ редуциран глутатион, 0.5 тМ оксидиран глутатион, 0.1 mM PMSF) по същество както е описано (Garboczi et al. 1992). След незадължителен етап на гел филтрация, протеинът е подложен на обмяна върху 0.1 натриев борат pH 8.8 и най- накрая се концентрира до 5- 10 mg/ml. β-2-микроглобулин се подлага също и на количествено определяне с помощта на пробата на Bradford (Biorad). Добавя се 5 молярен излишък на биотин хидроксисукцинимид (Sigma) от щока, направен до 10 mg/ml в DMSO. Реакцията бе оставена за 1 час на стайна температура, и се стопира с използване на 20 μΙ 1М амониев хлорид/ 250 pg биотинов естер. Вторично огънатият HLA комплекс се отделя от свободния биотин и свободния биотинилиран бета-2- микроглобулин с помощта на Superdex 200 гел филтрационна колона (Pharmacia). Стрептавидина се имобилизира по стандартни методи за амино куплиране.

Изводи:

Така, методите да вторично огъване на протена, описани в Премир 1, продуцират стабилен, коректно огънат, функционален рекомбинантен рецепторен фузионен протеин, който е подходящ за биофизичен анализ с помощта на оптичен биосенсор. По този начин се осигурява реагент, използван за провеждане на подробен афинитетен и кинетичен анализ на човешки TCR-pMHC взаимодействия. Изследвани са също и ефектите на Т- клетъчни корецептор- МНС и TCR- рМНС взаимодействия върху всеки друг. Използваните рекомбинантни техники са приложими по принцип както върху миши, така и върху човешки TCR, както от клас I, така и от клас II- рестриктирани, и биха позволили сходни анализи от на кръг от TCR-и. Това би позволило адресирането на различни въпроси, като афинитета на TCR в рамките на антивирусният отговор, свойствата на доминантно подбраните рецептори и кинетичните изисквания за рецепторно заключване. Методите предлагат също начин за потвърждаване литандната специфичност на TCR преди изследванията за кристализация и може да имат също приложения за рекомбинантно получаване на други клетъчно повърхностни рецептори.

= Пример 3- Биотинилиране и тетрамеризация на разтворими Т| клетъчни рецептори ί I I

2.5 ml пречистен разтворим TCR, изготвен както е описан в

I Пример 1 (~0.2 mg/ml) се прехвърля в биотинилиран реакционен | буфер (10 mM Tris pH 8.0, 5 тМ NaCI, 7.5 тМ MgCI₂) с помощта на

PD-10 колона (Pharmacia). Елуатът (3.5 ml) се концентрира до 1 ml с помощта на центрикон концентратор (Amicon) с 10 kDa молекулно тегло. Това става чрез добавяне на 5 тМ АТФ от щок (0.1 g/ml | доведен до pH 7.0). Добавя се коктейл от протеазни инхибитори:

j леупептин, пепстатин и PMSF (0.1 тМ), последвано от 1 тМ биотин (добавен от 0.2 М щок) и 5 pg/ml ензим (от 0.5 mg/ml щок). Сместа j след това се инкубира за една нощ на стайна температура. Излишъка ? 0 от биотин се отстранява от разтвора чрез диализа срещу 10 mM Tris pH 8.0, 5 тМ NaCI (200 обема, с 2 промени при 4°С). Протеина след това се тества за наличие на свързан биотин чрез оцветяване върху нитроцелулоза, последвано от блокране с 5% сухо обесметанено j мляко, и детекция с помощта на стрептавидин- HRP конюгат (Biorad).

j Тетрамеризация на биотинилирания разтворим TCR става или с j

екстравидин- RPE или с ектравидин- FITC конюгат (Sigma).

.i

Концентрацията на биотин- разтворим TCR се измерва с помощта на

Coomassie свързваща протеинова проба (Pierce), и съотношението на екстравидин конюгат към разтворим TCR от 0.224 mg/mg TCR се изчислява да достигне насищане на екстравидина от биотинилирания

TCR при съотношение 1:4. Екстравидиновият конюгат се добавя в равни части от 1/10 та от общото добавено количество, върху лед, за най- малко 15 минути за една част (за осигуряване насищане на екстравидина). Разтворими TR тетрамери се съхраняват при 4°С на тъмно. Тетрамерите са изключително стабилни за период от повече от месец.

Пример 4- Молекулярно клониране на гени за Т клетъчен рецептор от Т клетъчни линии или Т клетъчни клонове с известна специфичност.

Методите и процедурите за молекулярно клониране на TCR гени от клетки са идентични за всички а вериги и за всички β вериги, съответно, и поради това са описани само в този пример.

Подходящ брой Т клетки, обикновено 1-5 милиона, се лизират в буфер за лизис от тРНК улавящ кит (Boehringer Mannheim). mPHK е изолирана с кит реагенти чрез хибридизиращи биотинилирани олигоdT към поли-А краища на тРНК. Хибридизираните комплекси след това се улавят чрез свързване на биотина към PCR епруветка, покрита със стрептавидин. Следвайки имобилизацията на тРНК в PCR епруветката, сДНК е генерирана с помощта на AMV обратна транскрибтаза (Stratagene) както е описано (Boehringer Mannheim manual for mRNA Capture Kit).

C все още имобилизираната сДНК, са генерирани поли-G опашки при 3’ краищата с помощта на Терминиращ трансферазен ензим (Boehringer Mannheim). След това се добавя PCR реакционна смес, включваща термостабилната полимераза pfu (клонирана,

Stratagene), която е използвана за минимизиране риска от грешки в PCR продуктите. PCR реакциите се провеждат с помощта на поли-С “прикрепващ праймер” (Фигура 4А) и а или рверижни специфични праймери (Фигури 4В и С, съответно), деспирализиращи в съответните TCR константни участъци. Провеждат се PCR реакции от по 30 цикъла на денатурация при 95°С за 1 минута, деспирализирайки при 50°С за 1 минута, и екстензии при 72°С за 5 минути, за амплификация на TCR генни фрагменти.

ф

PCR продукти се лигатират в Bluescript секвенционен вектор (pBluescript II KS-, Stratagene) с помощта на рестрикционните сайтове Xhol и Xmal, съдържащи се в PCR праймерите (всички ензими от New England Biolabs). Следвайки трансфекцията на лигационните смеси в щам на Е. coli XL-1 Blue, няколко клона от всяка верига са подбрани за ДНК съгласуване, което се провежда върху ABI 377 Prism автоматичен секвенатор с помощта на Big Dye™ терминатори (Applied Biosystems Inc.).

V β Пример 5- Молекулярно клониране на ДНК фрагменти, кодиращи двойно спирализираните (“левцин циперни”) участъци от 40 амино киселини от c-jun и c-fos.

ДНК фрагменти, кодиращи двойно спирализираните (левцинциперни)участъци на c-jun и c-fos са генерирани чрез PCR реакции с помощта на човешка сДНК като матрица и праймерите, показани на Фигура 5. PCR реакции се провеждат в реакционен буфер, включващ клонирана pfu полимераза (Stratagene) за 30 цикъла, състоящи се от

Ύ· денатуриране при 95°С за 1 минута, деспирализиране на праймера при 58°С за 1 минута, и екстензия при 72°С за 2 минути.

Фрагментите c-jun и c-fos се лигатират в pBluescript II KS(Stratagene) с помощта на уникалните Xhol и Xmal рестрикционни сайтове за получаване на структурите рВЛ08, съответно (Фигура 6). ДНК последователностите на c-jun и c-fos фрагменти се потвърждават чрез ДНС съгласуване, осъществено на ABI 377 Prism i

автоматичен секвенатор с помощта на BigDye™ терминатори (Applied Biosystems Inc.).

Съгласуваните c-jun и c-fos фрагменти след това се подлагат на субклониране, с помощта на уникалните Xmal и BamHI рестрикционни сайтове, в полилинкерният участък на Т7 полимеразен експресионен вектор, pGMT7 (Studier, Rosenberg et al. 1990).

Пример 6- Дизайн на TCR- левцин циперни фузионни протеини за продуцирането на стабилни, разтворими TCR

Опитите за повторно вторично огъване на екстрацелуларни фрагменти на TCR а и β вериги, срязани така че да съдържат цистеиновия участък, който in vivo формира дисулфидна връзка, водят до ограничен успех (данни не са показани, виж Пример 9 за експресионни методи и общи методи и материали за условията на вторично огъване). Независимо от това, когато TCR а и β вериги са срязани непосредствено преди, т.е. Ν- крайно на, цистеиновият остатък формиращ интерверижата дисулфидна връзка, аналитична хроматография върху Superdex G-75 колона (Pharmacia) показва, че

‘аинаьои/явс g BHnaiodu вн внвУжвбсвс! иии ааоовь nodg ьинвьинвШо io ojuat/ -ου aniada оивахоиси ид охаох ‘сиивнв вс вньчхвхооУан и вяоин о хоониидвхо BiBH>KMdo9 d/^{n 9h} иЬлваавхои ‘иудх oiMwwdoaicBd вн oHBiftKodeed ndu HHOSBduBH во иинеЬющдвн инУохд njndaa β и ю ygj. siMHdswoHow вн оМвахохаахочо ‘oujax ониЛхаиот вн вяии ваУ a Bauaheed ао ygi KHHdai/wtfodaiax вн оГпвахохаахочо oujai оннАхаиот о в1ьиИ>^ф аь ‘ваевяои BHnaiodu вн хчгиивнв ‘hiOH вн аинажичЬМи a iBauHBdx40 ао yoi niAindoaisBd ηεβι oxbjjox ‘аьвдо Hnaiodu хвинивюх ю %ое ^{10 90} втвоючо онааоняидо oujai ониЛхаиом OHixadox о ииЬявбф BiBaoHnaxodu ‘dawntfodaiax вн axnangotf вн anHadgotfou . OHhniBiAiBdtf васвяои ‘BMC4da вн^ифиХоиУ BiBHxndaaadi^a вdиιлιdoφ oii/iom ‘хчхвхоо lunaoHnaionh ntfadu oHaaiotfedoouaH HHBcudo axaata¹ и ‘njndaa β βηιηβιΧιλι и ό уз1 вн анвач-ю OHhndoia OHdoiaou 7. BdXjH0 вн инвавяои во иивха μηηοηΙίβχΑιλι иеа1 ве инвасиоиеи ‘ndaninBdu »Ηϋ зхиньихахнио хчхвхоо аонинвив иии aoHndao очо ΗβιοθίΑΐεε а ячхвхоо хииаониахои|~| yoi виньчхаих а наоаУХан а охиох ‘мчховнХ нахнвхонох (j yoj. а ячхвюо аониаюиП вн аинанашаи cadh инв0иеи1Л1ини1Л1 хвУчд Btf xbjoiai аь вхиьо ао ‘иьХио ао Btf ваох ахиюонжо1Л1еча ‘анвачио oxoHhndoxa ojj/л ui вн eiAieda ou BHnaiodu вн анвачю онииаебиан о1/\1ихвбдоан иниьи0и вЪ¹ажо1Л1 BXC4da внУифиЛоиЬ’ oHixadoxaH вн olθнвdиιлιdoφ охвх ичх (BtfoiaiAi 1Л1ЧМ BMiBduadu εε (9661 Ίθ I® ^ΖΙΠ ‘izooqjBQ оГпчо жиа) dai/\intfodaiax β/η lbHHBSbdo εε daiAieed HauXxauoi/v ьинвахвьо o oxauuwox a BXBH4J0 OHhndoxa а ‘анвачхо OHhndoia εε BiunhxBad а оахоаьииох οιΟΗΕβευουεπ io %£-|, 0Huaxn8nugndu ‘Hnaiodu io киИ>^ф bwbiai тези методи за продуциране на разтворим TCR само генерират рецептор с изключително ограничена стабилност.

За подобряване TCR α/β верижна стабилност, и потенциалното формиране на хетеродимер по време на вторичното огъване, TCR веригите се сливат към “левцин циперните” области от c-jun и c-fos, които са известни предимно като формиращи димери (O’Shea, Rutkowski et al. 1989; Schuermann, Hunter et al. 1991; O’Shea, Rutkowski et al. 1992; Glover and Harrison 1995). Изследвани са два дизайна за фузионните TCR. В един левцин циперите са сляти точно след, т.е. С- крайно на цистеиновите остатъци, формиращи вътреверижната дисулфидна връзка в TCR а и β веригите. Тъй като c-jun и c-fos левцин циперните пептиди също са способни да формират междуверижно дисулфидно свързване непосредствено Nкрайно спрямо използвания линкер (O’Shea, Rutkowski et al. 1989), деспирализирането на двете вериги една спрямо друга и спрямо междуверижната дисулфидна връзка, се счита че са оптимални.

В друг дизайн, левцин циперите се сливат точно преди, т. е. Nкрайно спрямо цистеиновите остатъци, формиращи междуверижна дисулфидна връзка в TCR а и β вериги (Фигура 8). Така, във вторият дизайн цистеиновите остатъци са отстранени от рекомбинантния рецептор.

В експериментите за вторично огъване с TCR-ципер (TCR-z) вериги на тези дизайни, установено е че добивът на хетеродимерен, разтворим рецептор е по- добър когато цистеиновите остатъци, формиращи междуверижната дисулфидна връзка, се отстраняват от | TCR а и β веригите, както в дизайна, показан на Фигура 8.

Ϊ

Пример 7- Структура на ДНК експресионни вектори за TCRлевцин циперни протеини j Този пример описва структурата на експресионни вектори за а и j β вериги на пет TCRn. Описаните стратегия и дизайн следва да бъдат © адаптивни за които и да са човешки или животински TCR гени. Макар описаните тук пет TCR всички да са ограничени до епитопи от МНС клас I, методите могат да бъдат използвани по идентичен начин за клониране и конструиране на експресионни вектори за рестриктираните до клас II МНС TCR. Всички вектори експресират [ протеин с цел вторично огъване на разтворими TCR съгласно j дизайна, показан на Фигура 9, с изключение на това че два TCR са експресирани с биотинилирана tag последователност при С- края (виж по- долу и Фигури 17, 18 и 19). Методиките за клониране са | идентични за всички TCR а и β вериги, съответно.

©

Обхвата на лидерната, или сигнална пептидни последователности на TCR а и β вериги са предсказани от анализи на j секвенционните данни, получени от плазмиди, съдържащи TCR прикрепващи PCR продукти (виж Пример 4). На тази основа са създадени 5’ праймери за генериране на PCR фрагменти за експресирането на TCR вериги без лидерни последователности (Фигура 9). Всички 5’ праймери кодират метионинов остатък точно преди зрелите TCR протеинови последователности с оглед да I ί позволи транслация в Е. coli. Затихващи мутации, заместващи С или

G бази c А или T (Фигура 9) са въведени в множество 5’ проксимални кодони от гените с оглед понижаване на тенденцията за секундарени тРНК структури, които биха инхибирали нивата на експресия в Е. coli (PCT/GB 98/03235; (Gao, Tormo et al. 1997; Gao, Gerth et al. 1998).

Гените, кодиращи Va0.2 и νβ17 веригите на рестриктираните TCR на човешкия JM22 грипен матриксен пептид HLA-A0201 (пептидна последователност GILGFTL), човешките Va23 и \Ζβ5.1 J © веригите на рестриктираните TCR на 003 HIV-1 Gag пептид-HLAА0201 (пептидна последователност SLYNTVATL), и мишите Va4 и νβ11 вериги на F5 ΝΡ пептид-Н2^0Ь (пептидна последователност ASNEMDAM) са амплифицирани с PCR с помощта на плазмиди, съдържащи TCR прикрепващи PCR продукти, генерирани както е описано в Пример 6. Гените за човешкия Аб (Va2.3/ νβ12.3) и В7 (Va17.2/ νβ12.3) TCR, които са специфични за HTLV-1 Тах пептидите, представени от HLA-A0201 (пептидна последователност LLFGYPVYV), са получени в плазмидна форма (Garboczi, Utz et al. 1996; Ding, Smith et al. 1998), които са използвани за генерирането на ® PCR продукти за конструиране на експресионни вектори за тези TCR вериги. Гените за тези TCR са клонирани в експресионни вектори, които съдържат последователността за c-fos левцин циперен биотинилиран tag фузионен фрагмент (виж Пример 8). Проведени са PCR реакции с клонирана pfu полимераза при стандартни буферни условия (Stratagene) с 25 цикъла на денатурация при 95°С за 1 | минута, праймерно деспирализиране при 60°С за 1 минута и екстензия при 72°С за 6 минути. PCR продуктите се разграждат рестрикционно с ензимите Ndel и Xmal и се лигатират в pGMT7 вектори, съдържащи инсерти от c-jun (TCR а вериги) и c-fos (TCR β вериги) (виж Пример 5).

Фигури 10-19 показват последователностите на TCR-z инсерти ипредположените протеинови последователности, експресирани от pGMT7 векторите. Фигура 20 показва последователността на А6 TCR β веригата, съдържаща мутация в константния участък, но който не повлиява по отчетлив начин огъването и функцията на разтворимия С TCR (виж Пример 9 и 10).

Пример 8 - Конструиране на ДНК вектори за експресията на TCR β вериги, сляти към c-fos левцин- циперен биотинилиран фрагмент.

За да стане възможно имобилизирането на разтворими TCR или да позволи отчитането или прикрепването към рецептора, би било полезно, ако протеина може да бъде продуциран с понататъшна функционална фузионна компонента. Това би позволило О получаването на разтворим TCR, така че да бъдат получени като мултимери или да позволи отчитането с висока чувствителност, или да присъедини други функции към рецептор/рецепторните комплекси.

Този пример демонстрира конструирането на експресионни вектори за TCR β вериги, върху който е конструиран фузионен полипептид, който може да бъде специфично биотинилиран в Е. coli in vivo или с ензима BirA in vitro (Baker and Campbell 1981; Baker and Campbell 1981; Howard, Shaw et al. 1985; Schatz 1993; O’Callaghan, Byford et al. 1999). Както е показано в Примери 10 и 11, тези разтворими TCR фузии могат да бъдат експресирани и вторично огънати заедно с а верига по идентичен начин и със сходни добиви към TCR β верига, който не е слят към “биотинилирания tag” (BT-tag). Тези резултати показват, че разтворимия TCR, описани тук, е вероятно подходящ за експресия с множество различни полипептиди като фузионни партньори.

Т клетъчни рецепторни β- вериги се подлагат на суб- клониране в pGMT7 експресионен вектор с биотин- tag последователност Скрайна спрямо c-fos левцин циперната последователност както следва:

старт- TCR β- верига- fos ципер- биотин- tag- стоп

Точната последователност на краищата на структурата е както следва (виж също Фигура 21):

Линкер —>|fos ципер -+|ВатН1|<-линкер->|<-биотин tag

Използвани са два подхода за продуциране на разтворими TCR с биотиновия tag. В случая на човешкия JM22 грипен Матриксен пептид-Н1_А-А0201 рестриктиран TCR, клонираната β-вepижнa-c-/bs левцин циперна фузия се модифицира в 3’- края спомощта на синтетичен ДНК праймер, показан на Фигура 22 за индуциране на BamHI място вместо Hindlll място с помощта на стандартна PCR реакция с pfu полимераза (Stratagene).

Оригиналният 5’ праймер (виж Фигура 9), съдържащ Ndel място, е използван като възходящ праймер. Продуцираният PCR продукт е клониран в модифициран pGMT7 вектор, съдържащ биотин-tag последователносттаФигура 21) за формиране на подчертаната погоре структура. Този плазмид е известен като JMB002.

Клонираният TCR специфичен за HLA-A0201 рестриктиран HTLV-1 епитоп LLFGYPVYV, известен като А6 тах TCR (Va2.3/ νβ12.3) се срязва с помощта на PCR с възходящите и обратни праймери, | показани на Фигура 9. Тази TCR β-верига е клонирана в Ndel и Xmal места от pGMT7 вектор (JMB002) съдържащ c-fos-BT фрагмент.

ф

След конструиране на фузионните експресионни вектори, се провежда ДНК съгласуване за подсигуряване липсата на грешки, въведени по време на процедурата на субклониране (цялото | субклониране е проведено в Biochemistry Dept. ДНК Sequencing

Facility, Oxford University c помощта на AB I 377 Prism секвенсер и ABI BigDye флуоресцентни терминатори). Предполага се, че има две грешки в тах TCR β-верига, в сравнение с публикуваната последователност и при по- нататъшно изследване, ние установихме, че и двете са налице в оригиналния плазмид, който получихме. Доколкото тези две грешки са 3’ от уникалния Bsu361 сайт в TCR βверига, те се използват за клониране в (правилния) JMB002 плазмид. ! Двете версии на tax TCR β- верига са експресирани и вторично | огънати с а- верига и сравнени с помощта на Biacore. И двете версии j на протеина специфично специфично се свързват към молекулите от тах пептидите МНС от клас I със сходни очевидни афинитети (виж Пример 17). В последващи експерименти се използва само коректната версия на β- веригата.

I

Пример 9- Експресия на TCR вериги в Е. coli и пречистване на инклузионните тела

TCR а и β вериги са експресирани поотделно в щам Е. coli BL21D3pLysS под контрола на вектора pGMT7 в среда ТУР с помощта на 0.5 mM IPTG за индуциране на протеинова продукция, когато оптичната плътност (OD) при 600 nm достига между 0.2 и 0.6. Индуцирането се оставя да продължи една нощ и бактерията се събира чрез центрофугиране при 4000 rpm Beckman J-6B центрофуга.

Утаените бактериални клетки след това се ресуспендират в “лизисен буфер” (10 mM Tris pH 8.1, 10 тМ EDTA, 150 тМ NaCI, 2 тМ DTT, 10% глицерол). Сместа се охлажда върху лед и се добавя следното: 20 pg/ml лизозим, 10 mM MgCI₂, и 20 pg/ml ДНаза I, последвано от инкубиране върху лед за минимум един час.

Сместа се ибработва с ултразвук с помощта на 12 тМ соникатор (Milsonix XL2020) при пълно налягане за 5 облъчвания от по 5 секунди с интервали от 30 секунди, което да позволи на сместа да се охлади. Температурата се поддържа по време на тази процедура с използването на ледена водна смес. След това сместа се разрежда с 5 обема промивен буфер Triton (50 mM Tris pH 8.1, 0.5% Triton Х-100, 100 тМ NaCI, 0.1% натриев азид, 10 тМ EDTA, 2 тМ DTT). След инкубация върху лед за минимум 1 час, сместа след това се центрофугира при 3500 rpm в центрофуга на Beckman GS-6R и супернатантата се изхвърля. Утайката се ресуспендира в буфер за ресуспендиране (50 mM Tris pH 8.1, 100 тМ NaCI, 10 тМ EDTA, 2 тМ DTT) с помощта на малка пластмасова пипета. След това сместа се

центрофугира при 8000 rpm в центрофуга на Beckman J2-21 и супернатантата се изхвърля. Утайката след това се ресуспендира м Гуанидинов буфер (50 mM Tris pH 8.1, 6.0 М гуанидин- HCI, 100 тМ NaCI, 10 тМ EDTA, 10 тМ DTT) с помощта на ръчен хомогенизатор. След центрофугиране на ниски обороти за отстраняване на неразтворимия материал, супернатантата се разпределя на равни части и се съхранява при -70°С.Рутинно се получава приблизителен добив от 100 mg за литър бактериална култура.

SDS- PAGE анализ на пречистеният препарат от инклузионно тяло се постига чрез разреждане на 2 μΙ препарат на инклузионно тяло в Гуанидинов буфер със SDS-PAGE буфер, последвано от нагряване до 100°С за 2 минути. Пробите се натоварват върху гела докато е все още топъл за предпазване на сместа от гуанидин и SDS от преципитиране по време на натоварването. Протеина на инклузионното тяло, пречистен по този начин, се довежда до приблизителна чистота 90% чрез оцветяване на SDS-PAGE с багрилото Coomassie, осъществено по този начин (виж фигура 23).

Пример 10- Вторично огъване и пречистване на TCRz хетгеродимера

Разтворени в урея протеини в еднакви съотношения по- нататък се денатурират в “гуанидинов буфер” (6М гуанидин- HCL, 10 тМ натриев ацетат pH 5.5, 10 mM EDTA, 2 тМ DTT) при 37°С. Сместа от протеини се инжектира в ледено студен буфер за вторично огъване (100 mM Tris pH 8.1, 0.4 М L- аргинин- HCI, 5.0 М урея, 5 тМ редуциран глутатион, 0.5 тМ оксидиран глутатион) в обща протеинова концентрация от 60 mg/L. След инкубиране върху лед за най- малко 5 часа, което да позволи вторичното огъване, сместа се диализира срещу 10 обема деминерализирана вода за 24 часа и след това срещу 10 обема 10 mM Tris pH 8.1 за 24 часа.

Диализираният вторично огънат протеин след това се филтрува за отстраняване на агрегиралия протеин (продуциран като страничен продукт по време на вторичното огъване) през 0.45 μ нитроцелулозна мембрана (Whatman). Пречистването на биотин-tag разтворими TCR след това се осъществява чрез натоварване върху POROS 20HQ колона, Biocad Sprint system. Приблизително 500 ml от вторично огънатия протеин може да бъде натоварен за едно пропускане и елуацията на протеина се постига при градиент на натриев хлорид в Bis-Tris-Propane буфер pH 8.0. Протеина елуира при около 100 тМ натриев хлорид и съответните фракции незабавно се охлаждат върху лед и се добавя протеазен инхибиторен коктейл. Фракциите се анализират с оцветен с Coomassie SDS-PAGE.

Пример 11- Вторично огъване на TCRz хетеродимер с податлива на биотинилиране β верига.

TCR β вериги с биотинилирани краища се смесват с еднакви количества от а- верига, експресирана и пречистена както за разтворимия Т клетъчен рецептор. Хетеродимерни TCRz-β-ΒΤ се подлагат на вторично огъване съгласно идентични процедури, както са описани в Пример 10 за TCR (виж Фигура 26).

Пример 12- Биотинилиране на разтворим TCRz-BT с биотинилирани краища

Съдържащи протеин фракции се концентрират до 2.5 ml с помощта на 10К- cut off центрофужни концентрации (Ultrafree, Millipore). Буферът е променен с помощта на PD-10 колони, еквилибрирани с 10 mM Tris pH 8.1, 5 тМ NaCI, добавя се буферен протеазен коктейл и протеина се концентрира до ~1 ml с помощта на центрофужни концентрации отново. Към този 1 ml от разтворим TCR с биотинилирани краища се добавя следното: 7.5 mM МдС1₂₁ 5 тМ АТФ (pH 8.0), 1 тМ биотин, 2.5 цд/т1 BirA биотинилационен ензим. Реакцията на биотинилиране след това се оставя да финишира на стайна температура (20- 25°С) за една нощ.

Ензимно биотинилиран разтворим TCR след това се отделя от остатъчния нереагирал биотин чрез гел филтрация върху Superdex 200 HR колона (Pharmacia), осъществена върху Pharmacia FPLC система (виж Фигура 27). Колоната се еквилибрира с PBS и фракциите от по 1 ml се събират, като незабавно се охлаждат върху лед и защитават с протеазен инхибиторен коктейл отново. Протеиновата концентрация се изпитва с помощта на свързваща Coomassie проба (Pierce) и биотинилираният протеин след това се съхранява на 4°С за време до 1 месец или при -20°С за по- дълги периоди.

Ефективността на реакцията на биотинилиране се изпитва с помощта на Western проби върху биотинилирания протеин. Гел SDSPAGE се пропуска с помощта на методите, описани по- горе, но вместо оцветяване, гелът се поставя върху PVDF мембрана (BioRad) с помощта на SemiPhor полу- сух електроблотинг апарат (Hoefer). Блотинг пакета съдържа 6 носителя от филтърна хартия (Whatman 4М) срязан до размера на гела и промокрен с трансферен

буфер (25 mM Tris база, 150 mM глицин), последвано от PVDF мембраната, която предварително е навлажнена с метанол и след това омокрена с трансферен буфер, последвано от гела, който е внимателно накиснат в трансферен буфер за 5 минути, последвано от още 6 носителя навлажнена филтърна хартия. Пакета внимателно се компресира с помощта на тест- епруветка, за да се изгонят възможните въздушни мехурчета и се добавят приблизително 10 ml допълнителен трансферен буфер. Катода се поставя отгоре на пакета и през апарата се пропуска постоянен ток от 50 mA за 1 час. Мембраната след това се инкубира в 2% разтвор на желатин (BioRad) в PBS-Т буфер (PBS + 0.05% Tween-20) за >1 на стайна температура с внимателно разбъркване. Инкубации в продължение на една нощ включва също 0.01% натриев азид за инхибиране на бактериалния растеж. Мембраната се промива с няколко (4-5) изменения на PBS-Т, последвано от оцветяване с авидин- HRP конюгат (Sigma), разреден 1: 1000 в 1% разтвор на желатин в PBS-T за >30 минути на стайна температура с внимателно разбъркване. Мембраната след това се промива с няколко (4-5) изменения на PBSТ преди отчитането с Opti-4CN (Bio-Rad). Това е реагент, който взаимодейства в присъствие на HRP за формиране на неразтворимо синьо багрило, което оцветява мембраната на мястото, където има релевантен протеин, както е установено от наличието на свързан HRP. Когато за оцветяване се използва авидин- HRP конюгат, това показва наличие на биотин- съдържащ протеин.

I

Фигура 28 показва блотинг, осъществен по същия начин върху няколко биотинилирани TCR. Стандартите, пропуснати върху този блот биотинилират маркире с широк кръг молекулно тегло (Bio- Rad). Блотът ясно показва, че високи нива на биотинилиране на TCR, съдържащи биотинилационната опашка, която е взаимодействала с ензима BirA.

Пример 13- Получаване на биотинилирани разтворими МНСпептидни комплекси

Биотинилирани разтворими МНС- ппептидни комплекси могат да бъдат получени както е описано в Пример 2.

Пример 14- Изпитване на специфичното свързване между разтворим TCR и МНС- flu- пептид

Разтворимата TCR молекула, JM22z, е специфична за HLA-A2 МНС молекули, представящ амино доминантен антиген, състоящ се от амино киселинните остатъци 58-66 (GILFVFTL) на грипен матриксен протеин. Клонирането, експресията и пречистването на JM22z е описано в Примери 4, 7, 9 и 10 и на фигури 24 и 25. Взаимодействията между JM22z и неговия лиганд/ МНС комплекс (HLA-A2- flu) или една ирелевантна HLA-A2 пептидна комбинация, получаването на която е описано на Пример 13, се анализират на Biacore 2000™ повърхностен плазмон резонансен беосенсор (SPR). SPR измерва измененията в рефрактивния индекс, експресиран в единиците на отговора (RU) в близост до сенсорната повърхност в рамките на малка обменна клетка, принципа който може да бъде използван за установяване на рецепторни лигандни взаимодействия и да анализира техния афинитет и кинетични параметри. Обменни клетки за пробата се изготвят чрез имобилизиране на HLA-A2пептидни комплекси в отделни обменни клетки чрез свързване между иотиновото кръстосване, прикрепено към р2т и стрептавидин, който е химически кръстосано свързан към активираната повърхност на обменните клетки. Изпитването след това се провежда чрез прекарване над повърхността на различните обменни клетки при постоянна скорост на потока, измервайки отговора на SPR. Отначало, специфичността на взаимодействието се потвърждава чрез преминаване на 28 μΜ JM22z при постоянна скорост на потока от 5 μΙ min'¹ над три различни повърхности; една покрита с 2800 RU HLA- А2flu, втората покрита с 4200 RU HLA-A2 огъната с ирелевантен пептид от HIV обратна транскрибтаза (HI_A-A2-pol: ILKEPVHGV), и трети, покрит с 4300 RU CD5 (фгура 29а). Инжекции на разтворим JM22z при постоянна скорост на потока и различни концентрации над HLA-A2pol се използват за дефиниране на обратния резонанс (Фиг. 29а). Стойностите на тези контролни измервания са извадени от стойностите, получени с HLA-A2-flu (фиг. 29в) и се използват за изчисляване на афинитета на свързване, изразено като дисоциационна константа, Kd (Фиг. 29c). Kd на JM22z и релевантната МНС молекула се определя като 15± 4 μΜ (п=7) при 37°С и 6.6 ±2 μΜ при 25°С. Определянето с учасдтие на имобилизиран TCR в сондата от обменни клетки и разтворим МНС- пептиден комплекс дава сходна стойност на Kd от 5.6 ± 4 μΜ (п=3) при 25°С. Скоростта на взаимодействието на входа се определя, че е между 6.7 х 10⁴ и 6.9 х 10⁴ M‘¹s'¹ при 37°С, докато скоростта на взаимодействие на изхода е 1.1 s’¹ (Willcox, Gaoetal. 1999).

Пример 15- Изпитване на специфичното свързване между разтворим миши TCR и миши МНС Н2- D^b - NP

В този експеримент ние използвахме миши TCR, F5, специфичен за пептид, получен от нуклеопротеин на грипен вирус (аа. 366-374: ASNENMDAM), представено от мишата Н2- D^b МНС молекула (H2-D^b-NP). Използваният тежко верижен МНС ген е слабо модифициран в смисъл, че кодира само амино киселини 1- 280 от нативния протеин плюс 13- амино киселинни последователности, разпознати от ензима BirA. Полученият в резултат протеин може да бъде биотинилиран ензимно (Schatz 1993; O’ Callaghan, Byford et al. 1999). SPR анализ върху Biacore 2000™ SPR биосенсор, използващ този разтворим TCR, специфичен за имобилизиран H2-D^b- NP, показва че се свързва специфично към лигандната МНС- пептидна комбинация (данни не са показани).

Пример 16- Сравнение на свързването на биотинилиран разтворим tax-TCR с биотинилиран разтворим мутантен tax-TCR

Биотинилирани разтворими tax-TCR се изготвят както в Примери 9-11 и се провежда анализ на Biacore 2000, както в Пример 14 с помощта на биотинилирани рМНС комплекси, вторично огънати както с грипен матриксен пептид (GILGFVTL), така и HTLV tax 11- 19 пептид (LLFGYPVYV). Биотинилирани разтворими TCR се пропускат върху всички клетки при 5 μΙ/минута за общо 1 минута. Фигура 30 показва свързването най- напред на биотинилиран разтворим taxTCR и след това биотинилираният разтворим мутантен tax-TCR към HTLV tax 11-19 пептид- МНС комплекс (А). Нито дивият тип, нито мутантния tax- TCR показват свързването както към пептид- МНС комплекса от грипен вирус (В/С), така и към контролата от 0X68 моноклонално антитяло (D). поради това, ние заключихме, че и двете - дивият тип и мутантните биотинилирани разтворими TCR ясно се свързват ефективно и специфично към tax-pMHC комплекс и показват много малка разлика в степента на свързването.

Пример 17- Анализ на едновременното TCR- и CD8 корецепторно свързване към имобилизиран МНС пептиден комплекс

CD8 и CD4 са повърхностни гликопротеини се счита, че функционират като ко- рецептори за TCR чрез свързване едновременно на същите МНС молекули като TCR. CD8 е характерен за цитотоксични Т клетки и се свързва към МНС молекули от клас I, докато CD4 се експресира върху Т клетки от хелперната линия и се свързва към МНС молекули от клас II. CD8 е димер, състоящ се или от две идентични а- вериги или а- и β- вериги. Хомодимерната ααCD8 молекула се продуцира както е описано (PCT/GB98/03235; (Gao, Totmo et al. 1997; Gao, Gerth et al. 1998). В този пример, ние описваме едновременното свързване на разтворими TCR и CD8 молекули към имобилизиран HLA-A2-flu комплекс. Както е видно от Фигура 31А, отговорът на свързването е прост адитив. Изваждането на стойностите на TCR отговора (отворени кръгове) от стойностите на комбинирания отговор (затворени кръгови) дават стойности (отворени квадрати) твърде близки до отговора на 120 μΜ CD8 самостоятелно (отворени триъгълници). Фигура 31В показва, че кинетиката на TCRМНС- пептидните взаимодействия неповлияни от едновременното CD8 свързване. Наблюдаваното допълнително свързване показва, че TCR и CD8 свързват МНС поптидния комплекс в отделни вътрешни повърхности. Примерът илюстрира също, че в някои случаи специфичното свързване на една молекула няма да повлияе специфичното свързване на друга молекула, ситуация която е найвероятно различна за други комбинации от молекули.

Пример 18- Експресия, вторично огъване и сайт- специфично биотинилиране на разтворим α/β TCR

а) Конструиране на TCR α и β вериги

Рекомбинантна разтворима форма на хетеродимерната TCR молекула е създадена както е подчертано на Фигура 36. Всяка верига се състои от мембранно- дистални и- проксимални имуноглобулинови области, които са сляти чрез къс гъвкав линкер към двойно спирализиран мотив, който подпомага стабилизирането на хетеродимера.

Фигури 32 до 34 и 38 до 41 показват ДНК кодиращите последователности и съответните амино киселинни последователности за различни TCR алфа и бета вериги от TCR, притежаващи различни специфики. Примерите се концентрират върху TCR, представени от последователностите от фигури 32 до 34, но описаните методи могат да бъдат аналогично представени с помощта на TCR, показани на фигури 38 до 41.

TCR константните области са срязани непосредствено преди цистеиновите остатъци, които in vivo формират вътреверижна дисулфидна връзка. В последствие двете вериги свързват с нековалентни кватернерни контакти. Тъй като Fos-Jun циперните пептидни хетеродимери са също способни да формират вътреверижна дисулфидна връзка непосредствено N- крайно спрямо използвания линкер (O’Shea et al 1989), всички деспирализации на двете вериги една спрямо друга се предполага че са оптимални. Фузионните протеини следва да бъдат свързани по начин, който е конкурентен с всеки от тези отделни компоненти, с оглед избягване разрушаването на всяка структура.

сДНК кодиращи алфа и бета веригите на TCR специфичен за епитопа на грипния матриксен протеин 58- 66 в HLA-A2, се получават от νβ17+ човешки CTL клон (JM22) чрез прикрепване на PCR, както е описано по- рано (Moss et al 1991).

Алфа и бета TCR-циперните структури pJM22a-Jun и ρΰΜ22βFos са отделно конструирани чрез амплифициране на вариабилна константна област от всяка верига, използвайки стандартна PCR технология и сплисинг продукти върху левцин циперни области от еукариотичните транскрибционни фактори Jun и Fos съответно. Тези последователности с дължина от 40 амино киселини е показано, че се хетеродимеризират специфично при вторичното огъване от синтетични пептиди, без необходимостта от ковалентно интраверижно свързване (O’Shea etal. 1989).

Праймерите са конструирани така, че да включват високо АТ съдържимо непосредствено 3’ спрямо старт кодона (за дестабилизиране на тРНК вторичната структура) и с използването на Е. coli кодонови преференции, с оглед максимизиране експресията (Gao et al. 1998). Спаринг цистеина в TCR бета константната област е променена в серин за подсигуряване предотвратяване на некоректно дисулфидно свързване в процеса на вторично огъване.

Слятата ДНК и протеиновите последователности са обозначени на фигури 32 и 33. За осъществяване на сайт- специфично биотинилиране на β веригата от този TCR, ДНК последователност, кодираща така- наречения “биотин- tag” се конструира в 3’ края на гена, експресиращ разтворим νβ17. Използвани са следните PCR праймери за създаване на тази ДНК структура:

5’-GCTCTAGACATATGGGCCCAGTGGATTCTGGAGTCAC-3’ и

5’GGGGGAAGCTTAATGCCATTCGATTTTCTGAGCTTCAAAAATATCGTT CAGACCACCACCGGATCCGTAAGCCAGGATGAACTCTAG-3’

Полученият PCR продукт се разгражда с рестрикционни ензими Ndel и Hindlll (New England Biolabs) и се лигатира с Т4 ДНК лигаза (New England Biolabs) във вектора pGMT7 (Studieret al., 1990). Фигура 3 показва ДНК последователността от инсерта в тази структура и дедуктивната протеинова последователност.

Ь) Експресия на TCR вериги

Експресията и вторичното огъване на TCR със специфичност за матриксния пептид на грипния вирус, представена чрез Н1_А-А*0201 се осъществява както следва:

TCR αβ вериги се експресират поотделно в щам Е. coli BL21DE3pLysS под контрола на вектора pGMT7 в среда TYP (1.6% бакто- триптон, 1.6% дрождев екстракт, 0.5% NaCI, 0.25% К₂НРО₄). Експресията е индуцирана в mid- логаритмична фаза с 0.5 mM IPTG и след 3-5 часа, бактерията се събира чрез центрофугиране. Бактериалните клетки се лизират чрез ресуспендиране в “лизисен буфер” (10 mM EDTA, 2 тМ DTT, 10 тМ Tris pH 8, 150 тМ NaCI, 0.5 mM PMSF, 0.1 mg/ml лизозим, 10 % глицерол), последвано от добавяне на 10 mM MgCI₂ и 20 ug/ml Дназа!, инкубация за 20 минути върху лед и обработка с ултразвук с помощта на соникатор в 10 х импулса от 30 секунди. Протеинът, в инклузионни тела, след това се пречиства с няколко пречиствания (обикновено 3) “Тритон буфер” (0.5% Тритон Х-100, 50 mM Tris pH 8, 100 тМ NaCI, 0.1% натриев азид, 10 тМ EDTA, 2 тМ DTT) с помощта на центрофугиране при 15000 rpm за 20 минути за утаяване на инклузионните тела и “dounce” ф хомогенизатор за ресуспендирането им. Детергента се отстранява от продукта с еднократно промиване от 50 mM Tris pH 8, 100 тМ NaCI, тМ EDTA, 2 тМ DTT и протеина се солюбилизира с “урея буфер” (20 тМ Tris pH 8, 8 М урея, 10% глицерол, 500 тМ NaCI, 10 тМ EDTA, 2 тМ DTT). След разбъркване в продължение на една нощ при 4°С, разтворът се осветлява чрез центрофугиране и солюбилизираният протеин се съхранява при -70°С. Концентрацията на протеина се измерва с пробата на Coomassie (Pierce).

Солюбилизиран с урея протеин в еднакви пропорции понататък се денатурира в “гуанидинов буфер” (6 М гуанидин- HCI, 10 тМ натриев ацетат pH 5.5, 10 mM EDTA, 2 тМ DTT) при 37°С. Този разтвор се добавя към буфера за вторично огъване (5 М урея, 100 mM Tris pH 8, 100 тМ L- аргинин, 5 тМ редуциран глутатион, 0.5 тМ оксидиран глутатион, 0.1 mM PMSF) върху лед, осигуряващ бързо смесване. След >12 часа при 4°С, разтворът се диализира срещу 10 обема вода, след това 10 обема 10 mM Tris pH 8, 100 тМ урея.

Протеазният инхибитор PMSF се добавя във всички етапи за минимизиране загубата на биотинилационен tag върху TCR.

d) Пречистване на TCR

Разреденият разтвор на TCR се филтрува през 0.45 микронен филтър за отстраняване на агрегиралият протеин и след това се натоварва върху колона POROS 10HQ. Вторично огънатият TCR се елуира с градиент на натриев хлорид в 10 mM Tris pH 8 и 1 ml фракции се събират и анализират чрез SDS-PAGE (виж Фигура 36). Фракции, съдържащи TCR се отливат и концентрират до 1 ml с помощта на 30 kDa центрофужен концентратор.

e) Биотинилиране на TCR ml разтвор на TCR се довежда до 7.5 тМ АТФ с помощта на буфериран АТФ, 5 mM MgCI₂, 1 тМ биотин и се добавя коктейл от протеазни инхибитори, който включва PMSF, леупептин и пепстатин. Накрая се добавя ензимът BirA до крайна концентрация от 5 ug/ml и реакцията се отсавя да финишира в продължение на една нощ при стайна температура. TCRTe след това се отделят от свободния биотин чрез гел филтрация (виж Фигура 37). Фракциите, съдържащи биотинилиран TCR се отливат и се добавя протеазният инхибиторен коктейл. Определя се също и протеиновата концентрация. Фигура 35 показва схематична диаграма на разтворимия, биотинилиран TCR.

Литература

Aifantis, I., 0. Azogui, et al. (1998). Immunity 9(5): 649-55.

Altamirano, Μ. M., C. Garcia, et al. (1999). Nature Biotechnology 17:187-

191.

Altamirano, M. M., R. Golbik, et al. (1997). Proc Natl Acad Sci USA 94(8):3576-8.

Amati, B., S. Dalton, et al. (1992). Nature 359(6394): 423-6. Barker, D. F. and A M. Campbell (1981). J Mol Biol 146(4): 469-92.

io Barker, D. F., and Campbell, A. M. (1981). J Mol Biol 146,469-92. Bentley, G. A., G. Boulot, et al. (1995). Science 267(5206): 1984-7 Issn: 0036-8075.

Bjorkman, P. J._f J. L Strominger, et al. (1985). J. Mol. Biol 186(1): 205-10 Issn: 0022-2836

Boice, J. A, G. R. Dieckmann, et al. (1996). Biochemistry 35(46): 14480-5. Boulot, G., G. A Bentley, et al. (1994). J Mol Biol 235(2): 795-7 Issn: 0022-2836.

Brocker, T., A Peter, et al. (1993). Eur J Immunol 23(7): 1435-9 Issn: 0014-2980.

Buday, L and J. Downward (1993). Cell 73(3): 611-20.

Calaman, S. D., G. R. Carson, etal. (1993). J Immunol Methods 164(2): 233-44 Issn: 0022-1759.

Chao, Η., Μ. E. Houston, Jr., et al. (1996). Biochemistry 35(37): 12175-85. Chang, H. C., Z. Bao, et al. (1994). Proc Natl Acad Sd U S A 91(24):

11408-12.

Chevray, P. M. and D. Nathans (1992). Proc Natl Acad Sd U S A 89(13): 5789-93.

Chicz, R. M., R. G. Urban, et al. (1993). J Exp Med 178(1): 27-47. Corn M., A E. Slanetz, et al. (1994). Science 265(5174): 946-9;

Davis, Μ. M., J. J. Boniface, et al. (1998). Annu. Rev. Immunol. 16:523544.

de Kruif, J. and T. Logtenberg (1996). J Biol Chem 271(13): 7630-4.

Ding, Y. H., K. J. Smith, et al. (1998). Immunity 8(4): 403-11.

Eilat, D., G. E. Kikuchi, et al. (1992). Proc Natl Acad Sci U S A 89(15):' 6871-5 Issn: 0027-8424.

Engelhard, V. H. (1994). Annu Rev Immunol 12:181-207.

Engelhard, V. Η., E. Appella, et al. (1993). Chem Immunol 57: 39-62. Fields, В. A., E. L. Malchiodi, et al. (1996). Nature 384(6605): 188-92 Issn: 0028-0836.

Gao, G. F., U. C. Gerth, et al. (1998). Prot. Sci. 7:1245-49.

Gao, G. F., J. Tornio, et al. (1997). Nature 387(6633): 630-4.

io Garboczi, D. N. and W. E. Biddison (1999). Immunity 10(1): 1-7. Garboczi, D. Ν., P. Ghosh, et al. (1996). Nature 384(6605): 134-41. Garboczi, D. N.. D. T. Hung, et al. (1992). Proc Natl Acad Sci U S A 89(8): 3429-33 Issn: 0027-8424.

Garboczi, D. N.. D. R. Madden, etal. (1994). J Mol Biol 239(4): 581-7 Issn: 15 0022-2836.

Garboczi, D. N.. U. Utz, et al. (1996). J Immunol 157(12): 5403-10. Garcia, K. C., M. Degano, et al. (1996). Science 274(5285): 209-19 Issn: 0036-8075.

Garcia, K. C., C. A Scott, et al. (1996). Nature 384(6609): 577-81 Issn:

0028-0836.

Glover, J. N. and S. C. Harrison (1995). Nature 373(6511): 257-61. Golden, A., S. S. Khandekar, et al. (1997). J Immunol Methods 206(1-2): 163-9.

Greenfield, N. J., G. T. Montelione, et al. (1998). Biochemistry 37(21):

7834-43.

Gregoire, C., B. Malissen, etal. (1996). Eur J Immunol 26(10): 2410-6 Issn: 0014-2980.

Gregoire, C., N. Rebai, et al. (1991). Proc Natl Acad Sci U S A 88(18): 8077*81 Issn: 0027-8424. t

Hilyard et al (1994) Proc. Natl.. Acad. Sci. 91:9057-9061.

Howard, Ρ. K., J. Shaw, et al. (1985). Gene 35(3): 321-31.

Hu, J. C., Ν. E. Newell, et al. (1993). Protein Sci 2(7): 1072-84.

Huczko, E. L., W. M. Bodnar, et al. (1993). J Immunol 151(5): 2572-87. Hunt, D. F., H. Michel, et al. (1992). Science 256(5065): 1817-20 Issn: 0036-8075.

Ishii, Y., T. Nakano, et al. (1995). J Immunol Methods 186(1): 27-36 Issn: 5 0022-1759.

Kouzarides, T. and E. Ziff (1989). Nature 340(6234): 568-71.

Landschulz, W. Η., P. F. Johnson, et al. (1988). Science 240(4860): 175964.

Lowenstein, E. J., R. J. Daly, et ai. (1992). Cell 70(3): 431-42.

io Lumb, K. J. and P. S. Kim (1995). Biochemistry 34(27): 8642-8.

Madden, D. R., D. N. Garboczi, et al. (1993).[published erratum appears in Cell 1994 Jan 28;76(2).iollowing 410]. Cell 75(4): 693-708 Issn: 00928674.

Matsui, K., J. J. Boniface, et al. (1994). Proc Natl Acad Sci USA 91(26):

12862-6 issn: 0027-8424.

McKnight, S. L. (1991). Sci Am 264(4): 54-64.

Moss et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8987-8990 Issn: 00278424.

Nautiyal, S., D. N. Woolfson, et al. (1995). Biochemistry 34(37): 11645-51.

Necker, A., N. Rebai, et al. (1991). EurJ Immunol 21 (12): 3035-40 Issn: 0014-2980.

O’Callaghan, C. A, M. F. Byford, et al. (1999). Anal Biochem 266(1): 9-15.

O’Shea, Е. K., R. Rutkowski, et al. (1992). Cell 68(4): 699-708.

O’Shea, Е. K., R. Rutkowski, et al. (1989). Science 245(4918): 646-8.

O’Shea, E.K., Lumb, K.J. and Kim, P.S. (1993) Curr. Biol. 3:658-667. Plaksin, D., K. Polakova, et al. (1997). J Immunol 158(5): 2218-27. Rabinowitz, J. D., C. Beeson, et al. (1996). Proc Natl Acad Sci U S A 93(4): 1401-5 Issn: 0027-8424.

Ramiro^A. R., C. Trigueros, et al. (1996). J Exp.Med 184(2): 519-30 Issn: 30 0022-1007.

Reid, S. W., S. McAdam, et al. (1996). J Exp Med 184(6): 2279-86.

Reid, S. W., K. J. Smith, et al. (1996). FEBS Lett 383(1-2): 119-23.

Riley, L. G., G. B. Ralston, et al. (1996).[published erratum appears in

Protein Eng 1996 Sep;9(9):831J. Protein Eng 9(2): 223-30.

Romagne, F., M. A. Peyrat, et al. (1996). J Immunol Methods 189(1): 2536 Issn: 0022-1759.

Saint Ruf, C., K. Ungewiss, et al. (1994). Science 266(5188): 1208-12 , Issn: 0036-8075.

Schatz, P. J. (1993). Biotechnology N Y 11(10): 1138-43. Schlessinger, J. (1994). Curr Qpin Genet Dev 4(1): 25-30.

Schuermann. M.. J. B. Hunter, et al. (1991). Nucleic Acids Res 19(4): 73946.

Smith, K. J., S. W. Reid, et al. (1996). Immunity 4(3): 215-28 Issn: 10747613.

Smith, K. J., S. W. Reid, et al. (1996). Immunity 4(3): 203-13 Issn: 107415 7613.

Studier, F. W., A. H. Rosenberg, et al. (1990). Methods Enzymol 185:6089 Issn: 0076-6879.

von Boehmer, Η., I. Aifantis, et al. (1998). Immunol Rev 165:111-9. Weber, S., A. Traunecker, et al. (1992). Nature 356(6372): 793-6 Issn:

Willcox, В. E., G. F. Gao, et al. (1999). Immunity 10: 357-65.

Wilson, A. and H. R. MacDonald (1995). Int Immunol 7(10): 1659-64 Issn: 0953-8178.

Wurch, A., J. Biro, et al. (1998). J Exp Med 188(9): 1669-78. 25 Wyer, J. R., В. E. Willcox, et al. (1999). Immunity 10:219-225.

Zhang, Z., A. Murphy, et al. (1999). Curr Biol 9(8): 417-20.

Claims

1. Вторично огънат Т клетъчен рецептор (TCR), който включва:

i) рекомбинантна TCR а или γ верижна екстрацелуларна област, притежаваща първи с- краен димеризационен пептид; и ii) рекомбинантна TCR β или δ верижна екстрацелуларна област, притежаваща втори с- краен

димеризационен пептид, който е специфично хетеродимеризиран с първият димеризационен пептид за формиране на хетеродимеризационна област, където дисулфидната връзка, разположена в нативните TCR между а и β или γ и δ веригите съседни на цитоплазматичната област отсъства.

2. Биологично- активен рекомбинантен Т клетъчен рецептор (TCR), който включва:

i) рекомбинантна TCR а или γ верижна екстрацелуларна област, притежаваща първи хетероложен С- краен димеризационен пептид; и ii) рекомбинантен TCR β или δ верижна екстрацелуларна област, притежаваща втори С- краен димеризационен пептид, който е специфично хетеродимеризиран с първия димеризационен пептид за формиране на хетеродимеризационна област, където дисулфидната връзка, намираща се в нативните TCR между а и β или γ и δ вериги, съседни на цитоплазматичната област отсъства.

3. Рекомбинантен TCR съгласно претенция 1 или претенция

I

2, където хетеродимеризационната област е двойно спирализирана област.

4. Рекомбинантен TCR съгласно претенция 3, където димеризационните пептиди са c-jun и с- fos димеризационни пептиди.

5. Рекомбинантен TCR съгласно която и да е от претенции 1 до 4, включващ гъвкав линкер, локализиран между TCR веригите и хетеродимеризационните пептиди.

6. Рекомбинантен TCR съгласно която и да е от претенции 1 до 5, експресиран в експресионна система на Е. coli.

7. Рекомбинантен TCR съгласно която и да е от претенции 1 до 6, който е биотинилиран в С- края.

8. Рекомбинантен TCR съгласно която и да е от претенции 1 до 7, маркиран с подходящ маркер.

9. Рекомбинантен TCR съгласно която и да е от претенции 1 до 8, присъединен към терапевтично средство като цитотоксично или имуностимулиращо средство.

10. Амино киселинни последователности, кодиращи рекомбинантните TCR съгласно която и да е от претенции 1 до 8.

11. Амино киселинна последователност съгласно претенция 10, в експресионен вектор на Е. coli.

12. Метод за създаване на рекомбинантен не- мембранно свързан Т клетъчен рецептор, който включва експресиране на:

i) рекомбинантна TCR α или γ верижна екстрацелуларнаобласт, притежаваща първи с- краен димеризационен пептид; и ii) рекомбинантна TCR β или δ верижна екстрацелуларна област, притежаваща втори с- краен

димеризационен пептид, който специфично хетеродимеризира първият димеризационен пептид за формиране на хетеродимеризационна област; и вторично огъване на веригите заедно in vitro за продуциране на TCR хетеродимер.

13. Метод съгласно претенция 12, където вторичното огъване се провежда в буфер за вторично огъване, включващ солюбилизиращ агент.

14. Метод съгласно претенция 13, където солюбилизиращият агент е урея в концентрация най- малко 0.1 М.

15. Метод съгласно ретенция 14, където солюбилизиращият агент е урея в концентрация от около 5 М.

16. Метод съгласно която и да е от претенции 12 до 14, ф където веригите са денатурирани в денатуриращ буфер преди вторичното огъване.

17. Метод съгласно претенция 16, където денатуриращият буфер съдържа DTT или гуанидин като редуциращ агент.

18. Метод съгласно която и да е от претенции 12 до 17, където TCR е рекомбинантен TCR съгласно която и да е от претенции 1 до 6.

19. Рекомбинантен TCR, продуциран по метода съгласно която и да е от претенции 12 до 18.

20. Мултимер на TCR съгласно претенция 19.