KR100530309B1 - 가용성 ｔ 세포 수용체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합 가용성 T 세포 수용체에 관한 것이다. T 세포 수용체(TCR)는 리폴딩되며, 제1 이종 C 말단 이량체화 펩티드를 보유한 재조합 TCR α쇄 또는 γ쇄 세포외 도메인; 및 제1 이량체화 펩티드와 특이적으로 헤테로이량체화하여 헤테로이량체 도메인을 형성하여 감겨진 코일 도메인이 될 수 있는 제2 C-말단 이량체화 펩티드를 보유한 재조합 TCR β 또는 δ쇄 세포외 도메인으로 구성된다. 본 발명은 또한 재조합 TCR을 암호화하는 핵산 서열 및 재조합 TCR을 생산하는 방법을 제공한다. TCR에 검출 가능한 표지를 하여 특이적 MHC-펩티드 복합체를 검출할 수 있다. 대안으로, 세포 독성제 또는 면역 자극제와 같은 치료제에 TCR을 결합하여 특이적 MHC-펩티드 복합체가 위치하는 곳에 치료제를 전달할 수 있다.

Description

가용성 Ｔ 세포 수용체{SOLUBLE T CELL RECEPTOR}
본 발명은 비-막 결합형(non-membrane bound) 재조합 T 세포 수용체(TCR)와 이를 생산하는 방법 및 시약에 관한 것이다.
1. 세포 표면에 항원의 제시
MHC 분자는 적응성 면역계의 세포 암(arm)이 세포 표면 상에서 인지하기 위한 펩티드 항원인 짧은 단백질 단편을 제시하는 특수한 단백질 복합체이다.
클래스 I MHC는 가변성 중쇄와 불변성 경쇄로 이루어진 이량체 단백질 복합체인 β2 마이크로글로불린이다. 클래스 I MHC는 세포 내에서 가공되고 MHC 중의 결합용 틈 내에 로딩되어 복합체가 MHC 중쇄에 의해 막에 고정되어 세포 표면으로 수송되는 펩티드를 제시한다. MHC에서 결합될 때 펩티드에 아치형이 도입되는 정도에 따라 펩티드는 통상 그 길이가 8 내지 11개 아미노산이다. MHC 중쇄의 막 말단 α1 및 α2 도메인에 의해 형성되는 결합용 틈은 "밀폐된" 말단을 가져서 결합될 수 있는 펩티드의 길이에 매우 엄격한 제한을 부과한다.
클래스 II MHC 역시 α(중쇄) 및 β(경쇄)로 구성되는 이량체 단백질인데, 이 α쇄 및 β쇄는 모두 가변성 당단백질이고, 경막 도메인에 의해 세포에 고정된다. 클래스 I MHC와 같이, 클래스 II MHC 분자는 12 내지 24개 아미노산으로 이루어진 보다 긴 펩티드가 삽입되는 결합용 틈을 형성한다. 펩티드는 세포내 이입 작용에 의해 세포외 환경으로부터 흡수되어 가공된 다음, 클래스 II 복합체 내로 로딩되고, 이어서 세포 표면으로 수송된다.
각 세포는 최대 6종의 상이한 클래스 I 분자 및 유사한 수의 클래스 II 분자로 펩티드를 제시하는데, 제시된 MHC 복합체의 총수는 세포당 105~106개의 범위에 있다. 클래스 I 분자에 제시된 펩티드의 다양성은 통상 1,000~10,000으로 추정되며, 이 중 90%가 세포당 100~1,000개 사본으로 존재한다(Hunt, Michel 등, 1992; Chicz, Urban 등, 1993; Engelhard, Appella 등, 1993; Huczko, Bodnar 등, 1993). 가장 풍부한 펩티드는 제시된 총 펩티드의 0.4~5%를 구성하는 것으로 생각되는데, 이것은 최대 20,000개의 동일한 복합체가 존재할 수 있음을 의미한다. 그러나, 가장 풍부한 단일 펩티드 복합체의 평균수는 세포당 2,000~4,000개의 범위에 있는 것으로 보이며, 인지 가능한 T 세포 에피토프의 통상의 제시 레벨은 세포당 100~500개의 복합체 범위에 있다(상기 Engelhard, 1994의 문헌 참조).
2. 항원 제시 세포의 인지
광범위한 세포가 MHC-펩티드로서 항원을 제시할 수 있고, 이러한 성질을 갖는 세포들은 항원 제시 세포(APC)로 알려져 있다. 특정 항원을 제시하는 세포 유형은 항원이 면역계의 세포를 어떻게 및 어디에서 최초로 접촉하는 지에 따라 좌우된다. APC로는 림프절 및 비장의 T 세포 영역에서 다수가 발견되는 서로 얽힌 수상 세포; 피부 중의 랑겔한스 세포; 림프 조직의 B 세포 영역의 여포 수상 세포; 단핵구, 대식세포 및 단핵구/대식세포 계통의 기타 세포; B 세포 및 T 세포; 및 고전적인 APC가 아니지만, APC의 방식으로 작용할 수 있는 섬유아세포 및 내피 세포와 같은 다양한 기타 세포가 있다.
APC는 자가 펩티드에 반응하는 T 세포가 제거되었는 지를 확인하도록 고안된 선별 과정(음성 선별)을 진행하는 흉선(T 세포)에서 성숙하는 림프구의 서브패밀리에 의해 인지된다. 또한, 제시되는 MHC 변형체를 인지하는 능력을 갖지 못한 T 세포(인간에서는 HLA 하플로타입)는 성숙하지 못한다(양성 선별).
T 세포에 의한 특이 MHC-펩티드 복합체의 인지는 T 세포 수용체(TCR)에 의해 매개되는데, 이 수용체는 α쇄 및 β쇄로 구성되며, 둘다 막에 고정되어 있다. 항체 유전자에 대해 관찰된 것과 유사한 재조합 과정으로, TCR α쇄 및 β쇄 유전자는 가변 요소, 결합 요소, 다양성 요소 및 불변 요소들이 재배열되어 세포외 항원 결합 도메인에 엄청난 다양성(1013~1015의 상이한 가능성)을 산출한다. TCR은 또한 γ쇄 및 δ쇄를 가지는 경우에는 상이한 형태로 존재하나, 이들은 T 세포 중의 약 5%에서만 존재한다.
항체 및 TCR은 특이적 방식으로 항원을 인지하는 단 2개 유형의 분자이며 따라서, TCR은 MHC에 제시된 특정 펩티드 항원에 특이적인 유일한 수용체이고, 외래 펩티드가 종종 세포 내 이상을 알리는 유일한 표시이다.
TCR은 엄청난 다양성으로 발현되는데, 각 TCR은 하나의 또는 몇 개의 MHC-펩티드 복합체에 특이적이다. TCR과 MHC-펩티드 리간드 사이의 접촉은 극히 짧게 이루어지는데, 통상 반감기가 1초 미만이다. T 세포와 표적 세포 사이의 접착은 아마도 TCR/MHC-펩티드를 산출하는 것으로서, TCR/MHC-펩티드간의 다수의 접촉 뿐만 아니라 보조수용체-리간드간의 많은 접촉을 이용하는 것에 좌우된다.
T-세포 및 항원 제시 세포(APC)가 직접 물리적으로 접촉할 때, T 세포 인지가 일어나고, T 세포 인지는 항원 특이적 TCR과 pMHC 복합체의 결찰에 의해 개시된다. TCR은 신호 전달을 매개하는 데 관여하는 CD3 복합체의 불변 단백질과 연합된 면역글로불린 수퍼패밀리의 헤테로이량체 세포 표면 단백질이다. TCR은 αβ 및 γδ형으로 존재하는데, 이들은 구조적으로 유사하나, 서로 구별되는 독특한 해부학적 위치와 기능을 가진다. 수용체의 세포외 부분은 두 개의 막 기부 불변 도메인과 두 개의 막 말단 가변 도메인으로 구성되는데, 막 말단 가변 도메인은 항체의 상보성 결정 영역(CDR)과 유사한 고도로 다형태성인 루프를 보유한다. TCR 분자의 MHC-결합 부위를 형성하고, 펩티드 특이성을 결정하는 것이 이들 루프이다. MHC 클래스 I 및 클래스 II 리간드는 또한 면역글로불린 수퍼패밀리 단백질이나, 고도로 다형태성의 펩티드 결합 부위와 함께 항원 제시를 담당하며, 이 때, 상기 펩티드 결합 부위는 상기 리간드가 APC 세포 표면에서 짧은 펩티드 단편의 다양한 배열을 제시할 수 있게 한다.
최근에, 상기 상호 작용의 예가 구조적으로 특성 분석되었다(Garboczi, Ghosh 등, 1996; Garcia, Degano 등, 1996; Ding, Smith 등, 1998). 쥐와 인간의 클래스 I pMHC-TCR 복합체의 결정학적 구조는 그 pMHC 리간드에 대해 TCR의 대각선 방향을 나타내며, 경계면에서 낮은 형태 상보성을 나타낸다. CDR3 루프는 오로지 펩티드 잔기와 접촉한다. 리간드형 및 비리간드형 TCR 구조를 비교하면, TCR CDR 루프에는 일정 정도의 가요성이 있는 것으로 시사되어 있다(Garboczi and Biddison 1999).
T 세포 활성화 모델은 T 세포와 항원 제시 세포(APC) 사이의 경계에서의 그러한 단백질-단백질 상호 작용이 어떻게 바이러스에 의해 감염된 표적 세포의 사멸과 같은 반응을 개시하는 지를 설명하려고 시도한다. TCR-pMHC 상호 작용의 물리적 성질은 다수의 상기 모델에서 중대한 매개변수로서 포함된다. 예컨대, TCR 해리 속도에서의 양적 변화는 수용체 결합의 생물학적 결과물, 예컨대, 완전 또는 부분 T 세포 활성화 또는 길항 작용에서의 질적 차이로 전환되는 것으로 확인되어 왔다(Matsui, Boniface 등, 1994; Rabinowitz, Beeson 등, 1996; Davis, Boniface 등, 1998).
TCR-pMHC 상호 작용은 낮은 친화성 및 비교적 느린 동력학적 특성을 갖는 것으로 알려져 있다. 다수의 연구에서는 바이오센서 기술, 예컨대, 바이어코어TM (Willcox, Gao 등, 1999; Wyer, Willcox 등, 1999)를 사용하였는데, 이 기술은 표면 플라스몬 공명(SPR)을 이용하고, 단백질-단백질 상호 작용의 직접적인 친화성 및 실시간 동력학적 측정을 가능하게 한다(Garcia, Scott 등, 1996; Davis, Boniface 등, 1998). 그러나, 연구된 수용체는 인공 면역원에 반응하여 생성된 수용체 또는 동종 반응성 TCR이다.
3. MHC-펩티드 복합체와의 TCR 및 CD8 상호 작용
클래스 I MHC-펩티드 복합체에 의해 제한되는 대부분의 T 세포 역시 활성화를 위해 보조수용체 CD8의 결합을 필요로 하는 반면에, 클래스 II MHC에 의해 제한된 T 세포는 CD4의 결합을 필요로 한다. T 세포 활성화에서 보조 수용체의 정확한 기능은 아직 완전히 밝혀지지 않았다. 활성화를 제어하는 중대한 메카니즘이나 매개변수는 없다. 그러나, CD8 및 CD4는 둘다 T 세포 활성화를 특징으로 하는 매우 초기의 티로신 인산화 과정에 관여하는 키나제 p56lck와 연합되는 세포질 도메인을 가진다. CD8은 αα형으로 또는 더 통상적으로는 αβ형으로 표현되는 이량체 수용체이다. CD4는 단량체이다. CD8 수용체에서는 α쇄만이 p56lck와 연합되어 있다.
가용성 형태의 수용체를 사용하여 MHC에의 TCR 및 CD8의 결합을 제어하는 물리적 매개변수에 관한 최근의 측정에서는 TCR에 의한 결합이 인지 과정을 지배하는 것으로 나타났다. TCR은 보조 수용체보다 MHC에 대해 상당히 더 높은 친화성을 가진다 (Willcox, Gao 등, Wyer, Willcox 등, 1999).
MHC와 수용체의 개개의 상호 작용은 생리학적 온도, 즉 37℃에서 매우 단시간 존재한다. TCR/MHC-펩티드 상호 작용의 반감기에 대한 대략적인 수치는 HLA-A*0201 (HLA-A2)에 의해 제시되는 인플루엔자 바이러스 "매트릭스" 펩티드에 대해 특이적인 인간 TCR로 측정할 때 0.7초이다. 상기 MHC/펩티드 복합체와의 CD8αα 상호 작용의 반감기는 0.01초 미만 또는 18배 이상 더 빠르다.
4. 가용성 MHC-펩티드 복합체의 생성
가용성 MHC-펩티드 복합체는 파파인으로 항원 제시 세포의 표면 분자를 절단함으로써 최초로 얻었다(Bjorkman, Strominger 등, 1985). 이 방법은 결정화용 재료를 제공하였지만, 최근 클래스 I 분자는 대장균(E. coli)에서 중쇄 및 경쇄를 개별적으로 발현시키고, 합성 펩티드의 존재 하의 리폴딩하여 대체되었다(Garboczi, Hung 등, 1992; Madden, Garboczi 등, 1993; Garboczi, Madden 등, 1994; Reid, McAdam 등, 1996; Reid, Smith 등, 1996; Smith, Reid 등, 1996; Smith, Reid 등, 1996; Gao, Tormo 등, 1997; Gao, Gerth 등, 1998). 상기 방법은 보다 적은 비용으로 보다 양호한 수율이 얻어지고, 펩티드 동일성을 매우 정확히 제어할 수 있으며, 최종 생성물이 보다 균질하다는 점에서 종래의 방법에 비해 몇 가지 장점을 가진다. 또한, 변형된 중쇄 또는 경쇄, 예컨대, 단백질 태그에 융합된 것들의 발현을 용이하게 수행할 수 있다.
5. 가용성 TCR
현재, 인간 TCR-pMHC 상호 작용에 대해 발표된 자료는 없으며, 천연(예, 비루스 성) 에피토프에 특이적인 자연적으로 선택된 TCR을 분석한 연구도 없는 실정이다. 이는 SPR에 대해 적합한 단백질, 즉 균질이고, 단량체이며, 정확하게 폴딩되고, 밀리그람의 양으로 입수가능하며, 농도범위에 걸쳐 안정한 단백질을 얻는 것이 어렵다는 것을 반영하는 것 일 수 있다.
특이적 TCR-pMHC 상호 작용을 관찰하는 목적 뿐만 아니라, 감염을 감지하거나, 자가면역 질환의 표지를 감지하거나, T 세포 백신의 효능을 감지하는 진단 도구로서 비-막 결합형(즉, 가용성) 형태의 재조합 TCR을 생산할 수 있다면 유리할 것이다. 또한, 가용성 TCR은 염색, 예를 들면 MHC에서 제시된 특정 비루스성 항원의 존재를 파악하기 위해 세포를 염색하는데 적용할 수 있을 것이다. 유사하게, 특정 항원을 제시하는 세포로 세포독성 화합물 또는 면역자극 화합물과 같은 치료제 를 전달하는데 가용성 TCR을 이용할 수 있다.
하나 이상의 폴리펩티드 서브유닛으로 구성되고, 경막 도메인을 가지는 단백질은, 많은 경우에 단백질이 경막 부위에 의해 안정화되기 때문에 가용성의 형태로 생산하기가 어려울 수 있다. 이것은 TCR의 경우도 마찬가지이다.
가용성 TCR의 제조에 대해서는 최근에 다수의 그룹에 의해 개시되었다. 일반적으로, 모든 방법은 세포외 도메인만 또는 세포외와 세포질 도메인을 보유하는 절두된(truncated) 형태의 TCR을 기재하고 있다. 따라서, 모든 경우에, 경막 도메인은 발현된 단백질로부터 결실되었다. 다수의 보고는 상기 방법에 따라 제조된 TCR이 TCR-특이적 항체에 의해 인지될 수 있음을 나타내고 있지만(항체가 인지하는 재조합 TCR의 일부가 정확히 폴딩되었음을 나타냄), 저농도에서 안정하고 MHC-펩티드 복합체를 인지할 수 있는, 양호한 수율로 가용성 TCR을 제조할 수 있는 방법은 없었다.
결정화 가능한 재료를 산출하는 첫 번째 방법은 진핵 세포에의 발현을 이용하는 것이나, 그 재료 제조 비용은 매우 고가이다(Garcia, Degano 등, 1996; Garcia, Scott 등, 1996). 결정화 가능한 재료를 제조한 또 다른 방법은 MHC-펩티드 복합체에 종래 사용되어 온 것과 유사한 대장균 발현계를 사용하는 것이다 (Garboczi, Ghosh 등, 1996; Garboczi, Utz 등, 1996). 쇄간 이황화 브리지를 형성하는 데 관여하는 시스테인 잔기 바로 앞에서 절두된 TCR쇄의 세포외 부분을 발현하고, 이어서 시험관 내에서 리폴딩시키는 후자의 방법은 일반적으로 적용할 수 없는 것으로 판명되었다. 대부분의 헤테로이량체 TCR은 α쇄와 β쇄 사이의 낮은 친화도로 인해 이런 유형으로 제조될 때 불안정한 것으로 보인다.
또한, 가용성 TCR의 조작된 생산과 관련한 다수의 다른 설명이 존재한다. 이들 중 일부는 TCR의 α쇄 또는 β쇄의 발현 만을 설명하고, 따라서, MHC-펩티드 특이적 결합을 보유하지 않는 단백질을 산출한다(Calaman, Carson 등, 1993; Ishii, Nakano 등, 1995). β쇄 결정은 α쇄 없이 단독으로 또는 초항원(superantigen)에 결합된 채로 얻어졌다(Boulot, Bentley 등, 1994; Bentley, Boulot 등, 1995; Fields, Malchiodi 등, 1996).
기타 보고 문헌에는 헤테로이량체 γ/δ 또는 α/β TCR의 발현 방법이 기술되어 있다(Gregoire, Rebai 등, 1991; Necker, Rebai 등, 1991; Eilat, Kikuchi 등, 1992; Weber, Traunecker 등, 1992; Corr, Slanetz 등, 1994; Ishii, Nakano 등, 1995; Gregoire, Malissen 등, 1996; Romagne, Pyrat 등, 1996). 일부 경우에, TCR은 단쇄 융합 단백질로서 발현되었다(Brocker, Peter 등, 1993; Gregoire, Malissen 등, 1996; Schlueter, Schodin 등, 1996). 또 다른 방법은 Ig 힌지 및 불변 도메인에 융합된 키메라 단백질로서 TCR쇄를 발현시키는 것이었다(Eilat, Kikuchi 등, 1992; Weber, Traunecker 등, 1992). 기타 키메라 TCR 단백질은 서로에 대해 높은 친화도 및 특이성을 가져서 TCR α-β 접촉을 안정화하고 용해도를 증가시키는 감겨진 코일(coiled-coil)을 형성하도록 고안된 서열을 사용하여 발현시켰다. 이러한 시도는 Chang, Bao 등(1994)에 의해 이루어졌는데, 이들은 단백질의 경막 부위를 특이적으로 상호 작용하여 헤테로이량체화 감겨진 코일을 형성하는 두가지 합성 펩티드 서열, 즉 산성 펩티드와 염기성 펩티드로 이루어진 루신 지퍼 단백질로 대체하였다. 그 저자들은 헤테로이량체화 TCR 단백질을 분비시키기 위해 진핵세포 내에서 바큘로바이러스 발현계를 이용하였다. 인공의 루신 지퍼 펩티드는 TCR α 및 β쇄의 헤테로이량체화를 도와주며, 이들은 또한 전술한 융합 지점 바로 위에서 쇄간 이황화 결합에 의해 지퍼 펩티드와 연결된다. 그러나, 이러한 기술이 성공적이라는 것은 입증되지 않았으며 설명한 가용성 TCR이 TCR 리간드를 인식할 수 있는지에 대한 증거도 없다. 유사하게 Golden, Khandekar 등(1997)은 루신 지퍼 융합 단백질로서 헤테로이량체화 T 세포의 생산을 기술하였다. 가용성 TCR은 대장균에서 Chang 등의 문헌에서처럼 α-β 쇄간 이황화 결합을 가진 분비된 헤테로이량체로서 발현되었다. 이 역시도, 이러한 이미 폴딩된 TCR 헤테로이량체가 이것의 리간드와 결합할 수 있다는 증거는 없다.
그러므로, 정확하게 폴딩되어서 천연 리간드를 인식할 수 있는 막 결합형 TCR의 가용성 형태가 필요한 실정이다. 장기간 동안 안정한 가용성 형태의 TCR과 이를 적당한 양 만큼 생산할 수 있는 방법 또한 유용할 것이다. 본 발명은 이러한 요구의 전부 또는 일부를 충족시키는 것을 목표로 한다.
첨부 도면에 대하여 다음을 참조한다.
도 1은 T-세포 수용체-루신 지퍼 융합 단백질의 개략도이다. 각각의 쇄는 두개의 면역글로불린 수퍼패밀리 도메인, 즉 하나의 가변부(V)와 하나의 불변부(C)로 이루어져 있다. 불변부 도메인은 쇄간 시스테인 잔기 바로 인접 n-말단에서 절두되어, C-말단에서 약 40 아미노산의 c-Jun(α) 또는 c-Fos(β)로부터의 루신 지퍼 헤테로이량체화 모티프에 짧은 링커를 통해 융합된다. α-Jun 및 β-Fos 각각은 두개의 쇄간 이황화 결합을 포함하며 비공유 접촉에 의해서만 쌍을 이룬다. 알파쇄는 더 작은 불변부 도메인을 보유하기 때문에 베타쇄보다 더 짧다.
도 2는 헤테로이량체 JM22zip 수용체의 환원/비환원 겔 분석의 사진이다. 정제된 TCR-지퍼의 동일한 시료를 환원 조건(레인 2) 및 비환원 조건(레인 4)하의 15% 아크릴아미드 SDS 겔에 로딩하였다. 마커 단백질은 레인 1 및 3에 표시된다. 분자량은 킬로달톤으로 표시된다. 양 세트의 조건 하에서 비공유적으로 연합된 헤테로이량체는 알파쇄과 베타쇄로 분리된다. 레인 4에서는 각 쇄는 이동성이 크며 단일한 분리대로 조작하는데, 이는 쇄간 이황화 결합의 단일 종이 존재한다는 것을 나타낸다. 이는 정확한 이황화 결합 형성에 적합하다.
도 3은 JM22zip TCR의 HLA-A2 Flu 매트릭스(M58-66) 복합체에 대한 특이적 결합을 도시하는 그래프이다. 단일 펩티드 부근에서 리폴딩되고 β2-마이크로글로불린 상에 비오티닐화된 HLA-A2 복합체는 스트렙타비딘으로 코팅된 3개의 유동 세포, 즉 HLA-A2 POL 대조군의 3770 공명 단위(RU)로 유동 세포(FC) 3, 2종의 상이한 레벨의 HLA-A2 M58-66 FLU(2970 RU로 FC1 및 4960 RU로 FC2)상에 고정시켰다. JM22zip은 43 μM의 농도로 60초 동안 모두 3종의 유동 세포에 대해 연속적으로 가용성 상에 주입하였다. 주입 과정에서, HLA-A2 FLU 코팅된 유동 세포 둘다의 반응에 있어서 상부 배경 증가가 나타나는데, 유동 세포 1 및 2 각각에 대한 JM22zip의 특이적 결합은 약 1000 RU 및 700 RU이다.
도 4는 TCR 유전자의 "앵커(anchor)" 증폭을 위해 사용된 합성 DNA 프라이머의 서열을 도시한다. 클로닝을 위해 사용된 DNA 제한 효소의 인식 부위에는 밑줄이 그어져 있다. A: 폴리-C "앵커 프라이머". B: TCR α쇄 불변부 특이적 프라이머. C: TCR β쇄 불변부 특이적 프라이머.
도 5는 c-jun 및 c-fos의 40개의 아미노산 감겨진 코일("루신 지퍼") 영역을 암호화하는 DNA 단편들을 PCR 증폭하는데 사용되는 합성 DNA 프라이머의 서열을 도시한다. 클로닝을 위해 사용된 DNA 제한 효소의 인식 부위에는 밑줄이 그어져 있다. A: c-jun 5' 프라이머. B: c-jun 3' 프라이머. C: c-fos 5' 프라이머. D: c-fos 3' 프라이머.
도 6은 TCRs에 융합되었을 때(pBJ107 및 pBJ108내 삽입체) c-fos 및 c-jun 단편 각각의 DNA 서열 및 아미노산 서열(한 문자 코드)을 도시한다다. A: TCR α쇄에 융합되었을 때 c-jun 루신 지퍼. B: TCR β쇄에 융합되었을 때 c-fos 루신 지퍼.
도 7은 TCR β쇄에서 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기를 돌연변이 유발시키기 위해 사용된 합성 DNA 프라이머의 서열을 나타낸다. 프라이머는 돌연변이 유발을 위한 "QuickchangeTM" 방법(스트라타젠)에 사용하기 위해 고안되었다. A: 시스테인의 세린으로의 돌연변이, 정방향(센스)프라이머, 아미노산 서열과 돌연변이를 나타냄. B: 시스테인의 세린으로의 돌연변이, 역방향(넌센스)프라이머. C: 시스테인의 알라닌으로의 돌연변이, 정방향(센스)프라이머, 아미노산 서열과 돌연변이를 나타냄. D: 시스테인의 알라닌으로의 돌연변이, 역방향(넌센스)프라이머.
도 8은 TCR-지퍼 융합 단백질의 개략도이다. 4개의 면역글로불린 도메인은 돔 처럼 표시되는데, 시스테인 잔기의 정합쌍 사이에 쇄간 이황화 결합이 도시된다. 숫자는 성숙 T-세포 수용체 쇄의 아미노산 위치를 나타낸다; 재조합 후에 쇄 길이가 약간 변할 수 있기 때문에 쇄의 길이는 서로 다른 TCRs 사이에 약간씩 다를 수 있다. 링커 서열에 도입된 잔기는 한 문자 코드로 표시한다.
도 9는 TCR α쇄 및 β쇄의 PCR 증폭을 위해 사용된 합성 DNA 프라이머의 서열을 나타낸다. DNA 제한 효소의 인식 부위에는 밑줄로 표시하고 각각의 TCR 쇄에 해당하는 아미노산 서열은 정방향 프라이머 서열 위에 표시한다. TCR 유전자 서열과 TCR 유전자에 대응하지 않는 다른 DNA 서열에 관련된 침묵 DNA 돌연변이는 소문자로 표시된다. A: JM22 인플루엔자 매트릭스 바이러스 펩티드-HLA-A0201 제한된 TCR 의 인간 Vα10.2 쇄용 5' PCR 프라이머. B: JM22 인플루엔자 매트릭스 바이러스 펩티드-HLA-A0201 제한된 TCR의 인간 Vβ17 쇄용 5' PCR 프라이머. C: 인플루엔자 핵단백질 펩티드-H2-Db 제한된 TCR의 마우스 Vα4 쇄용 5' PCR 프라이머. D: 인플루엔자 핵단백질 펩티드-H2-Db 제한된 TCR의 마우스 Vβ11 쇄용 5' PCR 프라이머. E: 003 HIV-1 Gag 펩티드-HLA-A0201 제한된 TCR의 인간 Vα23 쇄의 5' PCR 프라이머. F: 003 HIV-1 Gag 펩티드-HLA-A0201 제한된 TCR의 인간 Vβ5.1 쇄의 5' PCR 프라이머. G: HTLV-1 Tax 펩티드-HLA-A0201 제한된 A6 TCR의 인간 Vα2.3 쇄의 5' PCR 프라이머. H: HTLV-1 Tax 펩티드-HLA-A0201 제한된 A6 TCR의 인간 Vβ12.3 쇄의 5' PCR 프라이머. I: HTLV-1 Tax 펩티드-HLA-A0201 제한된 B7 TCR의 인간 Vα17.2 쇄의 5' PCR 프라이머. J: HTLV-1 Tax 펩티드-HLA-A0201 제한된 B7 TCR의 인간 V β12.3 쇄의 5' PCR 프라이머. K: 일반적으로 이용가능한 인간 Cα 쇄의 3' PCR 프라이머. L: 일반적으로 이용가능한 인간 Cβ쇄의 3' PCR 프라이머.
도 10은 c-jun의 "루신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때 JM22 유래의 가용성 HLA-A2/flu 매트릭스 제한된 TCR α쇄의 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. 대장균에서의 유전자 발현을 향상시키기 위해 DNA 서열의 5' 말단에 도입된 돌연변이는 TCR과 c-jun 서열 사이의 링커 서열에서와 같이 소문자로 표시한다.
도 11은 c-fos의 "루신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때 JM22 유래의 가용성 HLA-A2/flu 매트릭스 제한된 TCR β쇄의 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)를 도시한다. TCR과 c-fos 서열 사이의 링커 서열은 소문자로 표시한다.
도 12는 c-jun의 "루신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때 쥐 F5 수용체 유래의 가용성 H2-Db/인플루엔자 바이러스 핵단백질 제한된 TCR α쇄의 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. 대장균에서의 유전자 발현을 향상시키기 위해 DNA 서열의 5' 말단에 도입된 돌연변이는 TCR과 c-jun 서열 사이의 링커 서열에서와 같이 소문자로 표시한다.
도 13은 c-fos의 "루신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때 쥐 F5 수용체 유래의 가용성 H2-Db/인플루엔자 바이러스 핵단백질 제한된 TCR β쇄의 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. TCR과 c-fos 서열 사이의 링커 서열은 소문자로 표시한다.
도 14는 c-jun의 "루신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때 환자 003 유래의 가용성 HLA-A2/HIV-1 Gag 제한된 TCR α쇄 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. 대장균에서의 유전자 발현을 향상시키기 위해 DNA 서열의 5' 말단에 도입된 돌연변이는 TCR과 c-jun 서열 사이의 링커 서열에서와 같이 소문자로 표시한다.
도 15는 c-fos의 "루신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때 환자 003 유래의 가용성 HLA-A2/HIV-1 Gag 제한된 TCR β쇄의 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. TCR과 c-fod 서열 사이의 링커 서열은 소문자로 표시한다.
도 16은 c-jun의 "루신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때 클론 A6(Garboczi, Utz 등, 1996; Garboczi, Ghosh 등, 1996) 유래의 가용성 HTLV-1 Tax/HLA-A2 제한된 TCR α쇄의 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. 대장균에서의 유전자 발현을 향상시키기 위해 DNA 서열의 5' 말단에 도입된 돌연변이는 TCR과 c-jun 서열 사이의 링커 서열에서와 같이 소문자로 표시한다.
도 17은 c-fos의 "루신 지퍼" 도메인과 BirA(Barker 및 Campbell, 1981; Barker 및 Campbell, 1981; Howard, Shaw 등, 1985; Schatz, 1993; O'Callaghan, Byford, 1999) 대체물로서 작용하는 비오티닐화 태그에 융합되었을 때 클론 A6(Garboczi, Utz 등, 1996; Garboczi, Ghosh 등, 1996) 유래의 가용성 HTLV-1 Tax/HLA-A2 제한된 TCR β쇄의 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. TCR과 c-fos 서열 사이의 링커 서열은 소문자로 표시한다. 알라닌 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 돌연변이는 진한 글씨로 밑줄 그어 표시한다.
도 18은 c-jun의 "루신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때 클론 M10B7/D3(Ding 등, 1998) 유래의 가용성 HTLV-1 Tax/HLA-A2 제한된 TCR α쇄의 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. TCR과 c-jun 서열 사이의 링커 서열은 소문자로 표시한다.
도 19는 c-fos의 "루신 지퍼" 도메인과 BirA의 대체물로서 작용하는 비오티닐화 태그에 융합되었을 때 클론 M10B7/D3(Ding 등, 1998) 유래의 가용성 HTLV-1 Tax/HLA-A2 제한된 TCR β쇄의 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. TCR과 c-fos 서열 사이의 링커 서열은 소문자로 표시한다. 시스테인 잔기를 알라닌 잔기로 치환한 DNA 서열의 돌연변이는 진한 글씨로 밑줄 그어 표시한다. 클로닝을 목적으로 하고 Xmal 제한 위치를 제거하기 위해 도입된 두개의 침묵 돌연변이(P-G 코돈)도 소문자로 표시한다.
도 20은 c-fos의 "루신 지퍼" 도메인과 BirA(Barker 및 Campbell, 1981; Barker 및 Campbell, 1981; Howard, Shaw 등, 1985; Schatz, 1993; O'Callaghan, Byford, 1999)의 대체물로 작용하는 비오티닐화 태그에 융합되었을 때 클론 A6(Garboczi, Utz 등, 1996; Garboczi, Ghosh 등, 1996) 유래의 돌연변이된 가용성 HTLV-1 Tax/HLA-A2 제한된 TCR β쇄의 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. TCR과 c-fos 서열 사이의 링커 서열은 소문자로 표시한다. 알라닌 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 DNA 서열의 돌연변이는 진한 글씨로 밑줄 그어 표시한다. 또한, 가용성 TCR상에서 검출가능한 기능적인 효과를 보유하지 않는 불변부내 돌연변이인 아스파르트산을 아스파라긴 잔기로 치환한 것은 굵은 글씨로 밑줄 그어 표시한다.
도 21은 TCR β쇄를 위해 사용된 c-fos-비오티닐화 융합 파트너의 추정 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부)을 도시한다. DNA 제한 효소 인식 부위는 밑줄 그어 표시하고, 2개의 융합 도메인의 경계가 제시되어 있다. 링커 서열은 소문자로 표시한다.
도 22는 인간 JM22 인플루엔자 매트릭스 펩티드-HLA-A0201의 Vβ-c-fos 루신 지퍼 단편의 PCR 증폭을 위한 합성 DNA 프라이머의 서열을 도시한다.
도 23은 한 세트의 겔 사진이다. a. SDS-PAGE에 의해 분석된 003 HIV gag 펩티드-HLA-A2 복합체에 특이적인 TCR을 위한 변성된 단백질의 제조. 레인 1: 광범위한 분자량 마커(바이오라드), 레인 2 및 3: 0.5 mM IPTG로 단백질 발현을 유도시킨 후의 박테리아, 레인 4 및 5: 6M 구아니딘 완충액에 용해된 정제된 봉입체. b. SDS-PAGE에 의해 분석된 인플루엔자 매트릭스 펩티드-HLA-A2 복합체에 특이적인 비오틴 태그된 TCR을 위한 변성된 단백질의 제조. 레인 1: 광범위한 분자량 마커(바이오라드), 레인 2 및 3: 6M 구아니딘 완충액에 용해된 α쇄 및 β쇄 정제된 봉입체. c. SDS-PAGE에 의해 분석된 HTLV tax 펩티드-HLA-A2 복합체에 특이적인 비오틴이 태그된 TCR을 위한 변성된 단백질의 제조. 레인 1 및 5: 광범위한 분자량 마커(바이오라드), 레인 2, 3 및 4: 0.5 mM IPTG로 단백질 발현을 유도시킨 후의 박테리아의 α쇄, β쇄 및 돌연변이 β쇄 발현, 레인 6, 7 및 8: 6M 구아니딘 완충액에 용해된 α쇄, β쇄 및 돌연변이 β쇄 정제된 봉입체.
도 24는 POROS 10HQ 음이온 교환 컬럼으로부터 JM22z 헤테로이량체의 용출을 나타내는 크로마토그램이다. 점선은 염화나트륨 농도를 표시하는 전도성을 나타내고, 실선은 용출물의 단백질 농도를 나타내는 280 nm에서의 광학 밀도를 도시한다. 분획을 포함하는 피크 단백질은 추가의 분석을 위해서 모았다. 삽입 그래프는 슈퍼덱스 200 HR 컬럼으로부터의 정제된 JM22z 용출물의 크로마토그램을 나타낸다. 화살표는 분자량이 알려진 단백질을 가진 컬럼의 눈금을 나타낸다. 이러한 단백질들을 비교하면 리폴딩된 JM22z 단백질의 분자량은 헤테로이량체 단백질에 적합한 약 74 kDA이다.
도 25는 정제된 JM22z 단백질의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(코마시-염색)을 보여주는 사진이다. 레인 1 및 3: 공지된 분자량의 표준 단백질(표시된 바와 같음), 레인 2: 시료를 로딩하기 전에 환원제(DTT)를 포함하는 SDS-시료 완충액으로 처리한 JM22z 단백질, 레인 4: 환원제의 부재하에 SDS-시료 완충액으로 처리한 JM22z 단백질.
도 26. a. 인플루엔자 매트릭스 펩티드-HLA-A2 복합체에 대해 특이적인 비오틴이 태그된 리폴딩된 TCR의 정제. i. POROS 10HQ 컬럼으로부터의 단백질의 용출의 크로마토그램. 라인 x는 280 nm에서의 흡광도를 나타내고, 라인 y는 전도성(단백질을 용출시키기 위해 사용된 염화나트륨 농도 기울기의 척도)을 나타낸다. 분획 번호는 세로선에 표시된다. ii. i에서와 같이 컬럼으로부터 용출된 분획의 SDS-PAGE. 레인 1은 광범위의 분자량 마커(바이오라드)를 포함한다. 레인 2 내지 13은 분획물 6 내지 15를 각각 5 ㎕ 포함한다. iii. 비오틴이 태그된 flu-TCR을 포함하는 i로부터 모은 분획들의 SDS-PAGE 분석. 레인 1: 광범위한 분자량 마커(바이오라드). 레인 2: 비오틴이 태그된 flu-TCR 단백질. b. HTLV-tax 펩티드-HLA-A2 복합체에 특이적인 리폴딩된 비오틴이 태그된 TCR의 정제. i. POROS 10HQ 컬럼으로부터의 단백질 용출의 크로마토그램. 라인 x는 280 nm에서의 흡광도를 나타내고 라인 y는 전도성(단백질을 용출시키기 위해 사용된 염화나트륨 농도 기울기의 척도)을 나타낸다. 분획 번호는 세로선에 표시한다. ii. i에서 처럼 컬럼으로부터 용출된 분획의 SDS-PAGE. 레인 1은 광범위한 분자량 마커(바이오라드)를 포함하고, 레인 2 내지 10은 분획물 3 내지 11을 각각 5 ㎕ 포함한다. iii. i로부터 모은 비오틴이 태그된 tax-TCR의 분획의 SDS-PAGE 분석. 레인 1: 광범위한 분자량 마커(바이오라드), 레인 2: 비오틴이 태그된 tax-TCR 단백질, 레인 3: 비오틴이 태그된 돌연변이 tax-TCR 단백질.
도 27은 PBS로 평형화된 슈퍼덱스 200 HR 컬럼으로부터 BirA 효소로 비오티닐화 시킨 후 비오틴이 태그된 가용성 TCR의 용출을 나타내는 크로마토그램이다. 비오티닐화된 TCR은 약 15 내지 16분에 용출되고, 유리 비오틴은 약 21분에 용출된다. 비오티닐화된 가용성 TCR을 포함하는 분획은 추가의 사용을 위해 모은다.
도 28은 한 세트의 겔 사진이다. 비오티닐화된 TCRs의 비오티닐화 측정. a. 리폴딩된 TCRs과 봉입체 제제의 SDS-PAGE. 레인 1: 광범위의 분자량 마커(바이오라드), 레인 2: 비오티닐화된 flu-TCR, 레인 3: 비오티닐화된 tax-TCR, 레인 4: 비오티닐화된 돌연변이 tax-TCR, 레인 5: HIV gag-TCR,(비오틴이 태그되지 않음), b. 광범위한 마커가 비오틴 표지(바이오라드)된 것을 제외하면 a와 동일한 겔의 웨스턴 블롯. 아비딘-HRP 접합체로 염색하여 비오티닐화된 단백질을 제시하고 Opti-4CN(바이오라드)으로 가시화하였다.
도 29는 상이한 HLA-A2-펩티드 복합체에 결합하는 JM22z를 도시한다(삽입 그래프) JM22z와 HLA-A2-flu간의 상호작용의 특이성은 TCR을 HLA-A2-flu의 1900 RU로 코팅한 유동 세포를 통과시켜서 얻은 SPR 반응과 TCR을 HLA-A2-pol의 4200 RU로 코팅된 것과 CD5의 4300 RU로 코팅된 것 두 가지의 유동세포를 거치도록 통과시켜 얻은 SPR 반응을 비교함으로써 입증된다. 상이한 JM22z 농도에서의 배경 반응은 HLA-A2-pol(a)의 1700 RU에서 측정되었다. 배경 수치는 1900 RU의 HLA-A2-flu(b)에서 측정된 특이적인 반응에서 공제하였며, 농도(c)에 대해 플롯하였다. 비선형 곡선 맞춤에 의해 측정된 Kd 값, 13 μM은 동일한 데이타로 Scatchard 플롯을 기초로 계산한 Kd 값인 12 μM과 일치한다.
도 30은 야생형 및 돌연변이 가용성 비오티닐화된 tax TCR의 Biacore 2000TM분석의 결과를 나타내는 그래프이다. 5 ㎕의 2.2 mg/ml 농도의 야생형 tax TCR과 2.4 mg/ml 농도의 돌연변이 tax TCR을 차례로 4 종의 유동 세포상에서 유동시켰으며, 상기 세포의 표면에는 하기의 단백질들이 부착되어 있다: A: tax-pMHC 복합체, B/C: flu-pMHC 복합체, D: OX68 대조 단백질. 야생형과 돌연변이 단백질이 모두 특이적 pMHC 복합체에 유사하게 결합한다.
도 31은 동일한 HLA-A2-flu 복합체에 결합하는 가용성 TCR 대한 가용성 CD8aa의 결합 효과를 나타낸다. (A) TCR 또는 TCR + 120 μM 가용성 CD8을 4100 RU의 부적절한 단백질(CD5)로 코팅된 대조 유동 세포와 4700 RU의 HLA-A2-flu로 코팅된 프로브 유동 세포로 주입하였다. 배경을 제한 후에, TCR 단독(○) 또는 120 μM의 가용성 CD8과의 조합물(●)의 다양한 농도에서 계산한 평형 반응값을 나타낸다. 또한 CD8 단독(△)의 수치와 TCR + CD8과 TCR 단독(□)사이의 계산상의 차이를 나타낸다. (B) 25℃, 5 ㎕/분의 유속에서 49 μM TCR 단독(○) 또는 120 μM의 CD8과의 혼합물(●)의 4700 RU의 고정된 HLA-A2-flu에 대한 반응의 시간적인 의존도를 나타낸다.(그 값은 4100 RU의 고정된 CD5로 측정한 배경 값에 대해 보정한다); TCR의 해리 속도(off-rate)는 동시에 일어나는 CD8 결합에 의해 영향을 받지 않는다.
도 32는 c-jun의 "루신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때, JM22 유래의 가용성 HLA-A2/flu 매트릭스 제한된 TCR 알파쇄의 단백질 서열(한 문자 코드, 상부) 및 DNA 서열(하부)을 도시한다. 대장균에서의 유전자의 발현을 향상시키기 위해 DNA 서열의 5' 말단에 도입된 돌연변이는 TCR 및 c-jun 서열 사이의 링커 서열과 같이 소문자로 표시한다.
도 33은 c-fos의 "루신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때 JM22 유래의 가용성 HLA-A2/flu 매트릭스 제한된 TCR 베타쇄의 단백질 서열(한 문자 코드, 상부) 및 DNA 서열(하부)을 도시한다. TCR과 c-fos 서열 사이의 링커 서열은 소문자로 표시되어 있다. 시스테인 잔기를 세린 잔기로 치환한 DNA 서열의 돌연변이는 굵은 글씨로 밑줄을 그어 표시한다. 이 돌연변이는 TCR의 폴딩 효율을 증가시킨다.
도 34는 c-fos의 "루신 지퍼" 도메인과 BirA의 기질로 작용하는 비오티닐화 태그(tag)에 융합되었을 때, JM22 유래의 가용성 HLA-A2/flu 매트릭스 제한된 TCR 베타쇄의 단백질 서열(한 문자 코드, 상부) 및 DNA 서열(하부)을 도시한다. TCR과 c-fos 서열 사이의 링커 서열 및 c-fos서열과 비오티닐화 태그 사이의 링커 서열은 소문자로 표시되어 있다. 시스테인 잔기를 세린 잔기로 치환한 DNA 서열의 돌연변이는 굵은 글씨로 밑줄을 그어 표시한다. 이 돌연변이는 TCR의 폴딩 효율을 증가시킨다.
도 35는 TCR-지퍼-비오티닐화 태그 융합 단백질의 개략도이다.
도 36. 염화나트륨의 구배를 이용한 POROS 10HQ 컬럼으로부터 리폴딩된 TCR의 용출. TCR은 약 100 mM NaCl에서 단일 피크로 용출된다. 0.1 이상의 흡광도(280 nm)를 보유한 단백질을 함유하는 분획은 모아서 비오티닐화를 위해 농축시켰다.
도 37. 슈퍼덱스 200HR 10/30 컬럼(파마시아) 상의 겔 여과법에 의한 유리 비오틴으로부터 비오티닐화된 TCR의 분리. TCR-비오틴은 약 15 ml정도에서 용출되며, 분자량은 69 kDa에 해당한다. (표준 단백질 및 이들의 용출 부피: 티로글로불린(669 kDa) 10.14 ml, 아포페리틴(443 kDa) 11.36 ml, 베타-아밀라제(200 kDa) 12.72 ml, BSA 이량체(134 kDa) 13.12 ml, BSA 단량체(67 kDa) 14.93 ml, 난알부민(43 kDa) 15.00 ml, 키모트립시노겐 A(25 kDa) 18.09 ml, RNase A(13.7 kDa) 18.91 ml).
도 38. c-jun의 "루신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때 클론 A6(Garboczi 등, 1996; Garboczi 등, 1996) 유래의 가용성 HTLV-1 Tax/HLA-A2 제한된 TCR 알파쇄의 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부). 대장균에서의 유전자 발현을 향상시키기 위해 DNA 서열의 5' 말단에 도입된 돌연변이는 TCR과 c-jun 서열 사이의 링커 서열과 같이 소문자로 표시된다.
도 39. c-fos의 "루신 지퍼" 도메인과 BirA의 기질로 작용하는 비오티닐화 태그에 융합되었을 때 클론 A6(Garboczi 등, 1996; Garboczi 등, 1996) 유래의 가용성 HTLV-1 Tax/HLA-A2 제한된 TCR 베타쇄의 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부). TCR과 c-fos 서열 사이의 링커 서열은 소문자로 표시된다. 시스테인 잔기를 알라닌 잔기로 치환한 DNA 서열의 돌연변이는 굵은 글씨로 밀줄 그어 표시되어 있다.
도 40. c-jun의 "루신 지퍼" 도메인에 융합되었을 때 클론 M10B7/D3(Ding 등, 1998) 유래의 가용성 HTLV-1 Tax/HLA-A2 제한된 TCR 알파쇄의 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부). TCR과 c-jun 서열 사이의 링커 서열은 소문자로 표시된다.
도 41. c-fos의 "루신 지퍼" 도메인과 BirA의 기질로 작용하는 비오티닐화 태그에 융합되었을 때, 클론 m10B7/D3(Ding 등, 1998) 유래의 가용성 HTLV-1 Tax/HLA-A2 제한된 TCR 베타쇄의 단백질 서열(한 문자 코드, 상부)과 DNA 서열(하부). TCR과 c-fos 서열 사이의 링커 서열은 소문자로 표시된다. 시스테인 잔기를 알라닌 잔기로 치환한 DNA 서열의 돌연변이는 굵은 글씨로 밑줄 그어 표시되어 있다. 클로닝을 목적으로 하고 Xmal 제한 위치를 제거하기 위해 도입된 2 개의 침묵 돌연변이(P-G 코돈)도 소문자로 표시한다.
본 발명은 일 측면에서, 다음으로 구성되는 리폴딩된 재조합 T 세포 수용체(TCR)를 제공한다:
i) 제1의 이종성 C-말단 이량체화 펩티드를 가진 재조합 TCR α쇄 또는 γ쇄 세포외 도메인; 및
ii) 제1 이량체화 펩티드와 특이적으로 헤테로이량체화되어 헤테로이량체화 도메인을 형성하는 제2 C-말단 이량체화 펩티드를 가진 재조합 TCR β쇄 또는 δ쇄 세포외 도메인.
본 발명에 따른 TCR은 헤테로이량체로 분비되기보다는 발현 후 리폴딩되어, 구조적으로 종래에 이용 가능했던 가용성 TCR보다 우위에 있다. 이것은 MHC-펩티드 복합체를 인식할 수 있는 능력에 의해 알 수 있다. 또한, 비교적 저농도에서도 안정하다. 1 mg/ml 이하, 바람직하게는 약 10 ㎍ /ml 농도에서도 안정할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다음으로 구성되는 생물학적으로 활성이 있는 재조합 T 세포 수용체(TCR)를 제공한다:
i) 제1의 이종성 C-말단 이량체화 펩티드를 가진 재조합 TCR α쇄 또는 γ쇄 세포외 도메인; 및
ii) 제1 이량체화 펩티드와 특이적으로 헤테로이량체화되어 헤테로이량체화 도메인을 형성하는 제2 C-말단 이량체화 펩티드를 가진 재조합 TCR β쇄 또는 δ쇄 세포외 도메인. 이러한 TCR은 MHC-펩티드 복합체에 특이적으로 결합하며, 바람직하게는 이것이 유래된 천연 TCR과 유사한 방법으로 결합할 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 전술한 바와 같은 재조합 TCR쇄를 암호화하는 재조합 핵산 서열을 제공한다. 이러한 핵산 서열은 T-세포 클론으로부터 분리될 수 있다. 대안으로, 이들은 합성에 의해 생산될 수 있는데, 예를 들면 TCR쇄를 암호화하는 핵산 서열에 이종의 핵산 서열을 삽입시키든지, 또는 TCR쇄를 암호화하는 핵산 서열에 돌연변이를 유발시키는 방법(삽입, 결실 또는 치환)이 있다. 따라서, 본 발명은 발명의 범위 내에서 천연 TCR의 활성 및/또는 결합 특이성을 가진 합성 펩티드를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다음과 같이 재조합 비-막 결합형 수용체를 생산하는 방법을 제공한다:
제1의 이종성 C-말단 이량체화 펩티드를 가진 재조합 TCR α쇄 또는 γ쇄 세포외 도메인 및 제1 이량체화 펩티드와 특이적으로 헤테로이량체화되어 헤테로이량체화 도메인을 형성하는 제2 C-말단 이량체화 펩티드를 가진 재조합 TCR β쇄 또는 δ쇄 세포외 도메인의 발현 및;
이 쇄들을 시험관 내에서 함께 리폴딩하여 TCR 헤테로이량체를 생산.
본 발명에 따른 재조합 TCR은 클래스 I MHC-펩티드 복합체 및 클래스 II MHC-펩티드 복합체를 인식할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 TCR의 헤테로이량체화 도메인은 소위 "감겨진 코일" 또는 "루신 지퍼"가 바람직하다. 이들 용어는 특이적인 방식으로 서로 상호 작용하여 헤테로이량체를 형성하는 나선형 펩티드 쌍을 설명하는 데 사용된다. 상호 작용은 각 지퍼 펩티드의 한쪽을 따라 상보적인 소수성 잔기가 존재하기 때문에 일어난다. 펩티드의 성질은 헤테로이량체의 형성이 나선체의 호모이량체의 형성보다 훨씬 더 선호된다는 것이다. 루신 지퍼는 합성된 것이거나, 자연 발생적인 것일 수 있다. 합성 루신은 자연 발생적 루신 지퍼보다 결합 친화도를 훨신 크게 만들 수 있는데, 이것이 반드시 장점이 되는 것은 아니다. 실제로, 본 발명에 사용하기에 바람직한 루신 지퍼는 자연 발생적 루신 지퍼 또는 유사한 결합 친화도를 가진 루신 지퍼이다. c-jun 및 c-fos 단백질로부터 유래한 루신 지퍼는 적합한 결합 친화도를 가진 루신 지퍼의 일례이다. 기타 적합한 루신 지퍼로는 myc 및 max 단백질로부터 유래한 것들이 있다(Amati, Dalton 등, 1992). 적합한 성질을 가진 기타 루신 지퍼를 용이하게 설계할 수 있다(O'Shea 등, 1993).
본 발명에 따른 가용성 TCR은 c-jun(α쇄) 및 c-fos(β쇄)에서 유래한 헤테로이량체화 도메인에 상응하는 약 40개 아미노산의 루신 지퍼 융합체를 가지는 것이 바람직하다(O'Shea, Rutkowski 등, 1989, O'Shea, Rutkowski 등, 1992, Glover and Harrison, 1995). 더 긴 루신 지퍼를 사용할 수도 있다. 헤테로이량체화 특이성은 일부 루신 지퍼 도메인의 매우 짧은 단편에서도 보유되는 것으로 보이기 때문에(O'Shea, Rutkowski 등, 1992), 더 짧은 c-jun 및 c-fos 단편을 사용하여 유사한 이점을 얻을 수 있다. 그러한 보다 짧은 단편은 예컨대, 8개의 아미노산을 가질 수 있다. 따라서, 루신 지퍼 도메인은 아미노산 8 내지 60개의 길이를 가질 수 있다.
루신 지퍼 쌍 형성에서의 특이성의 분자적 원리는 널리 특성 분석되어 있고(Landschulz, Johnson 등, 1988; McKnight, 1991), 루신 지퍼는 당업자에 의해 설계 및 조작되어 호모이량체, 헤테로이량체 또는 삼량 복합체를 형성할 수 있다(Lumb and Kim, 1995; Nautiyal, Woolfson 등, 1995; Boice, Dieckmann 등, 1996; Chao, Houston 등, 1996). c-jun 및 c-fos 루신 지퍼보다 더 높은 친화도를 가진 설계된 루신 지퍼 또는 기타 헤테로이량체화 도메인은 일부 시스템에서 가용성 TCR의 발현에 유익할 수 있다. 그러나, 아래에 상세히 언급하는 바와 같이, 가용성 TCR이 시험관내에서 폴딩될 때, 가용화제를 폴딩 완충제에 포함시켜 비생산성 단백질 응집물의 형성을 감소시키는 것이 바람직하다. 이 현상의 한 가지 해석은 루신 지퍼 도메인의 폴딩 역학이 TCR쇄의 경우보다 더 빨라서 비폴딩된 TCR α쇄 및 β쇄의 이량체화를 일으키고, 다시 단백질 응집을 일으킨다는 것이다. 폴딩 과정을 감속하고 가용화제를 포함시켜 응집을 억제함으로써, 단백질은 두 융합 도메인의 폴딩이 완료될 때까지 용액 중에 유지될 수 있다. 그러므로, c-fos 및 c-jun 루신 지퍼보다 더 큰 친화도의 헤테로이량체화 도메인은 가용화제를 보다 고농도로 포함하여 c-iun 및 c-fos에 대한 것과 동등한 가용성 TCR의 수율을 얻을 수 있다.
상이한 생물학적 시스템은 다양한 방법을 사용하여 안정한 동종 단백질 이량체 및 이종 단백질 이량체를 형성하고, 이들 방법은 각각 원칙적으로 이량체화 도메인을 유전적으로 변형된 단백질로 조작하는 선택을 제공한다. 루신 지퍼 (Kouzarides and Ziff, 1989)는 아마도 가장 대중적인 이량체화 모듈이고, 유전적으로 설계된 이량체 단백질의 생성에 널리 사용되어 왔다. 따라서, 효모 사카로마이세스 세레비자의 전사 활성화 단백질인 GCN4의 루신 지퍼를 사용하여 다수의 이종성 단백질의 호모이량체화를 유도하여 왔다(Hu, Newell 등, 1993; Greenfield, Montelione 등, 1998). 바람직한 방법은 Jun/Fos 루신 지퍼쌍과 같이, 헤테로이량체 복합체의 직접적인 형성을 유도하는 지퍼를 사용하는 것이다(de Kruif and Logtenberg, 1996; Riley, Ralston 등, 1996).
본 발명에 따른 재조합 TCR의 헤테로이량체화 도메인은 루신 지퍼에 국한되지 않는다. 따라서, 그것은 이황화 브리지 형성 요소에 의해 제공될 수도 있다. 한편, 그것은 SH3 도메인과 소수성/프롤린 풍부 짝도메인(counterdomain)에 의해 제공될 수 있는데, 이들 도메인은 신호 전달에 관여하는 단백질 중에서 나타나는 단백질-단백질 상호 작용을 담당한다(Schlessinger, 1994). 신호 전달 캐스케이드에 관여하는 단백질 중에서 발견되는 기타 천연 단백질-단백질 상호 작용은 해독후 변형된 아미노산과 그러한 변형된 잔기를 특이적으로 인지하는 단백질 모듈 사이의 연합에 의해 좌우된다. 그러한 해독후 변형된 아미노산 및 단백질 모듈은 본 발명에 따른 재조합 TCR의 헤테로이량체화 도메인을 형성할 수 있다. 이러한 유형의 단백질 쌍의 예는 표피 성장 인자 수용체 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체와 GRB2의 SH2 도메인과 같은 티로신 인산화된 수용체에 의해 제공된다(Lowenstein, Daly 등, 1992; Buday and Downward, 1993). 모든 과학 분야와 마찬가지로, 새로운 이량체화 모듈이 적극 탐색되고 있고(Chevary and Nathans, 1992), 인공 모듈을 완전하게 조작하는 방법이 이제 성공적으로 개발되었다(Zhang, Murphy 등, 1999).
본 발명에 따른 바람직한 재조합 TCR에서는, 천연 α 및 β TCR 쇄 중의 두 개의 시스테인 잔기들 사이에 형성되는 쇄간 이황화 결합, 및 천연 γ 및 δ TCR 쇄 사이에 형성되는 쇄간 이황화 결합이 존재하지 않는다. 이것은 이량체화 도메인을 시스테인 잔기 위의 TCR 수용체 쇄에 이들 잔기가 재조합 단백질로부터 배제되도록 융합시킴으로써 달성될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 하나 이상의 시스테인 잔기가 이황화 결합 형성에 관여하지 않는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 대체된다. 이들 시스테인 잔기는 기능적 TCR의 시험관내 폴딩에 유해할 수 있기 때문에 도입되지 않을 수도 있다.
본 발명에 따른 리폴딩된 재조합 TCR의 α쇄 및 β쇄 또는 γ쇄 및 δ쇄의 리폴딩은 적합한 리폴딩 조건 하에 시험관 내에서 일어난다. 구체적인 양태에서, 정확한 형태를 가진 재조합 TCR은 우레아와 같은 가용화제를 포함하는 리폴딩 완충제 중에서 용해된 TCR 쇄를 리폴딩함으로써 얻어진다. 우레아는 농도가 0.1M 이상 또는 1M 이상 또는 2.5M 이상 또는 약 5M로 존재할 때 유용하다. 사용할 수 있는 또 다른 가용화제는 농도가 0.1M 내지 8M, 바람직하게는 1M 이상 또는 2.5M 이상인 구아니딘이다. 리폴딩 전에, 환원제를 이용하여 시스테인 잔기를 완전히 환원시키는 것이 바람직할 수 있다. DTT 및 구아니딘과 같은 추가의 변성제를 필요에 따라 사용할 수 있다. 상이한 변성제 및 환원제를 리폴딩 단계 전에 사용할 수 있다(예컨대, 우레아, β-머캡토에탄올). 또 다른 산화환원 쌍(redox couple)을 리폴딩 중에 사용할 수 있는데, 예컨대, 시스타민/시스테아민 산화환원 쌍, DTT 또는 β-머캡토에탄올/대기 산소와, 환원형 및 산화형의 시스테인이 있다.
전술한 단량체 TCR은 검출 가능한 표지로 표지할 수 있는데, 이의 예로는 진단 목적에 적합한 표지를 들 수 있다. 따라서, 본 발명은 MHC-펩티드 복합체에 특이적인 본 발명에 따른 TCR에 MHC-펩티드 복합체를 접촉시키고, TCR이 MHC-펩티드 복합체에 결합되는지를 검출하는 것을 포함하는 MHC-펩티드 복합체의 검출 방법을 제공한다. 비오티닐화된 헤테로이량체를 사용하여 형성된 사량체 TCR의 경우에는, 형광성 스트렙타비딘(시판됨)을 사용하여 검출 가능한 표지를 제공할 수 있다. 형광 표지된 사량체는 FACS 분석에 사용하기에, 예컨대, TCR이 특이적인 펩티드를 보유하는 항원 제시 세포의 검출에 적합하다.
가용성 TCR을 검출할 수 있는 또 다른 방식은 TCR-특이적 항체, 특히 모노클론 항체를 사용하는 것이다. βFI 및 αFI와 같은 다수의 시판 항-TCR 항체가 있는데, 이들은 각각 β쇄 및 α쇄의 불변 영역을 인지한다.
TCR은 예를 들면 독성 부분으로 작용할 수 있는 치료제에 선택적으로 또는 부가적으로 결합될 수 있으며, 이 독성 부분은 세포 사멸 또는 인터루킨이나 시토카인과 같은 면역 자극제에 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 표적 세포에 치료제를 전달하는 방법을 제공하며, 이 방법은 TCR이 표적 세포에 결합할 수 있는 조건 하에서 잠재선 있는 표적 세포를 본 발명에 따른 TCR에 접촉시키는 것을 포함하며, 이 때 TCR은 MHC-펩티드 복합체에 특이적이며, 이와 관련된 치료제를 포함한다. 특히, 가용성 TCR은 치료제를 특정 항원을 제시하는 세포가 위치하는 곳에 전달하는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, 종양에 독소를 전달시켜서 종양을 제거할 수 있다. 이것은 다수의 상황에 유용하며, 특히 종양에 유용한데, 이는 모든 종양 세포가 항원을 제공하지는 않으므로, 모든 종양 세포가 면역계에 의해 검출되지는 않기 때문이다. 가용성 TCR의 경우, 화합물은 그 효과를 국부적으로 뿐만 아니라 그것이 결합하는 세포에도 나타내도록 전달할 수 있다. 따라서, 한 가지 특별한 방법은 종양 항원에 특이적인 T 세포 수용체에 결합된 항-종양 분자를 고려하는 것이다.
다수의 독소를 이 용도로 이용할 수 있는데, 예컨대, 방사성 화합물, 효소(예컨대, 퍼포린) 또는 화학 치료제(예. cis-플라틴)가 있다. 독소의 효과가 원하는 위치에서 작용하는 것을 확실히 하기 위해, 독소를 스트렙타비딘에 결합된 리포좀 내부에 넣어 화합물이 천천히 분비되도록 할 수 있다. 이것은 체내에 전달되는 동안의 파괴 효과를 방지할 수 있고, TCR이 적절한 항원 제시 세포에 결합한 후에 독소가 최대 효과를 발휘할 수 있게 해준다.
독성 부분과 같은 또 다른 부분을 가용성 TCR에 표지, 즉 부착하는 대안의 방법은 혼합된 분자 다량체 내에 있는 표지 또는 다른 부분을 포함하는 것이다. 이러한 다량체 분자의 예로는 3개의 TCR 분자와 1개의 퍼옥시다제 분자를 보유하는 사량체가 있다. 이것은 TCR과 효소를 3:1의 몰비로 혼합하여 사량체 복합체를 생성시키고, 정확한 비의 분자를 함유하지 않는 임의의 복합체로부터 목적 다량체를 분리함으로써 얻을 수 있다. 혼합된 분자는 입체적 간섭이 분자의 목적하는 기능을 손상시키거나 상당히 손상시키지 않는다면, 분자들의 어떠한 조합도 포함할 수 있다. 스트렙타비딘 분자 상에 결합 부위를 위치시키는 것이 입체적 간섭을 일으키지 않을 수 있기 때문에 혼합된 사량체에 적합하다.
본 발명에 따른 재조합 TCR 쇄는 TCR 도메인과 이량체화 펩티드 사이에 위치한 가요성 링커를 갖는 것이 바람직하다. 적합한 가요성 링커로는 글리신을 함유하는 표준 펩티드 링커, 예컨대, 글리신 및 세린을 함유하는 링커가 있다. 쇄간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기와 가까운 C-말단 절두체는 α쇄 및 β쇄가 세포의 TCR에서 이들 잔기를 통해 매우 근접하게 존재하기 때문에 유용한 것으로 생각된다. 그러므로, 비교적 짧은 링커 서열만이 TCR 쇄로부터 헤테로이량체화 도메인으로 비변형성 전이를 제공하는 데 필요할 수 있다. 링커 서열 Pro-Gly-Gly 또는 Gly-Gly을 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 링커 서열은 변화시킬 수 있다. 예컨대, 링커는 완전히 생략하거나 또는 단일 잔기로 감소시킬 수 있으며, 이 경우에 바람직한 선택은 단일 글리신 잔기이다. 더 긴 링커 변이형 역시 α-β쇄 안정성의 계속적인 상실과 함께 TCR의 세포외 도메인으로부터 이량체화 펩티드의 분리를 초래하는 프로테아제 공격으로부터 보호될 수 있다면, 가용성 TCR에서 허용될 가능성이 있다.
본 발명에 따른 가용성 재조합 TCR은 반드시 α-β TCR인 것은 아니다. γ-δ, α-δ및 γ-β TCR 분자와 같은 분자들 뿐만 아니라, 발달 초기 단계에서만 발현되는 불변 알파쇄를 보유하는 TCR 분자들(프리-TCR)도 포함된다. γ-δ T 세포 수용체를 발현시키는 세포들과는 반대로, 프리-TCR은 α-β T 세포 수용체를 발현시키는 세포 계통을 지정한다(Aifantis, Azogui 등, 1998; von Boehmer, Aifantis 등, 1998; Wurch, Biro 등, 1998). 프리-TCR은 세포를 α-β T 세포 계통에 맡기는 것으로 보이는 불변 프리-TCR α쇄와 쌍을 형성하면서 TCR β쇄와 함께 발현된다(Saint Ruf, Ungewiss 등, 1994; Wilson and MacDonald, 1995). 그러므로, 프리-TCR은 흉선 발달 중에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다(Ramiro, Trigueros 등, 1996).
적당한 경우에는 본 발명에 따른 재조합 단백질에 대한 표준 변형을 수행할 수 있다. 그 예로는 β쇄의 불변 영역의 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기를 변형시켜 부정확한 쇄내 또는 쇄간 쌍 형성을 방지하는 것을 들 수 있다.
신호 펩티드는 성숙 수용체에서 어떠한 목적도 수행하지 않거나, 또는 그 리간드 결합능에 대해 어떠한 목적도 수행하지 않기 때문에, 생략할 수 있고, 실제로 TCR이 리간드를 인지하는 것을 방지할 수 있다. 대부분의 경우에, 신호 펩티드가 성숙 TCR 쇄로부터 제거되는 절단 부위는 예측되며, 실험에 의해 측정된 것은 아니다. 발현되는 TCR 쇄가 N-말단부에서 적은 수, 예컨대, 최고 약 10개 전후의 아미노산의 길이를 갖도록 조작하는 것은 가용성 TCR의 기능에 중요하지 않다. 본래의 단백질에 존재하지 않는 특정 서열을 부가할 수 있다. 예컨대, TCR 쇄의 정제를 보조할 수 있는 짧은 태그 서열은 이것이 정확한 구조 및 TCR의 항원 결합 부위의 폴딩을 방해하지 않는다면 첨가될 수 있다.
대장균에서의 발현을 위해, 메티오닌 잔기를 예측된 성숙 단백질 서열의 N-말단 출발점 상으로 도입하여 해독을 개시할 수 있다.
TCR 쇄의 가변 도메인의 모든 잔기는 항원 특이성 및 기능에 필수적인 것은 아니다. 따라서, 항원 특이성 및 기능에 영향을 끼치지 않으면서, 상당수의 돌연변이를 이 영역에 도입할 수 있다.
대조적으로, 펩티드 항원 또는 HLA 중쇄 폴리펩티드에 대한 접촉부 형성에 관여하는 특정 잔기, 즉 TCR 쇄의 CDR 영역을 구성하는 잔기는 리간드에 대한 TCR의 친화도를 증가시키는 잔기를 대체할 수 있다. 그러한 치환은 펩티드-MHC 리간드에 대해 대부분의 TCR의 낮은 친화도를 제공하는 것으로서, 가용성 TCR의 특이성 및 기능 잠재력을 향상시키는 데 유용할 수 있다. 본원의 실시예에서는, 가용성 TCR의 펩티드-MHC 리간드에 대한 친화도를 측정한다. 이러한 측정치를 사용하여 TCR에 도입된 돌연변이의 효과를 분석할 수 있고, 따라서, TCR의 활성을 증가시키는 치환을 포함하는 TCR을 확인할 수도 있다.
TCR 쇄의 불변 도메인의 모든 잔기는 항원 특이성 및 기능에 필수적인 것은 아니다. 따라서, 항원 특이성에 영향을 끼치지 않으면서 상당수의 돌연변이를 그 영역에 도입할 수 있다. 하기 실시예 14에서, 본 발명자들은 TCR β쇄의 불변 도메인의 두 개의 아미노산 치환은 TCR이 HLA-펩티드 리간드에 결합하는 능력에 대해 검출 가능한 결과를 가져오지 않았음을 나타냈다.
TCR β쇄는 세포 TCR 또는 천연 TCR에서 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기를 보유한다. 이 잔기의 돌연변이는 가용성 TCR의 시험관내 리폴딩 효율을 증가시킨다. 상기 시스테인 잔기를 세린 또는 알라닌으로 치환하면, 시험관내 리폴딩 효율에 상당한 양성적인 효과를 가진다. 다른 아미노산으로 대체할 경우에, 유사한 양성적인 효과, 즉 훨씬 양호한 효과를 얻을 수 있다.
전술한 바와 같이, 천연 TCR에서 쇄간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기는 리폴딩 문제를 피하기 위해 존재하지 않는 것이 바람직하다. 그러나, 상기 시스테인 잔기의 배열은 TCR에서 자연적인 디자인이고, c-jun 및 c-fos 루신 지퍼 도메인에 대한 상기 배열의 경우 작용하는 것으로 나타났기 때문에(O'Shea 등, 1989), 상기 시스테인 잔기는 TCR이 리폴딩될 수 있다면 포함될 수 있다.
불변 도메인이 펩티드-MHC 리간드와의 접촉에 직접 관여하지 않기 때문에, C-말단 절두점은 기능의 상실 없이 상당히 변화될 수 있다. 예컨대, 전체 불변 도메인을 배제하는 기능적 가용성 TCR을 생성시킬 수도 있어야 한다. 원칙적으로, 폴리펩티드는 더 짧을 수 있기 때문에, 가변 영역만을 포함하거나, 가변 영역과 불변 영역의 보다 짧은 단편만을 포함하는 가용성 TCR을 발현시키고 폴딩시키는 것이 더 간단하다. 그러나, 이 방법은 바람직하지 않다. 그 이유는 헤테로이량체화 도메인을 통한 α-β쇄 쌍 형성이 추가적인 안정성을 제공하여, 두 쇄의 조작된 C-말단이 긴 링커 서열을 필요로 하도록 약간 떨어져 있기 때문에 복잡할 수 있기 때문이다. 쇄간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 위치 바로 앞에 헤테로이량체화 도메인을 융합시키는 경우, 바람직하게도 α쇄와 β쇄가 세포 수용체와 근접하여 유지된다는 장점이 있다. 그러므로, 이 지점에서의 융합은 TCR 구조에 변형을 덜 부과하는 것 같다.
기능적인 가용성 TCR을 본원에서 바람직한 것보다 더 큰 불변 도메인 단편을 사용하여 생성할 수도 있다. 즉, 상기 불변 도메인을 쇄간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 바로 앞에서 절두할 필요가 없다. 예컨대, 경막 도메인을 제외한 전체 불변 도메인이 포함될 수 있다. 이는 세포 TCR의 쇄간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 돌연변이시키는 경우에 유용하다.
헤테로이량체화 도메인을 통해 쇄간 안정성을 보조하는 것 외에도, 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 도입할 수 있다. 한 가지 가능성은 정상적인 이황화 결합이 일어날 수 있도록 시스테인 잔기를 제거하지 않으면서 쇄간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기에 가까운 α쇄 및 β쇄를 절두시키는 것이다. 또 다른 가능성은 α쇄 및 β쇄의 경막 도메인 만을 결실시키는 것이다. α쇄 및 β쇄의 보다 짧은 단편이 발현되면, 두 쇄의 폴딩이 이황화 결합 형성에 적합한 근접 위치로 잔기를 유지해주는 아미노산 위치에 시스테인 잔기를 치환으로 도입할 수 있다.
TCR의 정제는 다수의 상이한 수단으로 수행할 수 있다. 이온 교환의 또 다른 방식을 이용하거나, 단백질 정제의 다른 방식, 예컨대, 겔 여과 크로마토그래피 또는 친화도 크로마토그래피를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 TCR을 생성시키는 방법에서, 폴딩 효율은 또한 특정의 기타 단백질 성분, 예컨대, 샤페론 단백질을 리폴딩 혼합물에 도입시킴으로써 증가시킬 수 있다. 고정화된 미니-샤페론을 가지는 칼럼을 통해 단백질을 통과시키면 증가된 리폴딩이 얻어질 수 있다(Altamirano, Golbik 등, 1997; Altamirano, Garcia 등, 1999).
실시예에 기재한 방법 외에도, TCR을 비오티닐화하는 또 다른 수단이 가능하다. 예컨대, 화학적 비오티닐화 방법을 사용할 수 있다. 비오틴 태그 서열의 특정 아미노산이 필수적이지만, 또 다른 비오티닐화 태그를 사용할 수 있다(Schatz 등, 1993). 비오티닐화에 사용된 혼합물을 변화시킬 수도 있다. 효소는 Mg-ATP 및 낮은 이온 강도를 필요로 하지만, 이들 조건은 둘다 변화시킬 수 있다. 예컨대, 더 높은 이온 강도 및 더 긴 반응 시간을 사용할 수 있다. 아비딘 또는 스트렙타비딘 이외의 분자를 사용하여 TCR의 다량체를 형성할 수 있다. 다가 방식으로 비오틴을 결합시키는 임의의 분자가 적절하다. 한편, 킬레이트화된 니켈 이온에 대한 폴리히스티딘 태그와 같이 완전히 상이한 연결체를 고안할 수도 있다 (Quiagen Product Guide 1999, 3장 "Protein Expression, Purification, Detection and Assay", p.35-37). 태그는 단백질의 C-말단을 향해 위치하여 잠재적 펩티드-MHC 복합체와의 상호 작용에서 입체적 간섭 정도를 최소화한다.
본 발명에 따른 TCR에 적합한 MHC-펩티드 표적의 예로는 HTLV-1 에피토프(예컨대, HLA-A2에 의해 제한된 Tax 펩티드; HTLV-1은 백혈병과 관련됨), HIV 에피토프, EBV 에피토프, CMV 에피토프와 같은 바이러스 에피토프; 흑색종 에티토프 및 기타 암 특이적 에피토프; 및 류마티스 관절염과 같은 자가 면역 질환과 관련된 에피토프를 들 수 있으나, 이에 국한된 것은 아니다.
많은 질병의 치료는 가용성 TCR의 특이성을 통해 약물을 정위시킴으로써 유효하게 향상시킬 수 있다.
해당 약물이 존재하는 바이러스 질병들, 예를 들면 HIV, SIV, EBV, CMV는 감염된 세포 근처에서 방출되는 약물로부터 이익을 얻게 된다. 암의 경우, 종양 또는 전이암 근처에 위치시키면 독소 또는 면역 자극제의 효과를 향상시킨다. 자가면역 질병의 경우, 면역 억제 약물은 서서히 방출되어 장시간 동안 더욱 국부적인 효과를 나타내는 반면에 전체의 면역력에는 최소한의 영향을 미친다. 이식 거부반응 예방에 있어서, 동일한 방식으로 면역 억제 약물의 효과를 최적화할 수 있다. 백신 전달의 경우, 백신 항원을 항원 제시 세포의 부근에 위치시켜 항원의 효능을 향상시킬 수 있다. 이 방법은 또한 영상화 용도로도 이용될 수 있다.
본 발명의 각 측면의 바람직한 특징들은 필요한 변경을 가한 다른 측면들 각각에도 적용된다. 본 발명에서 언급한 선행기술의 문헌은 법이 허용하는 최대한의 범위 내에서 본 명세서에 참고 인용한다.
본 발명을 후술하는 실시예로 추가 설명하지만, 이것이 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.
하기 실시예에서는 아래에 설명하는 일반적인 방법과 재료를 사용하였다.
재료
제한 효소(NdeI, BamHI, HinIII, Bsu36I, XmaI)는 뉴 잉글랜드 바이오랩스에서 입수하였다..
트리스 pH 8.1은 USB에서 입수한 트리스 염기와 트리스-HCl을 동일 부로 섞어 2 M 원액으로 제조하였다.
EDTA(시그마)는 0.5 M 원액을 만들어 5 M NaOH(시그마)를 이용하여 pH를 8.0으로 조정하였다.
산화 및 환원된 형태의 글루타티온은 시그마에서 입수하였다.
시스타민과 시스테아민은 시그마에서 입수하였다.
염화나트륨은 USB로부터 입수하여 4 M 원액을 제조하였다.
플라스미드 정제용 미니프렙 키트는 퀴아젠에서 입수하였다.
PCR 정제 키트는 퀴아젠에서 입수하였다.
DTT는 시그마에서 입수하였다.
구아니딘는 플루카에서 입수하였다.
우레아는 시그마에서 입수하였다.
RPMI 배지는 시그마에서 입수하였다.
PBS는 옥소이드에서 입수가능한 정제로부터 제조하였다.
글리세롤은 BDH에서 입수하였다.
일반적인 방법
박테리아 배지(TYP 배지)는 다음과 같이 제조하였다:
효모 추출물(디프코) 160 g, 트립톤(디프코) 160 g, NaCl(USB) 50 g 및 K2HPO4(BHD) 25 g을 2 L의 증류수에 용해시켰다. 이 용액의 200 ml 분액을 측정하여 10 ×2 L 원뿔형 플라스크에 넣고, 800 ml의 탈염수를 첨가하여 1 L로 채웠다. 플라스크는 알루미늄 호일 4층으로 덮어서 라벨을 붙이고 오트클레이브 처리하였다. 냉각시킨 후, 플라스크는 사용하기 전에 직사광선을 피해서 실온에서 보관하였다.
단백질 농도는 피어스 코마시 결합 분석법과 표준 단백질로서 BSA를 이용하여 측정하였다. 요약하면, 4 ml 플라스틱 큐벳에 있는 2 mg/ml BSA(Pierce) 원액으로부터 1 ml 부피의 물 중 0 내지 25 ㎍의 BSA 표준물을 제조하였다. 미지의 단백질 약 10 ㎍을 동일한 방법으로 1 ml가 되도록 물로 채웠다. 1 ml의 피어스 코마시 시약을 각각의 큐벳에 첨가하여 내용물을 철저히 혼합하였다. 광학 밀도는 벡크만 DU-530 자외선 분광광도계를 이용하여 15분 내로 595 nm에서 측정하였다. BSA 표준물로부터 얻은 결과에 대해 선형 회귀를 수행하고(선형도는 BSA 25 ㎍까지 우수하다) 미지의 단백질 농도는 이러한 결과를 내삽법을 통해 추정하였다.
겔 여과 크로마토그래피는 컴퓨터 제어기가 장착된 파마시아 FPLC 시스템으로 수행하였다. 단백질의 용출은 280 nm의 파장에서 흡광도를 측정하는 UV-M II 시스템을 이용하여 모니터하였다. 작은 양을 분리할 경우에는 슈퍼덱스 200 HR 10/30 컬럼을 이용하였고, 1 ml의 루프를 이용하여 시료를 로딩하였다. 컬럼을 전개시키기 전에 30 ml의 PBS로 평형화시켰으며, 시료는 수집한 1 ml의 분획을 0.5 ml/분의 유속으로 흐르게 하였다. 대규모 분리시 슈퍼덱스 75 또는 200 PG 26/60 컬럼을 10 ml의 슈퍼 루프와 함께 이용하였다. 이 경우에는 5 내지 10 ml의 시료가 모아졌고 컬럼은 4 ml/분의 유속으로 흐르게 하였다. 모든 분리는 실온에서 수행하였다.
이온 교환 크로마토그래피는 바이오카드 스프린트 시스템(퍼킨 엘머)에서 수행하였다. 양이온 교환을 위해서는, 20 HS 또는 50 HS 컬럼을 이용하였다. 음이온 교환을 위해서는 10 HQ, 20 HQ 또는 50 HQ 컬럼을 이용하였다. 컬럼은 6-웨이 혼합기를 부착한 권장되는 완충액을 이용하여 조작하였다. 작은 시료(5 내지 25 ml)는 5 ml의 주입 루프를 이용하여 주입하였다. 더 큰 시료(> 100 ml)는 완충액 라인 중 하나를 이용하여 주입하였다. 컬럼이 작동하는 용출 단계 동안 1 ml의 분획이 모아졌다. 단백질 용출물은 280 nm에서 흡광도를 인라인 방식으로 측정하였다.
SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)은 바이오라드 미니-프로틴 II 겔 세트를 이용하여 수행하였다. 겔을 부은 다음 다음의 절차를 이용하여 사용하였다. 겔 평판 조립체를 제조하여 누출이 없는 지를 확인하였다. 그 다음, 하기 혼합물을 준비하였다: 12% 아크릴아미드/비스아크릴아미드(30% 아크릴아미드/0.8% 비스아크릴아미드 원액(내쇼날 다이아그노스틱스)로부터 제조), 0.375 M 트리스 pH 8.8(동일한 pH의 1.5 M 원액으로부터 제조), 0.1% SDS(10% SDS 원액으로 제조), 0.05% 암모늄 퍼설페이트(동일한 10% 원액으로 제조. 4℃에서 보관) 및 0.1% TEMED(시그마). 혼합물은 즉시 겔 평판 조립체에 부었고, 물-포화된 부탄올을 겔상부에 적층하여 윗면이 평평하게 되도록 하였다. 겔이 굳은 후(최소 10 내지 15분), 스택(stack) 겔을 다음과 같이 혼합하였다. 4% 아크릴아미드(상기 원액으로 제조), 0.125 M 트리스 pH 6.8(동일한 pH의 0.5 M 원액으로 제조), 0.1% SDS, 0.05% 암모늄 퍼설페이트 및 0.2 % TEMED. 분해 겔의 표면으로부터 휴지를 이용해서 부탄올을 흡수 제거하고 스택 겔 혼합물을 분해 겔 위에 부었다. 겔 내로 기포가 들어가지 않도록 주의하면서 겔 소면기를 즉시 삽입하고, 스택 겔은 최소한 5분 이상 두어 경화시켰다.
그 후, 겔을 겔 장치에 넣어 조립하였고, 전개 완충액(3 g/L 트리스-염기, 14.4 g/L 글리신, 1g/L SDS(10배 농축된 원액으로부터 희석함))을 양극과 음극에서 장치에 부었다. 겔 소면기를 제거한 후, 웰은 전개 완충액으로 세척하여 잔여 아크릴아미드 혼합물이 웰 바닥에 침전되지 않게 하였다. 시료는 단백질과 하기 혼합물을 1:1로 섞어서 제조하였다.: 4% SDS, 0.125 M 트리스 pH 6.8, 20% 글리세롤, 10% β-머캅토에탄올, 1% 브로모페놀 블루(시그마). 그 후, 시료를 95℃로 2분 동안 가열한 다음, 냉각시켜서 스택 겔내 웰의 25 ㎕까지 로딩하였다. 일반적으로 약 1 내지 10 ㎍의 단백질을 로딩하는 것이 겔의 염색 및 전개에 적합하다. 로딩 후에 겔은 200V의 일정한 전압으로 약 40분 동안 전개시키거나 또는 브로모페놀 블루 염료가 겔 끝에서 약 5 mm 위로 진행할 때까지 전개하였다.
전기영동이 끝난 후에 겔을 장치로부터 제거하여 아세트산 10%, 메탄올 40%, 물 50% 중 코마시 R-250(시그마) 0.1% 용액에 조심스럽게 적하하였다. 그런 다음, 겔을 30분 이상 동안 부드럽게 교반하고, 아세트산 10%, 메탄올 40%, 물 50%의 용액을 수회 바꾸어서 겔의 배경이 선명해질 때까지 탈염색하였다. 그 후, 겔은 물에서 보관하였고, 광상자, 디지털 카메라 및 열 프린터로 구성된 UVP 겔 문서화 시스템을 이용하여 기록하였다.
실시예 1
재조합 가용성 TCR
헤테로이량체 TCR 분자의 재조합 가용성 형태는 도 1에 요약된 바와 같이 공학적으로 처리하였다. 각 쇄는 헤테로이량체의 안정화를 보조하는 감겨진 코일 모티프에 짧은 가요성 링커를 통해 융합된 막 말단 면역글로불린 도메인 및 막 기부 면역글로불린 도메인으로 구성된다.
TCR 불변 도메인은 생체내에서 쇄간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기 바로 앞에서 절두되어 있다. 결과적으로, 2개의 쇄는 비공유 4차 접촉에 의해서 쌍을 이루고, 이는 도 2b에서 확인할 수 있다. Fos-Jun 지퍼 펩티드 헤테로이량체는 사용된 링커에 대해 바로 N-말단에 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있기 때문에(O'Shea 등, 1989), 서로에 대한 2개 쇄의 정렬은 최적인 것으로 추정하였다. 융합 단백질은 별도의 성분 각각에 대해 적합한 방식으로 연결시켜, 구조를 방해하는 일이 없도록 하여야 한다.
HLA-A2에서 인플루엔자 매트릭스 단백질 58-66 에피토프에 특이적인 TCR의 알파쇄 및 베타쇄를 암호화하는 cDNA는 전술한 바와 같이 고착된 PCR에 의해 Vβ17+ 인간 CTL 클론(JM22)으로부터 얻었다(Moss 등, 1991).
알파 및 베타 TCR 지퍼 작제물인 pJM22α-Jun 및 pJM22β-Fos는 표준 PCR 기법을 사용하여 각 쇄의 가변 도메인 및 불변 도메인을 증폭시키고, 진핵세포 전사 인자인 Jun 및 Fos 각각으로부터 루신 지퍼 도메인상에 생성물을 스플라이싱하여 별도로 작제하였다(도 1 참조). 이들 40개의 아미노산 길이 서열은 합성 펩티드로부터 리폴딩되는 경우 특이적으로 헤테로이량체화되지만, 쇄간 공유 결합은 필요하지 않은 것으로 밝혀졌다(O'Shea 등, 1989).
프라이머는 개시 코돈에 대한 바로 인접한 3'에 AT를 고함량으로 도입하도록 고안하고(mRNA 2차 구조를 탈안정화시킴), 대장균 코돈을 선택하여 발현을 최대화하였다(Gao 등). TCR 베타 불변 도메인에서 여분의 시스테인을 세린으로 돌연변이시켜 리폴딩 과정에서 부정확한 이황화 결합을 방지한다.
DNA 작제물은 대장균 발현 벡터 pGMT7내로 따로 결찰시켰다. 플라스미드 분해 및 DNA 서열 결정으로 작제물이 정확함을 확인하였다.
사용된 절차를 하기에 상세히 설명하였다.
TCR 지퍼쇄의 발현 및 변성된 봉입체의 정제: 각각 JM22α-Jun 및 JM22β-Fos를 함유하는 pGMT7 발현 플라스미드인 GFG020 및 GFG021을 대장균 균주 BL21pLysS내로 별도로 형질전환시키고, 단일 앰피실린 내성 콜로니를 TYP(앰피실린 100 ㎍/㎖) 배지 중 37℃에서 OD600 0.4로 증식시킨 다음 0.5 mM IPTG로 단백질 발현을 유도하였다. 벡크만 J-6B내 4000 rpm에서 30 분 동안 원심분리로 3시간 후-유도 세포를 수거하였다. 세포 펠렛은 50 mM 트리스-HCl, 25%(w/v) 수크로즈, 1 mM NaEDTA, 0.1%(w/v) Na아지드, 10 mM DTT, pH8.0을 함유하는 완충액내에서 재현탁시켰다. 밤새 냉동-해동 단계를 수행한 후, 표준 12 mm 직경 프로브를 사용하여 밀소닉 XL2020 초음파기내에서 초음파 처리로 1분간 파열시키는 과정을 총 약 10분 동안 수행하는 방식으로 재현탁된 세포를 초음파 처리하였다. 봉입체 펠렛은 벡크만 J2-21 원심분리로 13000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 회수하였다. 3종의 세정제 세척을 수행하여 세포 파편 및 막 성분을 제거하였다. 각 회에서 봉입체 펠렛은 트리톤 완충액(50 mM 트리스-HCL, 0.5% 트리톤-X100, 200 mM NaCl, 10 mM NaEDTA, 0.1%(w/v) Na아지드, 2 mM DTT, pH 8.0)내에서 균질화시킨 다음, 벡크만 J2-21내에서 13000 rpm으로 15분 동안 원심분리하여 펠렛화하였다. 세정제 및 염을 완충액(50 mM 트리스-HCl, 1 mM NaEDTA, 0.1%(w/v) Na아지드, 2 mM DTT, pH 8.0)에서 유사한 세척 과정으로 제거하였다. 마지막으로, JM22α-Jun 및 JM22β-Fos 봉입체 펠렛을 3∼4 시간 동안 4℃에서 우레아 용액(50 mM MES, 8M 우레아, 10 mM NaEDTA, 2 mM DTT, pH 6.5)에 별도로 용해시켰다. 불용성 물질은 벡크만 J2-21에서 13000 rpm으로 30분 동안 원심분리하여 펠렛화하고, 상청액은 1 ㎖의 분액으로 나누어 -70℃에서 냉동시켰다. 우레아내에 용해된 봉입체는 브래드포드 염료 결합 분석(바이오라드)으로 정량하였다. 각 쇄에 대하여, 배양물 1 ℓ로부터 정제된 봉입체를 약 100 ㎎의 수율로 얻었다. 각 봉입체(JM22α-Jun, JM22β-Fos)는 약 20 ㎎/㎖의 농도로 우레아 용액에 용해시키고, 겔 분석 결과 이 형태에서 약 90% 순수한 것으로 추정하였다(데이타는 제시하지 않음).
TCR 지퍼 융합 단백질의 동시리폴딩:
표준 리폴딩 완충액(100 mM 트리스 pH 8.5, 1M L-아르기닌, 2mM EDTA, 5 mM 환원된 글루타티온, 0.5 mM 산화된 글루타티온, 0.2 mM PMSF)를 사용하여 초기 리폴딩 실험 결과 일부 단백질 침전물이 생겼으며, 이는 지퍼 도메인의 존재로 인한 것이었다. 이러한 현상이 지퍼 이량체화의 해리 상수 이하의 농도에서 발생하였다는 사실(즉, 대부분의 지퍼 나선형이 단량체인 것으로 추정되는 경우)은 추가의 힘이 잘못 폴딩된 종을 안정화시킨다는 것을 제시하였다. 가장 그럴 듯한 설명은, 완전한 알파 나선형 지퍼 도메인이 먼저 폴딩하고, 그의 일시적인 헤테로이량체화가 더욱 복잡한 면역글로불린 도메인의 부분적으로 폴딩된 중간체의 쇄간 응집을 유도한다는 것이다. 따라서, 리폴딩 완충액은 5M 우레아를 포함하도록 변경하여 부분적으로 폴딩된 면역글로불린 도메인간의 소수성 상호작용을 방지하고, 헤테로이량체화 되기 전에 개개 쇄가 완전히 폴딩되도록 하였다. 이 단계는 침전 발생을 억제하는 데 충분하며, 하기 프로토콜을 사용하여 허용가능한 수율로 정확하게 폴딩된 TCR 지퍼 헤테로이량체를 조립할 수 있다.
TCR 지퍼쇄인 JM22α-Jun 및 JM22β-Fos의 우레아 용해된 원료를 희석 동시 리폴딩으로 재생시켰다. 대략 30 mg(즉, 1 μM)의 각 용해된 봉입체 쇄를 냉동 원료로부터 해동시키고, DTT의 추가 펄스(4 μM/㎖)를 첨가하여 시스테인 잔기를 완전히 환원시켰다. 그 다음 시료를 혼합하고, 혼합물을 구아니딘 용액(6M 구아니딘-염화수소, 10 mM 아세트산나트륨, 10 mM EDTA) 15 ㎖내로 희석하여 완전히 쇄 변성시켰다. 완전히 환원되고 변성된 TCR-지퍼쇄를 함유하는 구아니딘 용액을 리폴딩 완충액(100 mM 트리스, pH 8.5, 400 mM L-아르기닌, 2 mM EDTA, 5 mM 환원된 글루타티온, 0.5 mM 산화된 글루타티온, 5M 우레아, 0.2 mM PMSF) 1ℓ에 주입하였다. 용액을 24시간 동안 방치하였다. 그 다음 리폴딩물을 2회 투석하는데, 처음에는 100 mM 우레아 10 ℓ에 대해 투석하고, 두 번째는 100 mM 우레아, 10 mM 트리스 pH 8.0 10 ℓ에 대해 투석하였다. 리폴딩 및 투석 단계는 6∼8℃에서 수행하였다.
리폴딩된 TCR-지퍼의 정제
TCR 지퍼 JM22zip는 7개의 200 ㎖ 분액내 POROS 10HQ 분석적 음이온 교환 컬럼상에 투석된 리폴딩물을 로딩하고 바이오카드 워크스테이션(퍼셉티브 바이오시스템스) 상에 0∼400 mM NaCl 구배로 결합 단백질을 용출시켜 분해 생성물 및 불순물로부터 분리하였다. 비공유적으로 연합된 헤테로이량체는 대략 100 mM NaCl에서 단일 피크로 용출되었다. 피크 분획물(통상적으로 100∼300 ㎍/㎖의 농도로 헤테로이량체를 포함)을 4℃에서 저장한 다음 모아서 농축시켰다. 헤테로이량체의 수율은 약 15%이다.
리폴딩된 TCR-지퍼 JM22zip의 특성화
음이온 교환으로 정제된 JM22zip 헤테로 이량체는 슈퍼덱스 200 겔 여과 크기별 컬럼(파마시아)으로부터 대략 70 kDa 단백질로서 용출된다. 정확한 친화도 및 역학 측정은 단량체 상호작용의 발생에 좌우되기 때문에, 표면 플라스몬 공명 결합 분석 전에 겔 여과 단계를 포함하는 것이 실질적으로 중요하다. 이러한 방식으로, 더 높은 차수의 응집물은 분석에 사용되는 가용성 단백질 분획으로부터 배제할 수 있다. 특히, 응집물은 인위적으로 느린 결합 및 해리 속도 상수를 검출할 수 있다.
각 쇄의 산화 상태는 도 2의 환원/비환원 겔 분석으로 검사하였다. SDS의 존재하에, 비공유적으로 결합된 헤테로이량체를 알파쇄 및 베타쇄로 해리한다. DTT가 로딩 완충액에 사용되는 경우, 2개의 쇄는 31 kD 마커의 어느 한 측면을 통과한다. 이러한 변성제의 부재하에, 양 쇄는 단일 종으로서 행동하지만, 각각의 이동성은 증가하는데, 이는 각 쇄가 단일의 이황화 결합된 종을 형성한다는 것을 제안한다(Garboczi 등, 1996).
리폴딩된 수용체의 항체 반응성은 바이아코어 2000 머신(바이어코어)상에 표면 플라스몬 공명을 사용하여 시험하였다. TCR 지퍼 JM22z은 표준 아민 커플링 방법을 사용하여 pH5.5에서 덱스트란 매트릭스(CM 칩) 결합 표면에 고정시켰다. 베타쇄(Vβ17)에 특이적인 가변부 항체는 고정된 수용체에 특이적으로 결합하는데, 이는 보정된 형태임을 제시하는 것이다.
안정성:
알파-jun 및 베타-fos 루신 지퍼 융합체로서 발현되는 가용성 TCR은 수 개월 동안 안정하고, 따라서 클래스 I MHC가 제공하는 특이적 항체의 검출에 적절하다.
실시예 2
인간 TCR 바이러스 펩티드 MHC의 역학 및 친화도 연구
펩티드-HMC 복합체에 대한 리폴딩된 TCR-지퍼의 특이적 결합
표면 플라스몬 공명 바이오센서(바이아코어)를 사용하여 TCR-지퍼(JM22zip, HLA-A2 인플루엔자 매트릭스 단백질 M58-66 복합체에 대해 특이적)의 펩티드-MHC 리간드에 대한 결합을 분석하였다(도 3 참조). 본 발명자들은 세미 배향 방식으로 스트렙타비딘 코팅된 결합 표면에 고정할 수 있는 단일 pMHC 복합체(후술)를 생성함으로써 상기 결합을 용이하게 하였으며, 이로서 가용성 T 세포 수용체가 최대 4개의 상이한 pMHC(별도의 유동 세포상에 고정됨)에 동시에 결합하는지를 효과적으로 시험할 수 있게 되었다. HLA 복합체의 수동 주입은 고정된 클래스 I 분자의 정확한 레벨을 쉽게 조작할 수 있다.
이러한 고정된 복합체는 T-세포 수용체(도 3 참조) 및 공동 수용체 CD 8αα를 결합시킬 수 있으며, 이들 양 수용체는 가용성 상으로 주입할 수 있다. TCR-지퍼의 특이적 결합은 낮은 농도(40 ㎍/㎖ 이상)에서도 얻어지는데, 이는 TCR 지퍼가 비교적 안정하다는 것을 의미한다. JM22z의 pMHC 결합 특성은, TCR을 가용성 또는 고정된 상에서 사용한 경우 정량적 및 정성적으로 유사하게 관찰된다. 이는 가용성 종의 부분 활성에 대한 중요한 제어 인자이며, 비오티닐화된 pMHC 복합체가 비오티닐화되지 않은 복합체과 생물학적으로 유사하게 활성이 있음을 제시한다.
화학적으로 비오티닐화된 HLA 복합체의 제조
가용성 재조합 단일 펩티드 클래스 I HLA 복합체의 제조 방법은 이미 기술하였다(Garboczi 등, 1992). 이들을 변형시켜 화학적으로 비오티닐화된 β-2-마이크로글로불린 도메인을 보유하는 HLA 복합체를 생성할 수 있으며, 따라서 스트렙타비딘 코팅된 결합 칩에 고정시키고 표면 플라스몬 결합 연구를 위해 사용할 수 있다.
전술한 바와 거의 유사하게 β-2 마이크로글로불린이 발현되고, 40 mg은 표준 리폴딩 완충액(100 mM 트리스 pH 8.0, 400 mM L-아르기닌, 2 mM EDTA, 5mM 환원된 글루타티돈, 0.5 mM 산화된 글루타티온, 0.1 mM PMSF) 중에서 리폴딩되었다(Garboczi 등, 1992). 필요에 따라 겔 여과 단계를 수행한 후, 단백질을 0.1 M 나트륨 보레이트 pH8.8과 교환하고, 마지막으로 5∼10 ㎎/㎖로 농축하였다. β-2 마이크로글로불린은 브래드포드 분석(바이오라드)을 사용하여 정량하였다. 5 몰 과량의 비오틴 히드록시숙신이미드(시그마)는 DMSO 중 10 ㎎/㎖로 구성된 원료로부터 첨가하였다. 반응을 실온에서 1 시간 동안 정치시키고, 사용된 비오틴 에스테르 250 ㎍ 당 1 M 염화암모늄 20 ㎕로 반응을 종결하였다. 리폴딩된 HLA 복합체는 슈퍼덱스 ×200 겔 여과 크기별 컬럼(파마시아)을 사용하여 유리 비오틴 및 유리 비오티닐화된 베타-2-마이크로글로불린으로부터 분리하였다. 스트렙타비딘은 표준 아민 커플링 방법으로 고정하였다.
결론
따라서, 실시예 1에 개시된 단백질 리폴딩 방법으로 안정하고 정확하게 폴딩된 기능성 재조합 수용체 융합 단백질을 산출하였으며, 이 단백질은 광학 바이오센서를 사용한 생체물리학적 분석에 적합하다. 이는 인간 TCR-pMHC 상호작용의 정밀한 친화도 및 역학 분석을 수행하는데 사용되는 시약을 제공하였다. T 세포 공동 수용체-MHC 및 TCR-pMHC 상호작용의 서로에 대한 영향을 연구하였다. 사용된 재조합 기법은 원칙적으로, 클래스 I 및 클래스 II 제한된 쥐 및 인간 TCR에 이용할 수 있으며, TCR의 범위를 유사하게 분석할 수 있다. 이는 각종 문제, 예컨대 항바이러스 반응내 TCR 친화도의 스팬, 우선적으로 선별되는 수용체의 특성, 수용체 촉발에 필요한 역학 조건을 해결할 수 있다. 또한 이 방법은 결정화 시도 전에 TCR의 리간드 특이성을 입증하는 방법을 제공하며, 기타 세포 표면 수용체의 재조합체 생성과 관련이 있을 수 있다.
실시예 3
가용성 T 세포 수용체의 비오티닐화 및 사량체화
실시예 1에 개시된 바와 같이 제조된 정제된 가용성 TCR 2.5 ㎖(∼0.2 ㎎/㎖)는 PD-10 컬럼(파마시아)을 사용하여 비오티닐화 반응 완충액(10 mM 트리스 pH 8.0, 5 mM NaCl, 7.5 mM MgCl2)내에서 완충액 교환하였다. 센트리콘 농축기(아미콘)를 사용하고 10 kDa 분자량 컷오프로 이 용출물(3.5 ㎖)을 1 ㎖로 농축하였다. 이는 원료로부터 ATP 첨가한 5 mM로 구성하였다(pH 7.0으로 조정된 0.1 g/㎖). 프로테아제 억제제의 칵테일, 류펩틴, 펩스타틴 및 PMSF(0.1 mM)를 첨가한 다음 1 mM 비오틴(0.2 M 원료로부터 첨가됨) 및 5 ㎍/㎖ 효소(0.5 ㎎/㎖ 원료)를 첨가하였다. 그 다음 혼합물을 실온에서 밤새 항온배양하였다. 과량의 비오틴은 10 mM 트리스 pH8.0, 5 mM NaCl(200 부피, 4℃에서 2회 교체)에 대해 투석하여 용액으로부터 제거하였다. 단백질은 니트로셀룰로스 상에 블롯팅한 다음 5% 탈지유 분말로 차단하여 결합된 비오틴의 존재에 대해 시험하고, 스트렙타비딘-HRP 접합체(바이오라드)를 사용하여 검출하였다. 비오티닐화된 가용성 TCR의 사량체화는 엡스트라비딘-RPE 또는 엑스트라비딘-FITC 접합체(시그마)를 사용하였다. 비오틴 가용성 TCR의 농도는 코마시 결합 단백질 분석(피어스)을 사용하여 측정하고, 가용성 TCR에 대한 엑스트라비딘 접합체의 비율이 0.024 ㎎/㎎ TCR임을 계산하여 1:4의 비율에서 비오티닐화된 TCR에 의한 엑스트라비딘의 포화를 달성하였다. 엑스트라비딘 접합체를 얼음상에서 총량의 1/10의 분액으로 첨가하였으며, 분액당 15분 이상 동안 첨가하였다(엑스트라비딘을 포화시킴). 가용성 TCR 사량체를 4℃, 암실에서 보관하였다. 사량체는 수 개월 동안 상당히 안정하다.
실시예 4
기지의 특이성을 보유한 T 세포주 또는 T 세포 클론으로부터 얻은 T 세포 수용체 유전자의 분자 클로닝
세포 유래의 TCR 유전자의 분자 클로닝 방법 및 절차는 모든 α쇄 및 모든 β쇄 각각에 대해 동일하며, 따라서, 본 실시예에서만 그 방법 및 절차를 기재한다.
적절한 수의 T 세포, 통상적으로 1백만∼5백만 세포를 세포 용해 완충액에서 "mRNA 포집 키트"(뵈링거 만하임)로부터 세포 용해시켰다. mRNA는 mRNA의 폴리-A 꼬리에 비오티닐화된 올리고-dT를 하이브리드화하여 키트 반응물로부터 분리하였다. 그 다음 하이브리드화된 복합체는 스트렙타비딘으로 코팅된 PCR 관에 비오틴을 결합시켜 포집하였다. PCR관내 mRAN의 고정화 후에, 개시된 바와 같이("mRNA 포집 키트"의 뵈링거 만하임 사용법) AMV 역전자효소(스트라타젠)를 사용하여 cDNA를 형성하였다.
cDNA는 고정되어 있으면서, 말단 트랜스퍼라제 효소(뵈링거 만하임)를 사용하여 폴리-G 꼬리를 3' 말단에 형성하였다. 고 충실도 열안정성 폴리머라제 pfu(클로닝됨, 스트라타젠)를 비롯한 PCR 반응 혼합물을 첨가하여, PCR 생성물의 착오 위험을 최소화하는데 사용하였다. 각 TCR 불변부에서 어닐링시키는 폴리-C "앵커 프라이머"(도 4A)와 α쇄 또는 β쇄 특이적 프라이머(각각 도 4B 및 도 4C)를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 95℃에서 1 분 변성, 50℃에서 1분 어닐링, 및 72℃에서 5분 연장의 30 사이클의 PCR 반응을 수행하여 TCR 유전자 단편을 증폭시켰다.
PCR 생성물은 PCR 프라이머에 함유된 XhoI 및 XmaI 제한 효소 부위(모든 효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩스에서 입수)를 사용하여 블루스크립트 서열 결정 벡터(p블루스크립트 II KS-, 스트라타젠)내로 결찰시켰다. 대장균 균주 XL-1블루내 결찰 혼합물의 형질감염 후에, 각 쇄에 대한 일부 클론을 DNA 서열 결정을 위해 선별하고, BigDyeTM 종결인자(어플라이드 바이오시스템즈 인코포레이티드)를 사용하여 ABI 377 프리즘 자동 서열 분석기에서 서열 결정하였다.
실시예 5
c-jun 및 c-fos의 40개 아미노산 감겨진 코일("루신 지퍼") 영역을 암호화하는 DNA 단편의 분자 클로닝
c-jun 및 c-fos의 40개 아미노산 감겨진 코일("루신 지퍼") 영역을 암호화하는 DNA 단편은 주형으로서 인간 cDNA를 사용하고 도 5에 도시된 프라이머를 사용하여 PCR 반응으로 생성하였다. PCR 반응을 클로닝된 pfu 폴리머라제(스트라타젠)을 포함하는 반응 완충액에서 95℃ 1분 변성, 58℃에서 1분 프라이머 어닐링, 및 72℃에서 2분간 연장으로 구성된 30 사이클로 수행하였다.
c-jun 및 c-fos 단편은 고유 XhoI 및 XmaI 제한 부위를 사용하여 p블루스크립트 II KS-(스트라타젠)내로 결찰시켜 작제물 pBJ107 및 pBJ108을 각각 얻었다(도 6). c-jun 및 c-fos 단편의 DNA 서열은 BigDyeTM 종결인자(어플라이드 바이오시스템즈 인코포레이티드)를 사용하여 ABI 377 프리즘 자동 서열 분석기에서 수행된 DNA 서열 결정으로 입증하였다.
서열 결정된 c-jun 및 c-fos 단편은 고유 XmaI 및 BamHI 제한 부위를 사용하여 T7 폴리머라제 발현 벡터인 pGMT7의 폴리링커 영역내로 서브클로닝하였다 (Studier, Rosenberg 등, 1990).
실시예 6
안정한 가용성 TCR의 생성을 위한 TCR-루신 지퍼 융합 단백질의 고안
생체내 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 함유하도록 절두시킨 TCR α 및 β쇄의 세포외 단편을 동시 리폴딩시키고자 하는 시도는 한정적으로 성공하였다(데이타는 도시되지 않음, 발현 방법과 리폴딩 조건을 위한 일반적인 방법 및 재료에 대해서 실시예 9 참조). 그러나, TCRα쇄 및 TCRβ쇄를 쇄간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기의 바로 앞, 즉 N-말단면에서 절두시키면, 슈퍼덱스 G-75 컬럼(파마시아) 상의 분석적 크로마토그래피는 리폴딩 반응에서 대략 1∼2% 양으로 사용된 소 분획 단백질이 절두된 α/β헤테로이량체의 경우 추정 분자 크기의 복합체로 리폴딩되었다는 것을 제시한다(방법의 경우 Garboczi, Utz 등, 1996 참조).
부정확한 이황화 결합 형성은 생체내 리폴딩 과정에서 단백질의 비가역적인 폴딩 오류를 유발할 수 있기 때문에, 이것이 발생할 확률은 세포내 TCR에서 쌍을 이루지 않은 TCRβ 불변부에서 시스테인 잔기를 돌연변이시켜 최소화하고자 하였다. 세린 또는 알라닌 잔기를 시스테인 잔기로 치환한다. 이들 돌연변이 단계에서 사용된 합성 DNA 프라이머는 도 7에 도시되어 있다. TCRα 및 돌연변이된 β쇄가 쇄간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기 바로 전에 절두된 이들 양 쇄의 동시 리폴딩은 헤테로 이량체의 수율을 급격히 개선시키며, 이 보정된 분자량의 단백질 분획은 통상적으로 총 단백질의 15∼30%를 구성한다. 그러나, 이들 가용성 TCR을 밤새 보관한 경우, 단백질의 분석 결과 헤테로이량체 TCR에 해당하는 분자량의 분획이 단량체 TCRα쇄 및 β쇄에 해당하는 두 개의 피크로 분할된 것을 확인하였다. 가용성 TCR의 희석시 유사한 관찰 결과를 얻었으며, α/β쇄 안정성은 단백질의 희석 또는 한정된 시간보다 더 긴 시간을 요하는 분석을 하기에는 낮고 불충분하다는 것을 제시한다. 결론적으로, 안정한 TCR을 생성하는 이들 방법은 극도로 제한된 안정성을 보유한 수용체만을 형성하였다.
TCRα/β쇄 안정성을 개선시키고, 리폴딩 과정에서 헤테로이량체 형성을 유효하게 보조하기 위해서, 헤테로이량체를 우선적으로 형성하는 것으로 알려진 c-jun 및 c-fos의 "루신 지퍼" 도메인에 TCR쇄를 융합시켰다(O'Shea, Rutkowski 등, 1989; Schuermann, Hunter 등, 1991; O'Shea, Rutkowski 등, 1992; Glover 및 Harrison 1995). 융합체 TCR에 대한 2종의 고안물을 시험하였다.
그 하나의 고안물에서는, 루신 저퍼를 TCRα쇄 및 β쇄내 쇄간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기 바로 다음, 즉 C-말단에 융합시켰다. c-jun 및 c-fos 루신 지퍼 펩티드는 사용된 링커의 바로 옆 N-말단에서 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있기 때문에(O'Shea, Rutkowski 등,1989), 서로에 대한 그리고 쇄내 이황화 결합에 대한 2개의 쇄의 정렬은 최적인 것으로 추정하였다.
또 다른 하나에서는, 루신 지퍼를 TCR α쇄 및 β쇄내 쇄간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기 바로 앞, 즉 N-말단에 융합시켰다(도 8). 따라서, 제2 고안물에서 시스테인 잔기가 재조합 수용체로부터 생략되어 있다.
이들 고안물의 TCR-지퍼(TCR-z)쇄를 사용한 리폴딩 실험에서, 헤테로 이량체이고 가용성인 수용체의 수율은, 도 8에 도시된 고안물에서와 같이 쇄간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기가 TCRα쇄 및 β쇄로부터 생략된 경우, 더 우수하다.
실시예 7
TCR 루신 지퍼 단백질용 DNA 발현 벡터의 작제
본 실시예는 5개 TCR의 α쇄 및 β쇄용 발현 벡터의 작제를 개시하고 있다. 개시된 방법 및 고안은 임의의 인간 또는 동물 TCR 유전자에 적용가능하다. 여기에 개시된 5개의 TCR은 모두 MHC 클래스 I 에피토프에 의해서 제한되지만, 그 방법은 MHC 클래스 II 제한된 TCR용 발현 벡터의 클로닝 및 작제를 위해서 동일하게 사용할 수 있다. 모든 벡터는 도 9에 도시된 고안물에 따라서 가용성 TCR을 리폴딩시키기 위한 목적으로 단백질을 발현하지만, 단 2개의 TCR은 C-말단에서 비오티닐화할 수 있는 태그 서열과 함께 발현되었다(하기 및 도 17, 18 및 19 참조). 클로닝 방법은 각각 모든 TCR α쇄 및 β쇄에 대한 것과 동일하다.
TCR α쇄 및 β쇄의 리더 또는 시그널 펩티드 서열의 범위는 TCR 앵커 PCR 생성물을 함유하는 플라스미드로부터 얻은 서열 데이타의 분석 결과로 추정하였다(실시예 4 참조). 이를 기초로, 리더 서열 없이 TCR쇄를 발현하기 위한 PCR 단편을 형성하는 5' 프라이머를 고안하였다(도 9). 모든 5' 프라이머는 성숙 TCR 단백질 서열 바로 전에 메티오닌 잔기를 암호화하여 대장균내에서 번역을 가능하게 한다. A 또는 T 염기를 C 또는 G 염기로 치환한 침묵 돌연변이(도 9)를 다수의 유전자의 5' 기부 코돈내로 도입하여 대장균내 발현량을 역으로 억제하는 2차 mRNA 구조 형성 경향을 감소시켰다(PCT/GB98/03235; (Gao, Tormo 등, 1997; Gao, Gerth 등, 1998).
인간 JM22 인플루엔자 매트릭스 펩티드-HLA-A0201(펩티드 서열 GILGFVFTL) 제한된 TCR의 Vα0.2 및 Vβ17쇄, 003 HIV-1 Gag 펩티드-HLA-A0201(펩티드 서열 SLYNTVATL) 제한된 TCR의 인간 Vα23 및 Vβ5.1쇄, 및 F5 NP 펩티드-H2-Db(펩티드 서열 ASNENMDAM)의 쥐 Vα4 및 Vβ11쇄를 암호화하는 유전자는 실시예 6에 개시된 바와 같이 형성된 TCR 앵커 PCR 생성물을 함유하는 플라스미드를 사용하여 PCR로 증폭하였다. HLA-A0201이 제공하는 특이적 HTLV-2 Tax 펩티드(펩티드 서열 LLFGYPVYV)인 인간 A6(Vα2.3/Vβ12.3) TCR 및 B7(Vα17.2/Vβ12.3) TCR에 대한 유전자는 이들 TCR쇄를 위한 발현 벡터의 작제용 PCR 생성물의 형성에 사용되는 플라스미드 형태(Garboczi, Utz 등, 1996; Ding, Smith 등, 1998)로 얻었다. 이들 TCR에 대한 유전자는 c-fos 루신 지퍼-비오티닐화 가능한 태그 융합 단편용 서열을 함유하는 발현 벡터내로 클로닝하였다(실시예 8 참조).
PCR 반응은 표준 완충 조건(스트라타젠)에서 클로닝된 pfu 폴리머라제와, 95℃에서 1분 변성, 60℃에서 1분 프라이머 어닐링 및 72℃에서 6분 연장의 25 사이클을 이용하여 수행하였다. PCR 생성물은 효소 NdeI 및 Xmal로 제한 분해하고, c-jun(TCR α쇄) 및 c-fos(TCR β쇄) 삽입체를 함유하는 pGMT7 벡터내로 결찰시켰다(실시예 5 참조).
도 10 내지 도 19는 TCR-z 삽입체의 서열과 pGMT7 벡터가 발현하는 추정된 단백질 서열을 도시한다. 도 20은 불변부내 돌연변이를 함유하지만 가용성 TCR의 폴딩 및 기능에는 검출가능한 영향을 미치지 않는 A6 TCR β쇄의 서열을 도시한다(실시예 9 및 10 참조).
실시예 8
c-fos 루신 지퍼 비오티닐화 가능한 단편에 융합된 TCR β쇄의 발현용 DNA 벡터 작제
가용성 TCR을 수용체에 고정시키거나 또는 수용체에 검출 또는 부착시키기 위해서, 추가의 기능성 융합 성분을 보유한 단백질이 생성되는 것이 유용하다. 이는 가용성 TCR을 예컨대 다량체로서 생성하는 것과 같이 유도하거나, 또는 고 감도로 검출하거나 또는 수용체/수용체 복합체에 기타 기능을 부속시킬 수 있다.
본 실시예는 대장균 생체내에서 특이적으로 비오티닐화하거나 또는 시험관내 효소 BirA와 특이적으로 비오티닐화할 수 있는 융합 폴리펩티드를 공학적으로 처리한 TCRβ쇄용 발현 벡터의 작제를 입증한다(Barker 및 Campbell 1981; Barker 및 Campbell 1981; Howard, Shaw 등, 1985; Schatz 1993; O'Callaghan, Byford 등, 1999). 실시예 10 및 실시예 11에 제시된 바와 같이, 이들 가용성 TCR 융합체는 발현되어 동일한 방식으로 α쇄와 함께 리폴딩되고, "비오티닐화 태그"(BT-태그)에 융합하지 않는 TCR β쇄에 대해 유사한 수율로 리폴딩된다. 이들 결과는 본원에 개시된 가용성 TCR이 융합 파트너로서 다수의 상이한 폴리펩티드와 함께 발현하기에 적합함을 입증한다.
T 세포 수용체 β-쇄는 다음과 같이 fos 루신 지퍼 서열에 대한 C 말단에 비오틴-태그 서열을 보유한 pGMT7 발현 벡터내로 서브클로닝하였다.
개시-TCRβ쇄-fos 지퍼-비오틴-태그-종지
이 작제물의 말단의 정확한 서열은 다음과 같다(도 21 참조).
링커→｜fos 지퍼→｜BamHI｜←링커→｜←비오틴 태그
2가지 접근 방법을 사용하여 비오틴 태그를 보유한 가용성 TCR을 산출하였다. 인간 JM22 인플루엔자 매트릭스 펩티드-HLA-A0201 제한된 TCR의 경우, 클로닝된 β-쇄-c-fos 루신 지퍼 융합체는 도 22에 도시된 합성 DNA 프라이머를 사용하여 3' 말단에서 변형시켜 pfu 폴리머라제(스트라타젠)와 표준 PCR 반응을 사용하여 HindIII 부위 대신에 BamHI 부위를 도입하였다.
NdeI 부위를 함유하는 본래의 5' 프라이머(도 9 참조)를 정방향 프라이머로 사용하였다. 생성된 PCR 생성물은 비오틴-태그 서열(도 21)을 함유하는 변형된 pGMT7 벡터내로 클로닝하여 전술한 바와 같은 작제물을 형성하였다. 이 플라스미드는 JMB002로서 공지되어 있다.
A6 tax TCR(Vα2.3/Vβ12.3)로서 알려진 HLA-A0201 제한된 HTLA-1 에피토프 LLFGYPVYV에 특이적인 클로닝된 TCR은 도 9에 도시된 정향향 및 역방향 프라이머와 PCR을 사용하여 절두시켰다. 이 TCR β쇄는 c-fos-BT 단편을 함유하는 pGMT7 벡터(JMB002)의 NdeI 및 Xmal 부위내로 클로닝시켰다.
융합 발현 벡터의 작제 후에, DNA 서열 결정을 수행하여 서브클로닝 절차 과정에서 도입되는 오류가 없도록 하였다(모든 서열 결정은 ABI 377 프리즘 서열 결정기와 ABI 빅다이 형광 종결자를 사용하여 옥스포드 유니버시티의 생화학과 DNA 서열 결정 시설에서 수행하였다). 공개된 서열과 비교하여 추가의 조사를 한 경우 tax TCR-β쇄내 2개의 오류가 있는 것으로 판명되었으며, 본 발명자들은 이들 오류가 본래의 플라스미드에서도 존재함을 발견하였다. 이들 2개의 오류는 TCR β쇄내 고유 Bsu361 부위의 3'에 존재하기 때문에, 이를 (보정) JMB002 플라스미드내로 클로닝하는데 사용하였다. tax TCR β-쇄의 양 형태는 발현되어 α쇄와 함께 리폴딩시키고, 바이오코어를 사용하여 비교하였다. 단백질의 양 형태는 유사한 겉보기 친화도로 tax 펩티드-MHC 클래스 I 분자에 특이적으로 결합하였다(실시예 17 참조). 후속 실험에서, 오직 β쇄의 보정 형태만을 사용하였다.
실시예 9
대장균내 TCR 쇄의 발현 및 봉입체의 정제
600 nm에서 광학 밀도(OD)가 0.2∼0.6에 도달할 때 단백질 생성을 유도하기 위해서 0.5 mM IPTG를 사용하여, TYP 배지내 벡터 pGMT7의 제어하에 대장균 균주 BL21DE3pLysS내에서 TCRα쇄 및 β쇄를 별도로 발현하였다. 밤새 유도시켜 벡크만 J-6B 원심분리내 4000 rpm으로 원심분리하여 박테리아를 수거하였다.
그 다음 박테리아 세포 펠렛을 "세포 용해 완충액"(10 mM 트리스 pH 8.1, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 10% 글리세롤)내 재현탁시켰다. 혼합물을 얼음에서 냉각하고, 20 ㎍/㎖ 리소자임, 10 mM MgCl2 및 20 ㎍/㎖ DNaseI를 첨가하고 최소 1시간 동안 얼음위에서 항온처리하였다.
이어서, 12 mM 프로브 초음파기(Milsonix XL2020)을 30초 간격으로 30초씩 5회 파열시키기 위해서 총 전력으로 사용하여 혼합물을 초음파 처리하여 혼합물을 침전시켰다. 이 절차를 수행하는 동안 얼음-물 혼합물을 사용하여 온도를 유지하였다. 그 다음 혼합물은 "트리톤 세척 완충액"(50 mM 트리스 pH 8.1, 0.5% 트리톤 X-100, 100 mM NaCl, 0.1% 나트륨 아지드, 10 mM EDTA, 2 mM DTT) 5 부피로 희석하였다. 최소 1 시간 동안 얼음위에서 항온처리한 다음, 벡크만 GS-6R 원심분리기내에서 3,500 rpm으로 혼합물을 원시분리하고 상청액을 버렸다. 작은 플라스틱 1회용 피펫을 사용하여 "재현탁 완충액"(50 mM 트리스 pH 8.1, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2mM DTT)내 펠렛을 재현탁시켰다. 그 다음 벡크만 J2-21 원심분리기에서 8,000 rpm으로 원심분리하고 상청액을 버렸다. 그 다음 펠렛을 "구아니딘 완충액"(50 mM 트리스 pH8.1, 6.0 구아니딘-HCl, 100 mM NaCl, 10mM EDTA, 10mM DTT)내에서 수동 균질기를 사용하여 재현탁시켰다. 저속 원심분리로 불용성 물질을 제거한 후에, 상청액을 분액화하고 -70℃에서 보관하였다. 박테리아 배양물 1 ℓ당 대략 100 ㎎의 수율을 일반적으로 얻었다.
정제된 봉입체 제제의 SDS-PAGE 분석은 구아니딘 완충액에서 봉입체 제제 2㎕를 SDS-PAGE 시료 완충액으로 희석한 다음 2 분 동안 100℃로 가열하여 수행할 수 있다. 시료를 가온하면서 겔상에 로딩하여 로딩 과정에서 구아니딘/SDS 혼합물이 침전되는 것을 방지하였다. 이러한 방식으로 정제된 봉입체 단백질은 이 방식으로 수행한 SDS-PAGE의 코마시 염색에 의해 순도가 대략 90%인 것으로 판명되었다(도 23 참조).
실시예 10
TCRz 헤테로이량체의 리폴딩 및 정제
동비율의 우레아 용해된 단백질을 "구아니딘 완충액"(6M 구아니딘-HCl, 10 mM 아세트산나트륨 pH 5.5, 10 mM EDTA, 2 mM DTT)을 37℃에서 추가로 변성시켰다. 단백질 혼합물은 급속히 혼합하면서 총 단백질 농도가 60 ㎎/ℓ가 되도록 얼음 냉각된 리폴딩 완충액(100 mM 트리스 pH 8.1, 0.4 M L-아르기닌-HCl, 5.0 M 우레아, 5 mM 환원된 글루타티온, 0.5 mM 산화된 글루타티온)에 주입하였다. 얼음위에서 5시간 이상 동안 항온처리하여 리폴딩시킨 후에, 혼합물을 24 시간 동안 탈염수 10 부피에 대해 투석한 다음 24 시간 동안 10 mM 트리스 pH8.1 10 부피에 대해 투석하였다.
투석된 리폴딩 단백질을 여과하여 0.45 μ니트로-셀룰로스 막(와트만)을 통해 응집된 단백질(리폴딩 과정에서 부산물로서 생성됨)을 제거하였다. 비오틴 태그화된 가용성 TCR은 바이오카드 스프린트 시스템에서 작동하는 POROS 20HQ 컬럼상에 로딩하여 정제하였다. 전개 1회당 대략 500 ㎖의 리폴딩된 단백질 용액을 로딩하고, 비스-트리스-프로판 완충액 pH 8.0 중 염화나트륨 구배를 사용하여 단백질을 용출시켰다. 대략 100 mM 염화나트륨에서 용출된 단백질 및, 관련 분획은 얼음상에서 즉시 냉장하고, 프로테아제 억제제 칵테일을 첨가하였다. 분획은 코마시 염색된 SDS-PAGE로 분석하였다.
실시예 11
비오티닐화 가능한 β쇄를 이용한 TCRz 헤테로이량체의 리폴딩 및 정제
비오틴 태그된 TCR β쇄를 가용성 T 세포 수용체의 경우와 같이 발현 및 정제된 동량의 α쇄와 혼합하였다. 헤테로이량체 TCRz-β-BT는 TCRz에 대해 실시예 10에 제시된 바와 동일한 절차에 따라 리폴딩시켰다(도 26 참조).
실시예 12
비오틴 태그된 가용성 TCRz-BT의 비오티닐화
단백질 함유 분획은 10 K 컷오프 원심분리 농축기(울트라프리, 밀리포어)를 사용하여 2.5 ㎖로 농축하였다. 10 mM 트리스 pH 8.1, 5 mM NaCl로 평형화시킨 PD-10 탈염 컬럼을 사용하여 완충액을 교환하고, 추가로 프로테아제 억제제 칵테일을 첨가하고, 다시 원심분리 농축기를 사용하여 단백질을 ∼1 ㎖로 농축시켰다. 비오틴 태그된 가용성 TCR 1㎖에 7.5 mM MgCl2, 5mM ATP(pH 8.0), 1 mM 비오틴, 2.5 ㎍/㎖ BirA 비오티닐화 효소를 첨가하였다. 비오티닐화 반응을 밤새 실온(20∼25 ℃)에서 수행하였다.
효소적으로 비오티닐화된 가용성 TCR은 파마시아 FPLC 시스템에서 작동하는 슈퍼덱스 200 HR 컬럼(파마시아)상에서 겔 여과하여 잔여 미반응 비오틴으로부터 분리하였다(도 27 참조). 컬럼을 PBS로 평형화시키고, 얼음위에서 즉시 냉장된 1 ㎖ 분획을 수거하고, 다시 프로테아제 억제제 컥테일로 보호하였다. 단백질 농도는 코마시 결합 분석(피어스)를 사용하여 추정하고, 그 다음 비오티닐화된 단백질을 4℃에서 최대 수개월 동안 또는 -20℃에서 더 장기간 동안 저장하였다.
비오티닐화 반응의 효과는 비오티닐화된 단백질의 웨스턴 블롯을 사용하여 검사하였다. SDS-PAGE 겔은 염색 대신에 전술한 방법을 사용하여 전개시키고, 겔은 세미포르 반건조 전기블롯팅 장치(호에퍼)를 사용하여 PVDF 막(바이오라드)상에서 블롯팅하였다. 블롯팅 스택은 겔 크기로 절단되고 전달 완충액(25 mM 트리스 염기, 150 mM 글리신)내 침지된 6층의 여과지(와트만 4M), 메탄올로 미리 적신 다음 전달 완충액 중에 침지한 PVDF 막, 5분 동안 전달 완충액에서 완만하게 교반된 겔, 추가 6층의 침지된 여과지로 구성하였다. 그 스택은 시험관을 사용하여 살짝 압축하여 임의의 공기 기포를 펴고 대략 10 ㎖의 추가의 전달 완충액을 첨가하여 전도를 보조하였다. 양극을 스택의 상부에 높고, 1시간 동안 50 mA의 일정 전류로 장치에 전류를 통과시켰다. 그 다음 막을 PBS-T 완충액(PBS + 0.05% 트윈 20)중 2% 젤라틴 용액(바이오라드)에서 1 시간 이상 동안 실온에서 살짝 교반하면서 항온처리하였다. 밤새 항온처리물은 0.01% 나트륨 아지드를 포함하여 박테리아 성장을 억제하였다. PBS-T를 수회(4∼5회) 교체하여 막을 세척한 다음 살짝 교반하면서 실온에서 >30분 동안 PBS-T 중 1% 젤라틴 용액으로 1:1000으로 희석한 아비딘-HRP 접합체(시그마)로 막을 염색하였다. 그 다음 PBS-T를 수회(4∼5회) 교체하여 막을 세척한 다음 Opti-4CN(바이오라드)로 검출하였다. 이는 HRP의 존재하에서 반응하여 불용성 청색 염료를 형성하는 시약으로서, 관련 단백질이 결합된 HRP의 존재에 의해 제시된 바와 같이 존재하는 장소에서 막을 염색한다. 아비딘-HRP 접합체를 사용하여 염색된 경우, 이는 비오틴 함유 단백질이 존재함을 제시하는 것이다.
도 28은 일부 비오티닐화된 TCR상에서 이러한 방식으로 수행한 블롯이다. 이러한 블롯상에서 조작한 표준물은 비오티닐화된 광범위한 분자량 마커(바이오라드)였다. 블롯은 비오티닐화 태그를 함유하는 TCR의 고 레벨의 비오티닐화가 BirA 효소와 반응함을 분명하게 보여준다.
실시예 13
비오티닐화된 가용성 MHC-펩티드 복합체의 생성
비오티닐화된 가용성 MHC-펩티드 복합체를 실시예 2에 개시된 바와 같이 생성할 수 있다.
실시예 14
가용성 TCR 및 MHC-flu-펩티드간의 특이적 결합에 대한 분석
가용성 TCR 분자인 JM22z는 인플루엔자 매트릭스 단백질의 아미노산 잔기 58-66(GILGFVFTL)로 구성된 면역 우성 항원을 제공하는 HLA-A2 MHC 분자에 대해 특이적이다. JM22z의 클로닝, 발현 및 정제는 실시예 4, 7, 9 및 10과 도 24 및 25에 도시되어 있다. JM22z 및 그의 리간드/MHC 복합체(HLA-A2-flu) 또는 부적절한 HLA-A2 펩티드 조합(그 생성은 실시예 13에 제시되어 있다)간의 상호작용은 바이오코어 2000TM 표면 플라스몬 공명(SPR) 바이오센서상에서 분석하였다. SPR은 작은 유동 세포내 센서 표면 부근에 있는 반응 단위체(RU)로 표시되는 굴절률의 변화를 측정하며, 그 원리를 사용하여 수용체 리간드 상호작용을 검출하고 친화도 및 역학 변수를 분석할 수 있다. 프로브 유동 세포는 β2m상에 교차 결합된 비오틴 및 유동 세포의 활성화된 표면에 화학적으로 교차 결합된 스트렙타비딘간의 결합을 통해 별개의 유동 세포내 개개 HLA-A2-펩티드 복합체를 고정하여 제조하였다. 이 분석은 일정한 유속으로 상이한 유동 세포의 표면상에 JM22z를 통과시켜 수행하여, SPR 반응을 측정하였다. 초기에, 이 상호작용의 특이성은 3개의 상이한 표면상에 5 ㎕/분의 일정한 유속으로 28 μM의 JM22z를 통과시켜 입증하였는데, 상기 3개의 표면 중 하나의 표면은 HLA-A2-flu의 2800 RU로 코팅하고, 제2 표면은 HIV 역전사 효소에서 유래한 부적절한 펩티드와 함께 폴딩된 HLA-A2의 4200 RU(HLA-A2-폴: ILKEPVHGV)로 코팅하고, 제3 표면은 CD5의 4300RU로 코팅하였다(도 29a 삽입 그래프). 일정한 유속과 상이한 농도로 HLA-A2-pol상에 가용성 JM22z를 주입하여 배경 공명을 정하였다(도 29a). 이들 대조 측정값은 HLA-A2-flu에서 얻은 값(도 29b)으로부터 공제하고, 해리 상수 Kd(도 29c)로서 표현되는 결합 친화도를 계산하는데 사용하였다. JM22z 및 관련 MHC 분자의 Kd는 37℃에서 15 ±4 μM(n=7)이고 25℃에서 6.6 ±2 μM(n=14)인 것으로 측정되었다. 프로브 유동 세포 및 가용성 MHC-펩티드 복합체내 고정된 TCR을 이용하여 측정하여 25℃에서 5.6 ±4 μM(n=3)의 유사한 Kd를 얻었다. 상호작용의 개시율(on-rate)는 37℃에서 6.7 ×104 내지 6.9 ×104 M-1s -1 인 반면, 정지율(off-rate)는 1.1 초-1였다(Wilcox, Gao 등, 1999).
실시예 15
가용성 쥐 TCR 및 쥐 MHC H2-D b -NP간의 특이적 결합 분석
이 실험에서, 본 발명자들은 쥐 H2-Db MHC 분자(H2-Db-NP)가 제공하는 인플루엔자 바이러스 핵단백질로부터 유래된 펩티드(아미노산 366-374; ASNENMDAM)에 특이적인 쥐 TCR, F5를 사용하였다. 사용된 MHV 중쇄 유전자는 천연 단백질의 아미노산 1∼280과 BirA 효소가 인식하는 13-아미노산 서열만을 암호화하도록 약간 변형시켰다. 생성 단백질은 효소적으로 비오티닐화될 수 있다(Schatz 1993; O'Callaghan, Byford 등, 1999). 고정된 H2-Db-NP에 특이적인 가용성 TCR을 사용하여 바이어코어 2000 SPR 바이오센서상에서 SPR 분석을 수행한 결과, 이것이 리간드 MHC-펩티드 조합물에 특이적으로 결합함을 확인하였다(도시되지 않음).
실시예 16
비오티닐화된 가용성 돌연변이 tax-TCR과 비오티닐화된 가용성 tax-TCR의 결합 비교
비오티닐화된 가용성 tax-TCR을 실시예 9∼11에서와 같이 제조하고, 인플루엔자 매트릭스 펩티드(GILGFVFTL) 또는 HTLV tax 11-19 펩티드(LLFGYPVYV)와 리폴딩된 비오티닐화된 pMHC 복합체를 사용하여 실시예 14에서와 같이 바이어코어 2000 분석을 수행하였다. 비오티닐화된 가용성 TCR을 총 1분 동안 5 ㎕/분의 속도로 모든 세포상에서 유동시켰다. 도 30은 비오티닐화된 가용성 tax-TCR을 먼저 HTLV tax11-19 펩티드-MHC 복합체(A)에 결합시킨 다음 비오티닐화된 가용성 돌연변이 tax-TCR을 결합시킨다는 것을 보여준다. 야생형도 돌연변이 tax-TCR도 인플루엔자 매트릭스 펩티드-MHC 복합체(B/C) 또는 OX68 모노클로날 항체 대조군(D)에 결합하지 않는다는 것을 보여준다. 따라서, 본 발명자들은 야생형 및 돌연변이 비오티닐화된 가용성 TCR이 모두 tax-pMHC 복합체에 효과적, 특이적으로 분명하게 결합하고, 결합 정도에는 거의 차이가 없다는 결론을 내렸다.
실시예 17
고정된 MHC 펩티드 복합체에 대한 TCR- 및 CD8 보조 수용체의 동시 결합 분석
CD8 및 CD4는 TCR과 동일한 MHC 분자에 동시에 결합하여 TCR에 대한 보조 수용체로서 기능하는 것으로 간주되는 표면 당단백질이다. CD8은 세포 독성 T세포에 대한 특성이 있으며 MHC 클래스 I 분자에 결합하는 반면, CD4는 헬퍼 계통의 T 세포에서 발현하고 MHC 클래스 II 분자를 결합시킨다. CD8은 2개의 동일한 α쇄 또는 α쇄 및 β쇄로 구성된 이량체이다. 헤테로이량체 αα-CD8 분자는 전술한 바와 같이 생성되었다(PCT/GB98/03235; Gao, Tormo 등, 1997; Gao, Gerth 등, 1998). 이 실시예에서, 본 발명자들은 고정된 HLA-A2-flu 복합체에 대한 가용성 TCR 및 CD 분자의 동시 결합을 개시하고 있다. 도 31A에서 볼 수 있는 바와 같이, 결합 반응은 단순히 합하면 된다. TCR 반응값(○)을 혼합된 반응값(●)으로부터 공제하면 120 μM CD8 단독(△)의 반응값과 매우 유사한 값(□)을 제공한다. 도 31B는 TCR-MHC-펩티드 상호작용의 역학이 동시 CD8 결합에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 보여준다. 관찰된 부가의 결합은 TCR 및 CD8이 별도의 계면에서 MHC 펩티드 복합체를 결합시킨다는 것을 제시한다. 이 실시예는, 일부 경우 한 분자의 결합이 다른 분자의 특이적 결합에 영향을 미치지 않으며, 이 상황은 분자들의 다른 조합에 대해서 가장 상이할 것 같다.
실시예 18
가용성 α/β TCR의 발현, 리폴딩 및 부위 특이적 비오티닐화
a) TCR α쇄 및 β쇄의 공학적 처리
헤테로이량체 TCR 분자의 재조합 가용성 형태는 도 36에 요약되어 있는 바와 같이 공학적으로 처리하였다. 각 쇄는 막 말단 및 막 기부 면역글로불린 도메인으로 구성되어 있으며, 이들 도메인은 헤테로이량체의 안정화를 보조하는 감겨진 코일 모티프에 짧은 가요성 링커를 통해 융합된다.
도 32 내지 도 34와 도 38 내지 도 41은 상이한 특이성을 보유한 각종 TCR 알파쇄 및 베타쇄에 대한 DNA 암호화 서열 및 해당 아미노산 서열을 도시한다. TCR 상에 본 실시예의 농축물은 도 32 내지 도 34의 서열에 의해 제시되지만 개시된 방법은 도 38 내지 도 41에 제공된 TCR을 이용하여 유사하게 수행할 수 있다.
TCR 불변 도메인은 생체내에서 쇄간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기 바로 앞에서 절두시켰다. 결과적으로, 2개의 쇄는 비공유 4차 접촉에 의해서 쌍을 형성한다. Fos-Jun 지퍼 펩티드 헤테로이량체는 사용된 링커에 대해 바로 N-말단에 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있기 때문에(O'Shea 등, 1989), 서로에 대한 2개 쇄의 정렬은 최적인 것으로 추정하였다. 융합 단백질은 별도의 성분 각각에 대해 적합한 방식으로 연결시켜, 구조를 방해하는 일이 없도록 하여야 한다.
HLA-A2에서 인플루엔자 매트릭스 단백질 58-66 에피토프에 대해 특이적인 TCR의 알파쇄 및 베타쇄를 암호화하는 cDNA는 전술한 바와 같이 고착된 PCR에 의해 Vβ17+ 인간 CTL 클론(JM22)으로부터 얻었다(Moss 등, 1991).
알파 및 베타 TCR 지퍼 작제물인 pJM22α-Jun 및 pJM22β-Fos는 표준 PCR 기법을 사용하여 각 쇄의 가변 도메인 및 불변 도메인을 증폭시키고, 진핵세포 전사 인자인 Jun 및 Fos 각각으로부터 루신 지퍼 도메인상에 생성물을 스플라이싱하여 별도로 작제하였다. 이들 40개의 아미노산 길이 서열은 합성 펩티드로부터 리폴딩되는 경우 특이적으로 헤테로이량체화되지만, 쇄간 공유 결합은 필요하지 않은 것으로 밝혀졌다(O'Shea 등, 1989).
프라이머는 개시 코돈에 대한 바로 인접한 3'에 AT를 고함량으로 도입하도록 고안하고(mRNA 2차 구조를 탈안정화시킴), 대장균 코돈을 선택하여 발현을 최대화하였다(Gao 등, 1998). TCR 베타 불변 도메인에서 여분의 시스테인을 세린으로 돌연변이시켜 리폴딩 과정에서 부정확한 이황화 결합을 방지하였다.
융합된 DNA 및 단백질 서열은 도 32 및 도 33에 제시되어 있다. 이 TCR의 β쇄의 부위 특이적 비오티닐화를 가능하게 하기 위해서, 소위 말하는 "비오틴 태그"를 암호화하는 DNA 서열을 가용성 Vβ17을 발현하는 유전자의 3' 말단으로 공학적으로 처리하였다. 하기 PCR 프라이머는 DNA 작제물을 공학적으로 처리하는데 사용하였다.
5'-GCTCTAGACATATGGGCCCAGTGGATTCTGGAGTCAC-3'
및
5'-GGGGGAAGCTTAATGCCATTCGATTTTCTGAGCTTCAAAAATATCGTT
CAGACCACCACCGGATCCGTAAGCTGCCAGGATGAACTCTAG-3'
생성 PCR 생성물은 제한 효소 NdeI 및 HindIII(뉴잉글랜드 바이오랩스)로 분해하고, T4 DNA 리가제(뉴잉글랜드 바이오랩스)를 사용하여 벡터 pGMT7(Studier 등, 1990)로 결찰시켰다. 도 3은 이 작제물내 삽입체의 DNA 서열 및 추론된 단백질 서열을 도시한다.
b) TCR 쇄의 발현
HLA-A* 0201이 제공하는 인플루엔자 바이러스 매트릭스 펩티드에 대한 특이성이 있는 TCR의 발현 및 리폴딩은 다음과 같이 수행하였다.
TCRα쇄 및 β쇄는 TYP 배지(1.6% 박토-트립톤, 1.6% 효모 추출물, 0.5% NaCl, 0.25% K2HPO4)내 벡터 pGMT7의 제어하에 대장균 균주 BL21DE3pLysS내에서 별도로 발현시켰다. 발현은 0.5 mM IPTG로 중간 대수증식기에서 유도하고, 3∼5 시간 후에, 박테리아를 원심분리로 수거하였다. 박테리아 세포는 "용해 완충액"(10 mM EDTA, 2 mM DTT, 10 mM 트리스 pH 8, 150 mM NaCl, 0.5 mM PMSF, 0.1 ㎎/㎖ 리소자임, 10% 글리세롤)내에 재현탁시킨 다음, 10 mM MgCl2 및 20 ㎍/㎖ DNaseI을 첨가하고, 얼음상에서 20분 동안 항온처리한 다음 30 초 동안 10 ×파열로 프로브 초음파기를 사용하여 초음파 처리하여 세포 용해시켰다. 봉입체내 단백질은, 봉입체를 펠렛화시키기 위한 20 분 동안 15,000 rpm에서의 원심분리 및 이들을 재현탁시키기 위한 "dounce" 균질기를 사용하여 "트리톤 완충액'(0.5% 트리톤 X-100, 50 mM 트리스 pH 8, 100 mM NaCl, 0.1% 나트륨 아지드, 10 mM EDTA, 2 mM DTT)으로 수회 세척(일반적으로 3회)하여 정제하였다.
세제는 50 mM 트리스 pH 8, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2mM DTT의 단일 세척액으로 제제로부터 제거하고, 단백질은 "우레아 완충액"(20 mM 트리스 pH 8, 8M 우레아, 10% 글리세롤, 500 mM NaCl, 500 mM EDTA, 2 mM DTT)으로 안정화시켰다. 밤새 4℃에서 상하 혼합한 후에, 용액을 원심분리로 맑게하고, 용해된 단백질을 -70℃에서 저장하였다. 단백질 농도는 코마시 결합 분석(피어스)으로 측정하였다.
c) TCR의 리폴딩
동비율의 우레아 용해된 단백질은 37℃에서 "구아니딘 완충액"(6M 구아니딘-HCl, 10 mM 아세트산나트륨 pH5.5, 10 mM EDTA, 2 mM DTT) 중에서 추가로 변성시켰다. 이 용액은 급속한 혼합을 유지하면서 얼음 위에서 리폴딩 완충액(5M 우레아, 100 mM 트리스 pH 8, 400 mM L-아르기닌, 5 mM 환원된 글루타티온, 0.5 mM 산화된 글루타티온, 0.1 mM PMSF)에 첨가하였다. 4℃에서 >12 시간 후에, 용액을 10 부피의 물에 대해 투석한 다음 10 부피의 10 mM 트리스 pH 8, 100 mM 우레아에 대해 투석하였다. 프로테아제 억제제 PMSF를 모든 단계에서 첨가하여 TCR 상의 비오티닐화 태그의 단백질 분해 손실을 최소화하였다.
d) TCR의 정제
TCR의 묽은 용액을 0.45 미크론 필터를 통해 여과시켜 응집된 단백질을 제거한 다음 POROS 10HQ 컬럼상에 로딩하였다. 리폴딩된 TCR을 10 mM 트리스 pH 8 중 염화나트륨 구배로 용출시키고, 1 ㎖ 분획을 수거하고 SDS-PAGE로 분석하였다(도 36 참조). TCR을 함유하는 분획을 모으고, 30 kDa 컷오프 원심분리 농축기를 사용하여 1 ㎖로 농축하였다.
e) TCR의 비오티닐화
TCR 용액 1 ㎖는 완충된 ATP, 5 mM MgCl2, 1 mM 비오틴을 사용하여 7.5 mM ATP로 구성되며, PMSF, 류펩틴 및 펩스타틴을 포함하는 프로테아제 억제제 칵테일을 첨가하였다. 마지막으로, 효소 BirA를 최종 농도 5 ㎍/㎖로 첨가하고, 반응을 실온에서 밤새 진행시켰다. 그 다음 겔 여과로 유리 비오틴으로부터 TCR을 분리하였다(도 37 참조). 비오티닐화된 TCR을 포함하는 분획을 모으고, 프로테아제 억제제 칵테일을 첨가하였다. 단백질 농도를 측정하였다. 도 35는 가용성 비오티닐화된 TCR의 개략도이다.
참고 문헌
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(Figure 5C). <400> 6 catacacccg ggggtctgac tgatacactc caagcggag 39 <210> 7 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Human c-fos leucine zipper 3'-specific PCR primer. (Figure 5D). <400> 7 tgtgtgctcg aggatcctag taagctgcca ggatgaactc tagtttttc 49 <210> 8 <211> 120 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Partial human c-fos sequence coding for the leucine zipper domain as fused to TCR beta chains. (Figure 6B). <400> 8 ctgactgata cactccaagc ggagacagac caactagaag atgagaagtc tgctttgcag 60 accgagattg ccaacctgct gaaggagaag gaaaaactag agttcatcct ggcagcttac 120 <210> 9 <211> 120 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Partial human c-jun sequence coding for the leucine zipper domain as fused to TCR alpha chains. (Figure 6A). <400> 9 agaatcgccc ggctggagga aaaagtgaaa accttgaaag ctcagaactc ggagctggcg 60 tccacggcca acatgctcag ggaacaggtg gcacagctta aacagaaagt catgaactac 120 <210> 10 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> C-jun leucine zipper amino acid sequence as fused to TCR alfa chains. (Figure 6A) <400> 10 Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn 1 5 10 15 Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln 20 25 30 Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr 35 40 <210> 11 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-fos leucine zipper amino acid sequence as fused to TCR beta chains. (Figure 6B). <400> 11 Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Glu Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys 20 25 30 Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr 35 40 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Forward PCR primer for mutating the unpaired cysteine of human TCR beta chains to serine (Figure 7A). <400> 12 gactccagat acagcctgag cagccg 26 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the human TCR beta chain after mutating the unpaired cysteine to serine (Figure 7A). <220> <223> Description of Artificial Sequence: Amino acid sequence of the human TCR beta chain after mutating the unpaired cysteine to serine (Figure 7A). <400> 13 Asp Ser Arg Tyr Ser Leu Ser Ser 1 5 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Backward PCR primer for mutating the unpaired cysteine of human TCR beta chains to serine (Figure 7B). <400> 14 cggctgctca ggctgtatct ggagtc 26 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Forward PCR primer for mutating the unpaired cysteine of human TCR beta chains to alanine (Figure 7C). <400> 15 gactccagat acgctctgag cagccg 26 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Amino acid sequence of the human TCR beta chain after mutating the unpaired cysteine to alanine (Figure 7C). <400> 16 Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser 1 5 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Backward PCR primer for mutating the unpaired cysteine of human TCR beta chains to alanine (Figure 7D). <400> 17 cggctgctca gagcgtatct ggagtc 26 <210> 18 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 5' PCR primer for the human V alpha10.2 chain of the JM22 Influenza matrix peptide-HLA-A0201 restricted TCR. (Figure 9A). <400> 18 gctctagaca tatgcaacta ctagaacaaa gtcctcagtt tctaagcatc caagagg 57 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> New N-terminal amino acid sequence of truncated V alpha10.2 chain of the human JM22 Influenza matrix peptide-HLA-A0201 restricted TCR. (Figure 9A). <400> 19 Met Gln Leu Leu Glu Gln Ser Pro Gln Phe Leu Ser Ile Gln Glu 1 5 10 15 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 5' PCR primer for the human V beta17 chain of the JM22 Influenza matrix peptide-HLA-A0201 restricted TCR. (Figure 9B) <400> 20 gctctagaca tatggtggat ggtggaatca ctcagtccc 39 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> New N-terminal amino acid sequence of truncated V beta17 chain of the human JM22 Influenza matrix peptide-HLA-A0201 restricted TCR. (Figure 9B). <220> <223> Description of Artificial Sequence:New N-terminal amino acid sequence of truncated V beta17 chain of the JM22 Influenza matrix peptide-HLA-A0201 restricted TCR. (Figure 9A) <400> 21 Met Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser 1 5 <210> 22 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 5' PCR primer for the mouse V alpha4 chain of the Influenza nucleoprotein peptide-H2Db restricted TCR. (Figure 9C). <400> 22 gctctagaca tatggattct gttactcaaa tgcaaggtca agtgaccctc tcatcag 57 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: New N-terminal amino acid sequence of truncated V alpha4 chain of the mouse Influenza nucleoprotein peptide-H2-Db restricted TCR. (Figure 9C). <400> 23 Met Asp Ser Val Thr Gln Met Gln Gly Gln Val Thr Leu Ser Ser 1 5 10 15 <210> 24 <211> 53 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> 5' PCR primer for the mouse V beta 11 chain of the Influenza nucleoprotein peptide-H2Db restricted TCR. (Figure 9D). <400> 24 gctctagaca tatggaacca acaaatgctg gtgttatcca aacacctagg cac 53 <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> New N-terminal amino acid sequence of truncated murine V beta 11 chain of the Influenza nucleoprotein peptide-H2-Db restricted TCR . <400> 25 Met Glu Pro Thr Asn Ala Gly Val Ile Gln Thr Pro Arg His 1 5 10 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 5' PCR primer for the human V alpha 23 chain of the 003 HIV-1 GAGag peptide-HLA-A0201 restricted TCR. (Figure 9E). <400> 26 ggaattccat atgaaacaag aggttacaca aattcc 36 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> New N-terminal amino acid sequence of truncated human Valpha23 chain of the 003 HIV-1 Gag peptide-HLA-A0201 restricted TCR . (Figure 9E). <400> 27 Met Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile 1 5 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 5' PCR primer for the human Vbeta5.1 chain of the 003 HIV-1 Gag peptide-HLA-A0201 restricted TCR. (Figure F). <400> 28 ggaattccat atgaaagctg gagttactca aactcc 36 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> New N-terminal amino acid sequence of truncated human Vbeta5.1 chain of the 003 HIV-1 Gag peptide-HLA-A0201 restricted TCR . (Figure 9F). <400> 29 Met Lys Ala Gly Val Thr Gln Thr 1 5 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 5' PCR primer for the human Valpha2.3 chain of the HTLV-1 Tax peptide-HLA-A0201 restricted A6 TCR. (Figure 9g). <400> 30 cccccccata tgcagaagga agtggagcag aac 33 <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> New N-terminal amino acid sequence of truncated human V alpha 2.3 chain of the HTLV-1 Tax peptide-HLA-A0201 restricted A6 TCR . (Figure 9G). <400> 31 Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Lys 1 5 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 5' PCR primer for the human Vbeta12.3 chain of the HTLV-1 Tax peptide-HLA-A0201 restricted A6 TCR. (Figure 9H). <400> 32 cccccccata tgaacgctgg tgtcactcag acc 33 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> New N-terminal amino acid sequence of truncated human Vbeta12.3 chain of the HTLV-1 Tax peptide-HLA-A0201 restricted A6 TCR . (Figure 9H). <400> 33 Met Lys Ala Gly Val Thr Gln Thr 1 5 <210> 34 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 5' PRC <220> <223> 5' PCR primer for the human Valpha17.2 chain of the HTLV-1 Tax peptide-HLA-A0201 restricted B7 TCR. (Figure 9I). <400> 34 cccccccata tgcaacaaaa aaatgatgac cagcaagtta agcaaaat 48 <210> 35 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> New N-terminal amino acid sequence of truncated human Valpha17.2 chain of the HTLV-1 Tax peptide-HLA-A0201 restricted B7 TCR . (Figure 9I). <400> 35 Met Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln Asn 1 5 10 <210> 36 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 5' PCR primer for the human Vbeta12.3 chain of the HTLV-1 Tax peptide-HLA-A0201 restricted B7 TCR. (Figure 9J) <400> 36 cccccccata tgaacgctgg tgtcactcag accccaaaat tccag 45 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> New N-terminal amino acid sequence of truncated human Vbeta12.3 chain of the HTLV-1 Tax peptide-HLA-A0201 restricted B7 TCR . (Figure 9J). <400> 37 Met Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln 1 5 10 <210> 38 <211> 38 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 3' PCR primer for human Calpha chains, generally applicable. (Figure 9K). <400> 38 catacacccg ggggaacttt ctgggctggg gaagaagg 38 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 3' PCR primer for human Cbeta chains, generally applicable. (Figure 9L). <400> 39 catacacccg gggtctgctc taccccaggc ctc 33 <210> 40 <211> 744 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Mutated DNA sequence of soluble HLA-A2/flu matrix restricted TCR alpha chain from JM22, as fused to the "leucine zipper" domain of human c-jun. (Figure 10). <400> 40 atgcaactac tagaacaaag tcctcagttt ctaagcatcc aagagggaga aaatctcact 60 gtgtactgca actcctcaag tgttttttcc agcttacaat ggtacagaca ggagcctggg 120 gaaggtcctg tcctcctggt gacagtagtt acgggtggag aagtgaagaa gctgaagaga 180 ctaacctttc agtttggtga tgcaagaaag gacagttctc tccacatcac tgcggcccag 240 cctggtgata caggcctcta cctctgtgca ggagcgggaa gccaaggaaa tctcatcttt 300 ggaaaaggca ctaaactctc tgttaaacca aatatccaga accctgaccc tgccgtgtac 360 cagctgagag actctaaatc cagtgacaag tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct 420 caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta 480 gacatgaggt ctatggactt caagagcaac agtgctgtgg cctggagcaa caaatctgac 540 tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc attattccag aagacacctt cttccccagc 600 ccagaaagtt cccccggggg tagaatcgcc cggctggagg aaaaagtgaa aaccttgaaa 660 gctcagaact cggagctggc gtccacggcc aacatgctca gggaacaggt ggcacagctt 720 aaacagaaag tcatgaacta ctag 744 <210> 41 <211> 247 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Predicted amino acid sequence of the soluble HLA-A2/flu matrix restricted alpha chain from JM22, as fused to the "lecine zipper" domain of c-jun. (Figure 10). <400> 41 Met Gln Leu Leu Glu Gln Ser Pro Gln Phe Leu Ser Ile Gln Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Leu Thr Val Tyr Cys Asn Ser Ser Ser Val Phe Ser Ser Leu 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Gln Glu Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu Val Thr 35 40 45 Val Val Thr Gly Gly Glu Val Lys Lys Leu Lys Arg Leu Thr Phe Gln 50 55 60 Phe Gly Asp Ala Arg Lys Asp Ser Ser Leu His Ile Thr Ala Ala Gln 65 70 75 80 Pro Gly Asp Thr Gly Leu Tyr Leu Cys Ala Gly Ala Gly Ser Gln Gly 85 90 95 Asn Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Lys Pro Asn Ile 100 105 110 Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser 115 120 125 Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val 130 135 140 Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu 145 150 155 160 Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser 165 170 175 Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile 180 185 190 Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Pro Gly Gly Arg 195 200 205 Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser 210 215 220 Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu 225 230 235 240 Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr 245 <210> 42 <211> 864 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> DNA sequence of the soluble HLA-A2/flu restricted TCR beta chain from JM22, as fused to the "leucine zipper" domain of c-fos. (Figure 11). <400> 42 atggtggatg gtggaatcac tcagtcccca aagtacctgt tcagaaagga aggacagaat 60 gtgaccctga gttgtgaaca gaatttgaac cacgatgcca tgtactggta ccgacaggac 120 ccagggcaag ggctgagatt gatctactac tcacagatag taaatgactt tcagaaagga 180 gatatagctg aagggtacag cgtctctcgg gagaagaagg aatcctttcc tctcactgtg 240 acatcggccc aaaagaaccc gacagctttc tatctctgtg ccagtagttc gaggagctcc 300 tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca cagaggacct gaaaaacgtt 360 ttcccacccg aggtcgctgt gtttgaacca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420 gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg 480 gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag 540 cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600 tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660 gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720 ggtagagcag accccggggg tctgactgat acactccaag cggagacaga tcaacttgaa 780 gacaagaagt ctgcgttgca gaccgagatt gccaatctac tgaaagagaa ggaaaaacta 840 gagttcatcc tggcagctta ctag 864 <210> 43 <211> 287 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Predicted amino acid sequence of the soluble HLA-A2/flu matrix restricted beta chain from JM22, as fused to the "lecine zipper" domain of c-fos. (Figure 11). <400> 43 Met Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys 1 5 10 15 Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp 20 25 30 Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu 50 55 60 Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val 65 70 75 80 Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Ser 85 90 95 Ser Arg Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr 100 105 110 Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe 115 120 125 Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val 130 135 140 Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp 145 150 155 160 Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro 165 170 175 Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser 180 185 190 Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe 195 200 205 Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr 210 215 220 Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp 225 230 235 240 Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr 245 250 255 Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn 260 265 270 Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr 275 280 285 <210> 44 <211> 795 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of the soluble H2-Db/Influenza virus nucleoprotein restricted TCR alpha chain from murine F5 receptor, as fused to the "leucine zipper" domain of c-jun. (Figure 12). <220> <223> Description of Artificial Sequence: Fusion gene coding for truncated murine F5 TCR alpha chain fused to the leucine zipper domain of human c-jun. <400> 44 atgaactatt ctccagcttt agtgactgtg atgctgtttg tgtttgggag gacccatgga 60 gactcagtaa cccagatgca aggtcaagtg accctctcag aagacgactt cctatttata 120 aactgtactt attcaaccac atggtacccg actcttttct ggtatgtcca atatcctgga 180 gaaggtccac agctcctttt gaaagtcaca acagccaaca acaagggaat cagcagaggt 240 tttgaagcta catatgataa aggaacaacg tccttccact tgcagaaagc ctcagtgcag 300 gagtcagact ctgctgtgta ctactgtgtg ctgggtgatc gacagggagg cagagctctg 360 atatttggaa caggaaccac ggtatcagtc agccccaaca tccagaaccc agaacctgct 420 gtgtaccagt taaaagatcc tcggtctcag gacagcaccc tctgcctgtt caccgacttt 480 gactcccaaa tcaatgtgcc gaaaaccatg gaatctggaa cgttcatcac tgacaaaact 540 gtgctggaca tgaaagctat ggattccaag agcaatgggg ccattgcctg gagcaaccag 600 acaagcttca cctgccaaga tatctccaaa gagaccaacg ccacctaccc cagttcagac 660 gttcccgggg gtagaatcgc ccggctggag gaaaaagtga aaaccttgaa agctcagaac 720 tcggagctgg cgtccacggc caacatgctc agggaacagg tggcacagct taaacagaaa 780 gtcatgaact actag 795 <210> 45 <211> 264 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Predicted amino acid sequence of the soluble H2-Db/Influenza virus nucleoprotein restricted alpha chain from murine F5 receptor, as fused to the "lecine zipper" domain of c-jun. (Figure 12). <220> <223> Description of Artificial Sequence: Fusion protein consisting of truncated murine F5 TCR alpha chain fused to the leucine zipper domain of human c-jun. <400> 45 Met Asn Tyr Ser Pro Ala Leu Val Thr Val Met Leu Phe Val Phe Gly 1 5 10 15 Arg Thr His Gly Asp Ser Val Thr Gln Met Gln Gly Gln Val Thr Leu 20 25 30 Ser Glu Asp Asp Phe Leu Phe Ile Asn Cys Thr Tyr Ser Thr Thr Trp 35 40 45 Tyr Pro Thr Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Gly Glu Gly Pro Gln 50 55 60 Leu Leu Leu Lys Val Thr Thr Ala Asn Asn Lys Gly Ile Ser Arg Gly 65 70 75 80 Phe Glu Ala Thr Tyr Asp Lys Gly Thr Thr Ser Phe His Leu Gln Lys 85 90 95 Ala Ser Val Gln Glu Ser Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Val Leu Gly 100 105 110 Asp Arg Gln Gly Gly Arg Ala Leu Ile Phe Gly Thr Gly Thr Thr Val 115 120 125 Ser Val Ser Pro Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu 130 135 140 Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe 145 150 155 160 Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile 165 170 175 Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn 180 185 190 Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile 195 200 205 Ser Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Gly Gly 210 215 220 Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn 225 230 235 240 Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln 245 250 255 Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr 260 <210> 46 <211> 864 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of soluble H2-Db/Influenza virus nucleoprotein restricted TCR beta chain from the murine F5 receptor, as fused to the leucine zipper domain of c-fos.(Figure 13). <220> <223> Description of Artificial Sequence: Sequence of soluble H2-Db/Influenza virus nucleoprotein restricted TCR beta chain from the murine F5 receptor, as fused to the leucine zipper domain of c-fos. <400> 46 atgaaagctg gagttactca aactccaaga tatctgatca aaacgagagg acagcaagtg 60 acactgagct gctcccctat ctctgggcat aggagtgtat cctggtacca acagacccca 120 ggacagggcc ttcagttcct ctttgaatac ttcagtgaga cacagagaaa caaaggaaac 180 ttccctggtc gattctcagg gcgccagttc tctaactctc gctctgagat gaatgtgagc 240 accttggagc tgggggactc ggccctttat ctttgcgcca gcagcttcga cagcgggaat 300 tcacccctcc actttgggaa cgggaccagg ctcactgtga cagaggacct gaacaaggtg 360 ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420 gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc ttccctgacc acgtggagct gagctggtgg 480 gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agccaggacc cgcagcccct caaggagcag 540 cccgccctca atgactccag atacagcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600 tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660 gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720 ggtagagcag accccggggg tctgactgat acactccaag cggagacaga tcaacttgaa 780 gacaagaagt ctgcgttgca gaccgagatt gccaatctac tgaaagagaa ggaaaaacta 840 gagttcatcc tggcagctta ctag 864 <210> 47 <211> 287 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of soluble H2-Db/Influenza virus nucleoprotein restricted TCR beta chain from the murine F5 receptor, as fused to the leucine zipper domain of c-fos. (Figure 13). <400> 47 Met Lys Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Arg Tyr Leu Ile Lys Thr Arg 1 5 10 15 Gly Gln Gln Val Thr Leu Ser Cys Ser Pro Ile Ser Gly His Arg Ser 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Gln Phe Leu Phe 35 40 45 Glu Tyr Phe Ser Glu Thr Gln Arg Asn Lys Gly Asn Phe Pro Gly Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Arg Gln Phe Ser Asn Ser Arg Ser Glu Met Asn Val Ser 65 70 75 80 Thr Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Phe 85 90 95 Asp Ser Gly Asn Ser Pro Leu His Phe Gly Asn Gly Thr Arg Leu Thr 100 105 110 Val Thr Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe 115 120 125 Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val 130 135 140 Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp 145 150 155 160 Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Gln Asp Pro Gln Pro 165 170 175 Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe 195 200 205 Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr 210 215 220 Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp 225 230 235 240 Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr 245 250 255 Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn 260 265 270 Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr 275 280 285 <210> 48 <211> 747 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of soluble HLA-A2/HIV-1 Gag restricted TCRalpha chain from patient 003r, as fused to the leucine zipper domain of c-jun. (Figure 14). <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA sequence of soluble HLA-A2/HIV-1 Gag restricted TCRalpha chain from patient 003, as fused to the leucine zipper domain of c-jun. <400> 48 atgaaacaag aagttacaca gattcctgca gctctgagtg tcccagaagg agaaaacttg 60 gttctcaact gcagtttcac tgatagcgct atttacaacc tccagtggtt taggcaggac 120 cctgggaaag gtctcacatc tctgttgctt attcagtcaa gtcagagaga gcaaacaagt 180 ggaagactta atgcctcgct ggataaatca tcaggacgta gtactttata cattgcagct 240 tctcagcctg gtgactcagc cacctacctc tgtgctgtga ccaacttcaa caaattttac 300 tttggatctg ggaccaaact caatgtaaaa ccaaatatcc agaaccctga ccctgccgtg 360 taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat 420 tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaaactgtg 480 ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct 540 gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc 600 agcccagaaa gttcccccgg gggtagaatc gcccggctgg aggaaaaagt gaaaaccttg 660 aaagctcaga actcggagct ggcgtccacg gccaacatgc tcagggaaca ggtggcacag 720 cttaaacaga aagtcatgaa ctactag 747 <210> 49 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Amino acid sequence of soluble HLA-A2/HIV-1 Gag restricted TCRalpha chain from patient 003, as fused to the leucine zipper domain of c-jun. Figure 14. <400> 49 Met Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val Pro Glu 1 5 10 15 Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr 20 25 30 Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu 35 40 45 Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn 50 55 60 Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala 65 70 75 80 Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Asn Phe 85 90 95 Asn Lys Phe Tyr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Asn Val Lys Pro Asn 100 105 110 Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser 115 120 125 Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn 130 135 140 Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val 145 150 155 160 Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp 165 170 175 Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile 180 185 190 Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Pro Gly Gly 195 200 205 Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn 210 215 220 Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln 225 230 235 240 Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr 245 <210> 50 <211> 864 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA sequence of soluble HLA-A2/HIV-1 Gag restricted TCRbeta chain from patient 003, as fused to the leucine zipper domain of c-fos. FIGURE 15. <400> 50 atgaaagctg gagttactca aactccaaga tatctgatca aaacgagagg acagcaagtg 60 acactgagct gctcccctat ctctgggcat aggagtgtat cctggtacca acagacccca 120 ggacagggcc ttcagttcct ctttgaatac ttcagtgaga cacagagaaa caaaggaaac 180 ttccctggtc gattctcagg gcgccagttc tctaactctc gctctgagat gaatgtgagc 240 accttggagc tgggggactc ggccctttat ctttgcgcca gcagcttcga cagcgggaat 300 tcacccctcc actttgggaa cgggaccagg ctcactgtga cagaggacct gaacaaggtg 360 ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420 gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc ttccctgacc acgtggagct gagctggtgg 480 gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agccaggacc cgcagcccct caaggagcag 540 cccgccctca atgactccag atacagcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600 tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660 gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720 ggtagagcag accccggggg tctgactgat acactccaag cggagacaga tcaacttgaa 780 gacaagaagt ctgcgttgca gaccgagatt gccaatctac tgaaagagaa ggaaaaacta 840 gagttcatcc tggcagctta ctag 864 <210> 51 <211> 287 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Amino acid sequence of soluble HLA-A2/HIV-1 Gag restricted TCR beta chain from patient 003, as fused to the leucine zipper domain of c-fos. FIGURE 15. <400> 51 Met Lys Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Arg Tyr Leu Ile Lys Thr Arg 1 5 10 15 Gly Gln Gln Val Thr Leu Ser Cys Ser Pro Ile Ser Gly His Arg Ser 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Gln Phe Leu Phe 35 40 45 Glu Tyr Phe Ser Glu Thr Gln Arg Asn Lys Gly Asn Phe Pro Gly Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Arg Gln Phe Ser Asn Ser Arg Ser Glu Met Asn Val Ser 65 70 75 80 Thr Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Phe 85 90 95 Asp Ser Gly Asn Ser Pro Leu His Phe Gly Asn Gly Thr Arg Leu Thr 100 105 110 Val Thr Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe 115 120 125 Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val 130 135 140 Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp 145 150 155 160 Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Gln Asp Pro Gln Pro 165 170 175 Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe 195 200 205 Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr 210 215 220 Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp 225 230 235 240 Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr 245 250 255 Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn 260 265 270 Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr 275 280 285 <210> 52 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA sequence of soluble HTLV1 Tax/HLA-A2 restricted TCR alpha chain clone A6, as fused to the leucine zipper domain of c-jun. FIGURE 16. <400> 52 atgcagaagg aagtggagca gaactctgga cccctcagtg ttccagaggg agccattgcc 60 tctctcaact gcacttacag tgaccgaggt tcccagtcct tcttctggta cagacaatat 120 tctgggaaaa gccctgagtt gataatgtcc atatactcca atggtgacaa agaagatgga 180 aggtttacag cacagctcaa taaagccagc cagtatgttt ctctgctcat cagagactcc 240 cagcccagtg attcagccac ctacctctgt gccgttacaa ctgacagctg ggggaaattg 300 cagtttggag cagggaccca ggttgtggtc accccagata tccagaaccc tgaccctgcc 360 gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg tctgcctatt caccgatttt 420 gattctcaaa caaatgtgtc acaaagtaag gattctgatg tgtatatcac agacaaaact 480 gtgctagaca tgaggtctat ggacttcaag agcaacagtg ctgtggcctg gagcaacaaa 540 tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga caccttcttc 600 cccagcccag aaagttcccc cgggggtaga atcgcccggc tggaggaaaa agtgaaaacc 660 ttgaaagctc agaactcgga gctggcgtcc acggccaaca tgctcaggga acaggtggca 720 cagcttaaac agaaagtcat gaactactag 750 <210> 53 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Amino acid sequence of soluble HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted TCR alpha chain from clone A6, as fused to the leucine zipper domain of c-jun. FIGURE 16. <400> 53 Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu 1 5 10 15 Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln 20 25 30 Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile 35 40 45 Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala 50 55 60 Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser 65 70 75 80 Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Thr Asp Ser 85 90 95 Trp Gly Lys Leu Gln Phe Gly Ala Gly Thr Gln Val Val Val Thr Pro 100 105 110 Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys 115 120 125 Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr 130 135 140 Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr 145 150 155 160 Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala 165 170 175 Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser 180 185 190 Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Pro Gly 195 200 205 Gly Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln 210 215 220 Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala 225 230 235 240 Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr 245 <210> 54 <211> 928 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA sequence of soluble HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted TCR beta chain from clone A6, as fused to the leucine zipper domain of c-fos and a BirA biotinylation tag. <400> 54 atgaacgctg gtgtcactca gaccccaaaa ttccaggtcc tgaagacagg acagagcatg 60 acactgcagt gtgcccagga tatgaaccat gaatacatgt cctggtatcg acaagaccca 120 ggcatggggc tgaggctgat tcattactca gttggtgctg gtatcactga ccaaggagaa 180 gtccccaatg gctacaatgt ctccagatca accacagagg atttcccgct caggctgctg 240 tcggctgctc cctcccagac atctgtgtac ttctgtgcca gcaggccggg actagcggga 300 gggcgaccag agcagtactt cgggccgggc accaggctca cggtcacaga ggacctgaaa 360 aacgtgttcc cacccgaggt cgctgtgttt gagccatcag aagcagagat ctcccacacc 420 caaaaggcca cactggtgtg cctggccaca ggcttctacc ccgaccacgt ggagctgagc 480 tggtgggtga atgggaagga ggtgcacagt ggggtcagca cagacccgca gcccctcaag 540 gagcagcccg ccctcaatga ctccagatac gctctgagca gccgcctgag ggtctcggcc 600 accttctggc agaacccccg caaccacttc cgctgtcaag tccagttcta cgggctctcg 660 gagaatgacg agtggaccca ggatagggcc aaacctgtca cccagatcgt cagcgccgag 720 gcctggggta gagcagaccc cgggggtctg actgatacac tccaagcgga gacagatcaa 780 cttgaagaca agaagtctgc gttgcagacc gagattgcca atctactgaa agagaaggaa 840 aaactagagt tcatcctggc agcttacgga tccggtggtg gtctgaacga tatttttgaa 900 gctcagaaaa tcgaatggca ttaagctt 928 <210> 55 <211> 307 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Amino acid sequence of soluble HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted TCR beta chain from clone A6, as fused to the leucine zipper domain of c-fos and a BirA biotinylation tag <400> 55 Met Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr 1 5 10 15 Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr 20 25 30 Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His 35 40 45 Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly 50 55 60 Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Arg Pro 85 90 95 Gly Leu Ala Gly Gly Arg Pro Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg 100 105 110 Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 115 120 125 Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr 130 135 140 Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 145 150 155 160 Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro 165 170 175 Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu 180 185 190 Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn 195 200 205 His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 210 215 220 Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu 225 230 235 240 Ala Trp Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala 245 250 255 Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile 260 265 270 Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala 275 280 285 Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile 290 295 300 Glu Trp His 305 <210> 56 <211> 765 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA sequence of soluble HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted TCR alpha chain from clone M10B7/D3 fused to the c-jun leucine zipper domain. <400> 56 atgcaacaga agaatgatga ccagcaagtt aagcaaaatt caccatccct gagcgtccag 60 gaaggaagaa tttctattct gaactgtgac tatactaaca gcatgtttga ttatttccta 120 tggtacaaaa aataccctgc tgaaggtcct acattcctga tatctataag ttccattaag 180 gataaaaatg aagatggaag attcactgtc ttcttaaaca aaagtgccaa gcacctctct 240 ctgcacattg tgccctccca gcctggagac tctgcagtgt acttctgtgc agcaatggag 300 ggagcccaga agctggtatt tggccaagga accaggctga ctatcaaccc aaatatccag 360 aaccctgacc ctgccgtgta ccagctgaga gactctaaat ccagtgacaa gtctgtctgc 420 ctattcaccg attttgattc tcaaacaaat gtgtcacaaa gtaaggattc tgatgtgtat 480 atcacagaca aaactgtgct agacatgagg tctatggact tcaagagcaa cagtgctgtg 540 gcctggagca acaaatctga ctttgcatgt gcaaacgcct tcaacaacag cattattcca 600 gaagacacct tcttccccag cccagaaagt tcccccgggg gtagaatcgc ccggctggag 660 gaaaaagtga aaaccttgaa agctcagaac tcggagctgg cgtccacggc caacatgctc 720 agggaacagg tggcacagct taaacagaaa gtcatgaact actag 765 <210> 57 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Amino acid sequence of soluble HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted TCR alpha chain from clone M10B7/D3 fused to the c-jun leucine zipper domain. <400> 57 Met Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln Asn Ser Pro Ser 1 5 10 15 Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Leu Asn Cys Asp Tyr Thr 20 25 30 Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys Tyr Pro Ala Glu 35 40 45 Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys Asp Lys Asn Glu 50 55 60 Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser Ala Lys His Leu Ser 65 70 75 80 Leu His Ile Val Pro Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ala Met Glu Gly Ala Gln Lys Leu Val Phe Gly Gln Gly Thr Arg 100 105 110 Leu Thr Ile Asn Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln 115 120 125 Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp 130 135 140 Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr 145 150 155 160 Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser 165 170 175 Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn 180 185 190 Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro 195 200 205 Glu Ser Ser Pro Gly Gly Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys 210 215 220 Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu 225 230 235 240 Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr 245 250 <210> 58 <211> 925 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA sequence of soluble HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted TCR beta chain from clone M10B7/D3 fused to the c-fos leucine zipper domain and a BirA biotinylation tag. <400> 58 atgaacgctg gtgtcactca gaccccaaaa ttccaggtcc tgaagacagg acagagcatg 60 acactgcagt gtgcccagga tatgaaccat gaatacatgt cctggtatcg acaagaccca 120 ggcatggggc tgaggctgat tcattactca gttggtgctg gtatcactga ccaaggagaa 180 gtccccaatg gctacaatgt ctccagatca accacagagg atttcccgct caggctgctg 240 tcggctgctc cctcccagac atctgtgtac ttctgtgcca gcagttacca ggaggggggg 300 ttttacgagc agtacttcgg gccgggcacc aggctcacgg tcacagagga cctgaaaaac 360 gtgttcccac ccgaggtcgc tgtgtttgag ccatcagaag cagagatctc ccacacccaa 420 aaggccacac tggtgtgcct ggccacaggc ttctaccccg accacgtgga gctgagctgg 480 tgggtgaatg ggaaggaggt gcacagtggg gtcagcacag acccgcagcc cctcaaggag 540 cagcccgccc tcaatgactc cagatacgct ctgagcagcc gcctgagggt ctcggccacc 600 ttctggcagg acccccgcaa ccacttccgc tgtcaagtcc agttctacgg gctctcggag 660 aatgacgagt ggacccagga tagggccaaa cccgtcaccc agatcgtcag cgccgaggcc 720 tggggtagag cagaccccgg gggtctgact gatacactcc aagcggagac agatcaactt 780 gaagacaaga agtctgcgtt gcagaccgag attgccaatc tactgaaaga gaaggaaaaa 840 ctagagttca tcctggcagc ttacggatcc ggtggtggtc tgaacgatat ttttgaagct 900 cagaaaatcg aatggcatta agctt 925 <210> 59 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Amino acid sequence of soluble HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted TCR beta chain from clone M10B7/D3 fused to the c-fos leucine zipper domain and a BirA biotinylation tag. <400> 59 Met Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr 1 5 10 15 Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr 20 25 30 Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His 35 40 45 Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly 50 55 60 Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Tyr 85 90 95 Pro Gly Gly Gly Phe Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu 100 105 110 Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val 115 120 125 Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu 130 135 140 Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp 145 150 155 160 Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln 165 170 175 Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser 180 185 190 Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His 195 200 205 Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp 210 215 220 Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala 225 230 235 240 Trp Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu 245 250 255 Thr Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala 260 265 270 Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr 275 280 285 Gly Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu 290 295 300 Trp His 305 <210> 60 <211> 928 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated DNA sequence of soluble HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted TCR beta chain from clone A6 fused to the c-fos leucine zipper domain and a BirA biotinylation tag. <220> <223> Description of Artificial Sequence:Mutated DNA sequence of soluble HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted TCR beta chain from clone A6 fused to the c-fos leucine zipper domain and a BirA biotinylation tag. <400> 60 atgaacgctg gtgtcactca gaccccaaaa ttccaggtcc tgaagacagg acagagcatg 60 acactgcagt gtgcccagga tatgaaccat gaatacatgt cctggtatcg acaagaccca 120 ggcatggggc tgaggctgat tcattactca gttggtgctg gtatcactga ccaaggagaa 180 gtccccaatg gctacaatgt ctccagatca accacagagg atttcccgct caggctgctg 240 tcggctgctc cctcccagac atctgtgtac ttctgtgcca gcaggccggg actagcggga 300 gggcgaccag agcagtactt cgggccgggc accaggctca cggtcacaga ggacctgaaa 360 aacgtgttcc cacccgaggt cgctgtgttt gagccatcag aagcagagat ctcccacacc 420 caaaaggcca cactggtgtg cctggccaca ggcttctacc ccgaccacgt ggagctgagc 480 tggtgggtga atgggaagga ggtgcacagt ggggtcagca cagacccgca gcccctcaag 540 gagcagcccg ccctcaatga ctccagatac gctctgagca gccgcctgag ggtctcggcc 600 accttctggc aggacccccg caaccacttc cgctgtcaag tccagttcta cgggctctcg 660 gagaatgacg agtggaccca ggatagggcc aaacctgtca cccagatcgt cagcgccgag 720 gcctggggta gagcagaccc cgggggtctg actgatacac tccaagcgga gacagatcaa 780 cttgaagaca agaagtctgc gttgcagacc gagattgcca atctactgaa agagaaggaa 840 aaactagagt tcatcctggc agcttacgga tccggtggtg gtctgaacga tatttttgaa 900 gctcagaaaa tcgaatggca ttaagctt 928 <210> 61 <211> 307 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of mutated soluble HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted TCR beta chain from clone A6 fused to the c-fos leucine zipper domain and a BirA biotinylation tag. <220> <223> Description of Artificial Sequence:Amino acid sequence of mutated soluble HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted TCR beta chain from clone A6 fused to c-fos leucine zipper domain and a BirA biotinylation tag. <400> 61 Met Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr 1 5 10 15 Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr 20 25 30 Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His 35 40 45 Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly 50 55 60 Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Arg Pro 85 90 95 Gly Leu Ala Gly Gly Arg Pro Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg 100 105 110 Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 115 120 125 Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr 130 135 140 Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 145 150 155 160 Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro 165 170 175 Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu 180 185 190 Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn 195 200 205 His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 210 215 220 Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu 225 230 235 240 Ala Trp Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala 245 250 255 Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile 260 265 270 Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala 275 280 285 Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile 290 295 300 Glu Trp His 305 <210> 62 <211> 190 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of the c-fos-BirA biotinylation tag fusion partner used for TCR beta chains. <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA sequence of the c-fos-BirA biotinylation tag fusion partner used for TCR beta chains. <400> 62 cccgggggtc tgactgatac actccaagcg gagacagatc aacttgaaga caagaagtct 60 gcgttgcaga ccgagattgc caatctactg aaagagaagg aaaaactaga gttcatcctg 120 gcagcttacg gatccggtgg tggtctgaac gatatttttg aagctcagaa aatcgaatgg 180 cattaagctt 190 <210> 63 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Amino acid sequence of the c-fos-BirA biotinylation tag fusion partner used for TCR beta chains. <400> 63 Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Leu Glu 1 5 10 15 Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu 20 25 30 Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His 50 55 60 <210> 64 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer used for PCR amplification of the v-beta-c-fos leucine zipper fragment of the Influenza Matrix peptide/HLA-A0201 restricted human JM22 TCR fusion gene. <220> <223> Description of Artificial Sequence:Reverse primer used for PCR amplification of the v-beta-c-fos leucine zipper fragment of the Influenza Matrix peptide/HLA-A0201 restricted human JM22 TCR fusion gene <400> 64 acacacggat ccgtaagctg cgacgatgaa ctcgattttc tt 42 <210> 65 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Gene coding for human HLA-A2/flu matrix peptide restricted JM22 TCR alpha chain fused to c-jun leucine zipper domain. <400> 65 atgcaactac tagaacaaag tcctcagttt ctaagcatcc aagagggaga aaatctcact 60 gtgtactgca actcctcaag tgttttttcc agcttacaat ggtacagaca ggagcctggg 120 gaaggtcctg tcctcctggt gacagtagtt acgggtggag aagtgaagaa gctgaagaga 180 ctaacctttc agtttggtga tgcaagaaag gacagttctc tccacatcac tgcggcccag 240 cctggtgata caggcctcta cctctgtgca ggagcgggaa gccaaggaaa tctcatcttt 300 ggaaaaggca ctaaactctc tgttaaacca aatatccaga accctgaccc tgccgtgtac 360 cagctgagag actctaaatc cagtgacaag tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct 420 caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta 480 gacatgaggt ctatggactt caagagcaac agtgctgtgg cctggagcaa caaatctgac 540 tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc attattccag aagacacctt cttccccagc 600 ccagaaagtt cccccggggg tagaatcgcc cggctggagg aaaaagtgaa aaccttgaaa 660 gctcagaact cggagctggc gtccacggcc aacatgctca gggaacaggt ggcacagctt 720 aaacagaaag tcatgaacta ctag 744 <210> 66 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Amino acid sequence of human HLA-A2/flu matrix peptide restricted JM22 TCR alpha chain fused to c-jun leucine zipper domain. <400> 66 Met Gln Leu Leu Glu Gln Ser Pro Gln Phe Leu Ser Ile Gln Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Leu Thr Val Tyr Cys Asn Ser Ser Ser Val Phe Ser Ser Leu 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Gln Glu Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu Val Thr 35 40 45 Val Val Thr Gly Gly Glu Val Lys Lys Leu Lys Arg Leu Thr Phe Gln 50 55 60 Phe Gly Asp Ala Arg Lys Asp Ser Ser Leu His Ile Thr Ala Ala Gln 65 70 75 80 Pro Gly Asp Thr Gly Leu Tyr Leu Cys Ala Gly Ala Gly Ser Gln Gly 85 90 95 Asn Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Lys Pro Asn Ile 100 105 110 Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser 115 120 125 Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val 130 135 140 Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu 145 150 155 160 Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser 165 170 175 Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile 180 185 190 Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Pro Gly Gly Arg 195 200 205 Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser 210 215 220 Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu 225 230 235 240 Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr 245 <210> 67 <211> 864 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Gene coding for human HLA-A2/flu matrix peptide restricted JM22 TCR beta chain fused to c-fos leucine zipper domain. <400> 67 atggtggatg gtggaatcac tcagtcccca aagtacctgt tcagaaagga aggacagaat 60 gtgaccctga gttgtgaaca gaatttgaac cacgatgcca tgtactggta ccgacaggac 120 ccagggcaag ggctgagatt gatctactac tcacagatag taaatgactt tcagaaagga 180 gatatagctg aagggtacag cgtctctcgg gagaagaagg aatcctttcc tctcactgtg 240 acatcggccc aaaagaaccc gacagctttc tatctctgtg ccagtagttc gaggagctcc 300 tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca cagaggacct gaaaaacgtt 360 ttcccacccg aggtcgctgt gtttgaacca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420 gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg 480 gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag 540 cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600 tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660 gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720 ggtagagcag accccggggg tctgactgat acactccaag cggagacaga tcaacttgaa 780 gacaagaagt ctgcgttgca gaccgagatt gccaatctac tgaaagagaa ggaaaaacta 840 gagttcatcc tggcagctta ctag 864 <210> 68 <211> 287 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Amino acid sequence of human HLA-A2/flu matrix peptide restricted JM22 TCR beta chain fused to c-fos leucine zipper domain. <400> 68 Met Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys 1 5 10 15 Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp 20 25 30 Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu 50 55 60 Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val 65 70 75 80 Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Ser 85 90 95 Ser Arg Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr 100 105 110 Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe 115 120 125 Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val 130 135 140 Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp 145 150 155 160 Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro 165 170 175 Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser 180 185 190 Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe 195 200 205 Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr 210 215 220 Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp 225 230 235 240 Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr 245 250 255 Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn 260 265 270 Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr 275 280 285 <210> 69 <211> 918 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Gene coding for human HLA-A2/flu matrix peptide restricted JM22 TCR beta chain fused to c-fos leucine zipper domain and BirA biotinylation tag. <400> 69 atggtggatg gtggaatcac tcagtcccca aagtacctgt tcagaaagga aggacagaat 60 gtgaccctga gttgtgaaca gaatttgaac cacgatgcca tgtactggta ccgacaggac 120 ccagggcaag ggctgagatt gatctactac tcacagatag taaatgactt tcagaaagga 180 gatatagctg aagggtacag cgtctctcgg gagaagaagg aatcctttcc tctcactgtg 240 acatcggccc aaaagaaccc gacagctttc tatctctgtg ccagtagttc gaggagctcc 300 tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca cagaggacct gaaaaacgtt 360 ttcccacccg aggtcgctgt gtttgaacca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420 gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg 480 gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag 540 cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600 tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660 gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720 ggtagagcag accccggggg tctgactgat acactccaag cggagacaga tcaacttgaa 780 gacaagaagt ctgcgttgca gaccgagatt gccaatctac tgaaagagaa ggaaaaacta 840 gagttcatcc tggcagctta cggatccggt ggtggtctga acgatatttt tgaagctcag 900 aaaatcgaat ggcattaa 918 <210> 70 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Amino acid sequence of human HLA-A2/flu matrix peptide restricted JM22 TCR beta chain fused to c-fos leucine zipper domain and BirA biotinylation tag. <400> 70 Met Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys 1 5 10 15 Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp 20 25 30 Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu 50 55 60 Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val 65 70 75 80 Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Ser 85 90 95 Ser Arg Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr 100 105 110 Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe 115 120 125 Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val 130 135 140 Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp 145 150 155 160 Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro 165 170 175 Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser 180 185 190 Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe 195 200 205 Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr 210 215 220 Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp 225 230 235 240 Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr 245 250 255 Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn 260 265 270 Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr Gly 275 280 285 Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp 290 295 300 His 305 <210> 71 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Gene coding for human HLA-A2/HTLV-1 Tax peptide restricted TCR alpha chain from clone A6 fused to the c-jun leucine zipper domain. <400> 71 atgcagaagg aagtggagca gaactctgga cccctcagtg ttccagaggg agccattgcc 60 tctctcaact gcacttacag tgaccgaggt tcccagtcct tcttctggta cagacaatat 120 tctgggaaaa gccctgagtt gataatgtcc atatactcca atggtgacaa agaagatgga 180 aggtttacag cacagctcaa taaagccagc cagtatgttt ctctgctcat cagagactcc 240 cagcccagtg attcagccac ctacctctgt gccgttacaa ctgacagctg ggggaaattg 300 cagtttggag cagggaccca ggttgtggtc accccagata tccagaaccc tgaccctgcc 360 gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg tctgcctatt caccgatttt 420 gattctcaaa caaatgtgtc acaaagtaag gattctgatg tgtatatcac agacaaaact 480 gtgctagaca tgaggtctat ggacttcaag agcaacagtg ctgtggcctg gagcaacaaa 540 tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga caccttcttc 600 cccagcccag aaagttcccc cgggggtaga atcgcccggc tggaggaaaa agtgaaaacc 660 ttgaaagctc agaactcgga gctggcgtcc acggccaaca tgctcaggga acaggtggca 720 cagcttaaac agaaagtcat gaactactag 750 <210> 72 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Amino acid sequence of human HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted TCR alpha chain from clone A6 fused to the c-jun leucine zipper domain. <400> 72 Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu 1 5 10 15 Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln 20 25 30 Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile 35 40 45 Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala 50 55 60 Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser 65 70 75 80 Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Thr Asp Ser 85 90 95 Trp Gly Lys Leu Gln Phe Gly Ala Gly Thr Gln Val Val Val Thr Pro 100 105 110 Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys 115 120 125 Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr 130 135 140 Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr 145 150 155 160 Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala 165 170 175 Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser 180 185 190 Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Pro Gly 195 200 205 Gly Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln 210 215 220 Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala 225 230 235 240 Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr 245 <210> 73 <211> 928 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Gene coding for human HLA-A2/HTLV-1 Tax peptide restricted TCR beta chain from clone A6 fused to the c-fos leucine zipper domain and BirA biotinylation tag. <400> 73 atgaacgctg gtgtcactca gaccccaaaa ttccaggtcc tgaagacagg acagagcatg 60 acactgcagt gtgcccagga tatgaaccat gaatacatgt cctggtatcg acaagaccca 120 ggcatggggc tgaggctgat tcattactca gttggtgctg gtatcactga ccaaggagaa 180 gtccccaatg gctacaatgt ctccagatca accacagagg atttcccgct caggctgctg 240 tcggctgctc cctcccagac atctgtgtac ttctgtgcca gcaggccggg actagcggga 300 gggcgaccag agcagtactt cgggccgggc accaggctca cggtcacaga ggacctgaaa 360 aacgtgttcc cacccgaggt cgctgtgttt gagccatcag aagcagagat ctcccacacc 420 caaaaggcca cactggtgtg cctggccaca ggcttctacc ccgaccacgt ggagctgagc 480 tggtgggtga atgggaagga ggtgcacagt ggggtcagca cagacccgca gcccctcaag 540 gagcagcccg ccctcaatga ctccagatac gctctgagca gccgcctgag ggtctcggcc 600 accttctggc agaacccccg caaccacttc cgctgtcaag tccagttcta cgggctctcg 660 gagaatgacg agtggaccca ggatagggcc aaacctgtca cccagatcgt cagcgccgag 720 gcctggggta gagcagaccc cgggggtctg actgatacac tccaagcgga gacagatcaa 780 cttgaagaca agaagtctgc gttgcagacc gagattgcca atctactgaa agagaaggaa 840 aaactagagt tcatcctggc agcttacgga tccggtggtg gtctgaacga tatttttgaa 900 gctcagaaaa tcgaatggca ttaagctt 928 <210> 74 <211> 307 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Amino acid sequence of human HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted TCR beta chain from clone A6 fused to the c-fos leucine zipper domain and BirA biotinylation tag. <400> 74 Met Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr 1 5 10 15 Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr 20 25 30 Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His 35 40 45 Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly 50 55 60 Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Arg Pro 85 90 95 Gly Leu Ala Gly Gly Arg Pro Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg 100 105 110 Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 115 120 125 Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr 130 135 140 Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 145 150 155 160 Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro 165 170 175 Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu 180 185 190 Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn 195 200 205 His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 210 215 220 Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu 225 230 235 240 Ala Trp Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala 245 250 255 Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile 260 265 270 Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala 275 280 285 Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile 290 295 300 Glu Trp His 305 <210> 75 <211> 765 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Gene coding for human HLA-A2/HTLV-1 Tax peptide restricted TCR alpha chain from clone M10B7/D3 fused to the c-jun leucine zipper domain. <400> 75 atgcaacaga agaatgatga ccagcaagtt aagcaaaatt caccatccct gagcgtccag 60 gaaggaagaa tttctattct gaactgtgac tatactaaca gcatgtttga ttatttccta 120 tggtacaaaa aataccctgc tgaaggtcct acattcctga tatctataag ttccattaag 180 gataaaaatg aagatggaag attcactgtc ttcttaaaca aaagtgccaa gcacctctct 240 ctgcacattg tgccctccca gcctggagac tctgcagtgt acttctgtgc agcaatggag 300 ggagcccaga agctggtatt tggccaagga accaggctga ctatcaaccc aaatatccag 360 aaccctgacc ctgccgtgta ccagctgaga gactctaaat ccagtgacaa gtctgtctgc 420 ctattcaccg attttgattc tcaaacaaat gtgtcacaaa gtaaggattc tgatgtgtat 480 atcacagaca aaactgtgct agacatgagg tctatggact tcaagagcaa cagtgctgtg 540 gcctggagca acaaatctga ctttgcatgt gcaaacgcct tcaacaacag cattattcca 600 gaagacacct tcttccccag cccagaaagt tcccccgggg gtagaatcgc ccggctggag 660 gaaaaagtga aaaccttgaa agctcagaac tcggagctgg cgtccacggc caacatgctc 720 agggaacagg tggcacagct taaacagaaa gtcatgaact actag 765 <210> 76 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Amino acid sequence of human HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted TCR alpha chain from clone M10B7/D3 fused to the c-jun leucine zipper domain. <400> 76 Met Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln Asn Ser Pro Ser 1 5 10 15 Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Leu Asn Cys Asp Tyr Thr 20 25 30 Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys Tyr Pro Ala Glu 35 40 45 Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys Asp Lys Asn Glu 50 55 60 Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser Ala Lys His Leu Ser 65 70 75 80 Leu His Ile Val Pro Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ala Met Glu Gly Ala Gln Lys Leu Val Phe Gly Gln Gly Thr Arg 100 105 110 Leu Thr Ile Asn Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln 115 120 125 Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp 130 135 140 Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr 145 150 155 160 Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser 165 170 175 Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn 180 185 190 Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro 195 200 205 Glu Ser Ser Pro Gly Gly Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys 210 215 220 Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu 225 230 235 240 Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr 245 250 <210> 77 <211> 925 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Gene coding for human HLA-A2/HTLV-1 Tax peptide restricted TCR beta chain from clone M10B7/D3 fused to the c-fos leucine zipper domain and BirA biotinylation tag. <400> 77 atgaacgctg gtgtcactca gaccccaaaa ttccaggtcc tgaagacagg acagagcatg 60 acactgcagt gtgcccagga tatgaaccat gaatacatgt cctggtatcg acaagaccca 120 ggcatggggc tgaggctgat tcattactca gttggtgctg gtatcactga ccaaggagaa 180 gtccccaatg gctacaatgt ctccagatca accacagagg atttcccgct caggctgctg 240 tcggctgctc cctcccagac atctgtgtac ttctgtgcca gcagttacca ggaggggggg 300 ttttacgagc agtacttcgg gccgggcacc aggctcacgg tcacagagga cctgaaaaac 360 gtgttcccac ccgaggtcgc tgtgtttgag ccatcagaag cagagatctc ccacacccaa 420 aaggccacac tggtgtgcct ggccacaggc ttctaccccg accacgtgga gctgagctgg 480 tgggtgaatg ggaaggaggt gcacagtggg gtcagcacag acccgcagcc cctcaaggag 540 cagcccgccc tcaatgactc cagatacgct ctgagcagcc gcctgagggt ctcggccacc 600 ttctggcagg acccccgcaa ccacttccgc tgtcaagtcc agttctacgg gctctcggag 660 aatgacgagt ggacccagga tagggccaaa cccgtcaccc agatcgtcag cgccgaggcc 720 tggggtagag cagaccccgg gggtctgact gatacactcc aagcggagac agatcaactt 780 gaagacaaga agtctgcgtt gcagaccgag attgccaatc tactgaaaga gaaggaaaaa 840 ctagagttca tcctggcagc ttacggatcc ggtggtggtc tgaacgatat ttttgaagct 900 cagaaaatcg aatggcatta agctt 925 <210> 78 <211> 306 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 78 Met Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr 1 5 10 15 Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr 20 25 30 Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His 35 40 45 Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly 50 55 60 Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Tyr 85 90 95 Pro Gly Gly Gly Phe Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu 100 105 110 Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val 115 120 125 Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu 130 135 140 Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp 145 150 155 160 Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln 165 170 175 Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser 180 185 190 Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His 195 200 205 Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp 210 215 220 Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala 225 230 235 240 Trp Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu 245 250 255 Thr Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala 260 265 270 Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr 275 280 285 Gly Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu 290 295 300 Trp His 305 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <223> Peptide derived from Influenza virus Matrix protein and presented as peptide antigen by HLA-A0201. This HLA/peptide combination restricts the JM22 TCR. <400> 79 Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <220> <223> Peptide derived fromHIV-1 Gag protein and presented as peptide antigen by HLA-A0201. This HLA/peptide combination restricts the cloned TCR from patient 003. <400> 80 Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu 1 5 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <223> Peptide derived from Influenza virus nucleoprotein and presented as peptide antigen by the murine H2-Db. This HLA/peptide combination restricts the murine F5 TCR. <400> 81 Ala Ser Asn Glu Asn Met Asp Ala Met 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Human T-cell lymphotropic virus type 1 <220> <223> Peptide derived from HTLV-1 Tax protein and presented as peptide antigen by HLA-A0201. This HLA/peptide combination restricts the A6 and B7 TCRs. <400> 82 Leu Leu Phe Gly Tyr Pro Val Tyr Val 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <223> Peptide derived from HIV-1 Pol protein and presented as peptide antigen by HLA-A0201. <400> 83 Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val 1 5 <210> 84 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer for PCR amplification of the human Vbeta17 chain fused to the BirA biotinylation tag. <400> 84 gctctagaca tatgggccca gtggattctg gagtcac 37 <210> 85 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer for PCR amplification of the human Vbeta17 chain fused to the BirA biotinylation tag. <400> 85 gggggaagct taatgccatt cgattttctg agcttcaaaa atatcgttca gaccaccacc 60 ggatccgtaa gctgccagga tgaactctag 90

Claims (21)

  1. i) 제1 이종 C-말단 이량체화 펩티드를 보유한 재조합 T 세포 수용체(TCR) α 또는 γ쇄 세포외 도메인; 및
    ii) 제1 이량체화 펩티드와 특이적으로 헤테로이량체화하여 헤테로이량체 도메인을 형성하는 제2 C-말단 이량체화 펩티드를 보유한 재조합 TCR β 또는 δ쇄 세포외 도메인을 포함하는 리폴딩된 재조합 TCR로서,
    천연 TCR에서 세포질 도메인에 인접한 α쇄와 β쇄간에, 또는 γ쇄와 δ쇄간에 존재하는 이황화 결합이 없는 것인 리폴딩된 재조합 TCR.
  2. i) 제1 이종 C-말단 이량체화 펩티드를 보유한 재조합 TCR α 또는 γ쇄 세포외 도메인; 및
    ii) 제1 이량체화 펩티드와 특이적으로 헤테로이량체화하여 헤테로이량체 도메인을 형성하는 제2 C-말단 이량체화 펩티드를 보유한 재조합 TCR β 또는 δ쇄 세포외 도메인을 포함하는 생물학적 활성이 있는 재조합 T 세포 수용체(TCR)로서,
    천연 TCR에서 세포질 도메인에 인접한 α쇄와 β쇄간에, 또는 γ쇄와 δ쇄간에 존재하는 이황화 결합이 없는 것인 생물학적 활성이 있는 재조합 TCR.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 헤테로이량체화 도메인이 감겨진 코일(coiled coil) 도메인인 것인 재조합 TCR.
  4. 제3항에 있어서, 이량체화 펩티드가 c-jun 및 c-fos 이량체화 펩티드인 것인 재조합 TCR.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, TCR쇄와 헤테로이량체화 펩티드 사이에 위치한 가요성 링커를 포함하는 것인 재조합 TCR.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 대장균(E. coli) 발현계에서 발현되는 것인 재조합 TCR.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, C-말단에서 비오티닐화된 것인 재조합 TCR.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 검출 가능한 표지로 표지된 것인 재조합 TCR.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 독성제 또는 면역 자극제를 비롯한 치료제에 결합된 것인 재조합 TCR.
  10. 제1항 또는 제2항에 따른 재조합 TCR의 재조합 TCR쇄를 암호화하는 핵산 서열.
  11. 제10항에 있어서, 대장균 발현 벡터내에 존재하는 것인 핵산 서열.
  12. i) 제1 이종 C-말단 이량체화 펩티드를 보유한 재조합 TCR α 또는 γ쇄 세포외 도메인, 및
    ii) 제1 이량체화 펩티드와 특이적으로 헤테로이량체화하여 헤테로이량체 도메인을 형성하는 제2 C-말단 이량체화 펩티드를 보유한 재조합 TCR β 또는 δ쇄 세포외 도메인을 발현시키는 단계; 및
    시험관내에서 상기 쇄들을 함께 리폴딩하여 TCR 헤테로이량체를 생성하는 단계를 포함하는, 재조합 비-막 결합형 TCR을 제조하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 리폴딩을 용해제를 포함하는 리폴딩 완충액 중에서 수행하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 용해제가 0.1 M 이상 농도의 우레아인 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 용해제가 약 5 M 농도의 우레아인 것인 방법.
  16. 제12항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 쇄들을 리폴딩 수행 전에 변성 완충액 중에서 변성시키는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 변성 완충액이 환원제로서 DTT 또는 구아니딘을 함유하는 것인 방법.
  18. 제12항에 있어서, TCR이 제1항 또는 제2항에 따른 재조합 TCR인 것인 방법.
  19. 제12항에 따른 방법에 의해 생산된 재조합 TCR로서, 천연 TCR에서 세포질 도메인에 인접한 α쇄와 β쇄간에, 또는 γ쇄와 δ쇄간에 존재하는 이황화 결합이 없는 것인 재조합 TCR.
  20. 제19항에 따른 TCR을 다수 포함하는 다량체.
  21. 삭제
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