KR20220031046A - 펩타이드-mhc 복합체 - Google Patents

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토마스 홀버그 블리셔
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이뮤노코어 리미티드
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Abstract

본 발명은 펩타이드-HLA-E 복합체와 같은 안정화된 펩타이드-MHC (pMHC) 복합체를 제공한다. 상기 복합체는 펩타이드의 C 말단 앵커 잔기와 MHC 결합 홈의 F 포켓 내의 아미노산 잔기 사이에 디설파이드 결합과 같은 비-고유 연결을 갖는다.

Description

펩타이드-MHC 복합체
본 발명은 펩타이드-MHC (pMHC) 복합체에 관한 것이다. 특히, 이는 안정화되고 고유형 (native-like) TCR 인식을 유지하는 pMHC 복합체에 관한 것이다.
MHC 분자는 T 세포에 내인성 및 외인성 항원성 펩타이드를 제시함으로써 면역 감시에 중요한 역할을 한다. MHC 부류 I 복합체는 2개의 서브유닛, 3개의 세포외 도메인 (α1, α2 및 α3), 막관통 도메인 및 세포질 꼬리로 이루어진 중쇄, 및 생체내 모든 부류 I 분자의 발현에 필요한 β2 마이크로글로불린 (β2M)이라고 하는 경쇄로 구성된다. 중쇄의 α1 및 α2 도메인은 함께 구조적으로 배열되어 펩타이드 결합 홈을 형성하는 2개의 알파 나선이 측면에 위치된 8개의 역-평행 β 스탠드 (stand)의 플랫폼을 형성한다. MHC 부류 I 분자는 일반적으로 약 8 내지 10개 아미노산의 펩타이드에 결합한다. MHC 부류 II 복합체는 부류 I 복합체와 유사한 전체 구조를 공유하지만, 펩타이드 결합 홈이 두 서브유닛으로부터 형성되고, 일반적으로 11 내지 30개 아미노산의 범위에 있는 더 긴 펩타이드를 수용하기 위해 보다 개방된 배치를 갖는다. MHC 복합체의 결합 홈은 포켓 A 내지 F로 지정된 6개의 포켓 또는 서브사이트로 분할되는 것으로 간주될 수 있다. 결합 홈 (A 및 F)의 각 단부에 있는 포켓은 고도로 보존되고, 광범위한 수소 결합 네트워크를 통해 펩타이드의 N 및 C 말단 앵커 잔기와 결합하는 역할을 한다. 다른 포켓은 다형성이므로 펩타이드 상호작용의 특이성을 결정하는 역할을 한다 (Matsumura et al., Science. 1992 Aug 14;257(5072):927-34).
단리된 pMHC 복합체는 면역학 연구 및 다양한 치료적 양식의 개발에 필수적인 도구이지만; 일부 경우에 펩타이드는 MHC에 약하게 결합하므로 빠르게 해리된다. 이는 MHC 다량체로 T 세포 반응을 계수하는 것과 같이 안정한 복합체에 의존하는 방법론에 문제를 제기할 수 있다. pMHC 복합체 불안정성은 비-고전적인 인간 MHC 부류 I 분자인 HLA-E에 결합하는 펩타이드에 특히 문제가 되는 것으로 나타난다.
고전적 MHC 분자와 달리, HLA-E는 거의 독점적으로 두 가지 대립유전자 형태인 E*01:01 및 E*01:03으로만 존재하고, 이들은 하나의 아미노산만 다르다. 이러한 이유로, HLA-E가 제시하는 펩타이드는, 고도로 다형성인 고전적 MHC 분자를 표적화하는 데 내재된 문제를 우회하기 때문에 면역 요법을 위한 매력적인 표적이 된다. 정상적인 조건 하에서, HLA-E는 다른 HLA 부류 I 분자로부터 절단된 리더 서열 펩타이드를 면역 감시의 방법으로서 NK 세포에 결합시키고 제시한다. 특정 감염원에 의해 유발되거나 종양 조직 내의 항원 처리 기구 (antigen processing machinery)의 결함은 NK 세포에 의한 표적화된 사멸을 유도하고, HLA-E 펩타이드 레퍼토리의 증가와 결합되어 잠재적으로 T-세포 면역 감시를 가능하게 한다. HLA-E가 예를 들어, 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) 또는 HIV로부터 유래된 다수의 박테리아 및 바이러스 펩타이드를 제시할 수 있고, 이들 펩타이드 HLA-E 복합체가 CD8+ T-세포를 자극할 수 있다는 증거가 증가하고 있다 (van Hall et al., Microbes Infect. 2010 Nov;12(12-13):910-8; Joosten et al., PLoS Pathog. 2010 Feb 26;6(2):e1000782; Joosten et al., J Immunol Res. 2016;2016:2695396; Hansen et al., Science. 2016 Feb 12;351(6274):714-20; Nattermann et al., Antivir Ther. 2005;10(1):95-107; Nattermann et al., Am J Pathol. 2005 Feb;166(2):443-53). HLA-E의 역할은 영장류 (primate)(Wu et al., J Immunol. 2018 Jan 1;200(1):49-60) 및 마우스 (Oliveira et al., J Exp Med. 2010 Jan 18;207(1):207-21)를 포함하는 다양한 포유동물에 걸쳐 보존되는 것으로 나타난다. 펩타이드 HLA-E 복합체를 표적으로 하는 면역치료 접근법을 이용하려는 노력은 HLA-A*02와 같은 고전적 부류 I 복합체와 비교하여 단리된 펩타이드 HLA-E 복합체의 안정성이 좋지 못하기 때문에 방해를 받았다. 예를 들어, 단리된 펩타이드 HLA-E 복합체의 불안정성은 복합체를 특이적으로 인식하는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 항체-기반 치료제의 동정 및 후속 전개를 방해할 수 있다.
단리된 pMHC 복합체를 안정화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 문헌 [US8992937; WO2013030620; Truscott J Immunol. 2007 May 15;178(10):6280-9; Mitaksov et al., Chem Biol. 2007 Aug;14(8):909-22]을 참조함). 그러나, 본 발명자들은 이러한 접근법이 HLA-E를 포함하는 복합체를 포함하는 pMHC 복합체를 고유형 TCR 결합을 유지하는 방식으로 안정화시키는 데 적합하지 않음을 밝혀냈다. 본 발명은 고유형 TCR 인식을 나타내는 안정화된 펩타이드-MHC 복합체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
제1 양태에서, 본 발명은 펩타이드의 C 말단 앵커 잔기와 MHC 결합 홈의 F 포켓 내의 아미노산 잔기 사이의 비-고유 연결을 포함하는 안정화된 펩타이드-MHC (pMHC) 복합체를 제공한다.
본 발명자들은 예기치 않게, pMHC 복합체가 펩타이드의 C 말단 앵커 아미노산 잔기와 MHC 결합 홈의 F 포켓 내의 아미노산 잔기 사이의 비-고유 연결의 도입에 의해 안정화될 수 있음을 밝혀냈다. 상기 연결은 pMHC 복합체가 고유 pMHC 복합체의 3차원 형태를 유지하고 고유 복합체를 인식하는 TCR에 의해 인식될 수 있도록 하는 것이다.
본 발명의 pMHC 복합체는 펩타이드의 C 말단 앵커 잔기와 MHC 결합 홈의 F 포켓 내의 아미노산 잔기 사이의 비-고유 연결이 없는 고유 복합체에 비해 우수한 안정성을 갖는다는 점에서 안정화된다. 안정성은 각각 Biacore 또는 Octet과 같은 당업자에게 널리 공지된 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance; SPR) 또는 생물층 간섭계 (Bio-layer interferometry; BLI) 방법에 의해 평가될 수 있다. 본 발명에 따르는 pMHC 복합체는 고유 pMHC 복합체의 결합 반감기보다 더 긴 결합 반감기를 가질 것이다. 본 발명의 pMHC 복합체의 결합 반감기는 고유 pMHC 복합체의 결합 반감기보다 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배 또는 적어도 5배 더 길 수 있다. 본 발명의 pMHC 복합체에서, 펩타이드는 적어도 3시간의 MHC에 대한 결합 반감기를 가질 수 있다. 바람직하게는, 결합 반감기는 적어도 4시간, 적어도 5시간, 적어도 10시간, 적어도 15시간 또는 적어도 20시간이다. 복합체 안정성을 결정하기 위한 대안적인 접근법에는 열 변성이 포함된다.
본 발명의 pMHC 복합체는 고유 pMHC 복합체의 고유 3차원 형태를 유지한다. 따라서, 이들은 고유 복합체를 인식하는 TCR 또는 TCR-모방 항체와 같은 펩타이드 MHC 결합 모이어티에 의해 인식될 수 있다. 인식은 SPR에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 pMHC 복합체에 대한 결합 모이어티의 친화도는 유사한 조건 하에서 측정될 때 고유 복합체에 대한 결합 모이어티의 친화도와 3배 미만으로 다를 수 있다. 당업자는 특정 고유 pMHC 복합체가 (실온과 같은) 표준 조건 하에서 너무 불안정하여 (예를 들어, 결합 반감기가 아주 짧음) 고유 복합체에 대한 결합 모이어티의 친화도를 측정하여, 본 발명의 복합체에 대한 결합 모이어티의 친화도를 비교하는 것이 불가능할 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 상황에서는 온도를 낮추는 것과 같이 조건을 변경함으로써 친화도를 측정하고 비교하는 것이 가능할 수 있다. 결합 모이어티는 실시예 2B에 제시된 것과 같은 표준 조건 하에서 복합체에 대한 KD가 적어도 100 μM, 적어도 50 μM, 적어도 10 μM, 적어도 1 μM 또는 그 이상일 수 있다.
본 발명의 pMHC 복합체는 MHC 결합 펩타이드의 C 말단 앵커 잔기와 펩타이드 결합 홈의 F 포켓 내의 아미노산 잔기 사이의 비-고유 연결을 포함한다. 이러한 연결은 펩타이드가 결합 홈에서 안정화되도록 하는 것이다. 비-고유 연결은 결합 홈에서 펩타이드의 형태를 교란시키지 않으며, 이는 TCR과 같은 펩타이드 MHC 결합 모이어티에 의해 고유형 방식으로 인식되어야 함을 의미한다. 펩타이드 형태는 x-선 결정학에 의해 결정될 수 있다. 연결은 공유 결합일 수 있다. 공유 결합은 pMHC 결합 홈의 F 포켓 및/또는 펩타이드의 C 말단 앵커 잔기, 바람직하게는 MHC 결합 홈의 F 포켓 및 펩타이드의 C 말단 앵커 잔기 내에 있는 아미노산 잔기를 대체하는 아미노산들 사이에 형성될 수 있다. MHC 결합 홈의 F 포켓 및/또는 C 말단 앵커 잔기 내에 있는 아미노산 잔기를 대체하는 아미노산 중 적어도 하나는 비-천연 아미노산일 수 있다. C 말단 앵커 잔기가 비-천연 아미노산인 경우가 바람직하다. 당업자는 MHC 분자의 어떤 아미노산 위치가 F 포켓 내에 위치되는지 알고 있다 (예를 들어, 문헌 [Matsumura et al., Science. 1992 Aug 14;257(5072):927-34]의 표 I을 참조함). 바람직하게는, 연결은 MHC 결합 펩타이드의 C 말단 앵커 잔기와 MHC 중쇄의 위치 116에 있는 아미노산 잔기 사이에 있다. 대안적으로, MHC 결합 펩타이드의 C 말단 앵커 잔기와 MHC 중쇄의 위치 147에 위치한 아미노산 잔기 사이의 연결이 또한 바람직하다. 연결을 위한 MHC 중쇄 상의 다른 적합한 위치는 위치 81, 124 및 143을 포함한다.
바람직하게는, 비-고유 연결은 디설파이드 결합이다. 이 결합은 MHC 결합 홈의 F 포켓 및/또는 펩타이드의 C 말단 앵커 잔기, 바람직하게는 MHC 결합 홈의 F 포켓 및 펩타이드의 C 말단 앵커 잔기 내에 있는 아미노산 잔기를 대체하는 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 아미노산들 (예컨대 시스테인 또는 이의 유도체) 사이에 형성될 수 있다.
하기 표는 다양한 MHC 부류 I 분자에서 바람직한 시스테인 또는 이의 유도체 돌연변이의 정체성 (identity) 및 위치를 나타낸다. 넘버링은 MHC 중쇄 상의 위치를 지칭한다.
Figure pct00001
가장 바람직한 돌연변이는 위치 116 또는 위치 147에서의 시스테인 또는 이의 유도체 치환이다. 특히 바람직한 돌연변이는 HLA-E의 위치 F116 또는 위치 S147에서의 시스테인 또는 이의 유도체 치환을 포함한다. HLA-E에서 시스테인 또는 이의 유도체 치환에 대한 대체 위치는 L81, S143 또는 L124이다.
pMHC 복합체는 2개의 MHC 서브유닛, 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있다. MHC 서브유닛은 하나 또는 둘 다의 서브유닛에 의해 형성된 결합 홈에 결합하는 펩타이드 리간드와 결합한다. 바람직하게는, MHC 복합체는 부류 I MHC 복합체이다. 대안적으로, MHC 복합체는 부류 II MHC 복합체이다. MHC 복합체는 가용성일 수 있다. 가용성 복합체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있으며; 예를 들어, 부류 I 복합체의 중쇄가 절단되어 막관통 및 세포질 영역을 제거할 수 있다. 바람직하게는, MHC 복합체는 인간으로부터 유래한 것으로 MHC 대신 인간 백혈구 항원 (Human Leukocyte Antigen; HLA) 복합체로 명명될 수 있다. 대안적으로, MHC 복합체는 마우스 또는 인간이 아닌 영장류와 같은 다른 종으로부터 유래할 수 있다. MHC 복합체는 고전적이거나 비-고전적일 수 있다. 인간으로부터의 고전적 MHC 복합체에는 중합체 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C가 포함된다. 펩타이드 리간드를 제시하는 비-고전적 MHC 복합체에는 HLA-E, HLA-F 및 HLA-G가 포함된다. 바람직하게는, MHC 복합체는 비-고전적 HLA-E이다.
pMHC 복합체는 천연 MHC 복합체에 비해 MHC 서브유닛 내에 하나 이상의 돌연변이를 함유할 수 있다. 돌연변이에는 치환, 삽입 및 결실이 포함된다. 바람직하게는, 돌연변이는 펩타이드 결합 홈의 F 포켓 내의 하나 이상의 위치에서 이루어진다. 대안적으로 또는 추가적으로, 삽입, 치환 또는 결실을 포함하는 돌연변이가 단리된 복합체의 안정성 또는 결합 모이어티에 의한 인식을 방해하지 않는 한 MHC 내의 다른 위치에서 이루어질 수 있다. 결합 홈의 F 포켓 내의 돌연변이는 하나 이상의 아미노산을 시스테인으로 치환하는 것을 포함한다.
pMHC 복합체는 펩타이드 리간드를 포함하며, 이는 MHC 결합 펩타이드로 명명될 수 있다. MHC 결합 펩타이드의 길이는 8 내지 30개의 아미노산일 수 있다. 펩타이드의 길이는 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 아미노산이거나 더 길 수 있다. 바람직하게는 MHC 결합 펩타이드의 길이는 9개의 아미노산이다. MHC 결합 펩타이드는 천연 MHC 결합 펩타이드 서열의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, MHC 결합 펩타이드는 천연 MHC 결합 펩타이드의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 함유할 수 있다. 돌연변이는 치환, 삽입 및 결실을 포함할 수 있다. 바람직하게는, MHC 결합 펩타이드는 HLA-E 결합 펩타이드이다. 대안적으로 또는 추가적으로, MHC 결합 펩타이드는 다른 MHC 복합체에 결합할 수 있다. 당업계에 공지된 MHC 결합 펩타이드의 많은 예가 있다. MHC 결합 펩타이드는 바이러스 또는 박테리아 단백질을 포함하는 외인성 단백질로부터 유래될 수 있거나 내인성 자가 단백질로부터 유래될 수 있다. 예를 들어 인실리코 (in silico) 예측 (예컨대 SYFPEITHI (Rammensee et al., Immunogenetics (1999) 50: 213-219) 및 NetMHCpan (Jurtz et al., J Immunol. 2017 Nov 1;199(9):3360-3368))을 이용하여 MHC 결합 펩타이드를 동정하고/하거나 질량 분석법을 이용하여 세포 표면으로부터 용리된 펩타이드 MHC 복합체를 동정하는 방법이 당업계에 공지되어 있다.
MHC 결합 펩타이드는 MHC에 대한 결합과 관련된 위치 중 하나 이상에서 돌연변이를 함유할 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, MHC 결합 펩타이드는 앵커 잔기를 함유하고, 이는 펩타이드와 MHC 결합 홈 사이의 상호작용을 안정화시키는 데 관여한다. MHC 부류 I의 결합 홈은 보존된 티로신 잔기에 의해 양쪽 단부가 폐쇄되어 결합된 펩타이드의 크기가 일반적으로 8 내지 10개의 잔기로 제한되고, 펩타이드의 C-말단 단부가 MHC의 F-포켓 내에 도킹된다. 앵커 잔기의 위치 및 정체성은 공지되어 있다 (Falk et al., Nature. 1991 May 23;351(6324):290-6). 예를 들어, HLA-A2에 결합하는 펩타이드의 앵커 잔기는 위치 2 및 9에 위치된다. 앵커 잔기에 대한 유사한 위치가 HLA-E 결합 펩타이드에서 발견되었다 (Lampen et al., Mol Immunol. 2013 Jan;53(1-2):126-31). 일반적으로 앵커 위치에서 아미노산의 정체성은 고정되거나 제한된 변형을 나타낸다. 모든 MHC 결합 펩타이드의 경우, C 말단 앵커 잔기는 소수성이고, 이의 측쇄는 MHC 결합 홈의 심부 소수성 F 포켓 내에 수용된다. 바람직하게는, 본 발명에서 MHC 결합 펩타이드는 C 말단 앵커 잔기 (P9 또는 PΩ로 나타냄)에서 돌연변이된다. MHC 결합 펩타이드가 HLA-E에 결합하는 경우, C 말단 앵커 잔기는 펩타이드의 위치 9에 있을 수 있다. HLA-E에 결합하는 펩타이드는 P9에서 류신에 대한 강한 선호도를 갖는다. 돌연변이는 천연 아미노산 시스테인과 같은 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 아미노산으로의 치환일 수 있거나, 대안적으로 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 비-천연 아미노산으로의 치환일 수 있다.
MHC 결합 홈의 F 포켓 및/또는 펩타이드의 C 말단 앵커 잔기 내에 있는 아미노산 잔기를 대체하는 아미노산들 중 적어도 하나는 비-천연 아미노산일 수 있고, 이는 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 비-천연 아미노산일 수 있다. 펩타이드의 C 말단 앵커 잔기가 그렇게 치환되는 것이 바람직하다.
디설파이드 결합을 형성할 수 있는 바람직한 비-천연 아미노산의 예에는 추가적인 (예를 들어, 1개 또는 2개의) 메틸 기를 포함하는 연장된 탄소 측쇄를 갖는 호모시스테인 및 호모시스테인의 유사체가 포함된다. 바람직한 예로는 본 명세서에서 "h3C"로서 지칭되는 (예컨대 Chem-Impex International Inc. 카탈로그 번호 29777 또는 Iris Biotech GmbH 카탈로그 번호 #917883-62-6으로 제공됨) 2-아미노-5-설파닐-펜탄산 및 본 명세서에서 "h4C"로서 지칭되는 (이는 예를 들어 Creative Chemistry Solutions에서 맞춤형 합성으로서 수득될 수 있음) 2-아미노-6-설파닐헥사노익산이 포함된다. h3C 및 h4C를 포함하는 비-천연 아미노산은 D 또는 L 이성질체 형태일 수 있다.
Figure pct00002
Figure pct00003
다음은 각각 호모시스테인, h3C 및 h4C의 화학적 구조를 나타낸다:
Figure pct00004
h3C 및 h4c의 연장된 탄소 측쇄는 그것과 시스테인 잔기 사이에 형성되는 디설파이드 브리지의 길이가 증가됨을 의미한다. 다음은 cys-cys에 비해 H3C 또는 H4C와 cys 사이에 형성되는 디설파이드 브리지의 길이가 증가됨을 보여주는 개략도이다.
Figure pct00005
이는 펩타이드의 C 말단 앵커 잔기가 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 이들 비-천연 아미노산들 (바람직하게는 h3C 또는 h4C) 중 하나로 치환되고, MHC 결합 홈의 F 포켓 내의 아미노산 (바람직하게는 잔기 116 또는 147)이 시스테인으로 치환되는 것이 바람직하다.
이러한 정보를 고려해 보면, 당업자는 어떤 비-천연 아미노산 (h3C 또는 h4C)이 펩타이드의 C 말단 앵커 잔기로 치환되어야 하는지 그리고 MKC 결합 홈의 F 포켓 내의 어떤 잔기 (116 또는 147)가 시스테인으로 치환되어야 하는지를 결정할 수 있다. 이는 펩타이드의 C 말단 앵커 위치에 있는 h3C와 HLA-E의 위치 147에 있는 시스테인 사이 또는 펩타이드의 C 말단 앵커 위치에 있는 h4C와 HLA-E의 위치 116에 있는 시스테인 사이에 디설파이드 결합이 형성되는 것이 바람직하다. 대안적으로, 디설파이드 결합은 펩타이드의 C 말단 앵커 위치에 있는 h3C와 HLA-E의 위치 116에 있는 시스테인 사이 또는 펩타이드의 C 말단 앵커 위치에 있는 h4C와 HLA-E의 위치 147에 있는 시스테인 사이에 형성된다.
pMHC 복합체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, MHC 복합체는 박테리아 발현 시스템에서 재조합적으로 생산되고, 합성 펩타이드로 시험관내에서 리폴딩된다. 적합한 방법은 Garboczi 등에 제공되어 있고 (Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Apr 15;89(8):3429-33), 본 명세서의 실시예 1에 추가로 기재되어 있다. MHC 결합 펩타이드는 합성적으로 생산될 수 있고, 이는 화학적으로 합성됨을 의미한다. 합성 펩타이드의 제조 방법, 특히 메리필드 (Merrifield) 합성으로도 공지된 고상 펩타이드 합성 (solid phase peptide synthesis; SPPS)이 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 복합체는 단리되고/되거나 실질적으로 순수한 형태일 수 있다. 예를 들어, 복합체는 다른 폴리펩타이드 또는 단백질이 실질적으로 없는 형태로 제공될 수 있다. pMHC 복합체는 가용성 형태일 수 있고, 이는 MHC 복합체가 절단되어 막관통 및 이의 세포질 영역을 제거할 수 있음을 의미한다.
본 발명의 pMHC 복합체는 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 이들은 치료 모이어티에 융합되고/되거나, 고체 지지체에 부착되고/되거나, 비오틴 태그와 같은 태그에 융합되고/되거나 다량체 형태일 수 있다. 태그는 C 말단일 수 있다.
본 발명의 pMHC 복합체는 치료 효과를 유도할 수 있는 모이어티와 (공유적으로 또는 다른 방식으로) 결합될 수 있다. 이러한 모이어티는 면역원성인 것으로 공지된 캐리어 단백질일 수 있다. 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin; KLH) 및 소 혈청 알부민이 백신 조성물에 사용되는 적합한 캐리어 단백질의 예이다. 대안적으로, 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드-MHC 복합체는 융합 파트너와 결합될 수 있다. 융합 파트너는 검출 목적을 위해, 또는 상기 복합체를 고체 지지체에 부착하기 위해, 또는 pMHC 올리고머화를 위해 사용될 수 있다. pMHC 복합체는, 예를 들어 BirA 효소를 사용하여 비오틴이 추가될 수 있는 비오틴화 부위를 포함할 수 있다 (O'Callaghan et al., 1999 Jan 1;266(1):9-15). 다른 적합한 융합 파트너에는 형광성 또는 발광성 표지, 방사성 표지, 핵산 프로브 및 조영제, 항체 또는 검출 가능한 생성물을 생산하는 효소가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 검출 방법에는 유세포 분석, 현미경 검사, 전기 영동 또는 섬광 계수가 포함될 수 있다. 융합 파트너에는 사이토카인, 예컨대 인터루킨 2, 인터페론 알파 및 과립구-대식세포 집락 자극 인자가 포함될 수 있다.
단리된 펩타이드 MHC 복합체는 적합한 고체 지지체에 부착하여 고정될 수 있다. 고체 지지체의 예에는 비드, 멤브레인, 세파로스, 자기 비드, 플레이트, 튜브, 칼럼이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 펩타이드-MHC 복합체는 ELISA 플레이트, 자기 비드 또는 표면 플라즈몬 공명 바이오센서 칩에 부착될 수 있다. 펩타이드-MHC 복합체를 고체 지지체에 부착시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 친화성 결합 쌍, 예를 들어 비오틴 및 스트렙타비딘 또는 항체 및 항원을 사용하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 펩타이드-MHC 복합체는 비오틴으로 표지되고 스트렙타비딘-코팅된 표면에 부착된다.
제2 양태에서, 본 발명은 제1 양태의 복합체의 다량체를 제공한다.
본 발명의 pMHC 복합체는 다량체 형태, 예를 들어 이량체, 또는 사량체, 또는 오량체, 또는 팔량체, 또는 그 이상일 수 있다. 다량체 펩타이드 MHC 복합체의 생산에 적합한 방법의 예는 문헌 [Greten et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2002 Mar;9(2):216-20] 및 그 안의 참고 문헌 및 문헌 [Wooldridge et al., Immunology (2009) 126(2):147-64)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 펩타이드-MHC 다량체는 비오틴 잔기로 태깅되고 형광 표지된 스트렙타비딘을 통해 복합화된 펩타이드-MHC를 사용하여 생산될 수 있다. 대안적으로, 다량체 폴리펩타이드-MHC 복합체는 분자 스캐폴드로서 면역글로불린을 사용하여 형성될 수 있다. 이 시스템에서, MHC 분자의 세포외 도메인은 짧은 아미노산 링커에 의해 분리된 면역글로불린 중쇄의 불변 영역과 융합된다. 폴리펩타이드-MHC 다량체는 또한 덱스트란과 같은 담체 분자를 사용하여 생산되었다 (WO02072631). 다량체 펩타이드 MHC 복합체는 결합력 효과 (avidity effect)로 인해 상기 복합체에 결합하는 T 세포 수용체와 같은 결합 모이어티의 검출을 개선시키는 데 유용할 수 있다.
제3 양태에서, 본 발명은 펩타이드의 C 말단 아미노산 앵커 잔기와 MHC 결합 홈의 F 포켓 내의 아미노산 잔기 사이에 비-고유 연결을 형성하는 단계를 포함하는 제1 양태의 안정화된 pMHC 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 유용한 MHC를 생산하는 편리한 방법은 발현 시스템에서 핵산을 사용하여 MHC를 암호화하는 핵산을 발현시키는 것이다. 본 발명은 본 발명에 유용한 안정화된 MHC를 암호화하는 단리된 핵산을 추가로 제공한다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함한다. 당업자는 본 발명에 유용한 안정화된 MHC를 여전히 제공하는 이러한 핵산에 대한 치환, 결실 및/또는 첨가를 결정할 수 있을 것이다.
본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 적어도 하나의 핵산을 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 작제물을 제공한다. 본 발명은 또한 상기와 같은 하나 이상의 작제물을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 언급한 바와 같이, 본 발명에 유용한 안정화된 MHC를 암호화하는 핵산은, 안정화된 MHC에 대해 암호화된 핵산으로부터의 발현을 포함하는 안정화된 MHC의 생산 방법과 마찬가지로 본 발명의 일 양태를 형성한다. 발현은 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건 하에서 배양함으로써 편리하게 달성될 수 있다. 발현에 의한 생산 후 안정화된 MHC는 임의의 적합한 기술을 사용하여 단리되고/되거나 정제된 후 적절하게 사용될 수 있다. 여러 다른 숙주 세포에서 폴리펩타이드의 클로닝 및 발현을 위한 시스템은 널리 공지되어 있다. 적합한 숙주 세포는 박테리아, 포유류 세포, 효모 및 배큘로바이러스 (baculovirus) 시스템을 포함한다. 이종성 폴리펩타이드의 발현을 위해 당업계에서 이용 가능한 포유류 세포주는 중국 햄스터 난소 세포, 헬라 세포 (HeLa cell), 새끼 햄스터 신장 세포, NSO 마우스 흑색종 세포 및 많은 다른 세포를 포함한다. 일반적이고 바람직한 박테리아 숙주는 이. 콜라이 (E. coli)이다. 이. 콜라이와 같은 원핵 세포에서의 발현은 당업계에 널리 확립되어 있다.
프로모터 서열, 종결 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 적절한 다른 서열을 포함하는 적절한 조절 서열을 함유하는 적합한 벡터가 선택되거나 구축될 수 있다. 벡터는 적절한 경우 플라스미드, 바이러스, 예를 들어 '파지 또는 파지미드 (phagemid)일 수 있다. 추가 세부사항은 예를 들어, 문헌 [Sambrook, et al, 1989. Molecular Cloning: a laboratory manual (Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)]을 참조한다. 예를 들어 핵산 작제물의 제조, 돌연변이 유발, 시퀀싱, DNA의 세포 내로의 도입 및 유전자 발현, 및 단백질 분석에서 핵산의 조작을 위한 많은 공지된 기술 및 프로토콜은 문헌 [Ausubel et al., Short protocols in molecular biology: a compendium of methods from Current protocols in molecular biology (Brooklyn, NY: Green Pub. Associates: New York, NY: Wiley)]에 자세히 기재되어 있다.
따라서, 본 발명의 추가 양태는 본 명세서에 개시한 핵산을 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 또 다른 양태는 이러한 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 도입은 임의의 이용 가능한 기술을 이용할 수 있다. 진핵 세포의 경우, 적합한 기술에는 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공, 리포솜 매개 형질감염, 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스, 예를 들어 백시니아 또는 곤충 세포의 경우, 배큘로바이러스를 사용한 형질도입이 포함될 수 있다. 박테리아 세포의 경우, 적합한 기술에는 염화칼슘 형질전환, 전기천공 및 박테리오파지를 사용한 형질감염이 포함될 수 있다. 도입 후에, 예를 들어 유전자의 발현을 위한 조건 하에서 숙주 세포를 배양함으로써 핵산으로부터 발현을 유발하거나 허용할 수 있다. 본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈 (예를 들어, 염색체) 내로 통합될 수 있다. 통합은 표준 기술에 따라 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열을 포함시킴으로써 촉진될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 안정화된 MHC를 발현시키기 위해 발현 시스템에서 상기 언급한 작제물을 사용하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한,
제1 양태의 복합체를 T 세포 수용체 (TCR), TCR 모방 항체 또는 T 세포의 집단과 결합시키는 단계; 및
복합체에 결합하는 TCR, TCR 모방 항체 또는 T 세포를 동정하는 단계
를 포함하는 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 각 양태의 바람직한 특징은 다른 양태 각각에 대해 준용된다. 본 명세서에 언급한 선행 기술 문서는 법률이 허용하는 최대 범위까지 포함된다.
본 발명은 이제 다음의 비제한적인 실시예 및 도면을 참조하여 설명될 것이다:
도 1은 시간 경과에 따른 ILT2 결합 손실로 결정된 바와 같은 표시된 pMHC 복합체의 안정성을 나타낸다. 고유 pHLA-E 복합체는 제한된 안정성을 나타낸다.
도 2는 기존 방법론을 사용하여 안정화된 고유 pMHC 복합체와 등가 pMHC 복합체 사이의 TCR 인식의 차이를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 고유 pMHC 복합체와 등가 안정화된 pMHC 복합체 사이의 TCR 인식의 차이를 나타낸다.
실시예
실시예 1 - 단리된 펩타이드 HLA-E 복합체는 안정성이 제한된다
본 실시예는 단리된 펩타이드 HLA-E 복합체가 짧은 반감기를 가지고 있음을 입증하고, 이는 TCR 및 항체와 같은 결합제의 동정 및 특징화에 사용하기에 충분히 안정적이지 않음을 의미한다. 적어도 4시간의 반감기가 일반적으로 이러한 목적을 위해 바람직하고, 실질적으로 이를 초과하는 반감기가 바람직하다.
안정성은 Joosten 등 (PLoS Pathog. 2010 Feb 26;6(2):e1000782) 및 Hansen 등 (Science. 2016 Feb 12;351(6274):714-20)에 각각 기재된 MTB 및 HIV 펩타이드뿐만 아니라 HLA-A*02 및 HLA-Cw3으로부터의 리더 펩타이드에 상응하는 2개의 자가 펩타이드 (self peptide)를 포함하는, HLA-E에 의해 제시되는 것으로 공지된 다수의 펩타이드를 사용하여 평가됐다.
방법
펩타이드
Peptide Protein Research Ltd에서 펩타이드를 화학적 합성으로 수득했고, 사용하기 전에 DMSO에 4 mg/ml의 농도로 용해시켰다.
HLA-E*01:01 및 HLA-E*01:03 펩타이드 복합체의 생산
E.coli에서 HLA-E 중쇄 및 베타 2-마이크로글로불린(β2m)을 봉입체로서 별도로 발현했고, 후속적으로 이전에 기재한 방법을 사용하여 리폴딩하고 정제했다 (Garboczi et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Apr 15;89(8):3429-33). HLA-E 중쇄에는 C-말단 비오틴화 태그 (AviTagTM GLNDIFEAQKIEWHE)가 포함되어 있었고, 막관통 및 세포질 도메인이 제외되어 있었다. 간략하게, HLA-E 중쇄 및 β2m을 관심 펩타이드와 함께 30:5:2의 비율로 혼합하고 리폴딩했다. 이어서, 가용성 리폴딩 pHLA를 음이온 교환에 이어 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 포함하는 2-단계 프로토콜을 사용하여 정제했다. 비오틴화 복합체를 생산하기 위해, 문헌 [O'Callaghan et al., Anal Biochem. 1999 Jan 1;266(1):9-15]에 기재한 바와 같이 비오틴-단백질 리가제 (BirA)를 사용하는 음이온 교환 후 및 SEC 전에 비오틴화 단계를 포함했다.
HLA-E * 01:03 중쇄 고유 + AviTag TM 의 서열 및 강조된 F116
MGSHSLKYFHTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWMHGCELGPDGRFLRGYEQ F AYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAEHQRAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPGSGGGLNDIFEAQKIEWHE
HLA-E * 01:03 중쇄 고유 + AviTag TM 의 서열 및 강조된 S147
MGSHSLKYFHTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWMHGCELGPDGRFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQK S NDASEAEHQRAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPGSGGGLNDIFEAQKIEWHE
AviTagTM 및 이의 GSGG 링커의 서열은 밑줄이 그어져 있고, F116 및 S147은 굵은 밑줄로 표시되어 있다.
인간 베타 -2 마이크로글로불린의 서열
MIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM
펩타이드-HLA 복합체 안정성 평가
BIAcore T200 기기를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 (SPR)으로 펩타이드-HLA-E 복합체의 안정성을 평가했다. 약 500 내지 1000 반응 유닛 (RU)의 정제된 비오틴화된 펩타이드-HLA-E 단량체를 스트렙타비딘-커플링된 CM-5 시리즈 S 센서 칩에 포획했다. 1 μM의 농도로 가용성, 친화도가 강화된 형태의 Ig-유사 전사체 2 수용체 (ILT2)를 10 ㎕ min-1의 유속으로 60초 동안 칩의 표면 위로 유동시켰다. ILT2는 형태 의존적 방식으로 부류 I HLA 분자에 결합하므로 복합체 안정성의 지표로서 사용된다. pHLA-E 복합체에 대한 ILT2 결합을 5시간의 시간에 걸쳐 일정한 간격으로 측정했고, 이어서 펩타이드-HLA를 함유하지 않는 대조군 유동 세포에서 벌크 완충제 반응을 빼서 ILT2 결합에 대한 반응을 정규화했다. 결합 반감기 (T1/2)를 BIA T200 평가 소프트웨어 및 GraphPad Prism 8을 사용하여 시간에 대한 % 활성을 플롯팅함으로써 계산했다.
결과
아래 표 1은 ILT2 결합으로 결정된 바와 같은 HLA-E*01:03과의 복합체에서 표시된 펩타이드 각각에 대한 반감기 (T1/2)를 제공한다. 모든 복합체의 반감기는 5시간 미만이고, 몇몇 복합체의 반감기는 1시간 미만이다. 결합 데이터의 대표적인 예는 도 1 (좌측 패널)에 제공된다.
[표 1]
Figure pct00006
이들 데이터는 고유 펩타이드-HLA-E 복합체의 안정성이 제한되고, 이는 결합제의 동정 및 특징화에 적합하지 않음을 나타낸다.
실시예 2 - 펩타이드 HLA-E 복합체는 cys 트랩 방법론을 통해 안정화될 수 있지만 교란된 TCR 결합을 보여준다
A)
본 실시예에서, 위치 Y84에서 시스테인 돌연변이를 포함하도록 HLA-E 중쇄를 변형시켰고; C 말단에서 3개의 추가 아미노산 (Gly-Cys-Gly)을 포함하도록 펩타이드를 변형시켰다. 이러한 접근법은 일반적으로 'Cys 트랩 (Cys trap)'으로서 지칭되고, 결합 홈에 펩타이드를 '포획'함으로써 다양한 HLA 복합체의 안정성을 개선시키는 데 성공적으로 이용됐다 (문헌 [Truscott J Immunol. 2007 May 15;178(10):6280-9; Mitaksov et al., Chem Biol. 2007 Aug;14(8):909-22]에 기재된 바와 같음).
방법
실시예 1에 기재된 것과 동일한 실험 방법을 사용했다.
결과
아래 표 2는 ILT2 결합으로 결정된 바와 같은, 표시된 cys 포획된 펩타이드 HLA-E 복합체 각각에 대한 반감기를 제공한다. 모든 복합체는 실시예 1에 나타낸 변형되지 않은 복합체와 비교하여 실질적으로 연장된 반감기를 나타내며, 대부분은 20시간을 초과한다. 결합 데이터의 대표적인 예는 도 1 (우측 패널)에 제공된다.
[표 2]
Figure pct00007
이들 데이터는 cys 트랩을 포함하는 변형된 펩타이드-HLA-E 복합체의 안정성이 개선됨을 나타낸다.
B)
항원 특이적 TCR에 의한 인식에 대해 MTB 펩타이드 RLPAKAPLL+GCG를 포함하는 Cys-트랩 안정화된 펩타이드-HLA-E 복합체를 후속적으로 시험하고 변형되지 않은 복합체와 비교했다. 변형되지 않은 고유 펩타이드 HLA-E 복합체가 상대적으로 긴 반감기를 가지므로 TCR 결합의 평가에 적합하기 때문에 이러한 펩타이드를 선택했다.
방법
펩타이드-HLA-E 복합체에 대한 TCR 결합 평가
나이브 (naive) 파지 라이브러리에서 MTB 펩타이드 RLPAKAPLL HLA-E 복합체를 인식하는 4개의 TCR을 단리하고 이전에 기재한 바와 같은 가용성 알파 베타 이종이량체로서 준비했다 (Boulter et al., Protein Eng. 2003 Sep;16(9):707-11).
결합 특징화
BIAcore T200 기기를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 (SPR)으로 펩타이드-HLA 복합체에 대한 정제된 가용성 TCR의 결합 분석을 수행했다. 비오틴화된 pHLA-E 분자를 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 관심 펩타이드로 리폴딩했다. 모든 측정을 0.005% 계면활성제 P20이 보충된 Dulbecco의 PBS 완충제에서 25℃에서 수행했다.
비오틴화된 펩타이드-HLA-E 단량체를 스트렙타비딘-커플링된 CM-5 시리즈 S 센서 칩에 고정시켰다. 약 1000 반응 유닛 (RU)의 펩타이드-HLA-E*01:03 복합체로 코팅된 유동 세포 상에서 10 내지 30 ㎕ min-1의 일정한 유속으로 주입된 가용성 TCR의 연속 희석액을 사용하여 평형 결합 상수를 결정했다. 펩타이드-HLA를 함유하지 않는 대조군 유동 세포에서 벌크 완충제 반응을 빼서 각각의 TCR 농도에 대한 평형 반응을 정규화했다. KD 값은 GraphPad Prism 8 소프트웨어와 랭뮤어 (Langmuir) 결합 등온선, 결합 = C*Max/(C + KD)를 사용하는 비선형 곡선 피팅으로 수득됐고, 여기서 "결합"은 주입된 TCR 농도 C에서 RU 단위의 평형 결합이고, Max는 최대 결합이다.
고친화도 상호작용의 경우, 단일 사이클 동력학 분석으로 결합 파라미터를 결정했다. 50 내지 60 ㎕ min-1의 유속을 사용하여 약 50 내지 200 RU의 펩타이드-HLA 복합체로 코팅된 유동 세포 상에 5개의 상이한 농도의 가용성 TCR을 주입했다. 일반적으로, 60 내지 200 ㎕의 가용성 TCR을 100 내지 1000 nM의 최고 농도로 주입하고, 연이은 2배 희석액을 다른 4회 주입에 사용했다. 가장 낮은 농도를 먼저 주입했다. 해리 단계 (dissociation phase)를 측정하기 위해, 일반적으로 1 내지 3시간 후에 10% 이상의 해리가 발생할 때까지 완충제를 주입했다. BIAevaluation® 또는 BIAcore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 동력학 파라미터를 계산했다. 해리 단계를 반감기 계산을 가능하게 하는 단일 지수 감쇠 방정식에 피팅했다. koff/kon에서 평형 상수 KD를 계산했다.
결과
도 2에 나타낸 결합 곡선과 함께 아래 표 3에 나타낸 결합 친화도는, 항원 특이적 TCR이 고유의 안정화되지 않은 펩타이드 HLA-E 복합체를 인식할 수 있는 반면, cys 트랩 안정화된 복합체의 인식은 실질적으로 감소되고 일부 경우에서는 검출 수준 미만임을 나타낸다.
[표 3]
Figure pct00008
ND - 낮은 결합 수준, 동력학 파라미터를 결정할 수 없음.
이들 데이터는, cys 트랩 접근법이 안정화된 복합체를 생산하지만, TCR 인식도 교란시킴을 나타낸다. 이는 추가 잔기의 혼입 및 디설파이드 결합의 형성으로 인한 펩타이드 또는 MHC의 구조적 변경 때문일 수 있다. 따라서 이러한 접근법은 TCR과 같은 결합제의 동정 및 특징화를 위한 안정화된 펩타이드 HLA-E 복합체의 생산에 적합하지 않다.
실시예 3 - TCR 인식의 최소 교대로 안정한 펩타이드 HLA-E 복합체의 생산
A)
본 실시예에서, HLA-E 중쇄의 펩타이드 결합 홈과 펩타이드의 C 말단 앵커 잔기 사이에 신규 조작된 디설파이드 결합을 포함하도록 펩타이드 HLA-E 복합체를 변형시켰다.
신규 디설파이드를 생성하기 위해, MTB 펩타이드 RLPAKAPLL 펩타이드의 P9 앵커 잔기를 비-천연 아미노산 L-3-C 호모시스테인 (2-아미노-5-설파닐-펜탄산)(RLPAKAPL-h3C)으로 변형시키고, HLA-E 중쇄를 위치 F116 또는 위치 S147 중 어느 하나의 위치에서 시스테인으로 돌연변이시켰다.
방법
펩타이드 HLA-E 복합체를 준비하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 안정성을 평가했다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 TCR 결합을 평가했다.
결과
아래 표 4는 신규 디설파이드가, 고유 복합체에 비해 복합체의 더 긴 반감기에 의해 표시된 바와 같이 안정성의 상당한 개선을 야기했음을 입증한다.
[표 4]
Figure pct00009
신규 안정화된 펩타이드-HLA-E 복합체가 고유형 TCR 인식을 유지함을 입증하기 위해, 펩타이드 (RLPAKAPLL)-HLA-E 복합체의 개선된 인식을 위해 파지 라이브러리에서 단리된 9개의 상이한 TCR에 대한 결합을 평가했다. 각각의 경우에, 안정화된 복합체에 대한 TCR 결합의 동력학을 고유 복합체와 비교했다.
표 5 및 표 6은 안정화된 복합체 (F116 또는 S147에서 각각 시스테인 돌연변이를 가짐)에 대한 TCR 결합이 모든 경우에서 보존됨을 나타낸다. 각각의 TCR에 대해 안정화된 복합체와 고유 복합체 사이에 결합의 작은 차이만 관찰되고, 이는 펩타이드가 거의 고유형 형태를 채택하고 있음을 나타낸다.
도 3은 표 5의 TCR 중 4개에 대한 결합 곡선을 나타낸다.
[표 5]
Figure pct00010
[표 6]
Figure pct00011
B)
추가 실시예에서, MTB 펩타이드 RLPAKAPLL 펩타이드의 P9 앵커 잔기를 비-천연 아미노산 L-4-C 호모시스테인 (2-아미노-6-설파닐헥사노익산)(RLPAKAPL-h4C)으로 변형시키고, HLA-E 중쇄를 위치 F116 또는 S147에서 시스테인으로 돌연변이시켰다. A 부분에 기재된 바와 같이 복합체 안정성 및 TCR 결합을 평가했다.
결과
생성된 복합체의 결합 반감기는 24.47시간이었고, 이는 신규 디설파이드가 고유 복합체에 비해 안정성에서 상당한 개선을 야기했음을 입증한다(표 4에 나타낸 바와 같음). 6가지 TCR에 대해 TCR 결합을 평가했다. 6가지 경우 모두에서 안정화된 복합체에 대한 TCR 결합은 보존됐다. 고유 복합체에 대한 결합의 차이는 F116이 있는 디설파이드의 경우 1.53 내지 3.24배의 범위였고, S147이 있는 디설파이드의 경우 1.11 내지 2.83배의 범위였다.
[표 7]
Figure pct00012
<110> Immunocore Limited <120> Peptide-MHC complexes <130> P124659WO <140> PCT/EP2020/068491 <141> 2020-07-01 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Biotinylation tag <400> 1 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 1 5 10 15 <210> 2 <211> 296 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Biotinylation-tagged HLA-E <400> 2 Met Gly Ser His Ser Leu Lys Tyr Phe His Thr Ser Val Ser Arg Pro 1 5 10 15 Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr 20 25 30 Gln Phe Val Arg Phe Asp Asn Asp Ala Ala Ser Pro Arg Met Val Pro 35 40 45 Arg Ala Pro Trp Met Glu Gln Glu Gly Ser Glu Tyr Trp Asp Arg Glu 50 55 60 Thr Arg Ser Ala Arg Asp Thr Ala Gln Ile Phe Arg Val Asn Leu Arg 65 70 75 80 Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu 85 90 95 Gln Trp Met His Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Gly Arg Phe Leu Arg 100 105 110 Gly Tyr Glu Gln Phe Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Thr Leu Asn 115 120 125 Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Val Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser 130 135 140 Glu Gln Lys Ser Asn Asp Ala Ser Glu Ala Glu His Gln Arg Ala Tyr 145 150 155 160 Leu Glu Asp Thr Cys Val Glu Trp Leu His Lys Tyr Leu Glu Lys Gly 165 170 175 Lys Glu Thr Leu Leu His Leu Glu Pro Pro Lys Thr His Val Thr His 180 185 190 His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly 195 200 205 Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Gln Asp Gly Glu Gly 210 215 220 His Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly 225 230 235 240 Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln 245 250 255 Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Val Thr 260 265 270 Leu Arg Trp Lys Pro Gly Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu 275 280 285 Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 290 295 <210> 3 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala 1 5 10 15 Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His 20 25 30 Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu 35 40 45 Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr 50 55 60 Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala 65 70 75 80 Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp 85 90 95 Asp Arg Asp Met 100 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 4 Arg Leu Pro Ala Lys Ala Pro Leu Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 5 Ile Leu Pro Ser Asp Ala Pro Val Leu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 6 Val Met Ala Thr Arg Arg Asn Val Leu 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> human immunodeficiency virus <400> 7 Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> human immunodeficiency virus <400> 8 Arg Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Ile Leu 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Val Leu 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Modified Mycobacterium tuberculosis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Where X is L-3-C homocysteine <400> 11 Arg Leu Pro Ala Lys Ala Pro Leu Xaa 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Modified Mycobacterium tuberculosis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223>Where X is L-4-C homocysteine <400> 12 Arg Leu Pro Ala Lys Ala Pro Leu Xaa 1 5

Claims (15)

  1. 안정화된 펩타이드-MHC (pMHC) 복합체로서, 펩타이드의 C 말단 앵커 잔기와 MHC 결합 홈의 F 포켓 내의 아미노산 잔기 사이의 비-고유 (non-native) 연결을 포함하는, 안정화된 펩타이드-MHC 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 비-고유 연결이 공유 결합인, 복합체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 공유 결합이 MHC 결합 홈의 F 포켓 및/또는 고유 펩타이드의 C 말단 앵커 잔기, 바람직하게는 MHC 결합 홈의 F 포켓 및 고유 펩타이드의 C 말단 앵커 잔기 내에 있는 아미노산 잔기를 대체하는 아미노산들 사이에 형성되는, 복합체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 MHC 결합 홈의 F 포켓 내 치환된 아미노산 잔기가 위치 116 또는 147에 있는, 복합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-고유 연결이 디설파이드 결합인, 복합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 MHC 중쇄의 위치 116 또는 147에 있는 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환되는, 복합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 C-말단 앵커 잔기에 대해 치환된 아미노산이 비-천연 아미노산인, 복합체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 펩타이드의 C 말단 아미노산 앵커 잔기가 연장된 탄소 측쇄를 갖는 호모시스테인의 유사체로 치환되는, 복합체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 호모시스테인의 유사체가 2-아미노-5-설파닐-펜탄산 또는 2-아미노-6-설파닐헥사노익산인, 복합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복합체가 가용성인, 복합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MHC가 비오틴화 태그를 포함하고, 선택적으로 태그가 C 말단인, 복합체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MHC가 HLA-E인, 복합체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 복합체의 다량체.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 청구된 펩타이드-MHC 복합체의 제조 방법으로서, 상기 MHC 중쇄와 상기 펩타이드의 C 말단 아미노산 앵커 잔기 사이에 공유 결합을 형성하는 단계를 포함하는, 제조 방법.
  15. 스크리닝 방법으로서,
    제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 청구된 복합체를 T 세포 수용체 (TCR), TCR 모방 항체 또는 T 세포의 집단과 결합시키는 단계; 및
    상기 복합체에 결합하는 TCR, TCR 모방 항체 또는 T 세포를 동정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
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