CN114174329A - 肽-mhc复合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种稳定化的肽‑MHC(pMHC)复合物，例如肽‑HLA‑E复合物。该复合物具有肽的C端锚定残基和MHC结合槽的F口袋中的氨基酸残基之间的非原始连接，例如二硫键。
Description
本发明涉及肽-MHC(peptide-MHC，pMHC)复合物。具体而言，它涉及稳定化的并保留原始样TCR识别的pMHC复合物。
MHC分子通过向T细胞呈递内源性和外源性抗原肽而在免疫监视中发挥关键作用。MHC I类复合物由两个亚基组成：重链，其由三个胞外结构域(α1、α2和α3)、跨膜结构域和胞质尾区组成；和轻链，其被称为β2微球蛋白(β2 Microglobulin，β2M)，是所有I类分子在体内表达所需要的。重链的α1结构域和α2结构域一起在结构上排列形成这样的平台，该平台由八个反平行的β股组成，β股两侧是两个α螺旋，从而形成肽结合槽。MHC I类分子通常结合具有大约8到10个氨基酸的肽。MHC II类复合物与I类复合物具有相似的整体架构，但肽结合槽由两个亚基形成，并且处于更开放的构型以容纳更长的通常为11个至30个氨基酸的肽。MHC复合物的结合槽可被认为分为六个口袋或亚位点，其指定为口袋A至F。结合槽两端的口袋(A和F)是高度保守的，负责通过广泛的氢键网络与肽的N端和C端锚定残基结合。其他口袋是多态的，因此在确定肽相互作用的特异性中起作用(Matsumura et al.,Science.1992 Aug 14；257(5072):927-34)。
分离的pMHC复合物是免疫学研究和各种治疗方式开发中必不可少的工具；然而，在某些情况下，肽与MHC的结合很弱，因此会迅速解离。这可能对依赖于稳定复合物的方法，例如使用MHC多聚体的T细胞反应的方法构成挑战。pMHC复合物的不稳定性似乎对于与非经典人类MHC I类分子HLA-E结合的肽来说尤其成问题。
与经典的MHC分子不同，HLA-E几乎只以两种等位基因形式存在，即E*01:01和E*01:03，它们仅区别于一个氨基酸。出于这个原因，HLA-E呈递的肽成为免疫治疗的有吸引力的目标，因为它们规避了靶向高度多态性的经典MHC分子所固有的挑战。在正常情况下，HLA-E与从其他HLA I类分子切割的前导序列肽结合并将其呈递到NK细胞，作为免疫监视的一种方法。由某些感染原引起的或肿瘤组织中的抗原加工机制缺陷，会导致NK细胞的靶向杀伤，并与HLA-E肽库的增加相关联，从而潜在地使T细胞免疫监视成为可能。越来越多的证据表明HLA-E可呈递许多细菌肽和病毒肽，例如来自结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)或HIV的肽，并且这些肽HLA-E复合物能够刺激CD8+T细胞(van Hall etal.,Microbes Infect.2010Nov；12(12-13):910-8；Joosten et al.,PLoSPathog.2010Feb 26；6(2):e1000782；Joosten et al.,J Immunol Res.2016；2016:2695396；Hansen et al.,Science.2016Feb 12；351(6274):714-20；Nattermann et al.,Antivir Ther.2005；10(1):95-107；Nattermann et al.,Am J Pathol.2005Feb；166(2):443-53)。HLA-E的作用似乎在一系列哺乳动物中是保守的，包括灵长类动物(Wu et al.,JImmunol.2018Jan 1；200(1):49-60)和小鼠(Oliveira et al.,J Exp Med.2010Jan 18；207(1):207-21)。与经典的I类复合物(如HLA-A*02)相比，分离的肽HLA-E复合物稳定性较差，这阻碍了开发针对肽HLA-E复合物的免疫治疗方法的努力。例如，分离的肽HLA-E复合物的不稳定性会阻碍特异性识别该复合物的T细胞受体(T cell receptor，TCR)或基于抗体的疗法的识别和后续开发。
使分离的pMHC复合物稳定化的方法是本领域已知的(例如，参见US8992937；WO2013030620；Truscott J Immunol.2007May 15；178(10):6280-9；Mitaksov et al.,Chem Biol.2007Aug；14(8):909-22)。然而，发明人已发现此类方法不适于以保留原始样TCR结合的方式使pMHC复合物(包括那些包含HLA-E的复合物)稳定。本发明旨在提供展示出原始样TCR识别的稳定化的肽-MHC复合物。
在第一方面，本发明提供了稳定化的肽-MHC(pMHC)复合物，其包含肽的C端锚定残基和MHC结合槽的F口袋中的氨基酸残基之间的非原始连接。
本发明人意外地发现，通过在肽的C端锚定氨基酸残基和MHC结合槽的F口袋中的氨基酸残基之间引入非原始连接，可使pMHC复合物稳定。这种连接使得pMHC复合物保留了原始pMHC复合物的三维构象，并且可被识别原始复合物的TCR识别。
本发明的pMHC复合物是稳定的，因为它们相对于在肽的C端锚定残基和MHC结合槽的F口袋中的氨基酸残基之间没有非原始连接的原始复合物来说具有优异的稳定性。稳定性可以分别通过本领域技术人员已知的表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)或生物层干涉(Bio-layer interferometry，BLI)方法来评估，例如Biacore或Octet。根据本发明的pMHC复合物将具有比原始pMHC复合物更长的结合半衰期。本发明的pMHC复合物的结合半衰期可以是原始pMHC复合物的结合半衰期的至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍。在本发明的pMHC复合物中，肽与MHC的结合半衰期可以为至少3小时。优选地，结合半衰期为至少4小时、至少5小时、至少10小时、至少15小时或至少20小时。确定复合物稳定性的替代方法包括热变性。
本发明的pMHC复合物保留了原始pMHC复合物的原始三维构象。因此，它们可以被识别原始复合物的肽MHC结合部分(例如TCR或TCR模拟抗体)识别。识别可以由SPR确定。当在可比较的条件下测量时，结合部分对本发明pMHC复合物的亲和力与结合部分对原始复合物的亲和力相差不到3倍。本领域技术人员将会理解，某些原始pMHC复合物在标准条件(例如室温)下非常不稳定(例如具有如此短的结合半衰期)，以至于可能无法测量结合部分对原始复合物的亲和力，从而无法与结合部分对本发明复合物的亲和力进行比较。在这些情况下，可以通过改变条件，例如降低温度，来测量和比较亲和力。在标准条件下，例如实施例2B中列出的那些标准条件，结合部分可以具有至少100μM、至少50μM、至少10μM、至少1μM或更强的对复合物的KD。
本发明的pMHC复合物包含MHC结合肽的C端锚定残基和肽结合槽的F口袋中的氨基酸残基之间的非原始连接。这种连接使得肽在结合槽中被稳定化。非原始连接不会干扰结合槽中肽的构象，这意味着它应该以原始样的方式被肽MHC结合部分(例如TCR)识别。肽构象可以通过X射线晶体学确定。连接可以是共价键。共价键可以在这样的氨基酸之间形成，所述氨基酸取代pMHC结合槽的F口袋和/或肽的C端锚定残基中的氨基酸残基，优选取代MHC结合槽的F口袋和肽的C端锚定残基中的氨基酸残基。取代MHC结合槽的F口袋和/或C端锚定残基中的氨基酸残基的氨基酸中的至少一个可以是非天然氨基酸。如果C末端锚定残基是非天然氨基酸，则是优选的。技术人员知道MHC分子的哪些氨基酸位置位于F口袋中(例如，参见Matsumura et al.,Science.1992 Aug 14；257(5072):927-34的表I)。优选地，所述连接在MHC结合肽的C端锚定残基与MHC重链的第116位氨基酸残基之间。可替代地，还优选的是，在MHC结合肽的C端锚定残基与位于MHC重链第147位的氨基酸残基之间的连接。对于连接，MHC重链上其他的合适位置包括第81、124和143位。
优选地，非原始连接是二硫键。这种键可以在这样的能够形成二硫键的氨基酸(例如半胱氨酸或其衍生物)之间形成，所述氨基酸取代MHC结合槽的F口袋和/或肽的C端锚定残基中的氨基酸残基，优选取代MHC结合槽的F口袋和肽的C端锚定残基中的氨基酸残基。
下表示出了在各种MHC I类分子中的优选的半胱氨酸或其衍生物突变的身份和位置。编号是指MHC重链上的位置。
最优选的突变是在第116或147位的半胱氨酸或其衍生物取代。特别优选的突变包括在HLA-E中在F116位或S147位的半胱氨酸或其衍生物取代。HLA-E中的半胱氨酸或其衍生物取代的替代位置是L81、S143或L124。
pMHC复合物可以包含两个MHC亚基：重链和轻链。MHC亚基与肽配体联结，肽配体与由一个或两个亚基形成的结合槽结合。优选地，MHC复合物是I类MHC复合物。可替代地，MHC复合物是II类MHC复合物。MHC复合物可以是可溶的。制备可溶性复合物的方法是本领域已知的；例如，可以截短I类复合物的重链以去除跨膜区和胞质区。优选地，MHC复合物来自人类并且可以称为人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)复合物来代替MHC。可替代地，MHC复合物可以来自其他物种，例如小鼠或非人灵长类动物。MHC复合物可以是经典的或非经典的。来自人类的经典MHC复合物包括聚合的HLA-A、HLA-B和HLA-C。呈递肽配体的非经典MHC复合物包括HLA-E、HLA-F和HLA-G。优选地，MHC复合物是非经典HLA-E。
相对于天然MHC复合物，pMHC复合物可以在MHC亚基内含有一个或多个突变。突变包括取代、插入和缺失。优选地，在肽结合槽的F口袋内的一个或多个位置处进行突变。可替代地或另外地，可以在MHC内的其他位置进行突变，包括插入、取代或缺失，只要它们不干扰分离的复合物的稳定性或不干扰通过结合部分进行识别即可。结合槽的F口袋中的突变包括将一个或多个氨基酸取代为半胱氨酸。
pMHC复合物包含肽配体，该肽配体可以称为MHC结合肽。MHC结合肽的长度可以为8个至30个氨基酸。肽的长度可以为8、9、10、11、12、13或14个氨基酸或更长。优选地，MHC结合肽的长度为9个氨基酸。MHC结合肽可以具有对应于天然MHC结合肽序列的氨基酸序列。可选择地，MHC结合肽可以含有相对于天然MHC结合肽的氨基酸序列的一个或多个突变。突变可以包括取代、插入和缺失。优选地，MHC结合肽是HLA-E结合肽。可替代地，或另外地，MHC结合肽可以与其他MHC复合物结合。本领域有许多已知的MHC结合肽的例子。MHC结合肽可以来源于包括病毒或细菌蛋白在内的外源蛋白，或者可以来源于内源性自身蛋白。识别MHC结合肽的方法是本领域已知的，例如使用计算机预测(例如SYFPEITHI，(Rammensee et al.,Immunogenetics(1999)50:213-219)和NetMHCpan(Jurtz et al.,J Immunol.2017Nov 1；199(9):3360-3368))和/或使用质谱识别从细胞表面洗脱的肽MHC复合物。
MHC结合肽可以在涉及与MHC结合的一个或多个位置处包含突变。如本领域技术人员已知的，MHC结合肽含有锚定残基，锚定残基参与使肽和MHC结合槽之间的相互作用稳定。MHC I类的结合槽在两端被保守的酪氨酸残基封闭，导致通常将结合肽的大小限制为8个至10个残基，其中肽的C端与MHC的F口袋对接。锚定残基的位置和身份是已知的(Falk etal.,Nature.1991May23；351(6324):290-6)。例如，与HLA-A2结合的肽的锚定残基位于第2位和第9位。对HLA-E结合肽已发现类似的锚定残基的位置(Lampen et al.,MolImmunol.2013Jan；53(1-2):126-31)。通常，锚定位置的氨基酸的身份是固定的，或显示出有限的变化。对于所有的MHC结合肽，C端锚定残基是疏水性的，并且其侧链位于MHC结合槽的深处疏水性F口袋内。优选地，在本发明中，MHC结合肽在C端锚定残基(表示为P9或PΩ)处发生突变。在MHC结合肽与HLA-E结合的情况下，C端锚定残基可以位于肽的第9位。与HLA-E结合的肽在P9处对亮氨酸有强偏好。突变可以是对能够形成二硫键的氨基酸的取代，例如天然氨基酸半胱氨酸，或者可替代地，取代可以是对能够形成二硫键的非天然氨基酸的取代。
取代MHC结合槽的F口袋和/或肽的C端锚定残基中的氨基酸残基的氨基酸中的至少一个可以是非天然氨基酸，该非天然氨基酸可以是能够形成二硫键的非天然氨基酸。如果肽的C端锚定残基被如此取代，则是优选的。
能够形成二硫键的优选非天然氨基酸的实例包括高半胱氨酸和具有延伸的碳侧链(结合额外的(例如一个或两个)甲基)的高半胱氨酸类似物。优选的实例包括：2-氨基-5-硫烷基-戊酸，在本文中称为“h3C”(例如由Chem-Impex International Inc.Cat No 29777或Iris Biotech GmbH Cat.No.#917883-62-6提供)；和2-氨基-6-硫烷基己酸，在本文中称为“h4C”(例如，可从Creative Chemistry Solutions作为委托合成而获得)。非天然氨基酸，包括h3C和h4C，可以是D或L异构体构型。
下面显示了高半胱氨酸、h3C和h4C各自的化学结构：
h3C和h4c的碳侧链延长意味着它与半胱氨酸残基之间形成的二硫键的长度增加。下面是显示H3C或H4C与cys之间形成的二硫键的长度相对于cys-cys增加的示意图。
如果肽的C端锚定残基被能够形成二硫键的这些非天然氨基酸之一(优选h3C或h4C)取代，MHC结合槽的F口袋中的氨基酸(优选残基116或147)被半胱氨酸取代，则是优选的。
鉴于此信息，本领域技术人员可确定哪个非天然氨基酸(h3C或h4C)将被置换到肽的C端锚定残基中以及MKC结合槽的F口袋中的哪个残基(116或147)将被取代为半胱氨酸。如果二硫键形成在肽的C端锚定位置的h3C和HLA-E的第147位的半胱氨酸之间，或形成在肽的C端锚定位置的h4C和HLA-E的第116位的半胱氨酸之间，则是优选的。可替代地，如果二硫键形成在肽的C端锚定位置的h3C和HLA-E的第116位的半胱氨酸之间，或形成在肽的C端锚定位置的h4C和HLA-E的第147位的半胱氨酸之间，则是优选的。
生产pMHC复合物的方法是本领域已知的。通常，MHC复合物在细菌表达系统中重组产生，并在体外用合成肽重折叠。Garboczi等人(Proc Natl Acad Sci U S A.1992Apr 15；89(8):3429-33)提供了一种合适的方法，这在本文的实施例1中进一步描述。MHC结合肽可以合成产生，这意味着它是化学合成的。生产合成肽的方法是本领域已知的，特别是固相肽合成(Slid phase peptide synthesis，SPPS)，也称为Merrifield合成。
本发明的复合物可以是分离的和/或呈基本上纯的形式。例如，复合物可以基本上不含其他多肽或蛋白质的形式提供。pMHC复合物可以是可溶形式，这意味着MHC复合物可以被截短以去除其跨膜区和胞质区。
本发明的pMHC复合物可以被进一步修饰。例如，它们可以与治疗部分融合，和/或与固体支撑物连接，和/或与标签(例如生物素标签)融合，和/或为多聚体形式。标签可以是C端标签。
本发明的pMHC复合物可以(共价地或以其他方式)与能够引起治疗效果的部分联结。这种部分可以是已知具有免疫原性的载体蛋白。匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpethemocyanin，KLH)和牛血清白蛋白是用于疫苗组合物的合适的载体蛋白的例子。可替代地，本发明的多肽和/或多肽-MHC复合物可以与融合配偶体联结。融合配偶体可以用于检测目的，或用于将所述复合物连接至固体支撑物，或用于pMHC寡聚化。pMHC复合物可以包含生物素化位点，例如，可使用BirA酶向生物素化位点中添加生物素(O’Callaghan et al.,1999Jan1；266(1):9-15)。其他合适的融合配偶体包括但不限于荧光或发光标记、放射性标记、核酸探针和造影剂、抗体或产生可检测产物的酶。检测方法可以包括流式细胞术、显微镜检查、电泳或闪烁计数。融合配偶体可以包括细胞因子，例如白介素2、干扰素α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。
分离的肽MHC复合物可以通过连接到合适的固体支撑物上来固定。固体支撑物的实例包括但不限于珠、膜、琼脂糖、磁珠、板、管、柱。肽-MHC复合物可以连接到ELISA板、磁珠或表面等离子共振生物传感器芯片。将肽-MHC复合物连接到固相支撑物的方法是技术人员已知的，包括，例如，使用亲和结合对，例如，生物素和链霉亲和素，或抗体和抗原。在优选的实施方式中，肽-MHC复合物用生物素标记并连接到链霉亲和素包被的表面。
在第二方面，本发明提供了第一方面的复合物的多聚体。
本发明的pMHC复合物可以是多聚体形式，例如，二聚体、或四聚体、或五聚体、或八聚体、或更大的多聚体。Greten et al.,Clin.Diagn.Lab.Immunol.2002 Mar；9(2):216-20and references therein and in Wooldridge et al.,Immunology(2009)126(2):147–64中描述了用于生产多聚的肽MHC复合物的合适方法的实例。通常，肽-MHC多聚体可以使用带有生物素残基标签的肽-MHC来产生，并通过荧光标记的链霉亲和素复合。可替代地，可以通过使用免疫球蛋白作为分子支架来形成多聚的多肽-MHC复合物。在该系统中，MHC分子的胞外结构域与由短氨基酸接头隔开的免疫球蛋白重链恒定区融合。多肽-MHC多聚体也已使用载体分子如葡聚糖(WO02072631)生产。由于亲合力作用，多聚的肽MHC复合物可用于改进对与所述复合物结合的结合部分(例如T细胞受体)的检测。
在第三方面，本发明提供了制备第一方面的稳定化的pMHC复合物的方法，该方法包括形成肽的C端锚定残基和MHC结合槽的F口袋中的氨基酸残基之间的非原始连接。
产生用于本发明的MHC的便利方式是，通过在表达系统中使用核酸来表达编码它们的核酸。本发明还提供编码在本发明中使用的稳定化的MHC的分离的核酸。核酸包括DNA和RNA。本领域技术人员能够确定仍将提供可用于本发明中的稳定化的MHC的对此类核酸的取代、缺失和/或添加。
本发明还提供含有至少一种上述核酸的质粒、载体(vector)、转录或表达盒形式的构建体。本发明还提供包括含有一种或多种上述构建体的重组宿主细胞。如上所述，编码可用于本发明中的稳定化的MHC的核酸构成本发明的一个方面；产生该稳定化的MHC的方法也构成本发明的一个方面，该方法包括表达编码该稳定化的MHC的核酸。通过在适当条件下培养含有所述核酸的重组宿主细胞，可以便利地实现表达。通过表达而产生后，可以视情况而定用任何合适的技术来分离和/或纯化稳定化的MHC然后使用。用于多肽在各种不同宿主细胞中克隆和表达的体系是众所周知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。本领域可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NSO小鼠黑色素瘤细胞和许多其他细胞。常见的优选细菌宿主为大肠杆菌(E.coli)。在原核细胞(例如大肠杆菌)中的表达在本领域是完备建立的。
可以选择或构建含有适当调控序列的合适载体，该调控序列视情况而定包括启动子序列、终止子序列、多聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其他序列。载体视情况而定可以是质粒、病毒例如噬菌体或噬菌粒。进一步的细节参见，例如，Sambrook,et al,1989.Molecular Cloning:a laboratory manual(Cold Spring Harbor,N.Y.:ColdSpring Harbor Laboratory,1989)。Ausubel et al.,Short protocols in molecularbiology:a compendium of methods from Current protocols in molecular biology(Brooklyn,NY:Green Pub.Associates:New York,NY:Wiley)中详细描述了许多核酸操作的已知技术和方案，例如核酸构建体的制备、诱变、测序、DNA引入细胞和基因表达以及蛋白分析。
因此，本发明的又一方面提供了一种含有本文所公开的核酸的宿主细胞。在再一个方面中，提供一种方法，该方法包括将这种核酸引入宿主细胞。可以使用任何可用技术进行引入。对于真核细胞，合适的技术可以包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染、和使用反转录病毒或其他病毒(例如痘苗病毒，或对昆虫细胞而言，使用杆状病毒)的转导。对于细菌细胞，合适的技术可以包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体进行转染。引入之后可以引发或允许由该核酸表达，例如通过在该基因的表达条件下培养宿主细胞来进行。本发明的核酸可以被整合到宿主细胞的基因组(例如染色体)中。可以根据标准技术，通过包含促进与该基因组重组的序列来促进整合。本发明还提供一种方法，该方法包括在表达体系中使用上述构建体以表达如上所述的稳定化的MHC。
本发明还提供一种筛选方法，该方法包括：
将第一方面的复合物与T细胞受体(TCR)、TCR模拟抗体或T细胞的群体组合；以及
识别与该复合物结合的TCR、TCR模拟抗体或T细胞。
本发明的每个方面的优选特征在细节上作必要修改后用于每个其他方面。本文提到的现有技术文件在法律允许的最大范围内并入本文。
实施例
现在下面将参照以下非限制性实施例和附图来描述本发明。
图1示出了指定的pMHC复合物的稳定性，其根据ILT2结合随时间推移的丧失确定。原始pHLA-E复合物显示出有限的稳定性。
图2示出了原始pMHC复合物和使用现有方法稳定化的等效pMHC复合物之间TCR识别的差异。
图3示出了原始pMHC复合物和本发明的等效稳定化的pMHC复合物之间TCR识别的差异。
实施例1-分离的肽HLA-E复合物稳定性有限
该实施例显示出分离的肽HLA-E复合物具有较短的半衰期，这意味着它们不够稳定，无法用于识别和表征结合剂，例如TCR和抗体。对于此类目的，至少4小时的半衰期通常是优选的，并且期望半衰期大大超过该值。
使用已知由HLA-E呈递的多种肽来评估稳定性，包括分别在Joosten等人(PLoSPathog.2010 Feb 26；6(2):e1000782)和Hansen等人(Science.2016 Feb 12；351(6274):714-20)中描述的MTB肽和HIV肽，以及对应于来自HLA-A*02和HLA-Cw3的前导肽的两种自身肽。
方法
肽
肽是从Peptide Protein Research Ltd通过化学合成获得的，并在使用前溶解在DMSO中至4mg/ml的浓度。
产生HLA-E*01:01和HLA-E*01:03肽复合物
HLA-E重链和β2-微球蛋白(β2m)各自在大肠杆菌中作为包涵体表达，随后使用先前所述的方法重折叠和纯化(Garboczi et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.1992Apr 15；89(8):3429-33)。HLA-E重链包含C端生物素化标签(AviTagTMGLNDIFEAQKIEWHE)并排除跨膜结构域和胞质结构域。简言之，HLA-E重链和β2m与目标肽以30:5:2的比例混合并重折叠在一起。然后使用包含阴离子交换和随后的尺寸排阻色谱(Size exclusionchromatography，SEC)的两步方案纯化可溶性重折叠的pHLA。为了产生生物素化复合物，如O’Callaghan et al.,Anal Biochem.1999Jan 1；266(1):9-15中所述，在阴离子交换之后且在SEC之前使用生物素-蛋白质连接酶(Biotin-protein ligase，BirA)以包括生物素化步骤。
HLA-E*01:03重链原始+AviTagTM的序列，其中F116突出显示
HLA-E*01:03重链原始+AviTagTM的序列，其中S147突出显示
AviTagTM及其GSGG接头的序列加有下划线，F116和S147以粗体和下划线显示。
人β-2微球蛋白序列
MIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM
肽-HLA复合物稳定性评估
使用BIAcore T200仪器通过表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)评估肽-HLA-E复合物的稳定性。将大约500-1000响应单位(Response unit，RU)的纯化的生物素化肽-HLA-E单体捕获到链霉亲和素偶联的CM-5系列S传感器芯片上。浓度为1μM的可溶性、亲和力增强形式的Ig样转录物2(Ig-like transcript 2，ILT2)受体以10μl min-1的流速流过芯片表面60秒。ILT2以构象依赖性方式与I类HLA分子结合，因此用作复合物稳定性的指标。在5小时的时间过程中每隔一定时间测量ILT2与pHLA-E复合物的结合，然后通过减去不含肽-HLA的对照流动池上的大量缓冲液响应使与ILT2结合的响应标准化。使用BIA T200评估软件和GraphPad Prism 8，通过绘制％活性与时间关系来计算结合半衰期(T1/2)。
结果
下表1提供了与HLA-E*01:03复合的每个指定肽的半衰期(T1/2)，其根据ILT2结合确定。所有复合物的半衰期都在5小时以下，并且若干复合物的半衰期不到1小时。图1(左图)中提供了结合数据的代表性实例。
表1
| 肽源 | 肽序列 | T<sub>1/2</sub>(h)(HLA-E*01:03) |
| MTB(Rv1484) | RLPAKAPLL | 4.50 |
| MTB(Rv3823c) | ILPSDAPVL | 0.70 |
| MTB(Rv 1518) | VMATRRNVL | 0.57 |
| HIV(Gag 275) | RMYSPTSIL | 0.50 |
| HIV(Gag 275) | RMYSPVSIL | 0.27 |
| Self(HLA-Cw3) | VMAPRTLIL | 3.20 |
| Self(HLA-A*02) | VMAPRTLVL | 3.00 |
这些数据表明原始肽-HLA-E复合物的稳定性有限，其不适用于结合剂的识别与表征。
实施例2-肽HLA-E复合物可通过cys陷阱法稳定化，但显示出被干扰的TCR结合
A)
在该实施例中，HLA-E重链被修饰为在Y84位并入半胱氨酸突变；并且肽被修饰以在C端包括三个额外的氨基酸(Gly-Cys-Gly)。这种方法通常被称为“Cys陷阱(Cys trap)”，并已通过“捕捉(trapping)”结合槽中的肽成功地用于提高各种HLA复合物的稳定性(如在Truscott J Immunol.2007May15；178(10):6280-9；Mitaksov et al.,ChemBiol.2007Aug；14(8):909-22中所述的)。
方法
使用与实施例1中所述的相同的实验方法。
结果
下表2提供了每个指定的cys陷阱的肽HLA-E复合物的半衰期，其根据ILT2结合确定的。与实施例1中所示的未修饰的复合物相比，所有复合物都具有显著延长的半衰期，大多数超过20小时。图1(右图)中提供了结合数据的代表性实例。
表2
这些数据表明，掺入半胱氨酸陷阱的修饰肽-HLA-E复合物具有改善的稳定性。
B)
随后测试了包含MTB肽RLPAKAPLL+GCG的Cys陷阱稳定化的肽-HLA-E复合物被抗原特异性TCR识别，并与未修饰的复合物进行比较。选择该肽是因为未修饰的原始肽HLA-E复合物具有相对长的半衰期，因此适合评估TCR结合。
方法
TCR与肽-HLA-E复合物结合的评估
如先前所述，从初始噬菌体文库中分离出四种识别MTB肽RLPAKAPLL HLA-E复合物的TCR，并制备为可溶性αβ异二聚体(Boulter et al.,Protein Eng.2003Sep；16(9):707-11)。
结合表征
使用BIAcore T200仪器通过表面等离子体共振(SPR)进行纯化的可溶性TCR与肽-HLA复合物的结合分析。如上文实施例1中所述，将生物素化的pHLA-E分子与目标肽一起重折叠。所有测量均在25℃下在补充有0.005％表面活性剂P20的Dulbecco's PBS缓冲液中进行。
将生物素化的肽-HLA单体固定在链霉亲和素偶联的CM-5系列S传感器芯片上。使用连续稀释的可溶性TCR/ImmTAC来测定平衡结合常数，该可溶性TCR以10μl/min-1至30μl/min-1的恒定流速注射至涂覆有～1000个响应单位(RU)的肽-HLA-E*01:03复合物的流动池。通过减去不含肽-HLA的对照流动池的本体缓冲液响应，使每个TCR浓度的平衡响应标准化。使用GraphPad Prism 8软件通过非线性曲线拟合以及通过Langmuir结合等温线获得KD值，结合＝C*Max/(C+KD)，其中“结合”是在注射的TCR浓度C下的平衡结合(以RU为单位)，Max是最大结合。
对于高亲和力相互作用，通过单循环动力学分析来确定结合参数。使用50μl/min-1至60μl/min-1的流速，在涂覆有～50RU至200RU的肽-HLA复合物的流动池上注射五种不同浓度的可溶性TCR。通常，以100nM至1000nM的最高浓度注射60μl至200μl可溶性TCR，连续2倍稀释用于其他四次注射。首先注射最低浓度。为了测量解离相，注射缓冲液直至发生≥10％解离，通常在1小时至3小时后。使用
或BIAcore T200评估软件来计算动力学参数。将解离相拟合为单个指数衰减方程，从而能够计算半衰期。平衡常数KD由koff/kon计算。
结果
下表3中给出的结合亲和力以及图2中示出的结合曲线表明，虽然抗原特异性TCR能够识别原始的、非稳定化的肽HLA-E复合物，但对cys陷阱稳定化的复合物的识别显著减少，并且在某些情况下低于检测水平。
表3
ND：低水平的结合，无法确定动力学参数。
这些数据表明，虽然cys陷阱法产生稳定化的复合物，但它也会干扰TCR识别。这可能是由于额外残基的掺入以及二硫键的形成导致肽或MHC的结构改变。因此，这种方法不适用于生产用于识别和表征结合剂(如TCR)的稳定化的肽HLA-E复合物。
实施例3-具有最小的TCR识别变化的稳定的肽HLA-E复合物的生产
A)
在本实施例中，肽HLA-E复合物被修饰，以在HLA-E重链的肽结合槽和肽的C端锚定残基之间掺入新型工程化二硫键。
为了制造新型二硫化物，MTB肽RLPAKAPLL肽的P9锚定残基被修饰为非天然氨基酸L-3-C高半胱氨酸(2-氨基-5-硫烷基-戊酸)(RLPAKAPL-h3C)，并且HLA-E重链在F116位或S147位突变为半胱氨酸。
方法
如实施例1中所述制备肽HLA-E复合物并评估其稳定性。如实施例2中所述评估TCR结合。
结果
下表4表明，如复合物相对于原始复合物具有更长的半衰期所表明的，新型二硫化物导致稳定性的显著改善。
表4
为了证明新型稳定化的肽-HLA-E复合物保留原始样TCR识别，评估了从噬菌体文库中分离出的9种不同TCR的结合，以提高对肽(RLPAKAPLL)-HLA-E复合物的识别。在每种情况下，将TCR与稳定化的复合物结合的动力学与原始复合物进行比较。
表5和表6显示出，TCR与稳定化的复合物(分别在F116或S147处具有半胱氨酸突变)的结合在所有情况下均得以保留。对于每个TCR，在稳定化的复合物和原始复合物之间仅观察到很小的结合差异，这表明肽采用了近原始样构象。
图3示出了表5中四种TCR的结合曲线。
表5
表6
B)
在另一个实施例中，MTB肽RLPAKAPLL肽的P9锚定残基被修饰为非天然氨基酸L-4-C高半胱氨酸(2-氨基-6-硫烷基己酸)(RLPAKAPL-h4C)，并且HLA-E重链在F116或S147位突变为半胱氨酸。如A部分所述评估复合物稳定性和TCR结合。
结果
所得复合物的结合半衰期为24.47小时，表明相对于原始复合物，新型二硫化物导致稳定性的显著改善(如表4所示)。评估了6种TCR的TCR结合。在所有6种情况中，TCR与稳定化的复合物的结合都得以保留。相对于原始复合物，在F116具有二硫化物的结合差异为1.53倍至3.24倍，在S147具有二硫化物的结合差异为1.11倍至2.83倍。
表7
Claims (15)
1.一种稳定化的肽-MHC(pMHC)复合物，包含肽的C端锚定残基和MHC结合槽的F口袋中的氨基酸残基之间的非原始连接。
2.根据权利要求1所述的复合物，其中，所述非原始连接是共价键。
3.根据权利要求2所述的复合物，其中，所述共价键是在这样的氨基酸之间形成，所述氨基酸取代所述MHC结合槽的所述F口袋和/或原始肽的所述C端锚定残基中的氨基酸残基，优选取代在所述MHC结合槽的所述F口袋和所述原始肽的所述C端锚定残基中的氨基酸残基。
4.根据权利要求3所述的复合物，其中，所述MHC结合槽的所述F口袋中被取代的氨基酸残基位于第116或147位。
5.根据前述权利要求中任一项所述的复合物，其中，所述非原始连接是二硫键。
6.根据权利要求5所述的复合物，其中，MHC重链的第116或147位的氨基酸残基被半胱氨酸取代。
7.根据前述权利要求中任一项所述的复合物，其中，取代了所述肽的所述C端锚定残基的所述氨基酸是非天然氨基酸。
8.根据权利要求7所述的复合物，其中，所述肽的所述C端氨基酸锚定残基被具有延长的碳侧链的高半胱氨酸类似物取代。
9.根据权利要求8所述的复合物，其中，所述高半胱氨酸类似物为2-氨基-5-硫烷基-戊酸或2-氨基-6-硫烷基己酸。
10.根据前述权利要求中任一项所述的复合物，其中，所述复合物是可溶的。
11.根据前述权利要求中任一项所述的复合物，其中，所述MHC包括生物素化标签，任选地其中所述标签是C端标签。
12.根据前述权利要求中任一项所述的复合物，其中，所述MHC是HLA-E。
13.一种根据前述权利要求中任一项所述的复合物的多聚体。
14.一种制备如权利要求1至12中任一项所述的肽-MHC复合物的方法，包括在MHC重链和肽的C端氨基酸锚残基之间形成共价键。
15.一种筛选方法，包括：
将如权利要求1至12中任一项所述的复合物与T细胞受体(TCR)、TCR模拟抗体或T细胞的群体组合；以及
识别与所述复合物结合的TCR、TCR模拟抗体或T细胞。
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