CZ20004214A3 - Rozpustný receptor T buněk - Google Patents

Abstract

Řešení se týká rekombinantního rozpustného receptoru T buněk. Receptor T buněk (TCR)je složený do správného prostorového uspořádání a obsahuje rekombinantní extracelulární doménu a nebo g řetězce TCR mající první heterologní C-koncový dimerizační peptid, a rekombinantní extracelulární doménu b nebo d řetězce TCR mající druhý heterologní C-koncový dimerizační peptid, který je specificky heterodimerizován s prvním dimerizačním peptidem, takže vytváří heterodimerizační doménu, což může být doména s konformací svinuté spirály. Řešení dále poskytuje sekvence nukleové kyseliny kódující rekombinantní TCR a způsob přípravy rekombinantních TCR. TCR mohou být označeny detekovatelnou značkou, takže umožňují detekci specifických MLIC-peptidových komplexů. Alternativně mohou být navázány na teapeutické činidlo, jako je např. cytotoxické nebo imunostimulaění činidlo, aby přenesly toto činidlo na místo specifického komplexu MHC-peptid.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká rekombinantního T buněk (TCR), který není vázán na membránu, a způsobu a činidel pro přípravu takových receptorů.

receptoru dále se týká

Dosavadní stav techniky

1. Prezentace antigenu na buněčném povrchu

Molekuly MHC jsou specializované proteinové komplexy, které prezentují krátké proteinové fragmenty, peptidové antigeny, na buněčném povrchu, aby mohly být rozpoznány buněčnou složkou adaptivního imunitního systému.

MHC I.třídy je dimerní proteinový komplexy sestávající z variabilního těžkého řetězce a konstantního lehkého řetězce, β2 mikroglobulinu. MHC I. třídy prezentuje peptidy, které jsou intracelulárně opracovány, navázány do vazebného místa (štěrbiny) v molekule MHC a transportovány na buněčný povrch, kde je komplex zakotven do membrány prostřednictvím těžkého řetězce. Peptidy jsou obvykle dlouhé 8 až 11 aminokyselin, v závislosti na stupni vyklenutí vneseného do peptidu, když se naváže na MHC. Vazebná štěrbina, která je tvořena distálními doménami al a cc2 těžkého řetězce MHC, má „uzavřené konce, což klade značné omezení na délku peptidu, který může být vázán.

MHC II. třídy je také dimerní protein sestávající z řetězce a (těžkého) a β (lehkého), což jsou oba variabilní glykoproteiny, ukotvené v buňce transmembránovými doménami. Podobně jako MHC I. třídy i molekula II. třídy vytváří vazebnou štěrbinu, do které se mohou vkládat delší peptidy obsahující 12 • ·

až 24 aminokyselin. Peptidy jsou přijaty z vnějšího prostředí endocytózou a opracovány před tím, než jsou navázány na komplex

II. třídy, který je pak transportován k buněčnému povrchu.

Každá buňka prezentuje peptidy až v šesti různých molekulách MHC I. třídy a obdobném počtu molekul II. třídy, přičemž celkový počet prezentovaných MHC komplexů je 10⁵ až 10⁶ v jedné buňce. Diverzita peptidů prezentovaných molekulami

1. třídy je obvykle určována na 1000 až 10000, přičemž 90 % r

z nich je přítomno v počtu 100 až 1000 kopií v jedné buňce (Hunt, Michel a kol., 1992, Chicz, Urban a kol 1993, Engelhard, Appella a kol., 1993, Huczko, Bodnar a kol., 1993). Nejhojněji se vyskytující peptidy představují 0,4 až 5 % všech přítomných peptidů, což znamená, že může být přítomno až 20000 identických komplexů. Avšak průměrný počet velmi hojných peptidových komplexů je s velkou pravděpodobností v rozmezí 2000 až 4000 na buňku, a typická prezentační hladina rozpoznatelných epitopů T buněk je v rozmezí 100 až 500 komplexů na buňku (viz přehled Engelhard 1994).

2. Rozpoznávání buněk prezentujících antigen

Celá řada buněk prezentuje antigen, jako je např. MHCpeptid, a buňky mající tuto schopnost jsou označovány jako buňky prezentující antigen (APC). Typ buňky, která prezentuje určitý antigen, je závislý na tom, jak a kde daný antigen _K vstoupil do buňky imunitního systému. K APC patří vmezeřené dendritické buňky nacházející se ve velkém počtu v oblastech * T buněk v lymfatických uzlinách a sleziny, Langerhansovy buňky v kůži, folikulární dendritické buňky v oblastech B buněk v lymfatické tkáni, monocyty, makrofágy a další buňky zárodečné řady monocyt/makrofág, B buňky, T buňky a celá řada dalších buněk jako jsou např. endotelové buňky a fibroblasty, které sice nejsou klasickými APC buňkami, ale mohou fungovat jako APC buňky.

« · · · · ·

APC jsou rozpoznávány podskupinou lymfocytů, které dozrávají v thymu (T buňky), kde procházejí selekčním procesem, který má zajistit, že T buňky rozpoznávající vlastní peptidy budou eradikovány (negativní selekce). Navíc T buňky, které nemají schopnost rozpoznávat varianty MHC, které jsou prezentovány (u člověka HLA haplotypy) nedozrávají (pozitivní selekce).

Rozpoznávání specifických komplexů MHC-peptid T buňkami je zprostředkováno receptory T buněk (TCR), které jsou složeny z řetězce a a β, které jsou oba ukotveny v membráně. V rekombinačním procesu, který je podobný jako u genů protilátek, se geny pro a a β TCR uspořádávají z variabilních, spojovacích, diverzitních a konstantních elementů, čímž vzniká mimořádná diverzita v extracelulárních vazebných doménách (10¹³ až 10¹⁵ různých možností). TCR existují také v různých formách s γ řetězcem a δ řetězcem, ale tyto formy se vyskytují pouze přibližně v 5 % T buněk.

Protilátky a TCR jsou jediné dva typy molekul, které rozpoznávají antigeny specifickým způsobem, a tudíž TCR je jediný receptor pro specifické rozpoznání konkrétního peptidového antigenu prezentovaného MHC, přičemž cizorodý peptid je často jediným signálem abnormality uvnitř buňky.

TCR jsou exprimovány v mimořádné diverzitě, každý TCR je specifický pro jeden nebo několik málo komplexů MHC-peptid. Kontakty mezi TCR a MHC-peptidovými ligandy jsou extrémně krátkodobé, obvykle s poločasem kratším než vteřina. Adheze mezi T buňkami a cílovými buňkami, pravděpodobně TCR/MHC-peptid, využívá mnohé TCR/MHC-peptidové kontakty a také řadu kontaktů koreceptor-ligand.

K rozpoznávání T buňkami dochází tehdy, když T-buňka a buňka prezentující antigen (APC) jsou v přímém fyzickém kontaktu a je iniciováno vznikem vazby mezi antigenněspecifickým TCR a MHC komplexem. TCR je heterodimerní protein na buněčném povrchu patřící do super-rodiny imunoglobulinů, • · · 0 « · · • · · · · ··· • · · 9 · * « · « · ·· · · 9 · » · · • · . « · · «? · • · · · · * · · ··· » » · který je asociován s invariantními proteiny komplexu CD3, který se podílí na zprostředkování signální transdukce. TCR existují ve formách αβ a γδ, které jsou strukturně podobné, ale mají odlišné anatomické lokalizace a pravděpodobně funkce. Extracelulární část receptoru sestává ze dvou konstantních domén proximálně k membráně a dvou variabilních domén distálně od membrány nesoucích vysoce polymorfní smyčky analogické úsekům určujícím komplementaritu (CDR) u protilátek. Právě tyto smyčky, které vytvářejí vazebná místa molekul TCR pro MHC, určují peptidovou specifitu. Ligandy MHC I. a II. třídy jsou proteiny ze superrodiny imunoglobulinů, které jsou ale specializované pro prezentaci antigenů, s vysoce polymorfním místem pro vazbu peptidů, které umožňuje prezentovat různé řady krátkých peptidových fragmentů na povrchu buněk prezentujících antigen (APC).

Nedávno byly strukturálně charakterizovány příklady těchto interakcí (Garboczi, Ghosh a kol, 1996, Garcia, Degano a kol., 1996, Ding, Smith a kol., 1998). Krystalografické studie struktury myších a lidských komplexů pMHC I.třídy s TCR ukázaly diagonální orientaci TCR přes pMHC ligand a také ukázaly nedokonalou prostorovou komplementaritu v oblasti rozhraní. Smyčky CD3 jsou v kontaktu výlučně s peptidovými zbytky. Srovnání struktury TCR s ligandem a bez ligandu vedlo k předpokladu, že existuje jistý stupeň flexibility v CDR smyčkách TCR (Garboczi a Biddison, 1999).

Modely aktivace T buněk se pokoušejí vysvětlit, jak protein-proteinové interakce na rozhraní mezi T buňkou a antigen prezentující buňkou (APC) vyvolají takovou reakci, jako je např. likvidace cílové buňky infikované virem. Fyzikální vlastnosti interakce TCR-pMHC jsou zahrnuty mezi kritické parametry v mnohých z těchto modelů. Například bylo zjištěno, že kvantitativní změny v disociační rychlosti TCR se odrážejí v kvalitativních rozdílech biologického výstupu zapojení receptoru, jako je např. úplná nebo částečná aktivace ·· *♦ ·· φ ··

ΦΦΦΦ 9 Φ · φ « φ * · · φφ φ ΦΦ • ΦΦΦφΦ φ · Φ φ • Φ·Φφ φ φ • ΦΦΦ Φ Φ Φ Φ ΦΦΦ φφ φ

Τ buněk nebo antagonismus (Matsui, Bonifáce a kol., 1994, Rabinowitz, Beeson a kol., 1996, Davis, Bonifáce a kol., 1998).

Bylo ukázáno, že interakce TCR-pMHC mají nízké afinity a relativně pomalou kinetiku. Mnohé studie užívající technologii s biosensory, jako je např. Biacore™ (Willcox, Gao a kol., 1999, Wyer, Willcox a kol., 1999), která je založena na povrchové plazmonové rezonanci (SPR) a umožňuje přímá měření afinity a měření kinetiky protein-proteinových interakcí v reálném čase (Garcia, Scott a kol., 1996, Davis, Bonifáce a kol., 1998). Avšak studované receptory byly buďto alloreaktivní TCR nebo takové receptory, které byly indukovány jako reakce na arteficiální imunogen.

3. Interakce TCR a CD8 s MHC-peptidovými komplexy

Velká část T buněk vymezená komplexy MHC I. třídy s peptidem vyžaduje pro aktivaci také účast receptor CD8, zatímco část T buněk vymezená komplexy MHC II. třídy s peptidem vyžaduje pro aktivaci účast CD4. Přesná funkce těchto koreceptorů (společně působících receptorů) v aktivaci T buněk není dosud známá. Ani kritické mechanismy a parametry určující aktivaci nejsou známé. Avšak jak CD8 tak CD4 mají cytoplazmatické domény, které jsou asociovány s kinázou p56^Ick, která se účastní velmi rané události v aktivaci T buněk, a sice fosforylace tyrosinu. CD8 je dimerní receptor, exprimovaný buďto ve formě act nebo v častější formě αβ. CD4 je monomer. V receptorů CD8 je pouze a řetězce asociován s p56^Ick.

Nedávná stanovení fyzikálních vlastností rozhodných pro vazbu TCR a CD8 na MHC, získaná pomocí rozpustných verzí receptorů, ukázala, že navázání TCR je dominantní událostí pro rozpoznávání. TCR má významně vyšší afinitu pro MHC než koreceptory (Willcox, Gao a kol., 1999, Wyer, Willcox a kol., 1999).

9«

Individuální interakce receptorů s MHC jsou velmi krátkodobé při fyziologické teplotě 37 °C. Přibližnou hodnotou pro poločas interakce TCR-MHC/peptid, měřenou s lidským TCR specifickým pro matrixový peptid viru chřipky prezentovaný HLA-A*0201 (HLA-A2) je 0,7 sekundy. Poločas interakce CD8ctct s komplexem MHC/peptid je menší než 0,01 sekundy, tj . je alespoň 18x rychlejší.

4. Příprava rozpustných komplexů MHC-peptid

Rozpustné komplexy MHC-peptid byly nejdříve získáný štěpením molekul na povrchu buněk prezentujících antigen papainem (Bjorkman, Strominger a kol., 1985). Ačkoliv tento přístup poskytl materiál pro krystalizaci, byl v nedávné době nahrazen, alespoň v případě molekul I. třídy, individuální expresí těžkého řetězce a lehkého řetězce v E. coli následovanou složením molekuly za účasti syntetického peptidu (Garboczi, Hung a kol., 1992, Madden, Garboczi a kol., 1993, garboczi, Madden a kol., 1994, Reid, McAdam a kol., 1996, Reid, Smith a kol., 1996, Smith, Reid, 1996, Gao, Tormo a kol., 1997, Gao, gerth a kol.,1998)(Termín složení molekuly proteinu, v orig. refolding nebo folding, zde označuje uspořádání syntetizovaných řetězců prostřednictvím sekundárních vazeb a zaujmutí konečné prostorové struktury). Tento přístup měl několik výhod ve srovnání s předchozími metodami, a sice lepší výsledky za nižší cenu, identita peptidu může být kontrolována velmi přesně a výsledný produkt je více homogenní. Kromě toho exprese modifikovaného těžkého řetězce, který je např. fúzován s proteinovou značkou, je snadno proveditelná.

5. Rozpustný TCR

V současnosti nejsou známy žádné publikované údaje o interakcích lidských TCR-pMHC a nejsou známy ani žádné studie analyzující selektované TCR specifické pro přírodní (např.

*· ·« ·» · ·· *««· · · · · « * « • ····· · · · · « • ♦ » · · · · • ··· · · ·» ··· ·« virové) epitopy. To odráží potíže spojené se získáním proteinu vhodného pro SPR, tj. proteinu, který je homogenní, monomerní, správně sestavený, dostupný v miligramovém množství a stabilní v určitém rozpětí koncentrací.

Bylo by výhodné mít možnost připravit rekombinantní TCR ve formě nenavázané na membránu (nebo rozpustné formě), a to nejen pro účely zkoumání specifických interakcí TCR-pMHC, ale také jako diagnostický nástroj pro detekci infekce nebo detekci markérů autoimunitních nemocí anebo pro detekci účinnosti T buněčných vakcín. Rozpustné TCR by byly také využitelné pro barvení buněk, např. pro barvení buněk, kde se vyskytují určité virové antigeny v kontextu MHC. Podobně by se rozpustné TCR mohly užít k podávání terapeutických činidel, např. cytotoxických sloučenin nebo imunostimulačních sloučenin, do buněk prezentujících konkrétní antigen.

Proteiny tvořené více než jednou polypeptidovou podjednotkou, které obsahují transmembránovou doménu, se obtížně připravují v rozpustné formě, neboť v mnohých případech je protein stabilizován právě svou transmembránovou částí. To je také případ TCR.

Příprava rozpustných TCR byla nedávno popsána několika vědeckými skupinami. Obecně všechny tyto popsané metody poskytují zkrácené formy TCR, obsahující buďto pouze extracelulární domény nebo extracelulární a cytoplazmatické domény. Takže ve všech popsaných případech byla z exprimovaného proteinu odstraněna transmembránová doména. Ačkoliv v mnohých pracech bylo uvedeno, že takto připravené TCR jsou rozpoznávány TCR-specifickými protilátkami (což ukazuje, že část rekombinantní molekuly TCR rozpoznávaná protilátkami je správně uspořádána a složena), nikomu se dosud nepodařilo připravit s dobrým výtěžkem rozpustný TCR, který by byl stabilní při nízkých koncentracích a který by rozpoznával MHC-peptidové komplexy.

První metoda přípravy krystalovatelného materiálu využívá expresi v eukaryotických buňkách, ale takto připravený materiál je extrémně drahý (Garcia, Degano a kol. 1996, Garcia, Scott a kol. 1996). Jiná metoda přípravy krystalovatelného materiálu užívá expresního systému E. coli, podobně jak byl užit pro expresi MHC-peptidových komplexů (Garboczi, Ghosh a kol. 1996, Garboczi, Utz a kol. 1996). Druhá metoda, která vede k expresi extracelulární části TCR řetězců zkrácených bezprostředně před cysteinovým zbytkem, který se podílí na vytvoření disulfidického můstku spojujícího řetězce, po jejímž použití jsou řetězce in vitro složeny, se ukázala jako metoda, která není použitelná zcela obecně. Většina heterodimerních TCR je nestabilní, když je připravována tímto způsobem díky nízké afinitě mezi řetězcem a a β.

Kromě toho existuje řada dalších publikovaných postupů genového inženýrství pro přípravu rozpustných TCR. Některé z nich popisují pouze expresi buďto a nebo β řetězce TCR, což vede k produkci proteinu, který již nemá vazebnou specifitu pro MHC-peptid (Calaman, Carson a kol. 1993, Ishii, Nakano a kol. 1995) . Krystaly β řetězce byly získány bez a řetězce, buďto samotné nebo vázané na superantigen (Boulot, Bentley a kol. 1994, Bentley, Boulot a kol., 1995, Fields, Malchiodo a kol. 1996).

Další publikace popisují metody exprese heterodimerních γ/δ nebo α/β TCR (Gregoire, Rebai a kol. 1991, Necker, Rebai a kol. 1991, Eilat, Kikuchi a kol. 1992, Weber, Traunecker a kol. 1992, Corr, Slanetz a kol. 1994, Ishii, Nakano a kol.

1995, Gregoire, Malissen a kol. 1996, Romagne, Peyrat a kol.

1996. ). V některých případech byly TCR exprimovány jako jednořetězcové fúzní proteiny (Brocker, Peter a kol. 1993, Gregoire, Malissen a kol. 1996, Schlueter, Schodin a kol. 1996) . Další strategií bylo exprimovat TCR řetězce jako chimérické proteiny fúzované s Ig kloubovou oblastí a konstantními doménami (Eilat, Kikuchi a kol. 1992, Weber, Traunecker a kol. 1992). Jiné chimérické TCR byly exprimovány s navrženými upravenými sekvencemi, které vytvářely svinuté • ·

šroubovicové struktury, který vykazovaly vzájemně značnou afinitu a tak stabilizovaly kontakty α-β v TCR a zvyšovaly rozpustnost molekuly TCR. Tento přístup použili např. Chang, Bao a kol. (1994), kteří nahradili transmembránovou oblast proteinu proteinem s leucinovým zipem složeným ze dvou syntetických peptidových sekvencí, a sice kyselého a bazického peptidů, které specificky interagovaly a vytvářely heterodimerní svinutou šroubovici. Tito autoři požili pro sekreci heterodimerního TCR proteinu bakulovirový expresní systém v eukaryotických buňkách. Arteficiální peptidy s leucinovým zipem napomohly heterodimerizaci a a β řetězce TCR, které jsou také navázány meziřetězcovými disulfidickými vazbami právě nad místem fúze pomocí zipových peptidů. Avšak dosud nebylo prokázáno, že by tyto metody byly úspěšné a neexistuje žádný důkaz, že takto připravené TCR mohou rozpoznávat ligandy TCR. Podobně Golden, Khandekar a kol. (1997) popsali přípravu heterodimerních receptorů T buněk ve formě fúzních proteinů s leucinovým zipem. Rozpustné TCR byly exprimovány v E. coli a secernovány jako heterodimerní molekuly s α-β meziřetězcovým disulfidickým můstkem stejně jako v práci Changa a kol. Avšak ani zde není žádný důkaz, že tyto heterodimery, které mají již hotovou svou prostorovou strukturu, mají schopnost interagovat s příslušnými ligandy.

Existuje tudíž stále potřeba rozpustných verzí TCR nenavázaných na membránu, které jsou správně složeny (tj. prostorově uspořádány prostřednictvím sekundárních vazeb), aby byly schopny rozpoznávat příslušné nativní ligandy. Rozpustné formy TCR stálé po určitou dobu, a způsoby jejich přípravy v dostatečném množství by byly také velmi užitečné. Cílem předkládaného vynálezu je splnit tyto požadavky.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje v první aspektu složený rekombinantní receptor T buněk (TCR) který obsahuje:

a) rekombinantní extracelulární doménu a nebo γ řetězce TCR mající první heterologní C-koncový demerizační peptid, a

b) rekombinantní extracelulární doménu β nebo δ řetězce TCR mající druhý heterologní C-koncový demerizační peptid, který je specificky heterodimerizován s prvním dimerizačním peptidem, aby se vytvořila heterodimerizační doména.

TCR podle předkládaného vynálezu, který je složen po té, co je exprimován, místo toho aby byl exprimován jako heterodimer, má lepší konformaci než dosud známé rozpustné TCR. (Termín složení, složená apod., v orig. refolding nebo folding apod., v souvislosti s molekulou proteinu se týká uspořádání syntetizovaných řetězců prostřednictvím sekundárních vazeb a zaujmutí konečné trojrozměrné struktury). To dokazuje jeho schopnost rozpoznávat komplexy MHC-peptid. Je také při relativně nízkých koncentracích. Je stálý při koncentracích nižších než než 1 mg/ml a výhodně 10 μg/ml.

V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje biologicky aktivní rekombinantní receptor T buněk (TCR), který obsahuje:

a) rekombinantní extracelulární doménu a nebo γ řetězce TCR mající první heterologní C-koncový dimerizační peptid, a

b) rekombinantní extracelulární doménu β nebo δ řetězce TCR mající druhý heterologní C-koncový demerizační peptid, který je specificky heterodimerizován s prvním dimerizačním peptidem, aby se vytvořila heterodimerizační doména.

Tento TCR specificky váže komplexy MHC-peptid, výhodně podobným způsobem jako nativní TCR, ze kterého je odvozen.

Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje sekvence nukleové kyseliny, které kódují řetězce TCR podle vynálezu. Takové sekvence napr. stálý rekombinantní rekombinantní nukleových kyselin mohou být izolovány z klonů T buněk.

• · ·

Alternativně mohou být připraveny synteticky, např. vložením heterologní sekvence nukleové kyseliny do sekvence nukleové kyseliny kódující řetězec TCR nebo mutací (inzerční, deleční nebo substituční) sekvence nukleové kyseliny kódující TCR. Takže vynález zahrnuje také syntetické peptidy, které mají aktivitu a/nebo vazebnou specifitu nativních TCR.

Ještě další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje způsob přípravy rekombinantního receptoru T buněk, který není vázán na membránu, kterýžto způsob obsahuje kroky:

- exprese rekombinantní extracelulární domény a nebo γ řetězce TCR mající první heterologní C-koncový dimerizační peptid, a rekombinantní extracelulární domény β nebo δ řetězce TCR mající druhý heterologní C-koncový dimerizační peptid, který je specificky heterodimerizován s prvním dimerizačním peptidem, aby se vytvořila heterpodimerizační doména, a složení řetězců in vitro tak, že se vytvoří heterodimerní TCR.

Rekombinantní TCR podle vynálezu rozpoznává komplexy MHC

I. třídy s peptidy nebo MHC II. třídy s peptidy.

Heterodimerizační doména rekombinantního TCR podle předkládaného vynálezu je výhodně tzv. typu „svinuté šroubovice (coiled coil) nebo „leucinového zipu. Tyto termíny se užívají k popisu dvojice šroubovicivých peptidů, které navzájem interagují specifickým způsobem, čímž se vytváří heterodimer. K interakci dochází proto, že jsou zde komplementární hydrofóbní zbytky podél jedné strany zipového peptidu. Povaha těchto peptidů je taková, že vytváření heterodimerů je upřednostněno proti vytvoření homodimerů šroubovic. Existují jak přírodně se vyskytující tak syntetické struktury luecinového zipu. Syntetické leucinové zipy se konstruují pro mnohem větší afinitu ve srovnání s přírodními leucinovmi zipy, což však nemusí být vždy výhodné. Ve skutečnosti výhodné leucinové zipy pro použití podle předkládaného vynálezu jsou přírodně se vyskytující leucinové • ·

zipy nebo jiné leucinové zipy s obdobnou vazebnou afinitou. Leucinové zipy z proteinů c-jun a c-fos jsou příklady leucinových zipů s vhodnou vazebnou afinitou. K dalším vhodným leucinovým zipům patří struktury z proteinů myc a max (Amati, Dalton a kol. 1992) . Další leucinové zipy s vhodnými vlastnostmi mohou být snadno navrženy (O'Shea a kol. 1993).

Výhodné rozpustné TCR podle předkládaného vynálezu obsahují fúze leucinového zipu velikosti přibližně 40 aminokyselin odpovídající heterodimerizační doméně z c-jun (a řetězec) a c-fos (β řetězec) (0'Shea, Rutkowski a kol. 1989, O'Shea, Rutkowski a kol. 1992, Glover a Harrison 1995). Mohou být užity i delší leucinové zipy. Jelikož k heterodimerizaci specificky dohází i u zcela krátkých fragmentů některých domén leucinových zipů (O'Shea, Rutkowski a kol. 1992), je možné, že podobný prospěch by mohl být dosažen i s kratšími fragmenty c-jun a c-fos. Takové kratší fragmenty mohou obsahovat jen několik málo aminokyselin jako např. 8 aminokyselin. Tudíž domény leucinových zipů mohou mít velikost 8 až 60 aminokyselin.

Molekulární principy specifity párování leucinových zipů byly dobře charakterizovány (Landschulz, Johnson a kol. 1988, McKnight 1991) a leucinové zipy mohou být navrhovány a připravovány metodami odborníky při použití metod genového inženýrství, aby vytvářely homodimerní, heterodimerní nebo trimerní komplexy (Lumb a Kim 1995, Nautiyal, Woolfson a kol. 1995, Boice, Dieckmann a kol. 1996, Chao, Houston a kol. 1996). Konstruované leucinové zipy, nebo jiné heterodimerizační domény, s vyšší afinitou než leucinové zipy c-jun a c-fos mohou být v některých systémech prospěšné pro expresi rozpustných TCR. Avšak, jak bude uvedeno ještě dále, když se rozpustné TCR skládají in vitro, je výhodně solubilizační činidlo přítomno v pufru, kde ke skládání dochází, aby se redukovalo vytváření neproduktivních proteinových agregátů. Jedna interpretace tohoto jevu je taková, že kinetika skládání domén leucinového zipu je rychlejší než TCR řetězců, což vede k dimerizaci • · ···· ·· nesložených oc a β řetězců, což zase způsobuje agregaci proteinů. Zpomalením procesu skládání a inhibicí agregace tím, že je přítomno solubilizační činidlo, může být protein udržován v roztoku dokud není zcela dokončeno skládání obou fúzních domén. Tudíž heterodimerizační domény s vyšší afinitou než c-fos a c-jun leucinové zipy vyžadují vyšší koncentrace solubilizačního činidla k dosažení rozpustného TCR srovnatelného s c-jun a c-fos.

Různé biologické systémy užívají různé metody k vytvoření stabilních homo- a heteroproteinových dimerů, a každá z těchto metod v principu poskytuje volbu pro konstrukci dimerizačních domén v geneticky modifikovaných proteinech. Leucinové zipy (Kouzarides a Ziff 1989) jsou pravděpodobně nej známější dimerizační moduly a byly široce využívány při přípravě geneticky konstruovaných dimerních proteinů. Tak např. leucinový zip z GCN4, transkripčního aktivátorového proteinu kvasinky Saccharomyces cerevisíae, byl použit pro přímou heterodimerizaci řady heterologních proteinů (Hu., Newell a kol.1993, Greenfield, Montelione a kol.1998). Výhodná strategie je použít leucinové zipy, které vedou k vytvoření heterodimerních komplexů jako je Jun/Fos leucinový zip (DeKruif a Logtenberg 1996, Riley, Ralston a kol. 1996).

Heterodimerizační doména rekombinantního TCR podle vynálezu není omezena jen na leucinové zipy. Může být např. vytvořena elementy tvořícími disulfidické můstky. Alternativně ji mohou vytvořit domény SH3 a hydrofóbní protidomény bohaté na prolin, které jsou zodpovědné za protein-proteinové interakce pozorované u proteinů účastnících se signální transdukce (viz přehled Schlessinger 1994). Další přírodní protein-proteinové interakce nalézané mezi proteiny účastnícími se v kaskádě signální transdukce jsou založené na asociaci mezi posttranslačně modifikovanými aminokyselinami a proteinovými moduly, které specificky rozpoznávají takové aminokyselinové zbytky. Tyto posttranslačně modifikované aminokyseliny a proteinové moduly vytvářejí heterodimerizační domény • · • · ·

rekombinantních TCR podle předkládaného vynálezu. Příkladem proteinového páru tohoto typu je tyrosinový fosforylovaný receptor, jako je např. receptor epidermálního růstového faktoru nebo receptor růstového faktoru destiček a SH2 doména z GRB2 (Lowenstein, Daly a kol. 1992, Buday a Dawnward 1993). Tak jako ve všech oborech vědy, aktivně byly hledány nové dimerizačni molekuly (Chevray a Nathans 1992) a byly úspěšně vyvinuty nové metody pro přípravu plně arteficiálních modulů (Zhang, Murphy a kol. 1999).

Ve výhodném rekombinantním TCR podle vynálezu chybí meziřetězcový disulfidický můstek (disulfidická vazba) vytvářený mezi nativními řetězci a a β a také γ a δ v molekule TCR. Toho lze dosáhnout např. fúzí dimerizačni domény s TCR receptorem nad cysteinovými zbytky, takže tyto zbytky jsou vyloučeny z rekombinantního proteinu. Alternativně je jeden nebo několik cysteinových zbytků nahrazeno jiným aminokyselinovým zbytkem, který se nepodílí na vytváření disulfidického můstku. Cysteinové zbytky mohou být vypuštěny neboť mohou mít škodlivý účinek na skládání in vitro funkčního TCR.

Složení (znovusložení) a a β a také γ a δ řetězce složeného rekombinantního TCR podle vynálezu se uskutečňuje in vitro za podmínek vhodných pro složení. V jednom provedení vynálezu je složení do správné konformace dosaženo složením rozpuštěných řetězců TCR ve skládácím pufru, který obsahuje solubilizační činidlo, např. močovinu. Výhodně je močovina přítomna v koncentraci nejméně O,1M nebo alespoň 1M nebo alespoň 2,5M nebo přibližně 5M. Alternativním solubilizačním činidlem, které lze použít, je guanidin, a sice v koncentraci O,1M až 8M, výhodně alespoň 1M nebo alespoň 2,5M. Před složením se výhodně použije solubilizační činidlo, aby se zajistila úplná redukce cysteinových zbytků. Pokud je to nutné, mohou být užita i další denaturační činidla jako je např. DTT a guanidin. Různá solubilizační a denaturační činidla mohou být použita

před krokem, kdy dojde ke složeni (např. močovina, β-merkaptoethanol) . Alternativně mohou být při skládání užity redoxní páry jako je např. cystamin/cysteaminový redoxní pár, DTT nebo β-merkaptoethanol/atmosférický kyslík a nebo cystein v redukované a oxidované formě.

Monomerní TCR popsaný v předkládaném vynálezu může být označen pomocí detekovatelné značky, např. takové značky, která je vhodná pro diagnostické účely. Vynález tak poskytuje způsob detekce MHC-peptidových komplexů s TCR podle vynálezu, který je specifický pro MHC-peptidový komplex, a detekci navázání TCR na MHC-peptidový komplex. U tetramerních TCR vytvořených užitím biotinylovaných heterodimerů může být užit fluorescenční streptavidin (komerčně dostupný) jako detekovatelná značka. Fluorescenčně značený tetramer je vhodný pro použití v analýze průtokovou cytometrií FACS, např. pro detekci buněk prezentujících antigen nesoucích peptid, pro který je TCR specifický.

Jiný způsob, kterým může být detekován TCR, je použití TCR-specifických protilátek, zejména monoklonálních protilátek. Existuje řada komerčně dostupných protilátek anti-TCR, jako jsou např. βΠ a aFI, které rozpoznávají konstantní úseky ct a β řetězce.

TCR mohou být alternativně nebo navíc navázány na terapeutické činidlo, které může být např. toxickou skupinou pro použití k usmrcení buněk, nebo imunostimulační činidlo jako je interleukin nebo cytokin. Takže vynález poskytuje způsob přenosu terapeutického činidla do cílové buňky, kterýžto způsob obsahuje kroky, kdy se kontaktují potenciální cílové buňky s TCR podle vynálezu v podmínkách, které dovolují přichycení TCR na cílovou buňku, přičemž TCR je specifický pro MHC-peptidové komplexy a je asociován s terapeutickým činidlem. Rozpustný TCR může být užit pro přenos terapeutického činidla na místo buněk prezentujících určitý antigen. Tak např. tímto způsobem může být do nádoru přenesen toxin, který ho pomůže ·· ·· ·· · • · · · · ··· • · · · · · • ····· · · • · · · · ···· ·· ·« ··· odstranit. To by bylo užitečné v mnohých případech a zejména proti nádorům, neboť ne všechny buňky v nádoru prezentují antigen a tudíž ne všechny nádorové buňky jsou rozpoznány imunitním systémem. Pomocí rozpustného TCR může být podána taková sloučenina, která bude sice účinkovat lokálně, ale nejen na buňky, na které se naváže. Takže jednou z předpokládaných strategií budou protinádorové molekuly navázané na receptory T buněk specifických pro nádorové antigeny.

Pro tento účel mohou být využity mnohé toxiny, např. radioaktivní sloučeniny, enzymy (např. perforin) nebo chemoterapeutická činidla (např. cis-platina). Pro zajištění toho, aby se toxický účinek projevil jen na definovaném místě, toxin může být uvnitř liposomu navázaný na strepatavidin, takže se sloučenina uvolňuje jen pomalu. To zabrání škodlivým účinkům v průběhu přenosu v těle a také zajistí, že toxin má maximální účinek po navázání TCR na odpovídající buňky prezentující antigen.

Alternativním způsobem značení nebo navázání další skupiny jako je např. toxická skupina, k rozpustnému TCR, je zahrnutí značky nebo jiné skupiny ve smíšeném molekulovém multimeru. Příkladem takové multimerní molekuly je tetramer obsahující 3 molekuly TCR a jednu molekulu peroxidázy. Toho lze dosáhnout smícháním molekul TCR a molekul peroxidázy v molárním poměru 3:1, aby se vytvořily tetramerní komplexy, a pak oddělením požadovaných komplexů od těch komplexů, které neobsahují správný poměr molekul. Smíšené molekuly mohou obsahovat jakoukoliv kombinaci molekul za předpokladu, že sterické zábrany nezhorší nebo podstatně nezhorší požadovanou funkci molekuly. Umístění vazebných míst na molekule streptavidinu je vhodné pro smíšené tetramery, neboť je nepravděpodobný vznik sterických zábran.

Výhodně rekombinantní řetězce TCR podle vynálezu obsahují flexibilní linker (spojovací prvek) umístěný mezi doménou TCR a dimerizačním peptidem. K vhodným flexibilním linkerům patří standardní peptidové linkery obsahující glycin, např. linkery • 4 *· 44 44 4 • · · · · 4 44 • · · 4 · 4 • ··· 4 4 4 4 • 4 4 4 4 •••4 44 «· _#·· obsahující glycin a serin. Má se za to, že C-koncové zkrácení v blízkosti cysteinových zbytků vytvářejících meziřetězcové disulfidické můstky, neboť řetězce a a β jsou prostřednictvím těchto zbytků v těsné blízkosti v buněčných TCR. Tudíž jen relativně krátké linkery jsou požadovány k doplnění nedistortivního přechodu z TCR řetězce k heterodimerizační doméně. Výhodné je použití linkeru se sekvencí Pro-Gly-Gly nebo Gly-Gly. Ale sekvence linkeru mohou být různé. Např. linker může být i úplně vynechán nebo redukován na jediný zbytek, přičemž v tomto případě je výhodný Gly. Rozpustné TCR budou také pravděpodobně tolerovat i delší variace linkeru, za předpokladu, že budou chráněny před napadením proteázami, což by vedlo k oddělení dimerizačních peptidů od extracelulárních domén TCR, po kterém by následovala ztráta stability α-β řetězců.

Rozpustný TCR podle vynálezu nemusí být nutně α-β TCR. K TCR podle vynálezu patří také molekuly jako γ-δ, α-δ a γ-β TCR molekuly, a také TCR molekuly (pre-TCR) obsahující invariantní a řetězce, které jsou exprimovány pouze v časných stadiích vývoje. Pre-TCR jsou specifické pro buněčnou řadu, která exprimuje α-β receptory T buněk, na rozdíl od buněk, které exprimují γ-δ receptory T buněk (viz přehledy Aifantis, Azogui a kol. 1998, von Boehmer, Aifantis a kol. 1998, Wurch, Biro a kol. 1998). Pre-TCR je exprimován s β TCR řetězcem párovaným s invariantním Pre-TCR a řetězcem (Saint Ruf, Ungweiss a kol. 1994, Wilson a MacDonald 1995), což, jak se zdá, predisponuje buňku k příslušnosti k řadě α-β T buněk. Role Pre-TCR se proto považuje za důležitou v průběhu vývoje thymu (Ramiro, Trigueros a kol. 1996).

Standardní modifikace rekombinantnich proteinů podle vynálezu lze provést, pokud je to vhodné. Patří sem např. záměna nepárových cysteinových zbytků v konstantním úseku « ·

·· *99 9 9 • ·

9 9

9

9 β řetězce, aby se zabránilo nesprávnému meziřetězcovému párování nebo nesprávnému párování uvnitř řetězce.

Signální peptid může být vynechán, neboť u zralého receptorů neplní žádnou funkci, ani nemá význam pro jeho schopnost vázat ligand, spíše ve skutečnosti brání TCR v rozpoznání ligandu. ve většině případů je štěpné místo, kde se odděluje signální peptid od zralého TCR řetězce, predikováno, ale není experimentálně určeno. Úpravy exprimovaných TCR řetězců, takže jsou o několik, např. 10, aminokyselin delší nebo kratší na svém N-konci, nemá žádný význam pro funkci rozpustných TCR. Je možné provést adice určitých sekvencí, které nejsou přítomny v původní proteinové sekvenci. Např. lze přidat krátkou sekvenci sloužící jako tzv. visačka či značka (tag), která může pomoci při purifikaci TCR řetězců, za předpokladu, že nenarušuje správné složení a strukturu vazebného místa v TCR pro antigen.

Pro expresi v E. coli může být přidán methioninový zbytek na N-koncový počátek sekvence predikovaného zralého proteinu, čímž se umožní iniciace translace.

Zdaleka ne všechny zbytky ve variabilních doménách TCR jsou esenciální pro antigenní specifitu a funkčnost. Tudíž je možné vnést značný počet mutací do tohoto úseku, aniž by došlo k ovlivnění antigenní specifity a funkčnosti.

Naproti tomu, některé zbytky účastnící se vytváření kontaktů s peptidovým antigenem nebo polypeptidovým těžkým řetězcem HLA, tj. zbytky vytvářející úseky CDR v TCR řetězcích, mohou být nahrazeny zbytky, které zvýší afinitu TCR k ligand. Takové substituce, vzhledem k nízké afinitě většiny TCR k MHC-peptidovým ligandům, mohou být užitečné ke zvýšení specifity a funkčního potenciálu rozpustných TCR. V příkladech byly určeny afinity rozpustných TCR k ligandům peptid-MHC. Taková měření mohou být užita k testování účinků mutací vnesených do TCR a tudíž k identifikaci TCR obsahujících substituce, které zvyšují aktivitu TCR.

Zdaleka ne všechny zbytky v konstantních doménách TCR řetězců jsou esenciální pro antigenní specifitu a funkčnost. Tudíž je možné vnést značný počet mutací úseku určujícího specifitu. V příkladu 14 bylo ukázáno, že dvě aminokyselinové substituce v konstantní doméně β řetězce TCR nevedly k žádnému zjistitelnému důsledku pro schopnost TCR vázat ligand HLA-peptid.

β řetězec TCR obsahuje cysteinový zbytek, který v nativním nebo buněčném TCR netvoří pár. Mutace tohoto zbytku zvyšuje účinnost in vitro skládání (znovuskládání) rozpustného TCR. Substituce tohoto cysteinu serinem nebo alaninem měla významný kladný účinek na účinnost skládání in vitro. Podobné kladní účinky, nebo dokonce ještě lepší účinky, mohou být dosaženy substitucemi jinými aminokyselinami.

Jak již bylo výše zmíněno, je výhodné, když cysteinové zbytky, které vytvářejí meziřetězcové disulfidické můstky v nativním TCR, nejsou přítomny, neboť se zabrání problémům při refoldingu. Avšak jelikož uspořádání těchto cysteinových zbytků v TCR je přírodní uspořádání a bylo ukázáno, že je také funkční v tomto uspořádání s doménami leucinových zipů c-jun a c-fos (O'Shea a kol. 1989) tyto cysteinové zbytky mohou být přítomny, pokud dochází k refoldingu TCR.

Jelikož konstantní domény se neúčastní bezprostředně kontaktů s ligandy peptid-MHC, místo zkrácení C-konce může být velmi různé, aniž by došlo ke ztrátě funkčnosti. Tak např. by mělo být možné vytvořit funkční rozpustný TCR vyloučením celé konstantní domény. V principu by pak bylo snazší exprimovat a skládat rozpustný TCR obsahující variabilní úseky nebo variabilní úseky a jen krátké fragmenty obsahující variabilní úseky nebo variabilní úseky a jen krátké fragmenty konstantních úseků, protože polypeptidy by byly kratší. Avšak tato strategie není výhodná. A to proto, že poskytnutí dodatečné stability párování α-β řetězců prostřednictvím heterodimerizační domény by bylo komplikované, neboť upravené C-konce dvou řetězců by • *

···· · · ··

byly vzdálené, což by vyžadovalo dlouhou linkerovou sekvenci. Výhoda fúze heterodimerizačních domén právě před pozici cysteinů vytvářejících meziřetězcové disulfidické můstky, je v tom, že řetězce a a β T buněčného receptoru jsou drženy v těsné blízkosti. Tudíž fúze v tomto bodě je méně náchylná ke vzniku distorze ve struktuře TCR.

Je možné, že může být připraven rozpustný TCR s fragmentem konstantních domén delším je ve výhodném provedení uvedeném zde, např. konstantní domény nemusejí být zkráceny právě před cysteiny, která vytvářejí meziřetězcové disulfidické můstky. Tak např. může být přítomna celá konstantní doména kromě transmembránové domény. V takovém případě by bylo výhodné mutovat cysteinové zbytky vytvářejí meziřetězcové disulfidické můstky v buněčných TCR.

Kromě toho, že se napomůže meziřetězcové stabilitě prostřednictvím heterodimerizační domény, může se využít vložení cysteinových zbytků, které vytvářejí meziřetězcové disulfidické můstky. Jednou možností je zkrátit a a β řetězce v blízkosti cysteinových zbytků, které vytvářejí meziřetězcové disulfidické můstky, ale tak, že zůstanou zachovány, takže dojde disulfidických můstků pouze transmebránové tyto cysteinové zbytky k vytvoření normálních (deletovat) Když jsou

Jinou možností je odstranit domény a a β řetězce.

exprimovány kratší fragmenty a a β řetězce, mohou být vloženy cysteinové zbytky jako substituce za aminokyseliny v pozicích, kde skládání řetězců přivede zbytky do takové vzájemné blízkosti, která je vhodná k vytvoření disulfidického můstku.

Purifikaci TCR lze provést mnoha různými způsoby. Alternativní způsoby chromatografie na iontoměničích mohou být užity nebo jiné způsoby purifikace proteinů jako je např. gelová filtrační chromatografie nebo afinitní chromatografie.

Ve způsobech přípravy rozpustných TCR podle vynálezu může být zvýšeny účinnost skládání přidáním určitých proteinových složek, např. chaperonových proteinů, ke skládací reakčni směsi. Zlepšení skládání bylo dosaženo po projití protein kolonou s imobilizovanými mini-chaperony (Altamirano, Golbik a kol. 1997, Altamirano, Garcia a kol. 1999).

Kromě způsobů popsaných v příkladech, jsou možně tak např. lze užít mohou být užity

Purification, Detection and značka lokalizována směrem alternativní způsoby biotinylace TCR. chemickou biotinylaci. Alternativně biotinylované značící sekvence, i když některé aminokyseliny v sekvenci biotinylované značky jsou esenciální (Schatz a kol.1993). Pro biotinylaci mohou být užity různé směsi. Enzym vyžaduje Mg-ATP a nízkou iontovou sílu, i když obě tyto podmínky mohou být různě měněny, např. je možné užít vyšší iontovou sílu a delší reakční čas. Je také možné užít jiné molekuly než avidin nebo streptavidin k vytvoření multimerů TCR. Jakákoliv molekula, která váže biotin multivalentním způsobem, je pro tento účel vhodná. Alternativně lze připravit zcela jiné vazby (jako je např. poly-histidinová značka s chelatovaným iontem niklu, viz Quiagen Proiduct Guide 1999, Chapter 3 Protein Expression,

Assay, p. 35-37). Výhodně je k N-konci proteinu, takže je minimalizováno množství sterických zábran v interakci s potenciálním MHC-peptidovým komplexem.

Příklady vhodných MHC-peptidových cílů pro TCR podle vynálezu zahrnují, přičemž výčet není omezen, virové epitopy jako jsou např. epitopy HTLV-1 (např. peptid Tax2 prezentovaný HLA-A2, HTLV-1 je asociován s leukémií), epitopy HIV, EBV, CMV, melanomové epitopy a další nádorové specifické epitopy, a také epitopy asociované s autoimunitními chorobami jako je revmatoidní artitida.

Léčení mnoha nemocí může být zlepšeno lokalizací léčiva prostřednictvím specifity rozpustných TCR.

Léčení virových nemocí, proti kterým existují léčiva, např. HIV, SIV, EBV nebo CMV, by se zlepšilo, kdyby se léčivo uvolňovalo v bezprostředním okolí infikovaných buněk. V případě rakovin by lokalizace v bezprostředním okolí nádorových buněk nebo metastáz zvýšila účinnost toxinů nebo imunostimulantů.

• · · · · · · «· * · · · · · · · · · · • · · ·· · · · • · · · · · · · ·· · ···· · · · · ··· ·· ·

V případě autoimunitních nemocí, imunosupresivní léčiva by se uvolňovala pomalu a měla lokalizovaný účinek, přičemž by jen v co nejmenší míře ovlivnila celkovou imunitní kapacitu organismu. V případě prevence odvržení štěpu by byl účinek imunosupresivních léčiv optimalizován stejným způsobem. Pro podávání vakcín by byl vakcinační antigen lokalizován v bezprostředním sousedství buněk prezentujících antigen, čímž by se zvýšila účinnost antigenu. Tyto způsoby lze také využít při zobrazovacích přístupech.

Výhodné rysy každého aspektu vynálezu jsou výhodné pro každý z ostatních aspektů mutatis mutandis. Dokumenty charakterizující stav techniky jsou zde uvedeny v co nejúplnějším rozsahu dle patentového zákona.

Předkládaný vynález je dále popsán formou příkladů, které však předmět vynálezu nijak neomezují, s odkazem na následující obrázky:

Popis obrázků:

Obr. 1 je schematický nákres fúzního proteinu „receptor T buňky leucinový zip. Každý řetězec je složen ze dvou domén superrodiny imunoglobulinů, tj . jedné variabilní (V) a jedné konstantní (C) domény. Konstantní domény jsou zkráceny bezprostředně za meziřetězcovými cysteinovými zbytky na N-konci a fúzovány s heterodimerizačními motivy leucinového zipu c-jun (a) nebo c-fos (β) o délce asi 40 aminokyselin na C-konci prostřednictvím krátkého linkeru. Každý z a-jun nebo β-fos obsahuje dvě meziřetězcové disulfidivké vazby a párují výlučně nekovalentními vazbami. Alfa řetězec je kratší než beta řetězec díky kratší konstantní doméně.

Obr. 2 je fotografie analýzy heterodimerního JM22zip receptorů na redukujícím/neredukujícím gelu. Identické vzorky purifikovaného TCR-zip byly naneseny na 15% akrylamid-SDS gel, • · buďto v redukujících (dráha 2) nebo neredukujících podmínkách (dráha 4). Proteinové markéry jsou v drahách 1 a 3. Molekulární hmotnosti jdou uvedeny v kilodaltonech. Jak v redukujících tak neredukujících podmínkách byly nekovalentně asociované dimery disociovány na alfa a beta řetězce. V dráze 4 se každý řetězec pohybuje s vyšší mobilitou a jako samostatný pás, což ukazuje, že je přítomný jediný druh meziřetězcové disulfidiké vazby. To ke kompatibilní se správnou tvorbou disulfidické vazby.

Obr. 3 je graf ukazující specifickou vazbu JM22zip TCR na komplexy HLA-A2 s chřipkovým peptidem Flu matrix (M58-66). Komplexy HLA-A2, uspořádané kolem jednotlivých peptidů a biotinylované na p2-mikroglobulínu, byly imobilizovány ve třech průtokových komůrkách potažených streptavidinem: komůrka 3 (FC3) - 3770 rezonančních jednotek (RU) HLA-A2 POL kontroly, dvě odlišné hladiny HLA-A2 M58-66 FLU - 2970 RU v FC1 a 4960 RU v FC2. JM22zip byl vstřikován v rozpustné fázi postupně do třech komůrek v koncentraci 43 μΜ po 60 sekund. V průběhu injikování bylo pozorováno zvýšení odpovědi nad hladinu pozadí u obou komůrek potažených HLA-A2 FLU, a sice přibližně 1000 RU a 700 RU specifické vazby JM22zip v komůrce 1 a v komůrce 2, v uvedeném pořadí.

Obr. 4. ukazuje sekvenci syntetických DNA oligonukleotidových primerů použitých pro „kotvovou PCR amplifikaci TCR genů. Rozpoznávací místa restrikčních enzymů použitá pro klonování jsou podtržena. A: poly-C „kotvový primer, B: primer specifický pro konstantní úsek a řetězce TCR, C: primer specifický pro konstantní úsek β řetězce TCR.

Obr. 5 ukazuje sekvenci syntetických DNA oligonukleotidových primerů použitých pro PCR amplifikaci DNA fragmentu, který kóduje úsek „svinuté šroubovice čili „leucinového zipu c-jun a c-fos. Rozpoznávací místa restrikčních enzymů použitá pro • 9 «·

9 9 • · • 9 9 • 99 « «

9999 99 klonování jsou podtržena.A. c-jun 5'-primer, B: c-jun 3'primer, C: c-fos 5^z-primer, D: c-fos 3'-primer.

Obr. 6 ukazuje příslušnou sekvenci DNA a aminokyselinovou sekvenci (v jednompísměnovém kódu) fragmentů c-fos a c-jun fúzovaných k TCR (inzerty pBJ107 a pBJ108). A. c-jun leucinový zip fúzovaný s ot řetězcem TCR, B: c-fos leucinový zip fúzovaný s β řetězcem TCR.

Obr. 7 ukazuje sekvence syntetických DNA oligonukleotidových primerů použitých pro mutaci nepárového cysteinového zbytku v β řetězci TCR. primery byly zkonstruovány metodou „Quickchange™ (Stratagene). A: mutace cysteinu na serin, přímý (tj. sense) primer, uvedena je aminokyselinová sekvence a šipkou ukázána mutace, B: mutace cysteinu na serin, zpětný (tj. nonsense) primer, uvedena je aminokyselinová sekvence a šipkou ukázána mutace,C: mutace cysteinu na alanin, zpětný (nonsense) primer.

Obr. 8 je schematické zobrazení fúzního proteinu TCR-zip. Čtyři imunoglobulinové domény jsou zobrazeny jako domény s vnitrořetězcovými disulfidickými vazbami mezi odpovídajícími cysteinovými zbytky. Čísla ukazují pozici aminokyseliny v řetězci zralého receptoru T buňky, vzhledem k malé variabilitě v délce řetězců po rekombinaci je délka řetězců mírně odlišná pro různé TCR. Aminokyselinové zbytky vnesené do molekuly formou linkeru jsou uvedeny v jednopísmenném kódu.

Obr. 9 ukazuje sekvenci syntetických DNA oligonukleotidových primerů použitých pro PCR amplifikaci a a β řetězce TCR. Rozpoznávací místa restrikčních enzymů použitá pro klonování jsou podtržena a aminokyselinové sekvence odpovídající příslušnému řetězci TCR jsou uvedeny nad sekvencí přímého primerů. Umlčené mutace DNA vzhledem k sekvenci genu TCR

a další sekvence, které neodpovídají sekvenci TCR řetězce, jsou uvedeny malým písmenem. A: 5'- PCR primer pro lidský řetězec ValO.2 TCR rozpoznávající komplex JM22 matrixový protein chřipkového viru - HLA-A0201. B: 5'- PCR primer pro lidský řetězec νβ17 TCR rozpoznávající komplex JM22 matrixový protein chřipkového viru - HLA-A0201. C: 5'- PCR primer pro myší řetězec Va4 TCR rozpoznávající komplex JM22 nukleoproteinový peptid chřipkového viru - H2D^b. D: 5'- PCR primer pro myší řetězec νβΐΐ TCR rozpoznávající komplex JM22 nukleoproteinový peptid chřipkového viru - H2D^b. E: 5'- PCR primer pro lidský řetězec Va23 TCR rozpoznávající komplex 003 HIV GAG peptidHLA-A0201. F: 5'- PCR primer pro lidský řetězec νβ5.1 TCR rozpoznávající komplex 003 HIV GAG peptid- HLA-A0201. G: 5'PCR primer pro lidský řetězec Va2.3 A6 TCR rozpoznávající komplex HTLV-1 Tax peptid- HLA-A0201. H: 5'- PCR primer pro lidský řetězec νβ12.3 A6 TCR rozpoznávájicí komplex HTLV-1 Tax peptid- HLA-A0201. I: 5'- PCR primer pro lidský řetězec Val7.2 B7 TCR rozpoznávající komplex HTLV-1 Tax peptid- HLA-A0201. J: 5'- PCR primer pro lidský řetězec νβ12.3 B7 TCR rozpoznávající komplex HTLV-1 Tax peptid- HLA-A0201. K: 3'-PCR primer pro lidské řetězce Ca, aplikovatelný univerzálně. L: 3'-PCR primer pro lidské Cβ řetězce, aplikovatelný univerzálně.

Obr. 10 ukazuje predikovanou proteinovou sekvenci (jednopísmenný kód, horní řádek) a sekvenci DNA (spodní řádek) rozpustného TCR a řetězce rozpoznávajícího HLA-A2/flu matrix z JM22, jako fúzi s doménou leucinového zipu c-jun. Mutace vnesené na 5'-konec sekvence DNA ke zvýšení exprese jsou genu v E. coli jsou znázorněny malým písmenem, stejné jako sekvence linkeru mezi sekvencemi TCR a c-jun.

• · ·· · · 4 4 4

4 4 4 4 4 4 · 4

4 4 4 4 4 9 9

99999 · · 99 9

9 9 9 9 9 9

9999 99 99 99 9 99 4

Obr. 11 ukazuje predikovanou proteinovou sekvenci (jednopísmenný kód, horní řádek) a sekvenci DNA (spodní řádek) rozpustného TCR β řetězce rozpoznávajícího HLA-A2/flu matrix z JM22, jako fúzi s doménou leucinového zipu c-fos. Sekvence linkeru mezi sekvencemi TCR a c-fos jsou znázorněny malým písmenem.

Obr. 12 ukazuje predikovanou proteinovou sekvenci (jednopísmenný kód, horní řádek) a sekvenci DNA (spodní řádek) rozpustného a TCR řetězce myšího F5 receptoru rozpoznávajícího H2D^b -nukleoproteinový peptid chřipkového viru, jako fúzi s doménou leucinového zipu c-jun. Mutace vnesené na 5'-konec sekvence DNA ke zvýšení exprese jsou genu v E. coli jsou znázorněny malým písmenem, stejné jako sekvence linkeru mezi sekvencemi TCR a c-jun.

Obr. 13 ukazuje predikovanou proteinovou sekvenci (jednopísmenný kód, horní řádek) a DNA sekvenci (spodní řádek) rozpustného β TCR řetězce myšího F5 receptoru rozpoznávajícího H2D^b - nukleoproteinový peptid chřipkového viru, jako fúzi s doménou leucinového zipu c-fos. Sekvence linkeru mezi sekvencemi TCR a c-fos je uvedena malými písmeny.

Obr. 14 ukazuje predikovanou proteinovou sekvenci (jednopísmenný kód, horní řádek) a sekvenci DNA (spodní řádek) rozpustného TCR a řetězce z pacienta 003 rozpoznávajícího HLAA2/HIV-1 GAG, jako fúzi s doménou leucinového zipu c-jun. Mutace vnesené na 5'-konec sekvence DNA ke zvýšení exprese jsou genu v E. coli jsou znázorněny malými písmeny, stejné jako sekvence linkeru mezi sekvencemi TCR a c-jun.

Obr. 15 ukazuje predikovanou proteinovou sekvenci (jednopísmenný kód, horní řádek) a sekvenci DNA (spodní řádek) rozpustného TCR β řetězce z pacienta 003 rozpoznávajícího HLA• · ··· ·

A2/HIV-1 GAG, jako fúzi s doménou leucinového zipu c-jun. Sekvence linkeru mezi sekvencemi TCR a c-jun je uvedena malými písmeny.

Obr. 16 ukazuje predikovanou proteinovou sekvenci (jednopísmenný kód, horní řádek) a sekvenci DNA (spodní řádek) rozpustného TCR a řetězce z klonu A6 (viz Garboczi a kol. 1996, Garboczi, Ghosh a kol. 1996) rozpoznávajícího HLAA2/HTLV-1 Tax, jako fúzi s doménou leucinového zipu c-jun. Mutace vnesené na 5'-konec sekvence DNA ke zvýšení exprese jsou genu v E. coli jsou znázorněny malými písmeny, stejné jako sekvence linkeru mezi sekvencemi TCR a c-jun.

Obr. 17 ukazuje predikovanou proteinovou sekvenci (jednopísmenný kód, horní řádek) a sekvenci DNA (spodní řádek) rozpustného TCR a řetězce z klonu A6 (viz Garboczi a kol. 1996, Garboczi, Ghosh a kol. 1996) rozpoznávajícího HLA-A2/HTLV-1 Tax, jako fúzi s doménou leucinového zipu c-fos a biotinylovanou značkou, která působí jako substituent BirA (Barker a Campbell 1981, Howard, Sahww a kol. 1985, Schatz 1993, O'Callaghan, Byford 1999). Sekvence linkeru mezi sekvencemi TCR a c-jun je uvedena malými písmeny. Mutace DNA sekvence vedoucí k substituci cysteinového zbytku alaninem je znázorněna tučně a podtržena.

Obr. 18 ukazuje predikovanou proteinovou sekvenci (jednopísmenný kód, horní řádek) a sekvenci DNA (spodní řádek) rozpustného TCR a řetězce z klonu M10B7/D3 (viz Ding a kol. 1998) rozpoznávajícího HLA-A2/HTLV-1 Tax, jako fúzi s doménou leucinového zipu c-jun. Sekvence linkeru mezi sekvencemi TCR a c-jun jsou znázorněny malými písmeny.

Obr. 19 ukazuje predikovanou proteinovou sekvenci (jednopísmenný kód, horní řádek) a sekvenci DNA (spodní řádek) • · ·· ·· • · · « · ·

• · • · ··· · rozpustného TCR a řetězce z klonu M10B7/D3 (viz Ding a kol. 1998) rozpoznávajícího HLA-A2/HTLV-1 Tax, jako fúzi s doménou leucinového zipu c-fos a biotinylovatelnou značkou, která působí jako substrát BirA. Sekvence linkeru mezi sekvencemi TCR a'c-fos je uvedena malými písmeny. Mutace DNA sekvence vedoucí k substituci cysteinového zbytku alaninem je znázorněna tučně a podtržena. Dvě umlčené mutace DNA sekvence (kodony P-G) vložené kvůli klonování, aby se odstranilo místo Xmal, jsou znázorněny také malými písmeny.

Obr. 20 ukazuje predikovanou proteinovou sekvenci (jednopísmenný kód, horní řádek) a sekvenci DNA (spodní řádek) rozpustného TCR β řetězce z klonu A6 (viz Garboczi a kol. 1996, Garboczi, Ghosh a kol. 1996) rozpoznávajícího HLA-A2/HTLV-1 Tax, jako fúzi s doménou leucinového zipu c-fos a biotinylovatelnou značkou, která působí jako substrát BirA (Barker a Campbell 1981, Howard, Sahww a kol. 1985, Schatz 1993, 0'Callaghan, Byford 1999). Sekvence linkeru mezi sekvencemi TCR a c-fos je uvedena malými písmeny. Mutace DNA sekvence vedoucí k substituci cysteinového zbytku alaninem je znázorněna tučně a podtržena. Stejně, tj . malým písmem a podtržením, je znázorněna substituce asparaginového zbytku kyselinou asparagovou, mutace v konstatním úseku, která nemá žádný detekovatelný vliv na rozpustný TCR.

Obr. 21 ukazuje predikovanou proteinovou sekvenci (jednopísmenný kód, horní řádek) a sekvenci DNA (spodní řádek) biotinylovaného c-fos jako fúzního partnera užitého pro TCR β řetězce. Rozpoznávací místa pro restrikční enzymy jsou podtržena a jsou znázorněny hranice dvou fúzních domén. Sekvence linkeru jsou uvedeny malými písmeny.

Obr. 22 ukazuje sekvenci syntetického oligonukleotidového primeru pro PCR amplifikaci fragmentu νβ-luecinový zip c-fos • 9 ·· ·· • 9 9 · · · • · · · • · • · · 9 · · specifického pro chřipkový matrixový peptid-HLA-A0201 z lidského genu JM22.

Obr. 23 je fotografie gelů. a. Preparát denaturovaného TCR specifického pro 003 HIV gag peptid - HLA-A2 komplex analyzovanýSDS-PAGE. Dráha 1: markér molekulových hmotností širokého rozpětí (Bio-rad). Dráhy 2 a 3: baktérie po indukci exprese užitím 0,5 mM IPTG. Dráhy 4 a 5: purifikovaná inkluzní tělíska solubilizovaná v 6M guanidinovém pufru. b. Preparát denaturovaného biotinem značeného TCR specifického pro komplex chřipkový matrixový peptid-HLA-A2 analyzovaný SDS-PAGE. Dráha 1: markér molekulových hmotností širokého rozpětí (Bio-rad). Dráhy 2 a 3: purifikované a- a β-řetězce z inkluzních tělísek solubilizovaných v 6M guanidinovém pufru. c. Preparát denaturovaného biotinem značeného TCR specifického pro komplex HTLV-tax peptid-HLA-A2 analyzovaný SDS-PAGE. Dráhy 1 a 5: markér molekulových hmotností širokého rozpětí (Bio-rad). Dráhy 2, 3 a 4: a- a β-řetězce a mutované β-řetězce exprimované v bakteriích po indukci 0,5 mM IPTG. Dráhy 6,7 a 8: a- a βřetězce a mutované β-řetězce purifikované z inkluzních tělísek solubilizovaných v 6M guanidinovém pufru.

Obr. 24 je chromatogram ukazující eluci heterodimeru JM22z z kolony s iontoměničem POROS 10HQ. Čárkovaná linie ukazuje konduktivitu typickou pro koncentraci chloridu sodného, plná linie ukazuje optickou denzitu při 280 nm, která je ukazatelem koncentrace proteinu v eluátu. vrcholové frakce obsahující protein byly sloučeny pro další analýzu. Vložený obrázek ukazuje chromatogram eluátu z purifikováných JM22z z kolony Superdex 200 HR. Šipky ukazují kalibraci kolony proteiny se známou molekulovou hmotností. Srovnáním s těmito proteiny má složený JM22z molekulovou hmotnost přibližně 74 kDA, což je v souladu s tím, že jde o heterodimerní protein.

·· ·· ·* « e · » » · • · · · * • ·· · · » • · · · ··*· *· ·· • ·· ·· · · · • · · • · · t • · · ··9 99 9

Obr. 25 je fotografie ukazující elektroforézu na SDSpolyakrylamidovém gelu (obarvený Coomassie) purifikovaných protein z JM22z. Dráhy 1 a 3: standardní proteiny známé molekulové hmotnosti (jak je uvedena). Dráha 2: protein JM22z ošetřený před nanesením nanášecím pufrem s SDS obsahujícím redukční činidlo (DDT). Dráha 4: protein JM22z ošetřený před nanesením nanášecím pufrem s SDS bez redukčního činidla.

Obr. 26: a. Purifikace loženého biotinem značeného TCR specifického pro komplex chřipkový matrixový peptid - HLA-A2.

I. Chromatogram eluátu z kolony POROS 1OHQ. Linie x ukazuje absorbanci při 280 nm y linie y konduktivitu (míru gradientu chloridu sodného užitého k eluci proteinu). Čísla frakcí jsou ukázána vertikální čárou. II. SDS-PAGE frakcí eluovaných podle

I. Dráha 1 obsahuje markéry široké rozpětí molekulových hmotností (Bio-rad) a dráhy 2 až 13 obsahují 5 μΐ frakce 6 až 15, v uvedeném pořadí. III. SDS-PAGE analýza sloučených frakcí z I obsahujících biotinem značený flu-TCR protein. Dráha 1: markéry široké rozpětí molekulových hmotností (Bio-rad). Dráha 2: biotinem značený flu-TCR protein. b. a. Purifikace znovusloženého biotinem značeného TCR specifického pro komplex HTLV-tax peptid - HLA-A2. I. Chromatogram eluátu z kolony POROS 1OHQ. Linie x ukazuje absorbanci při 280 nm y linie y konduktivitu (míru gradientu chloridu sodného užitého k eluci proteinu). Čísla frakcí jsou ukázána vertikální čárou. II. SDSPAGE frakcí eluovaných podle I. Dráha 1 obsahuje markéry široké rozpětí molekulových hmotností (Bio-rad) a dráhy 2 až 10 obsahují 5 μΐ frakce 3 až 11, v uvedeném pořadí. III. SDS-PAGE analýza sloučených frakcí z I obsahujících biotinem značený tax-TCR protein. Dráha 1: markéry pro široké rozpětí molekulových hmotností (Bio-rad). Dráha 2: biotinem značený tax-TCR protein. Dráha 3: biotinem značený mutovaný tax-TCR protein.

• · β · « € · »·· · ř> λ rt

Obr. 27 je chromatogram ukazující eluci biotinem značeného TCR po biotinylaci enzymem BirA z kolony Superdex 200 HR ekvilibrované PBS. Biotinylovaný TCR se eluoval v 15. až 16. minutě a volný biotin přibližně v 21. minutě. Frakce obsahující biotinylovaný rozpustný TCR byly sloučeny pro další použití.

Obr. 28 je sada fotografií gelů k vyhodnocení biotinylace TCR.

a. SDS-PAGE analýza složených TCR a preparátů inkluzních tělísek. Dráha 1: markéry pro široké rozpětí molekulových hmotností (Bio-rad). Dráha 2: biotinylovaný flu-TCR. Dráha 3: biotinylovaný tax-TCR protein. Dráha 4: biotinylovaný mutovaný tax-TCR protein. Dráha 5: HIV gag-TCR (bez biotinové značky).

b. Westernový přenos gelu identického s a až na to, že markér velikostí (Bio-rad) byl také značen biotinem. Barvení bylo provedeno konjugátem avidin-HRP, aby se ukázaly biotinylované proteiny a byly vizualizovány pomocí Opti-4CN (Bio-Rad).

Obr. 29 ilustruje vazbu JM22z na různé HLA-A2-peptidové komplexy (vložený obrázek). Specifita interakce mezi JM22z a HLA-A2-flu je demonstrována srovnáním reakce SPR při průchodu TCR průtokovou komůrkou potaženou 1900 RU HLA-A2-flu s reakcí při průchodu TCR dvěma dalšími průtokovými komůrkami, jednou potaženou 4200 RU HLA-A2-pol a druhou 4300 RU CD5. Základní hodnota (pozadí) pro různé koncentrace JM22z byla 1700 RU HLAA2-pol (a) . Hodnota pozadí byla odečtena od měřených hodnot specifické odpovědi 1900 RU of HLA-AZ-flu (b) a vynesena v závislosti na koncentarci (c) . Hodnota 13 μΜ pro Kd, stanovená pomocí nelineární regrese, je v souladu s hodnotou 12 μΜ pro Kd vypočtenou na základě vynesení shodných dat do grafu podle Scatcharda.

Obr. 30 je graf ukazující výsledky Biacore 2000™ analýzy rozpustného biotinylovaného tax-TCR divokého a mutovaného typu. 5 μΐ divokého tax-TCR s koncentrací 2,2 mg/ml a mutovaného tax• ·· · * · · · · · · · • · · · · · ·· · • ····· · · » · · · • · · ♦ · ··· ···· ·· ·Φ ··· ♦ · ,,,

TCR s koncentrací 2,4 mg/ml bylo analyzováno v průtokové komůrce s navázanými proteiny následujícího druhu: A: tax-pMHC komplex, B/C: flu-pMHC komplex, D: 0X68 kontrolní protein. Jak mutované tak proteiny divokého typu se vázaly podobně na specifické komplexy pMHC.

Obr. 31 ukazuje vliv vazby rozpustného CD8aa na vazbu rozpustného TCR ke stejnému komplexu HLA-A2-flu. (A) TCR nebo TCR se 120 μΜ rozpustného CD8 byl injikován do kontrolní průtokové komůrky potažené 4100 RU irelevantního proteinu (CD5) a vzorkové komůrky potažené 4700 RU of HLA-A2-flu. Jsou ukázány vypočtené rovnovážné hodnoty po odečtení pozadí při různých koncentracích TCR samotného (prázdné kroužky) nebo v kombinaci se 120 μΜ rozpustného CD8 (plné kroužky). Jsou také uvedeny hodnoty pro samotné CD8 (prázdné trojúhelníky) a vypočtené rozdíly mezi TCR + CD8 a TCR samotným (prázdně čtverečky). (B) Časová závislost reakce samotných 49 μΜ TCR (prázdné kroužky) nebo v kombinaci se 120 μΜ CD8 (plné kroužky) na 4700 RU imobilizovaného HLA-A2-flu při 25 °C a průtoku 5 μΐ/minuta (hodnoty jsou korigovány vzhledem k pozadí 4100 RU imobilizovaného CD5). Naměřené hodnoty nebyly ovlivněny současným navázáním CD8.

Obr. 32 ukazuje proteinovou sekvenci (jednopísměnkový kód, horní řádek) a DNA sekvenci (spodní řádek) rozpustného TCR alfa řetězce z JM22 specifického pro HLA-A2/flu matrix jakožto fúzi s doménou leucinového zipu c-jun. Mutace vnesené na 5'-konce DNA sekvence ke zvýšení exprese genu v E. coli jsou znázorněny malými písmeny stejně jako sekvence linkeru mezi sekvencemi TCR a c-jun.

Obr. 33 ukazuje proteinovou sekvenci (jednopísměnkový kód, horní řádek) a DNA sekvenci (spodní řádek) rozpustného TCR beta řetězce z JM22 specifického pro HLA-A2/flu matrix jakožto • · • · • · ···· · · · · · • · · · » · * • ··· · · · · · « • · · · · · ···· ·· ·· ··· fúzi s doménou leucinového zipu c-fos. Sekvence linkeru mezi sekvencemi TCR a c-fos jsou znázorněny malými písmeny. Mutace DNA sekvence vedoucí k substituci cysteinem zbytku serinem jsou znázorněny tučně a podtržením. Tato mutace zvyšuje účinnost složení TCR.

Obr. 34 ukazuje proteinovou sekvenci (jednopísměnkový kód, horní řádek) a DNA sekvenci (spodní řádek) rozpustného TCR beta řetězce z JM22 specifického pro HLA-A2/flu matrix jakožto fúzi s doménou leucinového zipu c-fos a biotinylovatelnou značkou, která působí jako substrát pro BirA. Sekvence linkeru mezi sekvencemi TCR a c-fos a mezi c-fos a biotinylovatelnou značkou jsou znázorněny malými písmeny. Mutace DNA sekvence, která nahrazuje cysteinový zbytek serinem, je znázorněna tučně a podtržena. Tato mutace zvyšuje účinnost skládání TCR.

Obr. 35 schematický diagram fúzního proteinu TCR-zipbiotinylovatelná značka.

Obr. 36. Eluce složeného TCR z kolony POROS 1OHQ gradientem chloridu sodného. TCR se eluuje jako jediný vrchol při 100 mM NaCl. Frakce obsahující protein s hodnotou OD(280 nm) vyšší než 0,1 byly sloučeny a koncentrován pro biotinylaci.

Obr. 37. Separace biotinylovaného TCR gelovou filtrací na koloně Supredex 200HR 10/30 (Pharmacia). TCR-biotin eluuje přibližně v 15 ml, což odpovídá molekulové hmotnosti 69 kDa. (Standardní proteiny a jejich eluční objemy: Thyroglobulin (669 kDa) 10,14 ml, apoferritin (443 kDA) 11,36 ml, betaamyláza (200 kDa) 12,72 ml, dimer BSA (134 kDa) 13,12 ml, monomer BSA (67 kDa) 14,93 ml, ovalbumin (43 kDa) 15,00 ml, chymotrypsinogen A (25 kDa) 18,09 ml, Rnáza A (13,7 kDa) 18,91 ml) .

• · ·« • · · · · · 9

Obr. 38 ukazuje proteinovou sekvenci (jednopisměnkový kód, horní řádek) a DNA sekvenci (spodní řádek) rozpustného TCR alfa řetězce klonu A6 specifického pro HTLV-1 tax/HLA-A2 (Garboczi a kol. 1996) jakožto fúzi s doménou leucinového zipu c-jun. Mutace vnesené na 5'-konec DNA sekvence pro zvýšení exprese v E. coli stejně jako sekvence linkeru mezi sekvencemi TCR a c-jun jsou znázorněny malými písmeny.

Obr. 39 ukazuje proteinovou sekvenci (jednopísmenkový kód, horní řádek) a DNA sekvenci (spodní řádek) rozpustného TCR beta řetězce klonu A6 specifického pro HTLV-1 tax/HLA-A2 (Garboczi a kol. 1996) jakožto fúzi s doménou leucinového zipu c-fos a biotinylovatelnou značkou, která působí jako substrát pro BirA. Sekvence linkeru mezi sekvencemi TCR a c-fos a mezi c-fos a biotinylovatelnou značkou jsou znázorněny malými písmeny. Mutace DNA sekvence, která nahrazuje cysteinový zbytek alaninem, je znázorněna tučně a podtržena.

Obr. 40 ukazuje proteinovou sekvenci (jednopísmenkový kód, horní řádek) a DNA sekvenci (spodní řádek) rozpustného TCR alfa řetězce klonu M10B7/D3 (Ding a kol. 1998) specifického pro HTLV-1 tax/HLA-A2 jakožto fúzi s doménou leucinového zipu c-jun. Sekvence linkeru mezi sekvencemi TCR a c-jun je znázorněna malými písmeny.

Obr. 41 ukazuje proteinovou sekvenci (jednopísmenkový kód, horní řádek) a DNA sekvenci (spodní řádek) rozpustného TCR beta řetězce z klonu mlOB7/D3 (Ding a kol., 1998) specifického pro HTLV-1 Tax/HLA-A2 jakožto fúzi s doménou leucinového zipu c-fos a biotinylovatelnnou značkou, která působí jako substrát pro BirA. Sekvence linkeru mezi sekvencemi TCR a c-fos jsou znázorněny malými písmeny. Mutace DNA sekvence vedoucí k substituci cysteinem zbytku serinem je znázorněna tučně a podtržením. Dvě umlčené mutace (kodony P-G) vnesené z důvodů ·♦ · · • · · « · • · · · ··· · · · • · « klonování a kvůli odstranění restrikčního místa Xmal jsou také vyznačeny malými písmeny.

Příklady provedení vynálezu

V následujících příkladech byly použity uvedené materiály a obecné metody.

Materiály

Restrikční enzymy (Ndel, BamHI, HindlII, Bsu361, Xmal) byly od firmy New England Biolabs.

Tris pH 8,1 byl připraven jako 2M zásobní roztok ze shodných dílů Tris-báze a Tris-HCl, obojí od USB.

EDTA (Sigma) byla připravena jako 0,5M zásobní roztok a pH bylo nastaveno na hodnotu 8,0 užitím 5M NaOH (Sigma).

Glutathion v oxidované a redukované formě byl od firmy Sigma. Také cystamin a cysteamin byly od firmy Sigma.

Chlorid sodný byl od firmy USB a byl připraven jako 4M zásobní roztok.

Soupravy pro minipreparaci plazmidové DNA byly od Quiagen.

PCR purifikační soupravy byly také od Quiagen. DTT byl od

S i gma.

Guanidin byl od firmy Fluka. Močovina byla od firmy

Sigma.

Médium RPMI bylo od firmy Sigma.

PBS byl připraven z tablet od formy Oxoid. Glycerol byl od firmy BDH.

• * • · • · · · φ φ · φ φ ♦ · · φφ φ φ φ φ φ ····)· · · · · · ₉ • φφφφ · · · ···· φφ φφ φφφ φφ φφφ

Obecné metody

Média pro baktérie (média TYP) byla připravena následujícím způsobem:

160 g kvasinkového extraktu (Difco) , 160 g Tryptonu (Difco), 50 g NaCl (USB) a 25 g K₂HPO₄ (BDH) bylo rozpuštěno ve 2 1 demineralizované vody. Alikvotní díly tohoto roztoku po

200 ml byly odměřeny do 10 x 2 L konických baněk a doplněny na 1 1 přidáním 800 ml demineralizované vody. Baňky byly zakryty čtyřmi vrstvami aluminiové fólie, označeny a autoklávovány. Po zchladnutí byly před použitím uschovány mimo přímé sluneční záření při teplotě místnosti.

Koncentrace proteinu se měřily Coomassie vazebným testem (Pierce) a jako standardní protein sloužil BSA. Stručně shrnuto: 0-25 pg BSA standardu v objemu 1 ml vody bylo připraveno ze zásobního roztoku 2 mg/ml BSA (Pierce) ve 4ml plastových kyvetách. Přibližně 10 μρ neznámého proteinu bylo rozpuštěno v 1 ml vody stejným způsobem. Pak se přidal 1 ml Coomassieho činidla (Pierce) do každé kyvety a obsah byl důkladně promíchán. Optická denzita se měřila po 15 minutách při 595 nm pomocí spektrofotometru Beckman DU-530 UV. Z hodnot BSA standardu bia provedena lineární regrese (linearita byla dobrá do 25 pg BSA) a neznámá koncentrace proteinu byla stanovena interpolací z těchto hodnot.

Gelová filtrační chromatografie se prováděla na zařízení FPLC (Pharmacia) řízeném počítačem. Eluce proteinu byla monitorována užitím systému UV-M II měřením absorbance při 280 nm.

Pro separaci v malém měřítku byla užita kolona Superdex 200 HR 10/30 a vzorky se nanášely 1 ml smyčkou. Před vlastní během byla kolona ekvilibrována 30 ml PBS a vzorky pak byly analyzovány s průtokem 0,5 ml/minuta s tím, že lml frakce pak byly sloučeny.

Pro separaci ve velkém měřítku byla užita kolona Superdex 75 nebo 200 PG 26/60 s 10 ml supersmyčkou. V tomto případě byly φφ ΦΦ φ φ φ Φ φ φ Φ φ ΦΦΦΦ φ Φ

ΦΦΦΦ φ φ ·· · ·Φ φ φ φφφ φ φφφ φφφ φφφ • φ ΦΦΦΦ φ φφφ φφφ •Φ Φφφ φφ φφφ odebírány 5 nebo 10 ml a kolona byla promývána průtokem 4 ml/min. Všechny separace probíhaly při teplotě místnosti.

Chromatografie na iontoměničích se prováděla na zařízení Biocad Sprint(Perkin-Elmer). Pro kationtovou výměnu byly užity kolony 20 HS a 50 HS, pro aniontovou výměnu kolony 10 HQ, 20 HQ a 50 HQ. Kolony se užívaly s pufry doporučenými výrobcem pomocí

6-cestného směšovacího zařízení. Malé vzorky (5 až 25 ml) byly vstřikovány pomocí 5ml injekční smyčky, větší vzorky (> 100 ml) byly vstřikovány pomocí jedné z cest pro pufr. V průběhu eluční fáze byly odebírány frakce velikosti 1 ml. Eluovaný protein byl detekován současným měřením (in-line) absorbance při 280 nm.

Elektroforéza na SDS-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) se prováděla na zařízení Mini-Protean II (Bio-Rad). Gely byly nality před použitím následujícím postupem: destičky pro nalévání gelů byly připraveny a zkontrolovány na těsnost. Pak byla připravena směs obsahující. 12 % akrylamid / bisakrylamid (ze zásobního roztoku 30 % akrylamid / 0,8 % bisakrylamid (National Diagnostics)), 0,375 M Tris, pH 8,8 (z 1,5M zásobního roztoku o stejném pH) , 0,1 % SDS (ze zásobního roztoku 10 % SDS), 0,05 % siřičitan amonný (z 10% zásobního roztoku skladovaného při 4 °C) a 0,1 % TEMED (Sigma). Tato směs byla okamžitě nalita na připravený nosič gelu a gel byl překryt vrstvou vodou saturovaného butanolu, aby se zajistil hladký horní povrch gelu. Po usazení gelu (nejméně 10 až 15 minut) byl namíchán vyrovnávací gel následujícího složení: 4 % akrylamid (z výše uvedeného zásobního roztoku), 0,125 M Tris, pH 6,8 (z 0,5M zásobního roztoku o stejném pH) , 0,1% SDS, 0,05% siřičitan amonný a 0,2% TEMED. Butanol byl odstraněn z povrchu rozdělovacího gelu odsátím a na vrch se nalil vyrovnávací gel. Okamžitě byl zasunut hřeben tak, aby se zabránilo vzniku vzduchových bublin a gel byl ponechán ztuhnout. Pak byl hotový gel vložen do výše zmíněného zařízení, které bylo naplněno ke katodě a anodě rozdělovacím pufrem 35 g/1 Tris-báze, 14,4 g/1 glycine, 1 g/1 SDS (připraven z lOx koncentrovaného zásobního roztoku). Po odstranění hřebenu byly nanášecí jamky • · až 10 μς a rozdělení.

propláchnuty pufrem, aby se odstranily zbytky akrylamidové směsi z jamek. Vzorky byly připraveny smícháním proteinu v poměru 1:1 s následující směsí: 4% SDS, 0,125M Tris pH 6,8, 20% glycerol, 10% β-merkaptoethanol, 1% bromfenolová modř (Sigma) . Vzorky pak byly zahřátý na 95 °C na 2 minuty a před nanesením do jamek ochlazeny na 25 °C. Obvykle bylo naneseno proteinu, aby bylo zaručeno dobré obarvení Po nanesení vzorků probíhala elektroforéza při konstantním napětí 200 V po dobu nejméně 40 minut dokud nebyla bromfenolová modř přibližně 5 mm od konce gelu. Po ukončení elektroforézy byl gel vyjmut ze zařízení a opatrně ponořen do roztoku 0,1 % Coomassie R-250 (Sigma) ve směsi 10 % kyseliny octové, 40 % methanolu a 50 % vody. gely pak byly mírně třepány nejméně po 30 minut a pak byly odbarveny v několikrát vyměňované lázni z 10 % kyseliny octové, 40 % methanolu a 50 % vody, dokud nebylo pozadí gelu čiré. Gely pak byly skladovány ve vodě a fotografovány pomocí dokumentačního zřízení UVP pro gely skládajícího se ze světelného zdroje, digitální kamery a termální tiskárny.

Příklad 1

Rekombinantní rozpustná forma heterodimerní molekuly TCR byla připravena metodami genového inženýrství jak je schematicky znázorněna na obr. 1. Každý řetězec se skládá z distální a proximální membránové imunoglobulinové domény, které jsou fúzovány prostřednictvím krátkého flexibilního linkeru (spojky) s motivem svinuté šroubovice („coiled coil), který pomáhá stabilizovat heterodimer.

TCR konstantní domény byly zkráceny bezprostředně před cysteinovým zbytkem, který v podmínkách in vivo vytváří meziřetězcovou disulfidickou vazbu. Tudíž se dva řetězce párují prostřednictvím nekovalentních kvarterních kontaktů, a to je také potvrzeno na obr. 2b. Jelikož Fos-Jun zipové peptidové

Φ Φ

«9

ΦΦ ♦ Φ Φ

ΦΦΦΦ Φ Φ

Φ ΦΦ ΦΦΦ heterodimery jsou schopné vytvářet meziřetězcové disulfidické můstky bezprostředně na N-konci směrem k užitému linkeru (O'Shea a kol. 1989), přičemž vzájemné přiložení řetězců bylo predikováno jako optimální. Fúzní proteiny musí být spojeny způsobem, který je kompatibilní s každou separátní složkou, aby se zabránilo porušení kterékoliv ze struktur.

cDNA kódující alfa a beta řetězce TCR specifického pro epitop 58-66 chřipkového matrixového proteinu v HLA-A2 byla získána z klonu νβ17 + lidského CTL (JM22) užitím metody „ukotvené polymerázové řetězové reakce (PCR), jak byla dříve popsána (Moss a kol. 1991).

Konstrukty alfa a beta řetězce TCR se zipovými doménami pJM22a-Jun a pJM22p-fos byly samostatně připraveny amplifikací variabilní a konstantní domény každého řetězce pomocí standardního postupu PCR a připojením těchto produktů k doménám leucinového zipu z eukaryotických transkripčních faktorů Jun a Fos, v uvedeném pořadí (viz obr. 1) . Bylo ukázáno, že tyto sekvence délky 40 aminokyselin vyvářejí specificky heterodimery, když jsou skládány ze syntetických peptidů, aniž by byly potřebné kovalentní meziřetězcové vazby (O'Shea a kol. 1989).

Primery byly navrženy tak, aby obsahovaly vysoký obsah AT bezprostředně směrem 3' od iniciačního kodonu (s cílem destabilizovat sekundární strukturu mRNA), s využitím preferenčních kodonů E. coli, aby bylo dosaženo maximální exprese (Gao a kol.). „Nadbytečný cystein v konstantní doméně TCR byl mutován na serin, by se s jistotou zabránilo nesprávnému vytvoření disulfidických vazeb v průběhu skládání molekuly.

DNA konstrukty byly ligovány samostatně do expresního vektoru pGMT7 pro E. coli. Štěpení plazmidu a sekvencování plazmidové DNA potvrdily, že konstrukty byly správné.

Celý postup, podrobně popsaný, byl následující:

4

4

4444 44 44 «44

Exprese řetězců TCR -zip inkluzních tělísek:

purifikace denaturovaných

GFG020 and GFG021, expresní plazmidy pGMT7 obsahující JM22a-Jun a JM22p-Fos, v uvedeném pořadí, byly samostatně transformací vneseny do E. coli kmenu BL21 pLysS a jednotlivé kolonie rezistentní k ampicilinu byly kultivovány při 37 °C v TYP médiu (ampicilin 100 μg/ml) do dosažení OD₆oo 0,4 a pak byla indukována exprese proteinu pomocí 0,5mM IPTG. Tři hodiny po indukci byly buňky sklizeny centrifugací 30 minut při 4000 rpm (Beckman J-6B). Pelet buněk byl resuspendován v pufru obsahujícím 50mM Tris-HCl, 25% (hmot./objem) sacharózy, lmM NaEDTA, 0,1% (hmot./objem) azid sodný, lOmM DTT, pH 8,0. Přes noc byly buňky zmraženy a opět rozmraženy, resuspendované buňky byly sonikovány pomocí 1 minutových pulzů celkem 10 minut v sonikátoru Milsonix XL2020 pomocí standardní sondy s průměrem 12 mm. Pelety inkluzních tělísek pak byly centrifugovány 30 minut při 13000rpm v centrifuze Beckman J2-21. Pak byly provedeny tři oplachy detergentem, aby se odstranily zbytky buněk a složky membrány. Pelet inkluzních tělísek byl vždy homogenizován v tritonovém pufru (50mM Tris-HCl, 0,5% TritonX100, 200mM NaCl, lOmM NaEDTA, 0,1 % (hmot./objem) azid sodný, 2mM DTT, pH 8,0) než byl peletován centrifugací 15 minut při 13000 rpm (Beckman J2-21). Detergent a soli pak byly odstraněny obdobně opláchnutím následujícím pufrem: 50mM Tris-HCl, lmM NaEDTA, 0,1 % 30 (hmot./objem) azid sodný, 2mM DTT, pH 8,0. Nakonec byly pelety inkluzních tělísek JM22cc-Jun a JM22P~Fos separátně rozpouštěny v roztoku močoviny (50mM MES, 8M močovina, lOmM NaEDTA, 2mM DTT, pH 6,5) 3 až 4 hodiny při °C. nerozpustný materiál byl pak peletován centrifugací 30 minut při 13000 rpm (Beckman J2-21) a supernatant byl pak rozdělen do alikvotních částí po 1 ml a zamražen v -70 °C. Inkluzní tělíska solubilizovaná v močovině byla kvantifikována Bradfordovým testem s navázáním barviva (Biorad). bylo tak ·99

9

9999 99

získáno pro každý řetězec přibližně 100 mg purifikovaných inkluzních tělísek z 1 litru buněčné kultury. Materiál inkluzních tělísek (JM22a-Jun, JM22p-Fos) byl jednotlivě rozpuštěn v roztoku močoviny na výslednou koncentraci přibližně 20 mg/ml a na základě gelové analýzy byla ověřena čistota, která byla 90% (data neukázána).

Společně složení fúzních proteinů TCR-zip

V počátečních experimentech se znovusložením proteinů, kdy se žíval standardní skládací pufr uvedeného složení (lOOmM Tris pH 8,5, 1 M L-Arginin, 2mM EDTA, 5mM redukovaný glutathion, 0,5mM oxidovaný glutathion, 0,2mM PMSF), docházelo k významné precipitaci proteinů, která byla závislá na přítomnosti zipových domén. Skutečnost, že k tomuto jevu docházelo při koncentracích nižších než je disociační konstanta dimerizace zipových domén (tj. kdy by se většina zipových šroubovic měla vyskytovat ve formě monomeru), vedla k domněnce, že existují ještě další síly, které stabilizují nesprávně složený řetězec. Nejpravděpodobnější vysvětlení je takové, že celé alfa-šroubovicové zipové domény se skládají první a jejich přechodná heterodimerizace indukuje meziřetězcovou agregaci částečně složených intermediátů komplexnějších imunoglobulinových domén. Skládací pufr byl proto změněn tak, že obsahoval 5M močovinu, aby se zabránilo hydrofóbním interakcím mezi částečně složenými imunoglobulinovými doménami a umožnilo se jednotlivým řetězcům úplně se složit před tím, než dojde k dimerizaci. tento krok byl dostatečný k tomu, že zabránil precipitaci, ke které docházelo, a umožnil vznik správně složených heterodimerů TCR-zip s přijatelným výtěžkem, a sice podle následujícího protokolu.

Zásobní roztoky močovinou solubilizovaných řetězců TCRzip JM22cc-Jun a 0M22p-Fos byly renaturovány metodou ředění doprovázeného složením proteinu. Přibližně 30 mg (tj. 1 pmol) ··· ·· · · · » • ··· 9 · · 9999 9 • · · · · ··· ···· ·· ·· »«· 99 999 materiálu inkluzních tělísek každého druhu bylo rozmraženo ze zásobního roztoku a byl přidán DTT (4 pmol/ml), aby se zajistila úplná redukce cysteinových zbytků. Vzorky pak byly promíchány a naředěny do 15 ml guanidinového roztoku (6M hydrochlorid guanidinu, lOmM octan sodný, lOmM EDTA), aby se zajistila úplná denaturace řetězců. Tento guanidinový roztok obsahující plně denaturované řetězce TCR-zip byl injikován do 1 1 skládacího pufru následujícího složení: lOOmM Tris pH 8,5, 400mM L-Arginin, 2mM EDTA, 5mM redukovaný glutathion,

0,5mM oxidovaný glutathion, 5M močovina, 0,2mM PMSF. Roztok byl ponechán 24 hodin. Složený materiál byl pak dvakrát dialyzován, poprvé proti 10 1 lOOmM močoviny a podruhé proti 10 1 lOOmM močoviny, lOmM Tris pH 8,0. Jak krok skládání tak dialyzační krok probíhaly při 6 až 8 °C.

Purifikace složených TCR-zip

Řetězce TCR-zip JM22zip byly separovány od degradačních produktů a nečistot tak, že se produkt o dialýze nanesl na analytickou kolonu POROS 1OHQ s iontoměničem v sedmi alikvotech po 200 ml a navázaný protein se eluoval gradientem 0-400mM NaCl s objemem větším než 50násobek objemu kolony užitím zařízení BioCad Workstation (Perseptive Biosystems). Nekovalentně asociované dimery eluované jako jediný vrchol při lOOmM NaCl. Vrcholové frakce (typicky obsahující heterodimer v koncentraci 100 až 300 μg/ml) byly uschovány při 4 °C před tím, než byly sloučeny a koncentrovány. Výtěžek heterodimerů byl přibližně 15 %.

Charakterizace složeného řetězce TCR-zip JM22zip , JM22zip heterodimer purifikovaný aniontovou výměnou byl eluován z gelové filtrační kolony Superdex 200 (Pharmacia) jako protein velikosti 70 kDa. Je to zvláště důležité vložit kroky gelové filtrace před analýzu vazby metodou povrchové plazmonové

9

999 9 9 rezonance, neboť přesná měření afinity a kinetiky jsou založena na monomerních interakcích, ke kterým dochází. Tímto způsobem lze z rozpustných proteinových frakcí použitých pro analýzu vyloučit agregáty vyšších řádů.

umělé zpomalení detekovaných rychlostních konstant.

Oxidační stav každého řetězce byly zkoumán analýzou na redukujícím/neredukujícím gelu, jak je ukázáno na obr. 2. V přítomnosti SDS, nekovalentně asociované heterodimery disociují na a a β řetězce. Pokud se v nanášecím pufru užije DTT, řetězce se rozdělí na obě strany markéru 31 kDa. v nepřítomnosti denaturantu se oba řetězce chovají jako jednotlivé druhy, ale oba mají zvýšenou mobilitu, což vede k domněnce, že každý řetězec vytvořil jediný druh svázaný disulfidickými vazbami (Garboczi a kol. 1996).

Protilátková reaktivita znovusloženého receptoru byla testována užitím povrchové plazmonové rezonance na zařízení Biacore 2000(Biacore). TCR-zip JM22z byl imobilizován na dextranové matrici (CM čip) při pH 5,5 aminovou kondenzační metodou. Variabilní úseky protilátky specifické pro beta řetězce (νβ17) se specificky vázaly na imobilizovaný receptor, což dokazuje, že receptor byl ve správné konformaci.

Agregáty způsobují zvláště asociačních disociačních

Stabilita

Rozpustné TCR exprimované jako fúze alfa-jun a β-fos leucinový zip byly stálé po dobu několika měsíců a jsou tudíž vhodné k detekci specifických antigenů prezentovaných MHC I. třídy.

9«

9 9 9 • 9 9 9

99999 9 • 9 9

99

Příklad 2

Studie kinetiky a afinity lidský TCR-virový peptid-MHC

Specifická vazba znovusloženého řetězce TCR-zip ke komplexu peptid-HMC

Zařízení pro měření povrchové plazmonové rezonance (Biacore) bylo užito k analýze vazby TCR-zip (JM22zip, specifický pro komplex HLA-A2/chřipkový matrixový protein M5866) k příslušnému peptid-MHC ligandu (viz obr. 3) . To bylo umožněno produkcí jednotlivých komplexů pMHC (níže popsaných), které byly imobilizovány na streptavidinem potažený vazebný povrch semi-orientovaným způsobem, což dovolilo účinné testování vazby rozpustných receptoru T buněk až pro čtyři různé pMHC (imobilizované ve čtyřech různých průtokových komůrkách) současně. Ruční vstřikování komplexů HLA dovoluje snadno nastavit hladinu imobilizovaných molekul I. třídy. Takové imobilizované komplexy jsou schopné vázat jak Treceptory (viz obr. 3) tak i koreceptory CD8act, které oba mohou být injikovány v rozpustné fázi. Specifické vazby TCRzipu je dosaženo i při nízkých koncentracích (alespoň 40 gg/ml), což vede k domněnce, že struktura TCR-zip je poměrně stabilní. Pozorované vazebné vlastnosti JM22z k pMHC jsou kvalitativně i kvantitativně podobné, ať je TCR užit v imobilizované nebo rozpustné fázi. To je důležitou kontrolou parciální aktivity rozpustných molekul a vyplývá z toho také, že biotinylované komplexy pMHC jsou biologicky stejně aktivní jako komplexy nebiotinylované.

Příprava chemicky biotinylovaných HLA komplexů

Způsoby přípravy rozpustných rekombinantních komplexů jediného peptidu s HLA I. třídy byly již popsány (Garboczi ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · • · · · · · · • · · · · · · · ···· ·· ·· ··· ·· ··· a kol 1992). Byly modifikovány, aby bylo možné připravit HLA komplexy, které mají β-2-mikroglobulinové domény chemicky biotinylované a mohou tudíž být imobilizovány na streptavidinem potažený vazebný čip a použity pro měření plazmonové rezonance.

β-2-mikroglobulin byl exprimován a 40mg bylo znovusloženo ve standardním skládacím pufru (lOOmM Tris pH 8,0, 400mM,

L-Arginin, 2mM EDTA, 5mM redukovaný glutathion, 0,5mM oxidovaný glutathion, 0,1 mM PMSF) v podstatě jak popsali Garboczi a kol (1992). Po volitelném kroku gelové filtrace byl protein vnesen do 0,1 M boritanu sodného pH 8,8 a nakonec koncentrován na 5 až 10 mg/ml. β-2-mikroglobulin byl také kvantifikován pomocí Bradfordova testu (Biorad). Nadbytek (5molární) biotinylhydroxysukcinimidu (Sigma) byl přidán ze zásobního roztoku o koncentraci 10 mg/ml v DMSO. Reakce byla ponechána 1 hodinu při teplotě místnosti a pak zastavena přidáním 20 μΐ 1M chloridu amonného/250 μg užitého esteru biotinu. Znovusložené HLA komplexy byl separovány od volného biotinu a volných molekul biotinylovaného beta-2-mikrogiobulinu užitím gelové filtrační kolony Superdex 200(Pharmacia). Streptavidin byl imobilizován standardní aminovou kondenzační metodou.

Závěr

Metody skládání proteinu popsané v příkladu 1 poskytly stálý, správně složený, plně funkční rekombinantní fúzní receptorový protein, který je vhodný pro biofyzikální analýzu prováděnou pomocí optického biosenzoru. Bylo tak poskytnuto činidlo pro detailní afinitní a kinetickou analýzu interakcí lidského TCR a pMHC. Byly také zkoumány vzájemné účinky interakcí koreceptor T buněk - MHC a TCR - pMHC. Použité rekombinantní metody jsou v principu použitelné jak pro lidské tak pro myší TCR, specifické pro I. i II. třídu , a umožňují analyzovat široké spektrum TCR. To umožní zkoumat celou řadu

	46	·· ·· • · · · • · Φ • · · » • · • ·· · ··	« · * • · • · · • · ·· ·	·· · 9 9 · · < · · • · · 9 9 9 9 • · · · · ·
otázek,	jako např.	rozsah afinity	TCR v	rámci	antivirové
reakce,	vlastnosti	dominantně	selektovaných	receptorů

a kinetické požadavky pro spouštění receptoru. Metody také poskytují způsob, jak ověřovat ligandovou specifitu TCR před krystalizačními pokusy a mají také důsledky pro rekombinantní produkci dalších receptorů buněčného povrchu.

Příklad 3

Biotinylace a tetramerizace rozpustných receptorů T buněk

2,5 ml purifikovaného TCR připraveného podle příkladu 1 (přibližně 0,2 mg/ml) bylo převedeno výměnnou pufrů do biotinylačního reakčního pufru (lOmM Tris pH 8,0, 5mM NaCl, 7,5mM MgCl₂) pomocí kolony PD-10 (Pharmacia). Eluát (3,5 ml) byl koncentrován na 1 ml pomocí koncentrátoru Concentricon (Amicon) s limitem molekulové hmotnosti 10 kDa. Pak byl doplněn ATP do 5mM ze zásobního roztoku (0,1 g/ml, pH upraveno na 7,0). Byla přidána směs inhibitorů proteáz: leupeptin, pepstatin a PMSF (0,lmM) a pak byl přidán lmM biotin (z 0,2M zásobního roztoku) a enzym na koncentraci 5 μg/ml (ze zásobního roztoku 0,5 mg/ml). Směs pak byla inkubována přes noc při teplotě místnosti. Nadbytek biotinu byl odstraněn z roztoku dialýzou proti roztoku lOmM Tris pH 8,0, 5mM NaCl (200x objem, se dvěma výměnami, při 4 °C) . Protein byl pak testován na přítomnost vázaného biotinu přenosem na nitorcelulózovou membránu, blokováním 5% odstředěným mlékem v prášku a detekcí pomocí konjugátu streptavidin-HRP (Biorad).

Tetramerizace biotinylovaného rozpustného TCR se uskutečnila buď s konjugáty extravidin-RPE nebo extravidin-FITC (Sigma). Koncentrace rozpustný TCR-biotin byla měřena pomocí Coomassie-vazebného proteinové testu (Pierce) a byl vypočten poměr extravidinové konjugáty/rozpustné TCR 0,224 mg/mg pro dosažení saturace extravidinu biotinylovaným TCR v poměru 1:4. Extravidinové konjugáty byly přidány v alikvotních částech 1/10 ·· ΦΦ Φ*

Φ · Φ 4 « φ

Φ Φ Φ Φ · * ΦΦΦ φ φ φ

Φ ΦΦΦ

ΦΦΦΦ ΦΦ (Φ « φφ φ •Φ Φ Φ ΦΦ

Φ ΦΦΦ

ΦΦΦΦ Φ Φ ΦΦΦ • ΦΦ ΦΦ ΦΦΦ celkového přidaného množství, na ledu, vždy nejméně 15 minut na jeden alikvot (aby se zajistilo nasycení extravidinu). Rozpustné tetramery TCR byly uchovávány ve tmě při 4 °C. Tetramery byly mimořádně stálé po dobu několika měsíců.

Příklad 4

Klonování genů pro receptor T buněk z buněčných linií T buněk nebo klonů T buněk se známou specifitou

Metody a postupy klonování TCR genů z buněk jsou shodné pro všechny a řetězce a β řetězce a jsou proto popsány pouze v tomto příkladu.

Vhodné množství T buněk, typicky 1 až 5 milionů, bylo lyžováno v lyzovacím pufru ze soupravy mRNA Capture Kit (Boehringer Mannheim). mRNA pak byla izolována užitím činidel z této soupravy pomocí hybridizace poly-A konců mRNA na biotinylované oligo-dT. Hybridizované komplexy pak byly vychytány pomocí vazby biotinu na stěny PCR zkumavky potažené streptavidinem. Po imobilizaci mRNA v PCR zkumavce byla generována cDNA pomocí AMV reverzní transkriptázy (Stratagene) podle popisu výrobce soupravy (Boehringer Mannheim, návod k soupravě mRNA Capture Kit).

Na ještě imobilizované cDNA byly generovány 3'poly-G konce užitím enzymu terminální transferázy (Boehringer Mannheim). Pak byla přidána reakční směs pro PCR obsahující přesnou termostabilní polymerázu pfu (klonovaná, Stratagene), aby bylo zajištěno co nejmenší nebezpečí vzniku chybných PCR produktů. PCR byla provedena užitím poly-C kotvového primeru (obr. 4A) a primeru specifického pro a nebo β řetězec (obr. 4B nebo C) nasedajícího na příslušný konstantní úsek TCR. PCR amplifikující fragment genu TCR proběhla ve 30 cyklech denaturace při 95°C, 1 minutu, nasednutí primerů při 50°C, minutu prodlužování řetězce při 72°C, 5 minut.

Produkty PCR byly ligovány do plazmidu Bluescript vhodného jako sekvenační vektor (pBluescript II KS-, Stratagene) s využitím restrikčních míst Xhol a Xmal obsažených v PCR primerech (všechny enzymy od firmy New England Biolabs). Po transfekci ligační směsi do E. colí kmenu XL-1 Blue bylo selektováno několik kolonií pro každý řetězec a bylo provedeno sekvencování DNA na automatickém sekvenačním zařízení ABI 377 Prism pomocí terminátorů BigDye™ (Applied Biosystems lne.).

Příklad 5

Klonování fragmentů DNA kódujících úsek svinuté šroubovice (leucinový zip) obsahujících 40 aminokyselin z c-jun a c-fos

Fragmenty DNA kódující úseky 40 aminokyselin svinuté šroubovice (leucinový zip) z c-jun a c-fos byly připraveny pomocí PCR užitím lidské cDNA jako templátu a oligonukleotidových primerů uvedených na obr. 5. PCR byly provedeny v reakčním pufru obsahujícím pfu polymerázu (Stratagene) ve 30 cyklech denaturace při 95°C, 1 minutu, nasednutí primerů při 58°C, 1 minutu prodlužování řetězce při 72°C, 2 minuty.

Fragmenty c-jun a c-fos byly ligovány do plazmidu pBluescript II KS- (Stratagene) . s využitím restrikčních míst Xhol a Xmal, čímž byly získány konstrukty p8J107 a pBJ108, (obr. 6). Sekvence DNA fragmentů c-jun a c-fos byla ověřena sekvencováním DNA na automatickém sekvenačním zařízení ABI 377 Prism pomocí terminátorů BigDye™ (Applied Biosystems lne.). Sekvencované fragmenty c-jun a c-fos byly subklonovány, s využitím restrikčních míst Xmal a BamHl, do polylinkeru T7 polymerázového expresního vektoru pGMT7 (Studier, Rosenberg a kol. 1990).

Příklad 6 • · φ · · · • · · · « • · ♦ φ « .»··«· φ · ·

Φ··· φφ ·» * · · φ

Konstrukce fúzních proteinů TCR-leucinový stálých rozpustných TCR zip pro přípravu

Pokusy o znovusložení extracelulárních fragmentů a a β TCR řetězců, které byly zkráceny tak aby obsahovaly cysteinové zbytky vytvářející in vivo disulfidické vazby, vedly pouze k částečnému úspěchu (údaje nejsou ukázány, viz také expresní metody a obecné materiály a postupy v příkladu 9) . Avšak když byly a a β TCR řetězce zkráceny bezprostředně před cysteinovým zbytkem, tj . na N-koncové straně, vytvářejícím meziřetězcovou disulfidickou vazbu, analytická chromatografie na koloně Superdex G-75 (Pharmacia) ukázala, že malá frakce proteinu, přibližně 1 až 2 % množství použitého ve skládací reakci, se poskládalo do komplexů s očekávanou velikostí molekuly pro heterodimer zkrácených řetězců α/β (viz také metoda popsaná v Garboczi, Utz a kol.1996).

Vzhledem k tomu, že vytvoření nesprávných disulfidických vazeb může způsobit ireverzibilní chybné složení proteinu v průběhu znovuskládání in vitro, byl mutován cysteinový zbytek v konstantním úseku TCR β řetězce, který není spárován, aby se tak minimalizovala pravděpodobnost, že dojde k chybnému složení

proteinu.	Cysteinový	zbytek	byl	nahrazen	serinovým	nebo
alaninovým	zbytkem. Syntetické	DNA	primery	použité pro	tyto
mutační kroky jsou	uvedeny	na	obr. 7.	Znovusložení a

a mutovaného β řetězce TCR, kdy oba řetězce byly zkráceny bezprostředně před cysteinovým zbytkem, který vytváří meziřetězcový disulfidický můstek, jevilo výrazné zlepšení ve výtěžku heterodimerů, proteinová frakce správně molekulové hmotnosti tvořila 15 až 30 % celkového proteinu.

Avšak když byly tyto rozpustné TCR uschovány přes noc, analýza proteinu pak ukázala, že frakce s molekulovou hmotností odpovídající heterodimerním TCR byla rozdělena do dvou vrcholů • · 9 » • * · · · · 99 * 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

99999 9 · · · · 9 * · · · · 9 9 9

9999 99 99 999 ¢1 · ··· s molekulovou hmotností odpovídající monomerním TCR a řetězcům a β řetězcům. Podobná pozorování byla učiněna po naředění rozpustných TCR, což ukazuje, že stabilita α/β řetězců je nízká a nedostatečná pro analýzu, která vyžaduje delší dobu než jen několik hodin nebo ředění proteinu. Lze tedy uzavřít, že tyto metody poskytly rozpustný TCR pouze s velmi omezenou stabilitou.

Pro zlepšení stability α/β řetězců a jako pomoc k potenciálnímu vytváření heterodimerů v průběhu znovuskládání, byly TCR řetězce fúzovány s doménami leucinového zipu c-jun a c-fos, které jsou známy hlavně tím, že vytvářejí heterodimery (0'Shea, Rutkowski a kol. 1989; Schuermann, Hunter a kol. 1991, O'Shea, Rutkowski a kol. 1992; Glover and Harrison 1995). Dva způsoby konstrukce fúzních TCR byly testovány.

V prvním byl leucinový zip fúzován v místě právě za, tj . na C-konci, cysteinovým zbytkem vytvářejícím meziřetězcovou disulfidickou vazbu v TCR a a β řetězci. Jelikož peptidy leucinových zipů c-jun a c-fos jsou také schopné vytvářet meziřetězcové disulfidické vazby na N-konci od použitého linkeru (O'Shea, Rutkowski a kol. 1989), přiřazení řetězců navzájem a také vzhledem k meziřetězcové disulfidické vazbě, bylo predikováno jako optimální.

Ve druhém způsobu byl leucinový zip fúzován právě před, tj. N-koncově, cysteinovým zbytkem vytvářejícím meziřetězcovou disulf idickou vazbu v TCR a a β řetězci (obr. 8). Takže při tomto druhém způsobu konstrukce je cysteinový zbytek vypuštěn z rekombinantního receptoru.

V pokusech se znovusložením řetězců TCR-zip (TCR-z) těchto konstrukcí bylo zjištěno, že výtěžek heterodimerních rozpustných receptorů byl lepší, když byl cysteinový zbytek vytvářející meziřetězcovou disulfidickou vazbu v TCR vypuštěn z a a β TCR řetězců, jak je ukázáno na obr. 8.

Příklad 7 • · · · ·· · ·· * · · · ««·· »·· • ··· · * · · · · · · • · » · · · · · ···· ·· «· ··· »· ···

Konstrukce DNA expresních vektorů pro proteiny TCR-leucinový zip

Tento příklad popisuje konstrukci expresních vektorů a a β řetězců z pěti TCR. Popsaná strategie a konstrukce je s úpravami použitelná pro jakékoliv lidské nebo zvířecí TCR geny. Ačkoliv pět TCR popsaných v tomto příkladů má specifitu omezenou pro epitopy MHC I. třídy, popsané metody lze shodně využít pro klonování a konstrukci expresních vektorů pro TCR specifické pro MHC II. třídy. Všechny vektory exprimují protein cílený pro znovusložení rozpustných TCR, jak je znázorněno na obr. 9, s výjimkou toho, že dva TCR byly exprimovány s biotinylovatelnou značkovací sekvencí na C-konci (viz dále a také obr. 17, 18 a 19). Použité strategie klonování byly shodné pro všechny a a β řetězce TCR.

Rozsah sekvence vedoucího, nebo signálního, peptidu a a β řetězců TCR byl předpovězen na základě analýzy sekvenčních dat získaných z plazmidů obsahujících produkt TCR kotvového PCR (viz příklad 4). Na základě těchto podkladů byly navrženy 5'primery pro vytvoření PCR fragmentů pro expresi TCR řetězců bez vedoucí sekvence (obr. 9). Všechny 5'primery kódují methioninový zbytek těsně před sekvencí zralého TCR proteinu,

Umlčené mutace byly vneseny do aby se snížila (sekvence peptidu: specifického pro aby byla možná translace v E. coli. substituující C nebo G za A nebo T (obr. 9) několika kodonů proximálně 5'-konci genů, tendence k vytváření sekundární struktury mRNA, která by měla nepříznivý účinek na expresní hladinu v E. coli. (PCT/GB 98103235, Gao, Tormo a kol. 1997, Gao, Gerth a kol. 1998) .

Geny kódující řetězce Vcc0.2 a νβ17 lidského JM22 TCR specifického pro chřipkový matrixový peptid - HLA-A0201

GILGFVFTL), lidské Va23 a νβ5.1 řetězce TCR 003 HIV-1 Gag peptid-HLA-A0201 (sekvence • φ φφφφ φ φ

ΦΦΦ φ 1» φ φ φ β φ φ « φ φφφ • ΦΦΦ ΦΦ ύ·

Φ Φ ΦΦΦ peptidu: SLYNTVATL) a myší Va4 a νβΐΐ řetězce F5 TCR specifického pro NP peptide-H2-D^b (sekvence peptidu: ASNENMDAM) byly amplifikována pomocí PCR užitím plazmidů, které obsahovaly PCR produkty z kotvové reakce na TCR připravené postupem popsaným v příkladu 6.

Geny pro lidské (Va2.3/νβ12.3) řetězce Ά6 TCR a (να17.2/νβ12.3) B7 TCR specifické pro HTLV-1 Tax peptid prezentovaný HLA-A0201 (sekvence peptidu: LLFGYPVYV) byly získány ve formě plazmidů (Garboczi, Utz a kol. 1996; Ding, Smith a kol. 1998), které byly užity pro přípravu PCR produktů ke konstrukci expresních vektorů pro tyto TCR řetězce. Geny pro tyto TCR byly klonovány do expresních vektorů obsahujících sekvence pro fúzní fragmenty biotinylovatelné značky a domény leucinových zipů c-jun a c-fos (viz příklad 8).

PCR reakce byly povedeny s klonovanou přu polymerázou ve standardních podmínkách a pufru (Stratagene) ve 25 cyklech denaturace při 95°C, 1 minutu, nasednutí primerů při 60°C, minutu a prodlužování řetězce při 72°C, 6 minut. PCR produkty byly štěpeny restrikčními enzymy Ndel a Xmal a ligována do vektorů pGMT7 obsahujících c-jun (TCR a řetězec) a c-fos (TCR β řetězec) inzerty (viz příklad 5).

Obr. 10 až 19 ukazují sekvence TCR-z inzertů a predikovanou proteinovou sekvenci exprimovanou vektory pGMT7. Obr. 20 ukazuje sekvenci A6 TCR β řetězce obsahující mutaci v konstantním úseku, která však neovlivňuje detekovatelným způsobem skládání a funkci rozpustného TCR (viz příklady 9 a 10) .

• I»

Příklad 8

Konstrukce DNA vektorů pro expresi TCR β řetězců fúzovaných s biotinylovatelný fragment - leucinový zip c-fos

Aby bylo možné imobilizovat rozpustné TCR nebo detekovat vazbu k receptoru, je užitečné připravit takový protein, který obsahuje další funkční složku. To umožní derivatizovat rozpustný TCR, aby byl produkován jako multimery, nebo umožnil vysokou citlivost detekce, nebo umožnil připojit ke komplexům receptor/receptor jiné funkce.

Tento příklad ukazuje, že konstrukce expresních vektorů pro TCR β řetězce, ke kterým je fúzován polypeptid, který může být specificky in vivo biotinylován v E. coli nebo in vitro pomocí enzymu BirA (Barker and Campbell 1981, Barker a Campbell 1981, Howard, Shaw a kol. 1985; Schatz 1993; O'Callaghan, Byford a kol. 1999). Jak je uvedeno v příkladech 10 a 11, tyto rozpustné TCR fúze mohou být exprimovány a skládány s a řetězcem stejným způsobem a s podobným výtěžkem jako β řetězce, které nejsou fúzovány s biotinylační značkou (BT-tag). Tyto výsledky ukázaly, že rozpustné TCR zde popsané jsou vhodné pro expresi s řadou různých polypeptidů jakožto fúzních partnerů.

β řetězce receptorů T buněk byly subklonovány do expresního vektoru pGMT7 se sekvencí biotinové značky na C-konci sekvence leucinového zipu c-fos uvedenou dále:

start - TCR β řetězec - fos zip - biotin. značka - stop Sekvence konců konstruktů byla následující (viz také obr. 21):

Linker -»|fos zip —»|BamHl|<- linker —>|<— biotin. značka

Pro přípravu rozpustných TCR s biotinovou značkou byly užity dva přístupy. V případě lidských JM22 TCR specifických pro chřipkový matrixový peptid- HLA-A0201 byla fúze β řetězec c-fos leucinový zip modifikována na 3'-konci užitím syntetického DNA primeru uvedeného na obr. 22, který vnesl • * 99 99 · ·9 • · 9 · 9 9 99 * « 9 • 9 9 9 ·· 9 9 9 · 9 · • · · · · »99

9999 99 99 «99 9» 999 restrikční místo BamHI místo HindlII pomocí standardní PCR s pfu polymerázou (Stratagene).

Původní 5'-primer (viz obr. 9) obsahující místo Ndel byl použit jako přímý primer. Vzniklý PCR produkt byl klonován do modifikovaného vektoru pGMT7 obsahujícího sekvenci biotinové , tj. biotinylovatelné značky (biotin-tag) , viz obr. 21, čímž byl vytvořen konstrukt znázorněný výše. Tento plazmid byl označen jako JM8002.

Klonovaný TCR specifický pro epitop HLA-A0201 prezentující HTLV-1 epitop LLFGYPVYV, známý pod označením A6 tax TCR (Va2.3/ νβ2.3) byl zkrácen pomocí PCR s přímým a zpětným primerem uvedeným na obr. 9. Tento řetězec TCR β byl klonován do míst Ndel a Xmal vektoru pGMT7 (JM8002) obsahujícího fragment c-fos-BT.

Po zkonstruování fúzních expresních vektorů bylo povedeno sekvencování DNA, aby bylo potvrzeno, že nebyla vnesena chyba v průběhu subklonování (všechno sekvencování bylo provedeno pomocí automatického sekvenátoru ABI 377 Prism a fluorescenčních terminátorů ABI BigDye v Laboratoři pro sekvencování katedry biochemie Oxfordské Univerzity). Ukázalo se, že v TCR β řetězci byly dvě chyby ve srovnání s publikovanou sekvencí a dalším zkoumáním se zjistilo, že obě chyby byly přítomny již v původním plazmidu. Jelikož obě tyto chyby byly na 3'-konci od jedinečného místa Bsu361 v β řetězci, bylo toto místo užito pro klonování do plazmidu JMB002 (správného) . Obě verze tax TCR β řetězce byly exprimovány a složeny s a řetězcem a porovnány pomocí zařízení Obě verze proteinu se specificky vázaly na peptid tax-MHC I. třídy se stejnou zjevnou (viz příklad 17) . V následujících experimentech byla jen správná verze β řetězce.

Biacore. komplexy afinitou použita

Příklad 9

Exprese TCR řetězců v E. coli a purifikace inkluzních tělísek

TCR a a β řetězce byly exprimovány separátně ve vektoru pGMT7 v E. coli kmenu BL21 DE3pLysS v médiu TYP, pro indukci exprese proteinu bylo užito 0,5mM IPTG, když optická denzita (OD) při 600 nm dosáhla hodnoty mezi 0,2 a 0,6. Indukce byla ponechána přes noc a baktérie pak byly sklizeny centrifugací při 4000 rpm v centrifuze Beckman J-6B.

Pelety bakteriálních buněk pak byly resuspendovány v lyzovacím pufru (lOmM Tris pH 8,1, lOmM EDTA, 150mM NaCl, 2mM DTT, 10% glycerol) . Směs byla ochlazena na ledu a bylo přidáno následující: 20 gg/ml lysozym, 10 mM MgCl₂ a 20 gg/ml DNase I, načež následovala inkubace na ledu nejméně 1 hodinu.

Směs pak byla sonikována užitím 12mm sondy (Milsonix XL2020) při plném výkonu 5 pulzy o délce 30 sekund s intervaly 30 sekund, aby směs vychladla. Teplota byla v průběhu této procedury udržována pomocí lázně voda-led. Směs pak byla naředěna 5 objemy tritonového promývacího pufru (50mM Tris pH 8,1, 0,5% Triton X-100, lOOmM NaCl, 0,1% azid sodný, lOmM EDTA, 2mM DTT). Po nejméně lhodinové inkubaci na ledu byla směs centrifugována při 3500 rpm v centrifuze Beckman GS-6R a supernatant byl odstraněn. Pelet byl resuspendován v resuspendovacím pufru (50mM Tris pH 8,1, lOOmM NaCl, lOmM EDTA, 2mM DTT) pomocí malé plastové pipety na jedno použití. Směs pak byla centrifugována při 8000 rpm v centifuze Beckman J221 a supernatant odstraněn. Pelet byl rozpuštěn v guanidinovém pufru (50mM Tris pH 8,1, 6,0M guanidin-HCl, lOOmM NaCl, lOmM EDTA, lOmM DTT) pomocí ručního homogenizátoru. Po centrifugací při nízké rychlosti kvůli odstranění nerozpustného materiálu byl supernatant rozdělen do shodných částí a uložen v -70 °C. Zpravidla byl dosažený výtěžek 100 mg z jednoho litru bakteriální kultury.

• · · · a · 9 9

9 9

9 99

SDS-PAGE analýza preparátu purifikovaných inkluzních tělísek byla provedena po naředění 2 μΐ preparátu v guanidinovém pufru ve vzorkovém SDS-PAGE pufru a zahřátí na 100 °C po 2 minuty. ještě horké vzorky pak byly naneseny na gel, aby se zabránilo precipitaci směsi guanidin/SDS v průběhu nanášení. Inkluzní tělíska takto purifikovaná měla 90% čistotu, jak se dalo soudit na základě barvení SDS-PAGE pomocí Coomasssie modři (viz obr. 23).

Příklad 10

Složení a purifikace heterodimerů TCR

Močovinou solubilizované proteiny ve stejném poměru byly dále denaturovány v guanidinovém pufru (6M guanidin-HCl, lOmM octan sodný pH 5,5, lOmM EDTA, 2mM DTT) při 37 °C. Směs proteinů byla injikována do ledového skládacího pufru (lOOmM Tris pH 8,1, 0,4M L-Arginin-HCl, 5,0M močovina, 5mM redukovaný glutathion, 0,5mM oxidovaný glutathion) při celkové koncentraci proteinu 60 mg/1 zajišťující dobré promíchání. Po inkubaci na ledu nejméně 5 hodin, aby došlo ke složení, byla směs dialyzována proti 10 objemům demineralizované vody po 24 hodin a pak opět proti 10 objemům 10 mM Tris pH 8,1 po 24 hodin.

Dialyzovaný složený protein byl pak filtrován, aby se odstranily agregované proteiny (vedlejší produkty skládání) přes 0,45 μτη nitrocelulózovou membránu (Whatman) . Purifikace biotinem značených rozpustných TCR byla provedena nanesením na kolonu POROS 2OHQ v zařízení Biocad Sprint. Přibližně 500 ml roztoku se složeným proteinem bylo naneseno v jednom běhu na kolonu a eluce proteinu byla provedena gradientem chloridu sodného v Bis-Tris-propanovém pufru s pH 8,0. protein eluovaný přibližně lOOmM chloridem sodným a odpovídající frakce byly okamžitě ochlazeny na ledu a byla přidána směs inhibitorů proteáz. Frakce byly analyzovány SDS-PAGE a Coomassie-barvením.

···

Příklad 11

Skládání a purifikace heterodimerů TCRz s biotinylovaným β řetězcem

TCR β řetězce s biotinovou značkou byly smíchány se stejným množstvím a řetězců exprimovaných a purifikovaných stejně jako pro rozpustné receptory T buněk. Heterodimerní TCRz-β-ΒΤ byly složeny stejným postupem jaký byl popsán v příkladu 10 pro TCRz (viz také obr. 26).

Příklad 12

Biotinylace rozpustných TCRz-BT s biotinylovatelnou značkou

Frakce obsahující protein byly koncentrovány na 2,5 ml pomocí centrifugačního koncentrátoru (Ultrafree, Millipore) s limitem 10 K. Pufr byl vyměněn užitím vysolovací kolony PD-10 ekvilibrované lOmM Tris pH 8,1, 5mM NaCl, dále byla přidána směs inhibitorů proteáz, a protein byl znovu koncentrován přibližně na 1 ml užitím centrifugačního koncentrátoru. K tomuto 1 ml rozpustného TCR s biotinovou značkou se přidalo následující: 7,5mM MgCl_2/ 5mM ATP (pH 8,0), ImM biotin,

2,5 μg/ml biotinylačního enzymu BirA. Biotinylační reakce pak proběhla při teplotě místnosti (20 až 25 °C) přes noc.

Enzymaticky biotinylované TCR pak byly separovány od zbytku nezreagovaného biotinu gelovou filtrací na koloně Superdex 200 HR (Pharmacia) užitím FPLC systému Pharmacia (viz obr. 27). Kolona byla ekvilibrována s PBS a byly odebírány frakce velikosti 1 ml, které byly okamžitě ochlazeny na ledu a chráněny přidáním směsi inhibitorů proteáz. Koncentrace proteinu byla určena pomocí Coomassie-vazebného testu (Pierce) a biotinylovaný protein byl uložen ve 4 °C na dobu do jednoho měsíce nebo v -20 °C pro dlouhodobé uskladnění.

• φφφ · φ φ φ φ φφφφφφ φφφ φ φφφφφ φ φ φφ φ φ φ ΦΦΦΦ φφφ • φφφ φφ φφ φφφ φφ φφφ

Účinnost biotinylační reakce byla kontrolována pomocí westernového přenosu biotinylovaného proteinu. Proteiny byly rozděleny na SDS-PAGE gelu, jak bylo již dříve popsáno, ale místo barvení gelu byl protein přenesen (blotován) polosuchým přenosem na PVDF membránu (Bio-Rad) pomocí elektroblotovacího zařízení SemiPhor (Hoefer). Blotovací sloupek byl složen ze 6 vrstev filtračního papíru (Whatman 4M) nařezaného na velikost gelu a navlhčeného přenosovým pufrem (25mM Tris-báze, 150mM glycine), PVDF membrány předem navlhčené metanolem a pak nasáknuté přenosovým pufrem, a nakonec z gelu, který byl před tím jemně protřepáván 5 minut v přenosovém pufru, a nakonec ještě 6 dalších vrstev navlhčeného filtračního papíru, celý sloupek byl jemně stlačen zkumavkou, aby se vytlačily všechny vzduchové bubliny, a pak bylo přidáno ještě 10 ml přenosového pufru, aby se usnadnilo vedení. Katoda byla umístěna na povrch sloupku a konstantní proud 50 mA procházel zařízením po 1 hodinu. Membrána pak byla inkubována ve 2% roztoku želatiny (Bio-Rad) v pufru PBS-T (PBS + 0,05% Tween-20) déle než hodinu při teplotě místnosti za jemného třepání. Při inkubaci přes noc byl přidán 0,01% azid sodný kvůli inhibici bakteriálního růstu. Pak byla membrána několikrát (4 až 5x) opláchnuta vždy v novém PBS-T a pak obarvena konjugátem avidin-HRP (Sigma) naředěným 1:1000 v 1% roztoku želatiny v PBS-T déle než 30 minut při teplotě místnosti za jemného třepání. Pak byla membrána několikrát (4 až 5x) opláchnuta vždy v novém PBS-T a pak byl detekován protein na zařízení Opti-4CN (Bio-Rad). Činidlo reaguje v přítomnosti HRP vytvořením nerozpustného modrého barviva, které obarví membránu v místě výskytu relevantního proteinu, což indikuje přítomnost vázané HRP. Když se k obarvení užije konjugát avidin-HRP, indikuje se výskyt proteinu obsahujícího biotin.

Obr. 28 ukazuje membránu po přenosu a detekci (blot) získanou výše uvedeným postupme pro několik biotinylovaných TCR. Standardy velikostí byly biotinylované markéry širokého rozpětí molekulové hmotnosti (Bio-Rad). Výsledky jasně ukazují

4a ·* • · 4 · · ·

4 4 4 4 • 44444 4

4 4 4

4444 44 44

4 4 4

4 444

4 4 4

4 4 4 4

4 4 4

444 44 444 vysokou hladinu biotinylace TCR obsahujících biotinylovatelnou značku po reakci s enzymem BirA.

Příklad 13

Příprava biotinylovaných rozpustných komplexů MHC-peptid

Biotinylované rozpustné komplexy MHC-peptid byly připraveny postupem, který byl popsán v příkladu 2.

Příklad 14

Test specifické vazby mezi rozpustným TCR a MHC-flu-peptidem

Rozpustné molekuly JM22z TCR jsou specifické pro MHC molekuly HLA-A2 prezentující imunodoménový antigen představovaný aminokyselinovým zbytky 58-66 (GILGFVFTL) matrixového chřipkového proteinu. Klonování, exprese a purifikace JM22z jsou popsány v příkladech 4, 7, 9 a 10 a na obr. 24 a 25. Interakce mezi JM22z a jeho komplexem ligand/MHC (HLA-A2-flu) nebo irelevantním komplexem HLA-A2-peptid, jejichž příprava byla popsána v příkladu 13, byly analyzovány měřením povrchové plazmonové rezonance (SPR) biosenzorem Biacore 2000™. SPR měří změny refraktivního indexu vyjádřené v jednotkách odpovědi (RU) v blízkosti povrchu senzoru v malé průtokové komůrce, což je princip, který může být využit k detekci interakcí ligandů a k analýze jejich afinity a kinetických parametrů. Průtoková komůrka pro vzorek byla připravena tak, že jednotlivé komplexy HLA-A2-peptid byly imobilizovány v separátních průtokových komůrkách prostřednictvím navázání biotinu na β2πι a streptavidin, který byl chemickým zesítěním navázán na aktivovaný povrch průtokové komůrky. Test byl pak proveden tak, že JM22z protekl konstantní rychlostí různými komůrkami a přitom se měřila reakce SPR. Na počátku byla specifita interakcí ověřena tím, že komůrkami prošel 28 μΜ

JM22z s konstantním průtokem 5 μΐ/minuta přes tři různé povrchy: jeden potažený 2800 RU HLAA2-flu, druhý 4200 RU HLA-A2 v komplexu s irelevantním peptidem z reverzní transkriptázy HIV (HLA-A2-pol: 1LKEPVHGV) a třetí potažený 4300 RU CD5 (obr. 29a uvnitř). Pro určení základní rezonance (pozadí) bylo užito vstříknutí rozpustného JM22z s konstantním průtokem při různých koncentracích HLA-A2-pol (obr. 29a). Hodnoty těchto kontrolních měření pak byly odečteny od hodnot měření získaných s HLA-A2flu (obr. 29b) a byly užity k výpočtu vazebných afinit vyjádřených formou disociační konstanty Kd (obr. 29c) . Hodnota Kd pro JM22z a relevantní molekuly MHC byla 15 ± 4 μΜ (n=7) při 37 °C a 6, 6 ± 2 μΜ (n=14) při 25 °C. Stanovení pomocí imobilizovaných TCR v průtokové komůrce a rozpustných komplexů MHC-peptid poskytlo podobné hodnoty Kd, a sice 5, 6 ± 4 μΜ (n=3) při 25 °C. Rychlost vzniku interakce byla stanovena na 6, 7 x 10⁴ až 6,9 x 10⁴ M^-1s^_1 při 37 °C a zániku na 1,1 s^-1 (Willcox, Gao a kol. 1999).

Příklad 15

Test specifické vazby mezi rozpustným myším TCR a myším MHC H2-D^b-NP

V tomto příkladu byl užit myší F5 TCR specifický pro peptid pocházející z nukleoproteinu chřipkového viru (aa.366-374: ASNENMDAM) prezentovaný myší MHC molekulou H2-D^b (H2-D^b-NP) . gen pro těžký řetězec MHc byl mírně modifikován v tom smyslu, že kódoval pouze aminokyseliny 1 až 280 z nativního proteinu a 13 aminokyselin rozpoznávaných enzymem BirA. Výsledný protein může být tudíž enzymaticky biotinylován (Schatz 1993, O'Callaghan, Byford a kol. 1999). SPR analýza, pomocí biosenzoru Biacore 2000™, rozpustných TCR specifických pro imobilizované H2-D^b-NP ukázala, že se tento TCR specificky • ··· ··· · · · · · • ···· · I · ···· ·· ·· ··· ·· ··· váže na tuto kombinaci ligandů MHC-peptid (data nejsou ukázána).

Příklad 16

Srovnání vazby biotinylovaného rozpustného tax-TCR a biotinylovaného mutovaného tax-TCR

Biotinylované rozpustné tax-TCR byly připraveny jak je popsáno v příkladech 9 až 11 a analýza pomocí biosenzoru Biacore 2000™ byla provedena jak je popsáno v příkladu 14 užitím biotinylovaných komplexů pMHC sestavených buďto s chřipkovým matrixovým peptidem (GILGFVFTL) nebo HTLV tax 11-19 peptidem (LLFGYPVYV). Biotinylované rozpustné TCR procházely všemi komůrkami při průtoku 5 μΐ/minuta celkem 1 minutu. Obr. 30 ukazuje vazbu nejdříve biotinylovaného rozpustného tax-TCR a pak biotinylovaného mutovaného tax-TCR na komplex MHC - HTLV tax 11-19 peptid (A) . Ani tax-TCR divokého typu ani mutovaný tax-TCR se nevázal ani ke komplexu MHC s chřipkovým matrixovým peptidem (B/C) ani ke kontrole s monoklonální protilátkou 0X68 (D). Tudíž byl učiněn závěr, že biotinylované rozpustné TCR jak divokého typu tak mutované se zjevně účinně a specificky váží na komplex tax-pMHC a projevují jen malé rozdíly ve stupni vazby.

Příklad 17

Analýza simultánní vazby TCR a CD8 koreceptoru na imobilizovaný komplex MHC-peptid

CD8 a CD4 jsou povrchové glykoproteiny, o kterých se věří, že fungují jako společné receptory (koreceptory) s TCR a váží se simultánně na stejné molekuly MHC jako TCR. CD8 je molekula charakteristická pro cytotoxické T buňky a váže se na MHC I. třídy, zatímco CD4 je exprimován na T buňkách pomocné • · · · · · · · · * • · · 9 · · ·· · · ·· «····· · · · • ··· · · · · ·« 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 999 99 999 řady váže se na molekuly MHC II. třídy. CD8 je dimer složený buďto ze dvou identických a řetězců nebo z jednoho a a jednoho β řetězce. Homodimerní molekula aa-CD8 byla připravena jak bylo popsáno již dříve (PCT/GB98/03235, Gao, Tormo a kol. 1997, Gao, Gerth a kol. 1998). V tomto pokusu je popsána simultánní vazba molekul TCR a CD8 na imobilizovaný komplex HLA-A2-flu. Jak je vidět na obr. 31A, vazebná odpověď byla jednoduše aditivní. Odečtením hodnot odpovědi pro TCR (prázdné kroužky) od hodnot kombinované odpovědi (plné kroužky) poskytlo výsledky (prázdné čtverečky) velmi blízké hodnotám odpovědi pro 120 μΜ CD8 samotný (prázdné trojúhelníky). Obr. 31B ukazuje, že kinetika interakce TCR-MHC-peptid nebyla ovlivněna simultánní vazbou CD8. Pozorovaná aditivní vazba ukazuje, že TCR a CD8 se váží na různých místech komplexu MHC-peptid. Tento příklad také ilustruje skutečnost, že v některých případech specifická vazba jedné molekuly neovlivňuje specifickou vazbu jiné molekuly, přičemž situace bude pravděpodobně odlišná pro jiné kombinace molekul.

Příklad 18

Exprese, složení a místně-specifická biotinylace rozpustných α/β TCR

a) Konstrukce a a β řetězců TCR

Rekombinantní rozpustné formy heterodimerních molekul TCR byly zkonstruovány jak je znázorněno na obr. 36. každý řetězec obsahují imunoglobulinové domény, distální a proximální vůči membráně, fúzované prostřednictvím krátkého flexibilního spojovacího prvku (linkeru) s motivem se strukturou svinuté šroubovice, který napomáhá stabilizaci heterodimerů.

Obr. 32 až 34 a 38 až 41 ukazují kódující sekvence DNA a odpovídající aminokyselinové sekvence pro různé TCR alfa

·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · • · · · · · · • · · · • · · · · · · · · a beta řetězce z TCR, které mají různou specifitu. Tento příklad se soustředí na TCR představovaný sekvencemi na obr. 32 až 24, ale popsané metody lze použít shodně s TCR uvedenými na obr. 38 až 41.

Konstantní domény TCR byly zkráceny bezprostředně před cysteinovým zbytkem, který in vivo vytváří meziřetězcovou disulfidickou vazbu. Tudíž dva řetězce párují díky nekovalentním vazbám. Jelikož heterodimery zipových peptidů Jun-Fos jsou také schopné vytvářet meziřetězcové disulfidické vazby bezprostředně na N-konci od linkeru (O'Shea a kol 1989), vzájemné přiřazení obou řetězců bylo predikováno jako optimální. Fúzní proteiny musí být spojeny způsobem, který je kompatibilní s každou složkou samostatně, aby se zabránilo porušení každé ze struktur.

cDNA kódující alfa a beta řetězce TCR specifického pro epitop 58-66 matrixového chřipkového proteinu s HLA-A2 byla získána z νβ17 a klonu lidských CTL (JM22) metodou kotvové PCR popsané v Moss a kol. 1991.

Konstrukty TCR alfa a beta řetězců se zipem pJM22a-Jun a pJM22p-Fos byly připraveny samostatně amplifikací variabilní a konstantní domény každého řetězce standardní metodou PCR a spojením těchto PCR produktů s doménou leucinového zipu z eukaryotických transkripčních faktorů Jun a Fos. Tyto sekvence velikosti 40 aminokyselin specificky heterodimerizuji, aniž by vyžadovaly meziřetězcovou kovalentní vazbu (O'Shea a kol. 1989).

Primery byly navrženy tak, že mají vysoký obsah AT bezprostředně na 3'straně od iniciačního kodonu (aby se destabilizovala sekundární struktura mRNA) a obsahovaly kodony preferované v E. coli, aby bylo dosaženo maximální exprese v E. coli (Gao a kol. 1998). Cystein v konstantní doméně beta řetězce TCR byl mutován na serin, aby se zabránilo nesprávnému vzniku disulfidické vazby v průběhu znovusložení molekuly.

φφ ·Φ·«

DNA sekvence fúze a odpovídající proteinové sekvence jsou uvedeny na obr. 32 a 33. Aby bylo možné uskutečnit místně specifickou biotinylaci beta řetězce TCR, byl na 3'-konce této DNA sekvence exprimující rozpustný νβ17 připojena biotinylovatelná značkovací sekvence (biotin-tag). Pro zkonstruování této DNA’byly užity následující primery:

' -GCTCTAGACATATGGGCCCAGTGGATTCTGGAGTCAC-3 ' a

’ GGGGGAAGCTTAATGCCATTCGAT ' TTTCTGAGCTTCAAAAATATCGTTCAGACCACCAC CGGATCCGTAAGCTGCCAGGATGAACTCTAG-3 ’ .

Výsledné PCR produkty byly naštěpeny restrikčními enzymy Ndel a HindlII (New England Biolabs) a ligovány za pomoci T4 DNA ligázy (New England Biolabs) do vektoru pGMT7 (Studier a kol., 1990). Obr. 3 ukazuje sekvenci DNA inzertu tohoto konstruktu a dedukovanou sekvenci proteinu.

b) Exprese řetězců TCR

Exprese a složení řetězců TCR specifických pro peptid matrixového proteinu chřipkového viru prezentovaný HLA-A*0201 byly provedeny následujícím způsobem:

a a β řetězce TCR byly exprimovány samostatně v E. coli kmenu BL21 DE3pLysS pod kontrolou vektoru pGMT7 v médiu TYP (1,6% bakto-trypton, 1,6% kvasinkový extrakt, 0,5% NaCl, 0,25% K₂HPO₄) . Exprese byla indukována ve střední logaritmické fázi růstu pomocí 0,5 mM IPTG a po 3 až 5 hodinách byly baktérie sklizeny centriugací. Bakteriální buňky byly lyžovány resuspendováním v lyzovacím pufru (lOmM EDTA, 2mM DTT, lOmM Tris pH 8, 150mM NaCl, 0,5mM PMSF, 0,1 mg/ml lysozym,

10% glycerol) a přidáním lOmM MgCl₂ and 20 μg/ml DNázy I, 20minutovou inkubací na ledu a pak sonikací 10 pulzy po 30 sekundách pomocí sonikátoru. Protein, v inkluzních

tělískách, byl purifikován několikerým propláchnutím (obvykle 3x) v tritonovém pufru (0,5% Triton X-100, 50mM Tris pH 8, lOOmM NaCl, 0,1% azid sodný, lOmM EDTA, 2mM DTT) užitím cetrifugace při 15000 rpm po 20 minut k peletaci inkluzních tělísek a pak homogenizátoru k resuspendování. Detergent byl z preparátu odstraněn jediným promytím v 50mM Tris pH 8, lOOmM NaCl, lOmM EDTA, 2mM DTT a protein byl solubilizován močovinovým pufrem (20mM Tris pH 8, 8M močovina, 10% glycerol, 500mM NaCl, lOmM EDTA, 2mM DTT) . Po celonočním promýchávání při 4 °C byl roztok pročištěn centrifugací a solubilizovaný protein byl uložen při -70 °C. Koncentrace proteinu byla stanovena Coomassie-vazebným testem (Pierce).

c) Znovusestavení TCR

Protein solubilizovaný močovinou ve stejných poměrech byl dále denaturován v guanidinovém pufru (6M guanidin-HCl, lOmM octan sodný pH 5,5, lOmM EDTA, 2mM DTT) při 37 °C. Tento roztok byl pak přidán ke skládacímu pufru (5M močovina, lOOmM Tris pH 8, 400mM L-arginin, 5mM redukovaný glutathion, 0,5mM oxidovaný glutathion, 0,lmM PMSF) na ledu při rychlém míchání. Po více než 12 hodinách ve 4 °C byl roztok dialyzován proti 10 objemům vody, pak 10 objemům roztoku lOmM Tris pH 8, lOOmM močoviny. Ve všech krocích byl přidán inhibitor proteáz PMSF, aby se minimalizovaly proteolytické ztráty biotinylovatelné značky TCR.

d) Purifikace TCR

Naředěný roztok TCR byl filtrován přes 0,45 pm filtr, aby se odstranily proteinové agregáty, a pak byl nanesen na kolonu POROS 10HQ. Sestavený TCR byl eluován gradientem chloridu sodného v 10 mM Tris pH 8 a frakce velikosti 1 ml byly odebírány a analyzovány pomocí SDS-PAGE (viz obr. 36) . Frakce • · ·· · o * · t e * ·· · 9 · · · 9 999

9« 99 9 99 9 • 99999 9 9 99 9 9 obsahující TCR byly sloučeny a koncentrovány na 1 ml pomocí centrifugačního koncentrátoru s limitem velikosti 30 kDa.

e) Biotinylace TCR ml roztoku TCR byl upraven na 7,5 mM ATP přidáním pufrovaného ATP, 5 mM MgCl₂ a lmM biotin a byla přidána směs inhibitorů proteáz obsahující PMSF, leupeptin a pepstatin. nakonec byl přidán enzym BirA na výslednou koncentraci 5 gg/ml a reakce probíhala při teplotě místnosti přes noc. TCR pak byly separovány od volného biotinu gelovou filtrací (viz obr. 37). Frakce obsahující biotinylovaný TCR byly sloučeny a byla přidána směs inhibitorů proteáz. Byla také určena koncentrace proteinu. Obr. 35 ukazuje schematický diagram rozpustného biotinylovaného TCR.

• · φ φ · · • · · · φφφ • · « φ φ • ΦΦΦΦ· φ

ΦΦΦΦ φφ ·· φφφ φ φ φφφ

Seznam citovaných publikací • v

Aifantis, I., O. Azogui, et al. (1998). Immunity 9(5): 649-55.

Altamirano, Μ. M., C. Garcia, et al. (1999). Nátuře Biotechnoloay 17: 187191.

Altamirano, Μ. M., R. Golbik, et al. (1997). Proč Nati Acad Sci U S A 94(8): 3576-8.

Amati, B., S. Dalton, et al. (1992). Nátuře 359(6394): 423-6.

Barker, D. F. and A. M. Campbell (1981). J Mol Biol 145(4): 469-92. Barker, D. F., and Campbell, A. M. (1981). J Mol Biol 146, 469-92.

Bentley, G. A., G. Boulot, et al. (1995). Science 267(5206): 1984-7 Issn: 0036-8075.

Bjorkman, P. J., J. L. Strominger, et al. (1985). J. Mol, Biol 186(1): 205-10 Issn: 0022-2836

Boice, J. A., G. R. Dieckmann, etal. (1996). Biochemistry 35(46): 14480-5. Boulot, G., G. A. Bentley, et al. (1994). J Mol Biol 235(2): 795-7 Issn: 0022-2836.

Brocker, T., A. Peter, et al. (1993). Eur J Immunol 23(7): 1435-9 Issn: 0014-2980.

Buday, L. and J. Downward (1993). Cell 73(3): 611-20.

Calaman, S. D., G. R. Carson, et al. (1993). J Immunol Methods 164(2): 233-44 Issn: 0022-1759.

Chao, Η., Μ. E. Houston, Jr., et al. (1996). Biochemistry 35(37): 12175-85. Chang, H. C., 2. Bao, et al. (1994). Proč Nati Acad Sci U S A 91(24): 11408-12.

Chevray, P. M. and D. Nathans (1992). Proč Nati Acad Sci U S A 89(13): 5789-93.

Chicz, R. M., R. G. Urban, et al. (1993). J Exp Med 178(1): 27-47.

Corr, ML, A. E. Slanetz, et al. (1994). Science 265(5174): 946-9.

Davis, Μ. M., J. J. Bonifáce, et al. (1998). Annu. Rev. Immunol. 16: 523544.

de Kruif, J. and T. Logtenberg (1996). J Biol Chem 271(13): 7630-4.

• · · · · · · · · · • · · · · · ···· · · »· · 4 · · ·

Ding, Y. Η., Κ. J. Smith, et al. (1998). Immunitv 8(4): 403-11.

Eilat, D., G. E. Kikuchi, et a!. (1992). Proč NathAcad Sci U S A 89(15): 6871-5 Issn: 0027-8424.

Engelhard, V. H. (1994). Annu Rev Immunol 12:181-207.

Engelhard, V. Η., E. Appella, et al. (1993). Chem Immunol 57: 39-62. Fields, B. A., E. L. Malchiodi, et al. (1996). Nátuře 384(6605): 188-92 Issn: 0028-0836,

Gao, G. F., U. C. Gerth, et al. (1998). Prot Sci. 7: 1245-49.

Gao, G. F., J. Tormo, et al. (1997). Nátuře 387(6633): 630-4.

Garboczi, D. N. and W. E. Biddison (1999). Immunitv 10(1): 1-7.

Garboczi, D. N., P. Ghosh, et al. (1996). Nátuře 384(6605): 134-41. Garboczi, D. N., D. T. Hung, et al. (1992). Proč Nati Acad Sci U S A 89(8): 3429-33 Issn: 0027-8424.

Garboczi, D. N., D. R. Madden, et al. (1994). J Mol Biol 239(4): 581-7 Issn: 0022-2836.

Garboczi, D. N., U. Utz, et al. (1996). J Immunol 157(12): 5403-10.

Garcia, K. C., M. Degano, et al. (1996). Science 274(5285): 209-19 Issn: 0036-8075.

Garcia, K. C., C. A. Scott, et al. (1996). Nátuře 384(6609): 577-81 Issn: 0028-0836.

Glover, J. N. and S. C. Harrison (1995). Nátuře 373(6511): 257-61. Golden, A., S. S. Khandekar, et al. (1997). J Immunol Methods 206(1-2): 163-9.

Greenfield, N. J., G. T. Montelíone, et al. (1998). Biochemistry 37(21): 7834-43.

Gregoire, C., B. Malissen, et al. (1996). Eur J Immunol 26(10): 2410-6 Issn: 0014-2980.

Gregoire, C., N. Rebai, et al. (1991). Proč Nati Acad Sc? U S A 88(18): 8077-81 Issn: 0027-8424.

Hilyard et al (1994) Proč. Nati., Acad, Sci. 91: 9057-9061.

Howard, P. K., J. Shaw, et al. (1985). Gene 35(3): 321-31.

Hu, J. C., N. E. Newell, et al. (1993). Protein Sci 2(7): 1072-84.

« ·

Huczko, E. L„ W. M. Bodnar, et al. (1993). J Immunol 151(5): 2572-87. Hunt, D. F., H. Michel, et al. (1992). Science 256(5065): 1817-20 Issn: 0036-8075.

Ishii, Y., T. Nakano, et al. (1995). J Immunol Methods 186(1): 27-36 Issn: 0022-1759.

Kouzarides, T. and E. Ziff (1989). Nátuře 340(6234): 568-71.

Landschulz, W. Η., P. F. Johnson, et al. (1988). Science 240(4860): 175964.

Lowenstein, E. J., R. J. Daly, et al. (1992). Cell 70(3): 431-42.

Lumb, K. J. and P. S. Kim (1995). Biochemistrv 34(27): 8642-8.

Madden, D. R., D. N. Garboczi, et al. (1993).[published erratum appears In Cell 1994 Jan 28;76(2):following 410]. Cell 75(4): 693-708 Issn: 00928674.

Matsui, K., J. J. Bonifáce, et al. (1994). Proč Nati Acad Sci U S A 91(26): 12862-6 Issn: 0027-8424.

McKnight, S. L. (1991). Sci Am 264(4): 54-64.

Moss et al (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 8987-8990 Issn: 00278424.

Nautiyal, S., D. N. Woolfson, et al. (1995). Biochemistrv 34(37): 11645-51. Necker, A., N. Rebai, et al. (1991). Eur J Immunol 21(12): 3035-40 Issn: 0014-2980.

0'Callaghan, C. A., M. F. Byford, et al. (1999). Anal Biochem 266(1): 9-15. 0'Shea, E. K., R. Rutkowski, et al. (1992). Cell 68(4): 699-708.

O’Shea, E. K., R. Rutkowski, et al. (1989). Science 245(4918): 646-8. O’Shea, E.K., Lumb, K.J. and Kim, P.S. (1993) Curr. Biol. 3: 658-667. Plaksin, D., K. Poláková, et al. (1997). J Immunol 158(5): 2218-27. Rabinowitz, J. D., C. Beeson, et al. (1996). Proč Nati Acad Sci U S A 93(4): 1401-5 Issn: 0027-8424.

Ramiro, A. R., C. Trigueros, et al. (1996). J Exp Med 184(2): 519-30 Issn: 0022-1007.

Reid, S. W., S. McAdam, et al. (1996). J Exp Med 184(6): 2279-86.

Reid, S. W., K. J. Smith, et al. (1996). FEBS Lett 383(1-2): 119-23.

• · · · ·« • · · * 9 9 • 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9

9 9 9

9999 99 99

Riley, L. G., G. B. Ralston, et al. (1996).[published erratum appears ín Protein Eng 1996 Seo:9(91:831l. Protein Eng 9(21: 223-30.

Romagne, F., M. A. Peyrat, et al. (1996). J immunol Methods 189(1): 2536 Issn: 0022-1759.

Saint Ruf, C., K. Ungewiss, et al. (1994). Science 266(5188): 1208-12 Issn: 0036-8075.

Schatz, P. J. (1993). Biotechnoloqy N Y 11(10): 1138-43.

Schlessinger, J. (1994). Curr Opin Genet Dev 4(1): 25-30.

Schlueter, C. J., B. A. Schodin, et al. (1996). J Mol Biol 256(5): 859-69. Schuermann, M., J. B. Hunter, et al. (1991). Nucleic Acids Res 19(4): 73946.

Smith, K. J., S. W. Reid, et al. (1996). Immunity 4(3): 215-28 Issn: 10747613.

Smith, K. J., S. W. Reid, et al. (19961. Immunity 4(3): 203-13 Issn: 10747613.

Studier, F. W., A. H. Rosenberg, et al. (1990). Methods Enzymol 185: 6089 Issn: 0076-6879.

von Boehmer, Η., I. Aifantis, et al. (1998). Immunol Rev 165:111-9. Weber, S., A. Traunecker, et al. (1992). Nátuře 356(6372): 793-6 Issn: 0028-0836.

Wiilcox, Β. E., G. F. Gao, et al. (1999). Immunity 10: 357-65.

Wilson, A. and H. R. MacDonaid (19951. Int Immunol 7(10): 1659-64 Issn: 0953-8178.

Wurch, A., J. Biro, et al. (1998). J Exp Med 188(9): 1669-78.

Wyer, J. R., Β. E. Wllcox, et al. (1999). Immunity 10: 219-225.

Zhang, Z., A. Murphy, et al. (1999). Curr Biol 9(8): 417-20.

SEZNAM SEKVENCÍ <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

Přímý poly-C kotvový oligonukleotidový primer pro PCR amplifikaci cDNA prodloužený na 3'-konci sekvencí G-zbytků užitím terminální transferázy (obr. 4A) <400> 1 taaatactcg aggcgcgccc cccccccccc ccc 33 <210> 2 <211> 48 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

3'-specifický PCR primer pro konstantní úsek lidského alfa řetězce TCR (obr. 4B) <400> 2 atataacccg gggaaccaga tccccacagg aactttctgg gctgggga 4 8 <210> 3 <211> 47 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

3'-specifický PCR primer pro konstantní úsek lidského beta řetězce TCR <400> 3 atataacccg gggaaccaga tccccacagt ctgctctacc ccaggcc 47 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

5'-specifický PCR primer pro leucinový zip lidského c-jun <400> 4 catacacccg ggggtagaat cgcccggctg gag <210> 5 <211> 50 <212> DNA • · • · · · · · · · ···· ·· ·· ·»· ·· ««!

<213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

3'-specifický PCR primer pro leucinový zip lidského c-jun (obr. 5B) <400> 5 gtgtgtgctc gaggatccta gtagttcatg actttctgtt taagctgtgc 50 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

5'-specificcký PCR primer pro leucinový zip lidského c-fos (obr. 5C) <400> 6 catacacccg ggggtctgac tgatacactc caagcggag 39 <210> 7 <211> 49 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

3'-specific PCR primer pro leucinový zip lidského c-fos (obr. 5D) <400> 7 tgtgtgctcg aggatcctag taagcťgcca ggatgaactc tagtttttc 49 <210> 8 <211> 120 <212> DNA <213> tíomo sapiens <220>

<223> Částečná sekvence lidského c-fos kódující doménu leucinového zipu jako fúze s beta řetězcem TCR (Obr. 6B).

<400> 8 ctgactgata cactccaagc ggagacagac caactagaag atgagaagtc tgctttgcag 60 accgagattg ccaacctgct gaaggagaag gaaaaactag agttcatcct ggcagcttac 120 <210> 9 <211> 120 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Částečná sekvence lidského c-jun kódující doménu leucinového zipu jako fúze s alfa řetězcem TCR (Obr. 6C).

<400> 9 agaatcgccc ggctggagga aaaagtgaaa accttgaaag ctcagaactc ggagctggcg 60 tccacggcca acatgctcag ggaacaggtg gcacagctta aacagaaagt catgaactac 120 φφφ * ·φ φφφ <210> 10 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> Aminokyselinová sekvence lidského leucinového zipu c-jun jako fúze s alfa řetězcem TCR (Obr. 6A).

<400> 10

Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gin Asn 15 10 15

Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gin Val Ala Gin 20 25 30

Leu Lys Gin Lys Val Met Asn Tyr 35 40 <210> 11 <211> 40 <212> PRT <213> Arteficiálni sekvence <220>

<223> Aminokyselinová sekvence leucinového zipu lidského C-fos fúzovaného s beta řetězcem TCR (Obr. 6B).

<400> 11

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

Gin

Ala

Glu

Thr

Asp

Gin

Leu

Glu

Asp

Glu

Lys

1

5

10

15

Ser

Ala

Leu

Gin

Thr

Glu

Ile

Ala

Asn

Leu

Leu

Lys

Glu

Lys

Glu

Lys

20

25

30

Leu

Glu

Phe

Ile

Leu

Ala

Ala

Tyr

40 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Arteficiálni sekvence <220>

<223> Popis arteficiálni sekvence:

Přímý PCR primer pro mutování nepárového cysteinu lidského TCR beta řetězce na serin (Obr. 7A) <400> 12 gactccagat acagcctgag cagccg 26 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiálni sekvence <220>

<223> Aminokyselinová sekvence lidského TCR beta řetězce po mutaci nepárového cysteinu na serin (Obr. 7A) <220>

• · • ·

<223> Popis arteficiální sekvence:

Aminokyselinová sekvence lidského TCR beta řetězce po mutaci nepárového cysteinu na serin (Obr. 7A) <400> 13

Asp Ser Arg Tyr Ser Leu Ser Ser 1 5 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

Zpětný PCR primer po mutaci nepárového cysteinu lidského TCR beta řetězce na serin (Obr. 7B) <400> 14 cggctgctca ggctgtatct ggagtc 26 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

Přímý PCR primer nepárového cysteinu lidského TCR beta řetězce na alanin (Obr. 7C) <400> 15 gactccagat acgctctgag cagccg 26 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

Aminokyselinová sekvence lidského beta řetězce TCR po mutaci nepárového cysteinu na alanin (obr. 7C).

<400> 16

Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser 1 5 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

Zpětný PPCR primer pro mutaci nepárového cysteinu lidského beta řetězce TCR na alanin (obr. 7D) <400> 17 cggctgctca gagcgtatct ggagtc ·· · · • ·

<210> 18 <211> 57 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

5' PCR primer pro lidský JM22 TCR Valfa al0.2 řetězec specifický p chřipkový matrixový peptid-HLA-A0201 (obr. 9A) .

<400> 18 gcťctagaca tatgcaacta ctagaacaaa gtccťcagtt tctaagcatc caagagg 57 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> Nová aminokyselinová sekvence zkráceného JM22 TCR alfal0.2 řetězce specifického pro chřipkový matrixový peptid-HLA-A0201 (obr. 9A) .

<400> 19

Meť Gin Leu Leu Glu Gin Ser Pro Gin Phe Leu Ser Ile Gin Glu 15 10 15 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

5’ PCR primer pro lidský JM22 TCR V betal7 řetězce specifický pro chřipkový matrixový peptid-HLA-A0201 (obr. 9B).

<400> 20 gcťctagaca tatggtggat ggtggaatca ctcagtccc 39 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Nová aminokyselinová sekvence zkráceného řetězce JM22 TCR řetězce V betal7 specifického pro chřipkový matrixový peptid-HLA-A0201 (obr. 9B).

<220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

5' PCR primer pro lidský JM22 TCR V betal7 řetězce specifický pro chřipkový matrixový peptid-HLA-A0201 (obr. 9A).

<400> 21

Met Val Asp Gly Gly Ile Thr Gin Ser 1 5 <210> 22 <211> 57 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

5' PCR primer pro myší TCR V alfa4 řetězec specifický pro chřipkový nukleoproteinový peptid-H2Db (obr. 9C).

<400> 22 gctctagaca ťatggattct gttactcaaa tgcaaggtca agtgaccctc tcatcag 57 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

Nová N-koncová aminokyselinová sekvence zkráceného myšího TCR V alfa4 řetězce specifického pro chřipkový nukleoproteinový peptid-H2-Db (Obr. 9C).

<400> 23

Met Asp Ser Val Thr Gin Met Gin Gly Gin Val Thr Leu Ser Ser 1 5 10 15 <210> 24 <211> 53 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<223> 5' PCR primer pro myší TCR V beta 11 řetězec specifický pro chřipkový nukleoproteinový peptid-H2-Db (Obr. 9D) .

<400> 24 gctctagaca tatggaacca acaaatgctg gtgttatcca aacacctagg cac 53 <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <22 0>

<223> Nová N-koncová aminokyselinová sekvence zkráceného myšího V beta 11 řetězce specifického pro chřipkový nukleoproteinový peptid-H2-Db (Obr. 9C).

<400> 25

Met Glu Pro Thr Asn Ala Gly Val Ile Gin Thr Pro Arg His 15 10 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens • · ·*

···· ·· ·· <220>

<223> 5' PCR primer pro lidský 003 TCR V alfa 23 řetězec specifický pro HIV-1 GAGag peptid-HLA-A0201 (obr. 9E) .

<400> 26 ggaattccat atgaaacaag aggttacaca aattcc 36 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> Nová aminokyselinová sekvence zkráceného lidského 003 TCR řetězce Valfa23 specifického pro HIV-1 Gag peptid-HLA-A0201 (Obr. 9E).

<400> 27

Met Lys Gin Glu Val Thr Gin Ile 1 5 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> 5' PCR primer pro lidský řetězce pro lidský 003 TCR řetězec Vbeta5.1 specifický pro HIV-1 Gag peptid-HLA-A0201 (Obr. 9F) .

<400> 28 ggaattccat atgaaagctg gagttactca aactcc 36 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> Nová aminokyselinová sekvence zkráceného lidského 003 TCR řetězce Vbeta5.1 specifického pro HIV-1 Gag peptid-HLA-A0201 (Obr. 9F).

<400> 29

Met Lys Ala Gly Val Thr Gin Thr 1 5 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> 5' PCR primer pro lidský A6 TCR řetězec Valfa2.3 specifický pro HTLV-1 Tax peptid-HLA-A0201 (Obr. 9g) .

<400> 30 cccccccata tgcagaagga agtggagcag aac • · ·· ·· ··

9 9 9 9 9 99 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 • 99999 9 9 9 » t <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> ffoao sapiens <220>

<223> Nová aminokyselinová sekvence zkráceného A6 TCR řetězce

V alfa 2.3 specifického pro HTLV-1 Tax peptid-HLA-A0201 (Obr.9G).

<400> 31

Met Gin Lys Glu Val Glu Gin Lys 1 5 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> ffomo sapiens <220>

<223> 5' PCR primer pro lidský řetězec Vbetal2.3 A6 TCR specifický pro HTLV-1 Tax peptid-HLA-A0201 (Obr.9H).

<400> 32 cccccccata tgaacgctgg tgtcactcag acc 33 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> Nová aminokyselinová sekvence zkráceného A6 TCR řetězce

Vbetal2.3 specifického pro HTLV-1 Tax peptid-HLA-A0201 (0br.9H).

<400> 33

Met Lys Ala Gly Val Thr Gin Thr 1 5 <210> 34 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> 5' PRC <220>

<223> 5' PCR primer pro lidský řetězec B7 TCR Valfal7.2 specifický pro HTLV-1 Tax peptid-HLA-A0201 (Obr. 91).

<400> 34 cccccccata tgcaacaaaa aaatgatgac cagcaagtta agcaaaat 48 <210> 35 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> Nová aminokyselinová sekvence zkráceného B7 TCR řetězce Valfal7.2 specifického pro HTLV-1 Tax peptid-HLA-A0201 TCR (Obr. 91).

• · • · ·· ·· • · · · · · • · · · · • ··· · · · • · · · ···· ·· ·· <400> 35

Met Gin Gin Lys Asn Asp Asp Gin Gin Val Lys Gin Asn 15 10 <210> 36 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> 5' PCR primer pro lidský B7 TCR řetězec Vbetal2.3 specifický pro HTLV-1 Tax peptid-HLA-A0201 (Obr. 9J) .

<400> 36 cccccccata tgaacgctgg tgtcactcag accccaaaat tccag 45 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> Nová aminokyselinová sekvence zkráceného B7 TCR řetězce

Vbetal2.3 specifického pro HTLV-1 Tax peptid-HLA-A0201 TCR (Obr.

<400> 37

Met Asn Ala Gly Val Thr Gin Thr Pro Lys Phe Gin 15 10 <210> 38 <211> 38 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> 3' PCR primer pro řetězec C alfa, obecně použitelný (Obr. 9K) . <400> 38 catacacccg ggggaacttt ctgggctggg gaagaagg 38 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> 3' PCR primer pro řetězec C beta, <400> 39 obecně použitelný (Obr.9L).

catacacccg gggtctgctc taccccaggc ctc <210> 40 <211> 744 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

·· ·· • » · · • · · • ··· • · ···· <· «· • · • · · • · • · • · ·· · <223> Mutovaná sekvence DNA rozpustného JM22 TCR alfa specifického pro HLA-A2/flu matrix, jakožto fúze s doménou leucinového zipu c-jun (Obr. 10).

<400> 40 atgcaactac tagaacaaag tectcagttt ctaagcatcc aagagggaga aaatctcact 60 gtgtactgca actcctcaag tgttttttcc agcttacaat ggtacagaca ggagcctggg 120 gaaggtcctg tcctcctggt gacagtagtt acgggtggag aagtgaagaa gctgaagaga 180 ctaacctttc agtttggtga tgcaagaaag gacagttctc tccacatcac tgcggcccag 240 cctggtgata caggcctcta cctctgtgca ggagcgggaa gccaaggaaa tctcatcttt 300 ggaaaaggca ctaaactctc tgttaaacca aatatccaga accctgaccc tgccgtgtac 360 cagctgagag actctaaatc cagtgacaag tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct 420 caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta 480 gacatgaggt ctatggactt caagagcaac agtgctgtgg cctggagcaa caaatctgac 540 tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc attattccag aagacacctt cttccccagc 600 ccagaaagtt cccccggggg tagaatcgcc cggctggagg aaaaagtgaa aaccttgaaa 660 gctcagaact cggagctggc gtccacggcc aacatgctca gggaacaggt ggcacagctt 720 aaacagaaag tcatgaacta ctag 744 <210> 41 <211> 247 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> Predikovaná aminokyselinová sekvence rozpustného JM 22 TCR alfa specifického pro HLA-A2/flu matrix, jakožto fúze s doménou

	leucinového zipu < <400> 41 Meť Gin Leu Leu Glu Gin 1 5	z-jun (Obr. Ser Pro Gin	10) Phe 10	Leu	Ser	Ile	Gin	Glu 15	Gly
	Glu Asn Leu Thr Val Tyr 20	Cys Asn Ser 25	Ser	Ser	Val	Phe	Ser 30	Ser	Leu
	Gin Trp Tyr Arg Gin Glu 35	Pro Gly Glu 40	Gly	Pro	Val	Leu 45	Leu	Val	Thr
	Val Val Thr Gly Gly Glu 50	Val Lys Lys 55	Leu	Lys	Arg 60	Leu	Thr	Phe	Gin
-	Phe Gly Asp Ala Arg Lys 65 70	Asp Ser Ser	Leu	His 75	Ile	Thr	Ala	Ala	Gin 80
·_	Pro Gly Asp Thr Gly Leu 85	Tyr Leu Cys	Ala 90	Gly	Ala	Gly	Ser	Gin 95	Gly
•	Asn Leu Ile Phe Gly Lys 100	Gly Thr Lys 105	Leu	Ser	Val	Lys	Pro 110	Asn	Ile
	Gin Asn Pro Asp Pro Ala 115	Val Tyr Gin 120	Leu	Arg	Asp	Ser 125	Lys	Ser	Ser
	Asp Lys Ser Val Cys Leu 130	Phe Thr Asp 135	Phe	Asp	Ser 140	Gin	Thr	Asn	Val
	Ser Gin Ser Lys Asp Ser 145 150	Asp Val Tyr	Ile	Thr 155	Asp	Lys	Thr	Val	Leu 160

• 4

44« ·» 44 « » 4 · 4 « • 4 4 « 4 * 444 44 ·

4 4 4 ♦ 44 t 44 44

Asp

Met

Arg

Sex

Met 165

Asp

Phe

Lys

Ser

Asn 170

Ser

Ala

Val

Ala

Trp 175

Ser

Asn

Lys

Ser

Asp 180

Phe

Ala

Cys

Ala

Asn 185

Ala

Phe

Asn

Asn

Ser 190

Ile

Ile

Pro

Glu

Asp 195

Thr

Phe

Phe

Pro

Ser 200

Pro

Glu

Ser

Ser

Pro 205

Gly

Gly

Arg

Ile

Ala 210

Arg

Leu

Glu

Glu

Lys 215

Val

Lys

Thr

Leu

Lys 220

Ala

Gin

Asn

Ser

Glu 225

Leu

Ala

Ser

Thr

Ala 230

Asn

Met

Leu

Arg

Glu 235

Gin

Val

Ala

Gin

Leu 240

Lys

Gin

Lys

Val

Met

Asn

Tyr

245 <210> 42 <211> 864 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> DNA sekvence rozpustného JM 22 TCR beta specifického pro

HLA-A2/flu matrix, jakožto fúze s doménou leucinového zipu c-fos (Obr. 11) .

<400> 42 atggtggatg gtggaatcac tcagtcccca aagtacctgt tcagaaagga aggacagaat 60 gtgaccotga gttgtgaaca gaatttgaac cacgatgcca tgtactggta ccgacaggac 120 ccagggcaag ggctgagatt gatctactac tcacagatag taaatgactt tcagaaagga 180 gatatagctg aagggtacag cgtctctcgg gagaagaagg aatcctttcc tctcactgtg 240 acatcggccc aaaagaaccc gacagctttc tatctctgtg ccagtagttc gaggagctcc 300 tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca cagaggacct gaaaaacgtt 360 ttcccacccg aggtcgctgt gtttgaacca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420 gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg 480 gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag 540 cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600 tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660 gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720 ggtagagcag accccggggg tctgactgat acactccaag cggagacaga tcaacttgaa 780 gacaagaagt ctgcgttgca gaccgagatt gccaatctac tgaaagagaa ggaaaaacta 840 gagttcatcc tggcagctta ctag 864 <210> 43 <211> 287 <212> PRT <213> Hama sapiens <220>

<223> Predikovaná aminokyselinová sekvence rozpustného JM 22 TCR beta specifického pro HLA-A2/flu matrix, jakožto fúze s doménou leucinového zipu c-fos (Obr. 11).

<400> 43

Met Val Asp Sly Gly Ile Thr Gin Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys 15 10 15 • · · β ·· c «· • · · · ···· 4» · · ··· · · · ♦ ♦ • · · · © · · · · · · • · · · · · · ···· ·· ·· ··· ·« ·

82

Glu

Gly

Gin

Asn

Val

Thr

Leu

Ser

Cys

Glu

Gin

Asn

Leu

Asn

His

Asp

20

25

30

Ala

Met

Tyr

Trp

Tyr

Arg

Gin

Asp

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Arg

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Tyr

Ser

Gin

Ile

Val

Asn

Asp

Phe

Gin

Lys

Gly

Asp

Ile

Ala

Glu

50

55

60

Gly

Tyr

Ser

Val

Ser

Arg

Glu

Lys

Lys

Glu

Ser

Phe

Pro

Leu

Thr

Val

65

70

75

80

Thr

Ser

Ala

Gin

Lys

Asn

Pro

Thr

Ala

Phe

Tyr

Leu

Cys

Ala

Ser

Ser

85

90

95

Ser

Arg

Ser

Ser

Tyr

Glu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Arg

Leu

Thr

100

105

110

Val

Thr

Glu

Asp

Leu

Lys

Asn

Val

Phe

Pro

Pro

Glu

Val

Ala

Val

Phe

115

120

125

Glu

Pro

Ser

Glu

Ala

Glu

Ile

Ser

His

Thr

Gin

Lys

Ala

Thr

Leu

Val

130

135

140

Cys

Leu

Ala

Thr

Gly

Phe

Tyr

Pro

Asp

His

Val

Glu

Leu

Ser

Trp

Trp

145

150

155

160

Val

Asn

Gly

Lys

Glu

Val

His

Ser

Gly

Val

Ser

Thr

Asp

Pro

Gin

Pro

165

170

175

Leu

Lys

Glu

Gin

Pro

Ala

Leu

Asn

Asp

Ser

Arg

Tyr

Cys

Leu

Ser

Ser

180

185

190

Arg

Leu

Arg

Val

Ser

Ala

Thr

Phe

Trp

Gin

Asn

Pro

Arg

Asn

His

Phe

195

200

205

Arg

Cys

Gin

Val

Gin

Phe

Tyr

Gly

Leu

Ser

Glu

Asn

Asp

Glu

Trp

Thr

210

215

220

Gin

Asp

Arg

Ala

Lys

Pro

Val

Thr

Gin

Ile

Val

Ser

Ala

Glu

Ala

Trp

225

230

235

240

Gly

Arg

Ala

Asp

Pro

Gly

Gly

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

Gin

Ala

Glu

Thr

245

250

255

Asp

Gin

Leu

Glu

Asp

Lys

Lys

Ser

Ala

Leu

Gin

Thr

Glu

Ile

Ala

Asn

260

265

270

Leu

Leu

Lys

Glu

Lys

Glu

Lys

Leu

Glu

Phe

Ile

Leu

Ala

Ala

Tyr

275 280 285 <210> 44 <211> 795 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

• · · 9 · · • · · β · ··· · · · · ·

9> ···*« · · β · · • · · · · · · •··· ·· ·· ··· ·Φ · <223> DNA sekvence rozpustného řetězce TCR alfa z myšího F5 TCR specifického pro H2-Db/nukleoprotein chřipkového viru, jakožto fúze s doménou leucinového zipu c-jun (Obr. 12).

<220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

Fúzní gen kódující zkrácený myší F5 TCR řetězec fúzovaný s doménou leucinového zipu c-jun <400> 44 aťgaacťaťť ctccagcttť agtgactgtg atgctgtttg tgtttgggag gacccatgga 60 gactcagtaa cccagatgca aggtcaagtg accctctcag aagacgactt cctatttata 120 aactgtactt attcaaccac atggtacccg actcttttct ggtatgtcca atatcotgga 180 gaaggtccac agctcctttt gaaagtcaca acagccaaca acaagggaat cagcagaggt 240 tttgaagcta catatgataa aggaacaacg tccttccact tgcagaaagc ctcagtgcag 300 gagtcagact ctgctgtgta ctactgtgtg ctgggtgatc gacagggagg cagagctctg 360 atatttggaa caggaaccac ggtatcagtc agccccaaca tccagaaccc agaacctgct 420 gtgtaccagt taaaagatce tcggtctcag gacagoaccc totgcctgtt caccgacttt 480 gactcccaaa tcaatgtgcc gaaaaccatg gaatctggaa cgttcatcac tgacaaaact 540 gtgctggaca tgaaagctat ggattccaag agcaatgggg ccattgcctg gagcaaccag 600 acaagcttca cctgccaaga tatctccaaa gagaccaacg coacctacoc cagttcagac 660 gttcccgggg gtagaatcgc ccggctggag gaaaaagtga aaaccttgaa agctcagaac 720 tcggagctgg cgtccacggc caacatgctc agggaacagg tggcacagct taaacagaaa 780 gtcatgaact actag 795 <210> 45 <211> 264 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Predikovaná aminokyselinová sekvence rozpustného myšího řetězce TCR alfa z F5 receptorů specifického pro H2-Db/nukleoprotein chřipkového viru jakožto fúze s doménou leucinového zipu c-jun (Obr. 12).

<220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

Fúzní protein složený ze zkráceného myšího F5 TCR alfa řetězce a domény leucinového zipu c-jun.

<400> 45

Meť 1

Asn

Tyr

Ser

Pro 5

Ala

Leu

Val

Thr

Val 10

Met

Leu

Phe

Val

Phe 15

Gly

Arg

Thr

His

Gly 20

Asp

Ser

Val

Thr

Gin 25

Meť

Gin

Gly

Gin

Val 30

Thr

Leu

Ser

Glu

Asp 35

Asp

Phe

Leu

Phe

Ile 40

Asn

Cys

Thr

Tyr

Ser 45

Thr

Thr

Trp

Tyr

Pro 50

Thr

Leu

Phe

Trp

Tyr 55

Val

Gin

Tyr

Pro

Gly 60

Glu

Gly

Pro

Gin

Leu 65

Leu

Leu

Lys

Val

Thr 70

Thr

Ala

Asn

Asn

Lys 75

Gly

Ile

Ser

Arg

Gly 80

Phe

Glu

Ala

Thr

Tyr 85

Asp

Lys

Gly

Thr

Thr 90

Ser

Phe

His

Leu

Gin 95

Lys

Ala

Ser

Val

Gin 100

Glu

Ser

Asp

Ser

Ala 105

Val

Tyr

Tyr

Cys

Val 110

Leu

Gly

«· 9 9 9 · • · · · · » • · · · a 9

99999 9 9

9 9 9 9

99 9 99 99 999

Asp Arg Gin Gly

Gly

Arg

Ala

Leu Ile Phe Gly Thr Gly Thr Thr

Val

115

120

125

Ser

Val

Ser

Pro

Asn

Ile

Gin

Asn

Pro

Glu

Pro

Ala

Val

Tyr

Gin

Leu

130

135

140

Lys

Asp

Pro

Arg

Ser

Gin

Asp

Ser

Thr

Leu

Cys

Leu

Phe

Thr

Asp

Phe

145

150

155

160

Asp

Ser

Gin

Xle

Asn

Val

Pro

Lys

Thr

Met

Glu

Ser

Gly

Thr

Phe

Ile

165

170

175

Thr

Asp

Lys

Thr

Val

Leu

Asp

Met

Lys

Ala

Met

Asp

Ser

Lys

Ser

Asn

180

185

190

Gly

Ala

Ile

Ala

Trp

Ser

Asn

Gin

Thr

Ser

Phe

Thr

Cys

Gin

Asp

Ile

195

200

205

Ser

Lys

Glu

Thr

Asn

Ala

Thr

Tyr

Pro

Ser

Ser

Asp

Val

Pro

Gly

Gly

210

215

220

Arg

Zle

Ala

Arg

Leu

Glu

Glu

Lys

Val

Lys

Thr

Leu

Lys

Ala

Gin

Asn

225

230

235

240

Ser

Glu

Leu

Ala

Ser

Thr

Ala

Asn

Met

Leu

Arg

Glu

Gin

Val

Ala

Gin

245

250

255

Leu

Lys

Gin

Lys

Val

Met

Asn

Tyr

260 <210> 46 <211> 864 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> DNA sekvence rozpustného TCR beta řetězce z myšího F5 receptoru specifického pro H2-Db/nukleoprotein chřipkového viru jako fúze s doménou leucinového zipu c-fos. (Obr. 13).

<220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

sekvence rozpustného TCR beta řetězce z myšího F5 receptoru specifického pro H2-Db/nukleoprotein chřipkového viru jako fúze s doménou leucinového zipu c-fos.

<400> 46 atgaaagctg gagttactca aactccaaga tatctgatca aaacgagagg acagcaagtg 60 acactgagct gctcccctat ctctgggcat aggagtgtat cctggtacca acagacccca 120 ggacagggcc ttcagttcct ctttgaatac ttcagtgaga cacagagaaa caaaggaaac 180 ttccctggtc gattctcagg gcgccagttc tctaactctc gctotgagat gaatgtgagc 240 accttggagc tgggggactc ggccctttat ctttgcgcca gcagcttcga cagcgggaat 300 tcacccctcc actttgggaa cgggaccagg ctcactgtga cagaggacct gaacaaggtg 360 ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420 gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc ttccctgacc acgtggagct gagctggtgg 480 gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agccaggacc cgcagcccct caaggagcag 540 cccgccctca atgactccag atacagcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600 tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctaegggct ctcggagaat 660 gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gteacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720 ggtagagcag accccggggg tctgactgat acactocaag cggagacaga tcaacttgaa 780 • · · · ·« < · · · « · 9 · ·· • · · ·· · · · • ···*· · « · · ·

9 9 9 9 9 9

99 9 9 9 · · ··· ·· gacaagaagt ctgcgttgca gaccgagatt gccaatctac tgaaagagaa ggaaaaacta 840 gagttoatcc tggcagctta ctag 864 <210> 47 <211> 287 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> aminokyselinová sekvence rozpustného TCR beta řetězce z myšího F5 receptoru specifického pro H2-Db/nukleoprotein chřipkového viru ja fúze s doménou leucinového zipu c-fos (Obr. 13).

<400> 47

Met 1

Lys

Ala

Gly

Val 5

Thr

Gin

Thr

Pro

Arg 10

Tyr

Leu

Ile

Lys

Thr 15

Arg

Gly

Gin

Gin

Val 20

Thr

Leu

Ser

Cys

Ser 25

Pro

Ile

Ser

Gly

His 30

Arg

Ser

Val

Ser

Trp 35

Tyr

Gin

Gin

Thr

Pro 40

Gly

Gin

Gly

Leu

Gin 45

Phe

Leu

Phe

Glu

Tyr 50

Phe

Ser

Glu

Thr

Gin 55

Arg

Asn

Lys

Gly

Asn 60

Phe

Pro

Gly

Arg

Phe 65

Ser

Gly

Arg

Gin

Phe 70

Ser

Asn

Ser

Arg

Ser 75

Glu

Met

Asn

Val

Ser 80

Thr

Leu

Glu

Leu

Gly 85

Asp

Ser

Ala

Leu

Tyr 90

Leu

Cys

Ala

Ser

Ser 95

Phe

Asp

Ser

Gly

Asn 100

Ser

Pro

Leu

His

Phe 105

Gly

Asn

Gly

Thr

Arg 110

Leu

Thr

Val

Thr

Glu 115

Asp

Leu

Asn

Lys

Val 120

Phe

Pro

Pro

Glu

Val 125

Ala

Val

Phe

Glu

Pro 130

Ser

Glu

Ala

Glu

Ile 135

Ser

His

Thr

Gin

Lys 140

Ala

Thr

Leu

Val

Cys 145

Leu

Ala

Thr

Gly

Phe 150

Phe

Pro

Asp

His

Val 155

Glu

Leu

Ser

Trp

Trp 160

Val

Asn

Gly

Lys

Glu 165

Val

His

Ser

Gly

Val 170

Ser

Gin

Asp

Pro

Gin 175

Pro

Leu

Lys

Glu

Gin 180

Pro

Ala

Leu

Asn

Asp 185

Ser

Arg

Tyr

Ser

Leu 190

Ser

Ser

Arg

Leu

Arg 195

Val

Ser

Ala

Thr

Phe 200

Trp

Gin

Asn

Pro

Arg 205

Asn

His

Phe

Arg

Cys 210

Gin

Val

Gin

Phe

Tyr 215

Gly

Leu

Ser

Glu

Asn 220

Asp

Glu

Trp

Thr

Gin 225

Asp

Arg

Ala

Lys

Pro 230

Val

Thr

Gin

Ile

Val 235

Ser

Ala

Glu

Ala

Trp 240

*999 «999 9 · 9

9 9 9 · 9 9» • 999 · 9 9 9 «9 9

9 9 9 9 9 9 •999 99 99 999 99 9

Gly

Arg

Ala

Asp

Pro 245

Gly

Gly

Leu

Thr

Asp 250

Thr

Leu

Gin

Ala

Glu 255

Thr

Asp

Gin

Leu

Glu 260

Asp

Lys

Lys

Ser

Ala 265

Leu

Gin

Thr

Glu

Ile 270

Ala

Asn

Leu

Leu

Lys 275

Glu

Lys

Glu

Lys

Leu 280

Glu

Phe

Ile

Leu

Ala 285

Ala

Tyr

<210> 48 <211> 747 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> DNA sekvence rozpustného TCR alfa řetězce zpacienta 003 specifického pro HLA-A2/HIV-1 Gag jako fúze s doménou leucinového zipu c-jun (Obr. 14).

<220>

<223> Popis arteficiální sekvence: DNA sekvence rozpustného TCR alfa řetězce zpacienta 003 specifického pro HLA-A2/HIV-1 Gag jako fúze s doménou leucinového zipu c-jun (Obr. 14).

<400> 48 atgaaacaag aagttacaca gattcctgca gctctgagtg tcccagaagg agaaaacttg 60 gttctcaact gcagtttcac tgatagcgct atttacaacc tccagtggtt taggcaggac 120 cctgggaaag gtctcacatc tctgttgctt attcagtcaa gtcagagaga gcaaacaagt 180 ggaagactta atgcctcgct ggataaatca tcaggacgta gtactttata cattgcagct 240 tctcagcctg gtgactcagc cacctacctc tgtgctgtga ccaacttcaa caaattttac 300 tttggatctg ggaccaaact caatgtaaaa ocaaatatcc agaaccctga ccctgccgtg 360 taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat 420 totoaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaaactgtg 480 ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct 540 gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc 600 agcccagaaa gttcccccgg gggtagaatc gcccggctgg aggaaaaagt gaaaaccttg 660 aaagctcaga actcggagct ggcgtccacg gccaacatgc tcagggaaca ggtggcacag 720 cttaaacaga aagtcatgaa ctactag 747 <210> 49 <211> 248 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

aminokyselinová sekvence rozpustného TCR alfa řetězce zpacienta 003

	specifického pro :	HLA-A2/HIV-1	Gag	jakc	i fúze s	doménou	leucinového
	zipu c-jun (Obr.	14) .
<400> 49
Met	Lys Gin Glu Val Thr	Gin	Ile	Pro	Ala	Ala	Leu	Ser	Val Pro	Glu
1	5				10				15
Gly	Glu Asn Leu Val Leu	Asn	Cys	Ser	Phe	Thr	Asp	Ser	Ala Ile	Tyr
	20			25					30
Asn	Leu Gin Trp Phe Arg	Gin	Asp	Pro	Gly	Lys	Gly	Leu	Thr Ser	Leu
	35		40					45

···· ·· »· · • ··

Leu

Leu

Ile

Gin

Ser

Ser

Gin

Arg

Glu

Gin

Thr

Ser

Gly

Arg

Leu

Asn

50

55

60

Ala

Ser

Leu

Asp

Lys

Ser

Ser

Gly

Arg

Ser

Thr

Leu

Tyr

Ile

Ala

Ala

65

70

75

80

Ser

Gin

Pro

Gly

Asp

Ser

Ala

Thr

Tyr

Leu

Cys

Ala

Val

Thr

Asn

Phe

85

90

95

Asn

Lys

Phe

Tyr

Phe

Gly

Ser

Gly

Thr

Lys

Leu

Asn

Val

Lys

Pro

Asn

100

105

110

Ile

Gin

Asn

Pro

Asp

Pro

Ala

Val

Tyr

Gin

Leu

Arg

Asp

Ser

Lys

Ser

115

120

125

Ser

Asp

Lys

Ser

Val

Cys

Leu

Phe

Thr

Asp

Phe

Asp

Ser

Gin

Thr

Asn

130

135

140

Val

Ser

Gin

Ser

Lys

Asp

Ser

Asp

Val

Tyr

Ile

Thr

Asp

Lys

Thr

Val

145

150

155

160

Leu

Asp

Met

Arg

Ser

Met

Asp

Phe

Lys

Ser

Asn

Ser

Ala

Val

Ala

Trp

165

170

175

Ser

Asn

Lys

Ser

Asp

Phe

Ala

Cys

Ala

Asn

Ala

Phe

Asn

Asn

Ser

Ile

180

185

190

Ile

Pro

Glu

Asp

Thr

Phe

Phe

Pro

Ser

Pro

Glu

Ser

Ser

Pro

Gly

Gly

195

200

205

Arg

Ile

Ala

Arg

Leu

Glu

Glu

Lys

Val

Lys

Thr

Leu

Lys

Ala

Gin

Asn

210

215

220

Ser

Glu

Leu

Ala

Ser

Thr

Ala

Asn

Met

Leu

Arg

Glu

Gin

Val

Ala

Gin

225

230

235

240

Leu

Lys

Gin

Lys

Val

Met

Asn

Tyr

245 <210> 50 <211> 864 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

DNA sekvence rozpustného TCR beta řetězce zpacienta 003 specifického pro HLA-A2/HIV-1 Gag jako fúze s doménou leucinového zipu c-fos (Obr. 15).

<400> 50 atgaaagctg gagttactca aactccaaga tatctgatca aaacgagagg acagcaagtg 60 acactgagct gctcccctat ctctgggcat aggagtgtat cctggtacca acagacccca 120 ggacagggcc ttcagttcct ctttgaatac ttcagtgaga cacagagaaa caaaggaaac 180 ttccctggtc gattctcagg gcgccagttc tctaactctc gctctgagat gaatgtgagc 240 accttggagc tgggggactc ggccctttat ctttgcgcca gcagcttcga cagcgggaat 300 tcacccctoo actttgggaa cgggaecagg ctcactgtga cagaggacct gaacaaggtg 360 ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420 gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc ttccctgacc acgtggagct gagctggtgg 480

ΦΦ ΦΦ · · φ ΦΦ • ΦΦΦ φφφφ « φφφ φφφ φφφ φ φφφφφ φ φ · φ φ φ φ φφφφ φφφ φφφφ ΦΦ ΦΦ φφφ ΦΦ φφφ gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcoaggacc cgcagcccct caaggagcag 540 cccgccotca atgaotccag atacagcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaocttc 600 tggcagaacc coogoaaooa cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660 gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcaoccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720 ggtagagcag accccggggg tctgactgat acactccaag cggagacaga tcaacttgaa 780 gacaagaagt ctgcgttgca gaccgagatt gccaatctac tgaaagagaa ggaaaaacta 840 gagttcatcc tggcagctta ctag 864 <210> 51 <211> 287 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

aminokyselinová sekvence DNA sekvence rozpustného TCR beta řetězce z pacienta 003 specifického pro HLA-A2/HIV-1 Gag jako fúze s doménou leucinového zipu c-fos (Obr. 15).

<400> 51

Met 1

Lys

Ala

Gly

Val 5

Thr

Gin

Thr

Pro

Arg 10

Tyr

Leu

Ile

Lys

Thr 15

Arg

Gly

Gin

Gin

Val 20

Thr

Leu

Ser

Cys

Ser 25

Pro

Ile

Ser

Gly

His 30

Arg

Ser

Val

Ser

Trp 35

Tyr

Gin

Gin

Thr

Pro 40

Gly

Gin

Gly

Leu

Gin 45

Phe

Leu

Phe

Glu

Tyr 50

Phe

Ser

Glu

Thr

Gin 55

Arg

Asn

Lys

Gly

Asn 60

Phe

Pro

Gly

Arg

Phe 65

Ser

Gly

Arg

Gin

Phe 70

Ser

Asn

Ser

Arg

Ser 75

Glu

Met

Asn

Val

Ser 80

Thr

Leu

Glu

Leu

Gly 85

Asp

Ser

Ala

Leu

Tyr 90

Leu

Cys

Ala

Ser

Ser 95

Phe

Asp

Ser

Gly

Asn 100

Ser

Pro

Leu

His

Phe 105

Gly

Asn

Gly

Thr

Arg 110

Leu

Thr

Val

Thr

Glu 115

Asp

Leu

Asn

Lys

Val 120

Phe

Pro

Pro

Glu

Val 125

Ala

Val

Phe

Glu

Pro 130

Ser

Glu

Ala

Glu

Xle 135

Ser

His

Thr

Gin

Lys 140

Ala

Thr

Leu

Val

Cys 145

Leu

Ala

Thr

Gly

Phe 150

Phe

Pro

Asp

His

Val 155

Glu

Leu

Ser

Trp

Trp 160

Val

Asn

Gly

Lys

Glu 165

Val

His

Ser

Gly

Val 170

Ser

Gin

Asp

Pro

Gin 175

Pro

Leu

Lys

Glu

Gin 180

Pro

Ala

Leu

Asn

Asp 185

Ser

Arg

Tyr

Ser

Leu 190

Ser

Ser

Arg

Leu

Arg 195

Val

Ser

Ala

Thr

Phe 200

Trp

Gin

Asn

Pro

Arg 205

Asn

His

Phe

Arg

Cys 210

Gin

Val

Gin

Phe

Tyr 215

Gly

Leu

Ser

Glu

Asn 220

Asp

Glu

Trp

Thr

Gin 225

Asp

Arg

Ala

Lys

Pro 230

Val

Thr

Gin

Ile

Val 235

Ser

Ala

Glu

Ala

Trp 240

Gly

Arg

Ala

Asp

Pro 245

Gly

Gly

Leu

Thr

Asp 250

Thr

Leu

Gin

Ala

Glu 255

Thr

Asp

Gin

Leu

Glu 260

Asp

Lys

Lys

Ser

Ala 265

Leu

Gin

Thr

Glu

Ile 270

Ala

Asn

Leu

Leu

Lys 275

Glu

Lys

Glu

Lys

Leu 280

Glu

Phe

Ile

Leu

Ala 285

Ala

Tyr

<210> 52 <211> 750 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

DNA sekvence TCR alfa řetězce klonu A6 specifického pro HTLV1 Tax/HLA-A2 jako fúze s doménou leucinového zipu c-jun (OBR. 16) <400> 52 atgcagaagg aagtggagca gaactctgga cccctcagtg ttccagaggg agccattgcc 60 tetctcaact gcacttacag tgaccgaggt tcccagtcct tcttctggta cagacaatat 120 tctgggaaaa gccctgagtt gataatgtcc atatactcca atggtgacaa agaagatgga 180 aggtttacag cacagctcaa taaagccagc cagtatgttt ctctgctcat cagagactcc 240 cagcccagtg attcagccac ctaectctgt gccgt+acaa ctgacagctg ggggaaattg 300 cagtttggag cagggaccca ggttgtggtc accccagata tccagaaccc tgaccctgcc 360 gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg tctgcctatt caccgatttt 420 gattctcaaa caaatgtgtc acaaagtaag gattctgatg tgtatatcac agacaaaact 480 gtgctagaca tgaggtctat ggactteaag agcaacagtg ctgtggcctg gagcaaeaaa 540 tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga caccttcttc 600 cccagcccag aaagttcccc cgggggtaga atcgcccggc tggaggaaaa agtgaaaacc 660 ttgaaagctc agaactcgga gctggcgtcc acggccaaca tgctcaggga acaggtggca 720 cagcttaaac agaaagtcat gaactactag 750 <210> 53 <211> 249 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

aminokyselinová sekvence TCR alfa řetězce klonu A6 specifického pro HTLV1 Tax/HLA-A2 jako fúze s doménou leucinového zipu c-jun (OBR. 16) <400> 53

Met Gin Lys Glu Val Glu Gin Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu 15 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gin 20 25 30 • 9

9 9 9 9 9 9

99 9 99 9 9 999 9 9 9

Ser

Phe

Phe 35

Trp

Tyr Arg

Gin

Tyr 40

Ser

Gly Lys

Ser

Pro 45

Glu

Leu

Ile

Met

Ser

Ile

Tyr

Ser

Asn

Gly

Asp

Lys

Glu

Asp

Gly

Arg

Phe

Thr

Ala

50

55

60

Gin

Leu

Asn

Lys

Ala

Ser

Gin

Tyr

Val

Ser

Leu

Leu

Ile

Arg

Asp

Ser

65

70

75

80

Gin

Pro

Ser

Asp

Ser

Ala

Thr

Tyr

Leu

Cys

Ala

Val

Thr

Thr

Asp

Ser

85

90

95

Trp

Gly

Lys

Leu

Gin

Phe

Gly

Ala

Gly

Thr

Gin

Val

Val

Val

Thr

Pro

100

105

110

Asp

Ile

Gin

Asn

Pro

Asp

Pro

Ala

Val

Tyr

Gin

Leu

Arg

Asp

Ser

Lys

115

120

125

Ser

Ser

Asp

Lys

Ser

Val

Cys

Leu

Phe

Thr

Asp

Phe

Asp

Ser

Gin

Thr

130

135

140

Asn

Val

Ser

Gin

Ser

Lys

Asp

Ser

Asp

Val

Tyr

Ile

Thr

Asp

Lys

Thr

145

150

155

160

Val

Leu

Asp

Met

Arg

Ser

Met

Asp

Phe

Lys

Ser

Asn

Ser

Ala

Val

Ala

165

170

175

Trp

Ser

Asn

Lys

Ser

Asp

Phe

Ala

Cys

Ala

Asn

Ala

Phe

Asn

Asn

Ser

180

185

190

Ile

Ile

Pro

Glu

Asp

Thr

Phe

Phe

Pro

Ser

Pro

Glu

Ser

Ser

Pro

Gly

195

200

205

Gly

Arg

Ile

Ala

Arg

Leu

Glu

Glu

Lys

Val

Lys

Thr

Leu

Lys

Ala

Gin

210

215

220

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Ser

Thr

Ala

Asn

Met

Leu

Arg

Glu

Gin

Val

Ala

225

230

235

240

Gin

Leu

Lys

Gin

Lys

Val

Met

Asn

Tyr

245 <210> 54 <211> 928 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

DNA sekvence TCR beta řetězce klonu A6 specifického pro HTLV-1 Tax/HLA-A2 jako fúze s doménou leucinového zipu c-fos a biotinylovanou značkou BirA.

<400> 54 atgaacgctg acactgcagt ggcatggggc gtccccaatg tcggctgctc gtgtcactca gtgcccagga tgaggctgat gctacaatgt cctcccagac gaccccaaaa ttccaggtcc tgaagacagg acagagcatg 60 tatgaaccat gaatacatgt cctggtatcg acaagaccca 120 tcattactca gttggtgctg gtatcactga ccaaggagaa 180 ctccagatca accacagagg atttcccgct caggctgctg 240 atctgtgtac ttctgtgcca gcaggccggg actagcggga 300 • · ··· · ·· gggcgaccag agcagtactt cgggccgggo accaggctca cggtcacaga ggacctgaaa 360 aacgtgttcc cacccgaggt cgctgtgttt gagccatcag aagcagagat ctcccacacc 420 caaaaggcca cactggtgtg cctggccaca ggcttctacc ccgaccacgt ggagctgagc 480 tggtgggtga atgggaagga ggtgcacagt ggggtcagca cagacccgca gcccctcaag 540 gagcagcccg ccctcaatga ctccagatac gctctgagca gccgcctgag ggtctcggcc 600 accttctggc agaacccccg caaccacttc cgctgtcaag tccagttcta cgggctctcg 660 gagaatgacg agtggaccca ggatagggcc aaacctgtca cccagatcgt cagcgccgag 720 gcctggggta gagcagaccc cgggggtctg actgatacac tccaagcgga gacagatcaa 780 cttgaagaca agaagtctgc gttgcagacc gagattgcca atctactgaa agagaaggaa 840 aaactagagt tcatcctggc agcttacgga tccggtggtg gtctgaacga tatttttgaa 900 gctcagaaaa tcgaatggca ttaagctt 928 <210> 55 <211> 307 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

Aminokyselinová sekvence TCR beta řetězce klonu A6 specifického pro HTLV-1 Tax/HLA-A2 jako fúze s doménou leucinového zipu c-fos a biotinylovanou značkou BirA.

<400> 55

Met 1

Asn Ala

Gly

Val 5

Thr

Gin Thr Pro Lys Phe Gin Val 10

Leu

Lys 15

Thr

Gly

Gin

Ser

Met

Thr

Leu

Gin

Cys

Ala

Gin

Asp

Met

Asn

His

Glu

Tyr

20

25

30

Met

Ser

Trp

Tyr

Arg

Gin

Asp

Pro

Gly

Met

Gly

Leu

Arg

Leu

Ile

His

35

40

45

Tyr

Ser

Val

Gly

Ala

Gly

Ile

Thr

Asp

Gin

Gly

Glu

Val

Pro

Asn

Gly

50

55

60

Tyr

Asn

Val

Ser

Arg

Ser

Thr

Thr

Glu

Asp

Phe

Pro

Leu

Arg

Leu

Leu

65

70

75

80

Ser

Ala

Ala

Pro

Ser

Gin

Thr

Ser

Val

Tyr

Phe

Cys

Ala

Ser

Arg

Pro

85

90

95

Gly

Leu

Ala

Gly

Gly

Arg

Pro

Glu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Arg

100

105

110

’’

Leu

Thr

Val

Thr

Glu

Asp

Leu

Lys

Asn

Val

Phe

Pro

Pro

Glu

Val

Ala

-

115

120

125

Val

Phe

Glu

Pro

Ser

Glu

Ala

Glu

Ile

Ser

His

Thr

Gin

Lys

Ala

Thr

130

135

140

Leu

Val

Cys

Leu

Ala

Thr

Gly

Phe

Tyr

Pro

Asp

His

Val

Glu

Leu

Ser

145

150

155

160

Trp

Trp

Val

Asn

Gly

Lys

Glu

Val

His

Ser

Gly

Val

Ser

Thr

Asp

Pro

165

170

175

Gin

Pro

Leu

Lys

Glu

Gin

Pro

Ala

Leu

Asn

Asp

Ser

Arg

Tyr

Ala

Leu

180

185

190

• Φ φφ ·· · ·· ···· φφφφ φ • · · · · φ φ · · • φ φφ φ φ φ · φ φ · · • φφφφ ΦΦΦ φφφφ φφ φφ Φ·· ·Φ ΦΦΦ

Ser Ser

Arg 195

Leu

Arg

Val

Ser

Ala 200

Thr Phe Trp

Gin Asn Pro 205

Arg

Asn

His

Phe

Arg

Cys

Gin

Val

Gin

Phe

Tyr

Gly

Leu

Ser

Glu

Asn

Asp

Glu

210

215

220

Trp

Thr

Gin

Asp

Arg

Ala

Lys

Pro

Val

Thr

Gin

Ile

Val

Ser

Ala

Glu

225

230

235

240

Ala

Trp

Gly

Arg

Ala

Asp

Pro

Gly

Gly

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

Gin

Ala

245

250

255

•

Glu

Thr

Asp

Gin

Leu

Glu

Asp

Lys

Lys

Ser

Ala

Leu

Gin

Thr

Glu

Ile

260

265

270

•

Ala

Asn

Leu

Leu

Lys

Glu

Lys

Glu

Lys

Leu

Glu

Phe

Ile

Leu

Ala

Ala

*

275

280

285

Tyr

Gly

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Asn

Asp

Ile

Phe

Glu

Ala

Gin

Lys

Ile

290

295

300

Glu

Trp

His

305 <210> 56 <211> 765 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

DNA sekvence TCR alfa řetězce klonu M10B7/D3 specifického pro HLA-A2/HTLV-1 Tax jako fúze s doménou leucinového zipu c-jun <400> 56 atgcaacaga agaatgatga ccagcaagtt aagcaaaatt caocatccct gagcgtccag 60 gaaggaagaa tttctattct gaactgtgac tatactaaca gcatgtttga ttatttccta 120 tggtacaaaa aataccctgc tgaaggtcct acattcctga tatctataag ttccattaag 180 gataaaaatg aagatggaag attcactgtc ttcttaaaca aaagtgccaa gcacctctct 240 ctgcacattg tgccctccca gcctggagac tctgcagtgt acttctgtgc agcaatggag 300 ggagcccaga agotggtatt tggccaagga accaggctga ctatcaaccc aaatatccag 360 aaccctgacc ctgccgtgta ccagctgaga gactctaaat ccagtgacaa gtctgtctgc 420 ctattcacog attttgattc tcaaacaaat gtgtcacaaa gtaaggattc tgatgtgtat 480 atcacagaca aaactgtgct agacatgagg tctatggact tcaagagcaa cagtgctgtg 540 gcctggagca acaaatctga ctttgcatgt gcaaacgcct tcaacaacag cattattcca 600 gaagacacct tcttccccag cccagaaagt tcccccgggg gtagaatcgc ccggctggag 660 gaaaaagtga aaaccttgaa agctcagaac tcggagctgg cgtccacggc caacatgctc 720 agggaacagg tggcacagct taaacagaaa gtcatgaact actag 765 <210> 57 <211> 254 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

aminokyselinová sekvence TCR alfa řetězce klonu M10B7/D3 specifického pro HLA-A2/HTLV-1 Tax jako fúze s doménou leucinového zipu c-jun

9999 99 <400> 57

Met Gin 1

Gin

Lys

Asn Asp Asp Gin Gin Val

Lys

Gin

Asn

Ser Pro 15

Ser

5

10

Leu

Ser

Val

Gin

Glu

Gly

Arg

Ile

Ser

Ile

Leu

Asn

Cys

Asp

Tyr

Thr

20

25

30

Asn

Ser

Met

Phe

Asp

Tyr

Phe

Leu

Trp

Tyr

Lys

Lys

Tyr

Pro

Ala

Glu

35

40

45

Gly

Pro

Thr

Phe

Leu

Ile

Ser

Ile

Ser

Ser

Ile

Lys

Asp

Lys

Asn

Glu

50

55

60

Asp

Gly

Arg

Phe

Thr

Val

Phe

Leu

Asn

Lys

Ser

Ala

Lys

His

Leu

Ser

65

70

75

80

Leu

His

Ile

Val

Pro

Ser

Gin

Pro

Gly

Asp

Ser

Ala

Val

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Met

Glu

Gly

Ala

Gin

Lys

Leu

Val

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Arg

100

105

110

Leu

Thr

Ile

Asn

Pro

Asn

Ile

Gin

Asn

Pro

Asp

Pro

Ala

Val

Tyr

Gin

115

120

125

Leu

Arg

Asp

Ser

Lys

Ser

Ser

Asp

Lys

Ser

Val

Cys

Leu

Phe

Thr

Asp

130

135

140

Phe

Asp

Ser

Gin

Thr

Asn

Val

Ser

Gin

Ser

Lys

Asp

Ser

Asp

Val

Tyr

145

150

155

160

Ile

Thr

Asp

Lys

Thr

Val

Leu

Asp

Met

Arg

Ser

Met

Asp

Phe

Lys

Ser

165

170

175

Asn

Ser

Ala

Val

Ala

Trp

Ser

Asn

Lys

Ser

Asp

Phe

Ala

Cys

Ala

Asn

180

185

190

Ala

Phe

Asn

Asn

Ser

Ile

Ile

Pro

Glu

Asp

Thr

Phe

Phe

Pro

Ser

Pro

195

200

205

Glu

Ser

Ser

Pro

Gly

Gly

Arg

Ile

Ala

Arg

Leu

Glu

Glu

Lys

Val

Lys

210

215

220

Thr

Leu

Lys

Ala

Gin

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Ser

Thr

Ala

Asn

Met

Leu

225

230

235

240

Arg

Glu

Gin

Val

Ala

Gin

Leu

Lys

Gin

Lys

Val

Met

Asn

Tyr

245 250 <210> 58 <211> 925 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

444 4 • 4 44 • · » · · 4 4··

44··· · • 4 4

4 4 4 · <223> Popis arteficiálni sekvence:

DNA sekvence TCR beta řetězce klonu M10B7/D3 specifického pro HLA-A2/HTLV-1 Tax jako fúze s doménou leucinového zipu c-fos a biotinylovnou značkou BirA.

<400> 58 atgaacgctg gtgtcactca gaccccaaaa ttccaggtcc tgaagacagg acagagcatg 60 acactgcagt gtgcccagga tatgaaccat gaatacatgt cctggtatcg acaagaccca 120 ggcatggggc tgaggctgat tcattactca gttggtgctg gtatcactga ccaaggagaa 180 gtccccaatg gctaoaatgt ctccagatca accacagagg atttcccgct caggctgctg 240 tcggctgctc ootoccagac atctgtgtac ttctgtgcca gcagttacca ggaggggggg 300 ttttacgagc agtacttcgg gccgggcacc aggctcacgg tcacagagga cctgaaaaac 360 gtgttcccac ccgaggtcgc tgtgtttgag ccatcagaag cagagatctc ccacacccaa 420 aaggccacac tggtgtgcct ggccacaggc ttctaccccg accacgtgga gctgagctgg 480 tgggtgaatg ggaaggaggt gcacagtggg gtcagcacag acccgcagcc cctcaaggag 540 cagcccgcco tcaatgactc cagataogct ctgagcagcc gcctgagggt ctcggccacc 600 ttctggcagg acccccgcaa coacttccgo tgtcaagtcc agttctacgg gctctcggag 660 aatgacgagt ggacccagga tagggccaaa cccgtoaccc agatcgtcag cgccgaggcc 720 tggggtagag cagaccccgg gggtctgact gatacactcc aagcggagac agatcaactt 780 gaagacaaga agtctgcgtt gcagaccgag attgccaatc tactgaaaga gaaggaaaaa 840 ctagagttca tcctggcagc ttacggatcc ggtggtggtc tgaacgatat ttttgaagct 900 cagaaaatcg aatggcatta agctt 925 <210> 59 <211> 306 <212> PRT <213> Arteficiálni sekvence <220>

<223> Popis arteficiálni sekvence:

aminokyselinová sekvence TCR beta řetězce klonu M10B7/D3 specifického pro HLA-A2/HTLV-1 Tax jako fúze s doménou leucinového zipu c-fos

a biotinylovnou značkou BirA.

<400> 59

Phe

Gin

Val

Leu

Lys 15

Thr

Met 1

Asn Ala

Gly Val 5

Thr

Gin Thr

Pro

Lys 10

Gly

Gin Ser

Met Thr 20

Leu

Gin Cys

Ala 25

Gin

Asp

Met

Asn

His 30

Glu

Tyr

Met

Ser Trp 35

Tyr Arg

Gin

Asp Pro 40

Gly

Met

Gly

Leu

Arg 45

Leu

Ile

His

Tyr

Ser Val 50

Gly Ala

Gly

Ile Thr 55

Asp

Gin

Gly

Glu 60

Val

Pro

Asn

Gly

Tyr 65

Asn Val

Ser Arg

Ser 70

Thr Thr

Glu

Asp

Phe 75

Pro

Leu

Arg

Leu

Leu 80

Ser

Ala Ala

Pro Ser 85

Gin

Thr Ser

Val

Tyr 90

Phe

Cys

Ala

Ser

Ser 95

Tyr

Pro

Gly Gly

Gly Phe 100

Tyr

Glu Gin

Tyr 105

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr 110

Arg

Leu

Thr

Val Thr 115

Glu Asp

Leu

Lys Asn 120

Val

Phe

Pro

Pro

Glu 125

Val

Ala

Val

Phe

Glu Pro 130

Ser Glu

Ala

Glu Ile 135

Ser

His

Thr

Gin 140

Lys

Ala

Thr

Leu

·· ·· • « φ · • · · • φφφ • · φφφφ ·· • φ • · « » • φ • φ • φ φ ·· φφ φφφ φ e φ φ · φ * φ φ φ φφφ φφ φ

Val 145

Cys

Leu

Ala

Thr

Gly Phe Tyr Pro 150

Asp

His 155

Val

Glu

Leu

Ser

Trp 160

Trp

Val

Asn

Gly

Lys

Glu

Val

His

Ser

Gly

Val

Ser

Thr

Asp

Pro

Gin

165

170

175

Pro

Leu

Lys

Glu

Gin

Pro

Ala

Leu

Asn

Asp

Ser

Arg

Tyr

Ala

Leu

Ser

180

185

190

Ser

Arg

Leu

Arg

Val

Ser

Ala

Thr

Phe

Trp

Gin

Asp

Pro

Arg

Asn

His

195

200

205

Phe

Arg

Cys

Gin

Val

Gin

Phe

Tyr

Gly

Leu

Ser

Glu

Asn

Asp

Glu

Trp

»

210

215

220

Thr

Gin

Asp

Arg

Ala

Lys

Pro

Val

Thr

Gin

Ile

Val

Ser

Ala

Glu

Ala

225

230

235

240

Trp

Gly

Arg

Ala

Asp

Pro

Gly

Gly

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

Gin

Ala

Glu

245

250

255

Thr

Asp

Gin

Leu

Glu

Asp

Lys

Lys

Ser

Ala

Leu

Gin

Thr

Glu

Ile

Ala

260

265

270

Asn

Leu

Leu

Lys

Glu

Lys

Glu

Lys

Leu

Glu

Phe

Ile

Leu

Ala

Ala

Tyr

275

280

285

Gly

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Asn

Asp

Ile

Phe

Glu

Ala

Gin

Lys

Ile

Glu

290

295

300

Trp His 305 <210> 60 <211> 928 <212> DNA <213> Arteficiálni sekvence <220>

<223> Mutovaná DNA sekvence TCR beta řetězce z klonu A6 specifickoého pro HLA-A2/HTLV-1 Tax jako fúze s doménou leucinového zipu c-fos a biotinylovanou značkou BirA.

<220>

<223> Popis arteficiálni sekvence:

Mutovaná DNA sekvence TCR beta řetězce z klonu A6 specifickoého pro HLA-A2/HTLV-1 Tax jako fúze s doménou leucinového zipu c-fos a biotinylovanou značkou BirA.

<400> 60 atgaacgctg gtgtcactca gaccccaaaa ttccaggtcc tgaagacagg acagagcatg 60 acactgcagt gtgcccagga tatgaaccat gaatacatgt cctggtatcg acaagaccca 120 ggcatggggc tgaggctgat tcattactca gttggtgctg gtatcactga ccaaggagaa 180 gtccccaatg gctacaatgt ctccagatca accacagagg atttcccgct caggctgctg 240 tcggctgctc cctcccagac atctgtgtac ttctgtgcca gcaggccggg actagcggga 300 gggcgaccag agcagtactt cgggccgggc accaggctca cggtcacaga ggacctgaaa 360 aacgtgttcc cacccgaggt cgctgtgttt gagccatcag aagcagagat ctcccacacc 420 caaaaggcca cactggtgtg cctggccaca ggcttctacc ccgaccacgt ggagctgagc 480 tggtgggtga atgggaagga ggtgcacagt ggggtcagca cagacccgca gcccctcaag 540 gagcagcccg ccctcaatga ctccagatac gctctgagca gccgcctgag ggtctcggcc 600 accttctggc aggacccccg caacoacttc cgctgtcaag tccagttcta cgggctctcg 660 gagaatgacg agtggaccca ggatagggcc aaacctgtca cccagatcgt cagcgccgag 720 gcctggggta gagcagaccc cgggggtctg actgatacac tccaagcgga gacagatcaa 780 cttgaagaca agaagtctgc gttgcagacc gagattgcca atctactgaa agagaaggaa 840 aaactagagt tcatcctggc agcttacgga tccggtggtg gtctgaacga tatttttgaa 900 gctcagaaaa tcgaatggca ttaagctt 928 <210> 61 <211> 307 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Aminokyselinová sekvence mutovaného TCR beta řetězce z klonu A6 specifického pro HLA-A2/HTLV-1 Tax jako fúze s doménou leucinového » zipu c-fos a biotinylovanou značkou BirA.

<220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

Aminokyselinová sekvence mutovaného TCR beta řetězce z klonu A6 specifického pro HLA-A2/HTLV-1 Tax jako fúze s doménou leucinového zipu c-fos a biotinylovanou značkou BirA.

<400> 61

Met 1

Asn

Ala

Gly

Val 5

Thr

Gin

Thr

Pro

Lys 10

Phe

Gin

Val

Leu

Lys 15

Thr

Gly

Gin

Ser

Met 20

Thr

Leu

Gin

Cys

Ala 25

Gin

Asp

Met

Asn

His 30

Glu

Tyr

Met

Ser

Trp 35

Tyr

Arg

Gin

Asp

Pro 40

Gly

Met

Gly

Leu

Arg 45

Leu

Ile

His

Tyr

Ser 50

Val

Gly

Ala

Gly

Ile 55

Thr

Asp

Gin

Gly

Glu 60

Val

Pro

Asn

Gly

Tyr 65

Asn

Val

Ser

Arg

Ser 70

Thr

Thr

Glu

Asp

Phe 75

Pro

Leu

Arg

Leu

Leu 80

Ser

Ala

Ala

Pro

Ser 85

Gin

Thr

Ser

Val

Tyr 90

Phe

Cys

Ala

Ser

Arg 95

Pro

Gly

Leu

Ala

Gly 100

Gly

Arg

Pro

Glu

Gin 105

Tyr

Phe

Gly

Pro

Gly 110

Thr

Arg

Leu

Thr

Val 115

Thr

Glu

Asp

Leu

Lys 120

Asn

Val

Phe

Pro

Pro 125

Glu

Val

Ala

Val

Phe 130

Glu

Pro

Ser

Glu

Ala 135

Glu

Ile

Ser

His

Thr 140

Gin

Lys

Ala

Thr

Leu 145

Val

Cys

Leu

Ala

Thr 150

Gly

Phe

Tyr

Pro

Asp 155

His

Val

Glu

Leu

Ser 160

Trp

Trp

Val

Asn

Gly

Lys

Glu

Val

His

Ser

Gly

Val

Ser

Thr

Asp

Pro

165 170 175

Gin Pro Leu Lys Glu Gin Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu 180 185 190 • 9 » * »9 » • »

I 9 ♦ · • 9

9*9 « 9 9 *

9 * • 9 (· 9 9 9

Ser

Ser

Arg 195

Leu

Arg

Val

Ser

Ala 200

Thr

Phe

Trp

Gin

Asp 205

Pro

Arg

Asn

His

Phe

Arg

Cys

Gin

Val

Gin

Phe

Tyr

Gly

Leu

Ser

Glu

Asn

Asp

Glu

210

215

220

Trp

Thr

Gin

Asp

Arg

Ala

Lys

Pro

Val

Thr

Gin

Ile

Val

Ser

Ala

Glu

225

230

235

240

Ala

Trp

Gly

Arg

Ala

Asp

Pro

Gly

Gly

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

Gin

Ala

245

250

255

Glu

Thr

Asp

Gin

Leu

Glu

Asp

Lys

Lys

Ser

Ala

Leu

Gin

Thr

Glu

Ile

260

265

270

Ala

Asn

Leu

Leu

Lys

Glu

Lys

Glu

Lys

Leu

Glu

Phe

Ile

Leu

Ala

Ala

275

280

285

Tyr

Gly

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Asn

Asp

Ile

Phe

Glu

Ala

Gin

Lys

Ile

290

295

300

Glu Trp His 305 <210> 62 <211> 190 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> DNA sekvence c-fos-BirA biotinylovaná značka použité jako fúzního partnera pro TCR beta.

<220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

DNA sekvence c-fos-BirA biotinylovaná značka použité jako fúzního partnera pro TCR beta.

<400> 62 cccgggggtc tgactgatac actccaagcg gagacagatc aacttgaaga caagaagtct 60 gcgttgcaga ccgagattgc caatctactg aaagagaagg aaaaactaga gttcatcctg 120 gcagcttacg gatccggtgg tggtctgaac gatatttttg aagctcagaa aatcgaatgg 180 cattaagc 11 190 <210> 63 <211> 61 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

aminokyselinová sekvence c-fos-BirA biotinylovaná značka použité jako fúzního partnera pro TCR beta.

<400> 63

Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gin Ala Glu Thr Asp Gin Leu Glu 15 10 15

Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gin Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu 20 25 30

9 9 9 íř ♦ φ

Φ *Φ Φ Φ φφ» • 9 · 9 9 9

ΦΦΦΦΦ Φ Φ Φ ΦΦΦΦ • ΦΦΦ ΦΦ 9 9 φ Φ φ

Lys

Glu

Lys 35

Leu

Glu

Phe

Ile

Leu 40

Ala

Ala

Tyr

Gly

Ser Gly Gly Gly 45

Leu

Asn 50

Asp

Xle

Phe

Glu

Ala 55

Gin

Lys

Ile

Glu

Trp 60

His

<210> 64 <211> 42 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Reverzní primer užitý pro PCR amplifikaci fragmentu v-beta-c-fos leucinový zip z fúzního genu JM22 TCR pro chřipkový matrixový peptid/HLA-A0201.

<220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

Reverzní primer užitý pro PCR amplifikaci fragmentu v-beta-c-fos leucinový zip z fúzního genu JM22 TCR pro chřipkový matrixový peptid/HLA-A0201.

<400> 64 acacacggat ccgtaagctg cgacgatgaa ctcgattttc tt 42 <210> 65 <211> 744 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence.

<220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

Gen kódující fúzi JM22 TCR alfa řetězce specifického pro HLA-A2/flu s doménou leucinového zipu c-jun.

<400> 65 atgoaaotao tagaacaaag tcctcagttt ctaagcatcc aagagggaga aaatctcact 60 gtgtactgca actcctcaag tgttttttcc agcttacaat ggtacagaca ggagcctggg 120 gaaggtcctg tcctcctggt gacagtagtt acgggtggag aagtgaagaa gctgaagaga 180 etaacctttc agtttggtga tgcaagaaag gacagttctc tcoacatcao tgcggcccag 240 cotggtgata caggcctcta cctctgtgca ggagcgggaa gccaaggaaa tctcatcttt 300 ggaaaaggca ctaaactctc tgttaaacca aatatocaga acoctgaccc tgcogtgtac 360 cagctgagag actctaaatc cagtgacaag tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct 420 caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta 480 gacatgaggt ctatggactt caagagcaac agtgctgtgg cctggagcaa caaatctgac 540 tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc attattccag aagacacctt cttccccagc 600 ccagaaagtt cccccggggg tagaatcgcc cggctggagg aaaaagtgaa aaccttgaaa 660 gctcagaact cggagotggc gtccacggcc aacatgctca gggaacaggt ggcacagctt 720 aaacagaaag tcatgaacta ctag 744 <210> 66 <211> 247 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

aminokyselinová sekvence fúze JM22 TCR alfa řetězce specifického pro HLA-A2/flu s doménou leucinového zipu c-jun.

• · ♦ · »· • · · · · · • · · · 4 « · · · · · · • · · · •··· ti · »

• · <400> 66

Met 1

Gin

Leu Leu

Glu 5

Gin

Ser

Pro

Gin Phe 10

Leu

Ser

Ile

Gin

Glu 15

Gly

Glu

Asn

Leu

Thr

Val

Tyr

Cys

Asn

Ser

Ser

Ser

Val

Phe

Ser

Ser

Leu

20

25

30

Gin

Trp

Tyr

Arg

Gin

Glu

Pro

Gly

Glu

Gly

Pro

Val

Leu

Leu

Val

Thr

35

40

45

Val

Val

Thr

Gly

Gly

Glu

Val

Lys

Lys

Leu

Lys

Arg

Leu

Thr

Phe

Gin

50

55

60

Phe

Gly

Asp

Ala

Arg

Lys

Asp

Ser

Ser

Leu

His

Ile

Thr

Ala

Ala

Gin

65

70

75

80

Pro

Gly

Asp

Thr

Gly

Leu

Tyr

Leu

Cys

Ala

Gly

Ala

Gly

Ser

Gin

Gly

85

90

95

Asn

Leu

Ile

Phe

Gly

Lys

Gly

Thr

Lys

Leu

Ser

Val

Lys

Pro

Asn

Ile

100

105

110

Gin

Asn

Pro

Asp

Pro

Ala

Val

Tyr

Gin

Leu

Arg

Asp

Ser

Lys

Ser

Ser

115

120

125

Asp

Lys

Ser

Val

Cys

Leu

Phe

Thr

Asp

Phe

Asp

Ser

Gin

Thr

Asn

Val

130

135

140

Ser

Gin

Ser

Lys

Asp

Ser

Asp

Val

Tyr

Ile

Thr

Asp

Lys

Thr

Val

Leu

145

150

155

160

Asp

Met

Arg

Ser

Met

Asp

Phe

Lys

Ser

Asn

Ser

Ala

Val

Ala

Trp

Ser

165

170

175

Asn

Lys

Ser

Asp

Phe

Ala

Cys

Ala

Asn

Ala

Phe

Asn

Asn

Ser

Ile

Ile

180

185

190

Pro

Glu

Asp

Thr

Phe

Phe

Pro

Ser

Pro

Glu

Ser

Ser

Pro

Gly

Gly

Arg

195

200

205

Ile

Ala

Arg

Leu

Glu

Glu

Lys

Val

Lys

Thr

Leu

Lys

Ala

Gin

Asn

Ser

210

215

220

Glu

Leu

Ala

Ser

Thr

Ala

Asn

Met

Leu

Arg

Glu

Gin

Val

Ala

Gin

Leu

225

230

235

240

Lys

Gin

Lys

Val

Met

Asn

Tyr

245 <210> 67 <211> 864 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

Gen kódující fúzi JM22 TCR beta řetězce specifického pro HLA-A2/flu s doménou leucinového zipu c-fos.

* «

100 <400> 67 atggtggatg gtggaatcac tcagtcccca aagtacctgt tcagaaagga aggacagaat 60 gtgaccctga gttgtgaaca gaatttgaac cacgatgcca tgtactggta ccgacaggac 120 ccagggcaag ggctgagatt gatctactac tcacagatag taaatgactt tcagaaagga 180 gatatagctg aagggtacag cgtctctcgg gagaagaagg aatcctttcc tctcactgtg 240 acatcggccc aaaagaaccc gacagctttc tatctctgtg ccagtagttc gaggagctcc 300 tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca cagaggacct gaaaaacgtt 360 ttcccacccg aggtcgctgt gtttgaacca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420 gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg 480 gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag 540 cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600 • tggcagaacc occgoaaoca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660 gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720 ggtagagcag accccggggg tctgactgat acactccaag cggagacaga tcaacttgaa 780 , gacaagaagt ctgcgttgca gaccgagatt gccaatctac tgaaagagaa ggaaaaacta 840 gagttcatcc tggcagctta ctag 864 <210> 68 <211> 287 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

aminokyselinová sekvence fúze JM22 TCR beta řetězce specifického pro

HLA-A2/flu s doménou leucinového : <400> 68

zipu Lys

c-fos.

Met Val 1

Asp

Gly Gly 5

Ile

Thr

Gin

Ser

Pro 10

Tyr

Leu

Phe

Arg 15

Lys

Glu Gly

Gin

Asn Val 20

Thr

Leu

Ser

Cys 25

Glu

Gin

Asn

Leu

Asn 30

His

Asp

Ala Met

Tyr 35

Trp Tyr

Arg

Gin

Asp 40

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu 45

Arg

Leu

Ile

Tyr Tyr 50

Ser

Gin Ile

Val

Asn 55

Asp

Phe

Gin

Lys

Gly 60

Asp

Ile

Ala

Glu

Gly Tyr 65

Ser

Val Ser

Arg 70

Glu

Lys

Lys

Glu

Ser 75

Phe

Pro

Leu

Thr

Val 80

Thr Ser

Ala

Gin Lys 85

Asn

Pro

Thr

Ala

Phe 90

Tyr

Leu

Cys

Ala

Ser 95

Ser

Ser Arg

Ser

Ser Tyr 100

Glu

Gin

Tyr

Phe 105

Gly

Pro

Gly

Thr

Arg 110

Leu

Thr

Val Thr

Glu 115

Asp Leu

Lys

Asn

Val 120

Phe

Pro

Pro

Glu

Val 125

Ala

Val

Phe

Glu Pro 130

Ser

Glu Ala

Glu

Ile 135

Ser

His

Thr

Gin

Lys 140

Ala

Thr

Leu

Val

Cys Leu 145

Ala

Thr Gly

Phe 150

Tyr

Pro

Asp

His

Val 155

Glu

Leu

Ser

Trp

Trp 160

Val Asn

Gly

Lys Glu 165

Val

His

Ser

Gly

Val 170

Ser

Thr

Asp

Pro

Gin 175

Pro

« ·

101

Leu

Lys

Glu

Gin 180

Pro

Ala

Leu

Asn

Asp 185

Ser

Arg

Tyr

Cys

Leu 190

Ser

Ser

Arg

Leu

Arg 195

Val

Ser

Ala

Thr

Phe 200

Trp

Gin

Asn

Pro

Arg 205

Asn

His

Phe

Arg

Cys 210

Gin

Val

Gin

Phe

Tyr 215

Gly

Leu

Ser

Glu

Asn 220

Asp

Glu

Trp

Thr

Gin 225

Asp

Arg

Ala

Lys

Pro 230

Val

Thr

Gin

Ile

Val 235

Ser

Ala

Glu

Ala

Trp 240

Gly

Arg

Ala

Asp

Pro 245

Gly

Gly

Leu

Thr

Asp 250

Thr

Leu

Gin

Ala

Glu 255

Thr

Asp

Gin

Leu

Glu 260

Asp

Lys

Lys

Ser

Ala 265

Leu

Gin

Thr

Glu

Ile 270

Ala

Asn

Leu

Leu

Lys

Glu

Lys

Glu

Lys

Leu

Glu

Phe

Ile

Leu

Ala

Ala

Tyr

275 280 285 <210> 69 <211> 918 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

Gen kódující fúzi JM22 TCR beta řetězce specifického pro HLA-A2/flu s doménou leucinového zipu c-fos biotinylovanou značkou BirA.

<4 0 0> 69 atggtggatg gtggaatcac tcagtcccca aagtacctgt tcagaaagga aggacagaat 60 gtgaccctga gttgtgaaca gaatttgaac cacgatgcca tgtactggta ccgacaggac 120 ccagggcaag ggctgagatt gatctactac tcacagatag taaatgactt tcagaaagga 180 gatatagctg aagggtacag cgtctctcgg gagaagaagg aatcctttcc tctcactgtg 240 acatcggccc aaaagaaccc gacagctttc tatctctgtg ccagtagttc gaggagctcc 300 tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca cagaggacct gaaaaacgtt 360 ttcccacccg aggtcgctgt gtttgaacca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420 gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg 480 gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcaoagacc cgcagcccct caaggagcag 540 cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600 tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctaegggct ctcggagaat 660 gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gteacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720 ggtagagcag accccggggg tctgactgat acactccaag cggagacaga tcaacttgaa 780 gacaagaagt ctgcgttgca gaccgagatt gccaatctac tgaaagagaa ggaaaaacta 840 gagttcatcc tggcagctta cggatccggt ggtggtctga acgatatttt tgaagctcag 900 aaaatcgaat ggcattaa 918 <210> 0 <211> 305 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

·

102 • · · · « · · 9

9 9 '9 9 9 9 9

9

9999 99 <223> Popis arteficiálni sekvence:

aminokyselinová sekvence fúze JM22 TCR beta řetězce specifického pro

HLA-A2/flu s doménou leucinového : BirA. <400> 70	zipu Lys	c-fos biotinylovanou značkou Tyr Leu Phe Arg Lys 15
Met 1	Val	Asp	Gly	Gly 5	Ile	Thr	Gin	Ser	Pro 10
Glu	Gly	Gin	Asn 20	Val	Thr	Leu	Ser	Cys 25	Glu	Gin	Asn Leu Asn His Asp 30
Ala	Met	Tyr 35	Trp	Tyr	Arg	Gin	Asp 40	Pro	Gly	Gin	Gly Leu Arg Leu Ile 45
Tyr	Tyr 50	Ser	Gin	Ile	Val	Asn 55	Asp	Phe	Gin	Lys	Gly Asp Ile Ala Glu 60
Gly 65	Tyr	Ser	Val	Ser	Arg 70	Glu	Lys	Lys	Glu	Ser 75	Phe Pro Leu Thr Val 80
Thr	Ser	Ala	Gin	Lys 85	Asn	Pro	Thr	Ala	Phe 90	Tyr	Leu Cys Ala Ser Ser 95
Ser	Arg	Ser	Ser 100	Tyr	Glu	Gin	Tyr	Phe 105	Gly	Pro	Gly Thr Arg Leu Thr 110
Val	Thr	Glu 115	Asp	Leu	Lys	Asn	Val 120	Phe	Pro	Pro	Glu Val Ala Val Phe 125
Glu	Pro 130	Ser	Glu	Ala	Glu	Ile 135	Ser	His	Thr	Gin	Lys Ala Thr Leu Val 140
Cys 145	Leu	Ala	Thr	Gly	Phe 150	Tyr	Pro	Asp	His	Val 155	Glu Leu Ser Trp Trp 160
Val	Asn	Gly	Lys	Glu 165	Val	His	Ser	Gly	Val 170	Ser	Thr Asp Pro Gin Pro 175
Leu	Lys	Glu	Gin 180	Pro	Ala	Leu	Asn	Asp 185	Ser	Arg	Tyr Cys Leu Ser Ser 190
Arg	Leu	Arg 195	Val	Ser	Ala	Thr	Phe 200	Trp	Gin	Asn	Pro Arg Asn His Phe 205
Arg	Cys 210	Gin	Val	Gin	Phe	Tyr 215	Gly	Leu	Ser	Glu	Asn Asp Glu Trp Thr 220
Gin 225	Asp	Arg	Ala	Lys	Pro 230	Val	Thr	Gin	Ile	Val 235	Ser Ala Glu Ala Trp 240
Gly	Arg	Ala	Asp	Pro 245	Gly	Gly	Leu	Thr	Asp 250	Thr	Leu Gin Ala Glu Thr 255
Asp	Gin	Leu	Glu 260	Asp	Lys	Lys	Ser	Ala 265	Leu	Gin	Thr Glu Ile Ala Asn 270

Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr Gly 275 280 285

103 φ

• ΦΦΦ • · φφ ♦ · 4

Φ Φ 4

Φ Φ · Φ Φ 1 • ♦ ι

Φ· ·Φ

Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gin Lys Ile Glu Trp 290 295 300

His

305 <210> 71 <211> 750 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

gen kódující TCR alfa řetězec z klonu A6 specifický pro HLA-A2/HTLV-1 Tax peptid fúzovaný s doménou leucinového zipu c-jun.

<400> 71 atgcagaagg aagtggagca gaactctgga cccctcagtg ttccagaggg agccattgcc 60 tctctcaact gcacttacag tgaccgaggt tcccagtcct tcttctggta cagacaatat 120 tctgggaaaa gccctgagtt gataatgtcc atatactcca atggtgacaa agaagatgga 180 aggtttacag cacagctcaa taaagccagc cagtatgttt ctctgctcat cagagactcc 240 cagcccagtg attcagccac ctacctctgt gccgttacaa ctgacagctg ggggaaattg 300 cagtttggag cagggaccca ggttgtggtc accocagata tccagaaccc tgaccctgcc 360 gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg tctgcctatt caccgatttt 420 gattctcaaa caaatgtgtc acaaagtaag gattctgatg tgtatatcac agacaaaact 480 gtgctagaca tgaggtctat ggacttcaag agcaacagtg ctgtggcctg gagcaacaaa 540 tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagoatta ttccagaaga caccttcttc 600 cccagcccag aaagttcccc cgggggtaga atcgcccggc tggaggaaaa agtgaaaaoc 660 ttgaaagctc agaactcgga gctggcgtcc acggccaaca tgctcaggga acaggtggca 720 cagcttaaac agaaagtcat gaactactag 750 <210> 72 <211> 249 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

aminokyselinová sekvence fúze TCR alfa řetězce z klonu A6 specifického pro HLA-A2/HTLV-1 Tax peptid s doménou leucinového zipu c-jun <400> 72

Met Gin 1

Lys

Glu Val 5

Glu Gin Asn

Ser Gly Pro 10

Leu

Ser

Val

Pro 15

Glu

Gly

Ala

Ile

Ala

Ser

Leu

Asn

Cys

Thr

Tyr

Ser

Asp

Arg

Gly

Ser

Gin

20

25

30

Ser

Phe

Phe

Trp

Tyr

Arg

Gin

Tyr

Ser

Gly

Lys

Ser

Pro

Glu

Leu

Ile

35

40

45

Met

Ser

Ile

Tyr

Ser

Asn

Gly

Asp

Lys

Glu

Asp

Gly

Arg

Phe

Thr

Ala

50

55

60

Gin

Leu

Asn

Lys

Ala

Ser

Gin

Tyr

Val

Ser

Leu

Leu

Ile

Arg

Asp

Ser

65

70

75

80

• · · 9 · * · ·«

9»· 9 · 9 9 999 > ®··*9 9 99

99999 9 9 «9 9 • 9 9 9 9 9 9

99·· 99 9· 999 9· 9

104

Gin

Pro

Ser Asp

Ser 85

Ala Thr

Tyr

Leu

Cys 90

Ala

Val

Thr

Thr

Asp 95

Ser

Trp

Gly

Lys Leu

Gin

Phe Gly

Ala

Gly

Thr

Gin

Val

Val

Val

Thr

Pro

100

105

110

Asp

Ile

Gin Asn

Pro

Asp Pro

Ala

Val

Tyr

Gin

Leu

Arg

Asp

Ser

Lys

115

120

125

Ser

Ser

Asp Lys

Ser

Val Cys

Leu

Phe

Thr

Asp

Phe

Asp

Ser

Gin

Thr

130

135

140

Asn

Val

Ser Gin

Ser

Lys Asp

Ser

Asp

Val

Tyr

Ile

Thr

Asp

Lys

Thr

145

150

155

160

Val

Leu

Asp Met

Arg

Ser Met

Asp

Phe

Lys

Ser

Asn

Ser

Ala

Val

Ala

165

170

175

Trp

Ser

Asn Lys

Ser

Asp Phe

Ala

Cys

Ala

Asn

Ala

Phe

Asn

Asn

Ser

180

185

190

Xle

Ile

Pro Glu

Asp

Thr Phe

Phe

Pro

Ser

Pro

Glu

Ser

Ser

Pro

Gly

195

200

205

Gly

Arg

Ile Ala

Arg

Leu Glu

Glu

Lys

Val

Lys

Thr

Leu

Lys

Ala

Gin

210

215

220

Asn

Ser

Glu Leu

Ala

Ser Thr

Ala

Asn

Met

Leu

Arg

Glu

Gin

Val

Ala

225

230

235

240

Gin

Leu

Lys Gin

Lys

Val Met

Asn

Tyr

245 <210> 73 <211> 928 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: Gene kódující fúzi TCR beta řetězce z klonu A6 specifického pro HLA-A2/HTLV-1 Tax peptid s doménou leucinového zipu c-fos a biotinylovanou značkou BirA.

<400> 73 atgaacgctg gtgtcactca gaocccaaaa ttceaggtcc tgaagacagg acagagcatg 60 acactgcagt gtgcccagga tatgaaccat gaatacatgt cctggtatcg acaagaccca 120 ggcatggggc tgaggctgat tcattactca gttggtgctg gtatcactga ccaaggagaa 180 gtccccaatg gctacaatgt ctccagatca accacagagg atttcccgct caggctgctg 240 tcggctgctc cctcccagac atctgtgtac ttctgtgcca gcaggccggg actagcggga 300 gggcgaccag agcagtactt cgggccgggc accaggctca cggtcacaga ggacctgaaa 360 aacgtgttcc cacccgaggt cgctgtgttt gagccatcag aagcagagat ctcccacaco 420 caaaaggcca cactggtgtg cctggccaca ggcttctacc ccgaccacgt ggagctgagc 480 tggtgggtga atgggaagga ggtgcacagt ggggtcagca cagacccgca gcccctcaag 540 gagcagcccg ccctcaatga ctccagatac gctctgagca gccgcctgag ggtctcggcc 600 accttctggc agaacccccg caaccacttc cgctgtcaag tccagttcta cgggctctcg 660 gagaatgacg agtggaccca ggatagggcc aaacctgtca cccagatcgt cagcgccgag 720 gcctggggta gagcagaccc cgggggtctg actgatacac tccaagcgga gacagatcaa 780 cttgaagaca agaagtctgc gttgcagacc gagattgcca atctactgaa agagaaggaa 840 aaactagagt tcatcctggc agcttacgga tccggtggtg gtctgaacga tatttttgaa 900 • · · • · • ·· • ·· · «· »» • · • 9 • · « ·

105 gctcagaaaa tcgaatggca ttaagctt

928 <210> 74 <211> 307 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

aminokyselinová sekvence fúze TCR beta řetězce z klonu A6 specifického pro HLA-A2/HTLV-1 Tax peptid s doménou leucinového zipu c-fos a biotinylovanou značkou BirA.

<400> 74

Met 1

Asn

Ala

Gly

Val 5

Thr

Gin

Thr

Pro

Lys 10

Phe

Gin

Val

Leu

Lys 15

Thr

Gly

Gin

Ser

Met 20

Thr

Leu

Gin

Cys

Ala 25

Gin

Asp

Met

Asn

His 30

Glu

Tyr

Met

Ser

Trp 35

Tyr

Arg

Gin

Asp

Pro 40

Gly

Met

Gly

Leu

Arg 45

Leu

Ile

His

Tyr

Ser 50

Val

Gly

Ala

Gly

Ile 55

Thr

Asp

Gin

Gly

Glu 60

Val

Pro

Asn

Gly

Tyr 65

Asn

Val

Ser

Arg

Ser 70

Thr

Thr

Glu

Asp

Phe 75

Pro

Leu

Arg

Leu

Leu 80

Ser

Ala

Ala

Pro

Ser 85

Gin

Thr

Ser

Val

Tyr 90

Phe

Cys

Ala

Ser

Arg 95

Pro

Gly

Leu

Ala

Gly 100

Gly

Arg

Pro

Glu

Gin 105

Tyr

Phe

Gly

Pro

Gly 110

Thr

Arg

Leu

Thr

Val 115

Thr

Glu

Asp

Leu

Lys 120

Asn

Val

Phe

Pro

Pro 125

Glu

Val

Ala

Val

Phe 130

Glu

Pro

Ser

Glu

Ala 135

Glu

Ile

Ser

His

Thr 140

Gin

Lys

Ala

Thr

Leu 145

Val

Cys

Leu

Ala

Thr 150

Gly

Phe

Tyr

Pro

Asp 155

His

Val

Glu

Leu

Ser 160

Trp

Trp

Val

Asn

Gly 165

Lys

Glu

Val

His

Ser 170

Gly

Val

Ser

Thr

Asp 175

Pro

Gin

Pro

Leu

Lys 180

Glu

Gin

Pro

Ala

Leu 185

Asn

Asp

Ser

Arg

Tyr 190

Ala

Leu

Ser

Ser

Arg 195

Leu

Arg

Val

Ser

Ala 200

Thr

Phe

Trp

Gin

Asn 205

Pro

Arg

Asn

His

Phe 210

Arg

Cys

Gin

Val

Gin 215

Phe

Tyr

Gly

Leu

Ser 220

Glu

Asn

Asp

Glu

Trp

Thr

Gin

Asp

Arg

Ala

Lys

Pro

Val

Thr

Gin

Ile

Val

Ser

Ala

Glu

225 230 235 240

106 r - r ρ r < r r <* # r '· /- r r r · r- re

Ala

Trp

Gly

Arg

Ala 245

Asp

Pro

Gly

Gly

Leu 250

Thr

Asp

Thr

Leu

Gin 255

Ala

Glu

Thr

Asp

Gin 260

Leu

Glu

Asp

Lys

Lys 265

Ser

Ala

Leu

Gin

Thr 270

Glu

Ile

Ala

Asn

Leu 275

Leu

Lys

Glu

Lys

Glu 280

Lys

Leu

Glu

Phe

Ile 285

Leu

Ala

Ala

Tyr

Gly 290

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu 295

Asn

Asp

Ile

Phe

Glu 300

Ala

Gin

Lys

Ile

Glu Trp His 305 <210> 75 <211> 765 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

Gene kódující fúzi TCR alfa řetězce z klonu M10B7/D3 specifického pro HLA-A2/HTLV-1 Tax peptid s doménou leucinového zipu c-jun.

<400> 75 atgcaacaga agaatgatga ccagcaagtt aagcaaaatt caccatccct gagcgtccag 60 gaaggaagaa tttctattct gaactgtgac tatactaaca gcatgtttga ttatttccta 120 tggtacaaaa aataccctgc tgaaggtcct acattcctga tatctataag ttccattaag 180 gataaaaatg aagatggaag attcactgtc ttcttaaaca aaagtgccaa gcacctctct 240 ctgcacattg tgccctccca gcctggagac tctgcagtgt acttctgtgc agcaatggag 300 ggagcccaga agctggtatt tggccaagga accaggctga ctatoaaccc aaatatccag 360 aaccctgacc ctgccgtgta ccagctgaga gactctaaat ccagtgacaa gtctgtctgc 420 ctattcaccg attttgattc tcaaacaaat gtgtcacaaa gtaaggattc tgatgtgtat 480 atcacagaca aaactgtgct agacatgagg tctatggact tcaagagcaa cagtgctgtg 540 gcctggagca acaaatctga ctttgcatgt gcaaacgcct tcaacaacag cattattcca 600 gaagacacct tcttccccag cccagaaagt tcccccgggg gtagaatcgc ccggctggag 660 gaaaaagtga aaaccttgaa agctcagaac tcggagctgg cgtccacggc caacatgctc 720 agggaacagg tggcacagct taaacagaaa gtcatgaact actag 765 <210> 76 <2U> 254 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

aminokyselinová sekvence fúze TCR alfa řetězce z klonu M10B7/D3 specifického pro HLA-A2/HTLV-1 Tax peptid s doménou leucinového zipu c-jun.

<400> 76

Met 1

Gin

Gin

Lys

Asn 5

Asp

Asp

Gin

Gin

Val 10

Lys

Gin

Asn

Ser

Pro 15

Ser

Leu

Ser

Val

Gin 20

Glu

Gly

Arg

Ile

Ser 25

Ile

Leu

Asn

Cys

Asp 30

Tyr

Thr

Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys Tyr Pro Ala Glu 35 40 45

107 r ,^A • rr r r 9 ( ' t t- r , c r r r · , r Γ t

Gly Pro 50

Thr

Phe

Leu

Ile

Ser 55

Ile

Ser

Ser

Ile

Lys 60

Asp

Lys

Asn

Glu

Asp

Gly

Arg

Phe

Thr

Val

Phe

Leu

Asn

Lys

Ser

Ala

Lys

His

Leu

Ser

65

70

75

80

Leu

His

Ile

Val

Pro

Ser

Gin

Pro

Gly

Asp

Ser

Ala

Val

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

Ala

Ala

Met

Glu

Gly

Ala

Gin

Lys

Leu

Val

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Arg

100

105

110

Leu

Thr

Ile

Asn

Pro

Asn

Ile

Gin

Asn

Pro

Asp

Pro

Ala

Val

Tyr

Gin

115

120

125

Leu

Arg

Asp

Ser

Lys

Ser

Ser

Asp

Lys

Ser

Val

Cys

Leu

Phe

Thr

Asp

130

135

140

Phe

Asp

Ser

Gin

Thr

Asn

Val

Ser

Gin

Ser

Lys

Asp

Ser

Asp

Val

Tyr

145

150

155

160

Ile

Thr

Asp

Lys

Thr

Val

Leu

Asp

Met

Arg

Ser

Met

Asp

Phe

Lys

Ser

165

170

175

Asn

Ser

Ala

Val

Ala

Trp

Ser

Asn

Lys

Ser

Asp

Phe

Ala

Cys

Ala

Asn

180

185

190

Ala

Phe

Asn

Asn

Ser

Ile

Ile

Pro

Glu

Asp

Thr

Phe

Phe

Pro

Ser

Pro

195

200

205

Glu

Ser

Ser

Pro

Gly

Gly

Arg

Ile

Ala

Arg

Leu

Glu

Glu

Lys

Val

Lys

210

215

220

Thr

Leu

Lys

Ala

Gin

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Ser

Thr

Ala

Asn

Met

Leu

225

230

235

240

Arg

Glu

Gin

Val

Ala

Gin

Leu

Lys

Gin

Lys

Val

Met

Asn

Tyr

245 250 <210> 77 <221> 925 <2L2> DNA <2 L3> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

Gene kódující fúzi TCR beta řetězce z klonu M10B7/D3 specifického pro HLA-A2/HTLV-1 Tax peptid s doménou leucinového zipu c-fos a biotinylovanou značkou BirA.

<2 20> 77 atgaacgctg gtgtcactca gaccccaaaa ttccaggtcc tgaagacagg acagagcatg 60 acuctgcagt gtgcccagga tatgaaccat gaatacatgt cctggtatcg acaagaccca 120 ggcatggggc tgaggctgat tcattactca gttggtgctg gtatcactga ccaaggagaa 180 gtccccaatg gctacaatgt ctccagatca accacagagg atttcccgct caggctgctg 240 tcggctgctc cctcccagac atctgtgtac ttctgtgcca gcagttacca ggaggggggg 300 ttttacgagc agtacttegg gccgggcacc aggctcacgg tcacagagga cctgaaaaac 360 gtgttcccac ccgaggtcgc tgtgtttgag ccatcagaag cagagatctc ccacacccaa 420 r ' r f Γ <- r f r e p , r r

-· r e < r ρ

108 aaggccacac tggtgtgcct ggccacaggc ttctaccccg accacgtgga gctgagctgg 480 tgggtgaatg ggaaggaggt gcacagtggg gtcagcacag acccgcagcc cctcaaggag 540 cagcccgccc tcaatgactc cagatacgct ctgagcagcc gcctgagggt ctcggccacc 600 ttctggcagg acccccgoaa ccacttccgc tgtcaagtcc agttctacgg gctctcggag 660 aatgacgagt ggacccagga tagggccaaa cccgtcaccc agatcgtcag cgccgaggcc 720 tggggtagag cagaccccgg gggtctgact gatacactcc aagcggagac agatcaactt 780 gaagacaaga agtctgcgtt gcagaccgag attgccaatc tactgaaaga gaaggaaaaa 840 ctagagttca tcctggcagc ttacggatcc ggtggtggtc tgaacgatat ttttgaagct 900

cagaaaatcg aatggcatta agctt <210> 78 <211> 306 <212> PRT <213> Chřipkový virus <400> 78

Met 1

Asn

Ala

Gly

Val 5

Thr

Gin

Thr

Pro

Lys 10

Phe

Gin

Val

Leu

Lys 15

Thr

Gly

Gin

Ser

Met 20

Thr

Leu

Gin

Cys

Ala 25

Gin

Asp

Met

Asn

His 30

Glu

Tyr

Met

Ser

Trp 35

Tyr

Arg

Gin

Asp

Pro 40

Gly

Met

Gly

Leu

Arg 45

Leu

Ile

His

Tyr

Ser 50

Val

Gly

Ala

Gly

Ile 55

Thr

Asp

Gin

Gly

Glu 60

Val

Pro

Asn

Gly

Tyr 65

Asn

Val

Ser

Arg

Ser 70

Thr

Thr

Glu

Asp

Phe 75

Pro

Leu

Arg

Leu

Leu 80

Ser

Ala

Ala

Pro

Ser 85

Gin

Thr

Ser

Val

Tyr 90

Phe

Cys

Ala

Ser

Ser 95

Tyr

Pro

Gly

Gly

Gly 100

Phe

Tyr

Glu

Gin

Tyr 105

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr 110

Arg

Leu

Thr

Val

Thr 115

Glu

Asp

Leu

Lys

Asn 120

Val

Phe

Pro

Pro

Glu 125

Val

Ala

Val

Phe

Glu 130

Pro

Ser

Glu

Ala

Glu 135

Ile

Ser

His

Thr

Gin 140

Lys

Ala

Thr

Leu

Val 145

Cys

Leu

Ala

Thr

Gly 150

Phe

Tyr

Pro

Asp

His 155

Val

Glu

Leu

Ser

Trp 160

Trp

Val

Asn

Gly

Lys 165

Glu

Val

His

Ser

Gly 170

Val

Ser

Thr

Asp

Pro 175

Gin

Pro

Leu

Lys

Glu 180

Gin

Pro

Ala

Leu

Asn 185

Asp

Ser

Arg

Tyr

Ala 190

Leu

Ser

Ser

Arg

Leu 195

Arg

Val

Ser

Ala

Thr 200

Phe

Trp

Gin

Asp

Pro 205

Arg

Asn

His

Phe

Arg 210

Cys

Gin

Val

Gin

Phe 215

Tyr

Gly

Leu

Ser

Glu 220

Asn

Asp

Glu

Trp

• r r r r c

Λ r

109

r r r e f~ e rrp r r · ( re·

Thr 225

Gin

Asp

Arg

Ala

Lys 230

Pro

Val

Thr

Gin

Ile 235

Val

Ser

Ala

Glu

Ala 240

Trp

Gly

Arg

Ala

Asp 245

Pro

Gly

Gly

Leu

Thr 250

Asp

Thr

Leu

Gin

Ala 255

Glu

Thr

Asp

Gin

Leu 260

Glu

Asp

Lys

Lys

Ser 265

Ala

Leu

Gin

Thr

Glu 270

Ile

Ala

Asn

Leu

Leu 275

Lys

Glu

Lys

Glu

Lys 280

Leu

Glu

Phe

Ile

Leu 285

Ala

Ala

Tyr

Gly

Ser 290

Gly

Gly

Gly

Leu

Asn 295

Asp

Ile

Phe

Glu

Ala 300

Gin

Lys

Ile

Glu

Trp His 305 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Chřipkový virus <220>

<223> Peptid odvozený z matrixového proteinu chřipkového viru a prezentovaný jako peptidový antigen pomocí HLA-A0201. Tato kombinace HLA/peptid vymezuje specifitu JM22 TCR.

<400> 79

Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu 1 5 <210> 80 <211> 9 <212:· PRT <213:· Virus imunodeficience typu 1 <220>

<223> Peptid odvozený HIV-1 Gag proteinu a prezentovaný jako peptidový antigen pomocí HLA-A0201. tato kombinace HLA/peptid vymezuje specifitu klonovaného TCR zpaienta 003.

<400> 80

Šer Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu 15 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213:· Chřipkový virus <22 0>

<223:- Peptid odvozený z nukleoptrteinu chřipkového viru a prezentovaný jako peptidový antigen pomocí myšího H2-Db. tato kombinace HLA/peptid vymezuje specifitu myšího F5 <400> 81

Ala Ser Asn Glu Asn Met Asp Ala Met 1 5 e r

I* I*

110 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> lymfotropní virus T-buněk typu 1 <220>

<223> Peptid odvozený z HTLV-1 Tax proteinu a prezentovaný jako peptidový antigen pomocí HLA-A0201. Tato kombinace HLA/peptid vymezuje specifitu TCR A6 a B7.

<400> 82

Leu Leu Phe Gly Tyr Pro Val Tyr Val 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Virus imunodeficience <220 <22Ξ> Peptid odvozený z proteinuHIV-1 Pol a prezentovaný jako peptidový antigen pomocí HLA-A0201.

<400> 83

Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val 1 5 <210 84 <211> 37 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

Primer pro PCR amplifikaci řetězce Vbetal7 fúzovaného s biotinylovanou značkou BirA.

<400 84 gctctagaca tatgggccca gtggattctg gagtcac 37 <210> 85 <211> 90 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence:

Primer pro PCR amplifikaci řetězce Vbetal7 fúzovaného s biotinylovanou značkou BirA.

<400> 85 gggggaagct taatgccatt cgattttctg agcttcaaaa atatcgttca gaccaccacc 60 ggatccgtaa gctgccagga tgaactctag 90

I»

111 tyfaVUOs

Claims (16)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Složený rekombinantní receptor T buněk (TCR), který obsahuj e:

   I) rekombinantní extracelulární doménu ct nebo γ řetězce TCR mající první heterologní C-koncový dimerizační peptid, a

   II) rekombinantní extracelulární doménu β nebo δ řetězce TCR mající druhý heterologní C-koncový dimerizační peptid, který je specificky heterodimerizován s prvním dimerizačním peptidem, takže vytváří heterodimerizační doménu, přičemž disulfidická vazba přítomná v nativním TCR mezi a a β řetězci nebo mezi γ a δ řetězci, sousedící s cytoplazmatickou doménou, chybí.
2. 2. Biologicky aktivní rekombinantní receptor T buněk (TCR), který obsahuje

   I) rekombinantní extracelulární doménu a nebo γ řetězce TCR mající první heterologní C-koncový dimerizační peptid, a

   II) rekombinantní extracelulární doménu β nebo δ řetězce TCR mající druhý heterologní C-koncový dimerizační peptid, který je specificky heterodimerizován s prvním dimerizačním peptidem, takže vytváří heterodimerizační doménu, přičemž disulfidická vazba přítomná v nativním TCR mezi a a β řetězci nebo mezi γ a δ řetězci, sousedící s cytoplazmatickou doménou, chybí.
3. 3. Rekombinantní TCR podle nároku 1 nebo 2, kde heterodimerizační doména je svinutá šroubovicová doména.
4. 4. Rekombinantní TCR podle nároku 3, kde dimerizační peptidy jsou c-jun a c-fos dimerizační peptidy.

   112 . .
5. 5. Rekombinantní TCR podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, který obsahuje flexibilní spojku lokalizovanou mezi řetězce TCR a heterdomerizační peptidy.

   6. Rekombinantní TCR podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, který je exprimován v · expresním systému E. coli. 7. Rekombinantní TCR podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, který je biotinylovaný na C-konci. 8. Rekombinantní TCR podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, který je značený detekovatelnou značkou. 9. Rekombinantní TCR podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8,

   který je spojen s terapeutickým činidlem jako je např. cytotoxické činidlo nebo imunostimulační činidlo.
6. 10. Sekvence nukleové kyseliny kódující rekombinantní TCR řetězce rekombinantního TCR podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8.
7. 11. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 10, která je v expresním vektoru E. coli.
8. 12. Způsob přípravy rekombinantního receptoru T buněk, který není vázán na membránu, vyznačující se tím, že obsahuje expresi

   I) rekombinantní extracelulární domény a nebo γ řetězce TCR mající první heterologní C-koncový dimerizační peptid, a

   II) rekombinantní extracelulární domény β nebo δ řetězce TCR mající druhý heterologní C-koncový dimerizační peptid, který je specificky heterodimerizován s prvním dimerizačním peptidem, takže vytváří heterodimerizační doménu, a složení řetězců in vitro tak, že vytvoří heterodimer.

   ř r r r * < · * * ^r

   - -z· * e * e e «· *rr_r ,- Γ r v f ř r r _r - - - f' p /· * r- r- r ', p r <- r r

   113
9. 13. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že složení se provádí ve skládacím pufru, který obsahuje solubilizační činidlo.
10. 14. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že solubilizační činidlo je močovina v koncentraci nejméně 0,1M.
11. 15. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že solubilizační činidlo je močovina v koncentraci 5M.
12. 16. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 12 až 14 vyznačující se tím, že před složením se řetězce denaturují v denaturačním pufru.
13. 17. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že denaturační pufr obsahuje DTT nebo guanidin jakožto redukční činidlo.
14. 18. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 12 až 17 vyznačující se tím, že TCR je rekombinantní TCR podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6.
15. 19. Rekombinantní TCR připravený způsobem podle kteréhokoliv z nároků 12 až 18.
16. 20. Multimer TCR podle nároku 19.

    0r MUnA Všewčka v,<r