SK17332000A3 - Preskladaný rekombinantný t bunkový receptor-tcr, sekvencie nukleových kyselín, ktoré kódujú rekombinantné tcr reťazce rekombinantného tcr, a spôsob jeho výroby - Google Patents
Preskladaný rekombinantný t bunkový receptor-tcr, sekvencie nukleových kyselín, ktoré kódujú rekombinantné tcr reťazce rekombinantného tcr, a spôsob jeho výroby Download PDFInfo
- Publication number
- SK17332000A3 SK17332000A3 SK1733-2000A SK17332000A SK17332000A3 SK 17332000 A3 SK17332000 A3 SK 17332000A3 SK 17332000 A SK17332000 A SK 17332000A SK 17332000 A3 SK17332000 A3 SK 17332000A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- tcr
- peptide
- protein
- chains
- recombinant
- Prior art date
Links
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 title claims abstract description 389
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 title claims abstract description 380
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 49
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 97
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea group Chemical group NC(=O)N XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 claims description 41
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 40
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 34
- 101001050288 Homo sapiens Transcription factor Jun Proteins 0.000 claims description 31
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 claims description 31
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 29
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 claims description 28
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 claims description 27
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 27
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 23
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 22
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 claims description 21
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 20
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 13
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 8
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims description 3
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 claims 25
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 claims 2
- 102100027584 Protein c-Fos Human genes 0.000 claims 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 claims 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 claims 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 47
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 122
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 114
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 109
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 69
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 63
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 62
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 62
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 60
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 50
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 41
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 41
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 39
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 39
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 37
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 37
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 36
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 31
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 28
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 28
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 26
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 25
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 25
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 25
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 24
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 24
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 23
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 23
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 23
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 22
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 17
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 16
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000004044 response Effects 0.000 description 16
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 16
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 14
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 13
- 108010088729 HLA-A*02:01 antigen Proteins 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 11
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 10
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 10
- 238000013461 design Methods 0.000 description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 10
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 108010003486 leucyl-leucyl-phenylalanyl-glycyl-tyrosyl-prolyl-valyl-tyrosyl-valine Proteins 0.000 description 9
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 7
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 7
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 7
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000018936 Vitellaria paradoxa Nutrition 0.000 description 6
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 5
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 5
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 5
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 5
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 5
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 5
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 5
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108010076804 DNA Restriction Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 4
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 3
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 101100112779 Mus musculus Cd247 gene Proteins 0.000 description 3
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical class CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 108010030694 avidin-horseradish peroxidase complex Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 3
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 3
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010032795 CD8 receptor Proteins 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 2
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 2
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- NTNWOCRCBQPEKQ-YFKPBYRVSA-N N(omega)-methyl-L-arginine Chemical compound CN=C(N)NCCC[C@H](N)C(O)=O NTNWOCRCBQPEKQ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 101710100170 Unknown protein Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 102000006707 alpha-beta T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010087408 alpha-beta T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical compound CCSSCCN OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940099500 cystamine Drugs 0.000 description 2
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 108010061181 influenza matrix peptide (58-66) Proteins 0.000 description 2
- 108010014346 influenza virus membrane protein (58-66) Proteins 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 2
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 2
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZVEUWSJUXREOBK-DKWTVANSSA-N 2-aminoacetic acid;(2s)-2-amino-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(O)=O.OC[C@H](N)C(O)=O ZVEUWSJUXREOBK-DKWTVANSSA-N 0.000 description 1
- SHWZFPFHYGKWIW-UFLZEWODSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoic acid;3-hydroxypyrrolidine-2,5-dione Chemical compound OC1CC(=O)NC1=O.N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 SHWZFPFHYGKWIW-UFLZEWODSA-N 0.000 description 1
- 101710191936 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101100107610 Arabidopsis thaliana ABCF4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 239000007989 BIS-Tris Propane buffer Substances 0.000 description 1
- 101001124039 Banna virus (strain Indonesia/JKT-6423/1980) Non-structural protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 241001609030 Brosme brosme Species 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010038061 Chymotrypsinogen Proteins 0.000 description 1
- 102100026398 Cyclic AMP-responsive element-binding protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101001023124 Drosophila melanogaster Myosin heavy chain, non-muscle Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010078851 HIV Reverse Transcriptase Proteins 0.000 description 1
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102000011786 HLA-A Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 101000855520 Homo sapiens Cyclic AMP-responsive element-binding protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101100395310 Homo sapiens HLA-A gene Proteins 0.000 description 1
- 101000659324 Homo sapiens Twinfilin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101000686985 Mouse mammary tumor virus (strain C3H) Protein PR73 Proteins 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 101100096028 Mus musculus Smok1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000591 Myc associated factor X Proteins 0.000 description 1
- 101710150912 Myc protein Proteins 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- HAAQQNHQZBOWFO-LURJTMIESA-N Pro-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 HAAQQNHQZBOWFO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 108010016131 Proto-Oncogene Proteins c-jun Proteins 0.000 description 1
- 102000000427 Proto-Oncogene Proteins c-jun Human genes 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100068078 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GCN4 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108700042075 T-Cell Receptor Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000002203 alpha-beta t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000012435 analytical chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 biotin ester Chemical class 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 210000000285 follicular dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 102000011778 gamma-delta T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010062214 gamma-delta T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 102000050945 human TWF1 Human genes 0.000 description 1
- 108010007811 human immunodeficiency virus p17 gag peptide Proteins 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003367 kinetic assay Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002614 leucines Chemical class 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 108010020755 prolyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 231100000617 superantigen Toxicity 0.000 description 1
- 230000005313 thymus development Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56977—HLA or MHC typing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/6425—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a receptor, e.g. CD4, a cell surface antigen, i.e. not a peptide ligand targeting the antigen, or a cell surface determinant, i.e. a part of the surface of a cell
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Virology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Preskladaný rekombinantný T bunkový receptor - TCR, sekvencie nukleových kyselín, ktoré kódujú rekombinantné TCR reťazce rekombinantného TCR a spôsob jeho výroby
Oblasť techniky
Vynález sa týka rekombinantných T bunkových receptorov (TCRs) nenaviazaných na membránu a spôsobov a reakčných činidiel na ich produkciu.
Doterajší stav techniky
1. Prezentácia antigénu na bunkovom povrchu
MHC molekuly sú špecializované proteínové komplexy, ktoré prezentujú krátke proteínové fragmenty, peptidové antigény, na bunkovom povrchu, aby boli rozoznávané bunkovou časťou adaptívneho imunitného systému.
MHC triedy I je dimérny proteínový komplex pozostávajúci s variabilného ťažkého reťazca a konštantného ľahkého reťazca, p2mikroglobulín. MHC triedy I prezentuje peptidy, ktoré sú spracovávané vo vnútri bunky, naložené do väzobnej štrbiny v MHC a transportované na bunkový povrch, kde sa komplex ukotví do membrány prostredníctvom MHC ťažkého reťazca. Peptidy sú zvyčajne dlhé 8 až 11 aminokyselín v závislosti na stupni vyklenutia zavedeného do peptidu pri väzbe v MHC. Väzobná štrbina, ktorá je tvorená membránovými distálnymi a1 a a2 doménami MHC ťažkého reťazca, má uzavreté konce, čo dosť tesne obmedzuje dĺžku peptidu, ktorý sa môže viazať.
Aj MHC triedy II je dimérny proteín pozostávajúci s a (ťažkého) a β (ľahkého) reťazca, pričom oba tieto reťazce sú variabilné glykoproteíny, a sú ukotvené v bunke transmembránovými doménami. Podobne ako MHC triedy I, vytvára molekula MHC triedy II väzobnú štrbinu, do ktorej sa začleňujú väčšie peptidy s dĺžkou 12 až 24 aminokyselín. Peptidy sa prijímajú z extracelulárneho prostredia • · ·· • · · · • » · • · · • · · ·· ····
-2·· · ·· • · ·· · · · • · · · · • · · · · · • · · · · ·· ··· ·· · endocytózou a pred naložením na komplex triedy II, ktorý ich transportuje na bunkový povrch, sa spracovávajú.
Každá bunka prezentuje peptidy na až šiestich rôznych molekulách triedy I a na podobnom množstve molekúl triedy II, pričom celkový počet MHC komplexov, ktoré sa nachádzajú v bunke je v rozsahu 10s až 106 na bunku. Typicky sa odhaduje, že diverzita peptidov prezentovaných na molekulách triedy I je medzi 1000 a 10000, pričom 90 % z nich je prezentovaných v 100 až 1000 kópiách na bunku (Hunt, Michel a ďalší, 1992; Chicz, Urban a ďalší 1993; Engelhard, Appella a ďalší 1993; Huczko, Bodnar a ďalší 1993). Najprevládajúcejšie peptidy tvoria 0,4 až 5 % celkových prezentovaných peptidov, čo znamená, že by mohlo byť prezentovaných do 20000 identických komplexov. Avšak je pravdepodobné, že priemerný počet najviac prevládajúcich jednotlivých peptidových komplexov je v rozsahu 2000 až 4000 na bunku, a typické prezentačné úrovne rozoznateľných T bunkových epitopov sú v rozsahu 100 až 500 komplexov na bunku (pozri zhrnutie (Engelhard 1994)).
2. Rozoznávanie antigén prezentujúcich buniek
Antigén môže prezentovať široké spektrum buniek, vo forme MHC-peptid, a bunky, ktoré túto vlastnosť majú, sú známe ako antigén prezentujúce bunky (APC). Typ bunky, ktorá prezentuje konkrétny antigén, závisí na tom ako a kde sa bunky imunitného systému prvý krát stretávajú s antigénom. APCs zahŕňajú dendritické bunky prepojené prstencovitými výbežkami, ktoré sa vo veľkom množstve nachádzajú v T bunkových oblastiach lymfatických uzlín a sleziny; Langerhansove bunky v koži; folikulárne dendrické bunky v B bunkových oblastiach lymfatického tkaniva; monocyty, makrofágy a iné bunky monocytovej/makrofágovej línie; B bunky a T bunky; a rôzne iné bunky, ako napríklad endoteliálne bunky a fibroblasty, ktoré nie sú klasickými APCs, ale môžu účinkovať rovnakým spôsobom ako APC.
APCs sú rozoznávané podtriedou lymfocytov, ktoré zrejú v týmuse (T bunky), kde prebieha ich selekcia, ktorá je nastavená tak, že zaisťuje, aby boli T bunky, ktoré odpovedajú na vlastné peptidy, zničené (negatívna selekcia). Okrem toho, T ·· ·· ··
·· ·
-3bunky, ktoré nie sú schopné rozoznávať prezentované MHC varianty (u človeka HLA haplotypy), nevyzrievajú (pozitívna selekcia).
Rozoznávanie špecifických MHC-peptidových komplexov T bunkami je sprostredkované T bunkovým receptorom (TCR), ktorý pozostáva z a- a β-reťazca, pričom oba tieto reťazce sú ukotvené v membráne. V procese rekombinácie podobnom s procesom pozorovaným pre gény protilátok, sa TCR a a β gény preskupujú z Variabilných, Spojovacích, Diverzitných a Konštantných elementov, čím vytvárajú enormnú diverzitu extraceiulárnych antigén viažucich domén (1013 až 1015 rôznych možností). TCRs existujú aj v odlišnej forme, s γ a δ reťazcami, ale tieto sú prítomné len na približne 5 % T buniek.
Protilátky a TCRs sú jediné dva typy molekúl, ktoré rozoznávajú antigény špecifickým spôsobom, takže TCR je jediný receptor špecifický pre konkrétne peptidové antigény prezentované na MHC, pričom cudzí peptid je často jedinou známkou abnormality vo vnútri bunky.
TCRs sú exprimované s enormnou diverzitou, každý TCR je špecifický pre jeden alebo niekoľko MHC-peptidových komplexov. Kontakty medzi TCR a MHCpeptidovými ligandami trvajú extrémne krátko, zvyčajne majú polčas rozpadu kratší ako jednu sekundu. Adhézia medzi T bunkami a cieľovými bunkami, pravdepodobne TCR/MHC-peptid, závisí na uskutočnení viacnásobných TCR/MHCpeptid kontaktov, ako aj na množstve kontaktov medzi koreceptorom a ligandom.
Rozoznávanie T bunkou nastáva, keď sú T-bunka a antigén prezentujúca bunka (APC) v priamom fyzickom kontakte, a iniciuje sa ligáciou komplexov antigén špecifických TCRs s pMHC. TCR je heterodimérny bunkový povrchový proteín patriaci do superrodiny imunoglobulínov, ktorý je spojený s nepremenlivými proteínmi CD3 komplexu, ktorý sa podieľa na sprostredkovaní prenosu signálu. TCRs existujú v αβ a γδ formách, ktoré sú štrukturálne podobné, ale majú dosť odlišnú anatomickú lokalizáciu a pravdepodobne aj funkcie. Extracelulárna časť receptora pozostáva z dvoch membránovo-proximálnych konštantných domén a dvoch membránovo-distálnych variabilných domén, ktoré nesú vysoko polymorné slučky analogické s komplementaritu determinujúcimi oblasťami (CDRs) protilátok.
·· · ·· • · ·· · · ·
9 9 9 9
-4·· ·· • · · · • e · • · · • · · ·· ···· • · · · · • · ··· ·· ·
Práve tieto slučky vytvárajú MHC-väzobné miesto TCR molekuly a determinujú peptidovú špecificitu. MHC triedy I a triedy II ligandy sú tiež proteíny patriace do imunoglobulínovej superrodiny, ale sú špecializované na prezentáciu antigénu, pričom majú vysoko polymorfné peptid viažuce miesto, ktoré im umožňuje prezentovať rôznu zostavu krátkych peptidových fragmentov na APC bunkovom povrchu.
V súčasnosti sa štrukturálne charakterizovali príklady týchto interakcií (Garboczi, Ghosh a ďalší 1996; Garcia, Degano a ďalší 1996; Ding, Smith a ďalší 1998). Z kryštalografických štruktúr hlodavčích a ľudských komplexov pMHC triedy l-TCR vyplýva diagonálna orientácia TCR na jeho pMHC ligand, a slabá tvarová komplementarita na rozhraní. Len CDR3 slučky prichádzajú do kontaktu s peptidovými zvyškami. Z porovnania TCR štruktúr s ligandom a bez ligandu tiež vyplýva, že existuje určitý stupeň flexibility v TCR CDR slučkách (Garboczi a Biddison 1999).
Modely aktivácie T bunky sa pokúšajú vysvetliť ako takéto proteín-proteín interakcie medzi T bunkou a antigén prezentujúcou bunkou (APC) iniciujú odpovede, ako napríklad usmrtenie vírusom infikovanej cieľovej bunky. V mnohých týchto modeloch sú zahrnuté fyzikálne vlastnosti TCR-pMHC interakcií ako kritické parametre. Napríklad sa zistilo, že kvantitatívne zmeny v TCR disociačných rýchlostiach sa prenášajú do kvalitatívnych rozdielov v biologickom výstupe receptorového spojenia, ako napríklad úplná alebo čiastočná aktivácia T bunky alebo antagonizmus (Matsui, Boniface a ďalší 1994; Rabinowitz, Beeson a ďalší 1996; Davis, Boniface a ďalší 1998).
Ukázalo sa, že TCR-pMHC interakcie majú nízke afinity a relatívne pomalé kinetiky. Mnohé štúdie využívali biosenzorovú technológiu, ako napríklad Biacore™ (Willcox, Gao a ďalší 1999; Wýer, Willcox a ďalší 1999), ktorá využíva povrchovú plazmonovú rezonanciu (SPR) a umožňuje priame afinitné merania a merania skutočného času kinetiky interakcií proteín-proteín (Garcia, Scott a ďalší 1996; Davis, Boniface a ďalší 1998). Avšak študované receptory sú buď aloreaktívne TCRs, alebo receptory, ktoré boli vyvolané ako odpoveď na umelý imunogén.
·· ··
-5• · · · • · · • · · • · · ·· ··· ·· · • · ·· • ι · • · · ·· ···
3. TCR a CD8 interakcie s MHC-peptidovými komplexami
Značná väčšina T buniek vymedzená MHC triedy l-peptidovými komplexami vyžaduje na aktiváciu aj zapojenie koreceptora CD8, zatiaľ čo T bunky vymedzené MHC triedy II vyžadujú zapojenie CD4. Presná funkcia koreceptorov v aktivácii T buniek nie je ešte úplne jasná. Ani to nie sú kritické mechanizmy a parametre riadenia aktivácie. Avšak tak CD8, ako aj CD4 majú cytoplazmatické domény, ktoré sa spájajú s kinázou p56lck, ktorá sa podieľa na úplne najskoršej tyrozínovej fosforylácii typickej pre aktiváciu T buniek. CD8 je dimérny receptor exprimovaný buď v αα forme, alebo, bežnejšie, v αβ forme. CD4 je monomér. V CD8 receptore sa s p56lck spája len a-reťazec.
Terajšie stanovovania fyzikálnych parametrov riadiacich väzbu TCR a CD8 na MHC použitím rozpustných verzií receptorov ukázali, že pri rozoznávaní je dominantnou väzba prostredníctvom TCR. TCR má významne vyššiu afinitu voči MHC ako koreceptory (Willcox, Gao a ďalší 1999; Wýer, Willcox a ďalší 1999).
Jednotlivé interakcie receptorov s MHC trvajú pri fyziologickej teplote, tzn. 37 °C, veľmi krátko. Približná hodnota polčasu rozpadu TCR-MHC/peptidovej interakcie, meraná s ľudským TCR špecifickým pre influenza vírusový matricový peptid prezentovaný prostredníctvom HI_A-A*0201(HI_A-A2) je 0,7 sekundy. Polčas rozpadu CD8aa interakcie s týmto MHC/peptidovým komplexom je kratší ako 0,01 sekundy, tzn. komplex sa rozpadáva 18 krát rýchlejšie.
4. Produkcia rozpustných MHC-peptidových komplexov
Rozpustné MHC-peptidové komplexy sa najprv získavali štiepením povrchových molekúl antigén prezentujúcich buniek papaínom (Bjorkman, Strominger a ďalší 1985). Hoci tento prístup poskytoval materiál na kryštalizáciu, v súčasnosti bol pre molekuly triedy I nahradený oddelenou expresiou ťažkého a ľahkého reťazca v E. coli a následne poskladaním v prítomnosti syntetického peptidu (Garboczi, Hung a ďalší 1992; Madden, Garboczi a ďalší 1993; Garboczi, Madden a ďalší 1994; Reid, McAdam a ďalší 1996; Reid, Smith a ďalší 1996; Smith, Reid a ďalší 1996; Smith, Reid a ďalší 1996; Gao, Tormo a ďalší 1997; Gao, ··
-6·· ·· ·· · • ·· · · · · · II · I I I • I · · · · · • · I · · I • I ···· ·· ···
Gerth a ďalší 1998). Tento prístup má niekoľko výhod oproti predchádzajúcim metódam v tom, že sa získava vyšší výťažok pri nižších nákladoch, veľmi presne je možné kontrolovať identitu peptidu a finálny produkt je homogénnejší. Navyše je možné jednoducho uskutočniť expresiu modifikovaného ťažkého alebo ľahkého reťazca, napríklad fúzovaním s proteínovým príveskom.
5. Rozpustný TCR
Doteraz neboli publikované žiadne údaje týkajúce sa interakcií ľudského TCR a pMHC a žiadne štúdie analyzujúce prirodzene vybrané TCRs špecifické pre prirodzené (napr. vírusové) epitopy. To môže odrážať ťažkosti pri získavaní proteínu, ktorý je vhodný na SPR, tzn. proteínu, ktorý je homogénny, monomérny, správne poskladaný, dostupný v miligramových množstvách a stabilný v určitom rozsahu koncentrácií.
Bolo by výhodné, keby bolo možné produkovať rekombinantný TCR vo forme nenaviazanej na membránu (alebo rozpustnej forme) nie len na účely skúmania špecifických TCR-pMHC interakcií, ale aj ako diagnostický nástroj na detekciu infekcie alebo na detekciu markerov autoimunitných ochorení alebo na detekciu účinnosti T bunkových vakcín. Rozpustný TCR by bol použiteľný aj na farbenie, napríklad na farbenie buniek, aby sa zistila prítomnosť konkrétneho vírusového antigénu prezentovaného v kontexte MHC. Podobne, rozpustný TCR by mohol byť použitý na doručenie terapeutického činidla, napríklad cytotoxickej zlúčeniny alebo imunostimulačnej zlúčeniny, do buniek prezentujúcich určitý antigén.
Je ťažké produkovať proteíny, ktoré sú vytvorené s viac ako jednej polypeptidovej podjednotky, a ktoré majú transmembránovú doménu, v rozpustnej forme, pretože v mnohých prípadoch je proteín stabilizovaný jeho transmembránovou oblasťou. To je prípad TCR.
Produkcia rozpustného TCR bola opísaná množstvom skupín len teraz. Vo všeobecnosti, všetky metódy opisujú skrátené formy TCR obsahujúce buď len extracelulárne domény, alebo extracelulárne a cytoplazmatické domény. Takže vo všetkých prípadoch boli z exprimovaného proteínu deletované transmembránové domény. Hoci mnohé publikácie dokazujú, že TCR produkovaný podľa ich metód ·· ·· ·· · ·· • · · · · · ·· · · · a · ···· · · • · · · · · ···· ··· · · · ·· ·· ···· ·· ··· ·· ·
-7môže byť rozoznávaný TCR-špecifickými protilátkami (z čoho vyplýva, že časť rekombinantného TCR rozoznávaná protilátkou je správne poskladaná), nikto nebol schopný vyrobiť rozpustný TCR s dobrým výťažkom, ktorý je stabilný v nízkych koncentráciách, a ktorý môže rozoznávať MHC-peptidové komplexy.
Prvý postup na získanie kryštalizovateľného materiálu využíva expresiu v eukaryotických bunkách, ale je extrémne nákladné produkovať tento materiál (Garcia, Degano a ďalší 1996; Garcia, Scott a ďalší 1996). Iný postup, ktorým sa produkuje kryštalizovateľný materiál, využíva E. coli expresný systém podobný systému, ktorý bol predtým použitý pre MHC-peptidové komplexy (Garboczi, Ghosh a ďľalší 1996; Garboczi, Utz a ďalší 1996). Ukázalo sa, že spôsob uvedený ako druhý, v ktorom sa exprimujú extracelulárne časti TCR reťazcov useknuté tesne pred cysteínovými zvyškami, ktoré sa podieľajú na vytvorení prepojenia reťazcov prostredníctvom disulfidového mostíka, a následne sa skladajú in vitro, je všeobecne použiteľný. Ukázalo sa, že väčšina heterodimérnych TCRs je nestabilná, keď sa produkuje týmto spôsobom, a to kvôli nízkej afinite medzi a a β reťazcami.
Okrem toho existuje množstvo opisov inžinierskej produkcie rozpustného TCR. Niektoré z nich opisujú len expresiu buď a, alebo β reťazca TCR, takže získaný proteín si nezachováva schopnosť špecificky viazať MHC-peptid (Calaman, Carson a ďalší 1993; Ishii, Nakano a ďalší 1995). Získali sa kryštály β reťazca bez a reťazca, buď samostatné, alebo naviazané na superantigén (Boulot, Bentley a ďalší 1994; Bentley, Boulot a ďalší 1995; Fields, Malchiodi a ďalší 1996).
Iné publikácie opisujú spôsoby expresie heterodimérnych γ/δ alebo α/β TCR (Gregoire, Rebai a ďalší 1991; Necker, Rebai a ďalší 1991; Eilat, Kikuchi a ďalší 1992; Weber, Tra u necker a ďalší 1992; Corr, Slanetz a ďalší 1994; Ishii, Nakano a ďalší 1995; Gregoire, Malissen a ďalší 1996; Romagne, Peyrat a ďalší 1996). V iných prípadoch sa TCR exprimoval ako jednoreťazcový fúzovaný proteín (Brocker, Peter a ďalší 1993; Gregoire, Malissen a ďalší 1996; Schlueter, Schodin a ďalší 1996). Inou stratégiou bolo exprimovať TCR reťazce ako chimérne proteíny fúzované na Ig pántovú a konštantnú oblasť (Eilat, Kikuchi a ďalší 1992; Weber, Traunecker a ďalší 1992). Iné chimérne TCR proteíny sa exprimovali s umelými ·· ·· ·
-8·· ·· • · · • a a · · • · · · · · • · · · · a· ···· ·· ·· sekvenciami, ktoré vytvárajú stočené závity, ktoré majú vysokú vzájomnú afinitu a špecificitu, takže stabilizujú TCR α-β kontakty a zvyšujú rozpustnosť. Tento prístup použili Chang, Bao a ďalší (1994), ktorí nahradili transmembránovú oblasť proteinu proteínom leucínového zipsu, ktorý pozostáva z dvoch syntetických peptidových sekvencií, kyslého peptidu a zásaditého peptidu, ktoré špecificky interagujú, čím vytvárajú heterodimérny stočený závit. Na vylučovanie heterodimérneho TCR proteinu autori použili bakulovírusový expresný systém v eukaryotických bunkách. Peptidy umelého leucínového zipsu napomáhajú heterodimerizácii TCR a a β reťazcov, ktoré sú spojené aj medzireťazcovoou disulfidovou väzbou tesne nad miestom fúzie so zipsovými peptidmi. Avšak tieto techniky sa doteraz nepotvrdili ako úspešné a neexistuje žiadny dôkaz, že opísaný rozpustný TCR môže rozoznávať TCR ligand. Podobne, Golden, Khandekar a ďalší (1997) opísali produkciu heterodimérnych T bunkových receptorov ako leucínových zipsových fúzovaných proteínov. Rozpustný TCR sa exprimoval v E. coli ako sekretovaný heterodimér s α-β medzireťazcovou disulfidovou väzbou ako v Chang a ďalší. Tiež neexistuje žiadny dôkaz, že tento neposkladaný TCR heterodimér je schopný interagovať so svojim ligandom.
Preto existuje potreba rozpustnej verzie na membránu naviazaného TCR, ktorá by bola správne poskladaná tak, že TCR by bol schopný rozoznávať svoj prirodzený ligand. Užitočná by bola aj rozpustná forma TCR, ktorá je stabilná určitú dobu a spôsob jej produkcie v rozumných množstvách. Cieľom predloženého vynálezu je splniť niektoré alebo všetky tieto požiadavky.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je preskladaný rekombinantný T bunkový receptor (TCR), ktorý obsahuje:
i) rekombinantnú TCR a alebo γ reťazcovú extracelulárnu doménu, ktorá obsahuje prvý heterológny C-koncový dimerizačný peptid; a ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ····
-9·· · ·· • · ·· · · · • · · t · • · · · · · • · · · · ii) rekombinantnú TCR β alebo δ reťazcovú extracelulárnu doménu, ktorá obsahuje druhý C-koncový dimerizačný peptid, ktorý vytvára špecifický heterodimér s prvým dimerizačným peptidom, čím sa vytvorí heterodimerizačná doména.
TCR podľa vynálezu, ktorý je preskladaný potom ako sa exprimuje, a nie je vylučovaný ako heterodimér, je konformačne vynikajúci v porovnaní s predtým dostupným rozpustným TCR. To vyplýva z jeho schopnosti rozoznávať MHCpeptidové komplexy. Je tiež stabilný pri relatívne nízkych koncentráciách. Môže byť stabilný pri koncentráciách nižších ako 1 mg/ml a výhodne približne 10 pg/ml.
Ďalšie uskutočnenie vynálezu poskytuje biologicky aktívny rekombinantný T bunkový receptor (TCR), ktorý obsahuje:
i) rekombinantnú TCR a alebo γ reťazcovú extracelulárnu doménu, ktorá obsahuje prvý heterológny C-koncový dimerizačný peptid; a ii) rekombinantnú TCR β alebo δ reťazcovú extracelulárnu doménu, ktorá obsahuje druhý C-koncový dimerizačný peptid, ktorý vytvára špecifický heterodimér s prvým dimerizačným peptidom, čím sa vytvorí heterodimerizačná doména. Takýto TCR sa bude špecificky viazať na MHC-peptidové komplexy, výhodne spôsobom podobným prirodzenému TCR, od ktorého je odvodený.
Ďalej vynález poskytuje rekombinantné sekvencie nukleových kyselín, ktoré kódujú tu opísané TCR reťazce. Takéto sekvencie nukleových kyselín sa môžu izolovať z klonov T buniek. Alternatívne sa môžu produkovať synteticky, napríklad zavedením heterológnej sekvencie nukleovej kyseliny do sekvencie nukleovej kyseliny, ktorá kóduje TCR reťazec, alebo mutovaním (inzerciou, deléciou alebo substitúciou) sekvencie nukleovej kyseliny, ktorá kóduje TCR reťazec. Takže vynález zahŕňa vo svojom rámci syntetické peptidy, ktoré sú účinné a/alebo sa špecificky viažu ako prirodzené TCRs.
Ešte iný predmet vynálezu poskytuje spôsob vytvárania rekombinantného T bunkového receptora nenaviazaného na membránu, ktorý zahŕňa:
expresiu rekombinantnej TCR a alebo γ reťazcovej extracelulárnej domény, ktorá obsahuje prvý heterológny C-koncový dimerizačný peptid, a rekombinantnej TCR β alebo δ reťazcovej extracelulárnej domény, ktorá obsahuje druhý C-koncový
-10·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · ·· • · • · ·· · dimerizačný peptid, ktorý vytvára špecifický heterodimér s prvým dimerizačným peptidom, čím formuje heterodimerizačnú doménu; a a vzájomné poskladanie reťazcov in vitro, čím sa produkuje TCR heterodimér.
Rekombinantné TCRs podľa vynálezu môžu rozoznávať MHC triedy Ipeptidových a MHC triedy ll-peptidových komplexov.
Heterodimerizačnou doménou rekombinantnéhoTCR podľa vynálezu je výhodne takzvaný stočený závit alebo leucínový zips. Tieto výrazy sú použité na opísanie párov závitnicových peptidov, ktoré navzájom interagujú špecifickým spôsobom, čím vytvárajú heterodimér. Interakcia nastáva vďaka prítomnosti komplementárnych hydrofóbnych zvyškov pozdĺž jednej strany každého zipsového peptidu. Povaha peptidov je taká, že vytváranie heterodimérov je značne výhodnejšie ako vytváranie homodimérov závitníc. Leucínové zipsy môžu byť syntetické alebo prirodzene sa vyskytujúce. Syntetické leucíny môžu byť navrhnuté tak, aby mali vyššiu väzobnú afinitu ako prirodzene sa vyskytujúce leucínové zipsy, čo nemusí byť vždy výhodné. V skutočnosti sú výhodnými leucínovými zipsami na použitie podľa vynálezu prirodzene sa vyskytujúce leucínové zipsy alebo leucínové zipsy s podobnou väzobnou afinitou. Leucínové zipsy z c-jun a c-fos proteínu sú príkladom leucínových zipsov s vhodnou väzobnou afinitou. Iné vhodné leucínové zipsy zahŕňajú zipsy z myc a max proteínov (Amati, Dalton a ďalší 1992). Je možné jednoducho navrhnúť aj iné leucínové zipsy s vhodnými vlastnosťami (O'Shea a ďalší 1993).
Výhodné je, aby rozpustné TCRs podľa vynálezu mali leucínové zipsové fúzie s dĺžkou približne 40 aminokyselín zodpovedajúce heterodimerizačným doménam z c-jun (a reťazec) a c-fos (β reťazec) (O'Shea, Rutkowski a ďalší 1989, O'Shea, Rutkowski a ďalší 1992, Glover a Harrison 1995). Môžu byť použité dlhšie leucínové zipsy. Keďže je zrejmé, že heterodimerizačná špecificita sa zachováva aj pri dosť krátkych fragmentoch niektorých leucínových zipsových domén (O'Shea, Rutkowski a ďalší 1992), je možné, že podobný účinok je možné dosiahnuť s kratšími c-jun a c-fos fragmentárni. Takéto kratšie fragmenty by mohli mať napríklad
99
9 9 9
9 9
9 9 9
9 9
999 99 ·
- 11 ·· ·· ·· • · · · · · • · · · · • · · · · · 9 9 9 9 9
9999 99 len 8 aminokyselín. Takže dĺžka leucínových zipsových domén môže byť v rozsahu od 8 do 60 aminokyselín.
Molekulové princípy špecificity párovania leucínového zipsu sú dobre charakterizované (Landschulz, Johnson a ďalší 1988; McKnight 1991) a priemerný odborník v oblasti je schopný navrhnúť a skonštruovať leucínové zipsy na vytvorenie homodimérov, heterodimérov alebo trimérnych komplexov (Lumb a Kim 1995; Nautiyal, Woolfson a ďalší 1995; Boice, Dieckmann a ďalší 1996, Chao, Houston a ďalší 1996). Navrhnutie leucínových zipsov alebo iných heterodimerizačných domén s vyššou afinitou ako je afinita c-jun a c-fos leucínových zipsov môže byť v niektorých systémoch užitočné pre expresiu rozpustných TCRs. Avšak, ako je podrobnejšie uvedené nižšie, keď sa TCR skladá in vitro, do skladacieho tlmivého roztoku je výhodne zavedené solubilizačné činidlo, aby sa redukovalo vytváranie neproduktívnych proteínových agregátov. Jednou interpretáciou tohto fenoménu je, že kinetika skladania leucínových zipsových domén je rýchlejšia ako kinetika skladania TCR reťazcov, čo vedie k dimerizácii neposkladaných TCR a a β reťazcov, a to spôsobuje agregáciu proteínov. Tým že sa spomalí proces skladania a inhibuje sa agregácia pridaním solubilizačného činidla, môže sa protein udržiavať v roztoku pokiaľ sa úplne neposkladajú obe fúzované domény. Preto heterodimerizačné domény s vyššou afinitou ako c-fos a cjun leucínové zipsy môžu vyžadovať vyššie koncentrácie solubilizačného činidla na dosiahnutie výťažku TCRs, ktorý je porovnateľný s výťažkom pri c-jun a c-fos.
Rôzne biologické systémy používajú rôzne spôsoby na vytváranie stabilných homo- a heteroproteínových dimérov a každý z týchto spôsobov v princípe poskytuje možnosť na skonštruovanie dimerizačných domén v geneticky modifikovaných proteínoch. Leucínové zipsy (Kouzarides a Ziff 1989) sú pravdepodobne najpopulárnejšie dimerizačné moduly a vo veľkej miere boli používané na produkciu geneticky skonštruovaných dimérnych proteínov. Tak bol použitý leucínový zips z GCN4, transkripčného aktivačného proteínu z kvasinky Saccharomyces cerevisiae, na priamu homodimerizáciu množstva heterológnych proteínov (Hu, Newell a ďalší 1993; Greenfield, Montelione a ďalší 1998). Výhodnou stratégiou je použitie zipsov,
-12·· ·· ·· · • · · · · ·· • · · · · · • · · · · · · • · · · · · ·· ···· ·· ··· ktoré priamo vytvárajú heterodimérne komplexy, ako Jun/Fos leucínový zipsový pár (de Kruif a Logtenberg 1996; Riley, Ralston a ďalší 1996).
Vo výhodnom rekombinantnom TCR podľa vynálezu chýba medzireťazcová disulfidová väzba, ktorá sa vytvára medzi dvoma cysteínovými zvyškami v prirodzených a a β TCR reťazcoch a medzi prirodzenými γ a δ TCR reťazcami. To sa dá dosiahnuť napríklad fúziou dimerizačných domén do TCR receptorových reťazcov nad cysteínovými zvyškami, takže tieto zvyšky sú z rekombinantného proteinu vylúčené. V alternatívnom príklade sa jeden alebo viacero cysteínových zvyškov nahradí iným aminokyselinovým zvyškom, ktorý nevytvára disulfidovú väzbu. Tieto cysteínové zvyšky nesmú byť prítomné, pretože môžu narušovať in vitro skladanie funkčného TCR.
Preskladávanie a a β reťazcov alebo γ a δ reťazcov preskladaného rekombinantnéhoTCR podľa vynálezu sa uskutočňuje in vitro v podmienkach vhodných na preskladanie. V konkrétnom uskutočnení sa získa rekombinantný TCR so správnou konformáciou poskladaním rozpustených TCR reťazcov v preskladávacom tlmivom roztoku, ktorý obsahuje solubilizačné činidlo, napríklad močovinu. Výhodne môže byť močovina prítomná v koncentrácii najmenej 0,1 M alebo najmenej 1 M alebo najmenej 2,5 M alebo približne 5 M. Alternatívnym solubilizačným činidlom, ktoré môže byť použité, je guanidín v koncentrácii medzi 0,1 M a 8M, výhodne najmenej 1 M alebo najmenej 2,5 M. Pred preskladaním sa výhodne používa redukčné činidlo na zaistenie úplnej redukcie cysteínových zvyškov. Ak je to nevyhnutné, môžu byť použité ďalšie denaturačné činidlá, ako DTT a guanidín. Pred krokom skladania môžu byť použité rôzne denaturanty a redukčné činidlá (napr. močovina, β-merkaptoetanol). Počas preskladávania môžu byť použité alternatívne redoxné páry, ako cystamín/cysteamín redoxný pár, DTT alebo β-merkaptoetanol/atmosferický kyslík a cysteín v redukovanej a v oxidovanej forme.
Tu opísaný monomérny TCR môže byť značený detegovateľnou značkou, napríklad značkou, ktorá je vhodná na diagnostické účely. Takto vynález poskytuje spôsob na detegovanie MHC-peptidových komplexov, ktorý zahŕňa uvedenie MHC·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ····
-13·· · ·· • ·· · · · • · · · • · · · · • e · · ·· ··· ·· · peptidových komplexov do kontaktu s TCR podľa vynálezu, ktorý je špecifický pre daný MHC-peptidový komplex; a detekciu viazania sa TCR na MHC-peptidový komplex. Na poskytnutie detegovateľnej značky môže byť v tetramérnom TCR vytvorenom použitím biotinylovaných heterodimérov použitý fluorescenčný streptavidín (komerčne dostupný). Fluorescenčné značený tetramér bude vhodný na použitie vo FACS analýzach, napríklad na detekciu antigén prezentujúcich buniek nesúcich peptid, voči ktorému je TCR špecifický.
Iným spôsobom, ktorým môžu byť detegované rozpustné TCRs, je použitie TCR-špecifických protilátok, najmä monoklonálnych protilátok. Existuje mnoho komerčne dostupných anti-TCR protilátok, ako napríklad pFI a aFI, ktoré rozoznávajú konštantné oblasti β, respektíve a reťazca.
TCR sa môže alternatívne alebo navyše spojiť s terapeutickým činidlom, ktorým môže byť napríklad toxická časť napríklad na použitie na usmrtenie bunky, alebo s imunostimulačným činidlom, ako interleukínom alebo cytokínom. Takto vynález poskytuje spôsob dodania terapeutického činidla do cieľovej bunky, ktorý zahŕňa uvedenie potenciálnych cieľových buniek do kontaktu s TCR podľa vynálezu v podmienkach, ktoré umožňujú pripojenie TCR na cieľovú bunku, pričom uvedený TCR je špecifický pre MHC-peptidové komplexy a je s ním spojené terapeutické činidlo. Najmä by mohol byť rozpustný TCR použitý na doručenie terapeutických činidiel na miesta buniek prezentujúcich konkrétny antigén. Napríklad, toxín by mohol byť doručený do nádoru, a tým by ho pomohol zničiť. To by mohlo byť užitočné v mnohých situáciách a najmä proti nádorom, pretože nie všetky bunky v nádore prezentujú antigény, a preto nie sú všetky nádorové bunky detegované imunitným systémom. S rozpustným TCR by bolo možné doručiť zlúčeninu tak, že by vykonávala svoju funkciu lokálne, ale nie len na bunke, na ktorú sa viaže. Takže v jednej konkrétnej stratégii sa navrhuje pripojenie protinádorových molekúl na T bunkové receptory špecifické pre nádorové antigény.
Na toto použitie by mohli byť využité mnohé toxíny, napríklad rádioaktívne zlúčeniny, enzýmy (napríklad perforín) alebo chemoterapeutické činidlá (napríklad c/s-platín). Na zaistenie toho, že toxín bude účinkovať v požadovanej lokalite, mohol
·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · ·· ···· ·· · by byť vo vnútri lipozómu spojený so streptavidínom, takže zlúčenina by sa vylučovala pomaly. Takto sa predíde poškodzujúcim účinkom počas transportu v tele a zaistí sa, že toxín bude mať maximálny účinok po naviazaní sa TCR na relevantnú antigén prezentujúcu bunku.
Alternatívnym spôsobom značenia alebo pripojenia inej časti, ako napríklad toxickej časti, na rozpustný TCR je zahrnutie značky alebo inej časti do zmiešanej molekuly multiméru. Príkladom takejto multimérnej molekuly je tetramér obsahujúci tri TCR molekuly a jednu molekulu peroxidázy. To by bolo možné dosiahnuť zmiešaním TCR a enzýmu v molárnom pomere 3:1, čím by sa generovali tetramérne komplexy, a izoláciou požadovaného komplexu od komplexov, ktoré neobsahujú správny pomer molekúl. Zmiešané molekuly by mohli obsahovať akúkoľvek kombináciu molekúl s podmienkou, že priestorová zábrana neprekáža alebo význame neprekáža požadovanej funkcii molekúl. Pre zmiešané tetraméry je vhodné umiestnenie väzobných miest na molekule streptavidínu, pretože potom nie je pravdepodobné, že by sa vyskytla priestorová prekážka.
Výhodne obsahujú rekombinantné TCR reťazce podľa vynálezu flexibilný spojovník, ktorý je umiestnený medzi TCR doménou a dimerizačným peptidom. Vhodné spojovníky zahŕňajú štandardné peptidové spojovníky obsahujúce glycín, napríklad spojovníky obsahujúce glycín a serín. Za výhodné sa považuje skrátenie na C-konci blízko cysteínových zvyškov vytvárajúcich medzireťazcovú disulfidovú väzbu, pretože prostredníctvom týchto zvyškov sú a a β reťazce blízko seba v bunkových TCRs. Preto na poskytnutie nepoškozujúcej tranzície z TCR reťazcov do heterodimerizačnej domény môžu byť potrebné len relatívne krátke spojovníkové sekvencie. Výhodné je ako spojovníkovú sekvenciu použiť Pro-Gly-Gly alebo GlyGly. Avšak spojovníková sekvencia môže varírovať. Napríklad, spojovník môže úplne chýbať alebo môže byť redukovaný na jediný zvyšok, v takom prípade je výhodnou voľbou jeden glycínový zvyšok. Pravdepodobne budú tolerované aj varianty dlhších spojovníkov v rozpustnom TCR, s podmienkou, že budú chránené voči útoku proteázy, ktorý by viedol segregácii dimerizačných peptidov od extracelulárnych domén TCR, čo by spôsobilo stratu α-β reťazcovej stability.
·· ·· • · · · • · ·
-15·· • · • · • · » ····
Rozpustným TCR podľa vynálezu nemusí nevyhnutne byť a-pTCR. Zahrnuté sú aj molekuly ako γ-δ, α-δ a y-pTCR molekuly, ako aj TCR molekuly (pre-TCR) obsahujúce invariantné a reťazce, ktoré sú exprimované len v skorom štádiu vývinu. Pre-TCR špecifikuje bunkovú líniu, ktorá bude exprimovať α-β T bunkový receptor, na rozdiel od tých buniek, ktoré budú exprimovať γ-δ T bunkový receptor (pozri zhrnutie Aifantis, Azogui a ďalší 1998; von Boehmer, Aifantis a ďalší 1998; Wúrch, Biro a ďalší 1998). Pre-TCR sa exprimuje ako TCR β reťazec spárovaný s invariantným Pre-TCR a reťazcom (Saint Ruf, Ungewiss a ďalší 1994; Wílson a MacDonald 1995), čo zrejme priraďuje bunku k α-β T bunkovej línii. Preto sa myslí, že Pre-TCR je dôležitý počas týmusového vývinu (Ramiro, Trigueros a ďalší 1996).
Ak je to vhodné, môžu sa uskutočniť štandardné modifikácie rekombinantných proteínov podľa vynálezu. Tieto modifikácie zahŕňajú napríklad zámenu nespárovaného cysteínového zvyšku v konštantnej oblasti β reťazca, aby sa zabránilo nesprávnemu spárovaniu vo vnútri reťazca alebo medzi reťazcami.
Signálny peptid môže chýbať, pretože neslúži v zrelom receptore žiadnemu účelu, ani nemá schopnosť viazať ligand, a môže v skutočnosti brániť TCR, aby bol schopný rozoznávať ligand. Vo väčšine prípadov sa predpokladá miesto štiepenia, v ktorom sa signálny peptid odstraňuje zo zrelých TCR reťazcov, ale nie je experimentálne stanovené. Skonštruovanie exprimovaných TCR reťazcov tak, aby boli na N-konci o maximálne 10 aminokyselín dlhšie alebo kratšie, nemá žiadny význam pre funkciu rozpustného TCR. Bolo by možné pridať určité prídavky, ktoré nie sú prítomné v pôvodnej proteínovej sekvencií. Napríklad by bolo možné pridať krátku príveskovú sekvenciu, ktorá by pomohla pri purifikácii TCR reťazcov, za predpokladu, že nebude interferovať so správnou štruktúrou a skladaním antigén väzobného miesta TCR.
Na expresiu v E. coli môže byť na N-koniec štartovacieho miesta predpokladanej zrelej proteínovej sekvencie zavedený metionínový zvyšok, aby bolo možné iniciovať transláciu.
·· ·· ·· · • · · · · · ·· • · » · · ·
-16Zďaleka nie všetky zvyšky variabilných domén TCR reťazcov sú kľúčové pre antigénovú špecificitu a funkciu. Preto je možné do tejto oblasti zaviesť značné množstvo mutácií bez toho, aby sa ovplyvnila špecificita a funkcia antigénu.
Naopak, určité zvyšky, ktoré sa podieľajú na vytváraní kontaktov s peptidovým antigénom alebo polypeptidom HLA ťažkého reťazca, tzn. zvyškami tvoriacimi CDR oblasti TCR reťazcov, môžu byť substituované zvyškami, ktoré by zvýšili afinitu TCR voči ligandu. Takéto substitúcie, berúc do úvahy nízku afinitu väčšiny TCRs voči peptid-MHC ligandom, by mohli byť užitočné na zosilnenie špecificity a funkčného potenciálu rozpustných TCRs. V tu uvedených príkladoch sú stanovené afinity rozpustných TCRs pre peptid-MHC ligandy. Takéto merania sa môžu použiť na testovanie mutácií zavedených do TCR, a tak aj na identifikáciu TCRs obsahujúcich substitúcie, ktoré zosilňujú aktivitu TCR.
Zďaleka nie všetky zvyšky v konštantných doménach TCR reťazcov sú nevyhnutné pre špecificitu a funkciu antigénu. Takže do tejto oblasti ovplyvňujúcej antigénovú špecificitu môže byť zavedené značné množstvo mutácií. V príklade 14 uvedenom nižšie sme ukázali, že dve aminokyselinové substitúcie v konštantnej doméne TCR β reťazca nemajú žiadne detegovateľné vplyvy na schopnosť TCR viazať HLA-peptidový ligand.
TCR β reťazec obsahuje cysteínový zvyšok, ktorý nie je spárovaný v bunkovom alebo prirodzenom TCR. Mutácia tohto zvyšku zosilňuje účinnosť in vitro preskladania rozpustného TCR. Substitúcie tohto cysteínového zvyšku za serín alebo alanín majú významný pozitívny účinok na účinnosť preskladania in vitro. Podobné pozitívne účinky, alebo ešte lepšie účinky, je možné dosiahnuť substitúciami za iné aminokyseliny.
Ako bolo uvedené vyššie, je výhodné, aby chýbali cysteinové zvyšky vytvárajúce medzireťazcovú disulfidovú väzbu v prirodzenom TCR, aby sa zabránilo problémom pri preskladávaní. Avšak, keďže umiestnenie týchto cysteínových zvyškov je prirodzeným dizajnom v TCR, a keďže sa aj ukázalo, že TCR s takto umiestnenými cysteínovými zvyškami je funkčné pri c-jun a c-fos leucínových
-17·· ·· ·· · • · · · · · ·· • · · · · · • · · · · · · • · · · · · ·· ···· ·· ··· • · ·· · zipsových doménach (O'Shea a ďalší, 1989), mohli by byť tieto cysteínové zvyšky prítomné, za predpokladu, že TCR by sa mohol preskladať.
Keďže konštantné domény sa priamo nepodieľajú na kontaktoch s peptidMHC ligandami, C-koncové miesto skrátenia sa môže meniť v podstate bez straty funcie. Napríklad by malo byť možné produkovať funkčné rozpustné TCRs bez celej konštantnej domény. V princípe by bolo jednoduchšie exprimovať a skladať rozpustné TCRs obsahujúce len variabilné oblasti alebo variabilné oblasti a len krátky fragment konštantných oblastí, pretože polypeptidy by boli kratšie. Avšak táto stratégia nie je výhodná. A to preto, že by sa skomplikovala podmienka ďalšej stability α-β reťazcového párovania cez heterodimerizačnú doménu, pretože skonštruované C-konce dvoch reťazcov by boli vzdialené, čo by vyžadovalo dlhé spojovníkové sekvencie. Výhodou heterodimerizačných domén fúzovaných tesne pred polohou cysteínou vytvárajúcich medzireťazcovú disulfidovú väzbu je, že v bunkovom receptore sú α a β reťazce držané veľmi blízko seba. Preto je menej pravdepodobné, že by fúzia v tomto mieste spôsobila deformovanie TCR štruktúry.
Je možné, že by bolo možné produkovať funkčný rozpustný TCR s väčším fragmentom konštantných domén, ako je tu uvedené ako výhodné, to znamená, že konštantné domény nemusia byť skrátené tesne pred cysteínmi vytvárajúcimi medzireťazcovú disulfidovú väzbu. Zahrnutá môže byť napríklad celá konštantná doména okrem transmembránovej domény. V takom prípade by bolo výhodné mutovať cysteínové zvyšky vytvárajúce medzireťazcovú disulfidovú väzbu v bunkovom TCR.
Okrem toho, by na podporu medzireťazcovej stability prostredníctvom heterodimerizačnej domény mohlo byť použité zavedenie cysteínových zvyškov, ktoré by mohli vytvárať medzireťazcovú disulfidovú väzbu. Jednou možnosťou by mohlo byť skrátenie α a β režazcov blízko cysteínových zvyškov vytvárajúcich mdzireťazcovú disulfidovú väzbu bez toho, aby sa odstránili, takže by mohlo nastať normálne vytvorenie disuifidovej väzby. Inou možnosťou by mohlo byť deletovanie len transmembránových domén α a β reťazcov. Ak by sa exprimovali kratšie fragmenty α a β reťazcov, mohli by byť cysteínové zvyšky zavedené ako substitúcie ·· ·· ·· · ·· ···· ···· ··· ·· · · · · · ·
-18·· ···· ·· ··· ·· · v aminokyselinových polohách, v ktorých by pri skladaní dvoch reťazcov dochádzalo k ich tesnému priblíženiu, ktoré by bolo vhodné na vytvorenie disulfidovej väzby.
Purifikáciu TCR je možné dosiahnuť rôznymi prostriedkami. Je možné využiť alternatívne spôsoby iónovej výmeny alebo je možné použiť iné spôsoby purifikácie proteínu, ako napríklad gélovú filtračnú chromatografiu alebo afinitnú chromatografiu.
V spôsobe produkcie rekombinantnéhoTCR podľa vynálezu je možné zvýšiť účinnosť skladania aj pridaním určitých iných proteínových zložiek, napríklad šaperonínových proteínov, do skladacej zmesi. Zlepšenie skladania sa dosiahlo prechodom proteínu cez kolónu s imobilizovanými mini-šaperonínmi (Altamirano, Golbik a ďalší 1997; Altamirano, Garcia a ďalší 1999).
Okrem spôsobov opísaných v príkladoch sú možné aj alternatívne prostriedky biotinylácie TCR. Použitá môže byť napríklad chemická biotinylácia. Použité môžu byť alternatívne biotinylačné prívesky, hoci určité aminokyseliny v sekvencii biotínového prívesku sú esenciálne (Schatz a ďalší 1993). Aj zmes používaná na biotinyláciu môže byť rôzna. Enzým vyžaduje Mg-ATP a nízku iónovú silu, hoci obe tieto podmienky môžu varírovať, napr. môže sa použiť vyššia iónová sila a dlhší reakčný čas. Môže sa použiť iná molekula ako avidín alebo streptavidín na vytvorenie multimérov TCR. Vhodná by bola akákoľvek molekula, ktorá viaže biotín multivalentným spôsobom. Alternatívne by bolo možné použiť úplne iné spojenie (ako napríklad poly-histidínový prívesok na chelatovanom ióne niklu (Quiagen Product Guide 1999, Kapitola 3 Protein Expression, Purification, Detection and Assay str. 35-37). Výhodne sa prívesok nachádza smerom k Ckoncu proteínu, tak, aby sa minimalizoval rozsah priestorového prekážania v interakcii s potenciálnymi peptid-MHC komplexami.
Príklady vhodných MHC-peptidových cieľov pre TCR podľa vynálezu zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na, vírusové epitopy, ako napríklad HTLV-1 epitopy (napr. Tax peptid obmedzený prostredníctvom HLA-A2; HTLV-1 je asociovaný s leukémiou), HIV epitopy, EBV epitopy, CMV epitopy; melanómové ·· ·· ·· • · · · · · • · 9 9 ·
9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9
9999 99 999 99 9
-19epitopy a iné rakovinovo-špecifické epitopy; a epitopy asociované s autoimunitnými poruchami, ako napríklad reumatoidnou artritídou.
Liečba veľkého množstva chorôb môže byť potenciálne zosilnená umiestnením liečiva prostredníctvom špecificity rozpustných TCRs.
Vírusové ochorenia, pre ktoré existujú liečivá, napr. HIV, SIV, EBV, CMV, by mohli profitovať z vylučovania liečiva v tesnej blízkosti infikovaných buniek. Pri rakovine by lokalizácia v blízkosti nádorov alebo metastáz zosilnila účinok toxínov alebo imunostimulátorov. Pri autoimunitných ochorenia by mohli byť imunosupresívne liečivá vylučované pomaly, čím by mali lokálnejší účinok počas dlhšej doby s minimálnym ovplyvňovaním celkovej imunitnej kapacity subjektu. Pri prevencii odvrhnutia štepu by rovnakým spôsobom mohol byť optimalizovaný účinok imunosupresívnych liečiv. Na podanie vakcíny by mohol byť vakcínový antigén lokalizovaný v blízkosti antigén prezentujúcich buniek, a tak by sa zosilnila účinnosť antigénu. Spôsob sa môže aplikovať aj na účely zobrazovania.
Výhodné znaky každého uskutočnenia vynálezu sú v každom ohľade mutatis mutandis. Tu citované dokumenty predchádzajúceho stavu techniky sú v rozsahu vynálezu zahrnuté kompletne v rozsahu umožnenom zákonom.
Vynález bude nižšie opísaný v nasledujúcich príkladoch, ktoré neobmedzujú žiadnym spôsobom rozsah vynálezu.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Opis sa odvoláva na nasledujúce priložené obrázky.
Obrázok 1 je schematický pohľad na proteín, ktorý je tvorený T bunkovým receptorom fúzovaným s leucínovým zipsom. Každý reťazec pozostáva z domén imunoglobulínovej superrodiny, jednej variabilnej (V) a jednej konštantnej (C). Konštantné domény sú skrátené hneď na N-konci medzirefazcových cystetínových zvyškov, a sú fúzované s leucínovým zipsovým heterodimerizačným motívom z cJun (a) alebo c-Fos (β) s dĺžkou približne 40 aminokyselín na C-konci prostredníctvom krátkeho spojovníka. α-Jun aj β-Fos obsahujú dve medzireťazcové
9· ·· · · ·· ··· ···· · · ·
-20·· · · · · ···» ··· · · · · · ·· ···· ·· ··· ·· · disulfidové väzby a párujú sa len prostredníctvom nekovalentných kontaktov. Alfa reťazec je kratší ako beta reťazec kvôli kratšej konštantnej doméne.
Obrázok 2 je fotografia redukčnej/neredukčnej gélovej analýzy heterodimérneho JM22zip receptora. Identické vzorky purifikovaného TCR-zipsu sa naniesli na 15% akrylamidový SDS gél, buď v redukujúcich podmienkach (dráha 2) alebo v neredukujúcich podmienkach (dráha 4). V dráhach 1 a 3 sú markerové proteíny. Molekulové hmotnosti sú uvedené v kilodaltonoch. Pri oboch podmienkach nekovalentne spojený heterodimér disociuje na a a β reťazce. V dráhe 4 sa každý reťazec pohybuje s väčšou mobilitou a jednotlivé pásy indikujú prítomnosť jednotlivých druhov medzireťazcovej disulfidovej väzby. To je kompatibilné s vytváraním správnej disulfidovej väzby.
Obrázok 3 je graf znázorňujúci špecifické viazanie sa JM22zip TCR na HLAA2 Flu matricové (M58-66) komplexy. HLA-A2 komplexy, preskladané okolo jednotlivých peptidov a biotinylované na p2-mikroglobulíne sa imobilizovali na troch streptavidínom pokrytých tečúcich bunkách: 3770 rezonančných jednotiek (RU) HLA-A2 POL ako kontrola na tečúcich bunkách (FC) 3, a dve odlišné úrovne HLAA2 M58-66 FLU (2970 RU na FC1 a 4960 RU na FC2). JM22zip sa injekčné zavádzal v rozpustnej fáze postupne na všetky tri tečúce bunky v koncentrácii 43 μΜ 60 sekúnd. Počas injekcie sa pozoruje vzrast nad pozadie pri odpovedi na obe HLA-A2 FLU-pokryté tečúce bunky. Približne 1000 RU špecifického viazania sa JM22zip na tečúce bunky 1 a približne 700 RU na tečúce bunky 2.
Obrázok 4 znázorňuje sekvencie syntetických DNA primerov použitých na ukotvenie amplifikácie TCR génov. Rozoznávacie miesta pre DNA reštrikčné enzýmy použité na klonovanie sú podčiarknuté. A: poly-Cukotvovací primer. B: Primer špecifický pre konštantnú oblasť TCR a reťazca. C: Primer špecifický pre konštantnú oblasť TCR β reťazca.
Obrázok 5 znázorňuje sekvencie syntetických DNA primerov použité na PCR amplifikáciu DNA fragmentov kódujúcich 40 aminokyselín oblastí stočeného závitu (leucínového zipsu) c-jun a c-fos. Rozoznávacie miesta pre DNA reštrikčné enzýmy ·· ·· ·· · ·· «··· ···· ··· • 9 · · · · ·
-21 ·· ···· ·· ··· ·· použité na klonovanie sú podčiarknuté. A: c-jun 5' primer. B: c-jun 3' primer. C: c-fos 5' primer. D: c-fos 3' primer.
Obrázok 6 znázorňuje zodpovedajúce DNA a aminokyselinové (jednopísmenový kód) sekvencie c-fos a c-jun fragmentov, ako sú fúzované s TCRs (zavedené v pBJ107 a pBJ108). A: c-jun leucínový zips, ako je fúzovaný s TCR α reťazcami. B: c-fos leucínový zips, ako je fúzovaný s TCR β reťazcami.
Obrázok 7 znázorňuje sekvencie syntetických DNA primérov použitých na mutovanie nespárovaného cysteínového zvyšku v TCR β reťazcoch. Priméry boli navrhnuté použitím Quickchange™ metódy mutagenézy (Stratagene). A: Mutácia cysteínu na serín, priamy (sense) primer, uvedená aminokyselinová sekvencia a označená mutácia. B: Mutácia cysteínu na serín, protismemý (nonsense) primer. C: Mutácia cysteínu na alanín, priamy (sense) primer, uvedená aminokyselinová sekvencia a označená mutácia. D: Mutácia cysteínu na alanín, protismemý (nonsense) primer.
Obrázok 8 je schematickým znázornením TCR-zipsového fúzovaného proteínu. Štyri imunoglobulínové domény sú znázornené ako polkruhy, pričom sú vyznačené vnútroreťazcové disulfidové mostíky medzi prislúchajúcimi pármi cysteínových zvyškov. Čísla označujú polohy aminokyselín v zrelých T-bunkových receptorových reťazcoch. Kvôli miernym rozdielom v dĺžke reťazca po rekombinácii môžu byť dĺžky reťazcov v rôznych TCRs mierne odlišné. Zvyšky zavedené v spojovníkovej sekvencii sú označené jednopísmenovým kódom.
Obrázok 9 znázorňuje sekvencie syntetických DNA primérov použité na PCR amplifikáciu TCR α a β reťazcov. Rozoznávacie miesta pre DNA reštrikčné enzýmy sú podčiarknuté a aminokyselinové sekvencie zodpovedajúce príslušným TCR reťazcom sú uvedené nad sekvenciami priamych primérov. Malými písmenami sú uvedené tiché DNA mutácie týkajúce sa TCR génových sekvencii a iné DNA sekvencie, ktoré nezodpovedajú TCR génom. A: 5' PCR primer pre ľudský Va10.2 JM22 TCR reťazec, ktorý je definovaný Influenza matricovým vírusovým peptidom prezentovaným na HLA-A0201. B: 5' PCR primer pre ľudský νβ17 JM22 TCR reťazec, ktorý je definovaný Influenza matricovým vírusovým peptidom •a aa a· * ·· • aa· ···· ···
-22·· ···· a a a a ··· · · a · · • a ···· ·· ··· ·· · prezentovaným na HLA-A0201. C: 5' PCR primer pre myšací Va4 TCR reťazec, ktorý je definovaný Influenza nukleoproteínovým peptidom prezentovaným na H2Db. D: 5' PCR primer pre myšací Vp11 TCR reťazec, ktorý je definovaný Influenza nukleoproteínovým peptidom prezentovaným na H2-Db. E: 5' PCR primer pre ľudský Va23 TCR reťazec, ktorý je definovaný 003 HIV-1 Gag peptidom prezentovaným na HLA-A0201. F: 5' PCR primer pre ľudský νβ5.1 TCR reťazec, ktorý je definovaný 003 HIV-1 Gag peptidom prezentovaným na HLA-A0201. G: 5' PCR primer pre ľudský Va2.3 A6 TCR reťazec, ktorý je definovaný HTLV-1 Tax peptidom prezentovaným na HLA-A0201. H: 5' PCR primer pre ľudský νβ12.3 A6 TCR reťazec, ktorý je definovaný HTLV-1 Tax peptidom prezentovaným na HLA-A0201. I: 5' PCR primer pre ľudský Va17.2 reťazec B7 TCR, ktorý je definovaný HTLV-1 Tax peptidom prezentovaným na HLA-A0201. J: 5' PCR primer pre ľudský νβ12.3 B7 TCR reťazec, ktorý je definovaný HTLV-1 Tax peptidom prezentovaným na HLA-A0201. K: 3' PCR primer pre ľudské Ca reťazce, všeobecne použiteľný. L: 3' PCR primer pre ľudské Οβ reťazce, všeobecne použiteľný.
Obrázok 10 znázorňuje predpokladanú proteínovú sekvenciu (jednopísmenový kód hore) a DNA sekvenciu (spodná) rozpustného TCR a reťazca z JM22, ktorý je definovaný flu matricovým proteínom prezentovaným na HLA-A2, ako je fúzovaná s c-jun doménou leucínového zipsu. Mutácie zavedené na 5' koniec DNA sekvencie na zosilnenie expresie génu v E. coli sú označené malými písmenami, ako aj sekvencia spojovníka medzi TCR a c-jun sekvenciami.
Obrázok 11 znázorňuje predpokladanú proteínovú sekvenciu (jednopísmenový kód hore) a DNA sekvenciu (spodná) rozpustného TCR β reťazca z JM22, ktorý je definovaný flu matricovým proteínom prezentovaným na HLA-A2, ako je fúzovaná s c-fos doménou leucínového zipsu. Sekvencia spojovníka medzi TCR a c-fos sekvenciami je označená malými písmenami.
Obrázok 12 znázorňuje predpokladanú proteínovú sekvenciu (jednopísmenový kód hore) a DNA sekvenciu (spodná) rozpustného TCR a reťazca z hlodavčieho F5 receptora, ktorý je definovaný Influenza vírusovým nukleoproteínom prezentovaným na H2-Db, ako je fúzovaná s c-jun doménou leucínového zipsu.
·· ·· • · · · • · · • · ·
-23»· ···· ·· · ·· ·· ·
Mutácie zavedené na 5' koniec DNA sekvencie na zosilnenie expresie génu v E. coli sú označené malými písmenami, ako aj sekvencia spojovníka medzi TCR a cjun sekvenciami.
Obrázok 13 znázorňuje predpokladanú proteínovú sekvenciu (jednopísmenový kód hore) a DNA sekvenciu (spodná) rozpustného TCR β reťazca z hlodavčieho F5 receptora, ktorý je definovaný Influenza vírusovým nukleoproteínom prezentovaným na H2-Db, ako je fúzovaná s c-fos doménou leucínového zipsu. Sekvencia spojovníka medzi TCR a c-fos sekvenciami je označená malými písmenami.
Obrázok 14 znázorňuje predpokladanú proteínovú sekvenciu (jednopismenový kód hore) a DNA sekvenciu (spodná) rozpustného TCR a reťazca od pacienta 003, ktorý je definovaný HIV-1 Gag prezentovaným na HLA-A2, ako je fúzovaná s c-jun doménou leucínového zipsu. Mutácie zavedené na 5' koniec DNA sekvencie na zosilnenie expresie génu v E. coli sú označené malými písmenami, ako aj sekvencia spojovníka medzi TCR a c-jun sekvenciami.
Obrázok 15 znázorňuje predpokladanú proteínovú sekvenciu (jednopísmenový kód hore) a DNA sekvenciu (spodná) rozpustného rozpustného TCR β reťazca od pacienta 003, ktorý je definovaný HIV-1 Gag prezentovaným na HLA-A2, ako je fúzovaná s c-fos doménou leucínového zipsu. Sekvencia spojovníka medzi TCR a c-fos sekvenciami je označená malými písmenami.
Obrázok 16 znázorňuje predpokladanú proteínovú sekvenciu (jednopísmenový kód hore) a DNA sekvenciu (spodná) rozpustného TCR a reťazca z klonu A6, ktorý je definovaný HTLV-1 Tax prezentovaným na HLA-A2 (Garboczi, Utz a ďalší, 1996; Garboczi, Ghosh a ďalší 1996), ako je fúzovaná s c-jun doménou leucínového zipsu. Mutácie zavedené na 5' koniec DNA sekvencie na zosilnenie expresie génu v E. coli sú označené malými písmenami, ako aj sekvencia spojovníka medzi TCR a c-jun sekvenciami.
Obrázok 17 znázorňuje predpokladanú proteínovú sekvenciu (jednopísmenový kód hore) a DNA sekvenciu (spodná) rozpustného TCR β reťazca z klonu A6, ktorý je definovaný HTLV-1 Tax na HLA-A2 (Garboczi, Utz a ďalší, 1996; Garboczi, ·· ·· ·· · ·· · · · · · ·· 9 · ·
-24·· ···· ·· 999 99 999
Ghosh a ďalší 1996), ako je fúzovaná s c-fos doménou leucínového zipsu a biotinylačným príveskom, ktorý slúži ako substrát pre BirA (Barker a Campbell, 1981; Barker a Campbell, 1981; Howard, Shaw a ďalší 1985; Schatz, 1993; O'Callaghan, Byford 1999). Sekvencia spojovníka medzi TCR a c-fos sekvenciami je označená malými písmenami. Mutácia DNA sekvencie, ktorou je substituovaný cysteínový zvyšok za alanínový zvyšok, je vytlačená hrubo a podčiarknutá.
Obrázok 18 znázorňuje predpokladanú proteínovú sekvenciu (jednopísmenový kód hore) a DNA sekvenciu (spodná) rozpustného TCR a reťazca z klonu M10B7/D3, ktorý je definovaný HTLV-1 Tax prezentovaným na HLA-A2 (Ding a ďalší 1998), ako je fúzovaná s c-jun doménou leucínového zipsu. Sekvencia spojovníka medzi TCR a c-jun sekvenciami je označená malými písmenami.
Obrázok 19 znázorňuje predpokladanú proteínovú sekvenciu Gednopísmenový kód hore) a DNA sekvenciu (spodná) rozpustného rozpustného TCR β reťazca z klonu M10B7/D3, ktorý je definovaný HTLV-1 Tax prezentovaným na HLA-A2 (Ding a ďalší 1998), ako je fúzovaná s c-fos doménou leucínového zipsu a biotinylačným príveskom, ktorý slúži ako substrát pre BirA. Sekvencia spojovníka medzi TCR a c-fos sekvenciami je označená malými písmenami. Mutácia DNA sekvencie, ktorou je substituovaný cysteínový zvyšok za alanínový zvyšok, je vytlačená hrubo a podčiarknutá. Malými písmenami sú označené aj dve tiché mutácie (P-G kodóny) zavedené za účelom klonovania a na odstránenie Xmal reštrikčného miesta.
Obrázok 20 znázorňuje predpokladanú proteínovú sekvenciu (jednopísmenový kód hore) a DNA sekvenciu (spodná) mutovaného rozpustného TCR β reťazca z klonu A6, ktorý je definovaný HTLV-1 Tax prezentovaným na HLA-A2 (Garboczi, Utz a ďalší, 1996; Garboczi, Ghosh a ďalší 1996), ako je fúzovaná s c-fos doménou leucínového zipsu a biotinylačným príveskom, ktorý slúži ako substrát pre BirA (Barker a Campbell, 1981; Barker a Campbell, 1981; Howard, Shaw a ďalší 1985; Schatz, 1993; O’Callaghan, Byford 1999). Sekvencia spojovníka medzi TCR a c-fos sekvenciami je označená malými písmenami. Mutácia DNA sekvencie, ktorou je substituovaný cysteínový zvyšok za alanínový zvyšok, je vytlačená hrubo a ·· ·« ·· · ·· ···· · · ·· ···
-25··· · · · · · · ·· ···· ·· ··· 99 999 podčiarknutá. Hrubo vytlačená a podčiarknutá je aj substitúcia asparag í nového zvyšku za kyselinu asparágovú, čo je mutácia v konštantnej oblasti, ktorá nemala žiadny funkčný účinok na rozpustný TCR.
Obrázok 21 znázorňuje predpokladanú proteínovú sekvenciu (jednopísmenový kód hore) a DNA sekvenciu (spodná) c-fos - biotinylačného fúzovacieho partnera použitého pre TCR β reťazce. Rozoznávacie miesta pre DNA reštrikčné enzýmy sú podčiarknuté a označené sú hranice dvoch fúzovacích domén. Spojovníkové sekvencie sú uvedené malými písmenami.
Obrázok 22 znázorňuje sekvenciu syntetického DNA primeru použitého na PCR amplifikáciu fragmentu Vfi-c-fos leucínového zipsu ľudského JM22 Influenza matricový peptid-HI_A-A0201 komplexu.
Obrázok 23 znázorňuje sadu fotografií gélov, a Prípravok denaturovaného proteínu TCR špecifického pre 003 HIV gag peptid-HLA-A2 komplex analyzovaný prostredníctvom SDS-PAGE. Dráha 1: markery molekulovej hmotnosti so širokým rozsahom (Bio-Rad), dráhy 2 a 3: baktérie po indukcii proteínovej expresie s 0,5 mM IPTG, dráhy 4 a 5: purifikované inklúzne telieska rozpustené v 6M guanidínovom tlmivom roztoku, b Prípravok denaturovaného TCR s biotínovým príveskom, ktorý je špecifický pre influenza matricový peptid-HI_A-A2 komplex analyzovaný prostredníctvom SDS-PAGE. Dráha 1: markery molekulovej hmotnosti so širokým rozsahom (Bio-Rad), dráhy 2 a 3: a- a β-reťazcové purifikované inklúzne telieska rozpustené v 6M guanidínovom tlmívom roztoku, c Dráha 1 a 5: markery molekulovej hmotnosti so širokým rozsahom (Bio-Rad), dráhy 2, 3 a 4: expresia α-, β- a mutantného β-reťazca v baktériách po indukcii proteínovej expresie s 0,5 mM IPTG, dráhy 6, 7 a 8: purifikované inklúzne telieska α-, β- a mutantného β-reťazca rozpustené v 6M guanidínovom tlmivom roztoku.
Obrázok 24 je chromatogram znázorňujúci elúciu JM22z heterodiméru z POROS 10HQ aniónovej výmennej kolóny. Prerušovaná čiara znázorňuje konduktivitu, z ktorej vyplýva koncentrácia chloridu sodného, neprerušovaná čiara znázorňuje optickú hustotu pri 280 nm, z ktorej vyplýva koncentrácia proteínu v eluáte. Vrcholové proteínové frakcie sa zhromaždili a ďalej analyzovali. Vložený ·· ·· ·· · ·· • · · · · · ·· · · ·· · · · · · · • · ···· · · · · ··· · · · ·· ·· ···· ·· ··· ··
-26obrázok znázorňuje chromatogram elúcie purifikovaného JM22z zo Superdex 200 HR kolóny. Šípky označujú kalibráciu kolóny proteínmi so známou molekulovou hmotnosťou. Z porovnania s týmito proteínmi vyplýva, že preskladaný JM22z proteín má molekulovú hmotnosť približne 74 kDA, čo zodpovedá heterodimérnemu proteínu.
Obrázok 25 je fotografia znázorňujúca SDS-polyakrylamidovú gélovú elektroforézu (Coomassie farbená) purifikovaného JM22z proteínu. Dráhy 1 a 3: štandardné proteíny so známou molekulovou hmotnosťou (ako je uvedená), dráha 2: JM22z proteín ošetrený pred nanesením s SDS-vzorkovým tlmivým roztokom obsahujúcim redukčné činidlo (DTT), dráha 4: JM22z proteín ošetrený s SDS vzorkovým tlmivým roztokom bez redukčných činidiel.
Obrázok 26 a Purifikácia preskladaného TCR s biotínovým príveskom, ktorý je špecifický pre influenza matricový peptid-HI_A-A2 komplex, i. Chromatogram elúcie proteínu z POROS 10HQ kolóny. Čiara x označuje absorbciu pri 280 nm a čiara y označuje konduktivitu (meranie gradientu chloridu sodného použitého na eluovanie proteínu). Čísla frakcií sú uvedené na vertikálnych čiarach, ii. SDS-PAGE frakcií eluovaných z kolóny ako bolo uvedené v bode i. Dráha 1 obsahuje markery molekulovej hmotnosti so širokým rozsahom (Bio-Rad) a dráhy 2 až 13 obsahujú 5 μΙ frakcií 6 až 15, postupne ako sú uvedené, iii. SDS-PAGE analýza spojených frakcií z bodu i., ktoré obsahujú flu-TCR s biotínovým príveskom. Dráha 1 obsahuje markery molekulovej hmotnosti so širokým rozsahom (Bio-Rad), dráha 2: flu-TCR proteín s biotínovým príveskom, b Purifikácia preskladaného TCR s biotínovým príveskom, ktorý je špecifický pre HTLV-tax peptid-HI_A-A2 komplex, i. Chromatogram elúcie proteínu z POROS 10HQ kolóny. Čiara x označuje absorbciu pri 280 nm a čiara y označuje konduktivitu (meranie gradientu chloridu sodného použitého na eluovanie proteínu). Čísla frakcií sú uvedené na vertikálnych čiarach, ii. SDS-PAGE frakcií eluovaných z kolóny ako bolo uvedené v bode i. Dráha 1 obsahuje markery molekulovej hmotnosti so širokým rozsahom (Bio-Rad) a dráhy 2 až 10 obsahujú 5 μΙ frakcií 2 až 11, postupne ako sú uvedené, iii. SDS-PAGE analýza spojených frakcií z bodu i., ktoré obsahujú tax-TCR s biotínovým ·· ·· ·· · ·· ···· · · ·· ···
-27«» ···· ·· ··· ·· ··· príveskom. Dráha 1 obsahuje markery molekulovej hmotnosti so širokým rozsahom (Bio-Rad), dráha 2: tax-TCR proteín s biotínovým príveskom, dráha 3: mutantný tax-TCR proteín s biotínovým príveskom.
Obrázok 27 je chromatogram znázorňujúci elúciu rozpustného TCR s biotínovým príveskom po biotinylácii s BirA enzýmom z Superdex 200 HR kolóny ekvilibrovanej v PBS. Biotinylovaný TCR sa eluuje v približne 15 až 16 minúte a nenaviazaný biotín sa eluuje približne v 21 minúte. Frakcie obsahujúce biotinylovaný rozpustný TCR sa spoja na ďalšie použitie.
Obrázok 28 je sada fotografií gélov. Stanovenie biotinylácie biotinylovaných TCRs. a. SDS-PAGE prípravkov preskladaných TCRs a inklúznych teliesok. Dráha 1: markery molekulových hmotností so širokým rozsahom (Bio-Rad), dráha 2: biotinylovaný flu-TCR, dráha 3: biotinylovaný tax-TCR, dráha 4: biotinylovaný mutantný tax-TCR, dráha 5: HIV gag-TCR (bez biotínového prívesku); b. Western blot rovnakého gélu ako v bode a., s tým rozdielom, že markery so širokým rozsahom boli biotinilované (Bio-Rad). Na znázornenie biotinylovaných proteínov bol použitý avidín-HRP konjugát a vizualizácia sa uskutočnila s Opti-4CN (Bio-Rad).
Obrázok 29 ilustruje viazanie sa JM22z na rôzne HLA-A2-peptidové komplexy, (a vložený obrázok) Špecificita interakcie medzi JM22z a HLA-A2-flu je demonštrovaná porovnaním SPR odpovede TCR na tečúcich bunkách pokrytých s 1900 RU HLA-A2-flu s odpoveďami TCR na tečúcich bunkách, z ktorých jedny sú pokryté so 4200 RU HI_A-A2-pol, a druhé so 4300 RU CD5. Odpovede pozadia pri rôznych koncentráciách JM22z sa merali na 1700 RU HLA-A2-pol (a). Hodnota pozadia bola subtraktovaná zo špecifickej odpovede meranej na 1900 RU HLA-A2flu (b) a bola vynesená do grafu oproti koncentrácii (c). Kd s hodnotou 13 μΜ, odhadnutá z nelineárnej krivky, bola v súlade s Kd s hodnotou 12 μΜ, ktorá bola vypočítaná na základe Scatchard grafu z rovnakých údajov.
Obrázok 30 je graf znázorňujúci výsledok Biacore 2000™ analýzy prirodzeného a mutantného rozpustného TCR s biotinylovaným príveskom. 5 μΙ prirodzeného tax TCR s koncentráciou 2,2 mg/ml a potom mutantného tax TCR s koncentráciou 2,4 mg/ml sa spustilo na štyri druhy tečúcich buniek, ktoré mali na
BB BB <· • · · B BBB
B B BBB
-28BBB BBB
BB BBBB BB BBB povrchu pripojené nasledujúce proteíny: A: tax-pMHC komplex, B/C: flu-pMHC komplex, D: 0X68 kontrolný proteín. Tak prirodzený, ako aj mutatný proteín sa podobne viazali na špecifický pMHC komplex.
Obrázok 31 znázorňuje účinok väzby rozpustného CD8aa na viazanie sa rozpustného TCR na rovnaký HLA-A2-flu komplex. (A) TCR alebo TCR so 120 μΜ rozpustného CD8 sa injekčné nanieslo na kontrolné tečúce bunky pokryté so 4100 RU irelevantného proteínu (CD5) a sondové tečúce bunky pokryté so 4700 RU HLA-A2-flu. Po subtraktovaní pozadia sú znázornené vypočítané hodnoty rovnovážnej odpovede pri rôznych koncentráciách samotného TCR (prázdne krúžky) alebo v kombinácii so 120 μΜ rozpustného CD8 (čierne krúžky). Znázornená je aj hodnota samotného CD8 (prázdne trojuholníky) a vypočítaný rozdiel medzi TCR + CD8 a samotným TCR (prázdne štvorce). (B) Znázornená je časová závislosť odpovedí 49 μΜ samotného TCR (prázdne krúžky) alebo v kombinácii so 120 μΜ CD8 (čierne krúžky) na 4700 RU imobilizovaného HLA-A2-flu pri 25 °C a rýchlosti prietoku 5 μΙ/min (Hodnoty sú upravené vzhľadom na podiel pozadia, ktorý bol meraný na 4100 RU imobilizovaného CD5); rýchlosť TCR nie je ovplyvnená simultánnym viazaním sa CD8.
Obrázok 32 znázorňuje proteínovú sekvenciu (jednopísmenový kód hore) a DNA sekvenciu (spodná) rozpustného TCR a reťazca z JM22, ktorý je definovaný flu matricovým proteínom prezentovaným na HLA-A2, ako je fúzovaná s c-jun doménou leucínového zipsu. Mutácie zavedené na 5' koniec DNA sekvencie na zosilnenie expresie génu v E. coli sú označené malými písmenami, ako aj sekvencia spojovníka medzi TCR a c-jun sekvenciami.
Obrázok 33 znázorňuje proteínovú sekvenciu (jednopísmenový kód hore) a DNA sekvenciu (spodná) rozpustného TCR β reťazca z JM22, ktorý je definovaný flu matricovým proteínom prezentovaným na HLA-A2, ako je fúzovaná s c-fos doménou leucínového zipsu. Sekvencia spojovníka medzi TCR a c-fos sekvenciami je označená malými písmenami. Mutácia DNA sekvencie, ktorou je substituovaný cysteínový zvyšok za šerí nový zvyšok, je vytlačená hrubo a podčiarknutá. Táto mutácia zvyšuje účinok skladania TCR.
·· ·· ·· · ·· ···· · · ·· ··· ·· · · · · · ·
-29·· ···· ·· ··· ·· ···
Obrázok 34 znázorňuje proteínovú sekvenciu (jednopísmenový kód hore) a DNA sekvenciu (spodná) rozpustného TCR β reťazca z JM22, ktorý je definovaný flu matricovým proteínom prezentovaným na HLA-A2, ako je fúzovaná s c-fos doménou leucínového zipsu a biotinylačným príveskom, ktorý slúži ako substrát pre BirA. Sekvencia spojovníka medzi TCR a c-fos sekvenciami je označená malými písmenami. Mutácia DNA sekvencie, ktorou je substituovaný cysteínový zvyšok za serínový zvyšok, je vytlačená hrubo a podčiarknutá. Táto mutácia zvyšuje účinok skladania TCR.
Obrázok 35 je schematickým znázornením fúzovaného proteínu obsahujúceho TCR, zips a biotinylačný prívesok.
Obrázok 36. Eluovanie preskladaného TCR z POROS 10HQ kolóny s gradientom chloridu sodného. TCR sa eluuje ako jeden vrchol pri koncentrácii približne 100 mM NaCI. Frakcie obsahujúce protein s hodnotou pri OD(280 nm) vyššou ako 0,1 sa spojili a zakoncentrovali na biotinyláciu.
Obrázok 37. Separácia biotinylovaného TCR od voľného biotínu prostredníctvom gólovej filtrácie na Superdex 200HR 10/30 kolóne (Pharmacia). TCR-biotín sa eluuje približne pri 15 ml a zodpovedá molekulovej hmotnosti 69 kDa. (Štandardné proteíny a ich elučné objemy: tyroglobulín (669 kDa) 10,14 ml, apoferitín (443 kDa) 11,36 ml, β-amyláza (200 kDa) 12,72 ml, BSA dimér (134 kDa) 13,12 ml, BSA monomér (67 kDa) 14,93 ml, ovoalbumín (43 kDa) 15,00 ml, chymotrypsinogén A (25 kDa) 18,09 ml, Rnáza A (13,7 kDa) 18,91 ml).
Obrázok 38 znázorňuje proteínovú sekvenciu (jednopísmenový kód hore) a DNA sekvenciu (spodná) rozpustného TCR a reťazca z klonu A6, ktorý je definovaný HTLV-1 Tax prezentovaným na HLA-A2 (Garboczi a ďalší, 1996; Garboczi a ďalší 1996), ako je fúzovaná s c-jun doménou leucínového zipsu. Mutácie zavedené na 5' koniec DNA sekvencie na zosilnenie expresie génu v E. coli sú označené malými písmenami, ako aj sekvencia spojovníka medzi TCR a cjun sekvenciami.
Obrázok 39 znázorňuje proteínovú sekvenciu (jednopísmenový kód hore) a DNA sekvenciu (spodná) rozpustného TCR β reťazca z klonu A6, ktorý je ·· ·· ·· · ·· ···· ···· ··· • · ···· ··
-30··· · · · 9 · · ·· ···· ·· ··· ·· ··· definovaný HTLV-1 Tax prezentovaným na HLA-A2 (Garboczi a ďalší, 1996; Garboczi a ďalší 1996), ako je fúzovaná s c-fos doménou leucínového zipsu a biotinylačným príveskom, ktorý slúži ako substrát pre BirA. Sekvencia spojovníka medzi TCR a c-fos sekvenciami je označená malými písmenami. Mutácia DNA sekvencie, ktorou je substituovaný cysteínový zvyšok za alanínový zvyšok, je vytlačená hrubo a podčiarknutá.
Obrázok 39 znázorňuje proteínovú sekvenciu (jednopísmenový kód hore) a DNA sekvenciu (spodná) rozpustného TCR a reťazca z klonu M10B7/D3, ktorý je definovaný HTLV-1 Tax prezentovaným na HLA-A2 (Ding a ďalší 1998), ako je fúzovaná s c-jun doménou leucínového zipsu. Sekvencia spojovníka medzi TCR a c-jun sekvenciami je označená malými písmenami.
Obrázok 41 znázorňuje proteínovú sekvenciu (jednopísmenový kód hore) a DNA sekvenciu (spodná) rozpustného TCR β reťazca z klonu M10B7/D3, ktorý je definovaný HTLV-1 Tax prezentovaným na HLA-A2 (Ding a ďalší 1998), ako je fúzovaná s c-fos doménou leucínového zipsu a biotinylačným príveskom, ktorý slúži ako substrát pre BirA. Sekvencia spojovníka medzi TCR a c-fos sekvenciami je označená malými písmenami. Mutácia DNA sekvencie, ktorou je substituovaný cysteínový zvyšok za alanínový zvyšok, je vytlačená hrubo a podčiarknutá. Malými písmenami sú označené aj dve tiché mutácie (P-G kodóny) zavedené za účelom klonovania a na odstránenie Xmal reštrikčného miesta.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Nižšie uvedené všeobecné metódy a materiály boli použité v nasledujúcich príkladoch.
Materiály
Reštrikčné enzýmy (Ndel, BamHI, HindlII, Bsu36l, Xmal) boli od New England Biolabs.
·· ·· ·· · ·· ···· · · ·· ···
-31 ··· ··· ··· ·· ···· ·· ··· ·· ···
Tris pH 8,1 bol pripravený ako 2M zásobný roztok z rovnakých podielov Tris-bázy a Tris-HCI, pričom oba boli od firmy USB.
EDTA (Sigma) sa pripravil ako 0,5M zásobný roztok a pH sa nastavilo na 8,0 použitím 5M NaOH (Sigma).
Glutatión v oxidovanej a redukovanej forme bol od firmy Sigma.
Cystamín a cysteamín bol od firmy Sigma.
Chlorid sodný bol od firmy USB a bol pripravený ako 4M zásobný roztok.
Miniprep kity na purifikáciu plazmidov boli od firmy Quiagen.
PCR purifikačné kity boli od firmy Quiagen.
DTT bol od firmy Sigma.
Guanidín bol od firmy Fluka.
Močovina bola od firmy Sigma.
RPMI médium bolo od firmy Sigma.
PBS bol pripravený z tabliet od firmy Oxoid.
Glycerol bol od firmy BDH.
Všeobecné metódy
Bakteriálne médiá (TYP médiá) sa pripravili nasledovne:
160 g kvasinkového extraktu (Difco), 160 g tryptónu (Difco), 50 g NaCl (USB) a 25 g K2HPO4 (BDH) sa rozpustilo v 2 I demineralizovanej vody. 200ml alikvoty tohto roztoku sa rozliali do desiatich 2I kužeľovitých fliaš a doplnili sa do 1 I pridaním 800 ml demineralizovanej vody. Fľaše sa zakryli štyrmi vrstvami hliníkovej fólie, označili sa a autoklávovali sa. Po ochladení a pred použitím sa fľaše uskladnili pri laboratórnej teplote mimo dosahu priameho slnka.
Koncentrácie proteínov sa merali použitím Pierce Coomassie-väzobného testu a použitím BSA ako štandardného proteinu. V stručnosti, 0 až 25 μg BSA štandardov v 1 ml vody sa pripravilo zo zásobného BSA (Pierce) s koncentráciou 2 mg/ml v 4ml plastických kyvetách. Rovnakým spôsobom sa pripravilo približne 10 μg neznámeho proteinu v 1ml s vodou. Do každej kyvety sa pridal 1 ml Pierce Coomassie reakčného činidla a obsahy sa dôkladne premiešali. Optická hustota sa ·· ·· ·· · ·· ···· ···· ···
-32·· ···· ·· ··· ·· ··· merala do 15 minút pri 595 nm použitím Beckman DU-530 UV spektrofotometra. Na základe výsledkov z BSA štandardov sa uskutočnila lineárna regresia (linearita bola dobrá až do 25 pg BSA) a koncentrácia neznámeho proteínu sa odhadla interpoláciou z týchto výsledkov.
Gélová filtračná chromatografia sa uskutočňovala na vybavení Pharmacia FPLC systémom s počítačovým riadením. Eluovanie proteínu sa monitorovalo použitím UV-M II systému merania absorbcie pri vlnovej dĺžke 280 nm. Na separácie v malom merítku sa využila Superdex 200 HR 10/30 kolóna a vzorka sa nanášala v objeme 1 ml. Pred spustením sa kolóna ekvilibrovala s 30 ml PBS a vzorka bežala rýchlosťou 0,5 ml/min, pričom sa odoberali 1ml frakcie. Na separácie vo veľkom merítku sa použila Superdex 75 alebo 200 PG 26/60 kolóna s 10ml nanášaním. V tomto prípade sa odoberali 5 alebo 10ml vzorky a kolóna bežala s prietokom 4 ml/min. Všetky separácie sa uskutočňovali pri laboratórnej teplote.
Iónová výmenná chromatografia sa uskutočňovala na Biocad Sprint systéme (Perkin-Elmer). Na katiónovú výmenu sa použila 20 HS alebo 50 HS kolóna. Na aniónovú výmenu sa použila 10 HQ, 20 HQ alebo 50 HQ kolóna. Kolóny bežali s použitím odporúčaných tlmivých roztokov, pričom boli pripojené na 6-smerný mixér. Malé vzorky (5 až 25 ml) sa injektovali použitím 5ml injekčného dávkovača. Väčšie vzorky (viac ako 100 ml) sa injektovali použitým jednej z tlmivých línií. Počas elučnej fázy priebehu kolóny sa odoberali 1ml frakcie. Eluovanie proteínu sa meralo prostredníctvom in-line absorbcie pri 280 nm.
SDS polyakrylamidová gélová elektroforéza (SDS-PAGE) sa uskutočňovala použitím Bio-Rad Mini-Protean II gélovej sady. Gély sa nalievali pred použitím nasledujúcim postupom. Pripravila sa zostava gélových platní a skontrolovala sa, aby bola zaistená proti presakovaniu. Potom sa pripravila nasledujúca zmes: 12% akrylamid/bisakrylamid (z 30% akrylamid/0,8% bisakrylamidového zásobného roztoku (National Diagnostics)), 0.375M Tris pH 8,8 (z 1,5M zásobného roztoku s rovnakým pH), 0,1% SDS (z 10% SDS zásobného roztoku), 0,05% persulfát amónny (z 10% zásobného roztoku uskladneného pri 4 °C) a 0,1% TEMED (Sigma). Zmes sa okamžite naliala do gélovej platňovej zostavy a na vrch sa nalial ·· ·· ·· · ·· ···· ···· ··· • · · · · · ··
-33vodou nasýtený butanol, aby sa zaistilo, že povrch bude rovný. Potom ako sa gél usadil (minimálne 10 až 15 minút) sa nasledovne namiešal hraničný gél. 4% akrylamid (z vyššie uvedeného zásobného roztoku), 0.125M Tris pH 6,8 (z 0,5M zásobného roztoku s rovnakým pH), 0,1% SDS, 0,05% persíran amónny a 0,2% TEMED. Z povrchu rozlišovacieho gélu sa odstránil butanol absorbciou na tkaninu a na vrch rozlišovacieho gélu sa naliala zmes hraničného gélu. Okamžite sa vsunul hrebeň, pričom sa dbalo na to, aby nevnikli vzduchové bubliny do gélu a hraničný gél sa nechal usadiť minimálne 5 minút.
Gél sa potom vložil do gélovej aparatúry a v mieste anódy a katódy sa do aparatúry vlial priebehový tlmivý roztok (3 g/l Tris-bázy, 14,4 g/l glycínu, 1 g/l SDS (naridený z 10x koncentrovaného zásobného roztoku). Po odstránení gólového hrebeňa sa jamky vymyli priebehovým tlmivým roztokom, aby sa z dna jamiek odstránili zvyšky akrylamidovej zmesi. Vzorky sa pripravili zmiešaním proteínu v pomere 1:1 s nasledujúcou zmesou: 4% SDS, 0.125M Tris pH 6,8, 20% glycerol, 10% β-merkaptoetanol, 1% brómfenolová modrá (Sigma). Vzorky sa potom zahriali na 95 °C 2 minúty a ochladili sa pred nanesením, pričom sa nanášalo do 25 μΙ na jamku v hraničnom géli. Zvyčajne sa nanášalo približne 1 až 10 μg proteínu, aby sa zaistilo dobré farbenie a priebeh gélu. Po nanesení sa vzorky nechali v géloch bežať pri konštantnom napätí 200 V približne 40 minút alebo pokiaľ nebola brómfenolová modrá farbička približne 5 mm od konca gélu.
Po ukončení elektroforézy sa gély vybrali z aparatúry a opatrne sa ponorili do 0,1% roztoku Coomasie R-250 (Sigma) v 10 % kyseliny octovej, 40 % metanolu, 50 % vody. Gély sa potom jemne miešali najmenej 30 minút na odfarbenie v niekoľkých dávkach 10 % kyseliny octovej, 40 % metanolu, 50 % vody, pokiaľ nebolo gélové pozadie čisté. Gély sa potom uskladnili vo vode a zosnímali sa použitím UVP gólového dokumentačného systému pozostávajúceho zo svetelného boxu, digitálneho fotoaparátu a termálnej tlačiarne.
Príklad 1
Rekombinantný rozpustný TCR ·· ·· ·· · ·· ···· ···· · · · ·· ···· ··
-34·· ···· ·· ··· ·· ···
Rekombinantné rozpustná forma heterodimérnej TCR molekuly sa skonštruovala ako je znázornené na obrázku 1. Každý reťazec pozostáva z imunoglobulínovej domény bližšej a imunoglobulínovej doméry vzdialenejšej od membrány, ktoré sú fúzované prostredníctvom krátkeho flexibilného spojovníka s motívom stočeného závitu, ktorý pomáha stabilizovať heterodimér.
TCR konštantné domény sa skrátili tesne pred cysteínovými zvyškami, ktoré in vivo tvoria medzireťazcovú disulfidovú väzbu. Z toho vyplýva, že dva reťazce sa párujú prostredníctvom nekovalentných kvartérnych kontaktov, čo je potvrdené na obrázku 2b. Keďže Fos-Jun zipsové peptidové heterodiméry sú schopné vytvárať aj medzireťazcový disulfid hneď na N-konci vzhľadom k použitému spojovníku (O'Shea a ďalší 1989), predpokladalo sa, že vzájomné zoradenie dvoch reťazcov je optimálne. Fúzované proteíny musia byť spojené spôsobom, ktorý je kompatibilný s každou z oddelených zložiek, aby sa zabránilo porušeniu hociktorej štruktúry.
cDNA kódujúca a a β reťazec TCR špecifického pre influenza-matricový proteínový 59-66 epitop v HLA-A2 sa získala z νβ17 + ľudský CTL klonu (JM22) ukotvenou PCR, ako bolo predtým opísané (Moss a ďalší 1991).
Alfa a beta TCR-zipsové konštrukty, pJM22a-Jun a pJM22p-Fos, sa oddelene skonštruovali amplifikácou variabilnej a konštantnej domény každého reťazca použitím štandardnej PCR technológie a priradením produktov na leucínové zipsové domény z eukaryotických transkripčných faktorov Jun a Fos (pozri obrázok 1). Ukázalo sa, že tieto sekvencie dlhé 40 aminokyselín špecificky vytvárajú heterodimér, keď sa preskladajú zo syntetických peptidov, bez toho, aby bola potrebná kovalentná medzireťazcová väzba (O’Shea a ďalší 1989).
Primery boli navrhnuté tak, aby obsahovali vysoký obsah AT hneď na 3’ konci za iniciačným kodónom (aby bola destabilizovaná sekundárna štruktúra mRNA), a s využitím E. coli kodónovej preferencie, aby sa maximalizovala expresia (Gao a ďalší). Prebytočný cysteín v TCR beta konštantnej doméne sa mutoval na serín, aby sa zaistila prevencia nesprávneho disulfidového viazania počas preskladávania.
-35• · · ·· ···· ·· • · · • ·
··
DNA konštrukty sa ligovali oddelene do E. coli expresného vektora pGMT7. Fragmenty plazmidov vzniknuté štiepením a DNA sekvenovanie potvrdili, že konštrukty sú správne.
Podrobný opis použitých postupov
Expresia TCR zipsových reťazcov a purifikácia denaturovaných inklúznych teliesok: GFG020 a GFG021, pGMT7 expresné plazmidy obsahujúce JM22a-Jun a JM22p-Fos sa transformovali oddelene do E. coli kmeňa BL21pLysS a jednotlivé ampicilín rezistentné kolónie sa pestovali pri 37 °C v TYP (ampicilín 100 pg/ml) médiu do OD600 hodnoty 0,4 pred tým, ako sa indukovala expresia proteínu s 0,5mM IPTG. Bunky sa zozbierali tri hodiny po indukcii centrifugáciou 30 minút pri 4000 otáčkach/min v Beckman J-6B. Bunkové pelety sa resuspendovali v tlmivom roztoku obsahujúcom 50mM Tris-HCI, 25% (w/v) sacharózu, 1mM NaEDTA, 0,1% (w/v)NaAzid, 10mM DTT, pH 8,0. Potom, ako sa resuspendované bunky cez noc zmrazili a rozmrazili, sonifikovali sa v minútových intervaloch celkovo približne 10 minút v Milsonix XL2020 sonifikátore použitím štandardnej sondy s priemerom 12 mm. Pelety z inklúznych teliesok sa znova izolovali centrifigáciou 30 minút pri 13000 ot./min v Beckman J2-21 centrifúge. Potom sa uskutočnilo trikrát premývanie s detergentom, aby sa odstránili zvyšky buniek a membránové komponenty. Zakaždým sa pelet inklúznych teliesok homogenizoval v Triton tlmivom roztoku (50mM Tris-HCI, 0,5% Triton-X100, 200mM NaCl, 10mM NaEDTA, 0,1% (w/v) NaAzid, 2mM DTT, pH 8,0) pred tým ako sa peletoval centrifugáciou 15 minút pri 13000 otáčkach/min v Beckman J2-21. Detergent a soľ sa potom odstránili podobným premývaním v nasledujúcom tlmivom roztoku: 50mM Tris-HCI, 1mM NaEDTA, 0,1% (w/v) NaAzid, 2mM DTT, pH 8,0. Nakoniec sa pelety JM22a-Jun a JM22p-Fos inklúznych teliesok rozpúšťali oddelene v močovinovom roztoku (50mM MES, 8M močovina, 10mM NaEDTA, 2mM DTT, pH 6,5) 3 až 4 hodiny pri 4 °C. Nerozpustný materiál sa peletizoval centrifugáciou 30 minút pri 13000 otáčkach/min v Beckman J2-21 a supernatant sa rozdelil na 1ml alikvoty a zmrazil sa pri -70 °C. Inklúzne teliska solubilizované v močovine sa kvantifikovali Bradfordovým testom • ·· ·· · · · • · · ·· ·· • · · · • · · • · · • · « ·· ····
-36·· • · • · viazania farbičky (Biorad). Z jedného litra kultúry sa získal výťažok približne 100 mg purifikovaných inklúznych teliesok pre každý reťazec. Každé inklúzne teliesko (JM22a-Jun, JM22p-Fos) sa solubilizovalo v močovinovom roztoku v koncentrácii približne 20 mg/ml a gélovou analýzou sa odhadlo, že v tejto forme majú približne 90% čistotu (údaje nie sú znázornené).
Spoločné preskladávanie TCR-zipsových fúzovaných proteínov
Výsledkom počiatočných preskladávacích experimentov s použitím štandardného preskladávacieho tlmivého roztoku (100mM Tris pH 8,5, 1M Larginín, 2mM EDTA, 5mM redukovaný glutatión, 0,5mM oxidovaný glutatión, 0,2mM PMSF) bola ťažká proteínová precipitácia, ktorá bola závislá na prítomnosti zipsových domén. Z faktu, že tento fenomén sa vyskytoval pri koncentráciách, ktoré boli nižšie ako disociačná konštanta zipsovej dimerizácie (tzn. hodnota, pre ktorú sa očakáva, že väčšina zipsových závitníc je monomérna), vyplýva, že nesprávne poskladané druhy stabilizovali ďalšie sily. Najpravdepodobnejším vysvetlením je, že najprv sa poskladajú celé alfa-závitnicové zipsové domény a ich prechodná heterodimerizácia indukuje medzireťazcovú agregáciu čiastočne poskladaných medziproduktov komplexnejších imunoglobulínových domén. Preto sa preskladávací tlmivý roztok zmenil tak, že obsahoval 5M močovinu, aby sa zabránilo hydrofóbnym interakciám medzi čiastočne poskladanými imunoglobulínovými doménami, aby sa jednotlivé reťazce mohli úplne poskladať pred heterodimerizáciou. Tento krok je dostatočný na to, aby sa zabránilo precipitácii, a aby sa mohli správne poskladané TCR-zipsové heterodiméry zostaviť s prijateľným výťažkom použitím nasledujúceho protokolu.
Zásobné roztoky TCR-zipsových reťazcov JM22a-Jun a JM22p-Fos solubilizované v močovine sa renaturovali riediacim spoločným preskladaním. Zo zmrazených zásobných roztokov sa roztopilo približne 30 mg (tzn. 1 μΜ) každého reťazca solubilizovaného inklúzneho telieska a pridal sa ďalší pulz DTT (4 μΜ/ml), aby sa zabezpečila úplná redukcia cysteínových zvyškov. Vzorky sa potom zmiešali a zmes sa nariedila v 15 ml guanidínového roztoku (6M guanidín-hydrochlorid, ·· ·· ·· · · ···· · · ·· ··· • · ···· · ·
-37··· · · ·· ·· ···· ·· ··· ·· ·
10mM octan sodný, 10mM EDTA), aby sa zaistila úplná denaturácia reťazca. Guanidínový roztok obsahujúci úplne redukované a denaturované TCR-zipsové reťazce sa potom injektoval do 1 litra nasledujúceho preskladávacieho tlmivého roztoku: 100mM Tris pH 8,5, 400mM L-arginín, 2mM EDTA, 5mM redukovaný glutatión, 0,5mM oxidovaný glutatión, 5M močovina, 0,2mM PMSF. Roztok sa nechal stáť 24 hodín. Preskladaný produkt sa potom dva krát dialyzoval, najprv oproti 10 litrom 100mM močoviny, a druhý krát oproti 10 litrom 10mM močoviny, 10mM Tris pH 8,0. Tak preskladávací, ako aj dialyzačný krok sa uskutočňovali pri 6 až 8 °C.
Purifikácia preskladaného TCR-zipsu
TCR-zipsový JM22zip sa oddelil od degradačných produktov a nečistôt nanesením dialyzovaného preskladaného produktu na POROS 10HQ analytickú aniónovú výmennú kolónu v siedmych 200ml alikvotách a eluovaním naviazaného proteínu s gradientom 0 až 400mM NaCI na 50 objemov kolóny použitím BioCad pracovnej stanice (Perseptive Biosystems). Nekovalentne spojený heterodimér eluoval v jednom vrchole pri približne 100mM NaCI. Vrcholové frakcie (typicky obsahujúce heterodimér v koncentrácii 100 až 300 μg/ml) sa uskladňovali pred tým ako sa spojili a zakoncentrovali pri 4 °C. Výťažok heterodiméru je približne 15 %.
Charakterizácia preskladaného TCR-zipsovéhoJM22zip
JM22zip heterodimér purifikovaný aniónovou výmenou sa eluoval ako približne 70kDa proteín zo Superdex 200 gélovej filtračnej veľkostnej kolóny (Pharmacia). Je veľmi dôležité zahrnúť gélové filtračné kroky pred povrchovou plazmónovou rezonančnou väzobnou analýzou, pretože presné merania afinity a kinetiky sú závislé na prítomných monomérnych interakciách. Týmto spôsobom je možné z frakcie rozpustného proteínu použitej na analýzu vylúčiť agregáty vyššieho rádu. Najmä je možné detegovať agregáty zapríčiňujúce pomalé asociačné a disociačné rýchlostné konštanty.
-38·· ·· ·· · • · · · · · ·· • · · · · · • · · · · · · • · · · · · ·· ···· ·· ···
9 9
9
9
9
Oxidačný stav každého reťazca bol skúmaný redukčnou/neredukčnou gélovou analýzou znázornenou na obrázku 2. V prítomnosti SDS sa nekovalentne asociovaný heterodimér disociuje na a a β reťazce. Ak sa v nanášacom tlmivom roztoku použije DTT, oba reťazce idú po oboch stranách 31kDa markera. Ak takéto denaturanty chýbajú, oba reťazce sa správajú ako oddelené druhy, ale mobilita každého sa zvyšuje, z čoho vyplýva, že každý reťazec tvorí jeden, disulfidovou väzbou viazaný, druh (Garboczi a ďalší 1996).
Protilátková reaktivita preskladaného receptora sa testovala použitím povrchovej plazmónovej rezonancie na Biacore 2000 prístroji (Biacore). TCRzipsový JM22z sa imobilizoval na dextránovom matricovom (CM čip) väzobnom povrchu pri pH 5,5 použitím štandardných amínových párovacích metód. Variabilná oblasť protilátky špecifickej pre beta reťazec (νβ17) sa špecificky viazala na imobilizovaný receptor, z čoho vyplývala správna konformácia.
Stabilita
Rozpustné TCRs exprimované ako alfa-jun a beta-fos leucinové zipsové fúzie sú stabilné mesiace, a sú preto vhodné na detekciu špecifických antigénov prezentovaných MHC triedy I.
Príklad 2
Kinetiky a afinitná štúdia ľudského TCR-vírusový peptid-MHC
Špecifické viazanie sa preskladaného TCR-zipsu na peptid-MHC komplexy
Povrchový plazmónový rezonančný biosenzor (Biacore) sa použil na analýzu viazania sa TCR-zipsu (JM22zip, špecifický pre HLA-A2 influenza matricový proteínový M58-66 komplex) na jeho peptid-MHC ligand (pozri obrázok 3). Uľahčili sme to vyprodukovaním jednotlivých pMHC komplexov (opísané nižšie), ktoré môžu byť imobilizované na streptavidín pokrytom väzobnom povrchu semi-orientovaným spôsobom, čo umožňuje účinné testovanie viazania sa rozpustného T-bunkového receptora až na štyri odlišné pMHC (imobilizované na oddelených tečúcich
-39·· ·· * • · · · · · ·· II · · · · • · · · · · · • II · · · • I ···· ·· ··· ·· • · · • I • · I ·· ··· bunkách) simultánne. Manuálne injektovanie HLA komplexu umožňuje jednoduchú manipuláciu s presnou hladinou imobilizovaných molekúl triedy I.
Takto imobilizované komplexy sú schopné viazať tak T-bunkové receptory (pozri obrázok 3), ako aj koreceptor CD8aa, ktoré oba môžu byť injektované v rozpustnej fáze. Špecifické viazanie sa TCR-zipsu sa získa aj pri nízkych koncentráciách (najmenej 40 pg/ml), z čoho vyplýva, že TCR zips je relatívne stabilný. Pozorovalo sa, že pMHC väzobné vlastnosti JM22z sú kvalitatívne a kvantitatívne podobné, keď sa použije TCR tak v rozpustnej forme, ako aj v imobilizovanej fáze. To je dôležitá kontrola čiastočnej aktivity rozpustných druhov, a tiež z toho vyplýva, že biotinylované pMHC komplexy sú rovnako biologicky aktívne ako nebiotinylované komplexy.
Príprava chemicky biotinylovaných HLA komplexov
Spôsoby produkcie rozpustných, rekombinantných komplexov tvorených HLA triedy I a jedným peptidom už boli opísané (Garboczi a ďalší 1992). Tieto spôsoby boli modifikované tak, aby produkovali HLA komplexy, ktoré majú β-2mikroglobulínové domény chemicky biotinylované, a tak môžu byť imobilizované na streptavidínom pokrytom čipe a použité na povrchové plazmónové väzobné štúdie.
Exprimoval sa β-2-mikroblobulín a 40 mg sa preskladalo v štandardnom preskladávacom tlmivom roztoku (100mM Tris pH 8,5, 400mM L-arginín, 2mM EDTA, 5mM redukovaný glutatión, 0,5mM oxidovaný glutatión, 0,1 mM PMSF) v podstate ako bolo opísané (Garboczi a ďalší 1992). Po voliteľnom gélovom filtračnom kroku sa proteín vymenil s 0,1 M borátom sodným pH 8,8 a nakoniec sa zakoncentroval na 5 až 10 mg/ml. β-2-mikroglobulín sa kvantifikoval aj použitím Bradfordovho testu (Biorad). 5 molárny nadbytok biotín hydroxysukcínimidu (Sigma) sa pridal zo zásobného roztoku pripraveného v koncentrácii 10 mg/ml v DMSO. Reakčná zmes sa nechala 1 hodinu pri laboratórne teplote a zastavila sa použitím zmesi 20 μΙ 1M chloridu amónneho a 250 μg biotínového esteru. Preskladaný HLA komplex sa oddelil od voľného biotínu a voľného biotinylovaného β-2-mikro·· ·· ·· ·· • · · · · · ·· ··· • · · · · · · · • · · · · · · · ·· ···· ·· ··· ·· ·
-40globulínu použitím Superdex 200 gélovej filtračnej veľkostnej kolóny (Pharmacia). Streptavidín sa imobilizoval štandardnými amínovými párovacími metódami.
Závery
Takže spôsoby preskiadávania proteínu opísané v príklade 1 produkujú stabilný, správne poskladaný, funkčný, rekombinantný receptorový fúzovaný protein, ktorý je schopný byť biofyzikálne analyzovaný použitím optického biosenzora. Tak sa poskytlo reakčné činidlo používané na uskutočňovanie detailných afinitných a kinetických analýz interakcie ľudského TCR a pMHC. Boli študované vzájomné účinky interakcií T-bunkového koreceptora a MHC a interakcií TCR a pMHC. Použité rekombinantné techniky sú v princípe aplikovateľné tak na hlodavčie, ako aj ľudské TCRs, definované tak triedou I, ako aj triedou II, a budú umožňovať podobné analýzy určitého rozsahu TCRs. To by umožnilo pokladanie rôznych otázok, akými sú napríklad rozsah TCR afinít v rámci protiví rusovej odpovede, vlastnosti dominantne selektovaných receptorov a kinetické požiadavky na spúšťanie dejov prostredníctvom receptora. Metódy poskytujú aj spôsob overovania ligandovej špecifity TCR pred kryštalizačnými testami, a môžu mať aj vplyv na rekombinantnú produkciu iných bunkových povrchových receptorov.
Príklad 3
Biotinylácia a tetramerizácia rozpustných T-bunkových receptorov
2,5 ml purifikovaného rozpustného TCR pripraveného ako bolo opísané v príklade 1 (približne 0,2 mg/ml) sa v tlmivom roztoku vymenilo do biotinylačného reakčného tlmivého roztoku (10mM Tris pH 8,0, 5mM NaCl, 7,5 mM MgCI2) použitím PD-10 kolóny (Pharmacia). Eluát (3,5 ml) sa zakoncentroval na 1 ml použitím centricon koncentrátora (Amicon) prepúšťajúcim maximálne 10kDa molekuly. To sa urobilo do 5mM, pričom sa zo zásobného roztoku (0,1 g/mi nastavený na pH 7,0) pridalo ATP. Pridal sa koktejl proteázových inhibítorov, leupeptin, pepstatín a PMSF (0,1 mM), nasledoval 1mM biotín (pridaný z 0,2M zásobného roztoku) a 5 gg/ml enzýmu (z 0,5 mg/ml zásobného roztoku). Zmes sa potom inkubovala cez noc pri laboratórnej teplote. Nadbytok biotínu sa z roztoku
88 ·· · 88
8 8 8 8 8 88 · · ·
8 8 · 8 · 88
-41 • 88 · β · · · ·· 8888 88 888 88 odstránil dialýzou oproti 10mM Tris pH 8,0, 5mM NaCl (200 objemov, s 2 výmenami pri 4 °C). Proteín sa potom testoval z hľadiska prítomnosti naviazaného biotínu prostretníctvom blotingu na nitroceiulózu, po ktorom nasledovalo blokovanie s 5% odstredeným mliečnym práškom a detekcia použitím streptavidín-HRP konjugátu (Biorad). Tetramerizácia biotinylovaného rozpustného TCR sa uskutočňovala buď extravidín-RPE konjugátom alebo extravidín-FITC konjugátom (Sigma). Koncentrácia biotín-rozpustného TCR sa merala použitím Coomassie väzobného proteínového testu (Pierce) a vypočítal sa pomer extravidinového konjugátu a rozpustného TCR s hodnotou 0,224 mg/1 mg, aby sa dosiahlo nasýtenie extravidínu biotinylovaným TCR v pomere 1:4. Pridával sa extravidínový konjugát v alikvotách 1/10 celkového pridaného množstva na ľade najmenej 15 minút na alikvotu (aby sa zaistila saturácia extravidínu). Rozpustné TCR tetraméry sa uskladňovali pri 4 °C v tme. Mesiace boli tetraméry extrémne stabilné.
Príklad 4
Molekulárne klonovanie génov T bunkového receptora z T bunkových línií alebo T bunkových klonov so známou špecifitou
Spôsoby a postupy molekulárneho klonovania TCR génov z buniek sú rovnaké pre všetky a reťazce a pre všetky β reťazce, a preto budú opísané len v tomto príklade.
Vhodné množstvo T buniek, typicky 1 až 5 miliónov, sa lyžovalo v lyzačnom tlmivom roztoku z mRNA Capture Kit (Boehringer Mannheim). S reakčnými činidlami kitu sa izolovala mRNA hybridizáciou biotinylovaného oligo-dT na poly-A chvosty mRNA. Potom sa zachytili hybridizované komplexy prostredníctvom viazania sa biotínu na PCR skúmavku pokrytú streptavidínom. Po imobilizácii mRNA v PCR skúmavke sa generovala cDNA použitím AMV reverznej transkriptázy (Stratagene) ako je opísané (Boehringer Mannheim manuál pre mRNA Capture Kit).
•· ·· ·· ·· • · · · ···· · · · ·· 1 · · · ·· • · · · · · · · · ··· · · · ·· ·· ···· ·· ··· ·· ·
-42Na takto imobilizovanej cDNA sa generovali poly-G chvosty na 3' koncoch použitím enzýmu terminálna transferáza (Boehringer Mannheim). Potom sa pridala PCR reakčná zmes vrátane termostabilnej polymerázy pfu s vysokou presnosťou (klonovaná, Stratagene), ktorá bola použitá, aby sa minimalizovalo riziko chýb v PCR produktoch. Uskutočnili sa PCR reakcie použitím poly-C ukotvovacieho primera (obrázok 4A) a primerov špecifických pre a a β reťazec (obrázok 4B, respektíve 4C), ktoré anelujú na zodpovedajúce TCR konštantné oblasti. Na amplifikáciu TCR génových fragmentov sa uskutočnili PCR reakcie v 30 cykloch denaturácie pri 95 °C počas 1 minúty, anelovania pri 50 °C počas 1 minúty a predlžovania pri 72 °C počas 5 minút.
PCR produkty sa ligovali do Bluescript sekvenačného vektora (pBluescript II KS-, Stratagene) použitím miest pre reštrikčné enzýmy Xhol a Xmal, ktoré sa nachádzali v primeroch (všetky enzýmy od New England Biolabs). Po transfekcii ligačných zmesí do E. coli kmeňa XL-1Blue, sa niekoľko klonov vybralo na DNA sekvenovanie, ktoré sa uskutočňovalo na ABI 377 Prism automatickom sekvenátore použitím BigDye™ terminátorov (Applied Biosystems Inc.).
Príklad 5
Molekulárne klonovanie DNA fragmentov kódujúcich 40 aminokyselinové oblasti stočených závitov (leucínové zipsy) c-jun a c-fos
DNA fragmenty kódujúce 40 aminokyselinové oblasti stočených závitov (leucínové zipsy) c-jun a c-fos sa generovali PCR reakciami použitím ľudskej cDNA ako templátu a použitím primerov znázornených na obrázku 5. PCR reakcie sa uskutočňovali v reakčnom tlmivom roztoku obsahujúcom klonovanú pfu polymerázu (Stratagene) v 30 cykloch pozostávajúcich z denaturácie pri 95 °C počas 1 minúty, anelovania primeru pri 58 °C počas 1 minúty a predlžovania pri 72 °C počas 2 minút.
C-jun a c-fos fragmenty sa ligovali do pBluescript II KS- (Stratagene) použitím unikátnych Xhol a Smal reštrikčných miest, čím sa získali konštrukty ·· ·· • · · ··· · · • e ···· ·· ··· ·· *
-43pBJ107, respektíve pBJ108 (obrázok 6). DNA sekvencie c-jun a c-fos fragmentov sa overili DNA sekvenovaním, ktoré sa uskutočňovalo na ABI 377 Prism automatickom sekvenátore použitím BigDye™ terminátorov (Applied Biosystems Inc.).
Sekvenované c-jun a c-fos fragmenty sa potom subklonovali použitím unikátnych Xmal a BamHI reštrikčných miest do polyspojovníkovej oblasti T7 polymerázového expresného vektora pGMT7 (Studier, Rosenberg a ďalší 1990).
Príklad 6
Navrhnutie TCR-leucínových zipsových fúzovaných proteínov na produkciu stabilných, rozpustných TCRs
Pokusy spoločne preskladať extracelulárne fragmenty TCR a a β reťazcov, ktoré boli skrátené tak, že obsahovali cysteínový zvyšok, ktorý in vivo vytvára disulfidovú väzbu, boli čiastočne úspešné (údaje nie sú uvedené, metódy expresie a všeobecné metódy a materiály a podmienky preskladávania pozri v príklade 9). Avšak, keď sa TCR a a β reťazce skrátili tesne pred, teda na N-koncovej strane cysteínového zvyšku tvoriaceho medzireťazcovú disulfidovú väzbu, z analytickej chromatografie na Superdex G-75 kolóne (Pharmacia) vyplynulo, že malá časť proteinu, približne 1 až 2 % množstva použitého v preskladávacej reakcii, sa poskladala do komplexu s molekulovou veľkosťou očakávanou pre skrátený α/β heterodimér (pozri aj Garboczi, Utz a ďalší 1996 ako odvolanie sa na metódu).
Keďže nesprávne vytvorenie disulfidovej väzby môže spôsobiť nevratné nesprávne poskladanie proteinu počas in vitro preskladávania, predpokladalo sa, že pravdepodobnosť takejto udalosti sa minimalizuje mutovaním cysteínového zvyšku v TCR β konštantnej oblasti, ktorá je v bunkovom TCR nespárovaná. Cysteínový zvyšok sa substituoval z serínový alebo za alanínový zvyšok. Na obrázku 7 sú znázornené syntetické DNA primery použité v týchto mutačných krokoch. Spoločné preskladávaníe TCR a a mutovaného β reťazca, ktoré oba boli skrátené tesne pred cysteínovým zvyškom, ktorý tvorí medzireťazcovú disulfidovú ·· ·· ·· · ·· ···· ···· ··· • · · · · · ·· ·· · · · · · · · · • · · · · · · · • a aaaa ·· ··· ·· ·
-44väzbu, vykázalo dramatické zlepšenie výťažkov heterodiméru, pričom proteínová frakcia so správnou molekulovou hmotnosťou typicky tvorila 15 až 30 % celkového proteínu. Avšak, keď sa tieto rozpustné TCRs uskladnili cez noc, analýzy proteínu ukázali, že frakcia s molekulovou hmotnosťou zodpovedajúcou heterodimérnemu TCR sa rozdelila do dvoch vrcholov s molekulovou hmotnosťou zodpovedajúcou monomérnym TCR a a β reťazcom. Podobné pozorovania sa zistili pri riedení rozpustných TCRs, z čoho vyplýva, že stabilita α/β reťazca bola nízka a nedostatočná na analýzy, ktoré by vyžadovali dlhší čas ako obmedzený počet hodín alebo riedenie proteínu. Z toho vyplýva, že tieto metódy na produkciu rozpustného TCR generovali len receptor s extrémne obmedzenou stabilitou.
Na zlepšenie TCR α/β reťazcovej stability a potenciálne na napomáhanie formovaniu heterodiméru počas preskladávania sa TCR reťazce fúzovali s doménami leucínového zipsu c-jun a c-fos, o ktorých je známe, že prednostne vytvárajú heterodiméry (O'Shea, Rutkowski a ďalší 1989; Schuermann, Hunter a ďalš 1991; O’Shea, Rutkowski a ďalší 1992; Glover a Harrison 1995). Testovali sa dva návrhy fúzovaných TCRs.
V jednom sa leucínové zipsy fúzovali tesne za, to je na C-koniec, cysteínových zvyškov vytvárajúcich medzireťazcovú disulfidovú väzbu medzi TCR a a β reťazcom. Keďže c-jun a c-fos leucínové zipsové peptidy sú schopné vytvárať medzireťazcový disulfid aj tesne na N-konci použitého spojovníka (O'Shea, Rutkowski a ďalší 1989), predpokladalo sa, že vzájomná zostava dvoch reťazcov a medzireťazcovej disulfidovej väzby bude optimálna.
V druhom návrhu sa leucínové zipsy fúzovali tesne pred, to je na N-koniec cysteínových zvyškov tvoriacich medzireťazcovú disulfidovú väzbu medzi TCR a a β reťazcami (obrázok 8). Takže pri druhom návrhu sa v rekombinantnom receptore cysteínové zvyšky vynechali.
V preskladávacích experimentoch s TCR-zipsovými (TCR-z) reťazcami s týmito dizajnami sa zistilo, že výťažok heterodimérneho, rozpustného receptora bol lepší, keď sa cysteínové zvyšky vytvárajúce medzireťazcovú disulfidovú väzbu vynechali v TCR a a β reťazcoch, ako je v návrhu znázornenom na obrázku 8.
-45·· ·· ·· * ·· ···· ···· · • s · · · · · · ·· · · · · · · · · ··· ··· · · ·· ···· ·· ··· ·· ·
Príklad 7
Konštrukcia DNA expresných vektorov pre TCR-leucínové zipsové proteíny
Tento príklad opisuje konštrukciu expresných vektorov pre a a β reťazce piatich TCRs. Opísaná stratégia a dizajn by mali byť adaptovateľné na akékoľvek ľudské alebo živočíšne TCR gény. Hoci všetkých päť tu opísaných TCRs je definovaných epitopmi MHC triedy I, rovnako by tieto metódy mohli byť použité na klonovanie a konštrukciu expresných vektorov pre TCRs definované MHC triedy II. Všetky vektory exprimujú proteín, ktorý má byť súčasťou preskladaných rozpustných TCRs podľa návrhu znázorneného na obrázku 9, s tou výnimkou, že dva TCRs sú exprimované s biotinylovateľnou príveskovou sekvenciou na C-konci (pozri nižšie a obrázky 17, 18 a 19). Klonovacia stratégia je rovnaká pre všetky TCR a a β reťazce.
Rozsah vedúcich alebo signálnych peptidových sekvencií TCR a a β reťazcov sa predpokladal z analýz sekvenčných údajov získaných z plazmidov obsahujúcich TCR ukotvovacie PCR produkty (pozri príklad 4). Na tomto základe sa navrhli 5' primery na generovanie PCR fragmentov na expresiu TCR reťazcov bez vedúcich sekvencií (obrázok 9). Všetky 5' primery kódujú metionínový zvyšok tesne pred zrelými TCR proteínovými sekvenciami, aby bola možná translácia v E. coli. Tiché mutácie substituujúce C alebo G bázy za A alebo T (obrázok 9) sa zaviedli v množstve 5' proximálnych kodónov génov, aby sa znížila tendencia vytvárania sekundárnej mRNA štruktúry, ktorá by mohla inhibovať hladiny expresie v E. coli (PCR/GB98/03235; Gao, Tornmo a ďalší 1997; Gao, Gerth a ďalší 1998).
Gény kódujúce Va0.2 a νβ17 reťazce ľudského JM22 TCR, ktorý je definovaný Influenza matricovým peptidom prezentovaným na HLA-A0201 (peptidová sekvencia GILGFVFTL), Va23 a νβ5.1 reťazce ľudského TCR, ktorý je definovaný 003 HIV-1 Gag peptidom prezentovaným na HLA-A0201 (peptidová sekvencia SLYNTVATL), a Va4 a νβ11 hlodavčie reťazce F5 TCR, ktorý je definovaný N P peptidom prezentovaným na H2-Db (peptidová sekvencia ASNENMDAM), sa amplifikovali prostredníctvom PCR použitím plazmidov
·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · ·· ···· ·· · obsahujúcich TCR ukotvovacie PCR produkty generované ako bolo opísané v príklade 6. Gény pre ľudské A6 (Va2.3/Vpi2.3) a B7 (Va17.2/Vpi2.3) TCRs, ktoré sú špecifické pre HTLV-1 Tax peptid prezentovaný prostredníctvom HLA-A0201 (peptidové sekvencia LLFGYPVYV) sa získali vo forme plazmidov (Garboczi, Utz a ďalší 1996; Ding, Smith a ďalší 1998), ktoré boli použité na generovanie PCR produktov na konštrukciu expresných vektorov pre tieto TCR reťazce. Gény pre tieto TCRs sa klonovali do expresných vektorov, ktoré obsahovali sekvenciu fragmentu fúzovaného z c-fos leucínového zipsu a biotinylovateľného prívesku (pozri príklad 8).
PCR reakcie sa uskutočňovali s klonovanou pfu polymerázou v štandardných podmienkach v tlmivom roztoku (Stratagene) a s 25 cyklami denaturácie pri 95 °C počas 1 minúty, anelovania primeru pri 60 °C počas 1 minúty a predlžovania pri 72 °C počas 6 minút. PCR produkty sa poštiepili reštrikčnými enzýmami Ndel a Xmal a ligovali sa do pGMT7 vektorov obsahujúcich c-jun (TCR a reťazce) a c-fos (TCR β reťazce) inzerty (pozri príklad 5).
Obrázky 10 až 19 znázorňujú sekvencie TCR-z inzertov a predpokladané proteínové sekvencie exprimované pGMT7 vektormi. Obrázok 20 znázorňuje sekvenciu A6 TCR β reťazca obsahujúcu mutáciu v konštantnej oblasti, ktorá však detegovateľne neovplyvňovala skladanie a funkciu rozpustného TCR (pozri príklady 9 a 10).
Príklad 8
Konštrukcia DNA vektorov na expresiu TCR β reťazcov fúzovaných s c-fos leucínovým zipsovým-biotinylovateľným fragmentom
Na umožnenie imobilizácie rozpustných TCRs alebo na umožnenie detekcie, alebo na pripojenie na receptor, bolo by užitočné, keby mohol byť proteín produkovaný s ďalším funkčným fúzovaným komponentom. Tak by mohli byť vytvárané deriváty rozpustného TCR, ako napríklad multiméry, alebo by sa tak ·· ·· ·· · ·· ···· ···· · · ·· ···· · ·
-47··· · · · ·· ·· ···· ·· ··· ·· mohla umožniť detekcia s vysokou citlivosťou alebo by sa mohli pripojiť iné funkcie receptor/receptor komplexom.
Tento príklad demonštruje konštrukciu expresných vektorov pre TCR β reťazce, v ktorých je zavedený fúzovaný polypeptid, ktorý môže byť špecificky biotinylovaný v E. coli in vivo alebo s enzýmom BirA in vitro (Barker a Campbell 1981; Barker a Campbell 1981; Howard, Shaw a ďalší 1985; Schatz 1993; O'Callaghan, Byford a ďalší 1999). Ako je ukázané v príkladoch 10 a 11, tieto rozpustné TCR fúzie sa môžu exprimovať a preskladať spolu s a reťazcom rovnakým spôsobom, a s podobnými výťažkami, akoTCR β reťazec, ktorý nie je fúzovaný s biotinylačným príveskom (BT-prívesok). Tieto výsledky demonštrujú, že tu opísaný rozpustný TCR je pravdepodobne vhodný na expresiu s množstvom rôznych polypeptidov ako fúzovacích partnerov.
T bunkové receptorové β reťazce sa subklonovali so pGMT7 expresného vektora so sekvenciou biotínového prívesku na C-konci sekvencie fos-leucí nového zipsu nasledovne:
štart-TCR β reťazec - fos zips - biotínový prívesok - stop
Presná sekvencia koncov konštruktov je nasledovná (pozri aj obrázok 21):
spojovník —>| fos zips -»| BamHI |<- spojovník -»|<- biotínový prívesok
Na produkciu rozpustných TCRs s biotínovým príveskom boli použité dva prístupy. V prípade ľudského JM22 TCR, ktorý je definovaný Influenza matricovým peptidom prezentovaným na HLA-A0201, sa klonovaná fúzia, tvorená β reťazcom a c-fos leucínovým zipsom, modifikovala na 3' konci použitím syntetického DNA primeru znázorneného na obrázku 22 tak, aby sa zaviedlo BamHI miesto namiesto Hindlll miesta, použitím štandardnej PCR reakcie s pfu polymerázou (Stratagene).
Pôvodný 5' primér (pozri obrázok 9) obsahujúci Ndel miesto bol použitý ako priamy primér. Vyrobený PCR produkt sa klonoval do modifikovaného pGMT7 vektora obsahujúceho sekvenciu s biotínovým príveskom (obrázok 21), aby sa vytvoril vyššie opísaný konštrukt. Tento plazmid je známy ako JMB002.
-48·· ·· ·· · • · · · · · ·· • · · · · · • · · · · · · • · · · · · ·· ···· ·· ··· ·· • · · • · • · ·· ·
Klonovaný TCR špecifický pre HLA-A0201 definovaný HTLV-1 epitopovou sekvenciou LLFGYPVYV, známy ako A6 tax TCR (Va2.3A/pi2.3), bol skrátený použitím PCR s priamym a reverzným primerom, ktoré sú znázornené na obrázku 9. Tento TCR β reťazec bol klonovaný do Ndel a Xmal miest pGMT7 vektora (JMB002), ktorý obsahuje c-fos-BT fragment.
Po skonštruovaní fúzovaných expresných vektorov sa uskutočnilo DNA sekvenovanie, aby sa zaistilo, že počas subklonovacej procedúry nebola zavedená žiadna chyba (všetky sekvenovania sa uskutočňovali v Biochemistry Dept. DNA Sequencing Facility, Oxford University použitím ABI 377 Prism sekvenátora a ABI BigDye fluorescenčných terminátorov). Objavili sa dve chyby v tax TCR β reťazci v porovaní s publikovanou sekvenciou a ďalším skúmaním sa zistilo, že tieto chyby boli obe prítomné už v pôvodnom plazmide, ktorý sme obdržali. Keďže obe tieto chyby boli na 3' konci unikátneho Bsu36l miesta v TCR β reťazci, toto miesto bolo použité na klonovanie do (správneho) JMB002 plazmidu. Obe verzie tax TCR β reťazca sa exprimovali a poskladali sa s a reťazcom a porovnali sa použitím Biacore. Obe verzie proteínu sa špecificky viazali na molekuly tax peptid-MHC triedy I s podobnými relatívnymi afinitami (pozri príklad 17). V nasledujúcich experimentoch sa používala len správna verzia β reťazca.
Príklad 9
Expresia TCR reťazcov v E. coli a purifikácia inklúznych teliesok
TCR a a β reťazce sa exprimovali oddelene v E. coli kmeni BL21DE3pLysS pod kontrolu vektora pGMT7 v TYP médiu použitím 0,5mM IPTG na indukciu produkcie proteínu, keď optická hustota (OD) pri 600nm dosiahla hodnotu medzi 0,2 a 0,6. Indukcia prebiehala cez noc a baktérie sa zozbierali centrifugáciou pri 4000 otáčkach/min v Beckman J-6B centrifúge.
Bakteriálne bunkové pelety sa potom resuspendovali v lyzačnom tlmivom roztoku (10mM Tris pH 8,1, 10mM EDTA, 150mM NaCl, 2mM DTT, 10% glycerol). Zmes sa ochladila na ľade a pridali sa nasledujúce látky: 20 pg/ml lyzozýmu, 10mM ·· ·· ·· · ·· ···· · · ·· ··· • · · · · · ·
-49··· ··· ·· ·· ···· ·· ··· · ·
MgCI2 a 20 pg/ml DNázy I, nasledovalo inkubovanie na ľade minimálne jednu hodinu.
Zmes sa potom sonifikovala použitím 12mM sondového sonikátora (Milsonix XL2020) pri plnom výkone v 5 cykloch po 30 sekúnd s 30 sekundovými prestávkami, v ktorých sa umožnilo, aby sa zmes ochladila. Počas tejto procedúry sa udržiavala teplota použitím zmesi ľadu a vody. Zmes sa potom nariedila s 5 objemami Triton premývacieho tlmivého roztoku (50mM Tris pH 8,1, 0,5% Triton X-100, 100mM NaCI, 0,1% azid sodný, 10mM EDTA, 2mM DTT). Po minimálne hodinovom inkubovaní na ľade sa zmes centrifugovala pri 3500 otáčkach/min v Beckman GS-6R centrifúge a supernatan sa odstránil. Pelet sa resuspendoval v resuspendačnom tlmivom roztoku (50mM Tris pH 8,1, 100mM NaCI, 10mM EDTA, 2mM DTT) použitím malej plastickej jednorazovaj pipety. Zmes sa potom centrifugovala pri 8000 otáčkach/min na Beckman J2-21 centrifúge a supernatant sa odstránil. Pelet sa potom resuspendoval v guanidínovom tlmivom roztoku (50mM Tris pH 8,1, 6,0M guanidín-HCI, 100mM NaCI, 10mM EDTA, 10mM DTT) použitím ručne ovládaného homogenizátora. Po centrifugácii s nízkou rýchlosťou na odstránenie nerospustného materiálu sa supernetant rozdelil na alikvoty a uskladnil pri -70 °C. Rutinne sa získaval výťažok približne 100 mg na liter bakteriiálnej kultúry.
SDS-PAGE analýza prípravku purifikovaných inklúznych teliesok sa dosiahla nariedenim 2 μΙ prípravku inklúznych teliesok v guanidínovom tlmivom roztoku spolu s SDS-PAGE vzorkovým tlmivým roztokom a nasledovalo zahrievanie na 100 °C počas 2 minút. Vzorky sa naniesli na gél, pričom sa udržiavali stále horúce, aby sa zabránilo precipitácii zmesi guanidínu a SDS počas nanášania. Prostredníctvom Coomassie farbenia SDS-PAGE, ktorá sa uskutočnila týmto spôsobom, sa usúdilo, že proteín inklúznych teliesok purifikovaný týmto spôsobom je čistý na približne 90 % (pozri obrázok 23).
Príklad 10
Preskladanie a purifikácia TCRz heterodiméru ·· ·· ·· · ·· ···· ···· · · · ·· ···· ·· ·· · · · · · · · ··· ··· · · ·· ···· ·· ··· ·· ·
-50Proteíny solubilizované rovnakým dielom v močovine sa ďalej denaturovali v guanidínovom tlmivom roztoku (6M guanidín-HCI, 10mM octan sodný pH 5,5, 10mM EDTA, 2mM DTT) pri 37 °C. Zmes proteínov sa injektovala do ľadom schladeného preskladávacieho tlmivého roztoku (100mM Tris pH 8,1, 0,4M Larginín-HCI, 5M močovina, 5mM redukovaný glutatión, 0,5mM oxidovaný glutatión) do celkovej koncentrácie proteínu 60 mg/l, aby sa zaistilo rýchle zmiešanie. Po najmenej 5 hodinovom inkubovaní na ľade, aby sa umožnilo preskladanie, sa zmes dialyzovala oproti 10 objemom demineralizovanej vody 24 hodín a potom oproti 10 objemom 10mM Tris pH 8,1 24 hodín.
Dialyzovaný preskladaný proteín sa potom filtroval, aby sa odstránil agregovaný proteín (produkovaný ako vedľajší produkt počas preskladávania) cez 0,45pm nitrocelulózovú membránu (Whatman). Purifikácia rozpustného TCR s biotínovým príveskom sa potom uskutočňovala nanesením na POROS 20HQ kolónu bežiacu na Biocad Sprint systéme. Na jedno kolo sa mohlo naniesť približne 500 ml roztoku preskladaného proteínu a eluovanie proteínu sa dosiahlo gradientom chloridu sodného v Bis-Tris-propánovom tlmivom roztoku pH 8,0. Proteín sa eluoval pri koncentrácii približne 100 mM chloridu sodného a relevantné frakcie sa okamžite schladili na ľade a pridal sa koktejl proteázových inhibítorov. Frakcie sa analyzovali Coomassie-farbenou SDS-PAGE.
Príklad 11
Preskladávanie a purifikácia TCRz heterodiméru s biotinylovateľným β reťazcom
TCR β reťazce s biotínovým príveskom sa zmiešali s rovnakým množstvom a reťazcov exprimovaných a purifikovaných ako rozpustný T bunkový receptor. TCRzβ-ΒΤ sa preskladal rovnakým spôsobom ako bolo opísané v príklade 10 pre TCRz (pozri obrázok 26).
Príklad 12
Biotinylácia rozpustného TCRz-BT s biotínovým príveskom ·· ·· ·· · ·· ···· · ·· ·· • · ···· · · ··· ··· · ·· ···· ·· ··· ··
-51 Frakcie obsahujúce proteín sa zakoncentrovali do 2,5 ml použitím centrifúgačných koncentrátorov s hranicou 10K (Ultrafree, Milipore). Tlmivý roztok sa vymenil použitím PD-10 odsoľovacích kolón ekvilibrovaných s 10mM Tris pH 8,1, 5mM NaCl. Ďalej sa pridal koktejl proteázových inhibítorov a proteín sa znova zakoncentroval na približne 1 ml použitím centrifugačných koncentrátorov. Do tohto 1 ml rozpustného TCR s biotínovým príveskom sa pridali nasledujúce látky: 7,5mM MgCI2, 5mM ATP (pH 8,0), 1mM biotín, 2,5 μg/ml BirA biotinylačného enzýmu. Biotinylačná reakcia sa potom nechala prebiehať pri laboratórnej teplote (20 až 25 °C) cez noc.
Enzymaticky biotinylovaný rozpustný TCR sa potom oddelil od zvyšného nezreagovaného biotínu gélovou filtráciou na Superdex 200 HR kolóne (Pharmacia), ktorá prebiehala na Pharmacia FPLC systéme (pozri obrázok 27). Kolóna bola ekvilibrovaná s PBS a odoberali sa 1ml frakcie, ktoré sa okamžite schladzovali na ľade a znova boli chránené koktejlom proteázových inhibítorov. Koncentrácia proteínu sa odhadla použitím Coomassie farbiaceho testu (Pierce) a biotinylovaný proteín sa potom uskladnil do jedného mesiaca pri 4 °C a na dlhšie obdobie pri -20 °C.
Účinnosť biotinylačnej reakcie sa skontrolovala použitím Westen blotingu biotinylovaného proteínu. SDS-PAGE prebiehala použitím vyššie opísaných metód, ale namiesto farbenia sa gél blotoval na PVDF membránu (Bio-Rad) použitím SemiPhor polosuchej elektroblotovacej aparatúry (Hoefer). Blotovací stĺpec obsahoval 6 vrstiev filtračného papiera (Whatman 4M) postrihaného na veľkosť gélu a nasiaknutého v prenášačom tlmivom roztoku (25mM Tris báza, 150mM glycín), nasledovala PVDF membrána, ktorá bola vopred navlhčená metanolom a potom nasiaknutá v prenášačom tlmivom roztoku, nasledoval gél, ktorý bol mierne kolísaný v prenášačom roztoku 5 minút, a nasledovalo 6 ďalších vrstiev nasiaknutého filtračného papiera. Stĺpec sa jemne stlačil, pričom sa použila skúmavka, aby sa vytlačili vzduchové bubliny a pridalo sa ďalších približne 10 ml prenášacieho tlmivého roztoku, aby sa napomohlo prenosu. Katóda sa umiestnila na vrch stĺpca a prúd prechádzal cez aparatúru s konštantnou hodnotou 50 mA ·· ·· · ·· ···· · · ·· ··· ·· · · · · ··
-52·· ···· ·· ··· ·· · jednu hodinu. Membrána sa potom inkubovala v 2% roztoku želatíny (Bio-Rad) v PBS-T tlmivom roztoku (PBS + 0,05% Tween-20) viac ako jednu hodinu pri laboratórnej teplote, pričom sa jemne kolísala. Inkubácie cez noc zahŕňali aj 0,01% azid sodný na inhibíciu rastu baktérií. Membrána sa niekoľko krát (4 až 5) premyla s PBS-T a nasledovalo farbenie s avidín-HRP konjugátom (Sigma) nariadeným v pomere 1:1000 v 1% roztoku želatíny v PBS-T viac ako 30 minút pri laboratórnej teplote, pričom sa membrána jemne kolísala. Membrána sa potom niekoľko krát (4 až 5) premyla s PBS-T pred tým, ako sa detegovala s Opti-4CN (Bio-Rad). To je reakčné činidlo, ktoré reaguje v prítomnosti HRP a vytvára nerozpustnú modrú farbu, ktorá farbí membránu v mieste, kde je prítomný relevantný proteín, čo vyplýva z prítomnosti naviazaného HRP. Ak je na farbenie použitý avidín-HRP konjugát, vyplýva z toho potom prítomnosť proteínu obsahujúceho biotín.
Obrázok 28 znázorňuje týmto spôsobom uskutočnené bloty niekoľkých biotinylovaných TCRs. Štandardami použitými pre tieto bloty boli biotinylované markery molekulovej hmotnosti so širokým rozsahom (Bio-Rad). Z blotu je zrejmé, že vysoká úroveň biotinylácie TCRs obsahujúcich biotinylačný prívesok, ktoré reagovali s BirA enzýmom...
Príklad 13
Produkcia biotinylovaných rozpustných MHC-peptidových komplexov
Biotinylované rozpustné MHC-peptidové komplexy sa produkovali ako bolo opísané v príklade 2.
Príklad 14
Test na špecifickú väzbu medzi rozpustným TCR a MHC-flu-peptidom
TCR molekula, JM22z, je špecifická pre HLA-A2 MHC molekuly prezentujúce imunodominantný antigén pozostávajúci z aminokyselinových zvyškov 58 až 66 (GILGFVFTL) influenza matricového proteínu. Klonovanie, expresia a purifikácia JM22z sú opísané v príkladoch 4, 7, 9 a 10 a na obrázkoch 24 a 25. Interakcie ·· ·· ·· · ·· ···· ···· ···
-53··· ··· ··· ·· ···· ·· ··· ·· ··· medzi JM22z a jeho ligand/MHC komplexom (HLA-A2-flu) alebo irelevantnou HLAA2 peptidovou kombináciou, ktorej produkcia je opísaná v príklade 13, sa analyzovali na Biacore 2000™ povrchovom plazmónovom rezonančnom (SPR) biosenzore. SPR meria zmeny v refraktívnom indexe, ktoré sú vyjadrené ako jednotky odpovede (RU), blízko povrchu senzora v malej tečúcej bunke, čo je princíp, ktorý môže byť použitý na detekciu interakcií receptora a ligandu a na analýzu ich afinity a kinetických parametrov. Sondové tečúce bunky sa pripravili imobilizáciou jednotlivých HLA-A2-peptidových komplexov v oddelených tečúcich bunkách prostredníctvom väzby medzi biotínom prepojeným s p2m a streptavidínom, ktorý bol chemicky prepojený s aktivovaným povrchom tečúcich buniek. Test sa potom uskutočňoval prechádzaním JM22z na povrchoch rôznych tečúcich buniek s konštantnou rýchlosťou prietoku, pričom sa merala SPR odpoveď. Najprv sa špecificita interakcie overila prechádzaním 28μΜ JM22z konštantnou prietokovou rýchlosťou 5 μΙ/min na troch rozličných povrchoch; prvý bol pokrytý s 2800 RU HLA-A2-flu, druhý bol pokrytý s 4200 RU HLA-A2, ktorý bol poskladaný s irelevantným peptidom z HIV reverznej transkriptázy (HLA-A-pol: ILKEPVHGV), a tretí bol pokrytý s 4300 RU CD5 (obrázok 29a, vložený výsek). Na definovanie pozadia rezonancie (obrázok 29a) boli použité injekcie rozpustného JM22z s konštantnou prietokovou rýchlosťou a rôznymi koncentráciami na HI_A-A2-pol. Hodnoty týchto kontrolných meraní boli subtraktované z hodnôt získaných s HLAA2-flu (obrázok 29b) a boli použité na výpočet väzobných afinít vyjadrených vo forme disociačnej konštanty, Kd (obrázok 29c). Stanovilo sa, že Kd JM22z je 15 ± 4 μΜ (n=7) pri 37 °C a Kd relevantnej MHC molekuly je 6,6 ± 2 μΜ (n=3) pri 25 °C. Použitím imobilizovaného TCR v sondovej tečúcej bunke a rozpustného MHCpeptidového komplexu sa stanovila podobná Kd s hodnotou 5,6 ± 4 μΜ (n=3) pri 25 °C. Rýchlosť vzniku interakcie sa stanovila medzi 6,7 x 104 a 6,9 x 104 M'1s'1 pri 37 °C, zatiaľ čo rýchlosť zániku bola 1,1 s1 (Willcox, Gao a ďalší 1999).
·· ·· • · · ·
-54• · · · · • ·· · · · ·· ···· ·· ··· ·· ···
Príklad 15
Test špecifickej väzby medzi rozpustným hlodavčím TCR a hlodavčím MHC H2-DbNP
V tomto experimente sme použili hlodavčí TCR, F5, špecifický pre peptid odvodený od influenza vírusového nukleoproteínu (aa.366-374: ASNENMDAM), ktorý je prezentovaný hlodavčou H2-Db MHC molekulou (H2-Db-NP). Použil sa mierne modifikovaný gén MHC ťažkého reťazca v tom zmysle, že kódoval len aminokyseliny 1 až 280 prirodzeného proteínu plus 13 aminokyselinovú sekvenciu rozoznávanú BirA enzýmom. Výsledný proteín je možné enzymaticky biotinylovať (Shatz 1993; O’Callaghan, Byford a ďalší 1999). SPR analýza na Biacore2000™ SPR biosenzore použitím tohto rozpustného TCR špecifického pre imobilizovaný H2-Db-NP ukázala, že sa špecificky viaže na ligand MHC-peptidovú kombináciu (údaje nie sú uvedené).
Príklad 16
Porovnanie viazania sa biotinylovaného rozpustného tax-TCR s viazaním sa biotinylovaného rozpustného mutantného tax-TCR
Biotinylované rozpustné tax-TCRs boli pripravené ako bolo uvedené v príkladoch 9 až 11 a Biacore 2000 analýza sa uskutočňovala ako bolo uvedené v príklade 14 použitím pMHC komplexov poskladaných buď s influenza matricovým peptidom (GILGFVGTL) alebo s HTLV tax 11-19 peptidom (LLFGYPVYV). Biotinylované rozpustné TCRs pretekali na všetkých bunkách rýchlosťou 5 μ/min celkovo 1 minútu. Z obrázka 30 je zrejmé, že na HTLV tax 11-19 peptidový-MHC komplex sa najprv viazal biotinylovaný rozpustný tax-TCR a potom biotinylovaný rozpustný mutantný tax-TCR (A). Ani prirodzený, ani mutantný tax-TCR sa neviazali ani na influenza matricový peptidový-MHC komplex (B/C), ani na 0X68 monoklonálnu protilátkovú kontrolu (D). Z toho sme vyvodili, že tak prirodzený, ako aj mutantný biotinylovaný rozpustný TCR sa jednoznačne viažu účinne a špecificky na tax-pMHC komplex a len veľmi málo sa líšia v stupni viazania sa.
·· ·· • · · · • · ·
-55·· • · • ·
Príklad 17
Analýza simultánneho viazania sa TCR a CD8 koreceptora na imobilizovaný MHC peptidový komplex
CD8 a CD4 sú povrchové glykoproteíny, o ktorých sa verí, že fungujú ako koreceptory TCRs, pričom sa simultánne viažu na rovnaké MHC molekuly ako TCR. CD8 je charakteristický pre cytotoxické T bunky a viaže sa na MHC molekuly triedy I, zatiaľ čo CD 4 je exprimovaný na T bunkách pomocnej línie a viaže sa na MHC molekuly triedy II. CD8 je dimér pozostávajúci buď z dvoch identických a-reťazcov, alebo α a β reťazca. Homodimérna aa-CD8 molekula bola vyrobená ako je opísané v PCT/GB98/03235 (Gao, Tormo a ďalší 1997; Gao, Gerth a ďalší 1998). V tomto príklade je opísané simultánne viazanie sa molekúl rozpustného TCR a CD8 na imobilizovaný HI_A-A2-flu komplex. Ako je vidno na obrázku 31A, väzobná odpoveď bola jednoducho aditívna. Výsledkom subtraktovania hodnôt TCR odpovede (prázdne krúžky) od hodnôt kombinovanej odpovede (čierne krúžky) boli hodnoty (prázdne štvorčeky), ktoré boli veľmi blízke hodnote odpovede 120μΜ samotného CD8 (prázdne trojuholníky). Obrázok 31B znázorňuje, že kinetiky interakcie TCR a MHC-peptidu neboli ovplyvnené simultánnym viazaním sa CD8. Z pozorovaného aditívneho viazania sa vyplýva, že TCR a CD8 sa viažu na MHC peptidový komplex na oddelených styčných miestach. Príklad tiež ilustruje, že v niektorých prípadoch neovplyvňuje špecifické viazanie sa jednej molekuly špecifické viazanie sa inej molekuly, čo je situácia, ktorá sa najväčšou pravdepodobnosťou nebude vyskytovať pri inej kombinácii molekúl.
Príklad 18
Expresia, skladanie a miestne špecifická biotinylácia rozpustného α/β TCR
a) Skonštruovanie TCR α a β reťazcov
Rekombinantné rozpustná forma heterodimérnej TCR molekuly sa skonštruovala ako je znázornené na obrázku 36. Každý reťazec pozostáva z
| 4 · | • 4 | • · | • | • · | ||||
| • | • | • · | • · | • · | • | • | • · | |
| • | • | • | • | • | • | • | • | |
| • | • | • | • | e | • | • | • | |
| ·· | 4444 | ·· | • 4 4 | • · | 44 |
imunoglobulínovej domény vzdialenejšej od membrány a imunoglobulínovej domény, ktorá je bližšie k membráne, pričom tieto domény sú fúzované prostredníctvom krátkeho flexibilného spojovníka s motívom stočenej závitnice, ktorá pomáha stabilizovať heterodimér.
Obrázky 32 až 34 a 38 až 41 znázorňujú DNA kódujúce sekvencie a zodpovedajúce aminokyselinové sekvencie rôznych a a β reťazcov z TCRs, ktoré majú rôzne špecificity. Tento príklad sa zameriava na TCRs reprezentované sekvenciami na obrázkoch 32 až 34, ale opísané spôsoby sa môžu podobne uskutočňovať aj použitím TCRs znázornených na obrázkoch 38 až 41.
TCR konštantné domény sa skrátili tesne pred cysteínovým zvyškom, ktorý in vivo vytvára medzireťazcovú disulfidovú väzbu. Následkom toho sa tieto dva reťazce párujú prostredníctvom nekovalentných kvartérnych kontaktov. Keďže FosJun zipsové peptidové heterodiméry sú tiež schopné vytvárať medzireťazcovú disulfidovú väzbu hneď na N-konci použitého spojovníka (O'Shea a ďalší 1989), predpokladalo sa, že vzájomné zostavenie dvoch reťazcov bude optimálne. Fúzované proteíny musia byť spojené spôsobom, ktorý je kompatibilný s každým z oddelených komponentov, aby sa zabránilo poškodeniu hociktorej zo štruktúr.
cDNA kódujúca alfa a beta reťazce TCR, ktoré sú špecifické pre influenza matricový proteínový 58-66 epitop v HLA-A2, sa získala z νβ17+ ľudského CTL klonu (JM22) ukotvenou PCR ako bolo už opísané (Moss a ďalší 1991).
Alfa a beta TCR-zipsové konštrukty, pJM22a-Jun a pJM22p-Fos, sa oddelene skonštruovali amplifikácou variabilnej a konštantnej domény každého reťazca použitím štandardnej PCR technológie a priradením produktov na leucinové zipsové domény z eukaryotických transkripčných faktorov Jun a Fos. Ukázalo sa, že tieto sekvencie dlhé 40 aminokyselín špecificky vytvárajú heterodimér, keď sa preskladajú zo syntetických peptidov, bez toho, aby bola potrebná kovalentná medzireťazcová väzba (O'Shea a ďalší 1989).
Primery boli navrhnuté tak, aby obsahovali vysoký obsah AT hneď na 3’ konci za iniciačným kodónom (aby bola destabilizovaná sekundárna štruktúra mRNA), a s využitím E. coli kodónovej preferencie, aby sa maximalizovala expresia
-57·· ·· ·· • · · · · · · • 9 · · · ·· ··· ·· ··· (Gao a ďalší). Prebytočný cysteín v TCR beta konštantnej doméne sa mutoval na serín, aby sa zaistila prevencia nesprávneho disulfidového viazania počas preskladávania.
Sekvencie fúzovanej DNA a proteinu sú uvedené na obrázkoch 32 a 33. Aby sa umožnila miestne špecifická biotinylácia β reťazca tohto TCR, vniesla sa DNA sekvencia kódujúca takzvaný biotínový prívesok na 3' koniec génu exprimujúceho rozpustný νβ17. Na vnesenie tohto DNA konštruktu sa použili nasledujúce PCR primery:
5'-GCTCTAGACATATGGGCCCAGTGGATTCTGGAGTCAC-3' a
5'GGGGGAAGCTTAATGCCATTCGATTTTCTGAGCTTCAAAAATATCGTTCAGAC
CACCACCGGATCCGTAAGCTGCCAGGATGAACTCTAG-3'
Výsledný PCR produkt sa poštiepil reštrikčnými enzýmami Ndel a Hindlll (New England Biolabs) a ligoval sa s T4 DNA ligázou (New England Biolabs) do vektora pGMT7 (Studier a ďalší, 1990). Obrázok 3 znázorňuje DNA sekvenciu inzertu v tomto konštrukte a odvodenú proteínovú sekvenciu.
b) Expresia TCR reťazcov
Expresia a skladanie TCR špecifického pre influenza vírusový matricový peptid prezentovaný na HLA-A*0201 sa uskutočňoval nasledovne:
TCR a a β reťazce sa exprimovali oddelene v E. coli kmeni BL21DE3pLysS pod kontrolou vektora pGMT7 v TYP médiu (1,6% bakto-tryptón, 1,6% kvasnicový extrak, 0,5% NaCI, 0,25% K2HPO4). Expresia sa indukovala v strednej logaritmickej fáze s 0,5mM IPTG a, po 3 až 5 hodinách, sa baktérie zozbierali centrifugáciou. Bakteriálne bunky sa lyžovali resuspendovaním v lyzačnom tlmivom roztoku (10mM EDTA, 2mM DTT, 10mM Tris pH 8, 150mM NaCI, 0,5mM PMSF, 0,1 mg/ml lyzozýmu, 10% glycerol) a nasledovalo pridanie 10mM MgCI2 a 20 pg/ml DNázyl, 20 minútová inkubácia na ľade a sonifikácia použitím sondového sonifikátora v 10 cykloch po 30 sekúnd. Proteín, v inklúznych telieskach, sa potom purifikoval ·· ·· ·· · ·· ···· · · ·· ···
-58··· ··· ··· ·· ···· ·· ··· ·· ··· niekoľkými premývaniami (zvyčajne troma) s Triton tlmivým roztokom (0,5% Triton X-100, 50mM Tris pH 8, 100mM NaCl, 0,1% azid sodný, 10mM EDTA, 2mM DTT) použitím centrifugácie pri 15000 otáčkach/min 20 minút na usadenie inkúznych teliesok a na ich resuspendovanie sa použil homogenizátor. Detergent sa z prípravku odstránil jedným premytím s 50mM Tris pH 8, 100mM NaCl, 10mM EDTA, 2mM DTT a protein sa solubilizoval s močovinovým tlmivým roztokom (20mM Tris pH 8, 8M močovina, 10% glycerol, 500mM NaCl, 10mM EDTA, 2mM DTT). Po miešaní cez noc pri 4 °C sa roztok vyčistil centrifugáciou a solubilizovaný protein sa uskladnil pri -70 °C. Koncentrácia proteínu sa merala Coomassie väzobným testom (Pierce).
c) Preskladanie TCR
Protein solubilizovaný rovnakým dielom v močovine sa ďalej denaturoval v guanidinovom tlmivom roztoku (6M guanidín-HCl, 10mM octan sodný pH 5,5, 10mM EDTA, 2mM DTT) pri 37 °C. Tento roztok sa potom pridal do preskladávacieho tlmivého roztoku (5M močovina, 100mM Tris pH 8, 400mM L-arginín, 5mM redukovaný glutatión, 0,5mM oxidovaný glutatión, 0,1 mM PMSF) na ľade, aby sa zaistilo rýchle premiešanie. Po viac ako 12 hodinách pri 4 °C sa roztok dialyzoval oproti 10 objemom vody, potom 10 objemom 10mM Tris pH 8, 100mM močoviny. Vo všetkých štádiách sa pridával proteázový inhibítor PMSF, aby sa minimalizovala proteolytická strata biotinylačných príveskov na TCR.
d) Purifikácia TCR
Nariedený roztok TCR sa filtroval cez 0,45 pm filter, aby sa odstránil agregovaný protein, a potom sa naniesol na POROS 10HQ kolónu. Preskladaný TCR sa eluoval gradientom chloridu sodného v 10mM Tris pH 8 a izolovali sa 1ml frakcie, ktoré sa analyzovali prostredníctvom SDS-PAGE (pozri obrázok 36). Frakcie obsahujúce TCR sa spojili a zakoncentrovali sa na 1 ml použitím centrifugačného koncentrátora s hranicou 30 kDa.
·· ·· ·· · ·· ···· ···· ··· ·· ···· ·· ·· ···· ·· ··· ·· ···
-59e) Biotinylácia TCR ml TCR roztoku sa upravil tak, že obsahoval 7,5 mM ATP, použitím tlmeného ATP, 5mM MgCI2, 1mM biotínu a pridal sa koktejl proteázových inhibítorov, ktorý obsahoval PMSF, leupeptín a pepstatín. Nakoniec sa pridal enzým BirA do konečnej koncentrácie 5 pg/ml a reakcia sa nechala prebiehať cez noc pri laboratórnej teplote. TCR sa potom oddelil od voľného biotínu gélovou filtráciou (pozri obrázok 37). Frakcie obsahujúce biotinylovaný TCR sa spojili a pridal sa koktejl proteázových inhibítorov. Stanovila sa aj koncentrácia proteínu. Obrázok 35 znázorňuje schematický diagram rozpustného, biotinylovaného TCR.
Claims (20)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Preskladaný rekombinantný T bunkový receptor - TCR, ktorý obsahuje:i) rekombinantnú TCR a alebo γ reťazcovú extracelulárnu doménu, ktorá obsahuje prvý heterológny C-koncový dimerizačný peptid; a ii) rekombinantnú TCR β alebo δ reťazcovú extracelulárnu doménu, ktorá obsahuje druhý C-koncový dimerizačný peptid, ktorý vytvára špecifický heterodimér s prvým dimerizačným peptidom na vytvorenie heterodimerizačnej domény, pričom chýba disulfidová väzba, ktorá sa nachádza v prirodzených TCRs pri cytoplazmatickej doméne medzi a a β alebo medzi γ a δ reťazcami.
- 2. Biologicky aktívny rekombinantný T bunkový receptor - TCR, ktorý obsahuje:i) rekombinantnú TCR a alebo γ reťazcovú extracelulárnu doménu, ktorá obsahuje prvý heterológny C-koncový dimerizačný peptid; a ii) rekombinantnú TCR β alebo δ reťazcovú extracelulárnu doménu, ktorá obsahuje druhý C-koncový dimerizačný peptid, ktorý vytvára špecifický heterodimér s prvým dimerizačným peptidom na vytvorenie heterodimerizačnej domény, pričom chýba disulfidová väzba, ktorá sa nachádza v prirodzených TCRs pri cytoplazmatickej doméne medzi a a β alebo medzi γ a δ reťazcami.
- 3. Rekombinantný TCR podľa nároku 1 alebo 2, kde heterodimerizačnou doménou je doména stočeného závitu.
- 4. Rekombinantný TCR podľa nároku 3, kde dimerizačnými peptidmi sú c-jun a c-fos dimerizačné peptidy.
- 5. Rekombinantný TCR podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, ktorý obsahuje flexibilný spojovník umiestnený medzi TCR reťazcami a heterodimerizačnými peptidmi.·· ·· ·· · ·· ···· · · ·· ··· • · · · · · ··-61 ··· · · · ··· ·· ···· ·· ··· ·· ···
- 6. Rekombinantný TCR podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, ktorý je exprimovaný v E. coli expresnom systéme.
- 7. Rekombinantný TCR podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, ktorý je biotinylovaný na C-konci.
- 8. Rekombinantný TCR podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, ktorý je značený detegovateľnou značkou.
- 9. Rekombinantný TCR podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, ktorý je spojený s terapeutickým činidlom, ako napríklad cytotoxickým činidlom, alebo imunostimulačným činidlom.
- 10. Sekvencie nukleových kyselín, ktoré kódujú rekombinantné TCR reťazce rekombinantného TCR podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8.
- 11. Sekvencia nukleovej kyseliny podľa nároku 10 v E. coli expresnom vektore.
- 12. Spôsob výroby rekombinantného T bunkového receptora nenaviazaného na membránu, vy z n aču j ú ci sa t ý m , že zahŕňa expresiu:i) rekombinantnej TCR a alebo γ reťazcovej extracelulárnej domény, ktorá obsahuje prvý heterológny C-koncový dimerizačný peptid; a ii) rekombinantnej TCR β alebo δ reťazcovej extracelulárnej domény, ktorá obsahuje druhý C-koncový dimerizačný peptid, ktorý vytvára špecifický heterodimér s prvým dimerizačným peptidom na vytvorenie heterodimerizačnej domény, a spoločné preskladanie reťazcov in vitro na vytvorenie TCR heterodiméru.·· ·· ·· 9 999 9 9 9 9 9 99 9 9 99 9 9 9 9 9 9 9-6299 ···· ·· 999 99 999
- 13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že preskladanie sa uskutočňuje v preskladávacom tlmivom roztoku, ktorý obsahuje solubilizačné činidlo.
- 14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že solubilizačným činidlom je močovina s koncentráciou najmenej 0,1 M.
- 15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že solubilizačným činidlom je močovina s koncentráciou približne 5 M.
- 16. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 12 až 14, vyznačujúci sa tým, že pred preskladávaním sa reťazce denaturujú v denaturačnom tlmivom roztoku.
- 17. Spôsob podľa nároku 16, vy z n a č u j ú c i sa t ý m , že ako redukčné činidlo obsahuje denaturačný tlmivý roztok DTT alebo guanidín.
- 18. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 12 až 17, vyznačujúci sa t ý m , že TCR je rekombinantný TCR podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6.
- 19. Rekombinantný TCR vyrobený spôsobom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 12 až 18.
- 20. Multimér TCR podľa nároku 19.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9810759.2A GB9810759D0 (en) | 1998-05-19 | 1998-05-19 | Soluble t cell receptor |
| GBGB9821129.5A GB9821129D0 (en) | 1998-09-29 | 1998-09-29 | Multimeric T cell receptor |
| PCT/GB1999/001588 WO1999060120A2 (en) | 1998-05-19 | 1999-05-19 | Soluble t cell receptor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK17332000A3 true SK17332000A3 (sk) | 2001-06-11 |
Family
ID=26313710
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1733-2000A SK17332000A3 (sk) | 1998-05-19 | 1999-05-19 | Preskladaný rekombinantný t bunkový receptor-tcr, sekvencie nukleových kyselín, ktoré kódujú rekombinantné tcr reťazce rekombinantného tcr, a spôsob jeho výroby |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US20020119149A1 (sk) |
| EP (2) | EP1066380B1 (sk) |
| JP (2) | JP2002515244A (sk) |
| KR (2) | KR20010085250A (sk) |
| CN (2) | CN1308674A (sk) |
| AT (1) | ATE208819T1 (sk) |
| AU (2) | AU746164B2 (sk) |
| BG (1) | BG105053A (sk) |
| BR (1) | BR9910253A (sk) |
| CA (2) | CA2327314A1 (sk) |
| DE (1) | DE69900468T2 (sk) |
| DK (1) | DK1066380T3 (sk) |
| EA (1) | EA200001216A1 (sk) |
| EE (1) | EE200000697A (sk) |
| ES (1) | ES2168866T3 (sk) |
| HK (1) | HK1035739A1 (sk) |
| HR (1) | HRP20000790A2 (sk) |
| HU (1) | HUP0103614A2 (sk) |
| ID (1) | ID28040A (sk) |
| IL (2) | IL139344A0 (sk) |
| IS (1) | IS5697A (sk) |
| NO (2) | NO20005811L (sk) |
| NZ (2) | NZ507887A (sk) |
| PL (1) | PL364734A1 (sk) |
| PT (1) | PT1066380E (sk) |
| SK (1) | SK17332000A3 (sk) |
| TR (1) | TR200003391T2 (sk) |
| WO (2) | WO1999060119A2 (sk) |
Families Citing this family (170)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1066380B1 (en) * | 1998-05-19 | 2001-11-14 | Avidex Ltd | Soluble t cell receptor |
| EP1118661A1 (en) * | 2000-01-13 | 2001-07-25 | Het Nederlands Kanker Instituut | T cell receptor libraries |
| WO2001090747A2 (en) * | 2000-05-25 | 2001-11-29 | Sunol Molecular Corporation | Modulation of t-cell receptor interactions |
| MXPA04001974A (es) | 2001-08-31 | 2004-07-16 | Avidex Ltd | Receptor de celula t soluble. |
| EP1435776A4 (en) | 2001-09-24 | 2006-01-25 | Univ Pittsburgh | VACCINE AGAINST CANCER AND DIAGNOSTIC PROCEDURE AND REAGENTS |
| US8623822B2 (en) | 2002-03-01 | 2014-01-07 | Bracco Suisse Sa | KDR and VEGF/KDR binding peptides and their use in diagnosis and therapy |
| US7261876B2 (en) | 2002-03-01 | 2007-08-28 | Bracco International Bv | Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications |
| US7794693B2 (en) * | 2002-03-01 | 2010-09-14 | Bracco International B.V. | Targeting vector-phospholipid conjugates |
| SI1482987T1 (sl) * | 2002-03-01 | 2014-12-31 | Bracco Suisse Sa | Večvalentni konstrukti za terapevtske in diagnostične aplikacije |
| US7211240B2 (en) * | 2002-03-01 | 2007-05-01 | Bracco International B.V. | Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications |
| US20050100963A1 (en) | 2002-03-01 | 2005-05-12 | Dyax Corporation | KDR and VEGF/KDR binding peptides and their use in diagnosis and therapy |
| EP2292638A3 (en) | 2002-09-27 | 2011-03-23 | Ludwig Institute For Cancer Research | MAGE-C2 antigenic peptides and uses thereof |
| CA2501870C (en) * | 2002-10-09 | 2013-07-02 | Avidex Limited | Single chain recombinant t cell receptors |
| NZ570811A (en) | 2002-11-09 | 2009-11-27 | Immunocore Ltd | T cell receptor display |
| GB0227351D0 (en) * | 2002-11-22 | 2002-12-31 | Isis Innovation | Soluble T-cell receptors |
| EP1567553A2 (en) * | 2002-12-03 | 2005-08-31 | Avidex Ltd. | Complexes of receptors |
| GB0304068D0 (en) * | 2003-02-22 | 2003-03-26 | Avidex Ltd | Substances |
| EP2338509B1 (en) | 2003-06-27 | 2014-06-18 | International Institute of Cancer Immunology, Inc. | Method of selecting patients suitable for WT1 vaccine |
| AU2004289316B2 (en) * | 2003-11-10 | 2011-03-31 | Altor Bioscience Corporation | Soluble TCR molecules and methods of use |
| US9090673B2 (en) | 2003-12-12 | 2015-07-28 | City Of Hope | Synthetic conjugate of CpG DNA and T-help/CTL peptide |
| US20060014941A1 (en) * | 2003-12-22 | 2006-01-19 | University Of Tennessee Research Foundation, Inc. | Isolated T lymphocyte receptors specific for human autoantigens complexed with human MHC molecules and methods of making and using same |
| GB0411125D0 (en) * | 2004-05-19 | 2004-06-23 | Avidex Ltd | Method of improving T-cell receptors |
| WO2007044033A2 (en) | 2004-12-07 | 2007-04-19 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Therapeutic and diagnostic cloned mhc-unrestricted receptor specific for the muc1 tumor associated antigen |
| GB0427585D0 (en) * | 2004-12-16 | 2005-01-19 | Avidex Ltd | Assay |
| ES2599010T3 (es) * | 2005-04-01 | 2017-01-31 | Immunocore Ltd. | Receptores de linfocitos T con alta afinidad por el VIH |
| EP1888634A2 (en) | 2005-05-13 | 2008-02-20 | Oxford Biomedica (UK) Limited | Mhc class i and ii peptide antigens derived from tumour antigen 5t4 |
| GB0510627D0 (en) | 2005-05-25 | 2005-06-29 | Avidex Ltd | Polypeptides |
| EP2463307A1 (en) * | 2005-08-31 | 2012-06-13 | CBIO Limited | Modified chaperonin 10 |
| WO2007085266A1 (en) * | 2006-01-30 | 2007-08-02 | Dako Denmark A/S | High-speed quantification of antigen specific t-cells in whole blood by flow cytometry |
| JP2009536922A (ja) * | 2006-04-05 | 2009-10-22 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | ウイルスに特異的な可溶性ｔ細胞受容体組成物 |
| WO2008039818A2 (en) | 2006-09-26 | 2008-04-03 | Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Modified t cell receptors and related materials and methods |
| JP5484041B2 (ja) * | 2007-02-23 | 2014-05-07 | 学校法人関西学院 | 蛋白質結晶化剤および蛋白質結晶化剤を用いた蛋白質結晶化方法 |
| EP2857508A3 (en) | 2007-03-05 | 2015-04-15 | International Institute of Cancer Immunology, Inc. | Cancer antigen-specific T-cell receptor gene, peptide encoded by the gene, and use of them |
| AU2013206501B2 (en) * | 2007-03-05 | 2016-05-19 | International Institute Of Cancer Immunology, Inc. | Cancer antigen-specific T-cell receptor gene, peptide encoded by the gene and use of them |
| WO2008116468A2 (en) | 2007-03-26 | 2008-10-02 | Dako Denmark A/S | Mhc peptide complexes and uses thereof in infectious diseases |
| KR100877480B1 (ko) * | 2007-06-08 | 2009-01-07 | 왕성호 | 숫자 기억 게임 방법 |
| EP3620465A1 (en) | 2007-07-03 | 2020-03-11 | Dako Denmark A/S | Improved methods for generation, labeling and use of mhc multimers |
| EP2197908A2 (en) | 2007-09-27 | 2010-06-23 | Dako Denmark A/S | Mhc multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics |
| US10968269B1 (en) | 2008-02-28 | 2021-04-06 | Agilent Technologies, Inc. | MHC multimers in borrelia diagnostics and disease |
| WO2010009735A2 (en) | 2008-07-23 | 2010-01-28 | Dako Denmark A/S | Combinatorial analysis and repair |
| WO2010011994A2 (en) | 2008-07-25 | 2010-01-28 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Polypeptides and uses thereof |
| GB0817244D0 (en) | 2008-09-20 | 2008-10-29 | Univ Cardiff | Use of a protein kinase inhibitor to detect immune cells, such as T cells |
| US10369204B2 (en) | 2008-10-02 | 2019-08-06 | Dako Denmark A/S | Molecular vaccines for infectious disease |
| GB0908613D0 (en) * | 2009-05-20 | 2009-06-24 | Immunocore Ltd | T Cell Reseptors |
| WO2010151688A2 (en) | 2009-06-25 | 2010-12-29 | Amgen Inc. | Capture purification processes for proteins expressed in a non-mammalian system |
| GB0911566D0 (en) * | 2009-07-03 | 2009-08-12 | Immunocore Ltd | T cell receptors |
| CA2777053A1 (en) | 2009-10-06 | 2011-04-14 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Human single-chain t cell receptors |
| GB201002730D0 (en) * | 2010-02-18 | 2010-04-07 | Uni I Oslo | Product |
| EP3150750B1 (en) | 2011-04-08 | 2018-12-26 | Prognosys Biosciences, Inc. | Peptide constructs and assay systems |
| EP2746393A4 (en) | 2011-06-28 | 2015-06-10 | Int Inst Cancer Immunology Inc | RECEPTOR GENE FOR A SPECIFIC LYMPHOCYTE OF A CANCER PEPTIDE ANTIGEN |
| ES2659217T3 (es) | 2012-03-28 | 2018-03-14 | Gadeta B.V. | Intercambio combinatorio de cadena receptora de célula T gamma 9 delta 2 |
| SG10201700442QA (en) | 2012-07-27 | 2017-03-30 | Univ Illinois | Engineering t-cell receptors |
| AU2013308409A1 (en) | 2012-08-31 | 2015-03-26 | University Of Birmingham | Target peptides for immunotherapy and diagnostics |
| WO2014039675A2 (en) | 2012-09-05 | 2014-03-13 | University Of Virginia Patent Foundation | Target peptides for colorectal cancer therapy and diagnostics |
| US20160000893A1 (en) | 2012-12-13 | 2016-01-07 | University Of Virginia Patent Foundation | Target peptides for ovarian cancer therapy and diagnostics |
| GB201223172D0 (en) | 2012-12-21 | 2013-02-06 | Immunocore Ltd | Method |
| EP3736573A1 (en) * | 2013-03-15 | 2020-11-11 | Prognosys Biosciences, Inc. | Methods for detecting peptide/mhc/tcr binding |
| TR201908404T4 (tr) | 2013-11-22 | 2019-07-22 | Hutchinson Fred Cancer Res | İşlenmiş yüksek afinite insan t hücresi reseptörleri. |
| WO2015091823A1 (en) * | 2013-12-19 | 2015-06-25 | Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg | Influenza-specific t-cell receptor and its uses in the detection, prevention and/or treatment of influenza |
| SG11201607181WA (en) | 2014-03-14 | 2016-09-29 | Immunocore Ltd | Tcr libraries |
| US10654908B2 (en) | 2014-04-15 | 2020-05-19 | University Of Virginia Patent Foundation | Isolated T cell receptors and methods of use therefor |
| GB201409558D0 (en) * | 2014-05-29 | 2014-07-16 | Ucb Biopharma Sprl | Method |
| CN106279404A (zh) * | 2015-05-20 | 2017-01-04 | 广州市香雪制药股份有限公司 | 一种可溶且稳定的异质二聚tcr |
| MA45352A (fr) | 2015-08-07 | 2018-06-13 | Univ Birmingham | Identification de glycopeptides associés à mhc de catégorie i comme cibles d'immunothérapie de cancer |
| GB201514875D0 (en) * | 2015-08-20 | 2015-10-07 | Autolus Ltd | Receptor |
| EP3347374A1 (en) | 2015-09-09 | 2018-07-18 | Immune Design Corp. | Ny-eso-1 specific tcrs and methods of use thereof |
| GB201516272D0 (en) | 2015-09-15 | 2015-10-28 | Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd | TCR Libraries |
| GB201516274D0 (en) | 2015-09-15 | 2015-10-28 | Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd | TCR Libraries |
| GB201516275D0 (en) | 2015-09-15 | 2015-10-28 | Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd | TCR Libraries |
| GB201516277D0 (en) | 2015-09-15 | 2015-10-28 | Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd | TCR libraries |
| GB201516270D0 (en) | 2015-09-15 | 2015-10-28 | Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd | TCR Libraries |
| GB201516265D0 (en) | 2015-09-15 | 2015-10-28 | Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd | TCR Libraries |
| GB201516269D0 (en) | 2015-09-15 | 2015-10-28 | Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd | TCR Libraries |
| JP6895975B2 (ja) * | 2016-01-06 | 2021-06-30 | ヘルス リサーチ インコーポレイテッドＨｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ． | 組換えｔ細胞受容体を含む組成物及びライブラリー並びに組換えｔ細胞受容体を使用する方法 |
| AU2017206656B2 (en) | 2016-01-10 | 2024-02-01 | Neotx Therapeutics Ltd. | Immunopotentiator enhanced superantigen mediated cancer immunotherapy |
| US20190161530A1 (en) * | 2016-04-07 | 2019-05-30 | Bluebird Bio, Inc. | Chimeric antigen receptor t cell compositions |
| MX2018013445A (es) | 2016-05-06 | 2019-09-09 | Juno Therapeutics Inc | Celulas diseñadas geneticamente y metodos para obtener las mismas. |
| US11827688B2 (en) | 2016-06-02 | 2023-11-28 | Immunocore Limited | Dosing regimen for GP100-specific TCR—anti-CD3 SCFV fusion protein |
| CA3026180A1 (en) | 2016-06-10 | 2017-12-14 | Gadeta B.V. | Human leukocyte antigen restricted gamma delta t cell receptors and methods of use thereof |
| MA45491A (fr) * | 2016-06-27 | 2019-05-01 | Juno Therapeutics Inc | Épitopes à restriction cmh-e, molécules de liaison et procédés et utilisations associés |
| US20200182884A1 (en) | 2016-06-27 | 2020-06-11 | Juno Therapeutics, Inc. | Method of identifying peptide epitopes, molecules that bind such epitopes and related uses |
| EP3519433A1 (en) | 2016-10-03 | 2019-08-07 | Juno Therapeutics, Inc. | Hpv-specific binding molecules |
| MA46649A (fr) | 2016-10-13 | 2019-08-21 | Juno Therapeutics Inc | Méthodes et compositions d'immunothérapie impliquant des modulateurs de la voie métabolique du tryptophane |
| JP2019532997A (ja) | 2016-11-03 | 2019-11-14 | ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド | Ｔ細胞療法とｂｔｋ阻害剤との併用療法 |
| US20190292246A1 (en) | 2016-11-03 | 2019-09-26 | Juno Therapeutics, Inc. | Combination therapy of a cell based therapy and a microglia imhibitor |
| CA3045355A1 (en) | 2016-12-03 | 2018-06-07 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods for determining car-t cells dosing |
| US11590167B2 (en) | 2016-12-03 | 2023-02-28 | Juno Therapeutic, Inc. | Methods and compositions for use of therapeutic T cells in combination with kinase inhibitors |
| MX2019006285A (es) | 2016-12-03 | 2019-12-16 | Juno Therapeutics Inc | Metodos para modulacion de celulas cart-t. |
| US20190350978A1 (en) | 2016-12-05 | 2019-11-21 | Juno Therapeutics, Inc. | Production of engineered cells for adoptive cell therapy |
| US11821027B2 (en) | 2017-01-10 | 2023-11-21 | Juno Therapeutics, Inc. | Epigenetic analysis of cell therapy and related methods |
| MA47325A (fr) | 2017-01-20 | 2019-11-27 | Juno Therapeutics Gmbh | Conjugués de surface cellulaire et compositions cellulaires et méthodes associées |
| WO2018140427A1 (en) | 2017-01-25 | 2018-08-02 | Molecular Templates, Inc. | Cell-targeting molecules comprising de-immunized, shiga toxin a subunit effectors and cd8+ t-cell epitopes |
| CN110612119A (zh) * | 2017-02-07 | 2019-12-24 | 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） | 磷脂醚(ple)car t细胞肿瘤靶向(ctct)剂 |
| WO2018148180A2 (en) | 2017-02-07 | 2018-08-16 | Immune Design Corp. | Materials and methods for identifying and treating cancer patients |
| AU2018222749B2 (en) | 2017-02-17 | 2024-04-18 | Fred Hutchinson Cancer Center | Combination therapies for treatment of BCMA-related cancers and autoimmune disorders |
| CN110582287A (zh) | 2017-02-27 | 2019-12-17 | 朱诺治疗学股份有限公司 | 与在细胞疗法中给药有关的组合物、制品和方法 |
| EP3589295A4 (en) | 2017-02-28 | 2020-11-04 | Endocyte, Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS OF T CAR LYMPHOCYTE THERAPY |
| EP3595440A2 (en) | 2017-03-14 | 2020-01-22 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods for cryogenic storage |
| US20230190796A1 (en) | 2017-04-07 | 2023-06-22 | Juno Therapeutics, Inc. | Engineered cells expressing prostate-specific membrane antigen (psma) or a modified form thereof and related methods |
| US11796534B2 (en) | 2017-04-14 | 2023-10-24 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods for assessing cell surface glycosylation |
| WO2018204427A1 (en) | 2017-05-01 | 2018-11-08 | Juno Therapeutics, Inc. | Combination of a cell therapy and an immunomodulatory compound |
| CN107216371B (zh) * | 2017-05-27 | 2020-09-18 | 浙江师范大学 | 一种成人t细胞白血病的特异性靶向多肽及其应用 |
| JP2020522489A (ja) | 2017-06-02 | 2020-07-30 | ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド | 養子細胞療法を用いる処置のための製造物品および方法 |
| US11740231B2 (en) | 2017-06-02 | 2023-08-29 | Juno Therapeutics, Inc. | Articles of manufacture and methods related to toxicity associated with cell therapy |
| CA3067602A1 (en) | 2017-06-29 | 2019-01-03 | Juno Therapeutics, Inc. | Mouse model for assessing toxicities associated with immunotherapies |
| MX2020000900A (es) | 2017-07-29 | 2021-01-08 | Juno Therapeutics Inc | Reactivos para expandir celulas que expresan receptores recombinantes. |
| US11851678B2 (en) | 2017-08-09 | 2023-12-26 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods for producing genetically engineered cell compositions and related compositions |
| CA3070575A1 (en) | 2017-08-09 | 2019-02-14 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for preparing genetically engineered cells |
| EP3676403A1 (en) | 2017-09-01 | 2020-07-08 | Juno Therapeutics, Inc. | Gene expression and assessment of risk of developing toxicity following cell therapy |
| EP3679370A1 (en) | 2017-09-07 | 2020-07-15 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods of identifying cellular attributes related to outcomes associated with cell therapy |
| SG11202002728VA (en) | 2017-10-03 | 2020-04-29 | Juno Therapeutics Inc | Hpv-specific binding molecules |
| US11564946B2 (en) | 2017-11-01 | 2023-01-31 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods associated with tumor burden for assessing response to a cell therapy |
| US20210132042A1 (en) | 2017-11-01 | 2021-05-06 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods of assessing or monitoring a response to a cell therapy |
| EP3704251A2 (en) | 2017-11-01 | 2020-09-09 | Editas Medicine, Inc. | Methods, compositions and components for crispr-cas9 editing of tgfbr2 in t cells for immunotherapy |
| US11851679B2 (en) | 2017-11-01 | 2023-12-26 | Juno Therapeutics, Inc. | Method of assessing activity of recombinant antigen receptors |
| MX2020004240A (es) | 2017-11-01 | 2020-09-25 | Juno Therapeutics Inc | Proceso para generar composiciones terapeuticas de celulas modificadas. |
| EP3704229B1 (en) | 2017-11-01 | 2023-12-20 | Juno Therapeutics, Inc. | Process for producing a t cell composition |
| BR112020008812A2 (pt) | 2017-11-06 | 2020-10-27 | Juno Therapeutics Inc | combinação de terapia celular e um inibidor de gama secretase |
| WO2019090202A1 (en) | 2017-11-06 | 2019-05-09 | Editas Medicine, Inc. | Methods, compositions and components for crispr-cas9 editing of cblb in t cells for immunotherapy |
| GB201719169D0 (en) | 2017-11-20 | 2018-01-03 | Univ College Cardiff Consultants Ltd | Novel T-cell receptor and ligand |
| WO2019109053A1 (en) | 2017-12-01 | 2019-06-06 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods for dosing and for modulation of genetically engineered cells |
| EP3720480A2 (en) | 2017-12-08 | 2020-10-14 | Juno Therapeutics, Inc. | Phenotypic markers for cell therapy and related methods |
| JP2021505168A (ja) | 2017-12-08 | 2021-02-18 | ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド | 操作されたｔ細胞の組成物を製造するための方法 |
| CN112041430A (zh) | 2017-12-08 | 2020-12-04 | 朱诺治疗学股份有限公司 | 用于培养细胞的无血清培养基配制品及其使用方法 |
| AU2019209428A1 (en) | 2018-01-22 | 2020-07-30 | Endocyte, Inc. | Methods of use for CAR T cells |
| JP7181517B2 (ja) * | 2018-01-23 | 2022-12-01 | 国立大学法人三重大学 | Ｔ細胞レセプター |
| US20210069246A1 (en) | 2018-01-31 | 2021-03-11 | Celgene Corporation | Combination therapy using adoptive cell therapy and checkpoint inhibitor |
| PE20201345A1 (es) | 2018-04-05 | 2020-11-25 | Juno Therapeutics Inc | Receptores de celulas t, y celulas disenadas que expresan los mismos |
| EP3775238A1 (en) | 2018-04-05 | 2021-02-17 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods of producing cells expressing a recombinant receptor and related compositions |
| CA3095084A1 (en) | 2018-04-05 | 2019-10-10 | Juno Therapeutics, Inc. | T cells expressing a recombinant receptor, related polynucleotides and methods |
| US20220275043A1 (en) * | 2018-07-17 | 2022-09-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Soluble multimeric immunoglobulin-scaffold based fusion proteins and uses thereof |
| SG11202101130VA (en) | 2018-08-09 | 2021-03-30 | Juno Therapeutics Inc | Methods for assessing integrated nucleic acids |
| KR20210057730A (ko) | 2018-08-09 | 2021-05-21 | 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 | 조작 세포 및 이의 조성물 생성 방법 |
| BR112021004261A2 (pt) | 2018-09-11 | 2021-05-25 | Juno Therapeutics Inc | métodos para análise por espectrometria de massas de composições de células geneticamente modificadas |
| WO2020081537A1 (en) * | 2018-10-16 | 2020-04-23 | Texas Tech University System | Method to express, purify, and biotinylate eukaryotic cell-derived major histocompatibility complexes |
| EA202191107A1 (ru) | 2018-10-23 | 2021-09-17 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | T-клеточные рецепторы ny-eso-1 и способы их применения |
| SG11202104355SA (en) | 2018-10-31 | 2021-05-28 | Juno Therapeutics Gmbh | Methods for selection and stimulation of cells and apparatus for same |
| EP3873919A1 (en) * | 2018-11-02 | 2021-09-08 | University of Washington | Orthogonal protein heterodimers |
| EP3877054B1 (en) | 2018-11-06 | 2023-11-01 | Juno Therapeutics, Inc. | Process for producing genetically engineered t cells |
| CN113573719A (zh) | 2018-11-08 | 2021-10-29 | 朱诺治疗学股份有限公司 | 治疗和t细胞调节的方法和组合 |
| EP3886894B1 (en) | 2018-11-30 | 2024-03-13 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods for dosing and treatment of b cell malignancies in adoptive cell therapy |
| US20220088070A1 (en) | 2018-11-30 | 2022-03-24 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods for treatment using adoptive cell therapy |
| BR112021021075A2 (pt) | 2019-05-01 | 2021-12-14 | Editas Medicine Inc | Células que expressam um receptor recombinante de um locus de tgfbr2 modificado, polinucleotídeos relacionados e métodos |
| MX2021013908A (es) | 2019-05-15 | 2022-03-11 | Neotx Therapeutics Ltd | Tratamiento para el cáncer. |
| MX2021015125A (es) | 2019-06-07 | 2022-04-06 | Juno Therapeutics Inc | Cultivo automatizado de celulas t. |
| CA3142361A1 (en) | 2019-06-12 | 2020-12-17 | Juno Therapeutics, Inc. | Combination therapy of a cell-mediated cytotoxic therapy and an inhibitor of a prosurvival bcl2 family protein |
| KR20220066892A (ko) | 2019-08-22 | 2022-05-24 | 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 | Ｔ 세포 요법 및 제스트 동족체 2의 인핸서 (ｅｚｈ2) 억제제의 병용 요법 및 관련 방법 |
| JP2023500318A (ja) | 2019-10-30 | 2023-01-05 | ジュノ セラピューティクス ゲーエムベーハー | 細胞選択および／または細胞刺激デバイスならびに使用方法 |
| AU2020395318A1 (en) | 2019-12-06 | 2022-06-09 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods related to toxicity and response associated with cell therapy for treating B cell malignancies |
| MX2022009137A (es) | 2020-01-24 | 2022-10-21 | Regeneron Pharma | Antígeno expresado preferentemente en receptores de linfocitos t de melanoma (prame) y sus métodos de uso. |
| WO2021154887A1 (en) | 2020-01-28 | 2021-08-05 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods for t cell transduction |
| CN115484978A (zh) | 2020-03-05 | 2022-12-16 | 尼奥克斯医疗有限公司 | 使用免疫细胞治疗癌症的方法和组合物 |
| US20230178239A1 (en) | 2020-05-13 | 2023-06-08 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods of identifying features associated with clinical response and uses thereof |
| KR20230022868A (ko) | 2020-05-13 | 2023-02-16 | 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 | 재조합 수용체를 발현하는 공여자-배치 세포의 제조 방법 |
| US20210403528A1 (en) * | 2020-05-21 | 2021-12-30 | University College Cardiff Consultants Ltd. | Novel T-Cell Receptor and Ligand |
| EP4171616A1 (en) | 2020-06-26 | 2023-05-03 | Juno Therapeutics GmbH | Engineered t cells conditionally expressing a recombinant receptor, related polynucleotides and methods |
| WO2022060904A1 (en) | 2020-09-16 | 2022-03-24 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for expression of t-cell receptors with small molecule-regulated cd40l in t cells |
| WO2022133030A1 (en) | 2020-12-16 | 2022-06-23 | Juno Therapeutics, Inc. | Combination therapy of a cell therapy and a bcl2 inhibitor |
| KR20230165771A (ko) | 2021-03-03 | 2023-12-05 | 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 | T 세포 요법 및 dgk 억제제의 조합 |
| CN117321417A (zh) | 2021-03-22 | 2023-12-29 | 朱诺治疗学股份有限公司 | 确定治疗性细胞组合物的效力的方法 |
| WO2022212400A1 (en) | 2021-03-29 | 2022-10-06 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods for dosing and treatment with a combination of a checkpoint inhibitor therapy and a car t cell therapy |
| CN117916256A (zh) | 2021-05-06 | 2024-04-19 | 朱诺治疗学有限公司 | 用于刺激和转导t细胞的方法 |
| WO2023283446A1 (en) * | 2021-07-09 | 2023-01-12 | The Johns Hopkins University | Method for surface expression of membrane proteins that have a cytoplasmic c-terminal tail |
| WO2023147515A1 (en) | 2022-01-28 | 2023-08-03 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods of manufacturing cellular compositions |
| WO2023213969A1 (en) | 2022-05-05 | 2023-11-09 | Juno Therapeutics Gmbh | Viral-binding protein and related reagents, articles, and methods of use |
| WO2023230548A1 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Celgene Corporation | Method for predicting response to a t cell therapy |
| WO2024006960A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Juno Therapeutics, Inc. | Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids |
| WO2024054944A1 (en) | 2022-09-08 | 2024-03-14 | Juno Therapeutics, Inc. | Combination of a t cell therapy and continuous or intermittent dgk inhibitor dosing |
| WO2024097642A1 (en) | 2022-10-31 | 2024-05-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating cancer with a combination of adoptive cell therapy and a targeted immunocytokine |
| WO2024100604A1 (en) | 2022-11-09 | 2024-05-16 | Juno Therapeutics Gmbh | Methods for manufacturing engineered immune cells |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5225538A (en) * | 1989-02-23 | 1993-07-06 | Genentech, Inc. | Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins |
| US5620689A (en) * | 1989-10-20 | 1997-04-15 | Sequus Pharmaceuuticals, Inc. | Liposomes for treatment of B-cell and T-cell disorders |
| US5216132A (en) * | 1990-01-12 | 1993-06-01 | Protein Design Labs, Inc. | Soluble t-cell antigen receptor chimeric antigens |
| US5582996A (en) * | 1990-12-04 | 1996-12-10 | The Wistar Institute Of Anatomy & Biology | Bifunctional antibodies and method of preparing same |
| DE4040669A1 (de) * | 1990-12-19 | 1992-06-25 | Behringwerke Ag | Verwendung von peptidpaaren mit extrem hoher spezifischer affinitaet zueinander im bereich der in vitro diagnostik |
| US5328985A (en) * | 1991-07-12 | 1994-07-12 | The Regents Of The University Of California | Recombinant streptavidin-protein chimeras useful for conjugation of molecules in the immune system |
| AR246435A1 (es) * | 1992-08-20 | 1994-08-31 | Moreno Saul | Jeringa descartable para uso con cubreagujas |
| WO1996021028A2 (en) * | 1995-01-03 | 1996-07-11 | Procept, Inc. | Soluble heterodimeric t cell receptors and their antibodies |
| US5635363A (en) * | 1995-02-28 | 1997-06-03 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Compositions and methods for the detection, quantitation and purification of antigen-specific T cells |
| US5968511A (en) * | 1996-03-27 | 1999-10-19 | Genentech, Inc. | ErbB3 antibodies |
| AU729406B2 (en) * | 1996-03-28 | 2001-02-01 | Johns Hopkins University, The | Soluble divalent and multivalent heterodimeric analogs of proteins |
| US5776746A (en) * | 1996-05-01 | 1998-07-07 | Genitope Corporation | Gene amplification methods |
| DK0935607T3 (da) * | 1996-08-16 | 2004-12-06 | Harvard College | Oplöselige monovalente og multivalente MHC klasse II-fusionsproteiner samt anvendelser deraf |
| EP1066380B1 (en) * | 1998-05-19 | 2001-11-14 | Avidex Ltd | Soluble t cell receptor |
-
1999
- 1999-05-19 EP EP99922360A patent/EP1066380B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-19 JP JP2000549728A patent/JP2002515244A/ja active Pending
- 1999-05-19 CA CA002327314A patent/CA2327314A1/en not_active Abandoned
- 1999-05-19 PT PT99922360T patent/PT1066380E/pt unknown
- 1999-05-19 ES ES99922360T patent/ES2168866T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-19 IL IL13934499A patent/IL139344A0/xx unknown
- 1999-05-19 EA EA200001216A patent/EA200001216A1/ru unknown
- 1999-05-19 AT AT99922360T patent/ATE208819T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-05-19 TR TR2000/03391T patent/TR200003391T2/xx unknown
- 1999-05-19 IL IL13934599A patent/IL139345A0/xx unknown
- 1999-05-19 DE DE69900468T patent/DE69900468T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-19 CN CN99808473A patent/CN1308674A/zh active Pending
- 1999-05-19 WO PCT/GB1999/001583 patent/WO1999060119A2/en not_active Application Discontinuation
- 1999-05-19 SK SK1733-2000A patent/SK17332000A3/sk unknown
- 1999-05-19 AU AU39459/99A patent/AU746164B2/en not_active Ceased
- 1999-05-19 HU HU0103614A patent/HUP0103614A2/hu unknown
- 1999-05-19 CN CNB998076082A patent/CN1249229C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-19 WO PCT/GB1999/001588 patent/WO1999060120A2/en active IP Right Grant
- 1999-05-19 PL PL99364734A patent/PL364734A1/xx unknown
- 1999-05-19 KR KR1020007012844A patent/KR20010085250A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-05-19 JP JP2000549727A patent/JP2002515243A/ja not_active Withdrawn
- 1999-05-19 CA CA002328144A patent/CA2328144A1/en not_active Abandoned
- 1999-05-19 ID IDW20002387A patent/ID28040A/id unknown
- 1999-05-19 BR BR9910253-6A patent/BR9910253A/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-05-19 DK DK99922360T patent/DK1066380T3/da active
- 1999-05-19 EE EEP200000697A patent/EE200000697A/xx unknown
- 1999-05-19 NZ NZ507887A patent/NZ507887A/xx unknown
- 1999-05-19 KR KR10-2000-7012879A patent/KR100530309B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-05-19 AU AU39456/99A patent/AU758949B2/en not_active Ceased
- 1999-05-19 EP EP99922355A patent/EP1080193A2/en not_active Withdrawn
- 1999-05-19 NZ NZ507886A patent/NZ507886A/en unknown
-
2000
- 2000-10-31 IS IS5697A patent/IS5697A/is unknown
- 2000-11-17 NO NO20005811A patent/NO20005811L/no unknown
- 2000-11-17 HR HR20000790A patent/HRP20000790A2/hr not_active Application Discontinuation
- 2000-11-17 NO NO20005812A patent/NO20005812L/no not_active Application Discontinuation
- 2000-12-14 BG BG105053A patent/BG105053A/bg unknown
-
2001
- 2001-06-28 HK HK01104498A patent/HK1035739A1/xx unknown
- 2001-07-25 US US09/912,787 patent/US20020119149A1/en not_active Abandoned
- 2001-11-13 US US10/014,326 patent/US20020142389A1/en not_active Abandoned
-
2005
- 2005-06-27 US US11/167,773 patent/US20060093613A1/en not_active Abandoned
- 2005-12-29 US US11/321,894 patent/US20060155115A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK17332000A3 (sk) | Preskladaný rekombinantný t bunkový receptor-tcr, sekvencie nukleových kyselín, ktoré kódujú rekombinantné tcr reťazce rekombinantného tcr, a spôsob jeho výroby | |
| Willcox et al. | Production of soluble αβ T-cell receptor heterodimers suitable for biophysical analysis of ligand binding | |
| JP4436319B2 (ja) | 単鎖組換えｔ細胞レセプター | |
| US20040137537A1 (en) | Methods and systems for detecting MHC class I and II binding peptides | |
| KR20220066075A (ko) | T-세포 조절 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법 | |
| JP2007511760A (ja) | Ｍｈｃ結合ペプチドを検出するための溶液ベースの方法 | |
| Boulter et al. | Potent T cell agonism mediated by a very rapid TCR/pMHC interaction | |
| WO2021001414A1 (en) | Peptide-mhc complexes | |
| CN107108717A (zh) | 一种可溶且稳定的异质二聚tcr | |
| CN107847544B (zh) | 用多聚体结合试剂检测细胞表型和定量 | |
| Le Gall et al. | Efficient targeting of NY-ESO-1 tumor antigen to human cDC1s by lymphotactin results in cross-presentation and antigen-specific T cell expansion | |
| Gao et al. | Assembly and crystallization of the complex between the human T cell coreceptor CD8α homodimer and HLA‐A2 | |
| ZA200006181B (en) | Soluble T cell receptor. | |
| CZ20004214A3 (cs) | Rozpustný receptor T buněk | |
| Garner et al. | Expression, purification, and refolding of the myeloid inhibitory receptor leukocyte immunoglobulin-like receptor-5 for structural and ligand identification studies | |
| MXPA00011367A (en) | Soluble t cell receptor | |
| MXPA00011368A (en) | Multivalent t cell receptor complexes |