HRP20000790A2

HRP20000790A2 - Soluble t cell receptor

Info

Publication number: HRP20000790A2
Application number: HR20000790A
Authority: HR
Inventors: Bent Karsten Jakobsen; John Irving Bell; George Fu Gao; Benjamin Ernest Willcox; Jonathan Michael Boulter
Original assignee: Avidex Ltd
Priority date: 1998-05-19
Filing date: 2000-11-17
Publication date: 2001-06-30
Also published as: NO20005812D0; EE200000697A; WO1999060120A3; CA2327314A1; BG105053A; DK1066380T3; NO20005812L; PT1066380E; HUP0103614A2; EA200001216A1; US20060155115A1; JP2002515243A; CN1306572A; CN1249229C; ID28040A; NO20005811D0; HK1035739A1; AU758949B2; AU746164B2; PL364734A1

Description

Ovaj se izum odnosi na nemembranski vezane rekombinantne receptore T stanica (TCR) i na postupke i reagense za njihovo dobivanje.

Opća pozadina izuma

1. Prezentacija antigena na površini stanice

MHC molekule su specijalizirani proteinski kompleksi koji prezentiraju kratke proteinske fragmente, peptidne antigene, na površini stanice radi prepoznavanja koje vrši celularno oruđe prilagodljivog imuno sustava.

Klasa I MHC je dimerni proteinski kompleks koji se sastoji od promjenjivog teškog lanca i stalnog laganog lanca, β2mikroglobulina. Klasa I MHC prezentira peptide koji se intracelularno procesiraju, a koji se nalaze u mjestu za vezanje na MHC, te ih transportiraju na površinu stanice gdje se kompleks usidri na membranu pomoću MHC teškog lanca. Uobičajeno su ovi peptidi duljine 8-11 aminokiselina, što ovisi o stupnju svijanja kojem je podvrgnut peptid prilikom vezanja na MHC. Pukotina za vezivanje, koju stvaraju membranske distalne domene α1 i α2 MHC teškog lanca, ima "zatvorene" krajeve što dosta točno određuje duljinu peptida koji se može vezati.

Klasa II MHC je također dimerni protein koji se sastoji od α (teškog) i β (laganog) lanca koji su promjenjivi glikoproteini i koji se smještaju u stanicu pomoću transmembranskih domena. Kao i kod klase I MHC i molekule klase II oblikuju pukotine za vezanje u koje se smještaju duži peptidi duljine 12-24 aminokiselina. Ovi se peptidi odvode iz ekstracelularne okoline pomoću endocitoze i procesiraju prije smještanja u komplekse klase II koji se potom transportiraju na površinu stanice.

Svaka stanica prezentira i do 6 različitih molekula klase I i sličan broj molekula klase II, a ukupan broj prezentiranih MHC kompleksa iznosi 105-106 po stanici. Raznolikost peptida prezentiranih u molekulama klase I se uobičajeno procjenjuje da iznosi od 1.000 do 10.000, dok je 90 % njih prisutno u 100-1.000 kopija po stanici (Hunt, Michel et al. 1992; Chicz, Urban et al. 1993; Engelhard, Appella et al. 1993; Huczko, Bodnar et al. 1993). Vjeruje se da najzastupljeniji peptidi čine 0,4-5 % od ukupno prisutnih peptida, što znači da može biti prisutno i do 20.000 identičnih kompleksa. Ipak, vjerojatno je da broj najzastupljenijih jednopeptidnih kompleksa iznosi od 2.000 do 4.000 po stanici, a uobičajeni nivo prisutnosti prepoznatljivih epitopa T stanica iznosi od 100 do 500 kompleksa po stanici (za pregled vidjeti (Engelhard 1994)).

2. Prepoznavanje stanica koje prezentiraju antigen

Širok je spektar stanica koje mogu prezentirati antigen, kao MHC-peptidi, i stanice koje imaju takvo svojstvo nazivaju se antigen prezentirajuće stanice (APC). Vrsta stanice koja prezentira specifični antigen ovisi o načinu i mjestu na kojem je antigen po prvi puta napao stanice imunog sustava. U APC uključuju se isprepletene dendritične stanice nađene, u velikom broju, u područjima T stanice limfnog čvora i slezene; Langerhan stanice kože; folikularne dendritične stanice u područjima B stanica limfnog tkiva; monociti, makrofagi i druge stanice monocit/makrofag linije; B stanice i T stanice; i različite druge stanice kao što su endotelne stanice i fibroblasti koje nisu APC u klasičnom smislu ali mogu djelovati na način sličan APC.

Podgrupe limfocita koji sazrijevaju u timusu (T stanice), gdje prolaze kroz selekcijsku proceduru koja osigurava da T stanice koje reagiraju na vlastite peptide budu uništene (negativna selekcija), prepoznaju APC. Dodatno, T stanice koje nemaju sposobnost prepoznavanja promjenjivih MHC koji su prezentirani (u muškaraca, HLA haplotipovi) ne mogu niti sazrijeti (pozitivna selekcija).

Prepoznavanje specifičnih MHC-peptidnih kompleksa od strane T stanica posredovano je receptorom T stanice (TCR) koji se sastoji od α i β lanca koji su smješteni u membrani. U procesu rekombinacije sličnom onom opaženom u genima antitijela, TCR α i β geni se pregrađuju iz promjenjivih, različitih i stalnih elemenata tvoreći enormnu raznolikost u ekstracelularnim domenama vezanja antigena (1013 do 1015 različitih mogućnosti). TCR također postoje i u različitim oblicima s γ i δ lancima, ali su oni prisutni u samo oko 5 % T stanica.

Antitijela i TCR su jedine dvije vrste molekula koje prepoznaju antigene na specifičan način, pa je prema tome TCR jedini receptor specifičan za posebne peptide antigena prezentiranih u MHC, stranom peptidu koji je često jedini znak abnormalnosti unutar stanice.

TCR se eksprimiraju u velikoj raznolikosti, gdje je svaki TCR specifičan za jedan ili nekoliko MHC-peptidnih kompleksa. Kontakt između TCR i MHC-peptidnih liganada je ekstremno kratkotrajan, uobičajeno s vremenom polu-života manjim od sekunde. Adhezija između T stanica i ciljnih stanica, pretpostavljeno TCR/MHC-peptida, ovisi o uspostavi višestrukog TCR/MHC-peptidnog kontakta, a također i o broju koreceptor-ligand kontakata.

Prepoznavanje T stanica se ostvaruje neposrednim fizičkim kontaktom T stanice i antigen prezentirajuće stanice (APC) i inicirano je ligacijom TCR specifičnog za antigen s pMHC kompleksima. TCR je heterodimerni protein površine stanica koji pripada superfamiliji imunoglobulina koji su povezani s nepromjenjivim proteinima CD3 kompleksa uključenim u posredovanje prijenosa signala. TCR postoji u αβ i γδ obliku koji su strukturno slični, ali se odlikuju različitim anatomskim smještajem i vjerojatno funkcijom. Ekstracelularno smješteni receptor sastoji se od dvije membranski proksimalne stalne domene i od dvije membranski distalne promjenjive domene koje nose visoko polimorfne petlje analogne regijama koje određuju komplementarnost (CDR) antitijela. Upravo te petlje tvore mjesto za vezanje TCR molekula na MHC i određuju specifičnost peptida. Ligandi MHC klase I i klase II također pripadaju superfamiliji proteina imunoglobulina ali su specijalizirani za prezentaciju antigena, te se odlikuju visoko polimorfnim mjestom za vezanje peptida što im omogućuje prezentiranje raznolikih peptidnih fragmenata na površinu APC stanica.

Nedavno su primjeri ovakvih interakcija karakterizirani strukturno (Garboczi, Ghosh et al. 1996; Garcia, Degano et al. 1996; Ding, Smith et al. 1998). Kristalografske strukture mišjih i humanih pMHC klase I-TCR kompleksa pokazuju dijagonalnu orijentaciju TCR u odnosu na pMHC ligand i slabu komplementarnost oblika na površini. CD3 petlje dolaze u kontakt isključivo samo s peptidnim ostatkom. Usporedba struktura TCR s ligandom i bez njega također upućuje na postojanje određenog stupnja fleksibilnosti u TCR CDR petljama (Garboczi i Biddison 1999).

Modeli aktiviranja T stanice pokušavaju objasniti kako takve protein-protein interakcije na međupovršini između T stanice i antigen prezentirajuće stanice (APC) iniciraju djelovanja kao što je uništavanje virusno inficirane ciljne stanice. Fizička svojstva TCR-pMHC interakcija uključena su u mnogim takvim modelima kao kritičan parametar. Na primjer, pronađeno je da kvantitativna promjena u brzini disocijacije TCR odgovara kvalitativnoj promjeni u biološkom ishodu djelovanja receptora kao što je potpuna ili djelomična aktivacija T stanica ili antagonizam (Matsui, Boniface et al. 1994; Rabinowitz, Beeson et al. 1996; Davis, Boniface et al. 1998).

Pokazano je da se TCR-pMHC interakcije odlikuju malim afinitetom i relativno sporom kinetikom. Mnoga su istraživanja koristila biosenzorsku tehnologiju kao što je Biocore™ (Willcox, Gao et al. 1999; Wyer, Willcox et al. 1999), koja koristi površinsku plazma rezonanciju (SPR) i omogućuje neposredno mjerenje afiniteta i kinetike protein-protein interakcija u realnom vremenu (Garcia, Scott et al. 1996; Davis, Boniface et al. 1998). Ipak, istraživani su receptori bili ili aloreaktivni TCR ili su pak na aktivnost bili pobuđeni umjetnim imunogenom.

3. Interakcije TCR i CD8 s MHC-peptid kompleksima

Velikoj većini T stanica koje su ograničene na MHC klase I-peptid komplekse za aktivaciju je također potrebno i djelovanje koreceptora CD8, dok je za T stanice ograničene na MHC klase II-peptid komplekse za aktivaciju potrebno djelovanje CD4. Još uvijek nije u potpunosti objašnjena uloga koreceptora u aktivaciji T stanica. Također nisu u potpunosti objašnjeni niti kritički mehanizmi i parametri koji kontroliraju aktivaciju. Pa ipak, CD8 i CD4 posjeduju citoplazmatske domene koje su povezane s kinazom p56Ick koja je uključena u prvu tirozinsku fosforilaciju koja karakterizira aktivaciju T stanice. CD8 je dimerni receptor koji je eksprimiran ili u αα obliku ili, što je češće, u αβ obliku. CD4 je monomer. U CD8 receptoru samo je α lanac povezan s p56Ick.

Nedavna određivanja fizikalnih parametara koji kontroliraju vezanje TCR i CD8 na MHC, uz upotrebu topljivih oblika receptora, pokazala su da vezanje TCR dominira u procesu prepoznavanja. TCR se odlikuje signifikantno većim afinitetom prema MHC nego koreceptori (Willcox, Gao et al. 1999; Wyer, Willcox et al. 1999).

Individualne interakcije receptora s MHC vrlo su kratkotrajne na fiziološkoj temperaturi, tj. 37° C. Poluživot TCR-MHC/peptid interakcija, mjerena s humanim TCR specifičnim za peptid "matriksa" virusa influence prezentiranog pomoću HLA-A*0201 (HLA-A2), iznosi približno 0,7 sekundi. Poluživot interakcija CD8αα s ovim MHC/peptid kompleksom je manje od 0,01 sekunde, tj. barem 18 puta kraći. ;4. Dobivanje topljivih MHC-peptid kompleksa ;Topljivi MHC-peptid kompleksi su prvi puta dobiveni cijepanjem molekula koje se nalaze na površini antigen prezentirajućih stanica pomoću papaina (Bjorkman, Strominger et al. 1985). Iako se ovakvim postupkom dobiva materijal za kristalizaciju, zadnjih je godina ovaj postupak za molekule klase I zamijenjen s postupkom individualnog eksprimiranja teškog i laganog lanca u E. coli iza čega slijedi ponovno smotavanje uz prisustvo sintetičkog peptida (Garboczi, Hung et al. 1992; Madden, Garboczi et al. 1993; Garboczi, Madden et al. 1994; Reid, McAdams et al. 1996; Reid, Smith et al. 1996; Smith, Reid et al. 1996; Smith, Reid et al. 1996; Gao, Tormo et al. 1997; Gao, Gerth et al. 1998). Ovaj postupak ima nekoliko prednosti nad prijašnjim postupcima utoliko što se bolje iskorištenje dobiva uz sniženu cijenu koštanja, identitet peptida se može kontrolirati vrlo točno i konačni je produkt homogeniji. Nadalje, može se lako izvesti eksprimiranje modificiranih teških ili laganih lanaca, na primjer spojenih na proteinsku oznaku. ;5. Topljivi TCR ;Trenutno, ne postoje objavljeni podaci o interakcijama humanog TCR-pMHC, a također niti o istraživanju prirodno selektiranih TCR specifičnih za nativne (npr. virusne) epitope. Već ova činjenica može pokazati poteškoće prilikom dobivanja proteina pogodnih za SPR tj. protina koji su homogeni, monomerni, ispravno smotani, dostupni u miligramskim količinama i stabilni u širem području koncentracija. ;Bio bi napredak kada bi se moglo proizvesti rekombinantni TCR u nemembranski vezanom (ili topljivom) obliku, ne samo radi istraživanja specifičnih TCR-pMHC interakcija već i kao dijagnostičko oruđe za otkrivanje infekcija ili za detekciju markera autoimunih bolesti, ili pak za određivanje učinkovitosti T staničnih vakcina. Topljivi bi se TCR također mogao upotrijebiti za bojanje, na primjer za bojanje stanica za prisustvo određenog antigena virusa prezentiranog na način povezan s MHC. Tome slično, topljivi bi se TCR mogao upotrijebiti za isporuku terapijskih tvari, na primjer citotoksičnog spoja ili imunostimulatornog spoja, do stanica koje prezentiraju određeni antigen. ;Proteine koji se sastoje od više od jedne polipeptidne podjedinice i koji imaju transmembranske domene može biti teško prirediti u topljivom obliku jer su, u mnogim slučajevima, proteini stabilizirani svojim transmembranskim područjem. Ovo je slučaj kod TCR. ;Nekoliko grupa je tek nedavno opisalo dobivanje topljivog TCR. Gledavši općenito, svi ti postupci opisuju krnji oblik TCR koji sadrži ili samo ekstracelularne domene ili ekstracelularne domene i citoplazmatske domene. Prema tome, u svim je slučajevima iz eksprimiranog proteina izbrisana transmembranska domena. Iako mnogi izvještaji pokazuju da TCR dobiven njihovim postupkom može biti prepoznat od strane antitijela specifičnog za TCR (upućujući na to da je dio rekombinantnog TCR, koji je prepoznat od strane antitijela, ispravno smotan), nitko nije bio u mogućnosti dobivanja topljivog TCR uz veliko iskorištenje, a koji je stabilan pri niskim koncentracijama i koji može prepoznati MHC-peptid komplekse. ;Prvi pristup za dobivanje materijala za kristalizaciju koristi se ekspresijom u eukariotske stanice ali je materijal izvanredno skup za proizvodnju (Garcia, Degano et al. 1996; Garcia, Scott et al. 1996). Drugi pristup za dobivanje materijala za kristalizaciju koristi E.coli sustav za ekspresiju, slično kao u postupku koji se prije koristio za MHC-peptid komplekse (Garboczi, Ghosh et al. 1996; Garboczi, Utz et al. 1996). Drugi postupak, u kojem se eksprimira ekstracelularni dio TCR lanaca okrnjenog neposredno prije cisteinskih ostataka koji sudjeluju u stvaranju disulfidnog mosta između lanaca iza čega slijedi ponovno smotavanje in vivo, nije se pokazao općenito upotrebljiv. Čini se da većina ovako dobivenih heterodimernih TCR nije stabilna uslijed niskog afiniteta između α i β lanaca. ;Nadalje, postoji i određeni broj opisa konstrukcijskog dobivanja topljivog TCR. Neki od njih opisuju ekspresiju samo α ili samo β TCR lanca, dobivši tako protein koji ne zadržava svojstvo specifičnog vezanja između MHC i peptida (Calaman, Carson et al. 1993; Ishii, Nakano et al. 1995). Kristali β lanca dobiveni su bez α lanca ili u samostalnom obliku ili u obliku vezanom na superantigen (Boulot, Bentley et al. 1994; Bentley, Boulot et al. 1995; Fields, Malchiodi et al. 1996). ;U drugim se izvještajima opisuju načini ekspresije heterodimernih γ/δ ili α/β TCR (Gregoire, Rebai et al. 1991; Necker, Rebai et al. 1991; Eilat, Kikuchi et al. 1992; Weber, Traunecker et al. 1992; Corr, Slanetz et al. 1994; Ishii, Nakano et al. 1995; Gregoire, Malissen et al. 1996; Romagne, Peyrat et al. 1996). U nekim je slučajevima TCR eksprimiran kao jednolančani spojeni protein (Brocker, Peter et al. 1993; Gregoire, Malissen et al. 1996; Schlueter, Schodin et al. 1996). Slijedeći je način bio ekspresija TCR lanaca kao kimernih proteina spojenih na Ig zglob i stalne domene (Eilat, Kikuchi et al. 1992; Weber, Traunecker et al. 1992). Drugi kimerni TCR proteini eksprimirani su s konstruiranim sljedovima aminokiselina koji oblikuju smotana klupka (engl. coiled-coil) koja posjeduju visoki međusobni afinitet i specifičnost, te tako stabiliziraju α-β kontakte u TCR i povećavaju topljivost. Ovaj su postupak koristili Chang, Bao et al. (1994) koji su zamijenili transmembranski dio proteina s proteinom leucinskog zatvarača (engl. leucine zipper) koji se sastoji od dva peptida sintetiziranih sljedova aminokiselina, jednog kiselinskog peptida i jednog bazičnog peptida, koji svojom specifičnom interakcijom stvaraju heterodimerno smotano klupko. Autori su koristili sustav ekspresije bakulovirusa u eukariotskim stanicama za lučenje heterodimernih TCR proteina. Umjetno stvoreni peptidi leucinskog zatvarača sudjelovali su u heterodimerizaciji TCR α i β lanaca koji su također povezani, neposredno iznad mjesta spajanja peptida zatvarača, s međulančanom disulfidnom vezom. Ipak, ove se tehnike nisu pokazale uspješnima, a ne postoje niti dokazi da opisani topljivi TCR može prepoznati TCR ligand. Slično tome, Golden, Khandekar et al. (1997) opisali su dobivanje heterodimernih receptora T stanice kao spojenih proteina leucinskih zatvarača. Topljivi TCR je eksprimiran u E. coli kao lučeni heterodimer s α-β međulančanom disulfidnom vezom kao u Chang et al. Ponovo nije bilo dokaza da ovaj već smotani TCR heterodimer jest sposoban za interakciju sa svojim ligandom. ;Prema tome postoji potreba za topljivim oblikom membranski vezanog TCR koji je ispravno smotan, pa je sposoban prepoznati svoj nativni ligand. Također bio bi koristan topljivi oblik TCR koji je stabilan tijekom određenog vremenskog perioda, te postupak za njegovo dobivanje u dostatnoj količini. Ovaj izum nastoji udovoljiti neke ili pak sve ovakve zahtjeve. ;Izum ;U jednom svom vidu ovaj izum omogućuje ponovno smotani rekombinantni receptor T stanice (TCR) koji sadrži: ;i) rekombinantni TCR α ili γ lanac ekstracelularne domene koji sadrži prvi heterologni C-terminalni dimerizacijski peptid; i ;ii) rekombinantni TCR β ili δ lanac ekstracelularne domene koji sadrži drugi C-terminalni dimerizacijski peptid koji je specifično heterodimeriziran s prvim dimerizacijskim peptidom, te tako tvori heterodimerizacijsku domenu ;TCR prema ovom izumu koji je, umjesto da je lučen kao heterodimer, ponovno smotan po ekspresiji, konformacijski je nadmoćan topljivim TCR dobivenim prethodnim postupcima. Ova se nadmoć ogleda u njegovoj sposobnosti prepoznavanja MHC-peptid kompleksa. Također je stabilan pri relativno niskim koncentracijama. Može biti stabilan i pri koncentracijama nižim od 1 mg/ml, a poželjno pri oko 10 μg/ml. ;U slijedećem svom vidu ovaj izum omogućuje biološki aktivan rekombinantni receptor T stanice (TCR) koji sadrži: ;i) rekombinantni TCR α ili γ lanac ekstracelularne domene koji sadrži prvi heterologni C-terminalni dimerizacijski peptid; i ;ii) rekombinantni TCR β ili δ lanac ekstracelularne domene koji sadrži drugi C-terminalni dimerizacijski peptid koji je specifično heterodimeriziran s prvim dimerizacijskim peptidom, te tako tvori heterodimerizacijsku domenu. Takav će se TCR specifično vezati na MHC-peptid komplekse, poželjno na način sličan nativnom TCR iz kojeg je i dobiven. ;U svom drugom vidu ovaj izum omogućuje sljedove baza rekombinantnih nukleinskih kiselina koje kodiraju rekombinantne TCR lance kao što je ovdje opisano. Ovakvi sljedovi baza nukleinskih kiselina mogu se izolirati iz klonova T stanica. Alternativno, mogu se proizvesti sintetskim putem na primjer umetanjem heterolognih sljedova baza nukleinskih kiselina u sljedove baza nukleinskih kiselina koje kodiraju TCR lanac ili pak pomoću mutacije (umetanjem, brisanjem ili supstitucijom) sljedova baza nukleinskih kiselina koje kodiraju TCR lanac. Prema tome ovaj izum uključuje u svoj okvir sintetske peptide koji posjeduju aktivnost i/ili specifičnost vezanja kao nativni TCR. ;U još jednom svom vidu ovaj izum omogućuje postupak dobivanja rekombinantnog nemembranski vezanog receptora T stanice koji uključuje: ;ekspresiju rekombinantnog TCR α ili γ lanca ekstracelularne domene koji sadrži prvi heterologni C-terminalni dimerizacijski peptid i rekombinantni TCR β ili δ lanac ekstracelularne domene koji sadrži drugi C-terminalni dimerizacijski peptid koji je specifično heterodimeriziran s prvim dimerizacijskim peptidom, te tako tvori heterodimerizacijsku domenu; i ;ponovno smotavanje lanaca in vitro da bi se dobio TCR heterodimer. ;Rekombinantni TCR prema ovom izumu mogu prepoznati MHC klase I-peptid komplekse i MHC klase II-peptid komplekse. ;Poželjno je da heterodimerizacijska domena rekombinantnog TCR prema ovom izumu jest tzv. "smotano klupko" ili "leucinski zatvarač". Ovi se izrazi upotrebljavaju za opis para helikoidalnih peptida koje karakterizira međusobna specifična interakcija kojom nastaje heterodimer. Ova je interakcija posljedica međusobno komplementarnih hidrofobnih ostataka koji se nalaze na jednoj strani obaju peptida zatvarača. Ovim je peptidima svojstveno da je stvaranje heterodimera mnogo povoljnije nego stvaranje homodimera heliksa. Peptidi leucinskog zatvarača mogu biti sintetizirani ili nativni. Sintetizirani leucini mogu se prirediti u obliku s mnogo većim afinitetom prema vezanju od nativnih peptida leucinskih zatvarača što ne mora nužno biti i njihova prednost. U stvari, poželjan oblik peptida leucinskih zatvarača za upotrebu prema ovom izumu jest nativni peptid leucinskog zatvarača ili pak onaj sa sličnim afinitetom za vezanje kao i nativni. Peptidi leucinskih zatvarača iz c-jun i c-fos proteina primjeri su peptida leucinskih zatvarača s pogodnim afinitetom vezanja. U ostale pogodne peptide leucinskih zatvarača uključuju se oni iz myc i max proteina (Amati, Dalton, et al. 1992). Drugi pogodni peptidi leucinskih zatvarača mogu se lako pripremiti (OʹShea et al. 1993). ;Poželjno je da topljivi TCR prema ovom izumu sadrži peptid leucinskog zatvarača duljine od približno 40 aminokiselina što odgovara heterodimerizacijskoj domeni iz c-jun (α lanac) i c-fos (β lanac) (OʹShea, Rutkowski et al. 1989; OʹShea, Rutkowski et al. 1992; Glover i Harrison 1995). Mogu se koristiti i dulji peptidi leucinskih zatvarača. Kako se čini da specifična heterodimerizacija ostaje sačuvana i u dosta kratkim fragmentima ponekih domena leucinskog zatvarača (OʹShea, Rutkowski et al. 1992), moguće je da bi se slično poboljšanje moglo dobiti i s kraćim c-jun i c-fos fragmentima. Ovakvi kraći fragmenti mogli bi, na primjer, imati i do samo 8 aminokiselina. Prema tome duljina domena leucinskih zatvarača može biti u rasponu od 8 do 60 aminokiselina. ;Molekulski temelji specifičnog sparivanja peptida leucinskih zatvarača dobro su objašnjeni (Landschulz, Johnson et al. 1988; McKnight, 1991), pa stručnjaci na području mogu peptide leucinskih zatvarača prirediti u obliku homodimernih, heterodimernih ili trimernih kompleksa (Lumb i Kim, 1995; Nautiyal, Woolfson et al. 1995; Boice, Dieckmann et al. 1996; Chao, Houston et al. 1996). Priređeni peptidi leucinskih zatvarača ili druge heterodimerizacijske domene većeg afiniteta od c-jun i c-fos peptida leucinskih zatvarača mogu predstavljati poboljšanje pri ekspresiji topljivog TCR u nekim sustavima. Ipak, kako je to potanko objašnjeno u nastavku teksta, kada se topljivi TCR smota in vitro poželjno je da je u pufer za smotavanje uključeno i otapalo da bi se smanjilo stvaranje neproduktivnih proteinskih agregata. Jedno od objašnjenja ove pojave jest da je kinetika smotavanja domena leucinskih zatvarača brža od kinetike TCR lanaca uslijed čega dolazi do dimerizacije nesmotanih α i β lanaca, te tako uzrokuje agregaciju proteina. Usporavanjem procesa smotavanja i inhibicijom agregacije uključivanjem otapala u pufer, protein se može zadržati u otopini sve dok se ne završi smotavanje obje spojene domene. Prema tome, heterodimerizacijske domene s većim afinitetom nego c-jun i c-fos peptidi leucinskih zatvarača mogu zahtijevati i više koncentracije otapala, a da bi se postiglo iskorištenje topljivog TCR usporedljivo s onim za c-jun i c-fos. ;Različiti biološki sustavi koriste mnogobrojne postupke za dobivanje stabilnih homoproteinskih i heteroproteinskih dimera i svaki od tih postupaka, u načelu, pruža mogućnost stvaranja dimerizacijskih domena u genetski modificiranim proteinima. Peptidi leucinskih zatvarača (Kouzarides i Ziff 1989) su vjerojatno najpopularniji dimerizacijski moduli i u širokoj su upotrebi za pripravu genetski proizvedenih dimernih proteina. Tako se peptid leucinskog zatvarača GCN4, protein aktivacije transkripcije iz kvasca Saccharomyces cerevisiae, koristi za usmjeravanje heterodimerizacije brojnih heterolognih proteina (Hu, Newell et al. 1993; Greenfield, Montelione et al. 1998). Poželjna strategija jest upotreba peptida zatvarača za usmjeravanje stvaranja heterodimernih kompleksa kao što su to Jun/Fos par peptida leucinskog zatvarača (de Kruif i Logtenberg 1996; Riley, Ralston et al. 1996). ;Heterodimerizacijske domene rekombinantnog TCR prema ovom izumu nisu ograničene samo na peptide leucinskih zatvarača. Tako se mogu omogućiti i one koje tvore disulfidni most. Alternativno, mogu se omogućiti i one sa SH3 domenama i hidrofobno/prolinski bogatim protudomenama koje su odgovorne za protein-protein interakcije uočene u proteinima uključenim u prijenos signala (Schlessinger 1994). Druge nativne protein-protein interakcije uočene između proteina koji sudjeluju u kaskadi prijenosa signala, osnivaju se na asocijaciji post-translacijski modificiranih aminokiselina i proteinskih modula koji specifično prepoznaju ovakve modificirane ostatke. Ovakve post-translacijski modificirane aminokiseline i proteinski moduli mogu tvoriti heterodimerizacijsku domenu rekombinantnog TCR u skladu s ovim izumom. Primjer ovakvog proteinskog para su receptori fosfatizirani s tirozinom kao što je to receptor faktora epidermalnog rasta ili receptor faktora rasta dobivenog iz plateleta i SH2 domena iz GRB2 (Lowenstein, Daly et al. 1992; Buday i Downward 1993). Kao i u svim područjima znanosti, aktivno se traže novi dimerizacijski moduli (Chevray i Nathans 1992), a sada su uspješno razvijeni i mnogi postupci za dobivanje potpuno umjetnih modula (Zhang, Murphy et al. 1999). U poželjnom obliku rekombinantnog TCR prema ovom izumu nije prisutna međulančana disulfidna veza koja se stvara između dva cisteinska ostatka u nativnim α i β TCR lancima i između nativnih γ i δ TCR lanaca. Ovo se može postići, na primjer, spajanjem dimerizacijskih domena na TCR lance iznad cisteinskih ostataka tako da su ti ostaci isključeni iz rekombinantnog proteina. Alternativno, jedan ili više cisteinskih ostataka može se zamijeniti s drugim aminokiselinskim ostatkom koji ne sudjeluje u stvaranju disulfidne veze. Ovi cisteinski ostaci ne moraju se uvesti jer mogu biti štetni za in vitro smotavanje funkcionalnog TCR. ;Ponovno smotavanje α i β lanaca i γ i δ lanaca ponovno smotanog rekombinantnog TCR prema ovom izumu odvija se in vitro pri uvjetima pogodnim za ponovno smotavanje. U određenom uobličenju rekombinantni TCR s ispravnom konformacijom dobiva se pomoću ponovnog smotavanja otopljenih TCR lanaca u puferu za ponovno smotavanje koji sadrži otapalo, na primjer ureu. Pogodno je da je urea prisutna u koncentraciji od barem 0,1 M ili barem 1 M ili barem 2,5 M ili oko 5 M. Alternativno otapalo koje se može koristiti jest gvanidin pri koncentraciji između 0,1 M i 8 M, poželjno barem 1 M ili barem 2,5 M. Prije ponovnog smotavanja poželjno je uvesti reducirajuću tvar da bi se osigurala potpuna redukcija cisteinskih ostataka. Ukoliko je to potrebno mogu se koristiti i dodatne denaturirajuće tvari kao što je to DTT i gvanidin. Različite denaturirajuće i reducirajuće tvari mogu se koristiti prije ponovnog smotavanja (npr. urea, β-merkaptoetanol). Alternativni redoks parovi mogu se koristiti tijekom ponovnog smotavanja kao što su to cistamin/cisteamin redoks par, DTT ili β-merkaptoetanol/atmosferski kisik i cistein u svojim reduciranim i oksidiranim oblicima. ;Ovdje opisani monomerni TCR može se označiti s odredivom oznakom, na primjer s oznakom koja je pogodna za dijagnostičke svrhe. Tako ovaj izum omogućuje postupak za detekciju MHC-peptid kompleksa, a koji se sastoji od dovođenja u kontakt MHC-peptid kompleksa i TCR koji je, u skladu s ovim izumom, specifičan prema MHC-peptid kompleksu, te detekcija vezanja TCR na MHC-peptid kompleks. U slučaju tetramernog TCR dobivenog biotinilacijom heterodimera, kao odrediva oznaka može se koristiti fluorescentni streptavidin (komercijalno dostupan). Fluorescentno označen tetramer pogodan je za FACS analize kao što je npr. detekcija antigen prezentirajuće stanice koja nosi peptid za koji je TCR specifičan. ;Drugi način na koji se može detektirati topljivi TCR je upotreba antitijela specifičnih za TCR, a naročito upotreba monoklonskih antitijela. Komercijalno su dostupna mnoga antitijela za TCR kao što su to βFI i αFI koji prepoznaju stalni dio β i α lanca. ;Alternativno ili pak dodatno, TCR može biti vezan i na terapijsku tvar koja na primjer može biti toksični dio za, na primjer, upotrebu u uništavanju stanica ili imunostimulirajuća tvar kao što je to interleukin ili citokin. Prema tome ovaj izum omogućuje postupak za isporuku terapijske tvari do ciljane stanice. Ovaj postupak uključuje dovođenje u kontakt potencijalne ciljane stanice i TCR prema ovom izumu pri uvjetima koji omogućuju vezanje TCR na ciljanu stanicu, gdje je rečeni TCR specifičan za MHC-peptid komplekse i povezan s pripadajućom terapijskom tvari. Za određeni slučaj, topljivi TCR može se koristiti za isporuku terapijskih tvari na mjesta nalaženja stanica koje prezentiraju određeni antigen. Na primjer, toksin se može isporučiti na tumor pomažući time njegovo uništenje. Ovo bi moglo biti korisno u mnogim slučajevima, a naročito pri tumorima jer u njima nisu sve stanice antigen prezentirajuće pa ih niti imuno sustav ne može detektirati. Pomoću topljivog TCR spoj se može prenijeti tako da on djeluje lokalno ali ne samo na stanicu na koju je vezan. Tako se u jednom postupku koriste molekule s protiv tumornim djelovanjem vezane na receptore T stanice specifične za antigene tumora. ;Mnogi se toksini mogu upotrijebiti za ovakvu svrhu, na primjer radioaktivni spojevi, enzimi (perforin na primjer) ili kemoterapijske tvari (cis-platin na primjer). Da bi se osiguralo postupno povećanje učinka na željenom mjestu, toksin se može smjestiti unutar liposoma vezanog na streptavidin što omogućuje njegovo polagano otpuštanje. Ovako se sprečavaju štetni učinci tijekom transporta kroz tijelo i osigurava se maksimalan učinak toksina po vezanju TCR na odgovarajuće antigen prezentirajuće stanice. ;Alternativni način označavanja topljivog TCR ili njegovog vezanja na neki drugi dio kao što je to na primjer toksični dio jest uključivanje oznake ili drugog dijela u miješani molekulski multimer. Primjer takvog miješanog molekulskog multimera jest tetramer koji sadrži tri TCR molekule i jednu molekulu peroksidaze. Ovo se može postići miješanjem TCR i enzima u molarnom omjeru 3:1 čime se dobiva tetramerni kompleks, te izolacijom željenog kompleksa od kompleksa koji nemaju željeni udio molekula. Miješane molekule mogu sadržavati bilo koju kombinaciju molekula uz uvjet da steričke smetnje ne utječu ili signifikantno ne utječu na željenu funkciju molekula. Smještaj mjesta vezanja na streptavidinu je pogodan za miješane tetramere jer sterička ometanja nisu vjerojatna. ;Poželjno je da rekombinantni TCR lanci prema ovom izumu imaju fleksibilan poveznik smješten između TCR domene i dimerizacijskog peptida. U pogodne fleksibilne poveznike uključuju se uobičajeni peptidni poveznici koji sadrže glicin, na primjer poveznici koji sadrže glicin i serin. Vjeruje se da je C-terminalno okrnjeni, dakle TCR okrnjen u blizini cisteinskog ostatka koji tvori međulančanu disulfidnu vezu, poželjan jer su α i β lanci, preko ovog ostatka u celularnom TCR, u neposrednoj blizini. Prema tome dostatan je i samo relativno kratki slijed aminokiselina poveznika, a da se omogući neometan prijelaz iz TCR lanaca u heterodimerizacijsku domenu. Poželjno je da se koristi slijed aminokiselina poveznika Pro-Gly-Gly ili Gly-Gly. Ipak sljedovi aminokiselina poveznika mogu se mijenjati. Na primjer, poveznik se uopće ne mora koristiti ili se može svesti na samo jedan ostatak u kojem bi slučaju poželjan ostatak bio glicinski ostatak. Varijacije duljih poveznika u topljivom TCR također bi bile primjenjive uz uvjet da se poveznici mogu zaštiti od napada proteaza što bi dovelo do razdvajanja dimernih peptida iz ekstracelularnih domena TCR uz, tome sljedbeni, gubitak α-β stabilnosti lanaca. ;Topljivi TCR prema ovom izumu nije nužno α-β TCR. Uključene su i druge molekule kao što su γ-δ, α-δ i γ-β TCR molekule, a također i TCR molekule (pre-TCR) koje sadrže stalne alfa lance koji se eksprimiraju samo u ranom razvoju. Pre-TCR specificiraju staničnu liniju koja će eksprimirati α-β receptore T stanice što je u suprotnosti s onim stanicama koje će ekspresirati γ-δ receptore T stanice (za pregled vidjeti Aifantis, Azogui et al. 1998; von Boehmer, Aifantis et al. 1998; Wurch, Biro et al. 1998). Pre-TCR se eksprimira s TCR β lancem sparenim sa stalnim pre-TCR α lancem (Saint Ruf, Ungewiss et al. 1994; Wilson and MacDonald 1995) što se čini da obavezuje stanicu na α-β T staničnu liniju. Prema tome vjeruje se da je uloga pre-TCR važna tijekom timusnog razvoja (Ramiro, Trigueros et al. 1996). ;Ukoliko je to potrebno mogu se uraditi uobičajene modifikacije rekombinantnih proteina prema ovom izumu. One uključuju na primjer mijenjanje nesparenih cisteinskih ostataka u stalnom dijelu β lanca da bi se izbjeglo pogrešno intra ili inter lančano sparivanje. ;Signalni se peptid može isključiti jer on u zrelom receptoru ne služi nikakvoj svrsi niti ne doprinosi sposobnosti vezanja liganda, a moguće je da čak može i spriječiti TCR u prepoznavanju svojeg liganda. U većini slučajeva mjesto uklanjanja signalnog peptida zrelog TCR lanca se pretpostavlja ali ne utvrđuje eksperimentalno. Stvaranje eksprimiranih TCR lanaca koji su nekoliko, tj. do na primjer oko 10 aminokiselina, dulji ili kraći na n-terminalnom kraju nema utjecaja na funkcionalnost topljivog TCR. Mogu se dodati i određeni dodaci koji nisu prisutni u izvornom slijedu aminokiselina proteina. Na primjer, može se dodati kratki slijed aminokiselina određene oznake koja može pomoći prilikom pročišćavanja TCR lanaca uz uvjet da ona ne ometa ispravno strukturiranje i smotavanje TCR mjesta za vezanje antigena. ;Za ekspresiju u E. coli može se proizvesti metioninski ostatak na N-terminalnom polaznom mjestu predskazanog slijeda aminokiselina zrelog proteina čime se onemogućava početak translacije. ;Daleko je od toga da su svi ostaci u promjenjivom dijelu TCR lanaca bitni za specifičnost prema antigenu i funkcionalnost. Prema tome, značajan se broj mutacija može uvesti u tom dijelu a da se ne utječe na specifičnost prema antigenu i funkcionalnost. ;Nasuprot tome, pojedini ostaci uključeni u stvaranje kontakta prema peptidu antigena ili prema HLA polipeptidu teškog lanca, odnosno ostaci koji tvore CDR regije TCR lanaca, mogu se supstituirati s ostacima koji mogu povećati afinitet TCR prema ligandu. Ovakve supstitucije, uzevši u obzir niski afinitet većine TCR prema peptid-MHC ligandima, mogu biti korisne za povećanje specifičnosti i funkcijskog potencijala topljivog TCR. U ovdje danim primjerima određivan je afinitet topljivog TCR prema peptid-MHC ligandima. Ovakva mjerenja mogu se koristiti za utvrđivanje učinka mutacija na TCR i također za identifikaciju TCR koji sadrže supstituente koji povećavaju aktivnost TCR. ;Daleko je od toga da su svi ostaci u stalnim domenama TCR lanaca bitni za specifičnost prema antigenu i funkcionalnost. Prema tome, značajan se broj mutacija koje utječu na specifičnost prema antigenu može uvesti u tom dijelu. U primjeru 14, pokazali smo da dvije aminokiselinske supstitucije u stalnoj domeni TCR β lanca nisu uzrokovale odredive učinke na sposobnost TCR da veže HLA-peptid ligande. ;β lanac celularnog ili nativnog TCR sadrži cisteinske ostatke koji nisu spareni. Mutacija ovih ostataka povećava učinkovitost ponovnog smotavanja topljivog TCR in vitro. Supstitucije cisteinskog ostatka sa serinom ili alaninom pokazuju signifikantno pozitivan učinak na učinkovitost in vitro ponovnog smotavanja. Sličan pozitivan učinak, ili čak i veći, može se uočiti prilikom supstitucija s drugim aminokiselinama. ;Kao što je već prije rečeno, da bi se izbjegli problemi oko ponovnog smotavanja poželjno je da cisteinski ostaci koji stvaraju međulančanu disulfidnu vezu u nativnom TCR nisu prisutni. Pa ipak, kako je raspored tih cisteinskih ostataka u TCR prirodom dan i kako se pokazao funkcionalan u c-jun i c-fos domenama leucinskih zatvarača (OʹShea et al. 1989), ovi se cisteinski ostaci mogu uključiti uz uvjet da se TCR može ponovno smotati. ;Kako stalne domene nisu neposredno uključene u kontakte s peptid-MHC ligandima, mjesto za C-terminalno okrnjenje može se značajno mijenjati bez gubitka funkcionalnosti. Na primjer trebalo bi biti moguće proizvesti funkcionalan topljivi TCR koji uopće ne sadrži stalnu domenu. U načelu, trebalo bi biti jednostavnije eksprimirati i smotati topljivi TCR koji sadrži samo promjenjivi dio ili promjenjivi dio i kratki stalni dio jer bi tako polipeptid bio kraći. Ipak, ovakav pristup nije poželjan. Razlog tome je da bi zahtjev za dodatnom stabilnošću α-β, kroz heterodimerizacijsku domenu, sparenih lanaca bilo teže postići jer bi C-terminali dvaju lanaca bili odvojeni što bi zahtijevalo dulji slijed aminokiselina poveznika. Prednost spajanja heterodimeriziranih domena neposredno prije mjesta na kojem su smješteni cisteini koji tvore međulančanu disulfidnu vezu jest u tome da se α i β lanci drže u neposrednoj blizini u celularnom receptoru, što je i poželjno. Prema tome, spajanjem na opisanom mjestu smanjuje se vjerojatnost distorzije strukture. ;Vjerojatno je da bi se funkcionalan topljivi TCR mogao prirediti i s duljim fragmetom u stalnoj domeni nego što je to ovdje poželjan fragment, na primjer takve stalne domene ne bi morale biti okrnjene neposredno prije cisteina koji tvori međulančanu disulfidnu vezu. Na primjer, mogla bi biti uključena cjelokupna stalna domena s izuzetkom transmembranske domene. U takvom bi slučaju bilo pogodno mutirati cisteinske ostatke koji tvore međulančane disulfidne veze u celularnom TCR. ;Osim što se međulančana stabilnost postiže kroz heterodimerizacijsku domenu, mogu se upotrijebiti i dodatni cisteinski ostaci koji mogu stvarati međulančane disulfidne veze. Jedna od mogučnosti jest da se α i β lanci okrnje u blizini cisteinskih ostataka koji tvore međulančane disulfidne veze, a bez toga da ih se ukloni, te se tako omogući normalno disulfidno vezanje. Druga bi mogućnost bila da se uklone samo transmembranske domene α i β lanaca. Ukoliko su eksprimirani kraći fragmenti α i β lanaca, cisteinski se ostaci mogu uklopiti kao supstituenti na mjestima onih aminokiselina koje su uslijed smotavanja dvaju lanaca dovedena u neposrednu blizinu, te tako omogućiti stvaranje disulfidnih veza. ;Pročišćavanje TCR može se postići na mnogo različitih načina. Mogu se koristiti različiti oblici ionske izmjene ili drugi načini za pročišćavanje proteina kao što su gel filtracijska kromatografija ili afinitetna kromatografija. ;U postupku dobivanja rekombinantnog TCR prema ovom izumu, učinkovitost smotavanja može se također povećati i dodatkom određenih drugih proteinskih spojeva, na primjer dodatkom proteina pratioca (engl. chaperon), u smjesu za ponovno smotavanje. Poboljšanje ponovnog smotavanja postignuto je propuštanjem proteina kroz kolone s imobiliziranim mini-pratiocima (Altamirano, Golbik et al. 1997; Altamirano, Garcia et al. 1999). ;Osim onih opisanih u primjerima, mogući su i alternativni postupci za biotinilaciju TCR. Na primjer može se koristiti i kemijska biotinilacija. Alternativne biotinilacijske oznake mogu se koristiti, iako su određene aminokiseline u slijedu biotinske oznake bitne (Schatz et al. 1993). Može se također varirati i smjesa za biotinilaciju. Enzimi zahtijevaju Mg-ATP i nisku ionsku jakost iako se oba ova uvjeta mogu mijenjati npr. može se koristiti i veća ionska jakost i dulje vrijeme za reakciju. Moguća je upotreba i drugih molekula osim avidina ili streptavidina za dobivanje multimera TCR. Bila bi pogodna svaka molekula koja veže biotin na multivalentni način. Alternativno može se koristiti i potpuno drugačiji poveznik (kao što je polihistidinska oznaka na keliranom niklovom ionu (Quiagen Product Guide 1999, poglavlje 3 "Protein Exspression, Purification, Detection and Assay" str. 35-37). Poželjno je da je oznaka smještena prema C-terminalu proteina da bi se steričke smetnje pri interakciji s potencijalnim peptid-MHC kompleksom svele na minimum. ;U primjere pogodnih ciljanih MHC-peptid za TCR prema ovom izumu uključuju se, ali nisu na njih ograničeni, virusni epitopi kao što su HTLV-1 epitopi (npr. Tax peptidi ograničeni na HLA-A2; HTLV-1 je povezan s leukemijom), HIV epitopi, EBV epitopi, CMV epitopi, epitopi melanoma i drugi epitopi specifični za kancer; i epitopi povezani s autoimunim poremećajima kao što je to reumatski artritis. ;Broj bolesti koje je moguće liječiti može se i povećati uzevši u obzir mogućnost ciljane isporuke koja je omogućena specifičnostima topljivog TCR. ;Mogućnost isporuke lijeka u neposrednu blizinu inficirane stanice predstavlja poboljšanje u tretmanu virusnih bolesti za koje postoje lijekovi npr. HIV, SIV, EBV, CMV. U slučaju kancera, isporuka u neposrednoj blizini tumora ili metastaza, povećala bi učinak toksina ili imunostimulatora. Kod autoimunih bolesti, lijekovi za imunosupresiju mogli bi se lagano otpuštati što omogućuje lokalni učinak tijekom duljeg vremena dok se istovremeno minimalno utječe na ukupni imuno kapacitet subjekta. U prevenciji odbacivanja transplantata na isti se način može optimizirati učinak tvari za imunosupresiju. Prilikom isporuke vakcina, antigen iz vakcine se može isporučiti u neposrednu blizinu antigen prezentirajuće stanice te se time povećava učinak antigena. Ovakav postupak može se koristiti i u svrhu vizualizacije. ;Poželjna obličja svakog vida ovog izuma su kao i za svaki od drugih vidova mutatis mutandis. Ovdje spomenuti prethodni dokumenti s područja dani su u zakonski dozvoljenom okviru. ;Ovaj je izum nadalje opisan u slijedećim primjerima koji ne ograničavaju okvir izuma ni na koji način. ;U nastavku su dana objašnjenja popratnih crteža u kojima: ;Slika 1 predstavlja shematski prikaz spojenog proteina receptor T stanice-leucinski zatvarač. Svaki se lanac sastoji od dvije domene superfamilije imunoglobulina, od kojih je jedna promjenjiva (V) i druga stalna (C). Stalna domena je okrnjena neposredno do N-terminala unutar lančanog cisteinskog ostatka i pomoću kratkog poveznika C-terminalno spojena na motiv hetreodimerizacijskog leucinskog zatvarača iz c-Jun (α) ili c-Fos (β) koji se sastoji od oko 40 aminokiselina. I α-Jun i β-Fos sadrže dvije međulančane disulfidne veze te se sparuju potpuno nekovalentnim kontaktima. Alfa je lanac kraći od beta uslijed manje stalne domene. ;Slika 2 je fotografija reducirajuće/nereducirajuće gel analize heterodimernog receptora JM22zip. Jednaki uzorci pročišćenog TCR-zatvarač napunjeni su u 15 % akrilamid SDS gel ili pri reducirajućim uvjetima (linija 2) ili pri nereducirajućim uvijetima (linija 4). Proteini markeri prikazani su u liniji 2 i 3. Molekulska masa prikazana je u kilodaltonima. Pri oba uvjeta nekovalentno asocirani heterodimer se disocirao u alfa i beta lance. U liniji 4 svaki se lanac giba s većom mobilnosti i bez razdvajanja vrpci, što ukazuje da je prisutna samo jedna vrsta disulfidnog vezanja. To je u skladu s ispravnim stvaranjem disulfidne veze. ;Slika 3 je graf koji prikazuje specifično vezanje JM22zip TCR na HLA-A2 Flu matriksa (M58-66) komplekse. HLA-A2 kompleksi, ponovno smotani oko pojedinačnog peptida i biotinilirani na β2-mikroglobulinu, imobilizirani su na trima streptavidinom obloženim protočnim ćelijama: 3770 rezonantnih jedinica (RU) HLA-A2 POL kontrole na protočnoj ćeliji (FC) 3, i dva različita nivoa HLA-A2 M58-66 FLU (2970 RU na FC1 i 4960 RU na FC2). JM22zip je sekvencijski injektiran u topljivu fazu preko triju protočnih ćelija pri koncentraciji od 43 μM tijekom 60 sekundi. Tijekom injektiranja uočeno je povećanje odgovora iznad bazne linije i to u obje protočne ćelije obložene s HLA-A2 FLU. Navedeno povećanje iznosilo je približno 1000 RU i 700 RU specifičnog vezanja JM22zip na protočne ćelije 1 i 2. ;Slika 4 prikazuje sljedove baza sintetskih DNA klica korištenih za umnožavanje "sidra" (engl. "anchor") TCR gena. Podvučena su mjesta za DNA restrikcijske enzime koja su korištena za kloniranje. A: poli-C "klica sidra". B: specifična klica stalnog dijela lanca α TCR. C: specifična klica stalnog dijela lanca β TCR. ;Slika 5 prikazuje sljedove baza sintetskih DNA klica korištenih za PCR umnožavanje DNA fragmenata koji kodiraju područje smotanog klupka ("leucinskog zatvarača") iz c-jun i c-fos duljine 40 aminokiselina. Podvučena su mjesta za DNA restrikcijske enzime koja su korištena za kloniranje. A: c-jun 5ʹ klica. B: c-jun 3ʹ klica. C: c-fos 5ʹ klica. D: c-fos 3ʹ klica. ;Slika 6 prikazuje jednu za drugom sljedove baza DNA i sljedove aminokiselina (jednoslovni kod) c-fos i c-jun fragmenata spojenih na TCR (umetci na pBJ107 i pBJ108). A: c-jun leucinski zatvarač spojen na TCR α lance. B: c-fos leucinski zatvarač spojen na TCR β lance. ;Slika 7 prikazuje sljedove baza sintetskih DNA klica korištenih za mutaciju nesparenih cisteinskih ostataka na TCR β lancima. Klice su konstruirane za upotrebu u "Quickchange™" postupku za mutagenezu (Stratagene). A: mutacija cisteina u serin, napredna (smislena) klica, pokazuje sljedove aminokiselina i mutaciju. B: mutacija cisteina u serin, nazadna (besmislena) klica. C: mutacija cisteina u alanin, napredna (smislena) klica, pokazuje sljedove aminokiselina i mutaciju. D: mutacija cisteina u alanin, nazadna (besmislena) klica. ;Slika 8 je shematski prikaz TCR-zatvarač spojenog proteina. Četiri imunoglobulinske domene su naznačene kao kupole s prikazanim međulančanim disulfidnim mostovima između međusobno odgovarajućih parova cisteinskih ostataka. Brojevi označuju poziciju aminokiseline u lancima zrelog receptora T stanice. Uslijed manje varijacije u duljini lanaca po rekombinaciji, duljina lanaca može ponešto varirati između različitih TCR. Ostaci umetnuti u sljedove aminokiselina poveznika označeni su jednim slovom. ;Slika 9 prikazuje sljedove baza sintetskih DNA klica korištenih za PCR umnožavanje TCR α i β lanaca. Podvučena su mjesta za DNA restrikcijske enzime, te su, iznad sljedova baza naprednih klica, označeni sljedovi aminokiselina koje odgovaraju TCR lancima. Tihe DNA mutacije koje se odnose na sljedove baza TCR gena i na druge sljedove baza DNA koji ne odgovaraju TCR genima prikazane su malim slovima. A: 5ʹ PCR klica za humani Vα10,2 lanac JM22 na peptid matriksa virusa influence-HLAA0201 ograničenog TCR. B: 5ʹ PCR klica za humani Vβ17 lanac JM22 na peptid matriksa virusa influence-HLA-A0201 ograničenog TCR. C: 5ʹ PCR klica za mišji Vα4 lanac na peptid nukleoproteina influence-H2-Db ograničenog TCR. D: 5ʹ PCR klica za mišji Vβ11 lanac na peptid nukleoproteina influence-H2-Db ograničenog TCR. E: 5ʹ PCR primer za humani Vα23 lanac 003 na gag peptid HIV-1-HLA-A0201 ograničenog TCR. F: 5ʹ PCR klica za humani Vβ5,1 lanac 003 na gag peptid HIV-1-HLA-A0201 ograničenog TCR. G: 5ʹ PCR klica za humani Vα2,3 lanac A6 na tax peptid HTLV-1-HLA-A0201 ograničenog TCR. H: 5ʹ PCR klica za humani Vβ12,3 lanac A6 na tax peptid HTLV-1-HLA-A0201 ograničenog TCR. I: 5ʹ PCR klica za humani Vα17,2 lanac B7 na tax peptid HTLV-1-HLA-A0201 ograničenog TCR. J: 5ʹ PCR klica za humani Vβ12,3 lanac B7 na tax peptid HTLV-1-HLA-A0201 ograničenog TCR. K: 3ʹ PCR klica za humane Cα lance, općenito primjenjivo. L: 3ʹ PCR klica za humane Cβ lance, općenito primjenjivo. ;Slika 10 prikazuje predskazani slijed aminokiselina proteina (jednoslovni kod, na vrhu) i slijed baza DNA (na dnu) topljivog HLA-A2/flu matriksa ograničenog TCR α lanca iz JM22 spojenog na domenu "leucinskog zatvarača" c-jun. Mutacije uvedene na 5ʹ kraju slijeda baza DNA da bi se unaprijedila ekspresija gena u E. coli, te slijed aminokiselina poveznika između sljedova baza TCR i c-jun naznačeni su malim slovima. ;Slika 11 prikazuje predskazani slijed aminokiselina proteina (jednoslovni kod, na vrhu) i slijed baza DNA (na dnu) topljivog HLA-A2/flu matriksa ograničenog TCR β lanca iz JM22 spojenog na domenu "leucinskog zatvarača" c-fos. Slijed aminokiselina poveznika između sljedova baza TCR i c-Fos naznačen je malim slovima. ;Slika 12 prikazuje predskazani slijed aminokiselina proteina (jednoslovni kod, na vrhu) i slijed baza DNA (na dnu) topljivog H2-Db/nukleoprotein virusa influence ograničenog TCR α lanca iz mišjeg receptora F5 spojenog na domenu "leucinskog zatvarača" c-jun. Mutacije uvedene na 5ʹ kraju slijeda baza DNA da bi se unaprijedila ekspresija gena u E. coli, te slijed aminokiselina poveznika između sljedova baza TCR i c-jun naznačeni su malim slovima. ;Slika 13 prikazuje predskazani slijed aminokiselina proteina (jednoslovni kod, na vrhu) i slijed baza DNA (na dnu) topljivog H2-Db/nukleoprotein virusa influence ograničenog TCR β lanca iz mišjeg receptora F5 spojenog na domenu "leucinskog zatvarača" c-fos. Slijed aminokiselina poveznika između sljedova baza TCR i c-fos naznačen je malim slovima. ;Slika 14 prikazuje predskazani slijed aminokiselina proteina (jednoslovni kod, na vrhu) i slijed baza DNA (na dnu) topljivog HLA-A2/HIV-1 gag ograničenog TCR α lanca iz pacijentovog 003 spojenog na domenu "leucinskog zatvarača" c-jun. Mutacije uvedene na 5ʹ kraju slijeda baza DNA da bi se unaprijedila ekspresija gena u E. coli, te slijed aminokiselina poveznika između sljedova baza TCR i c-jun naznačeni su malim slovima. ;Slika 15 prikazuje predskazani slijed aminokiselina proteina (jednoslovni kod, na vrhu) i slijed baza DNA (na dnu) topljivog HLA-A2/HIV-1 gag ograničenog TCR β lanca iz pacijentovog 003 spojenog na domenu "leucinskog zatvarača" c-fos. Slijed aminokiselina poveznika između sljedova baza TCR i c-fos naznačen je malim slovima. ;Slika 16 prikazuje predskazani slijed aminokiselina proteina (jednoslovni kod, na vrhu) i slijed baza DNA (na dnu) topljivog HTLV-1 tax/HLA-A2 ograničenog TCR α lanca A6 klona (Garboczi, Utz et al. 1996; Ghosh et al. 1996) spojenog na domenu "leucinskog zatvarača" c-jun. Mutacije uvedene na 5ʹ kraju slijeda baza DNA da bi se unaprijedila ekspresija gena u E. coli, te slijed aminokiselina poveznika između sljedova baza TCR i c-jun naznačeni su malim slovima. ;Slika 17 prikazuje predskazani slijed aminokiselina proteina (jednoslovni kod, na vrhu) i slijed baza DNA (na dnu) topljivog HTLV-1 tax/HLA-A2 ograničenog TCR β lanca iz klona A6 (Garboczi, Utz et al. 1996; Ghosh et al. 1996) spojenog na domenu "leucinskog zatvarača" c-fos i oznaku za obilježavanje s biotinom koja je supstitucija za BirA (Barker and Campbell, 1981; Barker and Campbell, 1981; Howard, Show et al. 1985; Shatz, 1993; OʹCallaghan, Byford, 1999). Slijed aminokiselina poveznika između sljedova baza TCR i c-fos naznačen je malim slovima. Mutacije slijeda baza DNA kojima se cisteinski ostatak supstituira s alaninskim ostatkom označene su podebljanim i podcrtanim oznakama. ;Slika 18 prikazuje predskazani slijed aminokiselina proteina (jednoslovni kod, na vrhu) i slijed baza DNA (na dnu) topljivog HTLV-1 tax/HLA-A2 ograničenog TCR α lanca iz klona M10B7/D3 (Ding et al. 1998) spojenog na domenu "leucinskog zatvarača" c-jun. Slijed aminokiselina poveznika između slijeda baza TCR i c-jun naznačen je malim slovima. ;Slika 19 prikazuje predskazani slijed aminokiselina proteina (jednoslovni kod, na vrhu) i sljedove baza DNA (na dnu) topljivog HTLV-1 tax/HLA-A2 ograničenog TCR β lanca iz klona M10B7/D3 (Ding et al. 1998) spojenog na domenu "leucinskog zatvarača" c-fos i oznaku za obilježavanje s biotinom koja je supstitucija za BirA. Slijed aminokiselina poveznika između slijeda baza TCR i c-fos naznačen je malim slovima. Mutacije slijeda baza DNA kojima se alaninski ostatak supstituira s cisteinskim ostatkom označene su podebljanim i podcrtanim oznakama. Dvije tihe mutacije (P-G kodoni) uvedene u svrhu kloniranja i za uklanjanje Xmal restrikcijskog mjesta također su označene malim slovima. ;Slika 20 prikazuje predskazani slijed aminokiselina proteina (jednoslovni kod, na vrhu) i slijed baza DNA (na dnu) mutiranog topljivog HTLV-1 tax/HLA-A2 ograničenog TCR β lanca iz klona A6 (Garboczi, Utz et al. 1996; Garboczi, Ghosh et al. 1996) domenu "leucinskog zatvarača" c-fos i oznaku za obilježavanje s biotinom koja je supstitucija za BirA (Barker and Campbell, 1981; Barker and Campbell, 1981; Howard, Show et al. 1985; Shatz, 1993; OʹCallaghan, Byford, 1999). Slijed aminokiselina poveznika između slijeda baza TCR i c-fos naznačene su malim slovima. Mutacije slijeda baza DNA kojima se cisteinski ostatak supstituira s alaninskim ostatkom označene su podebljanim i podcrtanim oznakama. Na ovaj su način označene također i supstitucija asparaginskog ostatka s aspartatnom kiselinom i mutacije u stalnom dijelu koje nisu imale odredivih učinaka na funkcionalnost topljivog TCR. ;Slika 21 prikazuje predskazani slijed aminokiselina proteina (jednoslovni kod, na vrhu) i slijed baza DNA (na dnu) spojenih parova c-fos-oznaka za obilježavanje s biotinom korištenih za TCR β lance. Mjesta prepoznavanja DNA restrikcijskih enzima su podvučena i označene su granice dviju spojenih domena. Slijed aminokiselina poveznika prikazana je malim slovima. ;Slika 22 prikazuje slijed baza sintetske DNA klice korištene za PCR umnožavanje fragmenta leucinskog zatvarača Vβ-c-fos iz humanog JM22 peptida matriksa influence-HLA-A0201. ;Slika 23 je niz fotografija gelova. a. Priprava denaturiranog proteina za TCR specifičnog za kompleks 003 HIV gag peptid-HLA-A2, analiziranog pomoću SDS-PAGE. Linija 1: markeri širokog raspona molekulskih masa (Bio-Rad), linije 2 & 3: bakterija po indukciji ekspresije proteina s 0,5 mM IPTG, linije 4 & 5: pročišćena inkluzijska tijela otopljena u 6 M gvanidinskom puferu. b. Priprava denaturiranog proteina za biotinski označeni TCR specifičan za kompleks peptid matriksa influence-HLA-A2, analiziranog pomoću SDS-PAGE. Linija 1: markeri širokog raspona molekulskih masa (Bio-Rad), linije 2 & 3: pročišćena inkluzijska tijela za α- & β-lance, otopljena u 6 M gvanidinskom puferu. c. Priprava denaturiranog proteina za biotinski označeni TCR specifičan za kompleks HTLV tax peptid-HLA-A2, analiziranog pomoću SDS-PAGE. Linija 1 & 5: markeri širokog raspona molekulskih masa (Bio-Rad), linije 2, 3 & 4: ekspresija α-, β- & mutiranih β-lanaca u bakteriji po induciranju ekspresije pomoću 0,5 mM IPTG, linije 6, 7 & 8: pročišćena inkluzijska tijela u α-, β- & mutirane β-lance, otopljena u 6 M gvanidinskom puferu. ;Slika 24 je kromatogram koji prikazuje eluaciju JM22z heterodimera iz POROS 10HQ kolone za ionsku izmjenu. Crtkana linija prikazuje vodljivost koja je indikator koncentracije natrijeva klorida, a puna linija prikazuje optičku gustoću pri 280 nm koja je indikator koncentracije proteina u eluatu. Za daljnju su analizu uzete one frakcije proteina koje odgovaraju piku na slici. Umetak na slici prikazuje kromatogram eluacije pročišćenog JM22z iz Superdex 200 HR kolone. Strelice pokazuju kalibraciju kolone pomoću proteina poznatih molarnih masa. Prema usporedbi s tim proteinima ponovno smotani JM22z ima masu od približno 74 kDA, što je u skladu s heterodimernim proteinom. ;Slika 25 je fotografija koja prikazuje elektroforezu (Coomassie-obojen) pročišćenog JM22z proteina na SDS-poliakrilamid gelu. Linija 1 & 3: uobičajeni proteini poznatih molekulskih masa (kao što je označeno), linija 2: JM22z protein tretiran s puferom SDS-uzorak koji je sadržavao reducirajuću tvar (DTT), prije punjenja, linija 4: JM22z protein tretiran s puferom SDS-uzorak koji nije sadržavao reducirajuću tvar. ;Slika 26 a. Pročišćavanje ponovno smotanog biotinski označenog TCR specifičnog za kompleks peptid matriksa influence-HLA-A2. i. Kromatogram eluacije proteina iz POROS 10 HQ kolone. Linija x pokazuje absorbanciju pri 280 nm, dok linija y označava vodljivost (mjeru gradijenta natrijeva klorida korištenog za eluiranje proteina). Frakcijski brojevi naznačeni su vertikalnim linijama ii. SDS-PAGE frakcija eluiranih iz kolone kao u i. Linija 1 sadrži markere širokog raspona molekulskih masa (Bio-Rad) i linije 2-13 sadrže 5 μl frakcija 6-15. iii. SDS-PAGE analiza frakcija uzetih iz i. koje sadrže biotinski označeni flu-TCR. Linija 1: markeri širokog raspona molekulskih masa (Bio-Rad), linija 2: biotinski označeni flu-TCR protein. b. Pročišćavanje ponovno smotanog biotinski označenog TCR specifičnog za kompleks HTLV-tax peptid-HLA-A2. i. Kromatogram eluacije proteina iz POROS 10 HQ kolone. Linija x označava absorbanciju pri 280 nm i linija y označava vodljivost (mjeru gradijenta natrijeva klorida upotrebljenog za eluiranje proteina). Frakcijski brojevi naznačen su vertikalnim linijama. ii. SDS-PAGE frakcija eluiranih iz kolone kao u i. Linija 1 sadrži markere širokog raspona molekulskih masa (Bio-Rad) i linije 2-10 sadrže 5 μl frakcija 3-11. iii. SDS-PAGE analiza frakcija uzetih iz i. koje sadrže biotinski označeni tax-TCR. Linija 1: markeri širokog raspona molekulskih masa (Bio-Rad), linija 2: biotinski označeni tax-TCR protein, linija 3: mutirani biotinski označeni tax-TCR protein. ;Slika 27 je kromatogram koji prikazuje eluaciju biotinski označenog topljivog TCR po biotinilaciji s BirA enzimom, iz Superdex 200 HR kolone uravnotežene s PBS. Biotinski označeni TCR se izeluira tijekom oko 15-16 minuta, a slobodni biotin tijekom oko 21 minute. Za daljnju su analizu uzete frakcije s biotinski označenim topljivim TCR. ;Slika 28 je niz fotografija gelova. Određivanje stupnja biotinilacije TCR. a. SDS-PAGE ponovno smotanih TCR i priprema inkluzijskih tijela. Linija 1: markeri širokog raspona molekulskih masa (Bio-Rad), linija 2: biotinski označeni flu-TCR, linija 3: biotinski označeni tax-TCR, linija 4: biotinski označeni mutant tax-TCR, linija 5: HIV gag-TCR, (neoznačen s biotinom); b. Western upijanje (engl. blot) gela istovjetnog s a. osim što su markeri označeni s biotinom (Bio-Rad). Bojanje je izvedeno s avidin-HRP konjugatom da bi biotinski označeni proteini postali vidljivi, a vizualizacija je obavljena pomoću Opti-4CN (Bio-Rad). ;Slika 29 prikazuje vezanje JM22z na različite HLA-A2-peptid komplekse. (umetak a) Specifičnost interakcije između JM22z i HLA-A2-flu pokazana je usporedbom SPR odgovora dobivenog prolaskom TCR iznad protočnih ćelija obloženih s 1900 RU HLA-A2-flu i odgovora dobivenog prolaskom TCR iznad dvaju drugih protočnih ćelija od kojih je jedna obložena s 4200 RU HLA-A2-pol, a druga s 4300 RU CD5. Pozadinski odgovori pri različitim koncentracijama JM22z mjereni su na 1700 RU HLA-A2-pol (a). Vrijednost specifičnosti mjerene na 1900 RU HLA-A2-flu umanjena je za iznos pozadinske vrijednosti (b) i prikazana kao funkcija koncentracije (c). Kd od 13 μM, određena nelinearnom regresijom u skladu je s Kd od 12 μM izračunatom na osnovi Scatchard prikaza istih podataka. ;Slika 30 je graf koji prikazuje rezultate Biacore 2000™ analiza divljeg tipa i mutanta topljivog biotinski označenog tax TCR. 5 μl divljeg tipa tax TCR koncentracije 2,2 mg/ml, te potom mutanta tax TCR koncentracije 2,4 mg/ml propušteno je preko četiri tipa protočnih ćelija na čijim su površinama bili vezani slijedeći proteini: A: tax-pMHC kompleks, B/C: flu-pMHC kompleks, D: OX68 kontrolni protein. Oba tipa proteina, divlji i mutirani, podjednako se vezala na specifični pMHC kompleks. ;Slika 31 pokazuje učinak vezanja topljivog CD8aa na vezanje topljivog TCR na isti HLA-A2-flu kompleks. (A) TCR ili TCR uz 120 μM topljivog CD8 injektirano je u kontrolnu protočnu ćeliju obloženu s 4100 RU određenog nevažnog proteina (CD5) i u kontrolnu protočnu ćeliju obloženu s 4700 RU HLA-A2-flu. Prikazani su podaci za ravnotežne vrijednosti odgovora, izračunati po oduzimanju pozadinske vrijednosti, za različite koncentracije samostalnog TCR (neobojani kružići) ili za TCR u kombinaciji s 120 μM topljivog CD8 (obojani kružići). Također su prikazane vrijednosti i za samostalni CD8 (neobojani trokuti), te izračunate razlike između TCR + CD8 i samostalnog TCR (neobojani kvadratići). (B) prikazana je vremenska ovisnost odgovora na 4700 RU iz imobiliziranog HLA-A2-flu za koncentraciju od 49 μM samostalnog TCR (neobojani kružići) ili u kombinaciji s 120 μM CD8 (obojani kružići) pri 25° C i brzinom protoka od 5 μl/min (vrijednosti su korigirane za iznos pozadine mjerene na 4100 RU imobiliziranog CD5); istovremeno vezanje CD8 nije utjecalo na brzinu otpuštanja TCR. ;Slika 32 prikazuje slijed aminokiselina proteina (jednoslovni kod, na vrhu) i slijed baza DNA (na dnu) topljivog HLA-A2/flu matriksa ograničenog TCR alfa lanca iz JM22 spojenog na domenu "leucinskog zatvarača" iz c-jun. Malim su slovima označene mutacije za pospješenje ekspresije gena u E. coli uvedene na 5ʹ kraju slijeda baza DNA i slijed aminokiselina poveznika između slijeda baza TCR i c-jun. ;Slika 33 prikazuje slijed aminokiselina proteina (jednoslovni kod, na vrhu) i slijed baza DNA (na dnu) topljivog HLA-A2/flu matriksa ograničenog TCR beta lanca iz JM22 spojenog na domenu "leucinskog zatvarača" iz c-fos. Malim je slovima označen slijed aminokiselina poveznika između slijeda baza TCR i c-fos. Mutacije slijeda baza DNA koje supstituiraju serinski ostatak s cisteinskim označene su podebljano i podcrtano. Ove mutacije pospješuju učinak smotavanja TCR. ;Slika 34 prikazuje slijed aminokiselina proteina (jednoslovni kod, na vrhu) i slijed baza DNA (na dnu) topljivog HLA-A2/flu matriksa ograničenog TCR beta lanca iz JM22 spojenog na domenu "leucinskog zatvarača" iz c-fos, te oznaku za obilježavanje s biotinom koja je supstrat za BirA. Malim je slovima označen slijed aminokiselina poveznika između sljedova baza TCR i c-fos i između c-fos i oznake za obilježavanje s biotinom. Mutacije slijeda baza DNA koje supstituiraju serinski ostatak s cisteinskim označene su podebljano i podcrtano. Ove mutacije pospješuju učinak smotavanja TCR. ;Slika 35 je shematski dijagram spojenog proteina TCR-zatvarač-oznaka za obilježavanje s biotinom. ;Slika 36. Eluacija smotanog TCR iz POROS 10 HQ kolone uz pomoć gradijenta natrijeva klorida. TCR se izeluira kao samostalni pik pri približno 100 mM NaCl. Za biotinilaciju su uzete frakcije proteina s OD (280 nm) višom od 0,1, te su potom koncentrirane. ;Slika 37. Odvajanje biotinski označenog TCR od slobodnog biotina pomoću gel filtracije na Superdex 200HR 10/30 koloni (Pharmacia). TCR-biotin se izeluira pri oko 15 ml što odgovara molekulskoj masi od 69 kDa. (Uobičajeni proteini i njihovi eluacijski volumeni: tiroglobulin (669 kDa) 10,14 ml, apoferitin (443 kDa) 11,36 ml, beta-amilaza (200 kDa) 12,72 ml, BSA dimer (134 kDa) 13,12 ml, BSA monomer (67 kDa) 14,93 ml, ovalbumin (43 kDa) 15,00 ml, kimotripsinogen A (25 kDa) 18,09 ml, Rnaza A (13,7 kDa) 18,91 ml). ;Slika 38 prikazuje slijed aminokiselina proteina (jednoslovni kod, na vrhu) i slijed baza DNA (na dnu) topljivog HTLV-1 Tax/HLA-A2 ograničenog TCR alfa lanca iz klona A6 (Garboczi et al. 1996; Garboczi et al. 1996) spojenog na domenu "leucinskog zatvarača" iz c-jun. Malim su slovima označene mutacije za pospješenje ekspresije gena u E. coli uvedene na 5ʹ kraju slijeda baza DNA i slijed aminokiselina poveznika između slijeda baza TCR i c-jun. ;Slika 39. prikazuje slijed aminokiselina proteina (jednoslovni kod, na vrhu) i slijed baza DNA (na dnu) topljivog HTLV-1 Tax/HLA-A2 ograničenog TCR beta lanca iz klona A6 (Garboczi et al. 1996; Garboczi et al. 1996) spojenog na domenu "leucinskog zatvarača" iz c-fos i oznaku za obilježavanje s biotinom koja je supstrat za BirA. Malim je slovima označen slijed aminokiselina poveznika između slijeda baza TCR i c-fos. Mutacije slijeda baza DNA koje supstituiraju alaninski ostatak s cisteinskim označene su podebljano i podcrtano. ;Slika 40. prikazuje slijed aminokiselina proteina (jednoslovni kod, na vrhu) i slijed baza DNA (na dnu) topljivog HTLV-1 Tax/HLA-A2 ograničenog TCR alfa lanca iz klona M10B7/D3 (Ding et al. 1998) spojenog na domenu "leucinskog zatvarača" iz c-jun. Malim je slovima označen slijed aminokiselina poveznika između slijeda baza TCR i c-jun. ;Slika 41 prikazuje slijed aminokiselina proteina (jednoslovni kod, na vrhu) i slijed baza DNA (na dnu) topljivog HTLV-1 Tax/HLA-A2 ograničenog TCR beta lanca iz klona M10B7/D3 (Ding et al. 1998) spojenog na domenu "leucinskog zatvarača" iz c-fos i oznaku za obilježavanje s biotinom koja je supstrat za BirA. Malim je slovima označen slijed aminokiselina poveznika između slijeda baza TCR i c-fos. Mutacije slijeda baza DNA koje supstituiraju alaninski ostatak s cisteinskim označene su podebljano i podcrtano. Dvije tihe mutacije (P-G kodoni) uvedene zbog kloniranja i uklanjanja Xmal restrikcijskog mjesta također su označena malim slovima. ;PRIMJERI ;U narednim primjerima korišteni su slijedeći postupci i materijali. ;Materijali ;Restrikcijski enzimi (Ndel, BamHI, HindIII, Bsu36I, Xmal) od New England Biolabs. ;Tris pH 8,1 je pripravljen kao 2 M ishodna otopina dobivena iz Tris baza i Tris-HCl uzetih u jednakim dijelovima od USB. ;EDTA (Sigma) je pripremljena kao 0,5 M ishodna otopina, a pH je podešen na 8,0 pomoću 5 M NaOH (Sigma). ;Glutation u oksidiranim i reduciranim oblicima od Sigma. ;Cistamin i cisteamin od Sigma. ;Natrijev klorid od USB pripravljen je kao 4 M ishodna otopina. ;Miniprep probor za pročišćavanje plazmida od Quiagen. ;PCR pribor za pročišćavanje od Quiagen. ;DTT od Sigma. ;Gvanidin od Fluka. ;Urea od Sigma. ;RPMI podloga od Sigma. ;PBS je pripremljen iz tableta od Oxoid. ;Glicerol od BDH. ;Opći postupci ;Bakterijska podloga (TYP podloga) pripremljena je kako slijedi: ;160 g ekstrakta kvasca (Difco), 160 g triptona (Difco), 50 g NaCl (USB) i 25 g K2HPO4 (BDH) otopljeno je u 2 l demineralizirane vode. Alikvoti od po 200 ml ove otopine stavljeni su u 10 x 2 l tikvice s okruglim dnom i nadopunjeni do 1 l dodatkom 800 ml demineralizirane vode. Boce su prekrivene s četiri sloja aluminijske folije, označene i stavljene u autoklav. Nakon hlađenja boce su prije upotrebe stavljene na sobnu temperaturu bez doticaja sa direktnim sunčevim svjetlom. ;Koncentracija proteina je mjerena pomoću Pierce Coomassie pokusa vezanja uz BSA kao standardni protein. Ukratko, otopine 0-25 μg BSA standarda u 1 ml vode pripremljene su iz 2 mg/ml BSA (Pierce) ishodne otopine, te stavljene u 4 ml plastične kivete. Približno 10 μg nepoznatog proteina otopljeno je u 1 ml vode na isti način. U svaku je kivetu dodano po 1 ml Pierce Coomassie reagensa te je njihov sadržaj temeljito miješan. Optička gustoća je mjerena unutar 15 min pri 595 nm Beckman DU-530 UV spektrofotometrom. Pomoću linearne regresije na podacima za BSA standarde (linearnost je bila dobra sve do 25 μg BSA), te interpolacijom rezultata za nepoznati protein izračunata je njegova koncentracija. ;Gel filtracijska kromatografija izvedena na Pharmacia FPLC sustavu opremljenom s kompjutorskom kontrolom. Eluacija proteina je praćena mjerenjem absorbancije na valnoj duljini od 280 nm na UV-M II sustavu. Za odvajanja malih količina upotrebljena je Superdex 200 HR 10/30 kolona, a uzorak je punjen s davaljkom volumena 1 ml. Prije propuštanja uzorka kolona je uravnotežena s 30 ml PBS, a uzorak je propuštan brzinom od 0,5 ml/min, te su prikupljane frakcije volumena 1 ml. Za odvajanja velikih količina upotrebljena je Superdex 75 ili 200 PG 26/60 kolona, a uzorak je punjen sa super davaljkom volumena 10 ml. U ovim su slučajevima prikupljane frakcije volumena 5 ili 10 ml, a uzorci su propuštani brzinom od 4 ml/min. Sva odvajanja su izvođena pri sobnoj temperaturi. ;Kromatografija ionske izmjene izvedena je na Biocad Sprint sustavu (Perkin-Elmer). Za izmjenu kationa korištena je 20 HS ili 50 HS kolona. Za izmjenu aniona korištena je 10 HQ, 20 HQ ili 50 HQ kolona. Korišteni su preporučeni puferi povezani na šestostrani mješač. Injektirani su mali uzorci (5-25 ml) pomoću 5 ml injekcijske davaljke. Veći uzorci (> 100 ml) injektirani su uz pomoć jedne od puferskih linija. Tijekom eluacijske faze prikupljane su frakcije volumena 1 ml. Eluacija proteina praćena je istovremenim mjerenjem absorbancije pri 280 nm. ;Elektroforeza na SDS poliakrilamid gelu (SDS-PAGE) izvedena je na Bio-Rad Mini-Protean II gel sustavu. Prije upotrebe gelovi su pročišćeni na slijedeći način. Sustav nosača gela je pripremljen te osiguran od proljevanja. Zatim je pripremljena slijedeća smjesa: 12 % akrilamid/bisakrilamid (iz 30 % akrilamid/0,8 % bisakrilamid ishodne otopine (National Diagnostics)), 0,375 M Tris pH 8,8 (iz 1,5 M ishodne otopine istog pH), 0,1 % SDS (iz 10 % ishodne otopine SDS), 0,05 % amonijeva persulfata (iz 10 % ishodne otopine istog, čuvano na 4° C) i 0,1 % TEMED (Sigma). Smjesa je odmah ulita u sustav nosača gela, te je nadslojena s butanolom zasićenim s vodom da bi se dobila ravna gornja površina. Nakon što se gel nataložio (minimalno 10-15 minuta), gel za nadslojavanje (engl. stacking gel) je miješan kako slijedi. 4 % akrilamida (iz iste ishodne otopine kao i prije), 0,125 M Tris pH 6,8 (iz 0,5 M ishodne otopine istog pH), 0,1 % SDS, 0,05 % amonijeva persulfata i 0,2 % TEMED. Butanol je uklonjen sa površine poliakrilamidnog gela pomoću absorpcije na staničevinu, a smjesa gela za nadslojavanje je nanesena na poliakrilamidni gel. Odmah je stavljen češalj na gel pazeći pri tom da ne dođe do stvaranja mjehurića zraka u gelu, te je skupljeni gel ostavljen da se istaloži tijekom najmanje 5 minuta. ;Potom je gel učvršćen u aparaturu, te je u nju, kod katode i anode, ulit pufer (3 g/l Tris baze, 14,4 g/l glicina, 1 g/l SDS (razrijeđen iz 10 puta koncentriranije ishodne otopine). Po uklanjanju češlja, ježice su isprane puferom da bi se spriječilo taloženje zaostale smjese akrilamida na dno ježice. Uzorci su priređeni miješanjem, u odnosu 1:1 proteina i slijedeće smjese: 4 % SDS, 0,125 M Tris pH 6,8, 20 % glicerol, 10 % β-merkaptoetanol, 1 % bromfenolno plavo (Sigma). Potom su uzorci zagrijani na 95° C tijekom 2 minute i ohlađeni prije punjenja (do količine od 25 μL) u ježice u skupljenom gelu. Uobičajeno je punjeno približno 1-10 μg da bi se osiguralo dobro bojanje i propusnost gela. Po punjenju gelovi su podvrgnuti konstantnom naponu od 200 V tijekom približno 40 minuta ili sve dok se bromfenolna plava boja ne bi udaljila približno 5 mm od ruba gela. ;Po završetku elektroforeze gelovi su uklonjeni iz aparature i pažljivo stavljeni u 0,1 % otopinu Coomassie R-250 (Sigma) u 10 % octene kiseline, 40 % metanola, 50 % vode. Gelovi su obezbojani u nekoliko puta promjenjenim obrocima 10 % octene kiseline, 40 % metanola, 50 % vode sve dok se pozadina gela nije razbistrila, te su potom pažljivo potresani tijekom barem 30 minuta,. Gelovi su potom spremljeni u vodu i snimljeni pomoću UVP sustava za dokumentiranje gelova koji sadrži svjetlosnu kutiju, digitalnu kameru i termalni printer. ;Primjer 1 - rekombinantni topljivi TCR ;Rekombinantni topljivi oblik molakule TCR heterodimera stvoren je kako je to pokazano na slici 1. Svaki se lanac sastoji od membranski distalne i proksimalne imunoglobulinske domene koje su savitljivim poveznikom spojene na motiv smotanog klupka koji stabilizira heterodimer. ;Stalna TCR domena je okrnjena neposredno prije cisteinskog ostatka koji in vivo stvara međulančanu disulfidnu vezu. Kao posljedica toga dva se lanca sparuju putem nekovalentnih kvaternih kontakata što je potvrđeno na slici 2. Kako su heterodimeri Fos-Jun peptida zatvarača također sposobni stvarati međulančane disulfidne veze neposredno N-terminalno do upotrebljenog poveznika (OʹShea et al. 1989) može se predskazati da je usmjeravanje dvaju lanaca relativno jedan prema drugome optimalno. Spojeni proteini moraju biti povezani na način koji je sukladan sa odvojenim komponentama da bi se spriječilo narušavanje njihovih struktura. ;cDNA koja kodira alfa i beta lance TCR specifičnog za epitop 58-66 proteina matriksa influence u HLA-A2 dobivena je iz Vβ17+ humanog CTL klona (JM22) sidrenjem PCR kao što je to već opisano (Moss et al 1991). ;Alfa i beta TCR-zatvarač konstrukti pJM22α-Jun i pJM22β-Fos odvojeno su priređeni umnožavanjem promjenjive i stalne domene svakog lanca pomoću uobičajene PCR tehnologije i povezivanjem produkata na domene leucinskog zatvarača iz Jun i Fos faktora transkripcije u eukariota (vidjeti sliku 1). Ti 40 aminokiselina dugi sljedovi specifično se heterodimeriziraju prilikom ponovnog smotavanja iz sintetskih peptida, bez potrebe za kovalentnim međulančanim poveznikom (OʹShea et al. 1989). ;Klice su konstruirane za prihvat visokog sadržaja AT neposredno 3ʹ do kodona inicijacije (da bi destabilizirala sekundarnu strukturu mRNA) i upotrebu kodonskih preferencija E. coli, da bi ekspresiju povećali do maksimuma (Gao et al). Preostali cistein u TCR beta stalnoj domeni je mutiran u serin da bi se spriječilo neispravno disulfidno vezanje tijekom ponovnog smotavanja. ;DNA konstrukti odvojeno su legirani u E. coli ekspresijski vektor pGMT7. Razgradnja plazmida i sekvenciranje DNA potvrdilo je da su konstrukti ispravni. ;U nastavku je detaljno opisan korišteni postupak. ;Ekspresija TCR lanaca zatvarača i pročišćavanje denaturiranih inkluzijskih tijela: GFG020 i GFG021, pGMT7 ekspresijski plazmidi koji sadrže pJM22α-Jun i pJM22β-Fos odvojeno su transformirani u E. coli soj BL21pLysS, te su uzgojene pojedinačne kolonije otporne na ampicilin pri 37° C na TYP podlozi (ampicilin 100 μg/ml) do OD600 od 0,4 prije induciranja ekspresije proteina s 0,5 mM IPTG. Po indukciji stanice su prikupljane tijekom tri sata pomoću centrifuge pri 4000 rpm u Beckman J-68. Stanične nakupine su ponovno suspendirane u puferu koji je sadržavao 50 mM Tris-HCl, 25 % (m/v) saharoze, 1 mM NaEDTA, 0,1 % (m/v) NaAzid, 10 mM DTT, pH 8,0. Nakon liofilizacije tijekom noći, ponovno suspendirane stanice podvrgnute su sonikaciji tijekom 10 minuta koristeći se 1 minutnim udarima u Milsonix XL2020 sonikatoru uz upotrebu uobičajene sonde promjera 12 mm. Nakupine inkluzijskih tijela su prikupljene centrifugiranjem tijekom 30 minuta pri 13000 rpm u Beckman J2-21 centrifugi. Potom su uslijedila tri pranja s detergentima da bi se uklonile stanični fragmenti i membranske komponente. Svaki su se put nakupine inkluzijskih tijela homogenizirale u Triton puferu (50 mM Tris-HCl, 0,5 % Triton-X 100, 200 mM NaCl, 10 mM NaEDTA, 0,1 % (m/v) NaAzid, 2 mM DTT, pH 8,0) prije no što su skupljene pomoću centrifuge tijekom 15 minuta pri 13000 rpm u Beckman J2-21. Potom su detergenti i soli uklonjeni sličnim ispiranjem u slijedećem puferu: 50 mM Tris-HCl, 1 mM NaEDTA, 0,1 % (m/v) Na azid, 2 mM DTT, pH 8,0. Nakupine JM22α-Jun i JM22β-Fos inkluzijskih tijela odvojeno su otopljene u otopini uree (50 mM MES, 8 mM uree, 10 mM NaEDTA, 10 mM DTT, pH 6,5) tijekom 3 do 4 sata pri 4° C. ;Neotopljeni dio je skupljen centrifugiranjem tijekom 30 minuta na 13000 rpm u Beckman J2-21, a supernatant je podijeljen u alikvote od 1 ml te zamrznut na -70° C. Količina inkluzijskih tijela otopljenih u urei je određena pomoću pokusa vezanja Bradford boje (Biorad). Za svaki je lanac iz jedne litre kulture dobiveno iskorištenje od oko 100 mg pročišćenih inkluzijskih tijela. Svako od inkluzijskih tijela (JM22α-Jun, JM22β-Fos) otopljeno je u otopini uree pri koncentraciji od oko 20 mg/ml, te je pomoću gel analize određena njihova čistoća u takvom obliku od oko 90 % (podaci nisu prikazani). ;Potpomognuto ponovno smotavanje spojenih proteina TCR-zatvarač: ;U početnom eksperimentu ponovnog smotavanja uz upotrebu uobičajenih pufera za ponovno smotavanje (100 mM Tris pH 8,5, 1 M L-arginina, 2 mM EDTA, 5 mM reduciranog glutationa, 0,5 mM oksidiranog glutationa, 0,2 mM PMSF) došlo je do snažne precipitacije proteina koja je ovisila o prisutnosti domena zatvarača. Činjenica da je do ove pojave došlo pri koncentraciji manjoj od konstante disocijacije dimera zatvarača (tj. pri koncentraciji za koju se očekuje da je većina heliksa zatvarača u monomernom obliku), upućuje na zaključak da su određene dodatne sile stabilizirale pogrešno smotane vrste. Najvjerojatnije objašnjenje jest da se cjelokupna domena alfa-heliks zatvarača prva smotala i da je njezina prelazna heterodimerizacija potakla međulančanu agregaciju djelomično smotanih intermedijara složenijih imunoglobulinskih domena. Zato je u pufer za ponovno smotavanje uključena 5 M urea radi sprečavanja hidrofobnih interakcija između djelimično smotanih imunoglobulinskih domena, čime se omogućuje pojedinačnim lancima potpuno smotavanje prije heterodimerizacije. Ovaj je korak dovoljan za sprečavanje precipitacije i sastavljanje ispravno smotanih heterodimera TCR-zatvarač uz prihvatljivo iskorištenje. Ovaj je korak izveden na slijedeći način. ;JM22α-Jun i JM22β-Fos lanci TCR-zatvarač u urei uzetih iz ishodne otopine renaturirani su potpomognutim ponovnim smotavanjem uz razrjeđivanje. Približno 30 mg (tj. 1 μmol) otopljenih lanaca od svakog inkluzijskog tijela je odtaljeno iz smrznutih polaznih otopina, te je dodan DDT (4 μmol/ml) da bi se osigurala potpuna redukcija cisteinskih ostataka. Uzorci su potom miješani, a smjesa razrijeđena u 15 ml otopini gvanidina (6 M gvanidin-klorovodika, 10 mM natrijeva acetata, 10 mM EDTA) da bi se postigla potpuna denaturacija lanaca. Otopina gvanidina koja je sadržavala potpuno reducirane i denaturirane lance TCR-zatvarač injektirana je u 1 litru pufera za ponovno smotavanje slijedećeg sastava: 100 mM Tris pH 8,5, 400 mM L-arginina, 2 mM EDTA, 5 mM reduciranog glutationa, 0,5 mM oksidiranog glutationa, 5M uree, 0,2 mM PMSF. Otopina je ostavljena tijekom 24 h, te potom dva puta dializirana. Prva dijaliza je provedena prema 10 litara 100 mM uree, dok je druga bila prema 10 litara 100 mM uree, 10 mM Tris pH 8,0. Oba koraka, ponovno smotavanje i dijaliza, provedena su pri 6-8° C. ;Pročišćavanje ponovno smotanih TCR-zatvarač: ;TCR-zatvarač JM22zip odvojen je od razgrađenih produkata i nečistoća punjenjem dijalizirane otopine u POROS 10HQ analitičku kolonu za ionsku izmjenu u sedam alikvota od 200 ml, te eluacijom vezanog proteina s gradijentom od 0-400 mM otopine NaCl volumena 50 kolona u BioCad radnoj stanici (Perseptive Biosystems). Nekovalentno asocirani heterodimeri izeluirani su kao pojedinačan pik pri oko 100 mM NaCl. Prikupljene frakcije koje odgovaraju piku (uobičajeno su sadržavale heterodimer u koncentraciji od 100-300 μg/ml), pohranjene su na 4° C, te spojene i koncentrirane. Iskorištenje za heterodimere je približno 15 %. ;Karakterizacija ponovno smotanih TCR-zatvarač JM22zip: ;JM22zip heterodimer pročišćen anionskom izmjenom izeluira se iz Superdex 200 gel filtracijske kolone (Pharmacia) kao približno 70 kDa teški protein. Prije analize vezanja pomoću površinske plazma rezonancije posebno je važno napraviti gel filtraciju jer precizna mjerenja afiniteta i kinetike ovise o prisustvu monomernih interakcija. Na ovaj se način mogu ukloniti agregati višeg reda iz frakcija topljivog proteina uzetih za analizu. Kao posljedica prisustva agregata, mjerenjem se odrede umjetno niske konstante brzine asocijacije i disocijacije. ;Istraživanje oksidiranog oblika svakog pojedinog lanca provedeno je pomoću reduciran/nereduciran gel analize prikazane na slici 2. Uz prisustvo SDS nekovalentno asocirani heterodimer je disociran na alfa i beta lance. Ukoliko se u puferu za punjenje nalazi DTT, dva se lanca odvajaju na suprotne strane u razini markera koji odgovara 31 kDa. U odsustvu takvih denaturanata oba se lanca ponašaju kao jedna vrsta, ali im se povećava pokretljivost, što upućuje na zaključak da je svaki lanac stvorio pojedinačne disulfidno vezane vrste (Garboczi et al. 1996) ;Reaktivnost na antitijela ponovno smotanog receptora istražena je pomoću površinske plazma rezonancije na Biacore 2000 uređaju (Biacore). TCR-zatvarač JM22z je imobiliziran vezanjem na površinu matriksa dekstrana (CM chip) pri pH 5,5 uz upotrebu uobičajenog postupka amino kopulacije. Promjenjivi dio antitijela specifičnog na beta lanac (Vβ17) specifično se veže na imobilizirani receptor što upućuje na ispravnu konformaciju. ;Stabilnost: ;Topljivi TCR ekspresirani kao alfa-jun i beta-fos spojeni leucinski zatvarači stabilni su mjesecima pa su prema tome pogodni za detekciju specifičnih antigena prezentiranih klasom I MHC. ;Primjer 2 - istraživanje kinetike i afiniteta humanog TCR- peptid virusa-MHC ;Specifično vezanje ponovno smotanog TCR-zatvarač na peptid-MHC komplekse: ;Biosenzor za površinsku plazma rezonanciju (Biacore) korišten je za analizu vezanja TCR-zatvarač (JM22zip specifičan za kompleks HLA-A2 protein M58-66 matriksa influence) na svoj peptid-MHC ligand (vidjeti sliku 3). Ovakvu analizu smo olakšali pripremom pojedinačnih pMHC kompleksa (opisanih u nastavku) koji se mogu imobilizirati na površinu za vezanje obloženu streptavidinom, na polu usmjereni način, što omogućuje istovremeno, učinkovito istraživanje vezanja topljivog receptora T stanice na maksimalno četiri različita pMHC (imobilizirana na odvojenim tekučim ćelijama). Ručno injektiranje HLA kompleksa omogućuje lagano rukovanje s točnom količinom imobiliziranih molekula klase I. ;Ovakvi imobilizirani kompleksi sposobni su vezati se i na receptore T stanice (vidjeti sliku 3) i na koreceptore CD8αα koji se mogu injektirati u topljivu fazu. Specifično vezanje je uočljivo čak i pri niskim koncentracijama (barem 40 μg/ml), što upućuje na zaključak da je TCR-zatvarač relativno stabilan. Uočeno je da su svojstva vezanja JM22z na pMHC kvalitativno i kvantitativno slična neovisno o tome da li je TCR korišten u topljivoj ili imobiliziranoj fazi. Ovo je važna kontrola parcijalne aktivnosti topljivih vrsta, a također i upućuje na zaključak da su biotinilirani pMHC kompleksi biološki aktivni kao i nebiotinilirani kompleksi. ;Priprema HLA kompleksa kemijski označenih s biotinom: ;Već su prije opisani (Garboczi et al. 1992) postupci za pripremu topljivih, rekombinantnih pojedinačnih peptida klase I HLA kompleksa. Oni su modificirani da bi se priredili HLA kompleksi koji imaju β-2-mikroglobulinske kemijski biotinilirane domene, pa se prema tome mogu imobilizirati na streptavidinom obložen chip za vezanje i upotrijebiti za istraživanja pomoću površinske plazma rezonancije. ;β-2-mikroglobulin je eksprimiran i ponovno smotan u količini od 40 mg u uobičajenom puferu za ponovno smotavanje (100 mM Tris pH 8,0, 400 mM L-arginina, 2 mM EDTA, 5 mM reduciranog glutationa, 0,5 mM oksidiranog glutationa, 0,1 mM PMSF) na već opisan način (Garboczi et al. 1992). Nakon opcijski uvedenog koraka gel filtracije, protein je zamijenjen na 0,1 M natrijevom boratu pH 8,8 i koncentriran do 5-10 mg/ml. Količina β-2-mikroglobulina je određena pomoću Bradfordovog pokusa (Biorad). Dodan je 5 molarni suvišak biotin hidroksisukcinimida (Sigma) uzetog iz ishodne otopine koncentracije 10 mg/ml u DMSO. Reakcijska smjesa je ostavljena tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi i zaustavljena s 20 μl 1 M amonijeva klorida/250 μg estera korištenog biotina. Ponovno smotani HLA kompleks je odvojen od slobodnog biotina i slobodnog biotiniliranog β-2-mikroglobulina pomoću Superdex 200 gel filtracijske kolone (Pharmacia). Streptavidin je imobiliziran uobičajenim načinom amino kopulacije. ;Zaključak: ;Postupak ponovnog smotavanja proteina opisan u primjeru 1 daje stabilni, ispravno smotani, funkcionalni rekombinantni spojeni protein receptora koji je pogodan za biofizikalne analize pomoću optičkih biosenzora. Na ovaj se način omogućio reagens za detaljne analize afiniteta i kinetike interakcija u humanom TCR-pMHC. Također je istraživan i učinak međusobnih interakcija koreceptor T stanice-MHC i TCR-pMHC na oba navedena. Ovdje upotrebljene tehnike rekombinacije u načelu su upotrebljive i za mišji i za humani TCR, bilo da su ograničeni na klasu I ili klasu II, i omogućuju slične analize širokog raspona TCR. Na taj će se način omogućiti dobivanje odgovora na različita moguća pitanja kao što je raspon TCR afiniteta tijekom antivirusnog odgovora, svojstva dominantno odabranog receptora i kinetički zahtjevi za aktiviranje receptora. Ovi postupci također omogućuju određivanje specifičnosti TCR za ligand prije pokusa kristalizacije, a mogu također imati upotrebu i za rekombinantno stvaranje drugih receptora iz površine stanice. ;Primjer 3 - biotinilacija i tetramerizacija topljivih receptora T stanice ;2,5 ml pročišćenog topljivog TCR priređenog kako je opisano u primjeru 1 (~ 0,2 mg/ml) podvrgnuto je izmjeni u puferu za biotinilaciju (10 mM Tris pH 8,0, 5 mM NaCl, 7,5 mM MgCl2), koristeći se s PD-10 kolonom (Pharmacia). Eluat (3,5 ml) je koncentriran do 1 ml pomoću centricon koncentratora (Amicon) s granicom propuštanja od 10 kDa molekulske mase. Zatim je nadopunjen do 5 ml s ATP uzetim iz ishodne otopine (0,1 g/ml podešeno na pH 7,0). Potom je dodan koktel inhibitora proteaza: leupeptin, pepstatin i PMSF (0,1 mM), te potom 1 mM biotina (uzetog iz 0,2 M ishodne otopine) i 5 μg/ml enzima (uzetog iz 0,5 mg/ml ishodne otopine). Smjesa je potom inkubirana tijekom noći pri sobnoj temperaturi. Suvišak biotina je odvojen dijalizom na 10 mM Tris pH 8,0, 5 mM NaCl (200 volumena, s dvije promjene pri 4° C). Protein je testiran na prisustvo vezanog biotina upijanjem na nitrocelulozu, te blokiranjem s 5 % obranim mlijekom u prahu i detektiran pomoću streptavidin-HRP konjugata (Biorad). ;Tetramerizacija biotiniliranog topljivog TCR provedena je ili s ekstravidin-RPE ili s ekstravidin-FITC konjugatom (Sigma). Koncentracija biotiniliranog topljivog TCR mjerena je pomoću Coomassie pokusa vezanja proteina (Pierce). Da bi se postiglo zasićenje ekstravidina s biotiniliranim TCR u odnosu 1:4, izračunat je odnos konjugata ekstravidina prema topljivom TCR u iznosu od 0,224 mg/mg TCR. Konjugat ekstravidina je dodan, na ledu, u obliku alikvota od 1/10 ukupno dodanog konjugata tijekom barem 15 minuta po alikvotu (da bi se osiguralo zasićenje ektravidina). Topljivi tetrameri TCR pohranjeni su u mraku pri 4° C. Tetrameri su mjesecima izrazito stabilni. ;Primjer 4 - kloniranje molekula gena receptora T stanice iz T staničnih linija ili klonova T stanice poznate specifičnosti ;Postupci i procedure za kloniranje molekula gena TCR iz stanica su istovjetni za sve α i β lance, pa su stoga opisani samo u ovom primjeru. ;Pogodan broj T stanica, uobičajeno 1-5 miliona, liziran je u puferu za lizu iz "mRNA Capture Kit" (Boehringer Mannheim). mRNA je izolirana pomoću reagensa iz pribora postupkom hibridizacije biotiniliranog oligo-dT na poli-A repove mRNA. Hibridizirani kompleksi su potom uhvaćeni vezanjem biotina na PCR cjevčicu obloženu sa streptavidinom. Po imobilizaciji mRNA na PCR cjevčici, cDNA je generirana pomoću AMV reverzne transkriptaze (Stratagene) kao što je to opisano u Boehringer Mannheim uputama za "mRNA Capture Kit". ;Dok je cDNA bila imobilizirana, na 3ʹ kraju je generiran poli-G rep pomoću enzima terminalne transferaze (Boehringer Mannheim). Potom je dodana reakcijska smjesa PCR koja je sadržavala visoko vjernu termostabilnu polimerazu pfu (klonirana, Stratagene), a koja je korištena da se opasnost od pogreške u PCR produktima svede na minimum. PCR reakcije su izvedene sljepljivanjem (engl. annealing) poli-C " klice sidra" (slika 4A) i klica specifičnih za α i β lance (slike 4B i 4C) u odgovarajuće TCR stalne dijelove. Da bi se umnožili fragmenti TCR gena, provedene su PCR reakcije od 30 ciklusa denaturacije pri 95° C tijekom 1 minute, sljepljivanje pri 50° C tijekom 1 minute i ekstenzije pri 72° C tijekom 5 minuta. ;PCR produkti su legirani u Bluescript sekvencijskom vektoru (pBluescript II KS-, Stratagene) pomoću mjesta za restrikcijske enzime Xhol i Xmal koja su bila sadržana u PCR klicama (svi enzimi od New England Biolabs). Po transfekciji legirane smjese u E. coli soj XL-1Blue, za svaki je lanac odabrano nekoliko klonova za DNA sekvenciranje koje je izvedeno na ABI 377 Prism automatskom sekventoru koristeći se s BigDye™ terminatorima (Applied Biosystems Inc.). ;Primjer 5 - kloniranje molekula DNA fragmenata koji kodiraju 40 aminokiselina regije smotanog klupka ("leucinski zatvarač") iz c-jun i c-fos. ;DNA fragmenti koji kodiraju 40 aminokiselina regije smotanog klupka ("leucinski zatvarač") iz c-jun i c-fos generirani su pomoću PCR reakcija koristeći se s humanom cDNA kao nosiocem i s klicom prikazanim na slici 5. PCR reakcije izvedene su u reakcijskom puferu koji sadrži kloniranu pfu polimerazu (Stratagene) tijekom 30 ciklusa koji se sastoje od denaturacije pri 95° C tijekom 1 minute, sljepljivanja klica pri 58° C tijekom 1 minute i ekstenzije pri 72° C tijekom 2 minute. ;Fragementi c-jun i c-fos su legirani u pBluescript II KS-, (Stratagene) pomoću jedinstvenih restrikcijskih mjesta Xhol i Xmal da bi se dobili konstrukti pBJ107 i pBJ108 (slika 6). Sljedovi baza DNA c-jun i c-fos fragmenata potvrđeni su pomoću DNA sekvenciranja na ABI 377 Prism automatskom sekventoru koristeći se s BigDye™ terminatorima (Applied Biosystems Inc.). ;Sekvencirani fragmenti c-jun i c-fos su potom subklonirani, koristeći se s jedinstvenim restrikcijskim mjestima Xmal i BamHI, u regiju višestrukih poveznika T7 ekspresijskog vektora polimeraze, pGMT7 (Studier, Rosenberg et al. 1990). ;Primjer 6 - konstrukcija spojenih proteina TCR-leucinski zatvarač za pripravu stabilnih topljivih TCR. ;Pokušaji da se potpomognuto ponovno smotaju ekstracelularni fragmenti TCR α i β lanaca koji su okrnjeni tako da sadrže cisteinski ostatak koji in vivo stvara disulfidne veze, pokazali su ograničeni uspjeh (podaci nisu prikazani, vidjeti primjer 9 za opis postupaka ekspresije i općih postupaka i materijala za stvaranje uvjeta za ponovno smotavanje). Ipak, u slučajevima u kojima su α i β lanci TCR bili okrnjeni neposredno prije, dakle na N-terminalnoj strani, cisteinskog ostatka koji stvara međulančanu disulfidnu vezu, analitička kromatografija na Superdex G-75 koloni (Pharmacia) je pokazala malene frakcije proteina, približno 1-2 % količine upotrebljene za reakciju ponovnog smotavanja, koji su se ponovno smotali u kompleks molekulske veličine očekivane za okrnjeni α/β heterodimer (za postupak vidjeti također (Garboczi, Utz et al. 1996)). ;Smatralo se da je mogućnost pogrešnog stvaranja disulfidnih veza, koje može uzrokovati nepovratno pogrešno smotavanje proteina tijekom in vitro ponovnog smotavanja, smanjena na minimum time što se mutiralo cisteinski ostatak iz TCR β stalnog područja, a koji je nesparen u celularnom TCR. Cisteinski ostatak je supstituiran sa serinskim ili alaninskim ostatkom. Sintetske DNA klice koje su korištene za ovu mutaciju prikazani su na slici 7. Potpomognuto ponovno smotavanje α i mutiranih β lanaca TCR, okrnjenih neposredno prije cisteinskog ostatka koji stvara međulančanu disulfidnu vezu, pokazalo je izrazito poboljšanje u iskorištenju heterodimera jer su frakcije proteina s ispravnom molekulskom masom uobičajeno sadržavale 15-30 % ukupnog proteina. Pa ipak, kada su ovi topljivi TCR pohranjeni tijekom noći, analiza proteina je pokazala da se frakcija s molekulskom masom koja odgovara heterodimeru raspala na dva pika s molekulskim masama koje odgovaraju monomernim α i β lancima TCR. Slično je uočeno i kod razrjeđivanja topljivog TCR što ukazuje da je stabilnost α/β lanaca previše mala i nedostatna za analize koje zahtijevaju vremenski raspon veći od ograničenog broja sati ili veći broj razrjeđivanja proteina. U zaključku, ovaj postupak za dobivanje topljivog TCR daje samo receptor s iznimno ograničenom stabilnošću. ;Da bi se poboljšala stabilnost α/β lanaca TCR i da bi se moguće pomoglo stvaranje heterodimera tijekom ponovnog smotavanja, TCR lanci su spojeni na domenu "leucinskog zatvarača" iz c-jun i c-fos za koje je poznato da stvaraju heterodimere (OʹShea, Rutkowski et al. 1989; Schuermann, Hunter et al. 1991; OʹShea, Rutkowski et al. 1992; Glover and Harrison 1995). Dva su načina spajanja TCR isprobana. ;U prvom načinu leucinski zatvarači su spojeni neposredno poslije, dakle C-terminalno do cisteinskih ostataka koji tvore međulančanu disulfidnu vezu u α i β lancima TCR. Kako su i c-jun i c-fos peptidi leucinskog zatvarača također sposobni stvoriti međulančane disulfidne veze neposredno N-terminalno do upotrijebljenog poveznika (OʹShea, Rutkowski et al. 1989), predviđeno je optimalno usmjerenje dvaju lanaca jedan prema drugom i prema međulančanoj disulfidnoj vezi. ;U drugom načinu leucinski zatvarači su spojeni neposredno prije, dakle N-terminalno do cisteinskih ostataka koji tvore međulančanu disulfidnu vezu u α i β lancima TCR (slika 8). Prema tome u drugom načinu su cisteinski ostaci isključeni iz rekombinantnog receptora. ;Prilikom istraživanja ponovnog smotavanja lanaca TCR-zatvarač (TCR-z) priređenih opisanim načinima, pronađeno je da je iskorištenje heterodimernih topljivih receptora bolje u slučaju kada su cisteinski ostaci koji tvore međulančanu disulfidnu vezu isključeni iz α i β lanaca TCR, kao što je to slučaj u načinu prikazanom na slici 8. ;Primjer 7 - konstrukcija DNA ekspresijskih vektora za proteine TCR-leucinski zatvarač ;Ovaj primjer opisuje konstrukciju ekspresijskih vektora za α i β lance pet TCR. Opisana strategija i postupak trebao bi se moći prilagoditi bilo kojim humanim ili životinjskim TCR genima. Iako su svih pet ovdje opisanih TCR ograničeni na epitope MHC klase I, postupci se istovjetno mogu upotrijebiti i za kloniranje i konstrukciju ekspresijskih vektora TCR ograničenih na MHC klase II. Svi vektori ekspresiraju proteine namijenjene za ponovno smotavanje topljivog TCR prema načinu prikazanom na slici 9, s izuzetkom da su dva TCR eksprimirana sa slijedom aminokiselina namijenjenih za označavanje s biotinom na C-kraju (vidjeti dalje i slike 17, 18 i 19). Strategija kloniranja je istovjetna za α i β lance TCR. ;Duljina vodećeg ili signalnog slijeda aminokiselina peptida α i β lanaca TCR predskazano je temeljem analiza sekvencijskih podataka dobivenih iz plazmida koji sadrže TCR usidrene PCR produkte (vidjeti primjer 4). Na temelju ovog podatka napravljene su 5ʹ klice za dobivanje PCR fragmenata za ekspresiju TCR lanaca bez vodećeg slijeda aminokiselina (slika 9). Sve 5ʹ klice kodiraju metioninski ostatak neposredno prije sljedova aminokiselina zrelog TCR proteina, čime se omogućuje translacija u E. coli. Tihe mutacije kojima se supstituiraju C ili G baze s A ili T (slika 9) uvedene su u određeni broj 5ʹ proksimalnih kodona gena radi smanjenja stvaranja sekundarne strukture mRNA koja bi mogla nepovoljno inhibirati nivo ekspresija u E. coli (PCT/GB 98/03235; (Gao, Tormo et al. 1997; Gao, Gerth et al. 1998). ;Geni koji kodiraju Vα0,2 i Vβ17 lance humanog JM22 na peptid matriksa influence-HLA-A0201 ograničenog TCR (slijed aminokiselina peptida je GILGFVFTL), Vα23 i Vβ5,1 lance humanog 003 na HIV-1 gag peptid-HLA-A0201ograničenog TCR (slijed aminokiselina peptida je SLYNTVATL) i Vα4 i Vβ11 lance mišjeg F5 NP peptid-H2-Db (slijed aminokiselina peptida je ASNENMDAM), umnoženi su s PCR koristeći se plazmidima koji sadrže TCR usidrene PCR produkte načinjene kao što je opisano u primjeru 6. Geni za humane A6 (Vα2,3/ Vβ12,3) i B7 (Vα17,2/ Vβ12,3) TCR koji su specifični za HTLV-1 tax peptid prezentiran od HLA-A0201 (slijed aminokiselina peptida je LLFGYPVYV), dobiveni su u plazmidnom obliku (Garboczi, Utz et al. 1996; Ding, Smith et al. 1998) i korišteni za generiranje PCR produkata koji konstruiraju ekspresijske vektore za ove TCR lance. Geni za ove TCR klonirani su u ekspresijski vektor koji sadrži slijed baza za spojeni fragment c-fos leucinski zatvarač-oznaka za obilježavanje s biotinom (vidjeti primjer 8). ;PCR reakcije provedene su s kloniranim pfu polimerazama u uobičajenim uvijetima puferiranja (Stratagene) i s 25 ciklusa denaturacije pri 95° C tijekom 1 minute, sljepljivanja klice pri 60° C tijekom 1 minute i ekstenzije pri 72° C tijekom 6 minuta. PCR produkti su razgrađeni restrikcijom s Ndel i Xmal enzimima i legirani u pGMT7 vektore koji sadrže umetke c-jun (TCR α lance) i c-fos (TCR β lance) (vidjeti primjer 5). ;Slike 10-19 prikazuju sljedove baza TCR-z umetaka i predskazane sljedove aminokiselina proteina eksprimiranih pomoću pGMT7 vektora. Slika 20 prikazuje slijed baza A6 TCR β lanca koji sadrži mutaciju u stalnom dijelu, ali ne pokazuje uočljivi učinak na smotavanje i funkciju topljivog TCR (vidjeti primjere 9 i 10). ;Primjer 8 - konstrukcija DNA vektora za ekspresiju TCR β lanaca spojenih na c-fos leucinski zatvarač-fragment za obilježavanje s biotinom. ;Da bi se omogućila imobilizacija ili detekcija ili pak vezanje na receptor topljivog TCR, korisno bi bilo da se protein može prirediti u obliku s dodatno spojenim funkcionalnim komponentama. To bi omogućilo pripravu topljivog TCR u obliku npr. multimera ili u obliku pogodnom za detekciju s visokom osjetljivošću ili pak u obliku pogodnom za vezanje drugih funkcionalnih skupina na receptor/receptor komplekse. ;Ovaj primjer prikazuje konstrukciju ekspresijskog vektora za TCR β lance spojene na konstruirani spojeni polipeptid koji se može specifično biotinilirati u E. coli in vivo ili pomoću BirA enzima in vitro (Barker and Campbell 1981; Barker and Campbell 1981; Howard, Show et al. 1985; Schatz 1993; OʹCallaghan, Byford et al. 1999). Kao što je to pokazano u primjerima 10 i 11 ovi se topljivi TCR spojevi mogu eksprimirati i ponovno smotati zajedno s α lancem na istovjetan način i uz slično iskorištenje kao i TCR β lanac koji nije spojen na "oznaku za obilježavanje s biotinom" (BT-oznaka). Ovi rezultati pokazuju da je ovdje opisani topljivi TCR vjerojatno pogodan za ekspresiju s brojnim različitim polipeptidima koji se na njega mogu vezati. ;β lanci receptora T stanice su subklonirani u pGMT7 ekspresijski vektor sa slijedom baza za oznaku za obilježavanje s biotinom koja se nalazi C-terminalno do slijeda baza fos leucinskog zatvarača kako slijedi: ;start ⎯ TCR β lanac ⎯ fos zatvarač ⎯ oznaka za obilježavanje s biotinom ⎯ stop ;Točan slijed baza krajeva konstrukata bila je kako slijedi (vidjeti također sliku 21): ;poveznik →⏐fos zatvarač →⏐BamHI⏐←poveznik→⏐← oznaka za obilježavanje s biotinom ;Dva su načina korištena za dobivanje topljivih TCR s oznakom za obilježavanje s biotinom. Da bi se dobilo BamHI mjesto umjesto HindIII mjesta u slučaju humanog JM22 na peptid matriksa influence-HLA-A0201 ograničenog TCR, klonirani spojeni β-lanac-c-fos leucinski zatvarač modificiran je na 3ʹ-kraju pomoću sintetske DNA klice prikazane na slici 22 uz upotrebu uobičajenih PCR reakcija s pfu polimerazom (Stratagene). ;Izvorna 5ʹ klica (vidjeti sliku 9) koja sadrži Ndel mjesto korištena je kao napredna klica. Dobiveni PCR produkti su klonirani u modificirani pGMT7 vektor koji sadrži slijed baza za oznaku za obilježavanje s biotinom (slika 21) da bi se dobili gore opisani konstrukti. Ovaj plazmid je poznat kao JMB002. ;Klonirani TCR, specifičan za na HLA-A0201 ograničen HTLV-1 epitop LLFGYPVYV poznat kao A6 tax TCR (Vα2,3/Vβ12,3) okrnjen je pomoću PCR s naprednim i reverznim klicama prikazanim na slici 9. Ovi TCR β-lanci klonirani su na Ndel i Xmal mjestima u pGMT7 vektoru (JMB002) koji sadrži c-fos-BT fragment. ;Po dobivanju spojenih ekspresijskih vektora provedeno je DNA sekvenciranje da bi se spriječilo stvaranje pogrešaka tijekom postupka subkloniranja (sva sekvenciranja su provedena u Biochemistry Dept. DNA Sequencing Facility, Oxford University pomoću ABI 377 Prism sekventora i ABI BigDye fluorescentnih terminatora). U usporedbi s objavljenim sljedovima baza, pokazale su se dvije pogreške u tax TCR β-lancu i poslije dodatnog istraživanja otkrili smo da su obje greške već postojale u izvornom plazmidu koji smo primili. Kako su obje pogreške bile 3ʹ od jedinstvenog mjesta Bsu36I TCR β-lanca, to su oni korišteni za kloniranje u (ispravni) JMB002 plazmid. Obje verzije tax TCR β-lanca su eksprimirane i ponovno smotane s α-lancem i uspoređene pomoću Biocore. Obje verzije proteina se specifično vežu na tax peptid-molekule MHC klase I sa sličnim prividnim afinitetom (vidjeti primjer 17). U narednim istraživanjima korišteni su samo ispravni β-lanci. ;Primjer 9 - ekspresija TCR lanaca u E. coli i pročišćavanje inkluzijskih tijela ;TCR α i β lanci odvojeno su eksprimirani u E. coli soj BL21DE3pLysS pod kontrolom vektora pGMT7 na TYP podlozi. Kada je optička gustoća (OD) pri 600 nm dosegla razinu između 0,2 i 0,6 upotrijebilo se 0,5 mM IPTG za induciranje stvaranja proteina. Iduciranje se pustilo tijekom noći, a bakterija je skupljena centrifugiranjem na 4000 rpm u Beckman J-6B centrifugi. ;Nakupine stanica bakterije ponovno su suspendirane u "puferu za lizu" (10 mM Tris pH 8,1, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 10 % glicerola). Smjesa je ohlađena na ledu, dodano je 20 μg/ml lizozima, 10 mM MgCl2 i 20 μg/ml DNaze I i inkubirana na ledu tijekom najmanje jednog sata. ;Potom je smjesa sonicirana pomoću 12 mm sonde sonikatora (Milsonix XL2020) pri maksimalnoj snazi uz upotrebu 5 udara od po 30 s između kojih je bilo 30 s stanke da bi se smjesa mogla ohladiti. Tijekom tog postupka temperatura je održavana pomoću smjese led-voda. Potom je smjesa razrijeđena s 5 volumena "Triton pufera za ispiranje" (50 mM Tris pH 8,1, 0,5 % Triton X-100, 100 mM NaCl, 0,1 % natrijeva azida, 10 mM EDTA, 2 mM DTT). Po inkubaciji na ledu tijekom barem jednog sata, smjesa je centrifugirana na 3500 rpm u Beckman GS-6R centrifugi, a supernatant je odvojen. Nakupine su ponovno suspendirane u "puferu za resuspenziju" (50 mM Tris pH 8,1, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM DTT) pomoću malene plastične pipete. Potom je smjesa centrifugirana na 8000 rpm u Beckman J2-21 centrifugi, a supernatant je odvojen. Nakupine su potom ponovno suspendirane u "puferu gvanidina" (50 mM Tris pH 8,1, 6,0 M gvanidin-HCl, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT) pomoću ručno upravljanog homogenizatora. Da bi se uklonio neotopljeni materijal provedeno je centrifugiranje pri maloj brzini, a supernatant je podijeljen u alikvote i pohranjen na -70° C. Uobičajeno je dobiveno iskorištenje od približno 100 mg po litri kulture bakterije. SDS-PAGE analize pročišćenih pripravaka inkluzijskih tijela provedene su otapanjem 2 μl pripravka inkluzijskih tijela u gvanidinski pufer s SDS-PAGE puferom za uzorke iza čega je slijedilo grijanje na 100° C tijekom 2 minute. Uzorci su punjeni u gel još vruć da bi se spriječila precipitacija gvanidin/SDS smjese tijekom punjenja. Pomoću Coomassie bojenja SDS-PAGE izvedenog na ovaj način (vidjeti sliku 23), procijenjeno je da je ovako pročišćeni protein inkluzijskih tijela približno 90 % čist. ;Primjer 10 - ponovno smotavanje i pročišćavanje TCRz heterodimera. ;Jednake količine u urei otopljenih proteina dalje su denaturirane u "puferu gvanidina" (6,0 M gvanidin-HCl, 10 mM natrijeva acetata pH 5,5, 10 mM EDTA, 2 mM DTT) pri 37° C. Smjesa proteina je injektirana u ledeno hladni pufer za ponovno smotavanje (100 mM Tris pH 8,1, 0,4 M L-arginin-HCl, 5,0 M uree, 5 mM reduciranog glutationa, 0,5 mM oksidiranog glutationa) pri ukupnoj koncentraciji proteina od 60 mg/l uz žestoko miješanje. Da bi se omogućilo ponovno smotavanje smjesa je inkubirana na ledu tijekom barem 5 sati, te je potom provedena dijaliza pomoću 10 volumena demineralizirane vode tijekom 24 sata i 10 volumena 10 mM Tris pH 8,1 tijekom narednih 24 sata. ;Ponovno smotani protein je po dijalizi profiltriran pomoću 0,45 μ nitro-celulozne membrane (Whatman), radi ukljanjanja agregiranih proteina (dobivenih kao postranji produkt tijekom procesa ponovnog smotavanja). Pročišćavanje biotinski označenog TCR obavljeno je na POROS 20 HQ koloni u Biocad Sprint sustavu. Približno 500 ml otopine ponovno smotanog proteina može se napuniti u koloni, a za eluaciju proteina korišten je gradijent natrijeva klorida u bi-tris-propan puferu pH 8,0. Protein se izeluira na približno 100 mM natrijeva klorida, a odgovarajuće frakcije se odmah ohlade na ledu, te im se doda koktel inhibitora proteaze. Frakcije su analizirane pomoću Comassie bojenja SDS-PAGE. ;Primjer 11 - ponovno smotavanje i pročišćavanje TCRz heterodimera s β lancem koji sadrži oznaku za obilježavanje s biotinom. ;TCR β-lanci koji sadrže oznaku za obilježavanje s biotinom pomiješani su s jednakom količinom eksprimiranih α-lanaca i pročišćeni isto kao i oni za topljivi receptor T stanice. Heterodimerni TCRz-β-BT-oznaka ponovno je smotan na istovjetan način kako je opisano za TCRz u primjeru 10 (vidjeti sliku 26). ;Primjer 12 - biotiniliranje topljivog TCRz-BT-oznaka ;Frakcije koje su sadržavale proteine koncentrirane su do 2,5 ml pomoću centrifugalnog koncentratora s 10K granicom propuštanja (Ultrafree, Millipore). Pufer je izmijenjen pomoću PD-10 kolona za desalinizaciju uravnoteženu s 10 mM Tris pH 8,1, 5 mM NaCl, te je dodan naredni koktel inhibitora proteaza, a protein je koncentriran do ~1 ml pomoću centrifuga koncentratora. U ovu 1 ml otopinu topljivog TCR sa oznakom za obilježavanje s biotinom dodano je slijedeće: 7,5 mM MgCl2, 5 mM ATP (pH 8,0), 1 mM biotina, 2,5 μg/ml BirA enzima za biotiniliranje. Reakcija biotiniliranja ostavljena je preko noći na sobnoj temperaturi (20-25° C). ;Enzimatski biotiniliran topljivi TCR je potom odvojen od zaostalog neizreagiranog biotina pomoću gel filtracije na Superdex 200 HR koloni (Pharmacia) u Pharmacia FPLC sustavu (vidjeti sliku 27). Kolona je uravnotežena s PBS, te su prikupljane 1 ml frakcije koje su odmah ohlađene na ledu i zaštićene s koktelom inhibitora proteaza. Koncentracija proteina je određena pomoću Coomassie pokusa vezanja (Pierce), a biotinilirani protein je pohranjen pri 4° C tijekom jednog mjeseca ili pri -20° C tijekom duljeg vremenskog perioda. ;Učinkovitost reakcije biotiniliranja provjerena je pomoću Western upijanja biotinski označenog proteina. Napravljen je SDS-PAGE gel postupak na način kako je već gore opisano uz razliku da je gel umjesto bojanja upijen na PVDF membranu (Bio-Rad) pomoću SemiPhor polusuhe aparature za elektroupijanje. Pripravak za upijanje sadrži 6 slojeva filter papira (Whatman 4M) izrezanog na veličinu gela i umočenog u transfer pufer (25 mM Tris baze, 150 mM glicina), PVDF membranu koja je prije upotrebe ovlažena metanolom i potom namočena u transfer puferu, gel koji je lagano protresan s transfer puferom tijekom 5 minuta i dodatnih 6 namočenih filter papira. Pripravak je lagano komprimiran pomoću cjevčice da bi se izgurali mjehurići zraka, te je dodano približno 10 ml dodatnog transfer pufera radi poboljšanja vodljivosti. Katoda je smještena na vrh pripravka, a kroz aparuturu je propuštena struja jakosti od 50 mA tijekom jednog sata. Membrana je potom inkubirana u 2 % otopini želatine (Bio-Rad) u PBS-T puferu (PBS + 0,05 % Tween-20) tijekom > 1 sata pri sobnoj temperaturi uz lagano potresanje. Za inkubaciju tijekom noći dodan je i 0,01 % natrijev azid za inhibiciju rasta bakterija. Membrane je isprana s nekoliko (4-5) promjena TBS-T iza čega je slijedilo bojenje s avidin-HRP konjugatom (Sigma) razrijeđenim u odnosu 1:1000 u 1 % otopini želatine u PBS-T tijekom >30 minuta pri sobnoj temperaturi uz lagano potresanje. Prije određivanja s Opti-4CN (Bio-Rad), membrana je isprana s nekoliko (4-5) promjena PBS-T. To je reaktant koji u prisustvu HRP reagira stvarajući neotopljivu plavu boju koja boji membrane na mjestima na kojima je prisutan odgovarajući protein vezan na HRP. U slučaju kada se za bojenje upotrebljava avidin-HRP konjugat, boja pokazuje prisustvo proteina koji sadrži biotin. ;Slika 28 prikazuje upijanje (engl. blot) izvedeno na opisani način na nekoliko biotiniranih TCR. Upotrebljeni su uobičajeni biotinilirani markeri (Bio-Rad) širokog raspona molekulskih masa. Upijanje je jasno pokazalo visoki stupanj biotiniliranja TCR koji sadrže oznaku za obilježavanje s biotinom i koja je reagirala s BirA enzimom. ;Primjer 13 - dobivanje biotiniliranih topljivih MHC-peptid kompleksa ;Biotinilirani topljivi MHC-peptid kompleksi mogu se prirediti kao što je opisano u primjeru 2. ;Primjer 14 - istraživanje specifičnog vezanja između topljivog TCR i MHC-flu-peptid ;Molekula topljivog TCR, JM22z, specifična je za HLA-A2 MHC molekule koje prezentiraju imuno dominantni antigen koji se sastoji od aminokiselinskih ostataka 58-66 (GILGFVFTL) proteina matriksa influence. Kloniranje, ekspresija i pročišćavanje JM22z opisano je u primjerima 4, 7, 9 i 10, te na slikama 24 i 25. Interakcije između JM22z i njegovog ligand/MHC kompleksa (HLA-A2-flu) ili nevažne HLA-A2 peptidne kombinacije, čije je dobivanje opisano u primjeru 13, istraživane su pomoću Biacore 2000™ biosenzora površinske plazma rezonancije (SPR). SPR mjeri promjenu indeksa refrakcije, izraženog u jedinicama odgovora (RU), blizu površine senzora unutar male tekuče ćelije. Na toj se osnovi mogu detektirati interakcije između receptora i liganda, te analizirati parametri afiniteta i kinetike interakcija. Tekuče ćelije su priređene imobilizacijom pojedinačnih HLA-A2-peptid kompleksa u odvojenim tekučim ćelijama putem vezanja između biotin umreženog na β2m i streptavidina koji je bio kemijski umrežen na aktiviranu površinu tekuče ćelije. Istraživanje je potom provedeno propuštanjem JM22z preko površina različitih tekučih ćelija pri konstantnoj brzini protoka, te mjerenjem SPR odgovora. Na početku, specifičnost interakcija je potvrđena propuštanjem 28 μM JM22z s konstantnom brzinom protoka od 5 μl min-1 preko triju različitih površina; jedne obložene s 2800 RU HLA-A2-flu, druge obložene s 4200 RU HLA-A2 smotane s nevažnim peptidom iz HIV reverzne transkriptaze (HLA-A2-pol: ILKEPVHGV) i treće obložene s 4300 RU CD5 (slika 29a, umetak). Injekcije topljivog JM22z pri različitim koncentracijama i pri konstantnoj brzini protoka preko HLA-A2-pol korištene su za određivanje pozadinske rezonancije (slika 29a). Vrijednosti dobivene ovim kontrolnim mjerenjem oduzete su od vrijednosti dobivenih s HLA-A2-flu (slika 29b) i korištene za izračunavanje afiniteta vezanja izraženog kao konstanta disocijacije, Kd (slika 29c). Za JM22z i njegovu odgovarajuću MHC molekulu određena je vrijednost Kd od 15 ± 4 μM (n=7) pri 37° C i 6,6 ± 2 μM (n=14) pri 25° C. Mjerenja s imobiliziranim TCR u tekučoj ćeliji i topljivim MHC-peptid kompleksom dala su sličan rezultat za Kd u iznosu od 5,6 ± 4 μM (n=3) pri 25° C. Određena brzina stvaranja je između 6,7 x 104 i 6,9 x 104 M-1 s-1pri 37° C, dok je brzina raspada 1,1 s-1 (Wilcox, Gao et al. 1999). ;Primjer 15 - istraživanje specifičnog vezanja između mišjeg TCR i mišjeg MHC H2-Db-NP ;U ovom istraživanju koristili smo mišji TCR, F5, specifičan za peptid dobiven iz nukleoproteina virusa influence (aminokiselinski ostaci 366-374: ASNENMDAM) prezentiranog od strane mišje H2-Db MHC molekule (H2-Db-NP). Upotrijebljeni gen MHC teškog lanca malo je modificiran na način da kodira samo aminokiseline 1-280 nativnog proteina plus slijed od 13 aminokiselina koji prepoznaje BirA enzim. Ovako dobiveni protein može se biotinilirati pomoću enzima (Schatz 1993; OʹCallaghan, Byford et al. 1999). SPR analiza pomoću Biacore 2000™ SPR biosenzora ovakvog topljivog TCR specifičnog za imobilizirani H2-Db-NP pokazala je njegovo specifično vezanje na ligand MHC-peptid kombinaciju (podaci nisu prikazani) ;Primjer 16 - usporedba vezanja biotiniliranog topljivog tax-TCR i biotiniliranog topljivog mutantnog tax-TCR ;Biotinilirani topljivi tax-TCR su priređeni kao što je to opisano u primjerima 9-11, a Biocore analiza je provedena kao u primjeru 14 uz upotrebu biotiniliranih pMHC kompleksa, ponovno smotanih ili s peptidom matriksa influence (GILGFVFTL) ili s HTLV tax 11-19 peptidom (LLFGYPVYV). Biotinilirani topljivi TCR propuštani su preko svih ćelija tijekom ukupno 1 minute i uz brzinu od 5 μl/minuta. Slika 30 prvo prikazuje vezanje biotiniliranog topljivog tax-TCR, a potom vezanje biotiniliranog topljivog mutantnog tax-TCR na HTLV tax 11-19 peptid-MHC kompleks (A). Niti divlji tip niti mutirani tax-TCR nisu pokazali vezanje na kompleks peptid matriksa influence-MHC (B/C), a također niti na OX69 kontrole monoklonskog antitijela (D). Prema tome smo zaključili da se oba tipa, divlji i mutirani, biotiniliranog topljivog TCR nedvojbeno, učinkovito i specifično vežu na tax-pMHC kompleks, te da pokazuju vrlo malu razliku u stupnju vezanja. ;Primjer 17 - analize istovremenog vezanja TCR i koreceptora CD8 na imobilizirani MHC peptid kompleks ;CD8 i CD4 su površinski glikoproteini za koje se vjeruje da funkcioniraju kao koreceptori za TCR time što se istovremeno vežu na iste MHC molekule kao i TCR. CD8 je svojstven citotoksičnim T stanicama i veže se na molekule MHC klase I, dok se CD4 ekspresira na T stanice pomoćne linije i veže na molekule MHC klase II. CD8 je dimer koji se sastoji ili od dva jednaka α-lanca ili od jednog α-lanca i jednog β-lanca. Homodimerna αα-CD8 molekula priređena je kao što je opisano (PCT/GB98/03235; Gao, Torno et al.1997; Gao, Gerth et al. 1998). U ovom primjeru opisali smo istovremeno vezanje topljivih TCR i CD8 molekula na imobilizirani HLA-A2-flu kompleks. Kao što se može vidjeti na slici 31A, mjereni odgovor vezanja je aditivan. Oduzimanjem vrijednosti odgovora za TCR (neobojani kružići) od vrijednosti kombiniranog odgovora (obojani kružići) dobivene su vrijednosti (neobojani kvadrati) vrlo slične vrijednostima odgovora samostalnog 120 μM CD8 (neobojani trokuti). Slika 31B prikazuje da na kinetiku TCR-MHC-peptid interakcija ne utječe istovremeno vezanje CD8. Uočeno aditivno vezanje upućuje na zaključak da TCR i CD8 vežu MHC peptidni kompleks na različitim međupovršinama. Ovaj primjer pokazuje da u nekim slučajevima specifično vezanje jedne molekule ne utječe na specifično vezanje druge molekule. Najvjerojatnije je da je ovakva situacija različita za druge kombinacije molekula. ;Primjer 18 - ekspresija, ponovno smotavanje i biotiniliranje na specifičnom mjestu topljivog α/β TCR ;a) Dobivanje α i β lanaca TCR. ;Rekombinantni topljivi oblik hetrodimerne TCR molekule dobiven je na način naznačen na slici 36. Svaki se lanac sastoji od membranski distalnih i proksimalnih imunoglobulinskih domena koje su spojene kratkim fleksibilnim poveznikom na motiv smotanog klupka koji pomaže u stabiliziranju heterodimera. ;Slike 32 do 34 i 38 do 41 prikazuju sljedove baza koje kodiraju DNA i odgovarajuće sljedove aminokiselina za različite alfa i beta lance različitih TCR koji se odlikuju različitim specifičnostima. Ovaj se primjer zadržava na TCR predstavljenim sljedovima baza prikazanim na slikama 32 do 34, ali ovdje otkriveni postupci mogu se slično primijeniti i na TCR dane na slikama 38 do 41. ;Stalne domene TCR su okrnjene neposredno prije cisteinskih ostataka koji in vivo stvaraju međulančanu disulfidnu vezu. Prema tome, dva se lanca međusobno sparuju putem nekovalentnih kvaternih kontakata. Kako su i heterodimeri Fos-Jun peptida zatvarača također sposobni stvarati međulančanu disulfidnu vezu neposredno N-terminalno do upotrebljenog poveznika (OʹShea et al. 1989), može se predvidjeti da je usmjeravanje dvaju lanaca relativno jedan prema drugome optimalno. Proteini koji se vežu moraju se povezati na način sukladan sa svakom pojedinom odvojenom komponentom da bi se spriječilo ometanje njihovih struktura. ;cDNA koja kodira alfa i beta lance TCR specifičnog za epitop proteina 58-66 matriksa influence u HLA-A2 dobivena je iz Vβ17+ humanog CTL klona (JM22) pomoću usidrenog PCR kao što je prethodno opisano (Moss et al. 1991). ;Alfa i beta TCR-zatvarač konstrukti pJM22α-Jun i pJM22β-Fos odvojeno su dobiveni umnožavanjem stalne i promjenjive domene svakog lanca pomoću uobičajene PCR tehnologije i povezivanjem produkata na domene leucinskog zatvarača eukariotskih Jun i Fos faktora transkripcije. Pokazalo se da se ovi 40 aminokiselina dugi sljedovi specifično heterodimeriziraju prilikom ponovnog smotavanja iz sintetičkih peptida bez potrebe za kovalentnim međulančanim poveznikom (OʹShea et al. 1989). ;Klica je napravljena tako da prihvati visoki sadržaj AT neposredno 3ʹ do kodona za inicijaciju (da bi se destabilizirala sekundarna struktura mRNA) i za upotrebu kodonskih preferencija E. coli, da bi se maksimalno povećala ekspresija (Gao et al. 1998). Preostali cistein u TCR beta stalnoj domeni je mutiran u serin da bi se spriječilo neispravno disulfidno vezanje tijekom ponovnog smotavanja. ;Spojeni sljedovi baza DNA i proteina prikazani su na slikama 32 i 33. Da bi se omogućilo biotiniliranje beta lanaca ovih TCR na specifičnom mjestu, uveden je slijed baza DNA koji kodira tzv. "oznaku za obilježavanje s biotinom" na 3ʹ kraj gena za ekspresiju topljivog Vβ17. Slijedeće PCR klice korištene su za dobivanje ovih DNA konstrukata: ;5ʹ-GCTCTAGACATATGGGCCCAGTGGATTCTGGAGTCAC- 3ʹ ;i ;5ʹ-GGGGGAAGCTTAATGCCATTCGATTTTCTGAGCTTCAAAAATATCGTTCAGACCACCACCGGATCCGTAAGCTGCCAGGATGAACTCTAG-3ʹ ;Dobiveni PCR produkt je razgrađen s restrikcijskim enzimima Ndel i HindIII (New England Biolabs) i legiran s T4 DNA ligazom (New England Biolabs) u vektor pGMT7 (Studier et al. 1990). Slika 3 prikazuje slijed baza DNA umetka u ovakav konstrukt i predpostavljeni slijed aminokiselina proteina. ;b) Ekspresija TCR lanaca ;Ekspresija i ponovno smotavanje TCR specifičnog za peptid matriksa virusa influence prezentiranog od HLA-A*0201 provedeno je kako slijedi:

TCR α i β lanci odvojeno su eksprimirani u E. coli soj BL21DE3pLysS pod kontrolom vektora pGMT7 na TYP podlozi (1,6 % bakto triptona, 1,6 % ekstrakta kvasca, 0,5 % NaCl, 0,25 % K2HPO4). Ekspresija je inducirana u srednjem dijelu eksponencijalne faze rasta s 0,5 mM IPTG i po 3-5 sati bakterija je skupljena centrifugiranjem. Bakterijske stanice su podvrgnute lizi suspendiranjem u "puferu za lizu" (10 mM EDTA, 2 mM DTT, 10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM PMSF, 0,1 mg/ml lizozima, 10 % glicerola) iza čega je dodano 10 mM MgCl2 i 20 μg/ml Dnaze, te je provedena inkubacija na ledu tijekom 20 minuta i sonikacija pomoću sonde sonikatora u 10 udara svaki u trajanju 30 sekundi. Protein u inkluzijskim tijelima je potom pročišćen u nekoliko ispiranja (obično 3) s "Triton puferom" (0,5 % Triton X-100, 50 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl, 0,1 % natrijeva azida, 10 mM EDTA, 2 mM DTT) uz pomoć centrifugiranja na 15000 rpm tijekom 20 minuta da bi se nakupila inkluzijska tijela, te je potom ponovno suspendiran u "staklenom" (engl. "dounce") homogenizatoru. Detergent je iz pripravka uklonjen jednim pranjem s 50 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM DTT, a protein je otopljen u "urea puferu" (20 mM Tris pH 8, 8 M uree, 10 % glicerola, 500 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM DTT). Po miješanju preokretanjem tijekom noći pri 4° C, otopinu se razbistrilo centrifugiranjem, a otopljeni je protein pohranjen na -70° C. Koncentracija proteina je određena Coomassie pokusom vezanja (Pierce).

c) Ponovno smotavanje TCR

Jednake količine u urei otopljenih proteina dalje su denaturirane u "puferu gvanidina" (6 M gvanidin-HCl, 10 mM natrijeva acetata pH 5,5, 10 mM EDTA, 2 mM DTT) pri 37° C. Ova smjesa proteina je dodana u ledom hlađeni pufer za ponovno smotavanje (5,0 M uree,100 mM Tris pH 8, 400 mM L-arginina, 5 mM reduciranog glutationa, 0,5 mM oksidiranog glutationa, 0,1 mM PMSF) uz žestoko miješanje. Nakon >12 sati pri 4° C, otopina je podvrgnuta dijalizi na 10 volumena vode te potom na 10 volumena 10 mM Tris pH 8, 100 mM uree. Inhibitor proteaze PMSF je dodan u svim koracima da bi se proteolitički gubitak oznake za obilježavanje s biotinom na TCR smanjio na minimum.

d) Pročišćavanje TCR

Razrijeđena otopina TCR filtrirana je na 0,45 μ filteru da bi se uklonio agregirani protein, te je napunjena u POROS 10HQ kolonu. Ponovno smotani TCR eluiran je pomoću gradijenta natrijeva klorida u 10 mM Tris pH 8, a prikupljene frakcije od po 1 ml analizirane su pomoću SDS-PAGE (vidjeti sliku 36). Frakcije koje su sadržavale TCR su udružene i koncentrirane na 1 ml pomoću centrifugalnog koncentratora s 30 kDa granicom propuštanja.

e) Biotiniliranje TCR

1 ml otopine TCR priređen je u obliku otopine s 7,5 mM ATP pomoću puferiranog ATP, 5 mM MgCl2, 1 mM biotina, a dodan je i koktel inhibitora proteaza koji je sadržavao PMSF, leupeptin i pepstatin. Na kraju je dodan BirA enzim do konačne koncentracije od 5 μg/ml i reakcija je ostavljena pri sobnoj temperaturi tijekom noći. Potom je TCR odvojen od slobodnog biotina gel filtracijom (vidjeti sliku 37). Frakcije koje su sadržavale biotiniliran TCR su udružene i dodan je koktel inhibitora proteaza. Također je određena i koncentracija proteina. Slika 35 je shematski prikaz topljivog biotiniliranog TCR.

Literaturni navodi

Aifantis, I., O. Azoqui, et al. (1998). Immunity 9(5): 649-55.

Altamirano, M. M., C. Garcia, et al. (1999). Nature Biotechnology 17: 187-191.

Altamirano, M. M., R. Golbik, et al. (1997). Proc Natl Acad Sci USA 94(8): 3576-8.

Amati, B., S. Dalton, et al. (1992). Nature 359(6394): 423-6.

Barker, D. F. and A. M. Campbell (1981). J Mol Biol 146(4): 469-92.

Barker, D. F. and Campbell A. M. (1981). J Mol Biol 146(4): 469-92.

Bentley, G. A., G. Boulot, et al. (1995). Science 267(5206): 1984-7 Isnn: 0036-8075.

Bjorkman, P. J., L. Strominger, et al. (1992). J. Mol. Biol 186(1): 205-10 Isnn: 0022-2836.

Boice, J. A., G. R. Dieckmann, et al. (1996). Biochemistry 35(46): 14480-5.

Boulot, G., G. A. Bentley, et al. (1994). J. Mol. Biol 235(2): 795-7 Issn 0022-2836.

Brocker, T., A. Peter, et al. (1993). Eur J Immunol 23(7): 1435-9 Issn 0014-2980.

Buday, L. and J. Downward, et al. (1993). Cell 73(3): 611-20.

Calaman, S. D., G. R. Carson, et al. (1993). J Immunol Methods 164(2): 233-44 Issn 0022-1759.

Chao, H., M. E. Houston, Jr., et al. (1996). Biochemistry 35(37): 12175-85

Chang, H. C., Z. Bao, et al. (1994). Proc Natl Acad Sci USA 91(24): 11408-12.

Chevray, P. M. and D. Nathans, et al. (1992). Proc Natl Acad Sci USA 89(13): 5789-93.

Chicz, R. M., R. G. Urban, et al. (1992). J Exp Med 178(1): 27-47.

Corr, M., A. E. Slanetz, et al. (1994). Science 265(5174): 946-9.

Davis, M. M., J. J. Boniface, et al. (1998). Annu. Rev. Immunol. 16: 523-544.

de Kruif, J. and T. Logtenberg, et al. (1996). J Biol Chem 271(13): 7630-4.

Ding, Y. H., J. Smith, et al. (1998). Immunity 8(4): 403-11.

Eilat, D., G. E. Kikuchi, et al. (1992). Proc Natl Acad Sci USA 89(15): 6871-5 Issn: 0027-8424.

Engelhard, V. H. (1994). Annu Rev Immunol 12: 181-207.

Engelhard, V. H., E. Appella, et al. (1993). Chem Immunol 57: 39-62.

Fiekds, B. A., E. L. Malchiodi, et al. (1996). Nature 384(6605): 188-92 Issn: 0028-0836.

Gao, G. F., U. C. Gerth, et al. (1998). Prot. Sci 7: 1245-49.

Gao, G. F., J. Tormo, et al. (1997). Nature 387(6633): 630-4.

Garboczi, D. N. and W. E. Biddison, et al. (1999). Immunity 10(1): 1-7.

Garboczi, D. N., P. Ghosh, et al. (1996). Nature 384(6605): 134-41.

Garboczi, D. N., D. T. Hung, et al. (1992). Proc Natil Acad Sci USA 89(8): 3429-33 Issn: 0027-8424.

Garboczi, D. N., D. R. Madden, et al. (1994). J Mol Biol 239(4): 581-7 Issn 0022-2836.

Garboczi, D. N., U. Utz, et al. (1999). J Immunol 157(12): 5430-10.

Garcia, K. C., M. Degano, et al. (1996). Science 274(5285): 209-19 Issn 0036-8075.

Glover, J. N., S. C. Harrison, et al. (1995). Nature 373(6511): 257-61.

Golden, A., S. S. Khandekar, et al. (1997). J Immunol Methods 206(1-2): 163-9.

Greenfield, N. J., G. T. Montelione, et al. (1998). Biochemistry 37(21): 7834-43.

Gregorie, C., B. Malissen, et al. (1996). Eur J Immunol 26(10): 2410-6 Issn: 0014-2980.

Gregorie, C, N. Rebai, et al. (1991). Proc Natl Acad Sci USA 88(18): 8077-81 Issn: 0027-8424.

Hilyard, et al. (1994). Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 9057-9061.

Howard, P. K., J. Show, et al. (1985). Gene 35(3): 321-31.

Hu, J. C., N. E. Newell, et al. (1993). Protein Sci 2(7): 1072-84.

Huczko, E. L., W. M Bodnar, et al. (1993). J Immunol 151(5): 2572-87.

Hunt, D. F., H. Michel, et al. (1992). Science 256(5065): 1818-20 Issn 0036-8075.

Ishii, Y., T. Nakano, et al. (1995). J Immunol Methods 186(1): 27-36 Issn 0022-1759.

Kouzarides, T. and E. Ziff, et al. (1999). Nature 340(6234): 568-71.

Landschulz, W. H., P. F. Johnson, et al. (1988). Science 240(4860): 1759-64.

Lowenstein, E. J., R. J. Daly, et al. (1992). Cell 70(3): 431-42.

Lumb, K. J. and P. S. Kim, et al. (1995). Biochemistry 34(27): 8642-8.

Maden, D. R., D. N. Garboczi, et al. (1993).[pogreškom objavljen u Cell 1994 Jan 28;76(2): poslije 410] Cell 75(4): 693-708 Issn: 0092-8674.

Matsui, K., J. J. Boniface, et al. (1994). Proc Natl Acad Sci USA 91(26): 12862-6 Issn: 0027-8424.

McKnight, S. L. (1991). Sci Am 264(4): 54-64.

Moss et al. (1991). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8987-8990 Issn 0027-8424.

Nautiyal, S., D. N. Woolfson, et al. (1995). Biochemistry 34(37): 11645-51.

Necker, A., N. Rebai, et al. (1991). Eur J Immunol 21(12): 3035-40 Issn: 0014-2980.

OʹCallaghan, C. A., M. F. Byford, et al. (1999). Anal Biochem 266(1): 9-15.

OʹShea, E. K., R. Rutkowski, et al. (1992). Cell 68(4): 699-708.

OʹShea, E. K., R. Rutkowski, et al. (1989). Science 245(4918): 646-8.

OʹShea, E. K., Lumb, K. J. and Kim, P. S. (1993). Curr. Biol 3: 658-667.

Plaksin, D., K. Polakova, et al. (1997). J Immunol 158(5): 2218-27.

Rabinowitz, J. D., C. Beeson, et al. (1996). Proc Natl Acad Sci USA 93(4): 1401-5 Issn: 0027-8424.

Ramiro, A. R., C. Triqueros, et al. (1996). J Exp Med 184(2): 519-30 Issn 0022-1007.

Reid, S. W., S. McAdam, et al. (1996). J Exp Med 184(6): 2279-86.

Reid, S. W., K. J. Smith, et al. (1996). FEBS Lett 383(1-2): 119-23.

Riley, L. G., G. B. Ralston, et al. (1996).[pogreškom objavljen u Protein Eng 1996 Sep;9(9):831]. Protein Eng 9(2): 223-30.

Romagne, F., M. A. Peyart, et al. (1996). J Immunol Methods 189(1): 25-36 Issn 0022-1759.

Saint Ruf, C., K. Ungewiss, et al. (1994). Science 266(5188): 1208-12 Issn 0036-8075.

Schatz, P. J. (1993). Biotechnology N Y 11(10): 1138-43.

Schlessinger, J. (1994). Curr Opin Genet Dev 4(1): 25-30.

Schlueter, C. J., B. A. Schodin, et al. (1996). J Mol Biol 256(5): 859-69.

Schuermann, M., J. B. Hunter, et al. (1991). Nucleic Acids Res 19(4): 739-49.

Smith, K. J., S. W. Reid, et al. (1996). Imunity 4(3): 215-28 Issn 1074-7613.

Smith, K. J., S. W. Reid, et al. (1996). Imunity 4(3): 203-13 Issn 1074-7613.

Studier, F. W., A. H. Rosenberg, et al. (1990). Methods Enzymol 185: 60-89 Issn 0076-6879.

Von Boehmer, H, I. Aifantis, et al. (1998). Immunol Rev 165: 111-9.

Weber, S., A. Traunecker, et al. (1992). Nature 356(6372): 793-6 Issn: 0028-0836.

Wilcox, B. E., G. F. Gao, et al. (1999). Imunity 10: 357-65.

Wilson, A. and H. R. McDonald (1995). Int Immunol 7(10): 1659-64 Issn 0953-8178.

Wurch, A., J. Biro, et al. (1998). J Exp Med 188(9): 1669-78.

Wyer, J. R., B. E. Wilcox, et al. (1999). Imunity 10: 219-225.

Zhang, Z., A. Murphy, et al. (1999). Curr Biol 9(8): 417-20.

SEQUENCE LISTING

<110> Avidex Ltd.

<120> Soluble T Cell Receptor

<130> NJL/P21736WO

<140> PCT/GB99/01588

<141> 1999-05-19

<150> GB/9810759.2

<151> 1998-05-19

<160> 85

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Forward poly-C

"anchor" primer for PCR-amplificaton of cDNAs

extendedat their 3'-terminal with a strech of

G-residues using Terminal transferase. (Figure 4A)

<400> 1

taaatactcg aggcgcgccc cccccccccc ccc 33

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence:Human TCR alpha

chain constant region 3'-specific primer. (Figure

4B).

<400> 2

atataacccg gggaaccaga tccccacagg aactttctgg gctgggga 48

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Human TCR beta

chain constant region 3'-specific PCR primer.

<400> 3

atataacccg gggaaccaga tccccacagt ctgctctacc ccaggcc 47

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Human c-jun

leucine zipper 5'-specific PCR primer.

<400> 4

catacacccg ggggtagaat cgcccggctg gag 33

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Human c-jun

leucine zipper 3'-specific PCR primer. (Figure

5B).

<400> 5

gtgtgtgctc gaggatccta gtagttcatg actttctgtt taagctgtgc 50

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Human c-fos

leucine zipper 5'-specific PCR primer. (Figure

5C).

<400> 6

catacacccg ggggtctgac tgatacactc caagcggag 39

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Human c-fos

leucine zipper 3'-specific PCR primer. (Figure

5D).

<400> 7

tgtgtgctcg aggatcctag taagctgcca ggatgaactc tagtttttc 49

<210> 8

<211> 120

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Partial human c-fos sequence coding for the

leucine zipper domain as fused to TCR beta chains.

(Figure 6B).

<400> 8

ctgactgata cactccaagc ggagacagac caactagaag atgagaagtc tgctttgcag 60

accgagattg ccaacctgct gaaggagaag gaaaaactag agttcatcct ggcagcttac 120

<210> 9

<211> 120

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Partial human c-jun sequence coding for the

leucine zipper domain as fused to TCR alpha

chains. (Figure 6A).

<400> 9

agaatcgccc ggctggagga aaaagtgaaa accttgaaag ctcagaactc ggagctggcg 60

tccacggcca acatgctcag ggaacaggtg gcacagctta aacagaaagt catgaactac 120

<210> 10

<211> 40

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> C-jun leucine zipper amino acid sequence as fused

to TCR alfa chains. (Figure 6A)

<400> 10

Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn

1 5 10 15

Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln

20 25 30

Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr

35 40

<210> 11

<211> 40

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C-fos leucine zipper amino acid sequence as fused

to TCR beta chains. (Figure 6B).

<400> 11

Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Glu Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys

20 25 30

Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr

35 40

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Forward PCR

primer for mutating the unpaired cysteine of human

TCR beta chains to serine (Figure 7A).

<400> 12

gactccagat acagcctgag cagccg 26

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of the human TCR beta chain

after mutating the unpaired cysteine to serine

(Figure 7A).

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Amino acid

sequence of the human TCR beta chain after

mutating the unpaired cysteine to serine (Figure

7A).

<400> 13

Asp Ser Arg Tyr Ser Leu Ser Ser

1 5

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence:Backward PCR

primer for mutating the unpaired cysteine of human

TCR beta chains to serine (Figure 7B).

<400> 14

cggctgctca ggctgtatct ggagtc 26

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Forward PCR

primer for mutating the unpaired cysteine of human

TCR beta chains to alanine (Figure 7C).

<400> 15

gactccagat acgctctgag cagccg 26

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Amino acid

sequence of the human TCR beta chain after

mutating the unpaired cysteine to alanine (Figure

7C).

<400> 16

Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser

1 5

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Backward PCR

primer for mutating the unpaired cysteine of human

TCR beta chains to alanine (Figure 7D).

<400> 17

cggctgctca gagcgtatct ggagtc 26

<210> 18

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: 5' PCR primer

for the human V alpha10.2 chain of the JM22

Influenza matrix peptide-HLA-A0201 restricted TCR.

(Figure 9A).

<400> 18

gctctagaca tatgcaacta ctagaacaaa gtcctcagtt tctaagcatc caagagg 57

<210> 19

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> New N-terminal amino acid sequence of truncated V

alpha10.2 chain of the human JM22 Influenza matrix

peptide-HLA-A0201 restricted TCR. (Figure 9A).

<400> 19

Met Gln Leu Leu Glu Gln Ser Pro Gln Phe Leu Ser Ile Gln Glu

1 5 10 15

<210> 20

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: 5' PCR primer

for the human V beta17 chain of the JM22 Influenza

matrix peptide-HLA-A0201 restricted TCR. (Figure

9B)

<400> 20

gctctagaca tatggtggat ggtggaatca ctcagtccc 39

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> New N-terminal amino acid sequence of truncated V

beta17 chain of the human JM22 Influenza matrix

peptide-HLA-A0201 restricted TCR. (Figure 9B).

<220>

<223> Description of Artificial Sequence:New N-terminal

amino acid sequence of truncated V beta17 chain of

the JM22 Influenza matrix peptide-HLA-A0201

restricted TCR. (Figure 9A)

<400> 21

Met Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser

1 5

<210> 22

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: 5' PCR primer

for the mouse V alpha4 chain of the Influenza

nucleoprotein peptide-H2Db restricted TCR. (Figure

9C).

<400> 22

gctctagaca tatggattct gttactcaaa tgcaaggtca agtgaccctc tcatcag 57

<210> 23

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: New N-terminal

amino acid sequence of truncated V alpha4 chain of

the mouse Influenza nucleoprotein peptide-H2-Db

restricted TCR. (Figure 9C).

<400> 23

Met Asp Ser Val Thr Gln Met Gln Gly Gln Val Thr Leu Ser Ser

1 5 10 15

<210> 24

<211> 53

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<223> 5' PCR primer for the mouse V beta 11 chain of the

Influenza nucleoprotein peptide-H2Db restricted

TCR. (Figure 9D).

<400> 24

gctctagaca tatggaacca acaaatgctg gtgttatcca aacacctagg cac 53

<210> 25

<211> 14

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<223> New N-terminal amino acid sequence of truncated

murine V beta 11 chain of the Influenza

nucleoprotein peptide-H2-Db restricted TCR .

<400> 25

Met Glu Pro Thr Asn Ala Gly Val Ile Gln Thr Pro Arg His

1 5 10

<210> 26

<211> 36

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> 5' PCR primer for the human V alpha 23 chain of

the 003 HIV-1 GAGag peptide-HLA-A0201 restricted

TCR. (Figure 9E).

<400> 26

ggaattccat atgaaacaag aggttacaca aattcc 36

<210> 27

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> New N-terminal amino acid sequence of truncated

human Valpha23 chain of the 003 HIV-1 Gag

peptide-HLA-A0201 restricted TCR . (Figure 9E).

<400> 27

Met Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile

1 5

<210> 28

<211> 36

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> 5' PCR primer for the human Vbeta5.1 chain of the

003 HIV-1 Gag peptide-HLA-A0201 restricted TCR.

(Figure F).

<400> 28

ggaattccat atgaaagctg gagttactca aactcc 36

<210> 29

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> New N-terminal amino acid sequence of truncated

human Vbeta5.1 chain of the 003 HIV-1 Gag

peptide-HLA-A0201 restricted TCR . (Figure 9F).

<400> 29

Met Lys Ala Gly Val Thr Gln Thr

1 5

<210> 30

<211> 33

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> 5' PCR primer for the human Valpha2.3 chain of the

HTLV-1 Tax peptide-HLA-A0201 restricted A6 TCR.

(Figure 9g).

<400> 30

cccccccata tgcagaagga agtggagcag aac 33

<210> 31

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> New N-terminal amino acid sequence of truncated

human V alpha 2.3 chain of the HTLV-1 Tax

peptide-HLA-A0201 restricted A6 TCR . (Figure 9G).

<400> 31

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Lys

1 5

<210> 32

<211> 33

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> 5' PCR primer for the human Vbeta12.3 chain of the

HTLV-1 Tax peptide-HLA-A0201 restricted A6 TCR.

(Figure 9H).

<400> 32

cccccccata tgaacgctgg tgtcactcag acc 33

<210> 33

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> New N-terminal amino acid sequence of truncated

human Vbeta12.3 chain of the HTLV-1 Tax

peptide-HLA-A0201 restricted A6 TCR . (Figure 9H).

<400> 33

Met Lys Ala Gly Val Thr Gln Thr

1 5

<210> 34

<211> 48

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> 5' PRC

<220>

<223> 5' PCR primer for the human Valpha17.2 chain of

the HTLV-1 Tax peptide-HLA-A0201 restricted B7

TCR. (Figure 9I).

<400> 34

cccccccata tgcaacaaaa aaatgatgac cagcaagtta agcaaaat 48

<210> 35

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> New N-terminal amino acid sequence of truncated

human Valpha17.2 chain of the HTLV-1 Tax

peptide-HLA-A0201 restricted B7 TCR . (Figure 9I).

<400> 35

Met Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln Asn

1 5 10

<210> 36

<211> 45

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> 5' PCR primer for the human Vbeta12.3 chain of the

HTLV-1 Tax peptide-HLA-A0201 restricted B7 TCR.

(Figure 9J)

<400> 36

cccccccata tgaacgctgg tgtcactcag accccaaaat tccag 45

<210> 37

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> New N-terminal amino acid sequence of truncated

human Vbeta12.3 chain of the HTLV-1 Tax

peptide-HLA-A0201 restricted B7 TCR . (Figure 9J).

<400> 37

Met Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln

1 5 10

<210> 38

<211> 38

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> 3' PCR primer for human Calpha chains, generally

applicable. (Figure 9K).

<400> 38

catacacccg ggggaacttt ctgggctggg gaagaagg 38

<210> 39

<211> 33

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> 3' PCR primer for human Cbeta chains, generally

applicable. (Figure 9L).

<400> 39

catacacccg gggtctgctc taccccaggc ctc 33

<210> 40

<211> 744

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Mutated DNA sequence of soluble HLA-A2/flu matrix

restricted TCR alpha chain from JM22, as fused to

the "leucine zipper" domain of human c-jun.

(Figure 10).

<400> 40

atgcaactac tagaacaaag tcctcagttt ctaagcatcc aagagggaga aaatctcact 60

gtgtactgca actcctcaag tgttttttcc agcttacaat ggtacagaca ggagcctggg 120

gaaggtcctg tcctcctggt gacagtagtt acgggtggag aagtgaagaa gctgaagaga 180

ctaacctttc agtttggtga tgcaagaaag gacagttctc tccacatcac tgcggcccag 240

cctggtgata caggcctcta cctctgtgca ggagcgggaa gccaaggaaa tctcatcttt 300

ggaaaaggca ctaaactctc tgttaaacca aatatccaga accctgaccc tgccgtgtac 360

cagctgagag actctaaatc cagtgacaag tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct 420

caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta 480

gacatgaggt ctatggactt caagagcaac agtgctgtgg cctggagcaa caaatctgac 540

tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc attattccag aagacacctt cttccccagc 600

ccagaaagtt cccccggggg tagaatcgcc cggctggagg aaaaagtgaa aaccttgaaa 660

gctcagaact cggagctggc gtccacggcc aacatgctca gggaacaggt ggcacagctt 720

aaacagaaag tcatgaacta ctag 744

<210> 41

<211> 247

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Predicted amino acid sequence of the soluble

HLA-A2/flu matrix restricted alpha chain from

JM22, as fused to the "lecine zipper" domain of

c-jun. (Figure 10).

<400> 41

Met Gln Leu Leu Glu Gln Ser Pro Gln Phe Leu Ser Ile Gln Glu Gly

1 5 10 15

Glu Asn Leu Thr Val Tyr Cys Asn Ser Ser Ser Val Phe Ser Ser Leu

20 25 30

Gln Trp Tyr Arg Gln Glu Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu Val Thr

35 40 45

Val Val Thr Gly Gly Glu Val Lys Lys Leu Lys Arg Leu Thr Phe Gln

50 55 60

Phe Gly Asp Ala Arg Lys Asp Ser Ser Leu His Ile Thr Ala Ala Gln

65 70 75 80

Pro Gly Asp Thr Gly Leu Tyr Leu Cys Ala Gly Ala Gly Ser Gln Gly

85 90 95

Asn Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Lys Pro Asn Ile

100 105 110

Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser

115 120 125

Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val

130 135 140

Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu

145 150 155 160

Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser

165 170 175

Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile

180 185 190

Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Pro Gly Gly Arg

195 200 205

Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser

210 215 220

Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu

225 230 235 240

Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr

245

<210> 42

<211> 864

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> DNA sequence of the soluble HLA-A2/flu restricted

TCR beta chain from JM22, as fused to the "leucine

zipper" domain of c-fos. (Figure 11).

<400> 42

atggtggatg gtggaatcac tcagtcccca aagtacctgt tcagaaagga aggacagaat 60

gtgaccctga gttgtgaaca gaatttgaac cacgatgcca tgtactggta ccgacaggac 120

ccagggcaag ggctgagatt gatctactac tcacagatag taaatgactt tcagaaagga 180

gatatagctg aagggtacag cgtctctcgg gagaagaagg aatcctttcc tctcactgtg 240

acatcggccc aaaagaaccc gacagctttc tatctctgtg ccagtagttc gaggagctcc 300

tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca cagaggacct gaaaaacgtt 360

ttcccacccg aggtcgctgt gtttgaacca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420

gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg 480

gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag 540

cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600

tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660

gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720

ggtagagcag accccggggg tctgactgat acactccaag cggagacaga tcaacttgaa 780

gacaagaagt ctgcgttgca gaccgagatt gccaatctac tgaaagagaa ggaaaaacta 840

gagttcatcc tggcagctta ctag 864

<210> 43

<211> 287

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Predicted amino acid sequence of the soluble

HLA-A2/flu matrix restricted beta chain from JM22,

as fused to the "lecine zipper" domain of c-fos.

(Figure 11).

<400> 43

Met Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys

1 5 10 15

Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp

20 25 30

Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu

50 55 60

Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val

65 70 75 80

Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Ser

85 90 95

Ser Arg Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr

100 105 110

Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe

115 120 125

Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val

130 135 140

Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp

145 150 155 160

Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro

165 170 175

Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser

180 185 190

Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe

195 200 205

Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr

210 215 220

Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp

225 230 235 240

Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr

245 250 255

Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn

260 265 270

Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr

275 280 285

<210> 44

<211> 795

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DNA sequence of the soluble H2-Db/Influenza virus

nucleoprotein restricted TCR alpha chain from

murine F5 receptor, as fused to the "leucine

zipper" domain of c-jun. (Figure 12).

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Fusion gene

coding for truncated murine F5 TCR alpha chain

fused to the leucine zipper domain of human c-jun.

<400> 44

atgaactatt ctccagcttt agtgactgtg atgctgtttg tgtttgggag gacccatgga 60

gactcagtaa cccagatgca aggtcaagtg accctctcag aagacgactt cctatttata 120

aactgtactt attcaaccac atggtacccg actcttttct ggtatgtcca atatcctgga 180

gaaggtccac agctcctttt gaaagtcaca acagccaaca acaagggaat cagcagaggt 240

tttgaagcta catatgataa aggaacaacg tccttccact tgcagaaagc ctcagtgcag 300

gagtcagact ctgctgtgta ctactgtgtg ctgggtgatc gacagggagg cagagctctg 360

atatttggaa caggaaccac ggtatcagtc agccccaaca tccagaaccc agaacctgct 420

gtgtaccagt taaaagatcc tcggtctcag gacagcaccc tctgcctgtt caccgacttt 480

gactcccaaa tcaatgtgcc gaaaaccatg gaatctggaa cgttcatcac tgacaaaact 540

gtgctggaca tgaaagctat ggattccaag agcaatgggg ccattgcctg gagcaaccag 600

acaagcttca cctgccaaga tatctccaaa gagaccaacg ccacctaccc cagttcagac 660

gttcccgggg gtagaatcgc ccggctggag gaaaaagtga aaaccttgaa agctcagaac 720

tcggagctgg cgtccacggc caacatgctc agggaacagg tggcacagct taaacagaaa 780

gtcatgaact actag 795

<210> 45

<211> 264

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Predicted amino acid sequence of the soluble

H2-Db/Influenza virus nucleoprotein restricted

alpha chain from murine F5 receptor, as fused to

the "lecine zipper" domain of c-jun. (Figure 12).

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Fusion protein

consisting of truncated murine F5 TCR alpha chain

fused to the leucine zipper domain of human c-jun.

<400> 45

Met Asn Tyr Ser Pro Ala Leu Val Thr Val Met Leu Phe Val Phe Gly

1 5 10 15

Arg Thr His Gly Asp Ser Val Thr Gln Met Gln Gly Gln Val Thr Leu

20 25 30

Ser Glu Asp Asp Phe Leu Phe Ile Asn Cys Thr Tyr Ser Thr Thr Trp

35 40 45

Tyr Pro Thr Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Gly Glu Gly Pro Gln

50 55 60

Leu Leu Leu Lys Val Thr Thr Ala Asn Asn Lys Gly Ile Ser Arg Gly

65 70 75 80

Phe Glu Ala Thr Tyr Asp Lys Gly Thr Thr Ser Phe His Leu Gln Lys

85 90 95

Ala Ser Val Gln Glu Ser Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Val Leu Gly

100 105 110

Asp Arg Gln Gly Gly Arg Ala Leu Ile Phe Gly Thr Gly Thr Thr Val

115 120 125

Ser Val Ser Pro Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu

130 135 140

Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe

145 150 155 160

Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile

165 170 175

Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn

180 185 190

Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile

195 200 205

Ser Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Gly Gly

210 215 220

Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn

225 230 235 240

Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln

245 250 255

Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr

260

<210> 46

<211> 864

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DNA sequence of soluble H2-Db/Influenza virus

nucleoprotein restricted TCR beta chain from the

murine F5 receptor, as fused to the leucine zipper

domain of c-fos.(Figure 13).

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Sequence of

soluble H2-Db/Influenza virus nucleoprotein

restricted TCR beta chain from the murine F5

receptor, as fused to the leucine zipper domain of

c-fos.

<400> 46

atgaaagctg gagttactca aactccaaga tatctgatca aaacgagagg acagcaagtg 60

acactgagct gctcccctat ctctgggcat aggagtgtat cctggtacca acagacccca 120

ggacagggcc ttcagttcct ctttgaatac ttcagtgaga cacagagaaa caaaggaaac 180

ttccctggtc gattctcagg gcgccagttc tctaactctc gctctgagat gaatgtgagc 240

accttggagc tgggggactc ggccctttat ctttgcgcca gcagcttcga cagcgggaat 300

tcacccctcc actttgggaa cgggaccagg ctcactgtga cagaggacct gaacaaggtg 360

ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420

gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc ttccctgacc acgtggagct gagctggtgg 480

gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agccaggacc cgcagcccct caaggagcag 540

cccgccctca atgactccag atacagcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600

tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660

gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720

ggtagagcag accccggggg tctgactgat acactccaag cggagacaga tcaacttgaa 780

gacaagaagt ctgcgttgca gaccgagatt gccaatctac tgaaagagaa ggaaaaacta 840

gagttcatcc tggcagctta ctag 864

<210> 47

<211> 287

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of soluble H2-Db/Influenza

virus nucleoprotein restricted TCR beta chain from

the murine F5 receptor, as fused to the leucine

zipper domain of c-fos. (Figure 13).

<400> 47

Met Lys Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Arg Tyr Leu Ile Lys Thr Arg

1 5 10 15

Gly Gln Gln Val Thr Leu Ser Cys Ser Pro Ile Ser Gly His Arg Ser

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Gln Phe Leu Phe

35 40 45

Glu Tyr Phe Ser Glu Thr Gln Arg Asn Lys Gly Asn Phe Pro Gly Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Arg Gln Phe Ser Asn Ser Arg Ser Glu Met Asn Val Ser

65 70 75 80

Thr Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Phe

85 90 95

Asp Ser Gly Asn Ser Pro Leu His Phe Gly Asn Gly Thr Arg Leu Thr

100 105 110

Val Thr Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe

115 120 125

Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val

130 135 140

Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp

145 150 155 160

Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Gln Asp Pro Gln Pro

165 170 175

Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe

195 200 205

Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr

210 215 220

Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp

225 230 235 240

Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr

245 250 255

Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn

260 265 270

Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr

275 280 285

<210> 48

<211> 747

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DNA sequence of soluble HLA-A2/HIV-1 Gag

restricted TCRalpha chain from patient 003r, as

fused to the leucine zipper domain of c-jun.

(Figure 14).

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: DNA sequence

of soluble HLA-A2/HIV-1 Gag restricted TCRalpha

chain from patient 003, as fused to the leucine

zipper domain of c-jun.

<400> 48

atgaaacaag aagttacaca gattcctgca gctctgagtg tcccagaagg agaaaacttg 60

gttctcaact gcagtttcac tgatagcgct atttacaacc tccagtggtt taggcaggac 120

cctgggaaag gtctcacatc tctgttgctt attcagtcaa gtcagagaga gcaaacaagt 180

ggaagactta atgcctcgct ggataaatca tcaggacgta gtactttata cattgcagct 240

tctcagcctg gtgactcagc cacctacctc tgtgctgtga ccaacttcaa caaattttac 300

tttggatctg ggaccaaact caatgtaaaa ccaaatatcc agaaccctga ccctgccgtg 360

taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat 420

tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaaactgtg 480

ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct 540

gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc 600

agcccagaaa gttcccccgg gggtagaatc gcccggctgg aggaaaaagt gaaaaccttg 660

aaagctcaga actcggagct ggcgtccacg gccaacatgc tcagggaaca ggtggcacag 720

cttaaacaga aagtcatgaa ctactag 747

<210> 49

<211> 248

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Amino acid

sequence of soluble HLA-A2/HIV-1 Gag restricted

TCRalpha chain from patient 003, as fused to the

leucine zipper domain of c-jun. Figure 14.

<400> 49

Met Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val Pro Glu

1 5 10 15

Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr

20 25 30

Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu

35 40 45

Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn

50 55 60

Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala

65 70 75 80

Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Asn Phe

85 90 95

Asn Lys Phe Tyr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Asn Val Lys Pro Asn

100 105 110

Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser

115 120 125

Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn

130 135 140

Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val

145 150 155 160

Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp

165 170 175

Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile

180 185 190

Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Pro Gly Gly

195 200 205

Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn

210 215 220

Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln

225 230 235 240

Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr

245

<210> 50

<211> 864

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: DNA sequence

of soluble HLA-A2/HIV-1 Gag restricted TCRbeta

chain from patient 003, as fused to the leucine

zipper domain of c-fos. FIGURE 15.

<400> 50

atgaaagctg gagttactca aactccaaga tatctgatca aaacgagagg acagcaagtg 60

acactgagct gctcccctat ctctgggcat aggagtgtat cctggtacca acagacccca 120

ggacagggcc ttcagttcct ctttgaatac ttcagtgaga cacagagaaa caaaggaaac 180

ttccctggtc gattctcagg gcgccagttc tctaactctc gctctgagat gaatgtgagc 240

accttggagc tgggggactc ggccctttat ctttgcgcca gcagcttcga cagcgggaat 300

tcacccctcc actttgggaa cgggaccagg ctcactgtga cagaggacct gaacaaggtg 360

ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420

gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc ttccctgacc acgtggagct gagctggtgg 480

gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agccaggacc cgcagcccct caaggagcag 540

cccgccctca atgactccag atacagcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600

tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660

gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720

ggtagagcag accccggggg tctgactgat acactccaag cggagacaga tcaacttgaa 780

gacaagaagt ctgcgttgca gaccgagatt gccaatctac tgaaagagaa ggaaaaacta 840

gagttcatcc tggcagctta ctag 864

<210> 51

<211> 287

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Amino acid

sequence of soluble HLA-A2/HIV-1 Gag restricted

TCR beta chain from patient 003, as fused to the

leucine zipper domain of c-fos. FIGURE 15.

<400> 51

Met Lys Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Arg Tyr Leu Ile Lys Thr Arg

1 5 10 15

Gly Gln Gln Val Thr Leu Ser Cys Ser Pro Ile Ser Gly His Arg Ser

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Gln Phe Leu Phe

35 40 45

Glu Tyr Phe Ser Glu Thr Gln Arg Asn Lys Gly Asn Phe Pro Gly Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Arg Gln Phe Ser Asn Ser Arg Ser Glu Met Asn Val Ser

65 70 75 80

Thr Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Phe

85 90 95

Asp Ser Gly Asn Ser Pro Leu His Phe Gly Asn Gly Thr Arg Leu Thr

100 105 110

Val Thr Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe

115 120 125

Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val

130 135 140

Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp

145 150 155 160

Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Gln Asp Pro Gln Pro

165 170 175

Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe

195 200 205

Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr

210 215 220

Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp

225 230 235 240

Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr

245 250 255

Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn

260 265 270

Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr

275 280 285

<210> 52

<211> 750

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: DNA sequence

of soluble HTLV1 Tax/HLA-A2 restricted TCR alpha

chain clone A6, as fused to the leucine zipper

domain of c-jun. FIGURE 16.

<400> 52

atgcagaagg aagtggagca gaactctgga cccctcagtg ttccagaggg agccattgcc 60

tctctcaact gcacttacag tgaccgaggt tcccagtcct tcttctggta cagacaatat 120

tctgggaaaa gccctgagtt gataatgtcc atatactcca atggtgacaa agaagatgga 180

aggtttacag cacagctcaa taaagccagc cagtatgttt ctctgctcat cagagactcc 240

cagcccagtg attcagccac ctacctctgt gccgttacaa ctgacagctg ggggaaattg 300

cagtttggag cagggaccca ggttgtggtc accccagata tccagaaccc tgaccctgcc 360

gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg tctgcctatt caccgatttt 420

gattctcaaa caaatgtgtc acaaagtaag gattctgatg tgtatatcac agacaaaact 480

gtgctagaca tgaggtctat ggacttcaag agcaacagtg ctgtggcctg gagcaacaaa 540

tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga caccttcttc 600

cccagcccag aaagttcccc cgggggtaga atcgcccggc tggaggaaaa agtgaaaacc 660

ttgaaagctc agaactcgga gctggcgtcc acggccaaca tgctcaggga acaggtggca 720

cagcttaaac agaaagtcat gaactactag 750

<210> 53

<211> 249

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Amino acid

sequence of soluble HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted

TCR alpha chain from clone A6, as fused to the

leucine zipper domain of c-jun. FIGURE 16.

<400> 53

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu

1 5 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln

20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile

35 40 45

Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala

50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser

65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Thr Asp Ser

85 90 95

Trp Gly Lys Leu Gln Phe Gly Ala Gly Thr Gln Val Val Val Thr Pro

100 105 110

Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys

115 120 125

Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr

130 135 140

Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr

145 150 155 160

Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala

165 170 175

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser

180 185 190

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Pro Gly

195 200 205

Gly Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln

210 215 220

Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala

225 230 235 240

Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr

245

<210> 54

<211> 928

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: DNA sequence

of soluble HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted TCR beta

chain from clone A6, as fused to the leucine

zipper domain of c-fos and a BirA biotinylation

tag.

<400> 54

atgaacgctg gtgtcactca gaccccaaaa ttccaggtcc tgaagacagg acagagcatg 60

acactgcagt gtgcccagga tatgaaccat gaatacatgt cctggtatcg acaagaccca 120

ggcatggggc tgaggctgat tcattactca gttggtgctg gtatcactga ccaaggagaa 180

gtccccaatg gctacaatgt ctccagatca accacagagg atttcccgct caggctgctg 240

tcggctgctc cctcccagac atctgtgtac ttctgtgcca gcaggccggg actagcggga 300

gggcgaccag agcagtactt cgggccgggc accaggctca cggtcacaga ggacctgaaa 360

aacgtgttcc cacccgaggt cgctgtgttt gagccatcag aagcagagat ctcccacacc 420

caaaaggcca cactggtgtg cctggccaca ggcttctacc ccgaccacgt ggagctgagc 480

tggtgggtga atgggaagga ggtgcacagt ggggtcagca cagacccgca gcccctcaag 540

gagcagcccg ccctcaatga ctccagatac gctctgagca gccgcctgag ggtctcggcc 600

accttctggc agaacccccg caaccacttc cgctgtcaag tccagttcta cgggctctcg 660

gagaatgacg agtggaccca ggatagggcc aaacctgtca cccagatcgt cagcgccgag 720

gcctggggta gagcagaccc cgggggtctg actgatacac tccaagcgga gacagatcaa 780

cttgaagaca agaagtctgc gttgcagacc gagattgcca atctactgaa agagaaggaa 840

aaactagagt tcatcctggc agcttacgga tccggtggtg gtctgaacga tatttttgaa 900

gctcagaaaa tcgaatggca ttaagctt 928

<210> 55

<211> 307

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence:Amino acid

sequence of soluble HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted

TCR beta chain from clone A6, as fused to the

leucine zipper domain of c-fos and a BirA

biotinylation tag

<400> 55

Met Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr

1 5 10 15

Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr

20 25 30

Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His

35 40 45

Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly

50 55 60

Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu

65 70 75 80

Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Arg Pro

85 90 95

Gly Leu Ala Gly Gly Arg Pro Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg

100 105 110

Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala

115 120 125

Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr

130 135 140

Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser

145 150 155 160

Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro

165 170 175

Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu

180 185 190

Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn

195 200 205

His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu

210 215 220

Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu

225 230 235 240

Ala Trp Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala

245 250 255

Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile

260 265 270

Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala

275 280 285

Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile

290 295 300

Glu Trp His

305

<210> 56

<211> 765

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence:DNA sequence of

soluble HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted TCR alpha

chain from clone M10B7/D3 fused to the c-jun

leucine zipper domain.

<400> 56

atgcaacaga agaatgatga ccagcaagtt aagcaaaatt caccatccct gagcgtccag 60

gaaggaagaa tttctattct gaactgtgac tatactaaca gcatgtttga ttatttccta 120

tggtacaaaa aataccctgc tgaaggtcct acattcctga tatctataag ttccattaag 180

gataaaaatg aagatggaag attcactgtc ttcttaaaca aaagtgccaa gcacctctct 240

ctgcacattg tgccctccca gcctggagac tctgcagtgt acttctgtgc agcaatggag 300

ggagcccaga agctggtatt tggccaagga accaggctga ctatcaaccc aaatatccag 360

aaccctgacc ctgccgtgta ccagctgaga gactctaaat ccagtgacaa gtctgtctgc 420

ctattcaccg attttgattc tcaaacaaat gtgtcacaaa gtaaggattc tgatgtgtat 480

atcacagaca aaactgtgct agacatgagg tctatggact tcaagagcaa cagtgctgtg 540

gcctggagca acaaatctga ctttgcatgt gcaaacgcct tcaacaacag cattattcca 600

gaagacacct tcttccccag cccagaaagt tcccccgggg gtagaatcgc ccggctggag 660

gaaaaagtga aaaccttgaa agctcagaac tcggagctgg cgtccacggc caacatgctc 720

agggaacagg tggcacagct taaacagaaa gtcatgaact actag 765

<210> 57

<211> 254

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence:Amino acid

sequence of soluble HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted

TCR alpha chain from clone M10B7/D3 fused to the

c-jun leucine zipper domain.

<400> 57

Met Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln Asn Ser Pro Ser

1 5 10 15

Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Leu Asn Cys Asp Tyr Thr

20 25 30

Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys Tyr Pro Ala Glu

35 40 45

Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys Asp Lys Asn Glu

50 55 60

Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser Ala Lys His Leu Ser

65 70 75 80

Leu His Ile Val Pro Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ala Met Glu Gly Ala Gln Lys Leu Val Phe Gly Gln Gly Thr Arg

100 105 110

Leu Thr Ile Asn Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln

115 120 125

Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp

130 135 140

Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr

145 150 155 160

Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser

165 170 175

Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn

180 185 190

Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro

195 200 205

Glu Ser Ser Pro Gly Gly Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys

210 215 220

Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu

225 230 235 240

Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr

245 250

<210> 58

<211> 925

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence:DNA sequence of

soluble HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted TCR beta

chain from clone M10B7/D3 fused to the c-fos

leucine zipper domain and a BirA biotinylation

tag.

<400> 58

atgaacgctg gtgtcactca gaccccaaaa ttccaggtcc tgaagacagg acagagcatg 60

acactgcagt gtgcccagga tatgaaccat gaatacatgt cctggtatcg acaagaccca 120

ggcatggggc tgaggctgat tcattactca gttggtgctg gtatcactga ccaaggagaa 180

gtccccaatg gctacaatgt ctccagatca accacagagg atttcccgct caggctgctg 240

tcggctgctc cctcccagac atctgtgtac ttctgtgcca gcagttacca ggaggggggg 300

ttttacgagc agtacttcgg gccgggcacc aggctcacgg tcacagagga cctgaaaaac 360

gtgttcccac ccgaggtcgc tgtgtttgag ccatcagaag cagagatctc ccacacccaa 420

aaggccacac tggtgtgcct ggccacaggc ttctaccccg accacgtgga gctgagctgg 480

tgggtgaatg ggaaggaggt gcacagtggg gtcagcacag acccgcagcc cctcaaggag 540

cagcccgccc tcaatgactc cagatacgct ctgagcagcc gcctgagggt ctcggccacc 600

ttctggcagg acccccgcaa ccacttccgc tgtcaagtcc agttctacgg gctctcggag 660

aatgacgagt ggacccagga tagggccaaa cccgtcaccc agatcgtcag cgccgaggcc 720

tggggtagag cagaccccgg gggtctgact gatacactcc aagcggagac agatcaactt 780

gaagacaaga agtctgcgtt gcagaccgag attgccaatc tactgaaaga gaaggaaaaa 840

ctagagttca tcctggcagc ttacggatcc ggtggtggtc tgaacgatat ttttgaagct 900

cagaaaatcg aatggcatta agctt 925

<210> 59

<211> 306

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence:Amino acid

sequence of soluble HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted

TCR beta chain from clone M10B7/D3 fused to the

c-fos leucine zipper domain and a BirA

biotinylation tag.

<400> 59

Met Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr

1 5 10 15

Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr

20 25 30

Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His

35 40 45

Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly

50 55 60

Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu

65 70 75 80

Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Tyr

85 90 95

Pro Gly Gly Gly Phe Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu

100 105 110

Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val

115 120 125

Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu

130 135 140

Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp

145 150 155 160

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln

165 170 175

Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser

180 185 190

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His

195 200 205

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp

210 215 220

Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala

225 230 235 240

Trp Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu

245 250 255

Thr Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala

260 265 270

Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr

275 280 285

Gly Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu

290 295 300

Trp His

305

<210> 60

<211> 928

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Mutated DNA sequence of soluble HLA-A2/HTLV-1 Tax

restricted TCR beta chain from clone A6 fused to

the c-fos leucine zipper domain and a BirA

biotinylation tag.

<220>

<223> Description of Artificial Sequence:Mutated DNA

sequence of soluble HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted

TCR beta chain from clone A6 fused to the c-fos

leucine zipper domain and a BirA biotinylation

tag.

<400> 60

atgaacgctg gtgtcactca gaccccaaaa ttccaggtcc tgaagacagg acagagcatg 60

acactgcagt gtgcccagga tatgaaccat gaatacatgt cctggtatcg acaagaccca 120

ggcatggggc tgaggctgat tcattactca gttggtgctg gtatcactga ccaaggagaa 180

gtccccaatg gctacaatgt ctccagatca accacagagg atttcccgct caggctgctg 240

tcggctgctc cctcccagac atctgtgtac ttctgtgcca gcaggccggg actagcggga 300

gggcgaccag agcagtactt cgggccgggc accaggctca cggtcacaga ggacctgaaa 360

aacgtgttcc cacccgaggt cgctgtgttt gagccatcag aagcagagat ctcccacacc 420

caaaaggcca cactggtgtg cctggccaca ggcttctacc ccgaccacgt ggagctgagc 480

tggtgggtga atgggaagga ggtgcacagt ggggtcagca cagacccgca gcccctcaag 540

gagcagcccg ccctcaatga ctccagatac gctctgagca gccgcctgag ggtctcggcc 600

accttctggc aggacccccg caaccacttc cgctgtcaag tccagttcta cgggctctcg 660

gagaatgacg agtggaccca ggatagggcc aaacctgtca cccagatcgt cagcgccgag 720

gcctggggta gagcagaccc cgggggtctg actgatacac tccaagcgga gacagatcaa 780

cttgaagaca agaagtctgc gttgcagacc gagattgcca atctactgaa agagaaggaa 840

aaactagagt tcatcctggc agcttacgga tccggtggtg gtctgaacga tatttttgaa 900

gctcagaaaa tcgaatggca ttaagctt 928

<210> 61

<211> 307

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of mutated soluble

HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted TCR beta chain from

clone A6 fused to the c-fos leucine zipper domain

and a BirA biotinylation tag.

<220>

<223> Description of Artificial Sequence:Amino acid

sequence of mutated soluble HLA-A2/HTLV-1 Tax

restricted TCR beta chain from clone A6 fused to

c-fos leucine zipper domain and a BirA

biotinylation tag.

<400> 61

Met Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr

1 5 10 15

Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr

20 25 30

Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His

35 40 45

Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly

50 55 60

Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu

65 70 75 80

Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Arg Pro

85 90 95

Gly Leu Ala Gly Gly Arg Pro Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg

100 105 110

Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala

115 120 125

Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr

130 135 140

Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser

145 150 155 160

Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro

165 170 175

Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu

180 185 190

Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn

195 200 205

His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu

210 215 220

Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu

225 230 235 240

Ala Trp Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala

245 250 255

Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile

260 265 270

Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala

275 280 285

Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile

290 295 300

Glu Trp His

305

<210> 62

<211> 190

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DNA sequence of the c-fos-BirA biotinylation tag

fusion partner used for TCR beta chains.

<220>

<223> Description of Artificial Sequence:DNA sequence of

the c-fos-BirA biotinylation tag fusion partner

used for TCR beta chains.

<400> 62

cccgggggtc tgactgatac actccaagcg gagacagatc aacttgaaga caagaagtct 60

gcgttgcaga ccgagattgc caatctactg aaagagaagg aaaaactaga gttcatcctg 120

gcagcttacg gatccggtgg tggtctgaac gatatttttg aagctcagaa aatcgaatgg 180

cattaagctt 190

<210> 63

<211> 61

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence:Amino acid

sequence of the c-fos-BirA biotinylation tag

fusion partner used for TCR beta chains.

<400> 63

Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Leu Glu

1 5 10 15

Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr Gly Ser Gly Gly Gly

35 40 45

Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His

50 55 60

<210> 64

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Reverse primer used for PCR amplification of the

v-beta-c-fos leucine zipper fragment of the

Influenza Matrix peptide/HLA-A0201 restricted

human JM22 TCR fusion gene.

<220>

<223> Description of Artificial Sequence:Reverse primer

used for PCR amplification of the v-beta-c-fos

leucine zipper fragment of the Influenza Matrix

peptide/HLA-A0201 restricted human JM22 TCR fusion

gene

<400> 64

acacacggat ccgtaagctg cgacgatgaa ctcgattttc tt 42

<210> 65

<211> 744

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Gene coding

for human HLA-A2/flu matrix peptide restricted

JM22 TCR alpha chain fused to c-jun leucine zipper

domain.

<400> 65

atgcaactac tagaacaaag tcctcagttt ctaagcatcc aagagggaga aaatctcact 60

gtgtactgca actcctcaag tgttttttcc agcttacaat ggtacagaca ggagcctggg 120

gaaggtcctg tcctcctggt gacagtagtt acgggtggag aagtgaagaa gctgaagaga 180

ctaacctttc agtttggtga tgcaagaaag gacagttctc tccacatcac tgcggcccag 240

cctggtgata caggcctcta cctctgtgca ggagcgggaa gccaaggaaa tctcatcttt 300

ggaaaaggca ctaaactctc tgttaaacca aatatccaga accctgaccc tgccgtgtac 360

cagctgagag actctaaatc cagtgacaag tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct 420

caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta 480

gacatgaggt ctatggactt caagagcaac agtgctgtgg cctggagcaa caaatctgac 540

tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc attattccag aagacacctt cttccccagc 600

ccagaaagtt cccccggggg tagaatcgcc cggctggagg aaaaagtgaa aaccttgaaa 660

gctcagaact cggagctggc gtccacggcc aacatgctca gggaacaggt ggcacagctt 720

aaacagaaag tcatgaacta ctag 744

<210> 66

<211> 247

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Amino acid

sequence of human HLA-A2/flu matrix peptide

restricted JM22 TCR alpha chain fused to c-jun

leucine zipper domain.

<400> 66

Met Gln Leu Leu Glu Gln Ser Pro Gln Phe Leu Ser Ile Gln Glu Gly

1 5 10 15

Glu Asn Leu Thr Val Tyr Cys Asn Ser Ser Ser Val Phe Ser Ser Leu

20 25 30

Gln Trp Tyr Arg Gln Glu Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu Val Thr

35 40 45

Val Val Thr Gly Gly Glu Val Lys Lys Leu Lys Arg Leu Thr Phe Gln

50 55 60

Phe Gly Asp Ala Arg Lys Asp Ser Ser Leu His Ile Thr Ala Ala Gln

65 70 75 80

Pro Gly Asp Thr Gly Leu Tyr Leu Cys Ala Gly Ala Gly Ser Gln Gly

85 90 95

Asn Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Lys Pro Asn Ile

100 105 110

Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser

115 120 125

Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val

130 135 140

Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu

145 150 155 160

Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser

165 170 175

Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile

180 185 190

Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Pro Gly Gly Arg

195 200 205

Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser

210 215 220

Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu

225 230 235 240

Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr

245

<210> 67

<211> 864

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Gene coding

for human HLA-A2/flu matrix peptide restricted

JM22 TCR beta chain fused to c-fos leucine zipper

domain.

<400> 67

atggtggatg gtggaatcac tcagtcccca aagtacctgt tcagaaagga aggacagaat 60

gtgaccctga gttgtgaaca gaatttgaac cacgatgcca tgtactggta ccgacaggac 120

ccagggcaag ggctgagatt gatctactac tcacagatag taaatgactt tcagaaagga 180

gatatagctg aagggtacag cgtctctcgg gagaagaagg aatcctttcc tctcactgtg 240

acatcggccc aaaagaaccc gacagctttc tatctctgtg ccagtagttc gaggagctcc 300

tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca cagaggacct gaaaaacgtt 360

ttcccacccg aggtcgctgt gtttgaacca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420

gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg 480

gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag 540

cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600

tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660

gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720

ggtagagcag accccggggg tctgactgat acactccaag cggagacaga tcaacttgaa 780

gacaagaagt ctgcgttgca gaccgagatt gccaatctac tgaaagagaa ggaaaaacta 840

gagttcatcc tggcagctta ctag 864

<210> 68

<211> 287

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Amino acid

sequence of human HLA-A2/flu matrix peptide

restricted JM22 TCR beta chain fused to c-fos

leucine zipper domain.

<400> 68

Met Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys

1 5 10 15

Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp

20 25 30

Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu

50 55 60

Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val

65 70 75 80

Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Ser

85 90 95

Ser Arg Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr

100 105 110

Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe

115 120 125

Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val

130 135 140

Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp

145 150 155 160

Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro

165 170 175

Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser

180 185 190

Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe

195 200 205

Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr

210 215 220

Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp

225 230 235 240

Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr

245 250 255

Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn

260 265 270

Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr

275 280 285

<210> 69

<211> 918

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Gene coding

for human HLA-A2/flu matrix peptide restricted

JM22 TCR beta chain fused to c-fos leucine zipper

domain and BirA biotinylation tag.

<400> 69

atggtggatg gtggaatcac tcagtcccca aagtacctgt tcagaaagga aggacagaat 60

gtgaccctga gttgtgaaca gaatttgaac cacgatgcca tgtactggta ccgacaggac 120

ccagggcaag ggctgagatt gatctactac tcacagatag taaatgactt tcagaaagga 180

gatatagctg aagggtacag cgtctctcgg gagaagaagg aatcctttcc tctcactgtg 240

acatcggccc aaaagaaccc gacagctttc tatctctgtg ccagtagttc gaggagctcc 300

tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca cagaggacct gaaaaacgtt 360

ttcccacccg aggtcgctgt gtttgaacca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420

gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg 480

gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag 540

cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600

tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660

gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720

ggtagagcag accccggggg tctgactgat acactccaag cggagacaga tcaacttgaa 780

gacaagaagt ctgcgttgca gaccgagatt gccaatctac tgaaagagaa ggaaaaacta 840

gagttcatcc tggcagctta cggatccggt ggtggtctga acgatatttt tgaagctcag 900

aaaatcgaat ggcattaa 918

<210> 70

<211> 305

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Amino acid

sequence of human HLA-A2/flu matrix peptide

restricted JM22 TCR beta chain fused to c-fos

leucine zipper domain and BirA biotinylation tag.

<400> 70

Met Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys

1 5 10 15

Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp

20 25 30

Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu

50 55 60

Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val

65 70 75 80

Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Ser

85 90 95

Ser Arg Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr

100 105 110

Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe

115 120 125

Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val

130 135 140

Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp

145 150 155 160

Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro

165 170 175

Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser

180 185 190

Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe

195 200 205

Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr

210 215 220

Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp

225 230 235 240

Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr

245 250 255

Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn

260 265 270

Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr Gly

275 280 285

Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp

290 295 300

His

305

<210> 71

<211> 750

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Gene coding

for human HLA-A2/HTLV-1 Tax peptide restricted TCR

alpha chain from clone A6 fused to the c-jun

leucine zipper domain.

<400> 71

atgcagaagg aagtggagca gaactctgga cccctcagtg ttccagaggg agccattgcc 60

tctctcaact gcacttacag tgaccgaggt tcccagtcct tcttctggta cagacaatat 120

tctgggaaaa gccctgagtt gataatgtcc atatactcca atggtgacaa agaagatgga 180

aggtttacag cacagctcaa taaagccagc cagtatgttt ctctgctcat cagagactcc 240

cagcccagtg attcagccac ctacctctgt gccgttacaa ctgacagctg ggggaaattg 300

cagtttggag cagggaccca ggttgtggtc accccagata tccagaaccc tgaccctgcc 360

gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg tctgcctatt caccgatttt 420

gattctcaaa caaatgtgtc acaaagtaag gattctgatg tgtatatcac agacaaaact 480

gtgctagaca tgaggtctat ggacttcaag agcaacagtg ctgtggcctg gagcaacaaa 540

tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga caccttcttc 600

cccagcccag aaagttcccc cgggggtaga atcgcccggc tggaggaaaa agtgaaaacc 660

ttgaaagctc agaactcgga gctggcgtcc acggccaaca tgctcaggga acaggtggca 720

cagcttaaac agaaagtcat gaactactag 750

<210> 72

<211> 249

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Amino acid

sequence of human HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted TCR

alpha chain from clone A6 fused to the c-jun

leucine zipper domain.

<400> 72

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu

1 5 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln

20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile

35 40 45

Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala

50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser

65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Thr Asp Ser

85 90 95

Trp Gly Lys Leu Gln Phe Gly Ala Gly Thr Gln Val Val Val Thr Pro

100 105 110

Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys

115 120 125

Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr

130 135 140

Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr

145 150 155 160

Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala

165 170 175

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser

180 185 190

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Pro Gly

195 200 205

Gly Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln

210 215 220

Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala

225 230 235 240

Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr

245

<210> 73

<211> 928

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Gene coding

for human HLA-A2/HTLV-1 Tax peptide restricted TCR

beta chain from clone A6 fused to the c-fos

leucine zipper domain and BirA biotinylation tag.

<400> 73

atgaacgctg gtgtcactca gaccccaaaa ttccaggtcc tgaagacagg acagagcatg 60

acactgcagt gtgcccagga tatgaaccat gaatacatgt cctggtatcg acaagaccca 120

ggcatggggc tgaggctgat tcattactca gttggtgctg gtatcactga ccaaggagaa 180

gtccccaatg gctacaatgt ctccagatca accacagagg atttcccgct caggctgctg 240

tcggctgctc cctcccagac atctgtgtac ttctgtgcca gcaggccggg actagcggga 300

gggcgaccag agcagtactt cgggccgggc accaggctca cggtcacaga ggacctgaaa 360

aacgtgttcc cacccgaggt cgctgtgttt gagccatcag aagcagagat ctcccacacc 420

caaaaggcca cactggtgtg cctggccaca ggcttctacc ccgaccacgt ggagctgagc 480

tggtgggtga atgggaagga ggtgcacagt ggggtcagca cagacccgca gcccctcaag 540

gagcagcccg ccctcaatga ctccagatac gctctgagca gccgcctgag ggtctcggcc 600

accttctggc agaacccccg caaccacttc cgctgtcaag tccagttcta cgggctctcg 660

gagaatgacg agtggaccca ggatagggcc aaacctgtca cccagatcgt cagcgccgag 720

gcctggggta gagcagaccc cgggggtctg actgatacac tccaagcgga gacagatcaa 780

cttgaagaca agaagtctgc gttgcagacc gagattgcca atctactgaa agagaaggaa 840

aaactagagt tcatcctggc agcttacgga tccggtggtg gtctgaacga tatttttgaa 900

gctcagaaaa tcgaatggca ttaagctt 928

<210> 74

<211> 307

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Amino acid

sequence of human HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted TCR

beta chain from clone A6 fused to the c-fos

leucine zipper domain and BirA biotinylation tag.

<400> 74

Met Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr

1 5 10 15

Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr

20 25 30

Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His

35 40 45

Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly

50 55 60

Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu

65 70 75 80

Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Arg Pro

85 90 95

Gly Leu Ala Gly Gly Arg Pro Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg

100 105 110

Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala

115 120 125

Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr

130 135 140

Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser

145 150 155 160

Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro

165 170 175

Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu

180 185 190

Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn

195 200 205

His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu

210 215 220

Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu

225 230 235 240

Ala Trp Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala

245 250 255

Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile

260 265 270

Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala

275 280 285

Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile

290 295 300

Glu Trp His

305

<210> 75

<211> 765

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Gene coding

for human HLA-A2/HTLV-1 Tax peptide restricted TCR

alpha chain from clone M10B7/D3 fused to the c-jun

leucine zipper domain.

<400> 75

atgcaacaga agaatgatga ccagcaagtt aagcaaaatt caccatccct gagcgtccag 60

gaaggaagaa tttctattct gaactgtgac tatactaaca gcatgtttga ttatttccta 120

tggtacaaaa aataccctgc tgaaggtcct acattcctga tatctataag ttccattaag 180

gataaaaatg aagatggaag attcactgtc ttcttaaaca aaagtgccaa gcacctctct 240

ctgcacattg tgccctccca gcctggagac tctgcagtgt acttctgtgc agcaatggag 300

ggagcccaga agctggtatt tggccaagga accaggctga ctatcaaccc aaatatccag 360

aaccctgacc ctgccgtgta ccagctgaga gactctaaat ccagtgacaa gtctgtctgc 420

ctattcaccg attttgattc tcaaacaaat gtgtcacaaa gtaaggattc tgatgtgtat 480

atcacagaca aaactgtgct agacatgagg tctatggact tcaagagcaa cagtgctgtg 540

gcctggagca acaaatctga ctttgcatgt gcaaacgcct tcaacaacag cattattcca 600

gaagacacct tcttccccag cccagaaagt tcccccgggg gtagaatcgc ccggctggag 660

gaaaaagtga aaaccttgaa agctcagaac tcggagctgg cgtccacggc caacatgctc 720

agggaacagg tggcacagct taaacagaaa gtcatgaact actag 765

<210> 76

<211> 254

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Amino acid

sequence of human HLA-A2/HTLV-1 Tax restricted TCR

alpha chain from clone M10B7/D3 fused to the c-jun

leucine zipper domain.

<400> 76

Met Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln Asn Ser Pro Ser

1 5 10 15

Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Leu Asn Cys Asp Tyr Thr

20 25 30

Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys Tyr Pro Ala Glu

35 40 45

Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys Asp Lys Asn Glu

50 55 60

Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser Ala Lys His Leu Ser

65 70 75 80

Leu His Ile Val Pro Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ala Met Glu Gly Ala Gln Lys Leu Val Phe Gly Gln Gly Thr Arg

100 105 110

Leu Thr Ile Asn Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln

115 120 125

Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp

130 135 140

Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr

145 150 155 160

Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser

165 170 175

Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn

180 185 190

Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro

195 200 205

Glu Ser Ser Pro Gly Gly Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys

210 215 220

Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu

225 230 235 240

Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr

245 250

<210> 77

<211> 925

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Gene coding

for human HLA-A2/HTLV-1 Tax peptide restricted TCR

beta chain from clone M10B7/D3 fused to the c-fos

leucine zipper domain and BirA biotinylation tag.

<400> 77

atgaacgctg gtgtcactca gaccccaaaa ttccaggtcc tgaagacagg acagagcatg 60

acactgcagt gtgcccagga tatgaaccat gaatacatgt cctggtatcg acaagaccca 120

ggcatggggc tgaggctgat tcattactca gttggtgctg gtatcactga ccaaggagaa 180

gtccccaatg gctacaatgt ctccagatca accacagagg atttcccgct caggctgctg 240

tcggctgctc cctcccagac atctgtgtac ttctgtgcca gcagttacca ggaggggggg 300

ttttacgagc agtacttcgg gccgggcacc aggctcacgg tcacagagga cctgaaaaac 360

gtgttcccac ccgaggtcgc tgtgtttgag ccatcagaag cagagatctc ccacacccaa 420

aaggccacac tggtgtgcct ggccacaggc ttctaccccg accacgtgga gctgagctgg 480

tgggtgaatg ggaaggaggt gcacagtggg gtcagcacag acccgcagcc cctcaaggag 540

cagcccgccc tcaatgactc cagatacgct ctgagcagcc gcctgagggt ctcggccacc 600

ttctggcagg acccccgcaa ccacttccgc tgtcaagtcc agttctacgg gctctcggag 660

aatgacgagt ggacccagga tagggccaaa cccgtcaccc agatcgtcag cgccgaggcc 720

tggggtagag cagaccccgg gggtctgact gatacactcc aagcggagac agatcaactt 780

gaagacaaga agtctgcgtt gcagaccgag attgccaatc tactgaaaga gaaggaaaaa 840

ctagagttca tcctggcagc ttacggatcc ggtggtggtc tgaacgatat ttttgaagct 900

cagaaaatcg aatggcatta agctt 925

<210> 78

<211> 306

<212> PRT

<213> Influenza virus

<400> 78

Met Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr

1 5 10 15

Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr

20 25 30

Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His

35 40 45

Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly

50 55 60

Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu

65 70 75 80

Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Tyr

85 90 95

Pro Gly Gly Gly Phe Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu

100 105 110

Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val

115 120 125

Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu

130 135 140

Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp

145 150 155 160

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln

165 170 175

Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser

180 185 190

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His

195 200 205

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp

210 215 220

Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala

225 230 235 240

Trp Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu

245 250 255

Thr Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala

260 265 270

Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr

275 280 285

Gly Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu

290 295 300

Trp His

305

<210> 79

<211> 9

<212> PRT

<213> Influenza virus

<220>

<223> Peptide derived from Influenza virus Matrix

protein and presented as peptide antigen by

HLA-A0201. This HLA/peptide combination restricts

the JM22 TCR.

<400> 79

Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu

1 5

<210> 80

<211> 9

<212> PRT

<213> Human immunodeficiency virus type 1

<220>

<223> Peptide derived fromHIV-1 Gag protein and

presented as peptide antigen by HLA-A0201. This

HLA/peptide combination restricts the cloned TCR

from patient 003.

<400> 80

Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu

1 5

<210> 81

<211> 9

<212> PRT

<213> Influenza virus

<220>

<223> Peptide derived from Influenza virus nucleoprotein

and presented as peptide antigen by the murine

H2-Db. This HLA/peptide combination restricts the

murine F5 TCR.

<400> 81

Ala Ser Asn Glu Asn Met Asp Ala Met

1 5

<210> 82

<211> 9

<212> PRT

<213> Human T-cell lymphotropic virus type 1

<220>

<223> Peptide derived from HTLV-1 Tax protein and

presented as peptide antigen by HLA-A0201. This

HLA/peptide combination restricts the A6 and B7

TCRs.

<400> 82

Leu Leu Phe Gly Tyr Pro Val Tyr Val

1 5

<210> 83

<211> 9

<212> PRT

<213> Human immunodeficiency virus

<220>

<223> Peptide derived from HIV-1 Pol protein and

presented as peptide antigen by HLA-A0201.

<400> 83

Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val

1 5

<210> 84

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Primer for PCR

amplification of the human Vbeta17 chain fused to

the BirA biotinylation tag.

<400> 84

gctctagaca tatgggccca gtggattctg gagtcac 37

<210> 85

<211> 90

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Primer for PCR

amplification of the human Vbeta17 chain fused to

the BirA biotinylation tag.

<400> 85

gggggaagct taatgccatt cgattttctg agcttcaaaa atatcgttca gaccaccacc 60

ggatccgtaa gctgccagga tgaactctag 90

Claims

1. Ponovno smotani rekombinantni receptor T stanice (TCR), naznačen time, da sadrži: i) rekombinantni TCR α ili γ lanac ekstracelularne domene koji sadrži prvi heterologni C-terminalni dimerizacijski peptid; i ii) rekombinantni TCR β ili δ lanac ekstracelularne domene koji sadrži drugi C-terminalni dimerizacijski peptid koji je specifično heterodimeriziran s prvim dimerizacijskim peptidom, te tako tvori heterodimerizacijsku domenu, i da ne postoji disulfidna veza inače prisutna u nativnim TCR između α i β ili γ i δ lanaca vezanog na citoplazmatsku domenu.

2. Biološki aktivan receptor T stanice (TCR), naznačen time, da sadrži: i) rekombinantni TCR α ili γ lanac ekstracelularne domene koji sadrži prvi heterologni C-terminalni dimerizacijski peptid; i ii) rekombinantni TCR β ili δ lanac ekstracelularne domene koji sadrži drugi C-terminalni dimerizacijski peptid koji je specifično heterodimeriziran s prvim dimerizacijskim peptidom, te tako tvori heterodimerizacijsku domenu, i da ne postoji disulfidna veza inače prisutna u nativnim TCR između α i β ili γ i δ lanaca vezanog na citoplazmatsku domenu.

3. Rekombinantni TCR prema zahtjevu 1 ili zahtjevu 2, naznačen time, da heterodimerizacijska domena jest domena smotanog klupka.

4. Rekombinantni TCR prema zahtjevu 3, naznačen time, da su dimerizacijski peptidi c-jun ili c-fos dimerizacijski peptidi.

5. Rekombinantni TCR prema bilo kojem zahtjevu od 1 do 4, naznačen time, da sadrži fleksibilan poveznik između TCR lanaca i heterodimerizacijskih peptida.

6. Rekombinantni TCR prema bilo kojem zahtjevu od 1 do 5, naznačen time, da je ekspresiran u E. coli sustav za ekspresiju.

7. Rekombinantni TCR prema bilo kojem zahtjevu od 1 do 6, naznačen time, da je biotiniliran na C-kraju.

8. Rekombinantni TCR prema bilo kojem zahtjevu od 1 do 7, naznačen time, da je obilježen pomoću odredive oznake.

9. Rekombinantni TCR prema bilo kojem zahtjevu od 1 do 8, naznačen time, da je isti vezan na terapijsku tvar kao što je to citotoksična tvar ili imunostimulatornu tvar.

10. Sljedovi baza nukleinskih kiselina, naznačeni time, da kodiraju rekombinantne TCR lance rekombinantnog TCR prema bilo kojem zahtjevu od 1 do 8.

11. Sljedovi baza nukleinskih kiselina prema zahtjevu 10, naznačeni time, da se isti nalaze u E. coli ekspresijskom vektoru.

12. Postupak stvaranja rekombinantnog nemembranski vezanog receptora T stanice, naznačen time, da sadrži ekspresiju: i) rekombinantnog TCR α ili γ lanca ekstracelularne domene koji sadrži prvi heterologni C-terminalni dimerizacijski peptid; i ii) rekombinantnog TCR β ili δ lanca ekstracelularne domene koji sadrži drugi C-terminalni dimerizacijski peptid koji je specifično heterodimeriziran s prvim dimerizacijskim peptidom, te tako tvori heterodimerizacijsku domenu; i zajedničko ponovno smotavanje lanaca in vitro da bi se dobio TCR heterodimer.

13. Postupak prema zahtjevu 12, naznačen time, da se ponovno smotavanje izvodi u puferu za ponovno smotavanje koji sadrži otapalo.

14. Postupak prema zahtjevu 13, naznačen time, da otapalo jest urea pri koncentraciji od najmanje 0,1 M.

15. Postupak prema zahtjevu 14, naznačen time, da otapalo jest urea pri koncentraciji od oko 0,1 M.

16. Postupak prema bilo kojem zahtjevu od 12 do 14, naznačen time, da su lanci, prije ponovnog smotavanja, denaturirani u puferu za denaturiranje.

17. Postupak prema zahtjevu 16, naznačen time, da pufer za denaturiranje sadrži, kao reducirajuću tvar, DTT ili gvanidin.

18. Postupak prema bilo kojem zahtjevu od 12 do 17, naznačen time, da TCR jest rekombinantni TCR prema bilo kojem zahtjevu od 1 do 6.

19. Rekombinantni TCR, naznačen time, da je pripremljen pomoću postupka prema bilo kojem zahtjevu od 12 do 18.

20. Multimer TCR, naznačen time, da isti jest prema zahtjevu 19.