KR20220079645A - Ｋｒａｓ 돌연변이를 식별하는 ｔ 세포 수용체 및 그 코딩서열 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 KRASG12V 돌연변이(KRAS G12V) 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 T 세포 수용체(TCR)를 제공하며, 돌연변이 항원 단쇄 펩타이드는 VVGAVGVGK이고, HLA A1101과 복합물을 형성할 수 있으며, 본 발명의 TCR은 상기 복합물과 특이적으로 결합한다. 본 발명은 상기 TCR을 코딩하는 핵산 분자 및 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 더 제공한다. 또한, TCR이 형질도입된 세포도 제공한다.

Description

ＫＲＡＳ 돌연변이를 식별하는 Ｔ 세포 수용체 및 그 코딩서열
본 발명은 KRAS G12V 항원 유래의 단쇄 펩타이드를 식별할 수 있는 TCR 및 그 코딩서열에 관한 것이며, 본 발명은 또한 상기 TCR을 형질도입하여 획득한 KRAS G12V-특이적 T 세포, 및 KRAS G12V 관련 질병의 예방 및 치료에서의 이들의 용도에 관한 것이다.
KRAS 유전자(p21 유전자)는 길이가 약 35kb이고, 12번 염색체에 위치하는 마우스계 육종 바이러스 종양 유전자(murine sarcoma viral oncogene gene)이며, ras 유전자 패밀리의 구성원이고 KRAS 단백질을 코딩한다. KRAS 유전자는 야생형(wild type) 또는 돌연변이형(mutant type)으로 분류된다. 정상적인 조건에서, 즉 야생형의 KRAS는 세포 성장을 조절하는 경로를 제어할 수 있다. 하지만 이것이 일단 돌연변이가 발생되면 세포 성장을 지속적으로 자극하여 종양의 발생을 초래한다. KRAS 유전자의 통상적인 돌연변이 위치(mutation site)는 KRAS 유전자 2번 엑손(exon)의 12번 및 13번의 코돈(codon)에 위치하며, 여기서 G12V는 7개의 통상적인 돌연변이 위치 중 하나이다(Chin J Lab Med. November 2012, Vol.35, No.11). KRAS 돌연변이체(mKRAS)에 의해 코딩된 KRAS 단백질은 지속적인 활성화 상태에 처하게 되어, 세포 증식이 통제되지 않아 종양의 형성을 초래한다. 연구에 따르면, KRAS-G12V는 폐암, 결장직장암(Tumour Biol. 2016 May; 37(5): 6823-30), 췌장암, 위암(J Cancer 2019; 10(4): 821-828) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않은, 여러 가지 인간 악성 종양과 관련이 있으며, 또한 KRAS-G12V 돌연변이를 가진 종양 환자의 생존 기간이 가장 짧다(Br J Cancer. 2015 Oct 20; 113(8): 1206-1215). VVGAVGVGK(서열번호 9) 또는 VVVGAVGVGK(서열번호 38)는 KRAS G12V 항원에서 유래한 단쇄 펩타이드로, KRAS G12V 관련 질병 치료의 표적이다.
T 세포 입양 면역치료는 표적 세포 항원에 특이성을 구비하는 반응성 T 세포를 환자 체내에 도입하여, 표적 세포에 대해 작용을 발휘하게 하는 것이다. T 세포 수용체(TCR)는 대응되는 표적 세포 표면의 항원 단쇄 펩타이드를 인식할 수 있는 T 세포 표면의 막 단백질이다. 면역 시스템에서, 항원 단쇄 펩타이드-특이적 TCR이 단쇄 펩타이드-주조직적합성 복합체(major histocompatibility complex)(pMHC 복합체)와 결합하는 것을 통해 T 세포와 항원 제시 세포(antigen presenting cells)(APC)의 직접적인 물리적 접촉이 유발되고, 이어서 T 세포 및 APC 양자의 기타 세포막 표면 분자가 상호 작용하여, 일련의 후속 세포 신호전달 및 기타 생리 반응을 일으키므로, 상이한 항원 특이적-T 세포가 그의 표적 세포에 면역 효과를 발휘할 수 있도록 한다. 따라서, 당업자는 KRAS G12V 항원 돌연변이 단쇄 펩타이드에 특이성을 구비하는 TCR을 분리하고, 및 해당 TCR을 T 세포에 형질도입하여 KRAS G12V 항원 단쇄 펩타이드에 특이성을 구비하는 T 세포를 획득하여 이들이 세포 면역치료에서 작용을 발휘할 수 있도록 하는데 전념하고 있다.
본 발명의 목적은 KRAS G12V 항원 단쇄 펩타이드를 식별하는 T 세포 수용체를 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 측면은, VVGAVGVGK-HLA A1101 복합물과 특이적으로 결합할 수 있는 T 세포 수용체(TCR)를 제공한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 TCR은 TCRα사슬 가변 도메인 및 TCRβ사슬 가변 도메인을 포함하고, 상기 TCRα사슬 가변 도메인의 CDR3의 아미노산 서열은 ASLKGNNDMR(서열번호 12)이고; 및/또는 상기 TCRβ사슬 가변 도메인의 CDR3의 아미노산 서열은 ASSSSRWEQQF(서열번호: 15)이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 TCRα사슬 가변 도메인의 3개의 상보성 결정영역(CDR)은:
αCDR1-DRVSQS (서열번호 10)
αCDR2-IYSNGD (서열번호 11)
αCDR3-ASLKGNNDMR (서열번호 12)이고; 및/또는
상기 TCRβ사슬 가변 도메인의 3개의 상보성 결정영역(CDR)은:
βCDR1- SGHVS (서열번호 13)
βCDR2- FQNEAQ (서열번호 14)
βCDR3- ASSSSRWEQQF (서열번호 15)이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 TCR은 또한 VVVGAVGVGK-HLA A1101 복합물과 특이적으로 결합할 수 있다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 TCR은 TCRα사슬 가변 도메인 및 TCRβ사슬 가변 도메인을 포함하고, 상기 TCRα사슬 가변 도메인은 서열번호 1과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열이고; 및/또는 상기 TCRβ사슬 가변 도메인은 서열번호 5와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 TCR은 α사슬 가변 도메인 아미노산 서열인 서열번호 1을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 TCR은 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열인 서열번호 5를 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 TCR은 TCRα사슬의 불변영역 TRAC*01 및 TCRβ사슬의 불변영역 TRBC1*01 또는 TRBC2*01을 포함하는 αβ 이종이량체(heterodimer)이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 TCR의 α사슬의 아미노산 서열은 서열번호 3이고, 및/또는 상기 TCR의 β사슬의 아미노산 서열은 서열번호 7이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 TCR은 가용성을 갖는다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 TCR은 단일 사슬이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 TCR은 펩타이드 링커 서열을 통해 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인을 연결함으로써 형성된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 TCR은 α사슬 가변영역 아미노산의 11, 13, 19, 21, 53, 76, 89, 91 또는 94번 위치, 및/또는 α사슬 J 유전자 단쇄 펩타이드 아미노산의 끝으로부터 3번 위치, 끝으로부터 5번 위치 또는 끝으로부터 7번 위치에 1개 또는 여러 개의 돌연변이를 구비하고; 및/또는 상기 TCR은 β사슬 가변영역 아미노산의 11, 13, 19, 21, 53, 76, 89, 91 또는 94번 위치, 및/또는 β사슬 J 유전자 단쇄 펩타이드 아미노산의 끝으로부터 2번 위치, 끝으로부터 4번 위치 또는 끝으로부터 6번 위치에 1개 또는 여러 개의 돌연변이를 구비하며, 여기서 아미노산 위치 번호는 IMGT(국제면역유전학 정보시스템)에 나열된 번호와 같다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 TCR의 α사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 서열번호 32를 포함하고, 및/또는 상기 TCR의 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 서열번호 34를 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 TCR의 아미노산 서열은 서열번호 30이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 TCR은 (a) 막횡단 도메인(transmembrane domain)을 제외한 TCR α사슬의 전부 또는 일부; 및 (b) 막횡단 도메인을 제외한 TCRβ사슬의 전부 또는 일부를 포함하고;
또한 (a) 및 (b) 각각은 기능성 가변 도메인을 포함하고, 또는, 기능성 가변 도메인을 포함하고 상기 TCR사슬 불변 도메인의 적어도 일부분을 더 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 시스테인 잔기(cysteine residue)는 상기 TCR의 α와 β사슬의 불변 도메인 사이에 인공 이황화 결합(disulfide bond)을 형성한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 TCR에서 인공 이황화 결합을 형성한 시스테인 잔기는 아래 그룹에서 선택된 하나의 그룹 또는 여러 개의 그룹의 위치를 치환한다.
TRAC*01 엑손 1의 Thr48 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Ser57;
TRAC*01 엑손 1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Ser77;
TRAC*01 엑손 1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Ser17;
TRAC*01 엑손 1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Asp59;
TRAC*01 엑손 1의 Ser15 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Glu15;
TRAC*01 엑손 1의 Arg53 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Ser54;
TRAC*01 엑손 1의 Pro89 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Ala19; 및
TRAC*01 엑손 1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Glu20.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 TCR의 α사슬 아미노산 서열은 서열번호 26이고, 및/또는 상기 TCR의 β사슬 아미노산 서열은 서열번호 28이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 TCR의 α사슬 가변영역과 β사슬 불변영역 사이에 인공 사슬간 이황화 결합을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 TCR에서 인공 사슬간 이황화 결합을 형성한 시스테인 잔기는 아래 그룹에서 선택된 하나의 그룹 또는 여러 개의 그룹의 위치를 치환한다.
TRAV의 46번 위치 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 60번 위치 아미노산;
TRAV의 47번 위치 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 61번 위치 아미노산;
TRAV의 46번 위치 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 61번 위치 아미노산; 또는
TRAV의 47번 위치 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 60번 위치 아미노산.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 TCR은 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인 및 막횡단 도메인을 제외한 β사슬 불변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하지만, α사슬 불변 도메인을 포함하지 않고, 상기 TCR의 α사슬 가변 도메인과 β사슬은 이종이량체를 형성한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 TCR의 α사슬 및/또는
Figure pct00001
사슬의 C- 또는 N-말단에 접합체가 결합된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 T 세포 수용체와 결합하는 접합체는 검출가능한 마커(marker), 치료제, PK 변형 모이어티(modified moiety) 또는 임의의 이러한 물질의 조합이다. 바람직하게는, 상기 치료제는 항-CD3 항체이다.
본 발명의 제2 측면은, 적어도 2개의 TCR 분자를 포함하는 다가 TCR 복합물을 제공하고, 또한 여기서, 적어도 1개의 TCR 분자는 본 발명의 제1 측면에 기재된 TCR이다.
본 발명의 제3 측면은, 본 발명의 제1 측면에 기재된 TCR 분자를 코딩하는 핵산 서열 또는 그의 상보적 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 핵산 분자는 TCRα사슬 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(nucleotide sequence)인 서열번호 2 또는 서열번호 33을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 핵산 분자는 TCRβ사슬 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 서열번호 6 또는 서열번호 35을 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 핵산 분자는 TCRα사슬을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 서열번호 4를 포함하고, 및/또는 TCRβ사슬을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 서열번호 8을 포함한다.
본 발명의 제4 측면은, 본 발명의 제3 측면에 기재된 핵산 분자를 함유하는 벡터를 제공하며; 바람직하게는, 상기 벡터는 바이러스 벡터이고; 보다 바람직하게는, 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)이다.
본 발명의 제5 측면은, 본 발명의 제4 측면에 기재된 벡터를 포함하거나, 게놈에 외인성(exogenous)의 본 발명의 제3 측면에 기재된 핵산 분자가 통합된, 단리된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 제6 측면은, 본 발명의 제3 측면에 기재된 핵산 분자 또는 본 발명의 제4 측면에 기재된 벡터를 형질도입하는 세포를 제공하며; 바람직하게는, 상기 세포는 T 세포 또는 줄기세포이다.
본 발명의 제7 측면은, 약학적으로 허용 가능한 벡터 및 본 발명의 제1 측면에 기재된 TCR, 본 발명의 제2 측면에 기재된 TCR 복합물, 제3 측면에 기재된 핵산 분자, 본 발명의 제4 측면에 기재된 벡터, 또는 본 발명의 제6 측면에 기재된 세포를 함유하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 제8 측면은, 종양 또는 자가면역 질병을 치료하기 위한 약물을 제조하는데 사용되는 본 발명의 제1 측면에 기재된 T 세포 수용체, 또는 본 발명의 제2 측면에 기재된 TCR 복합물, 본 발명의 제3 측면에 기재된 핵산 분자, 본 발명의 제4 측면에 기재된 벡터, 또는 본 발명의 제6 측면에 기재된 세포의 용도를 제공한다. 바람직하게, 상기 종양은 췌장암, 결장암, 직장암 또는 폐암이다.
본 발명의 제9 측면은, 본 발명의 제1 측면에 기재된 T 세포 수용체, 또는 본 발명의 제2 측면에 기재된 TCR 복합물, 본 발명의 제3 측면에 기재된 핵산 분자, 본 발명의 제4 측면에 기재된 벡터, 또는 본 발명의 제6 측면에 기재된 세포를 이용하는, 종양 또는 자가면역 질병을 치료하기 위한 약물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 종양은 췌장암, 결장암, 직장암 또는 폐암이다.
본 발명의 제10 측면은, 본 발명의 제1 측면에 기재된 T 세포 수용체, 또는 본 발명의 제2 측면에 기재된 TCR 복합물, 본 발명의 제3 측면에 기재된 핵산 분자, 본 발명의 제4 측면에 기재된 벡터, 또는 본 발명의 제6 측면에 기재된 세포, 또는 본 발명의 제7 측면에 기재된 약학적 조성물을 적절한 양으로 치료가 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 질병은 종양이고, 보다 바람직하게는 상기 종양은 췌장암, 결장암, 직장암 또는 폐암이다.
본 발명의 범위 내에서, 전술한 본 발명의 여러 가지 기술적 특징과 하문(예를 들어 실시예)에서 구체적으로 설명한 여러 가지 기술적 특징 사이는 모두 서로 조합하여 새로운 또는 바람직한 기술방안을 구성할 수 있음을 이해해야 한다. 편폭 제한으로 인해 여기서 일일이 반복하지 않는다.
도 1a, 도 1b, 도 1c, 도 1d, 도 1e 및 도 1f는 각각 TCRα사슬 가변 도메인의 아미노산 서열, TCRα사슬 가변 도메인의 뉴클레오타이드 서열, TCRα사슬의 아미노산 서열, TCRα사슬의 뉴클레오타이드 서열, 리더 서열을 구비하는 TCRα사슬의 아미노산 서열 및 리더 서열을 구비하는 TCRα사슬의 뉴클레오타이드 서열이다.
도 2a, 도 2b, 도 2c, 도 2d, 도 2e 및 도 2f는 각각 TCRβ사슬 가변 도메인의 아미노산 서열, TCRβ사슬 가변 도메인의 뉴클레오타이드 서열, TCRβ사슬의 아미노산 서열, TCRβ사슬의 뉴클레오타이드 서열, 리더 서열을 구비하는 TCRβ사슬의 아미노산 서열 및 리더 서열을 구비하는 TCRβ사슬의 뉴클레오타이드 서열이다.
도 3은 단클론 세포의 CD8+ 및 테트라머-PE(tetramer-PE) 이중 양성 염색 결과이다.
도 4a 및 도 4b는 각각 가용성 TCRα사슬의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열이다.
도 5a 및 도 5b는 각각 가용성 TCRβ사슬의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열이다.
도 6a 및 도 6b는 정제 후 얻은 가용성 TCR의 겔 다이어그램이다. 여기서 도 6a 및 도 6b의 우측 레인은 각각 환원 겔 및 비환원 겔이고, 좌측 레인은 모두 분자량 마커(marker)이다.
도 7a 및 도 7b는 각각 단일 사슬 TCR의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열이다.
도 8a 및 도 8b는 각각 단일 사슬 TCRα사슬 가변 도메인의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열이다.
도 9a 및 도 9b는 각각 단일 사슬 TCRβ사슬 가변 도메인의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열이다.
도 10a 및 10b는 각각 단일 사슬 TCR 링커 서열(linker)의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열이다.
도 11은 정제 후 얻은 가용성 단일 사슬 TCR의 겔 다이어그램이다. 좌측 레인은 분자량 마커(marker)이고, 우측 레인은 비환원 겔이다.
도 12는 본 발명의 가용성 TCR이 VVGAVGVGK-HLA A1101 복합물과 결합한 BIAcore 키네틱 맵(Kinetic map)이다.
도 13은 본 발명의 가용성 단일 사슬 TCR이 VVGAVGVGK-HLA A1101 복합물과 결합한 BIAcore 키네틱 맵(Kinetic map)이다.
도 14는 얻어진 T 세포 클론의 ELISPOT 활성 기능의 검증 결과이다.
도 15는 본 발명의 TCR을 형질도입한 이펙터 세포(effector cell)의 ELISPOT 활성 기능의 검증 결과(표적 세포는 T2임)이다.
도 16은 본 발명의 TCR을 형질도입한 이펙터 세포의 ELISPOT 활성 기능의 검증 결과(표적 세포는 종양 세포주임)이다.
도 17은 본 발명의 TCR을 형질도입한 이펙터 세포의 LDH 사멸 기능의 검증 결과이다.
광범위하고 심층적인 연구 끝에, 본 발명자는 KRAS G12V 항원 단쇄 펩타이드 VVGAVGVGK(서열번호 9) 또는 VVVGAVGVGK(서열번호 38)과 특이적으로 결합할 수 있는 TCR을 찾았고, 상기 항원 단쇄 펩타이드 VVGAVGVGK 또는 VVVGAVGVGK는 각각 HLA A1101과 복합물을 형성할 수 있고 또한 함께 세포 표면에 제시된다. 본 발명은 상기 TCR을 코딩하는 핵산 분자 및 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 더 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 TCR을 형질도입한 세포를 더 제공한다.
용어
MHC 분자는 면역글로불린 슈퍼패밀리(immunoglobulin superfamily)의 단백질이며, 클래스 I 또는 클래스 II MHC 분자일 수 있다. 따라서, 이는 항원의 제시에 특이성을 구비하고, 상이한 개체마다 MHC가 다르며, 단백질 항원 중의 상이한 단쇄 펩타이드를 각 APC 세포의 표면에 제시할 수 있다. 인간의 MHC는 통상적으로 HLA 유전자 또는 HLA 복합체라고 한다.
T 세포 수용체(TCR)는, 주조직적합성 복합체(MHC)에 제시된 특이성 항원 펩타이드의 유일한 수용체이다. 면역 시스템에서, 항원 특이적인 TCR이 pMHC 복합체와 결합하는 것을 통해 T 세포와 항원 제시 세포(APC)의 직접적인 물리적 접촉이 유발되고, 이어서 T 세포 및 APC 양자의 기타 세포막 표면 분자가 상호 작용하여, 일련의 후속 세포 신호전달 및 기타 생리 반응을 일으키므로, 상이한 항원 특이적-T 세포가 그의 표적 세포에 면역 효과를 발휘할 수 있도록 한다.
TCR은 α사슬/β사슬 또는 γ사슬/δ사슬이 이종이량체의 형식으로 존재하는 세포막 표면의 당단백질이다. 95%의 T 세포에서 TCR 이종이량체는 α 및 β 사슬로 구성되는 반면, 5%의 T 세포는 γ 및 δ 사슬로 구성된 TCR을 구비한다. 천연 αβ 이종이량체 TCR은 α사슬과 β사슬을 구비하고, α사슬과 β사슬이 αβ 헤테로다이머 TCR의 서브유닛을 구성한다. 넓게 말하면, α와 β사슬은 각각 가변영역, 링커 영역 및 불변영역을 포함하고, β사슬은 통상적으로 또한 가변영역과 링커 영역 사이에 짧은 다양성 영역(diversity region)을 포함하지만, 해당 다양성 영역은 통상적으로 링커 영역의 일부로 간주한다. 각 가변영역은 프레임워크 영역(framework regions)에 키메라적으로 통합된 3개의 CDR(상보성 결정영역), CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. CDR 영역은 TCR과 pMHC 복합물의 결합을 결정하고, 여기서 CDR3은 가변영역 및 링커 영역이 재조합하여 이루어지는데, 이를 초가변영역이라고 한다. TCR의 α 및 β사슬은 일반적으로 각각 2개의 "도메인", 즉 가변 도메인 및 불변 도메인을 갖는 것으로 간주되며, 가변 도메인은 연결된 가변영역 및 링커 영역으로 구성된다. TCR 불변 도메인의 서열은 국제면역유전학 정보시스템(IMGT)의 공개 데이터베이스에서 찾을 수 있으며, 예를 들어 TCR 분자의 α사슬의 불변 도메인 서열은 "TRAC*01"이고, TCR 분자의 β사슬의 불변 도메인 서열은 "TRBC1*01" 또는 "TRBC2*01"이다. 또한, TCR의 α 및 β사슬은 막횡단 영역과 세포질 영역을 더 포함하며, 세포질 영역은 매우 짧다.
본 발명에서, 용어 "본 발명의 폴리펩타이드", "본 발명의 TCR", "본 발명의 T 세포 수용체"는 상호 교환하여 사용할 수 있다.
천연 사슬간 이황화 결합 및 인공 사슬간 이황화 결합
천연 TCR의 막-근처 영역에서 Cα 및 Cβ 사슬 사이에 한 세트의 이황화 결합이 존재하며, 본 발명에서 "천연 사슬간 이황화 결합"으로 지칭한다. 본 발명에서는, 인공적으로 도입한, 위치가 천연 사슬간 이황화 결합의 위치와 상이한 사슬간 공유 이황화 결합을 "인공 사슬간 이황화 결합"이라고 지칭한다.
이황화 결합의 위치를 편의하게 설명하기 위해, 본 발명에서 TRAC*01 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 아미노산 서열의 위치 번호를 N-말단에서 C-말단까지의 순차적인 순서에 따라 위치 넘버링을 수행하며, 예를 들어 TRBC1*01 또는 TRBC2*01에서, N-말단에서 C-말단까지 순차적인 순서에 따라 60번 위치 아미노산은 P(프롤린)이며, 즉 본 발명에서는 이를 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Pro60으로 기재할 수 있거나, 또한 이를 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 60번 위치 아미노산으로 기재할 수 있고, 또 예를 들어 TRBC1*01 또는 TRBC2*01에서, N-말단에서 C-말단까지 순차적인 순서에 따라 61번 위치 아미노산은 Q(글루타민)이며, 즉 본 발명에서는 이를 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Gln61로 기재할 수 있거나, 또한 이를 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 61번 위치 아미노산으로 기재할 수 있으며, 기타는 이와 같이 유추한다. 본 발명에서, 가변영역 TRAV 및 TRBV의 아미노산 서열의 위치 번호는 IMGT에 나열된 위치 번호에 따른다. 예를 들어 TRAV의 특정 아미노산에 대해, IMGT에 나열된 위치 번호가 46이면, 즉 본 발명에서는 이를 TRAV의 46번 위치 아미노산으로 기재하며, 기타는 이와 같이 유추한다. 본 발명에서, 기타 아미노산의 서열 위치 번호에 특별설명이가 있는 경우, 해당 특별설명에 따른다.
발명에 대한 상세한 설명
TCR 분자
항원 가공 과정에서, 항원은 세포 내에서 분해되며 그 후 MHC 분자에 의해 세포 표면으로 운반된다. T 세포 수용체는 항원 제시 세포 표면의 펩타이드-MHC 복합물을 식별할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제1 측면은 VVGAVGVGK-HLA A1101 또는 VVVGAVGVGK-HLA A1101 복합물을 결합할 수 있는 TCR 분자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 TCR 분자는 단리한 것이나 정제한 것이다. 해당 TCR의 α 및 β사슬은 각각 3개의 상보성 결정영역(CDR)을 구비한다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시방식에서, 상기 TCR의 α사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다:
αCDR1-DRVSQS (서열번호 10)
αCDR2-IYSNGD (서열번호 11)
αCDR3-ASLKGNNDMR (서열번호 12); 및/또는
상기 TCRβ사슬 가변 도메인의 3개의 상보성 결정영역은 다음과 같다:
βCDR1- SGHVS (서열번호 13)
βCDR2- FQNEAQ (서열번호: 14)
βCDR3-ASSSSRWEQQF (서열번호 15).
전술한 본 발명의 CDR 영역의 아미노산 서열을 임의의 적합한 프레임워크 구조에 삽입함으로써 키메라 TCR을 제조할 수 있다. 프레임워크 구조가 본 발명의 TCR의 CDR 영역과 양립(compatible)될 수 있는 한, 당업자는 본 발명에 개시된 CDR 영역에 따라 상응하는 기능을 갖는 TCR 분자를 디자인 또는 합성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 TCR 분자는 상기 α 및/또는 β사슬 CDR 영역 서열 및 임의의 적합한 프레임워크 구조를 포함하는 TCR 분자를 지칭한다. 본 발명의 TCRα사슬 가변 도메인은 서열번호 1과 적어도 90%, 바람직하게는 95%, 보다 바람직하게는 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열이고; 및/또는 본 발명의 TCRβ사슬 가변 도메인은 서열번호 5와 적어도 90%, 바람직하게는 95%, 보다 바람직하게는 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
본 발명의 하나의 바람직한 예에서, 본 발명의 TCR 분자는 α 및 β 사슬로 구성된 이종이량체이다. 구체적으로, 한 측면에서, 상기 이종이량체화 TCR 분자의 α사슬은 가변 도메인 및 불변 도메인을 포함하고, 상기 α사슬 가변 도메인의 아미노산 서열은 상기 α사슬의 CDR1(서열번호 10), CDR2(서열번호 11) 및 CDR3(서열번호 12)을 포함한다. 바람직하게는, 상기 TCR 분자는 서열번호 1의 α사슬 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 TCR 분자의 α사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 서열번호 1이다. 다른 한 측면으로, 상기 이종이량체화 TCR 분자의 β사슬은 가변 도메인 및 불변 도메인을 포함하고, 상기 β사슬 가변 도메인의 아미노산 서열은 상기 β사슬의 CDR1(서열번호 13), CDR2(서열번호 14) 및 CDR3(서열번호 15)을 포함한다. 바람직하게는, 상기 TCR 분자는 서열번호 5의 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 TCR 분자의 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 서열번호 5이다.
본 발명의 하나의 바람직한 예에서, 본 발명의 TCR 분자는 α사슬의 일부 또는 전부, 및/또는 β사슬의 일부 또는 전부로 구성된 단일 사슬 TCR 분자이다. 단일 사슬 TCR 분자에 관련한 설명은 문헌 Chung et al(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12654-12658을 참조할 수 있다. 문헌에 기재된 바와 같이, 당업자는 본 발명의 CDRs 영역을 포함하는 단일 사슬 TCR 분자를 용이하게 구축할 수 있다. 구체적으로, 상기 단일 사슬 TCR 분자는 Vα, Vβ 및 Cβ를 포함하며, 바람직하게는 N-말단에서 C-말단의 순서에 따라 연결한다.
상기 단일 사슬 TCR 분자의 α사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 상기 α사슬의 CDR1(서열번호 10), CDR2(서열번호 11) 및 CDR3(서열번호 12)을 포함한다. 바람직하게는, 상기 단일 사슬 TCR 분자는 서열번호 1의 α사슬 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 단일 사슬 TCR 분자의 α사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 서열번호 1이다. 상기 단일 사슬 TCR 분자의 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 상기 β사슬의 CDR1(서열번호 13), CDR2(서열번호 14) 및 CDR3(서열번호 15)을 포함한다. 바람직하게는, 상기 단일 사슬 TCR 분자는 서열번호 5의 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 단일 사슬 TCR 분자의 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 서열번호 5이다.
본 발명의 하나의 바람직한 예에서, 본 발명의 TCR 분자의 불변 도메인은 인간 불변 도메인이다. 당업자는 알고 있거나 관련 서적 또는 IMGT(국제면역유전학 정보시스템)의 공개 데이터베이스를 열람하는 것을 통해 인간의 불변 도메인 아미노산 서열을 획득할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 TCR 분자 α사슬의 불변 도메인 서열은 "TRAC*01"일 수 있고, TCR 분자 β사슬의 불변 도메인 서열은 "TRBC1*01" 또는 "TRBC2*01" 일 수 있다. IMGT의 TRAC*01에서 제공한 아미노산 서열의 53번 위치는 Arg이며, 여기서 TRAC*01 엑손 1의 Arg53으로 표시되며, 기타는 이와 같이 유추한다. 바람직하게는, 본 발명의 TCR 분자 α사슬의 아미노산 서열은 서열번호 3이고, 및/또는β사슬의 아미노산 서열은 서열번호 7이다.
자연적으로 존재하는 TCR은 막횡단 영역에 의해 안정화되는 막 단백질이다. 항원 식별 분자로서의 면역글로불린(항체)과 마찬가지로, TCR도 진단 및 치료에 개발 응용될 수 있으며, 이때 가용성의 TCR 분자를 획득하는 것이 필요하다. 가용성의 TCR 분자는 막횡단 도메인을 포함하지 않는다. 가용성 TCR은 TCR과 pMHC의 상호작용을 연구하는데 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 또한 감염을 감지하기 위한 진단도구 또는 자가면역 질병의 마커로 사용할 수 있어, 아주 광범위한 용도를 갖고 있다. 유사하게, 가용성 TCR은 특이성 항원을 제시하는 세포에 치료제(예를 들어 세포독성 화합물 또는 면역자극성 화합물)를 전달하는 데 사용될 수 있으며, 또한, 가용성 TCR은 기타 분자(예를 들어 항-CD3 항체)와 결합하여 T 세포를 리디렉션시키므로, 이가 특정 항원을 제시하는 세포를 표적으로 하도록 한다. 본 발명은 또한 KRAS G12V 항원 단쇄 펩타이드에 특이성을 구비하는 가용성 TCR을 획득하였다.
가용성 TCR을 획득하기 위해, 한 측면에서, 본 발명의 TCR은 이의 α 및 β사슬 불변 도메인의 잔기 사이에 인공 이황화 결합을 도입한 TCR일 수 있다. 시스테인 잔기는 상기 TCR의 α 및 β사슬 불변 도메인 사이에서 인공 사슬간 이황화 결합을 형성한다. 시스테인 잔기는 천연 TCR의 적절한 위치에 있는 기타 아미노산 잔기를 대체하여 인공 사슬간 이황화 결합을 형성할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기는 TRAC*01 엑손 1의 Thr48을 대체하고 또한 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Ser57을 대체하여 이황화 결합을 형성한다. 이황화 결합을 형성하기 위해 시스테인 잔기를 도입하는 기타 위치는 또한 TRAC*01 엑손 1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Ser77; TRAC*01 엑손 1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Ser17; TRAC*01 엑손 1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Asp59; TRAC*01 엑손 1의 Ser15 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Glu15; TRAC*01 엑손 1의 Arg53 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Ser54; TRAC*01 엑손 1의 Pro89 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Ala19; 또는 TRAC*01 엑손 1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Glu20일 수 있다. 즉, 시스테인 잔기는 상기 α 및 β사슬 불변 도메인의 임의의 한 세트의 위치를 대체하였다. 천연 이황화 결합을 제거하는 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 TCR 불변 도메인의 1개 또는 여러 개의 C-말단에서 최대 50개, 또는 최대 30개, 또는 최대 15개, 또는 최대 10개, 또는 최대 8개 또는 더 적은 아미노산을 절단(truncation)하여, 이를 시스테인 잔기를 포함하지 않게 하거나, 또한 천연 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 기타 아미노산으로 돌연변이시키는 것을 통해 상기 목적을 달성할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 TCR은 이의 α 및 β사슬 불변 도메인의 잔기 사이에 도입한 인공 이황화 결합을 포함할 수 있다. 불변 도메인 사이에 상기 도입한 인공 이황화 결합을 포함하거나 포함하지 않고, 본 발명의 TCR은 TRAC 불변 도메인 서열 및 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열을 모두 함유할 수 있음을 주의해야 한다. TCR의 TRAC 불변 도메인 서열과 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열은 TCR에 존재하는 천연 이황화 결합에 의해 연결될 수 있다.
가용성 TCR을 획득하기 위해, 다른 한 측면에서, 본 발명의 TCR은 이의 소수성 코어 영역에서 돌연변이가 발생한 TCR을 더 포함하고, 공개번호가 WO2014/206304인 특허 문헌에 기재된 바와 같이, 이러한 소수성 코어 영역의 돌연변이는 본 발명의 가용성 TCR의 안정성을 향상시킬 수 있는 돌연변이인 것이 바람직하다. 이러한 TCR은 하기 가변 도메인 소수성 코어 위치: (α 및/또는 β 사슬)가변영역 아미노산 11, 13, 19, 21, 53, 76, 89, 91, 94번 위치, 및/또는 α사슬 J 유전자(TRAJ)의 단쇄 펩타이드 아미노산의 위치의 끝으로부터 3, 5, 7번 위치, 및/또는 β사슬의 J 유전자(TRAJ)의 단쇄 펩타이드 아미노산의 위치의 끝으로부터 2, 4, 6번 위치에서 돌연변이가 발생될 수 있다. 여기서 아미노산 서열의 위치 번호는 국제면역유전학 정보시스템(IMGT)에 나열된 번호와 같다. 당업자는 상술한 국제면역유전학 정보시스템을 알고 있으며, 해당 데이터베이스에 따라 IMGT에서 상이한 TCR의 아미노산 잔기의 위치 번호를 얻을 수 있다.
본 발명에서 소수성 코어 영역에 돌연변이가 발생한 TCR은, 가요성 펩타이드(flexible peptide) 사슬로 TCR의 α 및 β사슬의 가변 도메인을 연결하여 구성된 안정적인 가용성 단일 사슬 TCR일 수 있다. 본 발명에서 가요성 펩타이드 사슬은 TCRα 및 β사슬의 가변 도메인을 연결하기에 적합한 임의의 펩타이드 사슬일 수 있음을 주의해야 한다. 본 발명의 실시예 4에서 구축된 단일 사슬 가용성 TCR의 경우, 이의 α사슬 가변 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 32이고, 코딩된 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 33이고; β사슬 가변 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 34이고, 코딩된 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 35이다.
또한, 안정성에 있어서, 특허 문헌 201680003540.2에는 TCR의 α사슬 가변영역과 β사슬 불변영역 사이에 인공 사슬간 이황화 결합을 도입함으로써 TCR의 안정성을 현저하게 향상시킬 수 있다고 개시하였다. 따라서, 본 발명의 고친화성 TCR의 α사슬 가변영역과 β사슬 불변영역 사이에 인공 사슬간 이황화 결합을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 TCR의 α사슬 가변영역과 β사슬 불변영역 사이에 인공 사슬간 이황화 결합을 형성한 시스테인 잔기는 TRAV의 46번 위치 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 60번 위치 아미노산; TRAV의 47번 위치 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 61번 위치 아미노산; TRAV의 46번 위치 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 61번 위치 아미노산; 또는 TRAV의 47번 위치 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 60번 위치 아미노산을 대체하였다. 바람직하게는, 이러한 TCR은 (i) 이의 막횡단 도메인을 제외한 TCRα사슬의 전부 또는 일부, 및 (ii) 이의 막횡단 도메인을 제외한 TCRβ사슬의 전부 또는 일부를 포함할 수 있으며, 여기서 (i) 및 (ii)은 모두 TCR사슬의 가변 도메인 및 적어도 일부분의 불변 도메인을 포함하고, α사슬과 β사슬은 이종이량체를 형성한다. 보다 바람직하게는, 이러한 TCR은 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인 및 막횡단 도메인을 제외한 β사슬 불변 도메인의 전부 또는 일부를 포함할 수 있지만, 이는 α사슬 불변 도메인을 포함하지 않으며, 상기 TCR의 α사슬 가변 도메인은 β사슬과 이종이량체를 형성한다.
본 발명의 TCR은 또한 다가 복합체의 형식으로 제공될 수 있다. 본 발명의 다가 TCR 복합체는 2개, 3개, 4개 또는 여러 개의 본 발명의 TCR이 서로 결합하여 형성된 다량체(Polymer)를 포함하며, 예를 들어, p53의 사량체화 도메인을 사용하여 사량체를 산생시키거나, 또는 여러 개의 본 발명의 TCR가 다른 분자와 결합하여 형성한 복합체이다. 본 발명의 TCR 복합물은 체외 또는 체내에서 특정 항원을 제시하는 세포를 추적하거나 표적하는데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 이러한 응용을 갖는 기타 다가 TCR 복합물의 중간체를 산생시키는데도 사용될 수 있다.
본 발명의 TCR은 단독으로 사용될 수 있거나, 또한 공유 또는 기타 방식으로 접합체와 결합할 수 있으며, 바람직하게는 공유 방식으로 결합한다. 상기 접합체는 검출가능한 마커(진단 목적을 위해, 여기서 상기 TCR은 VVGAVGVGK-HLA A1101 또는 VVVGAVGVGK-HLA A1101 복합물을 제시하는 세포의 존재를 검출하기 위해 사용됨), 치료제, PK(단백질 키나제) 변형 모이어티 또는 임의의 상기 이러한 물질의 조합이 결합하거나 접합하는 것을 포함한다.
진단 목적을 위한 검출가능한 마커는 형광 또는 발광 마커, 방사성 마커, MRI(자기 공명 영상) 또는 CT(컴퓨터 단층 촬영)(Computed Tomography) 조영제, 또는 검출가능한 생성물을 산생시킬수 있는 효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 TCR과 결합하거나 접합할 수 있는 치료제는 1. 방사성 핵종(Koppe 등, 2005, 암 전이 평론(Cancer metastasis reviews) 24, 539); 2. 생물독(Chaudhary 등, 자연(Nature) 339, 394; Epel 등, 2002, 암 면역학 및 면역치료(Cancer Immunology and Immunotherapy) 51, 565); 3. 사이토카인, 예를 들어 IL-2 등(Gillies 등, 1992, 미국 국립과학원회보(PNAS) 89, 1428; Card 등, 2004, 암 면역학 및 면역치료(Cancer Immunology and Immunotherapy) 53, 345; Halin 등, 2003, 암 연구(Cancer Research) 63, 3202); 4. 항체 Fc 단편(Mosquera 등, 2005, 면역학 저널(The Journal Of Immunology) 174, 4381); 5. 항체 scFv 단편(Zhu 등, 1995, 국제 암 저널(International Journal of Cancer) 62, 319); 6. 금 나노입자/나노막대(Lapotko 등, 2005, 암 통신(Cancer letters) 239 , 36; Huang 등, 2006, 미국 화학회지(Journal of the American Chemical Society) 128, 2115); 7. 바이러스 입자(Peng 등, 2004, 유전자 치료(Gene therapy) 11, 1234); 8. 리포솜(Mamot 등, 2005, 암 연구(Cancer research) 65, 11631); 9. 나노자성 입자; 10. 전구약물 활성화 효소(예를 들어, DT-디아포라제(DTD) 또는 비페닐 가수분해효소-유사 단백질(BPHL)); 11. 화학요법제(예를 들어, 시스플라틴) 또는 임의의 형식의 나노입자 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 TCR은 1종을 초과하는 종(species)으로부터 유래된 서열을 포함하는 하이브리드(hybrid) TCR일 수도 있다. 예를 들어, 연구에 따르면 쥣과(murine) TCR은 인간 TCR보다 인간 T 세포에서 더 효율적으로 발현한다. 따라서, 본 발명의 TCR은 인간 가변 도메인 및 쥐의 불변 도메인을 포함할 수 있다. 이 방법의 결함은 면역 반응(immune response)을 유발할 수 있는 것이다. 따라서, 쥣과를 발현하는 T 세포의 생착을 허용하기 위해, 이를 입양성 T 세포 치료에 사용할 경우, 면역 억제를 위한 조절 방안이 있어야 한다.
본문에서 아미노산의 명칭은 국제적인 단일 영어 알파벳 또는 세 개의 영어 알파벳으로 표시되며, 아미노산 명칭의 단일 영어 알파벳과 세 개의 영어 알파벳의 대응은 관계는 다음과 같다는 것을 이해해야 한다: Ala(A), Arg(R), Asn(N), Asp(D), Cys(C), Gln(Q), Glu(E), Gly(G), His(H), Ile(I), Leu(L), Lys(K), Met(M), Phe(F), Pro(P), Ser(S), Thr(T), Trp(W), Tyr(Y), Val(V).
핵산 분자
본 발명의 제2 측면은 본 발명의 제1 측면에 기재된 TCR 분자 또는 이의 모이어티를 코딩하는 핵산 분자를 제공하며, 상기 모이어티는 1개 또는 여러 개의 CDR, α 및/또는 β사슬의 가변 도메인, 및 α사슬 및/또는 β사슬 일 수 있다.
본 발명의 제1 측면에 기재된 TCR 분자의 α사슬 CDR 영역을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다:
α CDR1-gaccgagtttcccagtcc(서열번호 16)
α CDR2-atatactccaatggtgac(서열번호 17)
α CDR3-gcctccctcaagggtaacaatgacatgcgc(서열번호 18)
본 발명의 제1 측면에 기재된 TCR 분자의 β사슬 CDR 영역을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다:
β CDR1-tcgggtcatgtatcc(서열번호 19)
β CDR2-ttccagaatgaagctcaa(서열번호 20)
β CDR3-gccagcagctccagtaggtgggagcagcagttc(서열번호 21)
따라서, 본 발명의 TCRα사슬을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18을 포함하고, 및/또는 본 발명의 TCRβ사슬을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열은 단일 사슬 또는 이중 사슬일 수 있고, 해당 핵산 분자는 RNA 또는 DNA일 수 있고, 또한 인트론(intron)을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열은 인트론을 함유하지 않지만 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩할 수 있으며, 예를 들어 본 발명의 TCRα사슬의 가변 도메인을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2를 포함하고, 및/또는 본 발명의 TCRβ사슬의 가변 도메인을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 6을 포함한다. 또는, 본 발명의 TCRα사슬의 가변 도메인을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 33을 포함하고, 및/또는 본 발명의 TCRβ사슬의 가변 도메인을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 35를 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4 및/또는 서열번호 8을 포함한다. 또는, 본 발명의 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 31이다.
유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 상이한 뉴클레오티드 서열이 동일한 폴리펩타이드를 코딩할 수 있음이 이해될 것이다.
유전자 코드(genetic codon)의 축퇴로 인해, 상이한 뉴클레오타이드 서열은 동일한 폴리펩타이드를 코딩할 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명의 TCR을 코딩하는 핵산 서열은 본 발명의 도면에 도시된 핵산 서열과 동일하거나 축퇴된 변이체일 수 있다. 본 발명의 예 중 하나로 설명하면, "축퇴한 변이체"는 서열번호 1을 갖는 단백질 서열을 코딩하지만, 서열번호 2의 서열과 차이가 있는 핵산 서열을 지칭한다.
뉴클레오타이드 서열은 코돈에 의해 최적화 된 것일 수 있다. 상이한 세포는 구체적인 코돈의 사용에 상이하며, 세포의 유형에 따라 서열 중의 코돈을 변경하여 발현량을 증가시킬 수 있다. 포유동물 세포 및 여러 가지 기타 생물의 코돈 선택표는 당업자에게 공지된 것이다.
본 발명의 핵산 분자의 전장 서열 또는 이의 단편은 통상적으로 PCR 증폭법, 재조합 방법 또는 인공합성의 방법을 사용하여 획득할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 현재, 본 발명의 TCR(또는 이의 단편, 또는 이의 유도체)을 코딩하는 DNA 서열은 전적으로 화학적 합성에 의해 얻어질 수 있다. 그 후 해당 DNA 서열을 당업계에 공지된 여러 가지 기존 DNA 분자(또는 예를 들어 벡터) 및 세포에 도입할 수 있다. DNA는 암호 가닥(coding strand) 또는 비암호 가닥(non-coding strand)일 수 있다.
벡터
본 발명은 또한 발현 벡터, 즉 체내 또는 체외에서 발현이 가능한 구축체(construct)를 포함하는, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 일반적으로 사용되는 벡터에는 박테리아 플라스미드(bacterial plasmid), 박테리오파지(bacteriophage) 및 동식물 바이러스(virus)를 포함한다.
바이러스 전달 시스템은 아데노바이러스 벡터(adenoviral vectors), 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus)(AAV) 벡터, 헤르페스바이러스 벡터(herpesvirus vectors), 레트로바이러스 벡터(retroviral vectors), 렌티바이러스 벡터(lentiviral vectors), 배큘로바이러스 벡터(baculovirus vectors)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는, 벡터는 본 발명의 뉴클레오타이드를 세포, 예를 들어 T 세포 내로 전달할 수 있으며, 해당 세포가 KRAS G12V 항원에 특이적인 TCR을 발현하게 한다. 이상적인 경우, 해당 벡터는 T 세포에서 지속적이고 고수준으로 발현할 수 있어야 한다.
세포
본 발명은 또한 본 발명의 벡터 또는 코딩 서열을 사용하여 유전공학(genetic engineering)에 의해 산생된 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 숙주 세포는 본 발명의 벡터를 포함하거나, 본 발명의 핵산 분자가 염색체에 통합되어 있다. 숙주 세포는 예를 들어 대장균(Escherichia coli), 효모 세포(saccharomyces), CHO 세포 등, 원핵 세포(prokaryotic cell) 및 진핵 세포(Eukaryotic cell)로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 TCR을 발현하는 단리된 세포, 특히 T 세포를 더 포함한다. 해당 T 세포는 대상체로부터 단리된 T 세포로부터 유래될 수 있거나, 말초혈액 림프구(PBL)군과 같은, 대상체로부터 단리된 혼합 세포군의 일부분일 수 있다. 예를 들어, 해당 세포는 말초혈액 단핵세포(PBMC)로부터 단리될 수 있고, CD4+ 헬퍼 T 세포 또는 CD8+ 세포독성 T 세포일 수 있다. 해당 세포는 CD4+ 헬퍼 T 세포/CD8+ 세포독성 T 세포의 혼합군에 있을 수 있다. 일반적으로, 해당 세포는 형질주입(transfection)을 보다 용이하게 받아들일 수 있도록 항체(예를 들어, 항-CD3 또는 항-CD28 항체)로 활성화시킬수 있고, 예를 들어 본 발명의 TCR 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 형질주입을 수행할 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 세포는 조혈 줄기세포(HSC)와 같은 줄기세포이거나 그로부터 유래될 수 있다. 줄기세포 표면은 CD3 분자를 발현하지 않기 때문에, HSC로의 유전자 전달은 세포 표면에서 TCR 발현을 초래하지 않는다. 하지만 줄기 세포가 흉선으로 이동하는 림프구 전구체(lymphoid precursor)로 분화 시, CD3 분자의 발현은 흉선 세포 표면에서 도입된 해당 TCR 분자의 발현을 시동한다.
본 발명의 TCR의 DNA 또는 RNA을 코딩하여 T 세포 형질주입을 수행하는데 여러 가지 방법이 적합하다(예를 들어, Robbins 등, (2008) J. Immunol. 180: 6116-6131). 본 발명의 TCR을 발현하는 T 세포는 입양 면역치료에 사용될 수 있다. 당업자는 입양성 치료를 수행하는 여러 가지 적합한 방법을 알 수 있다(예를 들어, Rosenberg 등, (2008) Nat Rev Cancer 8(4): 299-308).
KRAS G12V 항원 관련 질병
본 발명은 또한 KRAS G12V-특이적 T 세포를 해당 대상체에게 입양성 전달하는 단계를 포함하는, 대상체에서 KRAS G12V와 관련된 질병을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 해당 KRAS G12V-특이적 T 세포는 VVGAVGVGK-HLA A1101 또는 VVVGAVGVGK-HLA A1101 복합물을 식별할 수 있다.
본 발명의 KRAS G12V-특이적 T 세포는, KRAS G12V 항원 단쇄 펩타이드 VVGAVGVGK-HLA A1101 또는 VVVGAVGVGK-HLA A1101 복합물을 제시하는 임의의 KRAS G12V 관련 질병을 치료하는데 사용될 수 있고, 해당 질병은 췌장암, 폐암, 결장암 및 직장암 등 종양을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
돌연변이가 발생되지 않은, 즉 야생형 KRAS 단백질의 전 20개 아미노산 서열은 MTEYKLVVVG AGGVGKSALT(서열번호 39)이고, 여기서 12번 위치 아미노산은 G이다. VVGAGGVGK 및 VVVGAGGVGK는 각각 KRAS 단백질의 8-16번 위치 및 7-16번 위치에 대응하며, 상기 대응 위치에서 G12V 돌연변이가 발생한 후 단쇄 펩타이드 VVGAVGVGK 및 VVVGAVGVGK를 형성한다.
치료 방법
KRAS G12V 항원과 관련된 질병을 앓고 있는 환자 또는 지원자로부터 T 세포를 분리하고, 본 발명의 TCR을 상기 T 세포에 도입한 다음, 유전공학에 의해 변형된 이러한 세포를 환자의 체내로 재주입함으로써 치료를 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 TCR을 발현하는 분리된 T 세포, 바람직하게는, 환자 자신으로부터 유래된 T 세포를 환자의 체내로 주입하는 것을 포함하는, KRAS G12V 관련 질병의 치료 방법을 제공한다. 일반적으로, (1) 환자의 T 세포를 분리하는 단계, (2) 본 발명의 핵산 분자 또는 본 발명의 TCR 분자를 코딩할 수 있는 핵산 분자로 체외에서 T 세포를 형질도입하는 단계, (3) 유전공학에 의해 변형된 T 세포를 환자 체내에 주입하는 단계를 포함한다. 분리, 형질감염 및 재주입하는 세포의 수량은 의사의 결정에 따른다.
본 발명의 주요 장점은 다음과 같다:
(1) 본 발명의 TCR은 KRAS G12V 항원 단쇄 펩타이드 복합물 VVGAVGVGK-HLA A1101 또는 VVVGAVGVGK-HLA A1101과 결합할 수 있고, 또한 본 발명의 TCR이 형질도입된 세포는 특이적으로 활성화될 수 있다.
(2) 본 발명의 TCR이 형질도입된 이펙터 세포는 표적 세포에 대해 우수한 특이적 사멸 효과를 갖는다.
하기의 특정 실시예는, 본 발명을 추가로 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위해 사용된 것이며, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다. 하기 실시예에서 구체적인 조건을 명시하지 않은 실험 방법은, 일반적으로 통상적인 조건, 예를 들어 (Sambrook and Russell 등, 분자 클로닝(molecular cloning): 실험실 매뉴얼(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(제3판)(2001)(CSHL출판사)에 기재된 조건, 또는 제조사에서 제안한 조건에 따른다. 달리 명시하지 않는 한, 백분율 및 부수(parts)는 중량기준으로 계산한다. 달리 명시하지 않는 한, 백분율 및 부수는 중량기준으로 계산한다. 이하 실시예에 사용된 실험 재료 및 시약은 달리 명시하지 않는 한, 모두 상업적 출처로부터 얻을 수 있다.
실시예 1 KRAS G12V 항원 단쇄 펩타이드 특이적 T 세포의 클로닝
합성 단쇄 펩타이드 VVGAVGVGK(서열번호 9)(Beijing SBS Genetech Co., Ltd.)를 사용하여 유전자형이 HLA-A1101인 건강한 지원자로부터 얻은 말초혈액 림프구(PBL)를 자극한다. 단쇄 펩타이드를 비오틴(biotin) 마커를 갖는 HLA-A1101과 재생(renaturation)하여, pHLA 반수체(haploid)를 제조한다. 이러한 반수체와 PE로 표기한 스트렙트아비딘(streptavidin)(BD회사)을 PE-표기된 사량체로 조합시키고, 해당 사량체 및 항-CD8-APC 이중 양성 세포를 분류한다. 분류된 세포를 증폭(amplification)하며, 상술한 바와 같이 2차 분류한 후 한계희석법(limiting dilution analysis)에 의해 단클론(monoclonal)을 수행한다. 단클론 세포를 사량체로 염색하며, 선별된 이중 양성 클론은 도 3에 나타낸 바와 같다. 층층히 선별하여 얻은 이중 양성 클론은 또한 추가의 기능 테스트를 충족해야 한다.
ELISPOT 실험에 의해, 해당 T 세포 클론의 기능 및 특이성을 추가로 테스트한다. 당업자는 ELISPOT 실험을 이용하여 세포 기능을 테스트하는 방법에 대해 잘 알고 있다. 본 실시예의 IFN-γ ELISPOT 실험에 사용된 이펙터 세포는 본 발명에서 얻은 T 세포 클론이고, 표적 세포는 본 발명의 단쇄 펩타이드가 로딩된 LCLs 세포이며, 대조군은 기타 단쇄 펩타이드가 로딩된 LCLs 세포 및 아무런 단쇄 펩타이드도 로딩하지 않은 LCLs 세포이다.
우선 ELISPOT 플레이트를 준비하며, ELISPOT 실험 단계는 다음과 같다: LCLs 세포는 2Х104개/웰, T 세포 클론은 2Х103/웰로, 시험할 각 구성 요소를 ELISPOT 플레이트에 추가한 후, 실험군에는 20μL의 특이성 단쇄 펩타이드를 추가하고, 대조군에는 20μL의 비특이성 단쇄 펩타이드를 추가하고, 블랭크 그룹에는 20μL의 배지(시험 배지)를 추가하며, 2개의 중복 웰을 설치한다. 그 후 밤새 배양(overnight incubation)한다(37°C, 5% CO2). 이어서 플레이트를 세척하고 2차 테스트 및 발색을 수행하며, 플레이트를 1시간 동안 건조시킨 후, 면역스팟 플레이트 리더(ELISPOT READER system; AID 회사)를 사용하여 막에 형성된 반점을 카운팅한다. 실험 결과는 도 14에 나타낸 바와 같이, 수득된 특정 항원-특이적 T 세포 클론은 본 발명의 단쇄 펩타이드가 로딩된 LCLs 세포에 대해 현저한 특이적 반응을 갖지만, 기타 무관 펩타이드가 로딩된 LCLs 세포 및 단쇄 펩타이드가 로딩되지 않은 LCLs 세포에 대해서는 거의 반응이 없다.
실시예 2: KRAS G12V 항원 단쇄 펩타이드 특이적 T 세포 클론을 얻기 위한 TCR 유전자 및 벡터의 구축
Quick-RNA™ MiniPrep(ZYMO research)에 의해 실시예 1에서 선별된 항원 단쇄 펩타이드 특이적, HLA-A1101 제한적-T 세포 클론의 전체 RNA를 추출한다. cDNA의 합성은 clontech의 SMART RACE cDNA 증폭 키트를 사용하며, 사용된 프라이머(primer)는 인간 TCR 유전자의 C-말단 보존 영역에 설계된다. 서열을 T 벡터(TAKARA)에 클로닝하여 시퀀싱(sequencing)을 수행한다. 주의해야 할 것은, 해당 서열은 상보적 서열이고, 인트론을 포함하지 않는다. 시퀀싱 후, 해당 이중 양성 클론이 발현하는 TCR의 α사슬과 β사슬의 서열 구조는 각각 도 1과 도 2에 나타낸 바와 같으며, 도 1a, 도 1b, 도 1c, 도 1d, 도 1e 및 도 1f는 각각 TCRα사슬 가변 도메인의 아미노산 서열, TCRα사슬 가변 도메인의 뉴클레오타이드 서열, TCRα사슬의 아미노산 서열, TCRα사슬의 뉴클레오타이드 서열, 리더 서열을 구비하는 TCRα사슬의 아미노산 서열 및 리더 서열을 구비하는 TCRα사슬의 뉴클레오타이드 서열이고; 도 2a, 도 2b, 도 2c, 도 2d, 도 2e 및 도 2f는 각각 TCRβ사슬 가변 도메인의 아미노산 서열, TCRβ사슬 가변 도메인의 뉴클레오타이드 서열, TCRβ사슬의 아미노산 서열, TCRβ사슬의 뉴클레오타이드 서열, 리더 서열을 구비하는 TCRβ사슬의 아미노산 서열 및 리더 서열을 구비하는 TCRβ사슬의 뉴클레오타이드 서열이다.
검증한 결과, α사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하고:
αCDR1-DRVSQS (서열번호 10)
αCDR2-IYSNGD (서열번호 11)
αCDR3-ASLKGNNDMR (서열번호 12)
β사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다:
βCDR1- SGHVS (서열번호 13)
βCDR2- FQNEAQ (서열번호: 14)
βCDR3-ASSSSRWEQQF (서열번호 15).
중첩(overlap) PCR에 의해 TCRα사슬 및 β사슬의 전장 유전자를 각각 렌티바이러스 발현 벡터 pLenti(addgene)에 클로닝한다. 구체적으로: overlap PCR에 의해 TCRα사슬과 TCRβ사슬의 전장 유전자를 연결하여 TCRα-2A-TCRβ 단편을 얻는다. 렌티바이러스 발현 벡터와 TCRα-2A-TCRβ를 효소 절단(Cleavage) 및 연결하여 pLenti-TRA-2A-TRB-IRES-NGFR 플라스미드를 얻는다. 대조군으로, eGFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터인 pLenti-eGFP도 구축한다. 그 후, 293T/17을 사용하여 슈도바이러스(pseudovirus)를 패키징한다.
실시예 3 KRAS G12V 항원 단쇄 펩타이드 특이적 가용성 TCR의 발현, 리폴딩(refolding) 및 정제
가용성 TCR 분자를 획득하기 위해, 본 발명의 TCR 분자의 α 및 β 사슬은 각각 가변 도메인 및 일부 불변 도메인만을 포함할 수 있고, α 및 β 사슬의 불변 도메인에 각각 1개의 시스테인 잔기를 도입하여 인공 사슬간 이황화 결합을 형성시키며, 시스테인 잔기를 도입하는 위치는 각각 TRAC*01 엑손 1의 Thr48 및 TRBC2*01 엑손 1의 Ser57이고; 이의 α사슬의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열은 각각 도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같고, 이의 β사슬의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열은 각각 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같다. <분자 클로닝 실험실 매뉴얼>(Molecular Cloning a Laboratory Manual) (제3판, Sambrook 및 Russell)에 기재된 표준 방법에 의해, 상기 TCR α 및 β 사슬의 표적 유전자 서열을 합성한 후 각각 발현 벡터 pET28a+ (Novagene)에 삽입하고, 상하류(upstream and downstream)의 클로닝 위치는 각각 NcoI 및 NotI이다. 삽입 단편은 시퀀싱을 통해 정확함을 확인하였다.
TCR의 α 및 β 사슬의 발현 벡터를 각각 화학적 변형(chemical transformation)에 의해 발현 박테리아 BL21(DE3)으로 형질전환(transformation)시키고, 박테리아는 LB 배지에서 성장하고, OD600=0.6시 최종 농도가 0.5 Mm인 IPTG에 의해 유도되며, TCR의 α 및 β 사슬이 발현 후 형성된 봉입체는 BugBuster Mix (Novagene)에 의해 추출되고, 또한 BugBuster 용액에 의해 반복적으로 세척되며, 마지막으로 봉입체는 6M의 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride), 10Mm의 디티오트레이톨(dithiothreitol)(DTT), 10mM의 에틸렌디아민 테트라아세트산 (ethylenediaminetetraacetic acid)(EDTA), 20mM의 Tris(pH 8.1)에 용해된다.
용해된 TCR α 및 β 사슬은 1:1의 질량비로 신속하게 5M의 요소(urea), 0.4M의 아르기닌(arginine), 20mM의 Tris(pH 8.1), 3.7mM의 cystamine, 6.6mM의 β-mercapoethylamine(4℃)에 혼합되며, 최종 농도는 60mg/mL이다. 혼합 후 용액을 10배 부피의 탈 이온수(4℃)에 방치하여 투석시키며, 12시간 후, 탈 이온수를 완충액 (20mM Tris, pH 8.0)으로 교체하고 계속하여 4℃에서 12시간 동안 투석을 수행한다. 투석 완료 후의 용액은 0.45Mm의 필터를 통해 여과한 후, 음이온 교환 컬럼 (HiTrap Q HP, 5ml, GE Healthcare)에 의해 정제된다. 성공적으로 재생(renaturation)한 α 및 β 이량체의 TCR가 함유된 용리 피크(elution peak)는 SDS-PAGE 겔 의해 확인되었다. TCR은 이어서 겔 여과 크로마토그래피(HiPrep 16/60, Sephacryl S-100 HR, GE Healthcare)에 의해 추가로 정제한다. 정제된 TCR 순도는 SDS-PAGE에 의해 측정한 결과 90%이상이고, 농도는 BCA법에 의해 확정한다. 본 발명에서 얻은 가용성 TCR의 SDS-PAGE 겔 다이어그램(gel diagram)은 도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같다.
실시예 4 KRAS G12V 항원 단쇄 펩타이드 특이적인 가용성 단일 사슬 TCR의 산생
특허 문헌 WO2014/206304에 기재한 바와 같이, 위치지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)의 방법을 사용하여 실시예 2에 따른 TCR α 및 β 사슬의 가변 도메인을 가요성 펩타이드(linker)에 의해 연결된 1개의 안정적인 가용성 단일 사슬 TCR 분자로 구축하였다. 해당 단일 사슬 TCR 분자의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열은 각각 도 7a 및 도 7b에 나타낸 바와 같다. 이의 α 사슬 가변 도메인의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열은 각각 도 8a 및 도 8b에 나타낸 바와 같고; 이의 β 사슬 가변 도메인의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열은 각각 도 9a 및 도 9b에 나타낸 바와 같으며; 이의 linker서열의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열은 각각 도 10a 및 도 10b에 나타낸 바와 같다.
표적 유전자를 NcoI 및 NotI 두 효소로 절단(double digests)하고, NcoI 및 NotI에 의해 절단된 pET28a 벡터와 연결시킨다. 연결 산물(ligation product)을 E.coli DH5α로 형질전환시키고, 카나마이신(kanamycin)을 함유하는 LB 플레이트에 코팅하며, 37℃에서 밤새 거꾸로 배양하고, 양성 클론을 선택하여 PCR 선별을 수행하고, 양성 레콘(recon)에 대해 시퀀싱을 수행하며, 서열이 정확한 것을 확정한 후 재조합 플라스미드를 추출하여 E.coli BL21(DE3)으로 형질전환시켜 발현에 사용한다.
실시예 5 KRAS G12V 항원 단쇄 펩타이드 특이적인 가용성 단일 사슬 TCR의 발현, 재생(renaturation) 및 정제
실시예 4에서 제조된 재조합 플라스미드 pET28a-주형 사슬을 함유하는 BL21 (DE 3) 콜로니를 카나마이신을 함유하는 LB 배지에 전부 접종시키고, 37℃에서 OD600가 0.6-0.8로 되도록 배양하고, 최종 농도가 0.5mM로 되게 IPTG를 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 계속 배양한다. 5,000rpm에서 15분 동안 원심분리하여 세포 침전물을 수확하고, Bugbuster Master Mix(Merck)로 세포 침전물을 용해시키며, 6,000rpm에서 15분 동안 원심분리하여 봉입체를 회수한 후, 세포 파편 및 막 성분을 제거하기 위해 다시 Bugbuster(Merck)를 사용하여 세척하고, 6,000rpm에서 15분 동안 원심분리하여 봉입체를 수집한다. 봉입체를 완충액(20mM Tris-HCl pH 8.0, 8M 요소)에 용해시키고, 고속 원심분리시켜 불용물을 제거하고, 상등액은 BCA법에 의해 정량한 후 분주(dispensed)하여 -80℃에서 보관한다.
용해된 단일 사슬 TCR 봉입체 단백질 5mg에 2.5mL의 완충액(6M Gua-HCl, 50mM Tris-HCl pH 8.1, 100mM NaCl, 10mM EDTA)을 추가한 다음 최종 농도가 10mM로 되게 DTT를 추가하고, 37°C에서 30분 동안 처리한다. 주사기로 125mL의 재생 완충액(100mM Tris-HCl pH 8.1, 0.4M L-아르기닌, 5M 요소, 2mM EDTA, 6.5mM β-mercapthoethylamine, 1.87mM Cystamine)에 상기 처리된 단일 사슬 TCR을 적가하고, 4℃에서 10분 동안 교반한 후, 재생액을 컷오프(cut-off)가 4kDa인 셀룰로오스 막 투석백(cellulose membrane dialysis bag)에 넣고, 투석백을 미리 냉각시킨 1L의 물에 넣어 4℃에서 천천히 교반하여 밤샌다. 17시간 후 투석액을 미리 냉각시킨 1L의 완충액(20mM Tris-HCl pH 8.0)으로 교체하고, 4℃에서 8시간 동안 투석을 계속한 후, 투석액을 동일한 새로운 완충액으로 교체하고 투석을 계속하여 밤샌다. 17시간 후, 샘플을 0.45μm의 필터로 여과하고, 진공탈가스(vacuum degassing) 후 음이온 교환 컬럼(HiTrap Q HP, GE Healthcare)을 통해, 20mM Tris-HCl pH 8.0로 제조한 0-1M NaCl의 선형 구배 용리액으로 단백질을 정제하고, 수집한 용리 성분은 SDS-PAGE 분석을 수행하고, 단일 사슬 TCR을 포함하는 성분은 농축한 후 추가로 겔 여과 컬럼(Superdex 75 10/300, GE Healthcare)으로 정제하고, 표적 성분도 SDS-PAGE 분석을 수행한다.
BIAcore 분석에 사용하는 용리 성분은 추가로 겔 여과법(gel filtration)을 사용하여 순도를 테스트한다. 조건은 다음과 같다. 크로마토그래피 컬럼은 Agilent Bio SEC-3(300A, φ7.8 x 300mm)이고, 이동상은 150Mm의 인산염 완충액이고, 유속은 0.5mL/min이고, 컬럼 온도는 25°C이고, UV 검출 파장은 214nm이다.
본 발명에서 획득한 가용성 단일 사슬 TCR의 SDS-PAGE 겔 다이어그램은 도 11에 나타낸 바와 같다.
실시예 6 결합 특성해석(binding characterization)
BIAcore 분석
본 실시예는 가용성의 본 발명의 TCR 분자와 VVGAVGVGK-HLA A1101 복합물이 특이적으로 결합하는 친화력을 측정한다.
BIAcore T200 실시간 분석 시스템(BIAcore T200 real-time analysis system)을 사용하여 실시예 3 및 실시예 5에서 얻은 TCR 분자와 VVGAVGVGK-HLA A1101 복합물의 결합활성을 검출한다. 항 스트렙트아비딘(streptavidin)의 항체(GenScript)를 결합 완충액(coupling buffer)(10mM 아세트산 나트륨 완충액(sodium acetate buffer), pH 4.77)에 첨가한 후, 항체가 EDC와 NHS로 미리 활성화 한 CM5 칩을 흐르게 하여 칩 표면에 항체를 고정시키고, 마지막으로 에탄올아민의 염산 용액으로 미반응한 활성화 표면을 차단킹하여 결합 과정을 완성하며, 결합 수준은 약 15,000RU이다.
항체가 코팅된 칩 표면에 낮은 농도의 스트렙트아비딘을 통과시킨 후, 검출 채널에 VVGAVGVGK-HLA A1101 복합물을 통과시키고, 다른 채널을 참조 채널로 하여 0.05mM의 비오틴을 10μL/min의 유속으로 2분 동안 칩을 흘러 지나가게 하며, 스트렙트아비딘의 나머지 결합 위치를 차단한다.
상기 VVGAVGVGK-HLA A1101 복합물의 제조 과정은 다음과 같다:
a. 정제
중쇄(heavy chain) 또는 경쇄(light chain) 발현을 유도하는 E. coli 균액 100ml를 수집하고, 4℃에서 8,000g로 10분 동안 원심분리하고, PBS 10ml로 균체(cell)를 1회 세척한 다음, BugBuster Master Mix Extraction Reagents(Merck) 5ml를 사용하여 강렬하게 진탕하고 균체를 재현탁하여 실온에서 20분 동안 회전하여 인큐베이션한 다음 4℃에서, 6,000g로 15분 동안 원심분리하고, 상등액을 버리고, 봉입체를 수집한다.
5ml의 BugBuster Master Mix에서 상기 봉입체를 재현탁하고, 실온에서 5분 동안 회전하여 인큐베이션하고; 10배 희석한 BugBuster를 30ml 추가하고, 균일하게 혼합하여, 4℃에서 6,000g로 15분 동안 원심분리하고; 상등액을 버리고, 10배 희석한 BugBuster를 30ml 추가하여 봉입체를 재현탁하고, 균일하게 혼합하여, 4℃에서 6,000g로 15분 동안 원심분리하며, 2회 반복하고, 20mM Tris-HCl pH 8.0을 30ml 추가하여 봉입체를 재현탁하고, 균일하게 혼합하여, 4℃에서 6,000g로 15분 동안 원심분리하며, 마지막으로 20mM Tris-HCl 8M 요소를 사용하여 봉입체를 용해시키고, SDS-PAGE로 봉입체의 순도를 검출하고, BCA 키트로 농도를 측정한다.
b. 재생(renaturation)
합성된 단쇄 펩타이드 VVGAVGVGK(Beijing SBS Genetech Co., Ltd.)를 20mg/ml의 농도로 되도록 DMSO에 용해시킨다. 경쇄 및 중쇄의 봉입체를 8M 요소, 20mM Tris pH 8.0, 10mM DTT로 용해시키고, 재생 전 3M의 구아니딘 하이드로클로라이드, 10mM의 아세트산 나트륨, 10mM의 EDTA를 첨가하여 추가로 변성시킨다. VVGAVGVGK 펩타이드를 25 mg/L(최종 농도)로 재생 완충액(0.4M L-아르기닌, 100mM Tris pH 8.3, 2mM EDTA, 0.5mM 산화성 글루타티온(oxidized glutathione), 5mM 환원형 글루타티온(reduced glutathione), 0.2mM PMSF, 4°C로 냉각)에 첨가한 후, 순차적으로 20mg/L의 경쇄와 90mg/L의 중쇄(최종 농도, 중쇄는 3회로 나누어 첨가, 8시간/회)를 첨가하고, 재생은 완성될 때까지 4°C에서 최소 3일 동안 수행되며, SDS-PAGE로 재생의 성공 여부를 검출한다.
c. 재생 후 정제
10부피의 20mM Tris pH 8.0으로 투석하여 재생 완충액을 교체하고, 용액의 이온 강도를 충분히 감소시키기 위해, 완충액을 적어도 2회 교체한다. 투석 후, 0.45μm의 셀룰로오스 아세테이트 필터(cellulose acetate filter)를 통해 단백질 용액을 여과한 후, HiTrap Q HP(GE 제너럴 일렉트릭) 음이온 교환 컬럼(5ml 베드 부피(bed volume))에 로딩한다. Akta 정제기(GE 제너럴 일렉트릭)를 사용하여, 20mM Tris pH 8.0으로 제조한 0-400mM NaCl의 선형 구배액으로 단백질을 용리하며, pMHC는 약 250mM NaCl에서 용리되고, 모든 피크 성분을 수집하며, SDS-PAGE로 순도를 검출한다.
d. 비오틴화
Millipore 한외여과 튜브(ultrafiltration tube)를 사용하여 정제된 pMHC 분자를 농축시키며, 완충액을 20mM Tris pH 8.0으로 교체한 후, 비오틴화 시약 0.05M Bicine pH 8.3, 10mM ATP, 10mM MgOAc, 50μM D-Biotin, 100μg/ml BirA 효소(GST-BirA)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 인큐베이션하고, 비오틴화의 완전 여부를 SDS-PAGE로 검출한다.
e. 비오틴화된 복합물의 정제
Millipore 한외여과 튜브를 사용하여 비오틴화된 표기된 pMHC 분자를 1mL로 농축시키고, Akta 정제기(GE 제너럴 일렉트릭)를 사용하여 비오티화된 pMHC를 겔 여과 크로마토그래피로 정제하며, 여과된 PBS를 사용하여 HiPrep?? 16/60 S200 HR 컬럼(GE)을 미리 평형화하고, 농축된 비오틴화된 pMHC 분자 1ml를 로딩한 후, PBS를 사용하여 1ml/min의 유속으로 용리한다. 비오틴화된 pMHC 분자는 약 55 ml시 단일 피크로 용리되어 나타난다. 단백질 함유 성분을 합병하고, Millipore 한외여과 튜브를 사용하여 농축하며, BCA법(Thermo)에 의해 단백질의 농도를 측정하고, 프로테아제 억제제(protease inhibitor)인 cocktail(Roche)을 첨가하여 비오틴화된 pMHC 분자를 분주(dispensed)하여 -80°C에서 보관한다.
BIAcore Evaluation 소프트웨어를 사용하여 동역학 매개변수를 계산하며, 얻은 본 발명의 가용성 TCR 분자 및 본 발명에 의해 구축된 가용성 단일 사슬 TCR 분자가 VVGAVGVGK-HLA A1101 복합물과 결합한 키네틱 맵은 각각 도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같다. 스펙트럼에 따르면, 본 발명에 의해 수득된 가용성 TCR 분자 및 가용성 단일 사슬 TCR 분자는 모두 VVGAVGVGK-HLA A1101 복합물과 결합할 수 있다. 또한, 상기 방법을 사용하여 본 발명의 가용성 TCR 분자와 기타 몇 가지 무관한 항원 단쇄 펩타이드 및 HLA 복합물의 결합활성을 검출하였는데, 결과에 따르면 본 발명의 TCR 분자는 기타 무관 항원과 모두 결합이 없다.
실시예 7 본 발명의 TCR을 형질도입한 T 세포의 활성화 실험(표적 세포는 T2임)
당업자는 ELISPOT 실험을 사용하여 세포 기능을 검출하는 방법을 잘 알고 있다. ELISPOT 실험에 의해 검출한 IFN-γ 생성량은 T 세포 활성화의 판독값으로, 표적 세포에 대한 본 발명의 TCR이 형질도입된 T 세포의 특이적인 활성화 반응을 증명한다.
우선 시험 배지를 포함하는 시약을 준비한다: 10% FBS(Gibco, #16000-044), RPMI 1640(Gibco, #C118755BT); 세척 완충액(PBST): 0.01M PBS (Gibco, #C10010500BT)/0.05% 트윈 20; PVDF ELISPOT 96-웰 플레이트(Merck Millipore, #MSIPS4510); 인간 IFN-γ ELISPOT PVDF-효소 키트(BD)는 필요하는 모든 기타 시약(항체를 포획 및 검출, 스트렙트아비딘-알칼리성 포스파타아제 및 BCIP/NBT 용액)이 담겨있다.
본 실험에서 사용되는 표적 세포는 특이성 단쇄 펩타이드를 로딩한 T2 세포, 비특이성 단쇄 펩타이드를 로딩한 T2 세포, 단쇄 펩타이드를 로딩하지 않은 T2 세포이다. T2 세포는 HLA-A1101를 형질도입하였다. 여기서, 특이성 단쇄 펩타이드는 VVGAVGVGK(KRAS G12V, 노나펩타이드) 및 VVVGAVGVGK(KRAS G12V, 데카펩타이드)이고; 비특이성 단쇄 펩타이드는 VVGAGGVGK(돌연변이가 발생하지 않은 KRAS 단쇄 펩타이드임), VVVGAGGVGK(돌연변이가 발생하지 않은 KRAS 단쇄 펩타이드임), VVGADGVGK(KRAS G12D, 12번 위치는 기타 돌연변이의 KRAS 단쇄 펩타이드임), VVVGADGVGK(KRAS G12D, 12번 위치는 기타 돌연변이의 KRAS 단쇄 펩타이드임) 및 SSCSSCPLSK(기타 항원 단쇄 펩타이드임)이다.
본 실험에 사용된 이펙터 세포(T cell)는 본 발명의 KRAS G12V 항원 단쇄 펩타이드 특이성 TCR을 발현하는 CD3+ T 세포이며, 또한 본 발명의 TCR이 형질감염되지 않은 동일한 지원자의 CD3+ T 세포를 대조군으로 사용한다. 항-CD3/CD28 코팅 비드(coated beads)(T 세포 증폭물, life technologies)로 T 세포를 자극하고, KRAS G12V 항원 단쇄 펩타이드 특이성 TCR 유전자를 가진 렌티바이러스로 형질도입하며, 50IU/mL IL-2 및 10ng/mL IL-7을 함유하는, 10% FBS를 함유하는 1640 배지에서 형질도입 후의 9-12일까지 증폭시킨 다음, 이러한 세포를 시험 배지에 넣고, 실온에서 300g로 10분 동간 원심분리하고 세척한다. 그 후, 세포를 2Х수요되는 최종 농도로 시험 배지에 재현탁시킨다. 음성 대조 이펙터 세포도 동일하게 처리한다. 그런 다음, 대응되는 단쇄 펩타이드를 첨가하여 ELISPOT 웰 플레이트에서 단쇄 펩타이드의 최종 농도가 10-6 M이 되도록 한다.
제조사에서 제공한 설명서에 따라, 다음과 같이 웰 플레이트를 준비한다: 플레이트당 항-인간 IFN-γ 포획 항체를 1:200으로 10mL의 멸균 PBS에 희석한 다음, 희석된 포획 항체 100 μL를 각 웰에 동일하게 첨가한다. 4℃에서 웰 플레이트를 밤새 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 과량의 포획 항체를 제거하기 위해 웰 플레이트를 세척한다. 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 100μL/웰씩 첨가하고, 웰 플레이트를 차단하기 위해, 실온에서 웰 플레이트를 2시간 동안 인큐베이션한다.그런 다음, 배지를 플레이트에서 세척하고, 종이위에서 ELISPOT 웰 플레이트를 가볍게 두드려 모든 잔여 세척 완충액을 제거한다. 그 후, 시험하는 각 성분을 ELISPOT 웰 플레이트에 추가한다: 표적 세포는 2Х104 개/웰, 이펙터 세포는 1Х103 개/웰(형질감염 양성률에 따라 계산)이며, 2개의 중복 웰을 설치한다.
웰 플레이트를 밤새 인큐베이션(37℃/5% CO2)한 후, 다음 날 배지를 버리고, 웰 플레이트를 2차 증류수(double distilled water)로 2회 세척한 후 세척 완충액으로 3회 세척하고, 종이위에서 가볍게 두드려 잔여 세척 완충액을 제거한다. 이어서, 검출 항체를 1:200으로 10% FBS를 함유하는 PBS로 희석하고, 100μL/웰씩 각 웰에 첨가한다. 웰 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후 세척 완충액으로 3회 세척하고, 종이위에서 웰 플레이트를 가볍게 두드려 과량의 세척 완충액을 제거한다. 스트렙트아비딘-알칼리성 포스파타아제를 1:100으로 10% FBS를 함유하는 PBS로 희석하고, 희석된 스트렙트아비딘-알칼리성 포스파타아제를 100μL/웰씩 각 웰에 첨가하고 웰 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 그 후 세척 완충액으로 4회 세척하고, PBS로 2회 세척하며, 종이위에서 웰 플레이트를 가볍게 두드려 과량의 세척 완충액 및 PBS를 제거한다. 세척 완료 후 키트에서 제공하는 BCIP/NBT 용액을 100μL/웰씩 첨가하여 발색시킨다. 발색시키는 동안 웰 플레이트를 은박지로 덮어 빛을 차단하고, 5~15분 동안 방치한다. 이 기간 동안 발색 플레이트의 반점을 통상적으로 확인하며, 반응을 종료할 최적의 시간을 확정한다. BCIP/NBT 용액을 제거하며 웰 플레이트를 2차 증류수로 헹구어 발색 반응을 종료시키고, 회전 건조시킨후, 웰 플레이트의 바닥을 제거하고, 플레이트의 각 웰이 완전히 건조될 때까지 실온에서 건조시킨 후, 면역스팟 플레이트 카운터(CTL, (주)셀룰러 테크놀로지(Cellular Technology Limited))를 사용하여 웰 플레이트 내의 바닥 막에 형성된 반점을 카운팅한다.
ELISPOT 실험(상기 기재된 바와 같음)을 통해, 표적 세포에 대해 반응하는 본 발명의 TCR이 형질도입된 T 세포의 IFN-γ의 방출을 검사한다. graphpad prism6을 사용하여 각 웰에서 관찰된 ELSPOT 반점수를 표시한다.
실험 결과는 도 15에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 TCR이 형질도입된 T 세포(이펙터 세포)는 KRAS G12V(노나펩타이드(nonapeptide) 및 데카펩타이드(decapeptide))가 로딩된 표적 세포에 대해 우수한 활성화 반응을 보였고, 돌연변이가 발생되지 않은 야생형 KRAS(노나펩타이드 및 데카펩타이드), 12번 위치에 기타 돌연변이가 발생된 KRAS G12D(노나펩타이드 및 데카펩타이드), 기타 항원 단쇄 펩타이드 및 로딩되지 않은 표적 세포에 대해서는 모두 활성화 반응을 보이지 않았다. 이는 본 발명의 TCR은 KRAS G12V(노나펩타이드 및 데카펩타이드)과 특이적으로 결합하여 세포 활성화 반응을 일으킬 수 있음을 설명한다.
실시예 8. 본 발명의 TCR이 형질도입된 T 세포의 활성화 실험(표적 세포는 종양 세포주임)
본 실시예는 역시 본 발명의 고친화성 TCR이 형질주입된 이펙터 세포가 표적 세포에 대해 우수한 특이적 활성화 작용을 갖는다는 것을 검증하기 위한 것이다. ELISPOT 실험을 통해 본 발명의 고친화성 TCR의 세포 내에서의 기능 및 특이성을 검출한다.
당업자는 ELISPOT 실험을 사용하여 세포 기능을 검출하는 방법을 잘 알고 있다. 사용된 이펙터 세포(T 세포)는 본 발명의 KRAS G12V 항원 단쇄 펩타이드 특이성 TCR이 형질주입된 CD3+ T 세포이며, 또한 본 발명의 TCR이 형질주입되지 않은 동일한 지원자의 CD3+ T 세포를 대조군으로 사용된다. 표적 세포주는 A562-A11-TMG1(A11 및 KRAS G12V 과발현), A562-A11(A11 과발현), A562-A11-TMG2(A11 및 KRAS G12D 과발현), SK-MEL-1, SW620-A11(A11 과발현) 및 SW620 세포이다. 여기서, 표적 세포주 A562-A11-TMG1 및 SW620-A11는 양성 종양 세포주로 사용하고; A562-A11, A562-A11-TMG2, SK-MEL-1 및 SW620은 음성 종양 세포주로, 대조군으로 사용된다.
우선 ELISPOT 플레이트를 준비한다. ELISPOT 플레이트를 활성화시키고 에탄올로 코팅하며 4℃에서 밤샌다. 실험 첫 날, 코팅액을 제거하고, 플레이트를 세척하여 차단하고 실온에서 2시간 동안 배양한 다음 차단액을 제거하고 시험하는 각 성분을 ELISPOT 플레이트에 추가한다: 표적 세포는 2Х104개/웰, 이펙터 세포는 1Х103개/웰(형질감염 양성률에 따라 계산)이며, 2개의 중복 웰을 설치한다. 밤새 인큐베이션(37℃/5% CO2)한다. 실험 2일차, 플레이트를 세척하며 2차 테스트 및 발색을 수행하고, 플레이트를 건조시킨 후, 면역스팟 플레이트 리더(ELISPOT READER system; AID 사)를 사용하여 막에 형성된 반점을 카운팅한다.
실험 결과는 도 16에 나타낸 바와 같이, 양성 표적 세포주에 대해, 본 발명의 TCR이 형질감염된 이펙터 세포는 우수한 특이적 활성화 작용을 나타냈지만, 음성 표적 세포주에 대해 반응이 없다. 또한, 표적 세포에 대해, 기타 TCR이 형질주입된 이펙터 세포는 활성화 작용이 거의 나타나지 않았다.
실시예 9. 본 발명의 TCR이 형질주입된 이펙터 세포의 LDH 사멸 기능 실험
본 실시예에서는 비방사성 세포독성 실험을 통해 LDH의 방출을 측정하며, 이로부터 본 발명의 TCR이 형질도입된 세포의 사멸 기능을 검증한다. 해당 시험은 51Cr 방출 세포독성 시험의 비색 대체 시험으로, 세포 용해 후 방출되는 젖산 탈수소효소(LDH)를 정량 측정한다. 30분 동안 결합하는 효소 반응을 사용하여 배지에 방출된 LDH를 검출하며, 효소 반응에서 LDH은 테트라졸륨 염(tetrazolium salt)(INT)을 적색의 포르마잔(formazan)으로 전환시킬 수 있다. 생성된 적색 산물의 양은 용해된 세포의 수와 정비례된다. 표준 96웰 플레이트 판독기를 사용하여 490nm에서의 가시광선 흡광도 값을 수집할 수 있다.
당업자는 LDH의 방출 실험을 사용하여 세포 기능을 검출하는 방법을 잘 알고 있다. 사용된 이펙터 세포(T 세포)는 본 발명의 KRASTCR이 형질감염된 CD3+ T 세포이며, 또한 본 발명의 TCR이 형질감염되지 않은 동일한 지원자의 CD3+ T 세포를 대조군으로 사용된다. 표적 세포주는 KRAS G12V(노나펩타이드)VVGAVGVGK를 로딩한 T2-A11(A11 과발현), T2-A11(A11 과발현), SK-MEL-28, SW620-A11(A11 과발현), SW620 및 SW480-A11(A11 과발현) 세포이다. 여기서, VVGAVGVGK 단쇄 펩타이드를 로딩한 T2-A11, SW620-A11 및 SW480-A11은 양성 종양 세포주이며; T2-A11, SK-MEL-28 및 SW620은 음성 종양 세포주로, 대조군으로 사용된다.
우선 LDH 플레이트를 준비한다. 실험 첫 날, 시험하는 각 성분을 플레이트에 추가한다: 표적 세포는 3Х104개 세포/웰, 이펙터 세포는 3Х104개 세포/웰이며, 3개의 중복 웰을 설치한다. 또한, 이펙터 세포 자발적 웰, 표적 세포 자발적 웰, 표적 세포 최대 웰, 부피 보정 대조 웰 및 배지 백그라운드 대조 웰을 설정한다. 밤새 인큐베이션(37℃/5% CO2)한다. 실험 2일차, 발색을 검출하고, 반응 종료 후 마이크로플레이트 리더(바이오텍)를 사용하여 490 nm에서의 흡광도 값을 기록한다.
실험 결과는 도 17에 나타낸 바와 같이, 양성 표적 세포주에 대해, 본 발명의 TCR이 형질주입된 이펙터 세포는 이에 대해 아주 강한 사멸 작용을 갖고 있지만, 음성 표적 세포주에 대해 사멸 작용이 없다. 또한, 기타 TCR이 형질주입된 이펙터 세포는 표적 세포에 대해 사멸 작용이 거의 없다.
본 발명에서 언급된 모든 문헌은, 각 문헌이 단독으로 인용되어 참조로 사용되는 것과 같이, 모두 참조로서 본 출원에 포함된다. 또한, 본 발명의 상기 교시 내용을 읽은 후, 당업자는 본 발명에 대해 여러 가지 변경 또는 수정을 가할 수 있고, 이러한 등가 형태도 역시 본 발명에 첨부된 특허청구범위에 의해 한정된 범위에 속한다는 것을 이해해야 한다.
<110> XLIFESC, LTD. <120> T CELL RECEPTOR RECOGNISING KRAS MUTATION AND ENCODING SEQUENCE THEREOF <130> P2020-2018 <150> CN2019109605233 <151> 2019-10-10 <160> 39 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide <400> 1 Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Val Ser Gln Ser 20 25 30 Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met 35 40 45 Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln 50 55 60 Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Ser Leu Lys Gly Asn Asn 85 90 95 Asp Met Arg Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Thr Val Lys Pro 100 105 110 <210> 2 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide <400> 2 cagaaggagg tggagcagaa ttctggaccc ctcagtgttc cagagggagc cattgcctct 60 ctcaactgca cttacagtga ccgagtttcc cagtccttct tctggtacag 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Phe Arg Ile Leu Leu Leu 245 250 255 Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 260 265 270 <210> 23 <211> 816 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide <400> 23 atgaaatcct tgagagtttt actagtgatc ctgtggcttc agttgagctg ggtttggagc 60 caacagaagg aggtggagca gaattctgga cccctcagtg ttccagaggg agccattgcc 120 tctctcaact gcacttacag tgaccgagtt tcccagtcct tcttctggta cagacaatat 180 tctgggaaaa gccctgagtt gataatgtcc atatactcca atggtgacaa agaagatgga 240 aggtttacag cacagctcaa taaagccagc cagtatgttt ctctgctcat cagagactcc 300 cagcccagtg attcagccac ctacctctgt gcctccctca agggtaacaa tgacatgcgc 360 tttggagcag ggaccagact gacagtaaaa ccaaatatcc agaaccctga ccctgccgtg 420 taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat 480 tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaaactgtg 540 ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct 600 gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc 660 agcccagaaa gttcctgtga tgtcaagctg gtcgagaaaa gctttgaaac agatacgaac 720 ctaaactttc aaaacctgtc agtgattggg ttccgaatcc tcctcctgaa agtggccggg 780 tttaatctgc tcatgacgct gcggctgtgg tccagc 816 <210> 24 <211> 311 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide <400> 24 Met Gly Thr Arg Leu Leu Cys Trp Val Val Leu Gly Phe Leu Gly Thr 1 5 10 15 Asp His Thr Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Val Ala 20 25 30 Lys Arg Gly Gln Asp Val Ala Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His 35 40 45 Val Ser Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe 50 55 60 Leu Thr Tyr Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ser Gly Leu Pro 65 70 75 80 Ser Asp Arg Phe Phe Ala Glu Arg Pro Glu Gly Ser Val Ser Thr Leu 85 90 95 Lys Ile Gln Arg Thr Gln Gln Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala 100 105 110 Ser Ser Ser Ser Arg Trp Glu Gln Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 130 135 140 Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr 145 150 155 160 Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 165 170 175 Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro 180 185 190 Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu 195 200 205 Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn 210 215 220 His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 225 230 235 240 Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu 245 250 255 Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln 260 265 270 Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala 275 280 285 Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val 290 295 300 Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly 305 310 <210> 25 <211> 933 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide <400> 25 atgggcacca ggctcctctg ctgggtggtc ctgggtttcc tagggacaga tcacacaggt 60 gctggagtct cccagtcccc taggtacaaa gtcgcaaaga gaggacagga tgtagctctc 120 aggtgtgatc caatttcggg tcatgtatcc cttttttggt accaacaggc cctggggcag 180 gggccagagt ttctgactta tttccagaat gaagctcaac tagacaaatc ggggctgccc 240 agtgatcgct tctttgcaga aaggcctgag ggatccgtct ccactctgaa gatccagcgc 300 acacagcagg aggactccgc cgtgtatctc tgtgccagca gctccagtag gtgggagcag 360 cagttcttcg ggccagggac acggctcacc gtgctagagg acctgaaaaa cgtgttccca 420 cccgaggtcg ctgtgtttga gccatcagaa gcagagatct cccacaccca aaaggccaca 480 ctggtgtgcc tggccacagg cttctacccc gaccacgtgg agctgagctg gtgggtgaat 540 gggaaggagg tgcacagtgg ggtcagcaca gacccgcagc ccctcaagga gcagcccgcc 600 ctcaatgact ccagatactg cctgagcagc cgcctgaggg tctcggccac cttctggcag 660 aacccccgca accacttccg ctgtcaagtc cagttctacg ggctctcgga gaatgacgag 720 tggacccagg atagggccaa acctgtcacc cagatcgtca gcgccgaggc ctggggtaga 780 gcagactgtg gcttcacctc cgagtcttac cagcaagggg tcctgtctgc caccatcctc 840 tatgagatct tgctagggaa ggccaccttg tatgccgtgc tggtcagtgc cctcgtgctg 900 atggccatgg tcaagagaaa ggattccaga ggc 933 <210> 26 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide <400> 26 Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu 1 5 10 15 Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Val Ser Gln 20 25 30 Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile 35 40 45 Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala 50 55 60 Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser 65 70 75 80 Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Ser Leu Lys Gly Asn 85 90 95 Asn Asp Met Arg Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Thr Val Lys Pro Asn 100 105 110 Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser 115 120 125 Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn 130 135 140 Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val 145 150 155 160 Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp 165 170 175 Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile 180 185 190 Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 27 <211> 618 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide <400> 27 atgcagaaag aagtggaaca gaattctgga cccctcagtg ttccagaggg agccattgcc 60 tctctcaact gcacttacag tgaccgagtt tcccagtcct tcttctggta cagacaatat 120 tctgggaaaa gccctgagtt gataatgtcc atatactcca atggtgacaa agaagatgga 180 aggtttacag cacagctcaa taaagccagc cagtatgttt ctctgctcat cagagactcc 240 cagcccagtg attcagccac ctacctctgt gcctccctca agggtaacaa tgacatgcgc 300 tttggagcag ggaccagact gacagtaaaa ccaaatatcc agaaccctga ccctgccgtg 360 taccagctga gagactctaa gtcgagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat 420 tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaatgtgtg 480 ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct 540 gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc 600 agcccagaaa gttcctaa 618 <210> 28 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide <400> 28 Met Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Val Ala Lys Arg 1 5 10 15 Gly Gln Asp Val Ala Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His Val Ser 20 25 30 Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr 35 40 45 Tyr Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ser Gly Leu Pro Ser Asp 50 55 60 Arg Phe Phe Ala Glu Arg Pro Glu Gly Ser Val Ser Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Gln Arg Thr Gln Gln Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser Ser 85 90 95 Ser Ser Arg Trp Glu Gln Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr 100 105 110 Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe 115 120 125 Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val 130 135 140 Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp 145 150 155 160 Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro 165 170 175 Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser 180 185 190 Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His Phe 195 200 205 Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr 210 215 220 Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp 225 230 235 240 Gly Arg Ala Asp <210> 29 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide <400> 29 atgggtgcag gtgttagcca gtcccctagg tacaaagtcg caaagagagg acaggatgta 60 gctctcaggt gtgatccaat ttcgggtcat gtatcccttt tttggtacca acaggccctg 120 gggcaggggc cagagtttct gacttatttc cagaatgaag ctcaactaga caaatcgggg 180 ctgcccagtg atcgcttctt tgcagaaagg cctgagggat ccgtctccac tctgaagatc 240 cagcgcacac agcaggagga ctccgccgtg tatctctgtg ccagcagctc cagtaggtgg 300 gagcagcagt tcttcgggcc agggacacgg ctcaccgtgc tagaggacct gaaaaacgtg 360 ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420 gccacactgg tgtgcctggc caccggtttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg 480 gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc tgcacagacc cgcagcccct caaggagcag 540 cccgccctca atgactccag atacgctctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600 tggcaggacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660 gacgagtgga cccaggatag ggccaaaccc gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720 ggtagagcag actaa 735 <210> 30 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide <400> 30 Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Val Ser Ile Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Val Ser Gln Ser 20 25 30 Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met 35 40 45 Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln 50 55 60 Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Glu Ile Arg Asp Val Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Ser Leu Lys Gly Asn Asn 85 90 95 Asp Met Arg Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Thr Val Lys Pro Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Glu Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr 130 135 140 Leu Ser Val Lys Arg Gly Gln Asp Val Thr Leu Arg Cys Asp Pro Ile 145 150 155 160 Ser Gly His Val Ser Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Ala Pro Gly Gln Gly 165 170 175 Pro Glu Phe Leu Thr Tyr Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ser 180 185 190 Gly Leu Pro Ser Asp Arg Phe Asn Ala Glu Arg Pro Glu Gly Ser Val 195 200 205 Ser Thr Leu Lys Ile Gln Arg Val Gln Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr 210 215 220 Leu Cys Ala Ser Ser Ser Ser Arg Trp Glu Gln Gln Phe Phe Gly Pro 225 230 235 240 Gly Thr Arg Leu Thr Val Asp 245 <210> 31 <211> 741 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide <400> 31 cagaaagagg tggaacaaaa cagcggtccg ctgagcgtgc cggagggtga aaacgttagc 60 atcaactgca cctacagcga ccgtgttagc cagagcttct tttggtaccg tcaatatagc 120 ggtaaaagcc cggagctgat catgagcatt tatagcaacg gtgacaagga agatggccgt 180 ttcaccgcgc agctgaacaa agcgagccaa tacgtgagcc tggagattcg tgacgttcag 240 ccgagcgata gcgcgaccta tctgtgcgcg agcctgaagg gtaacaacga tatgcgtttt 300 ggtgcgggca cccgtctgac cgtgaaaccg ggtggcggta gcgagggcgg tggcagcgaa 360 ggtggcggta gcgagggcgg tggcagcgaa ggtggcaccg gtggcgcggg tgtgagccag 420 agcccgcgtt acctgagcgt gaagcgtggt caagacgtta ccctgcgttg cgatccgatc 480 agcggccacg ttagcctgtt ctggtatcag caagcgccgg gtcagggtcc ggagttcctg 540 acctattttc agaacgaagc gcaactggac aagagcggtc tgccgagcga tcgttttaac 600 gcggagcgtc cggaaggcag cgtgagcacc ctgaaaattc agcgtgtgca accggaggac 660 agcgcggttt atctgtgcgc gagcagcagc agccgttggg aacagcaatt ctttggtccg 720 ggtacccgcc tgaccgttga t 741 <210> 32 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide <400> 32 Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Val Ser Ile Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Val Ser Gln Ser 20 25 30 Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met 35 40 45 Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln 50 55 60 Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Glu Ile Arg Asp Val Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Ser Leu Lys Gly Asn Asn 85 90 95 Asp Met Arg Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Thr Val Lys Pro 100 105 110 <210> 33 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide <400> 33 cagaaagagg tggaacaaaa cagcggtccg ctgagcgtgc cggagggtga aaacgttagc 60 atcaactgca cctacagcga ccgtgttagc cagagcttct tttggtaccg tcaatatagc 120 ggtaaaagcc cggagctgat catgagcatt tatagcaacg gtgacaagga agatggccgt 180 ttcaccgcgc agctgaacaa agcgagccaa tacgtgagcc tggagattcg tgacgttcag 240 ccgagcgata gcgcgaccta tctgtgcgcg agcctgaagg gtaacaacga tatgcgtttt 300 ggtgcgggca cccgtctgac cgtgaaaccg 330 <210> 34 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide <400> 34 Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr Leu Ser Val Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asp Val Thr Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His Val Ser Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Gln Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ser Gly Leu Pro Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Asn Ala Glu Arg Pro Glu Gly Ser Val Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Arg Val Gln Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Ser 85 90 95 Ser Arg Trp Glu Gln Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val 100 105 110 Asp <210> 35 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide <400> 35 ggcgcgggtg tgagccagag cccgcgttac ctgagcgtga agcgtggtca agacgttacc 60 ctgcgttgcg atccgatcag cggccacgtt agcctgttct ggtatcagca agcgccgggt 120 cagggtccgg agttcctgac ctattttcag aacgaagcgc aactggacaa gagcggtctg 180 ccgagcgatc gttttaacgc ggagcgtccg gaaggcagcg tgagcaccct gaaaattcag 240 cgtgtgcaac cggaggacag cgcggtttat ctgtgcgcga gcagcagcag ccgttgggaa 300 cagcaattct ttggtccggg tacccgcctg accgttgat 339 <210> 36 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide <400> 36 Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Glu Gly Gly Thr Gly 20 <210> 37 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide <400> 37 ggtggcggta gcgagggcgg tggcagcgaa ggtggcggta gcgagggcgg tggcagcgaa 60 ggtggcaccg gt 72 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide <400> 38 Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys 1 5 10 <210> 39 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide <400> 39 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr 20

Claims (35)

  1. VVGAVGVGK-HLA A1101 복합물과 특이적으로 결합할 수 있고, TCR은 TCRα사슬 가변 도메인 및 TCRβ사슬 가변 도메인을 포함하고, 상기 TCRα사슬 가변 도메인의 CDR3의 아미노산 서열은 ASLKGNNDMR(서열번호 12)이고; 및/또는 상기 TCRβ사슬 가변 도메인의 CDR3의 아미노산 서열은 ASSSSRWEQQF(서열번호: 15)인 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR).
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 TCRα사슬 가변 도메인의 3개의 상보성 결정영역(CDR)은:
    α CDR1-DRVSQS (서열번호 10)
    α CDR2-IYSNGD (서열번호 11)
    α CDR3-ASLKGNNDMR (서열번호 12)이고; 및/또는
    상기 TCRβ사슬 가변 도메인의 3개의 상보성 결정영역(CDR)은:
    β CDR1- SGHVS (서열번호 13)
    β CDR2- FQNEAQ (서열번호 14)
    β CDR3- ASSSSRWEQQF (서열번호 15)인 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR).
  3. 제 1 항에 있어서,
    TCRα사슬 가변 도메인 및 TCRβ사슬 가변 도메인을 포함하고, 상기 TCRα사슬 가변 도메인은 서열번호 1과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열이고; 및/또는 상기 TCRβ사슬 가변 도메인은 서열번호 5와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR).
  4. 제 1 항에 있어서,
    또한, VVVGAVGVGK-HLA A1101 복합물과 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR)
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 TCR은 α사슬 가변 도메인 아미노산 서열인 서열번호 1을 포함하는 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR).
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 TCR은 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열인 서열번호 5를 포함하는 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR).
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 TCR은 TCRα사슬의 불변영역 TRAC*01 및 TCRβ사슬의 불변영역 TRBC1*01 또는 TRBC2*01을 포함하는 αβ 이종이량체인 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR).
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 TCR의 α사슬의 아미노산 서열은 서열번호 3이고, 및/또는 상기 TCR의 β사슬의 아미노산 서열은 서열번호 7인 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR).
  9. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR은 가용성을 갖는 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR).
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 TCR은 단일 사슬인 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR).
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 TCR은 펩타이드 링커 서열을 통해 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인을 연결함으로써 형성된 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR).
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 TCR은 α사슬 가변영역 아미노산의 11, 13, 19, 21, 53, 76, 89, 91 또는 94번 위치, 및/또는 α사슬 J 유전자 단쇄 펩타이드 아미노산의 끝으로부터 3번 위치, 끝으로부터 5번 위치 또는 끝으로부터 7번 위치에 1개 또는 여러 개의 돌연변이를 구비하고; 및/또는 상기 TCR은 β사슬 가변영역 아미노산의 11, 13, 19, 21, 53, 76, 89, 91 또는 94번 위치, 및/또는 β사슬 J 유전자 단쇄 펩타이드 아미노산의 끝으로부터 2번 위치, 끝으로부터 4번 위치 또는 끝으로부터 6번 위치에 1개 또는 여러 개의 돌연변이를 구비하며, 여기서 아미노산 위치 번호는 IMGT(국제면역유전학 정보시스템)에 나열된 번호와 같은 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR).
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 TCR의 α사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 서열번호 32를 포함하고, 및/또는 상기 TCR의 β사슬 가변 도메인 아미노산 서열은 서열번호 34를 포함하는 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR).
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 TCR의 아미노산 서열은 서열번호 30인 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR).
  15. 제 9 항에 있어서,
    상기 TCR은 (a) 막횡단 도메인(transmembrane domain)을 제외한 TCR α사슬의 전부 또는 일부; 및 (b) 막횡단 도메인을 제외한 TCR β사슬의 전부 또는 일부를 포함하고;
    또한 (a) 및 (b) 각각은 기능성 가변 도메인을 포함하고, 또는, 기능성 가변 도메인을 포함하고 상기 TCR사슬 불변 도메인의 적어도 일부분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR).
  16. 제 15 항에 있어서,
    시스테인 잔기(cysteine residue)는 상기 TCR의 α와 β사슬의 불변 도메인 사이에 인공 이황화 결합(disulfide bond)을 형성하는 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR).
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 TCR에서 인공 이황화 결합을 형성한 시스테인 잔기는 아래 그룹에서 선택된 하나의 그룹 또는 여러 개의 그룹의 위치를 치환하는 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR):
    TRAC*01 엑손 1의 Thr48 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Ser57;
    TRAC*01 엑손 1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Ser77;
    TRAC*01 엑손 1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Ser17;
    TRAC*01 엑손 1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Asp59;
    TRAC*01 엑손 1의 Ser15 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Glu15;
    TRAC*01 엑손 1의 Arg53 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Ser54;
    TRAC*01 엑손 1의 Pro89 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Ala19; 및
    TRAC*01 엑손 1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Glu20.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 TCR의 α사슬 아미노산 서열은 서열번호 26이고, 및/또는 상기 TCR의 β사슬 아미노산 서열은 서열번호 28인 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR).
  19. 제 15 항에 있어서,
    상기 TCR의 α사슬 가변영역과 β사슬 불변영역 사이에 인공사슬간 이황화 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR).
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 TCR에서 인공사슬간 이황화 결합을 형성한 시스테인 잔기는 아래 그룹에서 선택된 하나의 그룹 또는 여러 개의 그룹의 위치를 치환하는 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR):
    TRAV의 46번 위치 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 60번 위치 아미노산;
    TRAV의 47번 위치 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 61번 위치 아미노산;
    TRAV의 46번 위치 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 61번 위치 아미노산; 또는
    TRAV의 47번 위치 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 60번 위치 아미노산.
  21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서,
    상기 TCR은 α사슬 가변 도메인과 β사슬 가변 도메인 및 막횡단 도메인을 제외한 β사슬 불변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하지만, α사슬 불변 도메인을 포함하지 않고, 상기 TCR의 α사슬 가변 도메인과 β사슬은 이종이량체를 형성하는 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR).
  22. 제 1 항에 있어서,
    상기 TCR의 α사슬 및/또는 β사슬의 C- 또는 N-말단에 접합체가 결합되는 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR).
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체와 결합하는 접합체는 검출가능한 표기물(marker), 치료제, PK 변형 모이어티(modified moiety) 또는 임의의 이러한 물질의 조합이고; 바람직하게는, 상기 치료제는 항-CD3 항체인 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체(TCR).
  24. 적어도 2개의 TCR 분자를 포함하고, 또한 여기서, 적어도 1개의 TCR 분자는 상기 청구항 중 어느 한 항에 따른 TCR인 것을 특징으로 하는 다가 TCR 복합물.
  25. 상기 청구항 중 어느 한 항에 따른 TCR 분자를 코딩하는 핵산 서열 또는 그의 상보적 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  26. 제 25 항에 있어서,
    TCRα사슬 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(nucleotide sequence)인 서열번호 2 또는 서열번호 33을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서,
    TCRβ사슬 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 서열번호 6 또는 서열번호 35을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  28. 제 25 항에 있어서,
    TCRα사슬을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 서열번호 4를 포함하고, 및/또는 TCRβ사슬을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 서열번호 8을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  29. 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 함유하며; 바람직하게는, 바이러스 벡터이고; 보다 바람직하게는, 렌티바이러스인 것을 특징으로 하는 벡터.
  30. 제 29 항에 따른 벡터를 포함하거나, 염색체에 외인성(exogenous)의 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자가 통합된 것을 특징으로 하는 단리된 숙주 세포.
  31. 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자 또는 제 29 항에 따른 벡터가 형질도입되고; 바람직하게는, T 세포 또는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  32. 약학적으로 허용 가능한 벡터 및 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 TCR, 제 24 항에 따른 TCR 복합물, 또는 제 31 항에 따른 세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  33. 종양 또는 자가면역 질병을 치료하기 위한 약물을 제조하는데 사용되는 것을 특징으로 하는, 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 수용체(TCR), 또는 제 24 항에 따른 TCR 복합물, 또는 제 31 항에 따른 세포의 용도.
  34. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 수용체(TCR), 또는 제 24 항에 따른 TCR 복합물, 또는 제 31 항에 따른 세포를 이용하는, 종양 또는 자가면역 질병을 치료하기 위한 약물.
  35. 질병을 치료하는 방법에 있어서,
    제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 TCR, 제 24 항에 따른 TCR 복합물, 제 31 항에 따른 세포 또는 제 32 항에 따른 약학적 조성물을 적절한 양으로 치료가 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하고;
    바람직하게는, 상기 질병은 종양이고, 보다 바람직하게는 상기 종양은 폐암, 결직장암, 췌장암 또는 위암인 것을 특징으로 하는 질병을 치료하는 방법.
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