TW202115109A - 一種識別kras突變的t細胞受體及其編碼序列 - Google Patents
一種識別kras突變的t細胞受體及其編碼序列 Download PDFInfo
- Publication number
- TW202115109A TW202115109A TW109135145A TW109135145A TW202115109A TW 202115109 A TW202115109 A TW 202115109A TW 109135145 A TW109135145 A TW 109135145A TW 109135145 A TW109135145 A TW 109135145A TW 202115109 A TW202115109 A TW 202115109A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- tcr
- chain
- seq
- amino acid
- variable domain
- Prior art date
Links
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 title claims abstract description 318
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 title claims abstract description 311
- 206010069755 K-ras gene mutation Diseases 0.000 title 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 130
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 47
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 34
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 91
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 61
- 101000662902 Homo sapiens T cell receptor beta constant 2 Proteins 0.000 claims description 50
- 102100037298 T cell receptor beta constant 2 Human genes 0.000 claims description 50
- 101000662909 Homo sapiens T cell receptor beta constant 1 Proteins 0.000 claims description 49
- 102100037272 T cell receptor beta constant 1 Human genes 0.000 claims description 49
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 48
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 48
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 48
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 32
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 18
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 16
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 claims description 8
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 7
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 101150008942 J gene Proteins 0.000 claims description 6
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 6
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 claims description 6
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 6
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 2
- -1 peptidyl amino acid Chemical class 0.000 claims description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 42
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 42
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 41
- 102200006531 rs121913529 Human genes 0.000 abstract description 40
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 43
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 23
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 20
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 13
- 101000584612 Homo sapiens GTPase KRas Proteins 0.000 description 12
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 12
- 102100030708 GTPase KRas Human genes 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 9
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 4
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 4
- 102200006539 rs121913529 Human genes 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- 101150105104 Kras gene Proteins 0.000 description 3
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 3
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 3
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 3
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 2
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004960 NAD(P)H dehydrogenase (quinone) Human genes 0.000 description 2
- 108020000284 NAD(P)H dehydrogenase (quinone) Proteins 0.000 description 2
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 101710130607 Valacyclovir hydrolase Proteins 0.000 description 2
- 102100025139 Valacyclovir hydrolase Human genes 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical compound CCSSCCN OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940099500 cystamine Drugs 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 2
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 101100172874 Caenorhabditis elegans sec-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 241000218691 Cupressaceae Species 0.000 description 1
- 235000000638 D-biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011665 D-biotin Substances 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000713862 Moloney murine sarcoma virus Species 0.000 description 1
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101150040459 RAS gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000703392 Tribec virus Species 0.000 description 1
- VYTBPJNGNGMRFH-UHFFFAOYSA-N acetic acid;azane Chemical compound N.N.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O VYTBPJNGNGMRFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000010580 coupled enzyme reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000011034 membrane dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002073 nanorod Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 108700042226 ras Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000010223 real-time analysis Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464454—Enzymes
- A61K39/464464—GTPases, e.g. Ras or Rho
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本發明提供了一種能夠專一性結合KRASG12V突變(KRAS G12V)抗原的T細胞受體(TCR),突變抗原短鏈胜肽為VVGAVGVGK可與HLA A1101形成複合物,本發明TCR專一性結合上述複合物。本發明還提供了編碼所述TCR的核酸分子以及包含所述核酸分子的載體。另外,本發明還提供了轉導本發明TCR的細胞。
Description
本發明涉及能夠辨識源自KRAS G12V抗原短鏈胜肽的TCR及其編碼序列,本發明還涉及轉導上述TCR來獲得的KRAS G12V專一性的T細胞,及他們在預防和治療KRAS G12V相關疾病中的用途。
KRAS基因(p21基因),是一種鼠類肉瘤病毒癌基因,長約35 kb,位於12號染色體,是ras基因家族成員之一,編碼KRAS蛋白。KRAS基因分為野生型或突變型。正常狀態下,即野生型的KRAS能控制調控細胞生長的路徑。而其一旦發生突變,則會持續刺激細胞生長,導致腫瘤的發生。KRAS基因常見的突變位址位於KRAS基因2號外顯子的12號和13號的密碼子上,其中G12V為7個常見突變位址之一(Chin J Lab Med. November 2012, Vol.35, No.11)。KRAS突變體(mKRAS)編碼的KRAS蛋白將處於持續活化的狀態,進而細胞增殖失控,導致腫瘤的形成。研究表明,KRAS-G12V與多種人類惡性腫瘤有關,包括但不限於,肺癌、結直腸癌[Tumour Biol. 2016 May; 37(5): 6823-30]、胰腺癌、胃癌[J Cancer 2019; 10(4): 821-828]等,並且攜帶KRAS-G12V突變的腫瘤患者生存期最短[Br J Cancer. 2015 Oct 20; 113(8): 1206-1215]。VVGAVGVGK (SEQ ID NO: 9)或VVVGAVGVGK (SEQ ID NO: 38)是衍生自KRAS G12V抗原的短鏈胜肽,是KRAS G12V相關疾病治療的一種標的。
T細胞過繼免疫治療是將對標的細胞抗原具有專一性的反應性T細胞轉入病人體內,使其針對標的細胞發揮作用。T細胞受體(TCR)是T細胞表面的一種膜蛋白,其能夠辨識相應的標的細胞表面的抗原短鏈胜肽。在免疫系統中,透過抗原短鏈胜肽專一性的TCR與短鏈胜肽-主組織相容性複合體(pMHC複合物)的結合引發T細胞與抗原呈現細胞(APC)直接的物理接觸,然後T細胞及APC兩者的其他細胞膜表面分子就發生相互作用,引起一系列後續的細胞訊息傳遞和其他生理反應,從而使得不同抗原專一性的T細胞對其標的細胞發揮免疫效應。因此,本領域技術人員致力於分離出對KRAS G12V抗原突變短鏈胜肽具有專一性的TCR,以及將該TCR轉導T細胞來獲得對KRAS G12V抗原短鏈胜肽具有專一性的T細胞,從而使他們在細胞免疫治療中發揮作用。
本發明的目的在於提供一種識別KRAS G12V抗原短鏈胜肽的T細胞受體。
本發明的第一方面,提供了一種T細胞受體(TCR),所述TCR能夠與VVGAVGVGK-HLA A1101複合物專一性結合。
在另一優選例中,所述TCR包含TCRα鏈可變域和TCRβ鏈可變域,所述TCRα鏈可變域的CDR3的胺基酸序列為ASLKGNNDMR (SEQ ID NO: 12);和/或所述TCRβ鏈可變域的CDR3的胺基酸序列為ASSSSRWEQQF (SEQ ID NO: 15)。
在另一優選例中,所述TCRα鏈可變域的3個互補決定區(CDR)為:
α CDR1- DRVSQS (SEQ ID NO: 10)
α CDR2- IYSNGD (SEQ ID NO: 11)
α CDR3- ASLKGNNDMR (SEQ ID NO: 12);和/或
所述TCRβ鏈可變域的3個互補決定區為:
β CDR1- SGHVS (SEQ ID NO: 13)
β CDR2- FQNEAQ (SEQ ID NO: 14)
β CDR3- ASSSSRWEQQF (SEQ ID NO: 15)。
在另一優選例中,所述TCR還能夠與VVVGAVGVGK-HLA A1101複合物專一性結合。
在另一優選例中,所述TCR包含TCRα鏈可變域和TCRβ鏈可變域,所述TCRα鏈可變域為與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列相同性的胺基酸序列;和/或所述TCRβ鏈可變域為與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列相同性的胺基酸序列。
在另一優選例中,所述TCR包含α鏈可變域胺基酸序列SEQ ID NO: 1。
在另一優選例中,所述TCR包含β鏈可變域胺基酸序列SEQ ID NO: 5。
在另一優選例中,所述TCR為αβ異質二聚體,其包含TCRα鏈恆定區TRAC*01和TCRβ鏈恆定區TRBC1*01或TRBC2*01。
在另一優選例中,所述TCR的α鏈胺基酸序列為SEQ ID NO: 3和/或所述TCR的β鏈胺基酸序列為SEQ ID NO: 7。
在另一優選例中,所述TCR是可溶的。
在另一優選例中,所述TCR為單鏈。
在另一優選例中,所述TCR是由α鏈可變域與β鏈可變域透過胜肽連接序列連接而成。
在另一優選例中,所述TCR在α鏈可變區胺基酸第11、13、19、21、53、76、89、91或第94位,和/或α鏈J基因短鏈胜肽胺基酸倒數第3位、倒數第5位或倒數第7位中具有一個或多個突變;和/或所述TCR在β鏈可變區胺基酸第11、13、19、21、53、76、89、91或第94位,和/或β鏈J基因短鏈胜肽胺基酸倒數第2位、倒數第4位或倒數第6位中具有一個或多個突變,其中胺基酸位置編號按IMGT (國際免疫遺傳學資訊系統)中列出的位置編號。
在另一優選例中,所述TCR的α鏈可變域胺基酸序列包含SEQ ID NO: 32和/或所述TCR的β鏈可變域胺基酸序列包含SEQ ID NO: 34。
在另一優選例中,所述TCR的胺基酸序列為SEQ ID NO: 30。
在另一優選例中,所述TCR包括(a) 除跨膜結構域以外的全部或部分TCRα鏈;以及(b) 除跨膜結構域以外的全部或部分TCRβ鏈;
並且(a)和(b)各自包含功能性可變結構域,或包含功能性可變結構域和所述TCR鏈恆定結構域的至少一部分。
在另一優選例中,半胱胺酸殘基在所述TCR的α和β鏈恆定域之間形成人工二硫鍵。
在另一優選例中,在所述TCR中形成人工二硫鍵的半胱胺酸殘基取代了選自下列的一組或多組位址:
TRAC*01外顯子1的Thr48和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57;
TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser77;
TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser17;
TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Asp59;
TRAC*01外顯子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu15;
TRAC*01外顯子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser54;
TRAC*01外顯子1的 Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ala19;和
TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu20。
在另一優選例中,所述TCR的α鏈胺基酸序列為SEQ ID NO: 26和/或所述TCR的β鏈胺基酸序列為SEQ ID NO: 28。
在另一優選例中,所述TCR的α鏈可變區與β鏈恆定區之間含有人工鏈間二硫鍵。
在另一優選例中,其特徵在於,在所述TCR中形成人工鏈間二硫鍵的半胱胺酸殘基取代了選自下列的一組或多組位址:
TRAV的第46位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位胺基酸;
TRAV的第47位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的61位胺基酸;
TRAV的第46位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位胺基酸;或
TRAV的第47位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位胺基酸。
在另一優選例中,所述TCR包含α鏈可變域和β鏈可變域以及除跨膜結構域以外的全部或部分β鏈恆定域,但其不包含α鏈恆定域,所述TCR的α鏈可變域與β鏈形成異質二聚體。
在另一優選例中,所述TCR的α鏈和/或β鏈的C-或N-末端結合有偶聯物。
在另一優選例中,與所述T細胞受體結合的偶聯物為可偵測標記物、治療劑、PK修飾部分或任何這些物質的組合。優選地,所述治療劑為抗-CD3抗體。
本發明的第二方面,提供了一種多價TCR複合物,其包含至少兩個TCR分子,並且其中的至少一個TCR分子為本發明第一方面所述的TCR。
本發明的第三方面,提供了一種核酸分子,所述核酸分子包含編碼本發明第一方面所述的TCR分子的核酸序列或其互補序列。
在另一優選例中,所述核酸分子包含編碼TCRα鏈可變域的核苷酸序列SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 33。
在另一優選例中,所述的核酸分子包含編碼TCRβ鏈可變域的核苷酸序列SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 35。
在另一優選例中,所述核酸分子包含編碼TCRα鏈的核苷酸序列SEQ ID NO: 4和/或包含編碼TCRβ鏈的核苷酸序列SEQ ID NO: 8。
本發明的第四方面,提供了一種載體,所述的載體含有本發明第三方面所述的核酸分子;優選地,所述的載體為病毒載體;更優選地,所述的載體為慢病毒載體。
本發明的第五方面,提供了一種分離的宿主細胞,所述的宿主細胞中含有本發明第四方面所述的載體或基因組中併入了外源的本發明第三方面所述的核酸分子。
本發明的第六方面,提供了一種細胞,所述細胞轉導本發明第三方面所述的核酸分子或本發明第四方面所述的載體;優選地,所述細胞為T細胞或幹細胞。
本發明的第七方面,提供了一種藥物組成物,所述組成物含有藥學上可接受的載劑以及本發明第一方面所述的TCR、本發明第二方面所述的TCR複合物、本發明第三方面所述的核酸分子、本發明第四方面所述的載體、或本發明第六方面所述的細胞。
本發明的第八方面,提供了本發明第一方面所述的T細胞受體、或本發明第二方面所述的TCR複合物、本發明第三方面所述的核酸分子、本發明第四方面所述的載體、或本發明第六方面所述的細胞的用途,用於製備治療腫瘤或自身免疫疾病的藥物。優選地,所述腫瘤為胰腺癌、結腸癌、直腸癌或肺癌。
本發明的第九方面,提供了本發明第一方面所述的T細胞受體、或本發明第二方面所述的TCR複合物、本發明第三方面所述的核酸分子、本發明第四方面所述的載體、或本發明第六方面所述的細胞用作治療腫瘤或自身免疫疾病的藥物。優選地,所述腫瘤為胰腺癌、結腸癌、直腸癌或肺癌。
本發明的第十方面,提供了一種治療疾病的方法,包括給需要治療的對象施用適量的本發明第一方面所述的T細胞受體、或本發明第二方面所述的TCR複合物、本發明第三方面所述的核酸分子、本發明第四方面所述的載體、或本發明第六方面所述的細胞、或本發明第七方面所述的藥物組成物;
優選地,所述的疾病為腫瘤;更優選地,所述腫瘤為胰腺癌、結腸癌、直腸癌或肺癌。
應理解,在本發明範圍內中,本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合,從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅,在此不再一一累述。
具體實施方式
本發明人經過廣泛而深入的研究,找到了與KRAS G12V抗原短鏈胜肽VVGAVGVGK (SEQ ID NO: 9)或VVVGAVGVGK (SEQ ID NO: 38)能夠專一性結合的TCR,所述抗原短鏈胜肽VVGAVGVGK或VVVGAVGVGK可分別與HLA A1101形成複合物並一起被呈現到細胞表面。本發明還提供了編碼所述TCR的核酸分子以及包含所述核酸分子的載體。另外,本發明還提供了轉導本發明TCR的細胞。術語
MHC分子是免疫球蛋白超家族的蛋白質,可以是Ⅰ類或Ⅱ類MHC分子。因此,其對於抗原的呈現具有專一性,不同的個體有不同的MHC,能呈現一種蛋白抗原中不同的短鏈胜肽到各自的APC細胞表面。人類的MHC通常稱為HLA基因或HLA複合體。
T細胞受體(TCR),是呈現在主組織相容性複合體(MHC)上的專一性抗原胜肽的唯一受體。在免疫系統中,透過抗原專一性的TCR與pMHC複合物的結合引發T細胞與抗原呈現細胞(APC)直接的物理接觸,然後T細胞及APC兩者的其他細胞膜表面分子就發生相互作用,這就引起了一系列後續的細胞訊息傳遞和其他生理反應,從而使得不同抗原專一性的T細胞對其標的細胞發揮免疫反應。
TCR是由α鏈/β鏈或者γ鏈/δ鏈以異質二聚體形式存在的細胞膜表面的醣蛋白。在95%的T細胞中TCR異質二聚體由α和β鏈組成,而5%的T細胞具有由γ和δ鏈組成的TCR。天然αβ異質二聚TCR具有α鏈和β鏈,α鏈和β鏈構成αβ異源二聚TCR的次單元廣義上講,α和β各鏈包含可變區、連接區和恆定區,β鏈通常還在可變區和連接區之間含有短的多變區,但該多變區常視作連接區的一部分。各可變區包含嵌合在框架結構(framework regions)中的3個CDR (互補決定區),CDR1、CDR2和CDR3。CDR區決定了TCR與pMHC複合物的結合,其中CDR3由可變區和連接區重組而成,被稱為超變區。TCR的α和β鏈一般看作各有兩個“結構域”即可變域和恆定域,可變域由連接的可變區和連接區構成。TCR恆定域的序列可以在國際免疫遺傳學信息系統(IMGT)的公開資料庫中找到,如TCR分子α鏈的恆定域序列為“TRAC*01”,TCR分子β鏈的恆定域序列為“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。此外,TCR的α和β鏈還包含跨膜區和胞質區,胞質區很短。
在本發明中,術語“本發明多肽”、“本發明的TCR”、“本發明的T細胞受體”可互換使用。天然鏈間二硫鍵與人工鏈間二硫鍵
在天然TCR的近膜區Cα與Cβ鏈間存在一組二硫鍵,本發明中稱為“天然鏈間二硫鍵”。在本發明中,將人工引入的,位置與天然鏈間二硫鍵的位置不同的鏈間共價二硫鍵稱為“人工鏈間二硫鍵”。
為方便描述二硫鍵的位置,本發明中TRAC*01與TRBC1*01或TRBC2*01胺基酸序列的位置編號按從N端到C端依次的順序進行位置編號,如TRBC1*01或TRBC2*01中,按從N端到C端依次的順序第60個胺基酸為P (脯胺酸),則本發明中可將其描述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Pro60,也可將其表述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位胺基酸,又如TRBC1*01或TRBC2*01中,按從N端到C端依次的順序第61個胺基酸為Q (麩醯胺酸),則本發明中可將其描述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Gln61,也可將其表述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位胺基酸,其他以此類推。本發明中,可變區TRAV與TRBV的胺基酸序列的位置編號,按照IMGT中列出的位置編號。如TRAV中的某個胺基酸,IMGT中列出的位置編號為46,則本發明中將其描述為TRAV第46位胺基酸,其他以此類推。本發明中,其他胺基酸的序列位置編號有特殊說明的,則按特殊說明。發明詳述
TCR分子
在抗原加工過程中,抗原在細胞內被降解,然後透過MHC分子攜帶至細胞表面。T細胞受體能夠辨識抗原呈現細胞表面的胜肽-MHC複合物。因此,本發明的第一方面提供了一種能夠結合VVGAVGVGK-HLA A1101或VVVGAVGVGK-HLA A1101複合物的TCR分子。優選地,所述TCR分子是分離的或純化的。該TCR的α和β鏈各具有3個互補決定區(CDR)。
在本發明的一個優選地實施方式中,所述TCR的α鏈包含具有以下胺基酸序列的CDR:
α CDR1- DRVSQS (SEQ ID NO: 10)
α CDR2- IYSNGD (SEQ ID NO: 11)
α CDR3- ASLKGNNDMR (SEQ ID NO: 12);和/或
所述TCRβ鏈可變域的3個互補決定區為:
β CDR1- SGHVS (SEQ ID NO: 13)
β CDR2- FQNEAQ (SEQ ID NO: 14)
β CDR3- ASSSSRWEQQF (SEQ ID NO: 15)。
可以將上述本發明的CDR區胺基酸序列嵌入到任何適合的框架結構中來製備嵌合TCR。只要框架結構與本發明的TCR的CDR區兼容,本領域技術人員根據本發明公開的CDR區就能夠設計或合成出具有相應功能的TCR分子。因此,本發明TCR分子是指包含上述α和/或β鏈CDR區序列及任何適合的框架結構的TCR分子。本發明TCRα鏈可變域為與SEQ ID NO: 1具有至少90%,優選地95%,更優選地98%序列相同性的胺基酸序列;和/或本發明TCRβ鏈可變域為與SEQ ID NO: 5具有至少90%,優選地95%,更優選地98%序列相同性的胺基酸序列。
在本發明的一個優選例中,本發明的TCR分子是由α與β鏈構成的異質二聚體。具體地,一方面所述異質二聚TCR分子的α鏈包含可變域和恆定域,所述α鏈可變域胺基酸序列包含上述α鏈的CDR1 (SEQ ID NO: 10)、CDR2 (SEQ ID NO: 11)和CDR3 (SEQ ID NO: 12)。優選地,所述TCR分子包含α鏈可變域胺基酸序列SEQ ID NO: 1。更優選地,所述TCR分子的α鏈可變域胺基酸序列為SEQ ID NO: 1。另一方面,所述異質二聚TCR分子的β鏈包含可變域和恆定域,所述β鏈可變域胺基酸序列包含上述β鏈的CDR1 (SEQ ID NO: 13)、CDR2 (SEQ ID NO: 14)和CDR3 (SEQ ID NO: 15)。優選地,所述TCR分子包含β鏈可變域胺基酸序列SEQ ID NO: 5。更優選地,所述TCR分子的β鏈可變域胺基酸序列為SEQ ID NO: 5。
在本發明的一個優選例中,本發明的TCR分子是由α鏈的部分或全部和/或β鏈的部分或全部組成的單鏈TCR分子。有關單鏈TCR分子的描述可以參考文獻Chunget al
(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12654-12658。根據文獻中所述,本領域技術人員能夠容易地建構包含本發明CDRs區的單鏈TCR分子。具體地,所述單鏈TCR分子包含Vα、Vβ和Cβ,優選地按照從N端到C端的順序連接。
所述單鏈TCR分子的α鏈可變域胺基酸序列包含上述α鏈的CDR1 (SEQ ID NO: 10)、CDR2 (SEQ ID NO: 11)和CDR3 (SEQ ID NO: 12)。優選地,所述單鏈TCR分子包含α鏈可變域胺基酸序列SEQ ID NO: 1。更優選地,所述單鏈TCR分子的α鏈可變域胺基酸序列為SEQ ID NO: 1。所述單鏈TCR分子的β鏈可變域胺基酸序列包含上述β鏈的CDR1 (SEQ ID NO: 13)、CDR2 (SEQ ID NO: 14)和CDR3 (SEQ ID NO: 15)。優選地,所述單鏈TCR分子包含β鏈可變域胺基酸序列SEQ ID NO: 5。更優選地,所述單鏈TCR分子的β鏈可變域胺基酸序列為SEQ ID NO: 5。
在本發明的一個優選例中,本發明的TCR分子的恆定域是人的恆定域。本領域技術人員知曉或可以透過查閱相關書籍或IMGT (國際免疫遺傳學資訊系統)的公開資料庫來獲得人的恆定域胺基酸序列。例如,本發明TCR分子α鏈的恆定域序列可以為“TRAC*01”,TCR分子β鏈的恆定域序列可以為“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。IMGT的TRAC*01中給出的胺基酸序列的第53位為Arg,在此表示為:TRAC*01外顯子1的Arg53,其他以此類推。優選地,本發明TCR分子α鏈的胺基酸序列為SEQ ID NO: 3,和/或β鏈的胺基酸序列為SEQ ID NO: 7。
天然存在的TCR是一種膜蛋白,透過其跨膜區得以穩定。如同免疫球蛋白(抗體)作為抗原辨識分子一樣,TCR也可以被開發應用於診斷和治療,這時需要獲得可溶性的TCR分子。可溶性的TCR分子不包括其跨膜區。可溶性TCR有很廣泛的用途,它不僅可用於研究TCR與pMHC的相互作用,也可用作檢測感染的診斷工具或作為自身免疫病的標記物。類似地,可溶性TCR可以被用來將治療劑(如細胞毒素化合物或免疫刺激性化合物)輸送到呈現專一性抗原的細胞,另外,可溶性TCR還可與其他分子(如,抗-CD3抗體)結合來重新定向T細胞,從而使其標靶呈現特定抗原的細胞。本發明也獲得了對KRAS G12V抗原短鏈胜肽具有專一性的可溶性TCR。
為獲得可溶性TCR,一方面,本發明TCR可以是在其α和β鏈恆定域的殘基之間引入人工二硫鍵的TCR。半胱胺酸殘基在所述TCR的α和β鏈恆定域間形成人工鏈間二硫鍵。半胱胺酸殘基可以取代在天然TCR中合適位址的其他胺基酸殘基以形成人工鏈間二硫鍵。例如,取代TRAC*01外顯子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57的半胱胺酸殘基來形成二硫鍵。引入半胱胺酸殘基以形成二硫鍵的其他位址還可以是:TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser77;TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser17;TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Asp59;TRAC*01外顯子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu15;TRAC*01外顯子1的 Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser54;TRAC*01外顯子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ala19;或TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu20。即半胱胺酸殘基取代了上述α與β鏈恆定域中任一組位址。可在本發明TCR恆定域的一個或多個C末端截短最多50個、或最多30個、或最多15個、或最多10個、或最多8個或更少的胺基酸,以使其不包括半胱胺酸殘基來達到缺失天然二硫鍵的目的,也可透過將形成天然二硫鍵的半胱胺酸殘基突變為另一胺基酸來達到上述目的。
如上所述,本發明的TCR可以包含在其α和β鏈恆定域的殘基間引入的人工二硫鍵。應注意,恆定域間含或不含上文所述的引入的人工二硫鍵,本發明的TCR均可含有TRAC恆定域序列和TRBC1或TRBC2恆定域序列。TCR的TRAC恆定域序列和TRBC1或TRBC2恆定域序列可透過存在於TCR中的天然二硫鍵連接。
為獲得可溶性TCR,另一方面,本發明TCR還包括在其疏水核心區域發生突變的TCR,這些疏水核心區域的突變優選為能夠使本發明可溶性TCR的穩定性提高的突變,如在公開號為WO2014/206304的專利文獻中所述。這樣的TCR可在其下列可變域疏水核心位置發生突變:(α和/或β鏈)可變區胺基酸第11、13、19、21、53、76、89、91、94位,和/或α鏈J基因(TRAJ)短鏈胜肽胺基酸位置倒數第3、5、7位,和/或β鏈J基因(TRBJ)短鏈胜肽胺基酸位置倒數第2、4、6位,其中胺基酸序列的位置編號按國際免疫遺傳學信息系統(IMGT)中列出的位置編號。本領域技術人員知曉上述國際免疫遺傳學信息系統,並可根據該資料庫得到不同TCR的胺基酸殘基在IMGT中的位置編號。
本發明中疏水核心區域發生突變的TCR可以是由一柔性肽鏈連接TCR的α與β鏈的可變域而構成的穩定性可溶單鏈TCR。應注意,本發明中柔性肽鏈可以是任何適合連接TCRα與β鏈可變域的肽鏈。如在本發明實施例4中建構的單鏈可溶性TCR,其α鏈可變域胺基酸序列為SEQ ID NO: 32,編碼的核苷酸序列為SEQ ID NO: 33;β鏈可變域胺基酸序列為SEQ ID NO: 34,編碼的核苷酸序列為SEQ ID NO: 35。
另外,對於穩定性而言,專利文獻201680003540.2還公開了在TCR的α鏈可變區與β鏈恆定區之間引入人工鏈間二硫鍵能夠使TCR的穩定性顯著提高。因此,本發明的高親和力TCR的α鏈可變區與β鏈恆定區之間還可以含有人工鏈間二硫鍵。具體地,在所述TCR的α鏈可變區與β鏈恆定區之間形成人工鏈間二硫鍵的半胱胺酸殘基取代了:TRAV的第46位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位胺基酸;TRAV的第47位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的61位胺基酸;TRAV的第46位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位胺基酸;或TRAV的第47位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位胺基酸。優選地,這樣的TCR可以包含(i)除其跨膜結構域以外的全部或部分TCRα鏈,和(ii)除其跨膜結構域以外的全部或部分TCRβ鏈,其中(i)和(ii)均包含TCR鏈的可變域和至少一部分恆定域,α鏈與β鏈形成異質二聚體。更優選地,這樣的TCR可以包含α鏈可變域和β鏈可變域以及除跨膜結構域以外的全部或部分β鏈恆定域,但其不包含α鏈恆定域,所述TCR的α鏈可變域與β鏈形成異質二聚體。
本發明的TCR也可以多價複合體的形式提供。本發明的多價TCR複合體包含兩個、三個、四個或更多個本發明TCR相結合而形成的多聚物,如可以用p53的四聚結構域來產生四聚體,或多個本發明TCR與另一分子結合而形成的複合物。本發明的TCR複合物可用於體外或體內追蹤或標靶呈現特定抗原的細胞,也可用於產生具有此類應用的其他多價TCR複合物的中間物。
本發明的TCR可以單獨使用,也可與偶聯物以共價或其他方式結合,優選以共價方式結合。所述偶聯物包括可偵測標記物(為診斷目的,其中所述TCR用於偵測呈現VVGAVGVGK-HLA A1101或VVVGAVGVGK-HLA A1101複合物的細胞的存在)、治療劑、PK (蛋白激酶)修飾部分或任何以上這些物質的組合結合或偶聯。
用於診斷目的的可偵測標記物包括但不限於:螢光或發光標記物、放射性標記物、MRI (磁共振成像)或CT (電腦X射線斷層掃描技術)造影劑、或能夠產生可偵測產物的酵素。
可與本發明TCR結合或偶聯的治療劑包括但不限於:1.放射性核種[Koppe等,2005,癌轉移評論(Cancer metastasis reviews) 24,539];2.生物毒[Chaudhary等,1989,自然(Nature) 339,394;Epel等,2002,癌症免疫學和免疫治療(Cancer Immunology and Immunotherapy) 51,565];3.細胞激素如IL-2等[Gillies等,1992,美國國家科學院院刊(PNAS) 89,1428;Card等,2004,癌症免疫學和免疫治療(Cancer Immunology and Immunotherapy) 53,345;Halin等,2003,癌症研究(Cancer Research) 63,3202];4.抗體Fc片段[Mosquera等,2005,免疫學雜誌(The Journal Of Immunology) 174,4381];5.抗體scFv片段[Zhu等,1995,癌症國際期刊(International Journal of Cancer) 62, 319];6.金奈米顆粒/奈米棒[Lapotko等,2005,癌症通信(Cancer letters) 239,36;Huang等,2006,美國化學學會雜誌(Journal of the American Chemical Society) 128,2115];7.病毒顆粒[Peng等,2004,基因治療(Gene therapy) 11,1234];8.脂質體[Mamot等,2005,癌症研究(Cancer research) 65,11631];9.奈米磁粒;10.前驅藥活化酶(例如,DT-心肌黃酶(DTD)或聯苯基水解酶-樣蛋白質(BPHL));11.化療劑(例如,順鉑)或任何形式的奈米顆粒等。
另外,本發明的TCR還可以是包含衍生自超過一種物種序列的雜合TCR。例如,有研究顯示鼠科TCR在人T細胞中比人TCR能夠更有效地表現。因此,本發明TCR可包含人可變域和鼠的恆定域。這一方法的缺陷是可能引發免疫反應。因此,在其用於過繼性T細胞治療時應當有調節方案來進行免疫抑制,以允許表現鼠科的T細胞的植入。
應理解,本文中胺基酸名稱採用國際通用的單英文字母或三英文字母表示,胺基酸名稱的單英文字母與三英文字母的對應關係如下:Ala (A)、Arg (R)、Asn (N)、Asp (D)、Cys (C)、Gln (Q)、Glu (E)、Gly (G)、His (H)、Ile (I)、Leu (L)、Lys (K)、Met (M)、Phe (F)、Pro (P)、Ser (S)、Thr (T)、Trp (W)、Tyr (Y)、Val (V)。核酸分子
本發明的第二方面提供了編碼本發明第一方面TCR分子或其部分的核酸分子,所述部分可以是一個或多個CDR,α和/或β鏈的可變域,以及α鏈和/或β鏈。
編碼本發明第一方面TCR分子α鏈CDR區的核苷酸序列如下:
α CDR1- gaccgagtttcccagtcc (SEQ ID NO: 16)
α CDR2- atatactccaatggtgac (SEQ ID NO: 17)
α CDR3- gcctccctcaagggtaacaatgacatgcgc (SEQ ID NO: 18)
編碼本發明第一方面TCR分子β鏈CDR區的核苷酸序列如下:
β CDR1- tcgggtcatgtatcc (SEQ ID NO: 19)
β CDR2- ttccagaatgaagctcaa (SEQ ID NO: 20)
β CDR3- gccagcagctccagtaggtgggagcagcagttc (SEQ ID NO: 21)
因此,編碼本發明TCRα鏈的本發明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18,和/或編碼本發明TCRβ鏈的本發明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 21。
本發明核酸分子的核苷酸序列可以是單鏈或雙鏈的,該核酸分子可以是RNA或DNA,並且可以包含或不包含內含子。優選地,本發明核酸分子的核苷酸序列不包含內含子但能夠編碼本發明多肽,例如編碼本發明TCRα鏈可變域的本發明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO: 2和/或編碼本發明TCRβ鏈可變域的本發明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO: 6。或者,編碼本發明TCRα鏈可變域的本發明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO: 33和/或編碼本發明TCRβ鏈可變域的本發明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO: 35。更優選地,本發明核酸分子的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 4和/或SEQ ID NO: 8。或者,本發明核酸分子的核苷酸序列為SEQ ID NO: 31。
應理解,由於遺傳密碼的簡併,不同的核苷酸序列可以編碼相同的多肽。因此,編碼本發明TCR的核酸序列可以與本發明附圖中所示的核酸序列相同或是簡併的變異體。以本發明中的其中一個例子來說明,“簡併的變異體”是指編碼具有SEQ ID NO: 1的蛋白序列,但與SEQ ID NO: 2的序列有差別的核酸序列。
核苷酸序列可以是經密碼子最適化的。不同的細胞在具體密碼子的利用上是不同的,可以根據細胞的類型,改變序列中的密碼子來增加表現量。哺乳動物細胞以及多種其他生物的密碼子選擇表是本領域技術人員公知的。
本發明的核酸分子全長序列或其片段通常可以用但不限於PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。目前,已經可以完全透過化學合成來得到編碼本發明TCR(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。載體
本發明還涉及包含本發明的核酸分子的載體,包括表現載體,即能夠在體內或體外表現的建構體。常用的載體包括細菌質體、噬菌體和動植物病毒。
病毒遞送系統包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體。
優選地,載體可以將本發明的核苷酸轉移至細胞中,例如T細胞中,使得該細胞表現KRAS G12V抗原專一性的TCR。理想的情況下,該載體應當能夠在T細胞中持續高位準地表現。細胞
本發明還涉及用本發明的載體或編碼序列經基因工程產生的宿主細胞。所述宿主細胞中含有本發明的載體或染色體中併入了本發明的核酸分子。宿主細胞選自:原核細胞和真核細胞,例如大腸桿菌、酵母細胞、CHO細胞等。
另外,本發明還包括表現本發明的TCR的分離的細胞,特別是T細胞。該T細胞可衍生自從受試者分離的T細胞,或者可以是從受試者中分離的混合細胞群,諸如周邊血液淋巴細胞(PBL)群的一部分。如,該細胞可以分離自周邊血液單核細胞(PBMC),可以是CD4+
輔助T細胞或CD8+
細胞毒性T細胞。該細胞可在CD4+
輔助T細胞/CD8+
細胞毒性T細胞的混合群中。一般地,該細胞可以用抗體(如,抗-CD3或抗-CD28的抗體)活化,以便使它們能夠更容易接受轉染,例如用包含編碼本發明TCR分子的核苷酸序列的載體進行轉染。
備選地,本發明的細胞還可以是或衍生自幹細胞,如造血幹細胞(HSC)。將基因轉移至HSC不會導致在細胞表面表現TCR,因為幹細胞表面不表現CD3分子。然而,當幹細胞分化為遷移至胸腺的淋巴前驅物(lymphoid precursor)時,CD3分子的表現將啟動在胸腺細胞的表面表現該引入的TCR分子。
有許多方法適合於用編碼本發明TCR的DNA或RNA進行T細胞轉染[如,Robbins等,(2008) J. Immunol. 180: 6116-6131]。表現本發明TCR的T細胞可以用於過繼免疫治療。本領域技術人員能夠知曉進行過繼性治療的許多合適方法[如,Rosenberg等,(2008) Nat Rev Cancer 8(4): 299-308]。KRAS G12V 抗原相關疾病
本發明還涉及在受試者中治療和/或預防與KRAS G12V相關疾病的方法,其包括過繼性轉移KRAS G12V專一性T細胞至該受試者的步驟。該KRAS G12V專一性T細胞可辨識VVGAVGVGK-HLA A1101或VVVGAVGVGK-HLA A1101複合物。
本發明的KRAS G12V專一性的T細胞可用於治療任何呈現KRAS G12V抗原短鏈胜肽VVGAVGVGK-HLA A1101或VVVGAVGVGK-HLA A1101複合物的KRAS G12V相關疾病,包括但不限於腫瘤,如胰腺癌、肺癌、結腸癌直腸癌等。
未發生突變的即野生型KRAS蛋白的前20個胺基酸序列為MTEYKLVVVG AGGVGKSALT(SEQ ID NO: 39),其第12位胺基酸為G。VVGAGGVGK和VVVGAGGVGK分別對應KRAS蛋白的第8-16位和7-16位,上述相應位置發生G12V突變後即形成短鏈胜肽VVGAVGVGK和VVVGAVGVGK。治療方法
可以透過分離患有與KRAS G12V抗原相關疾病的病人或志願者的T細胞,並將本發明的TCR導入上述T細胞中,隨後將這些基因工程修飾的細胞回輸到病人體內來進行治療。因此,本發明提供了一種治療KRAS G12V相關疾病的方法,包括將分離的表現本發明TCR的T細胞,優選地,該T細胞來源於病人本身,輸入到病人體內。一般地,包括(1)分離病人的T細胞,(2)用本發明核酸分子或能夠編碼本發明TCR分子的核酸分子體外轉導T細胞,(3)將基因工程修飾的T細胞輸入到病人體內。分離、轉染及回輸的細胞的數量可以由醫師決定。本發明的主要優點在於:
(1)本發明的TCR能夠與KRAS G12V抗原短鏈胜肽複合物VVGAVGVGK-HLA A1101或VVVGAVGVGK-HLA A1101結合,同時轉導了本發明TCR的細胞能夠被專一性活化。
(2)轉導本發明TCR的效應細胞對標的細胞有很好的專一性毒殺作用。
下面的具體實施例,進一步闡述本發明。應理解,這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法,通常按照常規條件,例如[Sambrook和Russell等人,分子選殖:實驗室手冊(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第三版)(2001) CSHL出版社]中所述的條件,或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明,否則百分比和份數按重量計算。以下實施例中所用的實驗材料和試劑如無特別說明均可從市售管道獲得。實施例 實施例 1 選殖 KRAS G12V 抗原短鏈胜肽專一性 T 細胞
利用合成短鏈胜肽VVGAVGVGK (SEQ ID NO: 9)(北京賽百盛基因技術有限公司)刺激來自於基因型為HLA-A1101的健康志願者的周邊血液淋巴細胞(PBL)。將短鏈胜肽與帶有生物素標記的HLA-A1101復性,製備pHLA單倍體。這些單倍體與用PE標記的鏈黴親和素(BD公司)組合成PE標記的四聚體,分選該四聚體及抗CD8-APC雙陽性細胞。擴增分選的細胞,並按上述方法進行二次分選,隨後用有限稀釋法進行單選殖。單轉殖株細胞用四聚體染色,篩選到的雙陽性轉殖株如圖3所示。經過層層篩選得到的雙陽性轉殖株,還需要滿足進一步的功能測試。
透過ELISPOT實驗進一步偵測該T細胞轉殖株的功能及專一性。本領域技術人員熟知利用ELISPOT實驗偵測細胞功能的方法。本實施例IFN-γELISPOT實驗中所用的效應細胞為本發明中獲得的T細胞轉殖株,標的細胞為攜載了本發明短鏈胜肽的LCLs細胞,對照組為攜載了其他短鏈胜肽的LCLs細胞及未攜載任何短鏈胜肽的LCLs細胞。
首先準備ELISPOT培養盤,ELISPOT實驗步驟如下:將試驗的各個組分加入ELISPOT培養盤:LCLs細胞2×104
個/孔、T細胞轉殖株2×103
個/孔後,實驗組加入20 μL專一性短鏈胜肽,對照組加入20 μL非專一性短鏈胜肽,空白組加入20 μL培養基(試驗培養基),並設置2複孔。然後恆溫培育過夜(37℃,5% CO2
)。隨後洗滌培養盤並進行二級偵測和顯色,乾燥培養盤1小時,再利用免疫斑點培養盤讀取儀(ELISPOT READER system; AID公司)計數膜上形成的斑點。實驗結果如圖14所示,得到的特定抗原專一性T細胞轉殖株對攜載本發明短鏈胜肽的LCLs細胞有明顯的專一性反應,而對攜載其他無關胜肽及未攜載短鏈胜肽的LCLs細胞基本沒有反應。實施例 2 獲取 KRAS G12V 抗原短鏈胜肽專一性 T 細胞轉殖株的 TCR 基因與載體的建構
用Quick-RNA™ MiniPrep (ZYMO research)萃取實施例1中篩選到的抗原短鏈胜肽專一性、HLA-A1101限制性的T細胞轉殖株的總RNA。cDNA的合成採用clontech的SMART RACE cDNA擴增套組,採用的引子是設計在人類TCR基因的C端保守區。將序列選殖至T載體(TAKARA)上進行定序。應注意,該序列為互補序列,不包含內含子。經定序,該雙陽性轉殖株表現的TCR的α鏈和β鏈序列結構分別如圖1和圖2所示,圖1a、圖1b、圖1c、圖1d、圖1e和圖1f分別為TCRα鏈可變域胺基酸序列、TCRα鏈可變域核苷酸序列、TCRα鏈胺基酸序列、TCRα鏈核苷酸序列、具有前導序列的TCRα鏈胺基酸序列以及具有前導序列的TCRα鏈核苷酸序列;圖2a、圖2b、圖2c、圖2d、圖2e和圖2f分別為TCRβ鏈可變域胺基酸序列、TCRβ鏈可變域核苷酸序列、TCRβ鏈胺基酸序列、TCRβ鏈核苷酸序列、具有前導序列的TCRβ鏈胺基酸序列以及具有前導序列的TCRβ鏈核苷酸序列。
經鑑定,α鏈包含具有以下胺基酸序列的CDR:
α CDR1- DRVSQS (SEQ ID NO: 10)
α CDR2- IYSNGD (SEQ ID NO: 11)
α CDR3- ASLKGNNDMR (SEQ ID NO: 12)
β鏈包含具有以下胺基酸序列的CDR:
β CDR1- SGHVS (SEQ ID NO: 13)
β CDR2- FQNEAQ (SEQ ID NO: 14)
β CDR3- ASSSSRWEQQF (SEQ ID NO: 15)。
透過重疊(overlap) PCR分別將TCRα鏈和β鏈的全長基因選殖至慢病毒表現載體pLenti (addgene)。具體為:用overlap PCR將TCRα鏈和TCRβ鏈的全長基因進行連接得到TCRα-2A-TCRβ片段。將慢病毒表現載體及TCRα-2A-TCRβ限制酶切割連接得到pLenti-TRA-2A-TRB-IRES-NGFR質體。作為對照用,同時也建構表現eGFP的慢病毒載體pLenti-eGFP。之後再用293T/17包裝假病毒。實施例 3 KRAS G12V 抗原短鏈胜肽專一性可溶 TCR 的表現、重折疊和純化
為獲得可溶的TCR分子,本發明的TCR分子的α和β鏈可以分別只包含其可變域及部分恆定域,並且α和β鏈的恆定域中分別引入了一個半胱胺酸殘基以形成人工鏈間二硫鍵,引入半胱胺酸殘基的位置分別為TRAC*01外顯子1的Thr48和TRBC2*01外顯子1的Ser57;其α鏈的胺基酸序列與核苷酸序列分別如圖4a和圖4b所示,其β鏈的胺基酸序列與核苷酸序列分別如圖5a和圖5b所示。透過《分子選殖實驗室手冊》(Molecular Cloning a Laboratory Manual)(第三版,Sambrook和Russell)中描述的標準方法將上述TCRα和β鏈的目標基因序列經合成後分別插入到表現載體pET28a+ (Novagene),上下游的選殖位址分別是NcoI和NotI。插入片段經過定序確認無誤。
將TCR α和β鏈的表現載體分別透過化學轉形法轉形進入表現細菌BL21 (DE3),細菌用LB培養液生長,於OD600
= 0.6時用終濃度0.5 mM IPTG誘導,TCR的α和β鏈表現後形成的包涵體透過BugBuster Mix (Novagene)進行萃取,並且經BugBuster溶液反覆多次洗滌,包涵體最後溶解於6 M鹽酸胍、10 mM二硫蘇糖醇(DTT)、10 mM乙二胺四乙酸(EDTA)、20 mM Tris (pH 8.1)中。
溶解後的TCR α和β鏈以1:1的質量比快速混合於5 M尿素、0.4 M精胺酸、20 mM Tris (pH 8.1)、3.7 mM cystamine、6.6 mM β-mercapoethylamine (4℃)中,終濃度為60 mg/mL。混合後將溶液置於10倍體積的去離子水中透析(4℃),12小時後將去離子水換成緩衝液(20 mM Tris, pH 8.0)繼續於4℃透析12小時。透析完成後的溶液經0.45 μM的濾膜過濾後,透過陰離子交換管柱(HiTrap Q HP, 5mL, GE Healthcare)純化。洗提峰含有復性成功的α和β二聚體的TCR透過SDS-PAGE膠確認。TCR隨後透過凝膠過濾層析(HiPrep 16/60,Sephacryl S-100 HR,GE Healthcare)進一步純化。純化後的TCR純度經過SDS-PAGE測定大於90%,濃度由BCA法確定。本發明得到的可溶性TCR的SDS-PAGE膠體電泳圖如圖6a和圖6b所示。實施例 4 KRAS G12V 抗原短鏈胜肽專一性的可溶性單鏈 TCR 的產生
根據專利文獻WO2014/206304中所述,利用定點突變的方法將實施例2中TCRα與β鏈的可變域建構成了一個以柔性短鏈胜肽(linker)連接的穩定的可溶性單鏈TCR分子。該單鏈TCR分子的胺基酸序列及核苷酸序列分別如圖7a和圖7b所示。其α鏈可變域的胺基酸序列及核苷酸序列分別如圖8a和圖8b所示;其β鏈可變域的胺基酸序列及核苷酸序列分別如圖9a和圖9b所示;其linker序列的胺基酸序列及核苷酸序列分別如圖10a和圖10b所示。
將目標基因經NcoⅠ和NotⅠ雙限制酶切割,與經過NcoⅠ和NotⅠ雙限制酶切割的pET28a載體連接。連接產物轉形至E.coli
DH5α,塗佈含卡那黴素的LB培養盤,37℃倒置培養過夜,挑取陽性轉殖株進行PCR篩選,對陽性交換子進行定序,確定序列正確後萃取重組質體轉形至E.coli
BL21 (DE3),用於表現。實施例 5 KRAS G12V 抗原短鏈胜肽專一性的可溶性單鏈 TCR 的表現、復性和純化
將實施例4中製備的含有重組質體pET28a-模板鏈的BL21 (DE3)菌落全部接種於含有卡那黴素的LB培養基中,37℃培養至OD600為0.6-0.8,加入IPTG至終濃度為0.5 mM,37℃繼續培養4 h。5000 rpm 離心15 min收取細胞沉澱物,用Bugbuster Master Mix (Merck)裂解細胞沉澱物,6000 rpm離心15 min回收包涵體,再用Bugbuster (Merck)進行洗滌以除去細胞碎片和膜組分,6000 rpm 離心15 min,收集包涵體。將包涵體溶解在緩衝液(20 mM Tris-HCl pH 8.0, 8 M尿素)中,高速離心去除不溶物,上清液用BCA法定量後進行分裝,於-80℃保存備用。
向5 mg溶解的單鏈TCR包涵體蛋白中,加入2.5 mL緩衝液(6 M Gua-HCl,50 mM Tris-HCl pH 8.1,100 mM NaCl,10 mM EDTA),再加入DTT至終濃度為10 mM, 37℃處理30 min。用注射器向125 mL復性緩衝液(100 mM Tris-HCl pH 8.1、0.4 M L-精胺酸、5 M尿素、2 mM EDTA、6.5 mM β-mercapthoethylamine、1.87 mM Cystamine)中滴加上述處理後的單鏈TCR,4℃攪拌10 min,然後將復性液裝入截留量為4 kDa的纖維素膜透析袋,透析袋置於1 L 預冷的水中,4℃緩慢攪拌過夜。17小時後,將透析液換成1L 預冷的緩衝液(20 mM Tris-HCl pH 8.0),4℃繼續透析8 h,然後將透析液換成相同的新鮮緩衝液繼續透析過夜。17小時後,樣品經0.45 µm濾膜過濾,真空脫氣後透過陰離子交換管柱(HiTrap Q HP, GE Healthcare),用20 mM Tris-HCl pH 8.0配製的0-1M NaCl線性梯度洗提液純化蛋白,收集的洗提組分進行SDS-PAGE分析,包含單鏈TCR的組分濃縮後進一步用凝膠過濾管柱(Superdex 75 10/300, GE Healthcare)進行純化,目標組分也進行SDS-PAGE分析。
用於BIAcore分析的洗提組分進一步採用凝膠過濾法測試其純度。條件為:層析管柱Agilent Bio SEC-3 (300 A,φ7.8×300 mm),流動相為150 mM磷酸鹽緩衝液,流速0.5 mL/min,柱溫25℃,紫外偵測波長214 nm。
本發明獲得的可溶性單鏈TCR的SDS-PAGE膠體電泳圖如圖11所示。實施例 6 結合特徵
BIAcore分析
本實施例測定了可溶性的本發明TCR分子與VVGAVGVGK-HLA A1101複合物專一性結合的親和力。
使用BIAcore T200實時分析系統偵測實施例3和實施例5中得到的TCR分子與VVGAVGVGK-HLA A1101複合物的結合活性。將抗鏈黴親和素的抗體(GenScript)加入偶聯緩衝液(10 mM醋酸鈉緩衝液,pH 4.77),然後將抗體流過預先用EDC和NHS活化過的CM5晶片,使抗體固定在晶片表面,最後用乙醇胺的鹽酸溶液封阻未反應的活化表面,完成偶聯過程,偶聯位準約為15,000 RU。
使低濃度的鏈黴親和素流過已塗佈抗體的晶片表面,然後將VVGAVGVGK-HLA A1101複合物流過偵測通道,另一通道作為參考通道,再將0.05 mM的生物素以10 µL/min的流速流過晶片2 min,封阻鏈黴親和素剩餘的結合位址。
上述VVGAVGVGK-HLA A1101複合物的製備過程如下:
a.純化
收集100 mL誘導表現重鏈或輕鏈的E. coli菌液,於4℃ 8000 g離心10 min後用10 mL PBS洗滌菌體一次,之後用5 mL BugBuster Master Mix Extraction Reagents (Merck)劇烈震盪重新懸浮菌體,並於室溫旋轉培育20 min,之後於4℃,6000 g離心15 min,棄去上清,收集包涵體。
將上述包涵體重新懸浮於5 mL BugBuster Master Mix中,室溫旋轉培育5 min;加30 mL稀釋10倍的BugBuster,混勻,4℃ 6000 g離心15 min;棄去上清,加30 mL稀釋10倍的BugBuster重新懸浮包涵體,混勻,4℃ 6000 g離心15 min,重複兩次,加30 mL 20 mM Tris-HCl pH 8.0重新懸浮包涵體,混勻,4℃ 6000 g離心15 min,最後用20 mM Tris-HCl 8M尿素溶解包涵體,SDS-PAGE檢測包涵體純度,BCA套組測濃度。
b.復性
將合成的短鏈胜肽VVGAVGVGK (北京賽百盛基因技術有限公司)溶解於DMSO至20 mg/mL的濃度。輕鏈和重鏈的包涵體用8M尿素、20 mM Tris pH 8.0、10 mM DTT來溶解,復性前加入3M鹽酸胍、10 mM醋酸鈉、10 mM EDTA進一步變性。將VVGAVGVGK胜肽以25 mg/L (終濃度)加入復性緩衝液(0.4 M L-精胺酸、100 mM Tris pH 8.3、2 mM EDTA、0.5 mM氧化性麩胱苷肽、5 mM還原型麩胱苷肽、0.2 mM PMSF,冷卻至4℃),然後依次加入20 mg/L的輕鏈和90 mg/L的重鏈(終濃度,重鏈分三次加入,8 h/次),復性在4℃進行至少3天至完成,SDS-PAGE偵測能否復性成功。
c.復性後純化
用10體積的20 mM Tris pH 8.0作透析來更換復性緩衝液,至少更換緩衝液兩次來充分降低溶液的離子強度。透析後用0.45 μm醋酸纖維素濾膜過濾蛋白質溶液,然後加載到HiTrap Q HP (GE通用電氣公司)陰離子交換管柱上(5 mL床體積)。利用Akta純化儀(GE通用電氣公司),20 mM Tris pH 8.0配製的0-400 mM NaCl線性梯度液洗提蛋白,pMHC約在250 mM NaCl處洗提,收集諸峰組分,SDS-PAGE偵測純度。
d.生物素化
用Millipore超濾管將純化的pMHC分子濃縮,同時將緩衝液置換為20 mM Tris pH 8.0,然後加入生物素化試劑0.05 M Bicine pH 8.3、10 mM ATP、10 mM MgOAc、50 μM D-Biotin、100 μg/mL BirA酶(GST-BirA),室溫培育混合物過夜,SDS-PAGE偵測生物素化是否完全。
e.純化生物素化後的複合物
用Millipore超濾管將生物素化標記後的pMHC分子濃縮至1 mL,採用凝膠過濾層析純化生物素化的pMHC,利用Akta純化儀(GE通用電氣公司),用過濾過的PBS預平衡HiPrepTM 16/60 S200 HR管柱(GE通用電氣公司),加載1 mL 濃縮過的生物素化pMHC分子,然後用PBS以1 mL/min流速洗提。生物素化的pMHC分子在約55 mL時作為單峰洗提出現。合併含有蛋白質的組分,用Millipore超濾管濃縮,BCA法(Thermo)測定蛋白質濃度,加入蛋白酶抑制劑cocktail (Roche)將生物素化的pMHC分子分裝保存在-80℃。
利用BIAcore Evaluation軟體計算動力學參數,得到本發明可溶性的TCR分子以及本發明建構的可溶性單鏈TCR分子與VVGAVGVGK-HLA A1101複合物結合的動力學圖譜分別如圖12和圖13所示。圖譜顯示,本發明得到的可溶性TCR分子以及可溶性單鏈TCR分子都能夠與VVGAVGVGK-HLA A1101複合物結合。同時,還利用上述方法檢測了本發明可溶性的TCR分子與其他幾種無關抗原短鏈胜肽與HLA複合物的結合活性,結果顯示本發明TCR分子與其他無關抗原均無結合。實施例 7 轉導本發明 TCR 的 T 細胞的活化實驗 ( 標的細胞為 T2)
本領域技術人員熟知利用ELISPOT實驗檢測細胞功能的方法。利用ELISPOT試驗檢測的IFN-γ產量作為T細胞活化的讀出值,以證明本發明TCR轉導的T細胞對標的細胞專一性的活化反應。
首先準備好試劑,其中包括試驗培養基:10% FBS (Gibco, #16000-044)、RPMI 1640 (Gibco, #C11875500BT);洗滌緩衝液(PBST):0.01M PBS (Gibco, #C10010500BT)/0.05%吐溫20;PVDF ELISPOT 96孔盤(Merck Millipore, #MSIPS4510);人IFN-γ ELISPOT PVDF-酵素套組(BD)裝有所需的所有其他試劑(捕捉和檢測抗體,鏈黴親和素-鹼性磷酸酶和BCIP/NBT溶液)。
本實驗中所用的標的細胞為攜載專一性短鏈胜肽的T2細胞、攜載非專一性短鏈胜肽的T2細胞、不攜載短鏈胜肽的T2細胞。T2細胞轉染了HLA-A1101。其中,專一性短鏈胜肽為VVGAVGVGK (KRAS G12V,9肽)、和VVVGAVGVGK (KRAS G12V,10肽);非專一性短鏈胜肽為VVGAGGVGK (未發生突變的KRAS短鏈胜肽)、VVVGAGGVGK (未發生突變的KRAS短鏈胜肽)、VVGADGVGK (KRAS G12D,第12位為其他突變的KRAS短鏈胜肽)、VVVGADGVGK (KRAS G12D,第12位為其他突變的KRAS短鏈胜肽)和SSCSSCPLSK (其他抗原短鏈胜肽)。
本實驗中所用的效應細胞(T細胞)是表現本發明KRAS G12V抗原短鏈胜肽專一性TCR的CD3+ T細胞,並以同一志願者未轉染本發明TCR的 CD3+ T細胞作為對照組。用抗CD3/CD28塗佈珠(T細胞擴增物,life technologies)刺激T細胞,用攜帶KRAS G12V抗原短鏈胜肽專一性TCR基因的慢病毒轉導,在含有50 IU/mL IL-2和10 ng/mL IL-7的含10% FBS的1640培養基擴增直至轉導後9-12天,然後將這些細胞置於試驗培養基中,300 g常溫離心10分鐘進行洗滌。然後將細胞以2×所需終濃度重新懸浮在試驗培養基中。同樣處理陰性對照效應細胞。然後加入對應短鏈胜肽,使短鏈胜肽在ELISPOT孔盤中的終濃度為10-6
M。
按照生產商提供的說明書,如下所述準備孔盤:以每塊培養盤10毫升無菌PBS按1:200稀釋抗人IFN-γ捕捉抗體,然後將100μ升的稀釋捕捉抗體等分加入各孔。4℃下培育孔盤過夜。培育後,洗滌孔盤以除去多餘的捕捉抗體。加入100μ升/孔含有10% FBS的RPMI 1640培養基,並在室溫下恆溫培育孔盤2小時以封阻孔盤。然後從孔盤中洗去培養基,透過在紙上輕彈和輕拍ELISPOT孔盤以除去任何殘餘的洗滌緩衝液。然後將試驗的諸組分加入ELISPOT孔盤:標的細胞2×104
個/孔、效應細胞1×103
個/孔(按轉染陽性率計算),並設置兩個複孔。
然後恆溫培育孔盤過夜(37℃ /5% CO2
)第二天,棄培養基,用雙蒸水洗滌孔盤2次,再用洗滌緩衝液洗滌3次,在紙巾上輕拍以除去殘餘的洗滌緩衝液。然後用含有10%FBS的PBS按1: 200稀釋偵測抗體,按100 μ升/孔加入各孔。室溫下恆溫培育孔盤2小時,再用洗滌緩衝液洗滌3次,在紙巾上輕拍孔盤以除去過量的洗滌緩衝液。用含有10% FBS的PBS按1: 100稀釋鏈黴親和素-鹼性磷酸酶,將100 μ升稀釋的鏈黴親和素-鹼性磷酸酶加入各孔並在室溫下恆溫培育孔盤1小時。然後用洗滌緩衝液洗滌4次PBS洗滌2次,在紙巾上輕拍孔盤以除去過量的洗滌緩衝液和PBS。洗滌完畢後加入套組提供的BCIP/NBT溶液100 μ升/孔進行顯影。在顯影期間用錫箔紙覆蓋孔盤避光,靜置5-15分鐘。在此期間常規檢測顯影孔盤的斑點,確定終止反應的最佳時間。去除BCIP/NBT溶液並用雙蒸水沖洗孔盤以中止顯影反應,甩乾,然後將孔盤底部去除,在室溫下乾燥孔盤直至每個孔完全乾燥,再利用免疫斑點培養盤讀取儀[CTL,細胞技術有限公司(Cellular Technology Limited)]計數孔盤內底膜形成的斑點。
透過ELISPOT實驗(如上所述)檢驗本發明TCR轉導的T細胞對標的細胞起反應的IFN-γ釋放。利用graphpad prism6繪製各孔中觀察到的ELSPOT斑點數量。
實驗結果如圖15所示,轉導本發明TCR的T細胞(效應細胞)針對攜載KRAS G12V (9肽和10肽)的標的細胞都有很好的活化反應,針對未發生突變的即野生型的KRAS (9肽和10肽)、第12位發生其他突變的KRAS G12D (9肽和10肽)、其他抗原短鏈胜肽以及未攜載的標的細胞都沒有活化反應。說明本發明TCR能夠與KRAS G12V (9肽和10肽)專一性結合,並產生細胞活化反應。實施例 8 轉導本發明 TCR 的 T 細胞的活化實驗 ( 標的細胞為腫瘤細胞株 )
本實施例同樣為驗證轉染本發明高親和力TCR的效應細胞對標的細胞有很好的專一性活化作用。透過ELISPOT實驗檢測本發明高親和力TCR在細胞中的功能及專一性。
本領域技術人員熟知利用ELISPOT實驗檢測細胞功能的方法。所用的效應細胞(T細胞)是轉染本發明KRAS G12V抗原短鏈胜肽專一性TCR的CD3+T細胞,並以同一志願者未轉染本發明TCR的 CD3+T細胞作為對照組。標的細胞株為A562-A11-TMG1 (A11和KRAS G12V過表現)、A562-A11 (A11過表現)、A562-A11-TMG2 (A11和KRAS G12D過表現)、SK-MEL-1、SW620-A11 (A11過表現)和SW620細胞。其中,標的細胞株A562-A11-TMG1和SW620-A11作為陽性腫瘤細胞株;A562-A11、A562-A11-TMG2、SK-MEL-1和SW620為陰性腫瘤細胞株,作為對照。
首先準備ELISPOT培養盤。ELISPOT培養盤乙醇活化塗佈,4℃過夜。實驗第1天,去掉塗佈液,洗滌封阻,室溫下培育兩個小時,去除封阻液,將試驗的各個組分加入ELISPOT培養盤:標的細胞為2×104
個/孔,效應細胞為103
個/孔(按轉染的陽性率計算),並設置二個複孔。恆溫培育過夜(37℃,5% CO2
)。實驗第2天,洗滌培養盤並進行二級偵測和顯色,乾燥培養盤,再利用免疫斑點培養盤讀取儀(ELISPOT READER system; AID20 公司)計數膜上形成的斑點。
實驗結果如圖16所示,針對陽性標的細胞株,轉染本發明TCR的效應細胞產生了很好的專一性活化作用,對陰性標的細胞株沒有反應。另外,針對標的細胞,轉導其他TCR的效應細胞基本沒有產生活化作用。實施例 9. 轉染本 發明 TCR 的效應細胞的 LDH 毒殺功能實驗
本實施例透過非放射性細胞毒性實驗,測定LDH的釋放,從而驗證轉導本發明TCR的細胞的毒殺功能。該試驗是51Cr釋放細胞毒性試驗的比色替代試驗,定量測定細胞裂解後釋放的乳酸脫氫酶(LDH)。採用30分鐘偶聯的酵素反應來偵測釋放在培養基中的LDH,在酵素反應中LDH可使一種四唑鹽(INT)轉化為紅色的甲臢(formazan)。生成的紅色產物的量與裂解的細胞數成正比。可以用標準的96孔盤讀取儀收集490 nm可見光吸光值數據。
本領域技術人員熟知利用LDH的釋放實驗檢測細胞功能的方法。所用的效應細胞(T細胞)是轉染本發明KRASTCR的CD3+ T細胞,並以同一志願者未轉染本發明TCR的CD3+ T細胞作為對照組。標的細胞株為攜載了KRAS G12V (9肽) VVGAVGVGK的T2-A11 (A11過表現)、T2-A11 (A11過表現)、SK-MEL-28、SW620-A11 (A11過表現)、SW620和SW480-A11 (A11過表現)細胞。其中,攜載VVGAVGVGK短鏈胜肽的T2-A11、SW620-A11和SW480-A11為陽性腫瘤細胞株;T2-A11、SK-MEL-28和SW620為陰性腫瘤細胞株,作為對照。
首先準備LDH培養盤。實驗第1天,將試驗的各個組分加入培養盤:標的細胞株3×104
個細胞/孔、效應細胞3×104
個細胞/孔,並設置三個複孔。同時設置效應細胞自發孔,標的細胞自發孔,標的細胞最大孔,體積校正對照孔及培養基背景對照孔。恆溫培育過夜(37℃,5% CO2
)。實驗第2天,偵測顯色,終止反應後用酵素標示讀取儀(Bioteck)在490 nm記錄吸光值。
實驗結果如圖17所示,針對陽性標的細胞株,轉導本發明TCR的效應細胞對其具有很強的毒殺作用,而對陰性標的細胞沒有毒殺作用。另外,轉導其他TCR的效應細胞對標的細胞基本沒有毒殺作用。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考,就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解,在閱讀了本發明的上述講授內容之後,本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改,這些等價形式同樣落於本申請所附申請專利範圍所限定的範圍。
圖1a、圖1b、圖1c、圖1d、圖1e和圖1f分別為TCRα鏈可變域胺基酸序列、TCRα鏈可變域核苷酸序列、TCRα鏈胺基酸序列、TCRα鏈核苷酸序列、具有前導序列的TCRα鏈胺基酸序列以及具有前導序列的TCRα鏈核苷酸序列。
圖2a、圖2b、圖2c、圖2d、圖2e和圖2f分別為TCRβ鏈可變域胺基酸序列、TCRβ鏈可變域核苷酸序列、TCRβ鏈胺基酸序列、TCRβ鏈核苷酸序列、具有前導序列的TCRβ鏈胺基酸序列以及具有前導序列的TCRβ鏈核苷酸序列。
圖3為單轉殖株細胞的CD8+
及四聚體-PE雙陽性染色結果。
圖4a和圖4b分別為可溶性TCRα鏈的胺基酸序列和核苷酸序列。
圖5a和圖5b分別為可溶性TCRβ鏈的胺基酸序列和核苷酸序列。
圖6a和圖6b為純化後得到的可溶性TCR的膠體電泳圖。其中,圖6a和圖6b的右側徑分別為還原膠和非還原膠,左側徑都為分子量標記(marker)。
圖7a和圖7b分別為單鏈TCR的胺基酸序列和核苷酸序列。
圖8a和圖8b分別為單鏈TCRα鏈可變域的胺基酸序列和核苷酸序列。
圖9a和圖9b分別為單鏈TCRβ鏈可變域的胺基酸序列和核苷酸序列。
圖10a和圖10b分別為單鏈TCR連接序列(linker)的胺基酸序列和核苷酸序列。
圖11為純化後得到的可溶性單鏈TCR的膠體電泳圖。左側徑為分子量標記(marker),右側徑為非還原膠。
圖12為本發明可溶性TCR與VVGAVGVGK-HLA A1101複合物結合的BIAcore動力學圖譜。
圖13為本發明可溶性單鏈TCR與VVGAVGVGK-HLA A1101複合物結合的BIAcore動力學圖譜。
圖14為得到的T細胞轉殖株的ELISPOT活化功能驗證結果。
圖15為轉導本發明的TCR的效應細胞的ELISPOT活化功能驗證結果(標的細胞為T2)。
圖16為轉導本發明的TCR的效應細胞的ELISPOT活化功能驗證結果(標的細胞為腫瘤細胞株)。
圖17為轉導本發明的TCR的效應細胞的LDH毒殺功能驗證結果。
Claims (35)
- 一種T細胞受體(TCR),其特徵在於,所述TCR能夠專一性結合VVGAVGVGK-HLA A1101複合物,所述TCR包含TCRα鏈可變域和TCRβ鏈可變域,所述TCRα鏈可變域的CDR3的胺基酸序列為ASLKGNNDMR (SEQ ID NO: 12);和/或所述TCRβ鏈可變域的CDR3的胺基酸序列為ASSSSRWEQQF (SEQ ID NO: 15)。
- 如請求項1所述的TCR,其特徵在於,所述TCRα鏈可變域的3個互補決定區(CDR)為: α CDR1- DRVSQS (SEQ ID NO: 10) α CDR2- IYSNGD (SEQ ID NO: 11) α CDR3- ASLKGNNDMR (SEQ ID NO: 12);和/或 所述TCRβ鏈可變域的3個互補決定區為: β CDR1- SGHVS (SEQ ID NO: 13) β CDR2- FQNEAQ (SEQ ID NO: 14) β CDR3- ASSSSRWEQQF (SEQ ID NO: 15)。
- 如請求項1所述的TCR,其特徵在於,其包含TCRα鏈可變域和TCRβ鏈可變域,所述TCRα鏈可變域為與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列相同性的胺基酸序列;和/或所述TCRβ鏈可變域為與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列相同性的胺基酸序列。
- 如請求項1所述的TCR,其特徵在於,所述TCR還能夠專一性結合VVVGAVGVGK-HLA A1101複合物。
- 如請求項1所述的TCR,其特徵在於,所述TCR包含α鏈可變域胺基酸序列SEQ ID NO: 1。
- 如請求項1所述的TCR,其特徵在於,所述TCR包含β鏈可變域胺基酸序列SEQ ID NO: 5。
- 如請求項1所述的TCR,其特徵在於,所述TCR為αβ異質二聚體,其包含TCRα鏈恆定區TRAC*01和TCRβ鏈恆定區TRBC1*01或TRBC2*01。
- 如請求項7中所述的TCR,其特徵在於,所述TCR的α鏈胺基酸序列為SEQ ID NO: 3和/或所述TCR的β鏈胺基酸序列為SEQ ID NO: 7。
- 如請求項1-6中任一所述的TCR,其特徵在於,所述TCR是可溶的。
- 如請求項9所述的TCR,其特徵在於,所述TCR為單鏈。
- 如請求項10所述的TCR,其特徵在於,所述TCR是由α鏈可變域與β鏈可變域透過胜肽連接序列連接而成。
- 如請求項11所述的TCR,其特徵在於,所述TCR在α鏈可變區胺基酸第11、13、19、21、53、76、89、91、或第94位,和/或α鏈J基因短鏈胜肽胺基酸倒數第3位、倒數第5位或倒數第7位中具有一個或多個突變;和/或所述TCR在β鏈可變區胺基酸第11、13、19、21、53、76、89、91、或第94位,和/或β鏈J基因短鏈胜肽胺基酸倒數第2位、倒數第4位或倒數第6位中具有一個或多個突變,其中胺基酸位置編號按IMGT(國際免疫遺傳學信息系統)中列出的位置編號。
- 如請求項12所述的TCR,其特徵在於,所述TCR的α鏈可變域胺基酸序列包含SEQ ID NO: 32和/或所述TCR的β鏈可變域胺基酸序列包含SEQ ID NO: 34。
- 如請求項13所述的TCR,其特徵在於,所述TCR的胺基酸序列為SEQ ID NO: 30。
- 如請求項9所述的TCR,其特徵在於,所述TCR包括(a)除跨膜結構域以外的全部或部分TCR α鏈;以及(b)除跨膜結構域以外的全部或部分TCRβ鏈; 並且(a)和(b)各自包含功能性可變結構域,或者包含功能性可變結構域,還包含所述TCR鏈恆定結構域的至少一部分。
- 如請求項15所述的TCR,其特徵在於,半胱胺酸殘基在所述TCR的α和β鏈恆定域之間形成人工二硫鍵。
- 如請求項16所述的TCR,其特徵在於,在所述TCR中形成人工二硫鍵的半胱胺酸殘基取代了選自下列的一組或多組位址: TRAC*01外顯子1的Thr48和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57; TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser77; TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser17; TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Asp59; TRAC*01外顯子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu15; TRAC*01外顯子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser54; TRAC*01外顯子1的 Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ala19;和TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu20。
- 如請求項17所述的TCR,其特徵在於,所述TCR的α鏈胺基酸序列為SEQ ID NO:26和/或所述TCR的β鏈胺基酸序列為SEQ ID NO:28。
- 如請求項15所述的TCR,其特徵在於,所述TCR的α鏈可變區與β鏈恆定區之間含有人工鏈間二硫鍵。
- 如請求項19所述的TCR,其特徵在於,在所述TCR中形成人工鏈間二硫鍵的半胱胺酸殘基取代了選自下列的一組或多組位址: TRAV的第46位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位胺基酸; TRAV的第47位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的61位胺基酸; TRAV的第46位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位胺基酸;或TRAV的第47位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位胺基酸。
- 如請求項19或20所述的TCR,其特徵在於,所述TCR包含α鏈可變域和β鏈可變域以及除跨膜結構域以外的全部或部分β鏈恆定域,但其不包含α鏈恆定域,所述TCR的α鏈可變域與β鏈形成異質二聚體。
- 如請求項1所述的TCR,其特徵在於,所述TCR的α鏈和/或β鏈的C-或N-末端結合有偶聯物。
- 如請求項22所述的T細胞受體,其特徵在於,與所述T細胞受體結合的偶聯物為可偵測標記物、治療劑、PK修飾部分或任何這些物質的組合;優選地,所述治療劑為抗-CD3抗體。
- 一種多價TCR複合物,其特徵在於,包含至少兩個TCR分子,並且其中的至少一個TCR分子為上述請求項中任一項所述的TCR。
- 一種核酸分子,其特徵在於,所述核酸分子包含編碼上述任一請求項所述的TCR分子的核酸序列或其互補序列。
- 如請求項25所述的核酸分子,其特徵在於,其包含編碼TCRα鏈可變域的核苷酸序列SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 33。
- 如請求項25或26所述的核酸分子,其特徵在於,其包含編碼TCRβ鏈可變域的核苷酸序列SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 35。
- 如請求項25所述的核酸分子,其特徵在於,其包含編碼TCRα鏈的核苷酸序列SEQ ID NO: 4和/或包含編碼TCRβ鏈的核苷酸序列SEQ ID NO: 8。
- 一種載體,其特徵在於,所述的載體含有請求項25-28中任一所述的核酸分子;優選地,所述的載體為病毒載體;更優選地,所述的載體為慢病毒載體。
- 一種分離的宿主細胞,其特徵在於,所述的宿主細胞中含有請求項29中所述的載體或染色體中併入了外源的請求項25-28中任一所述的核酸分子。
- 一種細胞,其特徵在於,所述細胞中轉導有請求項25-28中任一所述的核酸分子或請求項29中所述載體;優選地,所述細胞為T細胞或幹細胞。
- 一種藥物組成物,其特徵在於,所述組成物含有藥學上可接受的載劑以及請求項1-23中任一項所述的TCR、請求項24中所述的TCR複合物、或請求項31中所述的細胞。
- 請求項1-23中任一項所述的T細胞受體、或請求項24中所述的TCR複合物或請求項31中所述的細胞的用途,其特徵在於,用於製備治療腫瘤或自身免疫疾病的藥物。
- 請求項1-23中任一項所述的T細胞受體、或請求項24中所述的TCR複合物或請求項31中所述的細胞用作治療腫瘤或自身免疫疾病的藥物。
- 一種治療疾病的方法,其特徵在於,包括給需要治療的對象施用適量的請求項1-23中任一所述的TCR、請求項24中所述TCR複合物、請求項31中所述的細胞或請求項32中所述的藥物組成物; 優選地,所述的疾病為腫瘤,更優選地所述腫瘤為肺癌、結直腸癌、胰腺癌或胃癌。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910960523.3 | 2019-10-10 | ||
CN201910960523.3A CN112646024B (zh) | 2019-10-10 | 2019-10-10 | 一种识别kras突变的t细胞受体及其编码序列 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW202115109A true TW202115109A (zh) | 2021-04-16 |
Family
ID=75343499
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW109135145A TW202115109A (zh) | 2019-10-10 | 2020-10-12 | 一種識別kras突變的t細胞受體及其編碼序列 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20230159613A1 (zh) |
EP (1) | EP4043486A4 (zh) |
JP (1) | JP2022551514A (zh) |
KR (1) | KR20220079645A (zh) |
CN (1) | CN112646024B (zh) |
AU (1) | AU2020363138B2 (zh) |
BR (1) | BR112022006943A2 (zh) |
CA (1) | CA3154224A1 (zh) |
TW (1) | TW202115109A (zh) |
WO (1) | WO2021068938A1 (zh) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020154617A1 (en) * | 2019-01-25 | 2020-07-30 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for targeting mutant ras |
KR20230101286A (ko) * | 2021-12-29 | 2023-07-06 | 의료법인 명지의료재단 | K-ras 특이적 활성화 T 세포를 포함하는 폐 선암종의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 이의 제조방법 |
KR20230101287A (ko) * | 2021-12-29 | 2023-07-06 | 의료법인 명지의료재단 | K-ras 특이적 활성화 T 세포를 포함하는 흑색종의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 이의 제조방법 |
KR20230101283A (ko) * | 2021-12-29 | 2023-07-06 | 의료법인 명지의료재단 | K-ras 특이적 활성화 T 세포를 포함하는 폐 유두상 선암종의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 이의 제조방법 |
KR20230101284A (ko) * | 2021-12-29 | 2023-07-06 | 의료법인 명지의료재단 | K-ras 특이적 활성화 T 세포를 포함하는 대장암의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 이의 제조방법 |
KR20230101285A (ko) * | 2021-12-29 | 2023-07-06 | 의료법인 명지의료재단 | K-ras 특이적 활성화 T 세포를 포함하는 유방암의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 이의 제조방법 |
CN114835800B (zh) * | 2022-05-27 | 2023-10-13 | 重庆医科大学 | Tcr或其抗原结合片段及其应用 |
CN114920824B (zh) * | 2022-05-27 | 2023-12-05 | 重庆医科大学 | Tcr或其抗原结合片段及其应用 |
WO2023241522A1 (zh) * | 2022-06-14 | 2023-12-21 | 上海镔铁生物科技有限责任公司 | 靶向kras g12v突变多肽的t细胞受体及其用途 |
CN117430689A (zh) * | 2022-11-04 | 2024-01-23 | 新景智源生物科技(苏州)有限公司 | Kras_g12v突变抗原特异性tcr及其与cd8共表达重定向cd4 t细胞 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB0511124D0 (en) * | 2005-06-01 | 2005-07-06 | Avidex Ltd | High affinity melan-a t cell receptors |
CA2916960C (en) | 2013-06-26 | 2022-12-06 | Guangzhou Xiangxue Pharmaceutical Co. Ltd | High-stability t-cell receptor and preparation method and application thereof |
EP3223850B1 (en) * | 2014-11-26 | 2020-01-08 | The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services | Anti-mutated kras t cell receptors |
CN108395479B (zh) * | 2017-02-06 | 2021-07-16 | 高军 | 一种有关kras基因突变的t细胞受体 |
MA51043A (fr) * | 2017-12-04 | 2020-10-14 | Us Health | Récepteurs de lymphocytes t, limités à l'antigène hla de classe i, ayant une spécificité antigénique pour toute protéine ras mutée |
CN110272482B (zh) * | 2018-03-14 | 2022-08-19 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 识别prame抗原短肽的t细胞受体 |
-
2019
- 2019-10-10 CN CN201910960523.3A patent/CN112646024B/zh active Active
-
2020
- 2020-10-10 AU AU2020363138A patent/AU2020363138B2/en active Active
- 2020-10-10 WO PCT/CN2020/120191 patent/WO2021068938A1/zh unknown
- 2020-10-10 US US17/767,695 patent/US20230159613A1/en active Pending
- 2020-10-10 KR KR1020227015618A patent/KR20220079645A/ko active Search and Examination
- 2020-10-10 JP JP2022521508A patent/JP2022551514A/ja active Pending
- 2020-10-10 EP EP20875414.3A patent/EP4043486A4/en active Pending
- 2020-10-10 CA CA3154224A patent/CA3154224A1/en active Pending
- 2020-10-10 BR BR112022006943A patent/BR112022006943A2/pt unknown
- 2020-10-12 TW TW109135145A patent/TW202115109A/zh unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20230159613A1 (en) | 2023-05-25 |
EP4043486A1 (en) | 2022-08-17 |
AU2020363138B2 (en) | 2024-02-15 |
CN112646024B (zh) | 2023-03-24 |
KR20220079645A (ko) | 2022-06-13 |
EP4043486A4 (en) | 2023-11-15 |
JP2022551514A (ja) | 2022-12-09 |
CN112646024A (zh) | 2021-04-13 |
AU2020363138A1 (en) | 2022-05-05 |
WO2021068938A1 (zh) | 2021-04-15 |
CA3154224A1 (en) | 2021-04-15 |
BR112022006943A2 (pt) | 2022-07-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7452880B2 (ja) | Ssx2抗原を識別するt細胞受容体 | |
WO2021068938A1 (zh) | 一种识别kras突变的t细胞受体及其编码序列 | |
WO2017076308A1 (zh) | 识别ny-eso-1抗原短肽的tcr | |
CN106749620B (zh) | 识别mage-a1抗原短肽的t细胞受体 | |
CN106831978B (zh) | 识别prame抗原的t细胞受体 | |
CN110343167B (zh) | 识别ssx2抗原短肽的t细胞受体 | |
CN110776562B (zh) | 一种识别afp抗原的t细胞受体 | |
WO2021170115A1 (zh) | 一种识别hpv的t细胞受体 | |
JP7429462B2 (ja) | Ssx2抗原の短いペプチドを識別するt細胞受容体 | |
WO2021022447A1 (zh) | 识别afp抗原短肽的t细胞受体 | |
WO2021170116A1 (zh) | 一种识别afp的t细胞受体 | |
WO2021170117A1 (zh) | 一种识别afp抗原短肽的t细胞受体及其编码序列 | |
WO2021139698A1 (zh) | 一种识别hpv抗原的t细胞受体及其编码序列 | |
WO2021139699A1 (zh) | 一种识别afp的t细胞受体及其编码序列 | |
CN109400696B (zh) | 一种识别prame抗原短肽的tcr | |
WO2022262835A1 (zh) | 一种识别afp抗原的tcr及其编码序列 | |
WO2022206861A1 (zh) | 识别afp的t细胞受体 | |
WO2021035446A1 (zh) | 一种识别afp抗原短肽的t细胞受体及其编码序列 | |
CN110272483B (zh) | 识别sage1抗原短肽的t细胞受体 | |
CN110407926B (zh) | 一种识别lmp1抗原短肽的tcr及其编码序列 | |
CN117106059A (zh) | 一种识别mage的t细胞受体及其应用 |