JP2024511418A - 治療用細胞組成物の効力を決定する方法 - Google Patents

治療用細胞組成物の効力を決定する方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、細胞療法に関連する治療用細胞組成物の効力を決定する方法に関する。治療用細胞組成物の細胞は、組換え受容体、例えば、キメラ受容体、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）等の他のトランスジェニック受容体を発現できる。方法は、治療用細胞組成物の、相対効力を含む効力を同定するためのアッセイを提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、全ての目的のために参照により全体が組み込まれる、２０２１年３月２２日に出願した米国仮出願第６３／１６４，５２７号の優先権を主張するものである。
配列表の参照による組込み
本出願は、電子的フォーマットの配列表と共に提出される。配列表は、２０２２年３月２１日に作成された、７３５０４＿２０２３０４０＿ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴと題されたファイルとして提供され、そのサイズは８４，５７９バイトである。配列表の電子的フォーマットの情報は、参照により全体が組み込まれている。
本開示は、細胞療法に関連して使用するための治療用細胞組成物の効力を決定する方法に関する。治療用細胞組成物の細胞は、組換え受容体、例えば、キメラ受容体、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）等の他のトランスジェニック受容体を発現できる。方法は、治療用細胞組成物の、相対効力を含む効力を決定するためのアッセイを提供する。
種々の免疫療法および／または細胞療法の方法が、疾患および状態を処置するために利用可能である。例えば、養子細胞療法（目的の疾患または障害に特異的なキメラ受容体、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／または他の組換え抗原受容体を発現する細胞の投与を含むものならびに他の養子免疫細胞および養子Ｔ細胞療法を含む）は、がんまたは他の疾患もしくは障害の処置において有効であり得る。組成物のエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）生成の方法に関連してなど、有効治療用細胞組成物を特性決定するための、および細胞療法を用いて対象を処置するための改善されたアプローチが、必要とされる。このような必要性に対処する方法が本明細書において提供される。
治療用細胞組成物の効力を決定する方法であって、複数のインキュベーションを実施することであって、前記複数のインキュベーションの各々は、組換え受容体を発現するように操作された細胞を含む治療用細胞組成物の細胞を組換え受容体刺激剤と共に培養することを含み、組換え受容体への組換え受容体刺激剤の結合は、細胞において組換え受容体依存性活性を刺激し、複数のインキュベーションの各々は、組換え受容体刺激剤に対する治療用細胞組成物の細胞の異なる調整された比率を含む、実施すること、複数のインキュベーションの各々から組換え受容体依存性活性を測定すること、および複数のインキュベーションの各々から測定された組換え受容体依存性活性に基づいて、特定の組換え受容体依存性活性、例えば、最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす調整された比率を決定することを含む、方法が、本明細書において提供される。提供される実施形態のいずれかの一部では、方法は、参照標準の特定の受容体依存性活性（例えば、最大半量の組換え受容体依存性活性）をもたらす調整された比率に対して、治療用細胞組成物の特定の受容体依存性活性（例えば、最大半量の組換え受容体依存性活性）をもたらす調整された比率を比較することによって、治療用細胞組成物の相対効力を決定することをさらに含む。
また、治療用細胞組成物の効力を決定する方法であって、複数のインキュベーションを実施することであって、前記複数のインキュベーションの各々は、組換え受容体を発現するように操作された細胞を含む治療用細胞組成物の細胞を組換え受容体刺激剤と共に培養することを含み、組換え受容体への組換え受容体刺激剤の結合は、細胞において組換え受容体依存性活性を刺激し、複数のインキュベーションの各々は、組換え受容体刺激剤に対する治療用細胞組成物の細胞の異なる調整された比率を含む、実施すること、複数のインキュベーションの各々から組換え受容体依存性活性を測定すること、および参照標準の特定の組換え受容体依存性活性（例えば、最大半量の組換え受容体依存性活性）に対して、治療用細胞組成物の特定の組換え受容体依存性活性（例えば、治療用細胞組成物の最大半量の組換え受容体依存性活性）を比較することによって、治療用細胞組成物の相対効力を決定することを含む、方法が、本明細書において提供される。
提供される実施形態のいずれかの一部では、複数のインキュベーションの各々は、治療用組成物の一定数の細胞を、異なる量の組換え受容体刺激剤と共に培養して、複数の異なる調整された比率を生成することを含む。提供される実施形態のいずれかの一部では、複数のインキュベーションの各々は、一定量の結合分子、例えば、組換え受容体刺激剤を、治療用組成物の異なる数の細胞と共に培養して、複数の異なる調整された比率を生成することを含む。
提供される実施形態のいずれかの一部では、複数のインキュベーションは、２つまたはそれより多い、適宜、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い治療用細胞組成物について実施される。提供される実施形態のいずれかの一部では、２つまたはそれより多い治療用細胞組成物は、各々同一の組換え受容体を含む。提供される実施形態のいずれかの一部では、２つまたはそれより多い治療用細胞組成物は、各々異なる組換え受容体を含む。提供される実施形態のいずれかの一部では、２つまたはそれより多い治療用細胞組成物のうち少なくとも１つは、他の治療用組成物とは異なる組換え受容体を含む。
提供される実施形態のいずれかの一部では、２つまたはそれより多い治療用細胞組成物は、各々同一製造プロセスを使用して製造される。提供される実施形態のいずれかの一部では、２つまたはそれより多い治療用細胞組成物は、各々異なる製造プロセスを使用して製造される。提供される実施形態のいずれかの一部では、２つまたはそれより多い治療用細胞組成物のうち少なくとも１つは、他の治療用細胞組成物を製造するために使用されたものとは異なる製造プロセスを使用して製造される。
提供される実施形態のいずれかの一部では、２つまたはそれより多い治療用細胞組成物が、単一対象から得た細胞から生成される。提供される実施形態のいずれかの一部では、２つまたはそれより多い治療用細胞組成物が、異なる対象から得た細胞から生成される。提供される実施形態のいずれかの一部では、対象は、健康な対象または疾患もしくは状態を有する対象である。
提供される実施形態のいずれかの一部では、異なる対象の各々は、同一の疾患または状態を有する。提供される実施形態のいずれかの一部では、異なる対象の各々は、対象において疾患または状態を処置するための同一治療用細胞組成物を用いて処置されるべきである。
提供される実施形態のいずれかの一部では、複数のインキュベーションは少なくとも３回のインキュベーションである。提供される実施形態のいずれかの一部では、複数のインキュベーションは、少なくとも５回のインキュベーションである。提供される実施形態のいずれかの一部では、複数のインキュベーションが少なくとも７回のインキュベーションである。提供される実施形態のいずれかの一部では、複数のインキュベーションが、少なくとも１０回のインキュベーションである。
提供される実施形態のいずれかの一部では、組換え受容体依存性活性は、サイトカイン発現、細胞溶解活性、受容体上方制御、受容体下方制御、増殖、遺伝子上方制御、遺伝子下方制御または細胞の健康のうち１つまたは複数を含む。提供される実施形態のいずれかの一部では、組換え受容体依存性活性は、サイトカイン発現または生成を含むか、またはそれである。提供される実施形態のいずれかの一部では、組換え受容体依存性活性は、サイトカイン発現または生成を含むか、またはそれであり、サイトカインがＴＮＦ－アルファ、ＩＦＮガンマ（ＩＦＮｇ）またはＩＬ－２である。提供される実施形態のいずれかの一部では、組換え受容体依存性活性は、細胞溶解活性を含むか、またはそれである。提供される実施形態のいずれかの一部では、組換え受容体依存性活性は、受容体下方制御を含むか、またはそれである。提供される実施形態のいずれかの一部では、組換え受容体依存性活性は、増殖を含むか、またはそれである。提供される実施形態のいずれかの一部では、組換え受容体依存性活性は、遺伝子上方制御を含むか、またはそれである。提供される実施形態のいずれかの一部では、組換え受容体依存性活性は、遺伝子下方制御を含むか、またはそれである。提供される実施形態のいずれかの一部では、組換え受容体依存性活性は、細胞の健康を含むか、またはそれである。提供される実施形態のいずれかの一部では、組換え受容体依存性活性は、細胞の健康を含むか、またはそれであり、細胞の健康は、細胞死、細胞径、生細胞濃度および細胞計数のうち１つまたは複数を含む。
提供される実施形態のいずれかの一部では、複数のインキュベーションの各々で測定された組換え受容体依存性活性は、治療用細胞組成物について測定された最大受容体依存性活性に対して正規化される。
提供される実施形態のいずれかの一部では、参照標準は、特定の（例えば、最大半量の）組換え受容体依存性活性をもたらす検証された調整された比率を含む治療用細胞組成物、市販の治療用細胞組成物、治療用細胞組成物を製造するために使用される製造プロセスと同一である製造プロセスを使用して製造された治療用細胞組成物、治療用細胞組成物を製造するために使用された製造プロセスとは異なる製造プロセスを使用して製造された治療用細胞組成物、治療用細胞組成物と同一の組換え受容体を含む治療用細胞組成物、治療用細胞組成物とは異なる組換え受容体を含む治療用細胞組成物、同一対象から製造された治療用細胞組成物または異なる対象から製造された治療用細胞組成物である。
提供される実施形態のいずれかの一部では、参照標準は、２つまたはそれより多い治療用組成物のうちの１つである。
提供される実施形態のいずれかの一部では、組換え受容体刺激剤は、組換え受容体の標的抗原またはその細胞外ドメイン結合部分、適宜、組換え抗原を含む。提供される実施形態のいずれかの一部では、組換え受容体刺激剤は、抗原の細胞外ドメイン結合部分を含み、細胞外ドメイン結合部分は、組換え受容体によって認識されるエピトープを含む。提供される実施形態のいずれかの一部では、組換え受容体刺激剤は、組換え受容体の細胞外ドメイン（例えば、細胞外ドメイン上のエピトープ）に対して特異的な抗体を含む。提供される実施形態のいずれかの一部では、組換え受容体刺激剤は、組換え受容体の細胞外抗原結合ドメインに対して特異的な抗イディオタイプ抗体である。
提供される実施形態のいずれかの一部では、組換え受容体刺激剤は、固体支持体に固定化されるか、または付着している。提供される実施形態のいずれかの一部では、固体支持体は、複数のインキュベーションが実施される容器、適宜、マイクロウェルプレートのウェルの表面である。提供される実施形態のいずれかの一部では、固体支持体はビーズである。
提供される実施形態のいずれかの一部では、組換え受容体刺激剤は抗原発現細胞であり、細胞は、細胞株由来のクローン、細胞または対象から採取された一次細胞であってもよい。提供される実施形態のいずれかの一部では、抗原発現細胞は、細胞株である。提供される実施形態のいずれかの一部では、細胞株は腫瘍細胞株である。提供される実施形態のいずれかの一部では、抗原発現細胞は、組換え受容体の抗原を発現するように形質導入によって導入されていてもよい細胞である。
提供される実施形態のいずれかの一部では、調整された比率は、参照標準の組換え受容体依存性活性の線形用量反応範囲を達成する。提供される実施形態のいずれかの一部では、調整された比率は、参照標準の下側漸近線（最小）組換え受容体依存性活性および上側漸近線（最大）組換え受容体依存性活性を含む。
提供される実施形態のいずれかの一部では、治療用細胞組成物は、生物学的試料から濃縮もしくは精製された単細胞サブタイプまたは適宜、生物学的試料から濃縮もしくは精製された細胞サブタイプを混合することによって得られた混合細胞サブタイプの集団を含む。提供される実施形態のいずれかの一部では、生物学的試料は、全血試料、バフィーコート試料、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料、未分画細胞試料、リンパ球試料、白血球細胞試料、アフェレーシス生成物または白血球アフェレーシス生成物を含む。
提供される実施形態のいずれかの一部では、治療用細胞組成物は一次細胞を含む。提供される実施形態のいずれかの一部では、治療用細胞組成物は、処置されるべき対象から得た自家細胞を含む。提供される実施形態のいずれかの一部では、治療用細胞組成物は、同種異系細胞を含む。提供される実施形態のいずれかの一部では、治療用細胞組成物は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。提供される実施形態のいずれかの一部では、治療用細胞組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含むか、またはそれである。提供される実施形態のいずれかの一部では、治療用細胞組成物は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むか、またはそれである。提供される実施形態のいずれかの一部では、組換え受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
提供される実施形態のいずれかの一部では、治療用細胞組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。提供される実施形態のいずれかの一部では、組換え受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
提供される実施形態のいずれかの一部では、複数のインキュベーションは、フラスコ、チューブまたはマルチウェルプレート中で実施される。提供される実施形態のいずれかの一部では、複数のインキュベーションの各々は、マルチウェルプレートのウェルにおいて個別に実施される。提供される実施形態のいずれかの一部では、マルチウェルプレートは、９６ウェルプレート、４８ウェルプレート、１２ウェルプレートまたは６ウェルプレートである。
提供される実施形態のいずれかの一部では、方法は、特定の（例えば、最大半量の）組換え受容体依存性活性をもたらす調整された比率に基づいて、それを必要とする対象に投与するための治療用組成物の細胞の用量を決定することをさらに含む。提供される実施形態のいずれかの一部では、方法は、相対効力に基づいて、それを必要とする対象に投与するための治療用組成物の細胞の用量を決定することをさらに含む。
提供される実施形態のいずれかの一部では、対象は疾患または状態を有する。提供される実施形態のいずれかの一部では、疾患または状態はがんである。
提供される実施形態のいずれかの一部では、方法は、相対効力に基づいて、最適治療用細胞組成物効力を生成する製造プロセスを決定することをさらに含み、最適治療用細胞組成物効力が、完全な応答および／または持続性のある応答および／または毒性の低減と相関する。
提供される実施形態のいずれかの一部では、方法は、相対効力に基づいて、効力の分散が低減されたまたは低い治療用細胞組成物を生成する製造プロセスを決定することをさらに含み、低減されたまたは低い分散は、異なる製造プロセスにおける分散と比較して決定される。
図１Ａ～１Ｂは、３名の異なるドナーに関する種々の標的のエフェクター細胞に対する比率（Ｔ：Ｅ）でのサイトカイン分泌反応曲線を示す。図１Ａは生の値のサイトカイン分泌曲線を示し、図１Ｂは上方漸近線（Ｖｍａｘ）によって正規化された同じ分泌曲線を示す。 図１Ａ～１Ｂは、３名の異なるドナーに関する種々の標的のエフェクター細胞に対する比率（Ｔ：Ｅ）でのサイトカイン分泌反応曲線を示す。図１Ａは生の値のサイトカイン分泌曲線を示し、図１Ｂは上方漸近線（Ｖｍａｘ）によって正規化された同じ分泌曲線を示す。
操作されたＴ細胞療法（例えば、治療用細胞組成物）を含む細胞療法のための、例えば、細胞療法を生成するためのエクスビボプロセスをモニタリングすることに関連して使用するための、および種々のがんを含む疾患および状態の処置のための用量を決定するための治療用細胞組成物の効力を評価または決定する方法が、本明細書において提供される。提供される実施形態は、疾患または状態と関連する分子を認識する、および／またはそれに特異的に結合して、このような分子に結合した際にこのような分子に対する応答、例えば、免疫応答をもたらすように設計された、組換えタンパク質を発現するように操作された、例えば、組換え受容体を発現するもの等の操作されたＴ細胞を含有する治療用Ｔ細胞組成物に関する。受容体は、キメラ受容体、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む他のトランスジェニック抗原受容体を含み得る。
治療用細胞組成物の効力を決定する本方法は通常、治療用細胞組成物の操作された細胞の最大抗原刺激を使用する。例えば、種々の既存の方法は、最大刺激の際に治療用細胞組成物の細胞の抗原特異的活性、例えば、サイトカイン発現、受容体上方制御または下方制御を測定する。刺激に応じて測定された活性は、次いで、試験された全ての治療用細胞組成物に対して比較され、どの治療用細胞組成物が、最も活性、例えば、組換え受容体依存性活性を有していたかが決定される。最高活性を有する治療用細胞組成物は、最も強力な治療用細胞組成物と考えられ得る。
多くの場合、飽和レベルの抗原の使用は、生理学的に関連しない場合がある。さらに、飽和レベルの抗原の使用は、組換え受容体刺激に対する治療用細胞組成物の感受性を捕捉できない。例えば、現在のアッセイは、検出可能な活性応答を誘発するために必要な刺激（例えば、抗原の量または濃度）に対する組換え受容体の感受性を区別することができない。最大抗原刺激では、変動した刺激に対する組換え受容体の活性、例えば、組換え受容体依存性活性の解明は可能にならない。手短には、治療用細胞組成物における効力を評価する現在の方法は、治療用細胞組成物の効力の一次元的な見方を提供するが、治療用細胞組成物の感受性（例えば、挙動、活性）を捕捉できる尺度を確立する能力をさらに欠く。
本明細書において提供される方法は、治療用細胞組成物の感受性（例えば、挙動、活性）をより包括的に評価するように設計されている。本明細書において提供される方法は、治療用細胞組成物の効力のより生物学的に関連する尺度を提供するように設計されている。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って決定された治療用細胞組成物の効力は、治療用細胞組成物の安全性および有効性とより強力に相関する場合がある。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って決定された治療用細胞組成物の効力は、製造制御および／または変動性の改善された尺度を提供する場合があり、これは、次いで、製造された治療用細胞組成物の安定性および活性（例えば、組換え受容体依存性活性）の改善された評価を可能にすることができる。
提供される方法は、治療用細胞組成物が抗原に対してどのように応答するかを比較するための直接的な方法に関する。多くの場合、最大のあり得る刺激である単一標的抗原刺激に対する活性を比較する既存の方法とは異なり、提供される方法は、標的（例えば、抗原または抗体発現細胞）の、エフェクター細胞（治療用組成物の細胞）に対する比率を調整する。例えば、この比率は、アッセイにおいて一定数のエフェクター細胞を維持することによって、および標的発現細胞数を変動させることによって制御され得る。例えば、提供される方法によって、特定の受容体依存性活性に到達するために必要な標的発現細胞数および／または標的（例えば、抗原または抗体）量を決定することが可能である。一部の実施形態では、標的は、組換え受容体の抗原である。したがって、一部の場合には、標的発現細胞は、抗原発現細胞である。一部の実施形態では、特定の受容体依存性活性は、最大活性の５０％である。一部の実施形態では、特定の受容体依存性活性は、最大受容体依存性活性の１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％または９０％である。一部の実施形態では、特定の受容体依存性活性は、本明細書で開示されるような範囲である。一部の実施形態では、提供される方法は、治療用細胞組成物の比較を可能にする。例えば、治療用細胞組成物を、本明細書において提供される方法によって評価し、例えば、本明細書に記載されるように相対効力を決定できる。
重要なことに、異なる治療用細胞組成物間およびそれらの間で活性を比較することは可能であろうということは知られていなかった。特に、治療用細胞組成物は異なる感受性プロファイル（例えば、組換え受容体特異的刺激に対する応答）、例えば、異なる最小および最大応答を有すると考えられていたので、治療用細胞組成物を比較する能力は知られていなかった。治療用細胞組成物に影響を及ぼす変数は、細胞が由来するか、または得られるドナー、分化状態などの細胞、特定の組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）の抗原結合能力、特定の組換え受容体の細胞内シグナル伝達構成要素、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）を発現する組成物中の細胞のパーセンテージまたは頻度、治療用組成物を生成するために使用されるプロセスおよび他の因子における相違等のために生物製剤等の他の薬物製品よりもかなり大きい。例えば、図１Ａに示されるように、異なるドナーに由来する治療用組成物は、反応曲線に示されるものなどの抗原刺激に対する異なる応答を呈する。したがって、この結果は、治療用細胞組成物を比較することは可能でない場合があることを示すであろう。反応曲線の上側漸近線（例えば、最大刺激）に対して活性を正規化することによって、治療用細胞組成物の感受性を比較することができるであろうということが本明細書において見出される。提供される方法は、異なる方法、異なる抗原受容体を発現すること、異なるドナーから生成されていること、および他の変数によって生じている結果等として変わり得るものを含む、異なる細胞生成物の間およびそれらの中での感受性を測定することを可能にする。既存の方法は、最大刺激で活性を評価するが、これは、幾分かはそれがあり得る分散を説明する唯一の方法であると考えられているからである。
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、変動性の供給源を低減または排除する。例えば、本明細書において提供される方法は、ドナーの不均一性および／または日にち毎のサンプリングもしくは試験によって生じ得る変動性に対して頑強である。一部の場合には、ドナーの不均一性および／またはサンプリングもしくは試験による変動性等の変動性を排除することによって、治療用細胞組成物の比較が可能となる。
本明細書において提供される方法は、異なる調整された比率の治療用細胞組成物の細胞および組換え受容体刺激剤が培養される一連のインキュベーションを含むアッセイ形式を含む。提供された態様では、組換え受容体刺激剤は、組換え受容体の細胞内シグナル伝達領域を介してシグナルを誘導するか、または誘導可能である薬剤である。例えば、組換え受容体刺激剤は、組換え受容体の抗原、例えば、精製された抗原または組換え抗原、抗原発現細胞または組換え受容体の細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）に対して特異的な抗イディオタイプ抗体を含み得る。一部の実施形態では、本明細書において提供される、アッセイ形式を含む方法は、治療用細胞組成物の操作された細胞における組換え受容体依存性活性を刺激するために必要な、例えば、節Ｉ－Ｂに記載されるような組換え受容体刺激剤の量または濃度を測定または決定することによって、治療用細胞組成物の感受性を測定するように設計されている。例えば、本明細書において提供される方法は、治療用細胞組成物の定量可能なおよび検出可能な活性（例えば、組換え受容体依存性活性）を刺激する抗原のレベル（例えば、量、濃度）を決定できる。一部の実施形態では、感受性の尺度は、複数の調整された比率にわたる組換え受容体に結合する組換え受容体刺激剤によって刺激された組換え受容体依存性活性の測定値を含む。異なる調整された比率で組換え受容体依存性活性を評価する方法の能力によって、組換え受容体特異的刺激に対する治療用細胞組成物の一般的な活性または挙動の決定、推定および／または外挿が可能となる。
本明細書において提供される方法は、一連の制御されたインキュベーションにおいて組換え受容体の刺激に応じた、組換え受容体、例えば、本明細書に記載される組換え受容体を発現する治療用細胞組成物の細胞の活性を測定することによって、治療用細胞組成物の効力の評価を可能にするアッセイを含む。例えば、一連のインキュベーションは、組換え受容体を発現する治療用細胞組成物の操作された細胞を、異なる調整された比率で、組換え受容体に結合された場合に細胞によって発現される組換え受容体の活性、例えば、組換え受容体依存性活性を刺激する、例えば、本明細書（例えば、節Ｉ－Ｂ）に記載される組換え受容体刺激剤と共に培養することを含む場合があり、各インキュベーションは、異なる調整された比率である。一部の実施形態では、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくはそれより多い、または少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくはそれより多いインキュベーションが実施され、各インキュベーションは、組換え受容体刺激剤に対する治療用細胞組成物の細胞の異なる比率を含有する。一部の実施形態では、３回または少なくとも３回のインキュベーションが実施され、各インキュベーションは、組換え受容体刺激剤に対する治療用細胞組成物の細胞の異なる調整された比率を含有する。一部の実施形態では、６回または少なくとも６回のインキュベーションが実施され、各インキュベーションは、組換え受容体刺激剤に対する治療用細胞組成物の細胞の異なる調整された比率を含有する。一部の実施形態では、１０回または少なくとも１０回のインキュベーションが実施され、各インキュベーションは、組換え受容体刺激剤に対する治療用細胞組成物の細胞の異なる調整された比率を含有する。
一部の実施形態では、治療用組成物の一定数の細胞が、異なる量の組換え受容体刺激剤と共に培養されて、一連の（例えば、複数の）異なる調整された比率をもたらす。あるいは、一部の実施形態では、一定量または濃度の、例えば、節Ｉ－Ｂに記載されるような組換え受容体刺激剤が異なる数の治療用細胞組成物の細胞と共にインキュベートされて、一連の（例えば、複数の）異なる調整された比率をもたらす場合もある。異なる調整された比率が達成される方法にかかわらず、例えば、治療用細胞組成物の細胞の総数または組換え受容体刺激剤の量を変えることによって、一連の（例えば、複数の）調整された比率を使用して、刺激条件の範囲にわたる組換え受容体依存性活性の評価が可能となる。一部の実施形態では、測定の範囲を使用して、特定の治療用細胞組成物の操作された細胞が異なるレベルの組換え受容体刺激に応答する方法を抽出、推定および／または決定できる。
本明細書で記載された方法に従って生成された測定された組換え受容体依存性活性から、任意の数の手段を決定、抽出、外挿、推定および／または推測できる。尺度の限定されない例として、最大、最小および最大半量（５０％）の組換え受容体依存性活性が生じる調整された比率、最大組換え受容体依存性活性の特定のパーセンテージ（例えば、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％または９０％）が生じる調整された比率および組換え受容体依存性活性の一定範囲、例えば、最大組換え受容体依存性活性の１０％～９０％、２０％～８０％、３０％～７０％、４０％～６０％を包含する調整された比率が挙げられる。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の測定された組換え受容体依存性活性は、カーブフィッティングを受けて、組換え受容体依存性活性曲線を生成する。一部の実施形態では、曲線は、用量反応曲線と類似している。一部の実施形態では、特定の組換え受容体依存性活性が生じる組換え受容体依存性活性および／または比率の尺度は、曲線から外挿および／または推定される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性曲線を使用して、特定の組換え受容体依存性活性が生じる治療用細胞組成物および／または組換え受容体刺激剤の値または尺度を外挿できる。一部の実施形態では、例えば、治療用細胞組成物細胞計数が一定に維持され、組換え受容体刺激剤の量が変更される場合には、組換え受容体依存性活性が生じる最大、最小、最大半量および範囲を決定するために、組換え受容体刺激剤の、量（例えば、精製された標的もしくは組換え標的の場合には、質量（例えば、ピコグラムで）、もしくは標的発現細胞の場合には、細胞の数）または濃度（例えば、精製された標的もしくは組換え標的の場合には、質量／体積で（例えば、ｐｇ／ｍｌで）、もしくは標的発現細胞の場合には、単位体積当たりの細胞数（例えば、細胞／ｍＬ））が使用される。一部の実施形態では、例えば、治療用細胞組成物細胞計数が変更され、組換え受容体刺激剤の量が一定に維持される場合には、組換え受容体依存性活性が生じる最大、最小、最大半量および範囲を決定するために、治療用細胞組成物の細胞の数（例えば、計数、総数）が使用される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性が生じる最大、最小、最大半量および範囲を決定するために、調整された比率（複数可）が使用される。一部の実施形態では、最大半量の組換え受容体依存性活性を決定するために、組換え受容体刺激剤の量または濃度が使用される。一部の実施形態では、最大半量の組換え受容体依存性活性を決定するために、治療用細胞組成物の細胞の量（例えば、計数）が使用される。一部の実施形態では、最大半量の組換え受容体依存性活性を決定するために、調整された比率が使用される。これらの例示された尺度ならびに列挙されない他のものは、効力および／または相対効力（例えば、治療用細胞組成物の本明細書（例えば、節Ｉ－Ｄ）に記載されるもの等の参照標準に対する効力）を決定するために使用され得る治療用細胞組成物の定量的説明を提供する。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の効力は、組換え受容体依存性活性に基づいて決定された、調整された比率の値もしくは尺度、治療用細胞組成物の細胞の量、および／または組換え受容体刺激剤の量もしくは濃度として表される。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の効力は、組換え受容体依存性活性の最大半量値（例えば、最大活性の５０％）が生じる、調整された比率の値もしくは尺度、治療用細胞組成物の細胞の量、および／または組換え受容体刺激剤の量もしくは濃度である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の効力は、組換え受容体依存性活性の最大半量値（例えば、最大活性の５０％）が生じる、調整された比率である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の効力は、組換え受容体依存性活性の最大半量値が生じる、組換え受容体刺激剤の濃度である。一部の実施形態では、測定された組換え受容体依存性活性に従って、治療用細胞組成物の５０％有効刺激（ＥＳ５０）が生じる、組換え受容体依存性活性の最大半量値は、調整された比率、組換え受容体刺激剤の濃度および／または細胞計数を反映する。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の効力は、相対効力である。例えば、治療用細胞組成物について最大半量の組換え受容体依存性活性が測定される調整された比率を、参照標準について最大半量の組換え受容体依存性活性が測定される調整された比率に対して比較することができる。当然のことではあるが、妥当な場合には、組換え受容体刺激剤の濃度もしくは量または細胞計数は、調整された比率の代わりに使用され得る。一部の実施形態では、参照標準は、最大半量の組換え受容体依存性活性が生じる、既知および／または検証された調整された比率を有する治療用細胞組成物である。一部の実施形態では、参照標準は、最大半量の組換え受容体依存性活性が生じる調整された比率が、例えば、本明細書に記載されるような方法を使用して決定されている、市販の治療用細胞組成物である。一部の実施形態では、参照標準は、最大半量の組換え受容体依存性活性が生じる調整された比率が、例えば、本明細書に記載されるような方法を使用して決定されている異なる治療用細胞組成物である。一部の実施形態では、異なる治療用細胞組成物は、試験治療用細胞組成物と同一の抗原に結合するが、異なる受容体構造を有する組換え受容体を発現する細胞を含有する。一部の実施形態では、異なる治療用細胞組成物は、試験治療用細胞組成物と同一の組換え受容体を発現するが、治療用細胞組成物が、試験治療用細胞組成物を製造するために使用されたプロセスとは異なるプロセスを使用して製造された細胞を含有する。一部の実施形態では、相対効力は、試験治療用細胞組成物の最大半量の値をもたらす調整された比率を、参照標準の最大半量の値をもたらす調整された比率によって除することによって決定された比率である。一部の実施形態では、相対効力は、試験治療用細胞組成物の最大半量の値をもたらす調整された比率を、参照標準の最大半量の値をもたらす調整された比率によって除し、１００を乗じることによって決定されたパーセンテージである。
一部の場合には、治療用細胞組成物の組換え受容体依存性活性を正規化することは、２つまたはそれより多い治療用細胞組成物の組換え受容体依存性活性を比較できるか否かを決定するために有用である。例えば、２つまたはそれより多い治療用組成物の組換え受容体依存性活性が決定される場合には、試験された治療用細胞組成物各々の最大および／または最小組換え受容体依存性活性は異なっており、各組成物の組換え受容体依存性活性を、その自身の最大値に対して正規化することによって、組換え受容体依存性活性を比較することの妥当性の評価が可能となり得る。
一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、測定された最大組換え受容体依存性活性値に対して正規化される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性曲線は、測定された最大組換え受容体依存性活性に対して正規化される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性曲線が正規化される場合には、最大活性値は、曲線の上側漸近線にわたる平均である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物および参照標準の組換え受容体依存性活性を、そのそれぞれの最大値によって正規化することによって、試験治療用細胞組成物および参照標準の間の比較が容易になる。一部の実施形態では、治療用細胞組成物および参照標準の組換え受容体依存性活性をそのそれぞれの最大値によって正規化することによって、相対効力を算出することが容易になる。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物および参照標準の組換え受容体依存性活性をそのそれぞれの最大値によって正規化することによって、平行線試験が実施されることが可能となる。一部の実施形態では、平行線試験の結果は、治療用細胞組成物および参照標準を比較する能力を示す。
治療用細胞組成物の効力を評価するための、本明細書において提供されるアッセイを含む方法によって、参照標準を含む異なる治療用細胞組成物が比較されることが可能となる。治療用細胞組成物を比較する能力は、改善された、最適な、および／または一貫した効力を有する治療用細胞組成物を同定するだけではなく、さらなる開発および／もしくは分析のために候補治療用細胞組成物を同定し；改善された、もしくは最適な効力を有する治療用細胞組成物をもたらす製造プロセスおよび手順を同定し；一貫した効力を有する治療用細胞組成物をもたらす製造手順を同定し；ならびに／または製造手順に固有の変動性を推定し；それを必要とする対象に投与されるべき治療用細胞組成物の用量、例えば、毒性の発生を伴わない臨床応答をもたらす用量を決定し；ならびに／または自家治療用細胞組成物に対して同種異系の治療用細胞組成物の効力を比較する方法を提供する。本明細書において提供される方法は、試験治療用組成物または参照標準が異なるドナー（例えば、対象）、製造プロセスおよび／または治療用製品に由来するか否かについてとらわれない相対効力形式と適合するように設計される。
本出願において参照される特許文書、科学論文およびデータベースを含む全ての出版物は、それぞれ個々の出版物が個々に参照により組み込まれた場合と同程度に、あらゆる目的のために参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の定義が、参照により本明細書に組み込まれる特許、出願、公開された出願および他の出版物に記載の定義に反するか、または別の状況で矛盾する場合、参照により本明細書に組み込まれる定義より本明細書に記載の定義が優先される。
本明細書において使用される章の見出しは、単に系統化する目的のためであり、記載された主題を限定するものとして解釈されないものとする。
Ｉ．細胞効力アッセイ
複数のインキュベーションを含むアッセイを使用して、治療用細胞組成物、例えば、節Ｉ－Ａに記載されるような、例えば、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）を発現するように操作されたＴ細胞（例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を含有する治療用Ｔ細胞組成物の効力を評価する方法が本明細書において提供され、複数のインキュベーションの各々は、組換え受容体を発現するように操作された細胞を含有する治療用細胞組成物の細胞を、細胞において組換え受容体依存性活性を刺激するために組換え受容体によって認識される、またはそれによって結合されることが可能である、例えば、節Ｉ－Ｂにおいて記載されるような、組換え受容体刺激剤、例えば、抗原、抗原発現細胞または抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体）と共に培養することを含む。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、その組換え受容体の刺激に応じて誘発される細胞の活性である。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、例えば、サイトカイン発現、細胞溶解活性、受容体上方制御または下方制御、遺伝子上方制御もしくは下方制御、細胞溶解活性、増殖活性および／または例えば、節Ｉ－Ｃに記載されるような細胞の健康の尺度等の活性である。一部の実施形態では、複数のインキュベーションの各々は、組換え受容体刺激剤に対する治療用細胞組成物の細胞の異なる調整された比率を含有する。一部の実施形態では、複数のインキュベーションの各々は、治療用組成物の一定数の細胞を、異なる量の組換え受容体刺激剤と共に培養して、複数の異なる調整された比率を生成することを含む。一部の実施形態では、複数のインキュベーションの各々は、治療用組成物の異なる数の細胞を、一定量または濃度の組換え受容体刺激剤と共に培養して、複数の異なる調整された比率を生成することを含む。一部の実施形態では、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくはそれより多い、または少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくはそれより多いインキュベーションが実施され、各インキュベーションは、組換え受容体刺激剤に対する治療用細胞組成物の細胞の異なる比率を含有する。一部の実施形態では、３回または少なくとも３回のインキュベーションが実施され、各インキュベーションは、組換え受容体刺激剤に対する治療用細胞組成物の細胞の異なる比率を含有する。一部の実施形態では、６回または少なくとも６回のインキュベーションが実施され、各インキュベーションは、組換え受容体刺激剤に対する治療用細胞組成物の細胞の異なる比率を含有する。一部の実施形態では、１０回または少なくとも１０回のインキュベーションが実施され、各インキュベーションは、組換え受容体刺激剤に対する治療用細胞組成物の細胞の異なる比率を含有する。一部の実施形態では、複数のインキュベーションの各々から組換え受容体依存性活性が測定される。一部の実施形態では、複数のインキュベーションの各々からの組換え受容体依存性活性が、節Ｉ－Ｃに記載されるように、例えば、蛍光、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡによって測定される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性の測定値は、曲線によってフィッティングされて、例えば、上記のように組換え受容体依存性活性曲線を生成する。一部の実施形態では、複数のインキュベーションの各々から測定された組換え受容体依存性活性に基づいて、最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす調整された比率が決定される。一部の実施形態では、最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす調整された比率が、組換え受容体依存性活性曲線から推測、外挿または推定される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性曲線は、測定された最大組換え受容体依存性活性に対して正規化される。一部の実施形態では、最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす調整された比率は、治療用細胞組成物の効力である。一部の実施形態では、妥当な場合には、組換え受容体刺激剤の濃度もしくは量または細胞計数が、調整された比率の代わりに報告され得る。
一部の実施形態では、最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす調整された比率が、参照標準において最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす調整された比率に対して比較される。例えば、最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす治療用細胞組成物の調整された比率が、例えば、本明細書で記載された方法に従って決定された参照標準において最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす調整された比率によって除されて、相対効力をもたらす。一部の実施形態では、相対効力は、比率として表される。一部の実施形態では、相対効力は、パーセンテージとして表される。
効力を決定するための本明細書で提供される方法は、複製を用いて実施され得る。例えば、アッセイは、２、３、４、５回またはそれより多く実施され得る。一部の実施形態では、複製物は、組換え受容体依存性活性の測定されたものならびに／または決定された効力および／もしくは相対効力の一貫性を含む、アッセイの正確性および／または精度を確認するために使用される。一部の実施形態では、特定の治療用細胞組成物で２連または３連でアッセイを実行することによって単一アッセイが実施される。一部の実施形態では、アッセイは、２連で実施される。一部の実施形態では、アッセイは、３連で実施される。アッセイが例えば、２連または３連で実施される一部の場合には、複製物の各々からの測定された組換え受容体依存性活性は、組換え受容体依存性活性の統計的尺度を提供するために使用される。例えば、一部の場合には、組換え受容体依存性活性の各尺度の平均、中央値、標準偏差および／または分散が決定される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性の各尺度の平均が決定される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性の各尺度の標準偏差が決定される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性の平均尺度が数学的モデルを使用してフィッティングされ、組換え受容体依存性活性曲線を生成する。一部の実施形態では、曲線は平均最大値に対して正規化される。一部の実施形態では、最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす平均の調整された比率が、治療用細胞組成物の効力である。一部の実施形態では、妥当な場合には、組換え受容体刺激剤または細胞計数の平均濃度または量が、調整された比率の代わりに報告され得る。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の効力は、最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす平均の調整された比率をとることおよび平均の調整された比率を、参照標準において最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす単一のまたは平均の調整された比率に対して比較することによって決定される相対効力である。一部の実施形態では、相対効力は、標準参照の単一効力または平均効力によって除された治療用細胞組成物の平均効力である。一部の実施形態では、相対効力は、比率として表される。一部の実施形態では、相対効力は、パーセンテージとして表される。
本明細書で提供されるアッセイは、複数のインキュベーションに適した任意の容器（複数可）で実施され得る。一部の実施形態では、アッセイは、フラスコ中で実施される。一部の実施形態では、アッセイは、チューブ、例えば、微小遠心管、ＰＣＲチューブ、チューブ中で実施される。一部の実施形態では、アッセイは、マルチウェルプレート中で実施される。例えば、マルチウェルプレートは、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、４８ウェルプレートまたは９６ウェルプレートである。特定の実施形態では、アッセイは、１２ウェルプレート中で実施されるか、または実行される。
治療用細胞組成物および組換え受容体刺激剤を用いるインキュベーションが培養される条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間および／または薬剤、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオンのうち１つまたは複数を含み得る。複数のインキュベーションの持続期間は、あり得る組換え受容体依存性活性が検出される（例えば、測定される）ための少なくとも最小量の時間と釣り合うように企図される。例えば、サイトカイン発現を正確に測定するために必要とされる時間の量は、遺伝子発現の測定のためよりも長い場合がある。活性の種類、例えば、サイトカイン発現内で、特定のサイトカインが測定されるための時間に、別のものと比較して相違がある場合があることがさらに企図される。一部の実施形態では、複数のインキュベーションは、１、２もしくは３日間、約１、２もしくは３日間または少なくとも１、２もしくは３日間実施される。一部の実施形態では、複数のインキュベーションは、１もしくは２日間、約１もしくは２日間または少なくとも１もしくは２日間実施される。一部の実施形態では、複数のインキュベーションは、２４、３６、４８、６０もしくは７２時間、約２４、３６、４８、６０もしくは７２時間または少なくとも２４、３６、４８、６０もしくは７２時間実施される。一部の実施形態では、複数のインキュベーションは、２４もしくは４８時間、約２４もしくは４８時間または少なくとも２４もしくは４８時間実施される。一部の実施形態では、複数のインキュベーションは、２４時間から７２時間または約２４時間から約７２時間の間実施される。一部の実施形態では、複数のインキュベーションは、２４時間から４８時間または約２４時間から約４８時間の間実施される。一部の実施形態では、複数のインキュベーションは、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５もしくは６０分間、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５もしくは６０分間または少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５もしくは６０分間実施される。一部の実施形態では、複数のインキュベーションは、３０分間、約３０分間または少なくとも３０分間実施される。一部の実施形態では、複数のインキュベーションは、６０分間、約６０分間または少なくとも６０分間実施される。一部の実施形態では、複数のインキュベーションは、１０から６０、２０から６０、３０から６０、４０から６０、５０から６０分の間、または約１０から６０、２０から６０、３０から６０、４０から６０、５０から６０分の間実施される。
一部の実施形態では、複数のインキュベーションは、約２５～約３８℃、例えば、約３０～約３７℃、例えば、３７℃±２℃または約３７℃±２℃の温度で実施される。一部の実施形態では、複数のインキュベーションは、約２．５％～約７．５％、例えば、約４％～約６％、例えば、５％±０．５％または約５％±０．５％のＣＯ２レベルで実施される。一部の実施形態では、複数のインキュベーションは、３７℃もしくは約３７℃の温度で、および／または５％もしくは約５％のＣＯ２レベルで実施される。
Ａ．治療用細胞組成物
本明細書において提供される方法は、例えば、任意のプロセスによって製造された、治療用細胞組成物、例えば、治療用Ｔ細胞組成物の効力を評価することに向けられる。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、本明細書（例えば、節ＩＩ）に記載されるプロセスに従って製造された治療用細胞組成物を評価するために使用され得る。一部の実施形態では、任意のプロセスによって製造された複数の治療用細胞組成物の効力および／または相対効力は、本明細書において提供される方法に従って評価され得る。一部の実施形態では、評価される複数の治療用細胞組成物は、同一製造プロセスによって生成される。一部の実施形態では、複数の治療用細胞組成物は、同一製造プロセスによって製造されるが、異なる組換え受容体を含む。一部の実施形態では、標的は、組換え受容体の抗原である。したがって、一部の場合には、標的発現細胞は抗原発現細胞である。一部の実施形態では、異なる組換え受容体は全て、同一標的、例えば、標的抗原に結合する。一部の実施形態では、異なる組換え受容体は、異なる標的、例えば、標的抗原に結合する。一部の実施形態では、評価される複数の治療用細胞組成物は、異なる製造プロセスによって生成される。一部の実施形態では、複数の治療用細胞組成物は、異なる製造プロセスによって製造されるが、同一組換え受容体を含む。一部の実施形態では、複数の治療用細胞組成物は、異なる製造プロセスによって製造され、異なる組換え受容体を含む。一部の実施形態では、異なる組換え受容体は全て、同一の抗原に結合する。一部の実施形態では、複数の治療用細胞組成物は、単一の対象から製造される。一部の実施形態では、複数の治療用細胞組成物は、異なる対象から製造される。一部の実施形態では、対象は健康なドナーである。一部の実施形態では、対象は、疾患または状態、例えば、がんを有する。本明細書において提供される方法は、製造の方法にかかわらず、治療用細胞組成物である参照標準を含む治療用細胞組成物間の効力および／または相対効力の比較を可能にすることが可能である。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物は、１つまたは複数のインプット集団、例えば、単一の生物学的試料（例えば、節ＩＩ－Ａを参照されたい）から得られた、選択された、または濃縮された、例えば、インプット集団に由来する操作されたＴ細胞を含有する治療用細胞組成物を生成するか、または作製するプロセスに関連して生成または製造される。ある特定の実施形態では、治療用細胞組成物は、組換え受容体、例えば、ＣＡＲ、ＴＣＲを発現する細胞を含有する。特定の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞は、療法、例えば、自家細胞療法、同種異系の細胞療法として対象に投与するのに適している。本明細書において提供される方法は、細胞療法のための治療用細胞組成物の効力および／または相対効力を評価するために使用され得る。
一部の実施形態では、操作されたＴ細胞の治療用細胞組成物を作製または生成するプロセスは、生物学的試料を収集または取得する工程；生物学的試料からインプット細胞を単離、選択または濃縮する工程；インプット細胞をクライオ凍結および保存し、次いで、解凍する工程；目的のインプット細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞を選択し、刺激する工程；組換えポリヌクレオチド、例えば、ＣＡＲ等の組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを発現または含有するように刺激された細胞を遺伝子操作する工程；培養細胞をアウトプット組成物に製剤化する工程；ならびに細胞が注入およびまたは対象への投与のために放出されるまで、製剤化されたアウトプット細胞をクライオ凍結および保存する工程の一部または全てを含む。一部の実施形態では、治療用細胞組成物を製造する方法は、細胞が、インプット集団と比較して少なくとも２、３、４、５倍、またはそれより大きい細胞の量、レベルまたは濃度である閾値量等まで拡大する条件下で細胞をバイオリアクター中で培養すること等によってプロセスの際に細胞数を拡大または増大する工程を含まない。一部の実施形態では、治療用細胞組成物を製造する方法は、細胞が、インプット集団と比較して少なくとも２、３、４、５倍またはそれより大きい細胞の量、レベルまたは濃度である閾値量等まで拡大する条件下で細胞をバイオリアクター中でインキュベートまたは培養すること等によってプロセスの際に細胞数を拡大または増大する工程を含む。一部の実施形態では、細胞を遺伝子操作することは、ウイルス粒子の存在下で細胞をスピノキュレートすること、次いで、ウイルス粒子の存在下で静的条件下で細胞をインキュベートすること等によって細胞にウイルスベクターを形質導入する工程であるか、またはそれを含む。例えば、節ＩＩ－Ｃを参照されたい。
ある特定の実施形態では、刺激の開始から細胞の収集、回収または製剤化までの、操作された細胞を作製するプロセスの総持続期間は、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間もしくは１２０時間である、約３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間もしくは１２０時間である、または３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間もしくは１２０時間未満である。一部の実施形態では、刺激の開始から細胞の収集、回収または製剤化までの、操作された細胞を作製するための提供されるプロセスの総持続期間は、境界を含めて、３６時間から１２０時間、４８時間から９６時間もしくは４８時間から７２時間の間である、または約３６時間から約１２０時間、約４８時間から約９６時間もしくは約４８時間から約７２時間の間である。特定の実施形態では、インキュベーションの開始から細胞の回収、収集または製剤化までに測定されるような、提供されたプロセスを完了するための時間の量は、４８時間、７２時間もしくは９６時間である、約４８時間、約７２時間もしくは約９６時間である、または４８時間、７２時間もしくは９６時間未満である。特定の実施形態では、インキュベーションの開始から細胞の回収、収集または製剤化までに測定されるような、提供されたプロセスを完了するための時間の量は、４８時間±６時間、７２時間±６時間または９６時間±６時間である。
一部の実施形態では、全製造プロセスは、濃縮されたＴ細胞、例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の単一集団を用いて実施される。ある特定の実施形態では、製造プロセスは、濃縮されたＴ細胞の単一治療用細胞組成物（例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する治療用細胞組成物）を作製または生成するプロセスの前および／またはプロセスの間に組み合わされる、濃縮されたＴ細胞の２つまたはそれより多いインプット集団を用いて実施される。一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞は、操作されたＴ細胞、例えば、組換え受容体を発現するように形質導入されたＴ細胞であるか、またはそれを含む。
一部の実施形態では、生物学的試料からのインプット細胞（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞）の単離、濃縮および／または選択から治療用細胞組成物の操作された細胞が収集、製剤化および／または凍結保護される時間までに測定されるような、提供されるプロセスを完了するために必要な時間の持続期間または量は、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、４日、５日、７日もしくは１０日である、約４８時間、約７２時間、約９６時間、約１２０時間、約４日、約５日、約７日もしくは約１０日である、または４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、４日、５日、７日もしくは１０日未満である。一部の実施形態では、生物学的試料からのインプット細胞（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞）の単離、濃縮および／または選択から操作された細胞が収集、製剤化および／または凍結保護される時間までに測定されるような、提供されるプロセスを完了するために必要な時間の持続期間または量は、４～５日である、約４～５日である。一部の実施形態では、生物学的試料からのインプット細胞（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞）の単離、濃縮および／または選択から操作された細胞が収集、製剤化および／または凍結保護される時間までに測定されるような、提供されるプロセスを完了するために必要な時間の持続期間または量は、５日であるか、または約５日である。一部の実施形態では、生物学的試料からのインプット細胞（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞）の単離、濃縮および／または選択から操作された細胞が収集、製剤化および／または凍結保護される時間までに測定されるような、提供されるプロセスを完了するために必要な時間の持続期間または量は、５日である、５日未満である。一部の実施形態では、生物学的試料からのインプット細胞（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞）の単離、濃縮および／または選択から操作された細胞が収集、製剤化および／または凍結保護される時間までに測定されるような、提供されるプロセスを完了するために必要な時間の持続期間または量は、４日であるか、または約４日である。一部の実施形態では、単離、選択または濃縮された細胞は、刺激の前に凍結保護されず、インプット細胞の単離、濃縮および／または選択から操作された細胞が収集、製剤化および／または凍結保護される時間までに測定されるような、提供されるプロセスを完了するために必要な持続期間または量は、４８時間、７２時間、９６時間もしくは１２０時間である、約４８時間、約７２時間、約９６時間もしくは約１２０時間である、または４８時間、７２時間、９６時間もしくは１２０時間未満である。
ある特定の実施形態では、治療用細胞組成物は、生物学的試料から単離、濃縮または選択された細胞、例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ３＋Ｔ細胞の集団から製造された。一部の態様では、生物学的試料が対象から収集される時点から治療用細胞組成物を生成または作製する時間は、他の方法またはプロセスと比較して短縮された時間の量以内である。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％、少なくとも９５％が、組換え受容体を発現する。ある特定の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の少なくとも５０％が、組換え受容体を発現する。ある特定の実施形態では、治療用細胞組成物のＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、組換え受容体を発現する。一部の実施形態では、治療用細胞組成物のＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも５０％が、組換え受容体を発現する。特定の実施形態では、治療用細胞組成物のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％または９９％より多くが、組換え受容体を発現する。特定の実施形態では、治療用細胞組成物のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも５０％が、組換え受容体を発現する。一部の実施形態では、治療用細胞組成物のＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％または９９％より多くが、組換え受容体を発現する。ある特定の実施形態では、治療用細胞組成物のＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも５０％が、組換え受容体を発現する。
特定の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の大部分は、ナイーブ様、中枢記憶および／またはエフェクター記憶細胞である。特定の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の大部分は、ナイーブ様または中枢記憶細胞である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の大部分は、ＣＣＲ７またはＣＤ２７発現のうち１つまたは複数について陽性である。ある特定の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞は、拡大増殖を含むプロセス等の代替プロセスから作成された集団をアウトプットするナイーブ様または中枢記憶細胞のより大きな部分を有する。
ある特定の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞は、低い部分および／または頻度の消耗および／または老化している細胞を有する。特定の実施形態では、アウトプット集団の細胞は、低い部分および／または頻度の消耗および／または老化している細胞を有する。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満または１％未満が、消耗および／または老化している。ある特定の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の２５％未満が、消耗および／または老化している。ある特定の実施形態では、アウトプット集団の細胞の１０％未満が、消耗および／または老化している。特定の実施形態では、細胞は、低い部分を有する。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞は、低い部分および／または頻度の、ＣＤ２７およびＣＣＲ７発現、例えば、表面発現について陰性である細胞を有する。特定の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞は、低い部分および／または頻度の、ＣＤ２７－ＣＣＲ７－細胞を有する。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満または１％未満は、ＣＤ２７－ＣＣＲ７－細胞である。ある特定の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の２５％未満は、ＣＤ２７－ＣＣＲ７－細胞である。ある特定の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の１０％未満は、ＣＤ２７－ＣＣＲ７－細胞である。実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の５％未満は、ＣＤ２７－ＣＣＲ７－細胞である。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞は、高い部分および／または頻度の、ＣＤ２７およびＣＣＲ７発現の一方または両方、例えば、表面発現について陽性である細胞を有する。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞は、高い部分および／または頻度の、ＣＤ２７およびＣＣＲ７の一方または両方について陽性である細胞を有する。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％より多くが、ＣＤ２７およびＣＣＲ７の一方または両方について陽性である。種々の実施形態では、治療用細胞組成物のＣＤ４＋ＣＡＲ＋細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％より多くは、ＣＤ２７およびＣＣＲ７の一方または両方について陽性である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物のＣＤ８＋ＣＡＲ＋細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％より多くは、ＣＤ２７およびＣＣＲ７の一方または両方について陽性である。
ある特定の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞は、高い部分および／または頻度の、ＣＤ２７およびＣＣＲ７発現、例えば、表面発現について陽性である細胞を有する。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞は、高い部分および／または頻度のＣＤ２７＋ＣＣＲ７＋細胞を有する。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％より多くは、ＣＤ２７＋ＣＣＲ７＋細胞である。種々の実施形態では、治療用細胞組成物のＣＤ４＋ＣＡＲ＋細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％より多くは、ＣＤ２７＋ＣＣＲ７＋細胞である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物のＣＤ８＋ＣＡＲ＋細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％より多くは、ＣＤ２７＋ＣＣＲ７＋細胞である。
ある特定の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞は、低い部分および／または頻度の、ＣＣＲ７について陰性であり、ＣＤ４５ＲＡ発現、例えば、表面発現について陽性である細胞を有する。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞は、低い部分および／または頻度のＣＣＲ７－ＣＤ４５ＲＡ＋細胞を有する。特定の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満または１％未満は、ＣＣＲ７－ＣＤ４５ＲＡ＋細胞である。一部の実施形態では、アウトプット集団（例えば、治療用細胞組成物）の細胞の２５％未満は、ＣＣＲ７－ＣＤ４５ＲＡ＋細胞である。特定の実施形態では、アウトプット集団（例えば、治療用細胞組成物）の細胞の１０％未満は、ＣＣＲ７－ＣＤ４５ＲＡ＋細胞である。ある特定の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の５％未満は、ＣＣＲ７－ＣＤ４５ＲＡ＋細胞である。
一部の実施形態では、治療用細胞製造プロセスは、異なっており、その結果、例えば、異なって製造された治療用細胞組成物の効力を比較することによって代替製造プロセスを比較することができる。例えば、一部の実施形態では、代替プロセスは、細胞を拡大する工程を含有する場合がある。一部の実施形態では、代替プロセスは、細胞を拡大する工程を含有しない場合がある。一部の実施形態では、代替プロセスは、細胞選択および刺激のための別個の工程を含む。一部の実施形態では、代替プロセスは、細胞選択および刺激のための単一工程を含む。一部の実施形態では、代替プロセスは、１つまたは複数の特定の態様において異なる場合があるが、そうでないものは、提供された方法と関連するプロセスの同様の、または同一の特徴、態様、工程、段階、試薬および／または条件を含有する。一部の実施形態では、代替プロセスは、異なる試薬および／もしくは培地配合物を含むこと；インキュベーション、形質導入、トランスフェクションおよび／もしくは培養の際の血清の存在；インプット集団の異なる細胞構成、例えば、ＣＤ４＋のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比率；異なる刺激条件および／もしくは異なる刺激試薬；細胞に対する刺激試薬の異なる比率；異なるベクターおよび／もしくは形質導入の方法；細胞をインキュベート、形質導入および／もしくはトランスフェクトするための異なるタイミングもしくは順序；インキュベーションもしくは形質導入の際に存在する１つもしくは複数の組換えサイトカインの不在もしくは相違（例えば、異なるサイトカインもしくは異なる濃度）または細胞を回収もしくは収集するための異なるタイミングのうち１つまたは複数を含むが、これに限定されない方法において異なっている。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞は、リガンド、例えば、疾病または状態と関連している、例えば、腫瘍またはがんの細胞と関連している、またはその上に発現されるものに特異的に結合する、組換え受容体、例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するように操作される（例えば、節ＩＩＩを参照されたい）。一部の実施形態では、組換え受容体は、抗原に特異的に結合する細胞外リガンド結合ドメインを含有する。一部の実施形態では、組換え受容体は、抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインを含有するＣＡＲである。一部の実施形態では、リガンド、例えば、抗原は、細胞の表面上に発現されるタンパク質である。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＴＣＲ様ＣＡＲであり、抗原は、処理されたペプチド抗原、例えば、細胞内タンパク質のペプチド抗原であり、これは、ＴＣＲと同様に、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子の文脈において細胞表面で認識される。
ＣＡＲおよび組換えＴＣＲを含む例示的な組換え受容体ならびに受容体を操作し、細胞中に導入するための方法として、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０００１４２５７、ＷＯ２０１３１２６７２６、ＷＯ２０１２／１２９５１４、ＷＯ２０１４０３１６８７、ＷＯ２０１３／１６６３２１、ＷＯ２０１３／０７１１５４、ＷＯ２０１３／１２３０６１、米国特許出願公開番号ＵＳ２００２１３１９６０、ＵＳ２０１３２８７７４８、ＵＳ２０１３０１４９３３７、米国特許第６，４５１，９９５号、同７，４４６，１９０号、同８，２５２，５９２号、同８，３３９，６４５号、同８，３９８，２８２号、同７，４４６，１７９号、同６，４１０，３１９号、同７，０７０，９９５号、同７，２６５，２０９号、同７，３５４，７６２号、同７，４４６，１９１号、同８，３２４，３５３号および同８，４７９，１１８号ならびに欧州特許出願番号ＥＰ２５３７４１６に記載されるものならびに／またはSadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398；Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338；Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39；Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75によって記載されるものが挙げられる。一部の態様では、遺伝子操作された抗原受容体には、米国特許第７，４４６，１９０号に記載されるようなＣＡＲおよび国際特許出願公開番号ＷＯ／２０１４０５５６６８ Ａ１に記載されるものが含まれる。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の操作された細胞は、腫瘍抗原に結合する組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）を含有する。一部の実施形態では、組換え受容体は、がんと関連する、および／またはユニバーサルタグ上に存在する抗原を特異的に認識および／または標的とする。一部の実施形態では、組換え受容体によって認識される、または標的化される抗原は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＲＯＲ１、炭酸脱水酵素９（ＣＡＩＸ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（受容体チロシンキナーゼｅｒｂＢ２）、Ｌ１－ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡおよびＢ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、上皮糖タンパク質２（ＥＰＧ－２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＰＧ－４０）、ＥＰＨａ２、ｅｒｂ－Ｂ２、ｅｒｂ－Ｂ３、ｅｒｂ－Ｂ４、ｅｒｂＢ二量体、ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、ＦＣＲＬ５、ＦＣＲＨ５、胎児アセチルコリン受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＩＬ－２２Ｒ－アルファ、ＩＬ－１３Ｒ－アルファ２、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ｋｄｒ）、カッパ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１－細胞接着分子、（Ｌ１－ＣＡＭ）、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ６、黒色腫の優先的に発現される抗原（ＰＲＡＭＥ）、サバイビン、ＴＡＧ７２、Ｂ７－Ｈ６、ＩＬ－１３受容体アルファ２（ＩＬ－１３Ｒａ２）、ＣＡ９、ＧＤ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ－ＡＩ ＭＡＧＥ Ａｌ、ＨＬＡ－Ａ２ ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＣＡ、葉酸受容体－ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ａｖｂ６インテグリン、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、デュアル抗原、がん－精巣抗原、メソテリン、マウスＣＭＶ、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００、がん胎児性抗原、ＲＯＲ１、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ－Ｒ２、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ｃ－Ｍｅｔ、ＧＤ－２、Ｏ－アセチル化ＧＤ２（ＯＧＤ２）、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）、サイクリン、サイクリンＡ２、ＣＣＬ－１、ＣＤ１３８、適宜、前記のもののいずれかのヒト抗原；病原体特異的抗原である。一部の実施形態では、組換え受容体によって認識および／または標的化される抗原は、ノッチ１、ノッチ２、ノッチ３、ノッチ４、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）、エフリンＢ２、ベータグリカン（ＴＧＦＢＲ３）、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＬ１６、デルタ１、Ｅ－カドヘリン、Ｎ－カドヘリン、ＨＬＡ－Ａ２、ＩＦＮａＲ２、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ６Ｒおよびアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）からなる群から選択される。
一部の実施形態では、組換え受容体によって認識および標的化される抗原は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）である。ＢＣＭＡを標的とする、または特異的に結合する、例示的な抗原結合ドメインおよびこのような抗原結合ドメインを含有するＣＡＲは公知である、例えば、ＷＯ２０１６／０９０３２０、ＷＯ２０１６０９０３２７、ＷＯ２０１０１０４９４９Ａ２およびＷＯ２０１７１７３２５６を参照されたい。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＢＣＭＡに特異的な抗体または抗体断片に由来するＶＨおよびＶＬを含有するｓｃＦｖである。一部の実施形態では、ＢＣＭＡに結合する抗体または抗体断片は、国際特許出願、公開番号ＷＯ２０１６／０９０３２７およびＷＯ２０１６／０９０３２０に示される抗体または抗体断片に由来するＶＨおよびＶＬであるか、またはそれを含有する。
上記のように、アッセイは、複数のインキュベーションを含む場合があり、各インキュベーションは、組換え受容体刺激剤に対する治療用細胞組成物の操作された細胞の異なる調整された比率を含有する培養である、または逆もまた同様であり、組換え受容体依存性活性を刺激するように操作された細胞の組換え受容体を刺激することが可能である。アッセイにおいて調整された応答を達成するために治療用細胞組成物の細胞および受容体刺激剤の正確な範囲または量を経験的に決定することは、当業者のレベル内である。例えば、数または量は、アッセイの特定の形式、例えば、アッセイが実行される容器のサイズに応じて変わるであろう。量は、アッセイが、より大きな表面積を有する容器においてよりも小さい表面積を有する容器中で実施される場合に、少ないであろうということは理解される。通常、細胞の量は、細胞が２５％コンフルエントまたは５０％コンフルエント以下等のサブコンフルエントであるものである。さらに、比率の特定の範囲は、利用されている特定の抗原および標的細胞に応じて経験的に決定できる。例えば、選択された比率は、参照標準の複数の調整された量にわたる組換え受容体依存性活性における線形用量反応増大を含むものである。一部の実施形態では、比率は、参照標準の、それぞれ最小および最大応答を表す受容体依存性活性の下側漸近線および受容体依存性活性の上側漸近線を含むようにも選択される。
一部の実施形態では、結合分子の量または濃度が一定に維持されながら、治療用細胞組成物の操作された細胞の数が変更されて、異なる比率を生成する。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞数は、インキュベーションにわたって、１×１０４～１×１０６個細胞、１×１０４～９×１０５個細胞、１×１０４～８×１０５個細胞、１×１０４～７×１０５個細胞、１×１０４～６×１０５個細胞、１×１０４～５×１０５個細胞、１×１０４～４×１０５個細胞、１×１０４～３×１０５個細胞、１×１０４～２×１０５個細胞、１×１０４～１×１０５個細胞、１×１０４～９×１０４個細胞、１×１０４～８×１０４個細胞、１×１０４～７×１０４個細胞、１×１０４～６×１０４個細胞、１×１０４～５×１０４個細胞、１×１０４～４×１０４個細胞、１×１０４～３×１０４個細胞、１×１０４～２×１０４個細胞または約１×１０４～約１×１０６個細胞、約１×１０４～約９×１０５個細胞、約１×１０４～約８×１０５個細胞、約１×１０４～約７×１０５個細胞、約１×１０４～約６×１０５個細胞、約１×１０４～約５×１０５個細胞、約１×１０４～約４×１０５個細胞、約１×１０４～約３×１０５個細胞、約１×１０４～約２×１０５個細胞、約１×１０４～約１×１０５個細胞、約１×１０４～約９×１０４個細胞、約１×１０４～約８×１０４個細胞、約１×１０４～約７×１０４個細胞、約１×１０４～約６×１０４個細胞、約１×１０４～約５×１０４個細胞、約１×１０４～約４×１０４個細胞、約１×１０４～約３×１０４個細胞、約１×１０４～約２×１０４個細胞で調整される。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の数は、複数のインキュベーションにわたって１×１０４～１×１０５個細胞、１×１０４～８×１０４個細胞、１×１０４～６×１０４個細胞、１×１０４～４×１０４個細胞、１×１０４～２×１０４個細胞または約１×１０４～約１×１０５個細胞、１×１０４～約８×１０４個細胞、１×１０４～約６×１０４個細胞、１×１０４～約４×１０４個細胞、１×１０４～約２×１０４個細胞で調整される。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞数は、複数のインキュベーションにわたって１０，０００または約１０，０００～１，０００，０００または約１，０００，０００個細胞で調整される。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞数は、複数のインキュベーションにわたって１０，０００または約１０，０００～５００，０００または約５００，０００個細胞で調整される。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞数は、複数のインキュベーションにわたって１０，０００または約１０，０００～２５０，０００または約２５０，０００個細胞で調整される。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞数は、複数のインキュベーションにわたって１０，０００または約１０，０００～２００，０００または約２００，０００個細胞で調整される。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞数は、複数のインキュベーションにわたって１０，０００または約１０，０００～１５０，０００または約１５０，０００個細胞で調整される。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞数は、複数のインキュベーションにわたって１０，０００または約１０，０００～１００，０００または約１００，０００個細胞で調整される。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞数は、複数のインキュベーションにわたって１０，０００または約１０，０００～５０，０００または約５０，０００個細胞で調整される。一部の実施形態では、前記のいずれかの治療用細胞組成物の細胞数は、細胞の総数、生細胞の総数、ＣＡＲ＋細胞の総数、ＣＤ８＋細胞の総数、ＣＤ４＋細胞の総数、ＣＤ３＋細胞の総数、ＣＤ８＋／ＣＡＲ＋細胞の総数、ＣＤ４＋／ＣＡＲ＋細胞の総数またはＣＤ３＋／ＣＡＲ＋細胞の総数である。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞数は一定に維持され、組換え受容体刺激剤の量は、複数のインキュベーションにわたって調整される。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の一定数は、複数のインキュベーションにわたって約１×１０４～約１×１０６個細、約１×１０４～約９×１０５個細胞、約１×１０４～約８×１０５個細胞、約１×１０４～約７×１０５個細胞、約１×１０４～約６×１０５個細胞、約１×１０４～約５×１０５個細胞、約１×１０４～約４×１０５個細胞、約１×１０４～約３×１０５個細胞、約１×１０４～約２×１０５個細胞、約１×１０４～約１×１０５個細胞、約１×１０４～約９×１０４個細胞、約１×１０４～約８×１０４個細胞、約１×１０４～約７×１０４個細胞、約１×１０４～約６×１０４個細胞、約１×１０４～約５×１０４個細胞、約１×１０４～約４×１０４個細胞、約１×１０４～約３×１０４個細胞、約１×１０４～約２×１０４個細胞の間の量である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の一定数は、複数のインキュベーションにわたって１×１０４～１×１０５個細胞、１×１０４～８×１０４個細胞、１×１０４～６×１０４個細胞、１×１０４～４×１０４個細胞、１×１０４～２×１０４個細胞または約１×１０４～約１×１０５個細胞、１×１０４～約８×１０４個細胞、１×１０４～約６×１０４個細胞、１×１０４～約４×１０４個細胞、１×１０４～約２×１０４個細胞の量である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の一定数は、複数のインキュベーションにわたって１０，０００または約１０，０００～１，０００，０００個細胞または約１，０００，０００個細胞の量である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の一定数は、複数のインキュベーションにわたって１０，０００または約１０，０００～５００，０００または約５００，０００個細胞の量である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の一定数は、複数のインキュベーションにわたって１０，０００または約１０，０００～２５０，０００または約２５０，０００個細胞の量である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の一定数は、複数のインキュベーションにわたって１０，０００または約１０，０００～１５０，０００または約１５０，０００個細胞の量である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の一定数は、複数のインキュベーションにわたって１０，０００または約１０，０００～１００，０００または約１００，０００個細胞の量である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の一定数は、複数のインキュベーションにわたって１０，０００または約１０，０００～５０，０００または約５０，０００個細胞の量である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の一定数は、複数のインキュベーションにわたって５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００もしくは１００，０００個細胞または約５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００もしくは１００，０００個細胞である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の一定数は、複数のインキュベーションにわたって５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００もしくは５０，０００個細胞または約５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００もしくは５０，０００個細胞である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の一定数は、複数のインキュベーションにわたって２０，０００、３０，０００、４０，０００もしくは５０，０００個細胞または約２０，０００、３０，０００、４０，０００もしくは５０，０００個細胞である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞の一定数は、複数のインキュベーションにわたって５０，０００個細胞または約５０，０００個細胞である。一部の実施形態では、前記のいずれかにおける治療用細胞組成物の細胞の一定数は、細胞の総数、生細胞の総数、ＣＡＲ＋細胞の総数、ＣＤ８＋細胞の総数、ＣＤ４＋細胞の総数、ＣＤ３＋細胞の総数、ＣＤ８＋／ＣＡＲ＋細胞の総数、ＣＤ４＋／ＣＡＲ＋細胞の総数またはＣＤ３＋／ＣＡＲ＋細胞の総数である。
Ｂ．組換え受容体刺激剤
本明細書において提供される効力を評価する方法は、治療用細胞組成物の操作された細胞の組換え受容体（例えば、ＣＡＲ、ＴＣＲ）を刺激する手段を含む。例えば、刺激手段に対する治療用細胞組成物の細胞の異なる比率を生成するために、定量化される、および送達されることが可能である組換え受容体を刺激するのに適した任意の手段を使用してもよいということが企図される。一部の実施形態では、組換え受容体の刺激の手段は、節Ｉ－Ｃに記載されるものなど、組換え受容体によって細胞内シグナルに結合し、刺激し、組換え受容体依存性活性を生成できる組換え受容体刺激剤によって達成される。例示的な組換え受容体刺激剤として、組換え受容体の抗原（例えば、精製抗原または組換え抗原）、抗イディオタイプ抗体などの抗体および抗原発現細胞が挙げられる。
上記のように、一部の実施形態では、組換え受容体刺激剤に対する治療用細胞組成物の細胞の異なる調整された比率の複数のインキュベーションを、治療用細胞組成物の一定数の細胞（例えば、生細胞、ＣＡＲ＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋／ＣＡＲ＋、ＣＤ８＋／ＣＡＲ＋、ＣＤ３＋／ＣＡＲ＋細胞）を、変動する量または調整された量（例えば、濃度、質量）の組換え受容体刺激剤と共に培養することによって達成することができる。一部の実施形態では、組換え受容体刺激剤の量または濃度は、複数のインキュベーションにわたって１０，０００倍、５，０００倍、１，０００倍、１，５００倍、５００倍、２５０倍、２００倍、１５０倍、１００倍、７５倍、５０倍、２５倍もしくは１０倍または約１０，０００倍、５，０００倍、１，０００倍、１，５００倍、５００倍、２５０倍、２００倍、１５０倍、１００倍、７５倍、５０倍、２５倍もしくは１０倍で変更される、または調整される。一部の実施形態では、組換え受容体刺激剤の量または濃度は、複数のインキュベーションにわたって１０，０００～１００倍、５，０００～１００倍もしくは１，０００～１００倍または約１０，０００～１００倍、５，０００～１００倍もしくは１，０００～１００倍の間で変更される、または調整される。一部の実施形態では、組換え受容体刺激剤の量または濃度は、複数のインキュベーションにわたって５，０００倍、１，０００倍、１，５００倍もしくは５００倍または約５，０００倍、１，０００倍、１，５００倍もしくは５００倍で変更される、または調整される。一部の実施形態では、組換え受容体刺激剤の量または濃度は、複数のインキュベーションにわたって５，０００倍または約５，０００倍で変更される、または調整される。一部の実施形態では、組換え受容体刺激剤の量または濃度は、複数のインキュベーションにわたって１，０００倍または約１，０００倍で変更される、または調整される。一部の実施形態では、組換え受容体刺激剤の量または濃度は、複数のインキュベーションにわたって５００倍または約５００倍で変更される、または調整される。
１．結合分子および表面固定化
特定の実施形態では、組換え受容体によって結合されることが可能である結合分子（または標的）から構成される。一部の実施形態では、結合分子は、表面支持体上に固定化されている。提供される実施形態では、結合分子は、組換え受容体の抗原または抗原の一部分（例えば、抗原の細胞外部分）または組換え受容体に対して特異的な抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体）であり得る。例えば、結合分子（例えば、抗原またはその結合部分または抗イディオタイプ抗体）は、表面支持体、例えば、非細胞粒子に固定化または結合される場合があり、治療用組成物の組換え受容体を発現する細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）、例えば、細胞の調整された量が、表面支持体と接触される。一部の実施形態では、本明細書で記載される粒子（例えば、ビーズ粒子）は、結合分子（例えば、抗原またはその結合部分、または抗イディオタイプ抗体）が、結合分子と細胞間の相互作用、特に、結合分子と細胞の表面上に発現される組換え受容体、例えば、ＣＡＲの間の結合を可能にする方法で結合または付着されることができる固体支持体またはマトリックスを提供する。特定の実施形態では、コンジュゲートされた、または付着された結合分子と、細胞の間の相互作用が、１つまたは複数の組換え受容体依存性活性、例えば、活性化、拡大、サイトカイン生成、細胞毒性活性または例えば、節Ｉ．Ｃに記載される他の活性を含む組換え受容体の刺激を媒介する。
ある特定の実施形態では、表面支持体は、結合分子（例えば、抗原またはその結合部分、または抗イディオタイプ抗体）が固定化または付着される粒子（例えば、ビーズ粒子）である。一部の実施形態では、表面支持体は固体支持体である。一部の例では、固体支持体は、ビーズであり、抗原または部分は、ビーズ上に固定化される。一部の実施形態では、固体支持体は、ウェルまたはプレート、例えば、細胞培養プレートの表面である。一部の実施形態では、表面支持体は、可溶性オリゴマー粒子であり、抗原は、可溶性オリゴマー粒子の表面に上に固定化されている。組換え受容体への認識または結合のための薬剤（例えば、結合分子）の固定化または付着のため表面支持体の例は、公開国際出願ＷＯ２０１９／０２７８５０に見出すことができ、これは、全ての目的のために参照により組み込まれる。
特定の実施形態では、表面支持体は、コロイド粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、ビーズ、例えば、磁性ビーズ等を含み得る粒子である。一部の実施形態では、粒子またはビーズは、生体適合性、すなわち、非毒性である。ある特定の実施形態では、粒子またはビーズは、培養細胞、例えば、培養Ｔ細胞に対して非毒性である。特定の実施形態では、粒子は単分散である。ある特定の実施形態では、「単分散」は、５％未満の標準偏差を有する、例えば、直径において５％未満の標準偏差を有するサイズ分散を有する粒子（例えば、ビーズ粒子）を包含する。
一部の実施形態では、粒子またはビーズは、生体適合性である、すなわち、生物学的使用に適している材料から構成されている。一部の実施形態では、粒子、例えば、ビーズは、培養細胞、例えば、培養Ｔ細胞にとって非毒性である。一部の実施形態では、粒子、例えば、ビーズは、結合分子と細胞間の相互作用を可能にする方法で結合分子を付着することが可能である任意の粒子であり得る。ある特定の実施形態では、粒子、例えば、ビーズは、粒子の表面での結合分子の付着を可能にするために、改変され得る、例えば、表面官能基付与され得る任意の粒子であり得る。一部の実施形態では、粒子、例えば、ビーズは、ガラス、シリカ、ヒドロキシカルボン酸のポリエステル、ジカルボン酸のポリ酸無水物またはヒドロキシカルボン酸およびジカルボン酸のコポリマーから構成される。一部の実施形態では、粒子、例えば、ビーズは、直鎖もしくは分岐、置換もしくは非置換、飽和もしくは不飽和の線形もしくは架橋された、アルカニル、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、アラルケニル、ヘテロアリールもしくはアルコキシヒドロキシ酸のポリエステル、または直鎖もしくは分岐、置換もしくは非置換、飽和もしくは不飽和の、線形もしくは架橋された、アルカニル、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、アラルケニル、ヘテロアリールもしくはアルコキシジカルボン酸のポリ酸無水物から構成される場合がある、または少なくとも部分的にそれから構成される場合がある。さらに、粒子、例えば、ビーズは、量子ドットであり得る、または量子ドット、例えば、量子ドットポリスチレン粒子、例えば、ビーズから構成される場合がある。エステルおよび無水物結合（例えば、グリコール酸およびセバシン酸のコポリマー）の混合物を含む粒子、例えば、ビーズも、採用され得る。例えば、粒子、例えば、ビーズは、ポリグリコール酸ポリマー（ＰＧＡ）、ポリ乳酸ポリマー（ＰＬＡ）、ポリセバシン酸ポリマー（ＰＳＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）コポリマー（ＰＬＧＡ）、［ｒｈｏ］ポリ（乳酸－コ－セバシン酸）コポリマー（ＰＬＳＡ）、ポリ（グリコール酸－コ－セバシン酸）コポリマー（ＰＧＳＡ）等を含む材料を含み得る。粒子、例えば、ビーズを構成できる他のポリマーとして、カプロラクトン、炭酸、アミド、アミノ酸、オルトエステル、アセタール、シアノアクリレートおよび分解性ウレタンのポリマーまたはコポリマーならびにこれらの、直鎖もしくは分岐、置換もしくは非置換、アルカニル、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アルケニルもしくは芳香族ヒドロキシ－もしくはジカルボン酸とのコポリマーが挙げられる。さらに、反応性側鎖基、例えば、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシンおよびシステインまたはその鏡像異性体を有する生物学的に重要なアミノ酸が、上記の材料のいずれかとのコポリマー中に含まれ、結合分子、例えば、ポリペプチド抗原または抗体へコンジュゲートするための反応性基を提供する場合がある。
一部の実施形態では、粒子は、０．００１μｍより大きい、０．０１μｍより大きい、０．０５μｍより大きい、０．１μｍより大きい、０．２μｍより大きい、０．３μｍより大きい、０．４μｍより大きい、０．５μｍより大きい、０．６μｍより大きい、０．７μｍより大きい、０．８μｍより大きい、０．９μｍより大きい、１μｍより大きい、２μｍより大きい、３μｍより大きい、４μｍより大きい、５μｍより大きい、６μｍより大きい、７μｍより大きい、８μｍより大きい、９μｍより大きい、１０μｍより大きい、２０μｍより大きい、３０μｍより大きい、４０μｍより大きい、５０μｍより大きい、１００μｍより大きい、５００μｍより大きいおよび／または１，０００μｍより大きい直径を有するビーズである。一部の実施形態では、粒子またはビーズは、各々境界を含めて、０．００１μｍから１，０００μｍ、０．０１μｍから１００μｍ、０．１μｍから１０μｍ、０．１μｍから１００μｍ、０．１μｍから１０μｍ、０．００１μｍから０．０１μｍ、０．０１μｍから０．１μｍ、０．１μｍから１μｍ、１μｍから１０μｍ、１μｍから２μｍ、２μｍから３μｍ、３μｍから４μｍ、４μｍから５μｍ、１μｍから５μｍおよび／もしくは５μｍから１０μｍの間または約０．００１μｍから約１，０００μｍ、約０．０１μｍから約１００μｍ、約０．１μｍから約１０μｍ、約０．１μｍから約１００μｍ、約０．１μｍから約１０μｍ、約０．００１μｍから約０．０１μｍ、約０．０１μｍから約０．１μｍ、約０．１μｍから約１μｍ、約１μｍから約１０μｍ、約１μｍから約２μｍ、約２μｍから約３μｍ、約３μｍから約４μｍ、約４μｍから約５μｍ、約１μｍから約５μｍおよび／または約５μｍから約１０μｍの直径を有する。ある特定の実施形態では、粒子またはビーズは、各々境界を含めて１μｍおよび１０μｍの平均直径を有する。ある特定の実施形態では、粒子、例えば、ビーズは、１μｍまたは約１μｍの直径を有する。特定の実施形態では、粒子、例えば、ビーズは、２．８μｍまたは約２．８μｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、粒子、例えば、ビーズは、４．８μｍまたは約４．８μｍの直径を有する。
本明細書で記載される方法において使用される粒子（例えば、ビーズ粒子）は、商業的に生成し、入手することができる。粒子、例えば、ビーズは、粒子、例えば、ビーズを生成する方法を含めて当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第６，０７４，８８４号；同５，８３４，１２１号；同５，３９５，６８８号；同５，３５６，７１３号；同５，３１８，７９７号；同５，２８３，０７９号；同５，２３２，７８２号；同５，０９１，２０６号；同４，７７４，２６５号；同４，６５４，２６７号；同４，５５４，０８８号；同４，４９０，４３６号；同４，４５２，７７３号；米国特許出願公開第２０１００２０７０５１号；およびSharpe, Pau T., Methods of Cell Separation, Elsevier, 1988を参照されたい。市販の粒子、例えば、ビーズ（例えば、ビーズ粒子）として、ＰｒｏＭａｇＴＭ（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）；ＣＯＭＰＥＬＴＭ（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）；ＢｉｏＭａｇ（登録商標）Ｐｌｕｓ（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）およびＢｉｏＭａｇ（登録商標）Ｍａｘｉ（Ｂａｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を含むＢｉｏＭａｇ（登録商標）（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）；Ｍ－ＰＶＡ（Ｃｅｈｍａｇｅｎ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ＡＧ）；ＳｉＭＡＧ（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ ＧｍｂＨ）；ｂｅａｄＭＡＧ（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ ＧｍｂＨ）；ＭａｇａＰｈａｓｅ（登録商標）（Ｃｏｒｔｅｘ Ｂｉｏｃｈｅｍ）；Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ－２８０ヒツジ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） ＦｌｏｗＣｏｍｐＴＭ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＦｌｏｗＣｏｍｐＴＭＨｕｍａｎ ＣＤ３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ－４５０（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ－４５０トシル活性化、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＵｎｔｏｕｃｈｅｄＴＭ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） ＵｎｔｏｕｃｈｅｄＴＭ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８ Ｔ Ｃｅｌｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＴ細胞に結合し、拡大し、および／または活性化するＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ ｆｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；Ｅｓｔａｐｏｒ（登録商標）Ｍ（Ｍｅｒｋ Ｃｈｉｍｉｅ ＳＡＳ）；Ｅｓｔａｐｏｒ（登録商標）ＥＭ（Ｍｅｒｋ Ｃｈｉｍｉｅ ＳＡＳ）；ＭＡＣＳｉＢｅａｄｓＴＭ粒子（例えば、抗ビオチンＭＡＣＳｉＢｅａｄ粒子、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９１－１４７）；Ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒ（登録商標）磁性ビーズ（ＩＢＡ ＢｉｏＴＡＧｎｏｌｏｇｙ）；Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）磁性ビーズ（ＩＢＡ ＢｉｏＴＡＧｎｏｌｏｇｙ）；Ｓｉｃａｓｔａｒ（登録商標）－Ｍ（Ｍｉｃｏｒｍｏｄ Ｐａｒｔｉｋｅｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ＧｍｂＨ）Ｍｉｃｒｏｍｅｒ（登録商標）－Ｍ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ Ｐａｒｔｉｋｅｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）；ＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＧｍｂＨ）；ＭＧＰ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）；Ｐｉｅｒｃｅ（商標）プロテインＧ磁性ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）；Ｐｉｅｒｃｅ（商標）プロテインＡ磁性ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）；Ｐｉｅｒｃｅ（商標）プロテインＡ／Ｇ磁性ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）；Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＮＨＳ活性化磁性ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）；Ｐｉｅｒｃｅ（商標）プロテインＬ磁性ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）；Ｐｉｅｒｃｅ（商標）抗ＨＡ磁性ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）；Ｐｉｅｒｃｅ（商標）抗ｃ－Ｍｙｃ磁性ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）； Ｐｉｅｒｃｅ（商標）グルタチオン磁性ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）；Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ストレプトアビジン磁性ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）；ＭａｇｎａＢｉｎｄＴＭ磁性ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）；Ｓｅｒａ－ＭａｇＴＭ磁性ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）；抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２磁性ビーズ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）；ＳＰＨＥＲＯＴＭ磁性粒子（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）；およびＨｉｓＰｕｒＴＭ Ｎｉ－ＮＴＡ磁性ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、抗原またはその細胞外ドメイン部分は、共有結合化学結合を介して粒子（例えば、ビーズ）に結合される。特定の実施形態では、抗原またはその細胞外ドメイン部分のアミノ酸の反応性基または部分は、直接化学反応によって粒子の表面上の反応性基または部分に直接的にコンジュゲートされる。ある特定の実施形態では、抗原またはその細胞外結合部分のアミノ酸カルボキシル基（例えば、Ｃ末端カルボキシル基）、ヒドロキシル、チオールまたはアミン基（例えば、アミノ酸側鎖基）は、直接化学反応によって、ＰＬＡまたはＰＧＡポリマーのヒドロキシルまたはカルボキシル基、デンドリマーの末端アミンもしくはカルボキシル基、または粒子の表面上のリン脂質のヒドロキシル、カルボキシルもしくはホスフェート基に直接的にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、コンジュゲート部分は、結合分子および粒子の両方にコンジュゲートし、例えば、共有結合によって結合し、それによって、それらを一緒に連結する。
ある特定の実施形態では、粒子の表面は、結合分子（例えば、ポリペプチド抗原または抗体）の付着（例えば、共有結合、非共有結合）を可能にする化学部分および／または官能基を含む。特定の実施形態では、粒子表面は、露出した官能基を含有する。適した表面に露出した官能基として、カルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、硫酸塩基、トシル、エポキシおよびクロロメチル基が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、結合分子は、ポリペプチドであり、表面に露出した官能基にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、表面に露出した官能基は、活性化されなければならない、すなわち、化学反応を受けて、ポリペプチドに直接結合することを可能にする中間生成物をもたらさなければならない。例えば、ポリペプチド分子のカルボキシル基は、上記の薬剤を用いて活性化されて、粒子の表面に露出したアミノ基に直接結合することが可能な中間体エステルを生成し得る。他の例では、支持体表面（例えば、ビーズ）の表面上の遊離アミン基は、スルホスクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ－ＳＩＡＢ）化学を使用して抗原ペプチドおよびタンパク質または抗原ペプチドもしくはタンパク質融合タンパク質に共有結合によって結合され得る。さらに他の特定の実施形態では、ポリペプチド結合分子は、共有結合による付着の前に薬剤による活性化を必要としない表面に露出された官能基で粒子、例えば、ビーズ粒子に共有結合によって結合される。このような官能基の例として、トシル、エポキシおよびクロロメチル基が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、抗原ペプチドまたはタンパク質に結合されたリガンドと、表面支持体（例えば、ビーズ）に付着した抗リガンドの間の非共有結合による結合は、抗原を支持体（例えば、ビーズ）にコンジュゲートし得る。一部の実施形態では、ビオチンリガーゼ認識配列タグが、抗原ペプチドまたはタンパク質のＣ末端に接合される場合があり、このタグは、ビオチンリガーゼによってビオチン化され得る。次いで、ビオチンはリガンドとして働き、抗原ペプチドまたはタンパク質を、抗リガンドとして担体の表面に吸着される、またはそうでなければ結合されるアビジンまたはストレプトアビジンに非共有結合によってコンジュゲートし得る。あるいは、結合分子（例えば、抗原）が本明細書で記載されるようなＦｃ領域を有する免疫グロブリンドメインに融合される場合には、Ｆｃドメインは、リガンドとして作用することができ、表面支持体（例えば、ビーズ）の表面に共有結合によって、または非共有結合によって結合されたプロテインＡは、抗リガンドとして働き、抗原ペプチドまたはタンパク質を担体に非共有結合によってコンジュゲートすることができる。他の手段は当該技術分野で周知であり、結合分子（例えば、抗原または抗イディオタイプ抗体）を表面支持体に非共有結合によってコンジュゲートするために（例えば、ビーズ）金属イオンキレート化技術を含む（例えば、結合分子、例えば、抗原のＣ末端でのポリ－ＨｉｓタグおよびＮｉコーティングされた表面支持体を使用して）これを採用してもよく、これらの方法は、本明細書で記載されるものと置換されてもよい。
一部の実施形態では、結合分子（例えば、抗原または抗イディオタイプ抗体）は、リンカーによって粒子にコンジュゲートされる。ある特定の実施形態では、リンカーとして、様々な二機能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－ｌ－カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアネート）およびビス－活性フッ素化合物（例えば、ｌ，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を挙げることができるが、これらに限定されない。特定のカップリング剤として、ジスルフィド結合を提供する、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびＮ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が挙げられる。
ａ．抗原
一部の実施形態では、組換え受容体刺激剤は、抗原、例えば、組換え抗原またはその断片である、またはそれを含む。例えば、組換え受容体刺激剤は、例えば、上記で記載されるように、表面支持体、例えば、マイクロウェルプレート、固体粒子（例えば、ビーズ）またはオリゴマー粒子に固定化または結合される抗原であり得る。一部の実施形態では、抗原は、疾病と関連している細胞、例えば、がん細胞および／または腫瘍細胞の表面上で発現される、ポリペプチドまたはポリペプチドの変異体もしくは断片である。抗原は、組換え受容体の細胞外ドメインによって認識または結合される抗原であるということは理解される。当業者ならば、組換え受容体を刺激するのに十分な抗原および抗原の形式（例えば、固体表面で発現される、またはその上に固定化されている細胞）を決定できる。
一部の実施形態では、抗原は、αｖβ６インテグリン（ａｖｂ６インテグリン）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、炭酸脱水酵素９（ＣＡ９、またＣＡＩＸまたはＧ２５０としても公知）、がん精巣抗原、がん／精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ、またＮＹ－ＥＳＯ－１およびＬＡＧＥ－２としても公知）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、サイクリン、サイクリンＡ２、Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＣＬ－１）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、上皮増殖因子タンパク質（ＥＧＦＲ）、ＩＩＩ型上皮増殖因子受容体突然変異（ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＰＧ－２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＰＧ－４０）、エフリンＢ２、エフリン受容体Ａ２（ＥＰＨａ２）、エストロゲン受容体、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５；またＦｃ受容体ホモログ５またはＦＣＲＨ５としても公知）、胎児アセチルコリン受容体（胎児ＡｃｈＲ）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドＧＤ２、Ｏ－アセチル化ＧＤ２（ＯＧＤ２）、ガングリオシドＧＤ３、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、Ｇタンパク質共役受容体５Ｄ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（受容体チロシンキナーゼｅｒｂ－Ｂ２）、Ｈｅｒ３（ｅｒｂ－Ｂ３）、Ｈｅｒ４（ｅｒｂ－Ｂ４）、ｅｒｂＢ二量体、ヒト高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、Ｂ型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原Ａ１（ＨＬＡ－Ａ１）、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）、ＩＬ－２２受容体アルファ（ＩＬ－２２Ｒα）、ＩＬ－１３受容体アルファ２（ＩＬ－１３Ｒα２）、キナーゼインサートドメイン受容体（ｋｄｒ）、カッパ軽鎖、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、Ｌ１－ＣＡＭのＣＥ７エピトープ、ロイシンリッチリピート含有８ファミリーメンバーＡ（ＬＲＲＣ８Ａ）、ルイスＹ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ１０、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ｃ－Ｍｅｔ、マウスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ１６、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンド、メランＡ（ＭＡＲＴ－１）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、腫瘍胎児性抗原、黒色腫優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（ＴＰＢＧ、また５Ｔ４としても公知）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ１、またＴＹＲＰ１またはｇｐ７５としても公知）、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２、またドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムデルタイソメラーゼまたはＤＣＴとしても公知）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）、病原体特異的な、もしくは病原体によって発現される抗原、またはユニバーサルタグと会合した抗原、および／またはビオチン化分子、および／またはＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶもしくは他の病原体によって発現される分子であるかまたはそれらを含む。一部の実施形態では受容体により標的化される抗原は、Ｂ細胞悪性腫瘍に関連する抗原、例えばいくつかの公知のＢ細胞マーカーのいずれかを含む。一部の実施形態では、抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＣＤ４５、ＣＤ２１、ＣＤ５、ＣＤ３３、Ｉｇカッパ、Ｉｇラムダ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂまたはＣＤ３０である、またはそれを含む。
一部の実施形態では、抗原は、組換え受容体、例えば、ＣＡＲによって認識される、またはそれによって結合されるポリペプチド抗原の一部分である、またはそれを含む。特定の実施形態では、抗原の部分は、組換え受容体、例えば、ＣＡＲによって認識される、またはそれによって結合されるエピトープを含有する領域である。ある特定の実施形態では、ポリペプチド抗原の部分は、組換え受容体およびまたはＣＡＲによって認識される、またはそれによって結合されるポリペプチドの、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、４００もしくは５００個のアミノ酸を含有し、または少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、４００もしくは５００個のアミノ酸、一部の場合には、連続するアミノ酸を含有する。ある特定の実施形態では、ポリペプチド部分は、組換え受容体および／またはＣＡＲによって認識されるエピトープのアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、抗原または部分は、組換え受容体および／またはＣＡＲによって結合される、および／またはそれによって認識されるポリペプチドに対して、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％のアミノ酸配列同一性を含有し、または少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％のアミノ酸配列同一性を含有するポリペプチド変異体である。
ある特定の実施形態では、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）の細胞外ドメインは、ＢＣＭＡに対して特異的である、またはそれに結合し、抗原はＢＣＭＡである、またはＢＣＭＡの細胞外ドメイン部分である。一部の実施形態では、ＢＣＭＡポリペプチドは、哺乳動物ＢＣＭＡポリペプチドである。特定の実施形態では、ＢＣＭＡポリペプチドは、ヒトＢＣＭＡポリペプチドである。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ抗原は、抗原受容体、例えば、ＣＡＲによって認識されるエピトープを含む、ＢＣＭＡの細胞外ドメインまたはその一部分である、またはそれを含む。ある特定の実施形態では、ＢＣＭＡ抗原は、配列番号１３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高いの配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１３の少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０もしくは少なくとも１８０個の連続するアミノ酸を含有するその断片である、またはそれを含む。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ抗原は、配列番号１３に示される配列または抗原受容体、例えば、ＣＡＲによって認識されるエピトープである、またはそれを含有するその一部分である、またはそれを含む。
ある特定の実施形態では、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）の細胞外ドメインは、ＲＯＲ１に対して特異的である、またはそれに結合し、抗原は、ＲＯＲ１である、またはＲＯＲ１の細胞外ドメイン部分である。ある特定の実施形態では、ＲＯＲ１ポリペプチドは哺乳動物である。特定の実施形態では、ＲＯＲ１ポリペプチドはヒトである。一部の実施形態では、抗原はＲＯＲ１の細胞外ドメインまたは抗原受容体、例えば、ＣＡＲによって認識されるエピトープを含むその一部分である。一部の実施形態では、抗原は、配列番号１９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１９の少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０もしくは少なくとも１８０個の連続するアミノ酸を含有するその断片を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ＲＯＲ１抗原は、配列番号１９に示される配列または抗原受容体、例えば、ＣＡＲによって認識されるエピトープを含むその一部分を含む。
ある特定の実施形態では、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）の細胞外ドメインは、ＣＤ２２に対して特異的であるか、またはそれに結合し、抗原は、ＣＤ２２であるか、またはＣＤ２２の細胞外ドメイン部分である。ある特定の実施形態では、ＣＤ２２ポリペプチドは、哺乳動物である。特定の実施形態では、ＣＤ２２ポリペプチドはヒトである。一部の実施形態では、抗原は、ＣＤ２２の細胞外ドメインまたは抗原受容体、例えば、ＣＡＲによって認識されるエピトープを含むその一部分である。一部の実施形態では、抗原は、配列番号１４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１４の少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０もしくは少なくとも１８０個の連続するアミノ酸を含有するその断片を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ＣＤ２２抗原は、配列番号１４に示される配列または抗原受容体、例えば、ＣＡＲによって認識されるエピトープを含むその部分を含む。
ある特定の実施形態では、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）の細胞外ドメインは、ＣＤ１９に対して特異的である、またはそれに結合し、抗原は、ＣＤ１９である、またはＣＤ１９の細胞外ドメイン部分である。ある特定の実施形態では、ＣＤ１９ ポリペプチドは哺乳動物である。特定の実施形態では、ＣＤ１９ポリペプチドはヒトである。一部の実施形態では、抗原はＣＤ１９の細胞外ドメインまたは抗原受容体、例えば、ＣＡＲによって認識されるエピトープを含むその一部分である。一部の実施形態では、抗原は、配列番号１５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１５の少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０もしくは少なくとも１８０個の連続するアミノ酸を含有するその断片を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ＣＤ１９抗原は、配列番号１５に示される配列または抗原受容体、例えば、ＣＡＲによって認識されるエピトープを含むその部分を含む。
一部の実施形態では、抗原またはその部分は、組換え受容体、例えば、抗原受容体（例えば、ＣＡＲ）によって認識される、および／または結合される２つまたはそれより多いポリペプチド抗原またはその部分または変異体を含む多量体、例えば、二量体として形式を合わせられる。一部の実施形態では、ポリペプチド抗原またはその部分は同一である。ある特定の実施形態では、ポリペプチド抗原は、領域またはドメイン、例えば、多量体化ドメインに直接的にまたは間接的に連結され、これは、ドメインまたは領域の間の相補的相互作用によって２つまたはそれより多いポリペプチド抗原の間の相互作用を促進または安定化する。一部の実施形態では、ポリペプチド抗原を多量体、例えば、二量体として提供することは、抗原またはその細胞外ドメイン部分と、抗原受容体、例えば、ＣＡＲの抗原結合ドメインの間の多価相互作用を提供し、これは、一部の態様では、相互作用の結合力を増大する場合がある。一部の実施形態では、ビーズにコンジュゲートされた抗原またはその細胞外ドメイン部分による、増大された結合力は、抗原受容体、例えば、ＣＡＲの刺激活性またはアゴニスト活性に好都合であり得る。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、多量体化ドメインに直接的にまたは間接的に接合される。例示的な多量体化ドメインは、免疫グロブリン配列またはその部分、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域および適合しているタンパク質－タンパク質相互作用ドメインを含む。多量体化ドメインは、例えば、免疫グロブリン定常領域またはドメイン、例えば、ＦｃドメインまたはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＭを含むＩｇＧ由来のその部分およびその改変型であり得る。特定の実施形態では、ポリペプチド抗原は、Ｆｃドメインに直接的または間接的に連結される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチド抗原またはその部分およびＦｃドメインを含む融合ポリペプチドである。
特定の実施形態では、抗原またはその細胞外ドメイン部分は、Ｆｃドメインを含む融合ポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＡまたはＩｇＤアイソタイプの重鎖の第２および第３の定常ドメイン（すなわち、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤアイソタイプのＣＨ２またはＣＨ３から構成される。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＭまたはＩｇＥアイソタイプの３つの重鎖定常ドメイン（すなわち、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメイン）から構成される。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジ配列またはその部分をさらに含み得る。ある特定の態様では、Ｆｃドメインは、免疫グロブリン分子のヒンジドメインの一部もしくは全てならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有する。一部の場合には、Ｆｃドメインは、１つまたは複数のジスルフィド結合によって接合された２つのポリペプチド鎖の二量体を形成し得る。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、適した哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジまたはサル）の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＥ）に由来する。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ポリペプチド抗原のＣ末端に融合される。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ポリペプチド抗原のＮ末端に融合される。
一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメインまたはその部分または変異体である。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列または配列番号１６に示される配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性であるアミノ酸配列を含む、ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインまたはその部分または変異体である。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインまたはその部分または変異体である。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインの変異体である。
一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、変異体Ｆｃドメインを含む。ある特定の実施形態では、変異体ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインと軽鎖の間の対形成を低減する、低下させる、および／または減少する突然変異、例えば、置換、欠失または挿入を含有する。一部の実施形態では、変異体ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、ＦｃドメインとＦｃ受容体間の結合親和性を低減する突然変異を含有する。特定の実施形態では、変異体ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、ＦｃドメインとＦｃ受容体の間の相互作用または相互作用の確率もしくは可能性を低減する、低下させる、および／または減少する突然変異を含有する。一部の実施形態では、変異体ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインと補体システムのタンパク質の間の結合親和性を低減する突然変異を含有する。特定の実施形態では、変異体ヒトｇＧ Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインと補体システムのタンパク質の間の相互作用、または相互作用の確率もしくは可能性を低減する、低下させる、および／または減少する突然変異を含有する。
一部の実施形態では、抗原またはその部分は、変異体ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインに連結される。一部の実施形態では、変異体ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインのヒンジ領域においてシステインのセリンへの置換を含有する。一部の実施形態では、変異体ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインのヒンジ領域におけるロイシンのアラニンへの置換を含有する。特定の実施形態では、変異体ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、ヒンジ領域におけるグリシンのアラニンへの置換を含有する。ある特定の実施形態では、変異体ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、ＦｃドメインのＣＨ２領域におけるアラニンのセリンへの置換を含有する。一部の実施形態では、変異体ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、ＦｃドメインのＣＨ２領域においてプロリンのセリンへの置換を含む。一部の実施形態では、変異体ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、抗原またはその細胞外ドメイン部分は、Ｆｃドメインを含む融合ポリペプチドとして提供され、Ｆｃドメインは、融合ポリペプチドのＣ末端に存在する。
一部の実施形態では、抗原および多量体化ドメイン、例えば、Ｆｃドメインは、リンカー、例えば、アミノ酸リンカーによって接続される。ある特定の実施形態では、抗原は、アミノ酸リンカーのＮ末端に融合され、Ｆｃドメインなどの多量体化ドメインは、リンカーのＣ末端に融合される。アミノ酸リンカーは、任意の長さであり、アミノ酸の任意の組合せを含有する場合があるが、リンカー長は、連結されたドメイン間の相互作用を低減するために比較的短いものであり得る（例えば、１０個またはそれより少ないアミノ酸）。嵩高い側鎖を有するアミノ酸または二次構造を導入する可能性が高いアミノ酸の数を低減するために、リンカーのアミノ酸組成物も調整され得る。適したアミノ酸リンカーとして、最大３、４、５、６、７、１０、１５、２０または２５個のアミノ酸長のものが挙げられるが、これらに限定されない。代表的なアミノ酸リンカー配列は、ＧＧＧＧＳ（配列番号２２）を含み、リンカーは、ＧＧＧＧＳの２、３、４または５コピーを含む（配列番号２２）。
一部の実施形態では、抗原は、Ｆｃドメインに融合されたＢＣＭＡ、例えば、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメインとして提供される（ＢＣＭＡ－Ｆｃ）。特定の実施形態では、ＢＣＭＡ－Ｆｃ抗原は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列の全てもしくは一部分または配列番号１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を呈する、および抗原受容体、例えば、ＣＡＲによって認識されるエピトープを含むアミノ酸の配列を含有する。
一部の実施形態では、抗原は、Ｆｃドメインに融合された、ＲＯＲ１、例えば、ヒトＲＯＲ１の細胞外ドメイン（ＲＯＲ１－Ｆｃ）として提供される。ある特定の実施形態では、ＲＯＲ－１－Ｆｃ抗原は、配列番号２０に示されるアミノ酸配列の全てもしくは一部分または配列番号２０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を呈する、および抗原受容体、例えば、ＣＡＲによって認識されるエピトープを含むアミノ酸の配列を含有する。
特定の実施形態では、抗原は、Ｆｃドメインに融合された、ＣＤ２２、例えば、ヒトＣＤ２２の細胞外ドメイン（例えば、ＣＤ２２－Ｆｃ）として提供される。ある特定の実施形態では、ＣＤ２２－Ｆｃ抗原は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列の全てもしくは一部分または配列番号２１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を呈する、および抗原受容体、例えば、ＣＡＲによって認識されるエピトープを含むアミノ酸の配列を含有する。
一部の実施形態では、抗原またはその細胞外結合ドメインのＦｃ融合は、ポリペプチド抗原またはその部分Ｆｃドメインを含有する２つのＦｃ融合ポリペプチドによって形成される二量体として表面支持体に連結される、またはそれに付着される。一部の実施形態では、得られたポリペプチド抗原－Ｆｃ融合タンパク質、例えば、ＢＣＭＡ－Ｆｃ、ＲＯＲ１－Ｆｃ、ＣＤ２２－ＦｃまたはＣＤ１９－Ｆｃは、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主細胞において発現される場合があり、それによって、Ｆｃドメイン間のアセンブリーがＦｃ部分間で形成される分子内ジスルフィド結合によって生じ、二量体の、例えば、二価のポリペプチド抗原融合タンパク質が得られる場合がある。一部の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞株である。タンパク質の組換え発現のための哺乳動物細胞の例示的なものとして、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞またはその誘導体が挙げられる。一部の態様では、Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸は、細胞からの分泌のためのシグナルペプチドをさらに含む。例示的な実施形態では、シグナルペプチドはＣＤ３３（例えば、配列番号１２に示される）である。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞は、抗体またはその断片または変異体に融合され得るユニバーサルタグに結合する、またはそれを認識するＣＡＲを発現する。特定の実施形態では、このようなＣＡＲを発現する細胞は、ユニバーサルタグと融合されている抗体によって結合されている標的細胞、例えば、腫瘍細胞を特異的に認識し、死滅させることができる。一例として、それらの細胞ががん反応性ＦＩＴＣ標識抗体によって結合される場合に、種々のヒトがん細胞に結合でき、および／またはそれを認識できる抗ＦＩＴＣ ＣＡＲを発現するＴ細胞が挙げられるが、これに限定されない。したがって、一部の実施形態では、ユニバーサルタグに結合する同一ＣＡＲは、ユニバーサルタグを含有するがんと関連する抗原を認識する利用可能な抗体があるという条件で、種々のがんの処置にとって有用である。特定の実施形態では、粒子（例えば、ビーズ粒子）は、組換え受容体、例えば、ＣＡＲによって結合される、または認識されることが可能であるユニバーサルタグ結合分子を含む表面に露出した結合分子を含む。ある特定の実施形態では、結合分子は、抗原受容体、例えば、ＣＡＲによって結合される、または認識されるユニバーサルタグまたはその一部分である。特定の実施形態は、抗体またはその抗原結合断片または変異体に融合され得る、抗体がその反応性標的に結合することを妨げない任意のポリペプチドドメインが、ユニバーサルタグとして使用するために適していることを企図する。一部の実施形態では、粒子は、ＦＩＴＣ、ストレプトアビジン、ビオチン、ヒスチジン、ジニトロフェノール、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体、緑色蛍光タンパク質、ＰＥ、ＨＲＰ、パルミトイル化、ニトロシル化、アルカラニン（ａｌｋａｌａｎｉｎｅ）ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼおよびマルトース結合タンパク質からなる群から選択されるユニバーサルタグまたはその一部分を含む結合分子に結合される。
ｂ．抗体
一部の態様では、結合分子は、組換え受容体、例えば、ＣＡＲを特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片である。これらの態様の一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、組換え受容体、例えば、ＣＡＲの細胞外部分を特異的に認識する（例えば、具体的に言えば、組換え受容体の細胞外上のエピトープに特異的に結合する）。
一部の態様では、結合分子は、組換え受容体、例えば、節ＩＩＩに記載されるような組換え受容体、例えば、ＣＡＲを特異的に認識する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片（「抗ＩＤ」）である。特に、抗イディオタイプ抗体は、別の抗体の抗原結合部位、例えば、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインのｓｃＦｖを標的とする。一部の実施形態では、抗ＩＤは、組換え受容体に結合して、組換え受容体依存性活性を刺激できる。抗原特異的ＣＡＲに対する例示的な抗イディオタイプ抗体は公知である。これらとして、ＣＤ２２によって向けられるＣＡＲ、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１３１８８８６４を参照されたい；ＣＤ１９によって向けられるＣＡＲ、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１８／０２３１００を参照されたい；ＧＰＲＣ５Ｄによって向けられるＣＡＲ、例えば、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０６３４９７を参照された；およびＢＣＭＡによって向けられるＣＡＲ、例えば、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０６３４９２を参照されたい、に対して向けられる抗イディオタイプ抗体が挙げられるが、これに限定されない。抗イディオタイプ抗体は、抗イディオタイプ抗体によって標的化される組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）を発現する細胞に対する組換え受容体刺激剤として使用するために上記で記載されるような表面支持体（例えば、ビーズ）に固定化または付着できる。
用語「抗体」は、本明細書では最も広い意味で使用され、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含み、その例としては、無傷抗体および機能的な（抗原に結合する）抗体断片、例えば、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、単鎖抗体断片、例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、および単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）断片が挙げられる。この用語は、免疫グロブリンの遺伝子操作された、および／またはそれ以外の方法で改変された形態、例えばイントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｉｅｓ）、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性を有する、例えば二重特異性の抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、およびテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、タンデムジｓｃＦｖ、タンデムトリｓｃＦｖを包含する。用語「抗体」は、別段の指定がない限り、それらの機能的な抗体断片を包含すると理解されるべきである。この用語はまた、あらゆるクラスまたはサブクラスの抗体を含む無傷または全長抗体、例えば、ＩｇＧおよびそのサブクラス、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＤなども包含する。
用語「抗イディオタイプ抗体」とは、抗体のイディオトープ、例えば、抗原結合断片を特異的に認識する、それに特異的に標的化される、および／またはそれに特異的に結合するその抗原結合断片を含む抗体を指す。抗体のイディオトープは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）、抗体の可変領域および／もしくはこのような可変領域の、および／もしくはこのようなＣＤＲの部分的な部分もしくは部分のうち１つもしくは複数ならびに／または前記のものの任意の組合せ内の残基を含み得るが、必ずしもそれに限定されない。ＣＤＲは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３からなる群から選択される１つまたは複数であり得る。抗体の可変領域は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域または重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せであり得る。抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域の部分的断片または部分は、抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域内の２個もしくはそれより多い、５個もしくはそれより多い、または１０個もしくはそれより多い連続するアミノ酸、例えば、約２～約１００、約５～約１００、約１０～約１００、約２～約５０、約５～約５０または約１０～約５０個の連続するアミノ酸を含む断片であり得る；イディオトープは、アミノ酸の複数の非連続ストレッチを含み得る。抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の部分的断片は、可変領域内の２個もしくはそれより多い、５個もしくはそれより多い、または１０個もしくはそれより多い連続するアミノ酸、例えば、約２～約１００、約５～約１００、約１０～約１００、約２～約５０、約５～約５０または約１０～約５０個の連続するアミノ酸を含む断片である場合があり、一部の実施形態では、１つまたは複数のＣＤＲまたはＣＤＲ断片を含有する。ＣＤＲ断片は、ＣＤＲ内の連続または非連続の２個もしくはそれより多い、５個もしくはそれより多いアミノ酸であり得る。したがって、抗体のイディオトープは、抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域内の１つもしくは複数のＣＤＲまたは１つもしくは複数のＣＤＲ断片を含有する約２～約１００、約５～約１００、約１０～約１００、約２～約５０、約５～約５０または約１０～約５０個の連続するアミノ酸であり得る。別の実施形態では、イディオトープは、抗体の可変領域、例えば、ＣＤＲ部位に位置する単一アミノ酸であり得る。
一部の実施形態では、イディオトープは、抗体の可変部分内の任意の単一抗原決定基またはエピトープである。一部の場合には、抗体の実際の抗原結合部位に重複する場合があり、一部の場合には、抗体の抗原結合部位の外側の可変領域配列を含み得る。抗体の個々のイディオトープのセットは、一部の実施形態では、このような抗体の「イディオタイプ」と呼ばれる。
用語「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」は、「超可変領域」または「ＨＶＲ」と同義であり、当該技術分野で公知であり、抗原特異性および／または結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸の非連続配列を指す。一般に、各重鎖可変領域中に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）および各軽鎖可変領域中に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）がある。「フレームワーク領域」および「ＦＲ」は、当該技術分野で公知であり、重鎖および軽鎖の可変領域の非ＣＤＲ部分を指す。一般に、各全長重鎖可変領域中に４つのＦＲ（ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３およびＦＲ－Ｈ４）および各全長軽鎖可変領域中に４つのＦＲ（ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３およびＦＲ－Ｌ４）がある。
所与のＣＤＲまたはＦＲの正確なアミノ酸配列境界は、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 （「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）、MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996), “Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography,” J. Mol. Biol. 262, 732-745.” （「接触」番号付けスキーム）、Lefranc MP et al., “IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,” Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27(1): 55-77 （「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）およびHonegger A and Plueckthun A, “Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool,” J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3): 657-70、（「Ａｈｏ」番号付けスキーム）によって記載されたものを含むいくつかの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定できる。
所与のＣＤＲまたはＦＲの境界は、同定のために使用されるスキームに従って変わり得る。例えば、Ｋａｂａｔスキームは、構造アラインメントに基づいており、Ｃｈｏｔｈｉａスキームは、構造情報に基づいている。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａスキームの両方の番号付けは、最も一般的な抗体領域配列長に基づいており、挿入は、挿入文字、例えば「３０ａ」に対応し、欠失は、一部の抗体において現れる。２つのスキームは、ある特定の挿入および欠失（「挿入欠失」）を異なる配置に配置し、差次的番号付けをもたらす。接触スキームは、複雑な結晶構造の分析に基づいており、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームと多数の点で同様である。
以下の表１は、それぞれＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａおよび接触スキームによって同定されるようなＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３およびＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３の例示的な配置境界を列挙する。ＣＤＲ－Ｈ１について、残基番号は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームの両方を使用して列挙されている。ＦＲは、ＣＤＲの間に位置し、例えば、ＦＲ－Ｌ１はＣＤＲ－Ｌ１とＣＤＲ－Ｌ２の間に位置するなど。示されたＫａｂａｔ番号付けスキームは、挿入をＨ３５ＡおよびＨ３５Ｂに配置するので、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１ループの末端は、示されたＫａｂａｔ番号付け変換を使用して番号付けされる場合に、番号付け変換は、ループの長さに応じてＨ３２とＨ３４の間で変わるということが知られている。
したがって、特に断りのない限り、所与の抗体またはその領域、例えば、その可変領域の「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」または個々の特定のＣＤＲ（例えば、「ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２）は、上記のスキームのいずれかによって定義されるような１つの（または特異的な）相補性決定領域を包含すると理解されるべきである。例えば、指定のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ－Ｈ３）が所与のＶＨまたはＶＬアミノ酸配列中の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を含有すると記載される場合には、このようなＣＤＲは、上記のスキームのいずれかによって定義されるような可変領域内の対応するＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ－Ｈ３）の配列を有すると理解される。一部の実施形態では、指定のＣＤＲ配列が指定される。
同様に、特に断りのない限り、所与の抗体またはその領域、例えば、その可変領域のＦＲまたは個々の特定のＦＲ（複数可）（例えば、ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２）は、公知のスキームのいずれかによって定義されるような１つの（または特異的な）フレームワーク領域を包含すると理解されるべきである。一部の場合には、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａまたは接触法によって定義されるようなＣＤＲ等の、特定のＣＤＲ、ＦＲまたは複数のＦＲまたは複数のＣＤＲの同定のためのスキームが指定される。他の例では、ＣＤＲまたはＦＲの特定のアミノ酸配列が与えられる。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、一般的に、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つのＣＤＲを含む類似の構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照）。単一ＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原と結合する抗体を、抗原と結合する抗体からのＶＨまたはＶＬドメインを使用して、単離して、それぞれの相補的ＶＬまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングするためのことができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照されたい。
提供される抗体の中に抗体断片がある。「抗体断片」とは、無傷の抗体が結合する抗原に結合する無傷の抗体の一部分を含む無傷の抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、抗体は、重鎖可変鎖領域および／または軽鎖可変鎖領域を含む単鎖抗体断片、例えば、ｓｃＦｖである。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む抗体断片である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である。
抗体断片は、様々な技術によって作製することができ、その例としては、これらに限定されないが、無傷抗体のタンパク質分解による消化、加えて、組換え宿主細胞による生産が挙げられる。一部の実施形態では、抗体は、組換え生産された断片、例えば天然に存在しないアレンジメントを含む断片であり、例えば２つまたはそれより多くの抗体領域または鎖が、合成リンカー、例えばペプチドリンカーによって合体したもの、および／または天然に存在する無傷抗体の酵素消化によって生産される可能性がないものである。一部の態様では、抗体断片はｓｃＦｖである。
「ヒト化」抗体は、全てまたは実質的に全てのＣＤＲアミノ酸残基が非ヒトＣＤＲに由来し、全てまたは実質的に全てのフレームワークアミノ酸残基がヒトＦＲに由来する抗体である。一部の実施形態では、非ヒト抗体、例えば、マウス抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、非ヒト種からの１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域（ＦＲ）を有する非ヒト種からの抗体である。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、通常、親の非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減するためにヒト化を受けている非ヒト抗体の変異体を指す。一部の実施形態では、ヒト化抗体中の一部のＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復させるまたは改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基と置換される（例えば、Ｑｕｅｅｎ、米国特許第５，５８５，０８９号およびＷｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい）。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。
ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントの重鎖可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性および／または能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類の重鎖可変領域からの残基によって置換されるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合には、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体において、またはドナー抗体において見出されない残基を含む場合がある。一部の実施形態では、ヒト重鎖可変鎖および軽鎖可変鎖をコードする核酸配列は、ヒト（アクセプター）配列の１つまたは複数のＣＤＲ配列を、非ヒト抗体配列（ドナー配列）中のそれぞれのＣＤＲをコードする配列によって置き換えるように変更される。一部の実施形態では、ヒトアクセプター配列は、異なる遺伝子に由来するＦＲを含み得る。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、超可変ループの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つの、通常、２つの可変ドメインの実質的に全てを含有するであろう。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、適宜、通常、ヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分を含むであろう。さらなる詳細については、例えば、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照されたい。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)；および米国特許第６，９８２，３２１号および同７，０８７，４０９号も参照されたい。一部の実施形態では、ヒト化抗イディオタイプ抗体が本明細書で提供される。
特定の実施形態では、抗体、例えば、抗イディオタイプ抗体は、ヒト化される。ある特定の実施形態では、抗体は任意の適した公知の手段によってヒト化される。例えば、一部の実施形態では、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と呼ばれることが多く、これは通常、「移入」可変ドメインから取られる。特定の実施形態では、ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Jones et al. (1986) Nature 321:522-525；Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327；Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536）に従って、例えば、ヒト抗体の対応する配列の超可変領域配列を置換することによって本質的に実施され得る。したがって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ないものが、非ヒト種からの対応する配列によって置換されているキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、一部の超可変領域残基およびおそらくは一部のＦＲ残基が、げっ歯類抗体中の類似の部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
全長抗体をコードする配列は、与えられた重鎖可変および軽鎖可変鎖配列をヒト定常重鎖および定常軽鎖領域に接合することによってその後得ることができる。適したヒト定常軽鎖配列は、カッパおよびラムダ定常軽鎖配列を含む。適したヒト定常重鎖配列には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２および免疫刺激特性を与えられたＩｇＧ１突然変異体をコードする配列が含まれる。このような突然変異体は、補体および／または抗体依存性細胞毒性を活性化する能力の低減を有する場合があり、米国特許第５，６２４，８２１号；ＷＯ９９／５８５７２、米国特許第６，７３７，０５６号に記載されている。適した定常重鎖としてまた、置換Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓおよび残基２３６の欠失を含むＩｇＧ１が挙げられる。別の実施形態では、全長抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＹまたはＩｇＷ配列を含む。
適したヒトドナー配列は、マウスドナー配列によってコードされるペプチド配列の、ヒト配列の群に対する、好ましくは、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子または成熟抗体遺伝子によってコードされる配列に対する配列比較によって決定できる。高い配列相同性を有する、好ましくは、決定された最高相同性を有するヒト配列は、ヒト化プロセスのためにアクセプター配列として働く場合がある。
ヒトＣＤＲのマウスＣＤＲとの交換に加えて、最適化された特性（例えば、抗原の親和性）を有するヒト化抗体をコードする配列を得るために、ヒトドナー配列におけるさらなるマニピュレーションが実施される場合がある。
さらに、変更されたヒトアクセプター抗体可変ドメイン配列はまた、非ヒトドナーに対応する、軽可変領域の４、３５、３８、４３、４４、４６、５８、６２、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７３、８５、９８位および重可変領域の２、４、３６、３９、４３、４５、６９、７０、７４、７５、７６、７８、９２位の１つまたは複数のアミノ酸（Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って）をコードするようにされる場合がある（ＣａｒｔｅｒおよびＰｒｅｓｔａ、米国特許第６，４０７，２１３号）。
特定の実施形態では、一般に、抗体が抗原に対する高親和性および他の好都合な生物学的特性を保持してヒト化されることが望ましい。この目的を達成するために、一部の実施形態では、親およびヒト化配列の３次元モデルを使用する親配列および種々の概念的なヒト化生成物の分析のプロセスによって、ヒト化抗体が調製される。３次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者は精通している。選択された候補免疫グロブリン配列の高可能性の３次元コンフォメーション構造を例示し、ディスプレイするコンピュータープログラムが利用可能である。これらのディスプレイの調査によって、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性が高い役割の分析、すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、所望の抗体特徴、例えば、標的抗原（複数可）に対する親和性の増大が達成されるように、レシピエントおよび移入された配列からＦＲ残基を選択し、組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接的に、最も実質的に関与している。
特定の実施形態では、ヒト化抗体の作製において使用されるべきヒト可変ドメイン、軽および重両方の選択は、抗原性を低減するために重要であり得る。いわゆる「ベストフィット」法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列が、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。次いで、げっ歯類のものに最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のヒトフレームワークとして受容される。例えば、Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296；Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901を参照されたい。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークが使用される。いくつかの異なるヒト化抗体に同一フレームワークが使用される場合がある。例えば、Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285；Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623を参照されたい。
提供される抗体の中に、ヒト抗体がある。「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞またはヒト抗体レパートリーもしくはヒト抗体ライブラリーを含む他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト供給源によって生成された抗体のものに対応するアミノ酸配列を有する抗体である。この用語は、非ヒト抗原結合領域、例えば、全てまたは実質的に全てのＣＤＲが非ヒトであるものを含む非ヒト抗体のヒト化形態を除外する。
ヒト抗体は、抗原性抗原投与に応じて無傷のヒト抗体またはヒト可変領域を有する無傷の抗体を生成するように改変されているトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る。このような動物は通常、内因性免疫グロブリン遺伝子座と置き換わる、または染色体外に、もしくは動物の染色体中にランダムに統合されて存在する、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部分を含有する。このようなトランスジェニック動物では、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に、不活化されている。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイおよびヒトレパートリーに由来する抗体をコードする配列を含有する細胞不含ライブラリーを含む、ヒト抗体ライブラリーに由来する。
提供される抗体の中に、モノクローナル抗体断片を含むモノクローナル抗体がある。用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書において、実質的に均一な抗体の集団から得られる、またはその集団内の抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、天然に存在する突然変異を含有する、またはモノクローナル抗体調製物の製造の際に生じる潜在的な変異体を除いて同一であり、このような変異体は一般に、微量で存在する。通常、種々のエピトープに対して向けられた種々の抗体を含むポリクローナル抗体調製とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一エピトープに対して向けられる。この用語は、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるべきではない。モノクローナル抗体は、限定されるものではないが、ハイブリドーマからの生成、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイおよび他の抗体ディスプレイ法を含む、様々な技術によって作製され得る。
２．標的発現細胞
一部の実施形態では、組換え受容体刺激剤は、抗原受容体によって認識される標的を発現する細胞である、すなわち、組換え受容体刺激剤は、標的発現細胞である。一部の実施形態では、標的は、組換え受容体の抗原であり、したがって、一部の場合には、標的発現細胞は、抗原発現細胞である。一部の実施形態では、組換え受容体刺激剤は、抗原発現細胞、例えば、上記のような抗原を発現する細胞である。
ある特定の実施形態では、細胞、例えば、標的発現細胞、例えば、抗原発現細胞は、対象に対して外因性、異種性および／または自家性である。一部の実施形態では、細胞は対象に対して外因性である。
ある特定の実施形態では、標的発現細胞は、組換え受容体によって結合され、および／または認識される標的を発現する。一部の実施形態では、標的は抗体であり、標的発現細胞は、抗体を発現する。一部の実施形態では、標的発現細胞は、腫瘍細胞である。特定の実施形態では、標的発現細胞は、一次細胞である。
一部の実施形態では、標的は、組換え受容体によって認識される抗原であり、標的発現細胞は抗原発現細胞である。ある特定の実施形態では、抗原発現細胞は、組換え受容体によって結合され、および／または認識される抗原を発現する。一部の実施形態では、抗原発現細胞は腫瘍細胞である。特定の実施形態では、抗原発現細胞は一次細胞である。一部の実施形態では、細胞株は、不死細胞株である。特定の実施形態では、抗原発現細胞は、がん性細胞および／または腫瘍細胞である。一部の実施形態では、抗原発現細胞は、がん細胞および／または腫瘍細胞、例えば、ヒトがん細胞および／またはヒト腫瘍細胞に由来する。一部の実施形態では、抗原発現細胞は、がん細胞株、適宜、ヒトがん細胞株に由来する細胞である。一部の実施形態では、抗原発現細胞は、腫瘍細胞株、適宜、ヒト腫瘍細胞株に由来する細胞である。
特定の実施形態では、抗原発現細胞は腫瘍細胞である。一部の実施形態では、抗原発現細胞は、循環腫瘍細胞、例えば、腫瘍性免疫細胞、例えば、腫瘍性Ｂ細胞（または腫瘍性Ｂ細胞に由来する細胞）である。
特定の実施形態では、抗原発現細胞は、インテグリン（ａｖｂ６インテグリン）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、炭酸脱水酵素９（ＣＡ９、ＣＡＩＸまたはＧ２５０としても知られる）、がん精巣抗原、がん／精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ、ＮＹ－ＥＳＯ－１およびＬＡＧＥ－２としても知られる）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、サイクリン、サイクリンＡ２、Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＣＬ－１）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、上皮成長因子タンパク質（ＥＧＦＲ）、末端切断型上皮成長因子タンパク質（ｔＥＧＦＲ）、ＩＩＩ型上皮成長因子受容体突然変異（ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＰＧ－２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＰＧ－４０）、エフリンＢ２、エフリン受容体Ａ２（ＥＰＨａ２）、エストロゲン受容体、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５；Ｆｃ受容体相同体５またはＦＣＲＨ５としても知られる）、胎児アセチルコリン受容体（胎児ＡｃｈＲ）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、葉酸受容体アルファ、胎児アセチルコリン受容体、ガングリオシドＧＤ２、Ｏ－アセチル化ＧＤ２（ＯＧＤ２）、ガングリオシドＧＤ３、糖タンパク質１００（ｇｐｌＯＯ）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、Ｇタンパク質共役受容体５Ｄ（ＧＰＣＲ５Ｄ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（受容体チロシンキナーゼｅｒｂ－Ｂ２）、Ｈｅｒ３（ｅｒｂ－Ｂ３）、Ｈｅｒ４（ｅｒｂ－Ｂ４）、ｅｒｂＢ二量体、ヒト高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、Ｂ型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原Ａｌ（ＨＬＡ－ＡＩＡｌ）、ヒト白血球抗原Ａ２ＨＬＡ－Ａ２）、ＩＬ－２２受容体アルファ（ＩＬ－２２Ｒａ）、ＩＬ－１３受容体アルファ２（ＩＬ－１３Ｒａ２）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ｋｄｒ）、カッパ軽鎖、ＬＩ細胞接着分子（ＬＩ－ＣＡＭ）、ＬＩ－ＣＡＭのＣＥ７エピトープ、ロイシンリッチリピート含有８ファミリーメンバーＡ（ＬＲＲＣ８Ａ）、ルイスＹ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）－Ａｌ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ１０、メソテリン （ＭＳＬＮ）、ｃ－Ｍｅｔ、マウスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ１６、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＫＧ２Ｄ）リガンド、メランＡ（ＭＡＲＴ－１）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、がん胎児性抗原、黒色腫の優先的に発現される抗原（ＰＲＡＭＥ）、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４としても知られるＴＰＢＧ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰｌ、ＴＹＲＰｌまたはｇｐ７５としても知られる）、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２、ドパクロム、トートメラーゼ、ドパクロムデルタイソメラーゼまたはＤＣＴとしても知られる）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）またはそれらの組合せを発現する。一部の実施形態では、抗原発現細胞は、病原体特異的抗原もしくは病原体によって発現される抗原またはユニバーサルタグおよび／もしくはビオチン化分子および／もしくはＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶもしくは他の病原体によって発現される分子と関連した抗原を発現する。特定の実施形態では、抗原発現細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍と関連する１つまたは複数の抗原、例えば、いくつかの既知Ｂ細胞マーカーのいずれかを発現する。ある特定の実施形態では、抗原発現細胞は、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＣＤ４５、ＣＤ２１、ＣＤ５、ＣＤ３３、Ｉｇカッパ、Ｉｇラムダ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ３０またはそれらの組合せを発現する。一部の実施形態では、抗原発現細胞は、ＣＤ１９、例えば、ヒトＣＤ１９を発現する。
一部の実施形態では、抗原は、病原体特異的抗原または病原体によって発現される抗原である、またはそれを含む。一部の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ等に由来するウイルス抗原）、細菌抗原および／または寄生虫抗原である。ある特定の実施形態では、抗原発現細胞は、腫瘍細胞である、またはそれに由来する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、がん性である。特定の実施形態では、腫瘍細胞は、非がん性である。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、循環Ｂ細胞、例えば、インビボで腫瘍を形成可能である循環Ｂ細胞である、またはそれに由来する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、腫瘍性、腫瘍原性、またはがん性Ｂ細胞である循環Ｂ細胞である、またはそれに由来する。
ある特定の実施形態では、腫瘍細胞は、ヒトがん細胞である、またはそれに由来する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、ＡＩＤ関連がん、乳がん、消化管／胃腸管のがん、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、結腸がん、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、肝臓がん、膵臓がん、直腸がん、小腸がん、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））がん、内分泌系がん、副腎皮質癌、副甲状腺がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、甲状腺がん、眼のがん、眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫、膀胱がん、腎臓（腎細胞）がん、陰茎がん、前立腺がん、移行細胞腎盂および尿管がん、精巣がん、尿道がん、ウィルムス腫瘍または他の小児腎臓腫瘍、生殖細胞がん、中枢神経系がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、婦人科がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、妊娠性絨毛性腫瘍、卵巣上皮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰部がん、頭頸部がん、下咽頭がん、咽頭がん、口唇および口腔がん、転移性扁平頸部がん、鼻咽頭がん、中咽頭がん、副鼻腔および鼻腔のがん、咽頭がん、唾液腺がん、咽喉がん、筋骨格のがん、骨がん、ユーイング肉腫、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、骨肉腫、骨の悪性繊維性組織球腫、横紋筋肉腫、軟部組織肉腫、子宮肉腫、神経性がん、脳腫瘍、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、中枢神経系の非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、中枢神経系生殖細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、髄芽細胞腫、脊髄腫瘍、テント上原始神経外胚葉腫瘍および松果体芽腫、神経芽細胞腫、呼吸器のがん、胸部がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、悪性中皮腫、胸腺腫、胸腺癌、皮膚がん、カポジ肉腫、黒色腫またはメルケル細胞癌またはそれらの任意の同等のヒトがんの細胞に由来する。
特定の実施形態では、腫瘍細胞は、非造血系がん、例えば、固形腫瘍に由来する。ある特定の実施形態では、腫瘍細胞は、血液系がんに由来する。ある特定の実施形態では、腫瘍細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍または血液系悪性腫瘍であるがんに由来する。特定の実施形態では、腫瘍細胞は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または骨髄腫、例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ）またはそれらの任意の同等のヒトがんに由来する。一部の実施形態では、抗原発現細胞は、腫瘍性、がん性および／または腫瘍原性Ｂ細胞である。複数の腫瘍細胞株が公知であり、利用可能であり、特定の組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）によって認識される抗原に応じて選択できる。
いくつかの腫瘍細胞株のいずれも公知であり、利用可能である。特定の腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞株が公知であり、または腫瘍抗原の表面発現は、様々な技術のいずれを使用しても、例えば、フローサイトメトリーによって当業者によって容易に決定できる、もしくは測定できる。例示的な腫瘍細胞株として、リンパ腫細胞（Ｒａｊｉ；Ｄａｕｄｉ；Ｊｅｋｏ－１；ＢＪＡＢ；Ｒａｍｏｓ；ＮＣＩ－Ｈ９２９；ＢＣＢＬ－１；ＤＯＨＨ－２、ＳＣ－１、ＷＳＵ－ＮＨＬ、ＪＶＭ－２、Ｒｅｃ－１、ＳＰ－５３、ＲＬ、Ｇｒａｎｔａ ５１９、ＮＣＥＰ－１、ＣＬ－０１）、白血病細胞（ＢＡＬＬ－１、ＲＣＨ－ＡＣＶ、ＳＵＰ－Ｂ１５）；子宮頸がん細胞（３３Ａ；ＣａＳｋｉ；ＨｅＬａ）、肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ３５８；Ａ５４９、Ｈ１３５５、Ｈ１９７５、Ｃａｌｕ－１、Ｈ１６５０およびＨ７２７）、乳房細胞、（Ｈｓ－５７８Ｔ；ＺＲ－７５－１；ＭＣＦ－７；ＭＣＦ－７／ＨＥＲ２；ＭＣＦ１０Ａ；ＭＤＡ－ＭＢ－２３１；ＳＫＢＲ－３、ＢＴ－４７４、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）；卵巣細胞（ＥＳ－２；ＳＫＯＶ－３；ＯＶＣＡＲ３；ＨＥＹ１Ｂ）；多発性骨髄腫細胞（Ｕ２６６、ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＲＰＭＩ－８２２６、ＯＰＭ２、ＬＰ－１、Ｌ３６３、ＭＭ．１Ｓ、ＭＭ．１Ｒ、ＭＣ／ＣＡＲ、ＪＪＮ３、ＫＭＳ１１、ＡＭＯ－１、ＥＪＭ；ＭＯＬＰ－８）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、例示的なＣＤ１９発現細胞株として、Ｒａｊｉ、ＤａｕｄｉおよびＢＪＡＢを挙げられるが、これらに限定されない；例示的なＣＤ２０発現細胞株として、Ｄａｕｄｉ、ＲａｍｏｓおよびＲａｊｉが挙げられる；例示的なＣＤ２２発現細胞株として、Ｒａｍｏｓ、Ｒａｊｉ、Ａ５４９、Ｈ７２７およびＨ１６５０が挙げられるが、これらに限定されない；例示的なＨｅｒ２発現細胞株として、ＳＫＯＶ３、ＢＴ－４７４およびＳＫＢＲ－３が挙げられる；例示的なＢＣＭＡ発現細胞株として、ＲＰＭＩ－８２２６、ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＭＭ１Ｓ、ＭＭ１ＲおよびＫＭＳ１１が挙げられるが、これらに限定されない；例示的なＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞株として、ＡＭＯ－１、ＥＪＭ、ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ、ＭＭ１．Ｒ、ＭＯＬＰ－８およびＯＰＭ－２が挙げられるが、これらに限定されない；例示的なＲＯＲ１発現細胞株として、Ａ５４９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｈ１９７５、ＢＡＬＬ－１およびＲＣＨ－ＡＣＶが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、標的発現細胞株は、組換え受容体の標的を発現するように形質導入されている細胞株である。一部の実施形態では、標的は腫瘍抗原である。特定の実施形態では、抗原発現細胞株は、腫瘍抗原を発現するように形質導入されている細胞株である。この細胞株は、限定されるものではないが、ヒト細胞株を含む、哺乳動物細胞株であり得る。一部の実施形態では、ヒト細胞株は、Ｋ５６２、Ｕ９３７、７２１．２２１、Ｔ２およびＣ１Ｒ細胞であり得る。例えば、Ｋ５６２慢性骨髄性白血病細胞株は、腫瘍抗原をコードする核酸を導入され得る。一部の実施形態では、細胞株は、目的の腫瘍抗原をコードするプラスミドベクターまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を用いて操作され得る。一部の実施形態では、導入は、レンチウイルスベースの形質導入であり得る。一部の実施形態では、細胞株（例えば、Ｋ５６２細胞）は、腫瘍抗原をコードする外因性核酸を安定に発現する。一部の実施形態では、外因性核酸は、細胞株（例えば、Ｋ５６２細胞）のゲノム中に統合され得る。一部の実施形態では、外因性核酸は、特定の遺伝子座で細胞株（例えば、Ｋ５６２細胞） のゲノム中に統合され得る。一部の実施形態では、外因性核酸は、ゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）で細胞株（例えば、Ｋ５６２細胞）のゲノム中に統合され得る。ＧＳＨは、宿主細胞ゲノムとの不要な相互作用のリスクを最小にしながら、外因性核酸の安定な統合および発現を支持する部位である（例えば、Sadelain et al., Nat Rev Cancer. (2011) 12(1):51-8を参照されたい）。ＡＡＶＳ１、染色体１９でのＡＡＶウイルスの統合の天然に存在する部位；ＣＣＲ５遺伝子、ＨＩＶ－１共受容体としても知られるケモカイン受容体遺伝子；およびマウスＲｏｓａ２６遺伝子座のヒトオーソログ（例えば、Papapetrou and Schambach Mol Ther. (2016) 24(4): 678-684を参照されたい）を含む、ヒト細胞における外因性核酸の安定な統合のためのいくつかの安全なＧＳＨが同定されている。
一部の実施形態では、標的発現細胞は、固定量の、組換え受容体を発現する治療用組成物の細胞（エフェクター細胞）と比較して、変更された比率で複数のインキュベーションにわたって変更される、または調整される。一部の実施形態では、調整された量は、１００：１～０．００１の、標的発現標的細胞のエフェクターＴ細胞に対する比率（Ｔ：Ｅ）、例えば、５０：１～０．０５０のＴ：Ｅ比率、２５：１～０．０２５のＴ：Ｅ比率、１２：１～０．０１２：１のＴ：Ｅ比率、１０：１～０．０１０のＴ：Ｅ比率または５：１～０．５のＴ：Ｅ比率の調整された量である。一部の実施形態では、比率は、１２：１～０．０１２：１である、または約１２：１～約０．０１２：１のＴ：Ｅ比率である。比率の特定の範囲は、採用されている特定の標的および標的細胞に応じて経験的に決定できる。例えば、選択された比率は、複数の調整された量にわたって組換え受容体依存性活性の線形用量反応増大を含むものである。一部の実施形態では、比率は、それぞれ最小および最大応答を表す受容体依存性活性の下側漸近線および受容体依存性活性の上側漸近線を含むようにも選択される。
例えば、標的は、組換え受容体の抗原である。一部の実施形態では、抗原発現細胞は、固定量の、組換え受容体を発現する治療用組成物の細胞（エフェクター細胞）と比較して、変更された比率で複数のインキュベーションにわたって変更される、または調整される。一部の実施形態では、調整された量は、１００：１～０．００１の、抗原発現標的細胞のエフェクターＴ細胞に対する比率（Ｔ：Ｅ）、例えば、５０：１～０．０５０のＴ：Ｅ比率、２５：１～０．０２５のＴ：Ｅ比率、１２：１～０．０１２：１のＴ：Ｅ比率、１０：１～０．０１０のＴ：Ｅ比率または５：１～０．５のＴ：Ｅ比率の調整された量である。一部の実施形態では、比率は、１２：１～０．０１２：１である、または約１２：１～約０．０１２：１のＴ：Ｅ比率である。比率の特定の範囲は、採用されている特定の抗原および標的細胞に応じて経験的に決定できる。例えば、選択された比率は、複数の調整された量にわたって組換え受容体依存性活性の線形用量反応増大を含むものである。一部の実施形態では、比率は、それぞれ最小および最大応答を表す受容体依存性活性の下側漸近線および受容体依存性活性の上側漸近線を含むようにも選択される。
Ｃ．組換え受容体依存性活性の測定
本明細書で提供される効力を評価する方法は、治療用細胞組成物の操作された細胞の組換え受容体の刺激に応じた、治療用細胞組成物の活性を測定することを含む。上記のように、提供されたアッセイによって、各インキュベーションが組換え受容体刺激剤に対する治療用細胞組成物の細胞の異なる調整された比率を含む複数のインキュベーション条件からの、節Ｉ－Ｂに記載されるもの等の組換え受容体刺激剤に応じた組換え受容体依存性活性の測定が可能となる。
特定の実施形態では、組換え受容体依存性活性、例えば、ＣＡＲ依存性活性は、組換え受容体を発現しない細胞では生じない、および／または生じ得ない組換え受容体を発現する操作された細胞において生じる活性であるということが企図される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、組換え受容体の活性または存在に依存する活性である。組換え受容体依存性活性は、組換え受容体の発現および／もしくは存在によって、または組換え受容体の活性、例えば、受容体刺激の変化によって直接的または間接的に影響を受ける任意の細胞性プロセスであり得る。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性として、細胞分裂、ＤＮＡ複製、転写、タンパク質合成、膜輸送、タンパク質転位置および／もしくは分泌などの細胞性プロセスを挙げることができるが、これらに限定されない、または免疫細胞機能、例えば、細胞溶解活性であり得る。ある特定の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、ＣＡＲ受容体の確認、細胞内シグナル伝達分子のリン酸化、タンパク質の分解、転写、翻訳、タンパク質の転位置および／またはタンパク質もしくは増殖因子、サイトカインなどの因子の生成および分泌の変化によって測定され得る。ある特定の実施形態では、組換え受容体は、ＣＡＲである。ある特定の実施形態では、組換え受容体はＴＣＲである。
一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性、例えば、ＣＡＲ依存性活性は、因子の測定値、例えば、量もしくは濃度、または組換え受容体刺激剤を用いる治療用細胞組成物の刺激後の量もしくは濃度の変化である。ある特定の実施形態では、因子は、タンパク質、リン酸化されたタンパク質、切断されたタンパク質、転位置されたタンパク質、活性確認中のタンパク質、ポリヌクレオチド、ＲＮＡポリヌクレオチド、ｍＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡであり得る。一部の実施形態では、測定値として、キナーゼ活性、プロテアーゼ活性、ホスファターゼ活性、ｃＡＭＰ生成、ＡＴＰ代謝、転位置、例えば、タンパク質の核局在性の増減、転写活性の増大、転位置活性、可溶性因子の生成および／または分泌、細胞性取り込み、ユビキチン化および／またはタンパク質分解の増大を挙げることができるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、因子は、分泌される可溶性因子、例えば、ホルモン、増殖因子、ケモカインおよび／またはサイトカインである。
一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性、例えば、ＣＡＲ依存性活性は、組換え受容体刺激剤を用いる刺激に対する応答である。ある特定の実施形態では、細胞は、組換え受容体依存性活性を刺激可能である組換え受容体刺激剤の存在下でインキュベートされ、活性は刺激に対する応答の少なくとも１つの態様であるか、またはそれを含む。応答として、細胞内シグナル伝達事象、例えば、受容体分子の活性の増大、１つもしくは複数のキナーゼのキナーゼ活性の増大、１つもしくは複数の遺伝子の転写の増大、１つもしくは複数のタンパク質のタンパク質合成および／または細胞内シグナル伝達分子の増大、例えば、タンパク質のキナーゼ活性の増大を挙げることができるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、応答（例えば、組換え受容体依存性活性）は、免疫活性と関連し、可溶性因子、例えば、サイトカインの生成および／または分泌（ｓｅｃｔｉｏｎ）、抗体生成の増大および／または細胞溶解活性の増大を挙げることができるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、刺激（例えば、組換え受容体刺激剤）に対する組換え受容体依存性活性、すなわち、刺激（例えば、組換え受容体刺激剤）によって開始される、誘発される、支持される、延長される、および／または引き起こされる少なくとも１つの活性を測定、検出、または定量化することによって評価される。ある特定の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞は、組換え受容体刺激剤と共に培養され、組換え受容体への組換え受容体刺激剤の相互作用または結合は、組換え受容体を発現する細胞に対して特異的である組換え受容体依存性活性を刺激する、例えば、誘導する。ある特定の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、組換え受容体を発現する細胞において生じるが、受容体を発現しない細胞では生じないか、または最小にしか生じない。特定の実施形態では、組換え受容体はＣＡＲである。一部の実施形態では、活性は、ＣＡＲ依存性活性である。
組換え受容体刺激剤による操作された細胞、例えば、免疫細胞またはＴ細胞の組換え受容体の刺激の条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、薬剤、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオンのうち１つまたは複数を含み得る。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、可溶性因子、例えば、サイトカインまたはケモカインが生成または分泌されるか否かによって決定される。
一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、組換え受容体を発現する細胞に対して特異的である。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、組換え受容体を発現する細胞に対して特異的であり、組換え受容体の発現を欠く細胞では生じない。ある特定の実施形態では、組換え受容体はＣＡＲであり、活性はＣＡＲ依存性活性である。特定の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、組換え受容体を発現する細胞において活性が存在する同一条件下では、組換え受容体の発現を欠く細胞には存在しない。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ依存性活性は、同一条件下のＣＡＲ細胞におけるＣＡＲ依存性活性の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％または約９９％未満である。
一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、組換え受容体、例えば、ＣＡＲを発現する細胞に対して特異的であり、活性は、組換え受容体を発現する治療用細胞組成物の細胞に対して特異的である組換え受容体刺激剤を用いる刺激によって生成される。一部の実施形態では、組換え受容体はＣＡＲであり、ＣＡＲ特異的刺激は、ＣＡＲ＋細胞において活性を刺激する、誘発する、開始する、誘導する、および／または延長するが、ＣＡＲ－細胞では活性を刺激しない、誘発しない、開始しない、誘導しない、および／または延長しない。一部の実施形態では、ＣＡＲ依存性活性は、ＣＡＲ特異的刺激による刺激後にＣＡＲ＋細胞においてよりも、ＣＡＲ－細胞では約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％または約９９％未満である。
ある特定の実施形態では、活性は、組換え受容体に対して特異的である、節Ｉ－Ｂに記載されるものなどの組換え受容体刺激剤によって刺激される、組換え受容体依存性、例えば、ＣＡＲ依存性活性である。一部の実施形態では、組換え受容体刺激剤、例えば、ＣＡＲ特異的薬剤には、組換え受容体、例えば、ＣＡＲによって結合および／または認識される抗原またはそのエピトープが含まれる。一部の実施形態では、組換え受容体刺激剤には、組換え受容体に結合する、抗体、例えば、抗イディオタイプ抗体（抗ＩＤ）またはその活性断片、変異体または部分が含まれる。ある特定の実施形態では、組換え受容体刺激剤は、その表面上に抗原を発現する細胞である。ある特定の実施形態では、組換え受容体刺激剤は、その表面上に抗体を発現する細胞である。一部の実施形態では、細胞は、節Ｉ－Ｂ－２に記載されるもの等の細胞株に由来する。一部の実施形態では、細胞株は、腫瘍細胞株である。一部の実施形態では、細胞は、腫瘍抗原を発現する。
一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、組換え受容体、例えば、ＣＡＲを発現する細胞を含有する治療用細胞組成物中で測定され、測定値は、１つまたは複数の対照に対して比較される。ある特定の実施形態では、対照は、刺激されなかった細胞の同様または同一組成物である。例えば、一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、組換え受容体刺激剤と共のインキュベーション後またはその間に細胞組成物において測定され、得られた測定値は、組換え受容体刺激剤と共にインキュベートされていない同様または同一の細胞組成物からの活性の対照測定と比較される。一部の実施形態では、治療用細胞組成物および対照細胞組成物の両方とも、組換え受容体を発現する細胞を含有する。一部の実施形態では、対照は、組換え受容体、例えば、ＣＡＲ＋細胞を発現する細胞を含有しない同様の細胞組成物からとられる。したがって、一部の実施形態では、細胞を発現している組換え受容体を含有する治療用細胞組成物および細胞を発現している組換え受容体を含有しない対照細胞組成物を、組換え受容体刺激剤と接触させる。ある特定の実施形態では、対照は、任意の刺激の前にとられた組換え受容体を発現する同一細胞組成物からの測定値である。ある特定の実施形態では、対照測定は、バックグラウンドシグナルを決定するために取得され、対照測定値は、活性の測定値から差し引かれる。一部の実施形態では、細胞組成物中の活性の測定値は、対照測定値によって除され、対照レベルを上回る活性の比率である値が得られる。一部の実施形態では、全ての組換え受容体依存性活性測定値は、例えば、組換え受容体刺激剤が治療用細胞組成物の細胞と共に培養されなかった対照測定値に対して調整または正規化される。一部の実施形態では、対照条件に対する測定値の調整または正規化は、組換え受容体依存性活性のより正確な尺度を提供する。
特定の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、可溶性因子の生成および／または分泌であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性、例えば、ＣＡＲ依存性活性は、溶性因子の生成および／または分泌であるか、またはそれを含む。ある特定の実施形態では、可溶性因子は、サイトカインまたはケモカインである。
可溶性因子の生成または分泌を測定するための適した技術は、当該技術分野で公知である。可溶性因子の生成および／または分泌は、因子の細胞外量の濃度もしくは量を決定することまたは因子をコードする遺伝子の転写活性の量を決定することによって測定できる。適した技術として、イムノアッセイ、免疫測定法、アプタマーベースのアッセイ、組織学的もしくは細胞学的アッセイ、ｍＲＮＡ発現レベルアッセイ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロット法、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫染色、フローサイトメトリーアッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、化学発光アッセイ、ラテラルフローイムノアッセイ、阻害アッセイまたは結合力アッセイ、タンパク質マイクロアレイ、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、メソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）電気化学発光およびビーズベースのマルチプレックスイムノアッセイ（ＭＩＡ）等のアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、適した技術は、可溶性因子に特異的に結合する検出可能な結合試薬を採用する場合がある。
特定の実施形態では、可溶性因子、例えば、サイトカインの測定は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）によって測定される。ＥＬＩＳＡは、ペプチド、サイトカイン、抗体およびホルモンなどの物質を検出および定量化するために設計されたプレートベースアッセイ技術である。ＥＬＩＳＡでは、可溶性因子は、固体表面に固定化されなくてはならず、次いで、抗体と複合体形成し、これが、酵素に連結される。検出は、検出可能なシグナルをもたらす基質と共のインキュベーションによってコンジュゲートされた酵素活性を評価することによって達成される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定される。
一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、可溶性因子（例えば、サイトカイン）の分泌または生成である。ある特定の実施形態では、生成または分泌は、組換え受容体依存性活性、例えば、ＣＡＲ依存性活性を刺激する、組換え受容体に結合可能である組換え受容体刺激剤によって、組換え受容体発現細胞、例えば、ＣＡＲ発現細胞を含有する治療用細胞組成物において刺激される。一部の実施形態では、組換え受容体刺激剤は、組換え受容体に対して特異的である抗原またはそのエピトープを含む；抗原を発現する細胞であるか；または組換え受容体に結合する、および／もしくはそれを認識する抗体もしくはその一部分もしくは変異体を含む；またはそれらの組合せ（例えば、上記の節Ｉ－Ｂを参照されたい）。ある特定の実施形態では、組換え受容体刺激剤は、組換え受容体によって結合される、またはそれによって認識される抗原またはそのエピトープを含む組換えタンパク質である。
ある特定の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、可溶性因子生成および／または分泌であり、組換え受容体、例えば、ＣＡＲを発現する細胞を含有する治療用細胞組成物を、節Ｉ－Ｂに記載されるもの等の組換え受容体刺激剤と共にインキュベートすることによって測定される。ある特定の実施形態では、可溶性因子は、サイトカインまたはケモカインである。一部の実施形態では、組換え受容体発現細胞を含有する治療用細胞組成物の細胞は、組換え受容体刺激剤の存在下で一定量の時間インキュベートされ、可溶性因子の生成および／または分泌は、インキュベーションの間の１つまたは複数の時点で測定される。一部の実施形態では、細胞は、組換え受容体刺激剤と共に、最大または約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約４８時間または各々境界を含めて１時間から４時間の間、１時間から１２時間の間、１２時間から２４時間の間、または２４時間より長くインキュベートされ、可溶性因子、例えば、サイトカインの量が検出される。
一部の実施形態では、組換え受容体刺激剤は、組換え受容体によって認識される抗原もしくはその部分が、または組換え受容体の細胞外ドメイン（例えば、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ））に対して特異的な抗体、例えば、抗イディオタイプ抗体が付着している、または固定化されている粒子（例えば、ビーズ）である。一部の実施形態では、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）および一定数の治療用細胞組成物の細胞が、粒子と共に、１：１００、１：７５、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２もしくは１：０．１または約１：１００、１：７５、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２もしくは１：０．１等を含む、治療用細胞組成物の細胞の、粒子に対する複数の比率で、または前記のいずれかの間の範囲、例えば、各々境界を含めて１：１から１：１０または１：０．２～１：１２の間の比率でインキュベートされる。一部の実施形態では、複数の比率は、本明細書において提供されるありとあらゆる比率を含む。一部の実施形態では、組換え受容体刺激剤は、組換え受容体によって認識される抗原を発現する細胞である。一部の実施形態では、組換え受容体はＣＡＲであり、調整された数の治療用細胞組成物の細胞が、一定数のこのような粒子と共に、治療用細胞組成物の細胞の、粒子に対する複数の比率で、例えば、１：１００、１：７５、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２もしくは１：０．１または約１：１００、１：７５、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２もしくは１：０．１で、または前記のいずれかの間の範囲、例えば、各々境界を含めて１：１から１：１０または１：０．２～１：１２の間の比率でインキュベートされる。一部の実施形態では、複数の比率は、本明細書において提供されるありとあらゆる比率を含む。
一部の実施形態では、組換え受容体刺激剤は、組換え受容体によって認識される標的（例えば、抗原または抗体）を発現する細胞である。一部の実施形態では、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）および一定数の治療用細胞組成物の細胞が、細胞と共に、１：１００、１：７５、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２もしくは１：０．１または約１：１００、１：７５、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２もしくは１：０．１を含む、治療用細胞組成物の細胞の、標的（例えば、抗原または抗体）を発現する細胞に対する複数の比率で、または前記のいずれかの間の範囲、例えば、各々境界を含めて１：１から１：１０または１：０．２～１：１２の間の比率でインキュベートされる。一部の実施形態では、複数の比率は、本明細書において提供されるありとあらゆる比率を含む。一部の実施形態では、組換え受容体はＣＡＲであり、調整された数の治療用細胞組成物の細胞は、一定数の、標的（例えば、抗原または抗体）を発現する細胞と共に、１：１００、１：７５、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２もしくは１：０．１または約１：１００、１：７５、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２もしくは１：０．１を含む、治療用細胞組成物の細胞の、抗原を発現する細胞に対する複数の比率で、または前記のいずれかの間の範囲、例えば、各々境界を含めて１：１から１：１０または１：０．２～１：１２の間の比率でインキュベートされる。一部の実施形態では、複数の比率は、本明細書において提供されるありとあらゆる比率を含む。
一部の実施形態では、各々境界を含む、細胞組成物の約１×１０２から約１×１０４の間、約１×１０３から約１×１０５の間、約１×１０４から約１×１０６の間、約１×１０５から約１×１０７の間、約１×１０６から約１×１０８の間、約１×１０７から約１×１０９の間および約１×１０８から約１×１０１０の間の細胞が、一定の量または濃度の組換え受容体刺激剤と共にインキュベートされる。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞は、一定体積の細胞培地の中で組換え受容体刺激剤と共にインキュベートされる。正確な体積は経験的に決定でき、アッセイが実行されている容器（例えば、マルチウェルプレート）の表面積の関数であるということは理解される。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとももしくは約１μＬ、少なくとももしくは約１０μＬ、少なくとももしくは約２５μＬ、少なくとももしくは約５０μＬ、少なくとももしくは約１００μＬ、少なくとももしくは約５００μＬ、少なくとももしくは約１ｍＬ、少なくとももしくは約１．５ｍＬ、少なくとももしくは約２ｍＬ、少なくとももしくは約２．５ｍＬ、少なくとももしくは約５ｍＬ、少なくとももしくは約１０ｍＬ、少なくとももしくは約２０ｍＬ、少なくとももしくは約２５ｍＬ、少なくとももしくは約５０ｍＬ、少なくとももしくは約１００ｍＬまたは１００ｍＬより多い体積で組換え受容体刺激剤と共にインキュベートされる。ある特定の実施形態では、細胞は、各々境界を含む、約１μＬから約１００μＬの間、約１００μＬから約５００μＬの間、約５００μＬから約１ｍＬの間、約５００μＬから約１ｍＬの間、約１ｍＬから約１０ｍＬの間、約１０ｍＬから約５０ｍＬの間または約１０ｍＬから約１００ｍＬの間に入る体積中で組換え受容体刺激剤と共にインキュベートされる。ある特定の実施形態では、細胞は、境界を含む、約１００μＬから約１ｍＬの間の体積中で組換え受容体刺激剤と共にインキュベートされる。特定の実施形態では、細胞は、約５００μＬの体積で組換え受容体刺激剤と共にインキュベートされる。一部の実施形態では、マルチウェルプレートは６ウェルプレートであり、体積は、１ｍＬまたは約１ｍＬ～３ｍＬまたは約３ｍＬである。一部の実施形態では、マルチウェルプレートは１２ウェルプレートであり、体積は、１ｍＬまたは約１ｍＬ～２ｍＬまたは約２ｍＬである。一部の実施形態では、マルチウェルプレートは２４ウェルプレートであり、体積は、０．５ｍＬまたは約０．５ｍＬ～１ｍＬまたは約１ｍＬである。一部の実施形態では、マルチウェルプレートは４８ウェルプレートであり、体積は、０．２ｍＬまたは約０．２ｍＬ～０．４ｍＬまたは約０．４ｍＬである。一部の実施形態では、マルチウェルプレートは９６ウェルプレートであり、体積は、０．１ｍＬまたは約０．１ｍＬ～０．２ｍＬまたは約０．２ｍＬである。
一部の実施形態では、一定数の治療用細胞組成物の細胞が、各々境界を含めた約１ｆｍｏｌから約１ｐｍｏｌの間、約１ｐｍｏｌから約１ｎｍｏｌの間、約１ｎｍｏｌから約１μｍｏｌの間、約１μｍｏｌから約１ｍｍｏｌの間または約１ｍｍｏｌから１ｍｏｌの間で変わる濃度の組換え受容体刺激剤と共にインキュベートされる。特定の実施形態では、一定数の治療用細胞組成物の細胞が、各々境界を含めた約１ｆＭから約１ｐＭの間、約１ｐＭから約１ｎＭの間、約１ｎＭから約１μＭの間、約１μＭから約１ｍＭの間または約１ｍＭから１ｍｏｌの間で変わる濃度の組換え受容体刺激剤と共にインキュベートされる。例示的単位として、ｐｇ／ｍＬ、ｐｇ／（ｍＬ／ｈｒ）、ｐｇ（ｍＬ×細胞）、ｐｇ／（ｍＬ×ｈｒ×細胞）およびｐｇ／（ｍＬ×ｈｒ×１０６個細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、組換え受容体依存性活性、例えば、ＣＡＲ依存性活性の測定値は、試験された複数の比率の各々のインキュベーションの間の時点での、またはその最後での治療用細胞組成物中の可溶性因子の量もしくは濃度または相対量もしくは濃度である。特定の実施形態では、測定値は、対照測定値が差し引かれる、またはそれに対して正規化される。一部の実施形態では、対照測定値は、インキュベーションの前にとられた同一細胞組成物からの測定値である。特定の実施形態では、対照測定値は、結合分子と共にインキュベートされなかった同一の対照細胞組成物からとられた測定値である。ある特定の実施形態では、対照は、組換え受容体陽性細胞を含有しない細胞組成物からの結合分子と共のインキュベーションの間の同一時点でとられた測定値である。
一部の実施形態では、測定値は、対照と比較した量または濃度の正規化された比率である。特定の実施形態では、測定値は、時間量当たりの、例えば、分当たりの、または時間当たりの可溶性因子の量または濃度である。一部の実施形態では、測定値は、細胞当たりの、または細胞のセットもしくは参照数当たりの、例えば、１００個細胞当たりの、１０３個細胞当たりの、１０４個細胞当たりの、１０５個細胞当たりの、１０６個細胞当たり等の可溶性因子の量または濃度である。特定のものでは、測定値は、細胞当たりの、または参照数の細胞当たりの可溶性因子の量または濃度である。一部の実施形態では、測定値は、組換え受容体を発現する細胞当たりの可溶性因子の量または濃度である。ある特定の実施形態では、測定値は、治療用細胞組成物の、組換え受容体を発現する細胞、ＣＡＲ＋細胞当たりの、時間量当たりの（例えば、分当たりの、または時間当たりの）可溶性因子の量または濃度である。一部の実施形態では、測定値は、組換え受容体または組換え受容体刺激剤の量または濃度当たりの時間量当たりの可溶性因子の量または濃度である。一部の実施形態では、測定値は、組換え受容体刺激剤の量または濃度当たりの、細胞当たりの、または細胞のセットもしくは参照数当たりの可溶性因子の量または濃度である。一部の実施形態では、測定値は、細胞当たりの、または細胞の参照数当たりの、組換え受容体または組換え受容体刺激剤の量または濃度当たりの、時間量当たりの可溶性因子の量または濃度である。一部の実施形態では、測定値は、組換え受容体を発現する細胞当たりの、組換え受容体または組換え受容体刺激剤の量または濃度当たりの可溶性因子の量または濃度である。ある特定の実施形態では、測定値は、治療用細胞組成物のＣＡＲ＋細胞の量当たりの、組換え受容体または組換え受容体刺激剤の量または濃度当たりの、時間量当たりの可溶性因子の量または濃度である。
特定の実施形態では、組換え受容体－またはＣＡＲ－依存性活性は、２つまたはそれより多い可溶性因子の生成または分泌である。ある特定の実施形態では、組換え受容体－またはＣＡＲ－依存性活性は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０より多い可溶性因子の生成または分泌である。一部の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０より多い可溶性因子の測定値が、算術平均または幾何平均に組み合わされる。特定の測定値では、組換え受容体依存性活性の測定値は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０より多い可溶性因子の分泌または混合物である。
特定の実施形態では、組換え受容体依存性活性の測定値は、例えば、対数変換によって変換される。ある特定の実施形態では、組換え受容体活性の測定値は、常用対数（ｌｏｇ１０（ｘ））、自然対数（ｌｎ（ｘ））または２を底とする対数（ｌｏｇ２（ｘ））によって変換される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性の測定値は、２つより多い可溶性因子の生成または分泌の測定値の複合物である。一部の実施形態では、可溶性因子の生成または分泌の測２つより多い測定値は、複合測定値に組み合わされる前に変換される。特定の実施形態では、組換え受容体依存性活性の測定値は、参照測定値に対する正規化の前に変換される。ある特定の実施形態では、組換え受容体依存性活性の測定値は、参照測定値に対する正規化の前に変換される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性の正規化は、複数のインキュベーションから測定された最大組換え受容体依存性活性に対してである。
ある特定の実施形態では、可溶性因子はサイトカインである。サイトカインは、細胞コミュニケーションにおいて広範囲に機能する小さいシグナル伝達分子の大きな群である。サイトカインは、インターロイキン、ケモカインおよびインターフェロンを含む種々の免疫調節分子と関連することが最も多い。あるいは、サイトカインは、４つのファミリー、ＩＬ－２サブファミリー、ＩＦＮサブファミリーおよびＩＬ－１０サブファミリーを含む４つのアルファヘリックスファミリー；トランスフォーミング増殖因子ベータファミリーのメンバーを含む、ＩＬ－１ファミリー、ＩＬ－１７ファミリーおよびシステイン－ノットサイトカインに分類されるその構造を特徴とする場合がある。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、インターロイキン、インターフェロンおよびケモカインを含む１つまたは複数の可溶性因子の生成または分泌である。特定の実施形態では、組換え受容体依存性活性、例えば、ＣＡＲ依存性活性は、ＩＬ－２ファミリーメンバー、ＩＦＮサブファミリーメンバー、ＩＬ－１０サブファミリーメンバー、ＩＬ－１ファミリーメンバー、ＩＬ－１７ファミリーメンバー、システイン－ノットサイトカインおよび／またはトランスフォーミング増殖因子ベータファミリーのメンバーのうち１つまたは複数以上の生成または分泌である。
特定の実施形態では、組換え受容体依存性またはＣＡＲ依存性活性は、ＩＬ－１、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ｓＩＬ－２Ｒａ、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ ２７、ＩＬ－３３、ＩＬ－３５、ＴＮＦ、ＴＮＦアルファ、ＣＸＣＬ２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２４、ＰＧＤ２、ＬＴＢ４、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ）－１ａ、ＭＩＰ－１ｂ、Ｆｌｔ－３Ｌ、フラクタルカイン（ｆｒａｃｋｔａｌｋｉｎｅ）および／またはＩＬ－５のうち１つまたは複数の生成および／または分泌である。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ依存性活性は、Ｔｈ１７サイトカインの生成または分泌である。一部の実施形態では、Ｔｈ１７サイトカインはＧＭＣＳＦである。一部の実施形態では、ＣＡＲ依存性活性は、Ｔｈ２サイトカインの生成または分泌を含み、Ｔｈ２サイトカインは、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１０またはＩＬ－１３である。
ある特定の実施形態では、組換え受容体－またはＣＡＲ－依存性活性は、炎症性サイトカインの生成または分泌である。炎症性サイトカインは、炎症反応の開始において役割を果たし、自然免疫応答を媒介して病原に対する宿主防御を調節する。炎症性サイトカインとして、インターロイキン（ＩＬ）、インターロイキン－ｌ－ベータ（ＩＬ－１）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、インターロイキン－５（ＩＬ－５）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＸＣ－ケモカインリガンド２（ＣＸＣＬ２）、ＣＣ－ケモカインリガンド２（ＣＣＬ２）、ＣＣ－ケモカインリガンド３（ＣＣＬ３）、ＣＣ－ケモカインリガンド５（ＣＣＬ５）、ＣＣ－ケモカインリガンド１７（ＣＣＬ１７）、ＣＣ－ケモカインリガンド２４（ＣＣＬ２４）、プロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）およびロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）ならびにＩＬ－３３が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、組換え受容体－またはＣＡＲ－依存性活性は、インターロイキンおよび／またはＴＮＦファミリーメンバーの生成およびまたは分泌である。特定の実施形態では、組換え受容体－またはＣＡＲ－依存性活性は、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８およびＩＬ－１８、ＴＮＦ－アルファまたはそれらの組合せの生成およびまたは分泌である。
特定の実施形態では、組換え受容体活性（例えばＣＡＲ依存性活性）は、ＩＬ－２、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファまたはそれらの組合せの分泌である。一部の実施形態では、組換え受容体活性（例えばＣＡＲ依存性活性）は、ＩＬ－２の分泌である。一部の実施形態では、組換え受容体活性（例えばＣＡＲ依存性活性）は、ＩＦＮ－ガンマの分泌である。一部の実施形態では、組換え受容体活性（例えばＣＡＲ依存性活性）は、ＴＮＦ－アルファの分泌である。
特定の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、治療用細胞組成物の細胞溶解性（細胞傷害性）活性である。一部の実施形態では、組換え受容体依存性細胞溶解活性は、組換え受容体を発現する細胞または組換え受容体を発現する細胞を含有する細胞組成物を、組換え受容体によって結合される、および／または認識される抗原および／またはエピトープを発現する変動する量の標的細胞を用いて、曝露すること、インキュベートすることおよび／または接触させることによって評価される。細胞溶解活性は、経時的に標的細胞数を直接的または間接的に測定することによって測定され得る。例えば、標的細胞は、検出可能であり、次いで標的細胞が溶解されるようなマーカー、または生存可能な標的細胞において検出可能である検出可能なマーカーのような検出可能なマーカーと共にインキュベートされ、その後、組換え受容体を発現する細胞と共にインキュベートされる場合がある。これらの読み取り値は、標的細胞数および／または標的細胞死を直接または間接に提供し、アッセイの間の種々の時点で測定され得る。標的細胞数の低減および／または標的細胞死の増大は、細胞の細胞溶解活性を示す。細胞溶解アッセイを実施するための適した方法は、当技術分野で公知であり、クロム－５１放出アッセイ、非放射活性クロムアッセイ、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）、ＰＫＨ－２およびＰＫＨ－２６等の蛍光色素を使用するフローサイトメトリーアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、組換え受容体－、例えば、ＣＡＲ依存性細胞溶解活性は、組換え受容体を発現する細胞を含有する細胞組成物を、組換え受容体によって結合されるか、またはそれによって認識される抗原またはそのエピトープを発現する標的細胞と共にインキュベートすることによって測定される。ある特定の実施形態では、組換え受容体はＣＡＲである。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞は、抗原を発現する細胞と共に、１０：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９もしくは約１：１０を含む比率で、または各々境界を含めて１０：１から１：１、３：１から１：３もしくは１：１から１：１０の間の比率でインキュベートされる。一部の実施形態では、細胞組成物の細胞は、標的細胞と共に、比率約１０：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９もしくは約１：１０を含む治療用細胞組成物のＣＡＲ＋細胞の、標的細胞に対する比率で、または各々境界を含めて１０：１から１：１、３：１から１：３もしくは１：１から１：１０の間の比率でインキュベートされる。
ある特定の実施形態では、治療用細胞組成物の細胞は、標的細胞と共に、最大でまたは約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約８時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約４８時間または４８時間より長い間インキュベートされる。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の一定数の細胞が、抗原を発現する細胞と共に約１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間または２４時間インキュベートされる。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の一定数の細胞、各々境界を含む、約１×１０２から約１×１０４の間、約１×１０３から約１×１０５の間、約１×１０４から約１×１０６の間、約１×１０５から約１×１０７の間、約１×１０６から約１×１０８の間、約１×１０７から約１×１０９の間または約１×１０８から約１×１０１０の間の細胞が、変動する数の抗原発現細胞と共にインキュベートされて、複数の比率をもたらす。ある特定の実施形態では、治療用細胞組成物の一定量の細胞、各々境界を含む、約１×１０２から約１×１０４の間、約１×１０３から約１×１０５の間、約１×１０４から約１×１０６の間、約１×１０５から約１×１０７の間、約１×１０６から約１×１０８の間、約１×１０７から約１×１０９の間または約１×１０８から約１×１０１０の間のＣＡＲ＋細胞が、変動する数の抗原発現細胞と共にインキュベートされて、複数の比率をもたらす。
一部の実施形態では、活性の測定値は、対照に対して比較される。ある特定の実施形態では、対照は、細胞組成物と共にインキュベートされていない抗原発現細胞の培養物である。一部の実施形態では、対照は、同一比率で抗原発現細胞と共にインキュベートされているＣＡＲ＋細胞を含有しない対照細胞組成物からの測定値である。
ある特定の実施形態では、細胞溶解活性アッセイの測定値は、試験された各比率についてのインキュベーションの間の時点で、またはその最後で生存可能である抗原発現細胞の数である。ある特定の実施形態では、測定値は、インキュベーションの際に放出される標的細胞死のマーカー、例えば、クロム－５１の量である。一部の実施形態では、測定値は、単独でインキュベートされた対照の標的細胞の量から、所与の時点での同時インキュベーションにおける標的細胞の量を差し引くことによって決定される標的細胞死の量である。一部の実施形態では、測定値は、標的細胞の出発量と比較した、ある時点での残存する標的細胞のパーセンテージである。特定の実施形態では、測定値は、ある時間量にわたって死滅した細胞の量である。ある特定の実施形態では、測定値は、細胞組成物の各細胞当たりの死滅した細胞の量である。一部の実施形態では、測定値は、量である。細胞当たりの死滅した細胞の量、または細胞のセット数もしくは参照当たりの死滅した細胞の量、例えば、それだけには限らないが、組成物の１００個細胞当たりの、１０３個細胞当たりの、１０４個細胞当たりの、１０５個細胞当たりの、１０６個細胞当たりの、１０７個細胞当たりの、１０８個細胞当たりの、１０９個細胞当たりの、または１０１０個細胞当たりの死滅した標的細胞の量である。特定の実施形態では、測定値は、細胞組成物の各ＣＡＲ＋細胞またはその参照数もしくはセット数当たりの死滅した細胞の量である。ある特定の実施形態では、測定値は、細胞組成物の細胞当たりの時間量当たりの死滅した細胞の量である。特定の実施形態では、測定値は、治療用細胞組成物のＣＡＲ＋細胞当たりの時間量にわたる死滅した細胞の量である。
一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、治療用細胞組成物の細胞中の遺伝子の上方制御である。一部の実施形態では、組換え受容体依存性遺伝子上方制御活性は、組換え受容体を発現する細胞または組換え受容体を発現する細胞を含有する細胞組成物を、組換え受容体に結合し、刺激する変動する量の組換え受容体刺激剤を用いて、曝露すること、インキュベートすることおよび／または接触させることによって評価される。遺伝子活性の上方制御は、経時的に数によって直接的にまたは間接的に測定され得る。
一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、治療用細胞組成物の細胞中の遺伝子の下方制御である。一部の実施形態では、組換え受容体依存性遺伝子下方制御活性は、組換え受容体を発現する細胞または組換え受容体を発現する細胞を含有する細胞組成物を、組換え受容体に結合し、刺激する変動する量の組換え受容体刺激剤を用いて、曝露すること、インキュベートすることおよび／または接触させることによって評価される。遺伝子活性の下方制御は、経時的に数によって直接的にまたは間接的に測定され得る。
一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、治療用細胞組成物の細胞中の受容体の上方制御である。一部の実施形態では、組換え受容体依存性受容体上方制御活性は、組換え受容体を発現する細胞または組換え受容体を発現する細胞を含有する細胞組成物を、組換え受容体に結合し、刺激する変動する量の組換え受容体刺激剤を用いて、曝露すること、インキュベートすることおよび／または接触させることによって評価される。受容体活性の上方制御は、経時的に数によって直接的にまたは間接的に測定され得る。
一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、治療用細胞組成物の細胞中の受容体の下方制御である。一部の実施形態では、組換え受容体依存性受容体下方制御活性は、組換え受容体を発現する細胞または組換え受容体を発現する細胞を含有する細胞組成物を、組換え受容体に結合し、刺激する変動する量の組換え受容体刺激剤を用いて、曝露すること、インキュベートすることおよび／または接触させることによって評価される。受容体活性の下方制御は、経時的に数によって直接的にまたは間接的に測定され得る。
一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性の測定値を数学的モデルを使用してフィッティングして、組換え受容体依存性活性曲線を得る。カーブフィッティングによって、一部の場合には、治療用細胞組成物の挙動、例えば、組換え受容体依存性活性の推測または外挿が可能になる場合がある。カーブフィッティングを実施するための当技術分野で公知の任意の方法が使用され得るということが企図される。一部の実施形態では、曲線はＳ字形である。一部の実施形態では、複数のインキュベーションの各々から測定された組換え受容体依存性活性に基づいて、最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす調整された比率が決定される。一部の実施形態では、最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす調整された比率が、組換え受容体依存性活性曲線から推測、外挿または推定される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性曲線は、測定された最大組換え受容体依存性活性に対して正規化される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性曲線は、曲線の上側漸近線、適宜、上側漸近線の値の範囲に対して正規化される。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるようなアッセイを含む方法は、組換え受容体依存性活性の測定値を検証するために２連または３連で、またはそれより多くで実施される場合がある。アッセイが例えば、２連、３連またはそれより多くで実施される一部の場合には、複製物の各々から測定された組換え受容体依存性活性が使用されて、組換え受容体依存性活性の記述統計的尺度が提供される。例えば、一部の場合には、複数の比率試験の各々について、組換え受容体依存性活性の各尺度の平均（例えば、加算平均）、中央値、標準偏差および／または分散が決定される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性の各尺度の平均が決定される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性の各尺度の標準偏差が決定される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性の平均尺度が数学的モデルを使用してフィッティングされ、組換え受容体依存性活性曲線が生成または推定される。一部の実施形態では、曲線は、平均最大値に対して正規化される。一部の実施形態では、曲線は、上側漸近線、適宜、上側漸近線の値の範囲の平均に対して正規化される。
本明細書で記載された尺度は、参照標準、例えば、本明細書において、例えば、節Ｉ－Ｄ－１に記載される参照標準を参照して使用され得る。
Ｄ．治療用細胞組成物の効力の決定
本明細書で提供される方法によって、治療用細胞組成物の効力を決定することが可能となる。本明細書（例えば、節－ＩＩ）で記載されたもの等のプロセスならびに複数のインキュベーションを含み、各インキュベーションが、異なる比率の治療用組成物の細胞を、治療用細胞組成物中の組換え受容体依存性活性を刺激することが可能な組換え受容体刺激剤と共に培養することを含むアッセイにおいて、製造された治療用細胞組成物の細胞が培養されることを可能にする任意の他の製造プロセスによって製造された治療用細胞組成物の効力を評価するために、本明細書で記載されるアッセイを使用できることが企図される。一部の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い治療用細胞組成物が、本明細書で提供される方法に従って評価され得る。
試験された複数の比率の各々で組換え受容体依存性活性の測定値をとることによって、治療用細胞組成物の効力が決定され得る。一部の実施形態では、測定値は、２連、３連またはそれより多くの複製物にわたって加算平均または中央値をとることによって決定される複合物である。一部の実施形態では、測定値の標準偏差および／または分散は、決定され得る。一部の実施形態では、組換え受容体刺激剤に応じた、治療用細胞組成物の組換え受容体依存性活性の、複合測定値を含む１つまたは複数の測定値を、治療用細胞組成物の効力を決定するために使用できる。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性は、節Ｉ－Ｃに記載されるような任意のものであり得る。一部の実施形態では、組換え受容体刺激剤は、節Ｉ－Ｂに記載されるような任意のものであり得る。
一部の実施形態では、異なる比率での複数のインキュベーションは、カーブフィッティング法が適用され得る複数の測定値をもたらす。一部の実施形態では、複数の測定値は、複合測定値（例えば、平均値または中央値）を含む。例えば、組換え受容体依存性活性測定値を曲線、例えば、Ｓ字形とフィッティングして、治療用細胞組成物の挙動（例えば、感受性）の推測、外挿または推定を可能にできる。一部の実施形態では、測定値にフィッティングされた曲線を使用して、アッセイの際に直接調べなかった治療用組成物の挙動（例えば、感受性）を推定できる。例えば、曲線を使用して、下側漸近線；最小値；組換え受容体依存性活性の検出の喪失；最大半量の特定のパーセンテージ（１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％または９０％）最大半量値（例えば、５０％組換え受容体依存性活性）；最大組換え受容体依存性活性の１０％～９０％、２０％～８０％、３０％～７０％または４０％～６０％の範囲（すなわち、以下に記載されるような最大活性）；上側漸近線；および最大値および値または範囲の各々が生じる比率を推定できる。
任意の尺度、最大半量での比率、範囲、最大、最小、漸近線およびその複合尺度）を使用して、治療用細胞組成物の効力を決定できるということが企図される。一部の実施形態では、効力は相対効力である。
１．効力
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の効力は、組換え受容体依存性活性測定値のうち１つもしくは複数または範囲が生じる比率として定義される。一部の実施形態では、測定値のうち１つもしくは複数または範囲は、複製された実験から決定された複合測定値、例えば、平均または中央値である。一部の実施形態では、測定値および比率は、測定された組換え受容体依存性活性の組換え受容体依存性活性曲線から決定される。一部の実施形態では、測定された組換え受容体依存性活性は、治療用組成物について測定された最大活性に対して正規化される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性曲線は、治療用細胞組成物について測定された最大組換え受容体依存性活性に対して正規化される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性曲線は、治療用細胞組成物について測定された組換え受容体依存性活性の上側漸近線、適宜、漸近線にわたって測定された値の平均に対して正規化される。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の効力は、１０％～９０％の組換え受容体依存性活性が生じる比率の範囲である、またはその逆である。一部の実施形態では、１０％～９０％の組換え受容体依存性活性が生じる比率の範囲が、組換え受容体依存性活性曲線から推定される。一部の実施形態では、例えば、組換え受容体依存性活性尺度または組換え受容体依存性活性曲線が正規化される場合に、組換え受容体依存性活性値範囲の範囲は０．１～０．９または１０％～９０％である。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の効力は、２０％～８０％の組換え受容体依存性活性が生じる比率の範囲である、またはその逆である。一部の実施形態では、２０％～８０％の組換え受容体依存性活性が生じる比率の範囲が、組換え受容体依存性活性曲線から推定される。一部の実施形態では、例えば、組換え受容体依存性活性尺度または組換え受容体依存性活性曲線が正規化される場合に、組換え受容体依存性活性値範囲の範囲は、０．２～０．８または２０％～８０％である。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の効力は、３０％～７０％の組換え受容体依存性活性が生じる比率の範囲である、またはその逆である。一部の実施形態では、３０％～７０％の組換え受容体依存性活性が生じる比率の範囲が、組換え受容体依存性活性曲線から推定される。一部の実施形態では、例えば、組換え受容体依存性活性尺度または組換え受容体依存性活性曲線が正規化される場合に、組換え受容体依存性活性値範囲の範囲は０．３～０．７または３０％～７０％である。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の効力は、４０％～６０％の組換え受容体依存性活性が生じる比率の範囲である、またはその逆である。一部の実施形態では、４０％～６０％の組換え受容体依存性活性が生じる比率の範囲が、組換え受容体依存性活性曲線から推定される。一部の実施形態では、例えば、組換え受容体依存性活性尺度または組換え受容体依存性活性曲線が正規化される場合に、組換え受容体依存性活性値範囲の範囲は０．４～０．６または４０％～６０％である。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の効力は、最大半量の組換え受容体依存性活性が生じる比率の範囲である。一部の実施形態では、最大半量の値が生じる最大半量値および比率が、組換え受容体依存性活性曲線から推定される。一部の実施形態では、例えば、組換え受容体依存性活性尺度または組換え受容体依存性活性曲線が正規化される場合に、最大半量の組換え受容体依存性活性値が０．５または５０％である。
一部の実施形態では、例えば、組換え受容体依存性活性曲線がＳ字形によってフィッティングされる場合、曲線の線形部分が決定される。一部の実施形態では、効力は、測定値および曲線の線形部分からの対応する比率である。一部の実施形態では、最大半量値測定値および比率は、曲線の線形部分から決定される。
２．相対効力
本明細書で提供される方法は、異なる治療用細胞組成物、例えば、参照標準に対して、治療用細胞組成物の効力の決定を可能にする。この種の効力は、相対効力と呼ばれる場合もある。例えば、本明細書で提供される方法に従って評価された治療用細胞組成物を、例えば、本明細書で提供される方法に従って評価される、異なる治療用細胞組成物（例えば、参照標準、例えば、以下に記載されるような）と比較して、治療用細胞組成物の効力が互いにどのように関連するかを決定できる。これは、複数の治療用細胞組成物を比較して、どの組成物が最高効力または最適効力を有するかを決定できるという利点を与える。一部の実施形態では、最適効力は、対象において治療効果、例えば、持続的な応答、無増悪生存を誘発できる効力である。一部の実施形態では、最適効力は、対象において毒性をもたらさない効力である。一部の実施形態では、最適効力は、対象において治療効果、例えば、持続的な応答、無増悪生存を誘発でき、毒性をもたらさない効力である。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の相対効力は、参照標準の組換え受容体依存性活性測定値のうち１つまたは複数または範囲が生じる比率（複数可）に対して比較される、治療用細胞組成物の組換え受容体依存性活性測定値のうち１つまたは複数または範囲が生じる比率（複数可）として定義される。一部の実施形態では、治療用細胞組成物および参照標準のうち一方または両方の測定値のうち１つまたは複数または範囲は、複製された実験から決定された複合測定値、例えば、平均または中央値である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物および参照標準の測定値および比率は、それぞれ、組成物の測定された組換え受容体依存性活性の組換え受容体依存性活性曲線から決定される。一部の実施形態では、治療用細胞組成物および参照標準の測定された組換え受容体依存性活性は、それぞれ治療用組成物および参照標準について測定された最大活性に対して正規化される。一部の実施形態では、治療用細胞組成物および参照標準の組換え受容体依存性活性曲線は、それぞれ治療用細胞組成物および参照標準について測定された最大組換え受容体依存性活性に対して正規化される。一部の実施形態では、治療用細胞組成物および参照標準の組換え受容体依存性活性曲線は、それぞれ治療用細胞組成物および参照標準について測定された組換え受容体依存性活性の上側漸近線、適宜、漸近線にわたる測定された値の平均に対して正規化される。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の相対効力は、標準参照の、１０％～９０％の組換え受容体依存性活性が生じる範囲と比較された、またはその逆である、１０％～９０％の組換え受容体依存性活性が生じる比率の範囲である、またはその逆である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物および参照標準の１０％～９０％の組換え受容体依存性活性が生じる比率の範囲が、それぞれ治療用細胞組成物および参照標準の組換え受容体依存性活性曲線から推定される。一部の実施形態では、例えば、治療用細胞組成物および参照標準の組換え受容体依存性活性尺度または組換え受容体依存性活性曲線が正規化される場合には、組換え受容体依存性活性値範囲の範囲は、０．１～０．９または１０％～９０％である。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の相対効力は、標準参照の２０％～８０％の組換え受容体依存性活性が生じる範囲と比較して、２０％～８０％の組換え受容体依存性活性が生じる比率の範囲である、または逆もまた同様である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物および参照標準の２０％～８０％の組換え受容体依存性活性が生じる比率の範囲が、それぞれ治療用細胞組成物および参照標準の組換え受容体依存性活性曲線から推定される。一部の実施形態では、例えば、治療用細胞組成物および参照標準の組換え受容体依存性活性尺度または組換え受容体依存性活性曲線が正規化される場合には、組換え受容体依存性活性値範囲の範囲は、０．２～０．８または２０％～８０％である。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の相対効力は、標準参照の３０％～７０％の組換え受容体依存性活性が生じる範囲と比較して、３０％～７０％の組換え受容体依存性活性が生じる比率の範囲である、または逆もまた同様である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物および参照標準の３０％～７０％の組換え受容体依存性活性が生じる比率の範囲が、それぞれ治療用細胞組成物および参照標準の組換え受容体依存性活性曲線から推定される。一部の実施形態では、例えば、治療用細胞組成物および参照標準の組換え受容体依存性活性尺度または組換え受容体依存性活性曲線が正規化される場合には、組換え受容体依存性活性値範囲の範囲は、０．３～０．７または３０％～７０％である。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の相対効力は、標準参照の３０％～７０％の組換え受容体依存性活性が生じる範囲と比較して、４０％～６０％の組換え受容体依存性活性が生じる比率の範囲である、または逆もまた同様である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物および参照標準の４０％～６０％の組換え受容体依存性活性が生じる比率の範囲が、それぞれ治療用細胞組成物および参照標準の組換え受容体依存性活性曲線から推定される。一部の実施形態では、例えば、治療用細胞組成物および参照標準の組換え受容体依存性活性尺度または組換え受容体依存性活性曲線が正規化される場合には、組換え受容体依存性活性値範囲の範囲は、０．４～０．６または４０％～６０％である。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の相対効力は、標準参照の３０％～７０％の組換え受容体依存性活性が生じる範囲と比較して、最大半量の組換え受容体依存性活性が生じる比率の範囲である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物および参照標準の最大半量値および最大半量値が生じる比率が、それぞれ治療用細胞組成物および参照標準の組換え受容体依存性活性曲線から推定される。一部の実施形態では、例えば、治療用細胞組成物および参照標準の組換え受容体依存性活性尺度または組換え受容体依存性活性曲線が正規化される場合には、最大半量の組換え受容体依存性活性値は０．５または５０％である。
一部の実施形態では、例えば、治療用細胞組成物および参照標準の組換え受容体依存性活性曲線がＳ字形によってフィッティングされる場合には、曲線の線形部分が決定される。一部の実施形態では、相対効力は、治療用細胞組成物の測定値および曲線の線形部分からの対応する比率と、参照標準の測定値および曲線の線形部分からの対応する比率の比較である。一部の実施形態では、治療用細胞組成物および参照標準の最大半量の値の測定値および比率は、曲線の線形部分から決定される。
一部の実施形態では、治療用細胞組成物および参照組成物の上記のものなどの測定値間の比較は除算である。例えば、治療用細胞組成物の最大半量の組換え受容体依存性活性が生じる比率は、参照標準の最大半量の組換え受容体依存性活性が生じる比率によって除される。一部の実施形態では、相対効力は、比率として表される。一部の実施形態では、相対効力は、パーセンテージとして表される。
一部の実施形態では、例えば、治療用細胞組成物および参照標準の組換え受容体依存性活性曲線が上記のようにＳ字形によってフィッティングされ、正規化される場合には、相対効力は、曲線間の相違である。一部の実施形態では、曲線間の相違は、正規化された曲線の線形部分について測定される。一部の実施形態では、治療用細胞組成物および参照標準の組換え受容体依存性活性曲線、例えば、Ｓ字形曲線の正規化を使用して、治療用細胞組成物および参照標準の組換え受容体依存性活性曲線を直接比較できる。
ａ．参照標準
特定の実施形態は、治療用細胞組成物の組換え受容体依存性活性（例えば、ＣＡＲ＋依存性活性）の測定値を、参照標準の参照測定値（すなわち、参照尺度）と比較して、例えば、相対効力を決定することができることを企図する。特定の実施形態では、参照測定値は、参照標準の組換え受容体依存性活性の予め決定された測定値またはその値である。一部の実施形態では、参照標準の組換え受容体依存性活性は、本明細書で開示される方法に従って評価される。一部の実施形態では、参照標準は、組換え受容体依存性活性をもたらす調整された比率が検証されている治療用細胞組成物である。一部の実施形態では、参照標準は、組換え受容体依存性活性をもたらす調整された比率が検証されており、曲線、例えば、Ｓ字形が測定された活性にフィッティングされて、組換え受容体依存性活性曲線を生成する治療用細胞組成物である。一部の実施形態では、参照標準の組換え受容体依存性活性曲線が正規化される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性曲線は、最大の測定された組換え受容体依存性活性に対して正規化される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性曲線は、組換え受容体依存性活性曲線の上側漸近線に対して正規化される。一部の実施形態では、組換え受容体依存性活性曲線は、正規化される。組換え受容体依存性活性曲線の上側漸近線にわたって算出された平均値に対して正規化される。一部の実施形態では、参照標準は、最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす検証された調整された比率を含む治療用細胞組成物である。一部の実施形態では、最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす検証された調整された比率が、組換え受容体依存性活性曲線から決定される。
一部の実施形態では、参照標準は、市販の治療用細胞組成物である。一部の実施形態では、参照標準は、比較される治療用細胞組成物を製造するために使用された製造プロセスに対して同一である製造プロセスを使用して製造された治療用細胞組成物である。一部の実施形態では、参照標準は、比較される治療用細胞組成物を製造するために使用された製造プロセスとは異なる製造プロセスを使用して製造された治療用細胞組成物である。一部の実施形態では、参照標準は、比較される治療用細胞組成物と同一の組換え受容体を含む治療用細胞組成物である。一部の実施形態では、参照標準は、比較される治療用細胞組成物と異なる組換え受容体を含む治療用細胞組成物である。一部の実施形態では、参照標準は、比較される同一対象から製造された治療用細胞組成物である。一部の実施形態では、参照標準は、比較される治療用細胞組成物が製造された異なる対象から製造された治療用細胞組成物である。一部の実施形態では、参照標準は、健康な対象に由来する治療用細胞組成物である。一部の実施形態では、参照標準は、疾患または状態を有する対象に由来する。一部の実施形態では、参照標準は、がんを有する対象に由来する。一部の実施形態では、参照標準は、上記のもののうち１つまたは複数の組合せであり得る。
一部の実施形態では、参照標準は、対象に投与されている。特定の実施形態では、対象への参照標準の投与は、対象への投与後に許容可能な安全性プロファイルをもたらすと観察され、決定された。特定の実施形態では、参照標準の投与は、重度の毒性を全くもたらさなかった。ある特定の実施形態では、参照標準の投与は、重度の神経毒性を全くもたらさなかった。特定の実施形態では、参照標準は、神経毒性についてのグレード４以下、グレード３以下、グレード２以下、グレード１以下またはグレード０スコアと関連していた治療用細胞組成物である。一部の実施形態では、参照標準は、許容可能な安全性プロファイルと関連していた。特定の実施形態では、許容可能な安全性プロファイルは、観察されるグレード１以上、観察されるグレード２以上、観察されるグレード３以上またはグレード４以上の神経毒性がないことである。ある特定の実施形態では、参照標準は、観察されたグレード３以上の神経毒性がないこという許容可能な安全性プロファイルと関連する。特定の実施形態では、参照標準は、グレード３以上の神経毒性がないことという許容可能な安全性プロファイルと関連する。
ある特定の実施形態では、参照標準は、対象への投与後に所望の有効性をもたらすと観察されているか、または決定されている。ある特定の実施形態では、対象は、参照標準を投与された対象と同様に、抗原を発現するか、または抗原と関連する疾患または状態を有する。特定の実施形態では、参照標準は、完全奏功（ＣＲ）をもたらすと観察されているか、または決定されている。特定の実施形態では、参照標準は、持続的な応答をもたらすと観察されているか、または決定されている。
ＩＩ．操作されたＴ細胞を生成する方法
一部の実施形態では、本明細書において提供される治療用細胞組成物の効力の方法を、操作された細胞の治療用組成物（例えば、アウトプット組成物）、例えば、組換えタンパク質、例えば、組換え受容体。例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞を生成することに関連して使用できる。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞療法を製造すること、作製することまたは生成することに関連して使用され、細胞の単離、分離、選択、活性化または刺激、形質導入、洗浄、懸濁、希釈、濃縮および／または製剤化のための工程等のさらなる処理工程に関連して使用され得る。一部の実施形態では、操作された細胞、例えば、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞を作製または生成する方法は、対象から細胞を単離すること、刺激条件下で調製すること、処理すること、インキュベートすることおよび／または細胞を操作すること（例えば、形質導入すること）のうち１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、方法は、インプット細胞、例えば、一次細胞を、生物学的試料からまず単離し、例えば、選択または分離する；インプット細胞を刺激条件下でインキュベートし、例えば、形質導入またはトランスフェクションによって、ベクター粒子、例えば、ウイルスベクター粒子を用いて操作して、細胞中に組換えポリヌクレオチドを導入する；操作された細胞、例えば、形質導入された細胞を培養して、例えば、細胞を拡大増殖する；および細胞をアウトプット組成物に製剤化するために、細胞の全てまたは一部分を収集、回収および／または容器に充填する順序で実施される処理工程を含む。一部の実施形態では、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、例えば、別個のインプット組成物中で互いに独立に製造されるが、製造するプロセスは、同一の処理工程を含む。一部の実施形態では、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、例えば、同一のインプット組成物に一緒に製造される。一部の実施形態では、作製されたアウトプット組成物（例えば、治療用細胞組成物）の細胞は、凍結保存の前後に同一対象中に再導入される。一部の実施形態では、操作された細胞のアウトプット組成物（例えば、治療用細胞組成物）は、療法、例えば、自家細胞療法、同種異系細胞療法において使用するのに適している。例示的製造方法は、公開国際特許出願、公開番号ＷＯ２０１９／０８９８５５に記載されており、その開示内容は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
Ａ．試料および細胞調製物
特定の実施形態では、提供される方法は、生物学的試料から細胞を単離、選択および／または濃縮して、濃縮された細胞、例えば、Ｔ細胞の１つまたは複数のインプット組成物を作製することに関連して使用される。一部の実施形態では、提供される方法は、試料、例えば、対象、例えば、特定の疾患もしくは状態を有するもの、または細胞療法を必要とするものまたは細胞療法が投与されるものから得られたものまたはそれに由来するものからの、細胞またはその組成物の単離を含む。一部の態様では、対象は、ヒト、例えば、細胞が単離、処理および／または操作されている、特定の治療的介入、例えば、養子細胞療法を必要とする患者である対象である。したがって、細胞は、一部の実施形態では、一次細胞、例えば、一次ヒト細胞である。試料は、対象から直接的に採取された組織、流体および他の試料を含む。生物学的試料は、生物学的供給源または処理される試料から直接的に取得された試料であり得る。生物学的試料として、それだけには限らないが、体液、例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿および汗、組織および臓器試料が挙げられ、それらに由来する処理された試料を含む。
一部の態様では、試料は、血液または血液由来試料であるか、またはアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシス生成物であるか、もしくはそれに由来する。例示的試料として、全血、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸関連リンパ系組織、粘膜関連リンパ系組織、脾臓、他のリンパ系組織、肝臓、肺、胃、腸、結腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸部、精巣、卵巣、扁桃腺または他の臓器および／またはそれらに由来する細胞が挙げられる。試料には、細胞療法、例えば、養子細胞療法の文脈において、自家および同種異系供給源からの試料が含まれる。
一部の例では、例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって対象の循環血液から細胞が得られる。試料は、一部の態様では、Ｔ細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球および／または血小板を含有し、一部の態様では、赤血球および血小板以外の細胞を含有する。
一部の実施形態では、対象から収集された血液細胞を洗浄して、例えば、血漿画分を除去し、細胞をその後の処理工程のために適当な緩衝液または培地に入れる。一部の実施形態では、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムおよび／またはマグネシウムおよび／または二価カチオンの多くもしくは全てを欠く。一部の態様では、洗浄工程は、半自動化「フロースルー」遠心機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１セルプロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ）によって製造元の説明書に従って達成される。一部の態様では、洗浄工程は、製造元の説明書に従って、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって達成される。一部の実施形態では、細胞は、洗浄後、様々な生体適合性の緩衝液、例えば、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋非含有のＰＢＳなどに再懸濁される。ある特定の実施形態では、血液細胞試料の成分は除去され、細胞は培養培地に直接再懸濁される。
一部の実施形態では、調製方法は、単離、選択および／または濃縮および／または形質導入および操作のためのインキュベーションの前もしくは後のいずれか、ならびに／または操作された細胞の培養および／または回収の後の、細胞を凍結する、例えば、凍結保護するための工程を含む。一部の実施形態では、凍結し、その後に解凍する工程によって、細胞集団において顆粒球およびある程度まで単球が除去される。一部の実施形態では、細胞は、例えば、血漿および血小板を除去するための洗浄工程後に凍結溶液に懸濁される。種々の公知の凍結溶液およびパラメーターのいずれも、一部の態様において、使用され得る。一部の実施形態では、細胞は、１２．５％、１２．０％、１１．５％、１１．０％、１０．５％、１０．０％、９．５％、９．０％、８．５％、８．０％、７．５％、７．０％、６．５％、６．０％、５．５％もしくは５．０％ ＤＭＳＯの、または約１２．５％、１２．０％、１１．５％、１１．０％、１０．５％、１０．０％、９．５％、９．０％、８．５％、８．０％、７．５％、７．０％、６．５％、６．０％、５．５％もしくは５．０％ ＤＭＳＯまたは１％から１５％の間、６％から１２％の間、５％から１０％の間もしくは６％から８％の間のＤＭＳＯの最終濃度を有する培地および／または溶液中で凍結される、例えば、クライオ凍結または低温保存される。特定の実施形態では、細胞は、５．０％、４．５％、４．０％、３．５％、３．０％、２．５％、２．０％、１．５％、１．２５％、１．０％、０．７５％、０．５％もしくは０．２５％または約５．０％、４．５％、４．０％、３．５％、３．０％、２．５％、２．０％、１．５％、１．２５％、１．０％、０．７５％、０．５％もしくは０．２５％のＨＳＡ、または０．１％から－５％の間、０．２５％から４％の間、０．５％から２％の間または１％から２％の間のＨＡＳの最終濃度を有する培地および／または溶液中で凍結される、例えば、クライオ凍結または低温保存される。一例は、２０％ ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有するＰＢＳまたは他の適した細胞凍結培地を使用することを含む。次いで、これを培地を用いて１：１希釈し、その結果、ＤＭＳＯおよびＨＡＳの最終濃度はそれぞれ１０％および４％となる。次いで、一般に、細胞は、１分当たり１°または約１°の速度で－８０℃にまたは約－８０℃に凍結され、液体窒素保存タンクの気相中で保存される。
一部の実施形態では、細胞または集団の単離は、１つまたは複数の調製および／または非親和性ベースの細胞分離工程を含む。一部の例では、細胞は、洗浄され、遠心分離され、および／または例えば、不要な成分を除去する、望ましい成分を富化する、特定の試薬に感受性の細胞を溶解または除去するための１種または複数の試薬の存在下でインキュベートされる。一部の例では、細胞は、１つまたは複数の特性、例えば密度、接着特性、サイズ、特定の成分に対する感受性および／または耐性に基づき分離される。一部の実施形態では、本方法は、密度に基づく細胞分離方法、例えば赤血球の溶解およびパーコールまたはフィコール勾配による遠心分離による末梢血液からの白血球の調製を含む。
一部の実施形態では、選択工程の少なくとも一部分は、選択試薬と共の細胞のインキュベーションを含む。例えば、選択方法の一部としての選択試薬（単数または複数）とのインキュベーションは、１つまたは複数の特定の分子、例えば、表面マーカー、例えば、表面タンパク質、細胞内マーカーまたは核酸の細胞中または細胞上の発現または存在に基づく、１つまたは複数の異なる細胞種の選択のための１種または複数の選択試薬を使用して実施され得る。一部の実施形態では、このようなマーカーに基づいて分離するための選択試薬（単数または複数）を使用する任意の公知の方法が使用され得る。一部の実施形態では、選択試薬（単数または複数）は、親和性－または免疫親和性－ベースの分離である分離をもたらす。例えば、選択は、一部の態様では、１つまたは複数のマーカー、通常、細胞表面マーカーの細胞の発現または発現レベルに基づいて細胞および細胞集団を分離するための試薬（単数または複数）と共のインキュベーションを含み、例えば、このようなマーカーに特異的に結合する抗体または結合パートナーと共のインキュベーションと、一般的にその後の洗浄工程および抗体または結合パートナーに結合していない細胞からの抗体または結合パートナーに結合している細胞の分離による。
このようなプロセスの一部の態様では、一定体積の細胞が、一定量の所望の親和性ベースの選択試薬と混合される。免疫親和性ベースの選択は、分離されている細胞と、細胞上のマーカーに特異的に結合する分子、例えば、固体表面、例えば、粒子上の抗体または他の結合パートナーの間の好都合なエネルギー相互作用をもたらす任意のシステムまたは方法を使用して実施され得る。一部の実施形態では、方法は、細胞のマーカーに対して特異的な選択剤（例えば、抗体）を用いてコーティングされている粒子、例えば、ビーズ、例えば、磁性ビーズを使用して実施される。粒子（例えば、ビーズ）は、エネルギー的に有利な相互作用を促進することを補助するために一定の細胞密度対粒子（例えば、ビーズ）比率を有して、振盪または混合しながらチューブまたはバッグ等の容器中で細胞とインキュベートまたは混合され得る。他の場合には、本方法は、細胞の選択を含み、選択の全てまたは一部分は、例えば、遠心回転下で遠心チャンバーの内部空洞中で実施される。一部の実施形態では、選択試薬、例えば、免疫親和性ベースの選択試薬と共の細胞のインキュベーションが遠心チャンバー中で実施される。ある特定の実施形態では、単離または分離は、国際特許出願公開番号ＷＯ２００９／０７２００３またはＵＳ２０１１０００３３８０に記載されるシステム、デバイスまたは装置を使用して実施される。一例では、システムは、国際公開番号ＷＯ２０１６／０７３６０２に記載されるようなシステムである。
一部の実施形態では、遠心チャンバーの空洞においてこのような選択工程またはその部分（例えば、抗体がコーティングされた粒子、例えば、磁性ビーズと共のインキュベーション）を行うことによって、ユーザーは、種々の溶液の体積、処理の間の溶液の添加およびそのタイミング等のある特定のパラメーターを制御することが可能であり、これによって、他の利用可能な方法と比較して利点を提供できる。例えば、インキュベーションの際に空洞中の液体体積を減少させる能力は、空洞中の細胞の総数に影響を及ぼすことなく選択に使用される粒子（例えば、ビーズ試薬）の濃度、したがって、溶液の化学ポテンシャルを増大できる。これは、順に、処理されている細胞と、選択に使用される粒子の間の対相互作用を増強できる。一部の実施形態では、チャンバー中でインキュベーション工程を実施することによって、例えば、本明細書に記載されるようなシステム、回路および制御と関連する場合に、ユーザーがインキュベーションの間の所望の時間（複数可）で溶液の撹拌を行うことを可能にし、これによって、相互作用も改善され得る。
一部の実施形態では、選択試薬と共の細胞のインキュベーションを含む選択工程の少なくとも一部分が遠心チャンバー中で実施される。このようなプロセスの一部の態様では、一定体積の細胞が、製造元の説明書に従って同一数の細胞および／または細胞の体積を選択するためにチューブまたは容器中で同様の選択を実施する場合に普通使用されるものよりもかなり少ない、一定量の所望の親和性ベースの選択試薬と混合される。一部の実施形態では、製造元の説明書に従う同数の細胞および／または同一体積の細胞のチューブまたは溶液ベースのインキュベーションにおける細胞の選択に使用される同一選択試薬（複数可）の５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、５０％以下、６０％以下、７０％以下または８０％以下である選択試薬（単数または複数）の量が使用される。
一部の実施形態では、細胞の選択、例えば、免疫親和性ベースの選択のために、細胞は、選択緩衝液も含有する、組成物中でチャンバーの空洞中で、選択試薬、例えば、濃縮するおよび／または枯渇させることが望まれるが、組成物中の他の細胞上では望まれない細胞上の表面マーカーに特異的に結合する分子、例えば、ポリマーまたは表面、例えば、ビーズ、例えば、磁性ビーズ、例えば、ＣＤ４およびＣＤ８に対して特異的なモノクローナル抗体にカップリングされた磁性ビーズ等の足場にカップリグされていてもよい抗体と共にインキュベートされる。記載されるような一部の実施形態では、選択試薬は、選択が振盪または回転を伴ってチューブ中で実施される場合に同数の細胞または同一体積の細胞の選択のほぼ同一または同様の効率を達成するために通常使用される、または必要であるであろう選択試薬の量と比較して、実質的に少ない量（例えば、量の５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％以下である）でチャンバーの空洞中の細胞に添加される。一部の実施形態では、インキュベーションは、細胞および選択試薬に選択緩衝液を添加して、標的体積を達成し、例えば、１０ｍＬ～２００ｍＬ、例えば、少なくともまたは約少なくともまたは約１０ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、６０ｍＬ、７０ｍＬ、８０ｍＬ、９０ｍＬ、１００ｍＬ、１５０ｍＬまたは２００ｍＬの試薬をインキュベーションして実施される。一部の実施形態では、選択緩衝液および選択試薬は、細胞の添加の前に予め混合される。一部の実施形態では、選択緩衝液および選択試薬は、細胞に別個に添加される。一部の実施形態では、選択インキュベーションは、周期性に穏やかに混合する条件を用いて実施され、これは、エネルギー的に有利な相互作用の促進を補助でき、それによって、高い選択効率を達成しながらより少ない全体的な選択試薬の使用が可能となる。
一部の実施形態では、選択試薬を用いるインキュベーションの総持続期間は、５分～６時間または約５分～約６時間、例えば、３０分～３時間、例えば、少なくともまたは約少なくとも３０分、６０分、１２０分または１８０分である。
一部の実施形態では、インキュベーションは一般に、回転の存在下でなどの混合条件下で、一般に、比較的低い力または速度、例えば、細胞をペレット化するために使用されるものよりも低い速度、例えば、６００ｒｐｍ～１７００ｒｐｍまたは約６００ｒｐｍ～約１７００ｒｐｍで（例えば、６００ｒｐｍ、１０００ｒｐｍまたは１５００ｒｐｍもしくは１７００ｒｐｍまたは約６００ｒｐｍ、１０００ｒｐｍまたは１５００ｒｐｍもしくは１７００ｒｐｍまたは少なくとも６００ｒｐｍ、１０００ｒｐｍまたは１５００ｒｐｍもしくは１７００ｒｐｍで）、例えば、８０ｇ～１００ｇまたは約８０ｇ～約１００ｇ（例えば、８０ｇ、８５ｇ、９０ｇ、９５ｇもしくは１００ｇまたは約８０ｇ、８５ｇ、９０ｇ、９５ｇもしくは１００ｇまたは少なくとも８０ｇ、８５ｇ、９０ｇ、９５ｇもしくは１００ｇで）のチャンバーまたは他の容器の試料または壁でのＲＣＦで実施される。一部の実施形態では、回転は、低速と、その後の休息期間の回転の反復間隔、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０秒間の回転および／または休息、例えば、およそ１または２秒の回転と、その後のおよそ５、６、７または８秒の休息を使用して実施される。
一部の実施形態では、このようなプロセスは、チャンバーが不可欠である完全に閉鎖されたシステム内で実施される。一部の実施形態では、このプロセス（および一部の態様では、１つまたは複数のさらなる工程、例えば、アフェレーシス試料等の細胞を含有する試料を洗浄する前の洗浄工程も）は、自動化プログラムを使用して単一の閉鎖されたシステム中で、適当な時間で細胞、試薬および他の構成要素がチャンバー中に引き込まれ、押し出され、洗浄および結合工程を完了するために遠心分離が達成されるような自動化様式で実施される。
一部の実施形態では、細胞および選択試薬（単数および／または複数）のインキュベーションおよび／または混合後に、インキュベートされた細胞は、特定の試薬（単数または複数）の有無に基づいて細胞について選択するために分離に付される。一部の実施形態では、分離は、細胞の選択試薬と共のインキュベーションが実施された同一の閉鎖されたシステム中で実施される。一部の実施形態では、選択試薬と共のインキュベーション後に、選択試薬が結合した細胞を含むインキュベートされた細胞が、細胞の免疫親和性ベースの分離のためのシステム中に移される。一部の実施形態では、免疫親和性ベースの分離のためのシステムは、磁性分離カラムであるか、またはそれを含有する。
このような分離工程は、試薬、例えば、抗体または結合パートナーを結合している細胞がさらなる使用のために保持されるポジティブ選択および／または試薬、例えば、抗体または結合パートナーに結合していない細胞が保持されるネガティブ選択をベースとする場合がある。一部の例では、さらなる使用のために両画分が保持される。一部の態様では、不均一な集団中の細胞種を特異的に同定する抗体が利用可能ではない場合にはネガティブ選択が特に有用である場合があり、その結果、所望の集団以外の細胞によって発現されるマーカーに基づいて分離が最良に実施される。
一部の実施形態では、プロセス工程は、例えば、親和性ベースの選択を実施できるシステムまたは装置を使用する、インキュベートされた細胞の負および／またはポジティブ選択をさらに含む。一部の実施形態では、単離は、ポジティブ選択による特定の細胞集団の濃縮、またはネガティブ選択による特定の細胞集団の枯渇によって実施される。一部の実施形態では、ポジティブまたはネガティブ選択は、細胞を、それぞれポジティブまたはネガティブに選択された細胞上で発現された、または相対的に高いレベルで（マーカーｈｉｇｈ）発現された（マーカー＋）１つまたは複数の表面マーカーに特異的に結合する１つまたは複数の抗体または他の結合剤と共にインキュベートすることによって達成される。同一選択工程、例えば、ポジティブまたはネガティブ選択工程の複数ラウンドを実施できる。ある特定の実施形態では、ポジティブにまたはネガティブに選択された画分は、ポジティブまたはネガティブ選択工程を反復すること等によって選択のプロセスに付される。一部の実施形態では、選択は、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回または９回より多く反復される。ある特定の実施形態では、同一選択が最大５回実施される。ある特定の実施形態では、同一選択工程は、３回実施される。
分離は、特定の細胞集団または特定のマーカーを発現する細胞の１００％の濃縮または除去をもたらす必要はない。例えば、マーカーを発現するもの等の特定の種類の細胞のポジティブ選択または濃縮とは、そのような細胞の数またはパーセンテージを増加させることを指すが、マーカーを発現していない細胞の完全な不在をもたらす必要はない。同様に、マーカーを発現するもの等の特定の種類の細胞のネガティブ選択、除去または枯渇とは、そのような細胞の数またはパーセンテージを減少させることを指すが、全てのこのような細胞の完全な除去をもたらす必要はない。
一部の例では、分離工程の複数ラウンドが実施され、ある工程からポジティブにまたはネガティブに選択された画分が、その後のポジティブまたはネガティブ選択等の別の分離工程に付される。一部の例では、単一分離工程が、細胞を、各々、ネガティブ選択のために標的化されるマーカーに対して特異的な複数の抗体または結合パートナーと共にインキュベートすることによって同時に複数のマーカーを発現する細胞を枯渇させることができる。同様に、細胞を、種々の細胞種で発現される複数の抗体または結合パートナーと共にインキュベートすることによって、複数の細胞種が同時にポジティブに選択され得る。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の分離工程は、１回より多く反復されるおよび／または実施される。一部の実施形態では、ポジティブまたはネガティブ選択工程を反復することによって、分離工程に起因するポジティブにまたはネガティブに選択された画分が、同一分離工程に付される。一部の実施形態では、ポジティブに選択された細胞の収率を増大するために、ネガティブに選択された細胞の純度を増大するために、および／またはネガティブに選択された画分からポジティブに選択された細胞をさらに除去するために、単一分離工程が１回より多く反復および／または実施される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の分離工程は、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回または１０回より多く実施および／または反復される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の選択工程は、１から１０回の間、１から５回の間または４から５回の間、実施および／または反復される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の選択工程が３回反復される。
例えば、一部の態様では、Ｔ細胞、例えば、ポジティブな、または高レベルの１つまたは複数の表面マーカーを発現する細胞、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、および／またはＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞特定の亜集団が、ポジティブまたはネガティブ選択技術によって単離される。一部の実施形態では、このような細胞は、このようなマーカーに特異的に結合する１つまたは複数の抗体または結合パートナーと共のインキュベーションによって選択される。一部の実施形態では、抗体または結合パートナーを、磁性ビーズまたは常磁性ビーズ等の固体支持体またはマトリックスに直接的または間接的に等でコンジュゲートして、選択を達成できる。例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８がコンジュゲートしている磁性ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｄｅｒおよび／またはＥｘｐＡＣＴ（登録商標）ビーズ）を使用してポジティブに選択できる。
一部の実施形態では，Ｔ細胞は、非Ｔ細胞、例えば、Ｂ細胞、単球または他の白血球、例えば、ＣＤ１４で発現されたマーカーのネガティブ選択によってＰＢＭＣ試料から分離される。一部の態様では、ＣＤ４＋ヘルパーおよびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を分離するために、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋選択工程が使用される。このようなＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団は、１つまたは複数のナイーブ、記憶および／またはエフェクターＴ細胞亜集団で発現された、または相対的に高度に発現されたマーカーについてのポジティブまたはネガティブ選択によって亜集団にさらに選別され得る。
一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、それぞれの亜集団と関連する表面抗原に基づいたポジティブまたはネガティブ選択等によってナイーブ幹細胞、中枢記憶幹細胞、エフェクター記憶幹細胞および／または中枢記憶幹細胞がさらに濃縮または枯渇される。一部の実施形態では、中枢記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞の濃縮は、有効性を増大するため、例えば、投与後の長期間生存、拡大増殖および／または生着を改善するために実施され、これは一部の態様では、このような亜集団において特に頑強である。Terakura et al.、(2012) Blood.1:72-82；Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701を参照されたい。一部の実施形態では、ＴＣＭが濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を組み合わせることによって、有効性がさらに増強される。
実施形態では、記憶Ｔ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球のＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ６２Ｌ－サブセットの両方に存在する。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８および抗ＣＤ６２Ｌ抗体等を使用してＣＤ６２Ｌ－ＣＤ８＋および／またはＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋画分について濃縮または枯渇され得る。
一部の実施形態では、中枢記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞の濃縮は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３および／またはＣＤ１２７のポジティブまたは高い表面発現に基づいており、一部の態様では、ＣＤ４５ＲＡおよび／またはグランザイムＢを発現する、または高度に発現する細胞についてのネガティブ選択に基づいている。一部の態様では、ＴＣＭ細胞について濃縮されたＣＤ８＋集団の単離は、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞の枯渇、ＣＤ６２Ｌを発現する細胞についてのポジティブ選択または濃縮によって実施される。一態様では、中枢記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞の濃縮は、ＣＤ４発現に基づいて選択された細胞のネガティブ画分を用いて出発して実施され、これは、ＣＤ１４およびＣＤ４５ＲＡの発現に基づくネガティブ選択およびＣＤ６２Ｌに基づくポジティブ選択に付される。
このような選択は、一部の態様では、同時に実施され、他の態様では、いずれかの順序で逐次実施される。一部の態様では、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団または亜集団の調製において使用される同一ＣＤ４発現ベースの選択工程はまた、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団または亜集団を作製するために使用され、その結果、ＣＤ４ベースの分離から得られたポジティブおよびネガティブ画分の両方が保持され、方法のその後の工程、適宜、以下の１つまたは複数のさらなるポジティブまたはネガティブ選択工程において使用される。一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の選択およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の選択は、同時に実施される。一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の選択は、いずれかの順序で逐次実施される。一部の実施形態では、細胞を選択する方法として、公開された米国出願番号ＵＳ２０１７００３７３６９に記載されるものを挙げることができる。一部の実施形態では、選択されたＣＤ４＋Ｔ細胞集団および選択されたＣＤ８＋Ｔ細胞集団は、選択後に組み合わされる場合がある。一部の態様では、選択されたＣＤ４＋Ｔ細胞集団および選択されたＣＤ８＋Ｔ細胞集団は、本明細書で記載されるようなバイオリアクターバッグ中で組み合わされる場合がある。一部の実施形態では、選択されたＣＤ４＋Ｔ細胞集団および選択されたＣＤ８＋Ｔ細胞集団は、個別に処理され、それによって、選択されたＣＤ４＋Ｔ細胞集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞が濃縮され、刺激試薬（例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁性ビーズ）と共にインキュベートされ、組換えタンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードするウイルスベクターで形質導入され、Ｔ細胞を拡大増殖する条件下で培養され、選択されたＣＤ８＋Ｔ細胞集団は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が濃縮され、刺激試薬（例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁性ビーズ）と共にインキュベートされ、組換えタンパク質（例えば、ＣＡＲ）、例えば、同一ドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞の操作のためと同一の組換えタンパク質をコードするウイルスベクターで形質導入され、提供された方法と一致するなどのＴ細胞を拡大増殖する条件下で培養される。
特定の実施形態では、生物学的試料、例えば、ＰＢＭＣまたは他の白血球の試料がＣＤ４＋Ｔ細胞の選択に付され、ネガティブおよびポジティブ画分の両方が保持される。ある特定の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ネガティブ画分から選択される。一部の実施形態では、生物学的試料は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の選択に付され、ネガティブおよびポジティブ画分の両方が保持される。ある特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ネガティブ画分から選択される。
特定の例では、ＰＢＭＣの試料または他の白血球細胞試料がＣＤ４＋Ｔ細胞の選択に付され、ネガティブおよびポジティブ画分の両方が保持される。ネガティブ画分は、次いで、ＣＤ１４およびＣＤ４５ＲＡまたはＣＤ１９の発現に基づくネガティブ選択および中枢記憶Ｔ細胞に特徴的なマーカー、例えば、ＣＤ６２ＬまたはＣＣＲ７に基づいたポジティブ選択に付され、ポジティブおよびネガティブ選択は、いずれかの順序で実施される。
ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによってナイーブ、中枢記憶およびエフェクター細胞に選別される。ＣＤ４＋リンパ球は、標準方法によって得ることができる。一部の実施形態では、ナイーブＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、中枢記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋である。一部の実施形態では、エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ－およびＣＤ４５ＲＯ－である。
一例では、ネガティブ選択によってＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは通常、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含む。一部の実施形態では、抗体または結合パートナーが固体支持体またはマトリックス、例えば、磁性ビーズまたは常磁性ビーズに結合されて、ポジティブおよび／またはネガティブ選択のための細胞の分離が可能となる。例えば、一部の実施形態では、細胞および細胞集団は、免疫磁気（または親和性磁気）分離技術を使用して分離または単離される（Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher (c) Humana Press Inc., Totowa, NJに概説されている）。
一部の態様では、分離しようとする細胞のインキュベートされる試料または組成物は、小さい、磁化できる、または磁気的に応答性の材料、例えば磁気的に応答性の粒子またはマイクロパーティクル、例えば常磁性ビーズ（例えば、ＤｙｎａｌｂｅａｄｓまたはＭＡＣＳ（登録商標）ビーズなど）を含有する選択試薬と共にインキュベートされる。磁気的に応答性の材料、例えば、粒子は一般に、分離することが望ましい、例えばネガティブまたはポジティブ選択することが望ましい細胞、複数の細胞、または細胞の集団上に存在する分子、例えば表面マーカーに特異的に結合する結合パートナー、例えば抗体に、直接的または間接的に付着される。
一部の実施形態では、磁気粒子またはビーズは、特異的な結合メンバー、例えば抗体または他の結合パートナーに結合した磁気的に応答性の材料を含む。磁気分離方法で使用される多くの周知の磁気的に応答性の材料、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＭｏｌｄａｙ、米国特許第４，４５２，７７３号、および欧州特許明細書ＥＰ４５２３４２Ｂに記載されるものが公知である。コロイドサイズの粒子、例えばＯｗｅｎの米国特許第４，７９５，６９８号、およびＬｉｂｅｒｔｉらの米国特許第５，２００，０８４号に記載されるものも使用され得る。
インキュベーションは一般に、磁気粒子またはビーズに付着した抗体または結合パートナーまたはこのような抗体もしくは結合パートナーに特異的に結合する分子、例えば、二次抗体もしくは他の試薬が、細胞表面分子が試料内の細胞上に存在する場合、それに特異的に結合する条件下で実施される。
ある特定の実施形態では、磁気的に応答性の粒子は、一次抗体または他の結合パートナー、二次抗体、レクチン、酵素、またはストレプトアビジンでコーティングされる。ある特定の実施形態では、磁気粒子は、１種または複数のマーカーに特異的な一次抗体のコーティングを介して細胞に付着する。ある特定の実施形態では、ビーズではなく細胞が一次抗体または結合パートナーで標識され、次いで細胞型特異的な二次抗体、または他の結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン）でコーティングされた磁気粒子が添加される。ある特定の実施形態では、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気粒子は、ビオチン化した一次または二次抗体と共に使用される。
一部の態様では、分離は、試料が磁場に置かれ、磁気的に応答性の、または磁化できる粒子が付着された細胞が磁石に引き付けられ、非標識細胞から分離されることになる手順で達成される。ポジティブ選択については、磁石に引き付けられる細胞が保持され、ネガティブ選択については、引き付けられない細胞（非標識細胞）が保持される。一部の態様では、同一選択工程の間にポジティブおよびネガティブ選択の組合せが実施され、ポジティブおよびネガティブ画分が保持され、さらに処理されるか、またはさらなる分離工程に付される。
一部の実施形態では、親和性ベースの選択は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を介する。磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステムは、磁化された粒子が付着した細胞の高純度選択が可能である。ある特定の実施形態では、ＭＡＣＳは、外部の磁場を適用した後に非標的および標的種が逐次的に溶出される様式で作動する。すなわち、磁化された粒子に付着した細胞はその場に保持されたままで、付着していない種が溶出される。次いで、この第１の溶出工程が完了した後に、磁場にトラップされ、溶出が妨げられた種が、それらを溶出および回収できるような何らかの方式で解放される。ある特定の実施形態では、非標的細胞は、細胞の不均一集団から標識され、枯渇される。
一部の実施形態では、磁気的に応答性の粒子は、その後インキュベート、培養および／または操作されることになる細胞に付着したままであり、一部の態様では、粒子は、患者に投与するための細胞に付着したままである。一部の実施形態では、磁化できる、または磁気的に応答性の粒子は、細胞から除去される。細胞から磁化できる粒子を除去するための方法は公知であり、これとして、例えば、競合する非標識抗体、磁化できる粒子または切断可能なリンカーにコンジュゲートした抗体の使用が挙げられる。一部の実施形態では、磁化できる粒子は、生分解性である。
一部の実施形態では、単離および／または選択の結果、濃縮されたＴ細胞、例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の１つまたは複数のインプット組成物が得られる。一部の実施形態では、単一生物学的試料から２つまたはそれより多い別個のインプット組成物が単離、選択、濃縮または取得される。一部の実施形態では、別個のインプット組成物は、同一対象から収集、採取および／または取得された別個の生物学的試料から単離、選択、濃縮および／または取得される。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のインプット組成物は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％または１００％でもしくは約１００％でＣＤ３＋Ｔ細胞を含む濃縮されたＴ細胞の組成物であるか、またはそれを含む。特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞のインプット組成物は、本質的にＣＤ３＋Ｔ細胞からなる。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のインプット組成物は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％または１００％でもしくは約１００％でＣＤ４＋Ｔ細胞を含む濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞の組成物であるか、またはそれを含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞のインプット組成物は、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満または０．０１％未満のＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含有せず、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含まない、もしくは実質的に含まない。一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、本質的にＣＤ４＋Ｔ細胞からなる。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の組成物は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％または１００％でもしくは約１００％でＣＤ８＋Ｔ細胞であるか、またはそれを含むＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物であるか、またはそれを含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物は、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満または０．０１％未満のＣＤ４＋Ｔ細胞を含有し、および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞を含有せず、および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞を含まない、もしくは実質的に含まない。一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、本質的にＣＤ８＋Ｔ細胞からなる。
一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の１つまたは複数のインプット組成物は、単離、選択および／または濃縮後に凍結、例えば、低温保存および／またはクライオ凍結される。一部の実施形態では、１つまたは複数のインプット組成物は、細胞の組成物をインキュベートすること、活性化すること、刺激すること、操作すること、形質導入すること、トランスフェクトすること、培養すること、拡大増殖すること、回収することおよび／または製剤化することを含む任意の工程の前に、凍結される、例えば、低温保存および／またはクライオ凍結される。特定の実施形態では、１つまたは複数のクライオ凍結インプット組成物は、例えば、－８０℃で、または約－８０℃で、１２時間から７日の間、２４時間から１２０時間の間または２日から５日の間保存される。特定の実施形態では、１つまたは複数のクライオ凍結インプット組成物は、－８０℃で、または約－８０℃で、１０日、９日、８日、７日、６日または５日、４日、３日、２日または１日未満の時間量の間保存される。一部の実施形態では、１つまたは複数のクライオ凍結インプット組成物は、－８０℃で、または約－８０℃で、１日、２日、３日、４日、５日もしくは６日間または約１日、２日、３日、４日、５日もしくは６日間保存される。
Ｂ．細胞の活性化および刺激
一部の実施形態では、提供される方法は、細胞を刺激条件下でインキュベートすることに関連して使用される。一部の実施形態では、刺激条件は、細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞中のシグナル、例えば、ＴＣＲおよび／または共受容体から生じたシグナルを活性化または刺激する、ならびに／または活性化もしくは刺激可能である条件を含む。一部の実施形態では、刺激条件は、刺激試薬、例えば、細胞のシグナルを活性化もしくは刺激する、および／または活性化もしくは刺激可能である試薬と共に、および／またはそれの存在下で細胞を培養すること、栽培すること、インキュベートすること、活性化すること、増殖させることのうち１つまたは複数の工程を含む。一部の実施形態では、刺激性試薬は、ＴＣＲおよび／または共受容体を刺激および／または活性化する。特定の実施形態では、刺激試薬は、節ＩＩ－Ｂ－１に記載される試薬である。
ある特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の１つまたは複数の組成物は、節ＩＩ－Ｃに提供される技術等によって細胞を遺伝子操作する、例えば、細胞をトランスフェクトおよび／または形質導入する前に刺激条件下でインキュベートされる。特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の１つまたは複数の組成物は、１つまたは複数の組成物が生物学的試料から単離、選択、濃縮または取得された後に、刺激条件下でインキュベートされる。特定の実施形態では、１つまたは複数の組成物がインプット組成物である。特定の実施形態では、１つまたは複数のインプット組成物は、インキュベーションの前に事前にクライオ凍結されており、保存され、解凍される。
ある特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の１つまたは複数の組成物は、濃縮されたＴ細胞の２つの別個の組成物、例えば、別個のインプット組成物であるか、またはそれを含む。特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の２つの別個の組成物、例えば、同一生物学的試料から選択、単離および／または濃縮された、濃縮されたＴ細胞の２つの別個の組成物は、刺激条件下で別個にインキュベートされる。ある特定の実施形態では、２つの別個の組成物は、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞の組成物を含む。特定の実施形態では、２つの別個の組成物は、濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物を含む。一部の実施形態では、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞および濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の２つの別個の組成物は、刺激条件下で別個にインキュベートされる。
一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の単一組成物は、刺激条件下でインキュベートされる。ある特定の実施形態では、単一組成物は、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞の組成物である。一部の実施形態では、単一組成物は、インキュベーションの前に別個の組成物から組み合わされた濃縮されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物である。
一部の実施形態では、刺激条件下でインキュベートされる濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞の組成物は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％または１００％で、または約１００％でＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。ある特定の実施形態では、刺激条件下でインキュベートされる濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞の組成物は、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満または０．０１％未満のＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含有せず、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含まない、もしくは実質的に含まない。
一部の実施形態では、刺激条件下でインキュベートされる濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％または１００％で、もしくは約１００％でＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。ある特定の実施形態では、刺激条件下でインキュベートされる濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物は、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満または０．０１％未満のＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞を含有せず、および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞を含まない、もしくは実質的に含まない。
一部の実施形態では、濃縮されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の別個の組成物は、単一組成物中に組み合わされ、刺激条件下でインキュベートされる。ある特定の実施形態では、濃縮されたＣＤ４＋および濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の別個の刺激された組成物は、インキュベーションが実施され、および／または完了した後に、単一組成物に組み合わされる。一部の実施形態では、刺激されたＣＤ４＋および刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞の別個の刺激された組成物は、インキュベーションが実施され、および／または完了した後に、別個に処理され、それによって、刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞集団（例えば、刺激性の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁性ビーズ刺激試薬と共にインキュベートされた）は、組換えタンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードするウイルスベクターで形質導入され、Ｔ細胞を拡大増殖する条件下で培養され、刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞集団（例えば、刺激性の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁性ビーズ刺激試薬と共にインキュベートされた）は、組換えタンパク質（例えば、ＣＡＲ）、例えば、同一ドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞の操作のためと同一の組換えタンパク質をコードするウイルスベクターで形質導入され、提供された方法と一致するなどのＴ細胞を拡大増殖する条件下で培養される。
一部の実施形態では、刺激条件下でのインキュベーションは、刺激条件、例えば、集団中の細胞の増殖、拡大増殖、活性化、および／または生存を誘導するように、抗原曝露を模倣するために、／または遺伝子操作のため、例えば組換え抗原受容体の導入のために細胞を刺激するように設計された条件の存在下でのインキュベーションによってを含む、培養、栽培、刺激、活性化、増殖を挙げることができる。特定の実施形態では、刺激条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、薬剤、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオンおよび／または刺激因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体および細胞を活性化するように設計された任意の他の薬剤のうち１つまたは複数を含み得る。
一部の態様では、刺激条件下での刺激および／またはインキュベーションは、Riddell et al.の米国特許第6,040,1 77号、Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660、Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82、および／またはWang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701に記載されるもの等の技術に従って実施される。
一部の実施形態では、細胞、例えば、Ｔ細胞、細胞の組成物および／または細胞集団、例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞または組成物、集団またはその亜集団は、培養開始組成物フィーダー細胞、例えば、非分裂末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に添加すること（例えば、得られた細胞の集団が、拡大増殖されようとする最初の集団中の各Ｔリンパ球について少なくとも約５、１０、２０または４０またはそれより多いＰＢＭＣフィーダー細胞を含有するように）および培養物をインキュベートすること（例えば、Ｔ細胞の数を拡大増殖するのに十分な時間）によって拡大増殖される。一部の態様では、非分裂フィーダー細胞は、ガンマ－照射されたＰＢＭＣフィーダー細胞を含み得る。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、細胞分裂を防ぐために約３０００～３６００ラドの範囲でガンマ線を照射される。一部の態様では、フィーダー細胞は、Ｔ細胞の集団の添加の前に培養培地に添加される。
一部の実施形態では、刺激条件は、ヒトＴリンパ球の増殖に適した温度、例えば、少なくとも約２５セルシウス度、一般的に少なくとも約３０度、一般的に３７または約３７セルシウス度を含む。一部の実施形態では、培養の間に、例えば、３７セルシウス度から３５セルシウス度への温度シフトが達成される。適宜、インキュベーションは、フィーダー細胞として非分裂ＥＢＶで形質転換したリンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）を添加することを含んでいてもよい。ＬＣＬは、約６０００～１０，０００ラドの範囲でガンマ線照射されていてもよい。ＬＣＬフィーダー細胞は、一部の態様では、任意の適した量で、例えばＬＣＬフィーダー細胞の最初のＴリンパ球に対する比率が少なくとも約１０：１で提供される。
実施形態では、抗原特異的であるＣＤ４＋およびＣＤ８＋の集団は、ナイーブまたは抗原特異的Ｔリンパ球を、抗原で刺激することによって取得できる。例えば、感染対象からＴ細胞を単離することおよび同一抗原を用いてインビトロで細胞を刺激することによって、サイトメガロウイルス抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞株またはクローンを作製できる。ナイーブＴ細胞も使用され得る。
特定の実施形態では、刺激条件は、細胞を刺激試薬と共にインキュベートすること、培養することおよび／または栽培することを含む。特定の実施形態では、刺激試薬は、節ＩＩ－Ｂ－１に記載される試薬である。ある特定の実施形態では、刺激試薬は、ビーズを含有するか、またはそれを含む。例示的刺激試薬は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁性ビーズであるか、またはそれを含む。ある特定の実施形態では、刺激条件下で細胞をインキュベートすること、培養することおよび／または栽培することのはじめおよび／または開始は、細胞を刺激試薬と接触させると、および／または刺激試薬と共にインキュベートすると生じる。特定の実施形態では、細胞は、細胞の遺伝子操作、例えば、形質導入またはトランスフェクション等による組換えポリヌクレオチドの細胞への導入の前、その間および／またはその後にインキュベートされる。
一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、３：１、２．５：１、２：１、１．５：１、１．２５：１、１．２：１、１．１：１、１：１、０．９：１、０．８：１、０．７５：１、０．６７：１、０．５：１、０．３：１もしくは０．２：１または約３：１、２．５：１、２：１、１．５：１、１．２５：１、１．２：１、１．１：１、１：１、０．９：１、０．８：１、０．７５：１、０．６７：１、０．５：１、０．３：１もしくは０．２：１の刺激試薬および／またはビーズ、例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁性ビーズの、細胞に対する比率でインキュベートされる。特定の実施形態では、刺激試薬および／またはビーズの細胞に対する比率は、２．５：１から０．２：１の間、２：１から０．５：１の間、１．５：１から０．７５：１の間、１．２５：１から０．８：１の間、１．１：１から０．９：１の間である。特定の実施形態では、刺激試薬の細胞に対する比率は、約１：１であるか、または１：１である。
特定の実施形態では、３：１または細胞当たり３未満の刺激試薬、例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁性ビーズの比率、例えば、１：１の比率で細胞をインキュベートすることによって、インキュベーションの際に、例えば、活性化誘導性細胞死等によって生じる細胞死の量が低減される。一部の実施形態では、細胞は、３未満（または３：１または細胞当たり３未満のビーズ）の、ビーズの細胞に対する比率で刺激試薬、例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁性ビーズと共にインキュベートされる。特定の実施形態では、３：１未満または細胞当たり３未満のビーズの比率、例えば、１：１の比率で細胞をインキュベートすることによって、インキュベーションの際に、例えば、活性化誘導性細胞死等によって生じる細胞死の量が低減される。
特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、刺激試薬、例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁性ビーズと共に、３：１未満の細胞当たりの刺激試薬および／またはビーズの比率、例えば、１：１の比率などでインキュベートされ、生存するＴ細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または少なくとも９９．９％が、インキュベーションが完了した後、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日もしくは７日より長い間または少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日もしくは７日より長い間、例えば、生存可能であり、および／または壊死、プログラム細胞死もしくはアポトーシスを起こさない。特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物が、刺激試薬と共に３：１未満の細胞当たりの刺激試薬および／またはビーズの比率、例えば、１：１の比率でインキュベートされ、インキュベーションの際に細胞の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満または０．０１％未満が活性化誘導性細胞死を起こす。
ある特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、刺激試薬、例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁性ビーズと共に、３：１未満の細胞当たりのビーズの比率、例えば、１：１の比率でインキュベートされ、組成物の細胞は、濃縮されたＴ細胞の組成物が刺激試薬と共に３：１またはそれより大きい比率でインキュベートされる例示的および／または代替プロセスを受けている細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍もしくは少なくとも１００倍多い生存を有する。
一部の実施形態では、刺激試薬と共にインキュベートされた濃縮されたＴ細胞の組成物は、１．０×１０５個細胞／ｍＬ～１．０×１０８個細胞／ｍＬまたは約１．０×１０５個細胞／ｍＬ～約１．０×１０８個細胞／ｍＬ、例えば、少なくともまたは約少なくともまたは約１．０×１０５個細胞／ｍＬ、５×１０５個細胞／ｍＬ、１×１０６個細胞／ｍＬ、５×１０６個細胞／ｍＬ、１×１０７個細胞／ｍＬ、５×１０７個細胞／ｍＬまたは１×１０８個細胞／ｍＬを含む。一部の実施形態では、刺激試薬と共にインキュベートされた濃縮されたＴ細胞の組成物は、約０．５×１０６個細胞／ｍＬ、１×１０６個細胞／ｍＬ、１．５×１０６個細胞／ｍＬ、２×１０６個細胞／ｍＬ、２．５×１０６個細胞／ｍＬ、３×１０６個細胞／ｍＬ、３．５×１０６個細胞／ｍＬ、４×１０６個細胞／ｍＬ、４．５×１０６個細胞／ｍＬ、５×１０６個細胞／ｍＬ、５．５×１０６個細胞／ｍＬ、６×１０６個細胞／ｍＬ、６．５×１０６個細胞／ｍＬ、７×１０６個細胞／ｍＬ、７．５×１０６個細胞／ｍＬ、８×１０６個細胞／ｍＬ、８．５×１０６個細胞／ｍＬ、９×１０６個細胞／ｍＬ、９．５×１０６個細胞／ｍＬまたは１０×１０６個細胞／ｍＬ、例えば、約２．４×１０６個細胞／ｍＬを含む。
一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、刺激試薬と共に、約２５～約３８℃、例えば、約３０～約３７℃、例えば、約３７℃±２℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、刺激試薬と共に、約２．５％～約７．５％、例えば、約４％～約６％、例えば、５％±０．５％もしくは約５％±０．５％のＣＯ２レベルでインキュベートされる。一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、刺激試薬と共に、３７℃もしくは約３７℃の温度および／または５％もしくは約５％のＣＯ２レベルでインキュベートされる。
特定の実施形態では、刺激条件は、濃縮されたＴ細胞の組成物を、１つまたは複数のサイトカインと共に、および／または１つまたは複数のサイトカインの存在下でインキュベートすること、培養すること、および／または栽培することを含む。特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、組換えサイトカインである。一部の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、ヒト組換えサイトカインである。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、Ｔ細胞によって発現される、および／またはＴ細胞にとって内因性である受容体に結合する、および／またはそれに結合可能である。特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、サイトカインの４－アルファ－ヘリックスバンドルファミリーのメンバーであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、サイトカインの４－アルファ－ヘリックスバンドルファミリーのメンバーには、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、ＩＬ－１５であるか、またはこれを含む。特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、ＩＬ－７であるか、またはこれを含む。特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、ＩＬ－２であるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、刺激条件は、記載されたように、刺激試薬、例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁性ビーズの存在下で、および１つまたは複数の組換えサイトカインの存在下で濃縮されたＴ細胞、例えば、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞または濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物をインキュベートすることを含む。
特定の実施形態では、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞の組成物は、ＩＬ－２、例えば、組換えＩＬ－２と共にインキュベートされる。理論に捉われようとは思わないが、特定の実施形態は、一部の対象から取得されるＣＤ４＋Ｔ細胞が、細胞療法において使用するのに適したアウトプット細胞、例えば、操作された細胞の組成物を作製するプロセスを通じて成長、分裂および拡大増殖を可能にする量でＩＬ－２を産生しない、または十分に産生しないことを企図する。一部の実施形態では、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞の組成物を、組換えＩＬ－２の存在下で刺激条件下でインキュベートすることによって、組成物のＣＤ４＋Ｔ細胞が、インキュベーション工程の間およびプロセスを通じて生存、成長、拡大増殖および／または活性化し続ける確率または可能性が増大する。一部の実施形態では、組換えＩＬ－２の存在下での濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞の組成物をインキュベートすることによって、細胞療法に適した濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞のアウトプット組成物、例えば、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞が、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞の組成物から生成される確率および／または可能性が、組換えＩＬ－２の存在下で濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞の組成物をインキュベートしない代替および／または例示的方法と比較して、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍増大する。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインの量または濃度は、国際単位（ＩＵ）を用いて測定および／または定量化される。国際単位は、ビタミン、ホルモン、サイトカイン、ワクチン、血液製品および同様の生物活性物質を定量化するために使用され得る。一部の実施形態では、ＩＵは、比重および強度の国際参照標準、例えば、ＷＨＯヒトＩＬ－２の第１国際標準、８６／５０４との比較による生物学的調製物の効力の測定単位であるか、またはこれを含む。国際単位は、公開されており、国際的な共同研究活動に由来する、生物活性単位を報告するための唯一の認識され、標準化された方法である。特定の実施形態では、サイトカインの組成物、試料または供給源のＩＵは、類似のＷＨＯ標準製品を用いる製品比較試験によって得ることができる。例えば、一部の実施形態では、ヒト組換えＩＬ－２、ＩＬ－７またはＩＬ－１５の組成物、試料または供給源のＩＵ／ｍｇは、それぞれ、ＷＨＯ標準ＩＬ－２製品（ＮＩＢＳＣコード：８６／５００）、ＷＨＯ標準ＩＬ－１７製品（ＮＩＢＳＣコード：９０／５３０）およびＷＨＯ標準ＩＬ－１５製品（ＮＩＢＳＣコード：９５／５５４）に対して比較される。
一部の実施形態では、ＩＵ／ｍｇでの生物活性は、（ｎｇ／ｍｌでのＥＤ５０）－１×１０６と同等である。特定の実施形態では、組換えヒトＩＬ－２またはＩＬ－１５のＥＤ５０は、ＣＴＬＬ－２細胞を用いた細胞増殖の最大半量の刺激（ＸＴＴ切断）に必要な濃度と同等である。ある特定の実施形態では、組換えヒトＩＬ－７のＥＤ５０は、ＰＨＡ活性化ヒト末梢血リンパ球の増殖の最大半量の刺激に必要な濃度と同等である。ＩＬ－２のアッセイおよびＩＵの算出に関連する詳細は、Wadhwa et al., Journal of Immunological Methods (2013), 379 (1-2): 1-7；およびGearing and Thorpe, Journal of Immunological Methods (1988), 114 (1-2): 3-9に論じられており、ＩＬ－１５のアッセイおよびＩＵの算出に関連する詳細は、参照によりその全文で本明細書に組み込まれる、Soman et al. Journal of Immunological Methods (2009) 348 (1-2): 83-94に論じられている。
特定の実施形態では、濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物は、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５の存在下で刺激条件下でインキュベートされる。ある特定の実施形態では、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞の組成物は、ＩＬ－２、ＩＬ－７および／またはＩＬ－１５の存在下で刺激条件下でインキュベートされる。一部の実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７および／またはＩＬ－１５は、組換え型である。ある特定の実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７および／またはＩＬ－１５はヒトである。特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、ヒト組換えＩＬ－２、ＩＬ－７および／またはＩＬ－１５であるか、またはそれを含む。一部の態様では、濃縮されたＴ細胞組成物のインキュベーションはまた、刺激試薬、例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁性ビーズの存在を含む。
一部の実施形態では、細胞は、１ＩＵ／ｍｌから１，０００ＩＵ／ｍｌの間、１０ＩＵ／ｍｌから５０ＩＵ／ｍｌの間、５０ＩＵ／ｍｌから１００ＩＵ／ｍｌの間、１００ＩＵ／ｍｌから２００ＩＵ／ｍｌの間、１００ＩＵ／ｍｌから５００ＩＵ／ｍｌの間、２５０ＩＵ／ｍｌから５００ＩＵ／ｍｌの間または５００ＩＵ／ｍｌから１，０００ＩＵ／ｍｌの間の濃度のサイトカイン、例えば、組換えヒトサイトカインと共にインキュベートされる。
一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、１ＩＵ／ｍｌから２００ＩＵ／ｍｌの間、１０ＩＵ／ｍｌから２００ＩＵ／ｍｌの間、１０ＩＵ／ｍｌから１００ＩＵ／ｍｌの間、５０ＩＵ／ｍｌから１５０ＩＵ／ｍｌの間、８０ＩＵ／ｍｌから１２０ＩＵ／ｍｌの間、６０ＩＵ／ｍｌから９０ＩＵ／ｍｌの間または７０ＩＵ／ｍｌから９０ＩＵ／ｍｌの間の濃度のＩＬ－２、例えば、ヒト組換えＩＬ－２と共にインキュベートされる。特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、５０ＩＵ／ｍｌ、５５ＩＵ／ｍｌ、６０ＩＵ／ｍｌ、６５ＩＵ／ｍｌ、７０ＩＵ／ｍｌ、７５ＩＵ／ｍｌ、８０ＩＵ／ｍｌ、８５ＩＵ／ｍｌ、９０ＩＵ／ｍｌ、９５ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ、１１０ＩＵ／ｍｌ、１２０ＩＵ／ｍｌ、１３０ＩＵ／ｍｌ、１４０ＩＵ／ｍｌもしくは１５０ＩＵ／ｍｌまたは約５０ＩＵ／ｍｌ、５５ＩＵ／ｍｌ、６０ＩＵ／ｍｌ、６５ＩＵ／ｍｌ、７０ＩＵ／ｍｌ、７５ＩＵ／ｍｌ、８０ＩＵ／ｍｌ、８５ＩＵ／ｍｌ、９０ＩＵ／ｍｌ、９５ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ、１１０ＩＵ／ｍｌ、１２０ＩＵ／ｍｌ、１３０ＩＵ／ｍｌ、１４０ＩＵ／ｍｌもしくは１５０ＩＵ／ｍｌの濃度の組換えＩＬ－２と共にインキュベートされる。一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、８５ＩＵ／ｍｌの、または約８５ＩＵ／ｍｌの組換えＩＬ－２の存在下でインキュベートされる。一部の実施形態では、組換えＩＬ－２と共にインキュベートされた組成物は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の集団について濃縮される。一部の実施形態では、Ｔ細胞の集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団である。一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物である。特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、ＣＤ８＋Ｔ細胞について濃縮され、ＣＤ４＋Ｔ細胞は濃縮されず、および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞は、組成物からネガティブに選択されるか、または枯渇される。一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞の組成物である。特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞について濃縮され、ＣＤ８＋Ｔ細胞は濃縮されず、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、組成物からネガティブに選択されるか、または枯渇される。一部の実施形態では、組換えＩＬ－２と共にインキュベートされた濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞組成物はまた、記載される量等の組換えＩＬ－７および／または組換えＩＬ－１５と共にインキュベートされ得る。一部の実施形態では、組換えＩＬ－２と共にインキュベートされた濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞組成物はまた、記載された量等の組換えＩＬ－１５と共にインキュベートされ得る。
一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、１００ＩＵ／ｍｌから２，０００ＩＵ／ｍｌの間、５００ＩＵ／ｍｌから１，０００ＩＵ／ｍｌの間、１００ＩＵ／ｍｌから５００ＩＵ／ｍｌの間、５００ＩＵ／ｍｌから７５０ＩＵ／ｍｌの間、７５０ＩＵ／ｍｌから１，０００ＩＵ／ｍｌの間または５５０ＩＵ／ｍｌから６５０ＩＵ／ｍｌの間の濃度の組換えＩＬ－７、例えば、ヒト組換えＩＬ－７と共にインキュベートされる。特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、５０ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ、１５０ＩＵ／ｍｌ、２００ＩＵ／ｍｌ、２５０ＩＵ／ｍｌ、３００ＩＵ／ｍｌ、３５０ＩＵ／ｍｌ、４００ＩＵ／ｍｌ、４５０ＩＵ／ｍｌ、５００ＩＵ／ｍｌ、５５０ＩＵ／ｍｌ、６００ＩＵ／ｍｌ、６５０ＩＵ／ｍｌ、７００ＩＵ／ｍｌ、７５０ＩＵ／ｍｌ、８００ＩＵ／ｍｌ、７５０ＩＵ／ｍｌ、７５０ＩＵ／ｍｌ、７５０ＩＵ／ｍｌもしくは１，０００ＩＵ／ｍｌまたは約５０ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ、１５０ＩＵ／ｍｌ、２００ＩＵ／ｍｌ、２５０ＩＵ／ｍｌ、３００ＩＵ／ｍｌ、３５０ＩＵ／ｍｌ、４００ＩＵ／ｍｌ、４５０ＩＵ／ｍｌ、５００ＩＵ／ｍｌ、５５０ＩＵ／ｍｌ、６００ＩＵ／ｍｌ、６５０ＩＵ／ｍｌ、７００ＩＵ／ｍｌ、７５０ＩＵ／ｍｌ、８００ＩＵ／ｍｌ、７５０ＩＵ／ｍｌ、７５０ＩＵ／ｍｌ、７５０ＩＵ／ｍｌもしくは１，０００ＩＵ／ｍｌの濃度の組換えＩＬ－７と共にインキュベートされる。特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、６００ＩＵ／ｍｌまたは約６００ＩＵ／ｍｌの組換えＩＬ－７の存在下でインキュベートされる。一部の実施形態では、組換えＩＬ－７と共にインキュベートされる組成物は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団について濃縮される。一部の実施形態では、組換えＩＬ－７と共にインキュベートされた濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞組成物はまた、記載された量等の組換えＩＬ－２および／または組換えＩＬ－１５と共にインキュベートされる場合がある。特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞について濃縮され、ＣＤ８＋Ｔ細胞は濃縮されず、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、組成物からネガティブに選択されるか、または枯渇される。一部の実施形態では、濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞組成物は、組換えＩＬ－７と共にインキュベートされない。
一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、０．１ＩＵ／ｍｌから１００ＩＵ／ｍｌの間、１ＩＵ／ｍｌから１００ＩＵ／ｍｌの間、１ＩＵ／ｍｌから５０ＩＵ／ｍｌの間、５ＩＵ／ｍｌから２５ＩＵ／ｍｌの間、２５ＩＵ／ｍｌから５０ＩＵ／ｍｌの間、５ＩＵ／ｍｌから１５ＩＵ／ｍｌの間または１０ＩＵ／ｍｌから１００ＩＵ／ｍｌの間の濃度の組換えＩＬ－１５、例えば、ヒト組換えＩＬ－１５と共にインキュベートされる。特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、１ＩＵ／ｍｌ、２ＩＵ／ｍｌ、３ＩＵ／ｍｌ、４ＩＵ／ｍｌ、５ＩＵ／ｍｌ、６ＩＵ／ｍｌ、７ＩＵ／ｍｌ、８ＩＵ／ｍｌ、９ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌ、１１ＩＵ／ｍｌ、１２ＩＵ／ｍｌ、１３ＩＵ／ｍｌ、１４ＩＵ／ｍｌ、１５ＩＵ／ｍｌ、２０ＩＵ／ｍｌ、２５ＩＵ／ｍｌ、３０ＩＵ／ｍｌ、４０ＩＵ／ｍｌもしくは５０ＩＵ／ｍｌまたは約１ＩＵ／ｍｌ、２ＩＵ／ｍｌ、３ＩＵ／ｍｌ、４ＩＵ／ｍｌ、５ＩＵ／ｍｌ、６ＩＵ／ｍｌ、７ＩＵ／ｍｌ、８ＩＵ／ｍｌ、９ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌ、１１ＩＵ／ｍｌ、１２ＩＵ／ｍｌ、１３ＩＵ／ｍｌ、１４ＩＵ／ｍｌ、１５ＩＵ／ｍｌ、２０ＩＵ／ｍｌ、２５ＩＵ／ｍｌ、３０ＩＵ／ｍｌ、４０ＩＵ／ｍｌもしくは５０ＩＵ／ｍｌの濃度の組換えＩＬ－１５と共にインキュベートされる。一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、１０ＩＵ／ｍｌまたは約１０ＩＵ／ｍｌの組換えＩＬ－１５においてインキュベートされる。一部の実施形態では、組換えＩＬ－１５と共にインキュベートされた組成物は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の集団について濃縮される。一部の実施形態では、Ｔ細胞の集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団である。一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物である。特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、ＣＤ８＋Ｔ細胞について濃縮されており、ＣＤ４＋Ｔ細胞は濃縮されず、および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞は、組成物からネガティブに選択されるか、または枯渇される。一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞の組成物である。特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞について濃縮され、ＣＤ８＋Ｔ細胞は濃縮されず、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、組成物からネガティブに選択されるか、または枯渇される。一部の実施形態では、組換えＩＬ－１５と共にインキュベートされた濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞組成物はまた、記載される量等の組換えＩＬ－７および／または組換えＩＬ－２と共にインキュベートされる場合がある。一部の実施形態では、共にインキュベートされた組換えＩＬ－１５ｔ濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞組成物はまた、記載された量などの組換えＩＬ－２と共にインキュベートされる場合がある。
特定の実施形態では、細胞、例えば、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／または濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、１つまたは複数の抗酸化物質の存在下で刺激試薬と共にインキュベートされる。一部の実施形態では、抗酸化物質として、トコフェロール、トコトリエノール、アルファ－トコフェロール、ベータ－トコフェロール、ガンマ－トコフェロール、デルタ－トコフェロール、アルファ－トコトリエノール、ベータ－トコトリエノール、アルファ－トコフェロールキノン、トロロクス（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、フラボノイド、イソフラボン、リコピン、ベータ－カロテン、セレン、ユビキノン、ルエチン、Ｓ－アデノシルメチオニン、グルタチオン、タウリン、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、クエン酸、Ｌ－カルニチン、ＢＨＴ、モノチオグリセロール、アスコルビン酸、没食子酸プロピル、メチオニン、システイン、ホモシステイン、グルタチオン、シスタミンおよびシスタチオン（ｃｙｓｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ）および／またはグリシン－グリシン－ヒスチジンを含む１種または複数の抗酸化物質が挙げられるが、これらに限定されない。一部の態様では、濃縮されたＴ細胞組成物、例えば、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／または濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の、抗酸化物質と共のインキュベーションはまた、刺激試薬、例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁性ビーズおよび記載されたような１つまたは複数の組換えサイトカインの存在を含む。
一部の実施形態では、１種または複数の抗酸化物質は、硫黄含有オキシダント（ｏｘｉｄａｎｔ）であるか、またはそれを含む。ある特定の実施形態では、硫黄抗酸化物質には、チオール含有抗酸化物質および／または例えば、環構造内に１つもしくは複数の硫黄部分を呈する抗酸化物質が含まれ得る。一部の実施形態では、硫黄含有抗酸化物質には、例えば、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）および２，３－ジメルカプトプロパノール（ＤＭＰ）、Ｌ－２－オキソ－４－チオゾリジンカルボキシレート（ＯＴＣ）およびリポ酸が含まれ得る。特定の実施形態では、硫黄含有抗酸化物質は、グルタチオン前駆体である。一部の実施形態では、グルタチオン前駆体は、グルタチオンを導き出すための細胞内の１つまたは複数の工程において改変され得る分子である。特定の実施形態では、グルタチオン前駆体として、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、Ｌ－２－オキソチオゾリジン－４－カルボン酸（プロシステイン）、リポ酸、Ｓ－アリルシステインまたはメチルメチオニンスルホニウムクロリドを挙げることができるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、細胞、例えば、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／または濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、刺激条件下でインキュベートすることは、１つまたは複数の抗酸化物質の存在下で細胞をインキュベートすることを含む。特定の実施形態では、細胞は、１つまたは複数の抗酸化物質の存在下で刺激試薬を用いて刺激される。一部の実施形態では、細胞は、１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの間、１０ｎｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌの間、１００ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの間、１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの間、１０μｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの間、１００μｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの間、１５００μｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌの間、５００μｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌの間、１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの間または１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの間の１つまたは複数の抗酸化物質の存在下でインキュベートされる。一部の実施形態では、細胞は、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．８ ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、３００ｍｇ／ｍｌ、４００ｍｇ／ｍｌ、５００ｍｇ／ｍｌまたは約１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、３００ｍｇ／ｍｌ、４００ｍｇ／ｍｌ、５００ｍｇ／ｍｌの１つまたは複数の抗酸化物質の存在下でインキュベートされる。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗酸化物質は、硫黄含有抗酸化物質であるか、またはそれを含む。特定の実施形態では、１つまたは複数の抗酸化物質は、グルタチオン前駆体であるか、またはそれを含む。
一部の実施形態では、１つまたは複数の抗酸化物質は、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）を含むか、またはそれを含む。一部の実施形態では、細胞、例えば、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／または濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、刺激条件下でインキュベートすることは、ＮＡＣの存在下で細胞をインキュベートすることを含む。特定の実施形態では、細胞は、ＮＡＣの存在下で刺激試薬を用いて刺激される。一部の実施形態では、細胞は、１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの間、１０ｎｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌの間、１００ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの間、１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの間、１０μｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの間、１００μｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの間、１－５００μｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌの間、５００μｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌの間、１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの間または１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの間のＮＡＣの存在下でインキュベートされる。一部の実施形態では、細胞は、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、３００ｍｇ／ｍｌ、４００ｍｇ／ｍｌ、５００ｍｇ／ｍｌまたは約１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、３００ｍｇ／ｍｌ、４００ｍｇ／ｍｌ、５００ｍｇ／ｍｌのＮＡＣの存在下でインキュベートされる。一部の実施形態では、細胞は０．８ｍｇ／ｍｌと共にまたは約０．８ｍｇ／ｍｌと共にインキュベートされる。
特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞、例えば、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／または濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物を、１つまたは複数の抗酸化物質、例えば、ＮＡＣの存在下でインキュベートすることによって、細胞の活性化が、抗酸化物質が存在しない代替および／または例示的プロセスにおいてインキュベートされる細胞と比較して低減される。ある特定の実施形態では、低減された活性化は、細胞における１つまたは複数の活性化マーカーの発現によって測定される。ある特定の実施形態では、活性化のマーカーとして、細胞内複雑性（例えば、側方散乱（ＳＳＣ）を測定することによって決定されるような）の増大、細胞サイズ（例えば、細胞径および／または前方散乱（ＦＳＣ）を測定することによって決定されるような）の増大、ＣＤ２７の発現の増大および／またはＣＤ２５の発現の減少が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、組成物の細胞は、インキュベーション、操作、形質導入、トランスフェクション、拡大増殖もしくは製剤化の間もしくはその後またはインキュベーション後に生じるプロセスの任意の段階の間もしくはその後に調べた場合に、ネガティブな、低減したまたは低い発現および／または活性化のマーカーの程度を有する。一部の実施形態では、組成物の細胞は、プロセスが完了した後に、ネガティブな、低減されたまたは低い発現および／または活性化のマーカーの程度を有する。特定の実施形態では、アウトプット組成物の細胞は、ネガティブな、低減されたまたは低い発現および／または活性化のマーカーの程度を有する。
一部の実施形態では、細胞の相対サイズを決定するためにフローサイトメトリーが使用される。特定の実施形態では、細胞を分析し、サイズおよび内部の複雑性に基づいて細胞を互いに識別するためにＦＳＣおよびＳＳＣパラメーターが使用される。特定の実施形態では、実際の細胞のサイズを決定ために、既知サイズの粒子またはビーズが標準として測定され得る。一部の実施形態では、フローサイトメトリーは、染色、例えば、標識された抗体と組み合わせて使用されて、表面タンパク質、例えば、活性化のマーカー、例えば、ＣＤ２５またはＣＤ２７の発現を測定または定量化する。
一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞、例えば、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／または濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物は、１つまたは複数の抗酸化物質、例えば、ＮＡＣの存在下でインキュベートされ、細胞径は、インキュベーションが抗酸化物質の存在下で実施されない代替および／または例示的プロセスにおいてインキュベートされた細胞と比較して少なくとも０．２５μｍ、０．５μｍ、０．７５μｍ、１．０μｍ、１．５μｍ、２μｍ、２．５μｍ、３μｍ、３．５μｍ、４μｍ、４．５μｍ、５μｍまたは５μｍよりも多く低減される。特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、１つまたは複数の抗酸化物質、例えば、ＮＡＣの存在下でインキュベートされ、ＦＳＣによって測定されるような細胞サイズは、インキュベーションが抗酸化物質の存在下で実施されない代替および／または例示的プロセスにおいてインキュベートされた細胞と比較して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％低減される。
一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞、例えば、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／または濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物は、１つまたは複数の抗酸化物質、例えば、ＮＡＣの存在下でインキュベートされ、ＳＳＣによって測定されるような細胞内複雑性は、インキュベーションが抗酸化物質の存在下で実施されない代替および／または例示的プロセスにおいてインキュベートされた細胞と比較して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％低減される。
特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞、例えば、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／または濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物は、１つまたは複数の抗酸化物質、例えば、ＮＡＣの存在下でインキュベートされ、例えば、フローサイトメトリーによって測定されるようなＣＤ２７の発現は、インキュベーションが抗酸化物質の存在下で実施されない代替および／または例示的プロセスにおいてインキュベートされた細胞と比較して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％低減される。
ある特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞、例えば、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／または濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物は、１つまたは複数の抗酸化物質、例えば、ＮＡＣの存在下でインキュベートされ、例えば、フローサイトメトリーによって測定されるようなＣＤ２５の発現は、インキュベーションが抗酸化物質の存在下で実施されない代替および／または例示的プロセスにおいてインキュベートされた細胞と比較して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％，少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍増大される。
特定の実施形態では、１つまたは複数の抗酸化物質、例えば、ＮＡＣの存在下で、濃縮されたＴ細胞、例えば、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／または濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物をインキュベートすることは、節ＩＩ－Ｄに記載されるような、例えば、インキュベーションまたは培養工程または段階の間の拡大増殖を増大する。一部の実施形態では、濃縮された細胞の組成物は、培養のはじめの３日以内に１４日、１２日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日以内に、または３日以内に、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍または１０倍よりも大きい拡大増殖に達する。一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、１つまたは複数の抗酸化物質の存在下でインキュベートされ、組成物の細胞は、インキュベーションが抗酸化物質の存在下で実施されない代替および／または例示的プロセスにおいてインキュベートされた培養された細胞よりも、培養の間に、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍速い速度の拡大増殖を起こす。
特定の実施形態では、濃縮された細胞、例えば、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／または濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物を、１つまたは複数の抗酸化物質、例えば、ＮＡＣの存在下でインキュベートすることによって、例えば、アポトーシスによる細胞死の量が低減される。一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、１つまたは複数の抗酸化物質、例えば、ＮＡＣの存在下でインキュベートされ、生存細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または少なくとも９９．９％は、例えば、インキュベーションが完了した後１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日もしくは７日よりも長い間または少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日もしくは７日よりも長い間アポトーシスを起こさない。一部の実施形態では、組成物は、１つまたは複数の抗酸化物質、例えば、ＮＡＣの存在下でインキュベートされ、組成物の細胞は、細胞が１つまたは複数の抗酸化物質の存在下でインキュベートされない例示的および／または代替プロセスを経験した細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍大きい生存を有する。
特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞、例えば、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／または濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物は、１つまたは複数の抗酸化物質、例えば、ＮＡＣの存在下でインキュベートされ、カスパーゼ発現、例えば、カスパーゼ３発現は、インキュベーションが抗酸化物質の存在下で実施されない代替および／または例示的プロセスにおいてインキュベートされた細胞と比較して、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％低減される。
一部の実施形態では、組成物または細胞、例えば、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／または濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、記載されるもの等の刺激条件または刺激剤の存在下でインキュベートされる。このような条件は、集団中の細胞の増殖、拡大増殖、活性化および／または生存を誘導するように、抗原曝露を模倣するために、および／または遺伝子操作のため、例えば組換え抗原受容体の導入のために細胞を刺激するように設計されたものを含む。例示的刺激試薬、例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁性ビーズは、以下に記載されている。刺激試薬と共のインキュベーションはまた、１つまたは複数の刺激性サイトカインの存在下で、例えば、組換えＩＬ－２、組換えＩＬ－７および／または組換えＩＬ－１５のうち１つまたは複数の存在下で、および／または上記のものなどの少なくとも１つの抗酸化物質、例えば、ＮＡＣの存在下で実施され得る。一部の実施形態では、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞の組成物は、記載されるような量等の刺激剤、組換えＩＬ－２、組換えＩＬ－７、組換えＩＬ－１５およびＮＡＣと共にインキュベートされる。一部の実施形態では、濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物は、記載されるような量等の刺激剤、組換えＩＬ－２、組換えＩＬ－１５およびＮＡＣと共に刺激条件下でインキュベートされる。
一部の実施形態では、刺激および／または活性化の条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、薬剤、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオンおよび／または刺激因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体および細胞を活性化するように設計された任意の他の薬剤のうち１つまたは複数を含み得る。
一部の態様では、インキュベーションは、Riddell et al.の米国特許第６，０４０，１７７号、Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660、Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82、および／またはWang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701に記載されるもの等の技術に従って実施される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の刺激条件または刺激剤の存在下でのインキュベーションの少なくとも一部分は、国際公開公報番号ＷＯ２０１６／０７３６０２に記載されるもの等の遠心回転下で遠心チャンバーの内部空洞中で実施される。一部の実施形態では、遠心チャンバー中で実施されるインキュベーションの少なくとも一部分は、刺激および／または活性化を誘導するために試薬（単数または複数）との混合を含む。一部の実施形態では、細胞、例えば、選択された細胞が、遠心チャンバー中で刺激条件または刺激剤と混合される。このようなプロセスの一部の態様では、一定体積の細胞が、細胞培養プレートまたは他のシステムにおいて同様の刺激を実施する場合に普通使用されるものよりもかなり少ない一定量の１つまたは複数の刺激条件または刺激剤と混合される。
一部の実施形態では、刺激剤は、選択が遠心チャンバー中での混合を行わずに、例えば、周期性の振盪または回転を伴ってチューブまたはバッグ中で実施される場合に同数の細胞または同一体積の細胞の選択のほぼ同一または同様の効率を達成するために通常使用される、または必要であるであろう刺激剤の量と比較して、実質的に少ない量（例えば、量の５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％以下である）でチャンバーの空洞中の細胞に添加される。一部の実施形態では、インキュベーションは、細胞および刺激剤にインキュベーション緩衝液を添加して、標的体積を達成し、例えば、約１０ｍＬ～約２００ｍＬまたは約２０ｍＬ～約１２５ｍＬ、例えば、少なくともまたは約少なくともまたは約１０ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、６０ｍＬ、７０ｍＬ、８０ｍＬ、９０ｍＬ、１００ｍＬ、１０５ｍＬ、１１０ｍＬ、１１５ｍＬ、１２０ｍＬ、１２５ｍＬ、１３０ｍＬ、１３５ｍＬ、１４０ｍＬ、１４５ｍＬ、１５０ｍＬ、１６０ｍＬ、１７０ｍＬ、１８０ｍＬ、１９０ｍＬまたは２００ｍＬの試薬をインキュベーションして実施される。一部の実施形態では、インキュベーション緩衝液および刺激剤は、細胞への添加の前に予め混合される。一部の実施形態では、インキュベーション緩衝液および刺激剤は、細胞に別個に添加される。一部の実施形態では、刺激インキュベーションは、周期性に穏やかに混合する条件を用いて実施され、これは、エネルギー的に有利な相互作用の促進を補助でき、それによって、細胞の刺激および活性化を達成しながらより少ない全体的な刺激剤の使用が可能となる。
一部の実施形態では、インキュベーションは一般に、回転の存在下でなどの混合条件下で、一般に、比較的低い力または速度、例えば、細胞をペレット化するために使用されるものよりも低い速度、例えば、６００ｒｐｍ～１７００ｒｐｍまたは約６００ｒｐｍ～約１７００ｒｐｍで（例えば、６００ｒｐｍ、１０００ｒｐｍまたは１５００ｒｐｍもしくは１７００ｒｐｍまたは約６００ｒｐｍ、１０００ｒｐｍまたは１５００ｒｐｍもしくは１７００ｒｐｍまたは少なくとも６００ｒｐｍ、１０００ｒｐｍまたは１５００ｒｐｍもしくは１７００ｒｐｍで）、例えば、８０ｇ～１００ｇまたは約８０ｇ～約１００ｇ（例えば、８０ｇ、８５ｇ、９０ｇ、９５ｇもしくは１００ｇまたは約８０ｇ、８５ｇ、９０ｇ、９５ｇもしくは１００ｇまたは少なくとも８０ｇ、８５ｇ、９０ｇ、９５ｇもしくは１００ｇで）のチャンバーまたは他の容器の試料または壁でのＲＣＦで実施される。一部の実施形態では、回転は、低速と、その後の休息期間の回転の反復間隔、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０秒間の回転および／または休息、例えば、およそ１または２秒の回転と、その後のおよそ５、６、７または８秒の休息を使用して実施される。
一部の実施形態では、例えば、刺激剤とのインキュベーションの総持続期間は、約１時間から９６時間、１時間から７２時間、１時間から４８時間、４時間から３６時間、８時間から３０時間、１８時間から３０時間または１２時間から２４時間、例えば、少なくともまたは約少なくともまたは約６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間または７２時間の間である。一部の実施形態では、さらなるインキュベーションは、１時間から４８時間、４時間から３６時間、８時間から３０時間もしくは１２時間から２４時間の間または約１時間から４８時間、４時間から３６時間、８時間から３０時間もしくは１２時間から２４時間の間の時間である。
一部の実施形態では、細胞は、例えば、節ＩＩ－Ｃに記載されるもの等の形質導入および／またはトランスフェクションによって、ポリヌクレオチド、例えば、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する工程の前および／またはその間に、細胞は、刺激条件下で培養、栽培および／またはインキュベートされる。ある特定の実施形態では、細胞は、刺激条件下で、遺伝子操作の前、３０分から２時間の間、１時間から８時間の間、１時間から６時間の間、６時間から１２時間の間、１２時間から１８時間の間、１６時間から２４時間の間、１２時間から３６時間の間、２４時間から４８時間の間、２４時間から７２時間の間、４２時間から５４時間の間、６０時間から１２０時間の間、９６時間から１２０時間の間、９０時間から１日から７日の間、３日から８日の間、１日から３日の間、４日から６日の間、または４日から５日の間の時間量の間培養、栽培および／またはインキュベートされる。一部の実施形態では、細胞は、操作の前約２日間インキュベートされる。
ある特定の実施形態では、細胞は、細胞を遺伝子操作する前に、および／またはその間に、刺激試薬と共におよび／または刺激試薬の存在下でインキュベートされる。ある特定の実施形態では、細胞は、刺激試薬と共におよび／または刺激試薬の存在下で、１２時間から３６時間の間、２４時間から４８時間の間、２４時間から７２時間の間、４２時間から５４時間の間、６０時間から１２０時間の間、９６時間から１２０時間の間、９０時間から２日から７日の間、３日から８日の間、１日から８日の間、４日から６日の間、または４日から５日の間の時間量の間、インキュベートされる。特定の実施形態では、細胞は、細胞を遺伝子操作する前に、および／またはその間に、１０日、９日、８日、７日、６日または５日、４日未満の時間量の間、または１６８時間、１６２時間、１５６時間、１４４時間、１３８時間、１３２時間、１２０時間、１１４時間、１０８時間、１０２時間もしくは９６時間未満の時間量の間、培養、栽培および／またはインキュベートされる。特定の実施形態では、細胞は、刺激試薬と共におよび／または刺激試薬の存在下で４日、５日、６日もしくは７日間または約４日、５日、６日もしくは７日間インキュベートされる。一部の実施形態では、細胞は、刺激試薬と共におよび／または刺激試薬の存在下で、４日間または約４日間インキュベートされる。特定の実施形態では、細胞は、刺激試薬と共におよび／または刺激試薬の存在下で、５日間または約５日間インキュベートされる。ある特定の実施形態では、細胞は、刺激試薬と共におよび／または刺激試薬の存在下で、７日間または約７日間インキュベートされる。
一部の実施形態では、細胞を刺激条件下でインキュベートすることは、細胞を、節ＩＩ－Ｂ－１に記載される刺激試薬と共にインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、刺激試薬は、ビーズ、例えば、常磁性ビーズを含有するか、または含み、細胞は、刺激試薬と共に、３：１未満（ビーズ：細胞）の比率、例えば、１：１の比率でインキュベートされる。特定の実施形態では、細胞は、刺激試薬と共に、１つまたは複数のサイトカインおよび／または１つまたは複数の抗酸化物質の存在下でインキュベートされる。一部の実施形態では、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞の組成物は、１：１（ビーズ：細胞）の比率で刺激試薬と共に、組換えＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５およびＮＡＣの存在下でインキュベートされる。ある特定の実施形態では、濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物は、１：１（ビーズ：細胞）の比率で刺激試薬と共に、組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＮＡＣの存在下でインキュベートされる。一部の実施形態では、刺激試薬は、インキュベーションのはじめまたは開始から、例えば、刺激試薬が添加された、または細胞と接触した時間から６日、５日もしくは４日で、６日、５日もしくは４日で以内で、または約６日、５日もしくは４日以内で細胞から除去および／または分離される。
１．刺激試薬
一部の実施形態では、濃縮された細胞の組成物を、刺激条件下でインキュベートすることは、細胞の組成物を、Ｔ細胞を活性化および／または拡大増殖させることが可能な刺激試薬を用いてインキュベートすることおよび／または接触させることであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、刺激試薬は、細胞中の１つまたは複数のシグナルを刺激および／または活性化可能である。一部の実施形態では、１つまたは複数のシグナルは、受容体によって媒介される。特定の実施形態では、１つまたは複数のシグナルは、シグナル伝達および／もしくは二次的メッセンジャー、例えば、ｃＡＭＰおよび／もしくは細胞内カルシウムのレベルもしくは量の変化、１つもしくは複数の細胞タンパク質の量、細胞局在性、確認、リン酸化、ユビキチン化および／もしくは末端切断の変化、ならびに／または細胞性活性、例えば、転写、翻訳、タンパク質分解、細胞形態学、活性化状態および／もしくは細胞分裂の変化であるか、またはそれと関連する。特定の実施形態では、刺激試薬は、活性化する、および／またはＴＣＲ複合体の１つもしくは複数の構成要素の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または１つもしくは複数の共刺激分子の１つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化可能である。
ある特定の実施形態では、刺激試薬は、細胞、例えば、Ｔ細胞を活性化および／または拡大増殖することを可能にする１つまたは複数の試薬、例えば、生体分子にコンジュゲートまたは連結している粒子、例えば、ビーズを含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数の薬剤が、ビーズに結合している。一部の実施形態では、ビーズは、生体適合性である、すなわち、生物学的使用に適した材料から構成されている。一部の実施形態では、ビーズは、培養細胞、例えば、培養Ｔ細胞に対して非毒性である。一部の実施形態では、ビーズは、薬剤と細胞間の相互作用を可能にする方法において薬剤を付着させることが可能である任意の粒子である。
一部の実施形態では、刺激試薬は、ビーズに、例えば、ビーズの表面に結合しているか、そうでなければ、付着している細胞、例えば、Ｔ細胞を活性化および／または拡大増殖することが可能である１つまたは複数の薬剤を含有する。ある特定の実施形態では、ビーズは、非細胞粒子である。特定の実施形態では、ビーズは、コロイド粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、磁性ビーズ等を含み得る。一部の実施形態では、ビーズは、アガロースビーズである。ある特定の実施形態では、ビーズはセファロースビーズである。
特定の実施形態では、刺激試薬は、単分散であるビーズを含有する。ある特定の実施形態では、単分散であるビーズは、互いに５％未満の直径標準偏差を有するサイズ分散を含む。
一部の実施形態では、ビーズは、ビーズの表面にカップリング、コンジュゲートまたは連結（直接的または間接的）している薬剤などの１つまたは複数の薬剤を含有する。一部の実施形態では、本明細書で企図されるような薬剤として、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質（例えば、酵素）、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、炭水化物、脂質、レクチンまたは所望の標的に対して親和性を有する任意の他の生体分子を挙げることができるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、所望の標的は、Ｔ細胞受容体および／またはＴ細胞受容体の構成要素である。ある特定の実施形態では、所望の標的はＣＤ３である。ある特定の実施形態では、所望の標的は、Ｔ細胞共刺激分子、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１－ＢＢ）、ＯＸ４０またはＩＣＯＳである。当技術分野で公知の利用可能な種々の方法によって、１つもしくは複数の薬剤を、ビーズに直接的または間接的に付着させることができる。付着は、共有結合性、非共有結合性、静電気性、または疎水性である場合があり、例えば、化学的手段、機械的手段または酵素的手段を含む種々の付着手段によって達成することができる。一部の実施形態では、生体分子（例えば、ビオチン化抗ＣＤ３抗体）を、ビーズに直接的に付着している別の生体分子（例えば、抗ビオチン抗体）を介してビーズに間接的に付着させることができる。
一部の実施形態では、刺激試薬は、ビーズと、細胞の表面上の高分子と直接的に相互作用する１つまたは複数の薬剤を含有する。ある特定の実施形態では、ビーズ（例えば、常磁性ビーズ）は、細胞上の１つまたは複数の高分子（例えば、１つまたは複数の細胞表面タンパク質）に対して特異的である１つまたは複数の薬剤（例えば、抗体）を介して細胞と相互作用する。ある特定の実施形態では、ビーズ（例えば、常磁性ビーズ）は、本明細書で記載される第１の薬剤、例えば、一次抗体（例えば、抗ビオチン抗体）または他の生体分子を用いて標識され、次いで、第２の薬剤、例えば、二次抗体（例えば、ビオチン化抗ＣＤ３抗体）または他の第２の生体分子（例えば、ストレプトアビジン）が添加され、それによって、二次抗体または他の二次生体分子は、粒子上のこのような一次抗体または他の生体分子に特異的に結合する。
一部の実施形態では、刺激試薬は、ビーズ（例えば、常磁性ビーズ）に付着しており、細胞（例えば、Ｔ細胞）上の以下の高分子のうち１つまたは複数に特異的に結合する、１つまたは複数の薬剤（例えば、抗体）を含有する：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ－１）、ＣＤ１２７、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＯＸ４０、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ；ＩＦＮ－ガンマＲ、ＴＮＦ－アルファＲ、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－１０Ｒ、ＣＤ１８／ＣＤｌ ｌａ（ＬＦＡ－１）、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）、ＣＤ２９／ＣＤ４９ｄ （ＶＬＡ－４）、ノッチリガンド（例えば、デルタ様１／４、Ｊａｇｇｅｄ １／２など）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７およびＣＸＣＲ３またはこれらの高分子またはその断片に対する対応するリガンドを含むその断片。一部の実施形態では、ビーズに付着している薬剤（例えば、抗体）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）上の以下の高分子のうち１つまたは複数に特異的に結合する：ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ１２７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡおよび／またはＣＤ４５ＲＯ。一部の実施形態では、ビーズに付着している１つまたは複数の薬剤は、抗体である。抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗体を含む）、ポリエピトープ性特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディおよび単鎖分子ならびに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ）が含まれ得る。一部の実施形態では、刺激試薬は、抗体断片（抗原結合断片を含む）、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖまたは（Ｆａｂ’）２断片である。本明細書で企図される抗体に、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ定常領域を含む任意のアイソタイプの定常領域を使用できること、およびこのような定常領域は、任意のヒトまたは動物種（例えば、マウス種）から取得できることは認められよう。
一部の実施形態では、薬剤は、Ｔ細胞受容体の１つもしくは複数の構成要素に結合し、および／または認識する抗体である。特定の実施形態では、薬剤は、抗ＣＤ３抗体である。ある特定の実施形態では、薬剤は、共受容体に結合し、および／または認識する抗体である。一部の実施形態では、刺激試薬は、抗ＣＤ２８抗体を含む。特定の実施形態では、刺激剤は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を含有する。一部の実施形態では、抗体はＦａｂである。一部の実施形態では、刺激剤は、抗ＣＤ３ Ｆａｂおよび抗ＣＤ２８ Ｆａｂを含有する。
一部の実施形態では、刺激剤は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０１５／１５８８６８またはＷＯ２０１９／１９７９４９に記載されるもの等の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ストレプトアビジンオリゴマー試薬である。
一部の実施形態では、刺激剤は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｄｅｒおよび／またはＥｘｐＡＣＴ（登録商標）ビーズ）である。
一部の実施形態では、ビーズは、約０．００１μｍより大きい、約０．０１μｍより大きい、約０．１μｍより大きい、約１．０μｍより大きい、約１０μｍより大きい、約５０μｍより大きい、約１００μｍより大きい、または約１０００μｍより大きい、約１５００μｍ以下の直径を有する。一部の実施形態では、ビーズは、約１．０μｍ～約５００μｍ、約１．０μｍ～約１５０μｍ、約１．０μｍ～約３０μｍ、約１．０μｍ～約１０μｍ、約１．０μｍ～約５．０μｍ、約２．０μｍ～約５．０μｍまたは約３．０μｍ～約５．０μｍの直径を有する。一部の実施形態では、ビーズは、約３μｍ～約５μｍの直径を有する。一部の実施形態では、ビーズは、少なくともまたは少なくとも約または約０．００１μｍ、０．０１μｍ、０．１μｍ、０．５μｍ、１．０μｍ、１．５μｍ、２．０μｍ、２．５μｍ、３．０μｍ、３．５μｍ、４．０μｍ、４．５μｍ、５．０μｍ、５．５μｍ、６．０μｍ、６．５μｍ、７．０μｍ、７．５μｍ、８．０μｍ、８．５μｍ、９．０μｍ、９．５μｍ、１０μｍ、１２μｍ、１４μｍ、１６μｍ、１８μｍもしくは２０μｍの直径を有する。ある特定の実施形態では、ビーズは、４．５μｍまたは約４．５μｍの直径を有する。ある特定の実施形態では、ビーズは、２．８μｍまたは約２．８μｍの直径を有する。
一部の実施形態では、ビーズは、０．００１ｇ／ｃｍ３より大きい、０．０１ｇ／ｃｍ３より大きい、０．０５ｇ／ｃｍ３より大きい、０．１ｇ／ｃｍ３より大きい、０．５ｇ／ｃｍ３より大きい、０．６ｇ／ｃｍ３より大きい、０．７ｇ／ｃｍ３より大きい、０．８ｇ／ｃｍ３より大きい、０．９ｇ／ｃｍ３より大きい、１ｇ／ｃｍ３より大きい、１．１ｇ／ｃｍ３より大きい、１．２ｇ／ｃｍ３より大きい、１．３ｇ／ｃｍ３より大きい、１．４ｇ／ｃｍ３より大きい、１．５ｇ／ｃｍ３より大きい、２ｇ／ｃｍ３より大きい、３ｇ／ｃｍ３より大きい、４ｇ／ｃｍ３より大きい、または５ｇ／ｃｍ３より大きい密度を有する。一部の実施形態では、ビーズは、約０．００１ｇ／ｃｍ３から約１００ｇ／ｃｍ３、約０．０１ｇ／ｃｍ３から約５０ｇ／ｃｍ３、約０．１ｇ／ｃｍ３から約１０ｇ／ｃｍ３、約０．１ｇ／ｃｍ３から約．５ｇ／ｃｍ３、約０．５ｇ／ｃｍ３から約１ｇ／ｃｍ３、約０．５ｇ／ｃｍ３から約１．５ｇ／ｃｍ３、約１ｇ／ｃｍ３から約１．５ｇ／ｃｍ３、約１ｇ／ｃｍ３から約２ｇ／ｃｍ３または約１ｇ／ｃｍ３から約５ｇ／ｃｍ３の間の密度を有する。一部の実施形態では、ビーズは、約０．５ｇ／ｃｍ３、約０．５ｇ／ｃｍ３、約０．６ｇ／ｃｍ３、約０．７ｇ／ｃｍ３、約０．８ｇ／ｃｍ３、約０．９ｇ／ｃｍ３、約１．０ｇ／ｃｍ３、約１．１ｇ／ｃｍ３、約１．２ｇ／ｃｍ３、約１．３ｇ／ｃｍ３、約１．４ｇ／ｃｍ３、約１．５ｇ／ｃｍ３、約１．６ｇ／ｃｍ３、約１．７ｇ／ｃｍ３、約１．８ｇ／ｃｍ３、約１．９ｇ／ｃｍ３または約２．０ｇ／ｃｍ３の密度を有する。ある特定の実施形態では、ビーズは、約１．６ｇ／ｃｍ３の密度を有する。特定の実施形態では、ビーズまたは粒子は、約１．５ｇ／ｃｍ３の密度を有する。ある特定の実施形態では、粒子は、約１．３ｇ／ｃｍ３の密度を有する。
ある特定の実施形態では、複数のビーズが、均一の密度を有する。ある特定の実施形態では、均一密度は、平均ビーズ密度の１０％未満、５％未満または１％未満の密度標準偏差を含む。
一部の実施形態では、ビーズは、約０．００１の粒子各１グラム当たりのｍ２（ｍ２／ｇ）～約１，０００ｍ２／ｇ、約．０１０ｍ２／ｇ～約１００ｍ２／ｇ、約０．１ｍ２／ｇ～約１０ｍ２／ｇ、約０．１ｍ２／ｇ～約１ｍ２／ｇ、約１ｍ２／ｇ～約１０ｍ２／ｇ、約１０ｍ２／ｇ～約１００ｍ２／ｇ、約０．５ｍ２／ｇ～約２０ｍ２／ｇ、約０．５ｍ２／ｇ～約５ｍ２／ｇまたは約１ｍ２／ｇ～約４ｍ２／ｇの間の表面積を有する。一部の実施形態では、粒子またはビーズは、約１ｍ２／ｇ～約４ｍ２／ｇの表面積を有する。
一部の実施形態では、ビーズは、磁場において反応する。一部の実施形態では、ビーズは、磁性ビーズである。一部の実施形態では、磁性ビーズは常磁性である。特定の実施形態では、磁性ビーズは、超常磁性である。ある特定の実施形態では、ビーズは、磁場に曝露されるまで磁気特性を全く呈さない。
特定の実施形態では、ビーズは、磁気コア、常磁性コアまたは超常磁性コアを含む。一部の実施形態では、磁気コアは、金属を含有する。一部の実施形態では、金属は、鉄、ニッケル、銅、コバルト、ガドリニウム、マンガン、タンタル、亜鉛、ジルコニウムまたはこれらの任意の組合せであり得るが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、磁気コアは、金属酸化物（例えば、鉄酸化物）、フェライト（例えば、マンガンフェライト、コバルトフェライト、ニッケルフェライト等）、ヘマタイトおよび金属合金（例えば、ＣｏＴａＺｎ）を含む。一部の実施形態では、磁気コアは、フェライト、金属、金属合金、鉄酸化物または二酸化クロムのうち１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、磁気コアは、元素鉄またはその化合物を含む。一部の実施形態では、磁気コアは、磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）、磁赤鉄鉱（γＦｅ２Ｏ３）またはグレイジャイト（Ｆｅ３Ｓ４）のうち１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、内部コアは、鉄酸化物（例えば、Ｆｅ３Ｏ４）を含む。
ある特定の実施形態では、ビーズは、表面官能化コートまたはコーティングで覆われた磁性、常磁性および／または超常磁性コアを含有する。一部の実施形態では、コートは、それだけには限らないが、ポリマー、多糖、シリカ、脂肪酸、タンパク質、炭素、アガロース、セファロースまたはそれらの組合せを挙げることができる材料を含有し得る。一部の実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸－グリコール酸共重合体、ポリグルタルアルデヒド、ポリウレタン、ポリスチレンまたはポリビニルアルコールであり得る。ある特定の実施形態では、外側コートまたはコーティングは、ポリスチレンを含む。特定の実施形態では、外側コーティングは、表面官能化されている。
一部の実施形態では、刺激試薬は、金属酸化物コア（例えば、鉄酸化物コア）およびコートを含有するビーズを含み、金属酸化物コアは、少なくとも１つの多糖（例えば、デキストラン）を含み、コートは、少なくとも１つの多糖（例えば、アミノデキストラン）、少なくとも１つのポリマー（例えば、ポリウレタン）およびシリカを含む。一部の実施形態では、金属酸化物コアは、コロイド鉄酸化物コアである。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の薬剤は、抗体またはその抗原結合断片を含む。特定の実施形態では、１つまたは複数の薬剤は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、刺激試薬は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体および抗ビオチン抗体を含む。一部の実施形態では、刺激試薬は、抗ビオチン抗体を含む。一部の実施形態では、ビーズは、約３μｍ～約１０μｍの直径を有する。一部の実施形態では、ビーズは、約３μｍ～約５μｍの直径を有する。ある特定の実施形態では、ビーズは、約３．５μｍの直径を有する。
一部の実施形態では、刺激試薬は、金属酸化物コア（例えば、鉄酸化物内部コア）およびコート（例えば、保護的コート）を含むビーズに付着していている１つまたは複数の薬剤を含み、コートはポリスチレンを含む。ある特定の実施形態では、ビーズは、常磁性（例えば、超常磁性）鉄コア、例えば、磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）および／または磁赤鉄鉱（γＦｅ２Ｏ３）ｃを含むコアおよびポリスチレンコートまたはコーティングを含む、単分散、常磁性（例えば、超常磁性）ビーズである。一部の実施形態では、ビーズは、非多孔性である。一部の実施形態では、ビーズは、１つまたは複数の薬剤が付着される官能化表面を含有する。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の薬剤は、共有結合によってビーズに表面で結合される。一部の実施形態では、１つまたは複数の薬剤として、抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。一部の実施形態では、１つもしくは複数の薬剤として、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体が挙げられる。一部の実施形態では、刺激試薬は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁性ビーズであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、１つもしくは複数の薬剤として、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体ならびに標識された抗体（例えば、ビオチン化抗体）、例えば、標識された抗ＣＤ３または抗ＣＤ２８抗体に結合可能な抗体またはその抗原断片が挙げられる。ある特定の実施形態では、ビーズは、約１．５ｇ／ｃｍ３の密度および約１ｍ２／ｇ～約４ｍ２／ｇの表面積を有する。特定の実施形態では、ビーズは、約４．５μｍの直径および約１．５ｇ／ｃｍ３の密度を有する、単分散の超常磁性ビーズである。一部の実施形態では、約２．８μｍの平均直径および約１．３ｇ／ｃｍ３の密度を有する、ビーズは、単分散の超常磁性ビーズである。
一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の組成物は、刺激試薬と共に、３：１、２．５：１、２：１、１．５：１、１．２５：１、１．２：１、１．１：１、１：１、０．９：１、０．８：１、０．７５：１、０．６７：１、０．５：１、０．３：１もしくは０．２：１または約３：１、２．５：１、２：１、１．５：１、１．２５：１、１．２：１、１．１：１、１：１、０．９：１、０．８：１、０．７５：１、０．６７：１、０．５：１、０．３：１もしくは０．２：１の、ビーズの細胞に対する比率でインキュベートされる。特定の実施形態では、ビーズの細胞に対する比率は、２．５：１から０．２：１の間、２：１から０．５：１の間、１．５：１から０．７５：１の間、１．２５：１から０．８：１の間、１．１：１から０．９：１の間である。特定の実施形態では、刺激試薬の細胞に対する比率は、約１：１であるか、または１：１である。
２．細胞からの刺激試薬の除去
ある特定の実施形態では、刺激試薬、例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁性ビーズは、細胞から除去される、および／または分離される。理論に捉われようとは思わないが、特定の実施形態は、刺激試薬と細胞の間の結合および／または会合は、一部の状況では、インキュベーションの間に経時的に低減される場合があるということを企図する。ある特定の実施形態では、刺激試薬と細胞の間の結合および／または会合を低減するために１つもしくは複数の薬剤が添加される場合がある。特定の実施形態では、細胞培養条件の変化、例えば、培地温度またはｐＨは、刺激試薬と細胞の間の結合および／または会合を低減する場合がある。したがって、一部の実施形態では、刺激試薬は、例えば、同様にインキュベーション、細胞培養システムおよび／または溶液から細胞を除去することなく、細胞とは別に、インキュベーション、細胞培養システムおよび／または溶液から除去される場合がある。
刺激試薬（例えば、粒子、例えば、ビーズ粒子または磁化できる粒子であるか、またはそれを含有する刺激試薬）を細胞から除去する方法は公知である。一部の実施形態では、競合抗体の使用、例えば、刺激試薬の一次抗体に結合し、細胞上のその抗原に対する親和性を変更し、それによって、穏やかな脱離を可能にする非標識抗体等を使用できる。一部の場合には、脱離後、競合抗体は粒子（例えば、ビーズ粒子）と会合したままである場合があり、未反応抗体は、洗浄除去されるか、または洗浄除される場合があり、細胞は、抗体を単離、選択、濃縮および／または活性化することがない。このような試薬の例示的なものとして、ＤＥＴＡＣａＢＥＡＤ（Friedl et al. 1995; Entschladen et al. 1997）がある。一部の実施形態では、粒子（例えば、ビーズ粒子）は、切断可能なリンカー（例えば、ＤＮＡリンカー）の存在下で除去される場合があり、それによって、粒子が結合した抗体が、リンカー（例えば、ＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ、Ｄｙｎａｌ）にコンジュゲートされる。一部の場合には、リンカー領域は、例えば、ＤＮアーゼまたは他の放出緩衝液の添加によって、単離後に細胞から粒子（例えば、ビーズ粒子）を除去するための切断可能な部位を提供する。一部の実施形態では、細胞からの粒子（例えば、ビーズ粒子）の放出のために他の酵素法も使用できる。一部の実施形態では、粒子（例えば、ビーズ粒子または磁化できる粒子）は、生分解性である。
一部の実施形態では、刺激試薬は、磁性、常磁性および／または超常磁性であり、および／または磁性、常磁性および／または超常磁性であるビーズを含有し、刺激試薬は、細胞を場に曝露することによって細胞から除去され得る。磁場を発生させるための磁石を含有する適した装置の例として、ＤｙｎａＭａｇ ＣＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ）およびＥａｓｙＳｅｐ Ｍａｇｎｅｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。
特定の実施形態では、刺激試薬は、提供された方法の完了の前に、例えば、本明細書において提供される方法によって生成された操作された細胞の回収、収集および／または製剤化の前に細胞から除去または分離される。一部の実施形態では、刺激試薬は、細胞を操作する、例えば、形質導入するまたはトランスフェクトする前に、細胞から除去および／または分離される。特定の実施形態では、刺激試薬は、細胞を操作する工程の後に細胞から除去および／または分離される。ある特定の実施形態では、刺激試薬は、細胞の培養の前に、例えば、増殖および／または拡大増殖を促進する条件下で、操作された、例えば、トランスフェクトされた、または形質導入された細胞を培養する前に除去される。
ある特定の実施形態では、刺激試薬は、一定時間量の後に細胞から分離および／または除去される。特定の実施形態では、時間量は、刺激条件下でのインキュベーションの始動および／または開始からの時間量である。特定の実施形態では、インキュベーションの始動は、細胞が刺激試薬および／または刺激試薬を含有する培地もしくは溶液と接触する時間またはほぼその時間と考えられる。特定の実施形態では、刺激試薬は、インキュベーションの始動または開始後１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日もしくは２日以内または約１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日もしくは２日以内に細胞から除去または分離される。特定の実施形態では、刺激試薬は、インキュベーションの始動または開始後、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日もしくは２日で、または約９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日もしくは２日で細胞から除去および／または分離される。ある特定の実施形態では、刺激試薬は、インキュベーションの始動または開始後、１６８時間、１６２時間、１５６時間、１４４時間、１３８時間、１３２時間、１２０時間、１１４時間、１０８時間、１０２時間もしくは９６時間で、または約１６８時間、１６２時間、１５６時間、１４４時間、１３８時間、１３２時間、１２０時間、１１４時間、１０８時間、１０２時間もしくは９６時間で細胞から除去および／または分離される。特定の実施形態では、刺激試薬は、インキュベーションの始動および／または開始後５日で、または約５日で細胞から除去および／または分離される。一部の実施形態では、刺激試薬は、インキュベーションの始動および／または開始後４日で、または約４日で細胞から除去および／または分離される。
Ｃ．細胞を操作すること
一部の実施形態では、提供される方法は、疾患または状態を有する対象に、組換え抗原受容体を発現する細胞を投与することを含む。遺伝子操作された構成要素、例えば、組換え受容体、例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを導入するための種々の方法は、周知であり、提供される方法および組成物と共に使用できる。例示的方法として、ウイルス、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスによる形質導入、トランスポゾンおよびエレクトロポレーションを介するものを含む、受容体をコードする核酸の移行のためのものが挙げられる。
受容体を発現し、提供される方法によって投与される細胞の中に、操作された細胞がある。遺伝子操作することは、一般に、レトロウイするによる形質導入、トランスフェクションまたは形質転換等によって、組換え構成成分または操作された構成成分をコードする核酸を、細胞を含有する組成物中に導入することを含む。
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、濃縮されたＴ細胞の１つまたは複数の組成物を操作することと関連して使用される。ある特定の実施形態では、操作することは、組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えば、組換えポリヌクレオチドの導入であるか、またはそれを含む。特定の実施形態では、組換えタンパク質は、組換え受容体、例えば、節ＩＩに記載されるいずれかである。細胞における組換え受容体等の組換えタンパク質をコードする核酸分子の導入は、いくつかの公知のベクターのいずれかを使用して実施され得る。このようなベクターには、レンチウイルス性およびガンマレトロウイルス性のシステムならびにＰｉｇｇｙＢａｃ等のトランスポゾンベースのシステムまたはスリーピングビューティーベースの遺伝子移入システムを含むウイルス性および非ウイルス性のシステムが含まれる。例示的な方法として、ウイルス性、例えば、レトロウイルス性またはレンチウイルス性、形質導入、トランスポゾンおよびエレクトロポレーションを介するものを含む、受容体をコードする核酸の移入のための方法が挙げられる。一部の実施形態では、操作することによって、濃縮されたＴ細胞の１つまたは複数の操作された組成物が生成される。
ある特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の１つまたは複数の組成物は、節ＩＩ－Ｄに提供される方法等によって増殖および／または拡大増殖を促進する条件下で細胞を培養する前に、操作される、例えば、形質導入される、またはトランスフェクトされる。特定の実施形態では、１つまたは複数の組成物が、節ＩＩ－Ｂに提供された方法に記載されるもの等の刺激条件下で刺激され、活性化され、および／またはインキュベートされた後に、濃縮されたＴ細胞の１つまたは複数の組成物は、操作される。特定の実施形態では、１つまたは複数の組成物は刺激された組成物である。特定の実施形態では、１つまたは複数の刺激された組成物は、操作することの前に、事前にクライオ凍結されており、保存され、解凍される。
ある特定の実施形態では、刺激されたＴ細胞の１つまたは複数の組成物は、濃縮されたＴ細胞の２つの別個の刺激された組成物であるか、またはそれを含む。特定の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の２つの別個の組成物、例えば、同一の生物学的試料から選択、単離および／または濃縮された濃縮されたＴ細胞の２つの別個の組成物が別個に操作される。ある特定の実施形態では、２つの別個の組成物は、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞の組成物を含む。特定の実施形態では、２つの別個の組成物は、濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物を含む。一部の実施形態では、上記のような刺激条件下でのインキュベーション後等の濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞および濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の２つの別個の組成物が、遺伝子操作される。一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞の単一組成物が遺伝子操作される。ある特定の実施形態では、単一組成物は、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞の組成物である。一部の実施形態では、単一組成物は、操作することの前に別個の組成物から組み合わされている、濃縮されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物である。
一部の実施形態では、操作される、例えば、形質導入される、またはトランスフェクトされる刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞等の濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞の組成物は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％または１００％で、または約１００％でＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。ある特定の実施形態では、操作される刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞等の濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞の組成物は、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満または０．０１％未満のＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含有せず、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含まない、もしくは実質的に含まない。
一部の実施形態では、操作される、例えば、形質導入される、またはトランスフェクトされる刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞等の濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％または１００％で、または約１００％でＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。ある特定の実施形態では、操作される刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞等の濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の組成物は、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満または０．０１％未満のＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞を含有せず、および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞を含まない、もしくは実質的に含まない。
一部の実施形態では、濃縮されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の別個の組成物は、単一組成物に組み合わされ、遺伝子操作される、例えば、形質導入される、またはトランスフェクトされる。ある特定の実施形態では、濃縮されたＣＤ４＋および濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の別個の操作された組成物は、遺伝子操作が実施され、および／または完了した後に、単一組成物に組み合わされる。特定の実施形態では、濃縮されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の別個の組成物、例えば、刺激されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の別個の組成物は、遺伝子操作が実施され、および／または完了した後に、Ｔ細胞の培養および／または拡大増殖のために別個に操作され、別個に処理される。
一部の実施形態では、組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えば、組換えポリヌクレオチドの導入は、濃縮されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば、刺激されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、ポリヌクレオチドを含有するウイルス粒子と接触させることによって実施される。一部の実施形態では、接触は、スピノキュレーション（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）（例えば、遠心による接種）などの遠心分離を用いて達成され得る。一部の実施形態では、細胞、ウイルス粒子および試薬を含有する組成物が、一般に、比較的低い力または速度、例えば、細胞をペレット化するために使用されるものよりも低い速度、例えば、６００ｒｐｍ～１７００ｒｐｍまたは約６００ｒｐｍ～約１７００ｒｐｍで（例えば、６００ｒｐｍ、１０００ｒｐｍもしくは１５００ｒｐｍもしくは１７００ｒｐｍまたは約６００ｒｐｍ、１０００ｒｐｍもしくは１５００ｒｐｍもしくは１７００ｒｐｍまたは少なくとも６００ｒｐｍ、１０００ｒｐｍもしくは１５００ｒｐｍもしくは１７００ｒｐｍで）回転され得る。一部の実施形態では、回転は、ある力で、例えば、チャンバーまたは空洞の内壁または外壁で測定されるような、例えば、１００ｇ～３２００ｇの、または約１００ｇ～約３２００ｇの（例えば、１００ｇ、２００ｇ、３００ｇ、４００ｇ、５００ｇ、１０００ｇ、１５００ｇ、２０００ｇ、２５００ｇ、３０００ｇもしくは３２００ｇの、または約１００ｇ、２００ｇ、３００ｇ、４００ｇ、５００ｇ、１０００ｇ、１５００ｇ、２０００ｇ、２５００ｇ、３０００ｇもしくは３２００ｇの、または少なくとももしくは約１００ｇ、２００ｇ、３００ｇ、４００ｇ、５００ｇ、１０００ｇ、１５００ｇ、２０００ｇ、２５００ｇ、３０００ｇもしくは３２００ｇの）、例えば、６９３ｇまたは約６９３ｇの相対遠心力で実施される。用語「相対遠心力」またはＲＣＦは、一般に、回転の軸と比較されるような空間中の特定の点での、地球の重力に対する、物体または物質（回転している、細胞、試料またはペレットおよび／またはチャンバーもしくは他の容器中のある点など）に与えられる有効力であると理解される。値は、重力、回転速度および回転の半径（回転の軸と、ＲＣＦが測定されている物体、物質または粒子からの距離）を考慮して周知の式を使用して決定され得る。一部の実施形態では、細胞、例えば、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞または濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激された組成物からの細胞の、ウイルスを用いる、接触、インキュベーションおよび／または操作の少なくとも一部分は、約１００ｇから３２００ｇ、１０００ｇから２０００ｇ、１０００ｇから３２００ｇ、５００ｇから１０００ｇ、４００ｇから１２００ｇ、６００ｇから８００ｇ、６００から７００ｇまたは５００ｇから７００ｇの間の回転を伴って実施される。一部の実施形態では、回転は、６００ｇから７００ｇの間、例えば、６９３ｇまたは約６９３ｇである。
ある特定の実施形態では、操作、形質導入、および／またはトランスフェクションの少なくとも一部分は、回転、例えば、スピノキュレーションおよび／または遠心分離を伴って実施される。一部の実施形態では、回転は、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、９０分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、２日、３日、４日、５日、６日の間、約５分、１０分、１５分、３０分、６０分、９０分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、２日、３日、４日、５日、６日の間、または少なくとももしくは約５分、１０分、１５分、３０分、６０分、９０分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、２日、３日、４日、５日、６日の間、または少なくとも７日間実施される。一部の実施形態では、回転は、６０分間または約６０分間実施される。ある特定の実施形態では、回転は、約３０分間実施される。一部の実施形態では、回転は、６００ｇから７００ｇの間、例えば、６９３ｇまたは約６９３ｇで約３０分間、実施される。
ある特定の実施形態では、操作され、形質導入され、および／またはトランスフェクトされようとする生細胞数は、約５×１０６個細胞～約１００×１０７個細胞、例えば、約１０×１０６個細胞～約１００×１０６個細胞、約１００×１０６個細胞～約２００×１０６個細胞、約２００×１０６個細胞～約３００×１０６個細胞、約３００×１０６個細胞～約４００×１０６個細胞、約４００×１０６個細胞～約５００×１０６個細胞または約５００×１０６個細胞～約１００×１０７個細胞の範囲である。特定の例では、操作され、形質導入され、および／またはトランスフェクトされようとする生細胞数は、約３００×１０６個細胞または約３００×１０６個細胞未満である。
ある特定の実施形態では、操作、形質導入および／またはトランスフェクションの少なくとも一部分は、約５ｍＬ～約１００ｍＬ、例えば、約１０ｍＬ～約５０ｍＬ、約１５ｍＬ～約４５ｍＬ、約２０ｍＬ～約４０ｍＬ、約２５ｍＬ～約３５ｍＬまたは３０ｍＬの、または約３０ｍＬの体積（例えば、スピノキュレーション体積）で行われる。ある特定の実施形態では、スピノキュレーション後の細胞ペレット体積は、約１ｍＬ～約２５ｍＬ、例えば、約５ｍＬ～約２０ｍＬ、約５ｍＬ～約１５ｍＬ、約５ｍＬ～約１０ｍＬまたは１０ｍの、または約１０ｍＬの範囲である。
一部の実施形態では、遺伝子導入は、まず細胞を刺激することによって、例えば、細胞を、例えば、サイトカインまたは活性化マーカーの発現によって測定されるような、増殖、生存および／または活性化などの応答を誘導する刺激と組み合わせることと、続いて、活性化された細胞の形質導入および臨床適用に十分な数までの培養での拡大増殖によって達成される。ある特定の実施形態では、遺伝子導入は、節Ｉ－Ｂに記載される方法のいずれか等によって、まず刺激条件下で細胞をインキュベートすることによって達成される。
一部の実施形態では、遺伝子操作の方法は、組成物の１つまたは複数の細胞を組換えタンパク質、例えば、組換え受容体をコードする核酸分子と接触させることによって実施される。一部の実施形態では、接触は、スピノキュレーション（例えば、遠心接種）などの遠心分離により成し遂げられ得る。このような方法は、国際公開公報番号ＷＯ２０１６／０７３６０２に記載されるようなもののいずれかを含む。例示的な遠心分離チャンバーは、Ｂｉｏｓａｆｅ ＳＡによって生成され、販売されるもの、例えば、Ｓｅｐａｘ（登録商標）およびＳｅｐａｘ（登録商標）２システムと共に使用するためのもの、例えば、Ａ－２００／ＦおよびＡ－２００遠心分離チャンバーおよびこのようなシステムと共に使用するための種々のキットを含む。例示的なチャンバー、システムおよび処理機器およびキャビネットが、例えば、米国特許第６，１２３，６５５号、米国特許第６，７３３，４３３号および公開された米国特許出願公開番号ＵＳ２００８／０１７１９５１および公開された国際特許出願公開番号ＷＯ００／３８７６２に記載されており、それらの各々の開示内容は、その全文で参照により本明細書に組み込まれる。このようなシステムと共に使用するための例示的キットとして、製品名ＣＳ－４３０．１、ＣＳ－４９０．１、ＣＳ－６００．１またはＣＳ－９００．２の下でＢｉｏＳａｆｅ ＳＡによって販売される単回使用キットが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、システムは、システムにおいて行われる形質導入工程および１つまたは複数の様々な他の処理工程、例えば、本明細書または国際公開第ＷＯ２０１６／０７３６０２号に記載の遠心チャンバーシステムを用いてまたはこれと接続して実施され得る１つまたは複数の処理工程の態様を作動、自動化、制御および／またはモニタリングする器具類を含む、他の器具類と共に含まれ、および／または他の器具類と関連し設置される。この器具類は一部の実施形態では、キャビネット内に含有される。一部の実施形態では、器具類はキャビネットを含み、キャビネットは、制御回路を含有する筐体、遠心分離機、カバー、モーター、ポンプ、センサー、ディスプレイ、およびユーザーインタフェースを含む。例示的なデバイスは、米国特許第６，１２３，６５５号、米国特許第６，７３３，４３３号およびＵＳ ２００８／０１７１９５１に記載されている。
一部の実施形態では、システムは、一連の容器、例えば、バッグ、チューブ、活栓、クランプ、コネクタ、および遠心チャンバーを含む。一部の実施形態では、容器、例えばバッグには、同じ容器または別々の容器、例えば同じバッグまたは別々のバッグ中に形質導入される細胞およびウイルスベクター粒子を含有する１つまたは複数の容器、例えばバッグが挙げられる。一部の実施形態では、システムは、該方法の間に成分および／または組成物を希釈、再懸濁、および／または洗浄するためにチャンバーおよび／または他のコンポーネントに入れられる媒体、例えば希釈液および／もしくは洗浄液を含有する１つまたは複数の容器、例えばバッグをさらに含む。容器は、システムの１つまたは複数の位置、例えば、投入ライン、希釈液ライン、洗浄ライン、廃液ラインおよび／またはアウトプットラインに対応する位置で接続することができる。
一部の実施形態では、チャンバーは、チャンバーを回転させることができる遠心分離機と、その回転軸の周辺などで結合される。回転は、細胞の形質導入に関連するインキュベーションの前、最中、および／もしくは後で、ならびに／または１つもしくは複数の他の処理工程中に起こってもよい。故に、一部の実施形態では、１つまたは複数の様々な処理工程は、回転下で、例えば、特定の力で実施される。遠心分離中、チャンバーが垂直に位置し、側壁および軸が垂直または概ね垂直であり、端壁が水平または概ね水平であるように、チャンバーは典型的には垂直回転または概ね垂直回転することができる。
一部の実施形態では、細胞を含有する組成物およびウイルスベクター粒子を含有する組成物、および適宜空気は、キャビティーに組成物を提供する前に組み合わされてもよく、または混合されてもよい。一部の実施形態では、細胞を含有する組成物およびウイルスベクター粒子を含有する組成物、および適宜空気は別々に提供され、キャビティー中で組み合わされ、混合される。一部の実施形態では、細胞を含有する組成物、ウイルスベクター粒子を含有する組成物、および適宜空気は、任意の順番で内部キャビティーに提供することができる。そのような一部の実施形態のいずれかでは、細胞およびウイルスベクター粒子を含有する組成物は、そのようなものが遠心チャンバーの内側もしくは外側で組み合わされるかもしくは混合されるかどうか、ならびに／または細胞およびウイルスベクター粒子が一緒にもしくは別々に、例えば同時にまたは連続的に遠心チャンバーに提供されるかどうかにかかわらず、いったん一緒に組み合わされるかまたは混合されれば、インプット組成物である。
一部の実施形態では、空気などの気体の体積の取り込みは、形質導入方法では回転などの細胞およびウイルスベクター粒子のインキュベートの前に生じる。一部の実施形態では、空気などの気体の体積の取り込みは、形質導入方法では細胞およびウイルスベクター粒子のインキュベーション、例えば回転中に生じる。
一部の実施形態では、形質導入組成物を構成する細胞またはウイルスベクター粒子の液体体積、および適宜空気の体積は、所定の体積であってもよい。体積は、システムに関連する回路にプログラムされたおよび／または該回路によって制御される体積であってもよい。
一部の実施形態では、形質導入組成物および適宜気体、例えば空気の取り込みは、所望のまたは所定の体積がチャンバーの内部キャビティーに取り込まれるまで手動、半自動および／または自動で制御される。一部の実施形態では、システムに関連するセンサーは、遠心チャンバーに出入りする液体および／または気体を、その色、流量および／または密度などを介して検出することができ、関連する回路と通信して、そのような所望のまたは所定の体積の取り込みが達成されるまで、適宜取り込みを停止または継続させることができる。一部の態様では、取り込みを止めることなくシステムに気体、例えば空気を通過させることができるように、気体（例えば、空気）ではなくシステム中の液体のみを検出するようにプログラムされるかまたは検出することができるセンサーが製造され得る。一部のそのような実施形態では、気体、例えば空気の取り込みが望まれる間、非透明のチューブがセンサー付近のラインに設置されてもよい。一部の実施形態では、気体、例えば空気の取り込みは、手動で制御されてもよい。
提供される方法の態様では、遠心チャンバーの内部キャビティーは高速回転に供される。一部の実施形態では、回転は、液体インプット組成物および適宜空気の取り込みの前に、同時に、その後に、または断続的に行われる。一部の実施形態では、回転は、液体インプット組成物および適宜空気の取り込みの後に行われる。一部の実施形態では、回転は、内部キャビティーの側壁の内面および／または細胞の表層における８００ｇ、１０００ｇ、１１００ｇ、１５００、１６００ｇ、１８００ｇ、２０００ｇ、２２００ｇ、２５００ｇ、３０００ｇ、３５００ｇもしくは４０００ｇ、または約８００ｇ、約１０００ｇ、約１１００ｇ、約１５００、約１６００ｇ、約１８００ｇ、約２０００ｇ、約２２００ｇ、約２５００ｇ、約３０００ｇ、約３５００ｇもしくは約４０００ｇ、または少なくとも８００ｇ、少なくとも１０００ｇ、少なくとも１１００ｇ、少なくとも１５００、少なくとも１６００ｇ、少なくとも１８００ｇ、少なくとも２０００ｇ、少なくとも２２００ｇ、少なくとも２５００ｇ、少なくとも３０００ｇ、少なくとも３５００ｇもしくは少なくとも４０００ｇ、または少なくとも約８００ｇ、少なくとも約１０００ｇ、少なくとも約１１００ｇ、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ｇ、少なくとも約１８００ｇ、少なくとも約２０００ｇ、少なくとも約２２００ｇ、少なくとも約２５００ｇ、少なくとも約３０００ｇ、少なくとも約３５００ｇもしくは少なくとも約４０００ｇの相対遠心力での遠心チャンバーの遠心分離による。一部の実施形態では、回転は、１１００ｇ超または約１１００ｇ超、例えば１２００ｇ超もしくは約１２００ｇ超、１４００ｇ超もしくは約１４００ｇ超、１６００ｇ超もしくは約１６００ｇ超、１８００ｇ超もしくは約１８００ｇ超、２０００ｇ超もしくは約２０００ｇ超、２４００ｇ超もしくは約２４００ｇ超、２８００ｇ超もしくは約２８００ｇ超、３０００ｇ超もしくは約３０００ｇ超、または３２００ｇ超もしくは約３２００ｇ超の力での遠心分離による。一部の実施形態では、回転は、１６００ｇであるかまたは約１６００ｇである力での遠心分離による。
一部の実施形態では、形質導入の方法は、形質導入組成物および適宜空気の５分超もしくは約５分超、例えば１０分超もしくは約１０分超、１５分超もしくは約１５分超、２０分超もしくは約２０分超、３０分超もしくは約３０分超、４５分超もしくは約４５分超、６０分超もしくは約６０分超、９０分超もしくは約９０分超、または１２０分超もしくは約１２０分超にわたる遠心チャンバーにおける回転または遠心分離を含む。一部の実施形態では、形質導入組成物および適宜空気は、５分を超えるが６０分以下、４５分以下、３０分以下、または１５分間以下にわたって遠心チャンバー中で回転または遠心分離される。特定の実施形態では、形質導入は、６０分または約６０分にわたる回転または遠心分離を含む。
一部の実施形態では、形質導入の方法は、形質導入組成物および適宜空気の１０分以上６０分以下もしくは約１０分以上約６０分以下、１５分以上６０分以下もしくは約１５分以上約６０分以下、１５分以上４５分以下もしくは約１５分以上約４５分以下、３０分以上６０分以下もしくは約３０分以上約６０分以下、または４５分以上６０分以下もしくは約４５分以上約６０分以下にわたる、ならびに内部キャビティーの側壁の内面および／または細胞の表層における少なくとも１０００ｇ、少なくとも１１００ｇ、少なくとも１２００ｇ、少なくとも１４００ｇ、少なくとも１５００ｇ、少なくとも１６００ｇ、少なくとも１８００ｇ、少なくとも２０００ｇ、少なくとも２２００ｇ、少なくとも２４００ｇ、少なくとも２８００ｇ、少なくとも３２００ｇもしくは少なくとも３６００ｇ、または１０００ｇ超、１１００ｇ超、１２００ｇ超、１４００ｇ超、１５００ｇ超、１６００ｇ超、１８００ｇ超、２０００ｇ超、２２００ｇ超、２４００ｇ超、２８００ｇ超、３２００ｇ超もしくは３６００ｇ超、または約１０００ｇ、約１１００ｇ、約１２００ｇ、約１４００ｇ、約１５００ｇ、約１６００ｇ、約１８００ｇ、約２０００ｇ、約２２００ｇ、約２４００ｇ、約２８００ｇ、約３２００ｇもしくは約３６００ｇの力での遠心チャンバーにおける回転または遠心分離を含む。特定の実施形態では、形質導入の方法は、形質導入組成物、例えば細胞およびウイルスベクター粒子の、６０分または約６０分にわたる１６００ｇまたは約１６００ｇでの回転または遠心分離を含む。
一部の実施形態では、チャンバーのキャビティー中の気体、例えば空気は、チャンバーから排出される。一部の実施形態では、気体、例えば空気は、閉鎖系の一部として遠心チャンバーと作動可能に連結された容器に排出される。一部の実施形態では、容器は非含有または空の容器である。一部の実施形態では、チャンバーのキャビティー中の空気、例えば気体は、滅菌チューブラインを介して内部チャンバーのキャビティーに作動可能に接続されたフィルターを通じて排出される。一部の実施形態では、空気は、手動、半自動または自動プロセスを使用して排出される。一部の実施形態では、空気は、形質導入が開始された細胞またはウイルスベクターで形質導入された細胞などのインキュベートされた細胞およびウイルスベクター粒子を含有するアウトプット組成物を、チャンバーのキャビティーから圧搾する前に、同時に、断続的にまたはその後にチャンバーから排出される。
一部の実施形態では、形質導入および／または他のインキュベーションは、連続的もしくは半連続的プロセスとして、またはその一部として行われる。一部の実施形態では、連続的プロセスは、インキュベーションの少なくとも一部の間、例えば遠心分離の間の、細胞およびウイルスベクター粒子（例えば、形質導入組成物）の連続的取り込み（単一の既存の組成物として、またはその一部を同じ容器、例えばキャビティーに連続的に入れ、それによって混合することによる）、ならびに／または容器からの液体の連続的圧搾もしくは排出、および適宜気体（例えば、空気）の排出を含む。一部の実施形態では、連続的取り込みおよび連続的圧搾は、少なくとも一部は同時に実施される。一部の実施形態では、連続的取り込みは、インキュベーションの一部の間、例えば遠心分離の一部の間に起こり、連続的圧搾はインキュベーションの別の部分の間に生じる。２つは交互であってもよい。故に、連続的取り込みおよび圧搾により、インキュベーションを実施しながら、試料のより大きな全体積の試料を処理する、例えば形質導入することが可能になる。
一部の実施形態では、インキュベーションは連続的プロセスの一部であり、方法は、インキュベーションの少なくとも一部の間、チャンバーの回転中に前記形質導入組成物のキャビティーへの連続的取り込みを行うこと、ならびにインキュベーションの一部の間、チャンバーの回転中に少なくとも１つの開口部を通じてキャビティーから液体の連続的圧搾および、適宜気体（例えば、空気）の排出を行うことを含む。
一部の実施形態では、半連続的インキュベーションは、キャビティーへの組成物の取り込み、インキュベーション、アウトプット容器などへのキャビティーからの液体の圧搾および適宜キャビティーからの気体（例えば、空気）の排出、次いでより多くの細胞および処理のための他の試薬、例えば、ウイルスベクター粒子を含有する後続の（例えば、第２、第３の等）組成物の取り込み、ならびにプロセスの反復を行う間に交互に繰り返すことによって実施される。例えば、一部の実施形態では、インキュベーションは半連続的プロセスの一部であり、方法は、インキュベーションの前に、前記少なくとも１つの開口部を通じてキャビティーへの形質導入組成物の取り込みを行うこと、ならびにインキュベーションに続いて、キャビティーから流体の圧搾を行うこと；細胞およびウイルスベクター粒子を含む別の形質導入組成物の前記内部キャビティーへの取り込みを行うこと；および前記別の形質導入組成物中の前記細胞が前記ベクターで形質導入される条件下で、別の形質導入組成物を前記内部キャビティーでインキュベートすることを含む。プロセスは、いくつかの追加の回については反復的に継続されてもよい。この点で、半連続的または連続的方法は、さらに大きな体積および／または数の細胞の作製を可能にすることができる。
一部の実施形態では、形質導入インキュベーションの一部は遠心チャンバーで行われ、回転または遠心分離を含む条件下で行われる。
一部の実施形態では、方法は、細胞およびウイルスベクター粒子のインキュベーションのさらなる一部が回転または遠心分離なしで実施されるインキュベーションを含み、一般に、チャンバーの回転または遠心分離を含むインキュベーションの少なくとも一部に続いて実施される。ある特定の実施形態では、細胞およびウイルスベクター粒子のインキュベーションは、回転または遠心分離なしで、少なくとも１時間、６時間、１２時間、２４時間、３２時間、４８時間、６０時間、７２時間、９０時間、９６時間、３日間、４日間、５日間、または５日間超にわたって実施される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、７２時間または約７２時間にわたって実施される。
一部のそのような実施形態では、さらなるインキュベーションは、１つまたは複数の細胞の宿主ゲノムへのウイルスベクターの組込みをもたらす条件下で行われる。インキュベーションが宿主ゲノムへのウイルスベクター粒子の組込みをもたらしたかどうかを評価または決定し、それ故にさらなるインキュベーションのための条件を経験的に決定することは、当業者のレベルの範囲内である。一部の実施形態では、宿主ゲノムへのウイルスベクターの組込みは、インキュベーション後にウイルスベクター粒子のゲノムに含有される核酸によってコードされる異種タンパク質などの組換えタンパク質の発現レベルを測定することによって評価することができる。組換え分子の発現レベルを評価するためのいくつかの周知の方法、例えば、親和性ベースの方法、例えば細胞表面タンパク質の関連では、フローサイトメトリーなどによる例えば免疫親和性ベースの方法による検出が使用されてもよい。一部の例では、発現は、形質導入マーカーおよび／またはレポーターコンストラクトの検出によって測定される。一部の実施形態では、切断された表面タンパク質をコードする核酸がベクター内に含められ、発現および／またはその増強のマーカーとして使用される。
一部の実施形態では、細胞、ベクター、例えばウイルス粒子を含有する組成物、および試薬は一般に、比較的低い力または速度、例えば、細胞をペレット化するのに使用される速度より低い速度、例えば６００ｒｐｍ～１７００ｒｐｍまたは約６００ｒｐｍ～約１７００ｒｐｍ（例えば、６００ｒｐｍ、１０００ｒｐｍ、もしくは１５００ｒｐｍもしくは１７００ｒｐｍ、または約６００ｒｐｍ、約１０００ｒｐｍ、もしくは約１５００ｒｐｍもしくは約１７００ｒｐｍ、または少なくとも６００ｒｐｍ、少なくとも１０００ｒｐｍ、もしくは少なくとも１５００ｒｐｍもしくは少なくとも１７００ｒｐｍ）で回転され得る。一部の実施形態では、回転は、例えばチャンバーまたはキャビティーの内壁または外壁で測定した場合、１００ｇ～３２００ｇまたは約１００ｇ～約３２００ｇ（例えば、１００ｇ、２００ｇ、３００ｇ、４００ｇ、５００ｇ、１０００ｇ、１５００ｇ、２０００ｇ、２５００ｇ、３０００ｇもしくは３２００ｇ、または約１００ｇ、約２００ｇ、約３００ｇ、約４００ｇ、約５００ｇ、約１０００ｇ、約１５００ｇ、約２０００ｇ、約２５００ｇ、約３０００ｇもしくは約３２００ｇ、または少なくとも１００ｇ、少なくとも２００ｇ、少なくとも３００ｇ、少なくとも４００ｇ、少なくとも５００ｇ、少なくとも１０００ｇ、少なくとも１５００ｇ、少なくとも２０００ｇ、少なくとも２５００ｇ、少なくとも３０００ｇもしくは少なくとも３２００ｇ、または少なくとも約１００ｇ、少なくとも約２００ｇ、少なくとも約３００ｇ、少なくとも約４００ｇ、少なくとも約５００ｇ、少なくとも約１０００ｇ、少なくとも約１５００ｇ、少なくとも約２０００ｇ、少なくとも約２５００ｇ、少なくとも約３０００ｇもしくは少なくとも約３２００ｇ）の力、例えば、相対遠心力で行われる。用語「相対遠心力」またはＲＣＦは、回転軸と比較した空間中の特定の点における、地球の重力と比べた物体または物質（細胞、試料、もしくはペレットおよび／または回転されるチャンバーまたは他の容器中の点など）に与えられる有効な力と一般に理解される。値は、重力、回転速度および回転半径（回転軸、およびＲＣＦが測定される物体、物質、または粒子からの距離）を考慮して、周知の式を使用して決定することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作、例えば形質導入の少なくとも一部の間に、および／または遺伝子操作の後で、細胞は、上記のように、遺伝子操作された細胞の培養、例えば細胞の培養または拡大などのためにバイオリアクターバッグアセンブリーに移される。
ある特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、形質導入アジュバントの存在下で操作され、例えば形質導入またはトランスフェクトされる。一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、１つまたは複数のポリカチオンの存在下で操作される。一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、１つまたは複数の形質導入アジュバントの存在下で形質導入され、例えば、ウイルスベクター粒子とインキュベートされる。特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、１つまたは複数の形質導入アジュバントの存在下でトランスフェクトされ、例えば、非ウイルスベクターとインキュベートされる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の形質導入アジュバントの存在は、操作（例えば、形質導入またはトランスフェクト）される組成物の細胞の量、部分、および／またはパーセンテージを増加させることなどによって遺伝子デリバリーの効率を高める。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の形質導入アジュバントの存在は、トランスフェクションの効率を高める。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の形質導入アジュバントの存在は、形質導入の効率を高める。特定の実施形態では、ポリカチオンの存在下で操作される細胞の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が、組換えポリヌクレオチドを含有または発現する。一部の実施形態では、形質導入アジュバントの存在なしで細胞を操作する代替のおよび／または例示的な方法と比較して、ポリカチオンの存在下で組換え形質導入アジュバントを含有または発現するように、組成物の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍多い細胞が操作される。
一部の実施形態では、濃縮細胞の組成物は、１００μｇ／ｍｌ未満、９０μｇ／ｍｌ未満、８０μｇ／ｍｌ未満、７５μｇ／ｍｌ未満、７０μｇ／ｍｌ未満、６０μｇ／ｍｌ未満、５０μｇ／ｍｌ未満、４０μｇ／ｍｌ未満、３０μｇ／ｍｌ未満、２５μｇ／ｍｌ未満、２０μｇ／ｍｌ未満、またはμｇ／ｍｌ未満、１０μｇ／ｍｌの形質導入アジュバントの存在下で操作される。ある特定の実施形態では、提供される方法との使用に適した形質導入アジュバントには、ポリカチオン、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン由来断片もしくは変異体、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、細胞は、サイトカイン、例えば、組換えヒトサイトカインの存在下で、１ＩＵ／ｍｌ～１，０００ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌ～５０ＩＵ／ｍｌ、５０ＩＵ／ｍｌ～１００ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ～２００ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ～５００ＩＵ／ｍｌ、２５０ＩＵ／ｍｌ～５００ＩＵ／ｍｌ、または５００ＩＵ／ｍｌ～１，０００ＩＵ／ｍｌの濃度で操作される。
一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、ＩＬ－２、例えば、ヒト組換えＩＬ－２の存在下で、１ＩＵ／ｍｌ～２００ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌ～１００ＩＵ／ｍｌ、５０ＩＵ／ｍｌ～１５０ＩＵ／ｍｌ、８０ＩＵ／ｍｌ～１２０ＩＵ／ｍｌ、６０ＩＵ／ｍｌ～９０ＩＵ／ｍｌ、または７０ＩＵ／ｍｌ～９０ＩＵ／ｍｌの濃度で操作される。特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、組換えＩＬ－２の存在下で、５０ＩＵ／ｍｌ、５５ＩＵ／ｍｌ、６０ＩＵ／ｍｌ、６５ＩＵ／ｍｌ、７０ＩＵ／ｍｌ、７５ＩＵ／ｍｌ、８０ＩＵ／ｍｌ、８５ＩＵ／ｍｌ、９０ＩＵ／ｍｌ、９５ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ、１１０ＩＵ／ｍｌ、１２０ＩＵ／ｍｌ、１３０ＩＵ／ｍｌ、１４０ＩＵ／ｍｌ、もしくは１５０ＩＵ／ｍｌ、または約５０ＩＵ／ｍｌ、約５５ＩＵ／ｍｌ、約６０ＩＵ／ｍｌ、約６５ＩＵ／ｍｌ、約７０ＩＵ／ｍｌ、約７５ＩＵ／ｍｌ、約８０ＩＵ／ｍｌ、約８５ＩＵ／ｍｌ、約９０ＩＵ／ｍｌ、約９５ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ、約１１０ＩＵ／ｍｌ、約１２０ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ、約１４０ＩＵ／ｍｌ、もしくは約１５０ＩＵ／ｍｌの濃度で操作される。一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、８５ＩＵ／ｍｌまたは約８５ＩＵ／ｍｌの存在下で操作される。一部の実施形態では、Ｔ細胞の集団は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の集団である。特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞が濃縮され、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は濃縮されない、および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞は負に選択されるかもしくは組成物から枯渇される。特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞の組成物である。特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞が濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞は濃縮されない、および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞は負に選択されるかもしくは組成物から枯渇される。
一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、組換えＩＬ－７、例えば、ヒト組換えＩＬ－７の存在下で、１００ＩＵ／ｍｌ～２，０００ＩＵ／ｍｌ、５００ＩＵ／ｍｌ～１，０００ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ～５００ＩＵ／ｍｌ、５００ＩＵ／ｍｌ～７５０ＩＵ／ｍｌ、７５０ＩＵ／ｍｌ～１，０００ＩＵ／ｍｌ、または５５０ＩＵ／ｍｌ～６５０ＩＵ／ｍｌの濃度で操作される。特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、ＩＬ－７の存在下で、５０ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ、１５０ＩＵ／ｍｌ、２００ＩＵ／ｍｌ、２５０ＩＵ／ｍｌ、３００ＩＵ／ｍｌ、３５０ＩＵ／ｍｌ、４００ＩＵ／ｍｌ、４５０ＩＵ／ｍｌ、５００ＩＵ／ｍｌ、５５０ＩＵ／ｍｌ、６００ＩＵ／ｍｌ、６５０ＩＵ／ｍｌ、７００ＩＵ／ｍｌ、７５０ＩＵ／ｍｌ、８００ＩＵ／ｍｌ、７５０ＩＵ／ｍｌ、７５０ＩＵ／ｍｌ、７５０ＩＵ／ｍｌ、もしくは１，０００ＩＵ／ｍｌ、または約５０ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ、約１５０ＩＵ／ｍｌ、約２００ＩＵ／ｍｌ、約２５０ＩＵ／ｍｌ、約３００ＩＵ／ｍｌ、約３５０ＩＵ／ｍｌ、約４００ＩＵ／ｍｌ、約４５０ＩＵ／ｍｌ、約５００ＩＵ／ｍｌ、約５５０ＩＵ／ｍｌ、約６００ＩＵ／ｍｌ、約６５０ＩＵ／ｍｌ、約７００ＩＵ／ｍｌ、約７５０ＩＵ／ｍｌ、約８００ＩＵ／ｍｌ、約７５０ＩＵ／ｍｌ、約７５０ＩＵ／ｍｌ、約７５０ＩＵ／ｍｌ、もしくは約１，０００ＩＵ／ｍｌの濃度で操作される。特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、６００ＩＵ／ｍｌまたは約６００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－７の存在下で操作される。一部の実施形態では、組換えＩＬ－７の存在下で操作される組成物は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の集団が濃縮される。特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞が濃縮され、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は濃縮されない、および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞は負に選択されるかもしくは組成物から枯渇される。
一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、組換えＩＬ－１５、例えば、ヒト組換えＩＬ－１５の存在下で、０．１ＩＵ／ｍｌ～１００ＩＵ／ｍｌ、１ＩＵ／ｍｌ～５０ＩＵ／ｍｌ、５ＩＵ／ｍｌ～２５ＩＵ／ｍｌ、２５ＩＵ／ｍｌ～５０ＩＵ／ｍｌ、５ＩＵ／ｍｌ～１５ＩＵ／ｍｌ、または１０ＩＵ／ｍｌ～１００ＩＵ／ｍｌの濃度で操作される。特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、ＩＬ－１５の存在下で、１ＩＵ／ｍｌ、２ＩＵ／ｍｌ、３ＩＵ／ｍｌ、４ＩＵ／ｍｌ、５ＩＵ／ｍｌ、６ＩＵ／ｍｌ、７ＩＵ／ｍｌ、８ＩＵ／ｍｌ、９ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌ、１１ＩＵ／ｍｌ、１２ＩＵ／ｍｌ、１３ＩＵ／ｍｌ、１４ＩＵ／ｍｌ、１５ＩＵ／ｍｌ、２０ＩＵ／ｍｌ、２５ＩＵ／ｍｌ、３０ＩＵ／ｍｌ、４０ＩＵ／ｍｌ、もしくは５０ＩＵ／ｍｌ、または約１ＩＵ／ｍｌ、約２ＩＵ／ｍｌ、約３ＩＵ／ｍｌ、約４ＩＵ／ｍｌ、約５ＩＵ／ｍｌ、約６ＩＵ／ｍｌ、約７ＩＵ／ｍｌ、約８ＩＵ／ｍｌ、約９ＩＵ／ｍｌ、約１０ＩＵ／ｍｌ、約１１ＩＵ／ｍｌ、約１２ＩＵ／ｍｌ、約１３ＩＵ／ｍｌ、約１４ＩＵ／ｍｌ、約１５ＩＵ／ｍｌ、約２０ＩＵ／ｍｌ、約２５ＩＵ／ｍｌ、約３０ＩＵ／ｍｌ、約４０ＩＵ／ｍｌ、もしくは約５０ＩＵ／ｍｌの濃度で操作される。一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、１０ＩＵ／ｍｌまたは約１０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－１５中で操作される。一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、１０ＩＵ／ｍｌまたは約１０ＩＵ／ｍｌの組換えＩＬ－１５中でインキュベートされる。一部の実施形態では、組換えＩＬ－１５の存在下で操作される組成物は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞の集団が濃縮される。一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞の組成物である。特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞が濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞は濃縮されない、および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞は負に選択されるかもしくは組成物から枯渇される。一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物である。特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞が濃縮され、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は濃縮されない、および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞は負に選択されるかもしくは組成物から枯渇される。
特定の実施形態では、濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞の組成物は、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５の存在下で操作される。ある特定の実施形態では、濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５の存在下で操作される。一部の実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５は組換えである。ある特定の実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５はヒトである。特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、ヒト組換えＩＬ－２、ＩＬ－７、および／もしくはＩＬ－１５であるか、またはこれらを含む。
特定の実施形態では、細胞は、１つまたは複数の抗酸化剤の存在下で操作される。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤には、トコフェロール、トコトリエノール、アルファ－トコフェロール、ベータ－トコフェロール、ガンマ－トコフェロール、デルタ－トコフェロール、アルファ－トコトリエノール、ベータ－トコトリエノール、アルファ－トコフェロールキノン、トロロックス（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、フラボノイド、イソフラボン、リコピン、ベータ－カロテン、セレン、ユビキノン、ルテイン（ｌｕｅｔｉｎ）、Ｓ－アデノシルメチオニン、グルタチオン、タウリン、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、クエン酸、Ｌ－カルニチン、ＢＨＴ、モノチオグリセロール、アスコルビン酸、没食子酸プロピル、メチオニン、システイン、ホモシステイン、グルタチオン（ｇｌｕｔｈａｔｉｏｎｅ）、シスタミンおよびシスタチオニン、ならびに／またはグリシン－グリシン－ヒスチジンが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は、硫黄含有酸化剤であるか、またはこれを含む。ある特定の実施形態では、硫黄含有抗酸化剤は、例えば環状構造内に１つまたは複数の硫黄部分を示す、チオール含有抗酸化剤および／または抗酸化剤を含んでもよい。一部の実施形態では、硫黄含有抗酸化剤には、例えば、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）および２，３－ジメルカプトプロパノール（ＤＭＰ）、Ｌ－２－オキソ－４－チアゾリジンカルボン酸（ＯＴＣ）およびリポ酸を挙げることができる。特定の実施形態では、硫黄含有抗酸化剤はグルタチオン前駆体である。一部の実施形態では、グルタチオン前駆体は、細胞内で１つまたは複数の段階で改変されてグルタチオンを得る分子である。特定の実施形態では、グルタチオン前駆体には、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、Ｌ－２－オキソチアゾリジン－４－カルボン酸（プロシステイン）、リポ酸、Ｓ－アリルシステイン、またはメチルメチオニンスルホニウムクロリドを挙げることができるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、細胞は、１つまたは複数の抗酸化剤の存在下で操作される。一部の実施形態では、細胞は、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ～２ｍｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ～５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの１つまたは複数の抗酸化剤の存在下で操作される。一部の実施形態では、細胞は、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、３００ｍｇ／ｍｌ、４００ｍｇ／ｍｌ、５００ｍｇ／ｍｌ、または約１ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌ、約３００ｍｇ／ｍｌ、約４００ｍｇ／ｍｌ、約５００ｍｇ／ｍｌの１つまたは複数の抗酸化剤の存在下で操作される。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は、硫黄含有抗酸化剤であるか、またはこれを含む。特定の実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は、グルタチオン前駆体であるか、またはこれを含む。
一部の実施形態では、細胞は、ＮＡＣの存在下で操作される。一部の実施形態では、細胞は、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌ、１，５００μｇ／ｍｌ～２ｍｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ～５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌのＮＡＣの存在下で操作される。一部の実施形態では、細胞は、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、３００ｍｇ／ｍｌ、４００ｍｇ／ｍｌ、５００ｍｇ／ｍｌ、または約１ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌ、約３００ｍｇ／ｍｌ、約４００ｍｇ／ｍｌ、約５００ｍｇ／ｍｌのＮＡＣの存在下で操作される。一部の実施形態では、細胞は、０．８ｍｇ／ｍｌまたは約０．８ｍｇ／ｍｌで操作される。
一部の実施形態では、刺激Ｔ細胞、例えば、刺激ＣＤ４＋ Ｔ細胞または刺激ＣＤ８＋ Ｔ細胞などの濃縮Ｔ細胞の組成物は、１つまたは複数のポリカチオンの存在下で操作される。一部の実施形態では、刺激Ｔ細胞、例えば、刺激ＣＤ４＋ Ｔ細胞または刺激ＣＤ８＋ Ｔ細胞などの濃縮Ｔ細胞の組成物は、１つまたは複数のポリカチオンの存在下で形質導入され、例えば、ウイルスベクター粒子とインキュベートされる。特定の実施形態では、刺激Ｔ細胞、例えば、刺激ＣＤ４＋ Ｔ細胞または刺激ＣＤ８＋ Ｔ細胞などの濃縮Ｔ細胞の組成物は、１つまたは複数のポリカチオンの存在下でトランスフェクトされ、例えば、非ウイルスベクターとインキュベートされる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のポリカチオンの存在は、操作（例えば、形質導入またはトランスフェクト）される組成物の細胞の量、部分、および／またはパーセンテージを増加させることなどによって遺伝子デリバリーの効率を高める。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のポリカチオンの存在は、トランスフェクションの効率を高める。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のポリカチオンの存在は、形質導入の効率を高める。特定の実施形態では、ポリカチオンの存在下で操作される細胞の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が、組換えポリヌクレオチドを含有または発現する。一部の実施形態では、ポリカチオンの存在なしで細胞を操作する代替のおよび／または例示的な方法と比較して、ポリカチオンの存在下で組換えポリヌクレオチドを含有または発現するように、組成物の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍多い細胞が操作される。
ある特定の実施形態では、濃縮細胞の組成物、例えば、濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物または濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞、例えばその刺激Ｔ細胞の組成物は、例えばポリカチオンの存在下で細胞を操作する例示的なおよび／または代替の方法と比べて、低い濃度または量のポリカチオンの存在下で操作される。ある特定の実施形態では、刺激Ｔ細胞、例えば、刺激ＣＤ４＋ Ｔ細胞または刺激ＣＤ８＋ Ｔ細胞などの濃縮細胞の組成物は、細胞を操作する例示的なおよび／または代替のプロセスの９０％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満の量および／または濃度のポリカチオンの存在下で操作される。一部の実施形態では、刺激Ｔ細胞、例えば、刺激ＣＤ４＋ Ｔ細胞または刺激ＣＤ８＋ Ｔ細胞などの濃縮細胞の組成物は、１００μｇ／ｍｌ未満、９０μｇ／ｍｌ未満、８０μｇ／ｍｌ未満、７５μｇ／ｍｌ未満、７０μｇ／ｍｌ未満、６０μｇ／ｍｌ未満、５０μｇ／ｍｌ未満、４０μｇ／ｍｌ未満、３０μｇ／ｍｌ未満、２５μｇ／ｍｌ未満、２０μｇ／ｍｌ、またはμｇ／ｍｌ未満、１０μｇ／ｍｌのポリカチオンの存在下で操作される。特定の実施形態では、刺激Ｔ細胞、例えば、刺激ＣＤ４＋ Ｔ細胞または刺激ＣＤ８＋ Ｔ細胞などの濃縮細胞の組成物は、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、３５μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌ、もしくは５０μｇ／ｍｌ、または約１μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約３５μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、約４５μｇ／ｍｌ、もしくは約５０μｇ／ｍｌのポリカチオンの存在下で操作される。
特定の実施形態では、ポリカチオンの存在下で、例えば刺激Ｔ細胞、例えば、刺激ＣＤ４＋ Ｔ細胞または刺激ＣＤ８＋ Ｔ細胞などの濃縮細胞の組成物を操作することは、例えば壊死、プログラム細胞死、またはアポトーシスによる細胞死の量を低減する。一部の実施形態では、刺激Ｔ細胞、例えば、刺激ＣＤ４＋ Ｔ細胞または刺激ＣＤ８＋ Ｔ細胞などの濃縮Ｔ細胞の組成物は、低量のポリカチオン、例えば、１００μｇ／ｍｌ未満、５０μｇ／ｍｌ、または１０μｇ／ｍｌの存在下で操作され、細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％は、操作工程中または操作工程が完了した少なくとも１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、もしくは７日超後に生存している、例えば、壊死、プログラム細胞死、またはアポトーシスを起こさない。一部の実施形態では、組成物は、より高い量または濃度のポリカチオン、例えば、５０μｇ／ｍｌ超、１００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、または１，０００μｇ／ｍｌの存在下で細胞を操作する代替のおよび／または例示的な方法と比較して、低い濃度または量のポリカチオンの存在下で操作され、組成物の細胞は、例示的なおよび／または代替のプロセスを受ける細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍大きい生存を有する。
一部の実施形態では、ポリカチオンは正に荷電される。ある特定の実施形態では、ポリカチオンは、細胞とベクター、例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクターの間の反発力を低減し、細胞表面へのベクターの接触および／または結合を媒介する。一部の実施形態では、ポリカチオンは、ポリブレン、ＤＥＡＥ－デキストラン、硫酸プロタミン、ポリ－Ｌ－リジン、またはカチオン性リポソームである。
特定の実施形態では、ポリカチオンは硫酸プロタミンである。一部の実施形態では、刺激Ｔ細胞、例えば、刺激ＣＤ４＋ Ｔ細胞または刺激ＣＤ８＋ Ｔ細胞などの濃縮Ｔ細胞の組成物は、５００μｇ／ｍｌ未満もしくは約５００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ未満もしくは約４００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ未満もしくは約３００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ未満もしくは約２００μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ未満もしくは約１５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ未満もしくは約１００μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌ未満もしくは約９０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ未満もしくは約８０μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌ未満もしくは約７５μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ未満もしくは約７０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ未満もしくは約６０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ未満もしくは約５０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ未満もしくは約４０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ未満もしくは約３０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ未満もしくは約２５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌ、または１５μｇ／ｍｌ未満もしくは約１５μｇ／ｍｌ、または１０μｇ／ｍｌ未満もしくは約１０μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンの存在下で操作される。特定の実施形態では、刺激Ｔ細胞、例えば、刺激ＣＤ４＋ Ｔ細胞または刺激ＣＤ８＋ Ｔ細胞などの濃縮細胞の組成物は、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、３５μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５５μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、８５μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌ、９５μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１０５μｇ／ｍｌ、１１０μｇ／ｍｌ、１１５μｇ／ｍｌ、１２０μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ、１３０μｇ／ｍｌ、１３５μｇ／ｍｌ、１４０μｇ／ｍｌ、１４５μｇ／ｍｌ、もしくは１５０μｇ／ｍｌ、または約１μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約３５μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、約４５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約５５μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約７５μｇ／ｍｌ、約８０μｇ／ｍｌ、約８５μｇ／ｍｌ、約９０μｇ／ｍｌ、約９５μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１０５μｇ／ｍｌ、約１１０μｇ／ｍｌ、約１１５μｇ／ｍｌ、約１２０μｇ／ｍｌ、約１２５μｇ／ｍｌ、約１３０μｇ／ｍｌ、約１３５μｇ／ｍｌ、約１４０μｇ／ｍｌ、約１４５μｇ／ｍｌ、約もしくは１５０μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンの存在下で操作される。
一部の実施形態では、刺激Ｔ細胞、例えば、刺激ＣＤ４＋ Ｔ細胞などの操作された濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物は、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または１００％もしくは約１００％のＣＤ４＋ Ｔ細胞を含む。ある特定の実施形態では、刺激Ｔ細胞、例えば、刺激ＣＤ４＋ Ｔ細胞などの操作される濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物は、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満、または０．０１％未満のＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む、および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞を含有しない、および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞がないかもしくは実質的にない。
一部の実施形態では、刺激Ｔ細胞、例えば、刺激ＣＤ８＋ Ｔ細胞などの操作される濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞の組成物は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または１００％もしくは約１００％のＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む。ある特定の実施形態では、刺激Ｔ細胞、例えば、刺激ＣＤ８＋ Ｔ細胞などの操作される濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞の組成物は、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満、または０．０１％未満のＣＤ４＋ Ｔ細胞を含む、および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞を含有しない、および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞がないかもしくは実質的にない。
一部の実施形態では、細胞の操作は、培養、ベクター、例えば、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターとの接触、該ベクターとのインキュベーションを含む。ある特定の実施形態では、操作は、細胞を培養すること、細胞をベクターと接触させること、および／または細胞をベクターとインキュベートすることを含み、４時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４０時間、４８時間、５４時間、６０時間、７２時間、８４時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、もしくは７日間、もしくは７日間を超えて、約４時間、約６時間、約８時間、約１２時間、約１６時間、約１８時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４０時間、約４８時間、約５４時間、約６０時間、約７２時間、約８４時間、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、もしくは約７日間、もしくは約７日間を超えて、または少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４０時間、少なくとも４８時間、少なくとも５４時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも８４時間、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、もしくは少なくとも７日間、もしくは少なくとも７日間を超えて行われる。特定の実施形態では、操作は、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、もしくは８４時間、または約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、約７２時間、もしくは約８４時間、または２日間、３日間、４日間、もしくは５日間、または約２日間、約３日間、約４日間、もしくは約５日間細胞を培養すること、細胞をベクターと接触させること、および／または細胞をベクターとインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、操作工程は、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、もしくは８４時間、または約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、約７２時間、もしくは約８４時間行われる。ある特定の実施形態では、操作は、約６０時間または約８４時間、７２時間もしくは約７２時間、または２日間もしくは約２日間行われる。
一部の実施形態では、操作は、約２５～約３８℃、例えば約３０～約３７℃、約３６～約３８℃、または３７℃±２℃もしくは約３７℃±２℃の温度で行われる。一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、約２．５％～約７．５％、例えば約４％～約６％のＣＯ２レベル、例えば５％±０．５％もしくは約５％±０．５％で操作される。一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、３７℃もしくは約３７℃の温度および／または５％もしくは約５％のＣＯ２レベルで操作される。
一部の実施形態では、細胞、例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞は、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含有するように細胞を遺伝子操作、例えば、形質導入またはトランスフェクションする１つまたは複数の工程が行われた後に培養される。一部の実施形態では、培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）は、培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）、インキュベーション、刺激、活性化、拡大、および／または増殖を含み得る。一部のそのような実施形態では、さらなる培養は、１つまたは複数の細胞の宿主ゲノムへのウイルスベクターの組込みをもたらす条件下で行われる。インキュベーションおよび／または操作は、培養または細胞培養のためのユニット、チャンバー、ウェル、カラム、管、チューブセット、バルブ、バイアル、培養皿、バッグ、または他の容器などの培養容器で実施され得る。一部の実施形態では、組成物または細胞は、刺激条件または刺激剤の存在下でインキュベートされる。そのような条件には、集団での細胞の増殖、拡大、活性化、および／もしくは生存を誘導する、抗原曝露を模倣する、ならびに／または組換え抗原受容体の導入などの遺伝子操作のためにプライムするように設計された条件が挙げられる。
一部の実施形態では、さらなるインキュベーションは、室温を超える、例えば２５℃を超えるまたは約２５℃を超える、例えば一般に約３２℃、３５℃もしくは３７℃を超えるまたは約３２℃、約３５℃もしくは約３７℃を超える温度で実施される。一部の実施形態では、さらなるインキュベーションは、３７℃±２℃または約３７℃±２℃の温度、例えば３７℃または約３７℃の温度で行われる。
一部の実施形態では、さらなるインキュベーションは、細胞の刺激および／または活性化のための条件下で行われ、該条件には、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、剤、例えば、栄養分、アミノ酸、抗生物質、イオン、および／または刺激因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、および細胞を活性化するように設計された任意の他の薬剤のうちの１つまたは複数を挙げることができる。
一部の実施形態では、刺激条件または刺激剤には、ＴＣＲ複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる１つまたは複数の剤（例えば、刺激剤および／または補助剤）、例えばリガンドが挙げられる。一部の態様では、一次シグナルをデリバリーする、例えば、ＩＴＡＭ誘導シグナルの活性化を開始するのに適した剤、例えばＴＣＲ成分に特異的なもの、および／または共刺激シグナルを促進する剤、例えばＴ細胞共刺激受容体に特異的なもの、例えば、例えばビーズなどの固体支持体に適宜結合された抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、もしくは抗４１－ＢＢ、および／または１つもしくは複数のサイトカインなどの剤は、Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３細胞内シグナル伝達カスケードを活性化または開始する。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ［例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｄｅｒ、および／またはＥｘｐＡＣＴ（登録商標）ビーズ］は、刺激剤の中の１つである。適宜、拡大方法は、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体を培養培地に添加する工程をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、刺激剤は、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５、例えば、少なくとも約１０単位／ｍＬのＩＬ－２濃度を含む。
一部の実施形態では、刺激条件または刺激剤には、ＴＣＲ複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる１つまたは複数の剤、例えばリガンドが挙げられる。一部の態様では、剤は、Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３細胞内シグナル伝達カスケードを活性化または開始する。そのような剤には、抗体、例えば、例えばビーズなどの固体支持体に結合した、ＴＣＲ成分および／もしくは共刺激受容体に特異的な抗体、例えば抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、ならびに／または１つもしくは複数のサイトカインを挙げることができる。適宜拡大方法は、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体を培養培地に添加する工程（例えば、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で）をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、刺激剤は、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５、例えば、少なくとも約１０単位／ｍＬ、少なくとも約５０単位／ｍＬ、少なくとも約１００単位／ｍＬまたは少なくとも約２００単位／ｍＬのＩＬ－２濃度を含む。
条件には、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、剤、例えば、栄養分、アミノ酸、抗生物質、イオン、および／または刺激因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、および細胞を活性化するように設計された任意の他の剤のうちの１つまたは複数を挙げることができる。
一部の態様では、インキュベーションは、Ｒｉｄｄｅｌｌらの米国特許第６，０４０，１ ７７号、Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660、Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82、および／またはWang et al. (2012) J Immunother. 35(9): 689-701に記載されているものなどの手法に従って実施される。
一部の実施形態では、さらなるインキュベーションは接触が生じる同じ容器または装置で実施される。一部の実施形態では、さらなるインキュベーションは回転または遠心分離なしに実施され、一般には、例えば遠心分離またはスピノキュレーションに関連する回転下で行われるインキュベーションの少なくとも一部に続いて実施される。一部の実施形態では、さらなるインキュベーションは、クロマトグラフィーマトリックスの外側などの固定相の外側で、例えば、溶液中で実施される。
一部の実施形態では、さらなるインキュベーションは、ウイルス粒子および試薬との接触に続いて異なる容器または装置への細胞組成物の移動、例えば自動移動などにより、接触が生じるものとは異なる容器または装置で実施される。
一部の実施形態では、例えばエクスビボ拡大を促進するためのさらなる培養またはインキュベーションは、２４時間超、２日超、３日超、４日超、５日超、６日超、７日超、８日超、９日超、１０日超、１１日超、１２日超、１３日超もしくは１４日超、または約２４時間超、約２日超、約３日超、約４日超、約５日超、約６日超、約７日超、約８日超、約９日超、約１０日超、約１１日超、約１２日超、約１３日超もしくは約１４日超にわたって実施される。一部の実施形態では、さらなる培養またはインキュベーションは、６日以下、５日以下、４日以下、３日以下、２日以下または２４時間以下にわたって実施される。
一部の実施形態では、例えば刺激剤とのインキュベーションの合計持続時間は、１時間～９６時間、１時間～７２時間、１時間～４８時間、４時間～３６時間、８時間～３０時間もしくは１２時間～２４時間、または約１時間～約９６時間、約１時間～約７２時間、約１時間～約４８時間、約４時間～約３６時間、約８時間～約３０時間もしくは約１２時間～約２４時間、例えば少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間もしくは少なくとも７２時間、または約少なくとも６時間、約少なくとも１２時間、約少なくとも１８時間、約少なくとも２４時間、約少なくとも３６時間もしくは約少なくとも７２時間、または約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間もしくは約７２時間である。一部の実施形態では、さらなるインキュベーションは、１時間以上４８時間以下、４時間以上３６時間以下、８時間以上３０時間以下もしくは１２時間以上２４時間以下、または約１時間以上約４８時間以下、約４時間以上約３６時間以下、約８時間以上約３０時間以下もしくは約１２時間以上約２４時間以下の時間にわたる。
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、さらなる培養またはインキュベーションを含まない、例えば、エクスビボ拡大工程を含まないか、または実質的により短いエクスビボ拡大工程を含む。
一部の実施形態では、刺激試薬は、操作前に細胞から除去および／または分離される。特定の実施形態では、刺激試薬は、操作後に細胞から除去および／または分離される。ある特定の実施形態では、刺激剤は、操作の後、操作された細胞を増殖および／または拡大を促進する例えば条件下で培養する前に、細胞から除去および／または分離される。ある特定の実施形態では、刺激試薬は、節Ｉ－Ｂ－１に記載されている刺激試薬である。特定の実施形態では、刺激試薬は、節Ｉ－Ｂ－２に記載されているように細胞から除去および／または分離される。
１．ベクターおよび方法
一部の実施形態では、細胞、例えばＴ細胞は、組換え受容体を発現するように遺伝子操作される。一部の実施形態では、操作は、組換え受容体またはその部分もしくは成分をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを導入することによって実施される。また、組換え受容体をコードするポリヌクレオチド、ならびにそのような核酸および／またはポリヌクレオチドを含有するベクターまたはコンストラクトも提供される。
特定の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである。一部の例では、ベクターは、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターである。
一部の実施形態では、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドは、組換え受容体の発現を制御するように作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含有する。一部の例では、ポリヌクレオチドは、組換え受容体の発現を制御するように作動可能に連結された２つ、３つ、またはそれより多いプロモーターを含有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、適宜およびポリヌクレオチドがＤＮＡベースであるかまたはＲＮＡベースであるかを考慮して、ポリヌクレオチドが導入される宿主のタイプ（例えば、細菌、真菌、植物、または動物）に特異的な、転写および翻訳開始および終止コドンなどの調節配列を含有することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、２Ａ配列、およびスプライスアクセプターまたはドナーなどの調節／制御エレメントを含有することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、組換え受容体および／または１つもしくは複数の追加のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した非天然プロモーターを含有することができる。一部の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡ ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの中から選択される。一部の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０初期領域またはアデノウイルス主要後期プロモーター）によって認識される。別の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（例えば、Ｕ６またはＨ１プロモーター）によって認識される。一部の実施形態では、プロモーターは、非ウイルスプロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーターなどのウイルスプロモーター、およびマウス幹細胞ウイルスの長末端反復で見出されるプロモーターであってもよい。他の既知のプロモーターも企図される。
一部の実施形態では、プロモーターは、恒常性プロモーターであるか、またはこれを含む。例示的な恒常性プロモーターには、例えば、サルウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ）、ヒトユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ヒト伸長因子１αプロモーター（ＥＦ１α）、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーター（ＰＧＫ）、およびＣＭＶ初期エンハンサー（ＣＡＧＧ）と結合したニワトリβ－アクチンプロモーターが挙げられる。一部の実施形態では、恒常性プロモーターは合成または改変プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを有する改変ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲのＵ３領域を含有する合成プロモーターであるＭＮＤプロモーター［Challita et al. (1995) J. Virol. 69(2) :748-755を参照］であるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、プロモーターは組織特異的プロモーターである。別の実施形態では、プロモーターはウイルスプロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは非ウイルスプロモーターでる。一部の実施形態では、例示的なプロモーターには、ヒト伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーターもしくはその改変型、またはＭＮＤプロモーターを挙げることができるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、プロモーターは調節されたプロモーター（例えば、誘導性プロモーター）である。一部の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、Ｌａｃオペレーター配列、テトラサイクリンオペレーター配列、ガラクトースオペレーター配列もしくはドキシサイクリンオペレーター配列を含むか、もしくはそのアナログであるか、またはＬａｃリプレッサーもしくはテトラサイクリンリプレッサー、もしくはそのアナログによって結合もしくは認識されることができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、調節エレメント、例えばプロモーターを含まない。
一部の例では、組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列は、シグナルペプチドをコードするシグナル配列を含有する。シグナルペプチドの非限定的な例示的な例には、例えば、配列番号１０に記載され、配列番号９に記載されたヌクレオチド配列によってコードされるＧＭＣＳＦＲアルファ鎖シグナルペプチド、配列番号１１に記載されたＣＤ８アルファシグナルペプチド、または配列番号１２に記載されたＣＤ３３シグナルペプチドが挙げられる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の追加のポリペプチド、例えば、１つもしくは複数のマーカーおよび／または１つもしくは複数のエフェクター分子をコードする核酸配列を含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数のマーカーには、形質導入マーカー、サロゲートマーカーおよび／または耐性マーカーまたは選択マーカーが挙げられる。例えば１つまたは複数の追加のポリペプチドをコードする、導入される追加の核酸配列の中には、移入された細胞の生存能および／または機能の促進などによって治療の有効性を改善することができる核酸配列；細胞の選択および／または評価のための遺伝子マーカーを提供するための、例えば、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）生存または局在化を評価するための核酸配列；Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991);およびRiddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)によって記載される（ドミナントポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーとの融合から得られる二機能性選択融合遺伝子の使用を記載するＷＯ１９９２００８７９６およびＷＯ１９９４０２８１４３、ならびに米国特許第６，０４０，１７７号も参照）、例えばインビボでのネガティブ選択に対して細胞を感受性にすることによる、安全性を改善するための核酸配列が挙げられる。
一部の実施形態では、マーカーは、形質導入マーカーまたはサロゲートマーカーである。形質導入マーカーまたはサロゲートマーカーは、ポリヌクレオチド、例えば、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを導入されたＴ細胞を検出するのに使用することができる。一部の実施形態では、形質導入マーカーは、細胞の改変を示すまたは確認することができる。一部の実施形態では、サロゲートマーカーは、細胞表面で組換え受容体、例えばＣＡＲと共発現されるように作られるタンパク質である。特定の実施形態では、そのようなサロゲートマーカーは、活性をほとんどまたは全く有さないように改変された表面タンパク質である。ある特定の実施形態では、サロゲートマーカーは、組換え受容体をコードする同じポリヌクレオチドにコードされる。一部の実施形態では、組換え受容体をコードする核酸配列は、マーカーをコードする核酸配列に作動可能に連結され、適宜、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチド、例えば２Ａ配列をコードする核酸によって隔てられる。外因性マーカー遺伝子は、一部の例では細胞の検出または選択を可能にするために、ならびに一部の例では、細胞排除および／または細胞自殺も促進するために、操作された細胞に関連して利用され得る。
例示的なサロゲートマーカーには、細胞表面ポリペプチドの切断型、例えば、非機能性であり、シグナルもしくは通常は細胞表面ポリペプチドの完全長型によって形質導入されるシグナルを形質導入しないもしくはすることができない、および／または内在化しないもしくはすることができない切断型を挙げることができる。例示的な切断型細胞表面ポリペプチドには、増殖因子または他の受容体の切断型、例えば、切断型ヒト上皮増殖因子受容体２（ｔＨＥＲ２）、切断型上皮増殖因子受容体（ｔＥＧＦＲ、配列番号２または３に記載された例示的なｔＥＧＦＲ配列）、または前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）もしくはその改変型、例えば切断型ＰＳＭＡ（ｔＰＳＭＡ）が挙げられる。一部の態様では、ｔＥＧＦＲは、抗体セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））または他の治療用抗ＥＧＦＲ抗体もしくは結合分子によって認識されるエピトープを含有してもよく、該抗体または結合分子は、ｔＥＧＦＲコンストラクトおよびコードされた外因性タンパク質で操作された細胞を同定もしくは選択する、ならびに／またはコードされた外因性タンパク質を発現する細胞を排除もしくは分離するのに使用され得る。米国特許第８，８０２，３７４号およびLiu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434を参照）。一部の態様では、マーカー、例えばサロゲートマーカーは、ＣＤ３４、ＮＧＦＲ、ＣＤ１９もしくは切断ＣＤ１９、例えば切断型非ヒトＣＤ１９、または上皮成長因子受容体（例えば、ｔＥＧＦＲ）の全体または部分（例えば、切断型）を含む。切断型ＥＧＦＲ（例えば、ｔＥＧＦＲ）の例示的なポリペプチドは、配列番号２もしくは３に記載されたアミノ酸の配列、または配列番号２もしくは３に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。
一部の実施形態では、マーカーは、検出可能なタンパク質、例えば蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、例えばスーパーフォールドＧＦＰ（ｓｕｐｅｒ－ｆｏｌｄ ＧＦＰ）（ｓｆＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、例えば、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄまたはＤｓＲｅｄ２、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、高感度青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ならびに蛍光タンパク質の種変異体、単量体変異体、コドン最適化され、安定化され、および／または増強された変異体を含むそれらの変異体であるか、またはこれらを含む。一部の実施形態では、マーカーは、ルシフェラーゼ、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）由来のｌａｃＺ遺伝子、アルカリホスファターゼ、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの酵素であるか、またはこれらを含む。例示的な発光レポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）またはそれらの変異体が挙げられる。一部の態様では、酵素の発現は、発現時に検出され得る基質の添加および酵素の機能的活性によって検出することができる。
一部の実施形態では、マーカーは、耐性マーカーまたは選択マーカーである。一部の実施形態では、耐性マーカーまたは選択マーカーは、外因性の薬剤または薬物に対する耐性を与えるポリペプチドであるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、耐性マーカーまたは選択マーカーは抗生物質耐性遺伝子である。一部の実施形態では、耐性マーカーまたは選択マーカーは、哺乳動物細胞に抗生物質耐性を与える抗生物質耐性遺伝子である。一部の実施形態では、耐性マーカーまたは選択マーカーは、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジェネティシン耐性遺伝子、もしくはゼオシン耐性遺伝子、またはそれらの改変型であるか、またはこれらを含む。
本明細書に記載されたいずれの組換え受容体および／または追加のポリペプチドも、組換え受容体をコードする１つまたは複数の核酸配列を任意の組み合わせ、配向または配置で含有する１つまたは複数のポリヌクレオチドによってコードされ得る。例えば、１つ、２つ、３つまたはそれより多いポリヌクレオチドが、１つ、２つ、３つもしくはそれより多い異なるポリペプチド、例えば、組換え受容体もしくはその部分もしくは成分、ならびに／または１つもしくは複数の追加のポリペプチド、例えば、マーカーおよび／もしくはエフェクター分子をコードしてもよい。一部の実施形態では、１つのポリヌクレオチドが、組換え受容体、例えばＣＡＲ、またはその部分もしくは成分をコードする核酸配列、および１つまたは複数の追加のポリペプチドをコードする核酸配列を含有する。一部の実施形態では、１つのベクターまたはコンストラクトが、組換え受容体、例えばＣＡＲ、またはその部分もしくは成分をコードする核酸配列を含有し、別々のベクターまたはコンストラクトが、１つまたは複数の追加のポリペプチドをコードする核酸配列を含有する。一部の実施形態では、組換え受容体をコードする核酸配列および１つまたは複数の追加のポリペプチドをコードする核酸配列は、２つの異なるプロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、組換え受容体をコードする核酸は、１つまたは複数の追加のポリペプチドをコードする核酸の上流に存在する。一部の実施形態では、組換え受容体をコードする核酸は、１つまたは複数の追加のポリペプチドをコードする核酸の下流に存在する。
ある特定の例では、１つのポリヌクレオチドが、２つまたはそれより多い異なるポリペプチド鎖、例えば、組換え受容体および１つまたは複数の追加のポリペプチド、例えば、マーカーおよび／またはエフェクター分子をコードする核酸配列を含有する。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い異なるポリペプチド鎖、例えば、組換え受容体および１つまたは複数の追加のポリペプチドをコードする核酸配列は、２つの別々のポリヌクレオチドに存在する。例えば、２つの別々のポリヌクレオチドが提供され、それぞれは、細胞での発現のために個々に細胞に移入または導入され得る。一部の実施形態では、マーカーをコードする核酸および組換え受容体をコードする核酸は、細胞のゲノム内の異なる位置に存在するか、または挿入される。一部の実施形態では、マーカーをコードする核酸および組換え受容体をコードする核酸は、２つの異なるプロモーターに作動可能に連結される。
一部の実施形態、例えば、ポリヌクレオチドが第１および第２の核酸配列を含有する実施形態では、異なるポリペプチド鎖の各々をコードするコード配列は、同じであってもまたは異なっていてもよいプロモーターに作動可能に連結され得る。一部の実施形態では、核酸分子は、２つまたはそれより多い異なるポリペプチド鎖の発現を駆動するプロモーターを含有することができる。一部の実施形態では、そのような核酸分子は、マルチシストロニック（バイシストロニックまたはトリシストロニック、例えば、米国特許第６，０６０，２７３号を参照）であり得る。一部の実施形態では、組換え受容体をコードする核酸および１つまたは複数の追加のポリペプチドをコードする核酸配列は、同じプロモーターに作動可能に連結され、適宜、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチド、例えば２Ａエレメントをコードする核酸によって隔てられる。例えば、例示的なマーカー、および適宜リボソームスキッピング配列は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４０３１６８７に開示されるいずれかであってもよい。
一部の実施形態では、転写ユニットは、単一のプロモーターからのメッセージによる遺伝子産物（例えば、組換え受容体および追加のポリペプチドをコードする）の共発現を可能にするＩＲＥＳを含有する、バイシストロニックユニットとして操作することができる。あるいは、一部の例では、単一のプロモーターが、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中に、自己切断ペプチド（例えば、２Ａ配列）またはプロテアーゼ認識部位（例えば、フューリン）をコードする配列によって互いに隔てられた２つまたは３つの遺伝子（例えば、マーカーをコードする、および組換え受容体をコードする）を含有するＲＮＡの発現を指示してもよい。ＯＲＦは故に、翻訳中（２Ａの場合）または翻訳後のどちらかに、個々のタンパク質にプロセシングされる単一ポリペプチドをコードする。一部の例では、Ｔ２Ａなどのペプチドは、２ＡエレメントのＣ末端におけるペプチド結合の合成をリボソームにスキップさせ（リボソームスキッピング）、２Ａ配列の末端と下流の次のペプチドの間に分離をもたらすことができる［例えば、de Felipe,遺伝子 Vaccines and Ther. 2:13 (2004)およびde Felipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)を参照］。様々な２Ａエレメントが知られている。本明細書に開示された方法およびシステムにおいて使用することができる２Ａ配列の例には、米国特許公開第２００７０１１６６９０号に記載の口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ、例えば配列番号８）、Ａ型ウマ鼻炎ウイルス（Ｅ２Ａ、例えば配列番号７）、トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（Ｔ２Ａ、例えば、配列番号１または４）、およびブタテッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ、例えば、配列番号５または６）由来の２Ａ配列が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、組換え受容体および／または追加のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ベクターに含有されるか、または１つもしくは複数のベクターにクローニングすることができる。一部の実施形態では、１つまたは複数のベクターは、宿主細胞、例えば、操作用の細胞を形質転換またはトランスフェクトするのに使用することができる。例示的なベクターには、導入、増殖および拡大のため、もしくは発現のため、またはその両方のために設計されたベクター、例えば、プラスミドおよびウイルスベクターが挙げられる。一部の態様では、ベクターは、発現ベクター、例えば組換え発現ベクターである。一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、標準的な組換えＤＮＡ法を使用して調製することができる。
一部の実施形態では、ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラホヤ、カリフォルニア）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ、マジソン、ウィスコンシン）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ウプサラ、スウェーデン）、またはｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、カリフォルニア）のベクターであってもよい。一部の例では、λＧ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、およびλＮＭ１１４９などのバクテリオファージベクターも使用され得る。一部の実施形態では、植物発現ベクターが使用されてもよく、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１およびｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。一部の実施形態では、動物発現ベクターにては、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭおよびｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。
一部の実施形態では、組換え受容体および／または１つまたは複数の追加のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、レトロウイルス形質導入、トランスフェクション、または形質転換などによって培養細胞を含有する組成物に導入される。
一部の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターである。一部の実施形態では、組換え受容体および／または追加のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、レトロウイルスもしくはレンチウイルスベクターを介して、またはトランスポゾンを介して細胞に導入される［例えば、Baum et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063;Frecha et al. (2010) Molecular Therapy 18:1748-1757;およびHackett et al. (2010) Molecular Therapy 18:674-683を参照］。
一部の実施形態では、ベクターには、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクター、非ウイルスベクターまたはトランスポゾン、例えば、スリーピングビューティートランスポゾン系、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクター、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、例えば、ガンマ－レトロウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）、マウス胚性幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するレトロウイルスベクターが挙げられる。
一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、電気穿孔を使用してＴ細胞に導入される［例えば、Chicaybam et al, ( 2013) PLoS ONE 8(3): e60298およびVan Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437を参照］。一部の実施形態では、組換え核酸は、転位を介してＴ細胞に移入される［例えば、Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437;Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74;およびHuang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126を参照］。免疫細胞に遺伝物質、例えば、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターを導入し、発現させる他の方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,新たなYork. N.Y.に記載の）、プロトプラスト融合、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション；タングステン粒子促進微粒子銃（ｔｕｎｇｓｔｅｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ－ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）［Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)］；およびリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈［Brash et al., Mol.Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)］、ならびに例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１４０５５６６８、および米国特許第７，４４６，１９０号に記載された他のアプローチが挙げられる。
一部の実施形態では、組換え受容体および／または追加のポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドまたはベクターは、拡大中または拡大後のどちらかに細胞、例えばＴ細胞に導入されてもよい。ポリヌクレオチドまたはベクターのこの導入は、例えば、任意の適切なレトロウイルスベクターを用いて実施することができる。得られた遺伝子操作された細胞は、次いで初期刺激（例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激）から解放され、その後、第２のタイプの刺激の存在下で（例えば、新たに導入された組換え受容体を介して）刺激され得る。この第２のタイプの刺激は、ペプチド／ＭＨＣ分子、遺伝子導入された受容体の同族（架橋）リガンド（例えば、ＣＡＲの天然の抗原および／またはリガンド）、または新たな受容体のフレームワーク内で直接結合する（例えば、受容体内の定常領域を認識することによって）任意のリガンド（抗体など）の形態の抗原刺激を含み得る。例えば、Cheadle et al, “Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy” Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66またはBarrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333347 (2014)を参照。
一部の例では、細胞、例えばＴ細胞が活性化されることを必要としないベクターが使用され得る。一部のそのような例では、細胞は、活性化の前に選択および／または形質導入され得る。故に、細胞は、細胞培養の前に、または細胞培養に続いて、および一部の例では、少なくとも一部の培養と同時にまたは少なくとも一部の培養の間に操作され得る。
ａ．ウイルスベクター粒子
一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する例えばベクターなどの組換え感染性ウイルス粒子を使用して細胞に導入される。一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、組換えレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、例えばガンマ－レトロウイルスベクターを使用してＴ細胞に導入される（例えば、Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10. 1038/gt.2014.25;Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28( 10): 1137-46;Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93;Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557を参照）。
一部の実施形態では、ベクターはレトロウイルスベクターである。一部の実施形態では、レトロウイルスベクターは、長末端反復配列（ＬＴＲ）、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）、マウス胚性幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するレトロウイルスベクターを有する。ほとんどのレトロウイルスベクターはマウスレトロウイルスに由来する。一部の実施形態では、レトロウイルスには、任意のトリまたは哺乳動物細胞源に由来するものが挙げられる。レトロウイルスは、典型的には両種指向性であり、両種指向性は、レトロウイルスがヒトを含むいくつかの種の宿主細胞に感染することができることを意味する。１つの実施形態では、発現される遺伝子は、レトロウイルスｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖ配列を交換する。多くの例示的なレトロウイルスシステムが記載されている［例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；第６，２０７，４５３号；第５，２１９，７４０号；Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990;Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5- 14;Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852;Bums et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037;およびBoris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109］。
レンチウイルス形質導入の方法は公知である。例示的方法は、例えば、Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114;およびCavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505に記載されている。
一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子は、レトロウイルスゲノムベースのベクターに由来する、例えばレンチウイルスゲノムベースのベクターに由来するゲノムを含有する。提供されたウイルスベクターの一部の態様では、組換え受容体、例えば、抗原受容体、例えば、ＣＡＲをコードする異種核酸は、ベクターゲノムの５’ＬＴＲと３’ＬＴＲ配列の間に含有される、および／またはその間に位置する。
一部の実施形態では、ウイルスベクターゲノムは、レンチウイルスゲノム、例えば、ＨＩＶ－１ゲノムまたはＳＩＶゲノムである。例えば、レンチウイルスベクターは、病原性遺伝子を多様に弱毒化するによって生成されており、例えば、治療目的のために遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｕおよびｎｅｆを欠失させて、ベクターをより安全にすることができる。レンチウイルスベクターは周知である。Naldini et al.. (1996 and 1998);Zufferey et al., (1997)；Dull et al., 1998、米国特許第６，０１３，５１６号；および同５，９９４，１３６号を参照されたい）。一部の実施形態では、これらのウイルスベクターは、プラスミドベースまたはウイルスベースであり、外来核酸を統合するための、選択のための、および宿主細胞への核酸の移動のための必須の配列を保持するように構成される。公知のレンチウイルスは、保管所またはコレクション、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ． ２０１１０－２２０９）から容易に得ることができる、または商業的に利用可能な技術を使用して公知の供給源から単離できる。
レンチウイルスベクターの限定されない例として、レンチウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）、ＨＩＶ－２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１（ＨＴＬＶ－１）、ＨＴＬＶ－２またはウマ感染貧血ウイルス（Ｅ１ＡＶ）に由来するものが挙げられる。例えば、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ病原性遺伝子を多様に弱毒化することによって生成されており、例えば、治療目的のために遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆを欠失させ、ベクターをより安全にする。レンチウイルスベクターは当該技術分野で公知である、Naldini et al., (1996 and 1998);Zufferey et al., (1997)；Dull et al., 1998、米国特許第６，０１３，５１６号；および同５，９９４，１３６号を参照されたい）。一部の実施形態では、これらのウイルスベクターは、プラスミドベースまたはウイルスベースであり、外来核酸を統合するための、選択のための、および宿主細胞への核酸の移動のための必須の配列を保持するように構成される。公知のレンチウイルスは、保管所またはコレクション、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ． ２０１１０－２２０９）から容易に得ることができる、または商業的に利用可能な技術を使用して公知の供給源から単離できる。
一部の実施形態では、ウイルスゲノムベクターは、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスの５’および３’ＬＴＲの配列を含有し得る。一部の態様では、ウイルスゲノムコンストラクトは、レンチウイルスの５’および３’ＬＴＲ由来の配列を含有し得る、特に、レンチウイルスの５’ＬＴＲ由来のＲおよびＵ５配列ならびにレンチウイルス由来の不活性化された３’ＬＴＲまたは自己不活性化３’ＬＴＲを含有し得る。ＬＴＲ配列は、任意の種に由来する任意のレンチウイルスに由来するＬＴＲ配列であり得る。例えば、それらは、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶまたはＢＩＶ由来のＬＴＲ配列であり得る。通常、ＬＴＲ配列は、ＨＩＶ ＬＴＲ配列である。
一部の実施形態では、ＨＩＶウイルスベクターなどのウイルスベクターの核酸は追加の転写ユニットを欠く。ベクターゲノムは、不活性化または自己不活性化３’ＬＴＲを含有することができる（Zufferey et al. J Virol 72: 9873, 1998; Miyoshi et al., J Virol 72:8150, 1998）。例えば、ウイルスベクターＲＮＡを生成するために使用される核酸の３’ＬＴＲのＵ３領域における欠失を使用して、自己不活性化（ＳＩＮ）ベクターを生成できる。次いで、この欠失を逆転写の際にプロウイルスのＤＮＡの５’ＬＴＲに移すことができる。自己不活性化ベクターは一般に、３’の長い末端反復配列（ＬＴＲ）からエンハンサーおよびプロモーター配列の欠失を有し、これは、ベクター統合の際に５’ＬＴＲ中にコピーされる。一部の実施形態では、ＬＴＲの転写活性を消失させるために、ＴＡＴＡボックスの除去を含む十分な配列が排除され得る。これは、形質導入された細胞における全長ベクターＲＮＡの生成を妨げ得る。一部の態様では、３’ＬＴＲのＵ３エレメントは、そのエンハンサー配列、ＴＡＴＡボックスＳｐ１、およびＮＦ－カッパＢ部位の欠失を含有する。自己不活性化３’ＬＴＲの結果として、侵入および逆転写後に生成されるプロウイルスは、不活性化された５’ＬＴＲを含有する。これは、ベクターゲノムの動員および隣接する細胞性プロモーターに対するＬＴＲの影響のリスクを低減することによって安全性を改善し得る。自己不活性化３’ＬＴＲは、当該技術分野で公知の任意の方法によって構築できる。一部の実施形態では、これは、ベクターのベクター力価またはインビトロもしくはインビボ特性に影響しない。
適宜、ウイルスコンストラクト、例えば、異種プロモーター配列において、レンチウイルス５’ＬＴＲ由来のＵ３配列をプロモーター配列と置き換えることができる。これは、パッケージング細胞株から回収されたウイルスの力価を増大し得る。エンハンサー配列もまた、含まれ得る。 パッケージング細胞株においてウイルスＲＮＡゲノムの発現を増大する任意のエンハンサー／プロモーターの組合せが使用され得る。一例では、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター配列が使用される（米国特許第５，３８５，８３９号および米国特許第５，１６８，０６２号）。
ある特定の実施形態では、統合に欠陥のあるレトロウイルスベクターゲノム、例えば、レンチウイルスベクターゲノムを構築することによって、挿入変異誘発のリスクを最小にすることができる。非組込みベクターゲノムを生成するために様々なアプローチを追求できる。一部の実施形態では、不活性インテグラーゼを有するタンパク質をコードするように、ｐｏｌ遺伝子のインテグラーゼ酵素構成要素中に突然変異（複数可）を操作することができる。一部の実施形態では、ベクターゲノム自体を改変して、例えば、一方または両方の付着部位を変異または欠失させることによって、または欠失もしくは改変によって３’ＬＴＲ近位ポリプリントラクト（ＰＰＴ）を非機能性にすることによって統合を妨げることができる。一部の実施形態では、非遺伝的アプローチが利用可能であり、これらには、インテグラーゼの１つまたは複数の機能を阻害する薬理学的薬剤が含まれる。アプローチは、相互に排他的ではなく、すなわち、それらのうち２つより多くを一度に使用できる。例えば、インテグラーゼおよび付着部位の両方が非機能的である場合があり、またはインテグラーゼおよびＰＰＴ部位が非機能的である場合があり、または結合部位およびＰＰＴ部位が非機能的である場合があり、またはそれらの全てが非機能的である場合がある。適宜そのような方法およびウイルスベクターゲノムは公知であり、利用可能である［Philpott and Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007;Engelman et al. J Virol 69:2729, 1995;Brown et al J Virol 73:9011 (1999);WO 2009/076524;McWilliams et al., J Virol 77: 1 1150, 2003;Powell and Levin J Virol 70:5288, 1996を参照］。
一部の実施形態では、ベクターは、宿主細胞、例えば、原核生物の宿主細胞における増殖のための配列を含有する。一部の実施形態では、ウイルスベクターの核酸は、原核細胞、例えば、細菌細胞における増殖のための１つまたは複数の複製の起源を含有する。一部の実施形態では、原核生物の複製起点を含むベクターはまた、その発現が検出可能なまたは薬物耐性などの選択マーカーを付与する遺伝子を含有し得る。
ウイルスベクターゲノムは通常、パッケージングまたはプロデューサー細胞株中にトランスフェクトされ得るプラスミド形態で構築される。そのゲノムがウイルスベクターゲノムのＲＮＡコピーを含有するレトロウイルス粒子を生成するために、様々な公知の方法のいずれも使用できる。一部の実施形態では、ウイルスベースの遺伝子デリバリーシステムの作成には少なくとも２つの構成要素、第１には、構造タンパク質を包含するパッケージングプラスミドならびにウイルスベクター粒子を生成するのに必要な酵素、第２には、ウイルスベクター自体、すなわち、移動されるべき遺伝物質が関与している。バイオセイフティー保護は、これらの構成要素の一方または両方の設計に導入され得る。
一部の実施形態では、パッケージングプラスミドは、全てのレトロウイルス、例えば、ＨＩＶ－１、エンベロープタンパク質以外のタンパク質を含有し得る（Naldini et al., 1998）。他の実施形態では、ウイルスベクターは、追加のウイルス遺伝子、例えば病原性に関連するもの、例えば、ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕおよびｎｅｆ、ならびに／またはＨＩＶの主要なトランス活性化因子であるＴａｔを欠いていてもよい。一部の実施形態では、レンチウイルスベクター、例えば、ＨＩＶベースのレンチウイルスベクターは、組換えを介した野生型ウイルスの再構築の可能性を低減または排除する親ウイルスの３つの遺伝子のみ：ｇａｇ、ｐｏｌおよびｒｅｖを含む。
一部の実施形態では、ウイルスベクターゲノムは、ウイルスベクターゲノムから転写されたウイルスゲノムＲＮＡをウイルス粒子にパッケージングするのに必要な全ての成分を含有するパッケージング細胞株に導入される。あるいは、ウイルスベクターゲノムは、目的の１つまたは複数の配列、例えば組換え核酸に加えてウイルス成分をコードする１つまたは複数の遺伝子を含んでもよい。しかし、一部の態様では、標的細胞におけるゲノムの複製を防ぐために、複製に必要とされる内因性ウイルス遺伝子が除去され、パッケージング細胞株に別々に提供される。
一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、粒子を生成するのに必要な構成要素を含有する１つまたは複数のプラスミドベクターでトランスフェクトされる。一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、ＬＴＲ、シス作用性パッケージング配列および目的の配列、すなわち、抗原受容体、例えば、ＣＡＲをコードする核酸を含むウイルスベクターゲノムを含有するプラスミドならびにウイルスの酵素的および／または構造的構成要素、例えば、Ｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｒｅｖをコードする１つまたは複数のヘルパープラスミドでトランスフェクトされる。一部の実施形態では、レトロウイルスベクター粒子を生成する種々の遺伝子構成要素を分離するために複数のベクターが利用される。一部のこのような実施形態では、別個のベクターをパッケージング細胞に提供することによって、そうでなければ複製能力のあるウイルスを生成する可能性がある組換え事象の機会が低減される。一部の実施形態では、レトロウイルス構成要素の全てを有する単一プラスミドベクターが使用され得る。
一部の実施形態では、レトロウイルスベクター粒子、例えば、レンチウイルスベクター粒子は、宿主細胞の形質導入効率を増大するための偽型である。例えば、レトロウイルスベクター粒子、例えば、レンチウイルスベクター粒子は、一部の実施形態では、ＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質を有する偽型であり、これは、形質導入され得る細胞種に拡大する広い細胞宿主域を提供する。一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、異種指向性、多指向性または両種指向性エンベロープ、例えば、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルスエンベロープ、ＧＡＬＶまたはＶＳＶ－Ｇを含むようになど、非天然エンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドまたはポリヌクレオチドでトランスフェクトされる。
一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、レンチウイルスベクター粒子へのウイルスゲノムＲＮＡのパッケージングにイントランスで（ｉｎ ｔｒａｎｓ）必要であるウイルス調節および構造タンパク質を含む構成要素を提供する。一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、レンチウイルスタンパク質を発現可能であり、機能的レンチウイルスベクター粒子を生成可能である任意の細胞株であり得る。一部の態様では、適したパッケージング細胞株として、２９３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ Ｘ）、２９３Ｔ、ＨｅＬＡ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｄ１７（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １８３）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０）およびＣｆ２Ｔｈ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４３０）細胞が挙げられる。
一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、ウイルスタンパク質（複数可）を安定に発現する。例えば、一部の態様では、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖおよび／または他の構造遺伝子を含有するが、ＬＴＲおよびパッケージング構成要素を有さないパッケージング細胞株を構築できる。一部の実施形態では、パッケージング細胞株を、異種タンパク質をコードする核酸分子および／またはエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸を含有するウイルスベクターゲノムと共に、１つまたは複数のウイルスタンパク質をコードする核酸分子を用いて一過性にトランスフェクトできる。
一部の実施形態では、ウイルスベクターならびにパッケージングおよび／またはヘルパープラスミドは、パッケージング細胞株中にトランスフェクションまたは感染を介して導入される。パッケージング細胞株は、ウイルスベクターゲノムを含有するウイルスベクター粒子を産生する。トランスフェクションまたは感染の方法は周知である。限定されない例として、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストランおよびリポフェクション法、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションが挙げられる。
組換えプラスミドおよびレトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列が特別の細胞株中に導入される場合に（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって、例えば）、パッケージング配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物がウイルス粒子中にパッケージングされることを可能にでき、次いで、培養培地中に分泌され得る。組換えレトロウイルスを含有する培地は、一部の実施形態では、次いで、収集され、適宜、濃縮され、遺伝子導入のために使用される。例えば、一部の態様では、パッケージング細胞株へのパッケージングプラスミドおよびトランスファーベクターの同時トランスフェクション後に、当業者によって使用される標準方法によってウイルスベクター粒子が培養培地から回収され、力価測定される。
一部の実施形態では、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターは、レンチウイルス粒子の生成を可能にするプラスミドの導入によって、パッケージング細胞株、例えば、例示的なＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株において生成され得る。一部の実施形態では、パッケージング細胞は、トランスフェクトされ、ならびに／またはｇａｇおよびｐｏｌをコードするポリヌクレオチドおよび組換え受容体、例えば、抗原受容体、例えば、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、適宜および／もしくはさらにトランスフェクトされる、ならびに／またはｒｅｖタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、適宜および／もしくはさらにトランスフェクトされる、ならびに／または非天然エンベロープ糖タンパク質、例えば、ＶＳＶ－Ｇをコードするポリヌクレオチドを含有する。一部のこのような実施形態では、細胞、例えば、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションのおよそ２日後、細胞上清は、組換えレンチウイルスベクターを含有し、これは回収され、力価測定され得る。
回収され、および／または生成されたレトロウイルスベクター粒子を使用して、記載されたような方法を使用して標的細胞に形質導入できる。ひとたび、標的細胞においてウイルスＲＮＡが逆転写されると、核中に移入され、宿主ゲノム中に安定に統合される。ウイルスＲＮＡの組込みの１日後または２日後に、組換えタンパク質、例えば、ＣＡＲなどの抗原受容体の発現が検出され得る。
一部の実施形態では、提供される方法は、複数の細胞を含む細胞組成物をウイルス粒子と接触させること、例えばインキュベーショすることによって細胞を形質導入する方法を含む。一部の実施形態では、トランスフェクトまたは形質導入される細胞は、対象から得られた一次細胞、例えば対象から濃縮および／または選択された細胞であるか、またはこれを含む。
一部の実施形態では、組成物の形質導入される細胞の濃度は、１．０×１０５細胞／ｍＬ～１．０×１０８細胞／ｍＬまたは約１．０×１０５細胞／ｍＬ～約１．０×１０８細胞／ｍＬ、例えば、少なくとも１．０×１０５細胞／ｍＬ、少なくとも５×１０５細胞／ｍＬ、少なくとも１×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも５×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも１×１０７細胞／ｍＬ、少なくとも５×１０７細胞／ｍＬもしくは少なくとも１×１０８細胞／ｍＬ、または約少なくとも１．０×１０５細胞／ｍＬ、約少なくとも５×１０５細胞／ｍＬ、約少なくとも１×１０６細胞／ｍＬ、約少なくとも５×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも１×１０７細胞／ｍＬ、少なくとも５×１０７細胞／ｍＬもしくは少なくとも１×１０８細胞／ｍＬ、または約１．０×１０５細胞／ｍＬ、少なくとも５×１０５細胞／ｍＬ、少なくとも１×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも５×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも１×１０７細胞／ｍＬ、少なくとも５×１０７細胞／ｍＬもしくは少なくとも１×１０８細胞／ｍＬである。
一部の実施形態では、ウイルス粒子は、形質導入される細胞の総数当たりのウイルスベクター粒子のコピーまたはその感染単位（ＩＵ）のある特定の比率（ＩＵ／細胞）で提供される。例えば、一部の実施形態では、ウイルス粒子は、接触中に細胞１個当たり０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、もしくは６０ＩＵ、または約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約１０、約１５、約２０、約３０、約４０、約５０、もしくは約６０ＩＵ、または少なくとも０．５、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、もしくは少なくとも６０ＩＵ、または少なくとも約０．５、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約もしくは少なくとも約６０ＩＵのウイルスベクター粒子で存在する。
一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子の力価は、１×１０６ＩＵ／ｍｌ～１×１０８ＩＵ／ｍＬまたは約１×１０６ＩＵ／ｍｌ～約１×１０８ＩＵ／ｍＬ、例えば、５×１０６ＩＵ／ｍｌ～５×１０７ＩＵ／ｍＬまたは約５×１０６ＩＵ／ｍｌ～約５×１０７ＩＵ／ｍＬ、例えば、少なくとも６×１０６ＩＵ／ｍＬ、少なくとも７×１０６ＩＵ／ｍＬ、少なくとも８×１０６ＩＵ／ｍＬ、少なくとも９×１０６ＩＵ／ｍＬ、少なくとも１×１０７ＩＵ／ｍＬ、少なくとも２×１０７ＩＵ／ｍＬ、少なくとも３×１０７ＩＵ／ｍＬ、少なくとも４×１０７ＩＵ／ｍＬ、または少なくとも５×１０７ＩＵ／ｍＬである。
一部の実施形態では、形質導入は、１００未満、例えば一般に６０未満、５０未満、４０未満、３０未満、２０未満、１０未満、５未満またはそれより低い感染多重度（ＭＯＩ）で達成することができる。
一部の実施形態では、方法は、細胞をウイルス粒子と接触させることまたはインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、接触は、３０分間～７２時間、例えば、３０分間～４８時間、３０分間～２４時間または１時間～２４時間、例えば、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間もしくはそれ以上、または約少なくとも３０分間、約少なくとも１時間、約少なくとも２時間、約少なくとも６時間、約少なくとも１２時間、約少なくとも２４時間、約少なくとも３６時間もしくはそれ以上、または約３０分間、約１時間、約２時間、約６時間、約１２時間、約２４時間、約３６時間もしくはそれ以上である。
一部の実施形態では、接触は溶液中で行われる。一部の実施形態では、細胞およびウイルス粒子は、０．５ｍＬ～５００ｍまたは約０．５ｍＬ～約５００ｍＬ、例えば、０．５ｍＬ～２００ｍＬ、０．５ｍＬ～１００ｍＬ、０．５ｍＬ～５０ｍＬ、０．５ｍＬ～１０ｍＬ、０．５ｍＬ～５ｍＬ、５ｍＬ～５００ｍＬ、５ｍＬ～２００ｍＬ、５ｍＬ～１００ｍＬ、５ｍＬ～５０ｍＬ、５ｍＬ～１０ｍＬ、１０ｍＬ～５００ｍＬ、１０ｍＬ～２００ｍＬ、１０ｍＬ～１００ｍＬ、１０ｍＬ～５０ｍＬ、５０ｍＬ～５００ｍＬ、５０ｍＬ～２００ｍＬ、５０ｍＬ～１００ｍＬ、１００ｍＬ～５００ｍＬ、１００ｍＬ～２００ｍＬもしくは２００ｍＬ～５００ｍＬ、または約０．５ｍＬ～約２００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約１００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約５０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約５ｍＬ、約５ｍＬ～約５００ｍＬ、約５ｍＬ～約２００ｍＬ、約５ｍＬ～約１００ｍＬ、約５ｍＬ～約５０ｍＬ、約５ｍＬ～約１０ｍＬ、約１０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１０ｍＬ～約１００ｍＬ、約１０ｍＬ～約５０ｍＬ、約５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約５０ｍＬ～約２００ｍＬ、約５０ｍＬ～約１００ｍＬ、約１００ｍＬ～約５００ｍＬ、約１００ｍＬ～約２００ｍＬもしくは約２００ｍＬ～約５００ｍＬの体積で接触される。
ある特定の実施形態では、インプット細胞は、ウイルスＤＮＡによってコードされた組換え受容体に結合するかまたは該受容体を認識する結合分子を含む粒子と処理され、インキュベートされ、または接触される。
一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子との細胞のインキュベーションは、ウイルスベクター粒子で形質導入された細胞を含むアプトプット組成物をもたらすかまたは生成する。
ｂ．非ウイルスベクター
一部の実施形態では、組換え核酸は、電気穿孔によりＴ細胞に移入される［例えば、Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 and Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437を参照］。一部の実施形態では、組換え核酸は、転位によりＴ細胞に移入される［例えば、Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Malec Ther Nucl Acids 2, e74; and Huang et al. (2009) Methods Mal Biol 506: 115-126を参照］。遺伝物質を免疫細胞に導入し、発現させる他の方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.に記載されているような）、プロトプラスト融合、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション；タングステン粒子促進微粒子銃［Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)］;およびリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈［Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)］が挙げられる。
組換え産物をコードする核酸を移入するための他のアプローチおよびベクターは、例えば、国際特許出願、公開番号：ＷＯ２０１４０５５６６８、および米国特許第７，４４６，１９０号に記載されたものである。
一部の実施形態では、組換え核酸は、トランスポゾンによりＴ細胞に移入される。トランスポゾン（転移因子）は、ゲノム内の１つの遺伝子座から別の遺伝子座へ移動することができるＤＮＡの可動セグメントである。これらの因子は、保存的「カットアンドペースト」機構を介して移動する：トランスポザーゼは、トランスポゾンのその元の位置からの切り出しを触媒し、ゲノム中の他の場所でのその再組込みを促進する。トランスポザーゼ欠損因子は、別のトランスポザーゼ遺伝子によってトランスポザーゼが提供されるならば移動することができる。故に、トランスポゾンは、ウイルス形質導入系を使用することなく外来ＤＮＡを宿主ゲノムに組み込むのに利用することができる。哺乳動物細胞、例えばヒト初代白血球との使用に適したトランスポゾンの例には、スリーピングビューティーおよびピギーバックが挙げられるが、これらに限定されない。
トランスポゾンベースのトランスフェクションは、トランスポザーゼおよびトランスポゾンからなる２成分系である。一部の実施形態では、該系は、付随するトランスポザーゼによって認識される逆方向反復／直列反復（ＩＲ／ＤＲ）配列と隣接している外来ＤＮＡ（本明細書ではカーゴＤＮＡとも呼ばれる）、例えば組換え受容体をコードする遺伝子を含むように操作されたトランスポゾンを含む。一部の実施形態では、非ウイルスプラスミドは、プロモーターの制御下でトランスポザーゼをコードする。宿主細胞へのプラスミドのトランスフェクションはトランスポザーゼの一過性発現をもたらし、故にトランスフェクション後の初期には、トランスポゾンをゲノムＤＮＡに組み込むのに十分なレベルでトランスポザーゼが発現される。一部の実施形態では、トランスポザーゼ自体はゲノムＤＮＡに組み込まれず、それ故にトランスポザーゼの発現は時間と共に減少する。一部の実施形態では、トランスポザーゼ発現は、対応するトランスポゾンを約４時間未満、約８時間未満、約１２時間未満、約２４時間未満、約２日未満、約３日未満、約４日未満、約５日未満、約６日未満、約７日未満、約２週間未満、約３週間未満、約４週間未満、約週間未満、または約８週間未満にわたって組み込むのに十分なレベルで宿主細胞によって発現される。一部の実施形態では、カーゴＤＮＡを切り出すことができる内因性トランスポザーゼを少なくとも宿主は発現しないため、宿主のゲノムに導入されるカーゴＤＮＡは、その後宿主のゲノムから除去されない。
スリーピングビューティー（ＳＢ）は、サケ科の魚のゲノムに含まれる休眠因子から再構築される、トランスポゾンのＴｃ／１マリナースーパーファミリーの合成メンバーである。ＳＢトランスポゾンベースのトランスフェクションは、トランスポザーゼおよび、ＴＡジヌクレオチドへの正確な組込みをもたらす逆方向反復／直列反復（ＩＲ／ＤＲ）配列を含有するトランスポゾンからなる２成分系である。トランスポゾンは、ＩＲ／ＤＲと隣接している目的の発現カセットと共に設計される。ＳＢトランスポザーゼは、スリーピングビューティートランスポゾンのＩＲに位置する特異的な結合部位に結合する。ＳＢトランスポザーゼは、該触媒酵素の結合部位を含む逆方向末端反復と両側で隣接しているカーゴ配列をコードする可動性因子である、トランスポゾン（ＳＢ）の組込みを媒介する。ＳＢが遺伝子配列を脊椎動物染色体にカットアンドペースト機構を通じてＴＡ標的ジヌクレオチドで挿入すると、安定な発現が生じる。この系は、初代ヒト末梢血白血球を含む様々な脊椎動物細胞タイプを操作するのに使用されている。一部の実施形態では、細胞は、カーゴ遺伝子、例えば、ＳＢ ＩＲ配列と隣接している組換え受容体またはＣＡＲをコードする遺伝子を含むＳＢトランスポゾンと接触され、インキュベートされ、および／または処理される。特定の実施形態では、トランスフェクトされる細胞は、ＳＢ ＩＲ配列と隣接しているカーゴ遺伝子、例えばＣＡＲをコードする遺伝子を含むＳＢトランスポゾンを含むプラスミドと接触され、インキュベートされ、および／または処理される。ある特定の実施形態では、プラスミドはさらに、ＳＢ ＩＲ配列と隣接していないＳＢトランスポザーゼをコードする遺伝子を含む。
ピギーバック（ＰＢ）は、カーゴＤＮＡを宿主の、例えばヒトのゲノムＤＮＡに組み込むのに使用することができる別のトランスポゾン系である。ＰＢトランスポザーゼは、トランスポゾンの両端に位置するＰＢトランスポゾン特異的逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を認識し、内容物を元の部位から効率的に移動させ、それらをＴＴＡＡ染色体部位に効率的に組み込む。ＰＢトランスポゾン系は、ＰＢベクターの２つのＩＴＲ間の目的の遺伝子を標的ゲノムに動員できるようにする。ＰＢ系は、初代ヒト細胞を含む様々な脊椎動物細胞タイプを操作するのに使用されている。一部の実施形態では、トランスフェクトされる細胞は、ＰＢ ＩＲ配列と隣接しているカーゴ遺伝子、例えばＣＡＲをコードする遺伝子を含むＰＢトランスポゾンと接触され、インキュベートされ、および／または処理される。特定の実施形態では、トランスフェクトされる細胞は、ＰＢ ＩＲ配列と隣接しているカーゴ遺伝子、例えばＣＡＲをコードする遺伝子を含むＰＢトランスポゾンを含むプラスミドと接触され、インキュベートされ、および／または処理される。ある特定の実施形態では、プラスミドはさらに、ＰＢ ＩＲ配列と隣接していないＳＢトランスポザーゼをコードする遺伝子を含む。
一部の実施形態では、対象の方法において使用されるトランスポゾン／トランスポザーゼの様々なエレメント、例えばＳＢまたはＰＢベクターは、制限酵素切断、ライゲーションおよび分子クローニングの標準的な方法によって作製することができる。対象のベクターを構築するための１つのプロトコールは、以下の工程を含む。まず、所望の成分のヌクレオチド配列および外来配列を含有する精製された核酸断片が、最初の供給源、例えば、トランスポザーゼ遺伝子を含むベクター由来の制限エンドヌクレアーゼにより切断される。次いで、所望のヌクレオチド配列を含有する断片が、従来の分離方法を使用して、例えばアガロースゲル電気泳動によって、異なるサイズの不要な断片から分離される。所望の断片がゲルから切り出され、所望の配列、例えば、上に記載の対象のベクターの様々なエレメントに対応する配列を含有する環状核酸またはプラスミドが作製されるように、適切な立体配置で互いにライゲーションされる。所望する場合、そのように構築された環状分子は、次いで原核生物宿主、例えば大腸菌で増幅される。これらの工程に含まれる切断、プラスミド構築、細胞形質転換およびプラスミド生成の手順は当業者に周知であり、制限およびライゲーションに必要とされる酵素は市販されている。［例えば、Ｒ． Ｗｕ， Ｅｄ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ６８， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． （１９７９）；Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８２）；カタログ１９８２－８３、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；カタログ１９８２－８３、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．を参照。対象の方法において使用されるベクターの構築方法の例は、以下の実験の節で提供される。代表的なスリーピングビューティートランスポゾン系の調製は、ＷＯ９８／４０５１０およびＷＯ９９／２５８１７にも開示されている］。
一部の実施形態では、トランスポゾンによる形質導入は、トランスポザーゼ遺伝子を含むプラスミド、およびトランスポザーゼによって認識される逆方向反復／直列反復（ＩＲ／ＤＲ）配列と隣接しているカーゴＤＮＡ配列を含有するトランスポゾンを含むプラスミドを用いて行われる。ある特定の実施形態では、カーゴＤＮＡ配列は、異種タンパク質、例えば、組換えＴ細胞受容体またはＣＡＲをコードする。一部の実施形態では、プラスミドは、トランスポザーゼおよびトランスポゾンを含む。一部の実施形態では、トランスポザーゼは、ユビキタスプロモーター、または標的細胞でのトランスポザーゼの発現を駆動するのに適した任意のプロモーターの制御下にある。ユビキタスプロモーターには、ＥＦ１ａ、ＣＭＢ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトβ－アクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、ＵＡＳ、Ａｃ５、ＣａＭＫＩＩａ、およびＵ６が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、カーゴＤＮＡは、ゲノムＤＮＡへのカーゴＤＮＡの安定な組込みを有する細胞の選択を可能にする選択カセットを含む。適切な選択カセットには、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、およびポリミキシンＢ耐性遺伝子をコードする選択カセットが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、トランスポゾンにより形質導入するための成分、例えば、ＳＢトランスポザーゼおよびＳＢトランスポゾンを含むプラスミドが標的細胞に導入される。標的細胞の位置に応じて、標的細胞への系の成分のインビトロまたはインビボでの導入を提供することができる、任意の簡便なプロトコールが使用され得る。例えば、標的細胞が単離細胞である場合、系は、標的細胞の生存能を許容する細胞培養条件下で、例えば、標準的な形質転換法を使用して細胞に直接導入されてもよい。そのような手法には：ウイルス感染、形質転換、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、電気穿孔、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ウイルスベクターデリバリー等が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。方法の選択は、一般に、形質転換される細胞のタイプ、および形質転換が行われる環境（すなわち、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）に依存する。これらの方法の一般的な考察は、Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995に見出すことができる。
一部の実施形態では、ＳＢトランスポゾンおよびＳＢトランスポザーゼ供給源は、トランスポゾンを担持するベクターからの逆方向反復隣接核酸の切り出し、および標的細胞のゲノムへの切り出された核酸のその後の組込みに十分な条件下で、多細胞生物、例えば、哺乳動物またはヒトの標的細胞に導入される。一部の実施形態は、必要なトランスポザーゼ活性が、導入されたトランスポゾンと共に標的細胞に存在することを確保する工程をさらに含む。トランスポゾンベクター自体の構造、すなわち、トランスポザーゼ活性を有する産物をコードする領域をベクターが含むか否かに応じて、方法は、必要なトランスポザーゼ活性をコードする第２のベクターを標的細胞に導入することをさらに含み得る。
一部の実施形態では、細胞に導入されるトランスポゾンを含むベクター核酸の量およびトランスポザーゼをコードするベクター核酸の量は、所望の切り出しおよび標的細胞ゲノムへのトランスポゾン核酸の挿入をもたらすのに十分である。かくして、導入されるベクター核酸の量は、標的細胞に挿入されることが望まれる十分な量のトランスポザーゼ活性および核酸の十分なコピー数を提供するはずである。標的細胞に導入されるベクター核酸の量は、使用される特定の導入プロトコール、例えば、使用される特定のエクスビボ投与プロトコールの効率に応じて異なる。
ベクターＤＮＡが必要なトランスポザーゼと組み合わせて標的細胞に侵入すると、逆方向反復と隣接しているベクターの核酸領域、すなわち、スリーピングビューティートランスポザーゼによって認識される逆方向反復の間に位置するベクター核酸は、提供されたトランスポザーゼを介してベクターから切り出され、標的化細胞のゲノムに挿入される。かくして、標的細胞へのベクターＤＮＡの導入に続いて、その後のトランスポザーゼ媒介切り出しと、ベクターによって運ばれる外因性核酸の、標的化細胞のゲノムへの挿入が起こる。特定の実施形態では、ベクターは、ＳＢトランスポゾンおよび／またはＳＢトランスポザーゼでトランスフェクトされる細胞の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％のゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、標的細胞ゲノムへの核酸の組込みは安定であり、すなわち、ベクター核酸は、一過性の期間を超えて標的細胞ゲノム中に存在したままであり、染色体遺伝物質の一部が標的細胞の子孫に受け継がれる。
ある特定の実施形態では、トランスポゾンは、様々なサイズの核酸、すなわちポリヌクレオチドを標的細胞ゲノムに組み込むのに使用される。一部の実施形態では、対象の方法を使用して標的細胞ゲノムに挿入されるＤＮＡのサイズは、約０．１ｋｂ～２００ｋｂ、約０．５ｋｂ～１００ｋｂ、約１．０ｋｂ～約８．０ｋｂ、約１．０～約２００ｋｂ、約１．０～約１０ｋｂ、約１０ｋｂ～約５０ｋｂ、約５０ｋｂ～約１００ｋｂ、または約１００ｋｂ～約２００ｋｂにわたる。一部の実施形態では、対象の方法を使用して標的細胞ゲノムに挿入されるＤＮＡのサイズは、約１．０ｋｂ～約８．０ｋｂにわたる。一部の実施形態では、対象の方法を使用して標的細胞ゲノムに挿入されるＤＮＡのサイズは、約１．０～約２００ｋｂにわたる。特定の実施形態では、対象の方法を使用して標的細胞ゲノムに挿入されるＤＮＡのサイズは、約１．０ｋｂ～約８．０ｋｂにわたる。
Ｄ．細胞の培養および／または拡大
一部の実施形態では、提供される方法は、細胞を培養するための、例えば、増殖および／または拡大を促進する条件下で細胞を培養するための１つまたは複数の工程を含む。一部の実施形態では、細胞は、遺伝子操作する工程、例えば、組換えポリペプチドを形質導入またはトランスフェクションによって細胞に導入する工程に続いて、増殖および／または拡大を促進する条件下で培養される。特定の実施形態では、細胞は、刺激条件下でインキュベートされ、組換えポリヌクレオチド、例えば、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドで形質導入またはトランスフェクトされた後に培養される。一部の実施形態では、培養は、濃縮Ｔ細胞の１つまたは複数の培養組成物を生成する。
ある特定の実施形態では、刺激Ｔ細胞および形質導入Ｔ細胞を含む濃縮Ｔ細胞の１つまたは複数の組成物、例えば、そのようなＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の別々の組成物が、例えば、細胞を製剤化する前に、増殖および／または拡大を促進する条件下で培養される。一部の態様では、増殖および／または拡大の促進などのための培養の方法は、節Ｉ－Ｆなど、本明細書に提供される方法を含む。特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の１つまたは複数の組成物は、１つまたは複数の組成物が操作された後、例えば、形質導入またはトランスフェクトされた後に培養される。特定の実施形態では、１つまたは複数の組成物は操作された組成物である。特定の実施形態では、１つまたは複数の操作された組成物は前もって低温凍結および保管されており、培養の前に解凍される。
ある特定の実施形態では、操作されたＴ細胞の１つまたは複数の組成物は、濃縮Ｔ細胞の２つの別々の組成物であるか、またはこれを含む。特定の実施形態では、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）と共に導入される濃縮Ｔ細胞の２つの別々の組成物、例えば、同じ生体試料から選択、単離、および／または濃縮された濃縮Ｔ細胞の２つの別々の組成物は、細胞の増殖および／または拡大を促進する条件下で別々に培養される。一部の実施形態では、条件は刺激条件である。ある特定の実施形態では、２つの別々の組成物は、濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞、例えば、組換え受容体をコードする核酸と共に導入され、および／または組換え受容体を発現する操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物を含む。特定の実施形態では、２つの別々の組成物は、濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞、例えば、組換え受容体をコードする核酸と共に導入され、および／または組換え受容体を発現する操作されたＣＤ８＋ Ｔ細胞の組成物を含む。一部の実施形態では、濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞および濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞、例えば、操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞および操作されたＣＤ８＋ Ｔ細胞の２つの別々の組成物は、例えば増殖および／または拡大を促進する条件下で別々に培養される。一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の単一組成物が培養される。ある特定の実施形態では、単一組成物は濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物である。一部の実施形態では、単一組成物は、培養の前に別々の組成物から組み合わされた濃縮ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の組成物である。
一部の実施形態では、例えば増殖および／または拡大を促進する条件下で培養される濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物、例えば操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または１００％もしくは約１００％のＣＤ４＋ Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、組成物は、組換え受容体を発現する、および／または組換え受容体をコードする組換えポリヌクレオチドで形質導入もしくはトランスフェクトされている、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または１００％もしくは約１００％のＣＤ４＋ Ｔ細胞を含む。ある特定の実施形態では、培養される濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物は、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満、または０．０１％未満のＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む、および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞を含有しない、および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞がないかもしくは実質的にない。
一部の実施形態では、例えば増殖および／または拡大を促進する条件下で培養される濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞、例えば操作されたＣＤ８＋ Ｔ細胞の組成物は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または１００％もしくは約１００％のＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む。特定の実施形態では、組成物は、組換え受容体を発現する、および／または組換え受容体をコードする組換えポリヌクレオチドで形質導入もしくはトランスフェクトされている、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または１００％もしく約１００％のＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む。ある特定の実施形態では、刺激条件下でインキュベートされる濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞の組成物は、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満、もしくは０．０１％未満のＣＤ４＋ Ｔ細胞を含む、および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞を含有しない、および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞がないかもしくは実質的にない。
一部の実施形態では、濃縮ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の別々の組成物、例えば、操作されたＣＤ４＋および操作されたＣＤ８＋ Ｔ細胞の別々の組成物は、単一組成物へと組み合わされ、例えば増殖および／または拡大を促進する条件下で培養される。特定の実施形態では、濃縮ＣＤ４＋および濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞の別々の培養組成物は、培養が行われた、および／または完了した後に単一組成物へと組み合わされる。特定の実施形態では、濃縮ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の別々の組成物、例えば、操作されたＣＤ４＋および操作されたＣＤ８＋ Ｔ細胞の別々の組成物は、例えば増殖および／または拡大を促進する条件下で別々に培養される。
一部の実施形態では、細胞、例えば操作された細胞は、１００ｍＬ、２００ｍＬ、３００ｍＬ、４００ｍＬ、５００ｍＬ、６００ｍＬ、７００ｍＬ、８００ｍＬ、９００ｍＬ、１，０００ｍＬ、１，２００ｍＬ、１，４００ｍＬ、１，６００ｍＬ、１，８００ｍＬ、２，０００ｍＬ、２，２００ｍＬ、もしくは２，４００ｍＬである、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１，０００ｍＬ、約１，２００ｍＬ、約１，４００ｍＬ、約１，６００ｍＬ、約１，８００ｍＬ、約２，０００ｍＬ、約２，２００ｍＬ、もしくは約２，４００ｍＬである、または少なくとも１００ｍＬ、少なくとも２００ｍＬ、少なくとも３００ｍＬ、少なくとも４００ｍＬ、少なくとも５００ｍＬ、少なくとも６００ｍＬ、少なくとも７００ｍＬ、少なくとも８００ｍＬ、少なくとも９００ｍＬ、少なくとも１，０００ｍＬ、少なくとも１，２００ｍＬ、少なくとも１，４００ｍＬ、少なくとも１，６００ｍＬ、少なくとも１，８００ｍＬ、少なくとも２，０００ｍＬ、少なくとも２，２００ｍＬ、もしくは少なくとも２，４００ｍＬである培地の体積で培養される。一部の実施形態では、細胞は、後で異なる体積に調整される初期体積で培養される。特定の実施形態では、体積は後で培養中に調整される。特定の実施形態では、体積は培養中に初期体積から増量される。ある特定の実施形態では、体積は、培養中に細胞が密度を達成すると増量される。ある特定の実施形態では、初期体積は５００ｍＬであるか、または約５００ｍＬである。
特定の実施形態では、体積は、培養中に細胞が密度または濃度を達成すると初期体積から増量される。特定の実施形態では、細胞が０．１×１０６細胞／ｍｌ、０．２×１０６細胞／ｍｌ、０．４×１０６細胞／ｍｌ、０．６×１０６細胞／ｍｌ、０．８×１０６細胞／ｍｌ、１×１０６細胞／ｍｌ、１．２×１０６細胞／ｍｌ、１．４×１０６細胞／ｍｌ、１．６×１０６細胞／ｍｌ、１．８×１０６細胞／ｍｌ、２．０×１０６細胞／ｍｌ、２．５×１０６細胞／ｍｌ、３．０×１０６細胞／ｍｌ、３．５×１０６細胞／ｍｌ、４．０×１０６細胞／ｍｌ、４．５×１０６細胞／ｍｌ、５．０×１０６細胞／ｍｌ、６×１０６細胞／ｍｌ、８×１０６細胞／ｍｌ、もしくは１０×１０６細胞／ｍｌ、約０．１×１０６細胞／ｍｌ、約０．２×１０６細胞／ｍｌ、約０．４×１０６細胞／ｍｌ、約０．６×１０６細胞／ｍｌ、約０．８×１０６細胞／ｍｌ、約１×１０６細胞／ｍｌ、約１．２×１０６細胞／ｍｌ、約１．４×１０６細胞／ｍｌ、約１．６×１０６細胞／ｍｌ、約１．８×１０６細胞／ｍｌ、約２．０×１０６細胞／ｍｌ、約２．５×１０６細胞／ｍｌ、約３．０×１０６細胞／ｍｌ、約３．５×１０６細胞／ｍｌ、約４．０×１０６細胞／ｍｌ、約４．５×１０６細胞／ｍｌ、約５．０×１０６細胞／ｍｌ、約６×１０６細胞／ｍｌ、約８×１０６細胞／ｍｌ、もしくは約１０×１０６細胞／ｍｌ、または少なくとも０．１×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも０．２×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも０．４×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも０．６×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも０．８×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．２×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．４×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．６×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．８×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも２．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも２．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも３．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも３．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも４．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも４．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも５．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０６細胞／ｍｌ、もしくは少なくとも１０×１０６細胞／ｍｌの密度および／または濃度を達成すると増量される。一部の実施形態では、体積は、細胞が０．６×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも０．６×１０６細胞／ｍｌ、または約０．６×１０６細胞／ｍｌの密度および／または濃度を達成すると、体積は初期体積から増量される。一部の実施形態では、密度および／または濃度は、培養物中の生細胞の密度および／または濃度である。特定の実施形態では、細胞が０．１×１０６生細胞／ｍｌ、０．２×１０６生細胞／ｍｌ、０．４×１０６生細胞／ｍｌ、０．６×１０６生細胞／ｍｌ、０．８×１０６生細胞／ｍｌ、１×１０６生細胞／ｍｌ、１．２×１０６生細胞／ｍｌ、１．４×１０６生細胞／ｍｌ、１．６×１０６生細胞／ｍｌ、１．８×１０６生細胞／ｍｌ、２．０×１０６生細胞／ｍｌ、２．５×１０６生細胞／ｍｌ、３．０×１０６生細胞／ｍｌ、３．５×１０６生細胞／ｍｌ、４．０×１０６生細胞／ｍｌ、４．５×１０６生細胞／ｍｌ、５．０×１０６生細胞／ｍｌ、６×１０６生細胞／ｍｌ、８×１０６生細胞／ｍｌ、もしくは１０×１０６生細胞／ｍｌ、約０．１×１０６生細胞／ｍｌ、約０．２×１０６生細胞／ｍｌ、約０．４×１０６生細胞／ｍｌ、約０．６×１０６生細胞／ｍｌ、約０．８×１０６生細胞／ｍｌ、約１×１０６生細胞／ｍｌ、約１．２×１０６生細胞／ｍｌ、約１．４×１０６生細胞／ｍｌ、約１．６×１０６生細胞／ｍｌ、約１．８×１０６生細胞／ｍｌ、約２．０×１０６生細胞／ｍｌ、約２．５×１０６生細胞／ｍｌ、約３．０×１０６生細胞／ｍｌ、約３．５×１０６生細胞／ｍｌ、約４．０×１０６生細胞／ｍｌ、約４．５×１０６生細胞／ｍｌ、約５．０×１０６生細胞／ｍｌ、約６×１０６生細胞／ｍｌ、約８×１０６生細胞／ｍｌ、もしくは約１０×１０６生細胞／ｍｌ、または少なくとも０．１×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも０．２×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも０．４×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも０．６×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも０．８×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも１．２×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも１．４×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも１．６×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも１．８×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも２．０×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも２．５×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも３．０×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも３．５×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも４．０×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも４．５×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも５．０×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０６生細胞／ｍｌ、もしくは少なくとも１０×１０６生細胞／ｍｌの密度および／または濃度を達成すると増量される。一部の実施形態では、体積は、生細胞が０．６×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも０．６×１０６生細胞／ｍｌ、または約０．６×１０６生細胞／ｍｌの密度および／または濃度を達成すると、体積は初期体積から増量される。一部の実施形態では、細胞または生細胞の密度および／または濃度は、デジタルホログラフィー顕微鏡法（ＤＨＭ）または微分デジタルホログラフィー顕微鏡法（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｇｉｔａｌ ｈｏｌｏｇｒａｐｈｙ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（ＤＤＨＭ）を含む光学的方法を含む、記載されている方法の使用などによって、培養中に決定またはモニタリングすることができる。
一部の実施形態では、細胞は密度および／または濃度を達成し、体積は１００ｍＬ、２００ｍＬ、３００ｍＬ、４００ｍＬ、５００ｍＬ、６００ｍＬ、７００ｍＬ、８００ｍＬ、９００ｍＬ、１，０００ｍＬ、１，２００ｍＬ、１，４００ｍＬ、１，６００ｍＬ、１，８００ｍＬ、２，０００ｍＬ、２，２００ｍＬもしくは２，４００ｍＬ、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１，０００ｍＬ、約１，２００ｍＬ、約１，４００ｍＬ、約１，６００ｍＬ、約１，８００ｍＬ、約２，０００ｍＬ、約２，２００ｍＬもしくは約２，４００ｍＬ、または少なくとも１００ｍＬ、少なくとも２００ｍＬ、少なくとも３００ｍＬ、少なくとも４００ｍＬ、少なくとも５００ｍＬ、少なくとも６００ｍＬ、少なくとも７００ｍＬ、少なくとも８００ｍＬ、少なくとも９００ｍＬ、少なくとも１，０００ｍＬ、少なくとも１，２００ｍＬ、少なくとも１，４００ｍＬ、少なくとも１，６００ｍＬ、少なくとも１，８００ｍＬ、少なくとも２，０００ｍＬ、少なくとも２，２００ｍＬもしくは少なくとも２，４００ｍＬ増量される。一部の実施形態では、体積は５００ｍＬ増量される。特定の実施形態では、体積は、５００ｍＬ、６００ｍＬ、７００ｍＬ、８００ｍＬ、９００ｍＬ、１，０００ｍＬ、１，２００ｍＬ、１，４００ｍＬ、１，６００ｍＬ、１，８００ｍＬ、２，０００ｍＬ、２，２００ｍＬもしくは２，４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１，０００ｍＬ、約１，２００ｍＬ、約１，４００ｍＬ、約１，６００ｍＬ、約１，８００ｍＬ、約２，０００ｍＬ、約２，２００ｍＬもしくは約２，４００ｍＬ、または少なくとも５００ｍＬ、少なくとも６００ｍＬ、少なくとも７００ｍＬ、少なくとも８００ｍＬ、少なくとも９００ｍＬ、少なくとも１，０００ｍＬ、少なくとも１，２００ｍＬ、少なくとも１，４００ｍＬ、少なくとも１，６００ｍＬ、少なくとも１，８００ｍＬ、少なくとも２，０００ｍＬ、少なくとも２，２００ｍＬもしくは少なくとも２，４００ｍＬの体積に増量される。ある特定の実施形態では、体積は１，０００ｍＬの体積に増量される。ある特定の実施形態では、体積は１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０分ごとに、５ｍＬ、１０ｍＬ、２０ｍＬ、２５ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、６０ｍＬ、７０ｍＬ、７５ｍＬ、８０ｍＬ、９０ｍＬ、もしくは１００ｍＬ、少なくとも５ｍＬ、少なくとも１０ｍＬ、少なくとも２０ｍＬ、少なくとも２５ｍＬ、少なくとも３０ｍＬ、少なくとも４０ｍＬ、少なくとも５０ｍＬ、少なくとも６０ｍＬ、少なくとも７０ｍＬ、少なくとも７５ｍＬ、少なくとも８０ｍＬ、少なくとも９０ｍＬ、もしくは少なくとも１００ｍＬ、または約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約２０ｍＬ、約２５ｍＬ、約３０ｍＬ、約４０ｍＬ、約５０ｍＬ、約６０ｍＬ、約７０ｍＬ、約７５ｍＬ、約８０ｍＬ、約９０ｍＬ、もしくは約１００ｍＬの速度で増量される。ある特定の実施形態では、速度は８分ごとに５０ｍＬであるか、または８分ごとに約５０ｍＬである。
一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞、例えば操作されたＴ細胞の組成物は、増殖および／または拡大を促進する条件下で培養される。一部の実施形態では、そのような条件は、集団での細胞の増殖、拡大、活性化、および／または生存を誘導するように設計され得る。特定の実施形態では、刺激条件には、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、薬剤、例えば、栄養分、アミノ酸、抗生物質、イオン、および／または刺激因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、ならびに細胞の成長、分裂、および／または拡大を促進するように設計された任意の他の薬剤のうちの１つまたは複数を挙げることができる。
一部の実施形態では、培養は、ヒトＴリンパ球などの初代免疫細胞の成長に適した温度、例えば、少なくとも摂氏約２５度、一般に少なくとも約３０度、および一般に摂氏３７度または摂氏約３７度を一般に含む条件下で行われる。一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、２５～３８℃、例えば３０～３７℃の温度、例えば３７℃±２℃または約３７℃±２℃でインキュベートされる。一部の実施形態では、インキュベーションは、培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）、例えば培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）または拡大が、細胞の所望のまたは閾値の密度、濃度、数または用量をもたらすまでの期間実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）、例えば培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）または拡大が、生細胞の所望のまたは閾値の密度、濃度、数または用量をもたらすまでの期間実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、２４時間超、４８時間超、７２時間超、９６時間超、５日間超、６日間超、７日間超、８日間超、９日間超もしくはそれ以上、または約２４時間超、約４８時間超、約７２時間超、約９６時間超、約５日間超、約６日間超、約７日間超、約８日間超、約９日間超もしくはそれ以上、または２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間もしくはそれ以上、または約２４時間、約４８時間、約７２時間、約９６時間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間もしくはそれ以上である。一部の実施形態では、細胞の密度、濃度および／または数または用量は、デジタルホログラフィー顕微鏡法（ＤＨＭ）または微分デジタルホログラフィー顕微鏡法（ＤＤＨＭ）を含む光学的方法を含む、記載されている方法の使用などによって、培養中に決定またはモニタリングすることができる。
一部の実施形態では、刺激試薬は、培養の前に細胞から除去および／または分離される。ある特定の実施形態では、刺激剤は、操作の後、操作された細胞を増殖および／または拡大を促進する、例えば条件下で培養する前に、細胞から除去および／または分離される。一部の実施形態では、刺激試薬は、本明細書において、例えば節Ｉ－Ｂ－１に記載されている刺激試薬である。特定の実施形態では、刺激試薬は、本明細書において、例えば節Ｉ－Ｂ－２に記載されているように細胞から除去および／または分離される。
特定の実施形態では、操作されたＴ細胞などの濃縮Ｔ細胞の組成物、例えば、操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞および操作されたＣＤ８＋ Ｔ細胞の別々の組成物は、１つまたは複数のサイトカインの存在下で培養される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは組換えサイトカインである。特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインはヒト組換えサイトカインである。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、Ｔ細胞によって発現される、および／またはＴ細胞に対して内因性である受容体に結合する、および／または結合することができる。特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、サイトカインの４－アルファ－ヘリックスバンドルファミリーのメンバーであるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、サイトカインの４－アルファ－ヘリックスバンドルファミリーのメンバーには、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、ＩＬ－１５であるか、またはこれを含む。特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、ＩＬ－７であるか、またはこれを含む。特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、組換えＩＬ－２であるか、またはこれを含む。
特定の実施形態では、操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞などの濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物は、組換えＩＬ－２と共に培養される。一部の実施形態では、操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞などの濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物を組換えＩＬ－２の存在下で培養することは、組成物のＣＤ４＋ Ｔ細胞が、培養工程中およびプロセス全体を通して生存、成長、拡大、および／または活性化し続ける可能性または確率を高める。一部の実施形態では、操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞などの濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物を組換えＩＬ－２の存在下で培養することは、濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞、例えば、細胞療法に適した操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞のアウトプット組成物が、濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物から生成される可能性および／または確率を、濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物を組換えＩＬ－２の存在下で培養しない代替のおよび／または例示的な方法と比較して少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、または少なくとも２００％ ＣＤ４＋高める。
一部の実施形態では、操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞および操作されたＣＤ８＋ Ｔ細胞の別々の組成物などの細胞は、サイトカイン、例えば組換えヒトサイトカインと共に、１ＩＵ／ｍｌ～２，０００ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌ～１００ＩＵ／ｍｌ、５０ＩＵ／ｍｌ～５００ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ～２００ＩＵ／ｍｌ、５００ＩＵ／ｍｌ～１４００ＩＵ／ｍｌ、２５０ＩＵ／ｍｌ～５００ＩＵ／ｍｌ、または５００ＩＵ／ｍｌ～２，５００ＩＵ／ｍｌの濃度で培養される。
一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物、例えば、操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の別々の組成物は、組換えＩＬ－２、例えばヒト組換えＩＬ－２と共に、２ＩＵ／ｍｌ～５００ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌ～２５０ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ～５００ＩＵ／ｍｌ、または１００ＩＵ／ｍｌ～４００ＩＵ／ｍｌの濃度で培養される。特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、ＩＬ－２と共に５０ＩＵ／ｍｌ、７５ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ、１２５ＩＵ／ｍｌ、１５０ＩＵ／ｍｌ、１７５ＩＵ／ｍｌ、２００ＩＵ／ｍｌ、２２５ＩＵ／ｍｌ、２５０ＩＵ／ｍｌ、３００ＩＵ／ｍｌ、もしくは４００ＩＵ／ｍｌ、または約５０ＩＵ／ｍｌ、約７５ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ、約１２５ＩＵ／ｍｌ、約１５０ＩＵ／ｍｌ、約１７５ＩＵ／ｍｌ、約２００ＩＵ／ｍｌ、約２２５ＩＵ／ｍｌ、約２５０ＩＵ／ｍｌ、約３００ＩＵ／ｍｌ、もしくは約４００ＩＵ／ｍｌの濃度で培養される。一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、組換えＩＬ－２と共に２００ＩＵ／ｍｌの濃度で培養される。一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物、例えば、操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物である。特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞の組成物、例えば、操作されたＣＤ８＋ Ｔ細胞の組成物である。
一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物、例えば、操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の別々の組成物は、ＩＬ－７、例えばヒト組換えＩＬ－７と共に、１０ＩＵ／ｍｌ～５，０００ＩＵ／ｍｌ、５００ＩＵ／ｍｌ～２，０００ＩＵ／ｍｌ、６００ＩＵ／ｍｌ～１，５００ＩＵ／ｍｌ、５００ＩＵ／ｍｌ～２，５００ＩＵ／ｍｌ、７５０ＩＵ／ｍｌ～１，５００ＩＵ／ｍｌ、または１，０００ＩＵ／ｍｌ～２，０００ＩＵ／ｍｌの濃度で培養される。特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、ＩＬ－７と共に１００ＩＵ／ｍｌ、２００ＩＵ／ｍｌ、３００ＩＵ／ｍｌ、４００ＩＵ／ｍｌ、５００ＩＵ／ｍｌ、６００ＩＵ／ｍｌ、７００ＩＵ／ｍｌ、８００ＩＵ／ｍｌ、９００ＩＵ／ｍｌ、１，０００ＩＵ／ｍｌ、１，２００ＩＵ／ｍｌ、１，４００ＩＵ／ｍｌ、もしくは１，６００ＩＵ／ｍｌ、または約１００ＩＵ／ｍｌ、約２００ＩＵ／ｍｌ、約３００ＩＵ／ｍｌ、約４００ＩＵ／ｍｌ、約５００ＩＵ／ｍｌ、約６００ＩＵ／ｍｌ、約７００ＩＵ／ｍｌ、約８００ＩＵ／ｍｌ、約９００ＩＵ／ｍｌ、約１，０００ＩＵ／ｍｌ、約１，２００ＩＵ／ｍｌ、約１，４００ＩＵ／ｍｌ、もしくは約１，６００ＩＵ／ｍｌの濃度で培養される。一部の実施形態では、細胞は、組換えＩＬ－７の存在下、１，２００ＩＵ／ｍｌまたは約１，２００ＩＵ／ｍｌの濃度で培養される。一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞などの濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物である。
一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物、例えば、操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の別々の組成物は、ＩＬ－１５、例えばヒト組換えＩＬ－１５と共に、０．１ＩＵ／ｍｌ～２００ＩＵ／ｍｌ、１ＩＵ／ｍｌ～５０ＩＵ／ｍｌ、５ＩＵ／ｍｌ～２５ＩＵ／ｍｌ、２５ＩＵ／ｍｌ～５０ＩＵ／ｍｌ、５ＩＵ／ｍｌ～１５ＩＵ／ｍｌ、または１０ＩＵ／ｍｌ～１００ＩＵ／ｍｌの濃度で培養される。特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、ＩＬ－１５と共に約１ＩＵ／ｍｌ、２ＩＵ／ｍｌ、３ＩＵ／ｍｌ、４ＩＵ／ｍｌ、５ＩＵ／ｍｌ、６ＩＵ／ｍｌ、７ＩＵ／ｍｌ、８ＩＵ／ｍｌ、９ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌ、１１ＩＵ／ｍｌ、１２ＩＵ／ｍｌ、１３ＩＵ／ｍｌ、１４ＩＵ／ｍｌ、１５ＩＵ／ｍｌ、２０ＩＵ／ｍｌ、２５ＩＵ／ｍｌ、３０ＩＵ／ｍｌ、４０ＩＵ／ｍｌ、５０ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ、もしくは２００ＩＵ／ｍｌ、または約１ＩＵ／ｍｌ、約２ＩＵ／ｍｌ、約３ＩＵ／ｍｌ、約４ＩＵ／ｍｌ、約５ＩＵ／ｍｌ、約６ＩＵ／ｍｌ、約７ＩＵ／ｍｌ、約８ＩＵ／ｍｌ、約９ＩＵ／ｍｌ、約１０ＩＵ／ｍｌ、約１１ＩＵ／ｍｌ、約１２ＩＵ／ｍｌ、約１３ＩＵ／ｍｌ、約１４ＩＵ／ｍｌ、約１５ＩＵ／ｍｌ、約２０ＩＵ／ｍｌ、約２５ＩＵ／ｍｌ、約３０ＩＵ／ｍｌ、約４０ＩＵ／ｍｌ、約５０ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ、もしくは約２００ＩＵ／ｍｌの濃度で培養される。特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、組換えＩＬ－１５と共に２０ＩＵ／ｍｌの濃度で培養される。一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞などの濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物である。特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、操作されたＣＤ８＋ Ｔ細胞などの濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞の組成物である。
特定の実施形態では、操作されたＣＤ８＋ Ｔ細胞などの濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞の組成物は、記載されているような量などのＩＬ－２および／またはＩＬ－１５の存在下で培養される。ある特定の実施形態では、操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞などの濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物は、記載されているような量などのＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５の存在下で培養される。一部の実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５は、組換えである。ある特定の実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５は、ヒトである。特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、ヒト組換えＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５であるか、またはこれらを含む。
特定の実施形態では、培養は閉鎖系で行われる。ある特定の実施形態では、培養は滅菌条件下の閉鎖系で行われる。特定の実施形態では、培養は、提供された系の１つまたは複数の工程と同じ閉鎖系で行われる。一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は閉鎖系から取り出され、培養用のバイオリアクターに入れられ、および／または接続される。培養用の適切なバイオリアクターの例には、ＧＥ Ｘｕｒｉ Ｗ２５、ＧＥ Ｘｕｒｉ Ｗ５、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＢｉｏＳＴＡＴ ＲＭ ２０ ｜ ５０、Ｆｉｎｅｓｓｅ ＳｍａｒｔＲｏｃｋｅｒ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、およびＰａｌｌ ＸＲＳ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、バイオリアクターは、培養工程の少なくとも一部の間に、細胞を灌流および／または混合するのに使用される。
一部の実施形態では、閉じ込められ、接続されている間に培養された細胞、および／またはバイオリアクターの制御下で培養された細胞は、バイオリアクターなしで培養された細胞、例えば、混合、揺動、運動、および／または灌流なしなどの静的条件下で培養された細胞より迅速に培養中に拡大する。一部の実施形態では、閉じ込められ、接続されている間に培養された細胞、および／またはバイオリアクターの制御下で培養された細胞は、１４日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日、６０時間、４８時間、３６時間、２４時間、または１２時間以内に閾値の拡大、細胞計数、および／または密度に達するか、またはそれらを達成する。一部の実施形態では、閉じ込められ、接続されている間に培養された細胞、および／またはバイオリアクターの制御下で培養された細胞は、細胞が閉じ込められ、接続されている間に培養されない、および／またはバイオリアクターの制御下で培養されない例示的なおよび／または代替のプロセスで培養された細胞より、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、閾値の拡大、細胞計数、および／または密度に達するか、またはそれらを達成する。
一部の実施形態では、混合は、揺動および／または運動であるか、またはこれらを含む。一部の例では、バイオリアクターは運動または揺動に供されてもよく、これは一部の態様では酸素移動を増加させることができる。バイオリアクターの運動は、水平軸に沿った回転、垂直軸に沿った回転、バイオリアクターの傾いたもしくは傾斜した水平軸に沿った揺動運動、またはそれらの任意の組合せが挙げられ得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、インキュベーションの少なくとも一部は揺動により実施される。揺動速度および揺動角度は、所望の撹拌を達成するように調整することができる。一部の実施形態では揺動角度は、２０°、１９°、１８°、１７°、１６°、１５°、１４°、１３°、１２°、１１°、１０°、９°、８°、７°、６°、５°、４°、３°、２°または１°である。ある特定の実施形態では、揺動角度は６～１６°である。他の実施形態では、揺動角度は７～１６°である。他の実施形態では、揺動角度は８～１２°である。一部の実施形態では、揺動速度は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１ １２、１３、１４ １５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ｒｐｍである。一部の実施形態では、揺動速度は、４～１２ｒｐｍ、例えば４ｒｐｍ以上６ｒｐｍ以下である。
一部の実施形態では、バイオリアクターは、０．０１Ｌ／分、０．０５Ｌ／分、０．１Ｌ／分、０．２Ｌ／分、０．３Ｌ／分、０．４Ｌ／分、０．５Ｌ／分、１．０Ｌ／分、１．５Ｌ／分、もしくは２．０Ｌ／分もしくは２．０Ｌ／分超、または約０．０１Ｌ／分、約０．０５Ｌ／分、約０．１Ｌ／分、約０．２Ｌ／分、約０．３Ｌ／分、約０．４Ｌ／分、約０．５Ｌ／分、約１．０Ｌ／分、約１．５Ｌ／分、もしくは約２．０Ｌ／分もしくは約２．０Ｌ／分超、または少なくとも０．０１Ｌ／分、少なくとも０．０５Ｌ／分、少なくとも０．１Ｌ／分、少なくとも０．２Ｌ／分、少なくとも０．３Ｌ／分、少なくとも０．４Ｌ／分、少なくとも０．５Ｌ／分、少なくとも１．０Ｌ／分、少なくとも１．５Ｌ／分、もしくは少なくとも２．０Ｌ／分もしくは少なくとも２．０Ｌ／分超の定常気流で３７℃または３７℃付近の温度、および５％または５％付近のＣＯ２レベルを維持する。ある特定の実施形態では、培養の少なくとも一部は、例えば培養の開始に関するタイミングおよび／または培養細胞の密度に応じて、灌流により、例えば、２９０ｍｌ／日、５８０ｍｌ／日、および／または１１６０ｍｌ／日の速度で行われる。一部の実施形態では、細胞培養拡大の少なくとも一部は、揺動運動により、例えば５°～１０°、例えば６°の角度で、５～１５ｒｐｍ、例えば６ｒｐｍまたは１０ｒｐｍの速度などの一定の揺動速度で行われる。
一部の実施形態では、培養工程の少なくとも一部は、一定の灌流、例えば遅い定常速度の灌流下で行われる。一部の実施形態では、灌流は、液体、例えば使用された培地の流出および新鮮な培地の流入であるか、またはこれを含む。ある特定の実施形態では、灌流は、使用された培地を新鮮な培地と交換する。一部の実施形態では、培養の少なくとも一部は、灌流下、１００ｍｌ／日、２００ｍｌ／日、２５０ｍｌ／日、２７５ｍｌ／日、２９０ｍｌ／日、３００ｍｌ／日、３５０ｍｌ／日、４００ｍｌ／日、４５０ｍｌ／日、５００ｍｌ／日、５５０ｍｌ／日、５７５ｍｌ／日、５８０ｍｌ／日、６００ｍｌ／日、６５０ｍｌ／日、７００ｍｌ／日、７５０ｍｌ／日、８００ｍｌ／日、８５０ｍｌ／日、９００ｍｌ／日、９５０ｍｌ／日、１０００ｍｌ／日、１１００ｍｌ／日、１１６０ｍｌ／日、１２００ｍｌ／日、１４００ｍｌ／日、１６００ｍｌ／日、１８００ｍｌ／日、２０００ｍｌ／日、２２００ｍｌ／日、もしくは２４００ｍｌ／日、または約１００ｍｌ／日、約２００ｍｌ／日、約２５０ｍｌ／日、約２７５ｍｌ／日、約２９０ｍｌ／日、約３００ｍｌ／日、約３５０ｍｌ／日、約４００ｍｌ／日、約４５０ｍｌ／日、約５００ｍｌ／日、約５５０ｍｌ／日、約５７５ｍｌ／日、約５８０ｍｌ／日、約６００ｍｌ／日、約６５０ｍｌ／日、約７００ｍｌ／日、約７５０ｍｌ／日、約８００ｍｌ／日、約８５０ｍｌ／日、約９００ｍｌ／日、約９５０ｍｌ／日、約１０００ｍｌ／日、約１１００ｍｌ／日、約１１６０ｍｌ／日、約１２００ｍｌ／日、約１４００ｍｌ／日、約１６００ｍｌ／日、約１８００ｍｌ／日、約２０００ｍｌ／日、約２２００ｍｌ／日、もしくは約２４００ｍｌ／日、または少なくとも１００ｍｌ／日、少なくとも２００ｍｌ／日、少なくとも２５０ｍｌ／日、少なくとも２７５ｍｌ／日、少なくとも２９０ｍｌ／日、少なくとも３００ｍｌ／日、少なくとも３５０ｍｌ／日、少なくとも４００ｍｌ／日、少なくとも４５０ｍｌ／日、少なくとも５００ｍｌ／日、少なくとも５５０ｍｌ／日、少なくとも５７５ｍｌ／日、少なくとも５８０ｍｌ／日、少なくとも６００ｍｌ／日、少なくとも６５０ｍｌ／日、少なくとも７００ｍｌ／日、少なくとも７５０ｍｌ／日、少なくとも８００ｍｌ／日、少なくとも８５０ｍｌ／日、少なくとも９００ｍｌ／日、少なくとも９５０ｍｌ／日、少なくとも１０００ｍｌ／日、少なくとも１１００ｍｌ／日、少なくとも１１６０ｍｌ／日、少なくとも１２００ｍｌ／日、少なくとも１４００ｍｌ／日、少なくとも１６００ｍｌ／日、少なくとも１８００ｍｌ／日、少なくとも２０００ｍｌ／日、少なくとも２２００ｍｌ／日、もしくは少なくとも２４００ｍｌ／日の定常速度で行われる。
特定の実施形態では、培養は灌流なしの条件下で開始され、灌流は一定および／または所定の時間後、例えば、培養の始まりまたは開始の１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、もしくは７２時間超後、または約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、約７２時間、もしくは約７２時間超後、または少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、もしくは少なくとも７２時間超後に開始される。特定の実施形態では、細胞の密度または濃度が一定または所定の密度または濃度に達すると、灌流が開始される。一部の実施形態では、培養細胞が、０．１×１０６細胞／ｍｌ、０．２×１０６細胞／ｍｌ、０．４×１０６細胞／ｍｌ、０．６×１０６細胞／ｍｌ、０．８×１０６細胞／ｍｌ、１×１０６細胞／ｍｌ、１．２×１０６細胞／ｍｌ、１．４×１０６細胞／ｍｌ、１．６×１０６細胞／ｍｌ、１．８×１０６細胞／ｍｌ、２．０×１０６細胞／ｍｌ、２．５×１０６細胞／ｍｌ、３．０×１０６細胞／ｍｌ、３．５×１０６細胞／ｍｌ、４．０×１０６細胞／ｍｌ、４．５×１０６細胞／ｍｌ、５．０×１０６細胞／ｍｌ、６×１０６細胞／ｍｌ、８×１０６細胞／ｍｌ、もしくは１０×１０６細胞／ｍｌ、約０．１×１０６細胞／ｍｌ、約０．２×１０６細胞／ｍｌ、約０．４×１０６細胞／ｍｌ、約０．６×１０６細胞／ｍｌ、約０．８×１０６細胞／ｍｌ、約１×１０６細胞／ｍｌ、約１．２×１０６細胞／ｍｌ、約１．４×１０６細胞／ｍｌ、約１．６×１０６細胞／ｍｌ、約１．８×１０６細胞／ｍｌ、約２．０×１０６細胞／ｍｌ、約２．５×１０６細胞／ｍｌ、約３．０×１０６細胞／ｍｌ、約３．５×１０６細胞／ｍｌ、約４．０×１０６細胞／ｍｌ、約４．５×１０６細胞／ｍｌ、約５．０×１０６細胞／ｍｌ、約６×１０６細胞／ｍｌ、約８×１０６細胞／ｍｌ、もしくは約１０×１０６細胞／ｍｌ、または少なくとも０．１×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも０．２×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも０．４×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも０．６×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも０．８×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．２×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．４×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．６×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．８×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも２．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも２．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも３．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも３．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも４．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも４．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも５．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０６細胞／ｍｌ、もしくは少なくとも１０×１０６細胞／ｍｌの密度または濃度に達すると、灌流が開始される。特定の実施形態では、生細胞の密度または濃度が一定または所定の密度または濃度に達すると、灌流が開始される。一部の実施形態では、培養生細胞が、０．１×１０６生細胞／ｍｌ、０．２×１０６生細胞／ｍｌ、０．４×１０６生細胞／ｍｌ、０．６×１０６生細胞／ｍｌ、０．８×１０６生細胞／ｍｌ、１×１０６生細胞／ｍｌ、１．２×１０６生細胞／ｍｌ、１．４×１０６生細胞／ｍｌ、１．６×１０６生細胞／ｍｌ、１．８×１０６生細胞／ｍｌ、２．０×１０６生細胞／ｍｌ、２．５×１０６生細胞／ｍｌ、３．０×１０６生細胞／ｍｌ、３．５×１０６生細胞／ｍｌ、４．０×１０６生細胞／ｍｌ、４．５×１０６生細胞／ｍｌ、５．０×１０６生細胞／ｍｌ、６×１０６生細胞／ｍｌ、８×１０６生細胞／ｍｌ、もしくは１０×１０６生細胞／ｍｌ、約０．１×１０６生細胞／ｍｌ、約０．２×１０６生細胞／ｍｌ、約０．４×１０６生細胞／ｍｌ、約０．６×１０６生細胞／ｍｌ、約０．８×１０６生細胞／ｍｌ、約１×１０６生細胞／ｍｌ、約１．２×１０６生細胞／ｍｌ、約１．４×１０６生細胞／ｍｌ、約１．６×１０６生細胞／ｍｌ、約１．８×１０６生細胞／ｍｌ、約２．０×１０６生細胞／ｍｌ、約２．５×１０６生細胞／ｍｌ、約３．０×１０６生細胞／ｍｌ、約３．５×１０６生細胞／ｍｌ、約４．０×１０６生細胞／ｍｌ、約４．５×１０６生細胞／ｍｌ、約５．０×１０６生細胞／ｍｌ、約６×１０６生細胞／ｍｌ、約８×１０６生細胞／ｍｌ、もしくは約１０×１０６生細胞／ｍｌ、または少なくとも０．１×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも０．２×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも０．４×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも０．６×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも０．８×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも１．２×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも１．４×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも１．６×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも１．８×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも２．０×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも２．５×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも３．０×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも３．５×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも４．０×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも４．５×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも５．０×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０６生細胞／ｍｌ、もしくは少なくとも１０×１０６生細胞／ｍｌの密度または濃度に達すると、灌流が開始される。
特定の実施形態では、灌流は培養中に異なる速さで行われる。例えば、一部の実施形態では、灌流の速度は培養細胞の密度および／または濃度に依存する。ある特定の実施形態では、灌流の速度は、細胞が一定または所定の密度または濃度に達すると増加される。灌流速度は変化し得、例えば、培養中に１つの一定の灌流速度から増加した一定の灌流速度に、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、５倍超、１０倍超、１５倍超、２０倍超、２５倍超、５０倍超、または１００倍超変化し得る。一部の実施形態では、一定の灌流速度は、細胞が０．６×１０６細胞／ｍｌ、０．８×１０６細胞／ｍｌ、１×１０６細胞／ｍｌ、１．２×１０６細胞／ｍｌ、１．４×１０６細胞／ｍｌ、１．６×１０６細胞／ｍｌ、１．８×１０６細胞／ｍｌ、２．０×１０６細胞／ｍｌ、２．５×１０６細胞／ｍｌ、３．０×１０６細胞／ｍｌ、３．５×１０６細胞／ｍｌ、４．０×１０６細胞／ｍｌ、４．５×１０６細胞／ｍｌ、５．０×１０６細胞／ｍｌ、６×１０６細胞／ｍｌ、８×１０６細胞／ｍｌ、もしくは１０×１０６細胞／ｍｌ、約０．６×１０６細胞／ｍｌ、約０．８×１０６細胞／ｍｌ、約１×１０６細胞／ｍｌ、約１．２×１０６細胞／ｍｌ、約１．４×１０６細胞／ｍｌ、約１．６×１０６細胞／ｍｌ、約１．８×１０６細胞／ｍｌ、約２．０×１０６細胞／ｍｌ、約２．５×１０６細胞／ｍｌ、約３．０×１０６細胞／ｍｌ、約３．５×１０６細胞／ｍｌ、約４．０×１０６細胞／ｍｌ、約４．５×１０６細胞／ｍｌ、約５．０×１０６細胞／ｍｌ、約６×１０６細胞／ｍｌ、約８×１０６細胞／ｍｌ、もしくは約１０×１０６細胞／ｍｌ、または少なくとも０．６×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも０．８×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．２×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．４×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．６×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．８×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも２．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも２．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも３．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも３．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも４．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも４．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも５．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０６細胞／ｍｌ、もしくは少なくとも１０×１０６細胞／ｍｌの一定または所定の細胞密度または濃度に達すると増加する。一部の実施形態では、一定の灌流速度は、細胞が０．６×１０６生細胞／ｍｌ、０．８×１０６生細胞／ｍｌ、１×１０６生細胞／ｍｌ、１．２×１０６生細胞／ｍｌ、１．４×１０６生細胞／ｍｌ、１．６×１０６生細胞／ｍｌ、１．８×１０６生細胞／ｍｌ、２．０×１０６生細胞／ｍｌ、２．５×１０６生細胞／ｍｌ、３．０×１０６生細胞／ｍｌ、３．５×１０６生細胞／ｍｌ、４．０×１０６生細胞／ｍｌ、４．５×１０６生細胞／ｍｌ、５．０×１０６生細胞／ｍｌ、６×１０６生細胞／ｍｌ、８×１０６生細胞／ｍｌ、もしくは１０×１０６生細胞／ｍｌ、約０．６×１０６生細胞／ｍｌ、約０．８×１０６生細胞／ｍｌ、約１×１０６生細胞／ｍｌ、約１．２×１０６生細胞／ｍｌ、約１．４×１０６生細胞／ｍｌ、約１．６×１０６生細胞／ｍｌ、約１．８×１０６生細胞／ｍｌ、約２．０×１０６生細胞／ｍｌ、約２．５×１０６生細胞／ｍｌ、約３．０×１０６生細胞／ｍｌ、約３．５×１０６生細胞／ｍｌ、約４．０×１０６生細胞／ｍｌ、約４．５×１０６生細胞／ｍｌ、約５．０×１０６生細胞／ｍｌ、約６×１０６生細胞／ｍｌ、約８×１０６生細胞／ｍｌ、もしくは約１０×１０６生細胞／ｍｌ、または少なくとも０．６×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも０．８×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも１．２×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも１．４×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも１．６×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも１．８×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも２．０×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも２．５×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも３．０×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも３．５×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも４．０×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも４．５×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも５．０×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０６生細胞／ｍｌ、もしくは少なくとも１０×１０６生細胞／ｍｌの一定または所定の生細胞密度または濃度に達すると増加する。一部の実施形態では、培養中の、例えば灌流下の細胞または生細胞の密度および／または濃度は、デジタルホログラフィー顕微鏡法（ＤＨＭ）または微分デジタルホログラフィー顕微鏡法（ＤＤＨＭ）を含む光学的方法を含む、記載されている方法の使用などによって決定またはモニタリングすることができる。
一部の実施形態では、培養は灌流なしの条件下で開始され、細胞の密度または濃度が一定または所定の密度または濃度に達すると、灌流が開始される。一部の実施形態では、細胞の密度または濃度が一定または所定の密度または濃度に達すると、１００ｍｌ／日、２００ｍｌ／日、２５０ｍｌ／日、２７５ｍｌ／日、２９０ｍｌ／日、３００ｍｌ／日、３５０ｍｌ／日、４００ｍｌ／日、４５０ｍｌ／日、５００ｍｌ／日、５５０ｍｌ／日、５７５ｍｌ／日、５８０ｍｌ／日、６００ｍｌ／日、６５０ｍｌ／日、７００ｍｌ／日、７５０ｍｌ／日、８００ｍｌ／日、８５０ｍｌ／日、９００ｍｌ／日、９５０ｍｌ／日、１０００ｍｌ／日、１１００ｍｌ／日、１１６０ｍｌ／日、１２００ｍｌ／日、１４００ｍｌ／日、１６００ｍｌ／日、１８００ｍｌ／日、２０００ｍｌ／日、２２００ｍｌ／日、もしくは２４００ｍｌ／日、約１００ｍｌ／日、約２００ｍｌ／日、約２５０ｍｌ／日、約２７５ｍｌ／日、約２９０ｍｌ／日、約３００ｍｌ／日、約３５０ｍｌ／日、約４００ｍｌ／日、約４５０ｍｌ／日、約５００ｍｌ／日、約５５０ｍｌ／日、約５７５ｍｌ／日、約５８０ｍｌ／日、約６００ｍｌ／日、約６５０ｍｌ／日、約７００ｍｌ／日、約７５０ｍｌ／日、約８００ｍｌ／日、約８５０ｍｌ／日、約９００ｍｌ／日、約９５０ｍｌ／日、約１０００ｍｌ／日、約１１００ｍｌ／日、約１１６０ｍｌ／日、約１２００ｍｌ／日、約１４００ｍｌ／日、約１６００ｍｌ／日、約１８００ｍｌ／日、約２０００ｍｌ／日、約２２００ｍｌ／日、もしくは約２４００ｍｌ／日、または少なくとも１００ｍｌ／日、少なくとも２００ｍｌ／日、少なくとも２５０ｍｌ／日、少なくとも２７５ｍｌ／日、少なくとも２９０ｍｌ／日、少なくとも３００ｍｌ／日、少なくとも３５０ｍｌ／日、少なくとも４００ｍｌ／日、少なくとも４５０ｍｌ／日、少なくとも５００ｍｌ／日、少なくとも５５０ｍｌ／日、少なくとも５７５ｍｌ／日、少なくとも５８０ｍｌ／日、少なくとも６００ｍｌ／日、少なくとも６５０ｍｌ／日、少なくとも７００ｍｌ／日、少なくとも７５０ｍｌ／日、少なくとも８００ｍｌ／日、少なくとも８５０ｍｌ／日、少なくとも９００ｍｌ／日、少なくとも９５０ｍｌ／日、少なくとも１０００ｍｌ／日、少なくとも１１００ｍｌ／日、少なくとも１１６０ｍｌ／日、少なくとも１２００ｍｌ／日、少なくとも１４００ｍｌ／日、少なくとも１６００ｍｌ／日、少なくとも１８００ｍｌ／日、少なくとも２０００ｍｌ／日、少なくとも２２００ｍｌ／日、もしくは少なくとも２４００ｍｌ／日の速度で灌流が開始される。一部の実施形態では、培養細胞または培養生細胞が、０．１×１０６細胞／ｍｌ、０．２×１０６細胞／ｍｌ、０．４×１０６細胞／ｍｌ、０．６×１０６細胞／ｍｌ、０．８×１０６細胞／ｍｌ、１×１０６細胞／ｍｌ、１．２×１０６細胞／ｍｌ、１．４×１０６細胞／ｍｌ、１．６×１０６細胞／ｍｌ、１．８×１０６細胞／ｍｌ、２．０×１０６細胞／ｍｌ、２．５×１０６細胞／ｍｌ、３．０×１０６細胞／ｍｌ、３．５×１０６細胞／ｍｌ、４．０×１０６細胞／ｍｌ、４．５×１０６細胞／ｍｌ、５．０×１０６細胞／ｍｌ、６×１０６細胞／ｍｌ、８×１０６細胞／ｍｌ、もしくは１０×１０６細胞／ｍｌ、約０．１×１０６細胞／ｍｌ、約０．２×１０６細胞／ｍｌ、約０．４×１０６細胞／ｍｌ、約０．６×１０６細胞／ｍｌ、約０．８×１０６細胞／ｍｌ、約１×１０６細胞／ｍｌ、約１．２×１０６細胞／ｍｌ、約１．４×１０６細胞／ｍｌ、約１．６×１０６細胞／ｍｌ、約１．８×１０６細胞／ｍｌ、約２．０×１０６細胞／ｍｌ、約２．５×１０６細胞／ｍｌ、約３．０×１０６細胞／ｍｌ、約３．５×１０６細胞／ｍｌ、約４．０×１０６細胞／ｍｌ、約４．５×１０６細胞／ｍｌ、約５．０×１０６細胞／ｍｌ、約６×１０６細胞／ｍｌ、約８×１０６細胞／ｍｌ、もしくは約１０×１０６細胞／ｍｌ、または少なくとも０．１×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも０．２×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも０．４×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも０．６×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも０．８×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．２×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．４×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．６×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．８×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも２．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも２．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも３．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも３．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも４．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも４．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも５．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０６細胞／ｍｌ、もしくは少なくとも１０×１０６細胞／ｍｌの密度または濃度に達すると、灌流が開始される。
ある特定の実施形態では、培養の少なくとも一部は、ある特定の速度の灌流により行われ、灌流速度は、細胞の密度または濃度が一定または所定の密度または濃度に達すると、１００ｍｌ／日、２００ｍｌ／日、２５０ｍｌ／日、２７５ｍｌ／日、２９０ｍｌ／日、３００ｍｌ／日、３５０ｍｌ／日、４００ｍｌ／日、４５０ｍｌ／日、５００ｍｌ／日、５５０ｍｌ／日、５７５ｍｌ／日、５８０ｍｌ／日、６００ｍｌ／日、６５０ｍｌ／日、７００ｍｌ／日、７５０ｍｌ／日、８００ｍｌ／日、８５０ｍｌ／日、９００ｍｌ／日、９５０ｍｌ／日、１０００ｍｌ／日、１１００ｍｌ／日、１１６０ｍｌ／日、１２００ｍｌ／日、１４００ｍｌ／日、１６００ｍｌ／日、１８００ｍｌ／日、２０００ｍｌ／日、２２００ｍｌ／日、もしくは２４００ｍｌ／日、約１００ｍｌ／日、約２００ｍｌ／日、約２５０ｍｌ／日、約２７５ｍｌ／日、約２９０ｍｌ／日、約３００ｍｌ／日、約３５０ｍｌ／日、約４００ｍｌ／日、約４５０ｍｌ／日、約５００ｍｌ／日、約５５０ｍｌ／日、約５７５ｍｌ／日、約５８０ｍｌ／日、約６００ｍｌ／日、約６５０ｍｌ／日、約７００ｍｌ／日、約７５０ｍｌ／日、約８００ｍｌ／日、約８５０ｍｌ／日、約９００ｍｌ／日、約９５０ｍｌ／日、約１０００ｍｌ／日、約１１００ｍｌ／日、約１１６０ｍｌ／日、約１２００ｍｌ／日、約１４００ｍｌ／日、約１６００ｍｌ／日、約１８００ｍｌ／日、約２０００ｍｌ／日、約２２００ｍｌ／日、もしくは約２４００ｍｌ／日、または少なくとも１００ｍｌ／日、少なくとも２００ｍｌ／日、少なくとも２５０ｍｌ／日、少なくとも２７５ｍｌ／日、少なくとも２９０ｍｌ／日、少なくとも３００ｍｌ／日、少なくとも３５０ｍｌ／日、少なくとも４００ｍｌ／日、少なくとも４５０ｍｌ／日、少なくとも５００ｍｌ／日、少なくとも５５０ｍｌ／日、少なくとも５７５ｍｌ／日、少なくとも５８０ｍｌ／日、少なくとも６００ｍｌ／日、少なくとも６５０ｍｌ／日、少なくとも７００ｍｌ／日、少なくとも７５０ｍｌ／日、少なくとも８００ｍｌ／日、少なくとも８５０ｍｌ／日、少なくとも９００ｍｌ／日、少なくとも９５０ｍｌ／日、少なくとも１０００ｍｌ／日、少なくとも１１００ｍｌ／日、少なくとも１１６０ｍｌ／日、少なくとも１２００ｍｌ／日、少なくとも１４００ｍｌ／日、少なくとも１６００ｍｌ／日、少なくとも１８００ｍｌ／日、少なくとも２０００ｍｌ／日、少なくとも２２００ｍｌ／日、もしくは少なくとも２４００ｍｌ／日に増加される。一部の実施形態では、培養細胞または培養生細胞が、０．１×１０６細胞／ｍｌ、０．２×１０６細胞／ｍｌ、０．４×１０６細胞／ｍｌ、０．６×１０６細胞／ｍｌ、０．８×１０６細胞／ｍｌ、１×１０６細胞／ｍｌ、１．２×１０６細胞／ｍｌ、１．４×１０６細胞／ｍｌ、１．６×１０６細胞／ｍｌ、１．８×１０６細胞／ｍｌ、２．０×１０６細胞／ｍｌ、２．５×１０６細胞／ｍｌ、３．０×１０６細胞／ｍｌ、３．５×１０６細胞／ｍｌ、４．０×１０６細胞／ｍｌ、４．５×１０６細胞／ｍｌ、５．０×１０６細胞／ｍｌ、６×１０６細胞／ｍｌ、８×１０６細胞／ｍｌ、もしくは１０×１０６細胞／ｍｌ、約０．１×１０６細胞／ｍｌ、約０．２×１０６細胞／ｍｌ、約０．４×１０６細胞／ｍｌ、約０．６×１０６細胞／ｍｌ、約０．８×１０６細胞／ｍｌ、約１×１０６細胞／ｍｌ、約１．２×１０６細胞／ｍｌ、約１．４×１０６細胞／ｍｌ、約１．６×１０６細胞／ｍｌ、約１．８×１０６細胞／ｍｌ、約２．０×１０６細胞／ｍｌ、約２．５×１０６細胞／ｍｌ、約３．０×１０６細胞／ｍｌ、約３．５×１０６細胞／ｍｌ、約４．０×１０６細胞／ｍｌ、約４．５×１０６細胞／ｍｌ、約５．０×１０６細胞／ｍｌ、約６×１０６細胞／ｍｌ、約８×１０６細胞／ｍｌ、もしくは約１０×１０６細胞／ｍｌ、または少なくとも０．１×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも０．２×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも０．４×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも０．６×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも０．８×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．２×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．４×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．６×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．８×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも２．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも２．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも３．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも３．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも４．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも４．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも５．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０６細胞／ｍｌ、もしくは少なくとも１０×１０６細胞／ｍｌの密度または濃度に達すると、灌流が開始される。一部の実施形態では、細胞が３００ｍＬ、４００ｍＬ、５００ｍＬ、６００ｍＬ、７００ｍＬ、８００ｍＬ、９００ｍＬ、もしくは１０００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、もしくは約１０００ｍＬ、または少なくとも３００ｍＬ、少なくとも４００ｍＬ、少なくとも５００ｍＬ、少なくとも６００ｍＬ、少なくとも７００ｍＬ、少なくとも８００ｍＬ、少なくとも９００ｍＬ、もしくは少なくとも１０００ｍＬの体積で培養される場合に灌流が行われる。一部の実施形態では、体積は１０００ｍＬである。
ある特定の実施形態では、培養は、灌流なしかまたはある特定の速度の灌流のいずれかによる条件下で開始され、細胞の密度または濃度が０．６１×１０６細胞／ｍｌ、約０．６１×１０６細胞／ｍｌ、または少なくとも０．６１×１０６細胞／ｍｌの濃度に達すると、灌流速度が２９０ｍｌ／日、約２９０ｍｌ／日、または少なくとも２９０ｍｌ／日に増加される。ある特定の実施形態では、細胞が１０００ｍＬ、約１０００ｍＬ、または少なくとも１０００ｍＬの体積で培養される場合、細胞の密度または濃度が０．６１×１０６細胞／ｍｌ、約０．６１×１０６細胞／ｍｌ、または少なくとも０．６１×１０６細胞／ｍｌの濃度に達すると、細胞は２９０ｍｌ／日、約２９０ｍｌ／日、または少なくとも２９０ｍｌ／日の速度で灌流される。一部の実施形態では、細胞の密度または濃度が０．８１×１０６細胞／ｍｌ、約０．８１×１０６細胞／ｍｌ、または少なくとも０．８１×１０６細胞／ｍｌの濃度に達すると、灌流速度は５８０ｍｌ／日、約５８０ｍｌ／日、または少なくとも５８０ｍｌ／日に増加される。ある特定の実施形態では、細胞の密度または濃度が１．０１×１０６細胞／ｍｌ、約１．０１×１０６細胞／ｍｌ、または少なくとも１．０１×１０６細胞／ｍｌの濃度に達すると、灌流速度は１１６０ｍｌ／日、約１１６０ｍｌ／日、または少なくとも１１６０ｍｌ／日に増加される。一部の実施形態では、細胞の密度または濃度が１．２×１０６細胞／ｍｌ、約１．２×１０６細胞／ｍｌ、または少なくとも１．２×１０６細胞／ｍｌの濃度に達すると、灌流速度は１１６０ｍｌ／日、約１１６０ｍｌ／日、または少なくとも１１６０ｍｌ／日に増加される。
提供された実施形態の態様では、本明細書および上に記載の灌流が開始または増加されるタイミングを含む灌流の速度は、培養中に細胞の密度および／もしくは濃度を評価する、または生細胞の密度および／もしくは濃度を評価することから決定される。一部の実施形態では、細胞の密度および／または濃度は、デジタルホログラフィー顕微鏡法（ＤＨＭ）または微分デジタルホログラフィー顕微鏡法（ＤＤＨＭ）を含む光学的方法を含む、記載されている方法を使用して決定することができる。
一部の実施形態では、操作されたＴ細胞、例えば、操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞または操作されたＣＤ８＋ Ｔ細胞などの濃縮細胞の組成物は、界面活性剤の存在下で培養される。特定の実施形態では、組成物の細胞を培養することは、培養中、例えば、混合、揺動、運動、および／または灌流により生じ得るせん断応力の量を低減する。特定の実施形態では、操作されたＴ細胞、例えば、操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞または操作されたＣＤ８＋ Ｔ細胞などの濃縮Ｔ細胞の組成物は、界面活性剤と共に培養され、培養中または培養が完了した少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、または７日超後に、Ｔ細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％が生存し、例えば、生存可能であり、および／または壊死、プログラム細胞死、もしくはアポトーシスを起こさない。特定の実施形態では、操作されたＴ細胞、例えば、操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞または操作されたＣＤ８＋ Ｔ細胞などの濃縮細胞の組成物は、界面活性剤の存在下で培養され、細胞の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満または０．０１％ 未満が、せん断応力またはせん断誘発応力などによる細胞死、例えば、プログラム細胞死、アポトーシス、および／または壊死を起こさない。
特定の実施形態では、操作されたＴ細胞、例えば、操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞または操作されたＣＤ８＋ Ｔ細胞などの濃縮細胞の組成物は、０．１μｌ／ｍｌ～１０．０μｌ／ｍｌ、０．２μｌ／ｍｌ～２．５μｌ／ｍｌ、０．５μｌ／ｍｌ～５μｌ／ｍｌ、１μｌ／ｍｌ～３μｌ／ｍｌ、または２μｌ／ｍｌ～４μｌ／ｍｌの界面活性剤の存在下で培養される。一部の実施形態では、操作されたＴ細胞、例えば、操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞または操作されたＣＤ８＋ Ｔ細胞などの濃縮細胞の組成物は、０．１μｌ／ｍｌ、０．２μｌ／ｍｌ、０．４μｌ／ｍｌ、０．６μｌ／ｍｌ、０．８μｌ／ｍｌ、１μｌ／ｍｌ、１．５μｌ／ｍｌ、２μｌ／ｍｌ、２．５μｌ／ｍｌ、５μｌ／ｍｌ、１０μｌ／ｍｌ、２５μｌ／ｍｌ、もしくは５０μｌ／ｍｌ、約０．１μｌ／ｍｌ、約０．２μｌ／ｍｌ、約０．４μｌ／ｍｌ、約０．６μｌ／ｍｌ、約０．８μｌ／ｍｌ、約１μｌ／ｍｌ、約１．５μｌ／ｍｌ、約２μｌ／ｍｌ、約２．５μｌ／ｍｌ、約５μｌ／ｍｌ、約１０μｌ／ｍｌ、約２５μｌ／ｍｌ、もしくは約５０μｌ／ｍｌ、または少なくとも０．１μｌ／ｍｌ、少なくとも０．２μｌ／ｍｌ、少なくとも０．４μｌ／ｍｌ、少なくとも０．６μｌ／ｍｌ、少なくとも０．８μｌ／ｍｌ、少なくとも１μｌ／ｍｌ、少なくとも１．５μｌ／ｍｌ、少なくとも２μｌ／ｍｌ、少なくとも２．５μｌ／ｍｌ、少なくとも５μｌ／ｍｌ、少なくとも１０μｌ／ｍｌ、少なくとも２５μｌ／ｍｌ、もしくは少なくとも５０μｌ／ｍｌの界面活性剤の存在下で培養される。ある特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、２μｌ／ｍｌまたは約２μｌ／ｍｌの界面活性剤の存在下で培養される。
一部の実施形態では、界面活性剤は、液体および／または固体の表面張力を低減する薬剤であるか、またはこれを含む。例えば、界面活性剤には、脂肪アルコール（例えば、ステリルアルコール）、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、またはポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（例えば、ポリソルベート２０、４０、６０）が挙げられる。ある特定の実施形態では界面活性剤は、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）、ポリソルベート２０（ＰＳ２０）、ポロキサマー１８８（Ｐ１８８）からなる群から選択される。例示的な実施形態では、合成流加培地の界面活性剤の濃度は、ＰＳ８０約０．００２５％～約０．２５％（ｖ／ｖ）；ＰＳ２０約０．００２５％～約０．２５％（ｖ／ｖ）；またはＰ１８８約０．１％～約５．０％（ｗ／ｖ）である。
一部の実施形態では、界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、またはそれらに添加される非イオン性界面活性剤であるか、またはこれらを含む。適切なアニオン性界面活性剤には、スルホン酸アルキル、リン酸アルキル、ホスホン酸アルキル、ラウリン酸カリウム、ステアリン酸トリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン硫酸アルキル、アルギン酸ナトリウム、ジオクチルソジウムスルホサクシネート、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸およびそれらの塩、カルボキシメチルセルロースナトリウム、コール酸および他の胆汁酸（例えば、デオキシコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、グリコデオキシコール酸）およびそれらの塩（例えば、デオキシコール酸ナトリウム）が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、適切な非イオン性界面活性剤には：グリセリルエステル、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート）、ポリオキシエレチン脂肪酸エステル、ソルビタンエステル、モノステアリン酸グリセロール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、セチルアルコール、セトステアリルアルコール、ステアリルアルコール、アリールアルキルポリエーテルアルコール、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマー（ポロキサマー）、ポラキサミン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、非結晶性セルロース、デンプンおよびヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）などのデンプン誘導体を含む多糖類、ポリビニルアルコール、およびポリビニルピロリドンが挙げられる。ある特定の実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンコポリマー、好ましくはプロピレングリコールとエチレングリコールのブロックコポリマーである。そのようなポリマーは、商標ＰＯＬＯＸＡＭＥＲの下に販売されている［ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ６８またはＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８とも呼ばれる場合がある］。ポリオキシエチレン脂肪酸エステルの中には、短いアルキル鎖を有するものが含まれる。そのような界面活性剤の１つの例は、ＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標）ＨＳ １５、ポリエチレン－６６０－ヒドロキシステアレートである。
一部の実施形態では、適切なカチオン性界面活性剤には、天然のリン脂質、合成リン脂質、第４級アンモニウム化合物、塩化ベンザルコニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、キトサン、塩化ラウリルジメチルベンジルアンモニウム、塩酸アシルカルニチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジミリストイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジメチルアミノエタンカルバモイルコレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、１，２－ジアシルグリセロ－３－（Ｏ－アルキル）ホスホコリン、Ｏ－アルキルホスファチジルコリン、アルキルピリジニウムハライド、または例えばｎ－オクチルアミンおよびオレイルアミンなどの長鎖アルキルアミンが挙げられ得るが、これらに限定されない。
双性イオン性界面活性剤は電気的に中性であるが、同じ分子内に局所正電荷および負電荷を有する。適切な双性イオン性界面活性剤には、双性イオン性リン脂質が挙げられるが、これに限定されない。適切なリン脂質には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジアシル－グリセロ－ホスホエタノールアミン［ジミリストイル－グリセロ－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイル－グリセロ－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイル－グリセロ－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、およびジオレオリル（ｄｉｏｌｅｏｌｙｌ）－グリセロ－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）など］が挙げられるが、これらに限定されない。アニオン性リン脂質および双性イオン性リン脂質を含むリン脂質の混合物が、本発明では使用され得る。そのような混合物には、リゾリン脂質、卵リン脂質もしくは大豆リン脂質、またはそれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質は、アニオン性、双性イオン性、またはリン脂質の混合物であるかにかかわらず、塩化もしくは脱塩化、水素化もしくは部分的水素化されてもよいか、または天然半合成もしくは合成であってもよい。
ある特定の実施形態では、界面活性剤は、ポロキサマー、例えばポロキサマー１８８である。一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、０．１μｌ／ｍｌ～１０．０μｌ／ｍｌ、０．２μｌ／ｍｌ～２．５μｌ／ｍｌ、０．５μｌ／ｍｌ～５μｌ／ｍｌ、１μｌ／ｍｌ～３μｌ／ｍｌ、または２μｌ／ｍｌ～４μｌ／ｍｌのポロキサマーの存在下で培養される。一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、０．１μｌ／ｍｌ、０．２μｌ／ｍｌ、０．４μｌ／ｍｌ、０．６μｌ／ｍｌ、０．８μｌ／ｍｌ、１μｌ／ｍｌ、１．５μｌ／ｍｌ、２μｌ／ｍｌ、２．５μｌ／ｍｌ、５μｌ／ｍｌ、１０μｌ／ｍｌ、２５μｌ／ｍｌ、もしくは５０μｌ／ｍｌ、約０．１μｌ／ｍｌ、約０．２μｌ／ｍｌ、約０．４μｌ／ｍｌ、約０．６μｌ／ｍｌ、約０．８μｌ／ｍｌ、約１μｌ／ｍｌ、約１．５μｌ／ｍｌ、約２μｌ／ｍｌ、約２．５μｌ／ｍｌ、約５μｌ／ｍｌ、約１０μｌ／ｍｌ、約２５μｌ／ｍｌ、もしくは約５０μｌ／ｍｌ、または少なくとも０．１μｌ／ｍｌ、少なくとも０．２μｌ／ｍｌ、少なくとも０．４μｌ／ｍｌ、少なくとも０．６μｌ／ｍｌ、少なくとも０．８μｌ／ｍｌ、少なくとも１μｌ／ｍｌ、少なくとも１．５μｌ／ｍｌ、少なくとも２μｌ／ｍｌ、少なくとも２．５μｌ／ｍｌ、少なくとも５μｌ／ｍｌ、少なくとも１０μｌ／ｍｌ、少なくとも２５μｌ／ｍｌ、もしくは少なくとも５０μｌ／ｍｌの界面活性剤の存在下で培養される。ある特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の組成物は、２μｌ／ｍｌまたは約２μｌ／ｍｌのポロキサマーの存在下で培養される。
特定の実施形態では、細胞が閾値の量、濃度、および／または拡大を達成すると、細胞の収集などによって培養は終了する。特定の実施形態では、細胞が、例えば培養の始まりまたは開始時点の細胞の密度の量の観点でおよび／または該量に関して、１．５倍の拡大、２倍の拡大、２．５倍の拡大、３倍の拡大、３．５倍の拡大、４倍の拡大、４．５倍の拡大、５倍の拡大、６倍の拡大、７倍の拡大、８倍の拡大、９倍の拡大、１０倍の拡大、もしくは１０倍超の拡大を達成するか、または約もしくは少なくとも１．５倍の拡大、２倍の拡大、２．５倍の拡大、３倍の拡大、３．５倍の拡大、４倍の拡大、４．５倍の拡大、５倍の拡大、６倍の拡大、７倍の拡大、８倍の拡大、９倍の拡大、１０倍の拡大、もしくは１０倍超の拡大を達成すると、培養は終了する。一部の実施形態では、閾値拡大は、例えば培養の始まりまたは開始時点の細胞の密度の量の観点でおよび／または該量に関して、４倍の拡大である。
一部の実施形態では、細胞が細胞の閾値総量、例えば閾値細胞計数を達成すると、細胞の収集などによって培養は終了する。一部の実施形態では、細胞が閾値総有核細胞（ＴＮＣ）数を達成すると、培養は終了する。一部の実施形態では、細胞が細胞の閾値生存量、例えば閾値生細胞計数を達成すると、培養は終了する。一部の実施形態では、閾値細胞計数は、５０×１０６細胞、１００×１０６細胞、２００×１０６細胞、３００×１０６細胞、４００×１０６細胞、６００×１０６細胞、８００×１０６細胞、１０００×１０６細胞、１２００×１０６細胞、１４００×１０６細胞、１６００×１０６細胞、１８００×１０６細胞、２０００×１０６細胞、２５００×１０６細胞、３０００×１０６細胞、４０００×１０６細胞、５０００×１０６細胞、１０，０００×１０６細胞、１２，０００×１０６細胞、１５，０００×１０６細胞もしくは２０，０００×１０６細胞であるか、または約５０×１０６細胞、約１００×１０６細胞、約２００×１０６細胞、約３００×１０６細胞、約４００×１０６細胞、約６００×１０６細胞、約８００×１０６細胞、約１０００×１０６細胞、約１２００×１０６細胞、約１４００×１０６細胞、約１６００×１０６細胞、約１８００×１０６細胞、約２０００×１０６細胞、約２５００×１０６細胞、約３０００×１０６細胞、約４０００×１０６細胞、約５０００×１０６細胞、約１０，０００×１０６細胞、約１２，０００×１０６細胞、約１５，０００×１０６細胞もしくは約２０，０００×１０６細胞であるか、または少なくとも５０×１０６細胞、少なくとも１００×１０６細胞、少なくとも２００×１０６細胞、少なくとも３００×１０６細胞、少なくとも４００×１０６細胞、少なくとも６００×１０６細胞、少なくとも８００×１０６細胞、少なくとも１０００×１０６細胞、少なくとも１２００×１０６細胞、少なくとも１４００×１０６細胞、少なくとも１６００×１０６細胞、少なくとも１８００×１０６細胞、少なくとも２０００×１０６細胞、少なくとも２５００×１０６細胞、少なくとも３０００×１０６細胞、少なくとも４０００×１０６細胞、少なくとも５０００×１０６細胞、少なくとも１０，０００×１０６細胞、少なくとも１２，０００×１０６細胞、少なくとも１５，０００×１０６細胞もしくは少なくとも２０，０００×１０６細胞であるか、または生細胞の前述の閾のいずれかである。特定の実施形態では、細胞が閾値細胞計数を達成すると、培養は終了する。一部の実施形態では、閾値細胞計数が達成された後、６時間時点、１２時間時点、２４時間時点、３６時間時点、１日時点、２日時点、３日時点、４日時点、５日時点、６日時点、もしくは７日以上の時点、約６時間時点、約１２時間時点、約２４時間時点、約３６時間時点、約１日時点、約２日時点、約３日時点、約４日時点、約５日時点、約６日時点、もしくは約７日以上の時点、または６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、３６時間以内、１日以内、２日以内、３日以内、４日以内、５日以内、６日以内、もしくは７日以上以内で培養は終了する。特定の実施形態では、閾値細胞計数が達成された後、１日または約１日時点で培養は終了される。ある特定の実施形態では、閾値密度は、０．１×１０６細胞／ｍｌ、０．５×１０６細胞／ｍｌ、１×１０６細胞／ｍｌ、１．２×１０６細胞／ｍｌ、１．５×１０６細胞／ｍｌ、１．６×１０６細胞／ｍｌ、１．８×１０６細胞／ｍｌ、２．０×１０６細胞／ｍｌ、２．５×１０６細胞／ｍｌ、３．０×１０６細胞／ｍｌ、３．５×１０６細胞／ｍｌ、４．０×１０６細胞／ｍｌ、４．５×１０６細胞／ｍｌ、５．０×１０６細胞／ｍｌ、６×１０６細胞／ｍｌ、８×１０６細胞／ｍｌ、もしくは１０×１０６細胞／ｍｌである、約０．１×１０６細胞／ｍｌ、約０．５×１０６細胞／ｍｌ、約１×１０６細胞／ｍｌ、約１．２×１０６細胞／ｍｌ、約１．５×１０６細胞／ｍｌ、約１．６×１０６細胞／ｍｌ、約１．８×１０６細胞／ｍｌ、約２．０×１０６細胞／ｍｌ、約２．５×１０６細胞／ｍｌ、約３．０×１０６細胞／ｍｌ、約３．５×１０６細胞／ｍｌ、約４．０×１０６細胞／ｍｌ、約４．５×１０６細胞／ｍｌ、約５．０×１０６細胞／ｍｌ、約６×１０６細胞／ｍｌ、約８×１０６細胞／ｍｌ、もしくは約１０×１０６細胞／ｍｌである、または少なくとも０．１×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも０．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．２×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．６×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．８×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも２．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも２．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも３．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも３．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも４．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも４．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも５．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０６細胞／ｍｌ、もしくは少なくとも１０×１０６細胞／ｍｌであるか、または生細胞の前述の閾値のいずれかである。特定の実施形態では、細胞が閾値密度を達成すると、培養は終了する。一部の実施形態では、閾値密度が達成された後、６時間時点、１２時間時点、２４時間時点、３６時間時点、１日時点、２日時点、３日時点、４日時点、５日時点、６日時点、もしくは７日以上の時点、約６時間時点、約１２時間時点、約２４時間時点、約３６時間時点、約１日時点、約２日時点、約３日時点、約４日時点、約５日時点、約６日時点、もしくは約７日以上の時点、または６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、３６時間以内、１日以内、２日以内、３日以内、４日以内、５日以内、６日以内、もしくは７日以上以内で培養は終了する。特定の実施形態では、閾値密度が達成された後、１日または約１日時点で培養は終了される。
一部の実施形態では、培養工程は、閾値の量、密度、および／または拡大を細胞が達成するために必要とされる時間の量にわたって行われる。一部の実施形態では、培養は、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１週間、２週間、３週間、もしくは４週間、または約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、約７２時間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１週間、約２週間、約３週間、もしくは約４週間、または６時間未満、１２時間未満、１８時間未満、２４時間未満、３６時間未満、４８時間未満、６０時間未満、７２時間未満、２日間未満、３日間未満、４日間未満、５日間未満、６日間未満、７日間未満、７日間未満、８日間未満、９日間未満、１０日間未満、１週間未満、２週間未満、３週間未満、もしくは４週間未満行われる。特定の実施形態では、異なる生体試料から単離、濃縮、および／または選択された濃縮Ｔ細胞の複数の別々の組成物の細胞が閾値密度を達成するのに必要とされる時間の平均量は、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、２日間、３日間 ４日間、５日間、６日間、７日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１週間、２週間、３週間、もしくは４週間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、約７２時間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１週間、約２週間、約３週間、もしくは約４週間、または６時間未満、１２時間未満、１８時間未満、２４時間未満、３６時間未満、４８時間未満、６０時間未満、７２時間未満、２日間未満、３日間未満、４日間未満、５日間未満、６日間未満、７日間未満、７日間未満、８日間未満、９日間未満、１０日間未満、１週間未満、２週間未満、３週間未満、もしくは４週間未満である。ある特定の実施形態では、異なる生体試料から単離、濃縮、および／または選択された濃縮Ｔ細胞の複数の別々の組成物の細胞が閾値密度を達成するために必要とされる時間の平均量は、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、２日間、３日間 ４日間、５日間、６日間、７日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１週間、２週間、３週間、もしくは４週間であり、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、約７２時間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１週間、約２週間、約３週間、もしくは約４週間であり、または６時間未満、１２時間未満、１８時間未満、２４時間未満、３６時間未満、４８時間未満、６０時間未満、７２時間未満、２日間未満、３日間未満、４日間未満、５日間未満、６日間未満、７日間未満、７日間未満、８日間未満、９日間未満、１０日間未満、１週間未満、２週間未満、３週間未満、もしくは４週間未満である。
ある特定の実施形態では、培養工程は、最低４日間、５日間、６日間、７日間、７日間、８日間、９日間、もしくは１０日間にわたって、および／または細胞が１０００×１０６細胞、１２００×１０６細胞、１４００×１０６細胞、１６００×１０６細胞、１８００×１０６細胞、２０００×１０６細胞、２５００×１０６細胞、３０００×１０６細胞、４０００×１０６細胞、もしくは５０００×１０６細胞、または約１０００×１０６細胞、約１２００×１０６細胞、約１４００×１０６細胞、約１６００×１０６細胞、約１８００×１０６細胞、約２０００×１０６細胞、約２５００×１０６細胞、約３０００×１０６細胞、約４０００×１０６細胞、もしくは約５０００×１０６細胞の閾値細胞計数（または数）もしくは閾値生細胞計数（または数）を達成した１２時間後、２４時間後、３６時間後、１日後、２日後、もしくは３日後まで行われる。一部の実施形態では、培養工程は、細胞が１２００×１０６細胞または約１２００×１０６細胞の閾値細胞計数を達成した１日後まで行われ、最低１０日間にわたって、および／または細胞が５０００×１０６細胞もしくは約５０００×１０６細胞の閾値細胞計数を達成した１日後まで培養される。一部の実施形態では、培養工程は、細胞が１２００×１０６細胞または約１２００×１０６細胞の閾値細胞計数を達成した１日後まで行われ、最低９日間にわたって、および／または細胞が５０００×１０６細胞もしくは約５０００×１０６細胞の閾値細胞計数を達成した１日後まで培養される。一部の実施形態では、培養工程は、細胞が１０００×１０６細胞または約１０００×１０６細胞の閾値細胞計数を達成した１日後まで行われ、最低８日間にわたって、および／または細胞が４０００×１０６細胞もしくは約４０００×１０６細胞の閾値細胞計数を達成した１日後まで培養される。ある特定の実施形態では、培養は拡大工程であり、最低４日間、５日間、６日間、７日間、７日間、８日間、９日間、もしくは１０日間にわたって、および／または細胞が１０００×１０６細胞、１２００×１０６細胞、１４００×１０６細胞、１６００×１０６細胞、１８００×１０６細胞、２０００×１０６細胞、２５００×１０６細胞、３０００×１０６細胞、４０００×１０６細胞、もしくは５０００×１０６細胞、または約１０００×１０６細胞、約１２００×１０６細胞、約１４００×１０６細胞、約１６００×１０６細胞、約１８００×１０６細胞、約２０００×１０６細胞、約２５００×１０６細胞、約３０００×１０６細胞、約４０００×１０６細胞、もしくは約５０００×１０６細胞の閾値細胞計数（または数）または閾値生細胞計数（または数）を達成した１２時間後、２４時間後、３６時間後、１日後、２日後、もしくは３日後まで行われる。一部の実施形態では、拡大工程は、細胞が１２００×１０６細胞または約１２００×１０６細胞の閾値細胞計数を達成した１日後まで行われ、最低１０日間にわたって、および／または細胞が５０００×１０６細胞もしくは約５０００×１０６細胞の閾値細胞計数を達成した１日後まで拡大される。一部の実施形態では、拡大工程は、細胞が１２００×１０６細胞または約１２００×１０６細胞の閾値細胞計数を達成した１日後まで行われ、最低９日間にわたって、および／または細胞が５０００×１０６細胞もしくは約５０００×１０６細胞の閾値細胞計数を達成した１日後まで拡大される。一部の実施形態では、拡大工程は、細胞が１０００×１０６細胞または約１０００×１０６細胞の閾値細胞計数を達成した１日後まで行われ、最低８日間にわたって、および／または細胞が４０００×１０６細胞もしくは約４０００×１０６細胞の閾値細胞計数を達成した１日後まで拡大される。一部の実施形態では、拡大工程は、細胞が１４００×１０６細胞または約１４００×１０６細胞の閾値細胞計数を達成した１日後まで行われ、最低５日間にわたって、および／または細胞が４０００×１０６細胞もしくは約４０００×１０６細胞の閾値細胞計数を達成した１日後まで拡大される。
一部の実施形態では、培養は、少なくとも最小限の時間行われる。一部の実施形態では、培養は、最小限の時間の前に閾値が達成されたとしても、少なくとも１４日間、少なくとも１２日間、少なくとも１０日間、少なくとも７日間、少なくとも６日間、少なくとも５日間、少なくとも４日間、少なくとも３日間、少なくとも２日間、少なくとも３６時間、少なくとも２４時間、少なくとも１２時間、または少なくとも６時間行われる。一部の実施形態では、培養が行われる最小限の時間を増加することは、一部の例では、培養細胞、製剤化された細胞、および／またはアプトプット組成物の細胞における活性化を低減し得、および／または１つもしくは複数の活性化マーカーのレベルを低減し得る。一部の実施形態では、最小培養時間は、例示的なプロセス（例えば、選択工程；解凍工程；および／または活性化工程）の所定の時点から細胞が収集される日までである。
提供された実施形態の態様では、培養中の細胞または生細胞の密度および／または濃度は、培養中に、例えば、閾値の量、密度、および／または拡大が記載されているように達成されるまで、モニタリングまたは実施される。一部の実施形態ではそのような方法には、デジタルホログラフィー顕微鏡法（ＤＨＭ）または微分デジタルホログラフィー顕微鏡法（ＤＤＨＭ）を含む光学的方法を含む、記載されているものが挙げられる。
ある特定の実施形態では、培養細胞はアプトプット細胞である。一部の実施形態では、操作されたＴ細胞などの濃縮Ｔ細胞の培養された組成物は、濃縮Ｔ細胞のアウトプット組成物である。特定の実施形態では、培養されたＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞は、アウトプットＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞である。特定の実施形態では、操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞などの濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の培養された組成物は、濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞のアウトプット組成物である。一部の実施形態では、操作されたＣＤ８＋ Ｔ細胞などの濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞の培養された組成物は、濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞のアウトプット組成物である。
一部の実施形態では、細胞は、１つまたは複数のサイトカインの存在下、増殖および／または拡大を促進する条件下で培養される。特定の実施形態では、培養の少なくとも一部は、一定の混合および／または灌流、例えば、バイオリアクターによって制御された混合または灌流により行われる。一部の実施形態では、細胞は１つまたは複数のサイトカインの存在下で、一定の混合および／または灌流からのせん断および／またはせん断応力を低減するための界面活性剤、例えば、ポロキサマー１８８などのポロキサマーを用いて培養される。一部の実施形態では、操作されたＣＤ４＋ Ｔ細胞などの濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物は、組換えＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、およびポロキサマーの存在下で培養され、培養の少なくとも一部は、一定の混合および／または灌流により行われる。ある特定の実施形態では、操作されたＣＤ８＋ Ｔ細胞などの濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞の組成物は、組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５、およびポロキサマーの存在下で培養され、培養の少なくとも一部は、一定の混合および／または灌流により行われる。一部の実施形態では、培養は、例えば培養の始まりと比較して少なくとも４倍の閾値拡大に細胞が達するまで行われる。
１．培養中の細胞のモニタリング
一部の実施形態では、細胞は、培養工程中にモニタリングされる。モニタリングは、例えば、細胞形態、細胞生存能、細胞死、および／または聖望濃度（例えば、生細胞濃度）を確かめる（例えば、測定する、定量化する）ために行われ得る。一部の実施形態では、モニタリングは、人間のオペレーターなどによって手動で行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、自動化システムによって行われる。自動化システムは、培養細胞をモニタリングするために最小限の手動入力を必要としてもよく、または手動入力を必要としなくてもよい。一部の実施形態では、モニタリングは、手動および自動化システムの両方によって行われる。
ある特定の実施形態では、細胞は、手動入力を必要とする自動化システムによってモニタリングされる。一部の実施形態では、自動化システムは、培養を受けている細胞をバイオリアクターから取り除き、モニタリングし、その後バイオリアクターに戻すことができるように、バイオリアクター、例えば本明細書に記載のバイオリアクターに適合可能である。一部の実施形態では、モニタリングおよび培養は閉ループ構成で生じる。一部の態様では、閉ループ構成にあって、自動化システムおよびバイオリアクターは無菌のままである。実施形態では、自動化システムは無菌である。一部の実施形態では、自動化システムはインラインシステムである。
一部の実施形態では、自動化システムは、細胞形態、細胞生存能、細胞死、および／または細胞濃度（例えば、生細胞濃度）を検出するための光学的手法（例えば、顕微鏡法）の使用を含む。例えば、細胞の特徴、生存能、および濃度を決定するのに適した任意の光学的手法が本明細書において企図される。有用な光学的手法の非限定的な例には、ｉｎｃｌｕｄｅ 明視野顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、微分干渉（ＤＩＣ）顕微鏡法、位相差顕微鏡法、デジタルホログラフィー顕微鏡法（ＤＨＭ）、微分デジタルホログラフィー顕微鏡法（ＤＤＨＭ）、またはそれらの組合せが挙げられる。微分デジタルホログラフィー顕微鏡法、ＤＤＨＭ、および微分ＤＨＭは、本明細書において互換的に使用され得る。ある特定の実施形態では、自動化システムには、微分デジタルホログラフィー顕微鏡が挙げられる。ある特定の実施形態では、自動化システムには、照射手段（例えば、レーザー、ｌｅｄ）を含む微分デジタルホログラフィー顕微鏡が挙げられる。ＤＤＨＭ方法論および使用の記載は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ ７，３６２，４４９；ＥＰ １，６３１，７８８；ＵＳ ９，９０４，２４８；およびＵＳ ９，６８４，２８１に見出すことができる。
ＤＤＨＭは、細胞の標識なしの非破壊的イメージングを可能にし、高コントラストのホログラフィック画像をもたらす。画像は、オブジェクト分割およびさらなる解析を受けて、画像化されたオブジェクト（例えば、培養細胞、細胞残屑）を定量的に記述する複数の形態的特徴を得ることができる。そのため、様々な特徴（例えば、細胞形態、細胞生存能、細胞濃度）が、ＤＤＨＭから、例えば、画像取得、画像処理、画像分割、および特徴抽出の工程を使用して直接評価または算出され得る。一部の実施形態では、自動化システムは、ホログラフィック画像を記録するためのデジタル記録装置を含む。一部の実施形態では、自動化システムは、ホログラフィック画像を分析するためのアルゴリズムを含むコンピューターを含む。一部の実施形態では、自動化システムは、ホログラフィック画像分析の結果を表示するためのモニターおよび／またはコンピューターを含む。一部の実施形態では、分析は自動化される（すなわち、ユーザー入力の非存在下で行うことができる）。培養中の細胞をモニタリングするための適切な自動化システムの例には、Ｏｖｉｚｉｏ ｉＬｉｎｅ Ｆ（Ｏｖｉｚｉｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＮＶ／ＳＡ、ブリュッセル、ベルギー）が挙げられるが、これに限定されない。
ある特定の実施形態では、モニタリングは、培養工程中に連続的に行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程中リアルタイムで行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程中別個の時点で行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程中の間中少なくとも１５分ごとに行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも３０分ごとに行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも４５分ごとに行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも１時間ごとに行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも２時間ごとに行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも４時間ごとに行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも６時間ごとに行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも８時間ごとに行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも１０時間ごとに行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも１２時間ごとに行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも１４時間ごとに行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも１６時間ごとに行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも１８時間ごとに行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも２０時間ごとに行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも２２時間ごとに行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも１日１回行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも２日ごとに１回行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも３日ごとに１回行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも４日ごとに１回行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも５日ごとに１回行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも６日ごとに１回行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも７日ごとに１回行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも８日ごとに１回行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも９日ごとに１回行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程の間中少なくとも１０日ごとに１回行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、培養工程中少なくとも１回行われる。
一部の実施形態では、ＤＨＭまたはＤＤＨＭなどの光学的手法の使用を含むモニタリングによって決定され得る細胞の特徴には、細胞生存能、細胞濃度、細胞数および／または細胞密度が挙げられる。一部の実施形態では、細胞生存能が特徴付けられ、または決定される。一部の実施形態では、細胞濃度、密度および／または数が特徴付けられ、または決定される。一部の実施形態では、生細胞濃度、生細胞数および／または生細胞密度が特徴付けられ、または決定される。一部の実施形態では、培養細胞は、上記などのように拡大の閾値に達するまで自動化システムによってモニタリングされる。一部の実施形態では、拡大の閾値に達すると、培養細胞は、自動または手動方法などによって、例えばヒトオペレーターによって収集される。拡大の閾値は、自動化システムによって決定される培養細胞の総濃度、密度および／または数に依存し得る。あるいは、拡大の閾値は、生細胞濃度、密度および／または数に依存し得る。
一部の実施形態では、収集された細胞は、薬学的に許容される担体の存在下などで、記載されているように製剤化される。一部の実施形態では、収集された細胞は、凍結保護剤の存在下で製剤化される。一部の実施形態では、治療用組成物の収集された細胞の効力は、上の節Ｉに提供された方法に従って効力が評価される。一部の実施形態では、治療用組成物の収集された細胞の効力は、凍結保存の前に効力が評価される。一部の実施形態では、治療用組成物の収集された細胞の効力は、凍結保存後に効力が評価される。
Ｅ．細胞および組換え受容体操作細胞の治療用組成物の製剤化
上（節Ｉ）に提供された方法に従って効力が評価される治療用細胞組成物を含有する、医薬組成物およびその製剤を含む組成物も提供される。一部の実施形態では、細胞療法および／または操作された細胞を製造、生成または作製するために提供される方法は、組換え受容体を発現する細胞を含有する治療用細胞組成物を作製するための提供された処理工程から得られる遺伝子操作された細胞の製剤化を含み得る。一部の実施形態では、細胞の製剤化に関連して提供される方法は、上に記載された処理工程を使用して形質導入および／または拡大された細胞などの形質導入細胞を閉鎖系で処理することを含む。一部の実施形態では、組換え抗原受容体、例えばＣＡＲまたはＴＣＲを用いて操作された細胞を含む細胞の用量は、組成物または製剤、例えば、医薬組成物または製剤として提供される。そのような組成物は、疾患、状態、および障害の予防もしくは処置、または検出、診断、および予後方法などの提供される方法に従って使用することができる。
一部の例では、細胞療法および／または操作された細胞を製造、生成または作製するための１つまたは複数の工程（例えば、遠心チャンバーおよび／または閉鎖系で実施される）で処理された細胞は、培養（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）、例えば培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）および拡大の前もしくは後の提供された形質導入処理工程、ならびに／または記載されているような１つもしくは複数の他の処理工程から得られる遺伝子操作された細胞の製剤化などの細胞の製剤化を含み得る。一部の例では、細胞は、単一の単位投与量の投与または複数の投与量の投与などの投与量の投与用の量で製剤化することができる。一部の実施形態では、上の節Ｉに提供された方法に従って決定される治療用組成物の細胞の効力は、単位用量および／または投与量の投与を決定するのに使用される。一部の実施形態では、治療用組成物の細胞の効力は、単位用量および／または投与量投与を決定する目的のために、節Ｉに提供された方法に従って評価される。一部の実施形態では、細胞の製剤化に関連して提供される方法は、上に記載された処理工程を使用して形質導入および／または拡大された細胞などの形質導入細胞を閉鎖系で処理することを含む。
ある特定の実施形態では、操作および培養されたＴ細胞、例えばアウトプットＴ細胞などの濃縮Ｔ細胞の１つまたは複数の組成物、治療用細胞組成物が製剤化される。特定の実施形態では、操作および培養されたＴ細胞、例えばアウトプットＴ細胞などの濃縮Ｔ細胞の１つまたは複数の組成物、治療用細胞組成物は、１つまたは複数の組成物が操作および／または培養された後で製剤化される。特定の実施形態では、１つまたは複数の組成物はインプット組成物である。一部の実施形態では、１つまたは複数のインプット組成物は前もって低温凍結および保管されており、インキュベーションの前に解凍される。
ある特定の実施形態では、操作および培養されたＴ細胞、例えばアウトプットＴ細胞などの濃縮Ｔ細胞の１つまたは複数の治療用組成物は、濃縮Ｔ細胞の２つの別々の組成物、例えば、別々の操作および／または培養された組成物であるか、またはこれを含む。特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の２つの別々の治療用組成物、例えば、同じ生体試料から選択、単離、および／または濃縮され、別々に操作され、別々に培養された濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の２つの別々の組成物が別々に製剤化される。ある特定の実施形態では、２つの別々の治療用細胞組成物は、濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物、例えば、操作および／または培養されたＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物を含む。特定の実施形態では、２つの別々の治療用細胞組成物は、濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞の組成物、例えば、操作および／または培養されたＣＤ８＋ Ｔ細胞の組成物を含む。一部の実施形態では、濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞および濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞の２つの別々の治療用組成物、例えば、操作および培養されたＣＤ４＋ Ｔ細胞および操作および培養されたＣＤ８＋ Ｔ細胞の別々の組成物は別々に製剤化される。一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の単一の治療用組成物が製剤化される。ある特定の実施形態では、単一の治療用組成物は、濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物、例えば、操作および／または培養されたＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物である。一部の実施形態では、単一の治療用組成物は、製剤化の前に別々の組成物から組み合わされた濃縮ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の組成物である。
一部の実施形態では、濃縮ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の別々の治療用組成物、例えば、操作および培養されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の別々の組成物は、単一の治療用組成物に組み合わされ、製剤化される。ある特定の実施形態では、濃縮ＣＤ４＋および濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞の別々の製剤化された治療用組成物は、製剤化が行われ、および／または完了した後で単一の治療用組成物に組み合わされる。特定の実施形態では、濃縮ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の別々の治療用組成物、例えば、操作および培養されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の別々の組成物は、別々の組成物として別々に製剤化される。
一部の実施形態では、操作および培養されたＣＤ４＋ Ｔ細胞、例えばアウトプットＣＤ４＋ Ｔ細胞などの、製剤化される濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の治療用組成物は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または１００％もしくは約１００％のＣＤ４＋ Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、組成物は、組換え受容体を発現する、および／または組換えポリヌクレオチドで形質導入もしくはトランスフェクトされている、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または１００％もしくは約１００％のＣＤ４＋ Ｔ細胞を含む。ある特定の実施形態では、操作および培養されたＣＤ４＋ Ｔ細胞、例えばアウトプットＣＤ４＋ Ｔ細胞などの、製剤化される濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の治療用組成物は、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満、もしく０．０１％未満のＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む、および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞を含有しない、および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞がないかもしくは実質的にない。
一部の実施形態では、操作および培養されたＣＤ８＋ Ｔ細胞、例えばアウトプットＣＤ８＋ Ｔ細胞などの、製剤化される濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞の治療用組成物は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または１００％もしくは約１００％のＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む。ある特定の実施形態では、治療用組成物は、組換え受容体を発現する、および／または組換えポリヌクレオチドで形質導入もしくはトランスフェクトされている、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または１００％もしくは約１００％のＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む。ある特定の実施形態では、操作および培養されたＣＤ８＋ Ｔ細胞、例えばアウトプットＣＤ８＋ Ｔ細胞などの、刺激条件下でインキュベートされる濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞の治療用組成物は、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満、または０．０１％未満のＣＤ４＋ Ｔ細胞を含む、および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞を含有しない、および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞がないかもしくは実質的にない。
ある特定の実施形態では、製剤化された細胞はアプトプット細胞である。一部の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の製剤化された治療用組成物、例えば、操作および培養されたＴ細胞の製剤化された組成物は、濃縮Ｔ細胞のアウトプット組成物である。特定の実施形態では、製剤化されたＣＤ４＋ Ｔ細胞および／または製剤化されたＣＤ８＋ Ｔ細胞は、アウトプットＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞である。特定の実施形態では、濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞の製剤化された組成物は、濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞のアウトプット組成物である。一部の実施形態では、濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞の製剤化された組成物は、濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞のアウトプット組成物である。
一部の実施形態では、細胞は、バッグまたはバイアルなどの容器に製剤化することができる。一部の実施形態では、細胞は、閾値細胞計数、密度、および／または拡大が培養中に達成された後、０日～１０日間、０～５日間、２日～７日間、０．５日～４日間、または１日～３日間製剤化される。ある特定の実施形態では、細胞は、閾値細胞計数、密度、および／または拡大が培養中に達成された後、１２時間時点、１８時間時点、２４時間時点、１日時点、２日間時点、もしくは３日間時点、または約１２時間時点、約１８時間時点、約２４時間時点、約１日時点、約２日間時点、もしくは約３日間時点、または１２時間以内、１８時間以内、２４時間以内、１日以内、２日間以内、もしくは３日以内で製剤化される。一部の実施形態では、細胞は、閾値細胞計数、密度、および／または拡大が培養中に達成された後、１日または約１日時点で製剤化される。
一部の実施形態では、細胞は、一部の態様では、薬学的に許容される担体または賦形剤を含み得る薬学的に許容される緩衝液で製剤化される。一部の実施形態では、処理は、対象への投与のために薬学的に許容されるかまたは望ましい培地または製剤緩衝液への培地の交換を含む。一部の実施形態では、処理工程は、形質導入および／または拡大された細胞を洗浄して、１つまたは複数の適宜の薬学的に許容される担体または賦形剤を含み得る薬学的に許容される緩衝液中の細胞を交換することを含み得る。薬学的に許容される担体または賦形剤を含むそのような薬学的形態の例は、細胞および組成物を対象に投与するのに許容される形態と併せて以下に記載されるいずれかであり得る。医薬組成物は一部の実施形態では、疾患または状態を処置または予防するのに有効な量、例えば、治療有効量または予防有効量で細胞を含有する。
用語「医薬品製剤」とは、その中に含有される有効成分の生物活性を有効にさせるような形態にあり、製剤が投与される対象にとって容認しがたい毒性となる追加の成分を含有しない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」とは、対象にとって非毒性の、有効成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、または保存料が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の態様では、担体の選択は、一部には特定の細胞および／または投与の方法によって決定される。したがって、様々な適切な製剤がある。例えば、医薬組成物は保存料を含んでもよい。適切な保存料には、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、および塩化ベンザルコニウムが挙げられ得る。一部の態様では、２つまたはそれより多い保存料の混合物が使用される。保存料またはその混合物は、典型的には、組成物全体の約０．０００１重量％～約２重量％の量で存在する。担体は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に記載されている。薬学的に許容される担体は、一般に、使用される投与量および濃度ではレシピエントにとって非毒性であり、以下が挙げられるが、これらに限定されない：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤。
一部の態様では緩衝剤が組成物に含まれる。適切な緩衝剤には、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、および様々な他の酸および塩が挙げられる。一部の態様では、２つまたはそれより多い緩衝剤の混合物が使用される。緩衝剤またはその混合物は、典型的には組成物全体の約０．００１％～約４重量％の量で存在する。投与可能な医薬組成物を調製する方法は公知である。例示的な方法は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)により詳細に記載されている。
医薬組成物は一部の実施形態では、疾患または状態を処置または予防するのに有効な量、例えば、治療有効量または予防有効量で細胞を含有する。治療的有効性または予防的有効性は一部の実施形態では、処置された対象の定期的な評価によってモニタリングされる。状態に応じた数日間またはそれより長い反復投与については、疾患症状の所望の抑制が生じるまで処置が反復される。しかし、他の投与量レジメンが有用であることがあり、決定することができる。所望の投与量は、組成物の単回ボーラス投与、組成物の複数回ボーラス投与、または組成物の連続注入投与によってデリバリーすることができる。
細胞は、標準的な投与法、製剤、および／または装置を使用して投与することができる。組成物の保管および投与のための、製剤ならびにシリンジおよびバイアルなどの装置が提供される。細胞の投与は、自家または異種であってもよい。例えば、免疫応答性細胞または前駆体が１つの対象から得られ、同じ対象または異なる適合する対象に投与されてもよい。末梢血由来免疫応答性細胞またはそれらの子孫（例えば、インビボ、エクスビボまたはインビトロ由来）が、カテーテル投与、全身注射、局所注射、静脈内注射、または非経口投与を含む局所注射を介して投与されてもよい。治療用組成物（例えば、遺伝子改変された免疫応答性細胞を含有する医薬組成物）を投与する場合、治療用組成物は、一般に、単位投与量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）で製剤化される。
製剤は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、肺内、経皮、筋肉内、鼻腔内、頬側、舌下、または坐薬投与用のものを含む。一部の実施形態では、細胞集団は非経口投与される。用語「非経口」は本明細書で使用される場合、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣内、および腹腔内投与を含む。一部の実施形態では、細胞集団は、静脈内、腹腔内、または皮下注射による末梢全身デリバリーを使用して対象に投与される。
一部の実施形態における組成物は、滅菌液体調製物、例えば、等張水溶液、懸濁液、エマルジョン、分散液、または粘性組成物として提供され、該調製物は、一部の態様では選択されたｐＨに緩衝され得る。液体調製物は通常、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物より調製するのが容易である。さらに、液体組成物は、特に注射によって投与するのに幾分より便利である。一方、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間をもたらす適切な粘度範囲内で製剤化され得る。液体組成物または粘性組成物は担体を含むことができ、担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。
滅菌注射用溶液は、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロース等などの適切な担体、希釈液、または賦形剤との混合物などの溶媒に、細胞を組み込むことによって調製することができる。組成物は、凍結乾燥することもできる。組成物は、所望の投与経路および調製物に応じて、湿潤剤、分散剤、または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化または粘性増強添加物、保存料、香味剤、着色料等などの補助物質を含有することができる。一部の態様では、適切な調製物を調製するのに標準的なテキストが調べられてもよい。
抗菌保存料、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝液を含む、組成物の安定性および無菌性を増強する様々な添加物が添加され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等によって確保することができる。注射可能な薬学的形態の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。
インビボ投与に使用される製剤は、一般に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通じた濾過によって容易に達成され得る。
一部の実施形態では、製剤緩衝液は凍結保存料を含有する。一部の実施形態では、細胞は、１．０％～３０％ＤＭＳＯ溶液、例えば５％～２０％ＤＭＳＯ溶液または５％～１０％ＤＭＳＯ溶液を含有する凍結保存料溶液を用いて製剤化される。一部の実施形態では、凍結保存溶液は、例えば、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有するＰＢＳ、または他の適切な細胞凍結培地であるか、またはこれを含有する。一部の実施形態では、凍結保存料溶液は、例えば、少なくともまたは約７．５％ＤＭＳＯであるか、またはこれを含有する。一部の実施形態では、処理工程は、形質導入および／または拡大された細胞を洗浄して、凍結保存料溶液中の細胞を交換することを含み得る。一部の実施形態では、細胞は、１２．５％、１２．０％、１１．５％、１１．０％、１０．５％、１０．０％、９．５％、９．０％、８．５％、８．０％、７．５％、７．０％、６．５％、６．０％、５．５％、もしくは５．０％ＤＭＳＯ、または約１２．５％、約１２．０％、約１１．５％、約１１．０％、約１０．５％、約１０．０％、約９．５％、約９．０％、約８．５％、約８．０％、約７．５％、約７．０％、約６．５％、約６．０％、約５．５％、もしくは約５．０％ＤＭＳＯ、または１％～１５％、６％～１２％、５％～１０％、もしくは６％～８％ＤＭＳＯの最終濃度を含む培地および／または溶液に凍結され、例えば、低温凍結または凍結保存される。特定の実施形態では、細胞は、５．０％、４．５％、４．０％、３．５％、３．０％、２．５％、２．０％、１．５％、１．２５％、１．０％、０．７５％、０．５％、もしくは０．２５％ＨＳＡ、または約５．０％、約４．５％、約４．０％、約３．５％、約３．０％、約２．５％、約２．０％、約１．５％、約１．２５％、約１．０％、約０．７５％、約０．５％、もしくは約０．２５％ＨＳＡ、または０．１％～－５％、０．２５％～４％、０．５％～２％、もしくは１％～２％ＨＳＡの最終濃度を含む培地および／または溶液に凍結され、例えば、低温凍結または凍結保存される。
特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞、例えば、刺激され、操作され、および／または培養されたＴ細胞の治療用組成物は、製剤化され、低温凍結され、次いで一定量の時間保管される。ある特定の実施形態では、製剤化され、低温凍結された細胞は、典型的には、注入のために細胞が放出されるまで複数のバイアルまたは容器で保管される。一部の実施形態では、特定の治療用組成物のバイアルまたは容器は、治療用細胞組成物の注入の前に、提供された効力アッセイを実施するのに使用されてもよい。特定の実施形態では、製剤化された低温凍結細胞は、１日～６カ月間、１カ月～３カ月間、１日～１４日間、１日～７日間、３日～６日間、６カ月～１２カ月間、または１２カ月より長く保管される。一部の実施形態では、細胞は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、もしくは７日間、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、もしくは約７日間、または１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、もしくは７日間、または１日未満、２日未満、３日未満、４日未満、５日未満、６日未満、もしくは７日未満にわたって低温凍結され、保管される。ある特定の実施形態では、細胞は、保管後に解凍され、対象に投与される。ある特定の実施形態では、細胞は、５日間または約５日間保管される。
一部の実施形態では、細胞は、凍結保護剤を、１０ｍＬ～１０００ｍまたは約１０ｍＬ～約１０００ｍＬ、例えば、少なくともまたは約少なくともまたは約５０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、３００ｍＬ、４００ｍＬ、５００ｍＬ、６００ｍＬ、７００ｍＬ、８００ｍＬ、９００ｍＬまたは１０００ｍＬの体積で適宜含む、薬学的に許容される緩衝液で製剤化される。一部の実施形態では、治療用細胞組成物は、容器、例えば１つまたは複数のバイアルまたはバッグに保管される。一部の実施形態では、バイアルまたはバッグは、一般に、投与される細胞、例えば、その１つまたは複数の単位用量を含有する。単位用量は、対象に投与される細胞の量もしくは数、または投与される細胞の２倍（またはそれ以上）の数であってもよい。単位用量は、対象に投与されることになる細胞の最低用量または最も低い可能性のある用量であってもよい。
一部の実施形態では、容器、例えばバイアルまたはバッグの各々は、個々に単位用量の細胞を含む。故に、一部の実施形態では、各容器は、同じ、またはほぼ同じ、または実質的に同じ数の細胞を含む。一部の実施形態では、各単位用量は、少なくともまたは約少なくとも１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、または１×１０８個の操作された細胞、全細胞、Ｔ細胞、またはＰＢＭＣを含む。一部の実施形態では、各容器、例えば、バッグまたはバイアル中の製剤化された細胞組成物の体積は、１０ｍＬ～１００ｍＬ、例えば、少なくともまたは約少なくともまたは約２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、６０ｍＬ、７０ｍＬ、８０ｍＬ、９０ｍＬまたは１００ｍＬである。一部の実施形態では、容器、例えば、バッグまたはバイアル中の細胞は凍結保存されてもよい。一部の実施形態では、容器、例えばバイアルは、さらなる使用まで液体窒素で保管されてもよい。
一部の実施形態では、記載された工程の１つまたは複数を含む方法などによって作製された組換え受容体発現細胞（例えば、ＣＡＲ発現細胞）を含有する組成物の細胞の効力、例えば相対的効力は、本明細書に記載された効力アッセイを使用して決定または測定される。一部の実施形態では、記載された工程の１つもしくは複数を含む方法などによって作製された組換え受容体発現細胞（例えば、ＣＡＲ発現細胞）を含有し、および／または効力が決定されている組成物の細胞が、疾患または状態を処置するために対象に投与され得る。
ＩＩＩ．組換え受容体
一部の実施形態では、治療用細胞組成物の効力、例えば相対的効力を決定するために提供される方法は、組換え組換え受容体、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含有もしくは発現する、または含有もしくは発現するように操作された組成物由来の細胞で行われるか、または実施される。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、組換えタンパク質を発現または含有するように操作され、およびそのような作製され、操作された細胞の効力が決定または測定され得る細胞または、細胞を含有するおよび／もしくは細胞が濃縮された集団もしくは組成物を作製する、および／または作製することができる。様々な実施形態では、提供される方法は、１つまたは複数の組換え受容体を発現するように操作、形質転換、形質導入、またはトランスフェクトされた細胞である免疫細胞、例えばＴ細胞などの細胞組成物で実施される。
一部の実施形態では、提供される方法は、１つまたは複数の組換え受容体を発現する免疫細胞、例えばＴ細胞などの操作された細胞の効力を評価するための方法である。受容体の中には、抗原受容体および１つまたは複数のその成分を含有する受容体が含まれる。組換え受容体には、キメラ受容体、例えば、そのリガンド結合ドメインまたは結合性断片および細胞内シグナル伝達ドメインまたは領域を含有するもの、機能性非ＴＣＲ抗原受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば組換えまたはトランスジェニックＴＣＲ、キメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）および前述のいずれかのうちの成分が挙げられ得る。ＣＡＲなどの組換え受容体は、一般に、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達成分に連結された細胞外抗原（またはリガンド）結合ドメインを、一部の態様ではリンカーおよび／または膜貫通ドメインを介して含む。一部の実施形態では、操作された細胞は、異なる成分、ドメインまたは領域を含有する２つまたはそれより多い受容体を発現する。一部の態様では、２つまたはそれより多い受容体は、組換え受容体の特異性、活性、抗原（またはリガンド）結合、機能および／または発現を空間的または時間的に調節または制御できる。
Ａ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
提供される方法の一部の実施形態では、キメラ抗原受容体などのキメラ受容体は、所望の標的［例えば、抗原（例えば、腫瘍抗原）］に対する特異性をもたらすリガンド結合ドメイン（例えば、抗体または抗体断片）を細胞内シグナル伝達ドメインと結び付ける１つまたは複数のドメインを含有する。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次活性化シグナルをもたらす、Ｔ細胞活性化ドメインなどの活性化細胞内ドメイン部分である。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能を促進する共刺激シグナル伝達ドメインを含有するか、またはさらに含有する。一部の実施形態では、キメラ受容体は免疫細胞の中に遺伝子操作される場合、Ｔ細胞活性をモジュレートすることができ、一部の例では、Ｔ細胞分化または恒常性をモジュレートすることができ、それによって、養子細胞療法方法などで使用するための、インビボでの寿命、生存および／または持続性が改善された遺伝子操作された細胞をもたらす。
ＣＡＲを含む例示的な抗原受容体、ならびにそのような受容体を細胞の中に操作および導入するための方法には、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０００１４２５７、ＷＯ２０１３１２６７２６、ＷＯ２０１２／１２９５１４、ＷＯ２０１４０３１６８７、ＷＯ２０１３／１６６３２１、ＷＯ２０１３／０７１１５４、ＷＯ２０１３／１２３０６１、ＷＯ２０１５／１６８６１３、ＷＯ２０１６／０３０４１４、米国特許出願公開第ＵＳ２００２１３１９６０号、ＵＳ２０１３２８７７４８号、ＵＳ２０１３０１４９３３７号、ＵＳ２０１９０３８９９２５号、米国特許第６，４５１，９９５号、７，４４６，１９０号、８，２５２，５９２号、８，３３９，６４５号、８，３９８，２８２号、７，４４６，１７９号、６，４１０，３１９号、７，０７０，９９５号、７，２６５，２０９号、７，３５４，７６２号、７，４４６，１９１号、８，３２４，３５３号、８，４７９，１１８号、１０，２６６，５８０号および欧州特許出願番号ＥＰ２５３７４１６に記載されているもの、ならびに／またはSadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398;Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 63339;Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75によって記載されているものが挙げられる。一部の態様では、抗原受容体には、米国特許第７，４４６，１９０号に記載のＣＡＲ、および国際特許出願公開番号ＷＯ／２０１４０５５６６８ Ａ１に記載されているものが挙げられる。ＣＡＲの例には、ＷＯ２０１４０３１６８７、ＵＳ ８，３３９，６４５、ＵＳ ７，４４６，１７９、ＵＳ ２０１３／０１４９３３７、米国特許第７，４４６，１９０号、米国特許第８，３８９，２８２号、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， １０， ２６７－２７６ （２０１３）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ３５（９）： ６８９－７０１；およびＢｒｅｎｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ２０１３ ５（１７７）などの上述の刊行物のいずれかに開示のＣＡＲが挙げられる。ＷＯ２０１４０３１６８７、ＵＳ ８，３３９，６４５、ＵＳ ７，４４６，１７９、ＵＳ ２０１３／０１４９３３７、米国特許第７，４４６，１９０号、および米国特許第８，３８９，２８２号も参照のこと。
ＣＡＲなどのキメラ受容体は、一般に、例えば、抗体分子の一部、一般に抗体、例えばｓｃＦｖ抗体断片の可変重鎖（ＶＨ）領域および／または可変軽鎖（ＶＬ）領域などの細胞外標的結合ドメイン（例えば、抗原結合ドメイン）を含む。
一部の実施形態では、受容体によって標的化される抗原はポリペプチドである。一部の実施形態では、それは炭水化物または他の分子である。一部の実施形態では、抗原は、正常な、または標的化されていない細胞または組織と比較して、疾患または状態を有する細胞で、例えば、腫瘍または病原性の細胞で、選択的に発現または過剰発現される。他の実施形態では、抗原は、正常細胞で発現され、および／または操作された細胞で発現される。
一部の実施形態では、抗原は、αｖβ６インテグリン（αｖβ６インテグリン）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、炭酸脱水酵素９（ＣＡ９、ＣＡＩＸまたはＧ２５０としても知られる）、がん－精巣抗原、がん／精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ、ＮＹ－ＥＳＯ－１およびＬＡＧＥ－２としても知られる）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、サイクリン、サイクリンＡ２、Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＣＬ－１）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、上皮成長因子タンパク質（ＥＧＦＲ）、ＩＩＩ型上皮成長因子受容体突然変異（ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＰＧ－２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＰＧ－４０）、エフリンＢ２、エフリン受容体Ａ２（ＥＰＨａ２）、エストロゲン受容体、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５；Ｆｃ受容体ホモログ５またはＦＣＲＨ５としても知られる）、胎児アセチルコリン受容体（胎児ＡｃｈＲ）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドＧＤ２、Ｏ－アセチル化ＧＤ２（ＯＧＤ２）、ガングリオシドＧＤ３、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、Ｇタンパク質共役受容体５Ｄ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（受容体チロシンキナーゼｅｒｂ－Ｂ２）、Ｈｅｒ３（ｅｒｂ－Ｂ３）、Ｈｅｒ４（ｅｒｂ－Ｂ４）、ｅｒｂＢ二量体、ヒト高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、Ｂ型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原Ａ１（ＨＬＡ－Ａ１）、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）、ＩＬ－２２受容体アルファ（ＩＬ－２２Ｒα）、ＩＬ－１３受容体アルファ２（ＩＬ－１３Ｒα２）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ｋｄｒ）、カッパ軽鎖、Ｌ１細胞軽鎖分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、Ｌ１－ＣＡＭのＣＥ７エピトープ、ロイシンリッチリピート含有８ファミリーメンバーＡ（ＬＲＲＣ８Ａ）、ルイスＹ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ１０、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ｃ－Ｍｅｔ、マウスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ１６、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンド、メランＡ（ＭＡＲＴ－１）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、癌胎児性抗原、黒色腫優先的発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（ＴＰＢＧ、５Ｔ４としても知られる）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ１、ＴＹＲＰ１またはｇｐ７５としても知られる）、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２、ドーパクロムトートメラーゼ、ドーパクロムデルタイソメラーゼまたはＤＣＴとしても知られる）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）、病原体特異的もしくは病原体発現抗原、またはユニバーサルタグを含むかもしくはユニバーサルタグに関連する抗原、および／またはビオチン化分子、および／またはＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶもしくは他の病原体によって発現される分子であるか、あるいはこれらを含む。一部の実施形態では、受容体によって標的化された抗原としては、Ｂ細胞悪性腫瘍に関連する抗原、例えば多数の公知のＢ細胞マーカーのいずれかが挙げられる。一部の実施形態では、抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＣＤ４５、ＣＤ２１、ＣＤ５、ＣＤ３３、Ｉｇカッパ、Ｉｇラムダ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂもしくはＣＤ３０であるか、またはこれらを含む。一部の実施形態では、抗原は、病原体特異的または病原体によって発現される抗原である、またはそれを含む。一部の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ等に由来するウイルス抗原）、細菌抗原および／または寄生虫抗原である。
一部の実施形態では、抗体は、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域などの２つの抗体ドメインまたは領域を連結する１つまたは複数のリンカーを含む抗原結合性断片、例えばｓｃＦｖである。リンカーは、典型的にはペプチドリンカー、例えば、フレキシブルおよび／または可溶性ペプチドリンカーである。リンカーの中には、グリシンおよびセリンおよび／または一部の例ではスレオニンに富むものがある。一部の実施形態では、リンカーは、可溶性を改善することができるリジンおよび／またはグルタミン酸などの荷電残基をさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のプロリンをさらに含む。一部の態様では、グリシンおよびセリン（および／またはスレオニン）に富むリンカーは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のそのようなアミノ酸を含む。一部の実施形態では、それらは、少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、７０％、もしくは７５％のグリシン、セリン、および／もしくはスレオニンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、実質的にグリシン、セリン、および／またはスレオニンのみから成る。リンカーは一般に、約５～約５０アミノ酸長、典型的には１０または約１０～３０または約３０アミノ酸長、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０アミノ酸長、および一部の例では１０～２５アミノ酸長である。例示的なリンカーには、配列ＧＧＧＧＳ（４ＧＳ；配列番号２２）またはＧＧＧＳ（３ＧＳ；配列番号２３）の様々な数の反復、例えば、そのような配列の２、３、４、および５反復を有するリンカーが挙げられる。例示的なリンカーには、配列番号２４（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）、配列番号２５（ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ）または配列番号２６（ＳＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥＭＡ）に記載された配列を有するか、またはからなるものが挙げられる。
一部の実施形態において受容体によって標的化される抗原は、Ｂ細胞悪性腫瘍に関連する抗原、例えば多くの公知のＢ細胞マーカーのいずれかを含む。一部の実施形態では、受容体によって標的化される抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＣＤ４５、ＣＤ２１、ＣＤ５、ＣＤ３３、Ｉｇカッパ、Ｉｇラムダ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂまたはＣＤ３０である。
一部の実施形態では、抗原または抗原結合ドメインはＣＤ１９である。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＣＤ１９に対して特異的な抗体または抗体断片に由来するＶＨおよびＶＬを含有する。一部の実施形態では、ＣＤ１９と結合する抗体または抗体断片は、マウス由来の抗体、例えばＦＭＣ６３およびＳＪ２５Ｃ１である。一部の実施形態では、抗体または抗体断片は、ヒト抗体であり、例えば、米国特許公開番号ＵＳ２０１６／０１５２７２３号に記載されるヒト抗体である。
本明細書において用語「抗体」は最も広い意味で使用され、インタクトな抗体ならびに、抗原結合性（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、抗原を特異的に結合することができる重鎖可変（ＶＨ）領域、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む一本鎖抗体断片、および単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）断片を含む機能性（抗原結合性）抗体断片を含む、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含む。該用語は、遺伝子操作されたおよび／またはさもなければ改変された形態の免疫グロブリン、例えばイントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性抗体、例えば二重特異性または三重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ、タンデムｄｉ－ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ－ｓｃＦｖを包含する。特に明記しない限り、用語「抗体」は、本明細書において「抗原結合性断片」とも呼ばれるその機能性抗体断片を包含すると理解されるべきである。この用語はまた、あらゆるクラスまたはサブクラスの抗体を含む無傷または全長抗体、例えば、ＩｇＧおよびそのサブクラス、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＤなども包含する。
「超可変領域」または「ＨＶＲ」と同義の用語「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」は、抗原特異性および／または結合親和性を与える抗体可変領域内のアミノ酸の非連続配列を指すことが当技術分野で公知である。一般に、各重鎖可変領域（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）に３つのＣＤＲがあり、各軽鎖可変領域（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）に３つのＣＤＲがある。「フレームワーク領域」および「ＦＲ」は、重鎖および軽鎖の可変領域の非ＣＤＲ部分を指すことが当技術分野で公知である。一般に、各完全長重鎖可変領域に４つのＦＲ（ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、およびＦＲ－Ｈ４）、および各完全長軽鎖可変領域に４つのＦＲ（ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３、およびＦＲ－Ｌ４）がある。
所与のＣＤＲまたはＦＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabat et al. ( 1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（「Ｋａｂａｔ」の番号付けスキーム）；Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948（「Ｃｈｏｔｈｉａ」の番号付けスキーム）；MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), “Antibody-antigen 相互作用s: Contact analysis and binding site topography,” J. Mol. Biol. 262, 732-745.（「Ｃｏｎｔａｃｔ」番号付けスキーム）；Lefranc MP et al., “IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and lg superfamily V-like domains,” Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27( 1):55-77（「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）；Honegger A and Pliickthun A, “Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool,” J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3):65770（「Ａｈｏ」番号付けスキーム）；およびMartin et al., “Modeling antibody hypervariable loops: a combined algorithm,” PNAS, 1989, 86(23):9268-9272（「ＡｂＭ」番号付けスキーム）によって記載されているものを含む多くの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定することができる。
所与のＣＤＲまたはＦＲの境界は、同定に使用されるスキームに応じて異なり得る。例えば、Ｋａｂａｔスキームは構造的アライメントに基づくが、Ｃｈｏｔｈｉａスキームは構造情報に基づく。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａスキームの両方の番号付けは、挿入文字、例えば「３０ａ」によって調節される挿入および一部の抗体で現れる欠失を用いる、最も一般的な抗体領域配列長に基づく。２つのスキームは、ある特定の挿入および欠失（「インデル」）を異なる位置に配置し、異なる番号付けをもたらす。Ｃｏｎｔａｃｔスキームは複合な結晶構造の解析に基づいており、Ｃｈｏｔｈｉａの番号付けスキームと多くの点で類似している。ＡｂＭスキームは、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されるものに基づくＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの定義の妥協案である。
表１は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、およびＣｏｎｔａｃｔスキームによってそれぞれ同定されたＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３およびＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３の例示的な境界位置をリストしている。ＣＤＲ－Ｈ１に関して、残基番号付けはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームの両方を使用してリストされる。ＦＲはＣＤＲ間に位置し、例えば、ＦＲ－Ｌ１はＣＤＲ－Ｌ１の前に位置し、ＦＲ－Ｌ２はＣＤＲ－Ｌ１とＣＤＲ－Ｌ２の間に位置し、ＦＲ－Ｌ３はＣＤＲ－Ｌ２とＣＤＲ－Ｌ３の間に位置する、などである。なお、示されたＫａｂａｔの番号付けスキームは、挿入をＨ３５ＡおよびＨ３５Ｂに配置するため、示されたＫａｂａｔの番号付けの規定を使用して付番される場合、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１ループの末端はループの長さに応じてＨ３２～Ｈ３４で異なる。
故に、特に指定のない限り、所与の抗体またはその領域、例えばその可変領域の「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」または個々の指定されたＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）は、上述のスキームまたは他の公知のスキームのいずれかによって定義される、ある（または特定の）相補性決定領域を包含すると理解されるべきである。例えば、特定のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ－Ｈ３）が、所与のＶＨまたはＶＬ領域アミノ酸配列中の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を含有すると述べられている場合、そのようなＣＤＲは、上述のスキームまたは他の公知のスキームのいずれかによって定義される可変領域内の対応するＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ－Ｈ３）の配列を有することが理解される。一部の実施形態では、特定のＣＤＲ配列が指定される。提供された抗体の例示的なＣＤＲ配列は、様々な番号付けスキームを使用して記載されるが、提供された抗体は、他の上述の番号付けスキームまたは当業者に公知の他の番号付けスキームのいずれかに従って記載されるＣＤＲを含み得ることが理解される。
同様に、特に指定のない限り、所与の抗体またはその領域、例えばその可変領域のＦＲまたは個々の指定されたＦＲ（例えば、ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、ＦＲ－Ｈ４）は、公知のスキームのいずれかによって定義される、ある（または特定の）フレームワーク領域を包含すると理解されるべきである。一部の例では、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭもしくはＣｏｎｔａｃｔ方法、または他の公知のスキームによって定義されるＣＤＲなどの、特定のＣＤＲ、ＦＲ、またはＦＲｓもしくはＣＤＲｓを同定するためのスキームが指定される。他の場合では、ＣＤＲまたはＦＲの特定のアミノ酸配列が示される。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗原への抗体の結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖および軽鎖の可変領域（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）は、一般に、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つのＣＤＲを含む各ドメインを含む、類似した構造を有する［例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照］。単一のＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体が、該抗原に結合する抗体由来のＶＨまたはＶＬドメインを使用して単離されて、それぞれ相補的なＶＬまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照のこと。
提供されたＣＡＲに含まれる抗体の中には抗体断片が含まれる。「抗体断片」または「抗原結合性断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する該インタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖抗体；重鎖可変（ＶＨ）領域、一本鎖抗体分子、例えばｓｃＦｖ、およびＶＨ領域のみを含む単一ドメイン抗体；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、提供されたＣＡＲの抗原結合性ドメインは、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）領域を含む抗体断片であるか、またはこれを含む。特定の実施形態では、抗体は、重鎖可変（ＶＨ）領域および／または軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む一本鎖抗体断片、例えばｓｃＦｖである。
一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＦＭＣ６３から誘導される。ＦＭＣ６３は、一般的に、ヒト起源のＣＤ１９を発現するＮａｌｍ－１および－１６細胞に対して生じたマウスモノクローナルＩｇＧ１抗体を指す（Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302）。一部の実施形態では、ＦＭＣ６３抗体は、配列番号２７および２８にそれぞれ記載されたＣＤＲＨ１およびＨ２、ならびに配列番号２９または３０に記載されたＣＤＲＨ３、ならびに配列番号５５に記載されたＣＤＲＬ１、ならびに配列番号３２または３３に記載されたＣＤＲ Ｌ２、ならびに配列番号３４または３５に記載されたＣＤＲ Ｌ３を含む。一部の実施形態では、ＦＭＣ６３抗体は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３１のＣＤＲＬ１配列、配列番号３２のＣＤＲＬ２配列、および配列番号３４のＣＤＲＬ３配列を含有する可変軽鎖、ならびに／または配列番号２７のＣＤＲＨ１配列、配列番号２８のＣＤＲＨ２配列、および配列番号２９のＣＤＲＨ３配列を含有する可変重鎖を含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３６に記載された可変重鎖領域および配列番号３７に記載された可変軽鎖領域を含む。一部の実施形態では、可変重鎖および可変軽鎖はリンカーによって連結される。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号２５に記載される。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、順に、ＶＨ、リンカー、およびＶＬを含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、順に、ＶＬ、リンカー、およびＶＨを含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３８に記載されたヌクレオチドの配列、または配列番号３８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示す配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３９に記載されたアミノ酸の配列、または配列番号３９に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示す配列を含む。
一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＳＪ２５Ｃ１から誘導される。ＳＪ２５Ｃ１は、ヒト起源のＣＤ１９を発現するＮａｌｍ－１および－１６細胞に対して生じたマウスモノクローナルＩｇＧ１抗体である（Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302）。一部の実施形態では、ＳＪ２５Ｃ１抗体は、配列番号５１～５３にそれぞれ記載されたＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３、ならびに配列番号４８～５０にそれぞれ記載されたＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３配列を含む。一部の実施形態では、ＳＪ２５Ｃ１抗体は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号４８のＣＤＲＬ１配列、配列番号４９のＣＤＲＬ２配列、および配列番号５０のＣＤＲＬ３配列を含有する可変軽鎖、ならびに／または配列番号５１のＣＤＲＨ１配列、配列番号５２のＣＤＲＨ２配列、および配列番号５３のＣＤＲＨ３配列を含有する可変重鎖を含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号４６に記載された可変重鎖領域および配列番号４７に記載された可変軽鎖領域を含む。一部の実施形態では、可変重鎖および可変軽鎖は、リンカーによって連結される。一部の実施形態では、リンカーは配列番号２４に記載される。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、順に、ＶＨ、リンカー、およびＶＬを含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、順に、ＶＬ、リンカー、およびＶＨを含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号５４に記載されたアミノ酸の配列、または配列番号５４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示す配列を含む。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片（例えば、ｓｃＦｖまたはＶＨドメイン）はＢＣＭＡなどの抗原を特異的に認識する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体もしくは抗原結合性断片に由来するか、またはＢＣＭＡに特異的に結合する抗体もしくは抗原結合性断片の変異体である。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ、例えばヒトＢＣＭＡに特異的な抗ＢＣＭＡ ＣＡＲである。マウス抗ヒトＢＣＭＡ抗体およびヒト抗ヒト抗体を含む抗ＢＣＭＡ抗体を含有するキメラ抗原受容体ならびにこのようなキメラ受容体を発現する細胞がこれまでに記載されている。Carpenter et al., Clin Cancer Res., 2013, 19(8):2048-2060、ＷＯ２０１６／０９０３２０、ＷＯ２０１６０９０３２７、ＷＯ２０１０１０４９４９Ａ２およびＷＯ２０１７１７３２５６を参照されたい。一部の実施形態では、抗原または抗原結合ドメインはＢＣＭＡである。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＢＣＭＡに特異的な抗体または抗体断片に由来するＶＨおよびＶＬを含有する。一部の実施形態では、ＢＣＭＡに結合する抗体または抗体断片は、国際特許出願公開番号ＷＯ ２０１６／０９０３２７およびＷＯ ２０１６／０９０３２０に記載された抗体または抗体断片由来のＶＨおよびＶＬであるか、またはこれを含有する。
一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、ＷＯ ２０１６／０９０３２０またはＷＯ２０１６０９０３２７に記載された抗体に由来する可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）領域を含有する抗原結合性ドメイン、例えばｓｃＦｖを含有する。一部の実施形態では、抗原結合性ドメイン、例えばｓｃＦｖは、配列番号５５に記載されたＶＨおよび配列番号５６に記載されたＶＬを含有する。一部の実施形態では、抗原結合性ドメイン、例えばｓｃＦｖは、配列番号５７に記載されたＶＨおよび配列番号５８に記載されたＶＬを含有する。一部の実施形態では、抗原結合性ドメイン、例えばｓｃＦｖは、配列番号５９に記載されたＶＨおよび配列番号６０に記載されたＶＬを含有する。一部の実施形態では、抗原結合性ドメイン、例えばｓｃＦｖは、配列番号６１に記載されたＶＨおよび配列番号６２に記載されたＶＬを含有する。一部の実施形態では抗原結合性ドメイン、例えばｓｃＦｖは、配列番号６３に記載されたＶＨおよび配列番号６４に記載されたＶＬを含有する。一部の実施形態では、抗原結合性ドメイン、例えばｓｃＦｖは、配列番号６５に記載されたＶＨおよび配列番号６６に記載されたＶＬを含有する。一部の実施形態では、抗原結合性ドメイン、例えばｓｃＦｖは、配列番号６７に記載されたＶＨおよび配列番号６８に記載されたＶＬを含有する。一部の実施形態では、ＶＨまたはＶＬは、前述のＶＨまたはＶＬ配列のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を示す、およびＢＣＭＡへの結合を保持するアミノ酸の配列を有する。一部の実施形態では、ＶＨ領域はＶＬ領域のアミノ末端側である。一部の実施形態では、ＶＨ領域はＶＬ領域のカルボキシ末端側である。
一部の実施形態では、抗原または抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄである。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的な抗体または抗体断片由来のＶＨおよびＶＬを含有する。一部の実施形態では、ＧＰＲＣ５Ｄと結合する抗体または抗体断片は、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１６／０９０３２９およびＷＯ２０１６／０９０３１２に記載の抗体または抗体断片からのＶＨおよびＶＬであるかまたはそれを含有する。
一部の態様では、ＣＡＲは、ユニバーサルタグまたはユニバーサルエピトープを結合または認識する、例えば、特異的に結合するリガンド（例えば、抗原）結合ドメインを含有する。一部の態様では、結合ドメインは、疾患または障害に関連する抗原を認識する異なる結合分子（例えば、抗体または抗原結合性断片）に連結できる分子、タグ、ポリペプチドおよび／またはエピトープと結合することができる。例示的なタグまたはエピトープとしては、色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート）またはビオチンが挙げられる。一部の態様では、タグに連結された結合分子（例えば、抗体または抗原結合性断片）は、疾患または障害に関連する抗原、例えば腫瘍抗原を認識し、タグに特異的なＣＡＲを発現する操作された細胞は、操作された細胞の細胞傷害性または他のエフェクター機能を発揮する。一部の態様では、疾患または障害に関連する抗原へのＣＡＲの特異性は、タグを有する結合分子（例えば抗体）によって提供され、異なる抗原を標的化するのに異なるタグを有する結合分子を使用してもよい。ユニバーサルタグまたはユニバーサルエピトープに特異的な例示的なＣＡＲとしては、例えば、ＵＳ９，２３３，１２５、ＷＯ２０１６／０３０４１４、Urbanska et al., (2012) Cancer Res 72: 1844-1852、およびTamada et al., (2012) Clin Cancer Res 18:6436-6445に記載されたものが挙げられる。
一部の実施形態では、抗原は、病原体特異的または病原体発現抗原であるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原（ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ等由来のウイルス抗原など）、細菌抗原、および／または寄生虫抗原である。一部の実施形態では、ＣＡＲは、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）－ペプチド複合体として細胞表面に提示される、腫瘍関連抗原などの細胞内抗原を特異的に認識する抗体または抗原結合性断片（例えば、ｓｃＦｖ）などのＴＣＲ様抗体を含有する。一部の実施形態では、ＭＨＣ－ペプチド複合体を認識する抗体またはその抗原結合部分は、抗原受容体などの組換え受容体の一部として細胞で発現され得る。抗原受容体の中には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの機能性非Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）抗原受容体が含まれる。一部の実施形態では、ペプチド－ＭＨＣ複合体に対するＴＣＲ様特異性を示す抗体または抗原結合性断片を含有するＣＡＲは、ＴＣＲ様ＣＡＲとも呼ばれ得る。一部の実施形態では、ＣＡＲはＴＣＲ様ＣＡＲであり、抗原は、ＴＣＲと同様にＭＨＣ分子の状況において細胞表面で認識される、処理されたペプチド抗原、例えば細胞内タンパク質のペプチド抗原である。一部の実施形態では、ＴＣＲ様ＣＡＲのＭＨＣ－ペプチド複合体に特異的な細胞外抗原結合性ドメインは、一部の態様ではリンカーおよび／または膜貫通ドメインを介して、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達成分に連結される。一部の実施形態では、そのような分子は、典型的には、ＴＣＲなどの天然の抗原受容体を通じたシグナル、および適宜、共刺激受容体と組み合わせたそのような受容体を通じたシグナルを模倣または近似することができる。
「主要組織適合複合体」（ＭＨＣ）への言及は、一部の場合には、細胞機構によって処理されたペプチド抗原を含むポリペプチドのペプチド抗原と複合体形成できる多型結合部位または結合溝を含有するタンパク質、一般に、糖タンパク質を指す。一部の場合において、ＭＨＣ分子は、Ｔ細胞上の抗原受容体、例えばＴＣＲまたはＴＣＲ様抗体によって認識可能なコンフォメーションでの抗原提示のために、例えばペプチドとの複合体、すなわちＭＨＣ－ペプチド複合体などとして、細胞表面上に提示されてもよいし、または細胞表面上で発現されてもよい。一般的に、ＭＨＣクラスＩ分子は、膜貫通α鎖、一部の場合において３つのαドメインを有する膜貫通α鎖、および非共有結合で会合したβ２ミクログロブリンを有するヘテロ二量体である。一般的に、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、２つの膜貫通糖タンパク質、αおよびβで構成され、これらは両方、典型的には膜貫通型である。ＭＨＣ分子は、抗原結合部位またはペプチド結合のための部位、および適切な抗原受容体による認識に必要な配列を含有するＭＨＣの有効な部分を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、サイトゾルに由来するペプチドを細胞表面に送達する、この場合、ＭＨＣ－ペプチド複合体は、Ｔ細胞、例えば一般的にＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されるが、一部の場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識される。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、小胞系に由来するペプチドを細胞表面に送達し、この場合、これらは、典型的には、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識される。一般的に、ＭＨＣ分子は、連鎖した遺伝子座の群によってコードされており、これは集合的に、マウスではＨ－２、ヒトではヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる。したがって、典型的には、ヒトＭＨＣはまた、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と称される場合もある。
用語「ＭＨＣ－ペプチド複合体」または「ペプチド－ＭＨＣ複合体」またはそれらの派生語は、ペプチド抗原およびＭＨＣ分子の複合体または会合を指し、これは例えば、一般的に、ＭＨＣ分子の結合溝またはクレフトにおけるペプチドの非共有結合の相互作用による会合である。一部の実施形態では、ＭＨＣ－ペプチド複合体は、細胞の表面上に存在するかまたは提示される。一部の実施形態では、ＭＨＣ－ペプチド複合体は、抗原受容体、例えばＴＣＲ、ＴＣＲ様ＣＡＲまたはそれらの抗原結合部位によって特異的に認識され得る。
一部の実施形態では、ポリペプチドのペプチド、例えばペプチド抗原またはエピトープは、例えば抗原受容体による認識のために、ＭＨＣ分子と会合することができる。一般的に、ペプチドは、それより長い生体分子、例えばポリペプチドまたはタンパク質の断片から誘導されるかまたはそれに基づく。一部の実施形態では、ペプチドは、典型的には、約８～約２４アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ複合体における認識のために、９～２２アミノ酸または約９～約２２アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ複合体における認識のために、８～１３アミノ酸または約８～約１３アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、ＭＨＣ分子、例えばＭＨＣ－ペプチド複合体の状態でのペプチドの認識のとき、抗原受容体、例えばＴＣＲまたはＴＣＲ様ＣＡＲは、Ｔ細胞応答、例えばＴ細胞増殖、サイトカイン生産、細胞傷害性Ｔ細胞応答または他の応答を誘導するＴ細胞への活性化シグナルを生産するかまたはそのきっかけとなる。
一部の実施形態では、ＴＣＲ様抗体または抗原結合部分は公知であるか、または公知の方法によって作製することができる（例えば、米国公開出願番号ＵＳ ２００２／０１５０９１４；ＵＳ ２００３／０２２３９９４；ＵＳ ２００４／０１９１２６０；ＵＳ ２００６／００３４８５０；ＵＳ ２００７／００９９２５３０；ＵＳ２００９０２２６４７４；ＵＳ２００９０３０４６７９；および国際出願公開番号ＷＯ ０３／０６８２０１を参照）。
一部の実施形態では、ＭＨＣ－ペプチド複合体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、特異的ＭＨＣ－ペプチド複合体を含有する有効量の免疫原で宿主をヒト化して作製されてもよい。一部の例では、ＭＨＣ－ペプチド複合体のペプチドは、ＭＨＣに結合することができる抗原、例えば腫瘍抗原、例えば、ユニバーサル腫瘍抗原、免疫原抗原または以下に記載の他の抗原のエピトープである。一部の実施形態では、有効量の免疫原が次いで、免疫応答を惹起するために宿主に投与され、この場合、免疫原は、ＭＨＣ分子の結合溝におけるペプチドの３次元提示に対して免疫応答を惹起するのに十分な期間にわたりその３次元形態を保持する。次いで宿主から収集された血清をアッセイして、ＭＨＣ分子の結合溝におけるペプチドの３次元提示を認識する望ましい抗体が生産されているかどうかを決定する。一部の実施形態では、抗体が、ＭＨＣ分子単独、目的のペプチド単独、およびＭＨＣと無関係のペプチドとの複合体からＭＨＣ－ペプチド複合体を区別できることを確認するために、生産された抗体を評価することができる。次いで望ましい抗体を単離することができる。
一部の実施形態では、ＭＨＣ－ペプチド複合体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部位は、抗体ライブラリーディスプレイ方法、例えばファージ抗体ライブラリーを採用することによって生産することができる。一部の実施形態では、突然変異体Ｆａｂ、ｓｃＦｖまたは他の抗体形態のファージディスプレイライブラリーが生成されてもよく、例えば、ライブラリーのメンバーは、ＣＤＲまたはＣＤＲｓの１つまたは複数の残基で変異される。例えば、米国特許出願公開番号ＵＳ２００２０１５０９１４、ＵＳ２０１４０２９４８４１；およびCohen CJ. et al. (2003) J Mal. Recogn. 16:324-332を参照のこと。
一部の実施形態では、抗原はＣＤ２０である。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＣＤ２０に特異的な抗体または抗体断片に由来するＶＨおよびＶＬを含有する。一部の実施形態では、ＣＤ２０に結合する抗体または抗体断片は、リツキシマブである抗体、またはリツキシマブに由来する抗体であり、例えばリツキシマブｓｃＦｖである。
一部の実施形態では、抗原はＣＤ２２である。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＣＤ２２に特異的な抗体または抗体断片に由来するＶＨおよびＶＬを含有する。一部の実施形態では、ＣＤ２２に結合する抗体または抗体断片は、ｍ９７１である抗体、またはｍ９７１に由来する抗体であり、例えばｍ９７１ ｓｃＦｖである。
一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、抗体または抗体断片を含有する細胞外部分を含む。一部の態様では、キメラ抗原受容体は、抗体または断片および細胞内シグナル伝達ドメインを含有する細胞外部分を含む。一部の実施形態では、抗体または断片はｓｃＦｖを含む。
一部の実施形態では、組換え受容体、例えばＣＡＲの抗体部分は、ヒンジ領域、例えばＩｇＧ４ヒンジ領域、および／またはＣＨ１／ＣＬおよび／またはＦｃ領域などの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部をさらに含む。一部の実施形態では、定常領域または位置は、ヒトＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１のものである。一部の態様では、定常領域の部分は、抗原認識構成要素、例えば、ｓｃＦｖと膜貫通ドメインの間でスペーサー領域として働く。スペーサーは、スペーサーの不在下と比較して、抗原結合後に細胞の増大された反応性を提供する長さのものであり得る。例示的なスペーサーには、Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１４０３１６８７、米国特許第８，８２２，６４７号または公開出願番号ＵＳ２０１４／０２７１６３５に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、定常領域または部分は、ヒトＩｇＧ、例えばＩｇＧ４またはＩｇＧ１の定常領域または部分である。一部の実施形態では、スペーサーは、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号６９に記載された）を有し、配列番号７０に記載された配列によってコードされる。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号７１に記載された配列を有する。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号７２に記載された配列を有する。一部の実施形態では、定常領域または部分はＩｇＤの定常領域または部分である。一部の実施形態では、スペーサーは、ヒンジ配列であるかまたはヒンジ配列を含む免疫グロブリン定常領域の一部である。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号７３に記載された配列を有する。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号６９、７０、７１、７２、または７３のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号７４～８２に記載された配列を有する。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号７４～８２のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する。
一部の実施形態では、抗原受容体は、細胞外ドメインに直接または間接的に連結された細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結する膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインはＩＴＡＭを含む。例えば、一部の態様では、抗原認識ドメイン（例えば、細胞外ドメイン）は、一般に、１つもしくは複数の細胞内シグナル伝達成分、例えば、抗原受容体複合体、例えばＣＡＲの場合ではＴＣＲ複合体を通じた活性化を模倣するシグナル伝達成分、および／または別の細胞表面受容体を介したシグナルに連結される。一部の実施形態では、キメラ受容体は、細胞外ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）と細胞内シグナル伝達ドメインの間で連結または融合された膜貫通ドメインを含む。故に、一部の実施形態では、抗原結合成分（例えば、抗体）は、１つまたは複数の膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。
一実施形態では、受容体、例えば、ＣＡＲ中のドメインの１つと天然に関連する膜貫通ドメインが使用される。一部の場合には、膜貫通ドメインは、同一または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのこのようなドメインの結合を避けて、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するためにアミノ酸置換によって選択または改変される。
膜貫通ドメインは、一部の実施形態では、天然供給源に、または合成供給源に由来する。供給源が天然である場合には、ドメインは、一部の態様では、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４に由来するものを含む（すなわち、少なくともこれらの膜貫通領域を含む）。あるいは、一部の実施形態における膜貫通ドメインは合成である。一部の態様では、合成膜貫通ドメインは、主に疎水性の残基、例えば、ロイシンおよびバリンを含む。一部の態様では、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットは、合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。一部の実施形態では、連結は、リンカー、スペーサー、および／または膜貫通ドメインによる。一部の態様では、膜貫通ドメインはＣＤ２８の膜貫通部分を含有する。
一部の実施形態では、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインは、直接または間接的に連結することができる。一部の実施形態では、細胞外ドメインおよび膜貫通は、本明細書に記載されたいずれかなどのスペーサーによって連結される。一部の実施形態では、受容体は、膜貫通ドメインが由来する分子の細胞外部分、例えばＣＤ２８細胞外部分を含有する。
細胞内シグナル伝達ドメインの中には、天然の抗原受容体を通じたシグナル、共刺激受容体と組み合わせたそのような受容体を通じたシグナル、および／または共刺激受容体単独を通じたシグナルを模倣または近似するものが含まれる。一部の実施形態では、短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカー、例えば、２から１０個のアミノ酸長のリンカー、例えば、グリシンおよびセリンを含有するもの、例えば、グリシン－セリンダブレットが存在し、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインの間の連結を形成する。
Ｔ細胞活性化は、一部の態様では、２つのクラスの細胞質シグナル伝達配列：ＴＣＲを通じて抗原依存的一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）、および抗原非依存的に作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルをもたらすもの（二次細胞質シグナル伝達配列）によって媒介されると説明される。一部の態様では、ＣＡＲは、そのようなシグナル伝達成分の一方または両方を含む。
受容体、例えばＣＡＲは、一般に、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達成分（複数可）を含む。一部の態様では、ＣＡＲは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する一次細胞質シグナル伝達配列を含む。刺激的方法で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含有し得る。一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例には、ＣＤ３ゼータ鎖、ＦｃＲガンマ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタおよびＣＤ３イプシロンに由来するものが挙げられる。一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞質シグナル伝達分子は、細胞質シグナル伝達ドメイン、その部分、またはＣＤ３ゼータに由来する配列を含有する。
一部の実施形態では、受容体は、ＴＣＲ複合体の細胞内構成要素、例えば、Ｔ細胞活性化および細胞毒性を媒介するＴＣＲ ＣＤ３鎖、例えば、ＣＤ３ゼータ鎖を含む。したがって、一部の態様では、抗原結合部分は、１つまたは複数の細胞シグナル伝達モジュールに連結される。一部の実施形態では、細胞シグナル伝達モジュールは、ＣＤ３膜貫通ドメイン、ＣＤ３細胞内シグナル伝達ドメイン、および／または他のＣＤ３膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、受容体、例えばＣＡＲは、Ｆｃ受容体γ、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５、またはＣＤ１６などの１つまたは複数の追加の分子の一部をさらに含む。例えば、一部の態様では、ＣＡＲまたは他のキメラ受容体は、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３－ζ）またはＦｃ受容体γとＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５またはＣＤ１６の間のキメラ分子を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲまたは他のキメラ受容体が連結すると、受容体の細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現するように操作された免疫細胞、例えばＴ細胞の正常なエフェクター機能または応答の少なくとも１つを活性化する。例えば、一部の文脈では、ＣＡＲは、Ｔ細胞の機能、例えば、細胞溶解活性またはＴヘルパー活性、例えば、サイトカインまたは他の因子の分泌を誘導する。一部の実施形態では、無傷の免疫賦活性鎖の代わりに、抗原受容体構成要素または共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインの末端切断型部分が、例えば、それがエフェクター機能シグナルを伝達する場合には使用される。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列を含み、一部の態様では、天然の状況でそのような受容体と協調作用して抗原受容体との結合後にシグナル伝達を開始する共受容体の細胞質配列も含む。
天然ＴＣＲの文脈において、完全活性化は、一般に、ＴＣＲを介したシグナル伝達だけでなく、共刺激シグナルも必要とする。したがって、一部の実施形態では、完全活性化を促進するために、二次または共刺激シグナルを生成するための構成要素もＣＡＲ中に含まれる。他の実施形態では、ＣＡＲは、共刺激シグナルを生成するための構成要素を含まない。一部の態様では、さらなるＣＡＲは、同一細胞において発現され、二次または共刺激シグナルを生成するための構成要素を提供する。
一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、共刺激受容体のシグナル伝達ドメインおよび／または膜貫通部分、例えばＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、およびＩＣＯＳを含む。一部の態様では、同じＣＡＲが活性化成分および共刺激成分の両方を含む。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞共刺激分子またはその機能性変異体に由来する細胞内ドメインを、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインの間などに含有する。一部の態様では、Ｔ細胞共刺激分子はＣＤ２８または４１ＢＢである。
一部の実施形態では、活性化ドメインは１つのＣＡＲの中に含まれるのに対し、共刺激成分は別の抗原を認識する別のＣＡＲによって提供される。一部の実施形態では、ＣＡＲは、両方とも同じ細胞で発現される活性化ＣＡＲまたは刺激ＣＡＲ、共刺激ＣＡＲを含む（ＷＯ２０１４／０５５６６８を参照）。一部の態様では、細胞は、１つまたは複数の刺激ＣＡＲもしくは活性化ＣＡＲおよび／または共刺激ＣＡＲを含む。一部の実施形態では、細胞は、疾患もしくは状態に関連するおよび／または特異的な抗原以外の抗原を認識するＣＡＲなどの抑制性ＣＡＲ［ｉＣＡＲ、Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 2013)を参照］をさらに含み、それにより、抑制性ＣＡＲがそのリガンドに結合することによって、疾患標的化ＣＡＲを通じてデリバリーされる活性化シグナルは減少または抑制されて、例えばオフターゲット効果を低減する。
一部の実施形態では、２つ受容体は、受容体のうちの１つのその抗原への連結は細胞を活性化するかまたは応答を誘導するが、第２の抑制性受容体のその抗原への連結はその応答を抑制するまたは弱めるように、それぞれ活性化シグナルおよび抑制性シグナルを細胞に誘導する。例は、活性化ＣＡＲおよび抑制性ＣＡＲ（ｉＣＡＲｓ）の組合せである。そのような戦略は、例えば、疾患または状態で発現されるが、正常な細胞でも発現される抗原に活性化ＣＡＲが結合し、正常な細胞で発現されるが、疾患または状態の細胞では発現されない別々の抗原に抑制性受容体が結合する状況においてオフターゲット効果の可能性を低減するのに使用され得る。
一部の態様では、キメラ受容体は、抑制性ＣＡＲ（例えば、ｉＣＡＲ）であるか、またはこれを含み、細胞におけるＩＴＡＭ促進応答および／または共刺激促進応答などの免疫応答を弱めるまたは抑制する細胞内成分を含む。そのような細胞内シグナル伝達成分の例は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、ＯＸ２Ｒ、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ－１、ＰＧＥ２受容体、Ａ２ＡＲを含むＥＰ２／４アデノシン受容体を含む、免疫チェックポイント分子で見出されるものである。一部の態様では、操作された細胞は、抑制性ＣＡＲが細胞の応答（例えば、活性化ＣＡＲおよび／または共刺激ＣＡＲによって誘導される）を弱める役割を果たすように、そのような抑制性分子の、またはそのような抑制性分子に由来するシグナル伝達ドメイを含む抑制性ＣＡＲを含む。
ある特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３ゼータ）細胞内ドメインに連結されたＣＤ２８膜貫通およびシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインに連結されたキメラＣＤ２８およびＣＤ１３７（４－１ＢＢ、ＴＮＦＲＳＦ９）共刺激ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、１つまたは複数の、例えば２つ以上の共刺激ドメインおよび活性化ドメイン、例えば一次活性化ドメインを細胞質部分に包含する。例示的なＣＡＲには、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、および４－１ＢＢの細胞内成分が挙げられる。
一部の実施形態では、抗原受容体は、マーカーおよび／またはＣＡＲもしくは他の抗原受容体を発現する細胞をさらに含み、受容体を発現させるための細胞の形質導入または操作を確認するのに使用され得る細胞表面マーカーなどのサロゲートマーカーをさらに含む。一部の態様では、マーカーは、ＣＤ３４、ＮＧＦＲ、または上皮成長因子受容体の全体または部分（例えば、切断型）、例えばそのような細胞表面受容体の切断バージョン（例えば、ｔＥＧＦＲ）を含む。一部の実施形態では、マーカーをコードする核酸は、切断可能なリンカー配列、例えばＴ２Ａなどのリンカー配列をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される。例えば、マーカー、および適宜リンカー配列は、公開特許出願番号ＷＯ２０１４０３１６８７に開示されているいずれかであってもよい。例えば、マーカーは、Ｔ２Ａ切断可能リンカー配列などのリンカー配列に適宜連結された切断型ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）であってもよい。
切断型ＥＧＦＲ（例えば、ｔＥＧＦＲ）の例示的なポリペプチドは、配列番号２もしくは３に記載されたアミノ酸の配列、または配列番号２もしくは３に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。例示的なＴ２リンカー配列は、配列番号１もしくは４に記載されたアミノ酸の配列、または配列番号１もしくは４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。
一部の実施形態では、マーカーは、Ｔ細胞で天然に見出されない、またはＴ細胞の表面で天然に見出されない分子、例えば細胞表面タンパク質、またはその部分である。一部の実施形態では、分子は、非自己分子、例えば非自己タンパク質、すなわち、細胞が養子移入される宿主の免疫系によって「自己」として認識されない分子である。
一部の実施形態では、マーカーは、治療機能を提供せず、かつ／または遺伝子操作についてのマーカーとして使用されること、例えば操作に成功した細胞を選択するため以外の効果を生産しない。他の実施形態では、マーカーは、治療用分子または別の方法で一部の所望の効果を発揮する分子、例えばインビボにおいて遭遇される細胞のリガンド、例えば養子移入およびリガンドとの遭遇に際して細胞の応答を向上および／または減弱する共刺激分子または免疫チェックポイント分子であってもよい。
一部の例では、ＣＡＲは、第１、第２、および／または第３世代ＣＡＲと呼ばれる。一部の態様では、第１世代ＣＡＲは、抗原結合時にＣＤ３鎖誘導シグナルだけをもたらすものであり；一部の態様では、第２世代ＣＡＲは、そのようなシグナルおよび共刺激シグナルをもたらすもの、例えば、ＣＤ２８またはＣＤ１３７などの共刺激受容体由来の細胞内シグナル伝達ドメインを含むものであり；一部の態様では、第３世代ＣＡＲは、異なる共刺激受容体の複数の共刺激ドメインを含むものである。
例えば、一部の実施形態では、ＣＡＲは、記載されているいずれかを含む抗原に特異的な抗体、例えば、ｓｃＦｖなどの抗体断片、ＣＤ２８の膜貫通部分である膜貫通ドメインもしくはＣＤ２８の膜貫通部分を含有する膜貫通ドメインまたはその機能性変異体、およびＣＤ２８のシグナル伝達部分を含有する細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能性変異体、およびＣＤ３ゼータのシグナル伝達部分またはその機能性変異体を含有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、記載されているいずれかを含む抗原に特異的な抗体、例えば、ｓｃＦｖなどの抗体断片、ＣＤ２８の膜貫通部分である膜貫通ドメインもしくはＣＤ２８の膜貫通部分を含有する膜貫通ドメインまたはその機能性変異体、および４－１ＢＢのシグナル伝達部分を含有する細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能性変異体、およびＣＤ３ゼータのシグナル伝達部分またはその機能性変異体を含有する。一部のそのような実施形態では、受容体は、ヒトＩｇ分子などのＩｇ分子の一部、例えばＩｇヒンジ、例えばＩｇＧ４ヒンジを含有するスペーサー、例えばヒンジのみのスペーサーをさらに含む。
一部の実施形態では、組換え受容体、例えばＣＡＲの膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメイン（例えば、アクセッション番号Ｐ０１７４７．１）もしくはその変異体、例えば、配列番号８３に記載されたアミノ酸の配列、または配列番号８３に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示アミノ酸の配列を含む膜貫通ドメインであるか、またはこれを含む；一部の実施形態では、組換え受容体の一部を含有する膜貫通ドメインは、配列番号８４に記載されたアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。
一部の実施形態では、組換え受容体、例えばＣＡＲの細胞内シグナル伝達成分は、ヒトＣＤ２８の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能性変異体もしくは部分、例えば、天然のＣＤ２８タンパク質の１８６～１８７位にＬＬからＧＧへの置換を有するドメインを含有する。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８５もしくは８６に記載されたアミノ酸の配列、または配列番号８５もしくは８６に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を含むことができる。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、４－１ＢＢの細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、アクセッション番号Ｑ０７０１１．１）またはその機能性変異体もしくは部分、例えば、配列番号８７に記載されたアミノ酸の配列、または配列番号８７に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。
一部の実施形態では、組換え受容体、例えばＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ゼータ刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能性変異体、例えば、ヒトＣＤ３ζのアイソフォーム３の１１２ ＡＡ細胞質ドメイン（アクセッション番号：Ｐ２０９６３．２）、または米国特許第７，４４６，１９０号もしくは米国特許第８，９１１，９９３号に記載のＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。例えば、一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８８、８９もしくは９０に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号８８、８９もしくは９０に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。
一部の態様では、スペーサーは、ＩｇＧのヒンジ領域のみ、例えば、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１のヒンジのみ、例えば、配列番号６９に記載されたヒンジのみのスペーサーを含有する。他の実施形態では、スペーサーは、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインに適宜連結されたＩｇヒンジ、例えばＩｇＧ４由来ヒンジであるか、またはこれを含有する。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号７２に記載されたような、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに連結されたＩｇヒンジ、例えばＩｇＧ４ヒンジである。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号７１に記載されたような、ＣＨ３ドメインのみに連結されたＩｇヒンジ、例えばＩｇＧ４ヒンジである。一部の実施形態では、スペーサーは、グリシン－セリンリッチ配列または公知のフレキシブルリンカーなどの他のフレキシブルリンカーであるか、またはこれを含む。
例えば、一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗体、例えば、ｓｃＦｖを含む抗体断片、スペーサー、例えば、重鎖分子のヒンジ領域および／または１つまたは複数の定常領域などの免疫グロブリン分子の一部を含有するスペーサー、例えばＩｇヒンジ含有スペーサー、ＣＤ２８由来膜貫通ドメインの全体または部分を含有する膜貫通ドメイン、ＣＤ２８由来細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗体またはｓｃＦｖなどの断片、Ｉｇヒンジ含有スペーサーのいずれかなどのスペーサー、ＣＤ２８由来膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ由来細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータ由来シグナル伝達ドメインを含む。
例示的なサロゲートマーカーは、細胞表面ポリペプチドの切断型、例えば、非機能性であり、シグナルもしくは通常は細胞表面ポリペプチドの完全長型によって形質導入されるシグナルを形質導入しないもしくはすることができない、および／または内在化しないもしくはすることができない切断型を挙げることができる。例示的な切断型細胞表面ポリペプチドには、増殖因子または他の受容体の切断型、例えば、切断型ヒト上皮成長因子受容体２（ｔＨＥＲ２）、切断型上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲ、配列番号２または３に記載された例示的なｔＥＧＦＲ配列）、または前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）もしくはその改変型が挙げられる。ｔＥＧＦＲは、抗体セツキシマブ［Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）］または他の治療用抗ＥＧＦＲ抗体もしくは結合分子によって認識されるエピトープを含有してもよく、該抗体または結合分子は、ｔＥＧＦＲコンストラクトおよびコードされた外因性タンパク質を発現するように操作された細胞を同定もしくは選択する、ならびに／またはコードされた外因性タンパク質を発現する別々の細胞を排除するのに使用され得る。［米国特許第８，８０２，３７４号およびLiu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434を参照］。一部の態様では、マーカー、例えばサロゲートマーカーは、ＣＤ３４、ＮＧＦＲ、ＣＤ１９もしくは切断ＣＤ１９、例えば切断型非ヒトＣＤ１９、または上皮成長因子受容体（例えば、ｔＥＧＦＲ）の全体または部分（例えば、切断型）を含む。一部の実施形態では、マーカーは、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、例えばスーパーフォールドＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、例えば、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄまたはＤｓＲｅｄ２、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、高感度青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ならびに蛍光タンパク質の種変異体、単量体変異体、およびコドン最適化および／または増強された変異体を含むそれらの変異体であるか、またはこれらを含む。一部の実施形態では、マーカーは、ルシフェラーゼ、大腸菌由来のｌａｃＺ遺伝子、アルカリホスファターゼ、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの酵素であるか、またはこれらを含む。例示的な発光レポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）またはそれらの変異体が挙げられる。
一部の実施形態では、マーカーは、耐性マーカーまたは選択マーカーである。一部の実施形態では、耐性マーカーまたは選択マーカーは、外因性薬剤または薬物に対する耐性を与えるポリペプチドであるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、耐性マーカーまたは選択マーカーは抗生物質耐性遺伝子である。一部の実施形態では、耐性マーカーまたは選択マーカーは、哺乳動物細胞に抗生物質耐性を与える抗生物質耐性遺伝子である。一部の実施形態では、耐性マーカーまたは選択マーカーは、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジェネティシン耐性遺伝子、もしくはゼオシン耐性遺伝子、またはそれらの改変型であるか、またはこれらを含む。
一部の実施形態では、マーカーをコードする核酸は、切断可能なリンカー配列、例えばＴ２Ａなどのリンカー配列をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される。例えば、マーカー、および適宜リンカー配列は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４０３１６８７に開示されているいずれかであってもよい。
一部の実施形態では、そのようなＣＡＲコンストラクトをコードする核酸分子は、例えばＣＡＲをコードする配列の下流に、Ｔ２Ａリボソームスキップエレメントおよび／またはｔＥＧＦＲ配列をコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、該配列は、配列番号１もしくは４に記載されたＴ２Ａリボソームスキップエレメント、または配列番号１もしくは４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列をコードする。
一部の実施形態では、抗原受容体（例えば、ＣＡＲ）を発現するＴ細胞は、非免疫原性選択エピトープとして切断型ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）を発現するように生成することもでき（例えば、同じコンストラクトから２つのタンパク質を発現するようにＴ２Ａリボソームスイッチによって隔てられたＣＡＲおよびｔＥＧＦＲをコードするコンストラクトの導入によって）、次いでｔＥＧＦＲは、そのような細胞を検出するマーカーとして使用することができる（例えば、米国特許第８，８０２，３７４号を参照）。一部の実施形態では、配列は、配列番号２もしくは３に記載されたｔＥＧＦＲ配列、または配列番号２もしくは３に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列をコードする。一部の場合には、ペプチド、例えば、Ｔ２Ａは、リボソームが２ＡエレメントのＣ末端におけるペプチド結合の合成をスキップ（リボソームスキッピング）することをもたらし、２Ａ配列の末端と下流の次のペプチドとの分離をもたらし得る（例えば、de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004)およびdeFelipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)を参照されたい）。多数の２Ａエレメントが公知である。本明細書に開示された方法および核酸において使用することができる２Ａ配列の例には、米国特許公開第２００７０１１６６９０号に記載の口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ、例えば、配列番号８）、Ａ型ウマ鼻炎ウイルス（Ｅ２Ａ、例えば、配列番号７）、トセア・アシグナウイルス（Ｔ２Ａ、例えば、配列番号１または４）、およびブタテッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ、例えば、配列番号５または６）由来の２Ａ配列が挙げられるが、これらに限定されない。
対象に投与される細胞によって発現された組換え受容体、例えば、ＣＡＲは一般に、処置されている疾患または状態またはその細胞において発現される、それと関連している、および／またはそれに対して特異的である分子を認識する、または特異的に結合する。受容体は、分子、例えば、抗原へ特異的に結合すると、一般に、免疫賦活性シグナル、例えば、ＩＴＡＭが形質導入されたシグナルを細胞中に送達し、それによって、疾患または状態に標的化された免疫応答を促進する。例えば、一部の実施形態では、細胞は、疾患もしくは状態の、または疾患もしくは状態と関連する細胞または組織によって発現された抗原に特異的に結合するＣＡＲを発現する。
Ｂ．キメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）
一部の実施形態では、組換え受容体はキメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）である。一部の実施形態では、ＣＡＡＲは、自己抗体に結合する、例えば特異的結合するか、または認識する。一部の実施形態では、ＣＡＡＲを発現する細胞、例えば、ＣＡＡＲを発現するように操作されたＴ細胞は、正常な抗体発現細胞ではなく自己抗体発現細胞に結合し、これを死滅させるのに使用することができる。一部の実施形態では、ＣＡＡＲ発現細胞は、自己免疫疾患などの、自己抗原の発現に関連する自己免疫疾患を処置するのに使用することができる。一部の実施形態では、ＣＡＡＲ発現細胞は、最終的に自己抗体を生成しおよびその細胞表面に自己抗体を提示するＢ細胞を標的化し、治療介入のための疾患特異的標的としてこれらのＢ細胞をマークすることができる。一部の実施形態では、ＣＡＡＲ発現細胞は、抗原特異的キメラ自己抗体受容体を使用して疾患を引き起こすＢ細胞を標的化することによって、自己免疫疾患における病原性Ｂ細胞を効率的に標的化し、死滅させるのに使用することができる。一部の実施形態では、組換え受容体は、米国特許出願公開番号ＵＳ ２０１７／００５１０３５に記載されているいずれかなどのＣＡＡＲである。
一部の実施形態では、ＣＡＡＲは、自己抗体結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および１つまたは複数の細胞内シグナル伝達領域またはドメイン（互換的に細胞質シグナル伝達ドメインまたは領域とも呼ばれる）を含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達領域は細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、Ｔ細胞において一次活性化シグナルを刺激および／または誘導することができるシグナル伝達ドメイン、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）成分のシグナル伝達ドメイン［例えば、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメインもしくは領域、またはその機能性変異体もしくはシグナル伝達部分］、および／または免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含むシグナル伝達ドメインであるか、またはこれらを含む。
一部の実施形態では、自己抗体結合ドメインは自己抗原またはその断片を含む。自己抗原の選択は、標的化される自己抗体のタイプに依存し得る。例えば、自己抗原は、特定の疾患状態、例えば、自己抗体媒介自己免疫疾患などの自己免疫疾患に関連する、Ｂ細胞などの標的細胞上の自己抗体を認識することができるため、自己抗原が選択され得る。一部の実施形態では、自己免疫疾患は尋常性天疱瘡（ＰＶ）を含む。例示的な自己抗原には、デスモグレイン１（Ｄｓｇ１）およびＤｓｇ３が挙げられる。
Ｃ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
一部の実施形態では、標的ポリペプチド、例えば、腫瘍タンパク質、ウイルスタンパク質または自己免疫タンパク質の抗原のペプチドエピトープまたはＴ細胞エピトープを認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその抗原結合部分を発現する、Ｔ細胞などの操作された細胞が提供される。
一部の実施形態では、「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」は、可変αおよびβ鎖（それぞれ、ＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても知られる）もしくは可変γおよびδ鎖（それぞれ、ＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても知られる）、またはそれらの抗原結合部分を含有し、ＭＨＣ分子に結合したペプチドに特異的に結合することができる分子である。一部の実施形態では、ＴＣＲはαβ型である。典型的には、αβ型およびγδ型で存在するＴＣＲは概ね構造的に類似しているが、それらを発現するＴ細胞は異なる解剖学的位置または機能を有し得る。ＴＣＲは、細胞の表面でまたは可溶型で見出され得る。一般に、ＴＣＲは、Ｔ細胞（またはＴリンパ球）の表面で見出され、一般に、そこで主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関与している。
特に明記しない限り、用語「ＴＣＲ」は、完全なＴＣＲおよびその抗原結合部分または抗原結合性断片を包含すると理解されるべきである。一部の実施形態では、ＴＣＲは、αβ型またはγδ型のＴＣＲを含むインタクトなまたは完全長のＴＣＲである。一部の実施形態では、ＴＣＲは、完全長ＴＣＲに満たないが、ＭＨＣ分子中の結合した特定のペプチドに結合する、例えばＭＨＣ－ペプチド複合体に結合する、抗原結合部分である。一部の例では、ＴＣＲの抗原結合部分または断片は、完全長またはインタクトなＴＣＲの構造ドメインの一部のみを含有し得るが、完全なＴＣＲが結合するＭＨＣ－ペプチド複合体などのペプチドエピトープに依然として結合することができる。一部の例では、抗原結合部分は、特異的ＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するのに十分なＴＣＲの可変ドメイン、例えば、ＴＣＲの可変α鎖および可変β鎖を含有する。一般に、ＴＣＲの可変鎖は、ペプチド、ＭＨＣおよび／またはＭＨＣ－ペプチド複合体の認識に関与する相補性決定領域を含有する。
一部の実施形態では、ＴＣＲの可変ドメインは、一般に抗原認識および結合能および特異性に対する主要な寄与因子である、超可変ループまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。一部の実施形態では、ＴＣＲのＣＤＲまたはその組合せは、所与のＴＣＲ分子の抗原結合部位の全てまたは実質的に全てを形成する。ＴＣＲ鎖の可変領域内の様々なＣＤＲは、一般にフレームワーク領域（ＦＲ）によって隔てられ、ＣＤＲと比較してＦＲは、ＴＣＲ分子間でより少ない可変性を一般に示す（例えば、Jares et al., Proc. Nat’ l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990;Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988を参照；また、Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003も参照のこと）。一部の実施形態では、ＣＤＲ３は、抗原結合もしくは特異性に関与する主なＣＤＲであるか、または抗原認識、および／もしくはペプチド－ＭＨＣ複合体の処理されたペプチド部分との相互作用にとって、所与のＴＣＲ可変領域の３つのＣＤＲの中で最も重要である。一部の状況では、アルファ鎖のＣＤＲ１は、ある特定の抗原ペプチドのＮ末端部分と相互作用することができる。一部の状況では、ベータ鎖のＣＤＲ１は、ペプチドのＣ末端部分と相互作用することができる。一部の状況では、ＣＤＲ２は、ＭＨＣ－ペプチド複合体のＭＨＣ部分との相互作用もしくは該部分の認識に最も強く寄与するかまたは関与する主要なＣＤＲである。一部の実施形態では、β鎖の可変領域は、一般にスーパー抗原結合に関与し、抗原認識に関与しない、さらなる超可変領域（ＣＤＲ４またはＨＶＲ４）を含有することができる［Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426］。
一部の実施形態では、ＴＣＲは、定常ドメイン、膜貫通ドメインおよび／または短い細胞質テイルも含有することができる（例えば、Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997を参照）。一部の態様では、ＴＣＲの各鎖は、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびＣ末端の短い細胞質テイルを有することができる。一部の実施形態では、ＴＣＲは、シグナル伝達の媒介に関与するＤ３複合体のインバリアントタンパク質と会合する。
一部の実施形態では、ＴＣＲ鎖は１つまたは複数の定常ドメインを含有する。例えば、所与のＴＣＲ鎖（例えば、α鎖またはβ鎖）の細胞外部分は、細胞膜に隣接する２つの免疫グロブリン様ドメイン、例えば、可変ドメイン（例えば、ＶαまたはＶβ；典型的にはＫａｂａｔ番号付けに基づくアミノ酸１～１１６ Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.）および定常ドメイン（例えば、α鎖定常ドメインまたはＣα、典型的にはＫａｂａｔ番号付けに基づくα鎖の１１７～２５９位、またはβ鎖定常ドメインまたはＣβ、典型的にはＫａｂａｔに基づくβ鎖の１１７～２９５位）を含有する。例えば、一部の例では、２つの鎖によって形成されるＴＣＲの細胞外部分は２つの膜近位定常ドメイン、および２つの膜遠位可変ドメインを含有し、可変ドメインは各々ＣＤＲを含有する。ＴＣＲの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、それによってＴＣＲの２つの鎖を連結する短い連結配列を含有してもよい。一部の実施形態では、ＴＣＲが定常ドメインに２つのジスルフィド結合を有するように、ＴＣＲはαおよびβ鎖の各々に追加のシステイン残基を有してもよい。
一部の実施形態では、ＴＣＲ鎖は膜貫通ドメインを含有する。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは正に荷電される。一部の例では、ＴＣＲ鎖は細胞質テイルを含有する。一部の例では、構造がＴＣＲをＣＤ３およびそのサブユニットのような他の分子と会合させる。例えば、膜貫通領域を有する定常ドメインを含有するＴＣＲは、細胞膜にタンパク質を固定し、ＣＤ３シグナル伝達装置または複合体のインバリアントサブユニットと会合し得る。ＣＤシグナル伝達サブユニット（例えば、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εおよびＣＤ３ζ鎖）の細胞内テイルは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能力に関与する１つまたは複数の免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはＩＴＡＭを含有する。
一部の実施形態では、ＴＣＲは、２つの鎖αおよびβ（または適宜γおよびδ）のヘテロ二量体であってもよく、または一本鎖ＴＣＲコンストラクトであってもよい。一部の実施形態では、ＴＣＲは、ジスルフィド結合（複数可）などによって連結された２つの別々の鎖（αおよびβ鎖またはγおよびδ鎖）を含有するヘテロ二量体である。
一部の実施形態では、ＴＣＲは、実質的に完全長のコード配列が容易に利用可能なＶα、β鎖の配列などの公知のＴＣＲ配列から生成することができる。細胞源からＶ鎖配列を含む完全長ＴＣＲ配列を得る方法は周知である。一部の実施形態では、ＴＣＲをコードする核酸は、所与の細胞内のもしくは所与の細胞から単離されたＴＣＲコード核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、または市販のＴＣＲ ＤＮＡ配列の合成などによって様々な供給源から得ることができる。
一部の実施形態では、ＴＣＲは、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔ細胞ハイブリドーマなどの細胞などの生物学的供給源、または他の市販の供給源から得られる。一部の実施形態では、Ｔ細胞はインビボで単離された細胞から得ることができる。一部の実施形態では、ＴＣＲは胸腺で選択されたＴＣＲである。一部の実施形態では、ＴＣＲはネオエピトープ拘束性ＴＣＲである。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞ハイブリドーマまたはクローンであってもよい。一部の実施形態では、ＴＣＲまたはその抗原結合部分もしくは抗原結合性断片は、ＴＣＲの配列の知識から合成で生成されてもよい。
一部の実施形態では、ＴＣＲは、標的ポリペプチド抗原、またはその標的Ｔ細胞エピトープに対する候補ＴＣＲのライブラリーのスクリーニングから同定または選択されたＴＣＲから生成される。ＴＣＲライブラリーは、ＰＢＭＣ、脾臓または他のリンパ器官に存在する細胞を含む対象から単離されたＴ細胞由来のＶαおよびＶβのレパートリーの増幅によって生成することができる。一部の例では、Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から増幅され得る。一部の実施形態では、ＴＣＲライブラリーがＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞から生成され得る。一部の実施形態では、ＴＣＲは健康な対象の正常なＴ細胞源から増幅され得る（すなわち、正常なＴＣＲライブラリー）。一部の実施形態では、ＴＣＲは疾患を有する対象のＴ細胞源から増幅され得る（すなわち、疾患ＴＣＲライブラリー）。一部の実施形態では、ヒトから得られたＴ細胞などの試料でのＲＴ－ＰＣＲなどによってＶαおよびＶβの遺伝子レパートリーを増幅するのに縮重プライマーが使用されてもよい。一部の実施形態では、増幅産物がリンカーによって隔てられるようにクローニングされるかまたは組み立てられるナイーブＶαおよびＶβライブラリーから、ｓｃＴｖライブラリーが組み立てられてもよい。対象および細胞供給源に応じて、ライブラリーはＨＬＡ対立遺伝子特異的であり得る。あるいは、一部の実施形態では、ＴＣＲライブラリーは、親または足場ＴＣＲ分子の変異誘発または多様化によって生成することができる。一部の態様では、ＴＣＲは、例えばαまたはＶβ鎖の変異誘発などによって定向進化に供される。一部の態様では、ＴＣＲのＣＤＲ内の特定の残基が変更される。一部の実施形態では、選択されたＴＣＲが親和性成熟によって改変され得る。一部の実施形態では、ペプチドに対するＣＴＬ活性を評価するためにスクリーニングなどによって抗原特異的Ｔ細胞が選択され得る。一部の態様では、例えば抗原特異的Ｔ細胞に存在するＴＣＲが、結合活性、例えば、抗原に対する特定の親和性またはアビディティーなどによって選択され得る。
一部の実施形態では、ＴＣＲまたはその抗原結合部分は、改変または操作されたものである。一部の実施形態では、特異的ＭＨＣ－ペプチド複合体に対する親和性がより高いなど、特性が変更されたＴＣＲを生成するのに定向進化方法が使用される。一部の実施形態では、定向進化は、酵母ディスプレイ［Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92］、ファージディスプレイ［Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54］、またはＴ細胞ディスプレイ［Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84］を含むがこれらに限定されないディスプレイ方法によって達成される。一部の実施形態では、ディスプレイアプローチは、既知の親または参照ＴＣＲの操作または改変を必要とする。例えば、一部の例では、ＣＤＲの１つまたは複数の残基が変異され、所望の変更された特性、例えば、所望の標的抗原に対するより高い親和性を有する変異体が選択される変異誘発ＴＣＲを作製するための鋳型として、野生型ＴＣＲが使用され得る。
一部の実施形態では、目的のＴＣＲの作製または生成において使用するための標的ポリペプチドのペプチドは既知であるか、または容易に同定することができる。一部の実施形態では、ＴＣＲまたは抗原結合部分の生成における使用に適したペプチドは、以下に記載される標的ポリペプチドなどの目的の標的ポリペプチド中のＨＬＡ拘束性モチーフの存在に基づき決定することができる。一部の実施形態では、ペプチドは、利用可能なコンピューター予測モデルを使用して同定される。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ結合部位の予測に関するそのようなモデルには、ＰｒｏＰｒｅｄ１［Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17(12): 1236- 1237］、およびＳＹＦＰＥＩＴＨＩ［Schuler et al. (2007) 226 Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007を参照］が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＭＨＣ拘束性エピトープは、全白人の約３９～４６％で発現され、それ故に、ＴＣＲまたは他のＭＨＣ－ペプチド結合分子の調製において使用するためのＭＨＣ抗原の適切な選択となるＨＬＡ－Ａ０２０１である。
コンピューター予測モデルを使用したＨＬＡ－Ａ０２０１結合モチーフならびにプロテアソームおよび免疫プロテアソームの切断部位は公知である。ＭＨＣクラスＩ 結合部位の予測に関するそのようなモデルには、ＰｒｏＰｒｅｄ１［Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12): 1236-1237 2001により詳細に記載されている］、およびＳＹＦＰＥＩＴＨＩ［Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93 2007を参照］挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、ＴＣＲまたはその抗原結合部分は、結合特性などの１つまたは複数の特性が変更されている組換えにより作製された天然のタンパク質またはその変異型であってもよい。一部の実施形態では、ＴＣＲは様々な動物種、例えば、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物の１つに由来してもよい。ＴＣＲは細胞結合型または可溶型であってもよい。一部の実施形態では、提供される方法の目的のために、ＴＣＲは細胞の表面で発現される細胞結合型である。
一部の実施形態では、ＴＣＲは完全長ＴＣＲである。一部の実施形態では、ＴＣＲは抗原結合部分である。一部の実施形態では、ＴＣＲは二量体ＴＣＲ（ｄＴＣＲ）である。一部の実施形態では、ＴＣＲは一本鎖ＴＣＲ（ｓｃ－ＴＣＲ）である。一部の実施形態では、ｄＴＣＲまたはｓｃＴＣＲは、ＷＯ ０３／０２０７６３、ＷＯ ０４／０３３６８５、ＷＯ２０１１／０４４１８６に記載の構造を有する。
一部の実施形態では、ＴＣＲは膜貫通配列に対応する配列を含有する。一部の実施形態では、ＴＣＲは細胞質配列に対応する配列を含有する。一部の実施形態では、ＴＣＲはＣＤ３とＴＣＲ複合体を形成することができる。一部の実施形態では、ｄＴＣＲまたはｓｃＴＣＲを含むＴＣＲのいずれかが、Ｔ細胞の表面で活性ＴＣＲを生成するシグナル伝達ドメインに連結されてもよい。一部の実施形態では、ＴＣＲは細胞の表面で発現される。
一部の実施形態ではｄＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変領域配列に対応する配列がＴＣＲα鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のＮ末端に融合される第１のポリペプチド、およびＴＣＲβ鎖可変領域配列に対応する配列がＴＣＲβ鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のＮ末端に融合される第２のポリペプチドを含有し、第１および第２のポリペプチドはジスルフィド結合によって連結される。一部の実施形態では、結合は、天然の二量体αβＴＣＲに存在する天然の鎖間ジスルフィド結合に対応し得る。一部の実施形態では、鎖間ジスルフィド結合は天然のＴＣＲに存在しない。例えば、一部の実施形態では、１つまたは複数のシステインがｄＴＣＲポリペプチド対の定常領域細胞外配列に組み込まれてもよい。一部の例では、天然および非天然ジスルフィド結合の両方が望ましい場合がある。一部の実施形態では、ＴＣＲは、膜に固定するための膜貫通配列を含有する。
一部の実施形態では、ｄＴＣＲは、可変αドメイン、定常αドメイン、および定常αドメインのＣ末端に結合した第１の二量体化モチーフを含有するＴＣＲα鎖、ならびに可変βドメイン、定常βドメイン、および定常βドメインのＣ末端に結合した第１の二量体化モチーフを含むＴＣＲβ鎖を含有し、第１および第２の二量体化モチーフは容易に相互作用して、第１の二量体化モチーフ中のアミノ酸と第２の二量体化モチーフ中のアミノ酸の間に共有結合を形成し、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖を連結する。
一部の実施形態では、ＴＣＲはｓｃＴＣＲである。典型的には、ｓｃＴＣＲは、公知の方法を使用して生成することができ、例えば、Soo Hoo, W. F. et al. PNAS (USA) 89, 4759 (1992);Wuelfing, C. and Plueckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994);Kurucz, I. et al. PNAS (USA) 90 3830 (1993)；国際公開ＰＣＴ第ＷＯ９６／１３５９３号、ＷＯ９６／１８１０５号、ＷＯ９９／６０１２０号、ＷＯ９９／１８１２９号、ＷＯ０３／０２０７６３号、ＷＯ２０１１／０４４１８６号；およびSchlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996)を参照のこと。一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ＴＣＲ鎖の会合を容易にするための導入された非天然ジスルフィド鎖間結合を含有する（例えば、国際公開ＰＣＴ第ＷＯ０３／０２０７６３を参照）。一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、そのＣ末端に融合された異種ロイシンジッパーが鎖の会合を容易にする非ジスルフィド連結切断型ＴＣＲである（例えば、国際公開ＰＣＴ第ＷＯ９９／６０１２０号を参照）。一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ペプチドリンカーを介してＴＣＲβ可変ドメインに共有結合されたＴＣＲα可変ドメインを含有する（例えば、国際公開ＰＣＴ第ＷＯ９９／１８１２９号を参照）。
一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変領域に対応するアミノ酸配列によって構成される第１のセグメント、ＴＣＲβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合した、ＴＣＲβ鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列によって構成される第２のセグメント、および第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列を含有する。
一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、α鎖細胞外定常ドメイン配列のＮ末端に融合したα鎖可変領域配列によって構成される第１のセグメント、ならびに配列β鎖細胞外定常および膜貫通配列のＮ末端に融合したβ鎖可変領域配列によって構成される第２のセグメント、ならびに適宜、第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列を含有する。
一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、β鎖細胞外定常ドメイン配列のＮ末端に融合したＴＣＲβ鎖可変領域配列によって構成される第１のセグメント、ならびに配列α鎖細胞外定常および膜貫通配列のＮ末端に融合したα鎖可変領域配列によって構成される第２のセグメント、ならびに適宜、第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列を含有する。
一部の実施形態では、第１および第２のＴＣＲセグメントを連結するｓｃＴＣＲのリンカーは、ＴＣＲ結合特異性を保持しながら、単一ポリペプチド鎖を形成することができる任意のリンカーであってもよい。一部の実施形態では、リンカー配列は、例えば、式－Ｐ－ＡＡ－Ｐ－（式中、Ｐはプロリンであり、ＡＡはアミノ酸配列を表し、アミノ酸はグリシンおよびセリンである）を有し得る。一部の実施形態では、第１および第２のセグメントは対合され、その結果、それらの可変領域配列はそのような結合のために配向される。それ故に、一部の例では、リンカーは、第１のセグメントのＣ末端と第２のセグメントのＮ末端の間の距離に及ぶ十分な長さを有するか、またはその逆も同様であるが、標的リガンドへのｓｃＴＣＲの結合をブロックまたは低減するほど長くはない。一部の実施形態では、リンカーは、１０～４５個のアミノ酸または約１０～約４５個のアミノ酸、例えば１０～３０個のアミノ酸または２６～４１個のアミノ酸残基、例えば２９、３０、３１または３２個アミノ酸を含有することができる。一部の実施形態では、リンカーは、式－ＰＧＧＧ－（ＳＧＧＧＧ）５－Ｐ－（式中、Ｐはプロリンであり、Ｇはグリシンであり、Ｓはセリンである）（配列番号９１）を有する。一部の実施形態では、リンカーは、配列ＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＧＫＳ（配列番号９２）を有する。
一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、α鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基を、β鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基に連結する共有ジスルフィド結合を含有する。一部の実施形態では、天然のＴＣＲの鎖間ジスルフィド結合は存在しない。例えば、一部の実施形態では、１つまたは複数のシステインがｓｃＴＣＲポリペプチドの第１および第２のセグメントの定常領域細胞外配列に組み込まれ得る。一部の例では、天然および非天然ジスルフィド結合の両方が望ましい場合がある。
導入された鎖間ジスルフィド結合を含有するｄＴＣＲまたはｓｃＴＣＲの一部の実施形態では、天然ジスルフィド結合は存在しない。一部の実施形態では、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成する１つまたは複数の天然システインは、別の残基、例えばセリンまたはアラニンに置換される。一部の実施形態では、導入されたジスルフィド結合は、第１および第２のセグメントの非システイン残基をシステインに変異させることによって形成されてもよい。ＴＣＲの例示的な非天然ジスルフィド結合は、公開国際ＰＣＴ番号ＷＯ２００６／０００８３０に記載されている。
一部の実施形態では、ＴＣＲまたはその抗原結合性断片は、標的抗原に対する平衡結合定常が、１０－５～１０－１２Ｍまたは約１０－５～約１０－１２Ｍおよびその中の全ての個々の値および範囲の親和性を示す。一部の実施形態では、標的抗原は、ＭＨＣ－ペプチド複合体またはリガンドである。
一部の実施形態では、αおよびβ鎖などのＴＣＲをコードする核酸は、ＰＣＲ、クローニングまたは他の適切な手段によって増幅され、適切な発現ベクターにクローニングされ得る。発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであってもよく、任意の適切な宿主を形質転換またはトランスフェクトするのに使用することができる。適切なベクターには、増殖および拡大、もしくは発現または両方のために設計されたベクター、例えばプラスミドおよびウイルスが挙げられる。
一部の実施形態では、ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラホヤ、カリフォルニア）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ、マジソン、ウィスコンシン）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ウプサラ、スウェーデン）、またはｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、カリフォルニア）のベクターであってもよい。一部の例では、λＧ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、およびλＮＭ１１４９などのバクテリオファージベクターも使用することができる。一部の実施形態では、植物発現ベクターが使用されてもよく、これはｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１およびｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む。一部の実施形態では、動物発現ベクターは、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭおよびｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む。一部の実施形態では、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターが使用される。
一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、標準的な組換えＤＮＡ法を使用して調製され得る。一部の実施形態では、ベクターは、必要に応じて、およびベクターがＤＮＡベースかまたはＲＮＡベースかを考慮しながら、ベクターが導入される宿主のタイプ（例えば、細菌、真菌、植物、または動物）に固有の転写および翻訳の開始および終止コドンなどの調節配列を含有することができる。一部の実施形態では、ベクターは、ＴＣＲまたは抗原結合部分（または他のＭＨＣ－ペプチド結合分子）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された非天然プロモーターを含有することができる。一部の実施形態では、プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、およびマウス幹細胞ウイルスの長末端反復で見出されるプロモーターであってもよい。他の既知のプロモーターも企図される。
一部の実施形態では、ＴＣＲをコードするベクターを生成するために、目的のＴＣＲを発現するＴ細胞クローンから単離された全ｃＤＮＡからαおよびβ鎖がＰＣＲ増幅され、発現ベクターにクローニングされる。一部の実施形態では、αおよびβ鎖は同じベクターにクローニングされる。一部の実施形態では、αおよびβ鎖は異なるベクタークローニングされる。一部の実施形態では、生成されたαおよびβ鎖は、レトロウイルス、例えばレンチウイルスのベクターに組み込まれる。
ＩＶ．投与方法
疾患、状態、および障害、例えばがんの処置などにおいて組成物を使用する方法も提供される。
本明細書（例えば、節Ｉ）に提供された方法に従って効力が評価された治療用細胞組成物を投与する方法、ならびにがんを含む疾患、状態、および障害を処置または予防するためのそのような細胞、集団、および組成物の使用が提供される。また、本明細書（例えば、節Ｉ）に提供された方法に従って効力が評価された治療用細胞組成物を使用する方法、ならびにがんを含む疾患、状態、および障害を処置または予防するためのそのような治療用細胞組成物の使用も提供される。特定の実施形態では、細胞、集団および組成物は、提供される方法のいずれかに従って作製および操作されたものである。一部の実施形態では、細胞、集団、および組成物は、処置されるべき特定の疾患または状態を有する対象または患者に、例えば、養子Ｔ細胞療法などの養子細胞療法を介して投与される。一部の実施形態では、インキュベーションおよび／または他の処理工程後の操作された組成物および作製終了時の組成物など、提供される方法によって調製された細胞および組成物が対象、例えば、疾患もしくは状態を有するまたは疾患もしくは状態のリスクがある対象に投与される。一部の態様では、方法はそれによって、例えば、操作されたＴ細胞によって認識される抗原を発現するがんの腫瘍負荷を低下させて、疾患または状態の１つまたは複数の症状を処置（例えば、改善）する。
そのような方法および使用は、例えば、インキュベーションおよび／または他の処理工程後の操作された組成物および作製終了時の組成物など、提供される方法によって調製された細胞および組成物を、がんなどの疾患、状態または障害を有する対象に投与して、疾患または障害の処置を達成することを含む、治療的方法および使用を含む。一部の実施形態では、組成物の効力は、本明細書で提供される方法に従って決定される。使用は、そのような方法および処置における組成物の使用、ならびにそのような治療的方法を実施するための医薬の調製におけるそのような組成物の使用を含む。一部の実施形態では、方法および使用はそれによって、対象における腫瘍またはがんなどの疾患または状態または障害を処置する。
養子細胞療法のための細胞の投与方法は公知であり、提供される方法および組成物と関連付けて使用することができる。例えば、養子Ｔ細胞療法方法は、例えば、Gruenberg et alの米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号；Rosenbergの米国特許第４，６９０，９１５号；Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oneal. 8(10):577-85に記載されている。例えば、Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933；Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9；Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338を参照のこと。
本明細書で使用される場合、「対象」はヒトまたは他の動物などの哺乳動物であり、典型的にはヒトである。一部の実施形態では、細胞、細胞集団、または組成物が投与される対象、例えば患者は、哺乳動物、典型的には、ヒトなどの霊長類である。一部の実施形態では、霊長類はサルまたは類人猿である。対象は、男性または女性であってもよく、乳児、若年、青年、成人、および老人の対象を含む任意の適切な年齢であり得る。一部の実施形態では、対象は、非霊長類哺乳動物、例えばげっ歯類である。
本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（およびその文法的変形、例えば「ｔｒｅａｔ」または「ｔｒｅａｔｉｎｇ」）とは、疾患もしくは状態もしくは障害、または症状、副作用または転帰、またはそれらに関連する表現型の完全もしくは部分的な改善または低減を指す。処置の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接または間接的病理学的帰結の減少、転移の予防、疾患進行の減速、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後改善が挙げられるが、これらに限定されない。該用語は、疾患の完全な治癒、または任意の症状の完全な排除、または全ての症状もしくは転帰に対する効果を意味しない。
本明細書で使用される場合、「疾患の発症の遅延」は、疾患（がんなど）の発症を延期し、妨げ、遅くし、遅らせ、安定化し、抑制し、および／または先延ばしにすることを意味する。この遅延は、処置される疾患の病歴および／または個体に応じて様々な時間の長さになり得る。当業者には明らかなように、十分なまたは有意な遅延は、個体が疾患を発症しないという点で実質的に予防を包含し得る。例えば、転移の発生などの後期のがんが遅延され得る。
「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」は、本明細書で使用される場合、疾患に罹りやすい可能性はあるが、まだ疾患と診断されていない対象における疾患の発生または再発に関して、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）を提供することを含む。一部の実施形態では、提供された細胞および組成物は、疾患の発症を遅延するかまたは疾患の進行を遅くするのに使用される。
本明細書で使用される場合、機能または活性を「抑制する」ことは、目的の条件もしくはパラメーターを除けば同じである条件と比較して、またはあるいは別の条件と比較して、機能または活性を低減することである。例えば、腫瘍増殖を抑制する細胞は、該細胞の非存在での腫瘍の増殖速度と比べて腫瘍の増殖速を低下させる。
投与の文脈における剤、例えば、医薬製剤、細胞、または組成物の「有効量」とは、治療的または予防的結果などの所望の結果を達成するために必要な投与量／量および期間での有効な量を指す。
剤、例えば、医薬製剤または細胞の「治療有効量」とは、疾患、状態、もしくは障害の処置などに対する所望の治療的結果、および／または処置の薬物動体的もしくは薬力学的効果を達成するために必要な投与量および期間での有効な量を指す。治療有効量は、対象の病期、年齢、性別、および体重、ならびに投与される細胞集団などの要因に従って異なり得る。一部の実施形態では、提供される方法は、細胞および／または組成物を有効量、例えば治療有効量で投与することを含む。一部の実施形態では、治療用細胞組成物の決定された効力は、有効量、例えば治療有効量を決定するのに使用される。
「予防有効量」とは、所望の予防的結果を達成するために必要な投与量および期間での有効な量を指す。典型的には、必ずしもではないが、予防的用量は、疾患の初期段階の前にまたは初期段階で対象において使用されるため、予防有効量は治療有効量より少なくなる。一部の実施形態では、治療用細胞組成の決定された効力は、治療有効量を決定するのに使用される。
処置される疾患または状態は、抗原の発現が、疾患、状態または障害の病因に関連するおよび／または関与する、例えば、そのような疾患、状態、または障害を引き起こす、増悪させる、またはさもなければ関与する任意の疾患または状態であり得る。例示的な疾患および状態には、悪性腫瘍または細胞の形質転換（例えば、がん）、自己免疫疾患もしくは炎症性疾患、または例えば、細菌、ウイルスもしくは他の病原体に起因する感染症に関連する疾患または状態を挙げることができる。処置され得る様々な疾患および状態に関連する抗原を含む例示的な抗原は、上に記載されている。特定の実施形態では、キメラ抗原受容体またはトランスジェニックＴＣＲは、疾患または状態に関連する抗原に特異的に結合する。
故に、提供される方法および使用は、養子細胞療法のための方法および使用を含む。一部の実施形態では、方法は、該細胞または該細胞を含有する組成物を、対象、組織、または細胞、例えば、疾患、状態もしくは障害を有するか、そのリスクがあるか、またはそれが疑われるものに投与することを含む。一部の実施形態では、細胞、集団、および組成物は、処置されるべき特定の疾患または状態を有する対象に、例えば、養子Ｔ細胞療法などの養子細胞療法を介して投与される。一部の実施形態では、細胞または組成物は、対象、例えば、疾患もしくは状態を有するかまたはそのリスクがある対象に投与され、疾患または状態の１つまたは複数の症状を改善する。
一部の実施形態では、細胞療法、例えば養子Ｔ細胞療法は自家移植によって実施される。自家移植では、細胞は、細胞療法を受けることになっている対象から、またはそのような対象に由来する試料から単離および／またはさもなければ調製される。故に、一部の態様では、細胞は、処置および細胞を必要とする対象、例えば患者に由来し、単離および処理後に同じ対象に投与される。
一部の実施形態では、細胞療法、例えば養子Ｔ細胞療法は同種移植によって実施される。同種移植では、細胞は、細胞療法を受けることになっている、または最終的に細胞療法を受ける対象（例えば第１の対象）以外の対象から単離および／またはさもなければ調製される。そのような実施形態では、細胞は次いで、同じ種の異なる対象、例えば第２の対象に投与される。一部の実施形態では、第１および第２の対象は遺伝的に同一である。一部の実施形態では、第１および第２の対象は遺伝的に類似している。一部の実施形態では、第２の対象は、第１の対象と同じＨＬＡクラスまたはサブタイプを発現する。細胞は任意の適切な手段によって投与することができる。投薬および投与は、投与が短時間かまたは長期であるかに一部依存し得る。様々な投薬スケジュールには、単回投与または様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、細胞、または細胞のサブタイプの個々の集団は、約１００万～約１０００億個の細胞の範囲で、および／または体重１キログラム当たりのその量の細胞で、例えば、１００万～約５００億個の細胞（例えば、約５００万個の細胞、約２５００万個の細胞、約５億個の細胞、約１０億個の細胞、約５０億個の細胞、約２００億個の細胞、約３００億個の細胞、約４００億個の細胞、または前述の値のいずれか２つによって規定される範囲）、例えば約１０００万～約１０００億個の細胞（例えば、約２０００万個の細胞、約３０００万個の細胞、約４０００万個の細胞、約６０００万個の細胞、約７０００万個の細胞、約８０００万個の細胞、約９０００万個の細胞、約１００億個の細胞、約２５０億個の細胞、約５００億個の細胞、約７５０億個の細胞、約９００億個の細胞、または前述の値のいずれか２つによって規定される範囲）、および一部の例では約１億個の細胞～約５００億個の細胞（例えば、約１億２０００万細胞、約２億５０００万個の細胞、約３億５０００万個の細胞、約４億５０００万個の細胞、約６億５０００万個の細胞、約８億個の細胞、約９億個の細胞、約３０億個の細胞、約３００億個の細胞、約４５０億個の細胞）、またはこれらの範囲の間のおよび／もしくは体重１キログラム当たりの任意の値で対象に投与される。やはり、投与量は、特に疾患もしくは障害および／または患者および／または他の処置の特質に応じて異なり得る。一部の実施形態では、投与量は、治療用細胞組成物の効力に依存し得る。一部の実施形態では、細胞は、組合せ処置の一部として、例えば、別の治療介入、例えば抗体または操作された細胞または受容体または剤（細胞傷害性薬剤または治療剤など）と同時に、または任意の順で連続的に投与される。一部の実施形態において細胞は、１つもしくは複数の追加の治療剤と共に、または別の治療介入に関連して、同時にまたは任意の順で連続的に共投与される。一部の状況では、細胞集団が１つもしくは複数の追加の治療剤の効果を増強するように、またはその逆となるように、細胞は十分に近い時間内に別の治療と共投与される。一部の実施形態では、細胞は、１つまたは複数の追加の治療剤の前に投与される。一部の実施形態では、細胞は、１つまたは複数の追加の治療剤の後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加の薬剤は、例えば持続性を増強するＩＬ－２などのサイトカインを含む。一部の実施形態では、方法は化学療法剤の投与を含む。
細胞の投与後、一部の実施形態では操作された細胞集団（例えば、治療用細胞組成物）の生物活性が、例えばいくつかの公知の方法のいずれかによって測定される。評価するパラメーターには、インビボでは、例えばイメージングによる、またはエクスビボでは、例えばＥＬＩＳＡもしくはフローサイトメトリーによる、抗原への操作されたまたは天然のＴ細胞または他の免疫細胞の特異的結合が挙げられる。ある特定の実施形態では、標的細胞を破壊する操作された細胞の能力は、例えば、Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009)、およびHerman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)に記載された細胞傷害性アッセイなどの、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して測定することができる。ある特定の実施形態では、細胞の生物活性は、ＣＤ １０７ａ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、およびＴＮＦなどの１つまたは複数のサイトカインの発現および／または分泌をアッセイすることによって測定される。一部の態様では生物活性は、腫瘍負荷または腫瘍量の低下などの臨床転帰を評価することによって測定される。
ある特定の実施形態では、操作された細胞は、それらの治療的または予防的有効性が向上するようにいくつもの方法でさらに改変される。例えば、集団によって発現される操作されたＣＡＲまたはＴＣＲは、標的化部分に直接、またはリンカーを通じて間接的にコンジュゲートされ得る。化合物、例えばＣＡＲまたはＴＣＲを標的化部分にコンジュゲートする行為は、当技術分野で公知である。例えば、Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995)、および米国特許第５，０８７，６１６号を参照のこと。一部の実施形態では、治療的または予防的有効性の向上の確認は、本明細書（例えば、節Ｉ）に記載された効力を評価する方法を使用して決定される。
ＩＶ．定義
別に定義されない限り、本明細書において使用される、本分野の全ての用語、表記法ならびに他の技術および科学用語または用語法は、特許請求の範囲の主題が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有することが意図される。一部の場合、通常理解される意味を有する用語は、明確にするためにおよび／または参照を容易にするために本明細書において定義され、本明細書におけるそのような定義の包含は、必ずしも、当該技術分野において一般的に理解されている定義との実質的な相違を表すとは解釈すべきでない。
本明細書において、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、別に明確に示されない限り、複数の言及を含む。例えば、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」とは、「少なくとも１つの」または「１つまたは複数の」を含む。本明細書において説明される態様および変形は、態様および変形「からなること」および／または「から本質的になること」を含むことが理解される。
本開示を通じて、特許請求される主題の様々な態様が範囲形式で提示される。範囲形式における説明は、単に便利および簡潔さのためであり、特許請求の範囲の主題の範囲に対する変更不能な限定として解釈すべきでないことを理解すべきである。したがって、範囲の記載は、特に開示される全ての可能な下位範囲およびその範囲内の個々の数値を有すると考えるべきである。例えば、ある範囲の値が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の各間の値、およびその示される範囲内の任意の他の示される値または間の値は、特許請求の範囲の主題の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は独立して、より小さい範囲に含まれてもよく、また、特許請求の範囲の主題の範囲内に包含され、示される範囲内の任意の特に除外される限定を受ける。示される範囲が限定のうちの１つまたは両方を含む場合、また、それらの含まれる限定のいずれかまたは両方を除外する範囲は、特許請求の範囲の主題に含まれる。これは範囲の広さに関係なく適用される。
用語「約」とは、本明細書で使用される「約」という用語は、この技術分野の当業者に容易に知られるそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書中の「約」を伴う値またはパラメーターについての言及は、その値またはパラメーターそれ自体を対象とする実施形態を含み（かつ説明する）。例えば、「約Ｘ」に言及する説明は、「Ｘ」の説明を含む。
本明細書で使用される場合、ヌクレオチドまたはアミノ酸位置が、例えば配列表に記載された、開示された配列のヌクレオチドまたはアミノ酸位置「に対応する」という記載は、ＧＡＰアルゴリズムなどの標準的な整列アルゴリズムを使用して、開示された配列と同一性を最大化するように整列させたときに同定されるヌクレオチドまたはアミノ酸位置を指す。配列を整列させることにより、当業者は、例えば、保存されたおよび同一のアミノ酸残基をガイドとして使用して対応する残基を同定することができる。一般に、対応する位置を同定するために、アミノ酸の配列は最上位のマッチが得られるように整列される［例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；およびSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991；Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073を参照］。
用語「ベクター」とは、本明細書において、連結された別の核酸を増殖することが可能な核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、およびそれが導入されている宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結された核酸の発現を方向付けることができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。ベクターの中には、レトロウイルス、例えば、ガンマレトロウイルスおよびレンチウイルスのベクターなどのウイルスベクターが含まれる。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、そのような細胞の子孫を含む、外因性核酸が導入された細胞を指す。宿主細胞は、「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これは、一次形質転換細胞および継代数にかかわらずそれに由来する子孫を含む。子孫は、核酸含量において親細胞に対して完全に同一ではない場合もあり、突然変異を含有する場合もある。元の形質転換細胞についてスクリーニングまたは選択されたものと同一の機能または生物活性を有する突然変異体子孫も本明細書で含まれる。
本明細書で使用する場合、細胞または細胞の集団が、特定のマーカーについて「陽性」であるという記載は、特定のマーカー、通常、表面マーカーの細胞上または細胞中での検出可能な存在を指す。表面マーカーについて言及する場合、この用語は、フローサイトメトリーによって、例えばマーカーに特異的に結合する抗体により染色し、前記抗体を検出することによって検出される表面発現の存在を指し、ここで、染色は、他は同一の条件下においてアイソタイプ適合対照について同じ手順を行って検出される染色を実質的に超えるレベルにおいて、かつ／またはそのマーカーについて陽性であることが公知の細胞についてのレベルと実質的に同様のレベルにおいて、かつ／またはそのマーカーについて陰性であることが公知の細胞についてのレベルよりも実質的に高いレベルにおいて、フローサイトメトリーによって検出可能である。
本明細書で使用される場合、細胞または細胞集団が特定のマーカーに対して「陰性」であるという記述は、特定のマーカー、典型的には表面マーカーの、細胞上または細胞内の実質的な検出可能な存在がないことを指す。表面マーカーに関して、該用語は、フローサイトメトリーによって、例えば、マーカーに特異的に結合する抗体で染色し、前記抗体を検出することによって検出されるような表面発現がないことを指し、他は同一の条件下のアイソタイプ適合対照を用いて同じ手順を行って検出される染色を実質的に上回るレベル、および／またはマーカーに対して陽性であることが公知の細胞より実質的に低いレベル、および／またはマーカーに対して陰性であることが公知の細胞と比較して実質的に同様のレベルでは、染色はフローサイトメトリーによって検出されない。
本明細書において使用される場合、「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」および「同一性パーセント」は、アミノ酸配列（参照ポリペプチド配列）について使用される場合、最大配列同一性パーセントを達成するように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、かつ任意の保存的置換を配列同一性の部分として考慮しない、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列（例えば対象抗体または断片）中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のアラインメントは、当業者の技術内である種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成できる。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適当なパラメーターを決定できる。
アミノ酸置換は、ポリペプチド中の１個のアミノ酸と別のアミノ酸との交換を含み得る。置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であってもよい。アミノ酸置換は、目的の結合分子、例えば抗体に導入され、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの改善について産物がスクリーニングされ得る。
アミノ酸は一般に、以下の共通する側鎖特性に従って分類することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の向きに影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
一部の実施形態では、保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーと、同じクラスの別のメンバーとの交換を含み得る。一部の実施形態では、非保存的アミノ酸置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーと、別のクラスとの交換を含み得る。
本明細書において使用される場合、組成物は、２つまたはそれより多い、細胞を含む生成物、物質または化合物の任意の混合物を指す。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはそれらの任意の組合せであり得る。
本明細書で使用される場合、「対象」は、ヒトまたは他の動物などの哺乳動物であり、典型的にはヒトである。
別に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記法、およびその他の技術的および科学的用語または専門用語は、請求された主題が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有することを意図している。一部の場合には、一般に理解されている意味を有する用語は、明確にするため、および／または容易な参照のために本明細書で定義されており、そのような定義を本明細書に含めることは、必ずしも当該技術分野で一般に理解されているものとの実質的な違いを表すと解釈されるべきではない。
Ｖ．例示的な実施形態
提供される実施形態の中には以下がある：
１．治療用細胞組成物の効力を決定する方法であって、
複数のインキュベーションを実施することであって、前記複数のインキュベーションの各々は、組換え受容体を発現するように操作された細胞を含む治療用細胞組成物の細胞を組換え受容体刺激剤と共に培養することを含み、
組換え受容体への組換え受容体刺激剤の結合は、細胞において組換え受容体依存性活性を刺激し、
複数のインキュベーションの各々は、組換え受容体刺激剤に対する治療用細胞組成物の細胞の異なる調整された比率を含む、実施すること、
複数のインキュベーションの各々から組換え受容体依存性活性を測定すること、および
複数のインキュベーションの各々から測定された組換え受容体依存性活性に基づいて、最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす調整された比率を決定すること
を含む、方法。
２．参照標準の最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす調整された比率に対して、治療用細胞組成物の最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす調整された比率を比較することによって、治療用細胞組成物の相対効力を決定することをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
３．治療用細胞組成物の効力を決定する方法であって、
複数のインキュベーションを実施することであって、前記複数のインキュベーションの各々は、組換え受容体を発現するように操作された細胞を含む治療用細胞組成物の細胞を組換え受容体刺激剤と共に培養することを含み、
組換え受容体への組換え受容体刺激剤の結合は、細胞において組換え受容体依存性活性を刺激し、
複数のインキュベーションの各々は、組換え受容体刺激剤に対する治療用細胞組成物の細胞の異なる調整された比率を含む、実施すること、
複数のインキュベーションの各々から組換え受容体依存性活性を測定すること、および
参照標準の最大半量の組換え受容体依存性活性に対して、治療用細胞組成物の最大半量の組換え受容体依存性活性を比較することによって、治療用細胞組成物の相対効力を決定すること
を含む、方法。
４．複数のインキュベーションの各々が、治療用組成物の一定数の細胞を、異なる量の組換え受容体刺激剤と共に培養して、複数の異なる調整された比率を生成することを含む、実施形態１～３のいずれかに記載の方法。
５．複数のインキュベーションの各々が、一定量の結合分子を、治療用組成物の異なる数の細胞と共に培養して、複数の異なる調整された比率を生成することを含む、実施形態１～３のいずれかに記載の方法。
６．２つまたはそれより多い、適宜、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い治療用細胞組成物について、複数のインキュベーションが実施される、実施形態１～５のいずれかに記載の方法。
７．２つまたはそれより多い治療用細胞組成物が、各々同一の組換え受容体を含む、実施形態６に記載の方法。
８．２つまたはそれより多い治療用細胞組成物が、各々異なる組換え受容体を含む、実施形態６に記載の方法。
９．２つまたはそれより多い治療用細胞組成物のうち少なくとも１つが、他の治療用組成物とは異なる組換え受容体を含む、実施形態６に記載の方法。
１０．２つまたはそれより多い治療用細胞組成物が、各々同一製造プロセスを使用して製造される、実施形態６～９のいずれかに記載の方法。
１１．２つまたはそれより多い治療用細胞組成物が、各々異なる製造プロセスを使用して製造される、実施形態６～９のいずれかに記載の方法。
１２．２つまたはそれより多い治療用細胞組成物のうち少なくとも１つが、他の治療用細胞組成物を製造するために使用されたものとは異なる製造プロセスを使用して製造される、実施形態６～９のいずれかに記載の方法。
１３．２つまたはそれより多い治療用細胞組成物が、単一対象から得た細胞から生成される、実施形態６～１２のいずれかに記載の方法。
１４．２つまたはそれより多い治療用細胞組成物が、異なる対象から得た細胞から生成される、実施形態６～１２のいずれかに記載の方法。
１５．対象が健康な対象または疾患もしくは状態を有する対象である、実施形態１３または実施形態１４に記載の方法。
１６．複数のインキュベーションが少なくとも３回のインキュベーションである、実施形態１から１５のいずれかに記載の方法。
１７．複数のインキュベーションが、少なくとも５回のインキュベーションである、実施形態１～１６のいずれかに記載の方法。
１８．複数のインキュベーションが少なくとも７回のインキュベーションである、実施形態１～１７のいずれかに記載の方法。
１９．複数のインキュベーションが、少なくとも１０回のインキュベーションである、実施形態１～１８のいずれかに記載の方法。
２０．組換え受容体依存性活性が、サイトカイン発現、細胞溶解活性、受容体上方制御、受容体下方制御、増殖、遺伝子上方制御、遺伝子下方制御または細胞の健康のうち１つまたは複数を含む、実施形態１～１９のいずれかに記載の方法。
２１．組換え受容体依存性活性が、サイトカイン発現または生成を含むか、またはそれである、実施形態１～２０のいずれかに記載の方法。
２２．組換え受容体依存性活性が、サイトカイン発現または生成を含むか、またはそれであり、サイトカインがＴＮＦ－アルファ、ＩＦＮガンマ（ＩＦＮｇ）またはＩＬ－２である、実施形態１～２１のいずれかに記載の方法。
２３．組換え受容体依存性活性が細胞溶解活性を含むか、またはそれである、実施形態１～２２のいずれかに記載の方法。
２４．組換え受容体依存性活性が受容体上方制御を含むか、またはそれである、実施形態１～２３のいずれかに記載の方法。
２５．組換え受容体依存性活性が受容体下方制御を含むか、またはそれである、実施形態１～２４のいずれかに記載の方法。
２６．組換え受容体依存性活性が増殖を含むか、またはそれである、実施形態１～２５のいずれかに記載の方法。
２７．組換え受容体依存性活性が、遺伝子上方制御を含むか、またはそれである、実施形態１～２６のいずれかに記載の方法。
２８．組換え受容体依存性活性が、遺伝子下方制御を含むか、またはそれである、実施形態１～２７のいずれかに記載の方法。
２９．組換え受容体依存性活性が、細胞の健康を含むか、またはそれである、実施形態１～２８のいずれかに記載の方法。
３０．組換え受容体依存性活性が、細胞の健康を含むか、またはそれであり、細胞の健康が、細胞死、細胞径、生細胞濃度および細胞計数のうち１つまたは複数を含む、実施形態１～２９のいずれかに記載の方法。
３１．複数のインキュベーションの各々で測定された組換え受容体依存性活性が、治療用細胞組成物について測定された最大受容体依存性活性に対して正規化される、実施形態１～３０のいずれかに記載方法。
３２．参照標準が、最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす検証された調整された比率を含む治療用細胞組成物、市販の治療用細胞組成物、治療用細胞組成物を製造するために使用される製造プロセスと同一である製造プロセスを使用して製造された治療用細胞組成物、治療用細胞組成物を製造するために使用された製造プロセスとは異なる製造プロセスを使用して製造された治療用細胞組成物、治療用細胞組成物と同一の組換え受容体を含む治療用細胞組成物、治療用細胞組成物とは異なる組換え受容体を含む治療用細胞組成物、同一対象から製造された治療用細胞組成物または異なる対象から製造された治療用細胞組成物である、実施形態１～３１のいずれかに記載の方法。
３３．参照標準が、２つまたはそれより多い治療用組成物のうちの１つである、実施形態６～３２のいずれかに記載の方法。
３４．組換え受容体刺激剤が、組換え受容体の標的抗原またはその細胞外ドメイン結合部分、適宜、組換え抗原を含む、実施形態１～３３のいずれかに記載の方法。
３５．組換え受容体刺激剤が、抗原の細胞外ドメイン結合部分を含み、細胞外ドメイン結合部分が、組換え受容体によって認識されるエピトープを含む、実施形態３４に記載の方法。
３６．組換え受容体刺激剤が、組換え受容体の細胞外抗原結合ドメインに対して特異的な抗イディオタイプ抗体である、実施形態１～３３のいずれかに記載の方法。
３７．組換え受容体刺激剤が、固体支持体に固定化されるか、または付着している、実施形態１～３６のいずれかに記載の方法。
３８．固体支持体が、複数のインキュベーションが実施される容器、適宜、マイクロウェルプレートのウェルの表面である、実施形態３７に記載の方法。
３９．固体支持体がビーズである、実施形態３７に記載の方法。
４０．組換え受容体刺激剤が抗原発現細胞であり、細胞が、細胞株由来のクローンまたは対象から採取された一次細胞であってもよい、実施形態１～３３のいずれかに記載の方法。
４１．抗原発現細胞が細胞株である、実施形態４０に記載の方法。
４２．細胞株が腫瘍細胞株である、実施形態４１に記載の方法。
４３．抗原発現細胞が、組換え受容体の抗原を発現するように形質導入によって導入されていてもよい細胞である、実施形態４０に記載の方法。
４４．調整された比率が、参照標準の組換え受容体依存性活性の線形用量反応範囲を達成する、実施形態１～４３のいずれかに記載の方法。
４５．調整された比率が、参照標準の下側漸近線（最小）組換え受容体依存性活性および上側漸近線（最大）組換え受容体依存性活性を含む、実施形態４４に記載の方法。
４６．治療用細胞組成物が、生物学的試料から濃縮もしくは精製された単細胞サブタイプまたは適宜、生物学的試料から濃縮もしくは精製された細胞サブタイプを混合することによって得られた混合細胞サブタイプの集団を含む、実施形態１～３５のいずれかに記載の方法。
４７．生物学的試料が、全血試料、バフィーコート試料、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料、未分画細胞試料、リンパ球試料、白血球細胞試料、アフェレーシス生成物または白血球アフェレーシス生成物を含む、実施形態４６に記載の方法。
４８．治療用細胞組成物が一次細胞を含む、実施形態１～４７のいずれかに記載の方法。
４９．治療用細胞組成物が、処置されるべき対象から得た自家細胞を含む、実施形態１～３８のいずれかに記載の方法。
５０．治療用細胞組成物が同種異系細胞を含む、実施形態１～４９のいずれかに記載の方法。
５１．治療用細胞組成物が、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、実施形態１～５０のいずれかに記載の方法。
５２．治療用細胞組成物がＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、実施形態１～５１のいずれかに記載の方法。
５３．治療用細胞組成物がＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、実施形態１～５２のいずれかに記載の方法。
５４．組換え受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、実施形態１～５３のいずれかに記載の方法。
５５．複数のインキュベーションが、フラスコ、チューブまたはマルチウェルプレート中で実施される、実施形態１～５４のいずれかに記載の方法。
５６．複数のインキュベーションが、マルチウェルプレートのウェルにおいて個別に各々実施される、実施形態１～５５のいずれかに記載の方法。
５７．マルチウェルプレートが、９６ウェルプレート、４８ウェルプレート、１２ウェルプレートまたは６ウェルプレートである、実施形態５５または実施形態５６に記載の方法。
５８．最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす調整された比率に基づいて、それを必要とする対象に投与するための治療用組成物の細胞の用量を決定することをさらに含む、実施形態１および４～５７のいずれかに記載の方法。
５９．相対効力に基づいて、それを必要とする対象に投与するための治療用組成物の細胞の用量を決定することをさらに含む、実施形態２～５７のいずれかに記載の方法。
６０．対象が疾患または状態を有する、実施形態５８または実施形態５９に記載の方法。
６１．疾患または状態ががんである、実施形態６０に記載の方法。
６２．相対効力に基づいて、最適治療用細胞組成物効力を生成する製造プロセスを決定することをさらに含み、最適治療用細胞組成物効力が、完全な応答および／または持続性のある応答および／または毒性の低減と相関する、実施形態２～６１のいずれかに記載の方法。
６３．相対効力に基づいて、効力の分散が低減されたまたは低い治療用細胞組成物を生成する製造プロセスを決定することをさらに含み、低減されたまたは低い分散が、異なる製造プロセスにおける分散と比較して決定される、実施形態２～６２のいずれかに記載の方法。
ＶＩ．実施例
以下の実施例は、説明的な目的のためにのみ含まれ、本発明の範囲を限定することを意図しない。
［実施例１］
抗原刺激に対する細胞療法製品の感受性を評価するためのアッセイ
組換え受容体（例えば、キメラ抗原受容体）を発現する細胞を含有する治療用細胞組成物の抗原刺激に対する感受性を測定するアッセイを設計した。
３名の患者または健康なヒトドナー由来の初代ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞を、ドナー白血球アファレーシス試料から単離したＰＢＭＣから選択した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞を、組換えＩＬ－２、ＩＬ－７、およびＩＬ－１５の存在下の無血清培地中、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体または結合性断片の存在下で刺激した。刺激は１８～３０時間のインキュベーションによって実施した。特異的抗原（例えば、ＣＤ１９またはＢＣＭＡ）に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするレンチウイルスベクターを細胞に形質導入した。ＣＡＲは、抗原（例えば、ＣＤ１９またはＢＣＭＡ）に特異的なｓｃＦｖ抗原結合性ドメイン、免疫グロブリンスペーサー、膜貫通ドメイン（例えば、ヒトＣＤ２８由来の膜貫通ドメイン）、ならびにヒトＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含有する細胞内シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、ヒト４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン）を含有した。次いで、形質導入細胞を組換えサイトカインの存在下で拡大培養した。この例は、生成ＣＡＲ発現Ｔ細胞を用いて例証されるが、該アッセイは、任意の抗原指向性組換え受容体の抗原特異的感受性を評価するのに使用することができる。
抗原特異的刺激に対する例示的な治療用細胞組成物の感受性を測定するために、一定濃度の治療用細胞組成物を調整された量の抗原発現標的細胞とインキュベートした。このアッセイにおいてエフェクター細胞として機能する治療用細胞組成物の約５０，０００個のＣＡＲ＋ Ｔ細胞を、マルチウェルプレートの各ウェルに添加した。抗原発現標的細胞を、１２：１～０．０１２：１の、抗原発現標的細胞のエフェクター細胞に対する比率（Ｔ：Ｅ比率）の調整された量で添加した。細胞を２～４８時間共培養し、次いで抗原特異的応答をＴ細胞の機能的活性をモニタリングして評価した。この例示的なアッセイでは、１６時間後に上清を回収して抗原特異的サイトカイン生成を評価した。
図１Ａは、３つの例示的な生成した細胞産物に関する、ドナー別の各Ｔ：Ｅ比率での例示的な分泌サイトカインＩＦＮγ濃度を示す。図１Ｂは、上方漸近線で観察された最大サイトカイン濃度（Ｖｍａｘ）に対して正規化されたサイトカイン分泌（ｙ軸）を示す。
５０％サイトカイン分泌（例えば、５０％有効刺激またはＥＳ５０）をもたらすＴ：Ｅ比率をドナーごとに決定し、相対的効力をドナー１（参照標準）と比べて算出した。比較のために、製剤の最大抗原刺激でのサイトカイン分泌を測定する伝統的アッセイ形式を使用して、３つの異なる細胞組成物産物を評価し、相対的効力もドナー１と比べて算出した。結果を表Ｅ１に示す。表Ｅ１に記載された結果は、最大抗原特異的刺激で治療用細胞組成物の細胞によって分泌されたサイトカインの量と、５０％有効刺激（ＥＳ５０）でのＴ：Ｅ比率によって決定される抗原特異的刺激に対するそれらの感受性の間の異なる関係を実証する。これらの結果は、伝統的アッセイが抗原刺激に対する抗原感受性の正確な尺度を提供し得ない飽和レベルの抗原刺激をもたらす可能性があるのに対し、提供されたアッセイは、抗原による刺激に対する抗原指向性治療用細胞組成物の感受性をより確実に測定することができることを示している。
本発明は、例えば本発明の種々の態様を説明するために提供される特定の開示される実施形態に、範囲が限定されることを意図しない。記載される組成物および方法の種々の改変は、本明細書の記載および教示から明らかになるであろう。そのような変形形態は、本開示の真の範囲および趣旨から逸脱することなく実施することができ、本開示の範囲内にあることが意図される。

Claims (65)

  1. 治療用細胞組成物の効力を決定する方法であって、
    複数のインキュベーションを実施することであって、前記複数のインキュベーションの各々は、組換え受容体を発現するように操作された細胞を含む治療用細胞組成物の細胞を組換え受容体刺激剤と共に培養することを含み、
    組換え受容体への組換え受容体刺激剤の結合は、細胞において組換え受容体依存性活性を刺激し、
    複数のインキュベーションの各々は、組換え受容体刺激剤に対する治療用細胞組成物の細胞の異なる調整された比率を含む、実施すること、
    複数のインキュベーションの各々から組換え受容体依存性活性を測定すること、および
    複数のインキュベーションの各々から測定された組換え受容体依存性活性に基づいて、最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす調整された比率を決定すること
    を含む、方法。
  2. 参照標準の最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす調整された比率に対して、治療用細胞組成物の最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす調整された比率を比較することによって、治療用細胞組成物の相対効力を決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 治療用細胞組成物の効力を決定する方法であって、
    複数のインキュベーションを実施することであって、前記複数のインキュベーションの各々は、組換え受容体を発現するように操作された細胞を含む治療用細胞組成物の細胞を組換え受容体刺激剤と共に培養することを含み、
    組換え受容体への組換え受容体刺激剤の結合は、細胞において組換え受容体依存性活性を刺激し、
    複数のインキュベーションの各々は、組換え受容体刺激剤に対する治療用細胞組成物の細胞の異なる調整された比率を含む、実施すること、
    複数のインキュベーションの各々から組換え受容体依存性活性を測定すること、および
    参照標準の最大半量の組換え受容体依存性活性に対して、治療用細胞組成物の最大半量の組換え受容体依存性活性を比較することによって、治療用細胞組成物の相対効力を決定すること
    を含む、方法。
  4. 複数のインキュベーションの各々が、治療用組成物の一定数の細胞を、異なる量の組換え受容体刺激剤と共に培養して、複数の異なる調整された比率を生成することを含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. 複数のインキュベーションの各々が、一定量の組換え受容体刺激剤を、治療用組成物の異なる数の細胞と共に培養して、複数の異なる調整された比率を生成することを含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  6. ２つまたはそれより多い、適宜、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い治療用細胞組成物について、複数のインキュベーションが実施される、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
  7. ２つまたはそれより多い治療用細胞組成物が、各々同一の組換え受容体を含む、請求項６に記載の方法。
  8. ２つまたはそれより多い治療用細胞組成物が、各々異なる組換え受容体を含む、請求項６に記載の方法。
  9. ２つまたはそれより多い治療用細胞組成物のうち少なくとも１つが、他の治療用組成物とは異なる組換え受容体を含む、請求項６に記載の方法。
  10. ２つまたはそれより多い治療用細胞組成物が、各々同一製造プロセスを使用して製造される、請求項６から９のいずれかに記載の方法。
  11. ２つまたはそれより多い治療用細胞組成物が、各々異なる製造プロセスを使用して製造される、請求項６から９のいずれかに記載の方法。
  12. ２つまたはそれより多い治療用細胞組成物のうち少なくとも１つが、他の治療用細胞組成物を製造するために使用されたものとは異なる製造プロセスを使用して製造される、請求項６から９のいずれかに記載の方法。
  13. ２つまたはそれより多い治療用細胞組成物が、単一対象から得た細胞から生成される、請求項６から１２のいずれかに記載の方法。
  14. ２つまたはそれより多い治療用細胞組成物が、異なる対象から得た細胞から生成される、請求項６から１２のいずれかに記載の方法。
  15. 対象が健康な対象または疾患もしくは状態を有する対象である、請求項１３に記載の方法。
  16. 異なる対象の各々が同一の疾患または状態を有する、請求項１４に記載の方法。
  17. 異なる対象の各々が、対象において疾患または状態を処置するための同一治療用細胞組成物を用いて処置されるべきである、請求項１４に記載の方法。
  18. 複数のインキュベーションが少なくとも３回のインキュベーションである、請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
  19. 複数のインキュベーションが、少なくとも５回のインキュベーションである、請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
  20. 複数のインキュベーションが少なくとも７回のインキュベーションである、請求項１から１９のいずれかに記載の方法。
  21. 複数のインキュベーションが、少なくとも１０回のインキュベーションである、請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
  22. 組換え受容体依存性活性が、サイトカイン発現、細胞溶解活性、受容体上方制御、受容体下方制御、増殖、遺伝子上方制御、遺伝子下方制御または細胞の健康のうち１つまたは複数を含む、請求項１から２１のいずれかに記載の方法。
  23. 組換え受容体依存性活性が、サイトカイン発現または生成を含むか、またはそれである、請求項１から２２のいずれかに記載の方法。
  24. 組換え受容体依存性活性が、サイトカイン発現または生成を含むか、またはそれであり、サイトカインがＴＮＦ－アルファ、ＩＦＮガンマ（ＩＦＮｇ）またはＩＬ－２である、請求項１から２３のいずれかに記載の方法。
  25. 組換え受容体依存性活性が細胞溶解活性を含むか、またはそれである、請求項１から２４のいずれかに記載の方法。
  26. 組換え受容体依存性活性が受容体上方制御を含むか、またはそれである、請求項１から２５のいずれかに記載の方法。
  27. 組換え受容体依存性活性が受容体下方制御を含むか、またはそれである請求項１から２６のいずれかに記載の方法。
  28. 組換え受容体依存性活性が増殖を含むか、またはそれである、請求項１から２７のいずれかに記載の方法。
  29. 組換え受容体依存性活性が、遺伝子上方制御を含むか、またはそれである、請求項１から２８のいずれかに記載の方法。
  30. 組換え受容体依存性活性が、遺伝子下方制御を含むか、またはそれである、請求項１から２９のいずれかに記載の方法。
  31. 組換え受容体依存性活性が、細胞の健康を含むか、またはそれである、請求項１から３０のいずれかに記載の方法。
  32. 組換え受容体依存性活性が、細胞の健康を含むか、またはそれであり、細胞の健康が、細胞死、細胞径、生細胞濃度および細胞計数のうち１つまたは複数を含む、請求項１から３１のいずれかに記載の方法。
  33. 複数のインキュベーションの各々で測定された組換え受容体依存性活性が、治療用細胞組成物について測定された最大受容体依存性活性に対して正規化される、請求項１から３２のいずれかに記載の方法。
  34. 参照標準が、最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす検証された調整された比率を含む治療用細胞組成物、市販の治療用細胞組成物、治療用細胞組成物を製造するために使用される製造プロセスと同一である製造プロセスを使用して製造された治療用細胞組成物、治療用細胞組成物を製造するために使用された製造プロセスとは異なる製造プロセスを使用して製造された治療用細胞組成物、治療用細胞組成物と同一の組換え受容体を含む治療用細胞組成物、治療用細胞組成物とは異なる組換え受容体を含む治療用細胞組成物、同一対象から製造された治療用細胞組成物または異なる対象から製造された治療用細胞組成物である、請求項１から３３のいずれかに記載の方法。
  35. 参照標準が、２つまたはそれより多い治療用組成物のうちの１つである、請求項６から３４のいずれかに記載の方法。
  36. 組換え受容体刺激剤が、組換え受容体の標的抗原またはその細胞外ドメイン結合部分、適宜、組換え抗原を含む、請求項１から３５のいずれかに記載の方法。
  37. 組換え受容体刺激剤が、抗原の細胞外ドメイン結合部分を含み、細胞外ドメイン結合部分が、組換え受容体によって認識されるエピトープを含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 組換え受容体刺激剤が、組換え受容体の細胞外結合ドメインに対して特異的な抗体である、請求項１から３５のいずれかに記載の方法。
  39. 組換え受容体刺激剤が、組換え受容体の細胞外抗原結合ドメインに対して特異的な抗イディオタイプ抗体である、請求項１から３５および３８のいずれかに記載の方法。
  40. 組換え受容体刺激剤が、固体支持体に固定化されるか、または付着している、請求項１から３９のいずれかに記載の方法。
  41. 固体支持体が、複数のインキュベーションが実施される容器、適宜、マイクロウェルプレートのウェルの表面である、請求項４０に記載の方法。
  42. 固体支持体がビーズである、請求項４０の方法。
  43. 組換え受容体刺激剤が抗原発現細胞であり、細胞が、細胞株由来のクローンまたは対象から採取された一次細胞であってもよい、請求項１から３５のいずれかに記載の方法。
  44. 抗原発現細胞が細胞株である、請求項４３に記載の方法。
  45. 細胞株が腫瘍細胞株である、請求項４４に記載の方法。
  46. 抗原発現細胞が、組換え受容体の抗原を発現するように形質導入によって導入されていてもよい細胞である、請求項４３に記載の方法。
  47. 調整された比率が、参照標準の組換え受容体依存性活性の線形用量反応範囲を達成する、請求項１から４６のいずれかに記載の方法。
  48. 調整された比率が、参照標準の下側漸近線（最小）組換え受容体依存性活性および上側漸近線（最大）組換え受容体依存性活性を含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 治療用細胞組成物が、生物学的試料から濃縮もしくは精製された単細胞サブタイプまたは適宜、生物学的試料から濃縮もしくは精製された細胞サブタイプを混合することによって得られた混合細胞サブタイプの集団を含む、請求項１から３７のいずれかに記載の方法。
  50. 生物学的試料が、全血試料、バフィーコート試料、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料、未分画細胞試料、リンパ球試料、白血球細胞試料、アフェレーシス生成物または白血球アフェレーシス生成物を含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 治療用細胞組成物が一次細胞を含む、請求項１から５０のいずれかに記載の方法。
  52. 治療用細胞組成物が、処置されるべき対象から得た自家細胞を含む、請求項１から５１のいずれかに記載の方法。
  53. 治療用細胞組成物が同種異系細胞を含む、請求項１から５２のいずれかに記載の方法。
  54. 治療用細胞組成物が、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項１から５３のいずれかに記載の方法。
  55. 治療用細胞組成物がＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項１から５４のいずれかに記載の方法。
  56. 組換え受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１から５５のいずれかに記載の方法。
  57. 複数のインキュベーションが、フラスコ、チューブまたはマルチウェルプレート中で実施される、請求項１から５６のいずれかに記載の方法。
  58. 複数のインキュベーションの各々が、マルチウェルプレートのウェルにおいて個別に実施される、請求項１から５７のいずれかに記載の方法。
  59. マルチウェルプレートが、９６ウェルプレート、４８ウェルプレート、１２ウェルプレートまたは６ウェルプレートである、請求項５７または請求項５８に記載の方法。
  60. 最大半量の組換え受容体依存性活性をもたらす調整された比率に基づいて、それを必要とする対象に投与するための治療用組成物の細胞の用量を決定することをさらに含む、請求項１および４から５９のいずれかに記載の方法。
  61. 相対効力に基づいて、それを必要とする対象に投与するための治療用組成物の細胞の用量を決定することをさらに含む、請求項２から５９のいずれかに記載の方法。
  62. 対象が疾患または状態を有する、請求項６０または請求項６１に記載の方法。
  63. 疾患または状態ががんである、請求項１５から６２のいずれかに記載の方法。
  64. 相対効力に基づいて、最適治療用細胞組成物効力を生成する製造プロセスを決定することをさらに含み、最適治療用細胞組成物効力が、完全な応答および／または持続性のある応答および／または毒性の低減と相関する、請求項２から６３のいずれかに記載の方法。
  65. 相対効力に基づいて、効力の分散が低減されたまたは低い治療用細胞組成物を生成する製造プロセスを決定することをさらに含み、低減されたまたは低い分散が、異なる製造プロセスにおける分散と比較して決定される、請求項２から６４のいずれかに記載の方法。
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