JP2023531531A

JP2023531531A - 組換え受容体を条件付きで発現する操作されたｔ細胞、関連ポリヌクレオチド、および方法

Info

Publication number: JP2023531531A
Application number: JP2022579935A
Authority: JP
Inventors: マテウシュパヴェルポルトラック; クリスティアンシュテムベルガー; ローターゲルメロート
Original assignee: ジュノセラピューティクスゲーエムベーハー
Priority date: 2020-06-26
Filing date: 2021-06-25
Publication date: 2023-07-24
Also published as: KR20230042283A; EP4171616A1; WO2021260186A1; CN116234558A

Abstract

組換え受容体またはその一部分をコードする改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を含有する、操作されたT細胞が提供される。いくつかの局面では、組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列は、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントに機能的に連結され、場合によっては、標的組み込みによって操作される。いくつかの局面では、操作された細胞は、例えば、T細胞における刺激または活性化シグナルの際に、組換え受容体を条件付きで発現する。また、細胞組成物、細胞を操作するための核酸、ならびに、操作された細胞を作製するための方法および製造物品も開示される。いくつかの態様では、操作された細胞は、細胞療法に関連して、例えば、操作された細胞の養子移入を含むがん免疫療法に関連して、使用され得る。TIFF2023531531000041.tif116170

Description

関連出願の相互参照
本出願は、「ENGINEERED T CELLS CONDITIONALLY EXPRESSING A RECOMBINANT RECEPTOR, RELATED POLYNUCLEOTIDES AND METHODS」と題する2020年6月26日に出願された米国特許仮出願第63/044,984号の優先権を主張し、その内容は全体が参照により組み入れられる。

配列表の参照による組み入れ
本出願は、電子形式の配列表と共に提出されている。配列表は、サイズが220キロバイトである、2021年6月23日に作成された735042013840SeqList.txtと題するファイルとして提供される。配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により組み入れられる。

分野
本開示は、組換え受容体またはその一部分をコードする改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を含有する、操作されたT細胞に関する。いくつかの局面では、組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列は、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントに機能的に連結され、場合によっては、標的組み込みによって操作される。いくつかの局面では、操作された細胞は、例えば、T細胞における刺激または活性化シグナルの際に、組換え受容体を条件付きで発現する。また、細胞組成物、細胞を操作するための核酸、ならびに操作された細胞を作製するための方法および製造物品も開示される。いくつかの態様では、操作された細胞は、細胞療法に関連して、例えば、操作された細胞の養子移入を含むがん免疫療法に関連して、使用され得る。

背景
疾患に関連する抗原を認識する、キメラ抗原受容体（CAR）または組換えT細胞受容体（TCR）などの組換え受容体を利用する養子細胞療法は、がんおよび他の疾患の処置のための魅力的な治療様式に相当する。例えば、養子免疫療法における、例えば、がん、感染性疾患、および自己免疫疾患の処置における使用のために、組換え受容体を発現するようにT細胞を操作するための改善された戦略が必要とされる。そのような必要を満たす方法における使用のための、方法、細胞、組成物、およびキットが提供される。

概要
組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含有する改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を含む、操作されたT細胞であって、該導入遺伝子が、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントに機能的に連結され、該内在性転写制御エレメントが、機能的に連結された導入遺伝子の発現を、T細胞におけるシミュレーション（simulation）または活性化シグナルに続いて誘導するかまたは上方制御する、操作されたT細胞が、本明細書において提供される。

いずれかの態様のいくつかでは、内在性転写制御エレメントは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のプロモーターである。いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子は、プロモーターの下流に存在する。

いずれかの態様のいくつかでは、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、誘導性であり、細胞における刺激または活性化シグナルに続いて誘導される。いずれかの態様のいくつかでは、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞における刺激または活性化シグナルに続いて6時間未満以内にまたは約6時間未満以内に、上方制御されるかまたは誘導される。いずれかの態様のいくつかでは、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞における刺激または活性化シグナルに続いて12時間未満以内にまたは約12時間未満以内に、上方制御されるかまたは誘導される。いずれかの態様のいくつかでは、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞における刺激または活性化シグナルに続いて24時間未満以内にまたは約24時間未満以内に、上方制御されるかまたは誘導される。いずれかの態様のいくつかでは、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞における刺激または活性化シグナルに続いて36時間未満以内にまたは約36時間未満以内に、上方制御されるかまたは誘導される。いずれかの態様のいくつかでは、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞における刺激または活性化シグナルに続いて48時間未満以内にまたは約48時間未満以内に、上方制御されるかまたは誘導される。

いずれかの態様のいくつかでは、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、永久的ではなく、かつ/または、経時的にまたはT細胞による刺激もしくは活性化シグナルの非存在下で低減され得る。いずれかの態様のいくつかでは、発現の上方制御もしくは誘導に続いて、またはT細胞におけるシミュレーションもしくは活性化シグナルの低減もしくは非存在に続いて、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、低減されるかまたは下方制御される。いずれかの態様のいくつかでは、発現の上方制御もしくは誘導に続いて、またはT細胞におけるシミュレーションもしくは活性化シグナルの低減もしくは非存在に続いて、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも多く、または約30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも多く、低減されるかまたは下方制御される。いずれかの態様のいくつかでは、発現の上方制御または誘導に続いて、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞における刺激または活性化シグナルの、1、2、3、4、5、6、7、もしくは8日、もしくはそれ以上後にまたは約1、2、3、4、5、6、7、もしくは8日、もしくはそれ以上後に、低減されるかまたは下方制御される。いずれかの態様のいくつかでは、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在に続いて、6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内にまたは約6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内に、低減されるかまたは下方制御される。

いずれかの態様のいくつかでは、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、シミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在の後に、T細胞におけるさらなるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、再び誘導されるかまたは上方制御されることができる。いずれかの態様のいくつかでは、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、シミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在の後に、T細胞におけるさらなるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内にまたは約6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内に、上方制御されるかまたは誘導される。いずれかの態様のいくつかでは、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、誘導性であり、細胞における刺激または活性化シグナルに続いて誘導される。いずれかの態様のいくつかでは、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、シミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在の後に、T細胞におけるさらなるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて6時間未満以内にまたは約6時間未満以内に、上方制御されるかまたは誘導される。いずれかの態様のいくつかでは、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、シミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在の後に、T細胞におけるさらなるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて12時間未満以内にまたは約12時間未満以内に、上方制御されるかまたは誘導される。いずれかの態様のいくつかでは、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、シミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在の後に、T細胞におけるさらなるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて24時間未満以内にまたは約24時間未満以内に、上方制御されるかまたは誘導される。いずれかの態様のいくつかでは、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、シミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在の後に、T細胞におけるさらなるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて36時間未満以内にまたは約36時間未満以内に、上方制御されるかまたは誘導される。いずれかの態様のいくつかでは、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、シミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在の後に、T細胞におけるさらなるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて48時間未満以内にまたは約48時間未満以内に、上方制御されるかまたは誘導される。

いずれかの態様のいくつかでは、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームから翻訳される産物が細胞において発現されないか、または内在性T細胞刺激関連遺伝子座の機能的な内在性遺伝子産物が発現されない。いずれかの態様のいくつかでは、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームにおける欠失、挿入、フレームシフト変異、またはナンセンス変異を含む。

いずれかの態様のいくつかでは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座は、PDCD1、CD69、Nur77、FoxP3、およびHLA-DR遺伝子座の中から選択される。いずれかの態様のいくつかでは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座は、PDCD1遺伝子座である。いずれかの態様のいくつかでは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座は、CD69遺伝子座である。いずれかの態様のいくつかでは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座は、Nur77遺伝子座である。いずれかの態様のいくつかでは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座は、FoxP3遺伝子座である。いずれかの態様のいくつかでは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座は、HLA-DR遺伝子座である。いずれかの態様のいくつかでは、内在性転写制御エレメントは、刺激または活性化シグナルに続いて活性化される転写因子によって認識される、1つまたは複数の応答エレメントを含む。

いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体またはその一部分は、T細胞において刺激または活性化シグナルを誘導するかまたは伝達することができる。

いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体は、T細胞受容体（TCR）複合体の成分の細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内領域を含み、かつT細胞における刺激または活性化シグナルは、組換え受容体中に存在する細胞内シグナル伝達ドメインを通したシグナルを含む。いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体は、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内領域を含み、かつT細胞における刺激または活性化シグナルは、組換え受容体中に存在する細胞内シグナル伝達ドメインを通したシグナルを含む。いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体（例えば、CAR）の細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータシグナル伝達ドメインを含んでもよく、かつT細胞における刺激または活性化シグナルは、組換え受容体（例えば、CAR）中に存在する細胞内シグナル伝達ドメインを通したシグナルを含む。

いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体は、TCRであり、T細胞複合体の成分を動員して、T細胞において活性化シグナルを誘導するかまたは刺激することができる。

いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体は、作用物質（例えば、標的抗原）に結合するかまたはそれを認識することができる結合ドメインを含む、細胞外領域を含む。いずれかの態様のいくつかでは、刺激または活性化シグナルは、組換え受容体による作用物質の結合または認識の際に、T細胞において誘導される。

いずれかの態様のいくつかでは、作用物質は、標的抗原である。いずれかの態様のいくつかでは、標的抗原は、組換えタンパク質であるか、または細胞の表面上に発現している抗原である。いずれかの態様のいくつかでは、標的抗原は、ある疾患、障害、または状態の細胞または組織に関連しているか、それに特異的であるか、またはその上に発現している。いずれかの態様のいくつかでは、疾患、障害、または状態は、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである。いずれかの態様のいくつかでは、標的抗原は、腫瘍抗原である。いずれかの態様のいくつかでは、標的抗原は、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9；CAIXまたはG250としても知られている）、がん精巣抗原、がん/精巣抗原1B（CTAG；NY-ESO-1およびLAGE-2としても知られている）、癌胎児性抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮成長因子タンパク質（EGFR）、III型上皮成長因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体ホモログ5またはFCRH5としても知られている）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量-黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Rα）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Rα2）、キナーゼインサートドメイン受容体（kdr）、κ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、黒色腫関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソテリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、腫瘍胎児抗原、黒色腫優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（TPBG；5T4としても知られている）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1；TYRP1またはgp75としても知られている）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2；ドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムデルタ-イソメラーゼ、またはDCTとしても知られている）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的抗原もしくは病原体発現抗原、またはユニバーサルタグに関連する抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBV、もしくは他の病原体によって発現される分子の中から選択される。

いずれかの態様のいくつかでは、作用物質は、組換え受容体の細胞外ドメインに特異的である、抗イディオタイプ抗体である。

いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体は、キメラ抗原受容体（CAR）である。いずれかの態様のいくつかでは、CARは、結合ドメインを含有する細胞外領域、膜貫通ドメイン、および細胞内領域を含む。いずれかの態様のいくつかでは、細胞外領域はまた、スペーサーも含む。いずれかの態様のいくつかでは、スペーサーは、結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に機能的に連結される。いずれかの態様のいくつかでは、細胞外領域は、抗体またはその抗原結合断片、例えば、一本鎖可変断片（scFv）であるか、またはそれを含む、結合ドメインを含む。

いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体（例えば、CAR）の細胞内領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いずれかの態様のいくつかでは、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3鎖の細胞内シグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む。いずれかの態様のいくつかでは、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖またはそのシグナル伝達部分であるか、またはそれを含む。いずれかの態様のいくつかでは、細胞内領域は、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いずれかの態様のいくつかでは、細胞内領域は、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖またはそのシグナル伝達部分、および1つまたは複数の共刺激シグナル伝達領域を含む。いずれかの態様のいくつかでは、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、CD28、4-1BB、もしくはICOSの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそのシグナル伝達部分を含む。いずれかの態様のいくつかでは、共刺激シグナル伝達領域は、4-1BBの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

いずれかの態様のいくつかでは、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座は、CARである組換え受容体をコードし、該CARは、そのN末端からC末端へと順番に、細胞外結合ドメイン、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内領域を含む。

いずれかの態様のいくつかでは、導入遺伝子は、順番に、細胞外結合ドメイン、例えばscFv；例えば、ヒト免疫グロブリンヒンジ由来の、例えばIgG1、IgG2、もしくはIgG4、またはその改変バージョン由来の配列を含み、例えば、CH2領域および/またはCH3領域をさらに含む、スペーサー；ならびに、例えばヒトCD28由来の、膜貫通ドメイン；例えばヒト4-1BB由来の、共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびに、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばCD3ζ鎖またはその一部分、をコードするヌクレオチドの配列を含む。いずれかの態様のいくつかでは、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座は、順番に、細胞外結合ドメイン、例えばscFv；例えば、ヒト免疫グロブリンヒンジ由来の、例えばIgG1、IgG2、もしくはIgG4、またはその改変バージョン由来の配列を含み、例えば、CH2領域および/またはCH3領域をさらに含む、スペーサー；ならびに、例えばヒトCD28由来の、膜貫通ドメイン；例えばヒト4-1BB由来の、共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびに、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばCD3ζ鎖またはその一部分、をコードするヌクレオチドの配列を含む。

いずれかの態様のいくつかでは、導入遺伝子は、組換え受容体、例えば、組換え受容体の完全配列または全配列をコードする。いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体は、一本鎖ポリペプチドである。例えば、組換え受容体は、キメラ抗原受容体（CAR）であってもよく、導入遺伝子は、キメラ抗原受容体（CAR）、例えば、CARの完全配列または全配列をコードする。いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体は、多数鎖ポリペプチド、例えば二本鎖ポリペプチドである。例えば、組換え受容体は、α鎖およびβ鎖を含有するT細胞受容体（TCR）であってもよく、導入遺伝子は、TCRのα鎖およびβ鎖の両方、例えば、TCRのα鎖およびβ鎖の完全配列または全配列をコードする。そのような例では、TCRの別々の鎖は、リボソームスキップエレメント（例えば、T2AもしくはP2A）またはIRESなどの、マルチシストロン性エレメントによって分離されてもよい。

いずれかの態様のいくつかでは、導入遺伝子は、組換え受容体の一部分をコードする。態様では、導入遺伝子によってコードされる組換え受容体の一部分は、例えば、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、その一部分がT細胞から発現される時に、完全長組換え受容体の同じかまたは類似した（すなわち、それが保持する）機能的活性（例えば、抗原結合活性および受容体シグナル伝達活性）を促進するかまたは可能にすることができる。いずれかの態様のいくつかでは、T細胞から発現される時に、組換え受容体の一部分は、組換え受容体の完全長形態の機能的活性（例えば、抗原結合活性および受容体シグナル伝達活性）を保持する完全な組換え受容体またはその部分配列を形成することができる。いずれかの態様のいくつかでは、T細胞から発現される時に、組換え受容体の一部分は、組換え受容体の完全な活性の少なくとも75％、85％、90％、または100％を促進するかまたは可能にすることができる。いくつかの例では、T細胞から発現される時に、導入遺伝子によってコードされる組換え受容体の一部分は、操作されたT細胞によってまた発現される組換え受容体の別の成分（例えば、組換え受容体の別の鎖）と共に、完全な機能的受容体を形成することができる。他の例では、組換え受容体は、一本鎖ポリペプチド（例えば、CAR）であってもよく、その一部分は、T細胞から発現される時に、組換え受容体の機能的活性に必要である組換え受容体のアミノ酸の連続した配列を含んでもよい。そのような態様では、組換え受容体のその一部分は、組換え受容体の長さの少なくとも約85％、少なくとも約87％、少なくとも約90％、少なくとも約92％、少なくとも約95％、または少なくとも約97％である配列長を含む、かつ、組換え受容体の活性（例えば、抗原結合活性および受容体シグナル伝達活性）を保持する部分的な組換え受容体をコードする、組換え受容体のアミノ酸の連続した配列を有してもよい。

いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体のその一部分は、例えば、組換え受容体が多数の鎖から構成される態様（例えば、α鎖およびβ鎖を含有するTCR、または多鎖CAR）では、組換え受容体の1つのポリペプチド鎖である。例えば、組換え受容体の他の鎖は、操作されたT細胞によって別々に、さらに発現される。いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体は、2つの別々のポリペプチド鎖を含有し、ここで、導入遺伝子によってコードされる組換え受容体の一部分は、組換え受容体の1つの鎖であり、かつ操作されたT細胞は、組換え受容体の他の鎖をさらに発現する。いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体の他の鎖は、別々にT細胞に含有されかつT細胞によって発現されることができる、第2の導入遺伝子によってコードされる。

いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体は、多鎖CARであるCARである。いくつかの例では、導入遺伝子は、多鎖CAR、例えば多鎖CARの完全配列または全体配列、例えば、2つの鎖を有する多鎖CARの第1の鎖および第2の鎖をコードする。そのような例では、多鎖CARの別々の鎖は、リボソームスキップエレメント（例えば、T2AもしくはP2A）またはIRESなどの、マルチシストロン性エレメントによって分離されてもよい。他の例では、導入遺伝子は、多鎖CARの1つの鎖をコードし、多鎖CARの他の鎖は、例えば、第2の導入遺伝子によって、操作された細胞によって別々にコードされる。提供される態様のいずれかのいくつかでは、操作されたT細胞は、例えば、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、抗原結合活性および受容体シグナル伝達活性を保持するかまたは示す、完全に機能的な組換え多鎖CARを発現することができる。

いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体は、組換えT細胞受容体（TCR）である。いずれかの態様のいくつかでは、組換えTCRは、アルファ（TCRα）鎖およびベータ（TCRβ）鎖を含み、かつ導入遺伝子は、TCRα鎖をコードする核酸配列および/またはTCRβ鎖をコードする核酸配列を含む。いくつかの例では、導入遺伝子は、TCR、例えばTCRα鎖およびTCRβ鎖を含むTCRの完全配列または全体配列をコードする。そのような例では、TCRの別々の鎖は、リボソームスキップエレメント（例えば、T2AもしくはP2A）またはIRESなどの、マルチシストロン性エレメントによって分離されてもよい。いずれかの態様のいくつかでは、導入遺伝子は、TCRα鎖またはTCRβ鎖の一方をコードし、TCRα鎖またはTCRβ鎖の他方は、例えば、第2の導入遺伝子によって、操作された細胞によって別々にコードされる。提供される態様のいずれかのいくつかでは、操作されたT細胞は、例えば、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、抗原結合活性および受容体シグナル伝達活性を保持するかまたは示す、完全に機能的な組換えTCRを発現することができる。

いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体は、TCRα鎖およびTCRβ鎖を含有するTCRである。いずれかの態様のいくつかでは、TCRα鎖は、1つまたは複数の導入されたシステイン残基を含む定常（Cα）領域を含み、かつ/またはTCRβ鎖は、1つまたは複数の導入されたシステイン残基を含むCβ領域を含み、該1つまたは複数の導入されたシステイン残基は、α鎖とβ鎖との間に1つまたは複数の非天然ジスルフィド架橋を形成することができる。いずれかの態様のいくつかでは、1つまたは複数の導入されたシステイン残基は、非システイン残基のシステイン残基での置換を含む。いずれかの態様のいくつかでは、Cα領域は、SEQ ID NO:92に示されるような番号付けで48位に対応する位置にシステインを含み；かつ/またはCβ領域は、SEQ ID NO:96に示されるような番号付けで57位に対応する位置にシステインを含む。

いずれかの態様のいくつかでは、導入遺伝子は、少なくとも1つのさらなるタンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含む。いずれかの態様のいくつかでは、少なくとも1つのさらなるタンパク質は、操作されたT細胞による組換え受容体の発現をモニターするか、またはその代用として作用するマーカーなどの、代用マーカーである。いずれかの態様のいくつかでは、代用マーカーは、トランケートされた受容体である。いずれかの態様のいくつかでは、トランケートされた受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、かつ/またはそのリガンドが結合した場合に細胞内シグナル伝達を媒介することができない。

いずれかの態様のいくつかでは、導入遺伝子は、マルチシストロン性エレメントをさらに含む。いずれかの態様のいくつかでは、マルチシストロン性エレメントは、T2A、P2A、E2A、もしくはF2Aの中から選択されるリボソームスキップエレメント、または配列内リボソーム進入部位（IRES）をコードする配列を含む。

いずれかの態様のいくつかでは、マルチシストロン性エレメントは、CARをコードするヌクレオチドの配列と、少なくとも1つのさらなるタンパク質をコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている。いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体は、組換えTCRであり、かつマルチシストロン性エレメントは、TCRαをコードするヌクレオチドの配列と、TCRβをコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている。いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体は、多鎖CARであり、かつマルチシストロン性エレメントは、多鎖CARの1つの鎖をコードするヌクレオチドの配列と、多鎖CARの別の鎖をコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている。いずれかの態様のいくつかでは、マルチシストロン性エレメントは、組換え受容体をコードするヌクレオチドの配列の上流にある。

いずれかの態様のいくつかでは、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座は、例えば、相同性指向修復を用いた遺伝子編集による、内在性T細胞刺激関連遺伝子座中への、組換え受容体をコードする導入遺伝子の組み込みによって作製される。いずれかの態様のいくつかでは、組み込みは、a）内在性T細胞刺激関連遺伝子座のまたはその近くの1つまたは複数の標的部位で遺伝子破壊を誘導する工程；およびb）相同性指向修復（HDR）のためのポリヌクレオチドを導入する工程による。

いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体をコードする導入遺伝子は、T細胞刺激関連遺伝子座中の少なくとも1つの標的部位にまたはその近くに組み込まれる。いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、標的部位に特異的に結合するか、それを認識するか、またはそれにハイブリダイズする、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされる。いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、CRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつCRISPR-Cas9の組み合わせは、少なくとも1つの標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含む。いずれかの態様のいくつかでは、CRISPR-Cas9の組み合わせは、gRNAおよびCas9タンパク質を含むリボ核タンパク質（RNP）複合体である。いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、電気穿孔を介して複数のT細胞中に導入されるRNPによってもたらされる。

いずれかの態様のいくつかでは、T細胞刺激関連遺伝子座は、PDCD1である。いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、gRNAを含むCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつgRNAは、PDCD1遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する。いずれかの態様のいくつかでは、gRNAは、SEQ ID NO:75および104～109のいずれか1つに示される配列を含む。いずれかの態様のいくつかでは、gRNAは、SEQ ID NO:75に示される配列を含む。

いずれかの態様のいくつかでは、T細胞刺激関連遺伝子座は、CD69である。いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、gRNAを含むCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつgRNAは、CD69遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する。いずれかの態様のいくつかでは、gRNAは、SEQ ID NO:116～121のいずれか1つに示される配列を含む。

いずれかの態様のいくつかでは、T細胞刺激関連遺伝子座は、Nur77である。いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、gRNAを含むCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつgRNAは、Nur77遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する。いずれかの態様のいくつかでは、gRNAは、SEQ ID NO:122～127および134～136に示される配列を含む。

いずれかの態様のいくつかでは、T細胞刺激関連遺伝子座は、FoxP3である。いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、gRNAを含むCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつgRNAは、FoxP3遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する。

いずれかの態様のいくつかでは、T細胞刺激関連遺伝子座は、HLA-DR遺伝子座である。9. いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、gRNAを含むCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつgRNAは、HLA-DR遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する。

いずれかの態様のいくつかでは、T細胞は、内在性T細胞受容体α定常領域（TRAC）遺伝子および/または内在性T細胞受容体β定常領域（TRBC）遺伝子に遺伝子破壊をさらに含む。いずれかの態様のいくつかでは、T細胞は、内在性T細胞受容体α定常領域（TRAC）遺伝子に遺伝子破壊をさらに含む。いずれかの態様のいくつかでは、T細胞は、内在性T細胞受容体α定常領域（TRBC）遺伝子に遺伝子破壊をさらに含む。いずれかの態様のいくつかでは、T細胞は、内在性T細胞受容体α定常領域（TRAC）遺伝子および内在性T細胞受容体β定常領域（TRBC）遺伝子に遺伝子破壊をさらに含む。いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、少なくとも1つの標的部位、例えば、TRAC遺伝子またはTRBC遺伝子、TRBC1もしくはTRBC2遺伝子のいずれか内の少なくとも1つの標的部位に特異的に結合するか、それを認識するか、またはそれにハイブリダイズする、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされる。いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、CRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつCRISPR-Cas9の組み合わせは、少なくとも1つの標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含む。いずれかの態様のいくつかでは、CRISPR-Cas9の組み合わせは、gRNAおよびCas9タンパク質を含むリボ核タンパク質（RNP）複合体である。いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、電気穿孔を介して複数のT細胞中に導入されるRNPによってもたらされる。

いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、gRNAを含むCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつgRNAは、TRAC遺伝子またはTRBC遺伝子、TRBC1もしくはTRBC2遺伝子のいずれか内の少なくとも1つの標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する。いずれかの態様のいくつかでは、gRNAは、TRAC遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する。いずれかの態様のいくつかでは、gRNAは、SEQ ID NO:77および188～218のいずれか1つに示される配列を含む。いずれかの態様のいくつかでは、gRNAは、SEQ ID NO:77に示される配列を含む。いずれかの態様のいくつかでは、gRNAは、TRBC遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する。いずれかの態様のいくつかでは、gRNAは、SEQ ID NO:219～276のいずれか1つに示される配列を含む。

いずれかの態様のいくつかでは、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルの非存在下での、コードされる組換え受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを通したシグナル伝達活性は、T細胞のゲノム中の異なる場所に存在するかまたはT細胞のゲノム中のランダムな場所に存在する同じ組換え受容体をコードする導入遺伝子を含む操作されたT細胞と比較して、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、もしくはそれ以上よりも多く、または約10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、もしくはそれ以上よりも多く、低減される。

いずれかの態様のいくつかでは、T細胞は、CD8+ T細胞もしくはCD4+ T細胞またはそのサブタイプである。いずれかの態様のいくつかでは、T細胞は、対象に由来する初代T細胞である。いずれかの態様のいくつかでは、対象はヒトである。いくつかの態様では、T細胞は、ヒト対象に由来する初代T細胞である。いくつかの態様では、T細胞は、初代ヒトT細胞である。いずれかの態様のいくつかでは、T細胞は、多分化能細胞または多能性細胞に由来する。いずれかの態様のいくつかでは、T細胞は、iPSCに由来する。

また、複数の提供される操作された細胞のいずれかを含有する組成物も提供される。いずれかの態様のいくつかでは、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞における刺激または活性化シグナルに続いて、6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内にまたは約6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内に、組成物中の1つまたは複数の細胞において上方制御されるかまたは誘導される。いずれかの態様のいくつかでは、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、組成物中の細胞の中での、機能的に連結された導入遺伝子を発現する細胞の頻度は、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも高いか、または約50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも高い。いずれかの態様のいくつかでは、発現の上方制御もしくは誘導に続いて、またはT細胞におけるシミュレーションもしくは活性化シグナルの低減もしくは非存在に続いて、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、組成物中の1つまたは複数の細胞において低減されるかまたは下方制御される。

いずれかの態様のいくつかでは、発現の上方制御もしくは誘導に続いて、またはT細胞におけるシミュレーションもしくは活性化シグナルの低減もしくは非存在に続いて、組成物中の細胞の中での、機能的に連結された導入遺伝子を発現する細胞の頻度は、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも多く、または約30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも多く、低減される。いずれかの態様のいくつかでは、発現の上方制御または誘導に続いて、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞における刺激または活性化シグナルの、1、2、3、4、5、6、7、もしくは8日、もしくはそれ以上後にまたは約1、2、3、4、5、6、7、もしくは8日、もしくはそれ以上後に、組成物中の1つまたは複数の細胞において低減されるかまたは下方制御される。

いずれかの態様のいくつかでは、組成物中の細胞の1つまたは複数における機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在に続いて、6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内にまたは約6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内に、低減されるかまたは下方制御される。いずれかの態様のいくつかでは、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在に続いて、組成物中の細胞の中での、組換え受容体を発現する細胞の頻度は、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、もしくは5％、もしくはそれ以下よりも低いか、または約50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、もしくは5％、もしくはそれ以下よりも低い。

いずれかの態様のいくつかでは、組成物は、CD4+ T細胞および/またはCD8+ T細胞を含む。いずれかの態様のいくつかでは、組成物は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を含み、CD4+ T細胞対CD8+ T細胞の比は、1:3～3:1または約1:3～3:1である。いずれかの態様のいくつかでは、1:1である。

また、（a）組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子、および（b）T細胞中の内在性T細胞刺激関連遺伝子座の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む、導入遺伝子に連結された1つまたは複数の相同性アーム、を含む、ポリヌクレオチドも提供される。

いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体またはその一部分は、ポリヌクレオチドが導入された細胞から組換え受容体が発現される場合に、該組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含有する改変されたT細胞刺激関連遺伝子座によってコードされる。いずれかの態様のいくつかでは、導入遺伝子は、T細胞の内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームにとって外来性または異種である配列である。

いずれかの態様のいくつかでは、T細胞は、初代ヒトT細胞である。いずれかの態様のいくつかでは、T細胞は、対象に由来するT細胞である。いずれかの態様のいくつかでは、対象はヒトである。いずれかの態様のいくつかでは、T細胞はヒトT細胞である。

いずれかの態様のいくつかでは、1つまたは複数の相同性アームは、5'相同性アームおよび/または3'相同性アームを含む。いずれかの態様のいくつかでは、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、標的部位の周囲の核酸配列に相同な核酸配列を含み、該標的部位は、T細胞刺激関連遺伝子座内にある。いずれかの態様のいくつかでは、標的部位は、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントの下流にある。

いずれかの態様のいくつかでは、ポリヌクレオチドは、構造[5'相同性アーム]-[導入遺伝子]-[3'相同性アーム]を含む。いずれかの態様のいくつかでは、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、少なくとも1つの標的部位の周囲の核酸配列に相同な核酸配列を含む。いずれかの態様のいくつかでは、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、50または約50から、750または約750ヌクレオチド、50または約50から、500または約500ヌクレオチド、50または約50から、250または約250ヌクレオチド、50または約50から、100または約100ヌクレオチド、100または約100から、750または約750ヌクレオチド、100または約100から、500または約500ヌクレオチド、100または約100から、250または約250ヌクレオチド、250または約250から、750または約750ヌクレオチド、250または約250から、500または約500ヌクレオチドの長さである。いずれかの態様のいくつかでは、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、もしくは500ヌクレオチドまたは約50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、もしくは500ヌクレオチド、または前述のいずれかの間の任意の値の長さである。いずれかの態様のいくつかでは、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、100未満または約100未満のヌクレオチドの長さである。いずれかの態様のいくつかでは、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、50、60、70、80、もしくは90ヌクレオチドまたは約50、60、70、80、もしくは90ヌクレオチド、または前述のいずれかの間の任意の値の長さである。

いずれかの態様のいくつかでは、T細胞刺激関連遺伝子座は、PDCD1、CD69、Nur77、FoxP3、およびHLA-DR遺伝子座の中から選択される。

いずれかの態様のいくつかでは、T細胞刺激関連遺伝子座は、PDCD1である。いずれかの態様のいくつかでは、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、PDCD1の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む。いずれかの態様のいくつかでは、5'相同性アームは、a）SEQ ID NO:66に示される配列に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の配列同一性を示す配列に対する、150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個の連続したヌクレオチドを含む配列；b）SEQ ID NO:66に示される配列の、150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個の連続したヌクレオチドを含む配列；またはc）SEQ ID NO:66に示される配列、を含む。いずれかの態様のいくつかでは、3'相同性アームは、a）SEQ ID NO:67に示される配列に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の配列同一性を示す配列に対する、150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個の連続したヌクレオチドを含む配列；b）SEQ ID NO:67に示される配列の、150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個の連続したヌクレオチドを含む配列；またはc）SEQ ID NO:67に示される配列、を含む。

いずれかの態様のいくつかでは、T細胞刺激関連遺伝子座は、CD69である。いずれかの態様のいくつかでは、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、CD69の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む。

いずれかの態様のいくつかでは、T細胞刺激関連遺伝子座は、Nur77である。いずれかの態様のいくつかでは、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、Nur77の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む。

いずれかの態様のいくつかでは、T細胞刺激関連遺伝子座は、FoxP3である。いずれかの態様のいくつかでは、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、FoxP3の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む。

いずれかの態様のいくつかでは、T細胞刺激関連遺伝子座は、HLA-DR遺伝子座である。いずれかの態様のいくつかでは、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、HLA-DR遺伝子座の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む。

いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体は、T細胞受容体（TCR）複合体の成分の細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内領域を含み、かつT細胞における刺激もしくは活性化シグナルは、組換え受容体中に存在する細胞内シグナル伝達ドメインを通したシグナルを含むか、または、組換え受容体は、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内領域を含み、かつT細胞における刺激もしくは活性化シグナルは、組換え受容体中に存在する細胞内シグナル伝達ドメインを通したシグナルを含む。

いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体は、作用物質に結合するかまたはそれを認識することができる結合ドメインを含む、細胞外領域を含む。いずれかの態様のいくつかでは、刺激または活性化シグナルは、作用物質の結合の際に、T細胞において誘導される。

いずれかの態様のいくつかでは、作用物質は、標的抗原である。いずれかの態様のいくつかでは、標的抗原は、組換えタンパク質であるか、または細胞の表面上に発現している抗原である。いずれかの態様のいくつかでは、標的抗原は、ある疾患、障害、または状態の細胞または組織に関連しているか、それに特異的であるか、またはその上に発現している。いずれかの態様のいくつかでは、疾患、障害、または状態は、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである。いずれかの態様のいくつかでは、標的抗原は、腫瘍抗原である。いずれかの態様のいくつかでは、標的抗原は、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9；CAIXまたはG250としても知られている）、がん精巣抗原、がん/精巣抗原1B（CTAG；NY-ESO-11およびLAGE-12としても知られている）、癌胎児性抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-11）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮成長因子タンパク質（EGFR）、III型上皮成長因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-12）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体ホモログ5またはFCRH5としても知られている）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量-黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-122受容体アルファ（IL-122Rα）、IL-113受容体アルファ2（IL-113Rα2）、キナーゼインサートドメイン受容体（kdr）、κ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、黒色腫関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソテリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-11）、神経細胞接着分子（NCAM）、腫瘍胎児抗原、黒色腫優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（TPBG；5T4としても知られている）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1；TYRP1またはgp75としても知られている）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2；ドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムデルタ-イソメラーゼ、またはDCTとしても知られている）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-11）、病原体特異的抗原もしくは病原体発現抗原、またはユニバーサルタグに関連する抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBV、もしくは他の病原体によって発現される分子の中から選択される。

いずれかの態様のいくつかでは、作用物質は、抗イディオタイプ抗体である。

いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体は、キメラ抗原受容体（CAR）である。いずれかの態様のいくつかでは、CARは、細胞外領域、膜貫通ドメイン、および細胞内領域を含む。いずれかの態様のいくつかでは、細胞外領域は、スペーサーを含む。いずれかの態様のいくつかでは、スペーサーは、結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に機能的に連結される。いずれかの態様のいくつかでは、細胞外領域は、抗体またはその抗原結合断片であるか、またはそれを含む、結合ドメインを含む。

いずれかの態様のいくつかでは、細胞内領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いずれかの態様のいくつかでは、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3鎖の細胞内シグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む。いずれかの態様のいくつかでは、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖、またはそのシグナル伝達部分である。いずれかの態様のいくつかでは、細胞内領域は、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いずれかの態様のいくつかでは、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、CD28、4-1BB、もしくはICOSの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそのシグナル伝達部分を含む。いずれかの態様のいくつかでは、共刺激シグナル伝達領域は、4-1BBの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

いずれかの態様のいくつかでは、導入遺伝子は、順番に、細胞外結合ドメイン、例えばscFv；例えば、ヒト免疫グロブリンヒンジ由来の、例えばIgG1、IgG2、もしくはIgG4、またはその改変バージョン由来の配列を含み、例えば、CH2領域および/またはCH3領域をさらに含む、スペーサー；ならびに、例えばヒトCD28由来の、膜貫通ドメイン；例えばヒト4-1BB由来の、共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびに、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばCD3ζ鎖またはその一部分、をコードするヌクレオチドの配列を含む；かつ/あるいは、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座は、順番に、細胞外結合ドメイン、例えばscFv；例えば、ヒト免疫グロブリンヒンジ由来の、例えばIgG1、IgG2、もしくはIgG4、またはその改変バージョン由来の配列を含み、例えば、CH2領域および/またはCH3領域をさらに含む、スペーサー；ならびに、例えばヒトCD28由来の、膜貫通ドメイン；例えばヒト4-1BB由来の、共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびに、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばCD3ζ鎖またはその一部分、をコードするヌクレオチドの配列を含む。

いずれかの態様のいくつかでは、導入遺伝子は、組換え受容体をコードする。

いずれかの態様のいくつかでは、導入遺伝子は、組換え受容体の一部分をコードする。いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体は、2つの別々のポリペプチド鎖を含有し、ここで、導入遺伝子によってコードされる組換え受容体の一部分は、組換え受容体の1つの鎖である。いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体の他の鎖は、第2の導入遺伝子によってコードされる。

いずれかの態様のいくつかでは、CARは、多鎖CARである。いずれかの態様のいくつかでは、導入遺伝子は、多鎖CARの1つの鎖をコードする。

いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体は、組換えT細胞受容体（TCR）である。いずれかの態様のいくつかでは、組換えTCRは、アルファ（TCRα）鎖およびベータ（TCRβ）鎖を含み、かつ導入遺伝子は、TCRα鎖をコードする核酸配列および/またはTCRβ鎖をコードする核酸配列を含む。いずれかの態様のいくつかでは、導入遺伝子は、TCRα鎖またはTCRβ鎖のうちの1つをコードする。

いずれかの態様のいくつかでは、TCRα鎖は、1つまたは複数の導入されたシステイン残基を含む定常（Cα）領域を含み、かつ/またはTCRβ鎖は、1つまたは複数の導入されたシステイン残基を含むCβ領域を含み、該1つまたは複数の導入されたシステイン残基は、α鎖とβ鎖との間に1つまたは複数の非天然ジスルフィド架橋を形成することができる。いずれかの態様のいくつかでは、1つまたは複数の導入されたシステイン残基は、非システイン残基のシステイン残基での置換を含む。いずれかの態様のいくつかでは、Cα領域は、SEQ ID NO:92に示されるような番号付けで48位に対応する位置にシステインを含み；かつ/またはCβ領域は、SEQ ID NO:96に示されるような番号付けで57位に対応する位置にシステインを含む。

いずれかの態様のいくつかでは、導入遺伝子は、少なくとも1つのさらなるタンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含む。いずれかの態様のいくつかでは、少なくとも1つのさらなるタンパク質は、代用マーカーである。いずれかの態様のいくつかでは、代用マーカーは、トランケートされた受容体である。いずれかの態様のいくつかでは、トランケートされた受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、かつ/またはそのリガンドが結合した場合に細胞内シグナル伝達を媒介することができない。

いずれかの態様のいくつかでは、マルチシストロン性エレメントは、CARをコードするヌクレオチドの配列と、少なくとも1つのさらなるタンパク質をコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている；組換え受容体は、組換えTCRであり、かつマルチシストロン性エレメントは、TCRαをコードするヌクレオチドの配列と、TCRβをコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている；組換え受容体は、多鎖CARであり、かつマルチシストロン性エレメントは、多鎖CARの1つの鎖をコードするヌクレオチドの配列と、多鎖CARの別の鎖をコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている；および/または、マルチシストロン性エレメントは、組換え受容体をコードするヌクレオチドの配列の上流にある。

いずれかの態様のいくつかでは、ポリヌクレオチドは、直鎖ポリヌクレオチドである。いずれかの態様のいくつかでは、ポリヌクレオチドは、二本鎖ポリヌクレオチドである。いずれかの態様のいくつかでは、ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドである。いずれかの態様のいくつかでは、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクター中に含まれる。いずれかの態様のいくつかでは、ウイルスベクターは、AAVベクターである。いずれかの態様のいくつかでは、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。いずれかの態様のいくつかでは、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。

いずれかの態様のいくつかでは、ポリヌクレオチドは、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、もしくは4000ヌクレオチドの長さまたは約1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、もしくは4000ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である。いずれかの態様のいくつかでは、ポリヌクレオチドは、1500もしくは約1500から、2500もしくは約2500ヌクレオチド、または1750もしくは約1750から、2250もしくは約2250ヌクレオチドの長さである。

また、（a）T細胞の内在性T細胞刺激関連遺伝子座内の標的部位で遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質を、T細胞中に導入する工程；および（b）提供されるポリヌクレオチドのいずれかを、T細胞刺激関連遺伝子座に遺伝子破壊を含むT細胞中に導入する工程を含む、遺伝子操作されたT細胞を作製する方法であって、該方法が、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を作製し、該改変されたT細胞刺激関連遺伝子座が、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含有する、前記方法も提供される。いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子は、相同性指向修復（HDR）を介して内在性T細胞刺激関連遺伝子座内に組み込まれる。

また、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを、T細胞中に導入する工程を含む、遺伝子操作されたT細胞を作製する方法であって、該T細胞が、T細胞のT細胞刺激関連遺伝子座内に遺伝子破壊を有し、該組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子が、相同性指向修復（HDR）を介して内在性T細胞刺激関連遺伝子座内に組み込まれる、前記方法も提供される。

いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、T細胞の内在性T細胞刺激関連遺伝子座内の標的部位で遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質を、T細胞中に導入することによって実施される。いずれかの態様のいくつかでは、方法は、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を作製し、該改変されたT細胞刺激関連遺伝子座は、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含有する。

いずれかの態様のいくつかでは、ポリヌクレオチドは、核酸配列に連結された1つまたは複数の相同性アームをさらに含み、該1つまたは複数の相同性アームは、T細胞中の内在性T細胞刺激関連遺伝子座の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む。いずれかの態様のいくつかでは、1つまたは複数の相同性アームは、5'相同性アームおよび/または3'相同性アームを含む。いずれかの態様のいくつかでは、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、標的部位の周囲の核酸配列に相同な核酸配列を含み、該標的部位は、T細胞刺激関連遺伝子座内にある。

いずれかの態様のいくつかでは、標的部位は、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントの下流にある。

いずれかの態様のいくつかでは、作用物質は、標的抗原である。いずれかの態様のいくつかでは、標的抗原は、組換えタンパク質であるか、または細胞の表面上に発現している抗原である。いずれかの態様のいくつかでは、標的抗原は、ある疾患、障害、または状態の細胞または組織に関連しているか、それに特異的であるか、またはその上に発現している。いずれかの態様のいくつかでは、疾患、障害、または状態は、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである。

いずれかの態様のいくつかでは、標的抗原は、腫瘍抗原、病原体特異的抗原もしくは病原体発現抗原、炎症性抗原、または自己抗原である。いずれかの態様のいくつかでは、標的抗原は、腫瘍抗原である。いずれかの態様のいくつかでは、標的抗原は、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9；CAIXまたはG250としても知られている）、がん精巣抗原、がん/精巣抗原1B（CTAG；NY-ESO-11およびLAGE-12としても知られている）、癌胎児性抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-11）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮成長因子タンパク質（EGFR）、III型上皮成長因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-12）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体ホモログ5またはFCRH5としても知られている）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量-黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-122受容体アルファ（IL-122Rα）、IL-113受容体アルファ2（IL-113Rα2）、キナーゼインサートドメイン受容体（kdr）、κ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、黒色腫関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソテリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-11）、神経細胞接着分子（NCAM）、腫瘍胎児抗原、黒色腫優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（TPBG；5T4としても知られている）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1；TYRP1またはgp75としても知られている）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2；ドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムデルタ-イソメラーゼ、またはDCTとしても知られている）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-11）、病原体特異的抗原もしくは病原体発現抗原、またはユニバーサルタグに関連する抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBV、もしくは他の病原体によって発現される分子の中から選択される。

いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、標的部位に特異的に結合するか、それを認識するか、またはそれにハイブリダイズする、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされる。いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、CRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつCRISPR-Cas9の組み合わせは、少なくとも1つの標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含む。いずれかの態様のいくつかでは、CRISPR-Cas9の組み合わせは、gRNAおよびCas9タンパク質を含むリボ核タンパク質（RNP）複合体である。いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、電気穿孔を介して複数のT細胞中に導入されるRNPによってもたらされる。

いずれかの態様のいくつかでは、T細胞刺激関連遺伝子座は、FoxP3である。

いずれかの態様のいくつかでは、T細胞刺激関連遺伝子座は、HLA-DR遺伝子座である。

いずれかの態様のいくつかでは、T細胞は、内在性T細胞受容体α定常領域（TRAC）遺伝子および/または内在性T細胞受容体β定常領域（TRBC）遺伝子に遺伝子破壊をさらに含む。いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2遺伝子内の少なくとも1つの標的部位に特異的に結合するか、それを認識するか、またはそれにハイブリダイズする、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされる。いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、CRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつCRISPR-Cas9の組み合わせは、少なくとも1つの標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含む。いずれかの態様のいくつかでは、CRISPR-Cas9の組み合わせは、gRNAおよびCas9タンパク質を含むリボ核タンパク質（RNP）複合体である。いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、電気穿孔を介して複数のT細胞中に導入されるRNPによってもたらされる。いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、gRNAを含むCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつgRNAは、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2遺伝子内の少なくとも1つの標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する。

いずれかの態様のいくつかでは、gRNAは、TRAC遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する。いずれかの態様のいくつかでは、gRNAは、SEQ ID NO:77および188～218のいずれか1つに示される配列を含む。いずれかの態様のいくつかでは、gRNAは、SEQ ID NO:77に示される配列を含む。いずれかの態様のいくつかでは、gRNAは、TRBC遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する。いずれかの態様のいくつかでは、gRNAは、SEQ ID NO:219～276のいずれか1つに示される配列を含む。

いずれかの態様のいくつかでは、組換え受容体は、キメラ抗原受容体（CAR）である。いずれかの態様のいくつかでは、コードされる組換え受容体は、組換えT細胞受容体（TCR）であるか、またはそれを含む。

いずれかの態様のいくつかでは、RNPは、電気穿孔、パーティクルガン、リン酸カルシウムトランスフェクション、細胞の圧縮または圧迫を介して導入される。いずれかの態様のいくつかでは、RNPは、電気穿孔を介して導入される。いずれかの態様のいくつかでは、RNPは、電気穿孔を介して複数のT細胞中に導入される。いずれかの態様のいくつかでは、RNPの濃度は、1μMまたは約1μMから、5μMまたは約5μMである。いずれかの態様のいくつかでは、RNPの濃度は、2μMまたは約2μMである。

いずれかの態様のいくつかでは、T細胞は、CD8+ T細胞および/もしくはCD4+ T細胞またはそのサブタイプを含む。いずれかの態様のいくつかでは、T細胞は、対象にとって自己である。いずれかの態様のいくつかでは、T細胞は、対象に由来する初代T細胞である。いずれかの態様のいくつかでは、対象はヒトである。いずれかの態様のいくつかでは、T細胞は、対象にとって同種異系である。いずれかの態様のいくつかでは、T細胞は、多分化能細胞または多能性細胞に由来する。いずれかの態様のいくつかでは、T細胞は、iPSCに由来する。

いずれかの態様のいくつかでは、1つまたは複数の作用物質およびポリヌクレオチドは、同時にまたは逐次的に、任意の順序で導入される。いずれかの態様のいくつかでは、1つまたは複数の作用物質およびポリヌクレオチドは、同時に導入される。いずれかの態様のいくつかでは、ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の作用物質の導入の後に導入される。いずれかの態様のいくつかでは、ポリヌクレオチドは、作用物質の導入の直後に、または該導入後約30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間以内に導入される。

いずれかの態様のいくつかでは、1つもしくは複数の作用物質および/またはポリヌクレオチドの導入の前に、方法は、細胞を、1つまたは複数の免疫細胞を刺激するかまたは活性化するための条件下で刺激物質とインビトロでインキュベートする工程を含む。いずれかの態様のいくつかでは、刺激物質は、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体を含む。いずれかの態様のいくつかでは、刺激物質は、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体を含むオリゴマー粒子試薬を含む。いずれかの態様のいくつかでは、刺激物質は、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体でコーティングされたビーズを含む。

いずれかの態様のいくつかでは、方法は、1つもしくは複数の作用物質の導入および/またはポリヌクレオチドの導入の前に、その最中に、またはその後に、細胞を、1つまたは複数の組換えサイトカインとインキュベートする工程をさらに含む。いずれかの態様のいくつかでは、1つまたは複数の組換えサイトカインは、IL-2、IL-7、およびIL-15からなる群より選択される。いずれかの態様のいくつかでは、1つまたは複数の組換えサイトカインは、10 U/mLまたは約10 U/mLから、200 U/mLまたは約200 U/mLのIL-2の濃度から選択される濃度で添加される。いずれかの態様のいくつかでは、1つまたは複数の組換えサイトカインは、50 IU/mLまたは約50 IU/mLから、100 U/mLまたは約100 U/mLの濃度で；IL-7は0.5 ng/mL～50 ng/mLの濃度で添加される。いずれかの態様のいくつかでは、1つまたは複数の組換えサイトカインは、5 ng/mLもしくは約5 ng/mLから、10 ng/mLもしくは約10 ng/mLの濃度で、および/またはIL-15は0.1 ng/mL～20 ng/mLの濃度で添加される。いずれかの態様のいくつかでは、1つまたは複数の組換えサイトカインは、0.5 ng/mLまたは約0.5 ng/mLから、5 ng/mLまたは約5 ng/mLの濃度で添加される。

いずれかの態様のいくつかでは、インキュベーションは、1つまたは複数の作用物質の導入およびポリヌクレオチドの導入の後に、最大で24時間、36時間、48時間、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、もしくは21日間、またはおよそ24時間、36時間、48時間、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、もしくは21日間実施される。いずれかの態様のいくつかでは、インキュベーションは、最大で7日間または約7日間実施される。

また、提供される方法のいずれかを用いて生成された、操作されたT細胞または複数の操作されたT細胞も提供される。

また、提供される操作された細胞のいずれかまたは複数の提供される操作された細胞のいずれかを含む、組成物も提供される。

また、複数の提供される操作された細胞のいずれかを含有する、組成物も提供される。

いずれかの態様のいくつかでは、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞における刺激または活性化シグナルに続いて、6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内にまたは約6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内に、組成物中の1つまたは複数の細胞において上方制御されるかまたは誘導される。いずれかの態様のいくつかでは、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、組成物中の細胞の中での、機能的に連結された導入遺伝子を発現する細胞の頻度は、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも高いか、または約50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも高い。いずれかの態様のいくつかでは、発現の上方制御もしくは誘導に続いて、またはT細胞におけるシミュレーションもしくは活性化シグナルの低減もしくは非存在に続いて、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、組成物中の1つまたは複数の細胞において低減されるかまたは下方制御される。

いずれかの態様のいくつかでは、組成物中の細胞の1つまたは複数における機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在に続いて、6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内にまたは約6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内に、低減されるかまたは下方制御される。いずれかの態様のいくつかでは、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在に続いて、組成物中の細胞の中での組換え受容体を発現する細胞の頻度は、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、もしくは5％、もしくはそれ以下よりも低いか、または約50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、もしくは5％、もしくはそれ以下よりも低い。

また、提供される操作された細胞のいずれかまたは提供される操作された組成物のいずれかを、ある疾患または障害を有する対象に投与する工程を含む、処置の方法も提供される。

また、ある疾患または障害の処置のための、提供される操作された細胞のいずれかまたは提供される操作された組成物のいずれかの使用も提供される。

また、ある疾患または障害を処置するための薬剤の製造における、提供される操作された細胞のいずれかまたは提供される操作された組成物のいずれかの使用も提供される。

また、ある疾患または障害の処置における使用のための、提供される操作された細胞のいずれかまたは提供される操作された組成物のいずれかも提供される。

いずれかの態様のいくつかでは、疾患または障害は、がんまたは腫瘍である。いずれかの態様のいくつかでは、がんまたは腫瘍は、血液悪性腫瘍である。いずれかの態様のいくつかでは、がんまたは腫瘍は、リンパ腫、白血病、または形質細胞悪性腫瘍である。いずれかの態様のいくつかでは、がんは、リンパ腫であり、かつリンパ腫は、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（NHL）、ホジキンリンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、濾胞性リンパ腫、小型非切れ込み核細胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（MALT）、辺縁帯リンパ腫、脾リンパ腫、結節性単球様B細胞リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、大細胞リンパ腫、びまん性混合細胞型リンパ腫、肺B細胞血管中心性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、原発性縦隔B細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫（LPL）、またはマントル細胞リンパ腫（MCL）である。いずれかの態様のいくつかでは、がんは、白血病であり、かつ白血病は、慢性リンパ球性白血病（CLL）、形質細胞白血病、または急性リンパ球性白血病（ALL）である。いずれかの態様のいくつかでは、がんは、形質細胞悪性腫瘍であり、かつ形質細胞悪性腫瘍は、多発性骨髄腫（MM）である。

いずれかの態様のいくつかでは、腫瘍は、固形腫瘍である。いずれかの態様のいくつかでは、固形腫瘍は、非小細胞肺がん（NSCLC）または頭頚部扁平上皮癌（HNSCC）である。

また、T細胞刺激関連遺伝子座内の標的部位で遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質；および提供されるポリヌクレオチドのいずれか、を含む、キットも提供される。

また、T細胞刺激関連遺伝子座内の標的部位で遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質；および、組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、相同性指向修復（HDR）を介した標的部位でのまたはその近くでの組み込みのためにターゲティングされる、ポリヌクレオチド；および、提供される方法のいずれかを実施するための説明書、を含む、キットも提供される。

組換え受容体を条件付きで発現する操作されたT細胞を図示する概略図を示す。場合によっては、組換え受容体の発現は、T細胞刺激関連遺伝子座の操作可能な調節下にある。T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントに機能的に連結された組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を含有する、本明細書で提供される例示的な操作されたT細胞において、コードされる組換え受容体は、T細胞における刺激または活性化シグナルに続いて発現され得る。場合によっては、内在性TCR発現は、内在性TCRの成分、例えば、内在性T細胞受容体α定常領域（TRAC）遺伝子および/または内在性T細胞受容体β定常領域（TRBC）遺伝子をコードする遺伝子座に遺伝子破壊を導入することによって、低減されるかまたは抑制される。場合によっては、組換え受容体を通したシグナル伝達が、標的抗原を発現する標的細胞の排除により低減されるかまたは排除されるのであれば、組換え受容体の発現は、低減されるかまたは排除される。 0日目の抗CD3抗体および抗CD28抗体を含有する試薬での刺激後に経時的に、様々なT細胞刺激関連遺伝子座の遺伝子産物を含む様々なマーカーを発現する細胞のパーセントを示す。マーカーの発現を、フローサイトメトリーによって評価した。最初の刺激後7日目頃に、細胞を、同じ試薬を用いて再刺激し、マーカーを発現する細胞のパーセンテージを経時的に評価した。図3A～3Bは、PDCD1ターゲティングgRNAを含有するリボ核タンパク質（RNP）複合体（PD-1 KO）、TRACターゲティングgRNAを含有するRNP複合体（TRAC KO）、PDCD1遺伝子座でのターゲティング用のHDRのためのCARをコードする配列を含有するポリヌクレオチド（PD-1 KI CAR）、TRAC遺伝子座でのターゲティング用のHDRのためのCARをコードする配列を含有するポリヌクレオチド（TRAC KI CAR）、またはそれらの組み合わせが導入された細胞における、CD3、PD-1、およびキメラ抗原受容体（CAR）の発現についてのフローサイトメトリープロットを図示する。図3Aの説明を参照のこと。図4A～4Cは、内在性PDCD1遺伝子座の操作可能な調節下にCARをコードする配列（PD-1 KI CAR）またはTRAC転写制御エレメントの操作可能な調節下にCARをコードする配列（TRAC KI CAR）を含む操作されたT細胞における、最初の刺激後の休止時間の後、または最初の刺激および休止後の再刺激の後の、CD3、PD-1、CD69、およびキメラ抗原受容体（CAR）の発現についてのフローサイトメトリープロットを示す。図4Aの説明を参照のこと。図4Aの説明を参照のこと。図5A～5Bは、内在性PDCD1遺伝子座の操作可能な調節下にCARをコードする配列（PD-1 KI CAR）またはTRAC転写制御エレメントの操作可能な調節下にCARをコードする配列（TRAC KI CAR）を含む操作されたT細胞における、最初の刺激後の休止時間の後、または最初の刺激および休止後の再刺激の後の、再刺激を伴うかまたは伴わない、経時的なCAR+細胞のパーセンテージを図示する。図6Aは、例示的な抗CD19 CARが内在性PDCD1遺伝子座の操作可能な調節下で発現した細胞（PD1 KI CAR）における、電気穿孔の7日後、放射線照射されたCD19発現リンパ芽球様細胞株（LCL）と7日間共培養することによる第1ラウンドの刺激の後、および放射線照射されたCD19発現LCLと共培養することによる2ラウンドの刺激の後の、PDCD1プロモーターの調節下での例示的な抗CD19 CAR（抗イディオタイプ抗体を用いて検出）（PD1 KI CAR）およびCD8の発現についてのフローサイトメトリープロットを図示する。図6Bは、PD1KI CAR細胞、PDCD1 KO細胞（PDCD1ターゲティングRNP複合体のみを伴い、例示的なCARをコードするポリヌクレオチドは伴わずに電気穿孔；PD1 KO）、モック処理細胞（陰性対照）、および/またはレンチウイルスベクターを用いて操作された同じ例示的なCARを発現する細胞（LV対照）における、第1ラウンドおよび第2ラウンドの細胞の後の、細胞の増大倍率を図示する。図7Aは、再刺激を伴わずに休止させた細胞（休止）、または再刺激に供した細胞（2回目の刺激）における、放射線照射されたCD19発現LCLと共培養することによる第1ラウンドの刺激（1回目の刺激）の後の、PDCD1プロモーターの調節下での例示的な抗CD19 CAR（抗イディオタイプ抗体；aIDを用いて検出）（PD1 K1 CAR）およびCD8の発現についてのフローサイトメトリープロットを図示する。図7Bは、PD1 KO細胞、再刺激を伴わずに休止させたPD1 KI CAR細胞（PD1 KI CAR休止）、および再刺激に供したPD1 KI CAR細胞（PD1 KI CAR再刺激）における、CAR発現の平均蛍光強度（MFI）（抗イディオタイプ抗体を用いて検出；左）、CAR発現細胞のパーセンテージ（中央）、およびCD25+CD69+細胞のパーセンテージ（右）を示す。図7Cは、PD1 KO細胞、再刺激を伴わずに休止させたPD1 KI CAR細胞（PD1 KI CAR休止）、および再刺激に供したPD1 KI CAR細胞（PD1 KI CAR再刺激）における、CAR発現の統合積分された平均蛍光強度（MFI）を示す。図7Dは、CD19を発現する標的細胞に対する、PD1 KO細胞、再刺激を伴わずに休止させたPD1 KI CAR細胞（PD1 KI CAR休止）、および再刺激に供したPD1 KI CAR細胞（PD1 KI CAR再刺激）の細胞溶解活性を図示する。モック処理細胞（陰性対照）、LV対照、およびヒト胎児腎（HEK）細胞を、対照として用いた。図8Aは、ホタルルシフェラーゼをトランスフェクトしたRajiリンパ腫腫瘍細胞、および内在性PDCD1遺伝子座の操作可能な調節下に例示的な抗CD19 CARを発現する細胞（PD-1 KI CAR）、またはレンチウイルス送達による細胞（LV対照）を注射したマウスモデルにおける、インビボ抗腫瘍活性を評価するための時系列の概略図を図示する。図8Bは、生物発光により平均放射輝度を測定することによって示されるような、経時的な腫瘍成長を図示する。図8Cは、経時的なマウスの各群の生存を図示する。図8Dは、-1日目、7日目、14日目、および28日目での腫瘍の存在を示す、マウスの生物発光イメージングの結果を図示する。

詳細な説明
改変されたT細胞刺激関連遺伝子座などの改変された遺伝子座を含有する、操作されたT細胞などの操作された細胞が、本明細書において提供される。いくつかの局面では、操作された細胞は、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントに機能的に連結された受容体（例えば、キメラ抗原受容体または組換えT細胞受容体）またはその一部分をコードする、異種または外来性の核酸配列（例えば、導入遺伝子）を含有する。いくつかの局面では、内在性転写制御エレメントは、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、機能的に連結された核酸配列の発現を誘導するかまたは上方制御する。

いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座の転写制御エレメントからの発現は、T細胞における一次活性化シグナル、T細胞受容体（TCR）成分のシグナル伝達ドメイン、および/または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含むシグナル伝達ドメインなどの、組換え受容体の細胞内シグナル伝達領域を通したシグナルに応答性である。いくつかの態様では、例示的なT細胞刺激関連遺伝子座には、PDCD1（PD-1をコードする）、CD69、Nur77（NR4A1をコードする）、FoxP3、またはHLA-DR遺伝子座が含まれるが、それらに限定されない。

また、組換え受容体またはその一部分を発現する改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を含有する、遺伝子操作された細胞を作製するための方法も提供される。提供される態様は、具体的には、組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列を、内在性T細胞刺激関連遺伝子座にターゲティングすることを含む。いくつかの状況では、提供される態様は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座での組換え受容体をコードする核酸配列の標的組み込みのために、遺伝子編集法および相同性指向修復（HDR）を用いて、標的遺伝子破壊、例えば、DNA切断の生成を誘導することを含む。また、本明細書で提供される操作された細胞の生成および/または本明細書で提供される方法における使用のための、関連した細胞組成物、核酸、およびキットも提供される。

T細胞ベースの治療法、例えば、養子T細胞療法（関心対象の疾患または障害に特異的な組換え受容体、操作された受容体、またはキメラ受容体、例えば、キメラ抗原受容体（CAR）、組換えT細胞受容体（TCR）、または他の組換え受容体、操作された受容体、もしくはキメラ受容体を発現する操作された細胞の投与を含むものを含む）は、がん、ならびに他の疾患および障害の処置において有効であり得る。ある特定の状況では、養子細胞療法用の操作された細胞を設計するためおよび生成するための他のアプローチは、常に完全に満足のいくものではない可能性がある。いくつかの局面では、組換え受容体を含む操作された細胞は、場合によっては、組換え受容体によって認識される抗原を発現する健常細胞を標的にし得る。場合によっては、組換え受容体発現細胞は、疾患細胞、例えば、腫瘍細胞と、抗原を発現する正常細胞とを区別することができない。いくつかの局面では、操作された細胞が、疾患細胞、例えば、標的抗原を発現する腫瘍細胞を標的にして除去した後、組換え受容体発現細胞の継続的な持続は、抗原を発現する健常細胞を標的にして、望ましくない効果を結果としてもたらす可能性がある。例えば、場合によっては、腫瘍クリアランス後の抗CD19 CAR発現細胞の継続的な持続は、CAR発現細胞によるCD19発現健常B細胞の攻撃により、B細胞形成不全を結果としてもたらす可能性がある。

いくつかの局面では、提供される態様は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座でのHDRによって、標的遺伝子破壊および組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子の組み込みを誘導することを含む。いくつかの局面では、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子は、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントに機能的に連結される。例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメント、例えばプロモーターによって調節される。いくつかの局面では、内在性転写制御エレメントは、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、例えば、組換え受容体をコードする、機能的に連結された導入遺伝子の発現を誘導するかまたは上方制御する。いくつかの局面では、内在性転写制御エレメントは、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在に続いて、例えば、組換え受容体をコードする、機能的に連結された導入遺伝子の発現を低減するかまたは下方制御する。したがって、組換え受容体の発現は、T細胞における刺激または活性化関連シグナルの存在に基づいて調節することができる。

いくつかの局面では、提供される態様は、T細胞刺激関連遺伝子座、例えば、PDCD1の調節下で発現される組換え受容体、例えばCARを含むT細胞が、刺激または活性化シグナルの際に一過性に誘導されるかまたは上方制御されるという観察に基づく。組換え受容体は、休止の期間後に、再刺激シグナルに応答して発現されることが観察された。例示的なT細胞刺激関連遺伝子産物の発現は、例えば、抗CD3抗体および抗CD28抗体を介して、最初の刺激シグナルの際に誘導され、これは、最初の刺激後のある期間において、低減されることが観察された。ある特定の期間後の再刺激に続いて、例示的なT細胞刺激関連遺伝子産物の発現は、低減後に増加した。提供される態様はまた、再刺激に続いて、T細胞刺激関連遺伝子座、例えばPDCD1の調節下で発現される組換え受容体、例えばCARが、再び誘導されるかまたは再び上方制御され、組換え受容体を発現するT細胞が、標的細胞を効率的に殺すことができるという観察に基づく。

いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座の転写制御エレメントの操作可能な調節下での遺伝子発現は、T細胞刺激または活性化シグナルに応答性である。そのような応答性は、組換え受容体の発現の制御を可能にし、組換え受容体発現細胞の機能に対するさらなる欠点を伴わずに、標的抗原を発現する健常細胞に対する望ましくない効果または組換え受容体発現細胞の望ましくない機能を最小限に抑えるのに役立つ。

場合によっては、T細胞刺激関連遺伝子座の完全に機能的なまたは改変されていない内在性遺伝子産物が、内在性遺伝子産物と組換え受容体とが共発現されるように、細胞において発現される。場合によっては、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性遺伝子産物は、発現されないか、またはノックアウトされる。

いくつかの局面では、操作された細胞は、細胞において内在性T細胞受容体をコードする遺伝子の遺伝子破壊をさらに含む。例えば、内在性T細胞受容体α定常領域（TRAC）遺伝子および/または内在性T細胞受容体β定常領域（TRBC）遺伝子が、T細胞において破壊される。いくつかの局面では、そのような破壊はまた、組換え受容体発現細胞内の抗原非依存性、緊張性シグナル伝達を阻止し、T細胞における内在性T細胞受容体の制御されない発現を最小限に抑える。いくつかの態様では、コードされる組換え受容体の抗原非依存性シグナル伝達は、ランダムに組み込まれた同じ組換え受容体をコードする導入遺伝子を含む操作された細胞と比較して、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、もしくはそれ以上よりも多く、または約10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、もしくはそれ以上よりも多く、低減される。

いくつかの局面では、提供される態様は、細胞における内在性T細胞受容体をコードする遺伝子の破壊が、T細胞刺激関連遺伝子座の転写制御エレメントの調節下での組換え受容体の発現と共に、組換え受容体の発現に対するフィードバックループを生成するという利点をもたらす。そのような場合に、T細胞の刺激または活性化は、例えば、組換え受容体による標的抗原の結合または認識によって、組換え受容体のシグナル伝達領域を通して伝えられるかまたは伝達される刺激シグナルにより調節されるかまたはそれに依存し、刺激または活性化シグナルは、抗原特異的シグナルの非存在下で低減されるかまたは排除される。いくつかの状況では、組換え受容体および組換え受容体を発現する細胞は、標的細胞が排除されるか、または標的細胞がもはや利用できなくなるまで、標的細胞に対するその細胞傷害性機能を保持する。いくつかの局面では、標的細胞、例えば、標的抗原を発現する疾患細胞の除去に続いて、組換え受容体発現細胞における刺激または活性化シグナルが低減され、細胞は、応答性が小さくなるかまたは非応答性になり、これは、健常な正常細胞集団が組換え受容体発現細胞によって影響を受けないことを可能にする。場合によっては、内在性T細胞受容体の発現の欠如は、組換え受容体発現細胞の望ましくない再活性化を阻止する。いくつかの態様では、提供される細胞、組成物、および方法は、特に腫瘍微小環境中の抗原を標的とするかまたはそれに特異的である細胞療法について、改善された細胞療法を結果としてもたらし得る。いくつかの状況では、提供される細胞、組成物、および方法はまた、細胞療法の細胞上の組換え受容体、例えばCARの発現の調節および制御において利点をもたらす。いくつかの局面では、提供される操作された細胞および方法は、組換え受容体発現細胞の洗練された時間的制御を可能にし、組換え受容体発現細胞の望ましくない抗原非依存性効果を最小限に抑える。場合によっては、提供される態様は、組換え受容体発現細胞の投与後に、健常細胞の回復を可能にする。

いくつかの状況では、本明細書で提供される操作された細胞において改変されたT細胞刺激関連遺伝子座からコードされる組換え受容体は、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性制御エレメント、例えば、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のプロモーター、または5'および/もしくは3'非翻訳領域（UTR）などの、シス制御エレメントの調節下でコードされ得る。いくつかの局面では、そのような態様は、組換え受容体、例えばCAR、もしくはその一部分が発現されることを可能にし、かつ/または発現は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座に類似した時間、持続期間、レベルで、および類似した発現カイネティクスで制御される。

いくつかの局面では、組換え受容体全体または完全長組換え受容体は、操作された細胞における改変されたT細胞刺激関連遺伝子座からコードされる。いくつかの局面では、組換え受容体の一部分、例えば、組換え受容体のドメインもしくは領域、または多数の鎖を含む組換え受容体（例えば、多鎖CARもしくは2つ以上の鎖を含む組換えの組換えT細胞受容体（TCR））の1つもしくは複数の鎖は、操作された細胞における改変されたT細胞刺激関連遺伝子座からコードされる。いくつかの局面では、残りの部分（例えば、組換え受容体の別の鎖または別のドメイン）は、操作された細胞中に存在する第2の導入遺伝子によってコードされる。

いくつかの状況において、操作された細胞の最適な効力は、投与された細胞が、免疫細胞および/または治療用細胞組成物中の細胞の集団などの細胞の間の受容体の均一な、同質の、一貫した、かつ/または制御された発現を含み、組換え受容体を発現する能力、ならびに組換え受容体が、対象、腫瘍、およびその環境内で、標的、例えば標的抗原を認識して結合する能力に依存し得る。場合によっては、CARなどの組換え受容体を細胞中に導入するために利用可能な方法は、組換え受容体をコードする配列のランダム組み込みによる。ある特定の観点において、そのような方法は、完全に満足のいくものではない。いくつかの局面において、ランダム組み込みは、細胞の機能および活性に重要であり得るものを含み、可能な挿入性変異誘発および/または細胞中のもう1つの遺伝子座の遺伝子破壊を結果としてもたらし得る。場合によっては、細胞のゲノム中への受容体をコードする導入遺伝子のセミランダムなまたはランダムな組み込みは、場合によって、ゲノムにおける望ましくない場所中への、例えば、不可欠な遺伝子または細胞の活性の制御において重要な遺伝子中への核酸配列の組み込みによる、有害なかつ/または不要な効果を結果としてもたらす可能性がある。

場合によっては、ランダム組み込みは、組換え受容体をコードする配列の変動する組み込みを結果としてもたらす可能性があり、これは、治療用細胞組成物などの細胞組成物の細胞内の、一貫していないまたは制御されていない発現、変動する核酸のコピー数、および/または受容体発現の変動性を結果としてもたらし得る。場合によっては、受容体をコードする核酸配列のランダム組み込みは、組み込みの部位および/または核酸配列のコピー数に依存して、異型の、異質の、不均一な、制御されていない、かつ/または最適に満たない発現または抗原結合、発がん性形質転換、および核酸配列の転写サイレンシングを結果としてもたらし得る。いくつかの局面において、細胞集団における異質のかつ不均一な発現は、発現および/もしくは組換え受容体による抗原結合の不一致もしくは不安定性、操作された細胞の機能の予測不能性もしくは機能の低減、ならびに/または不均一な薬物製品をもたらし、それによって、操作された細胞の効力を低減させ得る。いくつかの局面において、ある特定のレンチウイルスベクターなどの特定のランダム組み込みベクターの使用は、操作された細胞が複製可能ウイルスを含有しないという確認を必要とする。核酸のランダム組み込みおよび/または集団における異質の発現を最小限に抑えながら、組換え受容体の一貫した発現レベルおよび機能を達成するために、改善された戦略が必要である。

いくつかの状況において、提供される態様は、相同性指向修復（HDR）によって、細胞、例えばT細胞の内在性T細胞刺激関連遺伝子座中に組み込まれる組換え受容体をコードする核酸を有するように、細胞を操作することに関する。いくつかの局面において、HDRは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座などの標的部位でまたはその近くで、導入遺伝子（例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子）の部位特異的組み込みを媒介することができる。いくつかの態様において、（例えば、内在性T細胞刺激関連遺伝子座での）遺伝子破壊および（例えば、遺伝子破壊の周囲の核酸配列相同配列を含有する）1つまたは複数の相同性アームを含有する鋳型ポリヌクレオチドの存在は、HDRを誘導するかまたは導くことができ、相同配列が、DNA修復のための鋳型として作用する。遺伝子破壊の周囲の内在性遺伝子配列と、鋳型ポリヌクレオチドに含まれる相同性アームとの間の相同性に基づいて、細胞のDNA修復機構は、鋳型ポリヌクレオチドを用いて、遺伝子破壊の部位でDNA切断を修復し、かつ遺伝情報を再合成し、それによって、遺伝子破壊の部位でまたはその近くで、相同性アーム間の配列（例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子）を効果的に挿入するか、または組み込むことができる。提供される態様は、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子が、HDRによって内在性T細胞刺激関連遺伝子座中に組み込まれている、組換え受容体またはその一部分をコードする改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を含有する細胞を生成することができる。

いくつかの局面において、提供される態様は、組換え受容体をコードする核酸の細胞中への改善された、かつ/またはより効率的なターゲティングを伴う、操作された細胞の作製における利点をもたらし、かつ、操作された細胞の改善された活性および/もしくは機能を結果としてもたらし得る。場合によっては、提供される態様は、可能なセミランダムもしくはランダムな組み込みおよび/または異質の、制御されていない、もしくは異型の発現を最小限に抑え、かつ、組換え受容体の改善された、均一の、同質の、一貫した、制御された、および/もしくは安定した発現、または挿入性変異誘発の可能性が低減している、低い、もしくはないことを結果としてもたらす。

いくつかの局面において、組換え受容体、例えば、TCRまたはCARを発現する遺伝子操作された免疫細胞を作製する他の方法と比較して、提供される態様は、組換え受容体のより安定な、生理学的な、調節可能な、制御された、均一な、一貫した、および/もしくは同質の発現を可能にする。場合によっては、方法は、より一貫し、かつより予測可能な薬物製品、例えば、操作された細胞を含有する細胞組成物の生成を結果としてもたらし、これは、処置される患者のためのより安全な治療法を結果としてもたらし得る。いくつかの局面において、提供される態様はまた、関心対象の単一の遺伝子座または複数の遺伝子座での、予測可能なかつ一貫した組み込みも可能にする。いくつかの態様において、提供される態様はまた、集団の細胞において組み込まれる核酸のコピー数が一貫した（典型的には、1または2）細胞集団を生成することも結果としてもたらすことができ、これは、いくつかの局面において、細胞集団内での組換え受容体発現および内在性受容体遺伝子の発現における一貫性を提供する。場合によっては、提供される態様は、組み込みのためのウイルスベクターの使用を含まず、したがって、操作された細胞が複製可能ウイルスを含有しないことの確認の必要を低減させ、それによって、細胞組成物の安全性を改善することができる。

また、操作された細胞を操作する、調製する、および作製するための方法、ならびに操作された細胞を生成するかまたは作製するためのキットおよびデバイスも提供される。また、方法によって生成された細胞および細胞組成物も提供される。また、組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列を含有するポリヌクレオチド、例えば、直鎖状ポリヌクレオチド、および、そのようなポリヌクレオチドを、例えば、形質導入によってまたは物理的送達、例えば電気穿孔によって、細胞中に導入するための方法が提供される。また、操作された細胞を含有する組成物、ならびに、例えば養子細胞療法のために、細胞および組成物を対象に投与するための方法、キット、およびデバイスも提供される。いくつかの局面において、細胞は、ある対象から単離され、操作されて、同じ対象に投与される。他の局面において、細胞は、1つの対象から単離され、操作されて、別の対象に投与される。いくつかの態様において、提供されるポリヌクレオチド、導入遺伝子、および/またはベクターは、免疫細胞中に送達された時に、T細胞活性を調節することができ、場合によってはT細胞の分化または恒常性を調節することができる、組換え受容体、例えば、TCRまたはCARの発現を結果としてもたらす。結果として生じる遺伝子操作された細胞または細胞組成物は、養子細胞療法の方法において用いることができる。

本出願において言及される特許文書、科学論文、およびデータベースを含むすべての刊行物は、あたかも各個々の刊行物が参照により個別に組み入れられるのと同じ程度に、すべての目的でその全体が参照により組み入れられる。本明細書において示される定義が、参照により本明細書に組み入れられる特許、出願、公開出願、および他の刊行物において示される定義と相反するか、または別のように一貫しない場合は、本明細書において示される定義が、参照により本明細書に組み入れられる定義よりも優先される。

本明細書において用いられるセクションの見出しは、組織化の目的だけのものであり、記載される主題を限定すると解釈されるべきではない。

I. 組換え受容体を条件付きで発現する細胞
T細胞刺激関連遺伝子座などのゲノム遺伝子座に存在する、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含有する、操作されたT細胞などの操作された免疫細胞が、本明細書において提供される。いくつかの態様では、操作された細胞は、組換え受容体（例えば、キメラ抗原受容体もしくは組換えT細胞受容体）またはその一部分をコードする核酸配列を含有する導入遺伝子（すなわち、異種または外来性の核酸配列）を含む、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座、例えば、PDCD1、CD69、Nur77、FoxP3、またはHLA-DR遺伝子座を含有する。いくつかの局面では、組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列は、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性制御エレメントの操作可能な調節下にある。いくつかの態様では、内在性転写制御エレメントは、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする、機能的に連結された導入遺伝子の発現を誘導するかまたは上方制御し、例えば、一過性に誘導するかまたは上方制御する。いくつかの状況では、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を含む提供される細胞において、コードされる組換え受容体またはその一部分の発現は、改変されていない細胞におけるT細胞刺激関連遺伝子座の内在性遺伝子産物の発現に類似しているか、またはそれを模倣する。いくつかの局面では、コードされる組換え受容体またはその一部分の発現の時間的制御およびレベルおよびカイネティクスは、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性遺伝子産物のものに類似している。例えば、いくつかの局面では、コードされる組換え受容体は、T細胞における刺激または活性化シグナルに続いて、一過性に誘導されるかまたは上方制御され、そのようなシグナルの非存在下では、低減されるかまたは下方制御される。いくつかの局面では、提供される態様は、コードされる組換え受容体の発現の洗練されたかつ条件付き制御を可能にする。

T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントに機能的に連結された組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を含む、操作されたT細胞であって、該内在性転写制御エレメントが、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、機能的に連結された導入遺伝子の発現を誘導するかまたは上方制御する操作されたT細胞が、本明細書において提供される。いくつかの態様では、内在性転写制御エレメントは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のプロモーターである。いくつかの局面では、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子は、プロモーターの下流に存在する。

また、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントに機能的に連結された組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列を含む、操作されたT細胞などの操作された細胞も提供される。いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントは、T細胞における刺激または活性化シグナルに応答して、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、機能的に連結された核酸配列の発現を誘導するかまたは上方制御する。いくつかの局面では、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の転写制御エレメントは、T細胞における刺激または活性化シグナルに応答性である。

また、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の転写制御エレメントに機能的に連結された組換え受容体またはその一部分をコードする核酸を含む、操作されたT細胞であって、該T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントが、T細胞における刺激または活性化シグナルに応答して、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、機能的に連結された核酸配列の発現を誘導するかまたは上方制御する操作されたT細胞も、提供される。また、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の転写制御エレメントに機能的に連結された組換え受容体またはその一部分をコードする核酸を含む、操作されたT細胞であって、該内在性T細胞刺激関連遺伝子座の転写制御エレメントが、T細胞における刺激または活性化シグナルに応答性である操作されたT細胞も、提供される。

いくつかの態様では、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞における刺激または活性化シグナルの後に一過性である。いくつかの局面では、発現は、発現の上方制御もしくは誘導に続いて、さらなる刺激もしくは活性化の非存在下で、またはT細胞におけるシミュレーションもしくは活性化シグナルの低減もしくは非存在に続いて、低減されるかまたは下方制御される。いくつかの態様では、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、シグナルの低減または非存在の後に、T細胞におけるさらなるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、再び誘導されるかまたは上方制御されることができる。

A. 刺激または活性化に関連した遺伝子座および遺伝子発現
いくつかの局面では、組換え受容体を条件付きで発現する操作された細胞が提供される。いくつかの態様では、操作された細胞は、組換え受容体をコードする、導入遺伝子または異種配列などの核酸配列を含有する。いくつかの局面では、組換え受容体をコードする導入遺伝子は、例えば、操作された細胞または環境における特定の条件またはシグナルの存在下で、条件付きで発現される。いくつかの局面では、操作された細胞または環境における特定の条件またはシグナルの非存在下で、組換え受容体が発現されないか、または発現が低減される。いくつかの局面では、組換え受容体の発現は、PDCD1（PD-1をコードする）、CD69、Nur77（NR4A1をコードする）、FoxP3、またはHLA-DR遺伝子座などの、T細胞刺激関連遺伝子座の転写制御エレメントによって調節される。いくつかの局面では、操作された細胞は、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を含有する。いくつかの局面では、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子は、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントに機能的に連結され、該内在性転写制御エレメントは、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、機能的に連結された導入遺伝子の発現を誘導するかまたは上方制御する。いずれかの態様のいくつかでは、内在性転写制御エレメントは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のプロモーターである。

いくつかの局面では、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントの調節下での、T細胞刺激関連遺伝子座からの発現は、操作された細胞、例えば操作されたT細胞における刺激または活性化シグナルの存在に続いて、誘導されるかまたは上方制御される。いくつかの局面では、刺激または活性化シグナルは、T細胞受容体（TCR）成分のシグナル伝達ドメインを通したシグナル、および/または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含むシグナル伝達ドメインを通したシグナルを含む。例えば、いくつかの局面では、コードされる組換え受容体、例えば、CARまたはTCRのライゲーションからのシグナルは、T細胞刺激関連遺伝子座からの発現を誘導する活性化または刺激シグナルを提供することができる。いくつかの局面では、ITAMなどのモチーフを含有するシグナル伝達ドメインを含有する受容体のライゲーションからのシグナルは、T細胞刺激関連遺伝子座からの発現を誘導する活性化または刺激シグナルを提供することができる。

いくつかの態様では、操作されたT細胞におけるT細胞刺激または活性化シグナルの存在は、コードされる組換え受容体の発現を誘導することができ、かつコードされる組換え受容体のさらなる誘導、発現、または上方制御を結果としてもたらすことができる。いくつかの局面では、コードされる組換え受容体の発現のそのような条件付き制御は、操作されたT細胞における刺激または活性化シグナルに続いて、組換え受容体の発現の増加または増幅を可能にすることができる、正のフィードバックループ、またはフィードフォワードループを結果としてもたらすことができる。いくつかの態様では、組換え受容体の細胞外結合ドメインに対する作用物質の結合は、細胞における刺激または活性化シグナルの誘導または伝達を結果としてもたらす。いくつかの態様では、T細胞における刺激または活性化シグナルは、組換え受容体の細胞外結合ドメインに対する作用物質の結合の際に、組換え受容体の細胞内シグナル伝達領域を通して伝達される。

いくつかの局面では、機能的に連結された導入遺伝子、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントに機能的に連結された組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子の発現は、T細胞における刺激または活性化シグナルに続いて、6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内にまたは約6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内に、上方制御されるかまたは誘導される。いくつかの態様では、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞における刺激または活性化シグナルに続いて、24時間未満以内にまたは約24時間未満以内に、上方制御されるかまたは誘導される。いくつかの態様では、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも多く、または約30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも多く、上方制御されるかまたは誘導される。いくつかの局面では、上方制御または誘導は、T細胞における刺激もしくは活性化シグナルの前の、もしくはその非存在下での、機能的に連結された導入遺伝子の発現、またはT細胞における刺激もしくは活性化シグナルの前の、機能的に連結された導入遺伝子の最小発現と比較される。

いくつかの局面では、発現の誘導または上方制御は、T細胞における刺激または活性化シグナルの存在下で、繰り返し調節可能である。いくつかの局面では、そのような調節された発現は、組換え受容体、例えばCARが、T細胞が活性化されている環境において、例えば、CARによって認識される抗原が存在する部位においてのみ、高レベルで発現されることを保証する。いくつかの局面では、例えば、腫瘍の細胞溶解性殺傷後に起こり得るような抗原の消失によって、活性化または刺激シグナルが終了すると、CARの発現は、下方制御されるかまたは低減される。いくつかの態様では、導入遺伝子の発現の誘導または上方制御は、刺激または活性化シグナルの期間にわたって一過性であり、次いで、低減されるかまたは下方制御される。

いくつかの態様では、T細胞における刺激または活性化シグナル、例えば、T細胞における最初の刺激または活性化シグナル（例えば、組換え受容体を介した）、およびその後の機能的に連結された導入遺伝子（例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする）の発現の上方制御または誘導の後に、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、低減されるかまたは下方制御される。いくつかの態様では、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、発現の上方制御もしくは誘導に続いて、またはT細胞におけるシミュレーションもしくは活性化シグナルの低減もしくは非存在に続いて、低減されるかまたは下方制御される。

いくつかの態様では、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞における刺激または活性化シグナル（例えば、最初の刺激または活性化シグナル）に続いて、発現の上方制御または誘導のある特定の期間の後に、低減されるかまたは下方制御される。いくつかの態様では、T細胞における刺激または活性化シグナルは、T細胞における最初の刺激または活性化シグナルであり、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞における最初の刺激または活性化シグナルの、1、2、3、4、5、6、7、もしくは8日、もしくはそれ以上後にまたは約1、2、3、4、5、6、7、もしくは8日、もしくはそれ以上後に、低減されるかまたは下方制御される。いくつかの態様では、T細胞における刺激または活性化シグナルに続く発現の上方制御または誘導に続いて、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞における最初の刺激または活性化シグナルの、1、2、3、4、5、6、7、もしくは8日、もしくはそれ以上後にまたは約1、2、3、4、5、6、7、もしくは8日、もしくはそれ以上後に、低減されるかまたは下方制御される。いくつかの態様では、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞における最初の刺激または活性化シグナルの、2、3、もしくは4日、もしくはそれ以上後にまたは約2、3、もしくは4日、もしくはそれ以上後に、低減されるかまたは下方制御される。いくつかの態様では、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞における最初の刺激または活性化シグナルの後、2日後にまたは約2日後に、低減されるかまたは下方制御される。

いくつかの態様では、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在に続いて、例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、低減されるかまたは下方制御される。いくつかの態様では、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在に続いて、6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内にまたは約6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内に、低減されるかまたは下方制御される。いくつかの態様では、T細胞における刺激もしくは活性化シグナルの後に、またはT細胞におけるシミュレーションもしくは活性化シグナルの低減もしくは非存在に続いて、例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも多く、または約30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも多く、低減される。いくつかの局面では、低減は、例えば、T細胞における最初の刺激または活性化シグナルに続いて、機能的に連結された導入遺伝子の最大発現と比較される。いくつかの局面では、低減は、例えば、T細胞における最初の刺激または活性化シグナルに続いて、機能的に連結された導入遺伝子の最大発現と比較される。

いくつかの局面では、コードされる組換え受容体の発現のそのような条件付き制御は、刺激または活性化シグナルの非存在下で、例えば、標的抗原または標的細胞の非存在下で、コードされる組換え受容体の発現を限定するかまたは阻止することができる、フィードバックループを結果としてもたらすことができる。そのような条件付き制御は、操作された細胞の非特異的な活性化または標的抗原の非存在下での操作された細胞の活性化を低減させることができる。いくつかの局面では、標的細胞、例えば、標的抗原を発現する悪性細胞または腫瘍細胞の除去に続いて、操作されたT細胞は、より少ない組換え受容体を発現して、反応性がより低くなることができ、これが、健常細胞集団が回復することを可能にし、操作された細胞の非特異的な活性化または刺激を低減させる。

いくつかの態様では、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、シグナルの低減または非存在の後に、T細胞におけるさらなるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、再び誘導されるかまたは上方制御されることができる。いくつかの態様では、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、シグナルの低減または非存在の後に、T細胞におけるさらなるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内にまたは約6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内に、上方制御されるかまたは誘導される。いくつかの態様では、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、シグナルの低減または非存在の後に、T細胞におけるさらなるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、24時間未満以内にまたは約24時間未満以内に、上方制御されるかまたは誘導される。いくつかの態様では、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも多く、または約30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも多く、上方制御されるかまたは誘導される。いくつかの局面では、上方制御または誘導は、T細胞におけるさらなる刺激または活性化シグナルの前の、またはその非存在下での、機能的に連結される導入遺伝子の発現、T細胞におけるさらなる刺激または活性化シグナルの前の、機能的に連結された導入遺伝子の最小発現と比較される。いくつかの態様では、T細胞におけるさらなるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、組換え受容体の発現の平均レベルは、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、もしくはそれ以上よりも多く、または約40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、もしくはそれ以上よりも多く、増加される。

いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座は、T細胞上で一過性に上方制御されるかまたは誘導される分子をコードする。いくつかの態様では、例示的なT細胞刺激関連遺伝子座には、PDCD1（PD-1をコードする）、CD69、Nur77（NR4A1をコードする）、FoxP3、またはHLA-DR遺伝子座が含まれる。いくつかの局面では、導入遺伝子（例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする）は、内在性PDCD1（PD-1をコードする）、CD69、Nur77（NR4A1をコードする）、FoxP3、またはHLA-DR遺伝子座の、プロモーターなどの転写制御エレメントに機能的に連結される。いくつかの態様では、導入遺伝子（例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする）は、内在性PDCD1（PD-1をコードする）、CD69、Nur77（NR4A1をコードする）、FoxP3、またはHLA-DR遺伝子座にまたはその近くに組み込まれる。いくつかの局面では、導入遺伝子は、T細胞刺激関連遺伝子座のプロモーターに機能的に連結され、かつその下流に組み込まれる。いくつかの局面では、導入遺伝子は、内在性PDCD1プロモーターに機能的に連結され、かつその下流に組み込まれる。いくつかの局面では、導入遺伝子は、内在性CD69プロモーターに機能的に連結され、かつその下流に組み込まれる。いくつかの局面では、導入遺伝子は、内在性Nur77プロモーターに機能的に連結され、かつその下流に組み込まれる。いくつかの局面では、導入遺伝子は、内在性FoxP3プロモーターに機能的に連結され、かつその下流に組み込まれる。いくつかの局面では、導入遺伝子は、内在性HLA-DRプロモーターに機能的に連結され、かつその下流に組み込まれる。

いくつかの態様では、例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする、導入遺伝子は、T細胞刺激関連遺伝子座に関連し、その操作可能な調節下にあり、かつ/またはそれによって制御される。いくつかの態様では、組換え受容体は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の操作可能な調節下の核酸配列によってコードされる。いくつかの局面では、例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする、導入遺伝子の発現は、細胞内シグナル伝達領域を通したシグナルの品質および/もしくは強度、ならびに/または標的抗原もしくはエピトープに対する組換え受容体の結合および/もしくは認識に応答性である、制御エレメントによって制御される。いくつかの態様では、「T細胞刺激関連遺伝子座」は、T細胞のTCR複合体の成分、またはTCR複合体の成分もしくはその一部分を含む細胞内シグナル伝達領域を含む組換え受容体を通して伝達されるシグナル、および/またはT細胞上に存在するかもしくは発現している受容体、例えば、T細胞受容体（TCR）もしくは組換え受容体による抗原もしくはエピトープ結合に応答性である、内在性遺伝子座である。いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座は、T細胞の正常な下流シグナル伝達経路の一部である標準因子によって制御され得る。いくつかの態様では、抗原もしくはエピトープ結合、および/または組換え受容体、例えば、CARもしくはTCRの細胞内シグナル伝達領域を通したシグナルもしくは活性は、例えば、組換え受容体をコードする、導入遺伝子を発現するようにT細胞刺激関連遺伝子座を誘導する、シグナル伝達を誘導する。内在性遺伝子産物および/または導入遺伝子の検出可能な発現は、次いで、T細胞活性化の指標としてモニターされ得る。

いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座は、1つまたは複数の転写調節エレメントなどの1つまたは複数の制御エレメントを含有し、その発現は、TCR複合体の成分の活性化に依存するか、またはそれに関連し、それにより、制御ドメインまたはエレメントは、転写因子によって認識されて、そのような遺伝子の発現を駆動する。いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座は、転写因子によって認識されて、その活性が通常、T細胞刺激または活性化によってオンになるかまたは活性化される遺伝子の発現を駆動する、プロモーター、エンハンサー、もしくは他の応答エレメント、またはその一部分を含有する。いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座は、その活性が、T細胞刺激または活性化によってオンになる転写因子の制御ドメインまたは領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、または他の応答エレメント）を含有することができる。いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座は、細胞内シグナル伝達領域を通したシグナルの品質および/もしくは強度、ならびに/または標的抗原、リガンド、もしくはエピトープに対する組換え受容体の結合および/もしくは認識のうちの1つまたは複数に応答性である。いくつかの態様では、制御エレメントは、抗原もしくはエピトープに結合する内在性TCRの状態、T細胞刺激もしくは活性化、TCRを通したシグナル強度、および/または内在性TCRの細胞内シグナル伝達領域を通したシグナル伝達の品質のうちの1つまたは複数に応答性である。

いくつかの態様では、内在性T細胞刺激関連遺伝子座は、T細胞転写因子に対する1つまたは複数の結合部位を含有する、およびそれによりT細胞転写因子の下流活性に関連する、1つまたは複数の制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、または応答エレメントなどの転写制御エレメントを含有する。いくつかの態様では、転写因子は、活性化T細胞核因子（NFAT）、C/EBP、STAT1、STAT2、またはNF-κBである。いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座は、活性化T細胞核因子（NFAT）、C/EBP、STAT1、STAT2、またはNF-κBによって認識される、1つまたは複数の応答エレメントを含有する。いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座は、1つまたは2つの、および場合によっては3つ以上の、特有の転写因子によって認識されるかまたはそれに応答性である、1つまたは複数の制御エレメントを含有することができる。

いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座は、内在性TCR複合体を通したT細胞の刺激の際に活性化される転写因子によって認識される、1つまたは複数の応答エレメントを含む。いくつかの態様では、遺伝子の制御領域は、細胞において1つよりも多いシグナル伝達経路に応答性であることができる、多数の制御エレメントを含有する。いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座は、NFATによって認識される、1つまたは複数の制御エレメントを含有する。いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座は、NF-κBによって認識される、1つまたは複数の制御エレメントを含有する。

いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座は、NFAT活性および/またはNFAT制御シグナル伝達に関連している。転写因子のNFATファミリーは、サイトカイン遺伝子、およびT細胞活性化への応答を含む、免疫応答に関与する他の遺伝子の転写制御において役割を果たす。いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座は、結合部位を含有する、かつ/またはNFATによって認識される、および、それに機能的に接続された、例えば、組換え受容体をコードする、導入遺伝子の発現を駆動することができる、プロモーター、エンハンサー、または応答エレメントなどの制御エレメントを含有する。

いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座は、NF-κBの活性および/またはNF-κB媒介性シグナル伝達に関連している。NF-κBの活性化は、TCRの刺激（すなわち、CD3シグナル伝達を介した）およびCD28を介した共刺激に依存し、CD3およびCD28の両方のライゲーションによって制御され得る。CD28またはCD3シグナル伝達は、NF-κB転写を誘導することができるが、CD28のTCRシグナル伝達（すなわち、CD3シグナル伝達）との共ライゲーションは、より大きい転写活性を生じ得る（Thaker et al. (2015) Immunology Letters, 163:113-119）。いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座は、1つもしくは複数の結合部位を含有する、かつ/またはNF-κBによって認識される、および、それに機能的に接続された、例えば、組換え受容体をコードする、導入遺伝子の発現を駆動することができる、プロモーター、エンハンサー、または応答エレメントなどの転写制御エレメントであることができる。場合によっては、NF-κBシグナル伝達に応答性の制御エレメントを含有するT細胞刺激関連遺伝子座は、T細胞シグナル伝達の品質、ならびにTCR媒介性シグナル伝達および共刺激シグナル伝達両方の存在の指標であることができる。

いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座の制御エレメントによって制御される発現は、T細胞シグナル伝達に依存し、その際に誘導され、かつ/またはその際に上方制御される。例えば、制御ドメインまたはエレメントは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のプロモーターまたはその一部分であることができる。いくつかの態様では、プロモーターまたはその一部分は、結合部位を含有することができ、かつ/または1つもしくは複数の転写因子によって認識されることができる。

いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座は、その発現がT細胞シグナル伝達または活性化によって誘導され得る遺伝子である、T細胞転写因子の発現を制御する内在性遺伝子座であるかまたはその一部である、プロモーターまたはエンハンサーまたは他の応答エレメントなどの転写制御エレメントを含有する。いくつかの態様では、転写因子は、活性化T細胞核因子（NFAT）、神経成長因子IB（Nur77、NR4A1としても知られている）、C/EBP、STAT1、STAT2、およびNFκBである。

いくつかの態様では、組換え受容体は、TCR複合体などの抗原受容体を通したシグナルの品質および/または強度に応答性である制御エレメントなどの、T細胞刺激関連遺伝子座の操作可能な調節下の核酸配列によってコードされる。いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座は、組換え受容体（内在性T細胞刺激関連遺伝子座に機能的に連結された受容体など）の細胞内シグナル伝達領域を通したシグナルの品質および/もしくは強度に応答性であり、かつ/またはその標的抗原もしくはエピトープに対する結合および/もしくは認識に応答する。

提供される態様のいずれかのいくつかでは、T細胞刺激関連遺伝子座は、PDCD1である。いくつかの態様では、提供される操作された細胞は、PDCD1の内在性転写制御エレメントに機能的に連結された、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む、改変されたPDCD1遺伝子座を含む。PDCD1は、中枢および末梢の免疫寛容および免疫消耗の媒介物質である、阻害性受容体プログラム細胞死-1（PD-1、PDCD1；CD279；PD-1；PD1；SLEB2；hPD-1；hPD-l；またはhSLE1としても知られている）をコードする。いくつかの局面では、CD8 T細胞上のPD-1発現は、T細胞受容体（TCR）を通したシグナルの存在および/または強度と相関する。いくつかの局面では、TCR刺激は、カルシニューリン経路を通してシグナル伝達カスケードを開始し、転写因子NFATc1（NFAT2としても知られている）の活性化および転位を結果としてもたらす。いくつかの局面では、NFATc1は、CD4 T細胞およびCD8 T細胞におけるPD-1の初期活性化により誘導される発現に関与し、他の制御機構もまた、慢性抗原曝露の発現の維持および強化に関与する（例えば、Bally et al., J Immunol (2016) 196 (6) 2431-2437；Simon et al., Oncoimmunology. 2018; 7(1): e1364828；Arasanz et al., Oncotarget. 2017 Aug 1; 8(31): 51936-51945を参照されたい）。

提供される態様のいずれかのいくつかでは、T細胞刺激関連遺伝子座は、CD69である。いくつかの態様では、提供される操作された細胞は、CD69の内在性転写制御エレメントに機能的に連結された、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む、改変されたCD69遺伝子座を含む。CD69は、膜貫通C型レクチンタンパク質である分化抗原群（Cluster of Differentiation）69（CD69、AIM；BL-AC/P26；CLEC2C；EA1；GP32/28；またはMLR-3としても知られている）をコードする。CD69は、T細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、樹状細胞（DC）、および他の免疫細胞において発現している初期活性化マーカーである。CD69は、リンパ球活性化中に獲得される初期誘導性の細胞表面糖タンパク質であり、リンパ球の増殖に関与し、かつナチュラルキラー（NK）細胞を含むリンパ球および血小板においてシグナル伝達受容体として機能する。CD69の発現は、TCR/CD3の結合後にTリンパ球の表面上で、急速に誘導され、例えば、活性化後早期（30～60分）に検出され、サイトカインおよびポリクローナルの分裂促進刺激を活性化する。CD69遺伝子の転写発現は、4～6時間後に急速に低下する。CD69タンパク質の発現は、早くも刺激2～3時間後に検出することができる（例えば、Alari-Pahissa et al., PLoS One. 2012; 7(10): e48593；Cibrian et al., Eur J Immunol. 2017 Jun; 47(6): 946-953を参照されたい）。

提供される態様のいずれかのいくつかでは、T細胞刺激関連遺伝子座は、Nur77である。いくつかの態様では、提供される操作された細胞は、Nur77の内在性転写制御エレメントに機能的に連結された、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む、改変されたNur77遺伝子座を含む。Nur77は、細胞内転写因子のNur核内受容体ファミリーのメンバーである、神経成長因子IB（NGFIB：Nr4a1、神経成長因子IB（NGFIB）、GFRP1；Gfrp；HMR；Hbr-1；Hbr1；Hmr；N10；NAK-1；NGFI-B；NGFIB；NP10；Ngfi-b；オーファン核内受容体HMR；ST-59；TIS1；TR3；TR3オーファン受容体；初期応答タンパク質NAK1；成長因子誘導性核タンパク質N10；ホルモン受容体；最初期遺伝子転写因子NGFI-B；神経成長因子IB核内受容体バリアント1；神経成長因子誘導タンパク質I-B；神経成長因子-誘導タンパク質I-B；神経オーファン核内受容体NUR77；nhr-6；nr4a1；核内ホルモン受容体NUR/77；核タンパク質N10；核内受容体サブファミリー4グループAメンバー1；オーファン核内受容体NGFI-B；オーファン核内受容体NR4A1；オーファン核内受容体TR3；ステロイド受容体TR3；精巣受容体3；またはzgc:92434としても知られている）をコードする。いくつかの状況では、Nur77の発現は、T細胞における一次活性化シグナル、T細胞受容体（TCR）成分のシグナル伝達ドメイン、および/または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含むシグナル伝達ドメインからのシグナルに感受性である。いくつかの状況では、Nur77の発現は、シグナル伝達領域を通したシグナルに対して用量応答性である。

Nur77は、TCR刺激後数時間以内にT細胞において発現される、最初期応答遺伝子であり、ヒトリンパ球におけるフィトヘマグルチニンによって、および停止した線維芽細胞の血清刺激によって、誘導され得る。Nur77は、内在性TCR複合体、内在性TCRの結合を通したシグナル伝達、もしくはそれからのシグナルの活性化に応答して、かつ/またはTCR複合体、例えば、CD3-ゼータシグナル伝達領域からのシグナルに関与する免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含有する分子を介して、誘導される。Nur77遺伝子産物自体は、一般に、いくつかの遺伝子のプロモーターに関連する制御エレメントに結合して、遺伝子の下流発現を誘導することができる。Nur77の発現のレベルまたは程度は、T細胞シグナル、例えば、TCRシグナルの強度についての指標として働き得る（Moran et al. (2011) JEM, 208:1279-1289）。したがって、いくつかの態様では、Nur77遺伝子座の1つまたは複数の転写制御エレメント、またはその一部分に機能的に接続されたレポーター分子の発現は、T細胞シグナル伝達の強度の指標を提供し得る。さらに、Nur77の発現は、一般に、細胞外因性様式で作用する場合があり、かつ組換え受容体を通したシグナル伝達には依存しない場合がある、サイトカインシグナル伝達またはtoll様受容体（TLR）シグナル伝達などの他のシグナル伝達経路（例えば、Ashouri et al., (2017) J. Immunol. 198:657-668を参照されたい）によっては、影響を受けないかまたは左右されない。

提供される態様のいずれかのいくつかでは、T細胞刺激関連遺伝子座は、FOXP3である。いくつかの態様では、提供される操作された細胞は、FOXP3の内在性転写制御エレメントに機能的に連結された、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む、改変されたFOXP3遺伝子座を含む。FOXP3遺伝子は、場合によっては、制御性T細胞の発生および機能における制御経路の制御因子と考えられる、免疫系応答に関与するタンパク質である、フォークヘッドボックスP3（Foxp3；スカーフィン（scurfin）、AIID、DIETER、IPEX、JM2、PIDX、XPIDとしても知られている）をコードする。FoxP3の発現は、刺激または活性化に続いて、活性化された非抑制性T細胞またはサプレッサーT細胞においてを含み、T細胞によって誘導される。発現は、CD8+CD25+ T細胞において一過性であるが、場合によっては、例えば、CD4+CD25+制御性T細胞においては、発現はより安定であり得る（例えば、Kmieciak et al., J Transl Med. 2009; 7: 89；Wang et al., Eur J Immunol. 2007 Jan; 37(1):129-38；Yu et al., Oncol Lett. 2018 Jun; 15(6): 8187-8194を参照されたい）。

提供される態様のいずれかのいくつかでは、T細胞刺激関連遺伝子座は、HLA-DR遺伝子座である。いくつかの態様では、提供される操作された細胞は、HLA-DR遺伝子座の内在性転写制御エレメントに機能的に連結された、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む、改変されたHLA-DR遺伝子座を含む。HLA-DRは、Bリンパ球、単球、およびマクロファージの表面上に構成的に発現しており、T細胞およびNK細胞上に活性化の後期に現れる、ヒトクラスII主要組織適合抗原複合体（MHC）抗原である。いくつかの局面では、HLA-DRは、後期活性化マーカーである（例えば、Bajnok et al., Mediators of Inflammation (2017) Article ID 8045161；Revenfeld et al., Int J Mol Sci. 2017 Jul; 18(7): 1603；Reddy et al., J. Immun. Methods. 2004, 293(1-2): 127-142を参照されたい）。HLA-DRは、6番染色体領域6p21.31上のヒト白血球抗原複合体によってコードされる、MHCクラスII細胞表面受容体である。HLA-DRは、いくつかの遺伝子座、および各遺伝子座での異なる機能のいくつかの遺伝子によってコードされる。DRα鎖は、HLA-DRA遺伝子座によってコードされる。DRβ鎖は、HLA-DRB1～HLA-DRB9を含む、いくつかの異なる遺伝子座によってコードされ、そのいくつかのみが、各個体に存在する。HLA-DRB1遺伝子座は、遍在しており、非常に多数の機能的に可変の遺伝子産物（HLA-DR1～HLA-DR17）をコードする（例えば、Marsh et al., Tissue Antigens. 2010 Apr; 75(4): 291-455を参照されたい）。

いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座、および/または、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座に機能的に連結された、導入遺伝子の発現のレベル、量、パターン、およびタイミングは、T細胞刺激または活性化シグナルの存在下で、遺伝子発現を評価するアッセイを使用することによって決定され得る。いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座、および/または、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座に機能的に連結された、導入遺伝子の発現のレベル、量、パターン、およびタイミングを検出することは、インビトロアッセイまたはインビボを行うことを含む。

いくつかの態様では、アッセイは、発現された遺伝子産物（例えば、T細胞刺激関連遺伝子座によってコードされるポリペプチドまたはタンパク質）のレベルを検出するアッセイ、例えば、イムノアッセイ、アプタマーベースのアッセイ、組織学的もしくは細胞学的アッセイ、または、mRNA発現レベルアッセイなどの、発現されたリボ核酸（RNA）のレベルを検出するアッセイを含む。いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座、および/または、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座に機能的に連結された、導入遺伝子の発現のレベル、量、パターン、およびタイミングは、免疫細胞化学または免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA；直接、間接、サンドイッチ、競合、多重、および携帯型ELISA（例えば、米国特許第7,510,687号を参照されたい）を含む）、ウェスタンブロッティング（任意でペプチドシーケンシングを含む、一次元、二次元、もしくはより高次元のブロッティングまたは他のクロマトグラフィー手段を含む）、免疫ブロッティング、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（RIA）、免疫染色、フローサイトメトリーアッセイ、表面プラズモン共鳴（SPR）、化学発光アッセイ、ラテラルフローイムノアッセイ、阻害アッセイ、結合力アッセイ、核酸ベースまたはタンパク質ベースのアプタマー技法、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、ペプチドシーケンシング（任意でHPLCにカップリングされた、エドマン分解シーケンシングまたは質量分析（例えばMS/MS）など）、および前述のいずれかのマイクロアレイ適応（核酸、抗体、またはタンパク質-タンパク質（すなわち、非抗体）アレイを含む）などのアッセイによって検出される。いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座、および/または、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座に機能的に連結された、導入遺伝子の発現のレベル、量、パターン、およびタイミングは、T細胞刺激関連遺伝子座またはコードされる組換え受容体の遺伝子産物に特異的に結合する結合試薬を用いて決定される。場合によっては、結合試薬は、抗体もしくはその抗原結合断片、アプタマー、または核酸プローブである。

いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座、および/または、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座に機能的に連結された、導入遺伝子の発現のレベル、量、パターン、およびタイミングは、メッセンジャーRNAなどの、核酸の量、レベル、または発現を検出する方法を用いて決定される。ある特定の態様では、アッセイは、ポリヌクレオチド、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座からのmRNAまたは導入遺伝子から産生されるmRNAのレベルを検出すること、測定すること、評価すること、および/または定量することを含む。いくつかの局面では、ポリヌクレオチドの量またはレベルは、逆転写酵素（rt）PCR、ドロップレットデジタルPCR、リアルタイムおよび定量PCR法（例えば、TAQMAN（登録商標）、分子ビーコン、LIGHTUP（商標）、SCORPION（商標）、SIMPLEPROBES（登録商標）を含む；例えば、米国特許第5,538,848号；第5,925,517号；第6,174,670号；第6,329,144号；第6,326,145号および第6,635,427号を参照されたい）を含む、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）；ノーザンブロッティング；例えば、逆転写産物および誘導体のサザンブロッティング；ブロットアレイ、マイクロアレイ、もしくはインサイチュ合成アレイを含む、アレイベースの方法；ならびに、シーケンシング、例えば、合成によるシーケンシング、パイロシーケンシング、ジデオキシシーケンシング、もしくはライゲーションによるシーケンシング、または、HELICOS（登録商標）、ROCHE（登録商標）454、ILLUMINA（登録商標）/SOLEXA（登録商標）、ABI SOLiD（登録商標）、およびPOLONATOR（登録商標）シーケンシングのような特定のプラットフォームを含む、例えば、Shendure et al., Nat. Rev. Genet. 5:335-44 (2004)もしくはNowrousian, Eukaryotic Cell 9(9): 1300-1310 (2010)において論じられる、当技術分野において公知の任意の他の方法によって、評価、測定、決定、および/または定量することができる。いずれかの態様のいくつかでは、ポリヌクレオチドのレベルは、qRT-PCRによって測定される。いくつかの態様では、qRT-PCRは、各遺伝子について3つの核酸セットを用い、該3つの核酸は、プライマーが結合する標的核酸の領域の間に結合するプローブと共に、プライマー対を含む。

いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座、および/または、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座に機能的に連結された、導入遺伝子の発現のレベル、量、パターン、およびタイミングは、ポリヌクレオチドをシーケンシングすることによって決定される。いくつかの態様では、シーケンシングは、非サンガーシーケンシング法および/または次世代シーケンシング（NGS）技法によって行われる。次世代シーケンシング技法の例には、Massively Parallel Signature Sequencing（MPSS）、Polonyシーケンシング、パイロシーケンシング、リバーシブルダイターミネーターシーケンシング、SOLiDシーケンシング、Ion半導体シーケンシング、DNAナノボールシーケンシング、Helioscope一分子シーケンシング、一分子リアルタイム（SMRT）シーケンシング、一分子リアルタイム（RNAP）シーケンシング、およびNanopore DNAシーケンシングが含まれるが、それらに限定されない。いくつかの態様では、NGS技法は、RNAシーケンシング（RNA-Seq）である。RNAシーケンシング法は、最も一般的なDNAシーケンシングプラットフォーム、例えば、HiSeqシステム（Illumina）、454 Genome Sequencer FLX System（Roche）、Applied Biosystems SOLiD（Life Technologies）、IonTorrent（Life Technologies）に適合している。これらのプラットフォームは、一般に、最初のRNAのcDNAへの逆転写を必要とする。逆に、一分子シーケンサーHeliScope（Helicos BioSciences）は、シーケンシングのための鋳型としてRNAを用いることができる。PacBio RSプラットフォーム上での直接RNAシーケンシングについての原理証明もまた、実証されている（Pacific Bioscience）。いくつかの態様では、1つまたは複数のRNA遺伝子産物が、RNAseqによって評価、測定、決定、および/または定量される。

いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座、および/または、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座に機能的に連結された、導入遺伝子の発現のレベル、量、パターン、およびタイミングは、刺激または活性化シグナルに対する曝露後に、細胞において決定され得る。いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座および/または導入遺伝子の発現は、細胞を、刺激または活性化シグナルを提供する作用物質とインキュベートすることによって決定される。いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座、および/または、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座に機能的に連結された、導入遺伝子の発現のレベル、量、およびパターンは、刺激または活性化シグナルに対する曝露後の様々な時間に評価され得る。いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座、および/または、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座に機能的に連結された、導入遺伝子の発現のレベル、量、およびパターンは、再刺激、反復刺激、または連続刺激の後に決定され得る。いくつかの態様では、導入遺伝子の発現は、組換え受容体の結合ドメインに結合する作用物質、および/または組換え受容体の細胞内シグナル伝達領域を通してシグナルを誘導するかもしくは誘導することができる作用物質の存在下または非存在下で、T細胞のインキュベーション後に評価され得る。

いくつかの局面では、発現のレベル、量、またはパターンを評価するための刺激または活性化シグナルを提供することができる例示的な作用物質には、抗原非依存性刺激を提供するもの、例えば、抗CD3抗体および抗CD28抗体がコンジュゲートされたビーズなどの、抗CD3抗体および/もしくは抗CD28抗体を含有する作用物質、または抗CD3/抗CD28抗体もしくは抗体断片がロードされた可溶性の多量体試薬もしくはオリゴマー試薬；または組換え受容体に対する抗原特異的刺激、例えば、組換え受容体が結合するかもしくは認識する精製抗原もしくは組換え抗原、例えば、組換え受容体の抗原結合ドメインもしくはリガンド結合ドメインの標的抗原もしくはリガンドが含まれる。発現のレベル、量、またはパターンを評価するためにT細胞に刺激または活性化シグナルを提供することができる他の例示的な作用物質には、12-O-テトラデカノイルホルボール13-アセタート（TPA）としても知られているホルボール12-ミリスタート13-アセタート（PMA）、イオノミシン、および/またはコンカナバリンA（Con A）が含まれる。

II. 相同性指向修復（HDR）によって、組換え受容体を条件付きで発現する細胞を作製するための方法
改変されたT細胞刺激関連遺伝子座（例えば、PDCD1（PD-1をコードする）、CD69、Nur77（NR4A1をコードする）、FoxP3、またはHLA-DR遺伝子座）を含む、遺伝子操作された細胞を生成するかまたは作製する方法であって、該改変されたT細胞刺激関連遺伝子座が、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（TCR）などの組換え受容体をコードする導入遺伝子（例えば、異種または外来性の核酸配列）を含む前記方法が、本明細書において提供される。いくつかの局面では、遺伝子操作された細胞における改変されたT細胞刺激関連遺伝子座は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座中に組み込まれた、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの態様では、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含有する鋳型ポリヌクレオチドを用いて、標的遺伝子破壊および相同性依存的修復（homology-dependent repair）（HDR）を誘導し、それにより、T細胞刺激関連遺伝子座に導入遺伝子の組み込みをターゲティングすることを含む方法が、提供される。また、方法によって生成された細胞および細胞組成物、ならびに、方法における使用のためのポリヌクレオチド、例えば、鋳型ポリヌクレオチド、およびキットも提供される。

いくつかの局面では、提供される態様は、T細胞刺激関連遺伝子座中への組換え配列または異種配列の標的組み込みのためにHDRを使用する。場合によっては、方法は、HDRによる組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子の標的組み込みと組み合わせて、遺伝子編集技法により内在性T細胞刺激関連遺伝子座に1つまたは複数の標的遺伝子破壊、例えば、DNA切断を導入することを含む。いくつかの局面では、1つまたは複数の標的遺伝子破壊は、遺伝子破壊を導入することができる1つまたは複数の作用物質の導入によって実施される。いくつかの態様では、HDR工程は、ゲノムの標的場所でのDNAにおける破壊または切断、例えば、二本鎖切断を必要とする。いくつかの態様では、DNA切断は、遺伝子編集法、例えば、標的ヌクレアーゼを使用することによって誘導される。いくつかの態様では、方法は、T細胞刺激関連遺伝子座の発現がノックアウトされている操作された細胞を生成する。いくつかの態様では、方法は、T細胞刺激関連遺伝子座の発現を保持する操作された細胞を生成する。いくつかの局面では、方法を実施した後に、操作されたT細胞は、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントに機能的に連結された組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの局面では、内在性転写制御エレメントは、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、機能的に連結された導入遺伝子の発現を誘導するかまたは上方制御する。

いくつかの局面では、提供される方法は、T細胞刺激関連遺伝子座内の標的部位で遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質を、T細胞中に導入する工程；および導入遺伝子および1つまたは複数の相同性アームを含むポリヌクレオチド、例えば、鋳型ポリヌクレオチドをT細胞中に導入する工程を含む。いくつかの局面では、導入遺伝子は、組換え受容体またはその一部分をコードするヌクレオチドの配列を含有する。いくつかの態様では、核酸配列は、相同性指向修復（HDR）を介したT細胞刺激関連遺伝子座内の組み込みのためにターゲティングされる。

いくつかの局面では、提供される方法は、T細胞刺激関連遺伝子座内に遺伝子破壊を有するT細胞中に、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子配列を含むポリヌクレオチドを導入する工程を含み、該遺伝子破壊は、T細胞刺激関連遺伝子座内の1つまたは複数の標的部位の遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質によって導入されており、かつ核酸配列は、HDRを介したT細胞刺激関連遺伝子座内の組み込みのためにターゲティングされる。いくつかの態様では、また、提供される方法のいずれかによって作製される遺伝子操作された免疫細胞を含んで、細胞集団が、より改善された、均一な、同質の、制御された、および/または安定な発現および/または組換え受容体による抗原結合を示すように、組換え受容体、例えば、CARまたはTCRを発現するように操作されている細胞の集団を含有する組成物も提供される。いくつかの局面では、提供される態様は、T細胞の刺激の際の、例えば、組換え受容体をコードする、連結された導入遺伝子の条件付き発現、および、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在に続く、発現の低減または下方制御などの、発現の制御を可能にする。

いくつかの局面では、態様は、遺伝子編集法および/または標的ヌクレアーゼを用いて標的DNA切断を生成すること、ならびにそれに続く、DNA切断でまたはその近くで導入遺伝子を特異的にターゲティングし、かつ組み込むための、1つまたは複数の鋳型ポリヌクレオチド、例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子、および場合によっては他の分子をコードする核酸配列に連結された、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の配列に相同である相同配列を含有する鋳型ポリヌクレオチドに基づくHDRを含む。したがって、いくつかの局面では、方法は、標的遺伝子破壊を誘導する工程（例えば、遺伝子編集）、およびポリヌクレオチド、例えば、導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを、細胞中に導入する工程（例えば、HDR）を含む。

いくつかの態様では、標的遺伝子破壊およびHDRによる導入遺伝子の標的組み込みは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の1つまたは複数の標的部位で起こる。いくつかの局面では、標的組み込みは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレーム配列内で起こる。いくつかの局面では、導入遺伝子の標的組み込みは、例えば、内在性遺伝子の発現が排除されるように、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の遺伝子のノックアウトを結果としてもたらす。

いくつかの局面では、導入遺伝子は、キメラ受容体またはその一部分をコードする配列が、エクソンの配列とインフレームであるように、例えば、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームのエクソンまたはその部分配列内の相同性指向修復（HDR）によって、T細胞刺激関連遺伝子座中に組み込まれている。いくつかの局面では、組み込まれた導入遺伝子の上流の一部分などの、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のすべてまたは一部分、および組換え受容体またはその一部分は、場合によってはマルチシストロン性エレメントによって分離されて、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座において発現される。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の標的遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質の導入の前に、それと同時に、またはその後に、操作された細胞中に導入される。1つまたは複数の標的遺伝子破壊、例えば、DNA切断の存在下で、鋳型ポリヌクレオチドは、遺伝子破壊の周囲の内在性遺伝子配列と、鋳型ポリヌクレオチドに含まれる5'および/または3'相同性アームなどの1つまたは複数の相同性アームとの間の相同性に基づいて、HDRによって標的遺伝子破壊の部位でまたはその近くで導入遺伝子を効果的に組み込むために、DNA修復鋳型として用いられ得る。

いくつかの局面では、鋳型ポリヌクレオチドおよび1つまたは複数の標的遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質は、同時に導入される。いくつかの局面では、鋳型ポリヌクレオチドおよび1つまたは複数の標的遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質は、本明細書に、例えばセクションII.A.3およびII.B.3に記載される、任意の送達方法を用いて導入される。いくつかの局面では、鋳型ポリヌクレオチドおよび1つまたは複数の標的遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質は、物理的送達方法を介して、例えば、電気穿孔、パーティクルガン、リン酸カルシウムトランスフェクション、細胞の圧縮または圧迫を介して導入される。いくつかの局面では、鋳型ポリヌクレオチドおよび1つまたは複数の標的遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質は、電気穿孔を介して、同時に導入される。

いくつかの局面では、2つの工程は、逐次的に行われ得る。いくつかの態様では、遺伝子編集およびHDR工程は、同時におよび/または1つの実験反応において行われる。いくつかの態様では、遺伝子編集およびHDR工程は、1つのまたは連続した実験反応において、連続的にまたは逐次的に行われる。いくつかの態様では、遺伝子編集およびHDR工程は、別々の実験反応において、同時にまたは異なる時間に行われる。

免疫細胞は、T細胞を含有する細胞の集団を含むことができる。そのような細胞は、対象から得られた、例えば、末梢血単核細胞（PBMC）試料、未分画T細胞試料、リンパ球試料、白血球細胞試料、アフェレーシス生成物、または白血球アフェレーシス生成物から得られた細胞であることができる。いくつかの態様では、T細胞は、正または負の選択および濃縮方法を用いて、集団中のT細胞を濃縮するために分離するかまたは選択することができる。いくつかの態様では、集団は、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、またはCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を含有する。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド鋳型を導入する工程および作用物質（例えば、Cas9/gRNA RNP）を導入する工程は、同時にまたは逐次的に、任意の順序で行われ得る。いずれかの態様のいくつかでは、ポリヌクレオチド鋳型は、作用物質（例えば、Cas9/gRNA RNP）を導入する工程によって遺伝子破壊を誘導した後に、免疫細胞中に導入される。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド鋳型および1つまたは複数の作用物質（例えば、Cas9/gRNA RNP）の導入の前に、その最中に、および/またはその後に、細胞の増大および/または増殖を刺激する条件下で、細胞を培養するかまたはインキュベートする。

提供される方法のいずれかの態様のいくつかでは、鋳型ポリヌクレオチドの導入は、遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質の導入と同時に行われる。遺伝子破壊を誘導するために用いられる特定の作用物質に応じて、1つまたは複数の作用物質を導入するための任意の方法を、記載されるように使用することができる。いくつかの局面では、破壊は、例えば、破壊されるT細胞刺激関連遺伝子座に特異的な、クラスター化して規則的な配置の短い回文核酸（clustered regularly interspersed short palindromic nucleic acid）（CRISPR）-Casシステム、例えばCRISPR-Cas9システムなどのRNA誘導型ヌクレアーゼを用いて、遺伝子編集によって実施される。いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座のある領域を標的とする、Cas9とターゲティングドメインを含有するガイドRNA（gRNA）とを含有する作用物質が、細胞中に導入される。いくつかの態様では、作用物質は、Cas9とT細胞刺激関連遺伝子座を標的とするターゲティングドメインを含有するgRNAとのリボ核タンパク質（RNP）複合体（Cas9/gRNA RNP）であるか、またはそれを含む。いくつかの態様では、導入は、インビトロで、作用物質またはその一部分を細胞と接触させることを含み、これは、最大で24、36、もしくは48時間、または3、4、5、6、7、もしくは8日間、細胞および作用物質を培養することまたはインキュベートすることを含むことができる。いくつかの態様では、導入は、作用物質および/またはHDRのための鋳型などの導入遺伝子を含むポリヌクレオチドの、細胞中への送達を行うことをさらに含むことができる。様々な態様では、本開示による方法、組成物、および細胞は、例えば電気穿孔による、Cas9とgRNAとのリボ核タンパク質（RNP）複合体および/または鋳型ポリヌクレオチドの細胞への直接送達を利用する。場合によっては、改変される細胞の電気穿孔は、細胞の電気穿孔後かつプレーティングの前に、例えば32℃で、細胞に低温ショックを与えることを含む。

鋳型ポリヌクレオチドの細胞への送達のために用いられる特定の方法に応じて、鋳型ポリヌクレオチドを導入するための任意の方法を、記載されるように使用することができる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、直鎖ポリヌクレオチドである。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、一本鎖直鎖ポリヌクレオチドである。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、二本鎖直鎖ポリヌクレオチドである。いくつかの局面では、鋳型ポリヌクレオチドは、電気穿孔などの物理的送達手段によって、別々に、またはゲノム中の標的部位のうちの1つまたは複数で遺伝子破壊を誘導するための1つまたは複数の作用物質と共に、細胞中に送達される。

例示的な方法には、ウイルス、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルス、形質導入、トランスポゾン、および電気穿孔を介するものを含む、受容体をコードする核酸の移入のためのものが含まれる。いずれかの態様のいくつかでは、ウイルス形質導入法が使用される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、例えば、シミアンウイルス40（SV40）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）に由来するベクターなどの、組換え感染性ウイルス粒子を用いて、細胞中に移入させるかまたは導入することができる。いくつかの態様では、組換え核酸は、組換えレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、例えばガンマ-レトロウイルスベクターを用いて、T細胞中に移入される（例えば、Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25；Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46；Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93；Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557を参照されたい）。いずれかの態様のいくつかでは、ウイルスベクターは、AAV2またはAAV6などのAAVである。

提供される方法のそのような局面では、鋳型ポリヌクレオチドは、例えば、電気穿孔を介して導入された1つまたは複数の作用物質、例えばCas9/gRNA RNPの導入後に、細胞中に導入される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質の導入の直後に導入される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質の導入の後、30秒もしくは約30秒以内に、1分もしくは約1分以内に、2分もしくは約2分以内に、3分もしくは約3分以内に、4分もしくは約4分以内に、5分もしくは約5分以内に、6分もしくは約6分以内に、6分もしくは約6分以内に、8分もしくは約8分以内に、9分もしくは約9分以内に、10分もしくは約10分以内に、15分もしくは約15分以内に、20分もしくは約20分以内に、30分もしくは約30分以内に、40分もしくは約40分以内に、50分もしくは約50分以内に、60分もしくは約60分以内に、90分もしくは約90分以内に、2時間もしくは約2時間以内に、3時間もしくは約3時間以内に、または4時間もしくは約4時間以内に細胞中に導入される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の作用物質を導入した、後15分または約15分から4時間または約4時間の間、例えば、15分もしくは約15分から3時間もしくは約3時間の間、15分もしくは約15分から2時間もしくは約2時間の間、15分もしくは約15分から1時間もしくは約1時間の間、15分もしくは約15分から30分もしくは約30分の間、30分もしくは約30分から4時間もしくは約4時間の間、30分もしくは約30分から3時間もしくは約3時間の間、30分もしくは約30分から2時間もしくは約2時間の間、30分もしくは約30分から1時間もしくは約1時間の間、1時間もしくは約1時間から4時間もしくは約4時間の間、1時間もしくは約1時間から3時間もしくは約3時間の間、1時間もしくは約1時間から2時間もしくは約2時間の間、2時間もしくは約2時間から4時間もしくは約4時間の間、2時間もしくは約2時間から3時間もしくは約3時間の間、または3時間もしくは約3時間から4時間もしくは約4時間の間の時間で細胞中に導入される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、例えば電気穿孔を介して導入された1つまたは複数の作用物質、例えばCas9/gRNA RNPの導入の後2時間または約2時間で細胞中に導入される。

いくつかの態様では、作用物質を細胞接触させるより前に、該接触の間、もしくは該接触に続いて、および/または送達（例えば、電気穿孔）を行うより前に、該送達の間、もしくは該送達に続いて、提供される方法は、サイトカイン、刺激作用物質、および/または免疫細胞（例えばT細胞）の増殖、刺激、または活性化を誘導することができる作用物質の存在下で、細胞をインキュベートすることを含む。いくつかの態様では、インキュベーションの少なくとも一部は、CD3に対して特異的な抗体、CD28に対して特異的な抗体、および/またはサイトカイン、例えば抗CD3/抗CD28ビーズであるか、またはこれらを含む刺激作用物質の存在下である。いくつかの態様では、インキュベーションの少なくとも一部は、サイトカイン、例えば、組換えIL-2、組換えIL-7、および/または組換えIL-15の1つまたは複数の存在下である。いくつかの態様では、インキュベーションは、例えば、電気穿孔を介した1つまたは複数の作用物質、例えばCas9/gRNA RNPの、および鋳型ポリヌクレオチドの導入の前または後、最大で8日間、例えば、最大で24時間、36時間、もしくは48時間、または3、4、5、6、7、もしくは8日間にわたる。

いくつかの態様では、方法は、作用物質、例えばCas9/gRNA RNP、およびポリヌクレオチド鋳型を導入するより前に、細胞を刺激作用物質（例えば、抗CD3/抗CD28抗体）で活性化または刺激することを含む。いくつかの態様では、刺激作用物質（例えば、抗CD3/抗CD28）の存在下でのインキュベーションは、例えば、電気穿孔を介した、1つまたは複数の作用物質、例えばCas9/gRNA RNPの導入より前の6時間～96時間、例えば、24～48時間または24～36時間にわたる。いくつかの態様では、刺激作用物質とのインキュベーションは、サイトカイン、例えば、組換えIL-2、組換えIL-7、および/または組換えIL-15の1つまたは複数の存在をさらに含むことができる。いくつかの態様では、インキュベーションは、組換えサイトカイン、例えばIL-2（例えば1U/mL～500U/mL、例えば10U/mL～200U/mL、例えば少なくとももしくは約50U/mLもしくは100U/mL）、IL-7（例えば0.5ng/mL～50ng/mL、例えば1ng/mL～20ng/mL、例えば少なくとももしくは約5ng/mLもしくは10ng/mL）、またはIL-15（例えば0.1ng/mL～50ng/mL、例えば0.5ng/mL～25ng/mL、例えば少なくとももしくは約1ng/mLもしくは5ng/mL）の存在下で行われる。いくつかの態様では、刺激作用物質（例えば、抗CD3/抗CD28抗体）は、遺伝子破壊を誘導することができる作用物質Cas9/gRNA RNPおよび/またはポリヌクレオチド鋳型を細胞中に導入または送達するより前に、細胞から洗浄または除去される。いくつかの態様では、作用物質を導入するより前に、例えば、任意の刺激または活性化作用物質の除去によって、細胞を休ませる。いくつかの態様では、作用物質を導入するより前に、刺激または活性化作用物質および/またはサイトカインは除去されない。

いくつかの態様では、作用物質、例えばCas9/gRNA、および/またはポリヌクレオチド鋳型の導入に続いて、組換えサイトカイン、例えば、組換えIL-2、組換えIL-7、および/または組換えIL-15の1つまたは複数の存在下で、細胞をインキュベート、培養（cultivate）または培養（culture）する。いくつかの態様では、インキュベーションは、組換えサイトカイン、例えばIL-2（例えば1U/mL～500U/mL、例えば10U/mL～200U/mL、例えば少なくとももしくは約50U/mLもしくは100U/mL）、IL-7（例えば0.5ng/mL～50ng/mL、例えば1ng/mL～20ng/mL、例えば少なくとももしくは約5ng/mLもしくは10ng/mL）、またはIL-15（例えば0.1ng/mL～50ng/mL、例えば0.5ng/mL～25ng/mL、例えば少なくとももしくは約1ng/mLもしくは5ng/mL）の存在下で行われる。細胞は、細胞の増殖または増大を誘導するための条件下でインキュベートまたは培養することができる。いくつかの態様では、細胞は、回収のための閾値細胞数、例えば治療有効量が達成されるまで、インキュベートまたは培養することができる。

いくつかの態様では、プロセスの任意の部分またはプロセスの全体の間のインキュベーションは、30℃±2℃～39℃±2℃、例えば少なくともまたは約少なくとも30℃±2℃、32℃±2℃、34℃±2℃、または37℃±2℃の温度であり得る。いくつかの態様では、インキュベーションの少なくとも一部は30℃±2℃であり、インキュベーションの少なくとも一部は37℃±2℃である。

いくつかの局面では、提供される態様は、組換え受容体が、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメント、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性プロモーターの調節下で発現されることを可能にする。いくつかの局面では、提供される態様は、組換え受容体をコードする核酸が、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の内在性制御または調節エレメント、例えば、プロモーター、または5'および/もしくは3'非翻訳領域（UTR）などのシス制御エレメントに機能的に連結されることを可能にする。したがって、いくつかの局面では、提供される態様は、組換え受容体、例えばCARが発現されることを可能にし、かつ/または発現は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座と同様に、条件付きで、時間的に、および/もしくは量的に制御される。いくつかの局面では、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞における刺激または活性化シグナルに続いて、上方制御されるかまたは誘導される。いくつかの局面では、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在に続いて、低減されるかまたは下方制御される。いくつかの局面では、機能的に連結された導入遺伝子の発現は、シグナルの低減または非存在の後に、T細胞におけるさらなるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、再び誘導されるかまたは上方制御されることができる。

A. 遺伝子破壊
いくつかの態様では、1つまたは複数の標的遺伝子破壊が、1つまたは複数の内在性T細胞刺激関連遺伝子座で誘導される。いくつかの態様では、標的遺伝子破壊は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のエクソンにおいてまたはその近くで誘導される。いくつかの態様では、標的遺伝子破壊は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のイントロンにおいてまたはその近くで誘導される。いくつかの態様では、標的遺伝子破壊は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のプロモーターにおいてまたはその近くで誘導される。いくつかの局面では、1つまたは複数の標的遺伝子破壊およびポリヌクレオチド、例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含有する鋳型ポリヌクレオチドの存在は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の1つまたは複数の遺伝子破壊でのまたはその近くでの導入遺伝子の標的組み込みを結果としてもたらし得る。

いくつかの態様では、遺伝子破壊は、ゲノム中の1つまたは複数の標的部位で、二本鎖切断（DSB）もしくは開裂などのDNA切断、または一本鎖切断（SSB）などのニックを結果としてもたらす。いくつかの態様では、遺伝子破壊、例えば、DNA切断またはニックの部位で、細胞のDNA修復機構の作用は、ノックアウト、挿入、ミスセンス変異もしくはフレームシフト変異、例えば両アレルフレームシフト変異、遺伝子のすべてもしくは一部の欠失をもたらし得るか、または、修復鋳型、例えば、鋳型ポリヌクレオチドの存在下で、鋳型ポリヌクレオチドに含有される核酸配列の組み込みもしくは挿入など、修復鋳型に基づいてDNA配列を変更することができる（例えば、本明細書のセクションII.B.2に記載される任意のもの）。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、遺伝子の1つもしくは複数のエクソンまたはその一部分にターゲティングされ得る。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、外来性配列、例えば、組換え受容体をコードする外来性配列の標的組み込みの望ましい部位の近くにターゲティングされ得る。いくつかの態様では、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子の組み込み後の、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレーム中に、欠失、挿入、フレームシフト変異、またはナンセンス変異を含む。いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性遺伝子産物は、細胞において産生されないか、またはトランケートされているか、または非機能的である。いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性遺伝子産物は、細胞において完全長で産生されるか、または機能的である。

いくつかの態様では、少なくとも1つの標的部位のうちの1つに近い領域の配列に特異的に結合するかまたはハイブリダイズするDNA結合タンパク質またはDNA結合核酸が、標的破壊に用いられる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチド、例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列および相同配列を含む鋳型ポリヌクレオチドを、例えば本明細書に、例えばセクションII.Aに記載される、遺伝子破壊の部位でのまたはその近くでの組換え受容体をコードする配列のHDRによる標的組み込みのために、導入することができる。

いくつかの態様では、遺伝子破壊は、遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質を導入することによって行われる。いくつかの態様では、そのような作用物質は、遺伝子に特異的に結合するかまたはハイブリダイズするDNA結合タンパク質またはDNA結合核酸を含む。いくつかの態様では、作用物質は、DNAターゲティングタンパク質とヌクレアーゼとを含む融合タンパク質またはRNA誘導型ヌクレアーゼなどの、様々な成分を含む。いくつかの態様では、作用物質は、1つまたは複数の標的部位または標的場所を標的とすることができる。いくつかの局面では、標的部位の各側上に1対の一本鎖切断（例えば、ニック）が生成され得る。

提供される態様では、「導入する」という用語は、インビトロまたはインビボのいずれかで、細胞中にDNAを導入する様々な方法を包含し、そのような方法には、形質転換、形質導入、トランスフェクション（例えば、電気穿孔）、および感染が含まれる。ベクターは、分子をコードするDNAを細胞中に導入するのに有用である。可能なベクターには、プラスミドベクターおよびウイルスベクターが含まれる。ウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、または他のベクター、例えば、アデノウイルスベクターもしくはアデノ随伴ベクターが含まれる。電気穿孔などの方法もまた、タンパク質、または、例えば、ターゲティングgRNAとの複合体中にCas9タンパク質を含有する、リボ核タンパク質（RNP）を、関心対象の細胞に導入するかまたは送達するために、用いられ得る。

いくつかの態様では、遺伝子破壊は、標的部位（「標的位置」、「標的DNA配列」、または「標的場所」としても知られている）で、例えば、内在性T細胞刺激関連遺伝子座で起こる。いくつかの態様では、標的部位は、遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質、例えば、標的部位を特定するgRNAと複合体化されたCas9分子によって改変される、標的DNA（例えば、ゲノムDNA）上の部位を含む。例えば、標的部位は、開裂またはDNA切断が生じる、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のDNA中の場所を含むことができる。いくつかの局面では、HDRによる核酸配列の組み込みは、標的部位または標的配列でまたはその近くで起こり得る。いくつかの態様では、標的部位は、1つまたは複数のヌクレオチドが付加されるDNA上の2つのヌクレオチド、例えば、隣接するヌクレオチドの間の部位であることができる。標的部位は、鋳型ポリヌクレオチドによって変更される1つまたは複数のヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの態様では、標的部位は、標的配列（例えば、gRNAが結合する配列）内にある。いくつかの態様では、標的部位は、標的配列の上流または下流にある。

1. 例示的な内在性T細胞刺激関連遺伝子座の標的部位
いくつかの態様では、遺伝子破壊および/または相同性指向修復（HDR）を介した組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子の組み込みは、本明細書に記載される内在性またはゲノムT細胞刺激関連遺伝子座にターゲティングされる。いくつかの局面では、本明細書に記載される標的部位での遺伝子破壊、およびT細胞刺激関連遺伝子座での導入遺伝子の標的組み込みのための鋳型ポリヌクレオチドの存在によって、結果として生じる操作されたT細胞は、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントに機能的に連結された、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含有する。いくつかの局面では、内在性転写制御エレメントは、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、機能的に連結された導入遺伝子の発現を誘導するかまたは上方制御する。

いくつかの態様では、遺伝子破壊は、T細胞刺激関連遺伝子座に、その近くに、またはそれ内にターゲティングされる。いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座は、T細胞上で一過性に上方制御されるかまたは誘導される分子をコードする。いくつかの態様では、例示的なT細胞刺激関連遺伝子座は、PDCD1（PD-1をコードする）、CD69、Nur77（NR4A1をコードする）、FoxP3、またはHLA-DR遺伝子座を含む。いくつかの局面では、標的部位は、PDCD1（PD-1をコードする）、CD69、Nur77（NR4A1をコードする）、FoxP3、またはHLA-DR遺伝子座にまたはその近くにある。例示的なT細胞刺激関連遺伝子座の発現は、本明細書に、例えばセクションI.Aに記載される。

例示的なヒトPD-1前駆体ポリペプチド配列は、SEQ ID NO:79に示される（成熟ポリペプチドは、SEQ ID NO:79の残基24～288を含む；Uniprotアクセッション番号Q15116-1；SEQ ID NO:80に示されるmRNA配列、NCBI参照配列：NM_005018.3を参照されたい）。ヒトにおいて、PD-1をコードするゲノム遺伝子座であるPDCD1は、5つのエクソンおよび4つのイントロンを含有するオープンリーディングフレームを含む。PDCD1の例示的なmRNA転写物は、ヒトゲノムバージョンGRCh38（UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly）を参照して、2番染色体：241,849,884-241,858,894リバース鎖に対応する配列にわたる。表1は、PD-1をコードする例示的な転写物のオープンリーディングフレームのエクソンおよびイントロンならびに非翻訳領域の座標を示す。

（表１）ヒトPDCD1遺伝子座のエクソンおよびイントロンの座標（GRCh38、2番染色体、リバース鎖）

例示的なヒトCD69ポリペプチド配列は、SEQ ID NO:81に示される（Uniprotアクセッション番号Q07108-1；SEQ ID NO:82に示されるmRNA配列、NCBI参照配列：NP_001772.1を参照されたい）。ヒトにおいて、CD69をコードする遺伝子座は、5つのエクソンおよび4つのイントロンを含有するオープンリーディングフレームを含む。CD69の例示的なmRNA転写物は、ヒトゲノムバージョンGRCh38（UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly）を参照して、12番染色体：9,752,486-9,760,901リバース鎖に対応する配列にわたる。表2は、CD69をコードする例示的な転写物のオープンリーディングフレームのエクソンおよびイントロンならびに非翻訳領域の座標を示す。

（表２）ヒトCD69遺伝子座のエクソンおよびイントロンの座標（GRCh38、12番染色体、リバース鎖）

例示的なヒトNR4A1ポリペプチド配列は、SEQ ID NO:83に示される（アイソフォーム1；Uniprotアクセッション番号P22736-1；SEQ ID NO:84に示されるmRNA配列、NCBI参照配列：NP_002126.2を参照されたい）。ヒトにおいて、いくつかの異なるmRNAおよびタンパク質アイソフォームが、Nur77について存在する。NR4A1をコードする例示的なゲノム遺伝子座であるNur77（NR4A1としても知られている）は、アイソフォーム1をコードする転写物バリアントについて、8つのエクソンおよび7つのイントロンを含有するオープンリーディングフレームを含む。アイソフォーム1をコードするNur77の例示的なmRNA転写物は、ヒトゲノムバージョンGRCh38（UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly）を参照して、12番染色体：52,051,402-52,059,506フォワード鎖に対応する配列にわたる。表3は、NR4A1をコードする例示的な転写物アイソフォーム1のオープンリーディングフレームのエクソンおよびイントロンならびに非翻訳領域の座標を示す。

（表３）ヒトNur77遺伝子座のエクソンおよびイントロンの座標（GRCh38、12番染色体、フォワード鎖）

例示的なヒトFoxP3ポリペプチド配列は、SEQ ID NO:85に示される（アイソフォーム1；Uniprotアクセッション番号Q9BZS1-1；SEQ ID NO:86に示されるmRNA配列、NCBI参照配列：NM_014009.3を参照されたい）。ヒトにおいて、いくつかの異なるmRNAおよびタンパク質アイソフォームが、FoxP3について存在する。FoxP3をコードする例示的なゲノム遺伝子座であるFOXP3は、アイソフォーム1をコードする転写物バリアントについて、12個のエクソンおよび11個のイントロンを含有するオープンリーディングフレームを含む。アイソフォーム1をコードするFOXP3の例示的なmRNA転写物は、ヒトゲノムバージョンGRCh38（UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly）を参照して、X染色体：49,250,436-49,264,924リバース鎖に対応する配列にわたる。表4は、FoxP3をコードする例示的な転写物アイソフォーム1のオープンリーディングフレームのエクソンおよびイントロンならびに非翻訳領域の座標を示す。

（表４）ヒトFOXP3遺伝子座のエクソンおよびイントロンの座標（GRCh38、X染色体、リバース鎖）

HLA-DRは、アルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖を含むヘテロ二量体タンパク質である。その各サブユニットは、2つの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質尾部を含有する。α鎖およびβ鎖は両方とも、膜に係留されている。HLA-DRは、いくつかの遺伝子座、および各遺伝子座での異なる機能のいくつかの遺伝子によってコードされる。DRα鎖は、HLA-DRA遺伝子座によってコードされる。DRβ鎖は、HLA-DRB1～HLA-DRB9を含む、いくつかの異なる遺伝子座によってコードされ、そのいくつかのみが、各個体に存在する。HLA-DRB1遺伝子座は、遍在しており、非常に多数の機能的に可変の遺伝子産物（HLA-DR1～HLA-DR17）をコードする（例えば、Marsh et al., Tissue Antigens. 2010 Apr; 75(4): 291-455を参照されたい）。

例示的な前駆体ヒトHLA-DRα鎖ポリペプチド配列は、SEQ ID NO:87に示される（成熟ポリペプチドは、SEQ ID NO:87の残基26～254を含む；Uniprotアクセッション番号P01903-1；SEQ ID NO:88に示されるmRNA配列、NCBI参照配列：NM_019111.4を参照されたい）。ヒトにおいて、HLA-DRα鎖をコードする遺伝子座であるHLA-DRAは、5つのエクソン（4つがエクソンをコードする）および4つのイントロンを含有するオープンリーディングフレームを含む。HLA-DRAの例示的なmRNA転写物は、ヒトゲノムバージョンGRCh38（UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly）を参照して、6番染色体：32,439,887-32,445,046フォワード鎖に対応する配列にわたる。表5は、HLA-DRα鎖をコードする例示的な転写物のオープンリーディングフレームのエクソンおよびイントロンならびに非翻訳領域の座標を示す。

（表５）ヒトHLA-DRA遺伝子座のエクソンおよびイントロンの座標（GRCh38、6番染色体、フォワード鎖）

例示的な前駆体ヒトHLA-DRβ鎖ポリペプチド配列は、SEQ ID NO:89に示される（成熟ポリペプチドは、SEQ ID NO:89の残基30～266を含む；Uniprotアクセッション番号P04229-1；SEQ ID NO:90に示されるmRNA配列、GenBank: X03069.1を参照されたい）。ヒトにおいて、HLA-DRβ鎖をコードする例示的な遺伝子座であるHLA-DRB1は、6つのエクソンおよび5つのイントロンを含有するオープンリーディングフレームを含む。HLA-DRB1の例示的なmRNA転写物は、ヒトゲノムバージョンGRCh38（UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly）を参照して、6番染色体：32,578,769-32,589,848リバース鎖に対応する配列にわたる。表6は、HLA-DRβ鎖をコードする例示的な転写物のオープンリーディングフレームのエクソンおよびイントロンならびに非翻訳領域の座標を示す。

（表６）ヒトHLA-DRB1遺伝子座のエクソンおよびイントロンの座標（GRCh38、6番染色体、フォワード鎖）

いくつかの態様では、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントに機能的に連結された組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を含有する、操作された細胞はまた、内在性T細胞受容体α定常領域（TRAC）遺伝子および/または内在性T細胞受容体β定常領域（TRBC）遺伝子に遺伝子破壊を含有する。いくつかの局面では、内在性TRACおよび/またはTRBC遺伝子座での追加の遺伝子破壊は、操作された細胞において内在性TCRの発現を阻止し、それにより、組換え受容体を介した刺激または活性化シグナルの非存在下で、例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする、導入遺伝子の発現を阻止する。いくつかの局面では、内在性TRACおよび/またはTRBC遺伝子座での追加の遺伝子破壊は、抗原特異的刺激または活性化シグナルの非存在下で、例えば、腫瘍の排除後に腫瘍特異的抗原が存在しない場合に、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子の再発現を阻止する。

いくつかの態様では、内在性TCR Cαは、TRAC遺伝子（IMGT命名法）によってコードされる。例示的なヒトTCR Cαポリペプチド配列は、SEQ ID NO:91または92に示される（UniProtKBアクセッション番号P01848またはGenbankアクセッション番号CAA26636.1；SEQ ID NO:93に示されるmRNA配列、GenBank: X02592.1を参照されたい）。ヒトにおいて、TRACの例示的なゲノム遺伝子座は、4つのエクソンおよび3つのイントロンを含有するオープンリーディングフレームを含む。TRACの例示的なmRNA転写物は、ヒトゲノムバージョンGRCh38（UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly）を参照して、14番染色体：22,547,506-22,552,154のフォワード鎖上の座標に対応する配列にわたることができる。表7は、例示的なヒトTRAC遺伝子座の転写物のオープンリーディングフレームのエクソンおよびイントロンならびに非翻訳領域の座標を示す。

（表７）例示的なヒトTRAC遺伝子座のエクソンおよびイントロンの座標（GRCh38、14番染色体、フォワード鎖）

いくつかの態様では、内在性TCR Cβは、TRBC1またはTRBC2遺伝子（IMGT命名法）によってコードされる。例示的なヒトTCR Cβポリペプチド配列は、SEQ ID NO:94、95、または96に示される（UniProtKBアクセッション番号P01850、A0A5B9、またはA0A0G2JNG9；SEQ ID NO:97に示されるmRNA配列；GenBank: X00437.1を参照されたい）。

ヒトにおいて、TRBC1の例示的なゲノム遺伝子座は、4つのエクソンおよび3つのイントロンを含有するオープンリーディングフレームを含む。TRBC1の例示的なmRNA転写物は、ヒトゲノムバージョンGRCh38（UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly）を参照して、7番染色体：142,791,694-142,793,368のフォワード鎖上の座標に対応する配列にわたることができる。表8は、例示的なヒトTRBC1遺伝子座の転写物のオープンリーディングフレームのエクソンおよびイントロンならびに非翻訳領域の座標を示す。

（表８）例示的なヒトTRBC1遺伝子座のエクソンおよびイントロンの座標（GRCh38、7番染色体、フォワード鎖）

ヒトにおいて、TRBC2の例示的なゲノム遺伝子座は、4つのエクソンおよび3つのイントロンを含有するオープンリーディングフレームを含む。TRBC2の例示的なmRNA転写物は、ヒトゲノムバージョンGRCh38（UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly）を参照して、7番染色体：142,801,041-142,802,748のフォワード鎖上の座標に対応する配列にわたることができる。表9は、例示的なヒトTRBC2遺伝子座の転写物のオープンリーディングフレームのエクソンおよびイントロンならびに非翻訳領域の座標を示す。

（表９）例示的なヒトTRBC2遺伝子座のエクソンおよびイントロンの座標（GRCh38、7番染色体、フォワード鎖）

いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、（例えば、本明細書における表1～9に記載される）T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCのオープンリーディングフレームに、その近くに、またはそれ内にターゲティングされる。ある特定の態様では、遺伝子破壊は、TCRα定常ドメインをコードするオープンリーディングフレームに、その近くに、またはそれ内にターゲティングされる。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、（例えば、本明細書における表1～9に記載される）T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBC、あるいは（例えば、本明細書における表1～9に記載される）T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCのすべてまたは一部分、例えば、500、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、もしくは4,000個、または少なくとも500、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、もしくは4,000個の連続したヌクレオチドに対して70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、もしくは99.9％、または少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、もしくは99.9％の配列同一性を有する配列に、その近くに、またはそれ内にターゲティングされる。

いくつかの局面では、標的部位は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCのオープンリーディングフレームのエクソン内にある。いくつかの局面では、標的部位は、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCのオープンリーディングフレームのイントロン内にある。いくつかの局面では、標的部位は、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCの制御または調節エレメント、例えば、プロモーター、5'非翻訳領域（UTR）、または3' UTR内にある。いくつかの態様では、標的部位は、本明細書における表1～9に記載されるT細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/もしくはTRBCゲノム領域配列内、またはそれに含有されるT細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/もしくはTRBCゲノム領域配列の任意のエクソンまたはイントロン内にある。いくつかの局面では、標的部位は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCの、エクソンとイントロンとの間、またはエクソンと制御もしくは調節エレメント、例えば、プロモーター、5'非翻訳領域（UTR）、もしくは3' UTRとの間のジャンクションもしくは境界に、またはその近くにある。いくつかの局面では、標的部位は、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCのオープンリーディングフレームのイントロン内にある。

いくつかの態様では、遺伝子破壊のための標的部位は、導入遺伝子の組み込み後に、細胞が、内在性T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCからの発現がノックアウトされる、低減される、かつ/または排除されるように選択される。

いくつかの態様では、遺伝子破壊、例えばDNA切断は、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/もしくはTRBC、またはそのオープンリーディングフレームのエクソン内にターゲティングされる。ある特定の態様では、遺伝子破壊は、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/もしくはTRBC、またはそのオープンリーディングフレームの第1エクソン、第2エクソン、第3エクソン、または第4エクソン内にある。いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/もしくはTRBC、またはそのオープンリーディングフレームの第1エクソン内にある。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/もしくはTRBC、またはそのオープンリーディングフレームにおける第1エクソンの5'末端から500塩基対（bp）以内下流にある。いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、エクソン1の5'ヌクレオチドと、エクソン1の3'ヌクレオチドの上流との間にある。ある特定の態様では、遺伝子破壊は、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/もしくはTRBC、またはそのオープンリーディングフレームにおける第1エクソンの5'末端から400 bp、350 bp、300 bp、250 bp、200 bp、150 bp、100 bp、または50 bp以内下流にある。いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/もしくはTRBC、またはそのオープンリーディングフレームにおける第1エクソンの5'末端から、それぞれ両端の値を含む、1 bp～400 bp、50～300 bp、100 bp～200 bp、または100 bp～150 bp下流にある。ある特定の態様では、遺伝子破壊は、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/もしくはTRBC、またはそのオープンリーディングフレームにおける第1エクソンの5'末端から、両端の値を含む、100 bp～150 bp下流にある。

いくつかの局面では、標的部位は、初期コード領域に対応するエクソンなどの、エクソン内にある。いくつかの態様では、標的部位は、初期コード領域に対応するエクソン、例えば、（例えば、本明細書における表1～9に記載される）内在性T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCのオープンリーディングフレームのエクソン1、2、3、4、または5内にあるかまたはそれに極めて近接しているか、あるいは、転写開始部位の直後の、エクソン1、2、3、4、もしくは5内の、またはエクソン1、2、3、4、もしくは5の500、450、400、350、300、250、200、150、100、もしくは50 bp未満以内の配列を含む。いくつかの局面では、標的部位は、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCの制御または調節エレメント、例えば、プロモーター内にある。

ある特定の態様では、遺伝子破壊は、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCに、その近くに、またはそれ内にターゲティングされる。いずれかの態様のいくつかでは、遺伝子破壊は、（例えば、本明細書における表1～9に記載される）T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCのオープンリーディングフレームに、その近くに、またはそれ内にターゲティングされる。ある特定の態様では、遺伝子破壊は、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCをコードするオープンリーディングフレームに、その近くに、またはそれ内にターゲティングされる。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、（例えば、本明細書における表1～9に記載される）T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBC、あるいは（例えば、本明細書における表1～9に記載される）T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCのすべてまたは一部分、例えば、500、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、もしくは4,000個、または少なくとも500、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、もしくは4,000個の連続したヌクレオチドに対して70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、もしくは99.9％、または少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、もしくは99.9％の配列同一性を有する配列に、その近くに、またはそれ内にターゲティングされる。

いくつかの局面では、鋳型ポリヌクレオチド内の導入遺伝子（例えば、外来性核酸配列）を、標的部位および/または相同性アームの場所をガイドするために用いることができる。いくつかの局面では、遺伝子破壊の標的部位を、HDRに用いられる鋳型ポリヌクレオチドおよび/または相同性アームを設計するためのガイドとして用いることができる。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、（例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする）導入遺伝子の標的組み込みの望ましい部位の近くにターゲティングされ得る。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドの1つまたは複数の相同性アーム配列は、遺伝子破壊の部位（標的部位）を取り囲むように設計される。いくつかの局面では、遺伝子破壊は、組換え受容体をコードする導入遺伝子の組み込みの際に、内在性T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCの発現が低減されるかまたは排除されるように、ターゲティングされる。いくつかの局面では、遺伝子破壊は、組換え受容体をコードする導入遺伝子の組み込みの際に、内在性T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCのすべてまたは一部分が発現されるように、ターゲティングされる。いくつかの局面では、組換え受容体をコードする導入遺伝子が、発現されるT細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCのコード配列とインフレームで組み込まれ得るように、標的部位は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCのエクソン内に、またはその近くに配置される。

2. 遺伝子破壊の方法
いくつかの局面において、遺伝子操作された細胞を生成するための方法は、1つまたは複数の標的部位、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座、TRACおよび/またはTRBCの1つまたは複数の標的部位に遺伝子破壊を導入する工程を含む。本明細書に記載されるものを含めて、遺伝子破壊を生成するための方法は、遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質、例えば、内在性またはゲノムDNA中の標的部位または標的場所で遺伝子破壊、開裂および/もしくは二本鎖切断（DSB）またはニック（例えば、一本鎖切断（SSB））を誘導し、その結果、非相同末端結合（NHEJ）などのエラーが生じるプロセスによる切断の修復、または修復鋳型を用いるHDRによる修復が、標的部位または位置でのまたはその近くでの関心対象の配列（例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする外来性核酸配列または導入遺伝子）の挿入を結果としてもたらし得る、操作されたシステムの使用を含むことができる。また、本明細書で提供される方法における使用のために、遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質も提供される。いくつかの局面において、1つまたは複数の作用物質は、導入遺伝子の相同性指向修復（HDR）媒介性標的組み込みのために、本明細書で提供される鋳型ヌクレオチドと組み合わせて使用することができる。

いくつかの態様では、遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質は、ゲノム中の特定の部位または位置、例えば標的部位または標的場所に特異的に結合またはハイブリダイズするDNA結合タンパク質またはDNA結合核酸を含む。いくつかの局面では、内在性T細胞刺激関連遺伝子座、TRACおよび/またはTRBCでの標的遺伝子破壊、例えばDNA切断または開裂は、タンパク質または核酸を使用して達成され、タンパク質または核酸は、例えばキメラまたは融合タンパク質において遺伝子編集ヌクレアーゼと結合または複合体化している。いくつかの態様では、遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質は、RNA誘導型ヌクレアーゼ、またはDNAターゲティングタンパク質とヌクレアーゼとを含む融合タンパク質を含む。

いくつかの態様では、作用物質は、様々な成分、例えば、RNA誘導型ヌクレアーゼ、またはDNAターゲティングタンパク質とヌクレアーゼとを含む融合タンパク質を含む。いくつかの態様では、標的遺伝子破壊は、ヌクレアーゼ、例えばエンドヌクレアーゼに融合したDNA結合タンパク質、例えば、1つまたは複数のジンクフィンガータンパク質（ZFP）または転写活性化因子様エフェクター（TALE）を含むDNAターゲティング分子を使用して行われる。いくつかの態様では、標的遺伝子破壊は、RNA誘導型ヌクレアーゼ、例えば、clustered regularly interspaced short palindromic nucleic acid（CRISPR）関連ヌクレアーゼ（Cas）システム（Casおよび/またはCfp1を含む）を使用して行われる。いくつかの態様では、標的遺伝子破壊は、遺伝子破壊を誘導することができる作用物質、例えば、配列特異的または標的ヌクレアーゼを使用して行われ、これには、DNA結合標的ヌクレアーゼおよび遺伝子編集ヌクレアーゼ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、ならびにRNA誘導型ヌクレアーゼ、例えば、CRISPR関連ヌクレアーゼ（Cas）システムが含まれ、これらは、少なくとも1つの標的部位、遺伝子の配列、またはこれらの一部分にターゲティングされるように特に設計されている。例示的なZFN、TALE、およびTALENは、例えば、Lloyd et al., Frontiers in Immunology, 4(221): 1-7 (2013)に記載されている。

ジンクフィンガータンパク質（ZFP）、転写活性化因子様エフェクター（TALE）、およびCRISPRシステムの結合ドメインは、例えば、天然に存在するZFPまたはTALEタンパク質の認識ヘリックス領域の操作（1つまたは複数のアミノ酸の変更）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作され」得る。操作されたDNA結合タンパク質（ZFPまたはTALE）は、天然に存在しないタンパク質である。設計のための合理的な判断基準は、置換ルール、ならびに既存のZFPおよび/またはTALEの設計および結合データの情報を格納するデータベース中の情報を処理するためのコンピュータ化アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第6,140,081号；第6,453,242号；および第6,534,261号を参照されたい。WO98/53058；WO98/53059；WO98/53060；WO02/016536、およびWO03/016496ならびに米国特許出願公開第20110301073号も参照されたい。

いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、T細胞刺激関連遺伝子座、TRACおよび/またはTRBCでまたはその近くで、少なくとも1つの標的部位を特異的に標的にする。いくつかの態様では、作用物質は、標的部位に特異的に結合する、標的部位を認識する、または標的部位にハイブリダイズする、ZFN、TALEN、またはCRISPR/Cas9の組み合わせを含む。いくつかの態様では、CRISPR/Cas9システムは、特異的な開裂をガイドするために、操作されたcrRNA/tracr RNA（「シングルガイドRNA」）を含む。いくつかの態様では、作用物質は、アルゴノートシステムに基づくヌクレアーゼ（例えば、T.サーモフィラス（T. thermophilus）に由来し、「TtAgo」として公知である（Swarts et al. (2014) Nature 507(7491): 258-261）を含む。本明細書において記載されるヌクレアーゼシステムのいずれかを使用する標的開裂を活用して、HDRまたはNHEJ媒介性プロセスのいずれかを使用して、導入遺伝子の配列、例えば組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列を、内在性T細胞刺激関連遺伝子座、TRACおよび/またはTRBCの特定の標的場所に挿入することができる。

いくつかの態様では、「ジンクフィンガーDNA結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、亜鉛イオンの配位を介してその構造が安定化する結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である1つまたは複数のジンクフィンガーを介して配列特異的にDNAに結合する、タンパク質であるか、またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーDNA結合タンパク質という用語は、ジンクフィンガータンパク質またはZFPと略されることが多い。ZFPの中には、個々のフィンガーのアセンブリーによって生成される、典型的には9～18ヌクレオチド長の特定のDNA配列をターゲティングする人工ZFPドメインがある。ZFPは、単一フィンガードメインがおよそ30アミノ酸の長さであり、亜鉛を介して単一ベータターンの2つのシステインと配位した2つの不変のヒスチジン残基を含むアルファヘリックスを含み、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのフィンガーを有するものを含む。一般に、ZFPの配列特異性は、ジンクフィンガー認識ヘリックス上の4つのヘリックス位置（-1、2、3、および6）でアミノ酸置換を行うことによって変更することができる。したがって、例えば、ZFPまたはZFP含有分子は天然に存在せず、例えば、選択標的部位に結合するように操作されている。

場合によっては、DNAターゲティング分子は、DNA開裂ドメインに融合してジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）を形成したジンクフィンガーDNA結合ドメインであるか、または該ジンクフィンガーDNA結合ドメインを含む。例えば、融合タンパク質は、少なくとも1つのIIS型制限酵素由来の開裂ドメイン（または開裂ハーフドメイン）、および操作されていてもよいし、操作されていなくてもよい、1つまたは複数のジンクフィンガー結合ドメインを含む。場合によっては、開裂ドメインはIIS型制限エンドヌクレアーゼFokIに由来し、これは、一方の鎖のその認識部位から9ヌクレオチドおよび他方の鎖のその認識部位から13ヌクレオチドにおいて、DNAの二本鎖開裂を一般に触媒する。例えば、米国特許第5,356,802号；第5,436,150号および第5,487,994号；Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279；Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768；Kim et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887；Kim et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 978-982を参照されたい。いくつかの遺伝子特異的な操作されたジンクフィンガーが市販されている。例えば、何千もの標的に対して特異的にターゲティングされたジンクフィンガーを提供する、ジンクフィンガー構築のためのCompoZrと呼ばれるプラットフォームが利用可能である。例えば、Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405を参照されたい。場合によっては、市販のジンクフィンガーが使用されるか、または特別設計される。いくつかの態様では、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座、TRACおよび/またはTRBC内の1つまたは複数の標的部位が、操作されたZFNによる遺伝子破壊のための標的にされ得る。

転写活性化因子様エフェクター（TALE）は、細菌種ザントモナス（Xanthomonas）由来のタンパク質であり、複数の反復配列を含み、各反復は、核酸標的配列の各ヌクレオチド塩基に特異的である2残基（RVD）を位置12および13に含む。類似したモジュラー塩基対塩基核酸結合特性（modular base-per-base nucleic acid binding properties）（MBBBD）を有する結合ドメインも、異なる細菌種に由来し得る。新しいモジュラータンパク質は、TAL反復よりも配列多様性を示すという利点を有する。いくつかの態様では、異なるヌクレオチドの認識と関係があるRVDは、Cを認識するためのHD、Tを認識するためのNG、Aを認識するためのNI、GまたはAを認識するためのNN、A、C、G、またはTを認識するためのNS、Tを認識するためのHG、Tを認識するためのIG、Gを認識するためのNK、Cを認識するためのHA、Cを認識するためのND、Cを認識するためのHI、Gを認識するためのHN、Gを認識するためのNA、GまたはAを認識するためのSN、およびTを認識するためのYG、Aを認識するためのTL、AまたはGを認識するためのVT、およびAを認識するためのSWである。いくつかの態様では、重要なアミノ酸12および13は、ヌクレオチドA、T、C、およびGに対するそれらの特異性をモジュレートするために、特に、この特異性を増強するために、他のアミノ酸残基に変異させることができる。

いくつかの態様では、「TALE DNA結合ドメイン」または「TALE」は、1つまたは複数のTALE反復ドメイン/単位を含むポリペプチドである。反復可変2残基（RVD）をそれぞれ含む反復ドメインは、TALEとその同種標的DNA配列の結合に関与する。単一「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には33～35アミノ酸の長さであり、天然に存在するTALEタンパク質内の他のTALE反復配列と少なくともある程度の配列相同性を示す。TALEタンパク質は、反復単位内の標準または非標準のRVDを使用して、標的部位に結合するように設計することができる。例えば、米国特許第8,586,526および第9,458,205号を参照されたい。

いくつかの態様では、「TALEヌクレアーゼ」（TALEN）は、典型的には転写活性化因子様エフェクター（TALE）に由来する核酸結合ドメインと核酸標的配列を開裂させるヌクレアーゼ触媒ドメインを含む融合タンパク質である。触媒ドメインは、ヌクレアーゼドメイン、またはエンドヌクレアーゼ活性を有するドメイン、例えばI-TevI、ColE7、NucA、およびFok-Iなどを含む。特定の態様では、TALEドメインは、メガヌクレアーゼ、例えばI-CreIおよびI-OnuIまたはそれらの機能的バリアントなどに融合させることができる。いくつかの態様では、TALENは単量体のTALENである。単量体のTALENは、特異的な認識および開裂のための二量体化、例えば、操作されたTAL反復とWO2012138927に記載されているI-TevIの触媒ドメインとの融合を必要としないTALENである。TALENは遺伝子ターゲティングおよび遺伝子改変について記載されており、使用されている（例えば、Boch et al. (2009) Science 326(5959): 1509-12；Moscou and Bogdanove (2009) Science 326(5959): 1501；Christian et al. (2010) Genetics 186(2): 757-61；Li et al. (2011) Nucleic Acids Res 39(1): 359-72を参照されたい）。いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座、TRACおよび/またはTRBCにおける1つまたは複数の部位は、操作されたTALENによる遺伝子破壊のための標的にされ得る。

いくつかの態様では、「TtAgo」は遺伝子サイレンシングに関与すると考えられている原核性アルゴノートタンパク質である。TtAgoは細菌サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）に由来する。例えば、Swarts et al (2014) Nature 507(7491): 258-261; G. Sheng et al., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 652を参照されたい。「TtAgoシステム」は、TtAgo酵素による開裂のためのガイドDNAを含めた、必要とされるすべての成分のことである。

いくつかの態様では、操作されたジンクフィンガータンパク質、TALEタンパク質、またはCRISPR/Casシステムは天然に見られず、それらの製造は、主として、ファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選抜などの実験的なプロセスから生じる。例えば、米国特許第5,789,538号；米国特許第5,925,523号；米国特許第6,007,988号；米国特許第6,013,453号；米国特許第6,200,759号；WO95/19431；WO96/06166；WO98/53057；WO98/54311；WO00/27878；WO01/60970；WO01/88197およびWO02/099084を参照されたい。

ジンクフィンガーおよびTALE DNA結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガータンパク質の認識ヘリックス領域の操作（1つもしくは複数のアミノ酸の変更）を介して、またはDNA結合に関与するアミノ酸（反復可変2残基もしくはRVD領域）を操作することによって、所定のヌクレオチド配列に結合するように操作され得る。したがって、操作されたジンクフィンガータンパク質またはTALEタンパク質は、天然に存在しないタンパク質である。ジンクフィンガータンパク質およびTALEを操作するための方法の非限定例は、設計および選択である。設計されたタンパク質は、その設計/組成物が合理的な判断基準からもたらされる、天然に存在しないタンパク質である。設計のための合理的な判断基準は、置換ルール、ならびに既存のZFPまたはTALEの設計（標準および非標準のRVD）ならびに結合データの情報を格納するデータベース中の情報を処理するためのコンピュータ化アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第9,458,205号；第8,586,526号；第6,140,081号；第6,453,242号；および第6,534,261号を参照されたい。WO98/53058；WO98/53059；WO98/53060；WO02/016536、およびWO03/016496も参照されたい。

ゲノムDNAの標的開裂のための様々な方法および組成物は記載されている。そのような標的開裂イベントを使用して、例えば、標的変異誘発を誘導すること、細胞のDNA配列の標的欠失を誘導すること、および所定の染色体座での標的組換えを推進することができる。例えば、その開示が、参照によりその全体が組み入れられる、米国特許第9,255,250号；第9,200,266号；第9,045,763号；第9,005,973号；第9,150,847号；第8,956,828号；第8,945,868号；第8,703,489号；第8,586,526号；第6,534,261号；第6,599,692号；第6,503,717号；第6,689,558号；第7,067,317号；第7,262,054号；第7,888,121号；第7,972,854号；第7,914,796号；第7,951,925号；第8,110,379号；第8,409,861；米国特許公報第20030232410号；第20050208489号；第20050026157号；第20050064474号；第20060063231号；第20080159996号；第201000218264号；第20120017290号；第20110265198号；第20130137104号；第20130122591号；第20130177983号；第20130196373号；第20140120622号；第20150056705号；第20150335708号；第20160030477号、および第20160024474号を参照されたい。

a. CRISPR/Cas9
いくつかの態様において、ヒトにおける内在性遺伝子T細胞刺激関連遺伝子座、TRACおよび/またはTRBCの標的遺伝子破壊、例えばDNA切断は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）（CRISPR）およびCRISPR関連（Cas）タンパク質を用いて実施される。Sander and Joung (2014) Nature Biotechnology, 32(4): 347-355を参照されたい。

一般に、「CRISPRシステム」は、CRISPR関連（「Cas」）遺伝子の発現またはその活性を方向づけることに関与する転写物および他のエレメントを、Cas遺伝子をコードする配列、tracr（トランス活性化CRISPR）配列（例えば、tracr RNAまたは活性を有する部分的tracr RNA）、tracrメイト配列（内在性CRISPRシステムの状況において「直列反復配列」およびtracr RNAのプロセシングを受けた部分的直列反復配列を包含する）、ガイド配列（内在性CRISPRシステムの状況において「スペーサー」とも称される）、および/またはCRISPR遺伝子座由来の他の配列および転写物を含めて、ひとまとめにして指す。

いくつかの局面において、CRISPR/CasヌクレアーゼまたはCRISPR/Casヌクレアーゼシステムは、配列特異的にDNAに結合する非コードガイドRNA（gRNA）と、ヌクレアーゼの機能性を有するCasタンパク質（例えば、Cas9）とを含む。

また、遺伝子破壊を導入することができる1つまたは複数の作用物質も提供される。また、遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質の1つまたは複数の成分をコードするポリヌクレオチド（例えば、核酸分子）も提供される。

(i) ガイドRNA（gRNA）
いくつかの態様において、遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質は、T細胞刺激関連遺伝子座、TRACおよび/またはTRBCの標的部位と相補的であるターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）またはgRNAをコードする少なくとも1つの核酸のうちの少なくとも1つを含む。

いくつかの局面において、「gRNA分子」とは、細胞のゲノムDNA上の遺伝子座などの標的核酸に対する、gRNA分子/Cas9分子複合体の特異的なターゲティングまたはホーミング（homing）を促進する核酸である。gRNA分子は、時には本明細書において「キメラ」gRNAと称される、（単一RNA分子を有する）単分子、または（1つよりも多い、典型的には2つの別々のRNA分子を含む）モジュラーであることができる。一般に、ガイド配列、例えば、ガイドRNAは、標的部位で標的配列とハイブリダイズし、標的配列に対するCRISPR複合体の配列特異的結合を導くのに十分な相補性を、例えばヒトにおけるT細胞刺激関連遺伝子座、TRACおよび/またはTRBCの、標的ポリヌクレオチド配列と有する少なくとも配列部分を含む、任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの態様では、CRISPR複合体の形成の状況において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計され、標的配列とガイドRNAのドメイン、例えばターゲティングドメインとの間のハイブリダイゼーションがCRISPR複合体の形成を促進する、配列である。ハイブリダイゼーションを引き起こし、CRISPR複合体の形成を促進するのに十分な相補性があるという条件で、完全な相補性は必ずしも必要とされない。一般に、ガイド配列は、ガイド配列内の二次構造の程度を低減させるように選択される。二次構造は、任意の適しているポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムによって決定され得る。

いくつかの態様では、関心対象の標的遺伝子座（例えば、ヒトにおけるT細胞刺激関連遺伝子座、TRACおよび/またはTRBC）に特異的なガイドRNA（gRNA）が、標的部位または標的位置でDNA切断を誘導するために、RNA誘導型ヌクレアーゼ、例えばCasに対して用いられる。gRNAおよび例示的なターゲティングドメインを設計するための方法には、例えば、国際PCT公開公報番号WO2015/161276、WO2017/193107、およびWO2017/093969に記載されているものが含まれる。

ドメインがその上に示されるいくつかの例示的なgRNA構造が、WO2015/161276に、例えばその中の図1A～1Gに記載されている。理論に拘束されることは望まないが、gRNAの活性型の三次元形態、または鎖内もしくは鎖間相互作用に関して、高い相補性の領域は、WO2015/161276において、例えばその中の図1A～1G、および本明細書で提供される他の描写において、時には二重鎖として示される。

場合によっては、gRNAは、5'から3'へ、T細胞刺激関連遺伝子座、TRACおよび/またはTRBC遺伝子由来の配列などの、標的核酸に相補的であるターゲティングドメイン；第1の相補性ドメイン；連結ドメイン；第2の相補性ドメイン（第1の相補性ドメインに相補的である）；近位ドメイン；および任意で、尾部ドメイン、を含む、単分子またはキメラのgRNAである。

場合によっては、gRNAは、第1および第2の鎖を含むモジュラーgRNAである。これらの場合に、第1の鎖は、好ましくは、5'から3'へ、ターゲティングドメイン（T細胞刺激関連遺伝子座、TRACおよび/またはTRBC遺伝子由来の配列などの、標的核酸に相補的である）および第1の相補性ドメインを含む。第2の鎖は、一般に、5'から3'へ、任意で、5'延長ドメイン；第2の相補性ドメイン；近位ドメイン；および任意で、尾部ドメイン、を含む。

(a) ターゲティングドメイン
ターゲティングドメインは、標的核酸上の標的配列に相補的である、例えば、少なくとも80、85、90、95、98、または99％相補的である、例えば、完全に相補的である、ヌクレオチド配列を含む。標的配列を含む標的核酸の鎖は、本明細書において標的核酸の「相補鎖」と称される。ターゲティングドメインの選択についてのガイダンスは、例えば、Fu et al., Nat Biotechnol 2014 Mar;32(3):279-284)およびSternberg et al., Nature 2014, 507:62-67に見出すことができる。ターゲティングドメインの配置の例には、WO2015/161276に、例えばその中の図1A～1Gに記載されているものが含まれる。

ターゲティングドメインは、RNA分子の一部であり、したがって、塩基ウラシル（U）を含むが、gRNA分子をコードする任意のDNAは塩基チミン（T）を含む。理論に拘束されることは望まないが、いくつかの態様では、ターゲティングドメインと標的配列との相補性が、gRNA分子/Cas9分子複合体と標的核酸との相互作用の特異性に寄与すると考えられる。ターゲティングドメインと標的配列との対において、ターゲティングドメイン中のウラシル塩基は、標的配列中のアデニン塩基と対形成することが理解される。いくつかの態様では、標的ドメインそれ自体が、5'から3'への方向で、任意の二次ドメインおよびコアドメインを含む。いくつかの態様において、コアドメインは、標的配列と完全に相補的である。いくつかの態様において、ターゲティングドメインは、5～50ヌクレオチドの長さである。ターゲティングドメインが相補的である標的核酸の鎖は、本明細書において相補鎖と称される。ドメインのヌクレオチドのいくつかまたはすべては、例えば、分解を受けにくくする、生体適合性を改善するなどの、修飾を有し得る。非限定的な例として、標的ドメインの骨格は、ホスホロチオエートまたは他の修飾で修飾することができる。場合によっては、ターゲティングドメインのヌクレオチドは、2'修飾、例えば、2-アセチル化、例えば、2'メチル化、または他の修飾を含むことができる。

様々な態様において、ターゲティングドメインは、16～26ヌクレオチドの長さである（すなわち、これは、16ヌクレオチドの長さ、または17ヌクレオチドの長さ、または18、19、20、21、22、23、24、25、もしくは26ヌクレオチドの長さである）。

(b) 例示的なターゲティングドメイン
いくつかの態様において、T細胞刺激関連遺伝子座、TRACおよび/またはTRBCなどの特定の遺伝子中の標的部位を標的とするターゲティングドメイン配列であるかまたはそれを含むgRNA配列が、設計されるか、または特定される。CRISPRゲノム編集のためのゲノムワイドのgRNAデータベースが、公的に利用可能であり、これは、ヒトゲノムまたはマウスゲノム中の遺伝子の構成的エクソンを標的とする例示的なシングルガイドRNA（sgRNA）配列を含有する（例えば、genescript.com/gRNA-database.htmlを参照されたい；Sanjana et al. (2014) Nat. Methods, 11:783-4もまた参照されたい）。いくつかの局面において、gRNA配列は、非標的部位または位置に対して最小のオフターゲット結合を有する配列であるか、またはそれを含む。

いくつかの態様では、標的配列（標的ドメイン）は、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCの任意の一部などの、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCにまたはその近くにある。いくつかの態様では、ターゲティングドメインに相補的な標的核酸は、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCなどの、関心対象の遺伝子の初期コード領域に位置する。初期コード領域のターゲティングは、関心対象の遺伝子の遺伝子破壊（すなわち、その発現の排除）に用いることができる。いくつかの態様では、関心対象の遺伝子の初期コード領域は、開始コドン（例えば、ATG）の直後、または開始コドンの500 bp以内（例えば、500、450、400、350、300、250、200、150、100、50bp、40bp、30bp、20bp、もしくは10bp未満）の配列を含む。特定の例では、標的核酸は、開始コドンの200bp、150bp、100bp、50bp、40bp、30bp、20bp、または10bp以内である。いくつかの例では、gRNAのターゲティングドメインは、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBC中の標的核酸などの、標的核酸上の標的配列に相補的である、例えば、少なくとも80、85、90、95、98、または99％相補的である、例えば、完全に相補的である。いくつかの態様では、ターゲティングドメインは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCの内在性の内在性転写制御エレメント、例えばプロモーターの下流に、および/またはその近くに位置する。

いくつかの態様では、gRNAは、例えば、組換え受容体をコードする、導入遺伝子の標的組み込みの望ましい部位の近くの、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCの部位をターゲティングすることができる。いくつかの局面では、gRNAは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCの制御に類似した様式、時間、および程度での、組換え受容体の発現の制御のために望ましい、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCをコードする配列の量に基づく部位をターゲティングすることができる。いくつかの局面では、gRNAは、組換え受容体を発現する細胞における発現のために望ましい、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCをコードする配列の量に基づく部位をターゲティングすることができる。いくつかの局面では、gRNAは、例えば、組換え受容体をコードする、導入遺伝子配列の組み込みの際に、結果として生じたT細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCが、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCによってコードされる内在性遺伝子産物の発現を保持するように、部位をターゲティングすることができる。いくつかの局面では、内在性遺伝子産物は、gRNAによるターゲティングおよびその後のHDRに続いて、発現されない（例えば、ノックアウトされる）。いくつかの局面では、gRNAは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCのオープンリーディングフレームのエクソン内の部位をターゲティングすることができる。いくつかの局面では、gRNAは、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCのオープンリーディングフレームのイントロン内の部位をターゲティングすることができる。いくつかの局面では、gRNAは、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCの制御または調節エレメント、例えばプロモーター内の、またはその下流の部位をターゲティングすることができる。いくつかの局面では、gRNAによってターゲティングされるT細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCの標的部位は、本明細書に、例えばセクションII.A.1に記載される任意の標的部位であることができる。いくつかの態様では、gRNAは、初期コード領域に対応するエクソン、例えば、内在性T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCのオープンリーディングフレームのエクソン1、2、3、4、または5内のまたはそれに極めて近接した部位、あるいは、転写開始部位の直後の、エクソン1、2、3、4、もしくは5内の、またはエクソン1、2、3、4、もしくは5の500、450、400、350、300、250、200、150、100、もしくは50 bp未満以内の配列を含む部位をターゲティングすることができる。いくつかの態様では、gRNAは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBCのエクソン2もしくはその近くの部位、またはエクソン2の500、450、400、350、300、250、200、150、100、もしくは50 bp未満以内の部位をターゲティングすることができる。

T細胞刺激関連遺伝子座PDCD1のための例示的な標的配列は、SEQ ID NO:74、78、または98～103に示される配列を含む。例示的なgRNAは、SEQ ID NO:74、78、または98～103に示される標的部位配列に結合できるか、またはそれをターゲティングするか、またはそれに相補的であるか、またはその相補鎖配列に結合できる、リボ核酸の配列を含むことができる。例示的なPDCD1 gRNA配列は、SEQ ID NO:75または104～109に示される配列を含む。例示的なPDCD1 gRNA配列は、SEQ ID NO:75に示される配列を含む。公知の方法の任意を、内在性PDCD1の遺伝子破壊をターゲティングし、生成するために用いることができ、本明細書で提供される態様において用いることができる。ヒトPDCD1遺伝子座の遺伝子破壊をターゲティングするためのgRNA内に含有される例示的な標的配列またはターゲティングドメインは、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、WO2015/161276、WO2017/093969、Schumann et al., PNAS August 18, 2015 112 (33) 10437-10442、およびXu et al., Sci Rep. 2018; 8: 11649に記載されているものを含む。

例示的なT細胞刺激関連遺伝子座CD69のための例示的な標的配列は、SEQ ID NO:110～115に示される配列を含む。例示的なgRNAは、SEQ ID NO:110～115に示される標的部位配列に結合できるか、またはそれをターゲティングするか、またはそれに相補的であるか、またはその相補鎖配列に結合できる、リボ核酸の配列を含むことができる。例示的なCD69 gRNA配列は、SEQ ID NO:116～121に示される配列を含む。公知の方法の任意を、内在性CD69の遺伝子破壊をターゲティングし、生成するために用いることができ、本明細書で提供される態様において用いることができる。ヒトCD69遺伝子座の遺伝子破壊をターゲティングするためのgRNA内に含有される例示的な標的配列またはターゲティングドメインは、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Simenov et al., Nature. 2017 Sep 7; 549(7670): 111-115に記載されているものを含む。

例示的なT細胞刺激関連遺伝子座Nur77（NR4A1）のための例示的な標的配列は、SEQ ID NO:122～127または134～136に示される配列を含む。例示的なgRNAは、SEQ ID NO:122～127または134～136に示される標的部位配列に結合できるか、またはそれをターゲティングするか、またはそれに相補的であるか、またはその相補鎖配列に結合できる、リボ核酸の配列を含むことができる。例示的なNur77（NR4A1）gRNA配列は、SEQ ID NO:128～133または136～138に示される配列を含む。公知の方法の任意を、内在性Nur77（NR4A1）の遺伝子破壊をターゲティングし、生成するために用いることができ、本明細書で提供される態様において用いることができる。ヒトNur77（NR4A1）遺伝子座の遺伝子破壊をターゲティングするためのgRNA内に含有される例示的な標的配列またはターゲティングドメインは、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、WO 2019/089982、WO 2019/104245、およびMunnur et al., Cell Reports (2019) 26, 2028-2036に記載されているものを含む。

例示的なT細胞刺激関連遺伝子座FoxP3のための例示的な標的配列は、SEQ ID NO:140～147に示される配列を含む。例示的なgRNAは、SEQ ID NO:140～147に示される標的部位配列に結合できるか、またはそれをターゲティングするか、またはそれに相補的であるか、またはその相補鎖配列に結合できる、リボ核酸の配列を含むことができる。例示的なFoxP3 gRNA配列は、SEQ ID NO:148～155に示される配列を含む。公知の方法の任意を、内在性FoxP3の遺伝子破壊をターゲティングし、生成するために用いることができ、本明細書で提供される態様において用いることができる。ヒトFoxP3遺伝子座の遺伝子破壊をターゲティングするためのgRNA内に含有される例示的な標的配列またはターゲティングドメインは、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Okada et al., Epigenetics Chromatin. 2017; 10: 24およびHolohan et al., bioRxiv 644229に記載されているものを含む。

例示的なT細胞刺激関連遺伝子座HLA-DRAのための例示的な標的配列は、SEQ ID NO:156～161に示される配列を含む。例示的なgRNAは、SEQ ID NO:156～161に示される標的部位配列に結合できるか、またはそれをターゲティングするか、またはそれに相補的であるか、またはその相補鎖配列に結合できる、リボ核酸の配列を含むことができる。例示的なHLA-DRA gRNA配列は、SEQ ID NO:162～167に示される配列を含む。公知の方法の任意を、内在性HLA-DRAの遺伝子破壊をターゲティングし、生成するために用いることができ、本明細書で提供される態様において用いることができる。ヒトHLA-DRA遺伝子座の遺伝子破壊をターゲティングするためのgRNA内に含有される例示的な標的配列またはターゲティングドメインは、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、WO 2016/021972およびWO 2017/093969に記載されているものを含む。

例示的なT細胞刺激関連遺伝子座HLA-DRB1のための例示的な標的配列は、SEQ ID NO:168～177に示される配列を含む。例示的なgRNAは、SEQ ID NO:168～177に示される標的部位配列に結合できるか、またはそれをターゲティングするか、またはそれに相補的であるか、またはその相補鎖配列に結合できる、リボ核酸の配列を含むことができる。例示的なHLA-DRB1 gRNA配列は、SEQ ID NO:178～187に示される配列を含む。公知の方法の任意を、内在性HLA-DRB1の遺伝子破壊をターゲティングし、生成するために用いることができ、本明細書で提供される態様において用いることができる。ヒトHLA-DRB1遺伝子座の遺伝子破壊をターゲティングするためのgRNA内に含有される例示的な標的配列またはターゲティングドメインは、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、WO 2016/021972およびWO 2017/093969に記載されているものを含む。

ヒトTRAC、TRBC1、またはTRBC2の遺伝子破壊をターゲティングするためのgRNA名に含有される例示的なターゲティングドメインは、例えば、WO2015/161276、WO2017/193107、WO2017/093969、WO2019/195492、US2016/272999、およびUS2015/056705に記載されているもの、または前述に記載されている標的配列に結合することができるターゲティングドメインを含む。化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）または黄色ブドウ球菌（S.aureus）のCas9を用いてヒトTRAC遺伝子座の遺伝子破壊をターゲティングするためのgRNA内に含有される例示的なターゲティングドメインは、SEQ ID NO:77および188～218に示されるもののいずれかを含むことができる。化膿性連鎖球菌または黄色ブドウ球菌のCas9を用いてヒトTRBC1またはTRBC2遺伝子座の遺伝子破壊をターゲティングするためのgRNA内に含有される例示的なターゲティングドメインは、SEQ ID NO:219～276に示されるもののいずれかを含むことができる。

いくつかの態様では、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2をターゲティングするためのgRNAは、本明細書に記載されているか、もしくは他の箇所、例えば、WO2015/161276、WO2017/193107、WO2017/093969、WO2019/195492、US2016/272999、およびUS2015/056705に記載されているいずれか、または前述に記載されている標的配列に結合することができるターゲティングドメインを含む。いくつかの態様では、TRAC遺伝子座をターゲティングするためのgRNAは、配列

（SEQ ID NO:277に示される；太字かつ下線の部分は、TRAC遺伝子座中の標的部位に相補的である）のインビトロ転写によって得ることができるか、または化学的に合成することができ、gRNAは、配列

（SEQ ID NO:278に示される；Osborn et al., Mol Ther. 24(3):570-581 (2016)を参照されたい）を有していた。TCRドメインまたは領域、例えば、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2をコードする内在性遺伝子の遺伝子破壊を生成するための他の例示的なgRNA配列は、例えば、WO2015/161276、WO2017/193107、WO2017/093969、WO2019/195492、US2016/272999、およびUS2015/056705に記載されている。

内在性TCR遺伝子座の遺伝子編集のための例示的な方法は、例えば、米国公開番号US2011/0158957、US2014/0301990、US2015/0098954、US2016/0208243、US2016/272999、およびUS2015/056705；国際PCT公開番号WO2014/191128、WO2015/136001、WO2015/161276、WO2016/069283、WO2016/016341、WO2017/193107、およびWO2017/093969；ならびにOsborn et al. (2016) Mol. Ther. 24(3):570-581に記載されているものを含む。公知の方法の任意を、TCRドメインまたは領域をコードする内在性遺伝子の遺伝子破壊を生成するために用いることができ、本明細書で提供される態様において用いることができる。

いくつかの態様では、ターゲティングドメインは、化膿性連鎖球菌Cas9を用いてまたは髄膜炎菌（N. meningitidis）Cas9を用いて、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2遺伝子座に遺伝子破壊を導入するためのものを含む。いくつかの態様では、ターゲティングドメインは、化膿性連鎖球菌Cas9を用いて、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2遺伝子座に遺伝子破壊を導入するためのものを含む。ターゲティングドメインの任意を、二本鎖切断（Cas9ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Cas9ニッカーゼ）を生成する化膿性連鎖球菌Cas9分子と共に用いることができる。

いくつかの態様では、二重ターゲティングを用いて、逆DNA鎖に相補的である2つのターゲティングドメインを有する化膿性連鎖球菌のCas9ニッカーゼを用いることによって逆DNA鎖上に2つのニックを作製し、例えば、任意のマイナス鎖ターゲティングドメインを含むgRNAは、プラス鎖ターゲティングドメインを含む任意のgRNAと対形成することができる。いくつかの態様では、2つのgRNAは、PAMが外側に向き、gRNAの5'末端間の距離が0～50bpであるように、DNA上に配向される。いくつかの態様では、2つのgRNAは、例えば、標的ドメインの逆鎖上の2つの一本鎖切断で標的ドメインを開裂させるように、2つの異なるgRNA分子によってガイドされる1対のCas9分子/gRNA分子複合体を用いて、2つのCas9ヌクレアーゼまたは2つのCas9ニッカーゼをターゲティングするために用いられる。いくつかの態様では、2つのCas9ニッカーゼは、HNH活性を有する分子、例えば、RuvC活性が不活性化したCas9分子、例えば、D10での変異、例えばD10A変異を有するCas9分子、RuvC活性を有する分子、例えば、HNH活性が不活性化したCas9分子、例えば、H840での変異、例えばH840Aを有するCas9分子、またはRuvC活性を有する分子、例えば、HNH活性が不活性化したCas9分子、例えば、N863での変異、例えばN863Aを有するCas9分子を含むことができる。いくつかの態様では、2つのgRNAの各々は、D10A Cas9ニッカーゼと複合体化される。

いくつかの態様では、標的配列（標的ドメイン）は、例えば、本明細書における表1～9に記載される、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2コード配列の任意の一部などの、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2遺伝子座にまたはその近くにある。いくつかの態様では、ターゲティングドメインに相補的な標的核酸は、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2などの、関心対象の遺伝子の初期コード領域に位置する。初期コード領域のターゲティングは、関心対象の遺伝子の遺伝子破壊（すなわち、その発現の排除）に用いることができる。いくつかの態様では、関心対象の遺伝子の初期コード領域は、開始コドン（例えば、ATG）の直後、または開始コドンの500 bp以内（例えば、500、450、400、350、300、250、200、150、100、50bp、40bp、30bp、20bp、もしくは10bp未満）の配列を含む。特定の例では、標的核酸は、開始コドンの200bp、150bp、100bp、50bp、40bp、30bp、20bp、または10bp以内である。いくつかの例では、gRNAのターゲティングドメインは、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2中の標的核酸などの、標的核酸上の標的配列に相補的である、例えば、少なくとも80、85、90、95、98、または99％相補的である、例えば、完全に相補的である。

いくつかの局面では、gRNAは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2のオープンリーディングフレームのエクソン内の部位をターゲティングすることができる。いくつかの局面では、gRNAは、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2のオープンリーディングフレームのイントロン内の部位をターゲティングすることができる。いくつかの局面では、gRNAは、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2の制御または調節エレメント、例えばプロモーター内の部位をターゲティングすることができる。いくつかの局面では、gRNAによってターゲティングされるT細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2の標的部位は、本明細書に、例えばセクションII.A.1に記載される任意の標的部位であることができる。いくつかの態様では、gRNAは、初期コード領域に対応するエクソン、例えば、内在性T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2のオープンリーディングフレームのエクソン1、2、または3内のまたはそれに極めて近接した部位、あるいは、転写開始部位の直後の、エクソン1、2、もしくは3内の、またはエクソン1、2、もしくは3の500、450、400、350、300、250、200、150、100、もしくは50 bp未満以内の配列を含む部位をターゲティングすることができる。いくつかの態様では、gRNAは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2のエクソン2もしくはその近くの部位、またはエクソン2の500、450、400、350、300、250、200、150、100、もしくは50 bp未満以内の部位をターゲティングすることができる。

いくつかの態様では、ターゲティングドメインは、化膿性連鎖球菌Cas9を用いてまたは髄膜炎菌Cas9を用いて、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBC遺伝子に遺伝子破壊を導入するためのものを含む。いくつかの態様では、ターゲティングドメインは、化膿性連鎖球菌Cas9を用いて、T細胞刺激関連遺伝子座、TRAC、および/またはTRBC遺伝子に遺伝子破壊を導入するためのものを含む。ターゲティングドメインの任意を、二本鎖切断（Cas9ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Cas9ニッカーゼ）を生成する化膿性連鎖球菌Cas9分子と共に用いることができる。

相補性ドメイン、連結ドメイン、5'延長ドメイン、近位ドメイン、および尾部ドメインなどのgRNAの他のドメイン、ならびにそれらの構造は、例えば、WO2015/161276に、例えば、その中の図1A～1Gに記載されている。

ターゲティングドメインを選択する、設計する、および検証するための方法を含めて、gRNAを設計するための方法が、本明細書において記載される。例示的なターゲティングドメインもまた、本明細書において提供される。本明細書において論じられるターゲティングドメインは、本明細書に記載されるgRNA中に組み込むことができる。

標的配列の選択および検証ならびにオフターゲット解析のための方法は、例えば、Mali et al., 2013 Science 339(6121): 823-826；Hsu et al. Nat Biotechnol, 31(9): 827-32；Fu et al., Nat Biotechnol 2014 Mar;32(3):279-284；Heigwer et al., 2014 Nat Methods 11(2):122-3；Bae et al., Bioinformatics. 2014 May 15;30(10):1473-5；Xiao A et al., Bioinformatics. 2014 Apr 15;30(8):1180-1182に記載されている。

いくつかの態様では、使用者の標的配列内のgRNAの選択を最適化するために、例えば、ゲノム全体にわたる全オフターゲット活性を最小化するために、ソフトウェアツールを使用することができる。オフターゲット活性は開裂以外でもよい。例えば、化膿性連鎖球菌のCas9を使用する、考えられる各gRNA選択のために、ソフトウェアツールによって、ある特定の数（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10）までのミスマッチ塩基対を含むすべての潜在的なオフターゲット配列（NAGまたはNGG PAMのいずれかに先行する）をゲノム全体にわたって特定することができる。各オフターゲット配列における開裂効率は、例えば実験的に得られた重み付け（weighting）スキームを使用して、予測することができる。次いで、その全予測オフターゲット開裂に従って、考えられる各gRNAをランク付けすることができ；トップにランク付けされたgRNAは、最大のオンターゲットおよび最小のオフターゲット開裂を有する可能性があるものに相当する。他の機能、例えば、gRNAベクター構築のための自動化された試薬設計、オンターゲットSurveyorアッセイのためのプライマー設計、および次世代シーケンシングを介したオフターゲット開裂のハイスループットな検出および定量化のためのプライマー設計もツールに含まれ得る。候補gRNA分子は、技術分野で公知の方法によって、または本明細書において記載されるように、評価することができる。

いくつかの態様では、化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、および髄膜炎菌のCas9とともに使用するためのgRNAは、DNA配列検索アルゴリズムを使用して、例えば、公的なツールcas-offinder（Bae et al. Bioinformatics. 2014；30(10): 1473-1475）に基づくカスタムgRNA設計ソフトウェアを使用して、特定される。カスタムgRNA設計ソフトウェアは、ガイドのゲノムワイドなオフターゲット傾向を計算した後に、ガイドをスコア化する。典型的には、完全なマッチから7ミスマッチに及ぶマッチが、17～24の長さにわたるガイドについて考慮される。いくつかの局面では、一旦オフターゲット部位が計算的に決定されると、総スコアが各ガイドについて計算され、webインタフェースを使用して表形式出力にまとめられる。PAM配列に隣接する潜在的なgRNA部位の特定に加えて、ソフトウェアは、選択されたgRNA部位と1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のヌクレオチドが異なる、すべてのPAM隣接配列を特定することもできる。いくつかの態様では、各遺伝子に対するゲノムDNA配列がUCSC Genome browserから得られ、公的に利用可能なRepeatMaskerプログラムを使用して、反復エレメントについて配列をスクリーニングすることができる。RepeatMaskerは、反復エレメントおよび低複雑度領域について入力DNA配列を検索する。出力は、所与のクエリ配列中に存在する反復の詳細なアノテーションである。

特定した後、標的部位へのそれらの距離、それらの直交性、および5'Gの存在の1つまたは複数に基づいて、gRNAを階層にランク付けすることができる（関連するPAM、例えば、化膿性連鎖球菌の場合はNGG PAM、黄色ブドウ球菌の場合はNNGRR（例えば、NNGRRTまたはNNGRRV）PAM、および髄膜炎菌の場合はNNNNGATTまたはNNNNGCTT PAMを含むヒトゲノムにおける厳密なマッチの特定に基づく）。直交性は、標的配列に対して最小数のミスマッチを含む、ヒトゲノム中の配列の数を指す。「高レベルの直交性」または「良好な直交性」は、例えば、意図された標的を除いて、ヒトゲノム中に同一の配列を有さず、標的配列中に1つまたは2つのミスマッチを含むいかなる配列も有さない、20-merのターゲティングドメインを指すことができる。良好な直交性を有するターゲティングドメインは、オフターゲットDNA開裂を最小化するために選択される。これは非限定例であること、ならびに化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、および髄膜炎菌または他のCas9酵素とともに使用するためのgRNAを特定するために、様々なストラテジーを利用することができることを理解されたい。

いくつかの態様では、化膿性連鎖球菌のCas9とともに使用するためのgRNAは、公的に利用可能なwebベースのZiFiTサーバー（Fu et al., Nat Biotechnol 2014 Mar;32(3):279-284、元の参考文献については、Sander et al., 2007, NAR 35:W599-605；Sander et al., 2010, NAR 38: W462-8を参照されたい）を使用して特定することができる。PAM配列に隣接する潜在的なgRNA部位の特定に加えて、該ソフトウェアは、選択されたgRNA部位と1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のヌクレオチドが異なるすべてのPAM隣接配列も特定する。いくつかの局面では、各遺伝子に対するゲノムDNA配列は、UCSC Genome browserから得ることができ、公的に利用可能なRepeat-Maskerプログラムを使用して、反復エレメントについて配列をスクリーニングすることができる。RepeatMaskerは、反復エレメントおよび低複雑度の領域について入力DNA配列を検索する。出力は、所与のクエリ配列中に存在する反復の詳細なアノテーションである。

(ii) Cas9
本明細書において記載される方法および組成物において、様々な種のCas9分子を使用することができる。化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、髄膜炎菌、およびS.サーモフィラスのCas9分子が本明細書の開示の多くの対象であるが、本明細書において列挙される他の種のCas9タンパク質のCas9分子、該Cas9タンパク質に由来するCas9分子、該Cas9タンパク質に基づいたCas9分子も同様に使用することができる。換言すれば、本明細書における説明の多くは、化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、髄膜炎菌、およびS.サーモフィラスのCas9分子を使用するが、他の種由来のCas9分子は、それらに取って代わることができる。そのような種としては、以下が挙げられる：アシドボラクス・アベナエ（Acidovorax avenae）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Actinobacillus succinogenes）、アクチノバチルス・スイス（Actinobacillus suis）、アクチノミセス属種（Actinomyces sp.）、シクリフィルスデニトリフィカンス（Cycliphilusdenitrificans）、アミノモナス・パウシボランス（Aminomonas paucivorans）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・スミシイ（Bacillus smithii）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、バクテロイデス属種（Bacteroides sp.）、ブラストピレルラ・マリナ（Blastopirellula marina）、ブラディリゾビウム属種（Bradyrhizobium sp.）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Brevibacillus laterosporus）、カンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、カンピロバクター・ラリ（Campylobacter lari）、カンジダツス・プニセイスピリルム（Candidatus puniceispirillum）、クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、コリネバクテリウム・アクコレンス（Corynebacterium accolens）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheria）、コリネバクテリウム・マツルショッティ（Corynebacterium matruchotii）、ディノロセオバクター・シバエ（Dinoroseobacter shibae）、ユーバクテリウム・ドリクム（Eubacterium dolichum）、ガンマプロテオ細菌（Gammaproteobacterium）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Gluconacetobacter diazotrophicus）、ヘモフィルス・パラインフルエンザ（Haemophilus parainfluenzae）、ヘモフィルス・スプトルム（Haemophilus sputorum）、ヘリコバクター・カナデンシス（Helicobacter canadensis）、ヘリコバクター・シネディ（Helicobacter cinaedi）、ヘリコバクター・ムステラエ（Helicobacter mustelae）、イリオバクター・ポリトロパス（Ilyobacter polytropus）、キンゲラ・キンゲ（Kingella kingae）、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）、リステリア・イバノビイ（Listeria ivanovii）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、リステリア科細菌（Listeriaceae bacterium）、メチロシスティス属種（Methylocystis sp.）、メチロサイナス・トリコスポリウム（Methylosinus trichosporium）、モビルンカス・ムリエリス（Mobiluncus mulieris）、ナイセリア・バシリフォルミス（Neisseria bacilliformis）、ナイセリア・シネレア（Neisseria cinerea）、ナイセリア・フラベッセンス（Neisseria flavescens）、ナイセリア・ラクタミカ（Neisseria lactamica）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、ナイセリア属種（Neisseria sp.）、ナイセリア・ワズワーシイ（Neisseria wadsworthii）、ニトロソモナス属種（Nitrosomonas sp.）、パルビバクラム・ラバメンチボランス（Parvibaculum lavamentivorans）、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）、ファスコラルクトバクテリウム・スクシナツテンス（Phascolarctobacterium succinatutens）、ラルストニア・シジジイ（Ralstonia syzygii）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ロドブラム属種（Rhodovulum sp.）、シモンシエラ・ムエレリ（Simonsiella muelleri）、スフィンゴモナス属種（Sphingomonas sp.）、スポロラクトバチルス・ビネエ（Sporolactobacillus vineae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Staphylococcus lugdunensis）、ストレプトコッカス属種（Streptococcus sp.）、サブドリグラヌルム属種（Subdoligranulum sp.）、ティストレラ・モビリス（Tistrella mobilis）、トレポネーマ属種（Treponema sp.）、またはベルミネフォロバクター・エイセニエ（Verminephrobacter eiseniae）。Cas9分子の例としては、例えば、WO2015/161276、WO2017/193107、WO2017/093969、US2016/272999、およびUS2015/056705に記載されているものを挙げることができる。

Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、この用語が本明細書において使用される場合、gRNA分子と相互作用することができ、gRNA分子と協調して、標的ドメインおよびPAM配列を含む部位に向かうかまたは局在化する、分子またはポリペプチドを指す。Cas9分子およびCas9ポリペプチドは、これらの用語が本明細書において使用される場合、天然に存在するCas9分子、および参照配列、例えば、最も類似した天然に存在するCas9分子と少なくとも1つのアミノ酸残基が異なる、操作された、変更された、または改変されたCas9分子またはCas9ポリペプチドを指す。

2つの異なる天然に存在する細菌性Cas9分子（Jinek et al., Science, 343(6176):1247997, 2014）について、およびガイドRNA（例えば、crRNAとtracrRNAの合成的融合体）を有する化膿性連鎖球菌Cas9（Nishimasu et al., Cell, 156:935-949, 2014；およびAnders et al., Nature, 2014 Sep 25;513(7519):569-73）について、結晶構造が決定されている。

例示的なCas9分子、その構造、およびバリアントは、例えば、WO2015/161276、例えば、その中の図2A～2Gおよび8A～8B、ならびにWO2017/193107、WO2017/093969、US2016/272999、およびUS2015/056705に記載されているものを含む。

本明細書において提供される態様のいずれかに関して、Cas9分子またはCas9ポリペプチド、例えば、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドをコードする核酸を使用することができる。

Cas9分子またはCas9ポリペプチドをコードする例示的な核酸は、Cong et al., Science 2013, 399(6121):819-823；Wang et al., Cell 2013, 153(4):910-918；Mali et al., Science 2013, 399(6121):823-826；Jinek et al., Science 2012, 337(6096):816-821、およびWO2015/161276、例えばその中の図8に記載されている。

いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドをコードする核酸は、合成核酸配列でもよい。例えば、合成核酸分子は化学的に修飾されていてもよい。いくつかの態様では、Cas9 mRNAは、以下の特性の1つまたは複数（例えば、すべて）を有する:Cas9 mRNAは、キャップされている、ポリアデニル化されている、5-メチルシチジンおよび/またはプソイドウリジンで置換されている。さらに、または代わりに、合成核酸配列をコドン最適化することができ、例えば、少なくとも1つの非共通コドンまたはあまり共通していないコドンが共通コドンに置き換えられている。例えば、合成核酸は、例として、例えば本明細書において記載される哺乳類発現システムにおける発現について最適化された、最適化されたメッセンジャーmRNAの合成を導くことができる。さらに、または代わりに、Cas9分子またはCas9ポリペプチドをコードする核酸は、核局在化配列（NLS）を含むことができる。核局在化配列は公知である。

いくつかの態様では、Cas9分子は、SEQ ID NO:279～287のいずれかであるかもしくはそれを含む配列、またはSEQ ID NO:112～117のいずれかに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示す配列を含む。例示的なCas9分子には、化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、または髄膜炎菌のCas9分子が含まれる。いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、生物学的に活性な分子、例えば、本明細書に記載される少なくとも1つの活性を有するCas9分子を提供するのに十分な追加のCas9分子配列と共に、領域1～5を含む。いくつかの態様では、領域1～6の各々は、独立して、本明細書に記載される、例えば、SEQ ID NO:279～287に示されるCas9分子もしくはCas9ポリペプチドの、またはWO2015/161276に開示される、例えば、その中の図2A～2G由来または図7A～7B由来の配列の対応する残基と、50％、60％、70％、または80％の相同性を有する。

前述のCas9配列いずれかがペプチドまたはポリペプチドとC末端で融合される場合、終止コドンが除去されるであろうことが理解されよう。

本明細書において開示される本発明を実施するために、様々なタイプのCas分子またはCasポリペプチドを使用することができる。いくつかの態様では、タイプII CasシステムのCas分子が使用される。他の態様では、他のCasシステムのCas分子が使用される。例えば、タイプIまたはタイプIII Cas分子が使用され得る。例示的なCas分子（およびCasシステム）は、例えば、Haft et al., PLoS Computational Biology 2005, 1(6): e60およびMakarova et al., Nature Review Microbiology 2011, 9:467-477に記載されており、両方の参考文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。例示的なCas分子（およびCasシステム）は、例えば、WO2015/161276、WO2017/193107、WO2017/093969、US2016/272999、およびUS2015/056705に記載されているものを含む。

(iii) Cpf1
いくつかの態様では、ガイドRNAまたはgRNAは、細胞のゲノム配列またはエピソーム配列などの標的配列への、Cas9またはCpf1などのRNA誘導型ヌクレアーゼの特異的結合ターゲティングを促進する。一般に、gRNAは、単分子（単一RNA分子を含み、あるいはキメラと称される）またはモジュラー（1つより多い、典型的には2つの別々のRNA分子、例えば、crRNAおよびtracrRNAを含み、これらは、通常、いくつかの態様では二本鎖化によって互いに結合している）であり得る。gRNAおよびその構成要素は、いくつかの態様では、参照により組み入れられるBriner et al. Molecular Cell (2014) 56(2), 333-339において、文献全体にわたって記載されている。

ガイドRNAは、単分子であろうとモジュラーであろうと、一般に、完全にまたは部分的に標的に相補的であるターゲティングドメインを含み、典型的には、10～30ヌクレオチドの長さであり、ある特定の態様では、16～24ヌクレオチドの長さ（いくつかの態様では、16、17、18、19、20、21、22、23、または24ヌクレオチドの長さ）である。いくつかの局面では、ターゲティングドメインは、Cas9 gRNAの場合はgRNAの5'末端またはその近くにあり、Cpf1 gRNAの場合は3'末端またはその近くにある。前述の説明はCas9とともに使用するためのgRNAに着目してきたが、ここまでに説明したものといくつかの点で異なるgRNAを利用する他のRNA誘導型ヌクレアーゼが発見もしくは発明されている（または将来的に発見もしくは発明され得る）ことを理解されたい。いくつかの態様では、Cpf1（「CRISPR from Prevotella and Franciscella 1」）は、機能するためにtracrRNAを必要としない、最近発見されたRNA誘導型ヌクレアーゼである。（参照により本明細書に組み入れられるZetsche et al., 2015, Cell 163, 759-771）。Cpf1ゲノム編集システムで使用するためのgRNAは、一般に、ターゲティングドメインおよび相補性ドメイン（あるいは、「ハンドル」と称される）を含む。Cpf1とともに使用するためのgRNAでは、ターゲティングドメインは、Cas9 gRNAに関して上で述べた5'末端ではなく、通常3'末端またはその近くに存在する（ハンドルは、Cpf1 gRNAの5'末端またはその近くにある）ことも留意されたい。

異なる原核生物種由来のgRNAの間で、またはCpf1とCas9 gRNAの間で、構造的差異が存在する可能性があるが、gRNAが作動する原理は一般に一定である。作動のこの一貫性のために、gRNAをそのターゲティングドメイン配列によって大まかに定義することができ、当業者は、単分子もしくはキメラのgRNA、または1つもしくは複数の化学修飾および/もしくは配列修飾（置換、付加ヌクレオチド、トランケーションなど）を含むgRNAを含めた任意の適切なgRNAに、所与のターゲティングドメイン配列を組み込むことができることを認識するであろう。したがって、本開示のいくつかの局面では、gRNAは、単にそのターゲティングドメイン配列の点から記載され得る。

より一般的には、本開示のいくつかの局面は、複数のRNA誘導型ヌクレアーゼを使用して実行することができる、システム、方法、および組成物に関する。別段の指定がない限り、gRNAという用語は、Cas9またはCpf1の特定の種に適合するgRNAだけでなく、任意のRNA誘導型ヌクレアーゼとともに使用することができる任意の適切なgRNAを包含すると理解されるべきである。例示として、gRNAという用語は、ある特定の態様では、クラス2のCRISPRシステム、例えば、タイプIIもしくはタイプV、またはCRISPRシステムに存在する任意のRNA誘導型ヌクレアーゼ、またはそれらに由来する、もしくはそれらから適合されたRNA誘導型ヌクレアーゼとともに使用するためのgRNAを含むことができる。

Cas9とCpf1は構造および機能に類似性を有するが、ある特定のCpf1活性は、いかなるCas9ドメインとも類似していない構造ドメインによって媒介されることを理解されたい。いくつかの態様では、標的DNAの相補鎖の開裂は、Cas9のHNHドメインと配列的および空間的に異なるNucドメインによって媒介されるように思われる。さらに、Cpf1 gRNAの非ターゲティング部分（ハンドル）は、Cas9 gRNAの反復：抗反復二本鎖によって形成されるステムループ構造ではなく、シュードノット構造をとる。

RNA誘導型ヌクレアーゼ、例えば、Cas9、Cpf1、またはそれらの機能的断片をコードする核酸は、本明細書において提供される。RNA誘導型ヌクレアーゼをコードする例示的な核酸は、例えばCong et al., Science 2013, 399(6121):819-823; Wang et al., Cell 2013, 153(4):910-918; Mali et al., Science 2013, 399(6121):823-826; Jinek et al., Science 2012, 337(6096):816-821に記載されているものを含む。

b. ゲノム編集アプローチ
一般に、本明細書に記載される方法による任意の遺伝子の変更は、任意の機構によって媒介され得ること、およびいずれの方法も、特定の機構に限定されないことが、理解されるべきである。遺伝子の変更に関連し得る例示的な機構には、非相同末端結合（例えば、古典的または代替的）、マイクロホモロジー媒介末端結合（MMEJ）、相同性指向修復（例えば、内在性ドナー鋳型媒介性）、合成依存的鎖アニーリング（SDSA）、一本鎖アニーリング、一本鎖侵入、一本鎖切断修復（SSBR）、ミスマッチ修復（MMR）、塩基除去修復（BER）、鎖間架橋（ICL）、損傷乗り越え合成（TLS）、または誤りのない複製後修復（PRR）が含まれるが、それらに限定されない。T細胞刺激関連遺伝子座、TRACおよび/またはTRBCの一方または両方のアレルの標的ノックアウトのための例示的な方法が、本明細書に記載される。例示的な機構は、例えば米国特許出願公開番号US20170349894、US20180362943、およびUS20180245079に記載されているものを含む。

NHEJ媒介性インデルを誘導する目的で、gRNAおよびCas9ヌクレアーゼが二本鎖切断を生成するいくつかの態様において、gRNA、例えば、単分子（もしくはキメラ）またはモジュラーgRNAは、標的位置のヌクレオチドに極めて近接して1つの二本鎖切断を位置づけるように構成される。いくつかの態様において、開裂部位は、標的位置から0～30 bp離れている（例えば、標的位置から30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1 bp未満にある）。

NHEJ媒介性インデルを誘導する目的で、Cas9ニッカーゼと複合体化している2つのgRNAが2つの一本鎖切断を誘導するいくつかの態様において、2つのgRNA、例えば、独立して、単分子（もしくはキメラ）またはモジュラーgRNAは、標的位置のヌクレオチドにNHEJ修復を提供するために2つの一本鎖切断を位置づけるように構成される。いくつかの態様において、gRNAは、本質的に二本鎖切断を模倣して、異なる鎖上の、同じ位置にまたは互いの数ヌクレオチド以内に、切れ目を位置づけるように構成される。いくつかの態様において、より近いニックは、標的位置から0～30 bp離れており（例えば、標的位置から30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1 bp未満にあり）、2つのニックは、互いの25～55 bp以内（例えば、25～50、25～45、25～40、25～35、25～30、50～55、45～55、40～55、35～55、30～55、30～50、35～50、40～50、45～50、35～45、または40～45 bp）であり、かつ互いから100 bp以下（例えば、90、80、70、60、50、40、30、20、または10 bp以下）離れている。いくつかの態様において、gRNAは、標的位置のヌクレオチドのいずれかの側に一本鎖切断を配置するように構成される。

二本鎖を開裂するeaCas9分子および一本鎖、またはニッカーゼ、eaCas9分子の両方を、標的位置の両側に切断を生成するために、本明細書に記載される方法および組成物において用いることができる。二本鎖切断またはペアの一本鎖切断が、2つの切れ目の間の核酸配列を取り去るために、標的位置の両側に生成されてもよい（例えば、2つの切断の間の領域が欠失する）。いくつかの態様では、2つのgRNA、例えば、独立して、単分子（もしくはキメラ）またはモジュラーgRNAが、標的位置の両側に二本鎖切断を位置づけるように構成される。代替の態様では、3つのgRNA、例えば、独立して、単分子（もしくはキメラ）またはモジュラーgRNAが、標的位置のいずれかの側に、二本鎖切断（すなわち、1つのgRNAと cas9ヌクレアーゼとの複合体）および2つの一本鎖切断またはペアの一本鎖切断（すなわち、2つのgRNAとCas9ニッカーゼとの複合体）を位置づけるように構成される。別の態様では、4つのgRNA、例えば、独立して、単分子（もしくはキメラ）またはモジュラーgRNAが、標的位置のいずれかの側に、2つのペアの一本鎖切断（すなわち、2つのペアの、2つのgRNAとCas9ニッカーゼとの複合体）を生成するように構成される。二本鎖切断またはペア中の2つの一本鎖ニックのうちの近い方は、理想的には、標的位置の0～500 bp以内（例えば、標的位置から450、400、350、300、250、200、150、100、50、または25 bp以下）であろう。ニッカーゼが用いられる場合、ペア中の2つのニックは、互いの25～55 bp以内（例えば、25～50、25～45、25～40、25～35、25～30、50～55、45～55、40～55、35～55、30～55、30～50、35～50、40～50、45～50、35～45、または40～45 bp）であり、かつ互いから100 bp以下（例えば、90、80、70、60、50、40、30、20、または10 bp以下）離れている。

Cas分子、gRNA分子、Cas9分子/gRNA分子複合体のいずれかを、当技術分野で公知の方法によってまたは本明細書に記載されるように、評価することができる。例えば、Cas9分子のエンドヌクレアーゼ活性を評価するための例示的な方法は、例えば、Jinek et al., Science 2012, 337(6096):816-821、WO2015/161276、WO2017/193107、WO2017/093969、US2016/272999、およびUS2015/056705に記載されている。

3. 遺伝子破壊のための作用物質の送達
いくつかの態様では、ヒトの内在性T細胞刺激関連遺伝子座、TRACおよび/またはTRBCの標的遺伝子破壊、例えばDNA切断は、細胞に導入するか、または移入させるためのいくつかの公知の送達方法またはビヒクルのいずれかを使用して、例えば、ウイルス、例えば、レンチウイルス送達ベクター、またはCas9分子およびgRNAを送達するための公知の方法もしくはビヒクルのいずれかを使用して、遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質、例えば、Cas9および/またはgRNA成分を細胞に送達または導入することによって、行われる。例示的方法は、例えば、Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701；Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644；Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114；およびCavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505に記載されている。いくつかの態様では、遺伝子破壊、例えばDNA切断を誘導することができる1つまたは複数の作用物質の1つまたは複数の成分をコードする核酸配列が、例えば、本明細書において記載されるかまたは公知である、細胞中に核酸を導入するための任意の方法によって、細胞中に導入される。いくつかの態様では、遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質の成分、例えば、CRISPRガイドRNAおよび/またはCas9酵素をコードするベクターを細胞中に送達することができる。

いくつかの態様では、遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質、例えば、Cas9/gRNAである1つまたは複数の作用物質が、リボ核タンパク質（RNP）複合体として細胞中に導入される。RNP複合体は、リボヌクレオチドの配列、例えばRNAまたはgRNA分子、およびタンパク質、例えばCas9タンパク質またはそのバリアントを含む。例えば、Cas9タンパク質は、例えば、電気穿孔または他の物理的送達方法を使用して、Cas9タンパク質および標的配列をターゲティングするgRNA分子を含むRNP複合体として送達される。いくつかの態様では、RNPは、電気穿孔または他の物理的手段、例えば、パーティクルガン、リン酸カルシウムトランスフェクション、細胞圧縮または細胞圧迫を介して、細胞中に送達される。いくつかの態様では、RNPは、さらなる送達作用物質（例えば、小分子作用物質、脂質など）の必要なく、細胞の原形質膜を通過することができる。いくつかの態様では、遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質、例えばCRISPR/Cas9のRNPとしての送達は、細胞子孫へ作用物質が伝わることなしに、例えばRNPが導入される細胞において、標的破壊が一過的に生じるという利点を与える。例えば、RNPによる送達は、作用物質がその子孫へ受け継がれることを最小化し、それによって、子孫におけるオフターゲット遺伝子破壊の機会を低減させる。そのような場合では、遺伝子破壊および導入遺伝子の組み込みは、子孫細胞によって受け継がれ得るが、オフターゲット遺伝子破壊をさらに導入する可能性がある作用物質それ自体がなくても、子孫細胞に伝えられる。

いくつかの態様では、RNP複合体は、3'ポリAテールおよび5'アンチリバースキャップアナログ（ARCA）キャップを含むように改変されたgRNAを含む。

遺伝子破壊を誘導することができる作用物質および成分、例えばCas9分子およびgRNA分子は、表10および11に記載されている様々な送達方法および製剤、または、例えば、WO 2015/161276；WO2017/193107、WO2017/093969、US 2015/0056705、US 2016/0272999、US 2017/0211075；もしくはUS 2017/0016027に記載される方法を使用して、様々な形で標的細胞中に導入することができる。本明細書にさらに記載されるように、送達方法および製剤は、本明細書に記載される方法の前または後の工程において、鋳型ポリヌクレオチドおよび/または他の作用物質（例えば、細胞を操作するために必要とされるもの）を細胞に送達するために用いることができる。Cas9またはgRNA成分が、送達のためにDNAとしてコードされる場合、DNAは、必ずではないが典型的には、発現をもたらすための、例えばプロモーターを含む調節領域を含んでもよい。Cas9分子配列に有用なプロモーターには、例えば、CMV、EF-1α、EFS、MSCV、PGK、またはCAGプロモーターが含まれる。gRNAに有用なプロモーターには、例えば、H1、EF-1α、tRNA、またはU6プロモーターが含まれる。成分の発現を調整するために、類似したかまたは類似していない強度を有するプロモーターを選択することができる。Cas9分子をコードする配列は、核局在化シグナル（NLS）、例えば、SV40 NLSを含んでもよい。いくつかの態様において、Cas9分子またはgRNA分子のためのプロモーターは、独立して、誘導性、組織特異的、または細胞特異的であってもよい。いくつかの態様では、遺伝子破壊を誘導することができる作用物質が、RNP複合体に導入される。

（表１０）例示的送達方法

（表１１）例示的送達方法の比較

いくつかの態様では、Cas9分子および/もしくはgRNA分子をコードするDNA、またはCas9分子および/もしくはgRNA分子を含むRNP複合体は、公知の方法によって、または本明細書において記載されるように、細胞中に送達することができる。例えば、Cas9をコードするおよび/またはgRNAをコードするDNAは、例えば、ベクター（例えば、ウイルスもしくは非ウイルスベクター）、ベクターに基づかない方法（例えば、ネイキッドDNAもしくはDNA複合体を使用する）、またはこれらの組み合わせによって、送達することができる。いくつかの態様では、作用物質および/またはそれらの成分を含むポリヌクレオチドは、ベクター（例えば、ウイルスベクター/ウイルスまたはプラスミド）によって送達される。ベクターは本明細書において記載される任意のものであってもよい。

いくつかの局面では、ガイド配列と組み合わせた（および任意でガイド配列と複合体化された）CRISPR酵素（例えば、Cas9ヌクレアーゼ）が細胞に送達される。例えば、CRISPRシステムの1つまたは複数の要素は、タイプI、タイプII、またはタイプIII CRISPRシステムに由来する。例えば、CRISPRシステムの1つまたは複数の要素は、内在性CRISPRシステムを含む特定の生物、例えば、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、黄色ブドウ球菌、または髄膜炎菌に由来する。

いくつかの態様では、Cas9ヌクレアーゼ（例えば、黄色ブドウ球菌もしくは化膿性連鎖球菌由来のmRNAにコードされるもの。例えば、pCW-Cas9、Addgene #50661、Wang et al. (2014) Science, 3:343-80-4；またはカタログ番号K002、K003、K005、もしくはK006としてApplied Biological Materials（ABM；Canada）から入手可能なヌクレアーゼもしくはニッカーゼレンチウイルスベクター）ならびに標的遺伝子座（例えば、T細胞刺激関連遺伝子座、TRACおよび/またはTRBC）に特異的なガイドRNAが細胞中に導入される。

いくつかの態様では、作用物質および/もしくはそれらの成分を含むポリヌクレオチド、またはRNP複合体は、ベクターに基づかない方法（例えば、ネイキッドDNAまたはDNA複合体を使用する）によって送達される。例えば、DNAまたはRNAまたはタンパク質またはこれらの組み合わせ、例えば、リボ核タンパク質（RNP）複合体は、例えば、有機的に修飾したシリカまたはシリケート（Ormosil）、電気穿孔、（例えば、Lee, et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27, Kollmannsperger et al (2016) Nat Comm 7, 10372に記載される）一過的な細胞圧縮または細胞圧迫、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、脂質媒介性トランスフェクション、デンドリマー、無機ナノ粒子、リン酸カルシウム、またはこれらの組み合わせによって、送達することができる。

いくつかの態様では、電気穿孔を介する送達は、カートリッジ、チャンバ、またはキュベット中で、Cas9および/もしくはgRNAをコードするDNAまたはRNP複合体と細胞を混合し、定められた持続時間および振幅の1回または複数回の電気的インパルスを加えることを含む。いくつかの態様では、電気穿孔を介する送達は、Cas9および/またはgRNAをコードするDNAと細胞が、装置（例えば、ポンプ）と接続している容器中で混合され、この装置が、混合物をカートリッジ、チャンバ、またはキュベットに送り込み、ここで、定められた持続時間および振幅の1回または複数回の電気的インパルスが加えられ、その後、細胞が第2の容器に送達されるシステムを使用して行われる。

いくつかの態様では、送達ビヒクルは非ウイルスベクターである。いくつかの態様では、非ウイルスベクターは無機ナノ粒子である。例示的無機ナノ粒子としては、例えば、磁性ナノ粒子（例えばFe₃MnO₂）およびシリカが挙げられる。ナノ粒子の外表面は、正に荷電したポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリン）とコンジュゲートすることができ、これにより、ペイロードの付着（例えば、コンジュゲーションまたは捕捉）が可能になる。いくつかの態様では、非ウイルスベクターは有機ナノ粒子である。例示的有機ナノ粒子としては、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）でコーティングされた中性ヘルパー脂質とともにカチオン性脂質を含むSNALPリポソーム、および脂質でコーティングされたプロタミン-核酸複合体が挙げられる。遺伝子移入のための例示的な脂質は、例えばWO2015/161276、WO2017/193107、WO2017/093969、US2016/272999、およびUS2015/056705に記載されているものを含む。

いくつかの態様では、ビヒクルは、ナノ粒子およびリポソーム、例えば、細胞特異的抗原、モノクローナル抗体、単鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖、および細胞透過性ペプチドの標的細胞アップデートを増加させるために、ターゲティング改変を有する。いくつかの態様では、ビヒクルは、融合性およびエンドソーム不安定化ペプチド/ポリマーを使用する。いくつかの態様では、ビヒクルは、（例えば、カーゴのエンドソーム脱出を加速するために）酸誘発性のコンフォメーション変化を受ける。いくつかの態様では、例えば細胞内コンパートメントにおける放出のために、刺激開裂可能なポリマーが使用される。例えば、還元細胞環境で開裂させられるジスルフィドベースのカチオン性ポリマーが使用され得る。

いくつかの態様では、送達ビヒクルは生物学的な非ウイルス性送達ビヒクルである。いくつかの態様では、ビヒクルは、弱毒化細菌（例えば、侵入性であるが、弱毒化されて発病を防止し、導入遺伝子を発現するように、天然または人工的に操作されている（例えば、リステリア・モノサイトゲネス、ある特定のサルモネラ（Salmonella）株、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、および改変大腸菌（Escherichia coli））、特定の細胞を標的にするために栄養的および組織特異的指向性を有する細菌、標的細胞特異性を変更するために改変表面タンパク質を有する細菌）である。いくつかの態様では、ビヒクルは、遺伝子改変バクテリオファージ（例えば、大きなパッケージング能力、低免疫原性を有し、哺乳類のプラスミド維持配列を含み、ターゲティングリガンドが組み込まれた、操作されたファージ）である。いくつかの態様では、ビヒクルは哺乳類のウイルス様粒子である。例えば、（例えば、「空」粒子の精製、それに続く、望ましいカーゴとのウイルスのエクスビボアセンブリーによって）改変ウイルス粒子を生成することができる。ビヒクルは、ターゲティングリガンドを組み込んで、標的組織特異性を変更するように操作することもできる。いくつかの態様では、ビヒクルは生物学的リポソームである。例えば、生物学的リポソームは、ヒト細胞に由来するリン脂質ベースの粒子、例えば、対象に由来する球状構造に壊された赤血球である、赤血球ゴースト（例えば、組織ターゲティングが、様々な組織もしくは細胞特異的リガンドの付着によって達成され得る）、または分泌性エキソソーム－エンドサイトーシス起源の対象由来膜結合ナノベシクル（30～100nm）（例えば、様々な細胞型から生成することができ、したがって、ターゲティングリガンドの必要なく細胞に取り込まれ得る）である。

いくつかの態様では、Cas9分子および/またはgRNA分子をコードするRNAは、公知の方法によって、または本明細書において記載されるように、細胞、例えば、本明細書において記載される標的細胞中に送達することができる。例えば、Cas9をコードするおよび/またはgRNAをコードするRNAは、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、（例えば、Lee, et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27に記載される）一過的な細胞圧縮または細胞圧迫、脂質媒介性トランスフェクション、ペプチド媒介性送達、例えば細胞透過性ペプチド、またはこれらの組み合わせによって、送達することができる。

いくつかの態様では、電気穿孔を介する送達は、カートリッジ、チャンバ、またはキュベット中でCas9分子および/またはgRNA分子をコードするRNAと細胞を混合し、定められた持続時間および振幅の1回または複数回の電気的インパルスを加えることを含む。いくつかの態様では、電気穿孔を介する送達は、Cas9分子および/またはgRNA分子をコードするRNAと細胞が装置（例えば、ポンプ）と接続している容器中で混合され、この装置が、混合物をカートリッジ、チャンバ、またはキュベットに送り込み、ここで、定められた持続時間および振幅の1回または複数回の電気的インパルスが加えられ、その後、細胞が第2の容器に送達されるシステムを使用して行われる。

いくつかの態様では、Cas9分子は、公知の方法によって、または本明細書において記載されるように、細胞中に送達することができる。例えば、Cas9タンパク質分子は、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、（例えば、Lee, et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27に記載される）一過的な細胞圧縮または細胞圧迫、脂質媒介性トランスフェクション、ペプチド媒介性送達、またはこれらの組み合わせによって、送達することができる。送達は、gRNAをコードするDNAまたはgRNAをともない得る。

いくつかの態様では、開裂を導入することができる1つまたは複数の作用物質、例えば、Cas9/gRNAシステムが、リボ核タンパク質（RNP）複合体として細胞中に導入される。RNP複合体は、リボヌクレオチド、例えば、RNAまたはgRNA分子、およびタンパク質、例えば、Cas9タンパク質またはそのバリアントの配列を含む。例えば、Cas9タンパク質は、例えば、電気穿孔または他の物理的送達方法を使用して、Cas9タンパク質および標的配列をターゲティングするgRNA分子を含むRNP複合体として送達される。いくつかの態様では、RNPは、電気穿孔または他の物理的手段、例えば、パーティクルガン、リン酸カルシウムトランスフェクション、細胞の圧縮または圧迫を介して、細胞中に送達される。

いくつかの態様では、電気穿孔を介する送達は、カートリッジ、チャンバ、またはキュベット中で、gRNA分子とともにまたはそのままCas9分子と細胞を混合し、定められた持続時間および振幅の1回または複数回の電気的インパルスを加えることを含む。いくつかの態様では、電気穿孔を介する送達は、gRNA分子とともにまたはそのままCas9分子と細胞が、装置（例えば、ポンプ）に接続している容器中で混合され、この装置が、カートリッジ、チャンバ、またはキュベットに混合物を送り込み、ここで、定められた持続時間および振幅の1回または複数回の電気的インパルスが加えられ、その後、細胞が第2の容器に送達されるシステムを使用して行われる。

いくつかの態様では、電気穿孔を介する送達は、カートリッジ、チャンバ、またはキュベット中で、gRNA分子とともにまたはそのままCas9分子（例えば、eaCas9分子、eiCas9分子、またはeiCas9融合タンパク質）と細胞を混合し、定められた持続時間および振幅の1回または複数回の電気的インパルスを加えることを含む。いくつかの態様では、電気穿孔を介する送達は、Cas9分子（例えば、eaCas9分子、eiCas9分子、またはeiCas9融合タンパク質）と細胞が混合されるシステムを使用して行われる。

いくつかの態様では、作用物質および/またはそれらの成分を含むポリヌクレオチドは、ベクターと非ベクターベースの方法との組み合わせによって送達される。例えば、ビロソームは、不活性化したウイルス（例えば、HIVまたはインフルエンザウイルス）と組み合わされたリポソームを含み、これは、ウイルス方法単独またはリポソーム方法単独のいずれかよりも効率的な遺伝子移入をもたらすことができる。

いくつかの態様では、1つより多い作用物質またはそれらの成分が細胞に送達される。例えば、いくつかの態様では、ゲノム中の2か所以上の場所の、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座、TRACおよび/またはTRBC内の2か所以上の部位の遺伝子破壊を誘導することができる作用物質が細胞に送達される。いくつかの態様では、作用物質およびそれらの成分は、1つの方法を使用して送達される。例えば、いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座、TRACおよび/またはTRBCの遺伝子破壊を誘導するための作用物質は、遺伝子破壊のための成分をコードするポリヌクレオチドとして送達される。いくつかの態様では、1つのポリヌクレオチドが、T細胞刺激関連遺伝子座、TRACおよび/またはTRBCを標的とする作用物質をコードすることができる。いくつかの態様では、2つ以上の異なるポリヌクレオチドが、T細胞刺激関連遺伝子座、TRACおよび/またはTRBCを標的とする作用物質をコードすることができる。いくつかの態様では、遺伝子破壊を誘導することができる作用物質をリボ核タンパク質（RNP）複合体として送達することができ、2つ以上の異なるRNP複合体を混合物として一緒に、または別々に送達することができる。

いくつかの態様では、遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質および/またはそれらの成分、例えば、Cas9分子成分および/またはgRNA分子成分以外の1つまたは複数の核酸分子、例えば、HDR誘導性組み込みのための鋳型ポリヌクレオチド（例えば、本明細書において、例えばセクションII.B.2に記載される任意の鋳型ポリヌクレオチド）が送達される。いくつかの態様では、核酸分子、例えば鋳型ポリヌクレオチドは、Casシステムの成分の1つまたは複数と同時に送達される。いくつかの態様では、核酸分子は、Casシステムの成分の1つまたは複数が送達される前または後（例えば、約1分、5分、10分、15分、30分、1時間、2時間、3時間、6時間、9時間、12時間、1日、2日、3日、1週、2週、または4週未満）に送達される。いくつかの態様では、核酸分子、例えば鋳型ポリヌクレオチドは、Casシステムの成分の1つまたは複数、例えば、Cas9分子成分および/またはgRNA分子成分と異なる手段によって送達される。核酸分子、例えば鋳型ポリヌクレオチドは、本明細書において記載される送達方法のいずれかによって送達することができる。例えば、核酸分子、例えば鋳型ポリヌクレオチドは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスによって送達することができ、Cas9分子成分および/またはgRNA分子成分は電気穿孔によって送達することができる。いくつかの態様では、核酸分子、例えば鋳型ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の外来性配列、例えば、組換え受容体もしくはその一部分および/または他の外来性遺伝子核酸配列をコードする配列を含む。

B. 相同性指向修復（HDR）を介する標的組み込み
いくつかの局面では、提供される態様は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のゲノム中の特定の場所（例えば、標的部位または標的場所）における、ポリヌクレオチドの特定の部分、例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドの部分の標的組み込みを含む。いくつかの局面では、相同性指向修復（HDR）は、標的部位における導入遺伝子の部位特異的組み込みを媒介することができる。いくつかの態様では、遺伝子破壊（例えばセクションII.Aに記載されるDNA切断）および1つまたは複数の相同性アーム（例えば、遺伝子破壊の周辺の核酸配列相同配列を含む）を含む鋳型ポリヌクレオチドの存在は、DNA修復のための鋳型として働く相同配列を用いて、HDRを誘導するか、または導くことができる。遺伝子破壊の周辺の内在性遺伝子配列と鋳型ポリヌクレオチド中に含まれる5'および/または3'相同性アームの間の相同性に基づいて、細胞のDNA修復機構は、鋳型ポリヌクレオチドを使用して、遺伝子破壊の部位においてDNA切断を修復し、遺伝情報を再合成し、それによって、遺伝子破壊の部位またはその近くに、鋳型ポリヌクレオチド中の導入遺伝子を効果的に挿入するかまたは組み込むことができる。いくつかの態様では、内在性T細胞刺激関連遺伝子座における遺伝子破壊は、本明細書において記載される標的遺伝子破壊を生成するための方法のいずれかによって、生成することができる。

ポリヌクレオチド、例えば、本明細書において記載される鋳型ポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドを含むキットも提供される。いくつかの態様では、提供されるポリヌクレオチドおよび/またはキットは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座に、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子をターゲティングするために、例えばHDRを含む、本明細書において記載される方法で用いることができる。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、組換え受容体またはその一部分（例えば、組換え受容体の1つまたは複数の領域またはドメイン）をコードする導入遺伝子、例えば、外来性または異種の核酸配列、および内在性T細胞刺激関連遺伝子座の内在性ゲノム部位の、またはその近くの配列と相同な相同配列（例えば相同性アーム）を含むポリヌクレオチドであるか、または該ポリヌクレオチドを含む。いくつかの局面では、鋳型ポリヌクレオチド中の導入遺伝子は、組換え受容体またはその一部分をコードするヌクレオチドの配列を含む。いくつかの局面では、導入遺伝子の標的組み込みの際に、操作された細胞のT細胞刺激関連遺伝子座が改変され、その結果、改変T細胞刺激関連遺伝子座は、組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）をコードする導入遺伝子を含む。

いくつかの局面では、鋳型ポリヌクレオチドは、直鎖状DNA断片として導入されるか、またはベクターに含まれる。いくつかの局面では、遺伝子破壊を誘導する工程および（例えば、鋳型ポリヌクレオチドの導入による）標的組み込みのための工程は、同時にまたは順次行われる。

1. 相同性指向修復（HDR）
いくつかの態様では、相同性指向修復（HDR）は、T細胞刺激関連遺伝子座の1つまたは複数の標的部位における、1つまたは複数の核酸配列、例えば、導入遺伝子の標的組み込みまたは挿入に利用可能である。いくつかの態様では、標的配列を変更する、特定の標的場所で導入遺伝子を組み込む、および/または特定の標的遺伝子、例えばT細胞刺激関連遺伝子座中の変異を編集もしくは修復するために、ヌクレアーゼ誘導性HDRを使用することができる。

標的部位での核酸配列の変更は、外来的に提供された鋳型ポリヌクレオチド（「ドナーポリヌクレオチド」または「鋳型配列」とも称される）を用いたHDRによって生じ得る。例えば、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列の変更、例えば、鋳型ポリヌクレオチド内に含まれる導入遺伝子の挿入をもたらす。いくつかの態様では、相同組換えのための鋳型としてプラスミドまたはベクターを使用することができる。いくつかの態様では、直鎖状DNA断片を相同組換えのための鋳型として使用することができる。いくつかの態様では、一本鎖鋳型ポリヌクレオチドを、標的配列と鋳型ポリヌクレオチドの間の相同性指向修復の代替方法（例えば、一本鎖アニーリング）による標的配列の変更のための鋳型として使用することができる。鋳型ポリヌクレオチドによってもたらされる標的配列の変更は、ヌクレアーゼ、例えば、CRISPR/Cas9などの標的ヌクレアーゼによる開裂に依存する。ヌクレアーゼによる開裂は、二本鎖切断または2つの一本鎖切断を含むことができる。

いくつかの態様では、「組換え」は、2つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換のプロセスを含む。いくつかの態様では、「相同組換え（HR）」は、例えば、相同性指向修復メカニズムを介した細胞中の二本鎖切断の修復の間に起こる、そのような交換の特殊化した形態を含む。このプロセスは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、標的DNA（すなわち、二本鎖切断を受けたもの、例えば、内在性遺伝子中の標的部位）の鋳型修復に鋳型ポリヌクレオチドを使用し、鋳型ポリヌクレオチドから標的への遺伝情報の伝達につながるので「非乗換え遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々に公知である。いくつかの態様では、そのような伝達は、壊れた標的と鋳型ポリヌクレオチドの間に生じるヘテロ二本鎖DNAのミスマッチ修正、および/または標的の一部となると考えられる遺伝情報を再合成するために鋳型ポリヌクレオチドが使用される「合成依存的鎖アニーリング」、および/または関連したプロセスをともない得る。そのような特殊化したHRは、鋳型ポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチド中に組み込まれるような、標的分子の配列の変更をもたらすことが多い。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチド、例えば、導入遺伝子を含むポリヌクレオチドは、相同性非依存的メカニズムを介して細胞のゲノム中に組み込まれる。本方法は、細胞のゲノム中に二本鎖切断（DSB）を作製し、ヌクレアーゼを使用して鋳型ポリヌクレオチド分子を開裂させ、その結果、鋳型ポリヌクレオチドがDSBの部位に組み込まれることを含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、非相同性依存的方法（例えば、NHEJ）を介して組み込まれる。インビボ開裂の際に、鋳型ポリヌクレオチドは、DSBの場所で細胞のゲノム中にターゲティングされた様式で組み込まれ得る。鋳型ポリヌクレオチドは、DSBを作製するために使用されるヌクレアーゼの1つまたは複数のために、1つまたは複数の同じ標的部位を含むことができる。したがって、鋳型ポリヌクレオチドは、組み込みが望まれる内在性遺伝子を開裂させるために使用される同じヌクレアーゼの1つまたは複数によって開裂され得る。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、DSBを誘導するために使用されるヌクレアーゼと異なるヌクレアーゼ標的部位を含む。本明細書において記載されるように、標的部位または標的場所の遺伝子破壊は、公知の任意の方法または本明細書に記載の任意の方法、例えば、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9システム、またはTtAgoヌクレアーゼによって作製され得る。

いくつかの態様では、DNA修復メカニズムは、(1)単一二本鎖切断、(2)2つの一本鎖切断、(3)切断が標的部位の両側で生じる、2つの二本鎖切断、(4)二本鎖切断および2つの一本鎖切断が標的部位の両側で生じる、1つの二本鎖切断および2つの一本鎖切断、（5)1対の一本鎖切断が標的部位の両側で生じる、4つの一本鎖切断、または(6)1つの一本鎖切断の後に、ヌクレアーゼによって誘導され得る。いくつかの態様では、一本鎖鋳型ポリヌクレオチドが使用され、標的部位は、代替HDRによって変更され得る。

鋳型ポリヌクレオチドによってもたらされる標的部位の変更は、ヌクレアーゼ分子による開裂に依存する。ヌクレアーゼによる開裂は、ニック、二本鎖切断、または2つの一本鎖切断、例えば標的部位のDNAの各鎖に1つを含むことができる。標的部位に切断を導入した後、切断末端で切除が生じ、一本鎖の突出DNA領域がもたらされる。

標準HDRでは、標的部位に直接組み込まれるか、または導入遺伝子を挿入するかもしくは標的部位の配列を修正するための鋳型として使用されるかのいずれかであろう、標的部位に対する相同配列を含む、二本鎖の鋳型ポリヌクレオチドが導入される。切断点で切除した後、修復は、様々な経路によって、例えば、ダブルホリデイジャンクションモデル（double Holliday junction model）（もしくは二本鎖切断修復、DSBR経路）または合成依存的鎖アニーリング（SDSA）経路によって、進行し得る。

ダブルホリデイジャンクションモデルでは、鋳型ポリヌクレオチド中の相同配列への標的部位の2つの一本鎖突出による鎖の侵入が生じ、その結果、2つのホリデイジャンクションを有する中間体が形成される。侵入鎖の末端から新しいDNAが合成されて、切除に起因するギャップが埋められるので、ジャンクションが移動する。新しく合成されたDNAの末端は、切除末端にライゲーションされ、ジャンクションが分解され、その結果、標的部位での挿入、例えば、鋳型ポリヌクレオチド中の導入遺伝子の挿入がもたらされる。鋳型ポリヌクレオチドとの乗換えが、ジャンクションの分解の際に生じ得る。

SDSA経路では、1つの一本鎖突出のみが鋳型ポリヌクレオチドに侵入し、侵入鎖の末端から新しいDNAが合成されて、切除に起因するギャップが埋められる。新しく合成されたDNAは、次いで、残りの一本鎖突出にアニールし、ギャップを埋めるために新しいDNAが合成され、鎖がライゲーションされて、改変されたDNA二本鎖がもたらされる。

代替HDRでは、一本鎖鋳型ポリヌクレオチド、例えば、鋳型ポリヌクレオチドが導入される。望ましい標的部位を変更するための、標的部位におけるニック、一本鎖切断、または二本鎖切断が、ヌクレアーゼ分子によって媒介され、切断点での切除が生じて、一本鎖突出が現れる。DNAの標的部位を修正するか、または変更するための鋳型ポリヌクレオチドの配列の組み込みは、本明細書において記載されるように、典型的にはSDSA経路によって生じる。

「代替HDR」または代替相同性指向修復は、いくつかの態様では、相同な核酸（例えば、内在性相同配列、例えば、姉妹染色分体、または外来性核酸、例えば、鋳型ポリヌクレオチド）を使用してDNA損傷を修復するプロセスを指す。代替HDRは、該プロセスが標準HDRと異なる経路を利用し、標準HDRの媒介物、RAD51およびBRCA2によって阻害され得るという点において標準HDRと異なる。さらに、代替HDRは、切断の修復のために、一本鎖のまたはニックが入った相同な核酸を使用する。「標準HDR」または標準相同性指向修復は、いくつかの態様では、相同な核酸（例えば、内在性相同配列、例えば、姉妹染色分体、または外来性核酸、例えば、鋳型核酸）を使用してDNA損傷を修復するプロセスを指す。標準HDRは、典型的には、二本鎖切断において有意な切除があった場合に作用し、DNAの少なくとも1つの一本鎖部分を形成する。正常細胞では、HDRは、典型的には、切断の認識、切断の安定化、切除、一本鎖DNAの安定化、DNA乗換え中間体の形成、乗換え中間体の分解、およびライゲーションなどの一連の工程をともなう。該プロセスはRAD51およびBRCA2を必要とし、相同な核酸は典型的には二本鎖である。別段指示がない限り、いくつかの態様における用語「HDR」は、標準HDRおよび代替HDRを包含する。

いくつかの態様では、二本鎖開裂は、ヌクレアーゼ、例えば、HNH様ドメインと関連する開裂活性およびRuvC様ドメイン、例えばN末端RuvC様ドメインと関連する開裂活性を有するCas9分子、例えば、野生型Cas9によってもたらされる。そのような態様は、単一gRNAしか必要としない。

いくつかの態様では、1つの一本鎖切断またはニックは、ニッカーゼ活性を有するヌクレアーゼ分子、例えば、Cas9ニッカーゼによってもたらされる。標的部位にニックが入ったDNAは代替HDRの基質となり得る。

いくつかの態様では、2つの一本鎖切断またはニックは、ヌクレアーゼ、例えば、ニッカーゼ活性、例えば、HNH様ドメインと関連する開裂活性またはN末端RuvC様ドメインと関連する開裂活性を有するCas9分子によってもたらされる。そのような態様は、通常2つのgRNAを必要とし、1つは各一本鎖切断の配置のためである。いくつかの態様では、ニッカーゼ活性を有するCas9分子はgRNAがハイブリダイズする鎖を開裂させるが、gRNAがハイブリダイズする鎖と相補的である鎖は開裂させない。いくつかの態様では、ニッカーゼ活性を有するCas9分子は、gRNAがハイブリダイズする鎖を開裂させるのではなく、gRNAがハイブリダイズする鎖に相補的である鎖を開裂させる。いくつかの態様では、ニッカーゼはHNH活性を有し、例えば、RuvC活性が不活性化しているCas9分子、例えば、D10での変異、例えばD10A変異を有するCas9分子である。D10AはRuvCを不活性化させ；したがって、Cas9ニッカーゼはHNH活性（のみ）を有し、gRNAがハイブリダイズする鎖（例えば、NGG PAMを有さない相補鎖）で切断すると考えられる。いくつかの態様では、H840、例えば、H840A変異を有するCas9分子をニッカーゼとして使用することができる。H840AはHNHを不活性化させ；したがって、Cas9ニッカーゼはRuvC活性（のみ）を有し、非相補鎖（例えば、NGG PAMを有し、その配列がgRNAと同一である鎖）で切断する。いくつかの態様では、Cas9分子はN末端RuvC様ドメインニッカーゼであり、例えば、Cas9分子はN863の変異、例えばN863Aを含む。

2つの一本鎖ニックを配置するためにニッカーゼおよび2つのgRNAが使用されるいくつかの態様では、1つのニックは標的DNAの＋鎖上にあり、1つのニックは－鎖上にある。PAMは外側を向いている。gRNAは、gRNAが約0～50、0～100、または0～200ヌクレオチドによって分離されるように、選択することができる。いくつかの態様では、2つのgRNAのターゲティングドメインに相補的である標的配列の間に重複はない。いくつかの態様では、gRNAは重複せず、50、100、または200ヌクレオチド程度によって分離される。いくつかの態様では、2つのgRNAの使用は、例えば、オフターゲット結合を減少させることによって、特異性を増加させることができる（Ran et al., Cell. 2013 Sep 12;154(6):1380-9）。

いくつかの態様では、HDR、例えば、代替HDRを誘導するために単一ニックを使用することができる。所与の開裂部位、例えば標的部位でHR対NHEJの比を増加させるために、単一ニックを使用することができることが、本明細書において意図される。いくつかの態様では、一本鎖切断は、該gRNAのターゲティングドメインが相補的である標的部位のDNAの鎖に形成される。いくつかの態様では、一本鎖切断は、該gRNAのターゲティングドメインが相補的である鎖以外の標的部位のDNAの鎖に形成される。

いくつかの態様では、ヌクレアーゼによって作製された二本鎖または一本鎖切断を修復するために、他のDNA修復経路、例えば、一本鎖アニーリング（SSA）、一本鎖切断修復（SSBR）、ミスマッチ修復（MMR）、塩基除去修復（BER）、ヌクレオチド除去修復（NER）、鎖内架橋（ICL）、損傷乗越え合成（TLS）、誤りのない複製後修復（PRR）が細胞によって用いられ得る。

標的組み込みによって、導入遺伝子、例えば相同性アーム間の配列が、ゲノム中のT細胞刺激関連遺伝子座に組み込まれる。導入遺伝子は、ゲノム中の少なくとも1つの標的部位または部位のうちの1つ、またはその近くのどこにでも組み込まれ得る。いくつかの態様では、導入遺伝子は、少なくとも1つの標的部位のうちの1つ、またはその近くに、例えば、開裂部位の上流または下流の300、250、200、150、100、50、10、5、4、3、2、1、またはそれ以下の塩基対以内、例えば、標的部位のいずれかの側の100、50、10、5、4、3、2、1塩基対以内、例えば、標的部位のいずれかの側の50、10、5、4、3、2、1塩基対以内に組み込まれる。いくつかの態様では、導入遺伝子を含む組み込まれる配列は、いかなるベクター配列（例えば、ウイルスベクター配列）も含まない。いくつかの態様では、組み込まれる配列は、ベクター配列（例えば、ウイルスベクター配列）の一部分を含む。

片方の鎖における二本鎖切断または一本鎖切断（例えば、標的部位）は、望ましい領域で変更がもたらされるように、例えば、導入遺伝子の挿入または変異の修正が生じるように、標的組み込み部位、例えば標的組み込みのための部位に十分に近くなければならない。いくつかの態様では、距離は、10、25、50、100、200、300、350、400、または500ヌクレオチド以下である。いくつかの態様では、切断は、末端切除の間にエキソヌクレアーゼ媒介性除去の対象になる領域内に切断があるように、標的組み込み部位に十分に近くなければならないと考えられる。いくつかの態様では、ターゲティングドメインは、開裂イベント、例えば、二本鎖または一本鎖切断が、変更が望まれる領域、例えば標的挿入のための部位の1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、300、350、400、または500ヌクレオチド以内に配置されるように構成される。切断、例えば、二本鎖または一本鎖切断は、変更が望まれる領域、例えば標的挿入のための部位の上流または下流に配置され得る。いくつかの態様では、切断は、変更が望まれる領域内、例えば、少なくとも2つの変異ヌクレオチドによって定められた領域内に配置される。いくつかの態様では、切断は、変更が望まれる領域の直ぐ近くに、例えば、標的組み込み部位の直ぐ上流または下流に配置される。

いくつかの態様では、一本鎖切断は、第2のgRNA分子によって配置される、さらなる一本鎖切断をともなう。例えば、ターゲティングドメインは、開裂イベント、例えば、2つの一本鎖切断が、標的組み込み部位の1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、300、350、400、または500ヌクレオチド以内に配置されるように構成される。いくつかの態様では、第1および第2のgRNA分子は、Cas9ニッカーゼをガイドする場合に、一本鎖切断が、第2のgRNAによって配置され、互いに十分接近したさらなる一本鎖切断をともなって、望ましい領域の変更をもたらすように構成される。いくつかの態様では、第1および第2のgRNA分子は、例えば、Cas9がニッカーゼである場合、第2のgRNAによって配置される一本鎖切断が、第1のgRNA分子によって配置される切断の10、20、30、40、または50ヌクレオチド以内であるように構成される。いくつかの態様では、2つのgRNA分子は、異なる鎖において、同じ位置に、または互いの数ヌクレオチド以内に切断を配置し、例えば、二本鎖切断を本質的に模倣するように構成される。

HDR媒介性の導入遺伝子の挿入または修正を誘導する目的で、gRNA（単分子、キメラ、またはモジュラーgRNA）およびCas9ヌクレアーゼが二本鎖切断を誘導する、いくつかの態様では、開裂部位、例えば標的部位は、標的組み込み部位から離れて、0～200bp（例えば、0～175、0～150、0～125、0～100、0～75、0～50、0～25、25～200、25～175、25～150、25～125、25～100、25～75、25～50、50～200、50～175、50～150、50～125、50～100、50～75、75～200、75～175、75～150、75～125、75～100bp）の間にある。いくつかの態様では、開裂部位、例えば標的部位などの標的部位は、標的組み込みのための部位から離れて、0～100bp（例えば、0～75、0～50、0～25、25～100、25～75、25～50、50～100、50～75、または75～100bp）の間にある。

いくつかの態様では、ニッカーゼを使用して突出を有する切断を引き起こすことによって、HDRを促進することができる。いくつかの態様では、突出の一本鎖の性質は、例えばNHEJとは対照的に、HDRによって切断を修復するという細胞の可能性を増強することができる。

特に、いくつかの態様では、HDRは、第1の標的部位に第1のニッカーゼをターゲティングする第1のgRNA、および第1の標的部位と逆のDNA鎖にあり、第1のニックからずれている第2の標的部位へ第2のニッカーゼをターゲティングする第2のgRNAを選択することによって促進される。いくつかの態様では、gRNA分子のターゲティングドメインは、あらかじめ選択されたヌクレオチド、例えばコード領域のヌクレオチドから十分に離れて開裂イベントを配置し、その結果、該ヌクレオチドが変わらないように構成される。いくつかの態様では、gRNA分子のターゲティングドメインは、エクソンの配列の変更または望まれないスプライシングイベントを回避するために、イントロン/エクソン境界、または天然に存在するスプライスシグナルから十分に離れてイントロンの開裂イベントを配置するように構成される。いくつかの態様では、gRNA分子のターゲティングドメインは、少なくとも1つの標的部位のうちの1つ、もしくはその近くにインフレームの導入遺伝子の組み込みを可能にするために、初期エクソン中に配置するように構成される。

いくつかの態様では、二本鎖切断は、第2のgRNA分子によって配置される、さらなる二本鎖切断をともない得る。いくつかの態様では、二本鎖切断は、第2のgRNA分子および第3のgRNA分子によって配置される、2つのさらなる一本鎖切断をともない得る。いくつかの態様では、2つのgRNA、例えば、独立に、単分子、キメラ、またはモジュラーgRNAは、標的組み込み部位、例えば、標的組み込みのための部位の両側に二本鎖切断を配置するように構成される。

2. 鋳型ポリヌクレオチド
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチド、例えば、組換え受容体またはその一部分をコードするヌクレオチドの配列を含む導入遺伝子、例えば、外来性または異種の核酸配列、および標的組み込みのための内在性ゲノム部位の、またはその近くの配列と相同な相同配列（例えば相同性アーム）を含むポリヌクレオチドは、修復鋳型として、細胞DNA修復プロセス、例えば相同組換えに関与する、用いられる分子および機構であり得る。いくつかの局面では、内在性DNA中の1つまたは複数の標的部位の、またはその近くの配列と相同性を有する鋳型ポリヌクレオチドは、トランスジェニックまたは外来性の配列、例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする外来性核酸配列の標的挿入のために、標的DNAの構造、例えば内在性T細胞刺激関連遺伝子座の標的部位を変更するために使用することができる。例えば、導入遺伝子の相同性指向修復（HDR）媒介性標的組み込みのための鋳型として、本明細書において提供される方法で使用するためのポリヌクレオチド、例えば鋳型ポリヌクレオチドも提供される。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列；および該核酸配列に連結される1つまたは複数の相同性アームを含み、1つまたは複数の相同性アームは、T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームの1つまたは複数の領域と相同な配列を含む。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、組換え受容体またはその一部分をコードするヌクレオチドの配列を含む導入遺伝子（外来性または異種の核酸配列）に連結しているおよび/または隣接している、1つまたは複数の相同配列（例えば相同性アーム）を含む。いくつかの態様では、相同配列は、外来性配列を内在性T細胞刺激関連遺伝子座にターゲティングするために使用される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、細胞のゲノム中への挿入または組み込みのために、核酸配列、例えば導入遺伝子を相同性アームの間に含む。鋳型ポリヌクレオチド中の導入遺伝子は、プロモーターまたは他の制御エレメントとともにまたはそのまま、機能的ポリペプチド（例えば、組換え受容体またはその一部分）をコードする1つまたは複数の配列を含むことができる。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位の構造を変更するために遺伝子破壊を導入することができる1つまたは複数の作用物質とともに使用することができる、核酸配列である。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、相同性指向修復イベントによって、標的部位の構造、例えば、導入遺伝子の挿入を変更する。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位の配列を変更し、例えば、細胞のゲノム中への相同性アームの間の導入遺伝子の挿入または組み込みをもたらす。いくつかの局面では、標的組み込みは、導入遺伝子のコード部分と内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームの1つまたは複数のエクソンとのインフレームの組み込みを、例えば、組み込み部位で隣接するエクソンとインフレームでもたらす。例えば、場合によっては、インフレームの組み込みは、内在性オープンリーディングフレームの一部分および発現される組換え受容体またはその一部分をもたらし、これらは、場合によっては、マルチシストロン性エレメント、例えば2Aエレメントによって分離される。したがって、改変T細胞刺激関連遺伝子座は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座によってコードされるポリペプチドおよび組換え受容体またはその一部分を発現することができ、これらは、マルチシストロン性エレメントによって2つの異なるポリペプチドに分離され得る。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子破壊を導入することができる1つまたは複数の作用物質によって開裂させられる標的配列上の部位に対応するかまたは相同である配列を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、遺伝子破壊を導入することができる第1の作用物質で開裂させられる標的配列上の第1の部位と遺伝子破壊を導入することができる第2の作用物質で開裂させられる標的配列上の第2の部位の両方に対応するかまたは相同である配列を含む。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは以下の成分を含む：[5'相同性アーム]-[導入遺伝子（例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする、外来性または異種の核酸配列）]-[3'相同性アーム]。相同性アームは染色体中への組換えをもたらし、したがって、例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を開裂部位、例えば標的部位の、またはその近くのゲノムDNA中に効果的に挿入するかまたは組み込む。いくつかの態様では、相同性アームは、遺伝子破壊の標的部位の配列に隣接する。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは二本鎖である。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは一本鎖である。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは一本鎖部分および二本鎖部分を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドはベクターに含まれる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドはDNAである。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドはRNAである。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは二本鎖DNAである。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは一本鎖DNAである。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは二本鎖RNAである。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは一本鎖RNAである。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは一本鎖部分および二本鎖部分を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドはベクターに含まれる。

ある特定の態様では、ポリヌクレオチド、例えば鋳型ポリヌクレオチドは、組換え受容体、例えば、CARまたはその一部分をコードする導入遺伝子を含む（contains）および/または含む（includes）。いずれかの態様のいくつかでは、導入遺伝子は、T細胞刺激関連遺伝子産物をコードする内在性の遺伝子、遺伝子座、またはオープンリーディングフレーム内にある標的部位にターゲティングされる。いくつかの態様では、導入遺伝子は、例えば、コードされるT細胞刺激関連遺伝子産物のすべてまたは一部分の発現をもたらすように、内在性T細胞刺激関連遺伝子座オープンリーディングフレーム内の組み込みのためにターゲティングされる。

挿入のためのポリヌクレオチドは、「導入遺伝子」または「外来性配列」または「ドナー」ポリヌクレオチドもしくは分子と称することもできる。鋳型ポリヌクレオチドは、一本鎖および/または二本鎖のDNAでもよく、直鎖状または環状の形態で細胞中に導入することができる。鋳型ポリヌクレオチドは、一本鎖および/または二本鎖のDNAでもよく、直鎖状または環状の形態で細胞中に導入することができる。鋳型ポリヌクレオチドは一本鎖および/または二本鎖のRNAでもよく、RNA分子（例えば、RNAウイルスの一部）として導入することができる。米国特許出願公開第20100047805号および第20110207221号も参照されたい。鋳型ポリヌクレオチドはDNA形態でも導入することができ、これは、環状または直鎖状の形態で細胞中に導入することができる。直鎖状形態で導入される場合、鋳型ポリヌクレオチドの末端は、公知の方法によって、（例えば、エキソヌクレアーゼによる分解から）保護され得る。例えば、1つまたは複数のジデオキシヌクレオチド残基が直鎖状分子の3'末端に加えられ、および/または自己相補的なオリゴヌクレオチドが一端または両端にライゲーションされる。例えば、Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963；Nehls et al. (1996) Science 272:886-889を参照されたい。外来性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる方法としては、限定されないが、末端アミノ基の付加、ならびに例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、およびO-メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間連結の使用が挙げられる。二本鎖形態で導入される場合は、鋳型ポリヌクレオチドは、1つまたは複数のヌクレアーゼ標的部位、例えば、細胞のゲノム中に組み込まれる導入遺伝子に隣接するヌクレアーゼ標的部位を含むことができる。例えば、米国特許出願公開第20130326645号を参照されたい。

いくつかの態様では、二本鎖鋳型ポリヌクレオチドは、1kbを超える長さ、例えば、2～200kb、2～10kb（または、これらの間の任意の値）の配列（導入遺伝子とも称される）を含む。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは一本鎖核酸である。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは二本鎖核酸である。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、付加されるか、または標的DNAの変化の鋳型になるであろう、例えば1つまたは複数のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位を改変するために、例えば、鋳型ポリヌクレオチド中の導入遺伝子を細胞のゲノム中へとコピーまたは挿入するために使用することができるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、例えば標的部位の標的DNAの野生型配列に対応する、例えば1つまたは複数のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは直鎖状二本鎖DNAである。長さは、例えば、約200～5000塩基対、例えば、約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000、または5000塩基対でもよい。長さは、例えば、少なくとも200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000、または5000塩基対でもよい。いくつかの態様では、長さは、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000、または5000塩基対以下である。いくつかの態様では、二本鎖鋳型ポリヌクレオチドは、160または約160塩基対を超える、例えば、約200～4000、300～3500、400～3000、500～2500、600～2000、700～1900、800～1800、900～1700、1000～1600、1100～1500、または1200～1400塩基対の長さを有する。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、もしくは4000ヌクレオチドの長さまたは約1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、もしくは4000ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、1500もしくは約1500から、2500もしくは約2500ヌクレオチド、または1750もしくは約1750から、2250もしくは約2250ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、約2000±250、2000±200、2000±150、2000±100、または2000±50ヌクレオチドの長さである。

本明細書において記載される鋳型ポリヌクレオチドに含まれる導入遺伝子は、PCRなどの公知の標準的な技法を使用して、プラスミド、細胞、または他の供給源から単離することができる。使用のための鋳型ポリヌクレオチドは、環状スーパーコイル型、環状弛緩型、直鎖状などを含めて、様々なタイプのトポロジーを含むことができる。あるいは、これは、標準的なオリゴヌクレオチド合成技法を使用して化学合成することができる。さらに、鋳型ポリヌクレオチドはメチル化されていてもよく、またはメチル化を欠いていてもよい。鋳型ポリヌクレオチドは、細菌または酵母の人工染色体（BACまたはYAC）の形態でもよい。

鋳型ポリヌクレオチドは直鎖状一本鎖DNAでもよい。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、(i)標的DNAのニックが入った鎖にアニールすることができる直鎖状一本鎖DNA、(ii)標的DNAのインタクトな鎖にアニールすることができる直鎖状一本鎖DNA、(iii)標的DNAの転写される鎖にアニールすることができる直鎖状一本鎖DNA、(iv)標的DNAの転写されない鎖にアニールすることができる直鎖状一本鎖DNA、または上記の1つより多くである。

長さは、例えば、約200～5000ヌクレオチド、例えば、約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000、または5000ヌクレオチドでもよい。長さは、例えば、少なくとも200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000、または5000ヌクレオチドでもよい。いくつかの態様では、長さは、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000、または5000ヌクレオチド以下である。いくつかの態様では、一本鎖鋳型ポリヌクレオチドは約160ヌクレオチド、例えば、約200～4000、300～3500、400～3000、500～2500、600～2000、700～1900、800～1800、900～1700、1000～1600、1100～1500、または1200～1400ヌクレオチドの長さを有する。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは環状二本鎖DNA、例えばプラスミドである。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、導入遺伝子および/または標的部位の両側に約500～1000塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位もしくは導入遺伝子の5'、標的部位もしくは導入遺伝子の3'、または標的部位もしくは導入遺伝子の5'と3'の両方に、約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位もしくは導入遺伝子の5'、標的部位もしくは導入遺伝子の3'、または標的部位もしくは導入遺伝子の5'と3'の両方に、少なくとも10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位もしくは導入遺伝子の5'、標的部位もしくは導入遺伝子の3'、または標的部位もしくは導入遺伝子の5'と3'の両方に、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000塩基対以下の相同性を含む。

a. 導入遺伝子
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、組換え受容体もしくはその一部分、本明細書おいて、例えばセクションIV.Bに記載される任意の組換え受容体、またはそのような組換え受容体の1つもしくは複数の領域、ドメイン、もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む。

いくつかの局面では、導入遺伝子は、細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および/または細胞内領域を含む組換え受容体をコードする。いくつかの局面では、導入遺伝子は、組換え受容体のすべてまたは一部分をコードすることができる。いくつかの態様では、導入遺伝子は、本明細書おいて、例えばセクションIV.Bに記載される任意の組換え受容体、またはそれらの1つもしくは複数の領域、ドメイン、もしくは鎖をコードする。いくつかの局面では、内在性T細胞刺激関連遺伝子座中への導入遺伝子の組み込みの際に、生じた改変T細胞刺激関連遺伝子座は、組換え受容体、例えば、本明細書おいて、例えばセクションIV.Bに記載される任意の組換え受容体、またはそれらの1つもしくは複数の領域、ドメイン、もしくは鎖をコードする。例えば、導入遺伝子は、細胞外領域、膜貫通ドメイン、ならびに共刺激シグナル伝達ドメインおよび他のドメインまたはそれらの一部分を含むことができる細胞内領域の1つまたは複数をコードするヌクレオチドの配列を含むことができる。

いくつかの局面では、ゲノム中の標的場所に挿入されるかまたは組み込まれる、コードおよび/または非コード配列および/またはそれらの部分的コード配列を含めた、組換え受容体またはその一部分をコードする関心対象の核酸配列である導入遺伝子は、「導入遺伝子」、「導入遺伝子配列」、「外来性核酸配列」、「異種配列」、または「ドナー配列」と称することもできる。いくつかの局面では、導入遺伝子は、T細胞、例えばヒトT細胞のゲノム中の特定の標的遺伝子座または標的場所の内在性ゲノム配列などの内在性ゲノム配列に対して外来性または異種である核酸配列である。いくつかの局面では、導入遺伝子は、T細胞、例えばヒトT細胞の標的遺伝子座または標的場所の内在性ゲノム配列と比較して、改変されているか、または異なる配列である。いくつかの局面では、導入遺伝子は、異なる遺伝子、種および/もしくは起源に由来する核酸配列から生じるか、または該核酸配列と比較して改変されている核酸配列である。いくつかの局面では、導入遺伝子は、同じ種の異なる遺伝子座、例えば、異なるゲノム領域または異なる遺伝子からの配列に由来する配列である。いくつかの局面では、例示的な組換え受容体としては、本明細書おいて、例えばセクションIV.Bに記載される任意のものが挙げられる。

いくつかの態様では、ヌクレアーゼ誘導性HDRは、標的挿入のための導入遺伝子の発現のために、導入遺伝子（「外来性配列」または「導入遺伝子配列」とも呼ばれる）の挿入をもたらす。鋳型ポリヌクレオチド配列は、典型的には、それが配置されるゲノム配列と同一ではない。鋳型ポリヌクレオチド配列は、関心対象の場所で効率的なHDRを可能にするために、2つの相同性領域が隣接する非相同配列を含むことができる。さらに、鋳型ポリヌクレオチド配列は、細胞のクロマチン中の関心対象の領域と相同でない配列を含むベクター分子を含むことができる。鋳型ポリヌクレオチド配列は、細胞のクロマチンに対して相同のいくつかの非連続的な領域を含むことができる。例えば、関心対象の領域中に通常は存在しない配列の標的挿入のために、該配列は導入遺伝子中に存在していてもよく、関心対象の領域中の配列に対して相同の領域が隣接していてもよい。

いくつかの局面では、導入遺伝子は、T細胞、場合によってはヒトT細胞の内在性のゲノムT細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームに対して外来性または異種である配列である。いくつかの局面では、内在性T細胞刺激関連遺伝子座における標的部位近くの配列に相同な1つまたは複数の相同性アームに連結した導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドの存在下のHDRは、組換え受容体またはその一部分をコードする改変T細胞刺激関連遺伝子座をもたらす。

いくつかの態様では、導入遺伝子は、組換え受容体の様々な領域、ドメイン、または鎖のすべてまたは一部分、例えば、本明細書のセクションIV.Bに記載される組換え受容体または様々な領域、ドメイン、もしくは鎖をコードする。

いくつかの局面では、導入遺伝子は、異なる遺伝子、種および/または起源からの異なる核酸配列を結合させることによって生成される配列を含むキメラ配列である。いくつかの局面では、導入遺伝子は、結合または連結された、異なる遺伝子、コード配列またはエクソンまたはそれらの一部分からの、異なる領域またはドメインまたはそれらの一部分をコードするヌクレオチドの配列を含む。いくつかの局面では、標的組み込みのための導入遺伝子は、ポリペプチドまたはその断片をコードする。

いくつかの態様では、導入遺伝子は、キメラ受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）、またはその一部分、例えばそのドメインもしくは領域である、組換え受容体をコードすることができる。いくつかの態様では、導入遺伝子は、組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）の様々な領域またはドメインをコードする。いくつかの態様では、導入遺伝子は、CARのすべてのドメインまたは領域を含む、CAR全体または完全長CARをコードする。いくつかの態様では、導入遺伝子は、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインを含む、細胞内領域、例えばCARの細胞内領域をコードするヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様では、導入遺伝子はまた、膜貫通領域または膜結合領域、例えばCARの膜貫通領域をコードするヌクレオチドの配列も含む。いくつかの態様では、導入遺伝子はまた、細胞外領域、例えばCARの細胞外領域をコードするヌクレオチドの配列も含む。いくつかの態様では、導入遺伝子は、CARの一部分、例えば、CARの1つまたは複数のドメインまたは領域をコードする。いくつかの態様では、CARは多鎖CARであり、導入遺伝子は、多鎖CARの1つまたは複数の鎖をコードする。いくつかの態様では、CARは多鎖CARであり、導入遺伝子は、多鎖CARの1つの鎖をコードする。いくつかの態様では、提供される操作された細胞においてT細胞刺激関連遺伝子座に組み込まれている導入遺伝子が、組換え受容体、例えばCARの一部分をコードする場合には、組換え受容体の残りの部分は、操作された細胞のゲノム中の異なる場所（例えば、異なるT細胞刺激関連遺伝子座、または異なる場所）に存在する第2の導入遺伝子によってコードされ得る。例示的なキメラ受容体には、以下のセクションIV.B.1およびIV.B.3に記載されるものが含まれる。

いくつかの態様では、導入遺伝子は、組換え受容体、例えば組換えT細胞受容体（TCR）、またはその一部分、例えばそのドメイン、領域、もしくは鎖をコードすることができる。いくつかの態様では、組換え受容体は、組換えTCRである。いくつかの態様では、組換え受容体、例えば組換えTCRは、2つ以上の別々のポリペプチド鎖、例えば、TCRアルファ（TCRα）鎖およびTCRベータ（TCRβ）鎖を含む。いくつかの局面では、導入遺伝子は、組換えTCRの1つまたは複数の鎖、例えば、TCRαまたはTCRβまたはその両方をコードすることができる。いくつかの局面では、導入遺伝子は、組換えTCR全体、例えば、組換えTCRの両鎖、例えば、TCRα鎖およびTCRβ鎖の両方をコードすることができる。いくつかの局面では、導入遺伝子は、組換えTCRの1つの鎖、例えば、TCRα鎖またはTCRβ鎖をコードすることができる。いくつかの局面では、導入遺伝子は、組換えTCRの1つまたは複数の領域またはドメイン、例えば、TCRαまたはTCRβまたはその両方の細胞内領域、膜貫通領域、および/または細胞外領域をコードすることができる。いくつかの態様では、提供される操作された細胞においてT細胞刺激関連遺伝子座に組み込まれている導入遺伝子が、組換え受容体の一部分、例えば、組換えTCRの1つの鎖をコードする場合には、組換え受容体の残りの部分、例えば、組換えTCRの他の鎖は、操作された細胞のゲノム中の異なる場所（例えば、異なるT細胞刺激関連遺伝子座、または異なる場所）に存在する第2の導入遺伝子によってコードされる得る。いくつかの態様では、提供される操作された細胞においてT細胞刺激関連遺伝子座に組み込まれている導入遺伝子が、組換え受容体の一部分、例えば、組換えTCRの1つのドメインをコードする場合には、組換え受容体の残りの部分、例えば、組換えTCRの他の残りのドメインは、操作された細胞のゲノム中の異なる場所に存在する第2の導入遺伝子によってコードされ得る。いくつかの局面では、TCRαおよびTCRβをコードする配列は、場合によっては、2Aエレメントなどのマルチシストロン性エレメントによって分離される。例示的な組換えTCRには、以下のセクションIII.B.4に記載されるものが含まれる。

いくつかの局面では、導入遺伝子は、非コード、制御、または調節配列、例えば、コードされるポリペプチドもしくはその断片の発現をモジュレートするおよび/もしくは制御することを可能にするのに必要とされる配列、またはポリペプチドを修飾するのに必要とされる配列も含む。いくつかの態様では、導入遺伝子は、イントロンを含まないか、または導入遺伝子がゲノム配列に由来する場合は、ゲノム中の対応する核酸と比較して1つもしくは複数のイントロンを欠く。いくつかの態様では、導入遺伝子はイントロンを含まない。態様のいくつかでは、導入遺伝子は組換え受容体またはその一部分をコードする配列を含み、例えばヒト細胞での発現のために、導入遺伝子のすべてまたは一部分がコドン最適化されている。

いくつかの態様では、コードおよび非コード領域を含む導入遺伝子の長さは、100～約10,000塩基対または約100～約10,000塩基対、例えば、約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、または10000塩基対である。いくつかの態様では、導入遺伝子の長さは、調製、合成、もしくはアセンブルすることができる、および/または細胞中に導入することができるポリヌクレオチドの最大の長さ、あるいはウイルスベクターの収容能力によって制限される。いくつかの局面では、導入遺伝子の長さは、鋳型ポリヌクレオチドの最大の長さおよび/または必要とされる1つまたは複数の相同性アームの長さによって変動し得る。

いくつかの態様では、遺伝子破壊誘導性HDRは、ゲノム中の標的場所で導入遺伝子の挿入または組み込みをもたらす。鋳型ポリヌクレオチド配列は、典型的には、それがターゲティングされるゲノム配列と同一ではない。鋳型ポリヌクレオチド配列は、関心対象の場所で効率的なHDRを可能にするために、2つの相同性領域が隣接する導入遺伝子を含むことができる。鋳型ポリヌクレオチド配列は、ゲノムDNAに対して相同のいくつかの非連続的な領域を含むことができる。例えば、関心対象の領域中に通常は存在しない配列の標的挿入のために、前記配列は導入遺伝子中に存在していてもよく、関心対象の領域中の配列に対して相同の領域が隣接していてもよい。いくつかの態様では、導入遺伝子は、組換え受容体またはその一部分、例えば、細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび/または細胞内領域の一部分の1つまたは複数をコードする。

いくつかの局面では、HDRによる導入遺伝子の標的組み込みの際に、細胞のゲノムは、組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列を含む改変T細胞刺激関連遺伝子座を含む。いくつかの局面では、完全な組換え受容体が導入遺伝子にコードされる。いくつかの局面では、導入遺伝子は、他の分子および/または制御もしくは調節エレメント、例えば、外来性プロモーターおよび/もしくは1つもしくは複数のマルチシストロン性エレメントをコードするヌクレオチドの配列も含む。

いくつかの態様では、導入遺伝子は、シグナルペプチド、制御または調節エレメント、例えばプロモーター、および/または1つもしくは複数のマルチシストロン性エレメント、例えば、リボソームスキップエレメントもしくは配列内リボソーム進入部位（IRES）をコードするシグナル配列も含む。いくつかの態様では、シグナル配列は、組換え受容体をコードするヌクレオチドの配列の5'に配置され得る。

導入遺伝子にコードされる例示的な領域、ドメイン、または鎖は以下に記載され、また、本明細書のセクションIV.Bに記載される任意の領域またはドメインでもよい。

(i) シグナル配列
いくつかの態様では、導入遺伝子は、シグナルペプチドをコードするシグナル配列を含む。いくつかの局面では、シグナル配列は、異種または非天然のシグナルペプチド、例えば、異なる遺伝子もしくは種からのシグナルペプチド、または内在性T細胞刺激関連遺伝子座のシグナルペプチドと異なるシグナルペプチドをコードすることができる。いくつかの局面では、例示的なシグナル配列としては、SEQ ID NO:24または288に記載され、SEQ ID NO:25に記載されるシグナルペプチドをコードするGMCSFRアルファ鎖のシグナル配列、またはSEQ ID NO:26に記載されるCD8アルファシグナルペプチドが挙げられる。発現される組換え受容体の成熟型では、シグナル配列はポリペプチドの残りの部分から切断される。いくつかの局面では、シグナル配列は、制御または調節エレメント、例えばプロモーター、例えば異種プロモーター、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座に由来しないプロモーターの3'に配置される。いくつかの局面では、シグナル配列は、1つまたは複数のマルチシストロン性エレメント、例えば、リボソームスキップ配列および/または配列内リボソーム進入部位（IRES）をコードするヌクレオチドの配列の3'に配置される。いくつかの局面では、シグナル配列は、導入遺伝子中の細胞外領域の1つまたは複数の成分をコードするヌクレオチドの配列の5'に配置され得る。いくつかの態様では、シグナル配列は導入遺伝子中に存在する最も5'の領域であり、相同性アームの1つに連結される。いくつかの局面では、導入遺伝子にコードされるシグナル配列としては、本明細書において記載される任意のシグナル配列が挙げられる。

(ii) 例示的な組換え受容体コード配列
いくつかの局面では、標的組み込みのための導入遺伝子は、キメラ受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）またはキメラ自己抗体受容体（CAAR）である組換え受容体をコードする配列を含む。いくつかの局面では、導入遺伝子は、結合または連結された、異なる遺伝子、コード配列またはエクソンまたはそれらの一部分に由来し得る、キメラ受容体の異なる領域またはドメインまたは一部分をコードするヌクレオチドの配列を含む。

いくつかの態様では、コードされる組換え受容体、例えばCARは、1つまたは複数の領域またはドメイン、例えば、（例えば、1つまたは複数の細胞外結合ドメインおよび/またはスペーサーを含む）細胞外領域、膜貫通ドメイン、ならびに/あるいは（例えば、一次シグナル伝達領域もしくはドメインおよび/または1つもしくは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む）細胞内領域の1つまたは複数を含む。いくつかの局面では、コードされるCARは、他のドメイン、そのような多量体化ドメインまたはリンカーをさらに含む。

いくつかの局面では、導入遺伝子中で、細胞外領域をコードするヌクレオチドの配列は、シグナル配列とスペーサーをコードするヌクレオチドとの間に配置される。いくつかの局面では、導入遺伝子中で、細胞外多量体化ドメインをコードするヌクレオチドの配列は、結合ドメインをコードするヌクレオチドの配列とスペーサーをコードするヌクレオチドの配列の間に配置される。いくつかの局面では、スペーサーをコードするヌクレオチドの配列は、結合ドメインをコードするヌクレオチドの配列と膜貫通ドメインをコードするヌクレオチドの配列の間に配置される。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'から3'の順番で、細胞外領域をコードするヌクレオチドの配列、ヌクレオチドの配列、膜貫通ドメイン（または膜結合ドメイン）、およびヌクレオチドの配列、細胞内領域を含む。

いくつかの態様では、コードされる組換え受容体はCARであり、細胞外領域をコードする導入遺伝子は、5'から3'の順番で、細胞外結合ドメインをコードするヌクレオチドの配列およびスペーサーをコードするヌクレオチドの配列を含むことができる。いくつかの態様では、導入遺伝子は、1つまたは複数の細胞外多量体化ドメインをコードするヌクレオチドの配列も含み、これは、結合ドメインおよび/もしくはスペーサーをコードするヌクレオチドの配列のいずれかの5'もしくは3'に、ならびに/または膜貫通ドメインをコードするヌクレオチドの配列の5'に配置され得る。いくつかの局面では、導入遺伝子は、典型的には細胞外領域をコードするヌクレオチドの配列の5'に配置されるシグナル配列も含む。

いくつかの局面では、導入遺伝子中で、結合ドメインをコードするヌクレオチドの配列は、シグナル配列とスペーサーをコードするヌクレオチドとの間に配置される。いくつかの局面では、導入遺伝子中で、細胞外多量体化ドメインをコードするヌクレオチドの配列は、結合ドメインをコードするヌクレオチドの配列とスペーサーをコードするヌクレオチドの配列の間に配置される。いくつかの局面では、スペーサーをコードするヌクレオチドの配列は、結合ドメインをコードするヌクレオチドの配列と膜貫通ドメインをコードするヌクレオチドの配列の間に配置される。

いくつかの態様では、導入遺伝子は、細胞内領域をコードするヌクレオチドの配列を含み、これは、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインおよび/または一次シグナル伝達ドメインもしくは領域をコードするヌクレオチドの配列を含むことができる。

いくつかの態様では、導入遺伝子は、1つまたは複数のマルチシストロン性エレメント、例えば、リボソームスキップ配列および/または配列内リボソーム進入部位（IRES）も含む。いくつかの局面では、導入遺伝子は、典型的には導入遺伝子の最も5'部分、例えば、シグナル配列の5'に、制御または調節エレメント、例えばプロモーターも含む。いくつかの局面では、1つまたは複数のさらなる分子またはさらなるドメインもしくは領域をコードするヌクレオチドの配列は、ポリヌクレオチドの導入遺伝子部分に含まれ得る。いくつかの局面では、1つまたは複数のさらなる分子またはさらなるドメインもしくは領域をコードするヌクレオチドの配列は、CARの1つまたは複数の領域またはドメイン、または鎖をコードするヌクレオチドの配列の5'に配置され得る。いくつかの局面では、1つまたは複数のさらなる分子またはさらなるドメイン、領域、もしくは鎖をコードするヌクレオチドの配列は、CARの1つまたは複数の領域をコードするヌクレオチドの配列の上流にある。

導入遺伝子にコードされるキメラ受容体の例示的なドメインまたは領域は以下に記載され、また、以下のセクションIV.B.1およびIV.B.3に記載される例示的なキメラ受容体の任意の領域またはドメインを挙げることができる。

(a) 結合ドメイン
いくつかの態様では、導入遺伝子は、組換え受容体、例えば、特定の抗原（またはリガンド）、例えば、特定の細胞型の表面で発現している抗原に特異性を有するCARの一部分をコードする。いくつかの態様では、抗原は、例えば、健常な細胞または組織中の正常なまたは非標的の細胞または組織と比較して、疾患または状態の細胞、例えば、腫瘍または病原性細胞上で選択的に発現しているか、または過剰発現している。

いくつかの局面では、導入遺伝子は組換え受容体の細胞外領域をコードする。いくつかの態様では、導入遺伝子は、細胞外結合ドメイン、例えば、抗原またはリガンドに特異的に結合する結合ドメインをコードする。

いくつかの態様では、結合ドメインは、ポリペプチド、リガンド、受容体、リガンド結合ドメイン、受容体結合ドメイン、抗原、エピトープ、抗体、抗原結合ドメイン、エピトープ結合ドメイン、抗体結合ドメイン、タグ結合ドメイン、もしくは前述のもののいずれかの断片であるか、またはこれらを含む。他の態様では、抗原は正常細胞上で発現している、および/または操作された細胞上で発現している。いくつかの局面では、抗原は結合ドメイン、例えば、リガンド結合ドメインまたは抗原結合ドメインによって認識される。いくつかの局面では、導入遺伝子は、1つまたは複数の結合ドメインを含む細胞外領域をコードする。いくつかの態様では、導入遺伝子にコードされる例示的な結合ドメインとしては、scFvまたはsdAbを含めて、抗体およびその抗原結合断片が挙げられる。いくつかの態様では、抗原結合断片は、可動性リンカーによって結合した抗体可変領域を含む。

いくつかの態様では、結合ドメインは、単鎖可変断片（scFv）であるか、またはこれを含む。いくつかの態様では、結合ドメインは、単一ドメイン抗体（sdAb）であるか、またはこれを含む。いくつかの態様では、結合ドメインは、ある疾患、障害、もしくは状態の細胞もしくは組織に関連している、それに特異的である、および/またはその上に発現している標的抗原に結合することができる。いくつかの態様では、疾患、障害、または状態は、感染疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである。いくつかの態様では、標的抗原は腫瘍抗原である。

導入遺伝子にコードされる例示的な抗原および抗原またはリガンド結合ドメインとしては、本明細書のセクションIV.B.1に記載されるものが挙げられる。いくつかの局面では、コードされる組換え受容体は、主要組織適合抗原複合体（MHC）-ペプチド複合体として細胞表面に提示される腫瘍関連抗原などの細胞内抗原を特異的に認識するscFvのようなTCR様抗体もしくはその断片であるかまたはこれらを含む、結合ドメインを含む。いくつかの局面では、導入遺伝子は、TCR様抗体またはその断片である結合ドメインをコードすることができる。したがって、コードされる組換え受容体は、TCR様CAR、例えば、本明細書においてセクションIV.Bに記載される任意のものである。いくつかの態様では、結合ドメインは、二重特異性などの多重特異性結合ドメインである。いくつかの態様では、コードされる組換え受容体は、自己抗体に結合する抗原である結合ドメインを含む。いくつかの態様では、組換え受容体はキメラ自己抗体受容体（CAAR）、例えば、本明細書においてセクションIV.B.3に記載される任意のものである。

いくつかの局面では、1つまたは複数の結合ドメインをコードするヌクレオチドの配列は、導入遺伝子中で、存在する場合は、シグナル配列の3'に配置され得る。いくつかの局面では、1つまたは複数の結合ドメインをコードするヌクレオチドの配列は、導入遺伝子中で、1つまたは複数の制御または調節エレメントをコードするヌクレオチドの配列の3'に配置され得る。いくつかの局面では、1つまたは複数の結合ドメインをコードするヌクレオチドの配列は、導入遺伝子中で、存在する場合は、スペーサーをコードするヌクレオチドの配列の5'に配置され得る。いくつかの局面では、1つまたは複数の結合ドメインをコードするヌクレオチドの配列は、導入遺伝子中で、膜貫通ドメインをコードするヌクレオチドの配列の5'に配置され得る。

(b) スペーサーおよび膜貫通ドメイン
いくつかの態様では、コードされる組換え受容体はCARであり、導入遺伝子は、スペーサーをコードする配列および/または膜貫通ドメインもしくはその一部分をコードする配列を含む。いくつかの態様では、コードされる組換え受容体の細胞外領域はスペーサーを含み、場合によっては、スペーサーは結合ドメインと膜貫通ドメインの間に機能的に連結される。いくつかの局面では、スペーサーおよび/または膜貫通ドメインは、リガンド（例えば抗原）結合ドメインを含む細胞外部分と組換え受容体の他の領域またはドメイン、例えば、（例えば、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメイン、細胞内多量体化ドメイン、および/または一次シグナル伝達ドメインもしくは領域を含む）細胞内領域とを連結することができる。

いくつかの態様では、導入遺伝子は、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインを分離するスペーサーおよび/またはヒンジ領域をコードするヌクレオチドの配列をさらに含む。いくつかの局面では、スペーサーは、免疫グロブリン定常領域、またはそのバリアントもしくは改変バージョンの少なくとも一部分、例えばヒンジ領域、例えばIgG4ヒンジ領域、ならびに/またはC_H1/C_Lおよび/もしくはFc領域であり得るか、またはこれらを含むことができる。いくつかの態様では、定常領域または部分は、ヒトIgG、例えば、IgG4またはIgG1のものである。いくつかの局面では、定常領域の部分は、結合ドメイン、例えばscFvと膜貫通ドメインの間のスペーサー領域として働く。導入遺伝子にコードされ得る例示的なスペーサーとしては、IgG4ヒンジ単独、C_H2およびC_H3ドメインに連結したIgG4ヒンジ、またはC_H3ドメインに連結したIgG4ヒンジ、およびHudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153, Hudecek et al. (2015) Cancer Immunol Res. 3(2): 125-135もしくは国際特許出願公開番号WO2014031687に記載されているもの、または本明細書のセクションIV.B.1に記載される任意のものが挙げられる。

いくつかの局面では、スペーサーをコードするヌクレオチドの配列は、導入遺伝子中で、1つまたは複数の結合ドメインをコードするヌクレオチドの配列の3'に配置され得る。いくつかの局面では、スペーサーをコードするヌクレオチドの配列は、導入遺伝子中で、膜貫通ドメインをコードするヌクレオチドの配列の5'に配置され得る。いくつかの態様では、スペーサーをコードするヌクレオチドの配列は、1つまたは複数の結合ドメインをコードするヌクレオチドの配列と膜貫通ドメインをコードするヌクレオチドの配列の間に配置される。

いくつかの態様では、導入遺伝子は膜貫通ドメインをコードし、これは、例えば、1つまたは複数の結合ドメインおよび/またはスペーサーを含む細胞外領域を例えば、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメイン、細胞内多量体化ドメイン、および/または一次シグナル伝達ドメインもしくは領域を含む細胞内領域と連結することができる。いくつかの態様では、導入遺伝子は膜貫通ドメインをコードするヌクレオチドの配列を含み、場合によっては、膜貫通ドメインはヒトであり、またはヒトタンパク質からの配列を含む。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは、CD4、CD28、またはCD8に由来する、場合によってはヒトCD4、ヒトCD28、またはヒトCD8に由来する膜貫通ドメインであるか、または該膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは、CD28に由来する、場合によってはヒトCD28に由来する膜貫通ドメインであるか、または該膜貫通ドメインを含む。

いくつかの態様では、膜貫通ドメインをコードするヌクレオチドの配列は細胞外領域をコードするヌクレオチドの配列に融合している。いくつかの態様では、膜貫通ドメインをコードするヌクレオチドの配列は、細胞内領域をコードするヌクレオチドの配列に融合している。いくつかの局面では、膜貫通ドメインをコードするヌクレオチドの配列は、導入遺伝子中で、1つまたは複数の結合ドメインおよび/またはスペーサーをコードするヌクレオチドの配列の3'に配置され得る。いくつかの局面では、膜貫通ドメインをコードするヌクレオチドの配列は、導入遺伝子中で、例えば、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメイン、細胞内多量体化ドメイン、および/または一次シグナル伝達ドメインもしくは領域を含む細胞内領域をコードするヌクレオチドの配列の5'に配置され得る。いくつかの局面では、導入遺伝子にコードされる膜貫通ドメインとしては、本明細書において、例えばセクションIV.B.1に記載される任意の膜貫通ドメインが挙げられる。

いくつかの態様では、コードされる組換え受容体が、一次シグナル伝達ドメインまたは領域を含む細胞内領域を含むが、膜貫通ドメインおよび/または細胞外領域を含まない場合には、導入遺伝子は、膜結合ドメイン、例えば、本明細書おいて、例えばセクションIV.Bに記載される任意のものをコードするヌクレオチドの配列を含むことができる。

(c) 細胞内領域
いくつかの態様では、導入遺伝子は、細胞内領域をコードするヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様では、導入遺伝子はCARをコードし、いくつかの局面では、細胞内領域は、1つまたは複数の二次的または共刺激性シグナル伝達領域を含む。いくつかの局面では、膜貫通ドメインをコードするヌクレオチドの配列は、導入遺伝子中で、導入遺伝子中の1つまたは複数の結合ドメインおよび/またはスペーサーをコードするヌクレオチドの配列の3'に配置され得る。いくつかの局面では、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチドの配列は、一次シグナル伝達ドメインまたは領域をコードするヌクレオチドの配列の5'に配置され得る。いくつかの局面では、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチドの配列は、一次シグナル伝達ドメインまたは領域をコードするヌクレオチドの配列の3'に配置され得る。いくつかの局面では、細胞内領域をコードするヌクレオチドの配列は、導入遺伝子中で最も3'領域にあり、これは、次いで、相同性アーム配列の1つ、例えば、3'相同性アーム配列に連結される。いくつかの局面では、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチドの配列は、導入遺伝子中で、膜貫通ドメインをコードするヌクレオチドの配列の3'に配置され得る。いくつかの局面では、導入遺伝子にコードされる共刺激シグナル伝達領域または一次シグナル伝達ドメインもしくは領域としては、本明細書において、例えばセクションIV.B.1に記載される任意の共刺激シグナル伝達領域または任意の一次シグナル伝達ドメインもしくは領域が挙げられる。

(1) 共刺激シグナル伝達ドメイン
いくつかの態様では、導入遺伝子は、細胞内領域の一部分をコードするヌクレオチドの配列を含み、これは、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含むことができる。いくつかの態様では、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、T細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインまたはそのシグナル伝達部分を含み、任意で、T細胞共刺激分子またはそのシグナル伝達部分はヒトである。

いくつかの態様では、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、T細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインまたはそのシグナル伝達部分を含む。いくつかの態様では、T細胞共刺激分子またはそのシグナル伝達部分はヒトである。いくつかの態様では、導入遺伝子にコードされる例示的な共刺激シグナル伝達ドメインとしては、1つまたは複数の共刺激受容体、例えば、CD28、CD137（4-1BB）、OX40（CD134）、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D、ICOS、および/または他の共刺激受容体からのシグナル伝達領域またはドメイン、例えば、本明細書において、本明細書のセクションIV.Bに記載される任意のものが挙げられる。いくつかの態様では、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、CD28、4-1BB、もしくはICOS、またはこれらのシグナル伝達部分の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、ヒトCD28、ヒト4-1BB、ヒトICOS、またはこれらのシグナル伝達部分のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、ヒト4-1BBの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

(2) 一次シグナル伝達領域またはドメイン
いくつかの態様では、組換え受容体、例えばCARをコードする導入遺伝子は、一次シグナル伝達領域またはドメイン、例えば、CD3ゼータ（CD3ζ）の細胞質内ドメインをコードするヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様では、一次シグナル伝達領域は、T細胞において一次活性化シグナルを刺激および/または誘導することができるシグナル伝達ドメイン、T細胞受容体（TCR）成分のシグナル伝達ドメイン（例えば、CD3ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメインもしくは領域またはそれらの機能的バリアントもしくはシグナル伝達部分）、ならびに/または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含むシグナル伝達ドメインであるか、あるいはこれらを含む。いくつかの態様では、コードされる組換え受容体は、本明細書において、例えばセクションIV.Bに記載される任意のものである。

いくつかの局面では、導入遺伝子は、TCR複合体の一次刺激および/または活性化を制御する一次細胞質内シグナル伝達領域をコードするヌクレオチドの配列を含む。刺激性様式で作用する一次細胞質内シグナル伝達領域は、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはITAMとして公知であるシグナル伝達モチーフを含むことができる。一次細胞質内シグナル伝達領域を含むITAMの例としては、TCRまたはCD3ゼータ（CD3ζ）、Fc受容体（FcR）ガンマまたはFcRベータに由来するものが挙げられる。いくつかの態様では、CAR中の細胞質内シグナル伝達領域またはドメインは、CD3ゼータに由来する細胞質内シグナル伝達ドメイン、その一部分、または配列を含む。いくつかの態様では、細胞内（または細胞質内）シグナル伝達領域は、ヒトCD3鎖、任意でCD3ゼータ刺激性シグナル伝達ドメインもしくはその機能的バリアント、例えば、ヒトCD3ζのアイソフォーム3（受託番号：P20963.2）の112AA細胞質内ドメイン、または米国特許第7,446,190号もしくは米国特許第8,911,993号に記載されるCD3ゼータシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達領域は、SEQ ID NO:13、14、または15に記載されるアミノ酸の配列、あるいはSEQ ID NO:13、14、または15に対して、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。

いくつかの局面では、導入遺伝子にコードされる一次シグナル伝達ドメインまたは領域としては、本明細書において、例えばセクションIV.B.1に記載される任意の一次シグナル伝達ドメインまたは領域が挙げられる。

(d) さらなるドメイン、例えば多量体化ドメイン
いくつかの態様では、導入遺伝子は、1つまたは複数の多量体化ドメイン、例えば、二量体化ドメインをコードするヌクレオチドの配列も含む。いくつかの局面では、コードされる多量体化ドメインは細胞外、または細胞内にあり得る。いくつかの態様では、コードされる多量体化ドメインは細胞外にある。いくつかの態様では、コードされる多量体化ドメインは細胞内にある。いくつかの態様では、導入遺伝子にコードされる細胞内領域の部分は、多量体化ドメイン、任意で二量体化ドメインを含む。いくつかの態様では、導入遺伝子は、細胞外領域をコードするヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様では、細胞外領域は、多量体化ドメイン、任意で二量体化ドメインを含む。いくつかの態様では、多量体化ドメインは、誘導物質への結合の際に、二量体化することができる。

いくつかの局面では、組換え受容体は多鎖組換え受容体、例えば多鎖CARである。いくつかの態様では、多鎖組換え受容体またはその一部分の1つまたは複数の鎖は導入遺伝子にコードされる。いくつかの態様では、多鎖組換え受容体の1つまたは複数の鎖は、組換え受容体のそれぞれの鎖に含まれる多量体化ドメインの多量体化によって、機能的または活性的な組換え受容体を一緒に形成することができる。

いくつかの局面では、多量体化ドメインをコードするヌクレオチドの配列は他のドメインの5'または3'にある。例えば、いくつかの態様では、コードされる多量体化ドメインは細胞外にあり、多量体化ドメインをコードする配列は、スペーサーをコードする配列の5'にある。いくつかの態様では、コードされる多量体化ドメインは細胞内にあり、多量体化ドメインをコードする配列は、一次シグナル伝達領域またはドメインをコードする配列の5'にある。いくつかの態様では、多量体化ドメインは細胞内にあり、多量体化ドメインをコードする配列は、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインをコードする配列の5'または3'にある。いくつかの態様では、コードされる多量体化ドメインは、誘導物質の結合の際に、多量体化する（例えば二量体化する）ことができる。例示的なコードされる多量体化ドメインとしては、本明細書おいて、例えば、本明細書のセクションIV.Bに記載される任意の多量体化ドメインが挙げられる。

(iii) 例示的なT細胞受容体（TCR）コード配列
いくつかの態様では、導入遺伝子にコードされる組換え受容体は組換えT細胞受容体（TCR）である。いくつかの局面では、導入遺伝子は、組換えTCRのすべてまたは一部分をコードすることができる。いくつかの態様では、導入遺伝子は、組換えTCRの1つまたは複数の鎖、領域、またはドメインをコードするヌクレオチドの配列を含む。導入遺伝子にコードされる例示的組換えTCRは以下に記載され、また、以下のセクションIV.B.4に記載される例示的組換えTCRの任意の鎖、領域、またはドメインを含むことができる。

いくつかの態様では、TCRは、2つ以上の別個のポリペプチド鎖、例えば、TCRアルファ（TCRα）およびTCRベータ（TCRβ）鎖を含む。いくつかの局面では、導入遺伝子は、組換えTCRの1つまたは複数の鎖、例えば、TCRαまたはTCRβまたは両方をコードすることができる。いくつかの局面では、導入遺伝子は、TCRαおよびTCRβ鎖を両方ともコードすることができる。いくつかの局面では、導入遺伝子は、TCRα鎖またはTCRβ鎖の一方をコードすることができ、操作された細胞中に存在する第2の導入遺伝子は、TCRのもう一方の鎖をコードすることができる。いくつかの局面では、TCRαおよびTCRβをコードする配列は、任意でマルチシストロン性エレメント、例えば2Aエレメントによって分離されている。

ある特定の態様では、導入遺伝子は、組換え受容体をコードする核酸配列を含み、組換えTCRまたはその抗原結合断片である。いくつかの局面では、導入遺伝子は、組換えTCRである場合、可変ドメインおよび定常ドメインを含む鎖をコードすることができる。いくつかの局面では、導入遺伝子は、1つまたは複数の可変ドメインおよび1つまたは複数の定常ドメインを含む組換えTCRの鎖をコードする。態様のいくつかでは、導入遺伝子はTCRαおよびTCRβ鎖をコードする配列を含む。

いくつかの態様では、コードされるTCRα鎖およびTCRβ鎖は、リンカー領域によって分離される。いくつかの態様では、TCRαとTCRβ鎖を連結して単一ポリペプチド鎖を形成するリンカー配列が含まれる。いくつかの態様では、リンカーは、α鎖のC末端からβ鎖のN末端の、またはその逆の距離にわたるのに十分な長さのものであり、一方で、リンカーの長さが、標的のペプチド-MHC複合体への結合を阻止するかまたは低減させるほど長くないことも確実にする。いくつかの態様では、リンカーは、単一ポリペプチド鎖を形成することができ、同時にTCR結合特異性を保持する任意のリンカーでもよい。いくつかの態様では、リンカーは、10または約10～45アミノ酸、例えば、10～30アミノ酸、または26～41アミノ酸残基、例えば、29、30、31、または32アミノ酸を含むことができる。いくつかの態様では、リンカーは式-PGGG-(SGGGG)n-P-を有し、式中nは5または6であり、Pはプロリンであり、Gはグリシンであり、Sはセリンである（SEQ ID NO:22）。いくつかの態様では、リンカーは、配列

を有する。いくつかの態様では、プロテアーゼによって認識される、および/またはプロテアーゼによって開裂され得る、TCRα鎖またはその一部分とTCRβ鎖またはその一部分の間のリンカー。ある特定の態様では、TCRα鎖またはその一部分をコードする核酸配列とTCRβ鎖またはその一部分をコードする核酸配列の間のリンカーは、マルチシストロン性エレメントを含む。

いくつかの態様では、導入遺伝子は、構造[TCRβ鎖]-[リンカーまたはマルチシストロン性エレメント]-[TCRα鎖]であるか、もしくは該構造を含むヌクレオチドの配列であるか、または該配列を含む。いずれかの態様のいくつかでは、導入遺伝子は、構造[TCRα鎖]-[リンカーまたはマルチシストロン性エレメント]-[TCRβ鎖]であるか、もしくは該構造を含むヌクレオチドの配列であるか、または該配列を含む。いくつかの局面では、マルチシストロン性エレメントは、リボソームスキッピングエレメント/自己開裂エレメント（例えば、2Aエレメントまたは配列内リボソーム進入部位（IRES）、例えば、本明細書において記載される任意のものを含む。

(iv) さらなる分子、例えばマーカー
いくつかの態様では、導入遺伝子は、1つまたは複数のさらなる分子、例えば、抗体、抗原、多鎖組換え受容体のさらなるキメラ鎖またはポリペプチド鎖（例えば、多鎖CAR、キメラ共刺激性受容体、阻害性受容体、制御可能なキメラ抗原受容体、または本明細書において、例えばセクションIV.B.2に記載される多鎖組換え受容体システムの他の成分、またはセクションIV.B.3に記載される組換えT細胞受容体（TCR））、形質導入マーカーまたは代用マーカー（例えばトランケートされた細胞表面マーカー）、酵素、因子、転写因子、阻害性ペプチド、増殖因子、核内受容体、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、ケモカイン、可溶性受容体、可溶性サイトカイン受容体、可溶性ケモカイン受容体、レポーター、前述のもののいずれかの機能的断片または機能的バリアント、および前述のものの組み合わせをコードするヌクレオチドの配列も含む。いくつかの局面では、1つまたは複数のさらなる分子をコードするヌクレオチドのそのような配列は、組換え受容体の領域またはドメインをコードするヌクレオチドの配列の5'に配置され得る。いくつかの局面では、1つまたは複数の他の分子をコードする配列および組換え受容体の領域またはドメインをコードするヌクレオチドの配列は、制御配列、例えば、2Aリボソームスキッピングエレメントおよび/またはプロモーター配列によって分離される。

いくつかの態様では、導入遺伝子は、1つまたは複数のさらなる分子をコードするヌクレオチドの配列も含む。いくつかの局面では、1つまたは複数のさらなる分子としては1つまたは複数のマーカーが挙げられる。いくつかの態様では、1つまたは複数のマーカーとしては、形質導入マーカー、代用マーカー、および/または選択マーカーが挙げられる。いくつかの態様では、導入遺伝子は、移入された細胞の生存率および/または機能を促進することによって療法の有効性を向上させることができる核酸配列；例えば、インビボでの生存または局在を評価するために、細胞の選択および/または評価のための遺伝子マーカーを提供するための核酸配列；例えば、Lupton et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991)；およびRiddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)によって記載されているようにインビボで細胞をネガティブ選択に感受性にすることによって安全性を向上させるための核酸配列も含み；ドミナントポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーを融合することから得られる二機能性の選択可能融合遺伝子の使用を記載するWO1992008796およびWO1994028143、ならびに米国特許第6,040,177号も参照されたい。いくつかの局面では、マーカーとしては、本明細書において、例えば、本セクションもしくはセクションIIもしくはIIIに記載される任意のマーカー、または本明細書において、例えばセクションIV.B.2に記載される任意のさらなる分子および/もしくは受容体ポリペプチドが挙げられる。いくつかの態様では、さらなる分子は、代用マーカー、任意でトランケートされた受容体であり、任意で、トランケートされた受容体は細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、かつ/またはそのリガンドが結合した場合に細胞内シグナル伝達を媒介することができない。

いくつかの態様では、マーカーは形質導入マーカーまたは代用マーカーである。形質導入マーカーまたは代用マーカーは、ポリヌクレオチド、例えば、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞を検出するために使用することができる。いくつかの態様では、形質導入マーカーは、細胞の改変を示すか、または確認することができる。いくつかの態様では、代用マーカーは、組換え受容体、例えば、CARまたはTCRと細胞表面で共発現するように作製されたタンパク質である。いずれかの態様のいくつかでは、そのような代用マーカーは、活性をほとんどまたは全く有さないように改変された表面タンパク質である。ある特定の態様では、代用マーカーは、組換え受容体をコードする同じポリヌクレオチド上にコードされる。いくつかの態様では、組換え受容体をコードする核酸配列は、任意で、配列内リボソーム進入部位（IRES）、あるいは自己切断ペプチドまたはリボソームスキッピングを引き起こすペプチド、例えば2A配列、例えば、T2A、P2A、E2A、もしくはF2Aをコードする核酸によって分離されて、マーカーをコードする核酸配列に機能的に連結される。細胞の検出または選択を可能にするために、場合によっては、細胞自殺を促進するためにも、外因性マーカー遺伝子を、場合によっては、操作された細胞に関連して利用することができる。

例示的な代用マーカーとしては、細胞表面ポリペプチドのトランケートされた形態、例えば、非機能的であり、シグナルもしくは普通は完全長形態の細胞表面ポリペプチドによって伝達されるシグナルを伝達しないか、もしくは伝達することができない、および/または内部移行しないか、もしくは内部移行することができないトランケートされた形態を挙げることができる。例示的なトランケートされた細胞表面ポリペプチドとしては、増殖因子または他の受容体のトランケートされた形態、例えば、トランケートされたヒト上皮成長因子受容体2（tHER2）、トランケートされた上皮成長因子受容体（tEGFR。例示的なtEGFR配列はSEQ ID NO:7もしくは16に記載される）、または前立腺特異的膜抗原（PSMA）、あるいはこれらの改変形態が挙げられる。tEGFRは、抗体セツキシマブ（アービタックス（登録商標））または他の治療的抗EGFR抗体もしくは結合分子によって認識されるエピトープを含むことができ、これは、tEGFRコンストラクトおよびコードされる外来性タンパク質で操作された細胞を特定もしくは選択するために、ならびに/またはコードされる外来性タンパク質を発現する細胞を排除もしくは分離するために使用することができる。米国特許第8,802,374号およびLiu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434）を参照されたい。いくつかの局面では、マーカー、例えば代用マーカーとしては、CD34、NGFR、CD19もしくはトランケートされたCD19、例えば、トランケートされた非ヒトCD19、または上皮成長因子受容体（例えば、tEGFR）のすべてまたは一部分（例えばトランケートされた形態）が挙げられる。いくつかの態様では、マーカーは、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）、高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）、例えばスーパーフォールドGFP（sfGFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、例えば、tdトマト、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRedもしくはDsRed2、シアン蛍光タンパク質（CFP）、青緑色蛍光タンパク質（BFP）、高感度青色蛍光タンパク質（EBFP）、および黄色蛍光タンパク質（YFP）、ならびにそれらのバリアント、例えば、蛍光タンパク質の種バリアント、単量体バリアント、ならびにコドン最適化および/もしくは高感度バリアントであるか、またはこれらを含む。いくつかの態様では、マーカーは、酵素、例えば、ルシフェラーゼ、大腸菌（E. coli）のlacZ遺伝子、アルカリホスファターゼ、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（SEAP）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）であるか、またはこれらを含む。例示的な発光レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ（luc）、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、β-グルクロニダーゼ（GUS）、またはそれらのバリアントが挙げられる。

いくつかの態様では、マーカーは選択マーカーである。いくつかの態様では、選択マーカーは、外来性の作用物質または薬物に対する抵抗性を与えるポリペプチドであるか、または該ポリペプチド含む。いくつかの態様では、選択マーカーは抗生物質抵抗性遺伝子である。いくつかの態様では、選択マーカーは、哺乳動物細胞に抗生物質抵抗性を与える抗生物質抵抗性遺伝子である。いくつかの態様では、選択マーカーは、ピューロマイシン抵抗性遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子、ブラストサイジン抵抗性遺伝子、ネオマイシン抵抗性遺伝子、ジェネテシン抵抗性遺伝子、もしくはゼオシン抵抗性遺伝子、またはこれらの改変形態であるか、またはこれらを含む。

いくつかの態様では、分子は非自己分子、例えば、非自己タンパク質、すなわち、細胞が養子移植されるであろう宿主の免疫系によって「自己」として認識されないものである。

いくつかの態様では、マーカーは、治療的機能を果たさず、および/または遺伝子操作のための、例えば、首尾よく操作された細胞を選択するためのマーカーとして使用される以外の効果をもたらさない。他の態様では、マーカーは、治療的分子、または別の方法である種の望ましい効果を発揮する分子、例えば、インビボで遭遇する細胞に対するリガンド、例えば、養子移植およびリガンドとの遭遇の際に細胞の応答を増強するおよび/または弱めるための共刺激または免疫チェックポイント分子でもよい。

いくつかの態様では、導入遺伝子は、免疫調節作用物質である1つまたは複数のさらなる分子をコードする配列を含む。いくつかの態様では、免疫調節分子は、免疫チェックポイントモジュレーター、免疫チェックポイント阻害剤、サイトカイン、またはケモカインより選択される。いくつかの態様では、免疫調節作用物質は、免疫チェックポイント分子の機能または免疫チェックポイント分子を含むシグナル伝達経路を阻害または阻止することができる免疫チェックポイント阻害剤である。いくつかの態様では、免疫チェックポイント分子は、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、TIM3、VISTA、アデノシン受容体もしくは細胞外アデノシン、任意で、アデノシン2A受容体（A2AR）もしくはアデノシン2B受容体（A2BR）、またはアデノシン、または前述のもののいずれかを含む経路の中より選択される。他の例示的なさらなる分子としては、エピトープタグ、検出可能な分子、例えば蛍光もしくは発光タンパク質、または細胞増殖および/もしくは遺伝子増幅の増強を媒介する分子（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素）が挙げられる。エピトープタグとしては、例えば、1つまたは複数コピーのFLAG、His、myc、Tap、HA、または任意の検出可能なアミノ酸配列が挙げられる。いくつかの態様では、さらなる分子としては、非コード配列、阻害性核酸配列、例えば、アンチセンスRNA、RNAi、shRNA、およびマイクロRNA（miRNA）、またはヌクレアーゼ認識配列を挙げることができる。

いくつかの局面では、さらなる分子としては、本明細書において記載される任意のさらなる受容体ポリペプチド、例えば、例えばセクションIV.B.2に記載される多鎖組換え受容体の任意のさらなるポリペプチド鎖を挙げることができる。

(v) マルチシストロン性エレメントおよび制御または調節エレメント
いくつかの局面では、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む導入遺伝子は、その発現が、組み込み部位にある内在性プロモーター、すなわち、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の遺伝子の発現を駆動するプロモーターによって駆動されるように、挿入することができる。ポリペプチドをコードする配列がプロモーターを有さないいくつかの態様では、組み込まれた導入遺伝子の発現は、次いで、関心対象の領域の内在性プロモーターまたは他の調節エレメントによって駆動される転写によって保証される。例えば、組換え受容体の一部分をコードする導入遺伝子は、プロモーターなしであるが、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のコード配列とインフレームで挿入することができ、その結果、組み込まれた導入遺伝子の発現は、組み込み部位にある内在性プロモーターおよび/または他の制御エレメントの転写によって調節される。いくつかの態様では、リボソームスキッピングエレメント/自己開裂エレメント（例えば、2Aエレメントまたは配列内リボソーム進入部位（IRES））などのマルチシストロン性エレメントは、組換え受容体の一部分をコードする導入遺伝子の上流に配置され、その結果、マルチシストロン性エレメントはT細胞刺激関連遺伝子座の内在性オープンリーディングフレームの1つまたは複数のエクソンとインフレームで配置され、その結果、組換え受容体をコードする導入遺伝子の発現は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のプロモーターに機能的に連結される。いくつかの態様では、導入遺伝子は3'UTRをコードする配列を含まない。いくつかの態様では、内在性T細胞刺激関連遺伝子座への導入遺伝子の組み込みの際に、導入遺伝子は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の3'UTRの上流に組み込まれ、その結果、組換え受容体をコードするメッセージは、例えば内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームまたはその部分配列からの、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の3'UTRを含む。いくつかの態様では、組換え受容体の残りの部分をコードするオープンリーディングフレームまたはその部分配列は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の3'UTRを含む。

いくつかの態様では、「タンデム」カセットが選択された部位に組み込まれる。いくつかの態様では、「タンデム」カセットの1つまたは複数は、1つまたは複数のポリペプチドまたは因子をコードし、これらは、それぞれ独立に制御エレメントによって調節されるか、またはすべてがマルチシストロン性発現システムとして調節される。いくつかの態様、例えば、ポリヌクレオチドが第1および第2の核酸配列を含む態様では、異なるポリペプチド鎖のそれぞれをコードするコード配列は、同じでもよいし、または異なっていてもよいプロモーターに機能的に連結され得る。いくつかの態様では、核酸分子は、2つ以上の異なるポリペプチド鎖の発現を駆動するプロモーターを含むことができる。いくつかの態様では、そのような核酸分子はマルチシストロン性（バイシストロン性またはトリシストロン性。例えば、米国特許第6,060,273号を参照されたい）でもよい。いくつかの態様では、転写単位は、単一プロモーターからのメッセージによる遺伝子産物の共発現を可能にするIRES（配列内リボソーム進入部位）を含むバイシストロン性単位として操作され得る。あるいは、場合によっては、単一プロモーターは、単一オープンリーディングフレーム（ORF）において、本明細書において記載されるように、自己開裂ペプチド（例えば2A配列）またはプロテアーゼ認識部位（例えばフューリン）をコードする配列によって互いに分離した2つまたは3つのポリペプチドを含むRNAの発現を指示することができる。したがって、ORFは単一ポリペプチドをコードし、これは、翻訳の間（2Aの場合）または後のいずれかで、個々のタンパク質へプロセッシングされる。いくつかの態様では、「タンデムカセット」はプロモーターを有さない配列、続いて転写終結配列を含むカセットの第1の成分、および自律発現カセットまたはマルチシストロン性発現配列をコードする第2の配列を含む。いくつかの態様では、タンデムカセットは、2つ以上の異なるポリペプチドまたは因子、例えば、組換え受容体の2つ以上の鎖またはドメインをコードする。いくつかの態様では、組換え受容体の2つ以上の鎖またはドメインをコードする核酸配列は、タンデム発現カセットまたはバイもしくはマルチシストロン性カセットとして1つの標的DNA組み込み部位に導入される。

いくつかの態様では、導入遺伝子（例えば、外来性核酸配列）はまた、1つまたは複数の異種または外来性の制御または調節エレメント、例えば、シス制御エレメントも含有し、これは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の制御または調節エレメントではないか、またはそれとは異なる。いくつかの態様では、異種または外来性の制御または調節エレメントは、組換え受容体をコードする核酸配列とは別に、導入遺伝子のさらなる成分をコードする核酸配列、例えば、さらなるポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に連結される。

いくつかの局面では、異種の制御または調節エレメントには、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、インスレーター、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、Kozakコンセンサス配列、マルチシストロン性エレメント（例えば、配列内リボソーム進入部位（IRES）、2A配列）、メッセンジャーRNA（mRNA）の非翻訳領域（UTR）に対応する配列、およびスプライスアクセプターまたはドナー配列、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座の制御または調節エレメントではないか、またはそれとは異なるものが含まれる。いくつかの態様では、異種の制御または調節エレメントには、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、Kozakコンセンサス配列、スプライスアクセプター配列、および/またはスプライスドナー配列が含まれる。いくつかの態様では、導入遺伝子は、例えば、導入遺伝子におけるさらなる成分の発現を調節するために、異種である、かつ/または標的部位にもしくはその近くに典型的には存在しない、プロモーターを含む。

場合によっては、マルチシストロン性エレメント、例えばT2Aは、リボソームに2AエレメントのC末端におけるペプチド結合の合成をスキップ（リボソームスキッピング）させ、2A配列の末端と下流の次のペプチドの間で分離をもたらすことができる（例えば、de Felipe, Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004)およびde Felipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)を参照されたい；自己開裂エレメントとも称される）。これにより、挿入された導入遺伝子が、組み込み部位にある内在性プロモーター、例えばT細胞刺激関連遺伝子座のプロモーターの転写によって調節されることが可能になる。例示的なマルチシストロン性エレメントとしては、米国特許出願公開第20070116690号に記載されている、口蹄疫ウイルス（F2A、例えば、SEQ ID NO:21）、ウマ鼻炎Aウイルス（E2A、例えば、SEQ ID NO:20）、ゾセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス（T2A、例えば、SEQ ID NO:6または17）、およびブタテッショウウイルス-1（P2A、例えば、SEQ ID NO:18、19、または61）由来の2A配列が挙げられる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、P2Aリボソームスキッピングエレメント（SEQ ID NO:18、19、または61に記載される配列）を導入遺伝子、例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする核酸の上流に含む。

いくつかの態様では、組換え受容体もしくはその一部分の1つもしくは複数の鎖をコードする導入遺伝子および/またはさらなる分子をコードする配列は、1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントを独立に含む。いくつかの態様では、1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントは、その組換え受容体部分をコードする導入遺伝子および/またはさらなる分子をコードする配列の上流にある。いくつかの態様では、マルチシストロン性エレメントは、その組換え受容体部分をコードする導入遺伝子および/またはさらなる分子をコードする配列の間に配置される。いくつかの態様では、マルチシストロン性エレメントは、組換え受容体の部分または鎖をコードする核酸配列の間に配置される。

いくつかの態様では、さらなる分子をコードする配列は、異種の制御または調節エレメントに機能的に連結される。いくつかの局面では、異種の制御または調節エレメントは異種プロモーターを含む。いくつかの態様では、異種プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、および/または組織特異的プロモーターの中より選択される。いくつかの態様では、制御または調節エレメントはプロモーターおよび/またはエンハンサー、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性もしくは組織特異的プロモーターである。いくつかの態様では、プロモーターは、RNA pol I、pol II、またはpol IIIプロモーターの中より選択される。いくつかの態様では、プロモーターはRNAポリメラーゼIIによって認識される（例えば、CMV、SV40初期領域、またはアデノウイルス主要後期プロモーター）。いくつかの態様では、プロモーターはRNAポリメラーゼIIIによって認識される（例えば、U6またはH1プロモーター）。いくつかの態様では、プロモーターは構成的プロモーターであるか、または該プロモーターを含む。例示的な構成的プロモーターとしては、例えば、シミアンウイルス40初期プロモーター（SV40）、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（CMV）、ヒトユビキチンCプロモーター（UBC）、ヒト伸長因子1αプロモーター（EF1α）、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ1プロモーター（PGK）、およびCMV初期エンハンサーと結合したニワトリβ-アクチンプロモーター（CAGG）が挙げられる。いくつかの態様では、異種プロモーターは、ヒト伸長因子1アルファ（EF1α）プロモーターもしくはMNDプロモーターもしくはそれらのバリアントであるか、またはこれらを含む。

いくつかの態様では、プロモーターは、制御型プロモーター（例えば、誘導性プロモーター）である。いくつかの態様では、プロモーターは、誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターである。いくつかの態様では、プロモーターは、Lacオペレーター配列、テトラサイクリンオペレーター配列、ガラクトースオペレーター配列、またはドキシサイクリンオペレーター配列を含むか、あるいはそれらの類似体であるか、あるいは、Lacリプレッサーもしくはその類似体が結合することができるか、またはそれらによって認識され得る。いくつかの態様では、プロモーターは組織特異的プロモーターである。ある場合には、プロモーターは、特定の細胞型でのみ発現される（例えば、T細胞またはB細胞またはNK細胞特異的プロモーター）。

いくつかの態様では、プロモーターは構成的プロモーターであるか、または該プロモーターを含む。例示的な構成的プロモーターとしては、例えば、シミアンウイルス40初期プロモーター（SV40）、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（CMV）、ヒトユビキチンCプロモーター（UBC）、ヒト伸長因子1αプロモーター（EF1α）、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ1プロモーター（PGK）、およびCMV初期エンハンサーと結合したニワトリβ-アクチンプロモーター（CAGG）が挙げられる。いくつかの態様では、構成的プロモーターは、合成または改変プロモーターである。いくつかの態様では、プロモーターは、MNDプロモーター、すなわち、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを有する改変MoMuLV LTRのU3領域を含む合成プロモーター（Challita et al. (1995) J. Virol. 69(2):748-755を参照されたい）であるか、または該プロモーターを含む。いくつかの態様では、プロモーターは組織特異的プロモーターである。ある場合には、プロモーターは特定の細胞型でのみ発現を駆動する（例えば、T細胞またはB細胞またはNK細胞特異的プロモーター）。

いくつかの態様では、プロモーターはウイルス性プロモーターである。いくつかの態様では、プロモーターは非ウイルス性プロモーターである。場合によっては、プロモーターは、ヒト伸長因子1アルファ（EF1α）プロモーターまたはこれらの改変形態（HTLV1エンハンサーを有するEF1αプロモーター）またはMNDプロモーターの中より選択される。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、異種または外来性の制御エレメント、例えば、プロモーターを含まない。いくつかの態様では、プロモーターは、双方向性プロモーター（例えば、WO2016/022994を参照されたい）。

いくつかの態様では、導入遺伝子はスプライス受容配列を含むこともできる。例示的な公知のスプライス受容部位配列としては、例えば、

（ヒトHBB遺伝子由来）および

（ヒトIgG遺伝子由来）が挙げられる。

いくつかの態様では、導入遺伝子は、転写終結および/またはポリアデニル化シグナルに必要とされる配列を含むこともできる。いくつかの局面では、例示的なポリアデニル化シグナルは、SV40、hGH、BGH、およびrbGlob転写終結配列、ならびに/またはポリアデニル化シグナルより選択される。いくつかの態様では、導入遺伝子はSV40ポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの態様では、導入遺伝子内に存在する場合、転写終結配列および/またはポリアデニル化シグナルは、典型的には導入遺伝子内の最も3'の配列であり、相同性アームの1つに連結される。いくつかの局面では、導入遺伝子は、3'UTRをコードする配列も転写ターミネータをコードする配列も含まない。いくつかの態様では、内在性T細胞刺激関連遺伝子座への導入遺伝子の組み込みの際に、導入遺伝子は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の3'UTRおよび/または転写ターミネータの上流に組み込まれ、その結果、組換え受容体をコードするメッセージは、例えば内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームまたはその部分配列からの、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の3'UTRを含む。したがって、いくつかの態様では、組換え受容体の一部分をコードする導入遺伝子の組み込みの際に、組換え受容体をコードする核酸配列は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の3'UTR、転写ターミネータおよび/または他の制御エレメントの調節下にあるように機能的に連結される。

(vi) 例示的な導入遺伝子配列
いくつかの態様では、例示的な導入遺伝子は、5'から3'の順番で、以下を各々コードするヌクレオチドの配列を含む：膜貫通ドメイン（または膜結合ドメイン）および細胞内領域。いくつかの態様では、例示的な導入遺伝子は、5'から3'の順番で、以下を各々コードするヌクレオチドの配列を含む：細胞外領域、膜貫通ドメイン、および細胞内領域。

いくつかの態様では、コードされる組換え受容体はCARであり、例示的な導入遺伝子は、5'から3'の方向で、それぞれ以下のものをコードするヌクレオチドの配列を含む：シグナルペプチド、細胞外結合ドメイン、スペーサー、膜貫通ドメイン、ならびに一次シグナル伝達ドメインまたは領域および/または共刺激性シグナル伝達ドメインを含む細胞内領域。いくつかの態様では、例示的な導入遺伝子は、5'から3'の方向で、それぞれ以下のものをコードするヌクレオチドの配列を含む：シグナルペプチド、細胞外結合ドメイン、スペーサー、膜貫通ドメイン、および1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメイン。いくつかの態様では、例示的な導入遺伝子は、5'から3'の方向で、それぞれ以下のものをコードするヌクレオチドの配列を含む：シグナルペプチド、細胞外結合ドメイン、スペーサー、膜貫通ドメイン、ならびに1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインまたは領域。

いくつかの態様では、例示的な導入遺伝子は、5'から3'の方向で、それぞれ以下のものをコードするヌクレオチドの配列を含む：膜貫通ドメイン（または膜結合ドメイン）、細胞内多量体化ドメイン、任意で1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインまたは領域。いくつかの態様では、例示的な導入遺伝子は、5'から3'の方向で、それぞれ以下のものをコードするヌクレオチドの配列を含む：細胞外多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、任意で1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインまたは領域。

いくつかの態様では、導入遺伝子は、順番に、細胞外結合ドメイン、任意でscFv；ヒト免疫グロブリンヒンジ由来の、任意でIgG1、IgG2、もしくはIgG4、またはこれらの改変バージョン由来の配列を任意で含み、C_H2領域および/またはC_H3領域を任意でさらに含む、スペーサー；ならびに任意でヒトCD28由来の、膜貫通ドメイン；任意でヒト4-1BB由来の、共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびに細胞内シグナル伝達領域、任意でCD3ζ鎖またはその一部分、をコードするヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様では、組換え受容体のコードされる細胞内領域は、そのN末端からC末端の順番で、以下のものを含む：1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメイン、および例えばCD3ゼータ鎖またはその断片を含む一次シグナル伝達ドメインまたは領域。

いくつかの態様では、例示的な導入遺伝子は、5'から3'の順番で、以下を各々コードするヌクレオチドの配列を含む：膜貫通ドメイン（または膜結合ドメイン）および細胞内領域。いくつかの態様では、例示的な導入遺伝子は、5'から3'の順番で、以下を各々コードするヌクレオチドの配列を含む：細胞外領域、膜貫通ドメイン、および細胞内領域。

いくつかの態様では、例示的な導入遺伝子はTCRα鎖のすべてまたは一部分をコードする。いくつかの態様では、例示的な導入遺伝子は、TCRβ鎖のすべてまたは一部分をコードする。いくつかの態様では、例示的な導入遺伝子は、TCRα鎖とTCRβ鎖の両方のすべてまたは一部分をコードする。いくつかの態様では、コードされる組換え受容体は組換えT細胞受容体（TCR）であり、例示的な導入遺伝子は、5'から3'の順番で、[TCRβ鎖]-[リンカーまたはマルチシストロン性エレメント]-[TCRα鎖]を含む。いくつかの態様では、コードされる組換え受容体は組換えTCRであり、例示的な導入遺伝子は、5'から3'の順番で、[TCRα鎖]-[リンカーまたはマルチシストロン性エレメント]-[TCRβ鎖]を含む。

いくつかの態様では、例示的な導入遺伝子はマルチシストロン性エレメント、例えば、2Aエレメントもしくは配列内リボソーム進入部位（IRES）、ならびに/またはシグナルペプチドおよび/もしくは細胞外領域をコードする配列の5'に配置される制御もしくは調節エレメント、例えば、プロモーターを含むこともできる。いくつかの態様では、例示的な導入遺伝子は、さらなる配列、例えば、1つまたは複数のさらなる分子、例えば、マーカー、さらなる組換え受容体、抗体もしくはその抗原結合断片、免疫調節分子、リガンド、サイトカイン、またはケモカインをコードするヌクレオチドの配列を含むこともできる。いくつかの局面では、1つまたは複数の他の分子をコードする配列および組換え受容体の領域またはドメインをコードするヌクレオチドの配列は、制御配列、例えば、2Aリボソームスキッピングエレメントおよび/またはプロモーター配列によって分離される。いくつかの局面では、例示的な導入遺伝子中で、1つまたは複数のさらなる分子をコードするヌクレオチドの配列は、シグナルペプチドおよび/または細胞外領域をコードする配列の5'に配置される。いくつかの態様では、1つまたは複数のさらなる分子をコードするヌクレオチドの配列は、マルチシストロン性エレメントおよび/または制御もしくは調節エレメントと組換え受容体の領域またはドメインをコードするヌクレオチドの配列との間に配置される。いくつかの態様では、1つまたは複数のさらなる分子をコードするヌクレオチドの配列は、2つのエレメントおよび/または制御もしくは調節エレメントの間に配置される。いくつかの態様では、例示的な導入遺伝子は、5'から3'の方向で、以下のものを含む：マルチシストロン性エレメントおよび/または制御エレメント、さらなる分子をコードするヌクレオチドの配列、マルチシストロン性エレメントおよび/または制御エレメント、シグナルペプチド、組換え受容体の領域またはドメイン（例えば、細胞外領域、膜貫通ドメイン、細胞内領域）をコードする核酸配列。

b. 相同性アーム
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子に連結された、または該導入遺伝子を取り囲む、1つまたは複数の相同配列（「相同性アーム」とも呼ばれる）を5'および3'末端に含む。相同性アームは、DNA修復機構、例えば、相同組換え機構が相同性を認識し、修復のための鋳型として鋳型ポリヌクレオチドを使用することを可能にし、相同性アームの間の核酸配列は、修復されるDNAにコピーされ、相同性の場所の間のゲノム中の組み込みの標的部位に導入遺伝子を効果的に挿入するかまたは組み込む。

いくつかの局面では、導入遺伝子の組み込みの際に、完全な組換え受容体が導入遺伝子にコードされ、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のコード配列の完全なコード配列または一部分が欠失する。いくつかの態様では、導入遺伝子は、1つまたは複数の相同性アームに含まれるT細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームの1つまたは複数のエクソンとインフレームであるヌクレオチドの配列を含む。いくつかの局面では、完全な組換え受容体が導入遺伝子にコードされ、T細胞刺激関連遺伝子座の一部分のみが欠失し、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の残りの部分は発現する。

いくつかの態様では、相同性アーム配列は、遺伝子破壊の周辺のゲノム配列、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座内の標的部位に相同な配列を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは以下の成分を含む：[5'相同性アーム]-[導入遺伝子（例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする、外来性または異種の核酸配列）]-[3'相同性アーム]。いくつかの態様では、5'相同性アーム配列は、5'側の遺伝子破壊の近くに位置する配列に相同な連続した配列を含む。いくつかの態様では、3'相同性アーム配列は、3'側の遺伝子破壊の近くに位置する配列に相同な連続した配列を含む。いくつかの局面では、標的部位は、遺伝子破壊を導入することができる1つまたは複数の作用物質、例えばT細胞刺激関連遺伝子座内の特定の部位を標的とするCas9およびgRNAのターゲティングによって、決定される。

いくつかの局面では、鋳型ポリヌクレオチド内の導入遺伝子は、標的部位および/または相同性アームの場所をガイドするために使用することができる。いくつかの局面では、遺伝子破壊の標的部位は、HDRに使用される鋳型ポリヌクレオチドおよび/または相同性アームを設計するためのガイドとして使用することができる。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、導入遺伝子の標的組み込みの望ましい部位の近くにターゲティングされ得る。いくつかの局面では、相同性アームは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームのエクソン内の組み込みをターゲティングするように設計され、相同性アーム配列は、遺伝子破壊の周辺のエクソンおよびイントロン配列を含めて、遺伝子破壊の周辺の組み込みの望ましい場所に基づいて決定される。いくつかの態様では、標的部位の場所、1つまたは複数の相同性アームの相対的な場所、および挿入のための導入遺伝子（外来性核酸配列）は、効率的なターゲティングの要件および使用することができる鋳型ポリヌクレオチドまたはベクターの長さに応じて設計され得る。いくつかの局面では、相同性アームは、T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームのイントロン内の組み込みをターゲティングするように設計される。いくつかの局面では、相同性アームは、T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームのエクソン内の組み込みをターゲティングするように設計される。

いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座内の標的組み込み部位（標的組み込みのための部位）は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレーム内に位置する。いくつかの態様では、標的組み込み部位は、本明細書おいて、例えばセクションII.Aに記載される標的部位のいずれかであるか、またはその近くである。いくつかの局面では、組み込みのための標的場所は、遺伝子破壊のための標的部位であるか、その周囲であり、例えば、遺伝子破壊のための標的部位の500、450、400、350、300、250、200、150、100、または50bp未満内である。

いくつかの局面では、標的組み込み部位は内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームのエクソン内である。いくつかの局面では、標的組み込み部位はT細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームのイントロン内である。いくつかの局面では、標的組み込み部位はT細胞刺激関連遺伝子座の制御または調節エレメント、例えば、プロモーター内である。いくつかの態様では、標的組み込み部位は、初期コード領域に対応するエクソン、例えば、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームのエクソン1、2、3、4、もしくは5内であるか、または該エクソンに極めて近接しているか、あるいは転写開始点の直後の、エクソン1、2、3、4、もしくは5（例えば、本明細書において表1～9に記載されるもの）内の、またはエクソン1、2、3、4、もしくは5の500、450、400、350、300、250、200、150、100、もしくは50bp未満内の配列を含む。いくつかの態様では、組み込みは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のエクソン2で、もしくはその近くで、またはエクソン2の500、450、400、350、300、250、200、150、100、もしくは50bp未満内でターゲティングされる。いくつかの局面では、標的組み込み部位は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のエクソン1またはその近く、例えば、エクソン1の500、450、400、350、300、250、200、150、100、もしくは50bp未満内である。いくつかの態様では、標的組み込み部位は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のエクソン2またはその近く、あるいはエクソン2の500、450、400、350、300、250、200、150、100、もしくは50bp未満内である。いくつかの局面では、標的組み込み部位は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のエクソン3またはその近く、例えば、エクソン3の500、450、400、350、300、250、200、150、100、もしくは50bp未満内である。いくつかの局面では、標的組み込み部位は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のエクソン4またはその近く、例えば、エクソン4の500、450、400、350、300、250、200、150、100、もしくは50bp未満内である。いくつかの局面では、標的組み込み部位は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のエクソン5またはその近く、例えば、エクソン5の500、450、400、350、300、250、200、150、100、もしくは50bp未満内である。いくつかの局面では、標的組み込み部位はT細胞刺激関連遺伝子座の制御または調節エレメント、例えば、プロモーター内である。

いくつかの態様では、5'相同性アーム配列は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の標的部位の近くから始めて、遺伝子破壊のための標的部位の5'のおよそ10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、または5000塩基対の連続した配列を含む。いくつかの態様では、3'相同性アーム配列は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の標的部位の近くから始めて、遺伝子破壊のための標的部位の3'のおよそ10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、または5000塩基対の連続した配列を含む。したがって、HDRを介した組み込みの際に、導入遺伝子は、遺伝子破壊のための標的部位、例えば、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のエクソンまたはイントロン内の標的部位またはその近くにおける組み込みのためにターゲティングされる。

いくつかの局面では、相同性アームは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレーム配列の一部分に相同な配列を含む。いくつかの局面では、相同性アーム配列は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座におけるエクソンおよびイントロンを含むオープンリーディングフレーム配列の連続した部分に相同な配列を含む。いくつかの局面では、相同性アームは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座におけるエクソンおよびイントロンを含むオープンリーディングフレーム配列の連続した部分と同一の配列を含む。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座（本明細書において表1～9に記載される例示的なゲノム遺伝子座配列；上記セクションII.A.1に記載される例示的なヒトmRNA配列）における導入遺伝子のターゲティング組み込みのための相同性アームを含む。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、遺伝子破壊のための作用物質のいずれか、例えば、本明細書において記載される標的ヌクレアーゼおよび/またはgRNAを使用して導入される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的ヌクレアーゼおよび/またはgRNAによって導入される遺伝子破壊の両側に約500～1000、例えば、500～900、または600～700塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、T細胞刺激関連遺伝子座における遺伝子破壊の5'の500、600、700、800、900、または1000塩基対の配列に相同な約500、600、700、800、900、または1000塩基対の5'相同性アーム配列、導入遺伝子、および、T細胞刺激関連遺伝子座における遺伝子破壊の3'の500、600、700、800、900、または1000塩基対の配列に相同な約500、600、700、800、900、または1000塩基対の3'相同性アーム配列を含む。

いくつかの局面では、導入遺伝子と1つまたは複数の相同性アーム配列の間の境界は、HDRおよび導入遺伝子の標的組み込みの際に、1つまたは複数のポリペプチド、例えば、組換え受容体の鎖、ドメイン、または領域をコードする導入遺伝子内の配列が、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレーム配列の1つもしくは複数のエクソンとインフレームで組み込まれる、および/またはポリペプチドをコードする導入遺伝子と内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレーム配列の1つもしくは複数のエクソンとのインフレームの融合をもたらすように設計される。いくつかの態様では、T細胞刺激関連遺伝子座の遺伝子産物のすべてまたは一部分が、内在性オープンリーディングフレームの核酸配列にコードされ、組換え受容体またはその一部分のポリペプチドが、任意でマルチシストロン性エレメント、例えば2Aエレメントによって分離された組み込まれた導入遺伝子にコードされる。

いくつかの態様では、1つまたは複数の相同性アーム配列は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレーム配列内にある標的部位を取り囲むか、または該標的部位に隣接する配列と相同である、実質的に同一である、または同一である配列を含む。いくつかの局面では、1つまたは複数の相同性アーム配列は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームの部分配列のイントロンおよびエクソンを含む。いくつかの局面では、5'相同性アーム配列と導入遺伝子の境界は、異種プロモーターを含まない導入遺伝子の場合、導入遺伝子のコード部分が、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームの標的組み込みの場所に応じて、上流のエクソンまたはその一部分、例えば、エクソン1、2、3、4、または5とインフレームで融合されるようなものである。

いくつかの局面では、5'相同性アーム配列と導入遺伝子の境界は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームの上流のエクソンまたはその一部分、例えば、エクソン1、2、3、4、または5が導入遺伝子のコード部分とインフレームで融合されるようなものである。したがって、標的組み込み、転写、および翻訳の際に、連続したポリペプチドであるコードされる組換え受容体が、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレーム配列と導入遺伝子の融合DNA配列から生成される。いくつかの局面では、上流のエクソンまたはその一部分は、T細胞刺激関連遺伝子座の遺伝子産物のすべてまたは一部分をコードする。いくつかの局面では、標的組み込みの際に、マルチシストロン性エレメント、例えば2Aエレメントまたは配列内リボソーム進入部位（IRES）は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレーム配列と組換え受容体をコードする導入遺伝子とを分離する。いくつかの局面では、改変T細胞刺激関連遺伝子座から発現され、翻訳される場合に、ポリペプチドは切断されて、内在性T細胞刺激関連遺伝子座にコードされるポリペプチドのすべてまたは一部分および組換え受容体を生成する。

いくつかの態様では、内在性T細胞刺激関連遺伝子座PDCD1におけるターゲティング組み込みのための例示的な5'相同性アームは、SEQ ID NO:66に記載される配列、またはSEQ ID NO:66もしくはその部分配列に対して、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示す配列を含む。

いくつかの態様では、内在性T細胞刺激関連遺伝子座PDCD1におけるターゲティング組み込みのための例示的な3'相同性アームは、SEQ ID NO:67に記載される配列、またはSEQ ID NO:67もしくはその部分配列に対して、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示す配列を含む。

いくつかの態様では、内在性TRAC遺伝子座におけるターゲティング組み込みのための例示的な5'相同性アームは、SEQ ID NO:68に記載される配列、またはSEQ ID NO:68もしくはその部分配列に対して、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示す配列を含む。

いくつかの態様では、内在性TRAC遺伝子座におけるターゲティング組み込みのための例示的な3'相同性アームは、SEQ ID NO:69に記載される配列、またはSEQ ID NO:69もしくはその部分配列に対して、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示す配列を含む。

いくつかの局面では、標的部位は、相同性アームの相対的な場所および配列を決定することができる。相同性アームは、例えば、切除された一本鎖突出が鋳型ポリヌクレオチド内の相補性領域を見つけることを可能にするために、典型的には、遺伝子破壊、例えばDSBが導入された後にDNA修復機構による末端切除が生じる得る領域まで少なくとも延びることができる。全体の長さは、プラスミドサイズ、ウイルスのパッケージング制限、またはコンストラクトサイズの制限などのパラメーターによって制限され得る。

いくつかの態様では、相同性アームは、内在性遺伝子の標的部位の両側に約500～1000、例えば、600～900、または700～800塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、相同性アームは、T細胞刺激関連遺伝子座において、標的部位の5'、標的部位の3'、または標的部位の5'と3'の両方に、約少なくとも200、300、400、500、600、700、800、900、もしくは1000塩基対の、または200、300、400、500、600、700、800、900、もしくは1000塩基対未満の、または約200、300、400、500、600、700、800、900、もしくは1000塩基対の相同性を含む。

いくつかの態様では、相同性アームは、T細胞刺激関連遺伝子座の標的部位の3'に、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、もしくは5000塩基対の、または約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、または5000塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、相同性アームは、導入遺伝子および/またはT細胞刺激関連遺伝子座の標的部位の3'に、100～500、200～400、もしくは250～350塩基対の、または約100～500、200～400、もしくは250～350塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、相同性アームは、T細胞刺激関連遺伝子座の標的部位の5'に、約100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、または10塩基対未満の相同性を含む。

いくつかの態様では、相同性アームは、T細胞刺激関連遺伝子座の標的部位の5'に、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、もしくは5000塩基対の、または約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、もしくは5000塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、相同性アームは、導入遺伝子および/またはT細胞刺激関連遺伝子座の標的部位の5'に、100～500、200～400、もしくは250～350塩基対の、または約100～500、200～400、もしくは250～350塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、相同性アームは、T細胞刺激関連遺伝子座の標的部位の3'に、約100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、または10塩基対未満の相同性を含む。

いくつかの態様では、5'相同性アームの3'末端は導入遺伝子の5'末端の隣の位置である。いくつかの態様では、5'相同性アームは、導入遺伝子の5'末端から5'に、少なくとも10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、もしくは5000ヌクレオチド、または少なくとも約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、もしくは5000ヌクレオチド延びることができる。

いくつかの態様では、3'相同性アームの5'末端は導入遺伝子の3'末端の隣の位置である。いくつかの態様では、3'相同性アームは、導入遺伝子の3'末端から3'に、少なくとも10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、もしくは5000ヌクレオチド、または少なくとも約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、もしくは5000ヌクレオチド延びることができる。

いくつかの態様では、標的挿入のために、相同性アーム、例えば5'および3'相同性アームは、最も遠位の標的部位に隣接する約1000塩基対（bp）の配列（例えば、変異の両側の1000bpの配列）をそれぞれ含むことができる。

相同性アームの例示的な長さとしては、少なくとも50、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900、1000、2000、3000、4000、もしくは5000ヌクレオチド、または少なくとも約50、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900、1000、2000、3000、4000、または5000ヌクレオチドが挙げられる。いくつかの態様では、相同性アームの長さは、50～100、100～250、250～500、500～750、750～1000、1000～2000、2000～3000、3000～4000、もしくは4000～5000ヌクレオチドであるか、または約50～100、100～250、250～500、500～750、750～1000、1000～2000、2000～3000、3000～4000、もしくは4000～5000ヌクレオチドである。相同性アームの例示的な長さとしては、50、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900、1000、2000、3000、4000、もしくは5000ヌクレオチド未満、または約50、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900、1000、2000、3000、4000、もしくは5000ヌクレオチド未満、または50、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900、1000、2000、3000、4000、もしくは5000ヌクレオチド、または約50、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900、1000、2000、3000、4000、もしくは5000ヌクレオチドが挙げられる。いくつかの態様では、相同性アームの長さは、50～100、100～250、250～500、500～750、750～1000、1000～2000、2000～3000、3000～4000、もしくは4000～5000ヌクレオチドであるか、または約50～100、100～250、250～500、500～750、750～1000、1000～2000、2000～3000、3000～4000、もしくは4000～5000ヌクレオチドである。相同性アームの例示的な長さとしては、100もしくは約100から、1000もしくは約1000ヌクレオチド、100もしくは約100から、750もしくは約750ヌクレオチド、100もしくは約100から、600もしくは約600ヌクレオチド、100もしくは約100から、400もしくは約400ヌクレオチド、100もしくは約100から、300もしくは約300ヌクレオチド、100もしくは約100から、200もしくは約200ヌクレオチド、200もしくは約200から、1000もしくは約1000ヌクレオチド、200もしくは約200から、750もしくは約750ヌクレオチド、200もしくは約200から、600もしくは約600ヌクレオチド、200もしくは約200から、400もしくは約400ヌクレオチド、200もしくは約200から、300もしくは約300ヌクレオチド、300もしくは約300から、1000もしくは約1000ヌクレオチド、300もしくは約300から、750もしくは約750ヌクレオチド、300もしくは約300から、600もしくは約600ヌクレオチド、300もしくは約300から、400もしくは約400ヌクレオチド、400もしくは約400から、1000もしくは約1000ヌクレオチド、400もしくは約400から、750もしくは約750ヌクレオチド、400もしくは約400から、600もしくは約600ヌクレオチド、600もしくは約600から、1000もしくは約1000ヌクレオチド、600もしくは約600から、750もしくは約750ヌクレオチド、または750～1000もしくは約1000ヌクレオチドが挙げられる。

任意のそのような態様のいくつかでは、導入遺伝子は、複数のT細胞のそれぞれに導入された鋳型ポリヌクレオチドによって組み込まれる。いずれかの態様のいくつかでは、鋳型ポリヌクレオチドは、構造[5'相同性アーム]-[導入遺伝子]-[3'相同性アーム]を含む。ある特定の態様では、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、少なくとも1つまたは少なくとも約1つの標的部位を取り囲む核酸配列に相同な核酸配列を含む。いくつかの態様では、5'相同性アームは、標的部位の5'の核酸配列に相同な核酸配列を含む。いずれかの態様のいくつかでは、3'相同性アームは、標的部位の3'の核酸配列に相同な核酸配列を含む。ある特定の態様では、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立に、少なくとも10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、または少なくとも約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、または少なくとも10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、または少なくとも約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、あるいは10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド未満、または約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド未満である。いくつかの態様では、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立に50または約50から、100または約100、100から、250または約250、250から、500または約500、500から、750または約750、750から、1000または約1000、1000から、2000または約2000ヌクレオチドである。任意のそのような態様のいくつかでは、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立に、50もしくは約50から、100もしくは約100ヌクレオチドの長さ、100もしくは約100から、250もしくは約250ヌクレオチドの長さ、250もしくは約250から、500もしくは約500ヌクレオチドの長さ、500もしくは約500から、750もしくは約750ヌクレオチドの長さ、750もしくは約750から、1000もしくは約1000ヌクレオチドの長さ、または1000もしくは約1000から、2000もしくは約2000ヌクレオチドの長さである。

いずれかの態様のいくつかでは、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立に、100もしくは約100から、1000もしくは約1000ヌクレオチド、100もしくは約100から、750もしくは約750ヌクレオチド、100もしくは約100から、600もしくは約600ヌクレオチド、100もしくは約100から、400もしくは約400ヌクレオチド、100もしくは約100から、300もしくは約300ヌクレオチド、100もしくは約100から、200もしくは約200ヌクレオチド、200もしくは約200から、1000もしくは約1000ヌクレオチド、200もしくは約200から、750もしくは約750ヌクレオチド、200もしくは約200から、600もしくは約600ヌクレオチド、200もしくは約200から、400もしくは約400ヌクレオチド、200もしくは約200から、300もしくは約300ヌクレオチド、300もしくは約300から、1000もしくは約1000ヌクレオチド、300もしくは約300から、750もしくは約750ヌクレオチド、300もしくは約300から、600もしくは約600ヌクレオチド、300もしくは約300から、400もしくは約400ヌクレオチド、400もしくは約400から、1000もしくは約1000ヌクレオチド、400もしくは約400から、750もしくは約750ヌクレオチド、400もしくは約400から、600もしくは約600ヌクレオチド、600もしくは約600から、1000もしくは約1000ヌクレオチド、600もしくは約600から、750もしくは約750ヌクレオチド、または750もしくは約750から、1000もしくは約1000ヌクレオチドである。いずれかの態様のいくつかでは、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立に、100または約100から、1000または約1000または1000または約1000ヌクレオチド、100または約100から、750または約750ヌクレオチド、100または約100から、600または約600ヌクレオチド、100または約100から、400または約400ヌクレオチド、100または約100から、300または約300ヌクレオチド、100または約100から、200または約200ヌクレオチド、200または約200から、1000または約1000ヌクレオチド、200または約200から、750または約750ヌクレオチド、200または約200から、600または約600ヌクレオチド、200または約200から、400または約400ヌクレオチド、200または約200から、300または約300ヌクレオチド、300または約300から、1000または約1000ヌクレオチド、300または約300から、750または約750ヌクレオチド、300または約300から、600または約600ヌクレオチド、300または約300から、400または約400ヌクレオチド、400または約400から、1000または約1000ヌクレオチド、400または約400から、750または約750ヌクレオチド、400または約400から、600または約600ヌクレオチド、600または約600から、1000または約1000ヌクレオチド、600または約600から、750または約750ヌクレオチドまたは750または約750から、1000または約1000ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様では、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立に、200、300、400、500、600、700、もしくは800ヌクレオチド、または約200、300、400、500、600、700、または800ヌクレオチドの長さ、あるいは前述のもののいずれかの間の任意の値である。いくつかの態様では、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立に、300ヌクレオチド超または約300ヌクレオチド超の長さであり、任意で、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立に、400、500、もしくは600ヌクレオチド、または約400、500、もしくは600ヌクレオチドの長さ、あるいは前述のもののいずれかの間の任意の値である。いくつかの態様では、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立に、300ヌクレオチド超または約300ヌクレオチド超の長さである。

いくつかの態様では、相同性アームの1つまたは複数は、T細胞刺激関連遺伝子座の遺伝子産物またはその断片をコードする配列に相同なヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の相同性アームは、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子とインフレームで接続または連結される。

いくつかの態様では、代替HDRが用いられる。いくつかの態様では、代替HDRは、鋳型ポリヌクレオチドが、標的部位に対して5'（すなわち、標的部位の鎖の5'方向）に相同性が延びている場合に、より効率的に進行する。したがって、いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドはより長い相同性アームおよびより短い相同性アームを有し、より長い相同性アームは標的部位の5'にアニールすることができる。いくつかの態様では、標的部位に対して5'にアニールすることができるアームは、標的部位または導入遺伝子の5'もしくは3'末端から少なくとも25、50、75、100、125、150、175、または200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、または5000ヌクレオチドである。いくつかの態様では、標的部位に対して5'にアニールすることができるアームは、標的部位に対して3'にアニールすることができるアームよりも少なくとも10％、20％、30％、40％、または50％長い。いくつかの態様では、標的部位に対して5'にアニールすることができるアームは、標的部位に対して3'にアニールすることができるアームよりも少なくとも2×、3×、4×、または5×長い。ssDNA鋳型がインタクトな鎖または標的鎖にアニールすることができるかどうかに応じて、標的部位に対して5'にアニールする相同性アームは、それぞれ、ssDNA鋳型の5'末端またはssDNA鋳型の3'末端にあり得る。

同様に、いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは5'相同性アーム、導入遺伝子、および3'相同性アームを有し、その結果、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位の5'に対して延長した相同性を含む。例えば、5'相同性アームおよび3'相同性アームは実質的に同じ長さでもよいが、導入遺伝子は、標的部位の3'よりも標的部位の5'にさらに延びてもよい。いくつかの態様では、相同性アームは、標的部位の3'末端よりも標的部位の5'末端にさらに少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、2×、3×、4×、または5×延びる。

いくつかの態様では、代替HDRは、鋳型ポリヌクレオチドが標的部位の中心に置かれる場合に、より効率的に進行する。したがって、いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、本質的に同じサイズの2つの相同性アームを有する。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドの第1の相同性アーム（例えば、5'相同性アーム）は、鋳型ポリヌクレオチドの第2の相同性アーム（例えば、3'相同性アーム）の10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、または1％以内の長さを有し得る。

同様に、いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは5'相同性アーム、導入遺伝子、および3'相同性アームを有し、その結果、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位の両側で実質的に同じ距離が延びる。例えば、相同性アームは異なる長さを有し得るが、導入遺伝子は、これを補償するように選択され得る。例えば、導入遺伝子は、標的部位の3'に延びるよりも、標的部位から5'にさらに延び得るが、標的部位の5'の相同性アームは、補償するために、標的部位の3'の相同性アームよりも短い。逆も可能であり、例えば、導入遺伝子は、標的部位の5'に延びるよりも、標的部位から3'にさらに延び得るが、標的部位の3'の相同性アームは、補償するために、標的部位の5'の相同性アームよりも短い。

いくつかの態様では、導入遺伝子および1つまたは複数の相同性アームを含む鋳型ポリヌクレオチドの長さは、1000～約20,000塩基対または約1000～約20,000塩基対、例えば、約1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、または20000塩基対である。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドの長さは、調製、合成、もしくはアセンブルすることができる、および/または細胞中に導入することができるポリヌクレオチドの最大の長さ、あるいはウイルスベクターの収容能力、およびポリヌクレオチドまたはベクターのタイプによって制限される。いくつかの局面では、鋳型ポリヌクレオチドの制限された収容能力によって、導入遺伝子および/または1つまたは複数の相同性アームの長さが決定され得る。いくつかの局面では、導入遺伝子と1つまたは複数の相同性アームの組み合わされた全長は、ポリヌクレオチドまたはベクターの最大の長さまたは収容能力内であるべきである。例えば、いくつかの局面では、鋳型ポリヌクレオチドの導入遺伝子部分は、約1000、1500、2000、2500、3000、3500、または4000塩基対であり、鋳型ポリヌクレオチドの最大の長さが約5000塩基対である場合、配列の残りの部分は、3'または5'相同性アームがおよそ500、750、1000、1250、1500、1750、または2000塩基対であり得るように、1つまたは複数の相同性アームの間で分割することができる。

3. 鋳型ポリヌクレオチドの送達
いくつかの態様では、ポリヌクレオチド、例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする鋳型ポリヌクレオチド（例えば、本明細書のセクションII.B.2に記載されるもの）などのポリヌクレオチドは、ヌクレオチド形態で、例えば、ポリヌクレオチドまたはベクターとして、細胞中に導入される。いずれかの態様のいくつかでは、ポリヌクレオチドは、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子および1つまたは複数の相同性アームを含み、導入遺伝子の相同性指向修復（HDR）媒介性組み込みのために、細胞中に導入され得る。

いくつかの局面では、提供される態様は、（HDRおよび導入遺伝子の標的組み込みを誘導するための、遺伝子破壊を誘導することができる1つもしくは複数の作用物質またはそれらの成分および鋳型ポリヌクレオチドの導入による細胞の遺伝子操作である。いくつかの局面では、1つまたは複数の作用物質および鋳型ポリヌクレオチドは同時に送達される。いくつかの局面では、1つまたは複数の作用物質および鋳型ポリヌクレオチドは順次送達される。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質はポリヌクレオチドの送達より前に送達される。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的遺伝子破壊を誘導することができる作用物質、例えば、ヌクレアーゼおよび/またはgRNAに加えて、操作のために細胞中に導入される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的遺伝子破壊を誘導することができる作用物質の1つまたは複数の成分が細胞中に導入されるより前に、該成分が細胞中に導入されるのと同時に、または該成分が細胞に導入された後に、送達することができる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは作用物質と同時に送達される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドおよび1つまたは複数の作用物質は、物理的送達手段を用いて、同時に、例えば、1回の反応で送達される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドおよび1つまたは複数の作用物質は、電気穿孔を介して、同時に送達される。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、作用物質より前に、例えば、鋳型ポリヌクレオチドの数秒～数時間～数日前、例えば、限定されないが、作用物質の1～60分（または、その間の任意の時間）前、作用物質の1～24時間（または、その間の任意の時間）前、または作用物質の24時間より前に送達される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、作用物質の後、作用物質の送達の直後を含めて、鋳型ポリヌクレオチドから数秒～数時間～数日後、例えば、作用物質の送達から30秒～4時間、例えば、約30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間後に、および/または好ましくは作用物質の送達の4時間以内に送達される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは作用物質の送達の4時間より後に送達される。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的遺伝子破壊を誘導することができる作用物質、例えば、ヌクレアーゼおよび/またはgRNAと同じ送達システムを使用して送達することができる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的遺伝子破壊を誘導することができる作用物質、例えば、異なる、ヌクレアーゼおよび/またはgRNAと同じ送達システムを使用して送達することができる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは作用物質と同時に送達される。他の態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、作用物質の送達の前または後の異なる時間に送達される。標的遺伝子破壊を誘導することができる作用物質、例えば、ヌクレアーゼおよび/またはgRNAにおける核酸の送達のための、本明細書においてセクションII.A.3（例えば、表10および11）に記載される送達方法のいずれかを、鋳型ポリヌクレオチドを送達するために使用することができる。

いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質および鋳型ポリヌクレオチドは同じ型式または方法で送達される。例えば、いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質および鋳型ポリヌクレオチドは両方とも、ベクター、例えば、ウイルスベクターに含まれる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、Cas9およびgRNAと同じベクター骨格、例えば、AAVゲノム、プラスミドDNAにコードされる。いくつかの局面では、1つまたは複数の作用物質および鋳型ポリヌクレオチドは、異なる型式、例えば、Cas9-gRNA作用物質についてはリボ核酸-タンパク質複合体（RNP）、および鋳型ポリヌクレオチドについては直鎖状DNAであるが、これらは同じ方法を使用して送達される。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは直鎖状または環状の核酸分子、例えば、直鎖状もしくは環状のDNAまたは直鎖状RNAであり、核酸分子を細胞中に送達するために、本明細書のセクションII.A.3（例えば、本明細書の表10および11）に記載される方法のいずれかを使用して送達することができる。

いずれかの態様のいくつかでは、ポリヌクレオチド、例えば鋳型ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド形態で、例えば、非ウイルスベクターとして、または非ウイルスベクター内で細胞中に導入される。いくつかの態様では、非ウイルスベクターは、遺伝子送達のための任意の適切なおよび/または公知の非ウイルス性方法、例えば、限定されないが、マイクロインジェクション、電気穿孔、（例えば、Lee et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27に記載される）一過的な細胞の圧縮もしくは圧迫、脂質媒介性トランスフェクション、ペプチド媒介性送達、例えば、細胞透過性ペプチド、またはこれらの組み合わせによる形質導入および/またはトランスフェクションに適したポリヌクレオチド、例えば、DNAまたはRNAポリヌクレオチドであるか、あるいは該ポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、非ウイルス性ポリヌクレオチドは、本明細書において記載される非ウイルス性方法、例えば、本明細書の表11に列挙される非ウイルス性方法によって、細胞中に送達される。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチド配列は、ゲノムDNA中の関心対象の領域と相同でない配列を含むベクター分子に含まれ得る。いくつかの態様では、ウイルスはDNAウイルス（例えば、dsDNAまたはssDNAウイルス）である。いくつかの態様では、ウイルスはRNAウイルス（例えば、ssRNAウイルス）である。例示的なウイルスベクター/ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルス、または本明細書の他の個所に記載されるウイルスのいずれかが挙げられる。ポリヌクレオチドは、例えば、複製開始点、プロモーター、および抗生物質抵抗性をコードする遺伝子などのさらなる配列を有するベクター分子の一部として、細胞中に導入することができる。さらに、鋳型ポリヌクレオチドは、ネイキッド核酸として、材料、例えば、リポソーム、ナノ粒子、またはポロキサマーと複合体化された核酸として導入することができ、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、AAV、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、およびインテグラーゼ欠陥レンチウイルス（IDLV））によって送達することができる。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、例えば、シミアンウイルス40（SV40）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）に由来するベクターなどの組換え感染性ウイルス粒子を使用して、細胞中に移入され得る。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、組換えレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、例えばガンマ-レトロウイルスベクター（例えば、Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25；Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46；Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93；Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557を参照されたい、またはHIV-1由来レンチウイルスベクターを使用して、T細胞中に移入される。

他の局面では、鋳型ポリヌクレオチドは、ウイルス性および/または非ウイルス性遺伝子移入方法によって送達される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、アデノ随伴ウイルス（AAV）を介して細胞に送達される。鋳型ポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼを送達するために使用されるものと同じ遺伝子移入システム（同じベクター上を含める）を使用して送達することができ、またはヌクレアーゼに使用される異なる送達システムを使用して送達することができる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドはウイルスベクター（例えば、AAV）を使用して送達され、ヌクレアーゼはmRNA形態で送達される。細胞は、（例えば、ヌクレアーゼおよび/または鋳型ポリヌクレオチドを保有する）ウイルスベクターの送達より前に、該送達と同時に、および/または該送達の後に、本明細書において記載される細胞表面レセプターへのウイルスベクターの結合を阻害する1つまたは複数の分子で処理することもできる。

いくつかの態様では、レトロウイルスベクター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（MPSV）、マウス胚性幹細胞ウイルス（MESV）、マウス幹細胞ウイルス（MSCV）、または脾フォーカス形成ウイルス（SFFV）に由来する組換えレトロウイルスベクターは、ロングターミナルリピート配列（LTR）を有する。大抵のレトロウイルスベクターはマウスレトロウイルスに由来する。いくつかの態様では、レトロウイルスとしては、任意の鳥類または哺乳動物細胞供給源に由来するものが挙げられる。レトロウイルスは典型的には広宿主性であり、これは、レトロウイルスが、ヒトを含めたいくつかの種の宿主細胞に感染することができることを意味する。一態様では、発現させられる遺伝子は、レトロウイルスのgag、pol、および/またはenv配列に取って代わる。いくつかの実例となるレトロウイルスシステムが記載されている（例えば、米国特許第5,219,740号；第6,207,453；第5,219,740；Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990；Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852；Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037；およびBoris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109）。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドはAAVベクターを使用して送達され、標的遺伝子破壊を誘導することができる作用物質、例えば、ヌクレアーゼおよび/またはgRNAは、異なる形態、例えば、ヌクレアーゼおよび/またはgRNAをコードするmRNAとして送達される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドおよびヌクレアーゼは、同じタイプの方法、例えば、ウイルスベクターを使用して送達されるが、別々のベクター上にある。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、遺伝子破壊を誘導することができる作用物質、例えば、ヌクレアーゼおよび/またはgRNAと異なる送達システムで送達される。送達のためのタイプまたは核酸およびベクターとしては、本明細書のセクションII.BまたはIIIに記載されるもののいずれかが挙げられる。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドおよびヌクレアーゼは、同じベクター、例えばAAVベクター（例えばAAV6）上にあってもよい。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、AAVベクターを使用して送達され、標的遺伝子破壊を誘導することができる作用物質、例えば、ヌクレアーゼおよび/またはgRNAは、異なる形態、例えば、ヌクレアーゼおよび/またはgRNAをコードするmRNAとして送達される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドおよびヌクレアーゼは、同じタイプの方法、例えば、ウイルスベクターを使用して送達されるが、別々のベクター上にある。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、遺伝子破壊を誘導することができる作用物質、例えば、ヌクレアーゼおよび/またはgRNAと異なる送達システムで送達される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、インビボでベクター骨格から切除され、例えば、これはgRNA認識配列に隣接している。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドはCas9およびgRNAと別々のポリヌクレオチド分子上にある。いくつかの態様では、Cas9およびgRNAはリボ核タンパク質（RNP）複合体の形態で導入され、鋳型ポリヌクレオチドは、例えばベクター中のポリヌクレオチド分子、または直鎖状核酸分子、例えば直鎖状DNAとして導入される。送達のためのタイプまたは核酸およびベクターとしては、本明細書のセクションII.BまたはIIIに記載されるもののいずれかが挙げられる。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、アデノウイルスベクター、例えばAAVベクターに含まれ、例えば、AAVカプシド中にパッケージングされることが可能になる長さおよび配列のssDNA分子である。ベクターは、例えば5kb未満でもよく、カプシド中へのパッケージングを促進するITR配列を含んでもよい。ベクターは組み込み欠損性であってもよい。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、導入遺伝子および/または標的部位の両側に、約150～1000ヌクレオチドの相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位もしくは導入遺伝子の5'、標的部位もしくは導入遺伝子の3'、または標的部位もしくは導入遺伝子の5'と3'の両方に、約100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000ヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位もしくは導入遺伝子の5'、標的部位もしくは導入遺伝子の3'、または標的部位もしくは導入遺伝子の5'と3'の両方に、少なくとも100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000ヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位もしくは導入遺伝子の5'、標的部位もしくは導入遺伝子の3'、または標的部位もしくは導入遺伝子の5'と3'の両方に、最大で100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000ヌクレオチドを含む。

いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクター、例えばIDLV（組み込み欠損レンチウイルス）である。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、導入遺伝子および/または標的部位の両側に、約500～1000塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位もしくは導入遺伝子の5'、標的部位もしくは導入遺伝子の3'、または標的部位もしくは導入遺伝子の5'と3'の両方に、約300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位もしくは導入遺伝子の5'、標的部位もしくは導入遺伝子の3'、または標的部位もしくは導入遺伝子の5'と3'の両方に、少なくとも300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位もしくは導入遺伝子の5'、標的部位もしくは導入遺伝子の3'、または標的部位もしくは導入遺伝子の5'と3'の両方に、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000塩基対以下の相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の変異、例えば、Cas9が鋳型ポリヌクレオチドを認識し、これを開裂させることを防止するサイレント変異を含む。鋳型ポリヌクレオチドは、例えば、変化させられる細胞のゲノム中の対応する配列に対して、少なくとも1、2、3、4、5、10、20、または30個のサイレント変異を含むことができる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、変化させられる細胞のゲノム中の対応する配列に対して、最大で2、3、4、5、10、20、30、または50個のサイレント変異を含む。いくつかの態様では、cDNAは、1つまたは複数の変異、例えば、Cas9が鋳型ポリヌクレオチドを認識し、これを開裂させることを防止するサイレント変異を含む。鋳型ポリヌクレオチドは、例えば、変化させられる細胞のゲノム中の対応する配列に対して、少なくとも1、2、3、4、5、10、20、または30個のサイレント変異を含むことができる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、変化させられる細胞のゲノム中の対応する配列に対して、最大で2、3、4、5、10、20、30、または50個のサイレント変異を含む。

本明細書において記載される二本鎖鋳型ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の非天然塩基および/または骨格を含むことができる。特に、関心対象の領域において転写静止状態を達成するために、メチル化シトシンを有する鋳型ポリヌクレオチドの挿入を本明細書において記載される方法を使用して行うことができる。

III. 核酸、ベクター、および送達
いくつかの態様では、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはベクターなどのヌクレオチド形態で細胞中に導入される。いずれかの態様のいくつかでは、ポリヌクレオチドは、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む。ある特定の態様では、遺伝子破壊のための1つもしくは複数の作用物質またはそれらの成分は、ポリヌクレオチドおよび/またはベクターなどの核酸形態で細胞中に導入される。いくつかの態様では、操作のための成分は、本明細書のセクションII.B.3および表10および11に記載される、作用物質の送達のために使用される任意の適切な方法を含めた、様々な送達方法を使用して、様々な形態で送達することができる。遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質の1つまたは複数の成分をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば核酸分子）、および/または導入遺伝子を含む1つまたは複数の鋳型ポリヌクレオチド（例えば、本明細書のセクションII.B.2に記載される任意のもの）、および導入遺伝子、例えば、鋳型ポリヌクレオチドまたは遺伝子破壊を誘導することができる1つもしくは複数の作用物質の1つもしくは複数の成分をコードするポリヌクレオチドの標的組み込みのために細胞を遺伝子操作するためのベクターも提供される。

いくつかの態様では、特定のゲノム標的場所、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座に導入遺伝子をターゲティングするための鋳型ポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドが提供される。いくつかの態様では、本明細書のセクションII.B.2に記載される任意の鋳型ポリヌクレオチドが提供される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、組換え受容体もしくはその一部分または他のポリペプチドおよび/もしくは因子をコードする核酸配列を含む導入遺伝子、ならびに標的組み込みのための相同性アームを含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドはベクター中に含まれ得る。

いくつかの態様では、遺伝子破壊を誘導することができる作用物質は、1つまたは複数のポリヌクレオチド中にコードされ得る。いくつかの態様では、Cas9分子および/またはgRNA分子などの作用物質の成分は、1つまたは複数のポリヌクレオチド中にコードされ得、細胞中に導入され得る。いくつかの態様では、作用物質の1つまたは複数の成分をコードするポリヌクレオチドはベクター中に含まれ得る。

いくつかの態様では、ベクターはCas9分子および/またはgRNA分子および/または鋳型ポリヌクレオチドをコードする配列を含むことができる。ベクターは、Cas9分子配列などに融合した（例えば、核局在化、核小体局在化、ミトコンドリア局在化のための）シグナルペプチドをコードする配列を含むこともできる。例えば、ベクターは、Cas9分子をコードする配列に融合した（例えば、SV40由来の）核局在化配列を含むことができる。

いずれかの態様のいくつかでは、1つまたは複数の制御/調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、配列内リボソーム進入部位（IRES）、2A配列、およびスプライス受容またはドナーが、ベクター中に含まれ得る。いくつかの態様では、プロモーターは、RNA pol I、pol II、またはpol IIIプロモーターの中より選択される。いくつかの態様では、プロモーターは、RNAポリメラーゼIIによって認識される（例えば、CMV、SV40初期領域、またはアデノウイルス主要後期プロモーター）。別の態様では、プロモーターは、RNAポリメラーゼIIIによって認識される（例えば、U6またはH1プロモーター）。

ある特定の態様では、プロモーターは、制御型プロモーター（例えば、誘導性プロモーター）である。いくつかの態様では、プロモーターは、誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターである。いくつかの態様では、プロモーターは、Lacオペレーター配列、テトラサイクリンオペレーター配列、ガラクトースオペレーター配列、またはドキシサイクリンオペレーター配列を含むか、あるいはそれらの類似体であるか、あるいは、Lacリプレッサーもしくはテトラサイクリンリプレッサー、もしくはそれらの類似体が結合することができるか、またはそれらによって認識され得る。

いくつかの態様では、プロモーターは構成的プロモーターであるか、または該プロモーターを含む。例示的な構成的プロモーターとしては、例えば、シミアンウイルス40初期プロモーター（SV40）、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（CMV）、ヒトユビキチンCプロモーター（UBC）、ヒト伸長因子1αプロモーター（EF1α）、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ1プロモーター（PGK）、およびCMV初期エンハンサーと結合したニワトリβ-アクチンプロモーター（CAGG）が挙げられる。いくつかの態様では、構成的プロモーターは、合成または改変型プロモーターである。いくつかの態様では、プロモーターは、MNDプロモーター、すなわち、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを有する改変型MoMuLV LTRのU3領域を含む合成プロモーター（Challita et al. (1995) J. Virol. 69(2):748-755を参照されたい）であるか、または該プロモーターを含む。いくつかの態様では、プロモーターは組織特異的プロモーターである。別の態様では、プロモーターはウイルス性プロモーターである。別の態様では、プロモーターは非ウイルス性プロモーターである。いくつかの態様では、例示的なプロモーターとしては、限定されないが、ヒト伸長因子1アルファ（EF1α）プロモーターまたはこれらの改変形態（例えば、HTLV1エンハンサーを有するEF1αプロモーター）またはMNDプロモーターを挙げることができる。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドおよび/またはベクターは制御エレメント、例えば、プロモーターを含まない。

いずれかの態様のいくつかでは、ポリヌクレオチド、例えば、組換え受容体またはその一部分をコードするポリヌクレオチドは、ヌクレオチド形態で、例えば、非ウイルスベクターとして、または非ウイルスベクター内で細胞中に導入される。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドはDNAまたはRNAポリヌクレオチドである。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは二本鎖または一本鎖ポリヌクレオチドである。いくつかの態様では、非ウイルスベクターは、遺伝子送達のための任意の適切なおよび/または公知の非ウイルス性方法、例えば、限定されないが、マイクロインジェクション、電気穿孔、（例えば、Lee et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27に記載される）一過的な細胞の圧縮もしくは圧迫、脂質媒介性トランスフェクション、ペプチド媒介性送達、またはこれらの組み合わせによる形質導入および/またはトランスフェクションに適したポリヌクレオチド、例えば、DNAまたはRNAポリヌクレオチドであるか、あるいは該ポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、非ウイルス性ポリヌクレオチドは、本明細書において記載される非ウイルス性方法、例えば、表11に列挙される非ウイルス性方法によって、細胞中に送達される。

いくつかの態様において、ベクターまたは送達媒体は、（例えば、組換えウイルスの生成のための）ウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスは、DNAウイルス（例えば、dsDNAウイルスまたはssDNAウイルス）である。いくつかの態様において、ウイルスは、RNAウイルス（例えば、ssRNAウイルス）である。例示的なウイルスベクター/ウイルスには、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルス、または本明細書中の他の箇所に記載されたウイルスのうちの任意のものが含まれる。

いくつかの態様において、ウイルスは、分裂細胞に感染させる。別の態様において、ウイルスは、非分裂細胞に感染させる。別の態様において、ウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染させる。別の態様において、ウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれ得る。別の態様において、ウイルスは、例えば、ヒトにおいて、低下した免疫を有するよう操作されている。別の態様において、ウイルスは、複製可能である。別の態様において、ウイルスは、複製欠陥型であり、例えば、付加的なビリオン複製および/またはパッケージングのために必要な遺伝子の1つまたは複数のコード領域が、他の遺伝子に交換されているか、または欠失している。別の態様において、ウイルスは、遺伝子破壊の一過性の誘導のため、Cas9分子および/またはgRNA分子の一過性発現を引き起こす。別の態様において、ウイルスは、Cas9分子および/またはgRNA分子の長期持続的な、例えば、少なくとも1週間、2週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、1年、2年、または永久の発現を引き起こす。ウイルスのパッケージング能力は、例えば、少なくとも約4kbから、少なくとも約30kb、例えば、少なくとも約5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb、または50kbまで、変動し得る。

いくつかの態様において、作用物質を含有するポリヌクレオチドおよび/または鋳型ポリヌクレオチドは、組換えレトロウイルスによって送達される。別の態様において、レトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス）は、例えば、宿主ゲノムへの組み込みを可能にする逆転写酵素を含む。いくつかの態様において、レトロウイルスは、複製可能である。別の態様において、レトロウイルスは、複製欠陥型であり、例えば、付加的なビリオン複製およびパッケージングのために必要な遺伝子の1つまたは複数のコード領域が、他の遺伝子に交換されているか、または欠失している。

いくつかの態様において、作用物質を含有するポリヌクレオチドおよび/または鋳型ポリヌクレオチドは、組換えレンチウイルスによって送達される。例えば、レンチウイルスは、複製欠陥型であり、例えば、ウイルス複製のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子を含まない。

いくつかの態様において、作用物質を含有するポリヌクレオチドおよび/または鋳型ポリヌクレオチドは、組換えアデノウイルスによって送達される。別の態様において、アデノウイルスは、ヒトにおいて低下した免疫を有するよう操作されている。

いくつかの態様において、作用物質を含有するポリヌクレオチドおよび/または鋳型ポリヌクレオチドは、組換えAAVによって送達される。いくつかの態様において、AAVは、宿主細胞、例えば、本明細書中に記載される標的細胞のゲノムへそのゲノムを組み入れることができる。別の態様において、AAVは、自己相補的アデノ随伴ウイルス（scAAV）、例えば、二本鎖DNAを形成するために共にアニールする両方の鎖をパッケージングするscAAVである。開示された方法において使用され得るAAV血清型には、AAV1、AAV2、改変型AAV2（例えば、Y444F、Y500F、Y730F、および/またはS662Vの改変）、AAV3、改変型AAV3（例えば、Y705F、Y731F、および/またはT492Vの改変）、AAV4、AAV5、AAV6、改変型AAV6（例えば、S663Vおよび/またはT492Vの改変）、AAV7、AAV8、AAV8.2、AAV9、AAV.rh10、改変型AAV.rh10、AAV.rh32/33、改変型AAV.rh32/33、AAV.rh43、改変型AAV.rh43、AAV.rh64R1、改変型AAV.rh64R1が含まれ、AAV2/8、AAV2/5、およびAAV2/6のようなシュードタイピングされた（pseudotyped）AAVも、開示された方法において使用され得る。

いくつかの態様において、作用物質を含有するポリヌクレオチドおよび/または鋳型ポリヌクレオチドは、ハイブリッドウイルス、例えば、本明細書中に記載されたウイルスのうちの1つまたは複数のハイブリッドによって送達される。

パッケージング細胞は、標的細胞に感染させることができるウイルス粒子を形成させるために使用される。そのような細胞には、アデノウイルスをパッケージングすることができる293細胞、およびレトロウイルスをパッケージングすることができるψ2細胞またはPA317細胞が含まれる。遺伝子治療において使用されるウイルスベクターは、一般的には、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングする産生細胞株によって生成される。ベクターは、典型的には、宿主細胞または標的細胞（適用可能な場合）へのパッケージングおよびその後の組み込みのために必要とされる最小のウイルス配列を含有し、その他のウイルス配列は、発現させたいタンパク質、例えば、Cas9をコードする発現カセットに交換されている。例えば、遺伝子治療において使用されるAAVベクターは、典型的には、宿主細胞または標的細胞におけるパッケージングおよび遺伝子発現のために必要とされるAAVゲノム由来の末端逆位配列（ITR）のみを保有する。欠けているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスに供給される。その後、ウイルスDNAは、その他のAAV遺伝子、即ち、repおよびcapをコードするが、ITR配列を欠いているヘルパープラスミドを含有する細胞株においてパッケージングされる。細胞株には、ヘルパーとしてのアデノウイルスも感染させる。ヘルパーウイルスは、AAVベクターの複製およびヘルパープラスミドからのAAV遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ITR配列の欠如のため、有意な量、パッケージングされない。アデノウイルスの混入は、例えば、アデノウイルスがAAVより感受性である熱処理によって低下させることができる。

いくつかの態様において、ウイルスベクターは、細胞型認識の能力を有する。例えば、ウイルスベクターは、異なる/別のウイルスエンベロープ糖タンパク質によってシュードタイピングされてもよく；細胞型特異的な受容体によって操作されてもよく（例えば、ペプチドリガンド、単鎖抗体、増殖因子のようなターゲティングリガンドを組み入れるためのウイルスエンベロープ糖タンパク質の遺伝子改変）；かつ/または一方の末端がウイルス糖タンパク質を認識し、他方の末端が標的細胞表面の一部分を認識する二重の特異性（例えば、リガンド-受容体、モノクローナル抗体、アビジン-ビオチン、および化学的コンジュゲーション）を有する分子ブリッジを有するよう操作されてもよい。

いくつかの態様において、ウイルスベクターは、細胞型特異的発現を達成する。例えば、導入遺伝子（Cas9およびgRNA）の発現を特定の標的細胞のみに制限するために、組織特異的プロモーターが構築されてよい。ベクターの特異性は、導入遺伝子発現のマイクロRNA依存性の調節によっても媒介され得る。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、ウイルスベクターと標的細胞膜との融合の増加した効率を有する。例えば、融合可能な赤血球凝集素（HA）のような融合タンパク質を、細胞へのウイルス取り込みを増加させるために組み入れることができる。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、核局在の能力を有する。例えば、（細胞分裂中の）核膜の分解を必要とし、従って、非分裂細胞に感染しないウイルスを、ウイルスのマトリックスタンパク質に核局在ペプチドを組み入れるために改変し、それによって、非増殖細胞の形質導入を可能にすることができる。

IV. 操作された細胞
組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）もしくはその一部分、または組換えT細胞受容体（TCR）もしくはその一部分もしくは鎖をコードする核酸配列（例えば、導入遺伝子）を含む改変T細胞刺激関連遺伝子座を含む遺伝子操作された細胞が、本明細書において提供される。いくつかの局面では、遺伝子操作された細胞中の改変T細胞刺激関連遺伝子座は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座に組み込まれた、組換え受容体またはその一部分をコードする外来性核酸配列（例えば、導入遺伝子）を含む。いくつかの局面では、提供される操作された細胞は本明細書において記載される方法を使用して生成され、この方法は、例えば、遺伝子破壊を誘導するための作用物質、および修復のための導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを用いることよる相同性依存的修復（HDR）を含む。いくつかの局面では、組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列を含む改変T細胞刺激関連遺伝子座を含む細胞を生成するために、ある部分、例えば、提供されるポリヌクレオチド、例えば、セクションII.B.2に記載される任意の鋳型ポリヌクレオチドの隣接したセグメントが、内在性T細胞刺激関連遺伝子座における組み込みのためにターゲティングされ得る。いくつかの態様では、HDRによって内在性T細胞刺激関連遺伝子座に組み込まれる、鋳型ポリヌクレオチドの部分は、鋳型ポリヌクレオチドの導入遺伝子部分、例えば、本明細書において、例えばセクションII.B.2に記載される任意のものを含む。

いくつかの局面では、細胞は、組換え受容体、例えばCARまたは組換えT細胞受容体（TCR）を発現するように操作される。いくつかの局面では、組換え受容体は、操作された細胞の改変T細胞刺激関連遺伝子座に存在する核酸配列にコードされる。いくつかの局面では、細胞は、HDRを介して、組換え受容体のすべてまたは一部分をコードする導入遺伝子を組み込むことによって生成される。いくつかの態様では、組換え受容体は、リガンドまたは抗原、例えば、ある疾患または障害と関連する抗原に結合するか、またはこれらを認識する結合ドメインを含む。

いくつかの局面では、操作された細胞は、免疫細胞、例えばT細胞である。いくつかの態様では、操作された細胞は、T細胞である。いくつかの態様では、操作された細胞は、ヒトT細胞である。いずれかの態様のいくつかでは、T細胞は、対象に由来するT細胞である。いずれかの態様のいくつかでは、対象はヒトである。いくつかの態様では、T細胞は、初代T細胞である。いずれかの態様のいくつかでは、操作された細胞は、初代ヒトT細胞である。いくつかの局面では、免疫細胞は、組換え受容体、例えば、キメラ抗原受容体または改変された組換え受容体、例えば本明細書に記載される任意のものを発現するように操作される。

いくつかの態様では、本明細書で提供される方法、組成物、製造物品、および/またはキットは、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を有するかまたは含有する、遺伝子操作された細胞、例えば、遺伝子操作された免疫細胞および/またはT細胞を生成する、製造する、または作製するのに有用である。いずれかの態様のいくつかでは、本明細書で提供される方法は、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を有するかまたは含有する、遺伝子操作された細胞を結果としてもたらす。いくつかの態様では、改変された遺伝子座は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の遺伝子のオープンリーディングフレームに組み込まれた導入遺伝子、例えば、セクションII.B.2に記載される導入遺伝子であるか、またはそれを含有する。ある特定の態様では、導入遺伝子は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の遺伝子のオープンリーディングフレーム中にインフレームで挿入され、内在性T細胞刺激関連遺伝子座によってコードされる遺伝子産物のすべてまたは一部分をコードする、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を結果としてもたらす。いくつかの態様では、組換え受容体は、キメラ抗原受容体（CAR）である。いくつかの局面では、組換え受容体は、組換えT細胞受容体（TCR）である。いくつかの局面では、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座は、完全長CAR、または2つの鎖を含む組換えTCRの両鎖などの、組換え受容体全体または完全長組換え受容体をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの局面では、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座は、組換え受容体の一部分、例えば、多鎖CARの1つの鎖、もしくは2つの鎖を含む組換えTCRの1つの鎖、または組換え受容体のあるドメインもしくは領域をコードする導入遺伝子を含み、かつ操作された細胞は、操作された細胞のゲノム中の異なる場所に存在する、組換え受容体の残りの部分、例えば、多鎖CARの別の鎖、または組換えTCRの他の鎖をコードする第2の導入遺伝子を含む。

場合によっては、細胞は、1つまたは複数のさらなる分子、例えば、さらなる因子および/またはアクセサリー分子、例えば、本明細書において記載される治療的分子を含めて、任意のさらなる分子を発現するように操作される。いくつかの態様では、さらなる分子としては、マーカー、さらなる組換え受容体ポリペプチド鎖、抗体もしくはその抗原結合断片、免疫調節分子、リガンド、サイトカイン、またはケモカインを挙げることができる。いくつかの態様では、さらなる因子は可溶性分子である。いくつかの態様では、さらなる因子は膜結合分子である。いくつかの局面では、さらなる因子は、免疫抑制環境、例えば腫瘍微小環境（TME）の影響に打ち勝つかまたは対抗するために使用することができる。いくつかの局面では、例示的なさらなる分子としては、サイトカイン、サイトカイン受容体、キメラ共刺激性受容体、共刺激性リガンド、およびT細胞の機能または活性の他のモジュレーターが挙げられる。いくつかの態様では、操作された細胞が発現するさらなる分子としては、IL-7、IL-12、IL-15、CD40リガンド（CD40L）、および4-1BBリガンド（4-1BBL）が挙げられる。いくつかの局面では、さらなる分子は、さらなる受容体、例えば、異なる分子に結合する膜結合受容体である。例えば、いくつかの態様では、さらなる分子はサイトカイン受容体またはケモカイン受容体、例えば、IL-4受容体またはCCL2受容体である。場合によっては、操作された細胞は、「強化（armored）CAR」または普遍的サイトカイン死滅に必要とされるT細胞（T cells redirected for universal cytokine killing）（TRUCK）と呼ばれる。

複数の操作された細胞を含む組成物も提供される。いくつかの局面では、操作された細胞を含む組成物は、他の操作方法、例えば、組換え受容体が細胞のゲノム中にランダムに導入される方法を使用して生成された細胞または細胞組成物と比較して、向上した、均一な、均質な、および/または安定した発現および/または組換え受容体による抗原結合を示す。いくつかの態様では、操作された細胞または操作された細胞を含む組成物は、療法、例えば、養子細胞療法で使用することができる。いくつかの態様では、提供される細胞または細胞組成物は、本明細書において記載される治療の方法のいずれかで、または本明細書において記載される治療的使用のために使用することができる。

A. 改変遺伝子座
いくつかの局面では、改変T細胞刺激関連遺伝子座を含む遺伝子操作された細胞、例えば改変T細胞が提供される。いくつかの態様では、改変T細胞刺激関連遺伝子座は、組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列を含む。いくつかの態様では、核酸配列は、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含み、導入遺伝子は、任意で相同性指向修復（HDR）を介して、内在性T細胞刺激関連遺伝子座に組み込まれている。いくつかの局面では、改変T細胞刺激関連遺伝子座は、本明細書おいて、例えばセクションIV.Bに記載されている組換え受容体、もしくはその一部分、例えば、そのドメインもしくは領域、または本明細書において記載される多鎖組換え受容体の1つもしくは複数の鎖のいずれか1つまたは複数をコードすることができる。

いくつかの態様では、PDCD1遺伝子座の内在性転写制御エレメントに機能的に連結された、組換え受容体またはその一部分、例えば、キメラ抗原受容体（CAR）または組換えT細胞受容体（TCR）をコードする導入遺伝子を含む改変されたPDCD1遺伝子座を含有する、操作された細胞が提供され、該内在性転写制御エレメントPDCD1は、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、機能的に連結された導入遺伝子の発現を誘導するかまたは上方制御し、例えば、一過性に誘導するかまたは上方制御する。

いくつかの態様では、CD69遺伝子座の内在性転写制御エレメントに機能的に連結された、組換え受容体またはその一部分、例えば、CARまたはTCRをコードする導入遺伝子を含む改変されたCD69遺伝子座を含有する、操作された細胞が提供され、該内在性転写制御エレメントCD69は、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、機能的に連結された導入遺伝子の発現を誘導するかまたは上方制御し、例えば、一過性に誘導するかまたは上方制御する。

いくつかの態様では、Nur77（NR4A1をコードする）遺伝子座の内在性転写制御エレメントに機能的に連結された、組換え受容体またはその一部分、例えば、CARまたはTCRをコードする導入遺伝子を含む改変されたNur77遺伝子座を含有する、操作された細胞が提供され、該内在性転写制御エレメントNur77（NR4A1をコードする）は、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、機能的に連結された導入遺伝子の発現を誘導するかまたは上方制御し、例えば、一過性に誘導するかまたは上方制御する。

いくつかの態様では、FoxP3遺伝子座の内在性転写制御エレメントに機能的に連結された、組換え受容体またはその一部分、例えば、CARまたはTCRをコードする導入遺伝子を含む改変されたFoxP3遺伝子座を含有する、操作された細胞が提供され、該内在性転写制御エレメントFoxP3は、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、機能的に連結された導入遺伝子の発現を誘導するかまたは上方制御し、例えば、一過性に誘導するかまたは上方制御する。

いくつかの態様では、HLA-DR遺伝子座の内在性転写制御エレメントに機能的に連結された、組換え受容体またはその一部分、例えば、CARまたはTCRをコードする導入遺伝子を含む改変されたHLA-DR遺伝子座を含有する、操作された細胞が提供され、該内在性転写制御エレメントHLA-DRは、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、機能的に連結された導入遺伝子の発現を誘導するかまたは上方制御し、例えば、一過性に誘導するかまたは上方制御する。

いくつかの態様では、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座は、遺伝子破壊、および例えばHDR方法を介した、組換え受容体またはその一部分をコードするヌクレオチドの配列を含む導入遺伝子（例えば、外来性または異種の核酸配列）の組み込みの結果として生成される。いくつかの局面では、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座に存在する核酸配列は、T細胞刺激関連遺伝子座の完全長遺伝子産物をコードするオープンリーディングフレームを通常は含むであろう、内在性T細胞刺激関連遺伝子座中のある領域に組み込まれた導入遺伝子、例えば外来性配列を含む。いくつかの局面では、HDRによる導入遺伝子の標的組み込みの際に、細胞のゲノムは、組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列を含む、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を含有する。

いくつかの態様では、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子の組み込み後に、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性遺伝子産物は、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座から発現される組換え受容体に加えて、完全に発現される。いくつかの態様では、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子の組み込み後に、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性遺伝子産物のすべてまたは一部分は、発現されない。いくつかの態様では、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座は、T細胞刺激関連遺伝子座の完全長内在性遺伝子産物の一部分をコードし、例えば、内在性遺伝子産物は、欠失を含有する。いくつかの態様では、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座は、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性遺伝子産物をコードせず、すなわち、内在性遺伝子産物は、ノックアウトされる。いくつかの態様では、標的組み込みの際に、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレーム内の部位中に組み込まれた導入遺伝子を含有し、その結果、組換え受容体が、操作された細胞から発現され、場合によっては、T細胞刺激関連遺伝子座の遺伝子産物の一部分、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座の部分的なまたはトランケートされた遺伝子産物も発現される。

いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座は、PDCD1であり、遺伝子座の内在性遺伝子産物であるPD-1は、発現されないか、または機能的ではない。いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座は、PDCD1であり、遺伝子座の内在性遺伝子産物であるPD-1は、完全長で発現されるか、または機能的である。いくつかの局面では、PD1ポリペプチドおよび組換え受容体またはその一部分の両方が、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座PDCD1を含む細胞において共発現される。

いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座は、CD69であり、遺伝子座の内在性遺伝子産物であるCD69は、発現されないか、または機能的ではない。いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座は、CD69であり、遺伝子座の内在性遺伝子産物であるCD69は、完全長で発現されるか、または機能的である。いくつかの局面では、CD69ポリペプチドおよび組換え受容体またはその一部分の両方が、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座CD69を含む細胞において共発現される。

いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座は、Nur77であり、遺伝子座の内在性遺伝子産物であるNR4A1は、発現されないか、または機能的ではない。いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座は、Nur77であり、遺伝子座の内在性遺伝子産物であるNR4A1は、完全長で発現されるか、または機能的である。いくつかの局面では、Nur77ポリペプチドおよび組換え受容体またはその一部分の両方が、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座Nur77を含む細胞において共発現される。

いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座は、FoxP3であり、遺伝子座の内在性遺伝子産物であるFoxP3は、発現されないか、または機能的ではない。いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座は、FoxP3であり、遺伝子座の内在性遺伝子産物であるFoxP3は、完全長で発現されるか、または機能的である。いくつかの局面では、FoxP3ポリペプチドおよび組換え受容体またはその一部分の両方が、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座FoxP3を含む細胞において共発現される。

いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座は、HLA-DRAであり、遺伝子座の内在性遺伝子産物であるHLA-DRAは、発現されないか、または機能的ではない。いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座は、HLA-DRAであり、遺伝子座の内在性遺伝子産物であるHLA-DRAは、完全長で発現されるか、または機能的である。いくつかの局面では、HLA-DRAポリペプチドおよび組換え受容体またはその一部分の両方が、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座HLA-DRAを含む細胞において共発現される。

いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座は、HLA-DRB1であり、遺伝子座の内在性遺伝子産物であるHLA-DRB1は、発現されないか、または機能的ではない。いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座は、HLA-DRB1であり、遺伝子座の内在性遺伝子産物であるHLA-DRB1は、完全長で発現されるか、または機能的である。いくつかの局面では、HLA-DRB1ポリペプチドおよび組換え受容体またはその一部分の両方が、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座HLA-DRB1を含む細胞において共発現される。

いくつかの態様では、導入遺伝子の組み込みの際に、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性配列は、遺伝子破壊、例えば、1つもしくは複数のアミノ酸をコードする核酸配列の欠失および/または終止コドンを導入する変異を含む。いくつかの態様では、導入遺伝子の組み込みの際に、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性配列は、T細胞刺激関連遺伝子座ポリペプチドの機能的な遺伝子産物をコードしない。いくつかの態様では、導入遺伝子の組み込みの際に、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性配列は、T細胞刺激関連遺伝子座ポリペプチドの部分的な遺伝子産物、またはT細胞刺激関連遺伝子座ポリペプチドのトランケートされた遺伝子産物をコードする。

ある特定の態様では、導入遺伝子は、組換え受容体をコードし、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性オープンリーディングフレーム内にインフレームで挿入される。特定の態様では、改変された遺伝子座の転写は、組換え受容体、例えばCARをコードするmRNAを結果としてもたらす。いくつかの局面では、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレーム中に存在する核酸配列の核酸配列は、T細胞刺激関連遺伝子座ポリペプチドの部分的なまたはトランケートされた遺伝子産物、例えば、T細胞刺激関連遺伝子座の遺伝子産物のドミナントネガティブ型をコードすることができる。いくつかの態様では、導入遺伝子は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームの1つまたは複数のエクソンの直ぐ下流の標的部位に、それとインフレームで組み込まれる。いくつかの態様では、導入遺伝子は、（例えば、本明細書における表1～9に記載される）内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームのエクソン1、2、3、または4の下流かつエクソン6、7、または8の上流に組み込まれるか、または挿入される。いくつかの態様では、導入遺伝子は、（例えば、本明細書における表1～9に記載される）内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームのエクソン1、2、3、または4の下流かつエクソン6の上流に組み込まれるか、または挿入される。いくつかの態様では、導入遺伝子は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームのエクソン1の下流かつエクソン8の上流にある。いくつかの態様では、導入遺伝子は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームのエクソン3の下流かつエクソン5の上流にある。いくつかの態様では、導入遺伝子は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームのエクソン4の下流かつエクソン6の上流にある。

いくつかの態様では、改変された遺伝子座から転写されるmRNAは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座によってコードされる、かつ/または内在性T細胞刺激関連遺伝子座から転写されるmRNAの3'UTRと同一である、3'UTRを含有する。いくつかの態様では、導入遺伝子は、CARの一部分をコードする核酸の配列の上流に、例えば、直ぐ上流に、リボソームスキッピングエレメントを含有する。いくつかの態様では、CARをコードするmRNAは、内在性T細胞刺激関連遺伝子座によってコードされる、かつ/または内在性T細胞刺激関連遺伝子座から転写されるmRNAの5'UTRと同一である、5'UTRを含有する。

いくつかの態様では、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座からコードされる組換え受容体は、CARである。いくつかの態様では、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座によってコードされるCARは、標的抗原に結合する、かつ/または標的抗原に結合することができる。いくつかの態様では、標的抗原は、ある疾患、障害、または状態に関連する細胞または組織に関連している、それに特異的である、かつ/またはその上に発現している。いくつかの態様では、CARは、例えば、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメインもしくは領域またはその機能的バリアントもしくはシグナル伝達部分を介して、T細胞における一次活性化シグナル、T細胞受容体（TCR）成分のシグナル伝達ドメイン、および/または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含むシグナル伝達ドメインを刺激および/または誘導することができる。

いくつかの態様では、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座からコードされる組換え受容体は、組換えTCRである。いくつかの局面では、組換えTCRは、2つのポリペプチド鎖、例えば、TCRアルファ（TCRα）鎖およびTCRベータ（TCRβ）鎖；またはTCRガンマ（TCRγ）鎖およびTCRデルタ（TCRδ）鎖を含む。いくつかの局面では、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座は、組換えTCRの1つまたは複数の鎖をコードする。いくつかの態様では、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座は、TCRαをコードする。いくつかの態様では、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座は、TCRβをコードする。いくつかの局面では、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座が、組換えTCRの1つの鎖のみをコードする場合には、TCRの他の鎖は、操作された細胞中に、例えば、異なるゲノム場所に存在する第2の導入遺伝子によってコードされ得る。いくつかの態様では、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座は、任意で、2Aエレメントなどのマルチシストロン性エレメントによって分離された、TCRαおよびTCRβをコードする。

B. コードされる組換え受容体
いくつかの態様では、本明細書で提供される操作された細胞、または本明細書で提供される方法に従って生成された操作された細胞によってコードされる組換え受容体には、キメラ抗原受容体（CAR）もしくはその一部分、または組換えT細胞受容体（TCR）もしくはその一部分が含まれる。組換え受容体の中には、キメラ受容体、抗原受容体、およびキメラ受容体または抗原受容体の1つまたは複数の成分を含有する受容体がある。組換え受容体には、リガンド結合ドメインまたはその結合断片および細胞内シグナル伝達ドメインまたは領域を含有するものが含まれ得る。いくつかの態様では、操作された細胞によってコードされる組換え受容体には、機能的な非TCR抗原受容体、キメラ抗原受容体（CAR）、キメラ自己抗体受容体（CAAR）、組換えT細胞受容体（TCR）、および前述のいずれかの領域、鎖、ドメイン、または成分が含まれる。いくつかの局面では、組換え受容体またはその一部分は、本明細書で提供されるポリヌクレオチド、例えば、上記のセクションII.B.2に記載される任意の鋳型ポリヌクレオチド中に存在する導入遺伝子によってコードされる。いくつかの局面では、ポリヌクレオチド中に含有される組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子は、操作された細胞の内在性T細胞刺激関連遺伝子座に組み込まれて、組換え受容体またはその一部分、例えば、多鎖組換え受容体の1つまたは複数のポリペプチド鎖を含む、本明細書に記載される任意の組換え受容体をコードする、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を結果としてもたらす。

いくつかの態様では、操作された細胞から発現される例示的な組換え受容体には、場合によっては、異なる成分、ドメイン、または領域を含有する、2つ以上の受容体ポリペプチドを含有する多鎖受容体が含まれる。いくつかの局面では、組換え受容体は、機能的な組換え受容体を一緒に構成する2つ以上のポリペプチドを含有する。いくつかの局面では、多鎖受容体は、機能的な組換え受容体を一緒に構成する2つのポリペプチドを含む、二鎖受容体である。いくつかの態様では、組換え受容体は、2つの異なる受容体ポリペプチド、例えば、TCRアルファ（TCRα）鎖およびTCRベータ（TCRβ）鎖；またはTCRガンマ（TCRγ）鎖およびTCRデルタ（TCRδ）鎖を含むTCRである。いくつかの態様では、組換え受容体は、多鎖CARなどの、2つ以上の異なる受容体ポリペプチドを含むCARである。いくつかの態様では、組換え受容体は、ポリペプチドのうちの1つまたは複数が、別の受容体ポリペプチドの発現、活性、または機能を制御する、改変する、または調節する、多鎖受容体である。いくつかの局面では、多鎖受容体は、受容体の特異性、活性、抗原（もしくはリガンド）結合、機能、および/または発現の空間的または時間的な制御または調節を可能にする。いくつかの局面では、多鎖組換え受容体のすべての鎖などの、組換え受容体全体は、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座中に存在する導入遺伝子によってコードされ得る。いくつかの局面では、多鎖組換え受容体の1つの鎖は、T細胞刺激関連遺伝子座中に存在する導入遺伝子によってコードされ得、かつ他の鎖は、ゲノム中の異なる場所（例えば、異なるT細胞刺激関連遺伝子座、または異なる場所）に存在する第2の導入遺伝子によってコードされる。

いくつかの態様では、本明細書において提供される遺伝子操作された細胞中にコードされる組換え受容体は、膜貫通ドメインまたは膜結合ドメインを含む。いくつかの局面では、組換え受容体は細胞外領域も含む。いくつかの局面では、組換え受容体は細胞内領域も含む。いくつかの態様では、本明細書において提供される遺伝子操作された細胞中にコードされる組換え受容体は、様々な領域またはドメイン、例えば、（例えば、1つまたは複数の細胞外結合ドメインおよび/またはスペーサーを含む）細胞外領域、膜貫通ドメイン、ならびに（例えば、細胞内シグナル伝達領域および/または1つもしくは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む）細胞内領域の1つまたは複数を含む。いくつかの局面では、コードされる組換え受容体は、他のドメイン、例えば、多量体化ドメイン、リンカーおよび/または制御エレメントをさらに含む。

いくつかの態様では、例示的なコードされる組換え受容体は、そのN末端からC末端の順番で、以下のものを含む：膜貫通ドメイン（または膜結合ドメイン）および細胞内領域。いくつかの態様では、例示的なコードされる組換え受容体は、そのN末端からC末端の順番で、以下のものを含む：細胞外領域、膜貫通ドメイン、および細胞内領域。いくつかの態様では、細胞外領域は、細胞外結合ドメインであるか、または該ドメインを含み、いくつかの局面では、コードされる組換え受容体は、そのN末端からC末端の順番で、以下のものを含む：細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内領域。場合によっては、細胞外領域、例えば細胞外結合ドメインと膜貫通ドメインの間を分離するか、または細胞外領域、例えば細胞外結合ドメインと膜貫通ドメインの間に配置されるスペーサー。いくつかの態様では、コードされる組換え受容体は、そのN末端からC末端の順番で、以下のものを含む：細胞外結合ドメイン、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内領域。いくつかの態様では、組換え受容体中に存在する細胞内シグナル伝達領域は、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）および/または1つもしくは複数の共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、1つ、2つ、もしくは3つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。

いくつかの態様では、組換え受容体は多量体化ドメインを含み、いくつかの局面では、このドメインは、それらの多鎖ポリペプチドの形成を生じさせることができる。いくつかの態様では、例示的なコードされる組換え受容体は、そのN末端からC末端の順番で、以下のものを含む：膜貫通ドメイン（または膜結合ドメイン）、細胞内多量体化ドメイン、任意で1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメイン、および細胞内シグナル伝達領域。いくつかの態様では、例示的な組換え受容体ポリペプチドは、そのN末端からC末端の順番で、以下のものを含む：細胞外多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、任意で1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメイン、および細胞内シグナル伝達領域。

いくつかの態様では、コードされる組換え受容体はキメラ受容体、例えばCARである。例示的なコードされるCAR配列は以下のものを含む：細胞外結合ドメイン、スペーサー、膜貫通ドメイン、ならびに一次シグナル伝達ドメインまたは領域および1つまたは複数の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む細胞内領域。いくつかの態様では、例示的なコードされるCAR配列は以下のものを含む：細胞外結合ドメイン、スペーサー、膜貫通ドメイン、ならびに1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインまたは領域。

いくつかの態様では、例示的なコードされるポリペプチド、例えば多鎖CARのポリペプチド鎖の配列は以下のものを含む：膜貫通ドメイン（または膜結合ドメイン）、細胞内多量体化ドメイン、任意で1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインまたは領域。いくつかの態様では、例示的なコードされるポリペプチド、例えば多鎖CARのポリペプチド鎖の配列は以下のものを含む：細胞外多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、任意で1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインまたは領域。

いくつかの態様では、例示的なコードされるCAR配列は、順番に、細胞外結合ドメイン、任意でscFv；ヒト免疫グロブリンヒンジ由来の、任意で、IgG1、IgG2、もしくはIgG4、またはこれらの改変バージョン由来の配列を任意で含み、C_H2領域および/またはC_H3領域を任意でさらに含む、スペーサー；ならびに任意でヒトCD28由来の、膜貫通ドメイン；任意でヒト4-1BB由来の、共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびに細胞内シグナル伝達領域、任意でCD3ζ鎖またはその一部分、をコードするヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様では、組換え受容体のコードされる細胞内領域は、そのN末端からC末端の順番で、以下のものを含む：1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメイン、および例えばCD3ゼータ鎖またはその断片を含む一次シグナル伝達ドメインまたは領域。

いくつかの態様では、コードされる組換え受容体は組換えTCRであり、例示的なコードされるTCRは、TCRα鎖またはTCRβ鎖または両方を含む。いくつかの態様では、例示的なコードされるポリペプチド、例えば、組換え受容体のポリペプチドは、TCRα鎖のすべてまたは一部分を含む。いくつかの態様では、例示的なコードされるポリペプチド、例えば、組換え受容体のポリペプチドは、TCRβ鎖のすべてまたは一部分を含む。いくつかの局面では、例示的なコードされる組換え受容体は、TCRα鎖およびTCRβ鎖を含む組換えTCRである。

1. キメラ抗原受容体（CAR）
いくつかの態様では、改変T細胞刺激関連遺伝子座にコードされる組換え受容体はキメラ抗原受容体（CAR）である。いくつかの態様では、操作された細胞、例えばT細胞は、特定の抗原（または、マーカーもしくはリガンド）、例えば、特定の細胞型の表面で発現している抗原に特異性を有する組換え受容体、例えばCARを発現する。いくつかの局面では、多鎖または制御可能なCARを含めて、本明細書において記載されるCARのいずれかの少なくとも一部分は、導入遺伝子中にコードされる。いくつかの局面では、本明細書において記載されるCARまたはその一部分をコードする導入遺伝子は、セクションII.B.2に記載される任意のものであり得る。いくつかの局面では、HDRを介した導入遺伝子の組み込みの際に、生じた改変T細胞刺激関連遺伝子座は、多鎖または制御可能なCARを含めて、CAR、例えば、本明細書において記載される任意のCARをコードする核酸配列を含む。

いくつかの態様では、改変T細胞刺激関連遺伝子座にコードされる組換え受容体、例えばCARは、（例えば、1つもしくは複数の細胞外結合ドメインおよび/もしくはスペーサーを含む）細胞外領域、膜貫通ドメイン、ならびに/あるいは（例えば、一次シグナル伝達領域もしくはドメインおよび/または1つもしくは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む）細胞内領域の1つまたは複数を含む。いくつかの局面では、コードされる組換え受容体は、他のドメイン、例えば、多量体化ドメインをさらに含む。いくつかの局面では、改変T細胞刺激関連遺伝子座は、リンカーおよび/または制御エレメントをコードする配列を含む。いくつかの態様では、コードされる組換え受容体は、そのN末端からC末端の順番で、以下のものを含む：細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに例えば、一次シグナル伝達領域もしくはドメインまたはそれらの一部分および/あるいは共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞内領域。いくつかの態様では、コードされる組換え受容体は、そのN末端からC末端の順番で、以下のものを含む：細胞外結合ドメイン、スペーサー、膜貫通ドメイン、ならびに例えば、一次シグナル伝達領域もしくはドメインまたはそれらの一部分および/あるいは共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞内領域。

a. 結合ドメイン
いくつかの態様では、コードされる組換え受容体の細胞外領域は結合ドメインを含む。いくつかの態様では、結合ドメインは細胞外結合ドメインである。いくつかの態様では、結合ドメインは、ポリペプチド、リガンド、受容体、リガンド結合ドメイン、受容体結合ドメイン、抗原、エピトープ、抗体、抗原結合ドメイン、エピトープ結合ドメイン、抗体結合ドメイン、タグ結合ドメイン、もしくは前述のもののいずれかの断片であるか、またはこれらを含む。いくつかの態様では、結合ドメインはリガンド結合または抗原結合ドメインである。

いくつかの局面では、細胞外結合ドメイン、例えば、リガンド（例えば抗原）結合領域またはドメインと細胞内領域またはドメインは、1つまたは複数のリンカーおよび/または膜貫通ドメインを介して連結または接続される。いくつかの態様では、キメラ抗原受容体は、細胞外領域と細胞内領域の間に配置された膜貫通ドメインを含む。

いくつかの態様では、抗原、例えば、組換え受容体の結合ドメインに結合する抗原はポリペプチドである。いくつかの態様では、抗原は炭水化物または他の分子である。いくつかの態様では、抗原は、例えば、健常な細胞または組織中の正常なまたは非標的の細胞または組織と比較して、疾患、障害、または状態の細胞、例えば、腫瘍または病原性細胞上で選択的に発現しているか、または過剰発現している。いくつかの態様では、疾患、障害、または状態は、感染疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである。いくつかの態様では、抗原は正常細胞上で発現している、および/または操作された細胞上で発現している。いくつかの局面では、組換え受容体、例えばCARは、細胞外リガンド（例えば抗原）結合または領域またはドメイン、例えば、本明細書において記載される抗体または断片のいずれか、および細胞内領域より選択される、1つまたは複数の領域またはドメインを含む。いくつかの態様では、リガンド（例えば抗原）結合領域またはドメインは、scFvもしくは単一ドメインV_H抗体であるか、またはこれらを含み、細胞内領域は、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含む細胞内シグナル伝達領域またはドメインを含む。

CARを含めた例示的なコードされる組換え受容体としては、例えば、国際特許出願公開番号WO2000/14257、WO2013/126726、WO2012/129514、WO2014/031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061、米国特許出願公開番号US2002131960、US2013287748、US20130149337、米国特許第6,451,995号、第7,446,190号、第8,252,592号、第8,339,645号、第8,398,282号、第7,446,179号、第6,410,319号、第7,070,995号、第7,265,209号、第7,354,762号、第7,446,191号、第8,324,353、および第8,479,118号、ならびに欧州特許出願第EP2537416号に記載されているもの、ならびに/またはSadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398；Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338；Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39；およびWu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75によって記載されているものが挙げられる。いくつかの局面では、抗原受容体としては、米国特許第7,446,190号に記載されるCAR、および国際特許出願公開番号WO2014/055668に記載されているものが挙げられる。CARの例としては、前述の参考文献、例えば、WO2014/031687、US8,339,645、US7,446,179、US2013/0149337、US7,446,190、US8,389,282、Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013)；Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701；およびBrentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177)のいずれかで開示されるCARが挙げられる。

いくつかの態様では、コードされる組換え受容体、例えば抗原受容体は、細胞外結合ドメイン、例えば、抗原、リガンド、および/またはマーカーに結合する、例えば特異的に結合する、抗原またはリガンド結合ドメインを含む。抗原受容体の中には、機能的な非TCR抗原受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）がある。いくつかの態様では、抗原受容体は、抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインを含むCARである。いくつかの態様では、CARは、特定の抗原、マーカーまたはリガンド、例えば、養子療法によって標的とされる特定の細胞型で発現している抗原、例えばがんマーカー、および/または応答を弱めることを誘導することを目的としている抗原、例えば、正常もしくは非病的細胞型で発現している抗原に特異性を持って構築される。したがって、CARは、典型的には、その細胞外部分に、1つまたは複数のリガンド（例えば抗原）結合分子、例えば、1つもしくは複数の抗原結合断片、ドメインもしくは部分、または1つもしくは複数の抗体可変ドメイン、および/または抗体分子を含む。いくつかの態様では、CARは、抗体分子の1つまたは複数の抗原結合部分、例えば、モノクローナル抗体（mAb）の可変重（V_H）鎖および可変軽（V_L）鎖に由来する単鎖抗体断片（scFv）、または単一ドメイン抗体（sdAb）、例えば、sdFv、ナノボディ、V_HH、およびV_NARを含む。いくつかの態様では、抗原結合断片は、可動性リンカーによって結合した抗体可変領域を含む。

いくつかの態様では、コードされるCARは、細胞の表面上で発現している抗原またはリガンド、例えば、インタクトな抗原を特異的に認識する抗体または抗原結合断片（例えば、scFv）を含む。いくつかの態様では、抗原またはリガンドは、細胞の表面上で発現しているタンパク質である。いくつかの態様では、抗原またはリガンドはポリペプチドである。いくつかの態様では、これは炭水化物または他の分子である。いくつかの態様では、抗原またはリガンドは、正常なまたは非標的の細胞または組織と比較して、疾患または状態の細胞、例えば、腫瘍または病原性細胞上で選択的に発現しているか、または過剰発現している。他の態様では、抗原は正常細胞上で発現している、および/または操作された細胞上で発現している。

いくつかの態様では、組換え受容体によって標的とされる抗原の中には、養子細胞療法によって標的とされるある疾患、状態、または細胞型において発現しているものがある。疾患および状態の中には、増殖性、新生物性、および悪性の疾患および障害、例えば、がんおよび腫瘍、例えば、血液悪性腫瘍、免疫系のがん、例えば、リンパ腫、白血病、および/または骨髄腫、例えば、B、T、および骨髄性白血病、リンパ腫、ならびに多発性骨髄腫がある。

いくつかの態様では、抗原またはリガンドは腫瘍抗原またはがんマーカーである。いくつかの態様では、疾患または障害と関連する抗原は、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9；CAIXまたはG250としても知られている）、がん精巣抗原、がん/精巣抗原1B（CTAG；NY-ESO-1およびLAGE-2としても知られている）、癌胎児性抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮成長因子タンパク質（EGFR）、III型上皮成長因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体ホモログ5またはFCRH5としても知られている）、胎児型アセチルコリン受容体（胎児型AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量-黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Rα）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Rα2）、キナーゼインサートドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、Lewis Y、黒色腫関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソテリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、腫瘍胎児抗原、黒色腫優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（TPBG；5T4としても知られている）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1；TYRP1またはgp75としても知られている）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2；ドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムデルタイソメラーゼ、またはDCTとしても知られている）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的もしくは病原体発現抗原、またはユニバーサルタグと関連する抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBVもしくは他の病原体によって発現される分子であるか、あるいはこれらを含む。いくつかの態様において受容体によって標的とされる抗原としては、B細胞悪性病変と関連する抗原、多数の公知のB細胞マーカーのいずれかが挙げられる。いくつかの態様では、抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igカッパ、Igラムダ、CD79a、CD79b、もしくはCD30であるか、またはこれらを含む。

いくつかの態様では、抗原は、病原体特異的もしくは病原体発現抗原であるか、またはこれらを含む。いくつかの態様では、抗原はウイルス抗原（例えば、HIV、HCV、HBVなどからのウイルス抗原）、細菌性抗原、および/または寄生虫抗原である。

いくつかの態様では、抗体または抗原結合断片（例えば、scFvまたはV_Hドメイン）は、抗原、例えばCD19を特異的に認識する。いくつかの態様では、抗体または抗原結合断片はCD19に特異的に結合する抗体もしくは抗原結合断片に由来するか、または該抗体もしくは抗原結合断片のバリアントである。

いくつかの態様では、抗原はCD19である。いくつかの態様では、scFvは、CD19に特異的な抗体又は抗体断片に由来するVHおよびVLを含む。いくつかの態様では、CD19に結合する抗体または抗体断片は、FMC63およびSJ25C1などのマウス由来抗体である。いくつかの態様では、抗体または抗体断片は、例えば、米国特許出願公開番号US2016/0152723に記載されているヒト抗体である。

いくつかの態様では、scFvはFMC63に由来する。FMC63は、一般に、ヒト起源のCD19を発現するNalm-1およびNalm-16細胞に対して産生させられたマウスモノクローナルIgG1抗体を指す（Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302）。いくつかの態様では、FMC63抗体は、それぞれSEQ ID NO:38および39に記載されるCDR-H1およびCDR-H2、およびSEQ ID NO:40または54に記載されるCDR-H3；ならびにSEQ ID NO:35に記載されるCDR-L1およびSEQ ID NO:36または55に記載されるCDR-L2およびSEQ ID NO:37または34に記載されるCDR-L3を含む。いくつかの態様では、FMC63抗体は、SEQ ID NO:41のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（V_H）およびSEQ ID NO:42のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（V_L）を含む。

いくつかの態様では、scFvは、SEQ ID NO:35のCDR-L1配列、SEQ ID NO:36のCDR-L2配列、およびSEQ ID NO:37のCDR-L3配列を含む可変軽鎖、ならびに/またはSEQ ID NO:38のCDR-H1配列、SEQ ID NO:39のCDR-H2配列、およびSEQ ID NO:40のCDR-H3配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの態様では、scFvは、SEQ ID NO:41に記載される可変重鎖領域およびSEQ ID NO:42に記載される可変軽鎖領域を含む。いくつかの態様では、可変重鎖と可変軽鎖はリンカーによって接続されている。いくつかの態様では、リンカーはSEQ ID NO:56に記載される。いくつかの態様では、scFvは、順番に、V_H、リンカー、およびV_Lを含む。いくつかの態様では、scFvは、順番に、V_L、リンカー、およびV_Hを含む。いくつかの態様では、scFvは、SEQ ID NO:57に記載されるヌクレオチドの配列に、またはSEQ ID NO:57に対して、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列にコードされる。いくつかの態様では、scFvは、SEQ ID NO:43に記載されるアミノ酸の配列、またはSEQ ID NO:43に対して、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を含む。

いくつかの態様では、scFvはSJ25C1に由来する。SJ25C1は、ヒト起源のCD19を発現するNalm-1およびNalm-16細胞に対して産生させられたマウスモノクローナルIgG1抗体である（Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302）。いくつかの態様では、SJ25C1抗体は、それぞれSEQ ID NO:47～49に記載されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3、ならびにそれぞれSEQ ID NO:44～46に記載されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3配列を含む。いくつかの態様では、SJ25C1抗体は、SEQ ID NO:50のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（V_H）およびSEQ ID NO:51のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（V_L）を含む。

いくつかの態様では、scFvは、SEQ ID NO:44のCDR-L1配列、SEQ ID NO:45のCDR-L2配列、およびSEQ ID NO:46のCDR-L3配列を含む可変軽鎖、ならびに/またはSEQ ID NO:47のCDR-H1配列、SEQ ID NO:48のCDR-H2配列、およびSEQ ID NO:49のCDR-H3配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの態様では、scFvは、SEQ ID NO:50に記載される可変重鎖領域およびSEQ ID NO:51に記載される可変軽鎖領域を含む。いくつかの態様では、可変重鎖と可変軽鎖はリンカーによって接続されている。いくつかの態様では、リンカーはSEQ ID NO:52に記載される。いくつかの態様では、scFvは、順番に、V_H、リンカー、およびV_Lを含む。いくつかの態様では、scFvは、順番に、V_L、リンカー、およびV_Hを含む。いくつかの態様では、scFvは、SEQ ID NO:53に記載されるアミノ酸の配列、またはSEQ ID NO:53に対して、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を示す配列を含む。

いくつかの態様では、抗原はCD20である。いくつかの態様では、scFvは、CD20に特異的な抗体または抗体断片に由来するV_HおよびV_Lを含む。いくつかの態様では、CD20に結合する抗体または抗体断片は、リツキシマブであるか、またはリツキシマブに由来する抗体、例えばリツキシマブscFvである。

いくつかの態様では、抗原はCD22である。いくつかの態様では、scFvは、CD22に特異的な抗体または抗体断片に由来するV_HおよびV_Lを含む。いくつかの態様では、CD22に結合する抗体または抗体断片は、m971であるか、またはm971に由来する抗体、例えばm971 scFvである。

いくつかの態様では、抗原または抗原結合ドメインはBCMAである。いくつかの態様では、scFvは、BCMAに特異的な抗体または抗体断片に由来するV_HおよびV_Lを含む。いくつかの態様では、BCMAに結合する抗体または抗体断片は、国際特許出願公開番号WO2016/090327およびWO2016/090320に記載される抗体または抗体断片に由来するV_HおよびV_Lであるか、または該V_HおよびV_Lを含む。

いくつかの態様では、抗原または抗原結合ドメインはGPRC5Dである。いくつかの態様では、scFvは、GPRC5Dに特異的な抗体または抗体断片に由来するV_HおよびV_Lを含む。いくつかの態様では、GPRC5Dに結合する抗体または抗体断片は、国際特許出願公開番号WO2016/090329およびWO2016/090312に記載される抗体または抗体断片に由来するV_HおよびV_Lであるか、または該V_HおよびV_Lを含む。

いくつかの局面では、コードされるCARは、ユニバーサルタグまたはユニバーサルエピトープに結合するかまたはこれらを認識する、例えば、これらに特異的に結合するリガンド（例えば抗原）結合ドメインを含む。いくつかの局面では、結合ドメインは、ある疾患または障害と関連する抗原を認識する異なる結合分子（例えば、抗体または抗原結合断片）に連結され得る分子、タグ、ポリペプチド、および/またはエピトープに結合することができる。例示的なタグまたはエピトープとしては、色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート）またはビオチンが挙げられる。いくつかの局面では、タグに対して特異的なCARを発現する操作された細胞で、ある疾患または障害と関連する抗原、例えば腫瘍抗原を認識して、操作された細胞の細胞傷害性または他のエフェクター機能をもたらす、タグに連結された結合分子（例えば、抗体または抗原結合断片）。いくつかの局面では、ある疾患または障害と関連する抗原に対するCARの特異性はタグ化結合分子（例えば抗体）によって提供され、異なるタグ化結合分子は、異なる抗原を標的とするために使用することができる。ユニバーサルタグまたはユニバーサルエピトープに対して特異的な例示的なCARとしては、例えば、U.S.9,233,125、WO2016/030414、Urbanska et al., (2012) Cancer Res 72: 1844-1852、およびTamada et al., (2012) Clin Cancer Res 18:6436-6445に記載されているものが挙げられる。

いくつかの態様では、コードされるCARは、主要組織適合抗原複合体（MHC）-ペプチド複合体として細胞表面に提示される腫瘍関連抗原などの細胞内抗原を特異的に認識する抗体または抗原結合断片（例えば、scFv）のようなTCR様抗体を含む。いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体を認識する抗体またはその抗原結合部分は、組換え受容体、例えば抗原受容体の一部として細胞上で発現され得る。抗原受容体の中には、機能的な非T細胞受容体（TCR）抗原受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）がある。いくつかの態様では、ペプチド-MHC複合体に対してTCR様の特異性を示す抗体または抗原結合断片を含むCARは、TCR様CARと称することもできる。いくつかの態様では、CARはTCR様CARであり、抗原はプロセッシングを受けたペプチド抗原、例えば細胞内タンパク質のペプチド抗原であり、これは、MHC分子の状況で、TCRのように、細胞表面上で認識される。いくつかの態様では、TCR様CARのMHC-ペプチド複合体に対して特異的な細胞外抗原結合ドメインは、いくつかの局面では、リンカーおよび/または膜貫通ドメインを介して、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達成分に連結される。いくつかの態様では、そのような分子は、典型的には、天然の抗原受容体、例えばTCRを通したシグナル、および任意で、共刺激受容体と組み合わさったそのような受容体を通したシグナルを模倣するか、またはこうしたシグナルに近似することができる。

いくつかの態様では、主要組織適合抗原複合体（MHC）は、場合によっては、細胞機構によってプロセッシングを受けたペプチド抗原を含めて、ポリペプチドのペプチド抗原と複合体化することができる多形性ペプチド結合部位または結合溝を含むタンパク質、一般に糖タンパク質を含む。場合によっては、MHC分子は、T細胞上の抗原受容体、例えば、TCRまたはTCR様抗体によって認識可能なコンフォメーションでの抗原の提示のために、例えばペプチドとの複合体、すなわちMHC-ペプチド複合体として、細胞表面上で提示または発現され得る。一般に、MHCクラスI分子は、場合によっては3つのαドメインを有する膜貫通α鎖、および非共有結合的に結合したβ2ミクログロブリンを有するヘテロ二量体である。一般に、MHCクラスII分子は2つの膜貫通糖タンパク質、αおよびβから構成され、これらの両方とも典型的には膜を貫通する。MHC分子は、ペプチドと結合するための1つまたは複数の抗原結合部位および適切な抗原受容体による認識に必要な配列を含む、MHCの有効部分を含むことができる。いくつかの態様では、MHCクラスI分子は、サイトゾルで生じたペプチドを細胞表面に送達し、ここで、MHC-ペプチド複合体はT細胞、例えば、通常CD8⁺T細胞であるが、場合によってはCD4⁺T細胞によって認識される。いくつかの態様では、MHCクラスII分子は小胞系で生じたペプチドを細胞表面に送達し、ここで、これは、典型的にはCD4⁺T細胞によって認識される。一般に、MHC分子は、マウスでH-2およびヒトでヒト白血球抗原（HLA）と総称される一群の連結した遺伝子座にコードされる。したがって、典型的には、ヒトMHCはヒト白血球抗原（HLA）と称することもできる。

用語「MHC-ペプチド複合体」または「ペプチド-MHC複合体」またはこれらの変形は、例えば、一般に、MHC分子の結合溝またはクレフトにおけるペプチドの非共有結合相互作用による、ペプチド抗原とMHC分子の複合体または結合物を指す。いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体は、細胞の表面上に存在するか、または提示される。いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体は、抗原受容体、例えば、TCR、TCR様CAR、またはそれらの抗原結合部分によって特異的に認識され得る。

いくつかの態様では、ポリペプチドのペプチド、例えば、ペプチド抗原またはエピトープは、例えば抗原受容体による認識のために、MHC分子と結合することができる。一般に、ペプチドは、より長い生物学的分子、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質の断片に由来するか、または基づく。いくつかの態様では、ペプチドは、典型的には約8～約24アミノ酸の長さである。いくつかの態様では、ペプチドは、MHCクラスII複合体における認識のために、9または約9～22アミノ酸の長さを有する。いくつかの態様では、ペプチドは、MHCクラスI複合体における認識のために、8または約8～13アミノ酸の長さを有する。いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体などのMHC分子に関連したペプチドの認識の際に、抗原受容体、例えば、TCRまたはTCR様CARは、T細胞応答、例えば、T細胞増殖、サイトカイン産生、細胞傷害性T細胞応答、または他の応答を誘導するT細胞に対する活性化シグナルを生成するか、または誘発する。

いくつかの態様では、TCR様抗体または抗原結合部分は公知であるか、または公知の方法によって作製することができる（例えば、米国特許出願公開番号US2002/0150914；US2003/0223994；US2004/0191260；US2006/0034850；US2007/00992530；US20090226474；US20090304679；および国際出願公開番号WO03/068201を参照されたい）。

いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、特定のMHC-ペプチド複合体を含む有効量の免疫原で宿主を免疫することによって作製することができる。場合によっては、MHC-ペプチド複合体のペプチドは、MHC、例えば腫瘍抗原、例えばユニバーサル腫瘍抗原、骨髄腫抗原、または本明細書において記載される他の抗原に結合することができる抗原のエピトープである。いくつかの態様では、有効量の免疫原は、次いで、免疫応答を惹起するために宿主に投与され、免疫原は、MHC分子の結合溝におけるペプチドの3次元的提示に対して免疫応答を惹起するのに十分である期間にわたって、その3次元形態を保持する。次いで、宿主から収集された血清をアッセイして、MHC分子の結合溝におけるペプチドの3次元的提示を認識する望ましい抗体が作製されているかどうかを決定する。いくつかの態様では、作製された抗体を評価して、抗体がMHC-ペプチド複合体をMHC分子単独、関心対象のペプチド単独、およびMHCと不適切なペプチドの複合体と区別することができることを確認することができる。次いで、望ましい抗体を単離することができる。

いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、抗体ライブラリーディスプレイ方法、例えばファージ抗体ライブラリーを用いて作製することができる。いくつかの態様では、変異型Fab、scFv、または他の抗体形態のファージディスプレイライブラリーを生成することができ、例えば、これは、ライブラリーのメンバーが1つまたは複数のCDRの1つまたは複数の残基において変異を受けている。例えば、米国特許出願公開番号US20020150914、US20140294841；およびCohen CJ. et al. (2003) J Mol. Recogn. 16:324-332を参照されたい。

本明細書における用語「抗体」は最も広い意味において使用され、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、例えば、インタクト抗体および機能的（抗原結合）抗体断片、例えば、断片抗原結合（fragment antigen binding）（Fab）断片、F(ab')₂断片、Fab'断片、Fv断片、組換えIgG（rIgG）断片、特異的抗原に結合することができる可変重鎖（V_H）領域、単鎖抗体断片、例えば単鎖可変断片（scFv）、および単一ドメイン抗体（例えば、sdAb、sdFv、ナノボディ、V_HHまたはV_NAR）または断片を含む。本用語は、免疫グロブリンの遺伝子操作されたおよび/または別の方法で改変された形態、例えば、イントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多特異性、例えば二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ、タンデムジ-scFv、タンデムトリ-scFvを包含する。別段の記載がない限り、用語「抗体」は、その機能的抗体断片を包含すると理解されるべきである。本用語は、インタクトなまたは完全長の抗体、例えば、IgGおよびそのサブクラス、IgM、IgE、IgA、およびIgDを含めて、任意のクラスまたはサブクラスの抗体も包含する。いくつかの局面では、CARは、例えば特異性が異なる2つの抗原結合ドメインを含む、二重特異性CARである。

いくつかの態様では、抗原結合タンパク質、抗体、およびそれらの抗原結合断片は、完全長抗体の抗原を特異的に認識する。いくつかの態様では、抗体の重鎖および軽鎖は完全長でもよく、または抗原結合部分（Fab、F(ab')2、Fv、もしくは単鎖Fv断片（scFv））でもよい。他の態様では、抗体の重鎖定常領域は、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、およびIgEから選ばれ、特に、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4から選ばれ、より詳細には、IgG1（例えばヒトIgG1）である。いくつかの態様では、抗体の軽鎖定常領域は、例えば、カッパまたはラムダから選ばれ、特にカッパである。

コードされる組換え受容体の結合ドメインの中には、抗体断片がある。「抗体断片」は、インタクト抗体以外の分子であって、インタクト抗体のうちの、インタクト抗体が結合する抗原に結合する部分を含む分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；ダイアボディ；直鎖抗体；可変重鎖（V_H）領域、単鎖抗体分子、例えば、scFvおよび単一ドメインV_H単一抗体；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。いずれかの態様のいくつかでは、抗体は、可変重鎖領域および/または可変軽鎖領域を含む単鎖抗体断片、例えばscFvである。

用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗原への抗体の結合に関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。ネイティブ抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、V_HおよびV_L）は、一般に類似した構造を有し、各ドメインは、4つの保存されたフレームワーク領域（FR）および3つのCDRを含む（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照されたい。単一のV_HまたはV_Lドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、該抗原に結合する抗体由来のV_HまたはV_Lドメインを使用して、それぞれ相補的なV_LまたはV_Hドメインのライブラリーをスクリーニングすることで、単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照されたい。

単一ドメイン抗体（sdAb）は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部分または軽鎖可変ドメインのすべてまたは一部分を含む抗体断片である。ある特定の態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である。いくつかの態様では、CARは、抗原、例えば、標的とされる細胞または疾患、例えば、腫瘍細胞またはがん細胞のがんマーカーまたは細胞表面抗原、例えば、本明細書において記載されるかまたは公知の標的抗原のいずれかに特異的に結合する抗体重鎖ドメインを含む。例示的な単一ドメイン抗体としては、sdFv、ナノボディ、V_HHまたはV_NARが挙げられる。

抗体断片は、限定されないが、インタクト抗体のタンパク質消化および組換え宿主細胞による作製を含めて、様々な技法によって作製することができる。いくつかの態様では、抗体は、組換えで作製された断片、例えば、天然に存在しない配置を含む断片、例えば、合成リンカー、例えばペプチドリンカーによって結合した2つ以上の抗体領域もしくは鎖を有するもの、および/または天然に存在するインタクト抗体の酵素消化によって作製することができないものである。いくつかの態様では、抗体断片はscFvである。

「ヒト化」抗体は、すべてまたは実質的にすべてのCDRアミノ酸残基が非ヒトCDRに由来し、すべてまたは実質的にすべてのFRアミノ酸残基がヒトFRに由来する抗体である。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含むことができる。非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、典型的にはヒトに対する免疫原性を低減させるようにヒト化されているが、親の非ヒト抗体の特異性および親和性を保持する、非ヒト抗体のバリアントを指す。いくつかの態様では、ヒト化抗体のいくつかのFR残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復または向上させるために、非ヒト抗体（例えば、CDR残基が由来する抗体）の対応する残基で置換される。

したがって、いくつかの態様では、TCR様CARを含めて、コードされるキメラ抗原受容体は、抗体または抗体断片を含む細胞外部分を含む。いくつかの態様では、抗体または断片はscFvを含む。いくつかの局面では、抗体または抗原結合断片は、ライブラリーなどの複数の抗原結合断片または分子をスクリーニングすることによって、例えば、特定の抗原またはリガンドへの結合についてscFvライブラリーをスクリーニングすることによって、得ることができる。

いくつかの態様では、コードされるCARは多重特異性CARであり、例えば、複数の異なる抗原に結合することができる、および/または該抗原を認識することができる、例えば、該抗原に特異的に結合する、複数のリガンド（例えば抗原）結合ドメインを含む。いくつかの局面では、コードされるCARは、例えば特異性が異なる2つの抗原結合ドメインを含むことなどによって、2つの抗原を標的とする、二重特異性CARである。いくつかの態様では、CARは、例えば、本明細書において記載される列挙される抗原のいずれかより選択される標的細胞上の異なる表面抗原、例えば、CD19およびCD22またはCD19およびCD20に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含む二重特異性結合ドメイン、例えば、二重特異性抗体またはその断片を含む。いくつかの態様では、二重特異性結合ドメインの、そのエピトープまたは抗原のそれぞれへの結合は、T細胞の機能、活性および/または応答、例えば、細胞傷害活性および引き続く標的細胞の溶解を刺激することができる。そのような例示的な二重特異性結合ドメインの中には、場合によっては、例えば可動性リンカーを介して互いに融合したタンデムscFv分子；タンデムダイアボディを含めた、ダイアボディおよびその誘導体（Holliger et al, Prot Eng 9, 299-305 (1996)；Kipriyanov et al, J Mol Biol 293, 41-66 (1999)）；C末端ジスルフィド架橋でダイアボディ型式を含むことができる二重親和性再ターゲティング（dual affinity retargeting）（DART）分子；可動性リンカーによって融合したタンデムscFv分子を含む二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）分子（例えば、Nagorsen and Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)を参照されたい；または全ハイブリッドマウス/ラットIgG分子を含むトリオマブ（Seimetz et al, Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)が含まれ得る。そのような結合ドメインのいずれかが本明細書において記載されるCARのいずれかに含まれ得る。

b. スペーサーおよび膜貫通ドメイン
いくつかの局面では、コードされる組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体は、1つまたは複数のリガンド（例えば抗原）結合ドメイン、例えば、抗体またはその断片を含む細胞外部分、および1つまたは複数の細胞内シグナル伝達領域またはドメイン（互換的に、細胞質内シグナル伝達ドメインまたは領域とも呼ばれる）を含む。いくつかの局面では、組換え受容体、例えばCARは、スペーサーおよび/または膜貫通ドメインもしくは部分をさらに含む。いくつかの局面では、スペーサーおよび/または膜貫通ドメインは、リガンド（例えば抗原）結合ドメインを含む細胞外部分と細胞内シグナル伝達領域またはドメインとを連結することができる。

いくつかの態様では、CARなどのコードされる組換え受容体はさらにスペーサーを含み、これは、免疫グロブリン定常領域、またはそのバリアントもしくは改変バージョンの少なくとも一部分、例えばヒンジ領域、例えばIgG4ヒンジ領域、ならびに/またはC_H1/C_Lおよび/もしくはFc領域であり得るか、これらを含むことができる。いくつかの態様では、組換え受容体は、スペーサーおよび/またはヒンジ領域をさらに含む。いくつかの態様では、定常領域または部分は、ヒトIgG、例えば、IgG4、IgG2、またはIgG1のものである。いくつかの局面では、定常領域の部分は、抗原認識成分、例えばscFvと膜貫通ドメインの間のスペーサー領域として働く。スペーサーは、スペーサーがない場合と比較して、抗原結合後に細胞の応答性の増加を提供する長さのものであり得る。いくつかの例では、スペーサーは12もしくは約12アミノ酸の長さであるか、または12アミノ酸以下の長さである。例示的なスペーサーとしては、少なくとも約10～229アミノ酸、約10～200アミノ酸、約10～175アミノ酸、約10～150アミノ酸、約10～125アミノ酸、約10～100アミノ酸、約10～75アミノ酸、約10～50アミノ酸、約10～40アミノ酸、約10～30アミノ酸、約10～20アミノ酸、または約10～15アミノ酸（列挙される範囲のいずれかの端点の間の任意の整数を含む）を有するものが挙げられる。いくつかの態様では、スペーサー領域は、約12アミノ酸もしくはそれ未満、約119アミノ酸もしくはそれ未満、または約229アミノ酸もしくはそれ未満を有する。いくつかの態様では、スペーサーは、250アミノ酸未満の長さ、200アミノ酸未満の長さ、150アミノ酸未満の長さ、100アミノ酸未満の長さ、75アミノ酸未満の長さ、50アミノ酸未満の長さ、25アミノ酸未満の長さ、20アミノ酸未満の長さ、15アミノ酸未満の長さ、12アミノ酸未満の長さ、または10アミノ酸未満の長さである。いくつかの態様では、スペーサーは、10または約10から、250アミノ酸の長さ、10～150アミノ酸の長さ、10～100アミノ酸の長さ、10～50アミノ酸の長さ、10～25アミノ酸の長さ、10～15アミノ酸の長さ、15～250アミノ酸の長さ、15～150アミノ酸の長さ、15～100アミノ酸の長さ、15～50アミノ酸の長さ、15～25アミノ酸の長さ、25～250アミノ酸の長さ、25～100アミノ酸の長さ、25～50アミノ酸の長さ、50～250アミノ酸の長さ、50～150アミノ酸の長さ、50～100アミノ酸の長さ、100～250アミノ酸の長さ、100～150アミノ酸の長さ、または150～250アミノ酸の長さである。例示的なスペーサーとしては、IgG4ヒンジ単独、C_H2およびC_H3ドメインに連結したIgG4ヒンジ、またはC_H3ドメインに連結したIgG4ヒンジが挙げられる。例示的なスペーサーとしては、限定されないが、Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153, Hudecek et al. (2015) Cancer Immunol Res. 3(2): 125-135または国際特許出願公開番号WO2014031687に記載されているものが挙げられる。

いくつかの態様では、スペーサーは、全部または部分的に、IgG4および/またはIgG2に由来してもよい。いくつかの態様では、スペーサーは、IgG4、IgG2、ならびに/またはIgG2およびIgG4に由来するヒンジ、C_H2、および/またはC_H3配列の1つまたは複数を含むキメラポリペプチドであり得る。いくつかの態様では、スペーサーは変異、例えば、1つまたは複数のドメインにおける1つまたは複数の単一アミノ酸変異を含んでもよい。いくつかの例では、アミノ酸修飾はIgG4のヒンジ領域中のセリン（S）からプロリン（P）への置換である。いくつかの態様では、アミノ酸修飾は、グリコシル化の異種性を低減させるためのアスパラギン（N）からグルタミン（Q）への置換、例えば、SEQ ID NO:60に記載されるIgG4重鎖定常領域配列のC_H2領域の位置177（Uniprot受託番号 P01861；EU番号付けによる位置297およびSEQ ID NO:4に記載されるヒンジ-C_H2-C_H3スペーサー配列の位置79に対応する位置）に対応する位置におけるNからQへの置換、またはSEQ ID NO:59に記載されるIgG2重鎖定常領域配列のC_H2領域の位置176（Uniprot受託番号P01859；EU番号付けによる位置297に対応する位置）に対応する位置におけるNからQへの置換である。

いくつかの局面では、スペーサーは、SEQ ID NO:1に記載され、SEQ ID NO:2に記載される配列にコードされるヒンジのみのスペーサーのように、IgGのヒンジ領域のみ、例えば、IgG4、IgG2、またはIgG1のヒンジのみを含む。他の態様では、スペーサーは、C_H2および/またはC_H3ドメインに連結されたIgヒンジ、例えばIgG4ヒンジである。いくつかの態様では、スペーサーは、SEQ ID NO:3に記載されるような、C_H2およびC_H3ドメインに連結されたIgヒンジ、例えばIgG4ヒンジである。いくつかの態様では、スペーサーは、SEQ ID NO:4に記載されるように、C_H3ドメインのみに連結されたIgヒンジ、例えばIgG4ヒンジである。いくつかの態様では、スペーサーは、グリシン-セリンリッチ配列または他の可動性リンカー、例えば公知の可動性リンカーであるか、またはこれらを含む。いくつかの態様では、定常領域または部分はIgDのものである。いくつかの態様では、スペーサーはSEQ ID NO:5に記載される配列を有する。いくつかの態様では、スペーサーは、SEQ ID NO:1、3、4、および5のいずれかに対して、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する。

いくつかの局面では、スペーサーは、以下より選択される1つまたは複数などのポリペプチドスペーサーである：(a)免疫グロブリンヒンジもしくはその改変バージョンの全部もしくは一部分を含むか、またはこれらからなるか、あるいは約15アミノ酸またはそれ未満を含み、CD28細胞外領域もCD8細胞外領域も含まない、(b)免疫グロブリンヒンジ、任意でIgG4ヒンジ、もしくはこれらの改変バージョンの全部もしくは一部分を含むか、またはこれらからなる、および/あるいは約15アミノ酸またはそれ未満を含み、CD28細胞外領域もCD8細胞外領域も含まない、あるいは(c)12または約12アミノ酸の長さである、および/あるいは免疫グロブリンヒンジ、任意でIgG4、もしくはこれらの改変バージョンの全部もしくは一部分を含むか、またはこれらからなる；あるいは(d)SEQ ID NO:1、3～5、もしくは27～34に記載されるアミノ酸の配列、またはこれらに対して、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する前述のもののいずれかのバリアントからなるか、あるいはこれらを含む、あるいは(e)X₁がグリシン、システイン、もしくはアルギニンであり、X₂がシステインもしくはスレオニンである式X₁PPX₂Pを含むか、または該式からなる。

例示的なスペーサーとしては、Igヒンジ、例えばIgGヒンジドメインを含むものなど、免疫グロブリン定常領域の一部分を含むものが挙げられる。いくつかの局面では、スペーサーは、IgGヒンジ単独、C_H2およびC_H3ドメインの1つまたは複数に連結されたIgGヒンジ、またはC_H3ドメインに連結されたIgGヒンジを含む。いくつかの態様では、IgGヒンジ、C_H2、および/またはC_H3は、全部または部分的に、IgG4またはIgG2に由来してもよい。いくつかの態様では、スペーサーは、IgG4、IgG2、ならびに/またはIgG2およびIgG4に由来するヒンジ、C_H2、および/またはC_H3配列の1つまたは複数を含むキメラポリペプチドであり得る。いくつかの態様では、ヒンジ領域は、IgG4ヒンジ領域のおよび/もしくはIgG2ヒンジ領域の全部もしくは一部分を含み、IgG4ヒンジ領域は任意でヒトIgG4ヒンジ領域であり、IgG2ヒンジ領域は任意でヒトIgG2ヒンジ領域であり；C_H2領域は、IgG4 C_H2領域のおよび/もしくはIgG2 C_H2領域の全部もしくは一部分を含み、IgG4 C_H2領域は任意でヒトIgG4 C_H2領域であり、IgG2 C_H2領域は任意でヒトIgG2 C_H2領域であり；ならびに/またはC_H3領域は、IgG4 C_H3領域のおよび/もしくはIgG2 C_H3領域の全部もしくは一部分を含み、IgG4 C_H3領域は任意でヒトIgG4 C_H3領域であり、IgG2 C_H3領域は任意でヒトIgG2 C_H3領域である。いくつかの態様では、ヒンジ、C_H2、およびC_H3は、IgG4由来のヒンジ領域、C_H2、およびC_H3のそれぞれのすべてまたは一部分を含む。いくつかの態様では、ヒンジ領域はキメラであり、ヒトIgG4およびヒトIgG2由来のヒンジ領域を含み；C_H2領域はキメラであり、ヒトIgG4およびヒトIgG2由来のC_H2領域を含み；ならびに/またはC_H3領域はキメラであり、ヒトIgG4およびヒトIgG2由来のC_H3領域を含む。いくつかの態様では、スペーサーは、IgG4/2キメラヒンジ、またはヒトIgG4ヒンジ領域と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含む改変IgG4ヒンジ；ヒトIgG2/4キメラC_H2領域；およびヒトIgG4 C_H3領域を含む。

いくつかの態様では、スペーサーは、全部または部分的に、IgG4および/またはIgG2に由来してもよく、変異、例えば、1つまたは複数のドメインにおける1つまたは複数の単一アミノ酸変異を含んでもよい。いくつかの例では、アミノ酸修飾はIgG4のヒンジ領域中のセリン（S）からプロリン（P）への置換である。いくつかの態様では、アミノ酸修飾は、グリコシル化の異種性を低減させるためのアスパラギン（N）からグルタミン（Q）への置換であり、例えば、SEQ ID NO:60に記載される完全長IgG4 Fc配列のC_H2領域の位置177のN177Q 変異、またはSEQ ID NO:59に記載される完全長IgG2 Fc配列のC_H2領域の位置176のN176Qである。いくつかの態様では、スペーサーは、IgG4/2キメラヒンジもしくは改変IgG4ヒンジ；IgG2/4キメラC_H2領域；およびIgG4 C_H3領域であるか、またはこれらを含み、任意で約228アミノ酸の長さであり；あるいはSEQ ID NO:291に記載されるスペーサーである。いくつかの態様では、CARのリガンド（例えば抗原）結合または認識ドメインは、例えば、抗原受容体複合体、例えばTCR複合体を通した活性化、および/または別の細胞表面レセプターを介するシグナルを模倣する、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達成分、例えば、細胞内シグナル伝達領域もしくはドメインおよび/またはシグナル伝達成分を含む細胞内領域に連結される。したがって、いくつかの態様では、例えば、抗原結合成分（例えば抗体）などの結合ドメインを含む細胞外領域は、1つまたは複数の膜貫通および細胞内領域またはドメインに連結される。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは細胞外領域と融合している。いくつかの態様では、受容体、例えばCAR中のドメインのうちの1つと天然に結合している膜貫通ドメインが使用される。ある場合には、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするために、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避するように選択されるか、またはアミノ酸置換によって改変される。

いくつかの態様の膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれかに由来する。供給源が天然である場合は、いくつかの局面のドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域は、T細胞受容体のアルファ、ベータ、またはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137（4-1BB）、またはCD154に由来するものを含む（すなわち、これらの少なくとも膜貫通領域を含む）。あるいは、いくつかの態様の膜貫通ドメインは合成的である。いくつかの局面では、合成膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含む。いくつかの局面では、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンの三つ組が合成膜貫通ドメインの各末端に見出されるであろう。いくつかの態様では、連結はリンカー、スペーサー、および/または膜貫通ドメインによる。いくつかの局面では、膜貫通ドメインは、CD28の膜貫通部分またはそのバリアントを含む。細胞外領域および膜貫通部は直接的または間接的に連結され得る。いくつかの態様では、細胞外領域および膜貫通部はスペーサー、例えば本明細書において記載される任意のものによって連結される。

いくつかの態様では、受容体、例えばCARの膜貫通ドメインはヒトCD28の膜貫通ドメインまたはそのバリアント、例えば、ヒトCD28（受託番号：P10747.1）の27アミノ酸膜貫通ドメインであるか、あるいはSEQ ID NO:8に記載されるアミノ酸の配列、またはSEQ ID NO:8に対して、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む膜貫通ドメインであり；いくつかの態様では、組換え受容体の膜貫通ドメイン含有部分は、SEQ ID NO:9に記載されるアミノ酸の配列、またはそれに対して、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。

c. 細胞内領域
いくつかの局面では、改変T細胞刺激関連遺伝子座中にコードされる組換え受容体、例えばCARは、シグナル伝達領域またはドメインを含む細胞内領域（細胞質内領域とも呼ばれる）を含む。いくつかの態様では、細胞内領域は細胞内シグナル伝達領域またはドメインを含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達領域またはドメインは、一次シグナル伝達領域、T細胞において一次活性化シグナルを刺激および/または誘導することができるシグナル伝達ドメイン、T細胞受容体（TCR）成分のシグナル伝達ドメイン（例えば、CD3ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメインもしくは領域またはそれらの機能的バリアントもしくはシグナル伝達部分）、ならびに/あるいは免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含むシグナル伝達ドメインであるか、あるいはこれらを含む。

いくつかの態様では、組換え受容体、例えばCARは、少なくとも1つの細胞内シグナル伝達成分、例えば、細胞内シグナル伝達領域またはドメインを含む。細胞内シグナル伝達領域の中には、天然の抗原受容体を通したシグナル、共刺激受容体と組み合わさったそのような受容体を通したシグナル、および/もしくは共刺激受容体単独を通したシグナルを模倣するか、またはこうしたシグナルに近似するものがある。いくつかの態様では、短いオリゴまたはポリペプチドリンカー、例えば、2～10アミノ酸の長さのリンカー、例えば、グリシンおよびセリン、例えば、グリシン-セリンダブレット含むものが、CARの膜貫通ドメインと細胞質内シグナル伝達ドメインの間に存在し、これらの間に連結を形成する。

いくつかの態様では、CARのライゲーションの際に、CARの細胞質内（または細胞内）ドメインまたは領域、例えば細胞内シグナル伝達領域は、免疫細胞、例えば、CARを発現するように操作されたT細胞の正常なエフェクター機能または応答の少なくとも1つを刺激および/または活性化する。例えば、いくつかの状況では、CARは、細胞溶解活性またはT-ヘルパー活性、例えばサイトカインもしくは他の因子の分泌などのT細胞の機能を誘導する。いくつかの態様では、抗原受容体成分または共刺激分子の細胞内シグナル伝達領域またはドメインのトランケートされた部分は、例えば、それがエフェクター機能シグナルを伝達する場合、インタクトな免疫賦活性鎖の代わりに使用される。いくつかの態様では、例えば1つまたは複数の細胞内ドメインを含む細胞内シグナル伝達領域は、T細胞受容体（TCR）の細胞質内配列を含み、いくつかの局面では、天然の状況下でそのような受容体と協調して作用して、抗原受容体の結合後にシグナルトランスダクションを開始する共受容体の細胞質内配列、および/またはそのような分子の任意の誘導体もしくはバリアント、および/または同じ機能的能力を有する任意の合成配列も含む。いくつかの態様では、例えば1つまたは複数の細胞内ドメインを含む細胞内シグナル伝達領域は、共刺激シグナルの提供に関与する領域またはドメインの細胞質内配列を含む。

(i) 共刺激シグナル伝達ドメイン
いくつかの態様では、完全な刺激および/または活性化を促進するために、二次的または共刺激シグナルを発生させるための1つまたは複数の成分はコードされるCARに含まれる。他の態様では、コードされるCARは共刺激シグナルを発生させるための成分を含まない。いくつかの局面では、さらなる受容体ポリペプチドまたはその一部分は同じ細胞で発現し、二次的または共刺激シグナルを発生させるための成分を提供する。

いくつかの態様では、コードされるCARは、共刺激受容体、例えば、CD28、4-1BB、OX40（CD134）、CD27、DAP10、DAP12、ICOS、および/または他の共刺激受容体のシグナル伝達領域および/または膜貫通部分を含む。いくつかの局面では、同じCARが、一次細胞質内シグナル伝達領域と共刺激シグナル伝達成分の両方を含む。

いくつかの態様では、1つまたは複数の異なる組換え受容体は、1つまたは複数の異なる細胞内シグナル伝達領域またはドメインを含むことができる。いくつかの態様では、一次細胞質内シグナル伝達領域は1つのコードされるCAR内に含まれるが、共刺激成分は別の受容体、例えば、別の抗原を認識する別のCARによって提供される。いくつかの態様では、コードされるCARは、活性化または刺激性CARと共刺激CARとを含み、これらは両方とも同じ細胞で発現する（WO2014/055668を参照されたい）。

ある特定の態様では、細胞内シグナル伝達領域は、CD3（例えばCD3ζ）の細胞内領域またはドメインに連結されたCD28の膜貫通およびシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様では、細胞内領域は、CD3ζの細胞内領域またはドメインに連結されたキメラのCD28およびCD137（4-1BB、TNFRSF9）共刺激性ドメインを含む。

いくつかの態様では、コードされるCARは、細胞質内部分に1つまたは複数の、例えば、2つ以上の共刺激ドメインおよび一次細胞質内シグナル伝達領域を包含する。例示的なCARはCD3ゼータ、CD28、CD137（4-1BB）、OX40（CD134）、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D、および/またはICOSの細胞内成分、例えば細胞内シグナル伝達領域またはドメインを含む。いくつかの態様では、キメラ抗原受容体は、例えば、CD28、CD137（4-1BB）、OX40（CD134）、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D、および/またはICOS由来の、T細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達領域またはドメインを、場合によっては、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達領域またはドメインとの間に含む。いくつかの局面では、T細胞共刺激分子は、CD28、CD137（4-1BB）、OX40（CD134）、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D、および/またはICOSの1つまたは複数である。いくつかの態様では、共刺激分子はヒト共刺激分子である。

いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達領域またはドメインは、ヒトCD28の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、またはその機能的バリアントもしくは一部分、例えば、その41アミノ酸ドメインおよび/またはネイティブCD28タンパク質の位置186～187におけるLLからGGへの置換を有するそのようなドメインを含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO:10または11に記載されるアミノ酸の配列、あるいはSEQ ID NO:10または11に対して、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含むことができる。いくつかの態様では、細胞内領域は、CD137（4-1BB）の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインもしくは領域、またはそれらの機能的バリアントもしくは一部分、例えば、ヒト4-1BB（受託番号Q07011.1）の42アミノ酸細胞質内ドメイン、またはその機能的バリアントもしくは一部分、例えば、SEQ ID NO:12に記載されるアミノ酸の配列、あるいはSEQ ID NO:12に対して、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。

場合によっては、コードされるCARは第1、第2、第3、または第4世代CARと称される。いくつかの局面では、第1世代CARは、例えば、抗原結合の際にCD3鎖誘導性シグナルを介して、一次刺激または活性化シグナルを単に提供するものであり；いくつかの局面では、第2世代CARは、そのようなシグナルおよび共刺激シグナルを提供するもの、例えば、1つまたは複数の共刺激受容体、例えば、CD28、CD137（4-1BB）、OX40（CD134）、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D、ICOS、および/または他の共刺激受容体由来の細胞内シグナル伝達領域またはドメインを含むものであり；いくつかの局面では、第3世代CARは、例えば、CD28、CD137（4-1BB）、OX40（CD134）、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D、ICOS、および/または他の共刺激受容体より選択される異なる共刺激受容体の複数の共刺激ドメインを含むものであり；いくつかの局面では、第4世代CARは、例えば、CD28、CD137（4-1BB）、OX40（CD134）、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D、ICOS、および/または他の共刺激受容体より選択される異なる共刺激受容体の3つ以上の共刺激ドメインを含むものである。

(ii) 一次シグナル伝達領域、例えばCD3ζ鎖
いくつかの態様では、コードされる組換え受容体は、TCR複合体の細胞内成分、例えば、T細胞活性化および細胞傷害性を媒介するTCR CD3鎖、例えば、CD3ゼータ鎖を含む。したがって、いくつかの局面では、抗原結合または抗原認識ドメインは、1つまたは複数の細胞シグナル伝達モジュールに連結される。いくつかの態様では、細胞シグナル伝達モジュールは、CD3膜貫通ドメイン、CD3細胞内シグナル伝達ドメイン、および/または他のCD膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様では、コードされる組換え受容体、例えばCARは、1つまたは複数のさらなる分子、例えば、Fc受容体ガンマ（FcRγ）、CD8アルファ、CD8ベータ、CD4、CD25、またはCD16をさらに含む。例えば、いくつかの局面では、CARは、CD3ゼータ（CD3ζ）とCD8アルファ、CD8ベータ、CD4、CD25、またはCD16の1つまたは複数との間のキメラ分子を含む。

天然のTCRにおいて、完全な刺激は、一般に、TCRを通したシグナル伝達だけでなく、共刺激シグナルも必要とする。T細胞刺激は、いくつかの局面では、2つのクラスの細胞質内シグナル伝達配列：TCRを通して抗原依存的一次活性化を開始するもの（一次細胞質内シグナル伝達領域またはドメイン）、および抗原非依存的様式で作用して二次的または共刺激性シグナルを提供するもの（二次細胞質内シグナル伝達領域またはドメイン）によって媒介され得る。いくつかの局面では、CARはそのようなシグナル伝達成分の一方または両方を含む。

いくつかの局面では、コードされるCARは、TCR複合体の一次刺激および/または活性化を制御する一次細胞質内シグナル伝達領域を含む細胞内領域を含む。刺激性様式で作用する一次細胞質内シグナル伝達領域は、例えばCD3ゼータ（CD3ζ）に由来する、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはITAMとして公知であるシグナル伝達モチーフを含むことができる。いくつかの態様では、CARは、CD3ζに由来する細胞質内シグナル伝達ドメイン、その断片もしくは一部分、または配列を含む。いくつかの態様では、細胞内（または細胞質内）シグナル伝達領域は、CD3ζの細胞内もしくは細胞質内刺激性シグナル伝達ドメインまたはその機能的バリアント、例えば、ヒトCD3ζのアイソフォーム3（受託番号：P20963.2）の112AA細胞質内ドメイン、または米国特許第7,446,190号：もしくは米国特許第8,911,993号に記載されるCD3ζシグナル伝達ドメインを含めて、ヒトCD3ゼータ鎖またはその断片もしくは一部分を含む。いくつかの態様では、コードされる組換え受容体の細胞内領域は、SEQ ID NO:13、14、または15に記載されるアミノ酸の配列、あるいはSEQ ID NO:13、14、もしくは15またはそれらの部分配列に対して、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。いくつかの態様では、改変T細胞刺激関連遺伝子座にコードされる例示的なCD3ζ鎖またはその断片は、CD3ζ鎖のITAMドメイン、例えば、SEQ ID NO:292に記載されるヒトCD3ζ鎖前駆体配列のアミノ酸残基61～89、100～128、または131～159、あるいはCD3ζ鎖由来の1つまたは複数のITAMドメインを含み、SEQ ID NO:292に対して、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。

いくつかの態様では、細胞は、1つまたは複数のさらなる分子（例えば、ポリペプチド、例えば、さらなる組換え受容体ポリペプチドまたはその一部分）を発現するように操作され、コードされるCARの機能および/または活性を制御する、調節する、またはモジュレートするために使用される。例示的な多鎖組換え受容体、例えば多鎖CARは、本明細書において、例えばセクションIV.B.2に記載される。

いくつかの態様では、コードされるCARは、抗体、例えば抗体断片、CD28の膜貫通部分もしくはその機能的バリアントであるか、またはこれらを含む膜貫通ドメイン、ならびにCD28のシグナル伝達部分またはその機能的バリアントおよびCD3ゼータのシグナル伝達部分またはその機能的バリアントを含む細胞内シグナル伝達領域を含む。いくつかの態様では、CARは、抗体、例えば抗体断片、CD28の膜貫通部分もしくはその機能的バリアントであるか、またはこれらを含む膜貫通ドメイン、ならびに4-1BBのシグナル伝達部分またはその機能的バリアントおよびCD3ゼータのシグナル伝達部分またはその機能的バリアントを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかのそのような態様では、受容体は、Ig分子、例えばヒトIg分子の一部分、例えばIgヒンジ、例えばIgG4ヒンジを含むスペーサー、例えばヒンジのみのスペーサーをさらに含む。いくつかの態様では、組換え受容体は、受容体のC末端にCD3ゼータ（CD3ζ）を含む。

2. 多鎖CAR
いくつかの態様では、改変T細胞刺激関連遺伝子座の核酸配列にコードされる組換え受容体は多鎖CARであり得る。いくつかの態様では、2つ以上のポリペプチド鎖を含む多鎖CARが細胞で発現する場合、ポリペプチド鎖の少なくとも1つは改変T細胞刺激関連遺伝子座にコードされる。いくつかの局面では、多鎖CARの1つまたは複数の鎖をコードする核酸配列を導入するために使用されるポリヌクレオチドは、本明細書においてセクションII.Bに記載される任意のものを含むことができる。いくつかの局面では、ポリヌクレオチド、例えば鋳型ポリヌクレオチドは、多鎖CARの少なくとも1つの鎖またはその一部分、例えば、多鎖CARの少なくとも1つのポリペプチドの少なくとも一部分をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの局面では、導入遺伝子は、異なるもしくはさらなるポリペプチド、例えば、多鎖CARの他のもしくはさらなる鎖、またはさらなる分子、例えば、本明細書においてセクションIV.B.2.に記載されるものをコードする配列も含む。いくつかの局面では、さらなるポリヌクレオチド、例えば、さらなる鋳型ポリヌクレオチドを導入することができ、このポリヌクレオチドは多鎖CARのさらなる成分をコードする。いくつかの局面では、さらなるポリヌクレオチドは、本明細書において、例えばセクションII.B.2に記載される任意のポリヌクレオチド、またはこれらの改変形態、例えば、別のゲノム遺伝子座における組み込みのために核酸をターゲティングするための異なる相同性アームを含むものでもよい。

いくつかの態様では、提供される操作された細胞としては、多鎖受容体、例えば多鎖CARを発現する細胞が挙げられる。いくつかの態様では、例示的な多鎖CARは、2つ以上の遺伝子操作された受容体を細胞上に含むことができ、これらは一緒に機能的組換え受容体を構成することができる。いくつかの局面では、組み合わせた様々なポリペプチド鎖は、CARの機能もしくは活性を果たす、ならびに/またはCARの機能および/もしくは活性を制御する、調節する、もしくはモジュレートする。いくつかの局面では、多鎖CARは2つ以上のポリペプチド鎖を含むことができ、それぞれが異なる抗原の同じものを認識し、典型的には、それぞれが異なる領域またはドメイン、例えば、異なる細胞内シグナル伝達成分を含む。いくつかの局面では、改変T細胞刺激関連遺伝子座は、多鎖受容体、例えば多鎖CARの少なくとも1つの鎖をコードする核酸配列を含むことができる。

いくつかの態様では、キメラ受容体は、2つ以上のポリペプチド鎖を含む、多鎖CARまたは二鎖CARである。いくつかの態様では、多鎖受容体は、制御可能なCAR、条件的に活性なCAR、または誘導性CARである。いくつかの局面では、組換え受容体、例えば二鎖CARの2つ以上のポリペプチドは、組換え受容体の特異性、活性、抗原（またはリガンド）結合、機能および/または発現の空間的または時間的な制御または調節を可能にする。そのような態様のいくつかでは、改変T細胞刺激関連遺伝子座の核酸配列にコードされる組換え受容体は、二鎖または多鎖受容体の1つまたは複数の鎖を含むことができる。いくつかの局面では、二鎖CARの1つのみが改変T細胞刺激関連遺伝子座にコードされる場合には、他の鎖は、異なるゲノム場所に組み込まれているか、またはエピソームである別の核酸分子にコードされ得る。

いくつかの態様では、多鎖CARは活性化CARと共刺激CARの組み合わせを含むことができる。例えば、いくつかの態様では、多鎖CARは、非標的細胞、例えば正常細胞上に個々に存在するが、治療される疾患または状態の細胞上にのみ一緒に存在する2つの異なる抗原を標的とするCARをコードする2つのポリペプチドを含むことができる。いくつかの態様では、多鎖CARは、活性化CARおよび阻害性CAR、例えば、活性化CARが、正常または非病的細胞と治療される疾患または状態の細胞の両方で発現している1つの抗原に結合し、阻害性CARが、正常細胞または治療することが望まれない細胞のみで発現している別の抗原に結合するものを含むことができる。いくつかの局面では、多鎖CARは、制御、モジュレート、または調節され得るCARをコードする1つまたは複数のポリペプチドを含むことができる。

いくつかの態様では、多鎖CARは、CARの1つまたは複数のドメインまたは領域をコードする1つまたは複数のポリペプチド鎖を含む。いくつかの局面では、組み合わせた様々なポリペプチド鎖はCARを構成することができる。いくつかの態様では、1つまたは複数のさらなるドメインまたは領域はCAR中に存在する。いくつかの態様では、多鎖CARの1つまたは複数のポリペプチド鎖中に存在する様々なドメインまたは領域は、CARの機能および/または活性を制御する、調節する、またはモジュレートするために使用される。いくつかの態様では、操作された細胞は、異なる成分、ドメインまたは領域を含む2つ以上のポリペプチド鎖を発現する。いくつかの局面では、2つ以上のポリペプチド鎖は、組換え受容体の特異性、活性、抗原（またはリガンド）結合、機能および/または発現の空間的または時間的な制御または調節を可能にする。1つより多いポリペプチド、例えば2つ以上のポリペプチドを含む多鎖CARのいくつかの態様では、少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸配列は、内在性T細胞刺激関連遺伝子座における組み込みのためにターゲティングされる。いくつかの態様では、さらなる分子またはポリペプチド、例えば多鎖CARのさらなるポリペプチド鎖またはさらなる分子をコードする核酸配列は、例えば、ターゲティングに使用される同じポリヌクレオチド上の配置によって、同じ遺伝子座にターゲティングされ得る。さらなる分子またはポリペプチドをコードするある種の核酸配列では、異なる遺伝子座にターゲティングされるか、または異なる方法によって送達される。

いくつかの局面では、CARのドメインまたは領域をコードする1つまたは複数のポリペプチド鎖は、1つまたは複数の抗原または分子を標的とすることができる。例示的な多鎖CARとしては、例えば、国際特許出願公開番号WO2014055668、またはFedorov et al., Sci. Transl. Medicine, Sci Transl Med. (2013) 5(215):215ra172；Sadelain, Curr Opin Immunol. (2016) 41: 68-76；Wang et al. (2017) Front. Immunol. 8:1934；Mirzaei et al. (2017) Front. Immunol. 8:1850；Marin-Acevedo et al. (2018) Journal of Hematology & Oncology 11:8；Fesnak et al. (2016) Nat Rev Cancer. 16(9): 566-581；およびAbate-Daga and Davila, (2016) Molecular Therapy - Oncolytics 3, 16014に記載されているものが挙げられる。

いくつかの態様では、操作された細胞は、組換え受容体、例えばCARの第1のポリペプチド鎖を発現することができ、これは、一般に、第1のポリペプチド鎖によって認識される抗原、例えば第1の抗原への特異的結合の際に、細胞への活性化または刺激シグナルを誘導することができる。いくつかの態様では、細胞は、組換え受容体、例えば、場合によってはキメラ共刺激受容体と呼ばれるCARの第2のポリペプチド鎖をさらに発現することができ、これは、一般に、第2のポリペプチド鎖によって認識される第2の抗原への特異的結合の際に、免疫細胞に対する共刺激シグナルを誘導することができる。いくつかの態様では、第1の抗原および第2の抗原は同じである。いくつかの態様では、第1の抗原および第2の抗原は異なる。

いくつかの態様では、第1および/または第2のポリペプチド鎖は、細胞への活性化または刺激シグナルを誘導することができる。いくつかの態様では、受容体はITAMまたはITAM様モチーフを含む細胞内シグナル伝達成分を含む。いくつかの態様では、第1のポリペプチド鎖によって誘導される活性化は、細胞中のシグナルトランスダクションまたはタンパク質発現の変化を含み、免疫応答の開始、例えば、ITAMのリン酸化および/またはITAM媒介性シグナルトランスダクションカスケードの開始、結合受容体の近くでの免疫シナプスの形成および/または分子（例えば、CD4またはCD8など）のクラスタリング、1つまたは複数の転写因子、例えば、NF-κBおよび/またはAP-1の活性化、および/またはサイトカインなどの因子の遺伝子発現の誘導、増殖、および/または生存をもたらす。いくつかの態様では、活性化ドメインは多鎖CARの少なくとも1つ、例えば、改変T細胞刺激関連遺伝子座にコードされるポリペプチド鎖内に含まれるが、共刺激成分は、別の抗原を認識する別のポリペプチドによって提供される。いくつかの態様では、操作された細胞は、両方とも同じ細胞で発現する、活性化または刺激性CAR、共刺激CARを含む、多鎖CARを含むことができる（WO2014/055668を参照されたい）。いくつかの局面では、細胞は、1つもしくは複数の刺激性もしくは活性化CAR（例えば、本明細書において、例えばセクションIV.Aに記載される改変T細胞刺激関連遺伝子座にコードされるもの）および/または共刺激CARを発現する。

いくつかの態様では、第1および/または第2のポリペプチド鎖は、共刺激受容体、例えば、CD28、CD137（4-1BB）、OX40（CD134）、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D、ICOS、および/または他の共刺激受容体の細胞内シグナル伝達領域またはドメインを含む。いくつかの態様では、第1および第2のポリペプチド鎖は、異なる共刺激受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。一態様では、第1のポリペプチド鎖はCD28共刺激シグナル伝達ドメインを含み、第2のポリペプチド鎖は4-1BB共刺激性シグナル伝達領域を含み、またはその逆も同じである。

いくつかの態様では、第1および/または第2のポリペプチド鎖は、ITAMまたはITAM様モチーフ、例えば、CD3ゼータ（CD3ζ）鎖またはその断片もしくは一部分、例えば、CD3ζ細胞内シグナル伝達ドメイン由来のものを含む細胞内シグナル伝達ドメインと共刺激受容体の細胞内シグナル伝達ドメインの両方を含む。いくつかの態様では、第1のポリペプチド鎖は、ITAMまたはITAM様モチーフを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含み、第2のポリペプチド鎖は、共刺激受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。同じ細胞で誘導される活性化または刺激シグナルと組み合わさった共刺激シグナルは、免疫応答、例えば、頑強かつ持続的な免疫応答、例えば、遺伝子発現の増加、サイトカインおよび他の因子の分泌、ならびに細胞死滅などのT細胞媒介性エフェクター機能をもたらすものである。

いくつかの態様では、第1のポリペプチド鎖単独のライゲーションも第2のポリペプチド鎖単独のライゲーションも頑強な免疫応答を誘導しない。いくつかの局面では、1つの受容体のみがライゲーションされる場合、細胞は、抗原に対して寛容化されるか、または非応答性になるか、あるいは因子を増殖させるかもしくは分泌する、またはエフェクター機能を実行することが、阻害される、および/または誘導されない。いくつかのそのような態様では、しかし、第1および第2の抗原を発現する細胞の遭遇時など、複数のポリペプチド鎖がライゲーションされる場合に、例えば、1つまたは複数のサイトカインの分泌、増殖、持続、および/または標的細胞の細胞傷害性死滅などの免疫エフェクター機能の実行によって示されるような、完全な免疫活性化または刺激などの望ましい応答が達成される。

いくつかの態様では、多鎖CARの1つまたは複数の鎖は、阻害性CAR（iCAR。Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (2013)を参照されたい、例えば、疾患もしくは状態と関連するおよび/または疾患もしくは状態に対して特異的なもの以外の抗原を認識するCARを含むことができ、それにより、疾患ターゲティングCARを通して送達される活性化シグナルが、阻害性CARのそのリガンドへの結合によって低減されるか、または阻害されて、例えば、オフターゲット効果を低減させる。いくつかの態様では、阻害性CARは、刺激または活性化CAR（例えば、CD3ゼータ（CD3ζ）鎖またはその断片もしくは一部分を含む）と同じポリヌクレオチドによって、あるいは異なるポリヌクレオチドによってコードされ得る。

いくつかの態様では、多鎖CARの2つのポリペプチド鎖は、細胞への活性化シグナルおよび阻害性シグナルをそれぞれ誘導して、その結果、1つのポリペプチド鎖のその抗原へのライゲーションは細胞を活性化するか、または応答を誘導するが、第2のポリペプチド鎖、例えば阻害性受容体のその抗原へのライゲーションはその応答を抑制するか、または弱めるシグナルを誘導する。例は、活性化CARと阻害性CAR（iCAR）の組み合わせである。そのようなストラテジーを使用して、例えば、活性化CARが、ある疾患または状態で発現しているが正常細胞でも発現している抗原に結合し、阻害性受容体が、正常細胞で発現しているが該疾患または状態の細胞では発現していない別の抗原に結合するという状況で、オフターゲット効果の可能性を低減させることができる。

いくつかの局面では、細胞中で発現するさらなる受容体ポリペプチドは阻害性CAR（例えばiCAR）をさらに含み、免疫応答、例えば、細胞中のITAMおよび/または共刺激促進性応答を弱めるか、または抑制する細胞内成分を含む。そのような細胞内シグナル伝達成分の例示的なものは、免疫チェックポイント分子、例えば、PDCD1、CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受容体、EP2/4アデノシン受容体、例えばA2ARで見出されるものである。いくつかの局面では、操作された細胞は、そのような阻害性分子の、またはそのような阻害性分子に由来するシグナル伝達ドメインを含む阻害性CARを含み、その結果、これは、例えば、活性化および/または共刺激CARによって誘導される細胞の応答を弱めるように働く。

いくつかの態様では、特定の疾患または状態と関連する抗原が、一過的（例えば、遺伝子操作に関連した刺激時）または永続的かのいずれかで、非病的細胞で発現している、および/または操作された細胞それ自体で発現している場合に、多鎖CARを用いることができる。そのような場合では、2つの別々の、個々に特異的なポリペプチドのライゲーションを必要とすることにより、特異性、選択性、および/または有効性を向上させることができる。

いくつかの態様では、複数の抗原、例えば、第1および第2の抗原は、標的とされる細胞、組織、または疾患もしくは状態で、例えばがん細胞で発現している。いくつかの局面では、細胞、組織、疾患、または状態は、多発性骨髄腫または多発性骨髄腫細胞である。いくつかの態様では、複数の抗原の1つまたは複数は、一般に、細胞療法で標的とするのに望ましくない細胞、例えば、正常もしくは非病的細胞もしくは組織、および/または操作された細胞自体でも発現している。そのような態様では、細胞の応答を達成するために複数の受容体のライゲーションを必要とすることによって、特異性および/または有効性が達成される。

いくつかの態様では、第1および/または第2のポリペプチド鎖のうちの1つは、他のポリペプチド鎖の発現、抗原結合、および/または活性を制御することができる。

いくつかの局面では、2つのポリペプチド鎖のシステムを使用して、該ポリペプチド鎖の少なくとも1つの発現を制御することができる。いくつかの態様では、第1のポリペプチド鎖は、制御可能な開裂エレメントを介して連結された制御分子、例えば転写因子に連結された、第1のリガンド（例えば抗原）結合ドメインを含む。いくつかの局面では、制御可能な開裂エレメントは改変ノッチ受容体（例えばsynNotch）に由来し、これは、第1のリガンド（例えば抗原）結合ドメインの結合の際に細胞内ドメインを開裂させ、放出することができる。いくつかの局面では、第2のポリペプチド鎖は、細胞への活性化または刺激シグナルを誘導することができる細胞内シグナル伝達成分、例えばITAM含有細胞内シグナル伝達ドメインに連結された、第2のリガンド（例えば抗原）結合ドメインを含む。いくつかの局面では、第2のポリペプチド鎖をコードする核酸配列は、特定の転写因子、例えば、第1のポリペプチド鎖にコードされる転写因子によって制御され得る転写制御エレメント、例えばプロモーターに機能的に連結される。いくつかの局面では、第1のリガンド（例えば抗原）結合ドメインへのリガンドまたは抗原の結合は、転写因子のタンパク分解性放出につながり、これが次に、第2のポリペプチド鎖の発現を誘導することができる（Roybal et al. (2016) Cell164:770-779；Morsut et al. (2016) Cell 164:780-791を参照されたい）。いくつかの態様では、第1の抗原および第2の抗原は異なる。

ある場合には、組換え受容体、例えばCARは、制御、調節、誘導、または阻害され得、組換え受容体を用いる療法の安全性および有効性を最適化することが望ましい場合がある。いくつかの態様では、多鎖CARは制御可能なCARである。いくつかの局面では、制御され得るCARを含む操作された細胞が本明細書において提供される。本明細書において「制御可能な組換え受容体」または「制御可能なCAR」とも称される、制御され得る組換え受容体は、少なくとも2つのポリペプチドの鎖セットなどの複数のポリペプチドであって、操作された細胞（例えば、操作されたT細胞）で発現する場合に、誘導物質の調節下で細胞内シグナルを発生させる能力を有する操作された細胞を提供する複数のポリペプチドを指す。

いくつかの態様では、制御可能なCARのポリペプチドは、別の多量体化ドメインと多量体化することができる多量体化ドメインを含む。いくつかの態様では、多量体化ドメインは、誘導物質への結合の際に多量体化することができる。例えば、多量体化ドメインは、誘導物質、例えば化学誘導物質と結合することができ、それにより、多量体化ドメインの多量体化によって制御可能なCARのポリペプチドの多量体化がもたらされ、それによって、制御可能なCARが作製される。

いくつかの態様では、制御可能なCARの1つのポリペプチドはリガンド（例えば抗原）結合ドメインを含み、制御可能なCARの別のポリペプチドは細胞内シグナル伝達領域を含み、多量体化ドメインの多量体化による2つのポリペプチドの多量体化は、リガンド結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達領域を含む制御可能なCARを作製する。いくつかの態様では、多量体化は、制御可能なCARを含む操作された細胞において、シグナルを誘導する、モジュレートする、活性化する、媒介する、および/または促進することができる。いくつかの態様では、誘導物質は、制御可能なCARの少なくとも1つのポリペプチドの多量体化ドメインに結合し、制御可能なCARのコンフォメーション変化を誘導し、コンフォメーション変化がシグナル伝達を活性化する。いくつかの態様では、そのようなキメラ受容体へのリガンドの結合は、場合によっては、ポリペプチド鎖のオリゴマー化を含めて、ポリペプチド鎖のコンフォメーション変化を誘導し、これは、受容体を細胞内シグナル伝達に適したものにする。

いくつかの態様では、誘導物質は、制御可能なCARと標的抗原の相互作用の間などに、制御可能なCARが望ましい細胞内シグナルを生成するために、操作された細胞で発現する制御可能なCARの少なくとも2つのポリペプチド鎖のセットを結合するかまたは多量体化する（例えば二量体化する）ように機能する。誘導物質による制御可能なCARの少なくとも2つのポリペプチドの結合または多量体化は、多量体化ドメインへの誘導物質の結合の際に達成される。例えば、いくつかの態様では、操作された細胞中の第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、それぞれ、誘導物質に結合することができる多量体化ドメインを含むことができる。誘導物質による多量体化ドメインの結合の際に、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが一緒に結合して、望ましい細胞内シグナルを生成する。いくつかの態様では、多量体化ドメインはポリペプチドの細胞内部分に位置する。いくつかの態様では、多量体化ドメインはポリペプチドの細胞外部分に位置する。

いくつかの態様では、制御可能なCARの少なくとも2つのポリペプチドのセットは、2つ、3つ、4つ、または5つまたはそれ以上のポリペプチドを含む。いくつかの態様では、少なくとも2つのポリペプチドのセットは、同じポリペプチド、例えば、細胞内シグナル伝達領域および多量体化ドメインを含む、2つ、3つまたはそれ以上の同じポリペプチドである。いくつかの態様では、少なくとも2つのポリペプチドのセットは、異なるポリペプチド、例えば、リガンド（例えば抗原）結合ドメインおよび多量体化ドメインを含む第1のポリペプチド、ならびに細胞内シグナル伝達領域および多量体化ドメインを含む第2のポリペプチドである。いくつかの態様では、細胞間シグナルは誘導物質の存在下で発生する。いくつかの態様では、細胞内シグナルは誘導物質の非存在下で発生し、例えば、誘導物質は、制御可能なCARの少なくとも2つのポリペプチドの多量体化を妨げ、それによって、制御可能なCARによる細胞内シグナル伝達を防止する。

いくつかの態様では、多鎖CAR、すなわち、ポリペプチド鎖の少なくとも1つをコードする核酸配列は、例えばHDRによって、内在性T細胞刺激関連遺伝子座に組み込まれる。いくつかの態様では、2つ以上の別個のポリペプチド鎖の他のものをコードする核酸配列は、同じ遺伝子座内に（例えば、同じ導入遺伝子内かつ他のポリペプチド鎖をコードする核酸配列5'もしくは3'に配置され得る）、または異なる遺伝子座にターゲティングされ得る。いくつかの局面では、2つ以上の別個のポリペプチド鎖の他のものをコードする核酸配列の導入は、例えば、一過的送達方法によって、またはエピソーム核酸分子として、異なる送達方法を介してもよい。

いくつかの態様では、多鎖CARのポリペプチド鎖の1つまたは複数は多量体化ドメインを含むことができる。いくつかの態様では、多量体化ドメインは、誘導物質の結合の際に多量体化する（例えば、二量体化する）ことができる。本明細書において意図される誘導物質としては、限定はされないが、化学誘導物質またはタンパク質（例えばカスパーゼ）が挙げられる。いくつかの態様では、誘導物質は、エストロゲン、グルココルチコイド、ビタミンD、ステロイド、テトラサイクリン、シクロスポリン、ラパマイシン、クーママイシン、ジベレリン、FK1012、FK506、FKCsA、リミドゥシド、もしくはHaXS、またはそれらの類似体もしくは誘導体より選択される。いくつかの態様では、誘導物質はAP20187またはAP20187類似体、例えばAP1510である。

いくつかの態様では、多量体化ドメインは、本明細書において提供される誘導物質などの誘導物質の結合の際に多量体化する（例えば二量体化する）ことができる。いくつかの態様では、多量体化ドメインは、FKBP、シクロフィリン受容体、ステロイド受容体、テトラサイクリン受容体、エストロゲン受容体、グルココルチコイド受容体、ビタミンD受容体、カルシニューリンA、CyP-Fas、mTORのFRBドメイン、GyrB、GAI、GID1、Snap-tag、および/もしくはHaloTag、またはそれらの一部分もしくは誘導体由来であり得る。いくつかの態様では、多量体化ドメインは、FK506結合タンパク質（FKBP）もしくはその誘導体、またはそれらの断片および/もしくは多量体、例えばFKBP12v36である。いくつかの態様では、FKBPは、アミノ酸配列

を含む。いくつかの態様では、FKBP12v36は、アミノ酸配列

を含む。

例示的な誘導物質および対応する多量体化ドメインは、例えば、米国特許出願公開第2016/0046700号、Clackson et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U S A. 95(18):10437-42；Spencer et al. (1993) Science 262(5136):1019-24；Farrar et al. (1996) Nature 383 (6596):178-81；Miyamoto et al. (2012) Nature Chemical Biology 8(5): 465-70；Erhart et al. (2013) Chemistry and Biology 20(4): 549-57）に記載されているように、公知である。いくつかの態様では、誘導物質はリミドゥシド（AP1903としても知られている；CAS索引名：2-ピペリジンカルボン酸、1-[(2S)-1-オキソ-2-(3,4,5-トリメトキシフェニル)ブチル]-,1,2-エタンジイルビス[イミノ(2-オキソ-2,1-エタンジイル)オキシ-3,1-フェニレン[(1R)-3-(3,4-ジメトキシフェニル)プロピリデン]]エステル、[2S-[1(R*),2R*[S*[S*[1(R*),2R]]]]]-(9Cl)；CAS登録番号：195514-63-7；分子式：C₇₈H₉₈N₄O₂₀；分子量：1411.65）であり、多量体化ドメインはFK506結合タンパク質（FKBP）である。

いくつかの態様では、操作された細胞の細胞膜は誘導物質に対して不透過性である。いくつかの態様では、操作された細胞の細胞膜は誘導物質に対して透過性である。

いくつかの態様では、制御可能なCARは、誘導物質の非存在下で多量体の一部でも、二量体の一部でもない。誘導物質の結合の際に、多量体化ドメインは多量体化、例えば二量体化することがきる。いくつかの局面では、多量体化ドメインの多量体化は、制御可能なCARのポリペプチドと制御可能なCARの別のポリペプチドとの多量体化、例えば、制御可能なCARの少なくとも2つのポリペプチドとの多量複合体をもたらす。いくつかの態様では、多量体化ドメインの多量体化は、シグナル伝達成分の物理的近接または多量体もしくは二量体の形成を誘導することによって、シグナルトランスダクションを誘導する、モジュレートする、活性化する、媒介する、および/または促進することができる。いくつかの態様では、誘導物質の結合の際に、多量体化ドメインの多量体化は、多量体化ドメインに直接的または間接的に連結されたシグナル伝達ドメインの多量体化も誘導する。いくつかの態様では、多量体化は、シグナル伝達ドメインまたは領域を通して、シグナル伝達を誘導する、モジュレートする、活性化する、媒介する、および/または促進する。いくつかの態様では、多量体化ドメインに連結されたシグナル伝達ドメインまたは領域は細胞内シグナル伝達領域である。

いくつかの態様では、多量体化ドメインは操作された細胞（例えば、操作されたT細胞）の細胞内にあるか、または細胞内側または細胞質内側の細胞膜と結合している。いくつかの局面では、細胞内多量体化ドメインは、膜結合ドメイン（例えば脂質連結ドメイン）、例えば、ミリストイル化ドメイン、パルミトイル化ドメイン、プレニル化ドメイン、または膜貫通ドメインに直接的または間接的に連結される。いくつかの態様では、多量体化ドメインは細胞内にあり、膜貫通ドメインを介して細胞外リガンド（例えば抗原）結合ドメインに連結される。いくつかの態様では、細胞内多量体化ドメインは細胞内シグナル伝達領域に直接的または間接的に連結される。いくつかの局面では、多量体化ドメインの誘導性多量体化はまた、細胞内シグナル伝達領域を互いに近接させて、多量体化、例えば二量体化を可能にし、細胞内シグナル伝達を刺激する。いくつかの態様では、制御可能なCARのポリペプチドは、膜貫通ドメイン、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達領域、および1つまたは複数の多量体化ドメインを含み、これらのそれぞれは直接的または間接的に連結される。

いくつかの態様では、多量体化ドメインは細胞外にあるか、または操作された細胞（例えば、操作されたT細胞）の細胞外側の細胞膜と結合している。いくつかの局面では、細胞外多量体化ドメインは、膜結合ドメイン（例えば脂質連結ドメイン）、例えば、ミリストイル化ドメイン、パルミトイル化ドメイン、プレニル化ドメイン、または膜貫通ドメインに直接的または間接的に連結される。いくつかの態様では、細胞外多量体化ドメインは、リガンド結合ドメイン、例えばある疾患と関連する抗原への結合ための抗原結合ドメインに直接的または間接的に連結される。いくつかの態様では、多量体化ドメインは細胞外にあり、膜貫通ドメインを介して細胞内シグナル伝達領域に連結される。

いくつかの局面では、膜結合ドメインは既存の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインである。いくつかの例では、膜結合ドメインは、本明細書において記載される膜貫通ドメインのいずれかである。いくつかの局面では、膜結合ドメインは、タンパク質-タンパク質相互作用モチーフまたは膜貫通配列を含む。

いくつかの局面では、膜結合ドメインは、アシル化ドメイン、例えば、ミリストイル化ドメイン、パルミトイル化ドメイン、プレニル化ドメイン（すなわち、ファルネシル化、ゲラニル-ゲラニル化、CAAXボックス）である。例えば、膜結合ドメインは、タンパク質のN末端またはC末端に存在するアシル化配列モチーフであり得る。そのようなドメインは、該ドメインを含むポリペプチドにアシル部分を移すアシルトランスフェラーゼによって認識され得る特定の配列モチーフを含む。例えば、アシル化モチーフは、単一アシル部分（場合によっては、アニオン性脂質頭部基との結合を向上させるために、その後にいくつかの正に荷電した残基、例えば、ヒトc-Src：

が続く）で修飾され得る。他の局面では、アセチル化モチーフは複数のアシル部分で修飾され得る。例えば、二重アシル化領域が、ある特定のプロテインキナーゼ、例えば、Srcファミリーメンバーのサブセット（例えば、Yes、Fyn、Lck）およびG-プロテインアルファサブユニットのN末端領域内に位置する。例示的な二重アシル化領域は、配列モチーフMet-Gly-Cys-Xaa-Cys（SEQ ID NO:296）を含み、Metは切断され、GlyはN-アシル化され、Cys残基の1つはS-アシル化される。Glyはミリストイル化されることが多く、Cysはパルミトイル化され得る。

他の例示的なアシル化領域としては、C15またはO10イソプレニル部分で修飾することができ、公知である配列モチーフCys-Ala-Ala-Xaa（いわゆる「CAAXボックス」；SEQ ID NO:297）（Gauthier-Campbell et al. (2004) Molecular Biology of the Cell 15:2205-2217；Glabati et al. (1994) Biochem. J. 303: 697-700および Zlakine et al. (1997) J. Cell Science 110:673-679；ten Klooster et al. (2007) Biology of the Cell 99:1-12；Vincent et al. (2003) Nature Biotechnology 21:936-40を参照されたい）が挙げられる。いくつかの態様では、アシル部分はC1～C20アルキル、C2～C20アルケニル、C2～C20アルキニル、C3～C6シクロアルキル、C1～C4ハロアルキル、C4～C12シクロアルキルアルキル、アリール、置換アリール、またはアリール（C1～C4）アルキルである。いくつかの態様では、アシル含有部分は脂肪酸であり、脂肪酸部分の例は、プロピル（C3）、ブチル（C4）、ペンチル（C5）、ヘキシル（C6）、ヘプチル（C7）、オクチル（C8）、ノニル（C9）、デシル（C10）、ウンデシル（C11）、ラウリル（C12）、ミリスチル（C14）、パルミチル（C16）、ステアリル（C18）、アラキジル（C20）、ベヘニル（C22）、およびリグノセリル部分（C24）であり、各部分は、0、1、2、3、4、5、6、7、または8個の不飽和結合（すなわち、二重結合）を含むことができる。いくつかの例では、アシル部分は、脂質分子、例えば、ホスファチジル脂質（例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴミエリン（shingomyelin）、スフィンゴシン、セラミド、ガングリオシド、セレブロシド）、またはこれらの改変バージョンである。ある特定の態様では、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つまたはそれ以上のアシル部分が膜結合ドメインに連結される。

いくつかの局面では、膜結合ドメインは、糖脂質（グリコシルホスファチジルイノシトールまたはGPIとしても知られている）の付加を促進するドメインである。いくつかの局面では、GPI分子がアミド基転移反応によってタンパク質標的に翻訳後に付着され、それにより、カルボキシ末端GPIシグナル配列の開裂（例えば、White et al. (2000) J. Cell Sci. 113:72を参照されたい）、および新しく形成されるカルボキシ末端アミノ酸への既に合成されているGPIアンカー分子の同時移行（例えば、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK20711/から入手可能な、Varki A, et al., editors. Essentials of Glycobiology. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1999. Chapter 10, Glycophospholipid Anchors.を参照されたい）がもたらされる。ある特定の態様では、膜結合ドメインはGPIシグナル配列である。

いくつかの態様では、本明細書において提供される多量体化ドメインは、細胞内シグナル伝達領域、例えば、一次シグナル伝達領域および/または共刺激シグナル伝達ドメインに連結される。いくつかの態様では、多量体化ドメインは細胞外にあり、膜貫通ドメインを介して細胞内シグナル伝達領域に連結される。いくつかの態様では、多量体化ドメインは細胞内にあり、膜貫通ドメインを介してリガンド（例えば抗原）結合ドメインに連結される。リガンド結合ドメインおよび膜貫通ドメインは、直接的または間接的に連結され得る。いくつかの態様では、リガンド結合ドメインおよび膜貫通部はスペーサー、例えば本明細書において記載される任意のものによって連結される。いくつかの態様では、多量体化ドメインは、FK506結合タンパク質（FKBP）またはその誘導体もしくは断片、例えばFKBP12v36である。いくつかの例では、誘導物質、例えばリミドゥシドの導入の際に、制御可能なCARのポリペプチドは多量体化、例えば二量体化し、それによって、多量体化ドメインと結合したシグナル伝達ドメインを刺激し、多量複合体を形成する。多量複合体の形成は、細胞内シグナル伝達領域を通してシグナルを誘導する、モジュレートする、刺激する、活性化する、媒介する、および/または促進する。

いくつかの態様では、制御可能なCARを通したシグナル伝達は、条件的な多量体化を通して、条件的な様式でモジュレートされ得る。例えば、制御可能なCARのポリペプチドの多量体化ドメインは、誘導物質に結合して多量体化することができ、誘導物質は外因的に提供することができる。いくつかの局面では、誘導物質の結合の際に、多量体化ドメインは多量体化し、シグナル伝達ドメインを通してシグナル伝達を誘導する、モジュレートする、活性化する、媒介する、および/または促進する。例えば、誘導物質は外因的に投与することができ、それによって、制御可能なCARを含む操作された細胞に与えられるシグナルの場所および持続時間を調節する。いくつかの態様では、制御可能なCARのポリペプチドの多量体化ドメインは、誘導物質に結合して多量体化することができ、誘導物質は内因的に提供することができる。例えば、誘導物質は、操作された細胞（例えば、操作されたT細胞）によって、誘導性または条件的プロモーターの調節下で、組換え発現ベクターから、または操作された細胞のゲノムから、内因的に生成することができ、それによって、制御可能なCARを含む操作された細胞に与えられるシグナルの場所および持続時間を調節する。

いくつかの態様では、制御可能なCARは自殺スイッチを使用して調節される。例示的なキメラ受容体は誘導性カスパーゼ-9（iCasp9）システムを利用し、これは、ヒトカスパーゼ-9と改変FKBP二量体化ドメインの融合体を含み、誘導物質、例えばAP1903と結合する際に、条件的な二量体化を可能にする。誘導物質の結合による二量体化の際に、カスパーゼ-9は活性化され、キメラ受容体を発現する細胞のアポトーシスおよび細胞死をもたらす（例えば、Di Stasi et al. (2011) N. Engl. J. Med. 365:1673-1683を参照されたい）。

いくつかの態様では、例示的な制御可能なCARは、以下のものを含む：(1)以下のものを含む、制御可能なCARの第1のポリペプチド：(i)細胞内シグナル伝達領域；および(ii)誘導物質に結合することができる少なくとも1つの多量体化ドメイン；および(2)以下のものを含む、制御可能なCARの第2のポリペプチド：(i)リガンド（例えば抗原）結合ドメイン；(ii)膜貫通ドメイン；および(iii)誘導物質に結合することができる少なくとも1つの多量体化ドメイン。いくつかの態様では、例示的な制御可能なCARは、以下のものを含む：(1)以下のものを含む、制御可能なCARの第1のポリペプチド：(i)膜貫通ドメインまたはアシル化ドメイン；(ii)細胞内シグナル伝達領域；および(iii)誘導物質に結合することができる少なくとも1つの多量体化ドメイン；ならびに(2)以下のものを含む、制御可能なCARの第2のポリペプチド：(i)リガンド（例えば抗原）結合ドメイン；(ii)膜貫通ドメイン；および(iii)誘導物質に結合することができる少なくとも1つの多量体化ドメイン。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達領域は共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの態様では、第2のポリペプチドは共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの態様では、両方のポリペプチドの少なくとも1つの多量体化ドメインは細胞内にある。いくつかの態様では、両方のポリペプチドの少なくとも1つの多量体化ドメインは細胞外にある。

いくつかの態様では、例示的な制御可能なCARは、以下のものを含む：(1)以下のものを含む、制御可能なCARの第1のポリペプチド：(i)誘導物質に結合することができる少なくとも1つの細胞外多量体化ドメイン；(ii)膜貫通ドメイン；および(iii)細胞内シグナル伝達領域；ならびに(2)以下のものを含む、制御可能なCARの第2のポリペプチド：(i)リガンド（例えば抗原）結合ドメイン；(ii)誘導物質に結合することができる少なくとも1つの細胞外多量体化ドメイン、および(iii)膜貫通ドメイン、アシル化ドメイン、またはGPIシグナル配列。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達領域は共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの態様では、第2のポリペプチドは共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。

いくつかの態様では、例示的な制御可能なCARは、以下のものを含む：(1)以下のものを含む、制御可能なCARの第1のポリペプチド：(i)膜貫通ドメインまたはアシル化ドメイン；(ii)少なくとも1つの共刺激ドメイン；(iii)誘導物質に結合することができる多量体化ドメイン、および(iv)細胞内シグナル伝達領域；および(iii)少なくとも1つの共刺激ドメイン；ならびに(2)以下のものを含む、制御可能なCARの第2のポリペプチド：(i)リガンド（例えば抗原）結合ドメイン；(ii)膜貫通ドメイン；(iii)少なくとも1つの共刺激ドメイン；および(iv)誘導物質に結合することができる少なくとも1つの細胞外多量体化ドメイン。

いくつかの局面では、例示的な制御可能なCARに記載される領域および/またはドメインのいずれかを様々な異なる順番で配列することができる。いくつかの局面では、制御可能なCARの様々なポリペプチドは、細胞膜の同じ側に多量体化ドメインを含み、例えば、2つ以上のポリペプチドの多量体化ドメインはすべて細胞内にあるか、またはすべて細胞外にある。

制御可能なCARの変形は公知であり、例えば、米国特許出願公開第2014/0286987号、米国特許出願公開第2015/0266973号、国際特許出願公開番号WO2014/127261、および国際特許出願公開番号WO2015/142675に記載されている。

3. キメラ自己抗体受容体（CAAR）
いくつかの態様では、改変T細胞刺激関連遺伝子座にコードされる組換え受容体はキメラ自己抗体受容体（CAAR）である。いくつかの態様では、CAARは、自己抗体に結合する、例えば特異的に結合する、または自己抗体を認識する。いくつかの態様では、CAARを発現する細胞、例えば、CAARを発現するように操作されたT細胞は、正常な抗体発現細胞ではなく、自己抗体発現細胞に結合し、これを死滅させるために使用することができる。いくつかの態様では、CAAR発現細胞は、自己抗原の発現と関連する自己免疫疾患、例えば自己免疫疾患を治療するために使用することができる。いくつかの態様では、CAAR発現細胞は、最終的に自己抗体を生成し、その細胞表面上に自己抗体を提示するB細胞を標的とすることができ、これらのB細胞を治療介入のための疾患特異的標的としてマークをつけることができる。いくつかの態様では、CAAR発現細胞は、抗原特異的キメラ自己抗体受容体を使用して疾患を引き起こすB細胞を標的とすることによって、自己免疫疾患において病原性B細胞を効率的に標的とし死滅させるために使用することができる。いくつかの態様では、組換え受容体はCAAR、例えば、米国特許出願公開番号US2017/0051035に記載される任意のものである。

いくつかの態様では、CAARは、自己抗体結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および1つまたは複数の細胞内シグナル伝達領域またはドメイン（互換的に、細胞質内シグナル伝達ドメインまたは領域とも呼ばれる）を含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達領域は細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達領域、T細胞において一次活性化シグナルを刺激および/または誘導することができるシグナル伝達ドメイン、T細胞受容体（TCR）成分のシグナル伝達ドメイン（例えばCD3ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメインもしくは領域またはそれらの機能的バリアントもしくはシグナル伝達部分）、ならびに/あるいは免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含むシグナル伝達ドメインであるか、あるいはこれらを含む。

いくつかの態様では、自己抗体結合ドメインは自己抗原またはその断片を含む。自己抗原の選択は、標的とされる自己抗体のタイプに依存し得る。例えば、自己抗原は、特定の病態、例えば自己免疫疾患、例えば自己抗体媒介性自己免疫疾患と関連する標的細胞、例えばB細胞上の自己抗体を認識という理由で、選択され得る。いくつかの態様では、自己免疫疾患としては尋常性天疱瘡（PV）が挙げられる。例示的な自己抗原としては、デスモグレイン1（Dsg1）およびDsg3が挙げられる。

4. T細胞受容体（TCR）
いくつかの態様では、コードされる組換え受容体は、標的ポリペプチド、例えば、腫瘍の抗原、ウイルス性または自己免疫性タンパク質の細胞内および/もしくはペプチドエピトープまたはT細胞エピトープを認識する、T細胞受容体（TCR）またはその抗原結合部分、例えば組換えTCRである。いくつかの局面では、コードされる受容体は、組換えTCRであるか、または該TCRを含む。いくつかの局面では、組換えTCRは単鎖TCRまたは多鎖TCR、例えば二鎖TCRである。

いくつかの態様では、「T細胞受容体」または「TCR」は、可変αおよびβ鎖（それぞれ、TCRαおよびTCRβとしても知られている）もしくは可変γおよびδ鎖（それぞれ、TCRγおよびTCRδとしても知られている）またはそれらの抗原結合部分を含み、MHC分子に結合したペプチドに特異的に結合することができる分子である。いくつかの態様では、TCRはαβ形態である。いくつかの態様では、αβおよびγδ形態で存在するTCRは、一般に構造的に類似しているが、それらを発現するT細胞は、異なる解剖学的場所または機能を有し得る。TCRは、細胞の表面上に、または可溶性形態で見出すことができる。いくつかの態様では、TCRは、TCRαおよびTCRβ；またはTCRγおよびTCRδ鎖を含む二鎖TCRである。いくつかの局面では、TCRは、これが、主要組織適合抗原複合体（MHC）分子に結合した抗原の認識に一般に関与するT細胞（またはTリンパ球）の表面上に見出される。

いくつかの態様では、TCRは、完全長TCRまたはその抗原結合部分もしくは抗原結合断片を包含する。いくつかの態様では、TCRは、αβ形態またはγδ形態のTCRを含めて、インタクトなまたは完全長のTCRである。いくつかの態様では、TCRは、完全長TCRより小さいが、MHC分子中に結合した特定のペプチドに結合する、例えばMHC-ペプチド複合体に結合する、抗原結合部分である。場合によっては、TCRの抗原結合部分または断片は、完全長のまたはインタクトなTCRの構造ドメインの一部分のみを含むことができるが、それにもかかわらず、完全なTCRが結合するペプチドエピトープ、例えばMHC-ペプチド複合体に結合することができる。場合によっては、抗原結合部分は、TCRの可変ドメイン、例えば、TCRの可変α（V_α）鎖および可変β（V_β）鎖、または特定のMHC-ペプチド複合体への結合のための結合部位を形成するのに十分であるそれらの抗原結合断片を含む。

いくつかの態様では、コードされる組換え受容体は、TCRであり、かつ改変された遺伝子座は、TCRの鎖をコードする。いくつかの態様では、コードされる組換え受容体は、二鎖TCRであり、かつ改変された遺伝子座は、二鎖TCRの1つの鎖をコードする。いくつかの態様では、コードされる組換え受容体は、二鎖TCRであり、かつ改変された遺伝子座は、二鎖TCRの両鎖をコードする。いくつかの態様では、コードされる組換え受容体は、α鎖およびβ鎖を含むTCRであり、かつ改変された遺伝子座は、TCRのα鎖およびβ鎖の両方をコードする。いくつかの態様では、TCRのα鎖およびTCRのβ鎖をコードする核酸配列は、マルチシストロン性エレメントによって分離される。

いくつかの態様では、コードされるTCRの可変ドメインは高頻度可変ループまたは相補性決定領域（CDR）を含み、これらは、一般に、抗原認識ならびに結合能力および特異性に対して主に寄与するものである。いくつかの態様では、TCRのCDRまたはそれらの組み合わせは、所与のTCR分子の抗原結合部位のすべてまたは実質的にすべてを形成する。TCR鎖の可変領域内の様々なCDRは、一般に、CDRと比較して、TCR分子の中で一般に可変性をあまり示さないフレームワーク領域（FR）によって分離される（例えば、Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990；Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988を参照されたい；Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003も参照されたい）。いくつかの態様では、CDR3は抗原結合または特異性に関与する主なCDRであり、または抗原認識にとって、および/もしくはペプチド-MHC複合体のプロセッシングを受けたペプチド部分との相互作用にとって、所与のTCR可変領域の3つのCDRの中で最も重要である。いくつかの状況では、アルファ鎖のCDR1は、ある特定の抗原ペプチドのN末端部分と相互作用することができる。いくつかの状況では、β鎖のCDR1はペプチドのC末端部分と相互作用することができる。いくつかの状況では、CDR2は、MHC-ペプチド複合体のMHC部分との相互作用もしくは該MHC部分の認識に最も強く寄与するか、またはMHC-ペプチド複合体のMHC部分との相互作用もしくは該MHC部分の認識に関与する主要なCDRである。いくつかの態様では、β鎖の可変領域はさらなる超可変領域（CDR4またはHVR4）を含むことができ、超可変領域は、一般に超抗原結合に関与し、抗原認識には関与しない（Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426）。

いくつかの態様では、コードされるTCRは、定常ドメイン、膜貫通ドメイン、および/または短い細胞質尾部も含むことができる（例えば、Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997を参照されたい）。いくつかの局面では、TCRのそれぞれの鎖は、1つのN末端免疫グロブリン可変ドメイン、1つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびC末端の短い細胞質尾部を有し得る。いくつかの態様では、TCRは、シグナルトランスダクションの媒介に関与するCD3複合体の不変タンパク質と結合している。

いくつかの態様では、コードされるTCR鎖は1つまたは複数の定常ドメインを含む。例えば、所与のTCR鎖（例えば、α鎖またはβ鎖）の細胞外部分は、2つの免疫グロブリン様ドメイン、例えば、1つの可変ドメイン（例えば、VαまたはVβ；典型的には、Kabatの番号付け、Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.に基づいて、アミノ酸1～116）および細胞膜に隣接した1つの定常ドメイン（例えば、α鎖定常ドメインもしくはCα、典型的には、Kabatの番号付けに基づいて該鎖の位置117～259、またはβ鎖定常ドメインもしくはC_β、典型的には、Kabatに基づいて該鎖の位置117～295）を含むことができる。例えば、場合によっては、2つの鎖によって形成されるTCRの細胞外部分は、2つの膜近位定常ドメインおよび2つの膜遠位可変ドメインを含み、これらの可変ドメインはそれぞれCDRを含む。TCRの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、それによってTCRの2つの鎖を連結する短い接続配列を含むことができる。いくつかの態様では、TCRは、αおよびβ鎖のそれぞれにさらなるシステイン残基を有することができ、その結果、TCRは定常ドメイン中に2つのジスルフィド結合を含む。

いくつかの態様では、コードされるTCR鎖は膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは正に荷電している。場合によっては、TCR鎖は細胞質尾部を含む。場合によっては、構造は、TCRがCD3およびそのサブユニットのような他の分子と結合することを可能にする。例えば、膜貫通領域を有する定常ドメインを含むTCRは、細胞膜中にタンパク質を係留することができ、かつCD3シグナル伝達装置または複合体の不変サブユニットと結合することができる。CD3シグナル伝達サブユニット（例えば、CD3γ、CD3δ、CD3ε、およびCD3ζ鎖）の細胞内尾部は、TCR複合体のシグナル伝達能力に関与する1つまたは複数の免疫受容活性化チロシンモチーフまたはITAMを含む。

いくつかの態様では、コードされるTCRは様々なドメインまたは領域を含む。場合によっては、正確なドメインまたは領域は、特定の構造的もしくはホモロジーモデリングまたは特定のドメインを説明するのに使用される他の特色によって変動し得る。組換え受容体、例えばTCRのドメイン構成を説明するのに使用されるSEQ ID NOとして記載される特定の配列への言及を含めて、アミノ酸への言及は例示目的のためであり、提供される態様の範囲を制限することを意図しないことが理解されよう。場合によっては、特定のドメイン（例えば、可変または定常）は、数アミノ酸（例えば、1つ、2つ、3つ、または4つ）長くてもよいし、短くてもよい。いくつかの局面では、TCRの残基は公知であるか、または国際免疫遺伝学情報システム（International Immunogenetics Information System）（IMGT）番号付けシステム（例えば、www.imgt.orgを参照されたい；Lefranc et al. (2003) Developmental and Comparative Immunology, 27;55-77；およびThe T Cell Factsbook 2nd Edition, Lefranc and LeFranc Academic Press 2001も参照されたい）に従って特定することができる。このシステムを使用して、TCR Vα鎖および/またはVβ鎖内のCDR1配列は残基番号27～38（両端の値を含む）の間に存在するアミノ酸に対応し、TCR Vα鎖および/またはVβ鎖内のCDR2配列は残基番号56～65（両端の値を含む）の間に存在するアミノ酸に対応し、TCR Vα鎖および/またはVβ鎖内のCDR3配列は残基番号105～117（両端の値を含む）の間に存在するアミノ酸に対応する。

いくつかの態様では、TCRのα鎖およびβ鎖はそれぞれ定常ドメインをさらに含む。いくつかの態様では、α鎖定常ドメイン（Cα）およびβ鎖定常ドメイン（Cβ）は個々に哺乳類であり、例えば、ヒトまたはマウスの定常ドメインである。いくつかの態様では、定常ドメインは細胞膜に隣接している。例えば、場合によっては、2つの鎖によって形成されるコードされるTCRの細胞外部分は、2つの膜近位定常ドメインおよび2つの膜遠位可変ドメインを含み、これらの可変ドメインはそれぞれCDRを含む。

いくつかの態様では、CαおよびCβドメインの各々は、ヒトである。いくつかの態様では、Cαは、TRAC遺伝子（IMGT命名法）によってコードされるか、またはそのバリアントである。いくつかの態様では、Cαは、SEQ ID NO:91もしくは92に示されるアミノ酸の配列、またはSEQ ID NO:91もしくは92に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有するか、またはそれを含む。いくつかの態様では、Cαは、SEQ ID NO:91または92のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有するか、またはそれを含む。いくつかの態様では、Cαは、SEQ ID NO:93に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸の配列、例えば、成熟ポリペプチド、またはSEQ ID NO:93に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸の配列、例えば、成熟ポリペプチドに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有するか、またはそれを含む。いくつかの態様では、Cβは、TRBC1もしくはTRBC2遺伝子（IMGT命名法）によってコードされるか、またはそのバリアントである。いくつかの態様では、Cβは、SEQ ID NO:94、95、もしくは96に示されるアミノ酸の配列、またはSEQ ID NO:94、95、もしくは96に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有するか、またはそれを含む。いくつかの態様では、Cβは、SEQ ID NO:94、95、または96に示されるアミノ酸の配列を有するか、またはそれを含む。いくつかの態様では、Cβは、SEQ ID NO:97に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸の配列、例えば、成熟ポリペプチド、またはSEQ ID NO:97に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸の配列、例えば、成熟ポリペプチドに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有するか、またはそれを含む。

いくつかの態様では、提供されるTCRまたはその抗原結合断片のいずれかは、ヒト/マウスキメラTCRであり得る。場合によっては、TCRまたはその抗原結合断片は、マウス定常領域を含むα鎖および/またはβ鎖を有する。いくつかの局面では、Cαおよび/またはCβ領域は、マウス定常領域である。

任意のそのような態様のいくつかでは、TCRまたはその抗原結合断片は、TCRまたはその抗原結合断片が細胞において発現される時に、TCRα鎖およびβ鎖と内在性TCRα鎖およびβ鎖との間のミスペアリングの頻度が低減し、TCRα鎖およびβ鎖の発現が増加し、かつ/またはTCRα鎖およびβ鎖の安定性が増加するように、α鎖および/またはβ鎖中に1つまたは複数の修飾を含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数の修飾は、Cα領域および/またはCβ領域における1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、または挿入である。いくつかの局面では、1つまたは複数の修飾は、α鎖とβ鎖との間に1つまたは複数の非天然ジスルフィド架橋を形成することができる1つまたは複数のシステイン残基を導入するための置換を含有する。

任意のそのような態様のいくつかでは、TCRまたはその抗原結合断片は、SEQ ID NO:92に示されるような番号付けで48位に対応する位置にシステインを含有するCα領域、および/またはSEQ ID NO:96に示されるような番号付けで57位に対応する位置にシステインを含有するCβ領域を含有する。いくつかの態様では、前記Cα領域は、SEQ ID NO:91もしくは92のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはβ鎖と非天然ジスルフィド結合を形成することができる1つもしくは複数のシステイン残基を含有する、それに少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含有し；かつ/あるいは前記Cβ領域は、SEQ ID NO:94、95、もしくは96のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはα鎖と非天然ジスルフィド結合を形成することができる1つもしくは複数のシステイン残基を含有する、それに少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含有する。

任意のそのような態様のいくつかでは、コードされるTCRまたはその抗原結合断片は、コドン最適化されたヌクレオチド配列にコードされる。

任意のそのような態様のいくつかでは、結合分子またはTCRまたはその抗原結合断片は、単離もしくは精製されるか、または組換え型である。任意のそのような態様のいくつかでは、結合分子またはTCRまたはその抗原結合断片はヒトである。

いくつかの態様では、コードされるTCRは、例えば1つまたは複数のジスルフィド結合によって連結されている2つの鎖αおよびβのヘテロ二量体でもよい。いくつかの態様では、コードされるTCRの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、それによって、コードされるTCRの2つの鎖を連結する短い接続配列を含むことができる。いくつかの態様では、TCRは、αおよびβ鎖のそれぞれにさらなるシステイン残基を有することができ、その結果、コードされるTCRは定常ドメイン中に2つのジスルフィド結合を含む。いくつかの態様では、定常ドメインおよび可変ドメインのそれぞれは、システイン残基によって形成されるジスルフィド結合を含む。

いくつかの態様では、コードされるTCRは、2つの鎖αおよびβもしくはγおよびδのヘテロ二量体、例えば二鎖TCRでもよく、またはこれは単鎖TCRコンストラクトでもよい。いくつかの態様では、TCRは、例えば1つまたは複数のジスルフィド結合によって連結されている2つの分離した鎖を含むヘテロ二量体（二鎖TCR、αおよびβ鎖またはγおよびδ鎖）である。

いくつかの態様では、コードされるTCRは、実質的に完全長のコード配列が容易に入手可能な公知のTCR配列、例えば、Vα、β鎖の配列から生成することができる。V鎖配列を含む完全長TCR配列を細胞供給源から得るための方法は周知である。いくつかの態様では、TCRをコードする核酸は、様々な供給源から、例えば、所与の1つまたは複数の細胞内のTCRをコードする核酸または該細胞から単離された該核酸のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅、あるいは公的に入手可能なTCR DNA配列の合成によって、得ることができる。

いくつかの態様では、コードされる組換え受容体は、組換えTCRおよび/または天然に存在するT細胞からクローニングされたTCRを含む。いくつかの態様では、標的抗原（例えばがん抗原）に対する高親和性T細胞クローンが特定され、患者から単離され、細胞中に導入される。いくつかの態様では、標的抗原に対するTCRクローンは、ヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原システム、またはHLA）で操作されたトランスジェニックマウスで生成された。例えば、腫瘍抗原を参照されたい（例えば、Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180およびCohen et al. (2005) J Immunol. 175:5799-5808を参照されたい。いくつかの局面では、標的抗原に対するTCRを単離するためにファージディスプレイが使用される（例えば、Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med. 14:1390-1395およびLi (2005) Nat Biotechnol. 23:349-354を参照されたい。

いくつかの態様では、コードされるTCRは、生物学的供給源から、例えば細胞から、例えばT細胞（例えば、細胞傷害性T細胞）、T細胞ハイブリドーマ、または他の公的に入手可能な供給源から得られる。いくつかの態様では、T細胞はインビボで単離された細胞から得ることができる。いくつかの態様では、TCRは胸腺的に選択されたTCRである。いくつかの態様では、TCRはネオエピトープ拘束性TCRである。いくつかの態様では、T細胞は培養されたT細胞ハイブリドーマまたはクローンであり得る。いくつかの態様では、TCRまたはその抗原結合部分またはその抗原結合断片は、TCRの配列の知識から合成的に生成することができる。

いくつかの態様では、コードされるTCRは、標的ポリペプチド抗原またはその標的T細胞エピトープに対して候補TCRのライブラリーをスクリーニングすることから特定または選択されたTCRから生成される。TCRライブラリーは、PBMC、脾臓、または他のリンパ器官中に存在する細胞を含めて、対象から単離されたT細胞からのVαおよびVβのレパートリーの増幅によって生成することができる。場合によっては、T細胞は腫瘍浸潤リンパ球（TIL）から増幅することができる。いくつかの態様では、TCRライブラリーはCD4+またはCD8+細胞から生成することができる。いくつかの態様では、TCRは、健康な対象の正常型のT細胞供給源、すなわち正常なTCRライブラリーから増幅することができる。いくつかの態様では、TCRは、病的対象のT細胞供給源、すなわち、病的TCRライブラリーから増幅することができる。いくつかの態様では、縮重プライマーを使用して、例えば、ヒトから得られたT細胞などの試料におけるRT-PCRによって、VαおよびVβの遺伝子レパートリーを増幅することができる。いくつかの態様では、単鎖TCR（scTv）ライブラリーなどのライブラリーは、増幅産物がリンカーによって分離されるようにクローニングされるか、またはアセンブルされるナイーブVαおよびVβライブラリーからアセンブルすることができる。対象および細胞の供給源に応じて、ライブラリーはHLAアレル特異的であり得る。あるいは、いくつかの態様では、TCRライブラリーは親またはスキャフォールドTCR分子の変異誘発または多様化によって生成することができる。

いくつかの局面では、コードされるTCRは、例えばαまたはβ鎖の変異誘発などによって、指向性進化に供される。いくつかの局面では、TCRのCDR内の特定の残基が変更される。いくつかの態様では、選択されたTCRを親和性成熟によって改変することができる。いくつかの態様では、抗原特異的T細胞は、例えばペプチドに対するCTL活性を評価するためのスクリーニングによって、選択することができる。いくつかの局面では、例えば抗原特異的T細胞上に存在する、コードされるTCRは、例えば、結合活性、例えば、抗原に対する特定の親和性または結合力によって、選択することができる。

いくつかの態様では、コードされるTCRまたはその抗原結合部分は、改変または操作されたものである。いくつかの態様では、指向性進化方法は、特性が変わった、例えば、特定のMHC-ペプチド複合体に対する親和性がより高いTCRを生成するために使用される。いくつかの態様では、指向性進化は、限定されないが、酵母ディスプレイ（Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62；Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92）、ファージディスプレイ（Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54）、またはT細胞ディスプレイ（Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84）を含めたディスプレイ方法によって達成される。いくつかの態様では、ディスプレイアプローチは、公知、親、または参照TCRを操作または改変することを含む。例えば、場合によっては、野生型TCRを、CDRの1つまたは複数の残基において変異を受けた、変異誘発されたTCRを作製するための鋳型として使用することができ、望ましい変化した特性、例えば、望ましい標的抗原に対するより高い親和性を有する変異体が選択される。

いくつかの態様では、抗原は、神経膠腫関連抗原、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（AFP）、B細胞成熟抗原（BCMA、BCM）、B細胞活性化因子受容体（BAFFR、BR3）、ならびに/または膜貫通活性化物質およびCAML相互作用物質（transmembrane activator and CAML interactor）（TACI）、Fc受容体様5（FCRL5、FcRH5）、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2（AS）、腸カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、メラニン-A/MART-1、WT-1、S-100、MBP、CD63、MUC1（例えば、MUC1-8）、p53、Ras、サイクリンB1、HER-2/neu、癌胎児性抗原（CEA）、gp100、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A11、MAGE-B1、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-C1、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP-1）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP-2）、β-カテニン、NY-ESO-1、LAGE-1a、PP1、MDM2、MDM4、EGVFvIII、Tax、SSX2、テロメラーゼ、TARP、pp65、CDK4、ビメンチン、S100、eIF-4A1、IFN誘導性p78、およびメラノトランスフェリン（p97）、ウロプラキンII、前立腺特異的抗原（PSA）、ヒトカリクレイン（huK2）、前立腺特異的膜抗原（PSM）、および前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）、好中球エラスターゼ、エフリンB2、BA-46、ベータ-カテニン、Bcr-abl、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、カスパーゼ8、またはB-Raf抗原であり得る、腫瘍抗原である。他の腫瘍抗原としては、FRa、CD24、CD44、CD133、CD166、epCAM、CA-125、HE4、Oval、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、uPA、PAI-1、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂質F77、GD-2、インスリン増殖因子（IGF）-I、IGF-IIおよびIGF-I受容体に由来する任意のものを挙げることができる。特定の腫瘍関連抗原またはT細胞エピトープが公知である（例えば、www.cancerimmunity.org/peptide/から入手可能である、van der Bruggen et al. (2013) Cancer Immun；Cheever et al. (2009) Clin Cancer Res, 15, 5323-37を参照されたい）。

いくつかの態様では、抗原はウイルス抗原である。HIV、HTLV、および他のウイルスのウイルスゲノムに由来するペプチドを含めて、多くのウイルス抗原標的が特定されており、公知である（例えば、Addo et al. (2007) PLoS ONE, 2, e321；Tsomides et al. (1994) J Exp Med, 180, 1283-93；Utz et al. (1996) J Virol, 70, 843-51を参照されたい）。例示的なウイルス抗原としては、限定されないが、A型肝炎、B型肝炎（例えば、HBVコアおよび表面抗原（HBVc、HBVs））、C型肝炎（HCV）、エプスタインバーウイルス（例えば、EBVA）、ヒトパピローマウイルス（HPV；例えば、E6およびE7）、ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV1）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（KSHV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、インフルエンザウイルス、ラッサウイルス、HTLN-1、HIN-1、HIN-II、CMN、EBN、またはHPNから選択される抗原が挙げられる。いくつかの態様では、標的タンパク質は、細菌性抗原または他の病原体抗原、例えば、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）（MT）抗原、トリパノソーマ（trypanosome）、例えばトリパノソーマ・クルージ（Tiypansoma cruzi）（T.クルージ）の表面抗原（TSA）などの抗原、またはマラリア抗原である。特定のウイルス抗原もしくはエピトープまたは他の病原体抗原もしくはT細胞エピトープは公知である（例えば、Addo et al. (2007) PLoS ONE, 2:e321；Anikeeva et al. (2009) Clin Immunol, 130:98-109を参照されたい）。

いくつかの態様では、抗原は、がんと関連するウイルス、例えば発がん性ウイルスに由来する抗原である。例えば、発がん性ウイルスは、ある特定のウイルスからの感染が、様々なタイプのがんの発生につながることが公知であるもの、例えば、A型肝炎、B型肝炎（例えば、HBVコアおよび表面抗原（HBVc、HBVs））、C型肝炎（HCV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、肝炎ウイルス感染、エプスタインバーウイルス（EBV）、ヒトヘルペスウイルス8（HHV-8）、ヒトT細胞白血病ウイルス-1（HTLV-1）、ヒトT細胞白血病ウイルス-2（HTLV-2）、またはサイトメガロウイルス（CMV）抗原である。

いくつかの態様では、ウイルス抗原はHPV抗原であり、これは、場合によっては、子宮頚がんの発生のより大きな危険性につながり得る。いくつかの態様では、抗原は、HPV-16抗原、およびHPV-18抗原、およびHPV-31抗原、HPV-33抗原、またはHPV-35抗原であり得る。いくつかの態様では、ウイルス抗原は、HPV-16抗原（例えば、HPV-16のE1、E2、E6および/もしくはE7タンパク質の血清反応性領域。例えば、米国特許第6,531,127号を参照されたい）またはHPV-18抗原（例えば、米国特許第5,840,306号に記載される、HPV-18のL1および/もしくはL2タンパク質の血清反応性領域）である。いくつかの態様では、ウイルス抗原は、HPV-16のE6および/またはE7タンパク質由来のHPV-16抗原である。いくつかの態様では、TCRはHPV-16 E6またはHPV-16 E7に対するTCRである。いくつかの態様では、TCRは、例えば、WO2015/184228、WO2015/009604、およびWO2015/009606に記載されているTCRである。

いくつかの態様では、ウイルス抗原はHBVまたはHCV抗原であり、これらは、場合によっては、HBVまたはHCV陰性対象と比べて、肝臓がんの発生の大きな危険性につながり得る。例えば、いくつかの態様では、異種抗原はHBV抗原、例えば、B型肝炎コア抗原またはB型肝炎エンベロープ抗原である（US2012/0308580）。

いくつかの態様では、ウイルス抗原はEBV抗原であり、これは、場合によっては、EBV陰性対象と比べて、バーキットリンパ腫、上咽頭癌、およびホジキン病の発生についての大きな危険性につながり得る。例えば、EBVはヒトヘルペスウイルスであり、これは、場合によっては、多様な組織起源の多数のヒト腫瘍と関連して見出される。無症候性感染として主に見出されるが、EBV陽性腫瘍は、ウイルス遺伝子産物、例えばEBNA-1、LMP-1、およびLMP-2Aの活発な発現を特徴とし得る。いくつかの局面では、異種抗原は、エプスタインバー核抗原（EBNA）-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-リーダータンパク質（EBNA-LP）、潜在性膜タンパク質（LMP）-1、LMP-2A、およびLMP-2B、EBV-EA、EBV-MA、またはEBV-VCAを含むことができるEBV抗原である。

いくつかの態様では、ウイルス抗原はHTLV-1またはHTLV-2抗原であり、これらは、場合によってはHTLV-1またはHTLV-2陰性対象と比べて、T細胞白血病の発生についての大きな危険性につながり得る。例えば、いくつかの態様では、異種抗原はHTLV-抗原、例えばTAXである。

いくつかの態様では、ウイルス抗原はHHV-8抗原であり、これは、場合によっては、HHV-8陰性対象と比べて、カポジ肉腫の発生についての大きな危険性につながり得る。いくつかの態様では、異種抗原はCMV抗原、例えばpp65またはpp64である（米国特許第8,361,473号を参照されたい）。

いくつかの態様では、抗原は自己抗原、例えば、自己免疫疾患または障害と関連するポリペプチドの抗原である。いくつかの態様では、自己免疫疾患または障害は、多発性硬化症（MS）、関節リウマチ（RA）、シェーグレン症候群、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、全身性エリテマトーデス、若年性関節リウマチ、強直性脊椎炎、重症筋無力症（MG）、水疱性類天疱瘡（真皮-上皮接合部の基底膜に対する抗体）、天疱瘡（ムコ多糖タンパク質複合体または細胞内セメント物質に対する抗体）、糸球体腎炎（糸球体基底膜に対する抗体）、グッドパスチャー症候群、自己免疫性溶血性貧血（赤血球に対する抗体）、橋本病（甲状腺に対する抗体）、悪性貧血（内因子に対する抗体）、特発性血小板減少性紫斑病（血小板に対する抗体）、グレーブス病、またはアジソン病（サイログロブリンに対する抗体）であり得る。いくつかの態様では、自己抗原、例えば、前述の自己免疫疾患のうちの1つと関連する自己抗原は、コラーゲン、例えばII型コラーゲン、マイコバクテリア熱ショックタンパク質、サイログロブリン、アセチルコリン受容体（AcHR）、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、またはプロテオリピドタンパク質（PLP）であり得る。特定の自己免疫関連エピトープまたは抗原は公知である（例えば、Bulek et al. (2012) Nat Immunol, 13:283-9；Harkiolaki et al. (2009) Immunity, 30:348-57；Skowera et al. (2008) J Clin Invest, 1(18): 3390-402を参照されたい）。

いくつかの態様では、関心対象のTCRを作製または生成するのに使用するための標的ポリペプチドのペプチドは公知であるか、または容易に特定することができる。いくつかの態様では、TCRまたは抗原結合部分の生成における使用に適するペプチドは、以下に記載の標的ポリペプチドなどの関心対象の標的ポリペプチド中のHLA拘束性モチーフの存在に基づいて決定することができる。いくつかの態様では、ペプチドは、利用可能なコンピュータ予測モデルを使用して特定される。いくつかの例では、コンピュータ予測モデルを使用したHLA-A0201結合モチーフならびにプロテアソームおよび免疫プロテアソームについての開裂部位が公知である。いくつかの態様では、MHCクラスI結合部位の予測に関して、そのようなモデルとしては、限定されないが、ProPred1（Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237、およびSYFPEITHI（Schuler et al. (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007を参照されたい）が挙げられる。いくつかの態様では、MHC拘束性エピトープはHLA-A0201であり、これは、全コーカサス人のおよそ39～46％で発現しており、したがって、TCRまたは他のMHCペプチド結合分子を調製する使用のためのMHC抗原の適切な選択に相当する。

いくつかの態様では、TCRまたはその抗原結合部分は、組換えで作製された天然タンパク質、または1つもしくは複数の特性、例えば結合性が変更されたそれらの変異形態であり得る。いくつかの態様では、TCRは、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物などの様々な動物種のうちの1つに由来し得る。TCRは、細胞結合性または可溶性形態であり得る。いくつかの態様では、提供される方法のために、TCRは細胞の表面上で発現している細胞結合性形態である。

いくつかの態様では、コードされる組換えTCRは完全長TCRである。いくつかの態様では、組換えTCRは抗原結合部分である。いくつかの態様では、TCRは二量体TCR（dTCR）である。いくつかの態様では、TCRは単鎖TCR（scTCR）である。いくつかの態様では、dTCRまたはscTCRは、例えば、国際特許出願公開番号WO03/020763、WO04/033685、およびWO2011/044186に記載される構造を有する。

いくつかの態様では、コードされる組換えTCRは膜貫通配列に対応する配列を含む。いくつかの態様では、TCRは細胞質内配列に対応する配列を含まない。いくつかの態様では、TCRは、CD3とともにTCR複合体を形成することができる。いくつかの態様では、dTCRまたはscTCRを含めた組換えTCRのいずれかは、T細胞の表面上に活発なTCRをもたらすシグナル伝達ドメインに連結され得る。いくつかの態様では、組換えTCRは細胞の表面上で発現している。導入または操作されたジスルフィド結合を含むdTCRまたはscTCRのいくつかの態様では、ネイティブジスルフィド結合は存在しない。

ある特定の態様では、コードされるTCRは、TCRα鎖とTCRβ鎖の間に1つまたは複数の非天然ジスルフィド架橋を形成することができる1つまたは複数のシステイン残基を導入するための1つまたは複数の修飾を含む。いくつかの態様では、コードされるTCRは、TCRβ鎖と非天然ジスルフィド結合を形成することができる1つまたは複数のシステイン残基を含むTCRα定常ドメインを含むTCRα鎖またはその一部分を含む。いくつかの態様では、導入遺伝子は、TCRα鎖と非天然ジスルフィド結合を形成することができる1つまたは複数のシステイン残基を含むTCRβ定常ドメインを含むTCRβ鎖またはその一部分をコードする。いくつかの態様では、コードされるTCRは、1つまたは複数のジスルフィド結合を導入するための1つまたは複数の修飾を含む、TCRαおよび/もしくはTCRβ鎖ならびに/またはTCRαおよび/もしくはTCRβ鎖定常ドメインを含む。いくつかの態様では、導入遺伝子は、例えば、導入遺伝子にコードされるTCRαと内在性TCRβ鎖の間の、または導入遺伝子にコードされるTCRβと内在性TCRα鎖の間のネイティブジスルフィド結合を除去または防止するための1つまたは複数の修飾を有する、TCRαおよび/もしくはTCRβ鎖ならびに/またはTCRαおよび/もしくはTCRβをコードする。いくつかの態様では、ネイティブ鎖間ジスルフィド結合を形成するおよび/または形成することができる1つまたは複数のネイティブシステインが、別の残基、例えば、セリンまたはアラニンに置換される。いくつかの態様では、TCRα定常ドメインの番号付けを参照して、残基Thr48、Thr45、Tyr10、Thr45、およびSer15の1つまたは複数にシステインが導入される。ある特定の態様では、TCRβ鎖定常ドメインのGlu15の残基Ser57、Ser77、Ser17、Asp59にシステインを導入することができる。TCRの例示的な非天然ジスルフィド結合は、公開された国際PCT番号WO2006/000830、WO2006/037960、およびKuball et al. (2007) Blood, 109:2331-2338に記載されている。いくつかの態様では、システインは、Cα鎖のThr48およびCβ鎖のSer57に対応する残基、Cα鎖の残基Thr45およびCβ鎖のSer77、Cα鎖の残基Tyr10およびCβ鎖のSer17、Cα鎖の残基Thr45およびCβ鎖のAsp59、ならびに/またはCα鎖の残基Ser15およびCβ鎖のGlu15において、導入または置換することができる。いくつかの態様では、システイン変異のいずれかは、別の配列中の、例えば、上記のヒトまたはマウスのCαおよびCβ配列中の対応する位置で行うことができる。アミノ酸位置は例示的なCαおよびCβ中のアミノ酸位置「に対応する」という記述などの、タンパク質の位置に関連した用語「対応する」は、構造配列アラインメントに基づいて、またはGAPアルゴリズムなどの標準的アライメントアルゴリズムを使用して、開示される配列とアライメントを行った際に、特定されるアミノ酸位置を指す。

いくつかの態様では、ネイティブ鎖間ジスルフィド結合を形成するネイティブシステインの1つまたは複数は、別の残基に、例えばセリンまたはアラニンに置換される。いくつかの態様では、導入または操作されたジスルフィド結合は、第1および第2のセグメントの非システイン残基をシステインに変異させることよって形成することができる。TCRの例示的な非天然ジスルフィド結合は公開された国際PCT番号WO2006/000830に記載されている。

いくつかの態様では、コードされる組換えTCRは二量体TCR（dTCR）である。いくつかの態様では、dTCRは、TCRα鎖可変領域配列に対応する配列がTCRα鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のN末端に融合している第1のポリペプチド、およびTCRβ鎖可変領域配列に対応する配列がTCRβ鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のN末端に融合している第2のポリペプチドを含み、第1および第2のポリペプチドはジスルフィド結合によって連結している。いくつかの態様では、結合は、ネイティブな二量体αβTCR中に存在するネイティブな鎖間ジスルフィド結合に対応し得る。いくつかの態様では、鎖間ジスルフィド結合はネイティブTCR中に存在しない。例えば、いくつかの態様では、1つまたは複数のシステインをdTCRポリペプチド対の定常領域細胞外配列中に組み込むことができる。場合によっては、ネイティブジスルフィド結合と非天然ジスルフィド結合の両方とも望ましい可能性がある。いくつかの態様では、TCRは、膜に係留するための膜貫通配列を含む。

いくつかの態様では、dTCRは、可変αドメイン、定常αドメイン、および定常αドメインのC末端に付着した第1の二量体化モチーフを含むTCRα鎖、ならびに可変βドメイン、定常βドメイン、および定常βドメインのC末端に付着した第1の二量体化モチーフを含むTCRβ鎖を含み、第1および第2の二量体化モチーフが相互作用して、第1の二量体化モチーフ中のアミノ酸と第2の二量体化モチーフ中のアミノ酸の間に共有結合を形成し、TCRα鎖とTCRβ鎖を一緒に連結する。

いくつかの態様では、コードされる組換えTCRは単鎖TCR（scTCRまたはscTv）である。典型的には、scTCRは公知の方法を使用して生成することができ、例えば、Soo Hoo, W. F. et al. PNAS (USA) 89, 4759 (1992)；Wulfing, C. and Pluckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994)；Kurucz, I. et al. PNAS (USA) 90 3830 (1993)；国際特許出願公開番号WO96/13593、WO96/18105、WO99/60120、WO99/18129、WO03/020763、WO2011/044186；およびSchlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996)を参照されたい。いくつかの態様では、scTCRは、TCR鎖の結合を容易にするために、導入された非天然ジスルフィド鎖間結合を含む（例えば、国際特許出願公開番号WO03/020763を参照されたい）。いくつかの態様では、scTCRは非ジスルフィド結合のトランケートされたTCRであり、そのC末端に融合した異種ロイシンジッパーが鎖結合を容易にする（例えば、国際特許出願公開番号WO99/60120を参照されたい）。いくつかの態様では、scTCRは、ペプチドリンカーを介してTCRβ可変ドメインに共有結合したTCRα可変ドメインを含む（例えば、国際特許出願公開番号WO99/18129を参照されたい）。

いくつかの態様では、scTCRは、TCRα鎖可変領域に対応するアミノ酸配列によって構成された第1のセグメント、TCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のN末端に融合したTCRβ鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列によって構成された第2のセグメント、および第1のセグメントのC末端を第2のセグメントのN末端に連結するリンカー配列を含む。いくつかの態様では、scTCRは、α鎖細胞外定常ドメイン配列のN末端に融合したα鎖可変領域配列によって構成された第1のセグメント、ならびに配列β鎖の細胞外定常および膜貫通配列のN末端に融合したβ鎖可変領域配列によって構成された第2のセグメント、ならびに任意で、第1のセグメントのC末端を第2のセグメントのN末端に連結するリンカー配列を含む。いくつかの態様では、scTCRは、β鎖細胞外定常ドメイン配列のN末端に融合したTCRβ鎖可変領域配列によって構成された第1のセグメント、ならびに配列α鎖の細胞外定常および膜貫通配列のN末端に融合したα鎖可変領域配列によって構成された第2のセグメント、ならびに任意で、第1のセグメントのC末端を第2のセグメントのN末端に連結するリンカー配列を含む。

いくつかの態様では、第1と第2のTCRセグメントを連結するscTCRのリンカーは、単一ポリペプチド鎖を形成することができ、同時にTCR結合特異性を保持する任意のリンカーであり得る。いくつかの態様では、リンカー配列は、例えば、式-P-AA-P-を有することができ、式中、Pはプロリンであり、AAはアミノ酸配列を表し、アミノ酸はグリシンおよびセリンである。いくつかの態様では、第1および第2のセグメントは、それらの可変領域配列がそのような結合のために配向されるように対になる。したがって、場合によっては、リンカーは、第1のセグメントのC末端から第2のセグメントのN末端の、またはその逆の距離にわたるのに十分な長さを有するが、標的リガンドへのscTCRの結合を阻止するかまたは低減させるほど長すぎることはない。いくつかの態様では、リンカーは、10または約10～45アミノ酸、例えば、10～30アミノ酸、または26～41アミノ酸残基、例えば、29、30、31、または32アミノ酸を含むことができる。いくつかの態様では、リンカーは式-PGGG-(SGGGG)₅-P-を有し、式中、Pはプロリンであり、Gはグリシンであり、Sはセリンである（SEQ ID NO:22）。いくつかの態様では、リンカーは配列

を有する。

いくつかの態様では、scTCRは、α鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基をβ鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基に連結する共有ジスルフィド結合を含む。いくつかの態様では、ネイティブTCR中の鎖間ジスルフィド結合は存在しない。例えば、いくつかの態様では、1つまたは複数のシステインをscTCRポリペプチドの第1および第2のセグメントの定常領域細胞外配列中に組み込むことができる。場合によっては、ネイティブジスルフィド結合と非天然ジスルフィド結合の両方とも望ましい可能性がある。

いくつかの態様では、コードされるTCRまたはその抗原結合断片は、10^-5～10^-12Mまたは約10^-5～10^-12Mならびにその中のすべての個々の値および範囲の標的抗原に対する平衡解離定数（K_D）で、親和性を示す。いくつかの態様では、標的抗原はMHC-ペプチド複合体またはリガンドである。

C. 遺伝子操作のための細胞および細胞の調製
いくつかの態様では、操作された細胞、例えば、遺伝子操作されたまたは改変された細胞、および細胞の操作方法が提供される。いくつかの態様では、組換え受容体もしくはその一部分および/またはさらなる分子をコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド、例えば鋳型ポリヌクレオチドが、例えば、本明細書において記載される操作方法に従って、操作のためのある細胞に導入される。いくつかの局面では、ポリヌクレオチドおよび/またはその一部分の中の導入遺伝子（外来性または異種の核酸配列）は異種であり、すなわち、細胞または細胞から得られた試料中に通常は存在せず、例えば、操作される細胞および/またはそのような細胞が由来する生物で普通は見出されない、別の生物または細胞から得られたものでなどである。いくつかの態様では、核酸配列は、複数の異なる細胞型由来の様々なドメインをコードする核酸のキメラの組み合わせを含むものを含めて、天然に見出されない核酸配列のように天然に存在しないか、または、天然に見出される核酸配列から改変される。

細胞は、一般に真核細胞、例えば哺乳動物細胞であり、典型的にはヒト細胞である。いくつかの態様では、細胞は、血液、骨髄、リンパ、またはリンパ器官に由来し、免疫系の細胞、例えば、自然または適応免疫の細胞、例えばリンパ球を含めた、骨髄性またはリンパ球系細胞、典型的には、T細胞および/またはNK細胞である。他の例示的な細胞としては、幹細胞、例えば、人工多能性幹細胞（iPSC）を含めた、多分化能および多能性幹細胞が挙げられる。細胞は、典型的には、初代細胞、例えば、対象から直接単離されたものおよび/または対象から単離され、凍結されたものである。いくつかの態様では、細胞としては、T細胞または他の細胞型の1つまたは複数のサブセット、例えば、全T細胞集団、CD4+細胞、CD8+細胞、およびそれらの亜集団、例えば、機能、活性化状態、成熟度、分化能、拡大、再循環、局在、および/または持続能力、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の器官またはコンパートメントにおける存在、マーカーまたはサイトカイン分泌プロファイル、および/または分化の程度によって定義されたものが挙げられる。治療される対象に関連して、細胞は同種異系および/または自己でもよい。方法の中には、既製の方法が含まれる。例えば既製の技術についてのいくつかの局面では、細胞は多能性および/または多分化能であり、例えば幹細胞、例えばiPSCである。いくつかの態様では、方法は、対象から細胞を単離すること、それを調製すること、処理すること、培養すること、および/または操作すること、ならびに凍結保存の前または後に同じ対象にそれを再導入することを含む。

T細胞ならびに/またはCD4+ T細胞および/もしくはCD8+ T細胞のサブタイプおよび亜集団の中には、ナイーブT（T_N）細胞、エフェクターT細胞（T_EFF）、メモリーT細胞およびそのサブタイプ、例えば、幹細胞メモリーT（T_SCM）、セントラルメモリーT（T_CM）、エフェクターメモリーT（T_EM）、または最終分化エフェクターメモリーT細胞、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、未熟T細胞、成熟T細胞、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、粘膜関連インバリアントT（MAIT）細胞、天然に存在するかつ適応性の制御性T（Treg）細胞、ヘルパーT細胞、例えば、TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾胞性ヘルパーT細胞、α/βT細胞、およびδ/γT細胞がある。

いくつかの態様において、細胞は、ナチュラルキラー（NK）細胞である。いくつかの態様において、細胞は、単球または顆粒球、例えば、骨髄系細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、マスト細胞、好酸球、および/または好塩基球である。いくつかの態様において、細胞は、遺伝子操作を介して導入された1つまたは複数の核酸を含み、それによって、そのような核酸の組換え産物または遺伝子操作された産物を発現する。いくつかの態様において、核酸は、異種であり、すなわち、細胞または細胞から得られる試料中に正常では存在せず、例えば、操作されている細胞、および/またはそのような細胞が由来する生物において通常は見出されない、別の生物または細胞から得られるものである。いくつかの態様において、核酸は、天然には存在せず、例えば、複数の異なる細胞型由来の様々なドメインをコードする核酸のキメラ組み合わせを含むものを含む、天然において見出されない核酸である。

いくつかの態様において、操作された細胞の調製は、1つまたは複数の培養工程および/または調製工程を含む。CARなどのトランスジェニック受容体をコードする核酸の導入のための細胞は、生物学的試料などの試料、例えば、対象から得られるかまたはそれに由来するものから単離され得る。いくつかの態様において、細胞が単離される対象は、疾患もしくは状態を有するか、または細胞療法の必要があるか、または細胞療法が施与される対象である。いくつかの態様における対象は、特定の治療的介入、例えば、そのために細胞が単離され、処理され、かつ/または操作されている養子細胞療法の必要があるヒトである。

したがって、いくつかの態様における細胞は、初代細胞、例えば、初代ヒト細胞である。いくつかの態様では、細胞はヒトT細胞である。試料には、組織、体液、および対象から直接採取された他の試料、ならびに分離、遠心分離、遺伝子操作（例えば、ウイルスベクターでの形質導入）、洗浄、および/またはインキュベーションなどの1つまたは複数の処理工程から結果として生じた試料が含まれる。生物学的試料は、生物学的供給源から直接得られた試料、または処理される試料であることができる。生物学的試料には、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿、および汗などの体液、組織および器官の試料が、それに由来する処理された試料を含めて含まれるが、それらに限定されない。

いくつかの局面において、細胞が由来するかまたは単離される試料は、血液もしくは血液由来の試料であるか、またはアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシスの産物であるかもしくはそれに由来する。例示的な試料には、全血、末梢血単核細胞（PBMC）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検材料、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸管関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓、他のリンパ組織、肝臓、肺、胃、腸、結腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸、精巣、卵巣、扁桃腺、もしくは他の器官、および/またはそれに由来する細胞が含まれる。試料には、細胞療法、例えば、養子細胞療法に関連して、自己由来および同種異系の供給源由来の試料が含まれる。

いくつかの態様において、細胞は、細胞株、例えばT細胞株に由来する。いくつかの態様における細胞は、異種供給源から、例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはブタから得られる。

いくつかの態様において、細胞の単離は、1つまたは複数の調製工程および/または親和性に基づかない細胞分離工程を含む。いくつかの例において、例えば、不要な構成要素を除去する、所望の構成要素を濃縮する、特定の試薬に感受性の細胞を溶解するかまたは除去するために、細胞を、洗浄し、遠心分離し、かつ/または1つもしくは複数の試薬の存在下でインキュベートする。いくつかの例において、細胞は、密度、接着特性、サイズ、特定の構成要素に対する感受性および/または耐性などの1つまたは複数の特性に基づいて分離される。

いくつかの例において、対象の循環血液由来の細胞は、例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られる。試料は、いくつかの局面において、T細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球、および/または血小板を含有し、いくつかの局面において、赤血球および血小板以外の細胞を含有する。

いくつかの態様において、対象から収集された血球を、例えば、血漿画分を除去するため、および細胞をその後の処理工程に適切な緩衝液または培地に置くために洗浄する。いくつかの態様において、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄する。いくつかの態様において、洗浄溶液は、カルシウムおよび/もしくはマグネシウム、ならびに/または多くのもしくはすべての二価カチオンを含まない。いくつかの局面において、洗浄工程は、半自動「フロースルー」遠心分離機（例えば、Cobe 2991細胞プロセッサ、Baxter）において、製造業者の説明書に従って達成される。いくつかの局面において、洗浄工程は、接線流濾過（TFF）によって、製造業者の説明書に従って達成される。いくつかの態様において、細胞を、洗浄後に、例えば、Ca⁺⁺/Mg⁺⁺を含まないPBSなどの様々な生体適合性緩衝液に再懸濁する。ある特定の態様において、血球試料の構成要素を除去し、細胞を、培養培地に直接再懸濁する。

いくつかの態様において、方法は、密度に基づく細胞分離法、例えば、赤血球を溶解することによる末梢血からの白血球の調製、およびPercollまたはFicoll勾配を通した遠心分離を含む。

いくつかの態様において、単離法は、表面マーカー、例えば、表面タンパク質、細胞内マーカー、または核酸などの1つまたは複数の特異的な分子の細胞における発現または存在に基づく、異なる細胞型の分離を含む。いくつかの態様において、そのようなマーカーに基づく分離のための任意の公知の方法が、用いられてもよい。いくつかの態様において、分離は、親和性または免疫親和性に基づく分離である。例えば、いくつかの局面における単離は、1つまたは複数のマーカー、典型的には細胞表面マーカーの細胞での発現または発現レベルに基づく、例えば、そのようなマーカーに特異的に結合する抗体または結合パートナーとのインキュベーション、ならびにその後概して続く、洗浄工程、および抗体または結合パートナーに結合していない細胞からの抗体または結合パートナーに結合した細胞の分離による、細胞および細胞集団の分離を含む。

そのような分離工程は、試薬に結合した細胞がさらなる使用のために保持される陽性選択、および/または抗体もしくは結合パートナーに結合していない細胞が保持される陰性選択に基づくことができる。いくつかの例において、両方の画分が、さらなる使用のために保持される。いくつかの局面において、陰性選択は、分離が、所望の集団以外の細胞によって発現されるマーカーに基づいて最も良好に実施されるように、不均一な集団において細胞型を特異的に同定する抗体が利用可能ではない場合に、特に有用であり得る。

分離は、特定の細胞集団または特定のマーカーを発現する細胞の100％の濃縮または除去を結果としてもたらす必要はない。例えば、マーカーを発現する細胞などの特定の型の細胞の陽性選択または濃縮は、そのような細胞の数またはパーセンテージを増加させることを指すが、マーカーを発現しない細胞の完全な非存在を結果としてもたらす必要はない。同様に、マーカーを発現する細胞などの特定の型の細胞の陰性選択、除去、または枯渇は、そのような細胞の数またはパーセンテージを減少させることを指すが、そのような細胞すべての完全な除去を結果としてもたらす必要はない。

いくつかの例において、1つの工程由来の陽性選択または陰性選択された画分が、その後の陽性選択または陰性選択などの別の分離工程に供される、複数回の分離工程が実施される。いくつかの例において、例えば、細胞を、陰性選択のために標的とされるマーカーに各々特異的な多数の抗体または結合パートナーとインキュベートすることによって、単一の分離工程が、複数のマーカーを発現する細胞を同時に枯渇させることができる。同様に、細胞を、様々な細胞型上に発現される多数の抗体または結合パートナーとインキュベートすることによって、複数の細胞型を同時に陽性選択することができる。

例えば、いくつかの局面において、T細胞の特異的な亜集団、例えば、1つまたは複数の表面マーカーについて陽性であるかまたは高レベルを発現する細胞、例えば、CD28⁺、CD62L⁺、CCR7⁺、CD27⁺、CD127⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD45RA⁺、および/またはCD45RO⁺ T細胞が、陽性選択または陰性選択の技法によって単離される。

例えば、CD3⁺、CD28⁺ T細胞は、抗CD3/抗CD28コンジュゲート磁性ビーズ（例えば、DYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T Cell Expander）を用いて陽性選択することができる。

いくつかの態様において、単離は、陽性選択による特定の細胞集団の濃縮、または陰性選択による特定の細胞集団の枯渇によって実施される。いくつかの態様において、陽性選択または陰性選択は、細胞を、それぞれ陽性選択または陰性選択される細胞上に発現される（マーカー⁺）かまたは比較的高いレベルで発現される（マーカー^高）1つまたは複数の表面マーカーに特異的に結合する1つまたは複数の抗体または他の結合物質とインキュベートすることによって達成される。

いくつかの態様において、T細胞は、B細胞、単球、または他の白血球などの非T細胞上に発現されるマーカー、例えばCD14の陰性選択によって、PBMC試料から分離される。いくつかの局面において、CD4⁺またはCD8⁺選択工程が、CD4⁺ヘルパーT細胞およびCD8⁺細胞傷害性T細胞を分離するために用いられる。そのようなCD4⁺およびCD8⁺集団は、1つまたは複数のナイーブ、メモリー、および/またはエフェクターT細胞亜集団上に発現されるかまたは比較的高い程度に発現されるマーカーについての陽性選択または陰性選択によって、さらに亜集団に選別することができる。

いくつかの態様において、CD8⁺細胞は、例えば、それぞれの亜集団に関連する表面抗原に基づく陽性選択または陰性選択によって、ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリー、および/またはセントラルメモリー幹細胞がさらに濃縮されるかまたは枯渇する。いくつかの態様において、セントラルメモリーT（T_CM）細胞の濃縮は、有効性を増加させるために、例えば、いくつかの局面ではそのような亜集団において特に堅牢である、投与後の長期生存、増大、および/または生着を改善するために実施される。Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82；Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701を参照されたい。いくつかの態様において、T_CM濃縮CD8⁺ T細胞とCD4⁺ T細胞とを組み合わせることは、有効性をさらに増強する。

態様において、メモリーT細胞は、CD8⁺末梢血リンパ球のCD62L⁺およびCD62L^-サブセットの両方に存在する。PBMCは、例えば抗CD8抗体および抗CD62L抗体を用いて、CD62L^-CD8⁺および/またはCD62L^＋CD8⁺画分を濃縮するかまたは枯渇させることができる。

いくつかの態様において、セントラルメモリーT（T_CM）細胞の濃縮は、CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、および/またはCD127の陽性または高い表面発現に基づき；いくつかの局面において、それは、CD45RAおよび/またはグランザイムBを発現するかまたは高発現する細胞についての陰性選択に基づく。いくつかの局面において、T_CM細胞が濃縮されたCD8⁺集団の単離は、CD4、CD14、CD45RAを発現する細胞の枯渇、およびCD62Lを発現する細胞の陽性選択または濃縮によって実施される。1つの局面において、セントラルメモリーT（T_CM）細胞の濃縮は、CD4発現に基づいて選択された細胞の陰性画分から出発して実施され、これが、CD14およびCD45RAの発現に基づく陰性選択、ならびにCD62Lに基づく陽性選択に供される。そのような選択は、いくつかの局面において同時に実施され、他の局面においては、連続的に任意の順序で実施される。いくつかの局面において、CD8⁺細胞集団または亜集団の調製において用いられるのと同じCD4発現に基づく選択工程がまた、CD4に基づく分離からの陽性画分および陰性画分が両方とも保持され、任意で1つまたは複数のさらなる陽性選択または陰性選択の工程後の、方法のその後の工程において用いられるように、CD4⁺細胞集団または亜集団を生成するためにも用いられる。

特定の例において、PBMCの試料または他の白血球試料を、CD4⁺細胞の選択に供し、ここで、陰性画分および陽性画分は両方とも保持される。次いで、陰性画分を、CD14およびCD45RAまたはCD19の発現に基づく陰性選択、ならびにCD62LまたはCCR7などのセントラルメモリーT細胞に特徴的なマーカーに基づく陽性選択に供し、ここで、陽性選択および陰性選択はいずれかの順序で実施される。

CD4⁺ Tヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによって、ナイーブ、セントラルメモリー、およびエフェクター細胞に選別される。CD4⁺リンパ球は、標準的な方法によって得ることができる。いくつかの態様において、ナイーブCD4⁺ Tリンパ球は、CD45RO^-、CD45RA⁺、CD62L^-、CD4⁺ T細胞である。いくつかの態様において、セントラルメモリーCD4⁺細胞は、CD62L⁺およびCD45RO⁺である。いくつかの態様において、エフェクターCD4⁺細胞は、CD62L^-およびCD45RO^-である。

1つの例において、陰性選択によってCD4⁺細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびCD8に対する抗体を含む。いくつかの態様において、抗体または結合パートナーは、陽性選択および/または陰性選択のための細胞の分離を可能にするように、磁性ビーズまたは常磁性ビーズなどの固体支持体またはマトリックスに結合している。例えば、いくつかの態様において、細胞および細胞集団は、免疫磁気（または親和性磁気）分離技法（Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In vitro and In vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher（著作権） Humana Press Inc., Totowa, NJにおいて概説されている）を用いて分離されるかまたは単離される。

いくつかの局面において、分離されるべき細胞の試料または組成物を、小さな磁化可能または磁気応答性材料、例えば磁気応答性粒子または微小粒子、例えば常磁性ビーズ（例えば、DynalbeadsまたはMACSビーズなど）とインキュベートする。磁気応答性材料、例えば粒子は、概して、分離することが望ましい、例えば、陰性選択または陽性選択することが望ましい細胞、複数の細胞、または細胞の集団上に存在する分子、例えば表面マーカーに特異的に結合する結合パートナー、例えば抗体に、直接または間接的に付着している。

いくつかの態様において、磁性粒子またはビーズは、抗体または他の結合パートナーなどの特異的結合メンバーに結合した磁気応答性材料を含む。磁気分離法で用いられる多くの周知の磁気応答性材料がある。適している磁性粒子には、参照により本明細書に組み入れられる、Moldayの米国特許第4,452,773号、および欧州特許明細書EP 452342 Bに記載されているものが含まれる。コロイドサイズの粒子、例えば、Owenの米国特許第4,795,698号およびLibertiらの米国特許第5,200,084号に記載されているものが、他の例である。

インキュベーションは、概して、磁性粒子もしくはビーズに付着している抗体もしくは結合パートナー、または、そのような抗体もしくは結合パートナーに特異的に結合する二次抗体もしくは他の試薬などの分子が、試料内の細胞上に存在する場合は細胞表面分子に特異的に結合する条件下で実施される。

いくつかの局面において、試料を磁場に置き、磁気応答性または磁化可能粒子が付着している細胞を、磁石に引きつけて、非標識細胞から分離する。陽性選択のためには、磁石に引きつけられる細胞が保持され；陰性選択のためには、引きつけられない細胞（非標識細胞）が保持される。いくつかの局面において、陽性選択と陰性選択との組み合わせが同じ選択工程中に行われ、ここで、陽性画分および陰性画分が保持され、さらに処理されるかまたはさらなる分離工程に供される。

ある特定の態様において、磁気応答性粒子は、一次抗体または他の結合パートナー、二次抗体、レクチン、酵素、またはストレプトアビジンでコーティングされている。ある特定の態様において、磁性粒子は、1つまたは複数のマーカーに特異的な一次抗体のコーティングを介して細胞に付着している。ある特定の態様において、ビーズではなく細胞を、一次抗体または結合パートナーで標識し、次いで、細胞型特異的二次抗体または他の結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン）でコーティングされた磁性粒子を添加する。ある特定の態様において、ストレプトアビジンコーティング磁性粒子を、ビオチン化一次抗体または二次抗体と組み合わせて用いる。

いくつかの態様において、磁気応答性粒子は、その後インキュベート、培養、および/または操作されることになる細胞に付着したままであり；いくつかの局面において、粒子は、患者への投与のための細胞に付着したままである。いくつかの態様において、磁化可能または磁気応答性粒子は、細胞から除去される。磁化可能粒子を細胞から除去するための方法は公知であり、例えば、競合する非標識抗体、および切断可能リンカーにコンジュゲートした磁化可能粒子または抗体の使用を含む。いくつかの態様において、磁化可能粒子は生分解性である。

いくつかの態様において、親和性に基づく選択は、磁気活性化細胞選別（MACS）（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）を介する。磁気活性化細胞選別（MACS）システムは、磁化粒子が付着している細胞の高純度の選択ができる。ある特定の態様において、MACSは、外部磁場の印加後に非標的種および標的種が連続的に溶出されるモードで動作する。すなわち、磁化粒子に付着した細胞は、付着していない種が溶出される間、適所に保持される。次いで、この最初の溶出工程が完了した後に、磁場に捕捉されて溶出が阻止されていた種は、それらが溶出されて回収され得るように、何らかの方法で遊離される。ある特定の態様において、非標的細胞を、標識して、不均一な細胞の集団から枯渇させる。

ある特定の態様において、単離または分離は、本発明の方法の単離、細胞調製、分離、処理、インキュベーション、培養、および/または製剤化工程のうちの1つまたは複数を実施するシステム、デバイス、または装置を用いて実施される。いくつかの局面において、システムは、例えば、エラー、使用者の取り扱い、および/または汚染を最小化するように、これらの工程の各々を閉鎖環境または無菌環境で実施するために用いられる。1つの例において、システムは、特許出願公開番号WO2009/072003、またはUS 20110003380に記載されているようなシステムである。

いくつかの態様において、システムまたは装置は、統合もしくは自己完結型システムで、および/または自動化もしくはプログラム可能方式で、単離、処理、操作、および製剤化工程のうちの1つまたは複数、例えばすべてを実施する。いくつかの局面において、システムまたは装置は、システムまたは装置に接続されたコンピュータおよび/またはコンピュータプログラムを含み、これにより、使用者が処理、単離、操作、および製剤化工程をプログラムする、制御する、そのアウトカムを評価する、かつ/またはその様々な局面を調整することが可能になる。

いくつかの局面において、分離工程および/または他の工程は、例えば、閉鎖系および無菌系における臨床規模レベルでの細胞の自動分離のために、CliniMACSシステム（Miltenyi Biotec）を用いて実施される。構成要素には、統合マイクロコンピュータ、磁気分離ユニット、蠕動ポンプ、および様々なピンチバルブが含まれ得る。いくつかの局面における統合コンピュータは、機器のすべての構成要素を制御し、標準化された順序で反復手順を行うようにシステムに指令する。いくつかの局面における磁気分離ユニットは、可動永久磁石および選択カラム用のホルダを含む。蠕動ポンプは、チューブセット全体の流速を制御し、ピンチバルブと共に、システムを通る緩衝液の制御された流れおよび細胞の継続的な懸濁を確実にする。

いくつかの局面におけるCliniMACSシステムは、無菌非発熱性溶液において供給される抗体カップリング磁化可能粒子を用いる。いくつかの態様において、細胞の磁性粒子での標識化後に、細胞を、洗浄して過剰の粒子を除去する。次いで、細胞調製バッグをチューブセットに接続し、これを次に、緩衝液を含有するバッグおよび細胞収集バッグに接続する。チューブセットは、プレカラムおよび分離カラムを含むあらかじめ組み立てられた無菌チューブからなり、使い捨て専用である。分離プログラムの開始後、システムは、自動的に細胞試料を分離カラム上にアプライする。非標識細胞が一連の洗浄工程によって除去される間、標識細胞は、カラム内に保持される。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法での使用のための細胞集団は、標識されておらず、カラムに保持されない。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法での使用のための細胞集団は、標識されており、カラムに保持される。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法での使用のための細胞集団は、磁場の除去後にカラムから溶出され、細胞収集バッグ内に収集される。

ある特定の態様において、分離工程および/または他の工程は、CliniMACS Prodigyシステム（Miltenyi Biotec）を用いて実施される。いくつかの局面におけるCliniMACS Prodigyシステムは、遠心分離による細胞の自動洗浄および分画を可能にする細胞処理ユニットを備える。CliniMACS Prodigyシステムはまた、供給源細胞産物の巨視的層を識別することによって最適な細胞分画エンドポイントを決定する、搭載カメラおよび画像認識ソフトウェアも含むことができる。例えば、末梢血は、赤血球、白血球、および血漿層に自動的に分離される。CliniMACS Prodigyシステムはまた、例えば、細胞分化および増大、抗原負荷、ならびに長期細胞培養などの細胞培養プロトコールを達成する、統合細胞培養チャンバも含むことができる。入力ポートは、培地の無菌除去および補充を可能にすることができ、細胞を、統合顕微鏡を用いてモニターすることができる。例えば、Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660、Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82、およびWang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701を参照されたい。

いくつかの態様において、本明細書に記載される細胞集団を、複数の細胞表面マーカーについて染色された細胞が流体の流れにおいて運ばれるフローサイトメトリーを介して、収集し、かつ濃縮する（または枯渇させる）。いくつかの態様において、本明細書に記載される細胞集団を、調製規模（FACS）選別を介して、収集し、かつ濃縮する（または枯渇させる）。ある特定の態様において、本明細書に記載される細胞集団を、FACSに基づく検出システムと組み合わせた微小電気機械システム（MEMS）チップの使用によって、収集し、かつ濃縮する（または枯渇させる）（例えば、WO 2010/033140、Cho et al. (2010) Lab Chip 10:1567-1573；およびGodin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376を参照されたい）。どちらの場合も、細胞を、明確に定義されたT細胞サブセットの高純度での単離を可能にする、複数のマーカーで標識することができる。

いくつかの態様において、抗体または結合パートナーは、陽性選択および/または陰性選択のための分離を容易にするために、1つまたは複数の検出可能なマーカーで標識される。例えば、分離は、蛍光標識抗体への結合に基づいてもよい。いくつかの例において、1つまたは複数の細胞表面マーカーに特異的な抗体または他の結合パートナーの結合に基づく細胞の分離は、例えば、調製規模（FACS）を含む蛍光活性化細胞選別（FACS）、および/または、例えばフローサイトメトリー検出システムと組み合わせた微小電気機械システム（MEMS）チップによって、流体の流れにおいて行われる。そのような方法は、同時に複数のマーカーに基づく陽性選択および陰性選択を可能にする。

いくつかの態様において、調製法は、単離、インキュベーション、および/または操作の前または後のいずれかに、細胞を凍結する、例えば凍結保存するための工程を含む。いくつかの態様において、凍結およびその後の解凍工程は、細胞集団中の顆粒球を、およびある程度まで、単球を除去する。いくつかの態様において、細胞は、例えば、血漿および血小板を除去するための洗浄工程の後に、凍結溶液中に懸濁される。様々な公知の凍結溶液およびパラメーターのいずれかが、いくつかの局面において用いられてもよい。1つの例は、20％ DMSOおよび8％ヒト血清アルブミン（HSA）を含有するPBS、または他の適している細胞凍結培地を用いることを含む。次いで、これを培地で1:1希釈して、DMSOおよびHSAの最終濃度が、それぞれ10％および4％になるようにする。次いで、細胞を、通常、1分あたり1°の速度で-80℃に凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相中で保管する。

いくつかの態様において、遺伝子操作の前に、またはそれに関連して、細胞をインキュベートおよび/または培養する。インキュベーション工程は、培養（culture）、培養（cultivation）、刺激、活性化、および/または増殖を含むことができる。インキュベーションおよび/または操作は、培養器、例えば、ユニット、チャンバ、ウェル、カラム、チューブ、チュービングセット、バルブ、バイアル、培養皿、バッグ、または細胞の培養（culture）もしくは培養（cultivate）のためのその他の容器において実施され得る。いくつかの態様において、組成物または細胞を、刺激条件または刺激物質の存在下でインキュベートする。そのような条件には、集団中の細胞の増殖、増大、活性化、および/もしくは生存を誘導するように、抗原曝露を模倣するように、ならびに/または、組換え抗原受容体の導入のためなどの遺伝子操作のために細胞をプライミングするように、設計されたものが含まれる。

条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、作用物質、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、および/または刺激因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、および細胞を活性化するように設計された任意の他の作用物質のうちの1つまたは複数を含むことができる。

いくつかの態様において、刺激条件または刺激作用物質は、TCR複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを刺激または活性化することができる1つまたは複数の作用物質、例えばリガンドを含む。いくつかの局面において、作用物質は、T細胞におけるTCR/CD3細胞内シグナル伝達カスケードを作動するかまたは開始する。そのような作用物質は、TCRに特異的な抗体などの抗体、例えば抗CD3を含むことができる。いくつかの態様において、刺激条件は、共刺激受容体を刺激することができる1つまたは複数の作用物質、例えばリガンド、例えば抗CD28を含む。いくつかの態様において、そのような作用物質および/またはリガンドは、ビーズなどの固体支持体、および/または1つもしくは複数のサイトカインに結合していてもよい。任意で、増大法は、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体を培養培地に（例えば、少なくとも約0.5 ng/mlの濃度で）添加する工程をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、刺激作用物質は、IL-2、IL-15、および/またはIL-7を含む。いくつかの局面では、IL-2濃度は少なくとも約10ユニット/mLである。

いくつかの局面において、インキュベーションは、US 6,040,177、Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660、Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82、および/またはWang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701に記載されている技法などの技法に従って実施される。

いくつかの態様において、T細胞は、培養開始組成物への非分裂末梢血単核細胞（PBMC）などのフィーダ細胞の添加（例えば、結果として生じる細胞の集団が、増大させるべき初期集団中の各Tリンパ球に対して少なくとも約5、10、20、もしくは40個、またはそれよりも多いPBMCフィーダ細胞を含有するように）；および培養物をインキュベートすること（例えば、T細胞の数を増大させるのに十分な時間）により増大される。いくつかの局面において、非分裂フィーダ細胞は、γ線照射PBMCフィーダ細胞を含むことができる。いくつかの態様において、PBMCは、細胞分裂を阻止するために、約3000～3600ラドの範囲のγ線を照射される。いくつかの局面において、フィーダ細胞は、T細胞の集団の添加の前に、培養培地に添加される。

いくつかの態様において、刺激条件は、ヒトTリンパ球の増殖に適している温度、例えば、少なくとも約25℃、概して少なくとも約30℃、および概して37℃または約37℃を含む。任意で、インキュベーションは、非分裂EBV形質転換リンパ芽球様細胞（LCL）をフィーダ細胞として添加することをさらに含んでもよい。LCLは、約6000～10,000ラドの範囲のγ線を照射することができる。いくつかの局面におけるLCLフィーダ細胞は、少なくとも約10:1のLCLフィーダ細胞対初期Tリンパ球の比などの、任意の適している量で提供される。

態様において、抗原特異的T細胞、例えば、抗原特異的CD4+および/またはCD8+ T細胞は、ナイーブまたは抗原特異的Tリンパ球を抗原で刺激することによって得られる。例えば、抗原特異的T細胞株またはクローンを、サイトメガロウイルス抗原に対して、感染した対象からT細胞を単離すること、および細胞をインビトロで同じ抗原で刺激することによって生成することができる。

遺伝子操作された成分、例えば、遺伝子破壊を誘導するための作用物質および/または組換え受容体、例えば、CARもしくはTCRをコードする核酸の導入のための様々な方法が、公知であり、提供された方法および組成物と共に使用され得る。例示的な方法には、ポリペプチドまたは受容体をコードする核酸の移入のための方法、例えば、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクター、非ウイルスベクター、またはトランスポゾン、例えば、Sleeping Beautyトランスポゾン系を介した方法が含まれる。遺伝子移入の方法には、形質導入、電気穿孔、もしくは細胞への遺伝子移入をもたらすその他の方法、または本明細書におけるセクションII.A.3またはII.B.3に記載された任意の送達方法が含まれ得る。組換え産物をコードする核酸の移入のためのその他のアプローチおよびベクターは、例えば、WO2014055668および米国特許第7,446,190号に記載されたものである。

いくつかの態様において、組換え核酸は、電気穿孔を介してT細胞に移入される（例えば、Chicaybam et al, (2013)PLoS ONE 8(3): e60298およびVan Tedeloo et al. (2000)Gene Therapy 7(16): 1431-1437を参照すること）。いくつかの態様において、組換え核酸は、転位を介してT細胞に移入される（例えば、Manuri et al. (2010)Hum Gene Ther 21(4): 427-437；Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74；およびHuang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126を参照すること）。免疫細胞に遺伝材料を導入し発現させるその他の方法には、（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.に記載される）リン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション；タングステン粒子によって容易にされる微粒子銃（Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)）；およびリン酸ストロンチウムDNA共沈殿（Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)）が含まれる。

いくつかの態様において、遺伝子移入は、例えば、サイトカインまたは活性化マーカーの発現によって測定される、増殖、生存、および/または活性化のような応答を誘導する刺激と組み合わせること等によって、最初に細胞を刺激し、その後、活性化された細胞を形質導入し、臨床的な適用のために十分な数へ培養物中で増大させることによって達成される。

いくつかの状況において、刺激因子（例えば、リンホカインまたはサイトカイン）の過剰発現が、対象における不要な転帰またはより低い効力、例えば、対象における毒性に関連した因子をもたらす可能性に対して、保護手段を有することが望まれ得る。従って、いくつかの状況において、操作された細胞は、細胞が、例えば、養子免疫治療において投与された時、インビボでネガティブ選択を受け易くなるようにする遺伝子セグメントを含む。例えば、いくつかの局面において、細胞は、それが投与された患者のインビボ条件の変化の結果として排除され得るよう、操作される。ネガティブ選択可能な表現型は、投与された作用物質、例えば、化合物に対する感受性を付与する遺伝子の挿入に起因し得る。ネガティブ選択可能な遺伝子には、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ（HSV-I TK）遺伝子（Wigler et al.,Cell 11:223,1977）；細胞ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子、細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（APRT）遺伝子、細菌シトシンデアミナーゼ（Mullen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33(1992)）が含まれる。

いくつかの態様において、細胞、例えば、T細胞は、増大中または増大後に操作され得る。所望のポリペプチドまたは受容体の遺伝子の導入のためのこの操作は、例えば、任意の適当なレトロウイルスベクターによって実施され得る。次いで、遺伝子改変された細胞集団を、一次刺激（例えば、CD3/CD28刺激）から解放し、その後、（例えば、新たに導入された受容体を介して）第2の型の刺激によって刺激することができる。この第2の型の刺激には、ペプチド/MHC分子の形態での抗原刺激、遺伝学的に導入された受容体の同族（架橋）リガンド（例えば、CARの天然リガンド）、または（例えば、受容体内の定常領域を認識することによって）新しい受容体のフレームワーク内に直接結合する（抗体のような）任意のリガンドが含まれ得る。例えば、Cheadle et al,"Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy" Methods Mol Biol.2012;907:645-66またはBarrett et al.,Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol.65:333-347(2014)を参照すること。

導入のための付加的な核酸、例えば、遺伝子には、例えば、移入された細胞の生存率および/または機能を促進することによって、治療の効力を改善するためのもの；細胞の選択および/または評価のため、例えば、インビボの生存または局在を評価するため、遺伝子マーカーを提供するための遺伝子；Lupton S.D.et al., Mol. and Cell Biol., 11: 6 (1991)；およびRiddell et al., Human Gene Therapy 3: 319-338 (1992)によって記載されたような、例えば、細胞がインビボでネガティブ選択を受け易くなるようにすることによって、安全性を改善するための遺伝子が含まれる。ドミナントポジティブ選択可能マーカーをネガティブ選択可能マーカーと融合させることによって得られた二機能性選択可能融合遺伝子の使用を記載している、LuptonらによるPCT/US91/08442およびPCT/US94/05601の公開も参照すること。例えば、Riddellらの米国特許第6,040,177号、第14～17欄を参照すること。

本明細書中に記載されるように、いくつかの態様において、細胞は、遺伝子操作前に、または遺伝子操作に関連して、インキュベートされかつ/または培養される。インキュベーション工程には、培養（culture）、培養（cultivation）、刺激、活性化、繁殖、および/または保存、例えば、凍結保存のための凍結が含まれ得る。

D. 組換え受容体を発現する細胞の組成物
また、複数のまたは集団の改変された細胞、そのような細胞を含有する、かつ/またはそのような細胞が濃縮された組成物も提供される。いくつかの局面において、提供される操作された細胞および/または操作された細胞の組成物は、本明細書に記載される方法によって作製される。

いくつかの態様において、操作された細胞を含有する提供される細胞集団および/または組成物は、他の方法を用いて生成された細胞集団および/または組成物の発現および/または抗原結合と比較して、より改善された、均一の、同質の、かつ/または安定した発現および/または組換え受容体による抗原結合を示し、例えば、低下した変動係数を示す、細胞集団を含む。いくつかの態様において、細胞集団および/または組成物は、他の方法、例えば、組換え受容体をコードする配列のランダム組み込みを用いて生成されたそれぞれの集団と比較して、少なくとも100％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、または10％低い、組換え受容体の発現および/または組換え受容体による抗原結合の変動係数を示す。変動係数とは、細胞、例えば、CD4+ T細胞および/またはCD8+ T細胞の集団内の、関心対象の核酸（例えば、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子）の発現の標準偏差を、それぞれの細胞の集団におけるそれぞれの関心対象の核酸の発現の平均値で割ったものとして定義される。いくつかの態様において、細胞集団および/または組成物は、本明細書で提供される方法を用いて操作されているCD4+ T細胞集団および/またはCD8+ T細胞集団の間で測定された時、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、もしくは0.30、またはそれよりも低い変動係数を示す。

いくつかの態様において、操作された細胞を含有する提供される細胞集団および/または組成物は、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子の最小のまたは低減したランダム組み込みを示す、細胞集団を含む。いくつかの局面において、細胞のゲノム中への導入遺伝子のランダム組み込みは、ゲノム中の望ましくない場所への、例えば、不可欠な遺伝子または細胞の活性の制御に重大な遺伝子中への導入遺伝子の組み込みのために、有害効果もしくは細胞死、および/または受容体の制御されないもしくは調節されない発現を結果としてもたらし得る。いくつかの局面において、導入遺伝子のランダム組み込みは、他の方法を用いて生成された細胞集団と比較して、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上、または50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上よりも多く、低減される。

いくつかの態様において、組換え受容体を発現する複数の操作された免疫細胞を含む細胞集団および/または組成物であって、該組換え受容体をコードする核酸配列が、例えば、相同性指向修復（HDR）を介したT細胞刺激関連遺伝子座での組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子の組み込みによって、T細胞刺激関連遺伝子座に存在する、細胞集団および/または組成物が提供される。いくつかの態様において、組成物中の細胞、および/またはT細胞刺激関連遺伝子座に遺伝子破壊を含有する組成物中の細胞の少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％は、または該細胞の30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％超は、T細胞刺激関連遺伝子座に組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子の組み込みを含む。

いくつかの態様において、提供される組成物は、組換え受容体を発現する細胞が、組成物中の全細胞のうちの、またはT細胞もしくはCD8+細胞もしくはCD4+細胞などのある特定のタイプの細胞のうちの、少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれよりも多くを占めるような、細胞を含有する。いくつかの態様において、提供される組成物は、組換え受容体を発現する細胞が、T細胞刺激関連遺伝子座に遺伝子破壊を含有する組成物中の全細胞のうちの、少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれよりも多くを占めるような、細胞を含有する。

V. 処置の方法および養子細胞療法における使用
本明細書に記載される操作された細胞または操作された細胞を含有する組成物のいずれかを投与する工程を例えば含む、処置の方法が、本明細書において提供される。いくつかの局面において、また、本明細書に記載される操作された細胞または操作された細胞を含有する組成物のいずれかを、ある疾患または障害を有する対象などの対象に投与する方法も提供される。本明細書に記載される、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（TCR）などの組換え受容体を発現する操作された細胞、またはそれを含む組成物は、様々な治療、診断、および予防の適応症において有用である。例えば、操作された細胞または操作された細胞を含む組成物は、対象における様々な疾患および障害の処置において有用である。そのような方法および使用は、例えば、操作された細胞、またはそれを含有する組成物の、腫瘍またはがんなどの、ある疾患、状態、または障害を有する対象への投与を含む、治療的な方法および使用を含む。いくつかの態様において、操作された細胞またはそれを含む組成物は、疾患または障害の処置をもたらすために有効量で投与される。使用には、そのような方法および処置における、ならびにそのような治療法を実施するための薬剤の調製における、操作された細胞または組成物の使用が含まれる。いくつかの態様において、方法は、操作された細胞またはそれを含む組成物を、疾患または状態を有するかまたはそれを有する疑いがある対象に投与することによって実施される。いくつかの態様において、方法は、それによって、対象における疾患または状態または障害を処置する。また、細胞および組成物を、対象、例えば患者に投与するための治療法も提供される。

養子細胞療法用の細胞の投与のための方法は、公知であり、提供される方法および組成物に関連して用いられ得る。例えば、養子T細胞療法の方法は、例えば、Gruenbergらの米国特許出願公開番号2003/0170238；Rosenbergの米国特許第4,690,915号；Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85に記載されている。例えば、Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933；Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9；Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338を参照されたい。

処置される疾患または状態は、抗原の発現が、疾患、状態または障害に関連している、かつ/またはその病因に関与している、例えば、そのような疾患、状態、または障害を引き起こす、悪化させる、または別のように関与している、いずれかのものであり得る。例示的な疾患および状態には、悪性腫瘍もしくは細胞の形質転換（例えば、がん）、自己免疫性もしくは炎症性の疾患、または、例えば、細菌、ウイルス、もしくは他の病原体によって引き起こされる感染性疾患に関連する疾患または状態が含まれ得る。例示的な抗原は、処置することができる様々な疾患および状態に関連する抗原を含み、本明細書に記載されている。いずれかの態様のいくつかにおいて、キメラ抗原受容体またはトランスジェニックTCRは、疾患または状態に関連する抗原に特異的に結合する。

疾患、状態、および障害の中には、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、および黒色腫を含む、ならびに限局性および転移性腫瘍を含む腫瘍、感染性疾患、例えばウイルスまたは他の病原体、例えば、HIV、HCV、HBV、CMV、HPVの感染、および寄生虫病、ならびに自己免疫性および炎症性の疾患がある。いくつかの態様において、疾患、障害、または状態は、腫瘍、がん、悪性腫瘍、新生物、または他の増殖性疾患もしくは障害である。そのような疾患には、白血病、リンパ腫、例えば、急性骨髄性（myeloid）（または骨髄性（myelogenous））白血病（AML）、慢性骨髄性（myeloid）（または骨髄性（myelogenous））白血病（CML）、急性リンパ性（またはリンパ芽球性）白血病（ALL）、慢性リンパ性白血病（CLL）、ヘアリー細胞白血病（HCL）、小リンパ球性リンパ腫（SLL）、マントル細胞リンパ腫（MCL）、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫（HL）、非ホジキンリンパ腫（NHL）、未分化大細胞型リンパ腫（ALCL）、濾胞性リンパ腫、治療抵抗性濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）、および多発性骨髄腫（MM）が含まれるが、それらに限定されない。いくつかの態様において、疾患または状態は、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、成人ALL、慢性リンパ芽球性白血病（CLL）、非ホジキンリンパ腫（NHL）、およびびまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）の中から選択されるB細胞悪性腫瘍である。いくつかの態様において、疾患または状態は、NHLであり、NHLは、アグレッシブNHL、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）、NOS（デノボ（de novo）および低悪性度から形質転換されたもの）、原発性縦隔大細胞型B細胞リンパ腫（PMBCL）、T細胞/組織球豊富型大細胞型B細胞リンパ腫（TCHRBCL）、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫（MCL）、および/または濾胞性リンパ腫（FL）、任意で濾胞性リンパ腫グレード3B（FL3B）からなる群より選択される。

いくつかの態様において、疾患または障害は、多発性骨髄腫（MM）である。いくつかの態様において、提供される細胞、例えば、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を有する操作された細胞の投与は、対象におけるMMなどの、疾患または状態の処置および/またはその寛解を結果としてもたらし得る。いくつかの態様において、対象は、B細胞腫瘍抗原（BCMA）などの、腫瘍関連抗原の発現に関連しているMMを有するか、またはそれを有する疑いがある。

いくつかの態様において、疾患または障害は、慢性リンパ性白血病（CLL）である。いくつかの態様において、提供される細胞、例えば、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を有する操作された細胞の投与は、対象におけるCLLなどの、疾患または状態の処置および/またはその寛解を結果としてもたらし得る。いくつかの態様において、対象は、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）などの、腫瘍関連抗原の発現に関連しているCLLを有するか、またはそれを有する疑いがある。

いくつかの態様において、疾患または障害は、固形腫瘍、または非血液腫瘍に関連するがんである。いくつかの態様において、疾患または障害は、固形腫瘍、または固形腫瘍に関連するがんである。いくつかの態様において、疾患または障害は、膵臓がん、膀胱がん、結腸直腸がん、乳がん、前立腺がん、腎がん、肝細胞がん、肺がん、卵巣がん、子宮頚がん、膵臓がん、直腸がん、甲状腺がん、子宮がん、胃がん、食道がん、頭頚部がん、黒色腫、神経内分泌がん、CNSがん、脳腫瘍、骨がん、または軟部組織肉腫である。いくつかの態様において、疾患または障害は、膀胱、肺、脳、黒色腫（例えば、小細胞肺、黒色腫）、乳房、子宮頚部、卵巣、結腸直腸、膵臓、子宮内膜、食道、腎臓、肝臓、前立腺、皮膚、甲状腺、または子宮のがんである。いくつかの態様において、疾患または障害は、膵臓がん、膀胱がん、結腸直腸がん、乳がん、前立腺がん、腎がん、肝細胞がん、肺がん、卵巣がん、子宮頚がん、膵臓がん、直腸がん、甲状腺がん、子宮がん、胃がん、食道がん、頭頚部がん、黒色腫、神経内分泌がん、CNSがん、脳腫瘍、骨がん、または軟部組織肉腫である。

いくつかの態様において、疾患または障害は、非小細胞肺がん（NSCLC）である。いくつかの態様において、提供される細胞、例えば、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を有する操作された細胞の投与は、対象におけるNSCLCなどの、疾患または状態の処置および/またはその寛解を結果としてもたらし得る。いくつかの態様において、対象は、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）などの、腫瘍関連抗原の発現に関連しているNSCLCを有するか、またはそれを有する疑いがある。

いくつかの態様において、疾患または障害は、頭頚部扁平上皮癌（HNSCC）である。いくつかの態様において、提供される細胞、例えば、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を有する操作された細胞の投与は、対象におけるHNSCCなどの、疾患または状態の処置および/またはその寛解を結果としてもたらし得る。いくつかの態様において、対象は、ヒトパピローマウイルス（HPV）16 E6またはE7などの、腫瘍関連抗原の発現に関連しているHNSCCを有するか、またはそれを有する疑いがある。いくつかの態様において、疾患または状態は、ウイルス、レトロウイルス、細菌、および原虫の感染、免疫不全、サイトメガロウイルス（CMV）、エプスタインバーウイルス（EBV）、アデノウイルス、BKポリオーマウイルスなどであるがそれらに限定されない、感染性疾患または状態である。いくつかの態様において、疾患または状態は、関節炎、例えば関節リウマチ（RA）、I型糖尿病、全身性エリテマトーデス（SLE）、炎症性腸疾患、乾癬、強皮症、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病、クローン病、多発性硬化症、喘息、および/または移植に関連する疾患もしくは状態などの、自己免疫性または炎症性の疾患または状態である。

いくつかの態様において、疾患または障害に関連する抗原は、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9；CAIXまたはG250としても知られている）、がん精巣抗原、がん/精巣抗原1B（CTAG；NY-ESO-1およびLAGE-2としても知られている）、癌胎児性抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮成長因子タンパク質（EGFR）、III型上皮成長因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体ホモログ5またはFCRH5としても知られている）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量-黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Rα）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Rα2）、キナーゼインサートドメイン受容体（kdr）、κ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、黒色腫関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソテリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、腫瘍胎児抗原、黒色腫優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（TPBG；5T4としても知られている）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1；TYRP1またはgp75としても知られている）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2；ドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムデルタ-イソメラーゼ、またはDCTとしても知られている）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的抗原もしくは病原体発現抗原、またはユニバーサルタグに関連する抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBV、もしくは他の病原体によって発現される分子であるか、またはそれを含む。受容体によって標的とされる抗原には、いくつかの態様において、多くの公知のB細胞マーカーのいずれかなどの、B細胞悪性腫瘍に関連する抗原が含まれる。いくつかの態様において、抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b、もしくはCD30であるか、またはそれを含む。

いくつかの態様において、抗原は、病原体特異的抗原もしくは病原体発現抗原であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、抗原は、ウイルス抗原（例えば、HIV、HCV、HBVなど由来のウイルス抗原）、細菌抗原、および/または寄生虫抗原である。

いくつかの局面において、CARなどの組換え受容体は、疾患もしくは状態に関連しているか、またはB細胞悪性腫瘍に関連する病巣の環境の細胞において発現している抗原に特異的に結合する。受容体によって標的とされる抗原には、いくつかの態様において、多くの公知のB細胞マーカーのいずれかなどの、B細胞悪性腫瘍に関連する抗原が含まれる。いくつかの態様において、受容体によって標的とされる抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b、もしくはCD30、またはそれらの組み合わせである。

いくつかの態様において、疾患または状態は、多発性骨髄腫などの骨髄腫である。いくつかの局面において、CARなどの組換え受容体は、疾患もしくは状態に関連しているか、または多発性骨髄腫に関連する病巣の環境の細胞において発現している抗原に特異的に結合する。受容体によって標的とされる抗原には、いくつかの態様において、多発性骨髄腫に関連する抗原が含まれる。いくつかの局面において、抗原、例えば、疾患特異的抗原および/または関連した抗原などの、第2のまたは追加の抗原が、多発性骨髄腫上に発現しており、例えば、B細胞成熟抗原（BCMA）、Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）、CD38（サイクリックADPリボースヒドロラーゼ）、CD138（シンデカン-1、シンデカン、SYN-1）、CS-1（CS1、CD2サブセット1、CRACC、SLAMF7、CD319、および19A24）、BAFF-R、TACI、ならびに/またはFcRH5である。他の例示的な多発性骨髄腫抗原には、CD56、TIM-3、CD33、CD123、CD44、CD20、CD40、CD74、CD200、EGFR、β2-ミクログロブリン、HM1.24、IGF-1R、IL-6R、TRAIL-R1、およびアクチビン受容体IIA型（ActRIIA）が含まれる。Benson and Byrd, J. Clin. Oncol. (2012) 30(16): 2013-15；Tao and Anderson, Bone Marrow Research (2011):924058；Chu et al., Leukemia (2013) 28(4):917-27；Garfall et al., Discov Med. (2014) 17(91):37-46を参照されたい。いくつかの態様において、抗原には、リンパ腫瘍、骨髄腫、AIDS関連リンパ腫、および/または移植後のリンパ球増殖に存在するもの、例えばCD38が含まれる。そのような抗原に対する抗体または抗原結合断片は、公知であり、例えば、米国特許第8,153,765号；第8,603477号、第8,008,450号；米国特許出願公開番号US20120189622もしくはUS20100260748；および/または国際PCT公開番号WO2006099875、WO2009080829、もしくはWO2012092612、もしくはWO2014210064に記載されているものを含む。いくつかの態様において、そのような抗体またはその抗原結合断片（例えば、scFv）は、多重特異性抗体、多重特異性キメラ受容体、例えば多重特異性CAR、および/または多重特異性細胞に含有される。

いくつかの態様において、疾患または障害は、Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）の発現および/またはB細胞成熟抗原（BCMA）の発現に関連している。

いくつかの態様において、疾患または障害は、B細胞関連障害である。提供される方法の提供される態様のいずれかのいくつかにおいて、BCMAに関連する疾患または障害は、自己免疫性の疾患または障害である。提供される方法の提供される態様のいずれかのいくつかにおいて、自己免疫性の疾患または障害は、全身性エリテマトーデス（SLE）、ループス腎炎、炎症性腸疾患、関節リウマチ、ANCA関連血管炎、突発性血小板減少性紫斑病（ITP）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）、自己免疫性血小板減少症、シャガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、乾癬、IgA腎症、IgM多発ニューロパチー、血管炎、真性糖尿病、レイノー症候群、抗リン脂質症候群、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血、重症筋無力症、または進行性糸球体腎炎である。

いくつかの態様において、疾患または障害はがんである。いくつかの態様において、がんはGPRC5D発現がんである。いくつかの態様において、がんは、形質細胞悪性腫瘍であり、形質細胞悪性腫瘍は、多発性骨髄腫（MM）または形質細胞腫である。いくつかの態様において、がんは多発性骨髄腫（MM）である。いくつかの態様において、がんは、再発性/治療抵抗性多発性骨髄腫である。

いくつかの態様において、抗原は、ヒトパピローマウイルス（HPV）などのウイルスに関連しており、疾患または障害は、HNSCCなどのがんである。いくつかの態様において、抗原はROR1であり、疾患または障害はCLLである。いくつかの態様において、抗原はROR1であり、疾患または障害はNSCLCである。

いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片（例えば、scFvまたはV_Hドメイン）は、CD19、BCMA、GPRC5D、またはROR1などの抗原を特異的に認識する。いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、CD19、BCMA、GPRC5D、またはROR1に特異的に結合する抗体または抗原結合断片に由来するか、またはそのバリアントである。

いくつかの態様において、細胞療法、例えば、養子T細胞療法は、細胞が、細胞療法を受ける予定である対象からまたはそのような対象に由来する試料から、単離されかつ/または別の方法で調製される、自己移入によって実施される。したがって、いくつかの局面において、細胞は、処置を必要とする対象、例えば、患者に由来し、細胞は、単離および加工の後、同じ対象に投与される。

いくつかの態様において、細胞療法、例えば、養子T細胞療法は、細胞が、細胞療法を受ける予定であるかまたは最終的に受ける対象以外の対象、例えば、第1の対象から、単離されかつ/または別の方法で調製される、同種移入によって実施される。そのような態様において、細胞は、次いで、同じ種の異なる対象、例えば、第2の対象に投与される。いくつかの態様において、第1および第2の対象は、遺伝学的に同一である。いくつかの態様において、第1および第2の対象は、遺伝学的に類似している。いくつかの態様において、第2の対象は、第1の対象と同じHLAクラスまたはスーパータイプを発現する。

細胞は、任意の適している手段によって、例えば、ボーラス注入によって、注射、例えば、静脈内注射もしくは皮下注射、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、結膜下（subconjectval）注射、結膜下（subconjuntival）注射、テノン嚢下注射、眼球後注射、眼球周囲注射、または後強膜近傍（posterior juxtascleral）送達によって投与され得る。いくつかの態様において、それらは、非経口投与、肺内投与、および鼻腔内投与によって、ならびに局所処置のために望まれる場合は、病巣内投与によって投与される。非経口注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与が含まれる。いくつかの態様において、所与の用量は、細胞の単回ボーラス投与によって投与される。いくつかの態様において、それは、例えば、3日以内の期間にわたる細胞の複数回ボーラス投与によって、または細胞の連続注入投与によって投与される。いくつかの態様において、細胞用量の投与または任意の追加の治療法、例えば、リンパ球枯渇療法、介入治療、および/または併用療法は、外来患者送達を介して実施される。

疾患の予防または処置のために、適切な投薬量は、処置されるべき疾患のタイプ、細胞または組換え受容体のタイプ、疾患の重症度および経過、細胞が予防目的で投与されるかまたは治療目的で投与されるか、以前の治療、対象の病歴および細胞に対する応答、ならびに主治医の裁量に依存し得る。組成物および細胞は、いくつかの態様において、一度にまたは一連の処置にわたって、対象に適切に投与される。

いくつかの態様において、細胞は、併用処置の一部として、例えば、別の治療的介入、例えば、抗体または改変された細胞または受容体または作用物質、例えば、細胞傷害剤または治療剤と同時にまたは逐次的に、任意の順序で投与される。細胞は、いくつかの態様において、同時にまたは任意の順序で逐次的にのいずれかで、1つもしくは複数の追加の治療剤と共に、または別の治療的介入に関連して、同時投与される。いくつかの状況において、細胞は、細胞集団が1つまたは複数の追加の治療剤の効果を増強するか、またはその逆であるように、時間的に十分に近く、別の治療と同時投与される。いくつかの態様において、細胞は、1つまたは複数の追加の治療剤の前に投与される。いくつかの態様において、細胞は、1つまたは複数の追加の治療剤の後に投与される。いくつかの態様において、1つまたは複数の追加の作用物質には、例えば、持続を増強するための、IL-2などのサイトカインが含まれる。いくつかの態様において、方法は、化学療法剤の投与を含む。

いくつかの態様において、方法は、例えば、投与の前に腫瘍負荷を低減させるための、化学療法剤、例えば、コンディショニング化学療法剤の投与を含む。

対象を免疫枯渇（例えば、リンパ球枯渇）療法でプレコンディショニングすることは、いくつかの対象において、養子細胞療法（ACT）の効果を改善することができる。

したがって、いくつかの態様において、方法は、細胞療法の開始前に対象に、プレコンディショニング剤、例えば、リンパ球枯渇剤または化学療法剤、例えば、シクロホスファミド、フルダラビン、またはそれらの組み合わせを投与する工程を含む。例えば、対象は、細胞療法の開始の少なくとも2日前に、例えば、少なくとも3、4、5、6、または7日前に、プレコンディショニング剤を投与されてもよい。いくつかの態様において、対象は、細胞療法の開始の7日以内前に、例えば、6、5、4、3、または2日以内前に、プレコンディショニング剤を投与される。

いくつかの態様において、対象は、20 mg/kg～100 mg/kgまたは約20 mg/kg～100 mg/kg、例えば40 mg/kg～80 mg/kgまたは約40 mg/kg～80 mg/kgの用量のシクロホスファミドでプレコンディショニングされる。いくつかの局面において、対象は、60 mg/kgまたは約60 mg/kgのシクロホスファミドでプレコンディショニングされる。いくつかの態様において、シクロホスファミドは、単一用量で投与することができ、または、毎日、1日おき、もしくは2日おきに与えられる、複数の用量で投与することができる。いくつかの態様において、シクロホスファミドは、毎日1回、1または2日間投与される。いくつかの態様において、リンパ球枯渇剤がシクロホスファミドを含む場合、対象は、100 mg/m²～500 mg/m²または約100 mg/m²～500 mg/m²、例えば200 mg/m²～400 mg/m²もしくは約200 mg/m²～400 mg/m²、または250 mg/m²～350 mg/m²もしくは約250 mg/m²～350 mg/m²（両端の値を含む）の用量のシクロホスファミドを投与される。いくつかの例において、対象は、約300 mg/m²のシクロホスファミドを投与される。いくつかの態様において、シクロホスファミドは、単一用量で投与することができ、または、毎日、1日おき、もしくは2日おきに与えられる、複数の用量で投与することができる。いくつかの態様において、シクロホスファミドは、毎日、例えば1～5日間、例えば、3～5日間投与される。いくつかの例において、対象は、細胞療法の開始の前に、3日間毎日、約300 mg/m²のシクロホスファミドを投与される。

いくつかの態様において、リンパ球枯渇剤がフルダラビンを含む場合、対象は、1 mg/m²～100 mg/m²または約1 mg/m²～100 mg/m²、例えば10 mg/m²～75 mg/m²もしくは約10 mg/m²～75 mg/m²、15 mg/m²～50 mg/m²もしくは約15 mg/m²～50 mg/m²、20 mg/m²～40 mg/m²もしくは約20 mg/m²～40 mg/m²、または24 mg/m²～35 mg/m²もしくは約24 mg/m²～35 mg/m²（両端の値を含む）の用量のフルダラビンを投与される。いくつかの例において、対象は、約30 mg/m²のフルダラビンを投与される。いくつかの態様において、フルダラビンは、単一用量で投与することができ、または、毎日、1日おき、もしくは2日おきに与えられる、複数の用量で投与することができる。いくつかの態様において、フルダラビンは、毎日、例えば1～5日間、例えば、3～5日間投与される。いくつかの例において、対象は、細胞療法の開始の前に、3日間毎日、約30 mg/m²のフルダラビンを投与される。

いくつかの態様において、リンパ球枯渇剤は、シクロホスファミドとフルダラビンとの組み合わせなどの、作用物質の組み合わせを含む。したがって、作用物質の組み合わせは、本明細書に記載されるものなどの、任意の用量または投与スケジュールのシクロホスファミドと、本明細書に記載されるものなどの、任意の用量または投与スケジュールのフルダラビンとを含んでもよい。例えば、いくつかの局面において、対象は、最初のまたはその後の用量の前に、60 mg/kg（約2 g/m²）のシクロホスファミドと、3～5用量の25 mg/m²のフルダラビンとを投与される。

細胞の投与後に、操作された細胞集団の生物学的活性が、いくつかの態様において、例えば、多くの公知の方法のいずれかによって測定される。評価するパラメーターには、例えばイメージングによる、インビボでの、またはELISAもしくはフローサイトメトリーによる、エクスビボでの、操作されたかまたは天然のT細胞または他の免疫細胞の抗原に対する特異的結合が含まれる。ある特定の態様において、操作された細胞の標的細胞を破壊する能力は、例えば、Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009)およびHerman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)に記載されている細胞傷害アッセイなどの、任意の適している公知の方法を用いて測定することができる。ある特定の態様において、細胞の生物学的活性は、CD107a、IFNγ、IL-2、およびTNFなどの1つまたは複数のサイトカインの発現および/または分泌をアッセイすることによって測定される。いくつかの局面において、生物学的活性は、腫瘍負荷または荷重の低減などの、臨床転帰を評価することによって測定される。

ある特定の態様において、操作された細胞は、それらの治療効力または予防効力を増加させるように、任意の数の方法においてさらに改変される。例えば、集団により発現される操作されたCARは、ターゲティング部分に、直接的にまたはリンカーを通して間接的にのいずれかで、コンジュゲートさせることができる。化合物、例えばCARをターゲティング部分にコンジュゲートする実践は、公知である。例えば、Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995)および米国特許第5,087,616号を参照されたい。

いくつかの態様において、細胞は、併用処置の一部として、例えば、別の治療的介入、例えば、抗体または改変された細胞または受容体または作用物質、例えば、細胞傷害剤または治療剤と同時にまたは逐次的に、任意の順序で投与される。細胞は、いくつかの態様において、同時にまたは任意の順序で逐次的にのいずれかで、1つもしくは複数の追加の治療剤と共に、または別の治療的介入に関連して、同時投与される。いくつかの状況において、細胞は、細胞集団が1つまたは複数の追加の治療剤の効果を増強するか、またはその逆であるように、時間的に十分に近く、別の治療と同時投与される。いくつかの態様において、細胞は、1つまたは複数の追加の治療剤の前に投与される。いくつかの態様において、細胞は、1つまたは複数の追加の治療剤の後に投与される。いくつかの態様において、1つまたは複数の追加の作用物質には、例えば、持続を増強するための、IL-2などのサイトカインが含まれる。

いくつかの態様において、細胞の用量は、提供される方法に従って、および/または提供される製造物品もしくは組成物に従って、対象に投与される。いくつかの態様において、用量のサイズまたはタイミングは、対象における特定の疾患または状態の相関関係として決定される。場合によっては、特定の疾患のための用量のサイズまたはタイミングは、提供される説明を考慮して、経験的に決定されてもよい。

いくつかの態様において、細胞の用量は、2×10⁵個または約2×10⁵個の細胞/kgから、2×10⁶個または約2×10⁶個の細胞/kg、例えば、4×10⁵個もしくは約4×10⁵個の細胞/kgから、1×10⁶個もしくは約1×10⁶個の細胞/kg、または6×10⁵個もしくは約6×10⁵個の細胞/kgから、8×10⁵個もしくは約8×10⁵個の細胞/kgを含む。いくつかの態様において、細胞の用量は、対象のキログラム体重当たり2×10⁵個以下の細胞（例えば、CAR発現細胞などの抗原発現細胞）（細胞/kg）、例えば、3×10⁵もしくは約3×10⁵細胞/kg以下、4×10⁵もしくは約4×10⁵細胞/kg以下、5×10⁵もしくは約5×10⁵細胞/kg以下、6×10⁵もしくは約6×10⁵細胞/kg以下、7×10⁵もしくは約7×10⁵細胞/kg以下、8×10⁵もしくは約8×10⁵細胞/kg以下、9×10⁵もしくは約9×10⁵細胞/kg以下、1×10⁶もしくは約1×10⁶細胞/kg以下、または2×10⁶もしくは約2×10⁶細胞/kg以下を含む。いくつかの態様において、細胞の用量は、対象のキログラム体重当たり少なくとも2×10⁵個または少なくとも約2×10⁵個または2×10⁵個または約2×10⁵個の細胞（例えば、CAR発現細胞などの抗原発現細胞）（細胞/kg）、例えば、少なくとも3×10⁵もしくは少なくとも約3×10⁵もしくは3×10⁵もしくは約3×10⁵細胞/kg、少なくとも4×10⁵もしくは少なくとも約4×10⁵もしくは4×10⁵もしくは約4×10⁵細胞/kg、少なくとも5×10⁵もしくは少なくとも約5×10⁵もしくは5×10⁵もしくは約5×10⁵細胞/kg、少なくとも6×10⁵もしくは少なくとも約6×10⁵もしくは6×10⁵もしくは約6×10⁵細胞/kg、少なくとも7×10⁵もしくは少なくとも約7×10⁵もしくは7×10⁵もしくは約7×10⁵細胞/kg、少なくとも8×10⁵もしくは少なくとも約8×10⁵もしくは8×10⁵もしくは約8×10⁵細胞/kg、少なくとも9×10⁵もしくは少なくとも約9×10⁵もしくは9×10⁵もしくは約9×10⁵細胞/kg、少なくとも1×10⁶もしくは少なくとも約1×10⁶もしくは1×10⁶もしくは約1×10⁶細胞/kg、または少なくとも2×10⁶もしくは少なくとも約2×10⁶もしくは2×10⁶もしくは約2×10⁶細胞/kgを含む。

ある特定の態様において、細胞、または細胞のサブタイプの個々の集団は、10万または約10万から、1000億または約1000億個の細胞の範囲で、および/または対象の体重のキログラム当たりその量の細胞で、例えば、10万または約10万から、500億または約500億個の細胞（例えば、500万もしくは約500万個の細胞、2500万もしくは約2500万個の細胞、5億もしくは約5億個の細胞、10億もしくは約10億個の細胞、50億もしくは約50億個の細胞、200億もしくは約200億個の細胞、300億もしくは約300億個の細胞、400億もしくは約400億個の細胞、または前述の値のうちの任意の2つによって規定される範囲）、100万または約100万から、500億または約500億個の細胞（例えば、500万もしくは約500万個の細胞、2500万もしくは約2500万個の細胞、5億もしくは約5億個の細胞、10億もしくは約10億個の細胞、50億もしくは約50億個の細胞、200億もしくは約200億個の細胞、300億もしくは約300億個の細胞、400億もしくは約400億個の細胞、または前述の値のうちの任意の2つによって規定される範囲）、例えば1000万または約1000万から、1000億または約1000億個の細胞（例えば、2000万もしくは約2000万個の細胞、3000万もしくは約3000万個の細胞、4000万もしくは約4000万個の細胞、6000万もしくは約6000万個の細胞、7000万もしくは約7000万個の細胞、8000万もしくは約8000万個の細胞、9000万もしくは約9000万個の細胞、100億もしくは約100億個の細胞、250億もしくは約250億個の細胞、500億もしくは約500億個の細胞、750億もしくは約750億個の細胞、900億もしくは約900億個の細胞、または前述の値のうちの任意の2つによって規定される範囲）など、場合によっては、1億または約1億から、500億または約500億個の細胞（例えば、1億2000万もしくは約1億2000万個の細胞、2億5000万もしくは約2億5000万個の細胞、3億5000万もしくは約3億5000万個の細胞、6億5000万もしくは約6億5000万個の細胞、8億もしくは約8億個の細胞、9億もしくは約9億個の細胞、30億もしくは約30億個の細胞、300億もしくは約300億個の細胞、450億もしくは約450億個の細胞）、またはこれらの範囲の間にある任意の値、および/または対象の体重のキログラム当たりで、対象に投与される。投薬量は、疾患もしくは障害および/または患者および/または他の処置に特有の属性に応じて変動し得る。いくつかの態様において、そのような値は、組換え受容体発現細胞の数を指し；他の態様において、それらは、投与されるT細胞またはPBMCまたは全細胞の数を指す。

いくつかの態様において、例えば、対象がヒトである場合、用量は、約5×10⁸個よりも少ない全組換え受容体（例えば、CAR）発現細胞、T細胞、または末梢血単核細胞（PBMC）、例えば、1×10⁶または約1×10⁶個から、5×10⁸または約5×10⁸個の範囲のそのような細胞、例えば、2×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、1.5×10⁸、もしくは5×10⁸個、または約2×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、1.5×10⁸、もしくは5×10⁸個の合計のそのような細胞、または前述の値のうちの任意の2つの間の範囲を含む。いくつかの態様において、例えば、対象がヒトである場合、用量は、1×10⁶または約1×10⁶個よりも多い全組換え受容体（例えば、CAR）発現細胞、T細胞、または末梢血単核細胞（PBMC）、かつ2×10⁹または約2×10⁹個よりも少ない全組換え受容体（例えば、CAR）発現細胞、T細胞、または末梢血単核細胞（PBMC）、例えば、2.5×10⁷または約2.5×10⁷個から、1.2×10⁹または約1.2×10⁹個の範囲のそのような細胞、例えば、2.5×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、1.5×10⁸、8×10⁸、もしくは1.2×10⁹個、または約2.5×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、1.5×10⁸、8×10⁸、もしくは1.2×10⁹個の合計のそのような細胞、または前述の値のうちの任意の2つの間の範囲を含む。

いくつかの態様において、遺伝子操作された細胞の用量は、1×10⁵もしくは約1×10⁵個から、5×10⁸もしくは約5×10⁸個の全CAR発現（CAR⁺）T細胞、1×10⁵もしくは約1×10⁵個から、2.5×10⁸もしくは約2.5×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、1×10⁵もしくは約1×10⁵個から、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、1×10⁵もしくは約1×10⁵個から、5×10⁷もしくは約5×10⁷個の全CAR⁺ T細胞、1×10⁵もしくは約1×10⁵個から、2.5×10⁷もしくは約2.5×10⁷個の全CAR⁺ T細胞、1×10⁵もしくは約1×10⁵個から、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の全CAR⁺ T細胞、1×10⁵もしくは約1×10⁵個から、5×10⁶もしくは約5×10⁶個の全CAR⁺ T細胞、1×10⁵もしくは約1×10⁵個から、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個の全CAR⁺ T細胞、1×10⁵もしくは約1×10⁵個から、1×10⁶もしくは約1×10⁶個の全CAR⁺ T細胞、1×10⁶もしくは約1×10⁶個から、5×10⁸もしくは約5×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、1×10⁶もしくは約1×10⁶個から、2.5×10⁸もしくは約2.5×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、1×10⁶もしくは約1×10⁶個から、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、1×10⁶もしくは約1×10⁶個から、5×10⁷もしくは約5×10⁷個の全CAR⁺ T細胞、1×10⁶もしくは約1×10⁶個から、2.5×10⁷もしくは約2.5×10⁷個の全CAR⁺ T細胞、1×10⁶もしくは約1×10⁶個から、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の全CAR⁺ T細胞、1×10⁶もしくは約1×10⁶個から、5×10⁶もしくは約5×10⁶個の全CAR⁺ T細胞、1×10⁶もしくは約1×10⁶個から、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個の全CAR⁺ T細胞、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個から、5×10⁸もしくは約5×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個から、2.5×10⁸もしくは約2.5×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個から、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個から、5×10⁷もしくは約5×10⁷個の全CAR⁺ T細胞、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個から、2.5×10⁷もしくは約2.5×10⁷個の全CAR⁺ T細胞、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個から、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の全CAR⁺ T細胞、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個から、5×10⁶もしくは約5×10⁶個の全CAR⁺ T細胞、5×10⁶もしくは約5×10⁶個から、5×10⁸もしくは約5×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、5×10⁶もしくは約5×10⁶個から、2.5×10⁸もしくは約2.5×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、5×10⁶もしくは約5×10⁶個から、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、5×10⁶もしくは約5×10⁶個から、5×10⁷もしくは約5×10⁷個の全CAR⁺ T細胞、5×10⁶もしくは約5×10⁶個から、2.5×10⁷もしくは約2.5×10⁷個の全CAR⁺ T細胞、5×10⁶もしくは約5×10⁶個から、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の全CAR⁺ T細胞、1×10⁷もしくは約1×10⁷個から、5×10⁸もしくは約5×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、1×10⁷もしくは約1×10⁷個から、2.5×10⁸もしくは約2.5×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、1×10⁷もしくは約1×10⁷個から、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、1×10⁷もしくは約1×10⁷個から、5×10⁷もしくは約5×10⁷個の全CAR⁺ T細胞、1×10⁷もしくは約1×10⁷個から、2.5×10⁷もしくは約2.5×10⁷個の全CAR⁺ T細胞、2.5×10⁷もしくは約2.5×10⁷個から、5×10⁸もしくは約5×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、2.5×10⁷もしくは約2.5×10⁷個から、2.5×10⁸もしくは約2.5×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、2.5×10⁷もしくは約2.5×10⁷個から、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、2.5×10⁷もしくは約2.5×10⁷個から、5×10⁷もしくは約5×10⁷個の全CAR⁺ T細胞、5×10⁷もしくは約5×10⁷個から、5×10⁸もしくは約5×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、5×10⁷もしくは約5×10⁷個から、2.5×10⁸もしくは約2.5×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、5×10⁷もしくは約5×10⁷個から、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、1×10⁸もしくは約1×10⁸個から、5×10⁸もしくは約5×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、1×10⁸もしくは約1×10⁸個から、2.5×10⁸もしくは約2.5×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、または2.5×10⁸もしくは約2.5×10⁸個から、5×10⁸もしくは約5×10⁸個の全CAR⁺ T細胞を含む。いくつかの態様において、遺伝子操作された細胞の用量は、2.5×10⁷または約2.5×10⁷個から、1.5×10⁸または約1.5×10⁸個の全CAR⁺ T細胞、例えば、5×10⁷または約5×10⁷個から、1×10⁸または約1×10⁸個の全CAR⁺ T細胞を含む。

いくつかの態様において、遺伝子操作された細胞の用量は、少なくとも1×10⁵もしくは少なくとも約1×10⁵個のCAR⁺細胞、少なくとも2.5×10⁵もしくは少なくとも約2.5×10⁵個のCAR⁺細胞、少なくとも5×10⁵もしくは少なくとも約5×10⁵個のCAR⁺細胞、少なくとも1×10⁶もしくは少なくとも約1×10⁶個のCAR⁺細胞、少なくとも2.5×10⁶もしくは少なくとも約2.5×10⁶個のCAR⁺細胞、少なくとも5×10⁶もしくは少なくとも約5×10⁶個のCAR⁺細胞、少なくとも1×10⁷もしくは少なくとも約1×10⁷個のCAR⁺細胞、少なくとも2.5×10⁷もしくは少なくとも約2.5×10⁷個のCAR⁺細胞、少なくとも5×10⁷もしくは少なくとも約5×10⁷個のCAR⁺細胞、少なくとも1×10⁸もしくは少なくとも約1×10⁸個のCAR⁺細胞、少なくとも1.5×10⁸もしくは少なくとも約1.5×10⁸個のCAR⁺細胞、少なくとも2.5×10⁸もしくは少なくとも約2.5×10⁸個のCAR⁺細胞、または少なくとも5×10⁸もしくは少なくとも約5×10⁸個のCAR⁺細胞を含む。

いくつかの態様において、細胞療法は、1×10⁵もしくは約1×10⁵個から、5×10⁸もしくは約5×10⁸個の全組換え受容体発現細胞、全T細胞、もしくは全末梢血単核細胞（PBMC）、5×10⁵もしくは約5×10⁵個から、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の全組換え受容体発現細胞、全T細胞、もしくは全末梢血単核細胞（PBMC）、または1×10⁶もしくは約1×10⁶個から、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の全組換え受容体発現細胞、全T細胞、もしくは全末梢血単核細胞（PBMC）（それぞれ両端の値を含む）の細胞数を含む用量の投与を含む。いくつかの態様において、細胞療法は、少なくとも1×10⁵または少なくとも約1×10⁵個の全組換え受容体発現細胞、全T細胞、または全末梢血単核細胞（PBMC）、例えば、少なくとも1×10⁶または少なくとも1×10⁶個、少なくとも1×10⁷または少なくとも約1×10⁷個、少なくとも1×10⁸または少なくとも約1×10⁸個のそのような細胞、の細胞数を含む細胞の用量の投与を含む。いくつかの態様において、数は、CD3⁺またはCD8⁺、場合によってはまた組換え受容体発現（例えば、CAR⁺）細胞の総数に関する。いくつかの態様において、細胞療法は、1×10⁵もしくは約1×10⁵個から、5×10⁸もしくは約5×10⁸個のCD3⁺もしくはCD8⁺全T細胞またはCD3⁺もしくはCD8⁺組換え受容体発現細胞、5×10⁵もしくは約5×10⁵個から、1×10⁷もしくは約1×10⁷個のCD3⁺もしくはCD8⁺全T細胞またはCD3⁺もしくはCD8⁺組換え受容体発現細胞、または1×10⁶もしくは約1×10⁶個から、1×10⁷もしくは約1×10⁷個のCD3⁺もしくはCD8⁺全T細胞またはCD3⁺もしくはCD8⁺組換え受容体発現細胞（それぞれ両端の値を含む）の細胞数を含む用量の投与を含む。いくつかの態様において、細胞療法は、1×10⁵もしくは約1×10⁵個から、5×10⁸もしくは約5×10⁸個の全CD3⁺/CAR⁺もしくはCD8⁺/CAR⁺細胞、5×10⁵もしくは約5×10⁵個から、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の全CD3⁺/CAR⁺もしくはCD8⁺/CAR⁺細胞、または1×10⁶もしくは約1×10⁶個から、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の全CD3⁺/CAR⁺もしくはCD8⁺/CAR⁺細胞（それぞれ両端の値を含む）の細胞数を含む用量の投与を含む。

いくつかの態様において、用量のT細胞には、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、またはCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞が含まれる。いくつかの態様において、用量のT細胞には、ヒトCD4+ T細胞、ヒトCD8+ T細胞、またはヒトCD4+ T細胞およびヒトCD8+ T細胞が含まれる。

いくつかの態様において、例えば、対象がヒトである場合、CD4⁺ T細胞およびCD8⁺ T細胞を含む用量において含む、用量のCD8⁺ T細胞は、1×10⁶または約1×10⁶個から、5×10⁸または約5×10⁸個の全組換え受容体（例えば、CAR）発現CD8⁺細胞、例えば、5×10⁶または約5×10⁶個から、1×10⁸または約1×10⁸個の範囲のそのような細胞、例えば、1×10⁷、2.5×10⁷、5×10⁷、7.5×10⁷、1×10⁸、1.5×10⁸、もしくは5×10⁸個の合計のそのような細胞、または前述の値のうちの任意の2つの間の範囲を含む。いくつかの態様において、患者は、複数の用量を投与され、用量の各々または全用量は、前述の値のうちの任意内であることができる。いくつかの態様において、細胞の用量は、1×10⁷もしくは約1×10⁷個から、0.75×10⁸もしくは約0.75×10⁸個の全組換え受容体発現CD8⁺ T細胞、1×10⁷もしくは約1×10⁷個から、5×10⁷もしくは約5×10⁷個の全組換え受容体発現CD8⁺ T細胞、1×10⁷もしくは約1×10⁷個から、0.25×10⁸もしくは約0.25×10⁸個の全組換え受容体発現CD8⁺ T細胞（それぞれ両端の値を含む）の投与を含む。いくつかの態様において、細胞の用量は、1×10⁷、2.5×10⁷、5×10⁷、7.5×10⁷、1×10⁸、1.5×10⁸、2.5×10⁸、もしくは5×10⁸個、または約1×10⁷、2.5×10⁷、5×10⁷、7.5×10⁷、1×10⁸、1.5×10⁸、2.5×10⁸、もしくは5×10⁸個の全組換え受容体発現CD8⁺ T細胞の投与を含む。

いくつかの態様において、細胞、例えば、組換え受容体発現T細胞の用量は、単一用量として対象に投与されるか、または2週間、1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、1年、もしくはそれよりも長い期間内に一度のみ投与される。養子細胞療法の状況において、所与の「用量」の投与は、単一組成物および/または単一の不断の投与として、例えば、単回注射または連続注入としての所与の量または数の細胞の投与を包含し、かつまた、複数の個々の組成物または注入物において、指定された期間にわたって、例えば3日以内にわたって提供される、分割用量としてのまたは複数の組成物としての、所与の量または数の細胞の投与も包含する。したがって、いくつかの状況において、用量は、単一の時点で与えられるかまたは開始される、指定された数の細胞の単回投与または連続投与である。しかし、いくつかの状況において、用量は、3日以内の期間にわたる、例えば3日間もしくは2日間の1日に1回の複数の注射もしくは注入において、または一日の期間にわたる複数の注入によって、投与される。

したがって、いくつかの局面において、用量の細胞は、単一の薬学的組成物において投与される。いくつかの態様において、用量の細胞は、用量の細胞をひとまとめにして含有する、複数の組成物において投与される。

いくつかの態様において、「分割用量」という用語は、1日よりも多くにわたって投与されるように分割される用量を指す。このタイプの投薬は、本発明によって包含され、単一用量とみなされる。

したがって、細胞の用量は、分割用量、例えば、経時的に投与される分割用量として投与されてもよい。例えば、いくつかの態様において、用量は、対象に、2日にわたってまたは3日にわたって投与されてもよい。分割投薬のための例示的な方法は、用量の25％を1日目に投与すること、および用量の残りの75％を2日目に投与することを含む。他の態様において、用量の33％が1日目に投与され、残りの67％が2日目に投与されてもよい。いくつかの局面において、用量の10％が1日目に投与され、用量の30％が2日目に投与され、用量の60％が3日目に投与される。いくつかの態様において、分割用量は、3日よりも多くにわたっては広がらない。

いくつかの態様において、細胞の用量は、各々が用量のいくつかの細胞を含有する、複数の組成物または溶液、例えば第1および第2、任意でそれよりも多くの投与によって、投与されてもよい。いくつかの局面において、各々が異なる細胞の集団および/またはサブタイプを含有する、複数の組成物が、別々にまたは独立して、任意である特定の期間内に投与される。例えば、細胞の集団またはサブタイプは、それぞれ、CD8⁺ T細胞およびCD4⁺ T細胞、ならびに/またはそれぞれ、CD8+およびCD4+が濃縮された集団、例えば、各々が組換え受容体を発現するように遺伝子操作された細胞を個々に含むCD4+ T細胞および/もしくはCD8+ T細胞を含むことができる。いくつかの態様において、用量の投与は、ある用量のCD8+ T細胞またはある用量のCD4+ T細胞を含む第1の組成物の投与、および用量の残りのCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を含む第2の組成物の投与を含む。

いくつかの態様において、組成物または用量の投与、例えば、複数の細胞組成物の投与は、細胞組成物の別々の投与を含む。いくつかの局面において、別々の投与は、同時にまたは逐次的に、任意の順序で実施される。いくつかの態様において、用量は、第1の組成物および第2の組成物を含み、第1の組成物および第2の組成物は、0もしくは約0から、12もしくは約12時間離れて、0もしくは約0から、6もしくは約6時間離れて、または0もしくは約0から、2もしくは約2時間離れて投与される。いくつかの態様において、第1の組成物の投与の開始および第2の組成物の投与の開始は、2時間もしくは約2時間以下、1時間もしくは約1時間以下、または30分もしくは約30分以下離れて、15分もしくは約15分以下、10分もしくは約10分以下、または5分もしくは約5分以下離れて実施される。いくつかの態様において、第1の組成物の投与の開始および/または完了、ならびに第2の組成物の投与の完了および/または開始は、2時間もしくは約2時間以下、1時間もしくは約1時間以下、または30分もしくは約30分以下離れて、15分もしくは約15分以下、10分もしくは約10分以下、または5分もしくは約5分以下離れて実施される。

いくつかの組成物において、第1の組成物、例えば、用量の第1の組成物は、CD4+ T細胞を含む。いくつかの組成物において、第1の組成物、例えば、用量の第1の組成物は、CD8+ T細胞を含む。いくつかの態様において、第1の組成物は、第2の組成物の前に投与される。

いくつかの態様において、細胞の用量または組成物は、組換え受容体を発現するCD4+細胞対組換え受容体を発現するCD8+細胞の、および/またはCD4+細胞対CD8+細胞の、規定された比または標的比を含み、該比は任意で、およそ1:1であるか、またはおよそ1:3～およそ3:1、例えばおよそ1:1である。いくつかの局面において、異なる細胞集団の標的比または所望の比（例えば、CD4+:CD8+比またはCAR+CD4+:CAR+CD8+比、例えば1:1）を有する組成物または用量の投与は、集団の一方を含有する細胞組成物の投与、および次いで、集団の他方を含む別々の細胞組成物の投与を含み、該投与は、標的比もしくは所望の比、またはおよそ標的比もしくは所望の比である。いくつかの局面において、規定された比での細胞の用量または組成物の投与は、T細胞療法の改善された増大、持続、および/または抗腫瘍活性をもたらす。

いくつかの態様において、対象は、細胞の複数の用量、例えば、2つ以上の用量または複数の連続した用量を受ける。いくつかの態様において、2つの用量が、対象に投与される。いくつかの態様において、対象は、連続した用量を受け、例えば、第2の用量は、第1の用量のおよそ4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または21日後に投与される。いくつかの態様において、複数の連続した用量は、1つまたは複数の追加の用量が、連続した用量の投与後に投与されるように、第1の用量後に投与される。いくつかの局面において、追加の用量で対象に投与される細胞数は、第1の用量および/または連続した用量と同じであるか、または類似している。いくつかの態様において、1つまたは複数の追加の用量は、以前の用量よりも大きい。

いくつかの局面において、第1のおよび/または連続した用量のサイズは、1つまたは複数の判断基準、例えば、以前の処置、例えば化学療法に対する対象の応答、対象における疾患負荷、例えば、腫瘍荷重、かさ、サイズ、もしくは程度、転移の範囲もしくはタイプ、病期、ならびに/または、対象が毒性転帰、例えば、CRS、マクロファージ活性化症候群、腫瘍崩壊症候群、神経毒性、および/もしくは、投与される細胞および/もしくは組換え受容体に対する宿主免疫応答を発症する可能性もしくは発生率に基づいて決定される。

いくつかの局面において、第1の用量の投与と連続した用量の投与との間の時間は、約9～約35日、約14～約28日、または15～27日である。いくつかの態様において、連続した用量の投与は、第1の用量の投与後約14日よりも長く、かつその後約28日よりも短い時点である。いくつかの局面において、第1の用量と連続した用量との間の時間は、約21日である。いくつかの態様において、1つまたは複数の追加の用量、例えば、連続した用量は、連続した用量の投与後に投与される。いくつかの局面において、1つまたは複数の追加の連続した用量は、以前の用量の投与の、少なくとも14日かつ約28日未満後に投与される。いくつかの局面において、追加の用量は、以前の用量の約14日未満後に、例えば、以前の用量の4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13日後に投与される。いくつかの態様において、いかなる用量も、以前の用量の約14日よりも短い後には投与されず、かつ/またはいかなる用量も、以前の用量の約28日よりも長い後には投与されない。

いくつかの態様において、細胞、例えば、組換え受容体発現細胞の用量は、T細胞の第1の用量およびT細胞の連続した用量を含む、2つの用量（例えば、二重用量）を含み、第1の用量および第2の用量の一方または両方は、T細胞の分割用量の投与を含む。

いくつかの態様において、細胞の用量は、一般に、疾患負荷を低減させるのに有効であるように十分大きい。

いくつかの態様において、細胞は、いくつかの局面では細胞もしくは細胞タイプの所望の用量もしくは数、および/または細胞タイプの所望の比を含む、所望の投薬量で投与される。したがって、細胞の投薬量は、いくつかの態様において、細胞の総数（またはkg体重当たりの数）、および個々の集団またはサブタイプの所望の比、例えばCD4+対CD8+の比に基づく。いくつかの態様において、細胞の投薬量は、個々の集団における細胞のまたは個々の細胞タイプの、所望の総数（または体重のkg当たりの数）に基づく。いくつかの態様において、投薬量は、そのような特徴の組み合わせ、例えば、全細胞の所望の数、所望の比、および個々の集団における細胞の所望の総数に基づく。

いくつかの態様において、CD8⁺ T細胞およびCD4⁺ T細胞などの、細胞の集団またはサブタイプは、T細胞の所望の用量などの全細胞の所望の用量で、またはその許容される差異の範囲内で投与される。いくつかの局面において、所望の用量は、所望の細胞数、または細胞が投与される対象の体重の単位当たりの所望の細胞数、例えば、細胞/kgである。いくつかの局面において、所望の用量は、最小の細胞数、または体重の単位当たりの最小の細胞数であるか、またはそれを上回る。いくつかの局面において、所望の用量で投与される全細胞の中で、個々の集団またはサブタイプは、所望のアウトプット比（例えば、CD4⁺対CD8⁺の比）でまたはその近くで、例えば、そのような比のある特定の許容される差異または誤差の範囲内で存在する。

いくつかの態様において、細胞は、細胞の個々の集団またはサブタイプの1つまたは複数の所望の用量、例えば、CD4+細胞の所望の用量および/またはCD8+細胞の所望の用量で、またはその許容される差異の範囲内で投与される。いくつかの局面において、所望の用量は、サブタイプもしくは集団の細胞の所望の数、または細胞が投与される対象の体重の単位当たりのそのような細胞の所望の数、例えば、細胞/kgである。いくつかの局面において、所望の用量は、集団もしくはサブタイプの細胞の最小の数、または体重の単位当たりの集団もしくはサブタイプの細胞の最小の数であるか、またはそれを上回る。

したがって、いくつかの態様において、投薬量は、全細胞の所望の固定された用量および所望の比に基づき、かつ/または個々のサブタイプもしくは亜集団の1つもしくは複数、例えば、各々の所望の固定された用量に基づく。したがって、いくつかの態様において、投薬量は、T細胞の所望の固定されたもしくは最小の用量、およびCD4⁺細胞対CD8⁺細胞の所望の比に基づき、かつ/またはCD4⁺細胞および/もしくはCD8⁺細胞の所望の固定されたもしくは最小の用量に基づく。

いくつかの態様において、細胞は、CD4+細胞およびCD8+細胞またはサブタイプなどの、複数の細胞集団またはサブタイプの所望のアウトプット比で、またはその許容される範囲内で投与される。いくつかの局面において、所望の比は、特定の比であることができ、または比の範囲であることができ、例えば、いくつかの態様において、所望の比（例えば、CD4⁺細胞対CD8⁺細胞の比）は、5:1もしくは約5:1から、5:1もしくは約5:1（もしくは約1:5よりも大きく、かつ約5:1よりも小さい）、または1:3もしくは約1:3から、3:1もしくは約3:1（もしくは約1:3よりも大きく、かつ約3:1よりも小さい）、例えば、2:1または約2:1から、1:5または約1:5（または約1:5よりも大きく、かつ約2:1よりも小さい）、例えば、5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、もしくは1:5、または約5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、もしくは1:5である。いくつかの局面において、許容される差異は、所望の比の約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％以内であり、これらの範囲の間の任意の値を含む。

いずれかの態様のいくつかにおいて、細胞の数および/または濃度は、組換え受容体（例えば、CAR）発現細胞の数を指す。他の態様において、細胞の数および/または濃度は、投与されるすべての細胞、T細胞、または末梢血単核細胞（PBMC）の数または濃度を指す。

いくつかの局面において、用量のサイズは、1つまたは複数の判断基準、例えば、以前の処置、例えば化学療法に対する対象の応答、対象における疾患負荷、例えば、腫瘍荷重、かさ、サイズ、もしくは程度、転移の範囲もしくはタイプ、病期、ならびに/または、対象が毒性転帰、例えば、CRS、マクロファージ活性化症候群、腫瘍崩壊症候群、神経毒性、および/もしくは、投与される細胞および/もしくは組換え受容体に対する宿主免疫応答を発症する可能性もしくは発生率に基づいて決定される。

いくつかの態様において、方法はまた、キメラ抗原受容体（CAR）を発現する細胞の1つもしくは複数の追加の用量および/またはリンパ球枯渇療法を投与する工程も含み、かつ/または、方法の1つまたは複数の工程は反復される。いくつかの態様において、1つまたは複数の追加の用量は、初期用量と同じである。いくつかの態様において、1つまたは複数の追加の用量は、初期用量とは異なり、例えば、初期用量よりも高く、例えば2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、もしくは10倍、またはそれ以上高いか、あるいは、初期用量よりも低く、例えばより高いなど、例えば2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、もしくは10倍、またはそれ以上低い。いくつかの態様において、1つまたは複数の追加の用量の投与は、初期処置または任意の以前の処置に対する対象の応答、対象における疾患負荷、例えば、腫瘍荷重、かさ、サイズ、もしくは程度、転移の範囲もしくはタイプ、病期、ならびに/または、対象が毒性転帰、例えば、CRS、マクロファージ活性化症候群、腫瘍崩壊症候群、神経毒性、および/もしくは、投与される細胞に対する宿主免疫応答を発症する可能性もしくは発生率に基づいて決定される。

いくつかの態様では、本明細書で提供される操作された細胞または組成物を投与された対象において、がんまたは腫瘍の体積またはサイズは、操作された細胞または組成物を投与されなかった対象におけるものと比較して低減される。いくつかの態様では、本明細書で提供される操作された細胞または組成物を投与された対象において、対象の生存は、操作された細胞または組成物を投与されなかった対象におけるものと比較して延長される。

VI. 薬学的組成物および製剤
組成物の中には、例えば養子細胞療法用の、投与のための薬学的組成物および製剤がある。いくつかの態様では、組換え抗原受容体、例えばCARで操作された細胞を含む細胞の用量が、薬学的組成物または製剤などの、組成物または製剤として提供される。そのような組成物は、提供される方法に従って、および/または提供される製造物品もしくは組成物と共に、例えば、疾患、状態、および障害の予防もしくは処置において、または検出法、診断法、および予後判定法において使用することができる。

「薬学的製剤」という用語は、その中に含有される活性成分の生物学的活性を有効にするような形態であり、かつ製剤が投与される対象に対して許容できないほど毒性である、いかなる追加の構成要素も含有しない、調製物を指す。

「薬学的に許容される担体」とは、対象に対して非毒性である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または保存剤が含まれるが、それらに限定されない。

いくつかの局面において、担体の選択は、一部には、特定の細胞もしくは作用物質によって、および/または投与の方法によって決定される。したがって、様々な適している製剤がある。例えば、薬学的組成物は、保存剤を含有することができる。適している保存剤には、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、および塩化ベンザルコニウムが含まれ得る。いくつかの局面において、2種類以上の保存剤の混合物が用いられる。保存剤またはその混合物は、典型的には、総組成物の重量で約0.0001％～約2％の量で存在する。担体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)によって記載されている。薬学的に許容される担体は、一般に、使用される投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、以下を含むが、それらに限定されない：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；およびm-クレゾールなど）；低分子量（約10残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；EDTAなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質錯体）；ならびに/またはポリエチレングリコール（PEG）などの非イオン性界面活性剤。

緩衝剤は、いくつかの局面において、組成物中に含まれる。適している緩衝剤には、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、ならびに様々な他の酸および塩が含まれる。いくつかの局面において、2種類以上の緩衝剤の混合物が用いられる。緩衝剤またはその混合物は、典型的には、総組成物の重量で約0.001％～約4％の量で存在する。投与可能な薬学的組成物を調製するための方法は、公知である。例示的な方法は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed.(May 1, 2005)に、より詳細に記載されている。

製剤または組成物はまた、細胞または作用物質で予防されるかまたは処置される特定の適応症、疾患、または状態に有用な1種類よりも多い活性成分を含有してもよく、それぞれの活性は、互いに有害な影響を及ぼさない。そのような活性成分は、意図される目的で有効である量での組み合わせで、適切に存在する。したがって、いくつかの態様において、薬学的組成物は、他の薬学的に活性を有する作用物質または薬物、例えば化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、パクリタクセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどをさらに含む。いくつかの態様において、作用物質または細胞は、塩、例えば、薬学的に許容される塩の形態で投与される。適している薬学的に許容される酸付加塩には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸、および硫酸などの無機酸、ならびに酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、およびアリールスルホン酸、例えば、p-トルエンスルホン酸などの有機酸に由来するものが含まれる。

薬学的組成物は、いくつかの態様において、疾患または状態を処置するかまたは予防するのに有効な量、例えば、治療的に有効な量または予防的に有効な量で、作用物質または細胞を含有する。治療効力または予防効力は、いくつかの態様において、処置される対象の定期的な評価によってモニタリングされる。状態に応じた、数日またはそれよりも長くにわたる反復投与については、疾患症状の所望の抑制が起こるまで、処置が反復される。しかし、他の投薬レジメンが有用である可能性があり、決定され得る。所望の投薬量は、組成物の単回ボーラス投与によって、組成物の複数回ボーラス投与によって、または組成物の連続注入投与によって送達することができる。

作用物質または細胞は、任意の適している手段によって、例えば、ボーラス注入によって、注射、例えば、静脈内注射もしくは皮下注射、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、結膜下（subconjectval）注射、結膜下（subconjuntival）注射、テノン嚢下注射、眼球後注射、眼球周囲注射、または後強膜近傍送達によって投与され得る。いくつかの態様において、それらは、非経口投与、肺内投与、および鼻腔内投与によって、ならびに局所処置のために望まれる場合は、病巣内投与によって投与される。非経口注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与が含まれる。いくつかの態様において、所与の用量は、細胞または作用物質の単回ボーラス投与によって投与される。いくつかの態様において、それは、例えば、3日以内の期間にわたる、細胞もしくは作用物質の複数回ボーラス投与によって、または細胞もしくは作用物質の連続注入投与によって投与される。

疾患の予防または処置のために、適切な投薬量は、処置されるべき疾患のタイプ、1つまたは複数の作用物質のタイプ、細胞または組換え受容体のタイプ、疾患の重症度および経過、作用物質または細胞が予防目的で投与されるかまたは治療目的で投与されるか、以前の治療、対象の病歴および作用物質または細胞に対する応答、ならびに主治医の裁量に依存し得る。組成物は、いくつかの態様において、一度にまたは一連の処置にわたって、対象に適切に投与される。

細胞または作用物質は、標準的な投与技法、製剤、および/またはデバイスを用いて投与されてもよい。組成物の保管および投与のために、シリンジおよびバイアルなどの、製剤およびデバイスが提供される。細胞に関して、投与は、自己または異種であることができる。いくつかの局面において、細胞は、ある対象から単離され、操作されて、同じ対象に投与される。他の局面において、細胞は、1つの対象から単離され、操作されて、別の対象に投与される。例えば、免疫応答性細胞または前駆体を、1つの対象から取得して、同じ対象または適合性を有する異なる対象に投与することができる。末梢血由来の免疫応答性細胞またはそれらの子孫（例えば、インビボ、エクスビボ、またはインビトロ由来）を、カテーテル投与を含む局所注射、全身注射、局所注射、静脈内注射、または非経口投与を介して投与することができる。治療用組成物（例えば、遺伝子改変された免疫応答性細胞または神経毒性の症状を処置するかもしくは寛解させる作用物質を含有する薬学的組成物）を投与する場合、治療用組成物は一般に、注射可能な単位剤形（溶液、懸濁液、エマルション）で製剤化される。

製剤には、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、肺投与、経皮投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、口腔投与、舌下投与、または坐剤投与のためのものが含まれる。いくつかの態様において、作用物質または細胞集団は、非経口投与される。本明細書において用いられる「非経口」という用語は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与、膣投与、および腹腔内投与を含む。いくつかの態様において、作用物質または細胞集団は、静脈内注射、腹腔内注射、または皮下注射による末梢全身送達を用いて、対象に投与される。

組成物は、いくつかの態様において、滅菌液体調製物、例えば、等張水溶液、懸濁液、エマルション、分散液、または粘性組成物として提供され、これは、いくつかの局面では、選択されたpHになるように緩衝されてもよい。液体調製物は通常、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物よりも調製が容易である。追加的に、液体組成物は、特に注射によって投与するのに、いくらかより便利である。他方で、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間を提供する適切な粘度範囲内で、製剤化することができる。液体組成物または粘性組成物は、担体を含むことができ、担体は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびそれらの適している混合物を含有する溶媒または分散媒であることができる。

無菌の注射可能な溶液は、作用物質または細胞を溶媒中に組み込むことによって、例えば、適している担体、希釈剤、または賦形剤、例えば滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどとの混合物において、調製することができる。

インビボ投与のために用いられる製剤は、一般に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過によって、容易に達成され得る。

VII. キットおよび製造物品
また、提供される態様を行うのに有用な製造物品、システム、装置、およびキットも提供される。いくつかの態様において、提供される製造物品またはキットは、遺伝子破壊を誘導することができる1つもしくは複数の作用物質の1つもしくは複数の成分、および/または鋳型ポリヌクレオチド、例えば、組換え受容体もしくはその一部分をコードする導入遺伝子を含有する鋳型ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの態様において、製造物品またはキットは、組換え受容体および/または他の分子を発現するようにT細胞を操作するための方法において、使用することができる。

いくつかの態様において、製造物品またはキットは、提供される方法を行うのに有用なポリペプチド、核酸、ベクター、および/またはポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、製造物品またはキットは、遺伝子破壊を誘導することができる1つもしくは複数の作用物質の1つもしくは複数の成分をコードする、かつ/または、例えば、HDRを介した細胞中への導入遺伝子のターゲティングにおける使用のための、鋳型ポリヌクレオチドを含む、1つまたは複数の核酸分子、例えば、プラスミドまたはDNA断片を含む。いくつかの態様において、本明細書で提供される製造物品またはキットは、対照ベクターを含有する。

いくつかの態様において、本明細書で提供される製造物品またはキットは、1つまたは複数の作用物質（該1つまたは複数の作用物質の各々は、独立して、T細胞刺激関連遺伝子座内の標的部位の遺伝子破壊を誘導することができる）；および組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチド（該導入遺伝子は、相同性指向修復（HDR）を介した標的部位でのまたはその近くでの組み込みのためにターゲティングされる）を含有する。いくつかの局面において、遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質は、本明細書に記載されるいずれかである。いくつかの局面において、1つまたは複数の作用物質は、Cas9/gRNA複合体を含むリボ核タンパク質（RNP）複合体である。いくつかの局面において、RNPに含まれるgRNAは、本明細書に記載されるいずれかの標的部位などの、T細胞刺激関連遺伝子座中の標的部位を標的とする。いくつかの局面において、鋳型ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される鋳型ポリヌクレオチドのいずれかである。

いくつかの態様において、製造物品またはキットは、1つまたは複数の容器、典型的には複数の容器と、パッケージング材料と、使用説明書、例えば、操作のために細胞中に成分を導入するための説明書を一般に含む、1つもしくは複数の容器および/またはパッケージング上のまたはそれに付随するラベルまたは添付文書とを含む。

本明細書で提供される製造物品は、パッケージング材料を含有する。提供される材料のパッケージングにおける使用のためのパッケージング材料は、周知である。例えば、その各々の全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第5,323,907号、第5,052,558号、および第5,033,252号を参照されたい。パッケージング材料の例には、ブリスターパック、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、使い捨ての実験備品、例えば、ピペットチップおよび/もしくはプラスチックプレート、またはボトルが含まれるが、それらに限定されない。製造物品またはキットは、材料の分配を容易にするための、またはハイスループットもしくは大規模の様式での使用を容易にするための、例えば、ロボット機器における使用を容易にするためのデバイスを含むことができる。典型的には、パッケージングは、その中に含有される組成物と非反応性である。

いくつかの態様において、遺伝子破壊を誘導することができる1つもしくは複数の作用物質および/または鋳型ポリヌクレオチドは、別々にパッケージングされる。いくつかの態様において、各容器は、単一のコンパートメントを有することができる。いくつかの態様において、製造物品またはキットの他の成分は、別々にパッケージングされるか、または単一のコンパートメントにおいて一緒にパッケージングされる。

また、例えば、治療または処置における使用のための、提供される細胞および/または細胞組成物を投与するのに有用な製造物品、システム、装置、およびキットも提供される。いくつかの態様において、本明細書で提供される製造物品またはキットは、T細胞および/またはT細胞組成物、例えば、本明細書に記載される任意のT細胞および/またはT細胞組成物を含有する。いくつかの局面において、本明細書で提供される製造物品またはキットは、T細胞またはT細胞組成物の投与のために用いることができ、使用説明書を含むことができる。

いくつかの態様において、本明細書で提供される製造物品またはキットは、T細胞および/またはT細胞組成物、例えば、本明細書に記載される任意のT細胞および/またはT細胞組成物を含有する。いくつかの態様において、T細胞および/またはT細胞組成物、改変されたT細胞の任意は、本明細書に記載されるスクリーニング法を用いた。いくつかの態様において、本明細書で提供される製造物品またはキットは、対照のまたは改変されていないT細胞および/またはT細胞組成物を含有する。いくつかの態様において、製造物品またはキットは、治療のための操作された細胞および/または細胞組成物の投与についての、1つまたは複数の説明書を含む。

治療のための細胞または細胞組成物を含有する製造物品および/またはキットは、容器と、容器上のまたはそれに付随するラベルまたは添付文書とを含んでもよい。適している容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。容器は、いくつかの態様において、単独であるか、または状態を処置する、予防する、かつ/または診断するのに有効な別の組成物と組み合わされている、組成物を保持する。いくつかの態様において、容器は、無菌アクセスポートを有する。例示的な容器には、静脈内溶液バッグ、注射用の針によって突き刺すことができる栓を有するものを含むバイアル、または経口投与される作用物質のためのボトルもしくはバイアルが含まれる。ラベルまたは添付文書は、組成物が、疾患または状態を処置するために用いられることを示し得る。製造物品は、（a）組換え受容体を発現する操作された細胞を含む組成物がその中に含有されている、第1の容器；および（b）第2の作用物質を含む組成物がその中に含有されている、第2の容器を含んでもよい。いくつかの態様において、製造物品は、（a）組換え受容体を発現する操作された細胞のあるサブタイプを含む第1の組成物がその中に含有されている、第1の容器；および（b）組換え受容体を発現する操作された細胞の異なるサブタイプを含む組成物がその中に含有されている、第2の容器を含んでもよい。製造物品は、組成物が特定の状態を処置するために使用され得ることを示す、添付文書をさらに含んでもよい。代替的にまたは追加的に、製造物品は、薬学的に許容される緩衝剤を含む別の容器または同じ容器をさらに含んでもよい。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、および/またはシリンジなどの他の材料をさらに含んでもよい。

VIII. 定義
別途定義されない限り、本明細書において用いられる専門用語、記号、ならびに他の技術用語および科学用語または用語法はすべて、特許請求の範囲に記載される主題が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有するように意図される。場合によっては、一般的に理解される意味を有する用語が、明確さおよび/または容易な参照のために本明細書において定義され、本明細書にそのような定義が含まれることは、当技術分野において一般に理解されるものとの実質的な差異を表すと必ずしも解釈されるべきではない。

本明細書において用いられる場合、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が明確に別のように示さない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「1つの（a）」または「1つの（an）」は、「少なくとも1つの」または「1つまたは複数の」を意味する。本明細書に記載される局面および変化形は、局面および変化形「からなる」ことおよび/または「から本質的になる」ことを含むと理解される。

本開示の全体を通して、特許請求の範囲に記載される主題の様々な局面は、範囲形式で示される。範囲形式での記載は単に便宜および簡潔性のためであり、特許請求の範囲に記載される主題の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、可能性のある部分範囲ならびにその範囲内にある個々の数値をすべて具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間にある各々の介在する値（intervening value）、およびその表記された範囲における任意の他の表記された値または介在する値が、特許請求の範囲に記載される主題の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して、より小さい範囲に含まれてもよく、表記された範囲における任意の具体的に除外された限界に従うことを条件として、特許請求の範囲に記載される主題の範囲内にも包含される。表記された範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれた限界のどちらかまたは両方を除外する範囲もまた、特許請求の範囲に記載される主題に含まれる。このことは、範囲の広さにかかわらず当てはまる。

本明細書において用いられる「約」という用語は、容易に知られるそれぞれの値についての通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体に関する態様を含む（かつ記載する）。例えば、「約X」に言及する記載は、「X」の記載を含む。いくつかの態様において、「約」は、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％、または±1％を指し得る。

本明細書において用いられる場合、ヌクレオチドまたはアミノ酸位置が、例えば配列表に示される、開示された配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸位置に「対応する」という記述は、GAPアルゴリズムなどの標準的なアライメントアルゴリズムを用いて同一性を最大化するように、開示された配列とのアライメント時に特定されたヌクレオチドまたはアミノ酸位置を指す。配列を整列させることによって、例えば、保存されたアミノ酸残基および同一のアミノ酸残基をガイドとして用いて、対応する残基を特定することができる。一般に、対応する位置を特定するために、最高オーダーマッチが得られるようにアミノ酸の配列を整列させる（例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；およびSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991；Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073を参照されたい）。

本明細書において用いられる「ベクター」という用語は、それが連結される別の核酸を増やすことができる核酸分子を指す。この用語には、自己複製性核酸構造物としてのベクター、および導入されている宿主細胞のゲノム中に組み込まれるベクターが含まれる。ある特定のベクターは、それが機能的に連結される核酸の発現を導くことができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。ベクターの中には、ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターがある。

「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に用いられ、外来性核酸が導入されている細胞を、そのような細胞の子孫を含めて指す。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、それらには、初代形質転換細胞および継代数にかかわらずそれに由来する子孫が含まれる。子孫は、親細胞と核酸内容が完全に同一でなくてもよく、変異を含有してもよい。当初形質転換された細胞においてスクリーニングされたかまたは選択されたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が、本明細書に含まれる。

場合によっては、「T細胞刺激関連遺伝子座」は、その発現が、T細胞における刺激または活性化シグナルに続いて、誘導されるか、増加されるか、または上方制御される遺伝子座を指す。いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座は、T細胞のTCR複合体の成分、またはTCR複合体の成分もしくはその一部分を含む細胞内シグナル伝達領域を含む組換え受容体を通して伝達されるシグナル、および/またはT細胞上に存在するかもしくは発現している受容体、例えば、T細胞受容体（TCR）もしくは組換え受容体による抗原もしくはエピトープ結合に応答性である、内在性遺伝子座である。いくつかの局面では、T細胞刺激関連遺伝子座は、T細胞の正常な下流シグナル伝達経路の一部である標準因子によって制御され得る。いくつかの局面では、抗原もしくはエピトープ結合、および/またはコードされる組換え受容体、例えば、CARもしくはTCRの細胞内シグナル伝達領域を通したシグナルもしくは活性は、例えば、組換え受容体をコードする、導入遺伝子を発現するようにT細胞刺激関連遺伝子座を誘導する、シグナル伝達を誘導する。内在性遺伝子産物および/または導入遺伝子の検出可能な発現は、次いで、T細胞活性化の指標としてモニターされ得る。

本明細書において用いられる場合、細胞または細胞の集団が特定のマーカーについて「陽性」であるという記述は、特定のマーカー、典型的には表面マーカーの細胞上でのまたは細胞中での検出可能な存在を指す。表面マーカーを指す場合、この用語は、フローサイトメトリーによって、例えば、マーカーに特異的に結合する抗体で染色し、該抗体を検出することによって検出されるような表面発現の存在を指し、ここで、染色は、アイソタイプが一致する対照を用いてそれ以外は同一の条件下で同じ手順を実施して検出される染色を実質的に上回るレベルで、および/またはマーカーについて陽性であることが公知の細胞のものと実質的に同様のレベルで、および/またはマーカーについて陰性であることが公知の細胞のものよりも実質的に高いレベルで、フローサイトメトリーによって検出可能である。

本明細書において用いられる場合、細胞または細胞の集団が特定のマーカーについて「陰性」であるという記述は、特定のマーカー、典型的には表面マーカーの細胞上でのまたは細胞中での実質的に検出可能な存在がないことを指す。表面マーカーを指す場合、この用語は、フローサイトメトリーによって、例えば、マーカーに特異的に結合する抗体で染色し、該抗体を検出することによって検出されるような表面発現の非存在を指し、ここで、染色は、アイソタイプが一致する対照を用いてそれ以外は同一の条件下で同じ手順を実施して検出される染色を実質的に上回るレベルでフローサイトメトリーによって検出されず、および/またはマーカーについて陽性であることが公知の細胞のものよりも実質的に低いレベル、および/またはマーカーについて陰性であることが公知の細胞のものと比較して実質的に同様のレベルである。

本明細書において用いられる場合、「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」および「同一性パーセント」は、アミノ酸配列（参照ポリペプチド配列）に対して用いられる時、最大の配列同一性パーセントを達成するように、配列を整列させて、必要である場合にギャップを導入し、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない後に、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列（例えば、対象の抗体または断片）中のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のアライメントは、様々な公知の方法で、いくつかの態様では、BLAST、BLAST-2、ALIGN、またはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成することができる。配列を整列させるための適切なパラメーターは、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含めて、決定することができる。

いくつかの態様において、「機能的に連結された」とは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が制御配列に結合した時に遺伝子発現を可能にするような、DNA配列、例えば、異種核酸および制御配列などの成分の会合を含み得る。したがって、それは、記載される成分が、その意図された様式で機能することを可能にする関係にあることを意味する。

アミノ酸置換は、ポリペプチド中の1つのアミノ酸の別のアミノ酸での置き換えを含み得る。置換は、保存的アミノ酸置換であってもよく、または非保存的アミノ酸置換であってもよい。アミノ酸置換を、関心対象の結合分子、例えば、抗体に導入してもよく、産物を、所望の活性、例えば、保持された/改善された抗原結合、減少した免疫原性、または改善されたADCCもしくはCDCについてスクリーニングしてもよい。

アミノ酸は、一般に、以下の共通の側鎖特性に従って分類することができる：
（1）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
（2）中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
（3）酸性：Asp、Glu；
（4）塩基性：His、Lys、Arg；
（5）鎖配向に影響を及ぼす残基：Gly、Pro；
（6）芳香族：Trp、Tyr、Phe。

いくつかの態様において、保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーの、同一クラスの別のメンバーとの交換を含むことができる。いくつかの態様において、非保存的アミノ酸置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーの、別のクラスとの交換を含むことができる。

本明細書において用いられる場合、組成物とは、細胞を含む、2種類以上の産物、物質、または化合物の任意の混合物を指す。組成物は、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。

本明細書において用いられる場合、「対象」は、ヒトまたは他の動物などの哺乳動物であり、典型的には、ヒトである。

IX. 例示的な態様
提供される態様には、以下がある。
1. 組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を含む、操作されたT細胞であって、該導入遺伝子が、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントに機能的に連結され、該内在性転写制御エレメントが、機能的に連結された該導入遺伝子の発現を、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて誘導するかまたは上方制御する、前記操作されたT細胞。
2. 前記内在性転写制御エレメントが、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のプロモーターである、態様1の操作されたT細胞。
3. 前記組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子が、プロモーターの下流に存在する、態様1または2の操作されたT細胞。
4. 機能的に連結された前記導入遺伝子の発現が、T細胞における刺激または活性化シグナルに続いて、6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内にまたは約6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内に、上方制御されるかまたは誘導される、態様1～3のいずれかの操作されたT細胞。
5. 発現の上方制御もしくは誘導に続いて、またはT細胞におけるシミュレーションもしくは活性化シグナルの低減もしくは非存在に続いて、機能的に連結された前記導入遺伝子の発現が、低減されるかまたは下方制御される、態様1～4のいずれかの操作されたT細胞。
6. 発現の上方制御もしくは誘導に続いて、またはT細胞におけるシミュレーションもしくは活性化シグナルの低減もしくは非存在に続いて、機能的に連結された前記導入遺伝子の発現が、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも多く、または約30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも多く、低減されるかまたは下方制御される、態様1～5のいずれかの操作されたT細胞。
7. 発現の上方制御または誘導に続いて、機能的に連結された前記導入遺伝子の発現が、T細胞における刺激または活性化シグナルの、1、2、3、4、5、6、7、もしくは8日、もしくはそれ以上後にまたは約1、2、3、4、5、6、7、もしくは8日、もしくはそれ以上後に、低減されるかまたは下方制御される、態様5または6の操作されたT細胞。
8. 機能的に連結された前記導入遺伝子の発現が、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在に続いて、6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内にまたは約6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内に、低減されるかまたは下方制御される、態様5～7のいずれかの操作されたT細胞。
9. 機能的に連結された前記導入遺伝子の発現が、シミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在の後に、T細胞におけるさらなるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、再び誘導されるかまたは上方制御されることができる、態様5～8のいずれかの操作されたT細胞。
10. 機能的に連結された前記導入遺伝子の発現が、シミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在の後に、T細胞におけるさらなるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内にまたは約6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内に、上方制御されるかまたは誘導される、態様9の操作されたT細胞。
11. T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームから翻訳される産物が細胞において発現されないか、または内在性T細胞刺激関連遺伝子座の機能的な内在性遺伝子産物が発現されない、態様1～10のいずれかの操作されたT細胞。
12. 改変されたT細胞刺激関連遺伝子座が、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームにおける欠失、挿入、フレームシフト変異、またはナンセンス変異を含む、態様11の操作されたT細胞。
13. 前記内在性T細胞刺激関連遺伝子座が、PDCD1、CD69、Nur77、FoxP3、およびHLA-DR遺伝子座の中から選択される、態様1～12のいずれかの操作されたT細胞。
14. 前記内在性転写制御エレメントが、
刺激または活性化シグナルに続いて活性化される転写因子によって認識される、1つまたは複数の応答エレメント
を含む、態様1～13のいずれかの操作されたT細胞。
15. 前記組換え受容体またはその一部分が、T細胞において刺激または活性化シグナルを誘導するかまたは伝達することができる、態様1～14のいずれかの操作されたT細胞。
16. 前記組換え受容体が、T細胞受容体（TCR）複合体の成分の細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内領域を含み、かつT細胞における刺激もしくは活性化シグナルが、前記組換え受容体中に存在する細胞内シグナル伝達ドメインを通したシグナルを含む、または
前記組換え受容体が、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内領域を含み、かつT細胞における刺激もしくは活性化シグナルが、前記組換え受容体中に存在する細胞内シグナル伝達ドメインを通したシグナルを含む、
態様1～15のいずれかの操作されたT細胞。
17. 前記組換え受容体が、作用物質に結合するかまたはそれを認識することができる結合ドメインを含む細胞外領域を含む、態様1～16のいずれかの操作されたT細胞。
18. 刺激または活性化シグナルが、作用物質の結合の際に、T細胞において誘導される、態様17の操作されたT細胞。
19. 前記作用物質が、標的抗原であり、任意で、該標的抗原が、組換えタンパク質であるか、または細胞の表面上に発現している抗原である、態様17または18の操作されたT細胞。
20. 前記標的抗原が、ある疾患、障害、または状態の細胞または組織に関連しているか、それに特異的であるか、またはその上に発現している、態様19の操作されたT細胞。
21. 前記疾患、障害、または状態が、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんであり、任意で、前記標的抗原が腫瘍抗原である、態様20の操作されたT細胞。
22. 前記標的抗原が、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9；CAIXまたはG250としても知られている）、がん精巣抗原、がん/精巣抗原1B（CTAG；NY-ESO-1およびLAGE-2としても知られている）、癌胎児性抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮成長因子タンパク質（EGFR）、III型上皮成長因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体ホモログ5またはFCRH5としても知られている）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量-黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Rα）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Rα2）、キナーゼインサートドメイン受容体（kdr）、κ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、黒色腫関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソテリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、腫瘍胎児抗原、黒色腫優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（TPBG；5T4としても知られている）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1；TYRP1またはgp75としても知られている）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2；ドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムデルタ-イソメラーゼ、またはDCTとしても知られている）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的抗原もしくは病原体発現抗原、またはユニバーサルタグに関連する抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBV、もしくは他の病原体によって発現される分子の中から選択される、態様17～21のいずれかの操作されたT細胞。
23. 前記作用物質が、抗イディオタイプ抗体である、態様17の操作されたT細胞。
24. 前記組換え受容体が、キメラ抗原受容体（CAR）である、態様1～23のいずれかの操作されたT細胞。
25. 前記CARが、細胞外領域、膜貫通ドメイン、および細胞内領域を含む、態様24の操作されたT細胞。
26. 前記細胞外領域が、スペーサーを含み、任意で、該スペーサーが、結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に機能的に連結される、態様25の操作されたT細胞。
27. 前記細胞外領域が、抗体またはその抗原結合断片であるか、またはそれを含む、結合ドメインを含む、態様25または26の操作されたT細胞。
28. 前記細胞内領域が、細胞内シグナル伝達ドメインを含む、態様25～27のいずれかの操作されたT細胞。
29. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3鎖、任意でCD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそのシグナル伝達部分であるか、またはそれを含む、態様28の操作されたT細胞。
30. 前記細胞内領域が、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む、態様28または29の操作されたT細胞。
31. 前記1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインが、CD28、4-1BB、もしくはICOSの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそのシグナル伝達部分を含む、態様30の操作されたT細胞。
32. 前記共刺激シグナル伝達領域が、4-1BBの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、態様30または31の操作されたT細胞。
33. 前記改変されたT細胞刺激関連遺伝子座が、CARである組換え受容体をコードし、該CARが、そのN末端からC末端へと順番に、細胞外結合ドメイン、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内領域を含む、態様1～32のいずれかの操作されたT細胞。
34. 前記導入遺伝子が、順番に、細胞外結合ドメイン、任意でscFv；任意で、ヒト免疫グロブリンヒンジ由来の、任意でIgG1、IgG2、もしくはIgG4、またはその改変バージョン由来の配列を含み、任意で、CH2領域および/またはCH3領域をさらに含む、スペーサー；ならびに、任意でヒトCD28由来の、膜貫通ドメイン；任意でヒト4-1BB由来の、共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびに、細胞内シグナル伝達ドメイン、任意でCD3ζ鎖またはその一部分、をコードするヌクレオチドの配列を含み；かつ/あるいは
前記改変されたT細胞刺激関連遺伝子座が、順番に、細胞外結合ドメイン、任意でscFv；任意で、ヒト免疫グロブリンヒンジ由来の、任意でIgG1、IgG2、もしくはIgG4、またはその改変バージョン由来の配列を含み、任意で、CH2領域および/またはCH3領域をさらに含む、スペーサー；ならびに、任意でヒトCD28由来の、膜貫通ドメイン；任意でヒト4-1BB由来の、共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびに、細胞内シグナル伝達ドメイン、任意でCD3ζ鎖またはその一部分、をコードするヌクレオチドの配列を含む、
態様1～33のいずれかの操作されたT細胞。
35. 前記導入遺伝子が、前記組換え受容体をコードする、態様1～34のいずれかの操作されたT細胞。
36. 前記導入遺伝子が、前記組換え受容体の一部分をコードする、態様1～34のいずれかの操作されたT細胞。
37. 前記組換え受容体が、2つの別々のポリペプチド鎖を含有し、ここで、前記導入遺伝子によってコードされる前記組換え受容体の一部分が、前記組換え受容体の1つの鎖であり、かつ操作されたT細胞が、前記組換え受容体の他の鎖をさらに発現する、態様36の操作されたT細胞。
38. 前記組換え受容体の前記他の鎖が、第2の導入遺伝子によってコードされる、態様37の操作されたT細胞。
39. 前記CARが、多鎖CARである、態様24～38のいずれかの操作されたT細胞。
40. 前記導入遺伝子が、多鎖CARの1つの鎖をコードする、態様39の操作されたT細胞。
41. 前記組換え受容体が、組換えT細胞受容体（TCR）である、態様1～23および35～38のいずれかの操作されたT細胞。
42. 組換えTCRが、アルファ（TCRα）鎖およびベータ（TCRβ）鎖を含み、かつ前記導入遺伝子が、TCRα鎖をコードする核酸配列および/またはTCRβ鎖をコードする核酸配列を含む、態様41の操作されたT細胞。
43. 前記導入遺伝子が、TCRα鎖またはTCRβ鎖のうちの1つをコードする、態様42の操作されたT細胞。
44. 前記TCRα鎖が、1つまたは複数の導入されたシステイン残基を含む定常（Cα）領域を含み、かつ/または前記TCRβ鎖が、1つまたは複数の導入されたシステイン残基を含むCβ領域を含み、該1つまたは複数の導入されたシステイン残基が、α鎖とβ鎖との間に1つまたは複数の非天然ジスルフィド架橋を形成することができ、任意で、該1つまたは複数の導入されたシステイン残基が、非システイン残基のシステイン残基での置換を含む、態様42または43の操作されたT細胞。
45. 前記Cα領域が、SEQ ID NO:92に示されるような番号付けで48位に対応する位置にシステインを含み；かつ/または前記Cβ領域が、SEQ ID NO:96に示されるような番号付けで57位に対応する位置にシステインを含む、態様44の操作されたT細胞。
46. 前記導入遺伝子が、少なくとも1つのさらなるタンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含む、態様1～45のいずれかの操作されたT細胞。
47. 前記少なくとも1つのさらなるタンパク質が、代用マーカーであり、任意で、該代用マーカーが、トランケートされた受容体であり、任意で、該トランケートされた受容体が、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、かつ/またはそのリガンドが結合した場合に細胞内シグナル伝達を媒介することができない、態様46の操作されたT細胞。
48. 前記導入遺伝子が、マルチシストロン性エレメントをさらに含む、態様1～47のいずれかの操作されたT細胞。
49. 前記マルチシストロン性エレメントが、T2A、P2A、E2A、もしくはF2Aの中から選択されるリボソームスキップエレメント、または配列内リボソーム進入部位（IRES）をコードする配列を含む、態様48の操作されたT細胞。
50. 前記マルチシストロン性エレメントが、CARをコードするヌクレオチドの配列と、少なくとも1つのさらなるタンパク質をコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている；
前記組換え受容体が、組換えTCRであり、かつ前記マルチシストロン性エレメントが、TCRαをコードするヌクレオチドの配列と、TCRβをコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている；
前記組換え受容体が、多鎖CARであり、かつ前記マルチシストロン性エレメントが、多鎖CARの1つの鎖をコードするヌクレオチドの配列と、多鎖CARの別の鎖をコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている；および/または
前記マルチシストロン性エレメントが、前記組換え受容体をコードするヌクレオチドの配列の上流にある、
態様48または49の操作されたT細胞。
51. 前記改変されたT細胞刺激関連遺伝子座が、以下の工程：
a）内在性T細胞刺激関連遺伝子座のまたはその近くの1つまたは複数の標的部位で遺伝子破壊を誘導する工程；および
b）相同性指向修復（HDR）のためのポリヌクレオチドを導入する工程
による、細胞刺激関連遺伝子座の内部中への、前記組換え受容体をコードする導入遺伝子の組み込みによって作製される、
態様1～50のいずれかの操作されたT細胞。
52. 前記組換え受容体をコードする導入遺伝子が、T細胞刺激関連遺伝子座中の少なくとも1つの標的部位にまたはその近くに組み込まれる、態様51の操作されたT細胞。
53. 前記遺伝子破壊が、標的部位に特異的に結合するか、それを認識するか、またはそれにハイブリダイズする、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされる、態様51または52の操作されたT細胞。
54. 前記遺伝子破壊が、CRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつ該CRISPR-Cas9の組み合わせが、少なくとも1つの標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含む、態様51～53のいずれかの操作されたT細胞。
55. 前記CRISPR-Cas9の組み合わせが、gRNAおよびCas9タンパク質を含むリボ核タンパク質（RNP）複合体である、態様54の操作されたT細胞。
56. 前記遺伝子破壊が、電気穿孔を介して複数のT細胞中に導入されるRNPによってもたらされる、態様55の操作されたT細胞。
57. 前記T細胞刺激関連遺伝子座が、PDCD1である、態様1～56のいずれかの操作されたT細胞。
58. 前記遺伝子破壊が、gRNAを含むCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつ該gRNAが、PDCD1遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する、態様57の操作されたT細胞。
59. 前記gRNAが、SEQ ID NO:75および104～109のいずれか1つに示される配列を含む、態様58の操作されたT細胞。
60. 前記gRNAが、SEQ ID NO:75に示される配列を含む、態様58または59の操作されたT細胞。
61. 前記T細胞刺激関連遺伝子座が、CD69である、態様1～56のいずれかの操作されたT細胞。
62. 前記遺伝子破壊が、gRNAを含むCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつ該gRNAが、CD69遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する、態様61の操作されたT細胞。
63. 前記gRNAが、SEQ ID NO:116～121のいずれか1つに示される配列を含む、態様62の操作されたT細胞。
64. 前記T細胞刺激関連遺伝子座が、Nur77である、態様1～56のいずれかの操作されたT細胞。
65. 前記遺伝子破壊が、gRNAを含むCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつ該gRNAが、Nur77遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する、態様64の操作されたT細胞。
66. 前記gRNAが、SEQ ID NO:122～127および134～136に示される配列を含む、態様65の操作されたT細胞。
67. 前記T細胞刺激関連遺伝子座が、FoxP3である、態様1～56のいずれかの操作されたT細胞。
68. 前記T細胞刺激関連遺伝子座が、HLA-DR遺伝子座である、態様1～56のいずれかの操作されたT細胞。
69. 前記T細胞が、内在性T細胞受容体α定常領域（TRAC）遺伝子および/または内在性T細胞受容体β定常領域（TRBC）遺伝子に遺伝子破壊をさらに含む、態様1～68のいずれかの操作されたT細胞。
70. 前記遺伝子破壊が、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2遺伝子内の少なくとも1つの標的部位に特異的に結合するか、それを認識するか、またはそれにハイブリダイズする、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされる、態様69の操作されたT細胞。
71. 前記遺伝子破壊が、CRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつ該CRISPR-Cas9の組み合わせが、少なくとも1つの標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含み、任意で、該CRISPR-Cas9の組み合わせが、gRNAおよびCas9タンパク質を含むリボ核タンパク質（RNP）複合体であり、任意で、該遺伝子破壊が、電気穿孔を介して複数のT細胞中に導入されるRNPによってもたらされる、態様69または70の操作されたT細胞。
72. 前記遺伝子破壊が、gRNAを含むCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつ該gRNAが、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2遺伝子内の少なくとも1つの標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する、態様69～71のいずれかの操作されたT細胞。
73. 前記gRNAが、TRAC遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する、態様72の操作されたT細胞。
74. 前記gRNAが、SEQ ID NO:77および188～218のいずれか1つに示される配列を含む、態様73の操作されたT細胞。
75. 前記gRNAが、SEQ ID NO:77に示される配列を含む、態様73または74の操作されたT細胞。
76. 前記gRNAが、TRBC遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する、態様72の操作されたT細胞。
77. 前記gRNAが、SEQ ID NO:219～276のいずれか1つに示される配列を含む、態様76の操作されたT細胞。
78. T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルの非存在下での、コードされる前記組換え受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを通したシグナル伝達活性が、T細胞のゲノム中の異なる場所に存在するかまたはT細胞のゲノム中のランダムな場所に存在する同じ組換え受容体をコードする導入遺伝子を含む操作されたT細胞と比較して、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、もしくはそれ以上よりも多く、または約10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、もしくはそれ以上よりも多く、低減される、態様1～77のいずれかの操作されたT細胞。
79. 前記T細胞が、CD8+ T細胞もしくはCD4+ T細胞またはそのサブタイプである、態様1～78のいずれかの操作されたT細胞。
80. 前記T細胞が、対象に由来する初代T細胞であり、任意で、該対象がヒトである、態様1～79のいずれかの操作されたT細胞。
81. 前記T細胞が、任意でiPSCである、多分化能細胞または多能性細胞に由来する、態様1～79のいずれかの操作されたT細胞。
82. 複数の態様1～81のいずれかの操作された細胞を含む、組成物。
83. 機能的に連結された導入遺伝子の発現が、T細胞における刺激または活性化シグナルに続いて、6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内にまたは約6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内に、組成物中の1つまたは複数の細胞において上方制御されるかまたは誘導される、態様82の組成物。
84. T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、組成物中の細胞の中での、機能的に連結された導入遺伝子を発現する細胞の頻度が、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも高いか、または約50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも高い、態様82または83の組成物。
85. 発現の上方制御もしくは誘導に続いて、またはT細胞におけるシミュレーションもしくは活性化シグナルの低減もしくは非存在に続いて、機能的に連結された導入遺伝子の発現が、組成物中の1つまたは複数の細胞において低減されるかまたは下方制御される、態様82～84のいずれかの組成物。
86. 発現の上方制御もしくは誘導に続いて、またはT細胞におけるシミュレーションもしくは活性化シグナルの低減もしくは非存在に続いて、組成物中の細胞の中での、機能的に連結された導入遺伝子を発現する細胞の頻度が、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも多く、または約30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも多く、低減される、態様82～84のいずれかの組成物。
87. 発現の上方制御または誘導に続いて、機能的に連結された導入遺伝子の発現が、T細胞における刺激または活性化シグナルの、1、2、3、4、5、6、7、もしくは8日、もしくはそれ以上後にまたは約1、2、3、4、5、6、7、もしくは8日、もしくはそれ以上後に、組成物中の1つまたは複数の細胞において低減されるかまたは下方制御される、態様82～86のいずれかの組成物。
88. 組成物中の細胞の1つまたは複数における機能的に連結された導入遺伝子の発現が、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在に続いて、6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内にまたは約6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内に、低減されるかまたは下方制御される、態様82～87のいずれかの組成物。
89. T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在に続いて、組成物中の細胞の中での前記組換え受容体を発現する細胞の頻度が、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、もしくは5％、もしくはそれ以下よりも低いか、または約50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、もしくは5％、もしくはそれ以下よりも低い、態様88の組成物。
90. CD4+ T細胞および/またはCD8+ T細胞を含む、態様82～89のいずれかの組成物。
91. CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を含み、かつCD4+ T細胞対CD8+ T細胞の比が、1:3～3:1または約1:3～3:1、任意で1:1である、態様82～90のいずれかの組成物。
92. （a）組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子、および
（b）T細胞中の内在性T細胞刺激関連遺伝子座の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む、該導入遺伝子に連結された1つまたは複数の相同性アーム
を含む、ポリヌクレオチド。
93. 前記組換え受容体またはその一部分が、前記ポリヌクレオチドが導入された細胞から前記組換え受容体が発現される場合に、前記組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む改変されたT細胞刺激関連遺伝子座によってコードされる、態様92のポリヌクレオチド。
94. 前記導入遺伝子が、T細胞、任意でヒトT細胞の内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームにとって外来性または異種である配列である、態様92または93のポリヌクレオチド。
95. 前記1つまたは複数の相同性アームが、5'相同性アームおよび/または3'相同性アームを含み、任意で、該5'相同性アームおよび3'相同性アームが、標的部位の周囲の核酸配列に相同な核酸配列を含み、該標的部位が、T細胞刺激関連遺伝子座内にある、態様92～94のいずれかのポリヌクレオチド。
96. 前記標的部位が、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントの下流にある、態様95のポリヌクレオチド。
97. 構造[5'相同性アーム]-[導入遺伝子]-[3'相同性アーム]を含む、態様95または96のポリヌクレオチド。
98. 前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、少なくとも1つの標的部位の周囲の核酸配列に相同な核酸配列を含む、態様97のポリヌクレオチド。
99. 前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、50または約50から、750または約750ヌクレオチド、50または約50から、500または約500ヌクレオチド、50または約50から、250または約250ヌクレオチド、50または約50から、100または約100ヌクレオチド、100または約100から、750または約750ヌクレオチド、100または約100から、500または約500ヌクレオチド、100または約100から、250または約250ヌクレオチド、250または約250から、750または約750ヌクレオチド、250または約250から、500または約500ヌクレオチドの長さである、態様95～98のいずれかのポリヌクレオチド。
100. 前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、もしくは500ヌクレオチドまたは約50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、もしくは500ヌクレオチド、または前述のいずれかの間の任意の値の長さである、態様95～99のいずれかのポリヌクレオチド。
101. 前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、100未満または約100未満のヌクレオチドの長さ、任意で、50、60、70、80、もしくは90ヌクレオチドまたは約50、60、70、80、もしくは90ヌクレオチド、または前述のいずれかの間の任意の値の長さである、態様95～100のいずれかのポリヌクレオチド。
102. 前記T細胞刺激関連遺伝子座が、PDCD1、CD69、Nur77、FoxP3、およびHLA-DR遺伝子座の中から選択される、態様95～101のいずれかのポリヌクレオチド。
103. 前記T細胞刺激関連遺伝子座が、PDCD1である、態様102のポリヌクレオチド。
104. 前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、PDCD1の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む、態様103のポリヌクレオチド。
105. 前記5'相同性アームが、
a）SEQ ID NO:66に示される配列に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の配列同一性を示す配列に対する、150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個の連続したヌクレオチドを含む配列；
b）SEQ ID NO:66に示される配列の、150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個の連続したヌクレオチドを含む配列；または
c）SEQ ID NO:66に示される配列
を含む、態様104のポリヌクレオチド。
106. 前記3'相同性アームが、
a）SEQ ID NO:67に示される配列に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の配列同一性を示す配列に対する、150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個の連続したヌクレオチドを含む配列；
b）SEQ ID NO:67に示される配列の、150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個の連続したヌクレオチドを含む配列；または
c）SEQ ID NO:67に示される配列
を含む、態様104または105のポリヌクレオチド。
107. 前記T細胞刺激関連遺伝子座が、CD69である、態様102のポリヌクレオチド。
108. 前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、CD69の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む、態様107のポリヌクレオチド。
109. 前記T細胞刺激関連遺伝子座が、Nur77である、態様102のポリヌクレオチド。
110. 前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、Nur77の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む、態様109のポリヌクレオチド。
111. 前記T細胞刺激関連遺伝子座が、FoxP3である、態様102のポリヌクレオチド。
112. 前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、FoxP3の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む、態様111のポリヌクレオチド。
113. 前記T細胞刺激関連遺伝子座が、HLA-DR遺伝子座である、態様102のポリヌクレオチド。
114. 前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、HLA-DR遺伝子座の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む、態様113のポリヌクレオチド。
115. 前記組換え受容体またはその一部分が、T細胞において刺激または活性化シグナルを誘導するかまたは伝達することができる、態様92～114のいずれかのポリヌクレオチド。
116. 前記組換え受容体が、T細胞受容体（TCR）複合体の成分の細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内領域を含み、かつT細胞における刺激もしくは活性化シグナルが、前記組換え受容体中に存在する細胞内シグナル伝達ドメインを通したシグナルを含む、または
前記組換え受容体が、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内領域を含み、かつT細胞における刺激もしくは活性化シグナルが、前記組換え受容体中に存在する細胞内シグナル伝達ドメインを通したシグナルを含む、
態様92～115のいずれかのポリヌクレオチド。
117. 前記組換え受容体が、作用物質に結合するかまたはそれを認識することができる結合ドメインを含む細胞外領域を含む、態様92～116のいずれかのポリヌクレオチド。
118. 刺激または活性化シグナルが、作用物質の結合の際に、T細胞において誘導される、態様117のポリヌクレオチド。
119. 前記作用物質が、標的抗原であり、任意で、該標的抗原が、組換えタンパク質であるか、または細胞の表面上に発現している抗原である、態様117または118のポリヌクレオチド。
120. 前記標的抗原が、ある疾患、障害、または状態の細胞または組織に関連しているか、それに特異的であるか、またはその上に発現している、態様119のポリヌクレオチド。
121. 前記疾患、障害、または状態が、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんであり、任意で、前記標的抗原が腫瘍抗原である、態様120のポリヌクレオチド。
122. 前記標的抗原が、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9；CAIXまたはG250としても知られている）、がん精巣抗原、がん/精巣抗原1B（CTAG；NY-ESO-11およびLAGE-12としても知られている）、癌胎児性抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-11）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮成長因子タンパク質（EGFR）、III型上皮成長因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-12）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体ホモログ5またはFCRH5としても知られている）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量-黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-122受容体アルファ（IL-122Rα）、IL-113受容体アルファ2（IL-113Rα2）、キナーゼインサートドメイン受容体（kdr）、κ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、黒色腫関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソテリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-11）、神経細胞接着分子（NCAM）、腫瘍胎児抗原、黒色腫優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（TPBG；5T4としても知られている）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1；TYRP1またはgp75としても知られている）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2；ドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムデルタ-イソメラーゼ、またはDCTとしても知られている）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-11）、病原体特異的抗原もしくは病原体発現抗原、またはユニバーサルタグに関連する抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBV、もしくは他の病原体によって発現される分子の中から選択される、態様117～121のいずれかのポリヌクレオチド。
123. 前記作用物質が、抗イディオタイプ抗体である、態様117のポリヌクレオチド。
124. 前記組換え受容体が、キメラ抗原受容体（CAR）である、態様92～123のいずれかのポリヌクレオチド。
125. 前記CARが、細胞外領域、膜貫通ドメイン、および細胞内領域を含む、態様124のポリヌクレオチド。
126. 前記細胞外領域が、スペーサーを含み、任意で、該スペーサーが、結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に機能的に連結される、態様125のいずれかのポリヌクレオチド。
127. 前記細胞外領域が、抗体またはその抗原結合断片であるか、またはそれを含む、結合ドメインを含む、態様125または126のポリヌクレオチド。
128. 前記細胞内領域が、細胞内シグナル伝達ドメインを含む、態様125～127のいずれかのポリヌクレオチド。
129. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3鎖、任意でCD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそのシグナル伝達部分であるか、またはそれを含む、態様128のポリヌクレオチド。
130. 前記細胞内領域が、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む、態様128または129のポリヌクレオチド。
131. 前記1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインが、CD28、4-1BB、もしくはICOSの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそのシグナル伝達部分を含む、態様130のポリヌクレオチド。
132. 前記共刺激シグナル伝達領域が、4-1BBの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、態様130または131のポリヌクレオチド。
133. 前記改変されたT細胞刺激関連遺伝子座が、CARである組換え受容体をコードし、該CARが、そのN末端からC末端へと順番に、細胞外結合ドメイン、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内領域を含む、態様92～132のいずれかのポリヌクレオチド。
134. 前記導入遺伝子が、順番に、細胞外結合ドメイン、任意でscFv；任意で、ヒト免疫グロブリンヒンジ由来の、任意でIgG1、IgG2、もしくはIgG4、またはその改変バージョン由来の配列を含み、任意で、CH2領域および/またはCH3領域をさらに含む、スペーサー；ならびに、任意でヒトCD28由来の、膜貫通ドメイン；任意でヒト4-1BB由来の、共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびに、細胞内シグナル伝達ドメイン、任意でCD3ζ鎖またはその一部分、をコードするヌクレオチドの配列を含み；かつ/あるいは
前記改変されたT細胞刺激関連遺伝子座が、順番に、細胞外結合ドメイン、任意でscFv；任意で、ヒト免疫グロブリンヒンジ由来の、任意でIgG1、IgG2、もしくはIgG4、またはその改変バージョン由来の配列を含み、任意で、CH2領域および/またはCH3領域をさらに含む、スペーサー；ならびに、任意でヒトCD28由来の、膜貫通ドメイン；任意でヒト4-1BB由来の、共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびに、細胞内シグナル伝達ドメイン、任意でCD3ζ鎖またはその一部分、をコードするヌクレオチドの配列を含む、
態様92～133のいずれかのポリヌクレオチド。
135. 前記導入遺伝子が、前記組換え受容体をコードする、態様92～134のいずれかのポリヌクレオチド。
136. 前記導入遺伝子が、前記組換え受容体の一部分をコードする、態様92～134のいずれかのポリヌクレオチド。
137. 前記組換え受容体が、2つの別々のポリペプチド鎖を含有し、ここで、導入遺伝子によってコードされる前記組換え受容体の一部分が、前記組換え受容体の1つの鎖である、態様136のポリヌクレオチド。
138. 前記組換え受容体の他の鎖が、第2の導入遺伝子によってコードされる、態様137のポリヌクレオチド。
139. 前記CARが、多鎖CARである、態様124～138のいずれかのポリヌクレオチド。
140. 導入遺伝子が、多鎖CARの1つの鎖をコードする、態様139のポリヌクレオチド。
141. 前記組換え受容体が、組換えT細胞受容体（TCR）である、態様92～123および135～138のいずれかのポリヌクレオチド。
142. 組換えTCRが、アルファ（TCRα）鎖およびベータ（TCRβ）鎖を含み、かつ前記導入遺伝子が、TCRα鎖をコードする核酸配列および/またはTCRβ鎖をコードする核酸配列を含む、態様141のポリヌクレオチド。
143. 前記導入遺伝子が、TCRα鎖またはTCRβ鎖のうちの1つをコードする、態様142のポリヌクレオチド。
144. 前記TCRα鎖が、1つまたは複数の導入されたシステイン残基を含む定常（Cα）領域を含み、かつ/または前記TCRβ鎖が、1つまたは複数の導入されたシステイン残基を含むCβ領域を含み、該1つまたは複数の導入されたシステイン残基が、α鎖とβ鎖との間に1つまたは複数の非天然ジスルフィド架橋を形成することができ、任意で、該1つまたは複数の導入されたシステイン残基が、非システイン残基のシステイン残基での置換を含む、態様142または143のポリヌクレオチド。
145. 前記Cα領域が、SEQ ID NO:92に示されるような番号付けで48位に対応する位置にシステインを含み；かつ/または前記Cβ領域が、SEQ ID NO:96に示されるような番号付けで57位に対応する位置にシステインを含む、態様144のポリヌクレオチド。
146. 前記導入遺伝子が、少なくとも1つのさらなるタンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含む、態様92～145のいずれかのポリヌクレオチド。
147. 前記少なくとも1つのさらなるタンパク質が、代用マーカーであり、任意で、該代用マーカーが、トランケートされた受容体であり、任意で、該トランケートされた受容体が、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、かつ/またはそのリガンドが結合した場合に細胞内シグナル伝達を媒介することができない、態様146のポリヌクレオチド。
148. 前記導入遺伝子が、マルチシストロン性エレメントをさらに含む、態様92～147のいずれかのポリヌクレオチド。
149. 前記マルチシストロン性エレメントが、T2A、P2A、E2A、もしくはF2Aの中から選択されるリボソームスキップエレメント、または配列内リボソーム進入部位（IRES）をコードする配列を含む、態様148のポリヌクレオチド。
150. 前記マルチシストロン性エレメントが、CARをコードするヌクレオチドの配列と、少なくとも1つのさらなるタンパク質をコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている；
前記組換え受容体が、組換えTCRであり、かつ前記マルチシストロン性エレメントが、TCRαをコードするヌクレオチドの配列と、TCRβをコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている；
前記組換え受容体が、多鎖CARであり、かつ前記マルチシストロン性エレメントが、多鎖CARの1つの鎖をコードするヌクレオチドの配列と、多鎖CARの別の鎖をコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている；および/または
前記マルチシストロン性エレメントが、前記組換え受容体をコードするヌクレオチドの配列の上流にある、
態様148または149のポリヌクレオチド。
151. 直鎖ポリヌクレオチドである、態様92～150のいずれかのポリヌクレオチド。
152. 二本鎖ポリヌクレオチドである、態様151のポリヌクレオチド。
153. 一本鎖ポリヌクレオチドである、態様151のポリヌクレオチド。
154. ウイルスベクター中に含まれる、態様92～150のいずれかのポリヌクレオチド。
155. 前記ウイルスベクターが、AAVベクターである、態様154のポリヌクレオチド。
156. 前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、任意でレンチウイルスベクターである、態様154のポリヌクレオチド。
157. 1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、もしくは4000ヌクレオチドの長さまたは約1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、もしくは4000ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である、態様92～156のいずれかのポリヌクレオチド。
158. 1500もしくは約1500から、2500もしくは約2500ヌクレオチド、または1750もしくは約1750から、2250もしくは約2250ヌクレオチドの長さである、態様92～157のいずれかのポリヌクレオチド。
159. （a）T細胞の内在性T細胞刺激関連遺伝子座内の標的部位で遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質を、T細胞中に導入する工程；および
（b）態様92～158のいずれかのポリヌクレオチドを、T細胞刺激関連遺伝子座に遺伝子破壊を含むT細胞中に導入する工程
を含む、遺伝子操作されたT細胞を作製する方法であって、
組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座
を作製する、前記方法。
160. 前記組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子が、相同性指向修復（HDR）を介して内在性T細胞刺激関連遺伝子座内に組み込まれる、態様159の方法。
161. 組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを、T細胞中に導入する工程を含む、遺伝子操作されたT細胞を作製する方法であって、該T細胞が、T細胞のT細胞刺激関連遺伝子座内に遺伝子破壊を有し、前記組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子が、相同性指向修復（HDR）を介して内在性T細胞刺激関連遺伝子座内に組み込まれる、前記方法。
162. 前記遺伝子破壊が、T細胞の内在性T細胞刺激関連遺伝子座内の標的部位で遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質を、T細胞中に導入することによって実施される、態様159または161の方法。
163. 組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座
を作製する、態様159～162のいずれかの方法。
164. 前記ポリヌクレオチドが、核酸配列に連結された1つまたは複数の相同性アームをさらに含み、該1つまたは複数の相同性アームが、T細胞中の内在性T細胞刺激関連遺伝子座の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む、態様159～163のいずれかの方法。
165. 前記1つまたは複数の相同性アームが、5'相同性アームおよび/または3'相同性アームを含み、任意で、該5'相同性アームおよび3'相同性アームが、標的部位の周囲の核酸配列に相同な核酸配列を含み、該標的部位が、T細胞刺激関連遺伝子座内にある、態様164の方法。
166. 前記標的部位が、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントの下流にある、態様165の方法。
167. 前記ポリヌクレオチドが、構造[5'相同性アーム]-[導入遺伝子]-[3'相同性アーム]を含む、態様165または166の方法。
168. 前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、少なくとも1つの標的部位の周囲の核酸配列に相同な核酸配列を含む、態様167の方法。
169. 前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、50または約50から、750または約750ヌクレオチド、50または約50から、500または約500ヌクレオチド、50または約50から、250または約250ヌクレオチド、50または約50から、100または約100ヌクレオチド、100または約100から、750または約750ヌクレオチド、100または約100から、500または約500ヌクレオチド、100または約100から、250または約250ヌクレオチド、250または約250から、750または約750ヌクレオチド、250または約250から、500または約500ヌクレオチドの長さである、態様165～168のいずれかの方法。
170. 前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、もしくは500ヌクレオチドまたは約50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、もしくは500ヌクレオチド、または前述のいずれかの間の任意の値の長さである、態様165～169のいずれかの方法。
171. 前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、100未満または約100未満のヌクレオチドの長さ、任意で、50、60、70、80、もしくは90ヌクレオチドまたは約50、60、70、80、もしくは90ヌクレオチド、または前述のいずれかの間の任意の値の長さである、態様165～170のいずれかの方法。
172. 前記T細胞刺激関連遺伝子座が、PDCD1、CD69、Nur77、FoxP3、およびHLA-DR遺伝子座の中から選択される、態様165～171のいずれかの方法。
173. 前記T細胞刺激関連遺伝子座が、PDCD1である、態様172の方法。
174. 前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、PDCD1の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む、態様173の方法。
175. 前記5'相同性アームが、
a）SEQ ID NO:66に示される配列に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の配列同一性を示す配列に対する、150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個の連続したヌクレオチドを含む配列；
b）SEQ ID NO:66に示される配列の、150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個の連続したヌクレオチドを含む配列；または
c）SEQ ID NO:66に示される配列
を含む、態様174の方法。
176. 前記3'相同性アームが、
a）SEQ ID NO:67に示される配列に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の配列同一性を示す配列に対する、150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個の連続したヌクレオチドを含む配列；
b）SEQ ID NO:67に示される配列の、150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個の連続したヌクレオチドを含む配列；または
c）SEQ ID NO:67に示される配列
を含む、態様174または175の方法。
177. 前記T細胞刺激関連遺伝子座が、CD69である、態様172の方法。
178. 前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、CD69の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む、態様177の方法。
179. 前記T細胞刺激関連遺伝子座が、Nur77である、態様172の方法。
180. 前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、Nur77の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む、態様179の方法。
181. 前記T細胞刺激関連遺伝子座が、FoxP3である、態様172の方法。
182. 前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、FoxP3の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む、態様181の方法。
183. 前記T細胞刺激関連遺伝子座が、HLA-DR遺伝子座である、態様172の方法。
184. 前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、HLA-DR遺伝子座の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む、態様183の方法。
185. 前記組換え受容体またはその一部分が、T細胞において刺激または活性化シグナルを誘導するかまたは伝達することができる、態様159～184のいずれかの方法。
186. 前記組換え受容体が、T細胞受容体（TCR）複合体の成分の細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内領域を含み、かつT細胞における刺激もしくは活性化シグナルが、前記組換え受容体中に存在する細胞内シグナル伝達ドメインを通したシグナルを含む、または、
前記組換え受容体が、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内領域を含み、かつT細胞における刺激もしくは活性化シグナルが、前記組換え受容体中に存在する細胞内シグナル伝達ドメインを通したシグナルを含む、
態様159～185のいずれかの方法。
187. 前記組換え受容体が、作用物質に結合するかまたはそれを認識することができる結合ドメインを含む細胞外領域を含む、態様159～186のいずれかの方法。
188. 刺激または活性化シグナルが、作用物質の結合の際に、T細胞において誘導される、態様187の方法。
189. 前記作用物質が、標的抗原であり、任意で、該標的抗原が、組換えタンパク質であるか、または細胞の表面上に発現している抗原である、態様187または188の方法。
190. 前記標的抗原が、ある疾患、障害、または状態の細胞または組織に関連しているか、それに特異的であるか、またはその上に発現している、態様189の方法。
191. 前記疾患、障害、または状態が、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんであり、任意で、前記標的抗原が腫瘍抗原である、態様190の方法。
192. 前記標的抗原が、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9；CAIXまたはG250としても知られている）、がん精巣抗原、がん/精巣抗原1B（CTAG；NY-ESO-11およびLAGE-12としても知られている）、癌胎児性抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-11）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮成長因子タンパク質（EGFR）、III型上皮成長因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-12）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体ホモログ5またはFCRH5としても知られている）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量-黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-122受容体アルファ（IL-122Rα）、IL-113受容体アルファ2（IL-113Rα2）、キナーゼインサートドメイン受容体（kdr）、κ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、黒色腫関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソテリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-11）、神経細胞接着分子（NCAM）、腫瘍胎児抗原、黒色腫優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（TPBG；5T4としても知られている）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1；TYRP1またはgp75としても知られている）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2；ドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムデルタ-イソメラーゼ、またはDCTとしても知られている）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-11）、病原体特異的抗原もしくは病原体発現抗原、またはユニバーサルタグに関連する抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBV、もしくは他の病原体によって発現される分子の中から選択される、態様187～191のいずれかの方法。
193. 前記遺伝子破壊が、標的部位に特異的に結合するか、それを認識するか、またはそれにハイブリダイズする、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされる、態様191または192の方法。
194. 前記遺伝子破壊が、CRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつ該CRISPR-Cas9の組み合わせが、少なくとも1つの標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含む、態様159～193のいずれかの方法。
195. 前記CRISPR-Cas9の組み合わせが、gRNAおよびCas9タンパク質を含むリボ核タンパク質（RNP）複合体である、態様194の方法。
196. 前記遺伝子破壊が、電気穿孔を介して複数のT細胞中に導入されるRNPによってもたらされる、態様195の方法。
197. 前記T細胞刺激関連遺伝子座が、PDCD1である、態様159～196のいずれかの方法。
198. 前記遺伝子破壊が、gRNAを含むCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつ該gRNAが、PDCD1遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する、態様197の方法。
199. 前記gRNAが、SEQ ID NO:75および104～109のいずれか1つに示される配列を含む、態様198の方法。
200. 前記gRNAが、SEQ ID NO:75に示される配列を含む、態様198または199の方法。
201. 前記T細胞刺激関連遺伝子座が、CD69である、態様159～196のいずれかの方法。
202. 前記遺伝子破壊が、gRNAを含むCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつ該gRNAが、CD69遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する、態様201の方法。
203. 前記gRNAが、SEQ ID NO:116～121のいずれか1つに示される配列を含む、態様202の方法。
204. 前記T細胞刺激関連遺伝子座が、Nur77である、態様159～196のいずれかの方法。
205. 前記遺伝子破壊が、gRNAを含むCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつ該gRNAが、Nur77遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する、態様204の方法。
206. 前記gRNAが、SEQ ID NO:122～127および134～136に示される配列を含む、態様205の方法。
207. 前記T細胞刺激関連遺伝子座が、FoxP3である、態様159～196のいずれかの方法。
208. 前記T細胞刺激関連遺伝子座が、HLA-DR遺伝子座である、態様159～196のいずれかの方法。
209. 前記T細胞が、内在性T細胞受容体α定常領域（TRAC）遺伝子および/または内在性T細胞受容体β定常領域（TRBC）遺伝子に遺伝子破壊をさらに含む、態様159～208のいずれかの方法。
210. 前記遺伝子破壊が、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2遺伝子内の少なくとも1つの標的部位に特異的に結合するか、それを認識するか、またはそれにハイブリダイズする、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされる、態様209の方法。
211. 前記遺伝子破壊が、CRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつ該CRISPR-Cas9の組み合わせが、少なくとも1つの標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含み、任意で、該CRISPR-Cas9の組み合わせが、gRNAおよびCas9タンパク質を含むリボ核タンパク質（RNP）複合体であり、任意で、該遺伝子破壊が、電気穿孔を介して複数のT細胞中に導入されるRNPによってもたらされる、態様209または210の方法。
212. 前記遺伝子破壊が、gRNAを含むCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつ該gRNAが、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2遺伝子内の少なくとも1つの標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する、態様209～211のいずれかの方法。
213. 前記gRNAが、TRAC遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する、態様212の方法。
214. 前記gRNAが、SEQ ID NO:77および188～218のいずれか1つに示される配列を含む、態様213の方法。
215. 前記gRNAが、SEQ ID NO:77に示される配列を含む、態様213または214の方法。
216. 前記gRNAが、TRBC遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有する、態様212の方法。
217. 前記gRNAが、SEQ ID NO:219～276のいずれか1つに示される配列を含む、態様216の方法。
218. 前記組換え受容体が、キメラ抗原受容体（CAR）である、態様159～217のいずれかの方法。
219. コードされる前記組換え受容体が、組換えT細胞受容体（TCR）であるか、またはそれを含む、態様159～217のいずれかの方法。
220. 前記RNPが、電気穿孔、パーティクルガン、リン酸カルシウムトランスフェクション、細胞の圧縮または圧迫を介して、任意で、電気穿孔を介して導入される、態様211～219のいずれかの方法。
221. 前記RNPが、電気穿孔を介して複数のT細胞中に導入される、態様220の方法。
222. 前記RNPの濃度が、1μMまたは約1μMから、5μMまたは約5μMであり、任意で、該RNPの濃度が、2μMまたは約2μMである、態様220または221の方法。
223. 前記T細胞が、CD8+ T細胞および/もしくはCD4+ T細胞またはそのサブタイプを含む、態様159～222のいずれかの方法。
224. 前記T細胞が、対象にとって自己である、態様159～223のいずれかの方法。
225. 前記T細胞が、対象に由来する初代T細胞であり、任意で、該対象がヒトである、態様159～224のいずれかの方法。
226. 前記T細胞が、対象にとって同種異系である、態様159～225のいずれかの方法。
227. 前記T細胞が、任意でiPSCである、多分化能細胞または多能性細胞に由来する、態様159～224のいずれかの方法。
228. 前記ポリヌクレオチドが、直鎖ポリヌクレオチドである、態様159～227のいずれかの方法。
229. 前記ポリヌクレオチドが、二本鎖ポリヌクレオチドである、態様228の方法。
230. 前記ポリヌクレオチドが、一本鎖ポリヌクレオチドである、態様228の方法。
231. 前記ポリヌクレオチドが、ウイルスベクター中に含まれる、態様159～227のいずれかの方法。
232. 前記ウイルスベクターが、AAVベクターである、態様231の方法。
233. 前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、任意でレンチウイルスベクターである、態様231の方法。
234. 前記ポリヌクレオチドが、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、もしくは4000ヌクレオチドの長さまたは約1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、もしくは4000ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である、態様159～233のいずれかの方法。
235. 前記ポリヌクレオチドが、1500もしくは約1500から、2500もしくは約2500ヌクレオチド、または1750もしくは約1750から、2250もしくは約2250ヌクレオチドの長さである、態様159～234のいずれかの方法。
236. 前記1つまたは複数の作用物質および前記ポリヌクレオチドが、同時にまたは逐次的に、任意の順序で導入される、態様159、160、および162～235のいずれかの方法。
237. 前記1つまたは複数の作用物質および前記ポリヌクレオチドが、同時に導入される、態様159、160、および162～236のいずれかの方法。
238. 前記ポリヌクレオチドが、前記1つまたは複数の作用物質の導入の後に導入される、態様159、160、および162～236のいずれかの方法。
239. 前記ポリヌクレオチドが、前記作用物質の導入の直後に、または該導入後約30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間以内に導入される、態様238の方法。
240. 前記1つもしくは複数の作用物質および/または前記ポリヌクレオチドの導入の前に、前記細胞を、1つまたは複数の免疫細胞を刺激するかまたは活性化するための条件下で刺激物質とインビトロでインキュベートする工程を含む、態様159、160、および162～239のいずれかの方法。
241. 前記刺激物質が、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体を含む、態様240の方法。
242. 前記刺激物質が、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体を含むオリゴマー粒子試薬を含む、態様240および241の方法。
243. 前記刺激物質が、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体でコーティングされたビーズを含む、態様240～242のいずれかの方法。
244. 前記方法が、前記1つもしくは複数の作用物質の導入および/または前記ポリヌクレオチドの導入の前に、その最中に、またはその後に、前記細胞を、1つまたは複数の組換えサイトカインとインキュベートする工程をさらに含み、任意で、該1つまたは複数の組換えサイトカインが、IL-2、IL-7、およびIL-15からなる群より選択される、態様159、160、および162～243のいずれかの方法。
245. 前記1つまたは複数の組換えサイトカインが、10 U/mLもしくは約10 U/mLから、200 U/mLもしくは約200 U/mL、任意で50 IU/mLもしくは約50 IU/mLから、100 U/mLもしくは約100 U/mLのIL-2の濃度；0.5 ng/mL～50 ng/mL、任意で5 ng/mLもしくは約5 ng/mLから、10 ng/mLもしくは約10 ng/mLのIL-7の濃度；および/または0.1 ng/mL～20 ng/mL、任意で0.5 ng/mLもしくは約0.5 ng/mLから、5 ng/mLもしくは約5 ng/mLのIL-15の濃度から選択される濃度で添加される、態様244の方法。
246. インキュベーションが、前記1つまたは複数の作用物質の導入および前記ポリヌクレオチドの導入の後に、最大で24時間、36時間、48時間、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、もしくは21日間、またはおよそ24時間、36時間、48時間、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、もしくは21日間、任意で最大で7日間または約7日間実施される、態様244または245の方法。
247. 態様159～246のいずれかの方法を用いて生成された、操作されたT細胞または複数の操作されたT細胞。
248. 態様247の操作されたT細胞または態様247の複数の操作されたT細胞を含む、組成物。
249. 機能的に連結された導入遺伝子の発現が、T細胞における刺激または活性化シグナルに続いて、6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内にまたは約6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内に、組成物中の1つまたは複数の細胞において上方制御されるかまたは誘導される、態様248の組成物。
250. T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、組成物中の細胞の中での、機能的に連結された導入遺伝子を発現する細胞の頻度が、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも高いか、または約50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも高い、態様248または249の組成物。
251. 発現の上方制御もしくは誘導に続いて、またはT細胞におけるシミュレーションもしくは活性化シグナルの低減もしくは非存在に続いて、機能的に連結された導入遺伝子の発現が、組成物中の1つまたは複数の細胞において低減されるかまたは下方制御される、態様248～250のいずれかの組成物。
252. 発現の上方制御もしくは誘導に続いて、またはT細胞におけるシミュレーションもしくは活性化シグナルの低減もしくは非存在に続いて、組成物中の細胞の中での、機能的に連結された導入遺伝子を発現する細胞の頻度が、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも多く、または約30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも多く、低減される、態様248～251のいずれかの組成物。
253. 発現の上方制御または誘導に続いて、機能的に連結された導入遺伝子の発現が、T細胞における刺激または活性化シグナルの、1、2、3、4、5、6、7、もしくは8日、もしくはそれ以上後にまたは約1、2、3、4、5、6、7、もしくは8日、もしくはそれ以上後に、組成物中の1つまたは複数の細胞において低減されるかまたは下方制御される、態様248～252のいずれかの組成物。
254. 組成物中の細胞の1つまたは複数における機能的に連結された導入遺伝子の発現が、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在に続いて、6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内にまたは約6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内に、低減されるかまたは下方制御される、態様248～253のいずれかの組成物。
255. T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在に続いて、組成物中の細胞の中での前記組換え受容体を発現する細胞の頻度が、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、もしくは5％、もしくはそれ以下よりも低いか、または約50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、もしくは5％、もしくはそれ以下よりも低い、態様254の組成物。
256. CD4+ T細胞および/またはCD8+ T細胞を含む、態様248～255のいずれかの組成物。
257. CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を含み、かつCD4+ T細胞対CD8+ T細胞の比が、1:3～3:1または約1:3～3:1、任意で1:1である、態様248～256のいずれかの組成物。
258. 態様1～81および247のいずれかの操作された細胞、または態様82～91および248～257のいずれかの組成物を、ある疾患または障害を有する対象に投与する工程を含む、処置の方法。
259. ある疾患または障害の処置のための、態様1～81および247のいずれかの操作された細胞、または態様82～91および248～257のいずれかの組成物の使用。
260. ある疾患または障害を処置するための薬剤の製造における、態様1～81および247のいずれかの操作された細胞、または態様82～91および248～257のいずれかの組成物の使用。
261. ある疾患または障害の処置における使用のための、態様1～81および247のいずれかの操作された細胞、または態様82～91および248～257のいずれかの組成物。
262. 前記疾患または障害が、がんまたは腫瘍である、態様258～261のいずれかの方法、使用、または使用のための操作された細胞、複数の操作された細胞、もしくは組成物。
263. 前記がんまたは腫瘍が、血液悪性腫瘍、任意でリンパ腫、白血病、または形質細胞悪性腫瘍である、態様262の方法、使用、または使用のための操作された細胞、複数の操作された細胞、もしくは組成物。
264. 前記がんが、リンパ腫であり、かつ該リンパ腫が、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（NHL）、ホジキンリンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、濾胞性リンパ腫、小型非切れ込み核細胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（MALT）、辺縁帯リンパ腫、脾リンパ腫、結節性単球様B細胞リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、大細胞リンパ腫、びまん性混合細胞型リンパ腫、肺B細胞血管中心性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、原発性縦隔B細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫（LPL）、またはマントル細胞リンパ腫（MCL）である、態様262または263の方法、使用、または使用のための操作された細胞、複数の操作された細胞、もしくは組成物。
265. 前記がんが、白血病であり、かつ該白血病が、慢性リンパ球性白血病（CLL）、形質細胞白血病、または急性リンパ球性白血病（ALL）である、態様262～264のいずれかの方法、使用、または使用のための操作された細胞、複数の操作された細胞、もしくは組成物。
266. 前記がんが、形質細胞悪性腫瘍であり、かつ該形質細胞悪性腫瘍が、多発性骨髄腫（MM）である、態様262～265のいずれかの方法、使用、または使用のための操作された細胞、複数の操作された細胞、もしくは組成物。
267. 前記腫瘍が、固形腫瘍である、態様262の方法、使用、または使用のための操作された細胞、複数の操作された細胞、もしくは組成物。
269. 前記固形腫瘍が、非小細胞肺がん（NSCLC）または頭頚部扁平上皮癌（HNSCC）である、態様267の方法、使用、または使用のための操作された細胞、複数の操作された細胞、もしくは組成物。
270. T細胞刺激関連遺伝子座内の標的部位で遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質；および
態様92～158のいずれかのポリヌクレオチド
を含む、キット。
271. T細胞刺激関連遺伝子座内の標的部位で遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質；および
組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、相同性指向修復（HDR）を介した標的部位でのまたはその近くでの組み込みのためにターゲティングされる、ポリヌクレオチド；および
態様159～246のいずれかの方法を実施するための説明書
を含む、キット。

X. 実施例
以下の実施例は、例示のみを目的として含まれ、本発明の範囲を限定するようには意図されない。

実施例1：T細胞刺激関連分子の発現カイネティクス
様々なT細胞刺激シグナル関連マーカーの発現を経時的に評価して、キメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸配列の組み込みをターゲティングするための候補遺伝子座を特定した。CARの発現が、刺激関連マーカーをコードする遺伝子のプロモーターの操作可能な調節下にあるように、CARをコードする核酸配列は、刺激関連マーカーをコードする細胞のゲノム中の標的遺伝子座中に組み込まれるべきであった。場合によっては、コードされるCARは、例えば、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖由来の、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含有するシグナル伝達ドメイン、またはそのシグナル伝達部分を含有する。図1に図示するように、場合によっては、CARの発現は、例えば、CAR中に存在するITAMドメインを介した操作されたT細胞におけるT細胞刺激シグナルの伝達後に発現される、フィードバックループによって制御され得る。T細胞刺激シグナルが存在しない場合、例えば、標的抗原によるCARの結合からの刺激シグナルの非存在下では、発現は、低減され得るか、またはオフにされ得る。

ヒトドナーから得られた初代T細胞を、0日目に、抗CD3/抗CD28 Fab抗体断片がロードされた可溶性多量体試薬または抗CD3/抗CD28抗体コンジュゲートビーズとインキュベートすることによって刺激し、7日間培養し、次いで、同じ試薬を用いて7日後に再刺激に供した。刺激関連マーカーの候補である分化抗原群25（CD25）、CD69、CD45RA、およびプログラム細胞死タンパク質l（PD-1）の発現を、フローサイトメトリーによって経時的にモニターした。

図2に示すように、CD25、CD69、およびPD-1の発現は、刺激後に増加した。最初の刺激後7日目頃に、CD69およびPD-1の発現は減少し、これは、刺激関連マーカーの下方制御と一貫していた。CD29およびPD-1の発現が減少した後、細胞を、同じ試薬を用いて再刺激した。再刺激後に、CD69およびPD-1の発現は、再び急速に増加することが観察された。CD25の発現は、7日目頃および再刺激後に高いままであった。CD45RAの発現は、3日目頃の後に低減し、再刺激後に増加しなかった。PD-1を、CARをコードする核酸配列の標的組み込みのための場所の1つとして選択した。

実施例2：刺激関連マーカーであるプログラム細胞死タンパク質1（PD-1）のプロモーターの調節下での例示的なキメラ抗原受容体（CAR）の発現
例示的なキメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸配列を、CRISPR/Cas9媒介性遺伝子編集および相同性依存的修復（HDR）を介した遺伝子破壊の部位での標的組み込みによって、T細胞受容体アルファ（TCRα）鎖および/またはプログラム細胞死タンパク質1（PD-1）をコードする内在性遺伝子座に遺伝子破壊を有するT細胞中に導入した。

A. 操作されたT細胞の生成
ヒトTCRα定常領域（TRAC）遺伝子またはPD-1をコードする遺伝子（PDCD1）での標的組み込みのための5'および3'相同性配列が隣接した、例示的な抗CD19 CARをコードする核酸配列を含有する直鎖二本鎖鋳型ポリヌクレオチドを、HDR媒介性ターゲティングのために生成させた。コードされる抗CD19 CARは、マウス抗体に由来するscFv（FMC63に由来する可変領域、V_L-リンカー-V_Hの配向）、3つのStrep-tag II配列、CD28に由来する膜貫通ドメイン、4-1BBに由来する共刺激領域、およびCD3-ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含有していた。ポリヌクレオチドはまた、挿入された核酸配列が、挿入部位の内在性プロモーターの調節下で発現されるようにするための、CARをコードする配列の上流のP2Aリボソームスキップ配列、ならびに転写終結およびmRNA成熟のためのポリアデニル化シグナルも含有していた。抗CD19 CARをコードする例示的な核酸配列は、SEQ ID NO:64に示される。PDCD1遺伝子座でのターゲティングのために、核酸配列は、およそ100～200塩基対の5'および3'相同性アーム（それぞれ、SEQ ID NO:66および67に示される）が隣接しており、SEQ ID NO:68および69に示されるプライマーを用いて増幅された。TRAC遺伝子座でのターゲティングのために、核酸配列は、およそ50～70塩基対の5'および3'相同性アーム（それぞれ、SEQ ID NO:68および69に示される）が隣接しており、SEQ ID NO:72および73に示されるプライマーを用いて増幅された。

初代ヒトCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を、刺激し、培養して、PDCD1ターゲティングgRNA（SEQ ID NO:75に示される）またはTRACターゲティングgRNA（SEQ ID NO:77に示される）を含有するリボ核タンパク質（RNP）複合体、およびPDCD1またはTRAC遺伝子座でのCARをコードする核酸のHDR媒介性ターゲティングのための直鎖ポリヌクレオチドを伴う、一段階電気穿孔に供した。T細胞を、抗CD3/抗CD28 Fab抗体断片がロードされた可溶性多量体試薬とのインキュベーションによって刺激したか、または試薬を伴わずに約48時間休止させた。細胞を、洗浄して、電気穿孔ミックスに懸濁した。TRACターゲティングgRNAおよびCas9タンパク質を含有する予めアセンブルされたRNP複合体を、直鎖ポリヌクレオチドと混合し、次いで、細胞懸濁液に添加した。細胞を、電気穿孔に供し、続いて、培養培地中で5日間のインキュベーションを行った。対照として、細胞を、RNP複合体のみを伴う（鋳型ポリヌクレオチドを伴わない）またはRNP複合体を伴わない電気穿孔に供した。電気穿孔の5日後（最初の刺激の7日後）に、細胞を、同じ試薬を用いた再刺激に供したか、または再刺激を伴わずに休止させた。細胞を、抗CD3抗体、CARの発現を評価するための抗Strep-tag試薬、抗PD1抗体、および抗CD69抗体で染色した後に、フローサイトメトリーによって評価して、CARおよびマーカーの発現を経時的にモニターした。

B. 例示的なCARの発現
図3A～3Bに示すように、最初の刺激の7日後に、PDCD1をターゲティングするRNP複合体およびPDCD1ターゲティング鋳型ポリヌクレオチドが導入された細胞は、PD-1のノックアウトを伴うCAR発現細胞（PD-1 KO PD-1 CAR群におけるPD1^-CAR⁺細胞の存在によって観察される；図3B）を結果としてもたらし；かつTRACをターゲティングするRNP複合体およびTRACターゲティング鋳型ポリヌクレオチドが導入された細胞は、内在性CD3のノックアウトを伴うCAR発現細胞（TRAC KO TRAC KI CAR群におけるCD3^-CAR⁺細胞の存在によって観察される；図3B）を結果としてもたらした。

C. CAR発現の刺激に関連した調節
CARをコードする核酸配列を内在性TRAC遺伝子座に組み込むことによって操作された（TRAC KI CAR；内在性TRACプロモーターの調節下）、CAR発現細胞のパーセンテージは、再刺激された細胞および休止した細胞において類似しており；かつPD-1を発現する細胞のパーセンテージおよびCD69を発現する細胞のパーセンテージは、再刺激後に増加した（図4Aを参照されたい）。比較して、CARをコードする核酸配列を内在性PDCD1遺伝子座に組み込むことによって操作された（PD1 KI CAR；内在性PDCD1プロモーターの調節下）、CAR発現細胞のパーセンテージは、再刺激された細胞において、休止した細胞と比較して高く；かつCD69を発現する細胞のパーセンテージは、再刺激後に増加した（図4Bを参照されたい）。対照細胞は、再刺激後にPD-1およびCD69の発現の増加を示した（図4Cを参照されたい）。

内在性TRAC遺伝子座での核酸の組み込みによって操作された細胞の集団におけるCAR+細胞のパーセンテージは、経時的に増加し、再刺激された細胞と休止した細胞との間で類似していた（図5Aを参照されたい）。比較して、内在性PDCD1遺伝子座での核酸の組み込みによって操作された細胞の集団におけるCAR+細胞のパーセンテージは、経時的に増加し、再刺激後に、再刺激された細胞において、実質的により高かった（図5Bを参照されたい）。

D. 結論
内在性PDCD1遺伝子座などの、例示的な刺激関連内在性遺伝子座のプロモーターの調節下での例示的なCARの発現は、T細胞の刺激シグナルにも依存することが観察された。発現は、細胞の再刺激の際に、休止させた細胞と比較して実質的に増加した。結果は、T細胞刺激または活性化シグナルに基づいてCARの発現を制御するための、CARをコードする配列の標的組み込みの使用を支持する。

実施例3：刺激関連マーカーであるプログラム細胞死タンパク質1（PD-1）のプロモーターの調節下で例示的なキメラ抗原受容体（CAR）を発現する操作されたTの活性の評価
上記の実施例2に記載されるように生成された、プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）をコードする内在性遺伝子座から例示的なキメラ抗原受容体（CAR）を発現するT細胞の活性を、評価した。

A. 操作されたT細胞
初代ヒトCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を、一般に実施例2に記載されるように、CARをコードする核酸配列を内在性PDCD1遺伝子座に組み込むことによって（内在性PDCD1プロモーターの調節下：PD1 KI CAR）、例示的な抗CD19 CARを発現するように操作した。PDCD1 KO細胞（PDCD1ターゲティングRNP複合体のみを伴い、鋳型ポリヌクレオチドを伴わずに電気穿孔；PD1 KO）、モック処理細胞（陰性対照）、および/またはレンチウイルスベクターを用いて操作された同じ例示的なCARを発現する細胞（LV対照）を、対照として用いた。

B. 増大
操作されたT細胞の抗原特異的増大を評価するために、上記のPD1 KI CAR（改変されたPDCD1遺伝子座から抗CD19 CARを発現する）、PD1 KO、陰性対照、およびLV対照細胞を、電気穿孔後に7日間培養した。次いで、細胞を、放射線照射されたCD19発現リンパ芽球様細胞株（LCL）と共培養することによって、7日間隔で2ラウンドの共培養で増大させた。抗原特異的刺激後の細胞の増大を、抗CD8抗体、および例示的な抗CD19 CARの発現を検出するための抗イディオタイプ抗体で染色して、フローサイトメトリーによって評価した。

図6A～6Bに示すように、PDCD1プロモーターの調節下でCARを発現する細胞（PD1 KI CAR）のパーセンテージは、第1および第2の刺激後に実質的に増加した。レンチウイルスベクターおよびランダム組み込みを用いて操作されたCARを発現する細胞（LV対照）もまた、抗原特異的刺激後に増大を示したが、PD1 KI CAR細胞と比較して、より低い程度であった。結果は、刺激関連PDCD1プロモーターの調節下でCARを発現する細胞が、抗原特異的刺激の際に効率的に増大したことを示した。

C. 再刺激後の発現
改変されたPDCD1遺伝子座から抗CD19 CARを発現する操作されたT細胞の再刺激後に、CAR発現を評価した。PD1 KI CARおよびPD1 KO細胞を、最初の刺激、および放射線照射されたCD19発現LCLと共培養することによる増大の後に、再刺激に供したか、または再刺激を伴わずに休止させた。細胞を、刺激関連マーカー（CD25、CD69）、および例示的な抗CD19 CARの発現を検出するための抗イディオタイプ抗体について染色して、フローサイトメトリーによって評価した。

図7A～7Cに示すように、CAR発現細胞のパーセンテージ（図7Aおよび7B）ならびに抗CD19 CARの発現の平均レベル（平均蛍光強度、MFIによって決定される；図7Bおよび7C）は、再刺激されなかった細胞（PD1 KI CAR休止）と比較して、PD1 KI CAR細胞において、再刺激後に（PD1 KI CAR再刺激）増加した。CD25+CD69+細胞のパーセンテージもまた、再刺激後の細胞において、より高かった（図7B）。

D. 再刺激後の細胞溶解活性
標的特異的な細胞溶解活性を、改変されたPDCD1遺伝子座から抗CD19 CARを発現する操作されたT細胞の再刺激後に評価した。PD1 KI CARおよびPD1 KO細胞を、最初の刺激、および放射線照射されたCD19発現LCLと共培養することによる増大の後に、再刺激に供したか、または再刺激を伴わずに休止させた。抗CD19 CARを発現するエフェクター細胞を、CD19を発現する標的細胞と、10:1のエフェクター対標的（E:T）比で培養したもののインピーダンス測定によって、細胞溶解活性を評価した。標的細胞を抗原特異的に溶解するT細胞の能力を、共培養後最大で24時間、標的細胞の剥離を測定することによって評価した。モック処理細胞（陰性対照）、LV対照、およびヒト胎児腎（HEK）細胞を、対照として用いた。

図7Dに示すように、再刺激されたPD1 KI CAR細胞は、再刺激されなかったPD1 KI CAR細胞またはLV対照よりも効率的に、標的細胞を殺した。

E. 結論
例示的な刺激関連内在性遺伝子座PDCD1の調節下でCARを発現するように操作されたT細胞（PD1 KI CAR）は、CARの刺激依存的な発現、および刺激の際の効率的な標的細胞殺傷を示した。結果は、T細胞刺激または活性化シグナルに基づいてCARの発現および機能を制御するための、CARをコードする配列の標的組み込みの使用を支持する。

実施例4：マウスにおける、PD1の調節下で例示的なCARを発現する操作されたTのインビボ抗腫瘍効果の評価
上記の実施例2に記載されるように生成された、プログラム細胞死タンパク質1（PD1）をコードする内在性遺伝子座から例示的なキメラ抗原受容体（CAR）を発現する操作されたT細胞の抗腫瘍活性を、腫瘍マウスモデルにおける操作された細胞の投与によって評価した。

NOD.Cg.Prkdc^scidIL2rg^tm1Wjl/SzJ（NSG）マウスに、0.5×10⁶個のホタルルシフェラーゼをトランスフェクトしたRajiリンパ腫腫瘍細胞（CD19を発現する不死化ヒトBリンパ球腫瘍細胞株）（Raji-ffluc）を静脈内（i.v.）注射した。6日間、腫瘍の生着が起こるようにさせ、生物発光イメージングを用いて確認した。腫瘍細胞注射の7日後に、マウスは、いかなる処置も受けなかったか、または、1×10⁶個の、上記の実施例2に記載されるような、例示的な抗CD19 CARを発現するように操作された初代ヒトT細胞（PD1 KI CAR）、もしくはレンチウイルスベクター送達およびランダム組み込みによって同じ抗CD19 CARを発現するように操作された初代ヒトT細胞（LV対照）の単回静脈内（i.v.）注射を受けた。腫瘍負荷を、操作されたT細胞の投与後、最大で35日間、毎週、生物発光によって評価した。生物発光イメージングのために、マウスは、PBSに懸濁されたルシフェリン基質（CaliperLife Sciences, Hopkinton, MA）の腹腔内（i.p.）注射を受けた（15μg/g体重）。平均放射輝度（p/s/cm²/sr）を測定した。実験の時系列の概略図を、図8Aに示す。

図8B～8Dに示すように、PD1 KI CARまたはLV対照を投与されたマウスは、腫瘍細胞成長の低減および生存の増加を結果としてもたらした。これらの結果は、例示的な刺激関連内在性遺伝子座PDCD1の調節下でCARを発現するように操作されたT細胞（PD1 KI CAR）のインビボ抗腫瘍活性を実証する。

本発明は、例えば、本発明の様々な局面を例示するために提供される、特定の開示された態様に範囲が限定されるようには意図されない。記載された組成物および方法に対する様々な改変が、本明細書における説明および教示から明白になるであろう。そのような変動は、本開示の真の範囲および精神から逸脱することなく実施されてもよく、本開示の範囲内に入るように意図される。

配列

Claims

T細胞の内在性T細胞刺激関連遺伝子座中に組み込まれた組換え受容体をコードする導入遺伝子を含む改変されたT細胞刺激関連遺伝子座を含む、操作されたT細胞であって、該導入遺伝子が、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントに機能的に連結され、該内在性転写制御エレメントが、機能的に連結された該導入遺伝子の発現を、T細胞におけるシミュレーション（simulation）または活性化シグナルに続いて誘導するかまたは上方制御する、前記操作されたT細胞。
前記内在性転写制御エレメントが、内在性T細胞刺激関連遺伝子座のプロモーターであり、かつ前記組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子が、該プロモーターの下流に存在する、請求項1記載の操作されたT細胞。
前記内在性転写制御エレメントが、
前記刺激または活性化シグナルに続いて活性化される転写因子によって認識される、1つまたは複数の応答エレメント
を含む、請求項1または2記載の操作されたT細胞。
機能的に連結された前記導入遺伝子の発現が、T細胞における前記刺激または活性化シグナルに続いて、6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内にまたは約6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内に、誘導されるかまたは上方制御され；任意で、機能的に連結された前記導入遺伝子の発現が、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも多く、または約30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも多く、上方制御されるかまたは誘導される、請求項1～3のいずれか一項記載の操作されたT細胞。
前記導入遺伝子の発現の誘導または上方制御が、前記刺激または活性化シグナルの期間にわたって一過性であり、次いで、低減されるかまたは下方制御される、請求項1～4のいずれか一項記載の操作されたT細胞。
発現の誘導または上方制御に続いて、任意で、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在に続いて、機能的に連結された前記導入遺伝子の発現が、低減されるかまたは下方制御される、請求項1～5のいずれか一項記載の操作されたT細胞。
機能的に連結された前記導入遺伝子の発現が、シミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在の後に、T細胞におけるさらなるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、誘導されるかまたは上方制御される、請求項6記載の操作されたT細胞。
前記内在性T細胞刺激関連遺伝子座が、PDCD1、CD69、Nur77、FoxP3、およびHLA-DR遺伝子座の中から選択される、請求項1～7のいずれか一項記載の操作されたT細胞。
前記組換え受容体が、細胞外結合ドメインを含み、かつ前記組換え受容体の細胞外結合ドメインに対する作用物質の結合が、細胞において前記刺激または活性化シグナルの誘導または伝達を結果としてもたらす、請求項1～8のいずれか一項記載の操作されたT細胞。
前記組換え受容体が、T細胞受容体（TCR）複合体の成分の細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内領域を含み、かつT細胞における前記刺激もしくは活性化シグナルが、前記組換え受容体中に存在する細胞内シグナル伝達ドメインを通したシグナルを含む、および/または
前記組換え受容体が、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内領域を含み、かつT細胞における前記刺激もしくは活性化シグナルが、前記組換え受容体中に存在する細胞内シグナル伝達ドメインを通したシグナルを含む、
請求項1～9のいずれか一項記載の操作されたT細胞。
細胞内シグナル伝達領域が、CD3鎖、任意でCD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそのシグナル伝達部分を含む、請求項10記載の操作されたT細胞。
前記作用物質が、標的抗原であり、任意で、該標的抗原が、組換えタンパク質であるか、または細胞の表面上に発現している抗原である、請求項9～11のいずれか一項記載の操作されたT細胞。
前記標的抗原が、腫瘍抗原、病原体特異的抗原もしくは病原体発現抗原、炎症性抗原、または自己抗原である、請求項12記載の操作されたT細胞。
前記作用物質が、抗イディオタイプ抗体である、請求項9～11のいずれか一項記載の操作されたT細胞。
前記組換え受容体が、キメラ抗原受容体（CAR）である、請求項1～14のいずれか一項記載の操作されたT細胞。
前記導入遺伝子が、前記組換え受容体または前記組換え受容体の一部分をコードする、請求項1～15のいずれか一項記載の操作されたT細胞。
前記組換え受容体が、2つの別々のポリペプチド鎖を含み、前記導入遺伝子によってコードされる前記組換え受容体の一部分が、前記組換え受容体の1つの鎖であり、かつ操作されたT細胞が、前記組換え受容体の他の鎖をさらに含み、任意で、前記組換え受容体の該他の鎖が、第2の導入遺伝子によってコードされる、請求項16記載の操作されたT細胞。
前記組換え受容体が、組換えT細胞受容体（TCR）であり、任意で、該組換えTCRが、アルファ（TCRα）鎖およびベータ（TCRβ）鎖を含み、かつ前記導入遺伝子が、TCRα鎖をコードする核酸配列およびTCRβ鎖をコードする核酸配列を含む、請求項1～14、16、および17のいずれか一項記載の操作されたT細胞。
前記導入遺伝子が、1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントをさらに含み、任意で、該マルチシストロン性エレメントが、T2A、P2A、E2A、もしくはF2Aの中から選択されるリボソームスキップエレメント、または配列内リボソーム進入部位（IRES）をコードする配列を含む、請求項1～18のいずれか一項記載の操作されたT細胞。
前記組換え受容体が、組換えTCRであり、かつ前記マルチシストロン性エレメントが、TCRαをコードするヌクレオチドの配列と、TCRβをコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている；
前記組換え受容体が、多鎖CARであり、かつ前記マルチシストロン性エレメントが、多鎖CARの1つの鎖をコードするヌクレオチドの配列と、多鎖CARの別の鎖をコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている；および/または
前記マルチシストロン性エレメントが、前記組換え受容体をコードするヌクレオチドの配列の上流にある、
請求項19記載の操作されたT細胞。
前記改変されたT細胞刺激関連遺伝子座が、以下の工程：
a）内在性T細胞刺激関連遺伝子座のまたはその近くの1つまたは複数の標的部位で遺伝子破壊を誘導する工程であって、任意で、該遺伝子破壊が、標的部位に特異的に結合するか、それを認識するか、またはそれにハイブリダイズする、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされる、工程；および
b）相同性指向修復（HDR）のためのポリヌクレオチドを導入する工程
による、細胞刺激関連遺伝子座の内部中への、前記組換え受容体をコードする導入遺伝子の組み込みによって作製される、
請求項1～20のいずれか一項記載の操作されたT細胞。
前記組換え受容体をコードする導入遺伝子が、T細胞刺激関連遺伝子座中の少なくとも1つの標的部位にまたはその近くに組み込まれる、請求項21記載の操作されたT細胞。
前記T細胞刺激関連遺伝子座が、PDCD1であり、遺伝子破壊が、gRNAを含むCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつ該gRNAが、PDCD1遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有し、任意で、該gRNAが、SEQ ID NO:75および104～109のいずれか1つ、任意でSEQ ID NO:75に示される配列を含む、請求項1～22のいずれか一項記載の操作されたT細胞。
前記T細胞刺激関連遺伝子座が、CD69であり、遺伝子破壊が、gRNAを含むCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつ該gRNAが、CD69遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有し、任意で、該gRNAが、SEQ ID NO:116～121のいずれか1つに示される配列を含む、請求項1～22のいずれか一項記載の操作されたT細胞。
前記T細胞刺激関連遺伝子座が、Nur77であり、遺伝子破壊が、gRNAを含むCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつ該gRNAが、Nur77遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有し、任意で、該gRNAが、SEQ ID NO:122～127および134～136に示される配列を含む、請求項1～22のいずれか一項記載の操作されたT細胞。
前記T細胞刺激関連遺伝子座が、FoxP3である、請求項1～22のいずれか一項記載の操作されたT細胞。
前記T細胞刺激関連遺伝子座が、HLA-DR遺伝子座である、請求項1～22のいずれか一項記載の操作されたT細胞。
前記T細胞が、内在性T細胞受容体α定常領域（TRAC）遺伝子および/または内在性T細胞受容体β定常領域（TRBC）遺伝子に遺伝子破壊をさらに含み、任意で、該遺伝子破壊が、CRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつ該CRISPR-Cas9の組み合わせが、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2遺伝子内の少なくとも1つの標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含み、任意で、該CRISPR-Cas9の組み合わせが、gRNAおよびCas9タンパク質を含むリボ核タンパク質（RNP）複合体であり、任意で、該遺伝子破壊が、電気穿孔を介して複数のT細胞中に導入されるRNPによってもたらされる、請求項1～27のいずれか一項記載の操作されたT細胞。
前記gRNAが、TRAC遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有し、任意で、該gRNAが、SEQ ID NO:77および188～218のいずれか1つ、任意でSEQ ID NO:77に示される配列を含む；ならびに/または
前記gRNAが、TRBC遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有し、任意で、該gRNAが、SEQ ID NO:219～276のいずれか1つに示される配列を含む、
請求項28記載の操作されたT細胞。
T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルの非存在下での、コードされる前記組換え受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを通したシグナル伝達活性が、T細胞のゲノム中の異なる場所に存在するかまたはT細胞のゲノム中のランダムな場所に存在する同じ組換え受容体をコードする導入遺伝子を含む操作されたT細胞と比較して、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、もしくはそれ以上よりも多く、または約10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、もしくはそれ以上よりも多く、低減される、請求項1～29のいずれか一項記載の操作されたT細胞。
前記T細胞が、CD8+ T細胞もしくはCD4+ T細胞であるか、またはそのサブタイプである、請求項1～30のいずれか一項記載の操作されたT細胞。
前記T細胞が、対象に由来するT細胞であり、任意で、該対象がヒトである、請求項1～31のいずれか一項記載の操作されたT細胞。
（a）組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子、および
（b）T細胞中の内在性T細胞刺激関連遺伝子座の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む、該導入遺伝子に連結された1つまたは複数の相同性アーム
を含む、ポリヌクレオチド。
前記組換え受容体が、前記ポリヌクレオチドが導入された細胞から発現され、前記組換え受容体またはその一部分が、前記組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む改変されたT細胞刺激関連遺伝子座によってコードされ；かつ/または
前記導入遺伝子が、T細胞、任意でヒトT細胞の内在性T細胞刺激関連遺伝子座のオープンリーディングフレームにとって外来性または異種である配列である、
請求項33記載のポリヌクレオチド。
前記1つまたは複数の相同性アームが、5'相同性アームおよび/または3'相同性アームを含み、任意で、該5'相同性アームおよび/または3'相同性アームが、標的部位の周囲の核酸配列に相同な核酸配列を含み、該標的部位が、T細胞刺激関連遺伝子座内にある、請求項33または34記載のポリヌクレオチド。
前記標的部位が、T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントの下流にある、請求項35記載のポリヌクレオチド。
構造[5'相同性アーム]-[導入遺伝子]-[3'相同性アーム]を含む、請求項35または36記載のポリヌクレオチド。
前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、50または約50から、750または約750ヌクレオチド、50または約50から、500または約500ヌクレオチド、50または約50から、250または約250ヌクレオチド、50または約50から、100または約100ヌクレオチド、100または約100から、750または約750ヌクレオチド、100または約100から、500または約500ヌクレオチド、100または約100から、250または約250ヌクレオチド、250または約250から、750または約750ヌクレオチド、250または約250から、500または約500ヌクレオチドの長さであるか；独立して、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、もしくは500ヌクレオチドまたは約50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、もしくは500ヌクレオチド、または前述のいずれかの間の任意の値の長さであるか；あるいは独立して、100未満または約100未満のヌクレオチドの長さ、任意で、50、60、70、80、もしくは90ヌクレオチドまたは約50、60、70、80、もしくは90ヌクレオチド、または前述のいずれかの間の任意の値の長さである、請求項33～37のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
前記T細胞刺激関連遺伝子座が、PDCD1、CD69、Nur77、FoxP3、およびHLA-DR遺伝子座の中から選択される、請求項33～38のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
前記T細胞刺激関連遺伝子座が、PDCD1であり、任意で、5'相同性アームおよび3'相同性アームが、PDCD1の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む、請求項39記載のポリヌクレオチド。
前記5'相同性アームが、
a）SEQ ID NO:66に示される配列に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の配列同一性を示す配列に対する、150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個の連続したヌクレオチドを含む配列；
b）SEQ ID NO:66に示される配列の、150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個の連続したヌクレオチドを含む配列；または
c）SEQ ID NO:66に示される配列
を含み；かつ/あるいは
前記3'相同性アームが、
d）SEQ ID NO:67に示される配列に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の配列同一性を示す配列に対する、150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個の連続したヌクレオチドを含む配列；
e）SEQ ID NO:67に示される配列の、150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個のまたは少なくとも150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは600個の連続したヌクレオチドを含む配列；または
f）SEQ ID NO:67に示される配列
を含む、
請求項40記載のポリヌクレオチド。
前記T細胞刺激関連遺伝子座が、CD69であり、任意で、前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、CD69の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む、請求項39記載のポリヌクレオチド。
前記T細胞刺激関連遺伝子座が、Nur77であり、任意で、前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、Nur77の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む、請求項39記載のポリヌクレオチド。
前記T細胞刺激関連遺伝子座が、FoxP3であり、任意で、前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、FoxP3の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む、請求項39記載のポリヌクレオチド。
前記T細胞刺激関連遺伝子座が、HLA-DR遺伝子座であり、任意で、前記5'相同性アームおよび3'相同性アームが、HLA-DR遺伝子座の1つまたは複数の領域に相同な配列を含む、請求項39記載のポリヌクレオチド。
前記組換え受容体が、細胞外結合ドメインを含み、かつ前記組換え受容体の細胞外結合ドメインに対する作用物質の結合が、細胞において前記刺激または活性化シグナルの誘導または伝達を結果としてもたらす、請求項33～45のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
前記組換え受容体が、T細胞受容体（TCR）複合体の成分の細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内領域を含み、かつT細胞における前記刺激もしくは活性化シグナルが、前記組換え受容体中に存在する細胞内シグナル伝達ドメインを通したシグナルを含む、および/または
前記組換え受容体が、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内領域を含み、かつT細胞における前記刺激もしくは活性化シグナルが、前記組換え受容体中に存在する細胞内シグナル伝達ドメインを通したシグナルを含む、
請求項33～46のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
細胞内シグナル伝達領域が、CD3鎖、任意でCD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそのシグナル伝達部分を含む、請求項47記載のポリヌクレオチド。
前記作用物質が、標的抗原であり、任意で、該標的抗原が、組換えタンパク質であるか、または細胞の表面上に発現している抗原である、請求項46～48のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
前記標的抗原が、腫瘍抗原、病原体特異的抗原もしくは病原体発現抗原、炎症性抗原、または自己抗原である、請求項49記載のポリヌクレオチド。
前記作用物質が、抗イディオタイプ抗体である、請求項46～48のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
前記組換え受容体が、キメラ抗原受容体（CAR）である、請求項33～51のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
前記導入遺伝子が、前記組換え受容体または前記組換え受容体の一部分をコードする、請求項33～52のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
前記組換え受容体が、2つの別々のポリペプチド鎖を含み、前記導入遺伝子によってコードされる前記組換え受容体の一部分が、前記組換え受容体の1つの鎖であり、任意で、前記組換え受容体の他の鎖が、第2の導入遺伝子によってコードされる、請求項53記載のポリヌクレオチド。
前記組換え受容体が、組換えT細胞受容体（TCR）であり、任意で、該組換えTCRが、アルファ（TCRα）鎖およびベータ（TCRβ）鎖を含み、かつ前記導入遺伝子が、TCRα鎖をコードする核酸配列およびTCRβ鎖をコードする核酸配列を含む、請求項33～51、53、および54のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
前記導入遺伝子が、1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントをさらに含み、任意で、該マルチシストロン性エレメントが、T2A、P2A、E2A、もしくはF2Aの中から選択されるリボソームスキップエレメント、または配列内リボソーム進入部位（IRES）をコードする配列を含む、請求項33～55のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
前記組換え受容体が、組換えTCRであり、かつ前記マルチシストロン性エレメントが、TCRαをコードするヌクレオチドの配列と、TCRβをコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている；
前記組換え受容体が、多鎖CARであり、かつ前記マルチシストロン性エレメントが、多鎖CARの1つの鎖をコードするヌクレオチドの配列と、多鎖CARの別の鎖をコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている；および/または
前記マルチシストロン性エレメントが、前記組換え受容体をコードするヌクレオチドの配列の上流にある、
請求項56記載のポリヌクレオチド。
直鎖ポリヌクレオチドである、請求項33～57のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
ウイルスベクター中に含まれる、請求項33～57のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
前記ウイルスベクターがAAVベクターである、請求項59記載のポリヌクレオチド。
1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、もしくは4000ヌクレオチド、または約1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、もしくは4000ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値；あるいは、1500もしくは約1500から、2500もしくは約2500ヌクレオチド、または1750もしくは約1750から、2250もしくは約2250ヌクレオチドの長さである、請求項33～60のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
（a）T細胞の内在性T細胞刺激関連遺伝子座内の標的部位で遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質を、T細胞中に導入する工程；および
（b）請求項33～61のいずれか一項記載のポリヌクレオチドをT細胞中に導入する工程
を含む、遺伝子操作されたT細胞を作製する方法であって、
該方法が、
組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座
を作製し、
該組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子が、相同性指向修復（HDR）を介して内在性T細胞刺激関連遺伝子座内に組み込まれる、
前記方法。
請求項33～61のいずれか一項記載のポリヌクレオチドをT細胞中に導入する工程を含む、遺伝子操作されたT細胞を作製する方法であって、該T細胞が、T細胞のT細胞刺激関連遺伝子座内に遺伝子破壊を有し、前記組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子が、相同性指向修復（HDR）を介して内在性T細胞刺激関連遺伝子座内に組み込まれる、前記方法。
前記遺伝子破壊が、T細胞の内在性T細胞刺激関連遺伝子座内の標的部位で遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質を、T細胞中に導入することによって実施される、請求項63記載の方法。
組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子を含む、改変されたT細胞刺激関連遺伝子座
を作製する、請求項62～64のいずれか一項記載の方法。
前記標的部位が、内在性T細胞刺激関連遺伝子座の内在性転写制御エレメントの下流にある、請求項62～65のいずれか一項記載の方法。
前記T細胞刺激関連遺伝子座が、PDCD1、CD69、Nur77、FoxP3、およびHLA-DR遺伝子座の中から選択される、請求項62～66のいずれか一項記載の方法。
前記遺伝子破壊が、標的部位に特異的に結合するか、それを認識するか、またはそれにハイブリダイズする、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされる、請求項62～67のいずれか一項記載の方法。
前記遺伝子破壊が、CRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつ該CRISPR-Cas9の組み合わせが、少なくとも1つの標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含み、任意で、該CRISPR-Cas9の組み合わせが、gRNAおよびCas9タンパク質を含むリボ核タンパク質（RNP）複合体であり、任意で、該遺伝子破壊が、電気穿孔を介して複数のT細胞中に導入されるRNPによってもたらされる、請求項62～68のいずれか一項記載の方法。
前記T細胞刺激関連遺伝子座が、PDCD1であり、前記遺伝子破壊が、gRNAを含むCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつ該gRNAが、PDCD1遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有し、任意で、該gRNAが、SEQ ID NO:75および104～109のいずれか1つ、任意でSEQ ID NO:75に示される配列を含む、請求項62～69のいずれか一項記載の方法。
前記T細胞刺激関連遺伝子座が、CD69であり、前記遺伝子破壊が、gRNAを含むCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつ該gRNAが、CD69遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有し、任意で、該gRNAが、SEQ ID NO:116～121のいずれか1つに示される配列を含む、請求項62～69のいずれか一項記載の方法。
前記T細胞刺激関連遺伝子座が、Nur77であり、前記遺伝子破壊が、gRNAを含むCRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつ該gRNAが、Nur77遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有し、任意で、該gRNAが、SEQ ID NO:122～127および134～136に示される配列を含む、請求項62～69のいずれか一項記載の方法。
前記T細胞刺激関連遺伝子座が、FoxP3である、請求項62～69のいずれか一項記載の方法。
前記T細胞刺激関連遺伝子座が、HLA-DR遺伝子座である、請求項62～69のいずれか一項記載の方法。
前記T細胞が、内在性T細胞受容体α定常領域（TRAC）遺伝子および/または内在性T細胞受容体β定常領域（TRBC）遺伝子に遺伝子破壊をさらに含み、任意で、該遺伝子破壊が、CRISPR-Cas9の組み合わせによってもたらされ、かつ該CRISPR-Cas9の組み合わせが、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2遺伝子内の少なくとも1つの標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含み、任意で、該CRISPR-Cas9の組み合わせが、gRNAおよびCas9タンパク質を含むリボ核タンパク質（RNP）複合体であり、任意で、該遺伝子破壊が、電気穿孔を介して複数のT細胞中に導入されるRNPによってもたらされる、請求項62～74のいずれか一項記載の方法。
前記gRNAが、TRAC遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有し、任意で、該gRNAが、SEQ ID NO:77および188～218のいずれか1つ、任意でSEQ ID NO:77に示される配列を含む；ならびに/または
前記gRNAが、TRBC遺伝子中の標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有し、任意で、該gRNAが、SEQ ID NO:219～276のいずれか1つに示される配列を含む、
請求項75記載の方法。
前記RNPが、電気穿孔、パーティクルガン、リン酸カルシウムトランスフェクション、細胞の圧縮または圧迫を介して、任意で電気穿孔を介して導入され、任意で、該RNPが、電気穿孔を介して複数のT細胞中に導入される、請求項69～76のいずれか一項記載の方法。
前記RNPの濃度が、1μMまたは約1μMから、5μMまたは約5μMであり、任意で、該RNPの濃度が、2μMまたは約2μMである、請求項69～77のいずれか一項記載の方法。
T細胞が、CD8+ T細胞および/もしくはCD4+ T細胞またはそのサブタイプを含む、請求項62～78のいずれか一項記載の方法。
前記T細胞が、ヒトT細胞であり、任意で、ヒト対象に由来する初代T細胞である、請求項62～79のいずれか一項記載の方法。
前記1つまたは複数の作用物質および前記ポリヌクレオチドが、同時に導入される、請求項62および64～80のいずれか一項記載の方法。
前記ポリヌクレオチドが、前記1つまたは複数の作用物質の導入の後に導入される、請求項62および64～80のいずれか一項記載の方法。
前記ポリヌクレオチドが、前記作用物質の導入の直後に、または該導入後約30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間以内に導入される、請求項82記載の方法。
前記1つもしくは複数の作用物質および/または前記ポリヌクレオチドの導入の前に、前記方法が、前記細胞を、1つまたは複数の免疫細胞を刺激するかまたは活性化するための条件下で刺激物質とインビトロでインキュベートする工程を含み、任意で、該刺激物質が、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体を含み、任意で、該刺激物質が、抗CD3抗体および/もしくは抗CD28抗体を含むオリゴマー粒子試薬、または抗CD3抗体および/もしくは抗CD28抗体でコーティングされたビーズを含む、請求項62および64～83のいずれか一項記載の方法。
前記方法が、前記1つもしくは複数の作用物質の導入および/または前記ポリヌクレオチドの導入の前に、その最中に、またはその後に、前記細胞を、1つまたは複数の組換えサイトカインとインキュベートする工程をさらに含み、任意で、該1つまたは複数の組換えサイトカインが、IL-2、IL-7、およびIL-15からなる群より選択され、任意で、該1つまたは複数の組換えサイトカインが、10 U/mLもしくは約10 U/mLから、200 U/mLもしくは約200 U/mL、任意で50 IU/mLもしくは約50 IU/mLから、100 U/mLもしくは約100 U/mLのIL-2の濃度；0.5 ng/mL～50 ng/mL、任意で5 ng/mLもしくは約5 ng/mLから、10 ng/mLもしくは約10 ng/mLのIL-7の濃度；および/または0.1 ng/mL～20 ng/mL、任意で0.5 ng/mLもしくは約0.5 ng/mLから、5 ng/mLもしくは約5 ng/mLのIL-15の濃度から選択される濃度で添加される、請求項62および64～84のいずれか一項記載の方法。
インキュベーションが、前記1つまたは複数の作用物質の導入および前記ポリヌクレオチドの導入の後に、最大で24時間、36時間、48時間、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、もしくは21日間、またはおよそ24時間、36時間、48時間、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、もしくは21日間、任意で、最大で7日間または約7日間実施される、請求項84または85記載の方法。
請求項62～86のいずれか一項記載の方法を用いて生成された、操作されたT細胞。
請求項1～32のいずれか一項記載の操作された細胞または複数の請求項1～32のいずれか一項記載の操作された細胞を含む、組成物。
請求項87記載の操作されたT細胞または複数の請求項87記載の操作されたT細胞を含む、組成物。
機能的に連結された前記導入遺伝子の発現が、T細胞における前記刺激または活性化シグナルに続いて、6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内にまたは約6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内に、組成物中の1つまたは複数の細胞において誘導されるかまたは上方制御され、任意で、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルに続いて、組成物中の細胞の中での、機能的に連結された前記導入遺伝子を発現する細胞の頻度が、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも高いか、または約50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも高い、請求項88または89記載の組成物。
発現の上方制御もしくは誘導に続いて、またはT細胞におけるシミュレーションもしくは活性化シグナルの低減もしくは非存在に続いて、機能的に連結された前記導入遺伝子の発現が、組成物中の1つまたは複数の細胞において低減されるかまたは下方制御される、請求項88～90のいずれか一項記載の組成物。
発現の上方制御または誘導に続いて、機能的に連結された前記導入遺伝子の発現が、T細胞における前記刺激または活性化シグナルの、1、2、3、4、5、6、7、もしくは8日、もしくはそれ以上後にまたは約1、2、3、4、5、6、7、もしくは8日、もしくはそれ以上後に、組成物中の1つまたは複数の細胞において低減されるかまたは下方制御される；あるいは
組成物中の細胞の1つまたは複数における機能的に連結された前記導入遺伝子の発現が、T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在に続いて、6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内にまたは約6、12、18、24、36、もしくは48時間未満以内に、低減されるかまたは下方制御され、任意で、組成物中の細胞の中での、機能的に連結された前記導入遺伝子を発現する細胞の頻度が、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも多く、または約30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、もしくはそれ以上よりも多く、低減される；および/あるいは
T細胞におけるシミュレーションまたは活性化シグナルの低減または非存在に続いて、組成物中の細胞の中での前記組換え受容体を発現する細胞の頻度が、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、もしくは5％、もしくはそれ以下よりも低いか、または約50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、もしくは5％、もしくはそれ以下よりも低い、
請求項88～91のいずれか一項記載の組成物。
CD4+ T細胞および/またはCD8+ T細胞を含む、請求項88～92のいずれか一項記載の組成物。
CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を含み、かつCD4+ T細胞対CD8+ T細胞の比が、1:3～3:1または約1:3～3:1、任意で1:1である、請求項88～93のいずれか一項記載の組成物。
請求項1～32および87のいずれか一項記載の操作された細胞、または請求項88～94のいずれか一項記載の組成物を、ある疾患または障害を有する対象に投与する工程を含む、処置の方法。
前記疾患または障害が、がんまたは腫瘍である、請求項95記載の方法。
前記がんまたは腫瘍が、血液悪性腫瘍、任意でリンパ腫、白血病、または形質細胞悪性腫瘍であり、任意で、該がんが、リンパ腫であり、かつ該リンパ腫が、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（NHL）、ホジキンリンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、濾胞性リンパ腫、小型非切れ込み核細胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（MALT）、辺縁帯リンパ腫、脾リンパ腫、結節性単球様B細胞リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、大細胞リンパ腫、びまん性混合細胞型リンパ腫、肺B細胞血管中心性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、原発性縦隔B細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫（LPL）、またはマントル細胞リンパ腫（MCL）である、請求項96記載の方法。
前記がんが、白血病であり、かつ該白血病が、慢性リンパ球性白血病（CLL）、形質細胞白血病、または急性リンパ球性白血病（ALL）である、請求項96または97記載の方法。
前記がんが、形質細胞悪性腫瘍であり、かつ該形質細胞悪性腫瘍が、多発性骨髄腫（MM）である、請求項96または97記載の方法。
前記腫瘍が、固形腫瘍であり、任意で、該固形腫瘍が、非小細胞肺がん（NSCLC）または頭頚部扁平上皮癌（HNSCC）である、請求項96記載の方法。
前記操作された細胞または前記組成物を投与されなかった対象におけるものと比較して、がんもしくは腫瘍の体積もしくはサイズが低減され、かつ/または対象の生存が延長される、請求項96～100のいずれか一項記載の方法。
T細胞刺激関連遺伝子座内の標的部位で遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質；および
請求項33～61のいずれか一項記載のポリヌクレオチド
を含む、キット。
T細胞刺激関連遺伝子座内の標的部位で遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質；および
組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、相同性指向修復（HDR）を介した標的部位でのまたはその近くでの組み込みのためにターゲティングされる、ポリヌクレオチド；および
請求項62～86のいずれか一項記載の方法を実施するための説明書
を含む、キット。