KR20230042283A - 재조합 수용체를 조건부로 발현하는 조작된 ｔ 세포, 관련된 폴리뉴클레오티드 및 방법 - Google Patents
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Abstract
재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 함유하는 조작된 T 세포가 제공된다. 일부 측면에서, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은, 일부 경우에 표적화 통합에 의해 조작된, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 일부 측면에서, 조작된 세포는 재조합 수용체를 조건부로, 예컨대 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 시에 발현한다. 또한, 세포 조성물, 세포를 조작하기 위한 핵산, 및 조작된 세포를 생산하기 위한 방법 및 제조 물품이 개시된다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 조작된 세포의 입양 전이(adoptive transfer)를 포함하는 암 면역요법과 관련하여 포함하는 세포 요법과 관련하여 사용될 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 "재조합 수용체를 조건부로 발현하는 조작된 T 세포, 관련된 폴리뉴클레오티드 및 방법"이라는 명칭으로 2020년 6월 26일자로 출원된 미국 가출원 제63/044,984호의 우선권을 주장하며 상기 출원의 내용은 그 전체가 참조로 포함된다.
서열 목록의 참조 포함
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열목록은 2021년 6월 23일에 생성된 735042013840SeqList.txt라는 제목의 파일로 제공되며 그의 크기는 220 킬로바이트이다. 서열 목록의 전자적 형식의 정보는 그 전체가 참조로 포함된다.
분 야
본 개시는 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 함유하는 조작된 T 세포에 관한 것이다. 일부 측면에서, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결되고, 일부 경우에, 표적화된 통합에 의해 조작된다. 일부 측면에서, 조작된 세포는 재조합 수용체를 조건부로, 예컨대 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 시에 발현한다. 또한, 세포 조성물, 세포를 조작하기 위한 핵산, 및 조작된 세포를 생산하기 위한 방법 및 제조 물품이 개시된다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 조작된 세포의 입양 전이(adoptive transfer)를 포함하는 암 면역요법과 관련하여 포함하는 세포 요법과 관련하여 사용될 수 있다.
질환과 관련된 항원을 인식하기 위해 재조합 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR) 또는 재조합 T 세포 수용체(T cell receptors, TCR)를 이용하는 입양 세포 요법은 암 및 다른 질환의 치료를 위한 매력적인 치료 양상(therapeutic modality)을 나타낸다. 예를 들어, 암, 감염성 질환 및 자가면역 질환을 치료하기 위해, 재조합 수용체를 발현하도록 T 세포를 조작하기 위한, 예컨대 입양 면역요법에서의 사용을 위한 개선된 전략이 필요하다. 이러한 필요를 충족시키는 방법에 사용하기 위한 방법, 세포, 조성물 및 키트가 제공된다.
재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유하는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 포함하는 조작된 T 세포가 본원에서 제공되며, 여기서 전이 유전자는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결되며, 여기서 내인성 전사 조절 요소는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현을 유도하거나 상향조절한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 내인성 전사 조절 요소는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 프로모터이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 전이 유전자는 프로모터의 하류(downstream)에 존재한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 유도성이고, 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 유도된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후 (약) 6시간 미만 이내에 상향조절되거나 유도된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후 (약) 12시간 미만 이내에 상향조절되거나 유도된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후 (약) 24시간 미만 이내에 상향조절되거나 유도된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후 (약) 36시간 미만 이내에 상향조절되거나 유도된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후 (약) 48시간 미만 이내에 상향조절되거나 유도된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 영구적이지 않고/않거나 시간 경과에 따라 또는 T 세포에 의한 자극 또는 활성화 신호의 부재 하에 감소될 수 있다. 임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포에서 발현의 상향조절 또는 유도 후 또는 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 감소되거나 하향조절된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 발현의 상향조절 또는 유도 후, 또는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 (약) 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과 보다 더 크게 감소되거나 하향조절된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 발현의 상향조절 또는 유도 후, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일 또는 그 초과 후에 감소되거나 하향조절된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후 (약) 6, 12, 18, 24, 36 또는 48시간 미만 이내에 감소되거나 하향조절된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에 T 세포에서 추가 자극 또는 활성화 신호 후에 다시 유도되거나 상향조절될 수 있다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에 T 세포에서 추가 자극 또는 활성화 신호 후에 (약) 6, 12, 18, 24, 36 또는 48 시간 미만 이내에 상향조절되거나 유도된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 유도성이고, 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 유도된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에 T 세포에서 추가 자극 또는 활성화 신호 후에 (약) 6 시간 미만 이내에 상향조절되거나 유도된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에 T 세포에서 추가 자극 또는 활성화 신호 후에 (약) 12 시간 미만 이내에 상향조절되거나 유도된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에 T 세포에서 추가 자극 또는 활성화 신호 후에 (약) 24 시간 미만 이내에 상향조절되거나 유도된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에 T 세포에서 추가 자극 또는 활성화 신호 후에 (약) 36 시간 미만 이내에 상향조절되거나 유도된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에 T 세포에서 추가 자극 또는 활성화 신호 후에 (약) 48 시간 미만 이내에 상향조절되거나 유도된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임으로부터의 번역된 생성물은 세포 내에서 발현되지 않거나, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 기능적 내인성 유전자 생성물은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 발현되지 않는다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)에 결실(deletion), 삽입(insertion), 프레임시프트 돌연변이(frameshift mutation) 또는 넌센스 돌연변이(nonsense mutation)를 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1, CD69, Nur77, FoxP3 및 HLA-DR 유전자 좌 중에서 선택된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1 유전자 좌이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 CD69 유전자 좌이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 Nur77 유전자 좌이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 FoxP3 유전자 좌이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 HLA-DR 유전자 좌이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 내인성 전사 조절 요소는 자극 또는 활성화 신호 후에 활성화되는 전사 인자에 의해 인식되는 하나 이상의 반응 요소를 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체 또는 이의 일부는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호를 유도 또는 전달할 수 있다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체는 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 성분의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하고, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호는 재조합 수용체에 존재하는 세포내 신호전달 도메인을 통한 신호를 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하고, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호는 재조합 수용체에 존재하는 세포내 신호전달 도메인을 통한 신호를 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체(예를 들어 CAR)의 세포내 신호전달 도메인은 CD3제타 신호전달 도메인을 포함할 수 있고, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호는 재조합 수용체(예를 들어 CAR)에 존재하는 세포내 신호전달 도메인을 통한 신호를 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체는 TCR이고, T 세포 복합체의 성분을 모집하여 T 세포에서 활성화 신호를 유도 또는 자극할 수 있다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체는 제제(예를 들어 표적 항원)에 결합하거나 이를 인식할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 세포외 영역을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 자극 또는 활성화 신호는 재조합 수용체에 의한 제제의 결합 또는 인식 시에 T 세포에서 유도된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 제제는 표적 항원이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 표적 항원은 재조합 단백질이거나, 세포의 표면에서 발현되는 항원이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 표적 항원은 질환, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 연관되거나, 그에 대해 특이적이거나, 그 위에서 발현된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 질환, 장애 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환, 또는 종양 또는 암이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 표적 항원은 종양 항원이다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 인테그린), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산탈수효소 9(CA9, 또한 CAIX 또는 G250으로 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2로 공지됨), 암태아성 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(chondroitin sulfate proteoglycan) 4(CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백 2(EPG-2), 상피 당단백 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5, 또한 Fc 수용체 유사 5 또는 FCRH5로 공지됨), 태아성 아세틸콜린 수용체(태아성 AchR), 폴레이트 결합 단백질(FBP), 폴레이트 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화된 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질-커플링된 수용체 부류 C 그룹 5 멤버 D(protein-coupled receptor class C group 5 member D; GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-멜라노마-연관 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복 함유 8 패밀리 멤버 A(LRRC8A), 루이스 Y, 멜라노마-연관 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 사이토메갈로바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 온코페탈 항원, 멜라노마의 우선 발현된 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 세포영양막 당단백(TPBG, 또한 5T4로 공지됨), 종양-연관 당단백 72(TAG72), 티로시나제 관련된 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75라고도 알려짐), 티로시나제 관련된 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토머라제(dopachrome tautomerase), 도파크롬 델타-이소머라제(dopachrome delta-isomerase) 또는 DCT라고도 알려짐), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 윌름스 종양 1(WT-1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원, 또는 유니버설 태그로 연관된 항원, 및/또는 비오틴화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자로부터 선택된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 제제는 재조합 수용체의 세포외 도메인에 특이적인 항-이디오타입 항체이다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, CAR은 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 영역을 함유하는 세포외 영역을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 세포외 영역은 또한 스페이서를 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 스페이서는 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 작동 가능하게 연결된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 세포외 영역은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 예를 들어, 단일-사슬 가변 단편(scFv)이거나 이를 포함하는 결합 도메인을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체(예를 들어 CAR)의 세포내 영역은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 사슬의 세포내 신호전달 도메인이거나 이를 포함한다. 임의의 실시형태의 일부에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 신호전달 부분이거나 이를 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 세포내 영역은 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인(들)을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 세포내 영역은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬, 또는 그의 신호전달 부분, 및 하나 이상의 공-자극 신호전달 영역을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 세포내 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 부분을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 공-자극 신호전달 영역은 4-1BB의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 CAR인 재조합 수용체를 암호화하며, 여기서 CAR은 그의 N 말단으로부터 C 말단까지 순서대로: 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 세포내 영역을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 전이 유전자는 세포외 결합 도메인, 예를 들어, scFv를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열; 스페이서, 예를 들어, 인간 면역글로불린 힌지로부터의 서열, 예를 들어, IgG1, IgG2 또는 IgG4으로부터의 서열 또는 그의 변형된 버전, 예를 들어, 추가로 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 포함하는 것; 및 막관통 도메인, 예를 들어, 인간 CD28로부터의 것; 공-자극 신호전달 도메인, 예를 들어, 인간 4-1BB로부터의 것; 및 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어, CD3ζ 사슬 또는 그의 일부를 순서대로 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 순서대로: 세포외 결합 도메인, 예를 들어, scFv를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열; 스페이서, 예를 들어, 인간 면역글로불린 힌지로부터의 서열, 예를 들어, IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터의 서열 또는 그의 변형된 버전, 예를 들어, 추가로 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 포함하는 것; 및 막관통 도메인, 예를 들어, 인간 CD28로부터의 것; 공-자극 신호전달 도메인, 예를 들어, 인간 4-1BB로부터의 것; 및 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어, CD3ζ 사슬 또는 이의 일부를 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 전이 유전자는 재조합 수용체, 예를 들어, 재조합 수용체의 충분한(full) 또는 완전한(complete) 서열을 암호화한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체는 단일-사슬 폴리펩티드이다. 예를 들어, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)일 수 있고, 전이 유전자는 키메라 항원 수용체(CAR), 예를 들어, CAR의 충분한 또는 완전한 서열을 암호화한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체는 다중-사슬 폴리펩티드, 예를 들어, 2 사슬 폴리펩티드이다. 예를 들어, 재조합 수용체는 알파 사슬 및 베타 사슬을 함유하는 T 세포 수용체(TCR)일 수 있고, 전이 유전자는 TCR의 알파 사슬 및 베타 사슬 둘 다, 예를 들어, TCR의 알파 및 베타 사슬의 충분한 또는 완전한 서열을 암호화한다. 이러한 구체예에서, TCR의 별개의 사슬은 멀티시스트로닉 요소(multicistronic element), 예를 들어, 리보솜 스킵 요소(ribosome skip element)(예를 들어 T2A 또는 P2A) 또는 IRES에 의해 분리될 수 있다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 전이 유전자는 재조합 수용체의 일부를 암호화한다. 실시예에서, 전이 유전자에 의해 암호화되는 재조합 수용체의 일부는, 그의 일부가 T 세포로부터 발현될 때, 예를 들어, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에, 전장 재조합 수용체의 기능적 활성(예를 들어 항원 결합 및 수용체 신호전달 활성)을 용이하게 하거나 또는 이와 동일하거나 또는 유사하게 할 수 있다(즉, 보유). 임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포로부터 발현될 때, 재조합 수용체의 일부는 재조합 수용체의 전장 형태(full-length form)의 기능적 활성(예를 들어 항원 결합 및 수용체 신호전달 활성)을 보유하는 전장 재조합 수용체 또는 이의 일부 서열을 형성할 수 있다. 임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포로부터 발현될 때, 재조합 수용체의 일부는 재조합 수용체의 전장 활성의 적어도 75%, 85%, 90%, 또는 100%를 촉진시키거나 또는 이를 허용할 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포로부터 발현될 때, 전이 유전자에 의해 암호화되는 재조합 수용체의 일부는 조작된 T 세포에 의해 또한 발현되는 재조합 수용체의 또 다른 성분(예를 들어 재조합 수용체의 또 다른 사슬)과 함께 전장 기능적 수용체를 형성할 수 있다. 다른 구체예에서, 재조합 수용체는 단일 사슬 폴리펩티드(예를 들어 CAR)일 수 있고, 그의 일부는 T 세포로부터 발현될 때, 재조합 수용체의 기능적 활성에 필요한 재조합 수용체의 아미노산의 인접 서열을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 재조합 수용체의 그의 일부는 재조합 수용체의 길이의 적어도 약 85%, 적어도 약 87%, 적어도 약 90%, 적어도 약 92%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%인 서열 길이를 포함하고, 재조합 수용체의 활성(예를 들어 항원 결합 및 수용체 신호전달 활성)을 보유하는 부분적 재조합 수용체를 암호화하는 재조합 수용체의 아미노산의 인접 서열을 가질 수 있다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체의 그의 일부는, 예를 들어, 재조합 수용체가 다중-사슬(예를 들어 알파 사슬 및 베타 사슬을 함유하는 TCR, 또는 다중-사슬 CAR)로 이루어진 구현예에서 재조합 수용체의 폴리펩티드 사슬이다. 예를 들어, 재조합 수용체의 다른 사슬은 조작된 T 세포에 의해 별도로 추가로 발현된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체는 2개의 별개의 폴리펩티드 사슬을 함유하고, 여기서 전이 유전자에 의해 암호화되는 재조합 수용체의 일부는 재조합 수용체의 하나의 사슬이고, 조작된 T 세포는 재조합 수용체의 다른 사슬을 추가로 발현한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체의 다른 사슬은 T 세포에 의해 발현될 수 있고 별도로 함유되는 제 2 전이 유전자에 의해 암호화된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체는 다중-사슬 CAR인 CAR이다. 일부 구체예에서, 전이 유전자는 다중-사슬 CAR, 예를 들어, 다중-사슬 CAR의 충분한 또는 전체 서열, 예를 들어, 2개의 사슬을 갖는 다중-사슬 CAR의 제 1 사슬 및 제 2 사슬을 암호화한다. 이러한 구체예에서, 다중-사슬 CAR의 별개의 사슬은 멀티시스트로닉 요소, 예를 들어, 리보솜 스킵 요소(예를 들어 T2A 또는 P2A) 또는 IRES에 의해 분리될 수 있다. 다른 구체예에서, 전이 유전자는 다중-사슬 CAR의 하나의 사슬을 암호화하고, 다중-사슬 CAR의 다른 사슬은 예를 들어, 제 2 전이 유전자에 의해 조작된 세포에 의해 별도로 암호화된다. 임의의 제공된 구현예 중의 일부에서, 조작된 T 세포는 예를 들어, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 항원-결합 및 수용체 신호전달 활성을 보유하거나 나타내는 완전 기능적 재조합 다중-사슬 CAR을 발현할 수 있다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체는 재조합 T 세포 수용체(TCR)이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 TCR은 알파(TCRα) 사슬 및 베타(TCRβ) 사슬을 포함하고, 전이 유전자는 TCRα 사슬을 암호화하는 핵산 서열 및/또는 TCRβ 사슬을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 전이 유전자는 TCR, 예를 들어, TCRα 및 TCRβ 사슬을 포함하는 TCR의 전체 또는 전체 서열을 암호화한다. 이러한 구체예에서, TCR의 별개의 사슬은 멀티시스트로닉 요소, 예를 들어, 리보솜 스킵 요소(예를 들어 T2A 또는 P2A) 또는 IRES에 의해 분리될 수 있다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 전이 유전자는 TCRα 사슬 또는 TCRβ 사슬 중의 하나를 암호화하고, TCRα 사슬 또는 TCRβ 사슬 중의 다른 것은 예를 들어, 제 2 전이 유전자에 의해 조작된 세포에 의해 별도로 암호화된다. 임의의 제공된 구현예 중의 일부에서, 조작된 T 세포는 예를 들어, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 항원-결합 및 수용체 신호전달 활성을 보유하거나 나타내는 완전 기능적 재조합 TCR을 발현할 수 있다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체는 TCRα 및 TCRβ 사슬을 함유하는 TCR이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, TCRα 사슬은 하나 이상의 도입된 시스테인 잔기를 포함하는 불변 (Cα) 영역을 포함하고, 및/또는 TCRβ사슬은 하나 이상의 도입된 시스테인 잔기를 포함하는 Cβ 영역을 포함하고, 여기서 하나 이상의 도입된 시스테인 잔기는 알파 사슬과 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비-천연 이황화물 브릿지(non-native disulfide bridges)을 형성할 수 있다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 하나 이상의 도입된 시스테인 잔기는 비-시스테인 잔기의 시스테인 잔기로의 대체를 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, Cα 영역은 서열번호 92에 제시된 바와 같은 넘버링으로 위치 48에 상응하는 위치에 시스테인을 포함하고/하거나; Cβ 영역은 서열번호 96에 제시된 바와 같은 넘버링으로 위치 57에 상응하는 위치에 시스테인을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 전이 유전자는 적어도 하나의 추가 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 적어도 하나의 추가 단백질은 대리 마커, 예를 들어, 조작된 T 세포에 의한 재조합 수용체의 발현을 위해 대리물(surrogate)로서 모니터링하거나 작용하는 마커이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 대리 마커(surrogate marker)는 절단된 수용체이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 절단된 수용체는 세포내 신호전달 도메인이 결여되고/되거나 이의 리간드에 의해 결합될 때 세포내 신호전달을 매개할 수 없다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 전이 유전자는 멀티시스트로닉 요소(들)를 더 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 멀티시스트로닉 요소(들)는 T2A, P2A, E2A 또는 F2A, 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 중에서 선택된 리보솜 스킵 요소를 암호화하는 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 멀티시스트로닉 요소는 CAR을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열과 적어도 하나의 추가 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 사이에 위치한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체는 재조합 TCR이고, 멀티시스트로닉 요소는 TCRα를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열과 TCRβ를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 사이에 위치한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체는 다중-사슬 CAR이고, 멀티시스트로닉 요소는 다중-사슬 CAR의 하나의 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열과 다중-사슬 CAR의 또 다른 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 사이에 위치한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 멀티시스트로닉 요소(들)는 재조합 수용체를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열의 상류(upstream)이다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자를 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내로 통합시킴으로써, 예를 들어, 상동성-지시된 수선을 사용하는 유전자 편집에 의해 생성된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 통합은 a) 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 또는 근처에서 하나 이상의 표적 부위(들)에서 유전자 파괴(genetic disruption)를 유도하는 것; 및 b) 상동성 지시된 수선(HDR)을 위한 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것에 의한 것이다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 적어도 하나의 표적 부위에서 또는 그 근처에서 통합된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 표적 부위에 특이적으로 결합하거나, 이를 인식하거나, 또는 혼성화하는 징크 핑거 핵산분해효소(zinc finger nuclease; ZFN), TAL-이펙터 핵산분해효소(TAL-effector nuclease; TALEN), 또는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어진다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지고, CRISPR-Cas9 조합은 적어도 하나의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, CRISPR-Cas9 조합은 gRNA 및 Cas9 단백질을 포함하는 리보핵단백질(ribonucleoprotein; RNP) 복합체이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 전기천공(electroporation)을 통해 복수의 T 세포 내로 도입된 RNP에 의해 이루어진다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지고, gRNA는 PDCD1 유전자에서 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는다. 임의의 구현예 중의 일부에서, gRNA는 서열번호 75 및 104-109 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, gRNA는 서열번호 75에 제시된 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 CD69이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지고, gRNA는 CD69 유전자에서 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는다. 임의의 구현예 중의 일부에서, gRNA는 서열번호 116-121 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 Nur77이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지고, gRNA는 Nur77 유전자에서 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는다. 임의의 구현예 중의 일부에서, gRNA는 서열번호 122-127 및 134-136에 제시된 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 FoxP3이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지고, gRNA는 FoxP3 유전자에서 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 HLA-DR 유전자 좌이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지고, gRNA는 HLA-DR 유전자에서 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포는 내인성 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC) 유전자 및/또는 내인성 T 세포 수용체 베타 불변 영역(TRBC) 유전자에서의 유전자 파괴를 더 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포는 내인성 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC) 유전자에서의 유전자 파괴를 더 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포는 내인성 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRBC) 유전자에서의 유전자 파괴를 더 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포는 내인성 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC) 유전자 및 내인성 T 세포 수용체 베타 불변 영역(TRBC) 유전자에서의 유전자 파괴를 더 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 적어도 하나의 표적 부위, 예를 들어, TRAC 유전자 또는 TRBC2 유전자 내의 적어도 하나의 표적 부위에 특이적으로 결합하거나, 인식하거나, 또는 혼성화하는 징크 핑거 핵산분해효소(ZFN), TAL-이펙터 핵산분해효소(TALEN), 또는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어진다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지고, CRISPR-Cas9 조합은 적어도 하나의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, CRISPR-Cas9 조합은 gRNA 및 Cas9 단백질을 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 전기천공을 통해 복수의 T 세포 내로 도입된 RNP에 의해 이루어진다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지고, gRNA는 TRAC 유전자 또는 TRBC 유전자, TRBC1 또는 TRBC2 유전자 중의 어느 하나 내의 적어도 하나의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는다. 임의의 구현예 중의 일부에서, gRNA는 TRAC 유전자 내의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는다. 임의의 구현예 중의 일부에서, gRNA는 서열번호 77 및 188-218 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, gRNA는 서열번호 77에 제시된 서열을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, gRNA는 TRBC 유전자 내의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는다. 임의의 구현예 중의 일부에서, gRNA는 서열번호 219-276 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 부재 하에 암호화된 재조합 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 통한 신호전달 활성은 T 세포의 게놈 내의 상이한 위치에 존재하거나 T 세포의 게놈 내의 무작위 위치에 존재하는 동일한 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 조작된 T 세포와 비교하여 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% 또는 그 초과 보다 더 크게 감소된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포는 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포 또는 이의 하위유형이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포는 대상체로부터 유래된 1차 T 세포이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, T 세포는 인간 대상체로부터 유래된 1차 T 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 1차 인간 T 세포이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포는 다능성 또는 만능 세포로부터 유래된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포는 iPSC로부터 유래된다.
복수의 제공된 조작된 세포 중의 임의의 것을 함유하는 조성물이 또한 제공된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후 (약) 6, 12, 18, 24, 36 또는 48 시간 미만 이내에 조성물 중의 하나 이상의 세포에서 상향조절되거나 유도된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에, 조성물 중의 세포 중에서 작동가능하게 연결된 전이 유전자를 발현하는 세포의 빈도는 (약) 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과보다 더 크다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 발현의 상향조절 또는 유도 후에 또는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 조성물 중의 하나 이상의 세포에서 감소되거나 하향조절된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 발현의 상향조절 또는 유도 후에, 또는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에, 조성물 중의 세포 중에서 작동가능하게 연결된 전이 유전자를 발현하는 세포의 빈도는 (약) 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과보다 더 크게 감소된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 발현의 상향조절 또는 유도 후에, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일 또는 그 초과 후에 조성물 중의 하나 이상의 세포에서 감소되거나 하향조절된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 조성물 중의 하나 이상의 세포에서 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에 (약) 6, 12, 18, 24, 36 또는 48 시간 미만 내에 감소되거나 하향조절된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에, 조성물 중의 세포 중에서 재조합 수용체를 발현하는 세포의 빈도는 (약) 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 또는 그 미만보다 적다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 조성물은 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하고, CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비는 (약) 1:3 내지 3:1이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 1:1이다.
또한, (a) 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자, 및 (b) 전이 유전자에 연결된 하나 이상의 상동성 암을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 여기서 하나 이상의 상동성 암은 T 세포에서 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체 또는 이의 일부는, 재조합 수용체가 폴리뉴클레오티드로 도입된 세포로부터 발현될 때, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유하는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 의해 암호화된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 전이 유전자는 T 세포의 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임에 대해 외인성 또는 이종성인 서열이다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포는 일차 인간 T 세포이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포는 대상체로부터 유래된 T 세포이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 대상체는 인간이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포는 인간 T 세포이다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 하나 이상의 상동성 암은 5' 상동성 암 및/또는 3' 상동성 암을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 표적 부위를 둘러싸는 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 포함하고, 여기서 표적 부위는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내에 있다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 표적 부위는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소의 하류에 있다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 폴리뉴클레오티드는 구조 [5' 상동성 암]-[전이 유전자]-[3' 상동성 암]을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 적어도 하나의 표적 부위를 둘러싸는 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 50 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드, (약) 50 내지 (약) 500개의 뉴클레오티드, (약) 50 내지 (약) 250개의 뉴클레오티드, (약) 50 내지 (약) 100개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 500개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 250개의 뉴클레오티드, (약) 250 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드, (약) 250 내지 (약) 500개의 뉴클레오티드의 길이이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400 또는 500개의 뉴클레오티드의 길이, 또는 상기 것들 사이의 임의의 값이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 100개 미만의 뉴클레오티드 길이이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 약 50, 60, 70, 80 또는 90개의 뉴클레오티드의 길이, 또는 상기 것들 사이의 임의의 값이다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1, CD69, Nur77, FoxP3 및 HLA-DR 유전자 좌 중에서 선택된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 PDCD1의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암은: a) 서열번호 66에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 나타내는 서열에 대해 적어도 (약) 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열; b) 서열번호 66에 제시된 서열 중의 적어도 (약) 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 또는 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열; 또는 c) 서열번호 66에 제시된 서열을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 3' 상동성 암은: a) 서열번호 67에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 나타내는 서열에 대해 적어도 (약) 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열; b) 서열번호 67에 제시된 서열 중의 적어도 (약) 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 또는 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열; 또는 c) 서열번호 67에 제시된 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 CD69이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 CD69의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 Nur77이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 Nur77의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 FoxP3이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 FoxP3의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 HLA-DR 유전자 좌이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 HLA-DR 유전자 좌의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체 또는 이의 일부는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호를 유도 또는 전달할 수 있다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체는 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 성분의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하고, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호는 재조합 수용체에 존재하는 세포내 신호전달 도메인을 통한 신호를 포함하거나, 또는 재조합 수용체는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하고, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호는 재조합 수용체에 존재하는 세포내 신호전달 도메인을 통한 신호를 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체는 제제에 결합하거나 또는 제제를 인식할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 세포외 영역을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 제제의 결합 시 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호가 유도된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 제제는 표적 항원이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 표적 항원은 재조합 단백질이거나, 세포의 표면에서 발현되는 항원이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 표적 항원은 질환, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 연관되거나, 그에 대해 특이적이거나, 그 위에서 발현된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 질환, 장애 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환, 또는 종양 또는 암이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 표적 항원은 종양 항원이다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 인테그린), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산탈수효소 9(CA9, 또한 CAIX 또는 G250으로 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, 또한 NY-ESO-11 및 LAGE-12로 공지됨), 암태아성 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-11), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(chondroitin sulfate proteoglycan) 4(CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백 2(EPG-12), 상피 당단백 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5, 또한 Fc 수용체 유사 5 또는 FCRH5로 공지됨), 태아성 아세틸콜린 수용체(태아성 AchR), 폴레이트 결합 단백질(FBP), 폴레이트 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화된 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질-커플링된 수용체 부류 C 그룹 5 멤버 D(protein-coupled receptor class C group 5 member D; GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-멜라노마-연관 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-122 수용체 알파(IL-122Rα), IL-113 수용체 알파 2(IL-113Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복 함유 8 패밀리 멤버 A(LRRC8A), 루이스 Y, 멜라노마-연관 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 사이토메갈로바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-11), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 온코페탈 항원, 멜라노마의 우선 발현된 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 세포영양막 당단백(TPBG, 또한 5T4로 공지됨), 종양-연관 당단백 72(TAG72), 티로시나제 관련된 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75라고도 알려짐), 티로시나제 관련된 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토머라제(dopachrome tautomerase), 도파크롬 델타-이소머라제(dopachrome delta-isomerase) 또는 DCT라고도 알려짐), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 윌름스 종양 1(WT-11), 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원, 또는 유니버설 태그로 연관된 항원, 및/또는 비오틴화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자로부터 선택된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 제제는 항-이디오타입 항체이다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, CAR은 세포외 영역, 막관통 도메인, 및 세포내 영역을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 세포외 영역은 스페이서를 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 스페이서는 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 작동가능하게 연결된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 세포외 영역은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 이를 포함하는 결합 도메인을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 세포내 영역은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 사슬의 세포내 신호전달 도메인이거나 이를 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬, 또는 이의 신호전달 부분이거나 이를 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 세포내 영역은 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인(들)을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 세포내 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 부분을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 공-자극 신호전달 영역은 4-1BB의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 CAR인 재조합 수용체를 암호화하며, 여기서 CAR은 이의 N-말단에서 C-말단의 순서대로: 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 세포내 영역을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 전이 유전자는 세포외 결합 도메인, 예를 들어, scFv를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열; 스페이서, 예를 들어, 인간 면역글로불린 힌지로부터의 서열, 예를 들어, IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터의 서열 또는 이의 변형된 버전, 예를 들어, 추가로 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 포함하는 것; 및 막관통 도메인, 예를 들어, 인간 CD28로부터의 서열; 공-자극 신호전달 도메인, 예를 들어, 인간 4-1BB로부터의 서열; 및 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어, CD3ζ 사슬 또는 이의 일부를 순서대로 포함하고/하거나; 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 죄는 세포외 결합 도메인, 예를 들어, scFv를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열; 스페이서, 예를 들어, 인간 면역글로불린 힌지로부터의 서열, 예를 들어, IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터의 서열 또는 이의 변형된 버전, 예를 들어, 추가로 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 포함하는 것; 및 막관통 도메인, 예를 들어, 인간 CD28로부터의 서열; 공-자극 신호전달 도메인, 예를 들어, 인간 4-1BB로부터의 서열; 및 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어, CD3ζ 사슬 또는 이의 일부를 순서대로 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 전이 유전자는 재조합 수용체를 암호화한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 전이 유전자는 재조합 수용체의 일부를 암호화한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체는 2개의 별개의 폴리펩티드 사슬을 함유하며, 여기서 전이 유전자에 의해 암호화된 재조합 수용체의 일부는 재조합 수용체의 하나의 사슬이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체의 다른 사슬은 제 2 전이 유전자에 의해 암호화된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, CAR은 다중-사슬 CAR이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 전이 유전자는 다중-사슬 CAR 중의 하나의 사슬을 암호화한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체는 재조합 T 세포 수용체(TCR)이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 TCR은 알파(TCRα) 사슬 및 베타(TCRβ) 사슬을 포함하고, 전이 유전자는 TCRα 사슬을 암호화하는 핵산 서열 및/또는 TCRβ 사슬을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 전이 유전자는 TCRα 사슬 또는 TCRβ 사슬 중의 하나를 암호화한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, TCRα 사슬은 하나 이상의 도입된 시스테인 잔기를 포함하는 불변(Cα) 영역을 포함하고/하거나, TCRβ 사슬은 하나 이상의 도입된 시스테인 잔기를 포함하는 Cβ 영역을 포함하되, 상기 하나 이상의 도입된 시스테인 잔기는 알파 사슬과 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비-천연 이황화물 브릿지를 형성할 수 있다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 하나 이상의 도입된 시스테인 잔기는 비-시스테인 잔기의 시스테인 잔기로의 대체를 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, Cα 영역은 서열번호 92에 제시된 바와 같은 넘버링으로 위치 48에 상응하는 위치에 시스테인을 포함하고/하거나; Cβ 영역은 서열번호 96에 제시된 바와 같은 넘버링으로 위치 57에 상응하는 위치에 시스테인을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 전이 유전자는 적어도 하나의 추가 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 적어도 하나의 추가 단백질은 대리 마커이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 대리 마커는 절단된 수용체이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 절단된 수용체는 세포내 신호전달 도메인이 없고/없거나 그의 리간드에 의해 결합될 때 세포내 신호전달을 매개할 수 없다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 전이 유전자는 멀티시스트로닉 요소(들)를 더 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 멀티시스트로닉 요소(들)는 T2A, P2A, E2A 또는 F2A 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 중에서 선택된 리보솜 스킵 요소를 암호화하는 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 멀티시스트로닉 요소는 CAR을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열과 적어도 하나의 추가 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 사이에 위치하고; 재조합 수용체는 재조합 TCR이고, 멀티시스트로닉 요소는 TCRα를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열과 TCRβ를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 사이에 위치하고; 재조합 수용체는 다중-사슬 CAR이고, 멀티시스트로닉 요소는 다중-사슬 CAR의 하나의 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열과 다중-사슬 CAR의 또 다른 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 사이에 위치하고/하거나; 멀티시스트로닉 요소(들)는 재조합 수용체를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열의 상류이다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 폴리뉴클레오티드는 선형 폴리뉴클레오티드이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 폴리뉴클레오티드는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 폴리뉴클레오티드이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터에 포함된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 (약) 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750 또는 4000개의 뉴클레오티드 길이이거나, 또는 상기 중 임의의 것들 사이의 임의의 값이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 (약) 1500개 내지 약 2500개의 뉴클레오티드 길이 또는 (약) 1750개 내지 (약) 2250개의 뉴클레오티드 길이이다.
또한, (a) T 세포의 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 T 세포 내로 도입하는 단계; 및 (b) 제공된 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 것을 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서의 유전자 파괴를 포함하는 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 생성하고, 상기 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 전이 유전자는 상동성-지시된 수선(HDR)을 통해 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내에 통합된다.
또한, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법이 제공되며, 상기 T 세포는 T 세포의 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내에 유전자 파괴를 가지며, 여기서 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자는 상동성-지시된 수선(HDR)을 통해 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내에 통합된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 T 세포의 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 T 세포 내로 도입함으로써 수행된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 상기 방법은 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 생성하고, 상기 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 폴리뉴클레오티드는 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암(들)을 더 포함하며, 여기서 하나 이상의 상동성 암(들)은 T 세포에서 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 하나 이상의 상동성 암은 5' 상동성 암 및/또는 3' 상동성 암을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 표적 부위를 둘러싸는 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 포함하고, 여기서 표적 부위는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내에 있다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 표적 부위는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소의 하류에 있다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 폴리뉴클레오티드는 구조 [5' 상동성 암]-[전이 유전자]-[3' 상동성 암]을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 적어도 하나의 표적 부위를 둘러싸는 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 50 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드 길이, (약) 50 내지 (약) 500개의 뉴클레오티드 길이, (약) 50 내지 (약) 250개의 뉴클레오티드 길이, (약) 50 내지 (약) 100개의 뉴클레오티드 길이, (약) 100 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드 길이, (약) 100 내지 (약) 500개의 뉴클레오티드 길이, (약) 100 내지 (약) 250개의 뉴클레오티드 길이, (약) 250 내지 (약) 750 뉴클레오티드 길이, (약) 250 내지 (약) 500개의 뉴클레오티드 길이이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400 또는 500개의 뉴클레오티드 길이, 또는 상기 중 임의의 것들 사이의 임의의 값이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 100개 미만의 뉴클레오티드 길이이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 50, 60, 70, 80 또는 90개의 뉴클레오티드 길이, 또는 상기 중 임의의 것들 사이의 임의의 값이다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1, CD69, Nur77, FoxP3 및 HLA-DR 유전자 좌 중에서 선택된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 PDCD1의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암은: a) 서열번호 66에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 나타내는 서열에 대해 적어도 (약) 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열; b) 서열번호 66에 제시된 서열의 적어도 (약) 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열; 또는 c) 서열번호 66에 제시된 서열;을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 3' 상동성 암은: a) 서열번호 67에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 나타내는 서열에 대해 적어도 (약) 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열; b) 서열번호 67에 제시된 서열의 적어도 (약) 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열; 또는 c) 서열번호 67에 제시된 서열;을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 CD69이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 CD69의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 Nur77이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 Nur77의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 FoxP3이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 FoxP3의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 HLA-DR 유전자 좌이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 HLA-DR 유전자 좌의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체 또는 이의 일부는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호를 유도 또는 전달할 수 있다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체는 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 성분의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하고, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호는 재조합 수용체에 존재하는 세포내 신호전달 도메인을 통한 신호를 포함하거나, 또는 재조합 수용체는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하고, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호는 재조합 수용체에 존재하는 세포내 신호전달 도메인을 통한 신호를 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체는 제제에 결합하거나 또는 제제를 인식할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 세포외 영역을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 제제의 결합 시 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호가 유도된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 제제는 표적 항원이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 표적 항원은 재조합 단백질이거나 또는 세포의 표면 상에서 발현되는 항원이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 표적 항원은 질환, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 연관되거나, 그에 특이적이거나 또는 그 위에서 발현된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 질환, 장애 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환, 또는 종양 또는 암이다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 표적 항원은 종양 항원, 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원, 염증성 항원 또는 자가항원(autoantigen)이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 표적 항원은 종양 항원이다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 인테그린), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산탈수효소 9(CA9, 또한 CAIX 또는 G250으로 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, 또한 NY-ESO-11 및 LAGE-12로 공지됨), 암태아성 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-11), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(chondroitin sulfate proteoglycan) 4(CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백 2(EPG-12), 상피 당단백 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5, 또한 Fc 수용체 유사 5 또는 FCRH5로 공지됨), 태아성 아세틸콜린 수용체(태아성 AchR), 폴레이트 결합 단백질(FBP), 폴레이트 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화된 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질-커플링된 수용체 부류 C 그룹 5 멤버 D(protein-coupled receptor class C group 5 member D; GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-멜라노마-연관 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-122 수용체 알파(IL-122Rα), IL-113 수용체 알파 2(IL-113Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복 함유 8 패밀리 멤버 A(LRRC8A), 루이스 Y, 멜라노마-연관 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 사이토메갈로바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-11), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 온코페탈 항원, 멜라노마의 우선 발현된 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 세포영양막 당단백(TPBG, 또한 5T4로 공지됨), 종양-연관 당단백 72(TAG72), 티로시나제 관련된 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75라고도 알려짐), 티로시나제 관련된 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토머라제(dopachrome tautomerase), 도파크롬 델타-이소머라제(dopachrome delta-isomerase) 또는 DCT라고도 알려짐), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 윌름스 종양 1(WT-11), 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원, 또는 유니버설 태그로 연관된 항원, 및/또는 비오틴화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자로부터 선택된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 표적 부위에 특이적으로 결합하거나, 인식하거나, 또는 혼성화하는 징크 핑거 핵산분해효소(ZFN), TAL-이펙터 핵산분해효소(TALEN), 또는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어진다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지고, CRISPR-Cas9 조합은 적어도 하나의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, CRISPR-Cas9 조합은 gRNA 및 Cas9 단백질을 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 전기천공을 통해 복수의 T 세포 내로 도입된 RNP에 의해 이루어진다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지고, gRNA는 PDCD1 유전자에서 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는다. 임의의 구현예 중의 일부에서, gRNA는 서열번호 75 및 104-109 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, gRNA는 서열번호 75에 제시된 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 CD69이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지고, gRNA는 CD69 유전자에서 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는다. 임의의 구현예 중의 일부에서, gRNA는 서열번호 116-121 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 Nur77이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지고, gRNA는 Nur77 유전자에서 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는다. 임의의 구현예 중의 일부에서, gRNA는 서열번호 122-127 및 134-136에 제시된 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 FoxP3이다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 HLA-DR 유전자 좌이다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포는 내인성 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC) 유전자 및/또는 내인성 T 세포 수용체 베타 불변 영역(TRBC) 유전자에서의 유전자 파괴를 더 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 내에 있는 적어도 하나의 표적 부위에 특이적으로 결합하거나, 인식하거나, 또는 혼성화하는 징크 핑거 핵산분해효소(ZFN), TAL-이펙터 핵산분해효소(TALEN), 또는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어진다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지고, CRISPR-Cas9 조합은 적어도 하나의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, CRISPR-Cas9 조합은 gRNA 및 Cas9 단백질을 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 전기천공을 통해 복수의 T 세포 내로 도입된 RNP에 의해 이루어진다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지고, gRNA는 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 내에 있는 적어도 하나의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는다.
임의의 구현예 중의 일부에서, gRNA는 TRAC 유전자 내의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는다. 임의의 구현예 중의 일부에서, gRNA는 서열번호 77 및 188-218 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, gRNA는 서열번호 77에 제시된 서열을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, gRNA는 TRBC 유전자 내의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는다. 임의의 구현예 중의 일부에서, gRNA는 서열번호 219-276 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 암호화된 재조합 수용체는 재조합 T 세포 수용체(TCR)이거나 이를 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, RNP는 전기천공, 입자 총, 인산칼슘 형질감염, 세포 압축(compression) 또는 압착(squeezing)을 통해 도입된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, RNP는 전기천공을 통해 도입된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, RNP는 전기천공을 통해 복수의 T 세포 내로 도입된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, RNP의 농도는 (약) 1 μM 내지 (약) 5 μM이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, RNP의 농도는 (약) 2 μM이다.
임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포는 CD8+ T 세포 및/또는 CD4+ T 세포 또는 이의 하위유형을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포는 대상체에 대해 자가성이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포는 대상체로부터 유래된 1차 T 세포이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 대상체는 인간이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포는 대상체에 대해 동종이계이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포는 다능성 또는 만능 세포로부터 유래된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포는 iPSC로부터 유래된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 폴리뉴클레오티드는 선형 폴리뉴클레오티드이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 폴리뉴클레오티드는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 폴리뉴클레오티드이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터에 포함된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 폴리뉴클레오티드는 (약) 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750 또는 4000개의 뉴클레오티드 길이, 또는 상기 것들 사이의 임의의 값이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 폴리뉴클레오티드는 (약) 1500 내지 (약) 2500개의 뉴클레오티드 길이, 또는 (약) 1750 내지 (약) 2250개의 뉴클레오티드 길이이다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 하나 이상의 제제(들) 및 폴리뉴클레오티드는 임의의 순서로 동시에 또는 순차적으로 도입된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 하나 이상의 제제(들) 및 폴리뉴클레오티드는 동시에 도입된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 제제(들)의 도입 후에 도입된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 폴리뉴클레오티드는 제제의 도입 직후, 또는 약 30초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 6분, 8분, 9분, 10분, 15분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분, 90분, 2시간, 3시간 또는 4시간 내에 도입된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 하나 이상의 제제(들) 및/또는 폴리뉴클레오티드의 도입 전에, 상기 방법은 하나 이상의 면역 세포를 자극 또는 활성화시키는 조건 하에 세포를 자극제(들)와 함께 시험관 내에서 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 자극제(들)는 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 자극제(들)는 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 포함하는 올리고머 입자 시약을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 자극제(들)는 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체로 코팅된 비드를 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 방법은 하나 이상의 제제의 도입 및/또는 폴리뉴클레오티드의 도입 전, 도입 동안 또는 도입 후에 세포를 하나 이상의 재조합 사이토카인과 함께 인큐베이션하는 단계를 더 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 하나 이상의 재조합 사이토카인은 IL-2, IL-7, 및 IL-15로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 하나 이상의 재조합 사이토카인은 (약) 10 U/mL 내지 (약) 200 U/mL의 IL-2의 농도로부터 선택된 농도로 첨가된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 하나 이상의 재조합 사이토카인은 (약) 50 IU/mL 내지 (약) 100 U/mL의 농도로; 0.5 ng/mL 내지 50 ng/mL의 IL-7의 농도로 첨가된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 하나 이상의 재조합 사이토카인은 (약) 5 ng/mL 내지 (약) 10 ng/mL의 농도로 및/또는 0.1 ng/mL 내지 20 ng/mL의 IL-15의 농도로 첨가된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 하나 이상의 재조합 사이토카인은 (약) 0.5 ng/mL 내지 (약) 5 ng/mL의 농도로 첨가된다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은 하나 이상의 제제의 도입 및 폴리뉴클레오티드의 도입 후 최대 또는 대략 24 시간, 36 시간, 48 시간, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21 일 동안 수행된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 인큐베이션은 최대 또는 약 7 일 동안 수행된다.
또한, 임의의 제공된 방법을 사용하여 생성된 조작된 T 세포 또는 복수의 조작된 T 세포가 제공된다.
또한, 제공된 조작된 세포 중 임의의 제공된 조작된 세포 또는 복수의 임의의 제공된 조작된 세포를 포함하는 조성물이 제공된다.
또한, 복수의 임의의 제공된 조작된 세포를 함유하는 조성물이 제공된다
임의의 구현예 중의 일부에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후 (약) 6, 12, 18, 24, 36 또는 48 시간 미만 이내에 조성물 중의 하나 이상의 세포에서 상향조절되거나 유도된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에, 조성물 중의 세포 중에서 작동가능하게 연결된 전이 유전자를 발현하는 세포의 빈도는 (약) 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과보다 더 크다. 임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포에서 발현의 상향조절 또는 유도 후 또는 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 조성물 중의 하나 이상의 세포에서 감소되거나 하향조절된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 발현의 상향조절 또는 유도 후, 또는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후, 조성물 중의 세포 중에서 작동가능하게 연결된 전이 유전자를 발현하는 세포의 빈도는 (약) 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과보다 더 크게 감소된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 발현의 상향조절 또는 유도 후, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일 또는 그 초과 후에 조성물 중의 하나 이상의 세포에서 감소되거나 하향조절된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 조성물 중의 하나 이상의 세포에서 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후 (약) 6, 12, 18, 24, 36 또는 48 시간 미만 이내에 감소되거나 하향조절된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에, 조성물 중의 세포 중에서 재조합 수용체를 발현하는 세포의 빈도는 (약) 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 또는 그 미만보다 적다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 조성물은 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하고, CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비는 (약) 1:3 내지 3:1이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 1:1이다.
또한, 임의의 제공된 조작된 세포 또는 임의의 제공된 조작된 조성물을 질환 또는 장애를 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 제공된다.
또한, 질환 또는 장애의 치료를 위한 임의의 제공된 조작된 세포 또는 임의의 제공된 조작된 조성물의 용도가 제공된다.
또한, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 임의의 제공된 조작된 세포 또는 임의의 제공된 조작된 조성물의 용도가 제공된다.
또한, 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 임의의 제공된 조작된 세포 또는 임의의 제공된 조작된 조성물이 제공된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 질환 또는 장애는 암 또는 종양이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 암 또는 종양은 혈액 악성종양이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 암 또는 종양은 림프종, 백혈병, 또는 형질 세포 악성종양이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 암은 림프종이고, 림프종은 버킷 림프종, 비-호지킨 림프종(NHL), 호지킨 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 여포성 림프종, 소형 비-절단 세포 림프종, 점막-연관 림프 조직 림프종(MALT), 변연부 림프종, 비장 림프종, 결절 단핵구 B 세포 림프종, 면역모세포 림프종, 대세포 림프종, 미만성 혼합 세포 림프종, 폐 B 세포 혈관중심성 림프종, 소형 림프구성 림프종, 원발성 종격 B 세포 림프종, 림프형질세포성 림프종(LPL), 또는 맨틀 세포 림프종(MCL)이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 암은 백혈병이고, 백혈병은 만성 림프구성 백혈병(CLL), 형질 세포 백혈병 또는 급성 림프구성 백혈병(ALL)이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 암은 형질 세포 악성종양이고, 형질 세포 악성종양은 다발성 골수종(MM)이다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 종양은 고형 종양이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 고형 종양은 비-소세포 폐암(NSCLC) 또는 두경부 편평 세포 암종(HNSCC)이다.
또한, T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들); 및 제공된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 키트가 제공된다.
또한, T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들); 및 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트가 제공되며, 여기서 재조합 수용체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 사슬을 암호화하는 전이 유전자는 상동성-지시된 수선(HDR)을 통해 표적 부위에서 또는 그 근처에서 통합을 위해 표적화되고; 제공된 방법 중 임의의 것을 수행하기 위한 설명서가 제공된다.
도 1은 재조합 수용체를 조건부로 발현하는 조작된 T 세포를 도시한 개략도이다. 일부 경우에, 재조합 수용체의 발현은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 작동가능한 제어 하에 있다. T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 함유하는 본원에서 제공된 예시적인 조작된 T 세포에서, 암호화된 재조합 수용체는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 발현될 수 있다. 일부 경우에, 내인성 TCR 발현은 내인성 TCR의 성분, 예를 들어 내인성 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC) 유전자 및/또는 내인성 T 세포 수용체 베타 불변 영역(TRBC) 유전자를 암호화하는 유전자 좌에 유전자 파괴를 도입함으로써 감소되거나 억제된다. 일부 경우에, 재조합 수용체를 통한 신호 전달이 표적 항원을 발현하는 표적 세포의 제거로 인해 감소 또는 제거되는 경우, 재조합 수용체의 발현이 감소 또는 제거된다.
도 2는 0일에 항-CD3 및 항-CD28 항체를 함유하는 시약으로 자극한 후 시간 경과에 따른 다양한 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 유전자 생성물을 포함하는, 다양한 마커를 발현하는 세포의 백분율을 나타낸다. 마커의 발현을 유세포 측정법에 의해 평가하였다. 초기 자극 후 약 7일에, 동일한 시약을 사용하여 세포를 재자극하고, 시간에 따라 마커를 발현하는 세포의 백분율을 평가하였다.
도 3a 및 도 3b는 PDCD1-표적화 gRNA(PD-1 KO)를 함유하는 리보핵단백질(ribonucleoprotein; RNP) 복합체, TRAC-표적화 gRNA(TRAC KO)를 함유하는 RNP 복합체, PDCD1 유전자 좌(PD-1 KI CAR)에서 표적화를 위한 HDR을 위한 CAR-암호화 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드, TRAC 유전자 좌(TRAC KI CAR)에서 표적화를 위한 HDR을 위한 CAR-암호화 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합이 도입된 세포에서 CD3, PD-1 및 키메라 항원 수용체(CAR)의 발현을 위한 유세포 측정 플롯을 도시한다.
도 4a 내지 도 4c는 내인성 PDCD1 유전자 좌(PD-1 KI CAR) 또는 TRAC 전사 조절 요소(TRAC KI CAR)의 작동가능한 제어 하에 CAR을 암호화하는 서열을 포함하는 조작된 T 세포에서의 CD3, PD-1, CD69 및 키메라 항원 수용체(CAR)의 발현에 대한 유세포 측정 플롯을, 초기 자극 후 휴지 시간 후, 또는 초기 자극 및 휴지 후 재자극 후에 나타낸다.
도 5a 및 5b는 내인성 PDCD1 유전자 좌(PD-1 KI CAR) 또는 TRAC 전사 조절 요소(TRAC KI CAR)의 작동가능한 제어 하에 CAR을 암호화하는 서열을 포함하는 조작된 T 세포에서, 초기 자극 후 휴지 시간 후에, 또는 초기 자극 및 휴지 후에 재자극 후에 시간 경과에 따른 CAR+ 세포의 백분율을 도시한다.
도 6a는 예시적인 항-CD19 CAR이 내인성 PDCD1 유전자 좌의 작동가능한 제어 하에 발현된 세포(PD1 KI CAR)에서, 전기천공 7일 후에, 7일 동안 방사선조사된 CD19-발현 림프아구성 세포주(LCL)와 공-배양함으로써 제 1 자극 라운드 후에, 및 방사선조사된 CD19-발현 LCL과 공-배양함으로써 제 2 자극 라운드 후에, PDCD1 프로모터 및 CD8의 제어 하에 예시적인 항-CD19 CAR(항-이디오타입(anti-idiotypic) 항체를 사용하여 검출됨)(PD1 KI CAR)의 발현에 대한 유세포 측정 플롯을 도시한다. 도 6b는 PD1KI CAR 세포, PDCD1 KO 세포(예시적인 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 없이, PDCD1 표적화 RNP 복합체만으로 전기천공됨; PD1 KO), 모의 처리된 세포(음성 대조군), 및/또는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 조작된 동일한 예시적인 CAR을 발현하는 세포(LV 대조군)에서의 세포의 제 1 라운드 및 제 2 라운드 후의 배수 증폭을 도시한다.
도 7a는 PDCD1 프로모터 및 CD8의 제어 하에 예시적인 항-CD19 CAR(항-이디오타입 항체를 사용하여 검출됨; aID)(PD1 KI CAR)의 발현에 대한 유세포 측정 플롯을, 재-자극 없이 휴지되거나(휴지됨) 재-자극(제 2 자극)을 받은 세포에서 조사된 CD19-발현 LCL(제 1 자극)과의 공-배양에 의한 제 1 자극 라운드 후의 유세포 측정 플롯을 도시한다. 도 7b는 CAR 발현(항-이디오타입 항체를 사용하여 검출됨; 좌측), CAR-발현 세포의 백분율(중간) 및 CD25+ CD69+ 세포의 백분율(우측), PD1 KO 세포에서 재-자극 없이 휴지되는 PD1 KI CAR 세포(PD1 KI CAR 휴지됨) 및 재-자극을 받은 PD1 KI CAR 세포(PD1 KI CAR 재자극)의 평균 형광 강도(MFI)를 도시한다. 도 7c는 재-자극 없이 휴지되는 PD1 KI CAR 세포(PD1 KI CAR 휴지됨) 및 재-자극을 받은 PD1 KI CAR 세포(PD1 KI CAR 재자극)의 PD1 KO 세포에서 CAR 발현의 통합된 평균 형광 강도(MFI)를 도시한다. 도 7d는 CD19를 발현하는 표적 세포에 대한, 재-자극 없이 휴지되는 PD1 KI CAR 세포(PD1 KI CAR 휴지됨) 및 재-자극을 받은 PD1 KI CAR 세포(PD1 KI CAR 재자극)의 세포용해 활성을 도시한다. 모의 처리된 세포(음성 대조군), LV 대조군 및 인간 배아 신장(HEK) 세포를 대조군으로서 사용하였다.
도 8a는 마우스 모델에서 생체내 항종양 활성을 평가하고, 반딧불이 루시퍼라제로 형질감염된 Raji 림프종 종양 세포, 및 내인성 PDCD1 유전자 좌(PD-1 KI CAR)의 작동가능한 제어 하에 또는 렌티바이러스 전달(LV 대조군)에 의해 예시적인 항-CD19 CAR을 발현하는 세포로 주사하기 위한 타임라인의 개략도를 도시한다. 도 8b는 생체발광에 의한 평균 방사능을 측정함으로써 나타낸 바와 같은 시간에 따른 종양 성장을 도시한다. 도 8c는 시간에 따른 마우스의 각각의 군의 생존을 도시한다. 도 8d는 마우스가 -1일, 7일, 14일 및 28일에 종양의 존재를 나타내는 경우의 생체발광 영상화의 결과를 도시한다.
도 2는 0일에 항-CD3 및 항-CD28 항체를 함유하는 시약으로 자극한 후 시간 경과에 따른 다양한 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 유전자 생성물을 포함하는, 다양한 마커를 발현하는 세포의 백분율을 나타낸다. 마커의 발현을 유세포 측정법에 의해 평가하였다. 초기 자극 후 약 7일에, 동일한 시약을 사용하여 세포를 재자극하고, 시간에 따라 마커를 발현하는 세포의 백분율을 평가하였다.
도 3a 및 도 3b는 PDCD1-표적화 gRNA(PD-1 KO)를 함유하는 리보핵단백질(ribonucleoprotein; RNP) 복합체, TRAC-표적화 gRNA(TRAC KO)를 함유하는 RNP 복합체, PDCD1 유전자 좌(PD-1 KI CAR)에서 표적화를 위한 HDR을 위한 CAR-암호화 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드, TRAC 유전자 좌(TRAC KI CAR)에서 표적화를 위한 HDR을 위한 CAR-암호화 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합이 도입된 세포에서 CD3, PD-1 및 키메라 항원 수용체(CAR)의 발현을 위한 유세포 측정 플롯을 도시한다.
도 4a 내지 도 4c는 내인성 PDCD1 유전자 좌(PD-1 KI CAR) 또는 TRAC 전사 조절 요소(TRAC KI CAR)의 작동가능한 제어 하에 CAR을 암호화하는 서열을 포함하는 조작된 T 세포에서의 CD3, PD-1, CD69 및 키메라 항원 수용체(CAR)의 발현에 대한 유세포 측정 플롯을, 초기 자극 후 휴지 시간 후, 또는 초기 자극 및 휴지 후 재자극 후에 나타낸다.
도 5a 및 5b는 내인성 PDCD1 유전자 좌(PD-1 KI CAR) 또는 TRAC 전사 조절 요소(TRAC KI CAR)의 작동가능한 제어 하에 CAR을 암호화하는 서열을 포함하는 조작된 T 세포에서, 초기 자극 후 휴지 시간 후에, 또는 초기 자극 및 휴지 후에 재자극 후에 시간 경과에 따른 CAR+ 세포의 백분율을 도시한다.
도 6a는 예시적인 항-CD19 CAR이 내인성 PDCD1 유전자 좌의 작동가능한 제어 하에 발현된 세포(PD1 KI CAR)에서, 전기천공 7일 후에, 7일 동안 방사선조사된 CD19-발현 림프아구성 세포주(LCL)와 공-배양함으로써 제 1 자극 라운드 후에, 및 방사선조사된 CD19-발현 LCL과 공-배양함으로써 제 2 자극 라운드 후에, PDCD1 프로모터 및 CD8의 제어 하에 예시적인 항-CD19 CAR(항-이디오타입(anti-idiotypic) 항체를 사용하여 검출됨)(PD1 KI CAR)의 발현에 대한 유세포 측정 플롯을 도시한다. 도 6b는 PD1KI CAR 세포, PDCD1 KO 세포(예시적인 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 없이, PDCD1 표적화 RNP 복합체만으로 전기천공됨; PD1 KO), 모의 처리된 세포(음성 대조군), 및/또는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 조작된 동일한 예시적인 CAR을 발현하는 세포(LV 대조군)에서의 세포의 제 1 라운드 및 제 2 라운드 후의 배수 증폭을 도시한다.
도 7a는 PDCD1 프로모터 및 CD8의 제어 하에 예시적인 항-CD19 CAR(항-이디오타입 항체를 사용하여 검출됨; aID)(PD1 KI CAR)의 발현에 대한 유세포 측정 플롯을, 재-자극 없이 휴지되거나(휴지됨) 재-자극(제 2 자극)을 받은 세포에서 조사된 CD19-발현 LCL(제 1 자극)과의 공-배양에 의한 제 1 자극 라운드 후의 유세포 측정 플롯을 도시한다. 도 7b는 CAR 발현(항-이디오타입 항체를 사용하여 검출됨; 좌측), CAR-발현 세포의 백분율(중간) 및 CD25+ CD69+ 세포의 백분율(우측), PD1 KO 세포에서 재-자극 없이 휴지되는 PD1 KI CAR 세포(PD1 KI CAR 휴지됨) 및 재-자극을 받은 PD1 KI CAR 세포(PD1 KI CAR 재자극)의 평균 형광 강도(MFI)를 도시한다. 도 7c는 재-자극 없이 휴지되는 PD1 KI CAR 세포(PD1 KI CAR 휴지됨) 및 재-자극을 받은 PD1 KI CAR 세포(PD1 KI CAR 재자극)의 PD1 KO 세포에서 CAR 발현의 통합된 평균 형광 강도(MFI)를 도시한다. 도 7d는 CD19를 발현하는 표적 세포에 대한, 재-자극 없이 휴지되는 PD1 KI CAR 세포(PD1 KI CAR 휴지됨) 및 재-자극을 받은 PD1 KI CAR 세포(PD1 KI CAR 재자극)의 세포용해 활성을 도시한다. 모의 처리된 세포(음성 대조군), LV 대조군 및 인간 배아 신장(HEK) 세포를 대조군으로서 사용하였다.
도 8a는 마우스 모델에서 생체내 항종양 활성을 평가하고, 반딧불이 루시퍼라제로 형질감염된 Raji 림프종 종양 세포, 및 내인성 PDCD1 유전자 좌(PD-1 KI CAR)의 작동가능한 제어 하에 또는 렌티바이러스 전달(LV 대조군)에 의해 예시적인 항-CD19 CAR을 발현하는 세포로 주사하기 위한 타임라인의 개략도를 도시한다. 도 8b는 생체발광에 의한 평균 방사능을 측정함으로써 나타낸 바와 같은 시간에 따른 종양 성장을 도시한다. 도 8c는 시간에 따른 마우스의 각각의 군의 생존을 도시한다. 도 8d는 마우스가 -1일, 7일, 14일 및 28일에 종양의 존재를 나타내는 경우의 생체발광 영상화의 결과를 도시한다.
변형된 유전자 좌, 예를 들어, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 함유하는 조작된 세포, 예를 들어, 조작된 T 세포가 본원에서 제공된다. 일부 측면에서, 조작된 세포는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된 수용체(예를 들어, 키메라 항원 수용체 또는 재조합 T 세포 수용체)를 암호화하는 이종성 또는 외인성 핵산 서열(예를 들어, 전이 유전자) 또는 이의 일부를 함유한다. 일부 측면에서, 내인성 전사 조절 요소는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 유도하거나 상향조절한다.
일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 전사 조절 요소로부터의 발현은 재조합 수용체의 세포내 신호전달 영역을 통한 신호, 예를 들어, T 세포, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호전달 도메인, 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인에서 1차 활성화 신호에 대해 반응한다. 일부 구현예에서, 예시적인 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1(암호화 PD-1), CD69, Nur77(암호화 NR4A1), FoxP3 또는 HLA-DR 유전자 좌를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
재조합 수용체 또는 이의 일부를 발현하는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 함유하는 유전자 조작된 세포를 생산하는 방법이 또한 제공된다. 제공된 구현예는 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 특이적으로 표적화하는 것을 포함한다. 일부 맥락에서, 제공된 구현예는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 재조합 수용체-암호화 핵산 서열의 표적화된 통합을 위한 표적화된 유전자 파괴, 예를 들어, DNA 절단의 생성, 및 유전자 편집 방법을 사용한 상동성-지시된 수선(HDR)을 유도하는 것을 수반한다. 본원에서 제공된 조작된 세포 및/또는 본원에서 제공된 방법의 생성에 사용하기 위한 관련된 세포 조성물, 핵산 및 키트가 또한 제공된다.
T 세포-기반 요법, 예를 들어, 입양 T 세포 요법(관심 질환 또는 장애에 특이적인 재조합, 조작된 또는 키메라 수용체를 발현하는 조작된 세포, 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR), 재조합 T 세포 수용체(TCR) 또는 다른 재조합, 조작된 또는 키메라 수용체의 투여를 수반하는 것을 포함함)은 암 및 다른 질환 및 장애의 치료에 효과적일 수 있다. 특정 맥락에서, 입양 세포 요법을 위한 조작된 세포를 설계하고 생성하기 위한 다른 접근법은 항상 완전히 만족스러운 것은 아닐 수 있다. 일부 측면에서, 재조합 수용체를 포함하는 조작된 세포는 일부 경우에 재조합 수용체에 의해 인식된 항원을 발현하는 건강한 세포를 표적화할 수 있다. 일부 경우에, 재조합 수용체 발현 세포는 질환 세포, 예를 들어, 종양 세포, 및 항원을 발현하는 정상 세포 사이를 구별할 수 없다. 일부 측면에서, 조작된 세포가 표적화되고 질환 세포, 예를 들어, 표적 항원을 발현하는 종양 세포를 제거한 후, 재조합 수용체 발현 세포의 계속된 지속은 항원을 발현하는 건강한 세포를 표적화할 수 있어서, 바람직하지 않은 효과를 초래할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 종양 제거 후 항-CD19 CAR-발현 세포의 계속된 지속은 CAR-발현 세포에 의한 CD19-발현 건강한 B 세포의 공격으로 인해 B 세포 무형성을 초래할 수 있다.
일부 측면에서, 제공된 구현예는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 HDR에 의해, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자의 표적화된 유전자 파괴 및 통합을 유도하는 것을 수반한다. 일부 측면에서, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소(들)에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 작동 가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 프로모터와 같은 내인성 전사 조절 요소에 의해 제어된다. 일부 측면에서, 내인성 전사 조절 요소는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에, 예를 들어, 재조합 수용체를 암호화하는 작동 가능하게 연결된 전이 유전자의 발현을 유도하거나 상향조절한다. 일부 측면에서, 내인성 전사 조절 요소는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에, 예를 들어, 재조합 수용체를 암호화하는 작동 가능하게 연결된 전이 유전자의 발현을 감소 또는 하향조절한다. 따라서, 재조합 수용체의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화-관련 신호의 존재에 기초하여 제어될 수 있다.
일부 측면에서, 제공된 구현예는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, 예를 들어, PDCD1의 제어 하에 발현된 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 포함하는 T 세포가 자극 또는 활성화 신호 시에 일시적으로 유도되거나 상향조절된다는 관찰에 기초한다. 재조합 수용체는 휴지 기간 후 재자극 신호에 반응하여 발현되는 것으로 관찰되었다. 예시적인 T 세포 자극-관련 유전자 생성물의 발현은 초기 자극 신호 시에, 예를 들어, 항-CD3 및 항-CD28 항체를 통해 유도되는 것으로 관찰되었으며, 이는 초기 자극 후의 기간에서 감소된다. 특정 기간 후 재자극 후에, 예시적인 T 세포 자극-관련 유전자 생성물의 발현은 감소 후 증가된다. 제공된 구현예는 또한 재자극 후에, T 세포 자극-연관된 유전자 좌, 예를 들어, PDCD1의 제어 하에 발현된 재조합 수용체, 예를 들어, CAR이 다시 유도되거나 상향조절되고, 재조합 수용체를 발현하는 T 세포는 표적 세포를 효율적으로 사멸시킬 수 있다는 관찰에 기초한다.
일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 전사 조절 요소의 작동 가능한 제어 하에 유전자 발현은 T 세포 자극 또는 활성화 신호에 반응한다. 이러한 반응성은 재조합 수용체 발현 세포의 기능에 대한 추가 단점 없이, 재조합 수용체의 발현의 조절을 허용하고, 표적 항원을 발현하는 건강한 세포 또는 재조합 수용체 발현 세포의 바람직하지 않은 기능에 대한 바람직하지 않은 효과를 최소화하는 것을 돕는다.
일부 경우에, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 완전히 기능적인 또는 비변형된 내인성 유전자 생성물은 세포 내에서 발현되어, 내인성 유전자 생성물 및 재조합 수용체가 공-발현된다. 일부 경우에, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 유전자 생성물은 발현되지 않거나, 녹 아웃된다(knocked out).
일부 측면에서, 조작된 세포는 세포에서 내인성 T 세포 수용체-암호화 유전자(들)의 유전자 파괴를 더 포함한다. 예를 들어, 내인성 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC) 유전자 및/또는 내인성 T 세포 수용체 베타 불변 영역(TRBC) 유전자는 T 세포에서 파괴된다. 일부 측면에서, 이러한 파괴는 또한 재조합 수용체 발현 세포 내에서 항원-비의존성, 강직성 신호전달을 방지하고, T 세포에서 내인성 T 세포 수용체의 조절되지 않은 발현을 최소화한다. 일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체의 항원-비의존성 신호전달은 무작위로 통합되는 동일한 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 조작된 세포와 비교하여 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% 초과로 감소된다.
일부 측면에서, 제공된 구현예는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 전사 조절 요소의 제어 하에 재조합 수용체의 발현과 함께, 세포 내의 내인성 T 세포 수용체-암호화 유전자(들)의 파괴가 재조합 수용체의 발현을 위한 피드백 루프를 생성하는 이점을 제공한다. 이러한 경우에, T 세포의 자극 또는 활성화는 예를 들어, 재조합 수용체에 의한 표적 항원의 결합 또는 인식에 의해 재조합 수용체의 신호전달 영역을 통해 전달되거나 형질도입된 자극 신호에 의해 또는 이에 의존적으로 제어되고, 자극 또는 활성화 신호는 항원-특이적 신호의 부재 하에 감소되거나 제거된다. 일부 맥락에서, 재조합 수용체 및 재조합 수용체를 발현하는 세포는 표적 세포가 제거되거나 표적 세포가 더 이상 이용 가능하지 않을 때까지, 표적 세포에 대한 그의 세포독성 기능을 보유한다. 일부 측면에서, 표적 세포의 제거 후, 예를 들어, 재조합 수용체 발현 세포에서 표적 항원을 발현하는 병든 세포, 자극 또는 활성화 신호가 감소되고, 세포는 덜 반응성 또는 비반응성으로 되어, 건강한 정상 세포 집단이 재조합 수용체-발현 세포에 의해 영향을 받지 않게 한다. 일부 경우에, 내인성 T 세포 수용체의 발현의 결여는 재조합 수용체 발현 세포의 바람직하지 않은 재활성화를 방지한다. 일부 구현예에서, 제공된 세포, 조성물 및 방법은 특히 종양 미세환경에서 항원을 표적으로 하거나 항원에 대해 특이적인 세포 요법을 위한 개선된 세포 요법을 초래할 수 있다. 일부 맥락에서, 제공된 세포, 조성물 및 방법은 또한 세포 요법의 세포 상에서 재조합 수용체, 예를 들어, CAR의 발현을 제어하고 조절하는 이점을 제공한다. 일부 측면에서, 제공된 조작된 세포 및 방법은 재조합 수용체-발현 세포의 정제된 시간적 조절을 허용하고, 재조합 수용체-발현 세포의 바람직하지 않은 항원-비의존성 효과를 최소화한다. 일부 경우에, 제공된 구현예는 재조합 수용체-발현 세포의 투여 후 건강한 세포의 회수를 허용한다.
일부 맥락에서, 본원에서 제공된 조작된 세포에서 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌로부터 암호화된 재조합 수용체는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 조절 요소, 예를 들어, 시스 조절 요소(cis regulatory elements), 예를 들어, 프로모터, 또는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 5' 및/또는 3' 비번역 영역(untranslated regions; UTR)의 제어 하에 암호화될 수 있다. 일부 측면에서, 이러한 구현예는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR, 또는 그의 일부가 발현되는 것을 허용하고/하거나 발현은 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌와 유사한 시간, 지속기간, 수준, 및 유사한 발현 동역학으로 조절된다.
일부 측면에서, 전체 재조합 수용체 또는 전장 재조합 수용체(full length recombinant receptor)는 조작된 세포에서 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌로부터 암호화된다. 일부 측면에서, 재조합 수용체의 일부, 예를 들어, 재조합 수용체의 도메인 또는 영역, 또는 다중-사슬(예를 들어, 다중-사슬 CAR 또는 2개 이상의 사슬을 포함하는 재조합 재조합 T 세포 수용체(TCR))를 포함하는 재조합 수용체의 하나 이상의 사슬은 조작된 세포에서 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌로부터 암호화된다. 일부 측면에서, 나머지 부분(예를 들어, 재조합 수용체의 또 다른 사슬 또는 또 다른 도메인)은 조작된 세포에 존재하는 제 2 전이 유전자에 의해 암호화된다.
일부 맥략에서, 조작된 세포의 최적 효능은 재조합 수용체를 발현하는 투여된 세포의 능력에 의존할 수 있으며, 이는 세포, 예를 들어, 치료적 세포 조성물 중 면역 세포 및/또는 세포의 집단, 및 재조합 수용체가 대상체, 종양, 및 그의 환경 내에서 표적, 예를 들어, 표적 항원을 인식하고 그에 결합하기 때문이다. 일부 경우에, 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 세포 내로 도입하기 위한 이용가능한 방법은 재조합 수용체를 암호화하는 서열의 무작위 통합에 의한 것이다. 특정 측면에서, 이러한 방법은 전적으로 만족스럽지 않다. 일부 측면에서, 무작위 통합은 세포 기능 및 활성에 중요할 수 있는 것들을 포함하여, 세포 내의 1개 이상의 유전자 유전자 좌의 가능한 삽입 돌연변이유발 및/또는 유전자 파괴를 초래할 수 있다. 일부 경우에, 세포의 게놈 내로의 수용체를 암호화하는 전이 유전자의 반-무작위 또는 무작위 통합은 일부 경우에 게놈 내의 바람직하지 않은 위치, 예를 들어, 필수 유전자 또는 세포의 활성을 조절하는데 중요한 유전자 내로의 핵산 서열의 통합으로 인한 역효과 및/또는 원치않는 효과를 초래할 수 있다.
일부 경우에, 무작위 통합은 재조합 수용체를 암호화하는 서열의 가변 통합을 초래할 수 있으며, 이는 세포 조성물, 예를 들어, 치료 세포 조성물의 세포 내에서의 불일치 또는 비조절된 발현, 핵산의 가변 카피 수, 및/또는 수용체 발현의 가변성을 초래할 수 있다. 일부 경우에, 수용체를 암호화하는 핵산 서열의 무작위 통합은 통합 부위 및/또는 핵산 서열 카피 수에 따라 핵산 서열의 다양한, 이종성(heterogeneous), 불균일한, 비조절된 및/또는 준최적(suboptimal) 발현 또는 항원 결합, 종양원성 형질전환 및 전사 침묵을 초래할 수 있다. 일부 측면에서, 세포 집단에서의 이종성 및 불균일한 발현은 재조합 수용체에 의한 발현 및/또는 항원 결합의 불일치 또는 불안정성, 조작된 세포의 기능의 예측불가능함 또는 기능의 감소 및/또는 불균일한 약물 생성물을 초래할 수 있고, 이에 의해 조작된 세포의 효능을 감소시킬 수 있다. 일부 측면에서, 특정 무작위 통합 벡터, 예를 들어, 특정 렌티바이러스 벡터의 사용은 조작된 세포가 복제 적격 바이러스를 함유하지 않는다는 확인을 필요로 한다. 재조합 수용체의 일관된 발현 수준 및 기능을 달성하면서 집단에서의 핵산의 무작위 통합 및/또는 이종성 발현을 최소화하기 위한 개선된 전략이 필요하다.
일부 맥락에서, 제공된 구현예는 세포의 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내로 통합될 재조합 수용체를 암호화하는 핵산을 갖는 세포를 조작하는 것, 예를 들어, T 세포는 상동성-지시된 수선(HDR)에 의해 조작된다. 일부 측면에서, HDR은 표적 부위, 예를 들어, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 또는 그 근처에서 전이 유전자(예를 들어, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자)의 부위 특이적 통합을 매개할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴(예를 들어, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서) 및 하나 이상의 상동성 암을 함유하는 (예를 들어, 유전자 파괴를 둘러싸는 상동성 서열을 함유하는) 주형 폴리뉴클레오티드의 존재는 DNA 수선을 위한 주형으로서 작용하는 상동성 서열과 함께 HDR을 유도 또는 직접적으로 유도할 수 있다. 유전자 파괴를 둘러싸는 내인성 유전자 서열과 주형 폴리뉴클레오티드에 포함된 상동성 암 사이의 상동성에 기초하여, 세포 DNA 수선 기구는 DNA 절단을 수선하고 유전자 파괴의 부위에서 유전자 정보를 재합성하기 위해 주형 폴리뉴클레오티드를 사용할 수 있고, 이에 의해 유전자 파괴의 부위에서 또는 그 근처에서 상동성 암(예를 들어, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자) 사이의 서열을 효과적으로 삽입 또는 통합할 수 있다. 제공된 구현예는 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 함유하는 세포를 생성할 수 있으며, 여기서 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자는 HDR에 의해 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내로 통합된다.
일부 측면에서, 제공된 구현예는 재조합 수용체를 암호화하는 핵산의 세포 내로의 개선된 및/또는 보다 효율적인 표적화를 갖는 조작된 세포를 생산하는데 있어서 이점을 제공하며, 조작된 세포의 개선된 활성 및/또는 기능을 초래할 수 있다. 일부 경우에, 제공된 구현예는 가능한 반-무작위 또는 무작위 통합 및/또는 이종성, 비조절되거나 또는 다양한 발현을 최소화하고, 재조합 수용체의 개선된, 균일한, 이종성, 일관된, 조절된 및/또는 안정한 발현을 초래하거나 삽입 돌연변이유발의 감소된, 낮은 또는 어떠한 가능성도 갖지 않는다.
일부 측면에서, 재조합 수용체, 예를 들어, TCR 또는 CAR을 발현하는 유전자 조작된 면역 세포를 생산하는 다른 방법과 비교하여, 제공된 구현예는 재조합 수용체의 더 안정한, 생리학적, 조절가능한, 균일한, 일관된 및/또는 균질한 발현을 허용한다. 일부 경우에, 상기 방법은 더 일관되고 더 예측가능한 약물 생성물, 예를 들어, 조작된 세포를 함유하는 세포 조성물을 생성하고, 이는 치료될 환자에 대한 더 안전한 요법을 제공할 수 있다. 일부 측면에서, 제공된 구현예는 또한 단일 유전자 좌 또는 관심있는 다중 유전자 좌에서 예측가능하고 일관된 통합을 허용한다. 일부 구현예에서, 제공된 구현예는 또한 집단의 세포에 통합된 핵산의 일관된 카피 수(전형적으로, 1 또는 2)를 갖는 세포 집단을 생성할 수 있고, 이는 일부 측면에서, 세포 집단 내의 내인성 수용체 유전자의 재조합 수용체 발현 및 발현에서 일관성을 제공한다. 일부 경우에, 제공된 구현예는 통합을 위한 바이러스 벡터의 사용을 수반하지 않고, 따라서 조작된 세포가 복제 적격 바이러스를 함유하지 않는 것에 대한 확인 필요성을 감소시킬 수 있고, 이로써 세포 조성물의 안전성을 개선시킨다.
또한, 조작된 세포를 조작하고, 제조하고, 생산하기 위한 방법, 및 조작된 세포를 생성 또는 생산하기 위한 키트 및 장치가 제공된다. 또한, 방법에 의해 생성된 세포 및 세포 조성물이 제공된다. 또한, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 선형 폴리뉴클레오티드, 및 이러한 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하기 위한 방법, 예를 들어, 형질도입에 의해 또는 물리적 전달, 예를 들어, 전기천공에 의해 제공된다. 또한, 조작된 세포를 함유하는 조성물, 및 세포 및 조성물을 대상체에 투여하기 위한, 예를 들어, 입양 세포 요법을 위한 방법, 키트, 및 장치가 제공된다. 일부 측면에서, 세포는 대상체로부터 단리되고, 조작되고, 동일한 대상체에 투여된다. 다른 측면에서, 이들은 하나의 대상체로부터 단리되고, 조작되고, 또 다른 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 제공된 폴리뉴클레오티드, 전이 유전자, 및/또는 벡터는, 면역 세포 내로 전달될 때, T 세포 활성을 조절할 수 있는 재조합 수용체, 예를 들어, TCR 또는 CAR의 발현을 초래하고, 일부 경우에, T 세포 분화 또는 항상성을 조절할 수 있다. 생성된 유전자 조작된 세포 또는 세포 조성물은 입양 세포 요법 방법에 사용될 수 있다.
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I. 재조합 수용체를 조건부로 발현하는 세포
게놈 유전자 좌, 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 존재하는 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유하는 조작된 면역 세포, 예를 들어, 조작된 T 세포가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 재조합 수용체(예를 들어, 키메라 항원 수용체 또는 재조합 T 세포 수용체) 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 전이 유전자(즉, 이종성 또는 외인성 핵산 서열)을 포함하는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, 예를 들어, PDCD1, CD69, Nur77 , FoxP3 또는 HLA -DR 유전자 좌를 함유한다. 일부 측면에서, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 조절 요소(들)의 작동적 제어 하에 있다. 일부 구현예에서, 내인성 전사 조절 요소(endogenous transcriptional regulatory element)는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현, 예를 들어, 재조합 수용체 또는 그 일부를 인코딩하는 것과 같이 일시적으로 유도 또는 상향 조절한다(upregulate). 일부 맥락에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 포함하는 제공된 세포에서, 암호화된 재조합 수용체 또는 이의 일부의 발현은 변형되지 않은 세포에서 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 유전자 생성물의 발현과 유사하거나 모방(mimics)된다. 일부 측면에서, 암호화된 재조합 수용체 또는 이의 일부의 발현의 시간적 조절 및 수준 및 동역학은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 유전자 생성물의 것과 유사하다. 예를 들어, 일부 측면에서, 암호화된 재조합 수용체는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후 일시적으로 유도되거나 상향조절되고, 이러한 신호가 없는 경우에는 감소되거나 하향조절된다. 일부 측면에서, 제공된 구현예는 암호화된 재조합 수용체의 발현의 정제된 및 조건부 조절을 허용한다.
T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 포함하는 조작된 T 세포가 본원에서 제공되며, 여기서 내인성 전사 조절 요소는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현을 유도하거나 상향조절한다. 일부 구현예에서, 내인성 전사 조절 요소는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 프로모터이다. 일부 측면에서, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자는 프로모터의 하류에 존재한다.
또한, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 세포, 예를 들어, 조작된 T 세포가 제공된다. 일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호에 반응하는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 유도하거나 상향조절한다. 일부 측면에서, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 전사 조절 요소는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호에 반응한다.
또한, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하는 조작된 T 세포가 제공되며, 여기서 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호에 반응하는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 유도하거나 상향조절한다. 또한, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하는 조작된 T 세포가 제공되며, 여기서 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 전사 조절 요소는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호에 반응한다.
일부 구현예에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 일시적이다. 일부 측면에서, 발현은 추가의 자극 또는 활성화의 부재 하에 발현의 상향조절 또는 유도 후에, 또는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에 감소되거나 하향조절된다. 일부 구현예에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 신호의 감소 또는 부재 후에 T 세포에서 추가의 자극 또는 활성화 신호 후에 다시 유도되거나 상향조절될 수 있다.
A. 자극 또는 활성화-연관 유전자 좌 및 유전자 발현
일부 측면에서, 재조합 수용체를 조건부로 발현하는 조작된 세포가 제공된다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열, 예를 들어, 전이 유전자 또는 이종성 서열을 함유한다. 일부 측면에서, 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자는 조건부로, 예를 들어, 조작된 세포 또는 환경에서 특정 조건 또는 신호의 존재 하에 발현된다. 일부 측면에서, 재조합 수용체는 발현되지 않거나, 또는 발현이 조작된 세포 또는 환경에서 특정 조건 또는 신호의 부재 하에 감소된다. 일부 측면에서, 재조합 수용체의 발현은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 전사 조절 요소(들), 예를 들어, PDCD1(암호화 PD-1), CD69, Nur77(암호화 NR4A1), FoxP3 또는 HLA -DR 유전자 좌에 의해 제어된다. 일부 측면에서, 조작된 세포는 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 함유한다. 일부 측면에서, 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 전이 유전자는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결되고, 여기서 내인성 전사 조절 요소는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현을 유도하거나 상향조절한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 내인성 전사 조절 요소는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 프로모터이다.
일부 측면에서, 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소의 제어 하에 T 세포 자극-연관된 유전자 좌로부터의 발현은 조작된 세포, 예를 들어, 조작된 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 존재에 따라 유도되거나 상향조절된다. 일부 측면에서, 자극 또는 활성화 신호는 T 세포 암호화된 재조합 성분의 신호전달 도메인을 통한 신호, 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인을 통한 신호를 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 암호화된 재조합 수용체, 예를 들어, CAR 또는 TCR의 결찰로부터의 신호는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌로부터의 발현을 유도하는 활성화 또는 자극 신호를 제공할 수 있다. 일부 측면에서, 모티프를 함유하는 신호전달 도메인을 함유하는 수용체의 결찰로부터의 신호, 예를 들어, ITAM은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌로부터의 발현을 유도하는 활성화 또는 자극 신호를 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 조작된 T 세포에서 T 세포 자극 또는 활성화 신호의 존재는 암호화된 재조합 수용체의 발현을 유도할 수 있고, 암호화된 재조합 수용체의 발현 또는 상향조절을 추가로 유도할 수 있다. 일부 측면에서, 암호화된 재조합 수용체의 발현의 이러한 조건부 조절은 조작된 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 재조합 수용체의 증가된 또는 증폭된 발현을 허용할 수 있는 양성 피드백 루프(positive feedback loop), 또는 피드-포워드 루프(feed-forward loop)를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 세포외 결합 도메인에 대한 제제의 결합은 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 유도 또는 전달을 초래한다. 일부 구현예에서, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호는 제제의 재조합 수용체의 세포외 결합 도메인에 대한 결합 시에 재조합 수용체의 세포내 신호전달 영역을 통해 전달된다.
일부 측면에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자, 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후 (약) 6, 12, 18, 24, 36 또는 48시간 미만 이내에 상향조절되거나 유도된다. 일부 구현예에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 (약) 24시간 미만 이내에 상향조절되거나 유도된다. 일부 구현예에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 (약) 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과보다 더 크게 상향조절되거나 유도된다. 일부 측면에서, 상향조절 또는 유도는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 전에 또는 부재 하에 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현, 또는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 전에 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 최소 발현과 비교된다.
일부 측면에서, 발현의 유도 또는 상향조절은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 존재 하에 반복적으로 제어가능하다. 일부 측면에서, 이러한 조절된 발현은 재조합 수용체, 예를 들어, CAR이 T 세포가 활성화되는 환경, 예를 들어, CAR에 의해 인식되는 항원이 존재하는 부위에서만 높은 수준으로 발현되는 것을 보장한다. 일부 측면에서, 일단 활성화 또는 자극 신호가 종결되면, 예를 들어, 종양의 세포용해 사멸 후에 발생할 수 있는 항원의 손실로 인해, CAR의 발현이 하향조절되거나 감소된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자의 발현의 유도 또는 상향조절은 자극 또는 활성화 신호의 기간 동안 일시적이며, 그 다음 감소되거나 하향조절된다.
일부 구현예에서, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호, 예를 들어, T 세포에서 초기 자극 또는 활성화 신호(예를 들어, 재조합 수용체를 통함), 및 작동가능하게 연결된 전이 유전자(예를 들어, 재조합 수용체 또는 그의 일부를 코딩함)의 발현의 후속 상향조절 또는 유도 후에, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 감소되거나 하향조절된다. 일부 구현예에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 발현의 상향조절 또는 유도 후에, 또는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에 감소되거나 하향조절된다.
일부 구현예에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호(예를 들어, 초기 자극 또는 활성화 신호)에 따른 발현의 상향조절 또는 유도의 특정 기간 후에 감소되거나 하향조절된다. 일부 구현예에서, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호는 T 세포에서 초기 자극 또는 활성화 신호이고, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 초기 자극 또는 활성화 신호의 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일 또는 그 초과 후에 감소되거나 하향조절된다. 일부 구현예에서, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호에 따른 발현의 상향조절 또는 유도 후에, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 초기 자극 또는 활성화 신호의 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일 또는 그 초과 후에 감소되거나 하향조절된다. 일부 구현예에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 초기 자극 또는 활성화 신호의 (약) 2, 3 또는 4일 또는 그 초과 후에 감소되거나 하향조절된다. 일부 구현예에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 초기 자극 또는 활성화 신호 후 또는 (약) 2일 후에 감소되거나 하향조절된다.
일부 구현예에서, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후, 예를 들어, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 작동 가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 감소되거나 하향조절된다. 일부 구현예에서, 작동 가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후 (약) 6, 12, 18, 24, 36 또는 48시간 미만 이내에 감소되거나 하향조절된다. 일부 구현예에서, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후, 또는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재에 따라, 예를 들어, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 작동 가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 (약) 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과보다 더 크게 감소된다. 일부 측면에서, 감소는 예를 들어, T 세포에서 초기 자극 또는 활성화 신호 후에 작동 가능하게 연결된 전이 유전자의 최대 발현과 비교된다. 일부 측면에서, 감소는 예를 들어, T 세포에서 초기 자극 또는 활성화 신호 후에 작동 가능하게 연결된 전이 유전자의 최대 발현과 비교된다.
일부 측면에서, 암호화된 재조합 수용체의 발현의 이러한 조건부 조절은 예를 들어, 표적 항원 또는 표적 세포의 부재 하에 자극 또는 활성화 신호의 부재 하에 암호화된 재조합 수용체의 발현을 제한하거나 방지할 수 있는 피드백 루프를 초래할 수 있다. 이러한 조건부 조절은 표적 항원의 부재 하에 조작된 세포의 비-특이적 활성화 또는 조작된 세포의 활성화를 감소시킬 수 있다. 일부 측면에서, 표적 세포, 예를 들어, 표적 항원을 발현하는 악성 또는 종양 세포의 제거 후, 조작된 T 세포는 더 적은 재조합 수용체를 발현할 수 있고 덜 반응성이 되어, 건강한 세포 집단이 조작된 세포의 비-특이적 활성화 또는 자극을 회복 및 감소시키는 것을 허용할 수 있다.
일부 구현예에서, 작동 가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 신호의 감소 또는 부재 후 T 세포에서 추가 자극 또는 활성화 신호 후에 다시 유도되거나 상향조절될 수 있다. 일부 구현예에서, 작동 가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 신호의 감소 또는 부재 후 T 세포에서 추가 자극 또는 활성화 신호 후 (약) 6, 12, 18, 24, 36 또는 48시간 미만 이내에 상향조절되거나 유도된다. 일부 구현예에서, 작동 가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 신호의 감소 또는 부재 후 T 세포에서 추가 자극 또는 활성화 신호 후 (약) 24시간 미만 이내에 상향조절되거나 유도된다. 일부 구현예에서, 작동 가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 (약) 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과보다 더 크게 상향조절되거나 유도된다. 일부 측면에서, 상향조절 또는 유도는 T 세포에서 추가 자극 또는 활성화 신호 전 또는 부재 하에, T 세포에서 추가 자극 또는 활성화 신호 이전에 작동 가능하게 연결된 전이 유전자의 최소 발현과 비교된다. 일부 구현예에서, T 세포에서 추가 자극 또는 활성화 신호 후, 재조합 수용체의 평균 발현 수준은 (약) 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상 초과로 증가된다.
일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 T 세포 상에서 일시적으로 상향조절되거나 유도되는 분자를 암호화한다. 일부 구현예에서, 예시적인 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1(암호화 PD-1), CD69, Nur77(암호화 NR4A1), FoxP3 또는 HLA -DR 유전자 좌를 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자(예를 들어, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화)는 내인성 PDCD1(암호화 PD-1), CD69, Nur77(암호화 NR4A1), FoxP3 또는 HLA -DR 유전자 좌의 전사 조절 요소, 예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자(예를 들어, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화)는 내인성 PDCD1(암호화 PD-1), CD69, Nur77(암호화 NR4A1), FoxP3 또는 HLA -DR 유전자 좌에서 또는 근처에서 통합된다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 이의 하류에 통합된다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 내인성 PDCD1 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 이의 하류에 통합된다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 내인성 CD69 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 이의 하류에 통합된다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 내인성 Nur77 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 이의 하류에 통합된다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 내인성 FoxP3 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 이의 하류에 통합된다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 내인성 HLA -DR 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 이의 하류에 통합된다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 작동 가능한 제어 하에 및/또는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 의해 조절된다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 작동 가능한 제어 하에 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 측면에서, 예를 들어, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자의 발현은 세포내 신호전달 영역을 통한 신호의 품질 및/또는 강도 및/또는 표적 항원 또는 에피토프에 대한 재조합 수용체의 결합 및/또는 인식에 반응하는 조절 요소에 의해 조절된다. 일부 구현예에서, "T 세포 자극-연관된 유전자 좌"는 T 세포 상에 존재하거나 발현되는, T 세포의 TCR 복합체의 성분을 통해 형질도입된 신호에 반응하는 내인성 유전자 유전자 좌, 또는 TCR 복합체의 성분 또는 이의 일부를 포함하는 세포내 신호전달 영역, 및/또는 수용체, 예를 들어, T 세포 수용체(TCR) 또는 재조합 수용체에 의한 항원 또는 에피토프 결합을 포함하는 재조합 수용체이다. 일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 T 세포의 정상 하류 신호전달 경로의 일부인 표준 인자에 의해 조절될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어, CAR 또는 TCR의 세포내 신호전달 영역을 통한 항원 또는 에피토프 결합 및/또는 신호 또는 활성은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 유도하여 전이 유전자를 발현하는, 예를 들어, 재조합 수용체를 암호화하는 신호전달을 유도한다. 이어서, 내인성 유전자 생성물 및/또는 전이 유전자의 검출가능한 발현을 T 세포 활성화의 지표로서 모니터링할 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 발현이 TCR 복합체의 성분의 활성화에 의존하거나 그와 연관되는 하나 이상의 조절 요소, 예를 들어, 하나 이상의 전사 제어 요소를 함유하며, 이에 의해서 조절 도메인 또는 요소는 이러한 유전자의 발현을 구동하는 전사 인자에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 전사 인자에 의해 인식되는 프로모터, 인핸서 또는 다른 반응 요소 또는 그의 일부를 함유하여 그의 활성이 정상적으로 T 세포 자극 또는 활성화에 의해 턴 온(turned on)되거나 활성화되는 유전자의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 그의 활성이 T 세포 자극 또는 활성화에 의해 턴온되는 전사 인자의 조절 도메인 또는 영역(예를 들어, 프로모터, 인핸서 또는 다른 반응 요소)을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 세포내 신호전달 영역을 통한 신호의 품질 및/또는 강도 및/또는 재조합 수용체의 표적 항원, 리간드 또는 에피토프에 대한 결합 및/또는 인식 중 하나 이상에 반응한다. 일부 구현예에서, 조절 요소는 항원 또는 에피토프에 결합하는 내인성 TCR의 상태, T 세포 자극 또는 활성화, TCR을 통한 신호 강도 및/또는 내인성 TCR의 세포내 신호전달 영역을 통한 신호전달의 품질 중 하나 이상에 반응한다.
일부 구현예에서, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 T 세포 전사 인자에 대한 하나 이상의 결합 부위를 함유하고, 이에 의해 T 세포 전사 인자의 하류 활성과 연관되는 하나 이상의 조절 요소, 예를 들어, 전사 조절 요소, 예를 들어, 프로모터, 인핸서 또는 반응 요소를 함유한다. 일부 구현예에서, 전사 인자는 활성화된 T 세포(NFAT), C/EBP, STAT1, STAT2, 또는 NF-κB의 핵 인자이다. 일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 활성화된 T 세포(NFAT), C/EBP, STAT1, STAT2, 또는 NF-κB의 핵 인자에 의해 인식되는 하나 이상의 반응 요소를 함유한다. 일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 1 또는 2종, 및 일부 경우에 3종 이상의 특유의 전사 인자에 의해 인식되거나 이에 반응성인 하나 이상의 조절 요소를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 내인성 TCR 복합체를 통한 T 세포의 자극시 활성화되는 전사 인자에 의해 인식되는 하나 이상의 반응 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자의 조절 영역은 세포에서 하나 초과의 신호전달 경로에 반응할 수 있는 다수의 조절 요소를 함유한다. 일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 NFAT에 의해 인식되는 하나 이상의 조절 요소를 함유한다. 일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 NF-κB에 의해 인식되는 하나 이상의 조절 요소를 함유한다.
일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 NFAT 활성 및/또는 NFAT-조절된 신호 전달과 연관된다. 전사 인자(transcription factors)의 NFAT 패밀리는 T 세포 활성화에 반응하는 것을 포함하여, 사이토카인 유전자 및 면역 반응에 수반되는 다른 유전자의 전사 조절에서 역할을 한다. 일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 결합 부위를 함유하고/하거나 NFAT에 의해 인식되고, 전이 유전자의 발현을 구동할 수 있는 프로모터, 인핸서 또는 반응 요소와 같은 조절 요소를 함유하며, 예를 들어, 이에 작동가능하게 연결된 재조합 수용체를 암호화한다.
일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 NF-κB 및/또는 NF-κB-매개된 신호 전달의 활성과 연관된다. NF-κB의 활성화는 TCR의 자극(즉, CD3 신호전달을 통해) 및 CD28을 통한 공-자극에 의존하고, CD3 및 CD28 둘 다의 결찰에 의해 조절될 수 있다. CD28 또는 CD3 신호전달이 NF-κB 전사를 유도할 수 있는 반면, TCR 신호전달(즉, CD3 신호전달)과 CD28의 공동-결찰은 더 큰 전사 활성을 초래할 수 있다 (문헌 [Thaker 등, (2015) Immunology Letters, 163:113-119]). 일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 하나 이상의 결합 부위를 함유하고/하거나 NF-κB에 의해 인식되고, 전이 유전자의 발현을 구동할 수 있는 프로모터, 인핸서 또는 반응 요소와 같은 전사 조절 요소를 함유하며, 예를 들어, 이에 작동가능하게 연결된 재조합 수용체를 암호화한다. 일부 경우에, NF-κB 신호전달에 반응하는 조절 요소를 함유하는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 T 세포 신호전달의 품질 및 TCR-매개된 신호전달 및 공-자극 신호전달 둘 다의 존재의 지표일 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 조절 요소에 의해 조절되는 발현은 T 세포 신호전달에 의존하고, 유도되고/되거나 상향조절된다. 예를 들어, 조절 도메인 또는 요소는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 프로모터 또는 이의 일부일 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터 또는 이의 일부는 결합 부위를 함유하고/하거나 하나 이상의 전사 인자에 의해 인식될 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 전사 조절 요소, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 또는 다른 반응 요소를 함유하고, 이는 발현이 T 세포 신호전달 또는 활성화에 의해 유도될 수 있는 유전자인, T 세포 전사 인자의 발현을 조절하는 내인성 유전자 유전자 좌이거나 이의 일부이다. 일부 구현예에서, 전사 인자는 활성화된 T 세포(NFAT), 신경 성장 인자 IB(Nur77, NR4A1로도 알려짐), C/EBP, STAT1, STAT2, 및 NFκB의 핵 인자이다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, 예를 들어, TCR 복합체와 같은 항원 수용체를 통한 신호의 품질 및/또는 강도에 반응하는 조절 요소의 작동가능한 제어 하에 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 표적 항원 또는 에피토프의 세포내 신호전달 영역을 통한 신호의 품질 및/또는 강도에 반응하고/하거나, 재조합 수용체(예를 들어, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 작동가능하게 연결된 수용체)의 결합 및/또는 인식에 반응한다.
임의의 제공된 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1이다. 일부 구현예에서, 제공된 조작된 세포는 PDCD1의 내인성 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 변형된 PDCD1 유전자 좌를 포함한다. PDCD1은 중추 및 말초 면역 내성 및 면역 고갈의 매개사슬 억제 수용체 프로그램된 세포 사멸-1(PD-1; PDCD1; CD279; PD-1; PD1; SLEB2; hPD-1; 또는 hSLE1로도 알려짐)을 암호화한다. 일부 측면에서, CD8 T 세포 상의 PD-1 발현은 T 세포 수용체(TCR)를 통한 신호의 존재 및/또는 강도와 상관관계가 있다. 일부 측면에서, TCR 자극은 칼시뉴린 경로를 통해 신호전달 캐스케이드를 개시하여, 전사 인자 NFATc1(또한 NFAT2로도 알려짐)의 활성화 및 전좌(translocation)를 초래한다. 일부 측면에서, NFATc1은 CD4 및 CD8 T 세포에서 PD-1의 초기 활성화-유도된 발현에 관여하고, 다른 조절 메카니즘은 또한 발현 만성 항원 노출을 유지 및 증대시키는데 관여한다(예를 들어, 문헌 [Bally 등, J Immunol (2016) 196 (6) 2431-2437; Simon 등, Oncoimmunology. 2018; 7(1): e1364828; Arasanz 등, Oncotarget. 2017 Aug 1; 8(31): 51936-51945] 참조).
임의의 제공된 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 CD69이다. 일부 구현예에서, 제공된 조작된 세포는 CD69의 내인성 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 변형된 CD69 유전자 좌를 포함한다. CD69는 분화 69의 막관통 C-형 렉틴 단백질 클러스터(CD69; AIM; BL-AC/P26; CLEC2C; EA1; GP32/28; 또는 MLR-3으로도 알려짐)를 암호화한다. CD69는 T 세포, 조혈 줄기 세포, 자연 살해(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 및 다른 면역 세포에서 발현되는 초기 활성화 마커이다. CD69는 림프구 활성화 동안 획득된 초기 유도성 세포 표면 당단백질이고, 림프구 증식에 관여하고, 자연 살해(NK) 세포, 및 혈소판을 포함하는 림프구에서 신호 전달 수용체로서 기능한다. CD69 발현은 빠르게 유도되는데, 예를 들어, TCR/CD3 결합 후 T 림프구의 표면 상에서 활성화(30 내지 60분) 후에 조기에 검출되고, 사이토카인 및 폴리클로날, 유사분열 자극을 활성화한다. CD69 유전자의 전사 발현은 4 내지 6시간 후에 빠르게 감소한다. CD69 단백질 발현은 자극 후 2 내지 3시간만큼 조기에 검출될 수 있다(예를 들어, [Alari-Pahissa 등, PLoS One. 2012; 7(10): e48593; Cibrian 등, Eur J Immunol. 2017 Jun; 47(6): 946-953] 참조).
임의의 제공된 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 Nur77이다. 일부 구현예에서, 제공된 조작된 세포는 Nur77의 내인성 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 변형된 Nur77 유전자 좌를 포함한다. Nur77은 세포내 전사 인자의 Nur 핵 수용체 패밀리의 구성원인, 신경 성장 인자 IB(NGFIB; 또한 Nr4a1, 신경 성장 인자 IB(NGFIB)로도 알려짐, GFRP1; Gfrp; HMR; Hbr-1; Hbr1; Hmr; N10; NAK-1; NGFI-B; NGFIB; NP10; Ngfi-b; 오펀 핵 수용체(Orphan nuclear receptor) HMR; ST-59; TIS1; TR3; TR3 오펀 수용체; 초기 반응 단백질 NAK1; 성장 인자-유도성 핵 단백질 N10; 호르몬 수용체; 즉시 초기 유전자 전사 인자 NGFI-B; 신경 성장 인자 IB 핵 수용체 변이체 1; 신경 성장 인자 유도된 단백질 I-B; 신경 성장 인자 유도된 단백질 I-B; 신경 오펀 핵 수용체 NUR77; nhr-6; nr4a1; 핵 호르몬 수용체 NUR/77; 핵 단백질 N10; 핵 수용체 서브패밀리 4 그룹 A 구성원 1; 오펀 핵 수용체 NGFI-B; 오펀 핵 수용체 NR4A1; 오펀 핵 수용체 TR3; 스테로이드 수용체 TR3; 고환 수용체 3; 또는 zgc:92434)을 암호화한다. 일부 맥락에서, Nur77 발현은 T 세포에서 1차 활성화 신호, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호전달 도메인으로부터의 신호, 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인에 민감하다. 일부 맥락에서, Nur77의 발현은 신호전달 영역을 통한 신호에 용량-반응성이다.
Nur77은 TCR 자극 후 수 시간 내에 T 세포에서 발현된 즉시-초기 반응 유전자이고, 인간 림프구에서 식물성 헤마글루티닌에 의해 및 정지된 섬유아세포의 혈청 자극에 의해 유도될 수 있다. Nur77은 내인성 TCR 복합체의 신호 또는 신호 활성화, 내인성 TCR의 관여 및/또는 TCR 복합체, 예를 들어, CD3-제타 신호전달 영역의 신호에 관여하는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 분자를 통해 신호에 반응하여 유도된다. Nur77 유전자 생성물 자체는 일반적으로 여러 유전자의 프로모터와 연관된 조절 요소에 결합하여 유전자의 하류 발현을 유도할 수 있다. Nur77의 발현 수준 또는 발현 정도는 T 세포 신호, 예를 들어, TCR 신호의 강도에 대한 지표로서 작용할 수 있다(문헌 [Moran 등, (2011) JEM, 208:1279-1289]). 따라서, 일부 구현예에서, Nur77 유전자 좌의 전사 조절 요소(들), 또는 이의 일부에 작동가능하게 연결된 리포터 분자의 발현은 T 세포 신호의 강도의 지표를 제공할 수 있다. 또한, Nur77 발현은 일반적으로 사이토카인 신호전달 또는 톨-유사 수용체(TLR) 신호전달과 같은 다른 신호전달 경로에 의해 영향을 받지 않거나 영향을 받지 않으며(예를 들어, 문헌 [Ashouri 등, (2017) J. Immunol. 198:657-668]), 이는 세포 외인성 방식으로 작용할 수 있고 재조합 수용체를 통한 신호에 의존하지 않을 수 있다.
임의의 제공된 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 FOXP3이다. 일부 구현예에서, 제공된 조작된 세포는 FOXP3의 내인성 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 변형된 FOXP3 유전자 좌를 포함한다. FOXP3 유전자는 포크헤드 박스 P3(Foxp3; 또한 스쿠르핀, AIID, DIETER, IPEX, JM2, PIDX, XPID로도 알려짐), 면역계 반응에 관여하는 단백질, 일부 경우, 조절 T 세포의 발달 및 기능에서 조절 경로의 조절제로 고려되는 것을 암호화한다. FoxP3의 발현은 자극 또는 활성화 후, 활성화된 비-억제성 T 세포 또는 억제성 T 세포를 포함하는 T 세포에 의해 유도된다. 발현은 CD8+CD25+ T 세포에서 일시적이지만, 일부 경우, 예를 들어, CD4+CD25+ 조절성 T 세포에서, 발현은 더 안정적일 수 있다(예를 들어, 문헌 [Kmieciak 등, J Transl Med. 2009; 7: 89; Wang 등, Eur J Immunol. 2007 Jan; 37(1):129-38; Yu 등, Oncol Lett. 2018 Jun; 15(6): 8187-8194] 참조).
임의의 제공된 구현예 중의 일부에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 HLA -DR 좌위이다. 일부 구현예에서, 제공된 조작된 세포는 HLA -DR 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 변형된 HLA-DR 유전자 좌를 포함한다. HLA-DR은 B 림프구, 단핵구 및 대식세포의 표면 상에서 구성적으로 발현되고 T 및 NK 세포 상에서의 활성화의 후기 단계에서 나타나는 인간 클래스 II 주요 조직적합성 복합체(MHC) 항원이다. 일부 측면에서, HLA-DR은 후기 단계 활성화 마커이다(예를 들어, 문헌 [Bajnok 등, Mediators of Inflammation (2017) Article ID 8045161; Revenfeld 등, Int J Mol Sci. 2017 Jul; 18(7): 1603; Reddy 등, J. Immun. Methods. 2004, 293(1-2): 127-142] 참조). HLA-DR은 염색체 6 영역 6p21.31 상에서 인간 백혈구 항원 복합체에 의해 암호화되는 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체이다. HLA-DR은 여러 유전자 좌 및 각각의 유전자 좌에서 상이한 기능의 여러 유전자에 의해 암호화된다. DR α-사슬은 HLA-DRA 유전자 좌에 의해 암호화된다. DR β-사슬은 HLA-DRB1 내지 HLA-DRB9를 비롯한 여러 상이한 유전자 좌에 의해 암호화되며, 여기서 이들 중 일부만이 각각의 개체에 존재한다. HLA-DRB1 유전자 좌는 유비쿼터스이고, 매우 많은 수의 기능적으로 가변적인 유전자 생성물(HLA-DR1 내지 HLA-DR17)을 암호화한다(예를 들어, 문헌 [Marsh 등, Tissue Antigens. 2010 Apr; 75(4): 291-455] 참조).
일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌, 및/또는 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 수준, 양, 패턴 및 시기는 T 세포 자극 또는 활성화 신호의 존재 하에 유전자 발현을 평가하기 위한 검정을 사용함으로써 결정될 수 있다. 일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌, 및/또는 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 수준, 양, 패턴 및 시기를 탐지하는 것은 시험관내 검정 또는 생체내 수행을 포함한다.
일부 구현예에서, 검정은 발현된 유전자 생성물(예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질)의 수준, 예를 들어, 면역검정, 압타머-기반 검정, 조직학적 또는 세포학적 검정, 또는 발현된 리보핵산(RNA)의 수준, 예를 들어, mRNA 발현 수준 검정을 검출하는 검정을 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌, 및/또는 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현의 수준, 양, 패턴 및 시기는 검정, 예를 들어, 면역세포화학 또는 면역조직화학, 효소 연결된 면역흡착 검정(ELISA; 직접, 간접, 샌드위치, 경쟁적, 다중 및 휴대용 ELISA(예를 들어, 미국특허 제7,510,687호 참조)포함), 웨스턴 블롯팅(선택적으로 펩티드 서열분석을 포함하는 1종, 2종 이상의 치수 블롯팅 또는 다른 크로마토그래피 수단 포함), 면역블롯팅, 면역침전, 방사성면역검정(RIA), 면역염색, 유세포 측정 검정, 표면 플라스몬 공명(SPR), 화학발광 검정, 측방향 유동 면역검정, 억제 검정, 친화도 검정, 핵산-기반 또는 단백질-기반 압타머 기술, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 펩티드 서열분석(예를 들어, 에드만 분해 서열분석 또는 질량 분광측정법(예를 들어, MS/MS), 선택적으로 HPLC에 커플링됨), 및 상기 중 임의의 것의 마이크로어레이 적응(핵산, 항체 또는 단백질-단백질(즉, 비-항체) 어레이 포함)에 의해 검출된다. 일부 구현예에서, 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 작동가능하게 연결된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 및/또는 전이 유전자의 발현 수준, 양, 패턴 및 시기는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 또는 암호화된 재조합 수용체의 유전자 생성물에 특이적으로 결합하는 결합 시약을 사용하여 결정된다. 일부 경우에, 결합 시약은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 압타머 또는 핵산 프로브이다.
일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌, 및/또는 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현 수준, 양, 패턴 및 시기는 핵산, 예를 들어, 메신저 RNA의 양, 수준 또는 발현을 검출하는 방법을 사용하여 결정된다. 특정 구현예에서, 검정은 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌로부터의 mRNA 또는 전이 유전자로부터 생성된 mRNA의 수준을 검출, 측정, 평가 및/또는 정량화하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드의 양 또는 수준은 역전사효소(rt) PCR, 액적 디지털 PCR, 실시간 및 정량적 PCR 방법(예를 들어, TAQMAN®, 분자 비콘(molecular beacon), LIGHTUPTM, SCORPIONTM, SIMPLEPROBES®을 포함함; 예를 들어, 미국특허 제5,538,848호; 제5,925,517호; 제6,174,670호; 제6,329,144호; 제6,326,145호 및 제6,635,427호 참조)을 비롯한 중합효소 연쇄 반응(PCR); 노던 블롯팅(northern blotting); 예를 들어, 역전사 생성물 및 유도체의 서던 블롯팅(Southern blotting); 블롯팅된 어레이, 마이크로어레이, 또는 인 시츄-합성된 어레이(in situ-synthesized arrays)를 포함하는 어레이 기반 방법; 및 예를 들어, 합성에 의한 서열분석(sequencing), 피로서열분석(pyrosequencing), 디데옥시 서열분석(dideoxy sequencing), 또는 결찰(ligation)에 의한 서열분석, 또는 예를 들어, HELICOS®, ROCHE® 454, ILLUMINA®/SOLEXA®, ABI SOLiD®, 및 POLONATOR® 서열분석과 같은 특정 플랫폼을 비롯한, 예를 들어, 문헌 [Shendure 등, Nat. Rev. Genet. 5:335-44 (2004)] 또는 [Nowrousian, Eukaryotic Cell 9(9): 1300-1310 (2010)]에 논의된 바와 같은 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 평가, 측정, 결정 및/또는 정량화될 수 있다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 폴리뉴클레오티드의 수준은 qRT-PCR에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, qRT-PCR은 각각의 유전자에 대해 3개의 핵산 세트를 사용하며, 여기서 3개의 핵산은 프라이머가 결합하는 표적 핵산의 영역 사이에 결합하는 프로브와 함께 프라이머 쌍을 포함한다.
일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌, 및/또는 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현의 수준, 양, 패턴 및 시기는 폴리뉴클레오티드를 서열분석함으로써 결정된다. 일부 구현예에서, 서열분석은 비-생거 서열분석 방법 및/또는 차세대 서열분석 (NGS) 기술에 의해 수행된다. 차세대 서열분석 기술의 예는 제한되지는 않지만, 대량 병렬 서열분석(Massively Parallel Signature Sequencing; MPSS), 폴로니 서열분석(Polony sequencing), 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 가역성 염료-종단기 서열분석(Reversible dye-terminator sequencing), SOLiD 서열분석, 이온 반도체 서열분석(Ion semiconductor sequencing), DNA 나노볼 서열분석(nanoball sequencing), 헬리오스코프 단일 분자 서열분석(Helioscope single molecule sequencing), 단일 분자 실시간(Single molecule real time; SMRT) 서열분석, 단일 분자 실시간(Single molecule real time; RNAP) 서열분석, 및 나노기공(Nanopore) DNA 서열분석을 포함한다. 일부 구현예에서, NGS 기술은 RNA 서열분석(RNA-Seq)이다. RNA 서열분석 방법은 HiSeq 시스템(Illumina), 454 게놈 시퀀서 FLX 시스템(Genome Sequencer FLX System)(Roche), 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems) SOLiD(Life Technologies), 이온토렌트(IonTorrent)(Life Technologies)와 같은 가장 통상적인 DNA 서열분석 플랫폼에 적합화되어 왔다. 이들 플랫폼은 일반적으로 RNA의 cDNA로의 초기 역전사를 필요로 한다. 반대로, 단일 분자 시퀀서 헬리코스코프(HeliScope)(Helicos BioSciences)는 서열분석을 위한 주형으로서 RNA를 사용할 수 있다. PacBio RS 플랫폼 상에서의 직접 RNA 서열분석에 대한 원리의 증거 또한 입증되었다(Pacific Bioscience). 일부 구현예에서, 하나 이상의 RNA 유전자 생성물은 RNAseq에 의해 평가, 측정, 결정 및/또는 정량화된다.
일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌, 및/또는 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현의 수준, 양, 패턴 및 시기는 자극 또는 활성화 신호에의 노출 후에 세포에서 결정될 수 있다. 일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌 및/또는 전이 유전자의 발현은 자극 또는 활성화 신호를 제공하는 제제와 세포를 인큐베이션함으로써 결정된다. 일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌, 및/또는 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현 수준, 양 및 패턴은 자극 또는 활성화 신호에 대한 노출 후 다양한 시간에 평가될 수 있다. 일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌, 및/또는 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현 수준, 양 및 패턴은 재자극, 반복된 자극 또는 연속 자극 후에 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자의 발현은 재조합 수용체의 결합 도메인에 결합하는 제제 및/또는 재조합 수용체의 세포내 신호전달 영역을 통해 신호를 유도하거나 유도할 수 있는 제제의 존재 또는 부재 하에 T 세포의 인큐베이션 후에 평가될 수 있다.
일부 측면에서, 발현의 수준, 양 또는 패턴을 평가하기 위해 자극 또는 활성화 신호를 제공할 수 있는 예시적인 제제는 항원-비의존성 자극을 제공하는 것들, 예를 들어, 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 함유하는 제제, 예를 들어, 항-CD3 및 항-CD28 항체와 접합된 비드, 또는 항-CD3/항-CD28 항체 또는 항체 단편으로 로딩된 가용성 다량체 또는 올리고머 시약; 또는 재조합 수용체에 대한 항원-특이적 자극, 예를 들어, 재조합 수용체가 결합하거나 인식하는 정제된 또는 재조합 항원, 예를 들어, 재조합 수용체의 항원- 또는 리간드-결합 도메인의 표적 항원 또는 리간드를 제공하는 것들을 포함한다. 발현 수준, 양 또는 패턴을 평가하기 위해 T 세포에 자극 또는 활성화 신호를 제공할 수 있는 다른 예시적인 제제는 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate; PMA), 12-O-테트라데카노일포르볼 13-아세테이트(12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate; TPA)로도 공지됨, 이오노마이신(ionomycin) 및/또는 콘카나발린 A(Concanavalin A; Con A)를 포함한다.
II.
상동성
-지시된 수선(
HDR
)에 의해 조건부로 재조합 수용체를 발현하는 세포의 생산 방법
변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌(예를 들어, PDCD1(암호화 PD-1), CD69, Nur77(암호화 NR4A1), FoxP3 또는 HLA-DR 유전자 좌)를 포함하는 유전자 조작된 세포를 생성 또는 생산하는 방법이 본원에서 제공되며, 여기서 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 재조합 수용체, 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 전이 유전자(예를 들어, 이종성 또는 외인성 핵산 서열)를 포함한다. 일부 측면에서, 유전자 조작된 세포 내의 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내로 통합된 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유하는 주형 폴리뉴클레오티드를 사용하여, 표적화된 유전자 파괴(genetic disruption) 및 상동성-의존성 수선(HDR)을 유도함으로써, T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 전이 유전자의 통합을 표적화하는 것을 수반하는 방법이 제공된다. 또한, 상기 방법에 의해 생성된 세포 및 세포 조성물, 및 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드, 및 상기 방법에 사용하기 위한 키트가 제공된다.
일부 측면에서, 제공된 구현예는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내로의 재조합 또는 이종성 서열의 표적화된 통합을 위해 HDR을 사용한다. 일부 경우에, 상기 방법은 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자의 HDR에 의한 표적화된 통합과 조합된 유전자 편집 기술에 의해 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴(들), 예를 들어, DNA 절단을 도입하는 것을 수반한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴(들)는 유전자 파괴(들)를 도입할 수 있는 하나 이상의 제제(들)의 도입에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, HDR 단계는 표적 게놈 위치에서의 DNA에서 파괴(disruption) 또는 절단(break), 예를 들어, 이중-가닥 절단(double-stranded break)을 수반한다. 일부 구현예에서, DNA 절단은 유전자 편집 방법, 예를 들어, 표적화된 핵산분해효소를 사용함으로써 유도된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 발현을 위해 녹 아웃된 조작된 세포를 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 발현을 보유하는 조작된 세포를 생성한다. 일부 측면에서, 상기 방법을 수행한 후, 조작된 T 세포는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함한다. 일부 측면에서, 내인성 전사 조절 요소는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현을 유도하거나 상향조절한다.
일부 측면에서, 제공된 방법은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 T 세포 내로 도입하는 단계; 및 전이 유전자 및 하나 이상의 상동성 암을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드를 T 세포 내로 도입하는 단계;를 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 상동성-지시된 수선(HDR)을 통해 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 통합을 위해 표적화된다.
일부 측면에서, 제공된 방법은 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 유전자 파괴를 갖는 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함하되, 상기 유전자 파괴는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 하나 이상의 표적 부위의 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제에 의해 유도되었고, 여기서 핵산 서열은 HDR을 통해 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 통합을 위해 표적화된다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어, CAR 또는 TCR을 발현하도록 조작된 세포의 집단을 함유하는 조성물이 또한 제공되며, 이는 상기 제공된 방법 중의 임의의 것에 의해 생산된 유전자 조작된 면역 세포를 비롯한, 재조합 수용체에 의한 보다 개선된, 균일한, 균질한, 조절된 및/또는 안정한 발현 및/또는 항원 결합을 나타내는 세포 집단을 나타낸다. 일부 측면에서, 상기 제공된 구현예는 발현의 조절, 예를 들어, 연결된 전이 유전자의 조건부 발현, 예를 들어, 재조합 수용체를 암호화하는 T 세포의 자극 시에, 및 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재에 따라 감소되거나 하향조절된 발현을 허용한다.
일부 측면에서, 상기 구현예는 유전자 편집 방법 및/또는 표적화된 핵산분해효소를 사용하여 표적화된 DNA 절단, 이어서 하나 이상의 주형 폴리뉴클레오티드(들), 예를 들어, 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 전이 유전자에 연결된 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서의 서열에 상동성인 상동성 서열 및 일부 경우에 다른 분자를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 주형 폴리뉴클레오티드(들)에 기초한 HDR을 생성하여, DNA 절단에서 또는 그 근처에서 전이 유전자를 특이적으로 표적화하고 통합하는 것을 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, 상기 방법은 표적화된 유전자 파괴(예를 들어, 유전자 편집)를 유도하고, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 전이 유전자를 포함하는 주형 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 것(예를 들어, HDR)을 포함한다.
일부 구현예에서, HDR에 의한 전이 유전자의 표적화된 유전자 파괴 및 표적화된 통합은 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 하나 이상의 표적 부위(들)에서 발생한다. 일부 측면에서, 표적화된 통합은 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 서열 내에서 발생한다. 일부 측면에서, 전이 유전자의 표적화된 통합은 예를 들어, 내인성 유전자의 발현이 제거되도록 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 유전자의 녹 아웃을 초래한다.
일부 측면에서, 전이 유전자는 예를 들어, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 그의 부분적 서열의 엑손 내의 상동성-지시된 수선(HDR)에 의해 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내로 통합되어, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 서열이 엑손의 서열과 인-프레임이 되도록 한다. 일부 측면에서, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 전부 또는 일부, 예를 들어, 통합된 전이 유전자의 일부 상류(portion upstream), 및 재조합 수용체 또는 그의 일부는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 발현되고, 일부 경우에 멀티시스트로닉 요소(multicistronic element)에 의해 분리된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴(genetic disruption)를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)의 도입 전, 동시에 또는 후에 조작된 세포로 도입된다. 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴, 예를 들어, DNA 파손의 존재 하에, 주형 폴리뉴클레오티드는 DNA 수선 주형으로 사용되어, 전이 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 유전자 파괴를 둘러싸는 내인성 유전자 서열과 하나 이상의 상동성 암, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드에 포함된 5' 및/또는 3' 상동성 암 사이의 상동성에 기초하여 HDR에 의한 표적화된 유전자 파괴 부위에서 또는 근처에서 효과적으로 통합될 수 있다.
일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)는 동시에 도입된다. 일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)는 본원에서, 예를 들어, 섹션 II.A.3 및 II.B.3에서 기재된 임의의 전달 방법을 사용하여 도입된다. 일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)는 물리적 전달 방법을 통해, 예를 들어, 전기천공(electroporation), 입자 총(particle gun), 인산칼슘 형질감염(calcium phosphate transfection), 세포 압축(compression) 또는 압착(squeezing)을 통해 도입된다. 일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)는 전기천공을 통해 동시에 도입된다.
일부 측면에서, 상기 두 단계는 순차적으로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 및 HDR 단계는 동시에 및/또는 하나의 실험 반응에서 수행된다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 및 HDR 단계는 하나 또는 연속적인 실험 반응에서 연속적으로 또는 순차적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 및 HDR 단계는 동시에 또는 상이한 시간에 별도의 실험 반응에서 수행된다.
면역 세포는 T 세포를 함유하는 세포 집단을 포함할 수 있다. 상기 세포는 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 샘플, 비분획화 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분 채집술 생성물 또는 백혈구 성분 채집술 생성물에서 수득된 것과 같은 대상체에서 수득된 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는 분리 또는 선택되어 양성 또는 음성 선택 및 농축 방법을 사용하여 집단에서 T 세포가 농축될 수 있다. 일부 구현예에서, 집단에는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 함유되어 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드를 도입시키는 단계 및 제제(예를 들어, Cas9/gRNA RNP)를 도입시키는 단계는 임의의 순서로 동시에 또는 순차적으로 발생할 수 있다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 폴리뉴클레오티드 주형은 제제(들)(예를 들어, Cas9/gRNA RNP)를 도입시키는 단계에 의해 유전자 파괴를 유도한 후에 면역 세포로 도입된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 주형 및 하나 이상의 제제(예를 들어, Cas9/gRNA RNP)의 도입 전, 동안 및/또는 후에, 세포는 세포의 증폭 및/또는 증식을 자극하는 조건 하에서 배양되거나 인큐베이션된다.
제공된 방법의 임의의 구현예 중의 일부에서, 주형 폴리뉴클레오티드의 도입은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제의 도입과 동시에 수행된다. 하나 이상의 제제(들)를 도입시키는 임의의 방법은 유전자 파괴를 유도하는데 사용되는 특정 제제(들)에 따라 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 파괴는 파괴될 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 특이적인 CRISPR-Cas9 시스템과 같은 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드롬 핵산(CRISPR)-Cas 시스템과 같은 RNA 가이드 핵산분해효소를 사용하는 것과 같은 유전자 편집에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌 영역을 표적화하는 표적화 도메인을 함유하는 Cas9 및 가이드 RNA(gRNA)를 함유하는 제제가 세포내로 도입된다. 일부 구현예에서, 제제는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌-표적 표적화 도메인을 함유하는 Cas9 및 gRNA의 리보핵단백질(RNP) 복합체(Cas9/gRNA RNP)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 도입은 시험관 내에서 세포와 제제 또는 이의 일부를 접촉시키는 것을 포함하며, 이는 최대 24, 36 또는 48시간 또는 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일 동안 세포 및 제제를 배양 또는 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 도입은 세포로 제제 및/또는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, HDR을 위한 주형의 전달을 달성하는 것을 더 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 개시에 따른 방법, 조성물 및 세포는 예를 들어, 전기천공에 의해 세포로 Cas9 및 gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드의 리보핵단백질(RNP) 복합체의 직접적인 전달을 이용한다. 일부 경우에, 변경될 세포의 전기천공은 세포의 전기천공 후 및 플레이팅 전에 예를 들어, 32℃에서 세포의 저온 충격을 포함한다.
주형 폴리뉴클레오티드를 도입시키는 임의의 방법이 세포로 주형 폴리뉴클레오티드 전달을 위해 사용되는 특정 방법에 따라 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 선형 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 선형 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 이중-가닥 선형 폴리뉴클레오티드이다. 일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 게놈 내의 표적 부위 중 하나 이상에서 유전자 파괴를 유도하기 위해 하나 이상의 제제(들)와 개별적으로 또는 함께 물리적 전달 수단, 예컨대 전기천공에 의해 세포내로 전달된다.
예시적인 방법에는 바이러스, 예를 들어, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스, 형질 도입, 트랜스포손 및 전기천공을 통한 것을 포함하여 수용체를 암호화하는 핵산의 전달을 위한 방법이 포함된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 바이러스 형질 도입 방법이 사용된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 유래된 벡터와 같은 재조합 감염성 바이러스 입자를 사용하여 세포내로 전달되거나 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마-레트로바이러스 벡터를 사용하여 T 세포내로 전달된다(예를 들어, 문헌 [Koste 등, (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens 등, (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino 등, (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park 등, Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557] 참조). 임의의 구현예 중의 일부에서, 바이러스 벡터는 AAV2 또는 AAV6과 같은 AAV이다.
제공된 방법의 상기 측면에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 전기천공을 통해 도입된 Cas9/gRNA RNP와 같은 하나 이상의 제제(들)를 도입한 후 세포내로 도입된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제의 도입 후 즉시 도입된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제의 도입 후 (약) 30 초 이내, (약) 1 분 이내, (약) 2 분 이내, (약) 3 분 이내, (약) 4 분 이내, (약) 5 분 이내, (약) 6 분 이내, (약) 6 분 이내, (약) 8 분 이내, (약) 9 분 이내, (약) 10 분 이내, (약) 15 분 이내, (약) 20 분 이내, (약) 30 분 이내, (약) 40 분 이내, (약) 50 분 이내, (약) 60 분 이내, (약) 90 분 이내, (약) 2 시간 이내, (약) 3 시간 이내 또는 (약) 4 시간 이내에 세포로 도입된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 제제(들) 도입 후 (약) 15 분 내지 (약) 4 시간, 예컨대 (약) 15 분 내지 (약) 3 시간, (약) 15 분 내지 (약) 2 시간, (약) 15 분 내지 (약) 1 시간, (약) 15 분 내지 (약) 30 분, (약) 30 분 내지 (약) 4 시간, (약) 30 분 내지 (약) 3 시간, (약) 30 분 내지 (약) 2 시간, (약) 30 분 내지 (약) 1 시간, (약)1 시간 내지 (약) 4 시간, (약) 1 시간 내지 (약) 3 시간, (약) 1 시간 내지 (약) 2 시간, (약) 2 시간 내지 (약) 4 시간, (약) 2 시간 내지 (약) 3 시간 또는 (약) 3 시간 내지 (약) 4 시간의 시기에 세포로 도입된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 전기천공을 통해 도입된 Cas9/gRNA RNP와 같은 하나 이상의 제제의 도입 후 (약) 2 시간에 세포로 도입된다.
일부 구현예에서, 세포와 제제를 접촉하기 전, 동안 또는 이후 및/또는 전달을 달성(예를 들어, 전기천공)하기 전, 동안 또는 이후에, 제공된 방법은 사이토카인, 자극제 및/또는 면역 세포(예를 들어, T 세포)의, 자극 또는 활성화를 유도할 수 있는 제제의 존재 하에 세포를 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션의 적어도 일부는 항-CD3/항-CD28 비드와 같은 CD28 및/또는 사이토카인에 특이적인 항체, CD3에 특이적인 항체이거나 이를 포함하는 자극제의 존재 하에 진행된다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션의 적어도 일부는 하나 이상의 재조합 IL-2, 재조합 IL-7 및/또는 재조합 IL-15와 같은 사이토카인의 존재 하에 진행된다. 일부 구현예에서, Cas9/gRNA RNP와 같은 하나 이상의 제제(들) 및 주형 폴리뉴클레오티드를 예를 들어, 전기천공을 통해 도입하기 전 또는 후 최대 8 일, 예컨대 최대 24 시간, 36 시간 또는 48 시간 또는 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 일 동안 인큐베이션한다.
일부 구현예에서, 방법은 제제, 예를 들어, Cas9/gRNA RNP 및 폴리뉴클레오티드 주형을 도입하기 전 자극제(예를 들어, 항-CD3/항-CD28 항체)로 세포를 활성화 또는 자극하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9/gRNA RNP와 같은 하나 이상의 제제(들)를 예를 들어, 전기천공을 통해 도입하기 전 자극제(예를 들어, 항-CD3/항-CD28)의 존재 하에 6 시간 내지 96 시간, 예컨대 24-48 시간 또는 24-36 시간 동안 인큐베이션한다. 일부 구현예에서, 자극제와의 인큐베이션은 하나 이상의 재조합 IL-2, 재조합 IL-7 및/또는 재조합 IL-15와 같은 사이토카인의 존재를 더 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 재조합 사이토카인, 예컨대 IL-2(예를 들어, 1 U/mL 내지 500 U/mL, 예컨대 10 U/mL 내지 200 U/mL, 예를 들어, 약 50 U/mL 또는 100 U/mL 또는 50 U/mL 또는 100 U/mL 이상), IL-7(예를 들어, 0.5 ng/mL 내지 50 ng/mL, 예컨대 1 ng/mL 내지 20 ng/mL, 예를 들어, 약 5 ng/mL 또는 10 ng/mL 또는 5 ng/mL 또는 10 ng/mL 이상) 또는 IL-15(예를 들어, 0.1 ng/mL 내지 50 ng/mL, 예컨대 0.5 ng/mL 내지 25 ng/mL, 예를 들어, 약 1 ng/mL 또는 5 ng/mL 또는 1 ng/mL 또는 5 ng/mL 이상)의 존재 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 자극제(들)(예를 들어, 항-CD3/항-CD28 항체)는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), Cas9/gRNA RNP 및/또는 폴리뉴클레오티드 주형을 세포로 도입 또는 전달하기 전에 세척되거나 세포로부터 제거된다. 일부 구현예에서, 제제(들) 도입 전에, 예를 들어, 임의의 자극제 또는 활성제를 제거함으로써 세포는 정치된다. 일부 구현예에서, 제제(들) 도입 전에, 자극제 또는 활성제 및/또는 사이토카인은 제거되지 않는다.
일부 구현예에서, 제제(들), 예를 들어, Cas9/gRNA 및/또는 폴리뉴클레오티드 주형의 도입 후에, 세포는 하나 이상의 재조합 IL-2, 재조합 IL-7 및/또는 재조합 IL-15와 같은 재조합 사이토카인의 존재 하에 인큐베이션, 경작 또는 배양된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 재조합 사이토카인, 예컨대 IL-2(예를 들어, 1 U/mL 내지 500 U/mL, 예컨대 10 U/mL 내지 200 U/mL, 예를 들어, 약 50 U/mL 또는 100 U/mL 또는 50 U/mL 또는 100 U/mL 이상), IL-7(예를 들어, 0.5 ng/mL 내지 50 ng/mL, 예컨대 1 ng/mL 내지 20 ng/mL, 예를 들어, 약 5 ng/mL 또는 10 ng/mL 또는 5 ng/mL 또는 10 ng/mL 이상) 또는 IL-15(예를 들어, 0.1 ng/mL 내지 50 ng/mL, 예컨대 0.5 ng/mL 내지 25 ng/mL, 예를 들어, 약 1 ng/mL 또는 5 ng/mL 또는 1 ng/mL 또는 5 ng/mL 이상)의 존재 하에 수행된다. 세포는 세포의 증식 또는 증폭을 유도하기 위한 조건 하에서 인큐베이션 또는 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 수확을 위한 세포의 역치 수, 예를 들어, 치료적 유효 용량이 달성될 때까지 인큐베이션 또는 배양될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 과정의 임의의 일부 또는 모든 과정 동안 30℃ ± 2℃ 내지 39℃± 2℃, 예컨대 (약) 30℃ ± 2℃, 32℃ ± 2℃, 34℃ ± 2℃ 또는 37℃ ± 2℃ 이상의 온도에서 인큐베이션될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션의 적어도 일부는 30℃ ± 2℃이고, 상기 인큐베이션의 적어도 일부는 37℃ ± 2℃이다.
일부 측면에서, 제공된 구현예는 재조합 수용체가 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소, 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 프로모터의 제어 하에 발현되게 한다. 일부 측면에서, 제공된 구현예는 재조합 수용체를 암호화하는 핵산이 내인성 조절 또는 제어 요소, 예를 들어, 시스 조절 요소, 예를 들어, 프로모터 또는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 5' 및/또는 3' 비번역 영역(UTR)에 작동가능하게 연결될 수 있게 한다. 따라서, 일부 측면에서, 제공된 구현예는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR이 발현되게 하고/하거나 상기 발현은 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌와 유사하게 조건부로, 일시적으로 및/또는 정량적으로 조절된다. 일부 측면에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 상향조절되거나 유도된다. 일부 측면에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재에 따라 감소되거나 하향조절된다. 일부 측면에서, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 신호의 감소 또는 부재에 따라 T 세포에서 추가 자극 또는 활성화 신호 후에 다시 유도되거나 상향조절될 수 있다.
A. 유전자 파괴
일부 구현예에서, 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴는 하나 이상의 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 유도된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 엑손(exon)에서 또는 그 근처에서 유도된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 인트론(intron)에서 또는 그 근처에서 유도된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 프로모터에서 또는 그 근처에서 유도된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴 및 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유하는 주형 폴리뉴클레오티드의 존재는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 하나 이상의 유전자 파괴에서 또는 그 근처에서 전이 유전자의 표적화된 통합을 초래할 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴는 게놈 내의 하나 이상의 표적 부위에서 DNA 절단, 예를 들어, 이중-가닥 절단(double-strand break; DSB) 또는 절단(cleavage), 또는 닉(nick), 예를 들어, 단일-가닥 절단(SSB)을 초래한다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴, 예를 들어, DNA 절단 또는 닉의 부위에서, 세포 DNA 수선 메카니즘의 작용은 녹-아웃, 삽입, 미스센스 또는 프레임시프트 돌연변이, 예를 들어, 이중대립유전자 프레임시프트 돌연변이, 유전자의 전부 또는 일부의 결실을 초래할 수 있거나; 또는 수선 주형의 존재하에, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드는, 상기 수선 주형, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 본원의 섹션 II.B.2에 기재된 임의의 것)에 함유된 핵산 서열의 통합 또는 삽입에 기초하여, DNA 서열을 변경시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 유전자 또는 그의 일부의 하나 이상의 엑손에 대해 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 외인성 서열, 예를 들어, 재조합 수용체를 암호화하는 외인성 서열의 표적화된 통합의 원하는 부위 근처에 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자의 통합 후, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임에 결실, 삽입, 프레임시프트 돌연변이 또는 넌센스 돌연변이를 포함한다. 일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 유전자 생성물은 생산되지 않거나, 절단되거나, 또는 세포에서 비기능성이다. 일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 유전자 생성물은 전장으로 생산되거나 또는 세포에서 기능적이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 표적 부위(들) 중 하나의 근처 영역에 있는 서열에 특이적으로 결합하거나 이와 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산이 표적화된 파괴를 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 재조합 수용체 또는 그의 일부, 및 상동성 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 주형 폴리뉴클레오티드가 여기, 예를 들어, 섹션 II.A.에 기재된 것과 같은 유전자 파괴 부위 또는 근처에서 재조합 수용체 암호화 서열의 HDR에 의한 표적화된 통합을 위해 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 도입함으로써 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 제제에는 유전자에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산이 포함된다. 일부 구현예에서, 제제에는 DNA 표적화 단백질 및 핵산분해효소 또는 RNA 가이드 핵산분해효소를 포함하는 융합 단백질과 같은 다양한 성분이 포함된다. 일부 구현예에서, 제제는 하나 이상의 표적 부위 또는 표적 위치를 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, 표적 부위의 한 측에 한 쌍의 단일-가닥 절단(예를 들어, 닉(nicks))가 생성될 수 있다.
제공된 구현예에서, 용어 "도입(introducing)"은 시험관 내 또는 생체 내에서 DNA를 세포로 도입하는 다양한 방법을 포괄하며, 상기 방법은 형질 전환, 형질 도입, 형질 감염(예를 들어, 전기천공) 및 감염을 포함한다. 벡터는 DNA 암호화 분자를 세포로 도입하는데 유용하다. 가능한 벡터에는 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터가 포함된다. 바이러스 벡터에는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터 또는 아데노 관련 벡터와 같은 기타 벡터가 포함된다. 전기천공과 같은 방법은 또한 예를 들어, 표적화 gRNA와 복합체로 Cas9 단백질을 함유하는 단백질 또는 리보핵단백질(RNP)을 관심 세포로 도입하거나 전달하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴는 표적 부위("표적 위치(target position)", "표적 DNA 서열" 또는 "표적 위치(target location)"로도 알려짐), 예를 들어, 내인성 T세포 자극-연관된 유전자 좌에서 발생한다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들), 예를 들어, 표적 부위를 지정하는 gRNA와 복합체를 이룬 Cas9 분자에 의해 변경되는 표적 DNA(예를 들어, 게놈 DNA) 상의 부위를 포함한다. 예를 들어, 표적 부위는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 절단 또는 DNA 손상이 발생하는 DNA에 있는 위치를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, HDR에 의한 핵산 서열의 통합은 표적 부위 또는 표적 서열 또는 근처에서 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 하나 이상의 뉴클레오티드가 첨가되는 DNA 상에 2개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 인접한 뉴클레오티드 사이의 부위일 수 있다. 표적 부위는 주형 폴리뉴클레오티드에 의해 변경되는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 표적 서열(예를 들어, gRNA가 결합하는 서열) 내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 표적 서열의 상류 또는 하류에 있다.
1. 예시적인 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서의 표적 부위
일부 구현예에서, 상동성-지시된 수선(HDR)을 통한, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자의 유전자 파괴 및/또는 통합은 본원에 기재된 내인성 또는 게놈 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 표적화된다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 표적 부위에서의 유전자 파괴, 및 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 전이 유전자의 표적화된 통합을 위한 주형 폴리뉴클레오티드의 존재에 의해서, 생성된 조작된 T 세포는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유한다. 일부 측면에서, 내인성 전사 조절 요소는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현을 유도하거나 상향조절한다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 표적화되거나, 그 근처에서 또는 그 내에 표적화된다. 일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 T 세포 상에서 일시적으로 상향조절되거나 유도되는 분자를 암호화한다. 일부 구현예에서, 예시적인 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1(암호화 PD-1), CD69, Nur77(암호화 NR4A1), FoxP3 또는 HLA-DR 유전자 좌를 포함한다. 일부 측면에서, 표적 부위는 PDCD1(암호화 PD-1), CD69, Nur77(암호화 NR4A1), FoxP3 또는 HLA-DR 유전자 좌 또는 그 근처에 있다. 예시적인 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 발현은 본 명세서, 예를 들어, 그의 섹션 IA에 기재된다.
예시적인 인간 PD-1 전구체 폴리펩티드 서열은 서열번호 79(성숙 폴리펩티드는 서열번호 79의 잔기 24-288을 포함함; Uniprot 수탁 번호 Q15116-1 참조; 서열번호 80에 제시된 mRNA 서열, NCBI 참조 서열: NM_005018.3)에 제시된다. 인간의 경우, PD-1, PDCD1을 암호화하는 게놈 유전자 좌는 5개의 엑손 및 4개의 인트론을 함유하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. PDCD1의 예시적인 mRNA 전사체는 인간 게놈 버전 GRCh38(인간 2013년 12월 UCSC 게놈 브라우저(GRCh38/hg38) 어셈블리)을 참조로 하여, 염색체 2: 241,849,884-241,858,894 역방향 가닥(reverse strand)에 상응하는 서열에 걸쳐 있다. 표 1은 오픈 리딩 프레임의 엑손 및 인트론의 좌표 및 PD-1을 암호화하는 예시적인 전사체의 비번역 영역을 제시한다.
[표 1]
예시적인 인간 CD69 폴리펩티드 서열은 서열번호 81(Uniprot 수탁 번호 Q07108-1 참조; 서열번호 82에 제시된 mRNA 서열, NCBI 참조 서열: NP_001772.1) 내에 제시된다. 인간의 경우, CD69를 암호화하는 유전자 좌는 5개의 엑손 및 4개의 인트론을 함유하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. CD69의 예시적인 mRNA 전사체는 인간 게놈 버전 GRCh38(인간 2013년 12월 UCSC 게놈 브라우저(GRCh38/hg38) 어셈블리)를 관련하여 염색체 12: 9,752,486-9,760,901 역방향 가닥에 상응하는 서열에 걸쳐 있다. 표 2는 오픈 리딩 프레임의 엑손 및 인트론의 좌표 및 CD69를 암호화하는 예시적인 전사체의 비번역 영역을 제시한다.
[표 2]
예시적인 인간 NR4A1 폴리펩티드 서열은 서열번호 83(이소형 1; Uniprot 수탁 번호 P22736-1 참조; 서열번호 84에 제시된 mRNA 서열, NCBI 참조 서열: NP_002126.2)에 제시된다. 인간의 경우, 여러 상이한 mRNA 및 단백질 이소형이 Nur77에 대해 존재한다. NR4A1, Nur77(NR4A1로도 공지됨)을 암호화하는 예시적인 게놈 유전자 좌는 이소형 1을 암호화하는 전사체 변이체에 대해 8개의 엑손 및 7개의 인트론을 함유하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 이소형 1을 암호화하는 Nur77의 예시적인 mRNA 전사체는 인간 게놈 버전 GRCh38(인간 2013년 12월 UCSC 게놈 브라우저(GRCh38/hg38) 어셈블리)를 관련하여 염색체 12: 52,051,402-52,059,506 정방향 가닥에 상응하는 서열에 걸쳐 있다. 표 3은 오픈 리딩 프레임의 엑손 및 인트론의 좌표 및 NR4A1을 암호화하는 예시적인 전사체 이소형 1의 비번역 영역을 제시한다.
[표 3]
예시적인 인간 FoxP3 폴리펩티드 서열은 서열번호 85(이소형 1; Uniprot 수탁 번호 Q9BZS1-1 참조; 서열번호 86에 제시된 mRNA 서열, NCBI 참조 서열: NM_014009.3)에 제시된다. 인간의 경우, 여러 상이한 mRNA 및 단백질 이소형이 FoxP3에 대해 존재한다. FoxP3, FOXP3을 암호화하는 예시적인 게놈 유전자 좌는 이소형 1을 암호화하는 전사체 변이체에 대해 12개의 엑손 및 11개의 인트론을 함유하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 이소형 1을 암호화하는 FOXP3의 예시적인 mRNA 전사체는 인간 게놈 버전 GRCh38(인간 2013년 12월 UCSC 게놈 브라우저(GRCh38/hg38) 어셈블리)를 관련하여, 염색체 X: 49,250,436-49,264,924 역방향 가닥에 상응하는 서열에 걸쳐 있다. 표 4는 오픈 리딩 프레임의 엑손 및 인트론의 좌표 및 FoxP3을 암호화하는 예시적인 전사체 이소형 1의 비번역된 영역을 제시한다.
[표 4]
HLA-DR은 알파(α) 사슬 및 베타(β) 사슬을 포함하는 이종이량체 단백질이다. 각각의 서브유닛은 2개의 세포외 도메인, 막-스패닝 도메인(membrane-spanning domain) 및 세포질 꼬리(cytoplasmic tail)를 함유한다. α 및 β 사슬 둘 다는 막 내에 고정된다. HLA-DR은 여러 유전자 좌 및 각각의 유전자 좌에서 상이한 기능의 여러 유전자에 의해 암호화된다. DR α-사슬은 HLA-DRA 유전자 좌에 의해 암호화된다. DR β-사슬은 HLA-DRB1 내지 HLA-DRB9를 포함하는 여러 상이한 유전자 좌에 의해 암호화되며, 여기서 이들 중 일부만이 각각의 개체에 존재한다. HLA-DRB1 유전자 좌는 유비쿼터스이며, 매우 많은 수의 기능적으로 가변적인 유전자 생성물(HLA-DR1 내지 HLA-DR17)을 암호화한다(예를 들어, 문헌 [Marsh 등, Tissue Antigens. 2010 Apr; 75(4): 291-455] 참조).
예시적인 전구체 인간 HLA-DR α-사슬 폴리펩티드 서열은 서열번호 87에 제시된다(성숙 폴리펩티드는 서열번호 87의 잔기 26-254를 포함함; Uniprot 수탁 번호 P01903-1 참조; 서열번호 88에 제시된 mRNA 서열, NCBI 참조 서열: NM_019111.4 참조). 인간의 경우, HLA-DR α-사슬, HLA-DRA를 암호화하는 유전자 좌는 5개의 엑손(4개의 암호화 엑손) 및 4개의 인트론을 함유하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. HLA-DRA의 예시적인 mRNA 전사체는 인간 게놈 버전 GRCh38(인간 2013년 12월 UCSC 게놈 브라우저(GRCh38/hg38) 어셈블리)를 관련하여, 염색체 6: 32,439,887-32,445,046 정방향 가닥에 상응하는 서열에 걸쳐 있다. 표 5는 HLA-DR α-사슬을 암호화하는 예시적인 전사체의 오픈 리딩 프레임의 엑손 및 인트론의 좌표 및 비번역된 영역을 제시한다.
[표 5]
예시적인 전구체 인간 HLA-DR β-사슬 폴리펩티드 서열은 서열번호 89에 제시된다(성숙 폴리펩티드는 서열번호 89의 잔기 30-266을 포함함; Uniprot 수탁 번호 P04229-1 참조; 서열번호 90에 제시된 mRNA 서열, GenBank: X03069.1 참조). 인간의 경우, HLA-DR β-사슬, HLA-DRB1을 암호화하는 예시적인 유전자 좌는 6개의 엑손 및 5개의 인트론을 함유하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. HLA-DRB1의 예시적인 mRNA 전사체는 인간 게놈 버전 GRCh38(인간 2013년 12월 UCSC 게놈 브라우저(GRCh38/hg38) 어셈블리)와 관련하여, 염색체 6: 32,578,769-32,589,848 역방향 가닥에 상응하는 서열에 걸쳐 있다. 표 6은 오픈 리딩 프레임의 엑손 및 인트론의 좌표 및 HLA-DR β-사슬을 암호화하는 예시적인 전사체의 비번역 영역을 제시한다.
[표 6]
일부 구현예에서, 조작된 세포는, 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 함유하며, 또한 내인성 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC) 유전자 및/또는 내인성 T 세포 수용체 베타 불변 영역(TRBC) 유전자에서의 유전자 파괴를 함유한다. 일부 측면에서, 내인성 TRAC 및/또는 TRBC 유전자 좌에서의 추가 유전자 파괴는 조작된 세포에서 내인성 TCR의 발현을 방지함으로써, 재조합 수용체를 통한 자극 또는 활성화 신호의 부재 하에, 예를 들어, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자의 발현을 방지한다. 일부 측면에서, 내인성 TRAC 및/또는 TRBC 유전자 좌에서의 추가 유전자 파괴는, 예를 들어, 종양-특이적 항원이 종양의 제거 후에 존재하지 않을 때, 항원-특이적 자극 또는 활성화 신호의 부재 하에 재조합 수용체 또는 이의 부분을 암호화하는 전이 유전자의 재발현을 방지한다.
일부 구현예에서, 내인성 TCR Cα는 TRAC 유전자(IMGT 명명법)에 의해 암호화된다. 예시적인 인간 TCR Cα 폴리펩티드 서열은 서열번호 91 또는 92에 제시된다(UniProtKB 수탁 번호 P01848 또는 진뱅크(Genbank) 수탁 번호 CAA26636.1; 서열번호 93에 제시된 mRNA 서열, 진뱅크: X02592.1 참조). 인간의 경우, TRAC의 예시적인 게놈 유전자 좌는 4개의 엑손 및 3개의 인트론을 함유하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. TRAC의 예시적인 mRNA 전사물은 인간 게놈 버전 GRCh38(UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly)을 참조하여 정방향 가닥으로 염색체 14: 22,547,506-22,552,154 좌표에 해당하는 서열을 포괄할 수 있다. 표 7은 예시적인 인간 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 및 인트론의 좌표 및 전사물의 비번역 영역을 제시한다.
[표 7]
일부 구현예에서, 내인성 TCR Cβ는 TRBC1 또는 TRBC2 유전자(IMGT 명명법)에 의해 암호화된다. 예시적인 인간 TCR Cβ 폴리펩티드 서열은 서열 94, 95 또는 96에 제시된다(UniProtKB 수탁 번호 P01850, A0A5B9 또는 A0A0G2JNG9; 서열번호 97에 제시된 mRNA 서열; GenBank: X00437.1 참조).
인간의 경우, TRBC1의 예시적인 게놈 유전자 좌는 4개의 엑손 및 3개의 인트론을 함유하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. TRBC1의 예시적인 mRNA 전사물은 인간 게놈 버전 GRCh38(UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly)을 참조로 정방향 가닥 상의 염색체 7: 142,791,694-142,793,368의 좌표에 해당하는 서열을 포괄할 수 있다. 표 8은 예시적인 인간 TRBC1 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 및 인트론의 좌표 및 전사물의 비번역 영역을 제시한다.
[표 8]
인간의 경우, TRBC2의 예시적인 게놈 유전자 좌는 4개의 엑손 및 3개의 인트론을 함유하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. TRBC2의 예시적인 mRNA 전사물은 인간 게놈 버전 GRCh38(UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly)을 참조로 정방향 가닥 상의 염색체 7: 142,801,041-142,802,748의 좌표에 해당하는 서열을 포괄할 수 있다. 표 9는 예시적인 인간 TRBC2 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 및 인트론의 좌표 및 전사물의 비번역 영역을 제시한다.
[표 9]
임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC(본원에서 표 1 내지 9에 기재된 바와 같음)의 오픈 리딩 프레임에서 또는 그 근처에서 또는 그 내에서 표적화된다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TCRα 불변 도메인을 암호화하는 오픈 리딩 프레임에서 또는 그 근처에서 또는 그 내에서 표적화된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC(본원에서 표 1 내지 9에 기재된 바와 같음)에서 또는 그 근처에서 또는 그 내에서 표적화되거나, 또는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC(본원에서 표 1 내지 9에 기재된 바와 같음)의 전부 또는 일부에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9%의 서열 동일성을 갖는 서열, 예를 들어, 500, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 또는 4,000개의 연속 뉴클레오티드(contiguous nucleotides)이다.
일부 측면에서, 표적 부위는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC의 오픈 리딩 프레임의 엑손 내에 있다. 일부 측면에서, 표적 부위는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC의 오픈 리딩 프레임의 인트론 내에 있다. 일부 측면에서, 표적 부위는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC의 조절 또는 제어 요소, 예를 들어, 프로모터, 5' 비번역 영역(UTR) 또는 3' UTR 내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 본원에 기재된 표 1 내지 9에 기재된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC 게놈 영역 서열 또는 그에 함유된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC 게놈 영역 서열의 임의의 엑손 또는 인트론 내에 있다. 일부 측면에서, 표적 부위는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC의 엑손과 인트론, 또는 엑손과 조절 또는 제어 요소, 예를 들어, 프로모터, 5' 비번역 영역(UTR) 또는 3' UTR 사이의 접합부 또는 경계에 또는 그 근처에 있다. 일부 측면에서, 표적 부위는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC의 오픈 리딩 프레임의 인트론 내에 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴를 위한 표적 부위는 전이 유전자의 통합 후, 세포가 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC로부터 발현을 위해 녹 아웃, 감소 및/또는 제거되도록 선택된다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴, 예를 들어, DNA 절단은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC 또는 이의 오픈 리딩 프레임의 엑손 내에 표적화된다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC 또는 이의 오픈 리딩 프레임의 제 1 엑손, 제 2 엑손, 제 3 엑손, 또는 제 4 엑손 내에 있다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC 또는 이의 오픈 리딩 프레임의 제 1 엑손 내에 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC 또는 이의 오픈 리딩 프레임에서 제 1 엑손의 5' 말단으로부터 하류에 500개의 염기쌍(bp) 내에 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 엑손 1의 5' 뉴클레오티드와 엑손 1의 3' 뉴클레오티드의 상류 사이에 있다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC 또는 이의 오픈 리딩 프레임에서 제 1 엑손의 5' 말단으로부터 400 bp, 350 bp, 300 bp, 250 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp, 또는 50 bp 하류에 있다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC 또는 이의 오픈 리딩 프레임에서 제 1 엑손의 5' 말단으로부터 1 bp 내지 400 bp, 50 bp 내지 300 bp, 100 bp 내지 200 bp, 또는 100 bp 내지 150 bp(각각의 경계 포함) 하류에 있다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC 또는 이의 오픈 리딩 프레임에서 제 1 엑손의 5' 말단으로부터 100 bp 내지 150 bp 하류에 있다.
일부 측면에서, 유전자 파괴는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC에서 또는 그 근처에서 또는 그 내에서 표적화된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 유전자 파괴는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC(본원에서 표 1 내지 9에 기재된 바와 같음)의 오픈 리딩 프레임에서 또는 그 근처에서 또는 그 내에서 표적화된다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC를 암호화하는 오픈 리딩 프레임에서 또는 그 근처에서 또는 그 내에서 표적화된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC(본원에서 표 1 내지 9에 기재된 바와 같음)에서 또는 그 근처에서 또는 그 내에서 표적화되거나, 또는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC(본원에서 표 1 내지 9에 기재된 바와 같음)의 전부 또는 일부에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9%의 서열 동일성을 갖는 서열, 예를 들어, 500, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 또는 4,000개의 연속 뉴클레오티드다.
일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오티드 내의 전이 유전자(예를 들어, 외인성 핵산 서열)는 표적 부위 및/또는 상동성 암의 위치를 안내하는데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 유전자 파괴의 표적 부위는 HDR에 사용되는 주형 폴리뉴클레오티드 및/또는 상동성 암을 설계하기 위한 가이드로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 전이 유전자의 표적화된 통합의 원하는 부위 근처에 표적화될 수 있다(예를 들어, 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화함). 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 상동성 암 서열은 유전자 파괴 부위(표적 부위)를 둘러싸도록 설계된다. 일부 측면에서, 유전자 파괴는 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자의 통합시 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC의 발현이 감소되거나 제거되도록 표적화된다. 일부 측면에서, 유전자 파괴는 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자의 통합시 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC의 전부 또는 일부가 발현되도록 표적화된다. 일부 측면에서, 표적 부위는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC의 엑손 내에 또는 그 근처에 배치되어, 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자가 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 암호화 서열과 인-프레임으로 통합될 수 있도록 하고, TRAC 및/또는 TRBC가 발현된다.
2. 유전자 파괴 방법
일부 측면에서, 유전자 조작된 세포를 생성하는 방법은 하나 이상의 표적 부위(들), 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC에서 하나 이상의 표적 부위에 유전자 파괴를 도입하는 것을 수반한다. 본원에 기재된 것을 포함하여 유전자 파괴를 생성하는 방법은 내인성 또는 게놈 DNA의 유전자 파괴, 절단 및/또는 이중 가닥 손상(double strand break, DSB) 또는 표적 부위 또는 표적 위치에서의 닉(nick)(예를 들어, 단일-가닥 절단(single strand break; SSB))을 유도하는 조작된 시스템과 같은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)의 사용을 포함할 수 있어서 NHEJ(non-homologous end joining)와 같은 오류 발생 프로세스에 의한 손상의 수선 또는 주형 수선을 이용한 HDR에 의한 수선은 표적 부위 또는 위치에서 또는 근처에서 유전자의 관심 서열(예를 들어, 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 외인성 핵산 서열 또는 전이 유전자)의 삽입을 초래할 수 있다. 여기에 제공된 방법에 사용하기 위한 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)가 또한 제공된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 제제(들)가 전이 유전자의 상동성-지시된 수선(HDR) 매개 표적화된 통합을 위해 여기에 제공된 주형 뉴클레오티드와 조합하여 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)에는 게놈의 특정 부위 또는 위치, 예를 들어, 표적 부위 또는 표적 위치에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산이 포함된다. 일부 측면에서, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서, TRAC 및/또는 TRBC에서의 표적화된 유전자 파괴, 예를 들어, DNA 손상 또는 절단은 키메라 또는 융합 단백질에서와 같이 유전자 편집 핵산분해효소에 결합되거나 이와 복합체를 형성한 단백질 또는 핵산을 사용하여 달성된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)에는 DNA 표적화 단백질 및 핵산분해효소를 포함하는 융합 단백질 또는 RNA-가이드 핵산분해효소가 포함된다.
일부 구현예에서, 제제에는 RNA 가이드 핵산분해효소 또는 DNA 표적화 단백질 및 핵산분해효소를 포함하는 융합 단백질과 같은 다양한 성분이 포함된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 핵산내부가수분해효소와 같은 핵산분해효소에 융합된 하나 이상의 징크 핑거 단백질(ZFP) 또는 전사 활성화제 유사 이펙터(transcription activator-like effector, TALE)와 같은 DNA 결합 단백질을 포함하는 DNA 표적화 분자를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드롬 핵산(CRISPR) 결합 핵산분해효소(Cas) 시스템(Cas 및/또는 Cfp1 포함)과 같은 RNA 가이드 핵산분해효소를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 하나 이상의 표적 부위(들), 유전자 또는 이의 일부의 서열에 표적화되도록 특이적으로 설계된 DNA 결합 표적화된 핵산분해효소 및 징크 핑거 핵산분해효소(ZFN) 또는 전사 활성화제 유사 이펙터 핵산분해효소(transcription activator-like effector nucleases, TALEN)와 같은 유전자 편집 핵산분해효소 및 CRISPR 결합 핵산분해효소(Cas) 시스템과 같은 RNA 가이드 핵산분해효소를 포함한 서열 특이적 또는 표적화된 핵산분해효소와 같은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제를 사용하여 수행된다. 예시적인 ZFN, TALE 및 TALEN이 예를 들어, 문헌 [Lloyd 등, Frontiers in Immunology, 4(221): 1-7 (2013)]에 기재되어 있다.
징크 핑거 단백질(ZFP), 전사 활성화제 유사 이펙터(TALE) 및 CRISPR 시스템 결합 도메인은, 예를 들어, 자연적으로 발생하는 ZFP 또는 TALE 단백질의 인식 나선 영역의 조작(하나 이상의 아미노산 변경)을 통해 미리 결정된 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 "조작(engineered)"될 수 있다. 조작된 DNA 결합 단백질(ZFP 또는 TALE)은 자연적으로 발생하지 않는 단백질이다. 설계에 대한 합리적인 기준에는 기존 ZFP 및/또는 TALE 설계 및 결합 데이터의 정보를 저장하는 데이터베이스에서 정보를 처리하기 위한 대체 규칙 및 전산화된 알고리즘의 적용이 포함된다. 예를 들어, 문헌 [미국특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 및 제6,534,261호; 또한 국제공개공보 제WO 98/53058호; 제WO 98/53059호; 제WO 98/53060호; 제WO 02/016536호 및 제WO 03/016496호 및 미국특허출원공개공보 제20110301073호]을 참조한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 제제(들)는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC에서 또는 근처에서 하나 이상의 표적 부위(들)를 특이적으로 표적화한다. 일부 구현예에서, 제제에는 표적 부위(들)에 특이적으로 결합, 인식 또는 혼성화하는 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas9 조합물이 포함된다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas9 시스템은 특정 절단을 가이드하도록 조작된 crRNA/tracr RNA("단일 가이드 RNA(single guide RNA)")를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제에는 Argonaute 시스템(예를 들어, 'TtAgo', (Swarts 등, (2014) Nature 507(7491): 258-261)로 공지되고, T. thermophilus 유래)에 기초한 핵산분해효소가 포함된다. 본원에 기재된 임의의 핵산분해효소 시스템을 사용한 표적화된 절단이 개발되어 전이 유전자 또는 그의 일부의 서열을, HDR 또는 NHEJ 매개 프로세스를 이용하여 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC에서의 특정 표적 위치에 삽입하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, "징크 핑거 DNA 결합 단백질(zinc finger DNA binding protein)"(또는 결합 도메인)은 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화된 결합 도메인 내 아미노산 서열 영역인, 하나 이상의 징크 핑거를 통해 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는 보다 큰 단백질 내 도메인이거나 단백질이다. 징크 핑거 DNA 결합 단백질 용어는 종종 징크 핑거 단백질 또는 ZFP(zinc finger protein)로 축약된다. ZFP 중에 전형적으로 9-18 뉴클레오티드 길이이고, 개별 핑거의 조립에 의해 생성된, 특정 DNA 서열을 표적화하는 인공 ZFP 도메인이 있다. ZFP는 단일 핑거 도메인이 약 30 개의 아미노산 길이이며 단일 베타 턴의 두 개의 시스테인과 아연을 통해 배위된 두 개의 불변 히스티딘 잔기를 함유하고 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 핑거를 갖는 알파 나선을 함유하는 것을 포함한다. 일반적으로, ZFP의 서열 특이성은 징크 핑거 인식 나선 상의 4개의 나선 위치(-1, 2, 3 및 6)에서 아미노산 치환을 함으로써 변경될 수 있다. 따라서, 예를 들어, ZFP 또는 ZFP 함유 분자는 자연적으로 발생하지 않고, 예를 들어, 선택 표적 부위에 결합하도록 조작된다.
일부 경우에, DNA 표적화 분자는 DNA 절단 도메인에 융합된 징크 핑거 DNA 결합 도메인이거나 이를 포함하여 징크 핑거 핵산분해효소(ZFN)를 형성한다. 예를 들어, 융합 단백질은 하나 이상의 IIS 유형 제한 효소의 절단 도메인(또는 절단 하프 도메인) 및 하나 이상의 징크 핑거 결합 도메인을 포함하며, 이는 조작되거나 조작되지 않을 수 있다. 일부 경우에, 절단 도메인은, 일반적으로 하나의 가닥 상의 제한 부위로부터 9 뉴클레오티드 및 다른 가닥 상의 제한 부위로부터 13 뉴클레오티드에서 DNA의 이중 가닥 절단을 촉매하는, IIS 유형 제한 핵산내부가수분해효소 FokI 유래이다. 예를 들어, 문헌 [미국 특허 번호 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; Li 등, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li 등, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim 등, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim 등, (1994) J. Biol. Chem. 269: 978-982]을 참조한다. 일부 유전자 특이적으로 조작된 징크 핑거가 상업적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 수 천개의 표적에 대해 특이적으로 표적화된 징크 핑거를 제공하고, 징크 핑거 작제물에 대해 CompoZr로 명명되는 플랫폼이 이용 가능하다. 예를 들어, 문헌 [Gaj 등, Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405]을 참조한다. 일부 경우에, 상업적으로 이용 가능한 징크 핑거가 사용되거나 맞춤 설계된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 표적 부위(들), 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내에서, TRAC 및/또는 TRBC는 조작된 ZFN에 의한 유전자 파괴를 위해 표적화될 수 있다.
전사 활성화제 유사 이펙터(TALE)는 Xanthomonas 세균 종 유래 단백질이고, 다수의 반복 서열을 포함하며, 각각의 반복은 핵산 표적화 서열의 각 뉴클레오티드 염기에 특이적인 12 및 13 위치에서 2개의 잔기(RVD)를 포함한다. 유사한 모듈의 염기 당 염기 핵산 결합 특성을 가진 결합 도메인(MBBBD)은 상이한 세균 종으로부터 또한 유래될 수 있다. 새로운 모듈 단백질은 TAL 반복보다 더 많은 서열 가변성을 나타내는 장점이 있다. 일부 구현예에서, 상이한 뉴클레오티드 인식에 관련된 RVD는 C 인식을 위한 HD, T 인식을 위한 NG, A 인식을 위한 NI, G 또는 A 인식을 위한 NN, A, C, G 또는 T 인식을 위한 NS, T 인식을 위한 HG, T 인식을 위한 IG, G 인식을 위한 NK, C 인식을 위한 HA, C 인식을 위한 ND, C 인식을 위한 HI, G 인식을 위한 HN, G 인식을 위한 NA, G 또는 A 인식을 위한 SN 및 T 인식을 위한 YG, A 인식을 위한 TL, A 또는 G 인식을 위한 VT 및 A 인식을 위한 SW이다. 일부 구현예에서, 중요한 아미노산 12 및 13은 A, T, C 및 G 뉴클레오티드에 대한 특이성을 조절하고 특히 상기 특이성을 향상시키기 위해 다른 아미노산 잔기로 돌연변이될 수 있다.
일부 구현예에서, "TALE DNA 결합 도메인(TALE DNA binding domain)" 또는 "TALE"은 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함하는 폴리펩티드이다. 반복 가변 2잔기(repeat variable diresidue, RVD)를 각각 포함하는 반복 도메인은 코그니트(cognate) 표적 DNA 서열에 대한 TALE의 결합에 관여한다. 단일 "반복 단위(repeat unit)"("반복(repeat)"으로도 지칭)는 전형적으로 33-35 개의 아미노산 길이이며 자연적으로 발생하는 TALE 단백질 내 다른 TALE 반복 서열과 적어도 일부 서열 상동성을 나타낸다. TALE 단백질은 반복 단위 내에서 정규 또는 비정규 RVD를 사용하여 표적 부위에 결합하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [미국특허 제8,586,526호 및 제9,458,205호]을 참조한다.
일부 구현예에서, "TALE 핵산분해효소(TALE-nuclease)"(TALEN)은 전사 활성화제 유사 이펙터(TALE)로부터 전형적으로 유래된 핵산 결합 도메인 및 핵산 표적 서열을 절단하는 핵산분해효소 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 촉매 도메인은 예를 들어, I-TevI, ColE7, NucA 및 Fok-I과 같은 핵산내부가수분해효소 활성을 갖는 도메인 또는 핵산분해효소 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, TALE 도메인은 예를 들어, I-CreI 및 I-OnuI과 같은 메가핵산분해효소 또는 이의 기능적 변이체에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, TALEN은 단량체성 TALEN이다. 단량체성 TALEN은 문헌 [국제공개공보 제WO2012138927호]에 기재된 I-TevI의 촉매 도메인과 조작된 TAL 반복의 융합과 같이 특이적 인식 및 절단을 위해 이량체화가 필요없는 TALEN이다. TALEN은 유전자 표적화 및 유전자 변형을 위해 설명되었고 사용되었다(예를 들어, 문헌 [Boch 등, (2009) Science 326(5959): 1509-12.; Moscou and Bogdanove (2009) Science 326(5959): 1501; Christian 등, (2010) Genetics 186(2): 757-61; Li 등, (2011) Nucleic Acids Res 39(1): 359-72] 참조). 일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 하나 이상의 부위, TRAC 및/또는 TRBC는 조작된 TALEN에 의한 유전자 파괴를 위해 표적화될 수 있다.
일부 구현예에서, TRAC , TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자가 조작된 TALEN에 의한 유전자 파괴를 위해 표적화될 수 있다. 내인성 T 세포 수용체(TCR) 유전자를 표적화하는 예시적인 TALEN에는, 예를 들어, 문헌 [국제 출원 WO 2017/070429, WO 2015/136001, 미국 출원 US20170016025 및 US20150203817]에 기재된 것(이의 개시 전체가 참조로 포함됨)이 포함된다.
일부 구현예에서, "TtAgo"는 유전자 침묵에 관여하는 것으로 생각되는 원핵 생물 아르고누테(Argonaute) 단백질이다. TtAgo는 Thermus thermophilus 세균으로부터 유래된다. 예를 들어, 문헌 [Swarts 등, (2014) Nature 507(7491): 258-261; G. Sheng 등, (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 652]을 참조한다. "TtAgo 시스템(TtAgo system)"은 예를 들어, TtAgo 효소에 의해 절단하기 위한 가이드 DNA를 포함하여 필요한 모든 성분이다.
일부 구현예에서, 조작된 징크 핑거 단백질, TALE 단백질 또는 CRISPR/Cas 시스템은 자연에서 발견되지 않으며 이의 생산은 파지 디스플레이, 상호 작용 트랩 또는 하이브리드 선택과 같은 경험적 공정으로부터 주로 발생한다. 예를 들어, 문헌 [미국 특허 번호 5,789,538; 미국 특허 번호 5,925,523; 미국 특허 번호 6,007,988; 미국 특허 번호 6,013,453; 미국 특허 번호 6,200,759; 국제 출원 WO 95/19431; 국제 출원 WO 96/06166; 국제 출원 WO 98/53057; 국제 출원 WO 98/54311; 국제 출원 WO 00/27878; 국제 출원 WO 01/60970; 국제 출원 WO 01/88197 및 국제 출원 WO 02/099084]을 참조한다.
징크 핑거 및 TALE DNA 결합 도메인은, 예를 들어, 자연적으로 발생하는 징크 핑거 단백질의 인식 나선 영역의 조작(하나 이상의 아미노산 변경)을 통해 또는 DNA 결합에 관여하는(반복 가변 2잔기 또는 RVD 영역) 아미노산의 조작에 의해 미리 결정된 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 따라서, 조작된 징크 핑거 단백질 또는 TALE 단백질은 자연적으로 발생하지 않는 단백질이다. 징크 핑거 단백질 및 TALE 조작을 위한 비제한적인 방법의 예는 설계 및 선택이다. 설계된 단백질은 이의 설계/구성이 주로 합리적인 기준에서 발생하는 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 설계에 대한 합리적인 기준에는 기존 ZFP 또는 TALE 설계(정규 및 비정규 RVD) 및 결합 데이터의 정보를 저장하는 데이터베이스에서 정보를 처리하기 위한 대체 규칙 및 전산화된 알고리즘의 적용이 포함된다. 예를 들어, 문헌 [미국 특허 제9,458,205호; 제8,586,526호; 제6,140,081호; 제6,453,242호; 및 제6,534,261호; 또한 국제공개공보 제WO 98/53058호; 제WO 98/53059호; 제WO 98/53060호; 제WO 02/016536호 및 제WO 03/016496호]을 참조한다.
게놈 DNA의 표적화된 절단을 위한 다양한 방법 및 조성물이 기재되었다. 상기 표적화된 절단 이벤트는, 예를 들어, 표적화된 돌연변이 유발을 유도하고, 세포 DNA 서열의 표적화된 결실을 유도하고, 미리 결정된 염색체 유전자 좌에서 표적화된 재조합을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [미국특허 제9,255,250호; 제9,200,266호; 제9,045,763호; 제9,005,973호; 제9,150,847호; 제8,956,828호; 제8,945,868호; 제8,703,489호; 제8,586,526호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,503,717호; 제6,689,558호; 제7,067,317호; 제7,262,054호; 제7,888,121호; 제7,972,854호; 제7,914,796호; 제7,951,925호; 제8,110,379호; 제8,409,861호; 미국특허출원공개공보 제20030232410호; 제20050208489호; 제20050026157호; 제20050064474호; 제20060063231호; 제20080159996호; 제201000218264호; 제20120017290호; 제20110265198호; 제20130137104호; 제20130122591호; 제20130177983호; 제20130196373호; 제20140120622호; 제20150056705호; 제20150335708호; 제20160030477호 및 제20160024474호]을 참조한다(이의 개시 전체가 참조로 삽입됨).
a.
CRISPR
/
Cas9
일부 구현예에서, 인간의 경우 내인성 유전자 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC에서의 표적화된 유전자 파괴, 예를 들어, DNA 손상은 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드롬 반복(CRISPR) 및 CRISPR 결합(Cas) 단백질을 사용하여 수행된다. 문헌 [Sander and Joung, (2014) Nature Biotechnology, 32(4): 347-355]을 참조한다.
일반적으로, "CRISPR 시스템(CRISPR system)"은 Cas 유전자를 암호화하는 서열, tracr(트랜스 활성화(trans-activating) CRISPR) 서열(예를 들어, tracrRNA 또는 부분 활성 tracrRNA), tracr-메이트 서열("동향 반복(direct repeat)" 및 내인성 CRISPR 시스템의 상황에서 tracrRNA 프로세싱된 부분 동향 반복을 포괄), 가이드 서열(내인성 CRISPR 시스템 상황에서 "스페이서(spacer)"로도 지칭) 및/또는 CRISPR 유전자 좌의 다른 서열 및 전사물을 포함하여, CRISPR 결합("Cas") 유전자의 발현 또는 이의 활성을 지시하는데 관여하는 전사물 및 다른 요소를 총괄하여 지칭한다.
일부 측면에서, CRISPR/Cas 핵산분해효소 또는 CRISPR/Cas 핵산분해효소 시스템은 DNA에 서열 특이적으로 결합하는 비코딩 가이드 RNA(gRNA) 및 핵산분해효소 기능을 갖는 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)을 포함한다.
또한, 유전자 파괴를 도입할 수 있는 하나 이상의 제제가 제공된다. 또한, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 핵산 분자)가 제공된다.
(i) 가이드 RNA(
gRNA
)
일부 구현예에서, 유전자 파괴를 도입할 수 있는 하나 이상의 제제(들)는, T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC 또는 gRNA에서 표적 부위를 암호화하는 적어도 하나의 핵산과 상보적인 표적화 도메인을 갖는 가이드 RNA(gRNA) 중의 적어도 하나를 포함한다.
일부 측면에서,"gRNA 분자(gRNA molecule)"는 세포의 게놈 DNA 상의 유전자 좌와 같은 표적 핵산에 대해 gRNA 분자/Cas9 분자 복합체의 특이적 표적화 또는 귀소를 촉진하는 핵산에 관한 것이다. gRNA 분자는 단분자(단일 RNA 분자를 가짐)일 수 있고, 때로는 여기에서 "키메라(chimeric)" gRNA 또는 모듈식(하나 이상 및 전형적으로 두 개의, 분리된 RNA 분자를 포함)으로 지칭될 수 있다. 일반적으로, 가이드 서열, 예를 들어, 가이드 RNA는 인간의 경우 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC에서의 것과 같은 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 표적 부위의 표적 서열과 혼성화하고 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 지시하기에 충분한 상보성을 갖는 적어도 서열 일부를 포함하는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 구현예에서, CRISPR 복합체 형성의 정황에서, "표적 서열(target sequence)"은 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열이며, 여기서 표적 서열과 가이드 RNA의 도메인, 예를 들어, 표적화 도메인 사이의 혼성화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 혼성화를 유발하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 있다면 완전한 상보성이 반드시 필요한 것은 아니다. 일반적으로 가이드 서열 내에서 2 차 구조의 정도가 감소되도록 가이드 서열이 선택된다. 2 차 구조는 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 폴딩 알고리즘에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 관심 표적 유전자 좌(예를 들어, 인간에서 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC에서)에 특이적인 가이드 RNA(gRNA)가 RNA 가이드 핵산분해효소, 예를 들어, Cas에 대해 사용되어 표적 부위 또는 표적 위치에서 DNA 파손을 유도한다. gRNA 및 예시적인 표적화 도메인을 설계하는 방법은 예를 들어, 문헌 [국제공개공보 제WO2015/161276호, 제WO2017/193107호 및 제WO2017/093969호]에 기재된 것들을 포함할 수 있다.
그 위에 표시된 도메인과 함께 몇몇 예시적인 gRNA 구조가 문헌 [국제공개공보 제WO2015/161276호, 예를 들어, 그의 도 1A-1G]에 기재되어 있다. gRNA 활성 형태의 3차원 구조 또는 가닥 내 또는 가닥 간 상호 작용에 관하여 이론에 구속되길 바라지 않으면서, 높은 상보성 영역은 때로 국제공개공보 제WO2015/161276호, 예를 들어, 그의 도 1A-1G 및 여기 제공된 다른 도면에서 이중 영역(duplexes)으로 표시된다.
일부 경우에, gRNA는 5'에서 3' 방향으로: 표적 핵산에 상보적인 표적화 도메인, 예컨대 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC 유전자로부터의 서열; 제 1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제 2 상보성 도메인(제 1 상보성 도메인에 상보적인); 근위 도메인; 및 선택적으로, 꼬리 도메인을 포함하는 단분자 또는 키메라 gRNA이다.
일부 경우에, gRNA는 제 1 및 제 2 가닥을 포함하는 모듈 gRNA이다. 이들 경우에, 제 1 가닥은 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로: 표적화 도메인 (표적 핵산에 상보적인, 예컨대 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC 유전자로부터의 서열) 및 제 1 상보성 도메인을 포함한다. 제 2 가닥은 일반적으로 5'에서 3' 방향으로: 선택적으로, 5' 연장 도메인; 제 2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 선택적으로, 꼬리 도메인을 포함한다.
(a)
표적화
도메인
표적화 도메인은 표적 핵산 상의 표적 서열에 대해 상보적, 예를 들어, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 이상 상보적, 예를 들어, 완전히 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 표적 서열을 포함하는 표적 핵산의 가닥은 여기에서 표적 핵산의 "상보적 가닥"으로 지칭된다. 표적화 도메인 선택에 대한 지침은, 예를 들어, 문헌 [Fu 등, Nat Biotechnol 2014 Mar;32(3):279-284] 및 [Sternberg 등, Nature 2014, 507:62-67]에서 찾을 수 있다. 표적화 도메인의 배치의 예는 국제공개공보 제WO2015/161276호, 예를 들어, 그의 도 1A-1G에 도시된 것들을 포함한다.
표적화 도메인은 RNA 분자의 일부이며, 따라서 우라실 염기(U)을 포함하게 되는 반면, gRNA 분자를 암호화하는 임의의 DNA는 티민 염기(T)을 포함할 것이다. 이론에 구속되길 바라지 않으면서, 일부 구현예에서, 표적 서열을 가진 표적화 도메인의 상보성은 표적 핵산을 가진 gRNA 분자/Cas9 분자 복합체의 상호작용의 특이성에 기여하는 것으로 여겨진다. 표적화 도메인 및 표적 서열 쌍에서, 표적화 도메인의 우라실 염기는 표적 서열의 아데닌 염기와 쌍을 이룰 것임이 이해된다. 일부 구현예에서, 표적 도메인 자체는 5'에서 3' 방향으로, 선택적인 제 2 도메인 및 코어 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 코어 도메인은 표적 서열과 완전히 상보적이다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 5 내지 50개의 뉴클레오티드 길이이다. 표적화 도메인이 상보적인 표적 핵산의 가닥은 여기에서 상보적 가닥으로 지칭된다. 도메인의 전부 또는 일부 뉴클레오티드는, 예를 들어, 분해에 덜 취약하게 되고 생체 적합성을 개선시키는 등의 변경을 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, 표적 도메인의 백본(backbone)은 포스포로티오에이트로 변경되거나 다른 변경(들)을 가질 수 있다. 일부 경우에, 표적화 도메인의 뉴클레오티드는 2' 변경, 예를 들어, 2-아세틸화, 예를 들어, 2' 메틸화 또는 기타 변경(들)을 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 표적화 도메인은 16-26 개의 뉴클레오티드 길이(즉, 16 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 17 개의 뉴클레오티드 길이 또는 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26 개의 뉴클레오티드 길이)이다.
(b) 예시적인
표적화
도메인
일부 구현예에서, 특정 유전자, 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC에서 표적 부위를 표적화하는 표적화 도메인 서열이거나 이를 포함하는 gRNA 서열이 설계되거나 식별된다. CRISPR 게놈 편집을 위한 게놈-와이드 gRNA 데이터베이스는 공개적으로 이용가능하고, 이는 인간 게놈 또는 마우스 게놈에서 유전자의 구성적 엑손을 표적화하는 예시적인 단일 가이드 RNA(sgRNA) 서열을 함유한다(예를 들어, 인터넷 주소 Genescript.com/gRNA-database.html; 또한 문헌 [Sanjana 등, (2014) Nat. Methods, 11:783-4] 참조). 일부 측면에서, gRNA 서열은 비-표적 부위 또는 위치에 최소의 오프-타겟 결합을 갖는 서열이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 표적 서열(표적 도메인)은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC, 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC의 임의의 부분에 또는 그 근처에 있다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인에 상보적인 표적 핵산은 관심 유전자, 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC의 초기 암호화 영역에 위치한다. 초기 암호화 영역의 표적화는 관심 유전자의 유전자 파괴(즉, 발현의 제거) 에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 관심 유전자의 초기 암호화 영역은 시작 코돈(예를 들어, ATG) 바로 다음의 서열, 또는 시작 코돈의 500 bp 이내(예를 들어, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50 bp, 40bp, 30bp, 20bp, 또는 10bp 미만)의 서열을 포함한다. 특정 예에서, 표적 핵산은 시작 코돈의 200bp, 150bp, 100bp, 50bp, 40bp, 30bp, 20bp 또는 10bp 이내이다. 일부 예에서, gRNA의 표적화 도메인은 표적 핵산 상의 표적 서열, 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC에서 표적 핵산에 상보적이고, 예를 들어, 적어도 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 상보적이고, 예를 들어, 충분히 상보적이다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC의 내인성 전사 조절 요소, 예를 들어, 프로모터의 하류 및/또는 근처에 위치한다.
일부 구현예에서, gRNA는, 예를 들어, 재조합 수용체를 암호화하는, 전이 유전자의 표적화된 통합의 원하는 부위 근처의 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC의 부위를 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, gRNA는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC의 조절과 유사한 방식, 시간 및 정도로, 재조합 수용체의 발현의 조절에 바람직한 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC를 암호화하는 서열의 양에 기초하여 부위를 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, gRNA는 재조합 수용체를 발현하는 세포에서 발현에 바람직한 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC를 암호화하는 서열의 양에 기초하여 부위를 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, gRNA는, 예를 들어, 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자의 통합시, 생성된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC가 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC에 의해 암호화된 내인성 유전자 생성물의 발현을 유지하도록 부위를 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, 내인성 유전자 생성물은 gRNA에 의한 표적화 및 후속 HDR 후 발현되지 않는다(예를 들어, 녹 아웃됨). 일부 측면에서, gRNA는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC의 오픈 리딩 프레임의 엑손 내의 부위를 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, gRNA는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC의 오픈 리딩 프레임의 인트론 내의 부위를 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, gRNA는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC의 조절 또는 제어 요소, 예를 들어, 프로모터 내의 또는 하류의 부위를 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, gRNA에 의해 표적화되는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC의 표적 부위는 본원, 예를 들어, 섹션 II.A.1에 기재된 임의의 표적 부위일 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA는 초기 암호화 영역에 상응하는 엑손 내의 또는 엑손에 매우 근접한 부위, 예를 들어, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1, 2, 3, 4 또는 5를 표적화할 수 있거나, 또는 엑손 1, 2, 3, 4 또는 5 내의, 또는 엑손 1, 2, 3, 4 또는 5의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만 내의 전사 시작 부위 바로 다음 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC의 엑손 2 또는 그 근처의 부위, 또는 엑손 2의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만 내의 부위를 표적화할 수 있다.
T 세포 자극-연관된 유전자 좌 PDCD1에 대한 예시적인 표적 서열은 서열번호 74, 78 또는 98-103에 제시된 서열을 포함한다. 예시적인 gRNA는 서열번호 74, 78 또는 98-103에 제시된 표적 부위 서열에 결합할 수 있거나 또는 그에 상보적이거나 또는 그에 결합할 수 있는 리보핵산의 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 PDCD1 gRNA 서열은 서열번호 75 또는 104-109에 제시된 서열을 포함한다. 예시적인 PDCD1 gRNA 서열은 서열번호 75에 제시된 서열을 포함한다. 임의의 공지된 방법을 사용하여 내인성 PDCD1의 유전자 파괴를 표적화하고 생성할 수 있는 것은 본원에서 제공된 구현예에서 사용될 수 있다. 인간 PDCD1 유전자 좌의 유전자 파괴를 표적화하기 위한 gRNA 내에 함유된 예시적인 표적 서열 또는 표적화 도메인은 예를 들어, 국제공개공보 제WO2015/161276호, 제WO2017/093969, 문헌 [Schumann 등, PNAS August 18, 2015 112 (33) 10437-10442], 및 [Xu 등, Sci Rep. 2018; 8: 11649]에 기재된 것을 포함하며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
예시적인 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 CD69에 대한 예시적인 표적 서열은 서열번호 110-115에 제시된 서열을 포함한다. 예시적인 gRNA는 서열번호 110-115에 제시된 표적 부위 서열에 결합할 수 있거나 또는 그에 상보적이거나 또는 그에 결합할 수 있는 리보핵산의 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 CD69 gRNA 서열은 서열번호 116-121에 제시된 서열을 포함한다. 임의의 공지된 방법을 사용하여 내인성 CD69의 유전자 파괴를 표적화하고 생성할 수 있는 것은 본원에서 제공된 구현예에서 사용될 수 있다. 인간 CD69 유전자 좌의 유전자 파괴를 표적화하기 위한 gRNA 내에 함유된 예시적인 표적 서열 또는 표적화 도메인은 예를 들어, 문헌 [Simenov 등, Nature. 2017 Sep 7; 549(7670): 111-115]에 기재된 것들을 포함하며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
예시적인 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 Nur77(NR4A1)에 대한 예시적인 표적 서열은 서열번호 122-127 또는 134-136에 제시된 서열을 포함한다. 예시적인 gRNA는 서열번호 122-127 또는 134-136에 기재된 표적 부위 서열의 상보적인 가닥 서열(complimentary strand sequence)에 결합하거나 표적화하거나 보완적이거나 결합할 수 있는 리보핵산 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 Nur77 ( NR4A1 ) gRNA 서열은 서열번호 128-133 또는 136-138에 제시된 서열을 포함한다. 임의의 공지된 방법을 사용하여 내인성 Nur77(NR4A1)의 유전자 파괴를 표적화하고 생성할 수 있는 것은 본원에서 제공된 구현예에서 사용될 수 있다. 인간 Nur77 ( NR4A1 ) 유전자 좌의 유전자 파괴를 표적화하기 위한 gRNA 내에 함유된 예시적인 표적 서열 또는 표적화 도메인은 예를 들어, 국제공개공보 제WO 2019/089982호, 제WO 2019/104245호 및 문헌 [Munnur 등, Cell Reports (2019) 26, 2028-2036]에 기재된 것을 포함하며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
예시적인 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 FoxP3에 대한 예시적인 표적 서열은 서열번호 140-147에 제시된 서열을 포함한다. 예시적인 gRNA는 서열번호 140-147에 제시된 표적 부위 서열의 상보적인 가닥 서열에 결합하거나 그에 상보적이거나 그에 결합할 수 있는 리보핵산의 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 FoxP3 gRNA 서열은 서열번호 148-155에 제시된 서열을 포함한다. 임의의 공지된 방법을 사용하여 내인성 FoxP3의 유전자 파괴를 표적화하고 생성할 수 있는 것이 본원에서 제공된 구현예에서 사용될 수 있다. 인간 FoxP3 유전자 좌의 유전자 파괴를 표적화하기 위해 gRNA 내에 함유된 예시적인 표적 서열 또는 표적화 도메인은 예를 들어, 문헌 [Okada 등, Epigenetics Chromatin. 2017; 10: 24] 및 [Holohan 등, bioRxiv 644229]에 기재된 것들을 포함하며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
예시적인 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 HLA-DRA에 대한 예시적인 표적 서열은 서열번호 156-161에 제시된 서열을 포함한다. 예시적인 gRNA는 서열번호 156-161에 제시된 표적 부위 서열의 상보적인 가닥 서열에 결합하거나 이에 상보적이거나 이에 결합할 수 있는 리보핵산의 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 HLA-DRA gRNA 서열은 서열번호 162-167에 제시된 서열을 포함한다. 임의의 공지된 방법을 사용하여 내인성 HLA-DRA의 유전자 파괴를 표적화하고 생성할 수 있는 것이 본원에서 제공된 구현예에서 사용될 수 있다. 인간 HLA-DRA 유전자 좌의 유전자 파괴를 표적화하기 위해 gRNA 내에 함유된 예시적인 표적 서열 또는 표적화 도메인은 예를 들어, 국제공개공보 제WO 2016/021972호 및 제WO 2017/093969호에 기재된 것들을 포함하며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
예시적인 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 HLA-DRB1에 대한 예시적인 표적 서열은 서열번호 168-177에 제시된 서열을 포함한다. 예시적인 gRNA는 서열번호 168-177에 제시된 표적 부위 서열의 상보적인 가닥 서열에 결합하거나 그에 상보적이거나 그에 결합할 수 있는 리보핵산의 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 HLA-DRB1 gRNA 서열은 서열번호 178-187에 제시된 서열을 포함한다. 임의의 공지된 방법을 사용하여 내인성 HLA-DRB1의 유전자 파괴를 표적화하고 생성할 수 있는 것이 본원에서 제공된 구현예에서 사용될 수 있다. 인간 HLA-DRB1 유전자 좌의 유전자 파괴를 표적화하기 위해 gRNA 내에 함유된 예시적인 표적 서열 또는 표적화 도메인은 예를 들어, 국제공개공보 제WO 2016/021972호 및 제WO 2017/093969호에 기재된 것들을 포함하며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
인간 TRAC , TRBC1 또는 TRBC2의 유전자 파괴를 표적화하기 위한 gRNA 내에 함유된 예시적인 표적화 도메인은, 예를 들어, 문헌 [국제공개공보 제WO2015/161276호, 제WO2017/193107호, 제WO2017/093969호, 제WO 2019/195492호, 미국 출원 제US2016/272999호 및 제US2015/056705호]에 기재된 것들 또는 상기에 기재된 표적화 서열에 결합할 수 있는 표적화 도메인을 포함한다. 에스 . 피오게네스(S. pyogenes) 또는 에스 . 아우레우스(S. aureus) Cas9를 사용한 인간 TRAC 유전자 좌의 유전자 파괴를 표적화하기 위한 gRNA 내에 함유된 예시적인 표적화 도메인은 서열번호 77 및 188-218에 제시된 것들 중 임의의 것을 포함할 수 있다. S. pyogenes 또는 S. aureus Cas9을 이용하여 인간 TRBC1 또는 TRBC2 유전자 좌의 유전자 파괴를 표적화하기 위한 gRNA 내에 함유된 예시적인 표적화 도메인은 서열번호 219-276에 제시된 것들 중의 어느 하나를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, TRAC , TRBC1 및/또는 TRBC2를 표적화하기 위한 gRNA는 여기에 기재되거나, 예를 들어, 다른 곳 문헌 [국제공개공보 제WO2015/161276호, 제WO2017/193107호, 제WO2017/093969호, 제WO2019/195492호, 미국특허출원공개공보 제US2016/272999호 및 제US2015/056705호]에 기재된 어느 하나 또는 상기에 기재된 표적화 서열에 결합할 수 있는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자의 유전자 좌를 표적화하기 위한 gRNA는 AGCGCTCTCGTACAGAGTTGGCATTATAATACGACTCACTATAGGG GAGAATCAAAATCGGTGAAT GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(서열번호 277에 제시; 굵고 밑줄친 부분은 TRAC 유전자 좌의 표적 부위에 상보적) 서열의 시험관 내 전사에 의해 수득되거나 화학적으로 합성될 수 있고, 여기서 상기 gRNA는 5'- GAG AAU CAA AAU CGG UGA AU G UUU UAG AGC UAG AAA UAG CAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGU UAU CAA CUU GAA AAA GUG GCA CCG AGU CGG UGC UUU U -3'(서열번호 278에 제시; 문헌 [Osborn 등, Mol Ther. 24(3):570-581 (2016)] 참조) 서열을 갖는다. TCR 도메인 또는 영역, 예를 들어, TRAC , TRBC1 및/또는 TRBC2를 암호화하는 내인성 유전자의 유전자 파괴를 생성하기 위한 다른 예시적인 gRNA 서열은, 예를 들어, 문헌 [PCT 국제 출원 공개 번호 제WO2015/161276호, 제WO2017/193107호, 제WO2017/093969호, 제WO2019/195492호, 제US2016/272999호 및 제US2015/056705호]에 기재되어 있다.
내인성 TCR 유전자 좌의 유전자 편집을 위한 예시적인 방법에는, 예를 들어, 문헌 [미국 출원 공개 번호 US2011/0158957, US2014/0301990, US2015/0098954,US2016/0208243; US2016/272999 및 US2015/056705; PCT 국제 출원 공개 번호 WO2014/191128, WO2015/136001, WO2015/161276, WO2016/069283, WO2016/016341, WO2017/193107, 및 WO2017/093969; 및 Osborn 등, (2016) Mol. Ther. 24(3):570-581]에 기재된 것들이 포함된다. TCR 도메인 또는 영역을 암호화하는 내인성 유전자의 유전자 파괴를 생성하기 위해 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있고 여기에 제공된 구현예에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 표적화 도메인은 S. pyogenes Cas9를 사용하거나 N. meningitidis Cas9를 사용하여 TRAC , TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌에서 유전자 파괴를 도입하기 위한 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 S. pyogenes Cas9를 사용하여 TRAC , TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌에서 유전자 파괴를 도입하기 위한 것을 포함한다. 임의의 표적화 도메인은 이중-가닥 절단(Cas9 핵산분해효소) 또는 단일-가닥 절단(Cas9 틈내기효소(nickase))를 생성하는 S. pyogenes Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 이중 표적화가 사용되어 맞은편 DNA 가닥에 상보적인 2개의 표적화 도메인을 갖는 S. pyogenes Cas9 틈내기효소를 사용함으로써 맞은편 DNA 가닥 상에 2개의 닉을 형성한다(예를 들어, 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 쌍을 이룰 수 있다). 일부 구현예에서, 2개의 gRNA는 PAM이 바깥쪽으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0-50bp이도록 DNA 상에 배향된다. 일부 구현예에서, 2개의 gRNA가, 예를 들어, 표적 도메인의 맞은편 가닥 상에 2개의 단일 가닥 파손을 가진 표적 도메인을 절단하기 위하여 2개의 상이한 gRNA 분자에 의해 가이드된 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체의 쌍을 사용하여 2개의 Cas9 핵산분해효소 또는 2개의 Cas9 틈내기효소를 표적화하도록 사용된다. 일부 구현예에서, 2개의 Cas9 틈내기효소는 HNH 활성을 갖는 분자, 예를 들어, 비활성화된 RuvC 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어, D10, 예를 들어, D10A 돌연변이를 갖는 Cas9 분자, RuvC 활성을 갖는 분자, 예를 들어, 비활성화된 HNH 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어, H840, 예를 들어, H840A에서 돌연변이를 갖는 Cas9 분자 또는 RuvC 활성을 갖는 분자, 예를 들어, 비활성화된 HNH 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어, N863, 예를 들어, N863A에서 돌연변이를 갖는 Cas9 분자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 gRNA 각각은 D10A Cas9 틈내기효소와 복합체를 이룬다.
일부 구현예에서, 표적 서열 (표적 도메인)은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC , TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌, 예를 들어, 예를 들어, 본원의 표 1-9에 기재된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC , TRBC1 및/또는 TRBC2 암호화 서열의 임의의 부분에 있거나 그 근처에 있다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인에 상보적인 표적 핵산은 관심 유전자의 초기 암호화 영역, 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC , TRBC1 및/또는 TRBC2에 위치한다. 초기 암호화 영역의 표적화는 관심 유전자의 유전자 파괴(즉, 발현의 제거)를 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 관심 유전자의 초기 암호화 영역은 시작 코돈(예를 들어, ATG) 바로 뒤의 서열, 또는 시작 코돈의 500 bp 이내(예를 들어, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 20 bp, 또는 10 bp 미만)를 포함한다. 특정 구체예에서, 표적 핵산은 시작 코돈의 200 bp, 150 bp, 100 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 20 bp 또는 10 bp 이내이다. 일부 예에서, gRNA의 표적화 도메인은 표적 핵산, 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC , TRBC1 및/또는 TRBC2 내의 표적 핵산 상의 표적 서열에 상보적인, 예를 들어, 적어도 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 상보적인, 예를 들어, 완전히 상보적이다.
일부 측면에서, gRNA는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC , TRBC1 및/또는 TRBC2의 오픈 리딩 프레임의 엑손 내의 부위를 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, gRNA는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC , TRBC1 및/또는 TRBC2의 오픈 리딩 프레임의 인트론 내의 부위를 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, gRNA는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC , TRBC1 및/또는 TRBC2의 조절 또는 제어 요소, 예를 들어, 프로모터 내의 부위를 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, gRNA에 의해 표적화되는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC , TRBC1 및/또는 TRBC2에서의 표적 부위는 본원, 예를 들어, 섹션 II.A.1에 기재된 임의의 표적 부위일 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA는 초기 암호화 영역에 상응하는 엑손 내 또는 엑손에 매우 근접한 부위, 예를 들어, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC , TRBC1 및/또는 TRBC2의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1, 2 또는 3 내의, 또는 엑손 1, 2 또는 3 내, 또는 엑손 1, 2 또는 3의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만 내의, 전사 시작 부위 바로 다음 서열을 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC , TRBC1 및/또는 TRBC2의 엑손 2 또는 그 근처의 부위, 또는 엑손 2의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만 내의 부위를 표적화할 수 있다.
일부 구현예에서, 표적화 도메인은 S. pyogenes Cas9를 사용하거나 N. meningitidis Cas를 사용하여 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC 유전자에서 유전자 파괴를 도입하기 위한 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 S. pyogenes Cas9를 사용하여 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC 유전자에서 유전자 파괴를 도입하기 위한 것들을 포함한다. 임의의 표적화 도메인은 이중-가닥 절단(Cas9 핵산분해효소) 또는 단일-가닥 절단(Cas9 틈내기효소)를 생성하는 S. pyogenes Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 이중 표적화가 사용되어 맞은편 DNA 가닥에 상보적인 2개의 표적화 도메인을 갖는 S. pyogenes Cas9 틈내기효소를 사용함으로써 맞은편 DNA 가닥 상에 2개의 닉을 형성한다(예를 들어, 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 쌍을 이룰 수 있다). 일부 구현예에서, 2개의 gRNA는 PAM이 바깥쪽으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0-50bp이도록 DNA 상에 배향된다. 일부 구현예에서, 2개의 gRNA가, 예를 들어, 표적 도메인의 맞은편 가닥 상에 2개의 단일 가닥 파손을 가진 표적 도메인을 절단하기 위하여 2개의 상이한 gRNA 분자에 의해 가이드된 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체의 쌍을 사용하여 2개의 Cas9 핵산분해효소 또는 2개의 Cas9 틈내기효소를 표적화하도록 사용된다. 일부 구현예에서, 2개의 Cas9 틈내기효소는 HNH 활성을 갖는 분자, 예를 들어, 비활성화된 RuvC 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어, D10, 예를 들어, D10A 돌연변이를 갖는 Cas9 분자, RuvC 활성을 갖는 분자, 예를 들어, 비활성화된 HNH 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어, H840, 예를 들어, H840A에서 돌연변이를 갖는 Cas9 분자 또는 RuvC 활성을 갖는 분자, 예를 들어, 비활성화된 HNH 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어, N863, 예를 들어, N863A에서 돌연변이를 갖는 Cas9 분자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 gRNA 각각은 D10A Cas9 틈내기효소와 복합체를 이룬다.
gRNA의 다른 도메인, 예컨대 상보성 도메인, 연결 도메인, 5' 연장 도메인, 근위 도메인 및 꼬리 도메인, 및 이들의 구조는 예를 들어, 국제공개공보 제WO2015/161276호, 예를 들어, 상기 공보의 도 1A-1G에 기재되어 있다.
표적화 도메인을 선택, 설계 및 유효성을 검사하는 방법을 포함하여, gRNA를 설계하는 방법이 여기에 기재되어 있다. 예시적인 표적화 도메인도 여기에 제공된다. 여기에 논의된 표적화 도메인은 여기 기재된 gRNA로 통합될 수 있다.
표적 서열의 선택 및 유효성 검사를 위한 방법 및 표적 외 분석이, 예를 들어, 문헌 [Mali 등, 2013 Science 339 (6121): 823-826; Hsu 등, Nat Biotechnol, 31(9): 827-32; Fu 등, Nat Biotechnol 2014 Mar;32(3):279-284; Heigwer 등, 2014 Nat Methods 11(2):122-3; Bae 등, Bioinformatics. 2014 May 15;30(10):1473-5; Xiao A 등, Bioinformatics. 2014 Apr 15;30(8):1180-1182]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 소프트웨어 툴이 사용되어 예를 들어, 게놈에 걸쳐 총 표적 외 활성을 최소화하기 위해 사용자의 표적 서열 내에서 gRNA의 선택을 최적화할 수 있다. 절단이 아닌 표적 외 활성이 있을 수 있다. 예를 들어, S. pyogenes Cas9를 사용한 각각의 가능한 gRNA 선택에 대해, 소프트웨어 툴이 최대 특정 수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)의 잘못 짝지어진 염기쌍을 함유하는 게놈에 걸쳐 모든 가능한 표적 외 서열(NAG 또는 NGG PAM 앞)을 확인할 수 있다. 각 표적 외 서열에서 절단 효율이 예를 들어, 실험적으로 유래된 가중치 체계를 사용하여 예측될 수 있다. 이후 각 가능한 gRNA는 이의 총 예측 표적 외 절단에 따라 순위가 매겨질 수 있고; 최상위 gRNA는 가장 큰 표적 상 및 최소한의 표적 외 절단을 가질 가능성의 것들을 나타낸다. 다른 기능, 예를 들어, gRNA 벡터 작제를 위한 자동화된 시약 설계, 표적 상 측량자 분석을 위한 프라이머 설계, 차세대 염기 서열 분석을 통한 표적 외 절단의 고처리량 검출 및 정량화를 위한 프라이머 설계도 툴에 포함될 수 있다. 후보 gRNA 분자는 여기에 기재된 바와 같은 또는 당업계에 공지된 방법으로 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, S. pyogenes, S. aureus 및 N. meningitidis Cas9와 함께 사용하기 위한 gRNA는 DNA 서열 검색 알고리즘, 예를 들어, 공개 툴인 cas-offinder(Bae 등, Bioinformatics. 2014; 30(10): 1473-1475)를 기반으로 한 사용자 지정 gRNA 설계 소프트웨어를 사용하여 확인된다. 사용자 지정 gRNA 설계 소프트웨어 점수는 게놈 전체 표적 외 성향을 계산한 후 안내한다. 전형적으로, 완벽한 매치에서 7개의 미스매치 범위의 매치가 17 내지 24개의 길이 범위 가이드로 간주된다. 일부 측면에서, 표적 외 부위가 계산으로 결정되면, 각 가이드에 대해 집계 점수가 계산되고 웹 인터페이스를 사용하여 표로 정리한 출력물로 요약된다. PAM 서열에 인접한 잠재적 gRNA 부위를 확인하는 것 외에도, 소프트웨어는 또한 선택된 gRNA 부위와 1, 2, 3 이상의 뉴클레오티드 차이로 상이한 모든 PAM 인접 서열을 확인할 수 있다. 일부 구현예에서, 각 유전자에 대한 게놈 DNA 서열은 UCSC 게놈 브라우저로부터 수득되며 서열은 공개적으로 이용 가능한 RepeatMasker 프로그램을 사용하여 반복 요소에 대해 선별될 수 있다. RepeatMasker는 반복 요소 및 복잡성이 낮은 영역에 대해 입력 DNA 서열을 검색한다. 결과는 주어진 의문의 서열에 존재하는 반복의 상세한 주석이다.
확인 후, gRNA는 표적 부위까지의 거리, 이의 직교성 및 5' G의 존재(관련된 PAM, 예를 들어, S. pyogenes의 경우 NGG PAM 및 S. aureus의 경우 NNGRR(예를 들어, NNGRRT 또는 NNGRRV) PAM 및 N. meningtidis의 경우 NNNNGATT 또는 NNNNGCTT PAM을 함유하는 인간 게놈 중 가까운 매치의 확인에 기초) 중 하나 이상에 기초하여 층으로 순위가 매겨질 수 있다. 직교성은 표적 서열에 대한 최소 수의 미스매치를 함유하는 인간 게놈의 서열 수를 지칭한다. "높은 수준의 직교성(high level of orthogonality)" 또는 "좋은 직교성(good orthogonality)"은 예를 들어, 의도된 표적 외에 인간 게놈의 동일한 서열을 갖지 않거나 또는 표적 서열에서 하나 또는 두 개의 미스매치를 함유하는 임의의 서열을 갖지도 않는 20-mer 표적화 도메인을 지칭할 수 있다. 좋은 직교성을 가진 표적화 도메인이 선택되어 표적 외 DNA 절단을 최소화한다. 상기는 비제한적인 예이며, 다양한 전략이 S. pyogenes , S. aureus 및 N. meningitidis 또는 기타 Cas9 효소와 함께 사용하기 위해 gRNA를 확인하는데 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.
일부 구현예에서, S. pyogenes Cas9와 함께 사용하기 위한 gRNA는 공개적으로 이용 가능한 웹 기반 ZiFiT 서버(Fu 등, Nat Biotechnol 2014 Mar;32(3):279-284, 최초 참조를 위해 문헌 [Sander 등, 2007, NAR 35:W599-605; Sander 등, 2010, NAR 38: W462-8]을 참조)를 사용하여 확인될 수 있다. PAM 서열에 인접한 잠재적 gRNA 부위를 확인하는 것 외에도, 소프트웨어는 또한 선택된 gRNA 부위와 1, 2, 3 이상의 뉴클레오티드 차이로 상이한 모든 PAM 인접 서열을 확인한다. 일부 측면에서, 각 유전자에 대한 게놈 DNA 서열은 UCSC 게놈 브라우저로부터 수득될 수 있고 서열은 공개적으로 이용 가능한 RepeatMasker 프로그램을 사용하여 반복 요소에 대해 선별될 수 있다. RepeatMasker는 반복 요소 및 복잡성이 낮은 영역에 대해 입력 DNA 서열을 검색한다. 결과는 주어진 의문의 서열에 존재하는 반복의 상세한 주석이다.
(ii)
Cas9
다양한 종의 Cas9 분자가 여기에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. S. pyogenes , S. aureus , N. meningitidis 및 S. thermophilus Cas9 분자가 여기에서 많은 개시의 주제이지만, 여기에 열거된 다른 종의 Cas9 단백질에 기초하거나 이로부터 유래되거나 이의 Cas9 분자 역시 사용될 수 있다. 즉, 여기에서 다수의 기재가 S. pyogenes , S. aureus , N. meningitidis 및 S. thermophilus Cas9 분자를 사용하나, 다른 종 유래 Cas9 분자가 이를 대체할 수 있다. 상기 종에는 Acidovorax avenae , Actinobacillus pleuropneumoniae , Actinobacillus succinogenes, Actinobacillus suis , Actinomyces sp ., Cycliphilusdenitrificans , Aminomonas paucivorans , Bacillus cereus , Bacillus smithii , Bacillus thuringiensis, Bacteroides sp ., Blastopirellula marina, Bradyrhizobium sp ., Brevibacillus laterosporus , Campylobacter coli , Campylobacter jejuni , Campylobacter lari , Candidatus puniceispirillum , Clostridium cellulolyticum , Clostridium perfringens , Corynebacterium accolens , Corynebacterium diphtheria, Corynebacterium matruchotii , Dinoroseobacter shibae , Eubacterium dolichum, Gammaproteobacterium , Gluconacetobacter diazotrophicus , Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus sputorum , Helicobacter canadensis , Helicobacter cinaedi, Helicobacter mustelae , Ilyobacter polytropus , Kingella kingae , Lactobacillus crispatus , Listeria ivanovii , Listeria monocytogenes , Listeriaceae bacterium, Methylocystis sp ., Methylosinus trichosporium , Mobiluncus mulieris , Neisseria bacilliformis , Neisseria cinerea , Neisseria flavescens, Neisseria lactamica , Neisseria meningitidis , Neisseria sp ., Neisseria wadsworthii , Nitrosomonas sp ., Parvibaculum lavamentivorans , Pasteurella multocida , Phascolarctobacterium succinatutens , Ralstonia syzygii, Rhodopseudomonas palustris , Rhodovulum sp ., Simonsiella muelleri , Sphingomonas sp ., Sporolactobacillus vineae , Staphylococcus aureus , Staphylococcus lugdunensis , Streptococcus sp ., Subdoligranulum sp ., Tistrella mobilis, Treponema sp . 또는 Verminephrobacter eiseniae가 포함된다. Cas9 분자의 예에는 예를 들어, 문헌 [국제공개공보 제WO2015/161276호, 제WO2017/193107호, 제WO2017/093969호, 미국특허출원공개공보 제US2016/272999호 및 제US2015/056705호]에 기재된 것들이 포함될 수 있다.
여기에서 사용된 바와 같은 용어, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 gRNA 분자와 상호작용할 수 있고, 표적 도메인 및 PAM 서열을 포함하는 부위로 gRNA 분자와 함께 귀소 또는 국소화하는 분자 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 여기에서 사용된 바와 같은 용어, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 자연적으로 발생하는 Cas9 분자를 지칭하고, 참조 서열 예를 들어, 가장 유사한 자연적으로 발생하는 Cas9 분자와 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 조작된, 변경된 또는 변형된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드를 지칭한다.
2개의 상이한 자연적으로 발생하는 세균의 Cas9 분자(Jinek 등, Science, 343(6176):1247997, 2014) 및 가이드 RNA를 갖는 S. pyogenes Cas9(예를 들어, crRNA 및 tracrRNA의 합성 융합)(Nishimasu 등, Cell, 156:935-949, 2014; 및 Anders 등, Nature, 2014, Sep 25;513(7519):569-73)에 대한 결정 구조가 결정되었다.
예시적인 Cas9 분자, 이들의 구조 및 변이체는, 예를 들어, 국제공개공보 제WO2015/161276호 예를 들어, 상기 공보의 도 2A-2G 및 8A-8B, 및 국제공개공보 제WO2017/193107호, 제WO2017/093969호, 미국특허출원공개공보 제US2016/272999호 및 제US2015/056705호에 기재된 것들을 포함한다.
Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드, 예를 들어, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 여기에 제공된 임의의 구현예와 관련하여 사용될 수 있다.
Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드를 암호화하는 예시적인 핵산은 문헌 [Cong 등, Science 2013, 399(6121):819-823; Wang 등, Cell 2013, 153(4):910-918; Mali 등, Science 2013, 399(6121):823-826; Jinek 등, Science 2012, 337(6096):816-821 및 WO2015/161276, 예를 들어, 그안의 도 8]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 합성 핵산 서열일 수 있다. 예를 들어, 합성 핵산 분자는 화학적으로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 mRNA는 캡핑, 폴리아데닐화, 5-메틸시티딘 및/또는 슈도유리딘으로의 치환 중 하나 이상의(예를 들어, 모두) 특징을 갖는다. 또한 또는 대안적으로, 합성 핵산 서열은 코돈 최적화될 수 있으며, 예를 들어, 하나 이상의 비일반적인 코돈 또는 덜 일반적인 코돈이 일반적인 코돈으로 대체되었다. 예를 들어, 합성 핵산은 최적화된 메신저 mRNA, 예를 들어, 포유류 발현 시스템에서의 발현에 최적화된, 예를 들어, 여기에 기재된 합성을 지시할 수 있다. 또한 또는 대안적으로, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 핵 국소화 서열(nuclear localization sequence, NLS)을 포함할 수 있다. 핵 국소화 서열이 공지되어 있다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 생물학적 활성 분자, 예를 들어, 여기에 기재된 하나 이상의 활성을 갖는 Cas9 분자를 제공하기에 충분한 추가 Cas9 분자 서열과 함께 영역 1-5를 포함한다. 일부 구현예에서, 영역 1-6 각각은 독립적으로, 여기에 기재, 예를 들어, 서열번호 279-287에 제시된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드의 해당 잔기 또는 문헌 [국제공개공보 제WO2015/161276호, 예를 들어, 그의 도 2A-2G 또는 도 7A-7B]에 개시된 서열과 50%, 60%, 70% 또는 80%의 상동성을 갖는다.
임의의 상기 Cas9 서열이 C-말단에서 펩티드 또는 폴리펩티드와 융합되는 경우, 정지 코돈이 제거될 것으로 이해된다.
다양한 유형의 Cas 분자 또는 Cas 폴리펩티드가 여기에 개시된 발명을 실행하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 유형 II Cas 시스템의 Cas 분자가 사용된다. 다른 구현예에서, 다른 Cas 시스템의 Cas 분자가 사용된다. 예를 들어, 유형 I 또는 유형 III Cas 분자가 사용될 수 있다. 예시적인 Cas 분자(및 Cas 시스템)가 예를 들어, 문헌 [Haft 등, PLoS Computational Biology 2005, 1(6): e60 및 Makarova 등, Nature Review Microbiology 2011, 9:467-477]에 기재되어 있고, 두 참조의 내용 전체가 여기에 참조로 통합되어 있다. 예시적인 Cas 분자(및 Cas 시스템)는 예를 들어, 국제공개공보 제WO2015/161276호, 제WO2017/193107호, 제WO2017/093969호, 미국특허출원공개공보 제US2016/272999호 및 제US2015/056705호에 기재된 것을 포함한다.
(iii)
Cpf1
일부 구현예에서, 가이드 RNA 또는 gRNA는 세포내 게놈 또는 에피솜 서열과 같은 표적 서열에 대한 Cas9 또는 Cpf1과 같은 RNA 가이드 핵산분해효소의 특이적 결합 표적화를 촉진한다. 일반적으로, gRNA는 단분자(단일 RNA 분자를 포함하고, 대안적으로 키메라로 지칭) 또는 모듈식(crRNA 및 tracrRNA와 같은 하나 이상 및 전형적으로 2 개의 분리된 RNA 분자를 포함하며, 이는 보통 일부 구현예에서 이중화에 의해 서로 연관됨)일 수 있다. gRNA 및 이의 성분 부분은 일부 구현예에서 참조로 통합된 문헌 [Briner 등, Molecular Cell (2014) 56(2), 333-339] 전체에 기재되어 있다.
단분자이든 모듈식이든 가이드 RNA는 일반적으로 표적에 완전히 또는 부분적으로 상보적인 표적화 도메인을 포함하고, 전형적으로 10-30 개의 뉴클레오티드 길이이며, 특정 구현예에서는 16-24 개의 뉴클레오티드 길이(일부 구현예에서 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 개의 뉴클레오티드 길이)이다. 일부 측면에서, 표적화 도메인은 Cas9 gRNA의 경우 gRNA의 5' 말단 또는 그 근처에 있으며, Cpf1 gRNA의 경우 3' 말단 또는 그 근처에 있다. 상기 설명은 Cas9와 함께 사용하기 위한 gRNA에 초점을 맞춘 반면, 상기 의미로 기재된 것과 어떤 면에서 상이한 gRNA를 활용하는 다른 RNA 가이드 핵산분해효소가 발견되었거나(또는 미래에 발견될 수 있음) 발명되었다는 것이 인식되어야 한다. 일부 구현예에서 Cpf1("Prevotella 및 Franciscella1 유래 CRISPR")은 기능에 tracrRNA를 필요로하지 않는 최근에 발견된 RNA 가이드 핵산분해효소이다(여기에 참조로 통합된 Zetsche 등, 2015, Cell 163, 759-771). Cpf1 게놈 편집 시스템에서 사용하기 위한 gRNA는 일반적으로 표적화 도메인 및 상보성 도메인을 포함한다(교대로 "핸들(handle)"로 지칭). 또한 Cpf1과 함께 사용하기 위한 gRNA에서, 표적화 도메인은 보통 Cas9 gRNA와 관련하여 상기 기재된 바와 같이 5' 말단이 아닌 3' 말단에 또는 그 근처에 존재한다는 점에 유의해야 한다 (핸들은 Cpf1 gRNA의 5' 말단에 있거나 그 근처에 있음).
상이한 원핵 생물 종 유래 gRNA 사이에 또는 Cpf1과 Cas9 gRNA 사이에 구조적 차이가 존재할 수 있다 하더라도, gRNA가 작동하는 원리는 일반적으로 일관적이다. 이러한 작동의 일관성 때문에, gRNA는 광범위한 관점에서 표적화 도메인 서열에 의해 정의될 수 있으며, 당업자는 주어진 표적화 도메인 서열이, 단분자 또는 키메라 gRNA 또는 하나 이상의 화학적 변경 및/또는 순차적 변경 (치환, 추가 뉴클레오티드, 절단 등)을 포함하는 gRNA를 포함한 임의의 적합한 gRNA에 통합될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 개시의 일부 측면에서, gRNA는 이의 표적화 도메인 서열의 관점에서만 기재될 수 있다.
보다 일반적으로, 본 개시의 일부 측면은 다중 RNA 가이드 핵산분해효소를 사용하여 구현될 수 있는 시스템, 방법 및 조성물에 관한 것이다. 달리 명시되지 않는 한, 용어 gRNA는 임의의 RNA 가이드 핵산분해효소와 함께 사용될 수 있는 임의의 적합한 gRNA 및 특정 종의 Cas9 또는 Cpf1과 양립 가능한 gRNA를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 예시를 통해, 용어 gRNA는, 특정 구현예에서, 유형 II 또는 유형 V 또는 CRISPR 시스템과 같은 클래스 2 CRISPR 시스템에서 발생하는 임의의 RNA 가이드 핵산분해효소 또는 이로부터 유래되거나 개조된 RNA 가이드 핵산분해효소와 함께 사용하기 위한 gRNA를 포함한다.
Cas9 및 Cpf1은 구조와 기능에 있어 유사성을 공유하나, 특정 Cpf1 활성은 어떠한 Cas9 도메인과도 유사하지 않은 구조 도메인에 의해 매개된다는 점이 인식되어야 한다. 일부 구현예에서 표적 DNA의 상보적 가닥의 절단은 Cas9의 HNH 도메인과 결과적으로 및 공간적으로 상이한 Nuc 도메인에 의해 매개되는 것으로 보인다. 또한, Cpf1 gRNA(핸들)의 비표적화 부분은 Cas9 gRNA에서 반복:항반복 이중 영역에 의해 형성된 줄기 루프 구조가 아닌 의사 매듭 구조를 채택한다.
RNA 가이드 핵산분해효소 예를 들어, Cas9, Cpf1 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산이 여기에 제공된다. RNA 가이드 핵산분해효소를 암호화하는 예시적인 핵산은 예를 들어, 문헌 [Cong 등, Science 2013, 399(6121):819-823; Wang 등, Cell 2013, 153(4):910-918; Mali 등, Science 2013, 399(6121):823-826; Jinek 등, Science 2012, 337(6096):816-821]에 기재된 것을 포함한다.
b.
게놈 편집 접근법
일반적으로, 본원에 기재된 방법에 따른 임의의 유전자의 변경(alteration)은 임의의 메카니즘에 의해 매개될 수 있고, 임의의 방법은 특정 메카니즘으로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 유전자의 변경과 연관될 수 있는 예시적인 메카니즘은, 비제한적으로, 비-상동성 말단 연결(non-homologous end joining)(예를 들어, 고전적 또는 대안적), 미세상동성-매개 말단 연결(microhomology-mediated end joining; MMEJ), 상동성-지시된 수선(예를 들어, 내인성 공여자 주형 매개됨), 합성 의존성 가닥 어닐링(synthesis dependent strand annealing; SDSA), 단일 가닥 어닐링(single strand annealing), 단일 가닥 침습(single strand invasion), 단일 가닥 절단 수선(single strand break repair; SSBR), 미스매치 수선(mismatch repair; MMR), 염기 절제 수선(base excision repair; BER), 가닥간 가교(Interstrand Crosslink; ICL), 병변 합성(Translesion synthesis; TLS), 또는 오류-부재 후복제 수선(Error-free postreplication repair; PRR)를 포함한다. T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC의 하나 또는 둘 다의 대립유전자의 표적화된 녹 아웃을 위한 예시적인 방법이 본원에 기재된다. 예시적인 메카니즘은, 예를 들어, 미국특허출원공개공보 제US20170349894호, 제US20180362943호 및 제US20180245079호에 기재된 것들을 포함한다..
gRNA 및 Cas9 핵산분해효소가 NHEJ-매개 삽입결실(indels)을 유도하기 위한 이중-가닥 절단을 생성하는 일부 구현예에서, gRNA, 예를 들어, 단분자 (또는 키메라) 또는 모듈 gRNA 분자는 하나의 이중-가닥 절단을 표적 위치의 뉴클레오티드에 근접하게 위치시키도록 구성된다. 일부 구현예에서, 절단 부위(cleavage site)는 표적 위치로부터 0-30 bp(예를 들어, 표적 위치로부터 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 bp 미만) 떨어져 있다.
Cas9 틈내기효소와 복합체를 형성하는 2개의 gRNA가 NHEJ-매개 삽입결실을 유도하기 위한 2개의 단일-가닥 절단을 유도하는 일부 구현예에서, 2개의 gRNA, 예를 들어, 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 2개의 단일-가닥 절단을 위치시켜 표적 위치의 뉴클레오티드를 NHEJ 수선에 제공하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 본질적으로 이중-가닥 절단을 모방하는 상이한 가닥 상에서 동일한 위치에 또는 서로의 소수의 뉴클레오티드 내에 절단을 위치시키도록 구성된다. 일부 구현예에서, 더 가까운 닉(nick)은 표적 위치로부터 0-30 bp(예를 들어, 표적 위치로부터 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 bp 미만) 떨어져 있고, 2개의 닉은 서로 25-55 bp(예를 들어, 25 내지 50, 25 내지 45, 25 내지 40, 25 내지 35, 25 내지 30, 50 내지 55, 45 내지 55, 40 내지 55, 35 내지 55, 30 내지 55, 30 내지 50, 35 내지 50, 40 내지 50, 45 내지 50, 35 내지 45, 또는 40 내지 45 bp) 이내이고, 서로 100 bp 이하(예를 들어, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10 bp 이하) 떨어져 있다. 일부 구현예에서, gRNA는 표적 위치의 뉴클레오티드의 양측에 단일 가닥 절단을 배치하도록 구성된다.
이중-가닥 절단 eaCas9 분자(double strand cleaving eaCas9 molecules) 및 단일 가닥 둘 다, 또는 틈내기효소, eaCas9 분자는 표적 위치의 양측에 절단을 생성하기 위해 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 이중 가닥 또는 쌍을 이룬 단일 가닥 절단은 표적 위치의 양측에 생성되어 2개의 절단(예를 들어, 결실된 2개의 절단 사이의 영역) 사이의 핵산 서열을 제거할 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 gRNA, 예를 들어, 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 표적 위치의 양측에 이중-가닥 절단을 위치시키도록 구성된다. 대안적인 구현예에서, 3개의 gRNA, 예를 들어, 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 표적 위치의 양측에 이중-가닥 절단(즉, cas9 핵산분해효소와의 하나의 gRNA 복합체) 및 2개의 단일 가닥 절단 또는 쌍을 이룬 단일 가닥 절단(즉, Cas9 틈내기효소와의 2개의 gRNA 복합체)를 위치시키도록 구성된다. 또 다른 구현예에서, 4개의 gRNA, 예를 들어, 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 표적 위치의 양측에 2개의 쌍의 단일 가닥 절단(즉, Cas9 틈내기효소와의 2개의 gRNA 복합체의 2개의 쌍)을 생성하도록 구성된다. 쌍에서 이중-가닥 절단(들) 또는 2개의 단일 가닥 닉의 더 가까운 것은 이상적으로 표적 위치의 0-500 bp(예를 들어, 표적 위치로부터 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50 또는 25 bp 이하) 이내일 것이다. 틈내기효소가 사용되는 경우, 쌍에서 2개의 닉은 서로 25-55 bp(예를 들어, 25 내지 50, 25 내지 45, 25 내지 40, 25 내지 35, 25 내지 30, 50 내지 55, 45 내지 55, 40 내지 55, 35 내지 55, 30 내지 55, 30 내지 50, 35 내지 50, 40 내지 50, 45 내지 50, 35 내지 45, 또는 40 내지 45 bp) 이내이고, 서로 100 bp 이하(예를 들어, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10 bp 이하) 떨어져 있다.
임의의 Cas9 분자, gRNA 분자, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 또는 본원에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. 예를 들어, Cas9 분자의 핵산내부가수분해효소(endonuclease) 활성을 평가하기 위한 예시적인 방법은, 예를 들어, 문헌 [Jinek 등, Science 2012, 337(6096):816-821], 국제공개공보 제WO2015/161276호, 제WO2017/193107호, 제WO2017/093969호, 미국특허출원공개공보 제US2016/272999호 및 제US2015/056705호]에 기재되어 있다.
3. 유전자 파괴를 위한 제제의 전달
일부 구현예에서, 인간에서 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC의 표적화된 유전자 파괴, 예를 들어, DNA 손상은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들), 예를 들어, Cas9 및/또는 gRNA 성분을, 세포로 도입 또는 전달하기 위한 많은 공지된 전달 방법 또는 비히클 중의 어느 하나를 사용하여, 예를 들어, Cas9 분자 및 gRNA를 전달하기 위한 바이러스, 예를 들어, 렌티바이러스 전달 벡터 또는 임의의 공지된 방법 또는 비히클을 사용하여, 세포로 전달 또는 도입함으로써 수행된다. 예시적인 방법이 예를 들어, 문헌 [Wang 등, (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper 등, (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen 등, (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; 및 Cavalieri 등, (2003) Blood. 102(2): 497-505]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴, 예를 들어, DNA 파손을 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)의 하나 이상의 성분을 암호화하는 핵산 서열이 예를 들어, 여기 기재되거나 공지된 세포로 핵산을 도입하는 임의의 방법에 의해 세포로 도입된다. 일부 구현예에서, CRISPR 가이드 RNA 및/또는 Cas9 효소와 같은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)의 성분을 암호화하는 벡터가 세포로 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들), 예를 들어, Cas9/gRNA인 하나 이상의 제제(들)가 리보핵단백질(RNP) 복합체로 세포에 도입된다. RNP 복합체에는 RNA 또는 gRNA 분자와 같은 리보뉴클레오티드의 서열 및 Cas9 단백질 또는 이의 변이체와 같은 단백질이 포함된다. 예를 들어, Cas9 단백질은 Cas9 단백질 및 표적 서열을 표적화하는 gRNA 분자를 포함하는 RNP 복합체로서 예를 들어, 전기천공 또는 기타 물리적 전달 방법을 이용하여 전달된다. 일부 구현예에서, RNP는 전기천공 또는 기타 물리적 수단, 예를 들어, 입자 총, 인산 칼슘 형질 감염, 세포 압축 또는 압착을 통해 세포로 전달된다. 일부 구현예에서, RNP는 추가 전달 제제(예를 들어, 소분자 제제, 지질 등)를 필요로 하지 않고 세포의 혈장 막을 가로지를 수 있다. 일부 구현예에서, RNP로서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들), 예를 들어, CRISPR/Cas9의 전달은, 표적화된 파괴가 예를 들어, RNP가 도입되는 세포에서 세포의 자손으로 제제가 전달되지 않으면서 일시적으로 발생한다는 이점을 제공한다. 예를 들어, RNP에 의한 전달은 제제가 자손으로 유전되는 것을 최소화하고, 이로써 자손에서 표적 외 유전자 파괴의 가능성을 줄인다. 상기 경우에, 유전자 파괴 및 전이 유전자의 통합은 제제 자체없이 자손 세포로 유전될 수 있고, 이는 자손 세포로 전달되면서 표적 외 유전자 파괴를 더 도입할 수 있다.
일부 구현예에서, RNP 복합체는 3' 폴리-A 꼬리 및 5' ARCA(Anti-Reverse Cap Analog) 캡을 포함하도록 변경된 gRNA를 포함한다.
유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들) 및 성분, 예를 들어, Cas9 분자 및 gRNA 분자는 표 10 및 표 11에 제시된 바와 같은 다양한 전달 방법 및 제형 또는 예를 들어, 문헌 [국제공개공보 제WO2015/161276호, 제WO2017/193107호, 제WO2017/093969호; 미국 출원 제US2015/0056705호, 제US2016/0272999호, 제US2017/0211075호; 또는 제US2017/0016027호]에 기재된 방법을 사용하여 다양한 형태로 표적 세포에 도입될 수 있다. 여기에 더 기재된 바와 같이, 전달 방법 및 제형은 여기에 기재된 방법의 이전 또는 후속 단계에서 세포에 주형 폴리뉴클레오티드 및/또는 다른 제제(예를 들어, 세포를 조작하는데 필요한 것들)를 전달하는데 사용될 수 있다.
Cas9 또는 gRNA 성분이 전달을 위한 DNA로서 암호화되는 경우, DNA는 전형적으로는, 예를 들어, 발현을 수행하기 위한 프로모터를 포함하는 제어 영역을 포함할 수 있지만, 반드시 요구되는 것은 아니다. Cas9 분자 서열에 유용한 프로모터는, 예를 들어, CMV, EF-1α, EFS, MSCV, PGK, 또는 CAG 프로모터를 포함한다. gRNA에 유용한 프로모터는, 예를 들어, H1, EF-1α, tRNA 또는 U6 프로모터를 포함한다. 유사하거나 상이한 강도를 갖는 촉진제는 성분의 발현을 조정하기 위해 선택될 수 있다. Cas9 분자를 암호화하는 서열은 핵 국부화 신호(nuclear localization signal; NLS), 예를 들어, SV40 NLS를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 gRNA 분자에 대한 프로모터는 독립적으로, 유도성, 조직 특이적, 또는 세포 특이적일 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제는 RNP 복합체가 도입된다.
[표 10]
[표 11]
일부 구현예에서, Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자를 암호화하는 DNA 또는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자를 포함하는 RNP 복합체는 공지된 방법에 의해 또는 여기에 기재된 바와 같이 세포로 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas9 암호화 및/또는 gRNA 암호화 DNA는, 예를 들어, 벡터(예를 들어, 바이러스 또는 비바이러스성 벡터), 비벡터 기반 방법(예를 들어, 있는 그대로의 DNA 또는 DNA 복합체 사용) 또는 이의 조합물에 의해 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 이의 제제(들) 및/또는 성분을 함유하는 폴리뉴클레오티드가 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터/바이러스 또는 플라스미드)에 의해 전달된다. 상기 벡터는 여기에 기재된 임의의 것일 수 있다.
일부 측면에서, 가이드 서열과 조합하여(및 선택적으로 이와의 복합체로) CRISPR 효소(예를 들어, Cas9 핵산분해효소)가 세포로 전달된다. 예를 들어, CRISPR 시스템 중 하나 이상의 요소는 I 유형, II 형 또는 III 유형 CRISPR 시스템에서 유래된다. 예를 들어, CRISPR 시스템 중 하나 이상의 요소는 Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus 또는 Neisseria meningitides와 같은 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체에서 유래된다.
일부 구현예에서, Cas9 핵산분해효소(예를 들어, Staphylococcus aureus 유래 또는 Streptococcus pyogenes 유래 mRNA에 의해 암호화됨, 예를 들어, pCW-Cas9, Addgene #50661, Wang 등, (2014) Science, 3:343-80-4; 또는 카탈로그 번호 K002, K003, K005 또는 K006으로 Applied Biological Materials (ABM; Canada)로부터 구매 가능한 핵산분해효소 또는 틈내기효소 렌티바이러스 벡터) 및 표적 유전자 좌(예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC)에 특이적인 가이드 RNA가 세포로 도입된다.
일부 구현예에서, 이의 제제(들) 및/또는 성분을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또는 RNP 복합체가 비벡터 기반 방법(예를 들어, 있는 그대로의 DNA 또는 DNA 복합체 사용)에 의해 전달된다. 예를 들어, DNA 또는 RNA 또는 단백질 또는 이의 조합물, 예를 들어, 리보핵단백질(RNP) 복합체는 예를 들어, 유기적으로 변형된 실리카 또는 규산염(Ormosil), 전기천공, 일시적인 세포 압축 또는 압착(예를 들어, 문헌 [Lee, 등, (2012) Nano Lett 12: 6322-27, Kollmannsperger 등 (2016) Nat Comm 7, 10372]에 기재된 바와 같음), 유전자 총, 소노포레이션(sonoporation), 자성 감염, 지질 매개 형질 감염, 덴드리머(dendrimer), 무기 나노 입자, 인산 칼슘 또는 이의 조합물에 의해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 전기천공을 통한 전달은 카트리지, 챔버 또는 큐벳에서 Cas9- 및/또는 gRNA- 암호화 DNA 또는 RNP 복합체와 세포를 혼합하고 정의된 지속 시간 및 진폭의 1회 이상의 전기적 자극을 적용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 전기천공을 통한 전달은, 카트리지, 챔버 또는 큐벳으로 혼합물을 공급하는 장치(예를 들어, 펌프)에 연결된 용기에서 Cas9- 및/또는 gRNA- 암호화 DNA와 세포가 혼합되는 시스템을 사용하여 수행되며, 여기서 정의된 지속시간 및 진폭의 1회 이상의 전기적 자극이 적용되고, 이후 세포가 제 2 용기로 전달된다.
일부 구현예에서, 전달 비히클은 비바이러스성 벡터이다. 일부 구현예에서, 비바이러스성 벡터는 무기 나노입자이다. 예시적인 무기 나노 입자에는 예를 들어, 자성 나노 입자(예를 들어, Fe3MnO2) 및 실리카가 포함된다. 나노입자의 외부 표면은 페이로드(payload)의 부착(예를 들어, 접합 또는 포집)을 허용하는 양전하 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌이민, 폴리리신, 폴리세린)로 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 비바이러스성 벡터는 유기 나노입자이다. 예시적인 유기 나노입자에는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)로 코팅된 중성 헬퍼 지질과 함께 양이온 지질을 함유하는 SNALP 리포좀 및 지질로 코팅된 프로타민(protamine) 핵산 복합체가 포함된다. 유전자 전달을 위한 예시적인 지질은 예를 들어, 국제공개공보 제WO2015/161276호, 제WO2017/193107호, 제WO2017/093969호, 미국특허출원공개공보 제US2016/272999호 및 제US2015/056705호에 기재된 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, 비히클은 표적 세포가 나노입자 및 리포솜의 갱신을 증가시키도록 표적화 변형, 예를 들어, 세포 특이적 항원, 단클론성 항체, 단일 사슬 항체, 압타머, 중합체, 설탕 및 세포 침투성 펩티드를 갖는다. 일부 구현예에서, 비히클은 융합생성(fusogenic) 및 엔도솜 불안정화 펩티드/중합체를 사용한다. 일부 구현예에서, 비히클은 산 유발성 구조적 변화(예를 들어, 카고의 엔도솜 탈출을 가속화하도록)를 겪는다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 세포 구획 내에서 방출을 위해 자극 절단 가능 중합체가 사용된다. 예를 들어, 환원성 세포 환경에서 절단되는 이황화물 기반 양이온성 중합체를 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 전달 비히클은 생물학적 비바이러스성 전달 비히클이다. 일부 구현예에서, 비히클은 약화된 세균(예를 들어, 침투적이나 발병 및 전이 유전자의 발현을 방지하도록 약화된 자연적 또는 인위적으로 조작된, 예를 들어, Listeria monocytogenes, 특정 Salmonella 균주, Bifidobacterium longum 및 변형된 Escherichia coli), 특정 세포를 표적화하도록 영양 및 조직 특이적 친화성(tropism)을 갖는 세균, 표적 세포 특이성을 변경하도록 변형된 표면 단백질을 갖는 세균이다. 일부 구현예에서, 비히클은 유전자 변형 박테리오파지(예를 들어, 대형 패키징 용량, 보다 작은 면역원성을 갖고, 포유류 플라스미드 보유 서열을 함유하고 통합된 표적화 리간드를 갖는 조작된 파지)이다. 일부 구현예에서, 비히클은 포유류 바이러스 유사 입자이다. 예를 들어, 변형된 바이러스 입자는 (예를 들어, "빈(empty)" 입자의 정제 후 원하는 카고를 갖는 바이러스의 생체 외 조립에 의해) 생성될 수 있다. 비히클은 또한 표적화 리간드를 통합하도록 조작되어 표적 조직 특이성이 변경될 수 있다. 일부 구현예에서, 비히클은 생물학적 리포솜(liposome)이다. 예를 들어, 생물학적 리포솜은 인간 세포(예를 들어, 대상체로부터 유래된 구형 구조로 파괴된 적혈구인 적혈구 고스트(예를 들어, 조직 표적화는 다양한 조직 또는 세포 특이적 리간드의 부착에 의해 달성될 수 있음)) 유래 인지질 기반 입자 또는 분비성 엑소좀 - 식균 작용 기원의 대상체 유래 막 결합 나노소포체(30-100 nm)(예를 들어, 다양한 세포 유형에서 제조될 수 있고 따라서 표적화 리간드 필요없이 세포에 의해 흡수될 수 있음) - 이다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자를 암호화하는 RNA는 공지된 방법에 의해 또는 여기에 기재된 바와 같이 세포, 예를 들어, 여기에 기재된 표적 세포로 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas9 암호화 및/또는 gRNA 암호화 RNA는, 예를 들어, 미세 주입법, 전기천공, 일시적인 세포 압축 또는 압착(예를 들어, 문헌 [Lee, 등, (2012) Nano Lett 12: 6322-27)]에 기재된 바와 같음), 지질 매개 형질 감염, 펩티드 매개 전달, 예를 들어, 세포-침투 펩티드, 또는 이의 조합물에 의해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 전기천공을 통한 전달은 카트리지, 챔버 또는 큐벳에서 Cas9 분자를 암호화하는 RNA 및/또는 gRNA 분자를 세포와 혼합하고 정의된 지속 시간 및 진폭의 1회 이상의 전기적 자극을 적용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 전기천공을 통한 전달은, 카트리지, 챔버 또는 큐벳으로 혼합물을 공급하는 장치(예를 들어, 펌프)에 연결된 용기에서 Cas9 분자를 암호화하는 RNA 및/또는 gRNA 분자가 세포와 혼합되는 시스템을 사용하여 수행되며, 여기서 정의된 지속시간 및 진폭의 1회 이상의 전기적 자극이 적용되고, 이후 세포는 제 2 용기로 전달된다.
일부 구현예에서, Cas9 분자는 공지된 방법에 의해 또는 여기에 기재된 바와 같이 세포로 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas9 단백질 분자는, 예를 들어, 미세 주입법, 전기천공, 일시적인 세포 압축 또는 압착(예를 들어, 문헌 [Lee, 등, (2012) Nano Lett 12: 6322-27)]에 기재된 바와 같음), 지질 매개 형질 감염, 펩티드 매개 전달 또는 이의 조합물에 의해 전달될 수 있다. 전달은 gRNA를 암호화하는 DNA 또는 gRNA를 동반할 수 있다.
일부 구현예에서, 절단, 예를 들어, Cas9/gRNA 시스템을 도입할 수 있는 하나 이상의 제제(들)는 리보핵단백질(RNP) 복합체로서 세포내로 도입된다. RNP 복합체는 리보뉴클레오티드, 예를 들어, RNA 또는 gRNA 분자의 서열, 및 단백질, 예를 들어, Cas9 단백질 또는 이의 변이체를 포함한다. 예를 들어, Cas9 단백질은, 예를 들어, 전기천공 또는 다른 물리적 전달 방법을 사용하여, Cas9 단백질 및 표적 서열을 표적화하는 gRNA 분자를 포함하는 RNP 복합체로서 전달된다. 일부 구현예에서, RNP는 전기천공 또는 다른 물리적 수단, 예를 들어, 입자 총, 인산칼슘 형질감염, 세포 압축 또는 압착을 통해 세포내로 전달된다.
일부 구현예에서, 전기천공을 통한 전달은 카트리지, 챔버 또는 큐벳에서 gRNA 분자를 갖는 Cas9 분자 또는 gRNA 분자를 갖지 않는 Cas9 분자와 세포를 혼합하고 정의된 지속 시간 및 진폭의 1회 이상의 전기적 자극을 적용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 전기천공을 통한 전달은, 카트리지, 챔버 또는 큐벳으로 혼합물을 공급하는 장치(예를 들어, 펌프)에 연결된 용기에서 gRNA 분자를 갖는 Cas9 분자 또는 gRNA 분자를 갖지 않는 Cas9 분자와 세포가 혼합되는 시스템을 사용하여 수행되며, 여기서 정의된 지속시간 및 진폭의 1회 이상의 전기적 자극이 적용되고, 이후 세포는 제 2 용기로 전달된다.
일부 구현예에서, 전기천공을 통한 전달은 세포를 Cas9 분자(예를 들어, eaCas9 분자, eiCas9 분자 또는 eiCas9 융합 단백질)와 gRNA 분자와 함께 또는 없이 카트리지, 챔버 또는 큐벳 내에서 혼합하고 정의된 지속기간 및 진폭의 하나 이상의 전기적 임펄스를 적용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 전기천공을 통한 전달은 세포가 Cas9 분자(예를 들어, eaCas9 분자, eiCas9 분자 또는 eiCas9 융합 단백질)와 혼합되는 시스템을 사용하여 수행된다.
일부 구현예에서, 이의 제제(들) 및/또는 성분을 함유하는 폴리뉴클레오티드가 벡터 및 비-벡터 기반 방법의 조합에 의해 전달된다. 예를 들어, 비로솜(virosome)은 불활성화 바이러스(예를 들어, HIV 또는 인플루엔자 바이러스)와 결합된 리포솜을 포함하며, 이는 바이러스 방법 또는 리포솜 방법 중의 어느 하나 단독보다 더 효율적인 유전자 전달을 초래할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 이의 제제(들) 및/또는 성분이 세포로 전달된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 게놈에서 2 이상의 위치에서, 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC 내의 2 이상의 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들)가 세포로 전달된다. 일부 구현예에서, 이의 제제(들) 및 성분이 한가지 방법을 사용하여 전달된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC의 유전자 파괴를 유도하는 제제(들)는 유전자 파괴를 위한 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서 전달된다. 일부 구현예에서, 하나의 폴리뉴클레오티드는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC를 표적화하는 제제를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 2 이상의 상이한 폴리뉴클레오티드는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, TRAC 및/또는 TRBC를 표적화하는 제제를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제는 리보핵단백질(RNP) 복합체로서 전달될 수 있고, 2 이상의 상이한 RNP 복합체는 혼합물로서 함께 또는 개별적으로 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들) 및/또는 이의 성분, 예를 들어, Cas9 분자 성분 및/또는 gRNA 분자 성분이 아닌 하나 이상의 핵산 분자, 예컨대 HDR-지시 통합을 위한 주형 폴리뉴클레오티드(예컨대 여기, 예를 들어, 여기 섹션 II.B.2에 기재된 임의의 주형 폴리뉴클레오티드)가 전달된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자, 예를 들어, 주형 폴리 뉴클레오티드는 Cas 시스템의 하나 이상의 성분과 동시에 전달된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 Cas 시스템의 하나 이상의 성분이 전달되기 전 또는 후(예를 들어, 약 1 분, 5 분, 10 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 6 시간, 9 시간, 12 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 1 주, 2 주 또는 4 주 미만)에 전달된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드는 Cas 시스템의 하나 이상의 성분, 예를 들어, Cas9 분자 성분 및/또는 gRNA 분자 성분과 상이한 수단에 의해 전달된다. 핵산 분자, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드는 여기에 기재된 임의의 전달 방법에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스에 의해 전달될 수 있고, Cas9 분자 성분 및/또는 gRNA 분자 성분은 전기천공에 의해 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 외인성 유전자, 예를 들어, 재조합 수용체 또는 그의 일부 및/또는 다른 외인성 유전자 핵산 서열을 암호화하는 서열을 포함한다.
B.
상동성
-지시된 수선(Homology-Directed Repair;
HDR
)을 통한
표적화된
통합
일부 측면에서, 제공된 구현예는 폴리뉴클레오티드의 특정 부분, 예를 들어, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 게놈 내의 특정 위치(예를 들어, 표적 부위 또는 표적 위치)에서 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유하는 주형 폴리뉴클레오티드의 부분의 표적화 통합을 수반한다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴(예를 들어, 섹션 II.A에 기재된 바와 같은 DNA 손상) 및 하나 이상의 상동성 암(예를 들어, 상기 유전자 파괴 주변 서열에 상동성인 핵산 서열을 함유)을 함유하는 주형 폴리뉴클레오티드의 존재는 HDR을 유도 또는 지시할 수 있고, 상동성 서열이 DNA 수선을 위한 주형으로 작용한다. 유전자 파괴를 둘러싼 내인성 유전자 서열과 주형 폴리뉴클레오티드에 포함된 5' 및/또는 3' 상동성 암 사이의 상동성에 기반하여, 세포 DNA 수선 기계는 주형 폴리뉴클레오티드를 사용하여 DNA 손상을 수선하고 유전자 파괴의 부위에서 유전 정보를 재합성할 수 있고, 이로써 유전자 파괴 부위 또는 그 근처에서 주형 폴리뉴클레오티드에 전이 유전자를 효과적으로 삽입하거나 통합할 수 있다. 일부 구현예에서, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서의 유전자 파괴는 여기에 기재된 표적화된 유전자 파괴를 생성하기 위한 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다.
또한 여기에 기재된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트가 제공된다. 일부 구현예에서, 제공된 폴리뉴클레오티드는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 표적화하기 위해, 예를 들어, HDR을 포함한 여기에 기재된 방법에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 재조합 수용체 또는 이의 일부(예를 들어, 재조합 수용체의 하나 이상의 영역(들) 또는 도메인(들))를 암호화하는 전이 유전자(예를 들어, 외인성 또는 이종 핵산 서열) 및 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 내인성 게놈 부위 또는 그 근처 서열에 상동성인 상동성 서열(예를 들어, 상동성 암)을 함유하는 폴리뉴클레오티드이거나 이를 포함한다. 일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오티드 내의 전이 유전자는 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자의 표적화 통합시, 조작된 세포내의 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌가 재조합 수용체, 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 전이 유전자를 함유하도록 변형된다.
일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 선형 DNA 단편으로 도입되거나 벡터에 포함된다. 일부 측면에서, 유전자 파괴를 유도하는 단계 및 표적화된 통합을 위한 단계(예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드의 도입에 의해)는 동시에 또는 순차적으로 수행된다.
1.
상동성
-지시된 수선(Homology-Directed Repair,
HDR
)
일부 구현예에서, 상동성-지시된 수선(HDR)은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서의 하나 이상의 표적 부위(들)에서 하나 이상의 핵산 서열, 예를 들어, 전이 유전자의 표적화된 통합 또는 삽입을 위해 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산분해효소-유도 HDR을 사용하여 표적 서열 변경, 특정 표적 위치, 예를 들어, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 전이 유전자의 통합 및/또는 특정 표적 유전자에서 돌연변이의 편집 또는 수선을 할 수 있다.
표적 부위에서 핵산 서열의 변경은 외인성으로 제공된 주형 폴리뉴클레오티드(도너 폴리뉴클레오티드 또는 주형 서열로도 지칭)를 사용하여 HDR에 의해 발생할 수 있다. 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드는 주형 폴리뉴클레오티드 내에 함유된 전이 유전자의 삽입과 같은 표적 서열의 변경을 제공한다. 일부 구현예에서, 플라스미드 또는 벡터가 상동성 재조합을 위한 주형으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 선형 DNA 단편이 상동성 재조합을 위한 주형으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 서열과 주형 폴리뉴클레오티드 사이의 상동성-지시된 수선의 대안적인 방법(예를 들어, 단일 가닥 어닐링)에 의해 표적 서열의 변경을 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 표적 서열의 주형 폴리뉴클레오티드로 달성된 변경은 핵산분해효소, 예를 들어, CRISPR/Cas9와 같은 표적화된 핵산분해효소에 의한 절단에 의존한다. 핵산분해효소에 의한 절단은 이중 가닥 파손 또는 2 개의 단일 가닥 파손을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, "재조합(recombination)"은 2 개의 폴리뉴클레오티드 사이의 유전 정보 교환 과정을 포함한다. 일부 구현예에서, "상동성 재조합(homologous recombination, HR)"은, 예를 들어, 상동성-지시된 수선 기제를 통해 세포에서 이중 가닥 파손 수선 동안 발생하는 상기 교환의 특화된 형태를 포함한다. 상기 과정은 뉴클레오티드 서열 상동성을 필요로 하고, 표적 DNA(즉, 예를 들어, 내인성 유전자의 표적 부위에서 이중 가닥 파손을 경험한 DNA)의 주형 수선을 위해 주형 폴리뉴클레오티드를 사용하며, 주형 폴리뉴클레오티드에서 표적으로 유전 정보를 전달하기 때문에 "비-교차 유전자 전환(non-crossover gene conversion)" 또는 "짧은 트랙 유전자 전환(short tract gene conversion)"으로 다양하게 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 상기 전달은 파손된 표적과 주형 폴리뉴클레오티드 사이에 형성되는 이종 이중체 DNA의 미스매치 교정 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드가 사용되어 표적 및/또는 관련 프로세스의 일부가 될 유전 정보를 재합성하는 "합성 의존적 가닥 어닐링(synthesis-dependent strand annealing)"을 포함할 수 있다. 상기 특화된 HR은 종종 표적 분자 서열의 변경을 초래하여 주형 폴리뉴클레오티드 서열의 일부 또는 전부가 표적 폴리뉴클레오티드에 통합된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 전이 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오티드는 상동성 독립적 기제를 통해 세포의 게놈으로 통합된다. 본 방법은 세포의 게놈에서 이중 가닥 파손(double-stranded break, DSB)을 생성하고 핵산분해효소를 사용하여 주형 폴리뉴클레오티드 분자를 절단하여, 주형 폴리뉴클레오티드가 DSB 부위에서 통합된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 비상동성 의존적 방법(예를 들어, NHEJ)을 통해 통합된다. 생체 내 절단시 주형 폴리뉴클레오티드는 표적화된 방식으로 DSB 위치에서 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 주형 폴리뉴클레오티드는 DSB를 생성하는데 사용되는 하나 이상의 핵산분해효소에 대해 하나 이상의 동일한 표적 부위를 포함할 수 있다. 따라서, 주형 폴리뉴클레오티드는 통합이 요청되는 내인성 유전자를 절단하는데 사용되는 하나 이상의 동일한 핵산분해효소에 의해 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 DSB를 유도하는데 사용되는 핵산분해효소와 상이한 핵산분해효소 표적 부위를 포함한다. 여기에 기재된 바와 같이, 표적 부위 또는 표적 위치의 유전자 파괴는 임의의 공지 방법 또는 본원에 기재된 임의의 방법, 예를 들어, ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9 시스템 또는 TtAgo 핵산분해효소에 의해 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, DNA 수선 기제는 (1) 단일 이중 가닥 파손, (2) 2 개의 단일 가닥 파손, (3) 표적 부위 각각의 측면 상에 발생하는 파손이 있는 2 개의 이중 가닥 파손, (4) 표적 부위 각각의 측면 상에 발생하는 이중 가닥 파손 및 2 개의 단일 가닥 파손이 있는 1 개의 이중 가닥 파손 및 2 개의 단일 가닥 파손, (5) 표적 부위 각각의 측면 상에 발생하는 한 쌍의 단일 가닥 파손이 있는 4 개의 단일 가닥 파손 또는 (6) 1 개의 단일 가닥 파손 후에 핵산분해효소에 의해 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 주형 폴리뉴클레오티드가 사용되며 표적 부위는 대안적인 HDR에 의해 변경될 수 있다.
표적 부위의 주형 폴리뉴클레오티드로 달성된 변경은 핵산분해효소 분자에 의한 절단에 따라 달라진다. 핵산분해효소에 의한 절단은 닉, 이중 가닥 파손 또는 2 개의 단일 가닥 파손, 예를 들어, 표적 부위의 각각의 DNA 가닥 상에 하나를 포함할 수 있다. 표적 부위 상에 손상이 도입된 후, 파손 말단에서 절제가 발생하여 단일 가닥의 돌출된 DNA 영역을 초래한다.
정규 HDR에서, 표적 부위에 직접 통합되거나 전이 유전자를 삽입하거나 표적 부위의 서열을 수정하기 위한 주형으로 사용될 표적 부위에 대해 상동성 서열을 포함하는 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오티드가 도입된다. 파손에서 절제 후, 상이한 경로, 예를 들어, 이중 홀리데이 접점 모델(또는 이중 가닥 파손 수선, DSBR, 경로) 또는 합성 의존적 가닥 어닐링(synthesis-dependent strand annealing, SDSA) 경로에 의해 수선이 진행될 수 있다.
이중 홀리데이 접점 모델에서, 주형 폴리뉴클레오티드에서 상동성 서열에 대해 표적 부위의 2개의 단일 가닥 오버행에 의한 가닥 침입이 발생하고, 2개의 홀리데이 접합을 갖는 중간체 형성을 초래한다. 새로운 DNA가 침입 가닥의 말단에서 합성되면서 접점이 이동하여 절제에서 발생하는 간격을 채운다. 새로 합성된 DNA의 말단은 절제된 말단에 결찰되고, 접점이 풀어져, 대상 부위에서의 삽입, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드에 전이 유전자의 삽입을 초래한다. 주형 폴리뉴클레오티드와의 교차는 접점이 풀어질 때 발생할 수 있다.
SDSA 경로에서, 하나의 단일 가닥 오버행만이 주형 폴리뉴클레오티드를 침입하고 새로운 DNA가 침입 가닥의 말단에서 합성되어 절제에서 발생하는 간격을 채운다. 이어서 새로 합성된 DNA가 남은 단일 가닥 오버행에 어닐링하고, 새로운 DNA가 합성되어 간격을 채우고, 상기 가닥들이 결찰되어 변형된 DNA 이중 영역을 생성한다.
대안적인 HDR에서, 단일 가닥 주형 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드가 도입된다. 원하는 표적 부위를 변경하기 위한 표적 부위에서의 닉, 단일 가닥 파손 또는 이중 가닥 파손이 핵산분해효소 분자에 의해 매개되고, 손상에서의 절제가 발행하여 단일 가닥 오버행을 드러낸다. 여기에 기재된 바와 같이, DNA의 표적 부위를 정정 또는 변경하기 위한 주형 폴리뉴클레오티드 서열의 통합은 전형적으로 SDSA 경로에 의해 발생한다.
일부 구현예에서, "대안적인 HDR(Alternative HDR)" 또는 대안적인 상동성-지시된 수선은 상동성 핵산(예를 들어, 내인성 상동성 서열, 예를 들어, 자매 크로마티드 또는 외인성 핵산, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드)을 사용하여 DNA 손상을 수선하는 과정을 지칭한다. 대안적인 HDR은 상기 과정이 정규 HDR과 상이한 경로를 이용하며, 정규 HDR 매개자, RAD51 및 BRCA2에 의해 억제될 수 있다는 점에서 정규 HDR과 구별된다. 또한 대안적인 HDR은 파손의 수선을 위해 단일 가닥 또는 닉형 상동성 핵산을 사용한다. 일부 구현예에서, "정규 HDR(Canonical HDR)" 또는 정규 상동성-지시된 수선은 상동성 핵산(예를 들어, 내인성 상동성 서열, 예를 들어, 자매 크로마티드 또는 외인성 핵산, 예를 들어, 주형 핵산)을 사용하여 DNA 손상을 수선하는 과정을 지칭한다. 정규 HDR은 전형적으로 이중 가닥 파손에 상당한 절제가 존재할 경우, 하나 이상의 단일 가닥 DNA 부분을 형성하면서 작용한다. 정상 세포에서, HDR은 전형적으로 파손의 인식, 파손의 안정화, 절제, 단일 가닥 DNA의 안정화, DNA 교차 중간체의 형성, 교차 중간체의 풀어짐 및 결찰과 같은 일련의 단계를 포함한다. 상기 과정은 RAD51 및 BRCA2를 필요로 하며 상동성 핵산은 전형적으로 이중 가닥이다. 달리 명시하지 않는 한, 일부 구현예에서 용어 "HDR"은 정규 HDR 및 대안적인 HDR을 포괄한다.
일부 구현예에서, 이중 가닥 절단은 핵산분해효소, 예를 들어, HNH 유사 도메인과 관련된 절단 활성 및 RuvC 유사 도메인, 예를 들어, N 말단 RuvC 유사 도메인과 관련된 절단 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어, 야생형 Cas9에 의해 달성된다. 상기 구현예는 단일 gRNA만을 필요로 한다.
일부 구현예에서, 하나의 단일 가닥 파손 또는 닉은 틈내기효소 활성을 갖는 핵산분해효소 분자, 예를 들어, Cas9 틈내기효소에 의해 달성된다. 표적 부위의 닉 DNA는 대안적인 HDR을 위한 기질이 될 수 있다.
일부 구현예에서, 2개의 단일 가닥 파손 또는 닉은, 핵산분해효소, 예를 들어, 틈내기효소 활성, 예를 들어, HNH 유사 도메인과 관련된 절단 활성 또는 N 말단 RuvC 유사 도메인과 관련된 절단 활성을 갖는 Cas9 분자에 의해 달성된다. 상기 구현예는 일반적으로 각각의 단일 가닥 파손의 배치를 위해 하나씩, 2 개의 gRNA를 필요로 한다. 일부 구현예에서, 틈내기효소 활성을 갖는 Cas9 분자는 gRNA가 혼성화하는 가닥을 절단하나 gRNA가 혼성화하는 가닥에 대해 상보적인 가닥은 절단하지 않는다. 일부 구현예에서, 틈내기효소 활성을 갖는 Cas9 분자는 gRNA가 혼성화하는 가닥을 절단하지 않고, 그보다 gRNA가 혼성화하는 가닥에 대해 상보적인 가닥을 절단한다. 일부 구현예에서, 틈내기효소는 HNH 활성, 예를 들어, 불활성화된 RuvC 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어, D10에서의 돌연변이, 예를 들어, D10A 돌연변이를 갖는 Cas9 분자를 갖는다. D10A는 RuvC를 불활성화하고; 따라서, Cas9 틈내기효소는 HNH 활성(만)을 가지며 gRNA가 혼성화하는 가닥(예를 들어, 그것에 NGG PAM이 없는 상보적 가닥)을 절단할 것이다. 일부 구현예에서, H840, 예를 들어, H840A 돌연변이를 갖는 Cas9 분자는 틈내기효소로서 사용될 수 있다. H840A는 HNH를 불활성화하고; 따라서, Cas9 틈내기효소는 RuvC 활성(만)을 가지며 비상보적인 가닥(예를 들어, NGG PAM을 갖는 가닥이고 이의 서열은 gRNA와 동일함)을 절단한다.
일부 구현예에서, Cas9 분자는 N-말단 RuvC 유사 도메인 틈내기효소이며, 예를 들어, Cas9 분자는 N863, 예를 들어, N863A에서 돌연변이를 포함한다.
틈내기효소와 2 개의 gRNA가 2 개의 단일 가닥 닉을 배치하는데 사용되는 일부 구현예에서, 하나의 닉은 표적 DNA의 + 가닥 상에 있고, 하나의 닉은 - 가닥 상에 있다. PAM은 바깥쪽으로 향하고 있다. gRNA는, gRNA가 약 0-50, 0-100 또는 0-200 개의 뉴클레오티드만큼 분리되도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 2 개의 gRNA의 표적화 도메인에 상보적인 표적 서열 사이에 중복이 없다. 일부 구현예에서, gRNA는 중복되지 않고, 50, 100 또는 200 개의 뉴클레오티드만큼 분리된다. 일부 구현예에서, 2 개의 gRNA의 사용은, 예를 들어, 표적 외 결합을 감소시킴으로써 특이성을 증가시킬 수 있다(Ran 등, Cell 2013 Sep 12;154(6):1380-9).
일부 구현예에서, 단일 닉을 사용하여 HDR, 예를 들어, 대안적인 HDR을 유도할 수 있다. 여기에서 단일 닉을 사용하여 주어진 절단 부위, 예를 들어, 표적 부위에서 NHEJ에 대한 HR의 비율을 높일 수 있음이 고려된다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 파손이 상기 gRNA의 표적화 도메인에 상보적인 표적 부위의 DNA 가닥에 형성된다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 파손이, 상기 gRNA의 표적화 도메인에 상보적인 가닥이 아닌 표적 부위의 DNA 가닥에 형성된다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 어닐링(ingle strand annealing, SSA), 단일 가닥 파손 수선(single-stranded break repair, SSBR), 미스매치 수선(mismatch repair, MMR), 염기 절제 수선(base excision repair, BER), 뉴클레오티드 절제 수선(nucleotide excision repair, NER), 가닥 내 교차 연결(intrastrand cross-link, ICL), 손상 통과 합성(translesion synthesis, TLS), 무오류 사후 복제 수선(postreplication repair, PRR)과 같은 기타 DNA 수선 경로가 세포에 의해 이용될 수 있다.
표적화 통합은 게놈에 있는 특정 유전자 또는 유전자 좌로 통합된 전이 유전자, 예를 들어, 상동성 암들 사이의 서열을 초래한다. 전이 유전자는 게놈에서 표적 부위 또는 하나 이상의 표적 부위(들) 중 하나 또는 그 근처 어디에서나 통합될 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 하나 이상의 표적 부위(들) 중 하나 또는 그 근처에서, 예를 들어, 절단 부위의 상류 또는 하류에서 300, 250, 200, 150, 100, 50, 10, 5, 4, 3, 2, 1 개 이하의 염기쌍 이내, 예컨대 표적 부위의 어느 한쪽의 100, 50, 10, 5, 4, 3, 2, 1 개 염기쌍 이내, 예컨대 표적 부위의 어느 한쪽의 50, 10, 5, 4, 3, 2, 1 개 염기쌍 이내에서 통합된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자를 포함하는 통합 서열은 임의의 벡터 서열(예를 들어, 바이러스 벡터 서열)을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 통합 서열은 벡터 서열(예를 들어, 바이러스 벡터 서열)의 일부를 포함한다.
가닥 중 하나에서 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손(예를 들어, 표적 부위)은, 원하는 영역에서 변경이 생성(예를 들어, 전이 유전자의 삽입 또는 돌연변이의 정정 발생)되도록 표적 통합 부위, 예를 들어, 표적화된 통합을 위한 부위에 충분히 가까이 있어야 한다. 일부 구현예에서, 거리는 10, 25, 50, 100, 200, 300, 350, 400 또는 500 개의 뉴클레오티드 이내이다. 일부 구현예에서, 파손이 말단 절제 중에 엑소핵산분해효소 매개 제거되는 영역 내에 있도록 파손이 표적 통합 부위에 충분히 가까이 있어야 할 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은, 절단 이벤트, 예를 들어, 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손이 변경, 예를 들어, 표적화된 삽입을 위한 부위가 될 바람직한 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 350, 400 또는 500 개의 뉴클레오티드 내에 위치하도록 구성된다. 파손, 예를 들어, 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손은, 변경, 예를 들어, 표적화된 삽입을 위한 부위가 될 바람직한 영역의 상류 또는 하류에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 변경될 바람직한 영역 내, 예를 들어, 2 개 이상의 돌연변이 뉴클레오티드에 의해 정의된 영역 내에 파손이 위치한다. 일부 구현예에서, 변경될 바람직한 영역에 바로 인접한, 예를 들어, 표적 통합 부위의 바로 상류 또는 하류에 파손이 위치한다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 파손은 제 2 gRNA 분자에 의해 배치된 추가 단일 가닥 파손에 동반된다. 예를 들어, 표적화 도메인은, 절단 이벤트, 예를 들어, 2 개의 단일 가닥 파손이 표적 통합 부위의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 350, 400 또는 500 개의 뉴클레오티드 내에 위치하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 gRNA 분자는 Cas9 틈내기효소를 안내할 때, 단일 가닥 파손이 원하는 영역의 변경을 초래하도록 서로 충분히 가깝고, 제 2 gRNA에 의해 위치되고, 추가 단일 가닥 파손이 동반되도록 구성된다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 gRNA 분자는, 예를 들어, Cas9가 틈내기효소인 경우, 상기 제 2 gRNA에 의해 위치된 단일 가닥 파손이 상기 제 1 gRNA 분자에 의해 위치된 파손의 10, 20, 30, 40 또는 50 개의 뉴클레오티드 내에 존재하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 2 개의 gRNA 분자는, 예를 들어, 본질적으로 이중 가닥 파손을 모방한, 상이한 가닥 상에 동일한 위치 또는 서로 몇 개의 뉴클레오티드 이내에 절단이 위치하도록 구성된다.
gRNA(단분자(또는 키메라) 또는 모듈식 gRNA) 및 Cas9 핵산분해효소가 HDR 매개 전이 유전자의 삽입 또는 정정을 유도하기 위한 목적으로 이중 가닥 파손을 유도하는 일부 구현예에서, 절단 부위, 예를 들어, 표적 부위는 표적 통합 부위에서 0-200 bp(예를 들어, 0-175, 0 내지 150, 0 내지 125, 0 내지 100, 0 내지 75, 0 내지 50, 0 내지 25, 25 내지 200, 25 내지 175, 25 내지 150, 25 내지 125, 25 내지 100, 25 내지 75, 25 내지 50, 50 내지 200, 50 내지 175, 50 내지 150, 50 내지 125, 50 내지 100, 50 내지 75, 75 내지 200, 75 내지 175, 75 내지 150, 75 내지 125, 75 내지 100 bp) 떨어져 있다. 일부 구현예에서, 절단 부위는 표적 부위에서 0-100 bp(예를 들어, 0 내지 75, 0 내지 50, 0 내지 25, 25 내지 100, 25 내지 75, 25 내지 50, 50 내지 100, 50 내지 75 또는 75 내지 100 bp) 떨어져 있다.
일부 구현예에서, 오버행을 갖는 파손을 생성하기 위해 틈내기효소를 사용함으로써 HDR을 촉진할 수 있다. 일부 구현예에서, 오버행의 단일 가닥 특성은 예를 들어, NHEJ와는 반대로 세포가 HDR에 의한 파손을 수선할 가능성을 향상시킬 수 있다.
구체적으로, 일부 구현예에서, HDR은 제 1 표적 부위에 대해 제 1 틈내기효소를 표적화하는 제 1 gRNA 및 제 1 표적 부위로부터 반대 DNA 가닥 상에 있고 제 1 닉을 상쇄하는, 제 2 표적 부위에 대해 제 2 틈내기효소를 표적화하는 제 2 gRNA를 선택함으로서 촉진된다. 일부 구현예에서, gRNA 분자의 표적화 도메인은 절단 이벤트가 미리 선택된 뉴클레오티드, 예를 들어, 암호화 영역의 뉴클레오티드로부터 충분히 멀리 떨어져 위치하도록 구성되어 뉴클레오티드가 변경되지 않는다. 일부 구현예에서, gRNA 분자의 표적화 도메인은 인트론의 절단 이벤트가 인트론/엑손 경계 또는 자연적으로 발생하는 스플라이스 신호로부터 충분히 멀리 떨어져 위치하도록 구성되어 엑손 서열의 변경 또는 원하지 않는 스플라이스 이벤트를 방지한다. 일부 구현예에서, gRNA 분자의 표적화 도메인은 초기 엑손에 위치하도록 구성되어, 하나 이상의 표적 부위(들) 중 하나 또는 그 근처에서 전이 유전자의 인-프레임 통합을 허용한다.
일부 구현예에서, 이중 가닥 파손은 제 2 gRNA 분자에 의해 위치된, 추가 이중 가닥 파손을 동반할 수 있다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 파손은 제 2 gRNA 분자 및 제 3 gRNA 분자에 의해 위치된, 2개의 추가 단일 가닥 파손을 동반할 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 gRNA, 예를 들어, 독립적으로, 단분자, 키메라 또는 모듈식 gRNA는, 표적 통합 부위, 예를 들어, 표적화된 통합을 위한 부위의 양쪽 모두에 이중 가닥 파손이 위치하도록 구성된다.
2. 주형 폴리뉴클레오티드
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열, 및 표적화된 통합을 위한 내인성 게놈 부위에서 또는 그 근처에서 서열에 상동성인 상동성 서열(예를 들어, 상동성 암)을 포함하는 전이 유전자, 예를 들어, 외인성 또는 이종성 핵산 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드는 세포 DNA 수선 과정에 수반되는 분자 및 기계, 예를 들어, 상동성 재조합을 수선 주형으로서 사용할 수 있다. 일부 측면에서, 내인성 DNA 내의 하나 이상의 표적 부위(들)에서 또는 그 근처의 서열과 상동성을 갖는 주형 폴리뉴클레오티드는 형질전환(transgenic) 또는 외인성 서열, 예를 들어, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 외인성 핵산 서열의 표적화된 삽입을 위해, 표적 DNA의 구조, 예를 들어, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서의 표적 부위를 변경하는데 사용될 수 있다. 또한, 예를 들어, 전이 유전자의 상동성-지시된 수선(HDR) 매개된 표적화된 통합을 위한 주형으로서 본원에서 제공된 방법에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 핵산 서열; 및 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암(들)을 포함하며, 여기서 하나 이상의 상동성 암(들)은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전이 유전자(외인성 또는 이종성 핵산 서열)에 연결되고/되거나 그에 플랭킹(flanking)하는 하나 이상의 상동성 서열(예를 들어, 상동성 암)을 함유한다. 일부 구현예에서, 상동성 서열은 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 외인성 서열을 표적화하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 세포의 게놈 내로의 삽입 또는 통합을 위한 상동성 암 사이의 핵산 서열, 예를 들어, 전이 유전자를 포함한다. 주형 폴리뉴클레오티드 내의 전이 유전자는 프로모터 또는 다른 조절 요소를 갖거나 갖지 않는 기능성 폴리펩티드(예를 들어, 재조합 수용체 또는 이의 일부)를 암호화하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위의 구조를 변경시키기 위해 유전자 파괴를 도입할 수 있는 하나 이상의 제제(들)와 함께 사용될 수 있는 핵산 서열이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 상동성-지시된 수선 사건에 의해 표적 부위의 구조, 예를 들어, 전이 유전자의 삽입을 변경시킨다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위의 서열을 변경하여, 예를 들어, 상동성 암 사이의 전이 유전자의 세포의 게놈 내로의 삽입 또는 통합을 초래한다. 일부 측면에서, 표적화된 통합은 전이 유전자의 암호화 부분을 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손과 인-프레임 통합, 예를 들어, 통합 부위에서 인접 엑손과 인-프레임 통합을 초래한다. 예를 들어, 일부 경우에, 인-프레임 통합은 내인성 오픈 리딩 프레임의 일부 및 재조합 수용체 또는 그의 일부가 발현되게 하고, 일부 경우에는 2A 요소와 같은 멀티시스트로닉 요소에 의해 분리된다. 따라서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 및 재조합 수용체 또는 이의 일부에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 발현할 수 있으며, 이는 멀티시스트로닉 요소에 의해 2개의 상이한 폴리펩티드로 분리될 수 있다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 유전자 파괴를 도입할 수 있는 하나 이상의 제제(들)에 의해 절단되는 표적 서열 상의 부위에 상응하거나 그와 상동성인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 유전자 파괴를 도입할 수 있는 제 1 제제에서 절단되는 표적 서열 상의 제 1 부위, 및 유전자 파괴를 도입할 수 있는 제 2 제제에서 절단되는 표적 서열 상의 제 2 부위에 상응하거나 또는 둘 다에 상동성인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 하기 성분을 포함한다: [5' 상동성 암]-[전이 유전자(외인성 또는 이종성 핵산 서열, 예를 들어, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 코딩함)]-[3' 상동성 암]. 상동성 암은 염색체 내로의 재조합을 제공하고, 따라서 예를 들어, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 절단 부위, 예를 들어, 표적 부위(들)에서 또는 그 근처의 게놈 DNA 내로 효과적으로 삽입 또는 통합시킨다. 일부 구현예에서, 상동성 암은 유전자 파괴의 표적 부위에서 서열을 플랭킹한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 부분 및 이중 가닥 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 벡터 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 DNA이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 DNA이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 RNA이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 RNA이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 부분 및 이중 가닥 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 벡터 내에 포함된다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드는 재조합 수용체 또는 이의 일부, 예를 들어, CAR 또는 그의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유하고/하거나 이를 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 전이 유전자는 T 세포 자극-연관된 유전자 생성물을 암호화하는 내인성 유전자, 유전자 좌, 또는 오픈 리딩 프레임 내에 있는 표적 부위(들)에서 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 오픈 리딩 프레임 내의 통합을 위해, 예를 들어, 암호화된 T 세포 자극-연관된 유전자 생성물의 전부 또는 일부의 발현을 초래하도록 표적화된다.
삽입을 위한 폴리뉴클레오티드는 또한 "전이 유전자(transgene)" 또는 "외인성 서열(exogenous sequences)" 또는 "도너(donor)" 폴리뉴클레오티드 또는 분자로 지칭될 수 있다. 주형 폴리뉴클레오티드는 DNA, 단일 가닥 및/또는 이중 가닥일 수 있으며 선형 또는 원형 형태로 세포에 도입될 수 있다. 주형 폴리뉴클레오티드는 DNA, 단일-가닥 및/또는 이중-가닥일 수 있고, 선형 또는 원형 형태로 세포내로 도입될 수 있다. 주형 폴리뉴클레오티드는 RNA 단일-가닥 및/또는 이중-가닥일 수 있고, RNA 분자 (예를 들어, RNA 바이러스의 일부)로서 도입될 수 있다. 또한, 문헌 [미국특허출원공개공보 제20100047805호 및 제20110207221호]을 또한 참조한다. 주형 폴리뉴클레오티드는 또한 DNA 형태로 도입될 수 있으며, 이는 원형 또는 선형 형태로 세포에 도입될 수 있다. 선형 형태로 도입되는 경우, 주형 폴리뉴클레오티드의 말단은 공지된 방법에 의해 (예를 들어, 엑소뉴클레오리틱(exonucleolytic) 분해로부터) 보호될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오티드 잔기가 선형 분자의 3' 말단에 추가되고/되거나 자기 상보성 올리고뉴클레오티드가 한쪽 또는 양쪽 말단에 결찰된다. 예를 들어, 문헌 [Chang 등, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls 등, (1996) Science 272:886-889]을 참조한다. 외인성 폴리뉴클레오티드를 분해로부터 보호하기 위한 추가 방법은 말단 아미노기(들)의 첨가 및 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기와 같은 변형된 뉴클레오티드 내 연결의 사용을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이중 가닥 형태로 도입되는 경우, 주형 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 핵산분해효소 표적 부위(들), 예를 들어, 세포의 게놈에 통합될 전이 유전자 측면에 있는 핵산분해효소 표적 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [미국특허출원공개공보 제20130326645호]을 참조한다.
일부 구현예에서, 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오티드는 길이가 1kb 초과, 예를 들어, 2 내지 200kb, 2 내지 10kb(또는 이들 사이의 임의의 수치)의 서열(또한 전이 유전자로도 지칭됨)를 포함한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 핵산이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 DNA에 추가되거나 표적 DNA에서 변화의 주형이 될 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위를 변경하는데 사용될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 세포의 게놈 내로 전이 유전자를 복제 또는 삽입하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 DNA, 예를 들어, 표적 부위의 야생형 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 선형 이중 가닥 DNA이다. 길이는 예를 들어, 약 200-5000 염기쌍, 예를 들어, 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 4000 또는 5000 개의 염기쌍일 수 있다. 길이는 예를 들어, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 4000 또는 5000 개 이상의 염기쌍일 수 있다. 일부 구현예에서, 길이는 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 4000 또는 5000 개 이하의 염기쌍이다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오티드는 (약) 160개 초과의 염기쌍, 예를 들어, 약 200-4000, 300-3500, 400-3000, 500-2500, 600-2000, 700-1900, 800-1800, 900-1700, 1000-1600, 1100-1500 또는 1200-1400 개의 염기쌍 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 (약) 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750 또는 4000 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들 중 임의의 것들 사이의 임의의 값이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 (약) 1500 내지 (약) 2500 개의 뉴클레오티드 또는 (약) 1750 내지 (약) 2250 개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 약 2000 ± 250, 2000 ± 200, 2000 ± 150, 2000 ± 100 또는 2000 ± 50 개의 뉴클레오티드 길이이다.
여기에 기재된 주형 폴리뉴클레오티드에 함유된 전이 유전자는 PCR과 같은 공지된 표준 기술을 사용하여 플라스미드, 세포 또는 기타 공급원으로부터 단리될 수 있다. 사용을 위한 주형 폴리뉴클레오티드는 원형 슈퍼코일(circular supercoiled), 원형 풀린(circular relaxed), 선형 등을 포함한 다양한 유형의 토폴로지(topology)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 이들은 표준 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 주형 폴리뉴클레오티드는 메틸화될 수 있거나 메틸화가 없을 수 있다. 주형 폴리뉴클레오티드는 세균 또는 효모 인공 염색체(BAC 또는 YAC)의 형태일 수 있다.
주형 폴리뉴클레오티드는 선형 단일 가닥 DNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 (i) 표적 DNA의 닉 가닥에 어닐링할 수 있는 선형 단일 가닥 DNA, (ii) 표적 DNA의 손상되지 않은 가닥에 어닐링할 수 있는 선형 단일 가닥 DNA, (iii) 표적 DNA의 전사 가닥에 어닐링할 수 있는 선형 단일 가닥 DNA, (iv) 표적 DNA의 비-전사 가닥에 어닐링할 수 있는 선형 단일 가닥 DNA 또는 상기 중 하나 이상이다.
길이는 예를 들어, 약 200-5000 개의 염기쌍, 예를 들어, (약) 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 4000 또는 5000 개의 뉴클레오티드일 수 있다. 길이는 예를 들어, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 4000 또는 5000 개 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 길이는 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 4000 또는 5000 개 이하의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 주형 폴리뉴클레오티드는 약 160개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 약 200-4000, 300-3500, 400-3000, 500-2500, 600-2000, 700-1900, 800-1800, 900-1700, 1000-1600, 1100-1500 또는 1200-1400 개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 원형 이중 가닥 DNA, 예를 들어, 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 전이 유전자 및/또는 표적 부위의 양쪽에 약 500 내지 1000 개의 상동성 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5', 표적 부위 또는 전이 유전자의 3' 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5' 및 3' 둘 다에 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개의 상동성 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5', 표적 부위 또는 전이 유전자의 3' 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5' 및 3' 둘 다에 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개 이상의 상동성 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5', 표적 부위 또는 전이 유전자의 3' 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5' 및 3' 둘 다에 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개 이내의 상동성 염기쌍을 포함한다.
a. 전이 유전자
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 재조합 수용체 또는 그의 일부, 예를 들어, 본원, 예를 들어, 섹션 IV.B에 기재된 임의의 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자, 또는 이러한 재조합 수용체의 하나 이상의 영역, 도메인 또는 사슬을 함유한다.
일부 측면에서, 전이 유전자는 세포외 결합 도메인, 막관통 도메인 및/또는 세포내 영역을 포함하는 재조합 수용체를 암호화한다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 재조합 수용체의 전부 또는 일부를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 본원, 예를 들어, 섹션 IV.B에 기재된 임의의 재조합 수용체, 또는 그의 하나 이상의 영역, 도메인 또는 사슬을 암호화한다. 일부 측면에서, 전이 유전자를 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내로 통합시, 생성된 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 재조합 수용체, 예를 들어, 본원, 예를 들어, 섹션 IV.B에 기재된 임의의 재조합 수용체, 또는 그의 하나 이상의 영역, 도메인 또는 사슬을 암호화한다. 예를 들어, 전이 유전자는 공-자극 신호전달 도메인, 및 다른 도메인 또는 그의 일부를 포함할 수 있는 세포외 영역, 막관통 도메인, 및 세포내 영역 중 하나 이상을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 게놈 내의 표적 위치에 삽입되거나 통합되는 암호화 및/또는 비-암호화 서열 및/또는 그의 부분 암호화 서열을 포함하는, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 관심 핵산 서열인 전이 유전자는 또한 "전이 유전자," "전이 유전자 서열," "외인성 핵산 서열," "이종성 서열" 또는 "공여자 서열"로 지칭될 수 있다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 내인성 게놈 서열, 예를 들어, T 세포, 예를 들어, 인간 T 세포의 게놈 내의 특정 표적 유전자 좌 또는 표적 위치에서의 내인성 게놈 서열에 대해 외인성 또는 이종성인 핵산 서열이다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 T 세포, 예를 들어, 인간 T 세포의 표적 유전자 좌 또는 표적 위치에서의 내인성 게놈 서열과 비교하여 변형되거나 상이한 서열이다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 상이한 유전자, 종 및/또는 기원으로부터 유래되거나 상이한 유전자, 종 및/또는 기원으로부터의 핵산 서열과 비교하여 변형되는 핵산 서열이다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 상이한 유전자 좌로부터의 서열, 예를 들어, 동일한 종의 상이한 게놈 영역 또는 상이한 유전자로부터 유래된 서열이다. 일부 측면에서, 예시적인 재조합 수용체는 본원, 예를 들어, 섹션 IV.B에 기재된 임의의 것이 포함된다.
일부 구현예에서, 핵산분해효소-유도 HDR은 표적화된 삽입을 위한 전이 유전자의 발현을 위한 전이 유전자("외인성 서열(exogenous sequence)" 또는 "전이 유전자 서열(transgene sequence)"로도 명명)의 삽입을 초래한다. 주형 폴리뉴클레오티드 서열은 전형적으로 그것이 배치된 게놈 서열과 동일하지 않다. 주형 폴리뉴클레오티드 서열은 관심 위치에서 효율적인 HDR을 허용하도록 2개의 상동성 영역이 측면에 있는 비상동성 서열을 함유할 수 있다. 또한, 주형 폴리뉴클레오티드 서열은 세포 염색질에서 관심 영역과 상동성이 아닌 서열을 함유하는 벡터 분자를 포함할 수 있다. 주형 폴리뉴클레오티드 서열은 세포 염색질에 대해 여러 불연속적인 상동성 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 관심 영역에 정상적으로 존재하지 않는 서열의 표적화된 삽입을 위해, 상기 서열은 전이 유전자에 존재할 수 있고 관심 영역의 서열에 대한 상동성 영역이 측면에 있을 수 있다.
일부 측면에서, 전이 유전자는 내인성 게놈 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임에 대해 T 세포, 일부 경우에 인간 T 세포에 외인성 또는 이종성인 서열이다. 일부 측면에서, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 표적 부위 근처의 서열에 상동성인 하나 이상의 상동성 암(들)에 연결된 전이 유전자를 함유하는 주형 폴리뉴클레오티드의 존재 하에 HDR은 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 초래한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 재조합 수용체의 다양한 영역, 도메인 또는 사슬, 예를 들어, 본원의 섹션 IV.B에 기재된 재조합 수용체 또는 다양한 영역, 도메인 또는 사슬의 전부 또는 일부를 암호화한다.
일부 측면에서, 전이 유전자는 상이한 유전자, 종 및/또는 기원으로부터의 상이한 핵산 서열을 연결함으로써 생성된 서열을 포함하는 키메라 서열이다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 결합되거나(joined) 연결된(linked) 상이한 유전자, 암호화 서열 또는 엑손 또는 그의 일부로부터의 상이한 영역 또는 도메인 또는 그의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 함유한다. 일부 측면에서, 표적화 통합을 위한 전이 유전자는 폴리펩티드 또는 그의 단편을 암호화한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 키메라 수용체, 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 그의 일부, 예를 들어, 도메인 또는 그의 영역인 재조합 수용체를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 재조합 수용체, 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR)의 다양한 영역 또는 도메인을 암호화한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 CAR의 모든 도메인 또는 영역을 포함하는 전체 CAR, 또는 전장(full-length) CAR을 암호화한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 예를 들어, 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 영역, 예를 들어, CAR의 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 또한 막관통 영역 또는 막 결합 영역(membrane association region), 예를 들어, CAR의 막관통 영역을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 또한 세포외 영역, 예를 들어, CAR의 세포외 영역을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 CAR의 일부, 예를 들어, CAR의 하나 이상의 도메인 또는 영역을 암호화한다. 일부 구현예에서, CAR은 다중-사슬 CAR이고, 전이 유전자는 다중-사슬 CAR의 하나 이상의 사슬을 암호화한다. 일부 구현예에서, CAR은 다중-사슬 CAR이고, 전이 유전자는 다중-사슬 CAR의 하나의 사슬을 암호화한다. 일부 구현예에서, 제공된 조작된 세포 내의 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 통합된 전이 유전자가 재조합 수용체, 예를 들어, CAR의 일부를 암호화하는 경우, 재조합 수용체의 나머지 부분은 조작된 세포의 게놈 내의 상이한 위치에 존재하는 제 2 전이 유전자에 의해 암호화될 수 있다(예를 들어, 상이한 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, 또는 상이한 위치). 예시적인 키메라 수용체는 하기 섹션 IV.B.1 및 IV.B.3에 기재된 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 재조합 수용체, 예를 들어, 재조합 T 세포 수용체(TCR), 또는 이의 일부, 예를 들어, 이의 도메인, 영역 또는 사슬을 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 재조합 TCR이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어, 재조합 TCR은 2개 이상의 별개의 폴리펩티드 사슬, 예를 들어, TCR 알파(TCRα) 및 TCR 베타(TCRβ) 사슬을 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 재조합 TCR의 하나 이상의 사슬, 예를 들어, TCRα 또는 TCRβ 또는 둘 다를 암호화할 수 있다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 전체 재조합 TCR, 예를 들어, 재조합 TCR의 둘 다의 사슬, 예를 들어, TCRα 사슬 및 TCRβ 사슬 둘 다를 암호화할 수 있다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 재조합 TCR 중의 하나의 사슬, 예를 들어, TCRα 사슬 또는 TCRβ 사슬을 암호화할 수 있다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 재조합 TCR의 하나 이상의 영역 또는 도메인, 예를 들어, TCRα 또는 TCRβ의 세포내 영역, 막관통 영역 및/또는 세포외 영역 또는 둘 다를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 조작된 세포 내의 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 통합된 전이 유전자가 재조합 수용체의 일부, 예를 들어, 재조합 TCR 중의 하나의 사슬, 재조합 수용체의 나머지 부분, 예를 들어, 재조합 TCR의 다른 사슬을 암호화하는 경우, 조작된 세포의 게놈 내의 상이한 위치에 존재하는 제 2 전이 유전자에 의해 암호화될 수 있다(예를 들어, 상이한 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, 또는 상이한 위치). 일부 구현예에서, 제공된 조작된 세포 내의 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 통합된 전이 유전자가 재조합 수용체의 일부, 예를 들어, 재조합 TCR 중의 하나의 도메인, 재조합 수용체의 나머지 부분, 예를 들어, 재조합 TCR의 다른 나머지 도메인을 암호화하는 경우, 조작된 세포의 게놈 내의 상이한 위치에 존재하는 제 2 전이 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 일부 측면에서, TCRα 및 TCRβ를 암호화하는 서열은 일부 경우에 멀티시스트로닉 요소, 예를 들어, 2A 요소에 의해 분리된다. 예시적인 재조합 TCR은 하기 섹션 III.B.4에 기재된 것들을 포함한다.
일부 측면에서, 전이 유전자는 또한 비-암호화, 조절 또는 제어 서열, 예를 들어, 암호화된 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 폴리펩티드를 변형시키는데 필요한 서열의 발현을 허용, 조정(modulating) 및/또는 조절(regulating)하는데 필요한 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 전이 유전자가 게놈 서열로부터 유래되는 경우에 게놈 내의 상응하는 핵산과 비교하여 인트론을 포함하지 않거나 또는 하나 이상의 인트론이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 인트론을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 서열을 함유하며, 여기서 전이 유전자의 전부 또는 일부는 예를 들어, 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다.
일부 구현예에서, 암호화 및 비-암호화 영역을 포함하는 전이 유전자의 길이는 (약) 100 내지 (약) 10,000개의 염기쌍, 예를 들어, 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 또는 10000개의 염기쌍이다. 일부 구현예에서, 전이 유전자의 길이는 세포 또는 바이러스 벡터의 능력 내로 제조, 합성 또는 조립 및/또는 도입될 수 있는 폴리뉴클레오티드의 최대 길이에 의해 제한된다. 일부 측면에서, 전이 유전자의 길이는 주형 폴리뉴클레오티드의 최대 길이 및/또는 필요한 하나 이상의 상동성 암(들)의 길이에 따라 달라질 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴-유도 HDR은 게놈 내의 표적 위치에서 전이 유전자의 삽입 또는 통합을 초래한다. 주형 폴리뉴클레오티드 서열은 전형적으로 그것이 표적화되는 게놈 서열과 동일하지 않다. 주형 폴리뉴클레오티드 서열은 관심 위치에서 효율적인 HDR을 허용하기 위해 상동성의 2개의 영역에 의해 플랭킹된(flanked) 전이 유전자를 함유할 수 있다. 주형 폴리뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA에 대한 상동성의 여러 불연속 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 관심 영역에 정상적으로 존재하지 않는 서열의 표적화 삽입을 위해, 상기 서열은 전이 유전자 내에 존재할 수 있고, 관심 영역 내의 서열에 대한 상동성의 영역에 의해 플랭킹될 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 재조합 수용체 또는 그의 일부, 예를 들어, 세포외 결합 도메인, 막관통 도메인 및/또는 세포내 영역의 일부 중 하나 이상을 암호화한다.
일부 측면에서, HDR에 의한 전이 유전자의 표적화 통합시, 세포의 게놈은 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 함유한다. 일부 측면에서, 전체 재조합 수용체는 전이 유전자에 의해 암호화된다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 또한 다른 분자 및/또는 조절 또는 제어 요소, 예를 들어, 외인성 프로모터 및/또는 하나 이상의 멀티시스트로닉 요소를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 또한 신호 펩티드를 암호화하는 신호 서열, 조절 또는 제어 요소, 예를 들어, 프로모터, 및/또는 하나 이상의 멀티시스트로닉 요소, 예를 들어, 리보솜 스킵 요소(ribosome skip element) 또는 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site; IRES)를 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 서열은 재조합 수용체를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열의 5'에 배치될 수 있다.
전이 유전자에 의해 암호화되는 예시적인 영역, 도메인 또는 사슬이 하기에서 기재되며, 또한 본원의 섹션 IV.B에 기재된 임의의 영역 또는 도메인일 수 있다.
(i) 신호 서열
일부 구현예에서, 전이 유전자는 신호 펩티드를 암호화하는 신호 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 신호 서열은 이종성 또는 비-천연 신호 펩티드, 예를 들어, 상이한 유전자 또는 종으로부터의 신호 펩티드 또는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 신호 펩티드와 상이한 신호 펩티드를 암호화할 수 있다. 일부 측면에서, 예시적인 신호 서열은 서열번호 24 또는 288에 제시된 GMCSFR 알파 사슬의 신호 서열 및 서열번호 25에 제시된 신호 펩티드를 암호화하는 신호 서열; 또는 서열번호 26에 제시된 CD8 알파 신호 펩티드를 포함한다. 발현된 재조합 수용체의 성숙 형태에서, 신호 서열은 폴리펩티드의 나머지 부분으로부터 절단된다. 일부 측면에서, 신호 서열은 조절 또는 제어 요소, 예를 들어, 프로모터, 예를 들어, 이종성 프로모터, 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌로부터 유래되지 않은 프로모터의 3'에 배치된다. 일부 측면에서, 신호 서열은 하나 이상의 멀티시스트로닉 요소(들), 예를 들어, 리보솜 스킵 서열 및/또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열의 3'에 배치된다. 일부 측면에서, 신호 서열은 전이 유전자에서 세포외 영역의 하나 이상의 성분을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열의 5'에 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 신호 서열은 전이 유전자에 존재하는 가장 높은 5' 영역을 포함하고, 상동성 암 중 하나에 연결된다. 일부 측면에서, 전이 유전자에 의해 암호화되는 신호 서열은 본원에 기재된 임의의 신호 서열을 포함한다.
(ii) 예시적인 재조합 수용체-암호화 서열
일부 측면에서, 표적화된 통합을 위한 전이 유전자는 키메라 수용체, 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 키메라 자가 항체 수용체(CAAR)인 재조합 수용체를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 결합되거나 또는 연결되는, 상이한 유전자, 암호화 서열 또는 엑손 또는 이의 일부로부터의 것일 수 있는, 키메라 수용체의 상이한 영역 또는 도메인 또는 부분을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체, 예를 들어, CAR은 하나 이상의 영역 또는 도메인, 예를 들어, 세포외 영역(예를 들어, 하나 이상의 세포외 결합 도메인(들) 및/또는 스페이서를 함유함), 막관통 도메인 및/또는 세포내 영역(예를 들어, 1차 신호전달 영역 또는 도메인 및/또는 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인을 함유함) 중의 하나 이상을 함유한다. 일부 측면에서, 암호화된 CAR은 다른 도메인, 예를 들어, 다량체화 도메인 또는 링커를 추가로 함유한다.
일부 측면에서, 전이 유전자에서, 세포외 영역을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 신호 서열과 스페이서를 암호화하는 뉴클레오티드 사이에 위치한다. 일부 측면에서, 전이 유전자에서, 세포외 다량체화 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열과 스페이서를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 사이에 배치된다. 일부 측면에서, 스페이서를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열과 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 사이에 배치된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 5'에서 3' 순서로 세포외 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 뉴클레오티드 서열 막관통 도메인(또는 막 결합 도메인) 및 뉴클레오티드 서열 세포내 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 CAR이고, 세포외 영역을 암호화하는 전이 유전자는 5'에서 3' 순서로 세포외 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 스페이서를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 또한 결합 도메인 및/또는 스페이서를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것의 5' 또는 3'에 위치될 수 있는 하나 이상의 세포외 다량체화 도메인(들)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및/또는 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'을 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 또한 전형적으로 세포외 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치한 신호 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 전이 유전자에서, 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 신호 서열과 스페이서를 암호화하는 뉴클레오티드 사이에 위치한다. 일부 측면에서, 전이 유전자에서, 세포외 다량체화 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열과 스페이서를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 사이에 배치된다. 일부 측면에서, 스페이서를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열과 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 사이에 배치된다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 함유하며, 이는 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인(들) 및/또는 1차 신호전달 도메인 또는 영역을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 또한 하나 이상의 멀티시스트로닉 요소(들), 예를 들어, 리보솜 스킵 서열 및/또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 또한 조절 또는 제어 요소, 예를 들어, 프로모터, 전형적으로 전이 유전자의 최대 5' 부분, 예를 들어, 신호 서열의 5' 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 추가 분자(들) 또는 추가 도메인 또는 영역을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 폴리뉴클레오티드의 전이 유전자 부분에 포함될 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 추가 분자(들) 또는 추가 도메인 또는 영역을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 CAR의 하나 이상의 영역(들) 또는 도메인(들) 또는 사슬(들)를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열의 5'에 배치될 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 추가 분자(들) 또는 추가 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열, 영역 또는 사슬은 CAR의 하나 이상의 영역을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열의 상류(upstream)이다.
전이 유전자에 의해 암호화되는 키메라 수용체의 예시적인 도메인 또는 영역은 하기 기재되며, 또한 하기 섹션 IV.B.1 및 IV.B.3에 기재된 예시적인 키메라 수용체의 임의의 영역 또는 도메인을 포함할 수 있다.
(a) 결합 도메인
일부 구현예에서, 전이 유전자는 특정 항원(또는 리간드)에 대한 특이성을 갖는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR의 일부, 예를 들어, 특정 세포 유형의 표면 상에서 발현되는 항원을 암호화한다. 일부 구현예에서, 항원은, 예를 들어, 건강한 세포 또는 조직에서 정상 또는 비-표적화 세포 또는 조직과 비교하여, 질환 또는 병태, 예를 들어, 종양 또는 병원성 세포의 세포 상에서 예를 들어, 발현되거나 과발현된다.
일부 측면에서, 전이 유전자는 재조합 수용체의 세포외 영역을 암호화한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 세포외 결합 도메인, 예를 들어, 항원 또는 리간드에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 암호화한다.
일부 구현예에서, 결합 도메인은 폴리펩티드, 리간드, 수용체, 리간드-결합 도메인, 수용체-결합 도메인, 항원, 에피토프, 항체, 항원-결합 도메인, 에피토프-결합 도메인, 항체-결합 도메인, 태그-결합 도메인 또는 상기 중 임의의 것의 단편이거나 이를 포함한다. 다른 구현예에서, 항원은 정상 세포 상에서 발현되고/되거나 조작된 세포 상에서 발현된다. 일부 측면에서, 항원은 결합 도메인, 예를 들어, 리간드 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인에 의해 인식된다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 하나 이상의 결합 도메인(들)을 함유하는 세포외 영역을 암호화한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자에 의해 암호화되는 예시적인 결합 도메인은 항체 및 그의 항원-결합 단편, 예를 들어, scFv 또는 sdAb를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원-결합 단편은 가요성 링커에 의해 연결된 항체 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 결합 도메인은 단일 사슬 가변 단편(scFv)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 도메인은 단일 도메인 항체(sdAb)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 도메인은 질환, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직 상에서 연관되고/되거나, 그에 특이적으로 및/또는 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 질환, 장애 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환, 또는 종양 또는 암이다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 종양 항원이다.
전이 유전자에 의해 암호화되는 예시적인 항원 및 항원- 또는 리간드-결합 도메인은 본원에서 섹션 IV.B.1에 기재된 것들을 포함한다. 일부 측면에서, 암호화된 재조합 수용체는 주요 조직적합성 복합체(MHC)-펩티드 복합체로서 세포 표면 상에 제시된, TCR-유사 항체 또는 이의 단편, 예를 들어, 세포내 항원, 예를 들어, 종양-관련 항원을 특이적으로 인식하는 scFv이거나 이를 포함하는 결합 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 TCR-유사 항체 또는 이의 단편인 결합 도메인을 암호화할 수 있다. 따라서, 암호화된 재조합 수용체는 TCR-유사 CAR, 예를 들어, 섹션 IV.B에 기재된 임의의 것이다. 일부 구현예에서, 결합 도메인은 다중-특이적, 예를 들어, 이중-특이적 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 자가항체에 결합하는 항원인 결합 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 키메라 자가항체 수용체(CAAR), 예를 들어, 섹션 IV.B3에 기재된 임의의 것이다.
일부 측면에서, 하나 이상의 결합 도메인(들)을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은, 존재하는 경우, 전이 유전자에서 신호 서열의 3'에 배치될 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 결합 도메인(들)을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 전이 유전자에서 하나 이상의 조절 또는 제어 요소(들)를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열의 3'에 배치될 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 결합 도메인(들)을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은, 존재하는 경우, 전이 유전자에서 스페이서를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열의 5'에 배치될 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 결합 도메인(들)을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 전이 유전자에서 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열의 5'에 배치될 수 있다.
(b)
스페이서
및
막관통
도메인
일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 CAR이고, 전이 유전자는 스페이서를 암호화하는 서열 및/또는 막관통 도메인 또는 이의 일부를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체의 세포외 영역은 스페이서를 포함하고, 일부 경우에 스페이서는 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 작동가능하게 연결된다. 일부 측면에서, 스페이서 및/또는 막관통 도메인은 리간드-(예를 들어, 항원-) 결합 도메인 및 재조합 수용체의 다른 영역 또는 도메인, 예를 들어, 세포내 영역(예를 들어, 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인(들), 세포내 다량체화 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인 또는 영역을 함유함)을 함유하는 세포외 부분을 연결할 수 있다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 항원-결합 도메인 및 막관통 도메인을 분리하는 스페이서 및/또는 힌지 영역을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 더 포함한다. 일부 측면에서, 스페이서는 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 변이체 또는 변형된 버전, 예를 들어, 힌지 영역, 예를 들어, IgG4 힌지 영역, 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역의 적어도 일부일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 인간 IgG, 예를 들어, IgG4 또는 IgG1의 것이다. 일부 측면에서, 불변 영역의 부분은 결합 도메인, 예를 들어, scFv, 및 막관통 도메인 사이의 스페이서 영역으로서 기능한다. 전이 유전자에 의해 암호화될 수 있는 예시적인 스페이서는 IgG4 힌지 단독, CH2 및 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지, 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지, 및 문헌 [Hudecek 등, (2013) Clin . Cancer Res., 19:3153], [Hudecek 등, (2015) Cancer Immunol Res. 3(2): 125-135] 또는 국제공개공보 제WO2014031687호에 기재된 것들, 또는 본원의 섹션 IV.B.1에 기재된 임의의 것을 포함한다.
일부 측면에서, 스페이서를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 전이 유전자에서 하나 이상의 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열의 3'에 배치될 수 있다. 일부 측면에서, 스페이서를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 전이 유전자에서 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열의 5'에 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 하나 이상의 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열과 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 사이에 배치된다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는, 예를 들어, 하나 이상의 결합 도메인 및/또는 스페이서를 함유하는 세포외 영역을, 예를 들어, 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인(들), 세포내 다량체화 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인 또는 영역을 함유하는 세포내 영역과 연결할 수 있는, 막관통 도메인을 암호화한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함하고, 일부 경우에, 막관통 도메인은 인간이거나 또는 인간 단백질로부터의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD4, CD28, 또는 CD8로부터 유래된 막관통 도메인이거나, 또는 이를 포함하고, 일부 경우에 인간 CD4, 인간 CD28 또는 인간 CD8로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD28로부터 유래된 막관통 도메인이거나, 또는 이를 포함하고, 일부 경우에 인간 CD28로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 세포외 영역을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열에 융합된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열에 융합된다. 일부 측면에서, 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 전이 유전자에서 하나 이상의 결합 도메인 및/또는 스페이서를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열의 3'에 배치될 수 있다. 일부 측면에서, 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 전이 유전자에서 예를 들어, 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인(들), 세포내 다량체화 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인 또는 영역을 함유하는 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열의 5'에 배치될 수 있다. 일부 측면에서, 전이 유전자에 의해 암호화되는 막관통 도메인은 본원, 예를 들어, 섹션 IV.B.1에 기재된 임의의 막관통 도메인을 포한다.
일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체가 1차 신호전달 도메인 또는 영역을 포함하지만 막관통 도메인 및/또는 세포외 영역을 포함하지 않는 세포내 영역을 포함하는 경우, 전이 유전자는 막 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열, 예를 들어, 본원, 예를 들어, 섹션 IV.B.2에 기재된 임의의 것을 포함할 수 있다.
(c)
세포내
영역
일부 구현예에서, 전이 유전자는 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 CAR을 암호화하고, 일부 측면에서, 세포내 영역은 하나 이상의 2차 또는 공-자극 신호전달 영역을 포함한다. 일부 측면에서, 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 전이 유전자에서 하나 이상의 결합 도메인 및/또는 스페이서를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열의 3'에 배치될 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 1차 신호전달 도메인 또는 영역을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열의 5'에 배치될 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 1차 신호전달 도메인 또는 영역을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열의 3'에 배치될 수 있다. 일부 측면에서, 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 전이 유전자에서 가장 많은 3' 영역이고, 이는 이어서 상동성 암 서열 중 하나, 예를 들어, 3' 상동성 암 서열에 연결된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 전이 유전자에서 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열의 3'에 배치될 수 있다. 일부 측면에서, 전이 유전자에 의해 암호화되는 공-자극 신호전달 영역 또는 1차 신호전달 도메인 또는 영역은 임의의 공-자극 신호전달 영역 또는 본원, 예를 들어, 섹션 IV.B_1에 기재된 임의의 1차 신호전달 도메인 또는 영역을 포함한다.
(1) 공-자극 신호전달 도메인
일부 구현예에서, 전이 유전자는 세포내 영역의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함하고, 이는 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인(들)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 T 세포 공-자극 분자의 세포내 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 부분을 포함하고, 선택적으로 여기서 T 세포 공-자극 분자 또는 이의 신호전달 부분은 인간이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 T 세포 공-자극 분자의 세포내 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포 공-자극 분자 또는 이의 신호전달 부분은 인간이다.
일부 구현예에서, 전이 유전자에 의해 암호화되는 예시적인 공-자극 신호전달 도메인은 하나 이상의 공-자극 수용체, 예를 들어, CD28, CD137(4-1BB), OX40(CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D, ICOS 및/또는 다른 공-자극 수용체로부터의 신호전달 영역 또는 도메인, 예를 들어, 본원의 섹션 IVB에 기재된 임의의 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 세포내 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 인간 CD28, 인간 4-1BB, 인간 ICOS 또는 이의 신호전달 부분의 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 인간 4-1BB의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
(2) 1차 신호전달 영역 또는 도메인
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 암호화하는 전이 유전자는 1차 신호전달 영역 또는 도메인, 예를 들어, CD3제타의 세포질 도메인(CD3ζ)을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 1차 신호전달 영역은 T 세포에서 1차 활성화 신호를 자극 및/또는 유도할 수 있는 신호전달 도메인, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호전달 도메인(예를 들어, CD3-제타(CD3ζ) 사슬 또는 그의 기능적 변이체 또는 신호전달 부분의 세포내 신호전달 도메인 또는 영역) 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 본원, 예를 들어, 섹션 IVB에 기재된 임의의 것이다.
일부 측면에서, 전이 유전자는 TCR 복합체의 1차 자극 및/또는 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호 전달 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호 전달 영역(들)은 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호 전달 모티프를 함유할 수 있다. 1차 세포질 신호 전달 영역(들)을 함유하는 ITAM의 예는 TCR 또는 CD3 제타(CD3ζ), Fc 수용체(FcR) 감마 또는 FcR 베타에서 유래된 것을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR의 세포질 신호 전달 영역 또는 도메인은 CD3 제타에서 유래된 세포질 신호 전달 도메인, 이의 부분 또는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 세포내(또는 세포질) 신호 전달 영역은, 인간 CD3 사슬, 선택적으로 CD3 제타 자극성 신호 전달 도메인 또는 이의 기능성 변이체, 예컨대 인간 CD3ζ의 동형 단백질 3(수탁 번호: P20963.2)의 112 AA 세포질 도메인 또는 문헌 [미국 특허 번호 7,446,190 또는 미국 특허 번호 8,911,993]에 기재된 바와 같은 CD3 제타 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은, 서열번호 13, 14 또는 15에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 13, 14 또는 15에 대해 (약) 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 전이 유전자에 의해 암호화되는 1차 신호전달 도메인 또는 영역은 본원에 기재된 임의의 1차 신호전달 도메인 또는 영역, 예를 들어 섹션 IV.B.1에 포함된다.
(d) 추가의 도메인, 예를 들어,
다량체화
도메인
일부 구현예에서, 전이 유전자는 또한 하나 이상의 다량체화 도메인(들), 예를 들어 이량체화 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 암호화된 다량체화 도메인은 세포외 또는 세포내일 수 있다. 일부 구현예에서, 암호화된 다량체화 도메인은 세포외이다. 일부 구현예에서, 암호화된 다량체화 도메인은 세포내이다. 일부 구현예에서, 전이 유전자에 의해 암호화된 세포내 영역의 부분은 다량체화 도메인, 선택적으로 이량체화 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 세포외 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 영역은 다량체화 도메인, 선택적으로 이량체화 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 유도인자(inducer)에 대한 결합시 이량체화될 수 있다.
일부 측면에서, 재조합 수용체는 다중-사슬 재조합 수용체, 예컨대 다중-사슬 CAR이다. 일부 구현예에서, 다중-사슬 재조합 수용체의 하나 이상의 사슬 또는 이의 일부는 전이 유전자에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 다중-사슬 재조합 수용체의 하나 이상의 사슬은 재조합 수용체의 각 사슬에 포함된 다량체화 도메인의 다량체화에 의해 기능성 또는 활성 재조합 수용체를 함께 형성할 수 있다.
일부 측면에서, 다량체화 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 다른 도메인의 5' 또는 3'이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 암호화된 다량체화 도메인은 세포외이고, 다량체화 도메인을 암호화하는 서열은 스페이서를 암호화하는 서열의 5'이다. 일부 구현예에서, 암호화된 다량체화 도메인은 세포내이고, 다량체화 도메인을 암호화하는 서열은 1차 신호전달 영역 또는 도메인을 암호화하는 서열의 5'이다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 세포내이고, 다량체화 도메인을 암호화하는 서열은 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인(들)을 암호화하는 서열의 5' 또는 3'이다. 일부 구현예에서, 암호화된 다량체화 도메인은 유도인자의 결합시 다량체화(예를 들어, 이량체화)될 수 있다. 예시적인 암호화된 다량체화 도메인은 본원, 예를 들어 본원의 섹션 IV.B에 기재된 임의의 다량체화 도메인을 포함한다.
(iii) 예시적인 T 세포 수용체(
TCR
)-암호화 서열
일부 구현예에서, 전이 유전자에 의해 암호화된 재조합 수용체는 재조합 T 세포 수용체(TCR)이다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 재조합 TCR의 전부 또는 일부를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 재조합 TCR의 하나 이상의 사슬, 영역 또는 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 전이 유전자에 의해 암호화된 예시적인 재조합 TCR은 또한 하기 섹션 IV.B.4에 기재된 예시적인 재조합 TCR의 임의의 사슬, 영역 또는 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 2 개 이상의 별개의 폴리펩티드 사슬, 예를 들어, TCR 알파(TCRα) 및 TCR 베타(TCRβ) 사슬을 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 재조합 TCR의 하나 이상의 사슬, 예를 들어, TCRα 또는 TCRβ 또는 둘 다를 암호화할 수 있다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 TCRα 및 TCRβ 사슬 둘 다를 암호화할 수 있다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 TCRα 사슬 또는 TCRβ 사슬 중의 하나를 암호화할 수 있고, 조작된 세포에 존재하는 제 2 전이 유전자는 TCR의 다른 사슬을 암호화할 수 있다. 일부 측면에서, TCRα 및 TCRβ를 암호화하는 서열은 멀티시스트로닉 요소, 예를 들어, 2A 요소에 의해 선택적으로 분리된다.
특정 구현예에서, 전이 유전자는 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열은 재조합 TCR 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 가변 도메인 및 불변 도메인을 함유하는 재조합 TCR이 사슬을 암호화할 수 있다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 하나 이상의 가변 도메인 및 하나 이상의 불변 도메인을 함유하는 재조합 TCR의 사슬을 암호화한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 TCRα 및 TCRβ 사슬을 암호화하는 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 암호화된 TCRα 사슬 및 TCRβ 사슬은 링커 영역에 의해 분리된다. 일부 구현예에서, TCRα 및 TCRβ 사슬을 연결하는 링커 서열이 포함되어 단일 폴리펩티드 가닥을 형성한다. 일부 구현예에서, 링커는 α 사슬의 C 말단과 β 사슬의 N 말단(또는 그 반대) 사이의 거리를 가로지르기에 충분한 길이인 반면, 링커 길이가 표적 펩티드 MHC 복합체에 대한 결합을 차단하거나 감소시킬 정도로 길지 않은 것을 또한 보장한다. 일부 구현예에서, 링커는 TCR 결합 특이성을 유지하면서 단일 폴리펩티드 가닥을 형성할 수 있는 임의의 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 (약) 10 내지 45 개의 아미노산, 예컨대 10 내지 30 개의 아미노산 또는 26 내지 41 개의 아미노산 잔기, 예를 들어, 29, 30, 31 또는 32 개의 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 화학식 -PGGG-(SGGGG)n-P-를 갖고, 여기서 n은 5 또는 6이고, P는 프롤린이고, G는 글리신이며 S는 세린이다(서열번호 22). 일부 구현예에서, 링커는 서열 GSADDAKKDAAKKDGKS(서열번호 23)을 갖는다. 일부 구현예에서, TCRα 사슬 또는 이의 일부 및 TCRβ 사슬 또는 이의 일부 사이의 링커는 프로테아제에 의해 인식되고/되거나 이에 의해 절단될 수 있다. 특정 구현예에서, TCRα 사슬 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 TCRβ 사슬 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열 사이의 링커는 멀티시스트로닉 요소를 함유한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 구조 TCRβ 사슬-링커 또는 멀티시스트로닉 요소-TCRα 사슬이거나 이를 포함하는 뉴클레오티드의 서열이거나 이를 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 전이 유전자는 구조 TCRα 사슬-링커 또는 멀티시스트로닉 요소-TCRβ 사슬이거나 이를 포함하는 뉴클레오티드의 서열이거나 이를 포함한다. 일부 측면에서, 멀티시스트로닉 요소는 리보솜 스키핑 요소/자가-절단 요소 (예를 들어, 2A 요소 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 예컨대 본원에 기재된 임의의 것을 포함한다
(iv) 추가 분자, 예를 들어,
마커
일부 구현예에서, 전이 유전자는 또한 하나 이상의 추가 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 예컨대 항체, 항원, 다중-사슬 재조합 수용체의 추가 키메라 또는 추가 폴리펩티드 사슬(예를 들어, 다중-사슬 CAR, 키메라 공-자극 수용체, 억제 수용체, 조절가능한 키메라 항원 수용체 또는 본원에 기재된 다중-사슬 재조합 수용체 시스템의 다른 성분, 예를 들어, 섹션 IV.B.2 또는 섹션 IV.B.3에 기재된 재조합 T 세포 수용체(TCR)), 형질도입 마커 또는 대리 마커(예를 들어, 말단절단된 세포 표면 마커(truncated cell surface marker)), 효소, 인자, 전사 인자, 억제 펩티드, 성장 인자, 핵 수용체, 호르몬, 림포카인, 사이토카인, 케모카인, 가용성 수용체, 가용성 사이토카인 수용체, 가용성 케모카인 수용체, 리포터, 상기 중 임의의 것의 기능적 단편 또는 기능적 변이체 및 상기 것들의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 추가 분자를 암호화하는 뉴클레오티드의 이러한 서열은 재조합 수용체의 뉴클레오티드 암호화 영역 또는 도메인의 서열의 5'에 배치될 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 다른 분자를 암호화하는 서열 및 재조합 수용체의 뉴클레오티드 암호화 영역 또는 도메인의 서열은 조절 서열, 예를 들어, 2A 리보솜 스키핑 요소(2A ribosome skipping element) 및/또는 프로모터 서열(promoter sequences)에 의해 분리된다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 또한 하나 이상의 추가 분자를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 추가 분자는 하나 이상의 마커(들)를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 마커(들)는 형질도입 마커, 대리 마커 및/또는 선택 마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 또한 예를 들어, 전달된 세포의 생존력 및/또는 기능을 촉진함으로써 요법의 효능을 개선할 수 있는 핵산 서열; 예를 들어, 생체내 생존 또는 국소화를 평가하기 위한 세포의 선택 및/또는 평가를 위한 유전자 마커(genetic marker)를 제공하는 핵산 서열; 예를 들어, 문헌 [Lupton 등, Mol . and Cell Biol ., 11:6 (1991)]; 및 [Riddell 등, Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)]에 기재된 바와 같이 생체내 음성 선택에 감수성인 세포를 제조함으로써 안전성을 개선하는 핵산 서열을 포함하며; 이에 대해서는 또한 음성 선택 마커를 갖는 우세한 양성 선택 마커 융합으로부터 유래된 이관능성 선택가능한 융합 유전자의 용도를 기재하는 국제공개공보 제WO 1992008796호 및 제WO 1994028143호 및 미국 특허 번호 6,040,177을 참조한다. 일부 측면에서, 마커는 본원, 예를 들어, 섹션 II 또는 III에 기재된 임의의 마커, 또는 본원, 예를 들어, 섹션 IV.B.2에 기재된 임의의 추가 분자 및/또는 수용체 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 추가 분자는 대리 마커, 선택적으로 말단절단된 수용체이고, 선택적으로 여기서 말단절단된 수용체는 세포내 신호전달 도메인이 결여되고/되거나 그의 리간드에 의해 결합될 때 세포내 신호전달을 매개할 수 없다.
일부 구현예에서, 마커는 형질 도입 마커 또는 대리 마커이다. 형질 도입 마커 또는 대리 마커는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 검출하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 형질 도입 마커는 세포의 변형을 나타내거나 확증할 수 있다. 일부 구현예에서, 대리 마커는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR 또는 TCR과 함께 세포 표면 상에 공발현되도록 제조된 단백질이다. 특정 구현예에서, 상기 대리 마커는 거의 또는 전혀 활성을 갖지 않도록 변형된 표면 단백질이다. 특정 구현예에서, 대리 마커는 재조합 수용체를 암호화하는 동일한 폴리뉴클레오티드 상에 암호화된다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열은 선택적으로 내부 리보솜 진입 부위(IRES)에 의해 분리된 마커를 암호화하는 핵산 서열 또는 자기 절단 펩티드 또는 리보솜 건너뛰기를 야기하는 펩티드, 예컨대 2A 서열, 예컨대, T2A, P2A, E2A 또는 F2A를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 외인성 마커 유전자는 일부 경우에, 세포의 검출 또는 선택을 허용하도록 조작된 세포와 관련하여 사용될 수 있고, 일부 경우에 세포의 자살을 촉진하도록 조작된 세포와 관련하여 또한 사용될 수 있다.
예시적인 대리 마커는 세포 표면 폴리펩티드의 절단 형태, 예컨대 비기능적이며 전장 형태의 세포 표면 폴리펩티드에 의한 신호 또는 이에 의해 일반적으로 전달되는 신호를 전달할 수 없거나 전달하지 않고/거나 내재화될 수 없거나 내재화되지 않는 절단 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 절단형 세포 표면 폴리펩티드에는 성장 인자 또는 다른 수용체의 절단 형태, 예컨대 절단된 인간 표피 성장 인자 수용체 2(truncated human epidermal growth factor receptor 2, tHER2), 절단된 표피 성장 인자 수용체(tEGFR, 서열번호 12 또는 13에 제시된 예시적인 tEGFR 서열) 또는 전립선 특이적 막 항원(prostate-specific membrane antigen, PSMA) 또는 이의 변형된 형태가 포함된다. tEGFR은 항체 세툭시맙(Erbitux®) 또는 다른 치료용 항-EGFR 항체 또는 결합 분자에 의해 인식되는 에피토프를 함유할 수 있으며, 이는 tEGFR 작제물 및 암호화된 외인성 단백질로 조작된 세포를 확인 또는 선택하기 위해 및/또는 암호화된 외인성 단백질을 발현하는 세포를 제거 또는 분리하기 위해 사용될 수 있다. 문헌 [미국특허 8,802,374 및 Liu 등, Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434]을 참조한다. 일부 측면에서, 마커, 예를 들어, 대리 마커에는 CD34의 전부 또는 일부(예를 들어, 절단 형태), NGFR, CD19 또는 절단형 CD19, 예를 들어, 절단형 비인간 CD19 또는 표피 성장 인자 수용체(예를 들어, tEGFR)가 포함된다. 일부 구현예에서, 마커는 형광 단백질, 예컨대 그린 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 강화된 그린 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP), 예컨대 슈퍼-폴드 GFP(super-fold GFP, sfGFP), 레드 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP), 예컨대 tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed 또는 DsRed2, 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 블루 그린 형광 단백질(blue green fluorescent protein, BFP), 강화된 블루 형광 단백질(enhanced blue fluorescent protein, EBFP) 및 옐로우 형광 단백질(yellow fluorescent protein, YFP) 및 형광 단백질의 종 변이체, 단량체 변이체 및 코돈-최적화된 및/또는 강화된 변이체를 포함한 이의 변이체이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 마커는 효소, 예컨대 루시퍼라제, 대장균 유래 lacZ 유전자, 알칼리 포스파타제, 분비 배아 알칼리 포스파타제(secreted embryonic alkaline phosphatase, SEAP), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyl transferase, CAT)이거나 이를 포함한다. 예시적인 발광 리포터 유전자는 루시퍼라제(luciferase, luc), β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase, GUS) 또는 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 마커는 선택 마커이다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 외인성 제제 또는 약물에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 항생제 저항 유전자이다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 포유류 세포에 대해 항생제 저항을 부여하는 항생제 저항 유전자이다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 퓨로마이신 저항 유전자, 히그로마이신 저항 유전자, 블라스티사이딘 저항 유전자, 네오마이신 저항 유전자, 게네티신 저항 유전자 또는 제오신 저항 유전자 또는 이의 변형된 형태이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 분자는 비자기 분자, 예를 들어, 비자기 단백질, 즉 세포가 입양으로 전달될 숙주의 면역 시스템에 의해 "자기(self)"로 인식되지 않는 것이다.
일부 구현예에서, 마커는 치료 기능을 제공하지 않고/거나 유전자 조작, 예를 들어, 성공적으로 조작된 세포를 선택하기 위한 마커로서 사용되는 것이 아닌 다른 효과를 생성하지 않는다. 기타 구현예에서, 마커는 치료적 분자 또는 달리 일부 원하는 효과를 나타내는 분자, 예컨대 생체 내에서 세포가 조우하게 될 리간드, 예컨대 입양 전이 및 리간드와의 조우 시 세포의 반응을 강화하고/하거나 약화시키는 공자극 또는 면역 체크 포인트 분자일 수 있다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 면역조절제인 하나 이상의 추가 분자를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역조절 분자는 면역 체크포인트 조절제(immune checkpoint modulator), 면역 체크포인트 억제제(immune checkpoint inhibitor), 사이토카인 또는 케모카인(chemokine)으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 면역조절제는 면역 체크포인트 분자의 기능을 억제 또는 차단할 수 있는 면역 체크포인트 억제제 또는 면역 체크포인트 분자를 포함하는 신호전달 경로이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 분자는 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG-3, TIM3, VISTA, 아데노신 수용체 또는 세포외 아데노신, 선택적으로 아데노신 2A 수용체(A2AR) 또는 아데노신 2B 수용체(A2BR), 또는 아데노신 또는 전술한 것들 중 임의의 것을 포함하는 경로 중에서 선택된다. 다른 예시적인 추가 분자는 에피토프 태그, 검출가능한 분자, 예를 들어, 형광 또는 발광 단백질, 또는 향상된 세포 성장 및/또는 유전자 증폭을 매개하는 분자(예를 들어, 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase))를 포함한다. 에피토프 태그는, 예를 들어, FLAG, His, myc, Tap, HA 또는 임의의 검출가능한 아미노산 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, 추가 분자는 비-암호화 서열, 억제 핵산 서열, 예를 들어, 안티센스 RNA, RNAi, shRNA 및 마이크로 RNA(miRNA), 또는 핵산분해효소 인식 서열(nuclease recognition sequences)을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 추가 분자는 본원에 기재된 임의의 추가 수용체 폴리펩티드, 예를 들어, 섹션 IV.B2에 기재된 바와 같은 예를 들어, 다중-사슬 재조합 수용체의 임의의 추가 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다.
(v)
멀티시스트로닉
요소 및 조절 또는 제어 요소
일부 측면에서, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 전이 유전자는 그의 발현이 통합 부위에서 내인성 프로모터, 즉 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 유전자의 발현을 구동하는 프로모터에 의해 구동되도록 삽입될 수 있다. 이어서, 폴리펩티드 암호화 서열이 프로모터가 없는 일부 구현예에서, 통합된 전이 유전자의 발현은 관심 영역에서 내인성 프로모터 또는 다른 제어 요소에 의해 구동되는 전사에 의해 보장된다. 예를 들어, 재조합 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자는 프로모터 없이 삽입될 수 있지만, 통합된 전이 유전자의 발현이 통합 부위에서 내인성 프로모터 및/또는 다른 조절 요소의 전사에 의해 제어되도록 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 암호화 서열과 인-프레임으로 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 리보솜 스키핑 요소/자가-절단 요소(예를 들어, 2A 요소 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES))와 같은 멀티시스트로닉 요소는 재조합 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자의 상류에 배치되어, 멀티시스트로닉 요소는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 내인성 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손과 인-프레임으로 배치되고, 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자의 발현은 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 3' UTR을 암호화하는 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 전이 유전자의 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내로의 통합시, 전이 유전자는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 3' UTR의 상류에 통합되어, 재조합 수용체를 암호화하는 메시지는 예를 들어, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열로부터 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 3' UTR을 함유한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 나머지 부분을 암호화하는 오픈 리딩 프레임 또는 이의 일부 서열은 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 3' UTR을 포함한다.
일부 구현예에서, "탠덤(tandem)" 카세트가 선택 부위로 통합된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 "탠덤" 카세트는 하나 이상의 폴리펩티드 또는 인자를 암호화하며, 각각 독립적으로 조절 요소에 의해 제어되거나 모두가 멀티시스트로닉 발현 시스템으로 제어된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드가 제 1 및 제 2 핵산 서열을 함유하는 것과 같이 상이한 폴리펩티드 사슬 각각을 암호화하는 암호화 서열은 동일하거나 상이할 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 2개 이상의 상이한 폴리펩티드 사슬의 발현을 구동하는 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 핵산 분자는 멀티시스트로닉(이중시스트론 또는 삼중시스트론, 예를 들어, 문헌 [미국특허 제6,060,273호] 참조)일 수 있다. 일부 구현예에서, 전사 단위는 단일 프로모터로부터의 메시지에 의한 유전자 생성물의 공-발현을 허용하는 IRES(내부 리보솜 진입 부위)를 함유하는 이중시스트론 단위로 조작될 수 있다. 대안적으로, 일부 경우에, 단일 프로모터는 여기 기재된 바와 같은 자기 절단 펩티드(예를 들어, 2A 서열) 또는 프로테아제 인식 부위(예를 들어, 푸린)를 암호화하는 서열에 의해 서로 분리된, 2 개 또는 3 개의 폴리펩티드를 단일 오픈 리딩 프레임(ORF)으로 함유하는 RNA의 발현을 지시할 수 있다. 따라서, ORF는 번역 동안(T2A의 경우) 또는 후에 개별적인 단백질로 프로세싱되는 단일 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, "탠덤 카세트(tandem cassette)"는 프로모터가 없는 서열 뒤에 전사 종결 서열을 포함하는 카세트의 제 1 성분 및 자율식 발현 카세트 또는 멀티시스트로닉 발현 서열을 암호화하는 제 2 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 탠덤 카세트는 2 개 이상의 상이한 폴리펩티드 또는 인자, 예를 들어, 재조합 수용체의 2 개 이상의 사슬 또는 도메인을 암호화한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 2 개 이상의 사슬 또는 도메인을 암호화하는 핵산 서열이 하나의 표적 DNA 통합 부위에 탠덤 발현 카세트 또는 이중 또는 다중 시스트론 카세트로서 도입된다.
일부 구현예에서, 전이 유전자(예를 들어, 외인성 핵산 서열)은 또한 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 조절 또는 제어 요소가 아니거나 상이한 하나 이상의 이종성 또는 외인성 조절 또는 제어 요소, 예를 들어, 시스-조절 요소(cis-regulatory elements)를 함유한다. 일부 구현예에서, 이종성 또는 외인성 조절 또는 제어 요소는 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열과는 별도로, 전이 유전자의 추가 성분을 암호화하는 핵산 서열, 예를 들어, 추가 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다.
일부 측면에서, 이종성 조절 또는 제어 요소는 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인트론, 인슐레이터(insulator), 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, 코작 컨센서스 서열(Kozak consensus sequence), 멀티시스트로닉 요소(예를 들어, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 2A 서열), 메신저 RNA(mRNA)의 비번역 영역(UTR)에 상응하는 서열, 및 스플라이스(splice) 수용자(acceptor) 또는 공여자(donor) 서열, 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 조절 또는 제어 요소가 아닌 것 또는 그와 상이한 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 조절 또는 제어 요소는 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 컨센서스 서열, 스플라이스 수용자 서열 및/또는 스플라이스 공여자 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 예를 들어, 전이 유전자에서 추가 성분의 발현을 제어하기 위해 표적 부위에 또는 그 근처에 이종성이고/이거나 전형적으로 존재하지 않는 프로모터를 포함한다.
일부 경우에, 멀티시스트로닉 요소, 예를 들어, T2A는 리보솜이 2A 요소의 C-말단에서 펩티드 결합의 합성을 스킵(리보솜 스킵)하게 하여, 2A 서열의 말단과 다음 펩티드 하류 사이의 분리를 초래할 수 있다(예를 들어, 문헌 [de Felipe, Genetic Vaccines and Ther . 2:13 (2004)] 및 [de Felipe 등, Traffic 5:616-626 (2004)] 참조; 또한 자가-절단 요소로서 지칭됨). 이는 삽입된 전이 유전자가 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 프로모터와 같은 통합 부위에서 내인성 프로모터의 전사에 의해 제어될 수 있게 한다. 예시적인 멀티시스트로닉 요소는 미국특허출원공개공보 제US20070116690호에 기재된 바와 같은 구강 질환 바이러스(F2A, 예를 들어, 서열번호 21), 말 비염 A 바이러스(E2A, 예를 들어, 서열번호 20), 토세아 아시그나 바이러스(T2A, 예를 들어, 서열번호 6 또는 17), 및 돼지 테스코바이러스-1(P2A, 예를 들어, 서열번호 18, 19 또는 61)로부터의 2A 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 전이 유전자의 상류에 P2A 리보솜 스키핑 요소(서열번호 18, 19 또는 61에 제시된 서열), 예를 들어, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체 또는 이의 일부의 하나 이상의 사슬을 암호화하는 전이 유전자 및/또는 추가 분자를 암호화하는 서열은 독립적으로 하나 이상의 멀티시스트로닉 요소(들)를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 멀티시스트로닉 요소(들)는 그의 재조합 수용체 부분을 암호화하는 전이 유전자 및/또는 추가 분자를 암호화하는 서열의 상류이다. 일부 구현예에서, 멀티시스트로닉 요소(들)는 그의 재조합 수용체 부분을 암호화하는 전이 유전자 및/또는 추가 분자를 암호화하는 서열 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 멀티시스트로닉 요소(들)는 재조합 수용체의 부분 또는 사슬을 암호화하는 핵산 서열 사이에 위치한다.
일부 구현예에서, 추가 분자를 암호화하는 서열은 이종성 조절 또는 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다. 일부 측면에서, 이종성 조절 또는 제어 요소는 이종성 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 억제성 프로모터, 및/또는 조직-특이적 프로모터 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 조절 또는 제어 요소는 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들어, 구성적 프로모터 또는 유도성 또는 조직-특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA pol I, pol II 또는 pol III 프로모터 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA 중합효소 II(예를 들어, CMV, SV40 초기 영역 또는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(adenovirus major late promoter)) 에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA 중합효소 III (예를 들어, U6 또는 H1 프로모터)에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이거나 이를 포함한다. 예시적인 구성적 프로모터는, 예를 들어, 원숭이 바이러스 40 초기 프로모터(simian virus 40 early promoter)(SV40), 사이토메갈로바이러스 즉시-초기 프로모터(cytomegalovirus immediate-early promoter)(CMV), 인간 유비퀴틴 C 프로모터(human Ubiquitin C promoter)(UBC), 인간 신장 인자 1α 프로모터(human elongation factor 1α promoter)(EF1α), 마우스 포스포글리세레이트 키나제 1 프로모터(mouse phosphoglycerate kinase 1 promoter)(PGK), 및 CMV 초기 인핸서(CAGG) 와 커플링된 닭 β-액틴 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 프로모터는 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터 또는 MND 프로모터 또는 이의 변이체이거나 이를 포함한다.
다른 구현예에서, 프로모터는 조절 프로모터(예를 들어, 유도 가능 프로모터)이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 유도 가능 프로모터 또는 억제 가능 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 Lac 오퍼레이터 서열, 테트라사이클린 오퍼레이터 서열, 갈락토오스 오퍼레이터 서열 또는 독시사이클린 오퍼레이터 서열을 포함하거나 또는 이의 유사체이거나 Lac 억제제 또는 테트라사이클린 억제제 또는 이의 유사체를 인식하거나 이와 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터이다. 일부 경우에, 프로모터는 단지 특정 세포 유형(예를 들어, T 세포 또는 B 세포 또는 NK 세포 특이적 프로모터)에서만 발현된다.
일부 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이거나 이를 포함한다. 예시적인 구성적 프로모터는, 예를 들어, 원숭이 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 사이토메갈로바이러스 즉시-초기 프로모터(CMV), 인간 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 인간 신장 인자 1α 프로모터(EF1α), 마우스 포스포글리세레이트 키나제 1 프로모터(PGK), 및 CMV 초기 인핸서(CAGG)와 커플링된 닭 β-액틴 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 구성적 프로모터는 합성 또는 변형된 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 MND 프로모터, 골수증식성 육종 바이러스 인핸서를 갖는 변형된 MoMuLV LTR의 U3 영역을 함유하는 합성 프로모터이거나 이를 포함한다(문헌 [Challita 등, (1995) J. Virol. 69(2):748-755] 참조). 일부 구현예에서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터이다. 일부 경우에, 프로모터는 특이적 세포 유형(예를 들어, T 세포 또는 B 세포 또는 NK 세포 특이적 프로모터)에서만 발현을 유도한다.
일부 구현예에서, 프로모터는 바이러스 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 비-바이러스 프로모터이다. 일부 경우에, 프로모터는 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터 또는 이의 변형된 형태(HTLV1 인핸서를 갖는 EF1α 프로모터) 또는 MND 프로모터 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 이종성 또는 외인성 조절 요소, 예를 들어, 프로모터를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 프로모터는 양방향성 프로모터이다(예를 들어, 국제공개공보 제WO2016/022994호 참조).
일부 구현예에서, 전이 유전자는 또한 스플라이스 수용자 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 공지된 스플라이스 수용자 부위 서열은, 예를 들어, (인간 HBB 유전자로부터의) CTGACCTCTTCTCTTCCTCCCACAG(서열번호 289) 및 (인간 IgG 유전자로부터의) TTTCTCTCCACAG(서열번호 290)를 포함한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 또한 전사 종결 및/또는 폴리아데닐화 신호에 필요한 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 예시적인 폴리아데닐화 신호는 SV40, hGH, BGH, 및 rbGlob 전사 종결 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 내에 존재하는 경우, 전사 종결 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호는 전형적으로 전이 유전자 내의 가장 많은 3' 서열이고, 상동성 암 중 하나에 연결된다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 3' UTR 또는 전사 종결자를 암호화하는 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 전이 유전자의 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내로의 통합시, 전이 유전자는 3' UTR 및/또는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 전사 종결자의 상류에 통합되어, 재조합 수용체를 암호화하는 메시지는 예를 들어, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열로부터 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 3' UTR을 함유한다. 따라서, 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자의 통합시, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열은 3' UTR, 전사 종결자 및/또는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 다른 조절 요소의 제어 하에 있도록 작동 가능하게 연결된다.
(vi) 예시적인 전이 유전자 서열
일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자는 5'에서 3' 순서로, 막관통 도메인(또는 막 결합 도메인) 및 세포내 영역을 각각 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자는 5'에서 3' 순서로, 세포외 영역, 막관통 도메인 및 세포내 영역을 각각 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 CAR이고, 예시적인 전이 유전자는 5'에서 3' 방향으로, 각각 하기를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다: 신호 펩티드, 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 1차 신호전달 도메인 또는 영역 및/또는 공-자극 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 영역. 일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자는 5'에서 3' 방향으로, 각각 하기를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다: 신호 펩티드, 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인. 일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자는 5'에서 3' 방향으로, 각각 하기를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다: 신호 펩티드, 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인 및 1차 신호전달 도메인 또는 영역.
일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자는 5'에서 3' 방향으로, 각각 하기를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다: 막관통 도메인(또는 막 결합 도메인), 세포내 다량체화 도메인, 선택적으로 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인(들), 및 1차 신호전달 도메인 또는 영역. 일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자는 5'에서 3' 방향으로, 각각 하기를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다: 세포외 다량체화 도메인, 막관통 도메인, 선택적으로 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인(들), 및 1차 신호전달 도메인 또는 영역.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 세포외 결합 도메인, 선택적으로 scFv를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열; 선택적으로 인간 면역글로불린 힌지로부터의 서열, 선택적으로 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 이의 변형된 버전을 포함하고, 선택적으로 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 더 포함하는 스페이서; 및 선택적으로 인간 CD28로부터의 막관통 도메인; 선택적으로 인간 4-1BB로부터의 공-자극 신호전달 도메인; 및 세포내 신호전달 영역, 선택적으로 CD3ζ 사슬 또는 이의 일부를 순서대로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 암호화된 세포내 영역은 그의 N-말단으로부터 순서대로: 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인(들) 및 1차 신호전달 도메인 또는 영역, 예를 들어, CD3제타 사슬 또는 이의 단편을 함유한다.
일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자는 5'에서 3' 순서로, 각각 하기를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다: 막관통 도메인(또는 막 결합 도메인) 및 세포내 영역. 일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자는 5'에서 3' 순서로, 각각 하기를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다: 세포외 영역, 막관통 도메인 및 세포내 영역.
일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자는 TCRα 사슬의 전부 또는 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자는 TCRβ 사슬의 전부 또는 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자는 TCRα 사슬 및 TCRβ 사슬 둘 다의 전부 또는 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 재조합 T 세포 수용체(TCR)이고, 예시적인 전이 유전자는 5' 에서 3' 순서로, TCRβ 사슬-링커 또는 멀티시스트로닉 요소-TCRα 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 재조합 TCR 이고, 예시적인 전이 유전자는 5' 에서 3' 순서로, TCRα 사슬-링커 또는 멀티시스트로닉 요소-TCRβ 사슬을 포함한다.
일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자는 또한 신호 펩티드 및/또는 세포외 영역을 암호화하는 서열의 5'에 배치된, 멀티시스트로닉 요소, 예를 들어, 2A 요소 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 및/또는 조절 또는 제어 요소, 예를 들어, 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자는 또한 추가 서열, 예를 들어, 마커, 추가 재조합 수용체, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 면역조절 분자, 리간드, 사이토카인 또는 케모카인과 같은 하나 이상의 추가 분자를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 다른 분자를 암호화하는 서열 및 재조합 수용체의 영역 또는 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 2A 리보솜 스키핑 요소 및/또는 프로모터 서열과 같은 조절 서열에 의해 분리된다. 일부 측면에서, 예시적인 전이 유전자에서, 하나 이상의 추가적인 분자를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 신호 펩티드 및/또는 세포외 영역을 암호화하는 서열의 5'에 배치된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 분자를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 멀티시스트로닉 요소 및/또는 조절 또는 제어 요소와 재조합 수용체의 영역 또는 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 사이에 배치된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 분자를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열은 2개의 요소 및/또는 조절 또는 제어 요소 사이에 배치된다. 일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자는 5'에서 3' 방향으로: 멀티시스트로닉 요소 및/또는 조절 요소, 추가 분자를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열, 멀티시스트로닉 요소 및/또는 조절 요소, 신호 펩티드, 재조합 수용체의 영역 또는 도메인을 암호화하는 핵산 서열(예를 들어, 세포외 영역, 막관통 도메인, 세포내 영역)을 포함한다.
b.
상동성
암
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자에 연결되거나 이를 둘러싸는, 5' 및 3' 말단에 하나 이상의 상동성 서열("상동성 암"으로도 지칭됨)을 함유한다. 상동성 암은 DNA 수선 메카니즘, 예를 들어, 상동성 재조합 기계가 상동성을 인식하고 주형 폴리뉴클레오티드를 수선을 위한 주형으로서 사용할 수 있게 하고, 상동성 암 사이의 핵산 서열은 수선되는 DNA 내로 복제되고, 상동성의 위치 사이의 게놈 내의 통합의 표적 부위 내로 전이 유전자를 효과적으로 삽입 또는 통합한다.
일부 측면에서, 전이 유전자의 통합시, 전체 재조합 수용체는 전이 유전자에 의해 암호화되고, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 전체 암호화 서열 또는 암호화 서열의 일부가 결실된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 하나 이상의 상동성 암(들)에 포함된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손과 인-프레임인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 전체 재조합 수용체는 전이 유전자에 의해 암호화되고, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 일부만이 결실되고, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 나머지 부분이 발현된다.
일부 구현예에서, 상동성 암 서열은 유전자 파괴, 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 표적 부위를 둘러싸는 게놈 서열에 상동성인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 하기 성분을 포함한다: [5' 상동성 암]-[a 전이 유전자(외인성 또는 이종성 핵산 서열, 예를 들어, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화함)]-[3' 상동성 암]. 일부 구현예에서, 5' 상동성 암 서열은 5' 측면 상의 유전자 파괴 근처에 위치된 서열에 상동성인 인접 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 상동성 암 서열은 3' 측면 상의 유전자 파괴 근처에 위치된 서열에 상동성인 인접 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 표적 부위는 유전자 파괴를 도입할 수 있는 하나 이상의 제제(들), 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 특정 부위를 표적화하는 Cas9 및 gRNA의 표적화에 의해 결정된다.
일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오티드 내의 전이 유전자는 표적 부위 및/또는 상동성 암의 위치를 가이드하는데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 유전자 파괴의 표적 부위는 HDR에 사용되는 주형 폴리뉴클레오티드 및/또는 상동성 암을 설계하기 위한 가이드로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 전이 유전자의 표적화된 통합의 원하는 부위 근처에 표적화될 수 있다. 일부 측면에서, 상동성 암은 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 내의 통합을 표적화하도록 설계되고, 상동성 암 서열은 유전자 파괴를 둘러싸는 엑손 및 인트론 서열을 포함하는, 유전자 파괴를 둘러싸는 통합의 원하는 위치에 기초하여 결정된다. 일부 구현예에서, 삽입을 위한 표적 부위, 하나 이상의 상동성 암(들)의 상대적 위치, 및 전이 유전자(외인성 핵산 서열)의 위치는 효율적인 표적화를 위한 요건 및 사용될 수 있는 주형 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 길이에 따라 설계될 수 있다. 일부 측면에서, 상동성 암은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 인트론 내에서의 통합을 표적화하도록 설계된다. 일부 측면에서, 상동성 암은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 내에서의 통합을 표적화하도록 설계된다.
일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 표적 통합 부위(표적화 통합을 위한 부위)는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 내에 위치된다. 일부 구현예에서, 표적 통합 부위는 본원, 예를 들어, 섹션 II.A에 기재된 임의의 표적 부위 또는 그 근처에 있다. 일부 측면에서, 통합을 위한 표적 위치는 유전자 파괴를 위한 표적 부위에 또는 그 근처에, 예를 들어, 유전자 파괴를 위한 표적 부위의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만 이내에 있다.
일부 측면에서, 표적 통합 부위는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 내에 있다. 일부 측면에서, 표적 통합 부위는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 인트론 내에 있다. 일부 측면에서, 표적 통합 부위는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 조절 또는 제어 요소, 예를 들어, 프로모터 내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 통합 부위는 초기 암호화 영역에 상응하는 엑손, 예를 들어, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1, 2, 3, 4 또는 5 내에 또는 그에 근접하여, 또는 전사 시작 부위 바로 다음에, 엑손 1, 2, 3, 4 또는 5 내에(본원에서 표 1-9에 기재된 바와 같음), 또는 엑손 1, 2, 3, 4 또는 5의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만 이내에 있는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 통합은 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 엑손 2에 또는 그 근처에, 또는 엑손 2의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만 이내에 표적화된다. 일부 측면에서, 표적 통합 부위는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 엑손 1에 또는 그 근처에, 예를 들어, 엑손 1의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만 이내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 통합 부위는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 엑손 2에 또는 그 근처에, 또는 엑손 2의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만 이내에 있다. 일부 측면에서, 표적 통합 부위는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 엑손 3에 또는 그 근처에, 예를 들어, 엑손 3의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만 이내에 있다. 일부 측면에서, 표적 통합 부위는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 엑손 4에 또는 그 근처에, 예를 들어, 엑손 4의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만 이내에 있다. 일부 측면에서, 표적 통합 부위는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 엑손 5에 또는 그 근처에, 예를 들어, 엑손 5의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만 이내에 있다. 일부 측면에서, 표적 통합 부위는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 조절 또는 제어 요소, 예를 들어, 프로모터 내에 있다.
일부 구현예에서, 5' 상동성 암 서열은, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 표적 부위 근처에서 시작하는, 유전자 파괴를 위한 표적 부위의 5'의 대략 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 또는 5000개의 염기쌍의 인접 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 상동성 암 서열은, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 표적 부위 근처에서 시작하는, 유전자 파괴를 위해 표적 부위의 대략 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 또는 5000개의 염기쌍 3'의 인접 서열을 포함한다. 따라서, HDR을 통한 통합시, 전이 유전자는 유전자 파괴를 위해 표적 부위에서 또는 그 근처에서, 예를 들어, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 엑손 또는 인트론 내의 표적 부위에서 통합을 위해 표적화된다.
일부 측면에서, 상동성 암은 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 오픈 리딩 프레임 서열의 일부에 상동성인 서열을 함유한다. 일부 측면에서, 상동성 암 서열은 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 엑손 및 인트론을 포함하는 오픈 리딩 프레임 서열의 인접 부분에 상동성인 서열을 함유한다. 일부 측면에서, 상동성 암은 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 엑손 및 인트론을 포함하는 오픈 리딩 프레임 서열의 인접 부분과 동일한 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 전이 유전자의 통합을 표적화하기 위한 상동성 암을 함유한다(본원의 표 1 내지 9에 기재된 예시적인 게놈 유전자 좌 서열; 본원의 섹션 II.A.1에 기재된 예시적인 인간 mRNA 서열). 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 유전자 파괴를 위한 임의의 제제, 예를 들어, 본원에 기재된 표적화된 핵산분해효소 및/또는 gRNA를 사용하여 도입된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적화된 핵산분해효소 및/또는 gRNA에 의해 도입된 유전자 파괴의 어느 한 측면 상의 상동성의 염기쌍 약 500 내지 1000개, 예를 들어, 500 내지 900개 또는 600 내지 700개를 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 유전자 파괴의 서열 5'의 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개의 염기쌍에 상동성인 5' 상동성 암 서열의 약 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개의 염기쌍, 및 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 유전자 파괴의 서열 3'의 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개의 염기쌍에 상동성인 3' 상동성 암 서열의 약 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개의 염기쌍을 포함한다.
일부 측면에서, 전이 유전자와 하나 이상의 상동성 암 서열 사이의 경계는 전이 유전자의 HDR 및 표적화된 통합시, 하나 이상의 폴리펩티드, 예를 들어, 재조합 수용체의 사슬(들), 도메인(들) 또는 영역(들)을 암호화하는 전이 유전자 내의 서열이 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 오픈 리딩 프레임 서열의 하나 이상의 엑손과 인-프레임으로 통합되고/되거나, 폴리펩티드 및 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 오픈 리딩 프레임 서열의 하나 이상의 엑손을 암호화하는 전이 유전자의 인-프레임 융합을 생성하도록 설계된다. 일부 구현예에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 유전자 생성물의 전부 또는 일부는 내인성 오픈 리딩 프레임의 핵산 서열에 의해 암호화되고, 재조합 수용체의 폴리펩티드 또는 이의 일부는 통합된 전이 유전자에 의해 암호화되고, 멀티시스트로닉 요소, 예를 들어, 2A 요소에 의해 선택적으로 분리된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 상동성 암 서열은 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 오픈 리딩 프레임 서열 내에 있는 표적 부위를 둘러싸거나 플랭킹하는 서열과 상동성이거나 실질적으로 동일하거나 동일한 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 상동성 암 서열은 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 오픈 리딩 프레임의 부분 서열의 인트론 및 엑손을 함유한다. 일부 측면에서, 5' 상동성 암 서열 및 전이 유전자의 경계는 이종성 프로모터를 함유하지 않는 전이 유전자의 경우에, 전이 유전자의 암호화 부분이 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 표적화 통합의 위치에 따라 상류 엑손 또는 이의 일부, 예를 들어, 엑손 1, 2, 3, 4 또는 5와 인-프레임으로 융합되도록 한다.
일부 측면에서, 5' 상동성 암 서열 및 전이 유전자의 경계는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 상류 엑손 또는 이의 일부, 예를 들어, 엑손 1, 2, 3, 4 또는 5가 전이 유전자의 암호화 부분과 인-프레임으로 융합되도록 한다. 따라서, 표적화 통합, 전사 및 번역 시, 인접 폴리펩티드인 암호화된 재조합 수용체는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 및 전이 유전자의 오픈 리딩 프레임 서열의 융합 DNA 서열로부터 생성된다. 일부 측면에서, 상류 엑손 또는 이의 일부는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 유전자 생성물의 전부 또는 일부를 암호화한다. 일부 측면에서, 표적화 통합시, 멀티시스트로닉 요소, 예를 들어, 2A 요소 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 서열 및 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자를 분리한다. 일부 측면에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌로부터 발현되고 번역될 때, 폴리펩티드는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 및 재조합 수용체에 의해 암호화된 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 생성하도록 절단된다.
일부 구현예에서, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 PDCD1에서 통합을 표적화하기 위한 예시적인 5' 상동성 암은 서열번호 66에 제시된 서열, 또는 서열번호 66에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 그의 부분 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 PDCD1에서의 통합을 표적화하기 위한 예시적인 3' 상동성 암은 서열번호 67에 제시된 서열, 또는 서열번호 67에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 그의 부분 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 내인성 TRAC 유전자 좌에서의 통합을 표적화하기 위한 예시적인 5' 상동성 암은 서열번호 68에 제시된 서열, 또는 서열번호 68에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 그의 부분 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 내인성 TRAC 유전자 좌에서의 통합을 표적화하기 위한 예시적인 3' 상동성 암은 서열번호 69에 제시된 서열, 또는 서열번호 69에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 그의 부분 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 표적 부위는 상동성 암의 상대적 위치 및 서열을 결정할 수 있다. 상동성 암은 전형적으로 적어도 DNA 수선 메카니즘에 의한 말단 절제(end resection)가 유전자 파괴, 예를 들어, DSB가 도입된 후에 일어날 수 있는 영역만큼 연장되어, 예를 들어, 절제된 단일 가닥 오버행(resected single stranded overhang)이 주형 폴리뉴클레오티드 내의 상보성 영역을 찾을 수 있게 한다. 전체 길이는 플라스미드 크기, 바이러스 패키징 한계(viral packaging limits) 또는 구조체 크기 한계(construct size limit)와 같은 파라미터에 의해 제한될 수 있다.
일부 구현예에서, 상동성 암은 내인성 유전자에서 표적 부위의 어느 한 측면 상에 약 500 내지 1000, 예를 들어, 600 내지 900 또는 700 내지 800개의 상동성의 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 상동성 암은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 표적 부위의 5', 표적 부위의 3', 또는 표적 부위의 5' 및 3' 둘 다에서 약 적어도 또는 (약) 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 미만의 염기쌍 상동성을 포함한다.
일부 구현예에서, 상동성 암은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 표적 부위의 3'에서 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 또는 5000개의 염기쌍 상동성을 포함한다. 일부 구현예에서, 상동성 암은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 전이 유전자 및/또는 표적 부위의 3'에서 (약) 100 내지 500, 200 내지 400 또는 250 내지 350개의 염기쌍 상동성을 포함한다. 일부 구현예에서, 상동성 암은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 표적 부위의 3'에서 약 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 또는 10개 미만의 염기쌍 상동성을 포함한다.
일부 구현예에서, 상동성 암은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 표적 부위의 5'에서 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 또는 5000개의 염기쌍 상동성을 포함한다. 일부 구현예에서, 상동성 암은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 전이 유전자 및/또는 표적 부위의 5'에서 (약) 100 내지 500, 200 내지 400 또는 250 내지 350개의 염기쌍 상동성을 포함한다. 일부 구현예에서, 상동성 암은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 표적 부위의 5'에서 약 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 또는 10개 미만의 염기쌍 상동성을 포함한다.
일부 구현예에서, 5' 상동성 암의 3' 말단은 전이 유전자의 5' 말단 옆에 위치한다. 일부 구현예에서, 5' 상동성 암은 전이 유전자의 5' 말단으로부터 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 또는 5000개 이상의 5' 뉴클레오티드까지 증폭시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 3' 상동성 암의 5' 말단은 전이 유전자의 3' 말단 옆에 위치한다. 일부 구현예에서, 3' 상동성 암은 전이 유전자의 3' 말단으로부터 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 또는 5000개 이상의 3' 뉴클레오티드까지 증폭시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 표적화된 삽입을 위해, 상동성 암, 예를 들어, 5' 및 3' 상동성 암은 가장 먼 표적 부위 측면에 있는 서열 중 약 1000개의 염기쌍(bp)(예를 들어, 돌연변이 양쪽 서열의 1000 bp)을 각각 포함할 수 있다.
예시적인 상동성 암 길이는 적어도 (약) 50, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 750, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 또는 5000개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서. 상동성 암 길이는 적어도 (약) 50, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 750, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 또는 5000개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서. 상동성 암 길이는 적어도 (약) 550-100, 100-250, 250-500, 500-750, 750-1000, 1000-2000, 2000-3000, 3000-4000, 또는 4000-5000개의 뉴클레오티드이다. 예시적인 상동성 암 길이는 (약) 100 내지 (약) 1000개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 600개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 400개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 300개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 200개의 뉴클레오티드, (약) 200 내지 (약) 1000개의 뉴클레오티드, (약) 200 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드, (약) 200 내지 (약) 600개의 뉴클레오티드, (약) 200 내지 (약) 400개의 뉴클레오티드, (약) 200 내지 (약) 300개의 뉴클레오티드, (약) 300 내지 (약) 1000개의 뉴클레오티드, (약) 300 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드, (약) 300 내지 (약) 600개의 뉴클레오티드, (약) 300 내지 (약) 400개의 뉴클레오티드, (약) 400 내지 (약) 1000개의 뉴클레오티드, (약) 400 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드, (약) 400 내지 (약) 600개의 뉴클레오티드, (약) 600 내지 (약) 1000개의 뉴클레오티드, (약) 600 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드 또는 750 내지 (약) 1000개의 뉴클레오티드를 포함한다.
임의의 이러한 구현예 중의 일부에서, 전이 유전자는 복수의 T 세포 각각에 도입된 주형 폴리뉴클레오티드에 의해 통합된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 구조 [5' 상동성 암]-[전이 유전자]-[3' 상동성 암]을 포함한다. 특정 구현예에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 적어도 (약) 하나의 표적 부위를 둘러싸는 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 상동성 암은 표적 부위의 핵산 서열 5'에 상동성인 핵산 서열을 포함한다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 3' 상동성 암은 표적 부위의 핵산 서열 3'에 상동성인 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 적어도 (약) 또는 적어도 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 또는 2000개의 뉴클레오티드, 또는 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 또는 2000개 미만의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 50 내지 (약) 100, 100 내지 (약) 250, 250 내지 (약) 500, 500 내지 (약) 750, 750 내지 (약) 1000, 1000 내지 (약) 2000개의 뉴클레오티드이다. 임의의 이러한 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 50 내지 (약) 100개의 뉴클레오티드 길이, (약) 100 내지 (약) 250개의 뉴클레오티드 길이, (약) 250 내지 (약) 500개의 뉴클레오티드 길이, 약 500 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드 길이, (약) 750 내지 (약) 1000개의 뉴클레오티드 길이, 또는 (약) 1000 내지 (약) 2000개의 뉴클레오티드 길이이다.
임의의 이러한 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 100 내지 (약) 1000개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 600개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 400개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 300개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 200개의 뉴클레오티드, (약) 200 내지 (약) 1000개의 뉴클레오티드, (약) 200 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드, (약) 200 내지 (약) 600개의 뉴클레오티드, (약) 200 내지 (약) 400개의 뉴클레오티드, (약) 200 내지 (약) 300개의 뉴클레오티드, (약) 300 내지 (약) 1000개의 뉴클레오티드, (약) 300 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드, (약) 300 내지 (약) 600개의 뉴클레오티드, (약) 300 내지 (약) 400개의 뉴클레오티드, (약) 400 내지 (약) 1000개의 뉴클레오티드, (약) 400 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드, (약) 400 내지 (약) 600개의 뉴클레오티드, (약) 600 내지 (약) 1000개의 뉴클레오티드, (약) 600 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드 또는 (약) 750 내지 (약) 1000개의 뉴클레오티드이다. 임의의 이러한 구현예 중의 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 100 내지 (약) 1000개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 600개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 400개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 300개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 200개의 뉴클레오티드, (약) 200 내지 (약) 1000개의 뉴클레오티드, (약) 200 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드, (약) 200 내지 (약) 600개의 뉴클레오티드, (약) 200 내지 (약) 400개의 뉴클레오티드, (약) 200 내지 (약) 300개의 뉴클레오티드, (약) 300 내지 (약) 1000개의 뉴클레오티드, (약) 300 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드, (약) 300 내지 (약) 600개의 뉴클레오티드, (약) 300 내지 (약) 400개의 뉴클레오티드, (약) 400 내지 (약) 1000개의 뉴클레오티드, (약) 400 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드, (약) 400 내지 (약) 600개의 뉴클레오티드, (약) 600 내지 (약) 1000개의 뉴클레오티드, (약) 600 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드 또는 (약) 750 내지 (약) 1000개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 200, 300, 400, 500, 600, 700 또는 800개의 뉴클레오티드 길이, 또는 상기 수치범위 사이의 임의의 값이다. 일부 구현예에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 300개 초과의 뉴클레오티드 길이, 선택적으로 상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 400, 500 또는 600개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 300개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 상동성 암은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 또는 이의 단편의 유전자 생성물(gene product)을 암호화하는 서열에 대해 상동성인 뉴클레오티드의 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 상동성 암은 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자와 인 프레임(in frame)으로 연결되거나(connected) 링크된다(linked).
일부 구현예에서, 대안적인 HDR이 사용된다. 일부 구현예에서, 대안적인 HDR은 주형 폴리뉴클레오티드가 표적 부위에 대해(즉, 표적 부위 가닥의 5' 방향으로) 연장된 5' 상동성을 가질 경우 보다 효율적으로 진행된다. 따라서, 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 보다 긴 상동성 암 및 보다 짧은 상동성 암을 가지며, 여기서 보다 긴 상동성 암이 표적 부위의 5'에 어닐링할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위에 대해 5'에서 어닐링할 수 있는 암은 표적 부위 또는 전이 유전자의 5' 또는 3' 말단으로부터 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 또는 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 또는 5000개 이상의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 표적 부위에 대해 5'에서 어닐링할 수 있는 암은, 표적 부위에 대해 3'에서 어닐링할 수 있는 암보다 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 더 길다. 일부 구현예에서, 표적 부위에 대해 5'에서 어닐링할 수 있는 암은, 표적 부위에 대해 3'에서 어닐링할 수 있는 암보다 2x, 3x, 4x 또는 5x 이상 더 길다. ssDNA 주형이 손상되지 않은 가닥 또는 표적화된 가닥에 어닐링할 수 있는지 여부에 따라, 표적 부위에 대해 5'에서 어닐링하는 상동성 암은 각각 ssDNA 주형의 5' 말단 또는 ssDNA 주형의 3' 말단이 될 수 있다.
유사하게, 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 5'상동성 암, 전이 유전자 및 3' 상동성 암을 가져서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위의 5'에 대한 연장된 상동성을 함유한다. 예를 들어, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 실질적으로 동일한 길이일 수 있으나, 전이 유전자는 표적 부위의 3'보다 표적 부위의 5'에서 보다 멀리 연장될 수 있다. 일부 구현예에서, 상동성 암은 표적 부위의 3' 말단보다 표적 부위의 5' 말단에 대해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 2x, 3x, 4x 또는 5x 이상 더 연장된다.
일부 구현예에서, 대안적인 HDR은 주형 폴리뉴클레오티드가 표적 부위 상에 집중될 때 보다 효율적으로 진행된다. 따라서, 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 본질적으로 동일한 크기의 2개의 상동성 암을 가지고 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드의 제 1 상동성 암(예를 들어, 5' 상동성 암)은 주형 폴리뉴클레오티드의 제 2 상동성 암(예를 들어, 3' 상동성 암)의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이내의 길이를 가질 수 있다.
유사하게, 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 5' 상동성 암, 전이 유전자 및 3' 상동성 암을 가져서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위의 양쪽에서 실질적으로 동일한 거리까지 연장된다. 예를 들어, 상동성 암은 상이한 길이를 가질 수 있으나, 이를 보상하도록 전이 유전자가 선택될 수 있다. 예를 들어, 전이 유전자는 표적 부위의 3'에서보다 표적 부위로부터 5'에서 더 연장될 수 있으나, 보상을 위해 표적 부위의 5' 상동성 암이 표적 부위의 3' 상동성 암보다 더 짧다. 반대도 가능하여, 예를 들어, 전이 유전자는 표적 부위의 5'에서보다 표적 부위로부터 3'에서 더 연장될 수 있으나, 보상을 위해 표적 부위의 3' 상동성 암이 표적 부위의 5' 상동성 암보다 더 짧다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 및 하나 이상의 상동성 암을 포함하는 주형 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 1000 내지 약 20,000 염기쌍, 예를 들어, 약 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000 또는 20000개의 염기쌍이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드의 길이는 세포 또는 바이러스 벡터의 능력, 및 폴리뉴클레오티드 또는 벡터 내로 제조, 합성 또는 조립 및/또는 도입될 수 있는 폴리뉴클레오티드의 최대 길이에 의해 제한된다. 일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오티드의 제한된 능력은 전이 유전자 및/또는 하나 이상의 상동성 암의 길이를 결정할 수 있다. 일부 측면에서, 전이 유전자 및 하나 이상의 상동성 암의 조합된 총 길이는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 최대 길이 또는 능력 내에 있어야 한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오티드의 전이 유전자 부분은 약 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 또는 4000개의 염기쌍이고, 주형 폴리뉴클레오티드의 최대 길이가 약 5000개의 염기쌍인 경우, 서열의 나머지 부분은 하나 이상의 상동성 암 사이에 분할될 수 있고, 예를 들어, 3' 또는 5' 상동성 암은 대략 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 또는 2000개의 염기쌍일 수 있다.
3. 주형 폴리뉴클레오티드의 전달
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 재조합 수용체 또는 이의 일부(예를 들어, 본원에서 섹션 II.B.2에 기재됨)을 암호화하는 주형 폴리뉴클레오티드와 같은 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 형태로, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로서 세포내로 도입된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 폴리뉴클레오티드는 재조합 수용체 또는 이의 일부 및 하나 이상의 상동성 암을 암호화하는 전이 유전자를 함유하고, 전이 유전자의 상동성-지시된 수선(HDR)-매개 통합을 위해 세포내로 도입될 수 있다.
일부 측면에서, 제공된 구현예는 전이 유전자의 HDR 및 표적화된 통합을 유도하기 위한, 유전자 파괴 및 주형 폴리뉴클레오티드를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들) 또는 이의 성분의 도입에 의한 세포의 유전자 조작이다. 일부 측면에서, 하나 이상의 제제(들) 및 주형 폴리뉴클레오티드는 동시에 전달된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 제제(들) 및 주형 폴리뉴클레오티드는 순차적으로 전달된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제(들)는 폴리뉴클레오티드의 전달 전에 전달된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적화된 유전자 파괴, 예를 들어, 핵산분해효소 및/또는 gRNA를 유도할 수 있는 제제(들) 이외에, 조작을 위한 세포내로 도입된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드(들)는 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들)의 하나 이상의 성분이 세포내로 도입되기 전에, 동시에 또는 후에 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드(들)는 제제와 동시에 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드(들) 및 하나 이상의 제제(들)는 물리적 전달 수단을 사용하여, 예를 들어, 하나의 반응으로 동시에 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드(들) 및 하나 이상의 제제(들)는 전기천공을 통해 동시에 전달된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 제제 전에, 예를 들어, 제제 전에 1 내지 60 분(또는 그 사이의 임의의 시간), 제제 전에 1 내지 24 시간(또는 그 사이의 임의의 시간) 또는 제제 전에 24 시간 초과를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 주형 폴리뉴클레오티드 전에 수 초 내지 수 시간 내지 수 일에 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 제제의 전달 직후, 예를 들어, 제제의 전달 후 약 30 초 내지 4 시간, 예를 들어, 약 30 초, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 6 분, 8 분, 9 분, 10 분, 15 분, 20 분, 30 분, 40 분, 50 분, 60 분, 90 분, 2 시간, 3 시간 또는 4 시간 내에, 및/또는 바람직하게는 제제의 전달 4 시간 내에, 제제의 전달 후 2 내지 5 시간 내지 7 일 후에 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 제제의 전달 후 4 시간 초과로 전달된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), 예를 들어, 핵산분해효소 및/또는 gRNA와 동일한 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), 예를 들어, 핵산분해효소 및/또는 gRNA와 상이한 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 제제(들)와 동시에 전달된다. 기타 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 제제(들)의 전달 전 또는 후, 상이한 시간에 전달된다. 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), 예를 들어, 핵산분해효소 및/또는 gRNA에서 핵산의 전달을 위해 여기에, 예를 들어, 섹션 II.A.3(예를 들어, 표 10 및 11)에 기재된 임의의 전달 방법은 주형 폴리뉴클레오티드 전달에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 제제(들) 및 주형 폴리뉴클레오티드는 동일한 형식 또는 방법으로 전달된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제(들) 및 주형 폴리뉴클레오티드 둘 다는 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터에 포함된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 Cas9 및 gRNA와 동일한 벡터 백본, 예를 들어, AAV 게놈, 플라스미드 DNA 상에 암호화된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 제제(들) 및 주형 폴리뉴클레오티드는 상이한 형식, 예를 들어, Cas9-gRNA 제제에 대해 리보 핵산-단백질 복합체(RNP) 및 주형 폴리뉴클레오티드에 대해 선형 DNA 형식이나 이들은 동일한 방법을 사용하여 전달된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 선형 또는 원형 DNA 또는 선형 RNA와 같은 선형 또는 원형 핵산 분자이고, 핵산 분자를 세포로 전달하기 위해 여기 섹션 II.A.3(본원에서 표 10 및 11)에 기재된 임의의 방법을 사용하여 전달될 수 있다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 비바이러스 벡터로 또는 비바이러스 벡터 내 뉴클레오티드 형태로 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 비바이러스 벡터는 예컨대 미세 주입, 전기천공, 일시적인 세포 압축 또는 압착(예를 들어, 문헌 [Lee, 등, (2012) Nano Lett 12: 6322-27]에 기재된 바와 같음), 지질 매개 형질 감염, 펩티드 매개 전달, 예를 들어, 세포-침투 펩티드 또는 이의 조합물로 제한되지 않는, 유전자 전달을 위한 임의의 적합한 및/또는 공지된 비바이러스 방법에 의한 형질 도입 및/또는 형질 감염에 적합한 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 비바이러스 폴리뉴클레오티드는 여기 표 11에 열거된 비바이러스 방법과 같이 여기에 기재된 비바이러스 방법에 의해 세포내로 전달된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA의 관심 영역과 상동성이 아닌 서열을 함유하는 벡터 분자에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스는 DNA 바이러스(예를 들어, dsDNA 또는 ssDNA 바이러스)이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 RNA 바이러스(예를 들어, ssRNA 바이러스)이다. 예시적인 바이러스 벡터/바이러스에는 예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 백시니아 바이러스, 폭스바이러스 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 또는 여기 다른 곳에 기재된 임의의 바이러스가 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 복제 기점, 프로모터 및 항생제 내성을 암호화하는 유전자와 같은 추가 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포에 도입될 수 있다. 또한, 주형 폴리뉴클레오티드는 있는 그대로의 핵산으로, 리포솜, 나노입자 또는 폴록사머와 같은 물질과 복합체를 이룬 핵산으로 도입될 수 있거나 또는 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 인테그라제 결함 렌티바이러스(integrase defective lentivirus, IDLV))에 의해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 유래된 벡터와 같은 재조합 감염성 바이러스 입자를 사용하여 세포내로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마-레트로바이러스 벡터(예를 들어, Koste 등, (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens 등, (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino 등, (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park 등, Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557 참조) 또는 HIV-1 유래 렌티바이러스 벡터를 사용하여 T 세포내로 전달된다.
다른 측면에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 바이러스 및/또는 비-바이러스 유전자 전달 방법에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 아데노 연관 바이러스 (AAV)를 통해 세포에 전달된다. 주형 폴리뉴클레오티드는 핵산분해효소 전달에 사용된 것과 동일한 유전자 전달 시스템(동일한 벡터 포함)을 사용하여 전달될 수 있거나 핵산분해효소에 대해 사용된 상이한 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터(예를 들어, AAV)를 사용하여 전달되고 핵산분해효소(들)는 mRNA 형태로 전달된다. 세포는 또한 바이러스 벡터(예를 들어, 핵산분해효소(들) 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드를 운반)를 전달하기 전, 동시에 및/또는 후에 여기 기재된 바와 같이 세포 표면 수용체에 바이러스 벡터의 결합을 억제하는 하나 이상의 분자로 처리될 수 있다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복 서열(long terminal repeat sequence, LTR), 예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 골수 증식 육종 바이러스(myeloproliferative sarcoma virus, MPSV), 뮤린 배아 줄기 세포 바이러스(murine embryonic stem cell virus, MESV), 뮤린 줄기 세포 바이러스(murine stem cell virus, MSCV), 비장 초점 형성 바이러스(spleen focus forming virus, SFFV)로부터 유래된 재조합 레트로바이러스 벡터를 갖는다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 뮤린 레트로바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 임의의 조류 또는 포유류 세포 출처로부터 유래된 것을 포함한다. 레트로바이러스는 전형적으로 인간을 포함하여 몇몇 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미하는, 암포트로픽(amphotropic)이다. 일 구현예에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스의 gag, pol 및/또는 env 서열을 대체한다. 다수의 예시적인 레트로바이러스 시스템이 문헌 [예를 들어, 미국특허 제5,219,740호; 제6,207,453호; 제5,219,740호; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa 등, (1991) Virology 180:849-852; Burns 등, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 AAV 벡터를 사용하여 전달되고, 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), 예를 들어, 핵산분해효소 및/또는 gRNA는 상이한 형태, 예를 들어, 핵산분해효소 및/또는 gRNA를 암호화하는 mRNA로 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드 및 핵산분해효소는 예를 들어, 바이러스 벡터이나 별개의 벡터로 동일한 유형의 방법을 사용하여 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제, 예를 들어, 핵산분해효소 및/또는 gRNA로서 상이한 전달 시스템으로 전달된다. 타입 또는 핵산 및 전달을 위한 벡터는 본원의 섹션 II.B 또는 III에 기재된 것들 중 임의의 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드 및 핵산분해효소는 동일한 벡터, 예를 들어, AAV 벡터(예를 들어, AAV6) 상에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 AAV 벡터를 사용하여 전달되고, 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), 예를 들어, 핵산분해효소 및/또는 gRNA는 상이한 형태, 예를 들어, 핵산분해효소 및/또는 gRNA를 암호화하는 mRNA로서 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드 및 핵산분해효소는 동일한 유형의 방법, 예를 들어, 바이러스 벡터를 사용하여 전달되지만, 별개의 벡터 상에서 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제, 예를 들어, 핵산분해효소 및/또는 gRNA로서 상이한 전달 시스템에서 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 생체 내에서, 예를 들어, gRNA 인식 서열이 측면에 있는 벡터 백본으로부터 절제된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 Cas9 및 gRNA와 별도의 폴리뉴클레오티드 분자 상에 있다. 일부 구현예에서, Cas9 및 gRNA는 리보핵단백질(RNP) 복합체의 형태로 도입되고, 주형 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 분자, 예를 들어, 벡터 또는 선형 핵산 분자, 예를 들어, 선형 DNA로 도입된다. 전달을 위한 핵산 및 벡터 유형에는 여기 섹션 II.B 또는 III에 기재된 것 중의 어느 하나가 포함된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 아데노바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 벡터, 예를 들어, AAV 캡시드로 패키징될 수 있게 하는 길이 및 서열의 ssDNA 분자에 포함된다. 벡터는 예를 들어, 5kb 미만일 수 있으며, 캡시드로의 패키징을 촉진하는 ITR 서열을 함유할 수 있다. 벡터는 통합 결함(integration-deficient)일 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 전이 유전자 및/또는 표적 부위의 양쪽에 약 150 내지 1000 개의 상동성 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5', 표적 부위 또는 전이 유전자의 3' 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5' 및 3' 둘 다에 약 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5', 표적 부위 또는 전이 유전자의 3' 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5' 및 3' 둘 다에 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5', 표적 부위 또는 전이 유전자의 3' 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5' 및 3' 둘 다에 최대 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 벡터, 예를 들어, IDLV(integration deficiency lentivirus, 통합 결함 렌티바이러스)이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 전이 유전자 및/또는 표적 부위의 양쪽에 약 500 내지 1000 개의 상동성 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5', 표적 부위 또는 전이 유전자의 3' 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5' 및 3' 둘 다에 약 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개의 상동성 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5', 표적 부위 또는 전이 유전자의 3' 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5' 및 3' 둘 다에 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개 이상의 상동성 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5', 표적 부위 또는 전이 유전자의 3' 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5' 및 3' 둘 다에 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개 이내의 상동성 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 Cas9가 주형 폴리뉴클레오티드를 인식하고 절단하는 것을 방해하는 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, 침묵 돌연변이를 포함한다. 주형 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 변경될 세포의 게놈에서 상응하는 서열에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 또는 30 개 이상의 침묵 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 변경될 세포의 게놈에서 상응하는 서열에 대해 최대 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30 또는 50 개의 침묵 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, cDNA는 Cas9가 주형 폴리뉴클레오티드를 인식하고 절단하는 것을 방해하는 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, 침묵 돌연변이를 포함한다. 주형 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 변경될 세포의 게놈에서 상응하는 서열에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 또는 30 개 이상의 침묵 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 변경될 세포의 게놈에서 상응하는 서열에 대해 최대 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30 또는 50 개의 침묵 돌연변이를 포함한다.
여기에 기재된 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 비천연 염기 및/또는 백본을 포함할 수 있다. 특히, 메틸화된 시토신을 갖는 주형 폴리뉴클레오티드의 삽입이 여기 기재된 방법을 사용하여 수행되어 관심 영역에서 전사 정지 상태를 달성할 수 있다.
III. 핵산, 벡터, 및 전달
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 이식유전자를 포함하는 주형 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터와 같은 뉴클레오티드 형태로 세포내로 도입된다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 폴리뉴클레오티드는 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유한다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴를 위한 하나 이상의 제제(들) 또는 이의 성분은 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터와 같은 핵산 형태로 세포내로 도입된다. 일부 구현예에서, 조작을 위한 성분은 본원의 섹션 II.B.3 및 표 10 및 11에 기재된 바와 같은 제제(들)의 전달에 사용되는 임의의 적합한 방법을 포함하는 다양한 전달 방법을 사용하여 다양한 형태로 전달될 수 있다. 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)의 하나 이상의 성분을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 핵산 분자), 및/또는 전이 유전자를 함유하는 하나 이상의 주형 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 본원의 섹션 II.B.2에 기재된 임의의 것), 및 전이 유전자의 표적화된 통합을 위한 유전자 조작 세포를 위한 벡터, 예를 들어, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)의 하나 이상의 성분을 암호화하는 주형 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 특정 게놈 표적 위치, 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 전이 유전자를 표적화하기 위한 주형 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 구현예에서, 본원의 섹션 II.B.2에 기재된 임의의 주형 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 재조합 수용체 또는 이의 일부 또는 기타 폴리펩티드 및/또는 인자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전이 유전자 및 표적화된 통합을 위한 상동성 암을 함유한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 벡터에 함유될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제가 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 암호화될 수 있다. 일부 구현예에서, 제제의 성분, 예를 들어, Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 암호화될 수 있고 세포로 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 벡터에 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 예를 들어, Cas9 분자 서열에 융합된 신호 펩티드(예를 들어, 핵 국소화, 핵인 국소화, 미토콘드리아 국소화를 위한)를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 Cas9 분자를 암호화하는 서열에 융합된 핵 국소화 서열(예를 들어, SV40 유래)을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 조절/제어 요소, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 컨센선스(Kozak consensus) 서열, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 2A 서열 및 스플라이스 수용체 또는 공여체가 벡터에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA pol I, pol II 또는 pol III 프로모터 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA 중합효소 II(예를 들어, CMV, SV40 초기 영역 또는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터)에 의해 인식된다. 다른 구현예에서, 프로모터는 RNA 중합효소 III(예를 들어, U6 또는 H1 프로모터)에 의해 인식된다.
특정 구현예에서, 프로모터는 조절 프로모터(예를 들어, 유도 가능 프로모터)이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 유도 가능 프로모터 또는 억제 가능 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 Lac 오퍼레이터 서열, 테트라사이클린 오퍼레이터 서열, 갈락토오스 오퍼레이터 서열 또는 독시사이클린 오퍼레이터 서열을 포함하거나 또는 이의 유사체이거나 Lac 억제제 또는 테트라사이클린 억제제 또는 이의 유사체를 인식하거나 이와 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이거나 이를 포함한다. 예시적인 구성적 프로모터는 시미안 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 사이토메갈로바이러스 초기 직후 프로모터(CMV), 인간 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 인간 신장 인자 1α 프로모터(EF1α), 마우스 포스포글리세레이트 키나제 1 프로모터(PGK) 및 CMV 초기 인핸서와 결합된 닭 β-액틴 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 구성적 프로모터는 합성 또는 변경된 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 MND 프로모터, 골수 증식 육종 바이러스 인핸서를 갖는 변형된 MoMuLV LTR의 U3 영역을 함유하는 합성 프로모터이거나 이를 포함한다(문헌 [Challita 등, (1995) J. Virol. 69(2):748-755] 참조). 일부 구현예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 바이러스 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 비바이러스 프로모터이다. 일부 구현예에서, 예시적인 프로모터는 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터 또는 이의 변형된 형태(예를 들어, HTLV1 인핸서를 갖는 EF1α 프로모터) 또는 MND 프로모터를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터는 조절 요소, 예를 들어, 프로모터를 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 비바이러스 벡터로서 또는 비바이러스 벡터 내의 뉴클레오티드 형태로 세포내에 도입된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 이중-가닥 또는 단일-가닥 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 비바이러스 벡터는 예컨대 미세 주입, 전기천공, 일시적인 세포 압축 또는 압착(예를 들어, 문헌 [Lee, 등, (2012) Nano Lett 12: 6322-27]에 기재된 바와 같음), 지질 매개 형질 감염, 펩티드 매개 전달 또는 이의 조합물로 제한되지 않는, 유전자 전달을 위한 임의의 적합한 및/또는 공지된 비바이러스 방법에 의한 형질 도입 및/또는 형질 감염에 적합한 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 비바이러스 폴리뉴클레오티드는 표 11에 열거된 비바이러스 방법과 같이 여기에 기재된 비바이러스 방법에 의해 세포내로 전달된다.
일부 구현예에서, 벡터 또는 전달 비히클은 바이러스 벡터(예를 들어, 재조합 바이러스의 생성을 위한)이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 DNA 바이러스(예를 들어, dsDNA 또는 ssDNA 바이러스)이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 RNA 바이러스(예를 들어, ssRNA 바이러스)이다. 예시적인 바이러스 벡터/바이러스에는 예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 백시니아 바이러스, 폭스바이러스 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 또는 여기 다른 곳에 기재된 임의의 바이러스가 포함된다.
일부 구현예에서, 바이러스는 분열 세포를 감염시킨다. 다른 구현예에서, 바이러스는 비분열 세포를 감염시킨다. 다른 구현예에서, 바이러스는 분열 및 비분열 세포 모두를 감염시킨다. 다른 구현예에서, 바이러스는 숙주 게놈으로 통합될 수 있다. 다른 구현예에서, 바이러스는 예를 들어, 인간에서 면역을 감소시키도록 조작된다. 다른 구현예에서, 바이러스는 복제능력이 있다. 다른 구현예에서, 바이러스는 예를 들어, 비리온 복제의 추가 라운드 및/또는 패키징에 필요한 유전자에 대한 하나 이상의 암호화 영역이 다른 유전자로 대체되었거나 결실된 복제 결함이다. 다른 구현예에서, 바이러스는 유전자 파괴의 일시적인 유도를 목적으로 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자의 일시적인 발현을 일으킨다. 다른 구현예에서, 바이러스는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자의 오래 지속되는 예를 들어, 1주, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 2년 또는 영구적인 발현을 일으킨다. 바이러스의 패키징 용량은, 예를 들어, 약 4 kb 이상 내지 약 30 kb 이상, 예를 들어, 약 5 kb, 10 kb, 15 kb, 20 kb, 25 kb, 30 kb, 35 kb, 40 kb, 45 kb 또는 50 kb 이상으로 다양할 수 있다.
일부 구현예에서, 제제(들) 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드는 재조합 레트로바이러스에 의해 전달된다. 다른 구현예에서, 레트로바이러스(예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스)는 예를 들어, 숙주 게놈 내로의 통합을 허용하는 역전사 효소를 포함한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 복제능력이 있다. 다른 구현예에서, 레트로바이러스는 예를 들어, 비리온 복제의 추가 라운드 및 패키징에 필요한 유전자에 대한 하나 이상의 암호화 영역이 다른 유전자로 대체되었거나 결실된 복제 결함이다.
일부 구현예에서, 제제(들) 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드는 재조합 렌티바이러스에 의해 전달된다. 예를 들어, 렌티바이러스는 예를 들어, 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 유전자를 포함하지 않는 복제 결함이다.
일부 구현예에서, 제제(들) 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드는 재조합 아데노바이러스에 의해 전달된다. 다른 구현예에서, 아데노바이러스는 인간에서 면역을 감소시키도록 조작된다.
일부 구현예에서, 제제(들) 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드는 재조합 AAV에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, AAV는 숙주 세포, 예를 들어, 여기 기재된 바와 같이 표적 세포의 게놈에 자신의 게놈을 통합할 수 있다. 다른 구현예에서, AAV는 자기 상보적 아데노 관련 바이러스(self-complementary adeno-associated virus, scAAV), 예를 들어, 이중 가닥 DNA를 형성하기 위해 서로 어닐링하는 양쪽 가닥을 패키징하는 scAAV이다. 개시된 방법에 사용될 수 있는 AAV 혈청형에는 AAV1, AAV2, 변경된 AAV2 (예를 들어, Y444F, Y500F, Y730F 및/또는 S662V에서 변경), AAV3, 변경된 AAV3 (예를 들어, Y705F, Y731F 및/또는 T492V에서 변경), AAV4, AAV5, AAV6, 변경된 AAV6 (예를 들어, S663V 및/또는 T492V에서 변경), AAV7, AAV8, AAV 8.2, AAV9, AAV.rh10, 변경된 AAV.rh10, AAV.rh32/33, 변경된 AAV.rh32/33, AAV.rh43, 변경된 AAV.rh43, AAV.rh64R1, 변경된 AAV.rh64R1 및 위형(pseudotyped) AAV, 예컨대 AAV2/8, AAV2/5가 포함되고, AAV2/6도 개시된 방법에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 제제(들) 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드는 하이브리드 바이러스, 예를 들어, 여기에 기재된 바이러스 중 하나 이상의 하이브리드에 의해 전달된다.
패키징 세포는 표적 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하는데 사용된다. 상기 세포에는 아데노바이러스를 패키징할 수 있는 293 세포 및 레트로바이러스를 패키징할 수 있는 ø2 세포 또는 PA317 세포가 포함된다. 유전자 요법에 사용되는 바이러스 벡터는 보통 핵산 벡터를 바이러스 입자로 패키징하는 생산자 세포주에 의해 생성된다. 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주 또는 표적 세포로의 후속 통합(적용 가능한 경우)에 필요한 최소 바이러스 서열을 함유하며, 다른 바이러스 서열은 발현될 단백질, 예를 들어, Cas9를 암호화하는 발현 카세트로 대체된다. 예를 들어, 유전자 요법에 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로 숙주 또는 표적 세포에서 패키징 및 유전자 발현에 필요한 AAV 게놈의 역말단 반복(inverted terminal repeat, ITR) 서열만을 보유한다. 누락된 바이러스 기능은 패키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 이후 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap을 암호화하나 ITR 서열이 없는 헬퍼 플라스미드를 함유하는 세포주에서 패키징된다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염된다. 헬퍼 바이러스는 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 벡터의 복제 및 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 부족으로 인해 상당한 양으로 패키징되지 않는다. 예를 들어, 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감한 열처리에 의해 아데노바이러스에 의한 오염을 줄일 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 세포 유형 인식 능력을 갖는다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 상이한/대안적인 바이러스 외피 당단백질로 위형화(pseudotyped); 세포 유형 특이적 수용체로 조작(예를 들어, 펩티드 리간드, 단일 사슬 항체, 성장 인자와 같은 표적화 리간드를 통합하도록 바이러스 외피 당단백질의 유전자 변경); 및/또는 하나의 말단이 바이러스 당 단백질을 인식하고 다른 하나의 말단이 표적 세포 표면의 모이어티를 인식하는 이중 특이성을 갖는 분자 가교를 갖도록 조작(예를 들어, 리간드-수용체, 단클론성 항체, 아비딘-비오틴 및 화학적 접합);될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 세포 유형 특이적 발현을 달성한다. 예를 들어, 조직 특이적 프로모터는 특정 표적 세포에서만 전이 유전자(Cas9 및 gRNA)의 발현을 제한하도록 작제될 수 있다. 벡터의 특이성은 또한 전이 유전자 발현의 마이크로 RNA 의존적 제어에 의해 매개될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 바이러스 벡터 및 표적 세포막의 융합 효율이 증가되었다. 예를 들어, 융합 능력이 있는 혈구 응집소(hemagglutinin, HA)와 같은 융합 단백질이 세포로의 바이러스 흡수를 증가시키도록 통합될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 핵 국소화 능력을 갖는다. 예를 들어, 핵막의 파괴를 필요로 하고(세포 분열 중) 따라서 비분열 세포를 감염시키지 않는 바이러스는 바이러스의 매트릭스 단백질에 핵 국소화 펩티드를 통합하도록 변경될 수 있고 이로써 비증식 세포로의 형질 도입이 가능하다.
IV. 조작된 세포
재조합 수용체, 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 이의 일부 또는 재조합 T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 일부 또는 사슬을 암호화하는 핵산 서열(예를 들어, 전이 유전자)을 포함하는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 세포가 본원에서 제공된다. 일부 측면에서, 유전자 조작된 세포 내의 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내로 통합된, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 외인성 핵산 서열(예를 들어, 전이 유전자)을 포함한다. 일부 측면에서, 제공된 조작된 세포는, 예를 들어, 유전자 파괴를 유도하기 위한 제제(들) 및 수선을 위한 전이 유전자를 함유하는 주형 폴리뉴클레오티드를 사용함으로써 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된다. 일부 측면에서, 제공된 폴리뉴클레오티드의 부분, 예를 들어, 인접 세그먼트, 예를 들어, 섹션 II.B.2에 기재된 임의의 주형 폴리뉴클레오티드는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서의 통합을 위해 표적화되어, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 함유하는 세포를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, HDR에 의해 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내로 통합되는 주형 폴리뉴클레오티드의 부분은 전이 주형 폴리뉴클레오티드의 유전자 부분, 예를 들어, 본원, 예를 들어, 섹션 II.B.2에 기재된 임의의 것을 포함한다.
일부 측면에서, 세포는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR 또는 재조합 T 세포 수용체(TCR)를 발현하도록 조작된다. 일부 측면에서, 재조합 수용체는 조작된 세포에서 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 존재하는 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 측면에서, 세포는 재조합 수용체의 전부 또는 일부를 암호화하는 전이 유전자를 HDR을 통해 통합시킴으로써 생성된다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 리간드 또는 항원, 예를 들어, 질환 또는 장애와 연관된 항원에 결합하거나 이를 인식하는 결합 도메인을 함유한다.
일부 측면에서, 조작된 세포는 면역 세포, 예를 들어, T 세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 인간 T 세포이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, T 세포는 대상체로부터 유래된 T 세포이다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, T 세포는 1차 T 세포이다. 임의의 실시예의 일부에서, 조작된 세포는 1차 인간 T 세포이다. 일부 측면에서, 면역 세포는 재조합 수용체, 예를 들어, 키메라 항원 수용체 또는 변형된 재조합 수용체, 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 것을 발현하도록 조작된다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공된 방법, 조성물, 제조 물품, 및/또는 키트는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 갖거나 함유하는 유전자 조작된 세포, 예를 들어, 유전자 조작된 면역 세포 및/또는 T 세포를 생성, 제조 또는 생산하는데 유용하다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 본원에서 제공된 방법은 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 갖거나 함유하는 유전자 조작된 세포를 생성한다. 일부 구현예에서, 변형된 유전자 좌는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 유전자의 오픈 리딩 프레임에 통합된 전이 유전자, 예를 들어, 섹션 II.B.2에 기재된 전이 유전자거나 이를 함유한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 유전자의 오픈 리딩 프레임 내로 인-프레임 삽입되어, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 의해 암호화된 유전자 생성물의 전부 또는 일부를 암호화하는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 생성한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 측면에서, 재조합 수용체는 재조합 T 세포 수용체(TCR)이다. 일부 측면에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 전체 재조합 수용체 또는 전장 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자, 예를 들어, 전장 CAR 또는 2개의 사슬을 포함하는 재조합 TCR의 둘 다의 사슬을 포함한다. 일부 측면에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 재조합 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자, 예를 들어, 다중-사슬 CAR의 하나의 사슬 또는 2개의 사슬을 포함하는 재조합 TCR의 하나의 사슬, 또는 재조합 수용체의 도메인 또는 영역을 포함하고; 조작된 세포는 조작된 세포의 게놈 내의 상이한 위치에 존재하는 재조합 수용체의 나머지 부분을 암호화하는 제 2 전이 유전자, 예를 들어, 다중-사슬 CAR의 또 다른 사슬 또는 재조합 TCR의 다른 사슬을 포함한다.
일부 경우에, 세포는 하나 이상의 추가 분자, 예를 들어, 추가의 인자 및/또는 부속 분자, 예를 들어, 본원에 기재된 치료 분자를 포함한 임의의 추가 분자를 발현하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 추가 분자는 마커, 추가의 재조합 수용체 폴리펩티드 사슬, 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 면역조절 분자, 리간드, 사이토카인 또는 케모카인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 인자는 가용성 분자이다. 일부 구현예에서, 추가의 인자는 막-결합된 분자이다. 일부 측면에서, 추가의 인자는 면역억제 환경, 예를 들어, 종양 미세환경(TME)의 효과를 극복하거나 또는 상쇄하는데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 예시적인 추가 분자는 사이토카인, 사이토카인 수용체, 키메라 공-자극 수용체, 공-자극 리간드 및 T 세포 기능 또는 활성의 다른 조정제를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 세포에 의해 발현된 추가 분자는 IL-7, IL-12, IL-15, CD40 리간드(CD40L), 및 4-1BB 리간드(4-1BBL)를 포함한다. 일부 측면에서, 추가 분자는 상이한 분자에 결합하는 추가의 수용체, 예를 들어, 막-결합된 수용체이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 추가 분자는 사이토카인 수용체 또는 케모카인 수용체, 예를 들어, IL-4 수용체 또는 CCL2 수용체이다. 일부 경우에, 조작된 세포는 "무장화된(armored) CAR" 또는 범용 사이토카인 사멸(TRUCK)에 대해 재지정되는 T 세포로 지칭된다.
복수의 조작된 세포를 함유하는 조성물이 또한 제공된다. 일부 측면에서, 조작된 세포를 함유하는 조성물은 다른 조작 방법, 예를 들어, 재조합 수용체가 세포의 게놈 내로 무작위로 도입되는 방법을 사용하여 생성된 세포 또는 세포 조성물과 비교하여 재조합 수용체에 의한 개선된, 균일한, 균질한 및/또는 안정한 발현 및/또는 항원 결합을 나타낸다. 일부 구현예에서, 조작된 세포 또는 조작된 세포를 포함하는 조성물은 요법, 예를 들어, 입양 세포 요법에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 세포 또는 세포 조성물은 본원에 기재된 임의의 치료 방법에서 또는 본원에 기재된 치료 용도를 위해 사용될 수 있다.
A. 변형된 유전자 좌들(Modified Loci)
일부 측면에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 세포, 예를 들어, 변형된 T 세포가 제공된다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하고, 전이 유전자는 선택적으로 상동성-지시된 수선(homology directed repair; HDR)를 통해 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 통합되었다. 일부 측면에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 예를 들어, 섹션 IVB에서 본원에 기재된 재조합 수용체 중 임의의 하나 이상, 또는 이의 일부, 예를 들어, 도메인 또는 이의 영역, 또는 본원에 기재된 다중-사슬 재조합 수용체의 하나 이상의 사슬을 암호화할 수 있다.
일부 구현예에서, PDCD1 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된, 재조합 수용체 또는 이의 일부, 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 재조합 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 변형된 PDCD1 유전자 좌를 함유하는 조작된 세포가 제공되며, 여기서 내인성 전사 조절 요소 PDCD1은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현을 유도 또는 상향조절, 예를 들어, 일시적으로 유도 또는 상향조절한다.
일부 구현예에서, CD69 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된, 재조합 수용체 또는 이의 일부, 예를 들어, CAR 또는 TCR을 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 변형된 CD69 유전자 좌를 함유하는 조작된 세포가 제공되며, 여기서 내인성 전사 조절 요소 CD69는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현을 유도 또는 상향조절, 예를 들어, 일시적으로 유도 또는 상향조절한다.
일부 구현예에서, Nur77(NR4A1을 암호화하는) 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된, 재조합 수용체 또는 이의 일부, 예를 들어, CAR 또는 TCR을 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 변형된 Nur77 유전자 좌를 함유하는 조작된 세포가 제공되며, 여기서 내인성 전사 조절 요소 Nur77(NR4A1을 암호화하는)은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현을 유도 또는 상향조절, 예를 들어, 일시적으로 유도 또는 상향조절한다.
일부 구현예에서, FoxP3 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된, 재조합 수용체 또는 이의 일부, 예를 들어, CAR 또는 TCR을 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 변형된 FoxP3 유전자 좌를 함유하는 조작된 세포가 제공되며, 여기서 내인성 전사 조절 요소 FoxP3은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현을 유도 또는 상향조절, 예를 들어, 일시적으로 유도 또는 상향조절한다.
일부 구현예에서, HLA-DR 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된, 재조합 수용체 또는 이의 일부, 예를 들어, CAR 또는 TCR을 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 변형된 HLA-DR 유전자 좌를 함유하는 조작된 세포가 제공되며, 여기서 내인성 전사 조절 요소는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현을 유도하거나 상향조절하며, 예를 들어, 일시적으로 유도하거나 상향조절한다.
일부 구현예에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 전이 유전자(예를 들어, 외인성 또는 이종성 핵산 서열)의 유전자 파괴 및 통합의 결과로서, 예를 들어, HDR 방법을 통해 생성된다. 일부 측면에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 존재하는 핵산 서열은 전이 유전자(들), 예를 들어, 일반적으로 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 전장 유전자 생성물을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 영역에 통합된 외인성 서열을 포함한다. 일부 측면에서, HDR에 의한 전이 유전자의 표적화된 통합시, 세포의 게놈은 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 함유한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자의 통합 후에, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 유전자 생성물은 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌로부터 발현되는 재조합 수용체에 더하여 완전히 발현된다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자의 통합 후에, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 유전자 생성물의 전부 또는 일부는 발현되지 않는다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 전장 내인성 유전자 생성물의 일부를 암호화하며, 예를 들어, 내인성 유전자 생성물은 결실을 함유한다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 유전자 생성물을 암호화하지 않으며, 즉, 내인성 유전자 생성물은 녹 아웃된다. 일부 구현예에서, 표적화된 통합시, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 내의 부위에 통합된 전이 유전자를 함유하여, 재조합 수용체는 조작된 세포로부터 발현되고, 일부 경우에, 또한 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 유전자 생성물의 일부, 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 부분적 또는 절단된 유전자 생성물이다.
일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1이고, 유전자 좌의 내인성 유전자 생성물, PD-1은 발현되지 않거나 기능적이지 않다. 일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1이고, 유전자 좌의 내인성 유전자 생성물, PD-1은 전장으로 발현되거나 기능적이다. 일부 측면에서, PD1 폴리펩티드 및 재조합 수용체 또는 그의 일부 둘 다는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 PDCD1을 포함하는 세포에서 공-발현된다.
일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 CD69이고, 유전자 좌의 내인성 유전자 생성물, CD69는 발현되지 않거나 또는 기능적이지 않다. 일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 CD69이고, 유전자 좌의 내인성 유전자 생성물, CD69는 전장으로 발현되거나 또는 기능적이다. 일부 측면에서, CD69 폴리펩티드 및 재조합 수용체 또는 그의 일부 둘 다는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 CD69를 포함하는 세포에서 공-발현된다.
일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 Nur77이고, 유전자 좌의 내인성 유전자 생성물, NR4A1은 발현되지 않거나 또는 기능적이지 않다. 일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 Nur77이고, 유전자 좌의 내인성 유전자 생성물, NR4A1은 전장으로 발현되거나 또는 기능적이다. 일부 측면에서, Nur77 폴리펩티드 및 재조합 수용체 또는 그의 일부 둘 다는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 Nur77을 포함하는 세포에서 공-발현된다.
일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 FoxP3이고, 유전자 좌의 내인성 유전자 생성물, FoxP3은 발현되지 않거나 또는 기능적이지 않다. 일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 FoxP3이고, 유전자 좌의 내인성 유전자 생성물, FoxP3은 전장으로 발현되거나 또는 기능적이다. 일부 측면에서, FoxP3 폴리펩티드 및 재조합 수용체 또는 그의 일부 둘 다는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 FoxP3을 포함하는 세포에서 공-발현된다.
일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 HLA - DRA이고, 유전자 좌의 내인성 유전자 생성물, HLA-DRA는 발현되지 않거나 또는 기능적이지 않다. 일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 HLA - DRA이고, 유전자 좌의 내인성 유전자 생성물, HLA-DRA는 전장으로 발현되거나 또는 기능적이다. 일부 측면에서, HLA-DRA 폴리펩티드 및 재조합 수용체 또는 그의 일부 둘 다는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 HLA - DRA를 포함하는 세포에서 공-발현된다.
일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 HLA - DRB1이고, 유전자 좌의 내인성 유전자 생성물, HLA-DRB1은 발현되지 않거나 또는 기능적이지 않다. 일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 HLA - DRB1이고, 유전자 좌의 내인성 유전자 생성물, HLA-DRB1은 전장으로 발현되거나 또는 기능적이다. 일부 측면에서, HLA-DRB1 폴리펩티드 및 재조합 수용체 또는 그의 일부 둘 다는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 HLA - DRB1을 포함하는 세포에서 공-발현된다.
일부 구현예에서, 전이 유전자의 통합시, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 서열은 유전자 파괴, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산을 암호화하는 핵산 서열의 결실 및/또는 정지 코돈을 도입하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자의 통합시, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 서열은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 폴리펩티드의 기능적 유전자 생성물을 암호화하지 않는다. 일부 구현예에서, 전이 유전자의 통합시, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 서열은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 폴리펩티드의 부분적 유전자 생성물 또는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 폴리펩티드의 절단된 유전자 생성물을 암호화한다.
특정 구현예에서, 전이 유전자는 재조합 수용체를 암호화하고, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 오픈 리딩 프레임 내에 인-프레임으로 삽입된다. 특정 구현예에서, 변형된 유전자 좌의 전사는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 암호화하는 mRNA를 초래한다. 일부 측면에서, 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임에 존재하는 핵산 서열 핵산 서열은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 폴리펩티드의 부분적 또는 절단된 유전자 생성물, 예를 들어, T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 유전자 생성물의 우성 음성 형태(dominant negative form)를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 하나 이상의 오픈 리딩 프레임의 바로 하류의 그리고 인-프레임의 표적 부위에 통합된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1, 2, 3 또는 4 및 엑손 6, 7 또는 8의 상류(본원의 표 1-9에 기재된 바와 같음) 하에 통합되거나 삽입된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1, 2, 3 또는 4 및 엑손 6의 상류(본원의 표 1-9에 기재된 바와 같음) 하에 통합되거나 삽입된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1 및 엑손 8의 상류 하에 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 3 및 엑손 5의 상류 하에 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 4 및 엑손 6의 상류 하에 있다.
일부 구현예에서, 변형된 유전자 좌로부터 전사된 mRNA는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 의해 암호화되고/되거나 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌로부터 전사된 mRNA의 3' UTR과 동일한 3' UTR을 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 CAR의 부분을 암호화하는 핵산의 서열의 상류, 예를 들어, 바로 상류의 리보솜 스키핑 요소를 함유한다. 일부 구현예에서, CAR을 암호화하는 mRNA는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 의해 암호화되고/되거나 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌로부터 전사된 mRNA의 5' UTR과 동일한 5' UTR을 함유한다.
일부 구현예에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌로부터 암호화된 재조합 수용체는 CAR이다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 의해 암호화된 CAR은 표적 항원에 결합하고/하거나 그에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 질환, 장애 또는 상태와 연관된 세포 또는 조직 상에서 연관되거나, 그에 특이적이고/이거나 발현된다. 일부 구현예에서, CAR은 예를 들어, CD3-제타(CD3ζ) 사슬 또는 그의 기능적 변이체 또는 신호전달 부분의 세포내 신호전달 도메인 또는 영역을 통해 T 세포, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호전달 도메인 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인에서 1차 활성화 신호를 자극 및/또는 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌로부터 암호화된 재조합 수용체는 재조합 TCR이다. 일부 측면에서, 재조합 TCR은 2개의 폴리펩티드 사슬, 예를 들어, TCR 알파(TCRα) 및 TCR 베타(TCRβ) 사슬; 또는 TCR 감마(TCRγ) 및 TCR 델타(TCRδ) 사슬을 포함한다. 일부 측면에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 재조합 TCR의 하나 이상의 사슬을 암호화한다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 TCRα를 암호화한다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 TCRβ를 암호화한다. 일부 측면에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌가 재조합 TCR의 단지 하나의 사슬을 암호화하는 경우, TCR의 다른 사슬은 예를 들어, 상이한 게놈 위치에서 조작된 세포에 존재하는 제 2 전이 유전자에 의해 암화화될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 선택적으로 2A 요소와 같은 멀티시스트로닉 요소에 의해 분리된 TCRα 및 TCRβ를 암호화한다.
B. 암호화된 재조합 수용체
일부 구현예에서, 본원에서 제공된 조작된 세포에 의해 암호화된 재조합 수용체, 또는 본원에서 제공된 방법에 따라 생성된 조작된 세포는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 그의 부분, 또는 재조합 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 일부를 포함한다. 재조합 수용체 중에는 키메라 수용체, 항원 수용체 및 키메라 수용체 또는 항원 수용체의 하나 이상의 성분을 함유하는 수용체가 있다. 재조합 수용체는 리간드-결합 도메인 또는 이의 결합 단편 및 새포내 신호 전달 도메인 또는 영역을 함유하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 세포에 의해 암호화된 재조합 수용체는 기능성 비-TCR 항원 수용체, 키메라 항원 수용체(CAR), 키메라 자가항체(CAAR), 재조합 T 세포 수용체(TCR) 및 전술한 임의의 것의 영역(들), 사슬(들), 도메인(들) 또는 성분(들)을 포함한다. 일부 측면에서, 재조합 수용체 또는 그의 일부는 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 상기 섹션 II.B.2에 기재된 임의의 주형 폴리뉴클레오티드에 존재하는 전이 유전자에 의해 암호화된다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드에 함유된 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 전이 유전자는 조작된 세포의 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 통합되어, 재조합 수용체 또는 그의 일부, 예를 들어, 다중-사슬 재조합 수용체의 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는, 본원에 기재된 임의의 재조합 수용체를 암호화하는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 생성한다.
일부 구현예에서, 조작된 세포로부터 발현된 예시적인 재조합 수용체는 둘 이상의 수용체 폴리펩티드를 함유하고, 일부 경우에 상이한 성분, 도메인 또는 영역을 함유하는 다중-사슬 수용체를 포함한다. 일부 측면에서, 재조합 수용체는 함께 기능적 재조합 수용체를 포함하는 둘 이상의 폴리펩티드를 함유한다. 일부 측면에서, 다중-사슬 수용체는 함께 기능적 재조합 수용체를 포함하는 두 개의 폴리펩티드를 포함하는 이중 사슬 수용체이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 두 개의 상이한 수용체 폴리펩티드, 예를 들어, TCR 알파(TCRα) 및 TCR 베타(TCRβ) 사슬; 또는 TCR 감마(TCRγ) 및 TCR 델타(TCRδ) 사슬을 포함하는 TCR이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 2개 이상의 상이한 수용체 폴리펩티드, 예를 들어, 다중-사슬 CAR을 포함하는 CAR이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 하나 이상의 폴리펩티드가 다른 수용체 폴리펩티드의 발현, 활성 또는 기능을 조절, 변형 또는 제어하는 다중-사슬 수용체이다. 일부 측면에서, 다중-사슬 수용체는 수용체의 특이성, 활성, 항원(또는 리간드) 결합, 기능 및/또는 발현의 공간적 또는 시간적 조절 또는 제어를 허용한다. 일부 측면에서, 전체 재조합 수용체, 예를 들어, 다중-사슬 재조합 수용체의 모든 사슬은 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 존재하는 전이 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 일부 측면에서, 다중-사슬 재조합 수용체의 하나의 사슬은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 존재하는 전이 유전자에 의해 암호화될 수 있고, 다른 사슬(들)은 게놈 내의 상이한 위치에 존재하는 제 2 전이 유전자(예를 들어, 상이한 T 세포 자극-연관된 유전자 좌, 또는 상이한 위치)에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공된 유전자 조작된 세포에서 암호화된 재조합 수용체는 막관통 도메인 또는 막 결합 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, 재조합 수용체는 또한 세포외 영역을 함유한다. 일부 측면에서, 재조합 수용체는 또한 세포내 영역을 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 유전자 조작된 세포에서 암호화된 재조합 수용체는 다양한 영역 또는 도메인, 예를 들어, 세포외 영역(예를 들어, 하나 이상의 세포외 결합 도메인(들) 및/또는 스페이서를 함유함), 막관통 도메인 및 세포내 영역(예를 들어, 세포내 신호전달 영역 및/또는 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인을 함유함) 중의 하나 이상을 함유한다. 일부 측면에서, 암호화된 재조합 수용체는 다른 도메인, 예를 들어, 다량체화 도메인, 링커 및/또는 조절 요소를 더 함유한다.
일부 구현예에서, 예시적인 암호화된 재조합 수용체는 그의 N-말단에서 C-말단 순서로: 막관통 도메인(또는 막 결합 도메인) 및 세포내 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 암호화된 재조합 수용체는 이의 N-말단에서 C-말단 순서로: 세포외 영역, 막관통 도메인 및 세포내 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 영역은 세포외 결합 도메인이거나 또는 이를 포함하고, 일부 측면에서, 암호화된 재조합 수용체는 이의 N-말단에서 C-말단 순서로: 세포외 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 영역을 포함한다. 일부 경우에, 스페이서는 세포외 영역, 예를 들어, 세포외 결합 도메인 및 막관통 도메인을 분리하거나 또는 이들 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 이의 N-말단에서 C-말단 순서로: 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 세포내 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체에 존재하는 세포내 신호전달 영역은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM) 및/또는 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인, 예를 들어, 1, 2 또는 3개의 공-자극 신호전달 도메인을 함유한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체는 다량체화 도메인을 함유하며, 이는 일부 측면에서 이의 다중-사슬 폴리펩티드의 형성을 달성할 수 있다. 일부 구현예에서, 예시적인 암호화된 재조합 수용체는 이의 N-말단에서 C-말단 순서로: 막관통 도메인(또는 막 결합 도메인), 세포내 다량체화 도메인, 선택적으로 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인(들), 및 세포내 신호전달 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 재조합 수용체 폴리펩티드는 이의 N-말단에서 C-말단 순서로: 세포외 다량체화 도메인, 막관통 도메인, 선택적으로 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인(들), 및 세포내 신호전달 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 키메라 수용체, 선택적으로 CAR이다. 예시적인 암호화된 CAR 서열은 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 1차 신호전달 도메인 또는 영역 및 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 암호화된 CAR 서열은 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인 및 1차 신호전달 도메인 또는 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 예시적인 암호화된 폴리펩티드, 선택적으로 다중-사슬 CAR의 폴리펩티드 사슬은 세포외 다량체화 도메인, 막관통 도메인, 선택적으로 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인(들), 및 1차 신호전달 도메인 또는 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 암호화된 폴리펩티드, 선택적으로 다중-사슬 CAR의 폴리펩티드 사슬은 세포외 다량체화 도메인, 막관통 도메인, 선택적으로 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인(들), 및 1차 신호전달 도메인 또는 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 예시적인 암호화된 CAR 서열은 세포외 결합 도메인, 선택적으로 scFv를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열; 선택적으로 인간 면역글로불린 힌지, 선택적으로 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 이의 변형된 버전으로부터의 서열을 포함하고, 선택적으로 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 더 포함하는 스페이서; 및 선택적으로 인간 CD28로부터의 막관통 도메인; 선택적으로 인간 4-1BB로부터의 공-자극 신호전달 도메인; 및 세포내 신호전달 영역, 선택적으로 CD3ζ 사슬 또는 이의 일부를 순서대로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 암호화된 세포내 영역은 이의 N-말단에서 C-말단의 순서로: 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인(들) 및 1차 신호전달 도메인 또는 영역, 선택적으로 CD3제타 사슬 또는 이의 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 재조합 TCR이고, 예시적인 암호화된 TCR은 TCRα 사슬 또는 TCRβ 사슬 또는 둘 다를 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 암호화된 폴리펩티드, 선택적으로 재조합 수용체의 폴리펩티드는 TCRα 사슬의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 암호화된 폴리펩티드, 선택적으로 재조합 수용체의 폴리펩티드는 TCRβ 사슬의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 측면에서, 예시적인 암호화된 재조합 수용체는 TCRα 사슬 및 TCRβ 사슬을 포함하는 재조합 TCR이다.
1.
키메라
항원 수용체(CAR)
일부 구현예에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 의해 암호화된 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 구현예에서, 조작된 세포, 예를 들어, T 세포는 특정 항원(또는 마커 또는 리간드), 예를 들어, 특정 세포 유형의 표면 상에서 발현된 항원에 대해 특이성을 갖는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 발현한다. 일부 측면에서, 다중-사슬 또는 조절가능한 CAR을 포함하는 본원에 기재된 임의의 CAR의 적어도 일부는 전이 유전자에서 암호화된다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 CAR 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자는 섹션 II.B.2에 기재된 임의의 것일 수 있다. 일부 측면에서, HDR을 통한 전이 유전자의 통합시, 생성된 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 CAR, 예를 들어, 다중-사슬 또는 조절가능한 CAR을 포함하는 본원에 기재된 임의의 CAR을 암호화하는 핵산 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 의해 암호화된 재조합 수용체, 예를 들어, CAR은 하나 이상의 세포외 영역(예를 들어, 하나 이상의 세포외 결합 도메인(들) 및/또는 스페이서를 함유함), 막관통 도메인 및/또는 세포내 영역(예를 들어, 1차 신호전달 영역 또는 도메인 및/또는 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인을 함유함)을 함유한다. 일부 측면에서, 암호화된 재조합 수용체는 다른 도메인, 예를 들어, 다량체화 도메인을 추가로 함유한다. 일부 측면에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 링커 및/또는 조절 요소를 암호화하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 이의 N 말단에서 C 말단의 순서로: 예를 들어, 1차 신호전달 영역 또는 도메인 또는 이의 일부 및/또는 공-자극 신호전달 도메인을 포함하는, 세포외 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 이의 N 말단에서 C 말단의 순서로: 예를 들어, 1차 신호전달 영역 또는 도메인 또는 이의 일부 및/또는 공-자극 신호전달 도메인을 포함하는, 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 세포내 영역을 포함한다.
a. 결합 도메인
일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체의 세포외 영역은 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 도메인은 세포외 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 결합 도메인은 폴리펩티드, 리간드, 수용체, 리간드-결합 도메인, 수용체-결합 도메인, 항원, 에피토프, 항체, 항원-결합 도메인, 에피토프-결합 도메인, 항체-결합 도메인, 항체-결합 도메인, 태그-결합 도메인 또는 상기 중 임의의 것의 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 도메인은 리간드- 또는 항원-결합 도메인이다.
일부 측면에서, 세포외 결합 도메인, 예를 들어, 리간드-(예를 들어, 항원-) 결합 영역 또는 도메인(들) 및 세포내 영역 또는 도메인(들)은 하나 이상의 링커 및/또는 막관통 도메인(들)을 통해 연결되거나(linked) 이어진다(connected). 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 세포외 영역과 세포내 영역 사이에 배치된 막관통 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원, 예를 들어, 재조합 수용체의 결합 도메인에 결합하는 항원은 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 항원은 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구현예에서, 항원은 정상 또는 비-표적화 세포 또는 조직, 예를 들어, 건강한 세포 또는 조직과 비교하여, 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 종양 또는 병원성 세포의 세포 상에서 예를 들어, 발현되거나 과발현된다. 일부 구현예에서, 질환, 장애 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환, 또는 종양 또는 암이다. 일부 구현예에서, 항원은 정상 세포 상에서 발현되고/되거나 조작된 세포 상에서 발현된다. 일부 측면에서, 재조합 수용체, 예를 들어, CAR은 세포외 리간드-(예를 들어, 항원-) 결합 또는 영역 또는 도메인, 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 항체 또는 단편, 및 세포내 영역으로부터 선택된 하나 이상의 영역 또는 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드-(예를 들어, 항원-) 결합 영역 또는 도메인은 scFv 또는 단일-도메인 VH 항체이거나 이를 포함하고, 세포내 영역은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 세포내 신호전달 영역 또는 도메인을 포함한다.
CAR을 포함하는 예시적 암호화된 재조합 수용체는 예를 들어, 국제공개공보 제WO200014257호, 제WO2013126726호, 제WO2012/129514호, 제WO2014031687호, 제WO2013/166321호, 제WO2013/071154호, 제WO2013/123061호 및 미국특허출원공개공보 제US2002131960호, 제US2013287748호, 제US20130149337호, 미국특허 제6,451,995호, 제7,446,190호, 제8,252,592호, 제8,339,645호, 제8,398,282호, 제7,446,179호, 제6,410,319호, 제7,070,995호, 제7,265,209호, 제7,354,762호, 제7,446,191호, 제8,324,353 및 제8,479,118호 및 유럽특허출원 제EP2537416호에 기재된 것들 및/또는 문헌 [Sadelain 등, Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila 등, (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle 등, Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu 등, Cancer, 2012 March 18(2): 160-75]에 기재된 것들을 포함한다. 일부 측면에서, 항원 수용체는 문헌 [미국특허 제7,446,190호]에 기재된 바와 같은 CAR 및 문헌 [국제공개공보 제WO/2014055668 A1호]에 기재된 것을 포함한다. CAR의 예로는 전술한 간행물 중의 어느 하나, 예컨대 문헌 [국제공개공보 제WO2014031687호, 미국특허 제US8,339,645호, 미국특허출원공개공보 제US7,446,179호, 제US2013/0149337호, 미국특허 제7,446,190호, 제8,389,282호, Kochenderfer 등의, 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang 등의 (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; 및 Brentjens 등의, Sci Transl Med. 2013 5(177)]에 개시된 바와 같은 CAR이 포함된다.
일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체, 예를 들어, 항원 수용체는 항원, 리간드 및/또는 마커에 예를 들어, 특이적으로 결합하는 세포외 결합 도메인, 예를 들어, 항원- 또는 리간드 결합 도메인을 함유한다. 항원 수용체 중에는 기능성 비-TCR 항원 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체(CAR)가 있다. 일부 구현예에서, 항원 수용체는 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 인식 도메인을 함유하는 CAR이다. 일부 구현예에서, 특정 항원, 마커 또는 리간드, 예컨대 입양 요법에 의해 표적화될 특정 세포 유형에서 발현되는 항원, 예를 들어, 암 마커 및/또는 감쇠 반응을 유도하도록 의도된 항원, 예컨대 정상 또는 비질환 세포 유형에서 발현된 항원에 대한 특이성을 갖는 CAR이 작제된다. 따라서, CAR은 전형적으로 하나 이상의 리간드-(예를 들어, 항원-) 결합 분자, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 단편, 도메인 또는 부분 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인 및/또는 항체 분자를 세포외 부분에 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 항체 분자의 항원 결합 부분 또는 부분들, 예컨대 단클론 항체(monoclonal antibody, mAb)의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)에서 유래된 단일 사슬 항체 단편(single-chain antibody fragment, scFv) 또는 단일 도메인 항체(single domain antibody, sdAb), 예컨대 sdFv, 나노바디(nanobody), VHH 및 VNAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단편은 가요성 링커에 의해 연결된 항체 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 암호화된 CAR은 세포의 표면 상에 발현된 온전한 항원과 같은 항원 또는 리간드를 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, scFv)을 함유한다. 일부 구현예에서, 항원 또는 리간드는 세포의 표면 상에 발현된 단백질이다. 일부 구현예에서, 항원 또는 리간드는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 이는 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구현예에서, 항원 또는 리간드는 정상 또는 비 표적화 세포 또는 조직과 비교하여 질환 또는 병태의 세포, 예를 들어, 종양 또는 병원성 세포 상에서 예를 들어, 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예에서, 항원은 정상 세포 상에서 발현되고/되거나 조작된 세포 상에서 발현된다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체에 의해 표적화된 항원 중에는 입양 세포 요법을 통해 표적화될 질환, 병태 또는 세포 유형의 맥락에서 발현되는 것이 있다. 질환 및 병태 중에는 혈액암(hematologic malignancy), 면역계 암, 예컨대 림프종, 백혈병 및/또는 골수종, 예컨대 B, T 및 골수성 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종을 포함한 암 및 종양을 포함한 증식성, 신생물성 및 악성 질환 및 장애가 있다.
일부 구현예에서, 항원 또는 리간드는 종양 항원 또는 암 마커(cancer marker)이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애와 관련된 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 인테그린), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산탈수효소 9(CA9, 또한 CAIX 또는 G250으로 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2로 공지됨), 암태아성 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(chondroitin sulfate proteoglycan) 4(CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백 2(EPG-2), 상피 당단백 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5, 또한 Fc 수용체 유사 5 또는 FCRH5로 공지됨), 태아성 아세틸콜린 수용체(태아성 AchR), 폴레이트 결합 단백질(FBP), 폴레이트 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화된 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질-커플링된 수용체 부류 C 그룹 5 멤버 D(protein-coupled receptor class C group 5 member D; GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-멜라노마-연관 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복 함유 8 패밀리 멤버 A(LRRC8A), 루이스 Y, 멜라노마-연관 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 사이토메갈로바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 온코페탈 항원, 멜라노마의 우선 발현된 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 세포영양막 당단백(TPBG, 또한 5T4로 공지됨), 종양-연관 당단백 72(TAG72), 티로시나제 관련된 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75라고도 알려짐), 티로시나제 관련된 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토머라제(dopachrome tautomerase), 도파크롬 델타-이소머라제(dopachrome delta-isomerase) 또는 DCT라고도 알려짐), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 윌름스 종양 1(WT-1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원, 또는 유니버설 태그로 연관된 항원, 및/또는 비오틴화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자이거나 또는 그들을 포함한다. 일부 구현예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 다수의 공지된 B 세포 마커의 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 연관된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 또는 그를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항원은 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항원은 바이러스성 항원(예를 들어, HIV, HCV, HBV 등으로부터 바이러스성 항원), 박테리아성 항원, 및/또는 기생충 항원이이다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv 또는 VH 도메인)은 항원, 예를 들어, CD19를 특이적으로 인식한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 CD19에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편으로부터 유래되거나, 또는 이의 변이체이다.
일부 구현예에서, 항원 또는 항원 결합 도메인은 CD19이다. 일부 구현예에서, scFv는 CD19에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, CD19에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 FMC63 및 SJ25C1과 같은 마우스 유래 항체이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 예를 들어, 미국특허출원공개공보 제US2016/0152723호에 서술된 바와 같은, 인간 항체이다.
일부 구현예에서, scFv는 FMC63으로부터 유래된다. FMC63은 일반적으로 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및 -16 세포에 대해 생성된 마우스 단일클론 IgG1 항체를 가리킨다(Ling, N. R. 등 (1987). Leucocyte typeing III. 302). 일부 구현예에서, FMC63 항체는 각각 서열번호 38 및 39에 제시된 CDR-H1 및 CDR-H2, 및 서열번호 40 또는 54에 제시된 CDR-H3 및 서열번호 35에 제시된 CDR-L1 및 서열번호 36 또는 55에 제시된 CDR-L2 및 서열번호 37 또는 34에 제시된 CDR-L3를 포함한다. 일부 구현예에서, FMC63 항체는 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 서열번호 35의 CDR-L1 서열, 서열번호 36의 CDR-L2 서열, 및 서열번호 37의 CDR-L3 서열을 함유하는 가변 경쇄 및/또는 서열번호 38의 CDR-H1 서열, 서열번호 39의 CDR-H2 서열 및 서열번호 40의 CDR-H3 서열을 함유하는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열번호 41에 제시된 가변 중쇄 영역 및 서열번호 42에 제시된 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경사슬은 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 서열번호 56에 제시되어 있다. 일부 구현예에서, scFv는 VH, 링커 및 VL을 순서대로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 VL, 링커 및 VH를 순서대로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열번호 57에 제시된 뉴클레오티드의 서열 또는 서열번호 57과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, scFv는 서열번호 43에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열번호 43과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 SJ25C1로부터 유래된다. SJ25C1은 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및 -16 세포에 대해 생성된 마우스 단일 클론 IgG1 항체이다(Ling, N. R. 등 (1987). Leucocyte typeing III. 302). 일부 구현예에서, SJ25C1 항체는 각각 서열번호 47-49에 제시된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3, 및 각각 서열번호 44-46에 제시된 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함한다. 일부 구현예에서, SJ25C1 항체는 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 서열번호 44의 CDR-L1 서열, 서열번호 45의 CDR-L2 서열, 및 서열번호 46의 CDR-L3 서열을 함유하는 가변 경쇄 및/또는 서열번호 47의 CDR-H1 서열, 서열번호 48의 CDR-H2 서열, 및 서열번호 49의 CDR-H3 서열을 함유하는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열번호 50에 제시된 가변 중쇄 영역 및 서열번호 51에 제시된 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경사슬은 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 서열번호 52에 제시되어 있다. 일부 구현예에서, scFv는 VH, 링커 및 VL을 순서대로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 VL, 링커 및 VH를 순서대로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열번호 53에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열번호 53과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원은 CD20이다. 일부 구현예에서, scFv는 항체 또는 CD20에 특이적인 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, CD20에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 리툭시맙이거나 리툭시맙으로부터 유래된 항체, 예를 들어, 리툭시맙 scFv이다.
일부 구현예에서, 항원은 CD22이다. 일부 구현예에서, scFv는 CD22에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, CD22에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 m971 scFv와 같이 m971 scFv이거나 m971 scFv로부터 유래된 항체이다.
일부 구현예에서, 항원 또는 항원 결합 도메인은 BCMA이다. 일부 구현예에서, scFv는 BCMA에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, BCMA에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 문헌 [국제공개공보 제WO 2016/090327호 및 제WO 2016/090320호]에 제시된 항체 또는 항체 단편으로부터의 VH 및 VL이거나 이를 함유한다.
일부 구현예에서, 항원 또는 항원 결합 도메인은 GPRC5D이다. 일부 구현예에서, scFv는 GPRC5D에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, GPRC5D에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 문헌 [국제공개공보 제WO 2016/090329호 및 제WO 2016/090312호]에 제시된 항체 또는 항체 단편으로부터의 VH 및 VL이거나 이를 함유한다.
일부 측면에서, 암호화된 CAR은 예를 들어, 보편적 태그 또는 보편적 에피토프에 결합하거나 이를 인식하는, 예를 들어, 이에 특이적으로 결합하는 리간드-(예를 들어, 항원-)결합 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, 결합 도메인은 질환 또는 장애와 관련된 항원을 인식하는 상이한 결합 분자(예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편)에 연결될 수 있는 분자, 표지, 폴리펩티드 및/또는 에피토프에 결합할 수 있다. 예시적인 표지 또는 에피토프는 염료(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트) 또는 비오틴을 포함한다. 일부 측면에서, 표지에 연결된 결합 분자(예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편)는 이 표지에 특이적인 CAR을 발현하는 조작된 세포로 질환 또는 장애(예를 들어, 종양 항원)을 인식하여 조작된 세포의 세포 독성 또는 다른 이펙터 기능을 달성한다. 일부 측면에서, 질환 또는 장애와 관련된 항원에 대한 CAR의 특이성은 표지된 결합 분자(예를 들어, 항체)에 의해 제공되고, 상이한 항원을 표적화하는 데는 상이하게 표지된 결합 분자가 사용될 수 있다. 보편적 태그 또는 보편적 에피토프에 특이적인 예시적인 CAR은 예를 들어, 문헌 [U.S. 9,233,125, WO 2016/030414, Urbanska 등., (2012) Cancer Res 72: 1844-1852, 및 Tamada 등., (2012) . Clin Cancer Res 18:6436-6445]에 기술된 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, 암호화된 CAR은 MHC-펩티드 복합체로서 세포 표면 상에 제시된 종양 관련 항원과 같은 세포내 항원을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, scFv)과 같은 TCR 유사 항체를 함유한다. 일부 구현예에서, 주요 조직적합성 복합체(MHC)-펩티드 복합체를 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항원 수용체와 같은 재조합 수용체의 일부로 세포 상에서 발현될 수 있다. 항원 수용체 중에는 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 기능성 비-T 세포 수용체(TCR) 항원 수용체가 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 MHC 복합체를 겨냥하여 TCR 유사 특이성을 나타내는 항체 또는 항원 결합 단편을 함유하는 CAR은 또한 TCR 유사 CAR로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 TCR-유사 CAR이고, 항원은 가공된 펩티드 항원, 예를 들어, TCR과 같은 세포내 단백질의 펩티드 항원이고, 이는 MHC 분자의 맥락에서 세포 표면 상에서 인식된다. 일부 구현예에서, TCR-유사 CAR의 MHC-펩티드 복합체에 특이적인 세포외 항원-결합 도메인은 일부 측면에서 링커 및/또는 막관통 도메인(들)을 통해 하나 이상의 세포내 신호전달 성분에 연결된다. 일부 구현예에서, 이러한 분자는 전형적으로 천연 항원 수용체, 예를 들어, TCR을 통한 신호, 및 선택적으로, 공-자극 수용체와 조합된 이러한 수용체를 통한 신호를 모방하거나 근사화할 수 있다.
일부 구현예에서, "주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC)"에 대한 언급은 일부 경우에, 세포 기작에 의해 가공된 펩티드 항원을 포함하여 폴리펩티드의 펩티드 항원과 복합체를 형성할 수 있는 다형성 펩티드 결합 부위 또는 결합 고랑(groove)을 함유하는 단백질, 일반적으로 당단백질을 포함한다. 일부 경우에, MHC 분자는 TCR 또는 TCR 유사 항체와 같은 T 세포 상의 항원 수용체에 의해 인식 가능한 형태로 항원 제시를 위해 펩티드와의 복합체로, 즉 MHC-펩티드 복합체를 포함하여 세포 표면 상에 표시되거나 발현될 수 있다. 일반적으로, MHC 클래스 I 분자는 일부 경우에, 3개의 α 도메인 및 비공유 결합된 β2 마이크로글로불린을 갖는, 막에 걸쳐있는 α 사슬을 갖는 이종이량체이다. 일반적으로 MHC 클래스 II 분자는 두 개의 막관통 당단백질, α 및 β로 구성되며, 둘 다 전형적으로 막에 걸쳐 있다. MHC 분자는 항원 결합 부위 또는 펩티드에 결합하기 위한 부위 및 적절한 항원 수용체에 의한 인식에 필요한 서열을 함유하는 MHC의 유효 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 분자는 시토솔에서 유래한 펩티드를 세포 표면으로 전달하고, 여기서 MHC-펩티드 복합체는 일반적으로 CD8+ T 세포와 같은, 일부 경우에는 CD4+ T 세포와 같은 T 세포에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 II 분자는 소포성 계(vesicular system)에서 기원한 펩티드를 세포 표면으로 전달하며, 이는 전형적으로 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. 일반적으로, MHC 분자는 인간에서 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen, HLA) 및 마우스에서 H-2라고 통칭되는 연관된 유전자 자리(loci) 그룹에 의해 암호화된다. 따라서, 전형적으로 인간 MHC는 인간 백혈구 항원(HLA)으로도 지칭될 수 있다.
용어 "MHC-펩티드 복합체(MHC-peptide complex)" 또는 "펩티드-MHC 복합체(peptide-MHC complex)" 또는 이의 변형은 예컨대 일반적으로 MHC 분자의 결합 고랑(groove) 또는 틈에서 펩티드의 비공유 상호작용에 의한 펩티드 항원 및 MHC 분자의 복합체 또는 회합을 지칭한다. 일부 구현예에서, MHC-펩티드 복합체는 세포의 표면 상에 존재하거나 표시된다. 일부 구현예에서, MHC-펩티드 복합체는 TCR, TCR 유사 CAR 또는 이의 항원 결합 부분과 같은 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드의 펩티드 항원 또는 에피토프와 같은 펩티드는 예컨대 항원 수용체에 의한 인식을 위해 MHC 분자와 회합할 수 있다. 일반적으로, 펩티드는 폴리펩티드 또는 단백질과 같은 보다 긴 생물학적 분자의 단편으로부터 유래되거나 이를 기초로 한다. 일부 구현예에서, 펩티드는 전형적으로 약 8 내지 약 24개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드는 MHC 클래스 II 복합체에서 인식을 위해 (약) 9 내지 22개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 펩티드는 MHC 클래스 I 복합체에서 인식을 위해 (약) 8 내지 13개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, MHC-펩티드 복합체와 같은 MHC 분자의 맥락에서 펩티드 인식 시, TCR 또는 TCR 유사 CAR과 같은 항원 수용체는 T 세포 반응, 예컨대 T 세포 증식, 사이토카인 생성, 세포 독성 T 세포 반응 또는 다른 반응을 유도하는 T 세포에 대한 활성화 신호를 생성하거나 유발시킨다.
일부 구현예에서, TCR 유사 항체 또는 항원 결합 부분은 공지되어 있거나, 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 미국특허출원공개공보 제US 2002/0150914호; 제US2003/0223994호; 제US 2004/0191260호; 제US2006/0034850호; 제US2007/00992530호; 제US20090226474호; 제US20090304679호; 및 국제공개공보 제WO 03/068201호 참조).
일부 구현예에서, MHC-펩티드 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 특이적인 MHC-펩티드 복합체를 함유하는 유효량의 면역원으로 숙주를 면역화함으로써 생산될 수 있다. 일부 경우에, MHC-펩티드 복합체의 펩티드는 종양 항원, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 범용 종양 항원, 골수종 항원 또는 기타 항원과 같이 MHC에 결합할 수 있는 항원의 에피토프이다. 일부 구현예에서, 이어서 유효량의 면역원이 면역 반응을 유발하기 위해 숙주에 투여되고, 여기서 면역원은 MHC 분자의 결합 고랑에서 펩티드의 3차원 제시에 대하여 면역 반응을 유발하기에 충분한 기간 동안 이의 3차원 형태를 유지한다. 이어서 숙주로부터 수집된 혈청을 분석하여 MHC 분자의 결합 고랑에서 펩티드의 3차원 제시를 인식하는 원하는 항체가 생성되고 있는지 여부를 결정한다. 일부 구현예에서, 생성된 항체를 분석하여 상기 항체가 MHC-펩티드 복합체와 MHC 분자 단독, 관심 펩티드 단독 및 MHC 및 무관한 펩티드의 복합체를 구별할 수 있는지 확인할 수 있다. 이어서 원하는 항체를 단리할 수 있다.
일부 구현예에서, MHC-펩티드 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 파지 항체 라이브러리와 같은 항체 라이브러리 디스플레이 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 라이브러리의 멤버들이 CDR 또는 CDR들의 하나 이상의 잔기에서 돌연변이되는 돌연변이체 Fab, scFv 또는 기타 항체 형태의 파지 디스플레이 라이브러리가 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [미국특허출원공개공보 제US20020150914호, 제US2014/0294841호; 및 Cohen CJ. 등. (2003) J Mol . Recogn. 16:324-332]을 참조한다.
여기에서 용어 "항체(antibody)"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 온전한 항체 및 기능성(항원-결합) 항체 단편을 포함하는 다클론성 및 단클론성 항체를 포함하며, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단편 항원 결합(Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG(rIgG) 단편, 가변 중쇄(VH) 영역, 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함한 단일 사슬 항체 단편 및 단일 도메인 항체(예를 들어, sdAb, sdFv, 나노바디(nanobody), VHH 또는 VNAR) 단편을 포함한다. 상기 용어는 유전자 조작되고/되거나 달리 변형된 형태의 면역 글로불린, 예컨대 인트라바디(intrabodies), 펩티바디(peptibodies), 키메라 항체, 완전한 인간 항체, 인간화된 항체 및 이종 접합 항체, 다중 특이적, 예를 들어, 이중 특이적 항체, 디아바디(diabodies), 트리아바디(triabodies) 및 테트라바디(tetrabodies), 탠덤 디-scFv, 탠덤 트리-scFv를 포괄한다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 "항체(antibody)"는 이의 기능성 항체 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 용어는 또한 IgG 및 이의 하위 클래스, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하는 임의의 클래스 또는 하위 클래스의 항체를 포함하는 온전한 또는 전장 항체를 포함한다. 일부 측면에서, CAR은 예를 들어, 상이한 특이성을 갖는 2개의 항원-결합 도메인을 함유하는 이중특이적 CAR이다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질, 항체 및 이의 항원 결합 단편은 전장 항체의 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 구현예에서, 항체의 중쇄 및 경사슬은 전장일 수 있거나 또는 항원 결합 부분(Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일 사슬 FV 단편(scFv))일 수 있다. 다른 구현예에서, 항체 중쇄 불변 영역은 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE로부터 선택되고, 특히 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택되고, 보다 특히, IgG1(예를 들어, 인간 IgG1)으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항체 경쇄 불변 영역은 예를 들어, 카파 또는 람다, 특히 카파에서 선택된다.
암호화된 재조합 수용체의 결합 도메인 중에는 항체 단편이 있다. "항체 단편(antibody fragment)" 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 가변 중쇄(VH) 영역, scFv와 같은 단일 사슬 항체 분자 및 단일 도메인 VH 단일 항체; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 임의의 구현예 중의 일부에서, 항체는 scFv와 같은 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역을 포함하는 단일 사슬 항체 단편이다.
용어 "가변 영역(variable region)" 또는 "가변 도메인(ariable domain)"은 항체가 항원에 결합하는데 관여하는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(framework region, FR) 및 3개의 CDR을 포함한다. (예를 들어, Kindt 등, Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91 페이지 (2007) 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보적 VL 또는 VH 도메인 라이브러리를 각각 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Portolano 등, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson 등, Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
단일 도메인 항체(sdAb)는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다. 일부 구현예에서, CAR은 항원, 예컨대 표적화될 세포 또는 질환의 암 마커 또는 세포 표면 항원, 예컨대 종양 세포 또는 암세포, 예컨대 여기에 기재되거나 공지된 표적 항원 중의 어느 하나에 특이적으로 결합하는 항체 중쇄 도메인을 포함한다. 예시적인 단일-도메인 항체는 sdFv, 나노바디, VHH 또는 VNAR을 포함한다.
항체 단편은 온전한 항체의 단백질 분해 소화 및 재조합 숙주 세포에 의한 생산을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 재조합으로 생성된 단편, 예컨대 합성 링커, 예를 들어, 펩티드 링커에 의해 연결된 둘 이상의 항체 영역 또는 사슬을 갖는 것과 같은 자연적으로 발생하지 않고/거나 자연적으로 발생하는 온전한 항체의 효소 소화에 의해 생성되지 않을 수 있는 배열을 포함하는 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 scFv이다.
"인간화된(humanized)" 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 아미노산 잔기가 비인간 CDR로부터 유래되고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 아미노산 잔기가 인간 FR로부터 유래된 항체이다. 인간화된 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 비인간 항체의 "인간화된 형태(humanized form)"는 모체 비인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서, 전형적으로 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화를 거친 비인간 항체의 변이체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체의 일부 FR 잔기는 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 회복 또는 개선시키기 위해 비인간 항체(예를 들어, CDR 잔기가 유래된 항체)로부터의 해당 잔기로 치환된다.
따라서, 일부 구현예에서, TCR 유사 CAR을 포함하는 암호화된 키메라 항원 수용체는 항체 또는 단편을 함유하는 세포외 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 scFv를 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 특이적 항원 또는 리간드에 대한 결합을 위해 scFv 라이브러리를 스크리닝하는 것과 같이, 항원-결합 단편 또는 분자의 복수, 예를 들어, 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다.
일부 구현예에서, 암호화된 CAR은 다중 특이적 CAR이고, 예를 들어, 복수의 상이한 항원에 결합 및/또는 인식할 수 있는, 예를 들어, 특이적으로 결합할 수 있는 복수의 리간드-(예를 들어, 항원-) 결합 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, 암호화된 CAR은 상이한 특이성을 갖는 2개의 항원-결합 도메인을 함유함으로써 2개의 항원을 표적화하는 이중 특이적 CAR이다. 일부 구현예에서, CAR은, 예를 들어, 여기에 기재된 바와 같은 임의의 열거된 항원, 예를 들어, CD19 및 CD22 또는 CD19 및 CD20에서 선택된 표적 세포 상의 상이한 표면 항원에 결합하는 하나 이상의 항원-결합 도메인을 함유하는 이중 특이적 결합 도메인, 예를 들어, 이중 특이적 항체 또는 이의 단편을 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 에피토프 또는 항원에 대한 이중 특이적 결합 도메인의 결합은 T 세포의 기능, 활성 및/또는 반응의 자극, 예를 들어, 세포 독성 활성 및 표적의 후속 용해를 초래할 수 있다. 상기 예시적인 이중 특이적 결합 도메인 중에는 일부 경우에 예를 들어, 가요성 링커를 통해 서로 융합된 탠덤 scFv 분자; 탠덤 디아바디를 포함하는 디아바디 및 이의 유도체(Holliger 등, Prot Eng 9, 299-305 (1996); Kipriyanov 등, J Mol Biol 293, 41-66 (1999)); C-말단 이황화물 가교를 갖는 디아바디 형태를 포함할 수 있는 이중 친화도 재표적화(dual affinity retargeting, DART) 분자; 가요성 링커에 의해 융합된 탠덤 scFv 분자를 함유하는 이중 특이적 T 세포 참여자(bispecific T cell engager, BiTE) 분자(예를 들어, Nagorsen and Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011) 참조); 또는 전체 하이브리드 마우스/래트 IgG 분자를 포함하는 트리오맙(triomabs)(Seimetz 등, Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010));을 포함할 수 있다. 임의의 상기 결합 도메인은 여기에 기재된 CAR에 함유될 수 있다.
b.
스페이서
및
막관통
도메인
일부 측면에서, 암호화된 재조합 수용체, 예를 들어, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 이의 단편과 같은 하나 이상의 리간드-(예를 들어, 항원-) 결합 도메인을 함유하는 세포외 부분 및 하나 이상의 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인(상호교환적으로 세포질 신호 전달 도메인 또는 영역으로도 명명)을 포함한다. 일부 측면에서, 재조합 수용체, 예를 들어, CAR은 스페이서 및/또는 막관통 도메인 또는 부분을 더 포함한다. 일부 측면에서, 스페이서 및/또는 막관통 도메인은 리간드-(예를 들어, 항원-) 결합 도메인을 함유하는 세포외 부분과 세포내 신호 전달 영역(들) 또는 도메인(들)을 연결할 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체 예컨대 CAR은 면역 글로불린 불변 영역 또는 이의 변이체 또는 변형된 버전의 적어도 일부, 예컨대 힌지 영역, 예를 들어, IgG4 힌지 영역 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역이거나 이를 포함할 수 있는 스페이서를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 스페이서 및/또는 힌지 영역을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgG4, IgG2 또는 IgG1과 같은 인간 IgG의 것이다. 일부 측면에서, 불변 영역의 일부는 항원-인식 성분, 예를 들어, scFv와 막관통 도메인 사이에서 스페이서 영역으로 기능한다. 스페이서는 스페이서의 부재와 비교하여 항원 결합 후에 세포의 반응성 증가를 제공하는 길이일 수 있다. 일부 예에서, 스페이서는 12 개 또는 약 12개의 아미노산 길이이거나 또는 12 개 이내의 아미노산 길이이다. 예시적인 스페이서는 약 10 내지 229개의 아미노산, 약 10 내지 200개의 아미노산, 약 10 내지 175개의 아미노산, 약 10 내지 150개의 아미노산, 약 10 내지 125개의 아미노산, 약 10 내지 100개의 아미노산, 약 10 내지 75개의 아미노산, 약 10 내지 50개의 아미노산, 약 10 내지 40개의 아미노산, 약 10 내지 30개의 아미노산, 약 10 내지 20개의 아미노산, 약 10 내지 15 개 이상의 아미노산을 갖는 것을 포함하고, 열거된 범위 중의 어느 하나의 종점 사이 임의의 정수를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 약 12개 이하의 아미노산, 약 119개 이하의 아미노산 또는 약 229개 이하의 아미노산을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 250개의 아미노산 길이 미만, 200개의 아미노산 길이 미만, 150개의 아미노산 길이 미만, 100개의 아미노산 길이 미만, 75개의 아미노산 길이 미만, 50개의 아미노산 길이 미만, 25개의 아미노산 길이 미만, 20개의 아미노산 길이 미만, 15개의 아미노산 길이 미만, 12개의 아미노산 길이 미만 또는 10개의 아미노산 길이 미만이다. 일부 예에서, 스페이서는 (약) 10 내지 250개의 아미노산 길이, 10 내지 150개의 아미노산 길이, 10 내지 100개의 아미노산 길이, 10 내지 50개의 아미노산 길이, 10 내지 25개의 아미노산 길이, 10 내지 15개의 아미노산 길이, 15 내지 250개의 아미노산 길이, 15 내지 150개의 아미노산 길이, 15 내지 100개의 아미노산 길이, 15 내지 50개의 아미노산 길이, 15 내지 25개의 아미노산 길이, 25 내지 250개의 아미노산 길이, 25 내지 100개의 아미노산 길이, 25 내지 50개의 아미노산 길이, 50 내지 250개의 아미노산 길이, 50 내지 150개의 아미노산 길이, 50 내지 100개의 아미노산 길이, 100 내지 250개의 아미노산 길이, 100 내지 150개의 아미노산 길이 또는 150 내지 250개의 아미노산 길이이다. 예시적인 스페이서는 IgG4 힌지 단독, CH2 및 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지, 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지를 포함한다. 예시적인 스페이서는 문헌 [Hudecek 등, (2013) Clin . Cancer Res., 19:3153, Hudecek 등, (2015) Cancer Immunol Res. 3(2): 125-135] 또는 국제공개공보 제WO2014/031687호에 기재된 것들을 포함하지만, 이로서 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 스페이서는 IgG4 및/또는 IgG2에서 전부 또는 일부 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서는 IgG4, IgG2 및/또는 IgG2 및 IgG4로부터 유래된 힌지, CH2 및/또는 CH3 서열(들) 중 하나 이상을 함유하는 키메라 폴리펩티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서는 하나 이상의 도메인에서 하나 이상의 단일 아미노산 돌연변이와 같은 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 예에서, 아미노산 변형은 IgG4의 힌지 영역에서 세린(S)에 대한 프롤린(P)의 치환이다. 일부 구현예에서, 아미노산 변형은 글리코실화 이질성을 감소시키기 위해 아스파라긴(N)을 글루타민(Q)으로의 치환, 예컨대 서열번호 60에 제시된 IgG4 중쇄 불변 영역 서열의 CH2 영역에서 177번 위치(Uniprot Accession No. P01861; EU 넘버링에 의한 297번 위치 및 서열번호 4에 제시된 힌지-CH2-CH3 스페이서 서열의 79번 위치에 대응되는 위치)에 대응되는 위치에서 N의 Q로의 치환 또는 서열번호 59에 제시된 IgG2 중쇄 불변 영역 서열의 CH2 영역에서 176번 위치(Uniprot Accession No. P01859; EU 넘버링에 의한 297번 위치에 대응되는 위치)에 대응되는 위치에서 N의 Q로의 치환이다.
일부 측면에서, 스페이서는 IgG 의 힌지 영역만을, 예를 들어, IgG4, IgG2 또는 IgG1의 힌지만을, 예를 들어, 서열번호 1에 제시된 힌지만을 함유하고, 서열번호 2에 제시된 서열에 의해 암호화된다. 다른 구현예에서, 스페이서는 CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지, 예를 들어, 및 IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 CH2 및 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지, 예를 들어, IgG4 힌지, 예를 들어, 서열번호 3에 제시된 바와 같다. 일부 구현예에서, 스페이서는 CH3 도메인에만 연결된 Ig 힌지, 예를 들어, IgG4 힌지, 예를 들어, 서열번호 4에 제시된 바와 같다. 일부 구현예에서, 스페이서는 글리신-세린 풍부 서열 또는 다른 가요성 링커, 예를 들어, 공지된 가요성 링커이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgD 이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열번호 5에 제시된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열번호 1, 3, 4 및 5 중 임의의 것에 대해 적어도 또는 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 갖는다.
일부 측면에서, 스페이서는 (a) 면역 글로불린 힌지의 전부 또는 일부 또는 이의 변형된 버전을 포함하거나 이로 구성되거나, 약 15개 이하의 아미노산을 포함하고, CD28 세포외 영역 또는 CD8 세포외 영역을 포함하지 않거나; (b) 면역글로불린 힌지, 선택적으로 IgG4 힌지의 전부 또는 일부 또는 이의 변형된 버전을 포함하거나, 이로 구성되고/되거나 약 15개 이하의 아미노산을 포함하고, CD28 세포외 영역 또는 CD8 세포외 영역을 포함하지 않거나; (c) (약) 12개의 아미노산 길이이고/거나 면역글로불린 힌지, 선택적으로 IgG4의 전부 또는 일부 또는 이의 변형된 버전를 포함하거나 이로 구성되거나; (d) 서열번호 1, 3-5, 27-34에 제시된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 상기 중의 어느 하나의 변이체로 구성되거나 상기를 포함하거나; 또는 (e) 화학식 X1PPX2P(여기에서 X1은 글리신, 시스테인 또는 아르기닌이고 X2는 시스테인 또는 트레오닌임)을 포함하거나 이로 구성되는; 것에서 선택된 하나 이상과 같은 폴리펩티드 스페이서이다.
예시적인 스페이서는 IgG 힌지 도메인과 같은 Ig 힌지를 함유하는 것과 같은 면역 글로불린 불변 영역의 부분(들)을 함유하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 스페이서는 IgG 힌지 단독, CH2 및 CH3 도메인 중의 하나 이상에 연결된 IgG 힌지 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG 힌지를 포함한다. 일부 구현예에서, IgG 힌지, CH2 및/또는 CH3은 IgG4 또는 IgG2에서 전부 또는 일부 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서는 IgG4, IgG2 및/또는 IgG2 및 IgG4에서 유래된 힌지, CH2 및/또는 CH3 서열(들) 중의 하나 이상을 함유하는 키메라 폴리펩티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 IgG4 힌지 영역 및/또는 IgG2 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함하고, 여기에서 IgG4 힌지 영역은 선택적으로 인간 IgG4 힌지 영역이고, IgG2 힌지 영역은 선택적으로 인간 IgG2 힌지 영역이며; CH2 영역은 IgG4 CH2 영역 및/또는 IgG2 CH2 영역의 전부 또는 일부를 포함하고, 여기에서 IgG4 CH2 영역은 선택적으로 인간 IgG4 CH2 영역이고, IgG2 CH2 영역은 선택적으로 인간 IgG2 CH2 영역이고/이거나; CH3 영역은 IgG4 CH3 영역 및/또는 IgG2 CH3 영역의 전부 또는 일부를 포함하며, 여기에서 IgG4 CH3 영역은 선택적으로 인간 IgG4 CH3 영역이고, IgG2 CH3 영역은 선택적으로 인간 IgG2 CH3 영역이다. 일부 구현예에서, 힌지, CH2 및 CH3은 IgG4의 힌지 영역, CH2 및 CH3 중 각각의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 키메라이고, 인간 IgG4 및 인간 IgG2의 힌지 영역을 포함하고; CH2 영역은 키메라이고, 인간 IgG4 및 인간 IgG2의 CH2 영역을 포함하고/하거나; CH3 영역은 키메라이고, 인간 IgG4 및 인간 IgG2의 CH3 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 IgG4/2 키메라 힌지 또는 인간 IgG4 힌지 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산 교체를 포함하는 변형된 IgG4 힌지; 인간 IgG2/4 키메라 CH2 영역; 및 인간 IgG4 CH3 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 스페이서는 IgG4 및/또는 IgG2로부터 전부 또는 일부 유래될 수 있으며, 돌연변이, 예를 들어, 하나 이상의 도메인에서 하나 이상의 단일 아미노산 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 예에서, 아미노산 변형은 IgG4의 힌지 영역에서 세린(S)을 프롤린(P)으로 치환한 것이다. 일부 구현예에서, 아미노산 변형은 아스파라긴(N)에 대한 글루타민(Q)의 치환으로, 글리코실화 이질성, 예를 들어, 서열번호 60에 제시된 전장 IgG4 Fc 서열의 CH2 영역에서의 위치 177에서 N177Q 돌연변이 또는 서열번호 59에 제시된 전장 IgG2 Fc 서열의 CH2 영역에서의 위치 176에서 N176Q를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 스페이서는 IgG4/2 키메라 힌지 또는 변형된 IgG4 힌지; IgG2/4 키메라 CH2 영역; 및 IgG4 CH3 영역이거나 이를 포함하고; 선택적으로 약 228개의 아미노산 길이이거나; 또는 서열번호 291에 제시된 스페이서이다. 일부 구현예에서, CAR의 리간드-(예를 들어, 항원-) 결합 또는 인식 도메인은, 예를 들어, 하나 이상의 세포내 신호 전달 성분을 함유하는, 세포내 영역, 예컨대 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인 및/또는 TCR 복합체와 같은 항원 수용체 복합체를 통한 활성화를 모방하는 신호 전달 성분 및/또는 또 다른 세포 표면 수용체를 통한 신호에 연결된다. 따라서, 일부 구현예에서, 항원 결합 성분(예를 들어, 항체)와 같은 결합 도메인을 함유하는 세포외 영역은 하나 이상의 막관통 및 세포내 영역(들) 또는 도메인(들)에 연결된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 세포외 영역에 융합된다. 일부 구현예에서, 수용체, 예를 들어, CAR에 있는 도메인 중 하나와 자연적으로 연합하는 막관통 도메인이 사용된다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 멤버와의 상호 작용을 최소화하기 위해 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 상기 도메인의 결합을 피하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형된다.
일부 구현예에서 막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래된다. 공급원이 천연인 경우, 일부 측면에서 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래된다. 막관통 영역은 T-세포수용체, CD28, CD3 입실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 (4-1BB), 또는 CD154의 알파, 베타 또는 제타 사슬(즉, 적어도 이의 막관통 영역을 포함함)로부터 유래된 것들을 포함한다. 대안으로는, 일부 측면에서 막관통 도메인은 합성된 것이다. 일부 측면에서, 합성 막관통 도메인은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함한다. 일부 측면에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛은 합성 막관통 도메인의 각각의 말단에서 발견될 것이다. 일부 구현예에서, 연결은 링커, 스페이서 및/또는 막관통 도메인(들)에 의한 것이다. 일부 측면에서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 함유한다. 세포외 영역 및 막관통은 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 영역 및 막관통은 스페이서, 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 것에 의해 연결된다.
일부 구현예에서, 수용체의 막관통 도메인, 예를 들어, CAR은 인간 CD28의 막관통 도메인 또는 그의 변이체, 예를 들어, 인간 CD28의 27-아미노산 막관통 도메인 (수탁 번호: P10747.1)이고, 또는 서열번호 8에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열식별번호 8에 대해 적어도 또는 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함하는 막관통 도메인이고; 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 막관통-도메인 함유 부분은 서열번호 9에 제시된 아미노산의 서열 또는 그에 대해 적어도 또는 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 포함한다.
c.
세포내
영역
일부 측면에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 암호화된 재조합 수용체, 예를 들어, CAR은 신호전달 영역 또는 도메인을 포함하는 세포내 영역 (또한 세포질 영역으로 지칭됨)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 영역은 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인은, 1차 신호 전달 영역, T 세포에서 1차 활성화 신호를 자극할 수 있고/거나 유도할 수 있는 신호 전달 도메인, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호 전달 도메인(예를 들어, CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 신호 전달 도메인 또는 영역 또는 이의 기능성 변이체 또는 신호 전달 부분) 및/또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)를 포함하는 신호 전달 도메인이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어, CAR은 적어도 하나의 세포내 신호전달 성분 또는 성분, 예를 들어, 세포내 신호전달 영역 또는 도메인을 포함한다. 세포내 신호 전달 영역 중에는 천연 항원 수용체를 통한 신호, 공자극 수용체와 조합으로 상기 수용체를 통한 신호 및/또는 공자극 수용체 단독을 통한 신호를 모방하거나 이와 유사한 것이 있다. 일부 구현예에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 예를 들어, 글리신 및 세린, 예를 들어, 글리신-세린 더블릿을 함유하는 것과 같은 2 내지 10 개 아미노산 길이의 링커가 CAR의 막관통 도메인과 세포질 신호 전달 도메인 사이에 존재하고 연결을 형성한다.
일부 구현예에서, CAR의 결찰시, CAR의 세포질(또는 세포내) 도메인 또는 영역, 예를 들어, 세포내 신호 전달 영역은, 면역 세포, 예를 들어, CAR을 발현하도록 조작된 T 세포의 정상 이펙터 기능 또는 반응 중 하나 이상을 활성화 및/또는 자극시킨다. 예를 들어, 일부 맥락에서, CAR은 T 세포의 기능, 예컨대 세포용해 활성 또는 T-헬퍼 활성, 예컨대 사이토카인 또는 다른 인자의 분비를 유도한다. 일부 구현예에서, 항원 수용체 성분 또는 공자극 분자의 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인의 절단 부분은, 예를 들어, 그것이 이펙터 기능 신호를 형질 도입하는 경우 온전한 면역 자극 사슬 대신에 사용된다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 세포내 도메인 또는 도메인들을 포함하는 세포내 신호 전달 영역은 T 세포 수용체(TCR)의 세포질 서열 및 일부 측면에서 천연 맥락에서 항원 수용체 결합 후에 신호 전달을 개시하기 위해 상기 수용체와 협력하여 작용하는 공-수용체 및/또는 상기 분자의 임의의 유도체 또는 변이체 및/또는 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열의 세포질 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 세포내 도메인 또는 도메인들을 포함하는 세포내 신호 전달 영역은 공자극 신호 제공에 포함되는 영역 또는 도메인의 세포질 서열을 포함한다.
(i) 공-자극 신호전달 도메인
일부 구현예에서, 완전한 자극 및/또는 활성화를 촉진하기 위해, 2차 또는 공자극 신호를 생성하기 위한 하나 이상의 성분이 암호화된 CAR에 포함된다. 다른 구현예에서, 암호화된 CAR은 공자극 신호를 생성하기 위한 성분을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 추가의 수용체 폴리펩티드 또는 그의 일부가 동일한 세포에서 발현되고 2차 또는 공자극 신호를 생성하기 위한 성분을 제공한다.
일부 구현예에서, 암호화된 CAR은 공자극 수용체, 예컨대 CD28, 4-1BB, OX40(CD134), CD27, DAP10, DAP12, ICOS 및/또는 다른 공자극 수용체의 신호 전달 영역 및/또는 막관통 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 동일한 CAR은 1차 세포질 신호 전달 영역 및 공자극 신호 전달 성분 둘 다를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 상이한 재조합 수용체는 하나 이상의 상이한 세포내 신호 전달 영역(들) 또는 도메인(들)을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 1차 세포질 신호 전달 영역은 하나의 암호화된 CAR 내에 포함되는 반면, 공자극 성분은 다른 수용체, 예를 들어, 다른 항원을 인식하는 다른 CAR에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, 암호화된 CAR은 활성화 또는 자극성 CAR 및 공자극 CAR을 포함하며, 둘 다 동일한 세포 상에서 발현된다(국제공개공보 제WO2014/055668호 참조).
특정 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 CD3(예를 들어, CD3ζ) 세포내 영역 또는 도메인에 연결된 CD28 막관통 및 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 영역은 CD3ζ 세포내 영역 또는 도메인에 연결된 키메라 CD28 및 CD137(4-1BB, TNFRSF9) 공자극 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 암호화된 CAR은 세포질 부분에서 하나 이상, 예를 들어, 2개 이상의 공자극 도메인 및 1차 세포질 신호 전달 영역을 포함한다. 예시적인 CAR은 CD3-제타, CD28, CD137(4-1BB), OX40(CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D 및/또는 ICOS의 세포내 성분, 예컨대 세포내 신호 전달 영역(들) 또는 도메인(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는, 일부 경우에 막관통 도메인과 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인 사이에, 예를 들어, CD28, CD137(4-1BB), OX40(CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D 및/또는 ICOS 유래 T 세포 공자극 분자의 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, T 세포 공자극 분자는 CD28, CD137(4-1BB), OX40(CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D 및/또는 ICOS 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 공자극 뉴클레오티드는 인간 공자극 분자이다.
일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인은, 인간 CD28의 세포내 공자극 신호 전달 도메인 또는 이의 기능적 변이체 또는 이의 일부, 예컨대 이의 41개 아미노산 도메인 및/또는 천연 CD28 단백질의 186-187 위치에서 LL의 GG로의 치환을 갖는 상기 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 서열번호 10 또는 11에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 10 또는 11에 대해 (약) 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포내 영역은, CD137(4-1BB)의 세포내 공자극 신호 전달 도메인 또는 영역 또는 도메인 또는 이의 기능성 변이체 또는 이의 일부, 예컨대 인간 4-1BB의 42-아미노산 세포질 도메인(수탁 번호: Q07011.1) 또는 이의 기능성 변이체 또는 이의 일부, 예컨대 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 12에 대해 (약) 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, 암호화된 CAR은 제 1, 제 2, 제 3 또는 제 4 세대 CAR로 지칭된다. 일부 측면에서, 제 1 세대 CAR은, 항원 결합 시, 예를 들어, CD3-사슬 유도 신호를 통해 1차 자극 또는 활성화 신호만을 제공하는 것이고; 일부 측면에서, 제 2 세대 CAR은 CD28, CD137(4-1BB), OX40(CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D, ICOS 및/또는 다른 공자극 수용체와 같은 하나 이상의 공자극 수용체 유래 세포내 신호 전달 영역(들) 또는 도메인(들)을 포함하는 것과 같은 상기 신호 및 공자극 신호를 제공하는 것이고; 일부 측면에서, 제 3 세대 CAR은, 예를 들어, CD28, CD137(4-1BB), OX40(CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D, ICOS 및/또는 다른 공자극 수용체에서 선택된 상이한 공자극 수용체의 다중 공자극 도메인을 포함하는 것이고; 일부 측면에서, 제 4 세대 CAR은, 예를 들어, CD28, CD137(4-1BB), OX40(CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D, ICOS 및/또는 다른 공자극 수용체에서 선택된 상이한 공자극 수용체의 3개 이상의 공자극 도메인을 포함하는 것이다.
(ii) 1차 신호전달 영역, 예를 들어,
CD3ζ
사슬
일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체 T-세포 활성화 및 세포 독성을 매개하는 TCR CD3 사슬, 예를 들어, CD3 제타 사슬과 같은 TCR 복합체의 세포내 성분을 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, 항원-결합 또는 항원-인식 도메인은 하나 이상의 세포 신호 전달 모듈에 연결된다. 일부 구현예에서, 세포 신호 전달 모듈은 CD3 막관통 도메인, CD3 세포내 신호 전달 도메인 및/또는 기타 CD 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체, 예를 들어, CAR은 또한 Fc 수용체 감마(FcRγ ), CD8 알파, CD8 베타, CD4, CD25 또는 CD16과 같은 하나 이상의 추가 분자를 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, CAR은 CD3-제타(CD3-ζ)와 CD8 알파, CD8 베타, CD4, CD25 또는 CD16 사이에 키메라 분자를 포함한다.
천연 TCR의 맥락에서, 완전한 자극은 일반적으로 TCR을 통한 신호 전달뿐만 아니라 공자극 신호가 필요하다. 일부 측면에서, T 세포 자극은 두 종류의 세포질 신호 전달 서열, 즉 TCR을 통한 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 서열(1차 세포질 신호 전달 영역(들) 또는 도메인(들)) 및 항원-비의존적 방식으로 작용하여 2차 또는 공자극 신호를 제공하는 서열(2차 세포질 신호 전달 영역(들) 또는 도메인(들))에 의해 매개되는 것으로 설명된다. 일부 측면에서, CAR은 상기 신호 전달 성분 중 하나 또는 둘 다를 포함한다.
일부 측면에서, 암호화된 CAR은 TCR 복합체의 1차 자극 및/또는 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호전달 영역을 포함하는 세포내 영역을 포함한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 영역(들)은 예를 들어, CD3 제타(CD3ζ)로부터 유래된 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 세포질 신호전달 도메인, 그의 단편 또는 일부, 또는 CD3ζ로부터 유래된 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 세포내(또는 세포질) 신호전달 영역은 CD3ζ의 세포내 또는 세포질 자극 신호전달 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 예를 들어, 인간 CD3ζ의 이소형 3의 112 AA 세포질 도메인(수탁 번호: P20963.2) 또는 미국특허 제7,446,190호 또는 미국특허 제8,911,993호에 기재된 바와 같은 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는, 인간 CD3 제타 사슬 또는 이의 단편 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체의 세포내 영역은 서열번호 13, 14 또는 15에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 13, 14 또는 15에 대해 적어도 또는 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 부분 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 의해 암호화된 예시적인 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편은 CD3ζ 사슬의 ITAM 도메인, 예를 들어, 서열번호 292에 제시된 인간 CD3ζ 사슬 전구체 서열의 아미노산 잔기 61-89, 100-128 또는 131-159 또는 CD3ζ 사슬로부터 하나 이상의 ITAM 도메인을 함유하고 서열번호 292에 대해 적어도 또는 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 분자(예를 들어, 폴리펩티드, 예를 들어, 추가 재조합 수용체 폴리펩티드 또는 이의 일부)를 발현하도록 조작되어 암호화된 CAR의 기능 및/또는 활성을 조절, 제어 또는 조절하는데 사용된다. 예시적인 다중-사슬 재조합 수용체, 예를 들어, 다중-사슬 CAR은 본원에서, 예를 들어, 섹션 IV.B2에서 기재된다.
일부 구현예에서, 암호화된 CAR은 항체, 예를 들어, 항체 단편, CD28의 막관통 부분 또는 이의 기능적 변이체이거나 상기를 함유하는 막관통 도메인 및 CD28의 신호 전달 부분 또는 이의 기능적 변이체 및 CD3 제타의 신호 전달 부분 또는 이의 기능적 변이체를 함유하는 세포 내 신호 전달 영역을 함유한다. 일부 구현예에서, CAR은 항체, 예를 들어, 항체 단편, CD28의 막관통 부분 또는 이의 기능적 변이체이거나 상기를 함유하는 막관통 도메인 및 4-1BB의 신호 전달 부분 또는 이의 기능적 변이체 및 CD3 제타의 신호 전달 부분 또는 이의 기능적 변이체를 함유하는 세포 내 신호 전달 도메인을 함유한다. 일부 상기 구현예에서, 수용체는 Ig 분자, 예컨대 인간 Ig 분자의 일부, 예컨대 Ig 힌지, 예를 들어, IgG4 힌지, 예컨대 힌지 단독 스페이서를 함유하는 스페이서를 더 포함한다. 일부 구현에에서, 재조합 수용체는 수용체의 c-말단에서 CD3 제타(CD3ζ)를 포함한다.
2. 다중-사슬 CAR
일부 구현예에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 핵산 서열에 의해 암호화된 재조합 수용체는 다중-사슬 CAR일 수 있다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 다중-사슬 CAR이 세포에서 발현되는 경우, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 의해 암호화된 폴리펩티드 사슬 중의 적어도 하나가 발현된다. 일부 측면에서, 다중-사슬 CAR의 하나 이상의 사슬을 암호화하는 핵산 서열을 도입하기 위해 사용된 폴리뉴클레오티드는 본원의 섹션 II.B에 기재된 임의의 것을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드는 다중-사슬 CAR의 적어도 하나의 사슬 또는 이의 일부, 예를 들어, 다중-사슬 CAR의 적어도 하나의 폴리펩티드의 적어도 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유한다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 또한 상이한 또는 추가의 폴리펩티드, 예를 들어, 다중-사슬 CAR의 다른 또는 추가의 사슬, 또는 추가 분자, 예를 들어, 본원의 섹션 IV.B.2에 기재된 것들을 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 다중-사슬 CAR의 추가의 성분을 암호화하는 추가의 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 추가의 주형 폴리뉴클레오티드가 도입될 수 있다. 일부 측면에서, 추가의 폴리뉴클레오티드는 본원, 예를 들어, 섹션 II.B.2에 기재된 임의의 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 변형된 형태, 예를 들어, 별개의 게놈 유전자 좌에서 통합을 위해 핵산을 표적화하기 위한 상이한 상동성 암을 포함하는 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 제공된 조작된 세포는 다중-사슬 수용체, 예를 들어, 다중-사슬 CAR을 발현하는 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 다중-사슬 CAR은 세포 상에 2개 이상의 유전자 조작된 수용체를 함유할 수 있고, 이는 함께 기능적 재조합 수용체를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 조합된 다양한 폴리펩티드 사슬은 CAR의 기능 또는 활동을 수행할 수 있고, 및/또는 CAR의 기능 및/또는 활동을 조절, 제어, 또는 조정할 수 있다. 일부 측면에서, 다중-사슬 CAR은 2개 이상의 폴리펩티드 사슬을 함유할 수 있고, 각각은 상이한 항원의 동일한 것을 인식하고, 전형적으로 각각은 상이한 영역 또는 도메인, 예를 들어, 상이한 세포내 신호전달 성분을 포함한다. 일부 측면에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 다중-사슬 수용체, 예를 들어, 다중-사슬 CAR의 적어도 하나의 사슬을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키메라 수용체는 2개 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 다중-사슬 CAR 또는 이중-사슬 CAR이다. 일부 구현예에서, 다중-사슬 수용체는 조절가능한 CAR, 조건부 활성 CAR 또는 유도성 CAR이다. 일부 측면에서, 재조합 수용체의 2개 이상의 폴리펩티드, 예를 들어, 이중-사슬 CAR은 재조합 수용체의 특이성, 활성, 항원(또는 리간드) 결합, 기능 및/또는 발현의 공간적 또는 시간적 조절 또는 제어를 허용한다. 이러한 구현예 중 일부에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 핵산 서열에 의해 암호화된 재조합 수용체는 이중-사슬 또는 다중-사슬 수용체의 하나 이상의 사슬을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 이중 사슬 CAR 중 오직 하나만이 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 의해 암호화되는 경우에, 다른 사슬은 상이한 게놈 위치에 통합되거나 에피솜인 별개의 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있다.
일부 구현예에서, 다중-사슬 CAR은 활성화 및 공-자극 CAR의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 다중-사슬 CAR은 비-표적 세포, 예를 들어, 정상 세포 상에 개별적으로 존재하지만 치료될 질환 또는 병태의 세포 상에만 함께 존재하는 2개의 상이한 항원을 표적화하는 CAR을 암호화하는 2개의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 다중-사슬 CAR은 활성화 및 억제성 CAR, 예를 들어, 활성화 CAR이 정상 또는 비-질환 세포 둘 다에서 발현된 하나의 항원 및 치료될 질환 또는 병태의 세포에 결합하는 것들을 포함할 수 있고, 억제성 CAR은 치료를 원하지 않는 정상 세포 또는 세포 상에서만 발현된 또 다른 항원에 결합한다. 일부 측면에서, 다중-사슬 CAR은 조절, 조정 또는 제어될 수 있는 CAR을 암호화하는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 다중-사슬 CAR은 CAR의 하나 이상의 도메인 또는 영역을 암호화하는 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 일부 측면에서, 다양한 폴리펩티드 사슬은 CAR을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가의 도메인 또는 영역이 CAR에 존재한다. 일부 구현예에서, 다중-사슬 CAR의 하나 이상의 폴리펩티드 사슬에 존재하는 다양한 도메인 또는 영역은 CAR의 기능 및/또는 활성을 조절, 제어 또는 조정하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 상이한 성분, 도메인 또는 영역을 함유하는 2개 이상의 폴리펩티드 사슬을 발현한다. 일부 측면에서, 2개 이상의 폴리펩티드 사슬은 재조합 수용체의 특이성, 활성, 항원(또는 리간드) 결합, 기능 및/또는 발현의 공간적 또는 시간적 조절 또는 제어를 가능하게 한다. 하나 초과의 폴리펩티드, 예를 들어, 2개 이상의 폴리펩티드를 수반하는 다중-사슬 CAR의 일부 구현예에서, 적어도 하나의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서의 통합을 위해 표적화된다. 일부 구현예에서, 추가 분자 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열, 예를 들어, 다중-사슬 CAR의 추가의 폴리펩티드 사슬 또는 추가 분자는 예를 들어, 표적화에 사용된 동일한 폴리뉴클레오티드 상의 배치에 의해 동일한 유전자 좌에서 표적화될 수 있다. 일부 핵산 서열에서 추가 분자 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 상이한 유전자 좌에서 표적화되거나 상이한 방법에 의해 전달된다.
일부 측면에서, CAR의 도메인 또는 영역을 암호화하는 하나 이상의 폴리펩티드 사슬은 하나 이상의 항원 또는 분자를 표적화할 수 있다. 예시적인 다중-사슬 CAR은 예를 들어, 국제공개보 제WO 2014055668호 또는 문헌 [Fedorov 등, Sci. Transl. Medicine, Sci Transl Med. (2013) 5(215):215ra172]; [Sadelain, Curr Opin Immunol. (2016) 41: 68-76]; [Wang 등, (2017) Front. Immunol. 8:1934]; [Mirzaei 등, (2017) Front. Immunol. 8:1850]; [Marin-Acevedo 등, (2018) Journal of Hematology & Oncology 11:8]; [Fesnak 등, (2016) Nat Rev Cancer. 16(9): 566-581]; 및 [Abate-Daga and Davila, (2016) Molecular Therapy - Oncolytics 3, 16014]에 기재된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 조작된 세포는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR의 제 1 폴리펩티드 사슬을 발현할 수 있으며, 이는 일반적으로 제 1 폴리펩티드 사슬에 의해 인식되는 항원, 예를 들어, 제 1 항원에 특이적인 결합시 세포에 대한 활성화 또는 자극 신호를 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 또한 일반적으로 재조합 수용체, 예를 들어, CAR의 제 2 폴리펩티드 사슬을 추가로 발현할 수 있으며, 이는 일부 경우에 키메라 공-자극 수용체로 불리며, 이는 일반적으로 제 2 폴리펩티드 사슬에 의해 인식되는 제 2 항원에 대한 특이적 결합 시에 면역 세포에 대한 공-자극 신호를 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 제 1 항원 및 제 2 항원은 동일하다. 일부 구현예에서, 제 1 항원 및 제 2 항원은 상이하다.
일부 구현예에서, 제 1 및/또는 제 2 폴리펩티드 사슬은 세포에 대한 활성화 또는 자극 신호를 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체는 ITAM 또는 ITAM 유사 모티프를 함유하는 세포내 신호 전달 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 사슬에 의해 유도된 활성화는 면역 반응의 개시, 예컨대 ITAM 인산화 및/또는 ITAM 매개 신호 전달 계단식 다단계 반응의 개시, 면역 시냅스의 형성 및/또는 결합된 수용체(예를 들어, CD4 또는 CD8 등) 근처 분자의 클러스터링, 하나 이상의 전사 인자, 예컨대 NF-κB 및/또는 AP-1의 활성화, 및/또는 사이토카인과 같은 인자의 유전자 발현, 증식 및/또는 생존의 유도를 초래하는 세포에서의 신호 전달 또는 단백질 발현의 변화를 수반한다. 일부 구현예에서, 활성화 도메인은 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 의해 암호화되는 폴리펩티드 사슬과 같은 다중-사슬 CAR 중의 적어도 하나 내에 포함되는 반면, 공-자극 성분은 또 다른 항원을 인식하는 또 다른 폴리펩티드에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 동일한 세포 상에서 발현되는 활성화 또는 자극 CAR, 공-자극 CAR을 포함하는 다중-사슬 CAR을 포함할 수 있다(국제공개공보 제WO2014/055668호 참조). 일부 측면에서, 세포는 하나 이상의 자극 또는 활성화 CAR(예를 들어, 본원에, 예를 들어, 섹션 IV.A에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 의해 암호화되는 것) 및/또는 공-자극 CAR을 발현한다.
일부 구현예에서, 제 1 및/또는 제 2 폴리펩티드 사슬은 CD28, CD137 (4-1BB), OX40 (CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D, ICOS 및/또는 다른 공-자극 수용체와 같은 공-자극 수용체의 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 상이한 공자극 수용체의 세포내 신호 전달 도메인을 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 사슬은 CD28 공-자극 신호 전달 도메인을 함유하고 제 2 폴리펩티드 사슬은 4-1BB 공-자극 신호 전달 영역을 함유하거나 반대로 함유한다.
일부 구현예에서, 제 1 및/또는 제 2 폴리펩티드 사슬은 ITAM 또는 ITAM 유사 모티프를 함유하는 세포내 신호 전달 도메인, 예를 들어, CD3제타(CD3ζ) 사슬로부터의 것 또는 그의 단편 또는 사슬, 예를 들어, CD3ζ 세포내 신호전달 도메인 및 공자극 수용체의 세포외 신호전달 도메인 둘 다를 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 사슬은 ITAM 또는 ITAM 유사 모티프를 함유하는 세포내 신호 전달 도메인을 함유하고 제 2 폴리펩티드 사슬은 공자극 수용체의 세포내 신호 전달 도메인을 함유한다. 동일한 세포에서 유도된 활성화 또는 자극 신호와 결합한 공자극 신호는 면역 반응, 예컨대 강력하고 지속적인 면역 반응, 예컨대 유전자 발현의 증가, 사이토카인 및 기타 인자의 분비, 및 세포 사멸과 같은 T 세포 매개 이펙터 기능을 초래하는 것이다.
일부 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 사슬은 단독의 결찰 또는 제 2 폴리펩티드 사슬은 단독의 결찰은 모두 강력한 면역 반응을 유도하지 못한다. 일부 측면에서, 하나의 수용체만 결찰되는 경우에, 세포는 항원에 내성화되거나 반응하지 않게 되거나 억제되고/되거나 증식 또는 인자 분비를 하도록 또는 이펙터 기능을 수행하도록 유도되지 않는다. 그러나, 일부 상기 구현예에서, 다중 폴리펩티드 사슬이 결찰되고 예컨대 제 1 및 제 2 항원을 발현하는 세포와의 조우 시, 예를 들어, 하나 이상의 사이토카인 분비, 증식, 지속성 및/또는 표적 세포의 세포 독성 사멸과 같은 면역 작동 기능의 수행에 의해 나타난 바와 같이 전체 면역 활성화 또는 자극과 같은 원하는 반응이 달성된다.
일부 구현예에서, 다중-사슬 CAR의 하나 이상의 사슬 억제성 CAR(iCARs, 문헌 [Fedorov 등, Sci. Transl. Medicine, 5(215) (2013)] 참조), 예를 들어, 질환 또는 병태와 연관되고/되거나 이에 특이적인 것 이외의 항원을 인식하는 CAR을 포함할 수 있고, 이에 의해 질환-표적화 CAR을 통해 전달된 활성화 신호는 억제성 CAR의 그의 리간드와의 결합에 의해 감소되거나 억제되어, 예를 들어, 표적-외 효과(off-target effects)를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 억제성 CAR은 (예를 들어, CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편 또는 일부를 함유하는) 자극 또는 활성화 CAR과 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해, 또는 상이한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다.
일부 구현예에서, 다중-사슬 CAR의 2개의 폴리펩티드 사슬은 각각 세포를 활성화하거나 억제성 신호를 유도하는데, 각각 그의 항원에 대한 하나의 폴리펩티드 사슬의 결찰이 세포를 활성화하거나 억제성 신호를 유도하는데, 항원에 폴리펩티드 사슬 중 하나의 결찰이 세포를 활성화하거나 반응을 유도하지만, 항원에 폴리펩티드 사슬, 예를 들어, 억제성 수용체의 결찰이 해당 반응을 억제하거나 약화시키는 신호를 유도한다. 활성화 CAR 및 억제성 CAR(iCAR)을 조합하는 예가 있다. 예를 들어, 상기 전략은 활성화 CAR이 질환 또는 병태에서 발현되나 정상 세포에서도 발현되는 항원에 결합하고, 억제성 수용체는 정상 세포에서 발현되나 질환 또는 병태의 세포에서는 발현되지 않는 별개의 항원에 결합하는 것과 같이 사용되어 표적외 효과의 가능성을 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, 세포내에서 발현되는 추가의 수용체 폴리펩티드는 억제성 CAR(예를 들어, iCAR)을 더 포함하고, 세포에서 면역 반응, 예를 들어, ITAM- 및/또는 공-자극-촉진된 반응을 감쇠시키거나 또는 억제하는 세포내 성분을 포함한다. 이러한 세포내 신호전달 성분의 예는 PDCD1, CTLA4, LAG3, BTLA, OX2R, TIM-3, TIGIT, LAIR-1, PGE2 수용체, A2AR을 포함하는 EP2/4 아데노신 수용체를 포함하는 면역 체크포인트 분자 상에서 발견되는 것이다. 일부 측면에서, 조작된 세포는 이러한 억제성 분자의 또는 이러한 억제성 분자로부터 유래된 신호전달 도메인을 포함하는 억제성 CAR을 포함하여, 이것은 예를 들어, 활성화 및/또는 공-자극 CAR에 의해 유도되는 세포의 반응을 감쇠시키는 역할을 한다.
일부 구현예에서, 다중-사슬 CAR은 특정 질환 또는 병태와 관련된 항원이 비질환 세포에서 발현되고/되거나 조작된 세포 자체에서 일시적으로(예를 들어, 유전자 조작과 관련된 자극시) 또는 상시적으로 발현되는 경우에 사용된다. 상기 경우에, 2개의 별도의 및 개별적으로 특이적인 폴리펩티드의 결찰을 요구함으로써, 특이성, 선택성 및/또는 효능이 향상될 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 항원, 예를 들어, 제 1 및 제 2 항원이 암세포 상과 같이 표적화되는 세포, 조직 또는 질환 또는 병태 상에서 발현된다. 일부 측면에서, 세포, 조직, 질환 또는 병태는 다발성 골수종 또는 다발성 골수종 세포이다. 일부 구현예에서, 복수의 항원 중 하나 이상은 일반적으로 정상 또는 비질환 세포 또는 조직 및/또는 조작된 세포 자체와 같이 세포 요법으로 표적화하는 것이 바람직하지 않은 세포 상에서도 발현된다. 상기 구현예에서, 세포의 반응을 달성하기 위해 다중 수용체의 결찰을 요구함으로써, 특이성 및/또는 효능이 달성된다.
일부 구현예에서, 제 1 및/또는 제 2 재조합 폴리펩티드 사슬 중 하나는 다른 폴리펩티드 사슬의 발현, 항원 결합 및/또는 활성을 조절할 수 있는 재조합 수용체이다.
일부 측면에서, 2개의 폴리펩티드 사슬이 적어도 하나의 폴리펩티드 사슬의 발현을 조절하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 사슬은 조절 가능한 절단 요소를 통해 연결된 조절 분자, 예컨대 전사 인자에 연결된 제 1 리간드-(예를 들어, 항원-) 결합 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, 조절 가능한 절단 요소는 제 1 리간드-(예를 들어, 항원-) 결합 도메인의 결합 시 세포 내 도메인을 절단 및 방출할 수 있는 변형된 노치(Notch) 수용체(예를 들어, synNotch)에서 유래된다. 일부 측면에서, 제 2 폴리펩티드 사슬은 세포에 대해 활성화 또는 자극 신호를 유도할 수 있는 세포 내 신호 전달 성분, 예컨대 ITAM-함유 세포 내 신호 전달 도메인에 연결된 제 2 리간드-(예를 들어, 항원-) 결합 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, 제 2 폴리펩티드 사슬을 암호화하는 핵산 서열은, 특정 전사 인자, 예를 들어, 제 1 폴리펩티드 사슬에 의해 암호화된 전사 인자에 의해 조절될 수 있는 전사 조절 요소, 예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 측면에서, 제 1 리간드-(예를 들어, 항원-) 결합 도메인에 대한 리간드 또는 항원의 결합은 전사 인자의 단백질 분해 방출로 이어지고, 이는 차례로 제 2 폴리펩티드 사슬의 발현을 유도할 수 있다(Roybal 등, (2016) Cell164:770-779; Morsut 등, (2016) Cell 164:780-791 참조). 일부 구현예에서, 제 1 항원 및 제 2 항원은 상이하다.
일부 경우에, 재조합 수용체, 예를 들어, CAR은 조절, 제어, 유도 또는 억제될 수 있고, 재조합 수용체를 이용한 요법의 안전성과 효능을 최적화하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, 다중-사슬 CAR은 조절될 수 있는 CAR이다. 일부 측면에서, 조절될 수 있는 CAR을 포함하는 조작된 세포가 여기에 제공된다. 여기에서 "조절 가능한 재조합 수용체(regulatable recombinant receptor)"로도 지칭되고, "조절 가능한 CAR"은, 조작된 세포(예를 들어, 조작된 T 세포)에서 발현될 때 유도제의 제어 하에 세포 내 신호를 생성하는 능력을 가진 조작된 세포를 제공하는 2개 이상의 폴리펩티드 사슬의 세트와 같은 다중 폴리펩티드를 지칭한다.
일부 구현예에서, 조절 가능한 CAR의 폴리펩티드는, 다른 다량체화 도메인과 다량체화할 수 있는 다량체화 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 유도제에 결합 시 다량체화할 수 있다. 예를 들어, 다량체화 도메인은, 다량체화 도메인의 다량체화에 의하여 조절 가능한 CAR의 다량체화를 초래하고, 이로써 조절 가능한 CAR을 생성하는 화학 유도제와 같은 유도제에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 조절 가능한 CAR의 하나의 폴리펩티드는 리간드-(예를 들어, 항원) 결합 도메인을 포함하고, 조절 가능한 CAR의 상이한 폴리펩티드는 세포 내 신호 전달 영역을 포함하며, 여기에서 다량체화 도메인의 다량체화에 의하여 2개의 폴리펩티드의 다량체화는 리간드 결합 도메인 및 세포 내 신호 전달 영역을 포함하는 조절 가능한 CAR을 생성한다. 일부 구현예에서, 다량체화는 조절 가능한 CAR을 함유하는 조작된 세포에서 신호를 유도, 조절, 활성화, 매개 및/또는 촉진할 수 있다. 일부 구현예에서, 유도제가 조절 가능한 CAR의 하나 이상의 폴리펩티드의 다량체화 도메인에 결합하고, 조절 가능한 CAR의 형태적 변화를 유도하며, 여기에서 상기 형태적 변호는 신호 전달을 활성화한다. 일부 구현예에서, 상기 키메라 수용체에 리간드의 결합은, 일부 경우에 수용체를 세포 내 신호 전달에 적합하게 만들 수 있는 폴리펩티드 사슬 올리고머화를 포함한, 폴리펩티드 사슬의 형태적 변화를 유도한다.
일부 구현예에서, 조절 가능한 CAR을 위해 조작된 세포에서 발현된 조절 가능한 CAR의 2개 이상의 폴리펩티드 사슬의 세트를 결합 또는 다량체화(예를 들어, 이량체화)하는 유도제 기능은, 예컨대 표적 항원과 조절 가능한 CAR의 상호 작용 중 바람직한 세포 내 신호를 생성한다. 유도제에 의한 조절 가능한 CAR의 2개 이상의 폴리펩티드의 결합 또는 다량체화는 다량체화 도메인에 유도제의 결합시 달성된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 조작된 세포의 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 각각 유도제에 결합할 수 있는 다량체화 도메인을 포함할 수 있다. 유도제에 의한 다량체화 도메인의 결합 시, 제 1 폴리펩티드와 제 2 폴리펩티드는 함께 결합되어 원하는 세포 내 신호를 생성한다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 폴리펩티드의 세포 내 부분에 위치한다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 폴리펩티드의 세포 외 부분에 위치한다.
일부 구현예에서, 조절 가능한 CAR의 2개 이상의 폴리펩티드 세트는 2, 3, 4 또는 5개 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 폴리펩티드 세트는, 세포 내 신호 전달 영역 및 다량체화 도메인을 포함하는 동일한 폴리펩티드, 예를 들어, 2, 3개 이상의 동일한 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 폴리펩티드 세트는, 예를 들어, 제 1 폴리펩티드가 리간드-(예를 들어, 항원-) 결합 도메인 및 다량체화 도메인을 포함하고, 제 2 폴리펩티드가 세포 내 신호 전달 영역 및 다량체화 도메인을 포함하는, 상이한 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 세포 간 신호는 유도제의 존재 하에 생성된다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호는, 예를 들어, 유도제가 조절 가능한 CAR의 2개 이상의 폴리펩티드의 다량체화를 방해하고, 이로써 조절 가능한 CAR에 의한 세포 내 신호 전달을 방지하여, 유도제의 부재 하에 발생된다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 사슬 중 적어도 하나를 암호화하는 핵산 서열인 다중-사슬 CAR은 예를 들어, HDR에 의해 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내로 통합된다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 별개의 폴리펩티드 사슬 중 다른 하나를 암호화하는 핵산 서열은 동일한 유전자 좌 내에서 (예를 들어, 동일한 전이 유전자 내에서, 그리고 다른 폴리펩티드 사슬을 암호화하는 핵산 서열의 5' 또는 3'의 위치에 배치될 수 있음), 또는 상이한 유전자 좌에서 표적화될 수 있다. 일부 측면에서, 2개 이상의 별개의 폴리펩티드 사슬 중 다른 하나를 암호화하는 핵산 서열의 도입은 상이한 전달 방법을 통해, 예를 들어, 일시적 전달 방법에 의해 또는 에피솜 핵산 분자로서 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 다중-사슬 CAR의 폴리펩티드 사슬 중 하나 이상은 다량체화 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 다량체화 도메인은 유도제의 결합 시 다량체화(예를 들어, 이량체화)할 수 있다. 여기에서 고려된 유도제는 화학 유도제 또는 단백질(예를 들어, 카스파제)을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 일부 구현예에서 유도제는 에스트로겐, 글루코코르티코이드, 비타민 D, 스테로이드, 테트라사이클린, 사이클로스포린, 라파마이신, 쿠머마이신, 기베렐린, FK1012, FK506, FKCsA, 리미두시드 또는 HaXS 또는 이의 유사체 또는 이의 유도체에서 선택된다. 일부 구현예에서 유도제는 AP20187 또는 AP20187 유사체, 예컨대, AP1510이다.
일부 구현예에서, 다량체화 도메인은, 여기에 제공된 유도제와 같은 유도제의 결합 시 다량체화(예를 들어, 이량체화)할 수 있다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 FKBP, 사이클로필린 수용체, 스테로이드 수용체, 테트라사이클린 수용체, 에스트로겐 수용체, 글루코코르티코이드 수용체, 비타민 D 수용체, 칼시뉴린 A, CyP-Fas, mTOR, GyrB, GAI, GID1, Snap-태그 및/또는 HaloTag의 FRB 도메인 또는 이의 일부 또는 이의 유도체 유래일 수 있다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 FK506 결합 단백질(FKBP) 또는 이의 유도체 또는 이의 단편 및/또는 이의 다량체, 예컨대 FKBP12v36이다. 일부 구현예에서, FKBP는 GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE(서열번호 293)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, FKBP12v36은 GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE(서열번호 294)의 아미노산 서열을 포함한다.
예시적인 유도제 및 대응하는 다량체화 도메인은, 예를 들어, 문헌 [미국 특허 출원 공개 번호 2016/0046700, Clackson 등, (1998) Proc Natl Acad Sci U S A. 95(18):10437-42; Spencer 등, (1993) Science 262(5136):1019-24; Farrar 등, (1996) Nature 383 (6596):178-81; Miyamoto 등, (2012) Nature Chemical Biology 8(5): 465-70; Erhart 등, (2013) Chemistry and Biology 20(4): 549-57]에 기재된 바와 같이 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 유도제는 리미두시드(AP1903으로도 공지; CAS 색인 명칭: 2-피페리딘카르복실산, 1-[(2S)-1-옥소-2-(3,4,5-트리메톡시페닐)부틸]-1,2-에탄디일비스[이미노(2-옥소-2,1-에탄디일)옥시-3,1-페닐렌[(1R)-3-(3,4-디메톡시페닐)프로필리덴]]에스테르, [2S-[1(R*),2R*[S*[S*[1(R*),2R]]]]]-(9Cl); CAS 등록 명칭: 195514-63- 7; 분자식: C78H98N4O20; 분자량: 1411.65)이고 다량체화 도메인은 FK506 결합 단백질(FKBP)이다.
일부 구현예에서, 조작된 세포의 세포 막은 유도제가 관통할 수 없다. 일부 구현예에서, 조작된 세포의 세포 막은 유도제가 관통할 수 있다.
일부 구현예에서, 조절 가능한 CAR은 유도제의 부재 하에 다량체 또는 이량체의 일부가 아니다. 유도제의 결합 시, 다량체화 도메인은 다량체화, 예를 들어, 이량체화할 수 있다. 일부 측면에서, 다량체화 도메인의 다량체화는 조절 가능한 CAR의 다른 폴리펩티드와 조절 가능한 CAR의 폴리펩티드의 다량체화, 예를 들어, 조절 가능한 CAR의 2개 이상의 폴리펩티드의 다량체 복합체를 초래한다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인의 다량체화는 신호 전달 성분의 물리적 근접성 또는 다량체 또는 이량체 형성을 유도함으로써 신호 전달을 유도, 조절, 활성화, 매개 및/또는 촉진할 수 있다. 일부 구현예에서, 유도제의 결합 시, 다량체화 도메인의 다량체화는 또한 다량체화 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결된 신호 전달 도메인의 다량체화를 유도한다. 일부 구현예에서, 다량체화는 신호 전달 도메인 또는 영역을 통해 신호 전달을 유도, 조절, 활성화, 매개 및/또는 촉진한다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인에 연결된 신호 전달 도메인 또는 영역은 세포 내 신호 전달 영역이다.
일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 세포 내에 있거나 또는 조작된 세포(예를 들어, 조작된 T 세포)의 세포 내 또는 세포질 측 상의 세포 막과 연관된다. 일부 측면에서, 세포 내 다량체화 도메인은 막 연합 도메인(예를 들어, 지질 연결 도메인), 예컨대 미리스토일화 도메인, 팔미토일화 도메인, 프레닐화 도메인 또는 막관통 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 세포 내에 있고, 막관통 도메인을 통해 세포 외 리간드-(예를 들어, 항원-) 결합 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, 세포 내 다량체화 도메인은 세포 내 신호 전달 영역에 직접 또는 간접적으로 연결된다. 일부 측면에서, 다량체화 도메인의 유도된 다량체화는 또한 세포 내 신호 전달 영역을 서로 근접하게 가져와서 다량체화, 예를 들어, 이량체화를 가능하게 하고 세포 내 신호 전달을 자극한다. 일부 구현예에서, 조절 가능한 CAR의 폴리펩티드는 막관통 도메인, 하나 이상의 세포 내 신호 전달 영역(들) 및 하나 이상의 다량체화 도메인(들)을 포함하며, 이들 각각은 직접 또는 간접적으로 연결된다.
일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 세포 외에 있거나 또는 조작된 세포(예를 들어, 조작된 T 세포)의 세포 외 측 상의 세포 막과 연관된다. 일부 측면에서, 세포 외 다량체화 도메인은 막 연합 도메인(예를 들어, 지질 연결 도메인), 예컨대 미리스토일화 도메인, 팔미토일화 도메인, 프레닐화 도메인 또는 막관통 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 세포 외 다량체화 도메인은 리간드 결합 도메인, 예를 들어, 질환과 관련된 항원에 결합하기 위한 것과 같은 항원 결합 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 세포 외에 있고, 막관통 도메인을 통해 세포 내 신호 전달 영역에 연결된다.
일부 측면에서, 막 연합 도메인은 기존의 막관통 단백질의 막관통 도메인이다. 일부 예에서, 막 연합 도메인은 본원에서 기재된 임의의 막관통 도메인이다. 일부 측면에서, 막 연합 도메인은 단백질-단백질 상호 작용 모티프 또는 막관통 서열을 함유한다.
일부 측면에서, 막 연합 도메인은 아실화 도메인, 예컨대 미리스토일화 도메인, 팔미토일화 도메인, 프레닐화 도메인(즉, 파르네실화, 제라닐-제라닐화, CAAX 박스)이다. 예를 들어, 막 연합 도메인은 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 존재하는 아실화 서열 모티프일 수 있다. 상기 도메인은, 도메인을 함유하는 폴리펩티드에 아실 모이어티를 전달하는 아실트랜스퍼라제에 의해 인식될 수 있는 특정 서열 모티프를 함유한다. 예를 들어, 아실화 모티프는 단일 아실 모이어티로 변형될 수 있다(일부 경우에, 음이온성 지질 두부와의 연합을 개선하도록 몇몇 양으로 하전된 잔기(예를 들어, 인간 c-Src: MGSNKSKPKDASQRRR(서열번호 295)가 뒤따른다). 다른 측면에서, 아세틸화 모티프는 다중 아실 모이어티로 변형될 수 있다. 예를 들어, 이중 아실화 영역은, Src 패닐리 멤버의 하위 세트(예를 들어, Yes, Fyn, Lck)와 같은 특정 단백질 키나아제의 N-말단 영역 및 G-단백질 알파 서브유닛 내에 위치한다. 예시적인 이중 아실화 영역은 Met-Gly-Cys-Xaa-Cys(서열번호 296)의 서열 모티프를 함유하고, 여기에서 Met은 절단되고, Gly은 N-아세틸화되며 Cys 잔기 중 하나는 S-아세틸화된다. Gly은 종종 미리스토일화되고, Cys은 팔미토일화될 수 있다.
다른 예시적인 아실화 영역은 C15 또는 O10 이소프레닐 모이어티로 변형될 수 있는 Cys-Ala-Ala-Xaa(소위 “CAAX 박스”; 서열번호 297) 서열 모티프를 포함하고, 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Gauthier-Campbell 등, (2004) Molecular Biology of the Cell 15:2205-2217; Glabati 등, (1994) Biochem. J. 303: 697-700 및 Zlakine 등, (1997) J. Cell Science 110:673-679; ten Klooster 등, (2007) Biology of the Cell 99:1-12; Vincent 등, (2003) Nature Biotechnology 21:936-40]을 참조한다). 일부 구현예에서, 아실 모이어티는 C1-C20 알킬, C2-C20 알케닐, C2-C20 알키닐, C3-C6 시클로알킬, C1-C4 할로알킬, C4-C12 시클로알킬알킬, 아릴, 치환 아릴 또는 아릴 (C1-C4) 알킬이다. 일부 구현예에서, 아실-함유 모이어티는 지방산이고, 지방산 모이어티의 예는 프로필(C3), 부틸(C4), 펜틸(C5), 헥실(C6), 헵틸(C7), 옥틸(C8), 노닐(C9), 데실(C10), 운데실(C11), 라우릴(C12), 미리스틸(C14), 팔미틸(C16), 스테아릴(C18), 아라키딜(C20), 베헤닐(C22) 및 리그노세릴 모이어티(C24)이며, 각각의 모이어티는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 불포화 결합(즉, 이중 결합)을 함유할 수 있다. 일부 예에서, 아실 모이어티는 지질 분자, 예컨대 포스파디딜 지질(예를 들어, 포스파디딜 세린, 포스파디딜 이노시톨, 포스파디딜 에탄올아민, 포스파디딜 콜린), 스핑고리피드(예를 들어, 신고미엘린, 스핑고신, 세라마이드, 강글리오사이드, 세레브로사이드) 또는 이의 변형된 버전이다. 특정 구현예에서, 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 아실 모이어티가 막 연합 도메인에 연결된다.
일부 측면에서, 막 연합 도메인은 당지질(글리코실 포스파티딜이노시톨 또는 GPI로도 공지)의 첨가를 촉진하는 도메인이다. 일부 측면에서, GPI 분자는, 카르복시 말단 GPI 신호 서열의 절단(예를 들어, 문헌 [White 등, (2000) J. Cell Sci. 113:721] 참조) 및 새롭게 형성된 카르복시 말단 아미노산으로 이미 합성된 GPI 앵커 분자의 동시 전달(예를 들어, 문헌 [Varki A, 등, editors. Essentials of Glycobiology. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1999. Chapter 10, Glycophospholipid Anchors. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK20711] 참조)을 초래하는 아미드기 전달 반응에 의해 단백질 표적에 번역 후 부착된다. 특정 구현예에서, 막 연합 도메인은 GPI 신호 서열이다.
일부 구현예에서, 여기 제공된 바와 같은 다량체화 도메인은 세포 내 신호 전달 영역, 예를 들어, 1차 신호 전달 영역 및/또는 공자극 신호 전달 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 세포 외에 있고, 막관통 도메인을 통해 세포 내 신호 전달 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 세포 내에 있고, 막관통 도메인을 통해 리간드-(예를 들어, 항원-) 결합 도메인에 연결된다. 리간드 결합 도메인과 막관통 도메인은 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드 결합 도메인과 막관통은 여기에 기재된 임의의 것과 같은 스페이서에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 FK506 결합 단백질(FKBP) 또는 이의 유도체 또는 이의 단편, 예컨대 FKBP12v36이다. 일부 예에서, 리미두디드와 같은 유도제 도입 시, 조절 가능한 CAR의 폴리펩티드는 다량체화, 예를 들어, 이량체화되고, 이로써 다량체화 도메인과 관련된 신호 전달 도메인을 자극하고 다량체 복합체를 형성한다. 다량체 복합체의 형성은 세포 내 신호 전달 영역을 통해 신호의 유도, 조절, 자극, 활성화, 매개 및/또는 촉진을 초래한다.
일부 구현예에서, 조절 가능한 CAR을 통한 신호 전달은 조건부 다량체화를 통한 조건부 방식으로 조절될 수 있다. 예를 들어, 조절 가능한 CAR의 폴리펩티드의 다량체화 도메인은 유도제에 결합하여 다량체화될 수 있고, 상기 유도제는 외인성으로 제공될 수 있다. 일부 측면에서, 유도제 결합 시, 다량체화 도메인은 다량체화되고, 신호 전달 도메인을 통해 신호 전달을 유도, 조절, 활성화, 매개 및/또는 촉진한다. 예를 들어, 유도제는 외인성으로 투여될 수 있고, 이로써 조절 가능한 CAR을 함유하는 조작된 세포에 제공된 신호의 위치 및 지속 기간을 제어할 수 있다. 일부 구현예에서, 조절 가능한 CAR의 폴리펩티드의 다량체화 도메인은 유도제에 결합하여 다량체화될 수 있고, 상기 유도제는 외인성으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 유도제는 재조합 발현 벡터에서 또는 유도 가능 또는 조건부 프로모터의 제어 하에 조작된 세포의 게놈에서 조작된 세포(예를 들어, 조작된 T 세포)에 의해 외인성으로 생성될 수 있고, 이로써 조절 가능한 CAR을 함유하는 조작된 세포에 제공된 신호의 위치 및 지속 기간을 제어할 수 있다.
일부 구현예에서, 조절 가능한 CAR은 자살 스위치를 사용하여 제어된다. 예시적인 키메라 수용체는, 유도제, 예를 들어, AP1903과 결합 시 조건부 이량체화를 가능하게 하는, 인간 카스파제-9과 변형된 FKBP 이량체화 도메인의 융합을 포함하는 유도 가능 카스파제-9(iCasp9) 시스템을 활용한다. 유도제의 결합에 의한 이량체화 시, 카스파제-9는 활성화되고, 키메라 수용체를 발현하는 세포의 세포 사멸 및 세포 자멸사를 초래한다(예를 들어, 문헌 [Di Stasi 등, (2011) N. Engl. J. Med. 365:1673-683] 참조).
일부 구현예에서, 예시적인 조절 가능한 CAR은, (1) (i) 세포 내 신호 전달 영역; 및 (ii) 유도제에 결합할 수 있는 하나 이상의 다량체화 도메인;을 포함하는 조절 가능한 CAR의 제 1 폴리펩티드; 및 (2) (i) 리간드-(예를 들어, 항원) 결합 도메인; (ii) 막관통 도메인; 및 (iii) 유도제에 결합할 수 있는 하나 이상의 다량체화 도메인;을 포함하는 조절 가능한 CAR의 제 2 폴리펩티드;를 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 조절 가능한 CAR은, (1) (i) 막관통 도메인 또는 아실화 도메인; (ii) 세포 내 신호 전달 영역; 및 (iii) 유도제에 결합할 수 있는 하나 이상의 다량체화 도메인;을 포함하는 조절 가능한 CAR의 제 1 폴리펩티드; 및 (2) (i) 리간드-(예를 들어, 항원) 결합 도메인; (ii) 막관통 도메인; 및 (iii) 유도제에 결합할 수 있는 하나 이상의 다량체화 도메인;을 포함하는 조절 가능한 CAR의 제 2 폴리펩티드;를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호 전달 영역은 공자극 신호 전달 도메인을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 제 2 폴리펩티드는 공자극 신호 전달 도메인을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 둘 다에 있는 하나 이상의 다량체화 도메인(들)은 세포 내에 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 둘 다에 있는 하나 이상의 다량체화 도메인(들)은 세포 외에 있다.
일부 구현예에서, 예시적인 조절 가능한 CAR은, (1) (i) 유도제에 결합할 수 있는 하나 이상의 세포 외 다량체화 도메인; (ii) 막관통 도메인; 및 (iii) 세포 내 신호 전달 영역;을 포함하는 조절 가능한 CAR의 제 1 폴리펩티드; 및 (2) (i) 리간드-(예를 들어, 항원) 결합 도메인; (ii) 유도제에 결합할 수 있는 하나 이상의 세포 외 다량체화 도메인; 및 (iii) 막관통 도메인, 아실화 도메인 또는 GPI 신호 서열;을 포함하는 조절 가능한 CAR의 제 2 폴리펩티드;를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호 전달 영역은 공자극 신호 전달 도메인을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 제 2 폴리펩티드는 공자극 신호 전달 도메인을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 예시적인 조절 가능한 CAR은, (1) (i) 막관통 도메인 또는 아실화 도메인; (ii) 하나 이상의 공자극 도메인; (iii) 유도제에 결합할 수 있는 다량체화 도메인; 및 (iv) 세포 내 신호 전달 영역; 및 (iii) 하나 이상의 공자극 도메인;을 포함하는 조절 가능한 CAR의 제 1 폴리펩티드; 및 (2) (i) 리간드-(예를 들어, 항원) 결합 도메인; (ii) 막관통 도메인; (iii) 하나 이상의 공자극 도메인; 및 (iv) 유도제에 결합할 수 있는 하나 이상의 세포 외 다량체화 도메인;을 포함하는 조절 가능한 CAR의 제 2 폴리펩티드;를 포함한다.
일부 측면에서, 예시적인 조절 가능한 CAR에 기재된 영역 및/또는 도메인 중 어느 것이든 다양한 상이한 순서로 지시될 수 있다. 일부 측면에서, 조절 가능한 CAR(들)의 다양한 폴리펩티드는 세포 막의 동일한 측면에 다량체화 도메인을 함유하며, 예를 들어, 2개 이상의 폴리펩티드에 있는 다량체화 도메인은 모두 세포 내 또는 모든 세포 외에 있다.
조절 가능한 CAR의 변이가 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [미국 특허 출원 공개 번호 2014/0286987, 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0266973, 국제 특허 출원 공개 번호 WO2014/127261 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO2015/142675]에 기재되어 있다.
3.
키메라
자가-항체 수용체(Chimeric Auto-Antibody Receptor,
CAAR
)
일부 구현예에서, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 의해서 암호화된 재조합 수용체는 키메라 자가-항체 수용체(CAAR)이다. 일부 구현예에서, CAAR은 자가-항체에 결합, 예를 들어, 특이적으로 결합하거나 이를 인식한다. 일부 구현예에서, CAAR을 발현하도록 조작된 T 세포와 같은 CAAR을 발현하는 세포는 정상적인 항체 발현 세포가 아닌 자가-항체 발현 세포에 결합하고 이를 사멸하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, CAAR 발현 세포는 자가면역 질환과 같은 자가항원 발현과 관련된 자가면역 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, CAAR 발현 세포는 궁극적으로 자가-항체를 생산하고 세포 표면에 자가-항체를 나타내는 B 세포를 표적화할 수 있고, 치료적 개입을 위한 질환 특이적 표적으로 상기 B 세포를 표시할 수 있다. 일부 구현예에서, CAAR 발현 세포는 항원 특이적 키메라 자가-항체 수용체를 이용하여 질환을 유발하는 B 세포를 표적화함으로써 자가면역 질환에서 병원성 B 세포를 효율적으로 표적화하고 사멸시키는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 문헌 [미국 특허 출원 공개 번호 US 2017/0051035]에 기재된 어느 하나와 같은 CAAR이다.
일부 구현예에서, CAAR은 자가항체 결합 도메인, 막관통 도메인 및 하나 이상의 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인(상호 교환적으로 세포질 신호 전달 도메인 또는 영역으로도 명명)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 1차 신호 전달 영역, T 세포에서 1차 활성화 신호를 자극할 수 있고/거나 유도할 수 있는 신호 전달 도메인, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호 전달 도메인(예를 들어, CD3-제타(CD3ζ사슬의 세포내 신호 전달 도메인 또는 영역 또는 이의 기능성 변이체 또는 신호 전달 부분) 및/또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)를 포함하는 신호 전달 도메인이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 자가항체 결합 도메인은 자가항원 또는 이의 단편을 포함한다. 자가항원의 선택은 표적화될 자가항체의 유형에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 자가 항원은 특정 질환 상태, 예를 들어, 자가 면역 질환, 예컨대 자가항체 매개 자가 면역 질환과 관련된 B 세포와 같은 표적 세포 상의 자가항체를 인식하기 때문에 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 자가면역 질환은 심상성 천포창(pemphigus vulgaris, PV)을 포함한다. 예시적인 자가항원은 데스모글레인 1(desmoglein 1, Dsg1) 및 Dsg3을 포함한다.
4. T 세포 수용체(
TCR
)
일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원-결합 부분, 예를 들어, 종양, 바이러스 또는 자가면역 단백질의 항원과 같은 표적 폴리펩티드의 세포내 및/또는 펩티드 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 인식하는 재조합 TCR이다. 일부 측면에서, 암호화된 수용체는 재조합 TCR이거나 이를 포함한다. 일부 측면에서, 재조합 TCR은 단일-사슬 TCR 또는 다중-사슬 TCR, 예를 들어, 이중-사슬 TCR이다.
일부 구현예에서, “T 세포 수용체”또는 “TCR”은 가변 α 및 β 사슬(각각 TCRα 및 TCRβ로도 공지) 또는 가변 γ 및 δ 사슬(각각 TCRγ 및 TCRδ로도 공지) 또는 이의 항원 결합 부분을 함유하는 분자이고 이는 MHC 분자에 결합된 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태이다. 통상적으로, αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만, 이들을 발현하는 T 세포는 구별되는 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포 표면 상에서 또는 가용성 형태로 발견될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 TCRα 및 TCRβ; 또는 TCRγ 및 TCRδ 사슬을 포함하는 이중-사슬 TCR이다. 일부 측면에서, 일반적으로 TCR은 T 세포(또는 T 림프구)의 표면 상에서 발견되며, 이는 일반적으로 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원의 인식을 담당한다.
일부 구현예에서, 용어 "TCR"은 전장(full-length) TCR 또는 이의 항원 결합 부분 또는 항원 결합 단편을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태 또는 γδ 형태의 TCR을 포함하는 온전한 또는 전장 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 전장 미만의 TCR이지만 MHC-펩티드 복합체에 결합하는 것과 같이 MHC 분자에서 결합된 특정 펩티드에 결합하는 항원 결합 부분이다. 일부 경우에, TCR의 항원 결합 부분 또는 단편은 전장 또는 온전한 TCR의 구조적 도메인의 일부만을 함유할 수 있으나, 그럼에도 완전한 TCR이 결합하는 MHC-펩티드 복합체와 같은 펩티드 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 항원 결합 부분은 특정 MHC-펩티드 복합체에 결합하기 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한, TCR의 가변 α(Vα) 사슬 및 가변 β(Vβ) 사슬과 같은 TCR, 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 도메인을 함유한다.
일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 TCR이고, 변형된 유전자 좌는 TCR의 사슬을 암호화한다. 일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 이중-사슬 TCR이고, 변형된 유전자 좌는 이중-쇄 TCR의 하나의 사슬을 암호화한다. 일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 이중-쇄 TCR이고, 변형된 유전자 좌는 이중-사슬 TCR의 두 사슬을 암호화한다. 일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 알파 사슬 및 베타 사슬을 포함하는 TCR이고, 변형된 유전자 좌는 TCR의 알파 및 베타 사슬 둘 다를 암호화한다. 일부 구현예에서, TCR의 알파 사슬 및 TCR의 베타 사슬을 암호화하는 핵산 서열은 멀티시스트로닉 요소(multicistronic element)에 의해 분리된다.
일부 구현예에서, 암호화된 TCR의 가변 도메인은 초가변 루프 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 함유하며, 이는 일반적으로 항원 인식 및 결합 능력 및 특이성에 대한 1차 기여자이다. 일부 구현예에서, TCR의 CDR 또는 이의 병용은 주어진 TCR 분자의 항원 결합 부위의 전부 또는 실질적으로 전부를 형성한다. TCR 사슬의 가변 영역 내의 다양한 CDR은 일반적으로 CDR에 비해 TCR 분자 중에서 일반적으로 가변성을 덜 나타내는 프레임워크 영역(FR)으로 분리된다(예를 들어, 문헌 [Jores 등., Proc. Nat’l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia 등., EMBO J. 7:3745, 1988 참조; 또한 Lefranc 등., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003] 참조). 일부 구현예에서, CDR3은 항원 결합 또는 특이성을 담당하는 주요 CDR이거나, 항원 인식을 위한 및/또는 펩티드-MHC 복합체의 가공된 펩티드 부분과의 상호작용을 위한 주어진 TCR 가변 영역상에서 3개의 CDR 중 가장 중요한 CDR이다. 일부 맥락에서, 알파 사슬의 CDR1은 특정 항원 펩티드의 N-말단 부분과 상호작용할 수 있다. 일부 맥락에서, 베타 사슬의 CDR1은 상기 펩티드의 C-말단 부분과 상호작용할 수 있다. 일부 맥락에서, CDR2는 MHC-펩티드 복합체의 MHC 부분과의 상호작용 또는 이의 인식을 담당하는 1차 CDR이거나 이에 가장 강력하게 기여한다. 일부 구현예에서, β 사슬의 가변 영역은 추가 초가변 영역(CDR4 또는 HVR4)을 함유할 수 있으며, 이는 일반적으로 항원 인식이 아닌 초항원 결합에 관여한다(Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426).
일부 구현예에서, 암호화된 TCR은 또한 불변 도메인, 막관통 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 함유할 수 있다(예를 들어, 문헌 [Janeway 등., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997] 참조). 일부 측면에서, TCR의 각 사슬은 1개의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 1개의 면역글로불린 불변 도메인, 막관통 영역 및 C-말단 끝에 짧은 세포질 꼬리를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 신호 전달 매개에 관여하는 CD3 복합체의 불변 단백질과 회합한다.
일부 구현예에서, 암호화된 TCR 사슬은 하나 이상의 불변 도메인을 함유한다. 예를 들어, 주어진 TCR 사슬(예를 들어, α-사슬 또는 b-사슬)의 세포외 부분은 세포막에 인접한 2개의 면역글로불린 유사 도메인, 예컨대 가변 도메인(예를 들어, Vα 또는 Vb; 전형적으로 Kabat 넘버링 Kabat 등., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.에 기초한 1 내지 116 아미노산) 및 불변 도메인(예를 들어, α 사슬 불변 도메인 즉 Cα, 전형적으로 Kabat 넘버링에 기초한 사슬의 117 내지 259 위치 또는 b 사슬 불변 도메인 또는 Cb, 전형적으로 Kabat에 기초한 사슬의 117 내지 295 위치)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 2개의 사슬에 의해 형성된 TCR의 세포외 부분은 2개의 막 근위 불변 도메인과 2개의 막 원위 가변 도메인을 함유하고, 상기 가변 도메인 각각은 CDR을 함유한다. TCR의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 이황화물 결합을 형성하여 이로써 2개의 TCR 사슬을 연결하는 짧은 연결 서열을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 각각의 α 및 β 사슬에 추가 시스테인 잔기를 가질 수 있어서, TCR은 불변 도메인에 2개의 이황화물 결합을 함유한다.
일부 구현예에서, 암호화된 TCR 사슬은 막관통 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 양으로 하전된다. 일부 경우에, TCR 사슬은 세포질 꼬리를 함유한다. 일부 경우에, 이 구조는 TCR이 CD3 및 이의 서브유닛과 같은 다른 분자와 회합하도록 허용한다. 예를 들어, 막관통 영역을 갖는 불변 도메인을 함유하는 TCR은 세포막에 단백질을 고정하고 CD3 신호 전달 장치 또는 복합체의 불변 서브유닛과 회합할 수 있다. CD3 신호 전달 서브유닛(예를 들어, CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ 사슬)의 세포내 꼬리는 TCR 복합체의 신호 전달 용량에 관여하는 하나 이상의 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 즉 ITAM을 함유한다.
일부 구현예에서, 암호화된 TCR은 다양한 도메인 또는 영역을 함유한다. 일부 경우에, 정확한 도메인 또는 영역은 특정 도메인을 기재하는데 사용된 특정 구조 또는 상동성 모델링 또는 기타 특성에 따라 달라질 수 있다. 재조합 수용체, 예를 들어, TCR의 도메인 구성을 기재하는데 사용된 서열번호로 제시된 특정 서열을 포함한 아미노산에 대한 언급은 예시 목적을 위한 것이며 제공된 구현예의 범위를 제한하는 것을 의미하지 않는다는 것이 이해된다. 일부 경우에, 특정 도메인(예를 들어, 가변 또는 불변)은 몇 개의 아미노산(예컨대 1, 2, 3 또는 4)이 더 길거나 더 짧을 수 있다. 일부 측면에서, TCR의 잔기는 공지되거나 IMGT(International Immunogenetics Information System) 넘버링 시스템(예를 들어, www.imgt.org 참조; 또한 Lefranc 등, (2003) Developmental and Comparative Immunology, 27;55-77; 및 The T Cell Factsbook 2nd Edition, Lefranc and LeFranc Academic Press 2001 참조)에 따라 확인될 수 있다. 상기 시스템을 사용하여, TCR Vα 사슬 및/또는 Vβ 사슬 내의 CDR1 서열은 잔기 번호 27-38(수치 포함) 사이에 존재하는 아미노산에 해당하며, TCR Vα 사슬 및/또는 Vβ 사슬 내의 CDR2 서열은 잔기 번호 56-65(수치 포함) 사이에 존재하는 아미노산에 해당하고, TCR Vα 사슬 및/또는 Vβ 사슬 내의 CDR3 서열은 잔기 번호 105-117(수치 포함) 사이에 존재하는 아미노산에 해당한다.
일부 구현예에서, TCR의 α 사슬 및 β 사슬은 각각 불변 도메인을 더 함유한다. 일부 구현예에서, α 사슬 불변 도메인(Cα) 및 β 사슬 불변 도메인(Cβ)은 개별적으로 인간 또는 뮤린 불변 도메인과 같은 포유류이다. 일부 구현예에서, 불변 도메인은 세포막에 인접해 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 2개의 사슬에 의해 형성된 암호화된 TCR의 세포외 부분은 2개의 막 근위 불변 도메인과 2개의 막 원위 가변 도메인을 함유하고, 상기 가변 도메인 각각은 CDR을 함유한다.
일부 구현예에서, 각각의 Cα 및 Cβ 도메인은 인간이다. 일부 구현예에서, Cα는 TRAC 유전자(IMGT 명명법)에 의해 암호화되거나 이의 변이체이다. 일부 구현예에서, Cα는 서열번호 91 또는 92에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 91 또는 92에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖거나 포함한다. 일부 구현예에서, Cα는 서열번호 91 또는 92 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, Cα는 서열번호 93에 제시된 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열, 예를 들어, 성숙 폴리펩티드 또는 서열번호 93에 제시된 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열, 예를 들어, 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, Cβ는 TRBC1 또는 TRBC2 유전자(IMGT 명명법)에 의해 암호화되거나 이의 변이체이다. 일부 구현예에서, Cβ는 서열번호 94, 95 또는 96에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 94, 95 또는 96에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, Cβ는 서열번호 94, 95 또는 96에 제시된 아미노산 서열을 갖거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, Cβ는 서열번호 97에 제시된 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열, 예를 들어, 성숙 폴리펩티드 또는 서열번호 97에 제시된 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열, 예를 들어, 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 제공된 TCR 또는 이의 항원 결합 단편 중의 어느 하나는 인간/마우스 키메라 TCR일 수 있다. 일부 경우에, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 마우스 불변 영역을 포함하는 α 사슬 및/또는 β 사슬을 갖는다. 일부 측면에서, Cα 및/또는 Cβ 영역은 마우스 불변 영역이다.
상기 임의의 구현예 중의 일부에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 α 사슬 및/또는 β 사슬에서 하나 이상의 변형을 함유하여, TCR 또는 이의 항원 결합 단편이 세포에서 발현될 경우, TCR α 사슬 및 β 사슬과 내인성 TCR α 사슬 및 β 사슬 사이의 짝짓기 오류 빈도가 감소하고/하거나 TCR α 사슬 및 β 사슬의 발현이 증가하고/하거나 TCR α 사슬 및 β 사슬의 안정성이 증가한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 Cα 영역 및/또는 Cβ 영역에서 하나 이상의 아미노산의 교체, 결실 또는 삽입이다. 일부 측면에서, 하나 이상의 변형은 교체(들)를 함유하여 α 사슬과 β 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입한다.
상기 임의의 구현예 중의 일부에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 92에 제시된 바와 같은 넘버링으로 48번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인을 함유하는 Cα 영역 및/또는 서열번호 96에 제시된 바와 같은 넘버링으로 57번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인을 함유하는 Cβ 영역을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 Cα 영역은 β 사슬과 비천연 이황화물 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 서열번호 91 또는 92 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열 또는 이에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유하고/하거나; 상기 Cβ 영역은 α 사슬과 비천연 이황화물 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 서열번호 94, 95 또는 96 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열 또는 이에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유한다.
상기 임의의 구현예 중의 일부에서, 암호화된 TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
상기 임의의 구현예 중의 일부에서, 결합 분자 또는 TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 단리 또는 정제 또는 재조합이다. 상기 임의의 구현예 중의 일부에서, 결합 분자 또는 TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 인간이다.
일부 구현예에서, 암호화된 TCR은 예컨대 이황화물 결합 또는 이황화물 결합들에 의해 연결된 2개의 사슬 α 및 β의 이종 이량체일 수 있다. 일부 구현예에서, 암호화된 TCR의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 이황화물 결합을 형성하는 짧은 연결 서열을 함유하고, 이로써 2개의 암호화된 TCR 사슬을 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 α 및 β 사슬 각각에 추가 시스테인 잔기를 가질 수 있어서, 암호화된 TCR은 불변 도메인에 2 개의 이황화물 결합을 함유한다. 일부 구현예에서, 불변 및 가변 도메인 각각은 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화물 결합을 함유한다.
일부 구현예에서, 암호화된 TCR은 2개의 사슬 α 및 β 또는 γ 및 δ의 이종이량체, 예를 들어, 이중-쇄 TCR일 수 있거나, 또는 이는 단일 사슬 TCR 구축물일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 예를 들어, 이황화물 결합 또는 이황화물 결합에 의해 연결된 2개의 별개의 사슬(이중-쇄 TCR, α 및 β 사슬 또는 γ 및 δ 사슬)를 함유하는 이종이량체이다.
일부 구현예에서, 암호화된 TCR은 Vα,β 사슬의 서열과 같은 공지된 TCR 서열(들)로부터 생성될 수 있으며, 이에 대해 실질적으로 전장 암호화 서열이 용이하게 이용가능하다. V 사슬 서열을 포함한 전장 TCR 서열을 세포 공급원으로부터 수득하는 방법은 잘 알려져 있다. 일부 구현예에서, TCR을 암호화하는 핵산은 예컨대 주어진 세포 또는 세포들 내의 또는 이로부터 단리된 TCR 암호화 핵산의 중합효소연쇄반응(PCR) 증폭에 의해 또는 공개적으로 이용 가능한 TCR DNA 서열의 합성에 의해 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다.
일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 재조합 TCR 및/또는 자연적으로 발생하는 T 세포로부터 클로닝된 TCR을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 항원(예를 들어, 암 항원)에 대한 높은 친화도 T 세포 클론이 환자로부터 식별 및 단리되고, 세포내로 도입된다. 일부 구현예에서, 표적 항원에 대한 TCR 클론이 인간 면역 계통 유전자(예를 들어, 인간 백혈구 항원 시스템 즉 HLA)로 조작된 형질전환 마우스에서 생성되었다. 예를 들어, 종양 항원(예를 들어, Parkhurst 등. (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180 및 Cohen 등. (2005) J Immunol . 175:5799-5808 참조)을 참조한다. 일부 측면에서, 표적 항원에 대하여 TCR을 단리하기 위해 파지 디스플레이가 사용된다(예를 들어, 문헌 [Varela-Rohena 등. (2008) Nat Med . 14:1390-1395 및 Li (2005) Nat Biotechnol . 23:349-354] 참조).
일부 구현예에서, 암호화된 TCR은 생물학적 공급원, 예컨대 세포, 예컨대 T 세포(예를 들어, 세포 독성 T 세포), T 세포 혼성세포 또는 기타 공개적으로 이용 가능한 공급원으로부터 수득된다. 일부 구현예에서, T 세포는 생체 내 단리된 세포로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 흉선에서 선택된 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 네오에피토프 제한(neoepitope-restricted) TCR이다. 일부 구현예에서, T 세포는 배양된 T 세포 혼성세포(hybridoma) 또는 클론일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원 결합 부분 또는 이의 항원 결합 단편은 TCR 서열에 대한 지식을 이용해 합성하여 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 표적 폴리펩티드 항원 또는 이의 표적 T 세포 에피토프에 대한 후보 TCR의 라이브러리를 스크리닝하여 식별되거나 선택된 TCR로부터 생성된다. TCR 라이브러리는 PBMC, 비장 또는 기타 림프구 기관에 존재하는 세포를 포함하여 대상체로부터 단리된 T 세포로부터의 Vα 및 Vβ 레퍼토리를 증폭하여 생성될 수 있다. 일부 경우에, T 세포는 종양 침윤 림프구(tumor-infiltrating lymphocyte, TIL)로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 라이브러리는 CD4+ 또는 CD8+ 세포로부터 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 정상적인 건강한 대상체의 T 세포 공급원, 즉 정상 TCR 라이브러리로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 유병 대상체의 T 세포 공급원, 즉 유병 TCR 라이브러리로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, 인간으로부터 수득된 T 세포와 같은 샘플에서 예컨대 RT-PCR에 의해 Vα 및 Vβ의 유전자 레퍼토리를 증폭시키기 위해 퇴화(degenerate) 프라이머가 사용된다. 일부 구현예에서, 라이브러리, 예를 들어, 단일-사슬 TCR(scTv) 라이브러리는 증폭된 산물이 클로닝되거나 결집되어 링커에 의해 분리되는 나이브(naive) Vα 및 Vβ 라이브러리로부터 결집될 수 있다. 대상체와 세포의 공급원에 따라, 라이브러리는 HLA 대립유전자 특이적일 수 있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, TCR 라이브러리는 모체(parent) 또는 지지체(scaffold) TCR 분자의 돌연변이 유발 또는 다양화에 의해 생성될 수 있다.
일부 측면에서, 암호화된 TCR은 예를 들어, α 또는 β 사슬의 예컨대 돌연변이 유발에 의해 유도 진화를 거친다. 일부 측면에서, TCR의 CDR 내 특정 잔기가 변경된다. 일부 구현예에서, 선택된 TCR은 친화도 성숙에 의해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 예컨대, 스크리닝에 의해 펩티드에 대한 CTL 활성을 산정하여 선택될 수 있다. 일부 측면에서, 예를 들어, 항원 특이적 T 세포에 존재하는 암호화된 TCR은 예컨대 결합 활성, 예를 들어, 항원에 대한 특정 친화도 또는 친화력에 의해 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 암호화된 TCR 또는 이의 항원 결합 부분은 변형되었거나 조작된 것이다. 일부 구현예에서, 특정 MHC-펩티드 복합체에 대한 더 높은 친화도를 갖는 것과 같은 변경된 특성을 갖는 TCR을 생성하기 위해 유도 진화 방법이 사용된다. 일부 구현예에서, 유도 진화는 효모 디스플레이(Holler 등. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler 등. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92), 파지 디스플레이(Li 등. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54) 또는 T 세포 디스플레이(Chervin 등. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84)를 포함하되 이에 한정되지 않는 디스플레이 방법에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 디스플레이 접근법은 공지된 모체(parent) 또는 기준 TCR을 조작 또는 변형하는 것을 수반한다. 예를 들어, 일부 경우에, 하나 이상의 CDR 잔기에서 돌연변이된 돌연변이를 일으킨 TCR을 생성하기 위한 주형(template)으로 야생형 TCR이 사용될 수 있고, 원하는 변경된 특성, 예컨대 원하는 표적 항원에 대한 보다 높은 친화도를 갖는 돌연변이가 선택된다.
일부 구현예에서, 항원은 신경 교종 관련 항원, β-인간 융모막 성선 자극 호르몬, 알파페토프로테인(alphafetoprotein, AFP), B 세포 성숙 항원(BCMA, BCM), B 세포 활성화 인자 수용체(BAFFR, BR3) 및/또는 막관통 활성제 및 CAML 상호작용자(TACI), Fc 수용체 유사 5(FCRL5, FcRH5), 렉틴 반응성 AFP, 티로글로불린(thyroglobulin), RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사 효소, RU1, RU2(AS), 장 카르복실 에스터라제, mut hsp70-2, M-CSF, 멜라닌-A/MART-1, WT-1, S-100, MBP, CD63, MUC1(예를 들어, MUC1-8), p53, Ras, 사이클린 B1, HER-2/neu, 암배아 항원(CEA), gp100, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A11, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-C1, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5, 티로시나제, 티로시나제 관련 단백질 1(TRP-1), 티로시나제 관련 단백질 2(TRP-2), β-카테닌, NY-ESO-1, LAGE-1a, PP1, MDM2, MDM4, EGVFvIII, Tax, SSX2, 텔로머라제, TARP, pp65, CDK4, 비멘틴, S100, eIF-4A1, IFN 유도성 p78 및 멜라노트랜스페린(p97), 우로플라킨 II, 전립선 특이적 항원(PSA), 인간 칼리크레인(huK2), 전립선 특이적 막 항원(PSM) 및 전립선산 포스파타아제(PAP), 호중구 엘라스타제, 에프린 B2, BA-46, 베타-카테닌, Bcr-abl, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, 카스파제 8 또는 B-Raf 항원일 수 있는 종양 항원이다. 기타 종양 항원에는 FRa, CD24, CD44, CD133, CD 166, epCAM, CA-125, HE4, 오발(Oval), 에스트로겐 수용체, 프로게스트론 수용체, uPA, PAI-1, CD19, CD20, CD22, ROR1, 메소텔린, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, 당지질 F77, GD-2, 인슐린 성장 인자(insulin growth factor, IGF)-I, IGF-II; 및 IGF-I 수용체로부터 유래된 어느 하나가 포함될 수 있다. 특정 종양 관련 항원 또는 T 세포 에피토프가 공지되어 있다(예를 들어, van der Bruggen 등, (2013) Cancer Immun, www.cancerimmunity.org/peptide/에서 이용 가능; Cheever 등, (2009) Clin Cancer Res, 15, 5323-37 참조).
일부 구현예에서, 항원은 바이러스 항원이다. HIV, HTLV 및 기타 바이러스의 바이러스 게놈 유래 펩티드를 포함한, 많은 바이러스 항원 표적이 확인되었으며 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Addo 등, (2007) PLoS ONE, 2, e321 ; Tsomides 등, (1994) J Exp Med, 180, 1283-93; Utz 등, (1996) J Virol, 70, 843-51] 참조). 예시적인 바이러스 항원은 A형 간염, B형 간염(예를 들어, HBV 코어 및 표면 항원(HBVc, HBVs)), C형 간염(HCV), 엡스타인-바 바이러스(예를 들어, EBVA), 인간 유두종 바이러스(HPV; 예를 들어, E6 및 E7), 인간 면역 결핍 유형-1 바이러스(HIV1), 카포시의 육종 헤르페스 바이러스(KSHV), 인간 유두종 바이러스(HPV), 인플루엔자 바이러스, 라사 바이러스, HTLN-1, HIN-1, HIN-II, CMN, EBN 또는 HPN으로부터 선택된 항원을 포함하되, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 표적 단백질은 세균성 항원 또는 기타 병원성 항원, 예컨대 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, MT) 항원, 트리파노소마, 예를 들어, 표면 항원과 같은 Tiypansoma cruzi(T. cruzi), 항원(TSA) 또는 말라리아 항원이다. 특정 바이러스 항원 또는 에피토스 또는 기타 병원성 항원 또는 T 세포 에피토프가 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Addo 등, (2007) PLoS ONE, 2:e321 ; Anikeeva 등, (2009) Clin Immunol, 130:98-109] 참조).
일부 구현예에서, 항원은 종양 형성 바이러스와 같은 암과 관련된 바이러스 유래 항원이다. 예를 들어, 종양 발생 바이러스는 특정 바이러스 감염이 상이한 유형의 암의 발달로 이어지는 것으로 공지된 바이러스, 예를 들어, A형 간염, B형 간염(예를 들어, HBV 코어 및 표면 항원(HBVc, HBVs)), C형 간염(HCV), 인간 유두종 바이러스(HPV), 간염 바이러스의 감염, 엡스타인-바 바이러스(EBV), 인간 헤르페스 바이러스 8(HHV-8), 인간 T 세포 백혈병 바이러스-1(HTLV-1), 인간 T 세포 백혈병 바이러스-2(HTLV-2) 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 항원이다.
일부 구현예에서, 바이러스 항원은 HPV 항원이며, 일부 경우에 이는 자궁 경부암 발병의 보다 큰 위험으로 이어질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 HPV-16 항원 및 HPV-18 항원 및 HPV-31 항원, HPV-33 항원 또는 HPV-35 항원일 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 항원은 HPV-16 항원(예를 들어, HPV-16E1의 E1, E2, E6 및/또는 E7 단백질의 혈청 반응성 영역, 예를 들어, 미국특허 제6,531,127호 참조) 또는 HPV-18 항원(예를 들어, 미국특허 제5,840,306호에 기재된 바와 같은 HPV-18의 L1 및/또는 L2 단백질의 혈청 반응성 영역)이다. 일부 구현예에서, 바이러스 항원은 HPV-16의 E6 및/또는 E7 단백질 유래의 HPV-16 항원이다. 일부 구현예에서, TCR은 HPV-16 E6 또는 HPV-16 E7에 대하여 유도된 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 예를 들어, 문헌 [국제공개공보 제WO2015/184228호, 제WO2015/009604호 및 제WO2015/009606호]에 기재된 TCR이다.
일부 구현예에서, 바이러스 항원은 HBV 또는 HCV 항원이며, 일부 경우에 이는 HBV 또는 HCV 음성 대상체보다 간암 발병의 보다 큰 위험으로 이어질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이종 항원은 B형 간염 코어 항원 또는 B형 간염 외피 항원과 같은 HBV 항원이다(미국특허출원공개공보 제US2012/0308580호).
일부 구현예에서, 바이러스 항원은 EBV 항원이고, 일부 경우에 이는 EBV 음성 대상체보다 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 비인두 암종 및 호지킨 질환의 발병에 대한 보다 큰 위험으로 이어질 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, EBV는 다양한 조직 기원의 수많은 인간 종양과 관련되어 발견되는 인간 헤르페스 바이러스이다. 주로 무증상 감염으로 발견되나, EBV 양성 종양은 EBNA-1, LMP-1 및 LMP-2A와 같은 바이러스 유전자 생성물의 활성 발현에 의해 특성화될 수 있다. 일부 측면에서, 이종 항원은 엡스타인-바 핵 항원(EBNA)-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA 리더 단백질(EBNA-LP), 잠재성 막 단백질(latent membrane protein; LMP)-1, LMP-2A 및 LMP-2B, EBV-EA, EBV-MA 또는 EBV-VCA를 포함할 수 있는 EBV 항원이다.
일부 구현예에서, 바이러스 항원은 HTLV-1 또는 HTLV-2 항원이며, 일부 경우에 이는 HTLV-1 또는 HTLV-2 음성 대상체보다 T 세포 백혈병 발병의 보다 큰 위험으로 이어질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이종 항원은 TAX와 같은 HTLV 항원이다.
일부 구현예에서, 바이러스 항원은 HHV-8 항원이며, 일부 경우에 이는 HHV-8 음성 대상체보다 카포시 육종(Kaposi's sarcoma) 발병의 보다 큰 위험으로 이어질 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 항원은 pp65 또는 pp64와 같은 CMV 항원이다(미국특허 제8,361,473호 참조).
일부 구현예에서, 항원은 자가면역 질환 또는 장애와 관련된 폴리펩티드 항원과 같은 자가항원이다. 일부 구현예에서, 자가면역 질환 또는 장애는 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS), 류마티스 천포창 관절염(RA), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 피부 경화증, 다발성 근육염(polymyositis), 피부근염(dermatomyositis), 전신 루푸스 홍반성, 청소년 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 중증 근무력증(myasthenia gravis, MG), 수포성류천포창(진피-표피 교차점에서 기저막에 대한 항체), 천포창(뮤코 다당류 단백질 복합체 또는 세포내 시멘트 물질에 대한 항체), 사구체 신염(사구체 기저막에 대한 항체), Goodpasture 증후군, 자가 면역 용혈성 빈혈(적혈구에 대한 항체), 하시모토병(갑상선에 대한 항체), 악성 빈혈(내인성 인자에 대한 항체), 특발성 혈소판 감소성 자반병(혈소판에 대한 항체), 그레이브병 또는 애디슨병(티로글로불린에 대한 항체)일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 자가면역 질환 중의 하나와 관련된 자가 항원과 같은 자가 항원은 II 형 콜라겐, 미코박테리아 열충격 단백질, 티로글로불린, 아세틸 콜린 수용체(acetyl choline receptor, AcHR), 미엘린 염기성 단백질(myelin basic protein, MBP) 또는 단백지질 단백질(proteolipid protein, PLP)과 같은 콜라겐일 수 있다. 특정 자가면역 관련 에피토프 또는 항원이 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Bulek 등, (2012) Nat Immunol, 13:283-9; Harkiolaki 등, (2009) Immunity, 30:348-57; Skowera 등, (2008) J Clin Invest, 1(18): 3390-402] 참조).
일부 구현예에서, 관심 TCR의 제조 또는 생성에 사용하기 위한 표적 폴리펩티드의 펩티드는 공지되어 있거나 당업자에 의해 용이하게 식별될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 또는 항원 결합 부분을 생성하는 데 사용하기에 적합한 펩티드는 하기 기재된 표적 폴리펩티드와 같은 관심 표적 폴리펩티드에서 HLA 제한 모티프의 존재에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드는 이용 가능한 컴퓨터 예측 모델을 사용하여 식별된다. 일부 예에서, HLA-A0201-결합 모티프 및 프로테아솜에 대한 절단 부위 및 컴퓨터 예측 모델을 사용하는 면역-프로테아솜이 공지되어 있다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 결합 부위를 예측하기 위해, 상기 모델은 ProPred1(Singh 및 Raghava (2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237) 및 SYFPEITHI(Schuler 등. (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007 참조)를 포함하되 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, MHC 제한 에피토프는 HLA-A0201이며, 이는 모든 백인의 약 39-46%에서 발현되고 따라서, TCR 또는 다른 MHC-펩티드 결합 분자를 제조하는 데 사용하기 위한 MHC 항원의 적합한 선택을 의미한다.
일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원 결합 부분은 결합 특성과 같은 하나 이상의 특성이 변경된 재조합으로 생산된 천연 단백질 또는 이의 돌연변이 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 인간, 마우스, 랫트 또는 기타 포유류와 같은 다양한 동물 종 중 하나에서 유래될 수 있다. TCR은 세포 결합 또는 가용성 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법의 목적을 위해, TCR은 세포의 표면 상에 발현된 세포 결합 형태이다.
일부 구현예에서, 암호화된 재조합 TCR은 전장 TCR이다. 일부 구현예에서, 재조합 TCR은 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, TCR은 이량체 TCR(dTCR)이다. 일부 구현예에서, TCR은 단일 사슬 TCR(sc-TCR)이다. 일부 구현예에서, dTCR 또는 scTCR은 예를 들어, 문헌 [국제공개공보 제WO 03/020763호, 제WO 04/033685호, 및 제WO2011/044186호]에 기술된 바와 같은 구조를 가지고 있다.
일부 구현예에서, 암호화된 재조합 TCR은 막관통 서열에 해당하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 세포질 서열에 해당하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 암호화된 TCR은 CD3과 TCR 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, dTCR 또는 scTCR을 포함하여 임의의 TCR은 T 세포 표면 상에 활성 TCR을 생성하는 신호 전달 도메인에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 세포의 표면 상에 발현된다. 도입된 또는 조작된 사슬간 이황화물 결합을 함유하는 dTCR 또는 scTCR의 일부 구현예에서, 천연 이황화물 결합은 존재하지 않는다.
특정 구현예에서, 암호화된 TCR은 하나 이상의 변형(들)을 함유하여 TCRα 사슬과 TCRβ 사슬 사이의 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입한다. 일부 구현예에서, 암호화된 TCR은, TCRβ 사슬과 비천연 이황화물 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 TCRα 불변 도메인을 함유하는 TCRα 사슬 또는 이의 일부를 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는, TCRα 사슬과 비천연 이황화물 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 TCRβ 불변 도메인을 함유하는 TCRβ 사슬 또는 이의 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, 암호화된 TCR은 하나 이상의 이황화물 결합을 도입하도록 하나 이상의 변형을 함유하는 TCRα 및/또는 TCRβ 사슬 및/또는 TCRα 및/또는 TCRβ 사슬 불면 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는, 예를 들어, 전이 유전자에 의한 암호화된 TCRα와 내인성 TCRβ 사슬 사이 또는 전이 유전자에 의한 암호화된 TCRβ와 내인성 TCR α 사슬 사이에 천연 이황화물 결합을 제거 또는 방지하도록 하나 이상의 변형을 갖는 TCRα 및/또는 TCRβ 사슬 및/또는 TCRα 및/또는 TCRβ를 암호화한다. 일부 구현예에서, 천연 사슬 간 이황화물 결합을 형성하고/하거나 형성할 수 있는 하나 이상의 천연 시스테인은 다른 잔기, 예를 들어, 세린 또는 알라닌으로 치환된다. 일부 구현예에서, TCRα 불변 도메인의 넘버링을 참조하여 Thr48, Thr45, Tyr10, Thr45 및 Ser15 잔기 중 하나 이상에 시스테인이 도입된다. 특정 구현예에서, TCRβ 사슬 불변 도메인의 Ser57, Ser77, Ser17, Asp59 또는 Glu15 잔기에 시스테인이 도입된다. TCR의 예시적인 비천연 이황화물 결합은 국제공개공보 제WO2006/000830호, 제WO 2006/037960호 및 문헌 [Kuball 등, (2007) Blood, 109:2331-2338]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 시스테인은 Cα 사슬의 Thr48 및 Cβ 사슬의 Ser57에 상응하는 잔기, Cα 사슬의 Thr45 및 Cβ 사슬의 Ser77에 상응하는 잔기, Cα 사슬의 Tyr10 및 Cβ 사슬의 Ser17에 상응하는 잔기, Cα 사슬의 Thr45 및 Cβ 사슬의 Asp59에 상응하는 잔기 및/또는 Cα 사슬의 Ser15 및 Cβ 사슬의 Glu15에 상응하는 잔기에 도입되거나 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, 임의의 시스테인 돌연변이는 또 다른 서열, 예를 들어, 상기 기재된 인간 또는 마우스 Cα 및 Cβ 서열 내의 상응하는 위치에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 아미노산 위치가 Cα 및 Cβ에서 아미노산 위치에 "상응한다"는 언급과 같이, 단백질의 위치와 관련하여 사용된 용어 "상응하는", 예시적인 구조적 서열 정렬에 기초하거나 또는 표준 정렬 알고리즘, 예를 들어, GAP 알고리즘을 사용하여 된 서열과의 정렬 시에 식별된 아미노산 위치를 지칭한다.
일부 구현예에서, 천연 사슬-간 이황화물 결합(inter-chain disulfide)을 형성하는 천연 시스테인 중 하나 이상은 또 다른 잔기, 예를 들어, 세린 또는 알라닌으로 치환된다. 일부 구현예에서, 도입된 또는 조작된 이황화물 결합은 제 1 및 제 2 분절 상의 비-시스테인 잔기를 시스테인으로 돌연변이시킴으로써 형성될 수 있다. TCR의 예시적인 비-천연 이황화물 결합은 국제공개공보 제WO2006/000830호에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 암호화된 재조합 TCR은 이량체 TCR(dTCR)이다. 일부 구현예에서, dTCR은 TCR α 사슬 가변 영역 서열에 해당하는 서열이 TCR α 사슬 불변 영역 세포외 서열에 해당하는 서열의 N 말단에 융합된 제 1 폴리펩티드, 및 TCR β 사슬 가변 영역 서열에 해당하는 서열이 TCR β 사슬 불변 영역 세포외 서열에 해당하는 N 말단 서열에 융합된 제 2 폴리펩티드를 함유하고, 제 1 및 제 2 폴리펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 이 결합은 천연 이량체 αβ TCR에 존재하는 천연 사슬 간 이황화물 결합에 해당할 수 있다. 일부 구현예에서, 사슬 간 이황화물 결합은 천연 TCR에 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인이 dTCR 폴리펩티드 쌍의 불변 영역 세포외 서열에 편입될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비천연 이황화물 결합이 모두 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 막에 고정하는 막관통 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, dTCR은 가변 α 도메인, 불변 α 도메인 및 이 불변 α 도메인의 C-말단에 부착된 제 1 이량체화(dimerization) 모티프를 함유하는 TCR α 사슬, 및 가변 β 도메인, 불변 β 도메인 및 이 불변 β 도메인의 C-말단에 부착된 제 2 이량체화 모티프를 포함하는 TCR β 사슬을 함유하고, 여기에서 제 1 및 제 2 이량체화 모티프는 상호작용하여 TCR α 사슬과 TCR β 사슬을 서로 연결하는 제 1 이량체화 모티프에 있는 아미노산과 제 2 이량체화 모티프에 있는 아미노산 사이에서 공유결합을 형성한다.
일부 구현예에서, 암호화된 재조합 TCR은 단일-사슬 TCR(scTCR 또는 scTv)이다. 전형적으로, scTCR은 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Soo Hoo, W. F. 등. PNAS (USA) 89, 4759 (1992)]; [Wulfing, C. 및 Pluckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994)]; [Kurucz, I. 등. PNAS (USA) 90 3830 (1993)]; 국제공개공보 제WO 96/13593호, 제WO 96/18105호, 제WO99/60120호, 제WO99/18129호, 제WO 03/020763호, 제WO2011/044186호; 및 문헌 [Schlueter, C. J. 등. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996)] 참조). 일부 구현예에서, scTCR은 도입된 비천연 사슬 간 이황화물 결합을 함유하여 TCR 사슬의 회합을 용이하게 한다(예를 들어, 국제공개공보 제WO 03/020763호 참조). 일부 구현예에서, scTCR은 비이황화물 연결 절단형 TCR이며 여기에서 이종 류신 지퍼(heterologous leucine zipper)가 이의 C-말단에 융합하여 사슬 결합을 촉진한다(예를 들어, 국제공개공보 제WO99/60120호 참조). 일부 구현예에서, scTCR은 펩티드 링커를 통해 TCRβ 가변 도메인에 공유적으로 연결된 TCRα 가변 도메인을 함유하고 있다(예를 들어, 국제공개공보 제WO99/18129호 참조).
일부 구현예에서, scTCR은 TCR α 사슬 가변 영역에 해당하는 아미노산 서열로 구성된 제 1 분절, TCR β 사슬 불변 도메인 세포외 서열에 해당하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된 TCR β 사슬 가변 영역 서열에 해당하는 아미노산 서열로 구성된 제 2 분절, 및 제 2 분절의 N 말단에 제 1 분절의 C 말단을 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, scTCR은 α 사슬 세포외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 α 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제 1 분절, 및 β 사슬 세포외 불변 및 막관통 서열의 N 말단에 융합된 β 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제 2 분절, 및 선택적으로 제 2 분절의 N 말단에 제 1 분절의 C 말단을 연결하는 링커 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, scTCR은 β 사슬 세포외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 TCRβ 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제 1 분절, 및 α 사슬 세포외 불변 및 막관통 서열의 N 말단에 융합된 α 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제 2 분절, 및 선택적으로 제 2 분절의 N 말단에 제 1 분절의 C 말단을 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 TCR 분절을 연결하는 scTCR의 링커는 TCR 결합 특이성을 유지하면서 단일 폴리펩티드 가닥을 형성할 수 있는 임의의 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 예를 들어, 화학식 -P-AA-P-를 가질 수 있고, 여기서 P는 프롤린이고 AA는 아미노산 서열을 나타내며 여기서 아미노산은 글리신과 세린이다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 분절은 이의 가변 영역 서열이 상기 결합을 향해 배향되도록 쌍을 이룬다. 따라서, 일부 경우에, 링커는 제 1 분절의 C 말단과 제 2 분절의 N 말단 사이(또는 그 반대)의 거리를 포괄할 수 있는 충분한 길이를 가지나 표적 리간드와 scTCR의 결합을 차단하거나 감소시킬 정도로 너무 길지 않다. 일부 구현예에서, 링커는 (약) 10 내지 45개의 아미노산, 예컨대 10 내지 30개의 아미노산 또는 26 내지 41개의 아미노산 잔기, 예를 들어, 29, 30, 31 또는 32개의 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 화학식 -PGGG-(SGGGG) 5-P-를 갖고 여기서 P는 프롤린이고, G는 글리신이고 S는 세린이다(서열번호 22). 일부 구현예에서, 링커는 서열 GSADDAKKDAAKKDGKS(서열번호 23)를 갖는다.
일부 구현예에서, scTCR은 β 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기에 α 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기를 연결하는 공유 이황화물 결합을 함유한다. 일부 구현예에서, 천연 TCR에서 사슬 간 이황화물 결합은 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인이 scTCR 폴리펩티드의 제 1 및 제 2 분절의 불변 영역 세포외 서열로 편입될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비천연 이황화물 결합이 모두 바람직할 수 있다.
일부 구현예에서, 암호화된 TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 표적 항원에 대해 (약) 10-5 내지 10-12 M 및 그 안의 모든 개별 수치 및 범위의 평형 결합 상수(KD)를 갖는 친화도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 MHC-펩티드 복합체 또는 리간드이다.
C. 유전자 조작을 위한 세포 및 세포의 준비
일부 구현에에서 조작된 세포, 예를 들어, 유전자 조작된 또는 변형된 세포, 및 세포를 조작하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 서열의 핵산 서열을 함유하는 주형 폴리뉴클레오티드 및/또는 부가적인 분자(들)은 예를 들어, 본원에서 기술된 조작 방법에 따른 조작을 위한 세포가 그 속으로 도입된다. 일부 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드 및/또는 그의 일부에서 전이 유전자(외인성 또는 이종성 핵산 서열)은 이종성이며, 즉 예를 들어, 조작되는 세포 및/또는 그러한 세포가 유도된 유기체에서 통상적으로 발견되지 않는 것 같은 다른 생물 또는 세포로부터 얻은 것과 같은 세포 또는 세포로부터 수득된 샘플에 통상적으로 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 여러 상이한 세포 유형으로부터의 다양한 도메인을 암호화하는 핵산의 키메라 조합물을 포함하여 자연계에서 발견되지 않거나 또는 자연계에서 발견된 핵산 서열로부터 변형된 핵산 서열과 같이 자연 발생적 핵산 서열은 아니다.
세포는 일반적으로 포유류 세포와 같은 진핵 세포이고, 전형적으로 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 혈액, 골수, 림프 또는 림프 기관으로부터 유래되며, 타고난 면역 또는 적응 면역의 세포, 예를 들어, 림프구를 비롯한 골수 또는 림프 세포, 전형적으로 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함한다. 다른 예시적인 세포는 유도된 만능 줄기 세포(pluripotent stem cell; iPSC)를 포함하여 다능성 및 만능 줄기 세포와 같은 줄기 세포를 포함한다. 세포는 전형적으로 대상으로부터 직접 분리된 및/또는 대상으로부터 분리되고 동결된 것과 같은 일차세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포의 하나 이상의 서브 세트 또는 전체 T 세포 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 이들의 모집단과 같은 다른 세포 유형, 예를 들어, 기능, 활성화 상태, 성숙도, 항원 특이성, 항원 수용체의 유형, 특정 기관 또는 구획에서의 존재, 마커 또는 사이토카인 분비 프로파일 및/또는 분화 정도에 의존적일 수 있다. 치료될 대상과 관련하여, 세포는 동종 및/또는 자기 조직일 수 있다. 방법 중에는 상용 방법이 포함된다. 상용 기술과 같은 일부 측면에서, 세포는 만능성 및/또는 다능성, 예를 들어, iPSC와 같은 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체로부터 세포를 분리하고, 이들을 제조, 가공, 배양하고/하거나 조작하고 동결 보존 전후에 동일 대상으로 도입하는 것을 포함한다.
T 세포 및/또 CD4+ 및/또는CD8+ T 세포의 서브 타입 및 하위집단 중에서, 천연 T(TN) 세포, 이펙터 T 세포(TEFF), 기억 T 세포 및 그의 서브-타입, 예를 들어, 줄기 세포 기억 T(TSCM), 센트럴 기억 T(TCM), 이펙터 기억 T(TEM), 또는 말단분화 이펙터 기억(terminally differentiated effector memory) T 세포, 종양-침윤 림프구(tumor-infiltrating lymphocytes; TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼(helper) T 세포, 세포독성 T 세포, 점막 관련 불변 T(mucosa-associated invariant T; TMAIT) 세포, 자연적으로 발생하는 및 적응 조절 T(adaptive regulatory Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예를 들어, TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 폴리큘러 헬퍼(follicular helper) T 세포, 알파/베타 T 세포, 및 델타/감마 T 세포가 있다.
일부 구현예에서, 세포는 천연 킬러 세포(NK cell)이다. 일부 구현예에서, 세포는 단핵 세포 또는 과립구, 예를 들어, 골수 세포, 대 식세포, 호중구, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구 및/또는 호염기구이다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작을 통해 도입된 하나 이상의 핵산을 포함하고, 이에 의해 그러한 핵산의 재조합 또는 유전자 조작된 생성물을 발현한다. 일부 구현예에서, 핵산은 이종성이며, 즉 예를 들어, 조작되는 세포 및/또는 그러한 세포가 유도된 유기체에서 통상적으로 발견되지 않는 세포는 다른 유기체 또는 세포로부터 얻어진 것과 같이 세포 또는 세포로부터 수득된 샘플에 통상적으로 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산은 여러 상이한 세포 유형으로부터 다양한 도메인을 암호화하는 핵산의 키메라 조합물을 포함하여 자연계에서 발견되지 않는 핵산과 같이 자연 발생적 핵산은 아니다.
일부 구현예에서, 조작된 세포의 제조는 하나 이상의 배양 및/또는 제조단계를 포함한다. CAR과 같은 형질전환 수용체를 암호화하는 핵산 도입용 세포는 생물학적 샘플, 예를 들어, 대상으로부터 수득되거나 이로부터 유도된 샘플과 같은 샘플로부터 분리 될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포가 분리된 대상은 질환 또는 증상를 가지거나 세포 치료가 필요하거나 세포 치료가 투여될 대상이다. 일부 구현예에서 환자는 세포가 분리, 가공 및/또는 조작되는 적용 세포 치료와 같은 특정 치료적 개입이 필요한 인간이다.
따라서, 한 구현예에서 세포는 1차 세포, 예를 들어, 1차 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 T 세포이다. 샘플에는 분리, 원심 분리, 유전자 조작(예를 들어, 바이러스 벡터를 이용한 형질도입), 세척 및/또는 배양과 같은 하나 이상의 처리 단계에서 생성되는 샘플뿐만 아니라 조직에서 추출한 조직, 유체 및 기타 샘플이 포함된다. 생물학적 샘플은 생물학적 소스 또는 처리된 샘플에서 직접 얻은 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플로는 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀, 조직 및 기관 샘플(이로부터 유도된 가공 샘플 포함)과 같은 체액이 있으나 이에 국한되지 않는다.
한 측면에서, 세포가 유래되거나 분리되는 샘플은 혈액 또는 혈액 유래 샘플이고, 또는 성분 채집술 또는 백혈구 추출물에서 유도된 것이다. 예시적인 샘플은 전혈, 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프 조직, 비장, 기타 림프 조직, 간, 폐, 전립선, 자궁 경부, 고환, 난소, 편도선 또는 다른 기관에서 유도된 세포, 및/또는 이로부터 유도된 세포를 포함한다. 샘플은 세포 치료와 관련하여, 예를 들어, 적용 세포 치료, 자기 및 동종 원천으로부터의 샘플을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 세포주, 예를 들어, T 세포주에서 유래한다. 일부 구현예에서 세포는 이종의 소스, 예를 들어, 마우스, 래트, 비인간 영장류 및 돼지로부터 수득된다.
일부 구현예에서, 세포의 분리는 하나 이상의 제조 및/또는 비친화도에 기초한 세포 분리 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포를 세척, 원심 분리 및/또는 하나 이상의 시약의 존재하에, 예를 들어, 원하지 않는 성분을 제거하고, 원하는 성분을 농축시키고, 특정 시약에 민감한 세포를 용해 시키거나 제거하기 위해 배양한다. 일뷰 구체예에서, 세포는 밀도, 부착 성질, 크기, 민감성 및/또는 특정 성분에 대한 내성과 같은 하나 이상의 특성에 기초하여 분리된다.
일부 구체예에서, 환자의 순환 혈액으로부터의 세포는 예를 들어, 성분 채집술 또는 백혈구 제거에 의해 얻어진다. 샘플에는 T 세포, 단핵 세포, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 비롯한 일부 림프구가 포함되어 있으며 일부 측면에서는 적혈구 및 혈소판 이외의 세포가 포함되어 있다.
일부 구현예에서, 환자로부터 수집된 혈액 세포를 세척하여 예를 들어, 혈장 분획을 제거하고 후속 공정 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 세포를 위치시킨다. 일부 구현예에서, 세포는 인산 환충 식염수(PBS)로 세척한다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 다수 또는 모든 2가 양이온이 부족하다. 일부 측면에서 세척 단계는 반자동 "플로우 스루(flow-through)" 원심 분리기(예를 들어, the Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter)를 제조사의 지침에 따라 수행한다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조사의 지시에 따라 접선 유동 여과(TFF)에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 세포는 세척 후 다양한 생체 적합성 완충액, 예를 들어, Ca++/Mg++ 부재 PBS에 재현탁된다. 특정 구현예에서, 혈액 세포 샘플의 성분을 제거하고 세포를 배양 배지에 직접 재현탁한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 적혈구를 용해시켜 퍼콜(Percoll) 또는 피콜(Ficoll) 구배를 통해 원심 분리하여 말초 혈액으로부터 백혈구를 제조하는 것과 같은 밀도-기반 세포 분리방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 분리 방법은 표면 마커, 예를 들어, 표면 단백질, 세포내 마커 또는 핵산과 같은 하나 이상의 특정 분자의 세포에서의 발현 또는 존재에 기초한 상이한 세포 유형의 분리를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 마커에 기초한 임의의 공지된 분리 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 분리는 친화도 또는 면역 친화도-기재분리이다. 예를 들어, 일부 측면에서 분리는 세포의 예를 들어, 그러한 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와의 배양에 의해, 전형적으로 세포 표면 마커의 세포 발현 또는 발현 수준에 기초한 세포 및 세포 집단의 분리를 포함하며, 일반적으로 세척 단계 및 항체 또는 결합 파트너에 결합한 세포를 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포로부터 분리하는 단계를 포함한다.
이러한 분리 단계는 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포가 보유되는 시약에 결합된 세포가 추가 사용을 위해 보유된 양성 선택 및/또는 음성 선택에 기초할 수 있다. 한 구체예에서, 두 분획은 추후 사용을 위해 보유된다. 일부 측면에서, 음성 선택은 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 식별하는 항체가 이용 가능하지 않은 경우에 특히 유용할 수 있어, 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발견된 마커에 기초하여 분리가 가장 잘 수행된다.
분리는 특정 세포 집단 또는 특정 마커를 발현하는 세포의 100% 농축 또는 제거를 수반할 필요는 없다. 예를 들어, 마커를 발현하는 세포와 같은 특정 유형의 세포에 대한 양성 또는 농축은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 말하지만, 마커를 발현하지 않는 세포가 완전히 없게 할 필요는 없다. 마찬가지로, 마커를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포의 음성 선택, 제거 또는 고갈은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 의미하지만 그러한 모든 세포를 완전히 제거할 필요는 없다.
일부 구체예에서, 한 번의 단계로부터 양 또는 음으로 선택된 분획이 후속적인 양성 또는 음성의 선택과 같은 다른 분리 단계를 거치는 다중 단계의 분리 단계가 수행된다. 일부 구체예에서, 단일 분리 단계는 복수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 세포를 항온 처리함으로써, 복수의 마커를 동시에 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있으며, 각각은 음성 선택을 목표로 하는 마커에 특이적이다. 마찬가지로, 여러 세포 유형은 다양한 세포 유형에서 발현되는 복수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 세포를 배양함으로써 동시에 양성으로 선택될 수 있다.
예를 들어, 일부 측면에서, 양성이거나 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ T 세포의 높은 수준을 발현하는 세포와 같은 T 세포의 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 분리된다.
예를 들어, CD3+, CD28+ T 세포는 항-CD3/항-CD28 접합된 자기 비드(conjugated magnetic bead)(예를 들어, DYNABEADS®M-450 CD3/CD28 T 세포 증폭기)를 사용하여 적극적으로 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 분리는 음성 선택에 의한 양성 선택 또는 특정 세포군의 고갈에 의해 특정 세포 집단에 대한 농축에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 양성 또는 음성 선택는 양성 또는 음성으로 선택된 세포 상에 상대적으로 높은 수준(마커 하이(high))으로 발현되거나 발현되는 하나 이상의 표면 마커(마커+)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 다른 결합제와 세포를 인큐베이션시킴으로써 달성된다.
일부 구현예에서, T 세포는 B 세포, 단구 또는 CD14와 같은 다른 백혈구와 같은 비 T 세포에서 발현된 마커의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 측면에서, CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계는 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포 독성 T 세포를 분리하는데 사용된다. 이러한 CD4+ 및 CD8+ 모집단은 하나 이상의 순진, 기억 및/또는 이펙터 T 세포 하위집단에서 상대적으로 높은 정도로 발현되거나 표현된 마커에 대한 양성 또는 음성 선택에 의해 하위집단으로 추가 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, CD8+ 세포는 각각의 부분 집단과 관련된 표면 항원에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해서, 네이비(naive), 센트럴 기억, 이펙터 기억(effector memory) 및/또는 센트럴 기억 줄기 세포(central memory stem cell)를 추가로 농축하거나 고갈시킨다. 일부 구현예에서, 센트럴 기억 T(TCM) 세포에 대한 농축은 증폭 및/또는 생체내 투여를 개선하는 것과 같은 효능을 증가시키기 위해 수행되며, 일부 측면에서는 특히 이러한 하위집단에서 강건하다[문헌 「Terakura 등, (2012) Blood,1:72-82; Wang 등, (2012) J Immunother . 35(9):689-701」 참조]. 일부 구현예에서, TCM-농축 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포를 결합시키는 것은 효능을 추가로 강화시킨다.
일부 구현예에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 서브 세트에 모두 존재한다. PBMC는 항-CD8 및 항-CD62L 항체를 사용하는 것과 같은, CD62L-CD8+ 및/또는 CD62L+CD8+ 분획을 농축하거나 고갈시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 센트럴 기억(central memory) T(TCM) 세포에 대한 농축은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, 및/또는 CD127의 양성 또는 고표면 발현에 기초하며; 일부 측면에서 그것은 CD45RA 및/또는 그랜자임 B(granzyme B)를 발현하거나 고도로 발현하는 세포에 대한 음성 선택에 기초한다. 일부 구현예에서, TCM 세포에 대해 농축된 CD8+ 집단의 분리는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈 및 CD62L을 발현하는 세포에 대한 양성 선택 또는 농축에 의해 수행된다. 일부 측면에서, 센트럴 기억 T(TCM) 세포에 대한 농축은 CD14 및 CD45RA의 발현에 기초한 음성 선택 및 CD62L에 기초한 양성 선택을 실시한 CD4 발현에 기초하여 선택된 세포의 음성 분획으로 시작하여 수행한다. 일부 측면에서, 이러한 선택은 동시에 수행되고 다른 양상에서는 어느 순서로 순차적으로 수행된다. 일부 구현예에서, CD8+ 세포 집단 또는 부분 집단을 제조하는데 사용된 동일한 CD4 발현-기반 선택 단계는 또한 CD4+ 세포 집단 또는 하위집단을 생성하는데 사용되어 CD4-기반 분리로부터의 양성 및 음성 분획을 둘 다 유지시켜서 상기 방법의 후속 단계에서 사용한 후, 선택적으로 하나 이상의 추가의 양성 또는 음성 선택 단계를 수행한다.
CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 가진 세포 집단을 확인함으로써 네이비하고 센트럴 기억 및 효과 세포로 분류된다. CD4+ 림프구는 표준 방법으로 얻을 수 있다. 일부 구현예에서, 천연의 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 센트럴 기억 CD4+ 세포는 CD62L+ 및 CD45RO+이다. 일부 구현예에서, 이펙터 CD4+ 세포는 CD62L- 및 CD45RO-이다.
한 구체예에서, 음성 선택에 의한 CD4+ 세포를 농축하기 위해, 단클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 양성 및/또는 음성 선택을 위한 세포의 분리를 허용하기 위해 자기 비드 또는 상자기 비드와 같은 고체 지지체 또는 매트릭스에 결합된다. 선택적으로 일부 구현예에서, 세포 및 세포 집단은 면역 자기(또는 친화력 자기) 분리 기술을 사용하여 분리 또는 분리된다[문헌 「Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher ⓒ Humana Press Inc., Totowa, NJ」에서 검토됨].
일부 측면에서, 분리될 세포의 샘플 또는 조성물은 상자기 비드(예를 들어, Dynalbeads 또는 MACS 비드)와 같은 자기적으로 반응하는 입자 또는 미세 입자와 같은 작고 자화 가능한 또는 자기적으로 반응하는 물질로 배양된다. 자기 반응 물질, 예를 들어, 입자는 세포, 세포 또는 분리하고자하는 세포 집단 상에 존재하는 분자, 예를 들어, 표면 마커에, 예를 들어, 음성 또는 양성으로 선발하는 것이 바람직하다는 것을 의미, 특이적으로 결합하는 항체와 같은 결합 파트너에 직접 또는 간접적으로 부착된다.
일부 구현예에서, 자성 입자 또는 비드는 항체 또는 다른 결합 파트너와 같은 특정 결합 부재에 결합된 자기 반응 물질을 포함한다. 자기 분리법에 많이 사용되는 자기 반응 재료가 있다. 적합한 자성 입자는 몰데이(Molday)의 미국특허 제4,452,773호 및 유럽특허 제452342 B호에 개시되어 있으며, 이는 본원에 참고로 인용된다. 오웬(Owen)의 미국특허 제4,795,698호 및 리버티(Liberti) 등의 미국특허 제5,200,084호에 기재된 것과 같은 콜로이드 상 입자는 다른 예이다.
일반적으로 배양은 샘플 내의 세포에 존재하는 경우, 자성 입자 또는 비드에 결합된 항체 또는 결합 파트너 또는 이 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 이차 항체 또는 다른 시약과 같은 분자가 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 조건 하에서 수행된다.
일부 측면에서, 샘플은 자기장에 놓이며, 자기적으로 반응하는 또는 자화 가능한 입자가 부착된 세포는 자석에 끌려가서 표지가 없는(unlabeled) 세포로부터 분리될 것이다. 긍정적인 선택의 경우, 자석에 끌리는 세포는 유지된다; 음성 선택의 경우 끌리지 않는 세포(표지가 없는 세포)은 유지된다. 일부 구현예에서, 양성 및 음성 선택의 조합은 양성 및 음성 분획이 보유되고 추가 처리되거나 추가 분리 단계에 종속되는 동일한 선택 단계에서 수행된다.
특정 구현예에서, 자기적 응답 입자는 1 차 항체 또는 다른 결합 파트너, 2차 항체, 렉틴, 효소 또는 스트렙타비딘에 코팅된다. 특정 구현예에서, 자성 입자는 하나 이상의 마커에 특이적인 1차 항체의 코팅을 통해 세포에 부착된다. 일부 구현예에서, 비드보다는 세포가 1차 항체 또는 결합 파트너로 표지되고, 이어서 세포-유형 특이적인 2차 항체 또는 다른 결합 파트너(예를 들어, 스트렙타빈)-코팅 자성 입자가 첨가된다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘-코팅 자성 입자는 바이오티닐화된 1차 또는 2차 항체와 함께 사용된다.
일부 구현예에서, 자기적으로 반응하는 입자는 후속 배양, 배양 및/또는 조작되는 세포에 부착된 채로 남게 된다; 일부 구현예에서 입자는 환자에게 투여하기 위해 세포에 부착된 채로 남는다. 일부 구현예에서, 자화가능하거나 또는 자기적으로 반응하는 입자는 세포로부터 제거된다. 세포로부터 자화 가능한 입자를 제거하는 방법은 공지되어 있으며, 예를 들어, 경쟁하는 비 표지된 항쳉 및 자화 가능한 입자 또는 절단 가능한 리어에 접합된 항체를 포함된다. 일부 구현예에서, 자화 가능한 입자는 생분해성이다.
일부 구현예에서, 친화도-기재 선택은 자기-활성화 세포 분류(MACS)(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 통해 이루어진다. 자기화성화 세포 분류(MACS) 시스템은 자화된 입자가 부착되 세포를 고순도로 선택할 수 있다. 일부 구현예에서, MACS는 비 표적종 및 표적종을 외부 자기장의 적용 후에 순차적으로 용출시키는 모드로 작동한다. 즉 자화된 입자에 부착된 세포는 부착되지 않은 화학종이 용리되는 동안 제 위치에 유지된다. 이어서, 이 첫 번째 용출 단계가 완료된 후, 자기장에 포획되어 용출되는 것을 방지한 종을 용리 및 회수할 수 있는 방법으로 자유롭게 한다. 일부 구현예에서, 비 표적 세포는 표적화되고 세포의 이종 집단으로부터 고갈된다.
일부 구현예에서, 추출 또는 분리는 세포 준비, 분리, 처리, 항온 배양, 배양 및/또는 방법의 제형 단계 중 하나 이상을 수행하는 시스템, 장치 또는 장치를 사용하여 수행된다. 일부 측면에서, 시스템은 폐쇄, 무균 환경, 예를 들어, 에러, 사용자 취급 및/또는 오염을 최소화하기 위해 이들 단계 각각을 수행하는데 사용된다. 한 구체예에서, 시스템은 국제공개공보 제WO2009/072003호 또는 미국특허출원공개공보 제20110003380호에 기재된 것과 같은 시스템이다.
일부 구현예에서, 시스템 또는 장치는 자동화된 또는 프로그래밍 가능한 방식으로, 하나 이상의, 예를 들어, 모든 분리, 처리, 엔지니어링 및 제형 단계를 수행한다. 일부 측면에서, 시스템 또는 장치는 사용자가 처리, 격리, 조작 및 제형 단계의 결과를 프로그램, 제어, 평가 및/또는 조정할 수 있게 하는 시스템 및/또는 장치와 통신하는 컴퓨터 및/또는 컴퓨터 프로그램을 포함한다.
일부 측면에서, 분리 및/또는 다른 단계는 ClinMACS 시스템(Miltenyi Biotec)을 사용하여, 예를 들어, 밀폐된 및 멸균 시스템에서 임상 규모의 세포의 자동화된 분리를 위해 수행된다. 구성 요소로는 통합 마이크로컴퓨터, 자기 분리 장치, 연동 펌프 및 다양한 핀치 밸브가 포함될 수 있다. 일부 측면에서 통합 컴퓨터는 계측기의 모든 구성요소를 제어하고 표준화된 순서로 반복적인 절차를 수행하도록 시스템에서 지시한다. 일부 측면에서 자기 분리 유닛은 이동 가능한 영구 자석 및 선택 칼럼용 홀더를 포함한다. 연동 펌프는 배관 세트 전체의 유속을 제어하며 핀치 밸브와 함께 시스템을 통한 완충액의 제어된 흐름과 세포의 지속적인 정지를 보장한다.
CliniMACS 시스템은 일부 측면에서 멸균 비 발열성 용액으로 공급되는 항체 결합 자성 입자를 사용한다. 일부 구현예에서, 자성 입자로 세포를 표지한 후, 세포를 세척하여 과량의 입자를 제거한다. 이어서 세포 준비 백을 튜빙 세트에 연결하고, 버퍼 세트 및 세포수집 백을 연결한다. 튜빙 세트는 프리-칼럼과 분리 칼럼을 포함하여 미리 조립된 무균 튜빙으로 구성되어 있으며 일회용으로만 사용된다. 분리 프로그램을 시작한 후, 상기 시스템은 세포 샘플을 자동으로 분리 칼럼에 적용한다. 표지된 세포는 칼럼 내에 보유되는 반면, 표지되지 않는 세포는 일련의 세척 단계에 의해 제거된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 지답은 표지되지 않고 칼럼에 보유되지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 표지되고 칼럼에 보유된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 자기장의 제거 후 칼럼으로부터 용리되어 세포수집 백 내에 수집된다.
특정 구현예에서, 분리 및/또는 다른 단계는 CliniMACS Prodigy 시스템(Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행된다. 상기 CliniMACS Prodigy 시스템은 원심 분리에 의한 세포의 자동화된 세척 및 분별을 가능하게 하는 세포 처리 단일체를 갖추고 있다. 상기 CliniMACS Prodigy 시스템에는 소스 세포 생성물의 거시적 층(macroscopic layer)을 식별하여 최적의 세포 분획 종말점을 결정하는 온보드 카메라 및 이미지 인식 소프트웨어가 포함될 수 있다. 예를 들어, 말초 혈액은 적혈구, 백혈구 및 혈장 층으로 자동 분리된다. 상기 CliniMACS Prodigy 시스템은 또한 세포 분화 및 증폭, 항원 로딩 및 장기 세포 배양과 같은 세포 배양 프로토콜을 수행하는 일체형 세포 배양 챔버를 포함할 수 있다. 입력 포트는 멸균 제거 및 매체의 보충을 허용할 수 있으며, 통합 현미경을 사용하여 세포를 모니터할 수 있다[문헌 예를 들어, 「Klebanoff 등, (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura 등, (2012) Blood.1:72-82, and Wang 등, (2012) J Immunother. 35(9):689-701」 참조].
일부 구현예에서, 본원에 기술된 세포 집단은 유세포 측정법을 통해 수집 및 농축(또는 고갈)되며, 여기서 다수의 세포 표면 마커로 염색된 세포는 유체 스트림으로 운반된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 세포 집단은 예비 스케일(FACS)-분류를 통해 수집 및 농축(또는 고갈)된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 세포 집단은 FACS-기반 검출 시스템과 조합된 마이크로 전자 기계 시스템(MEMS) 칩의 사용에 의해 수집 및 농축(또는 고갈)된다[예를 들어, 국제공개공보 제WO2010/033140호, 문헌 「Cho 등, (2010) Lab Chip 10, 1567-1573」; 및 「Godin 등, (2008) J Biophoton. 1(5):355-376」 참조]. 두 경우 모두 세포를 여러 마커로 분류하여 잘 정의된 T 세포 하위 세트를 고순도로 분리 할 수 있다.
일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 하나 이상의 검출 가능한 카로 표지되어 양성 및/또는 음성 선택을 위한 분리를 용이하게 한다. 예를 들어, 분리는 형광 표지된 항체와의 결합에 기초할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 세포 표면 마커에 특이적 항체 또는 다른 결합 파트너의 결합에 기초한 세포의 분리는 형광-활성 세포 분류(FACS)을 포함하는 분취용(FACS) 및/또는 미세 전자 기계 시스템(MEMS) 칩, 예를 들어, 유세포 측정 탐지 시스템과 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 방법은 동시에 여러 마커를 기반으로 긍정적이고 부정적인 선택을 허용한다.
일부 구현예에서, 제조 방법은 분리, 항온 처리 및/또는 조작 전 또는 후에 세포를 동결, 예를 들어, 냉동 보존하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 및 후속 행동 단계는 과립구 및 어는 정도는 세포 집단 내의 단핵구를 제거한다. 일부 구현예에서, 세포는 예를 들어, 혈장 및 혈소판을 제거하기 위한 세척 단계 후에 냉동 용액에 현탁된다. 임의의 다양한 공지된 동결 용액 및 파라미터가 사용될 수 있다. 일예로 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 다른 적합한 세포 동결 배지를 함유하는 PBS를 사용하는 것을 포함한다. 그런 다음 DMSO와 HSA의 최종 농도가 각각 10%와 4%가 되도록 배지로 1 : 1로 희석한다. 이어서, 세포를 일반적으로 분당 1℃의 속도로 -80℃로 동결시키고 액체 질소 저장 탱크의 증기 상에 저장한다.
일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작 전에 또는 유전자 조작과 관련하여 배양 및/또는 배양된다. 배양 단계는 배양(culture), 배양(cultivation), 자극, 활성화 및/또는 증식을 포함 할 수 있다. 배양 및/또는 조작은 배양 용기 또는 세포 배양을 위한 유닛, 챔버, 웰, 칼럼, 튜브, 튜빙 세트, 밸브, 바이알, 배양 접시, 백 또는 기타 용기와 같은 배양 용기에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물 또는 세포는 자극 조건 또는 자극제의 존재하에 배양된다. 그러한 조건은 집단 내에서 세포의 증식, 증폭, 활성화 및/또는 생존을 유도하고, 항원 노출을 모방하고, 및/또는 재조합 항원 수용체의 도입과 같은 유전자 조작을 위해 세포를 준비하는 것을 포함한다.
조건은 하나 이상의 특정 매질, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 영양제, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예를 들어, 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 용해성 수용체, 및 세포를 활성화 시키도록 고안된 임의의 다른 제제를 포함한다.
일부 구현예에서, 자극 조건 또는 제제는 TCR 복합체의 세포내 신호 전달 영역을 자극 또는 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 약제, 예를 들어, 리간드를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 약제는 T 세포에서 TCR/CD3 세포내 신호 전달 계통을 작동시키거나 개시시킨다. 이러한 제제는 항체, 예를 들어, TCR에 특이적인 항체, 예를 들어, 항-CD3을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 자극 조건은 하나 이상의 제제, 예를 들어, 공자극 수용체를 자극할 수 있는 리간드, 예를 들어, 항-CD28을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제제 및/또는 리간드는 고형 지지체 예를 들어, 비드, 및/또는 하나 이상의 사이토카인에 결합될 수 있다. 선택적으로 상기 증폭 방법은 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 배양 배지에 (예를 들어, 적어도 약 0.5ng/mL 농도로) 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극제는 IL-2, IL-15 및/또는 IL-7을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 IL-2 농도는 적어도 약 10 유닛/mL이다.
일부 측면에서, 배양은 미국특허 제6,040,177호, 문헌 [Klebanoff 등, (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura 등, (2012) Blood.1:72-82, and/or Wang 등, (2012) J Immunother. 35(9):689-701]에 기재된 기법에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 T 세포는 비분할 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 같은 배양-개시 조성물(culture-initiating composition)에 피더 세포(feeder cell)를 (예를 들어, 결과적인 세포 집단이 확대될 초기 집단에서 각 T 림프구에 대해 적어도 약 5, 10, 20 또는 40 이상의 PBMC 피더 세포를 포함하도록) 첨가하고; 상기 배양물을 (예를 들어, T 세포의 수를 증폭시키기에 충분한 시간동안) 배양함으로써 확대시킨다. 일부 측면에서는, 비분할 피더 세포는 감마-조사 PBMC 피더 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, PBMC는 세포 분열을 방지하기 위해 약 3000 내지 3600 rad 범위의 감마선으로 조사된다. 일부 측면에서, 피더 세포는 T 세포 집단을 첨가하기 전에 배양 배지에 첨가된다.
일부 측면에서, 자극 조건은 인간 T 림프구의 성장에 적합한 온도, 선택적으로 적어도 약 25℃, 일반적으로는 약 30℃, 일반적으로는 약 37℃의 온도를 포함한다. 선택적으로, 배양은 피더 세포로서 비분할 EBV-형질전환 림프구 세포(LCL)를 첨가하는 것을 더 포함 할 수 있다. LCL은 약 6000 내지 10,000 rad의 범위의 감마선으로 조사될 수 있다. 일부 측면에서, LCL 피더 세포는 적당한 양으로, 예를 들어, 약 10:1의 LCL 피더 세포 대 초기 T 림프구 비율의 양으로 제공된다.
일부 구현예에서, 항원-특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포와 같은 항원 특이적 T 세포는 항원으로 순수 또는 항원 특이적 T 림프구를 자극함으로써 수득된다. 예를 들어, 항원 특이적 T 세포주 또는 클론은 감염된 대상체로부터 T 세포를 분리하고 시험관내에서 동일한 항원으로 세포를 자극함으로써 사이토메갈로바이러스 항원(cytomegalovirus antigen)에 생성될 수 있다.
유전자 조작 성분, 예를 들어, 유전자 파괴를 유도하는 제제 및/또는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR 또는 TCR을 암호화하는 핵산의 도입을 위한 다양한 방법이 공지되어 있고 제공된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예시적인 방법에는 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스, 비바이러스 벡터 또는 트랜스포손, 예를 들어, 슬리핑 뷰티 (Sleeping Beauty) 트랜스포손 시스템을 통한 것을 포함하여 폴리펩티드 또는 수용체를 암호화하는 핵산의 전달을 위한 방법이 포함된다. 유전자 전달 방법에는 형질 도입, 전기천공 또는 세포로 유전자 전달을 초래하는 기타 방법 또는 본원의 섹션 II.A.3 또는 II.B.3에 기재된 임의의 전달 방법이 포함될 수 있다. 재조합 생성물을 암호화하는 핵산 전달을 위한 기타 접근법 및 벡터에는 예를 들어, 문헌 [국제공개공보 제WO2014/055668호 및 미국특허 제7,446,190호]에 기재된 것이 있다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전기천공을 통해 T 세포로 전달된다(예를 들어, 문헌 [Chicaybam 등, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 및 Van Tedeloo 등, (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437] 참조). 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전위를 통해 T 세포로 전달된다(예를 들어, 문헌 [Manuri 등, (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma 등, (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; 및 Huang 등, (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126] 참조). 면역 세포에서 유전 물질을 도입하고 발현시키는 다른 방법은 인산칼슘 형질 감염(예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.에 기재된 바와 같음), 원형질체 융합, 양이온성 리포좀-매개 형질 감염; 텅스텐 입자 촉진 미세 입자 충격(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); 및 스트론튬 포스페이트 DNA 공침전(Brash 등, Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))을 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 전달은 예를 들어, 활성화된 세포의 형질 도입 및 임상 적용에 충분한 수로 배양에서의 증폭 후에 사이토카인 또는 활성화 마커의 발현에 의해 측정된 바와 같이, 세포를 먼저 자극함으로써, 예컨대 증식, 생존 및/또는 활성화와 같은 반응을 유도하는 자극과 조합하여 달성된다.
일부 상황에서, 자극 인자(예를 들어, 림포카인 또는 사이토카인)의 과발현이 대상체에서 독성과 관련된 인자와 같은 대상체에서 원하지 않는 결과 또는 보다 낮은 효능을 잠재적으로 초래할 수 있는 가능성으로부터 보호하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 일부 상황에서, 조작된 세포는 예컨대 입양 면역 요법에 투여 시 생체 내에서 세포를 음성 선택에 취약하게 하는 유전자 분절을 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 세포는 이들이 투여되는 환자의 생체 내 조건의 변화의 결과로서 제거될 수 있도록 조작된다. 음성 선택 가능한 표현형은 투여된 제제, 예를 들어, 화합물에 대한 감수성을 부여하는 유전자의 삽입으로부터 초래될 수 있다. 음성 선택 가능한 유전자는 간시클로비르(ganciclovir) 감수성을 부여하는 헤르페스 심플렉스 바이러스 유형 I 티미딘 키나제(HSV-I TK) 유전자(Wigler 등, Cell 11:223, 1977); 세포성 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(hypoxanthine phosphribosyltransferase, HPRT) 유전자, 세포성 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(adenine phosphoribosyltransferase, APRT) 유전자, 세균성 시토신 디아미나제(Mullen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992))를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, T 세포는 증폭 중 또는 후에 조작될 수 있다. 원하는 폴리펩티드 또는 수용체의 유전자 도입을 위한 상기 조작은 예를 들어, 임의의 적합한 레트로바이러스 벡터로 수행될 수 있다. 이어서 유전자 변경 세포 집단은 초기 자극(예를 들어, CD3/CD28 자극)으로부터 자유로울 수 있으며, 후속적으로 제 2 유형의 자극(예를 들어, 새로이 도입된 수용체를 통해)으로 자극될 수 있다. 상기 제 2 유형의 자극은 새로운 수용체의 프레임워크 내에서 직접 결합하는(예를 들어, 수용체 내의 불변 영역을 인지함으로써) 유전자 도입된 수용체의 펩티드/MHC 분자, 즉 동종(교차 결합) 리간드(예를 들어, CAR의 천연 리간드) 또는 임의의 리간드(예컨대 항체) 형태의 항원 자극을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Cheadle 등, "Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy" Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 또는 Barrett 등, Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014)]을 참조한다.
추가 핵산 중에서, 예를 들어, 도입을 위한 유전자는 전달된 세포의 생존력 및/또는 기능을 촉진함으로써와 같은 치료의 효능을 개선하기 위한 유전자; 생체 내에서 생존 또는 국소화를 평가하기 위한 것과 같이 세포의 평가 및/또는 선택을 위한 유전자 마커를 제공하기 위한 유전자; 문헌 [Lupton S. D. 등, Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); 및 Riddell 등, Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)]에 기재된 바와 같이 예를 들어, 생체 내에서 음성 선택에 세포를 예민하게 만들어 안정성을 개선하기 위한 유전자가 있고; 또한 우성 양성 선택 가능한 마커를 음성 선택 가능한 마커와 융합시켜 유래된 2작용성 선택 가능 융합 유전자의 용도를 기술하는 문헌 [국제 출원 공보 PCT/US91/08442 및 PCT/US94/05601 by Lupton 등,]을 참조한다. 예를 들어, 문헌 [Riddell 등, 미국특허 6,040,177의 14-17 열]을 참조한다.
일부 구현예에서, 여기에 기재된 바와 같이, 세포는 유전자 조작과 관련하여 또는 그 전에 인큐베이션 및/또는 배양된다. 인큐베이션 단계는 배양, 사육, 자극, 활성화, 번식 및/또는 보존을 위한 동결, 예를 들어, 동결 보존을 포함할 수 있다.
D. 재조합 수용체를 발현하는 세포의 조성물
또한, 복수의 조작된 세포 또는 집단, 이러한 세포를 함유하고/하거나 이러한 세포에 대해 농축된 조성물이 제공된다. 일부 측면에서, 제공된 조작된 세포 및/또는 조작된 세포의 조성물은 본원에 기재된 방법에 의해 생산된다.
일부 구현예에서, 제공된 세포 집단 및/또는 조작된 세포를 함유하는 조성물은, 전통적인 방법을 사용하여 생성된 조성물 및/또는 세포 집단의 발현 및/또는 항원 결합에 비해, 재조합 수용체에 의한 보다 개선된, 일정한, 균질한 및/또는 안정적인 발현 및/또는 항원 결합을 나타내는, 예를 들어, 변이 계수의 감소를 나타내는 세포 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 집단 및/또는 조성물은, 다른 방법, 예를 들어, 재조합 수용체를 암호화하는 서열의 무작위 통합을 사용하여 생성된 각각의 집단에 비해, 재조합 수용체의 발현 및/또는 재조합 수용체에 의한 항원 결합의 변이 계수가 적어도 100%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 더 작다. 변이 계수는, 각각의 세포 집단 내 각각의 관심 핵산 발현의 평균으로 나누어진, 세포 집단, 예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포내의 관심 핵산(예를 들어, 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자 또는 그의 일부) 발현의 표준 편차로 정의된다. 일부 구현예에서, 세포 집단 및/또는 조성물은, 여기 제공된 방법을 사용하여 조작된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 집단 중에서 측정될 때 0.70, 0.65, 0.60, 0.55, 0.50, 0.45, 0.40, 0.35 또는 0.30 이하보다 작은 변이 계수를 나타낸다.
일부 구현예에서, 제공된 세포 집단 및/또는 조작된 세포를 함유하는 조성물은 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자의 최소 또는 감소된 무작위 통합을 나타내는 세포 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 게놈 내로의 전이 유전자의 무작위 통합은 게놈 내의 원하지 않는 위치, 예를 들어, 필수 유전자 또는 세포의 활성을 조절하는데 중요한 유전자로의 전이 유전자의 통합, 및/또는 수용체의 비조절된 또는 제어되지 않은 발현으로 인한 유해 효과 또는 세포 사멸을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자의 무작위 통합은 다른 방법을 사용하여 생성된 세포 집단과 비교하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 감소된다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체를 발현하는 복수의 조작된 면역 세포를 포함하는 세포 집단 및/또는 조성물이 제공되며, 여기서 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열은 예를 들어, 상동성-지시된 수선(HDR)을 통해 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자의 통합에 의해 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 존재한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 세포의 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 90% 이상 및/또는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 유전자 파괴를 함유하는 조성물 중 세포는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자의 통합을 포함한다.
일부 구현예에서, 제공된 조성물은 재조합 수용체를 발현하는 세포가 조성물 중 총 세포의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상을 구성하는 세포, 예를 들어, T 세포 또는 CD8+ 또는 CD4+ 세포와 같은 특정 유형의 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 제공된 조성물은 재조합 수용체를 발현하는 세포가 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 유전자 파괴를 함유하는 조성물 중 총 세포의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상을 구성하는 세포를 함유한다.
V. 입양 세포 요법에서의 치료 방법 및 용도
예를 들어, 임의의 조작된 세포 또는 여기 기재된 조작된 세포를 함유하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 여기에 제공된다. 일부 측면에서, 임의의 조작된 세포 또는 여기에 기재된 조작된 세포를 함유하는 조성물을 대상체, 예를 들어, 질환 또는 장애가 있는 대상체에 투여하는 방법이 또한 제공된다. 본원에서 기재된, 재조합 수용체, 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR), 또는 이를 포함하는 조성물은 다양한 증상의 치료, 진단 및 예방에 유용하다. 예를 들어, 조작된 세포를 포함하는 조작된 세포 또는 조성물은 대상체에서 다양한 질환 및 장애를 치료하는 데 유용하다. 상기 방법 및 용도는 예를 들어, 조작된 세포 또는 이를 함유하는 조성물을 종양 또는 암과 같은 질환, 병태 또는 장애를 가진 대상체에 투여하는 것을 포함한 치료 방법 및 용도를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 세포 또는 이를 포함하는 조성물은 질환 또는 장애의 치료에 효과적인 양으로 투여된다. 용도는 상기 방법 및 치료에서, 및 상기 치료 방법을 수행하기 위한 약제의 제조에서 조작된 세포 또는 조성물의 용도를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 조작된 세포 또는 이를 포함한 조성물을 질환 또는 병태가 있거나 있는 것으로 의심되는 대상체에게 투여함으로써 수행된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이를 통해 대상체에서 질환 또는 병태 또는 장애를 치료한다. 또한, 세포 및 조성물을 대상체, 예를 들어, 환자에 투여하기 위한 치료 방법이 제공된다.
입양 세포 요법을 위한 세포의 투여 방법은 공지되어 있으며 제공된 방법 및 조성물과 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 입양 T 세포 요법 방법은 예를 들어, 미국특허출원공개공보 제2003/0170238호(Gruenberg 등); 미국특허 제4,690,915호(Rosenberg); 문헌 [Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)]에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Themeli 등, (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara 등, (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila 등, (2013) PLoS ONE 8(4): e61338]을 참조한다.
치료되는 질환 또는 병태는 항원의 발현이 질환 상태 또는 장애의 병인과 관련되고 및/또는 이를 수반하고, 예를 들어, 그러한 질환, 병태, 또는 장애를 일으키거나, 악화시키거나, 그렇지 않으면 수반한다.
예시적인 질환 및 상태는 세포의 악성종양 또는 형질전환(예를 들어, 암), 자가 면역 또는 염증성 질환, 또는 감염성 질환과 연관된 질환 또는 병태를 포함할 수 있고, 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 또는 다른 병원체에 의해 발생한다. 치료될 수 있는 다양한 질환 및 상태와 관련된 항원을 포함하는 예시적인 항원은 본원에서 기술된다. 특정 구현예에서, 키메릭 항원 수용체 또는 형질전환 TCR은 질환 또는 병태와 관련된 항원에 특이적으로 결합한다.
질환 중에, 상태 및 장애는 고형 종양, 혈액 악성 종양 및 흑색종을 포함하는 종양 및 국소 및 전이성 종양을 포함하고, 전이성 종양, 바이러스 또는 다른 병원체, 예를 들어, HIV, HCV, HBV, CMV, HPV, 및 기생충 질환으로 감염된 것과 같은 감염성 질환, 및 자가면역 및 염증성 질환을 포함하는 종양이다. 일부 구현예에서, 질환, 장애 또는 상태는 종양, 암, 악성 종양, 신생물, 또는 다른 증식성 질환 또는 장애이다. 그러한 질환은 백혈병, 림프종, 예를 들어, 급성 골수(또는 골수성) 백혈병(AML), 만성 골수(또는 골수성) 백혈병(CML), 급성 림프구(또는 림프구성) 백혈병(ALL), 만성 림프구 백혈병(CLL), 털세포 백혈병(HCL), 작은 림프구 림프종(SLL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 한계 영역 림프종, 버킷 림프종, 호지킨 림프종(HL), 비-호지킨 림프종(NHL), 퇴행성 거대세포 림프종(ALCL), 여포성 림프종, 불응성 여포성 림프종, 확산성 거대 B- 세포 림프종(DLBCL) 및 다발성 골수종(MM)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 급성 림프모구 백혈병(ALL), 성인 ALL, 만성 림프모구 백혈병(CLL), 비-호지킨 림프종(NHL) 및 확산성 거대 B-세포 림프종(DLBCL) 중으로부터 선택된 B 세포 악성 종양이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 NHL이고, NHL은 공격적인 NHL, 확산성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), NOS(무통으로부터 de novo 및 형질전환된), 1차 종격동 거대 B 세포 림프종(PMBCL), T 세포/조직세포-농축 거대 B 세포 림프종(TCHRBCL), 버킷 림프종, 맨틀 세포 림프종(MCL) 및/또는 여포성 림프종(FL), 선택적으로, 여포성 림프종 3B(FL3B)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 다발성 골수종(MM)이다. 일부 구현예에서, 제공된 세포, 예를 들어, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 갖는 조작된 세포의 투여는 대상체에서 질환 또는 병태, 예를 들어, MM의 치료 및/또는 개선을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 종양-연관된 항원, 예를 들어, B 세포 성숙 항원(BCMA)의 발현과 연관된 MM을 갖거나 갖는 것으로 의심된다.
일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. 일부 구현예에서, 제공된 세포, 예를 들어, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 갖는 조작된 세포의 투여는 대상체에서 질환 또는 병태, 예를 들어, CLL의 치료 및/또는 개선을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 종양-연관된 항원, 예를 들어, 수용체 티로신 키나제 유사 오펀 수용체 1(Receptor Tyrosine Kinase Like Orphan Receptor 1; ROR1)의 발현과 연관된 CLL을 갖거나 갖는 것으로 의심된다
일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 고형 종양, 또는 비-혈액학적 종양과 관련된 암이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 고형 종양, 또는 고형 종양과 관련된 암이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 췌장암, 방광암, 결장직장암, 유방암, 전립선암, 신장암, 간세포암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 직장암, 갑상선암, 자궁암, 위암, 식도암, 두경부암, 흑색종, 신경내분비암, CNS 암, 뇌 종양, 골암, 또는 연조직 육종이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 방광암, 폐암, 뇌암, 흑색종 (예를 들어, 소세포 폐, 흑색종), 유방암, 자궁경부암, 난소암, 결장직장암, 췌장암, 자궁내막암, 식도암, 신장암, 간암, 전립선암, 피부암, 갑상선암, 또는 자궁암이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 췌장암, 방광암, 결장직장암, 유방암, 전립선암, 신장암, 간세포암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 직장암, 갑상선암, 자궁암, 위암, 식도암, 두경부암, 흑색종, 신경내분비암, CNS 암, 뇌 종양, 골암, 또는 연조직 육종이다.
일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 비-소세포 폐암(NSCLC)이다. 일부 구현예에서, 제공된 세포, 예를 들어, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 갖는 조작된 세포의 투여는 대상체에서 질환 또는 병태, 예를 들어, NSCLC 의 치료 및/또는 개선을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 종양-관련 항원, 예를 들어, 수용체 티로신 키나제 유사 오펀 수용체 1(ROR1) 의 발현과 관련된 NSCLC를 갖거나 갖는 것으로 의심된다.
일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 두경부 편평 세포 암종(HNSCC)이다. 일부 구현예에서, 제공된 세포, 예를 들어, 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 갖는 조작된 세포의 투여는 대상체에서 질환 또는 병태, 예를 들어, HNSCC의 치료 및/또는 개선을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 종양-관련 항원, 예를 들어, 인간 유두종 바이러스(HPV) 16 E6 또는 E7의 발현과 관련된 HNSCC를 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 바이러스성, 레트로바이러스성, 박테리아성, 및 원생동물 감염, 면역 결핍, 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, BK 폴리오마바이러스와 같은 감염성 질환 또는 병태이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 자가 면역 또는 염증성 질환 또는 병태, 예를 들어, 관절염, 예를 들어, 류마티스 관절염(RA), 제 1형 당뇨병, 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 염증성 장 질환, 건선, 경피증, 자가면역 갑상선 질환, 그레이브병, 크론병, 다발성 경화증, 천식 및/또는 이식과 관련된 질환 또는 병태이다.
일부 구현예에서, 질환 또는 장애와 관련된 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 인테그린), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산탈수효소 9(CA9, 또한 CAIX 또는 G250으로 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2로 공지됨), 암태아성 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(chondroitin sulfate proteoglycan) 4(CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백 2(EPG-2), 상피 당단백 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5, 또한 Fc 수용체 유사 5 또는 FCRH5로 공지됨), 태아성 아세틸콜린 수용체(태아성 AchR), 폴레이트 결합 단백질(FBP), 폴레이트 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화된 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질-커플링된 수용체 부류 C 그룹 5 멤버 D(protein-coupled receptor class C group 5 member D; GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-멜라노마-연관 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복 함유 8 패밀리 멤버 A(LRRC8A), 루이스 Y, 멜라노마-연관 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 사이토메갈로바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 온코페탈 항원, 멜라노마의 우선 발현된 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 세포영양막 당단백(TPBG, 또한 5T4로 공지됨), 종양-연관 당단백 72(TAG72), 티로시나제 관련된 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75라고도 알려짐), 티로시나제 관련된 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토머라제(dopachrome tautomerase), 도파크롬 델타-이소머라제(dopachrome delta-isomerase) 또는 DCT라고도 알려짐), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 윌름스 종양 1(WT-1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원, 또는 유니버설 태그로 연관된 항원, 및/또는 비오틴화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자이거나 또는 그들을 포함한다. 일부 구현예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 다수의 공지된 B 세포 마커의 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 연관된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 또는 그를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항원은 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원, 예를 들어, 바이러스성 항원(예를 들어, HIV, HCV, HBV 등으로부터 바이러스성 항원), 박테리아성 항원, 및/또는 기생충 항원이이거나 또는 그를 포함한다.
일부 측면에서, CAR과 같은 재조합 수용체는, B 세포 악성 종양과 관련된 병변 환경의 세포에서 발현되거나 질환 또는 병태와 관련된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화되는 항원은 다수의 공지된 B 세포 표지자 중의 어느 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 관련된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화되는 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30 또는 이의 조합물이다.
일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 다발성 골수종과 같은 골수종이다. 일부 측면에서, CAR과 같은 재조합 수용체는 다발성 골수종과 관련된 병변 환경의 세포에서 발현되거나 질환 또는 병태와 관련된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 다발성 골수종과 관련된 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 항원, 예를 들어, 질환 특이적 항원 및/또는 관련 항원과 같은 제 2 또는 추가 항원은 다발성 골수종, 예컨대 B 세포 성숙 항원(BCMA), G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D), CD38(환형 ADP 리보오스 가수 분해 효소), CD138(신데칸-1, 신데칸, SYN-1), CS-1(CS1, CD2 서브세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24), BAFF-R, TACI 및/또는 FcRH5 상에서 발현된다. 다른 예시적인 다발성 골수종 항원은 CD56, TIM-3, CD33, CD123, CD44, CD20, CD40, CD74, CD200, EGFR, β2-마이크로글로불린, HM1.24, IGF-1R, IL-6R, TRAIL-R1 및 액티빈(activin) 수용체 IIA형(ActRIIA)을 포함한다. 문헌 [Benson and Byrd, J. Clin. Oncol. (2012) 30(16): 2013-15; Tao and Anderson, Bone Marrow Research (2011):924058; Chu 등, Leukemia (2013) 28(4):917-27; Garfall 등, Discov Med. (2014) 17(91):37-46]을 참조한다. 일부 구현예에서, 항원은 림프성 종양, 골수종, 에이즈 관련 림프종 및/또는 CD38과 같은 이식 후 림프구 증식에 존재하는 것을 포함한다. 상기 항원에 대해 유도된 항체 또는 항원 결합 단편은 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [미국특허 제8,153,765호; 제8,603477호, 제8,008,450호; 미국특허출원공개공보 제US20120189622호 또는 제US20100260748호; 및/또는 국제공개공보 제WO2006099875호, 제WO2009080829호 또는 제WO2012092612호 또는 제WO2014210064호]에 기술된 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, scFv)은 다중 특이적 항체, 다중 특이적 키메라 수용체, 예컨대 다중 특이적 CAR 및/또는 다중 특이적 세포에 함유되어 있다.
일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D)의 발현 및/또는 B 세포 성숙 항원(BCMA)의 발현과 연관된다.
일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 B 세포 관련 장애이다. 제공된 방법의 제공된 임의의 구현예 중의 일부에서, BCMA와 연관된 질환 또는 장애는 자가면역 질환 또는 장애이다. 제공된 방법의 제공된 임의의 구현예 중의 일부에서, 자가면역 질환 또는 장애는 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 루푸스 신염, 염증성 장질환, 류마티스 관절염, ANCA 관련 혈관염, 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenia purpura, ITP), 혈전성 혈소판 감소성 자반증(thrombotic thrombocytopenia purpura, TTP), 자가 면역성 혈소판 감소증, 샤가스병(Chagas’ disease), 그레이브병(Grave’s disease), 베게너 육아종증(Wegener’s granulomatosis), 다발성 결절성 동맥염(poly-arteritis nodosa), 쇼그렌 증후군(Sjogren’s syndrome), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 피부 경화증(scleroderma), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 건선(psoriasis), IgA 신장병(nephropathy), IgM 다발성 신경병(polyneuropathies), 혈관염(vasculitis), 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 레이노드 증후군(Reynaud’s syndrome), 항인지질 증후군(anti-phospholipid syndrome), 굿파스처 병(Goodpasture’s disease), Kawasaki disease(가와사키 병), 자가면역 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 중증 근무력증(myasthenia gravis) 또는 진행성 사구체 신염(progressive glomerulonephritis)이다.
일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 구현예에서, 암은 GPRC5D-발현 암이다. 일부 구현예에서, 암은 형질 세포 악성 종양이고 형질 세포 악성 종양은 다발성 골수종(multiple myeloma, MM) 또는 형질 세포종(plasmacytoma)이다. 일부 구현예에서, 암은 다발성 골수종(MM)이다. 일부 구현예에서, 암은 재발성/불응성 다발성 골수종이다.
일부 구현예에서, 항원은 바이러스, 예를 들어, 인간 유두종 바이러스(HPV)와 연관되고, 질환 또는 장애는 암, 예를 들어, HNSCC이다. 일부 구현예에서, 항원은 ROR1이고, 질환 또는 장애는 CLL이다. 일부 구현예에서, 항원은 ROR1이고, 질환 또는 장애는 NSCLC이다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, scFv 또는 VH 도메인)은 CD19, BCMA, GPRC5D 또는 ROR1와 같은 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 CD19, BCMA, GPRC5D 또는 ROR1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에서 유래하거나 이의 변이체이다.
일부 구현예에서, 세포 요법, 예를 들어, 입양 T 세포 요법은 자가 전달에 의해 수행되고, 여기서 세포는 세포 요법을 받을 대상체, 또는 그러한 대상체로부터 유래된 샘플로부터 분리 및/또는 그렇지 않으면 준비된다. 따라서, 일부 측면에서, 세포는 치료를 필요로 하는 대상체, 예를 들어, 환자로부터 유래되고, 분리 및 처리 후 동일한 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서, 세포 요법, 예를 들어, 입양 T 세포 요법은 동종이계 전달에 의해 수행되고, 여기서 세포는 세포 요법을 받거나 궁극적으로 받을 대상체, 예를 들어, 제 1 대상체 이외의 대상체로부터 분리 및/또는 그렇지 않으면 준비된다. 그러한 구현예에서, 그다음, 세포는 동일한 종의 다른 대상체, 예를 들어, 제 2 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 대상체는 유전적으로 유사하다. 일부 구현예에서, 제 2 대상체는 제 1 대상체와 동일한 HLA 클래스 또는 슈퍼타입을 발현한다.
세포는 볼루스 주입, 주사, 예를 들어, 정맥내 또는 피하 주사, 안구내 주사, 눈주위(periocular) 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 트랜스-경막 주사, 공막하 주사, 맥락막내 주사, 전방내 주사, 결막하(subconjectval, subconjuntival) 주사, 서브-테논 주사, 안구후 주사, 안구주위(peribulbar) 주사, 또는 후배엽 전달에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 그들은 비경구, 폐내 및 비강 내, 및 국소 치료를 위해 필요한 경우, 병변내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 주어진 용량은 세포의 단일 일시 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 그것은 예를 들어, 3 일 이하의 기간에 걸쳐 세포의 다중 일시 투여에 의해, 또는 세포의 연속 주입 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 용량의 투여 또는 임의의 추가 치료, 예를 들어, 림프구 마비 치료, 중재 치료 및/또는 병용 치료는 외래 환자 전달을 통해 수행된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 치료될 질환의 유형, 세포 또는 재조합 수용체의 타입, 질환의 중증도 및 과정, 세포가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 치료, 대상체의 임상 이력 및 세포에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의존할 수 있다. 조성물 및 세포는 일부 구체 예에서 한번의 또는 일련의 치료에 걸쳐 대상체에게 적합하게 투여된다.
일부 구현예에서, 세포는 조합 치료의 일부로서, 예를 들어, 동시에 또는 순차적으로, 임의의 순서로, 다른 치료적 개입, 예를 들어, 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 제제, 예를 들어, 세포독성 또는 치료제가 투여된다. 일부 구현예에서 세포는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 또는 다른 치료적 개입과 관련하여 동시에 또는 임의의 순서로 동시에 투여된다. 일부 상황에서, 세포는 세포 집단이 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 향상시키도록 또는 그 반대의 시간에 충분히 근접한 다른 치료와 공동-투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 제제는 예를 들어, 지속성을 향상시키기 위해, IL-2와 같은 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 화학요법 제제의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 예를 들어, 투여 전에 종양 부담을 감소시키기 위해, 화학요법 제제, 예를 들어, 처리 화학요법 제제의 투여를 포함한다.
일부 측면에서 면역결핍(예를 들어, 림프구결핍) 치료를 가진 전처리 대상체는 입양 세포 요법(ACT)의 효과를 개선시킬 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 방법은 세포 요법의 개시 전에 대상체에 전처리 제제, 예를 들어, 림프구 마비 또는 화학요법 제제, 예를 들어, 사이클로포스파마이드, 플루다라빈, 또는 그의 조합을 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 대상체는 세포 요법의의 개시 적어도 2일 전, 예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6 또는 7 일 전 전처리 제제를 투여받는다. 일부 구현예에서, 대상체는 세포 요법의 개시 7 일 이하 전, 예를 들어, 6, 5, 4, 3 또는 2일 이하 이전에 전처리 제제를 투여받는다.
일부 구현예에서, 대상체는 20 mg/kg 내지 100 mg/kg 또는 약 20 mg/kg 내지 100 mg/kg, 예를 들어, 40 mg/kg 내지 80 mg/kg 또는 약 40 mg/kg 내지 80 mg/kg의 용량으로 사이클로포스파마이드로 전처리된다. 일부 측면에서, 대상체는 60 mg/kg 또는 약 60 mg/kg의 사이클로포스파마이드로 전처리된다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파마이드는 단일 용량으로 투여될 수 있거나, 매일, 격일로 또는 3 일 마다 주어진 것과 같은 복수의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파마이드는 1일 또는 2일 동안 1일 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 림프구 마비 제제가 사이클로포스파마이드를 포함하는 경우, 대상체는 사이클로포스파마이드를 100 mg/m2내지 500 mg/m2또는 약 100 mg/m2내지 500 mg/m2, 예를 들어, 200 mg/m2 내지 400 mg/m2 또는 250 mg/m2 내지 350 mg/m2 또는 약 200 mg/m2 내지 400 mg/m2 또는 약 250 mg/m2 내지 350 mg/m2의 용량으로 투여된다. 일부 예시에서, 대상체는 약 300 mg/m2 의 사이클로포스파마이드로 투여된다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파마이드는 단일 용량으로 투여될 수 있거나, 매일, 격일로 또는 3 일 마다 주어진 것과 같은 복수의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파마이드는 1일 내지 5 일 동안, 예를 들어, 3 일 내지 5 일 동안과 같이, 매일 투여된다. 일부 경우에, 대상체는 세포 요법의 개시 전에 3 일 동안 매일 약 300 mg/m2의 사이클로포스파마이드를 투여받는다.
일부 구현예에서, 림프구 마비 제제가 플루다라빈을 포함하는 경우, 대상체는 1 mg/m2 내지 100 mg/m2 또는 약 1 mg/m2 and 100 mg/m2, 예를 들어, 10 mg/m2 내지 75 mg/m2, 15 mg/m2 내지 50 mg/m2, 20 mg/m2 내지 40 mg/m2, 또는 24 mg/m2 내지 35 mg/m2, 또는 약 10 mg/m2 내지 75 mg/m2, 15 mg/m2 내지 50 mg/m2, 20 mg/m2 내지 40 mg/m2, 또는 24 mg/m2 내지 35 mg/m2의 용량으로 플루다라빈을 투여받는다. 일부 예시에서, 대상체는 약 30 mg/m2의 플루다라빈을 투여받을 수 있다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 단일 용량으로 투여될 수 있거나, 매일, 격일로 또는 3 일 마다 주어진 것과 같은 복수의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 1일 내지 5 일 동안, 예를 들어, 3 일 내지 5 일 동안과 같이, 매일 투여된다. 일부 경우에, 대상체는 세포 요법의 개시 전에 3 일 동안 매일 약 30 mg/m2의 플루다라빈을 투여받는다.
일부 구현예에서, 림프구 마비 제제는 제제의 조합, 예를 들어, 사이클로포스파마이드 및 플루다 라빈의 조합을 포함한다. 따라서, 제제의 조합은 본원에서 기재된 바와 같은 임의의 용량 또는 투여 스케쥴에서 사이클로포스파마이드 및 본원에서 기재된 바와 같은 임의의 용량 또는 투여 스케쥴에서 플루다라빈을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 대상체는 1차 또는 후속 용량 전에 60 mg/kg (~ 2 g/m2)의 사이클로포스파마이드 및 3회 내지 5 회 용량의 25 mg/m2 플루다라빈을 투여받는다.
세포의 투여 후, 일부 구현예에서 조작된 세포 집단의 생물학적 활성은 예를 들어, 임의의 다수의 공지 된 방법에 의해 측정된다. 평가하는 파라미터는 in vivo, 예를 들어, 영상화, 또는 ex vivo, 예를 들어, ELISA 또는 유세포 측정에 의해 조작된 또는 천연 T 세포 또는 다른 면역 세포의 항원에 대한 특이 적 결합을 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 세포가 표적 세포를 파괴하는 능력은 예를 들어, Kochenderfer 등, J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), 및 Herman 등, J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004) 에서 서술된 세포독성 분석과 같은 적합한 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포의 생물학적 활성은 CD107a, IFNγ, IL-2 및 TNF와 같은 하나 이상의 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 분석함으로써 측정된다. 일부 측면에서, 생물학적 활성은 종양 부담 또는 부하 감소와 같은 임상 결과를 평가함으로써 측정된다.
특정 구현예에서, 조작된 세포는 임의의 수의 방식으로 추가로 변형되어, 그의 치료 또는 예방 효능이 증가된다. 예를 들어, 집단에 의해 발현된 조작된 CAR 또는 TCR은 링커를 통해 표적 부분에 직접 또는 간접적으로 컨쥬게이션될 수 있다. 표적 모이어티에 대한 접합 화합물(conjugating compounds), 예를 들어, CAR 또는 TCR을 컨쥬게이션시키는 관행은 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Wadwa 등, J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995)], 및 미국특허 제5,087,616호 참조.
일부 구현예에서, 세포는 조합 치료의 일부로서, 예를 들어, 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 시약, 예를 들어, 세포 독성제 또는 치료제와 같은 다른 치료적 개입과 동시에 또는 순차적으로 임의의 순서로와 같이 조합 치료의 일부로서 투여된다. 일부 구현예에서 세포는 하나 이상의 추가 치료제 또는 다른 치료 개입과 관련하여 어떤 순서로든 동시에 또는 순차적으로 공동-투여된다. 일부 상황에서, 상기 세포들은, 충분히 가까운 시간에 또 다른 요법과 공동-투여되어, 세포 집단은 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 향상시키거나 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 제제는 예를 들어, 지속성을 향상시키기 위해 IL-2와 같은 사이토카인을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포의 용량은 제공된 방법, 및/또는 제조 또는 조성물의 제공된 물품에 따라 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 크기 또는 시기는 대상체에서 특정 질환 또는 병태의 함수로서 결정된다. 일부 경우에, 제공된 설명의 관점에서 특정 질환에 대한 용량의 크기 또는 시기는 경험적으로 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포의 용량은 2×105 개의 세포/kg 내지 2×106 개의 세포/kg 또는 약 2×105 개의 세포/kg 내지 2×106 개의 세포/kg, 예를 들어, 4×105 개의 세포/kg 내지 1×106 개의 세포/kg 또는 약 4×105 개의 세포/kg 내지 1×106 개의 세포/kg 또는 6×105 개의 세포/kg 내지 8×105 개의 세포/kg 또는 약 6×105 개의 세포/kg 내지 8×105 개의 세포/kg를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 2×105 대상체의 킬로그램 체중 당 세포(예를 들어, 항원-발현, 예를 들어, CAR- 발현 세포)(세포/kg) 이하, 예를 들어, 3×105 개의 세포/kg 또는 약 3×105 개의 세포/kg 이하, 4×105 개의 세포/kg 또는 약 4Х105 개의 세포/kg 이하, 5×105 개의 세포/kg 또는 약 5×105 개의 세포/kg 이하, 6×105 개의 세포/kg 또는 약 6Х105 개의 세포/kg 이하, 7×105 개의 세포/kg 또는 약 7×105 개의 세포/kg 이하, 8×105 개의 세포/kg 또는 약 8×105 개의 세포/kg 이하, 9×105 개의 세포/kg 또는 약 9×105 개의 세포/kg 이하, 1×106 개의 세포/kg 또는 약 1×106 개의 세포/kg 이하, 또는 2×106 개의 세포/kg 또는 약 2×106 개의 세포/kg 이하를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 적어도 2×105 대상체의 킬로그램 체중 당 세포(예를 들어, 항원-발현, 예를 들어, CAR- 발현 세포)(세포/kg) 또는 적어도 약 2×105 개의 세포/kg 또는 2×105 개의 세포/kg 또는 2×105 개의 세포/kg, 예를 들어 적어도 3Х105 개의 세포/kg 또는 적어도 약 3×105 개의 세포/kg 또는 3×105 개의 세포/kg 또는 3Х105 개의 세포/kg, 적어도 4×105 개의 세포/kg 또는 적어도 약 4×105 개의 세포/kg 또는 4×105 개의 세포/kg 또는 4×105 개의 세포/kg, 적어도 5×105 개의 세포/kg 또는 적어도 약 5×105 개의 세포/kg 또는 5×105 개의 세포/kg 또는 5Х105 개의 세포/kg, 적어도 6×105 개의 세포/kg 또는 적어도 약 6×105 개의 세포/kg 또는 6×105 개의 세포/kg 또는 6×105 개의 세포/kg, 적어도 7×105 개의 세포/kg 또는 적어도 약 7×105 개의 세포/kg 또는 7×105 개의 세포/kg 또는 7×105 개의 세포/kg, 적어도 8×105 개의 세포/kg 또는 적어도 약 8×105 개의 세포/kg 또는 8×105 개의 세포/kg 또는 8×105 개의 세포/kg, 적어도 9×105 개의 세포/kg 또는 적어도 약 9×105 개의 세포/kg 또는 9×105 개의 세포/kg 또는 9×105 개의 세포/kg, 적어도 1×106 개의 세포/kg 또는 적어도 약 1×106 개의 세포/kg 또는 1×106 개의 세포/kg 또는 1×106 개의 세포/kg, 또는 적어도 2×106 개의 세포/kg 또는 적어도 약 2Х106 개의 세포/kg 또는 2×106 개의 세포/kg 또는 2×106 개의 세포/kg를 포함한다.
특정 구현예에서, 세포 또는 세포의 하위 유형의 개별 집단은 (약) 10만 내지 (약) 1000억 세포의 범위로 및/또는 대상체의 체중 1kg 당 세포의 양으로, 예컨대, 예를 들어 (약) 10만 내지 (약) 500억 세포(예를 들어 (약) 5백만 세포, (약) 2천5백만 세포, (약) 5억 세포, (약) 10억 세포, (약) 50억 세포, (약) 200억 세포, (약) 300억 세포, (약) 400억 세포 또는 전술한 수치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위), (약) 1백만 내지 (약) 500억 세포(예를 들어 (약) 5백만 세포, (약) 2천5백만 세포, (약) 5억 세포, (약) 10억 세포, (약) 50억 세포, (약) 200억 세포, (약) 300억 세포, (약) 400억 세포 또는 전술한 수치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위), 예컨대 (약) 1천만 내지 (약) 1000억 세포(예를 들어 (약) 2천만 세포, (약) 3천만 세포, (약) 4천만 세포, (약) 6천만 세포, (약) 7천만 세포, (약) 8천만 세포, (약) 9천만 세포, (약) 100억 세포, (약) 250억 세포, (약) 500억 세포, (약) 750억 세포, (약) 900억 세포 또는 전술한 수치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위) 및 일부 경우에 (약) 1억 세포 내지 (약) 500억 세포(예를 들어 (약) 1억2천만 세포, (약) 2억5천만 세포, (약) 3억5천만 세포, (약) 6억5천만 세포, (약) 8억 세포, (약) 9억 세포, (약) 30억 세포, (약) 300억 세포, (약) 450억 세포) 또는 상기 범위 사이의 임의의 수치 및/또는 대상체의 체중 1kg당 세포의 양으로 대상체에 투여된다. 투여량은 질환 또는 장애 및/또는 환자 및/또는 다른 치료의 구체적인 속성에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 값은 재조합 수용체-발현 세포의 수를 지칭하고; 다른 구현예에서, 이들은 T 세포 또는 PBMC 또는 투여된 총 세포의 수를 지칭한다.
일부 구현예에서, 예를 들어 대상체가 인간인 경우, 단위 용량은 약 5×108개 미만의 총 재조합 수용체(예를 들어 CAR) 발현 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를, 예를 들어 (약) 1×106 내지 (약) 5×108의 상기 세포 수 범위내, 예컨대 (약) 2×106, 5Х106, 1Х107, 5Х107, 1Х108, 1.5Х108, 또는 5×108 총 상기 세포 수, 또는 전술한 수치 중 임의의 2개 사이의 범위내 수를 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어 대상체가 인간인 경우에, 단위 용량은 (약) 1×106개 초과의 총 재조합 수용체(예를 들어 CAR)-발현 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 (약) 2×109개 미만의 총 재조합 수용체(예를 들어 CAR)-발현 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를, 예를 들어 (약) 2.5×107 내지 (약) 1.2×109개의 상기 세포 수 범위내, 예컨대, (약) 2.5×107, 5Х107, 1Х108, 1.5Х108, 8Х108 또는 1.2×109개의 총 상기 세포 수, 또는 전술한 수치 중 임의의 2개 사이의 범위내 수를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 조작된 세포의 단위 용량은 (약) 1×105 내지 (약) 5Х108개의 총 CAR-발현 (CAR+) T 세포, (약) 1×105 내지 (약) 2.5×108개의 총 CAR T 세포, (약) 1×105 내지 (약) 1×108개의 총 CAR T 세포, (약) 1×105 내지 (약) 5Х107개의 총 CAR T 세포, (약) 1×105 내지 (약) 2.5×107개의 총 CAR T 세포, (약) 1Х105 내지 (약) 1×107개의 총 CAR T 세포, (약) 1×105 내지 (약) 5×106개의 총 CAR T 세포, (약) 1×105 내지 (약) 2.5×106개의 총 CAR T 세포, (약) 1×105 내지 (약) 1×106개의 총 CAR T 세포, (약) 1×106 내지 (약) 5×108개의 총 CAR T 세포, (약) 1×106 내지 (약) 2.5×108개의 총 CAR T 세포, (약) 1×106 내지 (약) 1×108개의 총 CAR T 세포, (약) 1×106 내지 (약) 5×107개의 총 CAR T 세포, (약) 1×106 내지 (약) 2.5×107개의 총 CAR T 세포, (약) 1×106 내지 (약) 1×107개의 총 CAR T 세포, (약) 1×106 내지 (약) 5Х106개의 총 CAR T 세포, (약) 1×106 내지 (약) 2.5Х106개의 총 CAR T 세포, (약) 2.5×106 내지 (약) 5×108개의 총 CAR T 세포, (약) 2.5Х106 내지 (약) 2.5×108개의 총 CAR T 세포, (약) 2.5×106 내지 (약) 1×108개의 총 CAR T 세포, (약) 2.5×106 내지 (약) 5×107개의 총 CAR T 세포, (약) 2.5Х106 내지 (약) 2.5×107개의 총 CAR T 세포, (약) 2.5×106 내지 (약) 1×107개의 총 CAR T 세포, (약) 2.5×106 내지 (약) 5×106개의 총 CAR T 세포, (약) 5×106 내지 (약) 5×108개의 총 CAR T 세포, (약) 5×106 내지 (약) 2.5×108개의 총 CAR T 세포, (약) 5×106 내지 (약) 1×108개의 총 CAR T 세포, (약) 5×106 내지 (약) 5×107개의 총 CAR T 세포, (약) 5Х106 내지 (약) 2.5×107개의 총 CAR T 세포, (약) 5Х106 내지 (약) 1×107개의 총 CAR T 세포, (약) 1×107 내지 (약) 5×108개의 총 CAR T 세포, (약) 1×107 내지 (약) 2.5×108개의 총 CAR T 세포, (약) 1×107 내지 (약) 1×108개의 총 CAR T 세포, (약) 1×107 내지 (약) 5×107개의 총 CAR T 세포, (약) 1×107 내지 (약) 2.5×107개의 총 CAR T 세포, (약) 2.5×107 내지 (약) 5×108개의 총 CAR T 세포, (약) 2.5×107 내지 (약) 2.5×108개의 총 CAR T 세포, (약) 2.5Х107 내지 (약) 1×108개의 총 CAR T 세포, (약) 2.5×107 내지 (약) 5×107개의 총 CAR T 세포, (약) 5×107 내지 (약) 5×108개의 총 CAR T 세포, (약) 5×107 내지 (약) 2.5×108개의 총 CAR T 세포, (약) 5×107 내지 (약) 1×108개의 총 CAR T 세포, (약) 1×108 내지 (약) 5×108개의 총 CAR T 세포, (약) 1×108 내지 (약) 2.5×108개의 총 CAR T 세포, 또는 (약) 2.5×108 내지 (약) 5×108개의 총 CAR T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 조작된 세포의 단위 용량은 (약) 2.5×107 내지 (약) 1.5×108개의 총 CAR T 세포, 예컨대 (약) 5×107 내지 (약) 1×108개의 총 CAR T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 조작된 세포의 단위 용량은 적어도 또는 약 1×105개의 CAR 세포, 적어도 또는 약 2.5×105개의 CAR 세포, 적어도 또는 약 5×105개의 CAR 세포, 적어도 또는 약 1×106개의 CAR 세포, 적어도 또는 약 2.5×106개의 CAR 세포, 적어도 또는 약 5×106개의 CAR 세포, 적어도 또는 약 1×107개의 CAR 세포, 적어도 또는 약 2.5×107개의 CAR 세포, 적어도 또는 약 5×107개의 CAR 세포, 적어도 또는 약 1×108개의 CAR 세포, 적어도 또는 약 1.5×108개의 CAR 세포, 적어도 또는 적어도 약 2.5×108개의 CAR 세포, 또는 적어도 또는 적어도 약 5×108개의 CAR 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 요법은 (약) 1Х105 내지 (약) 5×108 개의 전체 재조합 수용체-발현 세포, 전체 T 세포, 또는 전체 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 수, (약) 5×105 내지 (약) 1×107 개의 전체 재조합 수용체-발현 세포, 전체 T 세포, 또는 전체 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 수, 또는 (약) 1×106 내지 (약) 1×107 개의 전체 재조합 수용체-발현 세포, 전체 T 세포, 또는 전체 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 수를 포함하는 투여량의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포 요법은 적어도 (약) 1×105 개의 전체 재조합 수용체-발현 세포, 전체 T 세포, 또는 전체 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 수를 포함하는 세포 투여량의 투여를 포함하는데, 예를 들어 적어도 (약) 1×106 개, 적어도 (약) 1×107 개, 적어도 (약) 1Х108 개의 그러한 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 수는 CD3+ 또는 CD8+의 전체 수에 관한 것이며, 일부 경우, 재조합 수용체-발현 (예를 들어 CAR+) 세포에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 세포 요법은 (약) 1×105 내지 (약) 5×108 개의 CD3+ 또는 CD8+ 전체 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포, (약) 5Х105 내지 (약) 1×107 개의 CD3+ 또는 CD8+ 전체 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포, 또는 (약) 1×106 내지 (약) 1×107 개의 CD3+ 또는 CD8+ 전체 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포수를 포함하는 투여량의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포 요법은, (약) 1×105 내지 (약) 5×108 개의 전체 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포, (약) 5×105 내지 (약) 1×107 개의 전체 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포, 또는 (약) 1×106 내지 (약) 1×107 개의 전체 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포수를 포함하는 투여량의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 용량의 T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 용량의 T 세포는 인간 CD4+ T 세포, 인간 CD8+ T 세포 또는 인간 CD4+ 및 인간 CD8+ T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어 대상체가 인간인 경우, 용량은 (약) 1×106 내지 (약) 5×108 개의 총 재조합 수용체(예를 들어 CAR)-발현 CD8+ T 세포, 예를 들어 1Х107, 2.5Х107, 5Х107, 7.5Х107, 1Х108, 1.5Х108, 또는 5×108 개의 총 그러한 세포와 같은, (약) 5×106 내지 (약) 1×108 그러한 세포의 범위, 또는 2개 앞선 값 중 임의의 사이 범위에서 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 다중 용량으로 투여되고, 각각의 용량 또는 총 용량은 앞선 값 중 임의의 범위 내에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 (약) 1×107 내지 (약) 0.75×108 개의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포, (약) 1×107 내지 (약) 5×107 개의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포, (약) 1×107 내지 (약) 0.25×108 개(각각의 경계 포함)의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 (약) 1×107, 2.5Х107, 5Х107, 7.5Х107, 1Х108, 1.5Х108, 2.5Х108, 또는 5×108 개의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 재조합 수용체-발현 T 세포의 용량은 단일 용량으로서 대상체에 투여되거나 2주, 1달, 3달, 6달, 1년 이상의 기간 내에 오직 1회 투여된다. 입양 세포 요법의 경우, 주어진 "용량"의 투여는 단일 조성물로서 세포의 주어진 양 또는 수의 투여 및/또는 단일 중단없는 투여, 예를 들어 단일 주사 또는 연속 주입으로서를 포함하고, 또한, 특정된 기간, 예를 들어 3일 이하에 걸쳐, 다중 개별 조성물 또는 주입으로 제공된, 분할 용량 또는 복수의 조성물로서 세포의 주어진 양 또는 수의 투여를 포함한다. 따라서, 일부 상황에서, 용량은 단일 시점에서 제공되거나 개시되는 세포의 특정 수의 단일 또는 연속 투여이다. 그러나, 일부 상황에서, 용량은 3 일 이하, 예를 들어 3 일 동안 또는 2 일 동안 하루에 한번에 걸쳐 다중 주사 또는 주입으로, 또는 단일 기간에 걸쳐 다중 주입에 의해 투여된다.
따라서, 일부 측면에서, 용량의 세포는 단일 약학 조성물에서 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 세포는 용량의 세포를 총괄적으로 함유하는, 복수의 조성물에서 투여된다.
일부 구현예에서, 용어 "분할 용량"은 1 일 초과에 걸쳐 투여되도록 분할된 용량을 가리킨다. 용량의 이러한 타입은 본 방법에 포함되고 단일 용량으로 간주된다.
따라서, 세포의 용량은 분할 용량, 예를 들어 시간에 걸쳐 투여되는 분할 용량으로서 투여될 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, 용량은 2 일에 걸쳐 또는 3 일에 걸쳐 대상체에 투여될 수있다. 분할 투여를 위한 예시적인 방법은 첫째날에 용량의 25%를 투여하고 둘째날에 용량의 나머지 75%를 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 용량의 33%는 첫째날에 투여될 수 있고 나머지 67%는 둘째날에 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 용량의 10%는 첫째날에 투여되고, 용량의 30%는 둘째 날에 투여되고, 용량의 60%는 셋째날에 투여된다. 일부 구현예에서, 분할 용량은 3 일 초과에 걸쳐 퍼지지 않는다.
일부 구현예에서, 용량의 세포는 용량의 일부 세포를 각각 함유하는, 선택적으로 보다 많은, 제 1 및 제 2와 같은, 복수의 조성물 또는 용액의 투여에 의해 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 상이한 집단 및/또는 세포의 서브-타입을 각각 함유하는, 복수의 조성물은 선택적으로, 특정 기간 내에, 별도로 또는 독립적으로 투여된다. 예를 들어 세포의 집단 또는 서브-타입은 각각 CD8+ 및 CD4+ T 세포, 및/또는 각각 CD8+ 및 CD4+ 농축된 집단, 예를 들어 재조합 수용체를 발현시키기 위해 유전자 조작된 세포를 각각 개별적으로 포함하는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 용량의 투여는 CD8+ T 세포의 용량 또는 CD4+ T 세포의 용량을 포함하는 제 1 조성물의 투여 및 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 다른 용량을 포함하는 제 2 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 조성물 또는 용량의 투여, 예를 들어 복수의 세포 조성물의 투여는 별도로 세포 조성물의 투여를 포함한다. 일부 측면에서, 별도 투여는 임의의 순서로, 동시에, 또는 순차적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 용량은 제 1 조성물 및 제 2 조성물을 포함하고, 제 1 조성물 및 제 2 조성물은 (약) 0 내지 (약) 12 시간 간격, (약) 0 내지 (약) 6 시간 간격 또는 (약) 0 내지 (약) 2 시간 간격으로 투여된다. 일부 구현예에서, 제 1 조성물의 투여의 개시 및 제 2 조성물의 투여의 개시는 (약) 2 시간 이하, (약) 1 시간 이하, 또는 (약) 30 분 이하 간격, (약) 15 분 이하, (약) 10 분 이하 또는 (약) 5 분 이하 간격으로 수행된다. 일부 구현예에서, 제 1 조성물의 투여 개시 및/또는 완료 및 제 2 조성물의 투여 완료 및/또는 개시는 (약) 2 시간 이하, (약) 1 시간 이하, 또는 (약) 30 분 이하 간격, (약) 15 분 이하, (약) 10 분 이하 또는 (약) 5 분 이하 간격으로 수행된다.
일부 구현예에서, 제 1 조성물, 예를 들어 용량의 제 1 조성물은 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 조성물에서, 제 1 조성물, 예를 들어 용량의 제 1 조성물은 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 조성물은 제 2 조성물 이전에 투여된다.
일부 구현예에서, 세포의 용량 또는 조성물은 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ 세포 대 재조합 수용체를 발현하는 CD8+ 세포 및/또는 CD4+ 세포 대 CD8+ 세포의 정의된 또는 표적 비를 포함하고, 이러한 비는 선택적으로, 약 1:1 또는 약 1:3 내지 약 3:1, 예를 들어 약 1:1이다. 일부 측면에서, 상이한 세포 집단의 표적 또는 원하는 비(예를 들어 CD4+:CD8+ 비 또는 CAR+CD4+:CAR+CD8+ 비, 예를 들어, 1:1)로 조성물 또는 용량의 투여는 하나의 집단을 함유하는 세포 조성물의 투여 후 다른 집단을 포함하는 별도 세포 조성물의 투여를 포함하고, 여기서, 투여는 (대략) 표적 또는 원하는 비이다. 일부 측면에서, 한정된 비율로 세포의 용량 또는 조성물의 투여는 T 세포 요법의 증폭, 지속성 및/또는 항종양 활성을 개선시킨다.
일부 구현예에서, 대상체는 세포의 다중 용량, 예를 들어 2 회 이상 용량 또는 다중 연속 용량을 받는다. 일부 구현예에서, 2 가지 용량이 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체는 제 1 용량 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일 후 투여되는, 연속 용량, 예를 들어 제 2 용량을 받는다. 일부 구현예에서, 다중 연속 용량은 추가 용량 또는 용량이 연속 용량의 투여 후 투여되도록, 제 1 용량 후에 투여된다. 일부 측면에서, 추가 용량으로 대상체에 투여되는 세포의 수는 제 1 용량 및/또는 연속 용량과 동일하거나 유사하다. 일부 구현예에서, 추가 용량 또는 용량들은 이전 용량 보다 더 크다.
일부 측면에서, 제 1 및/또는 연속 용량의 크기는 이전 치료, 예를 들어 화학요법에 대한 대상체의 반응, 종양 부하, 벌크, 크기, 또는 정도, 범위, 또는 전이의 타입, 단계와 같은 대상체에서 질환 부담, 및/또는 독성 결과를 발생시키는 대상체의 가능성 또는 발생률, 예를 들어 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경독성 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응과 같은, 하나 이상의 기준에 기반하여 결정된다.
일부 측면에서, 제 1 용량의 투여 및 연속 용량의 투여 사이의 시간은 약 9 내지 약 35 일, 약 14 내지 약 28 일, 또는 15 내지 27 일이다. 일부 구현예에서, 연속 용량의 투여는 제 1 용량의 투여 후 약 14 일 초과 및 약 28 일 미만의 시점에 있다. 일부 측면에서, 제 1및 연속 용량 사이의 시간은 약 21일이다. 일부 구현예에서, 추가 용량 또는 용량들, 예를 들어 연속 용량은 연속 용량의 투여 후 투여된다. 일부 측면에서, 추가 연속 용량 또는 용량들은 이전 용량의 투여 후 적어도 약 14 일 및 약 28 일 미만에 투여된다. 일부 측면에서, 추가 용량은 이전 용량 후 약 14 일 미만, 예를 들어 이전 용량 후 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13 일에 투여된다. 일부 구현예에서, 용량은 이전 용량 후 약 14 일 미만으로 투여되지 않고 및/또는 용량은 이전 용량 후 약 28 일 초과로 투여되지 않는다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 재조합 수용체-발현 세포의 용량은 T 세포의 제 1 용량 및 T 세포의 연속 용량을 포함하는 2 가지 용량(예를 들어 이중 용량)을 포함하고, 여기서 제 1 용량 및 제 2 용량 중 하나 또는 둘다는 T 세포의 분할 용량의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포의 용량은 질환 부담을 감소시키는데 효과적일 정도로 충분히 일반적으로 크다.
일부 구현예에서, 세포는 원하는 용량으로 투여되는데, 이는 일부 측면에서 세포 또는 세포 타입(들)의 원하는 용량 또는 수 세포 타입(들)의 원하는 비를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서 세포의 용량은 세포의 총 수(또는 체중 kg 당 수) 및 개별 집단 또는 서브-타입의 원하는 비, 예를 들어 CD4+ 대 CD8+ 비를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 개별 집단 또는 개별 세포 타입에서 세포의 원하는 총 수(또는 체중 kg 당 수)를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 투여 량은 개별 집단에서 총 세포의 원하는 수, 원하는 비, 및 세포의 원하는 총 수와 같은, 그러한 특징의 조합에 기반한다.
일부 구현예에서, CD8+ 및 CD4+ T 세포와 같은 세포의 집단 또는 서브-타입은 T 세포의 원하는 용량과 같은, 총 세포의 원하는 용량의 허용된 차이로 또는 그의 내에 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 세포의 원하는 수 또는 세포가 투여되는 대상체의 체중의 단위 당 세포의 원하는 수, 예를 들어 cells/kg이다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 최소 세포수 또는 체중의 단위 당 세포의 최소 수이거나 그 이상이다. 일부 측면에서, 원하는 용량으로 투여된 총 세포 중에서, 개별 집단 또는 서브-타입은 원하는 산출 비(예를 들어 CD4+ 대 CD8+ 비), 예를 들어 그러한 비의 특정 허용된 차이 또는 오차 범위 내에 있거나 그 근처이다.
일부 구현예에서, 세포는 CD4+ 세포의 원하는 용량 및/또는 CD8+ 세포의 원하는 용량과 같은, 세포의 하나 이상의 개별 집단 또는 서브-타입의 원하는 용량의 허용된 차이에서 또는 그 내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 서브-타입 또는 집단의 세포의 원하는 수, 또는 세포가 투여되는 대상체의 체중의 단위당 그러한 세포의 원하는 수, 예를 들어 세포/kg이다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 집단 또는 서브-타입의 세포의 최소 수 또는 체중의 단위 당 집단 또는 서브-타입의 세포의 최소 수이거나 그 이상이다.
따라서, 일부 구현예에서, 투여량은 총 세포의 원하는 고정된 용량 및 원하는 비에 기반하고, 및/또는 하나 이상, 예를 들어 개별 서브-타입 또는 서브-집단 각각의 원하는 고정된 용량에 기반한다. 따라서, 일부 구현예에서, 투여량은 T 세포의 원하는 고정된 또는 최소 투여 및 CD4+ 대 CD8+ 세포의 원하는 비에 기반하고, 및/또는 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포의 원하는 고정된 또는 최소 투여에 기반한다.
일부 구현예에서, 세포는 다수의 세포 집단 또는 서브-타입, 예를 들어 CD4+ 및 CD8+ T 세포 또는 서브-타입의 원하는 산출 비의 허용 범위 내에서 또는 그 범위 내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 비는 특정 비일 수 있거나 비의 범위일 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, 원하는 비(예를 들어 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비)는 5:1 또는 약 5:1 또는 5:1 또는 약 5:1 사이(또는 약 1:5 초과 및 약 5:1 미만)이고, 또는 1:3 또는 약 1:3 또는 3:1 또는 약 3:1 사이(또는 약 1:3 초과 및 약 3:1 미만), 예를 들어 2:1 또는 약 2:1 또는 1:5 또는 약 1:5 사이(또는 약 1:5 초과 및 약 2:1 미만), 예를 들어 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9: 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, 또는 1:5, 또는 약 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9: 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, 또는 1:5이다. 일부 측면에서, 허용되는 차이는 원하는 비의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50% 이내이고, 이들 범위 사이의 임의의 값을 포함한다.
임의의 구현예 중의 일부에서, 세포의 수 및/또는 농도는 재조합 수용체(예를 들어 CAR)-발현 세포의 수를 가리킨다. 다른 구현예에서, 세포의 수 및/또는 농도는 투여되는 모든 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 수 또는 농도를 가리킨다.
일부 측면에서, 용량의 크기는 이전 치료, 예를 들어 화학요법에 대한 대상체의 반응, 종양 부하, 벌크, 크기, 또는 정도, 범위, 또는 전이의 타입, 단계와 같은 대상체에서 질환 부담, 및/또는 독성 결과를 발생시키는 대상체의 가능성 또는 발생률, 예를 들어 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경독성 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응과 같은, 하나 이상의 기준에 기반하여 결정된다.
일부 구현예에서, 또한, 방법은 키메릭 항원 수용체(CAR) 및/또는 림프구 마비 치료를 발현하는 하나 이상의 추가 용량의 세포를 투여하는 단계를 포함하고 /하거나 상기 방법의 하나 이상의 단계가 반복된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 용량은 초기 용량과 동일하다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 용량은 초기 용량과 상이하며, 예를 들어 초기 용량에 비해 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 이상 보다 높은 것과 같이, 보다 높거나, 예를 들어 초기 용량에 비해, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 이하 보다 낮은 것과 같이, 보다 낮다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 용량의 투여는 초기 치료 또는 임의이 이전 치료에 대한 대상체의 반응, 종양 부하, 벌크, 크기, 또는 정도, 범위, 또는 전이의 타입, 단계와 같은 대상체에서 질환 부담, 및/또는 독성 결과를 발생시키는 대상체의 가능성 또는 발생률, 예를 들어 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경독성 및/또는 투여되는 세포에 대한 숙주 면역 반응에 기반하여 결정된다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공된 조작된 세포 또는 조성물을 투여한 대상체에서, 암 또는 종양의 부피 또는 크기는 조작된 세포 또는 조성물을 투여하지 않은 대상체와 비교하여 감소된다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 조작된 세포 또는 조성물을 투여한 대상체에서, 대상체의 생존은 조작된 세포 또는 조성물을 투여하지 않은 대상체와 비교하여 연장된다.
ⅤI. 약학 조성물 및 제형
조성물 중에는 투여를 위한, 예를 들어 입양 세포 요법을 위한 약학 조성물 및 제형이 있다. 일부 구현예에서, 재조합 항원 수용체, 예를 들어 CAR로 조작된 세포를 포함하는 세포의 용량은 조성물 또는 제형, 예를 들어 약학 조성물 또는 제형으로서 제공된다. 상기 조성물은, 예컨대 질환, 병태 및 장애의 예방 또는 치료에서 또는 검출, 진단 및 예후 방법에서 제공된 방법 및/또는 제공된 제조 물품 또는 조성물과 부합되게 사용될 수 있다.
용어 "약학적 제형(pharmaceutical formulation)"은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적일 수 있도록 하는 형태이고, 제형이 투여될 대상체에 허용 가능하지 않게 독성이 있는 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용 가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 활성 성분이 아닌 약학 제형 안에 있는 성분을 지칭하고, 이는 대상체에 무독성이다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정제 또는 방부제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 측면에서, 담체의 선택은 특정 세포 및/또는 투여 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 다양한 적합한 제형이 존재한다. 예를 들어 약학 조성물은 방부제를 함유할 수 있다. 적합한 방부제는 예를 들어 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산 나트륨 및 염화벤잘코늄을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 2개 이상의 방부제가 혼합되어 사용된다. 방부제 또는 이의 혼합물은 전형적으로 전체 조성물의 약 0.0001% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다. 담체는 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 일반적으로 사용된 투여량 및 농도에서 수용체에게 무독성이며, 인산염, 구연산염 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 방부제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3- 펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA 와 같은 킬레이팅제; 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨과 같은 설탕; 나트륨과 같은 염 형성 카운터 이온; 금속 착물(예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온 계면활성제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 측면에서 완충제는 조성물에 포함된다. 적합한 완충제는 예를 들어 구연산, 구연산 나트륨, 인산, 인산 칼륨 및 다양한 다른 산 및 염을 포함한다. 일부 측면에서, 2 이상의 완충제 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이의 혼합물은 전형적으로 전체 조성물의 약 0.001% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약학 조성물의 제조 방법이 공지되어 있다. 예시적인 방법이, 예를 들어 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
제형 또는 조성물은 또한 세포 또는 제제로 예방 또는 치료될 특정 징후, 질환 또는 병태에 유용한 하나 이상의 활성 성분을 함유할 수 있으며, 여기서 각각의 활성이 서로 악영향을 미치지 않는다. 상기 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적절히 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, 약학 조성물은 화학 요법제, 예를 들어 아스파라기나제, 부술판, 카르보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 젬시타빈, 히드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 빈크리스틴 등의 다른 약학적 활성제 또는 약물을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 제제 또는 세포는 염, 예를 들어 약학적으로 허용되는 염의 형태로 투여된다. 적합한 약학적으로 허용되는 산 부가 염은 무기산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 인산, 메타인산, 질산 및 황산, 및 유기산, 예를 들어 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 말산, 락트산, 푸마르산, 벤조산, 글리콜산, 글루콘산, 석신산 및 아릴술폰산, 예를 들어 p-톨루엔설폰산으로부터 유도된 것을 포함한다.
일부 구현예에서 약학 조성물은 치료적 유효량 또는 예방적 유효량과 같이 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기에 효과적인 양으로 제제 또는 세포를 함유한다. 일부 구현예에서 치료적 또는 예방적 효능은 치료 대상체의 주기적인 평가에 의해 모니터링된다. 여러 날 또는 그 초과에 걸친 반복 투여의 경우, 병태에 따라, 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 치료를 반복한다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있고 결정될 수 있다. 원하는 투여량은 조성물의 단일 볼루스 투여, 조성물의 다중 볼루스 투여 또는 조성물의 지속적인 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
제제 또는 세포는 임의의 적합한 수단에 의해, 예를 들어 볼루스 주입에 의해, 주사에 의해, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사, 안내 주사, 안구주위 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 트랜스-격막 주사, 공막하 주사, 맥락막내 주사, 카메라내 주사, 공막하 주사, 공막하 주사, 서브-텐온(sub-Tenon) 주사, 구강내 주사, 구강주위 주사, 또는 후방 점막 전달에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 이들은 비경구, 폐내, 및 비강내, 및 원하는 경우에 국소 치료를 위해 병변내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 주어진 용량은 세포 또는 제제의 단일 볼루스 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 이는 세포 또는 제제의 다중 볼루스 투여에 의해, 예를 들어 3일 이하의 기간에 걸쳐, 또는 세포 또는 제제의 연속 주입 투여에 의해 투여된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 치료될 질환의 유형, 제제 또는 제제의 유형, 세포 또는 재조합 수용체의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 제제 또는 세포가 예방적 또는 치료적 목적을 위해 투여되는지 여부, 이전 요법, 대상체의 임상 병력 및 제제 또는 세포에 대한 반응, 및 담당 의사의 재량에 따라 달라질 수 있다. 조성물은 일부 구현예에서 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 대상체에게 적합하게 투여된다.
세포 및 조성물은 표준 투여 기술, 제형 및/또는 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 조성물의 저장 및 투여를 위한 제제 및 장치, 예를 들어 시린지 및 바이알이 제공된다. 세포와 관련하여, 투여는 자가 또는 이종일 수 있다. 일부 측면에서, 세포는 대상체로부터 단리되고, 조작되고, 동일한 대상체에게 투여된다. 다른 측면에서, 이들은 하나의 대상체로부터 단리되고, 조작되고, 또 다른 대상체에게 투여된다. 예를 들어 면역 반응성 세포 또는 전구체는 하나의 대상체로부터 수득될 수 있고, 동일한 대상체 또는 상이하고, 양립 가능한 대상체에 투여될 수 있다. 말초 혈액 유래 면역 반응성 세포 또는 이의 자손(예를 들어 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내 유래)은 카테터 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥 주사 또는 비경구 투여를 포함하는 국소 주사를 통해 투여될 수 있다. 치료 조성물(예를 들어 유전자 변경 면역 반응성 세포 또는 신경독성의 증상을 치료 또는 개선시키는 제제를 함유하는 약학 조성물)을 투여할 때, 일반적으로 이는 주사 가능한 단위 투여량 형태(용액, 현탁액, 에멀젼)로 제형화될 것이다.
제형은 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육, 비강, 볼, 설하 또는 좌약 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제 또는 세포 집단은 비경구적으로 투여된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "비경구(parenteral)"는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 및 복강내 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제 또는 세포 집단은 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 이용하여 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서 조성물은 멸균 액체 제제로서, 예를 들어 등장성 수용액, 현탁액, 에멀젼, 분산액 또는 점성 조성물로 제공되며, 이는 일부 측면에서 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액체 제제는 일반적으로 겔, 다른 점성 조성물 및 고체 조성물보다 제조가 보다 용이하다. 또한, 액체 조성물은 특히 주사에 의해 투여하기가 다소 더 편리하다. 다른 한편으로, 점성 조성물은 특정 조직과의 보다 긴 접촉 기간을 제공하기 위해 적절한 점도 범위 내에서 제형화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은 예를 들어 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜) 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 배지일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
멸균 주사용 용액은 적합한 담체, 희석제 또는 멸균수, 생리식염수, 포도당, 덱스트로스 등과 같은 부형제와의 혼화물과 같은 용매에 제제 또는 세포를 통합함으로써 제조될 수 있다.
생체 내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균된다. 멸균은, 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
VII.
키트
및 제조 물품
또한, 제공된 구현예를 수행하는데 유용한 제조 물품, 시스템, 장치, 및 키트가 제공된다. 일부 구현예에서, 제공된 제조 물품 또는 키트는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)의 하나 이상의 성분, 예를 들어 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유하는 주형 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 일부 구현예에서, 제조 물품 또는 키트는 재조합 수용체 및/또는 다른 분자를 발현하도록 T 세포를 조작하기 위한 방법에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 제조 물품 또는 키트는 제공된 방법을 수행하는데 유용한 폴리펩티드, 핵산, 벡터 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제조 물품 또는 키트는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)의 하나 이상의 성분을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자, 예를 들어 플라스미드 또는 DNA 단편을 포함하고, 예를 들어 HDR을 통해 전이 유전자를 세포 내로 표적화하는데 사용하기 위한 주형 폴리뉴클레오티드(들)를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 제조 물품 또는 키트는 대조군 벡터를 함유한다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공된 제조 물품 또는 키트는 하나 이상의 제제(들)를 함유하고, 여기서 하나 이상의 제제 각각은 독립적으로 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 표적 부위의 유전자 파괴를 유도할 수 있으며; 및 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 주형 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 전이 유전자는 상동성 지향된 수복 (HDR)을 통해 표적 부위에서 또는 그 근처에서 통합을 위해 표적화된다. 일부 측면에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)는 본원에 기재된 임의의 것이다. 일부 측면에서, 하나 이상의 제제(들)는 Cas9/gRNA 복합체를 포함하는 리보핵산단백질(RNP) 복합체이다. 일부 측면에서, RNP에 포함된 gRNA는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 표적 부위, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 표적 부위를 표적화한다. 일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 주형 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것이다.
일부 구현예에서, 제조 물품 또는 키트는 일반적으로 사용하기 위한 지침(instructions), 예를 들어 조작을 위한 세포 내로 성분을 도입하기 위한 지침을 포함하는, 용기 또는 용기 상에 또는 용기 또는 용기 및/또는 패키징과 연관된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다.
본원에서 제공된 제조 물품은 패키징 물질을 함유한다. 제공된 재료를 패키징하는데 사용되는 패키징 물질은 잘 알려져 있다. 예를 들어 그 내용 전체가 본원에 인용된 미국특허 제5,323,907호, 제5,052,558호 및 제5,033,252호를 참조한다. 패키징 물질의 예에는 블리스터 팩, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백, 바이알, 컨테이너, 주사기, 일회용 실험실 용품, 예를 들어 피펫 팁 및/또는 플라스틱 플레이트 또는 병이 포함되나 이에 국한되지 않는다. 제조 물품 또는 키트는 재료의 분배를 용이하게 하거나 고처리량 또는 대규모 방식으로 사용을 용이하게 하기 위한, 예를 들어 로봇 장비에서의 사용을 용이하게 하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 전형적으로, 패키징은 그 안에 함유된 조성물과 반응하지 않는다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드(들)를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)는 별도로 포장된다. 일부 구현예에서, 각 컨테이너는 단일 구획을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 제조 물품 또는 키트의 다른 성분은 개별적으로 또는 단일 구획(compartment)에 함께 포장된다.
또한, 예를 들어 요법 또는 치료에 사용하기 위한, 제공된 세포 및/또는 세포 조성물의 투여에 유용한 제조 물품, 시스템, 장치, 및 키트가 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 제조 물품 또는 키트는 T 세포 및/또는 T 세포 조성물, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 T 세포 및/또는 T 세포 조성물을 함유한다. 일부 측면에서, 본원에서 제공된 제조 물품 또는 키트는 T 세포 또는 T 세포 조성물의 투여를 위해 사용될 수 있고, 사용을 위한 지침을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공된 제조 물품 또는 키트는 T 세포, 및/또는 T 세포 조성물, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 T 세포 및/또는 T 세포 조성물을 함유한다. 일부 구현예에서, 임의의 변형된 T 세포는 본원에 기재된 스크리닝 방법을 사용하였다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 제조 물품 또는 키트는 대조군 또는 비변형된 T 세포 및/또는 T 세포 조성물을 함유한다. 일부 구현예에서, 제조 물품 또는 키트는 요법을 위한 조작된 세포 및/또는 세포 조성물의 투여를 위한 하나 이상의 지침을 포함한다.
상기 요법을 위한 세포 또는 세포 조성물을 함유하는 제조 물품 및/또는 키트는 용기 및 용기 상에 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기에는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백(bag) 등이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 용기는 조성물 그 자체로 또는 병태를 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 다른 조성물과 조합된 조성물을 보유한다. 일부 구현예에서, 용기는 멸균 접근 포트를 갖는다. 예시적인 용기는 정맥내 용액 백, 주사용 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 가지는 것을 포함하는 바이알, 또는 경구 투여 제제용 병 또는 바이알을 포함한다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 질환 또는 병태를 치료하기 위해 사용되는 것을 나타낼 수 있다. 제조 물품은 (a) 재조합 수용체를 발현하는 조작된 세포를 포함하는 조성물이 내부에 함유된 제 1 용기; 및 (b) 제 2 제제를 포함하는 조성물이 내부에 함유된 제 2 용기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제조 물품은 (a) 재조합 수용체를 발현하는 조작된 세포의 하위유형을 포함하는 제 1 조성물이 내부에 함유된 제 1 용기; 및 (b) 재조합 수용체를 발현하는 조작된 세포의 상이한 하위유형을 포함하는 조성물이 내부에 함유된 제 2 용기를 포함할 수 있다. 제조 물품은 조성물이 특정 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있다는 것을 나타내는 패키지 삽입물을 더 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 제조 물품은 약학적으로 허용 가능한 완충제를 포함하는 또 다른 또는 동일한 용기를 더 포함할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및/또는 주사기와 같은 다른 재료를 더 포함할 수 있다.
VIII. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용되는 분야의 모든 용어, 표기 및 다른 기술적 및 과학적 용어 또는 전문용어는 청구 대상이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에서, 일반적으로 이해되는 의미의 용어는 본 명세서에서 명확성 및/또는 용이한 참조를 위해 정의되며, 본 명세서에 이러한 정의가 포함된 경우에는 반드시, 당업계에서 일반적으로 이해되는 것 이상의 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명에서 사용되는바, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 분명히 다르게 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 예를 들어 "a" 또는 "an"은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다. 본 발명에서 기술된 측면 및 변형은 측면들 및 변형들"로 이루어지는" 및/또는 "필수적으로 그로 이루어지는"을 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서에 걸쳐, 청구된 주제의 다양한 측면이 범위 형식으로 제시된다. 범위 형식에서의 설명은 편의상 및 간략화를 위한 것이며 청구된 주제의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안됨을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 설명은 가능한 모든 하위 범위 및 그 범위 내의 개별적인 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어 값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 개재된 값 및 언급된 범위 내 임의의 언급된 또는 개재된 값이 청구된 주제 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이들과 같은 보다 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로보다 더욱 작은 범위에 포함될 수 있으며, 기술된 범위 내에서 특별히 배제된 한계에 따라 청구된 대상 내에 포함된다. 명시된 범위가 하나의 한계 또는 두 한계를 포함하는 경우, 포함된 한계들 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위는 청구 대상에 포함된다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
본 발명에서 사용되는 "약"이라는 용어는 쉽게 알려진 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 나타낸다. 본 발명에서 어떠한 값 또는 파라미터와 관련한 "약"의 언급은 그 값 또는 매개 변수 자체에 대한 구현예를 포함(및 설명)한다. 예를 들어, "약 X"을 언급하는 설명은 "X"에 대한 설명을 포함한다. 일부 구현예에서, "약"은 ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5%, 또는 ±1%를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는바, 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치가, 기재된 서열, 예를 들어 서열 목록에 기재된 서열 내 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치"에 대응한다"는 것은, 표준 정렬 알고리즘, 예를 들어 GAP 알고리즘을 사용하여 상기 기재된 서열과 상동성을 최대화하는 정렬시 확인된 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치를 말한다. 서열을 정렬시킴으로써, 상응하는 잔기는 예를 들어 보존된 아미노산 잔기 및 동일한 아미노산 잔기를 가이드로서 사용하여 확인될 수 있다. 일반적으로, 대응하는 위치를 확인하기 위해, 가장 높은 정도의 매치가 얻어지도록 아미노산 서열을 정렬한다[예를 들어 문헌 「Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New.Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo 등, (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073」 참조].
본 발명에 사용되는바, 용어 "벡터"는 그것이 연결된 다른 핵산을 전파시킬 수 있는 핵산 분자를 말한다. 상기 용어는 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈에 혼입된 벡터뿐만 아니라 자기 복제 핵산 구조로서의 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그들이 작동적으로 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터를 본 발명에서는 "발현 벡터"라 지칭한다. 벡터 중에는 레트로바이러스, 예를 들어 감마레트로바이러스 및 렌티 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터가 있다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양체"는 상호교환적으로 사용되며, 이러한 세포의 자손을 포함하여 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하는데, 여기에는 최초의 형질전환된 세포 및 계대의 수에 관계없이 그로부터 유도된 자손이 포함된다. 자손은 핵산 함량이 부모 세포와 완전히 동일하지는 않을 수 있고, 돌연변이를 포함할 수 있다. 본래의 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본 발명에 포함된다.
일부 경우에, "T 세포 자극-연관된 유전자 좌"는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 발현이 유도되거나, 증가되거나 상향조절되는 유전자 좌를 지칭한다. 일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 T 세포의 TCR 복합체의 성분을 통해 형질도입된 신호에 반응하는 내인성 유전자 유전자 좌, 또는 TCR 복합체의 성분 또는 그의 일부를 포함하는 세포내 신호전달 영역, 및/또는 T 세포 상에 존재하거나 발현되는 수용체, 예를 들어 T 세포 수용체(TCR) 또는 재조합 수용체에 의한 항원 또는 에피토프 결합을 포함하는 재조합 수용체이다. 일부 측면에서, T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 T 세포의 정상 하류 신호전달 경로의 일부인 정규 인자에 의해 조절될 수 있다. 일부 측면에서, 암호화된 재조합 수용체, 예를 들어 CAR 또는 TCR의 세포내 신호전달 영역을 통한 항원 또는 에피토프 결합 및/또는 신호 또는 활성은 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 유도하여 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자를 발현하는 신호전달을 유도한다. 이어서, 내인성 유전자 생성물 및/또는 전이 유전자의 검출가능한 발현을 T 세포 활성화의 지표로서 모니터링할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "양성"이라는 설명은 특정 마커, 통상 표면 마커의, 세포 상의 또는 세포내의 검출 가능한 존재를 말한다. 표면 마커를 언급할 때, 이 용어는 유세포 측정에 의하여 검출되는, 예를 들어 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출되는 표면 발현의 존재를 말하는데, 여기서 상기 염색은, 다른 것은 동일한 조건 하에서 이소형-매치된 대조군으로 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색을 실질적으로 초과하는 수준에서, 및/또는 상기 마커에 대하여 양성이라고 알려진 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준에서, 및/또는 상기 마커에 대하여 음성이라고 알려진 세포에 대한 것보다 실질적으로 더 높은 수준에서 유세포 측정에 의하여 검출 가능하다.
본 발명에서 사용되는 바, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "음성"이라는 설명은 특정 마커, 통상 표면 마커의, 세포 상에 또는 세포내의 실질적인 검출 가능한 존재의 부재를 말한다. 표면 마커를 언급할 때, 이 용어는 유세포 측정에 의하여 검출되는, 예를 들어 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출되는 표면 발현의 부재를 말하는데, 여기서 상기 염색은, 다른 것은 동일한 조건 하에서 이소형-매치된 대조군으로 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색을 실질적으로 초과하는 수준에서 유세포 측정에 의하여 검출되지 않고, 및/또는 상기 마커에 대하여 양성이라고 알려진 세포에 대한 것보다 실질적으로 낮은 수준에서, 및/또는 상기 마커에 대하여 음성이라고 알려진 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준에서 유세포 측정에 의하여 검출된다.
본 발명에서 사용되는바, 아미노산 서열(참조 폴리펩티드 서열)에 대해 사용되는 경우, "백분율(%) 아미노산 서열 상동성" 및 "백분율 상동성"은, 서열들과, 최대치의 백분율 서열 상동성을 얻기 위하여 필요하다면 도입되는 갭을 정렬한 후, 상기 참조 폴리펩티드 서열 내 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열(예를 들어 대상 항체 또는 단편) 내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의되며, 상기 서열 상동성의 일부로서 어떠한 보존적 치환은 고려하지 않는다. 백분율 아미노산 서열 상동성을 결정하는 목적을 위한 서열정렬은 다양한 방식, 일부 구현예에서 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈리안(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공중이 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 적절히 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 적절한 분자(예를 들어 전사 활성제 단백질)가 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 허용하는 방식으로 DNA 서열과 같은 성분, 예를 들어 이종 핵산 및 조절 서열(들)의 결합을 포함할 수 있다. 따라서, 기재된 성분은 이들이 의도된 방식으로 작용하도록 허용하는 관계에 있음을 의미한다.
아미노산 치환은 폴리펩티드에서 하나의 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비보존적 아미노산 치환일 수 있다. 아미노산 치환은 관심있는 결합 분자, 예를 들어 항체에 도입될 수 있고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
아미노산은 일반적으로 하기의 통상적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe
일부 구현예에서, 보존적 치환은 상기 클래스 중 하나의 구성원을 같은 클래스의 다른 구성원으로 교환하는 것을 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, 비보존적 아미노산 치환은 상기 클래스 중 하나의 구성원을 다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 수 있다.
본원에서 사용된 조성물은 세포를 포함한, 둘 이상의 생성물, 물질, 또는 화합물의 임의의 혼합물을 지칭한다. 그것은 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비-수성 또는 그들의 임의의 조합물일 수 있다.
본원에서 사용된 "대상체"는 포유동물, 예컨대 인간 또는 기타 동물이고, 전형적으로는 인간이다.
IX. 예시적인
구현예
제공된 구현예 중에는 하기의 것들이 있다:
1. 조작된 T 세포로서,
재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자(transgene)를 포함하는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌(modified T cell stimulation-associated locus)를 포함하되,
상기 전이 유전자는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소(endogenous transcriptional regulatory element)에 작동가능하게 연결되며,
상기 내인성 전사 조절 요소는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현을 유도하거나 상향조절하는(upregulate),
조작된 T 세포.
2. 구현예 1에 있어서,
상기 내인성 전사 조절 요소는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 프로모터(promoter)인, 조작된 T 세포.
3. 구현예 1 또는 2에 있어서,
상기 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 전이 유전자는 프로모터의 하류(downstream)에 존재하는, 조작된 T 세포.
4. 구현예 1 내지 3 중의 어느 하나에 있어서,
상기 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후 (약) 6, 12, 18, 24, 36 또는 48 시간 미만 이내에 상향조절되거나 유도되는, 조작된 T 세포.
5. 구현예 1 내지 4 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포에서 발현의 상향조절(upregulation) 또는 유도 후 또는 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에, 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 감소되거나 하향조절되는(downregulated), 조작된 T 세포.
6. 구현예 1 내지 5 중의 어느 하나에 있어서,
상기 발현의 상향조절 또는 유도 후, 또는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후, 상기 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 (약) 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과 보다 더 크게 감소되거나 하향조절되는, 조작된 T 세포.
7. 구현예 5 또는 6에 있어서,
상기 발현의 상향조절 또는 유도 후, 상기 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 일 또는 그 초과 후에 감소되거나 하향조절되는, 조작된 T 세포.
8. 구현예 5 내지 7 중의 어느 하나에 있어서,
상기 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후 (약) 6, 12, 18, 24, 36 또는 48 시간 미만 이내에 감소되거나 하향조절되는, 조작된 T 세포.
9. 구현예 5 내지 8 중의 어느 하나에 있어서,
상기 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에 T 세포에서 추가 자극 또는 활성화 신호 후에 다시 유도되거나 상향조절될 수 있는, 조작된 T 세포.
10. 구현예 9에 있어서,
상기 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에 T 세포에서 추가 자극 또는 활성화 신호 후에 (약) 6, 12, 18, 24, 36 또는 48 시간 미만 이내에 상향조절되거나 유도되는, 조작된 T 세포.
11. 구현예 1 내지 10 중의 어느 하나에 있어서,
상기 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임으로부터의 번역된 생성물은 세포 내에서 발현되지 않거나, 상기 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 기능적 내인성 유전자 생성물은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 발현되지 않는 것인, 조작된 T 세포.
12. 구현예 11에 있어서,
상기 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)에 결실(deletion), 삽입(insertion), 프레임시프트 돌연변이(frameshift mutation) 또는 넌센스 돌연변이(nonsense mutation)를 포함하는, 조작된 T 세포.
13. 구현예 1 내지 12 중의 어느 하나에 있어서,
상기 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1, CD69, Nur77, FoxP3 및 HLA-DR 유전자 좌 중에서 선택되는, 조작된 T 세포.
14. 구현예 1 내지 13 중의 어느 하나에 있어서,
상기 내인성 전사 조절 요소는 자극 또는 활성화 신호 후에 활성화되는 전사 인자에 의해 인식되는 하나 이상의 반응 요소를 포함하는, 조작된 T 세포.
15. 구현예 1 내지 14 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체 또는 이의 일부는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호를 유도 또는 전달할 수 있는 것인, 조작된 T 세포.
16. 구현예 1 내지 15 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 성분의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하고, 상기 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호는 재조합 수용체에 존재하는 세포내 신호전달 도메인을 통한 신호를 포함하거나, 또는
상기 재조합 수용체는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하고, 상기 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호는 재조합 수용체에 존재하는 세포내 신호전달 도메인을 통한 신호를 포함하는,
조작된 T 세포.
17. 구현예 1 내지 16 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 제제에 결합하거나 이를 인식할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 세포외 영역을 포함하는, 조작된 T 세포.
18. 구현예 17에 있어서,
상기 자극 또는 활성화 신호는 재조합 수용체에 의한 제제의 결합 또는 인식 시에 T 세포에서 유도되는, 조작된 T 세포.
19. 구현예 17 또는 18에 있어서,
상기 제제는 표적 항원, 선택적으로 상기 표적 항원은 재조합 단백질이거나, 또는 세포의 표면에서 발현되는 항원인, 조작된 T 세포.
20. 구현예 19에 있어서,
상기 표적 항원은 질환, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 연관되거나, 그에 대해 특이적이거나, 그 위에서 발현되는, 조작된 T 세포.
21. 구현예 20에 있어서,
상기 질환, 장애 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환, 또는 종양 또는 암, 선택적으로 상기 표적 항원은 종양 항원인, 조작된 T 세포.
22. 구현예 17 내지 21 중의 어느 하나에 있어서,
상기 표적 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 인테그린), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산탈수효소 9(CA9, 또한 CAIX 또는 G250으로 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2로 공지됨), 암태아성 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(chondroitin sulfate proteoglycan) 4(CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백 2(EPG-2), 상피 당단백 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5, 또한 Fc 수용체 유사 5 또는 FCRH5로 공지됨), 태아성 아세틸콜린 수용체(태아성 AchR), 폴레이트 결합 단백질(FBP), 폴레이트 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화된 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질-커플링된 수용체 부류 C 그룹 5 멤버 D(protein-coupled receptor class C group 5 member D; GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-멜라노마-연관 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복 함유 8 패밀리 멤버 A(LRRC8A), 루이스 Y, 멜라노마-연관 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 사이토메갈로바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 온코페탈 항원, 멜라노마의 우선 발현된 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 세포영양막 당단백(TPBG, 또한 5T4로 공지됨), 종양-연관 당단백 72(TAG72), 티로시나제 관련된 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75라고도 알려짐), 티로시나제 관련된 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토머라제(dopachrome tautomerase), 도파크롬 델타-이소머라제(dopachrome delta-isomerase) 또는 DCT라고도 알려짐), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 윌름스 종양 1(WT-1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원, 또는 유니버설 태그로 연관된 항원, 및/또는 비오틴화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자로부터 선택되는, 조작된 T 세포.
23. 구현예 17에 있어서,
상기 제제는 항-이디오타입 항체인, 조작되 T- 세포.
24. 구현예 1 내지 23 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 조작되 T- 세포.
25. 구현예 24에 있어서,
상기 CAR은 막관통 도메인, 및 세포내 영역을 함유하는 세포외 영역을 포함하는, 조작되 T- 세포.
26. 구현예 25에 있어서,
상기 세포외 영역은 스페이서를 포함하되, 선택적으로 상기 스페이서는 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 작동 가능하게 연결되는, 조작되 T- 세포.
27. 구현예 25 또는 26에 있어서,
상기 세포외 영역은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 이를 포함하는 결합 도메인을 포함하는, 조작되 T- 세포.
28. 구현예 25 내지 27 중의 어느 하나에 있어서,
상기 세포내 영역은 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 조작된 T 세포.
29. 구현예 28에 있어서,
상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3 사슬, 선택적으로 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 신호전달 도메인, 또는 이의 신호전달 부분이거나 이를 포함하는, 조작된 T 세포.
30. 구현예 28 또는 29에 있어서,
상기 세포내 영역은 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인(들)을 포함하는, 조작된 T 세포.
31. 구현예 30에 있어서,
상기 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 세포내 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 부분을 포함하는, 조작된 T 세포.
32. 구현예 30 또는 31에 있어서,
상기 공-자극 신호전달 영역은 4-1BB의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 조작된 T 세포.
33. 구현예 1 내지 32 중의 어느 하나에 있어서,
상기 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 CAR인 재조합 수용체를 암호화하되, 상기 CAR은 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 세포내 영역을 그의 N-말단에서 C-말단의 순서로 포함하는, 조작된 T 세포.
34. 구현예 1 내지 33 중의 어느 하나에 있어서,
상기 전이 유전자는, 세포외 결합 도메인, 선택적으로 scFv를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열; 스페이서, 선택적으로 인간 면역글로불린 힌지로부터의 서열, 선택적으로 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터의 서열 또는 이의 변형된 버전을 포함하는 것, 선택적으로 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 더 포함하는 것; 및 막관통 도메인, 선택적으로 인간 CD28로부터의 것; 공-자극 신호전달 도메인, 선택적으로 인간 4-1BB로부터의 것; 및 세포내 신호전달 도메인, 선택적으로 CD3ζ 사슬 또는 이의 일부를 순서대로 포함하고/하거나,
상기 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는, 세포외 결합 도메인, 선택적으로 scFv를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열; 스페이서, 선택적으로 인간 면역글로불린 힌지로부터의 서열, 선택적으로 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터의 서열 또는 이의 변형된 버전을 포함하는 것, 선택적으로 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 더 포함하는 것; 및 막관통 도메인, 선택적으로 인간 CD28로부터의 것; 공-자극 신호전달 도메인, 선택적으로 인간 4-1BB로부터의 것; 및 세포내 신호전달 도메인, 선택적으로 CD3ζ 사슬 또는 이의 일부를 순서대로 포함하는,
조작된 T 세포.
35. 구현예 1 내지 34 중의 어느 하나에 있어서,
상기 전이 유전자는 재조합 수용체를 암호화하는, 조작된 T 세포.
36. 구현예 1 내지 34 중의 어느 하나에 있어서,
상기 전이 유전자는 재조합 수용체의 일부를 암호화하는, 조작된 T 세포.
37. 구현예 36에 있어서,
상기 재조합 수용체는 2개의 별개의 폴리펩티드 사슬을 함유하고, 상기 전이 유전자에 의해 암호화된 재조합 수용체의 일부는 재조합 수용체의 하나의 사슬이고, 상기 조작된 T 세포는 재조합 수용체의 다른 사슬을 추가로 발현하는, 조작된 T 세포.
38. 구현예 37에 있어서,
상기 재조합 수용체의 다른 사슬은 제 2 전이 유전자에 의해서 암호화되는, 조작된 T 세포.
39. 구현예 24 내지 38 중의 어느 하나에 있어서,
상기 CAR은 다중-사슬 CAR인, 조작된 T 세포.
40. 구현예 39에 있어서,
상기 전이 유전자는 다중-사슬 CAR의 하나의 사슬을 암호화하는, 조작된 T 세포.
41. 구현예 1 내지 23 및 35 내지 38 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 재조합 T 세포 수용체(TCR)인, 조작된 T 세포.
42. 구현예 41에 있어서,
상기 재조합 TCR은 알파(TCRα) 사슬 및 베타(TCRβ) 사슬을 포함하고 상기 전이 유전자는 TCRα 사슬을 암호화하는 핵산 서열 및/또는 TCRβ 사슬을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
43. 구현예 42에 있어서,
상기 전이 유전자는 TCRα 사슬 또는 TCRβ 사슬 중의 하나를 암호화하는, 조작된 T 세포.
44. 구현예 42 또는 43에 있어서,
상기 TCRα 사슬은 하나 이상의 도입된 시스테인 잔기를 포함하는 불변(Cα) 영역을 포함하고/하거나, 상기 TCRβ사슬은 하나 이상의 도입된 시스테인 잔기를 포함하는 Cβ 영역을 포함하되, 상기 하나 이상의 도입된 시스테인 잔기는 알파 사슬과 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비-천연 이황화물 브릿지를 형성할 수 있고, 선택적으로, 상기 하나 이상의 도입된 시스테인 잔기는 비-시스테인 잔기를 시스테인 잔기로 대체하는 것을 포함하는, 조작된 T 세포.
45. 구현예 44에 있어서,
상기 Cα 영역은 서열번호 92에 제시된 바와 같은 넘버링으로 위치 48에 상응하는 위치에 시스테인을 포함하고/하거나; 상기 Cβ 영역은 서열번호 96에 제시된 바와 같은 넘버링으로 위치 57에 상응하는 위치에 시스테인을 포함하는, 조작된 T 세포.
46. 구현예 1 내지 45 중의 어느 하나에 있어서,
상기 전이 유전자는 적어도 하나의 추가 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
47. 구현예 46에 있어서,
상기 적어도 하나의 추가의 단백질은 대리 마커이고, 선택적으로 상기 대리 마커는 절단된 수용체이고, 선택적으로 상기 절단된 수용체는 세포내 신호전달 도메인이 결여되고/되거나, 그의 리간드에 의해 결합될 때 세포내 신호전달을 매개할 수 없는 것인, 조작된 T 세포.
48. 구현예 1 내지 47 중의 어느 하나에 있어서,
상기 전이 유전자는 멀티시스트로닉 요소( multicistronic element)(들)를 더 포함하는, 조작된 T 세포.
49. 구현예 48에 있어서,
상기 멀티시스트로닉 요소(들)는 T2A, P2A, E2A 또는 F2A 또는 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site; IRES) 중에서 선택된 리보솜 스킵 요소(ribosome skip element)를 암호화하는 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
50. 구현예 48 또는 49에 있어서,
상기 멀티시스트로닉 요소는 CAR을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열과 적어도 하나의 추가 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 사이에 위치하고;
상기 재조합 수용체는 재조합 TCR이고, 상기 멀티시스트로닉 요소는 TCRα를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열과 TCRβ를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 사이에 위치하며;
상기 재조합 수용체는 다중-사슬 CAR이고, 상기 멀티시스트로닉 요소는 다중-사슬 CAR의 하나의 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열과 다중-사슬 CAR의 또 다른 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 사이에 위치하고/하거나;
상기 멀티시스트로닉 요소(들)는 재조합 수용체를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열의 상류(upstream)인,
조작된 T 세포.
51. 구현예 1 내지 50 중의 어느 하나에 있어서,
상기 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는:
a) 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 또는 근처에서 하나 이상의 표적 부위(들)에서 유전자 파괴(genetic disruption)를 유도하는 단계; 및
b) 상동성 지시된 수선(HDR)을 위한 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계;
에 의해서, 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자의 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내로의 통합에 의해서 생성되는, 조작된 T 세포.
52. 구현예 1에 있어서,
상기 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 적어도 하나의 표적 부위에서 또는 그 근처에서 통합되는, 조작된 T 세포.
53. 구현예 51 또는 52에 있어서,
상기 유전자 파괴는 표적 부위에 특이적으로 결합하거나, 이를 인식하거나, 또는 혼성화하는 징크 핑거 핵산분해효소(zinc finger nuclease; ZFN), TAL-이펙터 핵산분해효소(TAL-effector nuclease; TALEN), 또는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어진, 조작된 T 세포.
54. 구현예 51 내지 53 중의 어느 하나에 있어서,
상기 유전자 파괴는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것이고, 상기 CRISPR-Cas9 조합은 적어도 하나의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는, 조작된 T 세포.
55. 구현예 54에 있어서,
상기 CRISPR-Cas9 조합은 gRNA 및 Cas9 단백질을 포함하는 리보핵단백질(ribonucleoprotein; RNP) 복합체인, 조작된 T 세포.
56. 구현예 54에 있어서,
상기 유전자 파괴는 전기천공(electroporation)을 통해 복수의 T 세포 내로 도입된 RNP에 의해 이루어지는 것인, 조작된 T 세포.
57. 구현예 1 내지 56 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1인, 조작된 T 세포.
58. 구현예 57에 있어서,
상기 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지고, 상기 gRNA는 PDCD1 유전자에서 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 것인, 조작된 T 세포.
59. 구현예 58에 있어서,
상기 gRNA는 서열번호 75 및 104-109 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
60. 구현예 58 또는 59에 있어서,
상기 gRNA는 서열번호 75에 제시된 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
61. 구현예 1 내지 56 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 CD69인, 조작된 T 세포.
62. 구현예 61에 있어서,
상기 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것이고, 상기 gRNA는 CD69 유전자 내의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 것인, 조작된 T 세포.
63. 구현예 62에 있어서,
상기 gRNA는 서열번호 116 내지 121 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
64. 구현예 1 내지 56 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 Nur77인, 조작된 T 세포.
65. 구현예 64에 있어서,
상기 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것이고, 상기 gRNA는 Nur77 유전자 내의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는, 조작된 T 세포.
66. 구현예 65에 있어서,
상기 gRNA는 서열번호 122 내지 127 및 134 내지 136에 제시된 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
67. 구현예 1 내지 56 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 FoxP3인, 조작된 T 세포.
68. 구현예 1 내지 56 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 HLA-DR 유전자 좌인, 조작된 T 세포.
69. 구현예 1 내지 68 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포는 내인성 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC) 유전자 및/또는 내인성 T 세포 수용체 베타 불변 영역(TRBC) 유전자에서의 유전자 파괴를 더 포함하는, 조작된 T 세포.
70. 구현예 69에 있어서,
상기 유전자 파괴는 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 내에 있는 적어도 하나의 표적 부위에 특이적으로 결합하거나, 그를 인식하거나, 또는 그에 혼성화하는 징크 핑거 핵산분해효소(zinc finger nuclease; ZFN), TAL-이펙터 핵산분해효소(TAL-effector nuclease; TALEN), 또는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것인, 조작된 T 세포.
71. 구현예 69 또는 70에 있어서,
상기 유전자 파괴는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것이고, 상기 CRISPR-Cas9 조합은 적어도 하나의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 가이드 RNA(gRNA)를 포함하되, 선택적으로 상기 CRISPR-Cas9 조합은 gRNA 및 Cas9 단백질을 포함하는 리보핵산단백질(RNP) 복합체이고, 선택적으로 전기천공을 통해 복수의 T 세포 내로 도입된 RNP에 의해 이루어지는 것인, 조작된 T 세포.
72. 구현예 69 내지 71 중의 어느 하나에 있어서,
상기 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것이고, 상기 gRNA는 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 내에 있는 적어도 하나의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는, 조작된 T 세포.
73. 구현예 72에 있어서,
상기 gRNA는 TRAC 유전자 내의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는, 조작된 T 세포.
74. 구현예 73에 있어서,
상기 gRNA는 서열번호 77 및 188-218 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
75. 구현예 73 또는 74에 있어서,
상기 gRNA는 서열번호 77에 제시된 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
76. 구현예 72에 있어서,
상기 gRNA는 TRBC 유전자 내 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는, 조작된 T 세포.
77. 구현예 76에 있어서,
상기 gRNA는 서열번호 219-276 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
78. 구현예 1 내지 77 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 부재 하에 암호화된 재조합 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 통한 신호전달 활성은 T 세포의 게놈 내의 상이한 위치에 존재하거나 T 세포의 게놈 내의 무작위 위치에 존재하는 동일한 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 조작된 T 세포와 비교하여 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% 또는 그 초과 보다 더 크게 감소되는, 조작된 T 세포.
79. 구현예 1 내지 78 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포는 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포 또는 이의 하위유형인, 조작된 T 세포.
80. 구현예 1 내지 79 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포는 대상체로부터 유래된 1차 T 세포, 선택적으로 상기 대상체는 인간인, 조작된 T 세포.
81. 구현예 1 내지 79 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포는 다능성 또는 만능 세포로부터 유래되고, 선택적으로는 iPSC로부터 유래되는, 조작된 T 세포.
82. 조성물로서, 구현예 1-81 중의 어느 하나의 복수의 조작된 세포를 포함하는 조성물.
83. 구현예 82에 있어서,
상기 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후 (약) 6, 12, 18, 24, 36 또는 48 시간 미만 이내에 상기 조성물 중의 하나 이상의 세포에서 상향조절되거나 유도되는, 조성물.
84. 구현예 82 또는 83에 있어서,
상기 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에, 상기 조성물 중의 세포 중에서 작동가능하게 연결된 전이 유전자를 발현하는 세포의 빈도는 (약) 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과보다 더 큰 것인, 조성물.
85. 구현예 82 내지 84 중의 어느 하나에 있어서,
상기 발현의 상향조절 또는 유도 후에 또는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에, 상기 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 조성물 중의 하나 이상의 세포에서 감소되거나 하향조절되는, 조성물.
86. 구현예 82 내지 84 중의 어느 하나에 있어서,
상기 발현의 상향조절 또는 유도 후에, 또는 상기 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에, 상기 조성물 중의 세포 중에서 작동가능하게 연결된 전이 유전자를 발현하는 세포의 빈도는 (약) 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과보다 더 크게 감소되는, 조성물.
87. 구현예 82 내지 86 중의 어느 하나에 있어서,
상기 발현의 상향조절 또는 유도 후에, 상기 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 일 또는 그 초과 후에 상기 조성물 중의 하나 이상의 세포에서 감소되거나 하향조절되는, 조성물.
88. 구현예 82 내지 87 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물 중 하나 이상의 세포에서 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에 (약) 6, 12, 18, 24, 36 또는 48 시간 미만 내에 감소되거나 하향조절되는, 조성물.
89. 구현예 88에 있어서,
상기 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에, 상기 조성물 중의 세포 중에서 재조합 수용체를 발현하는 세포의 빈도는 (약) 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 또는 그 미만보다 적은 것인, 조성물.
90. 구현예 82 내지 89 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는, 조성물.
91. 구현예 82 내지 90 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하고, 상기 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비는 (약) 1:3 내지 3:1, 선택적으로 1:1인, 조성물.
92. 폴리뉴클레오티드로서,
(a) 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자, 및
(b) 전이 유전자에 연결된 하나 이상의 상동성 암,
을 포함하고,
상기 하나 이상의 상동성 암은 T 세포에서 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
93. 구현예 92에 있어서,
상기 재조합 수용체 또는 이의 일부는, 재조합 수용체가 폴리뉴클레오티드로 도입된 세포로부터 발현될 때, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유하는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 의해 암호화되는, 폴리뉴클레오티드.
94. 구현예 92 또는 93에 있어서,
상기 전이 유전자는 T 세포, 선택적으로 인간 T 세포의 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임에 대해 외인성 또는 이종성인 서열인, 폴리뉴클레오티드.
95. 구현예 92 내지 94 중의 어느 하나에 있어서,
상기 하나 이상의 상동성 암은 5' 상동성 암 및/또는 3' 상동성 암을 포함하되, 선택적으로 상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 표적 부위를 둘러싸는 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 포함하되, 상기 표적 부위는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내에 있는, 폴리뉴클레오티드.
96. 구현예 95에 있어서,
상기 표적 부위는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소의 하류인, 폴리뉴클레오티드.
97. 구현예 95 또는 96에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 구조 [5' 상동성 암]-[전이 유전자]-[3' 상동성 암]을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
98. 구현예 97에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 적어도 하나의 표적 부위를 둘러싸는 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
99. 구현예 95 내지 98 중의 어느 하나에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 50 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드, (약) 50 내지 (약) 500개의 뉴클레오티드, (약) 50 내지 (약) 250개의 뉴클레오티드, (약) 50 내지 (약) 100개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 500개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 250개의 뉴클레오티드, (약) 250 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드, (약) 250 내지 (약) 500개의 뉴클레오티드의 길이인, 폴리뉴클레오티드.
100. 구현예 95 내지 99 중의 어느 하나에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400 또는 500개의 뉴클레오티드의 길이, 또는 임의의 상기 것들 사이의 임의의 값인, 폴리뉴클레오티드.
101. 구현예 95 내지 100 중의 어느 하나에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 100개 미만의 뉴클레오티드의 길이, 선택적으로 (약) 50, 60, 70, 80 또는 90개의 뉴클레오티드의 길이, 또는 임의의 상기 것들 사이의 임의의 값인, 폴리뉴클레오티드.
102. 구현예 95 내지 101 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1, CD69, Nur77, FoxP3 및 HLA-DR 유전자 좌 중에서 선택되는, 폴리뉴클레오티드.
103. 구현예 102에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1인, 폴리뉴클레오티드.
104. 구현예 103에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 PDCD1의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
105. 구현예 104에 있어서,
상기 5' 상동성 암은:
a) 서열번호 66에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 나타내는 서열에 대해 적어도 (약) 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열;
b) 서열번호 66에 제시된 서열 중의 적어도 (약) 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 또는 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열; 또는
c) 서열번호 66에 제시된 서열;
을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
106. 구현예 104 또는 105에 있어서,
상기 3' 상동성 암은:
a) 서열번호 67에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 나타내는 서열에 대해 적어도 (약) 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열;
b) 서열번호 67에 제시된 서열 중의 적어도 (약) 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 또는 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열; 또는
c) 서열번호 67에 제시된 서열;을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
107. 구현예 102에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 CD69인, 폴리뉴클레오티드.
108. 구현예 107에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 CD69의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
109. 구현예 102에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 Nur77인, 폴리뉴클레오티드.
110. 구현예 109에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 Nur77의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
111. 구현예 102에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 FoxP3인, 폴리뉴클레오티드.
112. 구현예 111에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 FoxP3의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
113. 구현예 102에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 HLA-DR 유전자 좌인, 폴리뉴클레오티드.
114. 구현예 113에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 HLA-DR 유전자 좌의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
115. 구현예 92 내지 114 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체 또는 이의 일부는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호를 유도 또는 전달할 수 있는 것인, 폴리뉴클레오티드.
116. 구현예 92 내지 115 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 성분의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하고, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호는 재조합 수용체에 존재하는 세포내 신호전달 도메인을 통한 신호를 포함하거나, 또는
상기 재조합 수용체는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하고, 상기 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호는 재조합 수용체에 존재하는 세포내 신호전달 도메인을 통한 신호를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
117. 구현예 92 내지 116 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 제제에 결합하거나 또는 제제를 인식할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 세포외 영역을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
118. 구현예 117에 있어서,
상기 자극 또는 활성화 신호은 상기 제제의 결합 시 T 세포에서 유도되는, 폴리뉴클레오티드.
119. 구현예 117 또는 118에 있어서,
상기 제제는 표적 항원이고, 선택적으로 상기 표적 항원은 재조합 단백질이거나, 세포의 표면에서 발현되는 항원인, 폴리뉴클레오티드.
120. 구현예 119에 있어서,
상기 표적 항원은 질환, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 연관되거나, 그에 대해 특이적이거나, 그 위에서 발현되는, 폴리뉴클레오티드.
121. 구현예 120에 있어서,
상기 질환, 장애 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환, 또는 종양 또는 암이고, 선택적으로 상기 표적 항원은 종양 항원인, 폴리뉴클레오티드.
122.
구현예 117 내지 121 중의 어느 하나에 있어서,
상기 표적 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 인테그린), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산탈수효소 9(CA9, 또한 CAIX 또는 G250으로 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, 또한 NY-ESO-11 및 LAGE-12로 공지됨), 암태아성 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-11), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(chondroitin sulfate proteoglycan) 4(CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백 2(EPG-12), 상피 당단백 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5, 또한 Fc 수용체 유사 5 또는 FCRH5로 공지됨), 태아성 아세틸콜린 수용체(태아성 AchR), 폴레이트 결합 단백질(FBP), 폴레이트 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화된 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질-커플링된 수용체 부류 C 그룹 5 멤버 D(protein-coupled receptor class C group 5 member D; GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-멜라노마-연관 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-122 수용체 알파(IL-122Rα), IL-113 수용체 알파 2(IL-113Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복 함유 8 패밀리 멤버 A(LRRC8A), 루이스 Y, 멜라노마-연관 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 사이토메갈로바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-11), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 온코페탈 항원, 멜라노마의 우선 발현된 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 세포영양막 당단백(TPBG, 또한 5T4로 공지됨), 종양-연관 당단백 72(TAG72), 티로시나제 관련된 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75라고도 알려짐), 티로시나제 관련된 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토머라제(dopachrome tautomerase), 도파크롬 델타-이소머라제(dopachrome delta-isomerase) 또는 DCT라고도 알려짐), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 윌름스 종양 1(WT-11), 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원, 또는 유니버설 태그로 연관된 항원, 및/또는 비오틴화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드.
123. 구현예 117에 있어서,
상기 제제는 항-이디오타입 항체인, 폴리뉴클레오티드.
124. 구현예 92 내지 123 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 폴리뉴클레오티드.
125. 구현예 124에 있어서,
상기 CAR은 세포외 영역, 막관통 도메인, 및 세포내 영역을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
126. 구현예 125에 있어서,
상기 세포외 영역은 스페이서를 포함하되, 상기 스페이서는 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 작동가능하게 연결되는, 폴리뉴클레오티드.
127. 구현예 125 또는 126에 있어서,
상기 세포외 영역은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 이를 포함하는 결합 도메인을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
128. 구현예 125 내지 127 중의 어느 하나에 있어서,
상기 세포내 영역은 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
129. 구현예 128에 있어서,
상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3 사슬, 선택적으로 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 신호전달 도메인, 또는 이의 신호전달 부분이거나 이를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
130. 구현예 128 또는 129에 있어서,
상기 세포내 영역은 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인(들)을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
131. 구현예 130에 있어서,
상기 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 세포내 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 부분을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
132. 구현예 130 또는 131에 있어서,
상기 공-자극 신호전달 영역은 4-1BB의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
133. 구현예 92 내지 132 중의 어느 하나에 있어서,
상기 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 CAR인 재조합 수용체를 암호화하되, 상기 CAR은 이의 N-말단에서 C-말단의 순서대로: 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 세포내 영역을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
134. 구현예 92 내지 133 중의 어느 하나에 있어서,
상기 전이 유전자는 세포외 결합 도메인, 선택적으로 scFv를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열; 스페이서, 선택적으로 인간 면역글로불린 힌지로부터의 서열, 선택적으로 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터의 서열 또는 이의 변형된 버전, 선택적으로 추가로 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 포함하는 것; 및 막관통 도메인, 선택적으로 인간 CD28로부터의 서열; 공-자극 신호전달 도메인, 선택적으로 인간 4-1BB로부터의 서열; 및 세포내 신호전달 도메인, 선택적으로 CD3ζ 사슬 또는 이의 일부를 순서대로 포함하고/하거나;
상기 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 죄는 세포외 결합 도메인, 선택적으로 scFv를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열; 스페이서, 선택적으로 인간 면역글로불린 힌지로부터의 서열, 선택적으로 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터의 서열 또는 이의 변형된 버전, 선택적으로 추가로 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 포함하는 것; 및 막관통 도메인, 선택적으로 인간 CD28로부터의 서열; 공-자극 신호전달 도메인, 선택적으로 인간 4-1BB로부터의 서열; 및 세포내 신호전달 도메인, 선택적으로 CD3ζ 사슬 또는 이의 일부를 순서대로 포함하는,
폴리뉴클레오티드.
135. 구현예 92 내지 134 중의 어느 하나에 있어서,
상기 전이 유전자는 재조합 수용체를 암호화하는, 폴리뉴클레오티드.
136. 구현예 92 내지 134 중의 어느 하나에 있어서,
상기 전이 유전자는 재조합 수용체의 일부를 암호화하는, 폴리뉴클레오티드.
137. 구현예 136에 있어서,
상기 재조합 수용체는 2개의 별개의 폴리펩티드 사슬을 함유하되, 상기 전이 유전자에 의해 암호화된 재조합 수용체의 일부는 재조합 수용체의 하나의 사슬인, 폴리뉴클레오티드.
138. 구현예 137에 있어서,
상기 재조합 수용체의 다른 사슬은 제 2 전이 유전자에 의해 암호화되는, 폴리뉴클레오티드.
139. 구현예 124 내지 138 중의 어느 하나에 있어서,
상기 CAR은 다중-사슬 CAR인, 폴리뉴클레오티드.
140. 구현예 139에 있어서,
상기 전이 유전자는 다중-사슬 CAR 중의 하나의 사슬을 암호화하는, 폴리뉴클레오티드.
141. 구현예 92 내지 123 및 135 내지 138 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 재조합 T 세포 수용체(TCR)인, 폴리뉴클레오티드.
142. 구현예 141에 있어서,
상기 재조합 TCR은 알파(TCRα) 사슬 및 베타(TCRβ) 사슬을 포함하고, 상기 전이 유전자는 TCRα 사슬을 암호화하는 핵산 서열 및/또는 TCRβ 사슬을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
143. 구현예 142에 있어서,
상기 전이 유전자는 TCRα 사슬 또는 TCRβ 사슬 중의 하나를 암호화하는, 폴리뉴클레오티드.
144. 구현예 142 또는 143에 있어서,
상기 TCRα 사슬은 하나 이상의 도입된 시스테인 잔기를 포함하는 불변(Cα) 영역을 포함하고/하거나, 상기 TCRβ 사슬은 하나 이상의 도입된 시스테인 잔기를 포함하는 Cβ 영역을 포함하되, 상기 하나 이상의 도입된 시스테인 잔기는 알파 사슬과 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비-천연 이황화물 브릿지를 형성할 수 있으되, 선택적으로 상기 하나 이상의 도입된 시스테인 잔기는 비-시스테인 잔기의 시스테인 잔기로의 대체를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
145. 구현예 144에 있어서,
상기 Cα 영역은 서열번호 92에 제시된 바와 같은 넘버링으로 위치 48에 상응하는 위치에 시스테인을 포함하고/하거나; Cβ 영역은 서열번호 96에 제시된 바와 같은 넘버링으로 위치 57에 상응하는 위치에 시스테인을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
146. 구현예 92 내지 145 중의 어느 하나에 있어서,
상기 전이 유전자는 적어도 하나의 추가 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
147. 구현예 146에 있어서,
상기 적어도 하나의 추가 단백질은 대리 마커(surrogate marker)이되, 선택적으로 상기 대리 마커는 절단된 수용체이고, 선택적으로 상기 절단된 수용체는 세포내 신호전달 도메인이 없고/없거나 그의 리간드에 의해 결합될 때 세포내 신호전달을 매개할 수 없는 것인, 폴리뉴클레오티드.
148. 구현예 92 내지 147 중의 어느 하나에 있어서,
상기 전이 유전자는 멀티시스트로닉 요소(multicistronic element)(들)를 더 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
149. 구현예 148에 있어서,
상기 멀티시스트로닉 요소(들)는 T2A, P2A, E2A 또는 F2A 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 중에서 선택된 리보솜 스킵 요소를 암호화하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
150. 구현예 148 또는 149에 있어서,
상기 멀티시스트로닉 요소는 CAR을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열과 적어도 하나의 추가 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 사이에 위치하고;
상기 재조합 수용체는 재조합 TCR이고, 상기 멀티시스트로닉 요소는 TCRα를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열과 TCRβ를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 사이에 위치하고;
상기 재조합 수용체는 다중-사슬 CAR이고, 상기 멀티시스트로닉 요소는 다중-사슬 CAR의 하나의 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열과 다중-사슬 CAR의 또 다른 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 사이에 위치하고/하거나;
상기 멀티시스트로닉 요소(들)는 재조합 수용체를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열의 상류(upstream)인,
폴리뉴클레오티드.
151. 구현예 92 내지 150 중의 어느 하나에 있어서,
선형 폴리뉴클레오티인, 폴리뉴클레오티드.
152. 구현예 151에 있어서,
이중-가닥 폴리뉴클레오티드인, 폴리뉴클레오티드.
153. 구현예 151에 있어서,
단일-가닥 폴리뉴클레오티드인, 폴리뉴클레오티드.
154. 구현예 92 내지 150 중의 어느 하나에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터에 포함되는, 폴리뉴클레오티드.
155. 구현예 154에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 AAV 벡터인, 폴리뉴클레오티드.
156. 구현예 154에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터인, 폴리뉴클레오티드.
157. 구현예 92 내지 156 중의 어느 하나에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 (약) 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750 또는 4000개의 뉴클레오티드 길이이거나, 또는 상기 중 임의의 것들 사이의 임의의 값인, 폴리뉴클레오티드.
158. 구현예 92 내지 157 중의 어느 하나에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 (약) 1500개 내지 약 2500개의 뉴클레오티드 또는 (약) 1750개 내지 (약) 2250개의 뉴클레오티드 길이인, 폴리뉴클레오티드.
159. 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법으로서,
상기 방법은:
(a) T 세포의 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 T 세포 내로 도입하는 단계; 및
(b) 구현예 92 내지 158 중의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서의 유전자 파괴를 포함하는 T 세포 내로 도입하는 단계;
를 포함하되, 상기 방법은 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 생성하고, 상기 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는, 방법.
160. 구현예 159에 있어서,
상기 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 전이 유전자는 상동성-지시된 수선(HDR)을 통해 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내에 통합되는, 방법.
161. 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법으로서,
상기 방법은:
재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 T 세포 내로 도입하는 단계, 상기 T 세포는 T 세포의 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내에 유전자 파괴를 가짐,
를 포함하되, 상기 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자는 상동성-지시된 수선(HDR)을 통해 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내에 통합되는, 방법.
162. 구현예 159 또는 161에 있어서,
상기 유전자 파괴는 T 세포의 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 T 세포 내로 도입함으로써 수행되는, 방법.
163. 구현예 159 내지 162 중의 어느 하나에 있어서,
상기 방법은 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 생성하고, 상기 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는, 방법.
164. 구현예 159 내지 163 중의 어느 하나에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암(들)을 더 포함하되, 상기 하나 이상의 상동성 암(들)은 T 세포에서 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함하는, 방법.
165. 구현예 164에 있어서,
상기 하나 이상의 상동성 암은 5' 상동성 암 및/또는 3' 상동성 암을 포함하되, 선택적으로 상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 표적 부위를 둘러싸는 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 포함하고, 여기서 상기 표적 부위는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내에 있는, 방법.
166. 구현예 165에 있어서,
상기 표적 부위는 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소의 하류인, 방법.
167. 구현예 165 또는 166에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 구조 [5' 상동성 암]-[전이 유전자]-[3' 상동성 암]을 포함하는, 방법.
168. 구현예 167에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 적어도 하나의 표적 부위를 둘러싸는 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 포함하는, 방법.
169. 구현예 165 내지 168 중의 어느 하나에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 50 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드 길이, (약) 50 내지 (약) 500개의 뉴클레오티드 길이, (약) 50 내지 (약) 250개의 뉴클레오티드 길이, (약) 50 내지 (약) 100개의 뉴클레오티드 길이, (약) 100 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드 길이, (약) 100 내지 (약) 500개의 뉴클레오티드 길이, (약) 100 내지 (약) 250개의 뉴클레오티드 길이, (약) 250 내지 (약) 750 뉴클레오티드 길이, (약) 250 내지 (약) 500개의 뉴클레오티드 길이인, 방법.
170. 구현예 165 내지 169 중의 어느 하나에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400 또는 500개의 뉴클레오티드 길이, 또는 상기 중 임의의 것들 사이의 임의의 값인, 방법.
171. 구현예 165 내지 170 중의 어느 하나에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 100개 미만의 뉴클레오티드 길이이되, 선택적으로 (약) 50, 60, 70, 80 또는 90개의 뉴클레오티드 길이, 또는 상기 중 임의의 것 사이의 임의의 값인, 방법.
172. 구현예 165 내지 171 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1, CD69, Nur77, FoxP3 및 HLA-DR 유전자 좌 중에서 선택되는, 방법.
173. 구현예 172에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1인, 방법.
174. 구현예 173에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 PDCD1의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함하는, 방법.
175. 구현예 174에 있어서,
상기 5' 상동성 암은:
a) 서열번호 66에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 나타내는 서열에 대해 적어도 (약) 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열;
b) 서열번호 66에 제시된 서열의 적어도 (약) 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열; 또는
c) 서열번호 66에 제시된 서열;
을 포함하는, 방법.
176. 구현예 174 또는 175에 있어서,
상기 3' 상동성 암은:
a) 서열번호 67에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 나타내는 서열에 대해 적어도 (약) 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열;
b) 서열번호 67에 제시된 서열의 적어도 (약) 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열; 또는
c) 서열번호 67에 제시된 서열;
을 포함하는, 방법.
177. 구현예 172에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 CD69인, 방법.
178. 구현예 177에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 CD69의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함하는, 방법.
179. 구현예 172에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 Nur77인, 방법.
180. 구현예 179에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 Nur77의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함하는, 방법.
181. 구현예 172에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 FoxP3인, 방법.
182. 구현예 181에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 FoxP3의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함하는, 방법.
183. 구현예 172에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 HLA-DR 유전자 좌인, 방법.
184. 구현예 183에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 HLA-DR 유전자 좌의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함하는, 방법.
185. 구현예 159 내지 184 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체 또는 이의 일부는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호를 유도 또는 전달할 수 있는 것인, 방법.
186. 구현예 159 내지 185 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 성분의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하고, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호는 재조합 수용체에 존재하는 세포내 신호전달 도메인을 통한 신호를 포함하거나, 또는
상기 재조합 수용체는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하고, T 세포에서 자극 또는 활성화 신호는 재조합 수용체에 존재하는 세포내 신호전달 도메인을 통한 신호를 포함하는,
방법.
187. 구현예 159 내지 186 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 제제에 결합하거나 또는 제제를 인식할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 세포외 영역을 포함하는, 방법.
188. 구현예 187에 있어서,
상기 제제의 결합 시 상기 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호가 유도되는, 방법.
189. 구현예 187 또는 188에 있어서,
상기 제제는 표적 항원이되, 선택적으로 상기 표적 항원은 재조합 단백질이거나 또는 세포의 표면 상에서 발현되는 항원인, 방법.
190. 구현예 189에 있어서,
상기 표적 항원은 질환, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 연관되거나, 그에 특이적이거나 또는 그 위에서 발현되는, 방법.
191. 구현예 190에 있어서,
상기 질환, 장애 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환, 또는 종양 또는 암인, 방법.
192. 구현예 187 내지 191 중의 어느 하나에 있어서,
상기 표적 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 인테그린), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산탈수효소 9(CA9, 또한 CAIX 또는 G250으로 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, 또한 NY-ESO-11 및 LAGE-12로 공지됨), 암태아성 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-11), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(chondroitin sulfate proteoglycan) 4(CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백 2(EPG-12), 상피 당단백 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5, 또한 Fc 수용체 유사 5 또는 FCRH5로 공지됨), 태아성 아세틸콜린 수용체(태아성 AchR), 폴레이트 결합 단백질(FBP), 폴레이트 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화된 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질-커플링된 수용체 부류 C 그룹 5 멤버 D(protein-coupled receptor class C group 5 member D; GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-멜라노마-연관 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-122 수용체 알파(IL-122Rα), IL-113 수용체 알파 2(IL-113Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복 함유 8 패밀리 멤버 A(LRRC8A), 루이스 Y, 멜라노마-연관 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 사이토메갈로바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-11), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 온코페탈 항원, 멜라노마의 우선 발현된 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 세포영양막 당단백(TPBG, 또한 5T4로 공지됨), 종양-연관 당단백 72(TAG72), 티로시나제 관련된 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75라고도 알려짐), 티로시나제 관련된 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토머라제(dopachrome tautomerase), 도파크롬 델타-이소머라제(dopachrome delta-isomerase) 또는 DCT라고도 알려짐), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 윌름스 종양 1(WT-11), 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원, 또는 유니버설 태그로 연관된 항원, 및/또는 비오틴화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자로부터 선택되는, 방법.
193.
구현예 191 또는 192에 있어서,
상기 유전자 파괴는 표적 부위에 특이적으로 결합하거나, 인식하거나, 또는 혼성화하는 징크 핑거 핵산분해효소(ZFN), TAL-이펙터 핵산분해효소(TALEN), 또는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것인, 방법.
194.
구현예 159 내지 193 중의 어느 하나에 있어서,
상기 유전자 파괴는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것이고, 상기 CRISPR-Cas9 조합은 적어도 하나의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는, 방법.
195.
구현예 194에 있어서,
상기 CRISPR-Cas9 조합은 gRNA 및 Cas9 단백질을 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체인, 방법.
196.
구현예 195에 있어서,
상기 유전자 파괴는 전기천공을 통해 복수의 T 세포 내로 도입된 RNP에 의해 이루어지는 것인, 방법.
197.
구현예 159 내지 196 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1인, 방법.
198.
구현예 197에 있어서,
상기 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것이고, 상기 gRNA는 PDCD1 유전자에서 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 것인, 방법.
199.
구현예 198에 있어서,
상기 gRNA는 서열번호 75 및 104-109 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는, 방법.
200.
구현예 198 또는 199에 있어서,
상기 gRNA는 서열번호 75에 제시된 서열을 포함하는, 방법.
201.
구현예 159 내지 196 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 CD69인, 방법.
202.
구현예 201에 있어서,
상기 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것이고, 상기 gRNA는 CD69 유전자에서 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 것인, 방법.
203.
구현예 202에 있어서,
상기 gRNA는 서열번호 116-121 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는, 방법.
204.
구현예 159 내지 196 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 Nur77인, 방법.
205.
구현예 204에 있어서,
상기 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것이고, 상기 gRNA는 Nur77 유전자에서 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 것인, 방법.
206.
구현예 205에 있어서,
상기 gRNA는 서열번호 122-127 및 134-136에 제시된 서열을 포함하는, 방법.
207.
구현예 159 내지 196 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 FoxP3인, 방법.
208.
구현예 159 내지 196 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 HLA-DR 유전자 좌인, 방법.
209.
구현예 159 내지 208 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포는 내인성 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC) 유전자 및/또는 내인성 T 세포 수용체 베타 불변 영역(TRBC) 유전자에서의 유전자 파괴를 더 포함하는, 방법.
210.
구현예 209에 있어서,
상기 유전자 파괴는 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 내에 있는 적어도 하나의 표적 부위에 특이적으로 결합하거나, 인식하거나, 또는 혼성화하는 징크 핑거 핵산분해효소(ZFN), TAL-이펙터 핵산분해효소(TALEN), 또는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것인, 방법.
211.
구현예 209 또는 210에 있어서,
상기 유전자 파괴는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지고, CRISPR-Cas9 조합은 적어도 하나의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 가이드 RNA(gRNA)를 포함하되, 선택적으로 상기 CRISPR-Cas9 조합은 gRNA 및 Cas9 단백질을 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체이고, 선택적으로 상기 유전자 파괴는 전기천공을 통해 복수의 T 세포 내로 도입된 RNP에 의해 이루어지는 것인, 방법.
212.
구현예 209 내지 211 중의 어느 하나에 있어서,
상기 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것이고, 상기 gRNA는 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 내에 있는 적어도 하나의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 것인, 방법.
213.
구현예 212에 있어서,
상기 gRNA는 TRAC 유전자 내의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 것인, 방법.
214.
구현예 213에 있어서,
상기 gRNA는 서열번호 77 및 188-218 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는, 방법.
215.
구현예 213 또는 214에 있어서,
상기 gRNA는 서열번호 77에 제시된 서열을 포함하는, 방법.
216.
구현예 212에 있어서,
상기 gRNA는 TRBC 유전자 내의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 것인, 방법.
217.
구현예 216에 있어서,
상기 gRNA는 서열번호 219-276 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는, 방법.
218.
구현예 159 내지 217 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 방법.
219.
구현예 159 내지 217 중의 어느 하나에 있어서,
상기 암호화된 재조합 수용체는 재조합 T 세포 수용체(TCR)이거나 이를 포함하는, 방법.
220.
구현예 211 내지 219 중의 어느 하나에 있어서,
상기 RNP는 전기천공, 입자 총, 인산칼슘 형질감염, 세포 압축(compression) 또는 압착(squeezing)을 통해 도입되는, 방법.
221.
구현예 220에 있어서,
상기 RNP는 전기천공을 통해 복수의 T 세포 내로 도입되는, 방법.
222.
구현예 220 또는 221에 있어서,
상기 RNP의 농도는 (약) 1 μM 내지 (약) 5 μM이고, 선택적으로 상기 RNP의 농도는 (약) 2 μM인, 방법.
223.
구현예 159 내지 222 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포는 CD8+ T 세포 및/또는 CD4+ T 세포 또는 이의 하위유형을 포함하는, 방법.
224.
구현예 159 내지 223 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포는 대상체에 대해 자가성인, 방법.
225.
구현예 159 내지 224 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포는 대상체로부터 유래된 1차 T 세포이되, 선택적으로 상기 대상체는 인간이다, 방법.
226.
구현예 159 내지 225 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포는 대상체에 대해 동종이계인, 방법.
227.
구현예 159 내지 224 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포는 다능성 또는 만능 세포, 선택적으로는 iPSC로부터 유래되는, 방법.
228.
구현예 159 내지 227 중의 어느 하나에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 선형 폴리뉴클레오티드인, 방법.
229.
구현예 228에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드인, 방법.
230.
구현예 228에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 폴리뉴클레오티드인, 방법.
231.
구현예 159 내지 227 중의 어느 하나에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터에 포함되는, 방법.
232.
구현예 231에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 AAV 벡터인, 방법.
233.
구현예 231에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 선택적으로 렌티바이러스 벡터인, 방법.
234.
구현예 159 내지 233 중의 어느 하나에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 (약) 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750 또는 4000개의 뉴클레오티드 길이, 또는 상기 것들 사이의 임의의 값인, 방법.
235.
구현예 159 내지 234 중의 어느 하나에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 (약) 1500 내지 (약) 2500개의 뉴클레오티드 또는 (약) 1750 내지 (약) 2250개의 뉴클레오티드 길이인, 방법.
236.
구현예 159, 160 및 162 내지 235 중의 어느 하나에 있어서,
상기 하나 이상의 제제(들) 및 폴리뉴클레오티드는 임의의 순서로 동시에 또는 순차적으로 도입되는, 방법.
237.
구현예 159, 160 및 162 내지 236 중의 어느 하나에 있어서,
상기 하나 이상의 제제(들) 및 폴리뉴클레오티드는 동시에 도입되는, 방법.
238.
구현예 159, 160 및 162 내지 236 중의 어느 하나에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 제제(들)의 도입 후에 도입되는, 방법.
239.
구현예 238에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 제제의 도입 직후, 또는 약 30초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 6분, 8분, 9분, 10분, 15분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분, 90분, 2시간, 3시간 또는 4시간 내에 도입되는, 방법.
240.
구현예 159, 160 및 162 내지 239 중의 어느 하나에 있어서,
상기 하나 이상의 제제(들) 및/또는 폴리뉴클레오티드의 도입 전에, 상기 방법은 하나 이상의 면역 세포를 자극 또는 활성화시키는 조건 하에 세포를 자극제(들)와 함께 시험관 내에서 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 방법.
241.
구현예 240에 있어서,
상기 자극제(들)는 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 포함하는, 방법.
242.
구현예 240 또는 241에 있어서,
상기 자극제(들)는 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 포함하는 올리고머 입자 시약을 포함하는, 방법.
243.
구현예 240 내지 242 중의 어느 하나에 있어서,
상기 자극제(들)는 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체로 코팅된 비드를 포함하는, 방법.
244.
구현예 159, 160 및 162 내지 243 중의 어느 하나에 있어서,
상기 방법은 하나 이상의 제제의 도입 및/또는 폴리뉴클레오티드의 도입 전, 도입 동안 또는 도입 후에 세포를 하나 이상의 재조합 사이토카인과 함께 인큐베이션하는 단계를 더 포함하되, 상기 하나 이상의 재조합 사이토카인은 IL-2, IL-7, 및 IL-15로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
245.
구현예 244에 있어서,
상기 하나 이상의 재조합 사이토카인은 (약) 10 U/mL 내지 (약) 200 U/mL, 선택적으로 (약) 50 IU/mL 내지 (약) 100 U/mL의 IL-2; 0.5 ng/mL 내지 50 ng/mL, 선택적으로 (약) 5 ng/mL 내지 (약) 10 ng/mL의 IL-7; 및/또는 0.1 ng/mL 내지 20 ng/mL, 선택적으로 (약) 0.5 ng/mL 내지 (약) 5 ng/mL의 IL-15의 농도 중에서 선택되는 농도로 첨가되는, 방법.
246.
구현예 244 또는 245에 있어서,
상기 인큐베이션은 하나 이상의 제제의 도입 및 폴리뉴클레오티드의 도입 후 최대 또는 대략 24 시간, 36 시간, 48 시간, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21 일 동안, 선택적으로 최대 또는 약 7 일 동안 수행되는, 방법.
247. 구현예 159 내지 246 중의 어느 하나의 방법을 사용하여 생성된 조작된 T 세포 또는 복수의 조작된 T 세포.
248. 구현예 247의 조작된 세포 또는 구현예 247의 복수의 조작된 세포를 포함하는 조성물.
249.
구현예 248에 있어서,
상기 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후 (약) 6, 12, 18, 24, 36 또는 48 시간 미만 이내에 조성물 중의 하나 이상의 세포에서 상향조절되거나 유도되는, 조성물.
250.
구현예 248 또는 249에 있어서,
상기 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에, 상기 조성물 중의 세포 중에서 작동가능하게 연결된 전이 유전자를 발현하는 세포의 빈도는 (약) 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과보다 더 큰 것인, 조성물.
251.
구현예 248 내지 250 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포에서 발현의 상향조절 또는 유도 후 또는 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에, 상기 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 조성물 중의 하나 이상의 세포에서 감소되거나 하향조절되는, 조성물.
252.
구현예 248 내지 251 중의 어느 하나에 있어서,
상기 발현의 상향조절 또는 유도 후, 또는 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후, 상기 조성물 중의 세포 중에서 작동가능하게 연결된 전이 유전자를 발현하는 세포의 빈도는 (약) 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과보다 더 크게 감소되는, 조성물.
253.
구현예 248 내지 252 중의 어느 하나에 있어서,
상기 발현의 상향조절 또는 유도 후, 상기 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일 또는 그 초과 후에 조성물 중의 하나 이상의 세포에서 감소되거나 하향조절되는, 조성물.
254.
구현예 248 내지 253 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물 중의 하나 이상의 세포에서 상기 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후 (약) 6, 12, 18, 24, 36 또는 48 시간 미만 이내에 감소되거나 하향조절되는, 조성물.
255.
구현예 254에 있어서,
상기 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에, 상기 조성물 중의 세포 중에서 재조합 수용체를 발현하는 세포의 빈도는 (약) 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 또는 그 미만보다 적은 것인, 조성물.
256.
구현예 248 내지 255 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는, 조성물.
257.
구현예 248 내지 256 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하고, CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비는 (약) 1:3 내지 3:1, 선택적으로 1:1인, 조성물.
258. 치료 방법으로서,
구현예 1 내지 81 및 247 중의 어느 하나의 조작된 세포 또는 구현예 82 내지 91 및 248 내지 257 중의 어느 하나의 조성물을 질환 또는 장애를 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 치료 방법.
259. 질환 또는 장애를 치료하기 위한, 구현예 1 내지 81 및 247 중의 어느 하나의 조작된 세포 또는 구현예 82 내지 91 및 248 내지 257 중의 어느 하나의 조성물의 용도.
260. 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조하기 위한, 구현예 1 내지 81 및 247 중의 어느 하나의 조작된 세포 또는 구현예 82 내지 91 및 248 내지 257 중의 어느 하나의 조성물의 용도.
261. 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한, 구현예 1 내지 81 및 247 중의 어느 하나의 조작된 세포 또는 구현예 82 내지 91 및 248 내지 257 중의 어느 하나의 조성물의 용도.
262. 구현예 258 내지 261 중의 어느 하나에 있어서,
상기 질환 또는 장애는 암 또는 종양인, 사용 방법, 용도 또는 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물.
263. 구현예 262에 있어서,
상기 암 또는 종양은 혈액 악성종양, 선택적으로 림프종, 백혈병, 또는 형질 세포 악성종양인, 사용 방법, 용도 또는 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물.
264. 구현예 262 또는 263에 있어서,
상기 암은 림프종이고, 상기 림프종은 버킷 림프종, 비-호지킨 림프종(NHL), 호지킨 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 여포성 림프종, 소형 비-절단 세포 림프종, 점막-연관 림프 조직 림프종(MALT), 변연부 림프종, 비장 림프종, 결절 단핵구 B 세포 림프종, 면역모세포 림프종, 대세포 림프종, 미만성 혼합 세포 림프종, 폐 B 세포 혈관중심성 림프종, 소형 림프구성 림프종, 원발성 종격 B 세포 림프종, 림프형질세포성 림프종(LPL), 또는 맨틀 세포 림프종(MCL)인, 사용 방법, 용도 또는 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물.
265. 구현예 262 내지 264 중의 어느 하나에 있어서,
상기 암은 백혈병이고, 상기 백혈병은 만성 림프구성 백혈병(CLL), 형질 세포 백혈병 또는 급성 림프구성 백혈병(ALL)인, 사용 방법, 용도 또는 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물.
266. 구현예 262 내지 265 중의 어느 하나에 있어서,
상기 암은 형질 세포 악성종양이고, 상기 형질 세포 악성종양은 다발성 골수종(MM)인, 사용 방법, 용도 또는 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물.
267. 구현예 262에 있어서,
상기 종양은 고형 종양인, 사용 방법, 용도 또는 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물.
269. 구현예 267에 있어서,
상기 고형 종양은 비-소세포 폐암(NSCLC) 또는 두경부 편평 세포 암종(HNSCC)인, 사용 방법, 용도 또는 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물.
270. 키트로서,
T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들); 및
구현예 92 내지 158 중의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드;
를 포함하는, 키트.
271. 키트로서,
T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들); 및
재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 재조합 수용체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 사슬을 암호화하는 전이 유전자는 상동성-지시된 수선(HDR)을 통해 표적 부위에서 또는 그 근처에서 통합을 위해 표적화됨; 및
구현예 159 내지 246 중의 어느 하나의 방법을 수행하기 위한 지침;
을 포함하는 키트.
X.
실시예
하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 포함되며, 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
1: T 세포 자극-연관된 분자의 발현 동역학
다양한 T 세포 자극 신호-연관된 마커의 발현을 시간 경과에 따라 평가하여, 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산 서열의 표적화 통합을 위한 후보 유전자 좌를 확인하였다. CAR을 암호화하는 핵산 서열은 자극-연관된 마커를 암호화하는 세포의 게놈 내의 표적 유전자 좌 내로 통합되어, CAR의 발현이 자극-연관된 마커를 암호화하는 유전자의 프로모터의 작동가능한 제어 하에 있도록 하였다. 일부 경우에, 암호화된 CAR은 예를 들어 CD3-제타(CD3ζ사슬, 또는 그의 신호전달 부분으로부터의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유하는 신호전달 도메인을 함유한다. 도 1에 도시된 바와 같이, 일부 경우에, CAR의 발현은 피드백 루프에 의해 조절될 수 있고, 예를 들어 CAR에 존재하는 ITAM 도메인을 통해 조작된 T 세포에서 T 세포 자극 신호의 전달 후에 발현될 수 있다. 상기 발현은 T 세포 자극 신호가 존재하지 않는 경우, 예를 들어 표적 항원에 의한 CAR의 결합으로부터의 자극 신호의 부재 하에 감소되거나 턴 오프(turn off)될 수 있다.
인간 공여자로부터 수득된 1차 T 세포를 항-CD3/항-CD28 Fab 항체 단편 또는 항-CD3/항-CD28 항체 접합된 비드가 로딩된 가용성 다량체 시약과 함께 0일째에 인큐베이션하고, 이어서 7일 동안 배양하고, 이어서 동일한 시약을 사용하여 7일 후에 재-자극을 수행하였다. 분화 클러스터 25(CD25), CD69, CD45RA 및 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1), 후보 자극-연관된 마커의 발현을 시간 경과에 따라 유세포 측정법에 의해 모니터링하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, CD25, CD69 및 PD-1의 발현은 자극 후에 증가하였다. 초기 자극 후 약 7일에, CD69 및 PD-1의 발현은 감소하였고, 이는 자극-연관된 마커의 하향조절과 일치한다. CD29 및 PD-1의 발현이 감소된 후, 세포를 동일한 시약을 사용하여 재-자극하였다. 재-자극 후, CD69 및 PD-1의 발현은 다시 빠르게 증가하는 것으로 관찰되었다. CD25의 발현은 약 7일 동안 그리고 재-자극 후에 높게 유지되었다. CD45RA의 발현은 약 3일 후에 감소하였고, 재-자극 후에 증가하지 않았다. PD-1은 CAR을 암호화하는 핵산 서열의 표적화된 통합을 위한 위치 중 하나로서 선택되었다.
실시예
2: 자극-연관된
마커
프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1)의 프로모터의 제어 하에 예시적인
키메라
항원 수용체(CAR)의 발현
예시적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산 서열을 CRISPR/Cas9 매개된 유전자 편집에 의해, 그리고 상동성-의존성 수선(HDR)을 통한 유전자 파괴의 부위에서의 표적화된 통합에 의해 T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬 및/또는 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1)을 암호화하는 내인성 유전자 좌에서 유전자 파괴와 함께 T 세포 내로 도입하였다.
A. 조작된 T 세포의 생성
인간 TCR α 불변 영역(TRAC) 유전자 또는 PD-1(PDCD1)을 암호화하는 유전자에서의 통합을 표적화하기 위한 5' 및 3' 상동성 서열에 의해 플랭킹된, 예시적인 항-CD19 CAR을 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 선형 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오티드를 HDR-매개된 표적화를 위해 생성하였다. 암호화된 항-CD19 CAR은 뮤린 항체로부터 유래된 scFv(FMC63, VL-링커-VH 배향으로부터 유래된 가변 영역), 3개의 스트렙-태그 II 서열, CD28로부터 유래된 막관통 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공-자극 영역, 및 CD3-제타 세포내 신호전달 도메인을 함유하였다. 폴리뉴클레오티드는 또한 CAR-암호화 서열의 상류에 P2A 리보솜 스킵 서열을 함유하여, 삽입된 핵산 서열이 삽입 부위에서 내인성 프로모터의 제어 하에 발현될 수 있게 하고, 전사 종결 및 mRNA 성숙을 위한 폴리아데닐화 신호를 허용하였다. 항-CD19 CAR을 암호화하는 예시적인 핵산 서열이 서열번호 64에 기재되어 있다. PDCD1 유전자 좌에서의 표적화를 위해, 핵산 서열은 대략 100 내지 200개의 염기쌍(각각 서열번호 66 및 67에 기재됨)의 5' 및 3' 상동성 암에 의해 플랭킹되고, 서열번호 68 및 69에 기재된 프라이머를 사용하여 증폭되었다. TRAC 유전자 좌에서의 표적화를 위해, 핵산 서열은 대략 50 내지 70개의 염기쌍(각각 서열번호 68 및 69에 기재됨)의 5' 및 3' 상동성 암에 의해 플랭킹되고, 서열번호 72 및 73에 기재된 프라이머를 사용하여 증폭되었다.
1차 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 자극하고, 배양하고, PD1-표적화 gRNA(서열번호 75에 기재됨) 또는 TRAC-표적화 gRNA(서열번호 77에 기재됨)를 함유하는 리보핵단백질(RNP) 복합체, 및 PDCD1 또는 TRAC 유전자 좌에서의 CAR-암호화 핵산의 HDR-매개된 표적화를 위한 선형 폴리뉴클레오티드를 사용하여 1-단계 전기천공에 적용하였다. T 세포를 항-CD3/항-CD28 Fab 항체 단편이 로딩된 가용성 다량체 시약과 함께 인큐베이션하거나 약 48시간 동안 시약 없이 휴지시킴으로써 자극하였다. 세포를 세척하고, 전기천공 믹스에 현탁시켰다. TRAC-표적화 gRNA 및 Cas9 단백질을 함유하는 예비-조립된 RNP 복합체를 선형 폴리뉴클레오티드와 혼합한 다음, 세포 현탁액에 첨가하였다. 세포를 전기천공에 적용한 다음, 배양 배지에서 5일 동안 인큐베이션하였다. 대조군으로서, 세포를 RNP 복합체 단독(주형 폴리뉴클레오티드 없이) 또는 RNP 복합체 없이 전기천공에 적용하였다. 전기천공 후 5일(초기 자극 후 7일)에, 세포를 동일한 시약을 사용하여 재-자극에 적용하거나, 재-자극 없이 휴지시켰다. 세포를 항-CD3 항체, 항-스트렙-태그 시약으로 염색한 후에 유세포 측정법에 의해 평가하여, CAR, 항-PD1 항체 및 항-CD69 항체의 발현을 평가하여, CAR 및 마커의 발현을 시간 경과에 따라 모니터링하였다.
B. 예시적인 CAR의 발현
도 3a 및 도 3b에 도시된 바와 같이, PDCD1 및 PDCD1-표적화 주형 폴리뉴클레오티드를 표적화하는 RNP 복합체로 도입된 세포는 PD-1의 녹아웃을 갖는 CAR-발현 세포를 생성하였고(PD-1 KO PD-1 CAR 군에서 PD1-CAR+ 세포의 존재에 의해 관찰됨; 도 3b); TRAC 및 TRAC-표적화 주형 폴리뉴클레오티드를 표적화하는 RNP 복합체로 도입된 세포는 초기 자극 7일 후에 내인성 CD3의 녹아웃을 갖는 CAR-발현 세포를 생성하였다(TRAC KO TRAC KI CAR 군에서 CD3-CAR+ 세포의 존재에 의해 관찰됨; 도 3b).
C. CAR 발현의 자극-연관 제어
내인성 TRAC 유전자 좌에서 CAR-암호화 핵산 서열을 통합함으로써 조작된 CAR-발현 세포의 백분율(TRAC KI CAR; 내인성 TRAC 프로모터의 제어 하에)은 재자극된 세포 및 휴지된 세포에서 유사하였고; PD-1 및 CD69를 발현하는 세포의 백분율은 재자극 후에 증가하였다(도 4a 참조). 비교하여, 내인성 PDCD1 유전자 좌에서 CAR-암호화 핵산 서열을 통합함으로써 조작된 CAR-발현 세포(PD1 KI CAR; 내인성 PDCD1 프로모터의 제어 하에)의 백분율은 휴지된 세포와 비교하여 재자극된 세포에서 더 높았고; CD69를 발현하는 세포의 백분율은 재자극 후에 증가하였다(도 4b 참조). 대조군 세포는 재자극 후에 PD-1 및 CD69 발현의 증가를 보여주었다(도 4c 참조).
내인성 TRAC 유전자 좌에서 핵산의 통합에 의해 조작된 세포의 집단에서 CAR+ 세포의 백분율은 시간이 지남에 따라 증가하였고, 재자극된 세포와 휴지된 세포 사이에 유사하였다(도 5a 참조). 비교하여, 내인성 PDCD1 유전자 좌에서 핵산의 통합에 의해 조작된 세포의 집단에서 CAR+ 세포의 백분율은 시간이 지남에 따라 증가하였고, 재자극 후에 재자극된 세포에서 실질적으로 더 높았다(도 5b 참조).
D.
결론
예시적인 자극-연관 내인성 유전자 좌, 예를 들어 내인성 PDCD1 유전자 좌의 프로모터의 제어 하에 예시적인 CAR의 발현은 또한 T 세포의 자극 신호에 의존하는 것으로 관찰되었다. 발현은 휴지된 세포와 비교하여 세포의 재자극 시에 실질적으로 증가하였다. 결과는 T 세포 자극 또는 활성화 신호에 기초하여 CAR의 발현을 조절하기 위한 CAR-암호화 서열의 표적화된 통합의 사용을 지지한다.
실시예
3: 자극-연관된
마커
프로그래밍된
세포 사멸 단백질 1(PD-1)의 프로모터의 제어 하에 예시적인
키메라
항원 수용체(CAR)를 발현하는 조작된 T 세포의 활성의 평가
상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성된 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD-1)을 암호화하는 내인성 유전자 유전자 좌로부터 예시적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포의 활성을 평가하였다.
A. 조작된 T 세포
1차 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포를, 일반적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이, 내인성 PDCD1 유전자 좌에 CAR-코딩 핵산 서열을 통합시킴으로써 예시적인 항-CD19 CAR(내인성 PDCD1 프로모터의 제어 하; PD1 KI CAR)을 발현하도록 조작하였다. PDCD1 KO 세포 (PDCD1 표적화 RNP 복합체만으로, 주형 폴리뉴클레오티드 없이 전기천공됨; PD1 KO), 모의 처리된 세포(음성 대조군), 및/또는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 조작된 동일한 예시적인 CAR을 발현하는 세포(LV 대조군)를 대조군으로서 사용하였다.
B. 증폭
조작된 T 세포의 항원-특이적 증폭을 평가하기 위해, PD1 KI CAR(변형된 PDCD1 유전자 좌로부터 항-CD19 CAR을 발현시킴), 상기 기재된 PD1 KO, 음성 대조군 및 LV 대조군 세포를 전기천공 후 7일 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 방사선조사된 CD19-발현 림프아구성 세포주(LCL)와 함께 7일 간격으로 2개의 라운드의 공동-배양으로 증폭시켰다. 항원-특이적 자극 후 세포의 증폭을 유세포 측정법, 항-CD8 항체 및 항-이디오타입 항체로 염색하여 예시적인 항-CD19 CAR의 발현을 검출함으로써 평가하였다.
도 6a 및 도 6b에 도시된 바와 같이, PDCD1 프로모터의 제어 하에 CAR을 발현하는 세포(PD1 KI CAR)의 백분율은 제 1 및 제 2 자극 후에 실질적으로 증가하였다. 렌티바이러스 벡터 및 무작위 통합을 사용하여 조작된 CAR을 발현하는 세포(LV 대조군)는 또한 항원-특이적 자극 후 확장을 나타내었지만, PD1 KI CAR 세포와 비교하여 더 적은 정도로 증폭을 나타내었다. 결과는 자극-관련 PDCD1 프로모터의 제어 하에 CAR을 발현하는 세포가 항원-특이적 자극 시 효율적으로 증폭되었음을 보여주었다.
C. 재-자극 후의 발현
변형된 PDCD1 유전자 좌로부터 항-CD19 CAR을 발현하는 조작된 T 세포의 재-자극 후에 CAR 발현을 평가하였다. PD1 KI CAR 및 PD1 KO 세포를 방사선조사된 CD19-발현 LCL과의 공동 배양에 의해, 또는 재자극 없이 휴지시킴으로써 초기 자극 및 증폭 후 재자극시켰다. 예시적인 항-CD19 CAR의 발현을 검출하기 위해, 자극-연관된 마커(CD25, CD69) 및 항-이디오타입 항체에 대한 염색인 유세포 측정법에 의해 세포를 평가하였다.
도 7a 내지 7c에 도시된 바와 같이, 항-CD19 CAR의 CAR-발현 세포의 백분율(도 7a 및 7b) 및 평균 발현 수준(평균 형광 강도, MFI에 의해 결정됨; 도 7b 및 7c)은 재자극되지 않은 세포(PD1 KI CAR 휴지됨)와 비교하여, 재자극 후 PD1 KI CAR 세포(PD1 KI CAR 재자극)에서 증가하였다. CD25+ CD69+ 세포의 백분율은 또한 재-자극 후 세포에서 더 높았다(도 7b).
D. 재-자극 후
세포용해
활성
변형된 PDCD1 유전자 좌로부터 항-CD19 CAR을 발현하는 조작된 T 세포의 재-자극 후에 표적-특이적 세포용해 활성을 평가하였다. PD1 KI CAR 및 PD1 KO 세포를 방사선조사된 CD19-발현 LCL과의 공동 배양에 의해, 또는 재자극 없이 휴지시킴으로써 초기 자극 및 확장 후 재자극시켰다. 세포용해 활성을 10:1의 이펙터 대 표적 (E:T) 비에서 CD19를 발현하는 표적 세포와 함께 배양된 항-CD19 CAR-발현 이펙터 세포의 임피던스 측정에 의해 평가하였다. 항원-특이적으로 표적 세포를 용해시키는 T 세포의 능력은 공동-배양 후 최대 24시간 동안 표적 세포의 탈착을 측정함으로써 평가하였다. 모의 처리된 세포(음성 대조군), LV 대조군 및 인간 배아 신장(HEK) 세포를 대조군으로서 사용하였다.
도 7d에 도시된 바와 같이, 재자극된 PD1 KI CAR 세포는 재자극되지 않은 PD1 KI CAR 세포 또는 LV 대조군보다 더 효율적으로 표적 세포를 사멸시켰다.
E. 결론
예시적인 자극-연관 내인성 유전자 좌 PDCD1의 제어 하에 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포(PD1 KI CAR)는 CAR의 자극-의존적 발현, 및 자극시 효율적인 표적 세포 사멸을 나타냈다. 결과는 T 세포 자극 또는 활성화 신호에 기초하여 CAR의 발현 및 기능을 조절하기 위한 CAR-암호화 서열의 표적화된 통합의 사용을 뒷받침한다.
실시예
4: 마우스에서 PD1의 제어 하에 예시적인 CAR을 발현하는 조작된 T 세포의
생체내
항-종양 효과의 평가
상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성된 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD1)을 암호화하는 내인성 유전자 좌로부터 예시적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 조작된 T 세포의 항-종양 활성을 종양 마우스 모델에서 조작된 세포의 투여에 의해 평가하였다.
NOD.Cg.PrkdcscidIL2rgt m1Wjl /SzJ(NSG) 마우스에 반딧불이 루시페라제(Raji-Wluc)로 형질감염된 0.5×106개의 Raji 림프종 종양 세포(CD19를 발현하는 불멸화 인간 B 림프구 종양 세포주)를 정맥내(i.v.) 주사하였다. 종양 생착은 6일 동안 일어나도록 하고, 생물발광 영상화를 사용하여 확인하였다. 종양 세포 주사 7일 후, 마우스는 치료를 받지 않거나, 또는 1×106개의 상기 실시예 2에 기재된 바와 같은 예시적인 항-CD19 CAR을 발현하도록 조작된 1차 인간 T 세포(PD1 KI CAR), 또는 렌티바이러스 벡터 전달 및 무작위 통합에 의해 동일한 항-CD19 CAR을 발현하도록 조작된 1차 인간 T 세포(LV 대조군)를 단일 정맥내(i.v.) 주사받았다. 종양 부담은 조작된 T 세포의 투여 후 최대 35일 동안 매주 생물발광에 의해 평가되었다. 생물발광 영상화를 위해, 마우스에게 PBS(15 μg/g 체중)에 재현탁된 루시페린 기질(CaliperLife Sciences, Hopkinton, MA)을 복강내(i.p.) 주사하였다. 평균 반경(p/s/cm2/sr)이 결정되었다. 실험의 타임라인의 개략도가 도 8a에 도시되어 있다.
도 8b 내지 8d에 도시된 바와 같이, PD1 KI CAR 또는 LV 대조군이 투여된 마우스는 종양 세포 성장의 감소 및 생존의 증가를 초래하였다. 이들 결과는 예시적인 자극-연관 내인성 유전자 좌 PDCD1의 제어 하에 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포(PD1 KI CAR)의 생체내 항종양 활성을 입증한다.
본 발명은 예를 들어 본 발명의 다양한 구현예를 예시할 목적으로 제공되는 특정 개시된 실시예로 그 범위가 제한되도록 의도되어서는 안된다. 기재된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형은 본원의 설명 및 교시로부터 명백해질 것이다. 이러한 변형은 본 개시의 진정한 범위 및 사상을 벗어남이 없이 실시될 수 있으며 본 개시의 범위 내에 속하도록 의도된다.
서열
SEQUENCE LISTING
<110> Juno Therapeutics GmbH
<120> ENGINEERED T CELLS CONDITIONALLY EXPRESSING A RECOMBINANT
RECEPTOR, RELATED POLYNUCLEOTIDES AND METHODS
<130> 73504-20138.40
<140> Not Yet Assigned
<141> 2021-06-25
<150> 63/044,984
<151> 2020-06-26
<160> 297
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> spacer (IgG4hinge)
<400> 1
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> spacer (IgG4hinge)
<400> 2
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge-CH3 spacer
<400> 3
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 4
<211> 229
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge-CH2-CH3 spacer
<400> 4
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 5
<211> 282
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgD-hinge-Fc
<400> 5
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A
<400> 6
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 7
<211> 357
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tEGFR
<400> 7
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28 (amino acids 153-179)
<400> 8
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 9
<211> 66
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28 (amino acids 114-179)
<400> 9
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 10
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28 (amino acids 180-220)
<400> 10
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 11
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28 (LL to GG)
<400> 11
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 12
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4-1BB (amino acids 214-255)
<400> 12
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3 zeta
<400> 13
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3 zeta
<400> 14
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3 zeta
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 16
<211> 335
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tEGFR
<400> 16
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 17
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A
<400> 17
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 18
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2A
<400> 18
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2A
<400> 19
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E2A
<400> 20
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 21
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F2A
<400> 21
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> REPEAT
<222> (5)...(9)
<223> Repeats 5 or 6 times
<400> 22
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro
1 5 10
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 23
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 24
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSFR alpha chain signal sequence
<400> 24
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 25
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSFR alpha chain signal sequence
<400> 25
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 26
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8 alpha signal peptide
<400> 26
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 27
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 28
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 29
<211> 61
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 29
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
1 5 10 15
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
20 25 30
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro
35 40 45
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 30
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(1)
<223> Xaa is gly, cys or arg
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)...(4)
<223> Xaa is cys or thr
<400> 31
Xaa Pro Pro Xaa Pro
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 32
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 33
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 34
Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L1
<400> 35
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L2
<400> 36
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L3
<400> 37
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR H1
<400> 38
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR H2
<400> 39
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR H3
<400> 40
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1 5
<210> 41
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH
<400> 41
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 43
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scFv
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L1
<400> 44
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L2
<400> 45
Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L3
<400> 46
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR H1
<400> 47
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR H2
<400> 48
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR H3
<400> 49
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 50
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH
<400> 50
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL
<400> 51
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 52
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 53
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scFv
<400> 53
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HC-CDR3
<400> 54
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LC-CDR2
<400> 55
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LC-CDR3
<400> 56
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 57
<211> 735
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence encoding scFv
<400> 57
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735
<210> 58
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 58
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 59
<211> 326
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human IgG2 Fc
<400> 59
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 60
<211> 327
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human IgG4 Fc
<400> 60
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 61
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2A
<400> 61
ggaagcggag agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc 60
cca 63
<210> 62
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2A
<400> 62
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 63
<211> 215
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Poly A signal
<400> 63
gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 60
ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 120
cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 180
gaggattggg aagacaatag caggcatgct gggga 215
<210> 64
<211> 1566
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD19 CAR
<400> 64
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atccccgaca tccagatgac ccagaccacc tccagcctga gcgccagcct gggcgaccgg 120
gtgaccatca gctgccgggc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180
aagcccgacg gcaccgtcaa gctgctgatc taccacacca gccggctgca cagcggcgtg 240
cccagccggt ttagcggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300
gaacaggaag atatcgccac ctacttttgc cagcagggca acacactgcc ctacaccttt 360
ggcggcggaa caaagctgga aatcaccggc agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc 420
ggcgagggca gcaccaaggg cgaggtgaag ctgcaggaaa gcggccctgg cctggtggcc 480
cccagccaga gcctgagcgt gacctgcacc gtgagcggcg tgagcctgcc cgactacggc 540
gtgagctgga tcaggcagcc ccccaggaag ggcctggaat ggctgggcgt gatctggggc 600
agcgagacca cctactacaa cagcgccctg aagagccggc tgaccatcat caaggacaac 660
agcaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga ccgacgacac cgccatctac 720
tactgcgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggactactg gggccagggc 780
accagcgtga ccgtgagcag cgagagcaag aattggagcc acccgcagtt cgaaaaagga 840
ggtggaggtt caggtggtgg aggctcttac ggaccgaatt ggtctcatcc tcagttcgag 900
aaaggaggcg gttctggagg tggaagcggt ggctcttgga gccacccaca gtttgaaaag 960
ggaggcgggg gctccggtgg cggaggctct tccggatctc cctgtccacc ttgccctatg 1020
ttctgggtgc tggtagtggt aggtggagtg ctggcctgct acagcctgct ggtgacagtg 1080
gccttcatca tcttttgggt gaaacggggc agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa 1140
ccatttatga gaccagtaca aactactcaa gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca 1200
gaagaagaag aaggaggatg tgaactgcgg gtgaagttca gcagaagcgc cgacgcacct 1260
gcctaccagc agggccagaa tcagctgtac aacgagctga acctgggacg aagggaagag 1320
tacgacgtcc tggataagcg gagaggccgg gaccctgaga tgggcggcaa gcctcggcgg 1380
aagaaccccc aggaaggcct gtataacgaa ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac 1440
agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggagg cggggcaagg gccacgacgg cctgtatcag 1500
ggcctgtcca ccgccaccaa ggatacctac gacgccctgc acatgcaggc cctgccccca 1560
aggtga 1566
<210> 65
<211> 499
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD19 CAR
<400> 65
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
245 250 255
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Gly Pro Asn Trp
260 265 270
Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
275 280 285
Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met Phe Trp
305 310 315 320
Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val
325 330 335
Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
340 345 350
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
355 360 365
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
370 375 380
Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
385 390 395 400
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
405 410 415
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
420 425 430
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
435 440 445
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
450 455 460
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
465 470 475 480
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
485 490 495
Pro Pro Arg
<210> 66
<211> 102
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDCD1 5' homology arm
<400> 66
taattacctc cgcctgagca gtggagaagg cggcactctg gtggggctgc tccaggcatg 60
cagatcccac aggcgccctg gccagtcgtc tgggcggtgc ta 102
<210> 67
<211> 187
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDCD1 3' homology arm
<400> 67
caactgggct ggcggccagg atggttctta ggtaggtggg gtcggcggtc aggtgtccca 60
gagccagggg tctggaggga ccttccaccc tcagtccctg gcaggtcggg gggtgctgag 120
gcgggcctgg ccctggcagc ccaggggtcc cggagcgagg ggtctggagg gacctttcac 180
tctcagt 187
<210> 68
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC 5' homology arm
<400> 68
gggaaatgag atcatgtcct aaccctgatc ctcttgtccc acagatatcc agaaccctga 60
ccctgccgtg 70
<210> 69
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC 3' homology arm
<400> 69
taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttg 58
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDCD1 5' primer
<400> 70
taattacctc cgcctgagca 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDCD1 3' primer
<400> 71
actgagagtg aaaggtccct 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC 5' primer
<400> 72
caaaatcggt gaataggcag 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC 3' primer
<400> 73
gggaaatgag atcatgtcct 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDCD1 gRNA targeting sequence
<400> 74
cgtctgggcg gtgctacaac 20
<210> 75
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDCD1 gRNA
<400> 75
cgucugggcg gugcuacaac 20
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC gRNA targeting sequence
<400> 76
agagtctctc agctggtaca 20
<210> 77
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC gRNA
<400> 77
agagucucuc agcugguaca 20
<210> 78
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDCD1 gRNA targeting sequence
<400> 78
cgtctgggcg gtgctacaac gttttagagc tatgct 36
<210> 79
<211> 288
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PD-1
<400> 79
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225 230 235 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 80
<211> 2097
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDCD1
<400> 80
gctcacctcc gcctgagcag tggagaaggc ggcactctgg tggggctgct ccaggcatgc 60
agatcccaca ggcgccctgg ccagtcgtct gggcggtgct acaactgggc tggcggccag 120
gatggttctt agactcccca gacaggccct ggaacccccc caccttctcc ccagccctgc 180
tcgtggtgac cgaaggggac aacgccacct tcacctgcag cttctccaac acatcggaga 240
gcttcgtgct aaactggtac cgcatgagcc ccagcaacca gacggacaag ctggccgcct 300
tccccgagga ccgcagccag cccggccagg actgccgctt ccgtgtcaca caactgccca 360
acgggcgtga cttccacatg agcgtggtca gggcccggcg caatgacagc ggcacctacc 420
tctgtggggc catctccctg gcccccaagg cgcagatcaa agagagcctg cgggcagagc 480
tcagggtgac agagagaagg gcagaagtgc ccacagccca ccccagcccc tcacccaggc 540
cagccggcca gttccaaacc ctggtggttg gtgtcgtggg cggcctgctg ggcagcctgg 600
tgctgctagt ctgggtcctg gccgtcatct gctcccgggc cgcacgaggg acaataggag 660
ccaggcgcac cggccagccc ctgaaggagg acccctcagc cgtgcctgtg ttctctgtgg 720
actatgggga gctggatttc cagtggcgag agaagacccc ggagcccccc gtgccctgtg 780
tccctgagca gacggagtat gccaccattg tctttcctag cggaatgggc acctcatccc 840
ccgcccgcag gggctcagct gacggccctc ggagtgccca gccactgagg cctgaggatg 900
gacactgctc ttggcccctc tgaccggctt ccttggccac cagtgttctg cagaccctcc 960
accatgagcc cgggtcagcg catttcctca ggagaagcag gcagggtgca ggccattgca 1020
ggccgtccag gggctgagct gcctgggggc gaccggggct ccagcctgca cctgcaccag 1080
gcacagcccc accacaggac tcatgtctca atgcccacag tgagcccagg cagcaggtgt 1140
caccgtcccc tacagggagg gccagatgca gtcactgctt caggtcctgc cagcacagag 1200
ctgcctgcgt ccagctccct gaatctctgc tgctgctgct gctgctgctg ctgctgcctg 1260
cggcccgggg ctgaaggcgc cgtggccctg cctgacgccc cggagcctcc tgcctgaact 1320
tgggggctgg ttggagatgg ccttggagca gccaaggtgc ccctggcagt ggcatcccga 1380
aacgccctgg acgcagggcc caagactggg cacaggagtg ggaggtacat ggggctgggg 1440
actccccagg agttatctgc tccctgcagg cctagagaag tttcagggaa ggtcagaaga 1500
gctcctggct gtggtgggca gggcaggaaa cccctccacc tttacacatg cccaggcagc 1560
acctcaggcc ctttgtgggg cagggaagct gaggcagtaa gcgggcaggc agagctggag 1620
gcctttcagg cccagccagc actctggcct cctgccgccg cattccaccc cagcccctca 1680
caccactcgg gagagggaca tcctacggtc ccaaggtcag gagggcaggg ctggggttga 1740
ctcaggcccc tcccagctgt ggccacctgg gtgttgggag ggcagaagtg caggcaccta 1800
gggcccccca tgtgcccacc ctgggagctc tccttggaac ccattcctga aattatttaa 1860
aggggttggc cgggctccca ccagggcctg ggtgggaagg tacaggcgtt cccccggggc 1920
ctagtacccc cgccgtggcc tatccactcc tcacatccac acactgcacc cccactcctg 1980
gggcagggcc accagcatcc aggcggccag caggcacctg agtggctggg acaagggatc 2040
ccccttccct gtggttctat tatattataa ttataattaa atatgagagc atgctaa 2097
<210> 81
<211> 199
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD69
<400> 81
Met Ser Ser Glu Asn Cys Phe Val Ala Glu Asn Ser Ser Leu His Pro
1 5 10 15
Glu Ser Gly Gln Glu Asn Asp Ala Thr Ser Pro His Phe Ser Thr Arg
20 25 30
His Glu Gly Ser Phe Gln Val Pro Val Leu Cys Ala Val Met Asn Val
35 40 45
Val Phe Ile Thr Ile Leu Ile Ile Ala Leu Ile Ala Leu Ser Val Gly
50 55 60
Gln Tyr Asn Cys Pro Gly Gln Tyr Thr Phe Ser Met Pro Ser Asp Ser
65 70 75 80
His Val Ser Ser Cys Ser Glu Asp Trp Val Gly Tyr Gln Arg Lys Cys
85 90 95
Tyr Phe Ile Ser Thr Val Lys Arg Ser Trp Thr Ser Ala Gln Asn Ala
100 105 110
Cys Ser Glu His Gly Ala Thr Leu Ala Val Ile Asp Ser Glu Lys Asp
115 120 125
Met Asn Phe Leu Lys Arg Tyr Ala Gly Arg Glu Glu His Trp Val Gly
130 135 140
Leu Lys Lys Glu Pro Gly His Pro Trp Lys Trp Ser Asn Gly Lys Glu
145 150 155 160
Phe Asn Asn Trp Phe Asn Val Thr Gly Ser Asp Lys Cys Val Phe Leu
165 170 175
Lys Asn Thr Glu Val Ser Ser Met Glu Cys Glu Lys Asn Leu Tyr Trp
180 185 190
Ile Cys Asn Lys Pro Tyr Lys
195
<210> 82
<211> 1676
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD69
<400> 82
agactcaaca agagctccag caaagacttt cactgtagct tgacttgacc tgagattaac 60
tagggaatct tgagaataaa gatgagctct gaaaattgtt tcgtagcaga gaacagctct 120
ttgcatccgg agagtggaca agaaaatgat gccaccagtc cccatttctc aacacgtcat 180
gaagggtcct tccaagttcc tgtcctgtgt gctgtaatga atgtggtctt catcaccatt 240
ttaatcatag ctctcattgc cttatcagtg ggccaataca attgtccagg ccaatacaca 300
ttctcaatgc catcagacag ccatgtttct tcatgctctg aggactgggt tggctaccag 360
aggaaatgct actttatttc tactgtgaag aggagctgga cttcagccca aaatgcttgt 420
tctgaacatg gtgctactct tgctgtcatt gattctgaaa aggacatgaa ctttctaaaa 480
cgatacgcag gtagagagga acactgggtt ggactgaaaa aggaacctgg tcacccatgg 540
aagtggtcaa atggcaaaga atttaacaac tggttcaacg ttacagggtc tgacaagtgt 600
gtttttctga aaaacacaga ggtcagcagc atggaatgtg agaagaattt atactggata 660
tgtaacaaac cttacaaata ataaggaaac atgttcactt attgactatt atagaatgga 720
actcaaggaa atctgtgtca gtggatgctg ctctgtggtc cgaagtcttc catagagact 780
ttgtgaaaaa aaattttata gtgtcttggg aattttcttc caaacagaac tatggaaaaa 840
aaggaagaaa ttccaggaaa atctgcactg tgggctttta ttgccatgag ctagaagcat 900
cacaggttga ccaataacca tgcccaagaa tgagaagaat gactatgcaa cctttggatg 960
cactttatat tattttgaat ccagaaataa tgaaataact aggcgtggac ttactattta 1020
ttgctgaatg actaccaaca gtgagagccc ttcatgcatt tgcactattg gaaggagtta 1080
gatgttggta ctagatactg aatgtaaaca aaggaattat ggctggtaac ataggttttt 1140
agtctaattg aatcccttaa actcagggag catttataaa tggacaaatg cttatgaaac 1200
taagatttgt aatatttctc tctttttaga gaaatttgcc aatttacttt gttatttttc 1260
cccaaaaaga atgggatgat catgtattta tttttttact tcctcagctg tagacaggtc 1320
cttttcgatg gtacatattt ctttgccttt ataatctttt atacagtgtc ttacagagaa 1380
aagacataag caaagactat gaggaatatt tgcaagacat agaatagtgt tggaaaatgt 1440
gcaatatgtg atgtggcaaa tctctattag gaaatattct gtaatcttca gacctagaat 1500
aatactagtc ttataatagg tttgtgactt tcctaaatca attctattac gtgcaatact 1560
tcaatacttc atttaaaata tttttatgtg caataaaatg tatttgtttg tattttgtgt 1620
tcagtacaat tataagctgt ttttatatat gtgaaataaa agtagaataa acacaa 1676
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NR4A1 (Nur77)
<400> 83
Met Pro Cys Ile Gln Ala Gln Tyr Gly Thr Pro Ala Pro Ser Pro Gly
1 5 10 15
Pro Arg Asp His Leu Ala Ser Asp Pro Leu Thr Pro Glu Phe Ile Lys
20 25 30
Pro Thr Met Asp Leu Ala Ser Pro Glu Ala Ala Pro Ala Ala Pro Thr
35 40 45
Ala Leu Pro Ser Phe Ser Thr Phe Met Asp Gly Tyr Thr Gly Glu Phe
50 55 60
Asp Thr Phe Leu Tyr Gln Leu Pro Gly Thr Val Gln Pro Cys Ser Ser
65 70 75 80
Ala Ser Ser Ser Ala Ser Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ala Thr Ser Pro
85 90 95
Ala Ser Ala Ser Phe Lys Phe Glu Asp Phe Gln Val Tyr Gly Cys Tyr
100 105 110
Pro Gly Pro Leu Ser Gly Pro Val Asp Glu Ala Leu Ser Ser Ser Gly
115 120 125
Ser Asp Tyr Tyr Gly Ser Pro Cys Ser Ala Pro Ser Pro Ser Thr Pro
130 135 140
Ser Phe Gln Pro Pro Gln Leu Ser Pro Trp Asp Gly Ser Phe Gly His
145 150 155 160
Phe Ser Pro Ser Gln Thr Tyr Glu Gly Leu Arg Ala Trp Thr Glu Gln
165 170 175
Leu Pro Lys Ala Ser Gly Pro Pro Gln Pro Pro Ala Phe Phe Ser Phe
180 185 190
Ser Pro Pro Thr Gly Pro Ser Pro Ser Leu Ala Gln Ser Pro Leu Lys
195 200 205
Leu Phe Pro Ser Gln Ala Thr His Gln Leu Gly Glu Gly Glu Ser Tyr
210 215 220
Ser Met Pro Thr Ala Phe Pro Gly Leu Ala Pro Thr Ser Pro His Leu
225 230 235 240
Glu Gly Ser Gly Ile Leu Asp Thr Pro Val Thr Ser Thr Lys Ala Arg
245 250 255
Ser Gly Ala Pro Gly Gly Ser Glu Gly Arg Cys Ala Val Cys Gly Asp
260 265 270
Asn Ala Ser Cys Gln His Tyr Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys
275 280 285
Gly Phe Phe Lys Arg Thr Val Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Ile Cys Leu
290 295 300
Ala Asn Lys Asp Cys Pro Val Asp Lys Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln
305 310 315 320
Phe Cys Arg Phe Gln Lys Cys Leu Ala Val Gly Met Val Lys Glu Val
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Val Arg Ala His Leu Asp Ser Gly Pro Ser Thr Ala Lys Leu Asp Tyr
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Ser Lys Phe Gln Glu Leu Val Leu Pro His Phe Gly Lys Glu Asp Ala
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Gly Asp Val Gln Gln Phe Tyr Asp Leu Leu Ser Gly Ser Leu Glu Val
405 410 415
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Leu Arg Leu Ala Tyr Arg Ser Lys Pro Gly Glu Gly Lys Leu Ile Phe
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Cys Ser Gly Leu Val Leu His Arg Leu Gln Cys Ala Arg Gly Phe Gly
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Asp Trp Ile Asp Ser Ile Leu Ala Phe Ser Arg Ser Leu His Ser Leu
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Leu Val Asp Val Pro Ala Phe Ala Cys Leu Ser Ala Leu Val Leu Ile
500 505 510
Thr Asp Arg His Gly Leu Gln Glu Pro Arg Arg Val Glu Glu Leu Gln
515 520 525
Asn Arg Ile Ala Ser Cys Leu Lys Glu His Val Ala Ala Val Ala Gly
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Glu Leu Arg Thr Leu Cys Thr Gln Gly Leu Gln Arg Ile Phe Tyr Leu
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NR4A1 (Nur77)
<400> 84
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ctcctgtgag gctagataga tgccctgtat ccaagcccaa tatgggacac cagcaccgag 360
tccgggaccc cgtgaccacc tggcaagcga ccccctgacc cctgagttca tcaagcccac 420
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cacccaccag ctgggggagg gagagagcta ttccatgcct acggccttcc caggtttggc 1020
acccacttct ccacaccttg agggctcggg gatactggat acacccgtga cctcaaccaa 1080
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Gly Pro Ser Pro Gly Ala Ser Pro Ser Trp Arg Ala Ala Pro Lys Ala
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Ser Asp Leu Leu Gly Ala Arg Gly Pro Gly Gly Thr Phe Gln Gly Arg
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Pro Ser Gly Ala Arg Leu Gly Pro Leu Pro His Leu Gln Ala Leu Leu
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115 120 125
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Ala Arg Pro Gly Leu Pro Pro Gly Ile Asn Val Ala Ser Leu Glu Trp
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Val Ser Arg Glu Pro Ala Leu Leu Cys Thr Phe Pro Asn Pro Ser Ala
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Pro Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ala Val Pro Gln Ser Ser Tyr Pro
180 185 190
Leu Leu Ala Asn Gly Val Cys Lys Trp Pro Gly Cys Glu Lys Val Phe
195 200 205
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Asp Glu Lys Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln Arg Glu Met Val Gln
225 230 235 240
Ser Leu Glu Gln Gln Leu Val Leu Glu Lys Glu Lys Leu Ser Ala Met
245 250 255
Gln Ala His Leu Ala Gly Lys Met Ala Leu Thr Lys Ala Ser Ser Val
260 265 270
Ala Ser Ser Asp Lys Gly Ser Cys Cys Ile Val Ala Ala Gly Ser Gln
275 280 285
Gly Pro Val Val Pro Ala Trp Ser Gly Pro Arg Glu Ala Pro Asp Ser
290 295 300
Leu Phe Ala Val Arg Arg His Leu Trp Gly Ser His Gly Asn Ser Thr
305 310 315 320
Phe Pro Glu Phe Leu His Asn Met Asp Tyr Phe Lys Phe His Asn Met
325 330 335
Arg Pro Pro Phe Thr Tyr Ala Thr Leu Ile Arg Trp Ala Ile Leu Glu
340 345 350
Ala Pro Glu Lys Gln Arg Thr Leu Asn Glu Ile Tyr His Trp Phe Thr
355 360 365
Arg Met Phe Ala Phe Phe Arg Asn His Pro Ala Thr Trp Lys Asn Ala
370 375 380
Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His Lys Cys Phe Val Arg Val Glu Ser
385 390 395 400
Glu Lys Gly Ala Val Trp Thr Val Asp Glu Leu Glu Phe Arg Lys Lys
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Arg Ser Gln Arg Pro Ser Arg Cys Ser Asn Pro Thr Pro Gly Pro
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> FoxP3
<400> 86
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> HLA-DRA
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Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ile Ala Val
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Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala Ile Lys Glu Glu His Val Ile
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Ile Gln Ala Glu Phe Tyr Leu Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met
35 40 45
Phe Asp Phe Asp Gly Asp Glu Ile Phe His Val Asp Met Ala Lys Lys
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Glu Val Thr Val Leu Thr Asn Ser Pro Val Glu Leu Arg Glu Pro Asn
115 120 125
Val Leu Ile Cys Phe Ile Asp Lys Phe Thr Pro Pro Val Val Asn Val
130 135 140
Thr Trp Leu Arg Asn Gly Lys Pro Val Thr Thr Gly Val Ser Glu Thr
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Val Phe Leu Pro Arg Glu Asp His Leu Phe Arg Lys Phe His Tyr Leu
165 170 175
Pro Phe Leu Pro Ser Thr Glu Asp Val Tyr Asp Cys Arg Val Glu His
180 185 190
Trp Gly Leu Asp Glu Pro Leu Leu Lys His Trp Glu Phe Asp Ala Pro
195 200 205
Ser Pro Leu Pro Glu Thr Thr Glu Asn Val Val Cys Ala Leu Gly Leu
210 215 220
Thr Val Gly Leu Val Gly Ile Ile Ile Gly Thr Ile Phe Ile Ile Lys
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Gly Val Arg Lys Ser Asn Ala Ala Glu Arg Arg Gly Pro Leu
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> HLA-DRA
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ggagacggtc tggcggcttg aagaatttgg acgatttgcc agctttgagg ctcaaggtgc 360
attggccaac atagctgtgg acaaagccaa cctggaaatc atgacaaagc gctccaacta 420
tactccgatc accaatgtac ctccagaggt aactgtgctc acaaacagcc ctgtggaact 480
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aagcaatgca gcagaacgca gggggcctct gtaaggcaca tggaggtgat ggtgtttctt 900
agagagaaga tcactgaaga aacttctgct ttaatggctt tacaaagctg gcaatattac 960
aatccttgac ctcagtgaaa gcagtcatct tcagcatttt ccagccctat agccacccca 1020
agtgtggata tgcctcttcg attgctccgt actctaacat ctagctggct tccctgtcta 1080
ttgccttttc ctgtatctat tttcctctat ttcctatcat tttattatca ccatgcaatg 1140
cctctggaat aaaacataca ggagtctgtc tctgctatgg aatgccccat ggggcatctc 1200
ttgtgtactt attgtttaag gtttcctcaa actgtgattt ttctgaacac aataaactat 1260
tttgatgatc ttgggtggaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1312
<210> 89
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1
<400> 89
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Arg Pro Arg Phe Leu Trp Gln Leu Lys Phe Glu Cys His Phe Phe Asn
35 40 45
Gly Thr Glu Arg Val Arg Leu Leu Glu Arg Cys Ile Tyr Asn Gln Glu
50 55 60
Glu Ser Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Tyr Arg Ala Val Thr
65 70 75 80
Glu Leu Gly Arg Pro Asp Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Leu
85 90 95
Leu Glu Gln Arg Arg Ala Ala Val Asp Thr Tyr Cys Arg His Asn Tyr
100 105 110
Gly Val Gly Glu Ser Phe Thr Val Gln Arg Arg Val Glu Pro Lys Val
115 120 125
Thr Val Tyr Pro Ser Lys Thr Gln Pro Leu Gln His His Asn Leu Leu
130 135 140
Val Cys Ser Val Ser Gly Phe Tyr Pro Gly Ser Ile Glu Val Arg Trp
145 150 155 160
Phe Arg Asn Gly Gln Glu Glu Lys Ala Gly Val Val Ser Thr Gly Leu
165 170 175
Ile Gln Asn Gly Asp Trp Thr Phe Gln Thr Leu Val Met Leu Glu Thr
180 185 190
Val Pro Arg Ser Gly Glu Val Tyr Thr Cys Gln Val Glu His Pro Ser
195 200 205
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225 230 235 240
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245 250 255
Ser Gly Leu Gln Pro Thr Gly Phe Leu Ser
260 265
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<211> 1182
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1
<400> 90
tagttctccc tgagtgagac ttgcctgctt ctctggcccc tggtcctgtc ctgttctcca 60
gcatggtgtg tctgaagctc cctggaggct cctgcatgac agcgctgaca gtgacactga 120
tggtgctgag ctccccactg gctttggctg gggacacccg accacgtttc ttgtggcagc 180
ttaagtttga atgtcatttc ttcaatggga cggagcgggt gcggttgctg gaaagatgca 240
tctataacca agaggagtcc gtgcgcttcg acagcgacgt gggggagtac cgggcggtga 300
cggagctggg gcggcctgat gccgagtact ggaacagcca gaaggacctc ctggagcaga 360
ggcgggccgc ggtggacacc tactgcagac acaactacgg ggttggtgag agcttcacag 420
tgcagcggcg agttgagcct aaggtgactg tgtatccttc aaagacccag cccctgcagc 480
accacaacct cctggtctgc tctgtgagtg gtttctatcc aggcagcatt gaagtcaggt 540
ggttccggaa cggccaggaa gagaaggctg gggtggtgtc cacaggcctg atccagaatg 600
gagattggac cttccagacc ctggtgatgc tggaaacagt tcctcggagt ggagaggttt 660
acacctgcca agtggagcac ccaagtgtga cgagccctct cacagtggaa tggagagcac 720
ggtctgaatc tgcacagagc aagatgctga gtggagtcgg gggcttcgtg ctgggcctgc 780
tcttccttgg ggccgggctg ttcatctact tcaggaatca gaaaggacac tctggacttc 840
agccaacagg attcctgagc tgaaatgcag atgaccacat tcaaggaaga accttctgtc 900
ccagctttgc agaatgaaaa gctttcctgc ttggcagtta ttcttccaca agagagggct 960
ttctcaggac ctggttgcta ctggttcggc aactgcagaa aatgtcctcc cttgtggctt 1020
cctcagctcc tgcccttggc ctgaagtccc agcattgatg acagcgcctc atcttcaact 1080
tttgtgctcc cctttgccta aaccgtatgg cctcccgtgc atctgtactc accctgtacg 1140
acaaacacat tacattatta aatgtttctc aaagatggag tt 1182
<210> 91
<211> 142
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR alpha constant
<400> 91
Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys
85 90 95
Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn
100 105 110
Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val
115 120 125
Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 92
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR alpha constant
<400> 92
Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys
1 5 10 15
Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr
20 25 30
Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr
35 40 45
Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp
85 90 95
Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe
100 105 110
Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala
115 120 125
Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 93
<211> 1508
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR alpha constant
<400> 93
ttttgaaacc cttcaaaggc agagacttgt ccagcctaac ctgcctgctg ctcctagctc 60
ctgaggctca gggcccttgg cttctgtccg ctctgctcag ggccctccag cgtggccact 120
gctcagccat gctcctgctg ctcgtcccag tgctcgaggt gatttttacc ctgggaggaa 180
ccagagccca gtcggtgacc cagcttggca gccacgtctc tgtctctgaa ggagccctgg 240
ttctgctgag gtgcaactac tcatcgtctg ttccaccata tctcttctgg tatgtgcaat 300
accccaacca aggactccag cttctcctga agtacacatc agcggccacc ctggttaaag 360
gcatcaacgg ttttgaggct gaatttaaga agagtgaaac ctccttccac ctgacgaaac 420
cctcagccca tatgagcgac gcggctgagt acttctgtgc tgtgagtgat ctcgaaccga 480
acagcagtgc ttccaagata atctttggat cagggaccag actcagcatc cggccaaata 540
tccagaaccc tgaccctgcc gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg 600
tctgcctatt caccgatttt gattctcaaa caaatgtgtc acaaagtaag gattctgatg 660
tgtatatcac agacaaaact gtgctagaca tgaggtctat ggacttcaag agcaacagtg 720
ctgtggcctg gagcaacaaa tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta 780
ttccagaaga caccttcttc cccagcccag aaagttcctg tgatgtcaag ctggtcgaga 840
aaagctttga aacagatacg aacctaaact ttcaaaacct gtcagtgatt gggttccgaa 900
tcctcctcct gaaagtggcc gggtttaatc tgctcatgac gctgcggctg tggtccagct 960
gagatctgca agattgtaag acagcctgtg ctccctcgct ccttcctctg cattgcccct 1020
cttctccctc tccaaacaga gggaactctc ctacccccaa ggaggtgaaa gctgctacca 1080
cctctgtgcc cccccggtaa tgccaccaac tggatcctac ccgaatttat gattaagatt 1140
gctgaagagc tgccaaacac tgctgccacc ccctctgttc ccttattgct gcttgtcact 1200
gcctgacatt cacggcagag gcaaggctgc tgcagcctcc cctggctgtg cacattccct 1260
cctgctcccc agagactgcc tccgccatcc cacagatgat ggatcttcag tgggttctct 1320
tgggctctag gtcctggaga atgttgtgag gggtttattt ttttttaata gtgttcataa 1380
agaaatacat agtattcttc ttctcaagac gtggggggaa attatctcat tatcgaggcc 1440
ctgctatgct gtgtgtctgg gcgtgttgta tgtcctgctg ccgatgcctt cattaaaatg 1500
atttggaa 1508
<210> 94
<211> 177
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR beta constant 1
<400> 94
Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
50 55 60
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
65 70 75 80
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
85 90 95
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
100 105 110
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
115 120 125
Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser
130 135 140
Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
145 150 155 160
Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp
165 170 175
Phe
<210> 95
<211> 178
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR beta constant 2
<400> 95
Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser
1 5 10 15
Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala
20 25 30
Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly
35 40 45
Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu
50 55 60
Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg
65 70 75 80
Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln
85 90 95
Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg
100 105 110
Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala
115 120 125
Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala
130 135 140
Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val
145 150 155 160
Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser
165 170 175
Arg Gly
<210> 96
<211> 179
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR beta constant
<400> 96
Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
50 55 60
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
65 70 75 80
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
85 90 95
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
100 105 110
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
115 120 125
Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser
130 135 140
Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
145 150 155 160
Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp
165 170 175
Ser Arg Gly
<210> 97
<211> 1151
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR beta constant
<400> 97
ctggtctaga atattccaca tctgctctca ctctgccatg gactcctgga ccttctgctg 60
tgtgtccctt tgcatcctgg tagcgaagca tacagatgct ggagttatcc agtcaccccg 120
ccatgaggtg acagagatgg gacaagaagt gactctgaga tgtaaaccaa tttcaggcca 180
caactccctt ttctggtaca gacagaccat gatgcgggga ctggagttgc tcatttactt 240
taacaacaac gttccgatag atgattcagg gatgcccgag gatcgattct cagctaagat 300
gcctaatgca tcattctcca ctctgaagat ccagccctca gaacccaggg actcagctgt 360
gtacttctgt gccagcagtt tctcgacctg ttcggctaac tatggctaca ccttcggttc 420
ggggaccagg ttaaccgttg tagaggacct gaacaaggtg ttcccacccg aggtcgctgt 480
gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag gccacactgg tgtgcctggc 540
cacaggcttc ttccccgacc acgtggagct gagctggtgg gtgaatggga aggaggtgca 600
cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag cccgccctca atgactccag 660
atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc tggcagaacc cccgcaacca 720
cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat gacgagtgga cccaggatag 780
ggccaaaccc gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg ggtagagcag actgtggctt 840
tacctcggtg tcctaccagc aaggggtcct gtctgccacc atcctctatg agatcctgct 900
agggaaggcc accctgtatg ctgtgctggt cagcgccctt gtgttgatgg ccatggtcaa 960
gagaaaggat ttctgaaggc agccctggaa gtggagttag gagcttctaa cccgtcatgg 1020
ttcaatacac attcttcttt tgccagcgct tctgaagagc tgctctcacc tctctgcatc 1080
ccaatagata tccccctatg tgcatgcaca cctgcacact cacggctgaa atctccctaa 1140
cccaggggga c 1151
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDCD1 gRNA target sequence 1
<400> 98
tgacgttacc tcgtgcggcc 20
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDCD1 gRNA target sequence 2
<400> 99
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<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDCD1 gRNA target sequence 3
<400> 100
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<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDCD1 gRNA target sequence 4
<400> 101
ttggaactgg ccggctggcc 20
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDCD1 gRNA target sequence 5
<400> 102
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDCD1 gRNA target sequence 6
<400> 103
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<210> 104
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDCD1 gRNA sequence 1
<400> 104
ugacguuacc ucgugcggcc 20
<210> 105
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDCD1 gRNA sequence 2
<400> 105
cacgaagcuc uccgaugugu 20
<210> 106
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDCD1 gRNA sequence 3
<400> 106
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDCD1 gRNA sequence 4
<400> 107
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDCD1 gRNA sequence 5
<400> 108
guggcauacu ccgucugcuc 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDCD1 gRNA sequence 6
<400> 109
gaugaggugc ccauuccgcu 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 110
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD69 gRNA target sequence 2
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD69 gRNA target sequence 3
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD69 gRNA target sequence 4
<400> 113
cttcatgacg tgttgagaaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD69 gRNA target sequence 5
<400> 114
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD69 gRNA target sequence 6
<400> 115
atggcattga gaatgtgtat 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD69 gRNA sequence 1
<400> 116
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD69 gRNA sequence 2
<400> 117
uuugacaggu ucaacguuac 20
<210> 118
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD69 gRNA sequence 3
<400> 118
cauuucucaa cacgucauga 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD69 gRNA sequence 4
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cuucaugacg uguugagaaa 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD69 gRNA sequence 5
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gugggccaau acaauugucc 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD69 gRNA sequence 6
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auggcauuga gaauguguau 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nur77 (NR4A1) gRNA target sequence 1
<400> 122
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nur77 (NR4A1) gRNA target sequence 2
<400> 123
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nur77 (NR4A1) gRNA target sequence 3
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nur77 (NR4A1) gRNA target sequence 4
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nur77 (NR4A1) gRNA target sequence 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nur77 (NR4A1) gRNA target sequence 6
<400> 127
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<213> Artificial Sequence
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<223> Nur77 (NR4A1) gRNA sequence 1
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nur77 (NR4A1) gRNA sequence 2
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nur77 (NR4A1) gRNA sequence 4
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<210> 132
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nur77 (NR4A1) gRNA sequence 5
<400> 132
caccuuggag uaguccaguu 20
<210> 133
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nur77 (NR4A1) gRNA sequence 6
<400> 133
uuucgccgcc ucuuguccac 20
<210> 134
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 134
tcattgacaa gatcttcatg 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 136
ccatattggg cttggataca 20
<210> 137
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nur77 (NR4A1) gRNA sequence 7
<400> 137
caugaagauc uugucaauga 20
<210> 138
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nur77 (NR4A1) gRNA sequence 8
<400> 138
ugcacacgug uucccaggc 19
<210> 139
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nur77 (NR4A1) gRNA sequence 9
<400> 139
ccauauuggg cuuggauaca 20
<210> 140
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FoxP3 gRNA target sequence1
<400> 140
cccacccaca gggatcaacg 20
<210> 141
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FoxP3 gRNA target sequence 2
<400> 141
ttcgaagacc ttctcacatc 20
<210> 142
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FoxP3 gRNA target sequence 3
<400> 142
agctctgggg cacagccgaa 20
<210> 143
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FoxP3 gRNA target sequence 4
<400> 143
ccacttacag gcactcctcc 20
<210> 144
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FoxP3 gRNA target sequence 5
<400> 144
cctggacacc cattccaggc 20
<210> 145
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FoxP3 gRNA target sequence 6
<400> 145
tgccccccag ctctcaacgg 20
<210> 146
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FoxP3 gRNA target sequence 7
<400> 146
tccagctggg cgaggctcct 20
<210> 147
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FoxP3 gRNA target sequence 8
<400> 147
tttgggtgca gccctccagc 20
<210> 148
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FoxP3 gRNA sequence 1
<400> 148
cccacccaca gggaucaacg 20
<210> 149
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FoxP3 gRNA sequence 2
<400> 149
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<210> 150
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FoxP3 gRNA sequence 3
<400> 150
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<210> 151
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FoxP3 gRNA sequence 4
<400> 151
ccacuuacag gcacuccucc 20
<210> 152
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FoxP3 gRNA sequence 5
<400> 152
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<210> 153
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FoxP3 gRNA sequence 6
<400> 153
ugccccccag cucucaacgg 20
<210> 154
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FoxP3 gRNA sequence 7
<400> 154
uccagcuggg cgaggcuccu 20
<210> 155
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FoxP3 gRNA sequence 8
<400> 155
uuugggugca gcccuccagc 20
<210> 156
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA gRNA target sequence 1
<400> 156
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<210> 157
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA gRNA target sequence 2
<400> 157
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<210> 158
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA gRNA target sequence 3
<400> 158
gattcagata gaactcggcc 20
<210> 159
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA gRNA target sequence 4
<400> 159
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<210> 160
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA gRNA target sequence 5
<400> 160
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA gRNA target sequence 6
<400> 161
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<210> 162
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA gRNA sequence 1
<400> 162
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<210> 163
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA gRNA sequence 2
<400> 163
caaacauaaa cucgccugau 20
<210> 164
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA gRNA sequence 3
<400> 164
gauucagaua gaacucggcc 20
<210> 165
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA gRNA sequence 4
<400> 165
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<210> 166
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA gRNA sequence 5
<400> 166
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<210> 167
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRA gRNA sequence 6
<400> 167
aaagcaaugc agcagaacgc 20
<210> 168
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1 gRNA target sequence 1
<400> 168
gacggagcgg gtgcggttcc 20
<210> 169
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1 gRNA target sequence 2
<400> 169
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<210> 170
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1 gRNA target sequence 3
<400> 170
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<210> 171
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1 gRNA target sequence 4
<400> 171
cctgaagtag atgaacagcc 20
<210> 172
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1 gRNA target sequence 5
<400> 172
gaaggatata cagtcacctt 20
<210> 173
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1 gRNA target sequence 6
<400> 173
agctccccac tggctttgtc 20
<210> 174
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1 gRNA target sequence 7
<400> 174
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<210> 175
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1 gRNA target sequence 8
<400> 175
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<210> 176
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1 gRNA target sequence 9
<400> 176
ccttccagac cctggtgatg ctg 23
<210> 177
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1 gRNA target sequence 10
<400> 177
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<210> 178
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1 gRNA sequence 1
<400> 178
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<210> 179
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1 gRNA sequence 2
<400> 179
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<210> 180
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1 gRNA sequence 3
<400> 180
cacugucagc gcugucaugc 20
<210> 181
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1 gRNA sequence 4
<400> 181
ccugaaguag augaacagcc 20
<210> 182
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1 gRNA sequence 5
<400> 182
gaaggauaua cagucaccuu 20
<210> 183
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1 gRNA sequence 6
<400> 183
agcuccccac uggcuuuguc 20
<210> 184
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1 gRNA sequence 7
<400> 184
auccaggcag cauugaaguc agg 23
<210> 185
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1 gRNA sequence 8
<400> 185
ccaggcagca uugaagucag gug 23
<210> 186
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1 gRNA sequence 9
<400> 186
ccuuccagac ccuggugaug cug 23
<210> 187
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-DRB1 gRNA sequence 10
<400> 187
ccagacccug gugaugcugg aaa 23
<210> 188
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-10
<400> 188
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<210> 189
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-110
<400> 189
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<210> 190
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-116
<400> 190
acacggcagg gucaggguuc 20
<210> 191
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-16
<400> 191
gagaaucaaa aucggugaau 20
<210> 192
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-4
<400> 192
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<210> 193
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-49
<400> 193
cucagcuggu acacggc 17
<210> 194
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-2
<400> 194
ugguacacgg caggguc 17
<210> 195
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-30
<400> 195
gcuagacaug aggucua 17
<210> 196
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-43
<400> 196
gucagauuug uugcucc 17
<210> 197
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-23
<400> 197
ucagcuggua cacggca 17
<210> 198
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-34
<400> 198
gcagacagac uugucac 17
<210> 199
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-25
<400> 199
gguacacggc aggguca 17
<210> 200
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-128
<400> 200
cuucaagagc aacagugcug 20
<210> 201
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-105
<400> 201
agagcaacag ugcuguggcc 20
<210> 202
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-106
<400> 202
aaagucagau uuguugcucc 20
<210> 203
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-123
<400> 203
acaaaacugu gcuagacaug 20
<210> 204
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-64
<400> 204
aaacugugcu agacaug 17
<210> 205
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-97
<400> 205
ugugcuagac augaggucua 20
<210> 206
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-148
<400> 206
ggcuggggaa gaaggugucu uc 22
<210> 207
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-147
<400> 207
gcuggggaag aaggugucuu c 21
<210> 208
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-234
<400> 208
ggggaagaag gugucuuc 18
<210> 209
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-167
<400> 209
guuuugucug ugauauacac au 22
<210> 210
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-177
<400> 210
ggcagacaga cuugucacug gauu 24
<210> 211
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-176
<400> 211
gcagacagac uugucacugg auu 23
<210> 212
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-257
<400> 212
gacagacuug ucacuggauu 20
<210> 213
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-233
<400> 213
gugaauaggc agacagacuu guca 24
<210> 214
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-231
<400> 214
gaauaggcag acagacuugu ca 22
<210> 215
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-163
<400> 215
gagucucuca gcugguacac gg 22
<210> 216
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-241
<400> 216
gucucucagc ugguacacgg 20
<210> 217
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-179
<400> 217
gguacacggc agggucaggg uu 22
<210> 218
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-178
<400> 218
guacacggca gggucagggu u 21
<210> 219
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-40
<400> 219
cacccagauc gucagcgccg 20
<210> 220
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-52
<400> 220
caaacacagc gaccucgggu 20
<210> 221
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-25
<400> 221
ugacgagugg acccaggaua 20
<210> 222
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-35
<400> 222
ggcucucgga gaaugacgag 20
<210> 223
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-50
<400> 223
ggccucggcg cugacgaucu 20
<210> 224
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-39
<400> 224
gaaaaacgug uucccacccg 20
<210> 225
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-49
<400> 225
augacgagug gacccaggau 20
<210> 226
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-51
<400> 226
aguccaguuc uacgggcucu 20
<210> 227
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-26
<400> 227
cgcugucaag uccaguucua 20
<210> 228
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-47
<400> 228
aucgucagcg ccgaggccug 20
<210> 229
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-45
<400> 229
ucaaacacag cgaccucggg 20
<210> 230
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-34
<400> 230
cguagaacug gacuugacag 20
<210> 231
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-227
<400> 231
aggccucggc gcugacgauc 20
<210> 232
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-41
<400> 232
ugacagcgga agugguugcg 20
<210> 233
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-30
<400> 233
uugacagcgg aagugguugc 20
<210> 234
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-206
<400> 234
ucuccgagag cccguagaac 20
<210> 235
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-32
<400> 235
cgggugggaa cacguuuuuc 20
<210> 236
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-276
<400> 236
gacagguuug gcccuauccu 20
<210> 237
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-274
<400> 237
gaucgucagc gccgaggccu 20
<210> 238
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-230
<400> 238
ggcucaaaca cagcgaccuc 20
<210> 239
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-235
<400> 239
ugagggucuc ggccaccuuc 20
<210> 240
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-38
<400> 240
aggcuucuac cccgaccacg 20
<210> 241
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-223
<400> 241
ccgaccacgu ggagcugagc 20
<210> 242
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-221
<400> 242
ugacagguuu ggcccuaucc 20
<210> 243
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-48
<400> 243
cuugacagcg gaagugguug 20
<210> 244
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-216
<400> 244
agaucgucag cgccgaggcc 20
<210> 245
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 245
gcgcugacga ucugggugac 20
<210> 246
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-268
<400> 246
ugagggcggg cugcuccuug 20
<210> 247
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-193
<400> 247
guugcggggg uucugccaga 20
<210> 248
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-246
<400> 248
agcucagcuc cacguggucg 20
<210> 249
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-228
<400> 249
gcggcugcuc aggcaguauc 20
<210> 250
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-43
<400> 250
gcggggguuc ugccagaagg 20
<210> 251
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-272
<400> 251
uggcucaaac acagcgaccu 20
<210> 252
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-33
<400> 252
acuggacuug acagcggaag 20
<210> 253
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 253
gacagcggaa gugguugcgg 20
<210> 254
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-211
<400> 254
gcugucaagu ccaguucuac 20
<210> 255
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-253
<400> 255
guaucuggag ucauugaggg 20
<210> 256
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-18
<400> 256
cucggcgcug acgaucu 17
<210> 257
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-6
<400> 257
ccucggcgcu gacgauc 17
<210> 258
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-85
<400> 258
ccgagagccc guagaac 17
<210> 259
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-129
<400> 259
ccagaucguc agcgccg 17
<210> 260
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-93
<400> 260
gaaugacgag uggaccc 17
<210> 261
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-415
<400> 261
gggugacagg uuuggcccua uc 22
<210> 262
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-414
<400> 262
ggugacaggu uuggcccuau c 21
<210> 263
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-310
<400> 263
gugacagguu uggcccuauc 20
<210> 264
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-308
<400> 264
gacagguuug gcccuauc 18
<210> 265
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-401
<400> 265
gauacugccu gagcagccgc cu 22
<210> 266
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-468
<400> 266
gaccacgugg agcugagcug gugg 24
<210> 267
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-462
<400> 267
guggagcuga gcuggugg 18
<210> 268
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-424
<400> 268
gggcgggcug cuccuugagg ggcu 24
<210> 269
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-423
<400> 269
ggcgggcugc uccuugaggg gcu 23
<210> 270
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-422
<400> 270
gcgggcugcu ccuugagggg cu 22
<210> 271
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-420
<400> 271
gggcugcucc uugaggggcu 20
<210> 272
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-419
<400> 272
ggcugcuccu ugaggggcu 19
<210> 273
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-418
<400> 273
gcugcuccuu gaggggcu 18
<210> 274
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-445
<400> 274
ggugaauggg aaggaggugc acag 24
<210> 275
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-444
<400> 275
gugaauggga aggaggugca cag 23
<210> 276
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-442
<400> 276
gaaugggaag gaggugcaca g 21
<210> 277
<211> 149
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC gRNA
<400> 277
agcgctctcg tacagagttg gcattataat acgactcact ataggggaga atcaaaatcg 60
gtgaatgttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga 120
aaaagtggca ccgagtcggt gcttttttt 149
<210> 278
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC gRNA
<400> 278
gagaaucaaa aucggugaau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 279
<211> 1344
<212> PRT
<213> Streptococcus mutans
<220>
<223> Cas9
<400> 279
Lys Lys Pro Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly
1 5 10 15
Trp Ala Val Val Thr Asp Asp Tyr Lys Val Pro Ala Lys Lys Met Lys
20 25 30
Val Leu Gly Asn Thr Asp Lys Ser His Ile Glu Lys Asn Leu Leu Gly
35 40 45
Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Asn Thr Ala Glu Asp Arg Arg Leu Lys
50 55 60
Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Arg Asn Arg Ile Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Glu Ile Phe Ser Glu Glu Met Gly Lys Val Asp Asp Ser Phe
85 90 95
Phe His Arg Leu Glu Asp Ser Phe Leu Val Thr Glu Asp Lys Arg Gly
100 105 110
Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Leu Glu Glu Glu Val Lys Tyr His
115 120 125
Glu Asn Phe Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Gln Tyr Leu Ala Asp Asn
130 135 140
Pro Glu Lys Val Asp Leu Arg Leu Val Tyr Leu Ala Leu Ala His Ile
145 150 155 160
Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Lys Phe Asp Thr Arg
165 170 175
Asn Asn Asp Val Gln Arg Leu Phe Gln Glu Phe Leu Ala Val Tyr Asp
180 185 190
Asn Thr Phe Glu Asn Ser Ser Leu Gln Glu Gln Asn Val Gln Val Glu
195 200 205
Glu Ile Leu Thr Asp Lys Ile Ser Lys Ser Ala Lys Lys Asp Arg Val
210 215 220
Leu Lys Leu Phe Pro Asn Glu Lys Ser Asn Gly Arg Phe Ala Glu Phe
225 230 235 240
Leu Lys Leu Ile Val Gly Asn Gln Ala Asp Phe Lys Lys His Phe Glu
245 250 255
Leu Glu Glu Lys Ala Pro Leu Gln Phe Ser Lys Asp Thr Tyr Glu Glu
260 265 270
Glu Leu Glu Val Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Asn Tyr Ala Glu Leu
275 280 285
Phe Leu Ser Ala Lys Lys Leu Tyr Asp Ser Ile Leu Leu Ser Gly Ile
290 295 300
Leu Thr Val Thr Asp Val Gly Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met
305 310 315 320
Ile Gln Arg Tyr Asn Glu His Gln Met Asp Leu Ala Gln Leu Lys Gln
325 330 335
Phe Ile Arg Gln Lys Leu Ser Asp Lys Tyr Asn Glu Val Phe Ser Asp
340 345 350
Val Ser Lys Asp Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Lys Thr Asn Gln
355 360 365
Glu Ala Phe Tyr Lys Tyr Leu Lys Gly Leu Leu Asn Lys Ile Glu Gly
370 375 380
Ser Gly Tyr Phe Leu Asp Lys Ile Glu Arg Glu Asp Phe Leu Arg Lys
385 390 395 400
Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gln
405 410 415
Glu Met Arg Ala Ile Ile Arg Arg Gln Ala Glu Phe Tyr Pro Phe Leu
420 425 430
Ala Asp Asn Gln Asp Arg Ile Glu Lys Leu Leu Thr Phe Arg Ile Pro
435 440 445
Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Lys Ser Asp Phe Ala Trp Leu
450 455 460
Ser Arg Lys Ser Ala Asp Lys Ile Thr Pro Trp Asn Phe Asp Glu Ile
465 470 475 480
Val Asp Lys Glu Ser Ser Ala Glu Ala Phe Ile Asn Arg Met Thr Asn
485 490 495
Tyr Asp Leu Tyr Leu Pro Asn Gln Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu
500 505 510
Leu Tyr Glu Lys Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr
515 520 525
Lys Thr Glu Gln Gly Lys Thr Ala Phe Phe Asp Ala Asn Met Lys Gln
530 535 540
Glu Ile Phe Asp Gly Val Phe Lys Val Tyr Arg Lys Val Thr Lys Asp
545 550 555 560
Lys Leu Met Asp Phe Leu Glu Lys Glu Phe Asp Glu Phe Arg Ile Val
565 570 575
Asp Leu Thr Gly Leu Asp Lys Glu Asn Lys Val Phe Asn Ala Ser Tyr
580 585 590
Gly Thr Tyr His Asp Leu Cys Lys Ile Leu Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Arg Lys Arg Leu Glu Asn Tyr Ser
625 630 635 640
Asp Leu Leu Thr Lys Glu Gln Val Lys Lys Leu Glu Arg Arg His Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Ala Glu Leu Ile His Gly Ile Arg Asn
660 665 670
Lys Glu Ser Arg Lys Thr Ile Leu Asp Tyr Leu Ile Asp Asp Gly Asn
675 680 685
Ser Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile Asn Asp Asp Ala Leu Ser Phe
690 695 700
Lys Glu Glu Ile Ala Lys Ala Gln Val Ile Gly Glu Thr Asp Asn Leu
705 710 715 720
Asn Gln Val Val Ser Asp Ile Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Ser Leu Lys Ile Val Asp Glu Leu Val Lys Ile Met Gly
740 745 750
His Gln Pro Glu Asn Ile Val Val Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Phe
755 760 765
Thr Asn Gln Gly Arg Arg Asn Ser Gln Gln Arg Leu Lys Gly Leu Thr
770 775 780
Asp Ser Ile Lys Glu Phe Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val
785 790 795 800
Glu Asn Ser Gln Leu Gln Asn Asp Arg Leu Phe Leu Tyr Tyr Leu Gln
805 810 815
Asn Gly Arg Asp Met Tyr Thr Gly Glu Glu Leu Asp Ile Asp Tyr Leu
820 825 830
Ser Gln Tyr Asp Ile Asp His Ile Ile Pro Gln Ala Phe Ile Lys Asp
835 840 845
Asn Ser Ile Asp Asn Arg Val Leu Thr Ser Ser Lys Glu Asn Arg Gly
850 855 860
Lys Ser Asp Asp Val Pro Ser Lys Asp Val Val Arg Lys Met Lys Ser
865 870 875 880
Tyr Trp Ser Lys Leu Leu Ser Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe
885 890 895
Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Thr Asp Asp Asp Lys
900 905 910
Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys
915 920 925
His Val Ala Arg Ile Leu Asp Glu Arg Phe Asn Thr Glu Thr Asp Glu
930 935 940
Asn Asn Lys Lys Ile Arg Gln Val Lys Ile Val Thr Leu Lys Ser Asn
945 950 955 960
Leu Val Ser Asn Phe Arg Lys Glu Phe Glu Leu Tyr Lys Val Arg Glu
965 970 975
Ile Asn Asp Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Ile
980 985 990
Gly Lys Ala Leu Leu Gly Val Tyr Pro Gln Leu Glu Pro Glu Phe Val
995 1000 1005
Tyr Gly Asp Tyr Pro His Phe His Gly His Lys Glu Asn Lys Ala Thr
1010 1015 1020
Ala Lys Lys Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Lys Asp
1025 1030 1035 1040
Asp Val Arg Thr Asp Lys Asn Gly Glu Ile Ile Trp Lys Lys Asp Glu
1045 1050 1055
His Ile Ser Asn Ile Lys Lys Val Leu Ser Tyr Pro Gln Val Asn Ile
1060 1065 1070
Val Lys Lys Val Glu Glu Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile
1075 1080 1085
Leu Pro Lys Gly Asn Ser Asp Lys Leu Ile Pro Arg Lys Thr Lys Lys
1090 1095 1100
Phe Tyr Trp Asp Thr Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Ile Val
1105 1110 1115 1120
Ala Tyr Ser Ile Leu Val Ile Ala Asp Ile Glu Lys Gly Lys Ser Lys
1125 1130 1135
Lys Leu Lys Thr Val Lys Ala Leu Val Gly Val Thr Ile Met Glu Lys
1140 1145 1150
Met Thr Phe Glu Arg Asp Pro Val Ala Phe Leu Glu Arg Lys Gly Tyr
1155 1160 1165
Arg Asn Val Gln Glu Glu Asn Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
1170 1175 1180
Phe Lys Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Leu Leu Ala Ser Ala Arg Glu
1185 1190 1195 1200
Leu Gln Lys Gly Asn Glu Ile Val Leu Pro Asn His Leu Gly Thr Leu
1205 1210 1215
Leu Tyr His Ala Lys Asn Ile His Lys Val Asp Glu Pro Lys His Leu
1220 1225 1230
Asp Tyr Val Asp Lys His Lys Asp Glu Phe Lys Glu Leu Leu Asp Val
1235 1240 1245
Val Ser Asn Phe Ser Lys Lys Tyr Thr Leu Ala Glu Gly Asn Leu Glu
1250 1255 1260
Lys Ile Lys Glu Leu Tyr Ala Gln Asn Asn Gly Glu Asp Leu Lys Glu
1265 1270 1275 1280
Leu Ala Ser Ser Phe Ile Asn Leu Leu Thr Phe Thr Ala Ile Gly Ala
1285 1290 1295
Pro Ala Thr Phe Lys Phe Phe Asp Lys Asn Ile Asp Arg Lys Arg Tyr
1300 1305 1310
Thr Ser Thr Thr Glu Ile Leu Asn Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile
1315 1320 1325
Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Asn Lys Leu Gly Gly Asp
1330 1335 1340
<210> 280
<211> 1367
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<220>
<223> Cas9
<400> 280
Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly
1 5 10 15
Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys
20 25 30
Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly
35 40 45
Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys
50 55 60
Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe
85 90 95
Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His
100 105 110
Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His
115 120 125
Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser
130 135 140
Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met
145 150 155 160
Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp
165 170 175
Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn
180 185 190
Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys
195 200 205
Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu
210 215 220
Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu
225 230 235 240
Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp
245 250 255
Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp
260 265 270
Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu
275 280 285
Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile
290 295 300
Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met
305 310 315 320
Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala
325 330 335
Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp
340 345 350
Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln
355 360 365
Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly
370 375 380
Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys
385 390 395 400
Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly
405 410 415
Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu
420 425 430
Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro
435 440 445
Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met
450 455 460
Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val
465 470 475 480
Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn
485 490 495
Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu
500 505 510
Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr
515 520 525
Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys
530 535 540
Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val
545 550 555 560
Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser
565 570 575
Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr
580 585 590
Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn
595 600 605
Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu
610 615 620
Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His
625 630 635 640
Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr
645 650 655
Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys
660 665 670
Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala
675 680 685
Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys
690 695 700
Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His
705 710 715 720
Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile
725 730 735
Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg
740 745 750
His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr
755 760 765
Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu
770 775 780
Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val
785 790 795 800
Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln
805 810 815
Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu
820 825 830
Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp
835 840 845
Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly
850 855 860
Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn
865 870 875 880
Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe
885 890 895
Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys
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<223> Cas9
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595 600 605
Ser Glu Asn Gln Asn Lys Gly Asn Gln Thr Pro Tyr Glu Tyr Phe Asn
610 615 620
Gly Lys Asp Asn Ser Arg Glu Trp Gln Glu Phe Lys Ala Arg Val Glu
625 630 635 640
Thr Ser Arg Phe Pro Arg Ser Lys Lys Gln Arg Ile Leu Leu Gln Lys
645 650 655
Phe Asp Glu Asp Gly Phe Lys Glu Arg Asn Leu Asn Asp Thr Arg Tyr
660 665 670
Val Asn Arg Phe Leu Cys Gln Phe Val Ala Asp Arg Met Arg Leu Thr
675 680 685
Gly Lys Gly Lys Lys Arg Val Phe Ala Ser Asn Gly Gln Ile Thr Asn
690 695 700
Leu Leu Arg Gly Phe Trp Gly Leu Arg Lys Val Arg Ala Glu Asn Asp
705 710 715 720
Arg His His Ala Leu Asp Ala Val Val Val Ala Cys Ser Thr Val Ala
725 730 735
Met Gln Gln Lys Ile Thr Arg Phe Val Arg Tyr Lys Glu Met Asn Ala
740 745 750
Phe Asp Gly Lys Thr Ile Asp Lys Glu Thr Gly Glu Val Leu His Gln
755 760 765
Lys Thr His Phe Pro Gln Pro Trp Glu Phe Phe Ala Gln Glu Val Met
770 775 780
Ile Arg Val Phe Gly Lys Pro Asp Gly Lys Pro Glu Phe Glu Glu Ala
785 790 795 800
Asp Thr Pro Glu Lys Leu Arg Thr Leu Leu Ala Glu Lys Leu Ser Ser
805 810 815
Arg Pro Glu Ala Val His Glu Tyr Val Thr Pro Leu Phe Val Ser Arg
820 825 830
Ala Pro Asn Arg Lys Met Ser Gly Gln Gly His Met Glu Thr Val Lys
835 840 845
Ser Ala Lys Arg Leu Asp Glu Gly Val Ser Val Leu Arg Val Pro Leu
850 855 860
Thr Gln Leu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Lys Met Val Asn Arg Glu Arg
865 870 875 880
Glu Pro Lys Leu Tyr Glu Ala Leu Lys Ala Arg Leu Glu Ala His Lys
885 890 895
Asp Asp Pro Ala Lys Ala Phe Ala Glu Pro Phe Tyr Lys Tyr Asp Lys
900 905 910
Ala Gly Asn Arg Thr Gln Gln Val Lys Ala Val Arg Val Glu Gln Val
915 920 925
Gln Lys Thr Gly Val Trp Val Arg Asn His Asn Gly Ile Ala Asp Asn
930 935 940
Ala Thr Met Val Arg Val Asp Val Phe Glu Lys Gly Asp Lys Tyr Tyr
945 950 955 960
Leu Val Pro Ile Tyr Ser Trp Gln Val Ala Lys Gly Ile Leu Pro Asp
965 970 975
Arg Ala Val Val Gln Gly Lys Asp Glu Glu Asp Trp Gln Leu Ile Asp
980 985 990
Asp Ser Phe Asn Phe Lys Phe Ser Leu His Pro Asn Asp Leu Val Glu
995 1000 1005
Val Ile Thr Lys Lys Ala Arg Met Phe Gly Tyr Phe Ala Ser Cys His
1010 1015 1020
Arg Gly Thr Gly Asn Ile Asn Ile Arg Ile His Asp Leu Asp His Lys
1025 1030 1035 1040
Ile Gly Lys Asn Gly Ile Leu Glu Gly Ile Gly Val Lys Thr Ala Leu
1045 1050 1055
Ser Phe Gln Lys Tyr Gln Ile Asp Glu Leu Gly Lys Glu Ile Arg Pro
1060 1065 1070
Cys Arg Leu Lys Lys Arg Pro Pro Val Arg
1075 1080
<210> 287
<211> 1053
<212> PRT
<213> S. aureus
<220>
<223> Cas9
<400> 287
Met Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val
1 5 10 15
Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly
20 25 30
Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg
35 40 45
Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile
50 55 60
Gln Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp His
65 70 75 80
Ser Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys Gly Leu
85 90 95
Ser Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His Leu
100 105 110
Ala Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu Glu Asp Thr
115 120 125
Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser Lys Ala
130 135 140
Leu Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys Lys
145 150 155 160
Asp Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg Phe Lys Thr Ser Asp Tyr
165 170 175
Val Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr His Gln
180 185 190
Leu Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Thr Arg
195 200 205
Arg Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly Trp Lys
210 215 220
Asp Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr Phe
225 230 235 240
Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Tyr
245 250 255
Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp Glu Asn
260 265 270
Glu Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn Val Phe
275 280 285
Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu
290 295 300
Val Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser Thr Gly Lys
305 310 315 320
Pro Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His Asp Ile Lys Asp Ile Thr
325 330 335
Ala Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile Ala
340 345 350
Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu Leu
355 360 365
Thr Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile Ser
370 375 380
Asn Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala Ile
385 390 395 400
Asn Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr Asn Asp Asn Gln Ile Ala
405 410 415
Ile Phe Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys Lys Val Asp Leu Ser Gln
420 425 430
Gln Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu Ser Pro
435 440 445
Val Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn Ala Ile
450 455 460
Ile Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala Arg
465 470 475 480
Glu Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met Ile Asn Glu Met Gln Lys
485 490 495
Arg Asn Arg Gln Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr Thr
500 505 510
Gly Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His Asp
515 520 525
Met Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu
530 535 540
Asp Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile Pro
545 550 555 560
Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Lys
565 570 575
Gln Glu Glu Asn Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr Leu
580 585 590
Ser Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His Ile
595 600 605
Leu Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys Glu
610 615 620
Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys Asp
625 630 635 640
Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Gly Leu
645 650 655
Met Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp Val Lys
660 665 670
Val Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys Trp
675 680 685
Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp
690 695 700
Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys
705 710 715 720
Leu Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys
725 730 735
Gln Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys Glu
740 745 750
Ile Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys Asp
755 760 765
Tyr Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Glu Leu Ile
770 775 780
Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr Leu
785 790 795 800
Ile Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu
805 810 815
Lys Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His His
820 825 830
Asp Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr Gly
835 840 845
Asp Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn Tyr
850 855 860
Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile
865 870 875 880
Lys Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp
885 890 895
Tyr Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Pro Tyr
900 905 910
Arg Phe Asp Val Tyr Leu Asp Asn Gly Val Tyr Lys Phe Val Thr Val
915 920 925
Lys Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val Asn Ser
930 935 940
Lys Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn Gln Ala
945 950 955 960
Glu Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Asn Asn Asp Leu Ile Lys Ile Asn Gly
965 970 975
Glu Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Leu Leu Asn Arg Ile
980 985 990
Glu Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu Asn Met
995 1000 1005
Asn Asp Lys Arg Pro Pro Arg Ile Ile Lys Thr Ile Ala Ser Lys Thr
1010 1015 1020
Gln Ser Ile Lys Lys Tyr Ser Thr Asp Ile Leu Gly Asn Leu Tyr Glu
1025 1030 1035 1040
Val Lys Ser Lys Lys His Pro Gln Ile Ile Lys Lys Gly
1045 1050
<210> 288
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSFR alpha chain signal sequence
<400> 288
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atccccga 68
<210> 289
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human HBB gene splice acceptor
<400> 289
ctgacctctt ctcttcctcc cacag 25
<210> 290
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human IgG gene splice acceptor
<400> 290
tttctctcca cag 13
<210> 291
<211> 228
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Spacer
<400> 291
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 292
<211> 164
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3 zeta precursor
<400> 292
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
100 105 110
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
115 120 125
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
145 150 155 160
Leu Pro Pro Arg
<210> 293
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FKBP
<400> 293
Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro
1 5 10 15
Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp
20 25 30
Gly Lys Lys Met Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe
35 40 45
Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala
50 55 60
Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr
65 70 75 80
Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr
85 90 95
Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
100 105
<210> 294
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FKBP12v36
<400> 294
Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro
1 5 10 15
Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp
20 25 30
Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe
35 40 45
Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala
50 55 60
Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr
65 70 75 80
Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr
85 90 95
Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
100 105
<210> 295
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human C-Src acylation motif
<400> 295
Met Gly Ser Asn Lys Ser Lys Pro Lys Asp Ala Ser Gln Arg Arg Arg
1 5 10 15
<210> 296
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dual acylation motif
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)...(4)
<223> Xaa is any amino acid
<400> 296
Met Gly Cys Xaa Cys
1 5
<210> 297
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAAX motif
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)...(4)
<223> Xaa is any amino acid
<400> 297
Cys Ala Ala Xaa
1
Claims (103)
- 조작된 T 세포로서,
상기 T 세포의 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내로 통합된 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자(transgene)를 포함하는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌(modified T cell stimulation-associated locus)를 포함하되,
상기 전이 유전자는 상기 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소(endogenous transcriptional regulatory element)에 작동가능하게 연결되며,
상기 내인성 전사 조절 요소는 상기 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에 상기 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현을 유도하거나 상향조절하는(upregulate),
조작된 T 세포. - 제 1 항에 있어서,
상기 내인성 전사 조절 요소는 상기 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 프로모터(promoter)이고, 상기 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 전이 유전자는 상기 프로모터의 하류(downstream)에 존재하는, 조작된 T 세포. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 내인성 전사 조절 요소는 상기 자극 또는 활성화 신호 후에 활성화되는 전사 인자에 의해 인식되는 반응 요소(들)을 포함하는, 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 작동 가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 상기 T 세포에서 상기 자극 또는 활성화 신호 후 (약) 6, 12, 18, 24, 36 또는 48 시간 미만 이내에 유도되거나 상향조절되고; 선택적으로 상기 작동 가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 (약) 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과보다 더 크게 상향조절되거나 또는 유도되는, 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 전이 유전자의 발현의 유도 또는 상향조절은 상기 자극 또는 활성화 신호의 기간 동안 일시적이고, 이어서 감소되거나 하향조절되는, 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 발현의 유도 또는 상향조절 후에, 선택적으로 상기 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에, 상기 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현이 유도 또는 하향조절되는, 조작된 T 세포. - 제 6 항에 있어서,
상기 작동 가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 상기 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에 상기 T 세포에서 추가 자극 또는 활성화 신호 후 유도되거나 상향조절되는, 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 7 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1, CD69, Nur77, FoxP3 및 HLA-DR 유전자 좌 중에서 선택되는, 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 8 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 수용체는 세포외 결합 도메인을 포함하고, 상기 재조합 수용체의 세포외 결합 도메인에 대한 제제의 결합은 상기 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 유도 또는 전달을 초래하는, 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 9 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 수용체는 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR) 복합체의 성분의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하고, 상기 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호는 상기 재조합 수용체에 존재하는 상기 세포내 신호전달 도메인을 통한 신호를 포함하고/하거나,
상기 재조합 수용체는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하고, 상기 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호는 상기 재조합 수용체에 존재하는 상기 세포내 신호전달 도메인을 통한 신호를 포함하는,
조작된 T 세포. - 제 10 항에 있어서,
상기 세포내 신호전달 영역은 CD3 사슬, 선택적으로 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 신호전달 도메인, 또는 그의 신호전달 부분을 포함하는, 조작된 T 세포. - 제 9 항 내지 제 11 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 제제는 표적 항원이고, 선택적으로 상기 표적 항원은 재조합 단백질이거나, 또는 세포의 표면에서 발현되는 항원인, 조작된 T 세포. - 제 12 항에 있어서,
상기 표적 항원은 종양 항원, 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원, 염증 항원, 또는 자가항원인, 조작된 T 세포. - 제 9 항 내지 제 11 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 제제는 항-이디오타입 항체인, 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 14 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)인, 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 15 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 전이 유전자는 상기 재조합 수용체 또는 상기 재조합 수용체의 일부를 암호화하는, 조작된 T 세포. - 제 16 항에 있어서,
상기 재조합 수용체는 2개의 별개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고,
상기 전이 유전자에 의해 암호화된 상기 재조합 수용체의 일부는 상기 재조합 수용체의 하나의 사슬이고, 상기 조작된 T 세포는 상기 재조합 수용체의 다른 사슬을 더 포함하고, 선택적으로 상기 재조합 수용체의 다른 사슬은 제 2 전이 유전자에 의해서 암호화되는, 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 14 항, 제 16 항 및 제 17 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 수용체는 재조합 T 세포 수용체(TCR)이고, 선택적으로 상기 재조합 TCR은 알파(TCRα) 사슬 및 베타(TCRβ) 사슬을 포함하고, 상기 전이 유전자는 상기 TCRα 사슬을 암호화하는 핵산 서열 및 상기 TCRβ 사슬을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 18 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 전이 유전자는 하나 이상의 멀티시스트로닉 요소(multicistronic element)(들)를 더 포함하고, 선택적으로 상기 멀티시스트로닉 요소(들)는 T2A, P2A, E2A 또는 F2A 또는 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site; IRES) 중에서 선택된 리보솜 스킵 요소를 암호화하는 서열을 포함하는, 조작된 T 세포. - 제 19 항에 있어서,
상기 재조합 수용체는 재조합 TCR이고, 상기 멀티시스트로닉 요소는 상기 TCRα를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열과 상기 TCRβ를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 사이에 위치하며;
상기 재조합 수용체는 다중-사슬 CAR이고, 상기 멀티시스트로닉 요소는 상기 다중-사슬 CAR의 하나의 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열과 상기 다중-사슬 CAR의 또 다른 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 사이에 위치하고/하거나;
상기 멀티시스트로닉 요소(들)는 상기 재조합 수용체를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열의 상류(upstream)인,
조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 20 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는:
a) 상기 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 또는 근처에서 하나 이상의 표적 부위(들)에서 유전자 파괴(genetic disruption)를 유도하는 것, 선택적으로 상기 유전자 파괴는 표적 부위에 특이적으로 결합하거나, 이를 인식하거나, 또는 혼성화하는 징크 핑거 핵산분해효소(zinc finger nuclease; ZFN), TAL-이펙터 핵산분해효소(TAL-effector nuclease; TALEN), 또는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어짐; 및
b) 상동성 지시된 수선(homology directed repair, HDR)을 위해 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것;
에 의해서, 상기 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자의 내인성 내지 세포 자극-연관된 유전자 좌 내로의 통합에 의해서 생성되는, 조작된 T 세포. - 제 21 항에 있어서,
상기 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자는 상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에서 적어도 하나의 표적 부위에 또는 그 근처에서 통합되는, 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 22 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1이고, 상기 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것이고, 상기 gRNA는 PDCD1 유전자에서 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖고, 선택적으로 상기 gRNA는 서열번호 75 및 104-109 중의 어느 하나, 선택적으로는 서열번호 75에 제시된 서열을 포함하는, 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 22 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 CD69이고, 상기 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것이고, 상기 gRNA는 CD69 유전자에서 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖고, 선택적으로 상기 gRNA는 서열번호 116-121 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는, 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 22 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 Nur77이고, 상기 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것이고, 상기 gRNA는 Nur77 유전자에서 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖고, 선택적으로 상기 gRNA는 서열번호 122-127 및 134-136에 제시된 서열을 포함하는, 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 22 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 FoxP3인, 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 22 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 HLA-DR 유전자 좌인, 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 27 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포는 내인성 T 세포 수용체 알파 불변 영역(T cell receptor alpha constant region, TRAC) 유전자 및/또는 내인성 T 세포 수용체 베타 불변 영역(T cell receptor beta constant region, TRBC) 유전자에서의 유전자 파괴를 더 포함하고,
선택적으로 상기 유전자 파괴는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것이고, 상기 CRISPR-Cas9 조합은 상기 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 내의 상기 적어도 하나의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 가이드 RNA(gRNA)를 포함하고,
선택적으로 상기 CRISPR-Cas9 조합은 상기 gRNA 및 Cas9 단백질을 포함하는 리보핵단백질(ribonucleoprotein, RNP) 복합체이고, 선택적으로 상기 유전자 파괴는 전기천공을 통해 복수의 T 세포 내로 도입된 상기 RNP에 의해 이루어지는 것인, 조작된 T 세포. - 제 28 항에 있어서,
상기 gRNA는 TRAC 유전자 내의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖고, 선택적으로 상기 gRNA는 서열번호 77 및 188-218 중의 어느 하나, 선택적으로 서열번호 77에 제시된 서열을 포함하고/하거나;
상기 gRNA는 TRBC 유전자 내의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖고, 선택적으로 상기 gRNA는 서열번호 219-276 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는, 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 29 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 부재 하에 상기 암호화된 재조합 수용체의 상기 세포내 신호전달 도메인을 통한 신호전달 활성은 상기 T 세포의 게놈 내의 상이한 위치에 존재하거나 상기 T 세포의 게놈 내의 무작위 위치에 존재하는 동일한 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 조작된 T 세포와 비교하여 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% 또는 그 초과 보다 더 크게 감소되는, 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 30 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포는 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포이거나 또는 이의 하위유형인, 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 31 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포는 대상체로부터 유래된 T 세포이고, 선택적으로 상기 대상체는 인간인, 조작된 T 세포. - 폴리뉴클레오티드로서,
(a) 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자, 및
(b) 상기 전이 유전자에 연결된 하나 이상의 상동성 암(homology arms),
을 포함하고,
상기 하나 이상의 상동성 암은 T 세포에서 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드. - 제 33 항에 있어서,
상기 재조합 수용체가 상기 폴리뉴클레오티드로 도입된 세포로부터 발현될 때, 상기 재조합 수용체 또는 이의 일부는 상기 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌에 의해 암호화되고/되거나;
상기 전이 유전자는 T 세포, 선택적으로 인간 T 세포의 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임에 대해 외인성 또는 이종성인 서열인,
폴리뉴클레오티드. - 제 33 항 또는 제 34 항에 있어서,
상기 하나 이상의 상동성 암은 5' 상동성 암 및/또는 3' 상동성 암을 포함하되, 선택적으로 상기 5' 상동성 암 및/또는 3' 상동성 암은 표적 부위를 둘러싸는 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 포함하고, 상기 표적 부위는 상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내에 있는, 폴리뉴클레오티드. - 제 35 항에 있어서,
상기 표적 부위는 상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소의 하류(downstream)인, 폴리뉴클레오티드. - 제 35 항 또는 제 36 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 구조 [5' 상동성 암]-[전이 유전자]-[3' 상동성 암]를 포함하는, 폴리뉴클레오티드. - 제 33 항 내지 제 37 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 50 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드, (약) 50 내지 (약) 500개의 뉴클레오티드, (약) 50 내지 (약) 250개의 뉴클레오티드, (약) 50 내지 (약) 100개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 500개의 뉴클레오티드, (약) 100 내지 (약) 250개의 뉴클레오티드, (약) 250 내지 (약) 750개의 뉴클레오티드, (약) 250 내지 (약) 500개의 뉴클레오티드의 길이이고; 독립적으로 (약) 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400 또는 500개의 뉴클레오티드의 길이, 또는 임의의 상기 것들 사이의 임의의 값; 또는 독립적으로 (약) 100개 미만의 뉴클레오티드의 길이, 선택적으로 (약) 50, 60, 70, 80 또는 90개의 뉴클레오티드의 길이, 또는 임의의 상기 것들 사이의 임의의 값인, 폴리뉴클레오티드. - 제 33 항 내지 제 38 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1, CD69, Nur77, FoxP3 및 HLA-DR 유전자 좌 중에서 선택되는, 폴리뉴클레오티드. - 제 39 항에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1이고, 선택적으로 상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 PDCD1의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드. - 제 40 항에 있어서,
상기 5' 상동성 암은:
a) 서열번호 66에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 나타내는 서열에 대해 적어도 (약) 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열;
b) 서열번호 66에 제시된 서열 중의 적어도 (약) 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 또는 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열; 또는
c) 서열번호 66에 제시된 서열;
을 포함하고; 및/또는
상기 3' 상동성 암은:
d) 서열번호 67에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 나타내는 서열에 대해 적어도 (약) 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열;
e) 서열번호 67에 제시된 서열 중의 적어도 (약) 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 또는 600개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열; 또는
f) 서열번호 67에 제시된 서열;
을 포함하는, 폴리뉴클레오티드. - 제 39 항에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 CD69이고, 선택적으로 상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 CD69의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드. - 제 39 항에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 Nur77이고, 선택적으로 상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 Nur77의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드. - 제 39 항에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 FoxP3이고, 선택적으로 상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 FoxP3의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드. - 제 39 항에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 HLA-DR 유전자 좌이고, 선택적으로 상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 HLA-DR 유전자 좌의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드. - 제 33 항 내지 제 45 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 수용체는 세포외 결합 도메인을 포함하고, 상기 재조합 수용체의 세포외 결합 도메인에 대한 제제의 결합은 상기 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 유도 또는 전달을 초래하는, 폴리뉴클레오티드. - 제 33 항 내지 제 46 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 수용체는 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 성분의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하고, 상기 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호는 상기 재조합 수용체에 존재하는 상기 세포내 신호전달 도메인을 통한 신호를 포함하고/하거나,
상기 재조합 수용체는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하고, 상기 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호는 상기 재조합 수용체에 존재하는 상기 세포내 신호전달 도메인을 통한 신호를 포함하는, 폴리뉴클레오티드. - 제 47 항에 있어서,
상기 세포내 신호전달 영역은 CD3 사슬, 선택적으로 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 신호전달 도메인, 또는 이의 신호전달 부분을 포함하는, 폴리뉴클레오티드. - 제 46 항 내지 제 48 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 제제는 표적 항원이고, 선택적으로 상기 표적 항원은 재조합 단백질이거나 또는 세포의 표면 상에 발현된 항원인, 폴리뉴클레오티드. - 제 49 항에 있어서,
상기 표적 항원은 종양 항원, 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원, 염증성 항원 또는 자가항원인, 폴리뉴클레오티드. - 제 46 항 내지 제 48 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 제제는 항-이디오타입 항체인, 폴리뉴클레오티드. - 제 33 항 내지 제 51 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 폴리뉴클레오티드. - 제 33 항 내지 제 52 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 전이 유전자는 상기 재조합 수용체, 또는 상기 재조합 수용체의 일부를 암호화하는, 폴리뉴클레오티드. - 제 53 항에 있어서,
상기 재조합 수용체는 2개의 별개의 폴리펩티드 사슬을 포함하되, 상기 전이 유전자에 의해 암호화된 상기 재조합 수용체의 일부는 상기 재조합 수용체의 하나의 사슬이고, 선택적으로 상기 재조합 수용체의 다른 사슬은 제 2 전이 유전자에 의해 암호화되는, 폴리뉴클레오티드. - 제 33 항 내지 제 51 항, 제 53 항 및 제 54 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 수용체는 재조합 T 세포 수용체(TCR)이고, 선택적으로 상기 재조합 TCR은 알파(TCRα) 사슬 및 베타(TCRβ) 사슬을 포함하고, 상기 전이 유전자는 상기 TCRα 사슬을 암호화하는 핵산 서열 및 상기 TCRβ 사슬을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드. - 제 33 항 내지 제 55 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 전이 유전자는 하나 이상의 멀티시스트로닉 요소(multicistronic element)(들)를 더 포함하되, 선택적으로 상기 멀티시스트로닉 요소(들)는 T2A, P2A, E2A 또는 F2A 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 중에서 선택된 리보솜 스킵 요소를 암호화하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드. - 제 56 항에 있어서,
상기 재조합 수용체는 재조합 TCR이고, 상기 멀티시스트로닉 요소는 상기 TCRα를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열과 상기 TCRβ를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 사이에 위치하고;
상기 재조합 수용체는 다중-사슬 CAR이고, 상기 멀티시스트로닉 요소는 상기 다중-사슬 CAR의 하나의 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열과 상기 다중-사슬 CAR의 또 다른 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열 사이에 위치하고/하거나;
상기 멀티시스트로닉 요소(들)는 상기 재조합 수용체를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열의 상류(upstream)인,
폴리뉴클레오티드. - 제 33 항 내지 제 57 항 중의 어느 한 항에 있어서,
선형 폴리뉴클레오티인, 폴리뉴클레오티드. - 제 33 항 내지 제 57 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터에 포함되는, 폴리뉴클레오티드. - 제 59 항에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 AAV 벡터인, 폴리뉴클레오티드. - 제 33 항 내지 제 60 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 (약) 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750 또는 4000개의 뉴클레오티드 길이, 또는 상기 중 임의의 것들 사이의 임의의 값; 또는 (약) 1500개 내지 약 2500개의 뉴클레오티드 또는 (약) 1750개 내지 (약) 2250개의 뉴클레오티드 길이인, 폴리뉴클레오티드. - 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법으로서,
상기 방법은:
(a) T 세포의 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 T 세포 내로 도입하는 단계; 및
(b) 제 33 항 내지 제 61 항 중의 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 상기 T 세포 내로 도입하는 단계;
를 포함하되,
상기 방법은 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 생성하고, 상기 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하고,
상기 재조합 수용체 또는 그의 일부를 암호화하는 전이 유전자는 상동성-지시된 수선(HDR)을 통해 상기 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내에 통합되는, 방법. - 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법으로서,
상기 방법은 제 33 항 내지 제 61 항 중의 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함하되,
상기 T 세포는 상기 T 세포의 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내에 유전자 파괴를 갖고,
상기 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자는 상동성-지시된 수선(HDR)을 통해 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내에 통합되는, 방법. - 제 63 항에 있어서,
상기 유전자 파괴는 상기 T 세포의 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 T 세포 내로 도입함으로써 수행되는, 방법. - 제 62 항 내지 제 64 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌를 생성하고, 상기 변형된 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는, 방법. - 제 62 항 내지 제 65 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 표적 부위는 상기 내인성 T 세포 자극-연관된 유전자 좌의 내인성 전사 조절 요소의 하류인, 방법. - 제 62 항 내지 제 66 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1, CD69, Nur77, FoxP3 및 HLA-DR 유전자 좌 중에서 선택되는, 방법. - 제 62 항 내지 제 67 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 유전자 파괴는 표적 부위에 특이적으로 결합하거나, 인식하거나, 또는 혼성화하는 징크 핑거 핵산분해효소(ZFN), TAL-이펙터 핵산분해효소(TALEN), 또는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것인, 방법. - 제 62 항 내지 제 68 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 유전자 파괴는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것이고, 상기 CRISPR-Cas9 조합은 적어도 하나의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 가이드 RNA(gRNA)를 포함하고, 선택적으로 상기 CRISPR-Cas9 조합은 gRNA 및 Cas9 단백질을 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체이고, 선택적으로 상기 유전자 파괴는 전기천공을 통해 복수의 T 세포 내로 도입된 RNP에 의해 이루어지는 것인, 방법. - 제 62 항 내지 제 69 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 PDCD1이고, 상기 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것이고, 상기 gRNA는 PDCD1 유전자에서 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖고, 선택적으로 상기 gRNA는 서열번호 75 및 104-109 중의 어느 하나, 선택적으로는 서열번호 75에 제시된 서열을 포함하는, 방법. - 제 62 항 내지 제 69 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 CD69이고, 상기 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것이고, 상기 gRNA는 CD69 유전자에서 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖고, 선택적으로 상기 gRNA는 서열번호 116-121 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는, 방법. - 제 62 항 내지 제 69 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 Nur77이고, 상기 유전자 파괴는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것이고, 상기 gRNA는 Nur77 유전자에서 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖고, 선택적으로 상기 gRNA는 서열번호 122-127 및 134-136에 제시된 서열을 포함하는, 방법. - 제 62 항 내지 제 69 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 FoxP3인, 방법. - 제 62 항 내지 제 69 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포 자극-연관된 유전자 좌는 HLA-DR 유전자 좌인, 방법. - 제 62 항 내지 제 74 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포는 내인성 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC) 유전자 및/또는 내인성 T 세포 수용체 베타 불변 영역(TRBC) 유전자에서의 유전자 파괴를 더 포함하고,
선택적으로 상기 유전자 파괴는 CRISPR-Cas9 조합에 의해 이루어지는 것이고, 상기 CRISPR-Cas9 조합은 상기 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 내의 상기 적어도 하나의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 가이드 RNA(gRNA)를 포함하고,
선택적으로 상기 CRISPR-Cas9 조합은 상기 gRNA 및 Cas9 단백질을 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체이고, 선택적으로 상기 유전자 파괴는 전기천공을 통해 복수의 T 세포 내로 도입된 상기 RNP에 의해 이루어지는 것인, 방법. - 제 75 항에 있어서,
상기 gRNA는 TRAC 유전자 내의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖고, 선택적으로 상기 gRNA는 서열번호 77 및 188-218 중의 어느 하나, 선택적으로 서열번호 77에 제시된 서열을 포함하고/하거나;
상기 gRNA는 TRBC 유전자 내의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖고, 선택적으로 상기 gRNA는 서열번호 219-276 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는, 방법. - 제 69 항 내지 제 76 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 RNP는 전기천공, 입자 총, 인산칼슘 형질감염, 세포 압축(compression) 또는 압착(squeezing)을 통해, 선택적으로는 전기천공을 통해 도입되고, 선택적으로 상기 RNP는 전기천공을 통해 복수의 T 세포 내로 도입되는, 방법. - 제 69 항 내지 제 77 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 RNP의 농도는 (약) 1 μM 내지 (약) 5 μM이고, 선택적으로 상기 RNP의 농도는 (약) 2 μM인, 방법. - 제 62 항 내지 제 78 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포는 CD8+ T 세포 및/또는 CD4+ T 세포 또는 이의 하위유형을 포함하는, 방법. - 제 62 항 내지 제 79 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포는 인간 T 세포, 선택적으로 인간 대상체로부터 유래된 1차 T 세포인, 방법. - 제 62 항 및 제 64 항 내지 제 80 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 제제(들) 및 폴리뉴클레오티드는 동시에 도입되는, 방법. - 제 62 항 및 제 64 항 내지 제 80 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 하나 이상의 제제(들)의 도입 후에 도입되는, 방법. - 제 82 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 제제의 도입 직후, 또는 도입 후 약 30초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 6분, 8분, 9분, 10분, 15분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분, 90분, 2시간, 3시간 또는 4시간 내에 도입되는, 방법. - 제 62 항 및 제 64 항 내지 제 83 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 제제(들) 및/또는 폴리뉴클레오티드의 도입 전에, 상기 방법은 하나 이상의 면역 세포를 자극 또는 활성화시키는 조건 하에 상기 세포를 자극제(들)와 함께 시험관 내에서 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 선택적으로 상기 자극제(들)는 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 포함하고, 선택적으로 상기 자극제(들)는 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 포함하는 올리고머 입자 시약 또는 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체로 코팅된 비드를 포함하는, 방법. - 제 62 항 및 제 64 항 내지 제 84 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 하나 이상의 제제의 도입 및/또는 폴리뉴클레오티드의 도입 전, 도입 동안 또는 도입 후에 상기 세포를 하나 이상의 재조합 사이토카인과 함께 인큐베이션하는 단계를 더 포함하되, 상기 하나 이상의 재조합 사이토카인은 IL-2, IL-7, 및 IL-15로 이루어진 군으로부터 선택되고, 선택적으로 상기 하나 이상의 재조합 사이토카인은 (약) 10 U/mL 내지 (약) 200 U/mL, 선택적으로 (약) 50 IU/mL 내지 (약) 100 U/mL의 IL-2; 0.5 ng/mL 내지 50 ng/mL, 선택적으로 (약) 5 ng/mL 내지 (약) 10 ng/mL의 IL-7; 및/또는 0.1 ng/mL 내지 20 ng/mL, 선택적으로 (약) 0.5 ng/mL 내지 (약) 5 ng/mL의 IL-15의 농도 중에서 선택되는 농도로 첨가되는, 방법. - 제 84 항 또는 제 85 항에 있어서,
상기 인큐베이션은 상기 하나 이상의 제제의 도입 및 폴리뉴클레오티드의 도입 후 최대 또는 대략 24 시간, 36 시간, 48 시간, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21 일 동안, 선택적으로 최대 또는 약 7 일 동안 수행되는, 방법. - 제 62 항 내지 제 86 항 중의 어느 한 항의 방법을 사용하여 생성된 조작된 T 세포.
- 제 1 항 내지 제 32 항 중의 어느 한 항의 조작된 세포 또는 제 1 항 내지 제 32 항 중의 어느 한 항의 복수의 조작된 세포를 포함하는 조성물.
- 제 87 항의 조작된 T 세포 또는 제 87 항의 복수의 조작된 T 세포를 포함하는 조성물.
- 제 88 항 또는 제 89 항에 있어서,
작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후 (약) 6, 12, 18, 24, 36 또는 48 시간 미만 이내에 상기 조성물 중의 하나 이상의 세포에서 상향조절되거나 유도되고, 선택적으로 상기 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호 후에, 상기 조성물 중의 세포 중에서 상기 작동가능하게 연결된 전이 유전자를 발현하는 세포의 빈도는 (약) 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과보다 더 큰 것인, 조성물. - 제 88 항 내지 제 90 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포에서 발현의 상향조절 또는 유도 후 또는 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에, 상기 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 상기 조성물 중의 하나 이상의 세포에서 감소되거나 하향조절되는, 조성물. - 제 88 항 내지 제 91 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 발현의 상향조절 또는 유도 후, 상기 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 상기 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일 또는 그 초과 후에 상기 조성물 중의 하나 이상의 세포에서 감소되거나 하향조절되거나; 또는
상기 조성물 중의 하나 이상의 세포에서 상기 작동가능하게 연결된 전이 유전자의 발현은 상기 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후 (약) 6, 12, 18, 24, 36 또는 48 시간 미만 이내에 감소되거나 하향조절되고, 선택적으로 상기 조성물 중의 세포 중에서 상기 작동가능하게 연결된 전이 유전자를 발현하는 세포의 빈도는 (약) 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과보다 더 크게 감소되고/되거나;
상기 T 세포에서 자극 또는 활성화 신호의 감소 또는 부재 후에, 상기 조성물 중의 세포 중에서 상기 재조합 수용체를 발현하는 세포의 빈도는 (약) 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 또는 그 미만보다 적은 것인, 조성물. - 제 88 항 내지 제 92 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는, 조성물. - 제 88 항 내지 제 93 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하고, CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비는 (약) 1:3 내지 3:1, 선택적으로 1:1인, 조성물. - 제 1 항 내지 제 32 항 및 제 87 항 중의 어느 한 항의 조작된 세포 또는 제 88 항 내지 제 94 항 중의 어느 한 항의 조성물을 질환 또는 장애를 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 치료 방법.
- 제 95 항에 있어서,
상기 질환 또는 장애는 암 또는 종양인, 치료 방법. - 제 96 항에 있어서,
상기 암 또는 종양은 혈액 악성종양, 선택적으로 림프종, 백혈병, 또는 형질 세포 악성종양이되, 선택적으로 상기 암은 림프종이고, 상기 림프종은 버킷 림프종, 비-호지킨 림프종(NHL), 호지킨 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 여포성 림프종, 소형 비-절단 세포 림프종, 점막-연관 림프 조직 림프종(MALT), 변연부 림프종, 비장 림프종, 결절 단핵구 B 세포 림프종, 면역모세포 림프종, 대세포 림프종, 미만성 혼합 세포 림프종, 폐 B 세포 혈관중심성 림프종, 소형 림프구성 림프종, 원발성 종격 B 세포 림프종, 림프형질세포성 림프종(LPL), 또는 맨틀 세포 림프종(MCL)인, 방법. - 제 96 항 또는 제 97 항에 있어서,
상기 암은 백혈병이고, 상기 백혈병은 만성 림프구성 백혈병(CLL), 형질 세포 백혈병 또는 급성 림프구성 백혈병(ALL)인, 방법. - 제 96 항 또는 제 97 항에 있어서,
상기 암은 형질 세포 악성종양이고, 상기 형질 세포 악성종양은 다발성 골수종(MM)인, 방법. - 제 96 항에 있어서,
상기 종양은 고형 종양이되, 선택적으로 상기 고형 종양은 비-소세포 폐암(NSCLC) 또는 두경부 편평 세포 암종(HNSCC)인, 방법. - 제 96 항 내지 제 100 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 암 또는 종양의 부피 또는 크기는 감소되고/되거나 상기 대상체의 생존은 상기 조작된 세포 또는 상기 조성물이 투여되지 않은 대상체에서의 것과 비교하여 연장되는, 방법. - 키트로서,
T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들); 및
제 33 항 내지 제 61 항 중의 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드;
를 포함하는, 키트. - 키트로서,
T 세포 자극-연관된 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들); 및
재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 재조합 수용체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 사슬을 암호화하는 전이 유전자는 상동성 지시된 수선(HDR)을 통해 표적 부위에서 또는 그 근처에서 통합을 위해 표적화됨; 및
제 62 항 내지 제 86 항 중의 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 지침;
을 포함하는, 키트.
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