JP5996630B2 - コンパクトｔａｌｅ−ヌクレアーゼを作製する方法及びその使用 - Google Patents

コンパクトｔａｌｅ−ヌクレアーゼを作製する方法及びその使用 Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、二本鎖DNAを効率的に標的しプロセシングすることのできるコンパクトな転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)の作製方法に関する。より具体的には、本発明は、活性実体が、単純で効率的なベクター化のために単一ポリペプチド鎖から構成され、興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的して該DNA標的配列の近傍のDNAをプロセシングするために二量体化を必要としない、少なくとも１つの触媒ドメインに融合された単一TALE DNA結合ドメインからなるTALENの作製方法に関する。本発明はまた、前記方法を実施するために使用するコンパクトTALEN、ベクター、組成物及びキットに関する。
発明の背景
哺乳動物ゲノムは、種々のタイプの損傷に継続的に悩まされており、そのうち二本鎖破断(DSB)が最も危険であると考えられている(Haber 2000)。DSBの修復は、細胞の状況に依存し得る多様な機構により起こり得る。相同組換え(HR)を介する修復は、破断点に元の配列を回復することができる。広範な配列相同性に対する厳格な依存性のために、この機構は、主に細胞サイクルのＳ期及びG2期(姉妹染色分体が非常に近接している)の間に活性であると示唆されている(Sonoda, Hocheggerら，2006)。一本鎖アニーリング(SSA)は、直列反復間のDSBを修復することにより、欠失を促進し得る別の１つの相同性依存プロセスである(Paques及びHaber 1999)。最後に、DNAの非相同末端結合(NHEJ)は、細胞サイクルを通して機能し得、相同組換えに依存しないDSB修復の主要経路である(Moore及びHaber 1996；Haber 2008)。NHEJは、少なくとも２つの異なる構成要素を含むようである：(i)DSB端部の直接再結合から本質的になり、XRCC4、Lig4及びKuタンパク質に依存する経路、及び；(ii)XRCC4、Lig4及びKuに依存せず、特に誤りが生じ易く、大抵は欠失を生じる代替のNHEJ経路(微小相同間に接合が生じる)(Frank, Sekiguchiら，1998；Gao, Sunら，1998；Guirouilh-Barbat, Huckら，2004；Guirouilh-Barbat, Rassら，2007；Haber 2008；McVey及びLee 2008)。
25年以上前に最初に記載された相同遺伝子ターゲッティング(HGT)(Hinnen, Hicksら，1978；Orr-Weaver, Szostakら，1981；Orr-Weaver, Szostakら，1983；Rothstein 1983)は、合理的なゲノム工学用の最初の方法の１つであり、今日まで依然として、遺伝子操作細胞又はノックアウトマウスの作製用の標準法である(Capecchi 2001)。にもかかわらず、本来的に低い効率が、ほとんどの細胞タイプ及び生物におけるルーチンプロトコルとしての使用を妨げている。この問題を扱うため、標的とした改変を１％を超えて達成する意図でもって広範な種類の合理的アプローチが提案されてきた。多くのグループが、HGTの効力を増強することに着目してきた。２つの主要な学問分野が明らかとなっている：(i)最大効力を達成するように、ターゲティングベクターの構造を改変することから本質的になる、いわゆる「マトリクス最適化」法；(ii)HRを刺激する追加のエフェクター(一般には、配列-特異的エンドヌクレアーゼ)が関与する方法。マトリクス最適化の分野は広範な技法をカバーし、種々の程度の成功を達成している(Russell及びHirata 1998；Inoue, Dongら，2001；Hirata, Chamberlainら，2002；Taubes 2002；Gruenert, Brusciaら，2003；Sangiuolo, Scaldaferriら，2008；Bedayat, Abdolmohamadiら，2010)。一方、ヌクレアーゼを介するHRの刺激は、効率的であることが繰り返し証明されている(Paques及びDuchateau 2007；Carroll 2008)。
(２つのホスホジエステル結合の加水分解によりDNAを切断する)生物学的試薬(例えば、メガヌクレアーゼ、ZFN及びTALEN(下記参照))により誘導されるDSBについては、付着末端の単純な再ライゲーションによりDNAは繋ぎ目のない様式で再結合され得る。或いは、種々のサイズの有害な挿入又は欠失(indel)が破断点で起き、最終的には遺伝子不活化をもたらし得る(Liang, Hanら，1998；Lloyd, Plaisierら，2005；Doyon, McCammonら，2008；Perez, Wangら，2008；Santiago, Chanら，2008；Kim, Leeら，2009；Yang, Djukanovicら，2009)。(部位特異的組換えにも相同組換えにも依拠しない)このプロセスの性質は、エンドヌクレアーゼ-誘導変異誘発に基づく第３の標的付けられたアプローチを生じる。このアプローチ並びに関連する応用は、(ａ)修復マトリクスを導入する必要がない点、及び；(ｂ)効力は細胞タイプ依存性が小さい点(HRとは対照的に、NHEJはおそらく、細胞サイクルを通して活性である)で、相同組換えに基づくものより単純であり得る(Delacote及びLopez 2008)。NHEJをベースにする標的付けられた変異誘発は、不死化細胞株における単一遺伝子又は複数遺伝子の不活化を誘引するために使用されてきた(Cost, Freyvertら，2010；Liu, Chanら，2010)。加えて、この方法は、古典的HR-ベースの遺伝子ノックアウト法が非効率であるか又は少なくとも成立が困難であると証明されている生物について新たな展望を開く(Doyon, McCammonら，2008；Geurts, Costら，2009；Shukla, Doyonら，2009；Yang, Djukanovicら，2009；Gao, Smithら，2010；Mashimo, Takizawaら，2010；Menoret, Iscacheら，2010)。
最近15年以上にもわたって、野生型I-SceIが関与する正攻法の実験から完全遺伝子操作酵素が関与するより精緻な研究まで、遺伝子ターゲッティングを成功裡に誘導するためのメガヌクレアーゼの使用が十分に実証されている(Stoddard, Scharenbergら，2007；Galetto, Duchateauら，2009；Marcaida, Munozら，2010；Arnould, Delendaら，2011)。メガヌクレアーゼ(ホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)とも呼ばれる)は、配列及び構造モチーフに基づいて５つのファミリーに分割され得る：LAGLIDADG、GIY-YIG、HNH、His-Cysボックス及びPD-(D/E)XK(Stoddard 2005；Zhao, Bonocoraら，2007)。各ファミリーの少なくとも１つのメンバーについて構造データが入手可能である。最もよく研究されているファミリーは、LAGLIDADGタンパク質のものであり、相当多数の生化学的、遺伝学的及び構造研究により、これらエンドヌクレアーゼを分子ツールとして使用し得ることが確証されている(Stoddard, Scharenbergら，2007；Arnould, Delendaら，2011)。メンバーのタンパク質は、類似のαββαββαフォールドをとるドメインから構成され、LAGLIDADGモチーフが、第１ヘリックスの末端領域を含んでなり、２部構成の(bipartite)触媒中心に寄与するだけでなく、コアサブユニット/サブユニット相互作用を形成する(Stoddard 2005)。２つのこのようなα/βドメインは、機能的タンパク質を形成するように組み立てられ、各々においてβ鎖がサドル形状のDNA結合領域を形成する。DNAと直接相互作用する領域での触媒中心の空間的分離は、特異性の再操作を可能にした(Seligman, Chisholmら，2002；Sussman, Chadseyら，2004；Arnould, Chamesら，2006；Doyon, Pattanayakら，2006；Rosen, Morrisonら，2006；Smith, Grizotら，2006；Arnould, Perezら，2007)。加えて、今日までに分析された既知の全てのLAGLIDADGタンパク質は、「クリベース」として作用して標的DNAの両鎖を切断する一方、最近の進歩により、一方の鎖のみを切断する「メガ-ニッカーゼ」が作製されている(Niu, Tenneyら，2008；McConnell Smith, Takeuchiら，2009)。この酵素は、原理的には、同様なレベルの標的付けられたHRを誘導し、NHEJの頻度を最小化し得る。
多くの工学的努力がLAGLIDADG HEに集中されてきたが、他の２つのファミリーGIY-YIG及びHNHのメンバーも特に興味深い。生化学的及び構造的研究により、両ファミリーにおいて、メンバーのタンパク質が別個の機能ドメイン：(１)DNA切断を主に担う触媒ドメイン及び(２)標的特異性を提供するDNA結合ドメインを有する２部構成フォールドをとり得ることが確立された(Stoddard 2005；Marcaida, Munozら，2010)。関連するGIY-YIG HEであるI-TevI及びI-BmoIは、これら酵素のDNA結合領域の互換性を証明するために開発された(Liu, Derbyshireら，2006)。I-BasI HEの分析により、Ｎ-末端触媒ドメインはHNHファミリーに属するが、Ｃ-末端DNA結合領域は、GIY-YIGファミリーのエンドヌクレアーゼ中に見出される、イントロンによりコードされるエンドヌクレアーゼ反復モチーフ(IENR1)に似ていることが明らかとなった(Landthaler及びShub 2003)。I-BasIの触媒頭部は、HNH HEであるI-HmuI、I-HmuII及びI-TwoI(これらの全てが鎖特異的ニッカーゼとして機能する)のものと配列類似性を有する(Landthaler, Begleyら，2002；Landthaler及びShub 2003；Landthaler, Lauら，2004；Shen, Landthalerら，2004；Landthaler, Shenら，2006)。
上記タンパク質ファミリーは配列-特異的ヌクレアーゼを含む一方、HNHモチーフは、E.coliコリシン(例えば、ColE9及びColE7)、S.pneumoniaeのEndA、AnabaenaのNucA及びCADのような非特異的ヌクレアーゼ中でも同定されている(Midon, Schaferら，2011)。これらヌクレアーゼの幾つかは、HNHモチーフを有すると共に、署名DRGHモチーフを含み、ββα-Me-フィンガー活性部位モチーフを形成するコアエレメントと構造的相同性を共有する。HNH/DRGHモチーフ中の残基の変異研究により、核酸切断活性における役割が確証された(Ku, Liuら，2002；Doudeva, Huangら，2006；Eastberg, Eklundら，2007；Huang及びYuan 2007)。更に、ColE7に対するDNA結合親和性及び配列嗜好性は効果的に変更され得る(Wang, Wrightら，2009)。このような詳細な研究により、標的付けられた目的のための非特異的ヌクレアーゼの再遺伝子操作の可能性が示される。
ジンク-フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)(これは、ジンク-フィンガー-ベースのDNA結合ドメインを独立の触媒ドメインと可撓性リンカーを介して融合させることにより創出された)(Kim, Chaら，1996；Smith, Bergら，1999；Smith, Bibikovaら，2000)は、遺伝子ターゲッティングを刺激するために通常使用される別の１つのタイプの遺伝子操作ヌクレアーゼである。原型のZFNは、タイプIIS制限酵素FokIの触媒ドメインをベースにし、遺伝子修正、遺伝子挿入及び遺伝子欠失を誘導するために成功裡に使用されている。ジンクフィンガー-ベースのDNA結合ドメインは、各々がDNAトリプレットを認識する３つ又は４つの個別のジンクフィンガーの連なりから作られている(Pabo, Peisachら，2001)。理論的には、ZFNの主要な利点の１つは、既知の認識パターンを有する既存のジンクフィンガーのコンビナトリアルアセンブリを用いて、容易に設計されることである(Choo及びKlug 1994；Choo及びKlug 1994；Kim, Leeら，2009)。しかし、高解像度精密構造検査により、実際にはユニット間にクロストークが存在することが示された(Elrod-Erickson, Rouldら，1996)。より良好な成功率及びより良質の試薬を達成するために、幾つかの方法を使用して、個別のジンクフィンガーをコンテクスト依存性様式(in a context dependant manner)で選択することにより、ZFタンパク質が組み立てられた(Greisman及びPabo 1997；Isalan及びChoo 2001；Maeder, Thibodeau-Begannyら，2008；Ramirez, Foleyら，2008)。
最近、FokI触媒ドメインを用いる新たなクラスのキメラヌクレアーゼが記載されている(Christian, Cermakら，2010；Li, Huangら，2011)。これらヌクレアーゼのDNA結合ドメインは、転写アクチベーター様エフェクター(TALE)(Xanthomonas種の植物病原体による感染プロセスで使用されるタンパク質ファミリー)に由来する。これらDNA結合ドメインにおいて、配列特異性は、本質的には２つの位置で異なる一連の33〜35アミノ酸反復に起因する(Boch, Scholzeら，2009；Moscou及びBogdanove 2009)。DNA標的中の各塩基対には単一の反復が接触し、特異性は、反復の２つの変化アミノ酸(いわゆる、反復可変ジペプチド(repeat variable dipeptide)、RVD)に起因する。これらDNA結合ドメインの明白なモジュール性は、新たな特異性を有するよう設計されたTALE-由来タンパク質のモジュール式組立てによって或る程度まで確証されている(Boch, Scholzeら，2009；Moscou及びBogdanove 2009)。しかし、ジンクフィンガータンパク質(上記参照)について観察されたような個別の反復/塩基認識パターンの或るレベルのコンテクスト依存性を依然として度外視できていない。更に、天然TALエフェクターは二量体化し得ることが示されており(Gurlebeck, Szurekら，2005)、このことが「二量体化-ベースの」TALE-由来ヌクレアーゼにどのように影響するかは、現在のところ不明である。
FokI-ベースのTALE-ヌクレアーゼ(TALEN)の機能的レイアウトは、本質的には、ZFNのものであり、ジンク-フィンガーDNA結合ドメインがTALEドメインで置換されている(Christian, Cermakら，2010；Li, Huangら，2011)。このため、TALENによるDNA切断は、非特異的な中央領域に隣接する２つのDNA認識領域を必要とする。この中央「スペーサー」DNA領域は、二量体化性(dimerizing)FokI触媒ドメインによる触媒作用の促進に必須であり、DNA結合部位間の距離を最適化することに広範な努力が投入された(Christian, Cermakら，2010；Miller, Tanら，2011)。このスペーサーの長さは14塩基対から30塩基対まで変えら、DNA切断の効率は、スペーサー長及びTALE足場構築物(すなわち、使用した融合構築物の性質)に相互依存性であった。反復領域における相違(すなわち、使用するRVDのタイプ及び数)がDNA「スペーサー」の要件又はTALENによるDNA切断の効率に影響するかどうかは依然として不明である。にもかかわらず、TALE-ヌクレアーゼは、酵母、哺乳動物細胞及び植物における細胞ベースアッセイで種々の程度に活性であることが示されている(Christian, Cermakら，2010；Li, Huangら，2011；Mahfouz, Liら，2011；Miller, Tanら，2011)。
本発明者らは、標的DNAを特異的に認識して効率的にプロセシングするように遺伝子操作され得る新たなタイプのTALENを開発した。これら新規な「コンパクトTALEN」(cTALEN)は、DNAプロセシング活性に二量体化を必要とせず、そのことで介在DNA「スペーサー」を有する「二重」標的部位の必要性を軽減する。更に、本発明は、別のDNA修復経路(HR 対 NHEJ)を増強することができる幾つかの別個のタイプの酵素の作製を可能にする。
発明の要旨
本発明は、興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的して該興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍のDNAをプロセシングするために二量体化を必要としない、単一のポリペプチド鎖から構成されるコンパクトな転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を作製する方法に関する。本発明はまた、単純で効率的なベクター化のための機能的な単一のポリペプチド融合タンパク質の作製に関する。別の観点では、本発明は、少なくともエンハンサードメインを含んでなるコンパクトTALENに関し、ここで、エンハンサードメインは、興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍でのコンパクトTALENのDNAプロセシング効率を増強する。本発明はまた、前記方法の実施に使用するコンパクトTALEN、ベクター、組成物及びキットに関する。本発明はまた、標的付けられたDNA切断から標的付けられた遺伝子調節までに及ぶ種々の適用に本発明によるコンパクトTALENを使用する方法に関する。本発明による方法は、トランスジェニック生物の作製から遺伝子疾患の治療までにわたる種々の分野において使用し得る。
図面の簡単な説明
前述の特徴に加えて、本発明は、下記の説明及び添付の図面から明らかとなる他の特徴を更に含む。下記の詳細な説明と共に図面を参照することにより本発明を十分に理解するにつれ、本発明及び付随する多くの利点を更に完全に正当に評価することが容易にできるようになる。
図１：エンドヌクレアーゼ-誘導遺伝子ターゲッティングアプローチ。切断に際して、DNA修復機構は幾つかの帰結の１つの生じ得る：(Ａ)２つの直列反復間の二本鎖破断を標的するとき、HRは介在配列と共に一方の反復の欠失を生じ得る。遺伝子挿入(Ｂ)又は遺伝子修正(Ｃ)は、DNA破断を取り囲む内因性配列に相同な配列を含有するDNA修復マトリクスの導入により達成され得る。変異は、破断点又は破断に対して遠位のいずれかで修正され得る。修正の頻度は距離が増すにつれ減少する。(Ｄ)エラーを生じ易いNHEJによるDNA端部の誤修復は、種々のサイズの挿入又は欠失を生じ、遺伝子不活化を導き得る。 図２：I-CreI及びI-TevIにより認識される標的DNAの配列。C1234(配列番号３)は、野生型I-CreIメガヌクレアーゼにより認識・切断される、部分的に対称な天然DNA配列を表す。C1221(配列番号2)は、C1234(配列番号３)に由来する人工パリンドロームDNA配列を表し、これもI-CreI(配列番号１)により認識・切断される。ヌクレオチドは、標的の中心から外側へ向かって(-/+)番号付けられている。DNA切断は、下線を付した配列のいずれかの側で、４-ヌクレオチドの3'オーバーハング端部を生成するように起きる。I-CreI-ベースのメガヌクレアーゼについては、-２位〜+２位のヌクレオチドの性質は、当該タンパク質の切断活性に潜在的に干渉し得る。Tev(配列番号105)は、野生型I-TevIメガヌクレアーゼにより認識・切断される非対称DNA配列を表す。ヌクレオチド番号付けは、天然標的配列のイントロン-挿入部位に対して相対的である。I-TevIによる切断は、下線を付した配列のいずれかの側で、２-ヌクレオチドの3'オーバーハング端部を生成するように起きる。 図３：TALEN及びコンパクトTALEN構築物により認識される標的DNAの配列。遺伝子操作コンパクトTALENであるcTN-Avr及びcTN-Pthの標的DNAは、それぞれ、天然に存在する非対称配列AvrBs3(19bp)[bT1-Avr(配列番号136)及びbT2-Avr(配列番号137)ベースラインタンパク質足場中]及びPthXo1(25bp)[bT1-Pth(配列番号138)及びbT2-Pth(配列番号139)ベースラインタンパク質足場中]をベースにする。各配列について、ヌクレオチドは、アンカーのＴ(-１位)から外側へ向かって(-/+)番号付けられている。示される配列に、当該タンパク質が直接接触して標的特異性をもたらす。野生型の反復可変ジペプチド(RVD)は、各配列に対して標的付けられた天然に存在するエフェクタータンパク質の反復中に見出されるジペプチドに相当する。暗号(cipher)RVDは、列挙したジペプチド/ヌクレオチド対のサブセットに基づく。人工RVDは、暗号RVDコードを用いる基礎のDNA配列の直接読み出しにより導き出される(配列番号245〜249)。 図４：メガヌクレアーゼ融合体形態の概略。融合構築物は、別個の課題に対処するか又はこれを克服するために最適化される。(Ａ)活性なメガヌクレアーゼへの２つの触媒ドメインの付加は、切断活性を増強し得るだけでなく(例えば、結合事象あたり、DNA切断をもたらす３つの機会)、エラーを生じ易いNHEJによる配列変更もまた促進し得る。なぜなら、一対の切断事象につき、小さなDNAセクションが複数切除されるからである。(Ｂ)特異性の操作がメガヌクレアーゼの切断活性の維持を妨げるときには、付着させた触媒ドメインが必要な鎖切断機能をもたらす。(Ｃ)及び(Ｄ)は、それぞれ、融合タンパク質あたり唯１つの触媒ドメインが許容される(例えば、Ｎ-若しくはＣ-末端融合体として又は単鎖分子でのいずれか)場合の(Ａ)及び(Ｂ)の例を表す。全ての場合で、考えられる触媒ドメインは、適用に依存して、クリベース(DNAの両鎖を切断する能力)又はニッカーゼ(一方のDNA鎖のみを切断)のいずれかであり得る。融合点(Ｎ-末端 対 Ｃ-末端)及びリンカーのデザインは適用により変化し得る。融合タンパク質の構成要素は説明文に示す。 図５：cTALEN形態の概略。コンパクトTALENは、DNA切断事象を標的するときの複数の独立タンパク質成分の必要性を軽減するように設計される。重要なことには、現在の古典的TALENの機能に必須である「スペーサー」領域及び二重の標的部位が不必要になる。加えて、触媒ドメインは特異的なDNA接触を必要としないので、コアTALE DNA結合ドメインを取り囲む領域に関して制限がない。(Ａ)標準の修復経路(クリベースドメイン)又は保存的修復経路(ニッカーゼドメイン)を介するHRを促進するＮ-末端融合構築物。(Ｂ)(Ａ)と同様の特性を有するＣ-末端融合構築物。(Ｃ)TALEの両端部への２つの触媒ドメインの付着により、NHEJが増強した二重切断が可能になる。融合点(Ｎ-末端 対 Ｃ-末端)及びリンカーのデザインは適用により変化し得る。融合タンパク質の構成要素は説明文に示す。 図６：増強cTALEN形態の概略。コンパクトTALENは、既存の又は代替の活性を促進するドメインの付加により、増強することができる。TALE DNA結合ドメインの各端部は融合に従順であるので、触媒ドメイン及びエンハンサードメインの付加の順序(Ｎ-末端 対 Ｃ-末端)は適用により変化させ得る。(Ａ)Ｃ-末端エンハンサードメインを有する標準のcTALEN。(Ｂ)エンハンサードメインをcTALENに触媒ドメインのＮ-末端を介して融合させる。この形態を使用して、触媒ドメインに助力し及び/又は触媒ドメインをDNA近くに繋ぎ止めて切断活性を増大させることができる。(Ｃ)エンハンサードメインを触媒ドメインとTALE DNA結合ドメインとの間に挟む。エンハンサードメインは、隣接ドメイン間の連絡を(触媒作用及び/又はDNA結合に助力するように)促進し得るか、又は全てのTALE-ベースの標的における-１位のＴヌクレオチドの必要性を克服するために使用し得る。(Ｄ)エンハンサードメインを、天然TALEタンパク質のＮ-末端領域の機能的置換に使用する。(Ｅ)エンハンサードメインを、天然TALEタンパク質のＣ-末端領域の機能的置換に使用する。融合点(Ｎ-末端 対 Ｃ-末端)及びリンカーのデザインは適用により変化し得る。融合タンパク質の構成要素は説明文に示す。 図７：トランスcTALEN形態の概略。コンパクトTALENは、代替の活性を促進する補助エンハンサードメインと組み合わせ得る。補助ドメインは、cTALEN活性に必須でない追加の機能を提供する。(Ａ)Ｎ-末端ニッカーゼ触媒ドメインを有する標準のcTALENは、補助ドメインを別途付加することにより「クリベース」になる。(Ｂ)幾つかの場合で、補助ドメインの特異性を標的することが必要となる。この形態はTALE融合体により達成され得る。この形態を使用して、cTALENの活性を増大させるように、補助ドメインを支援し及び/又は補助ドメインをDNA近くに繋ぎ止めるために使用することができる。(Ｃ)標的付けられた補助ドメインが、独立の任務を実行するためにcTALENの前又は後に提供される。融合タンパク質間の連絡は必要ない。融合点(Ｎ-末端 対 Ｃ-末端)及びリンカーのデザインは適用により変化し得る。融合タンパク質の構成要素は説明文に示す。 図８：DNA切断、インビボ再ライゲーション及び他の修復経路の概略。細胞中で、ペプチド性の稀切断性エンドヌクレアーゼ(rare-cutting endonuclease)による切断は、通常、付着末端を有するDNA二本鎖破断(DSB)をもたらす。例えば、LAGLIDADGファミリーのメガヌクレアーゼ(例えば、I-SceI及びI-CreI)は、3'オーバーハングを有するDSBを生じる。これら付着末端は、インビボではNHEJにより再ライゲートされ、継ぎ目のない修復を生じ、切断可能な標的配列の回復をもたらし得る。これは、その後、同じエンドヌクレアーゼにより再びプロセシングされ得る。よって、無益な一連の切断及び再ライゲーション事象のサイクルが起こり得る。不正確なNHEJ又は相同組換えが切断部位を変更又は除去し、サイクルの出口をもたらし得る；このことは、本発明によるコンパクトTALEN及び増強コンパクトTALENにも当てはめることができる(Ａ)。２つの他の方法もこのプロセスを停止させ得る：(i)染色体喪失は、DSBを修復することに失敗した結果として起こり得る；(ii)ヌクレアーゼの喪失(分解、希釈、細胞分裂など...)。Ｂ〜Ｅ：追加のホスホジエステル結合切断の結果。同じ鎖に影響する１つのニッカーゼ活性(Ｂ)又は２つのニッカーゼ活性(Ｃ)の付加により一本鎖ギャップが生じ、付着末端が抑制される。このことはその後の事象に影響し得る。向かい合う鎖に影響する２つのニッカーゼ活性(Ｄ)又は第２のDSBを生じる新たなクリベース活性(Ｅ)の付加により二本鎖ギャップが生じる；結果として、完全な再ライゲーションはもはや不可能であり、１つ又は幾つかの代替の修復成果が刺激され得る。この図は、これら代替の成果(不正確なNHEJ、相同組換え、その他…)の相対的頻度に関して推定していない。黒三角は、ホスホジエステル結合の加水分解を表す。 図９：酵母でのTALE-AvrBs3::TevIの活性(37℃)。ネガティブコントロールは、本質的に、RVDを有しないTALENからなる。n.d.は検出可能な活性なしを示し、＋は酵母アッセイにおける0.3を超える活性を示し、+++は酵母アッセイにおける0.7を超える活性を示す(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。 図10：哺乳動物細胞におけるTALE-AvrBs3::TevIの活性。(CHO-K1における染色体外アッセイ)。pCLS8993(配列番号194)を黒色バーで表し、pCLS8994(配列番号195)を濃い灰色バーで表す。ネガティブコントロール(空ベクター)を白色バーで表し、ポジティブコントロール(I-SceIメガヌクレアーゼ)を薄い灰色バーで表す。データは、ポジティブコントロールに対して規格化されている。 図11：酵母でのTALE-AvrBs3::NucAの活性(37℃)。ネガティブコントロールは、認識部位を欠く標的である(neg. ctrl.：配列番号228)。compactは唯一の認識部位を有する標的である(配列番号224)。n.d.は検出可能な活性なしを示し、＋は37℃での酵母アッセイにおける0.3を超える活性を示し；++は37℃での酵母アッセイにおける0.5を超える活性を示し、+++は37℃での酵母アッセイにおける0.7を超える活性を示す(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。 図12：酵母でのTALE-AvrBs3::ColE7の活性(37℃)。ネガティブコントロールは、認識部位を欠く標的である(neg. ctrl.：配列番号228)。compactは唯一の認識部位を有する標的である(配列番号224)。n.d.は検出可能な活性なしを示し、＋は37℃での酵母アッセイにおける0.3を超える活性を示し；++は37℃での酵母アッセイにおける0.5を超える活性を示し、+++は37℃での酵母アッセイにおける0.7を超える活性を示す(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。 図13：TALE::CreI原型コンパクトTALENの概略及び詳細。このクラスのコンパクトTALENは、メガヌクレアーゼ標的部位に近位のTALE DNA結合部位から構成される２部構成の認識配列を標的する。遺伝子操作TCRB02-Aメガヌクレアーゼ部位を、RVD及びTALE成分により認識されるDNA配列の詳細と共に示す。Ｔ細胞レセプターＢ遺伝子領域を示し、TALE::CreI-ベースのコンパクトTALENハイブリッド標的部位の内生レイアウトを強調する。 図14：酵母でのTALE::scTB2aD01-ベースの構築物の活性(30℃)。種々のハイブリッド標的のレイアウトを(5')側から示す。TALE DNA結合ドメインにより認識される領域を大文字で、非特異的スペーサー領域を小文字で、メガヌクレアーゼ標的部位を下線を付した小文字で示す。酵母での活性を、選択した代表的構築物について示す。n.d.は検出可能な活性なしを示し、＋は30℃での酵母アッセイにおける0.3を超える活性を示し；++は30℃での酵母アッセイにおける0.5を超える活性を示し、+++は30℃での酵母アッセイにおける0.7を超える活性を示す(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。 図15：TALE::scTB2aD01-ベースの構築物のウェスタンブロット。構築物をHEK293細胞で発現させ、総タンパク質抽出物をトランスフェクションの48時間後に調製した。タンパク質は、ポリクローナル抗-I-CreI抗体を用いて検出した。 図16：CHOK1細胞におけるTALE::scTB2aD01-ベースの構築物の毒性。細胞毒性は、標準コントロール(空プラスミドのトランスフェクション)に対する、生存細胞で発現したGFPの検出可能なレベル(１日目 対 ６日目)に基づく。 図17：HEK293細胞におけるTALE::scTB2aD01-ベースの構築物のNHEJ活性。トランスフェクション後のゲノムDNAのPCR-ベース分析を使用して、インビボ活性を評価する。T7エンドヌクレアーゼによるミスマッチDNA配列の切断は、標的付けられた遺伝子座でのcTALEN又はメガヌクレアーゼの活性に起因するNHEJ事象を示す。 図18：酵母でのTevI::TALE-AvrBs3 +/- TALE-RagT2-R::TevIの活性(37℃)。ネガティブコントロールは、認識部位を欠く標的である(neg. ctrl.：配列番号228)。n.d.は検出可能な活性なしを示し、＋は37℃での酵母アッセイにおける0.3を超える活性を示し；++は37℃での酵母アッセイにおける0.5を超える活性を示し、+++は37℃での酵母アッセイにおける0.7を超える活性を示す(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。 図19：酵母でのTALE::SnaseSTAAUの活性(37℃)。ネガティブコントロールは、認識部位を欠く標的である。compactは唯一の認識部位を有する標的である(配列番号224)。n.d.は37℃で検出可能な活性なしを示し、+/-は37℃での酵母アッセイにおける0.3を上回る活性を示し；＋は37℃での酵母アッセイにおける0.3を超える活性を示し；++は37℃での酵母アッセイにおける0.5を超える活性を示し、+++は37℃での酵母アッセイにおける0.75を超える活性を示す(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。 図20：酵母での、種々のポリペプチドリンカーを有するTALE::ColE7の活性(37℃)。compactは唯一の認識部位を有する標的である(配列番号224)。n.d.は37℃で検出可能な活性なしを示し、＋は37℃での酵母アッセイにおける0.3を超える活性を示し；++は37℃での酵母アッセイにおける0.5を超える活性を示し、+++は37℃での酵母アッセイにおける0.75を超える活性を示す(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。 表６：種々のスペーサー長を有するAvrBs3標的のリスト(配列番号157〜192)。 表７：唯一の認識部位を有する標的(compact、配列番号224)及び認識部位がない標的から本質的になるネガティブコントロール標的(neg. ctrl.、配列番号228)を含む、種々のスペーサー長を有するAvrBs3標的のリスト(配列番号157〜192)。 表13：種々のスペーサー長を有するハイブリッドRagT2-R/AvrBs3標的のリスト(配列番号315〜350)。
発明の詳細な説明
本明細書中で特に規定しない限り、使用する全ての技術及び科学用語は、遺伝子治療、生化学、遺伝学及び分子生物学の分野で当業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。
本明細書に記載したものと類似するか又は等価である全ての方法及び材料は、本発明の実施又は試験に使用することができ、適切な方法及び材料を本明細書中に記載する。本明細書中で言及する全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、参照よりその全体が本明細書中に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。更に、材料、方法及び例は、単なる例示に過ぎず、特に断らない限り、限定する意図はない。
他に示さない限り、本発明の実施には、当業分野の技術の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組換えDNA及び免疫学の通常の技術を用いる。このような技術は文献に十分に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL，2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA)；Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition (Sambrookら，2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編，1984)；Mullisら，米国特許第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries及びS. J. Higgins編 1984)；Transcription And Translation (B. D. Hames及びS. J. Higgins編 1984)；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press，1986)；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；Methods In ENZYMOLOGYシリーズ(J. Abelson及びM. Simon編集責任者, Academic Press, Inc., New York)、具体的には、154及び155巻(Wuら編)及び185巻,「Gene Expression Technology」(D. Goeddel編)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller及びM. P. Calos編，1987, Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer及びWalker編, Academic Press, London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir及びC. C. Blackwell編，1986)；及びManipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.，1986)を参照。
第１の観点において、本発明は、興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的して該興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍のDNAをプロセシングするために二量体化を必要としない、単一のポリペプチド鎖から構成されるコンパクトな転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(cTALEN)を作製する方法に関する。
第１の観点によれば、本発明は、
(i)(ａ)DNA結合特異性を変化させ興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的するための異なるセットの反復可変ジペプチド領域(RVD)を含んでなり、(ｂ)DNAプロセシングをもたらすように選択した触媒ドメインを付着させることが可能であるコアTALE足場を遺伝子操作する工程；
(ii)(i)の遺伝子操作コアTALE足場に融合させたとき、興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍のDNAをプロセシングすることができる少なくとも１つの触媒ドメインを決定するか又は遺伝子操作する工程；
(iii)任意に、(ii)の触媒ドメインを(i)の遺伝子操作コアTALE足場に融合させるためのペプチド性リンカーを決定するか又は遺伝子操作する工程
により、興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的して該興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍のDNAをプロセシングするために二量体化を必要としない、単一のポリペプチド鎖から構成されるコンパクトTALEN実体を取得する
ことを含んでなる、コンパクトな転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(cTALEN)を作製する方法である。換言すれば、本発明によるコンパクトTALENは、それ自体で、１つのDNA結合ドメインにより唯１つの興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的し、該興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍のDNAをプロセシングすることができる活性実体単位である。
別の１つの実施形態は、
(ａ)興味対象の１つのDNA標的配列を二本鎖DNAの一方の鎖上で選択し；
(ｂ)下記：
(i)興味対象のDNA標的配列に対するDNA結合特異性を有する反復可変ジペプチド領域(RVD)を含んでなる１つのコアTALE足場；
(ii)(i)のコアTALE足場のＣ末端及び/又はＮ末端に融合されたとき興味対象のDNA標的配列から数塩基対離れたDNAをプロセシングし得る少なくとも１つの触媒ドメイン；
(iii)任意に、必要な場合に(ii)の触媒ドメインを(i)のコアTALE足場に融合させるための１つのペプチド性リンカー
を含んでなり、二量体化を要することなく、二本鎖DNAに結合してプロセシングするように組み立てられている独特なコンパクトTALENモノマーを提供し；
(ｃ)二本鎖DNAを独特なモノマーと、該二本鎖が一本鎖標的配列から3'及び/又は5'方向に数塩基対離れた場所でプロセシングされるように接触させる
ことを含んでなる、二本鎖DNAを標的してプロセシングする方法である。
別の１つの実施形態では、本発明による遺伝子操作コアTALE足場は、追加のＮ末端ドメインを含んでなり、その結果、Ｎ末端ドメイン及びDNA結合特異性を変化させ興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的するための異なるセットの反復可変ジペプチド領域(RVD)をこの順で含んでなり、DNAプロセシングをもたらすように選択した触媒ドメインを付着させることが可能である遺伝子操作コアTALE足場を生じる。
別の１つの実施形態では、本発明による遺伝子操作コアTALE足場は、追加のＣ末端ドメインを含んでなり、その結果、DNA結合特異性を変化させ興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的するための異なるセットの反復可変ジペプチド領域(RVD)及びＣ末端ドメインをこの順で含んでなり、DNAプロセシングをもたらすように選択した触媒ドメインを付着させることが可能である遺伝子操作コアTALE足場を生じる。
別の１つの実施形態では、本発明による遺伝子操作コアTALE足場は、追加のＮ-末端及びＣ末端ドメインを含んでなり、その結果、Ｎ末端ドメイン、DNA結合特異性を変化させ興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的するための異なるセットの反復可変ジペプチド領域(RVD)及びＣ末端ドメインをこの順で含んでなり、DNAプロセシングをもたらすように選択した触媒ドメインを付着させることが可能である遺伝子操作コアTALE足場を生じる。別の１つの実施形態では、本発明による遺伝子操作コアTALE足場は、ST1(配列番号134)及びST2(配列番号135)からなる群より選択されるタンパク質配列を含んでなる。別の１つの実施形態では、遺伝子操作TALE足場は、配列番号134及び配列番号135からなる群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80％、より好ましくは90％、またより好ましくは95％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
別の１つの実施形態では、本発明による遺伝子操作コアTALE足場は、bT1-Avr(配列番号136)、bT2-Avr(配列番号137)、bT1-Pth(配列番号138)及びbT2-Pth(配列番号139)からなる群より選択されるタンパク質配列を含んでなる。別の１つの実施形態では、遺伝子操作TALE足場は、配列番号136〜配列番号139からなる群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80％、より好ましくは90％、またより好ましくは95％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
本発明の方法による１つの好適な実施形態では、遺伝子操作コアTALE足場の追加のＮ-末端及びＣ末端ドメインは天然TALEに由来する。１つのより好適な実施形態では、遺伝子操作コアTALE足場の追加のＮ-末端及びＣ末端ドメインは、非限定例としてのAvrBs3、PthXo1、AvrHah1、PthA、Tal1cのような天然TALEに由来する。別の１つのより好適な実施形態では、追加のＮ-末端及び/又はＣ末端ドメインは、それぞれ、非限定例としてのAvrBs3、PthXo1、AvrHah1、PthA、Tal1cのような、それらが由来する天然TALEのＮ-末端及び/又はＣ末端ドメインの短縮型形態である。１つのより好適な実施形態では、遺伝子操作コアTALE足場の追加のＮ-末端及びＣ末端ドメイン配列は、ベースラインタンパク質足場bT1-Avr(配列番号136)又はbT1-Pth(配列番号138)及びbT2-Avr(配列番号137)又はbT2-Pth(配列番号139)にそれぞれ例示されるように、ST1(配列番号134)及びST2(配列番号135)からなる群より選択される。
別の１つの実施形態では、コア足場の各RVDは、30〜42アミノ酸、より好ましくは33又は34アミノ酸から作られ、12位及び13位に位置する２つの重要なアミノ酸が、核酸標的配列の１つのヌクレオチドの認識を媒介する；等価な２つの重要なアミノ酸は、特に33又は34アミノ酸長より長いRVD中で、12位及び13位以外の位置に位置することができる。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関係するRVDは、Ｃを認識するためのHD、Ｔを認識するためのNG、Ａを認識するためのNI、Ｇ又はＡを認識するためのNN、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴを認識するためのNS、Ｔを認識するためのHG、Ｔを認識するためのIG、Ｇを認識するためのNK、Ｃを認識するためのHA、Ｃを認識するためのND、Ｃを認識するためのHI、Ｇを認識するためのHN、Ｇを認識するためのNA、Ｇ又はＡを認識するためのSN、及びＴを認識するためのYG、Ａを認識するためのTL、Ａ又はＧを認識するためのVT、及びＡを認識するためのSWである。より好ましくは、ヌクレオチドＣ、Ｔ、Ａ、Ｇ/Ａ及びＧの認識に関係するRVDは、それぞれ、Ｇを認識するためのNN又はNK、Ｃを認識するためのHD、Ｔを認識するためのNG及びＡを認識するためのNI、Ａを認識するためのTL、Ａ又はＧを認識するためのVT、及びＡを認識するためのSWからなる群より選択される。別の１つの実施形態では、ヌクレオチドＣの認識に関係するRVDは、N*からなる群より選択され、ヌクレオチドＴの認識に関係するRVDは、N*及びH*からなる群より選択される(ここで、*は、RVDの第２位のアミノ酸残基の欠如に対応する反復配列中のギャップを示す)。別の１つの実施形態では、重要なアミノ酸12及び13は、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ及びＧに対する特異性を変調させるため、特に特異性を増大させるために、他のアミノ酸残基に変異させることができる。他のアミノ酸残基により、20の天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸誘導体のいずれもが意図される。
別の１つの実施形態では、本発明のコア足場は８〜30のRVDを含んでなる。本発明のコア足場は、より好ましくは８〜20のRVD、またより好ましくは15のRVDを含んでなる。
別の１つの実施形態では、コア足場は、前記セットのRVDのＣ-末端に位置する20アミノ酸から作られる追加の単一短縮型RVD、すなわち追加のＣ-末端ハーフ-RVDを含んでなる。この場合、本発明のコア足場は8.5〜30.5のRVDを含んでなる。ここで、「.5」はハーフ-RVD(又は末端RVD、又はハーフ-反復)をいう。本発明のコア足場は、より好ましくは8.5〜20.5のRVD、またより好ましくは15.5のRVDを含んでなる。１つの好適な実施形態では、ハーフ-RVDは、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔに対するハーフ-RVDの特異性の欠如を可能にするコア足場形態中に存在する。１つのより好適な実施形態では、ハーフ-RVDは存在しない。
別の１つの実施形態では、本発明のコア足場は、異なる起源のRVDを含んでなる。１つの好適な実施形態では、コア足場は、天然に存在する異なるTALエフェクターを起源とするRVDを含んでなる。別の１つの好適な実施形態では、本発明のコア足場の幾つかのRVDの内部構造は、天然に存在する異なるTALエフェクターを起源とする構造又は配列により構成される。別の１つの実施形態では、本発明のコア足場はRVD-様ドメインを含んでなる。RVD-様ドメインは、天然に存在するRVDとは異なる配列を有するが、本発明のコア足場内で同じ機能及び/又は全体構造を有する。
別の１つの実施形態では、遺伝子操作コアTALE足場の追加のＮ末端ドメインは、エンハンサードメインである。別の１つの実施形態では、エンハンサードメインは、非限定例としてのPuf RNA結合タンパク質又はアンキリンスーパーファミリーからなる群より選択される。別の１つの実施形態では、エンハンサードメイン配列は、表１に列挙される非限定例としての配列番号４及び配列番号５のタンパク質ドメイン、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体からなる群より選択される。
別の１つの実施形態では、遺伝子操作コアTALE足場の追加のＣ末端ドメインは、エンハンサードメインである。別の１つの実施形態では、エンハンサードメインは、非限定例としてのPseudomonas Aeuriginosa科のヒドロラーゼ/トランスフェラーゼ、Mycobacterium tuberculosisリガーゼＤファミリーのポリメラーゼドメイン、Pyrococcus科の開始因子elF2、翻訳開始因子Aif2ファミリーからなる群より選択される。別の１つの実施形態では、エンハンサードメイン配列は、表１に列挙される非限定例としての配列番号６〜配列番号９のタンパク質ドメイン、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体からなる群より選択される。
表１：遺伝子操作コアTALE足場のためのエンハンサードメインのリスト
本発明の方法による別の１つの好適な実施形態では、本発明の方法による遺伝子操作コアTALE足場に融合されたときに興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍のDNAをプロセシングすることができる触媒ドメインが、コアTALE足場のＮ末端部に融合される。別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインはコアTALE足場のＣ末端部に融合される。別の１つの好適な実施形態では、２つの触媒ドメインがコアTALE足場のＮ-末端部及びＣ-末端部の両方に融合される。１つのより好適な実施形態では、触媒ドメインは、ヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、メチラーゼ活性、トポイソメラーゼ活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性又はリガーゼ活性からなる群より選択される酵素活性を有する。別の１つの好適な実施形態では、本発明のコアTALE足場に融合される触媒ドメインは、転写アクチベーター若しくはリプレッサー(すなわち転写レギュレーター)、又は他のタンパク質(例えばヒストン)と相互作用するか若しくはこれを改変するタンパク質であり得る。本発明のコンパクトTALENのDNAプロセシング活性の非限定例としては、例えば、エピジェネティックな調節エレメントの創出又は改変、DNAにおける部位-特異的挿入、欠失又は修復、遺伝子発現の制御、及びクロマチン構造の改変が挙げられる。
別の１つのより好適な実施形態では、触媒ドメインはエンドヌクレアーゼ活性を有する。別の１つのより好適な実施形態では、触媒ドメインは、本発明の方法による二本鎖DNAに対する切断活性を有する。別の１つのより好適な実施形態では、触媒ドメインは、本発明の方法による二本鎖DNAに対するニッカーゼ活性を有する。別の１つのより好適な実施形態では、触媒ドメインは、表２に列挙されるようなタンパク質MmeI、コリシン-E7(CEA7_ECOLX)、コリシン-E9、APFL、EndA、Endo I(END1_ECOLI)、ヒトEndo G(NUCG_HUMAN)、ウシEndo G(NUCG_BOVIN)、R.HinP1I、I-BasI、I-BmoI、I-HmuI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-TwoI、R.MspI、R.MvaI、NucA、NucM、Vvn、Vvn_CLS、スタフィロコッカスヌクレアーゼ(NUC_STAAU)、スタフィロコッカスヌクレアーゼ(NUC_STAHY)、ミクロコッカスヌクレアーゼ(NUC_SHIFL)、エンドヌクレアーゼyncB、エンドデオキシリボヌクレアーゼＩ(ENRN_BPT7)、メトナーゼ、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I(R.BspD6Iラージサブユニット)、ss.BspD6I(R.BspD6Iスモールサブユニット)、R.PleI、MlyI、AlwI、Mva1269I、BsrI、BsmI、Nb.BtsCI、Nt.BtsCI、R1.BtsI、R2.BtsI、BbvCIサブユニット１、BbvCIサブユニット２、Bpu10Iアルファサブユニット、Bpu10Iベータサブユニット、BmrI、BfiI、I-CreI、hExoI(EXO1_HUMAN)、酵母ExoI(EXO1_YEAST)、E.coli ExoI、ヒトTREX2、マウスTREX1、ヒトTREX1、ウシTREX1、ラットTREX1、ヒトDNA2、酵母DNA2(DNA2_YEAST)及びVP16(配列番号10〜配列番号66及び配列番号１、366及び367)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体からなる群より選択される。本発明の方法による別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインはI-TevI(配列番号20)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体である。別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインI-TevI(配列番号20)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体は、本発明の方法によるコアTALE足場のＮ末端ドメインに融合される。別の１つの好適な実施形態では、本発明の方法によるコンパクトTALENは、配列番号420〜432の群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80％、より好ましくは90％、またより好ましくは95％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインは、ColE7(配列番号11)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体である。別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインColE7(配列番号11)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体は、本発明の方法によるコアTALE足場のＮ末端ドメインに融合される。別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインColE7(配列番号11)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体は、本発明の方法によるコアTALE足場のＣ末端ドメインに融合される。別の１つの好適な実施形態では、本発明の方法によるコンパクトTALENは、配列番号435〜438の群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80％、より好ましくは90％、またより好ましくは95％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインは、NucA(配列番号26)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体である。別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインNucA(配列番号26)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体は、本発明の方法によるコアTALE足場のＮ末端ドメインに融合される。別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインNucA(配列番号26)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体は、本発明の方法によるコアTALE足場のＣ末端ドメインに融合される。別の１つの好適な実施形態では、本発明の方法によるコンパクトTALENは、配列番号433〜434の群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80％、より好ましくは90％、またより好ましくは95％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインは、I-CreI(配列番号1)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体である。別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインI-CreI(配列番号1)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体は、本発明の方法によるコアTALE足場のＮ末端ドメインに融合される。別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインI-CreI(配列番号1)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体は、本発明の方法によるコアTALE足場のＣ末端ドメインに融合される。別の１つの好適な実施形態では、本発明の方法によるコンパクトTALENは、配列番号439〜441及び配列番号444〜446の群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80％、より好ましくは90％、またより好ましくは95％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
別の１つの実施形態では、触媒ドメインは、制限酵素、例えば表２に列挙される非限定例のようなMmeI、R-HinPII、R.MspI、R.MvaI、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I、ss.BspD6I、R.PleI、MlyI及びAlwIである。別の１つのより好適な実施形態では、触媒ドメインはエキソヌクレアーゼ活性を有する。
別の１つのより好適な実施形態では、表２に列挙されるようなタンパク質MmeI、コリシン-E7(CEA7_ECOLX)、コリシン-E9、APFL、EndA、Endo I(END1_ECOLI)、ヒトEndo G(NUCG_HUMAN)、ウシEndo G(NUCG_BOVIN)、R.HinP1I、I-BasI、I-BmoI、I-HmuI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-TwoI、R.MspI、R.MvaI、NucA、NucM、Vvn、Vvn_CLS、スタフィロコッカスヌクレアーゼ(NUC_STAAU)、スタフィロコッカスヌクレアーゼ(NUC_STAHY)、ミクロコッカスヌクレアーゼ(NUC_SHIFL)、エンドヌクレアーゼyncB、エンドデオキシリボヌクレアーゼＩ(ENRN_BPT7)、メトナーゼ、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I(R.BspD6Iラージサブユニット)、ss.BspD6I(R.BspD6Iスモールサブユニット)、R.PleI、MlyI、AlwI、Mva1269I、BsrI、BsmI、Nb.BtsCI、Nt.BtsCI、R1.BtsI、R2.BtsI、BbvCIサブユニット１、BbvCIサブユニット２、Bpu10Iアルファサブユニット、Bpu10Iベータサブユニット、BmrI、BfiI、I-CreI、hExoI(EXO1_HUMAN)、酵母ExoI(EXO1_YEAST)、E.coli ExoI、ヒトTREX2、マウスTREX1、ヒトTREX1、ウシTREX1、ラットTREX1、ヒトDNA2、酵母DNA2(DNA2_YEAST)及びVP16(配列番号10〜配列番号66及び配列番号１、366及び367)、これらタンパク質の機能的変異体、バリアント又は誘導体のドメインからなる群より選択される２つの触媒ドメインの任意の組合せを、コアTALE足場のＮ-末端部及びＣ-末端部の両方にそれぞれ融合させることができる。例えば、I-HmuI触媒ドメインをコアTALE足場のＮ末端部に融合させることができ、ColE7触媒ドメインをコアTALE足場のＣ末端部に融合させることができる。別の１つの例では、I-TevI触媒ドメインをコアTALE足場のＮ末端部に融合させることができ、ColE7触媒ドメインをコアTALE足場のＣ末端部に融合させることができる。別の１つの実施形態では、本発明の方法による独特なコンパクトTALENモノマーは、コアTALE足場のＣ末端部及びＮ末端部にそれぞれ融合され、下記：
(i)Ｎ末端のNuc Aドメイン(配列番号26)及びＣ末端のNuc Aドメイン(配列番号26)；
(ii)Ｎ末端のColE7ドメイン(配列番号11)及びＣ末端のColE7ドメイン(配列番号11)；
(iii)Ｎ末端のTevIドメイン(配列番号20)及びＣ末端のColE7ドメイン(配列番号11)；
(iv)Ｎ末端のTevIドメイン(配列番号20)及びＣ末端のNucAドメイン(配列番号26)；
(v)Ｎ末端のColE7ドメイン(配列番号11)及びＣ末端のNucAドメイン(配列番号26)；
(vi)Ｎ末端のNucAドメイン(配列番号26)及びＣ末端のColE7ドメイン(配列番号11)
からなる群より選択される２つの触媒ドメインの組合せを含んでなる。
別の１つの好適な実施形態では、本発明の方法によるコンパクトTALENは、配列番号448及び450からなる群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80％、より好ましくは90％、またより好ましくは95％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
別の１つの好適な実施形態では、本発明の方法によるコンパクトTALENは、コアTALE足場のＣ末端部及びＮ末端部にそれぞれ融合され、下記：
(i)Ｎ末端のTevIドメイン(配列番号20)及びＣ末端のFokIドメイン(配列番号368)；
(ii)Ｎ末端のTevIドメイン(配列番号20)及びＣ末端のTevIドメイン(配列番号20)；
(iii)Ｎ末端のscTrex2ドメイン(配列番号451)及びＣ末端のFokIドメイン(配列番号368)。
からなる群より選択される、２つの触媒ドメインの組合せを含んでなる。
別の１つの好適な実施形態では、本発明の方法によるコンパクトTALENは、配列番号447〜450及び配列番号452からなる群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80％、より好ましくは90％、またより好ましくは95％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
本発明の範囲内において、触媒ドメインを、本発明による遺伝子操作コアTALE足場の２つの部分(各部分が１セットのRVDを含んでなる)の間に挿入することが考えられる。この場合、遺伝子操作コアTALE足場の各部分についてのRVDの数は、同じであってもなくてもよい。換言すれば、本発明のコアTALE足場を分割して、得られる２つの部分の間に１つの触媒ドメインを挿入することも考えられる。別の１つの好適な実施形態では、本発明の方法によるコンパクトTALENは、配列番号453〜455からなる群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80％、より好ましくは90％、またより好ましくは95％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
表２：コンパクトTALEN又は増強コンパクトTALEN用の触媒/エンハンサードメインのリスト
本発明の方法による別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインを本発明の方法によるコアTALE足場に連結することができるペプチド性リンカーは、表３に列挙されるようなNFS1、NFS2、CFS1、RM2、BQY、QGPSG、LGPDGRKA、1a8h_1、1dnpA_1、1d8cA_2、1ckqA_3、1sbp_1、1ev7A_1、1alo_3、1amf_1、1adjA_3、1fcdC_1、1al3_2、1g3p_1、1acc_3、1ahjB_1、1acc_1、1af7_1、1heiA_1、1bia_2、1igtB_1、1nfkA_1、1au7A_1、1bpoB_1、1b0pA_2、1c05A_2、1gcb_1、1bt3A_1、1b3oB_2、16vpA_6、1dhx_1、1b8aA_1及び1qu6A_1(配列番号67〜配列番号104及び配列番号372〜配列番号415)からなる群より選択され得る。１つのより好適な実施形態では、触媒ドメインを本発明の方法によるコアTALE足場に連結することができるペプチド性リンカーは、NFS1(配列番号98)、NFS2(配列番号99)及びCFS1(配列番号100)からなる群より選択され得る。触媒ドメインをTALE足場に融合させて本発明によるcTALENを取得するためにペプチド性リンカーを必要としない場合も本発明の範囲に包含される。
表３：コンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENに使用し得るペプチド性リンカーのリスト。
構造的組成[コアTALE足場のタイプ、関連する酵素活性を有する触媒ドメインのタイプ、最後にリンカーのタイプ]に依存して、本発明によるコンパクトTALENは、DNAを異なってプロセシングすることができる別々の酵素活性を異なるレベルで含み得、これにより、コンパクトTALENの全体のDNAプロセシング効率がもたらされ、異なる酵素活性の各々は独自のDNAプロセシング効率を有する。
別の１つの好適な実施形態では、本発明による方法は、以下の工程：
(i)少なくとも１つのエンハンサードメインを遺伝子操作する工程；
(ii)任意に、エンハンサードメインをコンパクトTALEN実体の１つの部分に融合させるための１つのペプチドリンカーを決定するか又は遺伝子操作する工程
により、興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍に増強したDNAプロセシング効率を有するコンパクトTALEN実体、すなわち増強コンパクトTALENを取得することを含んでなる。
換言すれば、本発明の方法による独特なコンパクトTALENモノマーは、
(i)少なくとも１つのエンハンサードメイン；
(ii)任意に、エンハンサードメインを独特なコンパクトTALENモノマーの活性実体の１つの部分に融合させるための１つのペプチドリンカー
を更に含んでなる。
別の１つのより好適な実施形態では、エンハンサードメインは、コンパクトTALEN実体のコアTALE足場部分のＮ-末端に融合される。別の１つのより好適な実施形態では、エンハンサードメインは、コンパクトTALEN実体のコアTALE足場部分のＣ-末端に融合される。別の１つのより好適な実施形態では、エンハンサードメインは、コンパクトTALEN実体の触媒ドメイン部分に融合される。別の１つのより好適な実施形態では、エンハンサードメインは、コアTALE足場部分のＮ-末端とコンパクトTALEN実体の触媒部分との間に融合される。別の１つのより好適な実施形態では、エンハンサードメインはコアTALE足場部分のＣ-末端とコンパクトTALEN実体の触媒部分との間に融合される。本発明の範囲内において、触媒ドメイン及び/又はエンハンサードメインを、本発明による遺伝子操作コアTALE足場の２つの部分(各部分が１セットのRVDを含んでなる)の間に挿入することが考えられる。この場合、各遺伝子操作コアTALE足場についてのRVDの数は、同じであってもなくてもよい。換言すれば、本発明のコアTALE足場を分割して、得られる２つの部分の間に１つの触媒ドメイン及び/又は１つのエンハンサードメインを挿入することも考えられる。
別の１つの好適な実施形態では、エンハンサードメインは触媒的に活性であるか又は活性でなく、コンパクトTALEN実体に機能的及び/又は構造的支持を提供する。１つのより好適な実施形態では、エンハンサードメインは、表２に列挙されるようなMmeI、コリシン-E7(CEA7_ECOLX)、コリシン-E9、APFL、EndA、Endo I(END1_ECOLI)、ヒトEndo G(NUCG_HUMAN)、ウシEndo G(NUCG_BOVIN)、R.HinP1I、I-BasI、I-BmoI、I-HmuI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-TwoI、R.MspI、R.MvaI、NucA、NucM、Vvn、Vvn_CLS、スタフィロコッカスヌクレアーゼ(NUC_STAAU)、スタフィロコッカスヌクレアーゼ(NUC_STAHY)、ミクロコッカスヌクレアーゼ(NUC_SHIFL)、エンドヌクレアーゼyncB、エンドデオキシリボヌクレアーゼI(ENRN_BPT7)、メトナーゼ、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I(R.BspD6Iラージサブユニット)、ss.BspD6I(R.BspD6Iスモールサブユニット)、R.PleI、MlyI、AlwI、Mva1269I、BsrI、BsmI、Nb.BtsCI、Nt.BtsCI、R1.BtsI、R2.BtsI、BbvCIサブユニット１、BbvCIサブユニット２、Bpu10Iアルファサブユニット、Bpu10Iベータサブユニット、BmrI、BfiI、I-CreI、hExoI(EXO1_HUMAN)、酵母ExoI(EXO1_YEAST)、E.coli ExoI、ヒトTREX2、マウスTREX1、ヒトTREX1、ウシTREX1、ラットTREX1、ヒトDNA2、酵母DNA2(DNA2_YEAST)及びVP16(配列番号10〜配列番号66及び配列番号１、366及び367)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体からなる群より選択されるタンパク質ドメインからなる。別の１つのより好適な実施形態では、エンハンサードメインは、上記及び表２に列挙されるタンパク質ドメインの触媒的に活性な誘導体からなり、コンパクトTALEN実体に機能的及び/又は構造的支持を提供する。別の１つの好適な実施形態では、エンハンサードメインは、上記及び表２に列挙されるタンパク質ドメインの触媒的に不活性な誘導体からなり、コンパクトTALEN実体に構造的支持を提供する。別の１つの好適な実施形態では、エンハンサードメインは、I-TevI(配列番号20)、ColE7(配列番号11)及びNucA(配列番号26)からなる群より選択される。
１つのより好適な実施形態では、本発明の方法による増強コンパクトTALENは、第２のエンハンサードメインを含んでなり得る。この実施形態では、第２のエンハンサードメインは、第１のエンハンサードメインと同じ特徴を有し得る。１つのより好適な実施形態では、第２のエンハンサードメインは、増強コンパクトTALEN実体に構造的支持を提供する。別の１つのより好適な実施形態では、第２のエンハンサードメインは、増強コンパクトTALEN実体に機能的支持を提供する。１つのより好適な実施形態では、第２のエンハンサードメインは、増強コンパクトTALEN実体に構造的及び機能的支持を提供する。１つのより好適な実施形態では、コンパクトTALEN実体は、１つの触媒ドメイン及び１つのエンハンサードメインを含んでなる。別の１つのより好適な実施形態では、増強コンパクトTALEN実体は、１つの触媒ドメイン及び２つのエンハンサードメインを含んでなる。別の１つのより好適な実施形態では、増強コンパクトTALEN実体は、２つの触媒ドメイン及び１つのエンハンサードメインを含んでなる。別の１つのより好適な実施形態では、増強コンパクトTALEN実体は、２つの触媒ドメイン及び２つのエンハンサードメインを含んでなる。
１つのより好適な実施形態では、第２のエンハンサードメインは、表２に列挙されるようなMmeI、コリシン-E7(CEA7_ECOLX)、コリシン-E9、APFL、EndA、Endo I(END1_ECOLI)、ヒトEndo G(NUCG_HUMAN)、ウシEndo G(NUCG_BOVIN)、R.HinP1I、I-BasI、I-BmoI、I-HmuI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-TwoI、R.MspI、R.MvaI、NucA、NucM、Vvn、Vvn_CLS、スタフィロコッカスヌクレアーゼ(NUC_STAAU)、スタフィロコッカスヌクレアーゼ(NUC_STAHY)、ミクロコッカスヌクレアーゼ(NUC_SHIFL)、エンドヌクレアーゼyncB、エンドデオキシリボヌクレアーゼI(ENRN_BPT7)、メトナーゼ、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I(R.BspD6Iラージサブユニット)、ss.BspD6I(R.BspD6Iスモールサブユニット)、R.PleI、MlyI、AlwI、Mva1269I、BsrI、BsmI、Nb.BtsCI、Nt.BtsCI、R1.BtsI、R2.BtsI、BbvCIサブユニット１、BbvCIサブユニット２、Bpu10Iアルファサブユニット、Bpu10Iベータサブユニット、BmrI、BfiI、I-CreI、hExoI(EXO1_HUMAN)、酵母ExoI(EXO1_YEAST)、E.coli ExoI、ヒトTREX2、マウスTREX1、ヒトTREX1、ウシTREX1、ラットTREX1、ヒトDNA2、酵母DNA2(DNA2_YEAST)及びVP16(配列番号10〜配列番号66及び配列番号１、366及び367)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体からなる群より選択されるタンパク質に由来するタンパク質ドメインからなる。別の１つのより好適な実施形態では、第２のエンハンサードメインは、上記及び表２に列挙されるタンパク質ドメインの触媒的に活性な誘導体からなり、増強コンパクトTALEN実体に機能的及び/又は構造的支持を提供する。別の１つの好適な実施形態では、第２のエンハンサードメインは、上記及び表２に列挙されるタンパク質ドメインの触媒的に不活性な誘導体からなり、増強コンパクトTALEN実体に構造的支持を提供する。
別の１つのより好適な実施形態では、非限定例として上記した触媒及び/又はエンハンサードメインの任意の組合せをコアTALE足場に融合させて、コンパクトTALEN実体に構造的及び/又は機能的支持を提供することが考えられる。より好ましくは、TevI(配列番号20)、ColE7(配列番号11)及びNucA(配列番号26)の群より選択される触媒ドメインの組合せが考えられる。任意に、FokI(配列番号368)を、表２のリストによる別の１つの触媒ドメインとの組合せで使用することができる。触媒及び/又はエンハンサードメインのこの組合せは、本発明の方法を用いる適用に関して考案され得る。
構造的組成[コアTALE足場のタイプ、関連する酵素活性を有する触媒ドメインのタイプ、最後にリンカーのタイプ及びエンハンサードメインのタイプ]に依存して、本発明による増強コンパクトTALENは、DNAを異なってプロセシングすることができる別々の酵素活性を異なるレベルで提示し得、これにより、増強コンパクトTALENの全体のDNAプロセシング効率がもたらされ、異なる酵素活性の各々は独自のDNAプロセシング効率を有する。
この好適な実施形態では、本発明の方法によるコンパクトTALEN実体のDNAプロセシング効率は、少なくとも１つのエンハンサードメイン及び１つのペプチド性リンカーの遺伝子操作により増強され、それにより、興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍に増強したDNAプロセシング活性を有するコンパクトTALEN実体、すなわち本発明による増強コンパクトTALENを得ることができる。
構造的組成に依存して、本発明による増強コンパクトTALENにおいて増強される全体のDNAプロセシング効率は、非限定例としてのヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、メチラーゼ活性、トポイソメラーゼ活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性又はリガーゼ活性からなる群より選択される優勢な酵素活性を有し得る。１つのより好適な実施形態では、本発明による増強コンパクトTALENにおいて増強される全体のDNAプロセシング効率は、非限定例としてのヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、メチラーゼ活性、トポイソメラーゼ活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性又はリガーゼ活性からなる群より選択される異なる酵素活性の組合せである。１つのより好適な実施形態では、本発明による増強コンパクトTALENにおいて増強される全体のDNAプロセシング効率は、その種々の酵素活性の１つであり、非限定例としてのヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、メチラーゼ活性、トポイソメラーゼ活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性又はリガーゼ活性からなる群より選択されるものである。この場合、全体的なDNAプロセシング効率は、上記の酵素活性のうちの１つのDNAプロセシング活性に等しい。別の１つのより好適な実施形態では、エンハンサーにより増強されるコンパクトTALEN実体のDNAプロセシング活性は、クリベース活性若しくはニッカーゼ活性又はクリベース活性及びニッカーゼ活性の組合せである。
本発明によるコンパクトTALEN実体のDNAプロセシング効率の増強は、少なくとも１つのエンハンサードメインによる構造的支持の結果であり得る。１つの好適な実施形態では、構造的支持は、増強したDNAプロセシング活性を有するコンパクトTALEN実体が得られるように、DNA標的配列に関する本発明によるコンパクトTALEN実体の結合を、同じDNA標的配列に関する出発材料のコンパクトTALEN実体の結合と比較して増強し、そのことにより触媒ドメインを間接的に支援する。別の１つの好適な実施形態では、構造的支持は、増強したDNAプロセシング活性を有するコンパクトTALEN実体が得られるように、DNA標的配列に関するコンパクトTALEN実体の既存の触媒活性を、同じDNA標的配列に関する出発材料のコンパクトTALEN実体の結合と比較して増強する。
別の１つの好適な実施形態では、本発明の方法によるエンハンサーは、増強したDNAプロセシング活性を有するコンパクトTALEN実体が得られるように、DNA標的配列に関するコンパクトTALEN実体の結合及び触媒ドメインの触媒活性の両方を増強する。これら全ての非限定例は、興味対象の遺伝子座でDNA標的配列に関して増強したDNAプロセシング効率を有するコンパクトTALEN実体、すなわち本発明による増強コンパクトTALENを導く。
出発材料のコンパクトTALEN実体と比較した本発明によるコンパクトTALEN実体のDNAプロセシング効率の増強は、少なくとも１つのエンハンサードメインによる機能的支持の結果でもあり得る。１つの好適な実施形態では、機能的支持は、追加のホスホジエステル結合の加水分解の結果であり得る。１つのより好適な実施形態では、機能的支持は、ヌクレアーゼに由来するタンパク質ドメインによる追加のホスホジエステル結合の加水分解であり得る。１つの実施形態では、機能的支持は、エンドヌクレアーゼに由来するタンパク質ドメインによる追加のホスホジエステル結合の加水分解であり得る。１つのより好適な実施形態では、機能的支持は、クリベースに由来するタンパク質ドメインによる追加のホスホジエステル結合の加水分解であり得る。別の１つのより好適な実施形態では、機能的支持は、ニッカーゼに由来するタンパク質ドメインによる追加のホスホジエステル結合の加水分解であり得る。１つのより好適な実施形態では、機能的支持は、エキソヌクレアーゼに由来するタンパク質ドメインによる追加のホスホジエステル結合の加水分解であり得る。
ゲノム工学実験においては、稀切断性エンドヌクレアーゼの効率、例えば或る遺伝子座で所望の事象(相同遺伝子ターゲッティング、標的付けられた変異誘発、配列の除去又は切り出し)を誘導する能力は、ヌクレアーゼの比活性、おそらく標的の接近可能性及び所望の事象を生じる修復経路(遺伝子ターゲッティングについては相同性修復、標的化された変異誘発についてはNHEJ経路)の効力及び帰結を含む幾つかのパラメータに依存する。
ペプチド性の稀切断性エンドヌクレアーゼによる切断は、通常、付着末端(LAGLIDADGメガヌクレアーゼについては3'オーバーハング(Chevalier及びStoddard 2001)及びジンクフィンガーヌクレアーゼについては5'オーバーハング(Smith, Bibikovaら，2000))を生じる。(ホスホジエステル結合の加水分解に起因する)これら端部は、インビボでNHEJにより継ぎ目のない様式で再ライゲートされ得る(すなわち、無瘢痕再ライゲーション)。切断可能な標的配列の回復により、同じエンドヌクレアーゼによる新たな切断事象が可能になり、よって無益な一連の切断及び再ライゲーション事象のサイクルが起こり得る。間接的証拠により、酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいてさえ、このようなサイクルがHOエンドヌクレアーゼによる連続切断に際して起こり得ることが示されている(Lee, Paquesら，1999)。哺乳動物細胞では、幾つかの実験により、２つの独立するが接近したI-SceI-誘導DSBに起因する適合性の付着末端の完全な再ライゲーションが効率的なプロセスであることが示されている(Guirouilh-Barbat, Huckら，2004；Guirouilh-Barbat, Rassら，2007；Bennardo, Chengら，2008；Bennardo, Gunnら，2009)。Ku DNA修復タンパク質の不在は、２つのDSBに由来する端部を再結合するNHEJ事象の全体頻度に顕著には影響しない；しかし、この不在は、CHO不死化細胞及びマウスES細胞において、修復プロセスに対する不正確なNHEJの寄与を非常に強力に増強する(Guirouilh-Barbat, Huckら，2004；Guirouilh-Barbat, Rassら，2007；Bennardo, Chengら，2008)。更に、Kuの不在は、マウスES細胞において、I-SceI-誘導事象、例えば不正確なNHEJ(Bennardo, Chengら，2008)、一本鎖アニーリング(Bennardo, Chengら，2008)及び遺伝子変換(Pierce, Huら，2001；Bennardo, Chengら，2008)を刺激する。同様な観察がXRCC4修復タンパク質を欠損する細胞(Pierce, Huら，2001；Guirouilh-Barbat, Rassら，2007；Bennardo, Gunnら，2009)(しかし、XRCC4欠損はCHO細胞におけるNHEJの全体レベルに影響する(Guirouilh-Barbat, Rassら，2007))又はDNA-PKを欠損する細胞(Pierce, Huら，2001)でなされている。対照的に、CtIPのノックダウンは、「alt-NHEJ」(不正確なNHEJをよりもたらし易いKu-及びXRCC4-非依存性形態のNHEJ)、一本鎖アニーリング及び遺伝子変換を抑制する一方、I-SceIにより生成される２つの適合性末端の再結合の全体レベルに影響しないことが示されている(Bennardo, Chengら，2008)。よって、異なるDSB修復経路の競合は、ヌクレアーゼ-誘導DSBに起因する修復事象の範囲に影響し得る。
加えて、DSB切除は或る種のDSB経路には重要である。広範なDSB切除(これは、大きな一本鎖領域(少なくとも数百ヌクレオチド)を生じる)は、酵母において、一本鎖アニーリング(Sugawara及びHaber 1992)及び鎖侵襲(相同鎖によるDNA二重鎖侵襲の多くの相同組換え事象を開始するATP-依存性工程(White及びHaber 1990；Sun, Trecoら，1991；機構の総説については、Paques及びHaber 1999を参照)を開始することが示されている。真核細胞において、DSB切除は、BLM/Sgs1及びDNA2、EXOI及びMRN複合体(Mre11、Rad50、Nbs1/Xrs2)を含む幾つかのタンパク質に依存し、異なる経路に起因すると考えられている。MRNは小規模の切除プロセスに関与するが、一方はBLM及びDNA2に依存し、他方はEXOIに依存する２つの冗長な経路は、広範な切除に関与する(Mimitou及びSymington 2008；Nimonkar, Genschelら，2011)。加えて、損傷ヌクレオチド(化学切断に起因するか、バルク付加物に起因する)が関係する末端のプロセシングは、CtIP/Sae2タンパク質をRMNと共に必要とする(Sartori, Lukasら，2007；Buis, Wuら，2008；Hartsuiker, Mizunoら，2009)。Trex2エキソヌクレアーゼの過剰発現は、僅か数塩基対の損失を伴う不完全なNHEJを強力に刺激することが示されている(Bennardo, Gunnら，2009)一方、遠位配列間の種々のDNA修復事象(例えば、一本鎖アニーリング、異なる破断による末端間のNHEJ、又は遠隔の微小相同性が関係する単一のDSBのNHEJ修復)を阻害した。同じ研究で、Trex2は、I-SceIにより導かれた3'オーバーハングを、非進行性の様式で切除することが示唆された。よって、刺激される経路のタイプは、切除のタイプ(切除の長さ、一本鎖 対 二本鎖、5'鎖の切除 対 3'鎖の切除)に依存し得る。
よって、コンパクトTALENの効率、例えば、標的付けられた変異誘発又は相同遺伝子ターゲッティングのような所望の事象を生じる能力(「コンパクトTALENの効率」の完全な定義については「定義」を参照)は、コンパクトTALENの全体のDNAプロセシング効率(「全体のDNAプロセシング効率」の完全な定義については「定義」を参照)、例えばコンパクトTALENが含み得る異なる別々の酵素活性の全体的な合力又は全体の結果の増強又は改変により増強され得る。
１つの好適な実施形態では、出発材料のコンパクトTALEN実体と比較した、本発明によるコンパクトTALEN実体の全体のDNAプロセシング効率の増強は、切断部位での追加のホスホジエステル結合の加水分解であり得る。
本発明に従う少なくとも１つのエンハンサーによる切断部位での追加のホスホジエステル結合の加水分解は、DSB切断部位で一方のDNA鎖若しくは両DNA鎖に影響し、5'オーバーハング端部若しくは3'オーバーハング端部若しくは両端部に影響し、又は切除の長さに依存する異なるタイプのDSB切除を導き得る。よって、コンパクトTALEN実体の既存のクリベース活性への新たなニッカーゼ又はクリベース活性の付加は、得られる本発明による増強コンパクトTALENの効率を興味対象の遺伝子座で増強し得る(図8B〜8E)。非限定例として、向かい合う鎖への２つのニッカーゼ活性の付加(図8D)又は第２のDSBを生じる新たなクリベース活性の付加(図8E)は、二本鎖ギャップをもたらし得る。結果として、完全な再ライゲーションは、もはや可能ではなく、１又は幾つかの代替の修復帰結(例えば、不正確なNHEJ、相同組換え又はSSA)が刺激され得る。別の非限定例として、１つのニッカーゼ活性の付加は、一本鎖ギャップをもたらし得、端部の付着性を抑制する。このこともまた、得られる本発明による増強コンパクトTALENの効率を興味対象の遺伝子座で、上記の１又は幾つかの代替の修復帰結の刺激を介して増強し得る。
本発明のこの観点において、コンパクトTALENのDNAプロセシング効率の増強とは、増強コンパクトTALENの標的DNA配列に対するDNAプロセシング効率の検出レベルが、第１のコンパクトTALENの同じ標的DNA配列に対する活性と比較して増大していることをいう。第１のコンパクトTALENは、出発材料のコンパクトTALEN、又は既に遺伝子操作されたコンパクトTALEN又は本発明による増強コンパクトTALENであり得る。出発材料のコンパクトTALEN又は出発材料の増強コンパクトTALENからの数回の増強が考えられる。
本発明の方法のこの観点において、コンパクトTALEN実体(又は増強コンパクトTALEN)のDNAプロセシング効率の増強とは、増強コンパクトTALENの興味対象の標的DNA配列に対するか又は該興味対象のDNA配列近傍のDNAプロセシング効率の検出レベルが、第１のコンパクトTALEN又は出発材料のコンパクトTALENの同じ標的DNA配列に対するか又は同じ標的DNA配列近傍の効率と比較して増大していることをいう。この場合、出発材料のコンパクトTALENは、DNAプロセシング効率を測定するための参照足場として採用される。増強コンパクトTALENは、本発明のこの観点によるエンハンサードメインを含んでなる遺伝子操作コンパクトTALENである。増強コンパクトTALENはまた、DNAプロセシング効率の更なる増強のための参照足場として採用され得る。非限定例として、DNAプロセシング効率は、増強コンパクトTALENにより生じる切断-誘導組換えに起因し得る。この場合、切断-誘導組換えのレベルは、例えば、国際PCT出願WO 2004/067736に記載されるような細胞ベース組換えアッセイにより決定さえ得る。重要なことに、細胞における効力の増強(標的付けられた変異誘発又は標的付けられた組換えの増強された生成)は、或る種のインビトロアッセイで検出し得る切断活性の増強と関連し得るが、必ずしも関連しない。例えば、図８に記載されるような追加のホスホジエステラーゼ活性は、インビトロ切断及び電気泳動ゲル上での切断生成物の分離により検出されるように、切断プロフィールにほとんど影響しない。しかし、上記及び図８の説明文で説明したとおり、このように生じるDSB端部は、検出可能なゲノム再配置、例えば(不正確なNHEJによる)標的付けられた変異誘発又は相同組換えをより誘導し易くあり得る。増強コンパクトTALENの切断-誘導組換えにおける増強は、出発材料の足場又は出発材料のコンパクトTALENと比較して、少なくとも５％増強、より好ましくは少なくとも10％増強、またより好ましくは少なくとも15％増強、またより好ましくは少なくとも20％増強、またより好ましくは少なくとも25％増強、またより好ましくは50％増強、またより好ましくは50％を超える増強であり、出発材料の足場又は出発材料のコンパクトTALENと比較して、増強コンパクトTALENのDNAプロセシング効率の少なくとも５％増強、より好ましくは少なくとも10％増強、またより好ましくは少なくとも15％増強、またより好ましくは少なくとも20％増強、またより好ましくは少なくとも25％増強、またより好ましくは50％増強、またより好ましくは50％を超える増強がもたらされる。
本発明の方法による別の１つの好適な実施形態では、エンハンサードメインを本発明の方法によるコンパクトTALEN実体の１つの部分に連結することができるペプチド性リンカーは、表３に列挙されるようなNFS1、NFS2、CFS1、RM2、BQY、QGPSG、LGPDGRKA、1a8h_1、1dnpA_1、1d8cA_2、1ckqA_3、1sbp_1、1ev7A_1、1alo_3、1amf_1、1adjA_3、1fcdC_1、1al3_2、1g3p_1、1acc_3、1ahjB_1、1acc_1、1af7_1、1heiA_1、1bia_2、1igtB_1、1nfkA_1、1au7A_1、1bpoB_1、1b0pA_2、1c05A_2、1gcb_1、1bt3A_1、1b3oB_2、16vpA_6、1dhx_1、1b8aA_1及び1qu6A_1(配列番号67〜配列番号104及び配列番号372〜配列番号415)からなる群より選択され得る。１つのより好適な実施形態では、エンハンサードメインを本発明の方法によるコンパクトTALEN実体の１つの部分に連結することができるペプチド性リンカーは、NFS1(配列番号98)、NFS2(配列番号99)及びCFS1(配列番号100)からなる群より選択され得る。１つのエンハンサードメインをコンパクトTALEN実体の１つの部分に融合させて本発明による増強コンパクトTALENを取得するためにペプチド性リンカーを必要としない場合も本発明の範囲に包含される。
構造的組成[コアTALE足場のタイプ、関連する酵素活性を有する触媒ドメインのタイプ、エンハンサーのタイプ、最後にリンカーのタイプ]に依存して、本発明によるコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENは、上記のように、DNAを異なってプロセシングすることができる別々の酵素活性を異なるレベルで含んでなり得る。新たな酵素活性をコンパクトTALEN若しくは増強コンパクトTALENに付加することにより、又は１若しくは幾つかの構成的酵素活性のDNAプロセシング効率を増強することにより、或るコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENの全体のDNAプロセシング効率を、出発材料のコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENと比較して増強させることができる。
本発明によれば、コンパクトTALENは、DNAプロセシング事象を標的するときの複数の独立タンパク質成分の必要性を軽減するように設計される。重要なことには、現在のTALENの機能に必須である「スペーサー」領域及び二重の標的部位が不必要になる。コアTALE足場の各端部は融合に従順であるので、触媒及び増強ドメインの付加の順序(Ｎ-末端 対 Ｃ-末端)は適用により変化させ得る。加えて、触媒ドメインは特異的なDNA接触を必要としないので、図５に示す非限定例のように、コアTALE足場を取り囲む領域に関して制限がない：(Ａ)クリベースドメイン又はニッカーゼドメインにより誘導される相同組換えを促進するＮ-末端融合構築物。(Ｂ)(Ａ)と同様の特性を有するＣ-末端融合構築物。(Ｃ)コアTALE足場の両端部への２つの触媒ドメインの付着により、NHEJが増強した二重切断が可能になる。融合点(Ｎ-末端 対 Ｃ-末端)及びリンカーのデザインは適用により変化し得る。
本発明によれば、コンパクトTALENは、図６に示す非限定例のように、既存の又は代替の活性を促進するドメインの付加により、増強することができる。：(Ａ)コアTALE足場部分のＣ-末端に融合されたエンハンサードメインを有する標準のコンパクトTALEN。(Ｂ)エンハンサードメインをコンパクトTALENに触媒ドメイン部分のＮ-末端を介して融合させる。この形態を使用して、触媒ドメイン部分を支援し及び/又は触媒ドメイン部分をDNA近くに繋ぎ止めてDNAプロセシング活性を増大させることができる。(Ｃ)エンハンサードメインを触媒ドメイン部分とコアTALE足場部分との間に挟む。エンハンサードメインを隣接ドメイン間の連絡を(触媒作用及び/又はDNA結合を支援するように)促進し得るか、又は全てのTALE-ベースの標的における-１位のＴヌクレオチドの必要性を克服するために使用し得る。(Ｄ)エンハンサードメインを、遺伝子操作コアTALE足場のＮ-末端領域の機能的置換に使用する。(Ｅ)エンハンサードメインを、遺伝子操作コアTALE足場のＣ-末端領域の機能的置換に使用する。融合点(Ｎ-末端 対 Ｃ-末端)及びリンカーのデザインは適用により変化し得る。
本発明によれば、コンパクトTALEN及び増強コンパクトTALENに含まれる触媒ドメインの性質は、適用に依存する。非限定例として、ニッカーゼドメインは、クリベースドメインより高いHR/NHEJ比を可能にし、そのことで治療適用により好ましくあり得る(McConnell Smith, Takeuchiら，2009；Metzger, McConnell-Smithら，2011)。例えば、一方の側のクリベースドメインと他方の側のニッカーゼドメインとのカップリングは、コンパクトTALENの結合領域を跨ぐDNAの一本鎖の切除を生じ得る。延長された一本鎖オーバーハングの標的付けられた生成は、DNA修復機構を標的する応用において適用され得る。標的付けられた遺伝子不活化には、２つのクリベースドメインの使用が好ましい。別の１つの好適な実施形態では、２つのニッカーゼドメインの使用が好ましくあり得る。更に、本発明は、標的付けられたDNA切断から標的付けられた遺伝子調節までに及ぶ応用に適用し得る幾つかの別個のタイプのコンパクトTALENを作製する方法に関する。
別の観点において、本発明は、
(i)DNA結合特異性を変化させ興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的するための異なるセットの反復可変ジペプチド領域(RVD)を含んでなり、DNAプロセシングをもたらすように選択した触媒ドメインを付着させることが可能である１つのコアTALE足場；
(ii)(i)の遺伝子操作コアTALE足場に融合させたとき、興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍のDNAをプロセシングすることができる少なくとも１つの触媒ドメイン；
(iii)任意に、必要な場合に(ii)の触媒ドメインを(i)の遺伝子操作コアTALE足場に融合させるための１つのペプチド性リンカー
を、興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的して該興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍のDNAをプロセシングするために二量体化を必要としないように含んでなるコンパクトTALENに関する。換言すれば、本発明によるコンパクトTALENは、それ自体で、１つのDNA結合ドメインにより唯１つの興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的し、該興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍のDNAをプロセシングすることができる活性実体単位である。
本発明は、下記：
(i)興味対象の特異的な二本鎖DNA標的配列に対するDNA結合特異性を有する反復可変ジペプチド領域(RVD)を含んでなる１つのコアTALE足場；
(ii)(i)のコアTALE足場のＣ末端又はＮ末端に融合されたとき興味対象の二本鎖DNA標的配列から数塩基対離れたDNAをプロセシングし得る少なくとも１つの触媒ドメイン；
(iii)任意に、必要な場合に(ii)の触媒ドメインを(i)の遺伝子操作コアTALE足場に融合させるための１つのペプチド性リンカー
を含んでなり、二量体化を要することなく、標的DNA配列に結合して二本鎖DNAをプロセシングするように組み立てられているコンパクトTALENモノマーに関する。
別の１つの実施形態では、本発明によるコンパクトTALENの遺伝子操作コアTALE足場は、追加のＮ末端ドメインを含んでなり、その結果、Ｎ末端ドメイン及びDNA結合特異性を変化させ興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的するための異なるセットの反復可変ジペプチド領域(RVD)をこの順で含んでなり、DNAプロセシングをもたらすように選択した触媒ドメインを付着させることが可能である遺伝子操作コアTALE足場を生じる。
別の１つの実施形態では、本発明によるコンパクトTALENの遺伝子操作コアTALE足場は、追加のＣ末端ドメインを含んでなり、その結果、DNA結合特異性を変化させ興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的するための異なるセットの反復可変ジペプチド領域(RVD)及びＣ末端ドメインをこの順で含んでなり、DNAプロセシングをもたらすように選択した触媒ドメインを付着させることが可能である遺伝子操作コアTALE足場を生じる。
別の１つの実施形態では、本発明によるコンパクトTALENの遺伝子操作コアTALE足場は、追加のＮ-末端及びＣ末端ドメインを含んでなり、その結果、Ｎ末端ドメイン、DNA結合特異性を変化させ興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的するための異なるセットの反復可変ジペプチド領域(RVD)及びＣ末端ドメインをこの順で含んでなり、DNAプロセシングをもたらすように選択した触媒ドメインを付着させることが可能である遺伝子操作コアTALE足場を生じる。
別の１つの実施形態では、本発明による遺伝子操作コアTALE足場は、ST1(配列番号134)及びST2(配列番号135)からなる群より選択されるタンパク質配列を含んでなる。別の１つの実施形態では、遺伝子操作コアTALE足場は、配列番号134及び配列番号135からなる群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80％、より好ましくは90％、またより好ましくは95％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。別の１つの実施形態では、本発明による遺伝子操作コアTALE足場は、bT1-Avr(配列番号136)、bT2-Avr(配列番号137)、bT1-Pth(配列番号138)及びbT2-Pth(配列番号139)からなる群より選択されるタンパク質配列を含んでなる。別の１つの実施形態では、遺伝子操作TALE足場は、配列番号136〜配列番号139からなる群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80％、より好ましくは90％、またより好ましくは95％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
１つの好適な実施形態では、遺伝子操作コアTALE足場の追加のＮ-末端及びＣ末端ドメインは天然TALEに由来する。１つのより好適な実施形態では、遺伝子操作コアTALE足場の追加のＮ-末端及びＣ末端ドメインは、非限定例としてのAvrBs3、PthXo1、AvrHah1、PthA、Tal1cからなる群より選択される天然TALEに由来する。別の１つのより好適な実施形態では、追加のＮ-末端及び/又はＣ末端ドメインは、それぞれ、非限定例としてのAvrBs3、PthXo1、AvrHah1、PthA、Tal1cのような、それらが由来する天然TALEのＮ-末端及び/又はＣ末端ドメインの短縮型形態である。１つのより好適な実施形態では、遺伝子操作コアTALE足場の追加のＮ-末端及びＣ末端ドメイン配列は、ベースラインタンパク質足場bT1-Avr(配列番号136)又はbT1-Pth(配列番号138)及びbT2-Avr(配列番号137)又はbT2-Pth(配列番号139)にそれぞれ例示されるように、ST1(配列番号134)及びST2(配列番号135)からなる群より選択される。
別の１つの実施形態では、コア足場の各RVDは、30〜42アミノ酸、より好ましくは33又は34アミノ酸から作られ、12位及び13位に位置する２つの重要なアミノ酸が、核酸標的配列の１つのヌクレオチドの認識を媒介する；等価な２つの重要なアミノ酸は、特に33又は34アミノ酸長より長いRVD中で、12位及び13位以外の位置に位置することができる。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関係するRVDは、Ｃを認識するためのHD、Ｔを認識するためのNG、Ａを認識するためのNI、Ｇ又はＡを認識するためのNN、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴを認識するためのNS、Ｔを認識するためのHG、Ｔを認識するためのIG、Ｇを認識するためのNK、Ｃを認識するためのHA、Ｃを認識するためのND、Ｃを認識するためのHI、Ｇを認識するためのHN、Ｇを認識するためのNA、Ｇ又はＡを認識するためのSN、及びＴを認識するためのYG、Ａを認識するためのTL、Ａ又はＧを認識するためのVT、及びＡを認識するためのSWである。より好ましくは、ヌクレオチドＣ、Ｔ、Ａ、Ｇ/Ａ及びＧの認識に関係するRVDは、それぞれ、Ｇを認識するためのNN又はNK、Ｃを認識するためのHD、Ｔを認識するためのNG及びＡを認識するためのNI、Ａを認識するためのTL、Ａ又はＧを認識するためのVT、及びＡを認識するためのSWからなる群より選択される。別の１つの実施形態では、ヌクレオチドＣの認識に関係するRVDは、N*からなる群より選択され、ヌクレオチドＴの認識に関係するRVDは、N*及びH*からなる群より選択される(ここで、*は、RVDの第２位のアミノ酸残基の欠如に対応する反復配列中のギャップを示す)。別の１つの実施形態では、重要なアミノ酸12及び13は、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ及びＧに対する特異性を変調させるため、特に特異性を増大させるために、他のアミノ酸残基に変異させることができる。他のアミノ酸残基により、20の天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸誘導体のいずれもが意図される。
別の１つの実施形態では、本発明のコア足場は８〜30のRVDを含んでなる。本発明のコア足場は、より好ましくは８〜20のRVD、またより好ましくは15のRVDを含んでなる。
別の１つの実施形態では、コア足場は、前記セットのRVDのＣ-末端に位置する20アミノ酸から作られる追加の単一短縮型RVD、すなわち追加のＣ-末端ハーフ-RVDを含んでなる。この場合、本発明のコア足場は8.5〜30.5のRVDを含んでなる。ここで、「.5」はハーフ-RVD(又は末端RVD、又はハーフ-反復)をいう。本発明のコア足場は、より好ましくは8.5〜20.5のRVD、またより好ましくは15.5のRVDを含んでなる。１つの好適な実施形態では、ハーフ-RVDは、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔに対するハーフ-RVDの特異性の欠如を可能にするコア足場形態中に存在する。１つのより好適な実施形態では、ハーフ-RVDは存在しない。
別の１つの実施形態では、本発明のコア足場は、異なる起源のRVDを含んでなる。１つの好適な実施形態では、コア足場は、天然に存在する異なるTALエフェクターを起源とするRVDを含んでなる。別の１つの好適な実施形態では、本発明のコア足場の幾つかのRVDの内部構造は、天然に存在する異なるTALエフェクターを起源とする構造又は配列により構成される。別の１つの実施形態では、本発明のコア足場はRVD-様ドメインを含んでなる。RVD-様ドメインは、天然に存在するRVDとは異なる配列を有するが、本発明のコア足場内で同じ機能及び/又は全体構造を有する。
別の１つの実施形態では、本発明によるコンパクトTALENの遺伝子操作コアTALE足場の追加のＮ末端ドメインは、エンハンサードメインである。別の１つの実施形態では、エンハンサードメインは、非限定例としてのPuf RNA結合タンパク質又はアンキリンスーパーファミリーからなる群より選択される。別の１つの実施形態では、エンハンサードメイン配列は、表１に列挙される非限定例としての配列番号４及び配列番号５のタンパク質ドメイン、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体からなる群より選択される。別の１つの実施形態では、遺伝子操作コアTALE足場の追加のＣ末端ドメインは、エンハンサードメインである。別の１つの実施形態では、エンハンサードメインは、非限定例としてのPseudomonas Aeuriginosa科のヒドロラーゼ/トランスフェラーゼ、Mycobacterium tuberculosisリガーゼＤファミリーのポリメラーゼドメイン、Pyrococcus科の開始因子elF2、翻訳開始因子Aif2ファミリーからなる群より選択される。別の１つの実施形態では、エンハンサードメイン配列は、表１に列挙される非限定例としての配列番号６〜配列番号９のタンパク質ドメインからなる群より選択される。
別の１つの好適な実施形態では、本発明による遺伝子操作コアTALE足場に融合されたときに興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍のDNAをプロセシングすることができる触媒ドメインが、コアTALE足場のＮ末端部に融合される。別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインはコアTALE足場のＣ末端部に融合される。別の１つの好適な実施形態では、２つの触媒ドメインがコアTALE足場のＮ-末端部及びＣ-末端部の両方に融合される。１つのより好適な実施形態では、触媒ドメインは、ヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、メチラーゼ活性、トポイソメラーゼ活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性又はリガーゼ活性からなる群より選択される酵素活性を有する。別の１つの好適な実施形態では、本発明のコアTALE足場に融合される触媒ドメインは、転写アクチベーター若しくはリプレッサー(すなわち転写レギュレーター)、又は他のタンパク質(例えばヒストン)と相互作用するか若しくはこれを改変するタンパク質であり得る。本発明のコンパクトTALENのDNAプロセシング活性の非限定例としては、例えば、エピジェネティックな調節エレメントの創出又は改変、DNAにおける部位-特異的挿入、欠失又は修復、遺伝子発現の制御、及びクロマチン構造の改変が挙げられる。
別の１つのより好適な実施形態では、触媒ドメインはエンドヌクレアーゼ活性を有する。別の１つのより好適な実施形態では、本発明によるコンパクトTALENの触媒ドメインは、本発明の方法による二本鎖DNAに対する切断活性を有する。別の１つのより好適な実施形態では、触媒ドメインは、本発明の方法による二本鎖DNAに対するニッカーゼ活性を有する。別の１つのより好適な実施形態では、触媒ドメインは、表２に列挙されるようなタンパク質MmeI、コリシン-E7(CEA7_ECOLX)、コリシン-E9、APFL、EndA、Endo I(END1_ECOLI)、ヒトEndo G(NUCG_HUMAN)、ウシEndo G(NUCG_BOVIN)、R.HinP1I、I-BasI、I-BmoI、I-HmuI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-TwoI、R.MspI、R.MvaI、NucA、NucM、Vvn、Vvn_CLS、スタフィロコッカスヌクレアーゼ(NUC_STAAU)、スタフィロコッカスヌクレアーゼ(NUC_STAHY)、ミクロコッカスヌクレアーゼ(NUC_SHIFL)、エンドヌクレアーゼyncB、エンドデオキシリボヌクレアーゼＩ(ENRN_BPT7)、メトナーゼ、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I(R.BspD6Iラージサブユニット)、ss.BspD6I(R.BspD6Iスモールサブユニット)、R.PleI、MlyI、AlwI、Mva1269I、BsrI、BsmI、Nb.BtsCI、Nt.BtsCI、R1.BtsI、R2.BtsI、BbvCIサブユニット１、BbvCIサブユニット２、Bpu10Iアルファサブユニット、Bpu10Iベータサブユニット、BmrI、BfiI、I-CreI、hExoI(EXO1_HUMAN)、酵母ExoI(EXO1_YEAST)、E.coli ExoI、ヒトTREX2、マウスTREX1、ヒトTREX1、ウシTREX1、ラットTREX1、ヒトDNA2、酵母DNA2(DNA2_YEAST)及びVP16(配列番号10〜配列番号66及び配列番号１、366及び367)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体からなる群より選択される。別の１つの好適な実施形態では、本発明によるコンパクトTALENの触媒ドメインはI-TevI(配列番号20)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体である。別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインI-TevI(配列番号20)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体は、本発明のコンパクトTALENによるコアTALE足場のＮ末端ドメインに融合される。別の１つの好適な実施形態では、本発明によるコンパクトTALENは、配列番号426〜432の群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80％、より好ましくは90％、またより好ましくは95％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
別の１つの好適な実施形態では、本発明によるコンパクトTALENの触媒ドメインは、ColE7(配列番号11)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体である。別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインColE7(配列番号11)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体は、本発明の方法によるコアTALE足場のＮ末端ドメインに融合される。別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインColE7(配列番号11)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体は、本発明の方法によるコアTALE足場のＣ末端ドメインに融合される。別の１つの好適な実施形態では、本発明の方法によるコンパクトTALENは、配列番号435〜438の群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80％、より好ましくは90％、またより好ましくは95％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
別の１つの好適な実施形態では、本発明によるコンパクトTALENの触媒ドメインは、NucA(配列番号26)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体である。別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインNucA(配列番号26)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体は、本発明の方法によるコアTALE足場のＮ末端ドメインに融合される。別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインNucA(配列番号26)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体は、本発明の方法によるコアTALE足場のＣ末端ドメインに融合される。別の１つの好適な実施形態では、本発明の方法によるコンパクトTALENは、配列番号433〜434の群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80％、より好ましくは90％、またより好ましくは95％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインは、I-CreI(配列番号1)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体である。別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインI-CreI(配列番号1)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体は、本発明によるコアTALE足場のＮ末端ドメインに融合される。別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインI-CreI(配列番号1)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体は、本発明によるコアTALE足場のＣ末端ドメインに融合される。別の１つの好適な実施形態では、本発明の方法によるコンパクトTALENは、配列番号439〜441及び配列番号444〜446の群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80％、より好ましくは90％、またより好ましくは95％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
別の１つの実施形態では、触媒ドメインは、制限酵素、例えば表２に列挙される非限定例のようなMmeI、R-HinPII、R.MspI、R.MvaI、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I、ss.BspD6I、R.PleI、MlyI及びAlwIである。別の１つのより好適な実施形態では、触媒ドメインはエキソヌクレアーゼ活性を有する。別の１つのより好適な実施形態では、表２に列挙されるようなタンパク質MmeI、コリシン-E7(CEA7_ECOLX)、コリシン-E9、APFL、EndA、Endo I(END1_ECOLI)、ヒトEndo G(NUCG_HUMAN)、ウシEndo G(NUCG_BOVIN)、R.HinP1I、I-BasI、I-BmoI、I-HmuI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-TwoI、R.MspI、R.MvaI、NucA、NucM、Vvn、Vvn_CLS、スタフィロコッカスヌクレアーゼ(NUC_STAAU)、スタフィロコッカスヌクレアーゼ(NUC_STAHY)、ミクロコッカスヌクレアーゼ(NUC_SHIFL)、エンドヌクレアーゼyncB、エンドデオキシリボヌクレアーゼＩ(ENRN_BPT7)、メトナーゼ、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I(R.BspD6Iラージサブユニット)、ss.BspD6I(R.BspD6Iスモールサブユニット)、R.PleI、MlyI、AlwI、Mva1269I、BsrI、BsmI、Nb.BtsCI、Nt.BtsCI、R1.BtsI、R2.BtsI、BbvCIサブユニット１、BbvCIサブユニット２、Bpu10Iアルファサブユニット、Bpu10Iベータサブユニット、BmrI、BfiI、I-CreI、hExoI(EXO1_HUMAN)、酵母ExoI(EXO1_YEAST)、E.coli ExoI、ヒトTREX2、マウスTREX1、ヒトTREX1、ウシTREX1、ラットTREX1、ヒトDNA2、酵母DNA2(DNA2_YEAST)及びVP16(配列番号10〜配列番号66及び配列番号１、366及び367)、これらタンパク質の機能的変異体、バリアント又は誘導体のドメインからなる群より選択される２つの触媒ドメインの任意の組合せを、コアTALE足場のＮ-末端部及びＣ-末端部の両方にそれぞれ融合させることができる。例えば、I-HmuI触媒ドメインをコアTALE足場のＮ末端部に融合させることができ、ColE7触媒ドメインをコアTALE足場のＣ末端部に融合させることができる。別の１つの例では、I-TevI触媒ドメインをコアTALE足場のＮ末端部に融合させることができ、ColE7触媒ドメインをコアTALE足場のＣ末端部に融合させることができる。
下記の表14は、本発明によるコンパクトTALENモノマーに含まれ得る触媒ドメインの組合せの非限定例を示す。任意に、FokI(配列番号:368)を、表２のリストに従う別の１つの触媒ドメインとの組合せで使用し得る。
表14：二重切断TALENを導くために、本発明によるコンパクトTALENコア足場のＮ-末端部及びＣ-末端部にそれぞれ融合される触媒ドメインの組合せの例
本発明による１つの好適な実施形態では、独特なコンパクトTALENモノマーは、コアTALE足場のＣ末端部及びＮ末端部にそれぞれ融合され、下記：
(i)Ｎ末端のNuc Aドメイン(配列番号26)及びＣ末端のNuc Aドメイン(配列番号26)；
(ii)Ｎ末端のColE7ドメイン(配列番号11)及びＣ末端のColE7ドメイン(配列番号11)；
(iii)Ｎ末端のTevIドメイン(配列番号20)及びＣ末端のColE7ドメイン(配列番号11)；
(iv)Ｎ末端のTevIドメイン(配列番号20)及びＣ末端のNucAドメイン(配列番号26)；
(v)Ｎ末端のColE7ドメイン(配列番号11)及びＣ末端のNucAドメイン(配列番号26)；
(vi)Ｎ末端のNucAドメイン(配列番号26)及びＣ末端のColE7ドメイン(配列番号11)
からなる群より選択される２つの触媒ドメインの組合せを含んでなる。
別の１つの好適な実施形態では、本発明によるコンパクトTALENは、配列番号448及び450からなる群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80％、より好ましくは90％、またより好ましくは95％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
別の１つの好適な実施形態では、本発明によるコンパクトTALENは、コアTALE足場のＣ末端部及びＮ末端部にそれぞれ融合され、下記：
(i)Ｎ末端のTevIドメイン(配列番号20)及びＣ末端のFokIドメイン(配列番号368)；
(ii)Ｎ末端のTevIドメイン(配列番号20)及びＣ末端のTevIドメイン(配列番号20)；
(iii)Ｎ末端のscTrex2ドメイン(配列番号451)及びＣ末端のFokIドメイン(配列番号368)
からなる群より選択される、２つの触媒ドメインの組合せを含んでなる。
別の１つの好適な実施形態では、本発明によるコンパクトTALENは、配列番号447〜450及び配列番号452からなる群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80％、より好ましくは90％、またより好ましくは95％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
本発明の範囲内において、触媒ドメイン及び/又はエンハンサードメインを、本発明による遺伝子操作コアTALE足場の２つの部分(各部分が１セットのRVDを含んでなる)の間に挿入することが考えられる。この場合、遺伝子操作コアTALE足場の各部分についてのRVDの数は、同じであってもなくてもよい。換言すれば、本発明のコアTALE足場を分割して、得られる２つの部分の間に１つの触媒ドメイン及び/又は１つのエンハンサードメインを挿入することも考えられる。別の１つの好適な実施形態では、本発明によるコンパクトTALENは、配列番号453〜455からなる群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80％、より好ましくは90％、またより好ましくは95％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
換言すれば、本発明のコンパクトTALENモノマーは、配列番号420〜450及び452〜455からなる群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80％、より好ましくは90％、またより好ましくは95％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
本発明の方法による別の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインを本発明の方法によるコアTALE足場に連結することができるペプチド性リンカーは、表３に列挙されるようなNFS1、NFS2、CFS1、RM2、BQY、QGPSG、LGPDGRKA、1a8h_1、1dnpA_1、1d8cA_2、1ckqA_3、1sbp_1、1ev7A_1、1alo_3、1amf_1、1adjA_3、1fcdC_1、1al3_2、1g3p_1、1acc_3、1ahjB_1、1acc_1、1af7_1、1heiA_1、1bia_2、1igtB_1、1nfkA_1、1au7A_1、1bpoB_1、1b0pA_2、1c05A_2、1gcb_1、1bt3A_1、1b3oB_2、16vpA_6、1dhx_1、1b8aA_1及び1qu6A_1(配列番号67〜配列番号104及び配列番号372〜配列番号415)からなる群より選択され得る。１つのより好適な実施形態では、触媒ドメインを本発明の方法によるコアTALE足場に連結することができるペプチド性リンカーは、NFS1(配列番号98)、NFS2(配列番号99)及びCFS1(配列番号100)からなる群より選択され得る。触媒ドメインをTALE足場に融合させて本発明によるcTALENを取得するためにペプチド性リンカーを必要としない場合も本発明の範囲に包含される。
構造的組成[コアTALE足場のタイプ、関連する酵素活性を有する触媒ドメインのタイプ、最後にリンカーのタイプ]に依存して、本発明によるコンパクトTALENは、DNAを異なってプロセシングすることができる別々の酵素活性を異なるレベルで含み得、これにより、コンパクトTALENの全体のDNAプロセシング効率がもたらされ、異なる酵素活性の各々は独自のDNAプロセシング効率を有する。
別の１つの好適な実施形態では、本発明によるコンパクトTALENは、下記：
(i)少なくとも１つのエンハンサードメイン；
(ii)任意に、エンハンサードメインをコンパクトTALEN活性実体の１つの部分に融合させるための１つのペプチドリンカー
を更に含んでなり、そのことにより、興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍に増強したDNAプロセシング効率を有するコンパクトTALEN実体、すなわち増強コンパクトTALENを得る。
換言すれば、独特なコンパクトTALENモノマーは、
(i)少なくとも１つのエンハンサードメイン；
(ii)任意に、エンハンサードメインを独特なコンパクトTALENモノマーの活性実体の１つの部分に融合させるための１つのペプチドリンカー
を更に含んでなる。
別の１つのより好適な実施形態では、エンハンサードメインは、コンパクトTALEN実体のコアTALE足場部分のＮ-末端に融合される。別の１つのより好適な実施形態では、エンハンサードメインは、コンパクトTALEN実体のコアTALE足場部分のＣ-末端に融合される。別の１つのより好適な実施形態では、エンハンサードメインは、コンパクトTALEN実体の触媒ドメイン部分に融合される。別の１つのより好適な実施形態では、エンハンサードメインは、コアTALE足場のＮ-末端部分とコンパクトTALEN実体の触媒部分との間に融合される。別の１つのより好適な実施形態では、エンハンサードメインはコアTALE足場のＣ-末端部分とコンパクトTALEN実体の触媒部分との間に融合される。本発明の範囲内において、触媒ドメイン及び/又はエンハンサードメインを、本発明による遺伝子操作コアTALE足場の２つの部分(各部分が１セットのRVDを含んでなる)の間に挿入することが考えられる。この場合、各遺伝子操作コアTALE足場についてのRVDの数は、同じであってもなくてもよい。換言すれば、本発明のコアTALE足場を分割して、得られる２つの部分の間に１つの触媒ドメイン及び/又は１つのエンハンサードメインを挿入することも考えられる。
別の１つの好適な実施形態では、エンハンサードメインは触媒的に活性であるか又は活性でなく、コンパクトTALEN実体に機能的及び/又は構造的支持を提供する。１つのより好適な実施形態では、エンハンサードメインは、表２に列挙されるようなMmeI、コリシン-E7(CEA7_ECOLX)、コリシン-E9、APFL、EndA、Endo I(END1_ECOLI)、ヒトEndo G(NUCG_HUMAN)、ウシEndo G(NUCG_BOVIN)、R.HinP1I、I-BasI、I-BmoI、I-HmuI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-TwoI、R.MspI、R.MvaI、NucA、NucM、Vvn、Vvn_CLS、スタフィロコッカスヌクレアーゼ(NUC_STAAU)、スタフィロコッカスヌクレアーゼ(NUC_STAHY)、ミクロコッカスヌクレアーゼ(NUC_SHIFL)、エンドヌクレアーゼyncB、エンドデオキシリボヌクレアーゼI(ENRN_BPT7)、メトナーゼ、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I(R.BspD6Iラージサブユニット)、ss.BspD6I(R.BspD6Iスモールサブユニット)、R.PleI、MlyI、AlwI、Mva1269I、BsrI、BsmI、Nb.BtsCI、Nt.BtsCI、R1.BtsI、R2.BtsI、BbvCIサブユニット１、BbvCIサブユニット２、Bpu10Iアルファサブユニット、Bpu10Iベータサブユニット、BmrI、BfiI、I-CreI、hExoI(EXO1_HUMAN)、酵母ExoI(EXO1_YEAST)、E.coli ExoI、ヒトTREX2、マウスTREX1、ヒトTREX1、ウシTREX1、ラットTREX1、ヒトDNA2、酵母DNA2(DNA2_YEAST)及びVP16(配列番号10〜配列番号66及び配列番号１、366及び367)、これらタンパク質の機能的変異体、バリアント若しくは誘導体からなる群より選択されるタンパク質ドメインからなる。別の１つのより好適な実施形態では、エンハンサードメインは、上記及び表２に列挙されるタンパク質ドメインの触媒的に活性な誘導体からなり、コンパクトTALEN実体に機能的及び/又は構造的支持を提供する。別の１つの好適な実施形態では、エンハンサードメインは、上記及び表２に列挙されるタンパク質ドメインの触媒的に不活性な誘導体からなり、コンパクトTALEN実体に構造的支持を提供する。別の１つの好適な実施形態では、エンハンサードメインは、I-TevI(配列番号20)、ColE7(配列番号11)及びNucA(配列番号26)からなる群より選択される。
１つのより好適な実施形態では、本発明による増強コンパクトTALENは、第２のエンハンサードメインを含んでなり得る。この実施形態では、第２のエンハンサードメインは、第１のエンハンサードメインと同じ特徴を有し得る。１つのより好適な実施形態では、第２のエンハンサードメインは、増強コンパクトTALEN実体に構造的支持を提供する。別の１つのより好適な実施形態では、第２のエンハンサードメインは、増強コンパクトTALEN実体に機能的支持を提供する。１つのより好適な実施形態では、第２のエンハンサードメインは、増強コンパクトTALEN実体に構造的及び機能的支持を提供する。１つのより好適な実施形態では、コンパクトTALEN実体は、１つの触媒ドメイン及び１つのエンハンサードメインを含んでなる。別の１つのより好適な実施形態では、増強コンパクトTALEN実体は、１つの触媒ドメイン及び２つのエンハンサードメインを含んでなる。別の１つのより好適な実施形態では、増強コンパクトTALEN実体は、２つの触媒ドメイン及び１つのエンハンサードメインを含んでなる。別の１つのより好適な実施形態では、増強コンパクトTALEN実体は、２つの触媒ドメイン及び２つのエンハンサードメインを含んでなる。
１つのより好適な実施形態では、第２のエンハンサードメインは、表２に列挙されるようなMmeI、コリシン-E7(CEA7_ECOLX)、コリシン-E9、APFL、EndA、Endo I(END1_ECOLI)、ヒトEndo G(NUCG_HUMAN)、ウシEndo G(NUCG_BOVIN)、R.HinP1I、I-BasI、I-BmoI、I-HmuI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-TwoI、R.MspI、R.MvaI、NucA、NucM、Vvn、Vvn_CLS、スタフィロコッカスヌクレアーゼ(NUC_STAAU)、スタフィロコッカスヌクレアーゼ(NUC_STAHY)、ミクロコッカスヌクレアーゼ(NUC_SHIFL)、エンドヌクレアーゼyncB、エンドデオキシリボヌクレアーゼI(ENRN_BPT7)、メトナーゼ、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I(R.BspD6Iラージサブユニット)、ss.BspD6I(R.BspD6Iスモールサブユニット)、R.PleI、MlyI、AlwI、Mva1269I、BsrI、BsmI、Nb.BtsCI、Nt.BtsCI、R1.BtsI、R2.BtsI、BbvCIサブユニット１、BbvCIサブユニット２、Bpu10Iアルファサブユニット、Bpu10Iベータサブユニット、BmrI、BfiI、I-CreI、hExoI(EXO1_HUMAN)、酵母ExoI(EXO1_YEAST)、E.coli ExoI、ヒトTREX2、マウスTREX1、ヒトTREX1、ウシTREX1、ラットTREX1、ヒトDNA2、酵母DNA2(DNA2_YEAST)及びVP16(配列番号10〜配列番号66及び配列番号１、366及び367)、これらタンパク質の機能的変異体、バリアント若しくは誘導体からなる群より選択されるタンパク質に由来するタンパク質ドメインからなる。別の１つのより好適な実施形態では、第２のエンハンサードメインは、上記及び表２に列挙されるタンパク質ドメインの触媒的に活性な誘導体からなり、増強コンパクトTALEN実体に機能的及び/又は構造的支持を提供する。別の１つの好適な実施形態では、第２のエンハンサードメインは、上記及び表２に列挙されるタンパク質ドメインの触媒的に不活性な誘導体からなり、増強コンパクトTALEN実体に構造的支持を提供する。
別の１つのより好適な実施形態では、非限定例として上記した触媒及び/又はエンハンサードメインの任意の組合せをコアTALE足場に融合させて、コンパクトTALEN実体に構造的及び/又は機能的支持を提供することが考えられる。より好ましくは、表14に列挙された触媒ドメインの組合せが考えられる。またより好ましくは、TevI(配列番号20)、ColE7(配列番号11)及びNucA(配列番号26)の群より選択される触媒ドメインの組合せが考えられる。任意に、FokI(配列番号368)を、表２のリストによる別の１つの触媒ドメインとの組合せで使用することができる。触媒及び/又はエンハンサードメインのこの組合せは、本発明の方法を用いる適用に関して考案され得る。
構造的組成[コアTALE足場のタイプ、関連する酵素活性を有する触媒ドメインのタイプ、リンカーのタイプ及びエンハンサードメインのタイプ]に依存して、本発明による増強コンパクトTALENは、DNAを異なってプロセシングすることができる別々の酵素活性を異なるレベルで提示し得、これにより、増強コンパクトTALENの全体のDNAプロセシング効率がもたらされ、異なる酵素活性の各々は独自のDNAプロセシング効率を有する。
この好適な実施形態では、本発明によるコンパクトTALEN実体のDNAプロセシング効率は、少なくとも１つのエンハンサードメイン及び１つのペプチド性リンカーの遺伝子操作により増強され、それにより、興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍に増強したDNAプロセシング活性を有するコンパクトTALEN実体、すなわち本発明による増強コンパクトTALENを得ることができる。
構造的組成に依存して、本発明による増強コンパクトTALENにおいて増強される全体のDNAプロセシング効率は、非限定例としてのヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、メチラーゼ活性、トポイソメラーゼ活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性又はリガーゼ活性からなる群より選択される優勢な酵素活性を有し得る。１つのより好適な実施形態では、本発明による増強コンパクトTALENにおいて増強される全体のDNAプロセシング効率は、非限定例としてのヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、メチラーゼ活性、トポイソメラーゼ活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性又はリガーゼ活性からなる群より選択される異なる酵素活性の組合せである。１つのより好適な実施形態では、本発明による増強コンパクトTALENにおいて増強される全体のDNAプロセシング効率は、その種々の酵素活性の１つであり、非限定例としてのヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、メチラーゼ活性、トポイソメラーゼ活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性又はリガーゼ活性からなる群より選択されるものである。この場合、全体的なDNAプロセシング効率は、上記の酵素活性のうちの１つのDNAプロセシング活性に等しい。別の１つのより好適な実施形態では、エンハンサーにより増強されるコンパクトTALEN実体のDNAプロセシング活性は、クリベース活性若しくはニッカーゼ活性又はクリベース活性及びニッカーゼ活性の組合せである。
本発明によるコンパクトTALEN実体のDNAプロセシング効率の増強は、少なくとも１つのエンハンサードメインによる構造的支持の結果であり得る。１つの好適な実施形態では、構造的支持は、増強したDNAプロセシング活性を有するコンパクトTALEN実体が得られるように、DNA標的配列に関する本発明によるコンパクトTALEN実体の結合を、同じDNA標的配列に関する出発材料のコンパクトTALEN実体の結合と比較して増強し、そのことにより触媒ドメインを間接的に支援する。別の１つの好適な実施形態では、構造的支持は、増強したDNAプロセシング活性を有するコンパクトTALEN実体が得られるように、DNA標的配列に関するコンパクトTALEN実体の既存の触媒活性を、同じDNA標的配列に関する出発材料のコンパクトTALEN実体の結合と比較して増強する。
別の１つの好適な実施形態では、本発明によるエンハンサーは、増強したDNAプロセシング活性を有するコンパクトTALEN実体が得られるように、DNA標的配列に関するコンパクトTALEN実体の結合及び触媒ドメインの触媒活性の両方を増強する。これら全ての非限定例は、興味対象の遺伝子座でDNA標的配列に関して増強したDNAプロセシング効率を有するコンパクトTALEN実体、すなわち本発明による増強コンパクトTALENを導く。
出発材料のコンパクトTALEN実体と比較した本発明によるコンパクトTALEN実体のDNAプロセシング効率の増強は、少なくとも１つのエンハンサードメインによる機能的支持の結果でもあり得る。１つの好適な実施形態では、機能的支持は、追加のホスホジエステル結合の加水分解の結果であり得る。１つのより好適な実施形態では、機能的支持は、ヌクレアーゼに由来するタンパク質ドメインによる追加のホスホジエステル結合の加水分解であり得る。１つのより好適な実施形態では、機能的支持は、エンドヌクレアーゼに由来するタンパク質ドメインによる追加のホスホジエステル結合の加水分解であり得る。１つのより好適な実施形態では、機能的支持は、クリベースに由来するタンパク質ドメインによる追加のホスホジエステル結合の加水分解であり得る。別の１つのより好適な実施形態では、機能的支持は、ニッカーゼに由来するタンパク質ドメインによる追加のホスホジエステル結合の加水分解であり得る。１つのより好適な実施形態では、機能的支持は、エキソヌクレアーゼに由来するタンパク質ドメインによる追加のホスホジエステル結合の加水分解であり得る。
ゲノム工学実験においては、稀切断性エンドヌクレアーゼの効率、例えば或る遺伝子座で所望の事象(相同遺伝子ターゲッティング、標的付けられた変異誘発、配列の除去又は切り出し)を誘導する能力は、ヌクレアーゼの比活性、おそらく標的の接近可能性及び所望の事象を生じる修復経路(遺伝子ターゲッティングについては相同性修復、標的化された変異誘発についてはNHEJ経路)の効力及び帰結を含む幾つかのパラメータに依存する。
ペプチド性の稀切断性エンドヌクレアーゼによる切断は、通常、付着末端(LAGLIDADGメガヌクレアーゼについては3'オーバーハング(Chevalier及びStoddard 2001)及びジンクフィンガーヌクレアーゼについては5'オーバーハング(Smith, Bibikovaら，2000))を生じる。(ホスホジエステル結合の加水分解に起因する)これら端部は、インビボでNHEJにより継ぎ目のない様式で再ライゲートされ得る(すなわち、無瘢痕再ライゲーション)。切断可能な標的配列の回復により、同じエンドヌクレアーゼによる新たな切断事象が可能になり、よって無益な一連の切断及び再ライゲーション事象のサイクルが起こり得る。間接的証拠により、酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいてさえ、このようなサイクルがHOエンドヌクレアーゼによる連続切断に際して起こり得ることが示されている(Lee, Paquesら，1999)。哺乳動物細胞では、幾つかの実験により、２つの独立するが接近したI-SceI-誘導DSBに起因する適合性の付着末端の完全な再ライゲーションが効率的なプロセスであることが示されている(Guirouilh-Barbat, Huckら，2004；Guirouilh-Barbat, Rassら，2007；Bennardo, Chengら，2008；Bennardo, Gunnら，2009)。Ku DNA修復タンパク質の不在は、２つのDSBに由来する端部を再結合するNHEJ事象の全体頻度に顕著には影響しない；しかし、この不在は、CHO不死化細胞及びマウスES細胞において、修復プロセスに対する不正確なNHEJの寄与を非常に強力に増強する(Guirouilh-Barbat, Huckら，2004；Guirouilh-Barbat, Rassら，2007；Bennardo, Chengら，2008)。更に、Kuの不在は、マウスES細胞において、I-SceI-誘導事象、例えば不正確なNHEJ(Bennardo, Chengら，2008)、一本鎖アニーリング(Bennardo, Chengら，2008)及び遺伝子変換(Pierce, Huら，2001；Bennardo, Chengら，2008)を刺激する。同様な観察がXRCC4修復タンパク質を欠損する細胞(Pierce, Huら，2001；Guirouilh-Barbat, Rassら，2007；Bennardo, Gunnら，2009)(しかし、XRCC4欠損はCHO細胞におけるNHEJの全体レベルに影響する(Guirouilh-Barbat, Rassら，2007))又はDNA-PKを欠損する細胞(Pierce, Huら，2001)でなされている。対照的に、CtIPのノックダウンは、「alt-NHEJ」(不正確なNHEJをよりもたらし易いKu-及びXRCC4-非依存性形態のNHEJ)、一本鎖アニーリング及び遺伝子変換を抑制する一方、I-SceIにより生成される２つの適合性末端の再結合の全体レベルに影響しないことが示されている(Bennardo, Chengら，2008)。よって、異なるDSB修復経路の競合は、ヌクレアーゼ-誘導DSBに起因する修復事象の範囲に影響し得る。
加えて、DSB切除は或る種のDSB経路には重要である。広範なDSB切除(これは、大きな一本鎖領域(少なくとも数百ヌクレオチド)を生じる)は、酵母において、一本鎖アニーリング(Sugawara及びHaber 1992)及び鎖侵襲(相同鎖によるDNA二重鎖侵襲の多くの相同組換え事象を開始するATP-依存性工程(White及びHaber 1990；Sun, Trecoら，1991；機構の総説については、Paques及びHaber 1999を参照)を開始することが示されている。真核細胞において、DSB切除は、BLM/Sgs1及びDNA2、EXOI及びMRN複合体(Mre11、Rad50、Nbs1/Xrs2)を含む幾つかのタンパク質に依存し、異なる経路に起因すると考えられている。MRNは小規模の切除プロセスに関与するが、一方はBLM及びDNA2に依存し、他方はEXOIに依存する２つの冗長な経路は、広範な切除に関与する(Mimitou及びSymington 2008；Nimonkar, Genschelら，2011)。加えて、損傷ヌクレオチド(化学切断に起因するか、バルク付加物に起因する)が関係する末端のプロセシングは、CtIP/Sae2タンパク質をRMNと共に必要とする(Sartori, Lukasら，2007；Buis, Wuら，2008；Hartsuiker, Mizunoら，2009)。Trex2エキソヌクレアーゼの過剰発現は、僅か数塩基対の損失を伴う不完全なNHEJを強力に刺激することが示されている(Bennardo, Gunnら，2009)一方、遠位配列間の種々のDNA修復事象(例えば、一本鎖アニーリング、異なる破断による末端間のNHEJ、又は遠隔の微小相同性が関係する単一のDSBのNHEJ修復)を阻害した。同じ研究で、Trex2は、I-SceIにより導かれた3'オーバーハングを、非進行性の様式で切除することが示唆された。よって、刺激される経路のタイプは、切除のタイプ(切除の長さ、一本鎖 対 二本鎖、5'鎖の切除 対 3'鎖の切除)に依存し得る。
よって、コンパクトTALENの効率、例えば、標的付けられた変異誘発又は相同遺伝子ターゲッティングのような所望の事象を生じる能力(「コンパクトTALENの効率」の完全な定義については「定義」を参照)は、コンパクトTALENの全体のDNAプロセシング効率(「全体のDNAプロセシング効率」の完全な定義については「定義」を参照)、例えば異なる別々の酵素活性の全体的な合力又は全体の結果の増強又は改変により増強され得る。
１つの好適な実施形態では、出発材料のコンパクトTALEN実体と比較した、本発明によるコンパクトTALEN実体の全体のDNAプロセシング効率の増強は、切断部位での追加のホスホジエステル結合の加水分解であり得る。
本発明に従う少なくとも１つのエンハンサーによる切断部位での追加のホスホジエステル結合の加水分解は、DSB切断部位で一方のDNA鎖若しくは両DNA鎖に影響し、5'オーバーハング端部若しくは3'オーバーハング端部若しくは両端部に影響し、又は切除の長さに依存する異なるタイプのDSB切除を導き得る。よって、コンパクトTALEN実体の既存のクリベース活性への新たなニッカーゼ又はクリベース活性の付加は、得られる本発明による増強コンパクトTALENの効率を興味対象の遺伝子座で増強し得る(図8B〜8E)。非限定例として、向かい合う鎖への２つのニッカーゼ活性の付加(図8D)又は第２のDSBを生じる新たなクリベース活性の付加(図8E)は、二本鎖ギャップをもたらし得る。結果として、完全な再ライゲーションは、もはや可能ではなく、１又は幾つかの代替の修復帰結(例えば、不正確なNHEJ、相同組換え又はSSA)が刺激され得る。別の非限定例として、１つのニッカーゼ活性の付加は、一本鎖ギャップをもたらし得、端部の付着性を抑制する。このこともまた、得られる本発明による増強コンパクトTALENの効率を興味対象の遺伝子座で、上記の１又は幾つかの代替の修復帰結の刺激を介して増強し得る。
本発明のこの観点において、コンパクトTALENのDNAプロセシング効率の増強とは、コンパクトTALENの標的DNA配列に対するDNAプロセシング効率の検出レベルが、第１のコンパクトTALENの同じ標的DNA配列に対する活性と比較して増大していることをいう。第１のコンパクトTALENは、出発材料のコンパクトTALEN、又は既に遺伝子操作されたコンパクトTALEN又は本発明による増強コンパクトTALENであり得る。出発材料のコンパクトTALEN又は出発材料の増強コンパクトTALENからの数回の増強が考えられる。
本発明のこの観点において、コンパクトTALEN実体(又は増強コンパクトTALEN)のDNAプロセシング効率の増強とは、増強コンパクトTALENの興味対象の標的DNA配列に対するか又は該興味対象のDNA配列近傍のDNAプロセシング効率の検出レベルが、第１のコンパクトTALEN又は出発材料のコンパクトTALENの同じ標的DNA配列に対するか又は同じ標的DNA配列近傍の効率と比較して増大していることをいう。この場合、出発材料のコンパクトTALENは、DNAプロセシング効率を測定するための参照足場として採用される。増強コンパクトTALENは、本発明のこの観点によるエンハンサードメインを含んでなる遺伝子操作コンパクトTALENである。増強コンパクトTALENはまた、DNAプロセシング効率の更なる増強のための参照足場として採用され得る。非限定例として、DNAプロセシング効率は、増強コンパクトTALENにより生じる切断-誘導組換えに起因し得る。この場合、切断-誘導組換えのレベルは、例えば、国際PCT出願WO 2004/067736に記載されるような細胞ベース組換えアッセイにより決定さえ得る。重要なことに、細胞における効力の増強(標的付けられた変異誘発又は標的付けられた組換えの増強された生成)は、或る種のインビトロアッセイで検出し得る切断活性の増強と関連し得るが、必ずしも関連しない。例えば、図８に記載されるような追加のホスホジエステラーゼ活性は、インビトロ切断及び電気泳動ゲル上での切断生成物の分離により検出されるように、切断プロフィールにほとんど影響しない。しかし、上記及び図８の説明文で説明したとおり、このように生じるDSB端部は、検出可能なゲノム再配置、例えば(不正確なNHEJによる)標的付けられた変異誘発又は相同組換えをより誘導し易くあり得る。増強コンパクトTALENの切断-誘導組換えにおける増強は、出発材料の足場又は出発材料のコンパクトTALENと比較して、少なくとも５％増強、より好ましくは少なくとも10％増強、またより好ましくは少なくとも15％増強、またより好ましくは少なくとも20％増強、またより好ましくは少なくとも25％増強、またより好ましくは50％増強、またより好ましくは50％を超える増強であり、出発材料の足場又は出発材料のコンパクトTALENと比較して、増強コンパクトTALENのDNAプロセシング効率の少なくとも５％増強、より好ましくは少なくとも10％増強、またより好ましくは少なくとも15％増強、またより好ましくは少なくとも20％増強、またより好ましくは少なくとも25％増強、またより好ましくは50％増強、またより好ましくは50％を超える増強がもたらされる。
本発明の方法による別の１つの好適な実施形態では、エンハンサードメインを本発明の方法によるコンパクトTALEN実体の１つの部分に連結することができるペプチド性リンカーは、表３に列挙されるようなNFS1、NFS2、CFS1、RM2、BQY、QGPSG、LGPDGRKA、1a8h_1、1dnpA_1、1d8cA_2、1ckqA_3、1sbp_1、1ev7A_1、1alo_3、1amf_1、1adjA_3、1fcdC_1、1al3_2、1g3p_1、1acc_3、1ahjB_1、1acc_1、1af7_1、1heiA_1、1bia_2、1igtB_1、1nfkA_1、1au7A_1、1bpoB_1、1b0pA_2、1c05A_2、1gcb_1、1bt3A_1、1b3oB_2、16vpA_6、1dhx_1、1b8aA_1及び1qu6A_1(配列番号67〜配列番号104及び配列番号372〜配列番号415)からなる群より選択され得る。１つのより好適な実施形態では、エンハンサードメインを本発明の方法によるコンパクトTALEN実体の１つの部分に連結することができるペプチド性リンカーは、NFS1(配列番号98)、NFS2(配列番号99)及びCFS1(配列番号100)からなる群より選択され得る。１つのエンハンサードメインをコンパクトTALEN実体の１つの部分に融合させて本発明による増強コンパクトTALENを取得するためにペプチド性リンカーを必要としない場合も本発明の範囲に包含される。
構造的組成[コアTALE足場のタイプ、関連する酵素活性を有する触媒ドメインのタイプ、エンハンサーのタイプ、最後にリンカーのタイプ]に依存して、本発明によるコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENは、上記のように、DNAを異なってプロセシングすることができる別々の酵素活性を異なるレベルで含んでなり得る。新たな酵素活性をコンパクトTALEN若しくは増強コンパクトTALENに付加することにより、又は１若しくは幾つかの構成的酵素活性のDNAプロセシング効率を増強することにより、或るコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENの全体のDNAプロセシング効率を、出発材料のコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENと比較して増強させることができる。
本発明によれば、コンパクトTALENは、DNAプロセシング事象を標的するときに複数の独立したタンパク質成分の必要性を軽減するように設計される。重要なことには、本発明によるコンパクトTALENは、興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的し、該興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍のDNAをプロセシングする唯一のDNA結合ドメインを含有するコアTALE足場を含んでなるので、現在のTALENの機能に必須である「スペーサー」領域及び二重の標的部位が不必要になる。コアTALE足場の各端部は融合に従順であるので、触媒及び増強ドメインの付加の順序(Ｎ-末端 対 Ｃ-末端)は適用により変化させ得る。加えて、触媒ドメインは特異的なDNA接触を必要としないので、図５に示す非限定例のように、コアTALE足場を取り囲む領域に関して制限がない：(Ａ)クリベースドメイン又はニッカーゼドメインにより誘導される相同組換えを促進するＮ-末端融合構築物。(Ｂ)(Ａ)と同様の特性を有するＣ-末端融合構築物。(Ｃ)コアTALE足場の両端部への２つの触媒ドメインの付着により、NHEJが増強した二重切断が可能になる。融合点(Ｎ-末端 対 Ｃ-末端)及びリンカーのデザインは適用により変化し得る。
本発明によれば、コンパクトTALENは、図６に示す非限定例のように、既存の又は代替の活性を促進するドメインの付加により、増強することができる。：(Ａ)コアTALE足場部分のＣ-末端に融合されたエンハンサードメインを有する標準のコンパクトTALEN。(Ｂ)エンハンサードメインをコンパクトTALENに触媒ドメイン部分のＮ-末端を介して融合させる。この形態を使用して、触媒ドメイン部分を支援し及び/又は触媒ドメイン部分をDNA近くに繋ぎ止めてDNAプロセシング活性を増大させることができる。(Ｃ)エンハンサードメインを触媒ドメイン部分とコアTALE足場部分との間に挟む。エンハンサードメインを隣接ドメイン間の連絡を(触媒作用及び/又はDNA結合を支援するように)促進し得るか、又は全てのTALE-ベースの標的における-１位のＴヌクレオチドの必要性を克服するために使用し得る。(Ｄ)エンハンサードメインを、遺伝子操作コアTALE足場のＮ-末端領域の機能的置換に使用する。(Ｅ)エンハンサードメインを、遺伝子操作コアTALE足場のＣ-末端領域の機能的置換に使用する。融合点(Ｎ-末端 対 Ｃ-末端)及びリンカーのデザインは適用により変化し得る。
本発明によれば、コンパクトTALEN及び増強コンパクトTALENに含まれる触媒ドメインの性質は、適用に依存する。非限定例として、ニッカーゼドメインは、クリベースドメインより高いHR/NHEJ比を可能にし、そのことで治療適用により好ましくあり得る(McConnell Smith, Takeuchiら，2009；Metzger, McConnell-Smithら，2011)。例えば、一方の側のクリベースドメインと他方の側のニッカーゼドメインとのカップリングは、コンパクトTALENの結合領域を跨ぐDNAの一本鎖の切除を生じ得る。延長された一本鎖オーバーハングの標的付けられた生成は、DNA修復機構を標的する応用において適用され得る。標的付けられた遺伝子不活化には、２つのクリベースドメインの使用が好ましい。別の１つの好適な実施形態では、２つのニッカーゼドメインの使用が好ましくあり得る。更に、本発明は、標的付けられたDNA切断から標的付けられた遺伝子調節までに及ぶ応用に適用し得る幾つかの別個のタイプのコンパクトTALENを作製する方法に関する。
本発明はまた、標的付けられたDNA切断から標的付けられた遺伝子調節までに及ぶ種々の応用のための本発明によるコンパクトTALENの使用方法に関する。１つの好適な実施形態では、本発明は、本発明によるDNA標的配列を標的するコンパクトTALENにおいて二本鎖破断活性が促進されるとき、標的付けられたHR(及びNHEJ)を増大させる方法に関する。別の１つのより好適な実施形態では、本発明による少なくとも２つの触媒的に活性なクリベースエンハンサードメインの付加は、遺伝情報の喪失を導いて標的付けられた興味対象の遺伝子座のNHEJによる無瘢痕再ライゲーションを防止することにより二本鎖破断-誘導変異誘発の増大を可能にする。
別の１つの好適な実施形態では、本発明は、本発明によるDNA標的配列を標的するコンパクトTALENにおいて一本鎖破断活性が促進されるとき、NHEJの少ない(すなわち、より保存的な様式で)標的付けられたHRを増大させる方法に関する。
別の１つの好適な実施形態では、本発明は、１つのクリベースエンハンサードメイン及び１つのニッカーゼエンハンサードメインが本発明によるコアTALE足場のＮ-末端及びＣ-末端にそれぞれ融合されるとき、コンパクトTALENの結合領域を跨ぐDNAの一本鎖の切り出しを増大させる方法に関する。
別の１つの好適な実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象者に有効量の本発明によるコンパクトTALENのバリアントを投与することを含んでなる、遺伝子中の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列における変異により引き起こされる遺伝子疾患の治療方法に関する。
別の１つの好適な実施形態では、本発明は、導入遺伝子を、細胞、組織、非ヒト動物又は植物の或る遺伝子座の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列中に挿入する方法に関し、ここで、本発明の少なくとも１つのコンパクトTALENは、細胞、組織、非ヒト動物又は植物中に一過性であるか又は一過性でなく導入される。
別の１つの実施形態では、本発明は、細胞で発現させたとき、コンパクトTALENの活性を変調する方法に関し、該方法は、細胞に、コンパクトTALENの活性を変調する補助ドメインを導入する工程を含んでなる。１つの好適な実施形態では、本発明は、一旦コンパクトTALENが活性(DNA切断、DNAニック生成又は他のDNAプロセシング活性)を達成したら、細胞に、コンパクトTALENの活性を変調する補助ドメインを導入することによって、細胞で発現させたときのコンパクトTALENの活性の一時的な制御を可能にする方法に関する。１つの好適な実施形態では、本発明は、細胞で発現させたとき、コンパクトTALENの活性を阻害する方法に関し、該方法は、細胞に、コンパクトTALENの活性を阻害する補助ドメインを導入する工程を含んでなる。１つのより好適な実施形態では、コンパクトTALENの触媒ドメインは、NucA(配列番号26)であり、補助ドメインはNuiA(配列番号229)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体である。別の１つのより好適な実施形態では、コンパクトTALENの触媒ドメインはColE7(配列番号11)であり、補助ドメインはIm7(配列番号230)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体である。
本発明によるコンパクトTALEN、二重コンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENをコードする組換えポリヌクレオチドもまた本発明の範囲に包含される。本発明によるコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENをコードする組換えポリヌクレオチドを含んでなるベクターもまた本発明の範囲に包含される。
本発明によるコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENをコードするベクター及び/又は組換えポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞もまた本発明の範囲に包含される。
本発明によるコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENをコードするベクター及び/又は組換えポリヌクレオチドを含んでなる非ヒトトランスジェニック動物もまた本発明の範囲に包含される。
本発明によるコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENをコードするベクター及び/又は組換えポリヌクレオチドを含んでなるトランスジェニック植物もまた本発明の範囲に包含される。
本発明はまた、本発明による方法を実施するために使用するキットに関する。より好ましくは、本発明によるコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALEN及び興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列のDNAプロセシング効率を増強させることに使用するための指示書を含んでなるキットは、本発明の範囲に包含される。
治療目的に関しては、本発明のコンパクトTALEN及び医薬的に許容され得る賦形剤を治療有効量で投与する。この組合せは、投与量が生理学的に有意義であれば、「治療有効量で」投与されると言える。薬剤は、その存在がレシピエントの生理に検出可能な変化を生じる場合、生理学的に有意義である。本発明に関しては、薬剤は、その存在が標的付けられた疾患の１又はそれより多い症状の重篤度の減少及びゲノム損傷又は異常の修正を生じる場合、生理学的に有意義である。コンパクトTALENをコードするターゲッティングDNA及び/又は核酸を含んでなるベクターは、種々の方法(例えば、注入、直接取り込み、プロジェクタイルボンバードメント、リポソーム、エレクトロポレーション)により細胞中に導入され得る。コンパクトTALENは、発現ベクターを用いて、細胞中に安定に又は一過性に発現され得る。真核細胞での発現技法は、当業者に周知である(Current Protocols in Human Genetics: Chapter 12 「Vectors For Gene Therapy」 & Chapter 13 「Delivery Systems for Gene Therapy」を参照)。
本発明の１つの更なる観点において、本発明のコンパクトTALENは実質的に非免疫原性である。すなわち、不都合な免疫学的応答をほとんど又は全く生じない。この種の有害な免疫学的反応を寛解するか又は除去する種々の方法が、本発明に従って使用され得る。１つの好適な実施形態では、コンパクトTALENは、Ｎ-ホルミルメチオニンを実質的に含まない。望まない免疫学的反応を回避する別の方法は、コンパクトTALENをポリエチレングリコール(「PEG」)又はポリプロピレングリコール(「PPG」)(好ましくは、500〜20,000ダルトンの平均分子量(MW)のもの)と接合させることである。PEG又はPPGとの接合は、例えばDavisら(米国特許第4,179,337号)に記載のように、抗-ウイルス活性を有する非免疫原性で、生理学的に活性な水溶性のコンパクトTALENコンジュゲートを提供し得る。ポリエチレン-ポリプロピレングリコールコポリマーを用いる類似の方法もSaiferら(米国特許第5,006,333号)に記載されている。
本発明の別の１つの観点は、本発明によるコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALEN及びキャリアを含んでなる組成物である。本発明によるコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALEN及び先行技術において公知の医薬的に活性なキャリアを含んでなる医薬組成物がより好ましい。
本発明の範囲において、及び上記の全ての適用に関して、本発明によるDNAプロセシングのために１より多いコンパクトTALEN(すなわち、コンパクトTALEN活性実体)又は１より多い増強コンパクトTALEN(すなわち、増強コンパクトTALEN活性実体)を使用することが考えられ得る。１つの好適な実施形態では、２つの異なるコンパクトTALEN又は２つの増強コンパクトTALENを使用し得る。この実施形態では、非限定例として、２つの異なるコンパクトTALENは、同じコアTALE足場を含んでなることもでき、同じコアTALE足場を含まないこともできる；２つの異なるコンパクトTALENは、同じセットの反復可変ジペプチドを含んでなることもでき、同じセットの反復可変ジペプチドを含まないこともできる；２つの異なるコンパクトTALENは、同じ触媒ドメインを含んでなることもでき、同じ触媒ドメインを含まないこともできる。２つの同一のコンパクトTALEN活性実体を本発明によるDNAプロセシングに使用する場合、それらはコンパクトTALEN活性実体のホモダイマー対とみなすことができる。２つの非同一のコンパクトTALEN活性実体を本発明によるDNAプロセシングに使用する場合、それらはコンパクトTALEN活性実体のヘテロダイマー対とみなすことができる。非限定例として、２つの本発明によるコンパクトTALENを使用する場合、コンパクトTALENの一方は、他方の活性を変調させることができ、例えば、唯一のコンパクトTALENにより達成される同じDNAプロセシング事象と比較して増強したDNAプロセシング事象を導くことができる；この非限定例において、トランス-TALENは、当初のコンパクトTALENの触媒活性を変調させ、増強する。
別の１つの好適な実施形態では、３つのコンパクトTALEN又は３つの増強コンパクトTALENを使用し得る。別の１つの好適な実施形態では、本発明によるDNAプロセシングに３より多いコンパクトTALEN又は３より多い増強コンパクトTALENを使用し得る。別の１つの好適な実施形態では、コンパクトTALEN及び増強コンパクトTALENの組合せを本発明によるDNAプロセシングに使用し得る。非限定例として、１つのコンパクトTALEN及び１つの増強コンパクトTALENを使用し得る。別の１つの非限定例として、１つのコンパクトTALEN及び１つの二重切断コンパクトTALENを使用し得る。別の１つの好適な実施形態では、コンパクトTALEN、増強コンパクトTALEN及び二重切断コンパクトTALENの組合せを使用し得、ここで、３つのコンパクトTALENは、同じ触媒ドメインを含むことも含まないこともでき、同じコアTALE足場を含むことも含まないこともできる。幾つかのコンパクトTALENを使用しなければならない場合、使用すべき組合せの各コンパクトTALENのDNA標的配列は、興味対象の同じ内因性ゲノムDNA遺伝子座に位置することもしないこともできる。DNA標的配列は、1000塩基対(bp)のおよその距離に位置し得る。より好ましくは、DNA標的配列は、500bp又は200bp、又は100bp、又は50bp、又は20bp、19bp、18bp、17bp、16bp、15bp、14bp、13bp、12bp、11bp、10bp、９bp、８bp、７bp、６bp、５bp、４bp、３bp、２bp、１bpのおよその距離に位置し得る。上記の距離で位置するDNA標的配列は、本発明によるDNAプロセシングの標的DNA配列に関して、「近傍」のDNA配列である。
別の１つの好適な実施形態では、本発明によるDNA標的配列近傍の２つの異なるDNAプロセシング活性を達成する方法として２つのコンパクトTALEN活性実体を使用し得る。非限定例として、標的付けられたDNA配列又はその近傍のDNA配列を標的し、各々が１つのニッカーゼ-由来触媒ドメインを含んでなる２つのコンパクトTALENを使用し得る；この場合、２つのコンパクトTALEN活性実体のこの使用は、DNA配列を標的しクリベース-由来触媒ドメインを含んでなる１つのコンパクトTALENの使用に対する、DNA標的配列近傍の二本鎖破断を達成する代替法を提示し得る。別の１つの非限定例として、クリベース-由来ドメインを含んでなる１つのコンパクトTALEN及びエキソヌクレアーゼ-由来ドメインを含んでなる１つのコンパクトTALENを、それぞれ二本鎖破断及びギャップを作製して、DNA標的配列を含んでなる興味対象の遺伝子座で不正確なNHEJ事象を達成するために使用し得る。この場合、このヘテロダイマー対のコンパクトTALENを形成する各コンパクトTALENがたとえそれ自体活性であっても、これら活性実体の各々は、望まれる結果のDNAプロセシング活性を達成するためには他方の活性実体に依存性である。確かに、この特定の場合において、望まれる結果の活性は、他方のコンパクトTALENのクリベースドメインにより達成される二本鎖破断からのみ可能であるエキソヌクレアーゼ活性により作製されるギャップである。本発明の範囲において、２つの同一のコンパクトTALEN活性実体(コンパクトTALENのホモダイマー対)が望まれる結果のDNAプロセシング活性を達成するために互いに依存性である場合も考えられる。
定義
−ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書中では一文字コードに従って指称する。一文字コードでは、例えば、ＱはGln又はグルタミン残基を意味し、ＲはArg又はアルギニン残基を意味し、ＤはAsp又はアスパラギン酸残基を意味する。
−アミノ酸置換は、或るアミノ酸残基の別のアミノ酸残基での置き換えを意味し、例えば、ペプチド配列におけるアルギニン残基のグルタミン残基での置き換えはアミノ酸置換である。
−増強/増大/改善したDNAプロセシング活性とは、標的DNA配列又はDNA標的配列に対する所与のコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENに関連するDNAプロセシング活性の検出レベルの、第２のコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENによる、標的DNA配列に対する第１のコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENの活性と比較しての増加をいう。第２のコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENは、第１のもののバリアントであり得、第１のコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENとの比較で１又はそれより多い置換アミノ酸残基を含んでなり得る。第２のコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENは、第１のもののバリアントであり得、第１のコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENとの比較で１又はそれより多い触媒ドメイン及び/又はエンハンサードメインを含んでなり得る。この定義は、より広義には、他のエンドヌクレアーゼ及び稀切断性エンドヌクレアーゼについて適用される。
−DNAプロセシング活性とは、コンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENの特定の/所与の酵素活性をいい、より広義には稀切断性エンドヌクレアーゼの酵素活性を適格化する。DNAプロセシング活性とは、切断活性、クリベース活性又はニッカーゼ活性をいい、より広義にはヌクレアーゼ活性を、また、非限定例としての、ポリメラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、メチラーゼ活性、トポイソメラーゼ活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性又はリガーゼ活性もいうことができる。この定義の範囲内で、特定の酵素活性の所与のDNAプロセシング活性はまた、該特定の酵素活性のDNAプロセシング効率として記述し得る。この定義に従うコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENのDNAプロセシング活性を増強する方法は、本発明に包含される。
−全体のDNAプロセシング効率は、本発明によるコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENに関しては、コンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENが含み得る異なる別々の酵素活性の全体的な合力又は全体の効果をいう。これら異なる別々の酵素活性によれば、コンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENは、興味対象の遺伝子座中の標的配列近傍のDNAをプロセシングする全体能力、すなわち全体のDNAプロセシング効率を示す。全体のDNAプロセシング効率は、第１の所与のコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENとの比較で、第２の所与のコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENを適格化又はランク付けし得る。コンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENの構造的組成[コアTALE足場のタイプ、関連する酵素活性を有する触媒ドメインのタイプ、最後にリンカーのタイプ及びエンハンサードメインのタイプ]に依存して、全体のDNAプロセシング効率とは、唯１つの酵素活性、２つの酵素活性、３つの酵素活性、４つの酵素活性又は４つより多い酵素活性をいい得る。全体のDNAプロセシング効率とは、個々の酵素活性の合計をいい得る。全体のDNAプロセシング効率とは、所与のコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENに含まれる異なる酵素活性の相乗又は組合せ効果をいい得る。本発明によるコンパクトTALENのDNAプロセシング効率の増強は、相乗の増強された組合せの効果を反映し得、別々の出発材料のコンパクトTALENのそれぞれのDNAプロセシング効率の合計又は同じ出発材料のコンパクトTALEN中に含まれる別々の酵素活性のそれぞれのDNAプロセシング効率の合計より大きい全体のDNAプロセシング効率によって特徴付けられる増強コンパクトTALENを生じる。
−本発明による稀切断性エンドヌクレアーゼの効率は、該稀切断性エンドヌクレアーゼの所望の事象を生じる特性である。この所望の事象は、例えば、相同遺伝子ターゲッティング、標的付けられた変異誘発又は配列の除去若しくは切り出しであり得る。所望の事象の効率は、所望の事象を生じるヌクレアーゼ及び修復経路の比活性(遺伝子ターゲッティングについては相同修復の効力、標的付けられた変異誘発についてはNHEJ経路の効力及び帰結)を含む幾つかのパラメータに依存する。遺伝子座についての稀切断性エンドヌクレアーゼの効率は、この遺伝子座で所望の事象を生じる能力を意味するものとする。標的についての稀切断性エンドヌクレアーゼの効率は、この標的の切断の結果として所望の事象を生じる能力を意味するものとする。
−ヌクレオチドは下記のとおり指称する：ヌクレオシドの塩基を指称するために一文字コードを使用する：ａはアデニンであり、ｔはチミンであり、ｃはシトシンであり、ｇはグアニンである。縮重ヌクレオチドに関しては、ｒはｇ又はａ(プリンヌクレオチド)を表し、ｋはｇ又はｔを表し、ｓはｇ又はｃを表し、ｗはａ又はｔを表し、ｍはａ又はｃを表し、ｙはｔ又はｃ(ピリミジンヌクレオチド)を表し、ｄはｇ、ａ又はｔを表し、ｖはｇ、ａ又はｃを表し、ｂはｇ、ｔ又はｃを表し、ｈはａ、ｔ又はｃを表し、ｎはｇ、ａ、ｔ又はｃを表す。
−「メガヌクレアーゼ」により、12より大きい二本鎖DNA標的配列を有する稀切断性エンドヌクレアーゼサブタイプが意図される。メガヌクレアーゼは、各ドメインがモノマー上にあるダイマー型酵素であるか、又は２つのドメインを単一ポリペプチド上に含んでなるモノマー型酵素である。
−「メガヌクレアーゼドメイン」により、メガヌクレアーゼのDNA標的の一方の半分と相互作用する領域であって、該DNA標的の他方の半分と相互作用する(同メガヌクレアーゼの)他方のドメインと会合して該DNA標的を切断し得る機能的メガヌクレアーゼを形成することができる領域が意図される。
−「エンドヌクレアーゼバリアント」、「稀切断性エンドヌクレアーゼバリアント」、「キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼバリアント」又は「メガヌクレアーゼバリアント」又は「コンパクトTALENバリアント」又は「増強コンパクトTALENバリアント」又は「二重切断コンパクトTALENバリアント」又は「バリアント」により、親のエンドヌクレアーゼ、稀切断性エンドヌクレアーゼ、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ又はコンパクトTALEN、増強コンパクトTALEN、二重切断コンパクトTALENのアミノ酸配列中の少なくとも１つの残基を少なくとも１つの異なるアミノ酸で置き換えることで得られるエンドヌクレアーゼ、稀切断性エンドヌクレアーゼ、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ又はコンパクトTALEN、増強コンパクトTALEN、二重切断コンパクトTALENが意図される。「バリアント」との呼称はまた、例えば、出発材料のコンパクトTALEN実体との比較で、少なくとも１つの補充のタンパク質ドメイン(触媒ドメイン又はエンハンサードメイン)を含んでなる増強コンパクトTALENにも適用される。これらバリアントに含まれ、本発明によるコンパクトTALEN、増強コンパクトTALEN、二重切断コンパクトTALEN又はタンパク質ドメイン及びポリペプチドの配列とヌクレオチドレベル又はポリペプチドレベルで高率の同一性又は高率の相同性を有する配列を示すバリアント及びタンパク質ドメインもまた、この定義の範囲に含まれる。高率の同一性又は高率の相同性により、60％、より好ましくは70％、より好ましくは75％、より好ましくは80％、より好ましくは85％、より好ましくは90％、より好ましくは95、より好ましくは97％、より好ましくは99％又は60％〜99％の間に含まれる任意の整数値の％が意図される。
−「ペプチドリンカー」、「ペプチド性リンカー」又は「ペプチドスペーサー」は、融合タンパク質における異なるモノマーの接続及び該融合タンパク質の活性のための正確なコンホメーションの採用を可能し、且つ標的に関していずれのモノマーの特異性も変更しないペプチド配列を意味するものとする。ペプチドリンカーは種々のサイズ(非限定的な例示範囲として３アミノ酸〜50アミノ酸)であり得る。ペプチドリンカーはまた、構造体化されているか又は構造体化されていないことができる。
−(特には、表現「選択した細胞タイプ又は生物に関連する１つの細胞タイプ」における)「に関連する」により、選択した細胞タイプ又は選択した生物と特徴を共有する細胞タイプ又は生物が意図される；選択した細胞タイプ又は生物に関連するこの細胞タイプ又は生物は、選択した細胞タイプ又は生物に由来することもあり、しないこともある。
−「サブドメイン」により、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの領域であって、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的のハーフ部位(half-site)の別々の部分と相互作用する領域が意図される。
−「ターゲティングDNA構築物/最小修復マトリクス/修復マトリクス」は、インサイチュでDNA標的の5'側領域及び3'側領域に相同である第１及び第２の部分を含んでなるDNA構築物を意味するものとする。DNA構築物はまた、第１の部分と第２の部分との間に位置し、インサイチュで対応するDNA配列と幾らかの相同性を有するか、或いはインサイチュでDNA標的の5'側領域及び3'側領域と相同性を有さない第３の部分を含んでなる。DNA標的の切断後、興味対象の遺伝子座に含まれる標的付けられた遺伝子を含有するゲノムと修復マトリクスとの間で相同組換え事象が刺激される。ここで、DNA標的を含有するゲノム配列は、修復マトリクスの第３の部分並びに修復マトリクスの第１及び第２の部分の一部分(変動し得る)で置き換わる。
−「機能的バリアント」は、タンパク質の触媒的に活性なバリアントを意図し、このようなバリアントはその親タンパク質と比較して追加の特性を有し得る。非限定例として、メガヌクレアーゼの機能的バリアントは、DNA標的配列を切断することが可能であり得、好ましくは、標的は、親メガヌクレアーゼにより切断されない新たな標的である。この定義はまた、本発明によるコンパクトTALEN、増強コンパクトTALEN、二重切断コンパクトTALEN又はこれらTALENを構成するタンパク質ドメインにも適用される。これら分子に含まれ、本発明によるコンパクトTALEN、増強コンパクトTALEN、二重切断コンパクトTALEN又はタンパク質ドメイン及びポリペプチドの配列とヌクレオチドレベル又はポリペプチドレベルで高率の同一性又は高率の相同性を有する配列を示す機能的バリアント、ポリペプチド及びタンパク質ドメインもまた、この定義の範囲に含まれる。高率の同一性又は高率の相同性により、60％、より好ましくは70％、より好ましくは75％、より好ましくは80％、より好ましくは85％、より好ましくは90％、より好ましくは95、より好ましくは97％、より好ましくは99％又は60％〜99％の間に含まれる任意の整数値の％が意図される。
−「(に)由来(する)」又は「誘導体」は、例えば、親メガヌクレアーゼから創られ、したがってそのペプチド配列が当該親メガヌクレアーゼのペプチド配列に(一次配列レベルで)関連するが、該配列から(変異により)得られるメガヌクレアーゼバリアントを意味するものとする。この定義において、変異は幾つかのアミノ酸残基の欠失又は挿入を包含する；非限定例として、I-CreIメガヌクレアーゼの短縮型バリアントは、I-CreIメガヌクレアーゼに由来する足場と見なされる。この表現はまた、本発明によるコンパクトTALEN、増強コンパクトTALEN、二重切断コンパクトTALEN又はこれらTALENを構成するタンパク質ドメインにも適用される。本発明によるコンパクトTALEN、増強コンパクトTALEN、二重切断コンパクトTALEN又はタンパク質ドメイン及びポリペプチドの配列とヌクレオチドレベル又はポリペプチドレベルで高率の同一性又は高率の相同性を有する配列を示す、本発明によるコンパクトTALEN、増強コンパクトTALEN、二重切断コンパクトTALEN又はタンパク質ドメイン及びポリペプチドの誘導体もまた、この定義の範囲に含まれる。高率の同一性又は高率の相同性により、60％、より好ましくは70％、より好ましくは75％、より好ましくは80％、より好ましくは85％、より好ましくは90％、より好ましくは95、より好ましくは97％、より好ましくは99％又は60％〜99％の間に含まれる任意の整数値の％が意図される。
−「I-CreI」により、配列表の配列番号１の配列に相当する、pdbアクセッションコード1g9yの配列を有する野生型I-CreIが意図される。本特許出願において、記載されるI-CreIバリアントは、野生型I-CreI配列(配列番号１)の第１メチオニンの後に、追加のアラニンを含んでなり得る。これらバリアントはまた、配列番号106に示されるように、野生型I-CreI配列の最後のプロリンの後に、２つの追加のアラニン残基及びアスパラギン酸残基を含んでなり得る。これら追加の残基は、当該酵素の性質に影響しない。混乱を回避するために、これら追加の残基は、本特許出願において言及するI-CreI又はバリアント中の残基の番号付けには影響しない。なぜならば、これらへの言及は、専ら、バリアント中に存在する野生型I-CreI酵素(配列番号１)の残基をいうからである。例えば、I-CreIの残基２は、実際には、最初のメチオニンの後に追加のアラニンを含んでなるバリアントの残基３である。
−新規な特異性を有するコンパクトTALEN、増強コンパクトTALEN、二重切断コンパクトTALENにより、それぞれの親のコンパクトTALEN、増強コンパクトTALEN、二重切断コンパクトTALENのものとは異なる標的切断パターンを有するこれらタンパク質のバリアントが意図される。用語「新規な特異性」、「改変された特異性」、「新規な切断特異性」、「新規な基質特異性」(これらは同義であり、等しく使用される)とは、DNA標的配列のヌクレオチドに対するバリアントの特異性をいう。
−「I-CreI部位」により、I-CreIによって切断される22〜24bpの二本鎖DNA配列が意図される。I-CreI部位には、野生型非パリンドロームI-CreIホーミング部位及びC1221又はC1221標的とも呼ばれる配列5'-t-12c-11a-10a-9a-8a-7c-6g-5t-4c-3g-2t-1a+1c+2g+3a+4c+5g+6t+7t+8t+9t+10g+11a+12(配列番号２)のような派生パリンドローム配列が含まれる。
−「ドメイン」又は「コアドメイン」により、約100アミノ酸残基の配列に相当する、LAGLIDADGファミリーのホーミングエンドヌクレアーゼに特徴的なαββαββαフォールドである「LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメイン」が意図される。当該ドメインは、DNA標的の一方の半分と相互作用する、逆平行βシートに折り畳まれた４つのβ鎖(β1β2β3β4)を含んでなる。このドメインは、DNA標的の他方の半分と相互作用する別のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインと会合して、該DNA標的を切断し得る機能的エンドヌクレアーゼを形成することができる。例えば、ダイマー型ホーミングエンドヌクレアーゼI-CreI(163アミノ酸)の場合には、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインは、残基６〜94に相当する。
−「βヘアピン」により、ループ又はターンにより接続された、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの連続する２つのβストランドの逆平行βシート(β1β2又はβ3β4)が意図される。
−「単鎖メガヌクレアーゼ」、「単鎖キメラメガヌクレアーゼ」、「単鎖メガヌクレアーゼ誘導体」、「単鎖キメラメガヌクレアーゼ誘導体」又は「単鎖誘導体」により、ペプチド性スペーサーにより連結された２つのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼドメイン又はコアドメインを含んでなるメガヌクレアーゼが意図される。単鎖メガヌクレアーゼは、親メガヌクレアーゼ標的配列の各々からの異なる１つの半分を含んでなるキメラDNA標的配列を切断することができる。
−「DNA標的」、「DNA標的配列」、「標的DNA配列」、「標的配列」、「標的部位」、「標的」、「部位」、「興味対象部位」、「認識部位」、「ポリヌクレオチド認識部位」、「認識配列」、「ホーミング認識部位」、「ホーミング部位」、「切断部位」により、I-CreIのようなLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ若しくはバリアント又はI-CreIに由来する単鎖キメラメガヌクレアーゼで認識され、切断され得るパリンドローム状、部分的パリンドローム状(偽パリンドローム状)又は非パリンドローム状の二本鎖ポリヌクレオチド配列が意図される。このDNA標的配列は、ゲノム配列内で認識されたときにエンドヌクレアーゼ、稀切断性エンドヌクレアーゼ、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ又はメガヌクレアーゼで「切断可能」であると適格化され得、所与のエンドヌクレアーゼ、稀切断性エンドヌクレアーゼ、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ若しくはメガヌクレアーゼ又はそれらのバリアントのDNA標的配列に相当することが知られている。これら用語は、エンドヌクレアーゼ、稀切断性エンドヌクレアーゼ、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ又はメガヌクレアーゼにより二本鎖破断(切断)が誘導され得る(非限定例としての)特異的なDNA位置(好ましくはゲノム位置)やその本体とは独立して存在し得る遺伝物質の一部(例えばプラスミド、エピソーム、ウイルス、トランスポゾン)又はオルガネラ中に存在し得る遺伝物質の一部(例えばミトコンドリア又は葉緑体)をいう。稀切断性エンドヌクレアーゼのLAGLIDADGサブファミリーについて、DNA標的は、C1221(配列番号２)について上記で示したように、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の5'→3'配列で定義される。DNA標的の切断は、センス鎖及びアンチセンス鎖についてそれぞれ＋２位及び−２位のヌクレオチドで生じ得る。そうでないと記載しない限り、I-CreI由来のバリアントによるDNA標的の切断が生じ得る位置は、DNA標的のセンス鎖上の切断部位に相当する。コンパクトTALEN(キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼのサブクラス)という特定の場合においては、以下の表現「DNA標的」、「DNA標的配列」、「標的DNA配列」、「標的配列」、「標的-部位」、「標的」、「部位」、「興味対象の部位」、「認識部位」、「ポリヌクレオチド認識部位」及び「認識配列」は、本発明によるコンパクトTALENにより認識される特異的DNA標的配列がコンパクトTALENによりプロセシングされ及び/又は切断されるものであるか否かという特殊性で特異的DNA標的配列を適格化するために適用し得る。本発明によるコンパクトTALEN、増強コンパクトTALEN又は二重切断コンパクトTALENは、特異的DNA標的配列内のDNAをプロセシング及び/又は切断し得る。コンパクトTALEN、増強コンパクトTALEN又は二重切断コンパクトTALENはまた、特異的DNA標的配列外のDNAをプロセシング及び/又は切断し得る。
−「特異的DNA標的配列近傍のDNA」又は「近傍のDNA」により、特異的DNA標的配列内又は外に位置するDNA配列が意図される。特異的DNA標的配列の位置でコンパクトTALEN若しくは増強コンパクトTALENによって結合されるDNA配列又は特異的DNA標的配列から１〜100塩基対(bp)、１〜50塩基対(bp)若しくは１〜25塩基対(bp)の距離だけ5'側若しくは3'側に位置するDNAもまた意図される。
特定のゲノム工学応用で幾つかのコンパクトTALENを使用しなければならない場合、使用すべき組合せの各コンパクトTALENのDNA標的配列は、同じ興味対象の内因性ゲノムDNA遺伝子座に位置しいることもあり、していないこともある。DNA標的配列は、１〜1000塩基対(bp)、より好ましくは１〜500bp、より好ましくは１〜100bp、より好ましくは１〜100bp、より好ましくは１〜50bp、より好ましくは１〜25bp、より好ましくは１〜10bのおよその距離に位置し得る。別の１つの実施形態では、使用すべき組合せの各コンパクトTALENのDNA標的配列は、同じDNA鎖上に位置していることもあり、していないこともある。上記の距離で位置するDNA標的配列は、本発明によるDNAプロセシングの標的DNA配列に関して「近傍」のDNA配列である。
−「単一の二本鎖DNA標的配列」により、コンパクトTALEN又は増強コンパクトTALEN又は二重切断コンパクトTALENの結合部位が意図される。コンパクトTALEN又は増強コンパクトTALEN又は二重切断コンパクトTALENの認識DNA結合部位は、長さが12〜100塩基対(bp)の範囲であり得、通常12bp長より大きくあり得る。
−「DNA標的ハーフ部位」、「ハーフ切断部位」又は「ハーフ部位」により、各々のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインが結合する、DNA標的の部分が意図される。
−用語「エンドヌクレアーゼ」とは、DNA又はRNA分子内、好ましくはDNA分子内の核酸同士間の結合の加水分解(切断)を触媒し得る任意の野生型の又はバリアントの酵素をいう。エンドヌクレアーゼは、代表的には約12塩基対(bp)長より大きい(より好ましくは14〜45bp長の)ポリヌクレオチド認識部位を有するとき、稀切断性エンドヌクレアーゼとして分類され得る。稀切断性エンドヌクレアーゼは、規定の遺伝子座でのDNA二本鎖破断(DSB)を誘導することによってHRを有意に増加させる(Rouet, Smihら，1994；Rouet, Smihら，1994；Choulika, Perrinら，1995；Pingoud及びSilva 2007)。稀切断性エンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ(Paques及びDuchateau 2007)、遺伝子操作ジンクフィンガードメインとFokIのような制限酵素の触媒ドメインとの融合から生じるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)(Porteus及びCarroll 2005)、又は化学的エンドヌクレアーゼ(Eisenschmidt, Lanioら，2005；Arimondo, Thomasら，2006；Simon, Cannataら，2008)であり得る。化学的エンドヌクレアーゼにおいて、化学的又はペプチド性切断物質は、特異的標的配列を認識する核酸ポリマー又は別のDNAに結合されて、切断活性を特異的配列に対して標的付けられている。化学的エンドヌクレアーゼはまた、オルトフェナントロリンとDNA切断性分子と三重鎖形成性オリゴヌクレオチド(TFO；特異的DNA配列に結合することが知られている)との結合体(Kalish及びGlazer 2005)のような合成ヌクレアーゼを包含する。このような化学的エンドヌクレアーゼは、本発明による用語「エンドヌクレアーゼ」に含まれる。
稀切断性エンドヌクレアーゼはまた、例えば、FokI触媒ドメイン及びXanthomonas属の植物病原因子による感染プロセスで使用されるタンパク質ファミリーである転写アクチベーター様エフェクター(TALE)に由来するDNA結合性ドメインを用いる新たなクラスのキメラヌクレアーゼである、TALENであり得る(Boch, Scholzeら，2009；Boch, Scholzeら，2009；Moscou及びBogdanove 2009；Moscou及びBogdanove 2009；Christian, Cermakら，2010；Christian, Cermakら，2010；Li, Huangら2010；Li, Huangら2011)。FokI-ベースのTALE-ヌクレアーゼ(TALEN)の機能的レイアウトは、本質的には、ジンクフィンガーDNA結合性ドメインがTALEドメインで置き換えられているZFNの機能的レイアウトである。このように、TALENによるDNA切断には、非特異的中心領域に接する２つのDNA認識領域が必要である。本発明に包含される稀切断性エンドヌクレアーゼはまた、TALENに由来し得る。本発明の発明者らは、標的DNAを特異的に認識し効率的にプロセシングするように遺伝子操作され得る新たなタイプのTALENを開発した。これら新規な「コンパクトTALEN」(cTALEN)は、DNAプロセシング活性に二量体化を必要とせず、そのことにより介在DNA「スペーサー」を有する「二重」標的部位の必要性を軽減する；これらコンパクトTALENは、本発明による稀切断性エンドヌクレアーゼ又はキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼの１つのサブクラスとみることができる。
稀切断性エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼの名称でも知られるホーミングエンドヌクレアーゼであり得る。このようなホーミングエンドヌクレアーゼは当該分野で周知である(Stoddard 2005)。ホーミングエンドヌクレアーゼはDNA標的配列を認識し、一本鎖又は二本鎖破断を生じさせる。12〜45塩基対(bp)長、通常は14〜40bp長のDNA標的部位を認識するホーミングエンドヌクレアーゼは高度に特異的である。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、HNHエンドヌクレアーゼ又はGIY-YIGエンドヌクレアーゼに相当し得る。
野生では、メガヌクレアーゼは、本質的には、ホーミングエンドヌクレアーゼに代表される。ホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)は、数百のタンパク質ファミリーを含む天然メガヌクレアーゼの広範なファミリーである(Chevalier及びStoddard 2001)。これらタンパク質は、「ホーミング」と呼ばれるプロセスによって伝播する可動遺伝子エレメントによりコードされる：エンドヌクレアーゼは、可動エレメントが存在しない同族対立遺伝子を切断することにより、レシピエント遺伝子座に可動DNAを複製する相同組換え事象を刺激する。エンドヌクレアーゼは、効力及び特異性に関する例外的な切断特性を考えれば、新規で高度に特異的なエンドヌクレアーゼを誘導するための理想的な足場を努め得る。
HEは４つの主要なファミリーに属する。LAGLIDADGファミリー(これは、触媒中心に関与する保存されたペプチド性モチーフに因んで名付けられた)は、最も広範で、最も特徴付けられた群である。現在、７つの構造が利用可能である。このファミリーのほとんどのタンパク質はモノマー型であり、２つのLAGLIDADGモチーフを提示する一方で、少数のものは唯１つのモチーフを有し、よって二量体化してパリンドローム又は偽パリンドロームの標的配列を切断する。
LAGLIDADGペプチドがそのファミリーメンバー内で保存された唯一の領域ではあるが、これらタンパク質は非常に類似する構造を有する。触媒コアは、ホモダイマー、例えばI-CreI(Chevalier, Monnatら，2001)、I-MsoI(Chevalier, Turmelら，2003)及びI-CeuI(Spiegel, Chevalierら，2006)に関しては完全な二回転対称であり、モノマー、例えばI-SceI(Moure, Gimbleら，2003)、I-DmoI(Silva, Dalgaardら，1999)又はI-AniI(Bolduc, Spiegelら，2003)に関しては偽対称である２つのDNA結合性ドメインに挟まれている。両モノマーとも又は(モノマー型タンパク質については)両ドメインとも、二価カチオンの周辺に組織化される触媒コアに寄与する。触媒コアの直ぐ上部で、２つのLAGLIDADGペプチドはまた、二量体化界面において本質的な役割を果たしている。DNA結合は、DNA主要溝上に位置する２つの典型的なサドル形状のαββαββαフォールドに依存する。その他のドメインは、例えば、PI-PfuI(Ichiyanagi, Ishinoら，2000)及びPI-SceI(Moure, Gimbleら，2002)のようなインテイン中に見出すことができ、このタンパク質スプライシングドメインもまたDNA結合に関与する。
Ｎ-末端I-DmoIドメインとI-CreIモノマーとの融合による機能的なキメラメガヌクレアーゼの作製は、LAGLIDADGタンパク質の可塑性を証明している(Chevalier, Kortemmeら，2002；Epinat, Arnouldら，2003)；国際PCT出願WO 03/078619(Cellectis)及びWO 2004/031346(Fred Hutchinson Cancer Research Center, Stoddardら))。
異なるグループもまた、I-CreI(Seligman, Stephensら，1997；Sussman, Chadseyら，2004)；国際PCT出願WO 2006/097784、WO 2006/097853、WO 2007/060495及びWO 2007/049156(Cellectis)；(Arnould, Chamesら，2006；Rosen, Morrisonら，2006；Smith, Grizotら，2006)、I-SceI(Doyon, Pattanayakら，2006)、PI-SceI(Gimble, Moureら，2003)及びI-MsoI(Ashworth, Havranekら，2006)の特異性を局所的に変更する半合理的アプローチを使用している。
加えて、局所的に変更した特異性を有する数百のI-CreI誘導体が、半合理的アプローチ及び高スループットスクリーニングを組み合わせることにより人工的に創り出された：
− I-CreIの残基Q44、R68及びR70、又はQ44、R68、D75及びI77が変異誘発され、DNA標的の±３〜５位(5NNN DNA標的)で変更した特異性を有するバリアントの一団がスクリーニングにより同定された(国際PCT出願WO 2006/097784及びWO 2006/097853(Cellectis)；(Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。
− I-CreIの残基K28、N30及びQ38、又はN30、Y33及びQ38、又はK28、Y33、Q38及びS40が変異誘発され、DNA標的の±８〜10位(10NNN DNA標的)で変更した特異性を有するバリアントの一団がスクリーニングにより同定された(Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)；国際PCT出願WO 2007/060495及びWO 2007/049156(Cellectis))。
２つの異なるバリアントを組み合わせて、各バリアントDNA標的配列の異なる２つの半分の融合から生じたキメラ標的を切断し得る機能的なへテロダイマー型エンドヌクレアーゼに組み立てた((Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)；国際PCT出願WO 2006/097854及びWO 2007/034262)。
更に、I-CreIの残基28〜40及び44〜77は、ホーミングエンドヌクレアーゼの標的ハーフ部位(half-site)の異なる部分に結合し得る２つの部分的に分離可能な機能的サブドメインを形成していることが示された(Smith, Grizotら，2006)；国際PCT出願WO 2007/049095及びWO 2007/057781(Cellectis))。
I-CreIの同じモノマー内の２つのサブドメインからの変異を組み合わせることにより、各サブドメインが結合する±３〜５位及び±８〜10位のヌクレオチドを含んでなるパリンドロームの組合せDNA標的配列を切断し得る新規キメラ分子(ホモダイマー)のデザインが可能になった((Smith, Grizotら，2006)；国際PCT出願WO 2007/049095及びWO 2007/057781(Cellectis))。
メガヌクレアーゼバリアントを製造する方法及び哺乳動物細胞又は酵母細胞における切断-誘導組換えに基づくアッセイ(変更した特異性を有するバリアントをスクリーニングするために使用される)は、国際PCT出願WO 2004/067736；(Epinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006)に記載されている。これらアッセイは、標準的な方法によりモニターすることができる機能的なLacZレポーター遺伝子を生じる。
前の２つの工程の組合せにより、４つの異なるサブドメインを含むより大きなコンビナトリアルアプローチが可能になる。この異なるサブドメインは別々に改変されて、選択された特異性を有する完全に再設計されたメガヌクレアーゼバリアント(へテロダイマー又は単鎖分子)が得られるように組み合わされる。第１の工程において、新規なメガヌクレアーゼの二者一組が、切断したい標的に由来するパリンドローム状標的を切断する新たな分子(「ハーフ-メガヌクレアーゼ」)に組み合わされる。その後、この「ハーフ-メガヌクレアーゼ」を組み合わせることで、興味対象の標的を切断するへテロダイマー型の種が生じ得る。４セットの変異の、モデル標的配列又は異なる遺伝子からの配列を切断するへテロダイマー型エンドヌクレアーゼへの組立てが、以下のCellectisの国際特許出願：XPC遺伝子(WO2007/093918)、RAG遺伝子(WO2008/010093)、HPRT遺伝子(WO2008/059382)、β-２ミクログロブリン遺伝子(WO2008/102274)、Rosa26遺伝子(WO2008/152523)、ヒトヘモグロビンβ遺伝子(WO2009/13622)及びヒトインターロイキン-２レセプターγ鎖遺伝子(WO2009019614)に記載されている。
これらバリアントは、真性の(genuine)染色体配列を切断するために用いることができ、遺伝子治療を含むいくつかの分野において、新しい展望のための道を切り開く。
このようなエンドヌクレアーゼの例としては、I-Sce I、I-Chu I、I-Cre I、I-Csm I、PI-Sce I、PI-Tli I、PI-Mtu I、I-Ceu I、I-Sce II、I-Sce III、HO、PI-Civ I、PI-Ctr I、PI-Aae I、PI-Bsu I、PI-Dha I、PI-Dra I、PI-Mav I、PI-Mch I、PI-Mfu I、PI-Mfl I、PI-Mga I、PI-Mgo I、PI-Min I、PI-Mka I、PI-Mle I、PI-Mma I、PI-Msh I、PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-Mxe I、PI-Npu I、PI-Pfu I、PI-Rma I、PI-Spb I、PI-Ssp I、PI-Fac I、PI-Mja I、PI-Pho I、PI-Tag I、PI-Thy I、PI-Tko I、PI-Tsp I、I-MsoIが挙げられる。
ホーミングエンドヌクレアーゼは、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、例えばI-SceI、I-CreI、I-CeuI、I-MsoI及びI-DmoIであり得る。
LAGLIDADGエンドヌクレアーゼは、２つのLAGLIDADGモチーフを含有しモノマーとして機能し、且つその分子量が唯一のLAGLIDADGモチーフを含有しホモダイマーとして機能するI-CreIのような他のファミリーメンバーの分子量の約２倍であるファミリーのメンバーであるI-Sce Iであり得る。
本出願で言及するエンドヌクレアーゼは、野生型(天然に生じる)及びバリアントのエンドヌクレアーゼの両方を包含する。本発明によるエンドヌクレアーゼは、「バリアント」エンドヌクレアーゼ、すなわち天然には存在せず、遺伝子工学的操作又はランダム変異誘発により得られるエンドヌクレアーゼ、すなわち遺伝子操作エンドヌクレアーゼであり得る。このバリアントエンドヌクレアーゼは、例えば、野生型の、天然に生じるエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列における少なくとも１つの残基の異なるアミノ酸での置換により得ることができる。置換は、例えば、部位-特異的変異誘発及び/又はランダム変異誘発により導入することができる。本発明の枠内で、このようなバリアントエンドヌクレアーゼは依然として機能的である。すなわち、それらは、標的配列を認識し(結合機能)、任意に特異的に切断して遺伝子ターゲッティングプロセスを開始する能力を保持する。
本発明によるバリアントエンドヌクレアーゼは、対応する野生型エンドヌクレアーゼの標的配列とは異なる標的配列を切断する。新規特異性を有するこのようなバリアントエンドヌクレアーゼを取得する方法は、当該分野において周知である。
エンドヌクレアーゼバリアントは、ホモダイマー(２つの同一モノマーを含んでなるメガヌクレアーゼ)であってもよいし、へテロダイマー(２つの非同一なモノマーを含んでなるメガヌクレアーゼ)であってもよい。本発明の範囲にはまた、ポリヌクレオチド配列中又はゲノム中の１つの興味対象の標的を切断することができるエンドヌクレアーゼバリアント(非限定的例として、ヘテロダイマー(WO2006097854)、偏性ヘテロダイマー(WO2008093249)及び単鎖メガヌクレアーゼ(WO03078619及びWO2009095793)を含む)自体も包含されると理解される。本発明はまた、異なる起源に由来する２つのモノマーから構成されるハイブリッドバリアント自体(WO03078619)も包含する。
新規特異性を有するエンドヌクレアーゼは、遺伝子を標的することにより興味対象の導入遺伝子をゲノム中に所定の位置で組み込む、本発明による方法において使用することができる。
−「親のメガヌクレアーゼ」は、野生型メガヌクレアーゼ又は該野生型メガヌクレアーゼの同一の性質を有するバリアント、或いは同じメガヌクレアーゼの野生型バージョンと比較して幾らか変更した特徴を有するメガヌクレアーゼを意味するものとする。この表現はまた、エンドヌクレアーゼ、稀切断性エンドヌクレアーゼ、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ、TALEN又はコンパクトTALEN及び誘導体に置き換えることができる。
−「送達ベクター」により、本発明で必要とされる因子/化学物質及び分子(タンパク質又は核酸)を細胞に接触させるか(すなわち「接触」)又は細胞内若しくは細胞区画内へ送達するために、本発明において使用することができる任意の送達ベクターが意図される。これには、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬剤送達ベクター、化学キャリア、ポリマーキャリア、リポプレックス(lipoplex)、ポリプレックス(polyplex)、デンドリマー、超微粒気泡(超音波造影剤)、ナノ粒子、エマルジョン又は他の適切な移入ベクターが含まれるが、これらに限定されない。これら送達ベクターは、分子、化学物質、高分子(遺伝子、タンパク質)、又は他のベクター、例えばプラスミド、Diatosにより開発されたペプチドの送達を可能にする。これらの場合において、送達ベクターは分子キャリアである。「送達ベクター」により、トランスフェクションを実行するための送達方法もまた意図される。
−用語「ベクター」とは、連結されている別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。本発明における「ベクター」としては、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、又は染色体、非染色体、半-合成若しくは合成の核酸からなり得る線状若しくは環状のDNA若しくはRNA分子が挙げられるが、これらに限定されない。好適なベクターは、自律複製(エピソームベクター)及び/又は連結された核酸の発現(発現ベクター)が可能なものである。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、市販されている。
ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス(例えばアデノ関連ウイルス)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えばオルソミクソウイルス(例えば、インフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば、狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば、麻疹及びセンダイ)、プラス鎖RNAウイルス、例えばピコルナウイルス及びアルファウイルス、及び二本鎖DNAウイルス(アデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス)、及びポックスウイルス(例えば、ワクシニア、鶏痘及びカナリア痘)を含む)が挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては：トリ白血病-肉腫群、哺乳動物Ｃ-型、Ｂ-型ウイルス、Ｄ型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプマウイルス(Coffin, J. M., Retroviridae：The viruses及びtheir replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fieldsら編, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)が挙げられる。
−「レンチウイルスベクター」は、比較的大きなパッケージング能力、低い免疫原性及び広範囲の異なる細胞タイプを高効率で安定的に形質導入する能力のため、遺伝子送達に非常に有望であるHIV-ベースのレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは、通常、産生細胞中への３つ(パッケージング、エンベロープ及び移入)又はそれより多いプラスミドの一過性トランスフェクション後に生じる。HIVと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質と細胞表面上のレセプターとの相互作用により標的細胞に進入する。進入に際して、ウイルスRNAは、ウイルス逆転写酵素複合体により媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は二本鎖線状ウイルスDNAであり、これが感染細胞のDNAへのウイルス組込みのための基質である。
−「組込みレンチウイルスベクター(又はLV)」は、非限定例として、標的細胞のゲノムに組み込まれ得るベクターを意味する。
−対して、「非組込みレンチウイルスベクター(又はNILV)」は、ウイルスインテグラーゼの作用により標的細胞のゲノムに組み込まれない効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。
好適なベクターの１つのタイプは、エピソーム、すなわち、染色体外複製が可能な核酸である。好適なベクターは、自律複製及び/又は連結された核酸の発現が可能なものである。作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことができるベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と呼ぶ。本発明によるベクターは、YAC(酵母人工染色体)、BAC(細菌人工)、バキュロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、又は染色体、非染色体、半-合成若しくは合成のDNAからなり得る線状若しくは環状のDNA若しくはRNA分子を含むが、これらに限定されない。一般には、組換えDNA技法に有用な発現ベクターは、しばしば、一般には(ベクター形態で染色体に結合していない)環状二本鎖DNAループをいう「プラスミド」の形態である。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、市販されている。ベクターは選択マーカーを含み得る。例えば：真核細胞培養については、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロフォレートレダクターゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ、及びヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；S. cerevisiaeについてはTRP1；E. coliにおいてはテトラサイクリン、リファンピシン又はアンピシリン耐性。好ましくは、ベクターは、興味対象のポリペプチドをコードする配列が該ポリペプチドの産生又は合成を可能にするに適切な転写及び翻訳制御エレメントの制御下に配置されている発現ベクターである。したがって、ポリヌクレオチドは発現カセットに含まれる。より具体的には、ベクターは、複製起点、コーディングポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーター、リボソーム結合部位、RNA-スプライシング部位(ゲノムDNAを使用する場合)、ポリアデニル化部位及び転写終止部位を含んでなる。これはまた、エンハンサー又はサイレンサーエレメントを含んでなり得る。プロモーターの選択は、ポリペプチドを発現させる細胞に依存する。適切なプロモーターとしては、組織特異的及び/又は誘導性プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの例は：重金属レベルの増大により誘導される真核生物性メタロチオニンプロモーター、イソプロピル-β-D-チオガラクト-ピラノシド(IPTG)に応答して誘導される原核生物性lacZプロモーター及び温度上昇により誘導される真核生物性熱ショックプロモーターである。組織特異的プロモーターの例は、骨格筋クレアチンキナーゼ、前立腺-特異的抗原(PSA)、α-アンチトリプシンプロテアーゼ、ヒトサーファクタント(SP)Ａ及びＢタンパク質、β-カゼイン及び酸性ホエータンパク質遺伝子である。
−誘導性プロモーターは、病原体又はストレスにより、より好ましくは低温、高温、UV光、又は高イオン濃度のようなストレスにより誘導され得る(Potenza Cら，2004, In vitro Cell Dev Biol 40:1-22で概説される)。誘導性プロモーターは化学物質により誘導され得る((Moore, Samalovaら，2006)；(Padidam 2003)；(Wang, Zhouら，2003)；(Zuo及びChua 2000)で概説される)。
送達ベクター及びベクターは、ソノポレーション(sonoporation)若しくはエレクトロポレーションのような任意の細胞透過技法又はこれら技法の派生法と組み合わされ得る。
−細胞により、任意の原核生物又は真核生物の生存細胞、インビトロ培養用にこれら生物から導いた細胞株、動物又は植物起源の初代細胞が意図される。
−「初代細胞」により、非常に少数のものしか分裂を経験していないので、連続分裂性(continuous tumorigenic)の又は人工的に不死化した細胞株と比較して、由来する組織の主要な機能的構成要素及び特徴をより代表する、生存組織(すなわち生検材料)から直接取り出し、インビトロ増殖用に樹立した細胞が意図される。よって、これら細胞は、言及するインビボ状態についてより価値のあるモデルである。
−本発明の枠内で、「真核細胞」とは、真菌、植物若しくは動物細胞又は下記に列挙する生物に由来するインビトロ培養用に樹立した細胞株をいう。より好ましくは、真菌は、アスペルギルス属(Aspergillus)、ペニシリウム属(Penicillium)、アクレモニウム属(Acremonium)、トリコデルマ属(Trichoderma)、クリソスポリウム属(Chrysoporium)、モルティエレラ属(Mortierella)、クルイベロマイセス属(Kluyveromyces)又はピキア属(Pichia)のものである；より好ましくは、真菌は、アスぺルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)、ペニシリウム・シトリヌム(Penicillium citrinum)、アクレモニウム・クリソゲナム(Acremonium Chrysogenum)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、クリソスポリウム・ルクノウェンス(Chrysosporium lucknowense)、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)又はピキア・シフェリイ(Pichia ciferrii)である。
より好ましくは、植物は、アラビドプシス属(Arabidospis)、タバコ属(Nicotiana)、ナス属(Solanum)、アキノノゲシ属(lactuca)、アブラナ属(Brassica)、イネ属(Oryza)、アスパラガス属(Asparagus)、エンドウ属(Pisum)、ウマゴヤシ属(Medicago)、トウモロコシ属(Zea)、オオムギ属(Hordeum)、ライムギ属(Secale)、コムギ属(Triticum)、トウガラシ属(Capsicum)、キュウリ属(Cucumis)、カボチャ属(Cucurbita)、スイカ属(Citrullis)、ミカン属(Citrus)、モロコシ属(Sorghum)のものである；より好ましくは、植物は、次の種：シロイヌナズナ(Arabidospis thaliana)、タバコ(Nicotiana tabaccum)、トマト(Solanum lycopersicum)、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、ナス(Solanum melongena)、トマト(Solanum esculentum)、レタス(Lactuca saliva)、セイヨウアブラナ(Brassica napus)、ヤセイカンラン(Brassica oleracea)、ブラッシカ・ラパ(Brassica rapa)、アフリカイネ(Oryza glaberrima)、イネ(Oryza sativa)、アスパラガス(Asparagus officinalis)、エンドウ(Pisum sativum)、ムラサキウマゴヤシ(Medicago sativa)、トウモロコシ(zea mays)、オオムギ(Hordeum vulgare)、ライムギ(Secale cereal)、パンコムギ(Triticum aestivum)、デュラムコムギ(Triticum durum)、カプシカム・サティバス(Capsicum sativus)、ペポカボチャ(Cucurbita pepo)、スイカ(Citrullus lanatus)、メロン(Cucumis melo)、ライム(Citrus aurantifolia)、ザボン(Citrus maxima)、シトロン(Citrus medica)、マンダリン(Citrus reticulata)のものである。
より好ましくは、動物細胞は、ヒト属(Homo)、クマネズミ属(Rattus)、ハツカネズミ属(Mus)、イノシシ属(Sus)、ウシ属(Bos)、ダニオ属(Danio)、イヌ属(Canis)、ネコ属(Felis)、ウマ属(Equus)、タイセイヨウサケ属(Salmo)、タイヘイヨウサケ属(Oncorhynchus)、ヤケイ属(Gallus)、シチメンチョウ属(Meleagris)、ショウジョウバエ属(Drosophila)、カエノラブディティス属(Caenorhabditis)のものである；より好ましくは、動物細胞は、次の種：ヒト(Homo sapiens)、ドブネズミ/ラット(Rattus norvegicus)、ハツカネズミ(Mus musculus)、イノシシ(Sus scrofa)、ウシ(Bos taurus)、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)、タイリクオオカミ(Canis lupus)、イエネコ(Felis catus)、ウマ(Equus caballus)、タイセイヨウサケ(Salmo salar)、ニジマス(Oncorhynchus mykiss)、セキショクヤケイ(Gallus gallus)、シチメンチョウ(Meleagris gallopavo)、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、カエノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)のものである。
本発明においては、細胞は、植物細胞、哺乳動物細胞、魚の細胞、昆虫細胞、又はインビトロ培養用のこれら生物に由来する細胞株若しくは生存組織から直接採取され、インビトロ培養用に樹立された初代細胞であり得る。非限定例として、細胞は、上記の植物から得られるプロトプラストであり得る。非限定例として、細胞株は、CHO-K1細胞；HEK293細胞；Caco2細胞；U2-OS細胞；NIH 3T3細胞；NSO細胞；SP2細胞；CHO-S細胞；DG44細胞；K-562細胞, U-937細胞；MRC5細胞；IMR90細胞；Jurkat細胞；HepG2細胞；HeLa細胞；HT-1080細胞；HCT-116細胞；Hu-h7細胞；Huvec細胞；Molt 4細胞からなる群より選択され得る。
これら全ての細胞株は、本発明の方法により、興味対象の遺伝子又はタンパク質を産生し、発現し、定量し、検出し、研究するための細胞株モデルを提供するように改変され得る；これらモデルはまた、研究及び製造及び(非限定例として、化学、バイオ燃料、治療薬及び農学のような)種々の分野において、興味対象の生物学的に活性な分子をスクリーニングするために使用し得る。遺伝子操作Ｔ細胞を用いる養子免疫治療は、悪性腫瘍及び感染性疾患の治療の見込みのあるアプローチである。最も最近のアプローチは、適切なＴ細胞レセプター(TCR)又はキメラ抗原レセプター(CAR)のランダム組込みによる遺伝子導入に依拠する。稀切断性エンドヌクレアーゼを用いる標的付けられたアプローチは、Ｔ細胞中に遺伝子を導入し、遺伝子操作Ｔ細胞を作製するための効率的で安全な代替法である。
−「相同」により、別の配列と、配列間での相同組換えを導くに充分な同一性を有する配列、より具体的には少なくとも95％同一性、好ましくは97％同一性、より好ましくは99％の同一性を有する配列が意図される。
−「同一性」とは、２つの核酸分子又はポリペプチド間の配列同一性をいう。同一性は、比較のために整列させ得る各配列中の位置を比較して決定することができる。比較される配列中の位置が同じ塩基により占められる場合、それら分子は、当該位置において同一である。核酸又はアミノ酸配列間の類似性又は同一性の程度は、核酸配列により共有される位置での同一の又は適合するヌクレオチドの数の関数である。種々のアラインメントアルゴリズム及び/又はプログラム(GCG配列解析パッケージ(University of Wisconsin, Madison, Wis.)の一部として利用可能であるFASTA又はBLASTを含む)を使用して、２つの配列間の同一性を算出してもよく、例えばデフォルト設定で使用することができる。
−「変異」により、ポリヌクレオチド(cDNA、遺伝子)又はポリペプチド配列中の１又はそれより多いヌクレオチド/アミノ酸の置換、欠失、挿入が意図される。変異は、遺伝子のコーディング配列又はその調節配列に影響することがある。これはまた、ゲノム配列の構造又はコードされるmRNAの構造/安定性に影響し得る。
−本発明の枠内で、表現「二本鎖破断-誘導変異誘発」(DSB-誘導変異誘発)とは、エンドヌクレアーゼの切断部位で挿入/欠失を導く、エンドヌクレアーゼ-誘導DSB後のNHEJ事象に続く変異誘発事象をいう。
−「遺伝子」は、特定のタンパク質又はタンパク質セグメントをコードする、染色体に沿って直鎖状様式で整列したDNAセグメントからなる、遺伝の基本単位を意味する。遺伝子は、代表的には、プロモーター、5'非翻訳領域、１又はそれより多いコーディング配列(エキソン)、任意にイントロン、3'非翻訳領域を含む。遺伝子は、ターミネーター、エンハンサー及び/又はサイレンサーを更に含んでなり得る。
−本明細書中で使用する場合、用語「導入遺伝子」とは、ポリペプチドをコードする配列をいう。好ましくは、導入遺伝子によりコードされるポリペプチドは、該導入遺伝子を挿入する細胞、組織又は個体中で発現していないか、又は発現しているが生物学的に活性でない。最も好ましくは、導入遺伝子は、個体の治療に有用である治療用ポリペプチドをコードする。
−用語「興味対象の遺伝子」又は「GOI」とは、既知又は推定の遺伝子産物をコードする任意のヌクレオチド配列をいう。
−本明細書中で使用する場合、用語「遺伝子座」は、染色体上での(例えば遺伝子の)DNA配列の特定の物理的位置である。用語「遺伝子座」とは、通常、染色体上でのエンドヌクレアーゼの標的配列の特定の物理的位置をいう。本発明に従うエンドヌクレアーゼにより認識・切断される標的配列を含んでなる遺伝子座は、「本発明による遺伝子座」と呼ぶ。また、表現「興味対象のゲノム遺伝子座」は、本発明による二本鎖破断の推定の標的であり得るゲノム中の核酸配列を言うために使用する。考えられる本発明の興味対象のゲノム遺伝子座は、細胞の遺伝物質本体中(すなわち、染色体中)に存在する核酸配列だけでなく、遺伝物質本体とは独立して存在し得る遺伝物質の一部、例えばプラスミド、エピソーム、ウイルス、トランスポゾン中又は非限定例としてミトコンドリア若しくは葉緑体のような細胞小器官中に存在する核酸配列をもいうと理解される。
−表現「遺伝情報の喪失」により、興味対象のゲノム遺伝子座内で、本発明のエンドヌクレアーゼ、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ、コンパクトTALEN若しくは増強コンパクトTALENの認識部位と境界を接する少なくとも１つの所与のDNAフラグメント(少なくとも１つのヌクレオチド)若しくは配列又は本発明のエンドヌクレアーゼ、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ、コンパクトTALEN若しくは増強コンパクトTALENの少なくとも２つのプロセシング部位の間の介在配列の消去又は付加であって、該エンドヌクレアーゼ-切断部位、該キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ-切断部位、コンパクトTALEN若しくは増強コンパクトTALEN認識DNA結合部位の近辺で元の配列の変化を導く消去又は付加が理解される。この遺伝情報の喪失は、非限定例として、コンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENの２つのエンドヌクレアーゼ-切断部位の間又は２つのプロセシング部位の間の介在配列の消去であり得る。別の非限定例として、この遺伝情報の喪失は、本発明によるコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENの結合領域にわたるDNAの一本鎖の切除であり得る。
−「無瘢痕再ライゲーション」により、二本鎖破断事象の生成後における、NHEJプロセスによる、DNA破断端部の遺伝情報の喪失なし(挿入/欠失事象なし)での完璧な再ライゲーション事象が意図される。
−「不正確なNHEJ」により、DSBにより生じた核酸端部の、ヌクレオチドの挿入又は欠失を伴う再ライゲーションが意図される。不正確なNHEJは結果であり、修復経路ではなく、種々のNHEJ経路(非限定例として、Ku依存性又はKu非依存性)に起因し得る。
−「融合タンパク質」により、元来は別々のタンパク質又はその部分をコードする２又はそれより多い遺伝子の連結から本質になる当該分野における周知プロセスの結果が意図される。「融合遺伝子」の翻訳は、元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を有する単一ポリペプチドを生じる。
−「キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ」は、稀切断性エンドヌクレアーゼを含んでなる任意の融合タンパク質を意味する。該稀切断性エンドヌクレアーゼは、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼのＮ-末端部分であり得る；反対に、稀切断性エンドヌクレアーゼは、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼのＣ-末端部分であってもよい。２つの触媒ドメインを含んでなる本発明による「キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ」は、「二機能性」又は「二機能性メガヌクレアーゼ」と説明することができる。２より多い触媒ドメインを含んでなる本発明による「キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ」は、「多機能性」又は「多機能性メガヌクレアーゼ」と説明することができる。非限定例として、本発明によるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、稀切断性エンドヌクレアーゼと１つの触媒ドメインとの融合タンパク質であり得る；本発明によるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼはまた、稀切断性エンドヌクレアーゼと２つの触媒ドメインとの融合タンパク質であり得る。前記のように、本発明によるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼの稀切断性エンドヌクレアーゼ部分は、２つの同一のモノマー、２つの非同一モノマー、又は単鎖メガヌクレアーゼを含んでなるメガヌクレアーゼであり得る。本発明によるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼの稀切断性エンドヌクレアーゼ部分はまた、不活性稀切断性エンドヌクレアーゼのDNA結合性ドメインであり得る。他の非限定例において、本発明によるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、TALE-ヌクレアーゼ(TALEN)、すなわち、転写アクチベータ様エフェクター(TALE)に由来するDNA結合性ドメインと１つ又は２つの触媒ドメインとの間の融合体に由来し得る。他の非限定例においては、本発明によるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼのサブクラスは、「コンパクトなTALE-ヌクレアーゼ」(cTALEN)、すなわち少なくとも１つの反復可変ジペプチド領域ドメインを含んでなる遺伝子操作コアTALE足場と少なくとも１つの触媒ドメインとの間の融合体であり得、該融合タンパク質はDNAプロセシング活性に二量体化を必要としないコンパクトTALEN活性実体を構成する。触媒ドメインは、表２に非限定例として列挙したようなエンドヌクレアーゼであり得る；触媒ドメインは、頻繁切断性エンドヌクレアーゼ(frequent-cutting endonuclease)、例えば、表２に列挙した非限定的な制限酵素の例のようなMmeI、R-HinPII、R.MspI、R.MvaI、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I、ss.BspD6I、R.PleI、MlyI及びAlwIからなる群より選択される制限酵素であり得る。
−「エンハンサードメイン」又は「エンハンサー」は、タンパク質足場(非限定例としてコンパクトTALEN)に機能的及び/又は構造的支持を提供するタンパク質ドメインを意味し、したがって出発材料のコンパクトTALENのDNAプロセシング効率と比較して、得られる融合タンパク質(すなわち、増強コンパクトTALEN)の全体のDNAプロセシング効率の増強を可能にする。特定のドメインは、出発材料の足場の効率の少なくとも５％増強、より好ましくは10％、またより好ましくは15％、またより好ましくは20％、またより好ましくは25％、またより好ましくは50％、またより好ましくは50％を超える増強を提供する場合、エンハンサードメインである。このようなエンハンサードメインの非限定例を表１及び２に示す。「補助エンハンサードメイン」又は「補助エンハンサー」又は「補助ドメイン」は、コンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENとトランスで作用して、該基本のコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENの活性に必須でない追加の機能を提供するタンパク質ドメインを意味する。このような補助エンハンサーを使用する場合、コンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENは、「トランスTALEN」、それぞれトランスコンパクトTALEN及びトランス増強コンパクトTALENに変換される。
−「触媒ドメイン」により、酵素の活性部位を含有するタンパク質ドメイン又はモジュールが意図される；活性部位により、基質の触媒反応が起きる酵素の部分が意図される。酵素は(その触媒ドメインもまた)、触媒する反応により分類され名付けられる。Enzyme Commission番号(EC番号)は、触媒する化学反応に基く酵素用の番号分類スキームである(http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)。本発明の範囲では、任意の触媒ドメインを遺伝子操作したコアTALE足場と融合させて、少なくとも該触媒ドメイン活性によって提供されるDNAプロセシング効率を有するコンパクトTALEN活性実体を作製することができる。触媒ドメインは、非限定例として、ヌクレアーゼ活性を(エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼ活性、クリベース又はニッカーゼ)、ポリメラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、メチラーゼ活性、トポイソメラーゼ活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性又はリガーゼ活性を提供することができる。このような触媒ドメインの非限定例を表１及び表２に示す。本発明の１つの好適な実施形態では、触媒ドメインは、エンハンサードメインとしてみなし得る。触媒的に活性である場合、エンハンサードメインは、コンパクトTALEN足場に、これと融合したとき増強コンパクトTALENを導く機能的及び/又は構造的支持を提供し得る。触媒的に不活性である場合、エンハンサードメインは、コンパクトTALEN足場に、これと融合したとき増強コンパクトTALENを導く構造的支持を提供し得る。本発明から、本発明による触媒ドメインを古典的TALENの１つの部分に融合させて、これら古典的TALENに、少なくとも該触媒ドメインの活性によって提供される新たな触媒特性を付与するか又はそのDNAプロセシング効率を改善することも考案し得る。
−「ヌクレアーゼ触媒ドメイン」により、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼ酵素の活性部位を含んでなるタンパク質ドメインが意図される。このようなヌクレアーゼ触媒ドメインは、例えば、「クリベースドメイン」又は「ニッカーゼドメイン」であり得る。「クリベースドメイン」により、触媒活性がDNA標的に二本鎖破断(DSB)を生じるタンパク質ドメインが意図される。「ニッカーゼドメイン」により、触媒活性がDNA標的配列に一本鎖破断を生じるタンパク質ドメインが意図される。このような触媒ドメインの非限定例を、参照としてGenBank又はNCBI又はUniProtKB/Swiss-Prot番号と共に表１及び２に示す。
−「TALE-ヌクレアーゼ」(TALEN)又は「古典的TALEN」により、転写アクチベータ様エフェクター(TALE)に由来するDNA結合性ドメインと１つのFokI触媒ドメインとからなり、DNA標的配列を切断することができる活性実体を形成するために二量体化する必要がある融合タンパク質が意図される。
−「コンパクトTALE-ヌクレアーゼ」(cTALEN)により、少なくとも１つの反復可変ジペプチドドメインを含んでなる遺伝子操作コアTALE足場と少なくとも１つの触媒ドメインとの間の本発明による融合タンパク質の一般的な呼称が意図され、該融合タンパク質は、コンパクトTALEN(又はcTALEN)活性実体を構成し、DNAプロセシング活性に二量体化を必要としない。コンパクトTALENは、DNA切断事象を標的するときの複数の独立タンパク質成分の必要性を軽減するように設計される。重要なことには、現在のTALENの機能に必須である「スペーサー」領域及び二重の標的部位が必要でなくなる。換言すれば、本発明によるコンパクトTALENは、それ自体で、１つのDNA結合ドメインにより唯１つの興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的し、該興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍のDNAをプロセシングすることができる活性実体単位である。加えて、触媒ドメインは特異的なDNA接触を必要としないので、コアTALE DNA結合ドメインを取り囲む領域に関して制限がない。本発明の範囲において、触媒ドメインにおけるいくらかの配列嗜好性が考えられ得る。cTALENが唯一の触媒ドメインを含んでなる場合、cTALENは、「基本のcTALEN」又は「cTALEN」として適格であり得る。cTALENが少なくとも１つの「エンハンサードメイン」を更に含んでなる場合、cTALENは増強cTALEN又は「eTALEN」として適格であり得る。少なくとも１つのクリベース触媒ドメイン及び１つのニッカーゼ触媒ドメイン又は少なくとも２つのクリベース触媒ドメインを含んでなるcTALEN又はeTALENは、特に、二重切断cTALEN又は「dcTALEN」として適格であり得る。補助ドメインとトランスで作用するcTALEN又はeTALENは、トランスコンパクトTALEN又はトランス増強コンパクトTALEN(共に「トランスTALEN」)として適格である。
本発明の上記説明は、当業者が本発明の対象を製造し使用することができるように、その様式及び方法を提供する。この実施可能性は、特に、(願書に最初に添付した明細書等の一部を構成する)添付の特許請求の範囲の主題について提供される。
上記で使用するように、句「からなる群より選択される」、「から選択される」などは、特定されたものの組合せを含む。
本明細書中で数値限定又は範囲に言及する場合には終点は含まれる。また、数値限定内の全ての値又は部分的範囲は、あたかも明示的に記載されているように明確に含まれる。
上記の説明は、当業者が本発明の対象を作製し、使用することができるように提示されており、特定の適用及びその要件に関して提供されている。好適な実施形態の種々の改変が、当業者に容易に明らかとなる。本明細書中で規定される包括的原理は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、他の実施形態及び応用に適用され得る。よって、本発明は、示された実施形態に限定されることを意図しておらず、本明細書中に開示された原理及び特徴と一致する最も広い範囲を意図される。
本発明を概説してきたので、(例示のためだけに提供され、そうでないと記載されない限り限定を意図していない)或る種の具体例を参照することにより更なる理解を得ることができる。
実施例
実施例１
野生型I-CreIメガヌクレアーゼ(配列番号106)を、I-TevI(配列番号107)の触媒ドメインを融合させる親足場として選択した。野生型I-TevIは、GIY-YIGファミリーのモノマー型クリベースとして機能して標的DNAに段違いの(staggered)二本鎖破断を生じる。生化学的及び構造学的データを指針として、可変長の構築物を、触媒ドメイン全体及びリンカーの欠失-不耐性領域を包むI-TevIのＮ-末端領域から設計した(配列番号109〜配列番号114)。１つを除き全ての場合において、フラグメントを、介在性の５残基ポリペプチドリンカー(-QGPSG-；配列番号103)を用いて、I-CreIのＮ-末端に融合させた。リンカーなしの融合構築物は、人工リンカー中のものと類似する残基(-LGPDGRKA-；配列番号104)を天然に含有していた。I-CreIはホモダイマーであるので、全ての融合構築物は３つの触媒中心を含有する(図４、ここで「触媒ドメイン」＝クリベース)：ダイマー界面の天然I-CreI活性部位及びモノマーあたり１つのI-TevI活性部位。
各「３機能性」メガヌクレアーゼの活性を、国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006に以前に記載した本発明者らの酵母アッセイを用いて評価した。全ての構築物は、C1221標的DNAを、野生型I-CreIのものに匹敵する活性で切断可能であった(表４)。
I-CreI触媒コアとは独立したI-TevI触媒ドメインの活性を検証するため、D20N点変異体を作製してI-CreI足場を不活化した[配列番号108、配列番号115〜配列番号120；Chevalier, Sussmanら，2004)]。本発明者らの酵母アッセイでの試験により、不活化I-CreI(D20N)変異体タンパク質単独の活性は認められなかった(表４)。しかし、切断活性は、I-TevI触媒ドメインを有する融合体について観察することができた(表４)。
表４：I-TevI/I-CreI融合体の酵母アッセイでの活性。２つの親タンパク質標的(I-CreIについてはC1221、I-TevIについてはTev)に対する野生型タンパク質及び融合タンパク質の相対的活性を示す。最大活性(++++)は、所与のタンパク質の各々で天然型DNA標的に対して見られた。I-CreI_N20は野生型I-CreI足場の不活性バリアントである。他の全ての場合で、DNA認識がI-CreI足場に由来するので、活性はC1221標的に対してのみ検出される。「N20」融合バリアントは、I-TevI触媒ドメインに起因する切断活性を示す。
相対的活性を下記のとおり分類する：−，検出可能な活性なし；＋，＜25％の活性；++，25％〜＜50％の活性；+++，50％〜＜75％の活性；++++，75％〜100％の活性。
実施例２
タンパク質-融合足場を、短縮型形態のI-CreI(配列番号106、I-CreI_X：配列番号121)及び該タンパク質のＮ-又はＣ-末端のいずれかに融合させた３つの異なるリンカーポリペプチド(NFS1 = 配列番号98；NFS2 = 配列番号99；CFS1 = 配列番号100)をベースにして設計した。DNA結合活性にもDNA切断活性にもほとんど又は全く影響しないでI-CreI親足場の表面を横切る「ベースライン」の融合リンカーを設計することを目的として、全ての場合で構造モデルを作製した。２つのＮ-末端融合足場については、I-CreIの残基２〜残基153にわたるポリペプチドを使用した(リンカーの配置を可能にするためのK82A変異を有する)。Ｃ-末端融合足場は野生型I-CreIの残基２〜残基155を含有する。両方の融合足場タイプについて、リンカーの「遊離」端(すなわち、ポリペプチドを連結することが可能である端)は、出発点としてI-CreI/DNA複合体構造(PDB id：1g9z)を用いて構築したモデルから決定されたように、DNAに対して近位であるように設計する。２つのI-CreI Ｎ-末端融合足場(I-CreI N-terminal fusion scaffold；I-CreI_NFS1 = 配列番号122及びI-CreI_NFS2 = 配列番号123)並びに１つのＣ-末端融合足場(I-CreI C-terminal fusion scaffold；I-CreI_CFS1 = 配列番号124)を本発明者らの酵母アッセイ(実施例１を参照)で試験して、野生型I-CreIのものと類似する活性を有することを見出した(表５)。
表５：ColE7/I-CreI融合体の酵母アッセイでの活性。C1221標的に対する野生型タンパク質及び融合タンパク質の相対的活性を示す。I-CreI_Xは結晶構造に基づく短縮型のI-CreIを表し、これを融合足場の土台として使用した(I-CreI_NFS1、I-CreI_NFS2及びI-CreI_CFS1)。「N20」構築物はそれぞれのI-CreI-ベース足場の不活性バリアントである。活性は、I-CreI足場が活性であるかDNA触媒作用がColE7ドメインにより提供される全ての場合で検出された。
相対的活性を下記のとおり分類する：−，検出可能な活性なし；＋，＜25％の活性；++，25％〜＜50％の活性；+++，50％〜＜75％の活性；++++，75％〜100％の活性。
コリシンE7は、一本鎖DNA及び二本鎖DNAをプロセシングできるHNHファミリーの非特異的ヌクレアーゼである(Hsia, Chakら，2004)。生化学的及び構造学的データを指針として、触媒ドメイン全体(配列番号140；(Hsia, Chakら，2004)を含むColE7の領域を選択した。このColE7ドメインを、I-CreI_NFS1(配列番号122)又はI-CreI_NFS2(配列番号123)のいずれかのＮ-末端に融合させ、それぞれhColE7Cre_D0101(配列番号128)又はhColE7Cre_D0102(配列番号129)を作製した。加えて、Ｃ-末端融合構築物hCreColE7_D0101(配列番号130)を、I-CreI_CFS1(配列番号124)を用いて作製した。I-CreIはホモダイマーであるので、全ての融合構築物は３つの触媒中心を含有する(図４、ここで「触媒ドメイン」＝クリベース)：ダイマー界面の天然I-CreI活性部位及びモノマーあたり１つのColE7活性部位。
各「３-機能性」メガヌクレアーゼの活性を、本発明者らの酵母アッセイ(実施例１を参照)を用いて評価した。全ての構築物は、C1221標的DNAを、野生型I-CreIのものに匹敵する活性で切断可能であった(表５)。
I-CreI触媒コアとは独立したColE7触媒ドメインの活性を検証するため、D20N点変異体を作製してI-CreI足場を不活化した(配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号131、配列番号132、配列番号133；(Chevalier, Sussmanら，2004))。本発明者らの酵母アッセイでの試験により、不活化I-CreI(D20N)変異体タンパク質単独の活性は認められなかった(表５)。しかし、切断活性は、ColE7触媒ドメインを有する融合体について観察することができた(表５)。
実施例３
(ａ)DNA結合特異性を変化させるために異なるセットのRVDドメインを挿入し得、(ｂ)DNA切断(又はニック生成)をもたらすために選択した触媒ドメインをＮ-末端又はＣ-末端に付着させ得る２つのコアTALE足場を作製する。コア足場(sT1：配列番号134及びsT2：配列番号135)はＮ-末端領域及びＣ-末端領域が異なり、sT2は、sT1と比較して、Ｎ-末端から152アミノ酸残基(Szurek, Rossierら，2002)を欠きＣ-末端から最後の220残基を欠く短縮型バリアントである。sT1において、Ｃ-末端領域は野生型TALEドメインに関して短縮形であり、DNAコーディング配列中に偶然に規定された制限部位(BamHI)で終端する。
この２つのコア足場を用いて、４つの「ベースライン」のTALE DNA結合性タンパク質(bT1-Avr = 配列番号136、bT2-Avr = 配列番号137、bT1-Pth = 配列番号138及びbT2-Pth = 配列番号139)を、天然に存在する非対称配列AvrBs3(19bp)及びPthXo1(25bp)を認識する反復ドメインの対応するセットの挿入により作製する(図３)。ベースライン足場のタンパク質配列の例を配列番号136〜配列番号139に列挙する。これら足場は、そのまま、唯１つの認識配列を有する標的に対するDNA結合能力についてインビトロで試験し得る。既存のTALENとの比較のために、FokIヌクレアーゼの触媒ドメイン(配列番号368及び非限定例として特に残基P381〜F583)を、ベースライン足場のＮ-末端又はＣ-末端のいずれかに融合させ得る。これらコントロールを用いる効果的切断には、２つのTALE結合配列を含有する標的部位DNAが必要である。
天然に存在する配列を用いる活性の検証に加えて、関連する配列を認識する５つの人工RVD構築物を作製した(図３)：RagT2-R、NptIIT5-L、NptIIT5-R、NptIIT6-L、NptIIT6-R。挿入RVDのタンパク質配列の例を配列番号253〜配列番号257に列挙する。人工RVD配列をsT1又はsT2足場内で上記のように使用して、所望の標的付けられたコンパクトTALENを作製する。
基本のコンパクトTALEN(cTALEN)は、ベースライン足場のＮ-末端又はＣ-末端のいずれかへの触媒ドメインの融合により作製する(図５、それぞれＡ又はＢ)。TALE DNA結合ドメインとの融合に適切な触媒ドメインの非限定的リストを表２に示す。使用し得るリンカーの非限定的リストを表３に示す。リンカーのデザインは、付着させる触媒ドメインの性質及び所与の用途に依存することに留意すべきである。また、特別に遺伝子操作されたリンカーを構築して、一方又は両方のドメインの活性をより良好に制御又は調節することもできると予想される。下記の実施例５、６及び７では、リンカーを規定し得る追加の方法及び代替の方法を議論する。全てのcTALENデザインを本発明者らの酵母アッセイ(実施例１を参照)評価する。全てのcTALENデザインは、既存の遺伝子操作メガヌクレアーゼに匹敵する検出可能な活性を提供する。
実施例3a：TALE::TevIコンパクトTALEN
I-TevI(配列番号20)(GIY-YIGエンドヌクレアーゼファミリーのメンバー)の触媒ドメインをTALE-由来足場(Ｎ末端ドメイン、RVDから構成される中心コア及びＣ末端ドメインから構成)に融合させて、新たなクラスのcTALEN(TALE::TevI)を作製した。触媒ドメイン(CD)融合体の方向(Ｎ-末端 対 Ｃ-末端)を区別するため、構築物の名称をCD::TALE-RVD(触媒ドメインをTALEドメインのＮ-末端に融合)又はTALE-RVD::CD(触媒ドメインをTALEドメインのＣ-末端に融合)と記述する(ここで、「-RVD」は、任意に、TALEドメインにより認識される配列を指称してもよく、「CD」は触媒ドメインタイプである)。本実施例で、本発明者らは、例えばAvrBs3配列を標的する(よってTALE-AvrBs3::TevIと名付けられた)新規なTALE::TevIを説明する。
酵母でのTALE::TevIの活性
(ａ)DNA結合特異性を変化させるために異なるセットのRVDドメインを挿入し得、(ｂ)DNA切断(又はニック生成)をもたらすために選択したI-TevI-由来触媒ドメインをＮ-末端又はＣ-末端に付着させ得るコアTALE足場sT2(配列番号135)を選択した。前記のsT2短縮型足場を、完全長コアTALEN足場テンプレート(pCLS7183、配列番号141)からプライマーCMP_G061(配列番号142)及びCMP_G065(配列番号143)を用いるPCRにより作製し、ベクターpCLS7865(配列番号144)中にクローニングして、pCLS7865-cTAL11_CFS1(pCLS9009、配列番号145)(ここで、CFS1はアミノ酸配列-GSSG-を指称する)を作製した(クローニングを容易にするためのコーディングDNAに内在する制限部位BamHI及びKpn2Iを有する)。I-TevI(配列番号20)触媒ドメインの３つのバリアントを、プライマー対CMP_G069(配列番号147)及びCMP_G070(配列番号148)を用いるテンプレートTevCreD01[配列番号109、プラスミドpCLS6614(配列番号146)中のタンパク質]に対するPCRにより、又はプライマー対CMP_G069(配列番号147)及びCMP_G071(配列番号149)を用いるテンプレートTevCreD02[配列番号110、プラスミドpCLS6615(配列番号203)中のタンパク質]に対するPCRにより、又はプライマー対CMP_G069(配列番号147)及びCMP_G115(配列番号259)を用いるテンプレートTevCreD05[配列番号113、プラスミドpCLS6618(配列番号258)中のタンパク質]に対するPCRにより増幅させ、BamHI及びEagI制限部位を用いる制限及びライゲーションによりpCLS9009骨格中にサブクローニングして、それぞれpCLS7865-cT11_TevD01(pCLS9010、配列番号150)、pCLS7865-cT11_TevD02(pCLS9011、配列番号151)及びpCLS7865-cT11_TevD05(pCLS15775、配列番号260)を得た。全ての融合体は、TALE-由来DNA結合ドメイン及びI-TevI-由来触媒ドメインを連結するジペプチド-GS-を含む。
AvrBs3部位(配列番号152)を標的するためのRVDをコードするDNA配列を、受容プラスミド用のタイプIIS制限酵素BsmBI並びに挿入RVD配列用のタイプIIS制限酵素BbvI及びSfaNIを用いてプラスミドpCLS9010(配列番号150、配列番号420のタンパク質をコードする)、pCLS9011(配列番号151、配列番号421のタンパク質をコードする)及びpCLS15775(配列番号260、配列番号422のタンパク質をコードする)中にサブクローニングして、TALE-AvrBs3::TevI構築物、それぞれcT11Avr_TevD01(pCLS9012、配列番号218、配列番号423のタンパク質をコードする)、cT11Avr_TevD02(pCLS9013、配列番号153、配列番号424のタンパク質をコードする)及びcT11Avr_TevD05(pCLS15776、配列番号261、配列番号425のタンパク質をコードする)を作製した。これらTALE-AvrBs3::TevI構築物を配列決定し、必要に応じて、挿入物を追加のベクターに移した(下記参照)。
最終のTALE-AvrBs3::TevI酵母発現プラスミドpCLS8523(配列番号154)、pCLS8524(配列番号155)及びpCLS12092(配列番号262)を、それぞれプラスミドpCLS9012、pCLS9013及びpCLS15776を用いる酵母インビボクローニングにより作製した。インビボ相同組換えによりインタクトなコーディング配列を作製するために、BssHIIでの消化により線状化した約40ngの各プラスミドとNcoI及びEagIでの消化により線状化した１ngのpCLS0542(配列番号156)プラスミドDNAとを使用して、高効率LiAc形質転換プロトコル(Arnouldら，2007)で酵母S. cerevisiae株FYC2-6Aを形質転換させた(MATα、trp1Δ63、leu2Δ1、his3Δ200)。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての酵母標的レポータープラスミドを、以前に記載されたように構築した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。
TALE-AvrBs3::TevI構築物を偽パリンドローム標的に対して以前に記載された酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)で試験して、活性を、その活性に２つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALEN(pCLS8590、配列番号244)と比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され５〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された２つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表６)。酵母細胞でのそれぞれの標的に対するTALE-AvrBs3::TevIの活性レベルを図９に示す。図９に要約したデータは、TALE-AvrBs3::TevIが酵母で幾つかの標的に対して活性であることを示す。
哺乳動物細胞におけるTALE::TevIの活性
pCLS9012(配列番号218)又はpCLS9013(配列番号153)に由来するTALE-AvrBs3::TevI構築物をコードするDNAを、受容プラスミド用のAscI及びXhoI制限酵素並びにTALE-AvrBs3::TevI挿入物用のBssHII及びXhoI制限酵素を用いてpCLS1853(配列番号193)哺乳動物発現プラスミド中にサブクローニングして、哺乳動物発現プラスミドpCLS8993及びpCLS8994(配列番号194及び195)を得た。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての哺乳動物標的レポータープラスミドを、標準のGatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いて、CHOレポーターベクター中に構築した(Arnould, Chamesら，2006, Grizot, Epinatら，2010)。TALE-AvrBs3::TevI構築物を偽パリンドローム標的に対して哺乳動物細胞(CHO K1)における染色体外アッセイで試験して、活性を、その活性に２つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALENと比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され５〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された２つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表６)。
このアッセイのために、CHO K1細胞を、96-ウェルプレートフォーマットにおいて、75ngの標的ベクター及び0.7〜25ngの漸増量の各バリアントDNAで、PolyFect試薬(１μL/ウェル)の存在下にトランスフェクトした。トランスフェクトDNAの全量を、空ベクターを用いて125ngとした(標的DNA、バリアントDNA、キャリアDNA)。トランスフェクションの72時間後、培養培地を除去し、150μlのβ-ガラクトシダーゼ液体アッセイ用溶解/顕色緩衝液を加えた。37℃でのインキュベーション後、光学密度を420nmにて測定した。全プロセスは、自動化Velocity11 BioCelプラットフォームで行う(Grizot, Epinatら，2009)。
Avr15標的(配列番号167)に対するTALE-AvrBs3::TevI構築物(12.5ngのトランスフェクトDNA)の哺乳動物細胞での活性レベルを図10に示す。TALE-AvrBs3::TevIは、標的配列を効率的に切断するように見える。
TALE::TevIのニッカーゼ活性
上記実施例に記載した結果は、２つのTALE::TevI融合体(各々１つのTALE-ベースのDNA結合ドメイン及び１つのI-TevI-ベースの触媒ドメインを含有する)が検出可能な活性を生じるように作用することを説明する。使用したアッセイは、一本鎖アニーリング(本質的にはDSBにより誘引されるプロセス)による縦列反復組換えを測定する(Sugawara及びHaber 1992；Paques及びDuchateau 2007)。TALE::TevI融合体は、細胞ベースアッセイにおいて単独でシグナルを誘引するには不十分であるニッカーゼ活性を有し得る。しかし、近傍の２部位での２つのTALE::TevIタンパク質の結合は、時に、(近位であり異なるDNA鎖上であるときにはDSBを作製することができる)２つの独立のニックを生じ得る。この場合、各TALE::TevIは、ニックを生じることができるcTALENである。
TALE::TevIニッカーゼ活性を測定するために異なる実験を設定する：
スーパーコイル状環状プラスミドニック生成及び/又は線状化アッセイ
TALE-AvrBs3::TevI構築物T11Avr_TevD01及びcT11Avr_TevD02をコードする配列を、NcoI/EagI制限部位を用いてT7-ベースの発現ベクター中にクローニングし、それぞれプラスミドpCLS9021(配列番号201)及びpCLS9022(配列番号202)を得る。このクローニング工程は、精製用の追加のヘキサ-Hisタグを有するTALE-AvrBs3::TevIタンパク質を生じる。次いで、プラスミドpCLS9021及びpCLS9022を用いて、２つの方法の一方により活性タンパク質を作製する：
１．プラスミドを標準的なインビトロ転写/翻訳系で使用し；翻訳物からの溶解物を更なる精製なしで直接使用する。
２．標準プロトコル(すなわち：対数増殖期まで増殖させ、IPTGで誘導し、採集し、His-タグ化タンパク質用のアフィニティー法による細胞溶解及び精製)で、プラスミドを使用して発現用E.coli BL21(DE3)細胞を形質転換する。
活性タンパク質を、AvrBs3認識部位配列を有しないか、１つ又は２つ有するDNA標的に対してアッセイする。１より多い部位が存在するとき、同一認識配列は、3'端部同士を近位に並置され５〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離される。
スーパーコイル状環状プラスミドニック生成及び/又は線状化アッセイを行う。上記のDNA標的を有するプラスミドを標準方法により作製し、カラム精製して、＞98％純度のスーパーコイル状プラスミドを得た。漸増量の(上記のように作製した)TALE-AvrBs3::TevIタンパク質を各プラスミドとDNA切断を促進する条件下で37℃にて１時間インキュベートする。反応生成物をアガロースゲル上で分離し、EtBr染色により可視化する。
線状DNAニック生成及び/又は切断アッセイ
線状DNAニック生成及び/又は切断アッセイもまた行う。上記の標的配列を含むPCR産物を標準方法により作製し、カラム精製して、＞98％純度の線状基質を得る。次いで、漸増量の(上記のように作製した)TALE-AvrBs3::TevIタンパク質を各PCR基質とDNA切断を促進する条件下で37℃にて１時間インキュベートする。反応生成物を変性アクリルアミドゲル上で分離し、一本鎖DNAを可視化する。
TALE::TevIの遺伝子操作
AvrBs3-由来TALEN(配列番号196)のＣ末端ドメインの異なる短縮化によるバリアントを出発材料の足場として選択する。これらバリアントのサブセットは、位置E886(C0)、P897(C11)、G914(C28)、L926(C40)、D950(C64)、R1000(C115)、D1059(C172)(短縮型Ｃ末端ドメインC11〜C172のタンパク質ドメインはそれぞれ配列番号204〜209で示される)及びP1117[天然AvrBs3(配列番号220)のＣ末端ドメインの活性化ドメインを欠くCter wt又はWT Cter(配列番号210)とも呼ぶ]の後での短縮形を含む。AvrBs3-由来Ｎ末端ドメイン、AvrBs3-由来の反復ドメインセット及び短縮型AvrBs3-由来Ｃ末端ドメインを含むバリアント足場をコードするプラスミド[pCLS7821、pCLS7803、pCLS7807、pCLS7809、pCLS7811、pCLS7813、pCLS7817(配列番号211〜217)。これらはpCLS7184(配列番号196)をベースにする。]により、制限部位BamHI及びEagIを用いる、Ｃ末端ドメインに融合した任意の触媒ドメインのクローニングが可能になる。
I-TevI(配列番号20)の触媒ドメインのバリアントは、I-TevIのＮ-末端領域から設計する。これらバリアントのサブセットは、(Liu, Dansereauら，2008)において名付けられたリンカーの欠失-不耐性領域、リンカーの欠失-耐性領域及びジンクフィンガーとしての触媒ドメインの短縮形を含む(配列番号197〜200)。
I-TevIのこれらバリアントに対応するDNAを、TALEのＣ末端ドメインとI-TevI触媒ドメインのバリアントとの間に、DNAレベルでBamHI制限部位(コーディング鎖の5'側)及びEagI制限部位(コーディング鎖の3'側)を、タンパク質レベルでリンカー(例えば、-SGGSGS-ストレッチ、配列番号219)を導入するようにPCRにより増幅する。最終のTALE::TevI構築物は、BamHI及びEagI並びに標準の分子生物学的手順を用いて足場バリアント中へのI-TevI触媒ドメインのバリアントの挿入により作製する。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての酵母標的レポータープラスミドを、以前に記載されたように構築した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。
TALE-AvrBs3::TevI構築物を偽パリンドローム標的に対して以前に記載された酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)で試験して、活性を、その活性に２つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALEN(pCLS8590、配列番号244)と比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され５〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された２つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表６)。
実施例3b：TevI::TALEコンパクトTALEN
実施例3aに記載したsT2(配列番号135)コアTALE足場を選択して、pCLS7865-cTAL11_NFS1(pCLS9008、配列番号234)を作製した(ここで、NFS1は、アミノ酸配列-GSSG-を指称する)(クローニングを容易にするためにコーディングDNAに内在する制限部位BamHI及びKpn2Iを有する)。I-TevI(配列番号20)触媒ドメインの４つのバリアントを、プライマー対CMP_G001(配列番号239)及びCMP_G067(配列番号263)又はCMP_G152(配列番号264)を用いるテンプレートTevCreD01[配列番号109、プラスミドpCLS6614(配列番号146)中のタンパク質]に対するPCRにより、又はプライマー対CMP_G001(配列番号239)及びCMP_G068(配列番号240)を用いるテンプレートTevCreD02[配列番号110、プラスミドpCLS6615(配列番号203)中のタンパク質]に対するPCRにより、又はプライマー対CMP_G001(配列番号239)及びCMP_G114(配列番号265)を用いるテンプレートTevCreD05[配列番号113、プラスミドpCLS6618(配列番号258)中のタンパク質]に対するPCRにより増幅させ、NcoI及びKpn2I制限部位を用いる制限及びライゲーションによりpCLS9008骨格中にサブクローニングして、それぞれpCLS7865-TevW01_cT11(pCLS15777、配列番号266、配列番号426のタンパク質をコードする)、pCLS7865-TevD01_cT11(pCLS15778、配列番号267、配列番号427のタンパク質をコードする)、pCLS7865-TevD02_cT11(pCLS12730、配列番号235、配列番号428のタンパク質をコードする)及びpCLS7865-TevD05_cT11(pCLS15779、配列番号268、配列番号429のタンパク質をコードする)を得た。TevW01_cT11-ベースの融合体はTALE-由来DNA結合ドメインとI-TevI-由来触媒ドメインとを連結するジペプチド-SG-を含む一方、他の全ての構築物は該ドメインを連結するより長いペンタペプチド-QGPSG-が組み込まれている。
酵母でのTevI::TALEの活性
AvrBs3部位(配列番号152)を標的するためのRVDをコードするDNA配列を、受容プラスミド用のタイプIIS制限酵素BsmBI並びに挿入RVD配列用のタイプIIS制限酵素BbvI及びSfaNIを用いてプラスミドpCLS15777(配列番号266)、pCLS15778(配列番号267)及びpCLS12730(配列番号235)中にサブクローニングして、TevI::TALE-AvrBs3構築物、それぞれTevW01_cT11Avr(pCLS15780、配列番号269、配列番号430のタンパク質をコードする)、TevD01_cT11Avr(pCLS15781、配列番号270、配列番号431のタンパク質をコードする)及びTevD02_cT11Avr(pCLS12731、配列番号236、配列番号432のタンパク質をコードする)を作製した。類似のクローニング技法を用いて、RagT2-R部位(配列番号271)を標的するためのRVDをプラスミドpCLS15779(配列番号268)中に導入して、構築物TevD05_cT11RagT2-R(pCLS15782、配列番号272)を作製した。全てのTevI::TALE構築物を配列決定し、必要に応じて、挿入物を追加のベクターに移した(下記参照)。
最終のTevI::TALE-ベースの酵母発現プラスミドpCLS11979(配列番号273)、pCLS8521(配列番号274)、pCLS8522(配列番号237)及びpCLS12100(配列番号275)を、それぞれプラスミドpCLS15780(配列番号269)、pCLS15781(配列番号270)、pCLS12731(配列番号236)及びpCLS15782(配列番号272)を用いる酵母インビボクローニングにより作製した。インビボ相同組換えによりインタクトなコーディング配列を作製するために、BssHIIでの消化により線状化した約40ngの各プラスミドとNcoI及びEagIでの消化により線状化した１ngのpCLS0542(配列番号156)プラスミドDNAとを使用して、高効率LiAc形質転換プロトコル(Arnouldら，2007)で酵母S. cerevisiae株FYC2-6Aを形質転換させた(MATα、trp1Δ63、leu2Δ1、his3Δ200)。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての酵母標的レポータープラスミドを、以前に記載されたように構築した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。
TevI::TALE-AvrBs3構築物及びTevI::TALE-RagT2-R構築物を、偽パリンドローム標的に対して以前に記載された酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)で試験して、活性を、その活性に２つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALEN(pCLS8590、配列番号244)と比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置させ５〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された２つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表６)。加えて、唯一のAvrBs3又はRagT2-R認識部位(配列番号238)を有する標的について構築物を試験した(表８)。酵母でのTevI::TALE-AvrBs3活性レベルは、適切な標的に対するTALE-AvrBs3::TevI(pCLS8524、配列番号155)のものに匹敵した。サンプルの単一部位標的についての本発明のcTALENによる有意な活性を表８に示す。
表８：二重部位DNA標的及び単一部位DNA標的に対するTevI::TALE-AvrBs3及びTevI::TALE-RagT2-Rの活性。相対的活性は下記のとおり分類する：n.d.，検出可能な活性なし；＋，＜25％の活性；++，25％〜＜50％の活性；+++，50％〜＜75％の活性；++++，75％〜100％の活性。
植物でのTevI::TALEの活性
NptIIT5-L及びNptIIT6-L部位標的するためのRVDをコードするDNA配列(配列番号276〜279)を、受容プラスミド用のタイプIIS制限酵素BsmBI並びに挿入RVD配列用のタイプIIS制限酵素BbvI及びSfaNIを用いてプラスミドpCLS12730(配列番号235)中にサブクローニングして、TevI::TALE構築物、それぞれTevD02_cT11NptIIT5-L(pCLS15783、配列番号280)及びTevD02_cT11NptIIT6-L(pCLS15784、配列番号281)を作製した。構築物を配列決定し、TevI::TALE挿入物を標準のクローニング技法によりプラスミドpCLS14529(配列番号282)に移入して、最終のTevI::TALE-NptIIT5-L及びTevI::TALE-NptIIT6-L発現プラスミド、それぞれpCLS14579(配列番号283)及びpCLS14581(配列番号284)を作製した。プラスミドpCLS14529により、植物細胞での高レベルの構成的発現を付与するプロモーターの下流への興味対象の遺伝子配列のクローニングが可能になる。
植物細胞での活性を試験するため、YFP-ベースの一本鎖アニーリング(SSA)アッセイを用いた。YFPレポーター遺伝子は、NptIIT5又はNptIIT6 TALEN標的部位により中断されるコーディング配列の短い重複を有する。標的部位での切断は反復間の組換えを刺激し、機能的なYFP遺伝子の再構築を生じる。切断を定量するため、レポーターを、タバコプロトプラスト中にFokI-ベースのTALEN又はコンパクトTALENをコードする構築物と共に(公知のような又は技術水準から導かれる)PEG-媒介形質転換により導入する。均一の形質転換効率が、各形質転換において同量のプラスミドを用いることにより得られた：すなわち、各15μgのYFPをコードするプラスミド及びTALEN又はcTALEN。24時間後、プロトプラストをフローサイトメトリーに供して、YFP陽性細胞の数を定量した。植物において本発明によるcTALENを用いたときのTevI::TALE活性レベルは、試験した標的に対するFokI-ベースのTALENコントロール構築物のものに匹敵した(表９)。
表９：適切なDNA標的に対するTevI::TALE-NptIIT5-L及びTevI::TALE-NptIIT6-Lの活性。コントロール構築物に関する相対的活性は下記のとおり分類する：n.a.，適用なし；＋，コントロールの100％活性(２％YFP陽性細胞)。
実施例3c：TALE::NucコンパクトTALEN
NucA(配列番号26)(Anabaena sp.由来の非特異的エンドヌクレアーゼ)をTALE-由来足場(Ｎ末端ドメイン、RVDから構成される中心コア及びＣ末端ドメインから構成される)に融合させて、新たなクラスのcTALEN(TALE::NucA)を作製した。触媒ドメイン(CD)融合体の方向(Ｎ-末端 対 Ｃ-末端)を区別するため、構築物の名称をCD::TALE-RVD(触媒ドメインをTALEドメインのＮ-末端に融合)又はTALE-RVD::CD(触媒ドメインをTALEドメインのＣ-末端に融合)と記述する(ここで、「-RVD」は、任意に、TALEドメインにより認識される配列を指称してもよく、「CD」は触媒ドメインタイプである)。本実施例で、本発明者らは、例えばAvrBs3配列を標的する(よってTALE-AvrBs3::NucAと名付けられた)新規なTALE::NucA構築物を説明する。特には、野生型NucAエンドヌクレアーゼは、NuiAタンパク質(配列番号229)との複合体形成により阻害され得る。コンパクトTALENに関しては、NuiAタンパク質は、TALE::NucA構築物のヌクレアーゼ活性を変調する補助ドメインとして機能し得る。
酵母でのTALE::NucAの活性
(ａ)DNA結合特異性を変化させるために異なるセットのRVDドメインを挿入し得、(ｂ)DNA切断(又はニック生成)をもたらすために選択したNucA-由来触媒ドメインをＮ-末端又はＣ-末端に付着させ得るコアTALE足場sT2(配列番号135)を選択した。前記のように、sT2短縮型足場を、完全長コアTALEN足場テンプレート(pCLS7183、配列番号141)からプライマーCMP_G061(配列番号142)及びCMP_G065(配列番号143)を用いるPCRにより作製し、ベクターpCLS7865(配列番号144)中にクローニングして、pCLS7865-cTAL11_CFS1(pCLS9009、配列番号145)(ここで、CFS1はアミノ酸配列-GSSG-を指称する)を作製した(クローニングを容易にするためのコーディングDNAに内在する制限部位BamHI及びKpn2Iを有する)。NucA(配列番号26)触媒ドメイン(アミノ酸残基25〜274に相当)を、BamHI及びEagI制限部位を用いる制限及びライゲーションによりpCLS9009骨格(配列番号145)中にサブクローニングして、pCLS7865-cT11_NucA(pCLS9937、配列番号221、配列番号433のタンパク質をコードする)を得た。この融合体は、TALE-由来DNA結合ドメインとNucA-由来触媒ドメインとを連結するジペプチド-GS-を含む。このクローニング工程はまた、アミノ酸レベルで、NucA触媒ドメインのＣ末端にAAD配列をもたらす。
AvrBs3部位を標的するためのRVD(配列番号152)をコードするDNA配列を、受容プラスミド用のタイプIIS制限酵素BsmBI並びに挿入RVD配列用のタイプIIS制限酵素BbvI及びSfaNIを用いてプラスミドpCLS9937(配列番号221)中にサブクローニングして、TALE-AvrBs3::NucA構築物cT11Avr_NucA(pCLS9938、配列番号222、配列番号434のタンパク質をコードする)を作製した。このTALE-AvrBs3::NucA構築物を配列決定し、必要に応じて、挿入物を追加のベクターに移した(下記参照)。
最終のTALE-AvrBs3::NucA酵母発現プラスミドpCLS9924(配列番号223)をプラスミドpCLS9938(配列番号222)を用いる酵母インビボクローニングにより作製した。インビボ相同組換えによりインタクトなコーディング配列を作製するために、BssHIIでの消化により線状化した約40ngのプラスミド(pCLS9938)とNcoI及びEagIでの消化により線状化した１ngのpCLS0542(配列番号156)プラスミドDNAとを使用して、高効率LiAc形質転換プロトコル(Arnouldら，2007)で酵母S. cerevisiae株FYC2-6Aを形質転換させた(MATα、trp1Δ63、leu2Δ1、his3Δ200)。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての酵母標的レポータープラスミドを、以前に記載されたように構築した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。
TALE-AvrBs3::NucA構築物を偽パリンドローム標的に対して以前に記載された酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)で試験して、活性を、その活性に２つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALEN(pCLS8590、配列番号244)と比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され５〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された２つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表７)。加えて、唯一のAvrBs3認識部位を有する標的について構築物を試験した(配列番号224；表７)。
TALE::NucAの遺伝子操作
AvrBs3-由来TALEN(配列番号196)のＣ末端ドメインの異なる短縮化によるバリアントを出発材料の足場として選択する。これらバリアントのサブセットは、位置E886(C0)、P897(C11)、G914(C28)、L926(C40)、D950(C64)、R1000(C115)、D1059(C172)(短縮型Ｃ末端ドメインC11〜C172のタンパク質ドメインはそれぞれ配列番号204〜209で示される)及びP1117[天然AvrBs3(配列番号220)のＣ末端ドメインの活性化ドメインを欠くCter wt又はWT Cter(配列番号210)とも呼ぶ]の後での短縮形を含む。AvrBs3-由来Ｎ末端ドメイン、AvrBs3-由来の反復ドメインセット及び短縮型AvrBs3-由来Ｃ末端ドメインを含むバリアント足場をコードするプラスミド[pCLS7821、pCLS7803、pCLS7807、pCLS7809、pCLS7811、pCLS7813、pCLS7817(配列番号211〜217)。これらはpCLS7184(配列番号196)をベースにする。]により、制限部位BamHI及びEagIを用いる、Ｃ末端ドメインに融合した任意の触媒ドメインのクローニングが可能になる。
NucAのアミノ酸残基25〜274に相当するDNAを、TALEのＣ末端ドメインとNucA触媒ドメインとの間に、DNAレベルでBamHI制限部位(コーディング鎖の5'側)及びEagI制限部位(コーディング鎖の3'側)を、タンパク質レベルでリンカー(例えば、-SGGSGS-ストレッチ、配列番号219)を導入するようにPCRにより増幅する。最終のTALE::NucA構築物は、BamHI及びEagI並びに標準の分子生物学的手順を用いて足場バリアント中へのNucA触媒ドメインの挿入により作製する。例えば、位置P897(C11)、G914(C28)及びD950(C64)の後で短縮化され、それぞれpCLS7803、pCLS7807、pCLS7811(配列番号212、213及び215)によりコードされる足場バリアントをNucA触媒ドメイン(配列番号26)に融合させて、pCLS9596、pCLS9597及びpCLS9599(配列番号225〜227)を導いた。クローニング工程はまた、アミノ酸レベルで、NucA触媒ドメインのＣ末端にAAD配列をもたらす。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての酵母標的レポータープラスミドを、以前に記載されたように構築した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。
TALE-AvrBs3::NucA構築物を偽パリンドローム標的に対して以前に記載された酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)で試験して、活性を、その活性に２つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALEN(pCLS8590、配列番号244)と比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され５〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された２つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表７)。加えて、唯一のAvrBs3認識部位を有する標的(配列番号224)についてTALE-AvrBs3::NucA構築物を試験した。図11に要約したデータは、本発明のcTALENによるTALE-AvrBs3::NucA構築物が少なくとも１つのAvrBs3認識部位を有する全ての標的について活性であることを示す。
実施例3d：TALE::ColE7コンパクトTALEN
ColE7(配列番号140)(E.coli由来の非特異的エンドヌクレアーゼ)の触媒ドメインをTALE-由来足場(Ｎ末端ドメイン、RVDから構成される中心コア及びＣ末端ドメインから構成)に融合させて、新たなクラスのcTALEN(TALE::ColE7)を作製した。触媒ドメイン(CD)融合体の方向(Ｎ-末端 対 Ｃ-末端)を区別するため、構築物の名称をCD::TALE-RVD(触媒ドメインをTALEドメインのＮ-末端に融合)又はTALE-RVD::CD(触媒ドメインをTALEドメインのＣ-末端に融合)と記述する(ここで、「-RVD」は、任意に、TALEドメインにより認識される配列を指称してもよく、「CD」は触媒ドメインタイプである)。本実施例で、本発明者らは、例えばAvrBs3配列を標的する(よってTALE-AvrBs3::ColE7と名付けられた)新規なTALE::ColE7構築物を説明する。特には、野生型ColE7エンドヌクレアーゼは、Im7免疫タンパク質(配列番号230)との複合体形成により阻害され得る。コンパクトTALENに関しては、Im7タンパク質は、TALE::ColE7構築物のヌクレアーゼ活性を変調する補助ドメインとして機能し得る。
酵母でのTALE::ColE7の活性
(ａ)DNA結合特異性を変化させるために異なるセットのRVDドメインを挿入し得、(ｂ)DNA切断(又はニック生成)をもたらすために選択したColE7-由来触媒ドメインをＮ-末端又はＣ-末端に付着させ得るコアTALE足場sT2(配列番号135)を選択した。前記のように、sT2短縮型足場を、完全長コアTALEN足場テンプレート(pCLS7183、配列番号141)からプライマーCMP_G061(配列番号142)及びCMP_G065(配列番号143)を用いるPCRにより作製し、ベクターpCLS7865(配列番号144)中にクローニングして、pCLS7865-cTAL11_CFS1(pCLS9009、配列番号145)(ここで、CFS1はアミノ酸配列-GSSG-を指称する)を作製した(クローニングを容易にするためのコーディングDNAに内在する制限部位BamHI及びKpn2Iを有する)。ColE7(配列番号140)触媒ドメインを、Kpn2I及びEagI制限部位を用いる制限及びライゲーションによりpCLS9009骨格中にサブクローニングして、pCLS7865-cT11_ColE7(pCLS9939、配列番号231、配列番号435のタンパク質をコードする)を得た。この融合体は、TALE-由来DNA結合ドメインとColE7-由来触媒ドメインとを連結するジペプチド-GSSG-を含む。
AvrBs3部位を標的するためのRVD(配列番号152)をコードするDNA配列を、受容プラスミド用のタイプIIS制限酵素BsmBI並びに挿入RVD配列用のタイプIIS制限酵素BbvI及びSfaNIを用いてプラスミドpCLS9939(配列番号231)中にサブクローニングして、TALE-AvrBs3::ColE7構築物cT11Avr_ColE7(pCLS9940、配列番号232、配列番号436のタンパク質をコードする)を作製した。TALE-AvrBs3::ColE7構築物を配列決定し、必要に応じて、挿入物を追加のベクターに移した(下記参照)。
最終のTALE-AvrBs3::ColE7酵母発現プラスミドpCLS8589(配列番号233)をプラスミドpCLS9940(配列番号232)を用いる酵母インビボクローニングにより作製した。インビボ相同組換えによりインタクトなコーディング配列を作製するために、BssHIIでの消化により線状化した約40ngのプラスミド(pCLS9940)とNcoI及びEagIでの消化により線状化した１ngのpCLS0542(配列番号156)プラスミドDNAとを使用して、高効率LiAc形質転換プロトコル(Arnouldら，2007)で酵母S. cerevisiae株FYC2-6Aを形質転換させた(MATα、trp1Δ63、leu2Δ1、his3Δ200)。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての酵母標的レポータープラスミドを、以前に記載されたように構築した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。
TALE-AvrBs3::ColE7構築物を偽パリンドローム標的に対して以前に記載された酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)で試験して、活性を、その活性に２つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALEN(pCLS8590、配列番号244)と比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され５〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された２つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表７)。加えて、唯一のAvrBs3認識部位を有する標的について構築物を試験した(配列番号224；表７)。酵母細胞におけるそれぞれの標的に対するTALE-AvrBs3::ColE7の活性レベルを図12に示す。
植物でのTALE::ColE7の活性
NptIIT5-L及びNptIIT6-L部位を標的するためのRVDをコードするDNA配列(配列番号276〜279)を、受容プラスミド用のタイプIIS制限酵素BsmBI並びに挿入RVD配列用のタイプIIS制限酵素BbvI及びSfaNIを用いてプラスミドpCLS15785(配列番号285；プラスミドpCLS9939(配列番号231)のＣ-末端改変ColE7 K497A変異体)中にサブクローニングして、TALE::ColE7_A497構築物、それぞれcT11NptIIT5-L_ColE7_A497(pCLS15786、配列番号286)及びcT11NptIIT6-L_ColE7_A497(pCLS15787、配列番号287)を作製した。この構築物を配列決定し、TALE::ColE7_A497挿入物を標準のクローニング技法によりプラスミドpCLS14529(配列番号282)に移入して、最終のTALE-NptIIT5-L::ColE7_A497及びTALE-NptIIT6-L::ColE7_A497発現プラスミド、それぞれpCLS14584(配列番号288、配列番号437のタンパク質をコードする)及びpCLS14587(配列番号289、配列番号438のタンパク質をコードする)を作製した。プラスミドpCLS14529により、植物細胞での高レベルの構成的発現を付与するプロモーターの下流への興味対象の遺伝子配列のクローニングが可能になる。
植物細胞での活性を試験するため、YFP-ベースの一本鎖アニーリング(SSA)アッセイを用いた。YFPレポーター遺伝子は、NptIIT5又はNptIIT6 TALEN標的部位により中断されるコーディング配列の短い重複を有する。標的部位での切断は反復間の組換えを刺激し、機能的なYFP遺伝子の再構築を生じる。切断を定量するため、レポーターを、タバコプロトプラスト中にFokI-ベースのTALEN又はコンパクトTALENをコードする構築物と共にPEG-媒介形質転換により導入する。均一の形質転換効率が、各形質転換において同量のプラスミドを用いることにより得られた：すなわち、各15μgのYFPをコードするプラスミド及びTALEN又はcTALEN。24時間後、プロトプラストをフローサイトメトリーに供して、YFP陽性細胞の数を定量した。植物において本発明によるcTALENを用いたときのTALE::ColE7_A497活性レベルは、試験した標的に対するFokI-ベースのTALENコントロール構築物のものに匹敵した(表10)。
表10：適切なDNA標的に対するTALE-NptIIT5-L::ColE7_A497及びTALE-NptIIT6-L::ColE7_A497の活性。コントロール構築物に関する相対的活性は下記のとおり分類する：n.a.，適用なし；＋，コントロールの100％活性(８％YFP陽性細胞)。
TALE::ColE7の遺伝子操作
AvrBs3-由来TALEN(配列番号196)のＣ末端ドメインの異なる短縮化によるバリアントを出発材料の足場として選択する。これらバリアントのサブセットは、位置E886(C0)、P897(C11)、G914(C28)、L926(C40)、D950(C64)、R1000(C115)、D1059(C172)(短縮型Ｃ末端ドメインC11〜C172のタンパク質ドメインはそれぞれ配列番号204〜209で示される)及びP1117[天然AvrBs3(配列番号220)のＣ末端ドメインの活性化ドメインを欠くCter wt又はWT Cter(配列番号210)とも呼ぶ]の後での短縮形を含む。AvrBs3-由来Ｎ末端ドメイン、AvrBs3-由来の反復ドメインセット及び短縮型AvrBs3-由来Ｃ末端ドメインを含むバリアント足場をコードするプラスミド[pCLS7821、pCLS7803、pCLS7807、pCLS7809、pCLS7811、pCLS7813、pCLS7817(配列番号211〜217)。これらはpCLS7184(配列番号196)をベースにする。]により、制限部位BamHI及びEagIを用いる、Ｃ末端ドメインに融合した任意の触媒ドメインのクローニングが可能になる。
ColE7の触媒ドメインに対応するDNAを、TALEのＣ末端ドメインとColE7触媒ドメインとの間に、DNAレベルでBamHI制限部位(コーディング鎖の5'側)及びEagI制限部位(コーディング鎖の3'側)を、タンパク質レベルでリンカー(例えば、-SGGSGS-ストレッチ、配列番号219)を導入するようにPCRにより増幅する。追加的に、以下の位置：K446、R447、D493、R496、K497、H545、N560及びH573[位置は、ColE7タンパク質(配列番号11)全体のアミノ酸配列を参照する]での変化を(個々に又は組合せで)有する、触媒活性を変調するColE7エンドヌクレアーゼドメインのバリアントを作製し得る。最終のTALE::ColE7構築物は、BamHI及びEagI並びに標準の分子生物学的手順を用いて足場バリアント中へのColE7触媒ドメインの挿入により作製する。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての酵母標的レポータープラスミドを、以前に記載されたように構築した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。
TALE-AvrBs3::ColE7構築物を偽パリンドローム標的に対して以前に記載された酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)で試験して、活性を、その活性に２つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALEN(pCLS8590、配列番号244)と比較する。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され５〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された２つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表７)。加えて、唯一のAvrBs3認識部位を有する標的について構築物を試験した(配列番号224、表７)。
実施例3e：TALE::CreIコンパクトTALEN
野生型I-CreIメガヌクレアーゼ(配列番号106)を、TALE-由来足場(Ｎ末端ドメイン、RVDから構成される中心コア及びＣ末端ドメインから構成)に融合させたときに新たなクラスのcTALEN(TALE::CreI)を生じる配列-特異的触媒ドメインを導くタンパク質テンプレートとして選択した。触媒ドメイン(CD)融合体の方向(Ｎ-末端 対 Ｃ-末端)を区別するため、構築物の名称をCD::TALE-RVD(触媒ドメインをTALEドメインのＮ-末端に融合)又はTALE-RVD::CD(触媒ドメインをTALEドメインのＣ-末端に融合)と記述する(ここで、「-RVD」は、任意に、TALEドメインにより認識される配列を指称してもよく、「CD」は触媒ドメインタイプである)。本実施例で、本発明者らは、例えば、TALE DNA結合ドメイン及び再遺伝子操作I-CreIドメインの両方を介してＴ細胞レセプターＢ遺伝子(TCRB遺伝子、配列番号290、図13)の配列を標的する新規なTALE::CreI-ベースの構築物を説明する。特には、TALE::CreIコンパクトTALENの特異性は、TALE DNA結合ドメイン及びI-CreI-由来触媒ドメインの両方に由来する。コンパクトTALENに関しては、このようなタンパク質は、適度な大きさのモノマー型タンパク質内で、治療適用に必須の高度特異性を提供し得る。
酵母でのTALE::CreIの活性
(ａ)DNA結合特異性を変化させるために異なるセットのRVDドメインを挿入し得、(ｂ)DNA切断(又はニック生成)をもたらすために選択したI-CreI-由来触媒ドメインをＮ-末端又はＣ-末端に付着させ得るコアTALE足場sT2(配列番号135)を選択した。前記のように、sT2短縮型足場を、完全長コアTALEN足場テンプレート(pCLS7183、配列番号141)からプライマーCMP_G061(配列番号142)及びCMP_G065(配列番号143)を用いるPCRにより作製し、ベクターpCLS7865(配列番号144)中にクローニングして、pCLS7865-cTAL11_CFS1(pCLS9009、配列番号145)(ここで、CFS1はアミノ酸配列-GSSG-を指称する)を作製した(クローニングを容易にするためのコーディングDNAに内在する制限部位BamHI及びKpn2Iを有する)。(Ｔ細胞レセプターＢ遺伝子(TCRB遺伝子、配列番号290、図13)中の配列を標的するように設計された)再遺伝子操作I-CreI触媒ドメインを２工程でサブクローニングした。最初に、I-CreI_NFS1(配列番号122)足場(ここで、NFS1(配列番号98)は、20アミノ酸-GSDITKSKISEKMKGQGPSG-のリンカーを含んでなる(クローニングを容易にするためのコーディングDNAに内在する制限部位BamHI及びKpn2Iを有する))を、(BamHI及びEagI制限部位を用いて)pCLS7865-cTAL11_CFS1足場に融合させてコーディング配列にインフレームでNFS1リンカーを挿入した。I-CreIメガヌクレアーゼを、その後、Kpn2I及びXhoI制限部位を用いて、遺伝子操作TCRB02-Aメガヌクレアーゼ(pCLS6857、配列番号291)構築物に置換し、pCLS7865-cT11_scTB2aD01(pCLS15788、配列番号292、配列番号439のタンパク質をコードする)を得た。TCRB02-Aメガヌクレアーゼの２点変異体バリアントTCRB02-A_148C(pCLS12083、配列番号293、配列番号442のタンパク質をコードする)及びTCRB02-A_333C(pCLS12195、配列番号294、配列番号443のタンパク質をコードする)もまた、TALE結合コアに融合した触媒ドメインとしてサブクローニングして、構築物pCLS7865-cT11_scTB2aD01_148C(pCLS15789、配列番号295、配列番号440のタンパク質をコードする)及びpCLS7865-cT11_scTB2aD01_333C(pCLS15790、配列番号296、配列番号441のタンパク質をコードする)を得た。
メガヌクレアーゼ部位から異なる距離でTCRB遺伝子を標的するRVDをコードする３つのDNA配列を設計し、メガヌクレアーゼTCRB部位の上流７bp、12bp及び16bpに位置する配列を標的するRVD、それぞれTCRB02A1(配列番号297)、TCRB02A2(配列番号298)及びTCRB02A3(配列番号299)を導いた(図13)。各RVDのDNA配列を独立して、受容プラスミド用のタイプIIS制限酵素BsmBI並びに挿入RVD配列用のタイプIIS制限酵素BbvI及びSfaNIを用いてプラスミドpCLS15788(配列番号292)中にサブクローニングして、TALE::scTB2aD01構築物cT11TB2A1_scTB2aD01(pCLS15791、配列番号300)、cT11TB2A2_scTB2aD01(pCLS15792、配列番号301)及びcT11TB2A3_scTB2aD01(pCLS15793、配列番号302)を作製した。追加的に、TCRB02A2(配列番号298) RVDをpCLS15789(配列番号295)中に同様にクローニングして、cT11TB2A2_scTB2aD01_148C(pCLS15794、配列番号303)を作製した。全ての構築物を配列決定し、必要に応じて、種々の挿入物を追加のベクターに移した(下記参照)。
最終のTALE::scTB2aD01酵母発現プラスミドpCLS13449(配列番号304、配列番号444のタンパク質をコードする)、pCLS13450(配列番号305、配列番号445のタンパク質をコードする)、pCLS13451(配列番号306、配列番号446のタンパク質をコードする)及びpCLS15148(配列番号307、配列番号455のタンパク質をコードする)を、それぞれプラスミドpCLS15791(配列番号300)、pCLS15792(配列番号301)、pCLS15793(配列番号302)及びpCLS15794(配列番号303)を用いる酵母インビボクローニングにより作製した。インビボ相同組換えによりインタクトなコーディング配列を作製するために、BssHIIでの消化により線状化した約40ngの各プラスミドとNcoI及びEagIでの消化により線状化した１ngのpCLS0542(配列番号156)プラスミドDNAとを使用して、高効率LiAc形質転換プロトコル(Arnouldら，2007)で酵母S. cerevisiae株FYC2-6Aを形質転換させた(MATα、trp1Δ63、leu2Δ1、his3Δ200)。
TALEN又はメガヌクレアーゼDNA標的配列を含有する全ての酵母標的レポータープラスミドを、以前に記載されたように構築した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。
TALE::scTB2aD01-ベースの構築物を図14に示されるハイブリッド標的TCRB02Tsp7(配列番号AC4)、TCRB02Tsp12(配列番号AC5)及びTCRB02Tsp16(配列番号AC6)に対して以前に記載され酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)で試験した。遺伝子操作TCRB02-Aメガヌクレアーゼ(pCLS6857、配列番号291)(これは、活性にTALE DNA結合部位を必要としない)と活性を比較するためにTCRB02.1単独標的を含ませた。示したTALE::scTB2aD01-ベース構築物について、酵母細胞でのそれぞれの標的に対する活性レベルを図14に示す。特に、試験したインビボ条件下で、TALE-TB2A2::scTB2aD01_148C(pCLS15794、配列番号303)構築物は、もはや、TALE DNA結合成分により認識されるDNA配列を欠く標的を切断しない。
哺乳動物細胞でのTALE::CreIの活性
pCLS15792(配列番号301)及びpCLS15793(配列番号302)からのTALE-TB2A2::scTB2aD01構築物及びTALE-TB2A3::scTB2aD01構築物をコードするDNAを、受容プラスミド用のAscI及びXhoI制限酵素並びにTALE::scTB2aD01-ベース挿入物用のBssHII及びXhoI制限酵素を用いてpCLS1853(配列番号193)哺乳動物発現プラスミド中にサブクローニングし、哺乳動物発現プラスミド、それぞれpCLS14894及びpCLS14895(配列番号308及び309)を得た。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての哺乳動物標的レポータープラスミドを、標準のGatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いてCHOレポーターベクター中に構築した(Arnould, Chamesら，2006, Grizot, Epinatら，2010)。
タンパク質発現レベルをモニターするために、TALE::scTB2aD01-ベースの構築物を、哺乳動物細胞(HEK293)中に、遺伝子操作TCRB02-Aメガヌクレアーゼ(pCLS6857、配列番号291)のそばにトランスフェクトした。簡潔には、細胞を、300ngの各タンパク質をコードするそれぞれのプラスミドで、リポフェクタミンの存在下にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、各サンプルについて20μgの総タンパク質抽出物を、ポリクローナル抗-I-CreI抗体を用いるウェスタンブロットにより分析した。代表的なウェスタンブロットを図15に示す。
TALE::scTB2aD01-ベースの構築物の相対的毒性を、細胞生存アッセイを用いて評価した。CHOK1細胞を、2.5*103細胞/ウェルの密度でプレートに播種した。翌日、TALE::scTB2aD01-ベースの構築物(pCLS14894及びpCLS14895；配列番号308及び309)又は遺伝子操作TCRB02-Aメガヌクレアーゼ(pCLS6857、配列番号291)をコードする種々の量のプラスミド及び一定量のGFPをコードするプラスミド(10ng)を用いて、PolyFect試薬を使用して総量200ngで細胞をトランスフェクトした。GFPレベルを、トランスフェクション後１日目及び６日目にフローサイトメトリー(Guava Easycyte, Guava technologies)によりモニターした。細胞生存はパーセンテージとして表し、１日目に決定したトランスフェクション効率に関して補正した比(６日目にGFPを発現するTALEN及びメガヌクレアーゼ-トランスフェクト細胞/６日目にGFPを発現するコントロール-トランスフェクト細胞)として算出した。代表的な細胞生存アッセイデータを図16に示す。
インビボ切断活性を、TREX2エキソヌクレアーゼの存在下でのNHEJ事象の検出によりモニターした。TALE::scTB2aD01-ベースの構築物(pCLS14894及びpCLS14895；配列番号308及び309)又は遺伝子操作TCRB02-Aメガヌクレアーゼ(pCLS6857、配列番号291)をコードするプラスミド(３μg)及び２μgのscTrex2をコードするプラスミド(pCLS8982、配列番号310)を用いて、リポフェクタミンの存在下にHEK293細胞をトランスフェクトした。ゲノムDNAを、DNeasy Blood and Tissue kit(Qiagen)でトランスフェクションの２日後及び７日後に抽出し、TCRB02部位を含む領域(図13)を、トランスフェクション後の２日目にオリゴTRBC2F3(配列番号311)及びTRBC2R3B(配列番号312)を用いるPCRで、トランスフェクション後の７日目にオリゴTRBC2F4(配列番号315)及びTRBC2R4B(配列番号314)を用いるPCRで増幅させた。それぞれのPCR産物(100ng)を熱変性させ、ゆっくりと冷却し、次いでT7エンドヌクレアーゼ１(NEB)で15分間37℃にて処理することにより再アニールさせた。消化したPCR産物を10％アクリルアミドゲル上で分離し、SYBRgreen(Invitrogen)染色で可視化する。T7エンドヌクレアーゼによるミスマッチDNA配列の切断は、標的付けられた遺伝子座でのcTALEN又はメガヌクレアーゼの活性に起因するNHEJ事象を示す。図17は、遺伝子操作TCRB02-Aメガヌクレアーゼ(pCLS6857、配列番号291)と比較した、TALE::scTB2aD01-ベースの構築物(pCLS14894及びpCLS14895；配列番号308及び309)の検出可能なNHEJ活性を示す。２日目には、NHEJの結果は全ての構築物について匹敵する一方、７日目のNHEJ活性は、TALE::scTB2aD01-ベースの構築物についてのみ検出可能である。このことは、これらコンパクトTALENが細胞毒性を誘導しないことを示唆する。
TALE::CreIの遺伝子操作
TALE::CreIコンパクトTALENの重要な新規特性は、該最終分子の「ハイブリッド」特異性を独立して操作可能であることにある。このように、本来的な活性/特異性の比を、TALE::CreI-由来構築物内で変調させることができる。このことにより、予測し得なかった、高いDNA切断活性を保持する特異的なターゲティングが可能になる。最も単純な形態において、TALE DNA結合ドメインの再ターゲティングの成功は、基本のDNA塩基との擬似１対１対応性を有するRVD暗号(図３)により達成される。しかし、I-CreI成分の遺伝子操作は、適切なDNA結合及び切断活性に必要なタンパク質-DNA接触の潜在的対応性が存在するので、より難題である。新規なDNA配列を標的するようにI-CreIメガヌクレアーゼを成功裡に遺伝子再操作する方法は記載されている(WO2006097854、WO2008093249、WO03078619、WO2009095793、WO 2007/049095、WO 2007/057781、WO 2006/097784、WO 2006/097853、WO 2007/060495、WO 2007/049156及びWO 2004/067736)。これら方法の幾つかはクラスター化アプローチに依拠するので、当該アプローチを用いれば、I-CreI成分の「絶対的」特異性は段階的に減少すると考えられる。例えば、I-CreI DNA相互作用面を不連続な10NNN、7NN、5NNN及び2NN領域(モノマーサブユニットハーフあたり)に分断することで、外側の10NNN-7NN領域中での「緩い」又は広い特異性と引き換えに中央の5NNN-2NN領域中での高特異性が維持される新規な遺伝子操作が可能になる。本質的には、コンパクトTALENに関しては、このようなアプローチは、I-CreI-由来足場を再遺伝子操作することの複雑性を減じ得る。なぜなら、触媒ドメインについては切断における「選択性」のみが必要とされ、特異性はタンパク質融合体のTALE DNA結合部分により提供されるからである。まとめると、潜在的に高い特異性及び高いDNA切断活性と組み合わされた遺伝子操作の容易性は、TALE::CreI-由来コンパクトTALENを治療応用の理想的なツールとする。最後に、I-CreI成分は、原理上、天然に存在するか又は再遺伝子操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ-由来の触媒ドメインの宿主と置換し得ることに留意すべきである。
実施例3f：TALE::SnaseSTAUUの活性
酵母でのTALE::SnaseSTAUUの活性
AvrBs3-由来TALEN(配列番号196)のＣ末端ドメインの異なる短縮化によるバリアントを出発材料の足場として選択する。これらバリアントのサブセットは、位置G914(C28)及びL926(C40)(短縮型Ｃ末端ドメインC28及びC40のタンパク質ドメインをそれぞれ配列番号205及び206に示す)の後での短縮形を含む。AvrBs3-由来Ｎ末端ドメイン、AvrBs3-由来の反復ドメインセット及び短縮型AvrBs3-由来Ｃ末端ドメインを含むバリアント足場をコードするプラスミド[pCLS7807及びpCLS7809(配列番号213及び214)。これらはpCLS7184(配列番号196)をベースにする。]により、制限部位BamHI及びEagIを用いる、Ｃ末端ドメインに融合した任意の触媒ドメインのクローニングが可能になる。
SnaseSTAAU(配列番号30)のアミノ酸残基83〜231に対応するDNAを、TALEのＣ末端ドメインとSnaseSTAAU触媒ドメインとの間に、DNAレベルでBamHI制限部位(コーディング鎖の5'側)及びEagI制限部位(コーディング鎖の3'側)を、タンパク質レベルでリンカー(例えば、-SGGSGS-ストレッチ、配列番号219)を導入するようにPCRにより増幅する。最終のTALE::SnaseSTAAU構築物は、BamHI及びEagI並びに標準の分子生物学的手順を用いて足場バリアント中へのSnaseSTAAU触媒ドメインの挿入により作製する。位置G914(C28)及びL926(C40)の後で短縮化され、それぞれpCLS7807及びpCLS7809(配列番号213及び214)によりコードされる足場バリアントをSnaseSTAAU触媒ドメイン(配列番号30)に融合させて、pCLS9082及びpCLS9081(配列番号370及び371)を導いた。クローニング工程はまた、アミノ酸レベルで、SnaseSTAAU触媒ドメインのＣ末端にAAD配列をもたらす。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての酵母標的レポータープラスミドを、以前に記載されたように構築した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。
TALE-AvrBs3::SnaseSTAAU構築物を偽パリンドローム標的に対して以前に記載された酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)で試験して、活性を、その活性に２つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALENと比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され５〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された２つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表７)。加えて、唯一のAvrBs3認識部位を有する標的(配列番号224)についてTALE-AvrBs3::SnaseSTAAU構築物を試験した。図19に要約したデータは、本発明のキメラタンパク質によるTALE-AvrBs3::SnaseSTAAU構築物が２つのAvrBs3認識部位を有する標的に対しても、唯一のAvrBs3認識部位を有する標的についても活性であることを示す。
実施例４
基本cTALENは、単一の触媒ドメインに融合した単一のDNA結合ドメインから構成され、単一の二本鎖DNA切断又は一本鎖ニック生成事象によりHRを刺激するように設計される。或る種の適用(例えば、遺伝子不活化)には、NHEJのレベルを亢進させることが好ましい。この例は、TALE DNA結合ドメインに隣接する２つの別個の部位で二本鎖DNAの切断をもたらし得る二重切断cTALEN(dcTALEN)の作製を説明する(図5C)。当該２つの部位でのDNAの同時切断は、介在配列を除去し、したがってNHEJによる「瘢痕なしの」再ライゲーションを止めると予測される(図１)。
実施例３に記載したベースラインの足場(配列番号136〜配列番号139)を、融合体デザインの出発点として使用する。TALE DNA結合ドメインとの融合に適する触媒ドメインの非限定的リストを表２に示す。使用可能なリンカーの非限定的リストを表３に示す。リンカー又は増強ドメインの選択に関する追加の詳細については、実施例３、５、６及び７を参照。dcTALENデザインについては、少なくとも１つのクリベースドメインをTALE DNA結合ドメインに融合させる(Ｎ-末端又はＣ-末端)。追加の触媒ドメインは、ニッカーゼ又はクリベース(エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼ)ドメインであり得、適用の性質に依存する。例えば、一方の側のクリベースドメインと他方の側のニッカーゼドメインとのカップリングは、TALE DNA結合領域を跨ぐDNAの一本鎖の切除を生じ得る。延長された一本鎖オーバーハングの標的付けられた生成は、DNA修復機構を標的する応用において適用され得る。標的付けられた遺伝子不活化には、dcTALENにおける２つのクリベースドメインの使用が好ましい。
全てのdcTALENデザインは、本発明者らの酵母アッセイを用いて評価され(実施例１を参照)、既存の遺伝子操作メガヌクレアーゼに匹敵する検出可能な活性を提供する。更に、NHEJにおける増強の可能性は、実施例３に記載したような哺乳動物細胞ベースアッセイを用いて、モニターする。
実施例4a：TevI::TALE::FokI及びTevI::TALE::TevI二重切断TALENの活性
二重切断TALEN(CD::TALE::CD)(Ｎ-末端I-TevI-由来触媒ドメイン及びFokI(配列番号:368)又はI-TevI(配列番号20)に由来するＣ-末端触媒ドメインを有する)を、ベースラインのbT2-Avr(配列番号137)足場に作製した。I-TevIの触媒ドメインフラグメントをプラスミドpCLS12731(配列番号236)から切り出し、NcoI及びNsiI制限部位を用いる制限及びライゲーションによりベクターpCLS15795(配列番号351)及びpCLS9013(配列番号153)中にサブクローニングして、それぞれTevD02_cT11Avr_FokI-L(pCLS15796、配列番号352、配列番号447のタンパク質をコードする)及びTevD02_cT11Avr_TevD02(pCLS15797、配列番号353、配列番号448のタンパク質をコードする)を得た。全ての構築物を配列決定し、必要に応じて、挿入物を追加のベクターに移した(下記参照)。
最終のTevI::TALE-AvrBs3::FokI及びTevI::TALE-AvrBs3::TevI酵母発現プラスミド、pCLS13299(配列番号354、配列番号449のタンパク質をコードする)及びpCLS13301(配列番号355、配列番号450のタンパク質をコードする)を、それぞれプラスミドpCLS15796(配列番号352)及びpCLS15797(配列番号353)を用いる酵母インビボクローニングにより作製した。インビボ相同組換えによりインタクトなコーディング配列を作製するために、BssHIIでの消化により線状化した約40ngの各プラスミドとNcoI及びEagIでの消化により線状化した１ngのpCLS0542(配列番号156)プラスミドDNAとを使用して、高効率LiAc形質転換プロトコル(Arnouldら，2007)で酵母S. cerevisiae株FYC2-6Aを形質転換させた(MATα、trp1Δ63、leu2Δ1、his3Δ200)。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての酵母標的レポータープラスミドを、以前に記載されたように構築した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。
TevI::TALE-AvrBs3::FokI構築物及びTevI::TALE-AvrBs3::TevI構築物を、偽パリンドローム標的に対して以前に記載された酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)で試験して、活性を、その活性に２つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALEN(pCLS8590、配列番号244)と比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され５〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された２つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表６)。加えて、唯一のAvrBs3又はRagT2-R認識部位(配列番号238)を有する標的について構築物を試験した(表11)。適切な標的に対する酵母でのTevI::TALE-AvrBs3::FokI及びTevI::TALE-AvrBs3::TevIの活性レベルは、Ｎ-末端I-TevI-由来触媒ドメインを欠く親分子のものに匹敵した。サンプルの単一部位標的についての本発明のdcTALENによる有意な活性を表11に示す。
表11：二重部位DNA標的及び単一部位DNA標的に対する種々のcTALEN及びdcTALENの活性。相対的活性は下記のとおり分類する：n.d.，検出可能な活性なし；＋，＜25％の活性；++，25％〜＜50％の活性；+++，50％〜＜75％の活性；++++，75％〜100％の活性。
実施例4b：scTrex2::TALE::FokI二重切断TALEN
二重切断TALEN(CD::TALE::CD)(Ｎ-末端scTrex2-由来触媒ドメイン及びFokIに由来するＣ-末端触媒ドメインを有する)を、ベースラインのbT2-Avr(配列番号137)足場に作製した。scTrex2の触媒ドメインフラグメントをプラスミドpCLS15798(配列番号356、配列番号451のタンパク質をコードする)から切り出し、NcoI及びNsiI制限部位を用いる制限及びライゲーションによりベクターpCLS15795(配列番号351)中にサブクローニングして、scTrex2_cT11Avr_FokI-L(pCLS15799、配列番号357、配列番号452のタンパク質をコードする)を得た。この構築物を配列決定し、必要に応じて、挿入物を追加のベクターに移した(下記参照)。
pCLS15795(配列番号351)又はpCLS15799(配列番号357)に由来するそれぞれTALE-AvrBs3::FokI又はscTrex2::TALE-AvrBs3::FokI構築物をコードするDNAを、受容プラスミド用のAscI及びXhoI制限酵素及び挿入物用のBssHII及びXhoI制限酵素を用いてpCLS1853(配列番号193)哺乳動物発現プラスミド中にサブクローニングして、それぞれ哺乳動物発現プラスミドpCLS14972及びpCLS14971(配列番号358及び359)を得た。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての哺乳動物標的レポータープラスミドを、標準のGatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いて、CHOレポーターベクター中に構築した(Arnould, Chamesら，2006, Grizot, Epinatら，2010)。TALE-AvrBs3::FokI構築物及びscTrex2::TALE-AvrBs3::FokI構築物を偽パリンドローム標的に対して哺乳動物細胞(CHO K1)における染色体外アッセイで試験して、活性を、その活性に２つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALENと比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され５〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された２つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表６)。
このアッセイのために、CHO K1細胞を、96-ウェルプレートフォーマットにおいて、75ngの標的ベクター及び0.7〜25ngの漸増量の各バリアントDNAで、PolyFect試薬(１μL/ウェル)の存在下にトランスフェクトした。トランスフェクトDNAの全量を、空ベクターを用いて125ngとした(標的DNA、バリアントDNA、キャリアDNA)。トランスフェクションの72時間後、培養培地を除去し、150μlのβ-ガラクトシダーゼ液体アッセイ用溶解/顕色緩衝液を加えた。37℃でのインキュベーション後、光学密度を420nmにて測定した。全プロセスは、自動化Velocity11 BioCelプラットフォームで行う(Grizot, Epinatら，2009)。
scTrex2::TALE-AvrBs3::FokI構築物についての哺乳動物細胞での適切な標的に対する活性レベルは、親TALE-AvrBs3::FokI分子のものに匹敵した。このことは、余分なscTrex2成分がTALEN DNA切断機能を害さないことを示す。scTrex2機能の評価はNHEJ事象の検出に適切なアッセイで行う。
実施例５
cTALEN足場のためのベースラインデザインは、確立されたTALE DNA結合ドメインをベースにする。コンパクトTALENは、できる限り小さく効率的であるように設計する。したがって、この目的を達成するため、コンパクトTALE DNA結合ドメインと種々の触媒ドメインとの間の機能的ギャップの橋渡しをする「エンハンサー」ドメインを組み入れる必要があり得る。図６(Ａ〜Ｅ)は、そのようなエンハンサードメインが適用され得る種々の非限定的構成を説明する。この図は例示に過ぎず、Ｎ-末端 対 Ｃ-末端のバリエーションが示されていることに留意すべきである(すなわち、図6Aはまた、Ｎ-末端エンハンサードメイン及びＣ-末端触媒ドメインを有し得る)。表１及び２は、DNA結合(特異的及び非特異的接触)を支援し得る可能なエンハンサードメインを列挙する。
増強TALEN(eTALEN)は、実施例３の機能的cTALENを用いて作製する。エンハンサードメインの付加は、本発明者らの酵母アッセイで評価する(実施例１を参照)。出発材料のcTALENの効率の最低限５％増強、より好ましくは最低限10％増強、より好ましくは20％、より好ましくは30％、より好ましくは40％、より好ましくは50％、またより好ましくは50％を超える増強を提供する場合、特定のエンハンサードメインを有用であると判断する。
実施例5a：TALE::ColE7::TALE増強TALEN
増強TALEN(TALE::CD::TALE)(中央のDNA切断ドメインに隣接するＮ-末端及びＣ-末端のTALE DNA結合ドメインを有する)を、sT2(配列番号135)コア足場を用いて作製した。このクラスのコンパクトTALENのレイアウトを図6Bに示す(ここで、Ｎ-末端「エンハンサードメイン」はそれ自体がTALE DNA結合ドメインである)。ColE7触媒ドメインの点変異体誘導体(pCLS15785、配列番号285)を、eTALENの触媒コア用に選択した。２つの最終構築物TALE-AvrBs3::ColE7_A497::TALE-RagT2-R(pCLS15800、配列番号360、配列番号453のタンパク質をコードする)及びTALE-RagT2-R::ColE7_A497::TALE-AvrBs3(pCLS15801、配列番号361、配列番号454のタンパク質をコードする)を、テンプレートとしてsT2(配列番号135)、pCLS15785(配列番号285)、AvrBs3(配列番号152)及びRagT2-R(配列番号271)のDNA配列を用いる標準の分子クローニング技法を使用して得た。全てのTALE::CD::TALE構築物を配列決定し、必要に応じて、挿入物を追加のベクターに移した(下記参照)。
最終のTALE::CD::TALE-ベースの酵母発現プラスミド、pCLS12106(配列番号362)及びpCLS12110(配列番号363)を、NcoI及びEagI制限部位を用いる制限及びライゲーションにより作製して、pCLS0542(配列番号156)プラスミド中にサブクローニングした。酵母S. cerevisiae株FYC2-6A(MATα、trp1Δ63、leu2Δ1、his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Arnouldら，2007)で形質転換させた。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての酵母標的レポータープラスミドを、以前に記載されたように構築した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。
TALE::CD::TALE構築物を非対称AvrBs3/RagT2-Rハイブリッド標的に対して以前に記載された酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)で試験して、活性を、親コンパクトTALEN(例えば、pCLS8589、配列番号233)(これは、単一の結合部位を有する標的に対して活性を有する)と比較する。加えて、唯一のAvrBs3又はRagT2-R認識部位を有する標的に対して構築物を試験する。
実施例６
今日まで、公知の全てのTALエフェクター及びその誘導体は、認識配列中の-１位にＴ塩基を必要とするようである(図３)。この制限を克服するため、エンハンサードメインを使用して、TALEタンパク質のＮ-末端領域を置き換える。bT2-誘導体のＮ-末端TALE領域の配列及び構造に基づく相同性モデリングにより、３つの可能な候補タンパク質を得た(表１)：(i)C.elegansに由来するFem-3結合性因子、配列番号４(FBF1、PufファミリーのRNA結合タンパク質)；(ii)人工α-らせん形反復タンパク質(αRep)、配列番号５；及び(iii)アンキリンスーパーファミリーのタンパク質。二次構造エレメントの内容及び配置(arrangement)により、TALEタンパク質のＮ-末端領域に置き換わるエンハンサードメインの出発点としてのこれらモデルの使用が可能になる。
第１の正準(canonical)反復ドメインまでのＮ-末端TALEタンパク質領域を置き換えるために上記３つの候補の１つからの類似領域を用いて、キメラタンパク質を構築する。指針として相同性モデルを用いてコンピュータで新たな界面を再設計する。このアプローチは、標的配列の-１位に必須のＴに対する特異性の決定要因を突き止めるために使用することができる。置換要員たるエンハンサードメインは、最低限、cTALENタンパク質に構造的一体性を提供すべきである。構築物を本発明者らの酵母アッセイで評価する(実施例１を参照)。標的の-１位でのＴの不存在下で、出発材料のcTALENの活性の最低限５％の保持、より好ましくは最低限10％の保持、より好ましくは20％、より好ましくは30％、より好ましくは40％、より好ましくは50％、またより好ましくは50％を超える活性の保持を提供する場合に、特定のエンハンサードメインを有用であると判断する。
実施例７
cTALEN用のより適切でコンパクトな足場を作製するために、TALEタンパク質の(最終ハーフ-反復ドメインを超える)Ｃ-末端領域の性質を分析した。bT2-誘導体のＣ-末端TALE領域の配列及び構造に基づく相同性モデリングにより、３つの可能な候補タンパク質を得た(表１)：(i)Pseudomonas Aeuriginosaのヒドロラーゼ/トランスフェラーゼ、配列番号６；(ii)Mycobacterium tuberculosisリガーゼＤ由来のポリメラーゼドメイン、配列番号７；(iii)Pyrococcus由来の開始因子eIF2、配列番号８；(iv)翻訳開始因子Aif2βγ、配列番号９。実施例６のように、可能なＣ-末端短縮形の作製用の領域を突き止めるために相同性モデルを使用する；可能性のある短縮位置としては、最後のハーフ-反復ドメインを超えて残存する28、40、64、118、136、169、190残基が挙げられる。追加的に、Ｃ末端ドメイン全体を置き換えるために上記タンパク質からの相同領域を使用し得る。タンパク質の一次配列から出発して、３Ｄ空間中で近位である可能性が高い残基対を同定するために、接触予測プログラムを使用し得る。このようなキメラタンパク質は、cTALENを構築するためのより安定な足場を提供すべきである。
構築物を本発明者らの酵母アッセイで評価する(実施例１を参照)。出発材料のcTALENの活性の最低限５％の保持、より好ましくは最低限10％の保持、より好ましくは20％、より好ましくは30％、より好ましくは40％、より好ましくは50％、またより好ましくは50％を超える活性の保持を提供する場合に、特定のエンハンサードメインを有用であると判断する。
実施例８
代替の活性を有するコンパクトTALENを作製するため、(ａ)分離可能な活性を有する触媒ドメインを使用することにより(図7A、B)；又は(ｂ)補助的活性を提供する(図7C)ことにより、トランスcTALENをTALE-融合体として作製する。クラスIIIの配列及び構造に基づくモデリング(Chan, Stoddardら，2011)。TypeIIS制限エンドヌクレアーゼ(REase)を用いてトランスTALENを作製した(非制限的リストについては表２を参照)。当初のトランスTALENは、実施例３及び４に記載のように、独立して活性な触媒ドメイン(例えばNt.BspD6Iニッカーゼ)の融合により作製する。原理上は、このトランスTALENは、適用に応じてそのままで使用することもできる。cTALENを機能的トランスTALENに変換するために、補助ドメイン(この場合、ss.BspD6I)をトランスで提供する(図8A)。このような随意にトランスの及び/又はヘテロダイマー型タンパク質は、所与の適用に対して変調され得る活性を有するcTALEN足場を可能にする。
構築物を本発明者らの酵母アッセイで評価する(実施例１を参照)。出発材料のcTALENの活性に代替する活性を提供する場合に、特定の補助ドメインを有用と判断する。
使用する補助ドメインは、当初のcTALEN(すなわち、非-トランスTALEN形態)とは独立した活性を示す場合には、特異的ターゲッティング用のTALEドメインに融合させることもできる(図7B)。補助ドメインはまた、cTALENに関連しない機能を提供する標的付けられた実体としてトランスで提供され得る(図7C)。
実施例8a：TALEN触媒活性の特異的阻害
実施例3c及び3dで記載したように、NucA(配列番号26)及びColE7(配列番号140)は共に、それぞれの阻害タンパク質NuiA(配列番号229)及びIm7(配列番号230)との複合体形成により阻害され得る。コリシン-E9(配列番号366)は、阻害剤Im9(配列番号369)により阻害され得るタンパク質の別の１つの非限定例である。NucA又はColE7触媒ドメインに由来するTALEN(TALE::NucA又はTALE::ColE7)に関して、阻害剤は、DNA切断を妨げることにより活性を変調する補助ドメインとして役立つ(図7A)。
Im7(配列番号230)及びNuiA(配列番号229)阻害タンパク質を、NcoI及びEagI制限部位を用いる制限及びライゲーションによりpCLS7763骨格(配列番号241)中にサブクローニングして、それぞれpCLS9922(配列番号242)及びpCLS9923(配列番号243)を得た。次いで、これらプラスミドを、同時形質転換実験において以前に記載された標準酵母SSAアッセイで使用した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての酵母標的レポータープラスミドを、以前に記載されたように構築した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。
TALE-AvrBs3::NucA(pCLS9924、配列番号223)構築物及びTALE-AvrBs3::ColE7(pCLS8589、配列番号233)構築物を偽パリンドローム標的に対して酵母SSAアッセイで試験して、活性を、その活性に２つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALEN(pCLS8590、配列番号244)と比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され５〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された２つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表７)。加えて、唯一のAvrBs3認識部位を有する標的について構築物を試験した(配列番号224、表７)。TALENの活性変調を、特異的又は非特異的阻害タンパク質の存在下又は不在下に、コントロールとしてTALE-AvrBs3::FokI TALENを用いて評価した。
表12に要約したデータは、本発明によるTALE-AvrBs3::NucA及びTALE-AvrBs3::ColE7構築物が、それぞれの阻害タンパク質NuiA及びIm7の存在により、特異的に不活化されることを示す。
表12：阻害タンパク質の存在下でのTALEN構築物の活性。相対的活性は下記のとおり分類する：n.d.，検出可能な活性なし；＋，＜25％の活性；++，25％〜＜50％の活性；+++，50％〜＜75％の活性；++++，75％〜100％の活性。
実施例8b：トランスTALENによるTALEN触媒活性の増強
実施例3bは、TevI::TALEが支援なしでコンパクトTALEN(pCLS8522、配列番号237)として機能することを説明する。活性を更に増強するため、図7Cに示したレイアウトでTALE::TevI構築物を用いてトランスTALENを設計した。RagT2-R部位を標的するためのRVDをコードするDNA配列(配列番号271)を、受容プラスミド用のタイプIIS制限酵素BsmBI並びに挿入RVD配列用のBbvI及びSfaNIを用いてプラスミドpCLS7865-cT11_TevD02(pCLS9011、配列番号151)中にサブクローニングして、TALE-RagT2-R::TevI構築物cT11RagT2-R_TevD02(pCLS15802、配列番号364)を作製した。この構築物を配列決定し、挿入物を、NcoI及びEagI制限部位を用いる制限及びライゲーションによりpCLS7763骨格(配列番号241)中にサブクローニングして、pCLS8990(配列番号365)を得た。次いで、プラスミド対pCLS8522(配列番号237)及びpCLS7763(配列番号241)又はpCLS8522(配列番号237)及びpCLS8990(配列番号365)を、同時形質転換実験において以前に記載された標準酵母SSAアッセイで使用した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての酵母標的レポータープラスミドを、以前に記載されたように構築した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。TALE-RagT2-R::TevI/TevI::TALE-AvrBs3構築物対を非対称RagT2-R/AvrBs3ハイブリッド標的に対して以前に記載された酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)で試験して、その活性を、１つの結合部位を有する標的に対して活性を有する親コンパクトTALEN(例えば、pCLS8522、配列番号237)と比較した。RagT2-R/AvrBs3ハイブリッド標的は、第１のもの(RagT2-R)の3'端部を第２のもの(AvrBs3)の5'端部に近位で並置され５〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された２つの異なる認識配列を含有する(配列番号G064〜G099、表13)。図18は、本発明のトランスcTALENによるTALE-RagT2-R::TevI構築物により提供されたTevI::TALE-AvrBs3活性における変調を説明する。
実施例９：ポリペプチドリンカーによるＣ末端ドメインの置換、ColE7触媒ドメインによる活性
本発明者らは、37の異なるリンカーの最初のライブラリを作製した。これらの多くは、３〜28アミノ酸残基をコードする可変領域を含んでなり、5'端及び3'端の両方でSGGSGSストレッチ(配列番号219)をコードする領域が隣接する共通構造を有する(配列番号372〜408)。これらリンカーは、5'及び3'端にそれぞれXmaI及びBamHI制限部位を含有する。次いで、このリンカーライブラリを、XmaI及びBamHI制限部位でpCLS7183(配列番号141)にサブクローニングして、AvrBs3-由来TALEN(pCLS7184、配列番号196)のＣ末端ドメインを置き換える。AvrBs3-由来の反復ドメイン(RVD)セット又は末端ハーフRVDを有するか若しくは欠く任意の他のRVD配列をこの骨格ライブラリにクローニングする。ペトリ皿からコロニーを擦り取った後、標準のミニプレップ技法を用いてこのライブラリからDNAを得る。FokI触媒性頭部をBamHI及びEagI制限酵素を用いて除去し、残る骨格を標準的なゲル抽出技法を用いて精製する。
ColE7触媒ドメイン(配列番号11)をコードする配列を、Ｃ末端ドメインライブラリと触媒性頭部との間に、DNAレベルでBamHI制限部位(コーディング鎖の5'側)及びEagI制限部位(コーディング鎖の3'側)を、タンパク質レベルでリンカー(例えば、-SGGSGS-ストレッチ、配列番号219)を導入するようにPCRにより増幅させた。BamHI及びEagI消化及び精製の後、異なる触媒性頭部をコードするDNAを、個々に、事前に作製したライブラリ足場中にサブクローニングした。
ペトリ皿からコロニーを擦り取った後、標準のミニプレップ技法を用いて最終ライブラリからDNAを得る。得られたライブラリを偽パリンドローム標的に対して以前に記載した本発明者らの酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)でスクリーニングして、活性を、その活性に２つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALENと比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され15、18、21及び24bpを含む「スペーサー」DNAで分離された２つの同一認識配列を含有する(配列番号167、170、173及び176、表７)。加えて、唯一のAvrBs3認識部位を有する標的(配列番号224)について構築物(配列番号416〜419)を試験した。図20に要約したデータは、ColE7構築物の一部のリンカー配列が、２つのAvrBs3認識部位又は唯一のAvrBs3認識部位を有する標的に対して活性であることを示す。
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Claims (15)

  1. 下記：
    (i)興味対象の特異的二本鎖DNA標的配列に対するDNA結合特異性を有する反復可変ジペプチド領域(RVD)を含んでなる１つのコア転写アクチベーター様エフェクター(TALE)足場；
    (ii)(i)のコアTALE足場のＣ末端又はＮ末端に融合されたとき前記興味対象の二本鎖DNA標的配列に近接するDNAを切断し得る少なくとも１つのI-TevI触媒ドメイン；
    を含んでなる、前記標的DNAに結合して二本鎖DNAを切断するコンパクト転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)モノマー。
  2. (ii)の触媒ドメインを(i)のコアTALE足場に融合させるための１つのペプチド性リンカー
    を更に含んでなる請求項１に記載のコンパクトTALENモノマー。
  3. 前記触媒ドメインが前記コアTALE足場のＣ末端ドメインに融合されている請求項１又は２に記載のコンパクトTALENモノマー。
  4. 前記触媒ドメインが前記コアTALE足場のＮ末端ドメインに融合されている請求項１又は２に記載のコンパクトTALENモノマー。
  5. 配列番号426〜432の群より選択されるタンパク質配列と、少なくとも80％、より好ましくは90％、またより好ましくは95％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる請求項１〜４のいずれか１項に記載のコンパクトTALENモノマー。
  6. 前記ペプチド性リンカー配列が配列番号67〜104及び配列番号372〜配列番号415からなる群より選択され得る請求項１〜５のいずれか１項に記載のコンパクトTALENモノマー。
  7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のコンパクトTALENをコードする組換えポリヌクレオチド。
  8. 請求項７に記載の組換えポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
  9. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のコンパクトTALENと医薬的に活性なキャリアとを含んでなる医薬組成物。
  10. 請求項７に記載の組換えポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞。
  11. 請求項７に記載の組換えポリヌクレオチドを含んでなる非ヒトトランスジェニック動物。
  12. 請求項７に記載の組換えポリヌクレオチドを含んでなるトランスジェニック植物。
  13. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のコンパクトTALENモノマー及び興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列のDNAプロセシング効率を増大させることに使用するための指示書を含んでなるキット。
  14. (ａ)興味対象の１つのDNA標的配列を二本鎖DNAの一方の鎖上で選択し；
    (ｂ)請求項１〜６のいずれか１項に記載のコンパクトTALENモノマーを提供し；
    (ｃ)前記二本鎖DNAを前記モノマーと、該コンパクトTALENモノマーが前記二本鎖DNAを切断するようにインビトロで接触させる
    ことを含んでなる、インビトロで二本鎖DNAを標的して切断する方法。
  15. インビトロで、細胞、組織又は非ヒト動物の遺伝子座の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列中に導入遺伝子を挿入する方法であって、少なくとも１つの請求項１〜６のいずれか１項に記載のコンパクトTALENモノマーが前記細胞、組織又は非ヒト動物に導入される方法。
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