ES2828663T3 - Dirección genética no disruptiva - Google Patents

Abstract

Una composición de polinucleótido donante para expresar un gen de interés a partir de un locus diana en una célula sin interrumpir la expresión del gen en el locus diana, comprendiendo el polinucleótido donante: (i) un casete de ácido nucleico que comprende: - el gen de interés, en donde el gen de interés es el factor de coagulación 9; - una secuencia que codifica un péptido 2A; y (ii) secuencias que flanquean el casete que son homólogas a las secuencias que flanquean un sitio de integración en el locus diana, donde el locus diana es el gen de la albúmina, en donde el casete está configurado de manera que el gen de interés está operativamente unido al promotor en el locus diana tras la inserción en el locus diana, para uso en terapia génica de la hemofilia, en donde la terapia no es un proceso para modificar la identidad genética de la línea germinal de los seres humanos.

Description

DESCRIPCIÓN

Dirección genética no disruptiva

Antecedentes de la invención

[0001] La manipulación del genoma en un sitio específico es un objetivo deseable para muchas aplicaciones en medicina, biotecnología e investigación biológica. En los últimos años se ha realizado un gran esfuerzo para desarrollar nuevas tecnologías para el direccionamiento de genes en células mitóticas y posmitóticas. Sin embargo, la integración de un gen de interés en un locus diana puede interrumpir la expresión del gen en el locus diana, produciendo efectos no deseados en la célula. La presente invención aborda estos problemas. El documento WO 2011/130345 enseña el uso de promotores endógenos para expresar proteínas heterólogas.

[0003] Barzel et al. (15a Reunión Anual de la Sociedad Estadounidense de Terapia Génica y Celular (ASGCT); Filadelfia, PA, EE.UU.; 16-19 de mayo de 2012; Terapia Molecular, Vol. 20, S234) enseña cómo dirigir fusiones 2A a genes endógenos. El documento US 2009/0241207 enseña la expresión de genes heterólogos según un perfil de expresión dirigido. El documento WO 2011/002988 enseña modelos de rata modificados genéticamente para la inmunodeficiencia combinada grave (SCID).

[0006] EE.UU. 2008/0299580 enseña métodos y composiciones para la integración dirigida de una secuencia exógena en el locus PPP1R12C humano, por ejemplo, para la expresión de un polipéptido de interés.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0007] La invención proporciona una composición de polinucleótidos de donantes para expresar un gen de interés a partir de un locus diana en una célula sin interrumpir la expresión del gen en el locus diana, el polinucleótido donante que comprende:

(i) un ácido nucleico casete que comprende:

- el gen de interés, en donde el gen de interés es el factor de coagulación 9;

- una secuencia que codifica un péptido 2A; y

(ii) secuencias que flanquean el casete que son homólogas a las secuencias que flanquean un sitio de integración en el locus diana, donde el locus diana es el gen de la albúmina, donde el casete está configurado de manera que el gen de interés está operativamente unido al promotor en el locus diana tras la inserción en el locus diana, para uso en terapia génica de la hemofilia, en donde la terapia no es un proceso para modificar la identidad genética de la línea germinal de los seres humanos.

SUMARIO DE LA DESCRIPCIÓN

[0008] Las composiciones y métodos se describen para la integración de uno o más genes de interés en el ADN celular sin interrumpir sustancialmente la expresión del gen en el locus de integración, es decir, el locus diana. Estas composiciones y métodos son útiles en cualquier aplicación in vitro o in vivo en donde sea deseable expresar un gen de interés en el mismo patrón restringido espacial y temporalmente que el de un gen en un locus diana mientras se mantiene la expresión del gen en el locus diana, por ejemplo, para tratar enfermedades, en la producción de organismos genéticamente modificados en la agricultura, en la producción a gran escala de proteínas por células con fines terapéuticos, de diagnóstico o de investigación, en la inducción de células iPS con fines terapéuticos, de diagnóstico, o con fines de investigación, en investigación biológica, etc. También se describen reactivos, dispositivos y kits de los mismos que encuentran uso en la práctica de los métodos diana.

[0009] En un aspecto de la divulgación, una composición de polinucleótidos de donantes para expresar un gen de interés a partir de un locus diana se describe en una célula sin interrumpir la expresión del gen en el locus diana. En algunas realizaciones, el polinucleótido donante comprende un casete de ácido nucleico que comprende el gen de interés y al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en un péptido 2A, un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES), una región de empalme de inteína N-terminal y una tegión de empalme de inteína C-terminal, un donante de empalme y un aceptor de empalme, y una secuencia de codificación para el gen en el locus diana; y secuencias que flanquean el casete que son homólogas a secuencias que flanquean un sitio de integración en el locus diana. En algunas realizaciones, el casete se configura de manera que el gen de interés esté operativamente ligado al promotor en el locus diana tras la inserción en el locus diana. En algunas realizaciones, el casete comprende un promotor operativamente ligado al gen de interés. En algunas realizaciones, el casete comprende dos o más genes de interés.

[0010] En un aspecto de la divulgación, se describe un método para expresar un gen de interés a partir de un locus diana en una célula sin interrumpir la expresión del gen en el locus diana. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un polinucleótido donante, por ejemplo, como se describe anteriormente o se describe en otra parte del presente documento. En algunas realizaciones, el contacto se produce en presencia de una o más nucleasas dirigidas. En algunas realizaciones, la célula expresa de forma estable la una o más nucleasas diana. En algunas realizaciones, el método además comprende poner en contacto la célula con una o más nucleasas más específicas. En algunas realizaciones, la una o más nucleasas dirigidas se selecciona del grupo que consiste en una nucleasa con dedos de zinc, una TALEN, una endonucleasa autodirigida o una nucleasa SPO11 dirigida. En algunas realizaciones, el locus diana se selecciona del grupo que consiste en actina, ADA, albúmina, a-globina, p-globina, CD2, CD3, CD5, CD7, E1a, IL2RG, Ins1, InS2, NCF1, p50, p65, PF4, PGC-y, PTEN, TERT, UBC y VWF. En algunas realizaciones, el gen de interés es un péptido o polipéptido terapéutico, un marcador seleccionable o un marcador de formación de imágenes. En algunas realizaciones, la célula es una célula mitótica. En otras realizaciones, la célula es una célula posmitótica. En algunas realizaciones, la célula es in vitro. En otras realizaciones, la célula está in vivo.

[0011] En un aspecto de la divulgación, se describe un método para producir una modificación de genes en una célula en un sujeto, la modificación del gen que comprende una inserción en un locus de ADN diana que no interrumpa la expresión del gen en el locus diana. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto una célula ex vivo con una cantidad eficaz de un polinucleótido donante, por ejemplo, como se describe anteriormente o se describe en otra parte de este documento, donde el contacto se produce en condiciones que permiten la unión de extremos no homólogos o recombinación homóloga; y trasplantar la célula al sujeto.

[0012] En algunas realizaciones, el método comprende además poner en contacto las células con una primera nucleasa dirigida que es específica para una primera secuencia de nucleótidos dentro del locus diana, y una segunda nucleasa específica que es específica para una segunda secuencia de nucleótidos dentro del locus diana. En algunas realizaciones, la célula a contactar se recolecta del sujeto. En algunas realizaciones, el método comprende además seleccionar las células que comprenden la inserción antes del trasplante. En algunas realizaciones, el método comprende además expandir las células que comprenden la inserción antes del trasplante.

[0013] En un aspecto de la divulgación, se describe un método para el tratamiento de una herida en un individuo. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto una célula con una cantidad eficaz de polinucleótido donante que comprende al menos un gen del factor de crecimiento de curación de heridas, en donde el polinucleótido del donante está configurado para promover la integración del factor de crecimiento de curación de heridas en un locus diana en la célula sin interrumpir la expresión del gen en el locus diana. En algunas realizaciones, el contacto se produce in vitro y el método comprende además trasplantar la célula al individuo. En otras realizaciones, el contacto se produce in vivo.

[0014] En algunas realizaciones, la célula es un fibroblasto. En algunas realizaciones, el fibroblasto es autólogo. En algunas realizaciones, el fibroblasto se induce a partir de una célula madre pluripotente. En algunas realizaciones, el fibroblasto es un fibroblasto universal. En algunas realizaciones, el gen del factor de crecimiento de cicatrización de heridas se selecciona del grupo que consiste en PDGF, VEGF, EGF, TGFa, TGBp, FGF, TNF, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 y factor de crecimiento derivado del endotelio. En determinadas realizaciones, el locus diana es el locus del gen de la adenosina desaminasa (ADA). En algunas de tales realizaciones, el polinucleótido donante promueve la integración en el locus ADA en el exón 1. En ciertas de tales realizaciones, las células se ponen en contacto con una primera nucleasa dirigida que es específica para una primera secuencia de nucleótidos dentro del locus ADA, y una segunda nucleasa que es específica para una segunda secuencia de nucleótidos dentro del locus ADA.

[0015] En algunas realizaciones, la primera nucleasa apuntada y la segunda nucleasa apuntada son TALENs. En algunas realizaciones, el polinucleótido donante comprende además un gen suicida. En algunas realizaciones, el gen suicida es el gen TK, caspasa 9 inducible o CD20. En algunas realizaciones, el gen suicida está bajo el control de un promotor que actúa de manera constitutiva. En otras realizaciones, el gen suicida está bajo el control de un promotor inducible.

[0016] En un aspecto de la divulgación, se describe un método para tratar o proteger contra una condición de sistema nervioso en un individuo. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto una célula con una cantidad eficaz de polinucleótido donante que comprende al menos un factor neuroprotector, en donde el polinucleótido donante está configurado para promover la integración del factor neuroprotector en un locus diana en la célula sin interrumpir la expresión del gen en el locus diana. En algunas realizaciones, el contacto se produce in vitro y el método comprende además trasplantar la célula al individuo. En otras realizaciones, el contacto se produce in vivo. En algunas realizaciones, la célula es un astrocito, un oligodendrocito, una célula de Schwann o una neurona. En algunas realizaciones, la célula es una neurona y el locus diana es el locus NF, el locus NSE, el locus NeuN o el locus MAP2. En algunas realizaciones, la célula es un astrocito y el locus diana es el locus GFAP o locus S100B. En algunas realizaciones, la célula es un oligodendrocito o una célula de Schwann, y el locus diana es el locus GALC o locus MBP. En algunas realizaciones, la célula es autóloga. En algunas realizaciones, la célula se induce a partir de una célula madre pluripotente. En algunas realizaciones, el factor neuroprotector se selecciona del grupo que consiste en una neurotrofina, Kifap3, Bcl-xl, Crmpl, Chkp, CALM2, Caly, NPG11, NPT1, E e fla l, Dhps, Cd151, MorF412, CTGF, LDH-A, Atl1, NPT2, EhD3, Cox5b, Tubala, Y-actina, Rpsa, NPG3, NPG4, NPG5, NPG6, NPG7, NPG8, NPG9 y NPG10.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0017] La invención se entiende mejor a partir de la siguiente descripción detallada cuando se lea en conjunción con los dibujos que se acompañan. Se enfatiza que, según la práctica común, las diversas características de los dibujos no están a escala. Por el contrario, las dimensiones de las diversas características se amplían o reducen arbitrariamente para mayor claridad. En los dibujos se incluyen las siguientes figuras.

La Figura 1 representa la integración dirigida sin alteración génica utilizando péptidos 2A. Un gen de interés ("transgén" en verde) se inserta en el locus diana de manera que esté operativamente ligado al promotor del gen en el locus diana ("gen endógeno" en azul). (A) El casete del transgén que se inserta comprende un péptido 2A corriente abajo del transgén. Esta configuración proporciona la inserción del transgén inmediatamente corriente abajo de la región no traducida (UTR) 5' y el codón de inicio del gen en el locus diana sin interrumpir la transcripción o traducción del gen endógeno corriente abajo del sitio de inserción. (B) El casete transgénico que se inserta comprende un péptido 2A corriente arriba del transgén. Esta configuración proporciona la inserción del transgén inmediatamente corriente arriba de la región no traducida 3' y el codón de parada del gen en el locus diana. P, promotor de gen endógeno; UTR, región no traducida del gen endógeno; PoliA, secuencia de poliadenilación; 2A, péptido 2A. El uso de la nucleasa dirigida TALEN es opcional.

La Figura 2 representa la integración dirigida sin alteración genética utilizando un IRES. (A) El casete de transgén que se inserta comprende una secuencia que codifica un IRES corriente abajo del transgén. Esta configuración proporciona la inserción del transgén dentro de la región no traducida (UTR) 5' del gen en el locus diana sin interrumpir la transcripción o traducción de la secuencia del gen endógeno corriente abajo del sitio de inserción. (B) El casete de transgén que se inserta comprende una secuencia que codifica un IRES corriente arriba del transgén. Esta configuración proporciona la inserción del transgén dentro de la UTR3' del gen en el locus diana sin interrumpir la transcripción o traducción de la secuencia del gen endógeno corriente arriba del sitio de inserción. P, promotor de gen endógeno; UTR, región no traducida del gen endógeno; PoliA, secuencia de poliadenilación; IRES, secuencia de entrada ribosómica interna. El uso de la nucleasa dirigida TALEN es opcional.

La Figura 3 representa la integración dirigida sin alteración genética utilizando una configuración de inteína. El casete del transgén comprende una región de empalme N-terminal inteína y una región de empalme C-terminal inteína corriente arriba y corriente abajo, respectivamente, del transgén, y se inserta en el locus diana de manera que esté operativamente enlazado y en marco con el promotor de la gen en el locus diana. Después de la traducción, el polipéptido transgénico se corta y empalma, lo que da como resultado la producción de proteína ininterrumpida codificada por el gen en el locus diana. Esta configuración proporciona la inserción del transgén en cualquier exón codificante del gen en el locus diana. P, promotor de gen endógeno; UTR, región no traducida del gen endógeno; PoliA, secuencia de poliadenilación; N' SR, región de empalme N-terminal; C' SR, región de empalme C-terminal. El uso de la nucleasa dirigida TALEN es opcional.

La Figura 4 representa la integración dirigida sin alteración genética utilizando una configuración de intrón. El casete transgénico comprende un donante de empalme y un aceptor de empalme corriente arriba y corriente abajo, respectivamente, del transgén, y se inserta en el locus diana de manera que esté operativamente unido y en marco con el promotor del gen en el locus diana. Después de la transcripción, el pre-ARNm del transgén se empalma, lo que permite la traducción ininterrumpida de la proteína codificada por el gen en el locus diana. Esta configuración proporciona la inserción del transgén en cualquier región transcrita del locus diana, es decir, cualquier región 5' de la secuencia de poliadenilación. P, promotor de gen endógeno; UTR, región no traducida del gen endógeno; PoliA, secuencia de poliadenilación; SD, donante de empalme; SA, aceptador de empalmes. El uso de la nucleasa dirigida TALEN es opcional.

La Figura 5 representa la integración dirigida sin alteración del gen mediante la complementación del ADNc del gen en el locus diana. La secuencia de codificación corriente abajo del sitio de inserción (con mutaciones de oscilación para evitar la recombinación prematura si se inserta en el extremo 3' de un exón codificante, o sin mutaciones de oscilación si se inserta en el extremo 5' del exón codificante) se proporciona en el polinucleótido donante("vector de direccionamiento") además del gen de interés ("GOI"), y se inserta en el locus diana de manera que esté bajo el control de su propio promotor. (A) El gen de interés puede separarse del cADN para el gen en el locus diana mediante un péptido 2A, de modo que el gen de interés también estará bajo el control del promotor en el locus diana. (B) Alternativamente, el gen de interés puede estar operativamente ligado a un promotor separado.

La Figura 6 representa la integración dirigida de múltiples genes de interés. El gen de interés ("GOI", en verde) acoplado a un péptido 2A se inserta en el locus diana de manera que esté operativamente unido al promotor del gen en el locus diana. Además, un segundo gen de interés, en este caso, un marcador seleccionable, también se inserta en el locus. (A) El marcador seleccionable se expresa a partir del mismo promotor que dirige la expresión del gen en el locus diana y el gen de interés al incluir un péptido 2A entre el gen de interés y el marcador seleccionable. (B) El seleccionable está operativamente ligado a un promotor distinto del que dirige la expresión del gen en el locus diana y el primer gen de interés.

La Figura 7 proporciona un esquema de una diana genómica diseñada. En este ejemplo, las células, por ejemplo, fibroblastos, se diseñan para secretar factores de crecimiento de cicatrización de heridas. El ADNc del factor de crecimiento (p. ej., PDGFbb, VEGF, FGF, etc.) se integra en un locus diana (p. ej., el gen ADA) bajo el control de un promotor fuerte (p. ej., CMV, CAG, UBC, EF1a, Fibronectina, etc.), que promueve una alta expresión del factor de crecimiento terapéutico por parte de las células. También se integra en este ejemplo el ADNc para el gen endógeno (para proporcionar la complementación génica), un marcador seleccionable (para la selección y purificación de las células manipuladas, por ejemplo, P140KMGMT, NGFR truncado, CD4 truncado, CD8 truncado, etc.) y un gen suicida bajo el control de un promotor inducible (para eliminar las células del cuerpo después de que hayan secretado suficientes factores de crecimiento para curar la herida, por ejemplo, inducible Caspasa9, HSV-TK, CD20, etc.).

La Figura 8 proporciona ejemplos de secuencias de TALEN que pueden usarse para dirigirse al gen IL2RG humano. (A) Secuencia izquierda L1 (SEQ ID NO:9); (B) Secuencia izquierda L2 (SEQ ID NO:10); (C) Secuencia izquierda L3 (SEQ ID NO:11); (D) Secuencia derecha R1 (SEQ ID NO:12); (E) Secuencia derecha R2 (SEQ ID NO:13); (F) Secuencia derecha R3 (SEQ ID NO:14). Las combinaciones de secuencias de particular interés incluyen L1/R1, L1/R2, L1/R³ , L2/R1, L2/R2, L2/R3 y L3/R3.

La Figura 9 proporciona ejemplos de secuencias de TALEN que pueden usarse juntas para apuntar al gen de la beta-globina humana. (A) Secuencia izquierda (SEQ ID n O:15); (B) Secuencia derecha (SEQ ID NO:16). La Figura 10 proporciona ejemplos de secuencias de TALEN que pueden usarse juntas para apuntar al gen de la gamma-globina humana. (A) Secuencia izquierda (SEQ ID NO:17); (B) Secuencia derecha (SEQ ID NO:18).

La Figura 11 proporciona ejemplos de secuencias de TALEN que pueden usarse para dirigirse al gen ADA humano. (A) Secuencia izquierda L1 (SEQ ID NO:19); (B) Secuencia izquierda L2 (SEQ ID NO:20); (C) Secuencia derecha R1 (Se Q ID NO:21); (D) Secuencia derecha R3 (SEQ ID NO:22). Las combinaciones de particular interés incluyen L1/R1 y L2/R3.

La Figura 12 es una descripción de la corrección de genes (A) frente a la adición de genes (B).

La Figura 13 representa la adición de genes con un informador no específico.

La Figura 14 muestra las lecturas del reportero.

La Figura 15 ilustra el desarrollo de un informador específico de adición de genes.

La Figura 16 ilustra la estrategia para modificar los codones de GFP para producir la secuencia de codificación de NH de GFP usada en el informador de la Figura 15 (secuencia superior: SEQ ID NO:23; secuencia inferior: SEQ ID NO:24).

La Figura 17 representa las implicaciones para el direccionamiento en células humanas.

La Figura 18 proporciona una revisión de las etapas de la cicatrización de heridas.

La Figura 19 proporciona ejemplos de citocinas que pueden expresarse a partir de un locus diana mediante los métodos diana para tratar heridas crónicas.

La Figura 20 representa la aplicación de la metodología de adición de genes en cuestión a la integración del gen PDGF en el locus ROSA26 de ratón en fibroblastos de ratón.

La Figura 21 demuestra la expresión del vector donante integrado en la Figura 20 en fibroblastos.

La Figura 22 representa un modelo de ratón de cicatrización de heridas, en donde el entablillado previene la contractura de la herida (Galiano et al. (2004) Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Rep Regen. 12 (4): 485-92).

La Figura 23 demuestra la eficacia con la que los fibroblastos modificados por los métodos diana para expresar PDGF promueven la cicatrización de heridas.

La Figura 24 representa la aplicación de la metodología de adición de genes en cuestión al tratamiento de una herida en un paciente. (A) Modificación de fibroblastos ex vivo y trasplante de nuevo al individuo. (B) Monitorear al receptor de fibroblastos y eliminar esos fibroblastos después de que se complete la cicatrización de la herida usando el gen suicida integrado.

La Figura 25 representa el diseño de un locus indicador de GFP específico de adición de genes seguido de la adición de genes de hormona de crecimiento humana. Diseñamos un plásmido donante que contiene regiones de homología con el locus Safe Harbor genómico. Cuando los plásmidos de expresión de nucleasas se cotransfectaron con el donante, se produjo un evento de adición de genes específicos del sitio (A). Críticamente, incluimos en nuestro donante una región de ADN que puede codificar el c-terminal de GFP, pero que no es homóloga para GFP de tipo silvestre (B, SEQ ID NO:24). Esto permite que la expresión de GFP sirva como un informador específico para la adición de genes al mismo tiempo que permite la inserción de transgenes. Demostramos que la cotransfección de los 3 plásmidos dio como resultado células GFP+ y que estas podrían clasificarse mediante citometría de flujo (C). Las células clasificadas se analizaron mediante DIG-Southern con una digestión con EcoRV y se confirmó la adición de genes (D). La PCR de células clasificadas también confirmó la adición de genes (E). Se realizó ELISA en la población clasificada de células y se confirmó la expresión de la hormona del crecimiento (F).

La Figura 26 demuestra el injerto de fibroblastos manipulados en ratones receptores. Trasplantamos fibroblastos dirigidos con la construcción de adición de genes descrita en la Figura 25 por vía subcutánea en Matrigel en un ratón hermano (gris oscuro), un ratón no relacionado pretratado con suero de timocitos anti­ ratón (ATS) para inmunosupresión (gris intermedio) o un ratón no relacionado sin Tratamiento ATS (gris claro). Escindimos el tapón de matrigel y observamos un injerto exitoso de los fibroblastos después de 10 días en las cohortes de ATS hermanos y no emparentados. Sin embargo, después de 30 días, solo la cohorte ATS no relacionada tenía un injerto sustancial (A). La expresión de hGH se analizó con ELISA después de la escisión del tapón de matrigel y se encontró que la expresión de hGH persistía después del trasplante y reflejaba la expresión de GFP (B). Las barras de error representan /-1 desviación estándar. La Figura 27 ilustra que la expresión de la hormona del crecimiento aumenta al dirigirse a matrices en tándem de ADNc unido a T2A. Diseñamos cuatro construcciones de donantes, cada una de las cuales contiene un número creciente de copias de ADNc de la hormona del crecimiento unidas por un péptido T2A (A). A medida que aumentaba el tamaño del donante, la eficacia de la focalización disminuía (B). A continuación, clasificamos las células GFP+ y normalizamos la expresión de la hormona del crecimiento (ELISA) al porcentaje de GFP. Descubrimos que aumentar el número de copias de ADNc puede aumentar la expresión. Sin embargo, Ubc-hGH4x tenía una expresión más baja que UbchGH3x(C). Las barras de error representan /- 1 desviación estándar y los valores p se calcularon con una prueba T de Student asumiendo varianzas desiguales. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

La Figura 28 ilustra que los TALEN demuestran un aumento de la focalización y una menor toxicidad en comparación con los ZFN. Comparamos la capacidad de los TALEN para estimular la adición de genes en comparación con los ZFN utilizados en la Figura 27.1,27,2 y 27,3. Encontramos que los TALEN superaron a los ZFN en términos de eficiencia de focalización (A) y también en términos de disminución de la toxicidad celular (D). Titulamos la cantidad de ZFN (B) y TALEN (C) y encontramos que los TALEN tenían niveles más altos de adición de genes en todas las cantidades. Luego diseñamos una construcción de donante para probar la capacidad de apuntar a un transgén (receptor del factor de crecimiento nervioso truncado) en el marco del locus diana sin el uso de un promotor exógeno (E). Pudimos apuntar y seleccionar con éxito el transgén utilizando cuentas magnéticas (F). Las barras de error representan /-1 desviación estándar y los valores p se calcularon con una prueba T de Student asumiendo varianzas desiguales. * p < 0,05, ** p < 0,001.

La Figura 29 ilustra la corrección del gen GFP frente a la adición del gen de la hormona del crecimiento humana GFP. Comparamos nuestra estrategia de corrección del gen GFP publicada anteriormente con la adición del gen GFP-hormona de crecimiento humana descrita en este estudio. Las modificaciones de ADN más pequeñas asociadas con la corrección génica ("Corrección del gen GFP") mostraron una mayor frecuencia de orientación en comparación con las inserciones de genes más grandes ("Adición del gen GFP/hGH"). Los TALEN (gris oscuro) demostraron una mayor frecuencia de orientación tanto para la corrección de genes como para la adición de genes en comparación con los ZFN (gris claro). * p < 0,05, ** p < 0,001.

La Figura 30 proporciona los sitios de unión de ZFN y TALEN. Se muestra el locus diana de GFP con una inserción de 85 pb (en negrita en rojo) que hace que el gen de GFP de knock-in endógeno no sea funcional. Los sitios de unión de ZFN izquierdo y derecho (A, SEQ ID NO:25, en negrita en negro) y los sitios de unión de TALEN izquierdo y derecho (B, SEQ ID NO:26, negrita en negro) se representan mostrando superposición y proximidad.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0018] Las composiciones y métodos se describen para la integración de uno o más genes de interés en el ADN celular sin interrumpir sustancialmente la expresión del gen en el locus de integración, es decir, el locus diana. Estas composiciones y métodos son útiles en cualquier aplicación in vitro o in vivo en donde sea deseable expresar un gen de interés en el mismo patrón restringido espacial y temporalmente que el de un gen en un locus diana mientras se mantiene la expresión del gen en el locus diana, por ejemplo, para tratar enfermedades, en la producción de organismos genéticamente modificados en la agricultura, en la producción a gran escala de proteínas por células con fines terapéuticos, de diagnóstico o de investigación, en la inducción de células iPS con fines terapéuticos, de diagnóstico, o con fines de investigación, en investigación biológica, etc. También se describen reactivos, dispositivos y kits de los mismos que encuentran uso en la práctica de los métodos diana. Estos y otros objetos, ventajas y características de las composiciones y métodos descritos en este documento resultarán evidentes para los expertos en la técnica al leer los detalles de las composiciones y métodos como se describe más completamente a continuación.

[0019] Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima de la unidad del límite inferior a menos que el contexto claramente dicte otra cosa, entre los límites superior e inferior de ese rango es también específicamente divulgado. Cada rango más pequeño entre cualquier valor establecido o valor intermedio en un intervalo establecido y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese rango establecido está incluido en la descripción. Los límites superior e inferior de estos rangos más pequeños pueden incluirse o excluirse independientemente en el intervalo, y cada rango en donde ninguno o ambos límites están incluidos en los rangos más pequeños también se incluye dentro de la divulgación, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el rango indicado incluye uno o ambos límites, los rangos que excluyen uno o ambos de los límites incluidos también se incluyen en la descripción.

[0020] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente entendido por un experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento se pueden usar en la práctica o ensayo de la presente invención, ahora se describen algunos métodos y materiales potenciales y preferidos.

[0021] Como será evidente para los expertos en la técnica al leer esta descripción, cada una de las realizaciones individuales descritas e ilustradas aquí tiene componentes y características discretas que pueden separarse fácilmente a partir de o en combinación con las características de cualquiera de las otras varias realizaciones. Cualquier método recitado puede llevarse a cabo en el orden de los eventos recitados o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.

[0022] Hay que señalar que, como se usa aquí y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “ella” incluyen los referentes plurales a menos que el contexto claramente dicte otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de tales células y la referencia al "péptido" incluye la referencia a uno o más péptidos y equivalentes de los mismos, por ejemplo polipéptidos, conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.

Definiciones

[0023] Una "molécula de ADN" se refiere a la forma polimérica de desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina, o citosina) en forma monocatenaria o una hélice de doble cadena. Este término se refiere solo a la estructura primaria y secundaria de la molécula y no la limita a ninguna forma terciaria en particular. Por tanto, este término incluye ADN de doble hebra que se encuentra, entre otras cosas, en moléculas de ADN lineal (p. ej., fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas.

[0024] Tal como se utiliza aquí, un "gen de interés" es una secuencia de ADN que se transcribe en ARN y en algunos casos traduce en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Un gen de interés puede incluir, pero no se limita a, secuencias procariotas, ADNc de ARNm eucariota, secuencias de ADN genómico de ADN eucariota (p. ej., de mamífero) y secuencias de ADN sintéticas. Por ejemplo, un gen de interés puede codificar un miARN, un shARN, un polipéptido nativo (es decir, un polipéptido que se encuentra en la naturaleza) o un fragmento del mismo; un polipéptido variante (es decir, un mutante del polipéptido nativo que tiene menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido nativo) o un fragmento del mismo; un polipéptido de ingeniería o fragmento de péptido, un péptido terapéutico o polipéptido, un marcador de formación de imágenes, un marcador seleccionable, etc.

[0025] Como se usa en este documento, un "locus diana" es una región de ADN en donde se integra un gen de interés, por ejemplo, una región de ADN en un vector, una región de ADN en un fago, una región de ADN cromosómico o mitocondrial en una célula, etc.

[0026] Tal como se utiliza aquí, un "gen diana" o "gen endógeno" o "gen en un locus diana" es un gen que existe naturalmente en un locus de integración, es decir, el gen que es endógeno al locus diana.

[0027] Una "secuencia codificante", por ejemplo, la secuencia de codificación para un gen en un locus diana, es una secuencia de ADN que se transcribe y traduce en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante están determinados por un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de terminación de la traducción en el extremo 3' (carboxilo). Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a, secuencias procariotas, ADNc de ARNm eucariota, secuencias de ADN genómico de ADN eucariota (p. ej., de mamífero) y secuencias de ADN sintéticas. Una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción pueden ubicarse en 3' con respecto a la secuencia codificante.

[0028] Las "secuencias reguladoras de ADN", como se usan en este documento, son secuencias de control de la transcripción y la traducción, tales como promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores y similares, que proporcionan y/o regulan la expresión de una secuencia codificante en una célula huésped.

[0029] Tal como se utiliza aquí, una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unir la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación (dirección 3') corriente abajo. Para los propósitos de definir la presente invención, la secuencia promotora está unida en su extremo 3' por el sitio de inicio de la transcripción y se extiende corriente arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción, así como dominios de unión a proteínas responsables de la unión de la ARN polimerasa. Los promotores eucariotas a menudo, pero no siempre, contienen cajas "TATA" y cajas "CAT". Se pueden usar varios promotores, incluidos los promotores inducibles, para impulsar los diversos vectores para su uso en la presente invención.

[0030] Como se usa en este documento, el término "gen indicador" se refiere a una secuencia codificante cuyo producto puede ensayarse fácilmente y cuantificablemente cuando se monta en el promotor y en algunos casos elementos potenciadores se introducen en tejidos o células. El promotor puede ser un promotor constitutivamente activo, es decir, un promotor es activo en ausencia de agentes aplicados externamente, o puede ser un promotor inducible, es decir, un promotor cuya actividad se regula tras la aplicación de un agente a la célula, por ejemplo, doxiciclina.

[0031] Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago, virus, o cósmido, al cual otro segmento de ADN, es decir, una "inserción", pueden estar unidos a fin de provocar la replicación del segmento unido.

[0032] Un "casete de expresión" comprende una secuencia de codificación de ADN unida operativamente a un promotor. Por "unido operativamente" se entiende que el promotor controla eficazmente la expresión de la secuencia codificante.

[0033] Una "construcción de ADN" es una molécula de ADN que comprende un vector y un inserto, por ejemplo, un casete de expresión.

[0034] Por un "péptido 2A" se quiere decir una pequeña secuencia (18-22 aminoácidos) que permite la producción eficiente estequiométrica de productos de proteína discretas dentro de un marco de lectura único a través de un evento de salto ribosomal, dentro de la secuencia peptídica 2A.

[0035] Por un "sitio de entrada ribosomas interno" o "IRES" se quiere decir una secuencia de nucleótidos que permite la iniciación de la traducción de proteínas en el medio de una secuencia ARN mensajero (ARNm).

[0036] Por una "inteína" se quiere decir un segmento de un polipéptido que es capaz de escindir en sí y reunirse con las porciones restantes (las "exteínas") con un enlace peptídico.

[0037] Por un "intrón" se quiere decir una secuencia de nucleótidos dentro de un gen que se elimina por empalme de ARN para generar el producto de ARN maduro definitivo de un gen.

[0038] Una célula se ha "transformado" o "transfectado" por ADN exógeno o heterólogo, por ejemplo, una construcción de ADN, cuando dicho ADN se ha introducido dentro de la célula. El ADN transformante puede o no estar integrado (unido covalentemente) en el genoma de la célula. En células procariotas, de levadura y de mamíferos, por ejemplo, el ADN transformante puede mantenerse en un elemento episomal como un plásmido. Con respecto a las células eucariotas, una célula transformada de manera estable es aquella en donde el ADN transformante se ha integrado en un cromosoma de modo que las células hijas lo heredan a través de la replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula eucariota para establecer líneas celulares o clones compuestos por una población de células hijas que contienen el ADN transformante. Un "clon" es una población de células derivadas de una sola célula o ancestro común por mitosis. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de un crecimiento estable in vitro durante muchas generaciones.

[0039] "Enlace" como se usa en el presente documento, por ejemplo con referencia a los dominios de unión de ADN, se refiere a una secuencia específica, interacción no covalente entre macromoléculas (p. ej., entre una proteína y un ácido nucleico). No todos los componentes de una interacción de unión necesitan ser específicos de secuencia (p. ej., contactos con residuos de fosfato en una cadena principal de ADN), siempre que la interacción en su conjunto sea específica de secuencia. Tales interacciones se caracterizan generalmente por una constante de disociación (Kd) de menos de 10-6 M, menos de 10-7 M, menos de 10-8 M, menos de 10-9 M, menos de 10-10 M, menos de 10-11 M, menos de 10-12 M, menos de 10-13 M, menos de 10-14 M, o menos de 10-15 M. "Afinidad" se refiere a la fuerza de unión, estando correlacionada la afinidad de unión aumentada con una Kd menor.

[0040] Por "dominio de unión" se entiende un dominio de proteína que es capaz de unirse no covalentemente a otra molécula. Un dominio de unión puede unirse, por ejemplo, a una molécula de ADN (una proteína de unión a ADN), una molécula de ARN (una proteína de unión a ARN) y/o una molécula de proteína (una proteína de unión a proteínas). En el caso de una proteína de unión a un dominio de proteína, puede unirse a sí misma (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) y/o puede unirse a una o más moléculas de una proteína o proteínas diferentes.

[0041] Por "dominio de unión a ADN heterólogo" se entiende un dominio en una proteína que no se encuentra en la unión de ADN de proteína nativa. Por ejemplo, en una proteína de fusión de dominio de unión a ADN Spo11 en donde el dominio de unión a ADN es un dominio de unión a ADN heterólogo, el dominio de unión a ADN es de una proteína distinta de Spo11.

[0042] Una "región accesible" es un sitio de la cromatina celular en donde un sitio diana presente en el ácido nucleico puede ser vinculado por una molécula exógena que comprende un dominio de unión a ADN que reconoce el sitio de destino. Un "sitio diana" o "secuencia diana" es una secuencia de ácido nucleico que define una porción de un ácido nucleico al que se unirá una molécula de unión de ADN, siempre que existan condiciones suficientes para la unión. Por ejemplo, la secuencia 5'-GAATTC-3' es un sitio diana para la endonucleasa de restricción Eco RI.

[0043] Por "escisión" se entiende la rotura de la columna vertebral covalente de una molécula de ADN. La escisión puede iniciarse mediante una variedad de métodos que incluyen, pero no se limitan a, hidrólisis enzimática o química de un enlace fosfodiéster. Tanto la escisión monocatenaria como la escisión bicatenaria son posibles, y la escisión bicatenaria puede ocurrir como resultado de dos eventos de escisión monocatenaria distintos. La escisión del ADN puede resultar en la producción de extremos romos o extremos escalonados. En determinadas realizaciones, los polipéptidos de fusión se utilizan para la escisión de ADN de doble hebra dirigida.

[0044] "Nucleasa" y "endonucleasa" se usan indistintamente en el presente documento para significar una enzima que posee actividad catalítica para la escisión de ADN.

[0045] Por "dominio de escisión" o "dominio activo" de una nucleasa se entiende la secuencia de polipéptido o dominio dentro de la nucleasa que posee la actividad catalítica para la escisión de ADN. Un dominio de escisión puede estar contenido en una única cadena polipeptídica o la actividad de escisión puede resultar de la asociación de dos (o más) polipéptidos.

[0046] Por "nucleasa dirigida" se quiere decir una nucleasa que se dirige a una secuencia de ADN específica. Las nucleasas dirigidas se dirigen a una secuencia de ADN específica por el dominio de unión de ADN al que están fusionadas. En otras palabras, la nucleasa se guía a una secuencia de ADN, por ejemplo, una secuencia cromosómica o una secuencia extracromosómica, por ejemplo, una secuencia episómica, una secuencia de minicírculo, una secuencia mitocondrial, una secuencia de cloroplasto, etc., en virtud de su fusión a un dominio de unión a ADN con especificidad para la secuencia de ADN diana de interés.

[0047] Por "recombinación" se entiende un proceso de intercambio de información genética entre dos polinucleótidos. Como se usa en este documento, "recombinación homóloga (RH)" se refiere a la forma especializada de dicho intercambio que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparación de roturas de doble hebra en células. Este proceso requiere homología de secuencia de nucleótidos, utiliza una molécula "donante" para reparar el molde de una molécula "objetivo" (es decir, la que experimentó la rotura de la doble hebra) y conduce a la transferencia de información genética del donante a la diana. La recombinación homóloga puede dar como resultado una alteración de la secuencia de la molécula diana, si el polinucleótido donante difiere de la molécula diana y parte o toda la secuencia del polinucleótido donante se incorpora al polinucleótido diana.

[0048] Los métodos generales de la bioquímica molecular y celular se pueden encontrar en libros de texto estándar tal como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed. (Sambrook y col., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4a ed. (Ausubel y col. Eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag y col., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. Eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); y Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998). Los reactivos, los vectores de clonación y los kits para la manipulación genética a los que se hace referencia en esta descripción están disponibles de proveedores comerciales como BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich y ClonTech.

[0049] Como se resume anteriormente, las composiciones y métodos se describen, por la integración de un gen de interés en celular de ADN sin alterar sustancialmente la expresión del gen en el locus de integración, es decir, el locus diana. En otras palabras, la expresión normal del gen que reside en el locus diana (el "gen endógeno" o "gen diana") se mantiene espacialmente(es decir, en las células y tejidos en los que normalmente se expresaría), temporalmente (es decir, en los momentos correctos, por ejemplo, durante el desarrollo, durante la respuesta celular, etc.), y a niveles que no cambian sustancialmente de los niveles normales, por ejemplo, a niveles que difieren 5 veces o menos de los niveles normales, por ejemplo, 4 veces o menos, o 3 veces o menos, más generalmente 2 veces o menos de los niveles normales, después de la integración dirigida del gen de interés en el locus diana. Por "integración" se entiende que el gen de interés se inserta de manera estable en el genoma celular, es decir, se une covalentemente a la secuencia de ácido nucleico dentro del ADN cromosómico o mitocondrial de la célula. Por "integración dirigida" se entiende que el gen de interés se inserta en el ADN cromosómico o mitocondrial de la célula en un sitio específico, o "sitio de integración". Estas composiciones y métodos son particularmente beneficiosos porque proporcionan la modificación genética del ADN celular y la expresión de uno o más genes de interés, por ejemplo, un gen que codifica un polipéptido terapéutico o péptido del mismo, un gen que codifica un marcador de imagen, un gen que codifica un marcador, etc., de ese ADN celular sin afectar las funciones celulares promovidas por el gen que se expresa a partir de ese ADN celular.

[0050] En la descripción de aspectos de la divulgación, las composiciones se describirán primero, seguido de métodos para su uso.

COMPOSICIONES

[0051] En la realización de los procedimientos objeto, un gen de interés se proporciona a las células en un polinucleótido donante, también se hace referencia en el presente documento como un "polinucleótido dirigido" o "vector dirigido". En otras palabras, las células se ponen en contacto con un polinucleótido donante que comprende la secuencia de ácido nucleico que se integrará en el genoma celular mediante integración dirigida. Para promover la integración dirigida, el polinucleótido donante puede comprender secuencias de ácido nucleico que promueven la recombinación homóloga en el sitio de integración. La recombinación homóloga se refiere al intercambio de material de ácido nucleico que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparación de roturas de doble hebra en las células, por ejemplo, roturas de doble hebra provocadas por una nucleasa diana. Este proceso requiere homología de secuencia de nucleótidos, utilizando la molécula "donante", por ejemplo, el polinucleótido donante, para la reparación del molde de una molécula "diana", es decir, el ácido nucleico que experimentó la ruptura de la doble hebra, por ejemplo, un locus diana en el genoma celular y conduce a la transferencia de información genética del donante a la diana. Como tal, en los polinucleótidos donantes de las composiciones diana, el gen de interés puede estar flanqueado por secuencias que contienen suficiente homología con una secuencia genómica en el sitio de escisión, por ejemplo, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de homología con las secuencias de nucleótidos que flanquean el sitio de escisión, por ejemplo, dentro de aproximadamente 50 bases o menos del sitio de escisión, p. ej., Dentro de aproximadamente 30 bases, dentro de aproximadamente 15 bases, dentro de aproximadamente 10 bases, dentro de aproximadamente 5 bases, o flanqueando inmediatamente el sitio de escisión, para apoyar la recombinación homóloga entre él y la secuencia genómica con la que tiene homología. Aproximadamente 25, 50, 100 o 200 nucleótidos o más de homología de secuencia entre un donante y una secuencia genómica apoyarán la recombinación homóloga entre ellos.

[0052] Las secuencias de recombinación de flanqueo pueden ser de cualquier longitud, por ejemplo, 10 nucleótidos o más, 50 nucleótidos o más, 100 nucleótidos o más, 250 nucleótidos o más, 500 nucleótidos o más, 1000 nucleótidos (1 kb) o más, 5000 nucleótidos (5 kb) o más, 10000 nucleótidos (10 kb) o más, etc. Generalmente, la región o regiones homólogas de una secuencia donante tendrán al menos 50% de identidad de secuencia con una secuencia genómica con la que se desea la recombinación. En determinadas realizaciones, está presente una identidad de secuencia del 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 99,9%. Puede estar presente cualquier valor entre 1% y 100% de identidad de secuencia, dependiendo de la longitud del polinucleótido donante.

[0053] En algunos casos, las secuencias flanqueantes pueden ser sustancialmente iguales en longitud a la otra, por ejemplo, uno puede ser 30% más corto o menor que la otra secuencia de flanqueo, 20% más corto o menor que la otra secuencia de flanqueo, 10% más corto o menos que la otra secuencia flanqueante, 5% más corta o menos que la otra secuencia flanqueante, 2% más corta o menos que la otra secuencia flanqueante, o sólo unos pocos nucleótidos menos que la otra. En otros casos, las secuencias flanqueantes pueden tener una longitud sustancialmente diferente entre sí, por ejemplo, una puede ser un 40% más corta o más, un 50% más corta o más, a veces un 60% más corta o más, un 70% más corta o más, un 80% más corta o más corta. más, 90% más corto o más, o 95% más corto o más que la otra secuencia flanqueante.

[0054] En algunos casos, las secuencias genómicas para las que las secuencias homólogas que flanquean en el polinucleótido de donantes tienen homología son secuencias que son utilizadas por las nucleasas o recombinasas específicas de sitio, por ejemplo integrasas, resolvasas, y similares, para promover la recombinación específica de sitio, por ejemplo, como se conoce en la técnica y como se describe con mayor detalle a continuación.

[0055] El polinucleótido donante típicamente también comprenderá uno o más elementos adicionales que proporcionan la expresión del gen de interés sin interrumpir sustancialmente la expresión del gen en el locus diana. Por ejemplo, el polinucleótido donante puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido 2A situado junto al gen de interés. Ver, por ejemplo, la Figura 1. Por un "péptido 2A" se entiende una pequeña secuencia de péptidos (18-22 aminoácidos) que permite una expresión concordante, estequiométrica y eficiente de productos proteicos discretos dentro de un solo vector, independientemente del orden de la colocación de los genes dentro del vector, mediante salto ribosómico. Los péptidos 2A son fácilmente identificables por su motivo de consenso (DVEXNPGP) y su capacidad para promover la escisión de proteínas. Se puede usar cualquier péptido 2A conveniente en el polinucleótido del donante, por ejemplo, el péptido 2A de un virus como el virus de la fiebre aftosa (F2A), el virus de la rinitis A equina, el teschovirus-1 porcino (P2A) o el virus de Thosea asigna (T2A), o cualquiera de los péptidos 2A descritos en Szymczak-Workman, A. et al. "Design and Construction of 2A Peptide-Linked Multicistronic Vectors". Adaptado de: Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA (ed. Friedmann y Rossi). CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, EE.UU., 2007.

[0056] Típicamente, el gen de interés y el péptido 2A se posicionará en el polinucleótido de donantes a fin de proporcionar para la expresión ininterrumpida del gen en el locus diana después de la inserción de la gen de interés. Por ejemplo, puede ser deseable insertar el gen de interés en un sitio de integración que esté 3', o "cadena abajo" del codón de iniciación del gen en el locus diana, por ejemplo, dentro de los primeros 50 nucleótidos 3' del codón de iniciación (es decir, el ATG de inicio) para el gen en el locus diana, por ejemplo, dentro de los primeros 25 nucleótidos 3' del codón de iniciación, dentro de los primeros 10 nucleótidos 3' del codón de iniciación, dentro de los primeros 5 nucleótidos 3' del codón de iniciación, o en algunos casos, inmediatamente 3' del codón de iniciación, es decir, adyacentes al codón de iniciación. En tales casos, el péptido 2A se colocaría dentro del polinucleótido donante de manera que esté inmediatamente en 3' con respecto al gen de interés, y se seleccionarán secuencias de recombinación flanqueantes que guiarán la recombinación homóloga y la integración del gen de interés al sitio de integración que está 3' del codón de iniciación en el locus diana. Consulte, por ejemplo, la Figura 1A. Como otro ejemplo, puede ser deseable insertar el gen de interés en un sitio de integración que está 5', o "cadena arriba" del codón de terminación del gen en el locus diana, por ejemplo, dentro de los primeros 50 nucleótidos 5' del codón de terminación (es decir, el codón de terminación, por ejemplo, TAA, TAG o t Ga ), por ejemplo, dentro de los primeros 25 nucleótidos 5' del codón de terminación, dentro de los primeros 10 nucleótidos 5' del codón de terminación, dentro de los primeros 5 nucleótidos del codón de terminación, o en algunas realizaciones, inmediatamente 5' del codón de terminación, es decir, adyacente al codón de terminación. En tales casos, el péptido 2A se colocaría dentro del polinucleótido donante de manera que esté inmediatamente en 5' del gen de interés, y se seleccionarán secuencias de recombinación flanqueantes que guiarán la recombinación homóloga y la integración del gen de interés al sitio de integración que es 5' del codón de terminación en el locus diana. Consulte, por ejemplo, la Figura 1B.

[0057] Como ejemplo adicional, el polinucleótido donante puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica un sitio de entrada al ribosoma interno situado en posición adyacente al gen de interés. Consulte la Figura 2. Por un "sitio de entrada de ribosoma interno" o "IRES" se entiende una secuencia de nucleótidos que permite el inicio de la traducción de proteínas en el medio de una secuencia de ARN mensajero (ARNm). Por ejemplo, cuando un segmento de IRES se encuentra entre dos marcos de lectura abiertos en una molécula de ARNm eucariota bicistrónica, puede impulsar la traducción de la región codificante de proteínas corriente abajo independientemente de la estructura de la tapa 5' unida al extremo 5' de la molécula de ARNm., es decir, delante de la región codificante de la proteína corriente arriba. En tal configuración, ambas proteínas se producen en la célula. La proteína ubicada en el primer cistrón se sintetiza mediante el enfoque de iniciación dependiente del casquete, mientras que la iniciación de la traducción de la segunda proteína está dirigida por el segmento IRES ubicado en la región espaciadora intercistrónica entre las dos regiones codificantes de la proteína. Los IRES se han aislado de genomas virales y genomas celulares. Los IRES diseñados artificialmente también son conocidos en la técnica. Puede emplearse cualquier IRES conveniente en el polinucleótido donante.

[0058] Típicamente, como con el péptido 2A, el gen de interés y IRES se posicionará en el polinucleótido de donantes con el fin de proporcionar la expresión ininterrumpida del gen en el locus diana tras la inserción del gen de interés. Por ejemplo, puede ser deseable insertar el gen de interés en un sitio de integración dentro de la región no traducida (UTR) 5' del gen en el locus diana. En tales casos, el IRES se colocaría dentro del polinucleótido donante de manera que esté inmediatamente en 3' con respecto al gen de interés, y se seleccionarán secuencias de recombinación flanqueantes que guiarán la recombinación homóloga y la integración del casete del gen de interés-IRES al sitio de integración dentro de la UTR de 5'. Ver, por ejemplo, la Figura 2A. Como otro ejemplo, puede ser deseable insertar el gen de interés en un sitio de integración dentro de la UTR3' del gen en el locus diana, es decir, corriente abajo del codón de terminación, pero corriente arriba de la secuencia de poliadenilación. En tales casos, el IRES se colocaría dentro del polinucleótido donante de manera que esté inmediatamente en 5' del gen de interés, y se seleccionarán secuencias de recombinación flanqueantes que guiarán la recombinación homóloga y la integración del casete del gen IRES de interés al sitio de integración dentro del 3' UTR del gen en el locus diana. Consulte, por ejemplo, la Figura 2B.

[0059] Como otro ejemplo, el polinucleótido donante puede comprender secuencias de ácidos nucleicos que configuran el gen de interés en una estructura de tipo inteína. Véase la Figura 3. Por "inteína" se entiende un segmento de un polipéptido que es capaz de escindirse a sí mismo y volver a unir las porciones restantes de la secuencia polipeptídica traducida (las "exteínas") con un enlace peptídico. En otras palabras, el polinucleótido donante comprende secuencias de ácido nucleico que, cuando se traducen, promueven la escisión de la proteína codificada por el gen de interés del polipéptido que se traduce del locus diana modificado. Las inteínas pueden ser de origen natural, es decir, inteínas que catalizan espontáneamente una reacción de corte y empalme de proteínas para escindir sus propias secuencias y unirse a las secuencias de exteína flanqueantes, o artificiales, es decir, inteínas que han sido diseñadas para sufrir un empalme controlable. Las inteínas comprenden típicamente una región de empalme N-terminal que comprende una Cys (C), Ser (S), Ala (A), Gln (Q) o Pro (P) en la posición más N-terminal y una secuencia TXXH corriente abajo; y una región de empalme C-terminal que comprende una Asn (N), Gln (Q) o Asp (D) en la posición más C-terminal y una His (H) en la penúltima posición C-terminal. En adición, una Cys (C), Ser (S), o Thr (T) se encuentra en la posición 1 de la exteína de la que se corta y empalma la inteína (-1 y 1 de la exteína se define como las posiciones inmediatamente N-terminal y C-terminal, respectivamente, al sitio de inserción de inteína). Véase, por ejemplo, el diagrama siguiente:

El mecanismo por el cual las inteínas promueven el empalme de proteínas y los requisitos para el empalme de inteínas se pueden encontrar en Liu, XQ, "Protein Splicing Intein: Genetic Mobility, Origin, and Evolution" Annual Review of Genetics 2000, 34: 61-76 y en bases de datos disponibles públicamente como, por ejemplo, la base de datos InBase en el sitio web de New England Biolabs, que se encuentra en la red mundial en "tools (dot) neb (dot) com/inbase/mech (punto) php”. Cualquier secuencia, por ejemplo, regiones de empalme N-terminal y regiones de empalme C-terminal, conocidas por conferir escisión asociada a inteína, ya sea escisión espontánea o controlada, en un polinucleótido donante,encontrar uso en las composiciones diana. Los genes de interés que están configurados como inteínas pueden insertarse en un sitio de integración en cualquier exón de un locus diana, es decir, entre el codón de inicio y el codón de terminación del gen en el locus diana. Véase, por ejemplo la Figura 3.

[0060] Como otro ejemplo, el polinucleótido donante puede comprender secuencias de ácidos nucleicos que configuran el gen de interés en una estructura de intrón. Ver Figura 4. Por "intrón" se entiende cualquier secuencia de nucleótidos dentro de un gen que se elimina mediante empalme de ARN para generar el producto de ARN maduro final de un gen. En otras palabras, el polinucleótido donante comprende secuencias de ácido nucleico que, cuando se transcriben, promueven la escisión del pre-ARN codificado por el gen de interés del pre-ARN que se transcribe del locus diana modificado, lo que permite que el gen de interés sea traducido por separado del ARNm del locus diana. Los intrones comprenden típicamente un sitio de empalme 5' (donante de empalme), un sitio de empalme 3' (aceptor de especias) y un sitio de ramificación. El donante de empalme incluye una secuencia GU casi invariable en el extremo 5' del intrón. El aceptor de empalme termina el intrón con una secuencia AG casi invariante. Corriente arriba (5') del aceptor de empalme hay una región rica en pirimidinas (C y U) o un tracto de polipirimidina. Corriente arriba del tracto de polipirimidina está el punto de ramificación, que incluye un nucleótido de adenina. Además de comprender estos elementos, el polinucleótido donante puede comprender una o más secuencias adicionales que promueven la traducción del ARNm transcrito del gen de interés, por ejemplo, una secuencia consenso de Kozak, un sitio de unión ribosómico, un sitio de entrada de ribosoma interno, etc. Los genes de interés que están configurados como intrones pueden insertarse en un sitio de integración dentro de la secuencia transcrita de un locus diana en cualquier lugar 5' de la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de poliadenilación, por ejemplo, la región no traducida 3', la secuencia codificante o la región 5' no traducida del gen en el locus diana. Véase, por ejemplo la Figura 4.

[0061] Como otro ejemplo, el polinucleótido donante puede comprender la secuencia de codificación, por ejemplo, ADNc, para el gen en el locus diana. La integración de la secuencia de codificación del gen en el locus diana en el locus diana tiene muchos usos. Por ejemplo, la integración de la secuencia codificante del gen en el locus diana que está corriente abajo, o 3', del sitio de inserción asegurará que la expresión del gen no se interrumpa sustancialmente por la integración del gen de interés. Como otro ejemplo, puede ser deseable integrar la secuencia codificante del gen en el locus diana para expresar una secuencia génica que sea una variante de la del locus diana de la célula, por ejemplo, si el gen en el locus diana de la célula es mutante, por ejemplo, para complementar un locus diana mutante con una secuencia de gen de tipo silvestre para tratar un trastorno genético. Si la expresión tanto del ADNc del gen en el locus diana como del gen de interés va a ser regulada por el promotor en el locus diana, la secuencia del ADNc endógeno y el gen de interés se pueden proporcionar en el polinucleótido donante como un casete con un péptido 2A que separa las secuencias. Consulte, por ejemplo, la Figura 5A. Alternativamente, puede ser deseable expresar el gen de interés a partir de un promotor separado, por ejemplo, un promotor inducible, o un promotor que se expresa en células distintas de aquellas en las que el promotor en el locus diana está activo. En tales casos, el gen de interés puede estar operativamente ligado a un promotor diferente, y la secuencia de ADNc colocada 5' del gen de interés en el polinucleótido donante de manera que estará operativamente ligado al promotor en el locus. Consulte, por ejemplo, la Figura 5B.

[0062] Como se ilustra por el ejemplo anterior, en algunos casos, puede ser deseable insertar dos o más genes de interés, por ejemplo tres o más, 4 o más, o 5 o más genes de interés en un locus diana. En tales casos, pueden usarse múltiples péptidos 2A o IRES para crear un polinucleótido donante bicistrónico o multicistrónico. Véase, por ejemplo, la Figura 6A, en donde un gen de interés y un marcador seleccionable se integran en la región 3' del gen en el locus diana, utilizándose péptidos 2A para promover su escisión a partir del polipéptido diana y entre sí. Alternativamente, como se muestra en la Figura 6B, se pueden proporcionar secuencias codificantes de interés adicionales en el polinucleótido donante bajo el control de un promotor distinto del del gen en el locus diana.

[0063] El polinucleótido donante también puede comprender secuencias, por ejemplo, sitios de restricción, polimorfismos de nucleótido, marcadores seleccionables, etc., que pueden usarse para evaluar para la inserción exitosa del gen de interés en el sitio de escisión. Además, el polinucleótido donante también puede comprender una cadena principal de vector que contiene secuencias que no son homólogas a la región de ADN de interés y que no están destinadas a la inserción en la región de ADN de interés.

MÉTODOS

[0064] Los polinucleótidos donantes descritos en este documento pueden usarse para modificar genéticamente el ADN cromosómico o mitocondrial de una célula en cualquier sitio conveniente. Ejemplos de loci diana de particular interés para la integración de un gen de interés incluyen, sin limitación, actina, ADA, albúmina, a-globina, p-globina, yglobina, CD2, CD3, CD5, CD7, E1a, IL2RG, Ins1, InS2, NCF1, p50, p65, PF4, PGC-y, PTEN, TERT, UBC y VWF. Se puede apuntar a cualquier ubicación conveniente dentro de un locus diana, configurándose el polinucleótido donante como se describió anteriormente y las figuras adjuntas para proporcionar la integración dirigida sin alterar el gen mencionado anteriormente.

[0065] El polinucleótido donante puede ser proporcionado a las células como ADN monocatenario o ADN de doble cadena. Puede introducirse en una célula en forma lineal o circular. Si se introduce en forma lineal, los extremos del polinucleótido donante pueden protegerse (p. ej., de la degradación exonucleolítica) mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se añaden uno o más residuos de didesoxinucleótidos al extremo 3' de una molécula lineal y/o se ligan oligonucleótidos autocomplementarios a uno o ambos extremos. Véase, por ejemplo, Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad Sci EE.UU. 84: 4959-4963; Nehls y col. (1996) Science 272: 886-889. Los métodos adicionales para proteger polinucleótidos exógenos de la degradación incluyen, pero no se limitan a, la adición de grupos amino terminales y el uso de enlaces internucleotídicos modificados tales como, por ejemplo, fosforotioatos, fosforamidatos y residuos de O-metilo ribosa o desoxirribosa. Como alternativa a la protección de los extremos de una secuencia donante lineal, se pueden incluir longitudes adicionales de secuencia fuera de las regiones de homología que pueden degradarse sin afectar a la recombinación.

[0066] El polinucleótido donante puede ser introducido en una célula como parte de una molécula de vector. Se encuentran disponibles muchos vectores, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, minicírculos, fagos, virus, etc., útiles para transferir ácidos nucleicos a células diana. Los vectores que comprenden el (los) ácido(s) nucleico(s) pueden mantenerse episómicamente, p. ej. como plásmidos, ADN de minicírculo, virus tales como citomegalovirus, adenovirus, etc., o pueden integrarse en el genoma de la célula diana, mediante recombinación homóloga o integración aleatoria, p. ej. vectores derivados de retrovirus tales como MMLV, VIH-1, ALV, etc. La molécula de vector puede tener secuencias adicionales tales como, por ejemplo, orígenes de replicación, promotores y genes que codifican resistencia a antibióticos. Los vectores pueden proporcionarse directamente a las células diana. En otras palabras, las células se ponen en contacto con vectores que comprenden el polinucleótido donante de manera que las células absorben los vectores. Los métodos para poner en contacto células con vectores de ácido nucleico que son plásmidos, tales como electroporación, transfección con cloruro de calcio y lipofección, son bien conocidos en la técnica. El ADN puede introducirse como ácido nucleico desnudo, como ácido nucleico complejado con un agente como un liposoma o poloxámero, o puede administrarse mediante virus (p. ej., adenovirus, AAV).

[0067] Para la entrega de vector viral, las células pueden ponerse en contacto con las partículas virales que comprenden el polinucleótido de donantes. Los retrovirus, por ejemplo, los lentivirus, son particularmente adecuados para el método de la invención. Los vectores retrovirales comúnmente usados son "defectuosos", es decir, incapaces de producir proteínas virales requeridas para una infección productiva. Más bien, la replicación del vector requiere el crecimiento en una línea celular empaquetadora. Para generar partículas virales que comprenden genes de interés, los ácidos nucleicos retrovirales que comprenden el ácido nucleico se empaquetan en cápsides virales mediante una línea celular empaquetadora. Diferentes líneas celulares de empaquetamiento proporcionan una proteína de envoltura diferente (ecotrópica, anfotrópica o xenotrópica) para ser incorporada a la cápside, esta proteína de envoltura determina la especificidad de la partícula viral para las células (ecotrópica para murinos y ratas; anfotrópica para la mayoría de los tipos de células de mamíferos, incluyendo humano, perro y ratón; y xenotrópica para la mayoría de los tipos de células de mamíferos excepto las células murinas). Puede usarse la línea celular de empaquetamiento apropiada para asegurar que las células sean la diana de las partículas virales empaquetadas. Los métodos para introducir los vectores retrovirales que comprenden el polinucleótido donante en líneas celulares de empaquetamiento y para recolectar las partículas virales que son generadas por las líneas de empaquetamiento son bien conocidos en la técnica.

[0068] En algunas realizaciones, la integración dirigida es promovida por la presencia de secuencias en el polinucleótido de donantes que son homólogas a secuencias que flanquean el sitio de integración. Por ejemplo, la integración dirigida utilizando los polinucleótidos donantes descritos en el presente documento puede lograrse siguiendo técnicas de transfección convencionales, por ejemplo, técnicas utilizadas para crear knockouts o knockins de genes mediante recombinación homóloga.

[0069] En otras realizaciones, la integración dirigida se promueve tanto por la presencia de secuencias en el donante de polinucleótido que son homólogas a secuencias que flanquean el sitio de integración, y poniendo en contacto las células con polinucleótido donante en presencia de una recombinasa específica de sitio. Por recombinasa específica de sitio, o simplemente recombinasa, se entiende un polipéptido que cataliza la recombinación conservadora específica de sitio entre sus sitios de recombinación compatibles. Como se usa en el presente documento, una recombinasa específica de sitio incluye polipéptidos nativos, así como derivados, variantes y/o fragmentos que retienen actividad, y polinucleótidos nativos, derivados, variantes y/o fragmentos que codifican una recombinasa que retiene actividad.

[0070] Por ejemplo, una recombinasa puede ser de las familias de la integrasa o resolvasa. La familia Integrasa de recombinasas tiene más de cien miembros e incluye, por ejemplo, FLP, Cre, integrasa lambda y R. La familia Integrasa, también conocida como la familia de la tirosina o la familia de la integrasa lambda (A), utiliza la tirosina catalítica grupo hidroxilo para un ataque nucleofílico en el enlace fosfodiéster del ADN. Por lo general, los miembros de la familia de las tirosinas cortan inicialmente el ADN, que luego forma una rotura de doble hebra. Los ejemplos de integrasa de la familia de tirosina incluyen Cre, FLP, SSV1 y la integrasa lambda (A). En la familia de las resolvasas, también conocida como familia de la serina recombinasa, un residuo de serina conservado forma un enlace covalente al sitio diana del ADN (Grindley, et al., (2006) Ann Rev Biochem 16:16). Ejemplos de resolvasas incluyen $C31 Int, R4, TP901-1, A118, $FC1, TnpX y CisA. Otros sistemas de recombinación incluyen, por ejemplo, el sistema de recombinación específico de sitio SSV1 de Sulfolobus shibatae (Maskhelishvili, et al., (1993) Mol Gen Genet 237: 334-42); y un sistema de integración retroviral basado en integrasa (Tanaka, et al., (1998) Gene 17: 67-76).

[0071] A veces, la recombinasa es uno que no requiere cofactores o un sustrato superenrollado, incluyendo, pero no limitado a Cre, FLP, y derivados activos, variantes o fragmentos de los mismos. La recombinasa FLP cataliza una reacción específica del sitio durante la replicación del ADN y la amplificación del plásmido de dos micrones de S. cerevisiae. La recombinasa FLP cataliza la recombinación específica del sitio entre dos sitios FRT. La proteína FLP se ha clonado y expresado (Cox, (1993) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 80: 4223-7). Se conocen derivados funcionales, variantes y fragmentos de FLP (Buchholz, et al., (1998) Nat Biotechnol 16: 617-8, Hartung, et al., (1998) J Biol Chem 273: 22884-91, Saxena, et al. al., (1997) Biochim Biophys Acta 1340: 187-204, y Hartley, et al., (1980) Nature 286: 860-4). La recombinasa Cre bacteriófago cataliza la recombinación específica de sitio entre dos sitios lox (Guo, et al., (1997) Nature 389: 40-6; Abremski, et al., (1984) J Biol Chem 259: 1509-14; Chen, et al., (1996) Somat Cell Mol Genet 22: 477-88; Shaikh, et al., (1977) J Biol Chem 272: 5695-702; y, Buchholz, et al., (1998) Nat Biotechnol 16: 617-8.

[0072] Los métodos para modificar la cinética, la interacción de cofactor y los requisitos, la expresión, las condiciones óptimas, y/o reconocimiento del sitio de especificidad, y la detección de la actividad de recombinasas y se conocen variantes, véase por ejemplo Miller, et al., (1980) Cell 20: 721-9; Lange-Gustafson y Nash, (1984) J Biol Chem 259: 12724-32; Christ, et al., (1998) J Mol Biol 288: 825-36; Lorbach, et al., (2000) J Mol Biol 296: 1175-81; Vergunst, et al., (2000) Science 290: 979-82; Dorgai, et al., (1995) J Mol Biol 252: 178-88; Dorgai, et al., (1998) J Mol Biol 277: 1059­ 70; Yagu, et al., (1995) J Mol Biol 252: 163-7; Sclimente, et al., (2001) Nucleic Acids Res 29: 5044- 51; Santoro y Schultze, (2002) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 99: 4185-90; Buchholz y Stewart, (2001) Nat Biotechnol 19: 1047-52; Voziyanov, et al., (2002) Nucleic Acids Res 30: 1656-63; Voziyanov y col., (2003) J Mol Biol 326: 65-76; Klippel y col., (1988) EMBO J 7: 3983-9; Arnold y col., (1999) EMBO J 18: 1407-14; WO03/08045; WO99/25840; y WO99/25841.

[0073] Una recombinasa se puede proporcionar a través de un polinucleótido que codifica la recombinasa o se puede expresar de forma estable por la célula. Se puede usar cualquier sitio de reconocimiento para una recombinasa en el sitio de integración y en el polinucleótido donante, incluidos los sitios y variantes de origen natural. Los sitios de reconocimiento varían desde aproximadamente 30 sitios mínimos de nucleótidos hasta unos pocos cientos de nucleótidos. En algunas realizaciones, la presencia de la recombinasa mejorará la eficiencia de integración, por ejemplo, 2 veces o más, por ejemplo, 3 veces, 4 veces, 5 veces o más, en algunos casos 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces o más con respecto a lo observado en ausencia de la enzima. Para revisiones de recombinasas específicas de sitio y sus sitios de reconocimiento, ver Sauer (1994) Curr Op Biotechnol 5: 521-7; y Sadowski, (1993) FASEB 7: 760-7.

[0074] En otras realizaciones, la integración dirigida se promueve tanto por la presencia de secuencias en el donante de polinucleótido que son homólogas a secuencias que flanquean el sitio de integración, y poniendo en contacto las células con polinucleótido donante en presencia de una nucleasa específica. Por "nucleasa dirigida" se entiende una nucleasa que escinde una secuencia de ADN específica para producir una ruptura de doble hebra en esa secuencia. En estos aspectos del método, este sitio de escisión se convierte en el sitio de integración para uno o más genes de interés. Como se usa en el presente documento, una nucleasa incluye nucleasas de origen natural así como nucleasas recombinantes, es decir, modificadas por ingeniería.

[0075] Un ejemplo de una nucleasa específica que se puede usar en los procedimientos es una nucleasa de dedos de cinc o "ZFN". Las ZFN son nucleasas dirigidas que comprenden una nucleasa fusionada a un dominio de unión al ADN con dedos de zinc. Por "dominio de unión al ADN con dedos de zinc" o "ZFBD" se entiende un dominio polipeptídico que se une al ADN de una manera específica de secuencia a través de uno o más dedos de zinc. Un dedo de zinc es un dominio de aproximadamente 30 aminoácidos dentro del dominio de unión del dedo de zinc cuya estructura se estabiliza mediante la coordinación de un ión de zinc. Ejemplos de dedos de zinc incluyen dedos de zinc C²H² , dedos de zinc C³H y dedos de zinc C⁴. Un dominio de dedos de zinc "diseñado" es un dominio que no ocurre en la naturaleza cuyo diseño/composición resulta principalmente de criterios racionales, por ejemplo, la aplicación de reglas de sustitución y algoritmos computarizados para procesar información en una base de datos que almacena información de diseños ZFP existentes y datos vinculantes. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N° 6,140,081; 6,453,242; y 6,534,261; ver también WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 y WO 03/016496. Un dominio de dedo de zinc "seleccionado" es un dominio que no se encuentra en la naturaleza, cuya producción resulta principalmente de un proceso empírico tal como presentación de fagos, trampa de interacción o selección de híbridos. Las ZFN se describen con mayor detalle en la Patente de EE.UU. N° 7,888,121 y la Patente de EE.UU. N° 7,972,854. El ejemplo más reconocido de una ZFN en la técnica es una fusión de la nucleasa Fokl con un dominio de unión al ADN con dedos de zinc.

[0076] Otro ejemplo de una nucleasa específica que encuentra uso en los procedimientos es una nucleasa TAL ("TALN", nucleasa de efector TAL, o "TALEN"). Una TALN es una nucleasa dirigida que comprende una nucleasa fusionada a un dominio de unión al ADN efector de TAL. Por "dominio de unión a ADN efector de tipo activador de la transcripción", "dominio de unión a ADN efector de TAL" o "dominio de unión a ADN de TALE" se entiende el dominio polipeptídico de las proteínas efectoras de TAL que es responsable de la unión de la proteína efectora de TAL al ADN. Las proteínas efectoras de TAL son secretadas por patógenos vegetales del género Xanthomonas durante la infección. Estas proteínas entran en el núcleo de la célula vegetal, se unen a secuencias de ADN específicas del efector a través de su dominio de unión al ADN y activan la transcripción génica en estas secuencias a través de sus dominios de transactivación. La especificidad del dominio de unión al ADN efector de TAL depende de un número variable efector de repeticiones imperfectas de 34 aminoácidos, que comprenden polimorfismos en posiciones de repetición seleccionadas llamadas diresidues variables de repetición (RVD). Los TALEN se describen con mayor detalle en la Solicitud de Patente de EE.UU. N° 2011/0145940; en Christian, M et al. (2010) Dirigido a rupturas de doble hebra del ADN con nucleasas efectoras de Tal. Genetics 186: 757-761; y en Li, T. et al. (2010) TAL nucleases (TALN): hybrid proteins composed of TAL effectors and Fokl DNA-cleavage domain. Nucleic Acids Res. 39 (1): 359-372. El ejemplo más reconocido de un TALEN en la técnica es un polipéptido de fusión de la nucleasa Fok1 a un dominio de unión al ADN efector de TAL.

[0077] Otro ejemplo de una nucleasa específica que encuentra uso en los procedimientos es una nucleasa Spo11 diana, un polipéptido que comprende un polipéptido de Spo11 que tiene actividad de nucleasa fusionada a un dominio de unión a a Dn , por ejemplo, un dedo de zinc de dominio de unión a ADN, un dominio de unión efector ADN TAL, etc. que tiene especificidad para una secuencia de ADN de interés. Véase, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos n° 61/555,857.

[0078] Otros ejemplos no limitantes de nucleasas específicas incluyen la de origen natural y nucleasas recombinantes, por ejemplo endonucleasas de restricción, meganucleasas homing endonucleasas, y similares.

[0079] Típicamente, las nucleasas específicas se utilizan en parejas, con una nucleasa diana específica para una secuencia de un sitio de integración y la segunda nucleasa diana específica para una segunda secuencia de un sitio de integración. En el presente caso, se puede usar cualquier nucleasa o nucleasas dirigidas que sean específicas para el sitio de integración de interés y promuevan la escisión de un sitio de integración. Las células pueden expresar de manera estable la(s) nucleasa(s) diana. Alternativamente, la(s) nucleasa(s) diana pueden ser expresadas transitoriamente por las células, por ejemplo, puede proporcionarse a las células antes, simultáneamente o después de poner en contacto las células con el polinucleótido donante. Si las células lo expresan de forma transitoria, la(s) nucleasa(s) diana pueden proporcionarse a las células como ADN, por ejemplo, como se describe anteriormente para el polinucleótido donante. Alternativamente, se pueden proporcionar nucleasas diana a las células como ARNm que codifica las nucleasas diana, por ejemplo, usando técnicas de transfección bien desarrolladas; ver, por ejemplo, Angel y Yanik (2010) PLoS ONE 5(7): e11756; Beumer y col. (2008) PNAS 105(50): 19821-19826, y los reactivos TransMessenger® disponibles comercialmente de Qiagen, Stemfect™ RNA Transfection Kit de Stemgent y TranslT®-mRNA Transfection Kit de Mirus Bio LLC. Alternativamente, la(s) nucleasa(s) diana pueden proporcionarse a las células como un polipéptido. Dichos polipéptidos se pueden fusionar opcionalmente con un dominio polipeptídico que aumenta la solubilidad del producto y/o fusionar con un dominio permeable polipeptídico para promover la absorción por la célula. La(s) nucleasa(s) diana pueden ser producidas por células eucariotas o por células procariotas, pueden procesarse adicionalmente por desplegado, por ejemplo, desnaturalización por calor, reducción de DTT, etc. y pueden replegarse adicionalmente, usando métodos conocidos en la técnica. Puede modificarse, por ejemplo, mediante derivatización química o mediante técnicas de biología molecular y química sintética, por ejemplo, para mejorar la resistencia a la degradación proteolítica o para optimizar las propiedades de solubilidad o para hacer que el polipéptido sea más adecuado como agente terapéutico.

[0080] El genoma de cualquier célula puede ser modificado por las composiciones y métodos descritos aquí. Por ejemplo, la célula puede ser una célula meiótica, una célula mitótica o una célula posmitótica. Las células mitóticas y posmitóticas de interés en estas realizaciones incluyen células madre pluripotentes, por ejemplo, células ES, células iPS y células germinales embrionarias; y células somáticas, por ejemplo, fibroblastos, células hematopoyéticas, neuronas, células musculares, células óseas, células endoteliales vasculares, células intestinales y similares, y sus progenitores y precursores de linaje restringido. Las células pueden ser de cualquier especie de mamífero, por ejemplo, murino, roedor, canino, felino, equino, bovino, ovino, primate, humano, etc. La composición de polinucleótidos del donante reivindicada es para uso en terapia génica de hemofilia, en donde la terapia no es un proceso para modificar la identidad genética de la línea germinal de los seres humanos.

[0081] Las células pueden ser modificadas in vitro o in vivo. Si se modifican in vitro, las células pueden ser de líneas celulares establecidas o pueden ser células primarias, donde "células primarias", "líneas celulares primarias" y "cultivos primarios" se usan indistintamente en este documento para referirse a células y cultivos celulares que se han derivado de un sujeto y modificado sin cultivo adicional significativo, es decir, modificado "ex vivo", por ejemplo, para volver al sujeto, o se deja crecer in vitro durante un número limitado de pases, es decir, escisiones, del cultivo. Por ejemplo, los cultivos primarios son cultivos que pueden haber pasado 0 veces, 1 vez, 2 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o 15 veces, pero no suficientes veces pasan por la etapa de crisis. Normalmente, las líneas celulares primarias descritas en este documento se mantienen durante menos de 10 pases in vitro.

[0082] Si las células son células primarias, pueden ser cosechadas de un individuo por cualquier método conveniente. Por ejemplo, los leucocitos se pueden recolectar convenientemente mediante aféresis, leucocitaféresis, separación por gradiente de densidad, etc., mientras que las células de tejidos tales como piel, músculo, médula ósea, bazo, hígado, páncreas, pulmón, intestino, estómago, etc. son las más convenientemente cosechadas por biopsia. Puede usarse una solución apropiada para la dispersión o suspensión de las células recolectadas. Dicha solución generalmente será una solución salina balanceada, por ejemplo, solución salina normal, PBS, solución salina balanceada de Hank, etc., convenientemente suplementada con suero de ternero fetal u otros factores naturales, junto con un tampón aceptable a baja concentración, generalmente de 5-25 mM. Los tampones convenientes incluyen HEPES, tampones de fosfato, tampones de lactato, etc. Las células pueden usarse inmediatamente, o pueden almacenarse, congelarse, durante largos períodos de tiempo, descongelarse y pueden reutilizarse. En tales casos, las células generalmente se congelarán en DMSO al 10%, suero al 50%, medio tamponado al 40% o alguna otra solución como la que se usa comúnmente en la técnica para preservar las células a temperaturas de congelación, y se descongelarán de la manera comúnmente conocida en la técnica para descongelar células cultivadas congeladas.

[0083] Para inducir la integración del ADN in vitro, el polinucleótido donante se proporciona a las células durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 24 horas, por ejemplo, 1 hora, 1,5 horas, 2 horas, 2,5 horas, 3 horas, 3,5 horas 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas o cualquier otro período de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 24 horas, que puede repetirse con una frecuencia de aproximadamente todos los días a aproximadamente cada 4 días, por ejemplo, cada 1,5 días, cada 2 días, cada 3 días, o cualquier otra frecuencia desde aproximadamente todos los días hasta aproximadamente cada cuatro días. El polinucleótido donante se puede proporcionar a las células del sujeto una o más veces, por ejemplo, una vez, dos, tres veces o más de tres veces, y las células se dejan incubar con el polinucleótido donante durante algún tiempo después de cada evento de contacto, p. ej. 16-24 horas, después de las cuales el medio se reemplaza con medio fresco y las células se cultivan más.

[0084] En los casos en los que tanto el polinucleótido donante como una nucleasa específica se proporcionan a la célula, el polinucleótido donante y nucleasa(s) diana pueden ser proporcionados de forma simultánea, por ejemplo, como dos vectores de ácido nucleico entregado simultáneamente, o como un vector de ácido nucleico único que comprende las secuencias de ácido nucleico tanto para la(s) nucleasa(s) diana, por ejemplo, bajo el control de un promotor, como para el polinucleótido donante. Alternativamente, el polinucleótido donante y la(s) nucleasa(s) diana pueden proporcionarse consecutivamente, por ejemplo, el polinucleótido donante se proporciona primero, seguido por la(s) nucleasa(s) diana, etc. o viceversa.

[0085] El contacto de las células con el polinucleótido donante puede ocurrir en cualquier medio de cultivo y bajo cualquier condición de cultivo que promueva la supervivencia de las células. Por ejemplo, las células se pueden suspender en cualquier medio nutriente apropiado que sea conveniente, como DMEM modificado de Iscove o RPMI 1640, complementado con suero de ternero fetal o suero de cabra inactivado por calor (aproximadamente 5-10%), L-glutamina, un tiol, particularmente 2-mercaptoetanol y antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina. El cultivo puede contener factores de crecimiento a los que responden las células. Los factores de crecimiento, como se definen en el presente documento, son moléculas capaces de promover la supervivencia, el crecimiento y/o la diferenciación de células, ya sea en cultivo o en tejido intacto, a través de efectos específicos sobre un receptor de transmembrana. Los factores de crecimiento incluyen polipéptidos y factores no polipeptídicos. Las condiciones que promueven la supervivencia de las células son típicamente permisivas de unión de extremos no homólogos y recombinación homóloga.

[0086] Típicamente, se proporciona una cantidad eficaz de polinucleótido donante a las células para promover la recombinación y la integración. Una cantidad eficaz de polinucleótido donante es la cantidad para inducir un aumento de 2 veces o más en el número de células en las que se observa la integración del gen de interés en presencia de nucleasa(s) diana en relación con un control negativo, p. ej. célula contactada con un vector vacío. La cantidad de integración puede medirse mediante cualquier método conveniente. Por ejemplo, la presencia del gen de interés en el locus puede detectarse mediante, por ejemplo, citometría de flujo. La PCR o la hibridación Southern pueden realizarse usando cebadores que amplificarán el locus diana para detectar la presencia de la inserción. La expresión o actividad del gen integrado de interés puede determinarse mediante Western, ELISA, pruebas de actividad proteica, etc., por ejemplo, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas o más después del contacto con el polinucleótido donante. Como otro ejemplo, la integración puede medirse cointegrando un marcador de formación de imágenes o un marcador seleccionable y detectando la presencia de la formación de imágenes o marcador seleccionable en las células.

[0087] Normalmente, la modificación genética de la célula usando las composiciones y métodos diana no irá acompañada de la alteración de la expresión del gen en el locus modificado, es decir, el locus diana. En otras palabras, la expresión normal del gen en el locus diana se mantiene espacial, temporalmente y en niveles que se mantienen sustancialmente sin cambios con respecto a los niveles normales, por ejemplo, a niveles que difieren 5 veces o menos de los niveles normales, por ejemplo, 4 veces o menos, o 3 veces o menos, más habitualmente 2 veces o menos de los niveles normales, después de la integración dirigida del gen de interés en el locus diana.

[0088] En algunos casos, la población de células puede ser enriquecida para los que comprenden la modificación genética por la separación de las células modificadas genéticamente de la población restante. La separación de células modificadas genéticamente se basa típicamente en la expresión de un marcador seleccionable que se cointegra en el locus diana. Por un "marcador seleccionable" se entiende un agente que se puede usar para seleccionar células, por ejemplo, células que han sido dirigidas por composiciones de la aplicación diana. En algunos casos, la selección puede ser una selección positiva; es decir, las células se aíslan de una población, por ejemplo, para crear una población enriquecida de células que comprenden la modificación genética. En otros casos, la selección puede ser una selección negativa; es decir, la población se aísla de las células, por ejemplo, para crear una población enriquecida de células que no comprenden la modificación genética. La separación puede realizarse mediante cualquier técnica de separación conveniente apropiada para el marcador seleccionable utilizado. Por ejemplo, si se ha insertado un marcador fluorescente, las células pueden separarse mediante clasificación celular activada por fluorescencia, mientras que si se ha insertado un marcador de superficie celular, las células pueden separarse de la población heterogénea mediante técnicas de separación por afinidad, por ejemplo, separación magnética, cromatografía de afinidad, "cribado" con un reactivo de afinidad unido a una matriz sólida, u otra técnica conveniente. Las técnicas que proporcionan una separación precisa incluyen clasificadores de células activadas por fluorescencia, que pueden tener diversos grados de sofisticación, como canales de color múltiples, canales de detección de dispersión de luz obtusa y de ángulo bajo, canales de impedancia, etc. Las células pueden seleccionarse contra células muertas empleando tintes asociados con células muertas (p. ej., yoduro de propidio). Puede emplearse cualquier técnica que no sea excesivamente perjudicial para la viabilidad de las células modificadas genéticamente.

[0089] De esta manera se consiguen composiciones celulares que están altamente enriquecidas en células que comprenden ADN modificado. Por "altamente enriquecido", se entiende que las células modificadas genéticamente serán 70% o más, 75% o más, 80% o más, 85% o más, 90% o más de la composición celular, por ejemplo, aproximadamente el 95% o más, o el 98% o más de la composición celular. En otras palabras, la composición puede ser una composición sustancialmente pura de células modificadas genéticamente.

[0090] Las células modificadas genéticamente producidas por los métodos descritos en este documento pueden usarse inmediatamente. Alternativamente, las células pueden congelarse a temperaturas de nitrógeno líquido y almacenarse durante largos períodos de tiempo, descongelarse y reutilizarse. En tales casos, las células generalmente se congelarán en DMSO al 10%, suero al 50%, medio tamponado al 40% o alguna otra solución como la que se usa comúnmente en la técnica para preservar las células a temperaturas de congelación, y se descongelarán de la manera comúnmente conocida en la técnica para descongelar células cultivadas congeladas.

[0091] Las células modificadas genéticamente pueden ser cultivadas in vitro bajo diferentes condiciones de cultivo. Las células se pueden expandir en cultivo, es decir, crecer en condiciones que promuevan su proliferación. El medio de cultivo puede ser líquido o semisólido, por ejemplo, que contenga agar, metilcelulosa, etc. La población celular puede suspenderse en un medio nutritivo apropiado, como DMEM modificado de Iscove o RPMI 1640, normalmente suplementado con suero de ternero fetal (aproximadamente 5-10%), L-glutamina, un tiol, particularmente 2-mercaptoetanol, y antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina. El cultivo puede contener factores de crecimiento a los que responden las células. Los factores de crecimiento, como se definen en el presente documento, son moléculas capaces de promover la supervivencia, el crecimiento y/o la diferenciación de células, ya sea en cultivo o en tejido intacto, a través de efectos específicos sobre un receptor de transmembrana. Los factores de crecimiento incluyen polipéptidos y factores no polipeptídicos.

[0092] Las células que han sido genéticamente modificadas de esta manera se pueden trasplantar a un sujeto para fines tales como la terapia génica, por ejemplo, para tratar una enfermedad o como una terapia antiviral, antipatogénica, o contra el cáncer, para la producción de organismos modificados genéticamente en la agricultura, o para investigación biológica. El sujeto puede ser un recién nacido, un joven o un adulto. Son de particular interés los mamíferos. Las especies de mamíferos que pueden tratarse con los presentes métodos incluyen caninos y felinos; equinos; bovinos; ovinos; etc. y primates, particularmente humanos. Se pueden usar modelos animales, particularmente pequeños mamíferos, por ejemplo, murinos, lagomorfos, etc. para investigaciones experimentales.

[0093] Las células se pueden proporcionar al sujeto solo o con un sustrato o matriz adecuado, por ejemplo para apoyar su crecimiento y/o la organización en el tejido al que están siendo trasplantadas. Normalmente, se administrarán al menos 1x103 células, por ejemplo 5x103 células, 1x104 células, 5x104 células, 1x105 células, 1 x 106 células o más. Las células pueden introducirse en el sujeto mediante cualquiera de las siguientes vías: parenteral, subcutánea, intravenosa, intracraneal, intraespinal, intraocular o en el líquido cefalorraquídeo. Las células pueden introducirse mediante inyección, catéter o similar. Los ejemplos de métodos para la administración local, es decir, la administración en el sitio de la lesión, incluyen, por ejemplo, a través de un depósito Ommaya, por ejemplo, para administración intratecal (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nos 5,222,982 y 5385582); mediante inyección en bolo, por ejemplo, mediante una jeringa, por ejemplo, en una articulación; por infusión continua, por ejemplo, por canulación, por ejemplo, con convección (ver, por ejemplo, la solicitud de EE.Uu . N° 20070254842); o implantando un dispositivo sobre el que se hayan fijado las células de forma reversible (véanse, por ejemplo, las solicitudes de EE.UU. nos 20080081064 y 20090196903).

[0094] El número de administraciones de tratamiento para un sujeto puede variar. La introducción de células modificadas genéticamente en el sujeto puede ser un evento único; pero en determinadas situaciones, dicho tratamiento puede provocar una mejora durante un período de tiempo limitado y requerir una serie continua de tratamientos repetidos. En otras situaciones, pueden ser necesarias múltiples administraciones de las células modificadas genéticamente antes de que se observe un efecto. Los protocolos exactos dependen de la enfermedad o afección, la etapa de la enfermedad y los parámetros del sujeto individual que se está tratando.

[0095] En otros aspectos de la invención, se emplea el uso del polinucleótido de donantes para modificar el ADN celular in vivo. En estas realizaciones in vivo, el polinucleótido donante para uso se administra directamente al individuo. El polinucleótido donante puede administrarse mediante cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica para la administración de ácidos nucleicos a un sujeto. El polinucleótido donante se puede incorporar en una variedad de formulaciones. Más particularmente, el polinucleótido donante para su uso en la presente invención se puede formular en composiciones farmacéuticas mediante combinación con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables apropiados.

[0096] Las preparaciones farmacéuticas son composiciones que incluyen uno o más polinucleótidos donantes presentes en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los "vehículos farmacéuticamente aceptables" pueden ser vehículos aprobados por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerados en la Farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en mamíferos, como los seres humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o portador con el que se formula un compuesto para su administración a un mamífero. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser lípidos, por ejemplo, liposomas, por ejemplo, dendrímeros de liposomas; líquidos, tales como agua y aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de maní, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares, solución salina; goma arábiga, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea y similares. Además, pueden usarse agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular en preparaciones en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como tabletas, cápsulas, polvos, gránulos, ungüentos, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes, geles, microesferas y aerosoles. Como tal, la administración del polinucleótido donante se puede lograr de diversas formas, incluyendo la administración oral, bucal, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intraqueal, etc. El agente activo puede ser sistémico después de la administración o puede localizarse mediante el uso de la administración regional, la administración intramural o el uso de un implante que actúa para retener la dosis activa en el sitio de implantación. El agente activo puede formularse para una actividad inmediata o puede formularse para una liberación sostenida.

[0097] Para algunas condiciones, particularmente las condiciones del sistema nervioso central, puede ser necesario formular agentes para cruzar la barrera hematoencefálica (BBB). Una estrategia para la administración de fármacos a través de la barrera hematoencefálica (BHE) implica la interrupción de la BHE, ya sea por medios osmóticos como manitol o leucotrienos, o bioquímicamente mediante el uso de sustancias vasoactivas como la bradicinina. La posibilidad de utilizar la apertura de BBB para apuntar agentes específicos a los tumores cerebrales también es una opción. Se puede coadministrar un agente disruptor de BBB con las composiciones terapéuticas para usar en la invención cuando las composiciones para usar se administran mediante inyección intravascular. Otras estrategias para pasar por la BHE pueden implicar el uso de sistemas de transporte endógenos, incluida la transcitosis mediada por Caveolin-1, transportadores mediados por portadores como los portadores de glucosa y aminoácidos, transcitosis mediada por receptores para insulina o transferrina y transportadores de eflujo activos como p-glicoproteína. Los restos de transporte activo también se pueden conjugar con los compuestos terapéuticos para su uso en la invención para facilitar el transporte a través de la pared endotelial del vaso sanguíneo. Alternativamente, la administración de fármacos de agentes terapéuticos detrás de la BBB puede ser mediante administración local, por ejemplo, por administración intratecal, por ejemplo, a través de un depósito Ommaya (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.Uu . nos 5,222,982 y 5385582); por inyección de bolo, por ejemplo, mediante una jeringa, por ejemplo, intravítrea o intracraneal; por infusión continua, por ejemplo, por canulación, por ejemplo, con convección (ver, por ejemplo, la solicitud de EE.UU. N° 20070254842); o implantando un dispositivo sobre el que se haya fijado el agente de forma reversible (véanse, por ejemplo, las solicitudes de EE.UU. nos 20080081064 y 20090196903).

[0098] Típicamente, se proporciona una cantidad eficaz de polinucleótido donante. Como se discutió anteriormente con respecto a los métodos ex vivo, una cantidad efectiva o una dosis efectiva de un polinucleótido donante in vivo es la cantidad para inducir un aumento de 2 veces o más en el número de células en las que la recombinación entre el polinucleótido donante y el locus diana puede observarse en relación con un control negativo, por ejemplo, una célula en contacto con un vector vacío o un polipéptido irrelevante. La cantidad de recombinación puede medirse mediante cualquier método conveniente, por ejemplo, como se describe anteriormente y es conocido en la técnica. El cálculo de la cantidad eficaz o la dosis eficaz de un polinucleótido donante que se va a administrar está dentro del conocimiento de un experto en la técnica y será rutinario para los expertos en la técnica. Huelga decir que la cantidad final a administrar dependerá de la vía de administración y de la naturaleza del trastorno o condición que se va a tratar.

[0099] La cantidad eficaz dada a un paciente particular dependerá de una variedad de factores, varios de los cuales serán diferentes de paciente a paciente. Un médico competente podrá determinar una cantidad eficaz de un agente terapéutico para administrar a un paciente para detener o revertir la progresión de la enfermedad según se requiera. Utilizando los datos de LD50en animales y otra información disponible para el agente, un médico puede determinar la dosis máxima segura para un individuo, dependiendo de la vía de administración. Por ejemplo, una dosis administrada por vía intravenosa puede ser mayor que una dosis administrada por vía intratecal, dado el mayor volumen de líquido en donde se administra la composición terapéutica. De manera similar, las composiciones que se eliminan rápidamente del cuerpo se pueden administrar a dosis más altas, o en dosis repetidas, para mantener una concentración terapéutica. Utilizando la habilidad ordinaria, el médico competente podrá optimizar la dosificación de un agente terapéutico particular en el curso de ensayos clínicos de rutina.

[0100] Para la inclusión en un medicamento, el polinucleótido donante puede ser obtenido de una fuente comercial adecuada. Como propuesta general, la cantidad farmacéuticamente eficaz total del polinucleótido donante administrado por vía parenteral por dosis estará en un intervalo que puede medirse mediante una curva de respuesta a la dosis.

[0101] Las terapias basadas en polinucleótidos del donante, es decir, las preparaciones de polinucleótidos del donante que se utilizarán para la administración terapéutica, deben ser estériles. La esterilidad se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles (p. ej., membranas de 0,2 |jm). Las composiciones terapéuticas generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica. Las terapias basadas en polinucleótidos del donante se pueden almacenar en envases unitarios o multidosis, por ejemplo, ampollas o viales sellados, como una solución acuosa o como una formulación liofilizada para reconstitución. Como ejemplo de una formulación liofilizada, se llenan viales de 10 ml con 5 ml de solución acuosa de compuesto al 1% (p/v) esterilizada y filtrada, y la mezcla resultante se liofiliza. La solución para perfusión se prepara reconstituyendo el compuesto liofilizado con agua para inyección bacteriostática.

[0102] Las composiciones farmacéuticas pueden incluir, dependiendo de la formulación deseada, portadores farmacéuticamente aceptables, no tóxicos de diluyentes, que se definen como vehículos comúnmente utilizados para formular composiciones farmacéuticas para la administración animal o humana. El diluyente se selecciona de manera que no afecte a la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, agua tamponada, solución salina fisiológica, PBS, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica puede incluir otros vehículos, adyuvantes o estabilizadores, excipientes y similares no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos. Las composiciones también pueden incluir sustancias adicionales para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes reguladores y tamponadores del pH, agentes reguladores de la toxicidad, agentes humectantes y detergentes.

[0103] La composición también puede incluir cualquiera de una variedad de agentes estabilizantes, tales como un antioxidante, por ejemplo. Cuando la composición farmacéutica incluye un polipéptido, el polipéptido puede formar complejos con varios compuestos bien conocidos que mejoran la estabilidad in vivo del polipéptido, o mejoran sus propiedades farmacológicas (p. ej., aumentan la vida media del polipéptido, reducen su toxicidad, mejoran solubilidad o absorción). Ejemplos de tales modificaciones o agentes complejantes incluyen sulfato, gluconato, citrato y fosfato. Los ácidos nucleicos o polipéptidos de una composición también se pueden formar complejos con moléculas que mejoran sus atributos in vivo. Estas moléculas incluyen, por ejemplo, carbohidratos, poliaminas, aminoácidos, otros péptidos, iones (p. ej., sodio, potasio, calcio, magnesio, manganeso) y lípidos.

[0104] Orientación adicional con respecto a las formulaciones que son adecuadas para varios tipos de administración se pueden encontrar en Remington Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Filadelfia, Pa., 17a ed. (1985). Para una breve revisión de los métodos para la administración de fármacos, véase Langer, Science 249: 1527­ 1533 (1990).

[0105] Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. La toxicidad y eficacia terapéutica del ingrediente activo se puede determinar de acuerdo con procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares y/o animales de experimentación, incluyendo, por ejemplo, determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD50/ED50. Se prefieren las terapias que exhiben grandes índices terapéuticos.

[0106] Los datos obtenidos a partir del cultivo celular y/o estudios de animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificaciones para seres humanos. La dosis del ingrediente activo típicamente se encuentra dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con baja toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada.

[0107] Los componentes utilizados para formular las composiciones farmacéuticas son preferiblemente de alta pureza y son sustancialmente libres de contaminantes potencialmente nocivos (p. ej., al menos National Food (grado NF), generalmente al menos grado analítico, y más típicamente al menos de grado farmacéutico). Además, las composiciones destinadas a uso in vivo suelen ser estériles. En la medida en que un compuesto dado deba sintetizarse antes de su uso, el producto resultante típicamente está sustancialmente libre de cualquier agente potencialmente tóxico, particularmente cualquier endotoxina, que pueda estar presente durante el proceso de síntesis o purificación. Las composiciones para administración parental también son estériles, sustancialmente isotónicas y se preparan en condiciones GMP.

[0108] La cantidad eficaz de una composición terapéutica que se administrará a un paciente particular dependerá de una variedad de factores, varios de los cuales diferirán de un paciente a otro. Un médico competente podrá determinar una cantidad eficaz de un agente terapéutico para administrar a un paciente para detener o revertir la progresión de la enfermedad según se requiera. Utilizando datos de LD50 en animales y otra información disponible para el agente, un médico puede determinar la dosis máxima segura para un individuo, dependiendo de la vía de administración. Por ejemplo, una dosis administrada por vía intravenosa puede ser mayor que una dosis administrada por vía intratecal, dado el mayor volumen de líquido en donde se administra la composición terapéutica. De manera similar, las composiciones que se eliminan rápidamente del cuerpo se pueden administrar a dosis más altas, o en dosis repetidas, para mantener una concentración terapéutica. Utilizando la habilidad ordinaria, el médico competente podrá optimizar la dosificación de un agente terapéutico particular en el curso de ensayos clínicos de rutina.

UTILIDAD

[0109] Las composiciones y métodos descritos en este documento encuentran uso en cualquier aplicación in vitro o in vivo en donde es deseable expresar uno o más genes de interés en una célula en el mismo patrón espacial y temporalmente restringido como el de un gen en un locus diana mientras se mantiene la expresión del gen endógeno en ese locus diana.

[0110] Por ejemplo, los métodos y composiciones del sujeto se pueden usar para tratar un trastorno, una enfermedad o afección médica en un sujeto. Con este fin, el uno o más genes de interés que se integrarán en un genoma celular pueden incluir un gen que codifique un agente terapéutico. Por "agente terapéutico" se entiende un agente, por ejemplo, siARN, shARN, miARN, agentes CRISPRi, péptido, polipéptido, gen suicida, etc. que tiene un efecto terapéutico sobre una célula o un individuo, por ejemplo, que promueve un proceso biológico para tratar una afección médica, por ejemplo, una enfermedad o trastorno. Los términos "individuo", "sujeto", "huésped" y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a cualquier sujeto mamífero para el que se desea diagnóstico, tratamiento o terapia, particularmente seres humanos. Los términos "tratamiento", "tratar" y similares se usan en este documento para significar generalmente la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevención total o parcial de una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de cura parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en este documento, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero e incluye: (a) evitar que la enfermedad se produzca en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aún no se ha diagnosticado que la padezca; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad. El agente terapéutico puede administrarse antes, durante o después del inicio de la enfermedad o lesión. El tratamiento de la enfermedad en curso, en donde el tratamiento estabiliza o reduce los síntomas clínicos indeseables del paciente, es de particular interés. Tal tratamiento se realiza de forma deseable antes de la pérdida completa de la función en los tejidos afectados. Deseablemente, la terapia en cuestión se administrará durante la etapa sintomática de la enfermedad y, en algunos casos, después de la etapa sintomática de la enfermedad.

[0111] Los ejemplos de agentes terapéuticos que pueden integrarse en un genoma celular usando los métodos y composiciones diana incluyen agentes, es decir, siARN, shARN, miARN, agentes CRISPRi, péptidos o polipéptidos, que alteran la actividad celular. Otros ejemplos de agentes terapéuticos que pueden integrarse usando los métodos y composiciones diana incluyen genes suicidas, es decir genes que promueven la muerte de las células en las que se expresa el gen. Los ejemplos no limitantes de genes suicidas incluyen genes que codifican un péptido o polipéptido que es citotóxico ya sea solo o en presencia de un cofactor, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, toxina del cólera, toxina diftérica, timidina quinasa de herpes simple (HSV-TK); genes que promueven la apoptosis en las células, por ejemplo, Fas, caspasas (p. ej., Caspasa9 inducible), etc.; y genes que se dirigen a una célula para la muerte dependiente de ADCC o CDC, por ejemplo, CD20.

[0112] En algunos casos, el agente terapéutico altera la actividad de la célula en donde se expresa el agente. En otras palabras, el agente tiene un efecto intrínseco a la célula. Por ejemplo, el agente puede ser una proteína intracelular, una proteína transmembrana o una proteína secretada que, cuando se expresa en una célula, sustituirá o "complementará" una proteína mutante en la célula. En otros casos, el agente terapéutico altera la actividad de células distintas de las células en las que se expresa el agente. En otras palabras, el agente tiene un efecto extrínseco celular. Por ejemplo, el gen integrado de interés puede codificar una citocina, quimiocina, factor de crecimiento, hormona, anticuerpo o receptor de la superficie celular que modula la actividad de otras células.

[0113] Los presentes métodos y composiciones se pueden aplicar a cualquier enfermedad, trastorno o proceso celular natural que se beneficiaría de la modulación de la actividad celular mediante la integración de un gen de interés. Por ejemplo, los agentes y métodos diana encuentran uso en el tratamiento de trastornos genéticos. Cualquier trastorno genético que resulte de un único defecto genético puede ser tratado por las composiciones y métodos diana, incluyendo, por ejemplo, hemofilia, deficiencia de adenosina desaminasa, enfermedad de células falciformes, inmunodeficiencia combinada severa ligada al cromosoma X (SCID-X1), talasemia, fibrosis quística, deficiencia de alfa-1 anti-tripsina, anemia Diamond-Blackfan, enfermedad de Gaucher, deficiencia de hormona del crecimiento y similares. Como otro ejemplo, los métodos diana se pueden usar en afecciones médicas y enfermedades en las que es deseable expresar ectópicamente un agente terapéutico, por ejemplo, siARN, shARN, miARN, agente CRISPRi, péptido, polipéptido, gen suicida, etc., para promover la reparación de tejidos, la regeneración de tejidos o proteger contra más lesiones tisulares, por ejemplo, para promover la cicatrización de heridas; promover la supervivencia de la célula y/o células vecinas, por ejemplo, en enfermedades degenerativas, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades renales, enfermedades hepáticas, etc.; prevenir o tratar la infección, etc.

[0114] Como ejemplo no limitante, los presentes métodos se pueden usar para integrar un gen que codifica un factor neuroprotector, por ejemplo, una neurotrofina (p. ej., NGF, BDNF, NT-3, NT-4, CNTF), Kifap3, Bcl-xl, Crmpl, Chkp, CALM2, Caly, NPG11, NPT1, E e fla l, Dhps, Cd151, MorF412, CTGF, LDH-A, Atl1, NPT2, EhD3, Cox5b, Tubala, yactina, Rpsa, NPG3, NPG4, NPG5, NPG6, NPG7, NPG8, NPG9, NPG10, etc., en el genoma de neuronas, astrocitos, oligodendrocitos o células de Schwann en un locus que está activo en esos tipos de células particulares (p. ej., para neuronas, el neurofilamento (NF), enolasa neuroespecífica (NSE), locus NeuN o Map2; para los astrocitos, el locus GFAP o S100B; para los oligodendrocitos y las células de Schwann, el locus GALC o m Bp ). Tales métodos pueden usarse para tratar afecciones del sistema nervioso y para proteger el SNC contra afecciones del sistema nervioso, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas, que incluyen, por ejemplo, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Spielmeyer-Vogt-SjogrenBatten (enfermedad de Batten), demencia frontotemporal con parkinsonismo, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, enfermedades priónicas (p. ej., enfermedad de Creutzfeldt-Jakob), amiloidosis, glaucoma, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad (AMD) y similares); trastornos neuropsiquiátricos (p. ej., trastornos de ansiedad (p. ej., trastorno obsesivo compulsivo), trastornos del estado de ánimo (p. ej., depresión), trastornos de la infancia (p. ej., trastorno por déficit de atención, trastornos autistas), trastornos cognitivos (p. ej., delirio, demencia), esquizofrenia, trastornos relacionados con sustancias (p. ej., adicción), trastornos alimentarios y similares); canalopatías (p. ej., epilepsia, migraña y similares); trastornos de almacenamiento lisosómico (p. ej., enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Fabry, enfermedad de Pompe, enfermedad de Niemann-Pick, mucopolisacaridosis (MPS) y enfermedades relacionadas, y similares); enfermedades autoinmunes del SNC (p. ej., esclerosis múltiple, encefalomielitis, síndromes paraneoplásicos (p. ej., degeneración cerebelosa), enfermedad autoinmune del oído interno, síndrome de opsoclonus myoclonus y similares); infarto cerebral, accidente cerebrovascular, lesión cerebral traumática y lesión de la médula espinal. Otros ejemplos de cómo se pueden usar los métodos diana para tratar afecciones médicas se describen en otra parte del presente documento, o serían fácilmente evidentes para el experto en la materia.

[0115] Como otro ejemplo, los presentes métodos y composiciones se pueden utilizar para seguir las células de interés, por ejemplo, células que comprenden un gen integrado de interés. Como tal, el gen de interés (o uno de los genes de interés) que se integrará puede codificar un marcador de formación de imágenes. Por "marcador de formación de imágenes" se entiende un agente no citotóxico que se puede usar para localizar y, opcionalmente, visualizar células, por ejemplo, células que han sido seleccionadas como diana por composiciones de la aplicación diana. Un resto de imagen puede requerir la adición de un sustrato para la detección, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (HRP), p-galactosidasa, luciferasa y similares. Alternativamente, un resto de imágenes puede proporcionar una señal detectable que no requiere la adición de un sustrato para la detección, por ejemplo, un colorante fluoróforo o cromóforo, por ejemplo Alexa Fluor 488® o Alexa Fluor 647®, o una proteína que comprende un fluoróforo o cromóforo, por ejemplo, una proteína fluorescente. Como se usa en este documento, una proteína fluorescente (FP) se refiere a una proteína que posee la capacidad de emitir fluorescencia (es decir, absorber energía en una longitud de onda y emitirla en otra longitud de onda). Por ejemplo, una proteína verde fluorescente (GFP) se refiere a un polipéptido que tiene un pico en el espectro de emisión a 510 nm o aproximadamente 510 nm. Se conocen en la técnica una variedad de FP que emiten a diversas longitudes de onda. Los FP de interés incluyen, entre otros, una proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente amarilla (YFP), proteína fluorescente naranja (OFP), proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente azul (BFP), proteína fluorescente roja (RFP), proteína fluorescente de rojo lejano o proteína fluorescente de infrarrojo cercano y variantes de las mismas.

[0116] Como otro ejemplo, los presentes métodos y composiciones se pueden usar para aislar células de interés, por ejemplo células que comprenden un gen integrado de interés. Con este fin, el gen de interés (o uno de los genes de interés) que se integrará puede codificar un marcador seleccionable. Por "marcador seleccionable" se entiende un agente que se puede usar para seleccionar células, por ejemplo, células que han sido diana mediante composiciones de la aplicación diana. En algunos casos, la selección puede ser una selección positiva; es decir, las células se aíslan de una población, por ejemplo, para crear una población enriquecida de células que comprenden la modificación genética. En otros casos, la selección puede ser una selección negativa; es decir, la población se aísla de las células, por ejemplo, para crear una población enriquecida de células que no comprenden la modificación genética. Puede emplearse cualquier marcador seleccionable conveniente, por ejemplo, un marcador seleccionable de fármaco, por ejemplo, un marcador que previene la muerte celular en presencia de fármaco, un marcador que promueve la muerte celular en presencia de fármaco, un marcador de formación de imágenes, etc.; un marcador de formación de imágenes que puede seleccionarse para usar tecnología de formación de imágenes, por ejemplo, clasificación de células activadas por fluorescencia; un polipéptido o péptido que puede seleccionarse para usar técnicas de separación por afinidad, por ejemplo, clasificación de células activadas por fluorescencia, separación magnética, cromatografía de afinidad, "cribado" con un reactivo de afinidad unido a una matriz sólida, etc.; y similares.

[0117] En algunos casos, el gen de interés se puede conjugar a un dominio de codificación que modula la estabilidad de la proteína codificada, por ejemplo, en la ausencia/presencia de un agente, por ejemplo, un cofactor o medicamento. Los ejemplos no limitantes de dominios desestabilizadores que pueden usarse incluyen un dominio FRB mutante que es inestable en ausencia de C20-MaRap derivado de rapamicina (Stankunas K, et al. (2003) Conditional protein alleles using knockin mice and a chemical inducer of dimerization. Mol Cell. 12 (6): 1615-24); un polipéptido mutante FKBP12 que es metabólicamente inestable en ausencia de su ligando Shield-1 (Banaszynski LA, et al. (2006) Un método rápido, reversible y sintonizable para regular la función de las proteínas en células vivas utilizando pequeñas moléculas sintéticas. Cell,126 (5): 995-1004); un polipéptido mutante de E. coli dihidrofolato reductasa (DHFR) que es metabólicamente inestable en ausencia de trimetoprima (TMP) (Mari Iwamoto, et al. (2010) A general Chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chem Biol., 24 de septiembre de 2010; 17 (9): 981-988); y similares.

[0118] Como se discutió anteriormente, cualquier gen de interés puede ser integrado en un locus diana, por ejemplo, cualquier gen que codifique un siARN, shARN, miARN, CRISPRi elemento, péptido o polipéptido puede ser integrado. Además, como se discutió anteriormente, puede integrarse más de un gen de interés, por ejemplo, pueden integrarse dos o más genes de interés, pueden integrarse tres o más genes, pueden integrarse cuatro o más genes, por ejemplo, cinco o más genes puede estar integrado. Así, por ejemplo, se pueden integrar un gen terapéutico y un marcador de formación de imágenes; se pueden integrar un gen terapéutico y un marcador seleccionable, un marcador de formación de imágenes y un marcador de selección, un gen terapéutico, un marcador de formación de imágenes y un marcador de selección, y así sucesivamente.

[0119] La integración de uno o más genes de interés en el ADN celular de manera que se exprese en un patrón restringido espacial y temporalmente sin interrumpir otras actividades celulares encuentra uso en muchos campos, que incluyen, por ejemplo, la terapia génica, la agricultura, la biotecnología y la investigación. Por ejemplo, tales modificaciones son terapéuticamente útiles, por ejemplo, para tratar un trastorno genético complementando una mutación genética en un sujeto con una copia de tipo silvestre del gen; para promover procesos que ocurren naturalmente, promoviendo/aumentando las actividades celulares (p. ej., promoviendo la cicatrización de heridas para el tratamiento de heridas crónicas o prevención de fallas agudas de heridas o colgajos, aumentando las actividades celulares asociadas con la cicatrización de heridas); para modular la respuesta celular (p. ej., para tratar la diabetes mellitus, proporcionando insulina); para expresar terapias antivirales, antipatogénicas o anticancerígenas en sujetos, por ejemplo, en poblaciones de células específicas o en condiciones específicas, etc. Otros usos para tales modificaciones genéticas incluyen en la inducción de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), por ejemplo, para producir iPSC de un individuo con fines de diagnóstico, terapéuticos o de investigación; en la producción de organismos genéticamente modificados, por ejemplo en la fabricación para la producción a gran escala de proteínas por células con fines terapéuticos, de diagnóstico o de investigación; en agricultura, por ejemplo, para la producción de cultivos mejorados; o en investigación, por ejemplo, para el estudio de modelos animales de enfermedad.

REACTIVOS, DISPOSITIVOS Y KITS

[0120] También se describen reactivos, dispositivos y kits de los mismos para practicar uno o más de los métodos descritos anteriormente. Los reactivos, dispositivos y kits de los mismos en cuestión pueden variar mucho. Los reactivos y dispositivos de interés pueden incluir composiciones de polinucleótidos del donante, por ejemplo, un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de interés que se insertará en un locus y elementos diana, por ejemplo, péptido(s) 2A, IRES(s), secuencias inteína o intrónicas, y/o secuencias de recombinación flanqueantes que promoverán la integración sin interrumpir la expresión del locus diana, o, por ejemplo, un vector que comprende un sitio de clonación, por ejemplo, un sitio de clonación múltiple, y elementos, por ejemplo, péptido(s) 2A, IRES(s), inteína o secuencias intrónicas, y/o secuencias de recombinación flanqueantes en las que se puede clonar una secuencia de ácido nucleico que se integrará en un locus diana para generar un polinucleótido donante. Otros ejemplos no limitantes de reactivos incluyen composiciones de nucleasa diana, por ejemplo, una nucleasa diana o un par de nucleasas diana específicas para el sitio de integración de interés; reactivos para seleccionar células modificadas genéticamente con el gen integrado de interés; y vectores de control positivo y negativo o células que comprenden secuencias de control positivas y/o negativas integradas para su uso en la evaluación de las composiciones de polinucleótidos donantes eficacia en las células, etc.

[0121] Además de los componentes anteriores, los kits en cuestión incluirán adicionalmente instrucciones para practicar los métodos de la asignatura. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits objeto en una variedad de formas, una o más de las cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en donde estas instrucciones pueden estar presentes es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, por ejemplo, una hoja o hojas de papel en las que se imprime la información, en el embalaje del kit, en un prospecto, etc. Otro medio más sería un medio legible por ordenador, por ejemplo, disquete, CD, etc., en donde se ha grabado la información. Otro medio más que puede estar presente es una dirección de sitio web que puede usarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio eliminado. Cualquier medio conveniente puede estar presente en los kits.

EJEMPLOS

[0122] Los siguientes ejemplos se exponen a fin de proporcionar a los expertos ordinarios en la técnica una exposición completa y descripción de cómo hacer y usar la presente invención, y no están destinados a limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención ni pretenden representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (p. ej., cantidades, temperatura, etc.) pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular medio ponderado, la temperatura está en grados centígrados y la presión es la atmosférica o cercana a ella.

EJEMPLO 1

D irigir fusiones 2A a genes endógenos.

[0123] Los péptidos 2A permiten la traducción de múltiples proteínas a partir de un único ARNm mediante la inducción de la omisión de ribosomal. Los TALEN se utilizaron para inducir el direccionamiento de transgenes fusionados a péptidos 2A justo en 3' de los marcos de lectura endógenos (Figura 1C). Este enfoque tiene varias ventajas sobre el uso común de casetes de expresión, incluidos el promotor y el terminador. En primer lugar, como el transgén no trae consigo ningún promotor, se reduce la posibilidad de activación del oncogén fuera de la diana. El transgén no se expresa a partir del vector, sino sólo si y cuando se integra en el marco corriente abajo de un promotor endógeno. Esto ocurre esencialmente solo si se induce la integración por recombinación homóloga en la diana deseada. Es importante destacar que, una vez integrado, la expresión del transgén se co-regula con la del gen endógeno en los niveles de transcripción, corte y empalme, exportación nuclear, silenciamiento de ARN y traducción. Mientras que el producto génico endógeno termina teniendo aproximadamente 20 aminoácidos C-terminales adicionales (el péptido 2A), la expresión y la actividad se conservan por lo demás.

[0124] El direccionamiento por fusión 2A en varios dominios puede usarse en varias aplicaciones, que incluyen: 1) Inmunoterapia contra el cáncer, por ejemplo, direccionamiento de un receptor de antígeno quimérico de fusión 2A a la molécula de adhesión celular específica de células T CD2 para la tratamiento de CLL; 2) Terapia génica de la hemofilia, por ejemplo, direccionamiento de una fusión del factor de coagulación 92A al gen Alb altamente expresado; y 3) Generación de modelos animales, por ejemplo, el diseño de un ratón transgénico portador de marcadores fluorescentes y luminiscentes 2A fusionados al gen de la telomerasa para permitir el seguimiento de la diferenciación, oncogénesis, metástasis, envejecimiento y más.

EJEMPLO 2

Adición de genes Safe Harbor mediada por nucleasa de dedo de zinc y nucleasa efectora TAL sin alteración del gen Safe Harbor en fibroblastos primarios de ratón.

[0125] Las estrategias de adición de genes Safe Harbor mediadas por nucleasas son prometedoras como tecnología de terapia génica de próxima generación. Hasta ahora, los "Safe Harbor" se han definido como loci que pueden alterarse sin consecuencias fisiológicas y que no tienen potencial oncogénico cuando se alteran. En este estudio, la focalización de Safe Harbor mediada por recombinación homóloga no requiere la interrupción del producto génico endógeno. En resumen, el ADN que da como resultado la misma secuencia de aminoácidos que el locus diana, pero que no es homólogo del locus diana mediante la modificación de la posición de oscilación dentro de múltiples codones, puede dirigirse en marco para que no produzca deficiencia de proteínas del Safe Harbor.

[0126] Para demostrar la viabilidad de esta estrategia, se usó un ensayo indicador de GFP descrito previamente (Connelly et al Mol Ther 2010). En este ensayo, un gen de GFP que porta una mutación de inserción que hace que la proteína no sea funcional fue golpeado en el locus ROSA26 del ratón. Para la adición de genes, un plásmido donante que contiene brazos de homología con el gen de GFP rodea el "gen de interés" deseado para ser añadido al genoma. Es importante destacar que, en 5' para el "gen de interés", incluimos una secuencia de ADN no homóloga que codifica la terminación del extremo C-terminal de GFP. Se cotransfectaron nucleasas de dedo de zinc o nucleasas efectoras TAL específicas para el locus GFP con este donante, lo que resultó en un evento de adición de genes que restaura la expresión de GFP.

[0127] Hemos diseñado múltiples plásmidos donantes con estos elementos GFP y se incluye como nuestro "gen de interés" el promotor Ubc que dirige la hormona del crecimiento humano (hGH) de ADNc de una matriz de múltiples genes de hGH unidas por péptidos 2A, o ANGFR, un marcador de superficie seleccionable que fue dirigido en marco con GFP por un péptido 2A sin el uso de un promotor exógeno. Las frecuencias de orientación variaron de 0,04 a 1,9% en fibroblastos primarios, dependiendo de la construcción del donante o de las nucleasas utilizadas, y los eventos de orientación fueron seleccionables clasificando para GFP o el marcador de superficie ANGFR. La expresión del transgén (hGH) se cuantificó mediante ELISA (6,5-19,3 ng por millón de células por 24 horas). Comparamos directamente la capacidad de las nucleasas con dedos de zinc o las nucleasas efectoras de TAL para estimular la focalización en el mismo sitio, y descubrimos que las TALEN mejoraron notablemente la eficiencia de la focalización sobre las ZFN (5 veces) con una disminución simultánea de la toxicidad celular asociada. También observamos que dirigirse a múltiples copias de un transgén unido con el péptido 2A aumenta la expresión después de la dirección y que los fibroblastos dirigidos podrían reintroducirse subcutáneamente en un ratón receptor isogénico o en un modelo de ratón de deficiencia de hormona del crecimiento durante al menos 10 días.

[0128] El impacto del sistema de dirección descrito aquí es doble. En primer lugar, ahora se puede estudiar la adición de genes en un locus Safe Harbor con prácticamente cualquier gen de interés en cualquier tipo de célula primaria con un informador de GFP fácilmente ensayable y cuantificable. Es importante destacar que la restauración de GFP es específica para eventos específicos únicamente. Este no es el caso de ningún otro indicador de la adición de genes descrito hasta la fecha. En segundo lugar, el sistema descrito aquí proporciona una prueba de principio para una evolución en la tecnología de adición de genes Safe Harbor donde ya no se requiere la interrupción del producto del gen del locus diana.

EJEMPLO 3

Integración de múltiples genes en el locus CCR5 para acumular resistencia genética al VIH.

[0129] Uno de los principales desafíos en el desarrollo de terapias para el VIH es la capacidad del virus para mutar y, por lo tanto, evadir la terapia. La reciente demostración de que las nucleasas con dedos de zinc (ZFN) se pueden utilizar para mutar el gen CCR5 y crear una población de células T o células madre hematopoyéticas resistentes al VIH, que imitan fenotípicamente el alelo CCR5 D32, plantea la posibilidad de que se pueda utilizar la ingeniería genética de precisión para modificar el curso de la infección por VIH. La debilidad potencial de este enfoque es que en un paciente infectado con virus trópico CXCR4 y CCR5, la simple mutación de CCR5 en una fracción de células T probablemente no será suficiente para alterar el curso de la enfermedad. En cambio, es necesario crear células que sean genéticamente resistentes al VIH. Un método para acumular de forma segura y sólida la resistencia genética a la infección es mediante el uso de recombinación homóloga mediada por ZFN para dirigir un cóctel de factores anti-VIH al locus CCR5.

[0130] En primer lugar, dirigimos un casete de GFP al locus CCR5, utilizando ZFN suministrados por ADN o ARNm y logramos una frecuencia de orientación de hasta 27% sin selección. A continuación, elegimos tres factores de restricción que inhiben el ciclo de replicación del VIH en tres etapas diferentes y dirigimos combinaciones de estos factores al locus CCR5 en una línea informadora de células T. Utilizando una lectura cuantitativa de la infección por VIH basada en fluorescencia, identificamos combinaciones de factores que proporcionan una resistencia sólida a la infección por VIH con CCR5 y CXCR4 trópico in vitro. Contra un virus de cepa de laboratorio con R5 trópico, la interrupción de CCR5 por sí sola confiere protección 15 veces mayor, pero no tiene efecto contra un virus de cepa de laboratorio con X4 trópico. TRIM5a rhesus humano quimérico, APOBEC3G D128K o rev M10 solo dirigido a CCR5 proporciona una resistencia eficaz a ambas variantes de cepas de laboratorio (entre 2 y 260 veces de protección). La combinación de los tres factores dirigidos a CCR5 confiere una resistencia 250 veces mayor al virus del R4 trópico y una resistencia 450 veces mayor al virus del R5 trópico.

[0131] En resumen, mediante el uso de la orientación de genes podemos crear células que son altamente resistentes al virus trópico tanto CXCR4 como CCR5. Esta estrategia puede ser la base para la próxima generación de ensayos clínicos de terapia génica para curar a los pacientes con SIDA.

EJEMPLO 4

Edición del genoma mediada por recombinación homóloga en el locus de adenosina desaminasa (ADA) en fibroblastos derivados del paciente usando nucleasas efectoras TAL.

[0132] La terapia génica, o la capacidad de enfermedades correctas a nivel del ADN, ha sido durante mucho tiempo un objetivo de la ciencia y la medicina. Desafortunadamente, los primeros ensayos de terapia génica que utilizan vectores retrovirales para insertar genes de interés dieron como resultado una oncogénesis de inserción. La inserción dirigida del gen de interés a través de la recombinación homóloga es una alternativa más segura a la inserción viral de un gen.

[0133] Para insertar un gen de interés en el locus de la adenosina desaminasa (ADA), desarrollamos 2 pares de nucleasas efectoras TAL (TALENs) específicos a los sitios en el exón 1 del locus de la adenosina desaminasa (ADA). Un sitio de corte está centrado 77 pb corriente arriba del ATG de inicio de traducción de ADA, mientras que el otro está centrado 27 pb corriente abajo del ATG. Estos TALEN pueden estimular la reparación mutagénica en sus sitios diana a una tasa del 15-25% de los alelos en las células K562. Creamos plantillas de donantes que contenían brazos de homología centrados en el sitio de inicio de ATG, con una variedad de fragmentos de ADN insertados en el marco entre los brazos, incluido el ADNc completo de GFP y ADA, cada uno conectado por el péptido de salto ribosómico t2A (una secuencia 2A de péptidos del virus Thosea asigna) a ADNc para P140K MGMT (permitiendo la selección posterior in vitro o in vivo). Las inserciones de ADNc dirigidas en marco permiten que estos genes sean regulados por el promotor de ADA endógeno.

[0134] Se usó citometría de flujo para demostrar la integración del fragmento de ADN deseado en el genoma cuando se transfectaron moldes del donante junto con plásmidos de expresión que codifican nuestros TALEN, en contraposición a las células transfectadas con el donante solo. A continuación, se usó PCR para mostrar que la inserción específica del sitio de estos fragmentos de ADN se produce en presencia del plásmido donante y TALEN, pero son indetectables en las células transfectadas con el plásmido donante solo. Tratamiento con O6BG y BCNU enriquecido para nuestras células diana, lo que demuestra que nuestras células diana expresan la construcción completa del promotor endógeno.

[0135] Los mismos experimentos se llevaron a cabo a continuación, en los fibroblastos derivados del paciente ADA deficientes en los pacientes. Usando citometría de flujo, observamos una mayor integración de nuestras construcciones cuando las células se transfectaron tanto con el plásmido del donante como con TALEN, en contraposición al donante solo. La integración dirigida de nuestras construcciones al exón 1 del locus ADA se confirmó en estas células derivadas de pacientes mediante PCR. Se espera que la actividad enzimática de ADA en aquellas células en las que se insertó ADNc de ADA en el exón 1 de las células deficientes en ADA se rescatará a niveles sustancialmente de tipo silvestre.

[0136] Hemos demostrado que podemos lograr inserción dirigida por recombinación homóloga de nuestros constructos, tanto en K562 como células de fibroblastos derivadas del paciente. También podemos enriquecer nuestros eventos específicos mediante el uso de un marcador seleccionable. Además, hemos demostrado la integración específica del sitio del ADNc de ADA en el exón 1 en células derivadas del paciente, lo que permite que la proteína ADA de longitud completa se exprese bajo el promotor endógeno, corrigiendo así el fenotipo de cualquier mutación de ADA.

EJEMPLO 5

Orientación genética de los loci de globina humana usando nucleasas modificadas genéticamente.

[0137] La anemia de células falciformes está causada por una mutación puntual en la beta-globina, que da como resultado la sustitución de una valina hidrófoba por el ácido glutámico hidrófilo en la posición 6, lo que conduce a la polimerización patológica de moléculas de hemoglobina mutadas. Gran parte del tratamiento farmacológico actual para pacientes con enfermedad de células falciformes busca aumentar la producción de gamma-globina, que puede reemplazar las subunidades de beta-globina mutadas para formar hemoglobina fetal no defectuosa. Se usó recombinación homóloga mediada por nucleasa para dirigir el ADNc de beta-globina terapéutico al locus de betaglobina endógeno. También se utilizó el direccionamiento genético del locus de la beta-globina y la gamma-globina para crear una línea celular que informa sobre la actividad de cada uno de estos genes.

[0138] Las nucleasas efectoras de Tal (TALEN) son proteínas diseñadas que inducen roturas de doble cadena de ADN de una manera específica de secuencia. Utilizando una estrategia de síntesis Golden Gate, diseñamos un par de TALEN que escinden el locus de la betaglobina humana a solo 3' del sitio de la mutación falciforme. Como lo demuestra un ensayo Cel-I, estas nucleasas crearon mutaciones en su sitio diana en las células HEK-293T en el 27% de los alelos. Estos TALEN estimularon la integración dirigida de un casete de GFP en el locus de beta-globina mediante recombinación homóloga en el 23% de las células K562 sin selección. Utilizando un enfoque similar, diseñamos TALEN para apuntar al gen de la gamma-globina humana. Los TALEN de gamma-globina crearon mutaciones en el -44% de sus sitios diana según lo determinado por el ensayo Cel-I, y estimularon la adición de genes dirigidos del gen tdTomato al sitio de gamma-globina en el 35% de las células. Usando estas nucleasas creamos líneas celulares que contienen tanto GFP bajo el control del promotor de beta-globina endógeno como tdTomato bajo el control del promotor de gamma-globina endógeno. Estamos utilizando esta línea celular doblemente etiquetada para cuantificar el efecto diferencial de moléculas pequeñas sobre la actividad de los dos genes.

[0139] Además de la orientación GFP a la ATG de iniciación del gen de la beta-globina, hemos utilizado una estrategia novedosa para orientar la plena beta-globina de ADNc en marco al sitio de inicio de beta-globina seguido de un casete de selección P140K MGMT. Hemos utilizado esta estrategia para enriquecer las células diana con la combinación de fármacos 6-bencilguanina y carmustina in vitro; este sistema de selección también se puede utilizar para seleccionar células diana in vivo. Después de cuatro rondas de selección in vitro, >80% de las células se seleccionaron como diana según lo determinado por un nuevo enfoque de secuenciación profunda para medir la eficacia de la selección. Esta combinación de nucleasas y vector de dirección podría usarse como un potencial terapéutico para el tratamiento tanto de la anemia de células falciformes como de la beta-talasemia.

EJEMPLO 6

Direccionamiento genético mediado por nucleasa manipulada del gen IL2Ry humano.

[0140] Inmunodeficiencia combinada severa X enlazada (X-SCID) es un trastorno genético provocado por mutaciones en el gen de cadena gamma del receptor de interleucina 2 (IL2Ry), que forma parte del receptor para las interleucinas IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21. Un producto del gen IL2Ry no funcional da como resultado defectos extensos en la señalización de interleucina que paralizan la capacidad de los linfocitos para diferenciarse en células T funcionales, células B y células asesinas naturales, lo que resulta en una devastadora falta de un sistema inmunológico adaptativo. Sin un trasplante de médula ósea exitoso, los pacientes generalmente mueren en el primer año de vida como resultado de infecciones graves.

[0141] Nuestro objetivo es utilizar la transcripción del tipo activador de nucleasas efectoras (TALENs) para estimular la adición genética de IL2Ry cADN en células X-SCID derivadas del paciente. TALENs crean saltos de sitio específico de doble cadena (DSBs) en el ADN que pueden ser reparados por medio de recombinación homóloga con una plantilla de ADN donante, dando como resultado la corrección del gen endógeno o adición de nuevas secuencias genéticas. Para un paciente específico, la forma más simple de terapia génica sería la corrección directa de la mutación que causa la enfermedad. Un inconveniente significativo de este enfoque es que el tratamiento de pacientes con X-SCID con diversas mutaciones diseminadas por todo el gen requeriría el desarrollo de muchos pares diferentes de nucleasas y plantillas de ADN del donante, cada uno de los cuales podría tener diferentes perfiles de eficacia y toxicidad. El direccionamiento del ADNc de IL2Ry completo al exón 1 podría evitar potencialmente este problema y permitir una estrategia de direccionamiento de un solo gen que sería terapéutica para casi todos los pacientes con X-SCID.

[0142] Desarrollamos pares de secuencias de direccionamiento de TALEN inmediatamente corriente arriba del codón de inicio de IL2Ry. Todos los pares de TALEN diseñados con una longitud de espaciador óptima fueron muy activos en la creación de DSB en la diana endógena, generando mutaciones en el 30-40% de los alelos en una línea celular K562. Curiosamente, el efecto de variar la longitud del espaciador se ve claramente con estos TALEN altamente activos, ya que cada combinación con longitudes de espaciador subóptimas o no óptimas mostró una actividad disminuida o ninguna actividad, respectivamente. Cuando se transfectó una plantilla de ADN de un donante que contenía un inserto de Ubc-eGFP con el par TALEN más activo, se observó integración de Ubc-eGFP en el 22% de las células, en comparación con un nivel de fondo de integración del 1-2% con el donante de Ubc-eGFP solo.

[0143] Los datos preliminares en líneas celulares linfoblastoides X-SCID derivadas del paciente de varios pacientes muestran la integración mediada por TALEN de UBC-eGFP y están en curso experimentos dirigidos a IL2Ry cADN completo a IL2Ry Exon 1. Los resultados de estos experimentos ilustran el potencial de usar una estrategia de selección de un solo gen para producir niveles de proteína funcional de tipo silvestre regulados endógenamente en células de pacientes con diversas mutaciones que causan enfermedades. El uso de TALEN para estimular la adición de genes en una población ex vivo de células derivadas de pacientes podría representar una estrategia de tratamiento para X-SCID y otras enfermedades monogénicas que restauran la función del gen de tipo silvestre en el locus endógeno sin estimular la transformación oncogénica.

EJEMPLO 7

Integración dirigida de factores de crecim iento en fibroblastos para promover la cicatrización de heridas.

[0144] El gen que codifica el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-B) fue dirigido al locus ROSA26 en fibroblastos de ratón (véase el Ejemplo 2, más arriba, y la Figura 20). Los fibroblastos modificados para comprender un gen PDGF integrado se ensayaron para determinar su capacidad para promover la cicatrización de heridas en el modelo de ratón de cicatrización de heridas por Galiano et al. ((2004) Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Rep Regen. 12 (4): 485-92) (Fig. 22). Las lesiones trasplantadas con fibroblastos modificados con PDGF demostraron una cicatrización significativamente mayor 14 días después del trasplante en comparación con las lesiones trasplantadas con fibroblastos no modificados.

[0145] Por lo tanto, el genoma de edición sin interrupción del gen diana se puede utilizar para células ingeniero ex vivo para secretar factores de crecimiento de curación de heridas, por ejemplo PDGF, VEGF, EGF, TGFa, TGBp, FGF, TNF, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, factor de crecimiento derivado del endotelio, etc. (véase, por ejemplo, la Figura 19), que luego se pueden trasplantar a un individuo para facilitar la curación de una herida aguda o crónica. Estas células pueden ser autólogas, es decir, derivadas del individuo al que se trasplantan, o pueden ser universales, es decir, células que no proceden del individuo receptor. Por ejemplo, las células pueden ser fibroblastos, por ejemplo, fibroblastos aislados de un individuo, fibroblastos universales, fibroblastos inducidos a partir de una célula madre, por ejemplo, iPSC. Se pueden trasplantar al sitio de una lesión, o a un sitio en otra parte del cuerpo y dejar que migren al sitio de la lesión. Además del factor de crecimiento de cicatrización de heridas, el ácido nucleico que está integrado en el locus diana puede comprender ADNc para el gen en el locus endógeno; y/o un marcador seleccionable, por ejemplo, para seleccionar y enriquecer las células manipuladas; y/o un gen suicida, por ejemplo, para eliminar los de las células manipuladas. Véase, por ejemplo, la Figura 7. El experto en la materia reconocerá que se puede utilizar cualquier combinación de elementos como se describe en el presente documento para lograr la curación de la herida.

[0146] La terapia basada en células de fibroblastos puede usarse en cualquiera de una variedad de condiciones. Por ejemplo, la terapia basada en células de fibroblastos puede usarse en el tratamiento de enfermedades genéticas, por ejemplo, epidermólisis ampollosa; como vehículo para la administración de proteínas sistémicas, por ejemplo, para administrar factores de coagulación; como vehículo para la administración de proteínas locales, por ejemplo, para administrar citocinas para la cicatrización de heridas, isquemia tisular, etc. El experto en la materia reconocerá otras aplicaciones.

[0147] Un ejemplo de una utilidad de la terapia basada en células de fibroblastos es para el tratamiento de heridas crónicas, por ejemplo en la diabetes. En 2007, había 24 millones de personas con diabetes y 54 millones con prediabetes. En 2001, el 6% de los pacientes desarrollaron úlceras diabéticas que no cicatrizaron. Actualmente, 1-3 millones de personas desarrollan nuevas úlceras por presión por año. Los factores que contribuyen a tales úlceras incluyen isquemia, neuropatía, inmovilidad, mala nutrición e infección. Las opciones de tratamiento actualmente incluyen control de infecciones, desbridamiento quirúrgico y/o cobertura de tejidos blandos, revascularización, nutrición correcta, prevención de la inmovilidad, apósitos de presión negativa y otras modalidades avanzadas de apósitos. Como se demuestra en las Figuras 20-23, la expresión de citocinas tales como PDGF a partir de fibroblastos modificados usando las metodologías descritas en el presente documento promueve la curación de heridas en un modelo de ratón de curación de heridas crónicas. Estos resultados demuestran la utilidad de la terapia basada en células de fibroblastos en el tratamiento de úlceras diabéticas.

EJEMPLO 8

[0148] La terapia génica es la modificación del contenido de ácido nucleico de las células con fines terapéuticos. Si bien los primeros éxitos de la terapia génica clínica fueron limitados, en los últimos cinco años se han realizado varios ensayos clínicos de terapia génica con éxito. Estos incluyen la restauración de la visión en pacientes con amaurosis congénita de Leber (LCA) con un vector AAV (Maguire, AM, et al., Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med, 2008. 358 (21): p. 2240-8), la generación de niveles terapéuticos de factor IX a partir de la transducción in vivo de AAV del hígado para la hemofilia B (Kay, MA, et al., Evidence for gene transfer and expression of factor IX in haemophilia B patients treated with an AAV vector. Nat Genet, 2000. 24 (3): p. 257-61; Manno, CS, et al., Successful transduction of liver in hemophilia by AAV-Factor IX and limitations imposed by the host immune response. Nat Med, 2006. 12 (3): p. 342-7; Nathwani, AC, et al., Adenovirusassociated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. N Engl J Med, 2011. 365 (25): p. 2357-65), la remisión de la leucemia a través de la transducción lentiviral de células T con un receptor de antígeno quimérico contra CD19 (Porter, DL, et al., Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med, 2011. 365 (8): pág. 725-33), la restauración de un sistema inmunológico funcional mediante la transducción retroviral ex vivo de células madre y progenitoras hematopoyéticas para las inmunodeficiencias primarias SCID-X1, ADA-SCID y síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) (Aiuti, A., et al., Correction of ADA-SCID by stem cell gene therapy combined with nonmyeloablative conditioning. Science, 2002. 296 (5577): p. 2410-3; Blaese, RM, et al., T lymphocyte-directed gene therapy for ADA-SCID: initial trial results after 4 years. Science, 1995. 270 (5235): p. 475-80; Boztug, K., et al., Stem-cell gene therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome. N Engl J Med, 2010. 363 (20): p. 1918-27; Cavazzana-Calvo, M., et al., Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)-X1 disease. Science, 2000. 288 (5466): p. 669-72) y el establecimiento de la independencia transfusional de un paciente con p-taiassemia después de la transducción ex vivo de células madre y progenitoras hematopoyéticas con un vector lentiviral (Cavazzana-Calvo, M., et al., Transfusion independence and HMGA2 activation after gene therapy of human beta-thalassaemia. Nature, 2010. 467 (7313): pág.

318-22).

[0149] Eventos adversos graves han ocurrido por desgracia, sin embargo, en algunos pacientes de la activación de un protooncogén por la inserción retroviral no controlada del transgén. En los ensayos SCID-X1 y WAS, esto fue generalmente el resultado de la activación del gen LMO2 (Boztug, K., et al., Stem-cell genes therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome. N Engl J Med, 2010. 363 (20): p. 1918-27; Hacein-Bey-Abina, S., et al., Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirusmediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest, 2008. 118 (9): p. 3132-42), mientras que en los ensayos de enfermedad granulomatosa crónica esto resultó de la activación del gen del sitio de integración viral ecotrópica 1 (EVI1) (Stein, S., et al., Genomic instability and myelodysplasia with monosomy 7 consequent to EVI1 activation after gene therapy for chronic granulomatous disease. Nat Med, 2010. 16 (2): p. 198-204). Mientras leucemia franca o mielodisplasia no ha dado lugar al ensayo p-talasemia, el paciente único informado desarrolló una expansión clonal no maligna de la desregulación de inserción del gen HMGA2 (Cavazzana-Calvo, M., et al, Transfusion independence and HMGA2 activation after gene therapy of human beta-thalassaemia. Nature, 2010. 467 (7313): p.

318-22). Actualmente, se están probando vectores retrovirales y lentivirales genómicamente más seguros, no está claro si la ventana terapéutica entre la eficacia clínica y el riesgo de desregulación insercional de oncogenes es lo suficientemente amplia como para que el enfoque sea útil como enfoque general cuando la integración del transgén es insuficiente. necesario.

[0150] Un enfoque alternativo sería evitar integraciones incontroladas por completo y, en su lugar, dirigir el nuevo material genético precisamente a una ubicación genómica especificada mediante recombinación homóloga. La recombinación homóloga es un mecanismo importante que utiliza las células para reparar roturas de doble hebra (DSB). En la edición del genoma, la maquinaria de recombinación homóloga puede incrementarse proporcionando una plantilla donante para que la célula la utilice para reparar una DSB inducida por nucleasa modificada. De esta forma, las secuencias del donante proporcionado se integran de forma precisa en el genoma. En contraste con la edición del genoma mediada por uniones terminales no homólogas en las que se insertan inserciones y/o deleciones aleatorias en una ubicación genómica específica mediante la reparación de un DSB inducido por nucleasa, se obtiene un nivel adicional de precisión en la edición de genoma mediada por recombinación homóloga como cambios definidos en el ADN (tanto grandes como pequeños) se introducen en un lugar preciso.

[0151] El uso de recombinación homóloga para la edición del genoma se puede clasificar en dos categorías básicas. La primera es utilizar la recombinación homóloga para modificar directamente el gen terapéutico de interés. Un ejemplo de este enfoque es modificar el locus IL2RG como un enfoque para curar SCID-X1 (Lombardo, A., et al., Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nat Biotechnol, 2007.

25 (11): p. 1298-306; Urnov, FD, et al., Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature, 2005. 435 (7042): p. 646-51). Este método tiene la ventaja de que el transgén se expresa a través de los elementos reguladores endógenos y mantiene así un control espacial y temporal preciso de la expresión del transgén. El segundo es utilizar la recombinación homóloga para dirigir un transgén a una ubicación genómica específica no relacionada con el transgén en sí (Benabdallah, BF, et al., Targeted gene addition to human mesenchymal stromal cells as a cell-based plasma-soluble protein delivery platform. Cytotherapy, 2010. 12 (3): p. 394­ 9; Hockemeyer, D., et al., Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol, 2009. 27 (9): pág,851-7). Idealmente la diana genómica sería un "Safe Harbor", definido como un sitio genómico que cuando un transgén se integra no habría ningún cambio en el comportamiento celular, excepto que se determina por el nuevo transgén. Esta es una definición estrictamente funcional más que bioinformática o supuesta de Safe Harbor. Dada la complejidad funcional del genoma que contiene no solo genes que codifican proteínas, sino también una abundancia de ARN no codificantes y una plétora de elementos reguladores dispersos, es muy difícil asignar con seguridad cualquier ubicación genómica como Safe Harbor, aunque el locus ROSA26 en ratones parece calificar. El locus AAVS1, por ejemplo, ha sido propuesto como un Safe Harbor (Hockemeyer, D., et al., Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol, 2009. 27 (9): p. 851-7), pero la alteración de incluso un alelo del gen 12C de la subunidad reguladora de la proteína fosfatasa 1 dentro del cual reside AAVS1 puede tener efectos sutiles pero importantes sobre el comportamiento celular. Los loci de Safe Harbor que pueden alterarse sin consecuencias fisiológicas pueden, por definición, desconectarse de los procesos biológicos activos de una manera que limite la expresión transgénica y la eficacia terapéutica. El estado de cromatina cerrado de un locus inactivo también puede inhibir el acceso óptimo a la nucleasa.

[0152] Este ejemplo describe la orientación de genes por recombinación homóloga. En este enfoque, se usa una nucleasa diseñada, ya sea una nucleasa con dedos de zinc (ZFN) o una nucleasa efectora TAL (TALEN), para inducir una DSB en un Safe Harbor, pero el vector de dirección está diseñado de manera que la modificación de la diana no se interrumpa después de la integración. En nuestros estudios de prueba de principio, en realidad corregimos simultáneamente el locus diana e insertamos un transgén. El aspecto de la corrección es un aspecto conveniente pero no esencial de la estrategia de focalización. Usando este método, virtualmente cualquier locus en el genoma podría usarse como Safe Harbor o usarse para impulsar la expresión de un transgén de una manera temporal y espacialmente específica.

MATERIALES Y MÉTODOS

[0153] Generación de construcciones de adición de genes. Construimos el vector de adición de genes en la Figura 27.1 sintetizando los nucleótidos 38-720 de GFP (Genscript). Los nucleótidos 38-303 consisten en los nucleótidos publicados, mientras que 304-720 se modifican como se describe en la Figura 27.1B. Luego subclonamos esta construcción en un vector de expresión pUB6 (Life Technologies, Grand Island, NY). Usando el mismo plásmido del que derivamos el ratón knock-in (Connelly, JP, et al., Gene correction by homologous recombination with zinc finger nucleases in primary cells from a mouse model of a generic recessive genetic disease. Mol Ther, 2010. 18 (6): p. 1103­ 10), amplificamos por PCR la región de homología 3' con 5'AAGGACGACGGCAACTAC3' (SEQ ID No :1) y 5'Ga CGTGCGCTt Tt GAAGCGT3' (SEQ ID NO:2) y también subclonamos en el vector de expresión pUB6. A continuación, amplificamos por PCR el gen de la hGH (SC300088 Origene, Rockville, MD) y lo subclonamos en el vector junto con una región PoliA. Para las construcciones de hGH de múltiples copias, realizamos dos PCR para la clonación: la primera eliminó el codón de terminación dentro de la hGH y la segunda fusionó una secuencia Furin-SGSG-T2A (5'CGCAAGCGCCGCAGCGGCAGCGGCGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTG ACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCC3' (SEQ ID NO:3) delante de hGH de modo que cuando se clonaran juntas, las dos construcciones estarían en el mismo ORF. La clonación en serie de estas dos construcciones permitió la generación de vectores donantes de múltiples copias. Para el vector ANGFR, la construcción sintetizada de GFP 38-720 descrita anteriormente se amplificó por PCR para eliminar el codón de terminación y la Furin-SGSG-T2A se fusionó mediante PCR con la construcción ANGFR. La subclonación de estos dos en marco dio como resultado el plásmido donante descrito en la Figura 27.4. Todas las enzimas de restricción se solicitaron a New England Biolabs Inc.

[0154] Generación de ZFN y TALEN. Los ZFN descritos son los mismos dos pares que hemos publicado anteriormente (Connelly, JP, et al., Gene correction by homologous recombination with zinc finger nucleases in primary cells from a mouse model of a generic recessive genetic disease. Mol Ther, 2010. 18 (6): pág,1103-10). Los TALEN se diseñaron para reconocer TGCCCGAAGGCTACGT (SEQ ID NO:4) en la hebra sentido y TTGCCGTCGTCCTTGAAG (SEQ ID NO:5) en la hebra antisentido. El espaciador entre los TALEN es de 18 pares de bases. Dentro de las repeticiones de TALEN, NN reconoce G, HD reconoce C, NI reconoce A y NG reconoce T. Estos se clonaron en un vector de expresión de CMV junto con el dominio de nucleasa Fokl de codón optimizado de tipo silvestre y contienen una etiqueta 3x FLAG.

[0155] Análisis de cultivo, transfección y adición de genes de fibroblastos primarios. Se aislaron fibroblastos primarios de las orejas de ratones de 3-6 meses mediante 1 hora de digestión en colagenasa/dispasa (4 mg/ml) (Roche) y luego se añadió 1 ml de medio MAF y las células se incubaron durante la noche a 37 grados. A la mañana siguiente, las células se trituraron, se filtraron con un colador de células 70 uM (BD Biosciences, San José, CA) y luego se cultivaron en DMEM, FBS al 16%, Pen/Strep, L-Glut, Fungizone y 1X aminoácidos no esenciales. Críticamente, todos los cultivos se mantuvieron en condiciones de bajo oxígeno (5%) lo que mejora drásticamente la supervivencia de las células y minimiza la senescencia temprana. 1x106 células por muestra se nucleofectaron por muestra utilizando el kit básico de fibroblastos (Lonza, Suiza, Cat. VPI-1002) con el programa U-23 y se analizaron para la fluorescencia de GFP mediante citometría de flujo. La adición de genes fue confirmada por DIG-Southern (Roche) usando un EcoRV digerido y una sonda diseñada contra la región PGK-Neo en el extremo 3' de nuestro locus knockin (descrito en Connelly, JP, et al., Gene correction by homologous recombination with zinc finger nucleases in primary cells from a mouse model of a generic recessive genetic disease. Mol Ther, 2010. 18 (6): p. 1103-10). La PCR para la adición de genes se realizó utilizando los 3 cebadores siguientes:

F: 5'ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA3' (SEQ ID NO:6)

R1: 5TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG3' (SEQ ID NO:7)

R2: 5'TTATTTGCCTAGAGCAGCTCG (SEQ ID NO:8)

La expresión de la hormona del crecimiento se cuantificó mediante ELISA (ELH-GH-001 RayBiotech, Norcross, GA) mediante el cultivo de 2 x 104 fibroblastos en 1 ml de medio durante 24 horas. La selección de NFGR se realizó mediante tinción con anticuerpos conjugados con cuentas magnéticas (kit MACS 130-092-283, Miltenyi Biotec). Las células se resuspendieron en 2,5 ml de tampón MAC, luego se incubaron en un imán Easy Sep (18000 Stemcell Technologies) durante 10 minutos en un tubo de 5 ml. El líquido se vertió enérgicamente fuera del tubo y luego se repitió la resuspensión y la incubación magnética. Después de 3-4 días, se repitió la selección.

[0156] Trasplante de fibroblastos primarios. Para los experimentos de trasplante, los fibroblastos se sometieron a la adición de genes mediante nucleofección como se describió anteriormente. Las células se analizaron mediante citometría de flujo antes del trasplante y luego se inyectaron por vía subcutánea en una matriz Matrigel (BD Biosciences, San José, CA) en el dorso de un ratón hermano o un suero antitimocito (Fitzgerald Industries) tratado sin parentesco. Los ratones que recibieron tratamiento con ATS recibieron 120 mg/kg por vía intraperitoneal durante el transcurso de 4 días antes del trasplante para un total de 480 mg/kg. La eliminación satisfactoria de linfocitos se confirmó con análisis de CBC utilizando un sistema HemaVet (Drew Scientific Waterbury, CT). Es de destacar que encontramos que en nuestros ratones la dosis necesaria para este lote de suero fue más alta que la requerida por estudios anteriores, lo que sugiere que los lotes individuales deben probarse por cepa para determinar la eficacia. Después de 10 o 30 días después del trasplante, se cortó el tapón de Matrigel y luego se procesó de la misma manera que la derivación inicial de fibroblastos anterior. La fluorescencia postrasplante se cuantificó mediante citometría de flujo, y el porcentaje de supervivencia se calculó como porcentaje postrasplante GFP positivo normalizado a pretrasplante GFP positivo. La expresión de hGH después del trasplante se cuantificó con ELISA del medio de cultivo de tejidos 24 horas después de que los tapones de Matrigel recolectados se sembraron en cultivo de tejidos, como se describió anteriormente.

RESULTADOS

[0157] D irig ir el ADNc de la hormona del crecim iento a un Safe Harbor sin interrupciones. Una desventaja de las estrategias actuales de adición de genes Safe Harbor es que debe identificarse un Safe Harbor en donde la inserción dirigida y la interrupción del locus no produzcan perturbaciones fisiológicas. Buscamos diseñar una estrategia de adición de genes que preservara el producto genético del Safe Harbor. Para este propósito, utilizamos un modelo de ratón knock-in que hemos descrito previamente (Connelly, JP, et al., Gene correction by homologous recombination with zinc finger nucleases in primary cells from a mouse model of a generic recessive genetic disease. Mol Ther, 2010.

18 (6): p. 1103-10), para servir como reportero de eventos de adición de genes. Brevemente, se insertó un gen GFP mutado no fluorescente en el locus ROSA26 de ratón en células madre embrionarias de ratón(es) mediante recombinación homóloga. Luego generamos ratones transgénicos a partir de estas células ES de ratón dirigidas. Elegimos este modelo porque la restauración del producto génico endógeno (GFP) proporciona un informador que es completamente específico para un evento de adición de genes.

[0158] Modelos reporteros de gen Safe Harbor actuales se basan en la integración de un transgén capaz de expresión independiente, independientemente del sitio de inserción. En esta estrategia, se transfectan nucleasas específicas de sitio junto con un plásmido donante que contiene un transgén y un promotor de longitud completa. Después de la transfección, puede producirse una integración dirigida o aleatoria. La eficiencia de la selección de genes determina la relación entre la integración dirigida y la aleatoria. Debido a que la expresión del transgén no depende de la integración específica del sitio, la integración aleatoria no se puede distinguir convenientemente (por citometría de flujo, por ejemplo) de los eventos dirigidos. En nuestro modelo, solo la adición de genes específicos del sitio restaura la expresión de nuestro informador y es un sistema más conveniente para estudiar los eventos de adición de genes.

[0159] Diseñamos un plásmido donante que contenía una región 5' de homología con el locus diana, seguida de una secuencia no homóloga capaz de completar el término C de GFP, seguida de un transgén, y finalmente una región 3' de homología con la locus diana (Figura 25A). Fundamentalmente, diseñamos el extremo C-terminal del gen GFP para que tenga múltiples mutaciones de oscilación que crean diferencias significativas a nivel de ADN pero no diferencias a nivel de proteína. Esta estrategia de creación de no homología sirve para prevenir el cruce por la maquinaria de recombinación homóloga antes de la integración del casete del transgén (Figura 25B). Generamos dos construcciones, una con aproximadamente cada tercer nucleótido modificado (64,5% de identidad) y una con aproximadamente cada sexto nucleótido modificado (83,5% de identidad). Encontramos que ambos eran lo suficientemente diferentes como para no ser reconocidos como homología por la maquinaria de recombinación homóloga y ambos eran capaces de restaurar la expresión de GFP. En las células 293T, la GFP resultante de ambas construcciones se expresó lo suficientemente bien como para ser analizada por citometría de flujo, sin embargo, en fibroblastos primarios derivados de nuestro modelo de ratón, la construcción del 64,5% era demasiado tenue para distinguir de manera confiable las células positivas de GFP. Creemos que la oscuridad de GFP es el resultado de tener que cambiar múltiples codones optimizados para la expresión a codones que no son óptimos para la expresión en células de mamíferos. Observamos una disminución en la frecuencia de selección de genes en comparación con la corrección directa de genes (Figura 29) pero a diferencia de un experimento de adición de genes estándar donde las células positivas reflejan integraciones tanto aleatorias como específicas, en este sistema podríamos identificar y purificar fácilmente integrantes específicos sin integrantes aleatorios. Como resultado, procedimos con construcciones que contenían un 83,5% de identidad de GFP para los experimentos restantes (Figura 25B).

[0160] Hemos observado que una construcción que consta de dos brazos de homología y nuestro constructo GFP al 83,5% seguido por el promotor de Ubiquitina C (UBC) de la expresión de la hormona del crecimiento humano de accionamiento (hGH) de ADNc podría ser dirigido en fibroblastos primarios derivados de nuestro modelo de ratón a una frecuencia del 0,27% (Figura 25C). Las células positivas para GFP se purificaron mediante FACS (Figura 25C) y se analizaron mediante transferencia Southern y PCR para confirmar el direccionamiento (Figura 25D y E).

[0161] La expresión de la hGH fue confirmada por ELISA a ser 15 ng por millón de células GFP positivas por 24 horas (Figura 25F). Estos datos confirmaron que podríamos generar un constructo donante para la adición de genes que, mediante la modificación de la secuencia de nucleótidos para evitar el reconocimiento como homología, podría mantener (o en este caso, restaurar) la expresión génica de Safe Harbor después de un evento de adición de genes. Además, establecimos un indicador específico para la adición de genes mediante la restauración de GFP que permite una rápida cuantificación de las frecuencias de adición de genes. El mantenimiento de la expresión del producto génico endógeno (GFP) en el locus de orientación proporciona una prueba del principio de que la adición de genes puede ocurrir mediante la estrategia descrita sin la necesidad de identificar un locus Safe Harbor que pueda tolerar la interrupción.

[0162] Trasplante de fibroblastos que expresan hormona de crecim iento dirigida. En un enfoque ex vivo para modificar células genéticamente para terapia génica, el injerto estable de células modificadas con genoma después del trasplante es fundamental. Por tanto, determinamos si los fibroblastos modificados generados en la Figura 1 podrían implantarse en un ratón receptor. Los fibroblastos se inyectaron por vía subcutánea en una matriz de Matrigel y se recolectaron 10 o 30 días después del trasplante. Después de la recuperación, las poblaciones de células se analizaron para determinar la expresión de GFP mediante citometría de flujo y la expresión de hGH mediante ELISA. En un ratón hermano, el 75% de las células recuperadas a los 10 días después del trasplante fueron positivas para GFP, normalizadas para la población previa al trasplante. Sin embargo, después de 30 días, quedaba el 45%. Estas poblaciones secretaron 14,4 y 6,5 ng de hGH por millón de células por 24 horas, respectivamente. Presumimos que esta disminución puede ser inmunomediada, ya sea debido a una respuesta al péptido de la hormona del crecimiento humano o porque nuestra cepa informadora de ratón no es una cepa isogénica y las células trasplantadas no son inmunológicamente idénticas al ratón receptor. Para probar la hipótesis del aclaramiento inmunomediado, se trasplantaron fibroblastos en una cepa no relacionada en presencia o ausencia de suero anti-timocitos de ratón (ATS) (inyectado intraperitonealmente durante 4 días antes del trasplante). Se observó que en ausencia de ETA, el 42% de las células trasplantadas permanecían después de 10 días, y después de 30 días, solo el 0,04%. Estas poblaciones secretaron 7 y 0,02 ng de hGH por millón de células por 24 horas, respectivamente. Sin embargo, después de solo un ciclo de tratamiento con ATS, el 92% de las células permanecieron después de 10 días y el 56% después de 30 días. Estas células secretaron 17,3 y 12,5 ng de hGH por millón de células por 24 horas, respectivamente (Figura 26). Estos resultados demuestran la reintroducción exitosa de células genéticamente modificadas que son capaces de persistir en un receptor durante al menos 30 días. A partir de estos datos, también se pudo demostrar que la expresión de GFP y la expresión de hGH tienen una relación lineal con un valor R2 de 0,95.

[0163] El direccionamiento de múltiples copias de ADNc aumenta la expresión transgénica. La integración aleatoria de transgenes a menudo se produce mediante la multimerización del transgén como una matriz integrada. La integración del transgén puede resultar en una disminución de la expresión a medida que la matriz se silencia o en un aumento de la expresión porque hay múltiples copias. Determinamos si la orientación controlada de múltiples copias de un transgén a un único locus genómico se traduciría en una mayor expresión del transgén. Se usó el péptido T2A derivado del insecto virus Thosea asigna para generar vectores multicistrónicos. El resto media un mecanismo de salto ribosómico que da como resultado el enlace y la expresión de múltiples marcos de lectura abiertos (Szymczak, AL, et al., Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'selfcleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nat Biotechnol, 2004, 22 (5): pág. 589-94). Se generaron cuatro construcciones, cada una con números crecientes de ADNc de hGH denominados hGH1x, hGH2x, hGH3x, hGH4x (Figura 27A). Hemos encontrado que la adición de genes se podría conseguir con éxito con todos los cuatro constructos a una frecuencia de 0,07%, 0,04%, 0,05%, 0,02%, respectivamente (Figura 27B). A continuación, clasificamos los fibroblastos positivos para GFP mediante FACS y analizamos la expresión de hGH mediante ELISA. Encontramos que entre 1-3 copias de hGH, el número de copias se correlacionó positivamente con los niveles de expresión (Figura 27C). Sin embargo, la expresión de 4 repeticiones (4x) fue menor que la de menos repeticiones. Por tanto, la orientación a una serie de transgenes unidos con un péptido 2A da como resultado un aumento no lineal en la expresión del transgén.

[0164] Las nucleasas efectoras de TAL son más activas y menos tóxicas que las nucleasas de dedo de zinc. Usamos nucleasas con dedos de zinc (ZFN) descritas anteriormente para apuntar a la adición de genes en las Figuras 25-27. Luego comparamos las nucleasas efectoras de TAL (TALEN) diseñadas para apuntar a la secuencia que se superpone con la secuencia dirigida por los ZFN (Figura 29). Utilizando el constructo del donante descrito en la Figura 1A, determinamos que la frecuencia de orientación para TALEN era cinco veces mayor que para ZFN (Figura 28A).

En un experimento de titulación, encontramos que los TALEN tenían frecuencias de direccionamiento más altas que las ZFN en cada cantidad de plásmido de expresión de nucleasa transfectado (Figuras 28B y 28C). De hecho, los TALEN fueron capaces de estimular un direccionamiento sustancial cuando se transfectaron incluso cantidades muy bajas (0,1 ug) de las construcciones de expresión de TALEN. En nuestro trabajo anterior con ZFN, habíamos visto un efecto de "ricitos de oro" en donde era necesario transfectar una cantidad óptima de ZFN para obtener las frecuencias máximas de focalización, pero nunca habíamos podido reducir la cantidad de ZFN tanto como pudimos con los TALEN. (Figuras 28B y 28C y (Pruett-Miller, SM, et al., Comparison of zinc finger nucleases for use in gene targeting in mammalian cells. Mol Ther, 2008. 16 (4): p. 707-17; Pruett-Miller, SM, et al., Atenuación de la toxicidad de nucleasa con dedos de zinc por regulación de moléculas pequeñas de los niveles de proteína. PLoS Genet, 2009. 5 (2): p. E1000376)).

[0165] Se compararon los perfiles de toxicidad para los pares de ZFN y TALEN utilizando un ensayo de supervivencia basada en células que ha demostrado ser un sustituto preciso para la especificidad de la nucleasa (Pruett-Miller, SM, et al., Comparison of zinc finger nucleases for use in gene targeting in mammalian cells, Mol Ther, 2008. 16 (4): p.

707-17). Se transfectó un plásmido fluorescente tdTomato con o sin nucleasas y la expresión de tdTomato se analizó mediante citometría de flujo en los días 2 y 6 después de la transfección. La supervivencia celular se calculó como una proporción de día 6: día 2 de fluorescencia normalizada a muestras transfectadas sin nucleasa. Encontramos que las células transfectadas con el promotor Ubc que impulsa un par de ZFN retuvieron el 96% de supervivencia celular, el promotor de CMV que impulsaba un segundo par de ZFN tenía una supervivencia celular del 83%, mientras que el par TALEN tenía una supervivencia celular del 100% (Figura 28D). Por lo tanto, el par TALEN demostró una marcada superioridad en comparación con los ZFN en términos de mayor frecuencia de adición de genes, incluso en cantidades de transfección muy bajas, y disminución de la toxicidad celular asociada.

[0166] Adición de genes que aprovecha un promotor endógeno. Finalmente, determinamos si un transgén podría insertarse en marco con el locus diana, de modo que no sería necesario el uso de un promotor exógeno. Diseñamos una construcción donante en donde un marcador seleccionable de superficie biológicamente inerte, ANGFR, se expresaría corriente abajo del gen GFP restaurado a través de un enlace peptídico T2A (Figura 28E). Demostramos que los TALEN podrían inducir altos niveles de focalización con este donante al 1,9% por ciento en comparación con el 0,07% de los ZFN y que los fibroblastos diana podrían purificarse rápida y fácilmente mediante separación de cuentas magnéticas para ANGFR (Figura 28F). Estos datos proporcionan una prueba de principio para una estrategia de direccionamiento en donde un transgén puede dirigirse a cualquier locus de manera que el transgen sea impulsado por los elementos reguladores endógenos del gen diana sin interrumpir la expresión del producto génico endógeno.

DISCUSIÓN

[0167] En un trabajo anterior (Connelly, JP, et al, Gene correction by homologous recombination with zinc finger nucleases in primary cells from a mouse model of a generic recessive genetic disease. Mol Ther, 2010. 18 (6): P 1103­ 10) describimos una estrategia de direccionamiento génico específico de sitio mediado por nucleasa ex vivo en fibroblastos primarios adultos de ratón. Este trabajo actual amplía esta estrategia al demostrar que los fibroblastos pueden sufrir eventos de adición de genes específicos del sitio para secretar proteínas de una manera que utiliza un informador específico de adición de genes que no requiere la interrupción del locus diana endógeno. En la literatura, la adición de genes en fibroblastos se ha utilizado para tres categorías de terapia. En primer lugar, los fibroblastos se han modificado en enfermedades en las que el fibroblasto está directamente relacionado con la patología, como la epidermólisis ampollosa (Titeux, M., et al., SIN retroviral vectors expressing COL7A1 under human promoters for ex vivo gene therapy of recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Mol Ther, 2010. 18 (8): p. 1509-18). En segundo lugar, los fibroblastos se han modificado para que sirvan como vehículos para el suministro de proteínas sistémicas mediante la secreción de proteínas ectópicas como el factor VIII y IX para el tratamiento de la hemofilia A y B (Palmer, TD, AR Thompson y AD Miller, Production of human factor IX in animals by genetically modified skin fibroblasts: potential therapy for hemophilia B. Blood, 1989. 73 (2): p. 438-45; Roth, dA, et al., Nonviral transfer of the gene encoding coagulation factor VIII in patients with severe hemophilia A. N Engl J Med, 2001. 344 (23): p. 1735-42; Qiu, X., et al., Implantation of autologous skin fibroblast genetically modified to secrete clotting factor IX partially corrects the hemorrhagic tendencies in two hemophilia B patients. Chin Med J (Engl), 1996. 109 (11): p. 832-9). Por último, los fibroblastos se han modificado para secretar proteínas ectópicas, como las citocinas, para que sirvan como potenciadores de un proceso biológico local. Esto se ha empleado en modelos de cicatrización de heridas, en modelos de isquemia tisular e incluso en modelos de neurorregeneración periférica a través de la secreción de factores neurotróficos después de una lesión (Zhang, Z., et al., Enhanced collateral growth by double transplantation of genenucleofected fibroblasts in ischemic hindlimb of rats. PLoS One, 2011. 6 (4): p. e19192; Mason, MR, et al., Gene therapy for the peripheral nervous system: a strategy to repair the injured nerve? Curr Gene Ther, 2011. 11 (2): p. 75­ 89; Breitbart, AS, et al., Treatment of ischemic wounds using cultured dermal fibroblasts transduced retrovirally with PDGF-B and VEGF121 genes. Ann Plast Surg, 2001. 46 (5): p. 555 -61; discusión 561-2). Aunque se han descrito muchas variaciones de la modificación de fibroblastos, esta es la primera descripción de la creación de fibroblastos modificados para expresar marcadores de superficie o proteínas secretadas utilizando la precisión de la recombinación homóloga y la integración específica de sitio mediada por nucleasa.

[0168] Estudios previos, por ejemplo, los descritos anteriormente, utilizan estrategias de adición de genes que aplican estrategias basadas en virus o plásmidos que se basan en la integración aleatoria de transgenes en el genoma de la célula huésped (Gauglitz, GG, et al., Combined gene and stem cell therapy for cutaneous wound healing. Mol Pharm, 2011. 8 (5): p. 1471-9). A nivel del genoma, esta estrategia conlleva limitaciones inherentes que incluyen la expresión génica impredecible, el silenciamiento de la expresión génica y también el riesgo de oncogénesis insercional. El desarrollo de leucemia y mielodisplasia en varios ensayos clínicos de terapia génica diferentes resalta el riesgo real, más que teórico, de la oncogénesis de inserción (Boztug, K., et al., Stem-cell gene therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome. N Engl J Med, 2010. 363 (20): p. 1918-27; Hacein-Bey-Abina, S., et al., Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirusmediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest, 2008. 118 (9): p. 3132-42; Stein, S., et al., Genomic instability and myelodysplasia with monosomy 7 consequent to EVI1 activation after gene therapy for chronic granulomatous disease. Nat Med, 2010. 16 (2): p. 198-204). La recombinación homóloga, por el contrario, proporciona un método más seguro para que la biología sintética cree fibroblastos con nuevos fenotipos potencialmente terapéuticos.

[0169] Vectores virales no integradores se pueden utilizar para entregar transgenes in vivo pero estos enfoques pueden dar como resultado la inducción de reacciones inflamatorias patológicas del reconocimiento de elementos virales y posterior eliminación de las células modificadas por el sistema inmune del huésped (Manno, CS, et al., Successful transduction of liver in hemophilia by AAVFactor IX and limitations imposed by the host immune response. Nat Med, 2006. 12 (3): p. 342-7). Esta respuesta inmune a los vectores virales administrados in vivo puede reducir la eficacia y la seguridad, aunque el éxito reciente de los ensayos clínicos de terapia génica para LCA y hemofilia B sugiere que el enfoque puede no tener fallas fatales cuando se diseña correctamente. En el presente ejemplo de trabajo, combinamos fibroblastos diseñados, un vehículo de administración de genes menos inflamatorio, con la tecnología de adición de genes controlada y mediada por nucleasa específica del sitio, una estrategia que evita la falta de precisión de la integración aleatoria y la necesidad de sistemas de administración viral.

[0170] La literatura actual sugiere que los "safe harbors" deben ser loci que pueden ser interrumpidos sin consecuencias fisiológicas y que no llevan potencial oncogénico cuando falla. Estos requisitos limitan los loci disponibles para la focalización y aumentan la dificultad de diseñar estrategias de focalización efectivas. Además, este requisito también puede resultar en el direccionamiento de loci de Safe Harbor que están esencialmente desconectados fisiológicamente de los procesos celulares activos. Esto puede significar que esta categoría de Safe Harbor no a) proporciona sitios diana accesibles para las nucleasas en ciertos tipos de células debido al estado de cromatina cerrada o b) resulta en una expresión de proteína suficiente en ciertos tipos de células por la misma razón, lo que puede limitar la eficacia terapéutica (van Rensburg, R., et al., Chromatin structure of two genomic sites for targeted transgene integration in induced pluripotent stem cells and hematopoietic stem cells. Gene Ther, 2012). Además, estos requisitos siguen siendo teóricos, ya que se ha proporcionado poca evidencia de que la inserción de transgenes en células humanas en los loci de Safe Harbor actualmente estudiados (como AAVS1) sea verdaderamente segura para el trasplante en pacientes humanos. Por ejemplo, AAVS1 se encuentra dentro del gen PPP1R12C en el cromosoma humano 19. PPP1R12C codifica la subunidad reguladora de una fosfatasa corriente abajo de la vía de la proteína quinasa activada AMP (AMPK) involucrada con la finalización adecuada de la mitosis (Banko, MR, et al., Chemical genetic screen for AMPKalpha2 substrates uncovers a network of proteins involved in mitosis. Mol Cell, 2011. 44 (6): p. 878-92). El direccionamiento mediado por nucleasas en este locus se basa en el supuesto de seguridad porque el virus adenoasociado se integra en este locus con una frecuencia baja en ciertos tipos de células y no parece dar lugar a un estado patológico. Aquí, describimos una nueva estrategia alternativa a la interrupción de un locus Safe Harbor que puede proporcionar una flexibilidad inherente para seleccionar y apuntar al locus expresado de manera más robusta para cada tipo de célula y no se basa en la suposición de que la interrupción de cualquier locus sería implícitamente segura.

[0171] Hemos demostrado prueba de principio para esta estrategia por la orientación de una secuencia no homóloga del a Dn que codifica y completa la secuencia de aminoácido C-terminal del locus diana. La alteración de la secuencia de nucleótidos para que no se reconozca como homología es fundamental porque esto evita que el evento de recombinación homóloga excluya el transgén. Demostramos que la alteración del 16,5% de los nucleótidos, o aproximadamente cada sexto nucleótido en la posición de oscilación era suficiente para evitar el reconocimiento como homología, pero era capaz de mantener la expresión desde el Safe Harbor. Esta estrategia mejorada proporciona una ventaja sobre las estrategias actuales de selección de Safe Harbor porque ya no estamos limitados solo a los loci que pueden ser alterados sin consecuencias fisiológicas y para probar si el puerto es realmente seguro. Estas limitaciones han llevado a la selección de Safe Harbors que no tienen las capacidades óptimas para dirigirse o para niveles terapéuticos de expresión. Por esta razón, hemos demostrado que podemos apuntar a un locus (con el transgén ANGFR), en marco con el producto génico endógeno y esto permite la expresión del promotor endógeno sin alterar el locus endógeno. El uso de hacer mutaciones sinónimas en el vector donante/diana es una estrategia útil cuando se dirige a un exón de un gen. Si se usa la edición del genoma para dirigir un transgén al extremo 3' o 5' del gen y la expresión del transgén es impulsada por los elementos reguladores endógenos a través de un enlace peptídico 2A, es posible que no sea necesario introducir tales mutaciones sinónimas en el gen donante/vector diana. En algunos casos, como aquellos con ingeniería de fibroblastos, ingeniería de hepatocitos o dentro del sistema hematopoyético, aprovechar la expresión robusta y específica de tejido de loci endógenos a través de la adición de genes dirigidos sin interrupción de genes Safe Harbor puede resultar una poderosa estrategia de terapia génica.

[0172] En la transgénesis convencional por integración aleatoria, los transgenes a menudo se integran en matrices tándem de copias múltiples. Esto puede tener consecuencias que van desde niveles más altos de expresión transgénica hasta el silenciamiento del transgén debido al reconocimiento celular de la matriz (Henikoff, S., et al., Conspiracy of silence among repeated transgenes. Bioessays, 1998. 20 (7): p 532-5; Mutskov, V., et al., Silencing of transgene transcription precedes methylation of promoter DNA and histone h 3 lysine 9. EMBO J, 2004. 23 (1): p. 138­ 49; Rosser, JM, et al. al., Repeat-induced gene silencing of L1 transgenes is correlated with differential promoter methylation. Gene, 2010. 456 (1-2): p. 15-23). Presumimos que apuntar a múltiples copias de un ADNc en nuestro locus Safe Harbor podría resultar en niveles más altos de expresión transgénica, pero en un cierto umbral de número de copias, la expresión podría disminuir, posiblemente debido al silenciamiento o la inestabilidad del locus. Nos centramos en la hormona de crecimiento humana de ADNc a las 1, 2, 3, o 4 copias y observamos que hasta 3 copias proporciona un aumento en la expresión durante 1-2 copias pero que no había ningún aumento adicional con 4 copias. Estos resultados demuestran que la creación de matrices de copias múltiples dirigidas es factible, aumenta la expresión pero que el número de copias óptimo debe determinarse experimentalmente.

[0173] Los TALEN recién descubiertos se han mostrado prometedores como una herramienta de ingeniería del genoma de próxima generación. Una de las principales razones por las que los TALEN son preferibles a los ZFN es que se pueden ensamblar rápidamente para apuntar a prácticamente cualquier lugar con un enfoque de ensamblaje modular en contraste con los ZFN de alta calidad que generalmente requieren altos niveles de experiencia técnica y laboriosos para diseñar. Nuestros resultados son consistentes con los resultados publicados de otros al proporcionar otro ejemplo de que los TALEN pueden proporcionar frecuencias de focalización aumentadas con una toxicidad celular reducida. Por lo tanto, nuestros resultados, combinados con la estrategia de diseño de ensamblaje modular rápido para TALEN, respalda el desarrollo continuo de TALEN para terapia génica con posturas.

[0174] En resumen, hemos utilizado un modelo de ratón para estudiar una serie de nuevos enfoques para la edición de genoma nucleasa mediada por recombinación homóloga. Estos estudios han demostrado que los TALEN tienen propiedades mejoradas en relación con los ZFN, que se puede orientar la integración de genes a loci genómicos específicos sin interrumpir el locus diana e incluso utilizar el locus endógeno para impulsar la expresión, que las matrices de transgén de múltiples copias para aumentar la expresión del transgen pueden ser integradas usando este enfoque, y que los fibroblastos pueden diseñarse para secretar proteínas biológicamente relevantes de esta manera. Todos estos hallazgos son importantes en el uso de biología sintética combinada con terapia génica y celular para desarrollar nuevas terapias para una amplia variedad de enfermedades humanas.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Una composición de polinucleótido donante para expresar un gen de interés a partir de un locus diana en una célula sin interrumpir la expresión del gen en el locus diana, comprendiendo el polinucleótido donante:

(i) un casete de ácido nucleico que comprende:

- el gen de interés, en donde el gen de interés es el factor de coagulación 9;

- una secuencia que codifica un péptido 2A; y

(ii) secuencias que flanquean el casete que son homólogas a las secuencias que flanquean un sitio de integración en el locus diana, donde el locus diana es el gen de la albúmina,

en donde el casete está configurado de manera que el gen de interés está operativamente unido al promotor en el locus diana tras la inserción en el locus diana,

para uso en terapia génica de la hemofilia,

en donde la terapia no es un proceso para modificar la identidad genética de la línea germinal de los seres humanos.

2. La composición de polinucleótidos de donante para uso de la reivindicación 1, en donde el péptido 2A es del virus de la fiebre aftosa (F2A), virus de la rinitis A equina, teschovirus-1 porcino (P2A) o virus de Thosea asigna (T2A).

3. La composición de polinucleótidos donante para uso de la reivindicación 1, en donde las secuencias que flanquean el casete se seleccionan para insertar el gen de interés en un sitio de integración que está dentro de los primeros 50 nucleótidos 3' del codón de iniciación del gen en el locus diana.

4. La composición de polinucleótidos donantes para uso de la reivindicación 1, en donde las secuencias que flanquean el casete se seleccionan para insertar el gen de interés en un sitio de integración que está inmediatamente 3' del codón de iniciación del gen en el locus diana.

5. La composición de polinucleótidos donantes para uso de la reivindicación 1, en donde las secuencias que flanquean el casete se seleccionan para insertar el gen de interés en un sitio de integración que se encuentra dentro de los primeros 50 nucleótidos 5' del codón de terminación del gen en el locus diana.

6. La composición de polinucleótidos donante para su uso de la reivindicación 1, en donde las secuencias que flanquean el casete se seleccionan para insertar el gen de interés en un sitio de integración que está inmediatamente 5' del codón de terminación del gen en el locus diana.