CN113453702A - 细胞重编程以逆转衰老并促进组织和组织再生 - Google Patents

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Abstract

本文提供了编码OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的工程化核酸(例如，表达载体，包括病毒载体，如慢病毒载体，腺病毒载体，AAV载体，疱疹病毒载体和逆转录病毒载体)，其用于例如诱导细胞重编程，组织修复，组织再生，器官再生，逆转衰老或其任何组合。本文还提供了包含工程化核酸(例如工程化核酸)的重组病毒(例如，慢病毒，α病毒，牛痘病毒，腺病毒，疱疹病毒，逆转录病毒或AAV)，工程化细胞，包含工程化核酸、重组病毒、工程化细胞、工程化蛋白质的组合物，能够激活OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合表达的化学剂；选自OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的工程化蛋白质，能够激活OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合表达的抗体，以及治疗(例如眼疾病)，预防疾病(例如眼疾病)，调节(例如诱导或诱导然后终止)细胞重编程，调节组织修复，调节组织再生或其任何组合的方法。

Description

细胞重编程以逆转衰老并促进组织和组织再生
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2018年9月28日提交的美国临时申请号62/738,922、2019年1月14日提交的美国临时申请号62/792,283、2019年6月24日提交的美国临时申请号62/865,877和2019年7月30日提交的美国临时申请号62/880,488的优先权，其每一篇通过引用以其整体并入本文。
政府支持
本发明是在美国国立卫生研究院(NIH)授予的授权号R01 AG019719和R01DK100263的政府支持下进行的。政府拥有本发明的某些权利。
发明背景
在包括脊椎动物在内的许多动物中，重要器官的再生和修复能力有限。急性损伤和慢性疾病会损害重要的器官和组织，包括心脏，胰腺，大脑，肾脏，肌肉，皮肤和神经元组织等。然而，成熟的体细胞通常无法幸免于这些损害，即使做到了，它们也无法自我更新和转分化来替换受损的细胞。此外，能够自我更新的细胞的数量可能有限，能力有限并且容易受到损害，尤其是随着年龄的增长。与成人的体细胞不同，按时间顺序更接近受精的个体的细胞(如胚胎和婴儿的细胞)显示出细胞的年轻状态，并具有更大的抵抗损伤和压力的能力，能够治愈，更新和再生器官和组织。因此，长期以来一直寻求用于使细胞恢复活力从而将它们从衰老的成熟状态恢复到更年轻，更有活力的生命状态的组合物和方法，用以治疗某些损伤和疾病，以及总体逆转和预防整个生物体的衰老。
体内有两种类型的信息：数字信息和模拟信息。DNA是数字信息，表观基因组是模拟信息。模拟信息的持续时间永远不会长于数字信息，与数字信息相比，模拟信息也无法以高保真度复制。这会影响生物体存活和良好存活的时间。曾经有人认为衰老是由细胞遗传物质突变驱动的过程。这个解释在很大程度上已被抛弃了。现在认为衰老的主要原因是表观遗传学变化，该变化导致细胞在错误的时间转录错误的基因以实现最佳功能，该过程随着时间的流逝变得越来越功能失调，导致疾病，无法治愈并最终导致死亡。Yamanaka因子(OCT4，SOX2，c-Myc和KLF4)先前已显示在体外诱导多能性(Takahashi et al.,Cell.2006Aug 25；126(4):663-76)并逆转DNA甲基化衰老(Horvath,Genome Biol.2013)。Nanog和Lin28可以与Yamanaka因子一起帮助诱导多能性。而且Tet1，NR5A-2，Sall4，NKX3-1可以替代Oct4(Gao et al.,Cell Stem Cell 12,1–17,April 4,2013and Mai et al.,Nature Cell Biology 20,900–908,2018)。然而，转基因小鼠中四个原始转录因子的表达会在体内诱导畸胎瘤，引起其他急性毒性(如肠上皮中发育异常)，从而在几天内杀伤动物(Abad et al.,Nature.2013Oct 17；502(7471):340-5)。因此，需要无毒且有效的细胞重编程方法。
发明概述
已经假定细胞衰老过程是由遗传和表观遗传信息的丢失引起的。尽管先前的研究假设衰老主要是由遗传信息的丢失引起的(最常见的是遗传突变的形式，例如生物体基因组中的取代和缺失)，但本公开内容的组合物和方法基于出乎意料的发现：衰老主要是由特定表观遗传信息的丢失驱动的，该信息距离特定细胞的受精和最终分化显著的近。表观遗传信息，通常采取对DNA进行共价修饰的形式，例如5-甲基胞嘧啶(5mC)，羟甲基胞嘧啶(5hmeC)，5-甲酰基胞嘧啶(fC)和5-羧基胞嘧啶(caC)和腺嘌呤甲基化，以及某些蛋白质例如赖氨酸乙酰化，赖氨酸和精氨酸甲基化，丝氨酸和苏氨酸磷酸化以及赖氨酸泛素化和组蛋白磺酰化，有时被称为细胞的“类似物”信息。该模拟信息的丢失会导致重要的细胞过程失调，例如维持细胞身份的过程失调，导致细胞表现出通常与衰老相关的特征，例如衰老。
本公开的方法，组合物和试剂盒通过预防和逆转衰老的细胞从而使细胞恢复活力。不受特定理论的束缚，更具体地，本公开的方法，组合物和试剂盒通过恢复由于衰老过程，损伤或疾病而丢失的表观遗传信息来使细胞恢复活力。本公开的方法组合物和试剂盒包含转录因子OCT4，SOX2和KLF4。OCT4，SOX2和KLF4是四个“Yamanaka因子”中的三个，第四个是c-Myc。传统上使用Yamanaka因子将细胞重编程为多能状态。然而，在转基因小鼠中诱导四种转录因子表达导致体内畸胎瘤的形成，以及其他急性毒性，如肠上皮的发育异常，可在几天内杀伤该动物。此外，四种Yamanaka因子通常用于将细胞重编程为完全多能状态，在这种情况下，细胞会失去其预先建立的细胞身份，这一事实对于体内应用而言很危险因为在体内应用中为组织和/或器官的完整性必须保持靶细胞的细胞身份。相反，在一些实施方案中，本文所述的方法允许不完全的重编程，并且不导致整体的脱甲基变化。在一些实施方案中，本文描述的方法不需要细胞完全的去分化。例如，虽然OCT4，SOX2和KLF4的表达促进了年轻和年老小鼠损伤后的再生以及长春新碱诱导的人类神经元损伤后的再生，但OCT4，SOX2和KLF4的表达并未诱导DNA甲基化的整体降低(请参见例如，图45B-45C)。
在一些实施方案中，本文公开的结果表明OCT4，SOX2和KLF4的表达可以使患病细胞恢复到更健康的状态而不会诱导完全重编程。不受特定理论的束缚，本文公开的结果表明细胞保有备用的表观基因组，可以使用本文所述的方法恢复。
本公开内容的方法，组合物和试剂盒部分地由令人惊讶和出乎意料的发现所启发，即在不诱导c-Myc表达的情况下，在特定空间和时间下诱导OCT4，SOX2和KLF4的表达可以使细胞恢复活力，且无需将其重新编程为多能状态。使用诱导型启动子，可以谨慎地控制OCT4，SOX2和KLF4的表达，以减少和逆转与衰老相关的表观遗传标记，增加与细胞年轻化相关的表观遗传标记，减少衰老相关蛋白的表达，增加与细胞年轻化相关的蛋白的表达，恢复常染色质和异染色质之间的平衡，防止细胞身份丧失，恢复细胞身份，逆转衰老相关的DNA甲基化变化，从而使细胞恢复活力，且无需将细胞重新编程为多能状态。
因此，在各个实施方案中，本发明的方法通过逆转一种或多种失调的发育途径的效果或预防一种或多种失调发育途径来恢复细胞的细胞身份从而使细胞恢复活力。例如，方法：
(i)增加细胞中组蛋白H2A，组蛋白H2B，组蛋白H3，组蛋白H4中至少一种或其任何组合的丰度；
(ii)增加CHAF1a，CHAF1b，HP1α，NuRD中至少一种或任何组合中的丰度；
(iii)增加细胞中至少一个异染色质标记，例如H3K9me3，H3K27me3或其任何组合；或减少一种杂染色质标记，例如H4K20me3，或常染色质标记H3K4me3；
(iv)趋向于年轻水平，增加/降低细胞中至少一个与年龄相关的CpG位点的DNA甲基化；
(v)增加细胞中层粘连蛋白B1的丰度；
(vi)增加细胞中赖氨酸27(H3K27ac)的组蛋白H3的乙酰化，增加赖氨酸56(H3K56ac)的组蛋白H3的乙酰化或其任何组合；
(vii)降低细胞中赖氨酸122(H3K122Ac)上的组蛋白H3或赖氨酸16(H4K16ac)上的组蛋白H4或其任何组合的乙酰化程度；
(viii)降低IL6，Ccl2，Ccl20，Apob，p16，LINE-1重复序列，Sat III重复序列，Alu元素，IAP或其任何组合的丰度；
(ix)恢复常染色质表观遗传标记(例如H3K4me3)和异染色质表观遗传标记(例如H3K9me3或H3K27me3)之间的平衡；
(x)诱导常染色质的形成；
(xi)恢复至少一种抑制性异染色质表观遗传标记的年轻水平；和/或
(xii)将表5中记载的至少一种基因的表达恢复到年轻的水平。
本公开源于出乎意料的发现，在一些实施方案中，在不存在外源性c-Myc表达的情况下，OCT4，SOX2和KLF4的精确表达可用于促进体内重编程和组织再生而无急性毒性。在某些实施方案中，本文提供的表达载体可以精确控制OCT4，SOX2和KLF4(OSK)表达，并以高病毒滴度(例如超过2x1012颗粒/制剂，1x1013颗粒/mL)掺入病毒(例如腺相关病毒(AAV))，逆转衰老，治疗疾病，包括眼部疾病，和/或受损后的体内组织再生(例如视神经再生)。
如图14中所示，具有OCT4，SOX2和KLF4(OSK)的可诱导转基因表达的小鼠在诱导OSK表达后两天死亡，这是由于肠上皮细胞的普遍性细胞学和结构异常。在具有OCT4，SOX2和KLF4的转基因加上c-Myc的小鼠中报道了类似的发现(Abad et al.,Nature.2013Oct17；502(7471):340-5；Ocampo et al.,Cell.2016Dec 16；167:1719-33)。令人惊讶地，在如图14所示的一些实施方案中，OCT4，SOX2和KLF4的表达在体内未引起毒性或癌症。通过AAV9递送(带有UBC-rtTA4的TRE-OSK)使OCT4，SOX2和KLF4连续表达(例如通过强力霉素给药诱导)不会导致体内畸胎瘤形成。当编码这三种转录因子的AAV9病毒被递送到小鼠的整个体内时，三个月没有检测到畸胎瘤或体重减轻。
因此，在某些实施方案中，本文提供了能够诱导OCT4，KLF4和/或SOX2表达的核酸(例如工程化核酸)，诱导剂，和/或包含其的重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)。核酸可以编码OCT4，KLF4和/或SOX2。核酸可编码一个选自OCT4，KLF4，SOX2的转录因子，及其任何组合。在某些实施方案中，一个核酸编码两个或更多个选自OCT4，KLF4和SOX2的转录因子。在某些实施方案中，核酸编码OCT4和SOX2，OCT4和KLF4。在某些实施方案中，核酸编码SOX2和KLF4。在某些实施方案中，核酸编码OCT4，KLF4和SOX2。在某些实施方案中，核酸编码四个或更多个转录因子(例如，OCT4，SOX2，KLF4和另一转录因子)。在一些实施方案中，本公开提供了编码诱导剂(例如，能够诱导OCT4，KLF4，SOX2或其组合的表达的诱导剂)的核酸。在一些实施方案中，核酸编码Cas9融合蛋白(CRISPR激活物)和靶向OCT4，KLF4和/或SOX2的内源性基因座的启动子或增强子的引导RNA序列。在一些实施方案中，核酸编码Cas9融合蛋白(CRISPR激活物)和靶向OCT4，SOX2，KLF4或其任何组合的内源性基因座上的启动子或增强子的引导RNA序列。
本公开的各方面还提供了调节细胞重编程，促进组织修复，促进组织存活，促进组织再生，促进组织生长，调节组织功能，促进器官再生，促进器官存活，调节器官功能，治疗和/或预防疾病的方法，或其任何组合。调节可包括诱导细胞重编程，逆转衰老，改善组织功能，改善器官功能，组织修复，组织存活，组织再生，组织生长，促进血管生成，减少疤痕形成，减少衰老的外观，促进器官再生，促进器官存活，改变源自动物的农产品的味道和质量，治疗疾病，或其任何组合，在体内或体外。该方法可以包括施用本文所述的任何核酸(例如，DNA和/或RNA)，任何编码KLF4，OCT4，诱导剂，和/或SOX2的工程化蛋白质，任何激活(例如，诱导表达)OCT4，KLF4，诱导剂，和/或SOX2的化学剂，激活(例如，诱导表达)OCT4，KLF4，诱导剂，和/或SOX2的抗体，和/或本文所述的任何重组病毒。该方法可以包括施用本文所述的任何核酸(例如，DNA和/或RNA)，任何编码KLF4，SOX2，OCT4，或其任何组合的工程化蛋白质，任何激活(例如，诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2，或其任何组合的化学剂。激活OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的抗体，和/或本文所述的任何重组病毒。在某些实施方案中，工程化核酸包含DNA和/或RNA。工程化核酸可以是表达载体，也可以不是表达载体。例如工程化核酸可以是mRNA或质粒DNA。在某些实施方案中，该方法进一步包括施用编码诱导剂的核酸(例如工程化核酸)，编码诱导剂的工程化蛋白质，能够调节(例如激活或抑制)诱导剂活性的化学剂，和/或编码诱导剂的重组病毒。例如工程化核酸可以是mRNA或质粒DNA。
本公开的一个方面提供了载体(例如，表达载体)，其单独或组合的包含编码OCT4的第一核酸(例如工程化核酸)，编码SOX2的第二核酸(例如工程化核酸)，编码KLF4的第三核酸(例如工程化核酸)，且不存在能够表达c-Myc的外源核酸(例如工程化核酸)。在某些实施方案中，载体(例如，表达载体)包含编码OCT4的第一核酸(例如工程化核酸)，编码SOX2的第二核酸(例如工程化核酸)，编码KLF4的第三核酸(例如工程化核酸)，或它们的任何组合。在某些实施方案中，第一，第二和第三核酸(例如工程化核酸)存在于单独的表达载体上。在某些实施方案中，第一，第二和第三核酸(例如工程化核酸)中的两个存在于同一表达载体上。在一些实施方案中，全部三种核酸(例如工程化核酸)都存在于同一表达载体上。在某些实施方案中，编码OCT4的序列与SEQ ID NO:2或41至少70％(例如，至少75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％)相同。在某些实施方案中，编码SOX2的序列与SEQ ID NO:4或43至少70％(例如，至少75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％)相同。在某些实施方案中，编码KLF4的序列与SEQ ID NO:6或45至少70％相同。在某些实施方案中，OCT4，SOX2，KLF4或其任何组合是人蛋白质。在某些实施方案中，OCT4，SOX2，KLF4或其任何组合是非人类蛋白质(例如，哺乳动物(例如，灵长类动物(例如，食蟹猴，恒河猴)；商业相关的哺乳动物，例如牛，猪，马)，绵羊，山羊，猫和/或狗)和鸟类(例如，与商业相关的鸟类，例如鸡，鸭，鹅和/或火鸡)。如果OCT4，SOX2和KLF4中的两个或多个在一个载体上，它们可以按任何顺序排列，单词“第一”，“第二”和“第三”并不意味着暗示载体上基因的顺序。
本公开的表达载体可以进一步包含诱导型启动子。表达载体可以仅具有一个诱导型启动子。在这种情况下，OCT4，SOX2和KLF4的表达受同一诱导型启动子的控制。在某些情况下，表达载体包含一个以上的诱导型启动子。诱导型启动子可以包含四环素响应元件(TRE)(例如，TRE3G启动子，TRE2启动子或P紧密启动子)，米非司酮响应性启动子(例如GAL4-E1b启动子，或香豆霉素响应性)。举例来说，TRE(例如，TRE3G)启动子可以包含与SEQID NO:7至少70％(例如，至少75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％)相同的核酸(例如工程化核酸)序列。例如，TRE(例如，TRE2)启动子可以包含与SEQ ID NO:23至少70％(例如，至少75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％)相同的核酸(例如工程化核酸)序列。例如，TRE(例如，P紧密)启动子可以包含与SEQ ID NO:24至少70％(例如，至少75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％)相同的核酸(例如工程化核酸)序列。参见例如，2018年9月28日提交的标题为“MUTANT REVERSE TETRACYCLINE TRANSACTIVATORSFOR EXPRESSION OF GENES的美国临时申请U.S.S.N.62/738,894，代理人案卷号为H0824.70300US00，以及与临时申请同一天提交的国际专利申请，标题为MUTANT REVERSETETRACYCLINE TRANSACTATORS FOR GENES PRESSIONSATORS FOR GENESSPRESSIONATORSFOR GENES PRESSIONATORS，代理人案卷号为H0824.70300WO00，其每一篇通过引用以其整体并入本文。
在某些实施方案中，在有四环素(例如强力霉素)存在的条件下，诱导剂能够从诱导型启动子诱导第一(例如，OCT4)，第二(例如，SOX2)，第三(例如，KLF4)核酸(例如工程化核酸)，或任何组合的表达。在某些实施方案中，所述诱导剂是反向四环素控制的反式激活物(rtTA)(例如，M2-rtTA，rtTA3或rtTA4)。在某些实施方案中，rtTA为rtTA3且包含与SEQID NO:11至少70％(例如，至少75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，rtTA为rtTA4且包含与SEQ ID NO:13至少70％(例如，至少75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％)相同的序列。在某些实施方案中，rtTA为M2-rtTA，并包含与SEQ ID NO:15至少70％(例如，至少75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％)相同的序列。
在某些实施方案中，在无四环素(例如强力霉素)存在的条件下，诱导剂能够从诱导型启动子诱导第一核酸(例如工程化核酸)(例如，OCT4)，第二核酸(例如工程化核酸)(例如，SOX2)，第三核酸(例如KLF4)或其任何组合的表达。在某些实施方案中，所述诱导剂是四环素控制的反式激活物(tTA)。
在某些实施方案中，本公开的表达载体包含组成型启动子(例如，CP1，CMV，EF1α，SV40，PGK1，Ubc，人β肌动蛋白，CAG，Ac5，多角体蛋白，TEF1，GDS，CaM3 5S，Ubi，H1和U6启动子)。组成型启动子可以可操作连接至编码OCT4，KLF4，SOX2，诱导剂，或其组合的核酸(例如工程化核酸)序列。在一些实施方案中，一个表达载体包含一个组成型启动子。在一些实施方案中，一个表达载体包含一个以上的组成型启动子。
在某些实施方案中，本公开的表达载体包含SV40衍生的终止子序列。在某些实施方案中，SV40衍生的序列与SEQ ID NO:8至少70％(例如，至少75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％)相同。
在某些实施方案中，本公开的表达载体包含分隔物序列，其可用于从一个转录物中产生两个分开的氨基酸序列。分隔物序列可以编码自切割肽(例如，2A肽，包括至少与SEQID NO:9至少70％(例如，至少75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％)相同的2A肽序列。在某些实施方案中，分隔物序列是内部核糖体进入位点(IRES)。
在某些实施方案中，表达载体是病毒载体(例如，慢病毒，逆转录病毒或腺相关病毒(AAV)载体)(例如，图2-3)。本公开的AAV载体通常包含位于感兴趣的转基因(例如，编码OCT4，SOX2，KLF4，诱导剂，或其组合的核酸(例如工程化核酸))侧翼的反向末端重复(ITR)。在一些实施方案中，两个反向末端重复之间的距离小于5.0kb(例如，小于4.9kb，小于4.8kb，小于4.7kb，小于4.6kb，小于4.5kb，小于4.4kb，小于4.3kb，小于4.2kb，小于4.1kb，小于4kb，小于3.5kb，小于3kb，小于2.5kb，小于2kb，小于1.5kb，小于1kb，或小于0.5kb)。
在某些实施方案中，本公开的表达载体(例如，编码OCT4，KLF4，SOX2，诱导剂，或其组合的表达载体)可以进一步包含选择剂(例如，抗生素，包括杀稻瘟素，遗传霉素，潮霉素B，霉酚酸，嘌呤霉素，zeocin，放线菌素D，氨苄青霉素，羧苄青霉素，卡那霉素和新霉素)和/或可检测标记(例如，GFP，RFP，荧光素酶，CFP，mCherry，DsRed2FP，mKate，生物素，FLAG-tag，HA-tag，His-tag，Myc-tag，V5-tag等)。
在一些实施方案中，编码OCT4，KLF4和SOX2的表达载体(例如，病毒载体)包含SEQID NO:16，SEQ ID NO:105或SEQ ID NO:121中提供的序列。在一些实施方案中，编码OCT4，KLF4和SOX2的表达载体包括图2，图3，图4A-4AL，图5A-5D所绘的元件，或其组合。病毒载体包括腺相关病毒(AAV)载体，逆转录病毒载体，慢病毒载体和疱疹病毒载体。
另一方面，本公开提供了包含本文所述的任何表达载体的重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒，逆转录病毒，疱疹病毒，α病毒，牛痘病毒或腺相关病毒(AAV))。在某些实施方案中，重组病毒编码一个选自OCT4；KLF4；SOX2；及其任何组合的转录因子。在某些实施方案中，重组病毒编码两个或多个选自OCT4；KLF4；SOX2的转录因子。在某些实施方案中，重组病毒编码OCT4和SOX2，OCT4和KLF4，OCT4，KLF4。SOX2，或SOX2和KLF4。在某些实施方案中，重组病毒编码OCT4，KLF4和SOX2。在某些实施方案中，四个或更多个转录因子编码四个或更多个转录因子(例如，OCT4，SOX2，KLF4和另一种转录因子)。
在另一方面，本公开提供调节(例如，诱导)细胞重编程，组织修复，组织再生，器官再生，逆转衰老或其任何组合的方法，包括在没有外源核酸(例如工程化核酸)能够表达c-Myc的情况下，向细胞施用编码OCT4的第一核酸(例如工程化核酸)，编码SOX2的第二核酸(例如工程化核酸)和编码KLF4的第三核酸(例如工程化核酸)。在某些实施方案中，将编码OCT4的第一核酸(例如工程化核酸)，编码SOX2的第二核酸(例如工程化核酸)和编码KLF4的第三核酸(例如工程化核酸)施用给受试者。受试者可以是人类或非人类。非人类受试者包括，例如，哺乳动物(例如，灵长类动物(例如食蟹猴，恒河猴)；与商业相关的哺乳动物，例如牛，猪，马，绵羊，山羊，猫和/或狗)和鸟类(例如与商业相关的鸟类，例如鸡，鸭，鹅和/或火鸡)。在某些实施方案中，同时施用三种核酸(例如工程化核酸)。在某些实施方案中，在同一载体上同时施用三种核酸(例如工程化核酸)。
在另一方面，本公开提供调节(例如，诱导)细胞重编程，组织修复，组织再生，器官再生，逆转衰老或其任何组合的方法，包括向细胞施用编码OCT4的第一核酸(例如工程化核酸)，编码SOX2的第二核酸(例如工程化核酸)，编码KLF4的第三核酸(例如工程化核酸)或其任意组合。在某些实施方案中，施与受试者编码OCT4的第一核酸(例如工程化核酸)，编码SOX2的第二核酸(例如工程化核酸)，编码KLF4的第三核酸(例如工程化核酸)或其任意组合。
包含一个或多个第一，第二和第三核酸(例如工程化核酸)的表达载体可以是上文和本文所述的任何表达载体。在一些实施方案中，第一核酸，第二核酸，第三核酸或其任何组合存在于分开的表达载体上。在某些实施方案中，两个第一核酸，第二核酸，第三核酸或其任何组合中的存在于同一表达载体上。在某些实施方案中，所有三种核酸(例如工程化核酸)都存在于同一表达载体上。在某些实施方案中，第一，第二或第三核酸中的至少两个(例如工程化核酸)可操作连接至相同的启动子。在某些实施方案中，第一，第二和第三核酸(例如工程化核酸)可操作地连接至相同的启动子。
在一些实施方案中，表达载体(例如，病毒表达载体，包括慢病毒，逆转录病毒，腺相关病毒载体)包含导型启动子(例如，包含四环素响应元件(TRE)的启动子，其包括TRE3G序列，TRE2序列或P紧密序列)，并且该方法进一步包括施用诱导剂(例如，化学剂，核酸(例如工程化核酸)(例如，核酸(例如工程化核酸))编码诱导剂)，蛋白质，光或温度)。在一些实施方案中，pH用于诱导与启动子可操作连接的核酸的表达。在某些实施方案中，能够调节诱导剂活性的化学剂是四环素(例如强力霉素)。作为非限制性实例，四环素控制的反式激活物(tTA)是活性被四环素抑制的诱导剂。作为非限制性实例，反向四环素控制的反式激活物(rtTA)是活性被四环素激活的诱导剂。诱导剂(例如，rtTA或tTA)可以被第四种核酸(例如工程化核酸)编码，及被施与的核酸。在某些实施方案中，诱导剂(例如化学剂，核酸(例如工程化核酸)(例如包含编码诱导剂的RNA和/或DNA的核酸)，蛋白质，光，特定pH或温度)与编码OCT4，SOX2和KLF4的核酸(例如工程化核酸)同时引入。在某些实施方案中，诱导剂(例如化学剂，核酸(例如工程化核酸)(例如包含编码诱导剂的RNA和/或DNA的核酸)，蛋白质，光，特定pH，或温度与从OCT4；SOX2；KLF4；及其任何组合中选出的编码一种或多种(例如，两个或两个以上或三个或三个以上)转录因子的核酸(例如工程化核酸)同时引入。启动子(例如，组成性启动子，包括CAG和Ubc，或诱导型启动子)可以可操作地连接至编码诱导剂的核酸(例如工程化核酸)。在某些实施方案中，与编码诱导剂的核酸(例如工程化核酸)可操作地连接的启动子是组织特异性启动子。
在某些实施方案中，编码诱导剂的核酸(例如工程化核酸)与至少一个编码OCT4，SOX2，KLF4，或其组合的核酸(例如工程化核酸)存在于同一个表达载体上。在某些实施方案中，编码诱导剂的核酸与编码OCT4的核酸(例如工程化核酸)，核酸SOX2(例如工程化核酸)，和编码KLF4的核酸(例如工程化核酸)存在于不同的表达载体上。在某些实施方案中，编码OCT4，SOX2和KLF4的核酸(例如工程化核酸)存在于第一表达载体上，而第四核酸(例如工程化核酸)存在于第二表达载体上。
在一些实施方案中，编码OCT4，SOX2，KLF4和/或诱导剂的核酸不存在病毒载体上。在一些实施方案中，编码选自OCT；SOX2；KLF4；及其任何组合的一种或多种(例如，两种或两种以上或三种或三种以上)转录因子的核酸不存在病毒载体上。在一些实施方案中，递送核酸没有使用病毒载体。在一些实施方案中，递送的核酸不是包含所施用裸核酸的病毒载体，电穿孔，纳米颗粒和/或脂质体。
表达载体可以是病毒载体(例如，慢病毒载体，腺病毒载体，逆转录病毒载体，疱疹病毒载体，α病毒，牛痘病毒或AAV载体)。例如，编码OCT4，SOX2和KLF4的第一表达载体可以包含SEQ ID NO:16所示的核酸(例如工程化核酸)序列。在一些实施方案中，编码诱导剂的表达载体包含SEQ ID NO:17(例如，图12)，SEQ ID NO:31(例如，图18)或SEQ ID NO:32(例如，图19)中提供的序列。
在某些实施方案中，编码诱导剂的第四核酸(例如工程化核酸)进一步包含SV-40衍生的终止子序列，其包括与SEQ ID NO:8至少70％相同的序列。
在某些实施方案中，在四环素(例如强力霉素)存在下，诱导剂能够从诱导型启动子诱导表达。在某些实施方案中，诱导剂是rtTA(例如，rtTA3，包括具有与SEQ ID NO:11至少70％相同的序列的rtTA3，以及rtTA4，包括具有与SEQ ID NO:13至少70％相同的序列的rtTA4)。在某些实施方案中，该方法进一步包括向细胞，组织或受试者施用四环素(例如，强力霉素)。在某些实施方案中，该方法包括从细胞，组织或受试者中去除四环素(例如，强力霉素)。诱导剂能够从诱导型启动子诱导。
在某些实施方案中，诱导剂能够在无四环素(例如强力霉素)的情况下从诱导型启动子诱导表达。在某些实施方案中，诱导剂是四环素反式激活物(tTA)。不受特定理论的束缚，四环素(例如强力霉素)可以结合tTA并阻止tTA结合其同源启动子(例如包含四环素应答元件(TRE)的启动子)并驱动可操作连接的核酸的表达。不受特定理论的束缚，编码诱导剂的核酸(例如工程化核酸)可以不与任何编码OCT4，KLF4和SOX2的核酸(例如工程化核酸)在同一载体上，从而降低病毒载体的大小并提高病毒滴度。
在某些实施方案中，将一种或多种表达载体(例如，包含表达载体的AAV)施用于需要其的细胞，组织或受试者。受试者可能有受伤或状况，被怀疑患有状况或受伤，或处于状况或受伤的风险中。不受特定理论的束缚，转录因子OCT4，SOX2和KLF4的表达诱导细胞重编程。在一些实施方案中，当编码OCT4，SOX2，KLF4或其组合的核酸(例如工程化核酸)可操作连接至诱导型启动子时，在适当的条件下(例如，在四环素的存在或不存在下)施用诱导剂(例如，化学，蛋白质，核酸(例如工程化核酸))(例如，编码诱导剂的核酸(例如工程化核酸))。在某些实施方案中，诱导剂仅在与四环素结合时，才能够结合启动子并驱动可操作连接的核酸(例如工程化核酸)的表达。在某些实施方案中，诱导剂与四环素结合后，不能结合启动子并驱动可操作连接的核酸(例如工程化核酸)的表达。在某些实施方案中，该状况可能是眼部疾病(例如，视网膜疾病，角膜疾病或任何疾病)影响眼睛)，癌症，衰老，与年龄有关的疾病，伤害或神经退行性疾病。在某些实施方案中，细胞或组织来自眼，耳，鼻，口，包括牙龈和牙根，骨头，肺，乳房(breast)，乳房(udder)，胰腺，胃，食管，肌肉(包括心肌)，肝脏，血管，皮肤(包括皮肤)头发，心脏，大脑，神经组织，肾脏，睾丸，前列腺，阴茎，泄殖腔，鳍，卵巢或肠。
在某些实施方案中，组织是被损坏(例如，由于伤害，事故或医源性伤害)的和/或衰老的组织。在某些实施例中，该组织可以认为是健康的，但是在当前或将来的条件下(例如，在农业，或包括毒性疗法，日光照射或在地球大气外旅行的不利条件下)，其性能或存活都不理想。
在某些实施方案中，该方法进一步包括调节生物过程。在一些实施方案中，本文所述的方法包括调节任何生物过程，包括细胞重编程，组织修复，组织存活，组织再生，组织生长，组织功能，器官再生，器官存活，器官功能或其任何组合。在一些实施方案中，该方法包括诱导细胞重编程，逆转衰老，改善组织功能，改善器官功能，促进组织修复，促进组织存活，促进组织再生，促进组织生长，促进血管生成，减少疤痕形成，减少衰老的外部表现，包括脱发症，头发稀疏，头发变白，皮肤松弛和皮肤皱纹，促进器官再生，促进器官存活，改变源自动物的农产品的味道和质量，治疗疾病或其任意组合，在体内或体外。例如，该方法可以诱导细胞重编程，细胞存活，器官再生，组织再生或其组合。在某些实施方案中，该方法包括诱导然后停止细胞重编程，细胞存活，组织再生，器官再生，衰老或其组合。在某些实施方案中，该方法逆转细胞、组织、器官或受试者的衰老。在一些实施方案中，该方法不诱导畸胎瘤形成。在一些实施方案中，该方法不诱导不希望的细胞增殖。在一些实施方案中，该方法不诱导恶性细胞生长。在一些实施方案中，该方法不诱发癌症。在一些实施方案中，该方法不诱导肿瘤生长或肿瘤形成。在一些实施方案中，该方法不诱导青光眼。
在一些实施方案中，本文描述的方法逆转细胞、组织、器官、受试者或其任何组合的表观遗传时钟。在一些实施方案中，使用基于DNA甲基化的(DNAm)年龄估计器确定表观遗传时钟。在一些实施方案中，该方法改变与衰老相关的一种或多种基因的表达。在一些实施方案中，该方法减少与衰老相关的一种或多种基因的表达。在一些实施方案中，该方法改变与衰老相关的一种或多种基因的表达。在一些实施方案中，一种或多种基因是一种或多种感官基因。
在一些实施方案中，该方法减少与衰老相关的一种或多种基因的表达。在一些实施方案中，该方法降低以下项的表达：0610040J01Rik、1700080N15Rik、2900064F13Rik、4833417C18Rik、4921522P10Rik、4930447C04Rik、4930488N15Rik、Ace、Ackr1、Acot10、Acvr1、Adamts17、Adra1b、AI504432、Best3、Boc、Cadm3、Cand2、Ccl9、Cd14、Cd36、Cfh、Chrm3、Chrna4、Cntn4、Cracr2b、Cryaa、CT573017.2、Cyp26a1、Cyp27a1、D330050G23Rik、D930007P13Rik、Ddo、Dgkg、Dlk2、Dnaja1-ps、Drd2、Dsel、Dytn、Ecscr、Edn1、Ednrb、Efemp1、Elfn2、Epha10、Ephx1、Erbb4、Fam20a、Fbxw21、Ffar4、Flt4、Fmod、Foxp4、Fzd7、Gabrd、Galnt15、Galnt18、Gfra2、Ggt1、Gm10416、Gm14964、Gm17634、Gm2065、Gm32352、Gm33172、Gm34280、Gm35853、Gm36298、Gm36356、Gm36937、Gm3898、Gm42303、Gm42484、Gm42537、Gm42743、Gm43151、Gm43843、Gm44545、Gm44722、Gm45516、Gm45532、Gm47494、Gm47982、Gm47989、Gm48398、Gm48495、Gm48593、Gm48958、Gm49089、Gm49326、Gm49331、Gm49760、Gm5796、Gm6374、Gm7276、Gm8237、Gm9796、Gm9954、Gpr75、Gprc5c、Grid2ip、Gsg1l2、Hapln4、Hcn3、Hcn4、Hhatl、Hs6st2、Htr3a、Il1rap、Il1rapl2、Inka1、Kbtbd12、Kcnj11、Kcnk4、Kdelc2、Klhl33、Lamc3、Lilra5、Lman1l、Lrfn2、Lrrc38、Lrrn4cl、Ltc4s、Mansc1、Mir344c、Msr1、Mycbpap、Myoc、Ngfr、Nipal2、Olfr1372-ps1、Otop3、P2rx5、P2ry12、P4ha2、Pcdha12、Pcdha2、Pcdhac2、Pcdhb18、Pcdhb5、Pcsk2os1、Pcsk6、Perp、Pkp1、Plxna4、Prickle2、Qsox1、Rapgef4os2、Rbp4、Rcn3、Sec14l5、Sel1l3、Serpinh1、Sgpp2、Shisa6、Siah3、Siglech、Slc12a4、Slc24a2、Slc2a5、Slc4a4、Slitrk3、Smagp、Smoc2、Speer4b、Spon2、Sstr2、Sstr3、St3gal3、Stc1、Stc2、Syndig1、Syt10、Thsd7a、Tlr8、Tmem132a、Tmem132d、Tmem200a、Tmem44、Trpc4、Trpv4、Unc5b、Vgf、Vmn1r90、Vwc2l、Wfikkn2、Wnt11、Wnt6、Zeb2os、Zfp608、Zfp976或其任何组合。在一些实施方案中，该方法降低以下项的表达：Ace、Kcnk4、Lamc3、Edn1、Syt10、Ngfr、Gprc5c、Cd36、Chrna4、Ednrb、Drd2或其组合。
在一些实施方案中，该方法增加与衰老相关的一种或多种基因的表达。在一些实施方案中，该方法增加以下项的表达：1700031P21Rik、1810053B23Rik、2900045O20Rik、2900060B14Rik、4921504E06Rik、4930402F11Rik、4930453C13Rik、4930455B14Rik、4930500H12Rik、4930549P19Rik、4930555B11Rik、4930556J02Rik、4932442E05Rik、4933431K23Rik、4933438K21Rik、6720475M21Rik、9830132P13Rik、A430010J10Rik、A530064D06Rik、A530065N20Rik、Abcb5、Abhd17c、AC116759.2、AC131705.1、AC166779.3、Acot12、Adig、Akr1cl、Ankrd1、Asb15、Atp2c2、AU018091、AW822073、Btnl10、C130093G08Rik、C730027H18Rik、Ccdc162、Chil6、Col26a1、Corin、Crls1、Cybrd1、Cyp2d12、Cyp7a1、D830005E20Rik、Dlx3、Dnah14、Dsc3、Dthd1、Eid2、Eps8l1、EU599041、Fam90a1a、Fancf、Fau-ps2、Fezf1、Gja5、Gm10248、Gm10513、Gm10635、Gm10638、Gm10718、Gm10722、Gm10800、Gm10801、Gm11228、Gm11251、Gm11264、Gm11337、Gm11368、Gm11485、Gm11693、Gm12793、Gm13050、Gm13066、Gm13323、Gm13339、Gm13346、Gm13857、Gm14387、Gm14770、Gm15638、Gm16072、Gm16161、Gm16181、Gm17200、Gm17791、Gm18025、Gm18757、Gm18795、Gm18848、Gm19719、Gm20121、Gm20356、Gm2093、Gm21738、Gm21940、Gm22933、Gm24000、Gm24119、Gm25394、Gm26555、Gm27047、Gm28262、Gm28530、Gm29295、Gm29825、Gm29844、Gm3081、Gm32051、Gm32122、Gm33056、Gm33680、Gm34354、Gm34643、Gm3551、Gm36660、Gm36948、Gm37052、Gm37142、Gm37262、Gm37535、Gm37569、Gm37589、Gm37647、Gm37648、Gm37762、Gm38058、Gm38069、Gm38137、Gm38218、Gm39139、Gm42535、Gm42680、Gm42895、Gm42994、Gm43027、Gm43158、Gm43288、Gm43366、Gm44044、Gm44081、Gm44187、Gm44280、Gm44535、Gm45338、Gm45644、Gm45740、Gm46555、Gm46565、Gm4742、Gm47485、Gm47853、Gm47992、Gm48225、Gm48314、Gm48383、Gm48673、Gm48804、Gm48832、Gm4994、Gm5487、Gm5724、Gm595、Gm6012、Gm6024、Gm7669、Gm7730、Gm8043、Gm8953、Gm9348、Gm9369、Gm9495、H2al2a、Ido2、Igfbp1、Kif7、Klhl31、Lrrc31、Mc5r、Mgam、Msh4、Mucl2、Mug1、Mybl2、Myh15、Nek10、Neurod6、Nr1h5、Olfr1042、Olfr1043、Olfr1082、Olfr1090、Olfr1124、Olfr1167、Olfr1205、Olfr1206、Olfr1223、Olfr1263、Olfr1264、Olfr1269、Olfr127、Olfr1291-ps1、Olfr1406、Olfr1469、Olfr215、Olfr273、Olfr328、Olfr355、Olfr372、Olfr390、Olfr427、Olfr456、Olfr466、Olfr481、Olfr522、Olfr6、Olfr601、Olfr603、Olfr706、Olfr727、Olfr728、Olfr741、Olfr801、Olfr812、Olfr816、Olfr822、Olfr860、Olfr890、Olfr923、Olfr943、Otogl、Pi15、Pkhd1、Pkhd1l1、Platr6、Pou3f4、Prr9、Pvalb、Rhag、Sav1、Serpinb9b、Skint1、Skint3、Skint5、Slc10a5、Slc6a4、Smok2a、Tcaf3、Tomm20l、Trcg1、Trdn、Ugt1a6a、Usp17la、Vmn1r178、Vmn1r179、Vmn1r33、Vmn1r74、Vmn1r87、Vmn2r102、Vmn2r113、Vmn2r17、Vmn2r52、Vmn2r66、Vmn2r68、Vmn2r76、Vmn2r78、Wnt16或其任何组合。在一些实施方案中，该方法增加以下项的表达：Olfr816、Olfr812、Olfr1264、Olfr727、Olfr923、Olfr1090、Olfr328、Olfr1124、Olfr522、Olfr1082、Olfr1206、Olfr1167、Olfr706、Olfr6、Pou3f4、Olfr603、Olfr127、Olfr1263、Olfr1269、Olfr1205、Olfr390、Olfr601、Olfr860、Olfr215、Olfr741、Olfr1469、Olfr355、Olfr481、Olfr456、Olfr1042、Olfr728、Olfr372、Olfr801、Olfr1223、Olfr822、Otogl、Olfr943、Olfr1406、Olfr273、Olfr466、Olfr1043、Olfr427、Olfr890、Rbp4或任何组合。
本公开的其他方面涉及重新编程的方法，其包括使细胞、组织、器官、受试者或其任何组合的表观遗传时钟恢复活力。
本公开的其他方面涉及重编程的方法，其包括改变与衰老相关的一个或多个基因的表达。
本公开内容的其他方面涉及包括在体外重置老细胞，老器官，老组织和/或其任何组合的转录谱的方法。
本公开的其他方面涉及包括在体内重置老细胞，老器官，老组织，老受试者和/或其任何组合的转录谱的方法。
本公开的其他方面涉及转分化细胞的方法。
本公开的另一方面提供了通过本文所述的任何方法产生的工程化细胞。本文所述的方法可用于产生任何工程化细胞，包括诱导多能干细胞。本公开的工程化细胞可以离体产生，并且所述方法可以进一步包括产生工程组织或工程器官。在一些实施方案中，本发明的方法包括将本发明的工程化细胞，工程组织和/或工程器官施用于需要其的受试者。在一些实施方案中，该方法进一步包括治疗疾病。
本公开的其他方面还提供组合物，其包含能够诱导OCT4，KLF4，诱导剂和/或SOX2表达(例如，表达载体)的核酸(例如工程化核酸)的任一种，本文所述工程化蛋白质的任一种，激活(例如诱导表达)OCT4，KLF4，诱导剂和/或SOX2的化学剂的任一种，激活(例如诱导表达)OCT4，KLF4，诱导剂，和/或SOX2的抗体的任一种，和/或本文所述重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)的任一种,单独或组合使用。在一些实施方案中，本公开的药物组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物还包含编码诱导剂(例如rtTA或tTA)的第二工程化核酸(例如工程化核酸)(例如包括病毒载体的表达载体)。
本公开的方面还提供了组合物，其包含本能诱导OCT4，KLF4和/或SOX2(例如，表达载体，包括诱导型表达载体)的核酸(例如工程化核酸)的任一种，本文所述工程化蛋白质的任一种，能激活(例如，诱导表达)OCT4，KLF4和/或SOX2的化学剂的任一种，能激活(例如，诱导表达)OCT4，KLF4，和/或SOX2的抗体的任一种，和/或本文所述重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)的任一种，单独或组合使用。在一些实施方案中，组合物还包含编码诱导剂的核酸(例如工程化核酸)，编码诱导剂的工程化蛋白质，能够调节(例如，激活或抑制)诱导剂活性的化学剂，和/或编码诱导剂的重组病毒。在一些实施方案中，本公开的药物组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物还包含编码诱导剂(例如rtTA或tTA)的第二工程化核酸(例如工程化核酸)(例如包括病毒载体的表达载体)。
本公开的方面还提供了组合物，其包含能诱导一种或多种选自OCT4；SOX2；KLF4；以及它们的任何组合的转录因子表达的核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)的任一种，本文所述工程化蛋白质的任一种，能激活(例如诱导表达)一种或多种选自OCT4；SOX2；KLF4，及其任何组合的转录因子的化学剂的任一种，能激活(例如诱导表达)一种或多种选自OCT4；SOX2；KLF4；及其任何组合的转录因子的抗体的任一种，和/或本文所述的重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)的任一种，单独或组合使用。在某些实施方案中，组合物包含能诱导选自OCT4；SOX2；KLF4；以及它们的任何组合的两个或更多个转录因子的表达的核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)的任一种；和本文所述工程化蛋白质的任一种，能激活(例如诱导其表达)选自OCT4；SOX2；KLF4；及其任何组合的两个或更多个转录的化学剂的任一种，能激活(例如诱导表达)选自OCT4；SOX2；KLF4；及其任何组合的两种或更多种转录因子的抗体的任一种，和本文所述重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)的任一种，单独或组合使用。所述两个或更多个转录因子可包括OCT4和SOX2，OCT4和KLF4，OCT4，KLF4和SOX2，或SOX2和KLF4。在某些实施方案中，组合物包含能诱导选自OCT4，SOX2，KLF4及其组合的三种或更多种转录因子表达的核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)的任一种，本文所述工程化蛋白质的任一种，能激活(例如，诱导表达)选自OCT4；SOX2；KLF4；及其任何组合的三个或更多个转录因子的化学剂的任一种，能激活(例如诱导表达)选自OCT4；SOX2；KLF4；及其任何组合的三种或更多种转录因子的抗体的任一种，和/或本文所述的重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)的任一种，单独或组合使用。在某些实施方案中，三个或更多个转录因子可包含OCT4，SOX2和KLF4。在一些实施方案中，药物组合物还包含编码诱导剂(例如rtTA或tTA)的核酸(例如工程化核酸)(例如表达载体)，编码诱导剂的工程化蛋白质的任一种，能激活(例如诱导表达)诱导剂的化学剂的任一种，和/或编码诱导剂的重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)的任一种。在一些实施方案中，本公开的药物组合物还包含药学上可接受的载体。
在另一方面，本公开提供了试剂盒，其包含能诱导OCT4，KLF4，诱导剂，和/或SOX2表达的核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)的任一种，本文所述工程化蛋白质的任一种，能激活(例如诱导表达)OCT4，KLF4，诱导剂，和/或SOX2的化学剂的任一种，能激活(例如诱导表达)OCT4，KLF4，诱导剂，和/或SOX2的抗体的任一种，和/或本文所述重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)的任一种。
在另一方面，本公开提供了试剂盒，其包含能诱导OCT4，KLF4和/或SOX2表达的核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，本文所述的蛋白质的任一种，能激活(例如诱导表达)OCT4，KLF4和/或SOX2的化学剂的任一种，能激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的抗体的任一种，和/或本文所述重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)的任一种。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含编码诱导剂的核酸(例如工程化核酸)，编码诱导剂的工程化蛋白质，能够调节(例如，激活或抑制)诱导剂活性的化学剂。和/或编码诱导剂的重组病毒。
在另一方面，本公开提供了试剂盒，其包含能诱导选自OCT4；SOX2；KLF4；及其任何组合的一种或多种转录因子表达的核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)的任一种，本文所述工程化蛋白质的任一种，能激活(例如，诱导表达)选自OCT4；SOX2；KLF4；及其任何组合的一种或多种转录因子的化学剂的任一种，能激活(例如，诱导表达)选自OCT4；SOX2；KLF4；及其任何组合的抗体，和/或本文所述重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)的任一种。在某些实施方案中，试剂盒进一步包含编码诱导剂(例如rtTA或tTA)的核酸(例如工程化核酸)(例如表达载体)，编码诱导剂的工程化蛋白质的任一种，能激活(例如，诱导表达)诱导剂的化学剂的任一种。和/或编码诱导剂的重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)的任一种。
在此阐述了本发明的一个或多个实施案例的细节。本发明的其他特征，目的和优点将在详细描述，实施例，附图和权利要求书中展示。
本申请中引用的参考文献通过引用并入本文。
定义
下面更详细地描述特定术语的定义。本公开无意以任何方式受到本文描述的取代者的示例性列表的限制。
“AAV”或“腺相关病毒”是非包膜病毒，其能够携带和递送核酸(例如工程化核酸)(例如编码OCT4；KLF4；SOX2；或其组合的核酸(例如工程化核酸))，并且属于依赖细小病毒属(Dependoparvovirus)。通常，AAV不整合进基因组中。AAV的组织特异性靶向能力通常由AAV衣壳血清型决定(对于AAV血清型的实例及其在组织特异性递送中的效用，参见例如下表1)。AAV的非限制性血清型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11，以及它们的变体。在某些实施方案中，AAV血清型是AAV9的变体(例如AAVPHP.b)。
“重组病毒”是已从其自然环境(例如从宿主细胞、组织或受试者)分离出或人工产生的病毒(例如慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、α病毒、牛痘病毒、或腺相关病毒(AAV))。
如本文所用，术语“AAV载体”是包含侧接于表达盒(例如，包含编码OCT4、KLF4和SOX2(各自单独地或组合地)的核酸的表达盒，或编码rtTA或tTA的表达盒)的AAV反向末端重复序列(ITR)的核酸(例如工程化核酸)。AAV载体还可包含启动子序列。
本文所用的术语“施用”是指引入本文所述的组合物的任一种，能诱导OCT4，KLF4，和/或SOX2表达的核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)的任一种，能诱导一种或多种选自OCT4；KLF4；SOX2；及其任何组合的转录因子表达的核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)的任一种，本文所述工程化蛋白质的任一种，能激活(例如，诱导表达)OCT4，KLF4和/或SOX2的化学剂的任一种，能激活(例如，诱导表达)一种或多种选自OCT4；KLF4；SOX2；及其任何组合的转录因子表达的化学剂的任一种，能激活(例如，诱导表达)OCT4，KLF4和/或SOX2的抗体的任一种，能激活(例如，诱导表达)一种或多种选自OCT4；KLF4；SOX2；及其任何组合的转录因子表达的抗体的任一种，和/或本文所述的任何重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)，单独或组合施用于任何细胞、组织、器官和/或受试者。在一些实施方案中，编码诱导剂的核酸(例如工程化核酸)，编码诱导剂的工程化蛋白质，能够调节(例如激活或抑制)诱导剂活性的化学剂，和/或编码诱导剂的重组病毒也被施用于细胞、组织、器官和/或受试者。本文所述的任何组合物，包括能够诱导OCT4，KLF4和/或SOX2表达的核酸(例如工程化核酸)(例如表达载体)的任一种，包括能诱导一种或多种选自OCT4；KLF4；SOX2；及其任何组合的转录因子表达的核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)的任一种，包括本文所述工程化蛋白质的任一种，能激活(例如，诱导表达)OCT4，KLF4和/或SOX2的化学剂的任一种，编码OCT4，SOX2，KLF4，或其任何组合的工程化蛋白质的任一种，能激活(例如，诱导表达)OCT4；KLF4；和/或SOX2，及其任何组合的化学剂的任一种，能激活(例如，诱导表达)OCT4，KLF4和/或SOX2的抗体的任一种，能激活(例如，诱导表达)OCT4；KLF4；和/或SOX2，及其任何组合的抗体的任一种，和/或本文所述的重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)的任一种，每个单独或组合，可以静脉内，皮内，动脉内，病变内，肿瘤内，颅内，关节内，前列腺内，胸膜内，鼻内，玻璃体内，阴道内，直肠内，局部，肿瘤内，肌肉内，腹膜内，皮下，结膜下，囊内，粘膜内，心包内，眼内,口服，局部(topically)，局部(locally)，系统地，注射，输注，连续输注，直接局部灌注浸润靶细胞，通过导管，乳膏，脂质组合物(例如脂质体)，或通过其他方法或上述方法的任意组合，施用，这对于本领域普通技术人员来说是普通技能(参见例如，Remington'sPharmaceutical Sciences(1990)，通过引用并入本文)。在一些实施方案中，组合物包含编码诱导剂的核酸(例如工程化核酸)，编码诱导剂的工程化蛋白质，能够调节(例如，激活或抑制)诱导剂活性的化学剂，和/或编码诱导剂的重组病毒也通过任一合适的方法向细胞、组织、器官和/或受试者施用。
术语“表观基因组”或“表观遗传学”是指控制细胞中核酸(例如工程化核酸)或基因组信息表达的细胞内的修饰和结构变化。表观基因组的改变发生在胚胎发育、疾病进展和衰老的过程期间，并且驱动这些过程。
术语“表观时钟”可以指年龄估计器或先天生物学过程。在一些实施方案中，使表观遗传时钟恢复活力或逆转是指减少细胞、组织、器官或受试者的估计年龄。表观遗传时钟可以通过本文所述的方法的任一种部分或完全逆转或恢复活力。在一些实施例中，年龄估计器是表观遗传年龄估计器。例如，表观遗传年龄估计器可以是CpG二核苷酸的集合，当与数学算法结合使用时，其可以用于估计包括细胞，器官或组织在内的DNA来源的年龄。在一些实施例中，年龄估计器是基于DNA甲基化的(DNAm)年龄估计器。在一些实施例中，DNAm年龄估算器使用Pearson相关系数r计算在NA甲基化的(DNam)年龄(也称为估计年龄)和时序年龄之间的年龄相关性。在一些实施方案中，基于DNA甲基化的(DNAm)年龄估计器是基于一个组织DNA甲基化的年龄估计器。在某些实施例中，基于DNA甲基化的年龄估计器是基于多组织DNA甲基化的年龄估计器。在一些实施例中，DNAm年龄估计器是DNAm PhenoAge。参见例如，Horvath and Raj,Nat Rev Genet.2018Jun；19(6):371-384；Levine et al.,Aging(Albany NY).2018Apr18；10(4):573-591；以及以下实施例。
如本文所用，“表观遗传信息”包括对DNA的共价修饰，例如5-甲基胞嘧啶(5mC)，羟甲基胞嘧啶(5hmeC)，5-甲酰基胞嘧啶(fC)和5-羧基胞嘧啶(caC)，以及某些蛋白质的共价修饰，例如赖氨酸的乙酰化，赖氨酸和精氨酸的甲基化，丝氨酸和苏氨酸的磷酸化，组蛋白的赖氨酸泛素化和磺酰化，以及细胞的3D结构，包括TAD(拓扑相关结构域)和区室。表观遗传信息有时被称为细胞的“模拟”信息。
表5中的至少一种基因的“恢复表达”至年轻水平是指包括增加衰老过程中下调的基因的表达或减少上调的基因的表达。
如本文所用，术语“细胞”不仅意味着包括单个细胞，而且还指其起源的特定组织或器官。
术语“细胞衰老”是指已经退出细胞周期，显示出与衰老一致的表观遗传学标记，或表达衰老细胞标记(例如衰老相关的β-半乳糖苷酶或炎性细胞因子)的细胞。细胞衰老可为部分的或完全的。
术语“基因表达”是指细胞或组织中的特定基因或所有基因转录为RNA的程度。在一些情况下，RNA被细胞翻译成蛋白质。表观基因组控制基因表达模式。
术语“细胞重编程”是指利用重编程因子改变细胞的表观基因组的过程(例如，逆转或防止细胞中的表观遗传变化，这些变化是功能障碍、恶化、细胞死亡、衰老或衰老的原因)。细胞重编程可为完全重编程，使得分化的细胞(例如体细胞)重编程为多能干细胞。细胞重编程可为不完全的，使得分化的细胞(例如体细胞)保持其细胞种类(例如谱系特异性干细胞)。细胞重编程可为不完全的(例如未产生干细胞)，使得细胞可恢复活力，或呈现出更幼年的属性(例如存活率增加、炎症减少、或分裂的能力)。细胞重编程可提供额外的细胞功能，或防止细胞衰老(例如转分化或向细胞衰老转变)。细胞重编程可以诱导暂时性或永久性的基因表达变化。在一些实施方案中，不完全的细胞重编程由缺乏Nanog表达显示。在一些实施方案中，细胞重编程防止衰老发生。
如本文所用，术语“使细胞恢复活力”旨在包括在不诱导多能状态的情况下预防或逆转细胞原因的衰老。本文所用的再生细胞包括例如表达RBPMS和/或Brn3a的视网膜神经节细胞。
如本文所用，“多能状态”意指细胞表达至少一种干细胞标记物，例如但不限于Esrrb，Nanog，Lin28，TRA-1-60/TRA-1-81/TRA-2-54，SSEA1或SSEA4的状态。测量细胞上干细胞标志物表达的方法是本领域已知的，并且包括本文所述的方法。
术语“转分化”是指一种细胞类型改变为另一种细胞类型而不进入多能状态的过程。转分化也可以称为谱系重编程或谱系转换。参见例如，
Figure BDA0003089814690000221
et al.,Biochim Biophys Acta Mol Cell Res.2017Jul；1864(7):1359-1369，其通过引用以其整体并入本文。
术语“状况”、“疾病”和“病症”可互换使用。状况、疾病和病症的非限制性实例包括急性损伤、神经变性疾病、慢性疾病、增生性疾病、心血管疾病、遗传病、炎性疾病、自身免疫性疾病、神经学疾病、血液学疾病、疼痛状况、精神障碍、代谢障碍、慢性疾病、癌症、衰老、年龄相关的疾病以及影响受试者中任何组织的疾病。例如，年龄相关的状况包括心力衰竭、中风、心脏病、动脉粥样硬化、神经变性疾病(例如帕金森病和阿尔茨海默病)、认知衰退、记忆丧失、糖尿病、骨质疏松症、关节炎、肌肉损失、听力损失(部分或全部)、眼相关状况(例如视力减退或视网膜疾病)、青光眼、早衰综合症(例如Hutchinson-Gilford早衰综合症)和癌症。在某些实施方案中，疾病是视网膜疾病(例如黄斑变性)。在一些实施方案中，年龄相关的状况是衰老。作为非限制性实例，神经胶质细胞的衰老可能是阿尔茨海默病的原因。参见例如，Bussian,et al.,Nature.2018Sep 19。在一些情况下，状况是神经损害。在一些情况下，状况是中枢神经系统(CNS)的损害。在一些情况下，神经损害是周围神经损害。在一些情况下，神经损害是神经失用症(neurapraxia)，轴突断伤或神经断伤。
在一些情况下，相对于对照，状况增加了细胞、组织、器官和/或受试者的基于DNA甲基化的年龄。在一些情况下，状况使细胞、组织、器官和/或受试者的基于DNA甲基化的年龄相对于对照增加至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％或至少1,000％。在一些情况下，对照是不具有该状况的细胞、组织、器官和/或受试者。在一些情况下，对照是患有该状况之前的相同细胞、组织、器官和/或受试者。不受特定理论的束缚，本文所述的任何方法都可用于减少患病细胞、患病组织、患病器官和/或患有疾病、有患病风险或怀疑患病的受试者的基于DNA甲基化的年龄。在一些情况下，该疾病增加了细胞、组织、器官和/或受试者的基于DNA甲基化的年龄。在一些情况下，该疾病是损伤。
在一些情况下，状况是正在衰老。在一些情况下，衰老是由表观遗传噪声驱动的。参见例如Oberdoerffer and Sinclair.Nat Rev Mol Cell Biol 8,692-702,doi:10.1038/nrm2238(2007)；Oberdoerffer et al.Cell 135,907-918,doi:10.1016/j.cell.2008.10.025(2008)。不受特定理论的束缚，哺乳动物细胞可以保留生命早期的表观遗传信息的忠实副本，类似于Shannon的信息论中的“观察者”系统，本质上是原始信号的备份拷贝，如果在传输过程中信息丢失或引入了噪声，此拷贝允许在接收端重建。参见例如Shannon,The Bell System Technical Journal 27,379-423(1948)关于观察者系统的描述。
如本文所用，“眼疾病”或“眼病”是眼睛的疾病或状况。影响眼睛的状况的非限制性实例包括睑外翻、兔眼、眼睑松弛、上眼睑下垂、麦粒肿、睑黄斑瘤、皮炎、毛囊螨、利什曼病、罗阿丝虫病、盘尾丝虫病、虱病(单纯疱疹病毒)、麻风病、触染性软疣、结核、雅司病、带状疱疹、脓疱性皮炎、泪腺炎、泪溢、突眼、结膜炎、巩膜炎、角膜炎、角膜溃疡/角膜擦伤、雪盲/电弧眼、Thygeson浅层点状角膜病变、角膜新血管形成、富克斯营养不良症、圆锥角膜、干燥性角结膜炎、虹膜炎、虹膜、葡萄膜炎、交感神经性眼炎、白内障、晶状体、脉络膜视网膜炎、局灶性脉络膜视网膜炎、脉络视网膜炎、脉络膜炎、视网膜炎、视网膜脉络膜炎、播散性脉络膜视网膜炎、渗出性视网膜病变、后睫状体炎、睫状体扁平部炎、脉络膜视网膜炎、原田氏病、脉络膜视网膜炎、脉络膜、脉络膜视网膜瘢痕、斑点瘢痕、后极(炎症后)(创伤后)、日光性视网膜病、脉络膜变性、萎缩、硬化症、血管样纹、脉络膜营养障碍、无脉络膜症、脉络膜乳晕(视乳头周围)螺旋状萎缩、脉络膜、鸟氨酸血症(ornithinaemia)、脉络膜出血、脉络膜脱离、脉络膜视网膜、脉络膜视网膜炎症、感染和寄生虫病、梅毒性脉络膜视网膜炎、弓形虫、结核、脉络膜视网膜、视网膜脱离、视网膜、脉络膜、视物变形、视网膜襞裂症、高血压性视网膜病、糖尿病性视网膜病、视网膜病、早产儿视网膜病、年龄相关性黄斑变性、黄斑、黄斑变性、牛眼状黄斑部病变、视网膜前膜、周围性视网膜变性、遗传性视网膜营养不良、色素性视网膜炎、视网膜下出血、视网膜层、中心性浆液视网膜病、视网膜脱离、黄斑部水肿视网膜疾病、黄斑视网膜疾病、糖尿病性视网膜病、青光眼、视神经疾病、高眼压症、开角型青光眼、闭角型青光眼、正常眼压性青光眼、开角型青光眼、闭角型青光眼、飞蚊症、Leber遗传性视神经病变、视盘玻璃膜疣、斜视、眼肌瘫痪、眼肌、进行性眼外肌麻痹、内斜视、外斜视、屈光和调节疾患、远视、近视、散光、屈光参差、老花眼、外眼肌瘫痪、弱视眼、伯氏先天性黑内障、暗点、视力缺失、色盲、全色盲/Maskun、视锥细胞、夜盲症、失明症、河盲、小眼症/虹膜裂、视神经、脑、脊髓、红眼、阿罗瞳孔、瞳孔、角膜真菌病、眼球干燥症和无虹膜症。在一些实施方案中，眼疾病是急性或慢性眼损伤。
在一些实施方案中，眼疾病是角膜擦伤。
在一些实施方案中，眼疾病是青光眼。
在一些实施方案中，眼疾病是角膜疾病(例如影响角膜或角膜细胞的疾病)。在一些实施方案中，眼疾病是棘阿米巴角膜炎、睑外翻、弱视(lagoph amblyopia)、瞳孔不等、散光、贝尔麻痹、睑缘炎、视力模糊、眼睛灼烧、白内障、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、糖尿病眼疾、青光眼、干眼症、视力不良(例如低视力)、散光、眼睑炎、白内障、睑板腺囊肿、结膜炎、糖尿病视网膜病变、干眼症、青光眼、角膜炎、圆锥角膜病、黄斑变性、高眼压症、睑裂斑、眼翳、色素性视网膜炎、或眼癌(例如视网膜母细胞瘤、眼黑色素瘤、眼淋巴瘤、髓质上皮瘤、结膜鳞状细胞癌)。角膜疾病的实例包括但不限于角膜新血管形成(NV)、角膜营养不良、角膜炎症、角膜擦伤和角膜纤维化。在一些实施方案中，眼疾病是圆锥角膜病(Keritaconus)。在一些实施方案中，眼疾病是黄斑变性。眼疾病的附加非限制性实例可见于疾病和相关健康问题的国际统计分类(International Statistical Classification of Diseases andRelated Health Problems)(例如眼和附属器的VII型疾病)。
眼疾病可以影响眼和/或附属器的任何部位。在一些实施方案中，眼疾病是眼睑、泪腺系统和/或眼眶的障碍。在一些实施方案中，眼疾病是结膜障碍。在一些实施方案中，眼疾病是巩膜、角膜、虹膜和/或睫状体的障碍。在一些实施方案中，眼疾病是晶状体障碍。在一些实施方案中，眼疾病是脉络膜和/或视网膜障碍。在一些实施方案中，眼疾病是青光眼。在一些实施方案中，眼疾病是玻璃体和/或眼球的障碍。在一些实施方案中，眼疾病是视神经和/或视觉通路的障碍。在一些实施方案中，眼疾病是眼肌、双眼运动、调视和/或屈光的障碍。在一些实施方案中，眼疾病是视力障碍和/或失明。在一些实施方案中，眼疾病与衰老有关，例如，与衰老相关的视力丧失，与衰老相关的视敏度下降，和/或视网膜功能的下降。
可以使用任何合适的方法来测量眼功能。非限制性实例包括视敏度测试，图案视网膜电图和病理学。
术语“遗传疾病”是指由受试者的基因组中的一种或多种异常引起的疾病，诸如从受试者出生起就存在的疾病。遗传疾病可为可遗传的，并且可以从亲代基因遗传下来。遗传疾病也可由受试者的DNA和/或RNA的突变或改变而引起。在此类情况下，如果遗传疾病发生在种系中，则其将是可遗传的。示例性遗传疾病包括但不限于阿-斯氏(Aarskog-Scott)综合征、阿瑟综合征、软骨发育不全、肢端发育不全、成瘾、肾上腺脑白质营养不良、白化病、先天性眼睑缺损巨口综合征、阿拉吉欧综合征、黑尿酸尿症、α-1-抗胰蛋白酶缺、奥尔波特综合征、阿尔茨海默病、哮喘、自身免疫性多腺综合征、雄激素不敏感综合征、快乐木偶综合征、共济失调、共济失调性毛细血管扩张症、动脉粥样硬化、注意力缺陷多动障碍(ADHD)、自闭症、秃发、贝敦氏症、贝克威思-威德曼综合征、贝斯特病、双相情感障碍、短指症、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、慢性髓样白血病、腓骨肌萎缩症、克罗恩病、唇裂、科克因综合征、科芬劳里综合征、结肠癌、先天性肾上腺增生、狄兰吉氏综合征、克斯提洛氏弹性蛋白缺陷症、考登综合征、颅额鼻发育异常综合征、克里格勒-纳贾二氏综合征、库贾氏病、囊肿性纤维化、聋症、抑郁症、糖尿病、畸型发育不良、迪格奥尔格综合征、唐氏综合征、阅读障碍、杜氏肌营养不良、多博维茨综合征、外胚层发育不良、埃利伟氏综合征、埃-当综合征、大疱性表皮松解症、癫痫症、特发性震颤、家族性血胆脂醇过多症、家族性地中海热、脆性X综合征、弗里德希共济失调、戈谢病、青光眼、葡萄糖-半乳糖吸收不良、戊二酸尿症、螺旋状萎缩、什普林茨恩-戈德堡综合征(颚心脸综合征)、戈尔林综合征、家族性良性慢性天疱疮、偏身肥大、血色素沉淀着症、血友病、遗传性运动和感觉神经病(HMSN)、遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)、亨丁顿舞蹈症、高IgM的免疫缺陷、青少年型糖尿病、克兰费尔特综合征、歌舞伎综合征、leigh病、长QT综合征、肺癌、恶性黑素瘤、躁狂抑郁、马方综合征、卷发综合征、流产、粘多糖疾病、多发性内分泌腺瘤形成、多发性硬化、肌肉萎缩症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、强直性肌营养不良症、多发性神经纤维瘤、尼曼匹克病、努南综合征、肥胖、卵巢癌、胰腺癌、帕金森病、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、彭德莱综合征、腓骨肌萎缩症、苯丙酮尿症(PKU)、多囊性肾病、小胖威利症、原发性胆汁性肝硬化、前列腺癌、REAR综合征、雷夫叙姆病、色素性视网膜炎、视网膜母细胞瘤、雷特氏症、沙费利波综合征、精神分裂症、重症联合免疫缺陷、镰刀型细胞贫血病、脊柱裂、脊髓肌肉萎缩、小脑萎缩症、成人猝死综合症、丹吉尔病、戴萨克斯症、桡骨缺失综合征、肛门-耳-肢体畸形综合征、结节性硬化症、特纳综合征、尤塞氏综合征、视网膜小脑脊髓血管瘤症、瓦登伯格综合征、韦弗综合征、沃纳综合征、威廉姆斯综合征、威尔森氏症、着色性干皮病，早衰综合症(例如，Hutchinson-Gilford早衰综合症)以及赵苇格氏症。
“增生性疾病”是指由于细胞增殖的异常生长或扩展而发生的疾病(Walker,Cambridge Dictionary of Biology；Cambridge University Press:Cambridge,UK,1990)。增生性疾病可与以下相关：1)正常静息细胞的病理性增殖；2)细胞从其正常部位的病理性迁移(例如赘生性细胞的转移)；3)蛋白水解酶诸如基质金属蛋白酶(例如胶原酶、明胶酶和弹性蛋白酶)的病理表达；或4)如增生性视网膜病和肿瘤转移中的病理性血管生成。示例性增生性疾病包括癌症(即“恶性瘤”)、良性瘤、血管生成、炎性疾病和自身免疫病。
术语“瘤”和“肿瘤”在本文中可互换使用并且是指异常的组织块，其中块的生长超过正常组织的生长且与正常组织的生长不协调。瘤或肿瘤可为“良性的”或“恶性的”，这取决于以下特征：细胞分化程度(包括形态学和功能性)、生长速率、局部侵入和转移。“良性瘤”通常完全分化，具有比恶性瘤典型更慢的生长，并且保持局限于起源部位。另外，良性瘤没有浸润、侵入或转移到远处部位的能力。示例性良性瘤包括但不限于脂肪瘤、软骨瘤、腺瘤、软垂疣、老年血管瘤、脂溢性角化病、雀斑和皮脂腺增生。在一些情况下，某些“良性”肿瘤可能后续产生恶性瘤，其可能由肿瘤的赘生性细胞亚群中的额外遗传变化引起，并且这些肿瘤被称为“癌前瘤”。示例性的癌前瘤是畸胎瘤。相反，“恶性瘤”通常分化不良(退行发育)并且具有典型快速的生长，同时伴随进行性浸润、侵入和周围组织的破坏。此外，恶性瘤通常具有转移至远处部位的能力。术语“转移”、“转移性”或“肿瘤转移”是指癌细胞从原发性肿瘤或原肿瘤向另一器官或组织扩散或迁移，并且通常可由原发性肿瘤或原肿瘤的组织类型(而非继发性(转移)肿瘤所在的器官或组织)的“继发性肿瘤”或“继发性细胞块”的存在来鉴定。例如，已经迁移到骨的前列腺癌被称为转移性前列腺癌，并且包括骨组织中正在生长的癌性前列腺癌细胞。
术语“癌症”是指以异常细胞的发育为特征的一类疾病，所述异常细胞不受控制地增殖并且具有浸润和破坏正常身体组织的能力。参见例如Stedman’s MedicalDictionary,第25版；Hensyl编辑；Williams&Wilkins:Philadelphia,1990。示例性癌症包括但不限于听神经瘤；腺癌；肾上腺癌；肛门癌；血管肉瘤(例如淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、血管肉瘤)；阑尾癌；良性单克隆丙球蛋白病；胆管癌(例如胆管细胞癌)；膀胱癌；乳腺癌(例如乳腺腺癌、乳腺乳头状癌、乳癌、乳腺髓样癌)；脑癌(例如脑膜瘤、恶性胶质瘤、胶质瘤(例如星形细胞瘤、少突神经胶质瘤)、髓母细胞瘤)；支气管癌；类癌瘤；宫颈癌(例如宫颈腺癌)；绒毛膜癌；背索上皮瘤；颅咽管瘤；结肠直肠癌(例如结肠癌、直肠癌、结肠直肠腺癌)；结缔组织癌；上皮癌；室管膜瘤；内皮肉瘤(例如卡波济氏肉瘤、多发性特发性出血性肉瘤)；子宫内膜癌(例如子宫癌、子宫肉瘤)；食道癌(例如食道的腺癌、巴雷特腺癌)；尤因肉瘤；眼癌(例如眼内黑素瘤、成视网膜细胞瘤)；常见嗜酸球增多症；胆囊癌；胃癌(例如胃腺癌)；胃肠道间质瘤(GIST)；生殖细胞癌；头颈癌(例如头颈部鳞片状细胞癌、口腔癌(例如口腔鳞状细胞癌)、咽喉癌(例如喉癌、咽癌、鼻咽癌、口咽癌))；造血系统癌症(例如白血病，诸如急性淋巴细胞性白血病(ALL)(例如B细胞ALL、T细胞ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)(例如B细胞AML、T细胞AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)(例如B细胞CML、T细胞CML)以及慢性淋巴细胞性白血病(CLL)(例如B细胞CLL、T细胞CLL))；淋巴瘤诸如霍奇金淋巴瘤(HL)(例如B细胞HL、T细胞HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)(例如B细胞NHL，诸如弥散大细胞淋巴瘤(DLCL)(例如弥漫大B细胞淋巴瘤)、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤(CLL/SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区B细胞淋巴瘤(例如粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、结内边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤)、原发性纵膈B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤(即华氏巨球蛋白血症)、毛细胞白血病(HCL)、成免疫大细胞淋巴瘤、B前躯淋巴芽细胞淋巴瘤和原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤；以及T细胞NHL诸如T前躯淋巴芽细胞淋巴瘤/白血病、周围T细胞淋巴瘤(PTCL)(例如皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)(例如蕈样肉芽肿病、Sezary综合征)、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、结外自然杀伤T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤和退行性大细胞淋巴瘤)；如上所述的一种或多种白血病/淋巴瘤的混合；和多发性骨髓瘤(MM))、重链病(例如α链病、γ链病、μ链病)；成血管瘤；下咽癌；炎性肌纤维母细胞瘤；免疫细胞淀粉样变；肾癌(例如肾母细胞瘤，亦称威尔姆氏瘤、肾细胞癌)；肝癌(例如肝细胞癌(HCC)、恶性肝癌)；肺癌(例如支气管癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌)；平滑肌肉瘤(LMS)；肥大细胞增生病(例如系统性肥大细胞增生病)；肌肉癌；脊髓发育不良综合症(MDS)；间皮瘤；骨髓增生性疾病(MPD)(例如真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)、特发性髓样化生(AMM)，亦称骨髓纤维化(MF)、慢性特发性骨髓纤维化、慢性髓性白血病(CML)、慢性嗜中性白血病(CNL)、高嗜酸性粒细胞综合征(HES))；成神经细胞瘤；纤维神经瘤(例如1型或2型神经纤维瘤病(NF)，神经鞘瘤)；神经内分泌癌(例如胃肠胰神经内分泌肿瘤(GEP-NET)、类癌瘤)；骨肉瘤(例如骨癌)；卵巢癌(例如囊腺癌、卵巢胚胎性癌、卵巢腺癌)；乳头状腺癌；胰腺癌(例如胰腺腺癌、管内乳头状黏液性肿瘤(IPMN)、胰岛细胞癌)；阴茎癌(例如阴茎和阴囊的佩吉特病)；松果体瘤；原始神经外胚层肿瘤(PNT)；浆细胞瘤；副肿瘤综合征；上皮内肿瘤；前列腺癌(例如前列腺腺癌)；直肠癌；横纹肌肉瘤；唾液腺癌；皮肤癌(例如鳞状细胞癌(SCC)、角化棘皮瘤(KA)、黑素瘤、基底细胞癌(BCC))；小肠癌(例如阑尾癌)；软组织肉瘤(例如恶性纤维性组织细胞瘤(MFH)、脂质肉瘤、恶性周围神经鞘肿瘤(MPNST)、软骨肉瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤)；皮脂腺癌；小肠癌；汗腺癌；滑膜瘤；睾丸癌(例如精原细胞瘤、睾丸胚胎性癌)；甲状腺癌(例如甲状腺乳头癌、乳头状甲状腺癌(PTC)、髓样甲状腺癌)；尿道癌；阴道癌；以及外阴癌(例如外阴佩吉特病)。
术语“炎性疾病”是指由炎症引起、造成、或导致炎症的疾病。术语“炎性疾病”还可指失调的炎性反应，其引起巨噬细胞、粒细胞和/或T淋巴细胞的过度反应，从而导致异常组织损伤和/或细胞死亡。炎性疾病可为急性或慢性的炎性状况，并且可以由感染或非感染因素引起。炎性疾病包括但不限于动脉粥样硬化、动脉硬化、自身免疫疾病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、风湿性多肌痛(PMR)、痛风性关节炎、退行性关节炎、肌腱炎、粘液囊炎、银屑病、囊性纤维化、关节骨炎、类风湿性关节炎、炎性关节炎、干燥综合征、巨细胞性动脉炎、进行性系统性硬化症(硬皮病)、强直性脊柱炎、多肌炎、皮肌炎、寻常性天疱疮、炎天疱疮、糖尿病(例如I型)、重症肌无力、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、古德帕斯丘疾病、混合性结缔组织病、硬化性胆管炎、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、恶性贫血症、炎性皮肤病、常见间质性肺炎(UIP)、石棉沉滞症、矽肺、支气管扩张、铍尘肺、滑石肺、尘肺、肉样瘤病、脱屑性间质性肺炎、淋巴细胞性间质性肺炎、巨细胞间质性肺炎、细胞间质性肺炎、外源性变应性肺泡炎、韦格纳肉芽肿病和脉管炎的相关形式(颞动脉炎和结节性多动脉炎)、炎性皮肤病、肝炎、迟发型超敏反应(例如毒漆藤皮炎)、肺炎、呼吸道炎症、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑炎、速发型超敏反应、哮喘、枯草热、过敏症、急性过敏症、风湿热、肾小球性肾炎、肾盂肾炎、蜂窝组织炎、膀胱炎、慢性胆囊炎、局部缺血(局部缺血性损伤)、再灌注损伤、同种异体移植排斥、宿主抗移植物排斥、阑尾炎、动脉炎、睑缘炎、细支气管炎、支气管炎、子宫颈炎、胆管炎、绒膜羊膜炎、结肠炎、泪腺炎、皮肌炎、心内膜炎、子宫内膜炎、肠炎、小肠结肠炎、上髁炎、附睾炎、筋膜炎、纤维肌炎、胃炎、肠胃炎、龈缘炎、回肠炎、虹膜炎、喉炎、脊髓炎、心肌炎、肾炎、脐炎、卵巢炎、睾炎、骨炎、中耳炎、胰腺炎、腮腺炎、心包炎、咽侧炎、肋膜炎、静脉炎、局限性肺炎、直肠炎、前列腺炎、鼻炎、输卵管炎、鼻窦炎、口腔炎、滑膜炎、腮腺炎、扁桃体炎、尿道炎、膀胱炎、葡萄膜炎、阴道炎、脉管炎、外阴炎、外阴阴道炎、血管炎、慢性支气管炎、骨髓炎、视神经炎、颞动脉炎、横贯性脊髓炎、坏死性筋膜炎和坏死性小肠结肠炎。眼炎性疾病包括但不限于术后炎症。在一些实施方案中，炎性疾病是炎性衰老(inflammaging)(例如作为衰老副作用的炎症)。
“自身免疫性疾病”是指由受试者的身体针对正常存在于身体内的物质和组织产生的不适当免疫应答引起的疾病。换言之，免疫系统将身体的某些部分误认为是病原体并攻击其自身细胞。这可限于某些器官(例如在自身免疫性甲状腺炎中)或涉及不同位置的特定组织(例如可影响肺和肾两者中的基底膜的古德帕斯丘疾病)。自身免疫性疾病的治疗通常采用免疫抑制，例如降低免疫应答的药物。示例性自身免疫性疾病包括但不限于肾小球性肾炎、古德帕斯丘综合征、坏死性血管炎、淋巴腺炎、结节性动脉周围炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、系统性红斑狼疮、牛皮癣、溃疡性结肠炎、系统性硬化病、皮肌炎/多发性肌炎、抗磷脂抗体综合征、抗磷脂硬皮病、寻常型天疱疮、ANCA相关血管炎(例如韦格纳肉芽肿病、显微镜下多血管炎)、葡萄膜炎、干燥综合征、克罗恩病、赖特尔综合征、强直性脊柱炎、Lyme病、吉兰-巴雷综合征、桥本甲状腺炎和心肌病。
术语“肝疾病”或“肝病”是指肝的损伤或疾病。肝疾病的非限制性实例包括肝内胆汁郁积(例如阿拉吉欧综合征、胆汁性肝硬变)、脂肪肝(例如酒精性脂肪肝、瑞氏综合征)、肝静脉血栓形成、肝豆状核变性(即威尔逊氏病)、肝肿大、肝脓肿(例如阿米巴肝脓肿)、肝硬化(例如酒精性、胆汁性和实验性肝硬化)、酒精性肝病(例如脂肪肝、肝炎、肝硬化)、寄生虫性肝疾病(例如肝包虫病、肝片吸虫病、阿米巴肝脓肿)、黄疸(例如溶血性、肝细胞性、胆汁淤滞性黄疸)、胆汁淤积、门静脉高血压、肝肿大、腹腔积液、肝炎(例如酒精性肝炎、动物肝炎)、慢性肝炎(例如自身免疫性乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、药物诱导的慢性肝炎)、中毒性肝炎、病毒性人肝炎(例如甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎)、肉芽肿性肝炎、继发性胆汁性肝硬变、肝性脑病、静脉曲张、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎、肝细胞腺瘤、血管瘤、胆结石、肝衰竭(例如肝性脑病、急性肝衰竭)、血管平滑肌脂肪瘤、钙化性肝转移瘤、囊肿性肝转移瘤、纤维板层肝癌、肝腺瘤、肝细胞癌、肝囊肿(例如单纯性囊肿、多囊肝病、肝胆管囊腺瘤、胆总管囊肿)、间充质肿瘤(间叶性错构瘤、婴儿血管内皮细胞瘤、血管瘤、肝紫癜、脂瘤、炎性假瘤)、上皮肿瘤(例如错构瘤、胆管腺瘤)、局灶性结节性增生、结节再生性增生、肝母细胞癌、肝细胞癌、胆管腺癌、囊腺癌、血管肿瘤、腺血管肉瘤、卡波西肉瘤、血管内皮瘤、胚胎肉瘤、纤维肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉癌、癌肉瘤、畸胎瘤、类癌、鳞状细胞癌、原发性淋巴瘤、肝紫癜病、红细胞肝性卟啉症、肝卟啉病(例如急性间歇性卟啉症、迟发性皮肤卟啉症)和泽尔韦格氏综合征。
术语“脾疾病”是指脾的疾病。脾疾病的实例包括但不限于脾肿大、脾癌、无脾、脾外伤、特发性紫癜、费尔蒂综合征、霍奇金病和免疫介导的脾损伤。
术语“肺疾病”或“肺病”是指肺的疾病。肺疾病的实例包括但不限于支气管扩张、支气管炎、支气管肺发育不良、间质性肺病、职业性肺病、肺气肿、囊性纤维化、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、严重急性呼吸道综合征(SARS)、哮喘(例如间歇性哮喘、轻度持续性哮喘、中度持续性哮喘、重度持续性哮喘)、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿、间质性肺病、结节病、石棉肺、曲霉肿、曲霉病、肺炎(例如大叶性肺炎、多叶肺炎、支气管性肺炎、间质性肺炎)、肺纤维化、肺结核、类风湿性肺病、肺栓塞和肺癌(例如非小细胞肺癌(例如腺癌、鳞状细胞肺癌、大细胞肺癌)、小细胞肺癌)。
“血液学疾病”包括影响造血细胞或组织的疾病。血液学疾病包括与异常血液学含量和/或功能相关的疾病。血液学疾病的实例包括由对癌症疾病的骨髓照射或化疗治疗引起的疾病，诸如恶性贫血、出血性贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血、镰状细胞性贫血、铁粒幼红细胞贫血、与慢性感染诸如疟疾、锥虫病、HTV、肝炎病毒或其他病毒相关的贫血、由骨髓缺乏引起的骨髓病性贫血、由贫血引起的肾衰竭、贫血症、红血球增多症、传染性单核细胞增多症(EVI)、急性非淋巴细胞白血病(ANLL)、急性髓细胞性白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病(APL)、急性粒单核细胞白血病(AMMoL)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病、威尔姆氏瘤、尤文氏肉瘤、视网膜母细胞瘤、血友病、血栓形成风险增大相关的障碍、疱疹、地中海贫血、抗体介导的病症诸如输血反应和骨髓成红细胞增多症、红细胞的机械性创伤诸如微血管病性溶血性贫血、血栓性血小板低下紫斑症和弥漫性血管内凝血、由寄生虫诸如疟原虫引起的感染、由例如铅中毒和脾功能亢进引起的化学损伤。
术语“神经性疾病”是指神经系统的任何疾病，包括涉及中枢神经系统(脑、脑干和小脑)、周围神经系统(包括颅神经)和植物性神经系统(其部分位于中枢和周围神经系统两者中)的疾病和损伤。神经变性疾病是指以神经细胞丧失为特征的神经性疾病的类型，包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、Tau蛋白病(tauopathy)(包括额颞痴呆)和亨廷顿舞蹈病。神经性疾病的实例包括但不限于血管性痴呆、卒中、头痛、木僵和昏迷、痴呆、癫痫发作、睡眠障碍、创伤、感染、瘤、神经眼科、运动障碍、脱髓鞘疾病、脊索障碍、以及外周神经、肌肉和神经肌肉接头的障碍。成瘾和精神疾病包括但不限于双相性精神障碍和精神分裂症，也包括在神经性疾病的定义中。神经性疾病的另外实例包括后天性癫痫样失语症；急性散播性脑脊髓炎；脑白质肾上腺萎缩症；胼胝体发育不全；认识不能；艾卡尔迪综合征；亚历山大症；阿尔珀斯病；交替性偏瘫；阿尔茨海默氏病；肌萎缩性侧索硬化；无脑畸形；快乐木偶综合征；血管瘤病；缺氧症；失语症；失用症；蛛网膜囊肿；蛛网膜炎；阿-基氏脑畸形；动静脉畸形；亚斯伯格综合征；共济失调毛细血管扩张；注意缺陷多动症；孤独症；自主功能障碍；背痛；贝敦氏症；贝切特氏病；贝耳麻痹；良性自发性眼睑痉挛症；良性局灶性；肌萎缩；良性颅内高压；宾斯万格病；睑痉挛；色素失调症；臂丛神经损伤；脑脓肿；脑损伤；脑瘤(包括多形性成胶质细胞瘤)；脊柱瘤；脊髓侧方压迫-脊髓半断综合征；卡纳范疾病；腕管综合征(CTS)；灼痛；中枢性疼痛综合症；脑桥中央髓鞘溶解症；头部障碍；脑动脉瘤；脑动脉硬化；脑萎缩；脑性巨人症；脑性瘫痪；进行性腓骨肌萎缩；化疗致神经病变和神经性疼痛；chiari畸形；舞蹈病；慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)；慢性疼痛；慢性区域性疼痛综合征；科芬-劳里综合征；昏迷，包括持续性植物状态；先天性两侧面瘫；皮质基底变性；颅动脉炎；颅缝早闭；库贾氏病；累积创伤失调；柯兴综合征；巨细胞性包涵体病(CIBD)；细胞巨化病毒感染；眼足舞蹈综合征；第四脑室闭锁综合征；Dawson疾病；DeMorsier综合征；下臂丛神经麻痹；痴呆；皮肤肌炎；糖尿病性的神经病；弥漫性硬化症；家族性自主神经异常；书写困难；诵读困难；肌张力障碍；早期婴儿型癫痫性脑病；空蝶鞍综合征；脑炎；脑膨出；脑三叉神经血管瘤病；癫痫症；尔勃氏麻痹；特发性震颤；弥漫性体血管角质瘤；法尔综合征；昏厥；家族性痉挛性麻痹；热性惊厥；菲希尔综合征；弗里德赖希氏共济失调；额颞叶痴呆和其他“Tau蛋白病”；脑苷脂病；格斯特曼综合征；巨细胞性动脉炎；巨细胞性包涵体病；球状体细胞白质营养不良；格林-巴利综合征；HTLV-1相关性脊髓病；蛋白球色素退变综合征；颅脑损伤；头痛；半面痉挛；遗传性痉孪性截瘫；雷弗素姆氏病；耳带状疱疹；带状疱疹；平山综合征；HIV相关痴呆和神经病变(另参见AIDS的神经表现)；前脑无裂畸形；亨廷顿舞蹈病及其他多麸胺醯胺重复序列病；水脑畸形；脑积水；皮质醇过多症；缺氧症；免疫介导的脑脊髓炎；包涵体肌炎；色素失调症；惊风烦渴；植烷酸贮积病；婴儿型瑞福森氏疾病；婴儿痉挛；炎性肌病；颅内囊肿；颅内高压；朱伯特综合征；卡恩斯-塞尔综合征；肯尼迪病；金斯伯恩综合征；先天性短颈综合征；克拉伯病；库格尔贝格-韦兰德病；库鲁病；拉福拉病；朗伯-伊顿肌无力综合征；获得性癫痫失语综合征；延髓外侧(瓦伦贝格)综合征；学习无能症；利氏病；伦-格综合征；莱斯奈恩综合征；脑白质营养不良；路易体痴呆；无脑回症；闭锁综合征；葛雷克氏症(亦名运动神经元病或肌萎缩性侧索硬化)；腰椎间盘突出症；莱姆病-神经系统后遗症；马查多-约瑟夫病；巨脑；巨脑畸形；梅-罗综合征；梅尼埃病；脑膜炎；发扭结综合征；异染性脑白质营养不良；头小畸型；偏头痛；米勒费雪症候群；轻微中风；线粒体肌病；莫比斯综合征；单肢肌萎缩；运动神经元疾病；脑底异常血管网病；粘多糖症；多发梗死性痴呆；多灶性运动神经病；多发性硬化症和其他脱髓鞘疾病；伴有体位性低血压的多系统萎缩症；肌肉萎缩；重症肌无力；弥漫性脱髓鞘硬化；乳儿肌阵挛性脑病；肌阵挛；肌病；先天肌强直；发作性睡病；神经纤维瘤病；神经阻滞剂恶性综合征；AIDS的神经表现；狼疮的神经系统后遗症；神经性肌强直；神经元蜡样质脂褐质沉积症；神经元移行异常；尼曼匹克病；O’Sullivan-McLeod综合征；枕神经痛；隐性脊柱神经管闭合不全序列征；大田原综合征；橄榄体脑桥小脑萎缩；眼肌阵挛性肌阵挛；视神经乳头炎；直立性低血压；过度使用综合征；感觉错乱；帕金森氏病；先天强直性肌痉挛；附肿瘤性疾病；阵发性发作；柏罗氏综合征；佩-迈二氏病；周期性瘫痪；外周神经病；痛性神经病变和神经性疼痛；持续性植物状态；广泛性发展障碍；旋光性喷嚏反射；植烷酸贮积病；皮克氏病；神经受压；垂体肿瘤；多肌炎；孔洞脑；脊髓灰质炎后遗症；带状疱疹后遗神经痛(PHN)；感染后脑脊髓炎；体位性低血压；普-威综合征；原发性脊髓侧索硬化；朊病毒病；进行性；面部单侧萎缩；进行性多灶性白质脑病；进行性硬化性灰质萎缩；渐进性核上性麻痹；假脑瘤；膝状神经节综合征(I型和II型)；Rasmussen脑炎；反射性交感神经营养不良综合征；雷夫叙姆病；重复性运动损伤；重复性压力损伤；不宁腿综合征；逆转录病毒相关的脊髓病；雷特氏症；瑞氏综合征；圣维特斯舞蹈病；山德霍夫氏病；谢尔德氏病；脑裂畸形；眼中隔发育不良；摇晃婴儿综合征；带状疱疹；希-德二氏综合征；干燥综合征；睡眠呼吸暂停；大脑性巨大症；痉挛；脊柱裂；脊髓损伤；脊髓肿瘤；脊髓性肌萎缩；僵人综合征；中风；斯特偶-韦伯综合征；亚急性硬化全脑炎；蛛网膜下出血；皮层下动脉硬化性脑病；小舞蹈病；晕厥；脊髓空洞症；迟发的运动障碍；黑蒙性家族性痴愚；颞动脉炎；脊髓拴系综合征；肌强直性白内障；胸廓出口综合征；痛性抽搐；托德麻痹；图雷特多综合征；短暂性缺血发作；传染性海绵状脑病；横贯性脊髓炎；创伤性脑损伤；震颤；三叉神经痛；热带痉挛性轻截瘫；结节性硬化；血管性痴呆(多发梗塞性痴呆)；血管炎，包括颞动脉炎；希佩尔-林道病(VHL)；瓦伦伯格氏综合征；韦德尼希-霍夫曼病；韦斯特综合征；颈部受伤；威廉姆斯综合征；威尔逊病；和泽尔韦格氏综合征。
术语“肌肉骨骼疾病”或“MSD”是指受试者的关节、韧带、肌肉、神经、肌腱和支撑肢体、颈部和背部的结构中的损伤和/或疼痛。在某些实施方案中，MSD是退行性疾病。在某些实施方案中，MSD包括炎性状况。可与MSD相关的受试者的身体部分包括上背和下背、颈部、肩部和四肢(手臂、腿、脚和手)。在某些实施方案中，MSD为骨疾病，诸如软骨发育不全、肢端肥大症、骨痂、骨骼脱矿质化、骨折、骨髓疾病、骨髓肿瘤、先天性角化不良、白血病(例如毛细胞白血病、淋巴细胞性白血病、髓性白血病、费城染色体阳性白血病、浆细胞白血病、干细胞性白血病)、系统性肥大细胞增多症、骨髓增生异常综合征、阵发性夜间血红蛋白尿、髓样肉瘤、骨髓纤维化疾病、多发性骨髓瘤、真性红细胞增多症、pearson骨髓-胰腺综合征、骨肿瘤、骨髓肿瘤、尤文肉瘤、骨软骨瘤、破骨细胞瘤、骨肉瘤、短指畸形、进行性骨干发育不良综合征、颅缝早闭症、克鲁松氏颅骨面骨发育不全、侏儒症、软骨发育不全、布卢姆综合征、科克因综合征、埃利伟氏综合征、塞克尔综合征、脊椎骨骺发育不良、先天性椎体骨骺结构不良、沃纳综合征、骨质增生、骨赘、不全型克-瑞-维氏综合征、马方综合征、多发性骨纤维营养不良、骨炎、骨性关节炎、骨软骨炎、莫尔基奥氏病、卡斯比克病、Leri-Weill软骨发育不良、骨软骨病、骨营养不良、成骨不全症、骨自溶症、Gorham-Stout综合征、骨软化症、骨髓炎、骨坏死、骨质稀少症、骨硬化症、骨质疏松症、骨骼石化症、耳脊椎骨骺发育不良、骨膜增生性厚皮症、骨派吉特氏病、多指趾畸形、麦克综合征、佝偻病、Rothmund-Thomson综合征、索托氏症、脊椎骨骺发育不良、先天性椎体骨骺结构不良、并指症、阿佩尔综合征、II型并指或沃纳综合征。在某些实施方案中，MSD为软骨疾病，诸如软骨瘤、骨软骨炎、莫尔基奥氏病、卡斯比克病或Leri-Weill软骨发育不良。在某些实施方案中，MSD为疝气，诸如腰椎间盘突出症。在某些实施方案中，MSD为关节疾病，诸如关节痛、关节炎(例如痛风(例如凯-赛二氏综合征、莱斯奈恩综合征))、莱姆病、骨性关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、风湿热、类风湿性关节炎、费尔蒂综合征、滑膜炎、Blau综合征、指甲髌骨综合征、脊椎关节病、反应性关节炎、史蒂克勒氏综合征、滑膜疾病、滑膜炎或Blau综合征。在某些实施方案中，MSD为兰-吉综合征。在某些实施方案中，MSD为肌肉疾病，诸如巴斯综合征、线粒体脑肌病、MELAS综合征、MERRF综合征、MNGIE综合征、线粒体肌病、卡恩斯-塞尔综合征、肌痛、纤维肌痛、风湿性多肌痛、肌瘤、肌炎、皮肌炎、神经肌肉疾病、卡恩斯-塞尔综合征、肌肉萎缩症、肌无力、先天性肌无力综合征、朗伯-伊顿肌无力综合征、重症肌无力、肌强直、先天性肌强直、脊髓性肌萎缩、手足搐搦、外眼肌麻痹或横纹肌溶解症。在某些实施方案中，MSD为普罗蒂斯综合征。在某些实施方案中，MSD为风湿性疾病，诸如关节炎(例如痛风(例如凯-赛二氏综合征、莱斯奈恩综合征、莱姆病))、骨性关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、风湿热、类风湿性关节炎、费尔蒂综合征、滑膜炎、Blau综合征、痛风(例如凯-赛二氏综合征、莱斯奈恩综合征)、风湿性多肌痛、风湿热、风湿性心脏病或干燥综合征。在某些实施方案中，MSD为施詹二氏综合征。在某些实施方案中，MSD为骨骼疾病，诸如Leri-Weill软骨发育不良、骨骼发育畸形、梅-尼二氏综合征、骨膜增生性厚皮症、Rieger综合征、脊柱疾病、椎间盘突出症、脊柱侧凸、脊柱裂、脊椎炎、强直性脊柱炎、脊椎关节病、反应性关节炎、脊柱骨骺发育不良、先天性椎体骨骺结构不良或颈椎病。在一些实施方案中，疾病为肌骨病。
“疼痛状况”包括但不限于神经性疼痛(例如周围神经性疼痛)、中枢痛、传入障碍性疼痛、慢性疼痛(例如慢性伤害感受性疼痛以及其他形式的慢性疼痛诸如术后疼痛，例如髋、膝、或其他置换手术后疼痛)、术前疼痛、痛觉受体的刺激(伤害感受性疼痛)、急性疼痛(例如幻觉和短暂的急性疼痛)、非炎性疼痛、炎性疼痛、与癌症相关的疼痛、伤口疼痛、烧伤疼痛、术后疼痛、与医疗程序相关的疼痛、瘙痒症导致的疼痛、膀胱疼痛综合征、与经前焦虑性障碍和/或经期前综合症相关的疼痛、与慢性疲劳综合征相关疼痛、与早产相关的疼痛、与药物成瘾的脱瘾症状相关的疼痛、关节疼痛、关节炎疼痛(例如结晶性关节炎、骨性关节炎、银屑病关节炎、痛风性关节炎、反应性关节炎、类风湿性关节炎或Reiter关节炎相关的疼痛)、腰骶疼痛、肌肉骨骼痛、头痛、偏头痛、肌肉痛、下背部疼痛、颈痛、齿痛、牙痛/颌面部疼痛、内脏痛等。本文所考虑的一种或多种疼痛状况可包括上文和本文提供的各种类型的疼痛的混合(例如伤害性疼痛、炎性疼痛、神经性疼痛等)。在一些实施方案中，特定的疼痛可占主导地位。在其他实施方案中，疼痛状况包括两种或更多种类型的疼痛，而无一种占主导地位。熟练临床医师可以基于疼痛状况来确定对特定受试者实现治疗有效量的剂量。
术语“精神障碍”是指心理疾病，并且包括由American PsychiatricAssociation,Washington D.C.(1994)公布的Diagnostic and Statistical Manual ofMental Disorders-第四版(DSM-IV)中所列的疾病和障碍。精神障碍包括但不限于焦虑障碍(例如急性应激障碍广场恐怖症、一般性焦虑症、强迫性障碍、惊恐性障碍、创伤后应激障碍、分离焦虑障碍、社会恐怖症和特殊恐惧障碍)、儿童期障碍(例如注意力缺陷/机能亢进障碍、品行障碍和对抗性挑衅行为障碍)、饮食障碍(例如神经性厌食症和神经性暴食症)、情绪障碍(例如抑郁症、双相型障碍、循环型情感障碍、精神抑郁障碍和严重抑郁症)、人格障碍(例如反社会人格障碍、回避型人格障碍、边缘型人格障碍、依赖性个性障碍、表演样人格障碍、自恋型个性障碍、强迫性人格障碍、偏执型人格障碍、精神分裂样人格障碍和分裂型人格障碍)、精神障碍(例如短时精神障碍、妄想性障碍、情感分裂性精神障碍、精神分裂症样障碍、综合失调症和分享性精神障碍)、药物相关性障碍(例如酒精依赖性、安非他明依赖性、大麻依赖性、可卡因依赖性、致幻剂依赖性、吸入剂依赖性、尼古丁依赖性、阿片类物质依赖性、苯环利定依赖性和镇静剂依赖性)、适应性障碍、孤独症、精神错乱、痴呆、多梗死性痴呆、学习和记忆障碍(例如健忘症和年龄相关相关的记忆丢失)和图雷特综合征。
术语“代谢障碍”是指涉及碳水化合物、脂质、蛋白质、核酸或它们的组合的正常代谢发生改变的任何障碍。代谢障碍与导致核酸、蛋白质、脂质和/或碳水化合物的代谢不平衡的代谢途径的缺乏或过度相关联。影响代谢的因素包括但不限于内分泌(激素)控制系统(例如胰岛素途径、肠内分泌激素，包括GLP-1、PYY等)、神经控制系统(例如脑内GLP-1)等。代谢障碍的实例包括但不限于糖尿病(例如I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠期糖尿病)、高血糖、高胰岛素血症、胰岛素抗性和肥胖。
在一些实施方案中，疾病以细胞功能障碍为特征。例如，疾病可为线粒体疾病。非限制性线粒体疾病包括弗里德希氏共济失调、alphers疾病、巴斯综合征、β-氧化缺陷、肉碱缺乏、CPTI缺乏和线粒体DNA缺失。细胞功能障碍可包括线粒体功能障碍、RNA复制功能障碍、DNA复制功能障碍、翻译功能障碍和/或蛋白质折叠功能障碍。
在一些实施方案中，疾病或状况是由神经错乱(wood)、出血、损伤(例如骨折、枪弹创伤、割伤、外科手术期间留下的疤痕(例如剖腹产)引起的。
在一些实施方案中，疾病是感染性疾病(例如由病原体和/或病毒引起的疾病)。感染性疾病的非限制性实例包括肺结核、HIV/AIDS、狂犬病、瘟疫、霍乱、登革热、麻疹、疟疾、脑膜炎、百日咳、莱姆病、流感、丙型肝炎、伤寒和脊髓灰质炎。
如本文所用，“衰老的细胞原因”包括表观遗传信息的丢失或修饰。
术语“c-Myc”或“Myc”是指与细胞周期进程有关的核磷蛋白。c-Myc能够与转录因子MAX形成异二聚体，并且异二聚体能够与核酸(例如工程化核酸)上的E盒结果序列结合以调节靶基因的转录。在某些实施方案中，编码c-Myc的核苷酸序列包含与NCBI RefSeq数据库中所述登录号为NM_001354870.1或NM_002467.5的序列至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列。在某些实施方案中，编码c-Myc的氨基酸序列包含与NP_002458.2或NP_001341799.1至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列。在某些实施方案中，方法包括在缺乏诱导c-Myc表达的情况下，或在缺乏激活c-Myc的情况下，诱导OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的表达。诱导c-Myc表达的缺乏可指在细胞、组织、受试者或其任何组合中，缺乏超过内源性水平的c-Myc表达的实质性诱导。与细胞、组织、受试者或其任何组合中c-Myc表达的内源性水平相比，缺乏c-Myc表达的实质性诱导可以指与细胞、组织、受试者或其任何组合中的c-Myc表达的内源性水平相比，c-Myc表达增加少于70％、少于60％、少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于10％或其间的任何值。激活c-Myc表达的缺乏可以指在细胞、组织、受试者或其任何组合中缺乏超过内源c-Myc活性的c-Myc的实质性激活(例如活性)。与细胞、组织、受试者或其任何组合中内源性c-Myc活性相比，缺乏c-Myc活性的实质性诱导可以指与细胞、组织、受试者或其任何组合中的内源性c-Myc活性相比，c-Myc活性增加少于70％、少于60％、少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于10％或其间的任何值。
如本文所用，术语“有效量”和“治疗有效的量”是指当施用给受试者时有效地至少部分治疗受试者所患的状况的本发明化合物的量或浓度。
如本文所用，“功能性”或“活性”蛋白质是保留其生物活性的蛋白质(例如能够充当转录因子或诱导剂)。相反，无功能或无活性的蛋白质是不能执行其一种或多种野生型功能的蛋白质。
术语“基因”是指表达蛋白质的核酸(例如工程化核酸)片段，包括在编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调节序列。“天然基因”是指天然发现的并携带其自身调节序列的基因。“嵌合基因”或“嵌合构建体”是指任何基因或构建体，并非天然基因，且包含非同时存在于自然中的调节和编码序列。因此，嵌合基因或者嵌合构建体可以包含衍生自不同来源的调节序列和编码序列，或者衍生自同一来源、但以非天然方式排列的调节序列和编码序列。“内源基因”是指在生物体的基因组中的自然位置的天然基因。“外源”基因是指在宿主生物体中并非通常存在的，而是通过基因转移引入到宿主生物体中的基因。外源基因可包含插入到非天然生物体中的天然基因，或嵌合基因。“转基因”指通过转化程序被引入基因组中的基因。
“同源物”或“同源”是指共享特定百分比同一性(例如至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％百分比同一性)的序列(例如核酸(例如工程化核酸)或氨基酸序列)。同源序列包括但不限于平行同源或直向同源序列。平行同源序列源于物种基因组内基因的复制，而直向同源序列在物种形成事件后分歧化。功能同源物保留野生型蛋白质的一种或多种生物活性。在某些实施方案中，OCT4、KLF4或SOX2的功能同源物保留野生型对应物的生物学活性(例如转录因子活性)的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。
“KLF4”也可以称为Kruppel样因子4，EZF或GKLF，并且是锌指转录因子。KLF4与分化和增殖的调节有关，并且能够与包括p300-CBP共激活物家族成员在内的共激活物相互作用。如本文所用，KLF4转录因子，其同源物(例如功能同源物)或变体可以源自任何物种，包括人类。在某些实施方案中，编码人KLF4的核酸(例如工程化核酸)包含与NCBI RefSeq数据库中所述登录号为NM_004235.5或NM_001314052.1的核酸(例如工程化核酸)至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列。KLF4变体的非限制性实例包括Krueppel样因子4转录物变体1和Krueppel样因子4转录物变体2。在某些实施方案中，KLF4包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:44至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的核酸(例如工程化核酸)序列。SEQ ID NO:5是来自小家鼠的编码KLF4的核苷酸序列的非限制性实例。SEQ ID NO:44是编码人KLF4的核苷酸序列的非限制性实例。在某些实施方案中，KLF4包含与NP_001300981.1或NP_004226.3至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，KLF4包含与SEQ ID NO:6至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，KLF4包含与SEQ ID NO:45至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的氨基酸序列。SEQ ID NO:6是来自小家鼠的编码KLF4的氨基酸序列的非限制性实例。SEQ ID NO:45是编码人KLF4的氨基酸序列的非限制性实例。
“反向末端重复序列”或“ITR”是彼此反向互补的核酸(例如工程化核酸)序列。一般来讲，在AAV载体中，IRT存在于盒(例如包含编码OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的核酸(例如工程化核酸)的表达盒)的任一侧。在一些情况下，盒编码诱导剂。AAV ITR包括来自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11以及它们的AAV变体的ITR。
术语“核酸”、“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸(例如工程化核酸)分子”、“核酸(例如工程化核酸)序列”和“寡核苷酸”是指DNA和RNA中的一系列核苷酸碱基(也称为“核苷酸”)，并且意指两个或更多个核苷酸的任何链。术语“核酸”或“核酸(例如工程化核酸)序列”、“核酸(例如工程化核酸)分子”、“核酸(例如工程化核酸)片段”或“多核苷酸”可以与“基因”、“基因编码的mRNA”和“cDNA”互换地使用。
核酸(例如工程化核酸)可为单链或双链的嵌合混合物或其衍生物或修饰的变型。例如，可在碱基部分、糖部分或磷酸酯主链上修饰寡核苷酸，例如以改善分子的稳定性、其杂交参数等。核苷酸序列典型地携带遗传信息，包括细胞机构用于制备蛋白质和酶的信息。这些术语包括双链或单链基因组和cDNA、RNA、任何合成和遗传操作的多核苷酸，以及有义和反义多核苷酸两者。这包括单链和双链分子即DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA杂交体，以及通过使碱基偶联于氨基酸主链形成的“蛋白核酸(例如工程化核酸)”(PNA)。这还包括含有碳水化合物或脂质的核酸(例如工程化核酸)。示例性DNA包括单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、质粒DNA(pDNA)、基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)、反义DNA、叶绿体DNA(ctDNA或cpDNA)、微卫星DNA、线粒体DNA(mtDNA或mDNA)、动基体DNA(kDNA)、前病毒、溶原性细菌、重复DNA、卫星DNA和病毒DNA。示例性RNA包括单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)、信使RNA(mRNA)、前体信使RNA(pre-mRNA)、小发夹RNA或短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、导向RNA(gRNA)、转移RNA(tRNA)、反义RNA(asRNA)、核不均一RNA(hnRNA)、编码RNA、非编码RNA(ncRNA)、长非编码RNA(长ncRNA或lncRNA)、卫星RNA、病毒卫星RNA、信号识别颗粒RNA、小细胞质RNA、小核RNA(snRNA)、核糖体RNA(rRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、聚肌苷酸、核酶、flexizyme、核仁小RNA(snoRNA)、剪接前导RNA、病毒RNA和病毒卫星RNA。
本文所述的核酸(例如工程化核酸)可通过本领域已知的标准方法合成，例如通过使用DNA自动合成仪(诸如可从Biosearch,Applied Biosystems等商购获得的那些)。例如，硫代磷酸酯寡核苷酸可通过Stein等人,Nucl.Acids Res.,16,3209,(1988)的方法合成，膦酸甲酯寡核苷酸可通过使用可控孔径的玻璃聚合物载体制备(Sarin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85,7448-7451,(1988))。已经开发出用于将反义DNA或RNA递送到细胞中的多种方法，例如，可将反义分子直接注射入组织部位，或者可将设计用于靶向期望细胞的经修饰反义分子(与靶细胞表面表达的受体或抗原特异性结合的肽或抗体相连的反义分子)进行全身施用。另选地，RNA分子可以通过使编码反义RNA分子的DNA序列体外和体内转录来产生。此类DNA序列可被引入多种载体中，这些载体中引入了适当的RNA聚合酶启动子，诸如T7或SP6聚合酶启动子。另选地，根据所用的启动子，可将组成性或诱导性地合成反义RNA的反义cDNA构建体稳定引入细胞系中。然而，通常难以达到足以抑制内源mRNA翻译的胞内反义浓度。因此，优选的方法利用了重组DNA构建体，其中反义寡核苷酸处于强启动子的控制之下。使用此类构建体转染患者体内的靶细胞将导致足量的单链RNA转录，该单链RNA将与内源靶基因转录物形成互补碱基配对并由此阻止靶基因mRNA的翻译。例如，载体可被引入体内从而被细胞吸收并指导反义RNA的转录。只要此类载体可转录产生期望的反义RNA，其就可保持游离体状态或整合到染色体中。通过本领域标准的重组DNA技术方法，可以构建此类载体。载体可以是用于在哺乳动物细胞中进行复制和表达的质粒、病毒或本领域中已知的其他载体。编码反义RNA的序列的表达可通过本领域已知的任何启动子在哺乳动物(优选地人)细胞中进行。此类启动子可为诱导型或组成型。任何类型的质粒、粘粒、酵母人造染色体，或病毒载体都可用于制备能直接引入组织部位的重组DNA构建体。
核酸(例如工程化核酸)可侧接有天然调节(表达控制)序列或者可结合异源序列，包括启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他核糖体结合位点序列、增强子、应答元件、抑制子、信号序列、聚腺苷酸化序列、内含子、5′-和3′-非编码区等。也可以用本领域已知的许多方法修饰该核酸(例如工程化核酸)。此类修饰的非限制性实例包括甲基化、“加帽”、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，以及核苷酸间修饰，例如具有不带电荷的键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、氨基甲酸酯等)和带电荷的键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些。多核苷酸可含有一或多个额外的共价连接的部分，例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)、嵌入物(例如吖啶、补骨酯素等)、螯合剂(例如金属、放射性金属、铁、氧化金属等)，以及烷化剂。多核苷酸可以通过形成磷酸三甲基酯或磷酸三乙基酯或氨基磷酸烷基酯连接而衍生化。此外,也可利用能够直接或间接提供可检测信号的标记对本文的多核苷酸进行修饰。示例性标记包括放射性同位素、荧光分子、表位标签、同位素(例如放射同位素)、生物素等。
“重组核酸(例如工程化核酸)分子”或“工程化核酸”是已经经历分子生物学操纵的核酸(例如工程化核酸)分子，即，非天然存在的核酸(例如工程化核酸)分子或遗传工程化的核酸(例如工程化核酸)分子。此外，术语“重组DNA分子”或“工程化核酸”是指非天然存在的核酸(例如工程化核酸)序列，或是可通过人工组合两个原本分离的核酸(例如工程化核酸)序列区段(即，通过将通常不连续的DNA片段连接在一起)而制备的核酸序列。所谓的“重组产生”是指通常通过化学合成方法或者以人工操纵分离的核酸(例如工程化核酸)区段实现的人工组合，例如，通过使用限制性酶、连接酶的遗传工程技术，以及如由例如以下描述的类似重组技术：Sambrook等人,Molecular Cloning,第二版,Cold Spring HarborLaboratory,Plainview,N.Y.；(1989)，或Ausubel等人,Current Protocols in MolecularBiology,Current Protocols(1989)，以及DNA Cloning:A Practical Approach,第I和II卷(D.N.Glover编辑)IREL Press,Oxford,(1985)；其各自以引用方式并入本文。
可以进行此类操纵，以用编码相同或保守氨基酸的多余密码子取代另一个密码子，同时常常引入或去除序列识别位点。另选地，可以将期望功能的核酸(例如工程化核酸)区段连接在一起，以产生包含非天然存在的功能的期望组合的单一遗传实体。限制性酶别位点通常是此类人工操纵的靶标，但是也可通过设计引入其他位点特异性靶标，例如启动子、DNA复制位点、调节序列、控制序列、开放阅读框或其他有用特征。
“OCT4”也可以称为八聚体结合转录因子，OCT3，OCT3/4，POU5F1或POU 5类同源盒1，并且是与胚胎发育和确定细胞命运有关的转录因子。与其他OCT转录因子相似，OCT4的特征在于称为POU结构域的二分DNA结合结构域。如本文所用，OCT4转录因子，其同源物或变体可以源自任何物种，包括人类。在某些实施方案中，编码人OCT4的核酸(例如工程化核酸)与NCBI RefSeq中所述登录号为NM_002701,NM_203289,NM_001173531,NM_001285986或NM_001285987的核酸(例如工程化核酸)至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同。在某些实施方案中，编码OCT4的核酸(例如工程化核酸)包含与SEQ ID NO:1提供的核酸(例如工程化核酸)序列至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列。SEQ ID NO:1是来自小家鼠的编码OCT4的核苷酸序列的非限制性实例。在某些实施方案中，编码人OCT4的核酸(例如工程化核酸)包含与SEQ ID NO:40提供的核酸(例如工程化核酸)序列至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列。SEQ ID NO:40是编码人OCT4的核苷酸序列的非限制性实例。本文涵盖的OCT4变体的非限制性实例包括POU5F1，转录物变体1，POU5F1，转录物变体2，POU5F1，转录物变体3，POU5F1，转录物变体4和POU5F1转录物变体5。在某些实施方案中，编码人OCT4的氨基酸序列与NCBI RefSeq中所述登录号为NP_001167002.1,NP_001272915.1,NP_001272916.1,NP_002692.2或NP_976034.4的核酸(例如工程化核酸)至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同。在某些实施方案中，OCT4包含与SEQ ID NO:2至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的氨基酸序列。SEQ ID NO:2是来自小家鼠的编码OCT4的氨基酸序列的非限制性实例。在某些实施方案中，OCT4包含与SEQ ID NO:41至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的氨基酸序列。SEQ ID NO:41是编码人OCT4的氨基酸序列的非限制性实例。其他OCT4转录因子(例如来自其他物种)是已知的，并且编码OCT4转录因子的核酸(例如工程化核酸)可以在包括GenBank在内的公众可获得的数据库中找到。
术语“启动子”是指核酸序列的控制区，在该控制区，核酸序列的剩余部分的启动和转录速度被控制。启动子也可含有调节蛋白和分子如RNA聚合酶和其他转录因子能够结合在其上的子区域。启动子可为组成型、诱导型、可活化型、阻抑型、组织特异型或它们的任何组合。启动子驱动其调节的核酸序列的表达或驱动其调节的核酸序列的转录。在本文中，当启动子处在相对于其所调节的核酸序列的正确功能位置和方向以控制(“驱动”)该序列的转录起始、该序列的表达或它们的组合时，认为该启动子是“可操作连接的”。
启动子可以促进来自任何物种(包括人)的可操作连接的核酸序列的遍在表达或组织特异性表达。在一些实施方案中，启动子是真核启动子。真核启动子的非限制性实例包括TDH3、PGK1、PKC1、TDH2、PYK1、TPI1、AT1、CMV、EF1a、SV40、PGK1(人或小鼠)、Ubc、人β肌动蛋白、CAG、TRE、UAS、Ac5、多角体蛋白、CaMKIIa、GAL1、GAL10、TEF1、GDS、ADH1、CaMV35S、Ubi、H1和U6，如本领域的普通技术人员已知的(参见例如Addgene website:blog.addgene.org/plasmids-101-the-promoter-region)。
遍在启动子的非限制性实例包括四环素反应性启动子(处于相关条件下)、CMV、EF1α、SV40启动子、PGK1、Ubc、CAG、人β肌动蛋白基因启动子和包含上游激活序列(UAS)的启动子。在某些实施方案中，启动子是哺乳动物启动子。组织特异性启动子的非限制性实例包括脑特异性、肝特异性、肌肉特异性、神经细胞特异性、肺特异性、心脏特异性、骨特异性、肠特异性、皮肤特异性启动子、脑特异性启动子和眼特异性启动子。例如，肌肉特异启动子是结蛋白启动子(例如，与SEQ ID NO:29至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列)。眼特异性启动子的非限制性实例包括人GRK1(视紫红质激酶)启动子(例如SEQ ID NO:50)，人CRX(锥杆同源盒转录因子)启动子(例如，SEQ ID NO:51)和人NRL启动子(人TK末端启动子上游的神经视网膜亮氨酸拉链转录因子增强子)。
在一些实施方案中，启动子对衰老细胞具有特异性。例如，启动子可以在衰老细胞中而非在非衰老细胞中特异性诱导可操作连接的核酸的表达。作为非限制性实例，p16启动子可用于促进衰老细胞中可操作连接的核酸的表达。
在一些实施方案中，本公开的启动子适合用于AAV载体。参见例如，美国专利申请公开号2018/0155789，出于此目的，该专利申请通过引用以其整体并入本文。
组成型启动子的非限制性实例包括CP1、CMV、EF1 alpha、SV40、PGK1、Ubc、人beta肌动蛋白、beta微管蛋白、CAG、Ac5、Rosa26启动子、COL1A1启动子、多角体蛋白、TEF1、GDS、CaM3 5S、Ubi、H1、U6、红视蛋白启动子(red启动子)、视紫红质启动子(rho启动子)、锥拘留蛋白(cone arrestin)启动子(car启动子)、视紫红质激酶启动子(rk启动子)。Ubc启动子可以包含与SEQ ID NO:18至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列。在一些情况下，组成型启动子是Rosa26启动子。在一些情况下，组成型启动子是COL1A1启动子。红视蛋白启动子可以包含与SEQ ID NO:101至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列。rho启动子可以包含与SEQID NO:102至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列。锥拘留蛋白蛋白启动子可以包含与SEQ ID NO:103至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列。视紫红质激酶启动子可以包含与SEQ IDNO:104至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列。组织特异性启动子可用于驱动工程化核酸的表达，所述工程化核酸包括例如编码rtTA、tTA、OCT4、KLF4、SOX2或其任何组合的核酸。在一些实施方案中，组织特异性启动子用于驱动rtTA或rTA的表达。在一些实施方案中，组织特异性启动子用于驱动OCT4、KLF4和SOX2的表达。在一些实施方案中，组织特异性启动子选自SEQ ID NO:101-104。在一些实施方案中，hRK启动子用于驱动OCT4、KLF4和SOX2的表达。
“诱导型启动子”是特征在于当存在诱导剂，受诱导剂影响，或与诱导剂接触时启动或增强转录活性的启动子。诱导剂可为内源性或通常外源性条件、化合物、试剂或蛋白质，它们以在由诱导型启动子诱导转录活性方面具有活性的方式与工程化核酸接触。在某些实施方案中，诱导剂是四环素敏感蛋白(例如tTA或rtTA，TetR家族调节物)。
根据本公开使用的诱导型启动子包括本文描述的或本领域普通技术人员已知的任何诱导型启动子。诱导型启动子的实例包括但不限于化学/生物化学调控和物理调控的启动子，诸如醇调控的启动子、四环素调控的启动子(例如，脱水四环素(aTc)反应性启动子和其他四环素反应性启动子系统，其包括四环素阻抑蛋白(TetR，例如SEQ ID NO:26；或TetRKRAB，例如SEQ ID NO:27)、四环素操纵子序列(tetO)和四环素反式激活物融合蛋白(tTA)，以及四环素操纵子序列(tetO)和反向四环素反式激活物融合蛋白(rtTA))、类固醇调控的启动子(例如，基于大鼠糖皮质激素受体、人雌激素受体、蛾蜕皮激素受体的启动子，以及来自类固醇/类视黄醇/甲状腺25受体超家族的启动子)、金属调控的启动子(例如，衍生自酵母、小鼠和人的金属硫蛋白(结合并多价螯合金属离子的蛋白质)基因的启动子)、发病机制调控的启动子(例如，由水杨酸、乙烯或苯并噻二唑(BTH)诱导)、温度/热诱导型启动子(例如热休克启动子)，pH调控启动子以及光调控的启动子。使用光调控的启动子的诱导型系统的非限制性实例提供于Wang et al.,Nat.Methods.2012Feb 12；9(3):266-9。
在某些实施方案中，诱导型启动子包含四环素(Tet)响应元件。例如，诱导型启动子可以是TRE3G启动子(例如，TRE3G启动子，其包含与SEQ ID NO:7至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列)。举例来说，TRE(例如TRE2)启动子可以包含与SEQ ID NO:23至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的核酸(例如工程化核酸)序列。举例来说，TRE(例如P紧密)启动子可以包含与SEQ ID NO:24至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的核酸(例如工程化核酸)序列。
诱导型启动子的其他非限制性实例包括米非司酮响应性启动子(例如，GAL4-E1b启动子)和香豆霉素响应性启动子。参见例如，Zhao et al.,Hum Gene Ther.2003Nov 20；14(17):1619-29。
如本文所用，“反向四环素反式激活物”(“rtTA”)是在四环素(例如强力霉素)存在下与TRE启动子(例如，TRE3G，TRE2启动子或P紧密启动子)结合的诱导剂，并且能够驱动与TRE启动子可操作连接的转基因的表达。rtTA通常包含突变体四环素阻遏物DNA结合蛋白(TetR)和反式激活结构域(参见例如，Gossen et al.,Science.1995Jun 23；268(5218):1766-9和本文所列的任何反式激活结构域)。当与四环素结合时，突变体TetR结构域能够与TRE启动子结合。参见例如，2018年9月28日提交的题为MUTANT REVERSE TETRACYCLINETRANSACTIVATORS FOR EXPRESSION OF GENES的美国临时申请号62/738,894，代理人案卷号为H0824.70300US00，并且通过引用以其整体并入本文。
“SRY-box2”或“SOX2”是SRY相关的HMG盒(SOX)转录因子家族的成员。SOX2与促进胚胎发育有关。SOX(与SRY相关的HMG盒)转录因子家族的成员的特征在于高迁移率组5(HMG)盒DNA序列。该HMG盒是在整个真核生物物种中高度保守的DNA结合结构域。如本文所用，SOX2转录因子，其同源物或变体可以源自任何物种，包括人类。在某些实施方案中，编码SOX2的核酸(例如工程化核酸)包含与NCBI RefSeq中所述登录号为NM_011443.4的核酸(例如工程化核酸)至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列。在某些实施方案中，编码人SOX2的核酸(例如工程化核酸)包含与NCBI RefSeq中所述登录号为NM_003106.4的核酸(例如工程化核酸)序列至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列。在某些实施方案中，SOX2包含与SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:42至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的核酸(例如工程化核酸)序列。SEQ ID NO:3是来自小家鼠的编码SOX2的核苷酸序列的非限制性实例。SEQ ID NO:42是编码人SOX2的核苷酸序列的非限制性实例。在某些实施方案中，编码人SOX2的核酸(例如工程化核酸)包含与NCBI RefSeq中所述登录号为NP_003097.1的氨基酸序列至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列。在一些情况下，SOX2包含与SEQ ID NO:4至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的氨基酸序列。在一些情况下，SOX2包含与SEQ ID NO:43至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的氨基酸序列。SEQ ID NO:4是来自小家鼠的编码SOX2的氨基酸序列的非限制性实例。SEQ IDNO:43是编码人SOX2的氨基酸序列的非限制性实例。
“多顺反子载体”是编码超过一个氨基酸序列的载体(例如，编码OCT4和KLF4，OCT4和SOX2，KLF4和SOX2，或OCT4、SOX2和KL4(OSK)的载体)。多顺反子载体允许从核酸(例如工程化核酸)序列表达多个氨基酸序列。编码每个转录因子(例如，OCT4、KLF4或SOX2)的核酸(例如工程化核酸)序列可以连接或分开，使得它们产生未连接的蛋白质。例如，可以将内部核糖体进入位点(IRES)或多肽切割信号置于载体中编码每个转录因子的核酸(例如工程化核酸)序列之间。示例性多肽切割信号包括2A肽(例如T2A，P2A，E2A和F2A)。2A肽可以包含与SEQ ID NO:9至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列。在一些实施方案中，本公开的表达载体是多顺反子表达载体。
如本文所用，“逆转衰老”是指改变与衰老相关的物理特征。所有动物通常经历一段生长和成熟期，紧接着一段进行性和不可逆的生理衰退，以死亡告终。从出生到死亡的时间长度被称为生物体的寿命期，并且每种生物体具有特征性平均寿命。衰老是时间流逝基础上变化的物理表现，如由平均寿命的百分比所测量。
预期所施用的“受试者”包括但不限于人(即任何年龄组的男性或女性，例如儿童受试者(例如婴儿、少儿、青少年)或成人受试者(例如青年、中年人、或老年人))和/或其他非人动物，例如哺乳动物(例如灵长类(例如猕猴、恒河猴)；商业上相关的哺乳动物，诸如牛、猪、马、绵羊、山羊、猫和/或狗)和鸟类(例如商业上相关的鸟类，诸如鸡、鸭、鹅和/或火鸡)。在某些实施方案中，动物是哺乳动物。动物可以是雄性或雌性并且处于任何发育阶段。非人动物可以是转基因动物。
本领域普通技术人员将认识到，小儿受试者或成年受试者的生物学年龄可以根据动物的类型而变化。作为非限制性实例，成年小鼠可以是1岁，而成年人类可以是超过21岁。在一些实施方案中，小儿受试者小于21岁、小于20岁、小于15岁、小于10岁、小于9岁、小于8岁、小于7岁、小于6岁、小于5岁、小于4岁、小于3岁、小于2岁、小于1岁、小于10月龄、小于9月龄、小于8月龄、小于7月龄、小于6月龄、小于5月龄、小于4月龄、小于2月龄或小于1月龄。在一些实施方案中，成年受试者为至少3周龄、1月龄、至少2月龄、至少3月龄、至少4月龄、至少5月龄、至少6月龄、至少7月龄、至少8月龄、至少9月龄、至少10月龄、至少11月龄、至少1岁、至少2岁、至少3岁、至少5岁、至少10岁、至少15岁、至少20岁、至少25岁、至少30岁、至少40岁、至少50岁、至少55岁、至少60岁、至少65岁、至少70岁、至少75岁、至少80岁、至少90岁或至少100岁。在一些实施方案中，中年成年受试者为1和6月龄之间、6和12月龄之间、1岁和5岁之间、5岁和10岁之间、10和20岁之间、20和30岁之间、30和50岁之间、50和60岁之间、40和60岁之间、40和50岁之间或45和65岁之间。在一些实施方案中，高级成年受试者为至少1月龄、至少2月龄、至少3月龄、至少4月龄、至少5月龄、至少6月龄、至少7月龄、至少8月龄、至少9月龄、至少10月龄、至少11月龄、至少1岁、至少2岁、至少3岁、至少5岁、至少10岁、至少15岁、至少20岁、至少25岁、至少30岁、至少40岁、至少50岁、至少55岁、至少60岁、至少65岁、至少70岁、至少75岁、至少80岁、至少90岁或至少100岁。
如本文所用，“终止子”或“终止序列”是导致转录终止的核酸(例如工程化核酸)序列。终止子可以是单向的或双向的。其由参与特异性终止RNA聚合酶合成RNA转录物的DNA序列组成。终止序列防止下游核酸(例如工程化核酸)序列被上游启动子转录激活。因此，在某些实施方案中，考虑了终止RNA转录物产生的终止子。
最常用的终止子类型是正向终止子。当置于通常被转录的核酸(例如工程化核酸)序列的下游时，正向转录终止子将导致转录中止。在一些实施方案中，可以使用双向转录终止子，其通常导致转录在正向和反向链两者上终止。在一些实施方案中，可以使用逆转录终止子，其通常仅终止反向链上的转录。
哺乳动物终止序列的非限制性实例包括牛生长激素终止子和病毒终止序列，诸如SV40终止子、spy、yejM、secG-leuU、thrLABC、rrnB T1、hisLGDCBHAFI、metZWV、rrnC、xapR、aspA和arcA终止子。在某些实施方案中，终止序列是SV40并且包含与SEQ ID NO:8至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列。
如本文所用，“Tet-Off”系统是一类诱导型系统，其能够在四环素(例如强力霉素(DOX))存在下抑制特定转基因的表达。相反地，Tet-Off系统能够在不存在四环素(例如强力霉素DOX)的情况下诱导特定转基因的表达。在某些实施方案中，Tet-Off系统包含与转基因(例如，编码OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合)可操作地连接的四环素反应性启动子和四环素控制的反式激活物(tTA)。具有四环素反应性启动子(例如TRE3G、P紧密或TRE2)的转基因和四环素控制的反式激活物可以在同一载体上编码或者在分开的载体上编码。参见例如题为MUTANT REVERSE TETRACYCLINE TRANSACTIVATORS FOR EXPRESSION OF GENES的美国临时申请号62/738,894，其于2018年9月28日提交，代理人案卷号为H0824.70300US00，并通过引用以其整体并入本文。
如本文所用，“Tet-On”系统是一类诱导型系统，其能够在四环素(例如强力霉素(DOX))存在下诱导特定转基因的表达。在某些实施方案中，Tet-On系统包含与转基因(例如，编码OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合)可操作地连接的四环素响应性启动子和反向四环素控制的反式激活物(rtTA)。例如，rtTA可以是rtTA3，rtTA4或其变体。在某些实施方案中，编码rtTA3的核酸(例如工程化核酸)包含与SEQ ID NO:10至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列。在某些实施方案中，编码rtTA3的氨基酸序列包含与(SEQ ID NO:11)至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列。在某些实施方案中，编码rtTA4的核酸(例如工程化核酸)包含与SEQ IDNO:12至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列。在某些实施方案中，编码rtTA4的氨基酸序列包含与(SEQ ID NO:13)至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列。编码四环素响应性启动子(例如，包含TRE，包括TRE3G，P紧密和TRE2的启动子)和反向四环素控制的反式激活物的表达盒可以在同一载体上编码或在分开的载体上编码。参见例如题为MUTANT REVERSETETRACYCLINE TRANSACTIVATORS FOR EXPRESSION OF GENES的美国临时申请号62/738,894，其于2018年9月28日提交，代理人案卷号为H0824.70300US00，并通过引用以其整体并入本文。
术语“组织”是指受试者的任何生物组织(包括细胞群、身体部分或器官)或其部分，包括血管和/或淋巴管，其是本发明的化合物、颗粒和/或组合物所要递送的对象。组织可以是需要治疗的异常、受损或不健康组织。组织也可以是正常或健康组织，其变异常或不健康的风险高于正常风险，这可能需要加以预防。在某些实施方案中，组织被认为是健康的，但是在当前或未来条件下，性能或存活未达最佳标准。例如，在农业实践中，包括气候和生长条件(例如营养)的环境条件可以受益于本文所述的任何方法。在某些实施方案中，组织是中枢神经系统。在某些实施方案中，组织是指来自某些实施方案的组织，细胞或组织来自于眼、耳、鼻、口(包括齿龈和齿根)、骨、肺、乳腺、乳房、胰腺、胃、食管、肌肉(包括心肌)、肝、血管、皮肤(包括毛发)、心脏、脑、神经组织、肾、睾丸、前列腺、阴茎、泄殖腔、鳍、卵巢或肠。在某些实施方案中，组织是受损的(例如，归因于先天性缺陷、损伤、意外事故或医源性损伤)并且/或者是衰老组织。在某些实施方案中，组织是用光纤探头可到达的深层组织。
术语“四环素阻遏物”或“TetR”是指能够在不存在四环素(例如强力霉素)的情况下与Tet-O序列(例如TRE中的Tet-O序列，例如Tet-O序列可以包含SEQ ID NO:19)结合且在不存在四环素(例如强力霉素)的情况下阻止rtTA(例如rtTA3、rtTA4或它们的变体)结合的蛋白质。TetR在不存在四环素(例如强力霉素)的情况下阻止由含有TRE的启动子的基因表达。在四环素存在下，TetR不能结合含有TRE的启动子，并且TetR不能阻止转录。TetR的非限制性实例包括tetR(例如SEQ ID NO:26)和tetRKRAB(例如SEQ ID NO:28)。在一些实施方案中，TetR是TetR融合物(例如TRSID，其可通过使TetR融合至Mad1的mSIN30相互作用结构域(SID)产生)。参见例如Zhang等人,J Biol Chem.2001年11月30日；276(48):45168-74。
如本文所用，“TRE启动子”是含有四环素应答元件(TRE)的启动子。如本文所用，TRE包含至少一个(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)Tet-O序列。Tet-O序列的非限制性实例是与SEQ ID NO:19至少70％(例如75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列。在一些实施方案中，TRE启动子还包含位于tet-O序列下游的最小启动子。最小启动子是含有启动子的最小元件(例如，TATA盒和转录起始位点)的启动子，但是在不存在上游增强子(例如，含有Tet-O的序列)的情况下无活性。例如，最小启动子可为包含与SEQ ID NO:20至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列的最小CMV启动子。例如，TRE启动子可为TRE3G启动子(例如包含与SEQ ID NO:7至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列的TRE3G启动子)。在一些实施方案中，TRE启动子是包含与SEQ ID NO:23至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列的TRE2启动子。在一些实施方案中，TRE启动子是包含与SEQ ID NO:24至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)相同的序列的P紧密启动子。
在受损组织的语境中，术语“组织修复”是指组织结构、组织损伤后的功能或它们的组合的恢复。组织修复包括组织再生、细胞生长、组织更替和/或现有组织的重新布局(重编程)。
术语“组织再生”是指在与感兴趣的组织类型相同(例如，与受损组织或细胞类型相同)的组织内产生新的组织或细胞。在一些实施方案中，本文所提供的方法促进器官再生。
术语“组织更替”是指产生与感兴趣的组织相比类型不同的组织(例如结缔组织更替受损组织)。
如本文所用，术语“治疗”、“处理”和“医治”是指逆转、减轻、延缓疾病或障碍或其一种或多种症状的发作或抑制疾病或障碍或其一种或多种症状的进展，如本文所述。在某些实施方案中，治疗可以在已经出现一种或多种症状之后给予。在其他实施方案中，治疗可以在没有症状的情况下给予。例如，治疗可以在症状发作之前给予易感个体，或者可以用另一种损伤剂进行治疗(例如，根据症状史，根据遗传或其他易感因素、疾病疗法或它们的任何组合)。还可以在症状已经消退之后继续治疗，例如，以预防或延迟它们的复发。
术语“变体”是指相对于野生型序列而言包含修饰的序列。氨基酸序列的非限制性修饰包括插入、缺失和点突变。对核酸(例如工程化核酸)序列的非限制性修饰包括移码突变、核苷酸插入和核苷酸缺失。
术语“WPRE”是指土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调节元件(WPRE)。WPRE在核酸(例如表达载体)中产生三级结构，并且能够增强转基因表达(例如来自病毒载体)。在某些实施方案中，WPRE序列与SEQ ID NO:21至少70％(例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少100％)相同。
在发明详述、实施例和权利要求书中更详细地描述了这些和其他示例性取代物。本发明不旨在以任何方式受限于上述取代物示例性列表。
附图的简要说明
图1是具有线性表示编码OCT4、SOX2和KLF4的表达载体的示意图。TRE3G显示为示例性的诱导型启动子，且SV40显示为示例性的终止子序列。
图2是TRE3G-OSK-SV40pA，即编码OSK的AAV载体的载体图。指示了包括编码OCT4、SOX2和KLF4的序列以及反向末端重复序列(ITR)的位置在内的特征。
图3是显示TRE3G-OSK-SV40pA中限制酶消化位点位置的载体图。
图4A-4AL包括将图2和3中所示的特征定位到TRE3G-OSK-SV40pA的核酸(例如工程化核酸)序列上的一系列示意图。
图5A-5D显示图4A-4AL中所示特征的核酸(例如工程化核酸)序列的核苷酸位置和长度。
图6A-6C包括western印迹数据，其显示编码OSK的AAV的不同血清型(TRE3G-OSK-SV40pA，SEQ ID NO:16)已成功用于强力霉素(DOX)诱导的系统中以控制293T细胞中的OSK表达。用抗体检测了OCT4、KLF4和H3表达。H3是指组蛋白3，并且是加样对照。图6A显示强力霉素对用带有TRE3G-OSK-SV40pA载体的AAV9病毒和用带有编码rtTA3的载体的AAV9病毒(四环素(Tet)-on系统)感染的细胞中蛋白质表达的影响。图6B显示DOX对用带有TRE3G-OSK-SV40pA载体的AAV2病毒和用带有编码tTA的载体的AAV2病毒(Tet-Off系统)感染的细胞中蛋白质表达的影响。图6C显示DOX处理和DOX去除对用带有TRE3G-OSK-SV40pA载体的AAV.PHP.b病毒和用带有编码rtTA3的载体的AAV.PHP.b病毒(Tet-On系统)感染的细胞中蛋白质表达的影响。括号中指出了DOX处理(+DOX)或DOX去除(-DOX)的天数长度。
图7A-7F包括的数据显示，编码OSK的AAV以可诱导的方式在神经挤压后诱导部分重编程并促进视神经的再生。图7A包括一系列照片，其显示将TRE-OSK-SV40 AAV病毒和CAG-tTA AAV病毒注射到小鼠视网膜中导致KLF4在小鼠视网膜神经节细胞(RGC)中表达。显示了来自小鼠视网膜的光学相干断层扫描(OCT)切片的RBPMS(RGC标志物)和KLF4染色。图7B包括一系列照片，其显示注射TRE-OSK-SV40 AAV病毒和CAG-tTA AAV病毒导致小鼠视网膜中KLF4和OCT4的诱导型表达。显示了在没有强力霉素处理的情况下(顶部两张照片)和在DOX处理4天后(底部两张照片)整个视网膜的OCT4和KLF4染色。图7C显示确定TRE-OSK-SV40AAV病毒单独或与CAG-tTA AAV病毒组合对视神经挤压损害后视神经再生的影响的实验时间线。CTB代表霍乱毒素β-亚基，并允许轴突的荧光成像。图7D显示通过与CAG-tTA组合注射的TRE-OSK-SV40 AAV病毒，来自全封装视网膜的OCT4和KLF4的共定位染色，RBPMS特异性地染色视网膜神经节细胞。图7E显示在注射单独的TRE-OSK-SV40 AAV病毒(左)或与CAG-tTAAAV组合的TRE-OSK-SV40 AAV(右)的小鼠视网膜中，挤压损害后视神经中CTB标记的轴突的荧光成像。星形代表病变部位。图7F显示如图7E所示用病毒处理的视神经的另外的荧光图像。
图8A-8G显示神经挤压损伤后施用编码OSK的病毒改善了RGC轴突再生。图8A显示编码tTA的病毒，在不存在DOX的情况下与编码TRE-OSK-SV40的病毒组合(圆圈，n＝9)，在存在dox的情况下与编码TRE-OSK-SV40的病毒组合(三角形，n＝5)，或与编码d2EGFP的病毒组合(正方形，对照，n＝5)对RGC轴突再生的影响。每条神经的估计轴突数目显示为距损伤部位的距离(μm)的函数。图8B是确定d2EGFP表达对RGC轴突再生的影响的实验时间线。图8C是一系列图像，其显示来自图8B中概述的实验的CTB标记的轴突。图8D是确定未诱导的OSK表达对轴突再生的影响的实验时间线。图8E是一系列图像，其显示来自图4D中概述的实验的CTB标记的轴突。图8F是确定诱导的OSK表达对轴突再生的影响的实验时间线。图8G是一系列图像，其显示来自图8F中概述的实验的CTB标记的轴突。星形指示病变部位。
图9A-9D显示与神经挤压后未感染OSK病毒的细胞相比，OSK感染的RGC具有更高的存活率。图9A显示在GFP AAV感染的未挤压的RGC(左上)和在挤压的RGC(右上)中对RBPMS和GFP的染色，以及在OSK AAV感染的未挤压的RGC(左下)和挤压的RGC(右下)中对RBPMS和KLF4的染色。图9B显示用未稳定形式的GFP(d2EGFP)病毒或OSK病毒感染的未挤压和挤压的RGC的RBPMS(具有多个剪接的RNA结合蛋白)-阳性(+)细胞的比率。GFP感染的RGC与未感染的RGC具有相同的存活率，因此，挤压损伤后GFP+RBPMs+％保持相同。OSK感染的RGC与未感染的RGC相比具有三倍的存活率，因此，挤压损伤后KLF4+RBPMS+％增加。图9C显示在未挤压(左)和挤压(右)的条件下，并在OSK病毒感染的情况下存活的RGC。图9D显示当RGC(RBPMS+)被d2EGFP病毒或OSK病毒感染时在未挤压和挤压的条件下的存活。
图10A-10B显示OSK介导的再生和保护不依赖于mTOR激活。图10A是一系列图像，其显示未挤压或挤压的对照和OSK感染的RGC的RBPMS和pS6染色。图10B是从一系列图像如图10A中定量pS6阳性细胞的百分比的图。
图11A-11D显示，在神经挤压后的视网膜细胞中，与AAV Tet-Off系统相比，包含CMV-rtTA载体(SEQ ID NO:31)的AAV Tet-On系统诱导更快的基因表达。图11A显示在AAVTet-Off系统中，测试强力霉素去除对GFP表达的影响的实验时间线。线表示DOX处理的长度。如所示的处理A-D分别对应于图7B的照片1-4。图11B是一系列照片，其显示图11A中概述的实验结果。显示了来自小鼠视网膜的GFP阳性细胞，该细胞在指定的DOX去除的当天用编码tTA的病毒和编码TRE-d2EGFP的病毒进行感染。图11C显示在包含CMV-rtTA载体(SEQ IDNO:31)的AAV Tet-On系统中，测试强力霉素处理对GFP表达的影响的实验时间线。线表示DOX处理的长度。如所示的处理A-C分别对应于图11D的照片1-3。图11D是一系列照片，其显示图11C中概述的实验结果。显示了来自小鼠视网膜的GFP阳性细胞，该细胞在指定的DOX处理的当天用编码rtTA的病毒和编码TRE-d2EGFP的病毒进行感染。
图12是显示编码反向四环素反式激活物4(rtTA4)的腺相关病毒(AAV)载体中的特征的载体图。Ubc是与编码rtTA4的核酸(例如工程化核酸)可操作连接的组成型启动子。SV40pA是SV40衍生的终止子序列。该载体的序列在SEQ ID NO:17中提供。
图13A-13C包括的数据显示，包含rtTA4(SEQ ID NO:13)的Tet-On系统在小鼠肝中具有低渗漏性。图13A是一系列免疫荧光图像，其显示在不存在强力霉素(无DOX)的情况下以及存在强力霉素(有DOX)的情况下，已经施用图13B中所示带有核酸(例如工程化核酸)的AAV的小鼠的肝中KLF4的表达。DAPI是用于可视化细胞的核染色剂。图13B是描绘AAV9病毒中对小鼠施用的两种核酸(例如工程化核酸)的示意图。图13C是来自接受图13B中所绘的构建体并未用强力霉素或者用强力霉素处理的小鼠的肝样品的western印迹。如使用抗体所示，检测OCT4、KLF4和SOX2水平。肌动蛋白显示为上样对照。
图14是比较在如所示的各种处理下的小鼠体重的图。WT表示没有外源性OSK表达的野生型小鼠。全部死亡表明用强力霉素处理的OSK转基因小鼠全部死亡。
图15A-15B包括的数据显示，OCT4、KLF4和SOX2表达的诱导逆转小鼠耳成纤维细胞的衰老，如组蛋白和Chaf(染色质装配因子)基因的表达所示，但未诱导Nanog表达。星号(*)表示来自293T细胞系的内源性KLF4表达。
图16是western印迹，其显示当掺入到AAV中时，包含载体中两个ITR之间大于4.7kb的核酸(例如工程化核酸)序列的AAV载体具有低病毒滴度并产生无功能的AAV。TRE2-OSK载体以SEQ ID NO:33提供。使用抗体检测OCT4、KLF4和H3的表达。H3显示为上样对照。星号(*)表示来自293T细胞系的内源性Klf4。
图17是western印迹，其显示施用编码OCT4、SOX2和KLF4的经修饰的mRNA诱导小鼠细胞中KLF4和OCT4的表达。针对KLF4、OCT4、GAPDH和H3的抗体用于检测指定的蛋白质。
图18是pAAV2_CMV_rtTA(VP16)(SEQ ID NO:31)的载体图。该载体是编码rtTA的载体的非限制性实例。
图19是pAAV-MCS-tTA2(or CAG-tTA)(SEQ ID NO:32)的载体图。该载体是编码CAG启动子下的tTA的载体的非限制性实例。
图20是p-AAV-TetO-OSK-WPRE3-SV50LpA(TRE2-OSK,pAAV-TRE2-OSK-SV40LpA或TRE2-OSK)(SEQ ID NO:33)的载体图。该载体是包含载体中两个ITR之间大于4.7kb的核酸(例如工程化核酸)序列的AAV载体的非限制性实例。
图21是一系列图像，其显示小鼠胚胎成纤维细胞的成功化学重编程。
图22包括显示在不存在四环素的情况下表达OCT4、SOX2和KLF4的Tet-Off系统的非限制性实例的示意图(上图)和显示在存在四环素的情况下表达OCT4、SOX2和KLF4(OSK)的Tet-ON系统的非限制性实例的示意图(下图)。
图23A-23C包括的数据显示，在视神经挤压后两周，施用编码OCT4、SOX2和KLF4的AAV2病毒改善成年和老年小鼠中的轴突再生和RGC存活。图23A是一系列图像，其显示来自指定年龄(以月计)小鼠的CTB标记的轴突，并将编码TRE-OSK-SV40的AAV2病毒的作用与编码GFP的AAV2病毒的作用进行比较。使用图22，上图中所绘的Tet-Off系统在不存在DOX的情况下实施实验。图23B将具有指定年龄和处理的小鼠每条神经的估计轴突数目定量为距损伤部位的距离(μm)的函数。图23C是显示与对照GFP相比，OSK增加视神经损伤后成年(3月龄)和老年(12月龄)小鼠的RGC的存活的图。显示了指定年龄的接受编码d2EGFP或OSK病毒的小鼠的RGC(RBPMS+)的存活。
图24A-24B包括的数据显示，将重编程时间从两周增加到五周改善老年小鼠中的再生。图24A是一系列照片，其显示视神经挤压损伤后五周来自12月龄的小鼠的CTB标记的轴突。在神经挤压损伤之前，对小鼠施用编码GFP或编码TRE-SV40-OSK的病毒和编码tTA的病毒。图24B是根据图24A将每条神经的估计轴突数目定量为距损伤部位的距离(μm)的函数的图。
图25A-25C包括的数据显示，即使在视神经挤压损伤之后，使用Tet-On和Tet-Off系统诱导OSK表达改善了小鼠中的再生和RGC细胞存活。图25A包括显示确定视神经挤压之前或之后OSK表达的作用的处理时间线的示意图。显示了在Tet-On系统中，视神经挤压损伤之前OSK表达的诱导(损伤前诱导)和视神经挤压损伤之后OSK表达的诱导(损伤后诱导)(上图)。强力霉素处理用于诱导OSK表达。显示了在Tet-Off系统中，在视神经挤压之前用强力霉素处理抑制OSK诱导(损伤前抑制)和在视神经挤压之后用强力霉素处理抑制OSK诱导(损伤后抑制)(下图)。时间线上的阴影线表示强力霉素(DOX)处理的长度。还显示了用于轴突成像的霍乱毒素β亚基(CTB)注射。图25B是对无OSK诱导(n＝4)，仅损伤前OSK诱导(n＝5)，OSK表达受损伤抑制(n＝5)和损伤后OSK诱导(n＝5)的四周龄(年轻)小鼠，将每条神经的估计轴突数目定量为距损伤部位的距离(μm)的函数的图。所使用的损伤前和损伤后诱导的方案如图25A中所示。图25C是定量来自无OSK诱导，仅损伤前OSK诱导，OSK受损伤抑制和损伤后OSK诱导的四周龄(年轻)小鼠的RBPMS+细胞的数目的图。
图26A-26E包括的数据显示，与从分开的转录物表达OCT4、SOX2和KLF4相比，来自单个转录物的OSK的表达改善了视神经挤压损伤后两周的轴突再生和视网膜神经节细胞(RGC)存活。图26A是显示在挤压损伤前两周在每组中注射的AAV组合以及在编码OCT4、SOX2和/或KLF4的Tet-Off系统中的非限制性示例性表达盒的示意图。图26B是显示相对于来自分开的转录物的OCT4、SOX2和KLF4的表达，来自单个转录物的OSK的表达改善了轴突再生的图。对于接受tTA病毒和以下(1)OCT4病毒，(2)SOX2病毒，(3)KLF4病毒，(4)具有在一个启动子下编码OCT4和SOX2的载体的病毒(OCT4-SOX2)，(5)分开的OCT4、SOX2和KLF4病毒(Oct4、Sox2、KLF4或O,S,K)，或(6)具有在一个启动子下编码OCT4、KLF4和SOX2的载体的病毒(Oct4-Sox2-KLF4或OSK)之一的小鼠，将视神经挤压损伤后每条神经的估计轴突数目定量为距损伤部位的距离(μm)的函数。图26A中描绘了所使用的各种载体。图26C是显示相对于来自分开的转录物的OCT4、SOX2和KLF4的表达，来自单个转录物的OSK的表达改善了RGC存活的图。图26D包括小鼠视网膜的全封装染色，其显示当将分开的病毒中编码OCT4、SOX2和KLF4的分开的病毒载体递送至小鼠的眼睛时，检测到具有少量RBPMS+细胞的异质细胞群。箭头指示在载体示意图下，左上图中表达OCT4、SOX2、KLF4和/或RBPMS的七种不同类型的细胞。与图26D相比，图26E包括的数据显示，当将包含在一个启动子下编码OSK的病毒载体的病毒递送至小鼠的眼睛时，检测到更同质的细胞群。与图26D相比，检测到更多的也是RBPMS+的OSK表达细胞。在所用载体示意图下的左上图中，长白箭头指向表达OCT4、SOX2和KLF4的RBPMS+细胞，而短箭头指示甚至一些不表达RBPMS的细胞也表达OSK。
图27是显示Tet1和Tet2 DNA脱甲基酶在OSK诱导的再生中起作用的图。在接受(1)OSK病毒和短发夹对照，(2)OSK病毒和针对Tet1的短发夹，或(3)OSK病毒和针对Tet2的短发夹的小鼠中定量视神经挤压后每条神经的估计轴突数目。
图28包括的数据显示，在注射编码TRE-OSK的AAV病毒和编码tTA的AAV病毒后一个月，使用Tet-Off系统表达OSK逆转老年小鼠中的年龄相关视敏度丧失。图28是显示在不存在强力霉素(OSK诱导条件)的情况下给小鼠玻璃体内注射编码tTA的病毒和编码TRE-OSK的病毒逆转在老年小鼠(12月龄(12m)和18月龄(18m)小鼠)中观察到的与年龄有关的空间频率阈值(周期/度，视敏度测试)的降低。使用基于视动反应(OMR)的视敏度测试。作为对照，年龄匹配的小鼠在不存在强力霉素的情况下接受了编码rtTA的病毒和编码TRE-OSK的病毒(未诱导对照)。成年小鼠(3月龄(3m))也用作对照。
图29包括的数据显示，OSK的表达逆转了老年小鼠中与年龄有关的视网膜神经节细胞(RGC)功能的下降。图29是显示从来自成年(3月龄(3m))和老年(12月龄(12m)和18月龄(18m))小鼠的RGC生成的电波的测量图。使用图案视网膜电图(图案ERG)。给小鼠注射不含强力霉素的rtTA病毒和TRE-OSK病毒(未诱导对照(ctl))或不含强力霉素的tTA病毒和TRE-OSK病毒(诱导，OSK)。病毒注射后一个月获得结果。
图30A-30E包括的数据显示，OSK的表达改善了一月龄小鼠中青光眼引起的视敏度和RGC功能下降。图30A是显示在成年C57BL/6J小鼠中，与盐水处理相比，如通过眼内压(IOP)增加所测量的聚苯乙烯微珠诱导的青光眼的图。微珠注射后的前四周显示IOP测量值。图30B-30C显示，在将微珠注射入眼的前房中后4周，轴突密度和RGC密度显著降低。在微珠注射后3周玻璃体内注射AAV，观察到OSK表达又用了一周时间。图30B包括使用对苯二胺(PPD)染色(例如，在右侧示出)定量轴突密度的图(左图)。图30C包括使用Brn3a染色(例如，在右侧示出)定量RGC细胞密度的图(左图)。图30D是显示在青光眼诱导的小鼠中通过OSKAAV处理视敏度改善的图。给小鼠玻璃体内注射微珠以诱导青光眼或无微珠的盐水(无青光眼对照；盐水)。微珠注射三周后，用以下项处理小鼠：(1)在不存在强力霉素的情况下，编码rtTA的病毒和病毒TRE-OSK(珠(OSK AAV OFF))；(2)在不存在强力霉素的情况下，编码tTA的病毒和编码TRE-OSK的病毒(珠(OSK AAV ON))。显示了盐水或微珠注射后3周(AAV注射前)和AAV注射后4周(微珠注射后7周)的结果。图30E是显示如图30B中处理的小鼠中图案视网膜电图的RGC功能结果的图。
图31A-31C包括的数据显示，OSK的表达促进长春新碱(VCS)诱导的损害后人SH-SY5Y神经元细胞的神经元存活和轴突再生。图31A包括一系列图像，其显示与未诱导OSK表达(OSK Off)相比，诱导OSK表达(OSK On)对神经元结构的影响。VCS处理24小时后的第3天和第9天拍摄图像。第9天显示神经元细胞区域的轮廓。图31B是对于其中诱导OSK表达的细胞(OSK On)和其中未诱导OSK表达的细胞(OSK Off)，定量在VCS处理24小时后指定天数的神经元细胞面积(μm2)的图。图31C是对于其中诱导OSK表达的细胞(OSK On)和其中未诱导OSK表达的细胞(OSK Off)，定量在VCS处理48小时后指定天数的神经元细胞面积(μm2)的图。
图32A-32G显示用AAV递送的多顺反子OSK进行的部分重编程是无毒的并且诱导CNS轴突再生。图32A是研究中使用的控制OSK表达的Tet-On和Tet-Off AAV载体的示意图。图32B显示在前4周(分别n＝5、3、6、4、6、3)中有或没有强力霉素诱导的WT小鼠、OSK转基因小鼠和AAV介导的表达OSK的小鼠(1.0x1012个基因拷贝)的体重。图32C是显示玻璃体内AAV注射至靶视网膜神经节细胞的示意图。视网膜的全封装展示和截面的免疫荧光显示感染率和靶定的视网膜层。比例尺分别代表1mm和100μm。图32D显示使用Tet-Off系统进行的视神经挤压研究的实验概述。图32E显示在病变部位远端不同距离处对d2EGFP、Oct4、Sox2、Klf4、OS、O+S+K或OSK AAV再生纤维的定量。误差线表示s.e.m.(n＝4-7)。****,P<0.0001,ANOVA与Bonferroni后检验。图32F显示在挤压损伤后第14天，用不同的AAV载体转导的RGC层中RBPMS阳性细胞的存活(n＝4-8)。相对于d2EGFP，***,P<0.001,****,P<0.0001,单向ANOVA与Bonferroni后检验。图32G显示视神经切片的代表性图像，其显示在视神经损伤后2周，在存在和不存在DOX的情况下，玻璃体内注射AAV2-tTA和TRE-OSK的野生型小鼠中CTB标记的轴突。挤压部位用星号表示。比例尺代表200μm。
图33A-33K显示OSK表达通过Tet依赖性机制促进轴突再生和神经元存活。图33A显示用于损伤前和损伤后诱导OSK表达的实验策略。图33B显示损伤前和损伤后OSK表达的视网膜中RGC的存活。图33C显示来自损伤前和损伤后OSK表达模型的再生纤维的定量。图33D显示视神经的代表性图像，其显示在有或没有损伤后OSK表达的情况下，损伤后4周的再生轴突。挤压部位以星号标出。比例尺代表200μm。图33E-33F显示用编码多顺反子OSK、tTA的AAV2载体和具有加扰序列(Scr)、Tet1或Tet2序列的shRNA载体共转导以敲低Tet DNA双加氧酶/脱甲基酶的视网膜中再生纤维和RGC存活的定量。图33G显示用于检查长春新碱(VCS)损害后人神经元中轴突再生的实验概述。图33H显示OSK根据皮肤和血液时钟使人神经元恢复活力。在图33H的上图中，通过线性回归模型计算P值，以观察DNAm年龄是否随时间减少。在图33H的下图中，显示了通过皮肤和血细胞时钟估计的在VCS损害之前(第-天)或在之后(第1天和第9天)具有OSK表达的人神经元的DNA甲基化年龄。图33I显示每个AAV处理组中的神经突区域。*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001，单向ANOVA与Tukey的多重比较检验。图33J显示从VCS损害恢复9天后人神经元和神经突区域的代表性图像。图33K显示神经挤压后4天从感染或未感染GFP的轴突完整视网膜，或者从感染GFP-AAV或OSK-AAV的轴突损伤视网膜分离的1月龄RGC的rDNA甲基化年龄。
图34A-34H显示通过OSK AAV处理逆转青光眼。图34A是显示实验概述的示意图。图34B显示在微珠注射后的前4周每周通过回弹眼压计测量的眼内压。图34C显示在AAV2或PBS注射后4周的PPD染色的视神经截面的代表性显微照片。比例尺，50μm。OSK Off(rtTA+TRE-OSK)；OSK On(tTA+TRE-OSK)。图34D显示在PBS或AAV注射后4周时健康的视神经轴突的定量。图34E是用于测量视动反应的高对比度视觉刺激测定的示意图。响应于运动条纹图案(其增加空间频率)的旋转的反射性头部运动用于评估视力。图34F显示在处理前和在玻璃体内注射AAV载体后4周测量的每只小鼠的空间频率阈值响应。图34G显示在处理前和用OSK-OFF AAV(上图)或OSK-ON AAV(下图)处理后四周从同一只眼在基线处记录的代表性pERG波形。图34H显示在处理前和玻璃体内注射AAV后4周从每只小鼠在基线处测量的记录的平均pERG幅度。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001,****P<0.0001。组间的双向ANOVA与Turkey后检验用于时间和处理的总体效果。配对的t检验用于比较处理前后。
图35A-35I显示OSK AAV诱导老年小鼠中的轴突再生并恢复视觉功能。图35A显示用于测试在老年小鼠中OSK AAV处理对视神经挤压后轴突再生和与生理性衰老相关的视敏度恢复的影响的实验概述。图35B显示在视神经挤压损伤后2或5周后，用OSK AAV或对照AAV(d2EGFP)处理的12月龄小鼠中的轴突再生。图35C，通过视神经的纵切面的代表性共聚焦图像，其显示OSK处理5周后CTB标记的轴突。比例尺代表200μm。图35D，用OSK-Off或OSK-OnAAV处理的年轻小鼠(4个月)和年老小鼠(12个月)中的空间频率阈值。图35E-35F显示用(i)OSK-Off，(ii)OSK-On或(iii)OSK-On加以下中任一：sh-Scr，sh-Tet1-或sh-Tet2介导的DNA脱甲基酶的敲低处理的年老小鼠(12个月)中的空间频率阈值和pERG幅度。OSK-Off，(rtTA+TRE-OSK)；OSK-On，(tTA+OSK)。图35G是分层聚类的热图，其显示来自完整年轻小鼠(5个月)，或完整年老小鼠(12个月)，或用对照AAV(TRE-OSK)或OSK-On AAV处理的年老小鼠的经细胞分选纯化的RGC中464个差异表达基因的RNA-Seq表达。图35H是OSK诱导的RNA水平变化相比与年龄有关的mRNA水平变化的散点图。点代表RGC中差异表达的基因。图35I显示从用-OSK或+OSK AAV以及具有加扰序列(sh-Scr)或靶向Tet1或Tet2(sh-Tet1/sh-Tet2)的短发夹DNA感染4周的视网膜FACS分离的12月龄的RGC的rDNA甲基化年龄。图35G和图35H的基因排除标准：总体表达低的基因(log2(CPM)<2)，不随年龄显著变化的基因(绝对log2倍数变化<1)或由病毒改变的基因(在完整年老者和用TRE-OSK AAV处理的年老者之间差异表达)。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001,****P<0.0001。图35D中，双向ANOVA；图35B、35E和35F中，单向ANOVA。
图36A-36H显示OSK(无Myc)对衰老和OSK AAV安全性的影响的探索。图36A是在年轻和年老转基因小鼠成纤维细胞中测试重编程作用的实验概述的示意图。图36B显示OSKM表达在不诱导多能性的情况下挽救了与年龄有关的转录变化。例如，不诱导Nanog表达。图36C显示OSK表达在不诱导多能性的情况下挽救了与年龄有关的转录变化。例如，不诱导Nanog表达。图36D显示与转基因小鼠相比，肝中的OSK AAV9表达。图36E显示在前4周后的9个月中有或没有强力霉素的WT小鼠和AAV介导的OSK表达小鼠(共1.0x10^12个基因拷贝)的体重(分别n＝5、3、6、4))。图36F显示用于测量组织分布的AAV-UBC-rtTA和AAV-TRE-Luc载体。图36G显示在眶后注射AAV9-UBC-rtTA和AAV9-TRE-LuC(共1.0x10^12个基因拷贝)后2个月时WT小鼠的萤光素酶成像。将强力霉素在饮用水(1mg/mL)中递送至右侧所示的小鼠达7天。图36H显示在眶后注射AAV9-UBC-rtTA和AAV9-TRE-Luc，然后用强力霉素处理7天后2个月时眼(Ey)、脑(Br)、脑垂体(Pi)、心脏(He)、胸腺(Th)、肺(Lu)、肝(Li)、肾(Ki)、脾(Sp)、胰腺(Pa)、睾丸(Te)、脂肪(Ad)、肌肉(Mu)、脊髓(SC)、胃(St)、小肠(In)和盲肠(Ce)的萤光素酶成像。萤光素酶信号主要在肝中。以更长的曝光时间对相同组织成像(图36H，下图)显示胰腺中的萤光素酶信号水平较低(肝被去除)。
图37A-37D显示可诱导的多顺反子AAV系统的表征。图37A显示在相同细胞中用表达OCT4、SOX2和KLF4的多顺反子AAV载体转导的全封装视网膜的免疫荧光分析。箭头指向三阳性细胞。图37B显示用分别编码OCT4、SOX2和KLF4的AAV转导的全封装视网膜的免疫荧光分析。虚线箭头指向双阳性细胞。实线箭头指向单阳性细胞，除了每个图像右下角的箭头，其指向三阳性细胞。图37C-37D是显示RBPMS和Klf4免疫荧光的全封装视网膜展示的图像。图37C显示可以通过Dox饮用水(2mg/mL 3天)关闭来自AAV2 Tet-Off系统的表达。图37D显示可以通过Dox饮用水(2mg/mL 2天)开启来自AAV2 Tet-On系统的表达。比例尺代表1mm。
图38A-38C显示损伤后OSK诱导长期轴突再生而没有RGC增殖。图38A显示视网膜全封装染色，其显示OSK感染的RGC不具有增殖标志物Ki67(左)，而增殖的293T细胞具有Ki67信号(右)。比例尺代表100μm。图38B显示视神经的全神经成像，其显示在损伤后3个月来自对照(无AAV)或OSK AAV处理的再生轴突。比例尺代表200μm。图38C显示全神经成像，其显示玻璃体内注射AAV2-tTA和TRE-OSK的野生型小鼠在损伤后16周(wpc)时CTB标记的再生轴突。比例尺代表200μm。
图39A-39D显示Tet-On系统具有更好的开启率并且OSK转导的RGC具有更高的存活率。图39A显示代表性图像，其显示来自具有不同Dox处理的Tet-Off AAV系统在视网膜中的d2EGFP表达。当用DOX预处理以抑制表达(on DOX)时，GFP表达仅在DOX撤回8天后稀疏显示，比峰表达(从未DOX)弱得多。图39B是显示来自Tet-On AAV系统的视网膜中的d2EGFP的代表性图像。在不存在DOX的情况下没有观察到GFP表达，并且在Dox诱导后2天GFP表达达到峰值，而在DOX诱导5天后GFP表达没有增强。图39C显示完整和挤压样品中GFP阳性或KLF4阳性RGC的代表性免疫荧光图像。图39D显示GFP-或KLF4-阳性细胞的定量，其表明挤压后表达OSK的RGC的存活率更高。图39A、图39B和图39C中比例尺代表200μm。
图40A-40F显示对OSK作用潜在的表观遗传机制的鉴定。图40A，在存在或不存在挤压损伤的情况下，用d2EGFP或OSK编码的AAV2转导的视网膜全封装的代表性图像。对视网膜全封装进行RGC标志物RBPMS和mTOR激活标志物pS6的免疫染色。图40B显示完整和挤压样品中pS6阳性RGC％的定量。图40C，在OSK表达的RGC中，shRNA-YFP AAV的转导率的定量。图40D显示用OSK编码的AAV2与sh-Scr、sh-Tet1或sh-Tet2 YFP AAV组合转导的视网膜全封装的代表性图像。视网膜全封装针对Klf4进行免疫染色。在图40A和图40D中比例尺代表100μm。图40E显示在存在OSK表达的情况下，在小鼠RGC中用sh-Scr或sh-Tet1处理的Tet1相比GAPDH mRNA水平。图40F显示在存在OSK表达的情况下，小鼠RGC中具有sh-Scr或sh-Tet2AAV的Tet2相比GAPDH mRNA水平。
图41A-41K显示OSK强烈地诱导不依赖于mTOR途径的人神经元轴突再生。图41A显示转导编码TRE-OSK和tTA(OSK On)或单独的TRE-OSK(OSK Off)的AAV-DJ载体的分化的人神经元的免疫荧光。图41B显示如图41A中用AAV-DJ载体转导的人神经元的Oct4、Sox2和Klf4的mRNA水平。图41C显示在未分化细胞和OSK On或Off的分化细胞中G1、S和G2期的FACS概况。图41D显示处于增殖S期的细胞群的定量。图41E显示具有或不具有OSK表达的长春新碱损害后人神经元的代表性图像和神经突区域。图41F显示长春新碱损害后不同时间点的神经突区域的定量。图41G显示在人神经元中用sh-Scr和sh-Tet2 AAV处理的Tet2 mRNA水平。图41H显示雷帕霉素处理(10nM)达5天的人神经元中S6的磷酸化水平。图41I显示在OSKOff或OSK On的情况下mTOR抑制对分化的神经元的轴突再生的影响。图41J显示使用皮肤或血细胞时钟估计的在不存在OSK表达的情况下，在长春新碱(VCS)损害之前(第-天)或损害后1天和9天的人神经元的DNA甲基化年龄。图41K显示在不存在或存在OSK表达的情况下，人神经元中具有sh-Scr或sh-Tet2 AAV的小鼠Oct4 mRNA水平。
图42A-42C显示微珠诱导的小鼠模型中OSK的作用。图42A显示在微珠注射或盐水注射后4周，来自用抗Brn3a(RGC特异性标志物)和DAPI(核染色剂)染色的视网膜平面封装的RGC的定量和代表性共聚焦显微图像。比例尺代表75mm。图42B显示在微珠注射或盐水注射后4周，健康的视神经轴突的定量和PPD染色的视神经截面的代表性显微照片。比例尺代表10μm。图42C显示在AAV注射后4周和在微珠或盐水注射后8周时RGC的定量和代表性共聚焦显微图像。
图43A-43G显示老年小鼠中OSK的作用。图43A显示OSK表达对年轻、成年和老年小鼠在视神经挤压后RGC存活的影响。图43B显示在损伤后2周的年轻(1月龄)、成年(3月龄)和老年(12月龄)的小鼠中，与d2EGFP对照相比，由OSK表达促进的轴突再生。图43C显示OSKOff或OSK On处理后一个月在不同年龄的pERG测量的比较。OSK Off，rtTA+TRE＝OSK AAV；OSK On，tTA+OSK AAV。图43D显示在OSK Off或OSK On处理后1个月时，在4m和12m龄小鼠中RGC细胞密度的比较。图43E显示在OSK Off或OSK On处理后1个月时，在4m和12m龄小鼠中轴突密度的比较。图43F显示在-OSK或+OSK处理后一个月，不同年龄的pERG测量的比较。-OSK：AAV-rtTA+AAV-TRE-OSK；+OSK：AAVtTA+AAV-TRE-OSK。图43G显示在用-OSK或+OSK AAV处理4周的18月龄小鼠中的空间频率阈值。
图44A-44D显示通过Reviver处理重置其表达的基因的RNA-seq分析。图44A是OSK诱导的RNA水平变化相比年龄有关的mRNA水平变化的散点图。显示的点表示在RGC中差异表达的基因。基因排除标准：总体表达低的基因(log2(CPM)<2)，不随年龄显著变化的基因(绝对log2倍数变化<1)或由病毒改变的基因(在完整年老者和用TRE-OSK AAV处理的年老者之间差异表达)。图44B是分层聚类的热图，其显示来自完整年轻小鼠(5个月)或完整年老小鼠(12个月)，或用对照AAV(TRE-OSK)或OSK-On AAV处理的年老小鼠的细胞分选纯化的RGC中感官基因的RNA-Seq表达。图44C显示十大生物学过程，其相比于年轻者在年老者中更低，并且通过OSK得以恢复。图44D显示十大生物学过程，其相比于年轻者在年老者中更高，并且通过OSK得以减少。
图45A-45C显示小鼠RGC和人神经元的甲基化时钟分析。图45A显示分选的小鼠RGC的rDNA甲基化年龄与实足年龄之间的相关性。图45B显示来自不同年龄和处理的RGC的平均DNA甲基化水平。图45C显示在用长春新碱(VCS)处理之前(-)或VCS损害后几天(1和9)用OSK处理的人神经元的平均DNA甲基化水平。
图46A-46B显示OSK以Tet2依赖性方式介导轴突再生。使用Tet2条件敲除小鼠。给小鼠眼睛注射(1)AAV-CRE(Tet2 cKO)；(2)AAV-tTA+AAV-TRE-OSK：OSK(Tet2 WT)；或(3)AAV-tTA+AAV-TRE-OSK+AAV-CRE：OSK(Tet2 cKO)。视神经挤压后测定轴突再生。图46A是代表性的视神经图像。图46B是定量轴突数目的图。
本发明某些实施方案的详述
本公开至少部分基于意想不到的结果，该结果表明在不存在外源性c-Myc表达的情况下OCT4、SOX2和KLF4的表达可用于促进体内部分重编程和组织再生。令人惊讶地，如本文所述，使用眼睛作为模型组织，在一些实施方案中，确定OCT4、SOX2和KLF4(OSK)的组合可用于重置年轻的基因表达模式和视网膜神经节的表观遗传年龄。在青光眼的啮齿动物模型和老年动物中，促进视神经再生和视力恢复的细胞。在一些实施方案中，这些恢复活性需要DNA脱甲基酶Tet1和Tet2，这不受特定理论的束缚，表明DNA甲基化时钟不仅与年龄有关，而且是它的调节物。
在某些实施方案中，本文提供了编码OCT4、SOX2和KLF4(各自单独或组合)的工程化核酸(例如表达载体，包括病毒载体)，包含其的重组病毒(例如慢病毒、α病毒、牛痘病毒、逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒或AAV)，包含工程化核酸和/或重组病毒的药物组合物，包含工程化核酸和/或重组病毒的试剂盒以及调节(例如诱导，诱导然后停止等)细胞重编程，逆转衰老，组织修复，器官再生和组织再生的方法。
在某些实施方案中，一种或多种基因的表达是瞬时的(例如，使用诱导型启动子来调节基因表达)。可以通过改变诱导剂的活性来调节一种或多种基因(例如，OCT4、SOX2、KLF4或其组合)的表达。作为非限制性实例，在不存在四环素的情况下，四环素反式激活物(tTA)能够诱导来自四环素响应性启动子的表达。当添加四环素时，tTA不再与启动子结合并诱导无法表达。作为另一个非限制性实例，反向四环素反式激活物(rtTA)能够在四环素存在下诱导来自四环素响应性启动子的表达。去除四环素后，rtTA不再与启动子结合，也无法诱导表达。如本文所述，编码OCT4、SOX2和KLF4(OSK)的可诱导AAV载体在损伤后促进体内视神经再生。因此，这三个基因的表达可用于组织和器官再生，组织和器官修复，逆转衰老，治疗神经退行性疾病和病症，细胞重编程。如下所述，在某些情况下，本文所述的载体可以包装，病毒滴度超过2x1012颗粒/制剂，可以在体外和体内精确控制OSK在哺乳动物细胞中的表达。
细胞重编程允许从现有的体细胞产生多种细胞类型。尽管已显示Yamanaka因子(OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc，也统称为OSKM)在分化的细胞中诱导多能性，但这些因子的施用可能在体内诱导畸胎瘤或其他癌症(Takahashi et al.,Cell.2006Aug 25；126(4):663-76)；(Abad et al.,Nature.2013Oct 17；502(7471):340-5)。由于这些安全问题，使用Yamanaka因子很大程度上仅限于体外应用。此外，现有的基因治疗方法受到靶细胞无效且不一致的基因转导的困扰。工程化核酸，包含其的重组病毒，其药物组合物和本文提供的试剂盒克服了许多这些限制。
工程化核酸
本公开内容的工程化核酸可以单独或组合地编码OCT4、SOX2、KLF4及其同系物或变体(例如，功能性变体)。在某些实施方案中，工程化核酸(例如工程化核酸)不编码c-Myc。在某些实施方案中，工程化核酸(例如工程化核酸)不编码功能性c-Myc，因为它缺少c-Myc序列。确定转录因子(例如，OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合)活性的测定法是本领域已知的，包括基于细胞的转录测定法和体外转录测定法。转录因子表达也可以使用其他方法确定，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)，western印迹和RNA定量(例如，使用逆转录聚合酶链反应)。
转录因子(例如，OCT4、SOX2、KLF4或其同源物或变体，包括哺乳动物OCT4，哺乳动物SOX2和哺乳动物KLF4)可以由单个核酸编码，或者单个核酸(例如工程化核酸)可编码两个或多个转录因子(例如，每个可操作地连接至不同的启动子，或两者可操作地连接至相同的启动子)。例如，在某些实施方案中，核酸(例如工程化核酸)可以编码任何顺序的OCT4；SOX2；KLF4；OCT4和SOX2；OCT4和KLF4；SOX2和KLF4；或OCT4,SOX2和KLF4。
在某些实施方案中，工程化核酸(例如工程化核酸)编码诱导剂(例如tTA或rtTA)。在某些实施方案中，核酸(例如工程化核酸)可以编码一种或多种转录因子(例如，一种，两种或三种转录因子)和一种诱导剂。在某些实施方案中，诱导剂由不还编码转录因子(例如OCT4、SOX2或KLF4)的单独核酸(例如工程化核酸)编码。在某些实施方案中，诱导剂由也编码转录因子(例如OCT4、SOX2和/或KLF4)的核酸(例如工程化核酸)编码。在某些实施方案中，诱导剂由还编码一种或多种选自OCT4的转录因子的核酸(例如工程化核酸)编码。SOX2；KLF4；及其任何组合(例如，OCT4；SOX2；KLF4；OCT4和SOX2；OCT4和KLF4；SOX2和KLF4；或OCT4、SOX2和KLF4)。
本文所述的转录因子(例如，OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合)或诱导剂可包含一个或多个氨基酸取代。可以根据本领域普通技术人员已知的用于改变多肽序列的方法来制备变体，如在编译此类方法的参考文献中发现的那些，例如Molecular Cloning:ALaboratory Manual,J.Sambrook,et al.,eds.,Second Edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989或Current Protocols inMolecular Biology,F.M.Ausubel et al.,eds.,John Wiley&Sons,Inc.,New York。氨基酸的保守取代包括在以下组内的氨基酸之间进行的取代：(a)M，I，L，V；(b)F，Y，W；(c)K，R，H；(d)A，G；(e)S，T；(f)Q，N；和(g)E，D。
在某些实施方案中，本发明的工程化核酸包含RNA(例如mRNA)和/或DNA。在一些实施方案中，RNA和/或DNA经进一步修饰。作为非限制性实例，本公开的核酸(例如工程化核酸)可以是编码OCT4、KLF4、SOX2、诱导物或其任何组合的经修饰的RNA(例如mRNA)。参见例如，Warren et al.,Cell Stem Cell.2010Nov 5；7(5):618-30。作为非限制性实例，可以将本发明的工程化核酸(例如，RNA，包括mRNA或DNA)配制在纳米颗粒中以进行递送。参见例如，Dong et al.,Nano Lett.2016Feb 10；16(2):842-8。在一些实施方案中，纳米颗粒包含乙酰化半乳糖。参见例如，Lozano-Torres et al.,J Am Chem Soc.2017Jul 5；139(26):8808-8811。在一些实施方案中，将工程化核酸(例如，RNA，包括mRNA或DNA)电穿孔或转染到细胞中。在某些实施方案中，工程化核酸以裸核酸(例如裸DNA或裸RNA)递送。
在一些实施方案中，配制在纳米颗粒中用于递送的工程化核酸不是AAV载体。用于配制在纳米颗粒中的合适的载体主链包括但不限于NANOPLASMIDTM载体和NTC'8'系列哺乳动物表达载体。用于配制在纳米颗粒中的载体主链的非限制性实例包括NTC9385R和NTC8685。不受特定理论的束缚，NTC'8'系列哺乳动物表达载体可能是有用的，因为它们通常在数周内被细胞清除。NTC'8'系列哺乳动物表达载体包含CMV启动子，可将其与编码OCT4、KLF4、SOX2或其组合的序列有效连接。不受特定理论的束缚，NANOPLASMIDTM载体的免疫原性可能低于其他载体，并以更高的水平表达并可以长时间表达，这可用于长期表达可操作连接的核酸。在一些实施方案中，NANOPLASMIDTM载体可用于OCT4、KLF4、SOX2或其组合的长期表达。
在一些实施方案中，编码OSK的工程化核酸可用于制备诱导多能干细胞。不受特定理论的束缚，修饰的RNA(例如，mRNA)可具有固有免疫反应的最小活化和有限的细胞毒性的优点，从而允许鲁棒且持续的蛋白质表达。在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含修饰，该修饰包括用5-甲基胞苷(5mC)完全取代胞苷或用假尿苷(psi)完全取代尿苷。
在一些实施方案中，可以使用CRISPR激活系统来激活OCT4、KLF4和/或SOX2表达。在一些实施方案中，可以使用CRISPR激活系统激活选自OCT4、KLF4、SOX2及其组合的一种或多种转录因子的表达。参见例如，Liao et al.,Cell.2017Dec 14；171(7):1495-1507.e15；Liu et al.,2018,Cell Stem Cell 22,1–10February 1,2018。通常，CRISPR激活系统包含酶促死亡的Cas9核酸酶(或缺乏核酸酶的Cas9(dCas9))，其融合至转录激活复合体(例如，包括VP64，P65，Rta和/或MPH)。下面提供了编码VP64，P65，Rta和/或MPH的序列的非限制性实例。VP64，P65，Rta或MPH可以由包含与本文所述的VP64，P65，Rta和/或MPH序列至少70％(例如75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％)相同的序列的序列编码。该Cas9融合蛋白可以称为CRISPR激活物。在CRISPR激活系统中使用靶向感兴趣的基因的启动子和/或增强子区域的引导RNA靶向dCas9转录激活复合物并驱动内源基因的表达。
在一些实施方案中，OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的表达可以使用转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)或锌指核酸酶(ZFN)系统激活。
本公开的工程化核酸可以编码sgRNA以靶向细胞中OCT4、SOX2和/或KLF4的内源基因座以及启动子和/或增强子区域。本公开的工程化核酸可以编码sgRNA以靶向和选自OCT4的一种或多种转录因子的内源基因座以及启动子和/或增强子区域。SOX2；KLF4；及其在细胞中的任何组合。在一些实施方案中，工程化核酸(例如表达载体)进一步编码dCas9(死Cas9)和转录激活复合物(例如VP64，P65，Rta，MPH)。在一些实施方案中，将dCas9(死Cas9)和转录激活复合物(例如，VP64，P65，Rta，MPH)施用至工程化的核酸(例如，表达载体)上的细胞。在一些实施方案中，编码sgRNA和/或dCas9的载体(死Cas9)和转录激活复合物(例如，VP64，P65，Rta，MPH)是病毒载体(例如，AAV载体)。在一些实施方案中，将dCas9(死Cas9)和转录激活复合物(例如，VP64，P65，Rta，MPH)作为蛋白质引入细胞。
在一些实施方案中，将靶向OCT4、SOX2和/或KLF4的增强子和/或启动子区域的引导RNA配制在纳米颗粒中，并与dCas9-VP64蛋白一起注射。在一些实施方案中，将靶向OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合的增强子和/或启动子区域的引导RNA配制在纳米颗粒中，并与dCas9-VP64蛋白一起注射。在一些实施方案中，引导RNA和/或编码dCas9(死Cas9)和转录激活复合物(例如，VP64，P65，Rta，MPH)的核酸作为裸核酸(例如，配制在纳米颗粒中的裸DNA)施用。在一些实施方案中，经由重组病毒(例如慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、α病毒、牛痘病毒或腺相关病毒(AAV))递送引导RNA和/或编码dCas9(死Cas9)和转录激活复合物(例如VP64，P65，Rta，MPH)的核酸。
非限制性实例，靶向内源性OCT4基因座或SOX2基因座的引导RNA的序列提供于Liuet al.,Cell Stem Cell.2018Feb 1；22(2):252-261.e4中。靶向OCT4、SOX2和/或KLF4的引导RNA的非限制性实例还提供于Weltner et al.,Nat Commun.2018Jul 6；9(1):2643中。
不受特定理论的束缚，在不存在c-Myc表达的情况下，使用CRISPR-CAS9系统激活OCT4、KLF4和/或SOX2的内源表达可以消除与外源基因表达和/或超生理基因表达相关的潜在毒性。
可以使用常规克隆技术将编码转录因子(OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合)或编码诱导剂的核酸(例如工程化核酸)引入表达载体。合适的表达载体包括具有与编码OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合的核酸(例如工程化核酸)可操作地连接的启动子(例如，组成型或诱导型启动子，包括TRE启动子)的载体，以及终止子序列(例如，如本文所述的SV40序列)。在一些实施方案中，核酸(例如工程化核酸)编码与编码诱导剂的核酸可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，载体包含WPRE序列。含有表达必需元件的表达载体是可商购的并且是本领域普通技术人员已知的(参见例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Fourth Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012)。
本发明的载体还可以包含标志物序列，用于鉴定已经或未被载体转化或转染，或者已经重编程的细胞。标志物包括例如编码能增强或减弱对抗生素(例如氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、四环素抗性基因和氯霉素抗性基因)或其他化合物的抗性或敏感性的蛋白质的基因；编码具有可通过本领域已知的标准测定法检测的活性的酶(例如β-半乳糖苷酶、衰老相关的beta半乳糖苷酶、萤光素酶或碱性磷酸酶)的基因；以及能明显影响转化或转染的细胞、宿主、集落或噬斑(例如绿色荧光蛋白)的表型的基因。在一些实施方案中，本文所用的载体能够自主复制并表达存在于它们可操作地连接的DNA片段中的结构基因产物。
在某些实施方案中，表达载体包含与编码转录因子(例如，OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合)的序列可操作连接的诱导型启动子(例如，四环素响应性启动子)。在某些实施方案中，与编码转录因子的序列(例如，OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合)可操作地连接的启动子是组织特异性或细胞类型特异性的启动子(例如，脑特异性，肝特异性，肌肉特异性，神经细胞特异性，神经胶质细胞特异性，内皮细胞特异性，肺特异性，心脏特异性，骨特异性，肠特异性，皮肤特异性启动子或眼特异性启动子)。例如，肌肉特异性启动子可以是结蛋白启动子(例如，与SEQ ID NO:29至少70％(例如，至少75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％)相同的序列)。在一些实施方案中，眼特异性启动子可以是与选自SEQ ID NO:101-104的序列至少70％(例如，至少75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％)相同的启动子。
在某些实施方案中，与编码转录因子的序列(例如，OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合)可操作地连接的启动子是年龄或衰老特异性的(例如，年龄或衰老特异性的启动子可以是可以是p16启动子或与甲基化DNA结合的Cas9定向转录因子(已知随着年龄的增长而积累)。
在某些实施方案中，表达载体包含与编码OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合的核酸(例如工程化核酸)可操作地连接的组成型启动子。在一些实施方案中，可以使用成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/指南RNA系统使这种载体失活。例如，引导RNA可以与载体互补并且能够将Cas9核酸酶靶向载体。在一些实施方案中，引导RNA在本文所述的任何表达载体中与转基因(例如，编码OCT4、KLF4、SOX2或其组合的转基因)互补。然后，Cas9可在载体中产生双链断裂和/或使载体突变，从而使载体失活。
在某些实施方案中，与编码诱导剂的序列可操作连接的启动子是组成型启动子(例如，CMV，EF1α，SV40启动子，PGK1，UBC，CAG，人β肌动蛋白基因启动子或UAS)。在某些实施方案中，与编码诱导剂的序列可操作连接的启动子是组织特异性启动子(例如，脑特异性，肝特异性，肌肉特异性，神经细胞特异性，肺特异性，心脏特异性，骨特异性，肠特异性，皮肤特异性启动子或眼特异性启动子)。例如，肌肉特异性启动子可以是结蛋白启动子(例如，与SEQ ID NO:29至少70％(例如，至少75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％)相同的序列)。
核酸(例如工程化核酸)(例如表达载体)可以进一步包含分隔物序列(例如，IRES或多肽切割信号)。示例性的多肽切割信号包括2A肽(例如T2A，P2A，E2A和F2A)。2A肽可包含与SEQ ID NO:9至少70％(例如，至少75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％)相同的序列。对于编码超过一个转录因子(例如OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合)的核酸(例如工程化核酸)(例如表达载体)，每个转录因子可以可操作地连接至不同的启动子或相同启动子。转录因子可以在核酸上分隔(例如，通过肽分隔物序列)。核酸(例如工程化核酸)的表达产生编码每个转录因子的分开的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开的表达载体(例如，编码OCT4、KLF4、SOX2或其组合的表达载体)可以进一步包含选择剂(例如，抗生素，包括杀稻瘟素，遗传霉素，潮霉素)B，霉酚酸，嘌呤霉素，zeocin，放线菌素D，氨苄青霉素，羧苄青霉素，卡那霉素和新霉素)和/或可检测标记(例如GFP，RFP，荧光素酶，CFP，mCherry，DsRed2FP，mKate，生物素，FLAG标签，HA标签，His标签，Myc标签，V5标签等)。
在某些实施方案中，编码本公开内容的诱导剂的表达载体可以进一步包含选择剂(例如，抗生素，包括杀稻瘟素，遗传霉素，潮霉素B，霉酚酸，嘌呤霉素，zeocin，放线菌素D，氨苄青霉素，羧苄青霉素，卡那霉素和新霉素)和/或可检测标记(例如GFP，RFP，荧光素酶，CFP，mCherry，DsRed2FP，mKate，生物素，FLAG标签，HA标签，His标签，Myc标签，V5-标签，等)。
在某些实施方案中，表达载体(例如，编码OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合)存在于病毒载体(例如，AAV载体)上。在某些实施方案中，编码诱导剂的表达载体存在于病毒载体(例如，AAV载体)上。如本文所用，AAV载体通常包含位于表达盒(例如包含与编码OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合的序列可操作连接的启动子序列和终止子序列的核酸(例如工程化核酸)，包含与编码诱导剂的序列可操作连接的启动子序列的核酸(例如工程化核酸)，或其组合)。
在某些实施方案中，本公开的AAV载体中的两个ITR之间的碱基对的数目小于5千碱基(kb)(例如小于4.9kb、小于4.8kb、小于4.7kb、小于4.6kb、小于4.5kb、小于4.4kb、小于4.3kb、小于4.2kb、小于4.1kb、小于4kb、小于3.5kb、小于3kb、小于2.5kb、小于2kb、小于1.5kb、小于1kb或小于0.5kb)。在某些实施方案中，两个ITR之间的距离小于4.7kb的AAV载体能够以至少0.5×10^10颗粒形成单位/ml(pfu/ml)、至少1×10^10pfu/ml、至少5×10^10pfu/ml、至少1×10^11pfu/ml、至少5×10^11pfu/ml、至少1×10^12pfu/ml、至少2×10^12pfu/ml、至少3×10^12pfu/ml、至少4×10^12pfu/ml、至少5×10^12pfu/ml、至少6x10^12pfu/ml、至少7×10^12pfu/ml、至少8×10^12pfu/ml、至少9×10^12pfu/ml、或至少1×10^13pfu/ml的滴度包装到病毒中。
在某些实施方案中，本公开的表达载体是至少1千碱基(kb)(例如，至少1kb,2kb,3kb,4kb,5kb,6kb,7kb,8kb,9kb,10kb,50kb或100kb)。在某些实施方案中，本公开的表达载体小于10kb(例如，小于9kb,less 8kb,小于7kb,小于6kb,小于5kb,小于4kb,小于3kb,小于2kb或小于1kb)。
不受特定理论的束缚，与一个单独的核酸相比，在一个启动子下编码OCT4、SOX2和KLF4的表达载体(例如AAV载体)可在体内更有效地转导所有三种转录因子((例如工程化核酸)编码一种或两种转录因子。在某些实施方案中，在细胞(例如动物细胞，包括哺乳动物细胞)中携带本发明的载体的重组病毒(例如慢病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，腺病毒，疱疹病毒或AAV)的感染效率。至少20％(例如，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％或100％)。
重组病毒
本公开的方面提供了重组病毒(例如，慢病毒，α病毒，牛痘病毒，腺病毒，疱疹病毒，逆转录病毒或AAV)。重组病毒(例如慢病毒，α病毒，牛痘病毒，腺病毒，疱疹病毒，逆转录病毒或AAV)可以带有编码转录因子(例如OCT4、SOX2、KLF4或它们的任意组合，或它们的组合。在一些实施方案中，重组病毒带有编码选自OCT4、SOX2和KLF4的至少两种转录因子的核酸(例如，OCT4和SOX2；KLF4和SOX2；OCT4、KLF4和SOX2；或OCT4和KLF4)。在一些实施方案中，重组病毒带有编码选自OCT4、SOX2和KLF4(例如，OCT4、SOX2和KLF4)的至少三种转录因子的核酸。在一些情况下，本公开的重组病毒包含编码诱导剂的核酸。
在某些实施方案中，重组病毒是重组AAV。在一些实施方案中，重组AAV具有组织特异性靶向能力，使得AAV的转基因将被特异性地递送至一个或多个预定组织。通常，AAV衣壳是决定AAV的组织特异性靶向能力的相关因素。AAV衣壳可以包含衍生自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11以及它们的变体的氨基酸序列。AAV血清型的组织特异性的非限制性实例提供在表1中。“x”表示指定的AAV血清型能够将转基因递送至特定组织。
表1.AAV血清型及其在特定组织中的效用的非限制性实例。
Figure BDA0003089814690000731
包含特定衣壳蛋白的重组AAV可使用任何合适的方法产生。参见例如美国专利申请公布US 2003/0138772，其以引用方式并入本文。AAV衣壳蛋白序列也是本领域已知的。参见例如已公布的PCT专利申请WO2010/138263，其以引用方式并入本文。通常，重组AAV在具有以下组分的宿主细胞中产生：(1)编码AAV衣壳蛋白的核酸(例如工程化核酸)序列或其片段，(2)编码功能性rep基因的核酸(例如工程化核酸)，(3)包含侧接于转基因(例如编码OCT4、KLF4、SOX2或其组合的核酸(例如工程化核酸))的AAV反向末端重复序列的重组AAV载体，以及(4)允许将重组AAV载体包装到AAV衣壳蛋白中的辅助功能物。在一些情况下，重组AAV载体包含编码诱导剂的核酸。在某些实施方案中，辅助功能物经由本领域已知的辅助载体引入。
在一些情况下，在常规实践之后，合适的宿主细胞系(例如，HEK293T细胞)可用于产生本文公开的重组AAV。可以通过外源核酸(例如工程化核酸)将编码上述一种或多种组分的一种或多种表达载体引入宿主细胞，所述外源核酸可以在合适的条件下培养以产生AAV颗粒。当需要时，可以使用辅助载体来促进复制，促进AAV颗粒的组装或其任何组合。在某些实施方案中，重组AAV载体存在于与其他组分(例如，编码AAV衣壳蛋白或其片段的核酸(例如工程化核酸)序列)分开的核酸(例如工程化核酸)上，在某些实施方案中，宿主细胞可以稳定地表达一种或多种生产所需的组分，所述核酸编码功能性rep基因的核酸(例如工程化核酸)和辅助功能，以允许将重组AAV载体包装到AAV衣壳蛋白中。在这种情况下，可以将剩余的组分引入宿主细胞，可以收集细胞培养物的上清液，并可以通过常规方法收集其中包含的病毒颗粒。
激活各自单独或组合的OCT4、SOX2和KLF4的方法及其替代方法
在一些实施方案中，本公开内容的方面涉及在细胞，组织和/或器官中单独或组合活化OCT4、SOX2和KLF4。在一些实施方案中，在不存在c-Myc活化的情况下，单独或组合地活化OCT4、SOX2和KLF4。细胞，组织和/或器官可以是体内的(例如，在受试者中)或离体的。如本文所用，活化包括能够增加目的蛋白质的生物学活性的任何核酸(例如，包含RNA，包含DNA的核酸，或其任何组合)，蛋白质，抗体，化学剂或其任何组合。(例如，OCT4、SOX2和/或KLF4)。可以使用本领域已知的任何常规方法来测量生物活性(例如，基因表达，重编程能力，转录因子活性等)。在一些实施方案中，本文所述的任何核酸(例如，包含RNA，包含DNA的核酸，或其任何组合)，蛋白质，抗体，化学剂或其任何组合替代OCT4、SOX2和/或KLF4。在一些实施方案中，本文所述的任何核酸(例如，包含RNA，包含DNA的核酸，或其任何组合)，蛋白质，抗体，化学剂或其任何组合替代OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合。在一些实施方案中，编码诱导剂的任何核酸(例如工程化核酸)，编码诱导剂的工程化蛋白质，能够调节(例如，激活或抑制)诱导剂活性的化学剂和/或编码本文描述的诱导剂的重组病毒用于激活诱导剂
OCT4、SOX2和KLF4(各自单独或组合)的激活包括增加OCT4、SOX2和KLF4(各自单独或组合)的表达(例如，RNA和/或蛋白质表达)。在一些实施方案中，在将编码OCT4、SOX2和/或KLF4的核酸(例如，包含RNA，包含DNA，或其任何组合的核酸)，编码OCT4、SOX2和/或KLF4的蛋白质，能够激活编码OCT4、SOX2和/或KLF4的抗体，能够激活编码OCT4、SOX2和/或KLF4的化学剂，或其任何组合施用于细胞、组织、器官和/或受试者后，OCT4、SOX2和KLF4(各自单独或组合)的表达与施用前相比增加至少1％,5％,10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,100％,200％,300％,400％,500％,600％,700％,800％,900％或1000％。在一些实施方案中，在将编码OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合的核酸(例如，包含RNA，包含DNA，或其任何组合的核酸)，编码OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合的蛋白质，能够激活编码OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合的抗体，能够激活编码OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合的化学剂，或其任何组合施用于细胞、组织、器官和/或受试者后，OCT4、SOX2和KLF4(各自单独或组合)的表达与施用前相比增加至少1％,5％,10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,100％,200％,300％,400％,500％,600％,700％,800％,900％或1000％。
诱导剂的激活包括增加诱导剂的表达(例如，RNA和/或蛋白质表达)。在一些实施方案中，在将编码诱导剂的核酸(例如，包含RNA，包含DNA，或其任何组合的核酸)，编码诱导剂的蛋白质，能够调节诱导剂活性的化学剂，或其任何组合施用于细胞、组织、器官和/或受试者后，诱导剂的表达与施用前相比增加至少1％,5％,10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,100％,200％,300％,400％,500％,600％,700％,800％,900％或1000％。
表达可以通过本领域已知的任何常规方法来测量，包括定量目的蛋白的水平(例如，使用ELISA和/或用识别目的蛋白的抗体进行的western印迹分析)或定量目的基因的RNA(例如，mRNA)水平的测定(例如，使用逆转录聚合酶链反应)。
除了本文讨论的工程化核酸外，OCT4、SOX2、KLF4(单独或组合)可以通过使用工程化蛋白质在细胞、组织、器官和/或受试者中激活。例如，可以产生(例如，以重组或合成方式)编码OCT4、SOX2和/或KLF4的蛋白质，并通过任何合适的途径将其施用于细胞、组织、器官和/或受试者。例如，可以产生(例如，以重组或合成方式)编码一种或多种选自OCT4；SOX2；KLF4；及其任何组合的转录因子的蛋白质，并通过任何合适的途径将其施用于细胞、组织、器官和/或受试者。
在一些实施方案中，激活OCT4的表达；SOX2；KLF4；替换；四环素诱导型表达载体中的“四环素”或其任何组合包括向细胞，器官，组织或受试者施用四环素(例如强力霉素)。如本领域普通技术人员将理解的，四环素施用的途径可取决于受试者的细胞，器官，组织的类型和/或特征。在一些实施方案中，将四环素直接施用于细胞，器官和/或组织。作为非限制性实例，可以通过任何合适的方法将四环素施用于受试者的眼睛，包括包含四环素的滴眼剂，缓释装置(例如，微泵，颗粒和/或药物贮库)和包含以下成分的含药隐形眼镜：四环素)。在一些实施方案中，将四环素系统性地(例如，通过饮用水或静脉内注射)施用给受试者。四环素可局部施用(例如，以乳膏形式)或通过皮下泵(例如，将四环素递送至特定组织)施用。四环素可以静脉内，皮内，动脉内，病变内，肿瘤内，颅内，颅内，关节内，前列腺内，胸膜内，鼻内，玻璃体内，阴道内，直肠内，局部，肿瘤内，肌肉内，腹膜内，腔内，皮下，结膜下，静脉内施用眼内，口服，局部地，系统地，注射，输注，连续输注，局部灌注直接浸润靶细胞，通过导管，靶标，乳膏，颗粒(例如纳米颗粒，微粒)，脂质组合物(例如脂质体)，或通过本领域普通技术人员已知的其他方法或上述方法的任何组合(参见例如Remington’s PharmaceuticalSciences(1990)，通过引用并入本文)。
作为非限制性实例，工程化蛋白质可以被进一步修饰或配制以递送至细胞、组织、器官和/或受试者。例如，蛋白质转导结构域(即，PTD或细胞穿透肽)可以连接至工程化的蛋白质(例如，OCT4、SOX2和/或KLF4)。作为非限制性实例，可以将蛋白质转导结构域(即，PTD或细胞穿透肽)连接至编码诱导剂的工程化蛋白质。不受特定理论的束缚，蛋白质转导结构域促进跨细胞膜递送货物(cargo)(例如蛋白质，核酸，纳米颗粒，病毒颗粒等)。蛋白质转导结构域包括阳离子肽，疏水性肽和/或细胞特异性肽。参见例如，Zhou et al.,Cell StemCell.2009May 8；4(5):381-4；Zahid et al.,Curr Gene Ther.2012Oct；12(5):374-80。
在一些实施方案中，将编码OCT4、SOX2和/或KLF4的蛋白质和/或诱导剂配制在纳米颗粒中(例如，用于核传递)。在一些实施方案中，将编码OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合的蛋白质(例如，OCT4和SOX2；KLF4和SOX2；OCT4和KLF4；或KLF4、SOX2和OCT4)配制在纳米粒子中(例如，用于核交货)。在某些实施方案中，纳米颗粒还包含编码诱导剂的蛋白质。例如，壳聚糖[聚(N-乙酰基葡糖胺)]是可生物降解的多糖，可以通过几种方法用于配制纳米颗粒。在一些实施方案中，壳聚糖聚合物纳米颗粒装载有编码OCT4、SOX2和/或KLF4的蛋白质和/或诱导剂，并被递送至细胞核。参见例如，Tammam et al.,Oncotarget.2016Jun 21；7(25):37728-37739。
在一些实施方案中，化学剂，抗体和/或蛋白质替代了OCT4、SOX2和/或KLF4。在一些实施方案中，化学剂，抗体，蛋白质或其任何组合代替OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合(例如，OCT4和SOX2；OCT4和KLF4；KLF4和SOX2；或KLF4、SOX2和OCT4)。例如，化学剂，抗体和/或蛋白质可以促进OCT4、SOX2和/或KLF4的表达。在某些情况下，化学剂，抗体和/或蛋白质可促进一种或多种选自OCT4的转录因子的表达。SOX2；KLF4；及其任何组合。在一些实施方案中，化学剂，抗体和/或蛋白质可以激活OCT4、SOX2和/或KLF4下游的靶基因。在一些实施方案中，化学剂，抗体，蛋白质或其任何组合可以激活选自OCT4的一种或多种转录因子下游的靶基因。SOX2；KLF4；及其任何组合。在一些实施方案中，如果化学剂，抗体和/或蛋白质可以与其他两个转录因子一起使用并促进细胞重编程，则化学剂，抗体和/或蛋白质被称为代替OCT4、SOX2和/或KLF4。在一些实施方案中，如果化学剂，抗体，蛋白质或其任何组合可以与其他两种一起使用，则化学剂，抗体，蛋白质或其任何组合被认为代替OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合。转录因子并促进细胞重编程。例如，可以通过测量基因表达(例如，胚胎标志物和/或多能性标志物的表达)来确定细胞重编程。在一些实施方案中，多能性标志物包括AP，SSEA1和/或Nanog。
在一些实施方案中，抗体用于激活OCT4、SOX2和/或KLF4。在一些实施方案中，抗体用于激活选自OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合的一种或多种转录因子。在一些实施方案中，抗体不靶向OCT4、SOX2和/或KLF4。在一些实施方案中，抗体不靶向OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合。在一些实施方案中，抗体增加OCT4、SOX2和/或KLF4的表达。在一些实施方案中，抗体增加OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合的表达。在一些实施方案中，抗体不增加OCT4、SOX2和/或KLF4的表达。在一些实施方案中，抗体替代OCT4、SOX2和/或KLF4。在一些实施方案中，抗体不增加OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合的表达。在一些实施方案中，抗体替代OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合。可以使用鉴定可以替代转录因子(例如，OCT4、SOX2和/或KLF4)的抗体的任何合适的方法。可以使用任何合适的鉴定可以替代转录因子的抗体的方法(例如，OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合)。参见例如，Blanchardet al.,Nat Biotechnol.2017Oct；35(10):960-968。
在一些实施方案中，另一种蛋白质(例如，编码该蛋白质的核酸或编码该蛋白质的多肽)可用于替代OCT4、SOX2和/或KLF4。在一些实施方案中，另一种蛋白质(例如，编码该蛋白质的核酸或编码该蛋白质的多肽)可用于替代OCT4、SOX2、KLF4或其组合。例如，OCT4可以用Tet1，NR5A-2，Sall4，E-钙粘着蛋白，NKX3-1或其任何组合代替。在一些实施例中，OCT4、SOX2和/或KLF4可以被NANOG和/或TET2代替。在一些实施例中，OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合可以被NANOG和/或TET2代替。参见例如，Nat Cell Biol.2018Aug；20(8):900-908；Gaoet al.,Cell Stem Cell.2013Apr 4；12(4):453-69。Nanog和Lin28可以替代Klf4。参见例如，Yu et al,Science.318,1917-1920,2007。在一些实施方案中，OCT4、SOX2和/或KLF4被Tet3(tet甲基胞嘧啶双加氧酶3)代替。在一些实施方案中，OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合被Tet3(tet甲基胞嘧啶双加氧酶3)代替。在一些实施方案中，编码Tet1 DNA脱甲基酶的核酸包含与NM_030625.3或NM_001253857.2至少70％(例如，至少75％,80％,85％,90％,95％,98％,99％或100％)相同的序列。在一些实施方案中，编码Tet1 DNA脱甲基酶的氨基酸包含与NP_085128.2或NP_001240786.1至少70％(例如，至少75％,80％,85％,90％,95％,98％,99％或100％)相同的序列。在一些实施方案中，编码Tet2 DNA脱甲基酶的核酸包含与NM_001127208.2,NM_001040400.2,NM_001346736.1或NM_017628.4至少70％(例如，至少75％,80％,85％,90％,95％,98％,99％或100％)相同的序列。在一些实施方案中，编码Tet2 DNA脱甲基酶的氨基酸包含与NP_060098.3,NP_001035490.2,NP_001333665.1或NP_001120680.1至少70％(例如，至少75％,80％,85％,90％,95％,98％,99％或100％)相同的序列。在一些实施方案中，编码Tet3 DNA脱甲基酶的核酸包含与NM_001287491.2,NM_001347313.1,NM_183138.2或NM_001366022.1至少70％(例如，至少75％,80％,85％,90％,95％,98％,99％或100％)相同的序列。在一些实施方案中，编码Tet1 DNA脱甲基酶的氨基酸包含与NP_001274420.1,NP_001334242.1,NP_898961.2或NP_001352951.1至少70％(例如，至少75％,80％,85％,90％,95％,98％,99％或100％)相同的序列。Tet1、Tet2和/或Tet3可以源自任何物种。在一些实施方案中，Tet1，Tet2和/或Tet3是野生型对应物的截短形式。作为非限制性实例，与野生型Tet1、Tet2和/或Tet3对应物相比，Tet1、Tet2和/或Tet3是N端截短的并且具有催化活性。在一些实施方案中，Tet1、Tet2和/或Tet3仅包含Tet1、Tet2和/或Tet3的催化结构域。在一些实施方案中，Tet1、Tet2和/或Tet3包含Tet1、Tet2、Tet3或其任何组合的催化结构域。功能性截短的Tet1的非限制性实例可以在Hrit et al.,Elife.2018Oct 16；7.pii:e34870中找到。
替代OCT4、SOX2和/或KLF4以促进细胞重编程的其他方法是本领域已知的。参见例如，Heng et al.,Cell Stem Cell 6,167–174(2010)；Eguchi et al.,Proc.NatlAcad.Sci.USA 113,E8257–E8266(2016)；Gao et al.,Cell Stem Cell12,453–469(2013)；Long et al.,Cell Res.25,1171–1174(2015)；Hou et al.,Science 341,651–654(2013)；Redmer et al.,EMBO Rep.12,720–726(2011)；Tan et al.,J.Biol.Chem.290,4500–4511(2014)；Anokye-Danso et al.,Cell Stem Cell 8,376–388(2011)；Miyoshi et al.,CellStem Cell 8,633–638(2011)；Shu et al.,Cell 153,963–975(2013)；Yu,J.et al.,Science 318,1917–1920(2007)。
在一些实施方案中，化学剂代替OCT4、SOX2和/或KLF4(例如，可以代替其他两个转录因子来代替OCT4、SOX2和/或KLF4以促进细胞重编程)。在一些实施方案中，化学剂代替OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合(例如，可以代替其他两种转录因子来代替OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合，以促进细胞重编程)。例如，SOX2可以替换为CHIR，FSK或616452。OCT4可以替换为DZNep。如上所述，由于Sall4可用于替代OCT4，因此任何可替代Sall4的化合物也可用于替代OCT4。例如，CHIR，FSK和616452可用于替代Sall4。Nanog可以替换为2i介质。参见例如，Hou et al.,Science.2013Aug 9；341(6146):651-4。还参见例如，Zhao et al.,Cell.2015Dec17；163(7):1678-91。
在一些实施方案中，化学重编程包括使用减少诱导化学重编程的化学剂的毒性的化学物质。降低化学重编程毒性的化学药品的非限制性实例包括ROCK抑制剂(例如Y27632和Fasudil)和P38 MAPK抑制剂(例如SB203580和BIRB796)。参见例如，Li et al.,CellStem Cell.2015Aug 6；17(2):195-203。
OCT4、KLF4、SOX2，替代物或其任何组合可以与激活重编程增强剂和/或抑制重编程障碍一起被激活(例如，可以诱导表达)。可以使用本领域已知的任何合适的方法来激活重编程的增强子，包括增强子的过表达，编码增强子的内源基因的表达增加(例如，使用CRISPR技术)，化学剂和/或抗体的使用来增加增强子的生物学活性，并使用化学剂和/或抗体促进增强子的表达。可使用本领域已知的任何合适方法抑制重编程障碍，包括敲低抑制剂的表达(例如，使用siRNA，miRNA，shRNA)，敲除抑制剂的内源性拷贝(例如，使用CRISPR技术，TALENs)(例如锌指核酸酶等)，使用化学剂和/或抗体降低抑制剂的生物活性，并使用化学剂和/或抗体降低抑制剂的表达。
表2中提供了增强子和重编程障碍的非限制性实例。还参见例如，Ebrahimi,CellRegen(Lond).2015Nov 11；4:10，为此目的通过引用以其整体并入。
表2.增强重编程策略的非限制性实例。
Figure BDA0003089814690000801
Figure BDA0003089814690000811
可与OCT4、KLF4、SOX2，其替代物或其任何组合的激活组合地被激活的另外的重编程增强子包括组蛋白赖氨酸脱甲基酶(例如，KDM2，KDM3和KDM4)。组蛋白赖氨酸脱甲基酶可以通过在细胞、组织、器官和/或受试者中过表达而被激活。本公开内容还包括组蛋白赖氨酸脱甲基酶的化学活化剂。例如，维生素C可用于激活KDM3和/或KDM4。
在一些实施方案中，OCT4、SOX2、KLF4，其替代物或它们的任何组合与C/EBPα和Tfcp2l1的激活一起被激活。不受特定理论的束缚，C/EBPα和Tfcp2l1与Klf4一起可以在重编程过程中驱动Tet2介导的增强子去甲基化和激活。
在一些实施方案中，OCT4、SOX2、KLF4，其替代物或其任何组合在细胞、组织、器官和/或受试者中与促进重编程的细胞因子组合被激活。IL6是细胞因子的非限制性实例。参见例如，Mosteiro et al,Science.2016Nov25；354(6315)，为此目的，通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，与激活miRNA(例如，施用miRNA和/或表达miRNA)组合，在细胞、组织、器官和/或受试者中激活OCT4、SOX2、KLF4，其替代物或其任何组合。例如，可以将促进细胞周期进程的miRNA引入细胞、组织、器官和/或受试者。促进细胞周期进程的miRNA的非限制性实例包括miR 302-367,miR 371-373,miR-200b,miR-200c,miR-205,miR 290-295,miR-93,miR-106和miR 135b。
作为非限制性实例，可以通过将OCT4、SOX2、KLF4的激活，其替代或它们的任意组合与增强剂的激活相结合来增强神经再生。增强子的非限制性激活包括KLF家族成员(例如KLF7)的过表达，c-Myc的过表达，STAT3激活，SOX11的过表达，Lin28的过表达，编码胰岛素样生长因子的可溶性蛋白的过表达或递送1(IGF1)和骨桥蛋白(OPN)，以及B-RAF的激活(例如，引入功能增强突变)。还参见例如，Blackmore et al.,Proc Natl Acad Sci U SA.2012May 8；109(19):7517-22；Belin et al.,Neuron.2015May20；86(4):1000-1014；Bareyre et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2011Apr12；108(15):6282-7；Norsworthy etal.,Neuron.2017Jun 21；94(6):1112-1120.e4；Wang et al.,Cell Rep.2018Sep 4；24(10):2540-2552.e6；Liu et al.,Neuron.2017Aug 16；95(4):817-833；O’Donovan etal.,J Exp Med,2014.211(5):p.801-14，为此目的，其各自通过引用将其整体并入本文。
在一些实施方案中，结合抑制或敲除重编程障碍，在细胞、组织、器官和/或受试者中激活OCT4、SOX2、KLF4，其替代物或它们的任何组合。重编程障碍的非限制性示例包括Chaf1a，Caf1b，Ube2i，sumo2和/或Nudt21。参见例如，Brumbaugh et al.,Cell.2018Jan11；172(1-2):106-120.e21；Cheloufi et al.,Nature.2015Dec 10；528(7581):218-24；and Borkent et al.,Stem Cell Reports,2016.6(5):p.704-716，为此目的，通过引用将其整体并入本文。
作为非限制性实例，重编程屏障可以是DNA甲基转移酶(DNMT)，并且可以抑制DNMT以促进组织，细胞和/或器官的重编程。大多数DNA甲基转移酶都使用S-腺苷-L-蛋氨酸作为甲基供体。DNMT可以来自任何物种。至少存在三种不同类型的甲基转移酶。m6A甲基转移酶能够使DNA中腺嘌呤的c-6位的氨基甲基化(例如，酶委员会(EC)第2.1.1.72号)。m4C甲基转移酶能够产生N4-甲基胞嘧啶(例如，酶委员会(EC)第2.1.1.113号)。M5C甲基转移酶能够产生C5-甲基胞嘧啶(例如，酶委员会(EC)第2.1.1.37号)。
哺乳动物DNA甲基转移酶(DNMT)的非限制性实例包括DNMT1及其同等型DNMT1b和DNMT1o(卵母细胞特异性)，DNMT3a，DNMT3b，DNMT3L。GenBank登录号NM_001130823.3(同等型a)，NM_001318730.1(同等型c)，NM_001318731.1(同等型d)和NM_001379.3(同等型b)是编码人DNMT1的核苷酸序列的非限制性实例。编码DNMT1的核酸可以包含与GenBank登录号NM_001130823.3(同等型a),NM_001318730.1(同等型c),NM_001318731.1(同等型d)和/或NM_001379.3(同等型b)中所示序列至少70％(例如，至少75％,80％,85％,90％,95％,98％,99％或100％)相同的序列。GenBank登录号NP_001124295.1(同等型a),NP_001305659.1(同等型c),NP_001305660.1(同等型d)和NP_001370.1(同等型b)是编码人DNMT1的氨基酸序列的非限制性实例。编码DNMT1的氨基酸可以包含与GenBank登录号NP_001124295.1(同等型a),NP_001305659.1(同等型c),NP_001305660.1(同等型d)和/或NP_001370.1(同等型b)中所示序列至少70％(例如，至少75％,80％,85％,90％,95％,98％,99％或100％)相同的序列。编码人DNMT3A的核酸包括GenBank登录号NM_001320892.1,NM_001320893.1,NM_022552.4,NM_153759.3,NM_175629.2和NM_175630.1。编码DNMT3A的核酸可以与GenBank登录号NM_001320892.1,NM_001320893.1,NM_022552.4,NM_153759.3,NM_175629.2和/或NM_175630.1中所示序列至少70％(例如，至少75％,80％,85％,90％,95％,98％,99％或100％)相同。编码人DNMT3A的氨基酸包括GenBank登录号NP_001307821.1,NP_001307822.1,NP_072046.2,NP_715640.2,NP_783328.1和NP_783329.1。编码DNMT3A的氨基酸可以与GenBank登录号NP_001307821.1,NP_001307822.1,NP_072046.2,NP_715640.2,NP_783328.1和/或NP_783329.1中所示序列至少70％(例如，至少75％,80％,85％,90％,95％,98％,99％或100％)相同。编码人DNMT3B的核酸包括GenBank登录号NM_001207055.1,NM_001207056.1,NM_006892.3,NM_175848.1,NM_175849.1和NM_175850.2。编码DNMT3B的核酸可以与GenBank登录号NM_001207055.1,NM_001207056.1,NM_006892.3,NM_175848.1,NM_175849.1和/或NM_175850.2中所示序列至少70％(例如，至少75％,80％,85％,90％,95％,98％,99％或100％)相同。编码人DNMT3B的氨基酸包括GenBank登录号NP_001193984.1,NP_001193985.1,NP_008823.1,NP_787044.1,NP_787045.1和NP_787046.1。编码DNMT3B的氨基酸可以与GenBank登录号NP_001193984.1,NP_001193985.1,NP_008823.1,NP_787044.1,NP_787045.1和/或NP_787046.1中所示序列至少70％(例如，至少75％,80％,85％,90％,95％,98％,99％或100％)相同。编码人DNMT3L的核酸包括GenBank登录号NM_013369.3and NM_175867.2。编码DNMT3L的核酸可以与GenBank登录号NM_013369.3和/或NM_175867.2中所示序列至少70％(例如，至少75％,80％,85％,90％,95％,98％,99％或100％)相同。编码人DNMT3L的氨基酸包括GenBank登录号NP_037501.2and NP_787063.1。编码DNMT3L的氨基酸可以与GenBank登录号NP_037501.2和/或NP_787063.1中所示序列至少70％(例如，至少75％,80％,85％,90％,95％,98％,99％或100％)相同。
可以使用本领域已知的任何合适的方法抑制DNMT。合适的方法包括敲除DNMTmRNA，从基因上敲除DNMT以及使用DNMT抑制剂(例如化学抑制剂)。DNMT抑制剂正在美国及其他地区的临床试验(例如III期临床试验)中进行研究。DNMT抑制剂的非限制性实例包括VIDAZATM(阿扎胞苷)(例如，用于治疗骨髓增生异常综合症和治疗急性髓性白血病(AML))，DACOGENTM(地西他滨)(例如，用于治疗AML和治疗慢性髓性白血病(CML))和瓜地西他滨(SGI-110)(例如，用于AML的治疗)。2012年，欧盟批准将DACOGENTM(地西他滨)用于AML患者。
DNMT可以通过抑制DNMT稳定剂来抑制。抑制DNMT稳定剂的合适方法包括敲除编码稳定剂的mRNA，从基因上敲除编码稳定剂的基因和使用抑制剂(例如化学抑制剂)。作为非限制性示例，也称为Lsd1或Aof2的KDM1a是DNMT1的稳定剂。参见例如，Wang et al.,NatGenet.2009Jan；41(1):125-9。在一些实施方案中，使用本文公开的或本领域已知的shRNA敲低KDM1a表达。在一些实施方案中，抑制KDM1a以防止由DNMT的超甲基化诱导的损伤，这可能对促进重编程有用。
在一些实施方案中，组蛋白甲基转移酶是重编程屏障，并且被抑制以促进细胞，组织和/或器官的重编程。组蛋白甲基转移酶可以通过任何合适的方法来抑制，包括使用化学抑制剂。例如，3-deazaneplanocin A(Dznep)，epz004777和BIX-01294是组蛋白甲基转移酶抑制剂的实例。
在一些实施方案中，重编程屏障是组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)，并且HDAC被抑制以促进细胞，组织和/或器官的重编程。HDAC抑制剂的非限制性实例包括丙戊酸(VPA)，曲古抑菌素A(TSA)，辛二酰苯胺基异羟肟酸(SAHA)，丁酸钠(SB)，Belinostat(PXD101)，Panobinostat(LBH589)，Quisinostat(JNJ-26481585)，Abexinostat(PCI-24781)，Givinostat(ITF2357)，Resminostat(4SC-201)，苯基丁酸(PBA)，Depsipeptide(romidepsin)，Entinostat(MS-275)，Mocetinostat(MGCD0103)和Tubastatin A(TBA)。
在一些实施方案中，重编程屏障是NF-κB，并且其被抑制以促进细胞，组织和/或器官的重编程。NF-κB抑制剂的非限制性实例包括BAY 11-7082，TPCA 1和p65 siRNA。参见例如由Abcam编写的NF-κB小分子指南，该指南可在Abcam网站(www.abcam.com/reagents/nf-kb-small-molecule-guide)上找到。
在一些实施方案中，重新成像屏障是从衰老细胞分泌的细胞因子，其中抑制细胞因子以促进细胞，组织和/或器官的重编程。细胞因子抑制剂的非限制性实例包括抗TNFα(Mahmoudi et al,Biorxiv,2018)和杀伤衰老细胞的药物，包括Navitoclax。
在一些实施方案中，重编程屏障是微RNA(miRNA)，并且抑制了微RNA以促进细胞，组织和/或器官的重编程。重编程障碍的microRNA的非限制性例子包括miR Let-7和miR-34。不受特定理论的束缚，由于miR Let-7抑制了细胞周期，抑制miR Let-7可以提高重编程的效率，而抑制miR-34则可以促进重编程，因为miR-34可以抑制p53的翻译。
在一些实施方案中，结合对PTEN，SOCS3，RhoA和/或ROCK的抑制以在细胞、组织、器官和/或受试者中激活OCT4、SOX2、KLF4，其替代物或其任何组合。增强神经再生。在一些实施方案中，在细胞、组织、器官和/或受试者中删除PTEN，删除SOCS3，敲低RhoA，和/或敲低ROCK。参见例如，Park et al.,Science.2008Nov 7；322(5903):963-6；Smith et al.,Neuron.2009Dec 10；64(5):617-23；Koch et al.,Front Cell Neurosci.2014Sep 5；8:273；Koch et al.,Cell Death Dis.2014May 15；5:e1225关于抑制PTEN,SOCS3,RhoA和/或ROCK的描述。为此，每篇参考文献通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，结合神经元电刺激(例如，高对比度视觉刺激)，在细胞、组织、器官和/或受试者中激活OCT4、SOX2、KLF4，其替代物或它们的任何组合，以促进神经再生。参见例如，Lim et al.,Nat Neurosci.2016Aug；19(8):1073-84对高对比度视觉刺激的描述。为此，该参考文献通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，结合γ带光刺激在细胞、组织、器官和/或受试者中激活OCT4、SOX2、KLF4，其替代物或其任何组合，以促进神经再生。参见例如，McDermott et al.,JAlzheimers Dis.2018；65(2):363–392中描述了伽马波段光刺激。为此，该参考文献通过引用以其整体并入本文。
工程化细胞
本公开内容还包括工程化细胞和产生工程化细胞的方法。例如，工程化细胞可用于基于细胞的疗法(例如干细胞疗法)。尽管干细胞疗法目前正在临床试验中(参见例如David Cyranoski,Nature 557,619-620(2018)，但毒性(例如脱靶毒性)仍是一个令人关注的问题，尽管不受特定理论的束缚，本公开的细胞(例如，使用编码OCT4、KLF4和/或SOX2的AAV载体和/或诱导剂工程化的细胞)可以具有较低的毒性，因为AAV不整合到宿主细胞的基因组中并且使用本文所述的控制OCT4、KLF4和/或SOX2表达的诱导系统可以允许精确控制基因表达(例如，数量和时间)。
能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，本文所述的工程化蛋白质，激活(例如，诱导OCT4表达的)化学剂，KLF4和/或SOX2抗体激活或诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达，和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)可以将本文所述的单独的或组合的)引入宿主细胞，宿主组织或器官中以产生工程化细胞，工程化组织或工程化器官。能够诱导OCT4表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)；KLF4；SOX2；或其任何组合，本文所述的工程化蛋白质，激活(例如诱导OCT4表达)的化学剂；KLF4；SOX2；抗体，或其任何组合，可激活(例如诱导)OCT4的抗体；KLF4；SOX2；或其组合，和/或本文所述的重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)，单独或组合使用，可以引入宿主细胞，宿主组织或产生工程化细胞，工程化组织或工程化器官的器官。在一些实施方案中，编码诱导剂的核酸(例如工程化核酸)，编码诱导剂的工程化蛋白质，能够调节(例如激活或抑制)诱导剂活性的化学剂和/或还将编码诱导剂的重组病毒引入宿主细胞，宿主组织或器官以产生工程化细胞，工程化组织或工程化器官。
在一些实施方案中，工程化细胞是诱导多能干细胞(iPSC)。
在一些实施方案中，将病毒载体(例如，AAV载体，包括具有与编码OCT4、KLF4和SOX2的核酸可操作地连接的TRE启动子的载体)包装到具有AAV-DJ衣壳的病毒中。在一些实施方案中，与没有AAV-DJ衣壳的细胞相比，AAV-DJ衣壳增加了对培养细胞的转导效率。在一些实施方案中，将编码OSK的AAV病毒施用于细胞。在一些实施方案中，将编码诱导剂的AAV病毒(例如，AAV-DJ病毒)或编码诱导剂的蛋白质施用于相同的细胞。在一些实施方案中，该系统产生工程化细胞(例如，诱导多能干细胞)。在一些实施方案中，工程化细胞进一步分化为(例如，分化为眼，耳，鼻，口，包括牙龈和牙根，骨，肺，乳房(breast)，乳房(udder)，胰腺，胃，食道，肌肉，包括心肌，肝，血管，皮肤，包括毛发，心脏，脑，神经组织，肾，睾丸，前列腺，阴茎，泄殖腔，鳍，卵巢或肠细胞)。在一些实施方案中，分化的细胞用于移植目的。在一些实施方案中，培养工程化细胞以产生工程化组织。在一些实施方案中，培养工程化细胞以产生工程化器官。在一些实施方案中，工程化细胞是视网膜色素上皮细胞，神经元细胞，胰腺β细胞或心脏细胞。
组合物
本公开的组合物可以包含以下项的至少一种：单独或组合地本文所述的能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，工程化蛋白质，工程化细胞，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的化学剂，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的抗体和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)。在某些实施方案中，本发明的组合物包含以下项的至少一种：单独或组合地本文所述的能够诱导OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，工程化蛋白质，工程化细胞，激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的化学剂，激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的抗体和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)。在一些实施方案中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的不同核酸(例如工程化核酸)(例如，编码OCT4、KLF4和/或SOX2的表达载体)。在一些实施方案中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种能够诱导OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合表达的不同核酸(例如工程化核酸)(例如，编码OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的表达载体)。在一些实施方案中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种各自具有一个或多个不同的转基因的不同的病毒(例如，慢病毒，α病毒，牛痘病毒，腺病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)。在一些实施方案中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的不同的化学剂。在一些实施方案中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的不同的化学剂。在一些实施方案中，组合物进一步包含一种或多种编码诱导剂的核酸(例如工程化核酸)，一种或多种编码诱导剂的工程化蛋白质，一种或多种能够调节(例如，激活或抑制)诱导剂活性的化学剂，和/或一种或多种编码诱导剂的重组病毒。在一些实施方案中，组合物包含工程化细胞(例如，诱导多能干细胞和/或分化的细胞)。在一些实施方案中，组合物包含编码OCT4、SOX2和/或KLF4的工程化蛋白质。在一些实施方案中，组合物包含编码OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合的工程化蛋白质。在一些实施方案中，组合物进一步包含编码诱导剂的工程化蛋白质。
在一些实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受的载体。考虑到例如以下项针对的指示，本领域技术人员可以容易地选择合适的载体：能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的核酸(例如工程化核酸)(例如表达载体)，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的化学剂，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的抗体，工程化蛋白质，工程化细胞和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)。考虑到例如以下项针对的指示，本领域技术人员可以容易地选择合适的载体：能够诱导OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合表达的核酸(例如工程化核酸)(例如表达载体)，激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的化学剂，激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的抗体，工程化蛋白质，工程化细胞和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)。考虑到例如以下项针对的指示，本领域技术人员可以容易地选择合适的载体：编码诱导剂的核酸(例如工程化核酸)，编码诱导剂的工程化蛋白质，能够调节(例如激活或抑制)诱导剂活性的化学剂，和/或包含诱导剂的重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)。例如，一种合适的载体包括盐水，其可以与多种缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)一起配制。其他示例性载体包括无菌盐水，乳糖，蔗糖，磷酸钙，明胶，葡聚糖，琼脂，果胶，花生油，芝麻油和水。载体的选择不是本公开的限制。
任选地，除了例如能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的核酸(例如工程化核酸)(例如表达载体)，包含OCT4、KLF4和/或SOX2的工程化细胞，工程化蛋白质，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的化学剂，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的抗体，和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)和载体之外，本发明的组合物还可以包含其他药物成分，如防腐剂或化学稳定剂。任选地，除了例如能够诱导OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合表达的核酸(例如工程化核酸)(例如表达载体)，包含OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的工程化细胞，工程化蛋白质，激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的化学剂，激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的抗体，和/或重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)和载体之外，本发明的组合物还可以包含其他药物成分，如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。本公开的组合物可以进一步包含编码诱导剂的核酸(例如工程化核酸)，编码诱导剂的工程化蛋白质，能够调节(例如，激活或抑制)诱导剂活性的化学剂，和/或编码诱导剂的重组病毒。
将本文所述的能够诱导OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合表达的核酸(例如工程化核酸)(例如表达载体)，工程化细胞，激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的化学剂，编码OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的工程化蛋白质，激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的抗体，和/或编码它们的重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)以足够的量施用以转染期望组织(例如眼，耳，鼻，口，包括牙龈和牙根，骨，肺，乳房(breast)，乳房(udder)，胰腺，胃，食道，肌肉，包括心肌，肝，血管，皮肤，包括毛发，心脏，脑，神经组织，肾，睾丸，前列腺，阴茎，泄殖腔，鳍，卵巢或肠组织)的细胞，并提供足够水平的基因转移和表达而不会产生不适当的不良影响。将编码诱导剂的核酸(例如工程化核酸)，编码诱导剂的工程化蛋白质，能够调节(例如激活或抑制)诱导剂活性的化学剂，和/或编码诱导剂的重组病毒的任一种以足够的量施用以转染期望组织(例如眼，耳，鼻，口，包括牙龈和牙根，骨，肺，乳房(breast)，乳房(udder)，胰腺，胃，食道，肌肉，包括心肌，肝，血管，皮肤，包括毛发，心脏，脑，神经组织，肾，睾丸，前列腺，阴茎，泄殖腔，鳍，卵巢或肠组织)的细胞，并提供足够水平的基因转移和表达而不会产生不适当的不良影响。药学上可接受的施用途径的实例包括但不限于直接递送至所选器官(例如直接递送至眼，耳，鼻，口，包括牙龈和牙根，骨，肺，乳房(breast)，乳房(udder)，胰腺，胃，食道，肌肉，包括心肌，肝，血管，皮肤，包括毛发，心脏，脑，神经组织，肾，睾丸，前列腺，阴茎，泄殖腔，鳍，卵巢或肠)。可以直接地静脉内、皮内、动脉内、病灶内、肿瘤内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、肿瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐内、眼内(intraocularally)、口服、局部、局域、系统、注射、输注、连续输注、局部灌注浸润靶细胞、经由导管、在乳膏中、在脂质组合物(例如脂质体)中，或通过本领域普通技术人员已知的其他方法或前述方法的任何组合递送。可以将本文所述的能够诱导OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合表达的核酸(例如工程化核酸)(例如表达载体)，工程化细胞，激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的化学剂，工程化蛋白质，激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的抗体，和/或重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)的任一种直接地静脉内、皮内、动脉内、病灶内、肿瘤内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、肿瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、局部、局域、系统、注射、输注、连续输注、局部灌注浸润靶细胞、经由导管、在乳膏中、在脂质组合物(例如脂质体)中，或通过本领域普通技术人员已知的其他方法或前述方法的任何组合递送。可以将编码诱导剂的核酸、能够调节诱导剂活性的化学剂、编码诱导剂的工程化蛋白质和/或编码诱导剂的重组病毒的任一种直接地静脉内、皮内、动脉内、病灶内、肿瘤内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、肿瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、局部、局域、系统、注射、输注、连续输注、局部灌注浸润靶细胞、经由导管、在乳膏中、在脂质组合物(例如脂质体)中，或通过本领域普通技术人员已知的其他方法或前述方法的任何组合递送。如果需要，可以组合施用途径。
在一些实施方案中，核酸是非病毒递送的(例如，不在病毒载体上和/或不在病毒中)。在一些实施方案中，在脂质体中施用编码OCT4、SOX2和/或KLF4和/或诱导剂的核酸(例如，RNA或DNA)。在一些实施方案中，在脂质体中施用编码OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合和/或诱导剂的核酸(例如，RNA或DNA)。在一些实施方案中，以颗粒形式施用编码OCT4、SOX2和/或KLF4和/或诱导剂的核酸(例如，RNA或DNA)。在一些实施方案中，将编码OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合和/或诱导剂的核酸(例如，RNA或DNA)以颗粒形式施用。在一些实施方案中，核酸是RNA(例如，mRNA)。
在一些实施方案中，将包含编码OCT4、KLF4和/或SOX2的表达载体的药物组合物或包含携带该表达载体的病毒的药物组合物施用于细胞、组织、器官或受试者。在一些实施方案中，将包含编码诱导剂的表达载体的药物组合物或包含携带该表达载体的病毒的药物组合物施用于细胞、组织、器官或受试者。在一些实施方案中，系统性施用编码OCT4、KLF4和/或SOX2的病毒和/或表达载体。在一些实施方案中，系统性施用编码诱导剂的病毒和/或表达载体。在一些实施方案中，将编码OCT4、KLF4和/或SOX2的病毒和/或表达载体局部施用(例如，直接施用到感兴趣的组织或器官，包括眼，耳，鼻，口，包括牙龈和牙根，骨，肺，乳房(breast)，乳房(udder)，胰腺，胃，食道，肌肉，包括心肌，肝，血管，皮肤，包括毛发，心脏，脑，神经组织，肾，睾丸，前列腺，阴茎，泄殖腔，鳍，卵巢或肠)。在一些实施方案中，将编码诱导剂的病毒和/或表达载体局部施用(例如，直接施用到感兴趣的组织或器官，包括眼，耳，鼻，口，包括牙龈和牙根，骨，肺，乳房(breast)，乳房(udder)，胰腺，胃，食道，肌肉，包括心肌，肝，血管，皮肤，包括毛发，心脏，脑，神经组织，肾，睾丸，前列腺，阴茎，泄殖腔，鳍，卵巢或肠)。在一些实施方案中，使用与OCT4、KLF4和/或SOX2(例如，编码OCT4、KLF4和/或SOX2的核酸)相同的施用途径施用诱导剂(例如，编码诱导剂的核酸、编码诱导剂的蛋白质或编码诱导剂的病毒)和/或能够调节(例如，激活或抑制)诱导剂活性的化学剂。在一些实施方案中，使用与OCT4、KLF4和/或SOX2(例如，编码OCT4、KLF4和/或SOX2的核酸)不同的施用途径施用诱导剂(例如，编码诱导剂的核酸、编码诱导剂的蛋白质或编码诱导剂的病毒)和/或能够调节(例如，激活或抑制)诱导剂活性的化学剂。
在一些实施方案中，将包含编码OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的表达载体的药物组合物，或包含带有表达载体的病毒的药物组合物施用于细胞、组织、器官或受试者。在一些实施方案中，将包含编码诱导剂的表达载体的药物组合物或包含携带该表达载体的病毒的药物组合物施用于细胞、组织、器官或受试者。在一些实施方案中，系统性施用编码OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的病毒和/或表达载体。在一些实施方案中，系统性施用编码诱导剂的病毒和/或表达载体。在一些实施方案中，局部施用编码OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的病毒和/或表达载体(例如，直接施用于感兴趣的组织或器官，包括眼，耳，鼻，口，包括牙龈和牙根，骨，肺，乳房(breast)，乳房(udder)，胰腺，胃，食道，肌肉，包括心肌，肝，血管，皮肤，包括毛发，心脏，脑，神经组织，肾，睾丸，前列腺，阴茎，泄殖腔，鳍，卵巢或肠)。在一些实施方案中，局部施用编码诱导剂的病毒和/或表达载体(例如，直接施用于感兴趣的组织或器官，包括眼，耳，鼻，口，包括牙龈和牙根，骨，肺，乳房(breast)，乳房(udder)，胰腺，胃，食道，肌肉，包括心肌，肝，血管，皮肤，包括毛发，心脏，脑，神经组织，肾，睾丸，前列腺，阴茎，泄殖腔，鳍，卵巢或肠)。在一些实施方案中，使用与OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合(例如，编码OCT4；KLF4；SOX2；OCT4和SOX2；OCT4和KLF4；KLF4和SOX2；或KLF4、OCT4和SOX2的核酸)相同的施用途径施用诱导剂(例如，编码诱导剂的核酸、编码诱导剂的蛋白质或编码诱导剂的病毒)和/或能够调节(例如，激活或抑制)诱导剂活性的化学剂。在一些实施方案中，经由与OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合(例如，编码OCT4；KLF4；SOX2；OCT4和SOX2；OCT4和KLF4；KLF4和SOX2；或KLF4、OCT4和SOX2的核酸)不同的施用途径施用诱导剂(例如，编码诱导剂的核酸、编码诱导剂的蛋白质或编码诱导剂的病毒)和/或能够调节(例如，激活或抑制)诱导剂活性的化学剂。
在一些实施方案中，表达载体是诱导型载体，其中编码OCT4、KLF4和/或SOX2和/或诱导剂的核酸可操作地连接至可诱导TRE启动子(例如，TRE3G，TRE2或P紧密)。在一些实施方案中，表达载体是诱导型载体，其中编码OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的核酸和/或诱导剂可操作地连接至可诱导的TRE启动子(例如，TRE3G，TRE2或P紧密)。在一些实施方案中，病毒和/或诱导型载体与四环素(例如，强力霉素)一起施用。在一些实施方案中，包含TRE启动子的病毒和/或表达载体与四环素(例如强力霉素)分开施用。例如，可以系统性施用本文所述的包含TRE启动子的任何病毒和/或表达载体，并且可以局部地(例如，对感兴趣的器官或组织)施用四环素。在一些实施方案中，可将本文所述的包含TRE启动子的任何病毒和/或表达载体局部施用(例如，直接施用于感兴趣的组织或器官，包括眼，耳，鼻，口，包括牙龈和牙根，骨，肺，乳房(breast)，乳房(udder)，胰腺，胃，食道，肌肉，包括心肌，肝，血管，皮肤，包括毛发，心脏，脑，神经组织，肾，睾丸，前列腺，阴茎，泄殖腔，鳍，卵巢或肠)并且可以系统性施用四环素。作为非限制性实例，将包含TRE启动子的病毒和/或表达载体直接(例如注射)施用至受试者的眼中，并且系统性施用四环素(例如强力霉素)(例如以丸剂形式口服)。
在一些实施方案中，四环素通过静脉内，皮内，动脉内，病变内，肿瘤内，颅内，关节内，前列腺内，胸膜内，鼻内，玻璃体内，阴道内，直肠内，局部，肿瘤内，肌肉内，腹膜内，经皮，皮下，皮下，粘膜，心包内，脐内，眼内，口服，局部地，系统地，注射，输注，连续输注，局部灌注直接浸润靶细胞，经由导管，在乳膏中或脂质组合物中。在一些实施方案中，将四环素直接施用于细胞，器官和/或组织。作为非限制性实例，可以通过任何合适的方法将四环素施用于受试者的眼睛，包括包含四环素的滴眼剂，缓释装置(例如，微泵，颗粒和/或药物贮库)和包含以下成分的含药隐形眼镜：四环素。在一些实施方案中，将四环素系统性地(例如，通过饮用水或静脉内注射)施用给受试者。四环素可局部施用(例如，以乳膏形式)或通过皮下泵(例如，将四环素递送至特定组织)施用。
实现特定治疗效果所需的重组病毒(例如慢病毒、α病毒、牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒或AAV)病毒体的剂量，例如，以基因组拷贝数/每公斤体重(GC/kg)计的剂量单位将基于若干因素而变化，包括但不限于：重组病毒(例如慢病毒、腺病毒、α病毒、牛痘病毒、逆转录病毒、疱疹病毒或AAV)病毒体施用途径、实现治疗效果所需的基因或RNA表达水平、所治疗的具体疾病或障碍，以及基因或RNA产物的稳定性。基于上述因素以及其他因素，本领域的技术人员可以容易地确定治疗患有特定疾病或障碍的患者的重组病毒(例如慢病毒、α病毒、牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒或AAV病毒体)剂量范围。
有效量的重组病毒(例如慢病毒、α病毒、牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒或AAV)是足以靶向感染动物，靶向期望组织的量。在一些实施方案中，有效量的重组病毒(例如慢病毒、α病毒、牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒或AAV)是足以产生稳定的体细胞转基因动物模型的量。有效量将主要取决于诸如物种、年龄、体重、受试者的健康状态和要靶向的组织等因素，并因此可以在动物和组织之间变化。例如，重组病毒(例如慢病毒、α病毒、牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒或AAV)的有效量通常为约1ml至约100ml含有约109至1016个基因组拷贝的溶液。在一些情况下，约1011至1013个重组病毒(例如慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、α病毒、牛痘病毒、疱疹病毒或AAV)基因组拷贝的剂量是合适的。在某些实施方案中，1010或1011个重组病毒(例如慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、α病毒、牛痘病毒、疱疹病毒或AAV)基因组拷贝有效地靶向眼组织(例如视网膜组织)。在一些情况下，稳定的转基因动物通过多剂量的重组病毒(例如慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、α病毒、牛痘病毒、疱疹病毒或AAV)产生。
在一些实施方案中，给受试者施用重组病毒(例如慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、α病毒、牛痘病毒或AAV)的剂量每日历日(例如24小时期间)不超过一次。在一些实施方案中，给受试者施用重组病毒(例如慢病毒、α病毒、牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒或AAV)的剂量每2、3、4、5、6或7个日历日不超过一次。在一些实施方案中，给受试者施用重组病毒(例如慢病毒、α病毒、牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒或AAV)的剂量每日历周(例如7个日历日)不超过一次。在一些实施方案中，给受试者施用重组病毒(例如慢病毒、α病毒、牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒或AAV)的剂量不超过两周一次(例如两个日历周一次)。在一些实施方案中，给受试者施用重组病毒(例如慢病毒、α病毒、牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒或AAV)的剂量每日历月不超过一次(例如30个日历日一次)。在一些实施方案中，给受试者施用重组病毒(例如慢病毒、α病毒、牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒或AAV)的剂量每六个日历月不超过一次。在一些实施方案中，给受试者施用重组病毒(例如慢病毒、腺病毒、α病毒、牛痘病毒、逆转录病毒、疱疹病毒或AAV)的剂量每日历年(例如365天或闰年366天)不超过一次。
在一些实施方案中，重组病毒(例如慢病毒、α病毒、牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒或AAV)组合物被配制成减少组合物中AAV颗粒的聚集，特别是在存在高重组病毒(例如慢病毒、α病毒、牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒或AAV)浓度(例如～1013GC/ml或更高)的情况下。可以使用用于减少聚集的适当方法，包括例如添加表面活性剂、pH调节、盐浓度调节等(参见例如Wright FR等人,Molecular Therapy(2005)12,171–178，其内容以引用方式并入本文)。
作为非限制性实例，已证明经由AAV递送转基因对人类是可行且无毒的。例如，可以将AAV递送到眼睛。参见例如Smalley Nat Biotechnol.2017Nov 9；35(11):998-999。
药学上可接受的赋形剂和载体溶液的配制是本领域的技术人员熟知的，正如开发适当的给药和治疗方案以在各种治疗方案中使用本文所述的特定组合物。通常，这些制剂可包含至少约0.1％的活性化合物或更多，但是一种或多种活性成分的百分比当然可以变化，并且可以方便地为总制剂重量或体积的约1％或2％至约70％或80％或更多。自然地，活性化合物在各治疗上有用的组合物中的量能够按使得以任何给定的化合物单位剂量得到合适剂量的方式制备。制备此类药用制剂的技术人员应当考虑诸如溶解度、生物利用率、生物半衰期、施用途径、产品保存期及其他药理学考虑因素，因此，多种剂量和治疗方案可能是希望的。
在一些实施方案中，将能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的核酸(例如工程化核酸)(例如表达载体)，包含OCT4、KLF4和/或SOX2的工程化细胞，编码Oct4、KLF4和/或SOX2的工程化蛋白质，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的化学剂，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的抗体和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)，例如在本文中公开的合适配制的药物组合物中，直接递送至靶组织，例如直接递送至感兴趣的组织(例如，眼，耳，鼻，口，包括牙龈和牙根，骨，肺，乳房(breast)，乳房(udder)，胰腺，胃，食道，肌肉，包括心肌，肝，血管，皮肤，包括毛发，心脏，脑，神经组织，肾，睾丸，前列腺，阴茎，泄殖腔，鳍，卵巢或肠)。
在一些实施方案中，将能够诱导OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合表达的核酸(例如工程化核酸)(例如表达载体)，包含OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的工程化细胞，编码Oct4、KLF4和/或SOX2的工程化蛋白质，激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的化学剂，激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的抗体和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)，例如在本文中公开的合适配制的药物组合物中，直接递送至靶组织，例如直接递送至感兴趣的组织(例如，眼，耳，鼻，口，包括牙龈和牙根，骨，肺，乳房(breast)，乳房(udder)，胰腺，胃，食道，肌肉，包括心肌，肝，血管，皮肤，包括毛发，心脏，脑，神经组织，肾，睾丸，前列腺，阴茎，泄殖腔，鳍，卵巢或肠)。
在一些实施方案中，编码诱导剂(例如表达载体)的核酸(例如工程化核酸)，包含诱导剂的工程化细胞，编码诱导剂的工程化蛋白质，能够调节活性的化学剂诱导剂和/或编码诱导剂的重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)在本文中公开的合适配制的药物组合物中的化合物直接递送至靶组织，例如直接递送至感兴趣的组织(例如，眼，耳，鼻，口，包括牙龈和牙根，骨，肺，乳房(breast)，乳房(udder)，胰腺，胃，食道，肌肉，包括心肌，肝，血管，皮肤，包括毛发，心脏，脑，神经组织，肾，睾丸，前列腺，阴茎，泄殖腔，鳍，卵巢或肠)。
然而，在某些情况下，可能期望经由另一种途径，例如皮下、胰内、鼻内、肠胃外、静脉内、肌肉内、鞘内或口服、腹膜内或通过吸入分开或另外递送能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达(例如表达载体)的核酸(例如工程化核酸)和/或编码诱导剂的核酸，能够诱导选自OCT4、KLF4的转录因子组合表达的核酸(例如工程化核酸)和/或编码诱导剂的核酸，工程化细胞，工程化蛋白质，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的化学剂，激活(例如诱导表达)选自OCT4、KLF4和SOX2的转录因子组合的化学剂，能够调节(例如，抑制或激活)诱导剂活性的化学剂，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的抗体，激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的抗体，和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)的任一项。在一些实施方案中，可以使用如美国专利号5,543,158；5,641,515和5,399,363(各自具体地通过引用以其整体并入本文)中所述的施用方式递送重组病毒(例如慢病毒，α病毒，牛痘病毒，腺病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)。在一些实施方案中，优选的施用方式是通过基质内注射。
在一些实施方案中，将编码OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合的核酸(例如，mRNA)纳米级化成多聚体，其可用于例如无创气雾吸入和核酸递送到肺部(例如肺上皮)。参见例如，Patel et al.,Adv Mater.2019Jan 4:e1805116.doi:10.1002/adma.201805116关于纳米形式的mRNA多聚体的描述，为此目的通过引用以其整体并入本文。
适于注射应用的药物形式包括无菌水溶液或分散体，以及用于无菌可注射溶液或分散体的临时配制的无菌粉末。也可在甘油、液态聚乙二醇以及它们的混合物和油中制备分散体。在正常储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂，以便阻止微生物的生长。在许多情况下，该形式是无菌的并且是达到易于注射程度的流体。它在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、它们合适的混合物和/或植物油。例如，可通过使用包衣诸如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等预防微生物的作用。在许多情况下，优选的是包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
对于可注射水溶液的施用，例如，溶液可以根据需要进行适当的缓冲处理，并且液体稀释剂首先使用足够的盐水或葡萄糖进行等渗处理。这些特定的水溶液尤其适于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。就这一点而言，可以采用合适的无菌水性介质。例如，可以将一个剂量溶于1ml等渗NaCl溶液中，并加入到1000ml皮下输液中或在指定的输注部位注射(参见例如“Remington's Pharmaceutical Sciences”第15版,第1035-1038和1570-1580页)。取决于宿主的状况，有必要产生剂量上的一些变化。负责施用的人将在任何事件中确定对于各宿主的适当剂量。
通过掺入能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的核酸(例如工程化核酸)(例如表达载体)，工程化细胞，工程化蛋白质，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的化学剂，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的抗体和/或活性重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)来制备无菌注射溶液，例如根据需要在适当的溶剂中以所需量与本文列举的多种其他成分混合，然后过滤灭菌。通过掺入能够诱导OCT4、KLF4、SOX2；或其任何组合表达的核酸(例如工程化核酸)(例如表达载体)，工程化细胞，工程化蛋白质，激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的化学剂，激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的抗体和/或活性重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)来制备无菌注射溶液，例如根据需要在适当的溶剂中以所需量与本文列举的多种其他成分混合，然后过滤灭菌。在某些实施方案中，通过掺入编码诱导剂的核酸(例如工程化核酸)，编码诱导剂的工程化蛋白质，能够调节诱导剂活性的化学剂和/或活性重组体来制备无菌注射溶液。编码诱导剂的病毒(例如，慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)根据需要在适当的溶剂中以所需量与本文列举的多种其他成分混合，然后过滤灭菌。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物包含基本分散介质和以上列举的那些所需的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。
本文公开的包含编码OCT4、KLF4和/或SOX2的核酸(例如工程化核酸)，(例如表达载体)，工程化细胞，工程化蛋白质，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的化学剂，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的抗体，和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)的组合物可以配制成中性或盐形式。本文公开的包含编码OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的核酸(例如工程化核酸)，(例如表达载体)，工程化细胞，工程化蛋白质，激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的化学剂，激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的抗体，和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)的组合物可以配制成中性或盐形式。所述组合物可以包含诱导剂(例如，编码诱导剂的核酸或编码诱导剂的蛋白质和/或编码诱导剂的重组病毒)和/或能够调节诱导剂活性的化学剂。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)并且其与无机酸或有机酸形成，所述无机酸诸如盐酸或磷酸，所述有机酸诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等。与游离羧基形成的盐还可例如源于无机碱，诸如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，以及有机碱诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。在配制后，以与剂量制剂兼容的方式并以治疗有效的量施用该溶液。制剂易于以各种剂型施用，诸如可注射溶液、药物释放胶囊等。
载体包括任何和所有的溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂、缓冲液、载体溶液、悬浮液、胶体等。此类介质和试剂对于药学活性物质的使用在本领域中是公知的。补充的活性成分也可以被引入组合物中。
递送媒介物诸如脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等可用于将本公开的组合物引入合适的宿主细胞中。特别地，能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如表达载体)，任何工程化蛋白质，任何激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的化学剂，任何激活或诱导OCT4、KLF4和/或SOX2的抗体，工程化细胞和/或任何重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)可包封在脂质颗粒，脂质体，囊泡，纳米球或纳米颗粒等中。在一些实施方案中，能够诱导OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如表达载体)，任何工程化蛋白质，任何激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的化学剂，任何激活或诱导OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的抗体，工程化细胞和/或任何重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)可包封在脂质颗粒，脂质体，囊泡，纳米球或纳米颗粒等中。诱导剂(例如，编码诱导剂的核酸或编码诱导剂的蛋白质和/或编码诱导剂的重组病毒)和/或能够调节诱导剂活性的化学试剂可以包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中。
在一些实施方案中，递送媒介物靶向货物。例如，本文所述的任何核酸，工程化蛋白质，化学剂，抗体和/或重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)可通过纳米颗粒递送。将货物递送到特定的组织或细胞类型。例如，已知涂覆有半乳糖聚合物的纳米颗粒由于其内源性β-半乳糖苷酶活性而在衰老细胞内释放其货物。参见例如，Lozano-Torres et al.,J Am Chem Soc.2017Jul 5；139(26):8808-8811。
在一些实施方案中，将核酸，工程化蛋白质，化学剂，抗体和/或重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)中的任何一种配制于聚(糖胺基胺)刷纳米颗粒(poly(glycoamidoamine)brush nanoparticle)中。参见例如，Dong etal.,Nano Lett.2016Feb10；16(2):842-8。
在一些实施方案中，将核酸，工程化蛋白质，化学剂，抗体和/或重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)中的任何一种配制于脂质纳米颗粒中。参见例如，Cullis and Hope Mol Ther.2017Jul 5；25(7):1467-1475。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含一种或多种膜融合蛋白，其将质粒直接递送至细胞质，或者因子OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合可以在有或没有纳米颗粒包封的情况下直接融合到靶向蛋白上。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒是Fusogenix脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒是“包裹的脂质体”(WL)。参见例如，Yamauchi et al.,Biochim BiophysActa.2006Jan；1758(1):90-7。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒是聚乙二醇化脂质体(例如，DOXILTM)(例如，Allen&Hansen,Biochim Biophys Acta.1991Jul 1；1066(1):29-36)，1,2-二油酰基-sn-甘油3磷脂酰乙醇胺(DOPE)，中性辅助脂质磷脂酰乙醇胺(PE)或其组合(例如，Farhood et al.,Biochim Biophys Acta.1995May 4；1235(2):289-95；Zhou&Huang,Biochim Biophys Acta.1994Jan 19；1189(2):195-203.)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒或融合蛋白包括采用分子或蛋白来模仿病毒用于细胞内递送大分子的方法(例如，Kobayashi et al.,Bioconjug Chem.2009May20；20(5):953-9)，例如，使用各种pH敏感肽，例如水泡性口炎病毒蛋白(VSV G)，噬菌体外壳蛋白和/或shGALA和/或融合相关小跨膜(FAST)蛋白，例如禽呼肠孤病毒(ARV)，纳尔逊湾呼肠孤病毒(NBV)和狒狒呼肠孤病毒(BBV)，水痘病毒呼肠孤病毒(AQV)和爬行动物呼肠孤病毒(RRV)和/或Bombesin靶向肽。参见例如，Peisajovich et al.,Eur J Biochem.2002Sep；269(17):4342-50.；Sakurai etal.,2011。另请参见Nesbitt,Targeted Intracellular Therapeutic Delivery UsingLiposomes Formulated with Multifunctional FAST proteins,Western UniversityThesis,2012.https://www.google.com/url？sa＝t&rct＝j&q＝&esrc＝s&source＝web&cd＝14&ved＝2ahUKEwiX-YW5puzfAhXGTd8KHUmCAT0QFjANegQIAhAB&url＝http％3A％2F％2Fir.lib.uwo.ca％2Fcgi％2Fviewcontent.cgi％3Farticle％3D1571％26con text％3Detd&usg＝AOvVaw3A20aOefHfJIJSZRR_-kPD。
在一些实施方案中，将编码OCT4、KLF4、SOX2或其组合的核酸(例如，RNA或DNA，包括质粒)包封在Fusogenix脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，将编码诱导剂(例如rtTA或tTA)的核酸包封在Fusogenix脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含病毒膜蛋白。不受特定理论的束缚，脂质纳米颗粒可以是无毒的，因为它包含不是病毒膜融合蛋白的膜融合蛋白。膜融合蛋白的非限制性实例包括在美国专利号7,851,595，美国专利号8,252,901，国际申请公开号WO 2012/040825和国际申请公开号WO2002/044206中公开的膜融合蛋白。
在一些实施方案中，本发明的组合物(例如，包含编码OCT4、KLF4、SOX2或其组合的核酸)是非病毒递送的。核酸的非病毒递送方法包括脂质转染，核转染，显微注射，生物弹药，病毒体，脂质体，免疫脂质体，聚阳离子或脂质：核酸偶联物，裸核酸(例如RNA或DNA)，人工病毒体和增强剂摄取核酸(例如RNA或DNA)。
在一些实施方案中，阳离子脂质用于递送核酸。阳离子脂质是在生理pH下具有阳离子或正电荷的脂质。阳离子脂质可以采取多种形式，包括但不限于脂质体或胶束。可用于本公开的某些方面的阳离子脂质在本领域中是已知的，并且通常包含极性和非极性域，与聚阴离子结合，例如核酸分子或带负电荷的蛋白质，并且通常已知可促进递送核酸进入细胞。有用的阳离子脂质的实例包括聚乙烯亚胺，聚酰胺基胺(PAMAM)星暴树状大分子，脂转染蛋白(DOTMA和DOPE的组合，参见例如，美国专利号5,049,386、4,946,787和4,897,355)，脂转染酶，
Figure BDA0003089814690001015
(例如，
Figure BDA0003089814690001014
2000,
Figure BDA0003089814690001011
3000,
Figure BDA0003089814690001012
RNAiMAX,
Figure BDA0003089814690001013
LTX)，SAINT-RED(SynvoluxTherapeutics,Groningen Netherlands),DOPE,Cytofectin(Gilead Sciences,Foster City,Calif.)和Eufectins(JBL,San Luis Obispo,Calif.)。示例性阳离子脂质体可以由N-[1-(2,3-二油氧基)-丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N-[1-(2,3-二油氧基)-丙基]-N,N,N-三甲基甲基硫酸铵(DOTAP)、3β-[N-(N',N'-二甲氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、2,3,-二烯氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙胺三氟乙酸盐(DOSPA)、1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵；和二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)制得。阳离子脂质已在本领域中用于将核酸分子递送至细胞(参见例如，美国专利号5,855,910；5,851,548；5,830,430；5,780,053；5,767,099；8,569,256；8,691,750；8,748,667；8,758,810；8,759,104；8,771,728；Lewis etal.1996.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:3176；Hope et al.1998.Molecular MembraneBiology 15:1)。
此外，其他脂质组合物在本领域中也是已知的，包括例如美国专利号4,235,871；美国专利号4,501,728；美国专利号4,837,028；美国专利号4,737,323中所教导的那些。适用于多核苷酸的有效受体识别脂质转染的阳离子脂质和中性脂质包括Feigner,WO 91/17424；WO 91/16024的那些。可以递送至细胞(例如体外或离体施用)或靶组织(例如体内施用)。
脂质:核酸复合物的制备，包括靶向脂质体，例如免疫脂质复合物，是本领域技术人员众所周知的(参见例如，Crystal,Science 270:404-410(1995)；Blaese et al.,Cancer Gene Ther.2:291-297(1995)；Behr et al.,Bioconjugate Chem.5:382-389(1994)；Remy et al.,Bioconjugate Chem.5:647-654(1994)；Gao et al.,Gene Therapy2:710-722(1995)；Ahmad et al.,Cancer Res.52:4817-4820(1992)；美国专利号4,186,183,4,217,344,4,235,871,4,261,975,4,485,054,4,501,728,4,774,085,4,837,028和4,946,787)。
基于聚合物的递送系统也可以用于递送核酸。可以使用包括聚乙烯亚胺(PEI)，壳聚糖，聚(DL-丙交酯)(PLA)和聚(DL-丙交酯-共糖苷)(PLGA)，脱水聚合物和聚甲基丙烯酸酯的聚合物。参见例如，Yang et al.,Macromol Biosci.2012Dec；12(12):1600-14；Ramamoorth et al.,J Clin Diagn Res.2015Jan；9(1):GE01–GE06。作为非限制性实例，可以使用阳离子聚合物。阳离子聚合物是具有净正电荷的聚合物。阳离子聚合物在本领域中是众所周知的，包括在Samal et al.,Cationic polymers and their therapeuticpotential.Chem Soc Rev.2012Nov 7；41(21):7147-94；公开的美国专利申请U.S.2014/0141487 A1,U.S.2014/0141094 A1,U.S.2014/0044793 A1,U.S.2014/0018404 A1,U.S.2014/0005269 A1和U.S.2013/0344117 A1；以及美国专利号8,709,466；8,728,526；8,759,103；和8,790,664(各自的全部内容通过引用并入本文)中描述的那些。示例性的阳离子聚合物包括但不限于聚烯丙胺(PAH)；聚乙烯亚胺(PEI)；聚(L-赖氨酸)(PLL)；聚(L-精氨酸)(PLA)；聚乙烯胺均聚物或共聚物；聚(乙烯基苄基-三-C1-C4-烷基铵盐)；脂肪族或芳脂肪族二卤化物和脂肪族N,N,N',N'-四-C1-C4-烷基-亚烷基二胺的聚合物；聚(乙烯基吡啶)或聚(乙烯基吡啶盐)；聚(N,N-二烯丙基-N,N-二-C1-C4-烷基-卤化铵)；季铵化二-C1-C4-烷基-氨基乙基丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯的均聚物或共聚物；POLYQUADTM；聚氨基酰胺；等。
此类配制剂优选地可用于引入本文所公开的核酸、工程化蛋白质、化学剂、抗体和/或重组病毒(例如慢病毒、腺病毒、α病毒、牛痘病毒、逆转录病毒、疱疹病毒或AAV)的任一项的药学上可接受的配制剂。脂质体的形成和应用通常是本领域技术人员已知的。最近，脂质体被开发为具有改善的血清稳定性和循环半衰期(美国专利号5,741,516)。此外，已经描述了作为潜在药物载剂的脂质体和脂质体样制剂的各种方法(美国专利号5,567,434；5,552,157；5,565,213；5,738,868；和5,795,587)。
脂质体已经成功地用于通常对通过其他方法转染产生抵抗的许多细胞类型。此外，脂质体没有DNA长度限制，其是基于病毒的递送系统中的典型特征。脂质体已经有效地用于将基因、药物、放射治疗剂、病毒、转录因子和变构效应物引入各种培养的细胞系和动物中。此外，已经完成了检验脂质体介导的药物递送的有效性的几个成功的临床试验。
脂质体由在水性介质中分散的磷脂形成并且自动形成多层同心双层囊泡(也称为多层脂质体(MLV))。MLV通常具有25nm至4μm的直径。对MLV进行超声处理导致小的单层囊泡(SUV)的形成，其直径为200至500.ANG.，在核中含有水溶液。
另选地，可以使用重组病毒(例如慢病毒、α病毒、牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒或AAV)的纳米胶囊制剂。纳米胶囊可通常以稳定和可重现的方式包裹物质。为了避免胞内聚合过载引起的副作用，此类超细颗粒(大小约为0.1μm)应当利用能够在体内降解的聚合物来设计。考虑使用满足这些要求的可生物降解的聚烷基氰基丙烯酸纳米颗粒。
试剂盒和相关的组合物
在一些实施方案中，可以将本文所述的核酸、工程化蛋白质、化学剂、抗体和/或重组病毒的任一项组装到药物或诊断或研究试剂盒中，以促进其用于治疗、诊断或研究应用中。试剂盒可以包括容纳本公开的组分和使用说明的一个或多个容器。具体地，此类试剂盒可以包括本文所述的一种或多种试剂，以及描述预期应用和这些试剂的适当用途的说明。在某些实施方案中，试剂盒中的试剂可为适于特定应用和试剂的施用方法的药物制剂和剂量。用于研究目的的试剂盒可以包含用于运行各种实验的适当浓度或量的组分。
在一些实施方案中，本公开涉及用于产生重组病毒(例如，慢病毒，α病毒，牛痘病毒，腺病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)和/或工程化细胞的试剂盒，该试剂盒包含容器容纳编码OCT4、KLF4、SOX2或其组合的工程化核酸(例如工程化核酸)和/或宿主细胞。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含用于产生重组病毒(例如，慢病毒，α病毒，牛痘病毒，腺病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)的说明书和/或用于产生工程化细胞的说明书。在一些实施方案中，试剂盒还包括至少一个容纳重组AAV载体的容器，其中重组AAV载体包含转基因(例如，与眼疾病例如角膜病相关的基因)。
在一些实施方案中，本公开涉及试剂盒，其包含容纳本文所述的任何工程化核酸(例如，表达载体)，化学剂，抗体，工程化细胞或重组病毒的容器。例如，编码KLF4、SOX2、OCT4或其组合的表达载体或重组病毒可包含与SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:105或SEQ IDNO:121至少70％(例如，至少75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％)相同的序列。在一些实施方案中，表达载体或重组病毒编码KLF4、SOX2、OCT4或其组合包含SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:105或SEQ ID NO:121。在一些实施方案中，编码这三种转录因子的表达载体由SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:105或SEQ ID NO:121组成。试剂盒可进一步包含表达载体或编码诱导剂的重组病毒。在一些实施方案中，编码诱导剂的表达载体包含SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32。在一些实施方案中，编码诱导剂的表达载体由SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32组成。参见例如，美国临时申请号62/738,894，标题为“MUTANT REVERSE TETRACYCLINE TRANSACTIVATORS FOR EXPRESSION OF GENES”，其于2018年9月28日提交，代理人案卷号H0824.70300US00，并且其通过引用以其整体并入本文。
试剂盒可被设计成便于研究者使用本文所述的方法并且可以采取多种形式。在适用的情况下，试剂盒的每种组合物能够以液体形式(例如以溶液形式)或以固体形式(例如干粉)提供。在某些情况下，一些组合物可为可组成的或以其他方式可处理的(例如，成为活性形式)，例如通过添加合适的溶剂或其他物类(例如水或细胞培养介质)，其可以与或可以不与试剂盒一起提供。如本文所用，“说明”可定义说明和/或推广的组分，并且典型地涉及本公开包装上的书面说明或与本公开包装相关的书面说明。说明还可以包括以任意方式提供的任意口头或电子说明，使得用户将清楚地认识到该说明将与试剂盒相关联，例如视听(例如录像带、DVD等)、因特网和/或基于web的通信等。书面说明可为监管药品或生物制品的制造、使用或销售的政府机构拟定的形式，该说明还可以反映机构批准针对动物施用的制造、使用或销售。
试剂盒可以在一个或多个容器中包含本文所述的任何一种或多种组分。例如，在一个实施方案中，试剂盒可包括用于混合试剂盒的一种或多种组分和/或分离和混合样品并应用于受试者的说明。试剂盒可包括容纳本文所述的试剂的容器。试剂可为液体、凝胶或固体(粉末)的形式。试剂可以无菌地制备，包装在注射器中并冷藏装运。另选地，其可容纳在小瓶或储存用的其他容器中。第二容器可具有无菌制备的其他试剂。另选地，试剂盒可包括在注射器、小瓶、管或其他容器中预混合并装运的活性剂。试剂盒可以具有将试剂施用给动物所需的一种或多种或所有组分，诸如注射器、局部施用装置或静脉注射(iv)针管和袋，特别是在用于产生特定体动物模型的试剂盒的情况下。
试剂盒可具有多种形式，诸如泡罩袋、收缩包裹袋、真空可密封袋、可密封热成型托盘、或类似的袋或托盘形式，以及松散地包装在袋内的附件、一个或多个管、容器、盒或袋。可在加入附件之后对试剂盒进行灭菌，由此允许容器中的各个附件以其他方式展开。试剂盒可使用任何适当的灭菌技术进行灭菌，诸如辐射灭菌、热灭菌或本领域已知的其他灭菌方法。该试剂盒还可根椐具体应用包括其他组分，例如容器、细胞介质、盐、缓冲液、试剂、注射器、针、用于施用或除去消毒剂的织物诸如纱布、一次性手套，在施用前用于这些试剂的支持物等。
试剂盒中包括的说明书可以涉及用于检测细胞中潜在的AAV的方法。另外，本公开的试剂盒可包括说明书，阴性和/或阳性对照，用于样品的容器，稀释剂和缓冲液，样品制备管以及用于序列比较的参考AAV序列的印刷品或电子表格。
治疗应用
可以使用本文所述的能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的核酸(例如工程化核酸)(例如表达载体)，工程化细胞，工程化蛋白质，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的化学剂，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的抗体和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)的任一种来调节(例如诱导或诱导并终止)细胞重编程、组织修复、组织再生、器官再生、逆转衰老、治疗疾病或其组合。可以使用本文所述的能够诱导选自OCT4、KLF4和SOX2的转录因子的组合(例如OCT4和KLF4、OCT4和SOX2、SOX2和KLF4，或KLF4、OCT4和SOX2)表达的核酸(例如工程化核酸)(例如表达载体)，工程化细胞，工程化蛋白质，激活(例如诱导表达)选自OCT4、KLF4和SOX2的转录因子的组合(例如OCT4和KLF4、OCT4和SOX2、SOX2和KLF4，或KLF4、OCT4和SOX2)的化学剂，激活(例如诱导表达)选自OCT4、KLF4和SOX2的转录因子的组合(例如OCT4和KLF4、OCT4和SOX2、SOX2和KLF4，或KLF4、OCT4和SOX2)的抗体和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)的任一种来调节(例如诱导或诱导并终止)细胞重编程、组织修复、组织再生、器官再生、逆转衰老、治疗疾病或其组合。在一些实施方案中，任何能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的核酸(例如工程化核酸)(例如表达载体)，任何工程化细胞，任何工程化蛋白质，任何激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的化学剂，任何激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的抗体和/或任何重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)可用于调节细胞重编程、组织修复、组织存活、组织再生、组织生长、组织功能、器官再生、器官存活、器官功能或其任何组合，任选地，其中调节包括诱导细胞重编程、逆转衰老、改善组织功能、改善器官功能、组织修复、组织存活、组织再生、组织生长、血管生成、疤痕形成、衰老的外观、器官再生、器官存活、改变来自动物的农产品的味道和质量、治疗疾病或其任何组合，体内或体外可施用于体内的细胞、组织或器官(例如，受试者的一部分)，或可离体施用于细胞、组织或器官。在一些实施方案中，任何能够诱导OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合表达的核酸(例如工程化核酸)(例如表达载体)，任何工程化细胞，任何工程化蛋白质，任何激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的化学剂，任何激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的抗体和/或任何重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)可用于调节细胞重编程、组织修复、组织存活、组织再生、组织生长、组织功能、器官再生、器官存活、器官功能或其任何组合，任选地，其中调节包括诱导细胞重编程、逆转衰老、改善组织功能、改善器官功能、组织修复、组织存活、组织再生、组织生长、血管生成、疤痕形成、衰老的外观、器官再生、器官存活、改变来自动物的农产品的味道和质量、治疗疾病或其任何组合，体内或体外可施用于体内的细胞、组织或器官(例如，受试者的一部分)，或可离体施用于细胞、组织或器官。如本文所用，调节可指任何类型的调节，包括诱导或促进、抑制和/或停止。血管生成是指新血管的生长，包括毛细血管。
在一些情况下，将病毒载体(例如慢病毒载体，α病毒载体，牛痘病毒载体，腺病毒载体，疱疹病毒载体，逆转录病毒载体或AAV载体)以重组病毒(例如慢病毒，α病毒，牛痘病毒，腺病毒，疱疹病毒，逆转录病毒或AAV)。不受特定理论的束缚，OCT4、SOX2和KLF4的瞬时表达可导致细胞的部分重编程。例如，部分重编程可诱导完全分化的细胞恢复活力并获得多能性。在一些实施方案中，OCT4、SOX2和/或KLF4的瞬时表达不诱导干细胞标志物(例如，Nanog)的表达。
在一些实施方案中，OCT4、SOX2、KLF4或其组合的瞬时表达不诱导干细胞标志物(例如，Nanog)的表达。不受任何特定理论的束缚，Nanog激活可诱导畸胎瘤并导致宿主死亡。在一些实施方案中，该方法不诱导畸胎瘤形成。在一些实施方案中，该方法不诱导不希望的细胞增殖。在一些实施方案中，该方法不诱导恶性细胞生长。在一些实施方案中，该方法不诱发癌症。在一些实施方案中，该方法不诱导青光眼。在一些实施方案中，瞬时表达至多为1小时，5小时，24小时，2天，3天，4天，5天或1周。在一些情况下，OCT4、SOX2和KLF4的延长表达(例如，持续表达至少5天，至少1周或至少1个月)导致细胞的完全重编程。例如，可以将细胞完全重编程为多能细胞(例如，诱导的多能细胞)。在一些情况下，OCT4、SOX2、KLF4或其组合的延长表达(例如，连续表达至少5天，至少1周或至少1个月)导致细胞的完全重编程。例如，可以将细胞完全重编程为多能细胞(例如，诱导的多能细胞)。
不受特定理论的束缚，因为OCT4、SOX2和KLF4的表达，OCT4、SOX2和KLF4的表达可促进细胞重编程，促进组织再生，促进器官再生，逆转衰老，治疗疾病或其任何组合。引起部分重编程。如本文所用，细胞的部分或不完全重编程是指不是干细胞但具有年轻特征的细胞。在一些实施方案中，年轻特征是类似于年轻细胞的表观基因组。在一些实施方案中，与不是干细胞的细胞相比，干细胞显示出更高水平的Nanog表达。在一些实施方案中，年轻特征是指细胞的复兴而不改变细胞身份。参见例如，图16中所示，其中组蛋白和Chaf(染色质组装因子)基因的表达在衰老的小鼠的耳成纤维细胞中的衰老过程中(12个月或15个月)与年轻小鼠的相比降低了。OSKM(3天)或OSK表达(5天)诱导可以将其基因表达水平重置为年轻状态，而无需使细胞成为干细胞(例如，在这些细胞中不诱导Nanog表达)。
为了实施该实施方案，有效量的能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，工程化蛋白质，激活(例如，诱导OCT4、KLF4和/或SOX2的表达，激活(例如诱导OCT4、KLF4和/或SOX2的抗体)和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，将逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)施用至细胞、组织、器官和/或受试者。在一些实施方案中，有效量的能够诱导OCT4、KLF4、SOX2或其组合表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，工程化蛋白质，活化的化学剂(例如，诱导OCT4、KLF4、SOX2或其组合的表达，激活OCT4、KLF4、SOX2或其组合的抗体和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)施用给细胞、组织、器官和/或受试者。可以将工程化细胞施用于任何组织，器官和/或受试者。当表达载体包含诱导型启动子(例如，TRE启动子，包括TRE3G，TRE2或P紧密型)时，诱导剂也可以被引入细胞中(例如，与一种或多种核酸同时或依次引入(例如，编码OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合的核酸)。在一个实施方案中，OCT4、SOX2和KLF4由一个表达载体编码，该表达载体与编码诱导剂的表达载体分开。在一些情况下，诱导剂由编码OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合的相同表达载体编码。
在一些情况下，诱导剂(例如，编码诱导剂的核酸，编码诱导剂的工程化蛋白质或编码诱导剂的病毒)和/或化学剂(例如四环素)还能够将能够调节(例如，激活或抑制)诱导剂活性的能力引入细胞、组织、器官和/或受试者中。在某些实施方案中，在存在或不存在能够调节诱导剂(例如，四环素，包括强力霉素)的活性的化学剂的情况下，进一步培养细胞、组织、受试者和/或器官。对于Tet-On系统，诱导剂可以是rtTA(例如，rtTA3或rtTA4)，并且在四环素存在下，诱导剂促进OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合的表达。对于Tet-Off系统，诱导剂可以是tTA，并且在不存在四环素的情况下，诱导剂促进OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合的表达。
施用编码本文所述的转录因子的表达载体，以及在某些情况下诱导剂(例如，编码诱导剂或作为蛋白质的诱导剂的核酸(例如工程化核酸))和/或化学剂在合适的表达条件下能够调节诱导剂活性的表达可以使细胞中转基因的表达增加至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少100％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％或至少1,000％。基因表达可以通过常规方法确定，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)，western印迹和RNA定量(例如，逆转录聚合酶链反应)。
在一些实施方案中，可以将能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，本文所述的工程化蛋白质，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的化学剂，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的抗体和/或本文所述的重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒，或AAV)单独或组合地引入离体(例如，不在受试者中)组织、细胞或器官，并且组织，细胞和/或器官可以进一步离体培养。在一些实施方案中，可以将能够诱导OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，本文所述的工程化蛋白质，激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的化学剂，激活(例如诱导表达)OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的抗体和/或本文所述的重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒，或AAV)单独或组合地引入离体(例如，不在受试者中)组织、细胞或器官，并且组织，细胞和/或器官可以进一步离体培养。在一些情况下，将诱导剂和/或能够调节诱导剂活性的化学剂离体引入组织、细胞和/或器官，并且可以进一步离体培养组织、细胞和/或器官。在一些实施方案中，培养工程化细胞以产生工程化组织。在一些实施方案中，培养工程化细胞以产生工程化器官。在一些实施方案中，培养工程化组织以产生工程化器官。这些方法可用于生产工程化的(例如眼，耳，鼻，口，包括牙龈和牙根，骨，肺，乳房(breast)，乳房(udder)，胰腺，胃，食道，肌肉，包括心肌，肝，血管，皮肤，包括毛发，心脏，脑，神经组织，肾，睾丸，前列腺，阴茎，泄殖腔，鳍，卵巢或肠)细胞，工程化的(例如，眼，耳，鼻，口，包括牙龈和牙根，骨，肺，乳房(breast)，乳房(udder)，胰腺，胃，食道，肌肉，包括心肌，肝，血管，皮肤，包括毛发，心脏，脑，神经组织，肾，睾丸，前列腺，阴茎，泄殖腔，鳍，卵巢或肠)组织或器官(例如眼，耳，鼻，口，包括牙龈和牙根，骨，肺，乳房(breast)，乳房(udder)，胰腺，胃，食道，肌肉，包括心肌，肝，血管，皮肤，包括毛发，心脏，脑，神经组织，肾，睾丸，前列腺，阴茎，泄殖腔，鳍，卵巢或肠)以移植到受试者体内。在一些实施方案中，将工程化细胞，组织和/或器官移植到受试者中。
在一些实施方案中，待工程化的细胞、组织、器官或其任何组合对于受试者是自体的，例如，从需要其的受试者获得。与非自体细胞，非自体组织和/或非自体细胞的施用相比，自体细胞，自体组织，自体器官或其任何组合的施用可导致细胞、组织、器官或其任何组合的减少的排斥。自体器官。或者，要工程化的细胞，组织或器官可以是同种异体细胞，同种异体组织或同种异体器官。例如，同种异体细胞，同种异体组织，同种异体器官或其任何组合可以源自供体(例如，来自特定物种)，并被施用于不同于供体的受体(例如，来自相同物种)。在一些实施方案中，同种异体细胞，同种异体组织，同种异体器官或其任何组合可以源自特定物种的供体受试者，并从与该供体不同的物种施用于受体受试者。
在一些实施方案中，工程化细胞是干细胞(iPSC)，其包括可以分为三个胚层的幼稚iPSC。在一些实施方案中，iPSC进一步分化成另一种细胞类型(例如，眼，耳，鼻，口，包括牙龈和牙根，骨，肺，乳房(breast)，乳房(udder)，胰腺，胃，食道，肌肉，包括心肌，肝，血管，皮肤，包括毛发，心脏，脑，神经组织，肾，睾丸，前列腺，阴茎，泄殖腔，鳍，卵巢或肠)。可以使用本领域已知的方法(例如，离体)进一步区分iPSC。
在一些实施方案中，工程化细胞包含一种以上的细胞类型(例如，眼，耳，鼻，口，包括牙龈和牙根，骨，肺，乳房(breast)，乳房(udder)，胰腺，胃，食道，肌肉，包括心肌，肝，血管，皮肤，包括毛发，心脏，脑，神经组织，肾，睾丸，前列腺，阴茎，泄殖腔，鳍，卵巢或肠)。
作为非限制性实例，编码OCT4、KLF4和SOX2的任何工程化核酸(例如裸核酸或配制在递送载体中的核酸，包括病毒载体和/或纳米颗粒)可以是递送至细胞(例如，分化的细胞)以产生诱导多能干细胞。在一些实施方案中，诱导多能干细胞被进一步分化(例如，分化为眼，耳，鼻，口，包括牙龈和牙根，骨，肺，乳房(breast)，乳房(udder)，胰腺，胃，食道，肌肉，包括心肌，肝，血管，皮肤，包括毛发，心脏，脑，神经组织，肾，睾丸，前列腺，阴茎，泄殖腔，鳍，卵巢或肠细胞)。在一些实施方案中，将细胞离体工程化并施用于需要其的受试者。在一些实施方案中，可以使用iPSC在体外再生器官或组织，并且将该器官或组织移植到个体中。
作为非限制性实例，本文所述的方法可用于离体产生工程化皮肤，工程化肝，工程化眼睛，工程化肝，任何工程化细胞，任何工程化器官或任何工程化组织。所述工程化器官，工程化组织，工程化器官或其任何组合可以施用于受试者。在一些实施方案中，施用工程化细胞，工程化组织，工程化器官或其组合改善了受试者的存活率(例如，相对于不接受工程化细胞，组织或器官，增加了受试者的寿命)。
可将本文所述的药物组合物施用给有此需要的受试者。受试者的非限制性实例包括任何动物(例如哺乳动物，包括人)。受试者可被怀疑患有状况，处于状况的风险中，或患有状况。例如，状况可为损伤或疾病，并且状况可影响任何组织(例如耳、鼻、口(包括齿龈和齿根)、骨、肺、乳房、乳房、胰腺、胃、食管、肌肉(包括心肌)、肝、血管、皮肤(包括毛发)、心脏、脑、神经组织、肾、睾丸、前列腺、阴茎、泄殖腔、鳍、卵巢或肠)。状况、疾病和障碍的非限制性实例包括急性损伤、神经变性疾病、慢性疾病、增殖性疾病、心血管疾病、遗传病、炎性疾病、自身免疫性疾病、神经学疾病、血液学疾病、疼痛状况、精神障碍、代谢障碍、癌症、衰老、年龄相关的疾病以及影响受试者中任何组织的疾病。在一些实施方案中，疾病是眼疾病。
在某些实施方案中，能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，本文所述的工程化蛋白质，激活(例如，诱导OCT4、KLF4和/或SOX2的表达)的化学剂，激活(例如诱导OCT4、KLF4和/或SOX2的表达)的抗体和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒)可以在疾病发作之前(例如，预防疾病或防止对细胞，组织或器官的损害)单独或组合地将本文所述的病毒(或AAV)或AAV引入受试者。在某些实施方案中，能够诱导OCT4表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)；等等。KLF4；SOX2；或其任何组合，本文所述的工程化蛋白质，激活(例如诱导OCT4表达)的化学剂；KLF4；SOX2；抗体，或其任何组合，可激活(例如诱导)OCT4的抗体；KLF4；SOX2；或其组合，和/或本文所述的重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)，单独或组合使用，可在患者发病前引入受试者。疾病(例如，预防疾病或防止对细胞，组织或器官的损害)。
在某些实施方案中，可以在疾病发作之前将诱导剂和/或能够调节诱导剂活性的化学剂引入受试者。在一些实施方案中，所述受试者可以是健康受试者。在某些实施方案中，能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，本文所述的工程化蛋白质，激活(例如，诱导其表达的)化学剂。OCT4、KLF4和/或SOX2，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的抗体和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或在疾病发作之后(例如，以减轻与疾病有关的损害或症状)，可以将本文所述的AAV)单独或组合引入受试者。在某些实施方案中，能够诱导OCT4表达的任何核酸(例如工程化核酸)；等等。KLF4；SOX2；或其表达的任何组合，本文所述的工程化蛋白质，激活(例如诱导OCT4表达)的化学剂；KLF4；SOX2；抗体，或其任何组合，可激活(例如诱导)OCT4的抗体；KLF4；SOX2；或其单独的或组合的和/或本文所述的重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)，可以在疾病发作后被引入受试者(例如，以减轻与疾病有关的损害或症状)。在一些实施方案中，在疾病发作之前诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达。在一些实施方案中，OCT4的表达；KLF4；SOX2；或在疾病发作之前诱导其任何组合。在一些实施方案中，在疾病发作后诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达。在一些实施方案中，OCT4的表达；KLF4；SOX2；或在疾病发作后诱导其任何组合。在一些实施方案中，在年轻受试者，年轻细胞，年轻组织和/或年轻器官中诱导了OCT4、KLF4和/或SOX2表达。在一些实施方案中，在老年受试者，老年细胞，老年组织和/或老年器官中诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达。在一些实施方案中，OCT4的表达；KLF4；SOX2；在年轻的受试者，年轻的细胞，年轻的组织和/或年轻的器官中诱导了“抗氧化剂”或其任何组合。在一些实施方案中，OCT4的表达；OCT4的表达；OCT4的表达。KLF4；SOX2；或在老年受试者，老年细胞，老年组织和/或老年器官中诱导其任何组合。在某些实施方案中，可以在疾病发作后将诱导剂和/或能够调节诱导剂活性的化学剂引入受试者。
在某些实施方案中，可以认为该组织是健康的，但是在当前或未来条件下(例如，在农业中，或包括疾病治疗，毒性疗法，日光照射或地球大气外的太空旅行在内的不利条件)在表现或存活方面欠佳。
在某些实施方案中，状况是衰老。所有动物通常经历一段生长和成熟期，紧接着一段进行性和不可逆的生理衰退，以死亡告终。从出生到死亡的时间长度被称为生物体的寿命期，并且每种生物体具有特征性平均寿命。衰老是时间流逝基础上变化的物理表现，如由平均寿命的百分比所测量。
在一些情况下，衰老的特征可以是相当明显的。例如，年老的人的特征包括皮肤皱纹、头发花白、脱发和白内障，以及色素沉着过多、骨质疏松症、大脑皮层萎缩、淋巴衰竭、胸腺萎缩，II型糖尿病、动脉粥样硬化、癌症和心脏病的发病率增高。Nehlin等人(2000),Annals NY Acad Sci 980:176-79。哺乳动物衰老的其他方面包括体重减轻、脊柱后凸(驼背脊椎)、缺乏活力、淋巴萎缩、骨密度减小、真皮增厚和皮下脂肪组织、耐受应力(包括热或冷、创伤、麻醉和造血前体细胞消融)能力降低、肝脏病理、小肠绒毛萎缩、皮肤溃疡、淀粉样沉积物和关节疾病。Tyner等人(2002),Nature 415:45-53。
本领域的技术人员认识到衰老过程也表现在细胞水平以及线粒体中。细胞衰老表现为倍增能力丧失、细胞凋亡水平提高、分化表型改变和代谢改变，例如蛋白质合成和周转水平降低。
考虑到细胞和生物体衰老的程序化性质，可以借助于与衰老相关的表型特征来评价细胞或生物体的“生物学年龄”。例如，可从以下模式推导生物学年龄：基因表达、抗应激性(例如氧化性或基因毒应激)、细胞增殖速率、以及细胞的代谢特征(例如，蛋白质合成和周转速率、线粒体功能、泛醌生物合成、胆固醇生物合成、细胞内ATP水平、细胞内克雷布斯循环中间物水平、葡萄糖代谢、核酸(例如工程化核酸)代谢、核糖体翻译速率等)。如本文所用，“生物学年龄”是基于细胞或生物体的分子特征的细胞或生物体的年龄的量度。生物学年龄不同于“时间年龄”，其是指如由天、月和年所测量的细胞或生物体的年龄。
可通过多种方法，例如通过以下项中的一种或多种来确定生物体，例如无脊椎动物(例如蠕虫或苍蝇)或脊椎动物(例如啮齿动物，例如小鼠)的衰老速度：a)评估细胞或生物体的寿命；(b)评估具有生物学年龄依赖性表达模式的细胞或生物体中基因转录物或基因产物的存在或丰度；(c)评价细胞或生物体对应激，例如基因毒应激(例如依托泊苷、紫外线照射、暴露于诱变剂等)或氧化应激的抗性；(d)评价细胞或生物体的一种或多种代谢参数；(e)评价生物体中存在的细胞或一组细胞的增殖能力；和(f)评价细胞或生物体的物理外观或行为。在一个示例中，评价衰老速度包括直接测量一组动物(例如一组遗传匹配的动物)的平均寿命，并将所得平均值与对照组动物(例如，未接受测试化合物但与接受测试化合物的动物组遗传匹配的一组动物)的平均寿命进行比较。另选地，可以通过测量与年龄相关的参数来确定生物体的衰老速度。年龄相关的参数的实例包括：外观，例如可见的衰老迹象；一个或多个基因或蛋白质(例如具有年龄相关表达模式的基因或蛋白质)的表达；耐氧化应激性；代谢参数(例如，蛋白质合成或降解、泛醌生物合成、胆固醇生物合成、ATP水平、葡萄糖代谢、核酸代谢、核糖体翻译速率等)；以及细胞增殖(例如，视网膜细胞、骨细胞、白细胞等的增殖)。
衰老还可以生物标志物(例如表观遗传标志，其包括基因组中CpG岛的DNA甲基化水平(称为“Horvath Clock”)，细胞中的β-半乳糖苷酶阳性细胞，基因表达变化或血液中分子丰度的某些变化)的变化速率来确定。一个示例是Segterra Inc.的算法，该算法根据血液生物标记物确定“InnerAge”(请参阅InsideTracker.com)。
如本文的实施例中所示，编码OCT4、KLF4和SOX2的重组病毒(例如AAV)促进轴突的再生，其可用于预防或减轻通常与衰老相关的神经变性。所述方法可用于预防或减轻神经变性和相关的周围神经病变。神经变性疾病包括帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、亨廷顿病和肌肉萎缩症。神经变性可以使用本领域已知的任何方法定量。例如，可以确定个体的执行功能(Moreira et al.,Front AgingNeurosci.2017Nov9；9:369)。
在一些实施方案中，相对于对照，如本文所述的OCT4、SOX2、KLF4或其组合的表达，诱导或激活增加了组织，器官或受试者中每条神经的轴突的数量。在一些实施方案中，本文描述的方法相对于对照，将每条神经的轴突的数量增加至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍。至少8倍，至少9倍，至少10倍，至少20倍，至少30倍，至少40倍，至少50倍，至少60倍，至少70倍，至少80倍，至少90倍或至少100倍。在一些实施方案中，对照是在表达，诱导或激活OCT4、SOX2、KLF4或其组合之前，组织，器官或受试者中每条神经中轴突的数目。
可以治疗的与年龄有关的其他状况包括心力衰竭，中风，糖尿病，肝病，纤维化疾病，骨质疏松症，关节炎，听力损失(部分或全部)，与眼睛有关的状况(例如，视敏度差，视网膜疾病，任何眼部疾病(例如，任何影响眼睛的疾病)，青光眼，肌肉疾病(例如，肌肉减少症和肌肉营养不良)，虚弱，早衰综合症(例如，Hutchinson-Gilford早衰综合症)和癌症。在某些实施方案中，该疾病是视网膜疾病(例如，黄斑变性)。
在一些实施方案中，相对于不表达、不诱导OCT4、SOX2、KLF4或其组合的激活的神经元，在神经元中OCT4、SOX2、KLF4或其组合的表达，诱导或激活使神经元的神经突区域增加至少1.5倍，至少2倍，至少3倍。至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍，至少10倍，至少20倍，至少30倍，至少40倍，至少50倍，至少60倍，至少70倍，至少80倍，至少90倍或至少100倍。
在一些实施方案中，相对于对照，如本文所述的OCT4、SOX2、KLF4或其组合的表达，诱导或激活增加了组织，器官或受试者中的轴突密度。在一些实施方案中，本文描述的方法相对于对照，将轴突密度增加至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍。至少9倍，至少10倍，至少20倍，至少30倍，至少40倍，至少50倍，至少60倍，至少70倍，降低至少80倍，至少90倍或至少100倍。在一些实施方案中，对照是在表达，诱导或激活OCT4、SOX2、KLF4或其组合之前的组织，器官或受试者中的轴突密度。
在一些实施方案中，相对于对照，OCT4、SOX2、KLF4或其组合的表达，诱导或激活增加了受试者的视敏度。在一些实施方案中，本文所述的方法相对于对照，将受试者的视敏度提高至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍。至少8倍，至少9倍，至少10倍，至少20倍，至少30倍，至少40倍，至少50倍，至少60倍，至少70倍，至少80倍，至少90倍或至少100倍。在一些实施方案中，对照是受试者在表达，诱导或激活OCT4、SOX2、KLF4或其组合之前的视敏度。在一些实施例中，视敏度是通过视敏度来测量的。在一些实施例中，使用模式视网膜电图响应来测量视敏度。在一些实施例中，使用远距离视敏度测试来测量视敏度，其中可以包括使用Snellen图表或E图表。参见例如，Marsden et al.,Community EyeHealth.2014；27(85):16和以下实施例。
在一些实施方案中，相对于对照，OCT4、SOX2、KLF4或其组合的表达，诱导或激活降低了受试者的眼压。在一些实施方案中，本文所述的方法相对于对照，将受试者的眼内压降低至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍。至少8倍，至少9倍，至少10倍，至少20倍，至少30倍，至少40倍，至少50倍，至少60倍，至少70倍，至少80倍，至少90倍或至少100倍。在一些实施方案中，对照是在表达，诱导或激活OCT4、SOX2、KLF4或其组合之前受试者的眼内压。参见例如下面的
实施例
在一些实施方案中，能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，工程化细胞，工程化蛋白质，激活(例如，诱导OCT4、KLF4和/或SOX2的表达，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的抗体和/或重组病毒(例如本文所述的慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)可用于治疗和/或预防本文所述的任何疾病。在一些实施方案中，还使用诱导剂和/或能够调节诱导剂活性的化学剂。
作为非限制性实例，本发明的工程化细胞可用于替代有此需要的受试者中的功能异常的细胞。作为另一个非限制性实例，能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，能够诱导至少两种(例如，至少三种)选自OCT4、KLF4和SOX2的转录因子，工程化蛋白质，激活(例如诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达)的的化学剂组合，激活(例如，诱导表达)选自OCT4、KLF4和SOX2的至少两种(例如，至少三种)转录因子的化学剂组合，激活(例如，诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达)的抗体，激活(例如诱导表达)选自OCT4、KLF4和SOX2的至少两个(例如，至少三个)转录因子的组合的抗体和/或重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒病毒，疱疹病毒或AAV)可用于在体内或体外对细胞进行重新编程(例如，不完全或完全)。在一些实施方案中，还使用诱导剂和/或能够调节诱导剂活性的化学剂。例如，能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的任何核酸(例如工程化核酸)中的任何一个(例如，表达载体)，工程化蛋白质，激活(例如，诱导其表达)的化学剂OCT4、KLF4和/或SOX2，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的抗体和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)可用于产生工程化细胞(例如，诱导多能干细胞)。例如，能够诱导OCT4、KLF4、SOX2或其组合表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，工程化蛋白质，激活(例如，诱导其表达)的化学剂OCT4、KLF4、SOX2或其组合，激活(例如诱导OCT4、KLF4、SOX2或其组合的抗体)和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)可用于产生工程化细胞(例如，诱导多能干细胞)。然后可以将工程化细胞(例如，诱导多能干细胞)给予需要其的受试者。在一些实施方案中，在诱导剂和/或能够调节诱导剂活性的化学剂的存在下培养工程化细胞。在一些实施方案中，还将诱导剂和/或能够调节该诱导剂活性的化学剂施用于受试者。
能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，诱导表达选自OCT4，KLF4和SOX2的至少两种(例如，至少三种)转录因子的组合，工程化细胞，工程化蛋白质，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2表达的化学剂的组合，激活(例如诱导表达)选自OCT4、KLF4和SOX2的至少两种(例如，至少三种)转录因子的化学剂组合，工程化细胞，激活(例如诱导表达)OCT4，KLF4和/或SOX2的抗体，激活(例如诱导表达)选自OCT4、KLF4和SOX2的至少两种(例如至少三种)转录因子的组合的抗体和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒例如，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)，包括伤口愈合，出血，受伤，骨头骨折，枪伤，割伤，手术中的疤痕(例如剖宫产)。在一些实施方案中，还使用诱导剂和/或能够调节诱导剂活性的化学剂。
在一些实施方案中，使用能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的核酸(例如工程化核酸)(例如表达载体)，能够诱导选自OCT4、KLF4和SOX2的转录因子的至少两种(例如至少三种)的组合表达的核酸，工程化细胞，工程化蛋白质，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的化学剂，激活(例如诱导表达)选自OCT4、KLF4和SOX2的转录因子的至少两种(例如至少三种)的组合的化学剂，激活(例如诱导表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的抗体，激活(例如诱导表达)选自OCT4、KLF4和SOX2的转录因子的至少两种(例如至少三种)的组合的抗体，和/或重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)的任一种治疗影响非人类受试者的疾病(例如，影响牲畜，家养宠物和/或其他非人类动物的疾病)。在一些实施方案中，还使用诱导剂和/或能够调节诱导剂活性的化学剂。例如，该疾病可以是牛疾病，灵长类动物(例如食蟹猴，恒河猴)疾病，影响与商业有关的动物(例如牛，猪，马，绵羊，山羊，猫和/或狗)的疾病，和/或影响鸟类(例如与商业相关的鸟类，例如鸡，鸭，鹅和/或火鸡)的疾病。
在一些实施方案中，能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，能够诱导选自OCT4、KLF4和SOX2的至少两种(例如，至少三种)转录因子的组合，工程化细胞，工程化蛋白质，激活(例如诱导表达)OCT4，KLF4和/或SOX2的化学剂，激活(例如，诱导表达)选自OCT4、KLF4和SOX2的至少两种(例如，至少三种)转录因子的化学剂的组合，激活(例如，诱导其表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的抗体，激活(例如诱导表达)选自OCT4、KLF4和SOX2的至少两种(例如，至少三种)转录因子的组合的抗体和/或重组病毒(例如本文所述的，慢病毒，腺病毒，α病毒，痘苗病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)用于促进伤口愈合(例如，用于割伤)，治疗损伤(例如，骨折，出血，枪击伤和/或减少手术过程中的疤痕形成)。在一些实施方案中，手术包括剖宫产。在一些实施方案中，还使用诱导剂和/或能够调节诱导剂活性的化学剂。
在一些实施方案中，能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，能够诱导选自OCT4、KLF4和SOX2的至少两种(例如，至少三种)转录因子的组合，工程化细胞，工程化蛋白质，激活(例如诱导OCT4 KLF4和/或SOX2表达)的化学剂，激活(例如，诱导表达)选自OCT4、KLF4和SOX2的至少两种(例如，至少三种)转录因子的组合的化学剂，激活(例如，诱导其表达)OCT4、KLF4和/或SOX2的抗体，激活(例如诱导表达)选自OCT4、KLF4和SOX2的至少两个(例如，至少三个)转录因子的组合的抗体和/或本文所述的重组病毒(例如，慢病毒，腺病毒，α病毒，痘苗病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)，可用于治愈损伤和/或炎症。在一些实施方案中，还使用诱导剂和/或能够调节诱导剂活性的化学剂。在一些实施方案中，炎症是过度炎症，这可能是衰老的副作用。在一些实施方案中，过度炎症是发炎的。
在一些实施方案中，能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，工程化细胞，工程化蛋白质，激活(例如诱导OCT4，KLF4和/或SOX2的表达)化学试剂，激活(例如诱导OCT4，KLF4和/或SOX2的表达)的抗体和/或重组病毒(例如本文所述的慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)具有治愈能力。
在一些实施方案中，能够诱导OCT4、KLF4、SOX2或其组合表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，工程化细胞，工程化蛋白质，活化化学剂(例如，诱导OCT4、KLF4、SOX2或其组合的表达)，活化(例如诱导OCT4、KLF4、SOX2或其组合的抗体)和/或重组病毒(例如本文所述的慢病毒，腺病毒，α病毒，痘苗病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)提供治愈能力。
在一些实施方案中，能够诱导OCT4、KLF4、SOX2或其组合表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，工程化细胞，工程化蛋白质，活化化学剂(例如诱导OCT4、KLF4、SOX2或其组合表达)，激活(例如诱导OCT4、KLF4、SOX2或其组合的表达)抗体和/或重组病毒(例如本文所述的慢病毒，腺病毒，α病毒，痘苗病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)可用于增强或恢复最佳或次最佳器官。作为非限制性实例，编码OCT4、KLF4、SOX2或其组合的本文所述的任何组合物(例如，包括重组AAV病毒的重组病毒)可用于增强或使次优器官(例如，来自老年个体)恢复活力。用于移植或在运输过程中促进器官存活或在将器官重新植入受试者后促进器官存活的物质。
能够诱导OCT4、KLF4、SOX2或其组合表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，工程化细胞，工程化蛋白质，激活(例如诱导)的化学剂OCT4、KLF4、SOX2或其组合的表达，激活(例如诱导OCT4、KLF4、SOX2或其组合的表达)的抗体和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒)本文所述的“逆转录病毒”，“逆转录病毒”，“疱疹病毒”或“AAV”可用于恢复或增加用于移植的细胞(例如造血干细胞，T细胞等)的存活率和寿命。在一些实施方案中，编码OCT4、KLF4、SOX2或其组合的重组病毒(例如，AAV病毒)可用于使移植中使用的细胞(例如，造血干细胞，T细胞等)恢复活力或增加其存活和寿命。
在一些实施方案中，在此所述的能够诱导OCT4、KLF4、SOX2或其组合表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，工程化细胞，工程化蛋白质，活化化学剂(例如诱导OCT4、KLF4、SOX2或其组合的表达)，激活(例如诱导OCT4、KLF4、SOX2或其组合的表达)的抗体和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，痘苗病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)用于预防或减轻受试者中毒素和/或药物(例如化学疗法)的副作用。副作用的非限制性实例包括脱发和周围神经病。化学疗法包括长春新碱(VCS)。参见例如，实施例15。在某些实施方案中，施用包含编码SOX2、KLF4，OCT4或其组合的重组病毒(例如，AAV病毒)的组合物以治疗(例如，从中恢复)或预防由毒素和/或破坏性药物疗法(例如包括VCS的化学疗法药物)诱导的副作用。
在一些实施方案中，在此所述的能够诱导OCT4、KLF4、SOX2或其组合表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，工程化细胞，工程化蛋白质，活化化学剂(例如诱导OCT4、KLF4、SOX2或其组合的表达)，激活(例如诱导OCT4、KLF4、SOX2或其组合的表达)的抗体和/或重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)施用给受试者以预防或减轻毒素和/或药物的副作用(例如化学疗法)。
在一些实施方案中，能够诱导OCT4、KLF4、SOX2或其组合表达的任何核酸(例如工程化核酸)(例如，表达载体)，工程化细胞，工程化蛋白质，活化化学剂(例如，诱导OCT4；KLF4；SOX2表达)，抗体，或其任何组合，可激活(例如诱导OCT4；KLF4；SOX2表达)的抗体；或其任何组合，和/或本文所述的重组病毒(例如慢病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒，逆转录病毒，疱疹病毒或AAV)施用于受试者以保护其组织，器官和/或全身受治疗者免受辐射(例如，防止辐射的破坏作用)。在某些实施方案中，将编码OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合的AAV施用给受试者以保护受试者的组织，器官和/或整个身体免受放射线保护(例如，防止放射线的破坏作用)。
用于鉴定怀疑患有状况的受试者的方法可包括身体检查、受试者的家庭病史、受试者的病史、活组织检查、遗传测试、病原体或微生物组，蛋白质组学的DNA测序或多种成像技术，诸如超声波检查、计算机断层扫描、磁共振成像、磁共振波谱或正电子成像。
如本领域技术人员所认识到，工程化核酸(例如表达载体，包括病毒载体)、病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、逆转录病毒、α病毒、牛痘病毒或AAV)或它们的组合物的有效量根据施用途径、赋形剂使用以及与其他活性剂的共同使用而变化。待施用的量取决于待治疗的受试者，包括例如受试者的年龄、状况的严重程度、受试者的体重、受试者的遗传学、待靶向的细胞、组织或器官，或它们的任何组合。
在一些实施方案中，本文描述的方法不诱导畸胎瘤形成。在一些实施方案中，在受试者，组织或器官中OCT4、SOX2、KLF4或其组合的表达或OCT4、SOX2、KLF4或其组合的激活导致至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少100％畸胎瘤形成的减少，与受试者，组织或器官中OCT4，SOX2，KLF4或其组合和c-MYC的表达或OCT4，SOX2，KLF4或其组合和c-MYC的激活相比。在一些实施方案中，在受试者，组织或器官中OCT4、SOX2和KLF4的表达或OCT4、SOX2和KLF4的激活导致至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少100％的畸胎瘤形成的减少，与受试者，组织或器官中OCT4，SOX2和KLF4的表达以及c-MYC或OCT4，SOX2，KLF4和c-MYC的激活相比。在一些实施方案中，在OCT4、SOX2、KLF4或其组合表达或OCT4、SOX2、KLF4的激活后，受试者，组织或器官中的畸胎瘤的数目或畸胎瘤的大小是相同的或者减少，相比于在激活或表达OCT4、SOX2、KLF4或其组合之前在受试者，组织或器官中的畸胎瘤的数量或畸胎瘤的大小。
在一些实施方案中，本文描述的方法不诱导不想要的细胞增殖。在一些实施方案中，有害细胞增殖是异常细胞增殖，其可以是良性或癌性的。在一些实施方案中，与使用c-Myc表达或激活的相同方法相比，在受试者，组织或器官中OCT4、SOX2、KLF4或其组合的表达或激活OCT4、SOX2、KLF4或其组合可将受试者，组织或器官中有害的细胞增殖减少至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少100％。在一些实施方案中，受试者，组织或器官中不需要的细胞增殖在受试者中表达OCT4、SOX2、KLF4或其组合或激活OCT4、SOX2、KLF4或其组合后是相同的或被减少，与在激活或表达OCT4、SOX2、KLF4或它们的组合之前在受试者，组织或器官中有害细胞增殖的量相比。
在一些实施方案中，本文描述的方法不诱导肿瘤形成或肿瘤生长。在一些实施方案中，在受试者，组织或器官中OCT4、SOX2、KLF4或其组合的表达或OCT4、SOX2、KLF4或其组合的激活减少了肿瘤的数目或肿瘤的大小。至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少与使用c-Myc表达或激活的相同方法相比，可降低90％或至少100％。在一些实施方案中，在表达OCT4、SOX2、KLF4或其组合或激活OCT4、SOX2、KLF4后，受试者，组织或器官中的肿瘤数目或肿瘤大小相同或减小。与在激活或表达OCT4、SOX2、KLF4或它们的组合之前在受试者，组织或器官中的肿瘤数目或肿瘤大小相比，在受试者，组织或器官中的“肿瘤”或其组合。在一些实施方案中，本文描述的方法不诱发癌症。在一些实施方案中，本文描述的方法不诱导青光眼。
本文还提供了重编程的方法。在一些实施方案中，本文所述的重编程方法包括使细胞、组织、器官或受试者的表观遗传时钟逆转或恢复活力。在一些实施例中，表观遗传时钟可以被部分或完全反转。在一些实施方案中，使用基于DNA甲基化的年龄(DNAmAGE或DNAm年龄)来测量细胞、组织、器官或受试者的表观遗传时钟。在一些实施方案中，本文描述的方法将细胞的DNAmAge年龄降低1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％。
在一些实施方案中，本文所述的重编程方法包括改变与衰老相关的一种或多种基因的表达。在一些实施方案中，基因的表达增加至少1％，至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少100％。在一些实施方案中，基因的表达降低了至少1％，至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少100％。在一些实施方案中，相对于该方法执行之前一种或多种基因的表达来确定一种方法执行之后一种或多种基因的表达。在一些实施方案中，相对于年轻细胞，年轻受试者，年轻组织，年轻器官或其任何组合中一种或多种基因的表达来确定一种或多种基因的表达。在一些实施方案中，相对于老细胞，老受试者，老组织，老器官或其任何组合中的一种或多种基因的表达来确定一种或多种基因的表达。
与衰老相关的基因可以是与年轻的对应物相比其在老的，老的组织，老的器官，老的受试者或其任何组合中表达改变的基因。在一些实施方案中，与衰老相关的基因是1700031P21Rik,1810053B23Rik,2900045O20Rik,2900060B14Rik, 4921504E06Rik,4930402F11Rik, 4930453C13Rik,4930455B14Rik, 4930500H12Rik, 4930549P19Rik,4930555B11Rik,4930556J02Rik, 4932442E05Rik, 4933431K23Rik, 4933438K21Rik,6720475M21Rik, 9830132P13Rik, A430010J10Rik, A530064D06Rik,A530065N20Rik,Abcb5,Abhd17c,AC116759.2,AC131705.1,AC166779.3,Acot12,Adig,Akr1cl,Ankrd1,Asb15,Atp2c2,AU018091,AW822073,Btnl10,C130093G08Rik,C730027H18Rik,Ccdc162,Chil6,Col26a1,Corin,Crls1,Cybrd1,Cyp2d12,Cyp7a1,D830005E20Rik,Dlx3,Dnah14,Dsc3,Dthd1,Eid2,Eps8l1,EU599041,Fam90a1a,Fancf,Fau-ps2,Fezf1,Gja5,Gm10248,Gm10513,Gm10635,Gm10638,Gm10718,Gm10722,Gm10800,Gm10801,Gm11228,Gm11251,Gm11264,Gm11337,Gm11368,Gm11485,Gm11693,Gm12793,Gm13050,Gm13066,Gm13323,Gm13339,Gm13346,Gm13857,Gm14387,Gm14770,Gm15638,Gm16072,Gm16161,Gm16181,Gm17200,Gm17791,Gm18025,Gm18757,Gm18795,Gm18848,Gm19719,Gm20121,Gm20356,Gm2093,Gm21738,Gm21940,Gm22933,Gm24000,Gm24119,Gm25394,Gm26555,Gm27047,Gm28262,Gm28530,Gm29295,Gm29825,Gm29844,Gm3081,Gm32051,Gm32122,Gm33056,Gm33680,Gm34354,Gm34643,Gm3551,Gm36660,Gm36948,Gm37052,Gm37142,Gm37262,Gm37535,Gm37569,Gm37589,Gm37647,Gm37648,Gm37762,Gm38058,Gm38069,Gm38137,Gm38218,Gm39139,Gm42535,Gm42680,Gm42895,Gm42994,Gm43027,Gm43158,Gm43288,Gm43366,Gm44044,Gm44081,Gm44187,Gm44280,Gm44535,Gm45338,Gm45644,Gm45740,Gm46555,Gm46565,Gm4742,Gm47485,Gm47853,Gm47992,Gm48225,Gm48314,Gm48383,Gm48673,Gm48804,Gm48832,Gm4994,Gm5487,Gm5724,Gm595,Gm6012,Gm6024,Gm7669,Gm7730,Gm8043,Gm8953,Gm9348,Gm9369,Gm9495,H2al2a,Ido2,Igfbp1,Kif7,Klhl31,Lrrc31,Mc5r,Mgam,Msh4,Mucl2,Mug1,Mybl2,Myh15,Nek10,Neurod6,Nr1h5,Olfr1042,Olfr1043,Olfr1082,Olfr1090,Olfr1124,Olfr1167,Olfr1205,Olfr1206,Olfr1223,Olfr1263,Olfr1264,Olfr1269,Olfr127,Olfr1291-ps1,Olfr1406,Olfr1469,Olfr215,Olfr273,Olfr328,Olfr355,Olfr372,Olfr390,Olfr427,Olfr456,Olfr466,Olfr481,Olfr522,Olfr6,Olfr601,Olfr603,Olfr706,Olfr727,Olfr728,Olfr741,Olfr801,Olfr812,Olfr816,Olfr822,Olfr860,Olfr890,Olfr923,Olfr943,Otogl,Pi15,Pkhd1,Pkhd1l1,Platr6,Pou3f4,Prr9,Pvalb,Rhag,Sav1,Serpinb9b,Skint1,Skint3,Skint5,Slc10a5,Slc6a4,Smok2a,Tcaf3,Tomm20l,Trcg1,Trdn,Ugt1a6a,Usp17la,Vmn1r178,Vmn1r179,Vmn1r33,Vmn1r74,Vmn1r87,Vmn2r102,Vmn2r113,Vmn2r17,Vmn2r52,Vmn2r66,Vmn2r68,Vmn2r76,Vmn2r78,Wnt16,0610040J01Rik,1700080N15Rik,2900064F13Rik,4833417C18Rik,4921522P10Rik,4930447C04Rik,4930488N15Rik,Ace,Ackr1,Acot10,Acvr1,Adamts17,Adra1b,AI504432,Best3,Boc,Cadm3,Cand2,Ccl9,Cd14,Cd36,Cfh,Chrm3,Chrna4,Cntn4,Cracr2b,Cryaa,CT573017.2,Cyp26a1,Cyp27a1,D330050G23Rik,D930007P13Rik,Ddo,Dgkg,Dlk2,Dnaja1-ps,Drd2,Dsel,Dytn,Ecscr,Edn1,Ednrb,Efemp1,Elfn2,Epha10,Ephx1,Erbb4,Fam20a,Fbxw21,Ffar4,Flt4,Fmod,Foxp4,Fzd7,Gabrd,Galnt15,Galnt18,Gfra2,Ggt1,Gm10416,Gm14964,Gm17634,Gm2065,Gm32352,Gm33172,Gm34280,Gm35853,Gm36298,Gm36356,Gm36937,Gm3898,Gm42303,Gm42484,Gm42537,Gm42743,Gm43151,Gm43843,Gm44545,Gm44722,Gm45516,Gm45532,Gm47494,Gm47982,Gm47989,Gm48398,Gm48495,Gm48593,Gm48958,Gm49089,Gm49326,Gm49331,Gm49760,Gm5796,Gm6374,Gm7276,Gm8237,Gm9796,Gm9954,Gpr75,Gprc5c,Grid2ip,Gsg1l2,Hapln4,Hcn3,Hcn4,Hhatl,Hs6st2,Htr3a,Il1rap,Il1rapl2,Inka1,Kbtbd12,Kcnj11,Kcnk4,Kdelc2,Klhl33,Lamc3,Lilra5,Lman1l,Lrfn2,Lrrc38,Lrrn4cl,Ltc4s,Mansc1,Mir344c,Msr1,Mycbpap,Myoc,Ngfr,Nipal2,Olfr1372-ps1,Otop3,P2rx5,P2ry12,P4ha2,Pcdha12,Pcdha2,Pcdhac2,Pcdhb18,Pcdhb5,Pcsk2os1,Pcsk6,Perp,Pkp1,Plxna4,Prickle2,Qsox1,Rapgef4os2,Rbp4,Rcn3,Sec14l5,Sel1l3,Serpinh1,Sgpp2,Shisa6,Siah3,Siglech,Slc12a4,Slc24a2,Slc2a5,Slc4a4,Slitrk3,Smagp,Smoc2,Speer4b,Spon2,Sstr2,Sstr3,St3gal3,Stc1,Stc2,Syndig1,Syt10,Thsd7a,Tlr8,Tmem132a,Tmem132d,Tmem200a,Tmem44,Trpc4,Trpv4,Unc5b,Vgf,Vmn1r90,Vwc2l,Wfikkn2,Wnt11,Wnt6,Zeb2os,Zfp608,Zfp976,或其任何组合。在一些实施方案中，该基因是感觉基因。
在一些实施方案中，本文描述的方法减少0610040J01Rik，1700080N15Rik，2900064F13Rik，4833417C18Rik，4921522P10Rik，4930447C04Rik，4930488N15Rik，Ace，Ackr1，Acot10，Acvr1，Adamts17，Adra2d，Best2ad，Bad2ad Ccl9，Cd14，Cd36，Cfh，Chrm3，Chrna4，Cntn4，Cracr2b，Cryaa，CT573017.2，Cyp26a1，Cyp27a1，D330050G23Rik，D930007P13Rik，Ddo，Dgkg，Dlk2，Dnaja1-ps，Drd2，Dsel，Esel，Dsel Ednrb，Efemp1，Elfn2，Epha10，Ephx1，Erbb4，Fam20a，Fbxw21，Ffar4，Flt4，Fmod，Foxp4，Fzd7，Gabrd，Galnt15，Galnt18，Gfra2，Ggt1，Gm10416，Gm14964，Gm17634，Gm2065 Gm35853，Gm36298，Gm36356，Gm36937，Gm3898，Gm42303，Gm42484，Gm42537，Gm42743，Gm43151，Gm43843，Gm44545，Gm44722，Gm45516，Gm45532，Gm47494，Gm47982，Gm47989、48m，48m，48m，48m，48m Gm49760，Gm5796，Gm6374，Gm7276，Gm8237，Gm9796，Gm9954，Gpr75，Gprc5c，Grid2ip，Gsg1l2，Hapln4，Hcn3，Hcn4，Hhatl，Hs6st2，Htr3a，Ilra p，Il1rapl2，Inka1，Kbtbd12，Kcnj11，Kcnk4，Kdelc2，Klhl33，Lamc3，Lilra5，Lman1l，Lrfn2，Lrrc38，Lrrn4cl，Ltc4s，Mansc1，Mir344c，Msr1，Mycbpfr，Nioc1，Ops2-Mypspal，Myocpal，Noc2，Op2，Op1 P2rx5，P2ry12，P4ha2，Pcdha12，Pcdha2，Pcdhac2，Pcdhb18，Pcdhb5，Pcsk2os1，Pcsk6，Perp，Pkp1，Plxna4，Prickle2，Qsox1，Rapgef4os2，Rbp4，Rcn3，Sec1，Sh1，Sh1，Sh1，Sh1，Sh1，Slc12a4、Slc24a2，Slc2a5，Slc4a4、Slitrk3，Smagp，Smoc2，Speer4b，Spon2，Sstr2，Sstr3，St3gal3，Stc1，Stc2，Syndig1，Syt10，Thsd7a，Tlr8，memm132a，Tmem4a，Tmem132a，Tmem4a，Tmem4a4，Tmem132a，Tmem4a，Tmem4a，Tmem4a，Tmem4a，Tmem4a Vgf，Vmn1r90，Vwc21，Wfikkn2，Wnt11，Wnt6，Zeb2os，Zfp608，Zfp976或其任何组合的表达。参见例如表5与衰老相关的基因。
在一些实施方案中，本文描述的方法增加了1700031P21Rik,1810053B23Rik,2900045O20Rik,2900060B14Rik,4921504E06Rik,4930402F11Rik,4930453C13Rik,4930455B14Rik,4930500H12Rik,4930549P19Rik,4930555B11Rik,4930556J02Rik,4932442E05Rik,4933431K23Rik,4933438K21Rik,6720475M21Rik,9830132P13Rik,A430010J10Rik,A530064D06Rik,A530065N20Rik,Abcb5,Abhd17c,AC116759.2,AC131705.1,AC166779.3,Acot12,Adig,Akr1cl,Ankrd1,Asb15,Atp2c2,AU018091,AW822073,Btnl10,C130093G08Rik,C730027H18Rik,Ccdc162,Chil6,Col26a1,Corin,Crls1,Cybrd1,Cyp2d12,Cyp7a1,D830005E20Rik,Dlx3,Dnah14,Dsc3,Dthd1,Eid2,Eps8l1,EU599041,Fam90a1a,Fancf,Fau-ps2,Fezf1,Gja5,Gm10248,Gm10513,Gm10635,Gm10638,Gm10718,Gm10722,Gm10800,Gm10801,Gm11228,Gm11251,Gm11264,Gm11337,Gm11368,Gm11485,Gm11693,Gm12793,Gm13050,Gm13066,Gm13323,Gm13339,Gm13346,Gm13857,Gm14387,Gm14770,Gm15638,Gm16072,Gm16161,Gm16181,Gm17200,Gm17791,Gm18025,Gm18757,Gm18795,Gm18848,Gm19719,Gm20121,Gm20356,Gm2093,Gm21738,Gm21940,Gm22933,Gm24000,Gm24119,Gm25394,Gm26555,Gm27047,Gm28262,Gm28530,Gm29295,Gm29825,Gm29844,Gm3081,Gm32051,Gm32122,Gm33056,Gm33680,Gm34354,Gm34643,Gm3551,Gm36660,Gm36948,Gm37052,Gm37142,Gm37262,Gm37535,Gm37569,Gm37589,Gm37647,Gm37648,Gm37762,Gm38058,Gm38069,Gm38137,Gm38218,Gm39139,Gm42535,Gm42680,Gm42895,Gm42994,Gm43027,Gm43158,Gm43288,Gm43366,Gm44044,Gm44081,Gm44187,Gm44280,Gm44535,Gm45338,Gm45644,Gm45740,Gm46555,Gm46565,Gm4742,Gm47485,Gm47853,Gm47992,Gm48225,Gm48314,Gm48383,Gm48673,Gm48804,Gm48832,Gm4994,Gm5487,Gm5724,Gm595,Gm6012,Gm6024,Gm7669,Gm7730,Gm8043,Gm8953,Gm9348,Gm9369,Gm9495,H2al2a,Ido2,Igfbp1,Kif7,Klhl31,Lrrc31,Mc5r,Mgam,Msh4,Mucl2,Mug1,Mybl2,Myh15,Nek10,Neurod6,Nr1h5,Olfr1042,Olfr1043,Olfr1082,Olfr1090,Olfr1124,Olfr1167,Olfr1205,Olfr1206,Olfr1223,Olfr1263,Olfr1264,Olfr1269,Olfr127,Olfr1291-ps1,Olfr1406,Olfr1469,Olfr215,Olfr273,Olfr328,Olfr355,Olfr372,Olfr390,Olfr427,Olfr456,Olfr466,Olfr481,Olfr522,Olfr6,Olfr601,Olfr603,Olfr706,Olfr727,Olfr728,Olfr741,Olfr801,Olfr812,Olfr816,Olfr822,Olfr860,Olfr890,Olfr923,Olfr943,Otogl,Pi15,Pkhd1,Pkhd1l1,Platr6,Pou3f4,Prr9,Pvalb,Rhag,Sav1,Serpinb9b,Skint1,Skint3,Skint5,Slc10a5,Slc6a4,Smok2a,Tcaf3,Tomm20l,Trcg1,Trdn,Ugt1a6a,Usp17la,Vmn1r178,Vmn1r179,Vmn1r33,Vmn1r74,Vmn1r87,Vmn2r102,Vmn2r113,Vmn2r17,Vmn2r52,Vmn2r66,Vmn2r68,Vmn2r76,Vmn2r78,Wnt16,或其任何组合的表达。
本公开的方面涉及包括在体外重置老细胞，老器官，老组织和/或其任何组合的转录谱的方法。本公开的方面涉及包括在体内重置老细胞，老器官，老组织，老受试者和/或其任何组合的转录谱的方法。在一些实施方案中，重置老细胞，老器官，老组织，老受试者和/或其任何组合的转录谱包括改变与衰老相关的一种或多种基因的基因表达。在一些实施方案中，将转录谱重置为老细胞，老器官，老组织，老受试者和/或其任何组合包括反转表观遗传时钟。在一些实施方案中，老细胞的转录概况被重置。在一些实施方案中，将老细胞，老器官，老组织，老受试者或其任何组合的转录概况重置为年轻细胞，年轻组织，年轻器官，年轻受试者或年轻细胞的转录概况。它们的任何组合。在一些实施方案中，本文所述的方法逆转了在老细胞，老器官，老组织，老受试者或其任何组合与对照之间检测到的基因表达的一个或多个改变。在一些实施方案中，对照是年轻细胞，年轻器官，年轻组织，年轻受试者或其任何组合。在一些实施方案中，老细胞，老器官，老组织，老受试者或其任何组合的转录概况与年轻的对应物有所不同。在一些实施例中，本文描述的方法重置至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少有90％或100％的基因表达在老细胞，老器官，老组织，老受试者或其任何组合中的变化达到年轻的水平。在一些实施方案中，感觉基因是感觉受体基因。不受特定理论的束缚，将衰老细胞中的传感器受体基因表达水平重置为年轻水平可以指示视网膜神经节细胞功能的改善。
在一些方面，本文所述的细胞重编程方法可用于促进细胞的转分化，这可用于治疗疾病。在一些实施方案中，本文描述的方法可以提高现有的转分化方法的效率。例如，OCT4、SOX2、KLF4或其组合可以与一种或多种影响细胞命运以促进谱系重编程或转化为另一种细胞类型的基因扰动一起在一种细胞类型中被激活(例如表达)。在一些实施例中，摄动是减少谱系确定因子的表达。在一些实施例中，扰动是谱系确定因子的表达。在一些实施方案中，谱系确定因子是谱系转录因子。
作为非限制性实施例，夜盲症是由视杆细胞死亡引起的，而白天盲症是由视锥细胞死亡引起的。可以将包括视锥细胞，视杆细胞和穆勒细胞的细胞类型重新编程为恢复视敏度所需的另一种细胞类型。例如，Nrl的丢失促进成年视杆细胞向视锥细胞的转分化。参见例如Montana et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2013Jan 29；110(5):1732-7。在一些实施方案中，促进视杆细胞命运的转录因子包括Otx2，Crx和Nrl。作为非限制性实施例，可以通过表达β-连环蛋白，Otx2，Crx和Nrl将Müller胶质细胞(MG)重编程为视杆细胞。参见例如，Yao et al.,Nature.2018Aug；560(7719):484-488。
作为另一个非限制性实施例，可以将胰腺α重编程为用于治疗自身免疫疾病和糖尿病的β细胞。转录因子(包括Pdx1和MafA)可用于将小鼠α细胞重编程为β细胞。参见例如，Xiao et al.,Cell Stem Cell.2018Jan4；22(1):78-90.e4。
用于产生各种细胞类型的转分化诱导因子的其他非限制性实施例可以在
Figure BDA0003089814690001271
et al.,Biochim Biophys Acta Mol Cell Res.2017Jul；1864(7):1359-1369中找到，其通过引用整体并入本文。参见例如
Figure BDA0003089814690001272
et al.,BiochimBiophys Acta Mol Cell Res.2017Jul；1864(7):1359-1369的表4。
与对照相比，OCT4、SOX2、KLF4或其组合的诱导可以使细胞的转分化效率提高至少1％，至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少100％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％或至少1000％，包括介于两者之间的所有值。可以通过任何合适的方法来测量转分化的效率，所述方法包括与对照细胞对比当OCT4、SOX2、KLF4或其组合被激活时转分化的细胞的百分比，其中所述对照细胞中OCT4、SOX2、KLF4或其组合未激活。
通过考虑以下实施例，将进一步理解本发明的这些和其他方面，它们旨在说明本发明的某些特定实施方案，但不旨在限制如由权利要求所限定的其范围。
实施例
为了可以更充分地理解本公开，阐述了以下示例。提供本申请中描述的合成和生物学实施例以举例说明本文提供的化合物、药物组合物和方法，并且不应以任何方式解释为限制其范围。
实施例1：开发用于在哺乳动物细胞中诱导表达OCT4、SOX2和KLF4(OSK)的腺病毒相关病毒(AAV)载体。
如本文所述，开发了能够在哺乳动物细胞中表达OCT4、SOX2和KLF4的AAV载体。如图1中所示，此类载体包含TRE3G启动子(SEQ ID NO:7)，编码OCT4、SOX2、KLF4的核酸(例如工程化核酸)和SV40polyA(SV40pA)终止子序列(SEQ ID NO:8)。该载体将称为TRE3G-OSK-SV40pA。编码自切割肽(T2A，2A肽，SEQ ID NO:9)的核酸(例如工程化核酸)序列用于分离编码OCT4、SOX2和KLF4的核酸(例如工程化核酸)。如图2中所示，整个载体的长度为7,408个碱基对，并且两个反向末端重复(ITR)位于OSK序列的侧翼。载体中的限制酶消化位点在图3中绘出。将图4A-4AL的载体图中所示的特征定位到载体的核酸(例如工程化核酸)序列上的示意图示于图2-3中。限制酶切割位点显示在下表3中。如图5A-5D中所示，编码OSK和间插2A肽(T2A肽)的开放阅读框(ORF框3)为3,610个碱基对。
表3.TRE3G-OSK-SV40pA载体中的限制性酶切割位点。
酶 位点 位置
AatII 1 4033
Acc65I 1 6074
AfeI 1 5333
AflII 1 2847
AleI 1 5656
BbvCI 1 5098
BclI 1* 4246*
BmtI 1 3349
Bpu10I 1 5098
BsaBI 1* 6098*
BspQI 1 1436
BsrDI 1 371
BstAPI 1 4016
BstXI 1 4667
BstZ17I 1 5078
EcoRI 1 1893
KpnI 1 6078
NheI 1 3345
NotI 1 2276
PaeR7I 1 4449
PflFI 1 3546
RsrII 1 3542
SacII 1 3765
SapI 1 1436
ScaI 1 7358
SexAI 1* 2330*
SpeI 1 5907
Tth111I 1 3546
XhoI 1 4449
ZraI 1 4031
使用常规方法克隆图3和4A-4AL中所示的载体。简而言之，使用侧翼限制性位点合成来自Clonetech的TRE3G启动子序列(SEQ ID NO:7)，设计引物以从TetO-FUW-OSKM质粒中克隆OSK，并添加终止密码子。为了使载体更短，合成了具有侧翼限制性切割位点的短SV40序列。常规的编码OSK的AAV载体超出了AAV的包装极限，仅可以包装到具有低滴度的AAV9衣壳中(少于2x10^12个颗粒/病毒制剂)，并且如图17中所示，由于可能的截短，低滴度的病毒无功能性。图3和4A-4AL中描绘的载体产生的病毒超过2x10^12病毒部分/制剂，或1x10^13/mL(数据未显示)。
为了确定OSK载体是否可以用于在哺乳动物细胞中的诱导型OSK表达，使用常规方法将OSK载体包装到不同血清型的AAV病毒(AAV9(图6A)，AAV2(图6B)和AAV.PhP.b(图6C))中。产生了另外一批具有编码rtTA3的载体的AAV9和AAV.PHP.b病毒(Tet-On系统)和具有编码tTA的载体的AAV2病毒(Tet-Off系统)。然后，将哺乳动物293T细胞与OSK病毒以及rtTA3或tTA病毒的相同血清型一起感染。随后用或不用强力霉素(DOX)处理细胞，并用针对OCT4、KLF4和H3的抗体通过western印迹测定OCT4、KLF4和加载对照H3的表达。
如图6A中以Tet-On系统所示，强力霉素处理增加了用编码OSK和rtTA3的AAV9病毒感染的293T细胞中OCT4和KLF4的表达。OSK表达也可以用Tet-Off系统控制。DOX处理降低了用OSK AAV2和AAV2(其具有在组成型CAG启动子下驱动tTA表达的载体)感染的293T细胞中OCT4和KLF4的表达(图6B)。此外，即使在刺激转基因表达后，也可以严格控制OSK表达。如图6C的第四泳道中所示，一天的DOX处理足以增加用TRE3G-OSK-SV40pA AAV.PHP.b病毒和用Ubc-rTtA3-p2a-mkate AAV.PHP.b病毒感染的293T细胞中OCT4和KLF4的表达。然而，在DOX处理的一天后去除DOX三天，使OCT4和KLF4表达恢复至未经诱导的水平(图6C的最后泳道)。Ubc-rtTA3-p2a-mkate载体包含驱动rtTA3、自切割2A肽和远红色荧光蛋白(mKate)的表达的组成型Ubc启动子。
因此，开发了允许OSK在哺乳动物细胞(例如，体内)中受控表达的AAV载体。此外，将AAV载体包装成不同的AAV血清型，其成功将功能性载体递送到293T细胞中。
实施例2：编码OSK的AAV以可诱导的方式促进神经挤压后的视神经再生和视网膜神经节细胞(RGC)神经的存活。
为了确定OSK是否可以由AAV递送并在体内诱导表达，通过常规方法产生了具有TRE-OSK-SV40载体的AAV病毒和编码CAG组成型启动子下的tTA的AAV病毒，并将其注射到小鼠的视网膜中。接下来，用针对RBPMS的抗体对光学相干断层扫描(OCT)切片染色以鉴定视网膜神经节细胞(RGC)，并用针对KLF4的抗体进行染色以检测KLF4的表达。如图7A中所示，KLF4在RGC(RBPMS阳性细胞)中表达，这表明载体是有功能的。
还在体内测试了系统的诱导性。在没有DOX处理的情况下，如通过整个视网膜封装染色所确定，OCT4和KLF4在小鼠视网膜中表达(图7B，顶部)。然而，在DOX处理四天后，OCT4和KLF4染色显著减少，表明来自TRE-OSK-SV40载体的表达被关闭(图7B，底部)。因此，可以严格控制OSK载体的表达。
为了确定诱导型OSK表达是否可以诱导神经损害后的部分重编程并促进再生，将具有TRE-OSK-SV40载体的AAV病毒和编码CAG组成型启动子下的tTA的AAV病毒注射到4周龄的小鼠(n＝6)中，如图7C中提供的实验时间线中所示。作为对照，向单独队列的小鼠(n＝2)仅注射OSK病毒。病毒注射后两周，两个队列中均通过视神经挤压引起机械损害。为了通过视神经的荧光显微术追踪轴突再生，将荧光标记的霍乱毒素β-亚基(CTB)眼内注射到小鼠中，并在CTB注射后两天进行灌注。随后实施轴突再生和轴突存活分析。
通过估计每神经的轴突数目来确定轴突再生。如图7D中所示，与仅施用OSK病毒相比，OSK和tTA病毒的共同施用显著促进了远离视神经挤压部位的视神经再生。当比较接受OSK和tTA病毒两者的小鼠与仅接受OSK病毒的小鼠的视神经的荧光强度时，这种效果在视觉上也是显而易见的。来自接受两种病毒的小鼠的视神经的荧光强度高于仅接受OSK病毒的小鼠的视神经的荧光强度，这表明用联合治疗的神经再生更高(图7E-7F)。
为了显示挤压损伤后观察到的轴突再生是由OSK特异性介导的，使用轴突再生实验来比较tTA病毒联合(1)未经DOX处理的TRE-OSK病毒，(2)未经DOX处理的TRE-d2EGFP病毒，以及(3)经DOX处理的TRE-OSK病毒的作用。处理(1)-(3)的实验时间线分别在图8B、8D和8F中示出。荧光标记的CTB用于可视化轴突。如图8A和8G中所示，其中诱导OSK表达的小鼠(在没有DOX的情况下接受OSK和tTA病毒的小鼠)的视神经再生程度在距挤压部位200μm和500μm处非常显著。相反，即使当诱导d2EGFP表达时(在没有DOX的情况下接受d2EGFP和tTA病毒的小鼠)，也观察到最小的再生(图8A和图8C)。值得注意的是，轴突再生取决于OSK表达的诱导。当如图8D中概述用DOX处理小鼠以抑制OSK表达时，tTA和OSK病毒的施用不诱导轴突再生(图8A)。这些经DOX处理的小鼠中CTB标记的轴突的强度类似于接受对照d2EGFP病毒的小鼠(将图8E与图8C进行比较)。因此，基于AAV的可诱导OSK表达系统的施用可用于促进视神经损伤后的再生。
还评估了OSK对视网膜神经节细胞(RGC)存活率的影响。如图9A-9D中所示，OSK显著提高了RGC的存活率。视神经挤压后显示感染OSK和tTA病毒(绿色)或未感染两者(红色)的RGC(RBPMS阳性细胞)，与无OSK感染的细胞相比，挤压后经OSK感染的RGC的存活率高3倍(54％比18％)，从一系列如所示的图片进行定量(图9A)。因此，表达KLF4的RBPMS阳性细胞(经OSK感染的细胞)的百分比在挤压前低于40％，但由于其较高的存活率，在视神经挤压后显著增加至70％左右。而挤压后，经d2EGFP感染的细胞的百分比保持在35-40％。这表明来自OSK表达的强烈的细胞保护作用(图9B)。如图9C中所示，在经d2EGFP或OSK加CAG-tTA(SEQID NO:32)AAV感染的视网膜中，未经挤压的RGC数目(RBPM阳性)没有显著差异，但是在挤压后，与经d2EGFP和CAG-tTA感染的RGC相比，当其经OSK和CAG-tTA感染时显然更多的RGC存活。图9D显示了来自每组的存活的RGC数目的定量。尽管用OSK和CAG-tTA AAV两者感染的细胞低于40％，但与d2EGFP相比，其增加了总生存RGC数目(542相比于323)。
已报道mTOR激活为视神经再生的途径(Parker et al.,Science,322(5903),963-966Nov.2008)。为了确定OSK表达是否激活了mTOR途径，在无损害(未挤压)的情况下和损害后(挤压)，使用针对RBPMS和磷酸化S6(pS6)的抗体对对照和经OSK病毒感染的细胞进行成像。染色的代表性图像显示在图10A中，并且如图10B中进行定量，在视神经挤压后，对照细胞和经OSK感染的细胞之间pS6-阳性细胞的百分比没有显著差异。
实施例3：与AAV Tet-Off系统相比，AAV Tet-On系统在神经挤压后的视网膜细胞中诱导更快的基因表达。
为了比较基于AAV的Tet-On和Tet-Off系统之间的基因表达率，将TRE-d2EGFP病毒和(1)编码tTA的病毒(Tet-Off)或(2)编码rtTA的病毒(Tet-On)施用于4周龄小鼠的视网膜。在Tet-Off系统中，从病毒注射开始给予小鼠DOX，并去除DOX达3天、5天或8天(图11A)。作为对照，Tet-Off系统中的一队列小鼠未给予DOX。需要大约8天的DOX去除以诱导与在Tet-Off系统中无DOX处理相同水平的GFP表达(图11B)。在Tet-On系统中，如图11C中所示处理小鼠。在Tet-On系统中DOX处理仅2天后观察到GFP表达(图11D)。因此，与基于AAV的Tet-Off系统感染相比，在用基于AAV的Tet-On系统感染的小鼠视网膜中诱导转基因表达需要更短的时间段。
实施例4：编码突变体反向四环素反式激活物(rtTA)的AAV载体显示出小鼠肝中的低渗漏性和低毒性。
如图13A-13C中所示，可以在用DOX处理的小鼠肝中成功诱导通过AAV9递送(具有UBC-rtTA4的TRE-OSK)的OCT4、SOX2和KLF4，其以western印迹和免疫染色两者显示。尽管具有OCT4、SOX2、KLF4转基因的小鼠由于肠上皮细胞中普遍性细胞学和结构异常而在强力霉素水诱导2天后死亡(图14)，本文所述的来自OCT4、SOX2和KLF4 AAV的表达在体内未引起毒性或畸胎瘤，即使通过强力霉素在其饮用水中连续表达。当将编码这三种转录因子的AAV9递送到小鼠的整个身体时，三个月未检测到畸胎瘤或体重减轻(图14)。
实施例5：OCT4、SOX2和KLF4的表达在小鼠中诱导部分重编程。
图15A-15B表明，与来自年轻小鼠的耳成纤维细胞相比，来自老年小鼠(12个月或15个月)的耳成纤维细胞中在衰老过程中组蛋白和Chaf(染色质组装因子)基因的表达下降，短期OSKM(3天)或OSK表达(5天)诱导将其基因表达水平重置为年轻状态，而没有使其进入干细胞(例如Nanog未打开)。
编码OSK的常规AAV载体超过AAV的包装极限(例如4.7Kb)，仅可以以低滴度(少于2x10^12颗粒/病毒制剂)包装到AAV9衣壳中，并且由于如图16中所示的可能的截短，低滴度病毒无功能性(例如，未检测到OCT4或KLF4的过表达)。
实施例6：编码突变体反向四环素反式激活物(rtTA)的AAV载体显示出小鼠肝中的低渗漏性。
还使用重组AAV9病毒在体内测试了包含rtTA4(SEQ ID NO:13)的Tet-On系统。使用了包含图13B中所示的组分的两种AAV载体。将图3中所绘的编码与UBC启动子可操作连接的rtTA4的AAV病毒(pAAV-UBC-rtTA4-WPRE3-SV40pA载体以SEQ ID NO:17提供，且SEQ IDNO:17的示例性载体图提供于图12中)和编码AAV TRE3G-OSK-SV40pA载体(SEQ ID NO:16)的AAV病毒施用于小鼠。不用强力霉素或用强力霉素处理小鼠，并收集肝样品。如图13A的免疫荧光图像中所示，在没有强力霉素的情况下，在肝中未检测到KLF4表达。当通过其饮用水用强力霉素处理小鼠时，在肝中检测到KLF4表达(图13A)。这些结果也使用针对OCT4、KLF4和SOX2的抗体通过western印迹确定这些蛋白质的表达得到证实(图13C)。肌动蛋白用作上样对照(图13C)。仅当用强力霉素处理小鼠时，才在肝中检测到OCT4、KLF4和SOX2(图13C)。
实施例7：编码OCT4、SOX2和KLF4(OSK)的经修饰的mRNA诱导小鼠成纤维细胞中OSK的表达。
用编码OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC(OSKM)的经修饰的mRNA成功转染了小鼠成纤维细胞。来自Invitrogen的LipofectamineTMMessengerMAXTM转染试剂用于转染经修饰的mRNA。修饰是用5-甲基胞苷(5mC)完全取代胞苷或用假尿苷(psi)完全取代尿苷。参见例如，Warren et al.,Cell Stem Cell.2010Nov 5；7(5):618-30；Mandal et al.,NatProtoc.2013Mar；8(3):568-82。下表4中提供了所使用的每种RNA的剂量。表4的第一列中的数字1-5对应于图17中的数字1-5。
表4.施用的mRNA的剂量。
Figure BDA0003089814690001341
使用western印迹来证实施用经修饰的mRNA诱导了小鼠成纤维细胞中蛋白质的表达。如图17中所示，将OSK经修饰的mRNA转染到小鼠成纤维细胞中以诱导OCT4、KLF4和SOX2蛋白的表达(NDG和zsGreen是表达绿色荧光蛋白的经修饰的mRNA，以表明转染的效率)。
该实施例显示向小鼠细胞递送编码OCT4、KLF4和SOX2的RNA(例如，mRNA，经修饰的RNA，经修饰的mRNA等)是可行的。这些发现可以扩展到编码OCT4、KLF4和SOX2的mRNA的体内递送。例如，对于体内肌肉递送，使用电穿孔。例如，对于肝和其他内部器官递送，使用包含编码OCT4、KLF4和SOX2的RNA的纳米颗粒。参见例如，Dong et al.,Nano Lett.2016Feb 10；16(2):842-8。
实施例8：细胞的化学重编程。
下面提供了将小鼠胚胎成纤维细胞化学重编程为诱导多能干细胞的方案的非限制性。可以在Zhao et al.,Cell.2015Dec 17；163(7):1678-91中找到类似的方案。图21显示了使用以下提供的方案后的结果。
阶段1
100ng/ml bFGF
0.5mM VPA,
20μM CHIR99021,
10μM 616452,
5 μM反式环丙胺,
50 μM毛喉素,
0.05μM AM580
5μM EPZ004777
在第12天，对细胞进行胰蛋白酶消化，收集，然后以50,000-200,000个细胞/孔重新铺板于6孔板(1:10-15)
在第12-16天期间，bFGF、CHIR和毛喉素的浓度分别降至25ng/ml、10μM和10μM。
在第16天，形成XEN样上皮集落，并将培养物更换为阶段2培养基
阶段2
25ng/ml bFGF,
0.5mM VPA,
10μM CHIR99021,
10μM 616452,
5 μM反式环丙胺,
10 μM毛喉素,
0.05μM AM580,
0.05μM DZNep,
0.5μM 5-aza-dC,
5μM SGC0946
在第28天，将培养物转移到阶段3培养基中。
阶段3
N2B27-2iL培养基
3μM CHIR99021,
1μM PD0325901,
1,000U/ml LIF
再过8-12天后，出现了2i感受态、ESC样和GFP阳性(如果使用pOct4-GFP报告物)CiPSC集落，然后对其进行挑取以进行扩增和表征。
实施例9：视神经挤压损伤后，成年和老年小鼠中OCT4、SOX2和KLF4的表达改善了轴突再生。
使用图22上图中描绘的Tet-Off系统以确定编码TRE-OSK-SV40(SEQ ID NO:16)的载体是否可以用于促进成年(3月龄)和老年(12月龄)小鼠的视神经轴突再生。
将具有TRE-OSK-SV40载体的AAV2病毒和编码CAG组成型启动子下的tTA的AAV2病毒注射到1月龄、3月龄或12月龄小鼠(n＝5-9)的视网膜中，类似于图7C中提供的实验时间线。作为对照，向单独队列的1月龄小鼠(n＝5-6)注射具有AAV2载体TRE-d2EGFP-SV40的AAV2病毒和编码tTA的AAV2病毒。病毒注射后两周，两个队列中均通过视神经挤压引起机械损害。为了通过视神经的荧光显微术追踪轴突再生，在视神经挤压损伤后两周，将荧光标记的霍乱毒素β-亚基(CTB)眼内注射到小鼠中，并在CTB注射后两天进行灌注。随后实施轴突再生分析。
如图23A-23B中所示，相对于施用编码d2EGFP的对照病毒，施用编码OSK的AAV2病毒增加了1月龄(年轻)、3月龄(成年)和12月龄(老年)小鼠中每条神经的估计轴突数目。此外，与对照GFP相比，TRE-OSK病毒还增加了成年(3月龄)和老年(12月龄)小鼠视神经损伤后RGC的存活率(图23C)。因此，在年轻、成年和老年小鼠中神经挤压损伤后，OSK表达出人意料地促进了轴突再生和RGC存活。
接下来，确定了OSK表达时间长度对老年小鼠中轴突再生的影响。在视神经挤压前2周，对小鼠施用tTA病毒和TRE-OSK病毒或TRE-GFP病毒。然后，将荧光标记的霍乱毒素β-亚基(CTB)眼内注射到视神经挤压损伤后五周而不是两周的小鼠中。如图24A-24B中所示，与图23B中损伤后两周OSK表达相比，将损伤后OSK表达的时间长度增加至五周增加了在12月龄的小鼠中每条神经的估计轴突数目。相反，增加损伤后GFP表达的时间长度对轴突再生没有影响(将图24A-24B中的GFP结果与图23A-23B中所示的结果进行比较)。因此，数据表明更长的OSK表达时间可以有益于促进老年小鼠中神经挤压损伤后的轴突再生和RGC存活。
实施例10：视神经挤压损伤后OSK表达的诱导增加了小鼠中的轴突再生和RGC存活。
还确定了视神经挤压损伤后诱导OSK表达是否促进轴突再生和RGC存活。使用图22的图中描绘的Tet-On和Tet-Off系统。在Tet-On系统中，通过常规方法产生具有TRE-OSK-SV40载体的AAV病毒和编码CMV组成型启动子下的rtTA的AAV病毒，并将其注射到小鼠的视网膜中。如图25A所示，在Tet-On系统(上图)中，在视神经挤压损伤之前或在视神经挤压损伤之后，通过给予小鼠强力霉素诱导OSK表达。一队列小鼠未用强力霉素处理作为对照(未诱导)。在Tet-Off系统中，通过常规方法产生具有TRE-OSK-SV40载体的AAV病毒和编码CAG组成型启动子下的tTA的AAV病毒，并将其注射到小鼠的视网膜中。如图25A中所示，在Tet-Off系统(下图)中，视神经挤压损伤后OSK表达受到抑制。使用荧光标记的霍乱毒素β-亚基(CTB)注射以可视化轴突。
如图25B中所示，与未诱导OSK或者仅通过Tet-On或Tet-Off系统在损伤之前(损伤前)诱导OSK相比，通过Tet-On系统诱导在损伤后诱导OSK表达显著增加了每条神经的估计轴突数目。此外，与未诱导OSK相比或者与仅通过Tet-On或Tet-Off系统在损伤前诱导OSK相比，损伤后对OSK表达的诱导显著增加了RBPMS+细胞的存活(图25C)。因此，图25A上图中描绘的Tet-On系统在视神经挤压损伤促进轴突再生和RGC存活后，允许暂时控制OSK的表达并诱导OSK。不受特定理论的束缚，当从损伤中复原不需要立即表达OCT4、KLF4和/或SOX2时，在损伤后使用Tet-Off系统诱导OCT4、KLF4和SOX2表达可以促进再生。
实施例11：与个别转录物相比，来自单个转录物的OCT4、SOX2和KLF4(OSK)表达在促进轴突再生方面具有优异的效果。
与单独或在单独的启动子下组合的OCT4、SOX2、KLF4的表达相比，该实施例探索了在一个启动子下表达OCT4、SOX2和KLF4的效果。将编码在CAG组成启动子下的tTA的AAV病毒和编码(1)在TRE启动子下的OCT4，(2)在TRE启动子下的SOX2，(3)在TRE启动子下的KLF4，(4)在一个TRE启动子下的OCT4和SOX2，(5)在单独启动子下的OCT4、SOX2和KLF4或(6)在相同启动子下的OCT4、SOX2和KLF4的一种或多种AAV病毒注射到小鼠的视网膜中。显示用于本研究的各种载体的示意图示于图26A中。病毒施用后2周引起视神经挤压损伤。使用视神经挤压后2周的荧光标记的霍乱毒素β亚基(CTB)注射来使轴突成像。
如图26B中所示，当所有三种转录因子(OSK)在一个启动子下表达时，每条神经的估计轴突数目比OCT4、SOX2和KLF4在单独的启动子下各自表达时高至少四倍(例如，对OCT4、SOX2、KLF4(5)和OCT4-SOX2-KLF4(6)结果进行比较)。类似地，每条神经的估计轴突数目在单个转录物上表达OSK时，也比单独的OCT4、SOX2和KLF4表达时高至少四倍(图26B)(例如，对OCT4(1)、SOX2(2)和KLF4(3)与OCT4-SOX2-KLF4(6)结果进行比较)。轴突再生的增加可能归因于一个启动子下所有三种转录因子(OSK)的表达，因为相对于单独每个转录因子的表达，一个启动子下的OCT4和SOX2的表达未显著增加每条神经的估计轴突数目(图26B)(例如，对OCT4-SOX2(4)与OCT4-SOX2-KLF4(6)结果进行比较)。
还通过定量RBPMS+细胞来实施视网膜神经节细胞(RGC)存活的分析。如图26C中所示，相对于单独的OCT4、SOX2或KLF4的表达以及相对于在一个启动子下的OCT4和SOX2的表达，来自一个启动子的OSK的表达增加了RBPMS+细胞的存活。相对于来自单独的病毒中的单独载体的OCT4、SOX2或KLF4的表达，来自一个启动子的OSK表达还增加了RBPMS+细胞的存活。
如图26D中所绘的荧光染色所示，OCT4、SOX2和KLF4在单独的病毒中单独载体中的表达导致RGC的异质群体。一些细胞仅表达OCT4、SOX2或KLF4。一些细胞表达三种转录因子中仅两种的组合，并且仅检测到少量的三因子阳性RGC(图26D中左上图的右下角中的白色细胞)。相比之下，如图26E中所示，从单个载体表达OCT4、SOX2和KLF4导致更同质的群体。所有的细胞都表达了所有三种OSK转录因子(左上图中的白色细胞)。即使在不是纯白色的细胞中，也检测到所有三种转录因子的表达，如图26E中所示，表明结果是由于三种转录因子的染色强度的差异。
因此，该实施例表明，与单独表达每种转录因子，在单独的启动子下表达所有三种转录因子，或者在一个启动子下表达仅两种转录因子(例如，OCT4和SOX2)相比，使用一种启动子表达OCT4、SOX2和KLF4具有更大的治疗效果(例如，增加的轴突再生和更大的视网膜神经节细胞存活)。
实施例12：在视神经挤压损伤后，敲低Tet1或Tet2消除了OSK诱导的轴突再生。
该实施例确定了敲低DNA脱甲基酶Tet1和Tet2对OSK诱导的轴突再生的影响。使用了Tet-Off系统。通过玻璃体内注射将CAG-tTA+TRE-OSK-SV40的AAV2与U6-shRNA的AAV2一起在挤压前两周注射到小鼠中。小鼠为一月龄，每组四只小鼠。
使用了编码shRNA序列的Addgene AAV质粒。对照shRNA包含序列5′-GTTCAGATGTGCGGCGAGT-3′(来自Addgene的质粒#85741)。mTET1(Tet1 shRNA)包含序列5′-GCTCATGGAGACTAGGTTTGG-3′(来自Addgene的质粒#85742)。mTet2(Tet2 shRNA)包含序列5′-GGATGTAAGTTTGCCAGAAGC-3′(来自Addgene的质粒#85743)。
如图27中所示，与对照发夹(sh-cntl)相比，敲低Tet1或Tet2显著减少了还用OSK病毒处理并经受视神经挤压损伤的动物中每条神经的估计轴突数目。
这些结果表明Tet DNA甲基化酶可能参与OSK诱导的轴突再生，并且单独的Tet(例如Tet1或Tet2)的过表达或与OSK表达组合可能促进再生。
作为非限制性实例，包含序列5′-GCTCCAACGAGAAGCTATTTG-3′的mTet3(来自Addgene的质粒#85740)可用于敲低Tet3。
实施例13：OSK的表达逆转了与年龄有关的视敏度下降并逆向了与年龄有关的视网膜神经节细胞(RGC)功能下降。
为了确定是否可以用OSK表达逆转与年龄有关的视敏度丧失，对成年小鼠(3月龄小鼠)和老年小鼠(12月龄和18月龄小鼠)进行了视动反应(OMR)测定。OMR是一种反射性头部运动，用于评估视敏度。为了诱导OMR，将单个小鼠放在由显示条纹的电脑显示器所围绕的圆形运动场(arena)中间的平台上。条纹图案的旋转通过反射性颈部运动引起小鼠头部沿相同方向跟踪。跟踪由两个独立的蒙面观察者监视。通过增加条纹的空间频率来定量视敏度，直到无法引起OMR。
在没有强力霉素(OSK诱导条件)的情况下向小鼠视网膜注射编码tTA的AAV病毒和编码TRE-OSK的AAV病毒。在该Tet-Off系统中，在没有强力霉素的情况下，OSK由单个启动子表达。作为对照，在不存在强力霉素的情况下，对年龄匹配的小鼠施用编码rtTA的病毒和编码TRE-OSK的病毒(未诱导对照，ctl)。在对照Tet-On系统中，OSK表达需要强力霉素处理。成年小鼠(3月龄(3m))也用作对照。实施了OMR研究，以测量病毒注射后一个月的空间频率阈值。
如图28中所示，在没有OSK表达的情况下(对照(ctl)条件)，与成年小鼠(3月龄小鼠)相比，老年小鼠(12月龄和18月龄小鼠)具有视力丧失。相对于3月龄的小鼠，老年小鼠的空间频率阈值降低表明在没有OSK表达的情况下的视力丧失。但是，当表达OSK时，相对于没有OSK表达，平均而言，12月龄和18月龄的小鼠的空间频率阈值增加。此外，在有和没有OSK表达的情况下，具有OSK表达的12月龄和18月龄的小鼠的空间频率阈值与3月龄的对照小鼠的空间频率阈值相似。这些结果证明，诱导OSK表达逆转了小鼠中与年龄有关的视力丧失。
为了确定是否也可以通过OSK处理逆转与年龄有关的视网膜神经节细胞(RGC)功能的下降，使用图案视网膜电图(图案ERG或pERG)测量了来自RGC的电波。在pERG测定法中，经由放置在不同年龄的小鼠(3月龄、12月龄或18月龄的小鼠)的角膜上的电极投射棋盘明暗图案刺激。显示对比反转图案，亮度没有整体变化。然后测量从RGC产生的电波。
在没有强力霉素(OSK诱导条件)的情况下向小鼠视网膜注射编码tTA的AAV病毒和编码TRE-OSK的AAV病毒。在该Tet-Off系统中，在没有强力霉素的情况下，OSK由单个启动子表达。作为对照，在不存在强力霉素的情况下，对年龄匹配的小鼠施用编码rtTA的病毒和编码TRE-OSK的病毒(未诱导对照，ctl)。在对照Tet-On系统中，OSK表达需要强力霉素处理。成年小鼠(3月龄(3m))也用作对照。实施了pERG研究以测量病毒注射后一个月图案刺激后RGC中电波的幅度。
如图29中所示，在不存在OSK表达的情况下(ctl条件)，老年小鼠中从RGC产生的电波下降(3月龄小鼠与12月龄和18月龄小鼠相比)。相反，在没有强力霉素(OSK诱导条件)的情况下，施用编码tTA的AAV病毒和编码TRE-OSK的AAV病毒恢复了12月龄小鼠的RGC电波。然而，对于18月龄的小鼠，RGC功能可能无法恢复，因为角膜混浊阻碍了图案刺激。这些结果表明，OSK的表达改善了老年(12月龄)小鼠的RGC功能。
因此，该实施例证明OSK表达的诱导可以改善由衰老引起的视敏度和RGC功能。
实施例14：OSK的表达逆转了由青光眼引起的视敏度下降并逆转了由青光眼引起的视网膜神经节细胞(RGC)功能下降。
为了确定OSK表达是否可用于逆转由青光眼引起的视敏度和RGC功能下降，使用了青光眼小鼠模型。通过向前房注射聚苯乙烯微珠，在成年C57BL/6J小鼠中单侧诱发眼内压(IOP)的慢性升高。在最初的四周中测量IOP。如图30A中所示时，微珠注射后4-21天，微珠注射增加了IOP。使用对苯二胺(PPD)染色定量轴突密度(图30B)。图30C包括使用Brn3a染色(例如，在右侧示出)定量RGC细胞密度的图表(左图)。图30B-30C显示，在将微珠注射到眼的前房后4周，在未经编码TRE-OSK的AAV病毒处理的野生型(WT)小鼠中，轴突密度和RGC密度存在显著丧失。
在这些实验中，以微珠注射诱导青光眼，然后三周后，实施OMR和pERG测定(图30D-30E中的AAV注射前测量)。然后，将小鼠分为两个处理组。一组小鼠在不存在四环素的情况下视网膜注射了编码rtTA的AAV病毒和编码TRE-OSK的AAV病毒(OSK AAV OFF)或编码tTA的AAV病毒和编码TRE-OSK的AAV病毒(OSK AAV ON)。在AAV病毒注射后四周，再次实施OMR和pERG测定(AAV后4周)测量(图30D-30E)。作为对照，还实施了注射盐水代替微珠的实验(无青光眼对照)。
如图30D中所示，与对具有青光眼的小鼠(注射微珠的小鼠)不诱导OSK表达(OSKAAV OFF)相比，诱导OSK表达(OSK AAV ON)增加了空间频率阈值。这些结果表明，诱导OSK表达可以改善与青光眼有关的视力丧失。
如图30E中所示，OSK表达的诱导恢复了具有微珠诱导的青光眼的小鼠的电波幅度。这些结果表明诱导OSK表达也可以逆转与青光眼相关的RGC功能下降。
因此，诱导OSK表达可以改善由青光眼诱导的症状。
实施例15：长春新碱诱导的神经元损害后，人OSK的表达促进人神经元的存活和轴突再生长。
为了确定人OCT4、人KLF4和人SOX2(人OSK)的表达是否可以保护人神经元细胞并在体外再生轴突，如下所述使用了神经突再生测定法。SH-SY5Y细胞是人神经母细胞瘤细胞，其分化为神经元，并在Tet诱导型启动子(使用Tet-Off系统)下用编码人OCT4、人KLF4和人SOX2的AAV.DJ载体转导。在OSK Off条件下，未在细胞中诱导OSK表达。在OSK On条件下，在细胞中诱导了OSK表达。转导后五天，长春新碱(VCS)用于诱导神经突变性。用VCS处理细胞24小时或48小时。处理时间线的示意图(使用24小时VCS处理)在图31A的左侧部分中提供。VCS是一种破坏微管的化学疗法药物。它通常在体外用于确定损害后处理是否维持和/或促进细胞功能(例如神经元功能)。如本文所述，使用VCS确定OSK处理对神经元存活和轴突再生长的影响。VCS处理后，细胞在分化培养基中生长，并测定神经突的长出。
在图31A中，将细胞用VCS处理24小时后九天测定细胞的神经元长出。相对于其中未诱导OSK表达的细胞(OSK Off条件)，其中诱导了OSK表达的细胞(OSK On条件)显示出增加的神经元存活和轴突长出(图31A)。类似地，对神经元细胞面积的定量显示与无OSK表达相比，OSK表达使神经元的细胞面积增加了至少8倍(图31B)。用VCS处理48小时也观察到类似的结果(图31C)。
这些结果表明人OSK的表达保护人神经元细胞免受VCS诱导的神经元变性。
方法
细胞培养和分化方案
SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞获自美国组织培养物保藏中心(ATCC，CRL-2266)，并根据ATCC的建议进行维护。将细胞在补充有10％胎牛血清(FBS，Sigma，F0926)和1×青霉素/链霉素(ThermoFisher Scientific，15140122)的Eagle最低基本培养基(EMEM，ATCC，30-2003)和F12培养基(ThermoFisher Scientific，11765054)的1:1混合物中进行培养。将细胞在37℃，5％CO2和3％O2的条件下培养。细胞以约80％汇合传代。
如先前1，2所述(具有一些修改)，将SH-SY5Y细胞分化为神经元(Encinas et al.,J Neurochem.2000Sep；75(3):991-1003；Shipley et al.,J Vis Exp.2016Feb 17；(108):53193)。简而言之，在铺板后1天，细胞开始在含有2.5％FBS，1×青霉素/链霉素和10μM全反式视黄酸(ATRA，Stemcell Technologies，72264)的EMEM/F12培养基(1：1)(分化培养基1)中分化3天，然后在含有1％FBS，1×青霉素/链霉素和10μM ATRA的EMEM/F12(1:1)(分化培养基2)中处理细胞3天。然后将细胞分到涂布有聚D-赖氨酸(ThermoFisher Scientific，A3890401)的35mm细胞培养板中。分开后一天，神经元在含有1×Glutamax(ThermoFisherScientific，35050061)，1×青霉素/链霉素和50ng/ml BDNF(Alomone labs)的无血清神经基底/B27加培养基(ThermoFisher Scientific，A3653401)(分化培养基3)中成熟至少5天。
神经突再生测定
用AAV.DJ载体以每细胞106个基因组拷贝转导来自SH-SY5Y细胞的分化的神经元。转导后五天，将100nM长春新碱(Sigma，V8879)添加到细胞中24小时或48小时以诱导神经突变性。长春新碱处理后，将神经元在PBS中洗涤两次，然后将新鲜的分化培养基添加回到平板中。神经元被追踪到神经突生长长达2周。
实施例16：通过Tet依赖性表观遗传钟的重置从损伤中复原并恢复视力。
为了确定哺乳动物细胞是否可以保留生命早期的表观遗传信息的忠实拷贝，测试了三种基因组合的OSK是否足以重置年龄。该三基因OSK组合进入来自年老小鼠的成纤维细胞中，并测量其对已知随年龄改变的基因(如H2A、H2B、LaminB1和Chaf1b)的RNA水平的影响。OSK处理来自年老小鼠的成纤维细胞恢复了年轻的基因表达模式，与OSKM相似，没有明显的细胞身份丧失或Nanog(可以诱导畸胎瘤的早期胚胎转录因子)的诱导(图36A-36C)。
为了在体内递送和控制OSK表达，开发了严格调节的Tet-ON和Tet-OFF腺相关病毒(AAV)载体系统，以在一个病毒颗粒中容纳所有三个重编程基因(Smalley et al.,FirstAAV gene therapy poised for landmark approval.Nat Biotechnol,2017.35(11):p.998-999；Senis et al.,AAV vector-mediated in vivo reprogramming intopluripotency.Nat Commun,2018.9(1):p.2651)(图32A)。首先，为了测试OSK AAV的诱导是否在体内引起毒性，用rtTA和TRE-OSK AAV9感染5月龄的C57BL/6J小鼠，并将其诱导表达至与转基因小鼠相当的水平(图36D)。出人意料的是，连续诱导OSK超过一年对小鼠没有明显的负面影响超过一年(图32B和图36E)。不受特定理论的束缚，表面上对小鼠没有明显的负面影响，因为避免了肠中的高水平表达(图36F-36H)，从而避免了在包括Abad et al.,Nature 502,340-345,doi:10.1038/nature12586(2013)在内的其他研究中看到的发育异常和体重减轻。
在衰老过程中，几乎所有物种都经历了再生潜力的下降。在哺乳动物中，最早失去这种潜力的系统之一是中枢神经系统(CNS)。一种典型的CNS细胞类型，即视网膜神经节细胞，将轴突从视网膜投射到脑，从而形成视神经。在胚胎发生期间和新生儿中，RGC如果受损则可以再生，但是这种能力很快丧失(Goldberg et al.,Science,2002.296(5574):p.1860-4)。随着时间的流逝，随着生物体衰老，CNS的整体功能和恢复力持续下降(Geoffroy et al.,Cell Rep,2016.15(2):p.238-46)。为了探索是否有可能恢复成年RGC的早期表观遗传概况，在各年龄的成年小鼠的神经挤压损伤模型中诱导OSK表达。将携带OSK(以单独的AAV或以相同的AAV)的Tet-Off系统(Tet-Off tTA-AAV2)注射到玻璃体中，从而在RGC中产生有效、选择性和强力霉素反应性的基因表达。作为阴性对照，也用强力霉素处理一组小鼠以遏制AAV(图32C和图37C)。注射后两周，进行视神经挤压，然后在此后两周后，计算轴突长度和视神经密度(图32D)。
多顺反子OSK-AAV2的诱导导致RGC存活和远距离轴突再生的显著增加(图32E和图37D)，而没有RGC增殖的任何迹象(图38A)。相反，当引入单独的AAV时，OCT4、SOX2、KLF4对再生能力没有影响(图32E)，表面上看是由于较低的共感染频率(图37A和图37B)。因为Klf4可以遏制轴突生长(Moore et al.,Science,2009.326(5950):p.298-301；Qin et al.,NatCommun,2013.4:p.2633)，OCT4、SOX2和KLF4还分别进行了测试，并对Oct4和Sox2的双顺反子进行了测试。但是，在不存在Klf4的情况下，未观察到再生作用。显著地，如果诱导了多顺反子OSK 3个月，则RGC轴突纤维一直延伸到交叉(chiasm)，距离超过3mm(图38B)。实际上，当诱导多顺反子OSK 12-16周时，再生的RGC轴突纤维进一步延伸到交叉(距挤压部位5mm)，在那里视神经连接至脑(图38B-38C)。
接下来，测试了OSK表达以促进神经元存活和再生的必要时机。对于这些实验，由于其开启速度快而使用了Tet-On AAV系统(图37D和图39A-39B)。仅当在损伤后诱导OSK表达时，轴突再生才发生显著改善，并且OSK诱导时间越长，神经元延伸的距离越大，而RGC的总数没有增加(图33B、33C和33D)。通过共染色OSK并进行神经元计数，存活率估计为未感染或GFP感染的RGC的2.5-3倍(52比17％-20％)(图39C和39D)，这表明OSK作用是细胞固有的。先前显示改善体内神经元存活的Pten-mTOR-S6K途径在损伤后经OSK感染的细胞中未激活(图40A和图40B)，表明可能涉及新途径。
确定了神经元损伤是否使表观基因组年龄提前，以及OSK的益处是否归因于更年轻的表观基因组的保存。在有或没有OSK诱导的情况下，在损伤前或损伤后4天，对RGC的基因组DNA进行FACS分离，并对其进行简并代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS-Seq)。不受特定理论的束缚，相对于其他可用的小鼠时钟(Meer et al.,Elife 7,doi:10.7554/eLife.40675(2018)；Thompson et al.,Aging(Albany NY)10,2832-2854,doi:10.18632/aging.101590(2018))，rDNAme时钟(Wang et al.,Genome Res 29,325-333,doi:10.1101/gr.241745.118(2019))提供了最佳的位点覆盖(70/72CpG位点)，并且其年龄估计仍然与RGC的实足年龄高度相关(图45A和方法)。在没有总体甲基化变化的情况下，损伤的RGC经历了表观遗传时钟的加速，并且OSK表达抵消了该效应(图33K和图45B)。
确定了是否通过恢复更年轻的表观基因组使OSK对神经元存活和再生的作用发生。如果是这样，则这些作用应取决于表观遗传时钟的逆转，这将需要经由10-11易位(TET)双加氧酶的活性从DNA去除甲基基团。利用了先前表征的表达针对Tet1和Tet2的短发夹RNA(sh-Tet1和sh-Tet2)的AAV(Guo et al.,Cell 145,423-434,doi:10.1016/j.cell.2011.03.022(2011)；Yu et al.,Nat Neurosci 18,836-843,doi:10.1038/nn.4008(2015)；Weng et al.,Neuron 94,337-346.e336,doi:10.1016/j.neuron.2017.03.034(2017))，并验证了体内的转导率和敲低效率(图40C-40F)。敲低Tet1或Tet2(sh-Tet1和sh-Tet2 AAV2，以OSK AAV的1/5滴度)(其转导约70％的OSK阳性细胞(图40C和40D))有效地阻碍了OSK再生轴突并改善了RGC存活(图33E和33F)。
为了测试通过OSK进行的神经元恢复活力对小鼠RGC是否具有特异性，在体外人神经元中进行了轴突再生测定(图33G)。将人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞分化为神经元，并用AAV-DJ载体转导它们以表达OSK(图33G、图41A和图41B)。与体内小鼠RGC相似(图38A)，OSK不诱导细胞增殖(图41C-41D)。然后通过用长春新碱(VCS)(一种化学治疗剂)处理24小时来诱导轴突变性，然后允许细胞恢复9天。使用皮肤和血细胞时钟测量这些神经元的表观遗传时钟(Horvath and Raj,Nat Rev Genet.2018Jun；19(6):371-384)。类似地，在人神经元中的VCS损害后，DNA甲基化年龄显著增加(图41J)，并且OSK表达不仅阻止了DNA甲基化年龄的这种增加，而且还恢复了更年轻的DNA甲基化年龄而没有DNA甲基化的整体降低(图33H，下图和图45C)。在VCS损害后第9天的实验中，经OSK处理的细胞中DNAm年龄显著降低，但在未经OSK处理的细胞中则没有(图33H)。在损害后第9天，神经突面积在恢复活力的OSK转导的细胞中比对照大15倍(图41E和图41F)，并且从损害中复原取决于Tet2脱甲基酶(图33I、图33J和图41G)，即使在存在高OSK表达的情况下(图41K)，而非平行于小鼠视网膜神经节细胞的mTOR-S6K途径(图41H和图41I)。因此，OSK重编程神经元和促进轴突生长的能力是细胞固有的，在哺乳动物中是保守的，并且需要通过DNA去甲基化进行表观遗传恢复活力。该过程在本文中称为经由表观遗传重编程的信息恢复(recovery of information viaepigenetic reprogramming)或简称为“REVIVER”。
青光眼(RGC及其轴突的进行性丧失，通常是由于眼内压升高)是世界范围内与年龄有关的失明的主要原因。尽管一些治疗可以减慢疾病进展，但一旦失去视力，目前无法恢复。考虑到OSK在急性神经损害后再生轴突的能力，我们决定测试REVIVER处理是否可以在慢性环境(achronic setting)像青光眼中恢复RGC的功能(图34A)。通过将微珠注射到前房中单侧诱导眼内压(IOP)升高4-21天。然后玻璃体内注射OSK AAV或PBS，并在青光眼损害建立的时间点表达，其中RGC和轴突密度显著降低(图34B、图42A和图42B)(Krishnan et al.,J Immunol,2016.197(12):p.4626-4638)。在AAV注射后四周，与PBS和OSK-Off处理的小鼠相比，经OSK-On处理的小鼠呈现轴突密度的显著增加。观察到的增加的轴突密度等同于仅盐水的非青光眼小鼠中的轴突密度(图34C和34D)，并且与RGC的增殖无关(图42C)。
为了确定在经OSK处理的小鼠中观察到的增加的轴突密度是否与增加的视力相一致，使用行为测定，视动反应(OMR)(图34E)跟踪每只小鼠的视敏度。与接受PBS或OSK-OffAAV的小鼠相比，相对于处理前的基线测量，OSK处理显著提高了视敏度，恢复了一半以上的视力丧失(图34F)。响应于反转对比棋盘图案(称为图案视网膜电图响应(pERG)分析)由RGC产生的电波的读出显示OSK处理相对于处理前的基线测量值，并且与PBS或OSK-Off AAV处理的小鼠相比显著改善了RGC功能(图34G和H)。不受特定理论的束缚，如本文所示，用OSKAAV处理可能是在任何青光眼模型中逆转视力丧失的第一种治疗。值得注意的是，OSK逆转了青光眼模型中的视力丧失。
考虑到OSK在年轻小鼠视神经挤压后诱导轴突再生并在青光眼损害后恢复视力的能力，确定了OSK是否还可以恢复与生理性衰老相关的视力丧失并在老年小鼠的视神经损伤后再生轴突。这一点尤为重要，因为最近报道的治疗年轻小鼠的成功视杆感光细胞再生方法在治疗较老的小鼠时，视网膜视杆感光细胞再生方法显著减弱(Yao,K.,et al.,Restoration of vision after de novo genesis of rod photoreceptors inmammalian retinas.Nature,2018.560(7719):p.484-488.)。
为了确定OSK AAV处理是否可以诱导衰老小鼠中的轴突再生，以所示的实验设计使用与图32D中相同的方案对12月龄的小鼠进行了视神经挤压损伤模型(图35A)。在老年小鼠中，损伤后两周的OSK AAV处理显示出加倍的RGC存活，类似于在年轻小鼠中所观察到的(图43A)。尽管在损伤后两周轴突再生略少于年轻小鼠(图43B)，但是在损伤后五周的老年小鼠中OSK AAV处理显示轴突再生显著增加(图35B和35C)，类似于在年轻小鼠中观察到的。这些数据表明，衰老并不会降低OSK AAV处理在视神经挤压损伤后诱导轴突再生中的有效性。
为了测试OSK处理是否可以逆转与生理衰老相关的视力丧失，4和12月龄的小鼠接受玻璃体内注射OSK-Off或OSK-On AAV。如所预期的，在一岁时，小鼠显示出视敏度和RGC功能的显著降低，如通过OMR和pERG所测量的，其通过OSK AAV处理得以恢复(图35D和图43C)。在18月龄的小鼠中未观察到此类恢复(图43F-43G)，可能是由于在该年龄发生的自发性角膜混浊(McClellan et al.,Am J Pathol 184,631-643,doi:10.1016/j.ajpath.2013.11.019(2014))，这表明修复效果是由AAV感染的RGC层特别贡献的。
接下来，确定了通过OSK恢复年轻的转录组是否指示年轻的表观基因组，因此将需要Tet酶。显著地，如通过OMR和pERG分析两者所测量的，Tet1或Tet2敲低完全阻断了OSK-OnAAV处理的恢复活力作用(图35E和图35F)，这与DNA甲基化作为视力恢复的关键过程一致。值得注意的是，在老年小鼠中，没有明显的OSK导致的RGC和轴突密度增加(图43D和图43E)，表明现有RGC的功能改善。测量了来自12月龄小鼠的FACS分选的RGC的rDNA甲基化年龄。OSKAAV表达4周显著降低了DNA甲基化年龄，并且Tet1和Tet2敲低阻碍了此类恢复活力(图35I)。总之，这些结果表明，Tet依赖性体内重编程可以恢复年轻的基因表达模式，逆转DNA甲基化时钟，并恢复复杂组织的功能和再生能力。
为了进一步确定Tet2敲除是否可以阻断OSK对轴突再生的作用，使用了小鼠OSK和Tet2条件性敲除小鼠(B6；129S-Tet2tm1.1Iaai/J)。给小鼠的眼注射(1)AAV-CRE(Tet2cKO)；(2)AAV-tTA+AAV-TRE-OSK:OSK(Tet2 WT)；或(3)AAV-tTA+AAV-TRE-OSK+AAV-CRE:OSK(Tet2 cKO)。两周后，实施视神经挤压。视神经挤压后两周施用CTB，并在CTB施用后两天处死小鼠以测定损伤后轴突再生的程度。如图46A-46B中所示，与施用OSK的Tet2敲除小鼠相比，施用OSK的Tet2野生型小鼠中，距损伤部位至少500μm的每条神经的轴突数目显著更高。这些结果表明OSK介导的轴突再生是Tet2依赖性的。
为了确定重编程对视网膜上的转录组的影响，通过全基因组RNA-seq对来自完整的年老小鼠(12个月)的FACS纯化的RGC和用空对照AAV(TRE-OSK)或OSK-On(tTA+TRE-OSK)处理的FACS纯化的RGC进行分析。与来自完整年轻小鼠(5个月)的RGC相比，鉴定出464个基因在衰老过程中差异表达(图35G、图35I、图44A和表5)，并且不受单独的空AAV诱导。其中，268个基因在衰老过程中下调，其富含感官知觉基因(图35I)，表明衰老过程中信号传导受体/感觉功能的下降(图44B和44C)。有趣的是，这些基因中有116个似乎未被表征，缺少正式的基因名称。在衰老过程中略微上调的其他196个基因富集了离子转运蛋白基因(图44D)。
值得注意的是，与OSK重置表观基因组局面一致，在衰老过程中表达变化的464个基因中的绝大多数(90％，418个)在处理后恢复到年轻水平(图35G和35H)。总之，这些结果表明，Tet依赖性体内重编程可以恢复年轻的基因表达模式，逆转表观遗传时钟并恢复像视网膜一样复杂的组织的功能。
中枢神经系统中的有丝分裂后神经元是机体中丧失其能力或再生的首批细胞中的一些。在这项研究中，其表明，对衰老的神经元进行体内重编程可以逆转表观遗传的年龄，并允许其像再次年轻一样再生并发挥作用。此过程对DNA脱甲基酶Tet1和Tet2的需求表明，时钟位点处的DNA甲基化不仅是衰老的指示，而且还是衰老的积极参与者。结论是，哺乳动物细胞保留了一组原始的表观遗传信息，以同样的方式，Shannon的观察者存储信息以确保以后丢失的信息得以恢复(SHANNON,C.E.,A Mathematical Theory ofCommunication.The Bell System Technical Journal,1948.27:p.379-423)。细胞如何能够找到并去除合适的DNA甲基化部分并恢复年轻的基因表达模式仍是一个悬而未决的问题，但是即使在缺乏这些知识的情况下，我们的数据也表明，逆转表观遗传年龄可能是一种有效的翻译策略，不仅恢复视力，还给予其他组织从损伤中恢复并抵抗与年龄有关的衰退的能力。
表5.在小鼠RGC中衰老的过程中差异表达的基因。
Figure BDA0003089814690001491
Figure BDA0003089814690001501
Figure BDA0003089814690001511
Figure BDA0003089814690001521
Figure BDA0003089814690001531
Figure BDA0003089814690001541
Figure BDA0003089814690001551
方法
小鼠品系
C57BL6/J野生型小鼠购自Jackson Laboratory(000664)，用于视神经挤压和青光眼模型实验。对于衰老实验，使用了来自NIA老年啮齿动物种群(https://www.nia.nih.gov/research/dab/aged-rodent-colonies-handbook)的雌性。Col1a1-tetOP-OKS-mCherry/Rosa26-M2rtTA等位基因描述于Bar-Nur et al.,Nat Methods,2014.11(11):p.1170-6。所有动物工作均得到哈佛医学院(Harvard Medical School)，波士顿儿童医院(Boston Children’s Hospital)，大众眼与耳机构(Mass Eye and EarInstitutional)动物护理和使用委员会的批准。
AAV的生产
通过将小鼠OcT4、SOx2和Klf4 cDNA克隆到由Tet应答元件(TRE3G启动子)和SV40元件组成的AAV质粒中来制备AAV-TRE-OSK的载体。其他载体是直接化学合成的。然后将如表6中列出的所有pAAV都包装到血清型2/2或2/9的AAV中(滴度：每毫升>5x1012个基因组拷贝)。腺相关病毒是由波士顿儿童医院病毒核心(Boston Children's Hospital ViralCore)产生的。
AAV9系统性递送至内部器官
通过眶后注射AAV9(3×1011TRE-OSK加7×1011UBC-rtTA4)实现了在内部器官中的表达。注射后3周连续处理1mg/mL强力霉素以诱导OSK表达。
细胞培养与分化
从重编程的4F(Jackson Laboratory 011011)或3F(Hochedlinger lab)小鼠中分离出耳成纤维细胞(EF)，并于37℃在含有Gluta-MAX、非必需氨基酸和10％胎牛血清(FBS)的DMEM(Invitrogen)中培养。将WT 4F和WT 3F小鼠的EF传代至P3，并在培养基中用强力霉素(2mg/ml)处理指定的时间段。
SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞获自美国组织培养物保藏中心(ATCC，CRL-2266)，并根据ATCC的建议进行维护。基本地，将细胞在补充有10％胎牛血清(FBS，Sigma，F0926)和1×青霉素/链霉素(ThermoFisher Scientific，15140122)的Eagle最低基本培养基(EMEM，ATCC，30-2003)和F12培养基(ThermoFisher Scientific，11765054)的1:1混合物中进行培养。将细胞在37℃，5％CO2和3％O2培养。当到达约80％汇合时对细胞传代。
如前所述1,2(具有一些修改)将SH-SY5Y细胞分化为神经元。简而言之，在铺板后1天，细胞开始在含有2.5％FBS，1×青霉素/链霉素和10μM全反式视黄酸(ATRA，StemcellTechnologies，72264)的EMEM/F12培养基(1：1)(分化培养基1)中分化3天，然后在含有1％FBS，1×青霉素/链霉素和10μM ATRA的EMEM/F12(1:1)(分化培养基2)中处理细胞3天。然后将细胞分到涂布有聚D-赖氨酸(ThermoFisher Scientific，A3890401)的35mm细胞培养板中。分开后一天，神经元在含有1×Glutamax(ThermoFisher Scientific，35050061)，1×青霉素/链霉素和50ng/ml BDNF(Alomone labs)的无血清神经基底/B27加培养基(ThermoFisher Scientific，A3653401)(分化培养基3)中成熟至少5天。
神经突再生测定
用AAV.DJ载体以每细胞106个基因组拷贝转导来自SH-SY5Y细胞的分化的神经元。转导后5天，将100nM长春新碱(Sigma，V8879)添加到细胞中24小时以诱导神经突变性。长春新碱处理后，将神经元在PBS中洗涤两次，并将新鲜的分化培养基添加回到平板中。跟踪神经元的神经突长出达2-3周。每三到四天以100倍的放大倍数拍摄相衬图像。使用Image J定量神经突面积。
细胞周期分析
收获细胞，并在4℃下用70％冷乙醇固定16小时。固定后，将细胞用PBS洗涤两次，然后与含有50μg/mL碘化丙啶(Biotium，40017)和100μg/mL RNase A(Omega)的PBS在室温下温育1小时。PI染色的样品在BD LSR II分析仪上进行分析，仅门控单个细胞进行分析。使用FCS Express 6(De Novo软件)分析细胞周期概况。
人神经元甲基化研究和表观遗传时钟
根据制造商的说明，使用Zymo Quick DNA mini-prep plus试剂盒(D4069)从细胞中提取DNA，并根据制造商的说明在Illumina 850EPIC阵列上测量DNA甲基化水平。Illumina BeadChip(EPIC)测量人类基因组中不同CpG位点处基于亚硫酸氢盐转化的单CpG分辨率DNAm水平。这些数据是按照Illumina甲基化测定的标准方案生成的，所述测定使用甲基化和未甲基化等位基因之间的强度比，通过β值对甲基化水平进行了定量。具体地，从甲基化(M，对应于信号A)和未甲基化(U，对应于信号B)等位基因的强度将β值计算为荧光信号之比β＝最大(M,0)/[最大(M,0)+最大(U,0)+100]。因此，β值的范围为0(完全未甲基化)至1(完全甲基化)。我们使用了“noob”归一化方法，该方法在“minfi”R程序包中执行(Triche et al.,NAR 2013,Fortin et al.,Bioinformatics 2017)。基于皮肤和血液时钟的数学算法和可用软件(基于391CpG)呈现于Horvath et al.,Aging 2018。
AAV2病毒玻璃体内注射
对于玻璃体内注射，用氯胺酮/甲苯噻嗪(100/10mg/kg)麻醉成年动物，然后在角膜缘平行结膜血管的后方，用使用塑料管附接到Hamilton注射器上的细玻璃移液管玻璃体内注射AAV(1-3μl)。在升高的IOP模型中，小鼠在微珠注射后3-4周间接受1μl玻璃体内注射。
视神经挤压
对于麻醉动物中的视神经挤压，在AAV注射后两周，使用一对Dumont#5镊子(FST)框内接近眼神并进行挤压。在安乐死前2-3天进行Alexa缀合的霍乱毒素β亚基(CTB-555，1mg/ml；1-2μl)注射，以追踪再生的RGC轴突。更详细的手术方法由Parket al.,Science,2008.322(5903):p.963-6描述。
体内强力霉素的诱导或抑制
通过在饮用水中施用盐酸强力霉素(2mg/ml)(Sigma)来进行视网膜中Tet-On系统的诱导或Tet-Off系统的抑制。通过在饮用水中施用强力霉素(1mg/ml)(USP级，MPBiomedicals 0219895505)进行全身Tet-On系统的诱导。
轴突再生定量
如前所述，通过计数距挤压部位不同距离处的CTB标记的轴突的数目来估算视神经中再生轴突的数目(Park,K.K.,et al.,Promoting axon regeneration in the adultCNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway.Science,2008.322(5903):p.963-6)。
全封装视神经准备
在甲醇中将视神经和连接交叉脱水5分钟，然后与
Figure BDA0003089814690001581
HISTO-1TM一起温育过夜。第二天将神经转移至
Figure BDA0003089814690001582
HISTO-2TM，然后温育3小时。最后，用
Figure BDA0003089814690001583
HISTO-2TM封装视神经和连接交叉。
免疫荧光
用马血清在4℃下将全封装的视网膜封闭过夜，然后在4℃下与稀释于PBS，BSA(3％)Triton X-100(0.5％)中的一抗一起温育3天：小鼠抗Oct4(1:100，BD bioscience，611203)，兔抗Sox2(1:100，Cell signaling，14962)，山羊抗Klf4(1:100，R&D system，AF3158)，兔抗Brn3a(1:200，EMD Millipore，MAB1585)和豚鼠抗RBPMS(1:400，将Raygene定制订单A008712肽GGKAEKENTPSEANLQEEEVRC)。然后，将组织与适当的用与一抗相同的封闭溶液稀释的Alexa Fluor缀合的二抗(Alexa 405、488、567、674；Invitrogen)在4℃下温育过夜，通常以1:400最终稀释度使用。对于切片染色，一抗在4℃下过夜，然后二抗在室温下2h。使用VECTASHIELD抗褪色封装介质封装切片或全封装视网膜。
Western印迹
根据标准程序进行SDS-PAGE和western印迹分析，并用ECL检测试剂盒检测。使用的抗体：兔抗Sox2(1:100，EMD Millipore，AB5603)，小鼠抗Klf4(1:1000，ReproCell，09-0021)，兔抗p-S6(S240/244)(1:1000，CST，2215)，小鼠抗S6(1:1000，CST，2317)，小鼠抗β-微管蛋白(1:1000，Sigma-Aldrich，05-661)，小鼠抗β-肌动蛋白-过氧化物酶抗体(1:20,000，Sigma-Aldrich，A3854)。
RGC存活和Phospho-S6信号
在用抗-RBPM抗体免疫染色全封装视网膜后，使用荧光显微镜对神经节层中的RBPMS阳性细胞进行计数。列举了每个视网膜总共四个随机视野。确定每个视野的平均数目，并通过比较从未损伤的对侧视网膜确定的值来获得活RGC的百分比。在相同条件下，phospho-S6染色后，通过比较未损伤的对侧视网膜的值，获得了phospho-S6阳性RGC的密度。
RGC富集
将新鲜的视网膜解剖并使用木瓜蛋白酶在AMES培养基中分离，然后小心研磨，并用Thy1.2-PE-Cy7抗体(Invitrogen 25-0902-81)和Calcine Blue活死细胞着色剂进行染色，然后使用130μm喷嘴在BD FACS Aria上进行流式分选，以收集10,000多个Thy1.2+和Clacine blue+细胞(占总事件的1-2％)。将冷冻细胞送至Genewiz进行RNA提取和超低输入RNA-seq测序，或送至Zymo研究进行DNA提取和超低输入RRBS测序。
经典RRBS文库制备
使用Quick-DNA Plus Kit Microprep Kit提取DNA。用30单位的MspI(NEB)消化2-10ng的起始输入基因组DNA。根据Illumina的规定指南，将片段连接到包含5'-甲基-胞嘧啶而不是胞嘧啶的预退火的衔接子上。使用DNA Clean&ConcentratorTM-5(Cat#:D4003)回收大小≥50bp的衔接子连接片段。然后使用EZ DNA Methylation-LightningTM试剂盒(Cat#：D5030)对片段进行亚硫酸氢盐处理。进行制备规模的PCR并将所得产物用DNA Clean&ConcentratorTM-5(Cat#:D4003)纯化，以使用2x125bp PE在Illumina HiSeq上测序。
小鼠RGC的DNA甲基化年龄分析
使用trim galore v0.4.1过滤读段，并使用Bismark v0.15.0将其定位于小鼠基因组GRCm38。合并每个CpG位点两个位置上的甲基化计数。仅考虑所有样品中覆盖的CpG位点进行分析。这导致总共708156个位点。对于rDNA甲基化时钟，将读段定位到BK000964并相应地调整坐标(Wang et al.,Genome Res 29,325-333,doi:10.1101/gr.241745.118(2019))。rDNA时钟覆盖了70/72个位点，相比之下，整个寿命多组织时钟为102/435个位点(Meer et al.,Elife 7,doi:10.7554/eLife.40675(2018))，或两个整个寿命的多组织时钟为248/582和77,342/193,651个位点(脊)(Thompson et al.,Aging(Albany NY)10,2832-2854,doi:10.18632/aging.101590(2018))。
微珠诱导的IOP升高小鼠模型
通过腹膜内注射氯胺酮(100mg/kg；Ketaset；Fort Dodge Animal Health,FortDodge,IA)和甲苯噻嗪(9mg/kg；TranquiVed；Vedco,Inc.,St.Joseph,MO)的混合物并补充局部应用丙美卡因(0.5％；Bausch&Lomb,Tampa,FL)对小鼠进行麻醉。如先前报道，通过在手术显微镜下向每只动物的右眼前房注射聚苯乙烯微珠(FluoSpheres；Invitrogen,Carlsbad,CA；15-μm直径)来单侧引起IOP升高(Krishnan et al.,J Immunol,2016.197(12):p.4626-4638)。简而言之，在无菌生理盐水中以5.0×106珠/mL的浓度制备微珠。使用锋利的玻璃微量移液器(World Precision Instruments Inc.,Sarasota,FL)在中心附近轻轻刺穿右角膜。通过预先形成的孔将2μL体积的微珠注射到前房中，然后经由与Hamilton注射器相连的微量移液管注射气泡。任何发生发炎迹象(角膜混浊，水肿性角膜等)的小鼠均从该研究排除。
IOP(眼内压)测量
如先前所述，用回弹TonoLab眼压计(Colonial Medical Supply,Espoo,Finland)测量IOP(Krishnan et al.,J Immunol,2016.197(12):p.4626-4638；Mukai et al.,PLoSOne,2019.14(1):p.e0208713)。通过精密蒸发器递送的100％氧气中3％异氟烷(诱导)，然后100％氧气中1.5％异氟烷(维持)麻醉小鼠。脚趾捏合反射消失或尾巴捏合反应消失后的2至3分钟内开始进行IOP测量。将麻醉的小鼠置于平台上，并将压力传感器的尖端置于距中央角膜约1/8英寸。消除最高和最低值后，自动显示6次测量后的平均IOP。机器生成的平均值被视为一个读数，并且每只眼获得六个读数。由于一天中IOP的变化，所有IOP均在一天的同一时间(在10:00和12:00小时之间)采集。
视动反应
使用基于视动反射的空间频率阈值测试来测量小鼠的视敏度(Gao et al.,Am JPathol,2016.186(4):p.985-1005；Sun et al.,Glia,2013.61(8):p.1218-1235)。小鼠将能够自由移动，并被放置在位于排列成四边形的四个电脑显示屏所形成的区域中心的基座上。显示屏显示了移动的垂直黑白正弦光栅图案。一个看不见移动条的方向的盲观察者检测了小鼠的跟踪行为。当头部向条的方向移动(运动反应)或身体沿与刺激方向一致的方向旋转时，跟踪认为是阳性。将根据光栅的旋转方向分别测试每只眼睛。使用阶梯法以确定空间频率从0.15开始至0.40个周期/度，间隔为0.05个周期/度。旋转速度(12°/s)和对比度(100％)保持恒定。由对动物和处理组不知情的个体在处理之前和之后测量反应。
图案视网膜电图(pERG)
用氯胺酮/甲苯噻嗪(100mg/kg和20mg/kg)麻醉小鼠，并用一滴1％托吡卡胺滴眼液散大瞳孔。将小鼠放在内置的将其体温保持在37℃的加热板上(Celeris，啮齿动物模型的全视野和图案刺激)，并在整个过程中保持在暗红色的光下。黑白反转棋盘图案(检查尺寸大小为1°)的视觉刺激显示在直接放置在双眼的眼表上并以瞳孔居中的导光电极刺激器上。视觉刺激呈现对比度为98％，恒定平均亮度为50cd/m2，空间频率为：0.05周期/度；时间频率：1Hz。每只眼睛重复两次共300次pERG完全对比反转，并对600个周期进行分割，取平均值并记录。分析平均PERG，以评估峰至谷N1至P1(正波)幅度。
视神经轴突的定量
为了定量轴突，解剖视神经并在Karnovsky试剂(磷酸盐缓冲液中50％)中固定过夜。在眼球后1.0mm处取神经的半薄截面，并用1％对苯二胺(PPD)染色，以通过光学显微镜进行评估。使用Nikon显微镜(Eclipse E800,Nikon,Japan)与DPController软件(Olympus,Japan)以60倍放大倍数对视神经截面成像，并拍摄6-8张不重叠的显微照片以覆盖每个视神经截面的整个区域。如先前所述，使用ImageJ(版本2.0.0-rc-65/1.51u)，在每个60x图像上放置一个100μMx100μM的正方形，并使用image J中的阈值和分析颗粒功能对正方形(0.01mm2)内的所有轴突进行计数(Krishnan et al.,J Immunol,2016.197(12):p.4626-4638；Mukai et al.,PLoS One,2019.14(1):p.e0208713；Gao et al.,Am J Pathol,2016.186(4):p.985-1005)。受损的轴突被PPD染成深色且未被计数。6-8个图像中的平均轴突计数用于计算每平方毫米视神经的轴突密度。对实验组不知情的个体进行所有轴突计数。
视网膜神经节细胞的定量
对于神经节细胞计数，使用Leica TCS SP5共焦显微镜(Leica Microsystems)的63x油浸物镜获取全封装视网膜的图像。将视网膜全封装分成四个象限，并从每个象限的中外围和外围区域拍摄三至四个图像(大小为248.53μmx248.53μm)，每个视网膜共有十二到十六个图像。取自中外围和外围区域(每象限4个图像)。图像作为z堆栈(0.5μm)获得，并如前所述对每个图像的神经节细胞层中的所有Brn3a阳性细胞均进行了手动计数(Gao etal.,Am J Pathol,2016.186(4):p.985-1005)。简而言之，使用Fiji is Just ImageJ软件中“Cell Counter”插件(fiji.sc/Cell_Counter)对RGC进行计数。将每个图像加载到Fiji中，然后选择一种颜色计数器类型以标记每个图像(0.025mm2)中所有Brn3a染色的RGC。使用12至16个图像中RGC的平均数量来计算每平方毫米视网膜的RGC密度。对实验组不知情的两个个体进行了所有RGC计数。
总RNA提取和样品QC
按照Trizol试剂用户指南(Thermo Fisher Scientific)提取总RNA。将1ul10mg/ml糖原添加到上清液中以增加RNA回收。使用Qubit 2.0荧光计(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)对RNA进行定量，并使用TapeStation(Agilent Technologies,PaloAlto,CA,USA)检查RNA完整性，以查看浓度是否符合要求。
超低输入RNA文库制备和多路复用(multiplexing)
使用Qubit 2.0荧光计(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)对RNA样品进行定量，并使用2100TapeStation(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)检查RNA完整性。RNA文库制备、测序反应和初始生物信息学分析均在GENEWIZ,LLC.(South Plainfield,NJ,USA)处实施。用于测序的SMART-Seq v4超低输入试剂盒用于全长cDNA合成和扩增(Clontech,Mountain View,CA)，并且Illumina Nextera XT文库用于测序文库制备。简而言之，将cDNA片段化，并使用转座酶添加衔接子，然后进行有限循环PCR富集并向cDNA片段添加索引。使用Qubit 2.0荧光计和Agilent TapeStation对最终文库进行了评估。
测序2x150bp PE
将测序文库多路复用并聚簇在流通池的两个泳道上。聚簇后，根据制造商的说明将流通池加载到Illumina HiSeq仪器上。使用2x150配对末端(PE)配置对样品进行测序。通过HiSeq控制软件(HCS)在HiSeq仪器上实施图像分析和碱基判读(base-calling)。从Illumina HiSeq生成的原始序列数据(.bcl文件)被转换为fastq文件，并使用Illuminabcl2fastq v.2.17程序进行多路分解。对于索引序列鉴定允许一个错配。
RNA-seq分析
使用来自Ensembl版本84注释的剪接点，将成对末端读段用hisat2 v2.1.0对齐Ensembl GRCm38主组件。成对的读段计数使用featureCounts v1.6.4使用MAPQ>＝20的读段进行定量。用edgeR v3.26鉴定每个成对比较的差异表达基因，并在至少三个样品中仅测试具有至少0.1每百万计数(CPM)的基因。用AmiGO v2.5.12进行差异表达基因的基因本体分析。与年龄有关的感觉知觉基因是从基因本体数据库的小鼠感觉知觉(GO：0007600)类别中提取的，包括在12月龄相比5月龄的小鼠中差异表达的基因(q<＝0.05)，但不包括由单独的对照病毒诱导的基因(q<＝0.1)。
表6.实施例16中使用的AAV载体
Figure BDA0003089814690001631
Figure BDA0003089814690001641
表7.引物
引物名称 序列 SEQ ID NO:
TRE3G F AACGTATCTACAGTTTACTCCCTATC 53
TRE3G R GGTAGGAAGTGGTACGGAAAG 54
WPRE F CACTGACAATTCCGTGGTGT 55
WPRE R GAGATCCGACTCGTCTGAGG 56
hGH F TGGGAAGACAACCTGTAGGG 57
hGH R TGAAACCCCGTCTCTACCAA 58
表8.用于RT-PCR的引物
Figure BDA0003089814690001642
Figure BDA0003089814690001651
实施例17：序列的非限制性实例。
编码小家鼠OCT4的核苷酸序列(无终止密码子)(SEQ ID NO:1)：ATGGCTGGACACCTGGCTTCAGACTTCGCCTTCTCACCCCCACCAGGTGGGGGTGATGGGTCAGCAGGGCTGGAGCCGGGCTGGGTGGATCCTCGAACCTGGCTAAGCTTCCAAGGGCCTCCAGGTGGGCCTGGAATCGGACCAGGCTCAGAGGTATTGGGGATCTCCCCATGTCCGCCCGCATACGAGTTCTGCGGAGGGATGGCATACTGTGGACCTCAGGTTGGACTGGGCCTAGTCCCCCAAGTTGGCGTGGAGACTTTGCAGCCTGAGGGCCAGGCAGGAGCACGAGTGGAAAGCAACTCAGAGGGAACCTCCTCTGAGCCCTGTGCCGACCGCCCCAATGCCGTGAAGTTGGAGAAGGTGGAACCAACTCCCGAGGAGTCCCAGGACATGAAAGCCCTGCAGAAGGAGCTAGAACAGTTTGCCAAGCTGCTGAAGCAGAAGAGGATCACCTTGGGGTACACCCAGGCCGACGTGGGGCTCACCCTGGGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTCAGCCAGACCACCATCTGTCGCTTCGAGGCCTTGCAGCTCAGCCTTAAGAACATGTGTAAGCTGCGGCCCCTGCTGGAGAAGTGGGTGGAGGAAGCCGACAACAATGAGAACCTTCAGGAGATATGCAAATCGGAGACCCTGGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACTAGCATTGAGAACCGTGTGAGGTGGAGTCTGGAGACCATGTTTCTGAAGTGCCCGAAGCCCTCCCTACAGCAGATCACTCACATCGCCAATCAGCTTGGGCTAGAGAAGGATGTGGTTCGAGTATGGTTCTGTAACCGGCGCCAGAAGGGCAAAAGATCAAGTATTGAGTATTCCCAACGAGAAGAGTATGAGGCTACAGGGACACCTTTCCCAGGGGGGGCTGTATCCTTTCCTCTGCCCCCAGGTCCCCACTTTGGCACCCCAGGCTATGGAAGCCCCCACTTCACCACACTCTACTCAGTCCCTTTTCCTGAGGGCGAGGCCTTTCCCTCTGTTCCCGTCACTGCTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAAC
编码小家鼠OCT 4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：MAGHLASDFAFSPPPGGGDGSAGLEPGWVDPRTWLSFQGPPGGPGIGPGSEVLGISPCPPAYEFCGGMAYCGPQVGLGLVPQVGVETLQPEGQAGARVESNSEGTSSEPCADRPNAVKLEKVEPTPEESQDMKALQKELEQFAKLLKQKRITLGYTQADVGLTLGVLFGKVFSQTTICRFEALQLSLKNMCKLRPLLEKWVEEADNNENLQEICKSETLVQARKRKRTSIENRVRWSLETMFLKCPKPSLQQITHIANQLGLEKDVVRVWFCNRRQKGKRSSIEYSQREEYEATGTPFPGGAVSFPLPPGPHFGTPGYGSPHFTTLYSVPFPEGEAFPSVPVTALGSPMHSN
编码小家鼠SOX2的核苷酸序列(无终止密码子)(SEQ ID NO:3)：ATGTATAACATGATGGAGACGGAGCTGAAGCCGCCGGGCCCGCAGCAAGCTTCGGGGGGCGGCGGCGGAGGAGGCAACGCCACGGCGGCGGCGACCGGCGGCAACCAGAAGAACAGCCCGGACCGCGTCAAGAGGCCCATGAACGCCTTCATGGTATGGTCCCGGGGGCAGCGGCGTAAGATGGCCCAGGAGAACCCCAAGATGCACAACTCGGAGATCAGCAAGCGCCTGGGCGCGGAGTGGAAACTTTTGTCCGAGACCGAGAAGCGGCCGTTCATCGACGAGGCCAAGCGGCTGCGCGCTCTGCACATGAAGGAGCACCCGGATTATAAATACCGGCCGCGGCGGAAAACCAAGACGCTCATGAAGAAGGATAAGTACACGCTTCCCGGAGGCTTGCTGGCCCCCGGCGGGAACAGCATGGCGAGCGGGGTTGGGGTGGGCGCCGGCCTGGGTGCGGGCGTGAACCAGCGCATGGACAGCTACGCGCACATGAACGGCTGGAGCAACGGCAGCTACAGCATGATGCAGGAGCAGCTGGGCTACCCGCAGCACCCGGGCCTCAACGCTCACGGCGCGGCACAGATGCAACCGATGCACCGCTACGACGTCAGCGCCCTGCAGTACAACTCCATGACCAGCTCGCAGACCTACATGAACGGCTCGCCCACCTACAGCATGTCCTACTCGCAGCAGGGCACCCCCGGTATGGCGCTGGGCTCCATGGGCTCTGTGGTCAAGTCCGAGGCCAGCTCCAGCCCCCCCGTGGTTACCTCTTCCTCCCACTCCAGGGCGCCCTGCCAGGCCGGGGACCTCCGGGACATGATCAGCATGTACCTCCCCGGCGCCGAGGTGCCGGAGCCCGCTGCGCCCAGTAGACTGCACATGGCCCAGCACTACCAGAGCGGCCCGGTGCCCGGCACGGCCATTAACGGCACACTGCCCCTGTCGCACATG
编码小家鼠SOX2的氨基酸序列(翻译)(SEQ ID NO:4)
MYNMMETELKPPGPQQASGGGGGGGNATAAATGGNQKNSPDRVKRPMNAFMVWSRGQRRKMAQENPKMHNSEISKRLGAEWKLLSETEKRPFIDEAKRLRALHMKEHPDYKYRPRRKTKTLMKKDKYTLPGGLLAPGGNSMASGVGVGAGLGAGVNQRMDSYAHMNGWSNGSYSMMQEQLGYPQHPGLNAHGAAQMQPMHRYDVSALQYNSMTSSQTYMNGSPTYSMSYSQQGTPGMALGSMGSVVKSEASSSPPVVTSSSHSRAPCQAGDLRDMISMYLPGAEVPEPAAPSRLHMAQHYQSGPVPGTAINGTLPLSHM
编码小家鼠KLF4的核苷酸序列(无终止密码子)(SEQ ID NO:5)：ATGAGGCAGCCACCTGGCGAGTCTGACATGGCTGTCAGCGACGCTCTGCTCCCGTCCTTCTCCACGTTCGCGTCCGGCCCGGCGGGAAGGGAGAAGACACTGCGTCCAGCAGGTGCCCCGACTAACCGTTGGCGTGAGGAACTCTCTCACATGAAGCGACTTCCCCCACTTCCCGGCCGCCCCTACGACCTGGCGGCGACGGTGGCCACAGACCTGGAGAGTGGCGGAGCTGGTGCAGCTTGCAGCAGTAACAACCCGGCCCTCCTAGCCCGGAGGGAGACCGAGGAGTTCAACGACCTCCTGGACCTAGACTTTATCCTTTCCAACTCGCTAACCCACCAGGAATCGGTGGCCGCCACCGTGACCACCTCGGCGTCAGCTTCATCCTCGTCTTCCCCAGCGAGCAGCGGCCCTGCCAGCGCGCCCTCCACCTGCAGCTTCAGCTATCCGATCCGGGCCGGGGGTGACCCGGGCGTGGCTGCCAGCAACACAGGTGGAGGGCTCCTCTACAGCCGAGAATCTGCGCCACCTCCCACGGCCCCCTTCAACCTGGCGGACATCAATGACGTGAGCCCCTCGGGCGGCTTCGTGGCTGAGCTCCTGCGGCCGGAGTTGGACCCAGTATACATTCCGCCACAGCAGCCTCAGCCGCCAGGTGGCGGGCTGATGGGCAAGTTTGTGCTGAAGGCGTCTCTGACCACCCCTGGCAGCGAGTACAGCAGCCCTTCGGTCATCAGTGTTAGCAAAGGAAGCCCAGACGGCAGCCACCCCGTGGTAGTGGCGCCCTACAGCGGTGGCCCGCCGCGCATGTGCCCCAAGATTAAGCAAGAGGCGGTCCCGTCCTGCACGGTCAGCCGGTCCCTAGAGGCCCATTTGAGCGCTGGACCCCAGCTCAGCAACGGCCACCGGCCCAACACACACGACTTCCCCCTGGGGCGGCAGCTCCCCACCAGGACTACCCCTACACTGAGTCCCGAGGAACTGCTGAACAGCAGGGACTGTCACCCTGGCCTGCCTCTTCCCCCAGGATTCCATCCCCATCCGGGGCCCAACTACCCTCCTTTCCTGCCAGACCAGATGCAGTCACAAGTCCCCTCTCTCCATTATCAAGAGCTCATGCCACCGGGTTCCTGCCTGCCAGAGGAGCCCAAGCCAAAGAGGGGAAGAAGGTCGTGGCCCCGGAAAAGAACAGCCACCCACACTTGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAAACCTATACCAAGAGTTCTCATCTCAAGGCACACCTGCGAACTCACACAGGCGAGAAACCTTACCACTGTGACTGGGACGGCTGTGGGTGGAAATTCGCCCGCTCCGATGAACTGACCAGGCACTACCGCAAACACACAGGGCACCGGCCCTTTCAGTGCCAGAAGTGCGACAGGGCCTTTTCCAGGTCGGACCACCTTGCCTTACACATGAAGAGGCAC
编码小家鼠KLF4的氨基酸序列(翻译)(SEQ ID NO:6)：MRQPPGESDMAVSDALLPSFSTFASGPAGREKTLRPAGAPTNRWREELSHMKRLPPLPGRPYDLAATVATDLESGGAGAACSSNNPALLARRETEEFNDLLDLDFILSNSLTHQESVAATVTTSASASSSSSPASSGPASAPSTCSFSYPIRAGGDPGVAASNTGGGLLYSRESAPPPTAPFNLADINDVSPSGGFVAELLRPELDPVYIPPQQPQPPGGGLMGKFVLKASLTTPGSEYSSPSVISVSKGSPDGSHPVVVAPYSGGPPRMCPKIKQEAVPSCTVSRSLEAHLSAGPQLSNGHRPNTHDFPLGRQLPTRTTPTLSPEELLNSRDCHPGLPLPPGFHPHPGPNYPPFLPDQMQSQVPSLHYQELMPPGSCLPEEPKPKRGRRSWPRKRTATHTCDYAGCGKTYTKSSHLKAHLRTHTGEKPYHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKHTGHRPFQCQKCDRAFSRSDHLALHMKRH
TRE3G启动子序列(TRE启动子的非限制性实例)(SEQ ID NO:7)：TTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGAAGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGCAGACTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGACCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATCTACAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATATCCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGCTTTAGGCGTGTACGGTGGGCGCCTATAAAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGCAATTCCACAACACTTTTGTCTTATACCAACTTTCCGTACCACTTCCTACCCTCGTAAA
SV40衍生的终止子序列(SEQ ID NO:8)：
TGCGCGCAGCGGCCGACCATGGCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTCGGTACCGT2A序列(SEQ ID NO:9)：GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
编码rtTA3的核苷酸序列(在3'末端具有2个VP16结构域)(SEQ ID NO:10)：
ATGTCTAGGCTGGACAAGAGCAAAGTCATAAACGGAGCTCTGGAATTACTCAATGGTGTCGGTATCGAAGGCCTGACGACAAGGAAACTCGCTCAAAAGCTGGGAGTTGAGCAGCCTACCCTGTACTGGCACGTGAAGAACAAGCGGGCCCTGCTCGATGCCCTGCCAATCGAGATGCTGGACAGGCATCATACCCACTTCTGCCCCCTGGAAGGCGAGTCATGGCAAGACTTTCTGCGGAACAACGCCAAGTCATACCGCTGTGCTCTCCTCTCACATCGCGACGGGGCTAAAGTGCATCTCGGCACCCGCCCAACAGAGAAACAGTACGAAACCCTGGAAAATCAGCTCGCGTTCCTGTGTCAGCAAGGCTTCTCCCTGGAGAACGCACTGTACGCTCTGTCCGCCGTGGGCCACTTTACACTGGGCTGCGTATTGGAGGAACAGGAGCATCAAGTAGCAAAAGAGGAAAGAGAGACACCTACCACCGATTCTATGCCCCCACTTCTGAGACAAGCAATTGAGCTGTTCGACCGGCAGGGAGCCGAACCTGCCTTCCTTTTCGGCCTGGAACTAATCATATGTGGCCTGGAGAAACAGCTAAAGTGCGAAAGCGGCGGGCCGACCGACGCCCTTGACGATTTTGACTTAGACATGCTCCCAGCCGATGCCCTTGACGATTTTGACCTTGACATGCTCCCCGGGTAA
编码的氨基酸序列rtTA3(SEQ ID NO:11)：
MSRLDKSKVINGALELLNGVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALPIEMLDRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSYRCALLSHRDGAKVHLGTRPTEKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEEQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLRQAIELFDRQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESGGPTDALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPG
编码的核苷酸序列rtTA4(在3'末端具有3个VP16结构域)(SEQ ID NO:12)：
ATGTCCCGCTTGGATAAGAGCAAGGTAATAAATAGCGCACTCGAACTCCTCAACGGCGTGGGCATCGAAGGTCTGACTACTCGAAAGCTCGCCCAGAAATTGGGTGTGGAGCAACCTACATTGTATTGGCATGTCAAGAACAAAAGAGCCCTGCTGGACGCTCTTCCTATTGAAATGCTTGACAGGCATCACACTCATTCCTGCCCCCTTGAGGTCGAGAGTTGGCAAGATTTTCTCCGAAACAATGCAAAGTCCTACCGCTGCGCACTTTTGTCCCATAGGGATGGAGCAAAAGTGCACCTGGGAACCAGGCCAACAGAGAAACAATACGAGACTCTCGAGAACCAGTTGGCTTTCTTGTGCCAACAGGGGTTCTCACTTGAAAATGCCCTTTACGCACTGTCAGCCGTTGGACATTTTACCCTGGGGTGCGTTCTTGAGGAGCAAGAACATCAGGTTGCTAAGGAGGAGCGCGAGACTCCAACCACTGATTCTATGCCACCTTTGCTGAAACAGGCCATTGAACTTTTCGATAGACAGGGTGCTGAACCTGCCTTTCTCTTCGGGTTGGAGCTGATTATTTGTGGTCTCGAAAAACAGCTGAAATGTGAAAGTGGTGGCCCTACTGACGCCCTCGATGATTTCGACCTGGATATGCTGCCAGCCGATGCACTTGATGATTTCGATTTGGATATGCTTCCAGCCGACGCACTGGACGACTTCGATTTGGACATGCTTCCCGGTTAA
编码rtTA4的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)：
MSRLDKSKVINSALELLNGVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALPIEMLDRHHTHSCPLEVESWQDFLRNNAKSYRCALLSHRDGAKVHLGTRPTEKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEEQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLKQAIELFDRQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESGGPTDALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPG
编码M2-rtTA的核苷酸序列(SEQ ID NO:14)：
ATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCATCGATACCGTCGACCTCGAGACCTAGAAAAACATGGAGCAATCACAAGTAGCAATACAGCAGCTACCAATGCTGATTGTGCCTGGCTAGAAGCACAAGAGGAGGAGGAGGTGGGTTTTCCAGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTGGCAGAACTACACACCAGGGCCAGGGATCAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCAGTTGAGCAAGAGAAGGTAGAAGAAGCCAATGAAGGAGAGAACACCCGCTTGTTACACCCTGTGAGCCTGCATGGGATGGATGACCCGGAGAGAGAAGTATTAGAGTGGAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATCACATGGCCCGAGAGCTGCATCCGGACTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGA
编码M2-rtTA的氨基酸序列(SEQ ID NO:15)：
MPLYHAIASRMAFIFSSLYKSWLLSLYEELWPVVRQRGVVCTVFADATPTGWGIATTCQLLSGTFAFPLPIATAELIAACLARCWTGARLLGTDNSVVLSGKSSSFPWLLACVATWILRGTSFCYVPSALNPADLPSRGLLPALRPLPRLRLRPQTSRISLWAASPHRYRRPRDLEKHGAITSSNTAATNADCAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGIRYPLTFGWCYKLVPVEQEKVEEANEGENTRLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHMARELHPDCTGSLWLDQI
pAAV-TRE3G-OSK-SV40pA,TRE-OSK-SV40或TRE3G-OSK-SV40pA载体的核酸序列(SEQ ID NO:16)：
TTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGTAATGGTAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTAAGGCCTTAATTAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGAAGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGCAGACTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGACCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATCTACAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATATCCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGCTTTAGGCGTGTACGGTGGGCGCCTATAAAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGCAATTCCACAACACTTTTGTCTTATACCAACTTTCCGTACCACTTCCTACCCTCGTAAAGCGGCCGCGCCACCATGGCTGGACACCTGGCTTCAGACTTCGCCTTCTCACCCCCACCAGGTGGGGGTGATGGGTCAGCAGGGCTGGAGCCGGGCTGGGTGGATCCTCGAACCTGGCTAAGCTTCCAAGGGCCTCCAGGTGGGCCTGGAATCGGACCAGGCTCAGAGGTATTGGGGATCTCCCCATGTCCGCCCGCATACGAGTTCTGCGGAGGGATGGCATACTGTGGACCTCAGGTTGGACTGGGCCTAGTCCCCCAAGTTGGCGTGGAGACTTTGCAGCCTGAGGGCCAGGCAGGAGCACGAGTGGAAAGCAACTCAGAGGGAACCTCCTCTGAGCCCTGTGCCGACCGCCCCAATGCCGTGAAGTTGGAGAAGGTGGAACCAACTCCCGAGGAGTCCCAGGACATGAAAGCCCTGCAGAAGGAGCTAGAACAGTTTGCCAAGCTGCTGAAGCAGAAGAGGATCACCTTGGGGTACACCCAGGCCGACGTGGGGCTCACCCTGGGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTCAGCCAGACCACCATCTGTCGCTTCGAGGCCTTGCAGCTCAGCCTTAAGAACATGTGTAAGCTGCGGCCCCTGCTGGAGAAGTGGGTGGAGGAAGCCGACAACAATGAGAACCTTCAGGAGATATGCAAATCGGAGACCCTGGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACTAGCATTGAGAACCGTGTGAGGTGGAGTCTGGAGACCATGTTTCTGAAGTGCCCGAAGCCCTCCCTACAGCAGATCACTCACATCGCCAATCAGCTTGGGCTAGAGAAGGATGTGGTTCGAGTATGGTTCTGTAACCGGCGCCAGAAGGGCAAAAGATCAAGTATTGAGTATTCCCAACGAGAAGAGTATGAGGCTACAGGGACACCTTTCCCAGGGGGGGCTGTATCCTTTCCTCTGCCCCCAGGTCCCCACTTTGGCACCCCAGGCTATGGAAGCCCCCACTTCACCACACTCTACTCAGTCCCTTTTCCTGAGGGCGAGGCCTTTCCCTCTGTTCCCGTCACTGCTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAACGCTAGCGGCAGCGGCGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCTGCATGCATGTATAACATGATGGAGACGGAGCTGAAGCCGCCGGGCCCGCAGCAAGCTTCGGGGGGCGGCGGCGGAGGAGGCAACGCCACGGCGGCGGCGACCGGCGGCAACCAGAAGAACAGCCCGGACCGCGTCAAGAGGCCCATGAACGCCTTCATGGTATGGTCCCGGGGGCAGCGGCGTAAGATGGCCCAGGAGAACCCCAAGATGCACAACTCGGAGATCAGCAAGCGCCTGGGCGCGGAGTGGAAACTTTTGTCCGAGACCGAGAAGCGGCCGTTCATCGACGAGGCCAAGCGGCTGCGCGCTCTGCACATGAAGGAGCACCCGGATTATAAATACCGGCCGCGGCGGAAAACCAAGACGCTCATGAAGAAGGATAAGTACACGCTTCCCGGAGGCTTGCTGGCCCCCGGCGGGAACAGCATGGCGAGCGGGGTTGGGGTGGGCGCCGGCCTGGGTGCGGGCGTGAACCAGCGCATGGACAGCTACGCGCACATGAACGGCTGGAGCAACGGCAGCTACAGCATGATGCAGGAGCAGCTGGGCTACCCGCAGCACCCGGGCCTCAACGCTCACGGCGCGGCACAGATGCAACCGATGCACCGCTACGACGTCAGCGCCCTGCAGTACAACTCCATGACCAGCTCGCAGACCTACATGAACGGCTCGCCCACCTACAGCATGTCCTACTCGCAGCAGGGCACCCCCGGTATGGCGCTGGGCTCCATGGGCTCTGTGGTCAAGTCCGAGGCCAGCTCCAGCCCCCCCGTGGTTACCTCTTCCTCCCACTCCAGGGCGCCCTGCCAGGCCGGGGACCTCCGGGACATGATCAGCATGTACCTCCCCGGCGCCGAGGTGCCGGAGCCCGCTGCGCCCAGTAGACTGCACATGGCCCAGCACTACCAGAGCGGCCCGGTGCCCGGCACGGCCATTAACGGCACACTGCCCCTGTCGCACATGGCATGCGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCACTCGAGATGAGGCAGCCACCTGGCGAGTCTGACATGGCTGTCAGCGACGCTCTGCTCCCGTCCTTCTCCACGTTCGCGTCCGGCCCGGCGGGAAGGGAGAAGACACTGCGTCCAGCAGGTGCCCCGACTAACCGTTGGCGTGAGGAACTCTCTCACATGAAGCGACTTCCCCCACTTCCCGGCCGCCCCTACGACCTGGCGGCGACGGTGGCCACAGACCTGGAGAGTGGCGGAGCTGGTGCAGCTTGCAGCAGTAACAACCCGGCCCTCCTAGCCCGGAGGGAGACCGAGGAGTTCAACGACCTCCTGGACCTAGACTTTATCCTTTCCAACTCGCTAACCCACCAGGAATCGGTGGCCGCCACCGTGACCACCTCGGCGTCAGCTTCATCCTCGTCTTCCCCAGCGAGCAGCGGCCCTGCCAGCGCGCCCTCCACCTGCAGCTTCAGCTATCCGATCCGGGCCGGGGGTGACCCGGGCGTGGCTGCCAGCAACACAGGTGGAGGGCTCCTCTACAGCCGAGAATCTGCGCCACCTCCCACGGCCCCCTTCAACCTGGCGGACATCAATGACGTGAGCCCCTCGGGCGGCTTCGTGGCTGAGCTCCTGCGGCCGGAGTTGGACCCAGTATACATTCCGCCACAGCAGCCTCAGCCGCCAGGTGGCGGGCTGATGGGCAAGTTTGTGCTGAAGGCGTCTCTGACCACCCCTGGCAGCGAGTACAGCAGCCCTTCGGTCATCAGTGTTAGCAAAGGAAGCCCAGACGGCAGCCACCCCGTGGTAGTGGCGCCCTACAGCGGTGGCCCGCCGCGCATGTGCCCCAAGATTAAGCAAGAGGCGGTCCCGTCCTGCACGGTCAGCCGGTCCCTAGAGGCCCATTTGAGCGCTGGACCCCAGCTCAGCAACGGCCACCGGCCCAACACACACGACTTCCCCCTGGGGCGGCAGCTCCCCACCAGGACTACCCCTACACTGAGTCCCGAGGAACTGCTGAACAGCAGGGACTGTCACCCTGGCCTGCCTCTTCCCCCAGGATTCCATCCCCATCCGGGGCCCAACTACCCTCCTTTCCTGCCAGACCAGATGCAGTCACAAGTCCCCTCTCTCCATTATCAAGAGCTCATGCCACCGGGTTCCTGCCTGCCAGAGGAGCCCAAGCCAAAGAGGGGAAGAAGGTCGTGGCCCCGGAAAAGAACAGCCACCCACACTTGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAAACCTATACCAAGAGTTCTCATCTCAAGGCACACCTGCGAACTCACACAGGCGAGAAACCTTACCACTGTGACTGGGACGGCTGTGGGTGGAAATTCGCCCGCTCCGATGAACTGACCAGGCACTACCGCAAACACACAGGGCACCGGCCCTTTCAGTGCCAGAAGTGCGACAGGGCCTTTTCCAGGTCGGACCACCTTGCCTTACACATGAAGAGGCACTAAATGACTAGTGCGCGCAGCGGCCGACCATGGCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTCGGTACCGGATCCAAATTCCCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAATTTCAGGTGGCATCTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAATAGTGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAA
pAAV-UBC-rtTA4-WPRE3-SV40pA载体的核酸序列(SEQ ID NO:17)：TTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCAT GTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGTAATGGTAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTAAGGCCTTAATTAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCCTGATCTGGCCTCCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGCGAGCGTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGGCGAGGAAAAGTAGTCCCTTCTCGGCGATTCTGCGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCGCTGTGATCGTCACTTGGTGAGTAGCGGGCTGCTGGGCTGGCCGGGGCTTTCGTGGCCGCCGGGCCGCTCGGTGGGACGGAAGCGTGTGGAGAGACCGCCAAGGGCTGTAGTCTGGGTCCGCGAGCAAGGTTGCCCTGAACTGGGGGTTGGGGGGAGCGCAGCAAAATGGCGGCTGTTCCCGAGTCTTGAATGGAAGACGCTTGTGAGGCGGGCTGTGAGGTCGTTGAAACAAGGTGGGGGGCATGGTGGGCGGCAAGAACCCAAGGTCTTGAGGCCTTCGCTAATGCGGGAAAGCTCTTATTCGGGTGAGATGGGCTGGGGCACCATCTGGGGACCCTGACGTGAAGTTTGTCACTGACTGGAGAACTCGGTTTGTCGTCTGTTGCGGGGGCGGCAGTTATGCGGTGCCGTTGGGCAGTGCACCCGTACCTTTGGGAGCGCGCGCCTCGTCGTGTCGTGACGTCACCCGTTCTGTTGGCTTATAATGCAGGGTGGGGCCACCTGCCGGTAGGTGTGCGGTAGGCTTTTCTCCGTCGCAGGACGCAGGGTTCGGGCCTAGGGTAGGCTCTCCTGAATCGACAGGCGCCGGACCTCTGGTGAGGGGAGGGATAAGTGAGGCGTCAGTTTCTTTGGTCGGTTTTATGTACCTATCTTCTTAAGTAGCTGAAGCTCCGGTTTTGAACTATGCGCTCGGGGTTGGCGAGTGTGTT TTGTGAAGTTTTTTAGGCACCTTTTGAAATGTAATCATTTGGGTCAATATGTAATTTTCAGTGTTAGACTAGTAAATTGTCCGCTAAATTCTGGCCGTTTTTGGCTTTTTTGTTAGACGAAGCGGCCGCATTAAACGCCACCATGTCCCGCTTGGATAAGAGCAAGGTAATAAATAGCGCACTCGAACTCCTCAACGGCGTGGGCATCGAAGGTCTGACTACTCGAAAGCTCGCCCAGAAATTGGGTGTGGAGCAACCTACATTGTATTGGCATGTCAAGAACAAAAGAGCCCTGCTGGACGCTCTTCCTATTGAAATGCTTGACAGGCATCACACTCATTCCTGCCCCCTTGAGGTCGAGAGTTGGCAAGATTTTCTCCGAAACAATGCAAAGTCCTACCGCTGCGCACTTTTGTCCCATAGGGATGGAGCAAAAGTGCACCTGGGAACCAGGCCAACAGAGAAACAATACGAGACTCTCGAGAACCAGTTGGCTTTCTTGTGCCAACAGGGGTTCTCACTTGAAAATGCCCTTTACGCACTGTCAGCCGTTGGACATTTTACCCTGGGGTGCGTTCTTGAGGAGCAAGAACATCAGGTTGCTAAGGAGGAGCGCGAGACTCCAACCACTGATTCTATGCCACCTTTGCTGAAACAGGCCATTGAACTTTTCGATAGACAGGGTGCTGAACCTGCCTTTCTCTTCGGGTTGGAGCTGATTATTTGTGGTCTCGAAAAACAGCTGAAATGTGAAAGTGGTGGCCCTACTGACGCCCTCGATGATTTCGACCTGGATATGCTGCCAGCCGATGCACTTGATGATTTCGATTTGGATATGCTTCCAGCCGACGCACTGGACGACTTCGATTTGGACATGCTTCCCGGTTAAACTAGTCTAGCAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTCTAGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCGGGGGATCCAAATTCCCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAATTTCAGGTGGCATCTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAATAGTGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAA
UBC启动子序列(SEQ ID NO:18)：
GATCTGGCCTCCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGCGAGCGTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGGCGAGGAAAAGTAGTCCCTTCTCGGCGATTCTGCGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCGCTGTGATCGTCACTTGGTGAGTAGCGGGCTGCTGGGCTGGCCGGGGCTTTCGTGGCCGCCGGGCCGCTCGGTGGGACGGAAGCGTGTGGAGAGACCGCCAAGGGCTGTAGTCTGGGTCCGCGAGCAAGGTTGCCCTGAACTGGGGGTTGGGGGGAGCGCAGCAAAATGGCGGCTGTTCCCGAGTCTTGAATGGAAGACGCTTGTGAGGCGGGCTGTGAGGTCGTTGAAACAAGGTGGGGGGCATGGTGGGCGGCAAGAACCCAAGGTCTTGAGGCCTTCGCTAATGCGGGAAAGCTCTTATTCGGGTGAGATGGGCTGGGGCACCATCTGGGGACCCTGACGTGAAGTTTGTCACTGACTGGAGAACTCGGTTTGTCGTCTGTTGCGGGGGCGGCAGTTATGCGGTGCCGTTGGGCAGTGCACCCGTACCTTTGGGAGCGCGCGCCTCGTCGTGTCGTGACGTCACCCGTTCTGTTGGCTTATAATGCAGGGTGGGGCCACCTGCCGGTAGGTGTGCGGTAGGCTTTTCTCCGTCGCAGGACGCAGGGTTCGGGCCTAGGGTAGGCTCTCCTGAATCGACAGGCGCCGGACCTCTGGTGAGGGGAGGGATAAGTGAGGCGTCAGTTTCTTTGGTCGGTTTTATGTACCTATCTTCTTAAGTAGCTGAAGCTCCGGTTTTGAACTATGCGCTCGGGGTTGGCGAGTGTGTTTTGTGAAGTTTTTTAGGCACCTTTTGAAATGTAATCATTTGGGTCAATATGTAATTTTCAGTGTTAGACTAGTAAATTGTCCGCTAAATTCTGGCCGTTTTTGGCTTTTTTGTTAGAC
Tet-O序列(SEQ ID NO:19)：TCCCTATCAGTGATAGAGA
编码最小CMV启动子的核酸序列(SEQ ID NO:20)：GCTTTAGGCGTGTACGGTGGGCGCCTATAAAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTC AGATCGCCTGGA
编码WPRE的核酸序列(SEQ ID NO:21)：
AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTT
编码反向末端重复序列的核酸序列(SEQ ID NO:22)：CCTTAATTAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
TRE2启动子的核酸序列(TRE启动子的非限制性实例)(SEQ ID NO:23)：AATTCGTACACGCCTACCTCGACCCATCAAGTGCCACCTGACGTCTCCCTATCAGTGATAGAGAAGTCGACACGTCTCGAGCTCCCTATCAGTGATAGAGAAGGTACGTCTAGAACGTCTCCCTATCAGTGATAGAGAAGTCGACACGTCTCGAGCTCCCTATCAGTGATAGAGAAGGTACGTCTAGAACGTCTCCCTATCAGTGATAGAGAAGTCGACACGTCTCGAGCTCCCTATCAGTGATAGAGAAGGTACGTCTAGAACGTCTCCCTATCAGTGATAGAGAAGTCGACACGTCTCGAGCTCCCTATCAGTGATAGAGAAGGTACCCCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTGGATCGC
P紧密启动子的核酸序列(TRE启动子的非限制性实例)(SEQ ID NO:24)：GAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGATGTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGTTTATCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGTTTACTC CCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCC
编码TetR的核酸序列(SEQ ID NO:25)：
ATGGCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAGCGCATTAGAGCTGCTTAATGAGGTCGGAATCGAAGGTTTAACAACCCGTAAACTCGCCCAGAAGCTAGGTGTAGAGCAGCCTACATTGTATTGGCATGTAAAAAATAAGCGGGCTTTGCTCGACGCCTTAGCCATTGAGATGTTAGATAGGCACCATACTCACTTTTGCCCTTTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCTAAAAGTTTTAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCAAAAGTACATTTAGGTACACGGCCTACAGAAAAACAGTATGAAACTCTCGAAAATCAATTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTTTCACTAGAGAATGCATTATATGCACTCAGCGCTGTGGGGCATTTTACTTTAGGTTGCGTATTGGAAGATCAAGAGCATCAAGTCGCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGCCGCCATTATTACGACAAGCTATCGAATTATTTGATCACCAAGGTGCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAATTGATCATATGCGGATTAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGG
编码TetR的氨基酸序列(SEQ ID NO:26)：
MARLDKSKVINSALELLNEVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALAIEMLDRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSFRCALLSHRDGAKVHLGTRPTEKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEDQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLRQAIELFDHQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESG
编码TetR-Krab的核酸序列(SEQ ID NO:27)
ATGGCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAGCGCATTAGAGCTGCTTAATGAGGTCGGAATCGAAGGTTTAACAACCCGTAAACTCGCCCAGAAGCTAGGTGTAGAGCAGCCTACATTGTATTGGCATGTAAAAAATAAGCGGGCTTTGCTCGACGCCTTAGCCATTGAGATGTTAGATAGGCACCATACTCACTTTTGCCCTTTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCTAAAAGTTTTAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCAAAAGTACATTTAGGTACACGGCCTACAGAAAAACAGTATGAAACTCTCGAAAATCAATTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTTTCACTAGAGAATGCATTATATGCACTCAGCGCTGTGGGGCATTTTACTTTAGGTTGCGTATTGGAAGATCAAGAGCATCAAGTCGCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGCCGCCATTATTACGACAAGCTATCGAATTATTTGATCACCAAGGTGCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAATTGATCATATGCGGATTAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCGCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCGACGGCGGTGGTGCTTTGTCTCCTCAGCACTCTGCTGTCACTCAAGGAAGTATCATCAAGAACAAGGAGGGCATGGATGCTAAGTCACTAACTGCCTGGTCCCGGACACTGGTGACCTTCAAGGATGTATTTGTGGACTTCACCAGGGAGGAGTGGAAGCTGCTGGACACTGCTCAGCAGATCGTGTACAGAAATGTGATGCTGGAGAACTATAAGAACCTGGTTTCCTTGGGTTATCAGCTTACTAAGCCAGATGTGATCCTCCGGTTGGAGAAGGGAGAAGAGCCCTGGCTGGTGGAGAGAGAAATTCACCAAGAGACCCATCCTGATTCAGAGACTGCATTTGAAATCAAATCATCAGTTTAA
编码TetR-KRAB的氨基酸序列(SEQ ID NO:28)：MARLDKSKVINSALELLNEVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALAIEMLDRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSFRCALLSHRDGAKVHLGTRPTEKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEDQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLRQAIELFDHQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESGSPKKKRKVDGGGALSPQHSAVTQGSIIKNKEGMDAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVEREIHQETHPDSETAFEIKSSV
Desmin启动子(SEQ ID NO:29)：
ACCTTGCTTCCTAGCTGGGCCTTTCCTTCTCCTCTATAAATACCAGCTCTGGTATTTCGCCTTGGCAGCTGTTGCTGCTAGGGAGACGGCTGGCTTGACATGCATCTCCTGACAAAACACAAACCCGTGGTGTGAGTGGGTGTGGGCGGTGTGAGTAGGGGGATGAATCAGAGAGGGGGCGAGGGAGACAGGGGCGCAGGAGTCAGGCAAAGGCGATGCGGGGGTGCGACTACACGCAGTTGGAAACAGTCGTCAGAAGATTCTGGAAACTATCTTGCTGGCTATAAACTTGAGGGAAGCAGAAGGCCAACATTCCTCCCAAGGGAAACTGAGGCTCAGAGTTAAAACCCAGGTATCAGTGATATGCATGTGCCCCGGCCAGGGTCACTCTCTGACTAACCGGTACCTACCCTACAGGCCTACCTAGAGACTCTTTTGAAAGGATGGTAGAGACCTGTCCGGGCTTTGCCCACAGTCGTTGGAAACCTCAGCATTTTCTAGGCAACTTGTGCGAATAAAACACTTCGGGGGTCCTTCTTGTTCATTCCAATAACCTAAAACCTCTCCTCGGAGAAAATAGGGGGCCTCAAACAAACGAAATTCTCTAGCCCGCTTTCCCCAGGATAAGGCAGGCATCCAAATGGAAAAAAAGGGGCCGGCCGGGGGTCTCCTGTCAGCTCCTTGCCCTGTGAAACCCAGCAGGCCTGCCTGTCTTCTGTCCTCTTGGGGCTGTCCAGGGGCGCAGGCCTCTTGCGGGGGAGCTGGCCTCCCCGCCCCCTCGCCTGTGGCCGCCCTTTTCCTGGCAGGACAGAGGGATCCTGCAGCTGTCAGGGGAGGGGCGCCGGGGGGTGATGTCAGGAGGGCTACAAATAGTGCAGACAGCTAAGGGGCTCCGTCACCCATCTTCACATCCACTCCAGCCGGCTGCCCGCCCGCTGCCTCCTCTGTGCGTCCGCCCAGCCAGCCTCGTCCACGCC
Desmin-rtTA4载体(SEQ ID NO:30)：
TTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGTAATGGTAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTAAGGCCTTAATTAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCCTAGATCTACCTTGCTTCCTAGCTGGGCCTTTCCTTCTCCTCTATAAATACCAGCTCTGGTATTTCGCCTTGGCAGCTGTTGCTGCTAGGGAGACGGCTGGCTTGACATGCATCTCCTGACAAAACACAAACCCGTGGTGTGAGTGGGTGTGGGCGGTGTGAGTAGGGGGATGAATCAGAGAGGGGGCGAGGGAGACAGGGGCGCAGGAGTCAGGCAAAGGCGATGCGGGGGTGCGACTACACGCAGTTGGAAACAGTCGTCAGAAGATTCTGGAAACTATCTTGCTGGCTATAAACTTGAGGGAAGCAGAAGGCCAACATTCCTCCCAAGGGAAACTGAGGCTCAGAGTTAAAACCCAGGTATCAGTGATATGCATGTGCCCCGGCCAGGGTCACTCTCTGACTAACCGGTACCTACCCTACAGGCCTACCTAGAGACTCTTTTGAAAGGATGGTAGAGACCTGTCCGGGCTTTGCCCACAGTCGTTGGAAACCTCAGCATTTTCTAGGCAACTTGTGCGAATAAAACACTTCGGGGGTCCTTCTTGTTCATTCCAATAACCTAAAACCTCTCCTCGGAGAAAATAGGGGGCCTCAAACAAACGAAATTCTCTAGCCCGCTTTCCCCAGGATAAGGCAGGCATCCAAATGGAAAAAAAGGGGCCGGCCGGGGGTCTCCTGTCAGCTCCTTGCCCTGTGAAACCCAGCAGGCCTGCCTGTCTTCTGTCCTCTTGGGGCTGTCCAGGGGCGCAGGCCTCTTGCGGGGGAGCTGGCCTCCCCGCCCCCTCGCCTGTGGCCGCCCTTTTCCTGGCAGGACAGAGGGATCCTGCAGCTGTCAGGGGAGGGGCGCCGGGGGGTGATGTCAGGAGGGCTACAAATAGTGCAGACAGCTAAGGGGCTCCGTCACCCATCTTCACATCCACTCCAGCCGGCTGCCCGCCCGCTGCCTCCTCTGTGCGTCCGCCCAGCCAGCCTCGTCCACGCCAAGCTTGCGGCCGCATTAAACGCCACCATGTCCCGCTTGGATAAGAGCAAGGTAATAAATAGCGCACTCGAACTCCTCAACGGCGTGGGCATCGAAGGTCTGACTACTCGAAAGCTCGCCCAGAAATTGGGTGTGGAGCAACCTACATTGTATTGGCATGTCAAGAACAAAAGAGCCCTGCTGGACGCTCTTCCTATTGAAATGCTTGACAGGCATCACACTCATTCCTGCCCCCTTGAGGTCGAGAGTTGGCAAGATTTTCTCCGAAACAATGCAAAGTCCTACCGCTGCGCACTTTTGTCCCATAGGGATGGAGCAAAAGTGCACCTGGGAACCAGGCCAACAGAGAAACAATACGAGACTCTCGAGAACCAGTTGGCTTTCTTGTGCCAACAGGGGTTCTCACTTGAAAATGCCCTTTACGCACTGTCAGCCGTTGGACATTTTACCCTGGGGTGCGTTCTTGAGGAGCAAGAACATCAGGTTGCTAAGGAGGAGCGCGAGACTCCAACCACTGATTCTATGCCACCTTTGCTGAAACAGGCCATTGAACTTTTCGATAGACAGGGTGCTGAACCTGCCTTTCTCTTCGGGTTGGAGCTGATTATTTGTGGTCTCGAAAAACAGCTGAAATGTGAAAGTGGTGGCCCTACTGACGCCCTCGATGATTTCGACCTGGATATGCTGCCAGCCGATGCACTTGATGATTTCGATTTGGATATGCTTCCAGCCGACGCACTGGACGACTTCGATTTGGACATGCTTCCCGGTTAAACTAGTCTAGCAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTCTAGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCGGGGGATCCAAATTCCCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAATTTCAGGTGGCATCTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAATAGTGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAA
pAAV2_CMV_rtTA(V16)(SEQ ID NO:31)：
AAATTGTAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGCCCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCAAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTACTATGGTTGCTTTGACGTATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCCCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCTCGGTCCGCACGATCTCAATTCGGCCATTACGGCCGGATCCGGCTCGAGGAGCTTGGCCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGCTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCCCGAATTCACCATGTCTAGACTGGACAAGAGCAAAATCATAAACAGCGCTCTGGAATTACTCAATGGAGTCGGTATCGAAGGCCTGACGACAAGGAAACTCGCTCAAAAGCTGGGAGTTGAGCAGCCTACCCTGTACTGGCACGTGAAGAACAAGCGGGCCCTGCTCGATGCCCTGCCAATCGAGATGCTGGACAGGCATCATACCCACAGCTGCCCCCTGGAAGGCGAGTCATGGCAAGACTTTCTGCGGAACAACGCCAAGTCATACCGCTGTGCTCTCCTCTCACATCGCGACGGGGCTAAAGTGCATCTCGGCACCCGCCCAACAGAGAAACAGTACGAAACCCTGGAAAATCAGCTCGCGTTCCTGTGTCAGCAAGGCTTCTCCCTGGAGAACGCACTGTACGCTCTGTCCGCCGTGGGCCACTTTACACTGGGCTGCGTATTGGAGGAACAGGAGCATCAAGTAGCAAAAGAGGAAAGAGAGACACCTACCACCGATTCTATGCCCCCACTTCTGAAGCAAGCAATTGAGCTGTTCGACCGGCAGGGAGCCGAACCTGCCTTCCTTTTCGGCCTGGAACTAATCATATGTGGCCTGGAGAAACAGCTAAAGTGCGAAAGCGGCGGGCCGACCGACGCCCTTGACGATTTTGACTTAGACATGCTCCCAGCCGATGCCCTTGACGACTTTGACCTTGATATGCTGCCTGCTGACGCTCTTGACGATTTTGACCTTGACATGCTCCCCGGGTAACTAAGTAAGGATCATCTTAATTAAATCGATAAGGATCTGGCCGCCTCGGCCTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAACTAGCGCGTGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATA
CAG-tTA(SEQ ID NO:32)：
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pAAV-Tet-O-OSK-SV40LpA(或pAAV-TRE2-OSK-SV40LpA)(SEQ ID NO:33)：
TTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGTAATGGTAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTAAGGCCTTAATTAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCGTACACGCCTACCTCGACCCATCAAGTGCCACCTGACGTCTCCCTATCAGTGATAGAGAAGTCGACACGTCTCGAGCTCCCTATCAGTGATAGAGAAGGTACGTCTAGAACGTCTCCCTATCAGTGATAGAGAAGTCGACACGTCTCGAGCTCCCTATCAGTGATAGAGAAGGTACGTCTAGAACGTCTCCCTATCAGTGATAGAGAAGTCGACACGTCTCGAGCTCCCTATCAGTGATAGAGAAGGTACGTCTAGAACGTCTCCCTATCAGTGATAGAGAAGTCGACACGTCTCGAGCTCCCTATCAGTGATAGAGAAGGTACCCCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTGGATCGCGGCCGCGCCACCATGGCTGGACACCTGGCTTCAGACTTCGCCTTCTCACCCCCACCAGGTGGGGGTGATGGGTCAGCAGGGCTGGAGCCGGGCTGGGTGGATCCTCGAACCTGGCTAAGCTTCCAAGGGCCTCCAGGTGGGCCTGGAATCGGACCAGGCTCAGAGGTATTGGGGATCTCCCCATGTCCGCCCGCATACGAGTTCTGCGGAGGGATGGCATACTGTGGACCTCAGGTTGGACTGGGCCTAGTCCCCCAAGTTGGCGTGGAGACTTTGCAGCCTGAGGGCCAGGCAGGAGCACGAGTGGAAAGCAACTCAGAGGGAACCTCCTCTGAGCCCTGTGCCGACCGCCCCAATGCCGTGAAGTTGGAGAAGGTGGAACCAACTCCCGAGGAGTCCCAGGACATGAAAGCCCTGCAGAAGGAGCTAGAACAGTTTGCCAAGCTGCTGAAGCAGAAGAGGATCACCTTGGGGTACACCCAGGCCGACGTGGGGCTCACCCTGGGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTCAGCCAGACCACCATCTGTCGCTTCGAGGCCTTGCAGCTCAGCCTTAAGAACATGTGTAAGCTGCGGCCCCTGCTGGAGAAGTGGGTGGAGGAAGCCGACAACAATGAGAACCTTCAGGAGATATGCAAATCGGAGACCCTGGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACTAGCATTGAGAACCGTGTGAGGTGGAGTCTGGAGACCATGTTTCTGAAGTGCCCGAAGCCCTCCCTACAGCAGATCACTCACATCGCCAATCAGCTTGGGCTAGAGAAGGATGTGGTTCGAGTATGGTTCTGTAACCGGCGCCAGAAGGGCAAAAGATCAAGTATTGAGTATTCCCAACGAGAAGAGTATGAGGCTACAGGGACACCTTTCCCAGGGGGGGCTGTATCCTTTCCTCTGCCCCCAGGTCCCCACTTTGGCACCCCAGGCTATGGAAGCCCCCACTTCACCACACTCTACTCAGTCCCTTTTCCTGAGGGCGAGGCCTTTCCCTCTGTTCCCGTCACTGCTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAACGCTAGCGGCAGCGGCGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCTGCATGCATGTATAACATGATGGAGACGGAGCTGAAGCCGCCGGGCCCGCAGCAAGCTTCGGGGGGCGGCGGCGGAGGAGGCAACGCCACGGCGGCGGCGACCGGCGGCAACCAGAAGAACAGCCCGGACCGCGTCAAGAGGCCCATGAACGCCTTCATGGTATGGTCCCGGGGGCAGCGGCGTAAGATGGCCCAGGAGAACCCCAAGATGCACAACTCGGAGATCAGCAAGCGCCTGGGCGCGGAGTGGAAACTTTTGTCCGAGACCGAGAAGCGGCCGTTCATCGACGAGGCCAAGCGGCTGCGCGCTCTGCACATGAAGGAGCACCCGGATTATAAATACCGGCCGCGGCGGAAAACCAAGACGCTCATGAAGAAGGATAAGTACACGCTTCCCGGAGGCTTGCTGGCCCCCGGCGGGAACAGCATGGCGAGCGGGGTTGGGGTGGGCGCCGGCCTGGGTGCGGGCGTGAACCAGCGCATGGACAGCTACGCGCACATGAACGGCTGGAGCAACGGCAGCTACAGCATGATGCAGGAGCAGCTGGGCTACCCGCAGCACCCGGGCCTCAACGCTCACGGCGCGGCACAGATGCAACCGATGCACCGCTACGACGTCAGCGCCCTGCAGTACAACTCCATGACCAGCTCGCAGACCTACATGAACGGCTCGCCCACCTACAGCATGTCCTACTCGCAGCAGGGCACCCCCGGTATGGCGCTGGGCTCCATGGGCTCTGTGGTCAAGTCCGAGGCCAGCTCCAGCCCCCCCGTGGTTACCTCTTCCTCCCACTCCAGGGCGCCCTGCCAGGCCGGGGACCTCCGGGACATGATCAGCATGTACCTCCCCGGCGCCGAGGTGCCGGAGCCCGCTGCGCCCAGTAGACTGCACATGGCCCAGCACTACCAGAGCGGCCCGGTGCCCGGCACGGCCATTAACGGCACACTGCCCCTGTCGCACATGGCATGCGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCACTCGAGATGAGGCAGCCACCTGGCGAGTCTGACATGGCTGTCAGCGACGCTCTGCTCCCGTCCTTCTCCACGTTCGCGTCCGGCCCGGCGGGAAGGGAGAAGACACTGCGTCCAGCAGGTGCCCCGACTAACCGTTGGCGTGAGGAACTCTCTCACATGAAGCGACTTCCCCCACTTCCCGGCCGCCCCTACGACCTGGCGGCGACGGTGGCCACAGACCTGGAGAGTGGCGGAGCTGGTGCAGCTTGCAGCAGTAACAACCCGGCCCTCCTAGCCCGGAGGGAGACCGAGGAGTTCAACGACCTCCTGGACCTAGACTTTATCCTTTCCAACTCGCTAACCCACCAGGAATCGGTGGCCGCCACCGTGACCACCTCGGCGTCAGCTTCATCCTCGTCTTCCCCAGCGAGCAGCGGCCCTGCCAGCGCGCCCTCCACCTGCAGCTTCAGCTATCCGATCCGGGCCGGGGGTGACCCGGGCGTGGCTGCCAGCAACACAGGTGGAGGGCTCCTCTACAGCCGAGAATCTGCGCCACCTCCCACGGCCCCCTTCAACCTGGCGGACATCAATGACGTGAGCCCCTCGGGCGGCTTCGTGGCTGAGCTCCTGCGGCCGGAGTTGGACCCAGTATACATTCCGCCACAGCAGCCTCAGCCGCCAGGTGGCGGGCTGATGGGCAAGTTTGTGCTGAAGGCGTCTCTGACCACCCCTGGCAGCGAGTACAGCAGCCCTTCGGTCATCAGTGTTAGCAAAGGAAGCCCAGACGGCAGCCACCCCGTGGTAGTGGCGCCCTACAGCGGTGGCCCGCCGCGCATGTGCCCCAAGATTAAGCAAGAGGCGGTCCCGTCCTGCACGGTCAGCCGGTCCCTAGAGGCCCATTTGAGCGCTGGACCCCAGCTCAGCAACGGCCACCGGCCCAACACACACGACTTCCCCCTGGGGCGGCAGCTCCCCACCAGGACTACCCCTACACTGAGTCCCGAGGAACTGCTGAACAGCAGGGACTGTCACCCTGGCCTGCCTCTTCCCCCAGGATTCCATCCCCATCCGGGGCCCAACTACCCTCCTTTCCTGCCAGACCAGATGCAGTCACAAGTCCCCTCTCTCCATTATCAAGAGCTCATGCCACCGGGTTCCTGCCTGCCAGAGGAGCCCAAGCCAAAGAGGGGAAGAAGGTCGTGGCCCCGGAAAAGAACAGCCACCCACACTTGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAAACCTATACCAAGAGTTCTCATCTCAAGGCACACCTGCGAACTCACACAGGCGAGAAACCTTACCACTGTGACTGGGACGGCTGTGGGTGGAAATTCGCCCGCTCCGATGAACTGACCAGGCACTACCGCAAACACACAGGGCACCGGCCCTTTCAGTGCCAGAAGTGCGACAGGGCCTTTTCCAGGTCGGACCACCTTGCCTTACACATGAAGAGGCACTAAATGACTAGTCTAGCAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTCTAGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCGGGGGATCCAAATTCCCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAATTTCAGGTGGCATCTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAATAGTGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAA
VP64,VP16的4个重复(SEQ ID NO:34)(反式激活结构域的非限制性实例)：
GAGGCCAGCGGTTCCGGACGGGCTGACGCATTGGACGATTTTGATCTGGATATGCTGGGAAGTGACGCCCTCGATGATTTTGACCTTGACATGCTTGGTTCGGATGCCCTTGATGACTTTGACCTCGACATGCTCGGCAGTGACGCCCTTGATGATTTCGACCTGGACATGCTGATTAACTCTAGA
P65(SEQ ID NO:35)(反式激活结构域的非限制性实例)：AGCCAGTACCTGCCCGACACCGACGACCGGCACCGGATCGAGGAAAAGCGGAAGCGGACCTACGAGACATTCAAGAGCATCATGAAGAAGTCCCCCTTCAGCGGCCCCACCGACCCTAGACCTCCACCTAGAAGAATCGCCGTGCCCAGCAGATCCAGCGCCAGCGTGCCAAAACCTGCCCCCCAGCCTTACCCCTTCACCAGCAGCCTGAGCACCATCAACTACGACGAGTTCCCTACCATGGTGTTCCCCAGCGGCCAGATCTCTCAGGCCTCTGCTCTGGCTCCAGCCCCTCCTCAGGTGCTGCCTCAGGCTCCTGCTCCTGCACCAGCTCCAGCCATGGTGTCTGCACTGGCTCAGGCACCAGCACCCGTGCCTGTGCTGGCTCCTGGACCTCCACAGGCTGTGGCTCCACCAGCCCCTAAACCTACACAGGCCGGCGAGGGCACACTGTCTGAAGCTCTGCTGCAGCTGCAGTTCGACGACGAGGATCTGGGAGCCCTGCTGGGAAACAGCACCGATCCTGCCGTGTTCACCGACCTGGCCAGCGTGGACAACAGCGAGTTCCAGCAGCTGCTGAACCAGGGCATCCCTGTGGCCCCTCACACCACCGAGCCCATGCTGATGGAATACCCCGAGGCCATCACCCGGCTCGTGACAGGCGCTCAGAGGCCTCCTGATCCAGCTCCTGCCCCTCTGGGAGCACCAGGCCTGCCTAATGGACTGCTGTCTGGCGACGAGGACTTCAGCTCTATCGCCGATATGGATTTCTCAGCCTTGCTG
RTA(SEQ ID NO:36)(反式激活结构域的非限制性实例)：CGGGATTCCAGGGAAGGGATGTTTTTGCCGAAGCCTGAGGCCGGCTCCGCTATTAGTGACGTGTTTGAGGGCCGCGAGGTGTGCCAGCCAAAACGAA TCCGGCCATTTCATCCTCCAGGAAGTCCATGGGCCAACCGCCCACTCCCCGCCAGCCTCGCACCAACACCAACCGGTCCAGTACATGAGCCAGTCGGGTCACTGACCCCGGCACCAGTCCCTCAGCCACTGGATCCAGCGCCCGCAGTGACTCCCGAGGCCAGTCACCTGTTGGAGGATCCCGATGAAGAGACGAGCCAGGCTGTCAAAGCCCTTCGGGAGATGGCCGATACTGTGATTCCCCAGAAGGAA GAGGCTGCAA TCTGTGGCCAAATGGACCTTTCCCA TCCGCCCCCAAGGGGCCA TCTGGA TGAGCT GACAACCACACTTGAGTCCATGACCGAGGATCTGAACCTGGACTCACCCCTGACCCCGGAATTGAACGAGATTCTGGATACCTTCCTGAACGACGAGTGCCTCTTGCATGCCATGCATATCAGCACAGGACTGTCCA TCTTCGACACA TCTCTGTTT
MPH MS2-P65-HSF1(SEQ ID NO:37)(反式激活结构域的非限制性实例)：
GCTTCAAACTTTACTCAGTTCGTGCTCGTGGACAATGGTGGGACAGGGGATGTGACAGTGGCTCCTTCTAATTTCGCTAATGGGGTGGCAGAGTGGATCAGCTCCAACTCACGGAGCCAGGCCTACAAGGTGACATGCAGCGTCAGGCAGTCTAGTGCCCAGAAGAGAAAGTATACCATCAAGGTGGAGGTCCCCAAAGTGGCTACCCAGACAGTGGGCGGAGTCGAACTGCCTGTCGCCGCTTGGAGGTCCTACCTGAACATGGAGCTCACTATCCCAATTTTCGCTACCAATTCTGACTGTGAACTCATCGTGAAGGCAATGCAGGGGCTCCTCAAAGACGGTAATCCTATCCCTTCCGCCATCGCCGCTAACTCAGGTATCTACAGCGCTGGAGGAGGTGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGTAGCGGACCTAAGAAAAAGAGGAAGGTGGCGGCCGCTGGATCCCCTTCAGGGCAGATCAGCAACCAGGCCCTGGCTCTGGCCCCTAGCTCCGCTCCAGTGCTGGCCCAGACTATGGTGCCCTCTAGTGCTATGGTGCCTCTGGCCCAGCCACCTGCTCCAGCCCCTGTGCTGACCCCAGGACCACCCCAGTCACTGAGCGCTCCAGTGCCCAAGTCTACACAGGCCGGCGAGGGGACTCTGAGTGAAGCTCTGCTGCACCTGCAGTTCGACGCTGATGAGGACCTGGGAGCTCTGCTGGGGAACAGCACCGATCCCGGAGTGTTCACAGATCTGGCCTCCGTGGACAACTCTGAGTTTCAGCAGCTGCTGAATCAGGGCGTGTCCATGTCTCATAGTACAGCCGAACCAATGCTGATGGAGTACCCCGAAGCCATTACCCGGCTGGTGACCGGCAGCCAGCGGCCCCCCGACCCCGCTCCAACTCCCCTGGGAACCAGCGGCCTGCCTAATGGGCTGTCCGGAGATGAAGACTTCTCAAGCATCGCTGATATGGACTTTAGTGCCCTGCTGTCACAGATTTCCTCTAGTGGGCAGGGAGGAGGTGGAAGCGGCTTCAGCGTGGACACCAGTGCCCTGCTGGACCTGTTCAGCCCCTCGGTGACCGTGCCCGACATGAGCCTGCCTGACCTTGACAGCAGCCTGGCCAGTATCCAAGAGCTCCTGTCTCCCCAGGAGCCCCCCAGGCCTCCCGAGGCAGAGAACAGCAGCCCGGATTCAGGGAAGCAGCTGGTGCACTACACAGCGCAGCCGCTGTTCCTGCTGGACCCCGGCTCCGTGGACACCGGGAGCAACGACCTGCCGGTGCTGTTTGAGCTGGGAGAGGGCTCCTACTTCTCCGAAGGGGACGGCTTCGCCGAGGACCCCACCATCTCCCTGCTGACAGGCTCGGAGCCTCCCAAAGCCAAGGACCCCACTGTCTCC
OCT4-2A-SOX2-2A-KLF4(编码人OCT4、人SOX2和人KLF4的核酸序列的非限制性实例,各自由2A肽隔开)(SEQ ID NO:38)：ATGGCGGGACACCTGGCTTCGGATTTCGCCTTCTCGCCCCCTCCAGGTGGTGGAGGTGATGGGCCAGGGGGGCCGGAGCCGGGCTGGGTTGATCCTCGGACCTGGCTAAGCTTCCAAGGCCCTCCTGGAGGGCCAGGAATCGGGCCGGGGGTTGGGCCAGGCTCTGAGGTGTGGGGGATTCCCCCATGCCCCCCGCCGTATGAGTTCTGTGGGGGGATGGCGTACTGTGGGCCCCAGGTTGGAGTGGGGCTAGTGCCCCAAGGCGGCTTGGAGACCTCTCAGCCTGAGGGCGAAGCAGGAGTCGGGGTGGAGAGCAACTCCGATGGGGCCTCCCCGGAGCCCTGCACCGTCACCCCTGGTGCCGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTGGAGCAAAACCCGGAGGAGTCCCAGGACATCAAAGCTCTGCAGAAAGAACTCGAGCAATTTGCCAAGCTCCTGAAGCAGAAGAGGATCACCCTGGGATATACACAGGCCGATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTCTATTTGGGAAGGTATTCAGCCAAACGACCATCTGCCGCTTTGAGGCTCTGCAGCTTAGCTTCAAGAACATGTGTAAGCTGCGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAATGAAAATCTTCAGGAGATATGCAAAGCAGAAACCCTCGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGAACCAGTATCGAGAACCGAGTGAGAGGCAACCTGGAGAATTTGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACACTGCAGCAGATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGTAACCGGCGCCAGAAGGGCAAGCGATCAAGCAGCGACTATGCACAACGAGAGGATTTTGAGGCTGCTGGGTCTCCTTTCTCAGGGGGACCAGTGTCCTTTCCTCTGGCCCCAGGGCCCCATTTTGGTACCCCAGGCTATGGGAGCCCTCACTTCACTGCACTGTACTCCTCGGTCCCTTTCCCTGAGGGGGAAGCCTTTCCCCCTGTCTCTGTCACCACTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAACGCTAGCGGCAGCGGCGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCTGCATGCATGTACAACATGATGGAGACGGAGCTGAAGCCGCCGGGCCCGCAGCAAACTTCGGGGGGCGGCGGCGGCAACTCCACCGCGGCGGCGGCCGGCGGCAACCAGAAAAACAGCCCGGACCGCGTCAAGCGGCCCATGAATGCCTTCATGGTGTGGTCCCGCGGGCAGCGGCGCAAGATGGCCCAGGAGAACCCCAAGATGCACAACTCGGAGATCAGCAAGCGCCTGGGCGCCGAGTGGAAACTTTTGTCGGAGACGGAGAAGCGGCCGTTCATCGACGAGGCTAAGCGGCTGCGAGCGCTGCACATGAAGGAGCACCCGGATTATAAATACCGGCCCCGGCGGAAAACCAAGACGCTCATGAAGAAGGATAAGTACACGCTGCCCGGCGGGCTGCTGGCCCCCGGCGGCAATAGCATGGCGAGCGGGGTCGGGGTGGGCGCCGGCCTGGGCGCGGGCGTGAACCAGCGCATGGACAGTTACGCGCACATGAACGGCTGGAGCAACGGCAGCTACAGCATGATGCAGGACCAGCTGGGCTACCCGCAGCACCCGGGCCTCAATGCGCACGGCGCAGCGCAGATGCAGCCCATGCACCGCTACGACGTGAGCGCCCTGCAGTACAACTCCATGACCAGCTCGCAGACCTACATGAACGGCTCGCCCACCTACAGCATGTCCTACTCGCAGCAGGGCACCCCTGGCATGGCTCTTGGCTCCATGGGTTCGGTGGTCAAGTCCGAGGCCAGCTCCAGCCCCCCTGTGGTTACCTCTTCCTCCCACTCCAGGGCGCCCTGCCAGGCCGGGGACCTCCGGGACATGATCAGCATGTATCTCCCCGGCGCCGAGGTGCCGGAACCCGCCGCCCCCAGCAGACTTCACATGTCCCAGCACTACCAGAGCGGCCCGGTGCCCGGCACGGCCATTAACGGCACACTGCCCCTCTCACACATGGCATGCGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCACTCGAGATGGCTGTCAGCGACGCGCTGCTCCCATCTTTCTCCACGTTCGCGTCTGGCCCGGCGGGAAGGGAGAAGACACTGCGT CAAGCAGGTGCCCCGAATAACCGCTGGCGGGAGGAGCTCTCCCACATGAAGCGACTTCCCCCAGTGCTTCCCGGCCGCCCCTATGACCTGGCGGCGGCGACCGTGGCCACAGACCTGGAGAGCGGCGGAGCCGGTGCGGCTTGCGGCGGTAGCAACCTGGCGCCCCTACCTCGGAGAGAGACCGAGGAGTTCAACGATCTCCTGGACCTGGACTTTATTCTCTCCAATTCGCTGACCCATCCTCCGGAGTCAGTGGCCGCCACCGTGTCCTCGTCAGCGTCAGCCTCCTCTTCGTCGTCGCCGTCGAGCAGCGGCCCTGCCAGCGCGCCCTCCACCTGCAGCTTCACCTATCCGATCCGGGCCGGGAACGACCCGGGCGTGGCGCCGGGCGGCACGGGCGGAGGCCTCCTCTATGGCAGGGAGTCCGCTCCCCCTCCGACGGCTCCCTTCAACCTGGCGGACATCAACGACGTGAGCCCCTCGGGCGGCTTCGTGGCCGAGCTCCTGCGGCCAGAATTGGACCCGGTGTACATTCCGCCGCAGCAGCCGCAGCCGCCAGGTGGCGGGCTGATGGGCAAGTTCGTGCTGAAGGCGTCGCTGAGCGCCCCTGGCAGCGAGTACGGCAGCCCGTCGGTCATCAGCGTCAGCAAAGGCAGCCCTGACGGCAGCCACCCGGTGGTGGTGGCGCCCTACAACGGCGGGCCGCCGCGCACGTGCCCCAAGATCAAGCAGGAGGCGGTCTCTTCGTGCACCCACTTGGGCGCTGGACCCCCTCTCAGCAATGGCCACCGGCCGGCTGCACACGACTTCCCCCTGGGGCGGCAGCTCCCCAGCAGGACTACCCCGACCCTGGGTCTTGAGGAAGTGCTGAGCAGCAGGGACTGTCACCCTGCCCTGCCGCTTCCTCCCGGCTTCCATCCCCACCCGGGGCCCAATTACCCATCCTTCCTGCCCGATCAGATGCAGCCGCAAGTCCCGCCGCTCCATTACCAAGAGCTCATGCCACCCGGTTCCTGCATGCCAGAGGAGCCCAAGCCAAAGAGGGGAAGACGATCGTGGCCCCGGAAAAGGACCGCCACCCACACTTGTGATTACGCGGGCTGCGGCAAAACCTACACAAAGAGTTCCCATCTCAAGGCACACCTGCGAACCCACACAGGTGAGAAACCTTACCACTGTGACTGGGACGGCTGTGGATGGAAATTCGCCCGCTCAGATGAACTGACCAGGCACTACCGTAAACACACGGGGCACCGCCCGTTCCAGTGCCAAAAATGCGACCGAGCATTTTCCAGGTCGGACCACCTCGCCTTACACATGAAGAGGCATTTT
OCT4-2A-SOX2-2A-KLF4(编码人OCT4、人SOX2和人KLF4的氨基酸序列的非限制性实例,各自由2A肽隔开)(SEQ ID NO:39)：MAGHLASDFAFSPPPGGGGDGPGGPEPGWVDPRTWLSFQGPPGGPGIGPGVGPGSEVWGIPPCPPPYEFCGGMAYCGPQVGVGLVPQGGLETSQPEGEAGVGVESNSDGASPEPCTVTPGAVKLEKEKLEQNPEESQDIKALQKELEQFAKLLKQKRITLGYTQADVGLTLGVLFGKVFSQTTICRFEALQLSFKNMCKLRPLLQKWVEEADNNENLQEICKAETLVQARKRKRTSIENRVRGNLENLFLQCPKPTLQQISHIAQQLGLEKDVVRVWFCNRRQKGKRSSSDYAQREDFEAAGSPFSGGPVSFPLAPGPHFGTPGYGSPHFTALYSSVPFPEGEAFPPVSVTTLGSPMHSNASGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPACMYNMMETELKPPGPQQTSGGGGGNSTAAAAGGNQKNSPDRVKRPMNAFMVWSRGQRRKMAQENPKMHNSEISKRLGAEWKLLSETEKRPFIDEAKRLRALHMKEHPDYKYRPRRKTKTLMKKDKYTLPGGLLAPGGNSMASGVGVGAGLGAGVNQRMDSYAHMNGWSNGSYSMMQDQLGYPQHPGLNAHGAAQMQPMHRYDVSALQYNSMTSSQTYMNGSPTYSMSYSQQGTPGMALGSMGSVVKSEASSSPPVVTSSSHSRAPCQAGDLRDMISMYLPGAEVPEPAAPSRLHMSQHYQSGPVPGTAINGTLPLSHMACGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPLEMAVSDALLPSFSTFASGPAGREKTLRQAGAPNNRWREELSHMKRLPPVLPGRPYDLAAATVATDLESGGAGAACGGSNLAPLPRRETEEFNDLLDLDFILSNSLTHPPESVAATVSSSASASSSSSPSSSGPASAPSTCSFTYPIRAGNDPGVAPGGTGGGLLYGRESAPPPTAPFNLADINDVSPSGGFVAELLRPELDPVYIPPQQPQPPGGGLMGKFVLKASLSAPGSEYGSPSVISVSKGSPDGSHPVVVAPYNGGPPRTCPKIKQEAVSSCTHLGAGPPLSNGHRPAAHDFPLGRQLPSRTTPTLGLEEVLSSRDCHPALPLPPGFHPHPGPNYPSFLPDQMQPQVPPLHYQELMPPGSCMPEEPKPKRGRRSWPRKRTATHTCDYAGCGKTYTKSSHLKAHLRTHTGEKPYHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKHTGHRPFQCQKCDRAFSRSDHLALHMKRHF
人OCT4核酸序列(编码人OCT4的核酸序列的非限制性实例)(SEQ ID NO:40)：
ATGGCGGGACACCTGGCTTCGGATTTCGCCTTCTCGCCCCCTCCAGGTGGTGGAGGTGATGGGCCAGGGGGGCCGGAGCCGGGCTGGGTTGATCCTCGGACCTGGCTAAGCTTCCAAGGCCCTCCTGGAGGGCCAGGAATCGGGCCGGGGGTTGGGCCAGGCTCTGAGGTGTGGGGGATTCCCCCATGCCCCCCGCCGTATGAGTTCTGTGGGGGGATGGCGTACTGTGGGCCCCAGGTTGGAGTGGGGCTAGTGCCCCAAGGCGGCTTGGAGACCTCTCAGCCTGAGGGCGAAGCAGGAGTCGGGGTGGAGAGCAACTCCGATGGGGCCTCCCCGGAGCCCTGCACCGTCACCCCTGGTGCCGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTGGAGCAAAACCCGGAGGAGTCCCAGGACATCAAAGCTCTGCAGAAAGAACTCGAGCAATTTGCCAAGCTCCTGAAGCAGAAGAGGATCACCCTGGGATATACACAGGCCGATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTCTATTTGGGAAGGTATTCAGCCAAACGACCATCTGCCGCTTTGAGGCTCTGCAGCTTAGCTTCAAGAACATGTGTAAGCTGCGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAATGAAAATCTTCAGGAGATATGCAAAGCAGAAACCCTCGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGAACCAGTATCGAGAACCGAGTGAGAGGCAACCTGGAGAATTTGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACACTGCAGCAGATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGTAACCGGCGCCAGAAGGGCAAGCGATCAAGCAGCGACTATGCACAACGAGAGGATTTTGAGGCTGCTGGGTCTCCTTTCTCAGGGGGACCAGTGTCCTTTCCTCTGGCCCCAGGGCCCCATTTTGGTACCCCAGGCTATGGGAGCCCTCACTTCACTGCACTGTACTCCTCGGTCCCTTTCCCTGAGGGGGAAGCCTTTCCCCCTGTCTCTGTCACCACTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAAC
人OCT4氨基酸序列(编码人OCT4的氨基酸序列的非限制性实例)(SEQ ID NO:41)：
MAGHLASDFAFSPPPGGGGDGPGGPEPGWVDPRTWLSFQGPPGGPGIGPGVGPGSEVWGIPPCPPPYEFCGGMAYCGPQVGVGLVPQGGLETSQPEGEAGVGVESNSDGASPEPCTVTPGAVKLEKEKLEQNPEESQDIKALQKELEQFAKLLKQKRITLGYTQADVGLTLGVLFGKVFSQTTICRFEALQLSFKNMCKLRPLLQKWVEEADNNENLQEICKAETLVQARKRKRTSIENRVRGNLENLFLQCPKPTLQQISHIAQQLGLEKDVVRVWFCNRRQKGKRSSSDYAQREDFEAAGSPFSGGPVSFPLAPGPHFGTPGYGSPHFTALYSSVPFPEGEAFPPVSVTTLGSPMHSN
人SOX2核酸序列(编码人SOX2的核酸序列的非限制性实例)(SEQ ID NO:42)：
ATGTACAACATGATGGAGACGGAGCTGAAGCCGCCGGGCCCGCAGCAAACTTCGGGGGGCGGCGGCGGCAACTCCACCGCGGCGGCGGCCGGCGGCAACCAGAAAAACAGCCCGGACCGCGTCAAGCGGCCCATGAATGCCTTCATGGTGTGGTCCCGCGGGCAGCGGCGCAAGATGGCCCAGGAGAACCCCAAGATGCACAACTCGGAGATCAGCAAGCGCCTGGGCGCCGAGTGGAAACTTTTGTCGGAGACGGAGAAGCGGCCGTTCATCGACGAGGCTAAGCGGCTGCGAGCGCTGCACATGAAGGAGCACCCGGATTATAAATACCGGCCCCGGCGGAAAACCAAGACGCTCATGAAGAAGGATAAGTACACGCTGCCCGGCGGGCTGCTGGCCCCCGGCGGCAATAGCATGGCGAGCGGGGTCGGGGTGGGCGCCGGCCTGGGCGCGGGCGTGAACCAGCGCATGGACAGTTACGCGCACATGAACGGCTGGAGCAACGGCAGCTACAGCATGATGCAGGACCAGCTGGGCTACCCGCAGCACCCGGGCCTCAATGCGCACGGCGCAGCGCAGATGCAGCCCATGCACCGCTACGACGTGAGCGCCCTGCAGTACAACTCCATGACCAGCTCGCAGACCTACATGAACGGCTCGCCCACCTACAGCATGTCCTACTCGCAGCAGGGCACCCCTGGCATGGCTCTTGGCTCCATGGGTTCGGTGGTCAAGTCCGAGGCCAGCTCCAGCCCCCCTGTGGTTACCTCTTCCTCCCACTCCAGGGCGCCCTGCCAGGCCGGGGACCTCCGGGACATGATCAGCATGTATCTCCCCGGCGCCGAGGTGCCGGAACCCGCCGCCCCCAGCAGACTTCACATGTCCCAGCACTACCAGAGCGGCCCGGTGCCCGGCACGGCCATTAACGGCACACTGCCCCTCTCACACATG
人SOX2氨基酸序列(编码人SOX2的氨基酸序列的非限制性实例)(SEQ ID NO:43)：
MYNMMETELKPPGPQQTSGGGGGNSTAAAAGGNQKNSPDRVKRPMNAFMVWSRGQRRKMAQENPKMHNSEISKRLGAEWKLLSETEKRPFIDEAKRLRALHMKEHPDYKYRPRRKTKTLMKKDKYTLPGGLLAPGGNSMASGVGVGAGLGAGVNQRMDSYAHMNGWSNGSYSMMQDQLGYPQHPGLNAHGAAQMQPMHRYDVSALQYNSMTSSQTYMNGSPTYSMSYSQQGTPGMALGSMGSVVKSEASSSPPVVTSSSHSRAPCQAGDLRDMISMYLPGAEVPEPAAPSRLHMSQHYQSGPVPGTAINGTLPLSHM
人KLF4(编码人KLF4的核苷酸序列的非限制性实例)(SEQ ID NO:44)：ATGGCTGTCAGCGACGCGCTGCTCCCATCTTTCTCCACGTTCGCGTCTGGCCCGGCGGGAAGGGAGAAGACACTGCGTCAAGCAGGTGCCCCGAATAACCGCTGGCGGGAGGAGCTCTCCCACATGAAGCGACTTCCCCCAGTGCTTCCCGGCCGCCCCTATGACCTGGCGGCGGCGACCGTGGCCACAGACCTGGAGAGCGGCGGAGCCGGTGCGGCTTGCGGCGGTAGCAACCTGGCGCCCCTACCTCGGAGAGAGACCGAGGAGTTCAACGATCTCCTGGACCTGGACTTTATTCTCTCCAATTCGCTGACCCATCCTCCGGAGTCAGTGGCCGCCACCGTGTCCTCGTCAGCGTCAGCCTCCTCTTCGTCGTCGCCGTCGAGCAGCGGCCCTGCCAGCGCGCCCTCCACCTGCAGCTTCACCTATCCGATCCGGGCCGGGAACGACCCGGGCGTGGCGCCGGGCGGCACGGGCGGAGGCCTCCTCTATGGCAGGGAGTCCGCTCCCCCTCCGACGGCTCCCTTCAACCTGGCGGACATCAACGACGTGAGCCCCTCGGGCGGCTTCGTGGCCGAGCTCCTGCGGCCAGAATTGGACCCGGTGTACATTCCGCCGCAGCAGCCGCAGCCGCCAGGTGGCGGGCTGATGGGCAAGTTCGTGCTGAAGGCGTCGCTGAGCGCCCCTGGCAGCGAGTACGGCAGCCCGTCGGTCATCAGCGTCAGCAAAGGCAGCCCTGACGGCAGCCACCCGGTGGTGGTGGCGCCCTACAACGGCGGGCCGCCGCGCACGTGCCCCAAGATCAAGCAGGAGGCGGTCTCTTCGTGCACCCACTTGGGCGCTGGACCCCCTCTCAGCAATGGCCACCGGCCGGCTGCACACGACTTCCCCCTGGGGCGGCAGCTCCCCAGCAGGACTACCCCGACCCTGGGTCTTGAGGAAGTGCTGAGCAGCAGGGACTGTCACCCTGCCCTGCCGCTTCCTCCCGGCTTCCATCCCCACCCGGGGCCCAATTACCCATCCTTCCTGCCCGATCAGATGCAGCCGCAAGTCCCGCCGCTCCATTACCAAGAGCTCATGCCACCCGGTTCCTGCATGCCAGAGGAGCCCAAGCCAAAGAGGGGAAGACGATCGTGGCCCCGGAAAAGGACCGCCACCCACACTTGTGATTACGCGGGCTGCGGCAAAACCTACACAAAGAGTTCCCATCTCAAGGCACACCTGCGAACCCACACAGGTGAGAAACCTTACCACTGTGACTGGGACGGCTGTGGATGGAAATTCGCCCGCTCAGATGAACTGACCAGGCACTACCGTAAACACACGGGGCACCGCCCGTTCCAGTGCCAAAAATGCGACCGAGCATTTTCCAGGTCGGACCACCTCGCCTTACACATGAAGAGGCATTTT
人KLF4(编码人KLF4的氨基酸序列的非限制性实例)(SEQ ID NO:45)：MAVSDALLPSFSTFASGPAGREKTLRQAGAPNNRWREELSHMKRLPPVLPGRPYDLAAATVATDLESGGAGAACGGSNLAPLPRRETEEFNDLLDLDFILSNSLTHPPESVAATVSSSASASSSSSPSSSGPASAPSTCSFTYPIRAGNDPGVAPGGTGGGLLYGRESAPPPTAPFNLADINDVSPSGGFVAELLRPELDPVYIPPQQPQPPGGGLMGKFVLKASLSAPGSEYGSPSVISVSKGSPDGSHPVVVAPYNGGPPRTCPKIKQEAVSSCTHLGAGPPLSNGHRPAAHDFPLGRQLPSRTTPTLGLEEVLSSRDCHPALPLPPGFHPHPGPNYPSFLPDQMQPQVPPLHYQELMPPGSCMPEEPKPKRGRRSWPRKRTATHTCDYAGCGKTYTKSSHLKAHLRTHTGEKPYHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKHTGHRPFQCQKCDRAFSRSDHLALHMKRHF
人RCVRN(恢复蛋白，recoverin)启动子(人RCVRN(恢复蛋白)启动子的非限制性实例)(SEQ ID NO:46)：
ATTTTAATCTCACTAGGGTTCTGGGAGCACCCCCCCCCACCGCTCCCGCCCTCCACAAAGCTCCTGGGCCCCTCCTCCCTTCAAGGATTGCGAAGAGCTGGTCGCAAATCCTCCTAAGCCACCAGCATCTCGGTCTTCAGCTCACACCAGCCTTGAGCCCAGCCTGCGGCCAGGGGACCACGCACGTCCCACCCACCCAGCGACTCCCCAGCCGCTGCCCACTCTTCCTCACTCA
RSV启动子(RSV启动子的非限制性实例)(SEQ ID NO:47)：AATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACATAAAC
CMV启动子(CMV启动子的非限制性实例)(SEQ ID NO:48)：CATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGAGATCCGC
EFS启动子(EFS启动子的非限制性实例)(SEQ ID NO:49)：TCGAGTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTGTCGTGACCGCGG
人GRK1(视紫红质激酶)启动子(人启动子的非限制性实例)(SEQ ID NO:50)：
Gggccccagaagcctggtggttgtttgtccttctcaggggaaaagtgaggcggccccttggaggaaggggccgggcagaatgatctaatcggattccaagcagctcaggggattgtctttttctagcaccttcttgccactcctaagcgtcctccgtgaccccggctgggatttcgcctggtgctgtgtcagccccggtctcccaggggcttcccagtggtccccaggaaccctcgacagggcccggtctctctcgtccagcaagggcagggacgggccacaggccaagggc
人CRX(锥杆同源盒转录因子)启动子(人CRX启动子的非限制性实例)(SEQ ID NO:51)：
Gcctgtagccttaatctctcctagcagggggtttgggggagggaggaggagaaagaaagggccccttatggctgagacacaatgacc cagccacaaggagggattaccgggcg
人NRL启动子(人TK末端启动子上游的神经视网膜亮氨酸拉链转录因子增强子)(人NRL启动子的非限制性实例)(SEQ ID NO:52)：Aggtaggaagtggcctttaactccatagaccctatttaaacagcttcggacaggtttaaacatctccttggataattcctagtatccctgttcccactcctactcagggatgatagctctaagaggtgttaggggattaggctgaaaatgtaggtcacccctcagccatctgggaactagaatg agtgagagaggagagaggggcagagacacacacattcgcatattaaggtgacgcgtgtggcctcgaacaccgagcgaccctgcagcgacccgcttaa
人红视蛋白启动子(hred启动子)(SEQ ID NO:101)：
Gatccggttccaggcctcggccctaaatagtctccctgggctttcaagagaaccacatgagaaaggaggattcgggctctgagcagtttcaccacccaccccccagtctgcaaatcctgacccgtgggtccacctgccccaaaggcggacgcaggacagtagaagggaacagagaacacataaacacagagagggccacagcggctcccacagtcaccgccaccttcctggcggggatgggtggggcgtctgagtttggttcccagcaaatccctctgagccgcccttgcgggctcgcctcaggagcaggggagcaagaggtgggaggaggaggtctaagtcccaggcccaattaagagatcaggtagtgtagggtttgggagcttttaaggtgaagaggcccgggctgatcccacaggccagtataaagcgccgtgaccctcaggtgatgcgccagggccggctgccgtcggggacagggctttccatagc
人视紫红质启动子(rho启动子)(SEQ ID NO:102)：
Agttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcggaattcgcccttaagctagcagatcttccccacctagccacctggcaaactgctccttctctcaaaggcccaaacatggcctcccagactgcaacccccaggcagtcaggccctgtctccacaacctcacagccaccctggacggaatctgcttcttcccacatttgagtcctcctcagcccctgagctcctctgggcagggctgtttctttccatctttgtattcccaggggcctgcaaataaatgtttaatgaacgaacaagagagtgaattccaattccatgcaacaaggattgggctcctgggccctaggctatgtgtctggcaccagaaacggaagctgcaggttgcagcccctgccctcatggagctcctcctgtcagaggagtgtggggactggatgactccagaggtaacttgtgggggaacgaacaggtaaggggctgtgtgacgagatgagagactgggagaataaaccagaaagtctctagctgtccagaggacatagcacagaggcccatggtccctatttcaaacccaggccaccagactgagctgggaccttgggacagacaagtcatgcagaagttaggggaccttctcctcccttttcctggatggatcctgagtaccttctcctccctgacctcaggcttcctcctagtgtcaccttggcccctcttagaagccaattaggccctcagtttctgcagcggggattaatatgattatgaacacccccaatctcccagatgctgattcagccaggagcttaggagggggaggtcactttataagggtctgggggggtcagaacccagagtcatcccctgaattctgca
小鼠锥拘留蛋白启动子(mcar启动子)(SEQ ID NO:103)：Ggttcttcccattttggctacatggtctttttttttacctttttggttcctttggccttttggcttttggcttccagggcttctggatcccccccaacccctcccatacacatacacatgtgcactcgtgcactcaacccagcacaggataatgttcattcttgacctttccacatacatctggctatgttctctctcttatctacaataaatctcctccactatacttaggagcagttatgttcttcttctttctttcttttttttttttttcattcagtaacatcatcagaatcccctagctctggcctacctcctcagtaacaatcagctgatccctggccactaatctgtactcactaatctgttttccaaactcttggcccctgagctaattatagcagtgcttcatgccacccaccccaaccctattcttgttctctgactcccactaatctacacattcagaggattgtggatataagaggctgggaggccagcttagcaaccagagctggagg
人视紫红质激酶启动子(hrk启动子)(SEQ ID NO:104)：Gggccccagaagcctggtggttgtttgtccttctcaggggaaaagtgaggcggccccttggaggaaggggccgggcagaatgatctaatcggattccaagcagctcaggggattgtctttttctagcaccttcttgccactcctaagcgtcctccgtgaccccggctgggatttagcctggtgctgtgtcagccccggtctcccaggggcttcccagtggtccccaggaaccctcgacagggcccggtctctctcgtccagcaagggcagggacgggccacaggccaagggc
TRE-人OSK-SV40(SEQ ID NO:105)：
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EFS-人OSK-SV40(SEQ ID NO:106)：
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ID NO:107)：
TTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGTAATGGTAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTAAGGCCTTAATTAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGAAGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGCAGACTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGACCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATCTACAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATATCCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGCTTTAGGCGTGTACGGTGGGCGCCTATAAAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGCAATTCCACAACACTTTTGTCTTATACCAACTTTCCGTACCACTTCCTACCCTCGTAAAGCGGCCGCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCGCTGGAAGATGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGAACAATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGGACATCACTTACGCTGAGTACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGCAGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGCCCGCGAACGACATTTATAATGAACGTGAATTGCTCAACAGTATGGGCATTTCGCAGCCTACCGTGGTGTTCGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAAAAAGCTCCCAATCATCCAAAAAATTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTGCCAGAGTCCTTCGATAGGGACAAGACAATTGCACTGATCATGAACTCCTCTGGATCTACTGGTCTGCCTAAAGGTGTCGCTCTGCCTCATAGAACTGCCTGCGTGAGATTCTCGCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCCATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAAGAAGAGCTGTTTCTGAGGAGCCTTCAGGATTACAAGATTCAAAGTGCGCTGCTGGTGCCAACCCTATTCTCCTTCTTCGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGTGGCGCTCCCCTCTCTAAGGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCCAAGAGGTTCCATCTGCCAGGTATCAGGCAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACATCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAAAGAGGCGAACTGTGTGTGAGAGGTCCTATGATTATGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGACAAGGATGGATGGCTACATTCTGGAGACATAGCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATCGTTGACCGCCTGAAGTCTCTGATTAAGTACAAAGGCTATCAGGTGGCTCCCGCTGAATTGGAATCCATCTTGCTCCAACACCCCAACATCTTCGACGCAGGTGTCGCAGGTCTTCCCGACGATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGATGACGGAAAAAGAGATCGTGGATTACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCGCGAAAAAGTTGCGCGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACCGAAAGGTCTTACCGGAAAACTCGACGCAAGAAAAATCAGAGAGATCCTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGATCGCCGTGTAAACTAGTGCGCGCAGCGGCCGACCATGGCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTCGGTACCGGATCCAAATTCCCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAATTTCAGGTGGCATCTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAATAGTGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAA
针对小鼠KDM1a的shRNA(SEQ ID NO:108)：
CACAAGTCAAACCTTTAT
针对人Tet1-1的shRNA(SEQ ID NO:109)：
GGACGTAATCCAGAAAGAAGA
针对人Tet1-2的shRNA(SEQ ID NO:110)：
TTGTGCCTCTGGAGGTTATAA
针对人Tet3-1的shRNA(SEQ ID NO:111)：
GGAAATAAAGGCTGGTGAAGG
针对人Tet3-2的shRNA(SEQ ID NO:112)：
GAAAGATGAAGGTCCATATTA
针对小鼠Tet1-2的shRNA(SEQ ID NO:113)：
GCAGATGGCCGTGACACAAAT
针对小鼠Tet1-1的shRNA(SEQ ID NO:114)：
GCTCATGGAGACTAGGTTTGG
针对小鼠和人Tet2两者的shRNA (SEQ ID NO:115)：
GGATGTAAGTTTGCCAGAAGC
针对小鼠Tet3的shRNA (SEQ ID NO:116)：
GCTCCAACGAGAAGCTATTTG
针对加扰(scramble)序列(基因组中无靶标)的shRNA (SEQ ID NO:117)：GTTCAGATGTGCGGCGAGT
编码P2A的氨基酸序列(SEQ ID NO:118)：
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
编码P2A的核酸序列(SEQ ID NO:119)：
GGCAGCGGCGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAA
ACCCCGGGCCT
编码T2A的核酸序列(SEQ ID NO:120)
GGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATC CCGGCCCA(SEQID NO:120)
SEQ ID NO:121:
TTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGTAATGGTAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTAAGGCCTTAATTAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGAAGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGCAGACTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGACCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATCTACAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATATCCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGCTTTAGGCGTGTACGGTGGGCGCCTATAAAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGCAATTCCACAACACTTTTGTCTTATACCAACTTTCCGTACCACTTCCTACCCTCGTAAAGCGGCCGCGCCACCATGGCGGGACACCTGGCTTCGGATTTCGCCTTCTCGCCCCCTCCAGGTGGTGGAGGTGATGGGCCAGGGGGGCCGGAGCCGGGCTGGGTTGATCCTCGGACCTGGCTAAGCTTCCAAGGCCCTCCTGGAGGGCCAGGAATCGGGCCGGGGGTTGGGCCAGGCTCTGAGGTGTGGGGGATTCCCCCATGCCCCCCGCCGTATGAGTTCTGTGGGGGGATGGCGTACTGTGGGCCCCAGGTTGGAGTGGGGCTAGTGCCCCAAGGCGGCTTGGAGACCTCTCAGCCTGAGGGCGAAGCAGGAGTCGGGGTGGAGAGCAACTCCGATGGGGCCTCCCCGGAGCCCTGCACCGTCACCCCTGGTGCCGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTGGAGCAAAACCCGGAGGAGTCCCAGGACATCAAAGCTCTGCAGAAAGAACTCGAGCAATTTGCCAAGCTCCTGAAGCAGAAGAGGATCACCCTGGGATATACACAGGCCGATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTCTATTTGGGAAGGTATTCAGCCAAACGACCATCTGCCGCTTTGAGGCTCTGCAGCTTAGCTTCAAGAACATGTGTAAGCTGCGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAATGAAAATCTTCAGGAGATATGCAAAGCAGAAACCCTCGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGAACCAGTATCGAGAACCGAGTGAGAGGCAACCTGGAGAATTTGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACACTGCAGCAGATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGTAACCGGCGCCAGAAGGGCAAGCGATCAAGCAGCGACTATGCACAACGAGAGGATTTTGAGGCTGCTGGGTCTCCTTTCTCAGGGGGACCAGTGTCCTTTCCTCTGGCCCCAGGGCCCCATTTTGGTACCCCAGGCTATGGGAGCCCTCACTTCACTGCACTGTACTCCTCGGTCCCTTTCCCTGAGGGGGAAGCCTTTCCCCCTGTCTCTGTCACCACTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAACGCTAGCGGCAGCGGCGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCTGCATGCATGTACAACATGATGGAGACGGAGCTGAAGCCGCCGGGCCCGCAGCAAACTTCGGGGGGCGGCGGCGGCAACTCCACCGCGGCGGCGGCCGGCGGCAACCAGAAAAACAGCCCGGACCGCGTCAAGCGGCCCATGAATGCCTTCATGGTGTGGTCCCGCGGGCAGCGGCGCAAGATGGCCCAGGAGAACCCCAAGATGCACAACTCGGAGATCAGCAAGCGCCTGGGCGCCGAGTGGAAACTTTTGTCGGAGACGGAGAAGCGGCCGTTCATCGACGAGGCTAAGCGGCTGCGAGCGCTGCACATGAAGGAGCACCCGGATTATAAATACCGGCCCCGGCGGAAAACCAAGACGCTCATGAAGAAGGATAAGTACACGCTGCCCGGCGGGCTGCTGGCCCCCGGCGGCAATAGCATGGCGAGCGGGGTCGGGGTGGGCGCCGGCCTGGGCGCGGGCGTGAACCAGCGCATGGACAGTTACGCGCACATGAACGGCTGGAGCAACGGCAGCTACAGCATGATGCAGGACCAGCTGGGCTACCCGCAGCACCCGGGCCTCAATGCGCACGGCGCAGCGCAGATGCAGCCCATGCACCGCTACGACGTGAGCGCCCTGCAGTACAACTCCATGACCAGCTCGCAGACCTACATGAACGGCTCGCCCACCTACAGCATGTCCTACTCGCAGCAGGGCACCCCTGGCATGGCTCTTGGCTCCATGGGTTCGGTGGTCAAGTCCGAGGCCAGCTCCAGCCCCCCTGTGGTTACCTCTTCCTCCCACTCCAGGGCGCCCTGCCAGGCCGGGGACCTCCGGGACATGATCAGCATGTATCTCCCCGGCGCCGAGGTGCCGGAACCCGCCGCCCCCAGCAGACTTCACATGTCCCAGCACTACCAGAGCGGCCCGGTGCCCGGCACGGCCATTAACGGCACACTGCCCCTCTCACACATGGCATGCGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCACTCGAGATGGCTGTCAGCGACGCGCTGCTCCCATCTTTCTCCACGTTCGCGTCTGGCCCGGCGGGAAGGGAGAAGACACTGCGTCAAGCAGGTGCCCCGAATAACCGCTGGCGGGAGGAGCTCTCCCACATGAAGCGACTTCCCCCAGTGCTTCCCGGCCGCCCCTATGACCTGGCGGCGGCGACCGTGGCCACAGACCTGGAGAGCGGCGGAGCCGGTGCGGCTTGCGGCGGTAGCAACCTGGCGCCCCTACCTCGGAGAGAGACCGAGGAGTTCAACGATCTCCTGGACCTGGACTTTATTCTCTCCAATTCGCTGACCCATCCTCCGGAGTCAGTGGCCGCCACCGTGTCCTCGTCAGCGTCAGCCTCCTCTTCGTCGTCGCCGTCGAGCAGCGGCCCTGCCAGCGCGCCCTCCACCTGCAGCTTCACCTATCCGATCCGGGCCGGGAACGACCCGGGCGTGGCGCCGGGCGGCACGGGCGGAGGCCTCCTCTATGGCAGGGAGTCCGCTCCCCCTCCGACGGCTCCCTTCAACCTGGCGGACATCAACGACGTGAGCCCCTCGGGCGGCTTCGTGGCCGAGCTCCTGCGGCCAGAATTGGACCCGGTGTACATTCCGCCGCAGCAGCCGCAGCCGCCAGGTGGCGGGCTGATGGGCAAGTTCGTGCTGAAGGCGTCGCTGAGCGCCCCTGGCAGCGAGTACGGCAGCCCGTCGGTCATCAGCGTCAGCAAAGGCAGCCCTGACGGCAGCCACCCGGTGGTGGTGGCGCCCTACAACGGCGGGCCGCCGCGCACGTGCCCCAAGATCAAGCAGGAGGCGGTCTCTTCGTGCACCCACTTGGGCGCTGGACCCCCTCTCAGCAATGGCCACCGGCCGGCTGCACACGACTTCCCCCTGGGGCGGCAGCTCCCCAGCAGGACTACCCCGACCCTGGGTCTTGAGGAAGTGCTGAGCAGCAGGGACTGTCACCCTGCCCTGCCGCTTCCTCCCGGCTTCCATCCCCACCCGGGGCCCAATTACCCATCCTTCCTGCCCGATCAGATGCAGCCGCAAGTCCCGCCGCTCCATTACCAAGAGCTCATGCCACCCGGTTCCTGCATGCCAGAGGAGCCCAAGCCAAAGAGGGGAAGACGATCGTGGCCCCGGAAAAGGACCGCCACCCACACTTGTGATTACGCGGGCTGCGGCAAAACCTACACAAAGAGTTCCCATCTCAAGGCACACCTGCGAACCCACACAGGTGAGAAACCTTACCACTGTGACTGGGACGGCTGTGGATGGAAATTCGCCCGCTCAGATGAACTGACCAGGCACTACCGTAAACACACGGGGCACCGCCCGTTCCAGTGCCAAAAATGCGACCGAGCATTTTCCAGGTCGGACCACCTCGCCTTACACATGAAGAGGCATTTTTAAATGACTAGTGCGCGCAGCGGCCGACCATGGCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTCGGTACCGGATCCAAATTCCCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAATTTCAGGTGGCATCTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAATAGTGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAA
Thy1.2启动子(RGC特异性)(SEQ ID NO:122)：AATTCAGAGACCGGGAACCAAACTAGCCTTTAAAAAACATAAGTACAGGAGCCAGCAAGATGGCTCAGTGGGTAAAGGTGCCTACCAGCAAGCCTGACAGCCTGAGTTCAGTCCCCACGAACTACGTGGTAGGAGAGGACCAACCAACTCTGGAAATCTGTTCTGCAAACACATGCTCACACACACACACACAAATAGTATAAACAATTTTAAATTTCATTTAAAAATAATTTGTAAACAAAATCATTAGCACAGGTTTTAGAAAGAGCCTCTTGGTGACATCAAGTTGATGCTGTAGATGGGGTATCATTCCTGAGGACCCAAAACCGGGTCTCAGCCTTTCCCCATTCTGAGAGTTCTCTCTTTTCTCAGCCACTAGCTGAAGAGTAGAGTGGCTCAGCACTGGGCTCTTGAGTTCCCAAGTCCTACAACTGGTCAGCCTGACTACTAACCAGCCATGAAGAAACAAGGAGTGGATGGGCTGAGTCTGCTGGGATGGGAGTGGAGTTAGTAAGTGGCCATGGATGTAATGACCCCAGCAATGCTGGCTAGAAGGCATGCCTCCTTTCCTTGTCTGGAGACGGAACGGGAGGGATCATCTTGTACTCACAGAAGGGAGAACATTCTAGCTGGTTGGGCCAAAATGTGCAAGTTCACCTGGAGGTGGTGGTGCATGCTTTTAACTCCAGTACTCAGGAGGCAGGGCCAGGTGGATCTCTGTGAGTTCAAGACCAGCCTGCACTATGGAGAGAGTTTTGGGACAGCCAGAGTTACACAGAAAAATCCTGGTGGAAAATCTGAAAGAAAGAGAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGGAAGAAAGAAAGAAAGAGTGGCAGGCAGGCAGGCAGGAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAAATAGGTGCGACTTCAAGATCCGGAGTTACAAGCAGAATGCACTGTTTCCCTAACAGGGCCAAGTGTTTTGAGTAACTGAAGGTGGGCATGATGCCTGGGAAGCAGAAACAAGCCAGGCAGATGCACCCCTTGCCTTGCTTCCGAAGGGCTGCAGTAGCATGGAAAACATGGAAAACAACCAATCCATTCCCTTTGCTGATATAACAGGCTCCAAAGCCAAAACCTGTCACTGGAGGCTCAAGAGCAGATCTCCAGCCAAGAGGCAAAGGAATGGGGGAAGCTGGAGGGCCTCCCTCTGGTTATCCAGGCTTCTGAAGGTTCAAGCAAAGAAAGGGTTACAACCTTAAAAGGAGAGCGTCCCGGGGTATGGGTAGAAGACTGCTCCACCCCGACCCCCAGGGTCCCTAACCGTCTTTTCCCTGGGCGAGTCAGCCCAATCACAGGACTGAGAGTGCCTCTTTAGTAGCAGCAAGCCACTTCGGACACCCAAATGGAACACCTCCAGTCAGCCCTCGCCGACCACCCCACCCCCTCCATCCTTTTCCCTCAGCCTCCGATTGGCTGAATCTAGAGTCCCTCCCTGCTCCCCCCTCTCTCCCCACCCCTGGTGAAAACTGCGGGCTTCAGCGCTGGGTGCAGCAACTGGAGGCGTTGGCGCACCAGGAGGAGGCTGCAGCTAGGGGAGTCCAGGTGAGAGCAGGCCGACGGGAGGGACCCGCACATGCAAGGACCGCCGCAGGGCGAGGATGCAAGCCTTCCCCAGCTACAGTTTTGGGAAAGGATACCAGGGCGCTCCTATATGGGGGCGCGGGAACTGGGGAAAGAAGGTGCTCCCAGGTCGAGGTGGGAGAGGAAGGCAGTGCGGGGTCACGGGCTTTCTCCCTGCTAACGGACGCTTTCGAAGAGTGGGTGCCGGAGGAGAACCATGAGGAAGGACATCAAGGACAGCCTTTGGTCCCCAAGCTCAAATCGCTTTAGTGGTGCGAATAGAGGGAGGAGGTGGGTGGCAAACTGGAGGGAGTCCCCAGCGGGTGACCTCGTGGCTGGCTGGGTGCGGGGCACCGCAGGTAAGAAAACCGCAATGTTGCGGGAGGGGACTGGGTGGCAGGCGCGGGGGAGGGGAAAGCTAGAAAGGATGCGAGGGAGCGGAGGGGGGAGGGAGCGGGAGAATCTCAACTGGTAGAGGAAGATTAAAATGAGGAAATAGCATCAGGGTGGGGTTAGCCAAGCCGGGCCTCAGGGAAAGGGCGCAAAGTTTGTCTGGGTGTGGGCTTAGGTGGGCTGGGTATGAGATTCGGGGCGCCGAAAACACTGCTGCGCCTCTGCCAAATCACGCTACCCCTGTATCTAGTTCTGCCAGGCTTCTCCAGCCCCAGCCCCAATTCTTTTCTCTAGTGTTCCCCCTTCCCTCCCCTGAATCTCAAGCCCACACTCCCTCCTCCATAACCCACTGTTATCAAATCTAAGTCATTTGCCACCCAACAACCATCAGGAGGCGGAAGCAGACGGGA GGAGTTTGAGATCAACTTGGGCTACATCACGAGTTCCAGGCTCACCAAGGCTTCTTAAGGAGACCTTGTCTCTAAAATTAATTAATTAATTAATTAATAGTCCCCTTTCTCTGCCACAGAACCTTGGGATCTGGCTCCTGGTCGCAGCTCCCCCCACCCCAGGCTGACATTCACTGCCATAGCCCATCCGGAAATCCTAGTCTATTTCCCCATGGATCTTGAACTGCAGAGAGAATGGCAGAGTGGCCCGCCCTGTGCAAAGGATGTTCCTAGCCTAGGTGGAGCTCGCGAACTCGCAGACTGTGCCTCTCTTGGGCAAGGACAGGCTAGACAGCCTGCCGGTGTGTTGAGCTAGGGCACTGTGGGGAAGGCAGAGAACCTGTGCAGGGCAGCAATGAACACAGGACCAGAAAACTGCAGCCCTAGGAACACTCAAGAGCTGGCCATTTGCAAGCATCTCTGGCCTCCGTGCTTCTCACTCATGTCCCATGTCTTATACAGGCCTCTGTGGCACCTCGCTTGCCTGATCTCATCCCTAGCCGTTAAGCTTTCTGCATGACTTATCACTTGGGGCATAATGCTGGATACCTACCATTTTCTTAGACCCCATCAAAATCCTATTTGAGTGTACGGTTCGGAGAACCTCATTTATCCGGTAAATGTCTTTTACTCTGCTCTCAGGGAGCTGAGGCAGGACATCCTGAGATACATTGGGAGAGGAGATACAGTTTCAATAAAATAATAGGTTGGGTGGAGGTACATGCCTATAATGCCACCACTCAGGAAATGGTGGCAGCTTCGTGAGTTTGAGGCCAACCCAAGAAACATAGTGAAACCCTGTCAGTAAATAAGTAAGCAAGTATTTGAGTATCTACTATATGCTAGGGCTGACCTGGACATTAGGGGTCATCTTCTGAACAAACTAGTGCTTGAGGGAGGTATTTGGGGTTTTTGTTTGTTTAATGGATCTGAATGAGTTCCAGAGACTGGCTACACAGCGATATGACTGAGCTTAACACCCCTAAAGCATACAGTCAGACCAATTAGACAATAAAAGGTATGTATAGCTTACCAAATAAAAAAATTGTATTTTCAAGAGAGTGTCTGTCTGTGTAGCCCTGGCTGTTCTTGAACTCACTCTGTAGACCAGGCTGGCCTGGAAATCCATCTGCCTGCCTCTGCCTCTCTGCCTCTCTGCCTCTCTGCCTCTCTCTCTGCCTCTCTCTGCCTCTCTCTGCCCCTCTCTGCCCCTCTCTGCCCCTCTCTGCCGCCCTCTGCCTTTTGCCCTCTGCCCTCTGTTCTCTGGCCTCTGCCCTCTGCCCTCTGGCCTCTGGCCTCTGCCTCTGCCTCTTGAGTGCTGGAATCAAAGGTGTGAGCTCTGTAGGTCTTAAGTTCCAGAAGAAAGTAATGAAGTCACCCAGCAGGGAGGTGCTCAGGGACAGCACAGACACACACCCAGGACATAGGCTCCCACTTCCTTGGCTTTCTCTGAGTGGCAAAGGACCTTAGGCAGTGTCACTCCCTAAGAGAAGGGGATAAAGAGAGGGGCTGAGGTATTCATCATGTGCTCCGTGGATCTCAAGCCCTCAAGGTAAATGGGGACCCACCTGTCCTACCAGCTGGCTGACCTGTAGCTTTCCCCACCACAGAATCCAAGTCGGAACTCTTGGCACCTAGAGGATCTCGAGGTCCTTCCTCTGCAGAGGTCTTGCTTCTCCCGGTCAGCTGACTCCCTCCCCAAGTCCTTCAAATATCTCAGAACATGGGGAGAAACGGGGACCTTGTCCCTCCTAAGGAACCCCAGTGCTGCATGCCATCATCCCCCCCACCCTCGCCCCCACCCCCGCCACTTCTCCCTCCATGCATACCACTAGCTGTCATTTTGTACTCTGTATTTATTCCAGGGCTGCTTCTGATTATTTAGTTTGTTCTTTCCCTGGAGACCTGTTAGAACATAAGGGCGTATGGTGGGTAGGGGAGGCAGGATATCAGTCCCTGGGGCGAGTTCCTCCCTGCCAACCAAGCCAGATGCCTGAAAGAGATATGGATGAGGGAAGTTGGACTGTGCCTGTACCTGGTACAGTCATACTCTGTTGAAAGAATCATCGGGGAGGGGGGGGGGCTCAAGAGGGGAGAGCTCTGCTGAGCCTTTGTGGACCATCCAATGAGGATGAGGGCTTAGATTCTACCAGGTCATTCTCAGCCACCACACACAAGCGCTCTGCCATCACTGAAGAAGCCCCCTAGGGCTCTTGGGCCAGGGCACACTCAGTAAAGATGCAGGTTCAGTCAGGGAATGATGGGGAAAGGGGTAGGAGGTGGGGGAGGGATCACCCCCTCCTCTAAAACACGAGCCTGCTGTCTCCAAAGGCCTCTGCCTGTAGTGAGGGTGGCAGAAGAAGACAAGGAGCCAGAACTCTGACTCCAGGATCTAAGTCCGTGCAGGAAGGGGATCCTAGAACCATCTGGTTGGACCCAGCTTACCAAGGGAGAGCCTTTATTCTTCTTTCCCTTGCCCCTCTGTGCCAGCCCCTCTTGCTGTCCCTGATCCCCCAGACAGCGAGAGTCTTGCAACCTGCCTCTTCCAAGACCTCCTAATCTCAGGGGCAGGCGGTGGAGTGAGATCCGGCGTGCACACTTTTTGGAAGATAGCTTTCCCAAGGATCCTCTCCCCCACTGGCAGCTCTGCCTGTCCCATCACCATGTATAATACCACCACTGCTACAGCATCTCACCGAGGAAAGAAAACTGCACAATAAAACCAAGCCTCTGGAGTGTGTCCTGGTGTCTGTCTCTTCTGTGTCCTGGCGTCTGTCTCTTCTGTGTTCTTCCAAGGTCAGAAACAAAAACCACACACTTCAACCTGGATGGCTCGGCTGAGCACTTCTGTGTGCAGAAGGTCCA ACCAGACTCTGGGGTACCCCGGCCCTCCCTATTCCCTTGCCTCCTGTCTCCCGCTTTTTATAGCTCCCTATGCTGGGCTTCTCTGGAGAGTGAAATCTTTGCCCAAATCAATGCGCATTCTCTCTGCTGAGTCATCTGGCGACAGCAGTTGAGTTCACCCGCCAACACATGGGCCCAGCTATGTAGCCGAACCCTGGCTCTGGAAGTGCCAGGGACTTTGTGCATAAGTATGTACCATGCCCTTTTTTCACAGTCCTAGCTCTGCAGAAGTGCAGCCTGAAGGCCTGTCTGCTGAGAGGACATGCCCTGGAGCCCTGAAACAGGCACAGTGGGAGGAGGAACGGAGGATGACAGGCATCAGGCCCTCAGTCCAAAAGCAACCACTTGAGAATGGGCTGGAGTACGAAACATGGGGTCCCGTCCCTGGATCCCTCCTCAAAGAGTAATAAGTAAAATATAAACAGGTACCCCAGGCCGTTCTGGGTTTGGGTTGTAATGGGATCCATTTGCAGAGAACTATTGAGACAGCCCAGCCGTACTGTGACAGGCAATGTGGGGGAGGAGGTTGAATCACTTGGTATTTAGCATGAATAGAATAATTCCCTGAACATTTTTCTTAAACATCCATATCTAAATTACCACCACTCGCTCCCAGTCTTCCTGCCTTTGCGCCAGCCTCCTGTCTGGCCATGCCTGAAGAAGGCTGGAGAAGCCACCCACCTCAGGCCATGACACTGCCAGCCACTTGGCAGGTGCAGCCAAACCTGAGCTGTCCCAGAAAGGGACATTCTCAAGACCCAGGCACCCTGATCAGCACTGACTTGGAGCTACAAGTGTCATGCCAGAAAAGTCTCTAAGAAAACCTTTTCAGGGAAAAGGGGGTGACTCAACACCGGGCAAGTTTGGGAAGCCCCACCCTTCGAGTGATGGAAGAGCAGATAGGAAGCCTCAGAAGAGAGACACCGGCACCCAGGTAACGTTCCTCATGTGGTCTCTGTCACACTAGGTGCTCTTCCCTGGACATCTCCGTGACCACACTCTCAGTTCTTAGGGAGATGCGGGTGCTCTCTGAGGCTATCTCAGAGTTGCAGATTCTGAGGCCTAGAGTGACTACAGTCAGCCTAGGAAGCCACAGAGGACTGTGGACCAGGAGGGCAGAAGAGGAGAAGGGAAGAAAAACCATCAGATAGGACTTGCAATGAAACTAACCCAAGACAATCATAATGCAGACAGGAATGTTAAAGGCGTTCAGCAGC
其他实施方案
实施方案1.方法，其包括：
在不存在诱导c-MYC表达的情况下，在细胞、组织、器官和/或受试者中诱导：
(i)OCT4表达；
(ii)SOX2表达；和
(iii)KLF4表达。
实施方案2.实施方案1的方法，其中通过施用以下项诱导OCT4表达：
(i)编码OCT4或编码Cas9融合蛋白(CRISPR激活物)的第一工程化核酸和靶向Oct4内源性基因座处的启动子或增强子的引导RNA序列，任选地其中第一核酸(例如工程化核酸)包含RNA和/或DNA；
(ii)诱导OCT4表达的化学剂；
(iii)诱导OCT4表达的抗体；或
(iv)编码OCT4的工程化蛋白质，
任选地其中OCT4包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:41至少70％相同的序列。
实施方案3.实施方案1-2中任一项的方法，其中SOX2表达包括施用：
(v)编码SOX2的第二工程化核酸，其编码Cas9融合蛋白(CRISPR激活物)，以及靶向SOX2内源性基因座处的启动子或增强子的引导RNA序列，其中第二工程化核酸包含RNA和/或DNA；
(vi)诱导SOX2表达的化学剂；
(vii)诱导SOX2表达的抗体；或
(viii)编码SOX2的工程化蛋白质，
任选地其中SOX2包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:43至少70％相同的序列。
实施方案4.实施方案1-3中任一项的方法，其中KLF4表达包括施用：
(ix)编码KLF4的第三工程化核酸，其编码Cas9融合蛋白(CRISPR激活物)，以及靶向KLF4内源性基因座处的启动子或增强子的引导RNA序列，其中第三核酸(例如工程化核酸)包含RNA和/或DNA；
(ix)诱导KLF4表达的化学剂；
(xi)诱导KLF4表达的抗体；或
(xii)编码KLF4的工程化蛋白质，
任选地其中KLF4包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:45至少70％相同的序列。
实施方案5.实施方案2-4中任一项的方法，其中所述第一、第二、第三工程化核酸或其组合存在于表达载体上或不存在于表达载体上，任选地其中第一、第二、第三工程化核酸是mRNA或质粒DNA。
实施方案6.实施方案5的方法，其中所述第一、第二和第三工程化核酸中的两个或三个存在于相同表达载体中。
实施方案7.实施方案1-5中任一项的方法，其中所述第一、第二和第三工程化核酸存在于分开的表达载体中。
实施方案8.实施方案5-7中任一项的方法，其中所述表达载体包括与第一、第二、第三工程化核酸或其组合可操作连接的诱导型启动子，任选地其中所述方法进一步包括施用诱导剂。
实施方案9.实施方案8的方法，其中所述启动子包含四环素应答元件(TRE)。
实施方案10.实施方案9的方法，其中诱导剂的施用包括施用蛋白质或编码诱导剂的第四工程化核酸，任选地其中第四工程化核酸与第一、第二和第三工程化核酸同时引入。
实施方案11.实施方案10的方法，其中第四工程化核酸存在于与第一、第二和第三工程化核酸分开的表达载体上。
实施方案12.实施方案10的方法，其中第四工程化核酸与第一、第二和第三工程化核酸中的至少一个存在于相同表达载体上。
实施方案13.实施方案9-12中任一项的方法，其中诱导剂能够在存在四环素的情况下从诱导型启动子诱导第一、第二、第三工程化核酸或其组合的表达，并且该方法进一步包括施用四环素和/或去除四环素，任选地其中四环素是强力霉素。
实施方案14.实施方案13的方法，其中诱导剂是反向四环素控制的反式激活物(rtTA)。
实施方案15.实施方案14的方法，其中rtTA是M2-rtTA或rtTA3。
实施方案16.实施方案15的方法，其中M2-rtTA包含与SEQ ID NO:15至少70％相同的氨基酸序列，或rtTA3包含与SEQ ID NO:11至少70％相同的氨基酸序列。
实施方案17.实施方案9-12中任一项的方法，其中诱导剂能够在不存在四环素的情况下从诱导型启动子诱导第一、第二、第三工程化核酸或其组合的表达，任选地其中四环素是强力霉素。
实施方案18.实施方案17的方法，其中诱导剂是温度、化学物质、pH、核酸、蛋白质，任选地其中蛋白质是四环素控制的反式激活物(tTA)。
实施方案19.实施方案11或13-18中任一项的方法，其中第一、第二和第三工程化核酸存在于第一表达载体中，并且第四工程化核酸存在于第二表达载体中。
实施方案20.实施方案9-19中任一项的方法，其中启动子是TRE3G、TRE2启动子或P紧密启动子，任选地其中启动子包含与SEQ ID NO:7至少70％相同的工程化核酸序列，任选地其中启动子包含与SEQ ID NO:23至少70％相同的工程化核酸序列，并且任选地其中启动子包含与SEQ ID NO:24至少70％相同的的序列。
实施方案21.实施方案1-7或10-20中任一项的方法，其中所述表达载体包含与第一、第二、第三、第四工程化核酸或其任何组合可操作连接的组成型启动子。
实施方案22.实施方案21的方法，其中组成性启动子可操作地连接至第四工程化核酸而不是第一、第二或第三工程化核酸，任选地其中组成型启动子是CP1、CMV、EF1alpha、SV40、PGK1、Ubc、人beta肌动蛋白、CAG、Ac5、多角体蛋白、TEF1、GDS、CaM3 5S、Ubi、H1和U6启动子或组织特异性启动子。
实施方案23.实施方案19-22的方法，其中第一表达载体包含SEQ ID NO:16中提供的序列，任选地其中第二表达载体包含SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32中提供的序列。
实施方案24.实施方案2-23中任一项的方法，其中(i)-(xii)中的至少一个在病毒载体中递送或在没有病毒载体的情况下递送，其中病毒载体选自下组：慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、α病毒、牛痘病毒和腺相关病毒(AAV)载体，任选地其中没有病毒载体情况下的递送包括裸核酸的施用、电穿孔、纳米颗粒的使用或脂质体的使用。
实施方案25.实施方案19-24中任一项的方法，其中第一表达载体是第一病毒载体，并且第二表达载体是病毒载体，任选地其中第一和第二病毒载体是AAV载体。
实施方案26.实施方案1-25中任一项的方法，其中至少一种工程化核酸包含SV40衍生的序列，所述序列包括与SEQ ID NO:8至少70％相同的序列。
实施方案27.实施方案1-26中任一项的方法，其中OCT4、KLF4或SOX2是哺乳动物蛋白质。
实施方案28.实施方案1-27中任一项的方法，其中细胞或组织在受试者中，其中受试者患有状况，怀疑患有状况或处于状况的风险中，任选地其中状况选自下组：眼疾病、衰老、癌症、肌肉骨骼疾病、与年龄有关的疾病、影响非人类动物的疾病和神经退行性疾病。
实施方案29.实施方案1-28中任一项的方法，其中方法进一步包括调节：细胞重编程，组织修复，组织存活，组织再生，组织生长，组织功能，器官再生，器官存活，器官功能，疾病或它们的任何组合，任选地其中调节包括离体或体外诱导细胞重编程，逆转衰老，改善组织功能，改善器官功能，组织修复，组织存活，组织再生，组织生长，促进血管生成，治疗疾病，减少疤痕形成，减少衰老的外观，促进器官再生，促进器官存活，改变源自动物的农产品的味道和质量，治疗疾病或它们的任何组合，并且任选地其中治疗疾病包括在疾病发作之前诱导OCT4、KLF4和/或SOX2的表达，或者其中治疗疾病包括在疾病发作之后诱导OCT4、KLF4和/或SOX2的表达。
实施方案30.实施方案29的方法，其中细胞或组织来自眼，耳，鼻，口，包括牙龈和牙根，骨，肺，乳房(breast)，乳房(udder)，胰腺，胃，食道，肌肉，包括心肌，肝，血管，皮肤，包括毛发，心脏，脑，神经组织，肾，睾丸，前列腺，阴茎，泄殖腔，鳍，卵巢或肠，任选地其中组织受到损害或或者组织可以被认为是健康的，但在当前或未来状况下的性能或存活次佳。
实施方案31.实施方案1-30中任一项的方法，其中工程化核酸进一步包含自切割肽，任选地其中自切割肽是与SEQ ID NO:9至少70％相同的2A肽。
实施方案32.实施方案1-31中任一项的方法，其中工程化核酸进一步包含位于第一核酸、第二核酸、第三核酸或其组合的侧翼的反向末端重复(ITR)，任选地其中ITR之间的距离为4.7kb或更小。
实施方案33.表达载体，其在不存在能够表达c-MYC的工程化核酸的情况下包含：
(i)编码OCT4的第一工程化核酸；
(ii)编码SOX2的第二工程化核酸；和
(iii)编码KLF4的第三工程化核酸。
实施方案34.实施方案33的表达载体，其中OCT4蛋白包含与SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:41至少70％相同的序列。
实施方案35.实施方案33-34中任一项的表达载体，其中SOX2蛋白包含与SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:43至少70％相同的序列。
实施方案36.实施方案33-35中任一项的表达载体，其中KLF4蛋白包含与SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:45至少70％相同的序列。
实施方案37.实施方案33-36中任一项的表达载体，其进一步包含与第一、第二、第三工程化核酸或其任何组合可操作连接的诱导型启动子。
实施方案38.实施方案37的表达载体，其中诱导剂能够在存在四环素的情况下从诱导型启动子诱导第一、第二、第三工程化核酸或其任何组合的表达，任选地其中四环素是强力霉素。
实施方案39.实施方案38的表达载体，其中诱导剂是反向四环素控制的反式激活物(rtTA)。
实施方案40.实施方案39的表达载体，其中rtTA是M2-rtTA或rtTA3。
实施方案41.实施方案40的表达载体，其中M2-rtTA包含与SEQ ID NO:15至少70％相同的氨基酸序列，或rtTA3包含与SEQ ID NO:11至少70％相同的氨基酸序列。
实施方案42.实施方案38-41中任一项的表达载体，其中诱导剂能够在不存在四环素的情况下从诱导型启动子中诱导第一、第二、第三工程化核酸或其任何组合的表达，任选地其中四环素是强力霉素。
实施方案43.实施方案42的表达载体，其中诱导剂是四环素控制的反式激活物(tTA)。
实施方案44.实施方案37-43中任一项的表达载体，其中诱导型启动子包含四环素响应元件(TRE)，任选地其中启动子是TRE3G启动子，其包含与SEQ ID NO:7至少70％相同的工程化核酸序列，任选地其中启动子包含与SEQ ID NO:23至少70％相同的工程化核酸序列，并且任选地其中启动子包含与SEQ ID NO:24至少70％相同的序列。
实施方案45.实施方案33-36中任一项的表达载体，其中表达载体包含与第一、第二、第三工程化核酸或其组合可操作连接的组成型启动子。
实施方案46.实施方案33-44中任一项的表达载体，其中表达载体包含SEQ ID NO:16中提供的序列。
实施方案47.实施方案33-46中任一项的表达载体，其中表达载体是病毒载体，其中该病毒载体选自下组：慢病毒、α病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒(AAV)载体。
实施方案48.实施方案33-47中任一项的表达载体，其中至少一种工程化核酸包含SV40衍生的序列，所述序列包括与SEQ ID NO:8至少70％相同的序列。
实施方案49.实施方案33-48中任一项的表达载体，其中OCT4、KLF4或SOX2是哺乳动物蛋白质。
实施方案50.实施方案33-49中任一项的表达载体，其中表达载体进一步包含自切割肽，任选地其中自切割肽是2A肽，任选地其中2A肽包含与SEQ ID NO:9至少70％相同的序列。
实施方案51.实施方案37-44和46-50中任一项的表达载体，其中表达载体包含一个诱导型启动子。
实施方案52.实施方案45-50中任一项的表达载体，其中表达载体包含一个组成型启动子。
实施方案53.实施方案33-52中任一项的表达载体，其中工程化核酸进一步包含位于第一核酸、第二核酸、第三核酸或其组合侧翼的反向末端重复序列(ITR)。
实施方案54.实施方案32的表达载体，其中ITR之间的距离为4.7kb或更小。
实施方案55.重组病毒，其包含实施方案47-54中任一项的表达载体，任选地其中重组病毒是逆转录病毒、腺病毒、AAV、α病毒、牛痘病毒、疱疹病毒或慢病毒。
实施方案56.工程化细胞，其通过实施方案1-32、63-66、70-75、81和85-87中任一项的方法产生，任选地其中工程化细胞包含实施方案33-54中任一项的表达载体。
实施方案57.组合物，其包含实施方案33-54中任一项的表达载体，实施方案55的重组病毒，实施方案56的工程化细胞，能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的化学剂，选自OCT4、KLF4和/或SOX2的工程化蛋白质，能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的抗体，任选地其中组合物包含药学上可接受的载体。
实施方案58.实施方案57的组合物，其进一步包含编码诱导剂的第二表达载体，编码诱导剂的第二蛋白质或编码诱导剂的第二重组病毒，任选地其中第二表达载体是AAV载体和/或第二重组病毒是AAV。
实施方案59.实施方案58的组合物，其中诱导剂是反向四环素反式激活物(rtTA)或四环素反式激活物(tTA)。
实施方案60.实施方案58-59中任一项的组合物，其中诱导剂由病毒载体编码，任选地其中病毒载体选自下组：慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体和逆转录病毒载体。
实施方案61.实施方案60的组合物，其中编码诱导剂的病毒载体包含SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32中所示的序列。
实施方案62.试剂盒，其包含实施方案33-54中任一项的表达载体，实施方案55的重组病毒，实施方案56的工程化细胞，能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的化学剂，选自OCT4、KLF4和/或SOX2的工程化蛋白质，能够诱导OCT4、KLF4和/或SOX2表达的抗体，或实施方案56-61中任一项的组合物。
实施方案63.产生工程化细胞的方法，其包括实施方案1-32中任一项的方法，从而产生工程化细胞。
实施方案64.实施方案63的方法，其中工程化细胞是诱导多能干细胞。
实施方案65.实施方案63-64中任一项的方法，其中工程化细胞是实施方案56的细胞。
实施方案66.产生工程化细胞的方法，其包括实施方案1-32和63-65中任一项的方法，其中工程化细胞是离体产生的。
实施方案67.实施方案63-66中任一项的方法，其进一步包括生成工程化组织或工程化器官。
实施方案68.实施方案66-67中任一项的方法，其进一步包括将工程化细胞、工程化组织和/或工程化器官施用于有此需要的受试者，任选地其中细胞、组织和/或器官来自眼，耳，鼻，口(包括牙龈和牙根)，骨，肺，乳房，乳房，胰腺，胃，食道，肌肉(包括心肌)，肝，血管，皮肤(包括毛发)，心脏，脑，神经组织，肾，睾丸，前列腺，阴茎，泄殖腔，鳍，卵巢或肠细胞。
实施方案69.实施方案63-68中任一项的方法，其中方法进一步包括治疗疾病，任选地其中疾病选自下组：急性损伤、神经退行性疾病、慢性疾病、增生性疾病、眼疾病、心血管疾病、遗传疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、神经系统疾病、血液病、疼痛状况、精神病症、代谢紊乱、慢性疾病、癌症、衰老、与年龄有关的疾病以及影响受试者中任何组织的疾病，任选地其中疾病是眼疾病。
实施方案70.方法，其包括：
在细胞、组织、器官和/或受试者中，且在没有激活c-Myc的情况下，
(i)激活OCT4；
(ii)激活SOX2；和
(iii)激活KLF4。
实施方案71.实施方案71的方法，其中(i)-(iii)中任一项的激活包括施用抗体、蛋白质、核酸或化学剂。
实施方案72.实施方案72中任一项的方法，其中核酸、抗体、蛋白质和/或化学剂替换OCT4、SOX2和/或KLF4。
实施方案73.实施方案72的方法，其中替换包括促进细胞重编程。
实施方案74.实施方案70-73中任一项的方法，其中(i)-(iii)中任一项的激活包括替换OCT4、SOX2和/或KLF4，选自下组：抗体、蛋白质、核酸和化学剂。
实施方案75.实施方案74的方法，其中OCT4、SOX2和/或KLF4的替换包括施用编码Tet1、NR5A-2、Sall4、E-钙粘着蛋白、NKX3-1、NANOG和/或Tet2的核酸和/或蛋白质。
实施方案76.实施方案1-32和70-75中任一项的方法，其中受试者是健康的。
实施方案77.实施方案1-32和70-76中任一项的方法，其中受试者是小儿受试者。
实施方案78.实施方案1-32和70-76中任一项的方法，其中受试者是成年受试者。
实施方案79.实施方案28-32和70-78中任一项的方法，其中受试者患有青光眼，怀疑患有青光眼或具有青光眼的风险。
实施方案80.实施方案28-32和70-79中任一项的方法，其中受试者患有，怀疑患有视敏度和/或视网膜功能的年龄相关的下降，或者具有视敏度和/或视网膜功能的年龄相关的下降的风险。
实施方案81.方法，其包括将编码Tet1或Tet2的核酸和/或蛋白质施用于细胞、组织、器官和/或受试者。
实施方案82.实施方案81的方法，其中受试者患有疾病。
实施方案83.实施方案82的方法，其中疾病选自急性损伤、神经退行性疾病、慢性疾病、增生性疾病、眼疾病、心血管疾病、遗传疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、神经系统疾病、血液病、疼痛状况、精神病症、代谢紊乱、慢性疾病、癌症、衰老、与年龄有关的疾病以及影响受试者中任何组织的疾病。
实施方案84.实施方案83的方法，其中疾病是眼疾病。
实施方案85.实施方案1-32和63-84中任一项的方法，其进一步包括激活细胞、组织、器官和/或受试者中重编程的增强子。
实施方案86.实施方案1-32和63-85中任一项的方法，其进一步包括抑制细胞、组织、器官和/或受试者中重编程的障碍。
实施方案87.实施方案86的方法，其中重编程的障碍是细胞、组织、器官和/或受试者中的DNA甲基转移酶(DNMT)。
实施方案88.方法，其包括：
在没有诱导c-MYC表达的情况下，在受试者中诱导：
(i)OCT4表达；
(ii)SOX2表达；和
(iii)KLF4表达；
其中受试者已经用化学疗法药物治疗。
实施方案89.实施方案89的方法，其中化学疗法药物是长春新碱(VCS)。
实施方案90.方法，其包括在细胞、组织、器官和/或受试者中诱导：
(i)OCT4表达；
(ii)SOX2表达；和
(iii)KLF4表达；
其中OCT4、SOX2和KLF4由核酸编码，并且从单个启动子诱导OCT4、SOX2和/或KLF4的表达。
实施方案91.方法，其包括：
在没有诱导c-MYC表达的情况下，在细胞、组织、器官和/或受试者中诱导：
(i)OCT4表达；
(ii)SOX2表达；
(iii)KLF4表达；或
(iv)(i)-(iii)的任何组合。
实施方案92.实施方案91的方法，其中(i)-(iii)的组合包含(i)和(ii)；(i)和(iii)；(ii)和(iii)；或(i)、(ii)和(iii)。
实施方案93.表达载体，其包含：
在不存在能够诱导c-MYC表达的工程化核酸的情况下，
(i)编码OCT4的第一工程化核酸；
(ii)编码SOX2的第二种工程化核酸；
(iii)编码KLF4的第三种工程化核酸；或
(iv)(i)-(iii)的任何组合。
实施方案94.实施方案93的表达载体，其中(i)-(iii)的组合包含(i)和(ii)；和(ii)；(i)和(iii)；(ii)和(iii)；或(i)、(ii)和(iii)。
实施方案95.重组病毒，其包含实施方案47-54和93-94中任一项的表达载体，任选地其中重组病毒是逆转录病毒、腺病毒、AAV、α病毒、牛痘病毒、疱疹病毒或慢病毒。
实施方案96.工程化细胞，其通过实施方案1-32、63-66、70-75、81、85-87和91-92中任一项的方法产生，任选地其中工程化细胞包含实施方案33-54和93-94中任一项的表达载体。
实施方案97.组合物，其包含实施方案33-54和93-94中任一项的表达载体，实施方案55或实施方案95的重组病毒，实施方案56或96的工程化细胞，能够诱导OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合表达的化学剂，选自OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的工程化蛋白质，能够诱导OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合表达的抗体，任选地其中组合物包含药学上可接受的载体。
实施方案98.试剂盒，其包含实施方案33-54和93-94中任一项的表达载体，实施方案55或95的重组病毒，实施方案56或96的工程化细胞，能够诱导OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合表达的化学剂，选自OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合的工程化蛋白质，能够诱导OCT4；KLF4；SOX2；或其任何组合表达的抗体，或实施方案56-61或97中任一项的组合物。
实施方案99.产生工程化细胞的方法，其包括实施方案1-32和91-92中任一项的方法，从而产生工程化细胞。
实施方案100.产生工程化细胞的方法，其包括实施方案1-32、63-65、91-92和99中任一项的方法，其中工程化细胞在体内产生。
实施方案101.产生工程化细胞的方法，其包括实施方案1-32、63-65、91-92和99中任一项的方法，其中工程化细胞离体产生。
实施方案102.方法，其包括：
在细胞、组织、器官、受试者或其任何组合中，且在没有激活超出内源性水平的c-Myc的情况下，
(i)激活OCT4；
(ii)激活SOX2；
(iii)激活KLF4；或
(iv)(i)-(iii)的任何组合。
实施方案103.实施方案102的方法，其中(i)-(iii)的组合包含(i)和(ii)；(i)和(iii)；(ii)和(iii)；或(i)、(ii)和(iii)。
实施方案104.方法，其包括：
在没有诱导c-MYC表达的情况下，在受试者中诱导：
(i)OCT4表达；
(ii)SOX2表达；
(iii)KLF4表达；或
(iv)(i)-(iii)的任何组合，
其中受试者已经用化学疗法药物治疗。
实施方案105.实施方案104的方法，其中(i)-(iii)的组合包含(i)和(ii)；(i)和(iii)；(ii)和(iii)；或(i)、(ii)和(iii)。
实施方案106.方法，其包括在细胞、组织、器官、受试者或其任何组合中诱导：
(i)OCT4表达；
(ii)SOX2表达；
(iii)KLF4表达；或
(iv)(i)-(iii)的任何组合，
其中OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合由核酸编码，并且从单个启动子诱导OCT4、SOX2、KLF4或其任何组合的表达。
实施方案107.实施方案106的方法，其中(i)-(iii)的组合包含(i)和(ii)；(i)和(iii)；(ii)和(iii)；或(i)、(ii)和(iii)。
实施方案108.实施方案1-32、68-92或102-107中任一项的方法，其中受试者是人。
实施方案109.实施方案1-32、68-92或102-108中任一项的方法，其中方法不诱导畸胎瘤形成。
实施方案110.实施方案1-32、68-92或102-109中任一项的方法，其中方法不诱导肿瘤形成或肿瘤生长。
实施方案111.实施方案110的方法，其中方法减少肿瘤形成或肿瘤生长。
实施方案112.实施方案1-32、68-92或102-111中任一项的方法，其中方法增加受试者中的视敏度。
实施方案113.实施方案1-32、68-92或102-112中任一项的方法，其中方法不诱导癌症。
实施方案114.实施方案1-32、68-92或102-113中任一项的方法，其中方法不诱导青光眼。
实施方案115.实施方案1-32、68-92或102-114中任一项的方法，其中方法逆转细胞、组织、器官、受试者或其任何组合的表观遗传时钟。
实施方案116.实施方案115的方法，其中使用基于DNA甲基化(DNAm)的年龄估算器确定表观遗传时钟。
实施方案117.实施方案1-32、68-92或102-116中任一项的方法，其中方法改变与衰老相关的一种或多种基因的表达。
实施方案118.实施方案117的方法，其中方法减少与衰老相关的一种或多种基因的表达。
实施方案119.实施方案118的方法，其中方法减少以下项的表达：0610040J01Rik、1700080N15Rik、2900064F13Rik、4833417C18Rik、4921522P10Rik、4930447C04Rik、4930488N15Rik、Ace、Ackr1、Acot10、Acvr1、Adamts17、Adra1b、AI504432、Best3、Boc、Cadm3、Cand2、Ccl9、Cd14、Cd36、Cfh、Chrm3、Chrna4、Cntn4、Cracr2b、Cryaa、CT573017.2、Cyp26a1、Cyp27a1、D330050G23Rik、D930007P13Rik、Ddo、Dgkg、Dlk2、Dnaja1-ps、Drd2、Dsel、Dytn、Ecscr、Edn1、Ednrb、Efemp1、Elfn2、Epha10、Ephx1、Erbb4、Fam20a、Fbxw21、Ffar4、Flt4、Fmod、Foxp4、Fzd7、Gabrd、Galnt15、Galnt18、Gfra2、Ggt1、Gm10416、Gm14964、Gm17634、Gm2065、Gm32352、Gm33172、Gm34280、Gm35853、Gm36298、Gm36356、Gm36937、Gm3898、Gm42303、Gm42484、Gm42537、Gm42743、Gm43151、Gm43843、Gm44545、Gm44722、Gm45516、Gm45532、Gm47494、Gm47982、Gm47989、Gm48398、Gm48495、Gm48593、Gm48958、Gm49089、Gm49326、Gm49331、Gm49760、Gm5796、Gm6374、Gm7276、Gm8237、Gm9796、Gm9954、Gpr75、Gprc5c、Grid2ip、Gsg1l2、Hapln4、Hcn3、Hcn4、Hhatl、Hs6st2、Htr3a、Il1rap、Il1rapl2、Inka1、Kbtbd12、Kcnj11、Kcnk4、Kdelc2、Klhl33、Lamc3、Lilra5、Lman1l、Lrfn2、Lrrc38、Lrrn4cl、Ltc4s、Mansc1、Mir344c、Msr1、Mycbpap、Myoc、Ngfr、Nipal2、Olfr1372-ps1、Otop3、P2rx5、P2ry12、P4ha2、Pcdha12、Pcdha2、Pcdhac2、Pcdhb18、Pcdhb5、Pcsk2os1、Pcsk6、Perp、Pkp1、Plxna4、Prickle2、Qsox1、Rapgef4os2、Rbp4、Rcn3、Sec14l5、Sel1l3、Serpinh1、Sgpp2、Shisa6、Siah3、Siglech、Slc12a4、Slc24a2、Slc2a5、Slc4a4、Slitrk3、Smagp、Smoc2、Speer4b、Spon2、Sstr2、Sstr3、St3gal3、Stc1、Stc2、Syndig1、Syt10、Thsd7a、Tlr8、Tmem132a、Tmem132d、Tmem200a、Tmem44、Trpc4、Trpv4、Unc5b、Vgf、Vmn1r90、Vwc2l、Wfikkn2、Wnt11、Wnt6、Zeb2os、Zfp608、Zfp976或其任何组合。
实施方案120.实施方案119的方法，其中基因是感觉基因。
实施方案121.实施方案118-120中任一项的方法，其中基因是Ace、Kcnk4、Lamc3、Edn1、Syt10、Ngfr、Gprc5c、Cd36、Chrna4、Ednrb、Drd2或其组合。
实施方案122.实施方案117的方法，其中方法增加与衰老相关的一种或多种基因的表达。
实施方案123.实施方案1-32、68-92、102-122中任一项的方法，其中方法增加以下项的表达：1700031P21Rik、1810053B23Rik、2900045O20Rik、2900060B14Rik、4921504E06Rik、4930402F11Rik、4930453C13Rik、4930455B14Rik、4930500H12Rik、4930549P19Rik、4930555B11Rik、4930556J02Rik、4932442E05Rik、4933431K23Rik、4933438K21Rik、6720475M21Rik、9830132P13Rik、A430010J10Rik、A530064D06Rik、A530065N20Rik、Abcb5、Abhd17c、AC116759.2、AC131705.1、AC166779.3、Acot12、Adig、Akr1cl、Ankrd1、Asb15、Atp2c2、AU018091、AW822073、Btnl10、C130093G08Rik、C730027H18Rik、Ccdc162、Chil6、Col26a1、Corin、Crls1、Cybrd1、Cyp2d12、Cyp7a1、D830005E20Rik、Dlx3、Dnah14、Dsc3、Dthd1、Eid2、Eps8l1、EU599041、Fam90a1a、Fancf、Fau-ps2、Fezf1、Gja5、Gm10248、Gm10513、Gm10635、Gm10638、Gm10718、Gm10722、Gm10800、Gm10801、Gm11228、Gm11251、Gm11264、Gm11337、Gm11368、Gm11485、Gm11693、Gm12793、Gm13050、Gm13066、Gm13323、Gm13339、Gm13346、Gm13857、Gm14387、Gm14770、Gm15638、Gm16072、Gm16161、Gm16181、Gm17200、Gm17791、Gm18025、Gm18757、Gm18795、Gm18848、Gm19719、Gm20121、Gm20356、Gm2093、Gm21738、Gm21940、Gm22933、Gm24000、Gm24119、Gm25394、Gm26555、Gm27047、Gm28262、Gm28530、Gm29295、Gm29825、Gm29844、Gm3081、Gm32051、Gm32122、Gm33056、Gm33680、Gm34354、Gm34643、Gm3551、Gm36660、Gm36948、Gm37052、Gm37142、Gm37262、Gm37535、Gm37569、Gm37589、Gm37647、Gm37648、Gm37762、Gm38058、Gm38069、Gm38137、Gm38218、Gm39139、Gm42535、Gm42680、Gm42895、Gm42994、Gm43027、Gm43158、Gm43288、Gm43366、Gm44044、Gm44081、Gm44187、Gm44280、Gm44535、Gm45338、Gm45644、Gm45740、Gm46555、Gm46565、Gm4742、Gm47485、Gm47853、Gm47992、Gm48225、Gm48314、Gm48383、Gm48673、Gm48804、Gm48832、Gm4994、Gm5487、Gm5724、Gm595、Gm6012、Gm6024、Gm7669、Gm7730、Gm8043、Gm8953、Gm9348、Gm9369、Gm9495、H2al2a、Ido2、Igfbp1、Kif7、Klhl31、Lrrc31、Mc5r、Mgam、Msh4、Mucl2、Mug1、Mybl2、Myh15、Nek10、Neurod6、Nr1h5、Olfr1042、Olfr1043、Olfr1082、Olfr1090、Olfr1124、Olfr1167、Olfr1205、Olfr1206、Olfr1223、Olfr1263、Olfr1264、Olfr1269、Olfr127、Olfr1291-ps1、Olfr1406、Olfr1469、Olfr215、Olfr273、Olfr328、Olfr355、Olfr372、Olfr390、Olfr427、Olfr456、Olfr466、Olfr481、Olfr522、Olfr6、Olfr601、Olfr603、Olfr706、Olfr727、Olfr728、Olfr741、Olfr801、Olfr812、Olfr816、Olfr822、Olfr860、Olfr890、Olfr923、Olfr943、Otogl、Pi15、Pkhd1、Pkhd1l1、Platr6、Pou3f4、Prr9、Pvalb、Rhag、Sav1、Serpinb9b、Skint1、Skint3、Skint5、Slc10a5、Slc6a4、Smok2a、Tcaf3、Tomm20l、Trcg1、Trdn、Ugt1a6a、Usp17la、Vmn1r178、Vmn1r179、Vmn1r33、Vmn1r74、Vmn1r87、Vmn2r102、Vmn2r113、Vmn2r17、Vmn2r52、Vmn2r66、Vmn2r68、Vmn2r76、Vmn2r78、Wnt16或其任何组合。
实施方案124.实施方案123的方法，其中方法增加以下项的表达：Olfr816、Olfr812、Olfr1264、Olfr727、Olfr923、Olfr1090、Olfr328、Olfr1124、Olfr522、Olfr1082、Olfr1206、Olfr1167、Olfr706、Olfr6、Pou3f4、Olfr603、Olfr127、Olfr1263、Olfr1269、Olfr1205、Olfr390、Olfr601、Olfr860、Olfr215、Olfr741、Olfr1469、Olfr355、Olfr481、Olfr456、Olfr1042、Olfr728、Olfr372、Olfr801、Olfr1223、Olfr822、Otogl、Olfr943、Olfr1406、Olfr273、Olfr466、Olfr1043、Olfr427、Olfr890、Rbp4或其任何组合。
实施方案125.重编程的方法，其包括使细胞、组织、器官、受试者或其任何组合的表观遗传时钟恢复活力。
实施方案126.实施方案125的方法，其中使细胞、组织、器官、受试者或其任何组合的表观遗传时钟恢复活力包括引入、激活和/或表达OCT4、KLF4、SOX2或其任何组合。
实施方案127.实施方案126中任一项的方法，其中将细胞、组织、器官、受试者或其任何组合的表观遗传时钟恢复活力为年轻细胞、组织、器官、受试者或其任何组合的表观遗传时钟。
实施方案128.实施方案125-127中任一项的方法，其中使表观遗传时钟恢复活力包括改变与细胞、组织、器官、受试者或其组合中衰老相关的一种或多种基因的表达。
实施方案129.实施方案128的方法，其中方法包括减少与衰老相关的一种或多种基因的表达。
实施方案130.根据实施方案129的方法，其中方法包括减少以下项的表达：0610040J01Rik、1700080N15Rik、2900064F13Rik、4833417C18Rik、4921522P10Rik、4930447C04Rik、4930488N15Rik、Ace、Ackr1、Acot10、Acvr1、Adamts17、Adra1b、AI504432、Best3、Boc、Cadm3、Cand2、Ccl9、Cd14、Cd36、Cfh、Chrm3、Chrna4、Cntn4、Cracr2b、Cryaa、CT573017.2、Cyp26a1、Cyp27a1、D330050G23Rik、D930007P13Rik、Ddo、Dgkg、Dlk2、Dnaja1-ps、Drd2、Dsel、Dytn、Ecscr、Edn1、Ednrb、Efemp1、Elfn2、Epha10、Ephx1、Erbb4、Fam20a、Fbxw21、Ffar4、Flt4、Fmod、Foxp4、Fzd7、Gabrd、Galnt15、Galnt18、Gfra2、Ggt1、Gm10416、Gm14964、Gm17634、Gm2065、Gm32352、Gm33172、Gm34280、Gm35853、Gm36298、Gm36356、Gm36937、Gm3898、Gm42303、Gm42484、Gm42537、Gm42743、Gm43151、Gm43843、Gm44545、Gm44722、Gm45516、Gm45532、Gm47494、Gm47982、Gm47989、Gm48398、Gm48495、Gm48593、Gm48958、Gm49089、Gm49326、Gm49331、Gm49760、Gm5796、Gm6374、Gm7276、Gm8237、Gm9796、Gm9954、Gpr75、Gprc5c、Grid2ip、Gsg1l2、Hapln4、Hcn3、Hcn4、Hhatl、Hs6st2、Htr3a、Il1rap、Il1rapl2、Inka1、Kbtbd12、Kcnj11、Kcnk4、Kdelc2、Klhl33、Lamc3、Lilra5、Lman1l、Lrfn2、Lrrc38、Lrrn4cl、Ltc4s、Mansc1、Mir344c、Msr1、Mycbpap、Myoc、Ngfr、Nipal2、Olfr1372-ps1、Otop3、P2rx5、P2ry12、P4ha2、Pcdha12、Pcdha2、Pcdhac2、Pcdhb18、Pcdhb5、Pcsk2os1、Pcsk6、Perp、Pkp1、Plxna4、Prickle2、Qsox1、Rapgef4os2、Rbp4、Rcn3、Sec14l5、Sel1l3、Serpinh1、Sgpp2、Shisa6、Siah3、Siglech、Slc12a4、Slc24a2、Slc2a5、Slc4a4、Slitrk3、Smagp、Smoc2、Speer4b、Spon2、Sstr2、Sstr3、St3gal3、Stc1、Stc2、Syndig1、Syt10、Thsd7a、Tlr8、Tmem132a、Tmem132d、Tmem200a、Tmem44、Trpc4、Trpv4、Unc5b、Vgf、Vmn1r90、Vwc2l、Wfikkn2、Wnt11、Wnt6、Zeb2os、Zfp608、Zfp976或其任何组合。
实施方案131.实施方案128-130的方法，其中一种或多种基因是一种或多种感觉基因。
实施方案132.实施方案128-131中任一项的方法，其中基因是Ace、Kcnk4、Lamc3、Edn1、Syt10、Ngfr、Gprc5c、Cd36、Chrna4、Ednrb、Drd2或其组合。
实施方案133.实施方案128-132中任一项的方法，其中方法包括增加与衰老相关的一种或多种基因的表达。
实施方案134.实施方案133的方法，其中方法包括增加以下项的表达：1700031P21Rik、1810053B23Rik、2900045O20Rik、2900060B14Rik、4921504E06Rik、4930402F11Rik、4930453C13Rik、4930455B14Rik、4930500H12Rik、4930549P19Rik、4930555B11Rik、4930556J02Rik、4932442E05Rik、4933431K23Rik、4933438K21Rik、6720475M21Rik、9830132P13Rik、A430010J10Rik、A530064D06Rik、A530065N20Rik、Abcb5、Abhd17c、AC116759.2、AC131705.1、AC166779.3、Acot12、Adig、Akr1cl、Ankrd1、Asb15、Atp2c2、AU018091、AW822073、Btnl10、C130093G08Rik、C730027H18Rik、Ccdc162、Chil6、Col26a1、Corin、Crls1、Cybrd1、Cyp2d12、Cyp7a1、D830005E20Rik、Dlx3、Dnah14、Dsc3、Dthd1、Eid2、Eps8l1、EU599041、Fam90a1a、Fancf、Fau-ps2、Fezf1、Gja5、Gm10248、Gm10513、Gm10635、Gm10638、Gm10718、Gm10722、Gm10800、Gm10801、Gm11228、Gm11251、Gm11264、Gm11337、Gm11368、Gm11485、Gm11693、Gm12793、Gm13050、Gm13066、Gm13323、Gm13339、Gm13346、Gm13857、Gm14387、Gm14770、Gm15638、Gm16072、Gm16161、Gm16181、Gm17200、Gm17791、Gm18025、Gm18757、Gm18795、Gm18848、Gm19719、Gm20121、Gm20356、Gm2093、Gm21738、Gm21940、Gm22933、Gm24000、Gm24119、Gm25394、Gm26555、Gm27047、Gm28262、Gm28530、Gm29295、Gm29825、Gm29844、Gm3081、Gm32051、Gm32122、Gm33056、Gm33680、Gm34354、Gm34643、Gm3551、Gm36660、Gm36948、Gm37052、Gm37142、Gm37262、Gm37535、Gm37569、Gm37589、Gm37647、Gm37648、Gm37762、Gm38058、Gm38069、Gm38137、Gm38218、Gm39139、Gm42535、Gm42680、Gm42895、Gm42994、Gm43027、Gm43158、Gm43288、Gm43366、Gm44044、Gm44081、Gm44187、Gm44280、Gm44535、Gm45338、Gm45644、Gm45740、Gm46555、Gm46565、Gm4742、Gm47485、Gm47853、Gm47992、Gm48225、Gm48314、Gm48383、Gm48673、Gm48804、Gm48832、Gm4994、Gm5487、Gm5724、Gm595、Gm6012、Gm6024、Gm7669、Gm7730、Gm8043、Gm8953、Gm9348、Gm9369、Gm9495、H2al2a、Ido2、Igfbp1、Kif7、Klhl31、Lrrc31、Mc5r、Mgam、Msh4、Mucl2、Mug1、Mybl2、Myh15、Nek10、Neurod6、Nr1h5、Olfr1042、Olfr1043、Olfr1082、Olfr1090、Olfr1124、Olfr1167、Olfr1205、Olfr1206、Olfr1223、Olfr1263、Olfr1264、Olfr1269、Olfr127、Olfr1291-ps1、Olfr1406、Olfr1469、Olfr215、Olfr273、Olfr328、Olfr355、Olfr372、Olfr390、Olfr427、Olfr456、Olfr466、Olfr481、Olfr522、Olfr6、Olfr601、Olfr603、Olfr706、Olfr727、Olfr728、Olfr741、Olfr801、Olfr812、Olfr816、Olfr822、Olfr860、Olfr890、Olfr923、Olfr943、Otogl、Pi15、Pkhd1、Pkhd1l1、Platr6、Pou3f4、Prr9、Pvalb、Rhag、Sav1、Serpinb9b、Skint1、Skint3、Skint5、Slc10a5、Slc6a4、Smok2a、Tcaf3、Tomm20l、Trcg1、Trdn、Ugt1a6a、Usp17la、Vmn1r178、Vmn1r179、Vmn1r33、Vmn1r74、Vmn1r87、Vmn2r102、Vmn2r113、Vmn2r17、Vmn2r52、Vmn2r66、Vmn2r68、Vmn2r76、Vmn2r78、Wnt16或其任何组合。
实施方案135.实施方案133-134中任一项的方法，其中方法包括增加以下项的表达：Olfr816、Olfr812、Olfr1264、Olfr727、Olfr923、Olfr1090、Olfr328、Olfr1124、Olfr522、Olfr1082、Olfr1206、Olfr1167、Olfr706、Olfr6、Pou3f4、Olfr603、Olfr127、Olfr1263、Olfr1269、Olfr1205、Olfr390、Olfr601、Olfr860、Olfr215、Olfr741、Olfr1469、Olfr355、Olfr481、Olfr456、Olfr1042、Olfr728、Olfr372、Olfr801、Olfr1223、Olfr822、Otogl、Olfr943、Olfr1406、Olfr273、Olfr466、Olfr1043、Olfr427、Olfr890、Rbp4或其任何组合。
实施方案136.重编程的方法，其包括改变与衰老相关的一种或多种基因的表达。
实施方案137.实施方案136的方法，其包括增加OCT4、KLF4、SOX2或其任何组合的表达。
实施方案138.实施方案136-137中任一项的方法，其中方法使细胞、组织、器官、受试者或其任何组合的表观遗传时钟恢复活力。
实施方案139.实施方案136-138中任一项的方法，其中方法包括减少与衰老相关的一种或多种基因的表达。
实施方案140.实施方案139的方法，其中方法减少以下项的表达：0610040J01Rik、1700080N15Rik、2900064F13Rik、4833417C18Rik、4921522P10Rik、4930447C04Rik、4930488N15Rik、Ace、Ackr1、Acot10、Acvr1、Adamts17、Adra1b、AI504432、Best3、Boc、Cadm3、Cand2、Ccl9、Cd14、Cd36、Cfh、Chrm3、Chrna4、Cntn4、Cracr2b、Cryaa、CT573017.2、Cyp26a1、Cyp27a1、D330050G23Rik、D930007P13Rik、Ddo、Dgkg、Dlk2、Dnaja1-ps、Drd2、Dsel、Dytn、Ecscr、Edn1、Ednrb、Efemp1、Elfn2、Epha10、Ephx1、Erbb4、Fam20a、Fbxw21、Ffar4、Flt4、Fmod、Foxp4、Fzd7、Gabrd、Galnt15、Galnt18、Gfra2、Ggt1、Gm10416、Gm14964、Gm17634、Gm2065、Gm32352、Gm33172、Gm34280、Gm35853、Gm36298、Gm36356、Gm36937、Gm3898、Gm42303、Gm42484、Gm42537、Gm42743、Gm43151、Gm43843、Gm44545、Gm44722、Gm45516、Gm45532、Gm47494、Gm47982、Gm47989、Gm48398、Gm48495、Gm48593、Gm48958、Gm49089、Gm49326、Gm49331、Gm49760、Gm5796、Gm6374、Gm7276、Gm8237、Gm9796、Gm9954、Gpr75、Gprc5c、Grid2ip、Gsg1l2、Hapln4、Hcn3、Hcn4、Hhatl、Hs6st2、Htr3a、Il1rap、Il1rapl2、Inka1、Kbtbd12、Kcnj11、Kcnk4、Kdelc2、Klhl33、Lamc3、Lilra5、Lman1l、Lrfn2、Lrrc38、Lrrn4cl、Ltc4s、Mansc1、Mir344c、Msr1、Mycbpap、Myoc、Ngfr、Nipal2、Olfr1372-ps1、Otop3、P2rx5、P2ry12、P4ha2、Pcdha12、Pcdha2、Pcdhac2、Pcdhb18、Pcdhb5、Pcsk2os1、Pcsk6、Perp、Pkp1、Plxna4、Prickle2、Qsox1、Rapgef4os2、Rbp4、Rcn3、Sec14l5、Sel1l3、Serpinh1、Sgpp2、Shisa6、Siah3、Siglech、Slc12a4、Slc24a2、Slc2a5、Slc4a4、Slitrk3、Smagp、Smoc2、Speer4b、Spon2、Sstr2、Sstr3、St3gal3、Stc1、Stc2、Syndig1、Syt10、Thsd7a、Tlr8、Tmem132a、Tmem132d、Tmem200a、Tmem44、Trpc4、Trpv4、Unc5b、Vgf、Vmn1r90、Vwc2l、Wfikkn2、Wnt11、Wnt6、Zeb2os、Zfp608、Zfp976或其任何组合。
实施方案141.实施方案136-140中任一项的方法，其中一种或多种基因是一种或多种感觉基因。
实施方案142.实施方案136-140中任一项的方法，其中基因是Ace、Kcnk4、Lamc3、Edn1、Syt10、Ngfr、Gprc5c、Cd36、Chrna4、Ednrb、Drd2或其组合。
实施方案143.实施方案136-142中任一项的方法，其中方法包括增加与衰老相关的一种或多种基因的表达。
实施方案144.实施方案143的方法，其中方法包括增加以下项的表达：1700031P21Rik、1810053B23Rik、2900045O20Rik、2900060B14Rik、4921504E06Rik、4930402F11Rik、4930453C13Rik、4930455B14Rik、4930500H12Rik、4930549P19Rik、4930555B11Rik、4930556J02Rik、4932442E05Rik、4933431K23Rik、4933438K21Rik、6720475M21Rik、9830132P13Rik、A430010J10Rik、A530064D06Rik、A530065N20Rik、Abcb5、Abhd17c、AC116759.2、AC131705.1、AC166779.3、Acot12、Adig、Akr1cl、Ankrd1、Asb15、Atp2c2、AU018091、AW822073、Btnl10、C130093G08Rik、C730027H18Rik、Ccdc162、Chil6、Col26a1、Corin、Crls1、Cybrd1、Cyp2d12、Cyp7a1、D830005E20Rik、Dlx3、Dnah14、Dsc3、Dthd1、Eid2、Eps8l1、EU599041、Fam90a1a、Fancf、Fau-ps2、Fezf1、Gja5、Gm10248、Gm10513、Gm10635、Gm10638、Gm10718、Gm10722、Gm10800、Gm10801、Gm11228、Gm11251、Gm11264、Gm11337、Gm11368、Gm11485、Gm11693、Gm12793、Gm13050、Gm13066、Gm13323、Gm13339、Gm13346、Gm13857、Gm14387、Gm14770、Gm15638、Gm16072、Gm16161、Gm16181、Gm17200、Gm17791、Gm18025、Gm18757、Gm18795、Gm18848、Gm19719、Gm20121、Gm20356、Gm2093、Gm21738、Gm21940、Gm22933、Gm24000、Gm24119、Gm25394、Gm26555、Gm27047、Gm28262、Gm28530、Gm29295、Gm29825、Gm29844、Gm3081、Gm32051、Gm32122、Gm33056、Gm33680、Gm34354、Gm34643、Gm3551、Gm36660、Gm36948、Gm37052、Gm37142、Gm37262、Gm37535、Gm37569、Gm37589、Gm37647、Gm37648、Gm37762、Gm38058、Gm38069、Gm38137、Gm38218、Gm39139、Gm42535、Gm42680、Gm42895、Gm42994、Gm43027、Gm43158、Gm43288、Gm43366、Gm44044、Gm44081、Gm44187、Gm44280、Gm44535、Gm45338、Gm45644、Gm45740、Gm46555、Gm46565、Gm4742、Gm47485、Gm47853、Gm47992、Gm48225、Gm48314、Gm48383、Gm48673、Gm48804、Gm48832、Gm4994、Gm5487、Gm5724、Gm595、Gm6012、Gm6024、Gm7669、Gm7730、Gm8043、Gm8953、Gm9348、Gm9369、Gm9495、H2al2a、Ido2、Igfbp1、Kif7、Klhl31、Lrrc31、Mc5r、Mgam、Msh4、Mucl2、Mug1、Mybl2、Myh15、Nek10、Neurod6、Nr1h5、Olfr1042、Olfr1043、Olfr1082、Olfr1090、Olfr1124、Olfr1167、Olfr1205、Olfr1206、Olfr1223、Olfr1263、Olfr1264、Olfr1269、Olfr127、Olfr1291-ps1、Olfr1406、Olfr1469、Olfr215、Olfr273、Olfr328、Olfr355、Olfr372、Olfr390、Olfr427、Olfr456、Olfr466、Olfr481、Olfr522、Olfr6、Olfr601、Olfr603、Olfr706、Olfr727、Olfr728、Olfr741、Olfr801、Olfr812、Olfr816、Olfr822、Olfr860、Olfr890、Olfr923、Olfr943、Otogl、Pi15、Pkhd1、Pkhd1l1、Platr6、Pou3f4、Prr9、Pvalb、Rhag、Sav1、Serpinb9b、Skint1、Skint3、Skint5、Slc10a5、Slc6a4、Smok2a、Tcaf3、Tomm20l、Trcg1、Trdn、Ugt1a6a、Usp17la、Vmn1r178、Vmn1r179、Vmn1r33、Vmn1r74、Vmn1r87、Vmn2r102、Vmn2r113、Vmn2r17、Vmn2r52、Vmn2r66、Vmn2r68、Vmn2r76、Vmn2r78、Wnt16或其任何组合。
实施方案145.实施方案144的方法，其中方法包括增加以下项的表达：Olfr816、Olfr812、Olfr1264、Olfr727、Olfr923、Olfr1090、Olfr328、Olfr1124、Olfr522、Olfr1082、Olfr1206、Olfr1167、Olfr706、Olfr6、Pou3f4、Olfr603、Olfr127、Olfr1263、Olfr1269、Olfr1205、Olfr390、Olfr601、Olfr860、Olfr215、Olfr741、Olfr1469、Olfr355、Olfr481、Olfr456、Olfr1042、Olfr728、Olfr372、Olfr801、Olfr1223、Olfr822、Otogl、Olfr943、Olfr1406、Olfr273、Olfr466、Olfr1043、Olfr427、Olfr890、Rbp4或其任何组合。
实施方案146.方法，其包括在体外重置老细胞的转录概况。
实施方案147.方法，其包括在体内重置老细胞的转录概况。
实施方案148.方法，其包括在没有诱导c-MYC表达的情况下，在受试者中诱导：
(i)OCT4表达；
(ii)SOX2表达；和/或
(iii)KLF4表达；
其中受试者患有，处于风险或怀疑患有与不具有状况的对照受试者的对照细胞、对照组织和/或对照器官相比，增加受试者内细胞、组织和/或器官的基于DNA甲基化的年龄的状况。
实施方案149.实施方案148的方法，其中方法减少细胞、组织、器官和/或受试者的基于DNA甲基化的年龄。
实施方案150.转分化的方法，其包括在一种类型的细胞中诱导：
(i)OCT4表达；
(ii)SOX2表达；
(iii)KLF4表达；和
(iv)谱系决定因子的表达，
其中从单个载体表达(i)-(iii)，从而将细胞转分化为另一种细胞类型。
实施方案151.转分化的方法，其包括在细胞中诱导：
(i)OCT4表达；
(ii)SOX2表达；和
(iii)KLF4表达；和
从而减少谱系决定因子的表达，其中从单个载体表达(i)-(iii)。
等同方案和范围
在权利要求中，除非相反地指出或以其他方式从上下文中明显看出，否则诸如“一”，“一个”和“该”的冠词可以表示一个或超过一个。除非相反地指出或以其他方式从上下文中明显看出，如果一个、超过一个或所有组成员存在于给定的产品或过程，被给定的产品或过程采用，或以其他方式与给定的产品或过程相关，则认为在一个或多个组成员之间包括“或”的权利要求或描述是满意的。本公开包括其中恰好一个组成员存在于给定的产品或过程，被给定的产品或过程采用，或以其他方式与给定的产品或过程相关的实施方案。本公开包括其中超过一个或所有组成员存在于给定的产品或过程，被给定的产品或过程采用，或以其他方式与给定的产品或过程相关的实施方案。
此外，本公开涵盖所有变型、组合和置换，其中将来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、要素、从句和描述性术语引入另一权利要求中。例如，可以将依赖于另一权利要求的任何权利要求修改为包括在依赖于同一基本权利要求的任何其他权利要求中找到的一个或多个限制。在要素以列表表示，例如以马库什(Markush)组格式的情况下，还公开了要素的每个亚组，并且可以从该组中去除任何一个或多个要素。应当理解，通常，在将本文中所描述的公开内容或方面称为包含特定要素和/或特征的情况下，本文中所描述的某些实施方案或本文中所描述的方面由此类要素和/或特征组成，或者基本上由此类要素和/或特征组成。为了简单起见，这些实施方案没有在本文中用这些话具体阐述。还应注意，术语“包含”和“含有”旨在是开放性的，并允许包括另外的要素或步骤。在给出范围的情况下，端点包括在内。此外，除非另外说明或以其他方式从上下文和本领域普通技术人员的理解中显而易见，否则在本文所述的不同实施方案中，表示为范围的值可以采用指定范围内的任何特定值或子范围，除非上下文另有明确规定，否则直至该范围的下限的十分之一。
本申请涉及各种已发布的专利，公开的专利申请，期刊文章和其他出版物，所有这些均通过引用并入本文。如果任何引用的参考文件与本说明书之间存在冲突，则以本说明书为准。另外，落入现有技术范围内的本公开的任何特定实施方案可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。因为此类实施方案被认为是本领域普通技术人员已知的，所以即使在本文中未明确提出排除，也可以将它们排除。出于任何原因，无论是否与现有技术的存在有关，本文描述的任何特定实施方案都可以从任何权利要求中排除。
本领域技术人员将仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文具体实施方案的许多等同方案。本文描述的本发明实施方案的范围不旨在限于以上说明书，而是如所附权利要求书中所阐述。本领域普通技术人员将理解，可以在不脱离如所附权利要求书所限定的本公开的精神或范围的情况下，对本说明书进行各种改变和修改。
序列表
<110> 哈佛大学的校长及成员们
<120> 细胞重编程以逆转衰老并促进组织和组织再生
<130> H0824.70296WO00
<140> Not Yet Assigned
<141> 2019-09-27
<150> US 62/880,488
<151> 2019-07-30
<150> US 62/865,877
<151> 2019-06-24
<150> US 62/792,283
<151> 2019-01-14
<150> US 62/738,922
<151> 2018-09-28
<160> 122
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1056
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 1
atggctggac acctggcttc agacttcgcc ttctcacccc caccaggtgg gggtgatggg 60
tcagcagggc tggagccggg ctgggtggat cctcgaacct ggctaagctt ccaagggcct 120
ccaggtgggc ctggaatcgg accaggctca gaggtattgg ggatctcccc atgtccgccc 180
gcatacgagt tctgcggagg gatggcatac tgtggacctc aggttggact gggcctagtc 240
ccccaagttg gcgtggagac tttgcagcct gagggccagg caggagcacg agtggaaagc 300
aactcagagg gaacctcctc tgagccctgt gccgaccgcc ccaatgccgt gaagttggag 360
aaggtggaac caactcccga ggagtcccag gacatgaaag ccctgcagaa ggagctagaa 420
cagtttgcca agctgctgaa gcagaagagg atcaccttgg ggtacaccca ggccgacgtg 480
gggctcaccc tgggcgttct ctttggaaag gtgttcagcc agaccaccat ctgtcgcttc 540
gaggccttgc agctcagcct taagaacatg tgtaagctgc ggcccctgct ggagaagtgg 600
gtggaggaag ccgacaacaa tgagaacctt caggagatat gcaaatcgga gaccctggtg 660
caggcccgga agagaaagcg aactagcatt gagaaccgtg tgaggtggag tctggagacc 720
atgtttctga agtgcccgaa gccctcccta cagcagatca ctcacatcgc caatcagctt 780
gggctagaga aggatgtggt tcgagtatgg ttctgtaacc ggcgccagaa gggcaaaaga 840
tcaagtattg agtattccca acgagaagag tatgaggcta cagggacacc tttcccaggg 900
ggggctgtat cctttcctct gcccccaggt ccccactttg gcaccccagg ctatggaagc 960
ccccacttca ccacactcta ctcagtccct tttcctgagg gcgaggcctt tccctctgtt 1020
cccgtcactg ctctgggctc tcccatgcat tcaaac 1056
<210> 2
<211> 352
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 2
Met Ala Gly His Leu Ala Ser Asp Phe Ala Phe Ser Pro Pro Pro Gly
1 5 10 15
Gly Gly Asp Gly Ser Ala Gly Leu Glu Pro Gly Trp Val Asp Pro Arg
20 25 30
Thr Trp Leu Ser Phe Gln Gly Pro Pro Gly Gly Pro Gly Ile Gly Pro
35 40 45
Gly Ser Glu Val Leu Gly Ile Ser Pro Cys Pro Pro Ala Tyr Glu Phe
50 55 60
Cys Gly Gly Met Ala Tyr Cys Gly Pro Gln Val Gly Leu Gly Leu Val
65 70 75 80
Pro Gln Val Gly Val Glu Thr Leu Gln Pro Glu Gly Gln Ala Gly Ala
85 90 95
Arg Val Glu Ser Asn Ser Glu Gly Thr Ser Ser Glu Pro Cys Ala Asp
100 105 110
Arg Pro Asn Ala Val Lys Leu Glu Lys Val Glu Pro Thr Pro Glu Glu
115 120 125
Ser Gln Asp Met Lys Ala Leu Gln Lys Glu Leu Glu Gln Phe Ala Lys
130 135 140
Leu Leu Lys Gln Lys Arg Ile Thr Leu Gly Tyr Thr Gln Ala Asp Val
145 150 155 160
Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Phe Gly Lys Val Phe Ser Gln Thr Thr
165 170 175
Ile Cys Arg Phe Glu Ala Leu Gln Leu Ser Leu Lys Asn Met Cys Lys
180 185 190
Leu Arg Pro Leu Leu Glu Lys Trp Val Glu Glu Ala Asp Asn Asn Glu
195 200 205
Asn Leu Gln Glu Ile Cys Lys Ser Glu Thr Leu Val Gln Ala Arg Lys
210 215 220
Arg Lys Arg Thr Ser Ile Glu Asn Arg Val Arg Trp Ser Leu Glu Thr
225 230 235 240
Met Phe Leu Lys Cys Pro Lys Pro Ser Leu Gln Gln Ile Thr His Ile
245 250 255
Ala Asn Gln Leu Gly Leu Glu Lys Asp Val Val Arg Val Trp Phe Cys
260 265 270
Asn Arg Arg Gln Lys Gly Lys Arg Ser Ser Ile Glu Tyr Ser Gln Arg
275 280 285
Glu Glu Tyr Glu Ala Thr Gly Thr Pro Phe Pro Gly Gly Ala Val Ser
290 295 300
Phe Pro Leu Pro Pro Gly Pro His Phe Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Ser
305 310 315 320
Pro His Phe Thr Thr Leu Tyr Ser Val Pro Phe Pro Glu Gly Glu Ala
325 330 335
Phe Pro Ser Val Pro Val Thr Ala Leu Gly Ser Pro Met His Ser Asn
340 345 350
<210> 3
<211> 957
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 3
atgtataaca tgatggagac ggagctgaag ccgccgggcc cgcagcaagc ttcggggggc 60
ggcggcggag gaggcaacgc cacggcggcg gcgaccggcg gcaaccagaa gaacagcccg 120
gaccgcgtca agaggcccat gaacgccttc atggtatggt cccgggggca gcggcgtaag 180
atggcccagg agaaccccaa gatgcacaac tcggagatca gcaagcgcct gggcgcggag 240
tggaaacttt tgtccgagac cgagaagcgg ccgttcatcg acgaggccaa gcggctgcgc 300
gctctgcaca tgaaggagca cccggattat aaataccggc cgcggcggaa aaccaagacg 360
ctcatgaaga aggataagta cacgcttccc ggaggcttgc tggcccccgg cgggaacagc 420
atggcgagcg gggttggggt gggcgccggc ctgggtgcgg gcgtgaacca gcgcatggac 480
agctacgcgc acatgaacgg ctggagcaac ggcagctaca gcatgatgca ggagcagctg 540
ggctacccgc agcacccggg cctcaacgct cacggcgcgg cacagatgca accgatgcac 600
cgctacgacg tcagcgccct gcagtacaac tccatgacca gctcgcagac ctacatgaac 660
ggctcgccca cctacagcat gtcctactcg cagcagggca cccccggtat ggcgctgggc 720
tccatgggct ctgtggtcaa gtccgaggcc agctccagcc cccccgtggt tacctcttcc 780
tcccactcca gggcgccctg ccaggccggg gacctccggg acatgatcag catgtacctc 840
cccggcgccg aggtgccgga gcccgctgcg cccagtagac tgcacatggc ccagcactac 900
cagagcggcc cggtgcccgg cacggccatt aacggcacac tgcccctgtc gcacatg 957
<210> 4
<211> 319
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 4
Met Tyr Asn Met Met Glu Thr Glu Leu Lys Pro Pro Gly Pro Gln Gln
1 5 10 15
Ala Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asn Ala Thr Ala Ala Ala Thr
20 25 30
Gly Gly Asn Gln Lys Asn Ser Pro Asp Arg Val Lys Arg Pro Met Asn
35 40 45
Ala Phe Met Val Trp Ser Arg Gly Gln Arg Arg Lys Met Ala Gln Glu
50 55 60
Asn Pro Lys Met His Asn Ser Glu Ile Ser Lys Arg Leu Gly Ala Glu
65 70 75 80
Trp Lys Leu Leu Ser Glu Thr Glu Lys Arg Pro Phe Ile Asp Glu Ala
85 90 95
Lys Arg Leu Arg Ala Leu His Met Lys Glu His Pro Asp Tyr Lys Tyr
100 105 110
Arg Pro Arg Arg Lys Thr Lys Thr Leu Met Lys Lys Asp Lys Tyr Thr
115 120 125
Leu Pro Gly Gly Leu Leu Ala Pro Gly Gly Asn Ser Met Ala Ser Gly
130 135 140
Val Gly Val Gly Ala Gly Leu Gly Ala Gly Val Asn Gln Arg Met Asp
145 150 155 160
Ser Tyr Ala His Met Asn Gly Trp Ser Asn Gly Ser Tyr Ser Met Met
165 170 175
Gln Glu Gln Leu Gly Tyr Pro Gln His Pro Gly Leu Asn Ala His Gly
180 185 190
Ala Ala Gln Met Gln Pro Met His Arg Tyr Asp Val Ser Ala Leu Gln
195 200 205
Tyr Asn Ser Met Thr Ser Ser Gln Thr Tyr Met Asn Gly Ser Pro Thr
210 215 220
Tyr Ser Met Ser Tyr Ser Gln Gln Gly Thr Pro Gly Met Ala Leu Gly
225 230 235 240
Ser Met Gly Ser Val Val Lys Ser Glu Ala Ser Ser Ser Pro Pro Val
245 250 255
Val Thr Ser Ser Ser His Ser Arg Ala Pro Cys Gln Ala Gly Asp Leu
260 265 270
Arg Asp Met Ile Ser Met Tyr Leu Pro Gly Ala Glu Val Pro Glu Pro
275 280 285
Ala Ala Pro Ser Arg Leu His Met Ala Gln His Tyr Gln Ser Gly Pro
290 295 300
Val Pro Gly Thr Ala Ile Asn Gly Thr Leu Pro Leu Ser His Met
305 310 315
<210> 5
<211> 1446
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 5
atgaggcagc cacctggcga gtctgacatg gctgtcagcg acgctctgct cccgtccttc 60
tccacgttcg cgtccggccc ggcgggaagg gagaagacac tgcgtccagc aggtgccccg 120
actaaccgtt ggcgtgagga actctctcac atgaagcgac ttcccccact tcccggccgc 180
ccctacgacc tggcggcgac ggtggccaca gacctggaga gtggcggagc tggtgcagct 240
tgcagcagta acaacccggc cctcctagcc cggagggaga ccgaggagtt caacgacctc 300
ctggacctag actttatcct ttccaactcg ctaacccacc aggaatcggt ggccgccacc 360
gtgaccacct cggcgtcagc ttcatcctcg tcttccccag cgagcagcgg ccctgccagc 420
gcgccctcca cctgcagctt cagctatccg atccgggccg ggggtgaccc gggcgtggct 480
gccagcaaca caggtggagg gctcctctac agccgagaat ctgcgccacc tcccacggcc 540
cccttcaacc tggcggacat caatgacgtg agcccctcgg gcggcttcgt ggctgagctc 600
ctgcggccgg agttggaccc agtatacatt ccgccacagc agcctcagcc gccaggtggc 660
gggctgatgg gcaagtttgt gctgaaggcg tctctgacca cccctggcag cgagtacagc 720
agcccttcgg tcatcagtgt tagcaaagga agcccagacg gcagccaccc cgtggtagtg 780
gcgccctaca gcggtggccc gccgcgcatg tgccccaaga ttaagcaaga ggcggtcccg 840
tcctgcacgg tcagccggtc cctagaggcc catttgagcg ctggacccca gctcagcaac 900
ggccaccggc ccaacacaca cgacttcccc ctggggcggc agctccccac caggactacc 960
cctacactga gtcccgagga actgctgaac agcagggact gtcaccctgg cctgcctctt 1020
cccccaggat tccatcccca tccggggccc aactaccctc ctttcctgcc agaccagatg 1080
cagtcacaag tcccctctct ccattatcaa gagctcatgc caccgggttc ctgcctgcca 1140
gaggagccca agccaaagag gggaagaagg tcgtggcccc ggaaaagaac agccacccac 1200
acttgtgact atgcaggctg tggcaaaacc tataccaaga gttctcatct caaggcacac 1260
ctgcgaactc acacaggcga gaaaccttac cactgtgact gggacggctg tgggtggaaa 1320
ttcgcccgct ccgatgaact gaccaggcac taccgcaaac acacagggca ccggcccttt 1380
cagtgccaga agtgcgacag ggccttttcc aggtcggacc accttgcctt acacatgaag 1440
aggcac 1446
<210> 6
<211> 482
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 6
Met Arg Gln Pro Pro Gly Glu Ser Asp Met Ala Val Ser Asp Ala Leu
1 5 10 15
Leu Pro Ser Phe Ser Thr Phe Ala Ser Gly Pro Ala Gly Arg Glu Lys
20 25 30
Thr Leu Arg Pro Ala Gly Ala Pro Thr Asn Arg Trp Arg Glu Glu Leu
35 40 45
Ser His Met Lys Arg Leu Pro Pro Leu Pro Gly Arg Pro Tyr Asp Leu
50 55 60
Ala Ala Thr Val Ala Thr Asp Leu Glu Ser Gly Gly Ala Gly Ala Ala
65 70 75 80
Cys Ser Ser Asn Asn Pro Ala Leu Leu Ala Arg Arg Glu Thr Glu Glu
85 90 95
Phe Asn Asp Leu Leu Asp Leu Asp Phe Ile Leu Ser Asn Ser Leu Thr
100 105 110
His Gln Glu Ser Val Ala Ala Thr Val Thr Thr Ser Ala Ser Ala Ser
115 120 125
Ser Ser Ser Ser Pro Ala Ser Ser Gly Pro Ala Ser Ala Pro Ser Thr
130 135 140
Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Ile Arg Ala Gly Gly Asp Pro Gly Val Ala
145 150 155 160
Ala Ser Asn Thr Gly Gly Gly Leu Leu Tyr Ser Arg Glu Ser Ala Pro
165 170 175
Pro Pro Thr Ala Pro Phe Asn Leu Ala Asp Ile Asn Asp Val Ser Pro
180 185 190
Ser Gly Gly Phe Val Ala Glu Leu Leu Arg Pro Glu Leu Asp Pro Val
195 200 205
Tyr Ile Pro Pro Gln Gln Pro Gln Pro Pro Gly Gly Gly Leu Met Gly
210 215 220
Lys Phe Val Leu Lys Ala Ser Leu Thr Thr Pro Gly Ser Glu Tyr Ser
225 230 235 240
Ser Pro Ser Val Ile Ser Val Ser Lys Gly Ser Pro Asp Gly Ser His
245 250 255
Pro Val Val Val Ala Pro Tyr Ser Gly Gly Pro Pro Arg Met Cys Pro
260 265 270
Lys Ile Lys Gln Glu Ala Val Pro Ser Cys Thr Val Ser Arg Ser Leu
275 280 285
Glu Ala His Leu Ser Ala Gly Pro Gln Leu Ser Asn Gly His Arg Pro
290 295 300
Asn Thr His Asp Phe Pro Leu Gly Arg Gln Leu Pro Thr Arg Thr Thr
305 310 315 320
Pro Thr Leu Ser Pro Glu Glu Leu Leu Asn Ser Arg Asp Cys His Pro
325 330 335
Gly Leu Pro Leu Pro Pro Gly Phe His Pro His Pro Gly Pro Asn Tyr
340 345 350
Pro Pro Phe Leu Pro Asp Gln Met Gln Ser Gln Val Pro Ser Leu His
355 360 365
Tyr Gln Glu Leu Met Pro Pro Gly Ser Cys Leu Pro Glu Glu Pro Lys
370 375 380
Pro Lys Arg Gly Arg Arg Ser Trp Pro Arg Lys Arg Thr Ala Thr His
385 390 395 400
Thr Cys Asp Tyr Ala Gly Cys Gly Lys Thr Tyr Thr Lys Ser Ser His
405 410 415
Leu Lys Ala His Leu Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr His Cys
420 425 430
Asp Trp Asp Gly Cys Gly Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Thr
435 440 445
Arg His Tyr Arg Lys His Thr Gly His Arg Pro Phe Gln Cys Gln Lys
450 455 460
Cys Asp Arg Ala Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Ala Leu His Met Lys
465 470 475 480
Arg His
<210> 7
<211> 376
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 7
tttactccct atcagtgata gagaacgtat gaagagttta ctccctatca gtgatagaga 60
acgtatgcag actttactcc ctatcagtga tagagaacgt ataaggagtt tactccctat 120
cagtgataga gaacgtatga ccagtttact ccctatcagt gatagagaac gtatctacag 180
tttactccct atcagtgata gagaacgtat atccagttta ctccctatca gtgatagaga 240
acgtataagc tttaggcgtg tacggtgggc gcctataaaa gcagagctcg tttagtgaac 300
cgtcagatcg cctggagcaa ttccacaaca cttttgtctt ataccaactt tccgtaccac 360
ttcctaccct cgtaaa 376
<210> 8
<211> 169
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 8
tgcgcgcagc ggccgaccat ggcccaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata 60
aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg 120
tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctggatc tcggtaccg 169
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 9
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 10
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 10
atgtctaggc tggacaagag caaagtcata aacggagctc tggaattact caatggtgtc 60
ggtatcgaag gcctgacgac aaggaaactc gctcaaaagc tgggagttga gcagcctacc 120
ctgtactggc acgtgaagaa caagcgggcc ctgctcgatg ccctgccaat cgagatgctg 180
gacaggcatc atacccactt ctgccccctg gaaggcgagt catggcaaga ctttctgcgg 240
aacaacgcca agtcataccg ctgtgctctc ctctcacatc gcgacggggc taaagtgcat 300
ctcggcaccc gcccaacaga gaaacagtac gaaaccctgg aaaatcagct cgcgttcctg 360
tgtcagcaag gcttctccct ggagaacgca ctgtacgctc tgtccgccgt gggccacttt 420
acactgggct gcgtattgga ggaacaggag catcaagtag caaaagagga aagagagaca 480
cctaccaccg attctatgcc cccacttctg agacaagcaa ttgagctgtt cgaccggcag 540
ggagccgaac ctgccttcct tttcggcctg gaactaatca tatgtggcct ggagaaacag 600
ctaaagtgcg aaagcggcgg gccgaccgac gcccttgacg attttgactt agacatgctc 660
ccagccgatg cccttgacga ttttgacctt gacatgctcc ccgggtaa 708
<210> 11
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 11
Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Gly Ala Leu Glu Leu
1 5 10 15
Leu Asn Gly Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln
20 25 30
Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys
35 40 45
Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Pro Ile Glu Met Leu Asp Arg His His
50 55 60
Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg
65 70 75 80
Asn Asn Ala Lys Ser Tyr Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly
85 90 95
Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr
100 105 110
Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu
115 120 125
Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Val Leu Glu Glu Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr
145 150 155 160
Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu
165 170 175
Phe Asp Arg Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu
180 185 190
Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Gly Pro
195 200 205
Thr Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala
210 215 220
Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Gly
225 230 235
<210> 12
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 12
atgtcccgct tggataagag caaggtaata aatagcgcac tcgaactcct caacggcgtg 60
ggcatcgaag gtctgactac tcgaaagctc gcccagaaat tgggtgtgga gcaacctaca 120
ttgtattggc atgtcaagaa caaaagagcc ctgctggacg ctcttcctat tgaaatgctt 180
gacaggcatc acactcattc ctgccccctt gaggtcgaga gttggcaaga ttttctccga 240
aacaatgcaa agtcctaccg ctgcgcactt ttgtcccata gggatggagc aaaagtgcac 300
ctgggaacca ggccaacaga gaaacaatac gagactctcg agaaccagtt ggctttcttg 360
tgccaacagg ggttctcact tgaaaatgcc ctttacgcac tgtcagccgt tggacatttt 420
accctggggt gcgttcttga ggagcaagaa catcaggttg ctaaggagga gcgcgagact 480
ccaaccactg attctatgcc acctttgctg aaacaggcca ttgaactttt cgatagacag 540
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ctgaaatgtg aaagtggtgg ccctactgac gccctcgatg atttcgacct ggatatgctg 660
ccagccgatg cacttgatga tttcgatttg gatatgcttc cagccgacgc actggacgac 720
ttcgatttgg acatgcttcc cggttaa 747
<210> 13
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 13
Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu
1 5 10 15
Leu Asn Gly Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln
20 25 30
Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys
35 40 45
Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Pro Ile Glu Met Leu Asp Arg His His
50 55 60
Thr His Ser Cys Pro Leu Glu Val Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg
65 70 75 80
Asn Asn Ala Lys Ser Tyr Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly
85 90 95
Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr
100 105 110
Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu
115 120 125
Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Val Leu Glu Glu Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr
145 150 155 160
Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Lys Gln Ala Ile Glu Leu
165 170 175
Phe Asp Arg Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu
180 185 190
Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Gly Pro
195 200 205
Thr Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala
210 215 220
Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp
225 230 235 240
Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Gly
245
<210> 14
<211> 1050
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 14
atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa 60
tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg 120
tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc 180
ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc 240
cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg 300
gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg 360
acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg 420
ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc 480
ctttgggccg cctccccgca tcgataccgt cgacctcgag acctagaaaa acatggagca 540
atcacaagta gcaatacagc agctaccaat gctgattgtg cctggctaga agcacaagag 600
gaggaggagg tgggttttcc agtcacacct caggtacctt taagaccaat gacttacaag 660
gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg gctaattcac 720
tcccaacgaa gacaagatat ccttgatctg tggatctacc acacacaagg ctacttccct 780
gattggcaga actacacacc agggccaggg atcagatatc cactgacctt tggatggtgc 840
tacaagctag taccagttga gcaagagaag gtagaagaag ccaatgaagg agagaacacc 900
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tggaggtttg acagccgcct agcatttcat cacatggccc gagagctgca tccggactgt 1020
actgggtctc tctggttaga ccagatctga 1050
<210> 15
<211> 349
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 15
Met Pro Leu Tyr His Ala Ile Ala Ser Arg Met Ala Phe Ile Phe Ser
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Lys Ser Trp Leu Leu Ser Leu Tyr Glu Glu Leu Trp Pro
20 25 30
Val Val Arg Gln Arg Gly Val Val Cys Thr Val Phe Ala Asp Ala Thr
35 40 45
Pro Thr Gly Trp Gly Ile Ala Thr Thr Cys Gln Leu Leu Ser Gly Thr
50 55 60
Phe Ala Phe Pro Leu Pro Ile Ala Thr Ala Glu Leu Ile Ala Ala Cys
65 70 75 80
Leu Ala Arg Cys Trp Thr Gly Ala Arg Leu Leu Gly Thr Asp Asn Ser
85 90 95
Val Val Leu Ser Gly Lys Ser Ser Ser Phe Pro Trp Leu Leu Ala Cys
100 105 110
Val Ala Thr Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Cys Tyr Val Pro Ser
115 120 125
Ala Leu Asn Pro Ala Asp Leu Pro Ser Arg Gly Leu Leu Pro Ala Leu
130 135 140
Arg Pro Leu Pro Arg Leu Arg Leu Arg Pro Gln Thr Ser Arg Ile Ser
145 150 155 160
Leu Trp Ala Ala Ser Pro His Arg Tyr Arg Arg Pro Arg Asp Leu Glu
165 170 175
Lys His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr Ala Ala Thr Asn Ala Asp
180 185 190
Cys Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val
195 200 205
Thr Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Ala Ala Val Asp
210 215 220
Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile His
225 230 235 240
Ser Gln Arg Arg Gln Asp Ile Leu Asp Leu Trp Ile Tyr His Thr Gln
245 250 255
Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Ile Arg
260 265 270
Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Tyr Lys Leu Val Pro Val Glu Gln
275 280 285
Glu Lys Val Glu Glu Ala Asn Glu Gly Glu Asn Thr Arg Leu Leu His
290 295 300
Pro Val Ser Leu His Gly Met Asp Asp Pro Glu Arg Glu Val Leu Glu
305 310 315 320
Trp Arg Phe Asp Ser Arg Leu Ala Phe His His Met Ala Arg Glu Leu
325 330 335
His Pro Asp Cys Thr Gly Ser Leu Trp Leu Asp Gln Ile
340 345
<210> 16
<211> 7408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 16
ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg 60
atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc 120
cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg 180
atgcctgtag taatggtaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta 240
gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg 300
cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg 360
tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc 420
tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt 480
gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt 540
gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 600
atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 660
atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 720
aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 780
aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 840
ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 900
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<400> 21
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttag ttcttgccac ggcggaactc 180
atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc 240
gtggtgtt 248
<210> 22
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 22
ccttaattag gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc t 141
<210> 23
<211> 438
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 23
aattcgtaca cgcctacctc gacccatcaa gtgccacctg acgtctccct atcagtgata 60
gagaagtcga cacgtctcga gctccctatc agtgatagag aaggtacgtc tagaacgtct 120
ccctatcagt gatagagaag tcgacacgtc tcgagctccc tatcagtgat agagaaggta 180
cgtctagaac gtctccctat cagtgataga gaagtcgaca cgtctcgagc tccctatcag 240
tgatagagaa ggtacgtcta gaacgtctcc ctatcagtga tagagaagtc gacacgtctc 300
gagctcccta tcagtgatag agaaggtacc ccctatataa gcagagctcg tttagtgaac 360
cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac 420
cgatccagcc tggatcgc 438
<210> 24
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 24
gagtttactc cctatcagtg atagagaacg tatgtcgagt ttactcccta tcagtgatag 60
agaacgatgt cgagtttact ccctatcagt gatagagaac gtatgtcgag tttactccct 120
atcagtgata gagaacgtat gtcgagttta ctccctatca gtgatagaga acgtatgtcg 180
agtttatccc tatcagtgat agagaacgta tgtcgagttt actccctatc agtgatagag 240
aacgtatgtc gaggtaggcg tgtacggtgg gaggcctata taagcagagc tcgtttagtg 300
aaccgtcaga tcgcc 315
<210> 25
<211> 618
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 25
atggctagat tagataaaag taaagtgatt aacagcgcat tagagctgct taatgaggtc 60
ggaatcgaag gtttaacaac ccgtaaactc gcccagaagc taggtgtaga gcagcctaca 120
ttgtattggc atgtaaaaaa taagcgggct ttgctcgacg ccttagccat tgagatgtta 180
gataggcacc atactcactt ttgcccttta gaaggggaaa gctggcaaga ttttttacgt 240
aataacgcta aaagttttag atgtgcttta ctaagtcatc gcgatggagc aaaagtacat 300
ttaggtacac ggcctacaga aaaacagtat gaaactctcg aaaatcaatt agccttttta 360
tgccaacaag gtttttcact agagaatgca ttatatgcac tcagcgctgt ggggcatttt 420
actttaggtt gcgtattgga agatcaagag catcaagtcg ctaaagaaga aagggaaaca 480
cctactactg atagtatgcc gccattatta cgacaagcta tcgaattatt tgatcaccaa 540
ggtgcagagc cagccttctt attcggcctt gaattgatca tatgcggatt agaaaaacaa 600
cttaaatgtg aaagtggg 618
<210> 26
<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 26
Met Ala Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu
1 5 10 15
Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln
20 25 30
Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys
35 40 45
Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His
50 55 60
Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg
65 70 75 80
Asn Asn Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly
85 90 95
Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr
100 105 110
Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu
115 120 125
Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr
145 150 155 160
Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu
165 170 175
Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu
180 185 190
Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly
195 200 205
<210> 27
<211> 1008
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 27
atggctagat tagataaaag taaagtgatt aacagcgcat tagagctgct taatgaggtc 60
ggaatcgaag gtttaacaac ccgtaaactc gcccagaagc taggtgtaga gcagcctaca 120
ttgtattggc atgtaaaaaa taagcgggct ttgctcgacg ccttagccat tgagatgtta 180
gataggcacc atactcactt ttgcccttta gaaggggaaa gctggcaaga ttttttacgt 240
aataacgcta aaagttttag atgtgcttta ctaagtcatc gcgatggagc aaaagtacat 300
ttaggtacac ggcctacaga aaaacagtat gaaactctcg aaaatcaatt agccttttta 360
tgccaacaag gtttttcact agagaatgca ttatatgcac tcagcgctgt ggggcatttt 420
actttaggtt gcgtattgga agatcaagag catcaagtcg ctaaagaaga aagggaaaca 480
cctactactg atagtatgcc gccattatta cgacaagcta tcgaattatt tgatcaccaa 540
ggtgcagagc cagccttctt attcggcctt gaattgatca tatgcggatt agaaaaacaa 600
cttaaatgtg aaagtgggtc gccaaaaaag aagagaaagg tcgacggcgg tggtgctttg 660
tctcctcagc actctgctgt cactcaagga agtatcatca agaacaagga gggcatggat 720
gctaagtcac taactgcctg gtcccggaca ctggtgacct tcaaggatgt atttgtggac 780
ttcaccaggg aggagtggaa gctgctggac actgctcagc agatcgtgta cagaaatgtg 840
atgctggaga actataagaa cctggtttcc ttgggttatc agcttactaa gccagatgtg 900
atcctccggt tggagaaggg agaagagccc tggctggtgg agagagaaat tcaccaagag 960
acccatcctg attcagagac tgcatttgaa atcaaatcat cagtttaa 1008
<210> 28
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 28
Met Ala Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu
1 5 10 15
Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln
20 25 30
Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys
35 40 45
Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His
50 55 60
Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg
65 70 75 80
Asn Asn Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly
85 90 95
Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr
100 105 110
Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu
115 120 125
Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr
145 150 155 160
Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu
165 170 175
Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu
180 185 190
Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser Pro
195 200 205
Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Gly Gly Gly Ala Leu Ser Pro Gln His
210 215 220
Ser Ala Val Thr Gln Gly Ser Ile Ile Lys Asn Lys Glu Gly Met Asp
225 230 235 240
Ala Lys Ser Leu Thr Ala Trp Ser Arg Thr Leu Val Thr Phe Lys Asp
245 250 255
Val Phe Val Asp Phe Thr Arg Glu Glu Trp Lys Leu Leu Asp Thr Ala
260 265 270
Gln Gln Ile Val Tyr Arg Asn Val Met Leu Glu Asn Tyr Lys Asn Leu
275 280 285
Val Ser Leu Gly Tyr Gln Leu Thr Lys Pro Asp Val Ile Leu Arg Leu
290 295 300
Glu Lys Gly Glu Glu Pro Trp Leu Val Glu Arg Glu Ile His Gln Glu
305 310 315 320
Thr His Pro Asp Ser Glu Thr Ala Phe Glu Ile Lys Ser Ser Val
325 330 335
<210> 29
<211> 977
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 29
accttgcttc ctagctgggc ctttccttct cctctataaa taccagctct ggtatttcgc 60
cttggcagct gttgctgcta gggagacggc tggcttgaca tgcatctcct gacaaaacac 120
aaacccgtgg tgtgagtggg tgtgggcggt gtgagtaggg ggatgaatca gagagggggc 180
gagggagaca ggggcgcagg agtcaggcaa aggcgatgcg ggggtgcgac tacacgcagt 240
tggaaacagt cgtcagaaga ttctggaaac tatcttgctg gctataaact tgagggaagc 300
agaaggccaa cattcctccc aagggaaact gaggctcaga gttaaaaccc aggtatcagt 360
gatatgcatg tgccccggcc agggtcactc tctgactaac cggtacctac cctacaggcc 420
tacctagaga ctcttttgaa aggatggtag agacctgtcc gggctttgcc cacagtcgtt 480
ggaaacctca gcattttcta ggcaacttgt gcgaataaaa cacttcgggg gtccttcttg 540
ttcattccaa taacctaaaa cctctcctcg gagaaaatag ggggcctcaa acaaacgaaa 600
ttctctagcc cgctttcccc aggataaggc aggcatccaa atggaaaaaa aggggccggc 660
cgggggtctc ctgtcagctc cttgccctgt gaaacccagc aggcctgcct gtcttctgtc 720
ctcttggggc tgtccagggg cgcaggcctc ttgcggggga gctggcctcc ccgccccctc 780
gcctgtggcc gcccttttcc tggcaggaca gagggatcct gcagctgtca ggggaggggc 840
gccggggggt gatgtcagga gggctacaaa tagtgcagac agctaagggg ctccgtcacc 900
catcttcaca tccactccag ccggctgccc gcccgctgcc tcctctgtgc gtccgcccag 960
ccagcctcgt ccacgcc 977
<210> 30
<211> 5428
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 30
ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg 60
atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc 120
cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg 180
atgcctgtag taatggtaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta 240
gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg 300
cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg 360
tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc 420
tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt 480
gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt 540
gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 600
atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 660
atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 720
aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 780
aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 840
ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 900
ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 960
tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 1020
ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 1080
acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 1140
gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 1200
cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 1260
aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac 1320
atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga 1380
gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg 1440
gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc 1500
tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt 1560
tagctcactc attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt 1620
ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaccatga ttacgccaga 1680
tttaattaag gccttaatta ggctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg cccgggcaaa 1740
gcccgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga 1800
gggagtggcc aactccatca ctaggggttc cttgtagtta atgattaacc cgccatgcta 1860
cttatctacg tagccatgct ctaggaagat cggaattcct agatctacct tgcttcctag 1920
ctgggccttt ccttctcctc tataaatacc agctctggta tttcgccttg gcagctgttg 1980
ctgctaggga gacggctggc ttgacatgca tctcctgaca aaacacaaac ccgtggtgtg 2040
agtgggtgtg ggcggtgtga gtagggggat gaatcagaga gggggcgagg gagacagggg 2100
cgcaggagtc aggcaaaggc gatgcggggg tgcgactaca cgcagttgga aacagtcgtc 2160
agaagattct ggaaactatc ttgctggcta taaacttgag ggaagcagaa ggccaacatt 2220
cctcccaagg gaaactgagg ctcagagtta aaacccaggt atcagtgata tgcatgtgcc 2280
ccggccaggg tcactctctg actaaccggt acctacccta caggcctacc tagagactct 2340
tttgaaagga tggtagagac ctgtccgggc tttgcccaca gtcgttggaa acctcagcat 2400
tttctaggca acttgtgcga ataaaacact tcgggggtcc ttcttgttca ttccaataac 2460
ctaaaacctc tcctcggaga aaataggggg cctcaaacaa acgaaattct ctagcccgct 2520
ttccccagga taaggcaggc atccaaatgg aaaaaaaggg gccggccggg ggtctcctgt 2580
cagctccttg ccctgtgaaa cccagcaggc ctgcctgtct tctgtcctct tggggctgtc 2640
caggggcgca ggcctcttgc gggggagctg gcctccccgc cccctcgcct gtggccgccc 2700
ttttcctggc aggacagagg gatcctgcag ctgtcagggg aggggcgccg gggggtgatg 2760
tcaggagggc tacaaatagt gcagacagct aaggggctcc gtcacccatc ttcacatcca 2820
ctccagccgg ctgcccgccc gctgcctcct ctgtgcgtcc gcccagccag cctcgtccac 2880
gccaagcttg cggccgcatt aaacgccacc atgtcccgct tggataagag caaggtaata 2940
aatagcgcac tcgaactcct caacggcgtg ggcatcgaag gtctgactac tcgaaagctc 3000
gcccagaaat tgggtgtgga gcaacctaca ttgtattggc atgtcaagaa caaaagagcc 3060
ctgctggacg ctcttcctat tgaaatgctt gacaggcatc acactcattc ctgccccctt 3120
gaggtcgaga gttggcaaga ttttctccga aacaatgcaa agtcctaccg ctgcgcactt 3180
ttgtcccata gggatggagc aaaagtgcac ctgggaacca ggccaacaga gaaacaatac 3240
gagactctcg agaaccagtt ggctttcttg tgccaacagg ggttctcact tgaaaatgcc 3300
ctttacgcac tgtcagccgt tggacatttt accctggggt gcgttcttga ggagcaagaa 3360
catcaggttg ctaaggagga gcgcgagact ccaaccactg attctatgcc acctttgctg 3420
aaacaggcca ttgaactttt cgatagacag ggtgctgaac ctgcctttct cttcgggttg 3480
gagctgatta tttgtggtct cgaaaaacag ctgaaatgtg aaagtggtgg ccctactgac 3540
gccctcgatg atttcgacct ggatatgctg ccagccgatg cacttgatga tttcgatttg 3600
gatatgcttc cagccgacgc actggacgac ttcgatttgg acatgcttcc cggttaaact 3660
agtctagcaa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact 3720
atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg 3780
cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttagtt cttgccacgg 3840
cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg 3900
acaattccgt ggtgtttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccattc 3960
tagctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa 4020
taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggagatgtg 4080
ggaggttttt taaagcgggg gatccaaatt cccgataagg atcttcctag agcatggcta 4140
cgtagataag tagcatggcg ggttaatcat taactacaag gaacccctag tgatggagtt 4200
ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg 4260
acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagcc ttaattaacc 4320
taattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact 4380
taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac 4440
cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgggacgcgc cctgtagcgg 4500
cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc 4560
cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc 4620
ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct 4680
cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac 4740
ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac 4800
tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat 4860
ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa 4920
aatattaacg tttataattt caggtggcat ctttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat 4980
ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata 5040
aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct 5100
tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa 5160
agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa 5220
tagtggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt 5280
taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg 5340
tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca 5400
tcttacggat ggcatgacag taagagaa 5428
<210> 31
<211> 5332
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 31
aaattgtaaa cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat 60
tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagcccgaga 120
tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca 180
acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccca 240
aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc 300
cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag 360
cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca 420
cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtacta tggttgcttt gacgtatgcg 480
gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc cctgcaggca 540
gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 600
tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 660
taggggttcc tgcggccgct cggtccgcac gatctcaatt cggccattac ggccggatcc 720
ggctcgagga gcttggccca ttgcatacgt tgtatccata tcataatatg tacatttata 780
ttggctcatg tccaacatta ccgccatgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt 840
aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta 900
cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga 960
cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt 1020
tacgctaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta 1080
ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg 1140
actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt 1200
tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 1260
accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 1320
gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct 1380
atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt 1440
ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg cggccccgaa ttcaccatgt 1500
ctagactgga caagagcaaa atcataaaca gcgctctgga attactcaat ggagtcggta 1560
tcgaaggcct gacgacaagg aaactcgctc aaaagctggg agttgagcag cctaccctgt 1620
actggcacgt gaagaacaag cgggccctgc tcgatgccct gccaatcgag atgctggaca 1680
ggcatcatac ccacagctgc cccctggaag gcgagtcatg gcaagacttt ctgcggaaca 1740
acgccaagtc ataccgctgt gctctcctct cacatcgcga cggggctaaa gtgcatctcg 1800
gcacccgccc aacagagaaa cagtacgaaa ccctggaaaa tcagctcgcg ttcctgtgtc 1860
agcaaggctt ctccctggag aacgcactgt acgctctgtc cgccgtgggc cactttacac 1920
tgggctgcgt attggaggaa caggagcatc aagtagcaaa agaggaaaga gagacaccta 1980
ccaccgattc tatgccccca cttctgaagc aagcaattga gctgttcgac cggcagggag 2040
ccgaacctgc cttccttttc ggcctggaac taatcatatg tggcctggag aaacagctaa 2100
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<211> 5392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 32
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ccaggtggcg ggctgatggg caagtttgtg ctgaaggcgt ctctgaccac ccctggcagc 5220
gagtacagca gcccttcggt catcagtgtt agcaaaggaa gcccagacgg cagccacccc 5280
gtggtagtgg cgccctacag cggtggcccg ccgcgcatgt gccccaagat taagcaagag 5340
gcggtcccgt cctgcacggt cagccggtcc ctagaggccc atttgagcgc tggaccccag 5400
ctcagcaacg gccaccggcc caacacacac gacttccccc tggggcggca gctccccacc 5460
aggactaccc ctacactgag tcccgaggaa ctgctgaaca gcagggactg tcaccctggc 5520
ctgcctcttc ccccaggatt ccatccccat ccggggccca actaccctcc tttcctgcca 5580
gaccagatgc agtcacaagt cccctctctc cattatcaag agctcatgcc accgggttcc 5640
tgcctgccag aggagcccaa gccaaagagg ggaagaaggt cgtggccccg gaaaagaaca 5700
gccacccaca cttgtgacta tgcaggctgt ggcaaaacct ataccaagag ttctcatctc 5760
aaggcacacc tgcgaactca cacaggcgag aaaccttacc actgtgactg ggacggctgt 5820
gggtggaaat tcgcccgctc cgatgaactg accaggcact accgcaaaca cacagggcac 5880
cggccctttc agtgccagaa gtgcgacagg gccttttcca ggtcggacca ccttgcctta 5940
cacatgaaga ggcactaaat gactagtcta gcaatcaacc tctggattac aaaatttgtg 6000
aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt 6060
taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata 6120
aatcctggtt agttcttgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga 6180
caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt tatttgtgaa atttgtgatg 6240
ctattgcttt atttgtaacc attctagctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt 6300
atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat 6360
gtttcaggtt cagggggaga tgtgggaggt tttttaaagc gggggatcca aattcccgat 6420
aaggatcttc ctagagcatg gctacgtaga taagtagcat ggcgggttaa tcattaacta 6480
caaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga 6540
ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga 6600
gcgagcgcgc agccttaatt aacctaattc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg 6660
ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg 6720
gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg 6780
cgaatgggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 6840
cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 6900
tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt 6960
ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg 7020
tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt 7080
taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt 7140
tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca 7200
aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgtttata atttcaggtg gcatctttcg 7260
gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc 7320
gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag 7380
tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt 7440
tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt 7500
gggttacatc gaactggatc tcaatagtgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga 7560
acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat 7620
tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga 7680
gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aa 7732
<210> 34
<211> 186
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 34
gaggccagcg gttccggacg ggctgacgca ttggacgatt ttgatctgga tatgctggga 60
agtgacgccc tcgatgattt tgaccttgac atgcttggtt cggatgccct tgatgacttt 120
gacctcgaca tgctcggcag tgacgccctt gatgatttcg acctggacat gctgattaac 180
tctaga 186
<210> 35
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 35
agccagtacc tgcccgacac cgacgaccgg caccggatcg aggaaaagcg gaagcggacc 60
tacgagacat tcaagagcat catgaagaag tcccccttca gcggccccac cgaccctaga 120
cctccaccta gaagaatcgc cgtgcccagc agatccagcg ccagcgtgcc aaaacctgcc 180
ccccagcctt accccttcac cagcagcctg agcaccatca actacgacga gttccctacc 240
atggtgttcc ccagcggcca gatctctcag gcctctgctc tggctccagc ccctcctcag 300
gtgctgcctc aggctcctgc tcctgcacca gctccagcca tggtgtctgc actggctcag 360
gcaccagcac ccgtgcctgt gctggctcct ggacctccac aggctgtggc tccaccagcc 420
cctaaaccta cacaggccgg cgagggcaca ctgtctgaag ctctgctgca gctgcagttc 480
gacgacgagg atctgggagc cctgctggga aacagcaccg atcctgccgt gttcaccgac 540
ctggccagcg tggacaacag cgagttccag cagctgctga accagggcat ccctgtggcc 600
cctcacacca ccgagcccat gctgatggaa taccccgagg ccatcacccg gctcgtgaca 660
ggcgctcaga ggcctcctga tccagctcct gcccctctgg gagcaccagg cctgcctaat 720
ggactgctgt ctggcgacga ggacttcagc tctatcgccg atatggattt ctcagccttg 780
ctg 783
<210> 36
<211> 570
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 36
cgggattcca gggaagggat gtttttgccg aagcctgagg ccggctccgc tattagtgac 60
gtgtttgagg gccgcgaggt gtgccagcca aaacgaatcc ggccatttca tcctccagga 120
agtccatggg ccaaccgccc actccccgcc agcctcgcac caacaccaac cggtccagta 180
catgagccag tcgggtcact gaccccggca ccagtccctc agccactgga tccagcgccc 240
gcagtgactc ccgaggccag tcacctgttg gaggatcccg atgaagagac gagccaggct 300
gtcaaagccc ttcgggagat ggccgatact gtgattcccc agaaggaaga ggctgcaatc 360
tgtggccaaa tggacctttc ccatccgccc ccaaggggcc atctggatga gctgacaacc 420
acacttgagt ccatgaccga ggatctgaac ctggactcac ccctgacccc ggaattgaac 480
gagattctgg ataccttcct gaacgacgag tgcctcttgc atgccatgca tatcagcaca 540
ggactgtcca tcttcgacac atctctgttt 570
<210> 37
<211> 1416
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 37
gcttcaaact ttactcagtt cgtgctcgtg gacaatggtg ggacagggga tgtgacagtg 60
gctccttcta atttcgctaa tggggtggca gagtggatca gctccaactc acggagccag 120
gcctacaagg tgacatgcag cgtcaggcag tctagtgccc agaagagaaa gtataccatc 180
aaggtggagg tccccaaagt ggctacccag acagtgggcg gagtcgaact gcctgtcgcc 240
gcttggaggt cctacctgaa catggagctc actatcccaa ttttcgctac caattctgac 300
tgtgaactca tcgtgaaggc aatgcagggg ctcctcaaag acggtaatcc tatcccttcc 360
gccatcgccg ctaactcagg tatctacagc gctggaggag gtggaagcgg aggaggagga 420
agcggaggag gaggtagcgg acctaagaaa aagaggaagg tggcggccgc tggatcccct 480
tcagggcaga tcagcaacca ggccctggct ctggccccta gctccgctcc agtgctggcc 540
cagactatgg tgccctctag tgctatggtg cctctggccc agccacctgc tccagcccct 600
gtgctgaccc caggaccacc ccagtcactg agcgctccag tgcccaagtc tacacaggcc 660
ggcgagggga ctctgagtga agctctgctg cacctgcagt tcgacgctga tgaggacctg 720
ggagctctgc tggggaacag caccgatccc ggagtgttca cagatctggc ctccgtggac 780
aactctgagt ttcagcagct gctgaatcag ggcgtgtcca tgtctcatag tacagccgaa 840
ccaatgctga tggagtaccc cgaagccatt acccggctgg tgaccggcag ccagcggccc 900
cccgaccccg ctccaactcc cctgggaacc agcggcctgc ctaatgggct gtccggagat 960
gaagacttct caagcatcgc tgatatggac tttagtgccc tgctgtcaca gatttcctct 1020
agtgggcagg gaggaggtgg aagcggcttc agcgtggaca ccagtgccct gctggacctg 1080
ttcagcccct cggtgaccgt gcccgacatg agcctgcctg accttgacag cagcctggcc 1140
agtatccaag agctcctgtc tccccaggag ccccccaggc ctcccgaggc agagaacagc 1200
agcccggatt cagggaagca gctggtgcac tacacagcgc agccgctgtt cctgctggac 1260
cccggctccg tggacaccgg gagcaacgac ctgccggtgc tgtttgagct gggagagggc 1320
tcctacttct ccgaagggga cggcttcgcc gaggacccca ccatctccct gctgacaggc 1380
tcggagcctc ccaaagccaa ggaccccact gtctcc 1416
<210> 38
<211> 3594
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 38
atggcgggac acctggcttc ggatttcgcc ttctcgcccc ctccaggtgg tggaggtgat 60
gggccagggg ggccggagcc gggctgggtt gatcctcgga cctggctaag cttccaaggc 120
cctcctggag ggccaggaat cgggccgggg gttgggccag gctctgaggt gtgggggatt 180
cccccatgcc ccccgccgta tgagttctgt ggggggatgg cgtactgtgg gccccaggtt 240
ggagtggggc tagtgcccca aggcggcttg gagacctctc agcctgaggg cgaagcagga 300
gtcggggtgg agagcaactc cgatggggcc tccccggagc cctgcaccgt cacccctggt 360
gccgtgaagc tggagaagga gaagctggag caaaacccgg aggagtccca ggacatcaaa 420
gctctgcaga aagaactcga gcaatttgcc aagctcctga agcagaagag gatcaccctg 480
ggatatacac aggccgatgt ggggctcacc ctgggggttc tatttgggaa ggtattcagc 540
caaacgacca tctgccgctt tgaggctctg cagcttagct tcaagaacat gtgtaagctg 600
cggcccttgc tgcagaagtg ggtggaggaa gctgacaaca atgaaaatct tcaggagata 660
tgcaaagcag aaaccctcgt gcaggcccga aagagaaagc gaaccagtat cgagaaccga 720
gtgagaggca acctggagaa tttgttcctg cagtgcccga aacccacact gcagcagatc 780
agccacatcg cccagcagct tgggctcgag aaggatgtgg tccgagtgtg gttctgtaac 840
cggcgccaga agggcaagcg atcaagcagc gactatgcac aacgagagga ttttgaggct 900
gctgggtctc ctttctcagg gggaccagtg tcctttcctc tggccccagg gccccatttt 960
ggtaccccag gctatgggag ccctcacttc actgcactgt actcctcggt ccctttccct 1020
gagggggaag cctttccccc tgtctctgtc accactctgg gctctcccat gcattcaaac 1080
gctagcggca gcggcgccac gaacttctct ctgttaaagc aagcaggaga tgttgaagaa 1140
aaccccgggc ctgcatgcat gtacaacatg atggagacgg agctgaagcc gccgggcccg 1200
cagcaaactt cggggggcgg cggcggcaac tccaccgcgg cggcggccgg cggcaaccag 1260
aaaaacagcc cggaccgcgt caagcggccc atgaatgcct tcatggtgtg gtcccgcggg 1320
cagcggcgca agatggccca ggagaacccc aagatgcaca actcggagat cagcaagcgc 1380
ctgggcgccg agtggaaact tttgtcggag acggagaagc ggccgttcat cgacgaggct 1440
aagcggctgc gagcgctgca catgaaggag cacccggatt ataaataccg gccccggcgg 1500
aaaaccaaga cgctcatgaa gaaggataag tacacgctgc ccggcgggct gctggccccc 1560
ggcggcaata gcatggcgag cggggtcggg gtgggcgccg gcctgggcgc gggcgtgaac 1620
cagcgcatgg acagttacgc gcacatgaac ggctggagca acggcagcta cagcatgatg 1680
caggaccagc tgggctaccc gcagcacccg ggcctcaatg cgcacggcgc agcgcagatg 1740
cagcccatgc accgctacga cgtgagcgcc ctgcagtaca actccatgac cagctcgcag 1800
acctacatga acggctcgcc cacctacagc atgtcctact cgcagcaggg cacccctggc 1860
atggctcttg gctccatggg ttcggtggtc aagtccgagg ccagctccag cccccctgtg 1920
gttacctctt cctcccactc cagggcgccc tgccaggccg gggacctccg ggacatgatc 1980
agcatgtatc tccccggcgc cgaggtgccg gaacccgccg cccccagcag acttcacatg 2040
tcccagcact accagagcgg cccggtgccc ggcacggcca ttaacggcac actgcccctc 2100
tcacacatgg catgcggctc cggcgagggc aggggaagtc ttctaacatg cggggacgtg 2160
gaggaaaatc ccggcccact cgagatggct gtcagcgacg cgctgctccc atctttctcc 2220
acgttcgcgt ctggcccggc gggaagggag aagacactgc gtcaagcagg tgccccgaat 2280
aaccgctggc gggaggagct ctcccacatg aagcgacttc ccccagtgct tcccggccgc 2340
ccctatgacc tggcggcggc gaccgtggcc acagacctgg agagcggcgg agccggtgcg 2400
gcttgcggcg gtagcaacct ggcgccccta cctcggagag agaccgagga gttcaacgat 2460
ctcctggacc tggactttat tctctccaat tcgctgaccc atcctccgga gtcagtggcc 2520
gccaccgtgt cctcgtcagc gtcagcctcc tcttcgtcgt cgccgtcgag cagcggccct 2580
gccagcgcgc cctccacctg cagcttcacc tatccgatcc gggccgggaa cgacccgggc 2640
gtggcgccgg gcggcacggg cggaggcctc ctctatggca gggagtccgc tccccctccg 2700
acggctccct tcaacctggc ggacatcaac gacgtgagcc cctcgggcgg cttcgtggcc 2760
gagctcctgc ggccagaatt ggacccggtg tacattccgc cgcagcagcc gcagccgcca 2820
ggtggcgggc tgatgggcaa gttcgtgctg aaggcgtcgc tgagcgcccc tggcagcgag 2880
tacggcagcc cgtcggtcat cagcgtcagc aaaggcagcc ctgacggcag ccacccggtg 2940
gtggtggcgc cctacaacgg cgggccgccg cgcacgtgcc ccaagatcaa gcaggaggcg 3000
gtctcttcgt gcacccactt gggcgctgga ccccctctca gcaatggcca ccggccggct 3060
gcacacgact tccccctggg gcggcagctc cccagcagga ctaccccgac cctgggtctt 3120
gaggaagtgc tgagcagcag ggactgtcac cctgccctgc cgcttcctcc cggcttccat 3180
ccccacccgg ggcccaatta cccatccttc ctgcccgatc agatgcagcc gcaagtcccg 3240
ccgctccatt accaagagct catgccaccc ggttcctgca tgccagagga gcccaagcca 3300
aagaggggaa gacgatcgtg gccccggaaa aggaccgcca cccacacttg tgattacgcg 3360
ggctgcggca aaacctacac aaagagttcc catctcaagg cacacctgcg aacccacaca 3420
ggtgagaaac cttaccactg tgactgggac ggctgtggat ggaaattcgc ccgctcagat 3480
gaactgacca ggcactaccg taaacacacg gggcaccgcc cgttccagtg ccaaaaatgc 3540
gaccgagcat tttccaggtc ggaccacctc gccttacaca tgaagaggca tttt 3594
<210> 39
<211> 1198
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 39
Met Ala Gly His Leu Ala Ser Asp Phe Ala Phe Ser Pro Pro Pro Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Asp Gly Pro Gly Gly Pro Glu Pro Gly Trp Val Asp Pro
20 25 30
Arg Thr Trp Leu Ser Phe Gln Gly Pro Pro Gly Gly Pro Gly Ile Gly
35 40 45
Pro Gly Val Gly Pro Gly Ser Glu Val Trp Gly Ile Pro Pro Cys Pro
50 55 60
Pro Pro Tyr Glu Phe Cys Gly Gly Met Ala Tyr Cys Gly Pro Gln Val
65 70 75 80
Gly Val Gly Leu Val Pro Gln Gly Gly Leu Glu Thr Ser Gln Pro Glu
85 90 95
Gly Glu Ala Gly Val Gly Val Glu Ser Asn Ser Asp Gly Ala Ser Pro
100 105 110
Glu Pro Cys Thr Val Thr Pro Gly Ala Val Lys Leu Glu Lys Glu Lys
115 120 125
Leu Glu Gln Asn Pro Glu Glu Ser Gln Asp Ile Lys Ala Leu Gln Lys
130 135 140
Glu Leu Glu Gln Phe Ala Lys Leu Leu Lys Gln Lys Arg Ile Thr Leu
145 150 155 160
Gly Tyr Thr Gln Ala Asp Val Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Phe Gly
165 170 175
Lys Val Phe Ser Gln Thr Thr Ile Cys Arg Phe Glu Ala Leu Gln Leu
180 185 190
Ser Phe Lys Asn Met Cys Lys Leu Arg Pro Leu Leu Gln Lys Trp Val
195 200 205
Glu Glu Ala Asp Asn Asn Glu Asn Leu Gln Glu Ile Cys Lys Ala Glu
210 215 220
Thr Leu Val Gln Ala Arg Lys Arg Lys Arg Thr Ser Ile Glu Asn Arg
225 230 235 240
Val Arg Gly Asn Leu Glu Asn Leu Phe Leu Gln Cys Pro Lys Pro Thr
245 250 255
Leu Gln Gln Ile Ser His Ile Ala Gln Gln Leu Gly Leu Glu Lys Asp
260 265 270
Val Val Arg Val Trp Phe Cys Asn Arg Arg Gln Lys Gly Lys Arg Ser
275 280 285
Ser Ser Asp Tyr Ala Gln Arg Glu Asp Phe Glu Ala Ala Gly Ser Pro
290 295 300
Phe Ser Gly Gly Pro Val Ser Phe Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Phe
305 310 315 320
Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Ser Pro His Phe Thr Ala Leu Tyr Ser Ser
325 330 335
Val Pro Phe Pro Glu Gly Glu Ala Phe Pro Pro Val Ser Val Thr Thr
340 345 350
Leu Gly Ser Pro Met His Ser Asn Ala Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn
355 360 365
Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
370 375 380
Ala Cys Met Tyr Asn Met Met Glu Thr Glu Leu Lys Pro Pro Gly Pro
385 390 395 400
Gln Gln Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn Ser Thr Ala Ala Ala Ala
405 410 415
Gly Gly Asn Gln Lys Asn Ser Pro Asp Arg Val Lys Arg Pro Met Asn
420 425 430
Ala Phe Met Val Trp Ser Arg Gly Gln Arg Arg Lys Met Ala Gln Glu
435 440 445
Asn Pro Lys Met His Asn Ser Glu Ile Ser Lys Arg Leu Gly Ala Glu
450 455 460
Trp Lys Leu Leu Ser Glu Thr Glu Lys Arg Pro Phe Ile Asp Glu Ala
465 470 475 480
Lys Arg Leu Arg Ala Leu His Met Lys Glu His Pro Asp Tyr Lys Tyr
485 490 495
Arg Pro Arg Arg Lys Thr Lys Thr Leu Met Lys Lys Asp Lys Tyr Thr
500 505 510
Leu Pro Gly Gly Leu Leu Ala Pro Gly Gly Asn Ser Met Ala Ser Gly
515 520 525
Val Gly Val Gly Ala Gly Leu Gly Ala Gly Val Asn Gln Arg Met Asp
530 535 540
Ser Tyr Ala His Met Asn Gly Trp Ser Asn Gly Ser Tyr Ser Met Met
545 550 555 560
Gln Asp Gln Leu Gly Tyr Pro Gln His Pro Gly Leu Asn Ala His Gly
565 570 575
Ala Ala Gln Met Gln Pro Met His Arg Tyr Asp Val Ser Ala Leu Gln
580 585 590
Tyr Asn Ser Met Thr Ser Ser Gln Thr Tyr Met Asn Gly Ser Pro Thr
595 600 605
Tyr Ser Met Ser Tyr Ser Gln Gln Gly Thr Pro Gly Met Ala Leu Gly
610 615 620
Ser Met Gly Ser Val Val Lys Ser Glu Ala Ser Ser Ser Pro Pro Val
625 630 635 640
Val Thr Ser Ser Ser His Ser Arg Ala Pro Cys Gln Ala Gly Asp Leu
645 650 655
Arg Asp Met Ile Ser Met Tyr Leu Pro Gly Ala Glu Val Pro Glu Pro
660 665 670
Ala Ala Pro Ser Arg Leu His Met Ser Gln His Tyr Gln Ser Gly Pro
675 680 685
Val Pro Gly Thr Ala Ile Asn Gly Thr Leu Pro Leu Ser His Met Ala
690 695 700
Cys Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val
705 710 715 720
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Leu Glu Met Ala Val Ser Asp Ala Leu Leu
725 730 735
Pro Ser Phe Ser Thr Phe Ala Ser Gly Pro Ala Gly Arg Glu Lys Thr
740 745 750
Leu Arg Gln Ala Gly Ala Pro Asn Asn Arg Trp Arg Glu Glu Leu Ser
755 760 765
His Met Lys Arg Leu Pro Pro Val Leu Pro Gly Arg Pro Tyr Asp Leu
770 775 780
Ala Ala Ala Thr Val Ala Thr Asp Leu Glu Ser Gly Gly Ala Gly Ala
785 790 795 800
Ala Cys Gly Gly Ser Asn Leu Ala Pro Leu Pro Arg Arg Glu Thr Glu
805 810 815
Glu Phe Asn Asp Leu Leu Asp Leu Asp Phe Ile Leu Ser Asn Ser Leu
820 825 830
Thr His Pro Pro Glu Ser Val Ala Ala Thr Val Ser Ser Ser Ala Ser
835 840 845
Ala Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ser Ser Ser Gly Pro Ala Ser Ala Pro
850 855 860
Ser Thr Cys Ser Phe Thr Tyr Pro Ile Arg Ala Gly Asn Asp Pro Gly
865 870 875 880
Val Ala Pro Gly Gly Thr Gly Gly Gly Leu Leu Tyr Gly Arg Glu Ser
885 890 895
Ala Pro Pro Pro Thr Ala Pro Phe Asn Leu Ala Asp Ile Asn Asp Val
900 905 910
Ser Pro Ser Gly Gly Phe Val Ala Glu Leu Leu Arg Pro Glu Leu Asp
915 920 925
Pro Val Tyr Ile Pro Pro Gln Gln Pro Gln Pro Pro Gly Gly Gly Leu
930 935 940
Met Gly Lys Phe Val Leu Lys Ala Ser Leu Ser Ala Pro Gly Ser Glu
945 950 955 960
Tyr Gly Ser Pro Ser Val Ile Ser Val Ser Lys Gly Ser Pro Asp Gly
965 970 975
Ser His Pro Val Val Val Ala Pro Tyr Asn Gly Gly Pro Pro Arg Thr
980 985 990
Cys Pro Lys Ile Lys Gln Glu Ala Val Ser Ser Cys Thr His Leu Gly
995 1000 1005
Ala Gly Pro Pro Leu Ser Asn Gly His Arg Pro Ala Ala His Asp
1010 1015 1020
Phe Pro Leu Gly Arg Gln Leu Pro Ser Arg Thr Thr Pro Thr Leu
1025 1030 1035
Gly Leu Glu Glu Val Leu Ser Ser Arg Asp Cys His Pro Ala Leu
1040 1045 1050
Pro Leu Pro Pro Gly Phe His Pro His Pro Gly Pro Asn Tyr Pro
1055 1060 1065
Ser Phe Leu Pro Asp Gln Met Gln Pro Gln Val Pro Pro Leu His
1070 1075 1080
Tyr Gln Glu Leu Met Pro Pro Gly Ser Cys Met Pro Glu Glu Pro
1085 1090 1095
Lys Pro Lys Arg Gly Arg Arg Ser Trp Pro Arg Lys Arg Thr Ala
1100 1105 1110
Thr His Thr Cys Asp Tyr Ala Gly Cys Gly Lys Thr Tyr Thr Lys
1115 1120 1125
Ser Ser His Leu Lys Ala His Leu Arg Thr His Thr Gly Glu Lys
1130 1135 1140
Pro Tyr His Cys Asp Trp Asp Gly Cys Gly Trp Lys Phe Ala Arg
1145 1150 1155
Ser Asp Glu Leu Thr Arg His Tyr Arg Lys His Thr Gly His Arg
1160 1165 1170
Pro Phe Gln Cys Gln Lys Cys Asp Arg Ala Phe Ser Arg Ser Asp
1175 1180 1185
His Leu Ala Leu His Met Lys Arg His Phe
1190 1195
<210> 40
<211> 1080
<212> DNA
<213> 智人
<400> 40
atggcgggac acctggcttc ggatttcgcc ttctcgcccc ctccaggtgg tggaggtgat 60
gggccagggg ggccggagcc gggctgggtt gatcctcgga cctggctaag cttccaaggc 120
cctcctggag ggccaggaat cgggccgggg gttgggccag gctctgaggt gtgggggatt 180
cccccatgcc ccccgccgta tgagttctgt ggggggatgg cgtactgtgg gccccaggtt 240
ggagtggggc tagtgcccca aggcggcttg gagacctctc agcctgaggg cgaagcagga 300
gtcggggtgg agagcaactc cgatggggcc tccccggagc cctgcaccgt cacccctggt 360
gccgtgaagc tggagaagga gaagctggag caaaacccgg aggagtccca ggacatcaaa 420
gctctgcaga aagaactcga gcaatttgcc aagctcctga agcagaagag gatcaccctg 480
ggatatacac aggccgatgt ggggctcacc ctgggggttc tatttgggaa ggtattcagc 540
caaacgacca tctgccgctt tgaggctctg cagcttagct tcaagaacat gtgtaagctg 600
cggcccttgc tgcagaagtg ggtggaggaa gctgacaaca atgaaaatct tcaggagata 660
tgcaaagcag aaaccctcgt gcaggcccga aagagaaagc gaaccagtat cgagaaccga 720
gtgagaggca acctggagaa tttgttcctg cagtgcccga aacccacact gcagcagatc 780
agccacatcg cccagcagct tgggctcgag aaggatgtgg tccgagtgtg gttctgtaac 840
cggcgccaga agggcaagcg atcaagcagc gactatgcac aacgagagga ttttgaggct 900
gctgggtctc ctttctcagg gggaccagtg tcctttcctc tggccccagg gccccatttt 960
ggtaccccag gctatgggag ccctcacttc actgcactgt actcctcggt ccctttccct 1020
gagggggaag cctttccccc tgtctctgtc accactctgg gctctcccat gcattcaaac 1080
<210> 41
<211> 360
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Met Ala Gly His Leu Ala Ser Asp Phe Ala Phe Ser Pro Pro Pro Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Asp Gly Pro Gly Gly Pro Glu Pro Gly Trp Val Asp Pro
20 25 30
Arg Thr Trp Leu Ser Phe Gln Gly Pro Pro Gly Gly Pro Gly Ile Gly
35 40 45
Pro Gly Val Gly Pro Gly Ser Glu Val Trp Gly Ile Pro Pro Cys Pro
50 55 60
Pro Pro Tyr Glu Phe Cys Gly Gly Met Ala Tyr Cys Gly Pro Gln Val
65 70 75 80
Gly Val Gly Leu Val Pro Gln Gly Gly Leu Glu Thr Ser Gln Pro Glu
85 90 95
Gly Glu Ala Gly Val Gly Val Glu Ser Asn Ser Asp Gly Ala Ser Pro
100 105 110
Glu Pro Cys Thr Val Thr Pro Gly Ala Val Lys Leu Glu Lys Glu Lys
115 120 125
Leu Glu Gln Asn Pro Glu Glu Ser Gln Asp Ile Lys Ala Leu Gln Lys
130 135 140
Glu Leu Glu Gln Phe Ala Lys Leu Leu Lys Gln Lys Arg Ile Thr Leu
145 150 155 160
Gly Tyr Thr Gln Ala Asp Val Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Phe Gly
165 170 175
Lys Val Phe Ser Gln Thr Thr Ile Cys Arg Phe Glu Ala Leu Gln Leu
180 185 190
Ser Phe Lys Asn Met Cys Lys Leu Arg Pro Leu Leu Gln Lys Trp Val
195 200 205
Glu Glu Ala Asp Asn Asn Glu Asn Leu Gln Glu Ile Cys Lys Ala Glu
210 215 220
Thr Leu Val Gln Ala Arg Lys Arg Lys Arg Thr Ser Ile Glu Asn Arg
225 230 235 240
Val Arg Gly Asn Leu Glu Asn Leu Phe Leu Gln Cys Pro Lys Pro Thr
245 250 255
Leu Gln Gln Ile Ser His Ile Ala Gln Gln Leu Gly Leu Glu Lys Asp
260 265 270
Val Val Arg Val Trp Phe Cys Asn Arg Arg Gln Lys Gly Lys Arg Ser
275 280 285
Ser Ser Asp Tyr Ala Gln Arg Glu Asp Phe Glu Ala Ala Gly Ser Pro
290 295 300
Phe Ser Gly Gly Pro Val Ser Phe Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Phe
305 310 315 320
Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Ser Pro His Phe Thr Ala Leu Tyr Ser Ser
325 330 335
Val Pro Phe Pro Glu Gly Glu Ala Phe Pro Pro Val Ser Val Thr Thr
340 345 350
Leu Gly Ser Pro Met His Ser Asn
355 360
<210> 42
<211> 951
<212> DNA
<213> 智人
<400> 42
atgtacaaca tgatggagac ggagctgaag ccgccgggcc cgcagcaaac ttcggggggc 60
ggcggcggca actccaccgc ggcggcggcc ggcggcaacc agaaaaacag cccggaccgc 120
gtcaagcggc ccatgaatgc cttcatggtg tggtcccgcg ggcagcggcg caagatggcc 180
caggagaacc ccaagatgca caactcggag atcagcaagc gcctgggcgc cgagtggaaa 240
cttttgtcgg agacggagaa gcggccgttc atcgacgagg ctaagcggct gcgagcgctg 300
cacatgaagg agcacccgga ttataaatac cggccccggc ggaaaaccaa gacgctcatg 360
aagaaggata agtacacgct gcccggcggg ctgctggccc ccggcggcaa tagcatggcg 420
agcggggtcg gggtgggcgc cggcctgggc gcgggcgtga accagcgcat ggacagttac 480
gcgcacatga acggctggag caacggcagc tacagcatga tgcaggacca gctgggctac 540
ccgcagcacc cgggcctcaa tgcgcacggc gcagcgcaga tgcagcccat gcaccgctac 600
gacgtgagcg ccctgcagta caactccatg accagctcgc agacctacat gaacggctcg 660
cccacctaca gcatgtccta ctcgcagcag ggcacccctg gcatggctct tggctccatg 720
ggttcggtgg tcaagtccga ggccagctcc agcccccctg tggttacctc ttcctcccac 780
tccagggcgc cctgccaggc cggggacctc cgggacatga tcagcatgta tctccccggc 840
gccgaggtgc cggaacccgc cgcccccagc agacttcaca tgtcccagca ctaccagagc 900
ggcccggtgc ccggcacggc cattaacggc acactgcccc tctcacacat g 951
<210> 43
<211> 317
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Met Tyr Asn Met Met Glu Thr Glu Leu Lys Pro Pro Gly Pro Gln Gln
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn Ser Thr Ala Ala Ala Ala Gly Gly
20 25 30
Asn Gln Lys Asn Ser Pro Asp Arg Val Lys Arg Pro Met Asn Ala Phe
35 40 45
Met Val Trp Ser Arg Gly Gln Arg Arg Lys Met Ala Gln Glu Asn Pro
50 55 60
Lys Met His Asn Ser Glu Ile Ser Lys Arg Leu Gly Ala Glu Trp Lys
65 70 75 80
Leu Leu Ser Glu Thr Glu Lys Arg Pro Phe Ile Asp Glu Ala Lys Arg
85 90 95
Leu Arg Ala Leu His Met Lys Glu His Pro Asp Tyr Lys Tyr Arg Pro
100 105 110
Arg Arg Lys Thr Lys Thr Leu Met Lys Lys Asp Lys Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Gly Gly Leu Leu Ala Pro Gly Gly Asn Ser Met Ala Ser Gly Val Gly
130 135 140
Val Gly Ala Gly Leu Gly Ala Gly Val Asn Gln Arg Met Asp Ser Tyr
145 150 155 160
Ala His Met Asn Gly Trp Ser Asn Gly Ser Tyr Ser Met Met Gln Asp
165 170 175
Gln Leu Gly Tyr Pro Gln His Pro Gly Leu Asn Ala His Gly Ala Ala
180 185 190
Gln Met Gln Pro Met His Arg Tyr Asp Val Ser Ala Leu Gln Tyr Asn
195 200 205
Ser Met Thr Ser Ser Gln Thr Tyr Met Asn Gly Ser Pro Thr Tyr Ser
210 215 220
Met Ser Tyr Ser Gln Gln Gly Thr Pro Gly Met Ala Leu Gly Ser Met
225 230 235 240
Gly Ser Val Val Lys Ser Glu Ala Ser Ser Ser Pro Pro Val Val Thr
245 250 255
Ser Ser Ser His Ser Arg Ala Pro Cys Gln Ala Gly Asp Leu Arg Asp
260 265 270
Met Ile Ser Met Tyr Leu Pro Gly Ala Glu Val Pro Glu Pro Ala Ala
275 280 285
Pro Ser Arg Leu His Met Ser Gln His Tyr Gln Ser Gly Pro Val Pro
290 295 300
Gly Thr Ala Ile Asn Gly Thr Leu Pro Leu Ser His Met
305 310 315
<210> 44
<211> 1410
<212> DNA
<213> 智人
<400> 44
atggctgtca gcgacgcgct gctcccatct ttctccacgt tcgcgtctgg cccggcggga 60
agggagaaga cactgcgtca agcaggtgcc ccgaataacc gctggcggga ggagctctcc 120
cacatgaagc gacttccccc agtgcttccc ggccgcccct atgacctggc ggcggcgacc 180
gtggccacag acctggagag cggcggagcc ggtgcggctt gcggcggtag caacctggcg 240
cccctacctc ggagagagac cgaggagttc aacgatctcc tggacctgga ctttattctc 300
tccaattcgc tgacccatcc tccggagtca gtggccgcca ccgtgtcctc gtcagcgtca 360
gcctcctctt cgtcgtcgcc gtcgagcagc ggccctgcca gcgcgccctc cacctgcagc 420
ttcacctatc cgatccgggc cgggaacgac ccgggcgtgg cgccgggcgg cacgggcgga 480
ggcctcctct atggcaggga gtccgctccc cctccgacgg ctcccttcaa cctggcggac 540
atcaacgacg tgagcccctc gggcggcttc gtggccgagc tcctgcggcc agaattggac 600
ccggtgtaca ttccgccgca gcagccgcag ccgccaggtg gcgggctgat gggcaagttc 660
gtgctgaagg cgtcgctgag cgcccctggc agcgagtacg gcagcccgtc ggtcatcagc 720
gtcagcaaag gcagccctga cggcagccac ccggtggtgg tggcgcccta caacggcggg 780
ccgccgcgca cgtgccccaa gatcaagcag gaggcggtct cttcgtgcac ccacttgggc 840
gctggacccc ctctcagcaa tggccaccgg ccggctgcac acgacttccc cctggggcgg 900
cagctcccca gcaggactac cccgaccctg ggtcttgagg aagtgctgag cagcagggac 960
tgtcaccctg ccctgccgct tcctcccggc ttccatcccc acccggggcc caattaccca 1020
tccttcctgc ccgatcagat gcagccgcaa gtcccgccgc tccattacca agagctcatg 1080
ccacccggtt cctgcatgcc agaggagccc aagccaaaga ggggaagacg atcgtggccc 1140
cggaaaagga ccgccaccca cacttgtgat tacgcgggct gcggcaaaac ctacacaaag 1200
agttcccatc tcaaggcaca cctgcgaacc cacacaggtg agaaacctta ccactgtgac 1260
tgggacggct gtggatggaa attcgcccgc tcagatgaac tgaccaggca ctaccgtaaa 1320
cacacggggc accgcccgtt ccagtgccaa aaatgcgacc gagcattttc caggtcggac 1380
cacctcgcct tacacatgaa gaggcatttt 1410
<210> 45
<211> 470
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Met Ala Val Ser Asp Ala Leu Leu Pro Ser Phe Ser Thr Phe Ala Ser
1 5 10 15
Gly Pro Ala Gly Arg Glu Lys Thr Leu Arg Gln Ala Gly Ala Pro Asn
20 25 30
Asn Arg Trp Arg Glu Glu Leu Ser His Met Lys Arg Leu Pro Pro Val
35 40 45
Leu Pro Gly Arg Pro Tyr Asp Leu Ala Ala Ala Thr Val Ala Thr Asp
50 55 60
Leu Glu Ser Gly Gly Ala Gly Ala Ala Cys Gly Gly Ser Asn Leu Ala
65 70 75 80
Pro Leu Pro Arg Arg Glu Thr Glu Glu Phe Asn Asp Leu Leu Asp Leu
85 90 95
Asp Phe Ile Leu Ser Asn Ser Leu Thr His Pro Pro Glu Ser Val Ala
100 105 110
Ala Thr Val Ser Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ser
115 120 125
Ser Ser Gly Pro Ala Ser Ala Pro Ser Thr Cys Ser Phe Thr Tyr Pro
130 135 140
Ile Arg Ala Gly Asn Asp Pro Gly Val Ala Pro Gly Gly Thr Gly Gly
145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Gly Arg Glu Ser Ala Pro Pro Pro Thr Ala Pro Phe
165 170 175
Asn Leu Ala Asp Ile Asn Asp Val Ser Pro Ser Gly Gly Phe Val Ala
180 185 190
Glu Leu Leu Arg Pro Glu Leu Asp Pro Val Tyr Ile Pro Pro Gln Gln
195 200 205
Pro Gln Pro Pro Gly Gly Gly Leu Met Gly Lys Phe Val Leu Lys Ala
210 215 220
Ser Leu Ser Ala Pro Gly Ser Glu Tyr Gly Ser Pro Ser Val Ile Ser
225 230 235 240
Val Ser Lys Gly Ser Pro Asp Gly Ser His Pro Val Val Val Ala Pro
245 250 255
Tyr Asn Gly Gly Pro Pro Arg Thr Cys Pro Lys Ile Lys Gln Glu Ala
260 265 270
Val Ser Ser Cys Thr His Leu Gly Ala Gly Pro Pro Leu Ser Asn Gly
275 280 285
His Arg Pro Ala Ala His Asp Phe Pro Leu Gly Arg Gln Leu Pro Ser
290 295 300
Arg Thr Thr Pro Thr Leu Gly Leu Glu Glu Val Leu Ser Ser Arg Asp
305 310 315 320
Cys His Pro Ala Leu Pro Leu Pro Pro Gly Phe His Pro His Pro Gly
325 330 335
Pro Asn Tyr Pro Ser Phe Leu Pro Asp Gln Met Gln Pro Gln Val Pro
340 345 350
Pro Leu His Tyr Gln Glu Leu Met Pro Pro Gly Ser Cys Met Pro Glu
355 360 365
Glu Pro Lys Pro Lys Arg Gly Arg Arg Ser Trp Pro Arg Lys Arg Thr
370 375 380
Ala Thr His Thr Cys Asp Tyr Ala Gly Cys Gly Lys Thr Tyr Thr Lys
385 390 395 400
Ser Ser His Leu Lys Ala His Leu Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro
405 410 415
Tyr His Cys Asp Trp Asp Gly Cys Gly Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp
420 425 430
Glu Leu Thr Arg His Tyr Arg Lys His Thr Gly His Arg Pro Phe Gln
435 440 445
Cys Gln Lys Cys Asp Arg Ala Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Ala Leu
450 455 460
His Met Lys Arg His Phe
465 470
<210> 46
<211> 235
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 46
attttaatct cactagggtt ctgggagcac ccccccccac cgctcccgcc ctccacaaag 60
ctcctgggcc cctcctccct tcaaggattg cgaagagctg gtcgcaaatc ctcctaagcc 120
accagcatct cggtcttcag ctcacaccag ccttgagccc agcctgcggc caggggacca 180
cgcacgtccc acccacccag cgactcccca gccgctgccc actcttcctc actca 235
<210> 47
<211> 229
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 47
aatgtagtct tatgcaatac tcttgtagtc ttgcaacatg gtaacgatga gttagcaaca 60
tgccttacaa ggagagaaaa agcaccgtgc atgccgattg gtggaagtaa ggtggtacga 120
tcgtgcctta ttaggaaggc aacagacggg tctgacatgg attggacgaa ccactgaatt 180
gccgcattgc agagatattg tatttaagtg cctagctcga tacataaac 229
<210> 48
<211> 617
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 48
cattgattat tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca 60
tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac 120
gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact 180
ttccattgac gtcaatgggt ggactattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa 240
gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg 300
cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta 360
gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg 420
tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg 480
caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg 540
ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctggtttagt gaaccgtcag 600
atccgctaga gatccgc 617
<210> 49
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 49
tcgagtggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag 60
ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg 120
gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata 180
agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggtg 240
tcgtgaccgc gg 252
<210> 50
<211> 292
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 50
gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg aaaagtgagg cggccccttg 60
gaggaagggg ccgggcagaa tgatctaatc ggattccaag cagctcaggg gattgtcttt 120
ttctagcacc ttcttgccac tcctaagcgt cctccgtgac cccggctggg atttcgcctg 180
gtgctgtgtc agccccggtc tcccaggggc ttcccagtgg tccccaggaa ccctcgacag 240
ggcccggtct ctctcgtcca gcaagggcag ggacgggcca caggccaagg gc 292
<210> 51
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 51
gcctgtagcc ttaatctctc ctagcagggg gtttggggga gggaggagga gaaagaaagg 60
gccccttatg gctgagacac aatgacccag ccacaaggag ggattaccgg gcg 113
<210> 52
<211> 281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 52
aggtaggaag tggcctttaa ctccatagac cctatttaaa cagcttcgga caggtttaaa 60
catctccttg gataattcct agtatccctg ttcccactcc tactcaggga tgatagctct 120
aagaggtgtt aggggattag gctgaaaatg taggtcaccc ctcagccatc tgggaactag 180
aatgagtgag agaggagaga ggggcagaga cacacacatt cgcatattaa ggtgacgcgt 240
gtggcctcga acaccgagcg accctgcagc gacccgctta a 281
<210> 53
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 53
aacgtatcta cagtttactc cctatc 26
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 54
ggtaggaagt ggtacggaaa g 21
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 55
cactgacaat tccgtggtgt 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 56
gagatccgac tcgtctgagg 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 57
tgggaagaca acctgtaggg 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 58
tgaaaccccg tctctaccaa 20
<210> 59
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 59
acatcgccaa tcagcttgg 19
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 60
agaaccatac tcgaaccaca tcc 23
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 61
acagatgcaa ccgatgcacc 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 62
tggagttgta ctgcagggcg 20
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 63
gtgccccgac taaccgttg 19
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 64
gtcgttgaac tcctcggtct 20
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 65
atgcccctca acgtgaactt c 21
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 66
cgcaacatag gatggagagc a 21
<210> 67
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 67
gcgacaacaa gaagacgcgc at 22
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 68
ctggatgttg ggcaggacgc c 21
<210> 69
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 69
aagaaggacg gcaagaagcg ca 22
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 70
cgctcgaaga tgtcgttcac ga 22
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 71
gaagaagcct caccgctacc g 21
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 72
ggttggtgtc ctcaaacaga ccc 23
<210> 73
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 73
aacatccagg gcatcaccaa gc 22
<210> 74
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 74
gttctccagg aacaccttca gc 22
<210> 75
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 75
ccggcctcaa ggctctcta 19
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 76
tgccgcctca tactctcgaa 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 77
agtgtgacgt tgacatccgt 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 78
tgctaggagc cagagcagta 20
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 79
tcttcctggt ccccacagtt t 21
<210> 80
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 80
gcaagaatag ttctcgggat gaa 23
<210> 81
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 81
gtgtcttcct caactttctc cttgg 25
<210> 82
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 82
cgcggacagc cgcggccgtg gattgc 26
<210> 83
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 83
ggctccttgc tgtcattcat cttccac 27
<210> 84
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 84
caccgccgtc aggatctgga agttgg 26
<210> 85
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 85
ccggcctcaa ggctctcta 19
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 86
tgccgcctca tactctcgaa 20
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 87
tcaagcaatg gaccactggg 20
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 88
tctccatgag ctccctgaca 20
<210> 89
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 89
actcctggtg aacaaagtca ga 22
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 90
catccctgag agctcttgcc 20
<210> 91
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 91
ccaatgtgtc cgtcgtggat ct 22
<210> 92
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 92
gttgaagtcg caggagacaa cc 22
<210> 93
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 93
acatcaagac atcgtgcgat att 23
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 94
ccagcggtac acaaagacca 20
<210> 95
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 95
aagcacctcc gaaagtacgt g 21
<210> 96
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 96
ctccagctct accttacagt tga 23
<210> 97
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 97
gatagaacca accatgttga ggg 23
<210> 98
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 98
tggagctttg tagccagagg t 21
<210> 99
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 99
caccattggc aatgagcggt tc 22
<210> 100
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 100
aggtctttgc ggatgtccac gt 22
<210> 101
<211> 492
<212> DNA
<213> 智人
<400> 101
gatccggttc caggcctcgg ccctaaatag tctccctggg ctttcaagag aaccacatga 60
gaaaggagga ttcgggctct gagcagtttc accacccacc ccccagtctg caaatcctga 120
cccgtgggtc cacctgcccc aaaggcggac gcaggacagt agaagggaac agagaacaca 180
taaacacaga gagggccaca gcggctccca cagtcaccgc caccttcctg gcggggatgg 240
gtggggcgtc tgagtttggt tcccagcaaa tccctctgag ccgcccttgc gggctcgcct 300
caggagcagg ggagcaagag gtgggaggag gaggtctaag tcccaggccc aattaagaga 360
tcaggtagtg tagggtttgg gagcttttaa ggtgaagagg cccgggctga tcccacaggc 420
cagtataaag cgccgtgacc ctcaggtgat gcgccagggc cggctgccgt cggggacagg 480
gctttccata gc 492
<210> 102
<211> 900
<212> DNA
<213> 智人
<400> 102
agttaatgat taacccgcca tgctacttat ctacgtagcc atgctctagg aagatcggaa 60
ttcgccctta agctagcaga tcttccccac ctagccacct ggcaaactgc tccttctctc 120
aaaggcccaa acatggcctc ccagactgca acccccaggc agtcaggccc tgtctccaca 180
acctcacagc caccctggac ggaatctgct tcttcccaca tttgagtcct cctcagcccc 240
tgagctcctc tgggcagggc tgtttctttc catctttgta ttcccagggg cctgcaaata 300
aatgtttaat gaacgaacaa gagagtgaat tccaattcca tgcaacaagg attgggctcc 360
tgggccctag gctatgtgtc tggcaccaga aacggaagct gcaggttgca gcccctgccc 420
tcatggagct cctcctgtca gaggagtgtg gggactggat gactccagag gtaacttgtg 480
ggggaacgaa caggtaaggg gctgtgtgac gagatgagag actgggagaa taaaccagaa 540
agtctctagc tgtccagagg acatagcaca gaggcccatg gtccctattt caaacccagg 600
ccaccagact gagctgggac cttgggacag acaagtcatg cagaagttag gggaccttct 660
cctccctttt cctggatgga tcctgagtac cttctcctcc ctgacctcag gcttcctcct 720
agtgtcacct tggcccctct tagaagccaa ttaggccctc agtttctgca gcggggatta 780
atatgattat gaacaccccc aatctcccag atgctgattc agccaggagc ttaggagggg 840
gaggtcactt tataagggtc tgggggggtc agaacccaga gtcatcccct gaattctgca 900
<210> 103
<211> 521
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 103
ggttcttccc attttggcta catggtcttt ttttttacct ttttggttcc tttggccttt 60
tggcttttgg cttccagggc ttctggatcc cccccaaccc ctcccataca catacacatg 120
tgcactcgtg cactcaaccc agcacaggat aatgttcatt cttgaccttt ccacatacat 180
ctggctatgt tctctctctt atctacaata aatctcctcc actatactta ggagcagtta 240
tgttcttctt ctttctttct tttttttttt tttcattcag taacatcatc agaatcccct 300
agctctggcc tacctcctca gtaacaatca gctgatccct ggccactaat ctgtactcac 360
taatctgttt tccaaactct tggcccctga gctaattata gcagtgcttc atgccaccca 420
ccccaaccct attcttgttc tctgactccc actaatctac acattcagag gattgtggat 480
ataagaggct gggaggccag cttagcaacc agagctggag g 521
<210> 104
<211> 292
<212> DNA
<213> 智人
<400> 104
gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg aaaagtgagg cggccccttg 60
gaggaagggg ccgggcagaa tgatctaatc ggattccaag cagctcaggg gattgtcttt 120
ttctagcacc ttcttgccac tcctaagcgt cctccgtgac cccggctggg atttagcctg 180
gtgctgtgtc agccccggtc tcccaggggc ttcccagtgg tccccaggaa ccctcgacag 240
ggcccggtct ctctcgtcca gcaagggcag ggacgggcca caggccaagg gc 292
<210> 105
<211> 7390
<212> DNA
<213> 智人
<400> 105
ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg 60
atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc 120
cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg 180
atgcctgtag taatggtaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta 240
gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg 300
cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg 360
tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc 420
tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt 480
gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt 540
gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 600
atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 660
atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 720
aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 780
aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 840
ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 900
ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 960
tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 1020
ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 1080
acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 1140
gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 1200
cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 1260
aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac 1320
atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga 1380
gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg 1440
gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc 1500
tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt 1560
tagctcactc attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt 1620
ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaccatga ttacgccaga 1680
tttaattaag gccttaatta ggctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg cccgggcaaa 1740
gcccgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga 1800
gggagtggcc aactccatca ctaggggttc cttgtagtta atgattaacc cgccatgcta 1860
cttatctacg tagccatgct ctaggaagat cggaattctt tactccctat cagtgataga 1920
gaacgtatga agagtttact ccctatcagt gatagagaac gtatgcagac tttactccct 1980
atcagtgata gagaacgtat aaggagttta ctccctatca gtgatagaga acgtatgacc 2040
agtttactcc ctatcagtga tagagaacgt atctacagtt tactccctat cagtgataga 2100
gaacgtatat ccagtttact ccctatcagt gatagagaac gtataagctt taggcgtgta 2160
cggtgggcgc ctataaaagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc tggagcaatt 2220
ccacaacact tttgtcttat accaactttc cgtaccactt cctaccctcg taaagcggcc 2280
gcgccaccat ggcgggacac ctggcttcgg atttcgcctt ctcgccccct ccaggtggtg 2340
gaggtgatgg gccagggggg ccggagccgg gctgggttga tcctcggacc tggctaagct 2400
tccaaggccc tcctggaggg ccaggaatcg ggccgggggt tgggccaggc tctgaggtgt 2460
gggggattcc cccatgcccc ccgccgtatg agttctgtgg ggggatggcg tactgtgggc 2520
cccaggttgg agtggggcta gtgccccaag gcggcttgga gacctctcag cctgagggcg 2580
aagcaggagt cggggtggag agcaactccg atggggcctc cccggagccc tgcaccgtca 2640
cccctggtgc cgtgaagctg gagaaggaga agctggagca aaacccggag gagtcccagg 2700
acatcaaagc tctgcagaaa gaactcgagc aatttgccaa gctcctgaag cagaagagga 2760
tcaccctggg atatacacag gccgatgtgg ggctcaccct gggggttcta tttgggaagg 2820
tattcagcca aacgaccatc tgccgctttg aggctctgca gcttagcttc aagaacatgt 2880
gtaagctgcg gcccttgctg cagaagtggg tggaggaagc tgacaacaat gaaaatcttc 2940
aggagatatg caaagcagaa accctcgtgc aggcccgaaa gagaaagcga accagtatcg 3000
agaaccgagt gagaggcaac ctggagaatt tgttcctgca gtgcccgaaa cccacactgc 3060
agcagatcag ccacatcgcc cagcagcttg ggctcgagaa ggatgtggtc cgagtgtggt 3120
tctgtaaccg gcgccagaag ggcaagcgat caagcagcga ctatgcacaa cgagaggatt 3180
ttgaggctgc tgggtctcct ttctcagggg gaccagtgtc ctttcctctg gccccagggc 3240
cccattttgg taccccaggc tatgggagcc ctcacttcac tgcactgtac tcctcggtcc 3300
ctttccctga gggggaagcc tttccccctg tctctgtcac cactctgggc tctcccatgc 3360
attcaaacgc tagcggcagc ggcgccacga acttctctct gttaaagcaa gcaggagatg 3420
ttgaagaaaa ccccgggcct gcatgcatgt acaacatgat ggagacggag ctgaagccgc 3480
cgggcccgca gcaaacttcg gggggcggcg gcggcaactc caccgcggcg gcggccggcg 3540
gcaaccagaa aaacagcccg gaccgcgtca agcggcccat gaatgccttc atggtgtggt 3600
cccgcgggca gcggcgcaag atggcccagg agaaccccaa gatgcacaac tcggagatca 3660
gcaagcgcct gggcgccgag tggaaacttt tgtcggagac ggagaagcgg ccgttcatcg 3720
acgaggctaa gcggctgcga gcgctgcaca tgaaggagca cccggattat aaataccggc 3780
cccggcggaa aaccaagacg ctcatgaaga aggataagta cacgctgccc ggcgggctgc 3840
tggcccccgg cggcaatagc atggcgagcg gggtcggggt gggcgccggc ctgggcgcgg 3900
gcgtgaacca gcgcatggac agttacgcgc acatgaacgg ctggagcaac ggcagctaca 3960
gcatgatgca ggaccagctg ggctacccgc agcacccggg cctcaatgcg cacggcgcag 4020
cgcagatgca gcccatgcac cgctacgacg tgagcgccct gcagtacaac tccatgacca 4080
gctcgcagac ctacatgaac ggctcgccca cctacagcat gtcctactcg cagcagggca 4140
cccctggcat ggctcttggc tccatgggtt cggtggtcaa gtccgaggcc agctccagcc 4200
cccctgtggt tacctcttcc tcccactcca gggcgccctg ccaggccggg gacctccggg 4260
acatgatcag catgtatctc cccggcgccg aggtgccgga acccgccgcc cccagcagac 4320
ttcacatgtc ccagcactac cagagcggcc cggtgcccgg cacggccatt aacggcacac 4380
tgcccctctc acacatggca tgcggctccg gcgagggcag gggaagtctt ctaacatgcg 4440
gggacgtgga ggaaaatccc ggcccactcg agatggctgt cagcgacgcg ctgctcccat 4500
ctttctccac gttcgcgtct ggcccggcgg gaagggagaa gacactgcgt caagcaggtg 4560
ccccgaataa ccgctggcgg gaggagctct cccacatgaa gcgacttccc ccagtgcttc 4620
ccggccgccc ctatgacctg gcggcggcga ccgtggccac agacctggag agcggcggag 4680
ccggtgcggc ttgcggcggt agcaacctgg cgcccctacc tcggagagag accgaggagt 4740
tcaacgatct cctggacctg gactttattc tctccaattc gctgacccat cctccggagt 4800
cagtggccgc caccgtgtcc tcgtcagcgt cagcctcctc ttcgtcgtcg ccgtcgagca 4860
gcggccctgc cagcgcgccc tccacctgca gcttcaccta tccgatccgg gccgggaacg 4920
acccgggcgt ggcgccgggc ggcacgggcg gaggcctcct ctatggcagg gagtccgctc 4980
cccctccgac ggctcccttc aacctggcgg acatcaacga cgtgagcccc tcgggcggct 5040
tcgtggccga gctcctgcgg ccagaattgg acccggtgta cattccgccg cagcagccgc 5100
agccgccagg tggcgggctg atgggcaagt tcgtgctgaa ggcgtcgctg agcgcccctg 5160
gcagcgagta cggcagcccg tcggtcatca gcgtcagcaa aggcagccct gacggcagcc 5220
acccggtggt ggtggcgccc tacaacggcg ggccgccgcg cacgtgcccc aagatcaagc 5280
aggaggcggt ctcttcgtgc acccacttgg gcgctggacc ccctctcagc aatggccacc 5340
ggccggctgc acacgacttc cccctggggc ggcagctccc cagcaggact accccgaccc 5400
tgggtcttga ggaagtgctg agcagcaggg actgtcaccc tgccctgccg cttcctcccg 5460
gcttccatcc ccacccgggg cccaattacc catccttcct gcccgatcag atgcagccgc 5520
aagtcccgcc gctccattac caagagctca tgccacccgg ttcctgcatg ccagaggagc 5580
ccaagccaaa gaggggaaga cgatcgtggc cccggaaaag gaccgccacc cacacttgtg 5640
attacgcggg ctgcggcaaa acctacacaa agagttccca tctcaaggca cacctgcgaa 5700
cccacacagg tgagaaacct taccactgtg actgggacgg ctgtggatgg aaattcgccc 5760
gctcagatga actgaccagg cactaccgta aacacacggg gcaccgcccg ttccagtgcc 5820
aaaaatgcga ccgagcattt tccaggtcgg accacctcgc cttacacatg aagaggcatt 5880
tttaaatgac tagtgcgcgc agcggccgac catggcccaa cttgtttatt gcagcttata 5940
atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 6000
attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atctcggtac 6060
cggatccaaa ttcccgataa ggatcttcct agagcatggc tacgtagata agtagcatgg 6120
cgggttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg 6180
cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg 6240
ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ccttaattaa cctaattcac tggccgtcgt 6300
tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca 6360
tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 6420
gttgcgcagc ctgaatggcg aatgggacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg 6480
tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt 6540
cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg 6600
ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga 6660
ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac 6720
gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 6780
tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa 6840
aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgtttataat 6900
ttcaggtggc atctttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 6960
acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg 7020
aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc 7080
attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga 7140
tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aatagtggta agatccttga 7200
gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg 7260
cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc 7320
tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac 7380
agtaagagaa 7390
<210> 106
<211> 7265
<212> DNA
<213> 智人
<400> 106
ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg 60
atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc 120
cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg 180
atgcctgtag taatggtaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta 240
gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg 300
cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg 360
tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc 420
tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt 480
gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt 540
gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 600
atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 660
atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 720
aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 780
aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 840
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ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 960
tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 1020
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 107
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
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<212> DNA
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<220>
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cca 63
<210> 121
<211> 7390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 121
ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg 60
atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc 120
cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg 180
atgcctgtag taatggtaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta 240
gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg 300
cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg 360
tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc 420
tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt 480
gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt 540
gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 600
atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 660
atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 720
aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 780
aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 840
ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 900
ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 960
tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 1020
ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 1080
acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 1140
gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 1200
cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 1260
aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac 1320
atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga 1380
gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg 1440
gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc 1500
tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt 1560
tagctcactc attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt 1620
ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaccatga ttacgccaga 1680
tttaattaag gccttaatta ggctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg cccgggcaaa 1740
gcccgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga 1800
gggagtggcc aactccatca ctaggggttc cttgtagtta atgattaacc cgccatgcta 1860
cttatctacg tagccatgct ctaggaagat cggaattctt tactccctat cagtgataga 1920
gaacgtatga agagtttact ccctatcagt gatagagaac gtatgcagac tttactccct 1980
atcagtgata gagaacgtat aaggagttta ctccctatca gtgatagaga acgtatgacc 2040
agtttactcc ctatcagtga tagagaacgt atctacagtt tactccctat cagtgataga 2100
gaacgtatat ccagtttact ccctatcagt gatagagaac gtataagctt taggcgtgta 2160
cggtgggcgc ctataaaagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc tggagcaatt 2220
ccacaacact tttgtcttat accaactttc cgtaccactt cctaccctcg taaagcggcc 2280
gcgccaccat ggcgggacac ctggcttcgg atttcgcctt ctcgccccct ccaggtggtg 2340
gaggtgatgg gccagggggg ccggagccgg gctgggttga tcctcggacc tggctaagct 2400
tccaaggccc tcctggaggg ccaggaatcg ggccgggggt tgggccaggc tctgaggtgt 2460
gggggattcc cccatgcccc ccgccgtatg agttctgtgg ggggatggcg tactgtgggc 2520
cccaggttgg agtggggcta gtgccccaag gcggcttgga gacctctcag cctgagggcg 2580
aagcaggagt cggggtggag agcaactccg atggggcctc cccggagccc tgcaccgtca 2640
cccctggtgc cgtgaagctg gagaaggaga agctggagca aaacccggag gagtcccagg 2700
acatcaaagc tctgcagaaa gaactcgagc aatttgccaa gctcctgaag cagaagagga 2760
tcaccctggg atatacacag gccgatgtgg ggctcaccct gggggttcta tttgggaagg 2820
tattcagcca aacgaccatc tgccgctttg aggctctgca gcttagcttc aagaacatgt 2880
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aggagatatg caaagcagaa accctcgtgc aggcccgaaa gagaaagcga accagtatcg 3000
agaaccgagt gagaggcaac ctggagaatt tgttcctgca gtgcccgaaa cccacactgc 3060
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ctttccctga gggggaagcc tttccccctg tctctgtcac cactctgggc tctcccatgc 3360
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ttgaagaaaa ccccgggcct gcatgcatgt acaacatgat ggagacggag ctgaagccgc 3480
cgggcccgca gcaaacttcg gggggcggcg gcggcaactc caccgcggcg gcggccggcg 3540
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gcaagcgcct gggcgccgag tggaaacttt tgtcggagac ggagaagcgg ccgttcatcg 3720
acgaggctaa gcggctgcga gcgctgcaca tgaaggagca cccggattat aaataccggc 3780
cccggcggaa aaccaagacg ctcatgaaga aggataagta cacgctgccc ggcgggctgc 3840
tggcccccgg cggcaatagc atggcgagcg gggtcggggt gggcgccggc ctgggcgcgg 3900
gcgtgaacca gcgcatggac agttacgcgc acatgaacgg ctggagcaac ggcagctaca 3960
gcatgatgca ggaccagctg ggctacccgc agcacccggg cctcaatgcg cacggcgcag 4020
cgcagatgca gcccatgcac cgctacgacg tgagcgccct gcagtacaac tccatgacca 4080
gctcgcagac ctacatgaac ggctcgccca cctacagcat gtcctactcg cagcagggca 4140
cccctggcat ggctcttggc tccatgggtt cggtggtcaa gtccgaggcc agctccagcc 4200
cccctgtggt tacctcttcc tcccactcca gggcgccctg ccaggccggg gacctccggg 4260
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ttcacatgtc ccagcactac cagagcggcc cggtgcccgg cacggccatt aacggcacac 4380
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gggacgtgga ggaaaatccc ggcccactcg agatggctgt cagcgacgcg ctgctcccat 4500
ctttctccac gttcgcgtct ggcccggcgg gaagggagaa gacactgcgt caagcaggtg 4560
ccccgaataa ccgctggcgg gaggagctct cccacatgaa gcgacttccc ccagtgcttc 4620
ccggccgccc ctatgacctg gcggcggcga ccgtggccac agacctggag agcggcggag 4680
ccggtgcggc ttgcggcggt agcaacctgg cgcccctacc tcggagagag accgaggagt 4740
tcaacgatct cctggacctg gactttattc tctccaattc gctgacccat cctccggagt 4800
cagtggccgc caccgtgtcc tcgtcagcgt cagcctcctc ttcgtcgtcg ccgtcgagca 4860
gcggccctgc cagcgcgccc tccacctgca gcttcaccta tccgatccgg gccgggaacg 4920
acccgggcgt ggcgccgggc ggcacgggcg gaggcctcct ctatggcagg gagtccgctc 4980
cccctccgac ggctcccttc aacctggcgg acatcaacga cgtgagcccc tcgggcggct 5040
tcgtggccga gctcctgcgg ccagaattgg acccggtgta cattccgccg cagcagccgc 5100
agccgccagg tggcgggctg atgggcaagt tcgtgctgaa ggcgtcgctg agcgcccctg 5160
gcagcgagta cggcagcccg tcggtcatca gcgtcagcaa aggcagccct gacggcagcc 5220
acccggtggt ggtggcgccc tacaacggcg ggccgccgcg cacgtgcccc aagatcaagc 5280
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ggccggctgc acacgacttc cccctggggc ggcagctccc cagcaggact accccgaccc 5400
tgggtcttga ggaagtgctg agcagcaggg actgtcaccc tgccctgccg cttcctcccg 5460
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ccaagccaaa gaggggaaga cgatcgtggc cccggaaaag gaccgccacc cacacttgtg 5640
attacgcggg ctgcggcaaa acctacacaa agagttccca tctcaaggca cacctgcgaa 5700
cccacacagg tgagaaacct taccactgtg actgggacgg ctgtggatgg aaattcgccc 5760
gctcagatga actgaccagg cactaccgta aacacacggg gcaccgcccg ttccagtgcc 5820
aaaaatgcga ccgagcattt tccaggtcgg accacctcgc cttacacatg aagaggcatt 5880
tttaaatgac tagtgcgcgc agcggccgac catggcccaa cttgtttatt gcagcttata 5940
atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 6000
attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atctcggtac 6060
cggatccaaa ttcccgataa ggatcttcct agagcatggc tacgtagata agtagcatgg 6120
cgggttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg 6180
cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg 6240
ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ccttaattaa cctaattcac tggccgtcgt 6300
tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca 6360
tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 6420
gttgcgcagc ctgaatggcg aatgggacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg 6480
tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt 6540
cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg 6600
ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga 6660
ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac 6720
gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 6780
tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa 6840
aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgtttataat 6900
ttcaggtggc atctttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 6960
acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg 7020
aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc 7080
attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga 7140
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cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc 7320
tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac 7380
agtaagagaa 7390
<210> 122
<211> 6586
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 122
aattcagaga ccgggaacca aactagcctt taaaaaacat aagtacagga gccagcaaga 60
tggctcagtg ggtaaaggtg cctaccagca agcctgacag cctgagttca gtccccacga 120
actacgtggt aggagaggac caaccaactc tggaaatctg ttctgcaaac acatgctcac 180
acacacacac acaaatagta taaacaattt taaatttcat ttaaaaataa tttgtaaaca 240
aaatcattag cacaggtttt agaaagagcc tcttggtgac atcaagttga tgctgtagat 300
ggggtatcat tcctgaggac ccaaaaccgg gtctcagcct ttccccattc tgagagttct 360
ctcttttctc agccactagc tgaagagtag agtggctcag cactgggctc ttgagttccc 420
aagtcctaca actggtcagc ctgactacta accagccatg aagaaacaag gagtggatgg 480
gctgagtctg ctgggatggg agtggagtta gtaagtggcc atggatgtaa tgaccccagc 540
aatgctggct agaaggcatg cctcctttcc ttgtctggag acggaacggg agggatcatc 600
ttgtactcac agaagggaga acattctagc tggttgggcc aaaatgtgca agttcacctg 660
gaggtggtgg tgcatgcttt taactccagt actcaggagg cagggccagg tggatctctg 720
tgagttcaag accagcctgc actatggaga gagttttggg acagccagag ttacacagaa 780
aaatcctggt ggaaaatctg aaagaaagag agaaagaaag aaagaaagaa aggaagaaag 840
aaagaaagag tggcaggcag gcaggcagga ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaggaagg 900
aaggaaggaa ggaaaatagg tgcgacttca agatccggag ttacaagcag aatgcactgt 960
ttccctaaca gggccaagtg ttttgagtaa ctgaaggtgg gcatgatgcc tgggaagcag 1020
aaacaagcca ggcagatgca ccccttgcct tgcttccgaa gggctgcagt agcatggaaa 1080
acatggaaaa caaccaatcc attccctttg ctgatataac aggctccaaa gccaaaacct 1140
gtcactggag gctcaagagc agatctccag ccaagaggca aaggaatggg ggaagctgga 1200
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gcagcaagcc acttcggaca cccaaatgga acacctccag tcagccctcg ccgaccaccc 1440
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ctaacggacg ctttcgaaga gtgggtgccg gaggagaacc atgaggaagg acatcaagga 1860
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aggtaagaaa accgcaatgt tgcgggaggg gactgggtgg caggcgcggg ggaggggaaa 2040
gctagaaagg atgcgaggga gcggaggggg gagggagcgg gagaatctca actggtagag 2100
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gggcgcaaag tttgtctggg tgtgggctta ggtgggctgg gtatgagatt cggggcgccg 2220
aaaacactgc tgcgcctctg ccaaatcacg ctacccctgt atctagttct gccaggcttc 2280
tccagcccca gccccaattc ttttctctag tgttccccct tccctcccct gaatctcaag 2340
cccacactcc ctcctccata acccactgtt atcaaatcta agtcatttgc cacccaacaa 2400
ccatcaggag gcggaagcag acgggaggag tttgagatca acttgggcta catcacgagt 2460
tccaggctca ccaaggcttc ttaaggagac cttgtctcta aaattaatta attaattaat 2520
taatagtccc ctttctctgc cacagaacct tgggatctgg ctcctggtcg cagctccccc 2580
caccccaggc tgacattcac tgccatagcc catccggaaa tcctagtcta tttccccatg 2640
gatcttgaac tgcagagaga atggcagagt ggcccgccct gtgcaaagga tgttcctagc 2700
ctaggtggag ctcgcgaact cgcagactgt gcctctcttg ggcaaggaca ggctagacag 2760
cctgccggtg tgttgagcta gggcactgtg gggaaggcag agaacctgtg cagggcagca 2820
atgaacacag gaccagaaaa ctgcagccct aggaacactc aagagctggc catttgcaag 2880
catctctggc ctccgtgctt ctcactcatg tcccatgtct tatacaggcc tctgtggcac 2940
ctcgcttgcc tgatctcatc cctagccgtt aagctttctg catgacttat cacttggggc 3000
ataatgctgg atacctacca ttttcttaga ccccatcaaa atcctatttg agtgtacggt 3060
tcggagaacc tcatttatcc ggtaaatgtc ttttactctg ctctcaggga gctgaggcag 3120
gacatcctga gatacattgg gagaggagat acagtttcaa taaaataata ggttgggtgg 3180
aggtacatgc ctataatgcc accactcagg aaatggtggc agcttcgtga gtttgaggcc 3240
aacccaagaa acatagtgaa accctgtcag taaataagta agcaagtatt tgagtatcta 3300
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cccccacccc cgccacttct ccctccatgc ataccactag ctgtcatttt gtactctgta 4320
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ataagggcgt atggtgggta ggggaggcag gatatcagtc cctggggcga gttcctccct 4440
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ctggtacagt catactctgt tgaaagaatc atcggggagg ggggggggct caagagggga 4560
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cattctcagc caccacacac aagcgctctg ccatcactga agaagccccc tagggctctt 4680
gggccagggc acactcagta aagatgcagg ttcagtcagg gaatgatggg gaaaggggta 4740
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agtccgtgca ggaaggggat cctagaacca tctggttgga cccagcttac caagggagag 4920
cctttattct tctttccctt gcccctctgt gccagcccct cttgctgtcc ctgatccccc 4980
agacagcgag agtcttgcaa cctgcctctt ccaagacctc ctaatctcag gggcaggcgg 5040
tggagtgaga tccggcgtgc acactttttg gaagatagct ttcccaagga tcctctcccc 5100
cactggcagc tctgcctgtc ccatcaccat gtataatacc accactgcta cagcatctca 5160
ccgaggaaag aaaactgcac aataaaacca agcctctgga gtgtgtcctg gtgtctgtct 5220
cttctgtgtc ctggcgtctg tctcttctgt gttcttccaa ggtcagaaac aaaaaccaca 5280
cacttcaacc tggatggctc ggctgagcac ttctgtgtgc agaaggtcca accagactct 5340
ggggtacccc ggccctccct attcccttgc ctcctgtctc ccgcttttta tagctcccta 5400
tgctgggctt ctctggagag tgaaatcttt gcccaaatca atgcgcattc tctctgctga 5460
gtcatctggc gacagcagtt gagttcaccc gccaacacat gggcccagct atgtagccga 5520
accctggctc tggaagtgcc agggactttg tgcataagta tgtaccatgc ccttttttca 5580
cagtcctagc tctgcagaag tgcagcctga aggcctgtct gctgagagga catgccctgg 5640
agccctgaaa caggcacagt gggaggagga acggaggatg acaggcatca ggccctcagt 5700
ccaaaagcaa ccacttgaga atgggctgga gtacgaaaca tggggtcccg tccctggatc 5760
cctcctcaaa gagtaataag taaaatataa acaggtaccc caggccgttc tgggtttggg 5820
ttgtaatggg atccatttgc agagaactat tgagacagcc cagccgtact gtgacaggca 5880
atgtggggga ggaggttgaa tcacttggta tttagcatga atagaataat tccctgaaca 5940
tttttcttaa acatccatat ctaaattacc accactcgct cccagtcttc ctgcctttgc 6000
gccagcctcc tgtctggcca tgcctgaaga aggctggaga agccacccac ctcaggccat 6060
gacactgcca gccacttggc aggtgcagcc aaacctgagc tgtcccagaa agggacattc 6120
tcaagaccca ggcaccctga tcagcactga cttggagcta caagtgtcat gccagaaaag 6180
tctctaagaa aaccttttca gggaaaaggg ggtgactcaa caccgggcaa gtttgggaag 6240
ccccaccctt cgagtgatgg aagagcagat aggaagcctc agaagagaga caccggcacc 6300
caggtaacgt tcctcatgtg gtctctgtca cactaggtgc tcttccctgg acatctccgt 6360
gaccacactc tcagttctta gggagatgcg ggtgctctct gaggctatct cagagttgca 6420
gattctgagg cctagagtga ctacagtcag cctaggaagc cacagaggac tgtggaccag 6480
gagggcagaa gaggagaagg gaagaaaaac catcagatag gacttgcaat gaaactaacc 6540
caagacaatc ataatgcaga caggaatgtt aaaggcgttc agcagc 6586

Claims (57)

1.组合物，其用于使有此需要的受试者中至少一种细胞，组织或器官恢复活力，所述组合物包含：
a)诱导OCT4表达的药剂；
b)诱导SOX2表达的药剂；和
c)诱导KLF4表达的药剂。
2.使有此需要的受试者中至少一种细胞，组织或器官恢复活力的方法，其包括向所述受试者体内施用包含以下项的组合物：
a)诱导OCT4表达的药剂；
b)诱导SOX2表达的药剂；和
c)诱导KLF4表达的药剂。
3.权利要求1-2中任一项的组合物或方法，其中使至少一种细胞恢复活力不包括将至少一种细胞，组织或器官重编程为多能状态。
4.权利要求1-3中任一项的组合物或方法，其中所述组合物诱导OCT4表达，SOX2和/或KLF4达如下的时间段，所述时间段足以使至少一种细胞，组织或器官恢复活力，而不足以将所述细胞重编程为多能状态。
5.权利要求1-4中任一项的组合物或方法，其中在向所述受试者施用所述组合物之后，至少一种恢复活力的细胞，组织或器官不表达至少一种干细胞标志物。
6.权利要求5的组合物或方法，其中所述干细胞标志物是Esrrb，Nanog，Lin28，TRA-1-60/TRA-1-81/TRA-2-54，SSEA1，SSEA4或其任何组合。
7.权利要求1-6中任一项的组合物或方法，其中在向所述受试者施用所述组合物之后，至少一种恢复活力的细胞，组织或器官表达RBPMS，Brn3a或其任何组合。
8.权利要求1-7中任一项的组合物或方法，其中使至少一种细胞，组织或器官恢复活力包括在至少一种细胞，组织或器官中恢复表观遗传信息。
9.权利要求1-8中任一项的组合物或方法，其中使至少一种细胞，组织或器官恢复活力包括恢复所述至少一种细胞，组织或器官中由于衰老，损伤，疾病或其任何组合而丢失的表观遗传信息。
10.权利要求1-9中任一项的组合物或方法，其中使至少一种细胞，组织或器官恢复活力包括将所述细胞，组织或器官的表观遗传状态重建为类似于在受精或最终分化后不久形成的状态的表观遗传状态。
11.权利要求1-10中任一项的组合物或方法，其中所述药剂是核酸，小分子，抗体或多肽。
12.权利要求1-11中任一项的组合物或方法，其中所述药剂包括至少一个纳米颗粒。
13.权利要求11-12中任一项的组合物或方法，其中所述药剂被包封在至少一个纳米颗粒中。
14.权利要求11-13中任一项的组合物或方法，其中所述核酸是DNA或RNA。
15.权利要求14的组合物或方法，其中所述DNA是质粒DNA。
16.权利要求14的组合物或方法，其中所述RNA是mRNA。
17.权利要求11-16中任一项的组合物或方法，其中所述诱导OCT4表达的药剂是编码OCT4的工程化核酸。
18.权利要求11-17中任一项的组合物或方法，其中所述诱导SOX2表达的药剂是编码SOX2的工程化核酸。
19.权利要求11-18中任一项的组合物或方法，其中所述诱导KLF4表达的药剂是编码KLF4的工程化核酸。
20.权利要求17、18或19的组合物或方法，其中所述工程化核酸存在于一种或多种表达载体上。
21.权利要求20的组合物或方法，其中所述工程化核酸存在于同一表达载体上。
22.权利要求20或21中任一项的组合物或方法，其中所述表达载体包括与所述工程化核酸的任一种或其组合可操作连接的诱导型启动子。
23.权利要求22的组合物或方法，其中所述启动子是TRE3G，TRE2启动子或P紧密启动子。
24.权利要求22或权利要求23的组合物或方法，其中所述启动子包含四环素应答元件(TRE)。
25.权利要求20-24中任一项的组合物或方法，其中所述表达载体包含自切割肽。
26.权利要求25的组合物或方法，其中所述自切割肽是2A肽。
27.权利要求20-26中任一项的组合物或方法，其中所述表达载体包含位于第一核酸，第二核酸，第三核酸或其组合的侧翼的反向末端重复(ITR)，其中所述ITR之间的距离为4.7kb或更小。
28.前述权利要求中任一项的组合物或方法，其中所述组合物进一步包含诱导剂，或者其中所述方法进一步包括向所述受试者施用诱导剂。
29.根据权利要求28的组合物或方法，其中所述诱导剂是四环素或反向四环素控制的反式激活物(rtTA)。
30.权利要求29的组合物或方法，其中所述四环素是强力霉素。
31.权利要求29或权利要求30的组合物或方法，其中所述rtTA存在于表达载体中。
32.权利要求31的组合物或方法，其中所述表达载体不是与编码Oct4，Sox2和/或KLF4的工程化核酸相同的表达载体。
33.权利要求29-32中任一项的组合物或方法，其中所述rtTA是M2-rtTA或rtTA3。
34.权利要求20-33中任一项的组合物或方法，其中所述表达载体是病毒载体。
35.权利要求34的组合物或方法，其中所述病毒载体是慢病毒，逆转录病毒，腺病毒，α病毒，牛痘病毒或腺相关病毒(AAV)载体。
36.权利要求34或权利要求35的组合物或方法，其中所述AAV载体是AAV2或AAV9。
37.前述权利要求中任一项的组合物或方法，其中所述受试者患有，怀疑患有，或具风险患眼疾病，衰老，癌症，肌肉骨骼疾病，与年龄有关的疾病或神经退行性疾病。
38.权利要求中任一项的组合物或方法，其中所述受试者是人类或非人类哺乳动物。
39.前述权利要求中任一项的组合物或方法，其中所述细胞，组织或器官来自眼，耳，鼻，口，包括牙龈和牙根，骨，肺，乳房(breast)，乳房(udder)，胰腺，胃，食道，肌肉，包括心肌，肝，血管，皮肤，包括毛发，心脏，脑，神经组织，肾，睾丸，前列腺，阴茎，泄殖腔，鳍，卵巢或肠。
40.前述权利要求中任一项的组合物或方法，其中所述施用是对所述组织或器官的直接施用。
41.表达载体，其按以下顺序包含核酸元件：
a.第一反向末端重复序列(ITR)序列；
b.TRE3G启动子序列；
c.Oct4序列；
d.P2A切割序列；
e.Sox2序列；
f.T2A切割序列；
g.Klf4序列；
h.SV-40衍生的终止子序列；和
i.第二反向末端重复(ITR)序列。
42.权利要求41的表达载体，其中所述Oct4序列是SEQ ID NO:40。
43.权利要求41或权利要求42的表达载体，其中所述Sox2序列是SEQ ID NO:42。
44.权利要求41-43中任一项的表达载体，其中所述Klf4序列编码人Klf4蛋白。
45.权利要求41-44中任一项的表达载体，其中所述Klf4序列是SEQ ID NO:44。
46.权利要求41-45中任一项的表达载体，其中所述P2A序列编码具有序列GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:118)的多肽。
47.权利要求41-46中任一项的表达载体，其中所述P2A序列是GGCAGCGGCGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCT(SEQ ID NO:119)。
48.权利要求41-47中任一项的表达载体，其中所述T2A序列编码SEQ ID NO:9的多肽。
49.权利要求41-48中任一项的表达载体，其中所述T2A序列是GGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCA(SEQ ID NO:120)。
50.权利要求41-49中任一项的表达载体，其中所述TRE3G启动子序列是SEQ ID NO:7。
51.权利要求41-50中任一项的表达载体，其中所述SV-40衍生的终止子序列是SEQ IDNO:8。
52.权利要求41-51中任一项的表达载体，其中所述TRE3G启动子序列包含至少一个最小CMV启动子序列。
53.权利要求41-52中任一项的表达载体，其中所述至少一个最小CMV启动子序列是SEQID NO:20。
54.权利要求41-53中任一项的表达载体，其中所述第一ITR序列是SEQ ID NO:22。
55.权利要求41-54中任一项的表达载体，其中所述构建体包含SEQ ID NO:38。
56.权利要求41-55中任一项的表达载体，其中所述构建体包含SEQ ID NO:121。
57.权利要求41-56中任一项的表达载体，其中所述构建体被包封在至少一个纳米颗粒中。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110628821A (zh) * 2018-06-25 2019-12-31 首都医科大学宣武医院 一种细胞模型及其制备方法、应用
CN114240934A (zh) * 2022-02-21 2022-03-25 深圳大学 一种基于肢端肥大症的图像数据分析方法及系统
CN114622020A (zh) * 2022-03-30 2022-06-14 华南农业大学 一种与鸡生长性状相关的klhl31基因分子标记及应用
CN115607689A (zh) * 2022-10-13 2023-01-17 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 Klf7基因在制备逆转细胞衰老的药物中的应用
CN116555432A (zh) * 2023-07-05 2023-08-08 广州凯普医药科技有限公司 一种膀胱癌快速检测试剂盒
CN116898988A (zh) * 2023-08-15 2023-10-20 臻赫医药(杭州)有限公司 皮肤重编程因子制剂、生物材料及用途
WO2024012503A1 (zh) * 2022-07-12 2024-01-18 南京瑞初医药有限公司 组合物及其使用方法
WO2024012502A1 (zh) * 2022-07-12 2024-01-18 南京瑞初医药有限公司 组合物及其使用方法
WO2024012504A1 (zh) * 2022-07-12 2024-01-18 南京瑞初医药有限公司 组合物及其使用方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022217142A1 (en) * 2021-04-09 2022-10-13 Washington University Compositions and methods for treatment of crx-linked retinopathies
WO2023192876A1 (en) * 2022-03-28 2023-10-05 Reilly Steve E Composition to increase cellular longevity
WO2023196851A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 President And Fellows Of Harvard College Reversing aging of the central nervous system
WO2023200223A1 (ko) * 2022-04-15 2023-10-19 주식회사 로노 노화 세포의 회춘 또는 세포 노화의 지연 또는 방지용 조성물
WO2024020033A2 (en) * 2022-07-19 2024-01-25 Syntax Bio, Inc. Systems for stem cell programming and methods thereof
WO2024073570A1 (en) * 2022-09-28 2024-04-04 Altos Labs, Inc. Expression of regeneration factors in aged/senescent cells
CN116041477B (zh) * 2022-10-13 2023-08-08 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 Tdgf1基因在制备治疗衰老相关疾病或逆转细胞衰老的药物中的应用
CN116970604B (zh) * 2023-04-24 2024-03-08 首都儿科研究所 一种shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090047263A1 (en) * 2005-12-13 2009-02-19 Kyoto University Nuclear reprogramming factor and induced pluripotent stem cells
US20100190250A1 (en) * 2005-10-14 2010-07-29 Jifan Hu Methods of Rejuvenating Cells In Vitro and In Vivo
CN103562376A (zh) * 2011-04-08 2014-02-05 国家医疗保健研究所 复壮细胞的方法
CN104919048A (zh) * 2012-10-01 2015-09-16 台北荣民总医院 制备诱导多能干细胞的方法及其应用

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4217344A (en) 1976-06-23 1980-08-12 L'oreal Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4186183A (en) 1978-03-29 1980-01-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis
US4261975A (en) 1979-09-19 1981-04-14 Merck & Co., Inc. Viral liposome particle
US4485054A (en) 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4774085A (en) 1985-07-09 1988-09-27 501 Board of Regents, Univ. of Texas Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5549910A (en) 1989-03-31 1996-08-27 The Regents Of The University Of California Preparation of liposome and lipid complex compositions
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1991017424A1 (en) 1990-05-03 1991-11-14 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
JP3218637B2 (ja) 1990-07-26 2001-10-15 大正製薬株式会社 安定なリポソーム水懸濁液
JP2958076B2 (ja) 1990-08-27 1999-10-06 株式会社ビタミン研究所 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法
US5399363A (en) 1991-01-25 1995-03-21 Eastman Kodak Company Surface modified anticancer nanoparticles
US5543158A (en) 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
US5651981A (en) 1994-03-29 1997-07-29 Northwestern University Cationic phospholipids for transfection
US5741516A (en) 1994-06-20 1998-04-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5767099A (en) 1994-12-09 1998-06-16 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles containing amino acid or dervatized amino acid groups for intracellular delivery of therapeutic molecules
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US5830430A (en) 1995-02-21 1998-11-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Cationic lipids and the use thereof
IE80468B1 (en) 1995-04-04 1998-07-29 Elan Corp Plc Controlled release biodegradable nanoparticles containing insulin
US5851548A (en) 1995-06-07 1998-12-22 Gen-Probe Incorporated Liposomes containing cationic lipids and vitamin D
US5738868A (en) 1995-07-18 1998-04-14 Lipogenics Ltd. Liposome compositions and kits therefor
CA2325088A1 (en) 2000-12-01 2002-06-01 Fusogenix Inc. Novel membrane fusion proteins derived from poikilothermic reovirus
ATE520707T1 (de) 2001-11-13 2011-09-15 Univ Pennsylvania Verfahren für den nachweis und/oder die identifikation von sequenzen des adeno- assoziierten virus (aav) sowie isolation von dadurch identifizierten, neuen sequenzen
WO2006023207A2 (en) 2004-08-19 2006-03-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services, Nih Coacervate of anionic and cationic polymer forming microparticles for the sustained release of therapeutic agents
JP2006248978A (ja) 2005-03-10 2006-09-21 Mebiopharm Co Ltd 新規なリポソーム製剤
WO2010026537A1 (en) 2008-09-05 2010-03-11 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Novel multimodular assembly useful for intracellular delivery
US8636884B2 (en) 2008-09-15 2014-01-28 Abbott Diabetes Care Inc. Cationic polymer based wired enzyme formulations for use in analyte sensors
US8734809B2 (en) 2009-05-28 2014-05-27 University Of Massachusetts AAV's and uses thereof
WO2011000106A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Improved cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
WO2011068916A1 (en) 2009-12-01 2011-06-09 Intezyne Technologies, Incorporated Pegylated polyplexes for polynucleotide delivery
GB201008267D0 (en) 2010-05-18 2010-06-30 Univ Edinburgh Cationic lipids
JP5957646B2 (ja) 2010-06-04 2016-07-27 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｉｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． オリゴヌクレオチド送達のための新規な低分子量カチオン性脂質
BR112013006381B1 (pt) 2010-09-20 2024-02-15 Spi Pharma Inc Composição que compreende um material de núcleo tendo um valor de sabor e um revestimento polimérico e formulação farmacêutica
CA2813300A1 (en) 2010-09-29 2012-04-05 Innovascreen Inc. Recombinant polypeptides for membrane fusion and uses thereof
WO2012070031A1 (en) 2010-11-26 2012-05-31 University Of The Witwatersrand, Johannesburg Polymeric matrix of polymer-lipid nanoparticles as a pharmaceutical dosage form
KR101255338B1 (ko) 2010-12-15 2013-04-16 포항공과대학교 산학협력단 표적 세포에 대한 폴리뉴클레오티드 전달체
WO2012083017A2 (en) 2010-12-16 2012-06-21 Celgene Corporation Controlled release oral dosage forms of poorly soluble drugs and uses thereof
US8709466B2 (en) 2011-03-31 2014-04-29 International Business Machines Corporation Cationic polymers for antimicrobial applications and delivery of bioactive materials
WO2012148953A1 (en) 2011-04-25 2012-11-01 Stc.Unm Solid compositions for pharmaceutical use
US8691750B2 (en) 2011-05-17 2014-04-08 Axolabs Gmbh Lipids and compositions for intracellular delivery of biologically active compounds
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100190250A1 (en) * 2005-10-14 2010-07-29 Jifan Hu Methods of Rejuvenating Cells In Vitro and In Vivo
US20090047263A1 (en) * 2005-12-13 2009-02-19 Kyoto University Nuclear reprogramming factor and induced pluripotent stem cells
CN103562376A (zh) * 2011-04-08 2014-02-05 国家医疗保健研究所 复壮细胞的方法
CN104919048A (zh) * 2012-10-01 2015-09-16 台北荣民总医院 制备诱导多能干细胞的方法及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRYCE W. CAREY ET AL.: "Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector", PROC NATL ACAD SCI U S A., vol. 106, no. 1, pages 157 *
吴佳慧;崔红平;: "诱导多能干细胞在眼科疾病的研究进展", 国际眼科杂志, no. 02, pages 295 - 298 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110628821A (zh) * 2018-06-25 2019-12-31 首都医科大学宣武医院 一种细胞模型及其制备方法、应用
CN114240934A (zh) * 2022-02-21 2022-03-25 深圳大学 一种基于肢端肥大症的图像数据分析方法及系统
CN114622020A (zh) * 2022-03-30 2022-06-14 华南农业大学 一种与鸡生长性状相关的klhl31基因分子标记及应用
CN114622020B (zh) * 2022-03-30 2022-09-27 华南农业大学 一种与鸡生长性状相关的klhl31基因分子标记及应用
WO2024012503A1 (zh) * 2022-07-12 2024-01-18 南京瑞初医药有限公司 组合物及其使用方法
WO2024012502A1 (zh) * 2022-07-12 2024-01-18 南京瑞初医药有限公司 组合物及其使用方法
WO2024012504A1 (zh) * 2022-07-12 2024-01-18 南京瑞初医药有限公司 组合物及其使用方法
CN115607689A (zh) * 2022-10-13 2023-01-17 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 Klf7基因在制备逆转细胞衰老的药物中的应用
CN116555432A (zh) * 2023-07-05 2023-08-08 广州凯普医药科技有限公司 一种膀胱癌快速检测试剂盒
CN116555432B (zh) * 2023-07-05 2023-09-05 广州凯普医药科技有限公司 一种膀胱癌快速检测试剂盒
CN116898988A (zh) * 2023-08-15 2023-10-20 臻赫医药(杭州)有限公司 皮肤重编程因子制剂、生物材料及用途

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