JP2022511373A - 加齢を逆行ならびに臓器および組織再生を促進するための細胞リプログラミング - Google Patents

加齢を逆行ならびに臓器および組織再生を促進するための細胞リプログラミング Download PDF

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Abstract

OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする操作された核酸（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、AAVベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターを包含する発現ベクター）が本願において提供され、これらは、例えば、細胞リプログラミングを誘導すること、組織修復、組織再生、臓器再生、加齢を逆行させること、またはそれらのいずれかの組み合わせに有用である。操作された核酸（例えば、操作された核酸）を含む組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、またはAAV）と、操作された核酸、組み換えウイルスを含む操作された細胞、組成物と、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を活性化することができる操作された細胞、操作された蛋白質、化学的因子と、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される操作された蛋白質と、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を活性化することができる抗体と、（例えば眼疾患）を処置、疾患（例えば眼疾患）を防止、細胞リプログラミングを制御（例えば、誘導、または誘導およびそれから停止）、組織修復を制御、組織再生を制御する方法、またはそれらのいずれかの組み合わせともまた本願において提供される）。

Description

関連出願
本願は、2018年9月28日出願のU.S.仮出願番号62/738,922、2019年1月14日出願のU.S.仮出願番号62/792,283、2019年6月24日出願のU.S.仮出願番号62/865,877、および2019年7月30日出願のU.S.仮出願番号62/880,488の35U.S.C.§119(e)による優先権を主張する。これらのそれぞれはその全体が参照によって本願に組み込まれる。
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所（NIH）によって授与された助成金番号R01AG019719およびR01DK100263の下で政府の支援によってなされた。政府は本発明にある種の権利を有する。
脊椎動物を包含する多くの動物では、不可欠な臓器は再生および修復の限定された固有の能力を有する。急性傷害および慢性障害は、特に心臓、膵臓、脳、腎臓、筋肉、皮膚、および神経組織を包含する不可欠な臓器および組織にダメージを与え得る。しかしながら、成熟体細胞は多くの場合にはこれらの損傷から生存し得ず、それらが生存する場合であっても、それらは、自己複製及び分化転換してダメージを受けた細胞を置換することができない。さらにその上、自己複製ができる細胞は数量が限定され得、限定された能力を有し、特に年齢によるダメージの影響を受けやすい。成体からの体細胞とは対照的に、暦年齢的に受精に近い個体からの細胞、例えば胚および乳幼児からのものは、細胞の若々しさを呈示し、傷害およびストレスに抵抗するための、臓器および組織を治癒、複製、および再生するためのより多大な能力を有する。それゆえに、細胞を若返らせ、それによってそれらを加齢した成熟した状態からより若いより元気な状態に復元することに向けられた組成物および方法は、ある種の傷害および疾患を処置するために、ならびに一般的に生物全体において加齢を逆行させるためにおよび防止するために、長く探し求められてきた。
体内の情報の2つの型がある：デジタルおよびアナログである。DNAはデジタル情報であり、エピゲノムはアナログ情報である。アナログ情報は常にデジタルほど長くは持ちこたえず、アナログ情報はデジタル情報と比較して高いフィデリティでコピーもされ得ない。これは、いかに長く生物が生き、育つかにとって重大さを有する。かつては、加齢は細胞の遺伝物質の変異によって駆動されるプロセスとして考えられていた。これは説明としては概ね放棄されている。今では、加齢の主要な原因は、エピジェネティックな変化を原因とすると考えられている。これらは、細胞が最適な機能にとって間違った時に間違った遺伝子を転写することを引き起こす。経時的により機能異常になり、疾患、治癒することの不能、およびついには死亡に至るプロセスである。山中因子（OCT4、SOX2、c－Myc、およびKLF4）はインビトロで多能性を誘導すること（Takahashi et al., Cell. 2006 Aug 25;126(4):663－76）および加齢のDNAメチル化（methlylation）時計を逆行させること（Horvath, Genome Biol. 2013）が先に示されている。NanogおよびLin28は山中因子と一緒になって多能性（pluoripotency）を誘導することを助け得る。かつ、Tet1、NR5A－2、Sall4、NKX3－1はOct4を代替し得る（Gao et al., Cell Stem Cell 12, 1－17, April 4, 2013およびMai et al., Nature Cell Biology 20, 900－908, 2018）。しかしながら、トランスジェニックマウスにおける元々の4つの転写因子の発現は、腸上皮の異形成のような他の急性毒性と併せて、インビボでテラトーマを誘導し、これは動物を数日で殺し得る（Abad et al., Nature. 2013 Oct l7;502(747l):340－5）。よって、細胞リプログラミングの無毒のかつ効率的な方法が必要とされる。
細胞加齢プロセスは遺伝子およびエピジェネティックな情報両方の損失によって引き起こされると仮定されている。先の研究は、加齢は主として遺伝子情報の損失によって（最も普通には、生物のゲノム上の置換および欠失などの遺伝子変異の形態で）引き起こされるという仮説をたてているが、本開示の組成物および方法は、加齢が、主として、受精および特定の細胞の最終分化のより近くにおいて確立される特定のエピジェネティックな情報の損失によって駆動されるという予期せぬ知見によって特徴づけられている。エピジェネティックな情報は場合によっては細胞の「アナログ」情報と言われ、これは、普通には、5－メチルシトシン（5mC）、ヒドロキシメチルシトシン（5hmeC）、5－ホルミルシトシン（fC）、および5－カルボキシルシトシン（caC）、およびアデニンメチル化などのDNAの、ならびにヒストン蛋白質のリジンアセチル化、リジンおよびアルギニンメチル化、セリンおよびスレオニンリン酸化、およびリジンユビキチン化、およびSUMO化などのある種の蛋白質の、共有結合的修飾の形態を取る。このアナログ情報の損失は、細胞アイデンティティを維持するプロセスなどの不可欠な細胞プロセスの制御不全をもたらし得、細胞が老化などの加齢に典型的に関連する形質を見せることを引き起こす。
本開示の方法、組成物、およびキットは、加齢の細胞性の原因を防止および逆行させることによって細胞を若返らせる。特定の理論によって拘束されることなしに、より具体的には、本開示の方法、組成物、およびキットは、加齢プロセス、傷害、または疾患を原因として失われたエピジェネティックな情報を復元することによって細胞を若返らせる。本開示の方法、組成物、およびキットは転写因子OCT4、SOX2、およびKLF4を含む。OCT4、SOX2、およびKLF4は4つの「山中因子」のうちの3つであり、第4はc－Mycである。山中因子は細胞を多能性状態へとリプログラミングするために従来用いられている。しかしながら、トランスジェニックマウスにおける4つの転写因子の発現の誘導は、腸上皮の異形成のような他の急性毒性と併せて、インビボでテラトーマの形成をもたらした。これは動物を数日で殺し得る。その上、細胞を完全に多能性の状態へとリプログラミングするためには、4つの山中因子が典型的に用いられ、細胞はその予め確立された細胞アイデンティティを失うという事実は、標的細胞の細胞アイデンティティが組織および／または臓器のインテグリティーのために維持されなければならないインビボの適用にとって危険であり得る。対照的に、いくつかの態様では、本願に記載される方法は不完全なリプログラミングを許し、脱メチル化のグローバルな変化をもたらさない。いくつかの態様では、本願に記載される方法は細胞の完全な脱分化を要求しない。例えば、OCT4、SOX2、およびKLF4の発現は、若いおよび老いたマウスの傷害後のならびにヒトニューロンのビンクリスチンによって誘導される傷害後の再生を促進したが、OCT4、SOX2、およびKLF4の発現はDNAメチル化のグローバルな縮減を誘導しなかった（例えば図45B～45Cを参照のこと）。
いくつかの態様では、本願において開示される結果は、OCT4、SOX2、およびKLF4の発現が、完全なリプログラミングを誘導することなしに、有疾患細胞がより健康な状態へと復帰することを許し得るということを示唆する。特定の理論によって拘束されることなしに、本願において開示される結果は、細胞が、本願に記載される方法を用いて復元され得るバックアップのエピゲノムを維持しているということを示唆する。
本開示の方法、組成物、およびキットは、c－Myc発現の誘導の不在下におけるOCT4、SOX2、およびKLF4発現の空間的にかつ時間的に特異的な誘導が、細胞を多能性状態へとリプログラミングすることなしに細胞を若返らせ得るという驚くべきかつ予期せぬ発見によって部分的に特徴づけられる。誘導性プロモーターを用いて、OCT4、SOX2、およびKLF4の発現は慎重にコントロールされて、加齢に関連するエピジェネティックなマークを減少および逆行させ、細胞の若々しさに関連するエピジェネティックなマークを増大させ、加齢に関連する蛋白質の発現を減少させ、若々しい細胞状態に関連する蛋白質の発現を増大させ、ユークロマチンおよびヘテロクロマチンの間の均衡を復元し、細胞アイデンティティの損失を防止し、細胞アイデンティティを復元し、DNAメチル化の加齢に関連する変化を逆行させ、それによって、細胞を多能性状態へとリプログラミングすることなしに細胞を若返らせ得る。
それゆえに、種々の態様では、本発明の方法は、1つ以上の制御不全の発生経路を防止するかまたはその効果を逆行させることによって、細胞の細胞アイデンティティを復元することによって、細胞を若返らせる。例えば、方法は：
（i）細胞のヒストンH2A、ヒストンH2B、ヒストンH3、ヒストンH4、またはそれらのいずれかの組み合わせの少なくとも１つの存在量を増大させる；
（ii）細胞のCHAF1a、CHAF1b、HP1α、NuRD、またはそれらのいずれかの組み合わせの少なくとも１つの存在量を増大させる；
（iii）例えばH3K9me3、H3K27me3、またはそれらのいずれかの組み合わせなどの、細胞の少なくとも１つのヘテロクロマチンマークを増大させるか；または1つのヘテロクロマチンマーク、例えばH4K20me3もしくはユークロマチンマークH3K4me3を減少させる；
（iv）細胞の少なくとも１つの加齢性CpG部位のDNAメチル化を若いレベルへと増大／減少させる；
（v）細胞のラミンB1の存在量を増大させる；
（vi）細胞のリジン27におけるヒストンH3のアセチル化（H3K27ac）を増大させるか、リジン56におけるヒストンH3のアセチル化（H3K56ac）を増大させるか、またはそれらのいずれかの組み合わせ；
（vii）細胞のリジン122におけるヒストンH3（H3K122Ac）もしくはリジン16におけるヒストンH4（H4K16ac）のアセチル化、またはそれらのいずれかの組み合わせを減少させる；
（viii）IL6、Cc12、Cc120、Apob、p16、LINE－1リピート、SatIIIリピート、Aluエレメント、IAP、またはそれらのいずれかの組み合わせの存在量を減少させる；
（ix）H3K4me3などのユークロマチンのエピジェネティックなマークおよび例えばH3K9me3またはH3K27me3などのヘテロクロマチンのエピジェネティックなマークの間の均衡を復元する；
（x）ユークロマチンの形成を誘導する；
（xi）少なくとも１つの抑制性のヘテロクロマチンのエピジェネティックなマークの若々しいレベルを復元する；および／あるいは
（xii）表5に記載されている遺伝子の少なくとも１つの発現を若々しいレベルに復元する。
本開示は、いくつかの態様では、外因性のc－Myc発現の不在下におけるOCT4、SOX2、およびKLF4の精密な発現が、急性毒性なしにインビボのリプログラミングおよび組織再生を促進するために用いられ得るという予期せぬ発見に由来する。本願において提供される発現ベクターは、ある種の態様では、OCT4、SOX2、およびKLF4（OSK）発現の精密なコントロール、高いウイルス力価（例えば、調製物あたり2×1012粒子、mLあたり1×1013粒子よりも多く）でのウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス（AAV））への組み込み、加齢を逆行させること、眼疾患を包含する疾患を処置すること、および／またはダメージ後のインビボの組織再生（例えば視神経再生）を許す。
図14に示されている通り、OCT4、SOX2、およびKLF4（OSK）の誘導性トランスジーン発現を有するマウスは、腸上皮における全般性の細胞学的およびアーキテクチャ的異形成を原因として、OSK発現の誘導の2日後に死んだ。類似の知見がOCT4、SOX2、およびKLF4プラスc－Mycのトランスジーンを有するマウスにおいて報告されている（Abad et al., Nature. 2013 Oct l7;502(747l):340－5；Ocampo et al., Cell. 2016 Dec 16; 167: 1719－33）。驚くべきことに、いくつかの態様では、図14に示されている通り、OCT4、SOX2、およびKLF4の発現は毒性または癌をインビボで引き起こさなかった。AAV9送達（UBC－rtTA4によるTRE－OSK）によるOCT4、SOX2、およびKLF4の連続的発現（例えば、ドキシサイクリン投与による誘導）はインビボのテラトーマ形成をもたらさなかった。これらの3つの転写因子をコードするAAV9ウイルスがマウスの体全体に送達されたときには、テラトーマまたは体重損失は3ヶ月に渡って検出されなかった（図14）。
従って、ある種の態様では、OCT4、KLF4、誘導因子、および／またはSOX2の発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）、ならびに／あるいはそれを含む組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）が本願において提供される。核酸はOCT4、KLF4、および／またはSOX2をコードし得る。核酸は、OCT4；KLF4；SOX2；およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される転写因子をコードし得る。ある種の態様では、核酸（nucleic）はOCT4、KLF4、およびSOX2からなる群から選択される2つ以上の転写因子をコードする。ある種の態様では、核酸はOCT4およびSOX2、OCT4およびKLF4をコードする。ある種の態様では、核酸はSOX2およびKLF4をコードする。ある種の態様では、核酸（nucleic）はOCT4、KLF4、およびSOX2をコードする。ある種の態様では、核酸は4つ以上の転写因子をコードする（例えば、OCT4、SOX2、KLF4、および別の転写因子）。いくつかの態様では、本開示は、誘導因子（例えば、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせの発現を誘導することができる誘導因子）をコードする核酸を提供する。いくつかの態様では、核酸は、OCT4、KLF4、および／またはSOX2の内因性の座位のプロモーターまたはエンハンサーを標的化するCas9融合蛋白質（CRISPR活性化因子）およびガイドRNA配列をコードする。いくつかの態様では、核酸は、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせの内因性の座位のプロモーターまたはエンハンサーを標的化するCas9融合蛋白質（CRISPR活性化因子）およびガイドRNA配列をコードする。
本開示の側面は、細胞リプログラミングを制御するか、組織修復を促進するか、組織生存を促進するか、組織再生を促進するか、組織成長を促進するか、組織機能を制御するか、臓器再生を促進するか、臓器生存を促進するか、臓器機能を制御するか、疾患を処置および／もしくは防止するか、またはそれらのいずれかの組み合わせの方法をもまた提供する。制御することは、インビボまたはインビトロで、細胞リプログラミングを誘導すること、加齢を逆行させること、組織機能を改善すること、臓器機能、組織修復、組織生存、組織再生、組織成長を改善すること、血管新生を促進すること、瘢痕形成を縮減すること、加齢の外見を縮減すること、臓器再生を促進すること、臓器生存を促進すること、動物に由来する農産物の味および品質を変改すること、疾患を処置すること、またはそれらのいずれかの組み合わせを含み得る。方法は、本願に記載される核酸のいずれか（例えば、DNAおよび／またはRNA）、KLF4、OCT4、誘導因子、および／またはSOX2をコードする操作された蛋白質のいずれか、OCT4、KLF4、誘導因子、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子のいずれか、OCT4、KLF4、誘導因子、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは本願に記載される組み換えウイルスのいずれかを投与することを含み得る。方法は、本願に記載される核酸のいずれか（例えば、DNAおよび／またはRNA）、KLF4、SOX2、OCT4、またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする操作された蛋白質のいずれか、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子のいずれか、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは本願に記載される組み換えウイルスのいずれかを投与することを含み得る。ある種の態様では、操作された核酸はDNAおよび／またはRNAを含む。操作された核酸は発現ベクターであり得るかまたは発現ベクターではなくあり得る。例えば、操作された核酸はmRNAまたはプラスミドDNAであり得る。ある種の態様では、方法は、さらに、誘導因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）、誘導因子をコードする操作された蛋白質、誘導因子の活性を調節する（例えば、活性化または阻害する）ことができる化学的因子、および／または誘導因子をコードする組み換えウイルスを投与することを含む。例えば、操作された核酸はmRNAまたはプラスミドDNAであり得る。
本開示の1つの側面は、単独でまたは組み合わせで、かつc－Mycを発現することができる外因性の核酸（例えば、操作された核酸）の不在下において、OCT4をコードする第1の核酸（例えば、操作された核酸）、SOX2をコードする第2の核酸（例えば、操作された核酸）、KLF4をコードする第3の核酸（例えば、操作された核酸）を含むベクター（例えば、発現ベクター）を提供する。ある種の態様では、ベクター（例えば、発現ベクター）は、OCT4をコードする第1の核酸（例えば、操作された核酸）、SOX2をコードする第2の核酸（例えば、操作された核酸）、KLF4をコードする第3の核酸（例えば、操作された核酸）、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。ある種の態様では、第1、第2、および第3の核酸（例えば、操作された核酸）は別個の発現ベクター上に存在する。ある種の態様では、第1、第2、および第3の核酸（例えば、操作された核酸）の2つは同じ発現ベクター上に存在する。いくつかの態様では、全ての3つの核酸（例えば、操作された核酸）は同じ発現ベクター上に存在する。ある種の態様では、OCT4をコードする配列は配列番号2または41と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である。ある種の態様では、SOX2をコードする配列は配列番号4または43と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である。ある種の態様では、KLF4をコードする配列は配列番号6または45と少なくとも70％同一である。ある種の態様では、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせはヒト蛋白質である。ある種の態様では、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせは非ヒト蛋白質である（例えば、哺乳動物（例えば、霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザル）；商業的に該当する哺乳動物、例えば牛、豚、ウマ、羊、ヤギ、ネコ、および／またはイヌ）および鳥（例えば、商業的に該当する鳥、例えばニワトリ、カモ、ガチョウ、および／または七面鳥）。OCT4、SOX2、およびKLF4の2つ以上が1つのベクター上にある場合には、それらはいずれかの順序であり得る。単語「第1の」、「第2の」、および「第3の」はベクター上の遺伝子の順序を含意することを意味されない。
本開示の発現ベクターはさらに誘導性プロモーターを含み得る。発現ベクターは1つの誘導性プロモーターのみを有し得る。かかる場合には、OCT4、SOX2、およびKLF4の発現は同じ誘導性プロモーターのコントロール下にある。いくつかの場合には、発現ベクターは1つよりも多くの誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモーターは、テトラサイクリン応答性エレメント（TRE）（例えば、TRE3Gプロモーター、TRE2プロモーター、またはPtightプロモーター）、ミフェプリストン応答性プロモーター（例えば、GAL4－Elbプロモーター）、またはクーママイシン応答性を含み得る）。例として、TRE（例えばTRE3G）プロモーターは、配列番号7と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である核酸（例えば、操作された核酸）配列を含み得る。例として、TRE（例えばTRE2）プロモーターは、配列番号23と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である核酸（例えば、操作された核酸）配列を含み得る。例として、TRE（例えばPtight）プロモーターは、配列番号24と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である核酸（例えば、操作された核酸）配列を含み得る。例えば、代理人整理番号H0824.70300ETS00による2018年9月28日に出願されたMUTANT REVERSE TETRACYCLINE TRANSACTIVATORS FOR EXPRESSION OF GENESと題するU.S.仮出願U.S.S.N.62/738,894、および本願と同じ日に出願された代理人整理番号H0824.70300WO00によるMUTANT REVERSE TETRACYCLINE TRANSACTIVATORS FOR EXPRESSION OF GENESと題する国際特許出願を参照のこと。これらのそれぞれはその全体が参照によって本願に組み込まれる。
ある種の態様では、誘導因子は、第1の（例えばOCT4）、第2の（例えば、SOX2）、第3の（例えば、KLF4）核酸（例えば、操作された核酸）、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を、テトラサイクリン（例えばドキシサイクリン）の存在下において誘導性プロモーターから誘導することができる。ある種の態様では、誘導因子はリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（rtTA）である（例えば、M2－rtTA、rtTA3、またはrtTA4）。ある種の態様では、rtTAは、配列番号11と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一であるアミノ酸配列を含むrtTA3である。ある種の態様では、rtTAはrtTA4であり、配列番号13と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含む。ある種の態様では、rtTAはM2－rtTAであり、配列番号15と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含む。
ある種の態様では、誘導因子は、第1の核酸（例えば、操作された核酸）（例えばOCT4）、第2の核酸（例えば、操作された核酸）（例えばSOX2）、第3の核酸（nucleic）（例えばKLF4）、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現の発現を、テトラサイクリン（例えばドキシサイクリン）の不在下において誘導性プロモーターから誘導することができる。ある種の態様では、誘導因子はテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（tTA）である。
ある種の態様では、本開示の発現ベクターは恒常的プロモーターを含む（例えば、CP1、CMV、EF1アルファ、SV40、PGK1、Ubc、ヒトベータアクチン、CAG、Ac5、ポリヘドリン、TEF1、GDS、CaM35S、Ubi、H1、およびU6プロモーター）。恒常的プロモーターは、OCT4、KLF4、SOX2、誘導因子、またはそれらの組み合わせをコードする核酸（例えば、操作された核酸）配列に作動可能に連結され得る。いくつかの態様では、発現ベクターは1つの恒常的プロモーターを含む。いくつかの態様では、発現ベクターは1つよりも多くの恒常的プロモーターを含む。
ある種の態様では、本開示の発現ベクターはSV40由来のターミネーター配列を含む。ある種の態様では、SV40由来の配列は配列番号8と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である。
ある種の態様では、本開示の発現ベクターはセパレータ配列を含み、これは1つの転写物から2つの別個のアミノ酸配列を生ずることに有用であり得る。セパレータ配列は自己切断ペプチドをコードし得る（例えば、2Aペプチド。配列番号9と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である2Aペプチド配列を包含する）。ある種の態様では、セパレータ配列は内部リボソーム進入部位（IRES）である。
ある種の態様では、発現ベクターはウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、またはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター）である（例えば、図2～3）。本開示のAAVベクターは、一般的に、目当てのトランスジーン（例えば、OCT4、SOX2、KLF4、誘導因子、またはそれらの組み合わせをコードする核酸（例えば、操作された核酸））をフランキングする末端逆向きリピート（ITR）を含む。いくつかの態様では、2つの末端逆向きリピート間の距離は5.0キロベース（kb）未満である（例えば、4.9kb未満、4.8kb未満、4.7kb未満、4.6kb未満、4.5kb未満、4.4kb未満、4.3kb未満、4.2kb未満、4.1kb未満、4kb未満、3.5kb未満、3kb未満、2.5kb未満、2kb未満、1.5kb未満、1kb未満、または0.5kb未満）。
ある種の態様では、本開示の発現ベクター（例えば、OCT4、KLF4、SOX2、誘導因子、またはそれらの組み合わせをコードする発現ベクター）は、さらに、選択薬剤（例えば、抗生物質。ブラストサイジン、ジェネティシン、ハイグロマイシンB、ミコフェノール酸、ピューロマイシン、ゼオシン、アクチノマイシンD、アンピシリン、カルベニシリン、カナマイシン、およびネオマイシンを包含する）および／または検出可能なマーカー（例えば、GFP、RFP、ルシフェラーゼ、CFP、mCherry、DsRed2FP、mKate、ビオチン、FLAGタグ、HAタグ、Hisタグ、Mycタグ、V5タグなど）を含み得る。
いくつかの態様では、OCT4、KLF4、およびSOX2をコードする発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）は、配列番号16、配列番号105、または配列番号121によって提供される配列を含む。いくつかの態様では、OCT4、KLF4、およびSOX2をコードする発現ベクターは、図2、図3、図4A～4AL、図5A～5Dに図示されているエレメント、またはそれらの組み合わせを含む。ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびヘルペスウイルスベクターを包含する。
別の側面では、本開示は、本願に記載される発現ベクターのいずれかを含む組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、またはアデノ随伴ウイルス（AAV））を提供する。ある種の態様では、組み換えウイルスは、OCT4；KFF4；SOX2；およびそれらのいずれかの組み合わせから選択される転写因子をコードする。ある種の態様では、組み換えウイルスはOCT4、KFF4、およびSOX2から選択される2つ以上の転写因子をコードする。ある種の態様では、組み換えウイルスはOCT4およびSOX2、OCT4およびKLF4、OCT4、KLF4、およびSOX2、またはSOX2およびKLF4をコードする。ある種の態様では、組み換えウイルスはOCT4、KLF4、およびSOX2をコードする。ある種の態様では、4つ以上の転写因子は4つ以上の転写因子（例えば、OCT4、SOX2、KLF4、および別の転写因子）をコードする。
なお別の側面では、本開示は、細胞リプログラミング、組織修復、組織再生、臓器再生、加齢を逆行させること、またはそれらのいずれかの組み合わせを制御する（例えば、誘導する）方法を提供し、OCT4をコードする第1の核酸（例えば、操作された核酸）、SOX2をコードする第2の核酸（例えば、操作された核酸）、およびKLF4をコードする第3の核酸（例えば、操作された核酸）を、c－Mycを発現することができる外因性の核酸（例えば、操作された核酸）の不在下において、細胞に投与することを含む。ある種の態様では、OCT4をコードする第1の核酸（例えば、操作された核酸）、SOX2をコードする第2の核酸（例えば、操作された核酸）、およびKLF4をコードする第3の核酸（例えば、操作された核酸）が対象に投与される。対象はヒトまたは非ヒトであり得る。非ヒト対象は、例えば、哺乳動物（例えば、霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザル）；商業的に該当する哺乳動物、例えば牛、豚、ウマ、羊、ヤギ、ネコ、および／またはイヌ）および鳥（例えば、商業的に該当する鳥、例えばニワトリ、カモ、ガチョウ、および／または七面鳥）を包含する。ある種の態様では、3つの核酸（例えば、操作された核酸）は同時に投与される。ある種の態様では、3つの核酸（例えば、操作された核酸）は同じベクター上で同時に投与される。
なお別の側面では、本開示は、細胞リプログラミング、組織修復、組織再生、臓器再生、加齢を逆行させること、またはそれらのいずれかの組み合わせを制御する（例えば、誘導する）方法を提供し、OCT4をコードする第1の核酸（例えば、操作された核酸）、SOX2をコードする第2の核酸（例えば、操作された核酸）、KLF4をコードする第3の核酸（例えば、操作された核酸）、またはそれらのいずれかの組み合わせを細胞に投与することを含む。ある種の態様では、OCT4をコードする第1の核酸（例えば、操作された核酸）、SOX2をコードする第2の核酸（例えば、操作された核酸）、KLF4をコードする第3の核酸（例えば、操作された核酸）、またはそれらのいずれかの組み合わせは対象に投与される。
第1、第2、および第3の核酸（例えば、操作された核酸）の1つ以上を含む発現ベクターは、上および本願に記載される発現ベクターのいずれかであり得る。いくつかの態様では、第1の核酸、第2の核酸、第3の核酸、またはそれらのいずれかの組み合わせは別個の発現ベクター上に存在する。ある種の態様では、第1の核酸、第2の核酸、第3の核酸、またはそれらのいずれかの組み合わせの2つは同じ発現ベクター上に存在する。ある種の態様では、全ての3つの核酸（例えば、操作された核酸）は同じ発現ベクター上に存在する。ある種の態様では、第1、第2、または第3の核酸（例えば、操作された核酸）の少なくとも2つは同じプロモーターに作動可能に連結される。ある種の態様では、第1、第2、および第3の核酸（例えば、操作された核酸）の全ての3つは同じプロモーターに作動可能に連結される。
いくつかの態様では、発現ベクター（例えば、ウイルス発現ベクター。レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスベクターを包含する）は誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性エレメント（TRE）を含むプロモーター。TRE3G配列、TRE2配列、またはPtight配列を包含する）を含み、方法はさらに誘導因子を投与することを含む（例えば、化学的因子、核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、誘導因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸））、蛋白質、光、または温度）。いくつかの態様では、プロモーターに作動可能に連結された核酸の発現を誘導するために、pHが用いられる。ある種の態様では、誘導因子の活性を調節することができる化学的因子はテトラサイクリン（例えばドキシサイクリン）である。限定しない例として、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子（tTA）は、その活性がテトラサイクリンによって阻害される誘導因子である。限定しない例として、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（rtTA）は、その活性がテトラサイクリンによって活性化される誘導因子である。誘導因子（例えば、rtTAまたはtTA）は、投与される核酸である第4の核酸（例えば、操作された核酸）によってコードされる。ある種の態様では、誘導因子（例えば、化学的因子、核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、誘導因子をコードするRNAおよび／またはDNAを含む核酸）、蛋白質、光、特定のpH、または温度）は、OCT4、SOX2、およびKLF4をコードする核酸（例えば、操作された核酸）と同時に導入される。ある種の態様では、誘導因子（例えば、化学的因子、核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、誘導因子をコードするRNAおよび／またはDNAを含む核酸）、蛋白質、光、特定のpHまたは温度）は、OCT4；SOX2；KLF4；およびそれらのいずれかの組み合わせから選択される1つ以上の（例えば、2つ以上のまたは3つ以上の）転写因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）と同時に導入される。プロモーター（例えば、CAGおよびUbcを包含する恒常的プロモーター、または誘導性プロモーター）は、誘導因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）に作動可能に連結され得る。ある種の態様では、誘導因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）に作動可能に連結されたプロモーターは、組織特異的なプロモーターである。
ある種の態様では、誘導因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）は、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらの組み合わせをコードする核酸（例えば、操作された核酸）の少なくとも１つと同じ発現ベクター上に存在する。ある種の態様では、誘導因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）は、OCT4をコードする核酸（例えば、操作された核酸）、SOX2をコードする核酸（例えば、操作された核酸）、およびKLF4をコードする核酸（例えば、操作された核酸）とは別個の発現ベクター上に存在する。ある種の態様では、OCT4、SOX2、およびKLF4をコードする核酸（例えば、操作された核酸）は第1の発現ベクター上に存在し、第4の核酸（例えば、操作された核酸）は第2の発現ベクター上に存在する。
いくつかの態様では、OCT4、SOX2、KLF4、および／または誘導因子をコードする核酸はウイルスベクター上に存在しない。いくつかの態様では、OCT4；SOX2；KLF4；およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の（例えば、2つ以上のまたは3つ以上の）転写因子をコードする核酸は、ウイルスベクター上に存在しない。いくつかの態様では、核酸はウイルスベクターなしに送達される。いくつかの態様では、ウイルスベクター上にない核酸の送達は、裸の核酸の投与、エレクトロポレーション、ナノ粒子の使用、および／またはリポソームの使用を含む。
発現ベクターはウイルスベクターであり得る（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、またはAAVベクター）。例えば、OCT4、SOX2、およびKLF4をコードする第1の発現ベクターは、配列番号16によって提出される核酸（例えば、操作された核酸）配列を含み得る。いくつかの態様では、誘導因子をコードする発現ベクターは、配列番号17（例えば、図12）、配列番号31（例えば、図18）、または配列番号32（例えば、図19）によって提供される配列を含む。
ある種の態様では、誘導因子をコードする第4の核酸（例えば、操作された核酸）は、さらに、配列番号8と少なくとも70％同一である配列を包含するSV－40由来のターミネーター配列を含む。
ある種の態様では、誘導因子は、テトラサイクリン（例えばドキシサイクリン）の存在下において誘導性プロモーターからの発現を誘導することができる。ある種の態様では、誘導因子はrtTAである（例えば、配列番号11と少なくとも70％同一である配列を有するrtTA3を包含するrtTA3、および配列番号13と少なくとも70％同一である配列を有するrtTA4を包含するrtTA4）。ある種の態様では、方法は、さらに、テトラサイクリン（例えばドキシサイクリン）を細胞、組織、または対象に投与することを含む。ある種の態様では、方法は細胞、組織、または対象からテトラサイクリン（例えばドキシサイクリン）を除去することを含む。
ある種の態様では、誘導因子は、テトラサイクリン（例えばドキシサイクリン）の不在下において誘導性プロモーターからの発現を誘導することができる。ある種の態様では、誘導因子はテトラサイクリントランス活性化因子（tTA）である。特定の理論によって拘束されることなしに、テトラサイクリン（例えばドキシサイクリン）はtTAに結合し得、tTAがそのコグネイトなプロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性エレメント（TRE）を含むプロモーター）に結合することおよび作動可能に連結された核酸の発現を駆動することを防止し得る。特定の理論によって拘束されることなしに、ウイルスベクターのサイズを縮減およびウイルス力価を改善するために、誘導因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）は、OCT4、KLF4、およびSOX2をコードする核酸（例えば、操作された核酸）のいずれかと同じベクターにはなくあり得る。
ある種の態様では、1つ以上の発現ベクター（例えば、発現ベクターを含むAAV）が、その必要がある細胞、組織、または対象に投与される。対象は傷害または状態を有し得るか、状態もしくは傷害を有することを疑われるか、または状態もしくは傷害のリスクがある。特定の理論によって拘束されることなしに、転写因子OCT4、SOX2、およびKLF4の発現は細胞リプログラミングを誘導する。いくつかの態様では、OCT4、SOX2、KFF4、またはそれらの組み合わせをコードする核酸（例えば、操作された核酸）が誘導性プロモーターに作動可能に連結されるときには、適切な条件下において（例えば、テトラサイクリンの存在または不在下において）、誘導因子（例えば、化学物質、蛋白質、核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、誘導因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸））が投与される（administration of）。ある種の態様では、誘導因子がテトラサイクリンに結合されるときにのみ、誘導因子（例えば、rtTA）は、プロモーターに結合することおよび作動可能に連結された核酸（例えば、操作された核酸）の発現を駆動することができる。ある種の態様では、誘導因子がテトラサイクリンに結合されるときに、誘導因子（例えばtTA）は、プロモーターに結合および作動可能に連結された核酸（例えば、操作された核酸）の発現を駆動し得ない。状態は、眼疾患（例えば、網膜疾患、角膜疾患、または眼を冒すいずれかの疾患）、癌、加齢、加齢性疾患、傷害、または神経変性疾患であり得る。ある種の態様では、細胞または組織は、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸からである。
ある種の態様では、組織はダメージを受けるか（例えば、傷害、事故、または医原性傷害を原因とする）および／または加齢した組織である。ある種の態様では、組織は、健康だが、現在のまたは将来の条件における（例えば、有毒な治療、日光暴露、または地球の大気圏外の旅行を包含する農業または有害条件における）性能または生存にとって最適ではないと考慮され得る。
ある種の態様では、方法はさらに生物学的プロセスの制御を含む（comprises comprises）。いくつかの態様では、本願に記載される方法は、細胞リプログラミング、組織修復、組織生存、組織再生、組織成長、組織機能、臓器再生、臓器生存、臓器機能、またはそれらのいずれかの組み合わせを包含するいずれかの生物学的プロセスを制御することを含む。いくつかの態様では、方法は、細胞リプログラミングを誘導すること、加齢を逆行させること、組織機能を改善すること、臓器機能を改善すること、組織修復を促進すること、組織生存を促進すること、組織再生を促進すること、組織成長を促進すること、血管新生を促進すること、瘢痕形成を縮減すること、脱毛症、細毛化、白髪化、たるんだ皮膚、および皮膚のシワを包含する加齢の外見を縮減すること、臓器再生を促進すること、臓器生存を促進すること、動物に由来する農産物の味および品質を変改すること、疾患を処置すること、またはそれらのいずれかの組み合わせを、インビボでまたはインビトロで含む。例えば、方法は、細胞リプログラミング、細胞生存、臓器再生、組織再生、またはそれらの組み合わせを誘導し得る。ある種の態様では、方法は、細胞リプログラミング、細胞生存、組織再生、臓器再生、加齢、またはそれらの組み合わせを誘導およびそれから停止することを含む。ある種の態様では、方法は細胞、組織、臓器、または対象の加齢を逆行させる。いくつかの態様では、方法はテラトーマ形成を誘導しない。いくつかの態様では、方法は不要の細胞増殖を誘導しない。いくつかの態様では、方法は悪性の細胞成長を誘導しない。いくつかの態様では、方法は癌を誘導しない。いくつかの態様では、方法は腫瘍成長または腫瘍形成を誘導しない。いくつかの態様では、方法は緑内障を誘導しない。
いくつかの態様では、本願に記載される方法は、細胞、組織、臓器、対象、またはそれらのいずれかの組み合わせのエピジェネティックな時計を逆行させる。いくつかの態様では、エピジェネティックな時計は、DNAメチル化に基づく（DNAm）年齢推定器を用いて決定される。いくつかの態様では、方法は加齢に関連する1つ以上の遺伝子の発現を変改する。いくつかの態様では、方法は加齢に関連する1つ以上の遺伝子の発現を縮減する。いくつかの態様では、方法は加齢に関連する1つ以上の遺伝子の発現を変改する。いくつかの態様では、1つ以上の遺伝子は1つ以上の感覚遺伝子である。
いくつかの態様では、方法は、加齢に関連する1つ以上の遺伝子の発現を縮減する。いくつかの態様では、方法は、0610040J0lRik、1700080N15Rik、2900064F13Rik、4833417C18Rik、4921522P10Rik、4930447C04Rik、4930488N15Rik、Ace、Ackr1、Acot1O、Acvr1、Adamts17、Adra1b、AI504432、Best3、Boc、Cadm3、Cand2、Cc19、Cd14、Cd36、Cfh、Chrm3、Chrna4、Cntn4、Cracr2b、Cryaa、CT573017.2、Cyp26a1、Cyp27a1、D330050G23Rik、D930007P13Rik、Ddo、Dgkg、Dlk2、Dnaja1－ps、Drd2、Dse1、Dytn、Ecscr、Edn1、Ednrb、Efemp1、Elfn2、Epha1O、Ephx1、Erbb4、Fam20a、Fbxw21、Ffar4、Flt4、Fmod、Foxp4、Fzd7、Gabrd、Galnt15、Galnt18、Gfra2、Ggt1、Gm10416、Gm14964、Gm17634、Gm2065、Gm32352、Gm33172、Gm34280、Gm35853、Gm36298、Gm36356、Gm36937、Gm3898、Gm42303、Gm42484、Gm42537、Gm42743、Gm43151、Gm43843、Gm44545、Gm44722、Gm45516、Gm45532、Gm47494、Gm47982、Gm47989、Gm48398、Gm48495、Gm48593、Gm48958、Gm49089、Gm49326、Gm49331、Gm49760、Gm5796、Gm6374、Gm7276、Gm8237、Gm9796、Gm9954、Gpr75、Gprc5c、Grid2ip、Gsg112、Hapln4、Hcn3、Hcn4、Hhat1、Hs6st2、Htr3a、Illrap、Illrap12、Inka1、Kbtbd12、Kcnj11、Kcnk4、Kdelc2、Klhl33、Lamc3、Lilra5、Lmanll、Lrfn2、Lrrc38、Lrrn4cl、Ltc4s、Manscl、Mir344c、Msr1、Mycbpap、Myoc、Ngfr、Nipa12、Olfr1372－ps1、Otop3、P2rx5、P2ry12、P4ha2、Pcdha12、Pcdha2、Pcdhac2、Pcdhb18、Pcdhb5、Pcsk2os1、Pcsk6、Perp、Pkp1、Plxna4、Prickle2、Qsox1、Rapgef4os2、Rbp4、Rcn3、Sec1415、Sel113、Serpinh1、Sgpp2、Shisa6、Siah3、Siglech、Slc12a4、Slc24a2、Slc2a5、Slc4a4、Slitrk3、Smagp、Smoc2、Speer4b、Spon2、Sstr2、Sstr3、St3ga13、Stc1、Stc2、Syndig1、Syt1O、Thsd7a、Tlr8、Tmem132a、Tmem132d、Tmem200a、Tmem44、Trpc4、Trpv4、Unc5b、Vgf、Vmnlr90、Vwc21、Wfikkn2、Wnt11、Wnt6、Zeb2os、Zfp608、Zfp976、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を縮減する。いくつかの態様では、方法は、Ace、Kcnk4、Lamc3、Edn1、Syt10、Ngfr、Gprc5c、Cd36、Chrna4、Ednrb、Drd2、またはそれらの組み合わせの発現を縮減する。
いくつかの態様では、方法は、加齢に関連する1つ以上の遺伝子の発現を増大させる。いくつかの態様では、方法は、1700031P21Rik、1810053B23Rik、2900045020Rik、2900060B14Rik、4921504E06Rik、4930402F11Rik、4930453C13Rik、4930455B14Rik、4930500H12Rik、4930549P19Rik、4930555B11Rik、4930556J02Rik、4932442E05Rik、4933431K23Rik、4933438K21Rik、6720475M21Rik、9830132P13Rik、A430010J10Rik、A530064D06Rik、A530065N20Rik、Abcb5、Abhd17c、AC116759.2、AC131705.1、AC166779.3、Acotl2、Adig、Akrlc1、Ankrd1、Asb15、Atp2c2、AU018091、AW822073、Btn11O、C130093G08Rik、C730027H18Rik、Ccdc162、Chi16、Col26a1、Corin、Crls1、Cybrd1、Cyp2d12、Cyp7a1、D830005E20Rik、Dlx3、Dnah14、Dsc3、Dthd1、Eid2、Eps811、EU599041、Fam90ala、Fancf、Fau－ps2、Fezf1、Gja5、Gm10248、Gm10513、Gm10635、Gm10638、Gm10718、Gm10722、Gm10800、Gm10801、Gm11228、Gm11251、Gm11264、Gm11337、Gm11368、Gm11485、Gm11693、Gm12793、Gm13050、Gm13066、Gm13323、Gm13339、Gm13346、Gm13857、Gm14387、Gm14770、Gm15638、Gm16072、Gm16161、Gm16181、Gm17200、Gm1779l、Gm18025、Gm18757、Gm18795、Gm18848、Gm19719、Gm20121、Gm20356、Gm2093、Gm2l738、Gm2l940、Gm22933、Gm24000、Gm24119、Gm25394、Gm26555、Gm27047、Gm28262、Gm28530、Gm29295、Gm29825、Gm29844、Gm3081、Gm32051、Gm32l22、Gm33056、Gm33680、Gm34354、Gm34643、Gm3551、Gm36660、Gm36948、Gm37052、Gm37142、Gm37262、Gm37535、Gm37569、Gm37589、Gm37647、Gm37648、Gm37762、Gm38058、Gm38069、Gm38137、Gm38218、Gm39139、Gm42535、Gm42680、Gm42895、Gm42994、Gm43027、Gm43158、Gm43288、Gm43366、Gm44044、Gm44081、Gm44187、Gm44280、Gm44535、Gm45338、Gm45644、Gm45740、Gm46555、Gm46565、Gm4742、Gm47485、Gm47853、Gm47992、Gm48225、Gm48314、Gm48383、Gm48673、Gm48804、Gm48832、Gm4994、Gm5487、Gm5724、Gm595、Gm6012、Gm6024、Gm7669、Gm7730、Gm8043、Gm8953、Gm9348、Gm9369、Gm9495、H2a12a、Ido2、Igfbp1、Kif7、Klhl31、Lrrc31、Mc5r、Mgam、Msh4、Mucl2、Mug1、Myb12、Myh15、Nek1O、Neurod6、Nr1h5、Olfr1042、Olfr1043、Olfr1082、Olfr1090、Olfr1124、Olfr1167、Olfr1205、Olfr1206、Olfr1223、Olfr1263、Olfr1264、Olfr1269、Olfr127、0lfr1291－ps1、Olfr1406、Olfr1469、Olfr215、Olfr273、Olfr328、Olfr355、Olfr372、Olfr390、Olfr427、Olfr456、Olfr466、Olfr481、Olfr522、Olfr6、Olfr601、Olfr603、Olfr706、Olfr727、Olfr728、Olfr741、Olfr801、Olfr8l2、Olfr8l6、Olfr822、Olfr860、Olfr890、Olfr923、Olfr943、Otog1、Pi15、Pkhd1、Pkhd111、Platr6、Pou3f4、Prr9、Pvalb、Rhag、Savl、Serpinb9b、Skint1、Skint3、Skint5、Slc10a5、Slc6a4、Smok2a、Tcaf3、Tomm201、Trcgl、Trdn、Ugt1a6a、Usp171a、Vmnlr178、Vmn1r179、Vmn1r33、Vmn1r74、Vmn1r87、Vmn2rl02、Vmn2r113、Vmn2r17、Vmn2r52、Vmn2r66、Vmn2r68、Vmn2r76、Vmn2r78、Wnt16、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を増大させる。いくつかの態様では、方法は、Olfr8l6、Olfr8l2、Olfr1264、Olfr727、Olfr923、Olfr1090、Olfr328、Olfr1124、Olfr522、Olfr1082、Olfr1206、Olfr1167、Olfr706、Olfr6、Pou3f4、Olfr603、Olfrl27、Olfr1263、Olfr1269、Olfr1205、Olfr390、Olfr60l、Olfr860、Olfr2l5、Olfr74l、Olfr1469、Olfr355、Olfr48l、Olfr456、Olfrl042、Olfr728、Olfr372、Olfr80l、Olfrl223、Olfr822、Otogl、Olfr943、Olfrl406、Olfr273、Olfr466、Olfrl043、Olfr427、Olfr890、Rbp4、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を増大させる。
本開示のさらなる側面は、細胞、組織、臓器、対象、またはそれらのいずれかの組み合わせのエピジェネティックな時計を若返らせることを含むリプログラミングの方法に関する。
本開示のさらなる側面は、加齢に関連する1つ以上の遺伝子の発現を変改することを含むリプログラミングの方法に関する。
本開示のさらなる側面は、インビトロの老いた細胞、老いた臓器、老いた組織、および／またはそれらのいずれかの組み合わせの転写プロファイルをリセットすることを含む方法に関する。
本開示のさらなる側面は、インビボの老いた細胞、老いた臓器、老いた組織、老いた対象、および／またはそれらのいずれかの組み合わせの転写プロファイルをリセットすることを含む方法に関する。
本開示のさらなる側面は細胞を分化転換する方法に関する。
本開示の別の側面は、本願に記載される方法のいずれかによって作り出される操作された細胞を提供する。本願に記載される方法は、人工多能性幹細胞を包含するいずれかの操作された細胞の生成に有用であり得る。本開示の操作された細胞はエクスビボで生じ得、方法はさらに操作された組織または操作された臓器を作り出すことを含み得る。いくつかの態様では、本開示の方法は、本開示の操作された細胞、操作された組織、および／または操作された臓器をその必要がある対象に投与することを含む。いくつかの態様では、方法はさらに疾患を処置することを含む。
本開示の側面は組成物をもまた提供し、OCT4、KLF4、誘導因子、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）のいずれか、本願に記載される操作された蛋白質のいずれか、OCT4、KLF4、誘導因子、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子のいずれか、OCT4、KLF4、誘導因子、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体のいずれか、ならびに／あるいは本願に記載される組み換えウイルスのいずれか（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）を、単独でまたは組み合わせで含む。いくつかの態様では、本開示の医薬組成物はさらに薬学的に許容される担体を含む。いくつかの態様では、医薬組成物は、さらに、誘導因子（例えば、rtTAまたはtTA）をコードする第2の操作された核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター。ウイルスベクターを包含する）を含む。
本開示の側面は、組成物をもまた提供し、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）の酸（例えば、誘導性発現ベクターを包含する発現ベクター）のいずれか、本願に記載される操作された蛋白質のいずれか、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）ことができる化学的因子のいずれか、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）ことができる抗体のいずれか、ならびに／あるいは本願に記載される組み換えウイルスのいずれか（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）を、単独でまたは組み合わせで含む。いくつかの態様では、組成物は、さらに、誘導因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）、誘導因子をコードする操作された蛋白質、誘導因子の活性を調節する（例えば、活性化または阻害する）ことができる化学的因子、および／または誘導因子をコードする組み換えウイルスを含む。いくつかの態様では、本開示の医薬組成物はさらに薬学的に許容される担体を含む。いくつかの態様では、医薬組成物は、さらに、誘導因子（例えば、rtTAまたはtTA）をコードする第2の操作された核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、ウイルスベクターを包含する発現ベクター）を含む。
本開示の側面は、組成物をもまた提供し、OCT4；SOX2；KLF4；およびそれらのいずれかの組み合わせから選択される1つ以上の転写因子の発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）のいずれか、本願に記載される操作された蛋白質のいずれか、OCT4；SOX2；KLF4；およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の転写因子を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子のいずれか、OCT4；SOX2；KLF4；およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の転写因子を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体のいずれか、ならびに／あるいは本願に記載される組み換えウイルスのいずれか（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）を、単独でまたは組み合わせで含む。ある種の態様では、組成物は、OCT4；SOX2；KLF4；およびそれらのいずれかの組み合わせから選択される2つ以上の転写因子の発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）のいずれか、本願に記載される操作された蛋白質のいずれか、OCT4；SOX2；KLF4；およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される2つ以上の転写を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子のいずれか、OCT4；SOX2；KLF4；およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される2つ以上の転写因子を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体のいずれか、ならびに／あるいは本願に記載される組み換えウイルスのいずれか（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）を、単独でまたは組み合わせで含む。2つ以上の転写因子は、OCT4およびSOX2、OCT4およびKLF4、OCT4、KLF4、およびSOX2、またはSOX2およびKLF4を含み得る。ある種の態様では、組成物は、OCT4、SOX2、KLF4、およびそれらの組み合わせの発現から選択される3つ以上の転写因子の発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）のいずれか、本願に記載される操作された蛋白質のいずれか、OCT4；SOX2；KLF4；およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される3つ以上の転写を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子のいずれか、OCT4；SOX2；KLF4；およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される3つ以上の転写因子を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体のいずれか、ならびに／あるいは本願に記載される組み換えウイルスのいずれか（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）を、単独でまたは組み合わせで含む。ある種の態様では、3つ以上の転写因子はOCT4、SOX2、およびKLF4を含み得る。いくつかの態様では、医薬組成物は、さらに、誘導因子（例えば、rtTAまたはtTA）をコードする核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、誘導因子をコードする操作された蛋白質のいずれか、誘導因子を活性化する（例えば、その発現を誘導する）ことができる化学的因子のいずれか、ならびに／あるいは誘導因子をコードする組み換えウイルスのいずれか（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）を含む。いくつかの態様では、本開示の医薬組成物はさらに薬学的に許容される担体を含む。
なお別の側面では、本開示はキットを提供し、OCT4、KLF4、誘導因子、および／またはSOX2の発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）のいずれか、本願に記載される操作された蛋白質のいずれか、OCT4、KLF4、誘導因子、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子のいずれか、OCT4、KLF4、誘導因子、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体のいずれか、ならびに／あるいは本願に記載される組み換えウイルスのいずれか（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）を含む。
なお別の側面では、本開示はキットを提供し、OCT4、KLF4、および／またはSOX2の発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）の酸（例えば、発現ベクター）のいずれか、本願に記載される操作された蛋白質のいずれか、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子のいずれか、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体のいずれか、ならびに／あるいは本願に記載される組み換えウイルスのいずれか（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）を含む。いくつかの態様では、キットは、さらに、誘導因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）、誘導因子をコードする操作された蛋白質、誘導因子の活性を調節する（例えば、活性化または阻害する）ことができる化学的因子、および／または誘導因子をコードする組み換えウイルスを含む。
なお別の側面では、本開示はキットを提供し、OCT4；SOX2；KLF4；およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の転写因子の発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）のいずれか、本願に記載される操作された蛋白質のいずれか、OCT4；SOX2；KLF4；およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の転写因子を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子のいずれか、OCT4；SOX2；KLF4；およびそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体のいずれか、ならびに／あるいは本願に記載される組み換えウイルスのいずれか（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）を含む。ある種の態様では、キットは、さらに、誘導因子（例えば、rtTAまたはtTA）をコードする核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、誘導因子をコードする操作された蛋白質のいずれか、誘導因子を活性化する（例えば、その発現を誘導する）ことができる化学的因子のいずれか、および／または誘導因子をコードする組み換えウイルスのいずれか（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）を含む。
本発明の1つ以上の態様の詳細が本願において提出される。本発明の他の特徴、目標、および利点は、発明を実施するための形態、実施例、図、および特許請求の範囲から明らかであろう。
本願において引用される参照は参照によって本願に組み込まれる。
定義
特定の用語の定義は下でより詳細に記載される。本開示は、本願に記載される置換物の例示的な列記によっていずれかの様式で限定されることを意図されない。
「AAV」または「アデノ随伴ウイルス」は、核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする核酸（例えば、操作された核酸））を保有および送達することができるノンエンベロープウイルスであり、ディペンドパルボウイルス属に属する。いくつかの場合には、AAVは誘導因子をコードする核酸を送達することができる。一般的に、AAVはゲノム上にインテグレーションしない。AAVの組織特異的な標的化能力は多くの場合にはAAVカプシド血清型によって決定される（例えば、AAV血清型の例および組織特異的な送達におけるそれらの有用性については、下の表1を参照のこと）。AAVの限定しない血清型はAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、およびそれらのバリアントを包含する。ある種の態様では、AAV血清型はAAV9のバリアントである（例えば、AAV PHP.b）。
「組み換えウイルス」は、その天然環境から（例えば、ホスト細胞、組織、または対象から）単離されたウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、またはアデノ随伴ウイルス（AAV）））であるか、または人工的に生ずる。
本願において用いられる用語「AAVベクター」は、発現カセット（例えば、それぞれ単独でもしくは組み合わせでOCT4、KLF4、およびSOX2をコードする核酸（例えば、操作された核酸）を含む発現カセット、またはrtTAもしくはtTAをコードする発現カセット）をフランキングするAAV末端逆向きリピート（ITR）を含む核酸（例えば、操作された核酸）である。AAVベクターはさらにプロモーター配列を含み得る。
本願において用いられる用語「投与する」、投与すること」、または「投与」は、本願に記載される組成物のいずれか、OCT4、KLF4、および／またはSOX2の発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）のいずれか、OCT4；KLF4；SOX2；およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の転写因子の発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）のいずれか、本願に記載される操作された蛋白質のいずれか、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子のいずれか、OCT4；KLF4；SOX2；およびそれらのいずれかの組み合わせから選択される1つ以上の転写因子を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子のいずれか、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体のいずれか、OCT4；KLF4；SOX2；およびそれらのいずれかの組み合わせから選択される1つ以上の転写因子を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体のいずれか、ならびに／あるいは本願に記載される組み換えウイルスのいずれか（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）の、単独でまたは組み合わせでの、いずれかの細胞、組織、臓器、および／または対象への導入を言う。いくつかの態様では、誘導因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）、誘導因子をコードする操作された蛋白質、誘導因子の活性を調節する（例えば、活性化または阻害する）ことができる化学的因子、および／または誘導因子をコードする組み換えウイルスもまた、細胞、組織、臓器および／または対象に投与される。OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）のいずれか、OCT4；KLF4；SOX2；およびそれらのいずれかの組み合わせから選択される1つ以上の転写因子の発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）のいずれか、本願に記載される操作された蛋白質のいずれか、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子のいずれか、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする操作された蛋白質のいずれか、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子のいずれか、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体のいずれか、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体のいずれか、ならびに／あるいは本願に記載される組み換えウイルスのいずれか（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）を、単独でまたは組み合わせで含む本願に記載される組成物のいずれかは、静脈内に、皮内に、動脈内に、病巣内に、腫瘍内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、鼻腔内に、硝子体内に、腟内に、直腸内に、外用的に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下、膀胱内に（intravesicularlly）、粘膜的に、心膜内に、臍帯内に、眼内に（intraocularally）、経口的に、外用的に、局所的に、全身的に、注射、輸液、連続的輸液、直接的に標的細胞を浸す限局的な灌流、カテーテルによって、クリームによって、脂質組成物（例えばリポソーム）によって、または当業者に公知であろう他の方法もしくは前述のいずれかの組み合わせによって、投与され得る（例えば、参照によって本願に組み込まれるRemington’s Pharmaceutical Sciences (1990）を参照のこと）。いくつかの態様では、誘導因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）、誘導因子をコードする操作された蛋白質、誘導因子の活性を調節する（例えば、活性化または阻害する）ことができる化学的因子、および／または誘導因子をコードする組み換えウイルスを含む組成物は、細胞、組織、臓器および／または対象に投与され、いずれかの好適な方法を用いてもまた投与される。
用語「エピゲノム」または「エピジェネティクス」は、細胞の核酸（例えば、操作された核酸）またはゲノム情報の発現をコントロールする細胞内の修飾および構造的変化を言う。エピゲノムの変化は胚発生、疾患進行、および加齢のプロセスの間に起こり、それらを駆動する。
用語「エピジェネティックな時計」は年齢推定器または生来の生物学的プロセスを言い得る。いくつかの態様では、エピジェネティックな時計を若返らせるかまたは逆行させることは、細胞、組織、臓器、または対象の推定される年齢を縮減することを言う。エピジェネティックな時計は本願に記載される方法のいずれかによって部分的にまたは完全に逆行し得るかまたは若返り得る。いくつかの態様では、年齢推定器はエピジェネティックな年齢推定器である。例えば、エピジェネティックな年齢推定器は、数理アルゴリズムとの組み合わせで用いられるときに、細胞、臓器、または組織を包含するDNAのソースの年齢を推定するために用いられ得るCpGジヌクレオチドのセットであり得る。いくつかの態様では、年齢推定器はDNAメチル化に基づく（DNAm）年齢推定器である。いくつかの態様では、DNAm年齢推定器は、DNAメチル化に基づく（DNam）年齢（推定される年齢としてもまた公知）と暦年齢との間のピアソン相関係数rを用いる年齢相関として計算される。いくつかの態様では、DNAメチル化に基づく（DNAm）年齢推定器は単一組織のDNAメチル化に基づく年齢推定器である。いくつかの態様（emodiments）では、DNAメチル化に基づく年齢推定器は多組織のDNAメチル化に基づく年齢推定器である。いくつかの態様では、DNAm年齢推定器はDNAm PhenoAgeである。例えばHorvath and Raj, Nat Rev Genet. 2018 Jun;19(6):371－384；Levine et al., Aging (Albany NY). 2018 Apr 18; 10(4):573－591；および下の例を参照のこと。
本願において用いられる「エピジェネティックな情報」は、5－メチルシトシン（5mC）、ヒドロキシメチルシトシン（5hmeC）、5－ホルミルシトシン（fC）、および5－カルボキシルシトシン（caC）などのDNAの、ならびにヒストン蛋白質のリジンアセチル化、リジンおよびアルギニンメチル化、セリンおよびスレオニンリン酸化、およびリジンユビキチン化、およびSUMO化などのある種の蛋白質の共有結合的修飾と、TAD（トポロジカルドメイン）およびコンパートメントを包含する細胞の3Dアーキテクチャとを包含する。エピジェネティックな情報は場合によっては細胞の「アナログ」情報と言われる。
若々しいレベルへと表5の少なくとも１つの遺伝子の「発現を復元する」は、加齢の間に変化する下方制御された遺伝子の発現を増大させることまたは上方制御された遺伝子の発現を減少させることを包含することを意味される。
本願において用いられる用語「細胞」は、個々の細胞を包含することを意味されるのみならず、それが起点とする特定の組織または臓器をもまた言う。
用語「細胞の老化」は、細胞周期を脱出しておりかつ老化と整合するエピジェネティックなマーカーを呈示するか、または老化細胞マーカー（例えば、老化関連ベータガラクトシダーゼまたは炎症性サイトカイン）を発現する細胞を言う。細胞の老化は部分的または完全であり得る。
用語「遺伝子発現」は、細胞または組織のある種の遺伝子または全ての遺伝子がRNAへと転写される度を言う。いくつかの場合には、RNAは細胞によって蛋白質へと翻訳される。エピゲノムは遺伝子発現パターンを記述する。
用語「細胞リプログラミング」は、リプログラミング因子を用いて（例えば、機能不全、衰弱、細胞死、老化、または加齢の原因である細胞のエピジェネティックな変化を逆行させるかまたは防止することによって）細胞のエピゲノムを変改するプロセスを言う。細胞リプログラミングは完全なリプログラミングであり得、その結果、分化した細胞（例えば体細胞）が多能性幹細胞へとリプログラミングされる。細胞リプログラミングは不完全であり得、その結果、分化した細胞（例えば体細胞）はその細胞アイデンティティ（例えば、系譜特異的幹細胞）を保持する。細胞リプログラミングは不完全であり得、例えば幹細胞は作出されず、その結果、細胞は若返らせられるか、またはより若々しい属性（例えば、増大した生存、縮減された炎症、または分裂する能力）を帯びる。細胞リプログラミングは追加の細胞機能を提供し得るかまたは細胞加齢（例えば、分化転換、または細胞老化への遷移）を防止し得る。細胞リプログラミングは一時的なまたは永久的な遺伝子発現の変化を誘導し得る。いくつかの態様では、不完全な細胞リプログラミングはNanog発現の欠如によって示される。いくつかの態様では、細胞リプログラミングは老化が起こることを防止する。
本願において用いられる用語「細胞を若返らせる」は、多能性状態を誘導することなしに加齢の細胞性の原因を防止するかまたは逆行させることを包含することを意味される。本願において用いられる若返った細胞は、例えば、RBPMSおよび／またはBrn3aを発現する網膜神経節細胞を包含する。
本願において用いられる「多能性状態」は、細胞がEsrrb、Nanog、Lin28、TRA－1－60／TRA－1－81／TRA－2－54、SSEA1、またはSSEA4などだがこれらに限定されない少なくとも１つの幹細胞マーカーを発現する状態を包含することを意味される。細胞の幹細胞マーカーの発現を測定する方法は当分野において公知であり、本願に記載される方法を包含する。
用語「分化転換」は、1つの細胞型が多能性状態に入ることなしに別の細胞型へと変化させられるプロセスを言う。分化転換は系譜リプログラミングまたは系譜変換ともまた言われ得る。例えば、その全体が参照によって本願に組み込まれるCieslar－Pobuda et al., Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 2017 Jul; 1864(7): 1359－1369を参照のこと。
用語「状態」、「疾患」、および「障害」は交換可能に用いられる。状態、疾患、および障害の限定しない例は、急性傷害、神経変性疾患、慢性疾患、増殖性疾患、心血管疾患、遺伝子疾患、炎症性疾患、自己免疫（autoimmunue）疾患、神経学的疾患、血液学的疾患、有痛状態、精神障害、代謝障害、慢性疾患、癌、加齢、加齢性疾患、および対象のいずれかの組織を冒す疾患を包含する。例えば、加齢性状態は、心不全、脳卒中、心臓病、アテローム性動脈硬化、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）、認知機能低下、記憶損失、糖尿病、骨粗鬆症、関節炎、筋肉量低下、難聴（部分的または全聾）、眼に関連する状態（例えば、眼のかすみまたは網膜疾患）、緑内障、早老症候群（例えば、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群）、および癌を包含する。ある種の態様では、疾患は網膜疾患である（例えば黄斑変性）。いくつかの態様では、加齢性状態は老化である。限定しない例として、グリア細胞の老化はアルツハイマー病の原因であり得る。例えばBussian, et al., Nature. 2018 Sep 19を参照のこと。いくつかの場合には、状態は神経ダメージである。いくつかの場合には、状態は中枢神経系（CNS）のダメージである。いくつかの場合には、神経ダメージは末梢神経ダメージである。いくつかの場合には、神経ダメージはニューラプラキシア、アクソノトメーシス、またはニューロトメーシスである。
いくつかの場合には、状態は、細胞、組織、臓器、および／または対象のDNAメチル化に基づく年齢をコントロールに対して相対的に増大させる。いくつかの場合には、状態は、細胞、組織、臓器、および／または対象のDNAメチル化に基づく年齢を、少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、少なくとも500％、少なくとも600％、少なくとも700％、少なくとも800％、少なくとも900％、または少なくとも1,000％だけ、コントロールに対して相対的に増大させる。いくつかの場合には、コントロールは状態を有さない細胞、組織、臓器、および／または対象である。いくつかの場合には、コントロールは、状態を有することに先立つ同じ細胞、組織、臓器、および／または対象である。特定の理論によって拘束されることなしに、本願に記載される方法のいずれかは、有疾患細胞、有疾患組織、有疾患臓器、および／または疾患を有するか、そのリスクがあるか、もしくはそれを有することを疑われる対象のDNAメチル化に基づく年齢を減少させることに有用であり得る。いくつかの場合には、疾患は、細胞、組織、臓器、および／または対象のDNAメチル化に基づく年齢を増大させる。いくつかの場合には、疾患は傷害である。
いくつかの場合には、状態は加齢である。いくつかの場合には、加齢はエピジェネティックなノイズによって駆動される。例えばOberdoerffer and Sinclair. Nat Rev Mol Cell Biol 8, 692－702, doi: 10.1038/nrm2238 (2007)；Oberdoerffer et al. Cell 135, 907－918, doi:10.1016/j.cell.2008.10.025 (2008)を参照のこと。特定の理論によって拘束されることなしに、哺乳類細胞は、一生の初期からのエピジェネティックな情報の忠実なコピーを保持し得る。情報理論におけるShannonの「観察者」系と相似に、本質的には、伝達の間に情報が失われるかまたはノイズが導入される場合に受信側におけるその再構成を許すための元々のシグナルのバックアップコピーである。例えば、観察者系の記載についてはShannon, The Bell System Technical Journal 27, 379－423 (1948)を参照のこと。
本願において用いられる「眼（ocular）疾患」または「眼（eye）疾患」は、眼の疾患または状態である。眼を冒す状態の限定しない例は、眼瞼外反、兎眼、眼瞼皮膚弛緩、眼瞼下垂、ものもらい、黄色板、皮膚炎、デモデックス、リーシュマニア症、ロア糸状虫症、オンコセルカ症、シラミ症、（単純ヘルペス）、らい病、伝染性軟属腫、結核、いちご腫、帯状疱疹、とびひ、涙腺炎、流涙、眼球突出、結膜炎、強膜炎、角膜炎、角膜潰瘍／角膜剥離、雪盲／アークアイ、タイゲソン点状表層角膜炎、角膜新生血管形成、フックスジストロフィー、円錐角膜、乾性角結膜炎、虹彩炎、虹彩、ぶどう膜炎、交感性眼炎、白内障、水晶体、脈絡網膜炎症、孤立性脈絡網膜炎症、脈絡網膜炎、脈絡膜炎、網膜炎、網膜脈絡膜炎、散在性脈絡網膜炎症、滲出性網膜症、後部毛様体炎、扁平部炎、脈絡網膜炎症、原田病、脈絡網膜炎症、脈絡膜、脈絡膜網膜瘢痕、黄斑瘢痕、後極（炎症後）（外傷後）、日光網膜症、脈絡膜変性、萎縮、硬化症、網膜色素線条症、脈絡膜ジストロフィー、コロイデレミア、脈絡膜性、輪紋状（傍視神経乳頭）、脳回状萎縮、脈絡膜、オルニチン血症、脈絡膜出血、脈絡膜剥離、脈絡膜網膜性、脈絡膜網膜炎症、感染性および寄生虫性疾患、脈絡網膜炎、梅毒性、トキソプラズマ、結核、脈絡網膜、網膜剥離、網膜、脈絡膜、乱視、網膜分離症、高血圧性網膜症、糖尿病網膜症、網膜症、未熟児網膜症、加齢性黄斑変性、黄斑、黄斑変性、標的黄斑症、網膜前膜、周辺部網膜変性、遺伝性網膜ジストロフィー、網膜色素変性症、網膜出血、網膜層、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、網膜障害、黄斑浮腫、黄斑、網膜障害、糖尿病網膜症、緑内障、視神経症、高眼圧、開放隅角緑内障、閉塞隅角緑内障、正常眼圧緑内障、開放隅角緑内障、閉塞隅角緑内障、飛蚊症、レーバー遺伝性視神経症、視神経乳頭ドルーゼン、斜視、眼筋眼麻痺、進行性外眼筋麻痺、内斜視、外斜視、屈折の障害、遠近調節、遠視、近視、アスティグマティズム、不同視、老眼、眼筋麻痺、弱視、レーバー先天性黒内障、暗点、アノプシア、色盲、全色盲／マスクン、錐体細胞、夜盲症、失明、河川盲目症、小眼球症／コロボーマ、視神経、脳、脊髄、眼の充血、アーガイルロバートソン瞳孔、瞳孔、角膜真菌症、眼球乾燥症、および無虹彩を包含する。いくつかの態様では、眼疾患は急性または慢性の眼の傷害である。
いくつかの態様では、眼疾患は角膜掻創である。
いくつかの態様では、眼疾患は緑内障である。
いくつかの態様では、眼疾患は角膜疾患である（例えば、角膜または角膜細胞を冒す疾患）。いくつかの態様では、眼疾患は、アカントアメーバ角膜炎、眼瞼外反、兎眼性弱視、アニソコリア、アスティグマティズム、ベル麻痺、眼瞼炎、霧視、眼の灼熱感、白内障、黄斑変性、加齢性黄斑変性、糖尿病性眼疾患、緑内障、ドライアイ、不良な視覚（例えばロービジョン）、アスティグマティズム、眼瞼炎、白内障、霰粒腫、結膜炎、糖尿病網膜症、ドライアイ、緑内障、角膜炎、円錐角膜、黄斑変性、高眼圧、瞼裂斑、翼状片、網膜色素変性症、または眼の癌（例えば、網膜芽細胞腫、眼の黒色腫、眼のリンパ腫、髄上皮腫、結膜の扁平上皮細胞癌）である。角膜疾患の例は、角膜新生血管形成（NV）、角膜ジストロフィー、角膜炎症、角膜剥離、および角膜線維症を包含するが、これらに限定されない。いくつかの態様では、眼疾患は円錐角膜である。いくつかの態様では、眼疾患は黄斑変性である。眼疾患の追加の限定しない例はInternational Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems（例えば、VII diseases of the eye and adnexa）に見出され得る。
眼疾患は眼および／または付属器のいずれかの一部を冒し得る。いくつかの態様では、眼疾患は、眼瞼、涙器系、および／または眼窩の障害である。いくつかの態様では、眼疾患は結膜の障害である。いくつかの態様では、眼疾患は強膜、角膜、虹彩、および／または毛様体の障害である。いくつかの態様では、眼疾患は水晶体の障害である。いくつかの態様では、眼疾患は脈絡膜および／または網膜の障害である。いくつかの態様では、眼疾患は緑内障である。いくつかの態様では、眼疾患は硝子体および／または眼球の障害である。いくつかの態様では、眼疾患は視神経および／または視覚経路の障害である。いくつかの態様では、眼疾患は眼筋、両眼運動、遠近調節、および／または屈折の障害である。いくつかの態様では、眼疾患は視覚の不調および／または失明である。いくつかの態様では、眼疾患は加齢に関連し、例えば、加齢に関連する失明、加齢に関連する視力の低下、および／または網膜機能の衰えである。
いずれかの好適な方法が眼の機能を測定するために用いられ得る。限定しない例は視力検査、パターン網膜電図、および病理を包含する。
用語「遺伝子疾患」は、対象のゲノムの1つ以上の異常によって引き起こされる疾患、例えば対象の誕生から存在する疾患を言う。遺伝子疾患は遺伝性であり得、親の遺伝子から受け継がれ得る。遺伝子疾患は、対象のDNAおよび／またはRNAの変異または変化によってもまた引き起こされ得る。かかるケースでは、それが生殖細胞系列に起こる場合には、遺伝子疾患は遺伝性であろう。例示的な遺伝子疾患は、アースコグ・スコット症候群、オーゼ症候群、軟骨無形成症、先端骨形成不全、嗜癖、副腎白質ジストロフィー、アルビニズム、無眼瞼・大口症症候群、アラジール症候群、アルカプトン尿症、アルファ－1アンチトリプシン欠損症、アルポート症候群、アルツハイマー病、喘息、自己免疫多腺性症候群、アンドロゲン不応症候群、アンジェルマン症候群、運動失調、毛細血管拡張性運動失調、アテローム性動脈硬化、注意欠如・多動障害（ADHD）、自閉症、禿頭症、バッテン病、ベックウィズ・ヴィーデマン症候群、ベスト病、双極性障害、短指症）、乳癌、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病、シャルコー・マリー・トゥース病、クローン病、口唇裂、コケイン症候群、コフィン・ローリー症候群、結腸癌、先天性副腎過形成、コルネリア・デランゲ症候群、コステロ症候群、カウデン症候群、頭蓋前頭鼻部異形成、クリグラー・ナジャー症候群、クロイツフェルトヤコブ病、嚢胞性線維症、聾、うつ病、糖尿病、捻曲性骨異形成、ディジョージ症候群、ダウン症候群、ディスレクシア、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、デュボビッツ症候群、外胚葉異形成、エリス・ファンクレフェルト症候群、エーラス・ダンロス、表皮水疱症、エピレプシー、本態性振戦、家族性高コレステロール血症、家族性地中海熱、脆弱X症候群、フリードライヒ運動失調、ゴーシェ病、緑内障、グルコース・ガラクトース吸収不良症、グルタル酸尿症、脳回状萎縮、ゴールドバーグ・シュプリンツェン症候群（口蓋心臓顔面症候群）、ゴーリン症候群、ヘイリー・ヘイリー病、片側肥大、ヘモクロマトーシス、血友病、遺伝性運動感覚ニューロパチー（HMSN）、遺伝性非ポリポーシス大腸癌（HNPCC）、ハンチントン病、高IgMを有する免疫不全、若年発症糖尿病、クラインフェルター症候群、歌舞伎症候群、リー病、QT延長症候群、肺癌、悪性黒色腫、躁うつ病、マルファン症候群、メンケス症候群、流産、ムコ多糖症、多発性内分泌腫瘍症、多発性硬化症、筋ジストロフィー、筋萎縮性筋萎縮性側索硬化症、筋強直性ジストロフィー、神経線維腫症、ニーマン・ピック病、ヌーナン症候群、肥満、卵巣癌、膵臓癌、パーキンソン病、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ペンドレッド症候群、腓骨筋萎縮、フェニルケトン尿症（PKU）、多発性嚢胞腎臓疾患、プラダー・ウィリ症候群、原発性胆汁性肝硬変、前立腺癌、REAR症候群、レフサム病、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、レット症候群、サンフィリポ症候群、統合失調症、重症複合免疫不全、鎌状赤血球貧血、二分脊椎症、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳萎縮、成人突然死症候群、タンジール病、テイ・サックス病、血小板減少橈骨欠損症候群、タウンズブロックス症候群、結節性硬化症、ターナー症候群、アッシャー症候群、フォン・ヒッペル・リンドウ症候群、ワールデンブルグ症候群、ウィーバー症候群、ウェルナー症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、色素性乾皮症、早老症候群（例えば、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群）、およびツェルウェーガー症候群を包含するが、これらに限定されない。
「増殖性疾患」は、細胞の増加による異常な成長または進展を原因として起こる疾患を言う（Walker, Cambridge Dictionary of Biology, Cambridge University Press: Cambridge, UK, 1990）。増殖性疾患は：1）正常では休止期の細胞の病的増殖；2）それらの正常な所在からの細胞の病的移動（例えば、新生物性の細胞の転移）；3）マトリックスメタロプロテイナーゼ（例えば、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、およびエラスターゼ）などの蛋白質分解酵素の病的発現；または4）増殖性網膜症および腫瘍転移におけるような病的血管新生に関連し得る。例示的な増殖性疾患は、癌（すなわち「悪性新生物」）、良性新生物、血管新生、炎症性疾患、および自己免疫疾患を包含する。
用語「新生物」および「腫瘍」は本願においては交換可能に用いられ、塊の成長が正常な組織の成長を凌駕し、それと調和していない組織の異常な塊を言う。新生物または腫瘍は、次の性質に依存して「良性」または「悪性」であり得る：細胞分化度（形態学および機能性を包含する）、成長速度、局所的な侵襲、および転移。「良性新生物」は一般的に良く分化しており、悪性新生物よりも特徴的に低速の成長を有し、原発部位に限局的なままに留まる。加えて、良性新生物は、浸潤、侵襲、または遠くの部位に転移する能力を有さない。例示的な良性新生物は、脂肪腫、軟骨腫、腺腫、アクロコルドン、老人性血管腫、脂漏性角化症、ほくろ、および脂腺増殖症を包含するが、これらに限定されない。いくつかのケースでは、ある種の「良性」腫瘍は後に悪性新生物を生起させ得る。これは腫瘍の新生物性の細胞の亜集団の追加の遺伝子変化からもたらされ得、これらの腫瘍は「前悪性新生物」と言われる。例示的な前悪性新生物はテラトーマである。対照的に、「悪性新生物」は一般的に不良に分化しており（退形成）、漸進的な浸潤、侵襲、および取り囲む組織の破壊を伴う特徴的に急速な成長を有する。さらにその上、悪性新生物は一般的に遠くの部位に転移する能力を有する。用語「転移」、「転移性」、または「転移する」は、原発のまたは元々の腫瘍から別の臓器または組織への癌性の細胞の広がりまたは移動を言い、典型的には、二次（転移）腫瘍が所在する臓器または組織のものではなく、原発のまたは元々の腫瘍の組織型の「二次腫瘍」または「二次細胞塊」の存在によって同定可能である。例えば、骨に移動した前立腺癌は転移した前立腺癌であると言われ、骨組織で成長する癌性の前立腺癌細胞を包含する。
用語「癌」は、コントロール不能に増殖し、かつ浸潤し正常な体組織を壊す能力を有する異常な細胞の発生を特徴とする疾患のクラスを言う。例えばStedman’s Medical Dictionary, 25th ed.; Hensyl ed.; Williams & Wilkins: Philadelphia, 1990を参照のこと。例示的な癌は、聴神経腫瘍；腺癌；副腎癌；肛門癌；脈管肉腫（例えば、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、血管肉腫）；虫垂癌；良性単クローン性ガンモパチー；胆道癌（例えば、胆管癌腫）；膀胱癌；乳癌（例えば、乳部の腺癌、乳部の乳頭癌腫、乳腺癌、乳部の髄様癌腫）；脳腫瘍（例えば、髄膜腫、膠芽腫、グリオーマ（例えば、星細胞腫、乏突起膠腫）、髄芽腫）；気管支癌；カルチノイド腫瘍；子宮頸癌（例えば、子宮頸部腺癌）；絨毛癌腫；コルドーマ；頭蓋咽頭腫；大腸癌（例えば、結腸癌、直腸癌、大腸腺癌）；結合組織癌；上皮癌腫；上衣腫；内皮肉腫（例えば、カポジ肉腫、多発性特発性出血性肉腫）；子宮内膜癌（例えば、子宮癌、子宮肉腫）；食道癌（例えば、食道の腺癌、バレット腺癌）；ユーイング肉腫；眼の癌（例えば、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫）；家族性好酸球増多症；胆嚢癌；胃癌（例えば、胃腺癌）；消化管間質腫瘍（GIST）；胚細胞癌；頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮細胞癌腫、口腔癌（例えば、口腔扁平上皮細胞癌腫）、喉の癌（例えば、喉頭癌、咽頭癌、上咽頭癌、中咽頭癌））；造血系の癌（例えば、白血病、例えば急性リンパ球性白血病（ALL）（例えば、B細胞ALL、T細胞ALL）、急性骨髄性白血病（AML）（例えば、B細胞AML、T細胞AML）、慢性骨髄性白血病（CML）（例えば、B細胞CML、T細胞CML）、および慢性リンパ球性白血病（CLL）（例えば、B細胞CLL、T細胞CLL））；リンパ腫、例えばホジキンリンパ腫（HL）（例えば、B細胞HL、T細胞HL）および非ホジキンリンパ腫（NHL）（例えば、B細胞NHL、例えばびまん性大細胞型リンパ腫（DLCL）（例えば、びまん性大B細胞リンパ腫）、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（CLL／SLL）、マントル細胞リンパ腫（MCL）、辺縁帯B細胞リンパ腫（例えば、粘膜関連リンパ組織（MALT）リンパ腫、節性辺縁帯B細胞リンパ腫、脾辺縁帯B細胞リンパ腫）、原発性縦隔B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫（すなわち、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症）、有毛細胞白血病（HCL）、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Bリンパ芽球性リンパ腫および原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；およびT細胞NHL、例えば前駆Tリンパ芽球性リンパ腫／白血病、末梢T細胞リンパ腫（PTCL）（例えば、皮膚T細胞リンパ腫（CTCL）（例えば、菌状息肉症、セザリー症候群）、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラーT細胞リンパ腫、腸管症型T細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様T細胞リンパ腫、および未分化大細胞型リンパ腫）；上に記載されている1つ以上の白血病／リンパ腫の混合物；および多発性骨髄腫（MM））、重鎖病（例えば、アルファ鎖病、ガンマ鎖病、ミュー鎖病）；血管芽腫；下咽頭癌；炎症性筋線維芽細胞腫瘍；免疫細胞性アミロイドーシス；腎臓癌（例えば、ウイルムス腫瘍としてもまた公知の腎芽腫、腎細胞癌腫）；肝臓癌（例えば、肝細胞癌（HCC）、悪性ヘパトーマ）；肺癌（例えば、気管支原性癌腫、小細胞肺癌（SCLC）、非小細胞肺癌（NSCLC）、肺の腺癌）；平滑筋肉腫（LMS）；肥満細胞症（例えば、全身性肥満細胞症）；筋肉癌；骨髄異形成症候群（MDS）；中皮腫；骨髄増殖性障害（MPD）（例えば、真性多血症（PV）、本態性血小板血症（ET）、骨髄線維症（MF）としてもまた公知の特発性骨髄化生（AMM）、慢性特発性骨髄線維症、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性好中球性白血病（CNL）、好酸球増多症候群（HES））；神経芽腫；神経線維腫（例えば、神経線維腫症（NF）1型または2型、シュワノマトーシス）；神経内分泌癌（例えば、膵・消化管神経内分泌腫瘍（GEP－NET）、カルチノイド腫瘍）；骨肉腫（例えば骨癌）；卵巣癌（例えば、嚢胞腺癌、卵巣胎児性癌、卵巣腺癌）；乳頭腺癌；膵臓癌（例えば、膵臓腺癌、膵管内乳頭粘液性新生物（IPMN）、膵島細胞腫瘍）；陰茎癌（例えば、陰茎および陰嚢のパジェット病）；松果体腫；未分化神経外胚葉腫瘍（PNT）；形質細胞新生物；傍腫瘍性症候群；上皮内新生物；前立腺癌（例えば、前立腺腺癌）；直腸癌；横紋筋肉腫；唾液腺癌；皮膚癌（例えば、扁平上皮細胞癌腫（SCC）、ケラトアカントーマ（KA）、黒色腫、基底細胞癌腫（BCC））；小腸癌（例えば、虫垂癌）；軟部組織肉腫（例えば、悪性線維性組織球腫（MFH）、脂肪肉腫、悪性末梢神経鞘腫（MPNST）、軟骨肉腫、線維肉腫、粘液肉腫）；脂腺癌腫；小腸癌；汗腺癌腫；滑膜腫；精巣癌（例えば、セミノーマ、精巣胎児性癌）；甲状腺癌（例えば、甲状腺の乳頭癌腫、乳頭甲状腺癌腫（PTC）、髄様甲状腺癌）；尿道癌；膣癌；および外陰癌（例えば、外陰のパジェット病）を包含するが、これらに限定されない。
用語「炎症性疾患」は、炎症によって引き起こされるか、それからもたらされるか、またはそれをもたらす疾患を言う。用語「炎症性疾患」は、マクロファージ、顆粒球、および／またはTリンパ球による過度の応答を引き起こし、異常な組織ダメージおよび／または細胞死に至る制御不全の炎症性反応をもまた言い得る。炎症性疾患は急性または慢性炎症性状態どちらかであり得、感染または非感染性の原因からもたらされ得る。炎症性疾患は、限定なしに、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、自己免疫障害、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、リウマチ性多発筋痛症（PMR）、痛風関節炎、変形性関節炎、腱炎、滑液包炎、乾癬、嚢胞性線維症、骨関節炎、関節リウマチ、炎症性関節炎、シェーグレン症候群、巨細胞性動脈炎、進行性全身硬化症（強皮症）、強直性脊椎炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、天疱瘡、類天疱瘡、糖尿病（例えばI型）、重症筋無力症、橋本甲状腺炎、グレーブス病、グッドパスチャー病、混合結合組織病、硬化性胆管炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、悪性貧血、炎症性皮膚症、通常型間質性肺臓炎（UIP）、石綿症、珪肺、気管支拡張症、ベリリウム肺、滑石肺、塵肺、サルコイドーシス、剥離性間質性肺炎、リンパ球性間質性肺炎、巨細胞性間質性肺炎、細胞性間質性肺炎、外因性アレルギー性肺胞炎、ウェゲナー肉芽腫症および血管炎の関連する形態（側頭動脈炎および結節性多発動脈炎）、炎症性皮膚症、肝炎、遅延型過敏性反応（例えば、ポイズンアイビー皮膚炎）、肺炎、気道炎症、成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、脳炎、即時型過敏性反応、喘息、枯草熱、アレルギー、急性アナフィラキシー、リウマチ熱、糸球体腎炎、腎盂腎炎、蜂窩織炎、膀胱炎、慢性胆嚢炎、虚血（虚血性傷害）、再灌流傷害、同種移植片拒絶、宿主対移植片拒絶、虫垂炎、動脈炎、眼瞼炎、細気管支炎、気管支炎、子宮頚炎、胆管炎、絨毛膜羊膜炎、結膜炎、涙腺炎、皮膚筋炎、心内膜炎、子宮内膜炎、腸炎、小腸結腸炎、上顆炎、精巣上体炎、筋膜炎、結合組織炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、回腸炎、虹彩炎、喉頭炎、脊髄炎、心筋炎、腎炎、臍炎、卵巣炎、睾丸炎、骨炎、耳炎、膵炎、耳下腺炎、心膜炎、咽頭炎、胸膜炎、静脈炎、肺臓炎、直腸炎、前立腺炎、鼻炎、卵管炎、副鼻腔炎、口内炎、滑膜炎、精巣炎、扁桃炎、尿道炎、膀胱炎、ぶどう膜炎、膣炎、血管炎、外陰炎、外陰部腟炎、血管炎、慢性気管支炎、骨髄炎、視神経炎、側頭動脈炎、横断性脊髄炎、壊死性筋膜炎、および壊死性腸炎を包含する。炎症性眼疾患は術後炎症を包含するが、これに限定されない。いくつかの態様では、炎症性疾患はインフラメージングである（例えば、加齢の副作用である炎症）。
「自己免疫疾患」は、正常で体内に存在する物質および組織に対する対象の体の不適当な免疫応答から生起する疾患を言う。換言すると、免疫系は体の何らかの一部を病原体と間違え、それ自身の細胞を攻撃する。これはある種の臓器に限られ得るか（例えば、自己免疫甲状腺炎）、または異なる場所の特定の組織が関わり得る（例えば、肺および腎臓両方の基底膜を冒し得るグッドパスチャー病）。自己免疫疾患の処置は、典型的には、免疫抑制、例えば免疫応答を減少させる薬によってである。例示的な自己免疫疾患は、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、壊死性血管炎、リンパ節炎、結節性動脈周囲炎、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、潰瘍性大腸炎、全身硬化症、皮膚筋炎／多発性筋炎、抗リン脂質抗体症候群、強皮症、尋常性天疱瘡、ANCA関連血管炎（例えば、ウェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎）、ぶどう膜炎、シェーグレン症候群、クローン病、ライター症候群、強直性脊椎炎、ライム病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、および心筋症を包含するが、これらに限定されない。
用語「肝臓疾患」または「肝疾患」は肝臓のダメージまたは疾患を言う。肝臓疾患の限定しない例は、肝内胆汁うっ滞（例えば、アラジール症候群、胆汁性肝硬変）、脂肪肝（例えば、アルコール性脂肪肝、ライ症候群）、肝静脈血栓症、肝レンズ核変性（すなわちウィルソン病）、肝腫大、肝膿瘍（例えば、アメーバ性肝膿瘍）、肝硬変（例えば、アルコール性、胆汁性、および実験的肝硬変）、アルコール性肝臓疾患（例えば、脂肪肝、肝炎、硬変）、寄生虫性肝臓疾患（例えば、肝エキノコックス症、肝蛭症、アメーバ性肝膿瘍）、黄疸（例えば、溶血性、肝細胞性、胆汁うっ滞性黄疸）、胆汁うっ滞、門脈圧亢進症、肝腫大、腹水、肝炎（例えば、アルコール性肝炎、動物肝炎、慢性肝炎（例えば、自己免疫、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、薬物性慢性肝炎）、中毒性肝炎、ウイルス性ヒト肝炎（例えば、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎）、肉芽腫性肝炎、続発性胆汁性肝硬変、肝性脳症、静脈瘤、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、肝細胞腺腫、血管腫、胆石、肝不全（例えば、肝性脳症、急性肝不全）、血管筋脂肪腫、石灰化肝転移、嚢胞性肝転移、線維層状型肝細胞癌腫、肝腺腫、ヘパトーマ、肝嚢胞（例えば、単純嚢胞、多発性嚢胞肝臓疾患、肝内胆管嚢胞腺腫、総胆管嚢胞）、間葉系腫瘍（間葉系過誤腫、小児血管内皮腫、血管腫、肝紫斑病、脂肪腫、炎症性偽腫瘍）、上皮腫瘍（例えば、胆管過誤腫、胆管腺腫）、限局性結節性過形成、結節性再生性過形成、肝芽腫、肝細胞癌腫、胆管癌腫、嚢胞腺癌、血管の腫瘍、血管肉腫、カポジ肉腫、血管内皮腫、胎児性肉腫、線維肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、癌肉腫、テラトーマ、カルチノイド、扁平上皮癌腫、原発リンパ腫、肝紫斑病、造血性ポルフィリン症、肝性ポルフィリン症（例えば、急性間欠性ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症）、およびツェルウェーガー症候群を包含する。
用語「脾臓疾患」は脾臓の疾患を言う。脾臓疾患の例は、脾腫、脾臓癌、無脾症、脾損傷、特発性紫斑病、フェルティ症候群、ホジキン病、および脾臓の免疫によって媒介される破壊を包含するが、これらに限定されない。
用語「肺（lung）疾患」または「肺（pulmonary）疾患」は肺の疾患を言う。肺疾患の例は、気管支拡張症、気管支炎、気管支肺異形成、間質性肺疾患、職業性肺疾患、肺気腫、嚢胞性線維症、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、重症急性呼吸器症候群（SARS）、喘息（例えば、間欠性喘息、軽症持続型喘息、中等症持続型喘息、重症持続型喘息）、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、肺気腫、間質性肺疾患、サルコイドーシス、石綿症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、肺炎（例えば、葉性肺炎、多葉性肺炎、気管支肺炎、間質性肺炎）、肺線維症、肺結核、リウマチ性肺疾患、肺塞栓、および肺癌（例えば、非小細胞肺癌腫（例えば、腺癌、扁平上皮細胞肺癌腫、大細胞肺癌腫）、小細胞肺癌腫）を包含するが、これらに限定されない。
「血液学的疾患」は、造血細胞または組織を冒す疾患を包含する。血液学的疾患は、異状な血液学的内容および／または機能に関連する疾患を包含する。血液学的疾患の例は、癌の骨髄照射または化学療法処置からもたらされる疾患、悪性貧血などの疾患、出血性貧血、溶血性貧血、再生不良性貧血、鎌状赤血球貧血、鉄芽球性貧血、マラリア、トリパノソーマ症、HTV、肝炎ウイルス、または他のウイルスなどの慢性感染に関連する貧血、骨髄不全によって引き起こされる骨髄癆性貧血、貧血からもたらされる腎不全、貧血、多血症、伝染性単核球症（EVI）、急性非リンパ球性白血病（ANLL）、急性骨髄性白血病（AML）、急性前骨髄球性白血病（APL）、急性骨髄単球性白血病（AMMoL）、真性多血症、リンパ腫、急性リンパ球性白血病（ALL）、慢性リンパ球性白血病、ウイルムス腫瘍、ユーイング肉腫、網膜芽細胞腫、血友病、血栓症の増大したリスクに関連する障害、疱疹、サラセミア、抗体によって媒介される障害、例えば輸血副作用および赤芽球症、赤血球の機械的外傷、例えば微小血管障害性溶血性貧血、血栓性血小板減少性紫斑病および播種性血管内凝固、プラスモジウムなどの寄生虫による感染、例えば鉛中毒からの化学的傷害、ならびに脾機能亢進症を包含する。
用語「神経学的疾患」は神経系のいずれかの疾患を言い、中枢神経系（脳、脳幹、および小脳）、末梢神経系（脳神経を包含する）、および自律神経系（これらの一部は中枢および末梢神経系両方に所在する）が関わる疾患および傷害を包含する。神経変性疾患は、神経細胞の損失をマークとする神経学的疾患の型を言い、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、タウオパチー（前頭側頭型認知症を包含する）、およびハンチントン病を包含するが、これらに限定されない。神経学的疾患の例は、血管性認知症、脳卒中、頭痛、昏迷および昏睡、認知症、痙攣、睡眠障害、トラウマ、感染、新生物、神経眼科学、運動障害、脱髄疾患、脊髄障害、ならびに末梢神経、筋肉、および神経筋接合部の障害を包含するが、これらに限定されない。嗜癖および精神病は双極性障害および統合失調症を包含するが、これらに限定されず、これらもまた神経学的疾患の定義に包含される。神経学的疾患のさらなる例は、後天性てんかん型失語症；急性散在性脳脊髄炎；副腎白質ジストロフィー；脳梁欠損症；失認；アイカルディ症候群；アレキサンダー病；アルパーズ病；交代性片麻痺；アルツハイマー病；筋萎縮性側索硬化症；無脳症；アンジェルマン症候群；血管腫症；無酸素症；失語症；失行症；くも膜嚢胞；くも膜炎；アーノルド・キアリ奇形；脳動静脈奇形；アスペルガー症候群；毛細血管拡張性運動失調；注意欠如・多動障害；自閉症；自律神経機能不全；背部痛；バッテン病；ベーチェット病；ベル麻痺；良性本態性眼瞼痙攣；良性焦点性；筋萎縮；良性頭蓋内圧亢進；ビンスワンガー病；眼瞼痙攣；ブロッホ・サルツバーガー症候群；腕神経叢傷害；脳膿瘍；脳傷害；脳腫瘍（多形性膠芽腫を包含する）；脊髄腫瘍；ブラウン・セカール症候群；カナバン病；手根管症候群（CTS）；カウザルギー；中枢痛症候群；橋中心髄鞘崩壊症；頭蓋障害；脳動脈瘤；脳動脈硬化症；脳萎縮；脳性巨人症；脳性麻痺；シャルコー・マリー・トゥース病；化学療法誘発性ニューロパチーおよびニューロパチー性の痛み；キアリ奇形；舞踏病；慢性炎症性脱髄性多発神経炎（CIDP）；慢性痛；慢性局所疼痛症候群；コフィン・ローリー症候群；遷延性植物状態を包含する昏睡；先天性両側性顔面神経麻痺；大脳皮質基底核変性；頭蓋動脈炎；頭蓋縫合早期癒合症；クロイツフェルトヤコブ病；累積外傷性障害；クッシング症候群；巨細胞封入体疾患（CIBD）；サイトメガロウイルス感染；ダンシングアイ・ダンシングフット症候群；ダンディー・ウォーカー症候群；ドーソン病；ドモルシア症候群；デジェリン・クルンプケ麻痺；認知症；皮膚筋炎；糖尿病ニューロパチー；びまん性硬化症；自律神経障害；ディスグラフィア；ディスレクシア；ジストニア；早期乳児てんかん性脳症；エンプティセラ症候群；脳炎；脳瘤；脳三叉神経領域血管腫症；エピレプシー；エルブ麻痺；本態性振戦；ファブリー病；ファール症候群；失神性めまい；家族性痙性麻痺；熱性痙攣；フィッシャー症候群；フリードライヒ運動失調；前頭側頭型認知症および他の「タウオパチー」；ゴーシェ病；ゲルストマン症候群；巨細胞性動脈炎；巨細胞封入体症；グロボイド細胞白質ジストロフィー；ギランバレー症候群；HTFV－1関連ミエロパチー；ハラーフォルデン・シュパッツ病；頭部傷害；頭痛；片側顔面痙攣；遺伝性痙性対麻痺；遺伝性多発神経炎性失調；耳性帯状疱疹；帯状疱疹；平山症候群；HIV関連認知症およびニューロパチー（AIDSの神経学的顕れをもまた参照のこと）；全前脳胞症；ハンチントン病および他のポリグルタミンリピート疾患；水頭無脳症；水頭症；高コルチゾール血症；低酸素症；免疫によって媒介される脳脊髄炎；封入体筋炎；色素失調症；幼児型；フィタン酸蓄積病；乳児型レフサム病；乳児スパズム；炎症性ミオパチー；頭蓋内嚢胞；頭蓋内圧亢進；ジュベール症候群；カーンズ・セイヤー症候群；ケネディー病；キンズボーン症候群；クリッペル・ファイル症候群；クラッベ病；クーゲルベルグ・ウェランダー病；クールー；ラフォラ病；ランバート・イートン筋無力症候群；ランドウ・クレフナー症候群；延髄外側（ワレンベルグ）症候群；学習障害；リー病；レノックス・ガストー症候群；レッシュ・ナイハン症候群；白質ジストロフィー；レビー小体型認知症；滑脳症；閉じ込め症候群；ルー・ゲーリック病（運動ニューロン疾患または筋萎縮性側索硬化症としてもまた公知）；腰椎椎間板疾患；ライム病の神経学的後遺症；マチャド・ジョセフ病；巨頭症；巨脳症；メルカーソン・ローゼンタール症候群；メニエール病；髄膜炎；メンケス病；異染性白質ジストロフィー；小頭症；偏頭痛；ミラーフィッシャー症候群；小発作；ミトコンドリアミオパチー；メビウス症候群；一側性筋萎縮；運動ニューロン疾患；もやもや病；ムコ多糖症；多発梗塞性認知症；多巣性運動ニューロパチー；多発性硬化症および他の脱髄障害；起立性低血圧を有する多系統萎縮症；筋ジストロフィー；重症筋無力症；髄鞘破壊性びまん性硬化症；乳幼児のミオクロニー脳症；ミオクローヌス；ミオパチー；先天性ミオトニア；ナルコレプシー；神経線維腫症；神経遮断薬悪性症候群；AIDSの神経学的顕れ；ループスの神経学的後遺症；ニューロミオトニア；神経セロイドリポフスチン症；神経移動障害；ニーマン・ピック病；オサリバン・マクロード症候群；後頭神経痛；潜在性脊椎閉鎖不全シークエンス；大田原症候群；オリーブ橋小脳萎縮；オプソクローヌス・ミオクローヌス；視神経炎；起立性低血圧；過用症候群；パレステジア；パーキンソン病；先天性パラミオトニア；傍腫瘍性疾患；発作；パリーロンバーグ症候群；ペリツェウス・メルツバッハ病；周期性四肢麻痺；末梢ニューロパチー；有痛性ニューロパチーおよびニューロパチー性の痛み；遷延性植物状態；広汎性発達障害；光くしゃみ反射；フィタン酸蓄積病；ピック病；ピンチナーブ；下垂体腫瘍；多発性筋炎；孔脳症；ポストポリオ症候群；帯状疱疹後神経痛（PHN）；感染後脳脊髄炎；起立性低血圧；プラダー・ウィリ症候群；原発性側索硬化症；プリオン病；進行性；顔面半側萎縮；進行性多巣性白質脳症；進行性硬化性ポリオジストロフィー；進行性核上性麻痺；脳偽腫瘍；ラムゼイ・ハント症候群（I型およびII型）；ラスムッセン脳炎；反射性交感神経性ジストロフィー症候群；レフサム病；反復運動障害；反復ストレス傷害；むずむず脚症候群；レトロウイルス関連ミエロパチー；レット症候群；ライ症候群；聖ヴィトゥス舞踏病；サンドホフ病；シルダー病；裂脳症；中隔視神経形成異常症；乳幼児揺さぶられ症候群；帯状疱疹；シャイ・ドレーガー症候群；シェーグレン症候群；睡眠時無呼吸；ソトス症候群；痙性；二分脊椎症；脊髄傷害；脊髄腫瘍；脊髄性筋萎縮症；スティッフパーソン症候群；脳卒中；スタージ・ウェーバー症候群；亜急性硬化性全脳炎；くも膜下出血；皮質下動脈硬化性脳症；シデナム舞踏病；失神；脊髄空洞症；遅発性ジスキネジア；テイ・サックス病；側頭動脈炎；係留脊髄症候群；トムセン病；胸郭出口症候群；三叉神経痛；トッド麻痺；トゥレット症候群；一過性脳虚血発作；伝達性海綿状脳症；横断性脊髄炎；外傷性脳傷害；振戦；三叉神経痛；熱帯性痙性不全対麻痺；結節性硬化症；血管性認知症（多発梗塞性認知症）；側頭動脈炎を包含する血管炎；フォン・ヒッペル・リンドウ病（VHL）；ワレンベルグ症候群；ウェルドニッヒ・ホフマン病；ウエスト症候群；むち打ち；ウィリアムズ症候群；ウィルソン病；およびツェルウェーガー症候群を包含する。
用語「筋骨格系疾患」または「MSD」は、対象の関節、靭帯、筋肉、神経、腱、ならびに手足、頸部、および背部を支持する構造の傷害ならびに／または痛みを言う。ある種の態様では、MSDは変性疾患である。ある種の態様では、MSDは炎症性状態を包含する。MSDに関連し得る対象の体の一部は、背中および腰、頸部、肩、ならびに四肢（腕、脚、足、および手）を包含する。ある種の態様では、MSDは、骨疾患、例えば軟骨無形成症、先端巨大症、骨性仮骨、骨の脱灰、骨の破折、骨髄疾患、骨髄新生物、先天性角化異常症、白血病（例えば、有毛細胞白血病、リンパ球性白血病、骨髄性白血病、フィラデルフィア染色体陽性白血病、形質細胞白血病、幹細胞白血病）、全身性肥満細胞症、骨髄異形成症候群、発作性夜間ヘモグロビン尿症、骨髄肉腫、骨髄増殖性障害、多発性骨髄腫、真性多血症、ピアソン骨髄膵臓症候群、骨新生物、骨髄新生物、ユーイング肉腫、骨軟骨腫、破骨細胞腫、骨肉腫、短指症、カムラティ・エンゲルマン症候群、頭蓋縫合早期癒合症、クルゾン頭蓋顔面異骨症、小人症、軟骨無形成症、ブルーム症候群、コケイン症候群、エリス・ファンクレフェルト症候群、ゼッケル症候群、脊椎骨端異形成、先天性脊椎骨端異形成、ウェルナー症候群、骨化過剰症、骨棘、クリッペル・トレノネー・ウェーバー症候群、マルファン症候群、マッキューン・オルブライト症候群、骨炎、骨関節炎、骨軟骨炎、骨軟骨異形成、カシン・ベック病、レリーワイル骨軟骨異形成、骨軟骨症、骨ジストロフィー、骨形成不全症、骨溶解、ゴーハム・スタウト症候群、骨軟化症、骨髄炎、骨壊死、オステオペニア、大理石骨病、骨粗鬆症、骨硬化症、耳脊椎巨大骨端異形成、肥厚性皮膚骨膜症、骨のパジェット病、多趾症、メッケル症候群、くる病、ロスムンド・トムソン症候群、ソトス症候群、脊椎骨端異形成、先天性脊椎骨端異形成、合指症、アペール症候群、合指症II型、またはウェルナー症候群である。ある種の態様では、MSDは、軟骨疾患、例えば軟骨新生物、骨軟骨炎、骨軟骨異形成、カシン・ベック病、またはレリーワイル骨軟骨異形成である。ある種の態様では、MSDは、ヘルニア、例えば椎間板ヘルニアである。ある種の態様では、MSDは、関節疾患、例えば関節痛、関節炎（例えば、痛風（例えば、ケリー・シーグミラー症候群、レッシュナイハン症候群）、ライム病、骨関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、リウマチ熱、関節リウマチ、フェルティ症候群、滑膜炎、ブラウ症候群、ネイル・パテラ症候群、脊椎関節症、反応性関節炎、スティックラー症候群、滑膜疾患、滑膜炎、またはブラウ症候群である。ある種の態様では、MSDはランガー・ギデオン症候群である。ある種の態様では、MSDは、筋肉疾患、例えばバース症候群、ミトコンドリア脳筋症、MELAS症候群、MERRF症候群、MNGIE症候群、ミトコンドリアミオパチー、カーンズ・セイヤー症候群、筋痛症、線維筋痛症、リウマチ性多発筋痛症、筋腫、筋炎、皮膚筋炎、神経筋疾患、カーンズ・セイヤー症候群、筋ジストロフィー、筋無力症、先天性筋無力症候群、ランバート・イートン筋無力症候群、重症筋無力症、ミオトニア、先天性ミオトニア、脊髄性筋萎縮症、テタニー、眼筋麻痺、または横紋筋融解症である。ある種の態様では、MSDはプロテウス症候群である。ある種の態様では、MSDは、リウマチ疾患、例えば関節炎（例えば、痛風（例えば、ケリー・シーグミラー症候群、レッシュナイハンライム病））、骨関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、リウマチ熱、関節リウマチ、フェルティ症候群、滑膜炎、ブラウ症候群、痛風（例えば、ケリー・シーグミラー症候群、レッシュナイハン症候群）、リウマチ性多発筋痛症、リウマチ熱、リウマチ性心臓病、またはシェーグレン症候群である。ある種の態様では、MSDはシュワルツ・ヤンペル症候群である。ある種の態様では、MSDは、骨系統疾患、例えばレリーワイル骨軟骨異形成、骨格奇形、メルニック・ニードルス症候群、肥厚性皮膚骨膜症、リーガー症候群、脊柱疾患、椎間板ヘルニア、側弯症、二分脊椎症、脊椎炎、強直性脊椎炎、脊椎関節症、反応性関節炎、脊椎骨端異形成、先天性脊椎骨端異形成、または脊椎症である。いくつかの態様では、疾患は筋骨格系疾患である。
「有痛状態」は、ニューロパチー性の痛み（例えば、末梢ニューロパチー性の痛み）、中枢痛、求心路遮断痛、慢性痛（例えば、慢性侵害受容性痛、および慢性痛の他の形態、例えば術後痛、例えば臀部、膝、または他の置換手術後に生起する痛み）、術前痛、侵害受容器の刺激（侵害受容性痛）、急性痛（例えば、幻影および一過的急性痛）、非炎症性痛、炎症性痛、癌に関連する痛み、創傷痛、熱傷痛、術後痛、医療措置に関連する痛み、掻痒からもたらされる痛み、膀胱痛症候群、月経前不快気分障害および／または月経前症候群に関連する痛み、慢性疲労症候群に関連する痛み、早産に関連する痛み、薬物嗜癖からの離脱症状に関連する痛み、関節痛、関節炎性の痛み（例えば、結晶性関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、痛風関節炎、反応性関節炎、関節リウマチ、またはライター関節炎に関連する痛み）、腰仙痛、筋骨格痛、頭痛、偏頭痛、筋肉痛、腰痛、頸部痛、歯痛、歯／顎顔面痛、内臓痛および同類を包含するが、これらに限定されない。本願において企図される有痛状態の1つ以上は、上でおよび本願において提供される痛みの種々の型の混合物を含み得る（例えば、侵害受容性痛、炎症性痛、ニューロパチー性の痛みなど）。いくつかの態様では、特定の痛みが優勢であり得る。他の態様では、有痛状態は1つが優勢であることなしに痛みの2つ以上の型を含む。技能を有する臨床医は有痛状態に基づいて特定の対象の治療上有効量を達成するための用量を決定し得る。
用語「精神障害」は心の疾患を言い、Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders － Fourth Edition (DSM－IV), アメリカ精神医学会刊, Washington D.C. (1994)に列記されている疾患および障害を包含する。精神障害は、不安障害（例えば、急性ストレス障害広場恐怖症、全般性不安障害、強迫性障害、パニック障害、心的外傷後ストレス障害、分離不安障害、社交恐怖症、および限局性恐怖症）、小児期障害（例えば、注意欠陥／多動性障害、行為障害、および反抗挑戦性障害）、摂食障害（例えば、神経性無食欲症および神経性大食症）、気分障害（例えば、うつ病、双極性障害、気分循環性障害、気分変調性障害、および大うつ病性障害）、パーソナリティ障害（例えば、反社会性パーソナリティ障害、回避性パーソナリティ障害、境界性パーソナリティ障害、依存性パーソナリティ障害、演技性パーソナリティ障害、自己愛性パーソナリティ障害、強迫性パーソナリティ障害、パラノイドパーソナリティ障害、スキゾイドパーソナリティ障害、および統合失調症型パーソナリティ障害）、精神病性障害（例えば、短期精神病性障害、妄想性障害、統合失調感情障害、統合失調症様障害、統合失調症、および共有精神病性障害）、物質関連障害（例えば、アルコール依存、アンフェタミン依存、大麻依存、コカイン依存、幻覚剤依存、吸入薬依存、ニコチン依存、オピオイド依存、フェンシクリジン依存、および鎮静剤依存）、適応障害、自閉症、せん妄、認知症、多発梗塞性認知症、学習および記憶障害（例えば、健忘および加齢性記憶損失）、およびトゥレット障害を包含するが、これらに限定されない。
用語「代謝障害」は、炭水化物、脂質、蛋白質、核酸、またはそれらの組み合わせの正常な代謝の変改が関わるいずれかの障害を言う。代謝障害は代謝経路の欠乏または過剰どちらかに関連し、核酸、蛋白質、脂質、および／または炭水化物の代謝の不均衡をもたらす。代謝に影響する因子は、内分泌（ホルモン）コントロール系（例えば、インスリン経路、腸管内分泌ホルモン。GLP－1、PYY、または同類を包含する）、神経コントロール系（例えば、脳のGLP－1）、または同類を包含し、これらに限定されない。代謝障害の例は、糖尿病（例えば、I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病）、高血糖症、高インスリン血症、インスリン抵抗性、および肥満を包含するが、これらに限定されない。
いくつかの態様では、疾患は細胞機能不全を特徴とする。例えば、疾患はミトコンドリア疾患であり得る。限定しないミトコンドリア疾患は、フリードライヒ運動失調症、アルパース病、バース症候群、ベータ酸化異常症、カルニチン欠乏症、CPT1欠損症、およびミトコンドリアDNA枯渇を包含する。細胞機能不全は、ミトコンドリア機能不全、RNA複製機能不全、DNA複製機能不全、翻訳機能不全、および／または蛋白質折り畳み機能不全を包含し得る。
いくつかの態様では、疾患または状態は、創傷（wood）、出血、傷害（例えば、骨折、銃創、切創、手術（例えば、帝王切開）の間の瘢痕化による。
いくつかの態様では、疾患は感染性疾患である（例えば、病原体および／またはウイルスによって引き起こされる疾患）。感染性疾患の限定しない例は、結核、HIV／AIDS、狂犬病、ペスト、コレラ、デング熱、麻疹、マラリア、髄膜炎、百日咳、ライム病、インフルエンザ、C型肝炎、腸チフス、およびポリオを包含する。
本願において用いられる「加齢の細胞性の原因」は、エピジェネティックな情報の損失または改変を包含する。
用語「c－Myc」または「Myc」は、細胞周期進行に関連づけられている核リン酸化蛋白質を言う。c－Mycは転写因子MAXとのヘテロ二量体を形成することができ、ヘテロ二量体は核酸（例えば、操作された核酸）上のEボックスコンセンサス（consequence）配列に結合して標的遺伝子の転写を制御することができる。ある種の態様では、c－Mycをコードするヌクレオチド配列は、アクセッション番号NM_001354870.1またはNM_002467.5でNCBI RefSeqデータベースに記載されている配列と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含む。ある種の態様では、c－Mycをコードするアミノ酸配列は、NP_002458.2またはNP_001341799.1と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含む。ある種の態様では、方法は、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を誘導することを、c－Myc発現を誘導することの不在下においてまたはc－Mycを活性化することの不在下において含む。c－Myc発現を誘導することの不在は、細胞、組織、対象、またはそれらのいずれかの組み合わせにおけるc－Myc発現の内因性のレベルを超えるc－Myc発現の実質的誘導の不在を言い得る。細胞、組織、対象、またはそれらのいずれかの組み合わせにおけるc－Myc発現の内因性のレベルと比較して、c－Myc発現の実質的誘導の不在は、細胞、組織、対象、またはそれらのいずれかの組み合わせにおけるc－Myc発現の内因性のレベルと比較して、c－Myc発現を70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満、またはその間のいずれかの値だけ増大させることを言い得る。c－Myc発現を活性化することの不在は、細胞、組織、対象、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける内因性のc－Myc活性を超えるc－Myc（例えば活性）の実質的活性化の不在を言い得る。細胞、組織、対象、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける内因性のc－Myc活性と比較して、c－Myc活性の実質的誘導の不在は、細胞、組織、対象、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける内因性のc－Myc活性と比較して、c－Myc活性を70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満、またはその間のいずれかの値だけ増大させることを言い得る。
本願において用いられる用語「有効量」および「治療上有効量」は、対象に投与されるときに、対象が患っている状態を少なくとも部分的に処置するために有効である本発明の化合物の量または濃度を言う。
本願において用いられる「機能的」または「活性」である蛋白質は、（例えば、転写因子としてまたは誘導因子として作用することができる）その生物活性を保持するものである。逆に、機能的でないかまたは不活性である蛋白質は、その野生型機能の1つ以上を発揮することができないものである。
用語「遺伝子」は、蛋白質を発現する核酸（例えば、操作された核酸）断片を言い、コード配列に先行する（5'非コード配列）および後続する（3'非コード配列）制御配列を包含する。「ネイティブな遺伝子」は、それ自身の制御配列を有する天然に見出される遺伝子を言う。「キメラ遺伝子」または「キメラコンストラクト」は、ネイティブな遺伝子ではなく、天然には一緒に見出されない制御およびコード配列を含むいずれかの遺伝子またはコンストラクトを言う。従って、キメラ遺伝子またはキメラコンストラクトは、異なるソースに由来する制御配列およびコード配列、または同じソースに由来するが、天然に見出されるものとは異なる様式で並べられた制御配列およびコード配列を含み得る。「内因性の遺伝子」は、生物のゲノム上のその天然の所在におけるネイティブな遺伝子を言う。「外来性の」遺伝子は、正常ではホスト生物に見出されないが、遺伝子移入によってホスト生物に導入される遺伝子を言う。外来性の遺伝子は、非ネイティブな生物に挿入されたネイティブな遺伝子、またはキメラ遺伝子を含み得る。「トランスジーン」は、形質転換手続きによってゲノム上に導入された遺伝子である。
「ホモログ」または「相同」は、ある種のパーセントの同一性を共有する配列（例えば、核酸（例えば、操作された核酸）またはアミノ酸配列）を言う（例えば、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも71％、少なくとも72％、少なくとも73％、少なくとも74％、少なくとも75％、少なくとも76％、少なくとも77％、少なくとも78％、少なくとも79％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％のパーセントの同一性）。相同配列はパラログまたはオーソログ配列を包含するが、これらに限定されない。パラログ配列は種のゲノム内の遺伝子の重複から生起するが、オーソログ配列は種分化事象後に分岐する。機能的ホモログは野生型蛋白質の1つ以上の生物活性を保持する。ある種の態様では、OCT4、KLF4、またはSOX2の機能的ホモログは、野生型カウンターパートの生物活性（例えば転写因子活性）の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも100％を保持する。
「KLF4」はKruppel様因子4、EZF、またはGKLFともまた言われ得、ジンクフィンガー転写因子である。KLF4は分化および増殖の制御に関連づけられており、p300－CBP共役活性化因子ファミリーのメンバーを包含する共役活性化因子と相互作用することができる。本願において用いられるKLF4転写因子、そのホモログ（例えば、機能的なホモログ）、またはバリアントは、ヒトを包含するいずれかの種に由来し得る。ある種の態様では、ヒトKLF4をコードする核酸（例えば、操作された核酸）は、アクセッション番号NM_004235.5またはNM_001314052.1でNCBI RefSeqデータベースに記載されている核酸（例えば、操作された核酸）と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含む。KLF4バリアントの限定しない例はKrueppel様因子4転写物バリアント1およびKrueppel様因子4転写物バリアント2を包含する。ある種の態様では、KLF4は、配列番号5または配列番号44と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である核酸（例えば、操作された核酸）配列を含む。配列番号5はMus musculusからのKLF4をコードするヌクレオチド配列の限定しない例である。配列番号44はヒトKLF4をコードするヌクレオチド配列の限定しない例である。ある種の態様では、KLF4は、NP_001300981.1またはNP_004226.3と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一であるアミノ酸配列を含む。ある種の態様では、KLF4は、配列番号6と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一であるアミノ酸配列を含む。ある種の態様では、KLF4は、配列番号45と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一であるアミノ酸配列を含む。配列番号6はMus musculusからのKLF4をコードするアミノ酸配列の限定しない例である。配列番号45はヒトKLF4をコードするアミノ酸配列の限定しない例である。
「末端逆向きリピート」または「ITR」は、互いの逆相補物である核酸（例えば、操作された核酸）配列である。一般的に、AAVベクターでは、ITRはカセット（例えば、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする核酸（例えば、操作された核酸）を含む発現カセット）の両側に見出される。いくつかの場合には、カセットは誘導因子をコードする。AAV ITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、およびそれらのAAVバリアントからのITRを包含する。
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸（例えば、操作された核酸）分子」、「核酸（例えば、操作された核酸）配列」、および「オリゴヌクレオチド」は、DNAおよびRNA上の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」ともまた呼ばれる）を言い、2つ以上のヌクレオチドのいずれかの鎖を意味する。用語「核酸」または「核酸（例えば、操作された核酸）配列」、「核酸（例えば、操作された核酸）分子」、「核酸（例えば、操作された核酸）断片」または「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「遺伝子によってコードされるmRNA」、および「cDNA」と交換可能に用いられ得る。
核酸（例えば、操作された核酸）は、一本鎖または二本鎖の、キメラ混合物またはその誘導体もしくは改変バージョンであり得る。例えば分子の安定性、そのハイブリダイゼーションパラメータなどを改善するために、オリゴヌクレオチドは塩基部分、糖部分、またはリン酸バックボーンを改変され得る。典型的には、ヌクレオチド配列は、蛋白質および酵素を作るために細胞機構によって用いられる情報を包含する遺伝子情報を保有する。これらの用語は、二本または一本鎖ゲノムおよびcDNA、RNA、いずれかの合成のおよび遺伝子操作されたポリヌクレオチド、ならびにセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチド両方を包含する。これは、一本および二本鎖分子、すなわちDNA－DNA、DNA－RNA、およびRNA－RNAハイブリッド、ならびに塩基をアミノ酸バックボーンにコンジュゲーションすることによって形成される「ペプチド（protein）核酸（例えば操作された核酸）」（PNA）を包含する。これは、炭水化物または脂質を含有する核酸（例えば、操作された核酸）をもまた包含する。例示的なDNAは、一本鎖DNA（ssDNA）、二本鎖DNA（dsDNA）、プラスミドDNA（pDNA）、ゲノムDNA（gDNA）、相補的DNA（cDNA）、アンチセンスDNA、葉緑体DNA（ctDNAまたはcpDNA）、マイクロサテライトDNA、ミトコンドリアDNA（mtDNAまたはmDNA）、キネトプラストDNA（kDNA）、プロウイルス、溶原、反復DNA、サテライトDNA、およびウイルスDNAを包含する。例示的なRNAは、一本鎖RNA（ssRNA）、二本鎖RNA（dsRNA）、短鎖干渉RNA（siRNA）、メッセンジャーRNA（mRNA）、前駆体メッセンジャーRNA（プレmRNA）、低分子ヘアピンRNAまたは短鎖ヘアピンRNA（shRNA）、マイクロRNA（miRNA）、ガイドRNA（gRNA）、トランスファーRNA（tRNA）、アンチセンスRNA（asRNA）、ヘテロ核RNA（hnRNA）、コードRNA、非コードRNA（ncRNA）、長鎖非コードRNA（長鎖ncRNAまたはlncRNA）、サテライトRNA、ウイルスサテライトRNA、シグナル認識粒子RNA、細胞質低分子RNA、核内低分子RNA（snRNA）、リボソームRNA（rRNA）、Piwi相互作用RNA（piRNA）、ポリイノシン酸、リボザイム、フレキシザイム、核小体低分子RNA（snoRNA）、スプライスリーダーRNA、ウイルスRNA、およびウイルスサテライトRNAを包含する。
本願に記載される核酸（例えば、操作された核酸）は、当分野において公知の標準的な方法によって、例えば自動DNA合成機（例えば、Biosearch、Applied Biosystemsなどから商業的に利用可能であるもの）の使用によって合成され得る。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドがStein et al., Nucl. Acids Res., 16, 3209, (1988)の方法によって合成され得、メチルホスホナートオリゴヌクレオチドがコントロールドポアガラスポリマー支持体（Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 7448－7451, (1988)）の使用によって合成され得る。いくつもの方法がアンチセンスDNAまたはRNAを細胞に送達するために開発されている。例えば、アンチセンス分子が直接的に組織部位に注射され得るか、または所望の細胞を標的化するように設計された修飾アンチセンス分子（標的細胞表面に発現された受容体または抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に連結されたアンチセンス）が全身投与され得る。代替的には、RNA分子は、アンチセンスRNA分子をコードするDNA配列のインビトロおよびインビボの転写によって作り出され得る。かかるDNA配列は、好適なRNAポリメラーゼプロモーター、例えばT7またはSP6ポリメラーゼプロモーターを組み込む幅広い種々のベクター上に組み込まれ得る。代替的には、用いられるプロモーターに依存してアンチセンスRNAを恒常的にまたは誘導的に合成するアンチセンスcDNAコンストラクトが細胞株に安定に導入され得る。しかしながら、多くの場合には、内因性のmRNAの翻訳を抑制するために十分なアンチセンスの細胞内濃度を達成することは困難である。よって、好ましいアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強いプロモーターのコントロール下に置かれる組み換えDNAコンストラクトを利用する。患者の標的細胞をトランスフェクションするためのかかるコンストラクトの使用は、内因性の標的遺伝子転写物と相補塩基対を形成するであろう十分量の一本鎖RNAの転写をもたらし、それによって、標的遺伝子mRNAの翻訳を防止するであろう。例えば、それが細胞によって取り込まれ、アンチセンスRNAの転写を導くようなベクターがインビボで導入され得る。それが転写されて所望のアンチセンスRNAを生じ得る限り、かかるベクターはエピソームのままに留まり得るか、または染色体にインテグレーションされ得る。かかるベクターは、当分野の標準的な組み換えDNAテクノロジー法によって構築され得る。ベクターは、哺乳類細胞における複製および発現に用いられるプラスミド、ウイルス性、または当分野において公知の他のものであり得る。アンチセンスRNAをコードする配列の発現は、哺乳類、好ましくはヒト細胞において作用することが当分野において公知のいずれかのプロモーターによってであり得る。かかるプロモーターは誘導性または恒常的であり得る。プラスミド、コスミド、酵母人工染色体、またはウイルスベクターのいずれかの型は、直接的に組織部位に導入され得る組み換えDNAコンストラクトを調製するために用いられ得る。
核酸（例えば、操作された核酸）は天然の制御（発現コントロール）配列によってフランキングされ得るか、またはプロモーター、内部リボソーム進入部位（IRES）および他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答性エレメント、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、5'および3'非コード領域、ならびに同類を包含する異種配列を随伴し得る。核酸（例えば、操作された核酸）は当分野において公知の多くの手段によって修飾もまたされ得る。かかる修飾の限定しない例は、メチル化、「キャップ」、アナログによる天然に存在するヌクレオチドの1つ以上の置換、ならびにヌクレオチド間修飾、例えば、例えば非荷電連結部（例えば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダート、カルバメートなど）によるおよび荷電連結部（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）によるものを包含する。ポリヌクレオチドは、1つ以上の追加の共有結合的に連結された部分、例えば、例えば蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリL－リジンなど）、インターカレート剤（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、鉄、酸化性金属など）、およびアルキル化剤を含有し得る。ポリヌクレオチドはメチルもしくはエチルホスホトリエステルまたはアルキルホスホロアミダート連結部の形成によって誘導体化され得る。さらにその上、本願のポリヌクレオチドは、直接的にまたは間接的にどちらかで検出可能なシグナルを提供することができる標識によってもまた修飾され得る。例示的な標識は、ラジオアイソトープ、蛍光分子、エピトープタグ、同位体（例えば放射性同位体）、ビオチン、および同類を包含する。
「組み換え核酸（例えば、操作された核酸）分子」または「操作された核酸」は、分子生物学的操作を経た核酸（例えば、操作された核酸）分子、すなわち天然に存在しない核酸（例えば、操作された核酸）分子または遺伝子操作された核酸（例えば、操作された核酸）分子である。さらにその上、用語「組み換えDNA分子」または「操作された核酸」は、天然に存在しないか、または核酸（例えば、操作された核酸）配列の2つのさもなければ分離したセグメントの人工的組み合わせによって、すなわち正常では連続的ではないDNA片を一緒にライゲーションすることによって作られ得る核酸（例えば、操作された核酸）配列を言う。「組み換え的に生ずる」によっては、多くの場合には化学合成手段によって、または核酸（例えば、操作された核酸）の単離されたセグメントの人工的操作によってどちらかで成就される人工的な組み合わせが意味される。例えば、制限酵素、リガーゼを用いる遺伝子工学技術により、および例えばSambrook et al., Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y.; (1989)、またはAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols (1989)、およびDNA Cloning: A Practical Approach, Volumes IおよびII (ed. D. N. Glover) IREL Press, Oxford, (1985)によって記載されている類似の組み換え技術による；これらのそれぞれは参照によって本願に組み込まれる。
かかる操作は、コドンをそれをコードする冗長コドンまたは保存的アミノ酸によって置換しながら、典型的には配列認識部位を導入または除去するためにされ得る。代替的には、それは、所望の機能の核酸（例えば、操作された核酸）セグメントを一緒に繋ぎ合わせて天然には見出されない機能の所望の組み合わせを含む単一の遺伝子実体を作り出すために実施され得る。多くの場合には、制限酵素認識部位がかかる人工的操作の標的であるが、他の部位特異的標的、例えばプロモーター、DNA複製部位、制御配列、コントロール配列、オープンリーディングフレーム、または他の有用なフィーチャーが設計によって組み込まれ得る。
「OCT4」は八量体結合転写因子4、OCT3、OCT3／4、POU5F1、またはPOUクラス5ホメオボックス1ともまた言われ得、胚発生および細胞運命の決定に関連づけられている転写因子である。他のOCT転写因子に類似に、OCT4はPOUドメインと呼ばれる双節型DNA結合ドメインを特徴とする。本願において用いられるOCT4転写因子、そのホモログ、またはバリアントは、ヒトを包含するいずれかの種に由来し得る。ある種の態様では、ヒトOCT4をコードする核酸（例えば、操作された核酸）は、アクセッション番号NM_002701、NM_203289、NM_001173531、NM_001285986、またはNM_001285987でNCBI RefSeqに記載されている核酸（例えば、操作された核酸）と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である。ある種の態様では、OCT4をコードする核酸（例えば、操作された核酸）は、配列番号1によって提供される核酸（例えば、操作された核酸）配列と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含む。配列番号1はMus musculusからのOCT4をコードするヌクレオチド配列の限定しない例である。ある種の態様では、ヒトOCT4をコードする核酸（例えば、操作された核酸）は、配列番号40として提供される核酸（例えば、操作された核酸）配列と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含む。配列番号40はヒトOCT4をコードするヌクレオチド配列の限定しない例である。本願に包摂されるOCT4バリアントの限定しない例は、POU5F1転写物バリアント1、POU5F1転写物バリアント2、POU5F1転写物バリアント3、POU5F1転写物バリアント4、およびPOU5F1転写物バリアント5を包含する。ある種の態様では、ヒトOCT4をコードするアミノ酸配列は、アクセッション番号NP001167002.1、NP_001272915.1、NP_001272916.1、NP_002692.2、またはNP_976034.4でNCBI RefSeqに記載されている核酸（例えば、操作された核酸）と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である。ある種の態様では、OCT4は、配列番号2と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一であるアミノ酸配列を含む。配列番号2はMus musculusからのOCT4をコードするアミノ酸配列の限定しない例である。ある種の態様では、OCT4は、配列番号41と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一であるアミノ酸配列を含む。配列番号41はヒトOCT4をコードするアミノ酸配列の限定しない例である。他のOCT4転写因子（例えば、他の種から）は公知であり、OCT4転写因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）はGenBankを包含する公に利用可能なデータベースに見出され得る。
用語「プロモーター」は、そこで核酸（例えば、操作された核酸）配列の残りの転写の開始および速度がコントロールされる核酸（例えば、操作された核酸）配列のコントロール領域を言う。プロモーターは、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子などの制御蛋白質および分子が結合し得る部分領域をもまた含有し得る。プロモーターは恒常的、誘導性、活性化可能、抑制性、組織特異的、またはそれらのいずれかの組み合わせであり得る。プロモーターは、それが制御する核酸（例えば、操作された核酸）配列の発現を駆動または転写を駆動する。本願において、プロモーターは、それが、それが制御する核酸（例えば、操作された核酸）配列との関係において、その配列の転写開始、その配列の発現、またはそれらの組み合わせをコントロールする（「駆動する」）ための正しい機能的な所在および向きにあるときに、「作動可能に連結されている」と考慮される。
プロモーターは、ヒトを包含するいずれかの種からの作動可能に連結された核酸（例えば、操作された核酸）配列のユビキタスな発現または組織特異的な発現を促進し得る。いくつかの態様では、プロモーターは真核生物プロモーターである。真核生物プロモーターの限定しない例は、当業者に公知であろうTDH3、PGK1、PKC1、TDH2、PYK1、TPI1、AT1、CMV、EF1アルファ、SV40、PGK1（ヒトまたはマウス）、Ubc、ヒトベータアクチン、CAG、TRE、UAS、Ac5、ポリヘドリン、CaMKIIa、GAL1、GAL10、TEF1、GDS、ADH1、CaMV35S、Ubi、H1、およびU6を包含する（例えばAddgeneウェブサイト：blog.addgene.org/plasmids－101－the－promoter－regionを参照のこと）。
ユビキタスなプロモーターの限定しない例は、テトラサイクリン応答性プロモーター（該当する条件下）、CMV（例えば、配列番号48）、EF1アルファ、SV40プロモーター、PGK1、Ubc、CAG、ヒトベータアクチン遺伝子プロモーター、RSVプロモーター（例えば配列番号47）、EFSプロモーター（例えば配列番号49）、および上流活性化配列（UAS）を含むプロモーターを包含する。ある種の態様では、プロモーターは哺乳類プロモーターである。
組織特異的なプロモーターの限定しない例は、脳特異的、肝臓特異的、筋肉特異的、神経細胞特異的、肺特異的、心臓特異的、骨特異的、腸特異的、皮膚特異的プロモーター、脳特異的プロモーター、および眼特異的プロモーターを包含する。例として、筋肉特異的プロモーターはdesminプロモーターである（例えば、配列番号29と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列）。眼特異的プロモーターの限定しない例は、ヒトGRK1（ロドプシンキナーゼ）プロモーター（例えば、配列番号50）、ヒトCRX（錐体桿体ホメオボックス転写因子）プロモーター（例えば、配列番号51）、およびヒトNRLプロモーター（ヒトTK末端プロモーターの上流の神経網膜ロイシンジッパー転写因子エンハンサー）を包含する。
いくつかの態様では、プロモーターは老化細胞に特異的である。例えば、プロモーターは、非老化細胞ではなく、老化細胞において、作動可能に連結された核酸の発現を特異的に誘導し得る。限定しない例として、p16プロモーターは、老化細胞において、作動可能に連結された核酸の発現を促進するために用いられ得る。
いくつかの態様では、本開示のプロモーターはAAVベクターへの使用にとって好適である。例えば、その全体がこの目的で参照によってここに組み込まれるU.S.特許出願公開No.2018/0155789を参照のこと。
恒常的プロモーターの限定しない例は、CP1、CMV、EF1アルファ、SV40、PGK1、Ubc、ヒトベータアクチン、ベータチューブリン、CAG、Ac5、Rosa26プロモーター、COL1A1プロモーター、ポリヘドリン、TEF1、GDS、CaM35S、Ubi、H1、U6、赤色オプシンプロモーター（redプロモーター）、ロドプシンプロモーター（rhoプロモーター）、錐体アレスチンプロモーター（carプロモーター）、ロドプシンキナーゼプロモーター（rkプロモーター）を包含する。Ubcプロモーターは、配列番号18と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含み得る。いくつかの場合には、恒常的プロモーターはRosa26プロモーターである。いくつかの場合には、恒常的プロモーターはCOL1A1プロモーターである。赤色オプシンプロモーターは、配列番号101と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含み得る。rhoプロモーターは、配列番号102と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含み得る。錐体アレスチンプロモーターは、配列番号103と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含み得る。ロドプシンキナーゼプロモーターは、配列番号104と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含み得る。組織特異的なプロモーターは、例えば、rtTA、tTA、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする核酸を包含する操作された核酸の発現を駆動するために用いられ得る。いくつかの態様では、組織特異的なプロモーターは、rtTAまたはrTAの発現を駆動するために用いられる。いくつかの態様では、組織特異的なプロモーターは、OCT4、KLF4、およびSOX2の発現を駆動するために用いられる。いくつかの態様では、組織特異的なプロモーターは配列番号101～104からなる群から選択される。いくつかの態様（mebodiments）では、hRKプロモーターはOCT4、KLF4、およびSOX2の発現を駆動するために用いられる。
「誘導性プロモーター」は、誘導因子の存在下にあるか、それによって影響されるか、またはそれによって接触されるときに、転写活性を開始または強化することを特徴とするものである。誘導因子は、内因性であり得るか、または誘導性プロモーターから転写活性を誘導することにおいて活性であるようなやり方で操作された核酸（例えば、操作された核酸）に接触する正常では外因性の条件、化合物、薬剤、もしくは蛋白質であり得る。ある種の態様では、誘導因子はテトラサイクリン感受性の蛋白質である（例えば、tTAまたはrtTA、TetRファミリー制御因子）。
本開示に従う使用のための誘導性プロモーターは、本願に記載されるかまたは当業者に公知のいずれかの誘導性プロモーターを包含する。誘導性プロモーターの例は、限定なしに、化学的に／生化学的に制御および物理的に制御されるプロモーター、例えばアルコールによって制御されるプロモーター、テトラサイクリンによって制御されるプロモーター（例えば、アンヒドロテトラサイクリン（aTc）応答性プロモーター、および他のテトラサイクリン応答性プロモーター系を包含する。これらは、テトラサイクリンリプレッサー蛋白質（TetR、例えば配列番号26、またはTetRKRAB、例えば配列番号27）、テトラサイクリンオペレーター配列（tetO）およびテトラサイクリントランス活性化因子融合蛋白質（tTA）、ならびにテトラサイクリンオペレーター配列（tetO）およびリバーステトラサイクリントランス活性化因子融合蛋白質（rtTA））、ステロイド制御型プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、ヒトエストロゲン受容体、蛾エクジソン受容体に基づくプロモーター、およびステロイド／レチノイド／甲状腺25受容体スーパーファミリーからのプロモーター）、金属制御型プロモーター（例えば、酵母、マウス、およびヒトからのメタロチオネイン（金属イオンに結合し封鎖する蛋白質）遺伝子に由来するプロモーター）、発病制御型プロモーター（例えば、サリチル酸、エチレン、またはベンゾチアジアゾール（BTH）によって誘導される）、温度／熱誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）、pH制御型プロモーター、および光制御型プロモーターを包含する。光制御型プロモーターを用いる誘導系の限定しない例はWang et al., Nat. Methods. 2012 Feb 12;9(3):266－9によって提供される。
ある種の態様では、誘導性プロモーターはテトラサイクリン（Tet）応答性エレメントを含む。例えば、誘導性プロモーターはTRE3Gプロモーターであり得る（例えば、配列番号7と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含むTRE3Gプロモーター）。例として、TRE（例えばTRE2）プロモーターは、配列番号23と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である核酸（例えば、操作された核酸）配列を含み得る。例として、TRE（例えばPtight）プロモーターは、配列番号24と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である核酸（例えば、操作された核酸）配列を含み得る。
誘導性プロモーターの追加の限定しない例はミフェプリストン応答性プロモーター（例えば、GAL4－E1bプロモーター）およびクーママイシン応答性プロモーターを包含する。例えばZhao et al., Hum Gene Ther. 2003 Nov 20;14(17):1619－29を参照のこと。
本願において用いられる「リバーステトラサイクリントランス活性化因子」（「rtTA」）は、テトラサイクリン（例えばドキシサイクリン）の存在下においてTREプロモーター（例えば、TRE3G、TRE2プロモーター、またはPtightプロモーター）に結合し、かつTREプロモーターに作動可能に連結されているトランスジーンの発現を駆動することができる誘導因子である。rtTAは一般的に変異体テトラサイクリンリプレッサーDNA結合蛋白質（TetR）およびトランス活性化ドメインを含む（例えば、Gossen et al., Science. 1995 Jun 23;268(5218):1766－9、および本願に列記されるトランス活性化ドメインのいずれかを参照のこと）。テトラサイクリンに結合されたときに、変異体TetRドメインはTREプロモーターに結合することができる。例えば、MUTANT REVERSE TETRACYCLINE TRANSACTIVATORS FOR EXPRESSION OF GENESと題するU.S.仮出願No.62/738,894を参照のこと。これは2018年9月28日に代理人整理番号H0824.70300US00で出願されており、その全体は参照によって本願に組み込まれる。
「SRYボックス2」または「SOX2」は転写因子のSRY関連HMGボックス（SOX）ファミリーのメンバーである。SOX2は胚発生を促進することに関連づけられている。転写因子のSOX（SRY関連HMGボックス）ファミリーのメンバーは、高移動度群5（HMG）ボックスDNA配列を特徴とする。このHMGボックスは真核生物種間で高度に保存されているDNA結合ドメインである。本願において用いられるSOX2転写因子、そのホモログ、またはバリアントは、ヒトを包含するいずれかの種に由来し得る。ある種の態様では、SOX2をコードする核酸（例えば、操作された核酸）は、アクセッション番号NM_011443.4でNCBI RefSeqに記載されている核酸（例えば、操作された核酸）と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含む。ある種の態様では、ヒトSOX2をコードする核酸（例えば、操作された核酸）は、アクセッション番号NM_003106.4でNCBI RefSeqに記載されている核酸（例えば、操作された核酸）と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含む。ある種の態様では、SOX2は、配列番号3または配列番号42と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である核酸（例えば、操作された核酸）配列を含む。配列番号3はMus musculusからのSOX2をコードするヌクレオチド配列の限定しない例である。配列番号42はヒトSOX2をコードするヌクレオチド配列の限定しない例である。ある種の態様では、ヒトSOX2をコードする核酸（例えば、操作された核酸）は、アクセッション番号NP_003097.1でNCBI RefSeqに記載されているアミノ酸配列と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含む。いくつかの場合には、SOX2は、配列番号4と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、SOX2は、配列番号43と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一であるアミノ酸配列を含む。配列番号4はMus musculusからのSOX2をコードするアミノ酸配列の限定しない例である。配列番号43はヒトSOX2をコードするアミノ酸配列の限定しない例である。
「マルチシストロンベクター」は、1つよりも多くのアミノ酸配列をコードするベクターである（例えば、OCT4およびKLF4、OCT4およびSOX2、KLF4およびSOX2、またはOCT4、SOX2、およびKL4（OSK）をコードするベクター）。マルチシストロンベクターは、核酸（例えば、操作された核酸）配列からの複数のアミノ酸配列の発現を許す。各転写因子（例えば、OCT4、KLF4、またはSOX2）をコードする核酸（例えば、操作された核酸）配列は、接続され得るか、またはそれらが未接続の蛋白質を生ずるように分離され得る。例えば、内部リボソーム進入部位（IRES）またはポリペプチド切断シグナルが、ベクター上の各転写因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）配列間に置かれ得る。例示的なポリペプチド切断シグナルは2Aペプチドを包含する（例えば、T2A、P2A、E2A、およびF2A）。2Aペプチドは、配列番号9と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含み得る。いくつかの態様では、本開示の発現ベクターはマルチシストロン発現ベクターである。
本願において用いられる「加齢（aging）を逆行させる」または「加齢（ageing）を逆行させる」は、加齢に関連する身体的性質を改変することを言う。全ての動物は、典型的には、成長および成熟の期間、次に漸進的かつ不可逆的な生理学的衰えの期間を通過し、死亡で終わる。誕生から死亡までの時間の長さは生物のライフスパンとして公知であり、各生物は特徴的な平均ライフスパンを有する。加齢は、平均ライフスパンのパーセントによって測定される時間経過の裏にある変化の身体的顕れである。
投与が企図される「対象」は、ヒト（すなわち、いずれかの年齢群の男性または女性。例えば、小児科の対象（例えば、乳幼児、小児、思春期）または成人対象（例えば、若い成人、中年の成人、または高齢の成人））および／または他の非ヒト動物、例えば哺乳動物（例えば、霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザル）；商業的に該当する哺乳動物、例えば牛、豚、ウマ、羊、ヤギ、ネコ、および／またはイヌ）および鳥（例えば、商業的に該当する鳥、例えばニワトリ、カモ、ガチョウ、および／または七面鳥）を包含するが、これらに限定されない。ある種の態様では、動物は哺乳動物である。動物は、雄または雌、および発生のいずれかのステージであり得る。非ヒト動物はトランスジェニック動物であり得る。
当業者は、小児科の対象または成人対象の生物学的年齢が動物の型に依存して変わり得るということを認識するであろう。限定しない例として、成体マウスは生後1年であり得るが、成人ヒトは生後21年よりも多くであり得る。いくつかの態様では、小児科の対象は生後21年未満、生後20年未満、生後15年未満、生後10年未満、生後9年未満、生後8年未満、生後7年未満、生後6年未満、生後5年未満、生後4年未満、生後3年未満、生後2年未満、生後1年未満、生後10ヶ月未満、生後9ヶ月未満、生後8ヶ月未満、生後7ヶ月未満、生後6ヶ月未満、生後5ヶ月未満、生後4ヶ月未満、生後2ヶ月未満、または生後1ヶ月未満である。いくつかの態様では、成人対象は生後少なくとも3週、生後1ヶ月、生後少なくとも2ヶ月、生後少なくとも3ヶ月、生後少なくとも4ヶ月、生後少なくとも5ヶ月、生後少なくとも6ヶ月、生後少なくとも7ヶ月、生後少なくとも8ヶ月、生後少なくとも9ヶ月、生後少なくとも10ヶ月、生後少なくとも11ヶ月、生後少なくとも1年、生後少なくとも2年、生後少なくとも3年、生後少なくとも5年、生後少なくとも10年、生後少なくとも15年、生後少なくとも20年、生後少なくとも25年、生後少なくとも30年、生後少なくとも40年、生後少なくとも50年、生後少なくとも55年、生後少なくとも60年、生後少なくとも65年、生後少なくとも70年、生後少なくとも75年、生後少なくとも80年、生後少なくとも90年、または生後少なくとも100年である。いくつかの態様では、中年の成人対象は、生後1および6ヶ月の間、生後6および12ヶ月の間、生後1年および5年の間、生後5年および10年の間、生後10および20年の間、生後20および30年の間、生後30および50年の間、生後50および60年の間、生後40および60年の間、生後40および50年の間、または生後45および65年の間である。いくつかの態様では、高齢の成人対象は、生後少なくとも1ヶ月、生後少なくとも2ヶ月、生後少なくとも3ヶ月、生後少なくとも4ヶ月、生後少なくとも5ヶ月、生後少なくとも6ヶ月、生後少なくとも7ヶ月、生後少なくとも8ヶ月、生後少なくとも9ヶ月、生後少なくとも10ヶ月、生後少なくとも11ヶ月、生後少なくとも1年、生後少なくとも2年、生後少なくとも3年、生後少なくとも5年、生後少なくとも10年、生後少なくとも15年、生後少なくとも20年、生後少なくとも25年、生後少なくとも30年、生後少なくとも40年、生後少なくとも50年、生後少なくとも55年、生後少なくとも60年、生後少なくとも65年、生後少なくとも70年、生後少なくとも75年、生後少なくとも80年、生後少なくとも90年、または生後少なくとも100年である。
本願において用いられる「ターミネーター」または「ターミネーター配列」は、転写が停止することを引き起こす核酸（例えば、操作された核酸）配列である。ターミネーターは一方向性または二方向性であり得る。それは、RNAポリメラーゼによるRNA転写物の特異的終結に関わるDNA配列から構成される。ターミネーター配列は上流プロモーターによる下流の核酸（例えば、操作された核酸）配列の転写活性化を防止する。それゆえに、ある種の態様では、RNA転写物の生成を終わらせるターミネーターが企図される。
ターミネーターの最も普通に用いられる型はフォワードターミネーターである。通常転写される核酸（例えば、操作された核酸）配列の下流に置かれるときに、フォワード転写ターミネーターは転写が中断することを引き起こすであろう。いくつかの態様では、二方向性の転写ターミネーターが用いられ得、これは通常は転写がフォワードおよびリバース鎖両方において終結することを引き起こす。いくつかの態様では、リバース転写ターミネーターが用いられ得、これは通常はリバース鎖の転写のみを終結させる。
哺乳類ターミネーター配列の限定しない例は、ウシ成長ホルモンターミネーター、およびウイルス終結配列、例えば、例えばSV40ターミネーター、spy、yejM、secG－leuU、thrLABC、rrnB T1、hisLGDCBHAFI、metZWV、rrnC、xapR、aspA、およびarcAターミネーターを包含する。ある種の態様では、ターミネーター配列はSV40であり、配列番号8と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含む。
本願において用いられる「Tet－Off系」は、テトラサイクリン（例えばドキシサイクリン（DOX））の存在下において特定のトランスジーンの発現を抑制することができる誘導性の系の型である。逆に、Tet－Off系はテトラサイクリン（例えばドキシサイクリンDOX）の不在下において特定のトランスジーンの発現を誘導することができる。ある種の態様では、Tet－Off系は、トランスジーン（例えば、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする）に作動可能に連結されたテトラサイクリン応答性プロモーターとテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（tTA）とを含む。テトラサイクリン応答性プロモーター（例えば、TRE3G、Ptight、またはTRE2）を有するトランスジーンとテトラサイクリン制御性トランス活性化因子とは、同じベクター上にコードまたは別個のベクター上にコードされ得る。例えば、MUTANT REVERSE TETRACYCLINE TRANSACTIVATORS FOR EXPRESSION OF GENESと題するU.S.仮出願No.62/738,894を参照のこと。これは2018年9月28日に代理人整理番号H0824.70300US00で出願されており、その全体は参照によって本願に組み込まれる。
本願において用いられる「Tet－On」系は、テトラサイクリン（例えばドキシサイクリン（DOX））の存在下において特定のトランスジーンの発現を誘導することができる誘導系の型である。ある種の態様では、Tet－On系は、トランスジーン（例えば、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする）に作動可能に連結されたテトラサイクリン応答性プロモーターとリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（rtTA）とを含む。例えば、rtTAはrtTA3、rtTA4、またはそれらのバリアントであり得る。ある種の態様では、rtTA3をコードする核酸（例えば、操作された核酸）は、配列番号10と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも100％）同一である配列を含む。ある種の態様では、rtTA3をコードするアミノ酸配列は、（配列番号11）と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも100％）同一である配列を含む。ある種の態様では、rtTA4をコードする核酸（例えば、操作された核酸）は、配列番号12と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも100％）同一である配列を含む。ある種の態様では、rtTA4をコードするアミノ酸配列は、（配列番号13）と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも100％）同一である配列を含む。テトラサイクリン応答性プロモーター（例えば、TRE3G、Ptight、およびTRE2を包含するTREを含むプロモーター）をコードする発現カセットとリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子とは、同じベクター上にコードまたは別個のベクター上にコードされ得る。例えば、MUTANT REVERSE TETRACYCLINE TRANSACTIVATORS FOR EXPRESSION OF GENESと題するU.S.仮出願No.62/738,894を参照のこと。これは2018年9月28日に代理人整理番号H0824.70300US00で出願されており、その全体は参照によって本願に組み込まれる。
用語「組織」は、対象のいずれかの生物学的組織（細胞の群、体の一部、または臓器を包含する）またはその一部を言い、血管および／またはリンパ管を包含し、これは本発明の化合物、粒子、および／または組成物が送達される目標である。組織は異常な、ダメージを受けた、または不健康な組織であり得、これは処置されることを必要とし得る。組織は、防止されることを必要とし得る異常または不健康になる正常よりも高いリスクがある正常なまたは健康な組織でもまたあり得る。ある種の態様では、組織は、健康だが、現在のまたは将来の条件における性能または生存にとって最適ではないと考慮される。例えば、農行為では、天候および成長条件を包含する環境条件（例えば栄養）は、本願に記載される方法のいずれかによって利され得る。ある種の態様では、組織は中枢神経系である。ある種の態様では、組織はからの組織を言う。ある種の態様では、細胞または組織は、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸からである。ある種の態様では、組織はダメージを受けるか（例えば、先天性の欠陥、傷害、事故、または医原性傷害を原因とする）および／または加齢した組織である。ある種の態様では、組織は光ファイバープローブによって到達可能である深部組織である。
用語「テトラサイクリンリプレッサー」または「TetR」は、テトラサイクリン（例えばドキシサイクリン）不在下においてTet－O配列（例えば、TREのTet－O配列、例えばTet－O配列は配列番号19を含み得る）に結合することができ、かつテトラサイクリン（例えばドキシサイクリン）の不在下においてrtTA（例えば、rtTA3、rtTA4、またはそれらのバリアント）の結合を防止する蛋白質を言う。TetRはテトラサイクリン（例えばドキシサイクリン）の不在下においてTREを含むプロモーターからの遺伝子発現を防止する。テトラサイクリンの存在下では、TetRはTREを含むプロモーターに結合し得ず、TetRは転写を防止し得ない。TetRの限定しない例は、tetR（例えば、配列番号26）、tetRKRAB（例えば、配列番号28）を包含する。いくつかの態様では、TetRはTetR融合体である（例えば、TRSID。これはTetRをMad1のmSIN30相互作用ドメイン（SID）に融合することによって作出され得る）。例えばZhang et al., J Biol Chem. 2001 Nov 30;276(48):45168－74を参照のこと。
本願において用いられる「TREプロモーター」はテトラサイクリン応答性エレメント（TRE）を含むプロモーターである。本願において用いられるTREは、少なくとも１つの（例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の）Tet－O配列を含む。Tet－O配列の限定しない例は、配列番号19と少なくとも70％（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列である。いくつかの態様では、TREプロモーターは、さらに、tet－0配列の下流に所在する最小プロモーターを含む。最小プロモーターは、プロモーターの最小限のエレメント（例えば、TATAボックス、および転写開始部位）を含むが、上流エンハンサー（例えば、Tet－Oを含む配列）の不在下において不活性であるプロモーターである。例として、最小プロモーターは、配列番号20と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含む最小CMVプロモーターであり得る。例えば、TREプロモーターはTRE3Gプロモーターであり得る（例えば、配列番号7と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含むTRE3Gプロモーター。いくつかの態様では、TREプロモーターは、配列番号23と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含むTRE2プロモーターである。いくつかの態様では、TREプロモーターは、配列番号24と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含むPtightプロモーターである。
ダメージを受けた組織の文脈における用語「組織修復」は、組織ダメージ後の組織アーキテクチャ、機能、またはそれらの組み合わせの復元を言う。組織修復は、組織再生、細胞成長、組織置換、および／または既存の組織のリワイヤリング（リプログラミング）を包含する。
用語「組織再生」は、目当ての組織と同じ型である新たな組織または組織内の細胞の生成を言う（例えば、ダメージを受けた組織または細胞と同じ型）。いくつかの態様では、本願において提供される方法は臓器再生を促進する。
用語「組織置換」は目当ての組織と比較して異なる型の組織の生成を言う（例えば、ダメージを受けた組織を置換するための結合組織）。
本願において用いられる用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本願に記載される疾患もしくは障害またはその1つ以上の症状を逆行させるか、軽減するか、その発症を遅延させるか、または進行を阻害することを言う。ある種の態様では、処置は1つ以上の症状が発生した後に投与され得る。他の態様では、処置は症状の不在下において投与され得る。例えば、処置は、症状の発症に先立つ易罹患性の個体に投与され得るか、または別の損傷剤によって処置され得る（例えば、症状の既往に照らして、遺伝学的なもしくは他の素因、疾患治療、またはそれらのいずれかの組み合わせに照らして）。処置は、症状が解消した後にもまた、例えばそれらの再発を防止するかまたは遅延させるために続けられ得る。
用語「バリアント」は野生型配列に対して相対的に改変を含む配列を言う。アミノ酸配列の限定しない改変は挿入、欠失、および点変異を包含する。核酸（例えば、操作された核酸）配列の限定しない改変はフレームシフト変異、ヌクレオチド挿入、およびヌクレオチド欠失を包含する。
用語「WPRE」はウッドチャック肝炎ウイルス（WHP）転写後制御エレメント（WPRE）を言う。WPREは核酸（例えば、発現ベクター）に三次構造を作出し、トランスジーン発現（例えばウイルスベクターからの）を強化することができる。ある種の態様では、WPRE配列は配列番号21と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも100％）同一である。
これらのおよび他の例示的な置換物は発明を実施するための形態、実施例、および請求項により詳細に記載される。本発明は置換物の上の例示的な列記にいずれかの様式で限定されることを意図されない。
図1は、OCT4、SOX2、およびKLF4をコードする発現ベクターの直線図による模式図である。TRE3Gは例示的な誘導性プロモーターとして示され、SV40は例示的なターミネーター配列として示されている。
図2は、OSKをコードするAAVベクターのTRE3G－OSK－SV40pAのベクターマップである。OCT4、SOX2、およびKLF4をコードする配列ならびに末端逆向きリピート配列（ITR）の所在を包含するフィーチャーが指示されている。
図3はTRE3G－OSK－SV40pA上の制限酵素消化部位の所在を示すベクターマップである。
図4A～4ALは、図2および3に示されているフィーチャーをTRE3G－OSK－SV40pAの核酸（例えば、操作された核酸）配列上にマッピングする一連の模式図を包含する。
図5A～5Dは、図4A～4ALに示されているフィーチャーの核酸（例えば、操作された核酸）配列のヌクレオチド位置および長さを示す。
図6A～6Cは、OSK（TRE3G－OSK－SV40pA、配列番号16）をコードするAAVの異なる血清型が、293T細胞におけるOSK発現をコントロールするためのドキシサイクリン（DOX）誘導系に首尾良く用いられたということを示すウエスタンブロットデータを包含する。OCT4、KLF4、およびH3発現は抗体によって検出した。H3はヒストン3を言い、ローディングコントロールである。図6Aは、TRE3G－OSK－SV40pAベクターを持っているAAV9ウイルスおよびrtTA3をコードするベクターを持っているAAV9ウイルスに感染した細胞における蛋白質発現に対する、ドキシサイクリンの効果を示す（テトラサイクリン（Tet）－on系）。図6Bは、TRE3G－OSK－SV40pAベクターを持っているAAV2ウイルスおよびtTAをコードするベクターを持っているAAV2ウイルスに感染した細胞における蛋白質発現に対する、DOXの効果を示す（Tet－Off系）。図6Cは、TRE3G－OSK－SV40pAベクターを持っているAAV.PHP.bウイルスおよびrtTA3をコードするベクターを持っているAAV.PHP.bウイルスに感染した細胞における蛋白質発現に対する、DOX処置およびDOX除去の効果を示す（Tet－On系）。DOX処置（+DOX）またはDOX除去（－DOX）の日数の長さは括弧内に指示されている。
図7A～7Fは、OSKをコードするAAVが、部分的なリプログラミングを誘導し、誘導性の様式で神経挫滅後の視神経の再生を促進したということを示すデータを包含する。図7Aは、マウス網膜へのTRE－OSK－SV40 AAVウイルスおよびCAG－tTA AAVウイルスの注射がマウス網膜神経節細胞（RGC）におけるKLF4の発現をもたらしたということを示す一連の写真を包含する。マウス網膜からの光干渉断層撮影（OCT）切片のRBPMS（RGCマーカー）およびKLF4染色が示されている。図7Bは、TRE－OSK－SV40 AAVウイルスおよびCAG－tTA AAVウイルスの注射がマウス網膜におけるKLF4およびOCT4の誘導性発現をもたらしたということを示す一連の写真を包含する。ドキシサイクリン処置の不在下における（上側の2つの写真）および4日のDOX処置後の（下側の2つの写真）網膜ホールマウントのOCT4およびKLF4染色が示されている。図7Cは、視神経挫滅ダメージ後の視神経再生に対する、単独でのまたはCAG－tTA AAVウイルスとの組み合わせでのTRE－OSK－SV40 AAVウイルスの効果を決定するための実験のタイムラインを示す。CTBはコレラ毒素βサブユニットの意であり、軸索の蛍光イメージングを許す。図7Dはホールマウント網膜からのOCT4およびKLF4の共局在染色を示し、TRE－OSK－SV40 AAVウイルスがCAG－tTAとの組み合わせで注射された。RBPMSは網膜神経節細胞を特異的に染色する。図7Eは、TRE－OSK－SV40 AAVウイルス単独（左）またはCAG－tTA AAVとの組み合わせでのTRE－OSK－SV40 AAV（右）を注射されたマウス網膜において、挫滅ダメージ後の視神経のCTB標識された軸索の蛍光イメージングを示す。星印は傷の部位を表す。図7Fは、指示されているウイルスによって図7Eのように処置された視神経の追加の蛍光画像を示す。
図8A～8Gは、OSKをコードするウイルスの投与が神経挫滅傷害後のRGC軸索再生を改善したということを示す。図8Aは、RGC軸索再生に対して、DOXの不在下におけるTRE－OSK－SV40をコードするウイルス（円形、n=9）、DOXの存在下におけるTRE－OSK－SV40をコードするウイルス（三角形、n=5）、またはd2EGFPをコードするウイルス（正方形、コントロール、n=5）との組み合わせでの、tTAをコードするウイルスの効果を示す。神経あたりの推定される軸索数が傷害部位からの距離（μm）の関数として示されている。図8BはRGC軸索再生に対するd2EGFP発現の効果を決定するための実験のタイムラインである。図8Cは、図8Bにおいて輪郭化されている実験からのCTB標識された軸索を示す一連の画像である。図8Dは、軸索再生に対する未誘導のOSK発現の効果を決定するための実験のタイムラインである。図8Eは、図4Dにおいて輪郭化されている実験からのCTB標識された軸索を示す一連の画像である。図8Fは、軸索再生に対する誘導されたOSK発現の効果を決定するための実験のタイムラインである。図8Gは、図8Fにおいて輪郭化されている実験からのCTB標識された軸索を示す一連の画像である。星印は傷の部位を指示する。
図9A～9Dは、OSK感染RGCがOSKウイルスに感染していない細胞と比較して神経挫滅後に高い生存率を有するということを示す。図9Aは、GFP AAV感染した未挫滅のRGC（左上）および挫滅したRGC（右上）のRBPMSおよびGFPの染色、OSK AAV感染した未挫滅のRGC（左下）および挫滅したRGC（右下）のRBPMSおよびKLF4の染色を示す。図9Bは、GFPの不安定化形態（d2EGFP）ウイルスまたはOSKウイルスに感染した未挫滅のおよび挫滅したRGCについて、RBPMS（複数のスプライシングを有するRNA結合蛋白質）陽性（+）細胞の比を示す。GFP感染RGCは未感染のRGCと同じ生存率を有する。よって、GFP+RBPMS+％は挫滅傷害後に同じままに留まる。OSK感染RGCは未感染のRGCと比較して3倍の生存率を有し、よって、KLF4+RBPMS+％は挫滅傷害後に増大した。図9Cは、OSKウイルス感染による未挫滅（左）および挫滅（右）条件下における生存RGCを示す。図9Dは、それらがd2EGFPウイルスまたはOSKウイルスに感染したときの未挫滅および挫滅条件下におけるRGC（RBPMS+）の生存を示す。
図10A～10Bは、OSKによって媒介される再生および保護がmTOR活性化に非依存的であるということを示す。図10Aは、未挫滅のまたは挫滅したコントロールおよびOSK感染RGCのRBPMSおよびpS6染色を示す一連の画像である。図10Bは、図10Aのような一連の像からのpS6陽性細胞のパーセンテージを定量するグラフである。
図11A～11Dは、CMV－rtTAベクター（配列番号31）を含むAAV Tet－On系が、AAV Tet－Off系と比較して神経挫滅後の網膜細胞において速い遺伝子発現を誘導するということを示す。図11Aは、AAV Tet－Off系におけるGFP発現に対するドキシサイクリン除去の効果を試験するための実験のタイムラインを示す。線はDOX処置の長さを指示する。指示されている処置A～Dは図7Bのそれぞれ写真1～4に対応する。図11Bは、図11Aにおいて輪郭化されている実験の結果を示す一連の写真である。DOX除去の指示されている日数における、tTAをコードするウイルスおよびTRE－d2EGFPをコードするウイルスに感染したマウス網膜からのGFP陽性細胞が示されている。図11Cは、CMV－rtTAベクター（配列番号31）を含むAAV Tet－On系におけるGFP発現に対するドキシサイクリン処置の効果を試験するための実験のタイムラインを示す。線はDOX処置の長さを指示する。指示されている処置A～Cは図11Dのそれぞれ写真1～3に対応する。図11Dは、図11Cにおいて輪郭化されている実験の結果を示す一連の写真である。DOX処置の指示されている日数における、rtTAをコードするウイルスおよびTRE－d2EGFPをコードするウイルスに感染したマウス網膜からのGFP陽性細胞が示されている。
図12は、リバーステトラサイクリントランス活性化因子4（rtTA4）をコードするアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター上のフィーチャーを示すベクターマップである。Ubcは恒常的プロモーターであり、これはrtTA4をコードする核酸（例えば、操作された核酸）に作動可能に連結されている。SV40pAはSV40由来のターミネーター配列である。このベクターの配列は配列番号17によって提供される。
図13A～13Cは、rtTA4（配列番号13）を含むTet－On系がマウスの肝臓における低い漏れを有するということを示すデータを包含する。図13Aは、ドキシサイクリンの不在下における（DOXなし）およびドキシサイクリンの存在下における（DOXあり）、図13Bに示されている核酸（例えば、操作された核酸）を持っているAAVを投与されたマウスの肝臓におけるKLF4の発現を示す一連の免疫蛍光画像である。DAPIは細胞を視覚化するために用いられた核染色剤である。図13Bは、AAV9ウイルスによってマウスに投与された2つの核酸（例えば、操作された核酸）を図示する模式図である。図13Cは、図13Bに図示されているコンストラクトを受け、ドキシサイクリンなしでまたはドキシサイクリンありで処置されたマウスからの肝臓サンプルのウエスタンブロットである。OCT4、KFF4、およびSOX2レベルは抗体を用いて指示されている通り検出された。アクチンはローディングコントロールとして示されている。
図14は、指示されている種々の処置によるマウスの体重を比較するグラフである。WTは外因性のOSK発現なしの野生型マウスを指示する。全て死亡は、ドキシサイクリンによって処置されたOSKトランスジェニックマウスが全て死亡したということを指示する。
図15A～15Bは、OCT4、KFF4、およびSOX2発現の誘導が、ヒストンおよびChaf（クロマチンアセンブリ因子）遺伝子の発現によって指示される通りマウス耳線維芽細胞の加齢を逆行させたが、Nanog発現を誘導しなかったということを示すデータを包含する。アステリスク（*）は293T細胞株からの内因性のKFF4発現を指示する。
図16はウエスタンブロットであり、ベクター上の2つのITR間に4.7kbよりも多大である核酸（例えば、操作された核酸）配列を含むAAVベクターが、AAVに組み込まれたときに低いウイルス力価を有し、非機能的なAAVを生ずるということを示す。TRE2－OSKベクターは配列番号33として提供される。OCT4、KLF4、およびH3の発現を抗体を用いて検出した。H3はローディングコントロールとして示されている。アステリスク（*）は293T細胞株からの内因性のKlf4を指示する。
図17は、OCT4、SOX2、およびKLF4をコードする修飾mRNAの投与が、マウス細胞においてKLF4およびOCT4の発現を誘導したということを示すウエスタンブロットである。KLF4、OCT4、GAPDH、およびH3に対する抗体を用いて、指示されている蛋白質を検出した。
図18はpAAV2_CMV_rtTA（VP16）のベクターマップである（配列番号31）。このベクターはrtTAをコードするベクターの限定しない例である。
図19はpAAV－MCS－tTA2（またはCAG－tTA）のベクターマップである（配列番号32）。このベクターは、CAGプロモーター下にtTAをコードするベクターの限定しない例である。
図20はp－AAV－TetO－OSK－WPRE3－SV50LpA（TRE2－OSK、pAAV－TRE2－OSK－SV40LpA、またはTRE2－OSK）のベクターマップである（配列番号33）。このベクターはAAVベクターの限定しない例であり、ベクター上の2つのITR間に4.7kbよりも多大である核酸（例えば、操作された核酸）配列を含む。
図21は、マウス胎児線維芽細胞の首尾良い化学的リプログラミングを示す一連の画像である。
図22は、テトラサイクリンの不在下においてOCT4、SOX2、およびKLF4を発現するためのTet－Off系の限定しない例を示す模式図（上側パネル）、ならびにテトラサイクリンの存在下においてOCT4、SOX2、およびKLF4（OSK）を発現するためのTet－ON系の限定しない例を示す模式図（下側パネル）を包含する。
図23A～23Cは、OCT4、SOX2、およびKLF4をコードするAAV2ウイルスの投与が、視神経挫滅の2週後の成体および加齢したマウスにおいて軸索再生およびRGC生存を改善したということを示すデータを包含する。図23Aは、指示されている年齢（月による）におけるマウスからのCTB標識された軸索を示し、TRE－OSK－SV40をコードするAAV2ウイルスの効果をGFPをコードするAAV2ウイルスの効果と比較する一連の画像である。実験は図22上側パネルに図示されているTet－Off系を用いてDOXの不在下において行った。図23Bは、指示されている年齢および処置によるマウスの神経あたりの推定される軸索数を、傷害部位からの距離（μm）の関数として定量している。図23Cは、OSKが、コントロールGFPと比較して、成体（3月齢）および加齢した（12月齢）マウスにおける視神経傷害後のRGCの生存を増大させたということを示すチャートである。RGC（RBPMS+）の生存が、d2EGFPまたはOSKをコードするウイルスを受けた指示されている年齢のマウスについて示されている。
図24A～24Bは、リプログラミングの時間を2週から5週に増大させることが加齢したマウスにおける再生を改善したということを示すデータを包含する。図24Aは、視神経挫滅傷害の5週後の12月齢マウスからのCTB標識された軸索を示す一連の写真である。マウスは、神経挫滅傷害に先立って、GFPをコードするウイルスまたはTRE－SV40－OSKをコードするウイルスおよびtTAをコードするウイルスを投与された。図24Bは、図24Aからの神経あたりの推定される軸索数を傷害部位からの距離（μm）の関数として定量するグラフである。
図25A～25Cは、Tet－OnおよびTet－Off系を用いるOSK発現の誘導が、視神経挫滅傷害後であっても、マウスにおける再生およびRGC細胞生存を改善したということを示すデータを包含する。図25Aは、視神経挫滅前のまたは後のOSK発現の効果を決定するための処置タイムラインを示す模式図を包含する。Tet－On系では、視神経挫滅傷害に先立つOSK発現の誘導（傷害前の誘導）および視神経挫滅傷害後のOSK発現の誘導（傷害後の誘導）が示されている（上側パネル）。ドキシサイクリン処置を用いてOSK発現を誘導した。Tet－Off系では、視神経挫滅に先立つドキシサイクリン処置によるOSK誘導の抑制（傷害前の抑制）および視神経挫滅後のドキシサイクリン処置によるOSK誘導の抑制（傷害後の抑制）が示されている（下側パネル）。タイムラインの網掛け線はドキシサイクリン（DOX）処置の長さを指示する。軸索のイメージングのためのコレラ毒素βサブユニット（CTB）注射もまた示されている。図25Bは、OSK誘導なし（n=4）、傷害前のみのOSK誘導（n=5）、傷害から抑制されたOSK発現（n=5）、および傷害後のOSK誘導（n=5）による、4週齢の（若い）マウスの神経あたりの推定される軸索数を傷害部位からの距離（μm）の関数として定量するチャートである。用いられた傷害前および傷害後の誘導のためのプロトコールは図25Aに示されている通りであった。図25Cは、OSK誘導なし、傷害前のみのOSK誘導、傷害から抑制されたOSK、および傷害後のOSK誘導による、4週齢の（若い）マウスからのRBPMS+細胞数を定量するチャートである。
図26A～26Eは、単一転写物からのOSKの発現が、別個の転写物からのOCT4、SOX2、およびKLF4の発現と比較して、視神経挫滅傷害の2週後における軸索再生および網膜神経節細胞（RGC）生存を改善したということを示すデータを包含する。図26Aは、挫滅傷害の2週前に各群において注射されたAAV組み合わせと、OCT4、SOX2、および／またはKLF4をコードするTet－Off系の限定しない例示的な発現カセットとを示す模式図である。図26Bは、単一転写物からのOSKの発現が別個の転写物からのOCT4、SOX2、およびKLF4の発現と比較して軸索再生を改善したということを示すチャートである。tTAウイルスおよび次の1つを受けたマウスについて、視神経挫滅傷害後の神経あたりの推定される軸索数を傷害部位からの距離（μm）の関数として定量した：（1）OCT4ウイルス、（2）SOX2ウイルス、（3）KLF4ウイルス、（4）OCT4およびSOX2を1つのプロモーター下にコードするベクターを有するウイルス（OCT4－SOX2）、（5）別個のOCT4、SOX2、およびKLF4ウイルス（OCT4、SOX2、KLF4、またはO、S、K）、または（6）OCT4、KLF4、およびSOX2を1つのプロモーター下にコードするベクターを有するウイルス（Oct4－Sox2－KLF4またはOSK）。用いられた種々のベクターが図26Aに図示されている。図26Cは、単一転写物からのOSKの発現が、別個の転写物からのOCT4、SOX2、およびKLF4の発現に対して相対的にRGC生存を改善したということを示すチャートである。図26Dはマウス網膜のホールマウント染色を包含し、OCT4、SOX2、およびKLF4をコードする別個のウイルスベクターが別個のウイルスによってマウスの眼に送達されたときには、少数のRBPMS+細胞を有する細胞の不均質な集団が検出されたということを示す。矢印は、ベクターの模式図の下の左上画像において、OCT4、SOX2、KLF4、および／またはRBPMSを発現する7つの異なる型の細胞を指す。図26Eは、OSKを1つのプロモーター下にコードするウイルスベクターを含むウイルスがマウスの眼に送達されたときには、図26Dと比較して、細胞のより均質な集団が検出されたということを示すデータを包含する。RBPMS+でもまたあるより多くのOSK発現細胞が、図26Dと比較して検出された。用いられたベクターの模式図の下の左上画像では、長い白矢印はOCT4、SOX2、およびKLF4を発現するRBPMS+細胞を指し、より短い矢印は、RBPMSを発現しないいくつかの細胞であってもOSKを発現したということを指示している。
図27は、Tet1およびTet2 DNAデメチラーゼがOSKによって誘導される再生に役割を演ずるということを示すチャートである。視神経挫滅後の神経あたりの推定される軸索数を、（1）OSKウイルスおよび短鎖ヘアピンコントロール、（2）OSKウイルスおよびTet1に対する短鎖ヘアピン、または（3）OSKウイルスおよびTet2に対する短鎖ヘアピンを受けたマウスにおいて定量した。
図28は、Tet－Off系を用いるOSKの発現が、TRE－OSKをコードするAAVウイルスおよびtTAをコードするAAVウイルスの注射の1ヶ月後の加齢したマウスにおける加齢性の視力損失を逆行させたということを示すデータを包含する。図28は、tTAをコードするウイルスおよびTRE－OSKをコードするウイルスによるマウスの硝子体注射が、ドキシサイクリンの不在下において（OSK誘導条件）、加齢したマウス（12月齢（12m）および18月齢（18m）マウス）で観察される空間周波数閾値（サイクル／度、視力試験）の加齢性の減少を逆行させたということを示すチャートである。視運動反応（OMR）に基づく視力検査を用いた。コントロールとして、年齢マッチしたマウスが、ドキシサイクリンの不在下において、rtTAをコードするウイルスおよびウイルスTRE－OSKをコードするウイルスを受けた（未誘導のコントロール）。成体マウス（3月齢（3m））をもまたコントロールとして用いた。
図29は、OSKの発現が加齢したマウスにおける網膜神経節細胞（RGC）機能の加齢性の衰えを逆行させたということを示すデータを包含する。図29は、成体（3月齢（3m））および加齢した（12月齢（12m）および18月齢（18m））マウスからのRGCから作り出された電気的な波の測定を示すチャートである。パターン網膜電図（パターンERG）を用いた。マウスにrtTAウイルスおよびTRE－OSKウイルスをドキシサイクリンなしで（未誘導のコントロール（ctl））またはtTAウイルスおよびTRE－OSKウイルス（OSK誘導）をドキシサイクリンなしで注射した。結果はウイルス注射の1ヶ月後に得た。
図30A～30Eは、OSKの発現が、1月齢マウスにおける視力およびRGC機能の緑内障によって誘導される衰えを改善したということを示すデータを包含する。図30Aは、ポリスチレンマイクロビーズが、成体C57BL/6Jマウスにおいて、生理食塩水処置と比較して、眼圧（IOP）の増大によって測定される緑内障を誘導したということを示すチャートである。IOP測定はマイクロビーズ注射の最初の4週において示されている。図30B～30Cは、前眼房へのマイクロビーズ注射の4週後に、軸索密度およびRGC密度の有意な損失があったということを示す。AAVをマイクロビーズの3週後において硝子体注射し、OSK発現が観察されるまでもう1週かかった。図30Bは、p－フェニレンジアミン（PPD）染色（例えば右に示されている）を用いて軸索密度を定量するチャートを包含する（左パネル）。図30Cは、Brn3a染色（例えば右に示されている）を用いてRGC細胞密度を定量するチャートを包含する（左パネル）。図30Dは、緑内障を誘導したマウスにおけるOSK AAV処置による視力改善を示すチャートである。マウスに、緑内障を誘導するためのマイクロビーズまたはマイクロビーズなしの生理食塩水（緑内障なしコントロール；生理食塩水）を硝子体注射した。それから、マイクロビーズ注射の3週後に、マウスは、（1）ドキシサイクリンの不在下のrtTAをコードするウイルスおよびウイルスTRE－OSK（ビーズ（OSK AAV Off））；（2）ドキシサイクリンの不在下のtTAをコードするウイルスおよびTRE－OSKをコードするウイルス（ビーズ（OSK AAV On））によって処置される。生理食塩水またはマイクロビーズ注射の3週後の（AAV注射前）およびAAV注射の4週後の（マイクロビーズの7週後）結果が示されている。図30Eは、図30Bのように処置されたマウスのパターン網膜電図によるRGC機能の結果を示すチャートである。
図31A～31Cは、OSKの発現が、ビンクリスチン（VCS）によって誘導されるダメージ後のヒトSH－SY5Y神経細胞の神経生存および軸索再生を促進したということを示すデータを包含する。図31Aは、ニューロンの構造に対する、OSK発現の誘導なし（OSK Off）と比較したOSK発現を誘導すること（OSK On）の効果を示す一連の画像を包含する。画像は24時間のVCS処置後の第3日および第9日に撮られた。神経細胞面積の輪郭が第9日において示されている。図31Bは、OSK発現が誘導された細胞（OSK On）およびOSK発現が誘導されなかった細胞（OSK Off）について、24時間のVCS処置後の指示されている日におけるニューロン細胞面積（μm2）を定量するチャートである。図31Cは、OSK発現が誘導された細胞（OSK On）およびOSK発現が誘導されなかった細胞（OSK Off）について、48時間のVCS処置後の指示されている日におけるニューロン細胞面積（μm2）を定量するチャートである。
図32A～32Gは、AAV送達されたポリシストロンOSKによる部分的なリプログラミングが無毒であり、CNS軸索再生を誘導するということを示す。図32Aは、OSK発現をコントロールするための研究に用いられたTet－OnおよびTet－Off AAVベクターの模式図である。図32Bは、最初の4週のドキシサイクリン誘導ありまたはなしの、WTマウス、OSKトランスジェニックマウス、およびAAVによって媒介されるOSKを発現するマウス（1.0×1012遺伝子コピー）の体重を示す（それぞれn=5、3、6、4、6、3）。図32Cは、網膜神経節細胞を標的化するためのAAV硝子体注射を示す模式図である。感染率および標的化された網膜層を示す、網膜のホールマウント呈示および断面の免疫蛍光。スケールバーはそれぞれ1mmおよび100μmを表す。図32DはTet－Off系を用いる視神経挫滅研究の実験の輪郭を示す。図32Eは、傷の部位から遠位の異なる距離におけるd2EGFP、OCT4、SOX2、KLF4、OS、O+S+K、またはOSK AAVによる再生繊維の定量を示す。エラーバーはs.e.m.を指示する（n=4～7）。****P<0.0001、ボンフェローニ事後検定によるANOVA。図32Fは、挫滅傷害の第14日後における、異なるAAVベクターによって形質導入されたRGC層のRBPMS陽性細胞の生存を示す（n=4～8）。d2EGFPに対して相対的に、***P<0.001、****P<0.0001、ボンフェローニ事後検定による1元配置ANOVA。図32Gは、視神経傷害の2週後の、DOXの存在および不在下におけるAAV2－tTAおよびTRE－OSKの硝子体注射による野生型マウスのCTB標識された軸索を示す、視神経切片の代表的画像を示す。挫滅部位はアステリスクによって指示されている。スケールバーは200μmを表す。
図33A～33Kは、OSK発現がTet依存的なメカニズムによって軸索再生および神経生存を促進するということを示す。図33AはOSK発現の傷害前および後の誘導のための実験の戦略を示す。図33Bは傷害前および後のOSK発現による網膜のRGC生存を示す。図33Cは傷害前および後のOSK発現モデルからの再生繊維の定量を示す。図33Dは、傷害後OSK発現ありまたはなしでの、傷害の4週後における再生軸索を示す視神経の代表的画像を示す。挫滅部位はアステリスクによって指示されている。スケールバーは200μmを表す。図33E～33Fは、ポリシストロンOSK、tTAをコードするAAV2ベクター、およびTet DNAジオキシゲナーゼ／デメチラーゼをノックダウンするためのスクランブル配列（Scr）、Tet1、またはTet2配列を有するshRNAベクターによって共形質導入された網膜における、再生繊維およびRGC生存の定量を示す。図33Gは、ビンクリスチン（VCS）ダメージ後のヒトニューロンにおける軸索再生を調べるための実験の輪郭を示す。図33Hは、OSKが皮膚および血液時計に従うとヒトニューロンを若返らせるということを示す。図33Hの上側パネルでは、P値が線形回帰モデルによって計算されて、DNAmAgeが時間と共に減少するかどうかを見ている。図33Hの下側パネルでは、皮膚および血液細胞時計によって推定された、VCSダメージの前の（第－日）または後の（第1および9日）OSK発現によるヒトニューロンのDNAメチル化年齢が示されている。図33Iは各AAV処置群の神経突起面積を示す。*p<0.05、**p<0.01、****p<0.0001、テューキーの多重比較検定による1元配置ANOVA。図33Jは、VCSダメージからの9日の回復後のヒトニューロンの代表的画像および神経突起面積を示す。図33Kは1月齢RGCのrDNAメチル化年齢を示す。GFPありでもしくはなしで感染した軸索がインタクトな網膜から、または神経挫滅の4日後のGFP－AAVもしくはOSK－AAVに感染した軸索を傷害された網膜から単離された。
図34A～34HはOSK AAV処置による緑内障の逆行を示す。図34Aは実験の輪郭を示す模式図である。図34Bは、マイクロビーズ注射後の最初の4週に渡ってリバウンドトノメトリによって毎週測定された眼圧を示す。図34Cは、AAV2またはPBS注射の4wks後におけるPPD染色された視神経断面の代表的顕微鏡像を示す。スケールバー50μm。OSK Off（rtTA+TRE－OSK）；OSK On（tTA+TRE－OSK）。図34Dは、PBSまたはAAV注射の4週後における視神経の健康な軸索の定量を示す。図34Eは、視運動反応を測定するための高コントラスト視覚刺激アッセイの模式図である。空間周波数が増大する動く縞模様パターンの回転に応答した反射的頭部運動を用いて、視覚を査定した。図34Fは、処置前におよびAAVベクターの硝子体注射の4週後に測定された各マウスの空間周波数閾値応答を示す。図34Gは、処置前のベースラインにおけるおよびOSK－OFF AAV（上側のグラフ）またはOSK－ON AAV（下側のグラフ）による処置後の4週後で同じ眼から記録された代表的pERG波形を示す。図34Hは、処置前のベースラインにおけるおよびAAVの硝子体注射の4週後の各マウスから測定された記録の平均pERG振幅を示す。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001、****P<0.0001。群間のテューキー（Turkey）事後検定による2元配置ANOVAを時間および処置の総体的効果について用いた。対応のあるt検定を用いて処置前および後を比較した。
図35A～35Iは、OSK AAVが加齢したマウスにおいて軸索再生を誘導し、視覚機能を復元するということを示す。図35Aは、視神経挫滅後の軸索再生と生理学的加齢に関連する失明の復元とに対する加齢したマウスにおけるOSK AAV処置の効果を試験するための実験の輪郭を示す。図35Bは、視神経挫滅後の2または5週後のOSK AAVまたはコントロールAAV（d2EGFP）処置による12月齢マウスにおける軸索再生を示す。図35Cは視神経の縦切片の代表的共焦点画像であり、5週のOSK処置後のCTB標識された軸索を示す。スケールバーは200μmを表す。図35Dは、OSK－OffまたはOSK－On AAVによって処置された若いマウス（4ヶ月）および老いたマウス（12ヶ月）の空間周波数閾値である。図35E～35Fは、老いたマウス（12ヶ月）の空間周波数閾値およびpERG振幅を示す：（i）OSK－Off、（ii）OSK－On、または（iii）OSK－Onプラス：DNAデメチラーゼのsh－Scr、sh－Tet1、もしくはsh－Tet2によって媒介されるノックダウンどちらかによって処置された。OSK－Off（rtTA+TRE－OSK）；OSK－On（tTA+OSK）。図35Gは階層クラスター化ヒートマップであり、インタクトな若いマウス（5ヶ月）もしくはインタクトな老いたマウス（12ヶ月）またはコントロールAAV（TRE－OSK）もしくはOSK－On AAVどちらかによって処置された老いたマウスからの、セルソーティングされた精製RGCにおける464個の差次的に発現された遺伝子のRNA－Seq発現を示す。図35Hは、RNAレベルのOSKによって誘導される変化対mRNAレベルの年齢に関連する変化のスキャッタープロットである。ドットは、RGCの差次的に発現された遺伝子を表す。図35Iは、スクランブル配列を有する（sh－Scr）またはTet1またはTet2へと標的化された（sh－Tet1／sh－Tet2）短鎖ヘアピンDNAと一緒に－OSKまたは+OSK AAVに4週に渡って感染した網膜からの、FACS単離された12月齢RGCのrDNAメチル化年齢を示す。図35Gおよび図35Hの遺伝子除外基準：低い総体的発現を有する遺伝子（log2（CPM）<2）、年齢によって有意に変化しなかった遺伝子（絶対的なlog2倍変化<1）、またはウイルスによって変改された遺伝子（インタクトな老いたものおよびTRE－OSK AAVによって処置された老いたものの間で差次的に発現される）。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001、****P<0.0001。図35Dでは2元配置ANOVA；図35B、35E、および35Fでは1元配置ANOVA。
図36A～36Hは、加齢に対するOSK（Mycなし）効果およびOSK AAVの安全性の探求を示す。図36Aは、若いおよび老いたトランスジェニックマウス線維芽細胞におけるリプログラミング効果を試験する実験の輪郭の模式図である。図36Bは、OSKM発現が多能性を誘導することなしに年齢に関連する転写の変化をレスキューするということを示す。例えば、Nanog発現は誘導されない。図36Cは、OSK発現が多能性を誘導することなしに年齢に関連する転写の変化をレスキューするということを示す。例えば、Nanog発現は誘導されない。図36Dはトランスジェニックマウスと比較した肝臓におけるOSK AAV9発現を示す。図36Eは、最初の4週後の次の9ヶ月にドキシサイクリンありまたはなしの、WTマウスおよびAAVによって媒介されるOSKを発現するマウス（トータルで1.0×1012遺伝子コピー）の体重を示す（それぞれn=5、3、6、4）。図36Fは、組織分布を測定するために用いられたAAV－UBC－rtTAおよびAAV－TRE－Lucベクターを示す。図36Gは、AAV9－UBC－rtTAおよびAAV9－TRE－Lucの後眼窩注射（トータルで1.0×1012遺伝子コピー）の2ヶ月後におけるWTマウスのルシフェラーゼイメージングを示す。ドキシサイクリンを右に示されているマウスに7日に渡って飲料水（1mg/mL）によって送達した。図36Hは、AAV9－UBC－rtTAおよびAAV9－TRE－Lucの後眼窩注射、次に7日に渡るドキシサイクリンによる処置の2ヶ月後の、眼（Ey）、脳（Br）、下垂体（Pi）、心臓（He）、胸腺（Th）、肺（Lu）、肝臓（Li）、腎臓（Ki）、脾臓（Sp）、膵臓（Pa）、精巣（Te）、脂肪（Ad）、筋肉（Mu）、脊髄（SC）、胃（St）、小腸（In）、および盲腸（Ce）のルシフェラーゼイメージングを示す。ルシフェラーゼシグナルは主として肝臓にある。より長い暴露時間で同じ組織をイメージングすることは（図36H下パネル）、膵臓においてより低いレベルのルシフェラーゼシグナルを明らかにした（肝臓は除去した）。
図37A～37Dは誘導性ポリシストロンAAV系のキャラクタリゼーションを示す。図37Aは、同じ細胞においてOCT4、SOX2、およびKLF4を発現するポリシストロンAAVベクターによって形質導入されたホールマウント網膜の免疫蛍光分析を示す。矢印は3重陽性細胞を指す。図37Bは、OCT4、SOX2、およびKLF4を別個にコードするAAVによって形質導入されたホールマウント網膜の免疫蛍光分析を示す。点線矢印は二重陽性細胞を指す。3重陽性細胞を指す各画像の右下角の矢印を例外として、塗りつぶされた矢印は一重陽性細胞を指す。図37C～37Dは、RBPMSおよびKlf4免疫蛍光のホールマウント網膜呈示を示す画像である。図37Cは、AAV2 Tet－Off系からの発現がDox飲料水（2mg/mL、3日）によってOffにされ得るということを示す。図37Dは、AAV2 Tet－On系からの発現がDox飲料水（2mg/mL、2日）によってOnにされ得るということを示す。スケールバーは1mmを表す。
図38A～38Cは、OSKがRGC増殖なしに傷害後の長期的な軸索再生を誘導するということを示す。図38Aは網膜ホールマウント染色を示し、OSK感染RGCは増殖マーカーKi67を有さないが（左）、増殖293T細胞はKi67シグナルを有する（右）ということを示す。スケールバーは100μmを表す。図38Bは視神経の全神経イメージングを示し、傷害の3ヶ月後のコントロール（AAVなし）またはOSK AAV処置からの再生軸索を示す。スケールバーは200μmを表す。図38Cは全神経イメージングを示し、AAV2－tTAおよびTRE－OSKの硝子体注射による野生型マウスにおける傷害の16週後の（wpc）CTB標識された再生軸索を示す。スケールバーは200μmを表す。
図39A～39Dは、Tet－On系がより良好なターンオン速度を有し、OSK形質導入RGCがより高い生存率を有するということを示す。図39Aは、異なるDox処置によるTet－Off AAV系からの網膜におけるd2EGFP発現を示す代表的画像を示す。発現を抑制するためにDOXによって前処置されたときには（DOXあり）、GFP発現はDOXが8日に渡って休薬された（withdrawal）後にうっすらと姿を見せるのみであり、ピーク発現（常にDOXなし）と比較してずっと弱かった。図39BはTet－On AAV系からの網膜におけるd2EGFPを示す代表的画像である。GFP発現はDOXの不在下では観察されず、GFP発現はDox誘導後に2日でピークに到達し、5日のDOX誘導によってより強くはならなかった。図39Cは、インタクトおよび挫滅サンプルにおけるGFP陽性のまたはKLF4陽性のRGCの代表的免疫蛍光画像を示す。図39Dは、GFPまたはKLF4陽性細胞の定量を示し、挫滅後のOSK発現RGCのより高い生存率を指示している。スケールバーは図39A、図39B、および図39Cにおいて200μmを表す。
図40A～40Fは、OSK効果の裏にあるエピジェネティックなメカニズムの同定を示す。図40Aは、挫滅傷害の存在または不在下におけるd2EGFPまたはOSKをコードするAAV2によって形質導入された網膜ホールマウントの代表的画像である。網膜ホールマウントをRGCマーカーRBPMSおよびmTOR活性化マーカーpS6について免疫染色した。図40Bはインタクトおよび挫滅サンプルにおけるpS6陽性RGC％の定量を示す。図40Cは、OSKを発現したRGCにおけるshRNA－YFP AAVの形質導入率の定量である。図40Dは、sh－Scr、sh－Tet1、またはsh－Tet2 YFP AAVとの組み合わせで、OSKをコードするAAV2によって形質導入された網膜ホールマウントの代表的画像を示す。網膜ホールマウントをKlf4について免疫染色した。スケールバーは図40Aおよび図40Dにおいて100μmを表す。図40Eは、OSK発現の存在下のマウスRGCにおけるsh－Scrまたはsh－Tet1処置によるTet1対GAPDH mRNAレベルを示す。図40Fは、OSK発現の存在下のマウスRGCにおけるsh－Scrまたはsh－Tet2 AAVによるTet2対GAPDH mRNAレベルを示す。
図41A～41Kは、OSKがmTOR経路に非依存的にヒトニューロン軸索再生をロバストに誘導するということを示す。図41Aは、TRE－OSKおよびtTA（OSK On）またはTRE－OSK単独（OSK Off）をコードするAAV－DJベクターの形質導入による分化したヒトニューロンの免疫蛍光を示す。図41Bは、図41AのようにAAV－DJベクターによって形質導入されたヒトニューロンのOct4、Sox2、およびKlf4のmRNAレベルを示す。図41Cは、OSK OnまたはOffによる未分化の細胞および分化した細胞におけるG1、S、およびG2期のFACSプロファイルを示す。図41Dは増殖するS期にある細胞集団の定量を示す。図41Eは、OSK発現ありまたはなしのビンクリスチンダメージ後のヒトニューロンの代表的画像および神経突起面積を示す。図41Fは、ビンクリスチンダメージ後の異なる時点における神経突起面積の定量を示す。図41Gは、ヒトニューロンにおけるsh－Scrおよびsh－Tet2 AAV処置によるTet2 mRNAレベルを示す。図41Hは、5日のラパマイシン処置（10nM）によるヒトニューロンにおけるS6のリン酸化レベルを示す。図41Iは、OSK OffまたはOSK Onによる分化したニューロンの軸索再生に対するmTOR阻害の効果を示す。図41Jは、OSK発現の不在下における、ビンクリスチン（VCS）ダメージ前の（第－日）またはダメージの1および9日後のヒトニューロンのDNAメチル化年齢を示す。皮膚または血液細胞時計を用いて推定した。図41Kは、OSK発現の不在または存在下のヒトニューロンにおけるsh－Scrまたはsh－Tet2 AAVによるマウスOct4 mRNAレベルを示す。
図42A～42Cは、マイクロビーズによって誘導されるマウスモデルにおけるOSKの効果を示す。図42Aは、マイクロビーズまたは生理食塩水注射の4週後のRGC特異的マーカー抗Brn3aおよび核染色剤DAPIによって染色された網膜フラットマウントからのRGCの定量および代表的な共焦点顕微鏡画像を示す。スケールバーは75mmを表す。図42Bは、マイクロビーズまたは生理食塩水注射の4週後のPPD染色された視神経断面の、視神経の健康な軸索の定量および代表的な顕微鏡写真像を示す。スケールバーは10μmを表す。図42Cは、AAV注射の4週後およびマイクロビーズまたは生理食塩水注射の8週後の、RGCの定量および代表的な共焦点顕微鏡画像を示す。
図43A～43Gは加齢したマウスにおけるOSKの効果を示す。図43Aは、視神経挫滅後の若い、成体の、および加齢したマウスにおけるRGC生存に対するOSK発現の効果を示す。図43Bは、傷害の2週後における若い（1月齢）、成体（3月齢）、および加齢した（12月齢）マウスにおいて、d2EGFPコントロールと比較してOSK発現によって促進される軸索再生を示す。図43Cは、OSK OffまたはOSK On処置の1ヶ月後の異なる年齢におけるpERG測定の比較を示す。OSK Off、rtTA+TRE=OSK AAV；OSK On、tTA+OSK AAV。図43Dは、OSK OffまたはOSK On処置の1ヶ月後における4mおよび12m齢マウスのRGC細胞密度（desnity）の比較を示す。図43Eは、OSK OffまたはOSK On処置の1ヶ月後の4mおよび12m齢マウスの軸索密度の比較を示す。図43Fは、－OSKまたは+OSK処置の1ヶ月後の異なる年齢におけるpERG測定の比較を示す。－OSK：AAV－rtTA+AAV－TRE－OSK；+OSK：AAVtTA+AAV－TRE－OSK。図43Gは、－OSKまたは+OSK AAVによって4週に渡って処置された18月齢マウスの空間周波数閾値を示す。
図44A～44Dは、それらの発現をREVIVER処置によってリセットした遺伝子のRNA－seq分析を示す。図44Aは、RNAレベルのOSKによって誘導される変化対mRNAレベルの年齢に関連した変化のスキャッタープロットである。ドットはRGCの差次的に発現された遺伝子を表し、示されている。遺伝子除外基準：低い総体的発現を有する遺伝子（log2（CPM）<2）、年齢によって有意に変化しなかった遺伝子（絶対的なlog2倍変化<1）、またはウイルスによって変改された遺伝子（インタクトな老いたものおよびTRE－OSK AAVによって処置された老いたものの間で差次的に発現される）。図44Bは階層クラスター化ヒートマップであり、インタクトな若いマウス（5ヶ月）もしくはインタクトな老いたマウス（12ヶ月）またはコントロールAAV（TRE－OSK）もしくはOSK－On AAVどちらかによって処置された老いたマウスからのセルソーティングされた精製RGCにおける感覚遺伝子のRNA－Seq発現を示す。図44Cは、若いものと比較して老いたものにおいて低く、かつOSKによって復元された上位10個の生物学的プロセスを示す。図44Dは、若いものと比較して老いたものにおいて高く、かつOSKによって縮減された上位10個の生物学的プロセスを示す。
図45A～45CはマウスRGCおよびヒトニューロンのメチル化時計分析を示す。図45Aは、ソーティングされたマウスRGCのrDNAメチル化年齢および暦年齢の間の相関を示す。図45Bは、異なる年齢および処置からのRGCの平均のDNAメチル化レベルを示す。図45Cは、ビンクリスチン（VCS）による処置前の（－）またはVCSダメージの～日（1および9）後のOSKによって処置されたヒトニューロンの平均DNAメチル化レベルを示す。
図46A～46BはOSKがTet2依存的な様式で軸索再生を媒介するということを示す。Tet2条件付きノックアウトマウスを用いた。マウスの眼に（1）AAV－CRE（Tet2 cKO）；（2）AAV－tTA+AAV－TRE－OSK:OSK（Tet2 WT）；または（3）AAV－tTA+AAV－TRE－OSK+AAV－CRE:OSK（Tet2 cKO）を注射した。軸索再生を視神経挫滅後にアッセイした。図46Aは代表的な視神経画像である。図46Bは軸索数を定量するグラフである。
本開示は、少なくとも部分的に、外因性のc－Myc発現の不在下におけるOCT4、SOX2、およびKLF4の発現が、インビボの部分的なリプログラミングおよび組織再生を促進するために用いられ得るということを実証する予期せぬ結果に基づく。驚くべきことに、本願に記載される通り眼をモデル組織として用いて、いくつかの態様では、OCT4、SOX2、およびKLF4の組み合わせ（OSK）が、網膜神経節細胞の若々しい遺伝子発現パターンおよびエピジェネティックな年齢をリセットして、視神経再成長および視覚の復元を緑内障の齧歯類モデルおよび老いた動物において促進するために用いられ得るということが決定された。いくつかの態様では、DNAデメチラーゼTet1およびTet2がこれらの復元活性に要求される。これは、特定の理論によって拘束されることなしに、DNAメチル化時計が年齢の相関物であるだけではなく、それの制御因子であるということを示唆する。
ある種の態様では、それぞれ単独でまたは組み合わせでOCT4、SOX2、およびKLF4をコードする操作された核酸（例えば、発現ベクター。ウイルスベクターを包含する）、それを含む組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）、操作された核酸および／または組み換えウイルスを含む医薬組成物、操作された核酸および／または組み換えウイルスを含むキット、ならびに細胞リプログラミング、加齢を逆行させること、組織修復、臓器再生、および組織再生を制御する（例えば、誘導する、誘導およびそれから停止するなど）方法が、本願において提供される。
ある種の態様では、遺伝子の1つ以上（one of more）の発現は一過的である（例えば、遺伝子発現を制御するための誘導性プロモーターを用いる）。遺伝子の1つ以上（例えば、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらの組み合わせ）の発現は、誘導因子の活性を変改することによって調節され得る。限定しない例として、テトラサイクリントランス活性化因子（tTA）は、テトラサイクリンの不在下においてテトラサイクリン応答性プロモーターからの発現を誘導することができる。テトラサイクリンが追加されるときには、tTAはもはやプロモーターに結合し得ず、発現を誘導し得ない。別の限定しない例として、リバーステトラサイクリントランス活性化因子（rtTA）は、テトラサイクリンの存在下においてテトラサイクリン応答性プロモーターからの発現を誘導することができる。テトラサイクリンが除去されるときには、rtTAはもはやプロモーターに結合し得ず、発現を誘導し得ない。本願に記載される通り、OCT4、SOX2、およびKLF4をコードする誘導性AAVベクター（OSK）は、ダメージ後のインビボの視神経系再生を促進した。よって、これらの3つの遺伝子の発現は、組織および臓器再生、組織および臓器修復、加齢を逆行させること、神経変性疾患および状態を処置すること、細胞リプログラミングに有用であり得る。下に記載される通り、いくつかの場合には、本願に記載されるベクターは、調製物あたり2×1012粒子よりも多くの力価でウイルスへとパッケージングされ得、インビトロおよびインビボの哺乳類細胞におけるOSK発現の精密なコントロールを許し得る。
細胞リプログラミングは既存の体細胞からの数々の細胞型の生成を許す。山中因子（OCT4、SOX2、KLF4、およびc－Myc。集合的に、OSKMとしてもまた公知）は分化した細胞に多能性を誘導することが示されているが、これらの因子の投与はテラトーマまたは他の癌をインビボで誘導し得る（Takahashi et al., Cell. 2006 Aug 25;126(4):663－76）；(Abad et al., Nature. 2013 Oct 17;502(7471):340－5）。これらの安全性の懸念の結果として、山中因子の使用は概ねインビトロの適用に限定されている。さらにその上、遺伝子治療の既存の方法は、標的細胞の非効率的なかつ一貫しない遺伝子形質導入を悩みとする。本願において提供される操作された核酸、それを含む組み換えウイルス、それらの医薬組成物、およびキットはこれらの限定の多くを克服する。
操作された核酸
本開示の操作された核酸は、OCT4、SOX2、KLF4、およびそれらのホモログまたはバリアント（例えば、機能的バリアント）をそれぞれ単独でまたは組み合わせでコードし得る。ある種の態様では、操作された核酸（例えば、操作された核酸）はc－Mycをコードしない。ある種の態様では、それはc－Myc配列を欠くので、操作された核酸（例えば、操作された核酸）は機能的なc－Mycをコードしない。転写因子（例えば、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせ）活性を決定するためのアッセイは当分野において公知であり、細胞に基づく転写アッセイおよびインビトロ転写アッセイを包含する。転写因子発現は、酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）、ウエスタンブロット、およびRNAの定量（例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いる）を包含する他の方法を用いてもまた決定されされ得る。
転写因子（例えば、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのホモログもしくはバリアント。哺乳類OCT4、哺乳類SOX2、および哺乳類KLF4を包含する）は単一の核酸によってコードされ得るか、または単一の核酸（例えば、操作された核酸）が2つ以上の転写因子をコードし得る（例えば、それぞれが異なるプロモーターに作動可能に連結されるか、または両方が同じプロモーターに作動可能に連結される）。例えば、ある種の態様では、核酸（例えば、操作された核酸）は、OCT4；SOX2；KLF4；OCT4およびSOX2；OCT4およびKLF4；SOX2およびKLF4；またはOCT4、SOX2、およびKLF4をいずれかの順序でコードし得る。
ある種の態様では、操作された核酸（例えば、操作された核酸）は誘導因子（例えば、tTAまたはrtTA）をコードする。ある種の態様では、核酸（例えば、操作された核酸）は1つ以上の転写因子（例えば、1、2、または3つの転写因子）および誘導因子をコードし得る。ある種の態様では、誘導因子は、転写因子（例えば、OCT4、SOX2、またはKLF4）をもまたコードしない別個の核酸（例えば、操作された核酸）によってコードされる。ある種の態様では、誘導因子は、転写因子（例えば、OCT4、SOX2、および／またはKLF4）をもまたコードする核酸（例えば、操作された核酸）によってコードされる。ある種の態様では、誘導因子は、OCT4；SOX2；KLF4；およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の転写因子（例えば、OCT4；SOX2；KLF4；OCT4およびSOX2；OCT4およびKLF4；SOX2およびKLF4；またはOCT4、SOX2、およびKLF4）をもまたコードする核酸（例えば、操作された核酸）によってコードされる。
本願に記載される転写因子（例えば、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせ）または誘導因子は1つ以上のアミノ酸置換を含み得る。バリアントは、当業者に公知のポリペプチド配列を変改するための方法、例えば、かかる方法をまとめている参照、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに見出されるものに従って調製され得る。アミノ酸の保存的置換は次の群のアミノ酸の間でなされる置換を包含する：（a）M、I、L、V；（b）F、Y、W；（c）K、R、H；（d）A、G；（e）S、T；（f）Q、N；および（g）E、D。
ある種の態様では、本開示の操作された核酸はRNA（例えばmRNA）および／またはDNAを含む。いくつかの態様では、RNAおよび／またはDNAはさらに修飾される。限定しない例として、本開示の核酸（例えば、操作された核酸）は、OCT4、KLF4、SOX2、誘導因子（inducing）、またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする修飾RNA（例えばmRNA）であり得る。例えばWarren et al., Cell Stem Cell. 2010 Nov 5;7(5):618－30を参照のこと。限定しない例として、本開示の操作された核酸（例えば、mRNAを包含するRNA、またはDNA）は送達のためにナノ粒子として製剤され得る。例えばDong et al., Nano Lett. 2016 Feb 10;16(2):842－8を参照のこと。いくつかの態様では、ナノ粒子はアセチル化ガラクトースを含む。例えばLozano－Torres et al., J Am Chem Soc. 2017 Jul 5;139(26):8808－8811を参照のこと。いくつかの態様では、操作された核酸（例えば、mRNAを包含するRNA、またはDNA）は細胞にエレクトロポレーションまたはトランスフェクションされる。ある種の態様では、操作された核酸は裸の核酸（例えば、裸のDNAまたは裸のRNA）として送達される。
いくつかの態様では、送達のためにナノ粒子として製剤される操作された核酸はAAVベクターではない。ナノ粒子による製剤のための好適なベクターバックボーンは、NANOPLASMID（商標）ベクターおよびNTC「8」シリーズ哺乳類発現ベクターを包含するが、これらに限定されない。ナノ粒子による製剤のためのベクターバックボーンの限定しない例はNTC9385RおよびNTC8685を包含する。特定の理論によって拘束されることなしに、NTC「8」シリーズ哺乳類発現ベクターは有用であり得る。なぜなら、それらは一般的に数週以内に細胞によってクリアランスされ得るからである。NTC「8」シリーズ哺乳類発現ベクターはCMVプロモーターを含み、これはOCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせをコードする配列に作動可能に連結され得る。特定の理論によって拘束されることなしに、NANOPLASMID（商標）ベクターは他のベクターよりも免疫原性ではなく、かつより高いレベルで発現し得、長い時間に渡って発現し得る。これは作動可能に連結された核酸の長期的発現に有用であり得る。いくつかの態様では、NANOPLASMID（商標）ベクターはOCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせの長期的発現に有用であり得る。
いくつかの態様では、OSKをコードする操作された核酸は人工多能性幹細胞を作ることに有用であり得る）。特定の理論によって拘束されることなしに、修飾RNA（例えばmRNA）は生来の免疫応答の最小限の活性化および限定された細胞毒性という利点を有し得、それによって、ロバストなかつ持続的な蛋白質発現を許す。いくつかの態様では、RNA（例えばmRNA）は、5－メチルシチジン（5mC）によるシチジンまたはシュードウリジン（psi）によるウリジンどちらかの完全な置換を包含する修飾を含む。
いくつかの態様では、OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現はCRISPR活性化系を用いて活性化され得る。いくつかの態様では、OCT4、KLF4、SOX2、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の転写因子の発現はCRISPR活性化系を用いて活性化され得る。例えばLiao et al., Cell. 2017 Dec 14;171(7):1495－1507.e15；Liu et al., 2018, Cell Stem Cell 22, 1－10, 2018年2月1日を参照のこと。一般的に、CRISPR活性化系は、転写活性化複合体に融合された酵素的にデッドなCas9ヌクレアーゼ（またはヌクレアーゼ欠損Cas9（dCas9））を含む（例えば、VP64、P65、Rta、および／またはMPHを含む）。VP64、P65、Rta、および／またはMPHをコードする配列の限定しない例が下で提供される。VP64、P65、Rta、またはMPHは、本願に記載されるVP64、P65、Rta、および／またはMPH配列のいずれかと少なくとも70％（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含む配列によってコードされ得る。このCas9融合蛋白質はCRISPR活性化因子と言われ得る。目当ての遺伝子のプロモーターおよび／またはエンハンサー領域を標的化するガイドRNAがCRISPR活性化系に用いられて、dCas9－転写活性化複合体を標的化し、内因性の遺伝子の発現を駆動する。
いくつかの態様では、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）系を用いて活性化され得る。
本開示の操作された核酸は、細胞のOCT4、SOX2、および／またはKLF4の内因性の座位のプロモーターおよび／またはエンハンサー領域を標的化する（target and）ためのsgRNAをコードし得る。本開示の操作された核酸は、細胞のOCT4；SOX2；KLF4；およびそれらのいずれかの組み合わせから選択される1つ以上の転写因子の内因性の座位のプロモーターおよび／またはエンハンサー領域を標的化する（target and）ためのsgRNAをコードし得る。いくつかの態様では、操作された核酸（例えば、発現ベクター）はさらにdCas9（デッドCas9）および転写活性化複合体（例えば、VP64、P65、Rta、MPH）をコードする。いくつかの態様では、dCas9（デッドCas9）および転写活性化複合体（例えば、VP64、P65、Rta、MPH）が、操作された核酸（例えば、発現ベクター）上で細胞に投与される。いくつかの態様では、sgRNAならびに／またはdCas9（デッドCas9）および転写活性化複合体（例えば、VP64、P65、Rta、MPH）をコードするベクターはウイルスベクターである（例えばAAVベクター）。いくつかの態様では、dCas9（デッドCas9）および転写活性化複合体（例えば、VP64、P65、Rta、MPH）は蛋白質として細胞に導入される。
いくつかの態様では、OCT4、SOX2、および／またはKLF4のエンハンサーおよび／またはプロモーター領域を標的化するガイドRNAがナノ粒子として製剤され、dCas9－VP64蛋白質と共に注射される。いくつかの態様では、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせのエンハンサーおよび／またはプロモーター領域を標的化するガイドRNAがナノ粒子として製剤され、dCas9－VP64蛋白質と共に注射される。いくつかの態様では、ガイドRNAならびに／あるいはdCas9（デッドCas9）および転写活性化複合体（例えば、VP64、P65、Rta、MPH）をコードする核酸は、裸の核酸として投与される（例えば、ナノ粒子によって製剤された裸のDNA）。いくつかの態様では、ガイドRNAならびに／あるいはdCas9（デッドCas9）および転写活性化複合体（例えば、VP64、P65、Rta、MPH）をコードする核酸は、組み換えウイルスによって送達される（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、またはアデノ随伴ウイルス（AAV））。
内因性のOCT4座位またはSOX2座位を標的化するガイドRNAの限定しない例の配列はLiu et al., Cell Stem Cell. 2018 Feb 1;22(2):252－261.e4によって提供されている。OCT4、SOX2、および／またはKLF4を標的化するガイドRNAの限定しない例はWeltner et al., Nat Commun. 2018 Jul 6;9(1):2643によってもまた提供されている。
特定の理論によって拘束されることなしに、c－Myc発現の不在下にいてOCT4、KLF4、および／またはSOX2の内因性の発現を活性化する（activation）ためのCRISPR－CAS9系の使用は、外因性の遺伝子発現および／または超生理学的な遺伝子発現に関連するあり得る毒性を取り除き得る。
転写因子（OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせ）をコードするかまたは誘導因子をコードする）核酸（例えば、操作された核酸）は、従来のクローニング技術を用いて発現ベクター上に導入され得る。好適な発現ベクターは、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする核酸（例えば、操作された核酸）に作動可能に連結されたプロモーター（例えば、恒常的または誘導性プロモーター。TREプロモーターを包含する）およびターミネーター配列（例えば、本願に記載されるSV40配列）を有するベクターを包含する。いくつかの態様では、核酸（例えば、操作された核酸）は、誘導因子をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターをコードする。いくつかの態様では、ベクターはWPRE配列を含む。発現にとって必要なエレメントを含有する発現ベクターは商業的に利用可能であり、当業者には公知である（例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012を参照のこと）。
本発明のベクターは、さらに、ベクターによって形質転換もしくはトランスフェクションされたかもしくはされていない、またはリプログラミングされた細胞の同定への使用のためのマーカー配列を含み得る。マーカーは、例えば、抗生物質または他の化合物に対する耐性または感受性どちらかを増大または減少させる蛋白質をコードする遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子）、当分野において公知の標準的なアッセイによって検出可能な活性を有する酵素をコードする遺伝子（例えば、β－ガラクトシダーゼ、老化関連ベータガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはアルカリホスファターゼ）、および形質転換またはトランスフェクションされた細胞、ホスト、コロニー、またはプラークの表現型に可視的に影響する遺伝子（例えば、緑色蛍光蛋白質）を包含する。いくつかの態様では、本願において用いられるベクターは、自立複製と、それらが作動可能に連結されるDNAセグメント上に存在する構造遺伝子産物の発現とができる。
ある種の態様では、発現ベクターは、転写因子（例えば、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせ）をコードする配列に作動可能に連結された誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター）を含む。ある種の態様では、転写因子（例えば、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせ）をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターは、組織特異的または細胞型特異的プロモーターである（例えば、脳特異的、肝臓特異的、筋肉特異的、神経細胞特異的、グリア細胞特異的、内皮細胞特異的、肺特異的、心臓特異的、骨特異的、腸特異的、皮膚特異的プロモーター、または眼特異的プロモーター）。例として、筋肉特異的プロモーターはdesminプロモーターであり得る（例えば、配列番号29と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列）。いくつかの態様では、眼特異的プロモーターは配列番号101～104から選択される配列と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一であるプロモーターであり得る。
ある種の態様では、転写因子（例えば、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせ）をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターは、年齢または老化特異的である（例えば、年齢または老化特異的プロモーターは、p16プロモーター、または年齢と共に蓄積することが公知であるメチル化DNAに結合するCas9によって導かれる転写因子であり得る）。
ある種の態様では、発現ベクターは、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする核酸（例えば、操作された核酸）に作動可能に連結された恒常的プロモーターを含む。いくつかの態様では、かかるベクターはクラスター化等間隔短回文リピート（CRISPR）／ガイドRNA系を用いて不活性化され得る。例えば、ガイドRNAはベクターに対して相補的であり得、Cas9ヌクレアーゼをベクターへと標的化することができる。いくつかの態様では、ガイドRNAは本願に記載される発現ベクターのいずれかにおけるトランスジーン（例えば、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせをコードするトランスジーン）に対して相補的である。それから、Cas9はベクター上に二本鎖切断部を作り出すか、および／またはベクターを変異させ、ベクターを不活性にし得る。
ある種の態様では、誘導因子をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターは恒常的プロモーターである（例えば、CMV、EF1アルファ、SV40プロモーター、PGK1、UBC、CAG、ヒトベータアクチン遺伝子プロモーター、またはUAS）。ある種の態様では、誘導因子をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターは組織特異的なプロモーターである（例えば、脳特異的、肝臓特異的、筋肉特異的、神経細胞特異的、肺特異的、心臓特異的、骨特異的、腸特異的、皮膚特異的プロモーター、または眼特異的プロモーター）。例として、筋肉特異的プロモーターはdesminプロモーターであり得る（例えば、配列番号29と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列）。
核酸（例えば、操作された核酸）（例えば発現ベクター）はさらにセパレータ配列（例えば、IRESまたはポリペプチド切断シグナル）を含み得る。例示的なポリペプチド切断シグナルは2Aペプチド（例えば、T2A、P2A、E2A、およびF2A）を包含する。2Aペプチドは配列番号9と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含み得る。1つよりも多くの転写因子（例えば、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせ）をコードする核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）では、各転写因子は異なるプロモーターにまたは同じプロモーターに作動可能に連結され得る。転写因子は核酸上において（例えば、ペプチドセパレータ配列によって）分離され得る。核酸（例えば、操作された核酸）の発現は、各転写因子をコードする別個のアミノ酸配列をもたらす。
ある種の態様では、本開示の発現ベクター（例えば、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせをコードする発現ベクター）は、さらに、選択薬剤（例えば、抗生物質。ブラストサイジン、ジェネティシン、ハイグロマイシンB、ミコフェノール酸、ピューロマイシン、ゼオシン、アクチノマイシンD、アンピシリン、カルベニシリン、カナマイシン、およびネオマイシンを包含する）および／または検出可能なマーカー（例えば、GFP、RFP、ルシフェラーゼ、CFP、mCherry、DsRed2FP、mKate、ビオチン、FLAGタグ、HAタグ、Hisタグ、Mycタグ、V5タグなど）を含み得る。
ある種の態様では、本開示の誘導因子をコードする発現ベクターは、さらに、選択薬剤（例えば、抗生物質。ブラストサイジン、ジェネティシン、ハイグロマイシンB、ミコフェノール酸、ピューロマイシン、ゼオシン、アクチノマイシンD、アンピシリン、カルベニシリン、カナマイシン、およびネオマイシンを包含する）および／または検出可能なマーカー（例えば、GFP、RFP、ルシフェラーゼ、CFP、mCherry、DsRed2FP、mKate、ビオチン、FLAGタグ、HAタグ、Hisタグ、Mycタグ、V5タグなど）を含み得る。
ある種の態様では、発現ベクター（例えば、OCT4、SOX2、KFF4、またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする）はウイルスベクター（例えばAAVベクター）上に存在する。ある種の態様では、誘導因子をコードする発現ベクターはウイルスベクター（例えばAAVベクター）上に存在する。本願において用いられるAAVベクターは、一般的には、発現カセット（例えば、OCT4、SOX2、KFF4、またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーター配列およびターミネーター配列を含む核酸（例えば、操作された核酸）、誘導因子をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む核酸（例えば、操作された核酸）、あるいはそれらの組み合わせ）をフランキングするITRを含む。
ある種の態様では、本開示のAAVベクター上の2つのITR間の塩基対数は、5キロベース（kb）未満である（例えば、4.9kb未満、4.8kb未満、4.7kb未満、4.6kb未満、4.5kb未満、4.4kb未満、4.3kb未満、4.2kb未満、4.1kb未満、4kb未満、3.5kb未満、3kb未満、2.5kb未満、2kb未満、1.5kb未満、1kb未満、または0.5kb未満）。ある種の態様では、2つのITR間に4.7kb未満の距離を有するAAVベクターは、少なくとも0.5×1010のmlあたりの粒子形成単位（pfu/ml）、少なくとも1×1010pfu/ml、少なくとも5×1010pfu/ml、少なくとも1×1011pfu/ml、少なくとも5×1011pfu/ml、少なくとも1×1012pfu/ml、少なくとも2×1012pfu/ml、少なくとも3×1012pfu/ml、少なくとも4×1012pfu/ml、少なくとも5×1012pfu/ml、少なくとも6×1012pfu/ml、少なくとも7×1012pfu/ml、少なくとも8×1012pfu/ml、少なくとも9×1012pfu/ml、または少なくとも1×1013pfu/mlの力価でウイルスへとパッケージングされることができる。
ある種の態様では、本開示の発現ベクターは少なくとも1キロベース（kb）である（例えば、少なくとも1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、50kb、または100kb）。ある種の態様では、本開示の発現ベクターは10kb未満である（例えば、9kb未満、8kb未満（less）、7kb未満、6kb未満、5kb未満、4kb未満、3kb未満、2kb未満、または1kb未満）。
特定の理論によって拘束されることなしに、転写因子のうちの1つまたは2つをコードする別個の核酸（例えば、操作された核酸）と比較して、OCT4、SOX2、およびKLF4を1つのプロモーター下にコードする発現ベクター（例えばAAVベクター）は、インビボにおける全ての3つの転写因子のより効率的な形質導入をもたらす。ある種の態様では、細胞（例えば、哺乳類細胞を包含する動物細胞）における本開示のベクターを持っている組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）の感染効率は、少なくとも20％である（例えば少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％、または100％）。
組み換えウイルス
本開示の側面は組み換えウイルスを提供する（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、またはAAV）。組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、またはAAV）は、転写因子（例えば、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせ）をコードする核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）またはそれらの組み合わせを持ち得る。いくつかの態様では、組み換えウイルスは、OCT4、SOX2、およびKLF4から選択される少なくとも2つの転写因子をコードする核酸を持っている（例えば、OCT4およびSOX2；KLF4およびSOX2；OCT4、KLF4、およびSOX2；またはOCT4およびKLF4）。いくつかの態様では、組み換えウイルスはOCT4、SOX2、およびKLF4から選択される少なくとも3つの転写因子をコードする核酸を持っている（例えば、OCT4、SOX2、およびKLF4）。いくつかの場合には、本開示の組み換えウイルスは誘導因子をコードする核酸を含む。
ある種の態様では、組み換えウイルスは組み換えAAVである。いくつかの態様では、組み換えAAVは組織特異的な標的化能力を有し、その結果、AAVのトランスジーンは1つ以上の所定の組織（単数または複数）に特異的に送達されるであろう。一般的に、AAVカプシドは、AAVの組織特異的な標的化能力を決定することに該当する因子である。AAVカプシドは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、およびそれらのバリアントに由来するアミノ酸配列を含み得る。AAV血清型の組織特異性の限定しない例が表1に提供されている。「x」は、指示されているAAV血清型がトランスジーンを特定の組織に送達することができるということを指示している。
表1．AAV血清型の限定しない例および特定の組織におけるそれらの有用性
Figure 2022511373000002
特定のカプシド蛋白質を含む組み換えAAVはいずれかの好適な方法を用いて生じ得る。例えば、参照によって本願に組み込まれるU.S.特許出願公開US2003/0138772を参照のこと。AAVカプシド蛋白質配列もまた当分野において公知である。例えば、参照によって本願に組み込まれる公開PCT出願WO2010/138263を参照のこと。一般的に、組み換えAAVはホスト細胞によって次のコンポーネントから生ずる：（1）AAVカプシド蛋白質またはその断片をコードする核酸（例えば、操作された核酸）配列、（2）機能的なrep遺伝子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）、（3）トランスジーン（例えば、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせをコードする核酸（例えば、操作された核酸））をフランキングするAAV末端逆向きリピートを含む組み換えAAVベクター、および（4）AAVカプシド蛋白質による組み換えAAVベクターのパッケージングを許すヘルパー機能。いくつかの場合には、組み換えAAVベクターは誘導因子をコードする核酸を含む。ある種の態様では、ヘルパー機能は当分野において公知であるヘルパーベクターによって導入される。
いくつかの場合には、好適なホスト細胞株（例えば、HEK293T細胞）が、慣行を踏襲して本願において開示される組み換えAAVを生ずるために用いられ得る。上に記載されているコンポーネントの1つ以上をコードする1つ以上の発現ベクターが外因性の核酸（例えば、操作された核酸）によってホスト細胞に導入され得、これはAAV粒子の生成を許す好適な条件下で培養され得る。必要とされるときには、ヘルパーベクターが用いられて、複製を容易化し得るか、AAV粒子のアセンブリを容易化し得るか、またはそれらのいずれかの組み合わせである。ある種の態様では、組み換えAAVベクターは、他のコンポーネント（例えば、AAVカプシド蛋白質またはその断片をコードする核酸（例えば、操作された核酸）配列、機能的なrep遺伝子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）、およびAAVカプシド蛋白質による組み換えAAVベクターのパッケージングを許すヘルパー機能）とは別個の核酸（例えば、操作された核酸）上に存在する。ある種の態様では、ホスト細胞はAAVウイルスを生ずるために必要とされる1つ以上のコンポーネントを安定発現し得る。そのケースでは、残りのコンポーネントはホスト細胞に導入され得る。細胞培養の上清が収集され得、その中に含有されるウイルス粒子が慣例的な方法論によって収集され得る。
OCT4、SOX2、およびKLF4をそれぞれ単独でまたは組み合わせで活性化する方法、ならびにそれらの代替物
本開示の側面は、いくつかの態様では、細胞、組織、および／または臓器においてOCT4、SOX2、およびKLF4をそれぞれ単独でまたは組み合わせで活性化することに関する。いくつかの態様では、OCT4、SOX2、およびKLF4はそれぞれ単独でまたは組み合わせでc－Myc活性化の不在下において活性化される。細胞、組織、および／または臓器はインビボ（例えば、対象内）またはエクスビボであり得る。本願において用いられる活性化は、目当ての蛋白質（例えば、OCT4、SOX2、および／またはKLF4）の生物活性を増大させることができるいずれかの核酸（例えば、RNAを含む、DNAを含む核酸、またはそれらのいずれかの組み合わせ）、蛋白質、抗体、化学的因子、またはそれらのいずれかの組み合わせを包含する。生物活性（例えば、遺伝子発現、リプログラミング能力、転写因子活性など）は当分野において公知のいずれかの慣例的な方法を用いて測定され得る。いくつかの態様では、本願に記載されるいずれかの核酸（例えば、RNAを含む、DNAを含む核酸、またはそれらのいずれかの組み合わせ）、蛋白質、抗体、化学的因子、またはそれらのいずれかの組み合わせは、OCT4、SOX2、および／またはKLF4を代替する。いくつかの態様では、本願に記載されるいずれかの核酸（例えば、RNAを含む、DNAを含む核酸、またはそれらのいずれかの組み合わせ）、蛋白質、抗体、化学的因子、またはそれらのいずれかの組み合わせは、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせを代替する。いくつかの態様では、本願に記載される誘導因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）、誘導因子をコードする操作された蛋白質、誘導因子の活性を調節する（例えば、活性化または阻害する）ことができる化学的因子、および／または誘導因子をコードする組み換えウイルスのいずれかは、誘導因子を活性化するために用いられる。
OCT4、SOX2、およびKLF4の活性化は、それぞれ単独でまたは組み合わせで、OCT4、SOX2、およびKLF4の発現（例えば、RNAおよび／または蛋白質発現）を、それぞれ単独でまたは組み合わせで増大させることを包含する。いくつかの態様では、OCT4、SOX2、および／またはKLF4をコードする核酸（例えば、RNAを含む、DNAを含む核酸、またはそれらのいずれかの組み合わせ）、OCT4、SOX2、および／またはKLF4をコードする蛋白質、OCT4、SOX2、および／またはKLF4をコードすることを活性化することができる抗体、OCT4、SOX2、および／またはKLF4をコードすることを活性化することができる化学的因子、あるいはそれらのいずれかの組み合わせの、細胞、組織、臓器、および／または対象への投与後に、投与前と比較して、OCT4、SOX2、およびKLF4の発現は、それぞれ単独でまたは組み合わせで、少なくとも1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、または1000％だけ増大する。いくつかの態様では、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする核酸（例えば、RNAを含む、DNAを含む核酸、またはそれらのいずれかの組み合わせ）、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする蛋白質、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせをコードすることを活性化することができる抗体、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせをコードすることを活性化することができる化学的因子、あるいはそれらのいずれかの組み合わせの、細胞、組織、臓器、および／または対象への投与後に、投与前と比較して、OCT4、SOX2、およびKLF4の発現は、それぞれ単独でまたは組み合わせで、少なくとも1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、または1000％だけ増大する。
誘導因子の活性化は、誘導因子の発現（例えば、RNAおよび／または蛋白質発現）を増大させることを包含する。いくつかの態様では、誘導因子をコードする核酸（例えば、RNAを含む、DNAを含む核酸、またはそれらのいずれかの組み合わせ）、誘導因子をコードする蛋白質、誘導因子の活性を調節することができる化学的因子、またはそれらのいずれかの組み合わせの、細胞、組織、臓器、および／または対象への投与後に、投与前と比較して、誘導因子の発現は、少なくとも1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、または1000％だけ増大する。
発現は、当分野において公知のいずれかの慣例的な方法によって測定され得る。目当ての蛋白質のレベルの定量（例えば、目当ての蛋白質を認識する抗体によるELISAおよび／またはウエスタンブロット分析を用いる）または目当ての遺伝子のRNA（例えばmRNA）レベルの定量（例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いる）を包含する。
本願において論じられる操作された核酸に加えて、OCT4、SOX2、KLF4は、単独でまたは組み合わせで、操作された蛋白質の使用によって細胞、組織、臓器、および／または対象において活性化され得る。例えば、OCT4、SOX2、および／またはKLF4をコードする蛋白質が（例えば、組み換え的にまたは合成的に）作り出され得、いずれかの好適な経路によって細胞、組織、臓器、および／または対象に投与され得る。例えば、OCT4；SOX2；KLF4；およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の転写因子をコードする蛋白質が（例えば、組み換え的にまたは合成的に）作り出され得、いずれかの好適な経路によって細胞、組織、臓器、および／または対象に投与され得る。
いくつかの態様では、テトラサイクリン誘導性発現ベクターからのOCT4；SOX2；KLF4；その代替物；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を活性化することは、テトラサイクリン（例えばドキシサイクリン）を細胞、臓器、組織、または対象に投与することを含む。当業者は了解するであろう通り、テトラサイクリン投与経路は細胞、臓器、組織の型、および／または対象の性質に依存し得る。いくつかの態様では、テトラサイクリンは直接的に細胞、臓器、および／または組織に投与される。限定しない例として、テトラサイクリンは、テトラサイクリンを含む点眼液、持続放出デバイス（例えば、マイクロポンプ、粒子、および／またはデポ剤）、およびテトラサイクリンを含む治療用コンタクトレンズを包含するいずれかの好適な方法によって、対象の眼に投与され得る）。いくつかの態様では、テトラサイクリンは（例えば、飲料水または静脈注射によって）対象に全身投与される。テトラサイクリンは、外用的に（例えばクリームによって）または皮下ポンプによって（例えば、テトラサイクリンを特定の組織に送達するために）投与され得る。テトラサイクリンは、静脈内に、皮内に、動脈内に、病巣内に、腫瘍内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、鼻腔内に、硝子体内に、腟内に、直腸内に、外用的に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下、膀胱内に（intravesicularlly）、粘膜的に、心膜内に、臍帯内に、眼内に（intraocularally）、経口的に、外用的に、局所的に、全身的に、注射、輸液、連続的輸液、直接的に標的細胞を浸す限局的な灌流、カテーテルによって、クリームによって、粒子（例えば、ナノ粒子、マイクロ粒子）によって、脂質組成物（例えば、リポソーム）によって、または当業者に公知であろう他の方法もしくは前述のいずれかの組み合わせによって、投与され得る（例えば、参照によって本願に組み込まれるRemington’s Pharmaceutical Sciences (1990)を参照のこと）。
限定しない例として、操作された蛋白質は細胞、組織、臓器、および／または対象への送達のためにさらに改変または製剤され得る。例えば、蛋白質トランスダクションドメイン（すなわち、PTDまたは細胞透過性ペプチド）が、操作された蛋白質（例えば、OCT4、SOX2、および／またはKLF4）に取り付けられ得る。限定しない例として、蛋白質トランスダクションドメイン（すなわち、PTDまたは細胞透過性ペプチド）が、誘導因子をコードする操作された蛋白質に取り付けられ得る。特定の理論によって拘束されることなしに、蛋白質トランスダクションドメインは細胞膜を通したカーゴ（例えば、蛋白質、核酸、ナノ粒子、ウイルス粒子など）の送達を容易化する。蛋白質トランスダクションドメインは、カチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、および／または細胞特異的ペプチドを包含する。例えばZhou et al., Cell Stem Cell. 2009 May 8;4(5):381－4；Zahid et al., Curr Gene Ther. 2012 Oct;12(5):374－80を参照のこと。
いくつかの態様では、OCT4、SOX2、および／またはKLF4、ならびに／あるいは誘導因子をコードする蛋白質は（例えば、核送達のための）ナノ粒子によって製剤される。いくつかの態様では、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせ（例えば、OCT4およびSOX2；KLF4およびSOX2；OCT4およびKLF4；またはKLF4、SOX2、およびOCT4）をコードする蛋白質は、（例えば、核送達のための）ナノ粒子によって製剤される。ある種の態様では、ナノ粒子は、さらに、誘導因子をコードする蛋白質を含む。例えば、キトサン［ポリ(N－アセチルグルコサミン)］は生分解性の多糖であり、いくつかの方法によってナノ粒子を製剤するために用いられ得る。いくつかの態様では、キトサンポリマーナノ粒子がOCT4、SOX2、および／またはKLF4、ならびに／あるいは誘導因子をコードする蛋白質をローディングされ、細胞の核に送達される。例えばTammam et al., Oncotarget. 2016 Jun 2l;7(25):37728－37739を参照のこと。
いくつかの態様では、化学的因子、抗体、および／または蛋白質がOCT4、SOX2、および／またはKLF4を代替する。いくつかの態様では、化学的因子、抗体、蛋白質、またはそれらのいずれかの組み合わせはOCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせ（例えば、OCT4およびSOX2；OCT4およびKLF4；KLF4およびSOX2；またはKLF4、SOX2、およびOCT4）を代替する。例えば、化学的因子、抗体、および／または蛋白質はOCT4、SOX2、および／またはKLF4の発現を促進し得る。ある種の場合には、化学的因子、抗体、および／または蛋白質は、OCT4；SOX2；KLF4；およびそれらのいずれかの組み合わせから選択される1つ以上の転写因子の発現を促進し得る。いくつかの態様では、化学的因子、抗体、および／または蛋白質はOCT4、SOX2、および／またはKLF4の下流の標的遺伝子を活性化し得る。いくつかの態様では、化学的因子、抗体、蛋白質、またはそれらのいずれかの組み合わせは、OCT4；SOX2；KLF4；およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の転写因子の下流の標的遺伝子を活性化し得る。いくつかの態様では、化学的因子、抗体、および／または蛋白質が他の2つの転写因子と一緒に用いられかつ細胞リプログラミングを促進し得る場合には、化学的因子、抗体、および／または蛋白質はOCT4、SOX2、および／またはKLF4を代替すると言われる。いくつかの態様では、化学的因子、抗体、蛋白質、またはそれらのいずれかの組み合わせが他の2つの転写因子と一緒に用いられかつ細胞リプログラミングを促進し得る場合には、化学的因子、抗体、蛋白質、またはそれらのいずれかの組み合わせはOCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせを代替すると言われる。例えば、細胞リプログラミングは遺伝子発現（例えば、胚性マーカーおよび／または多能性マーカーの発現）を測定することによって決定され得る。いくつかの態様では、多能性マーカーはAP、SSEA1、および／またはNanogを包含する。
いくつかの態様では、OCT4、SOX2、および／またはKLF4を活性化するために、抗体が用いられる。いくつかの態様では、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択される1つ以上の転写因子を活性化するために、抗体が用いられる。いくつかの態様では、抗体はOCT4、SOX2、および／またはKLF4を標的化しない。いくつかの態様では、抗体はOCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせを標的化しない。いくつかの態様では、抗体はOCT4、SOX2、および／またはKLF4の発現を増大させる。いくつかの態様では、抗体はOCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を増大させる。いくつかの態様では、抗体はOCT4、SOX2、および／またはKLF4の発現を増大させない。いくつかの態様では、抗体はOCT4、SOX2、および／またはKLF4を代替する。いくつかの態様では、抗体はOCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を増大させない。いくつかの態様では、抗体はOCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせを代替する。転写因子（例えば、OCT4、SOX2、および／またはKLF4）を代替し得る抗体を同定するいずれかの好適な方法が用いられ得る。転写因子（例えば、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせ）を代替し得る抗体を同定するいずれかの好適な方法が用いられ得る。例えばBlanchard et al., Nat Biotechnol. 2017 Oct;35(10):960－968を参照のこと。
いくつかの態様では、別の蛋白質（例えば、蛋白質をコードする核酸、または蛋白質をコードするポリペプチド）が、OCT4、SOX2、および／またはKLF4を代替するために用いられ得る。いくつかの態様では、別の蛋白質（例えば、蛋白質をコードする核酸、または蛋白質をコードするポリペプチド）が、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらの組み合わせを代替するために用いられ得る。例えば、OCT4はTet1、NR5A－2、Sall4、E－カドヘリン、NKX3－1、またはそれらのいずれかの組み合わせによって代替され得る。いくつかの態様では、OCT4、SOX2、および／またはKLF4は、NANOGおよび／またはTET2によって代替され得る。いくつかの態様では、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせは、NANOGおよび／またはTET2によって代替され得る。例えばNat Cell Biol. 2018 Aug;20(8):900－908；Gao et al., Cell Stem Cell. 2013 Apr 4;12(4):453－69を参照のこと。NanogおよびLin28はKlf4を代替し得る。例えばYu et al., Science. 318, 1917－1920, 2007を参照のこと）。いくつかの態様では、OCT4、SOX2、および／またはKLF4はTet3（Tetメチルシトシンジオキシゲナーゼ3）によって代替される。いくつかの態様では、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせはTet3（Tetメチルシトシンジオキシゲナーゼ3）によって代替される。いくつかの態様では、Tet1 DNAデメチラーゼをコードする核酸は、NM_030625.3またはNM_00l253857.2と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含む。いくつかの態様では、Tet1 DNAデメチラーゼをコードするアミノ酸は、NP_085128.2またはNP_00l240786.1と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含む。いくつかの態様では、Tet2 DNAデメチラーゼをコードする核酸は、NM_001127208.2、NM_001040400.2、NM_001346736.1、またはNM_017628.4と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含む。いくつかの態様では、Tet2 DNAデメチラーゼをコードするアミノ酸は、NP_060098.3、NP_001035490.2、NP_001333665.1、またはNP_001120680.1と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含む。いくつかの態様では、Tet3 DNAデメチラーゼをコードする核酸は、NM_001287491.2、NM_001347313.1、NM_183138.2、またはNM_001366022.1と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含む。いくつかの態様では、Tet3 DNAデメチラーゼをコードするアミノ酸は、NP_001274420.1、NP_001334242.1、NP_898961.2、またはNP_001352951.1と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含む。Tet1、Tet2、および／またはTet3はいずれかの種に由来し得る。いくつかの態様では、Tet1、Tet2、および／またはTet3は野生型カウンターパートの短縮型形態である。限定しない例として、Tet1、Tet2、および／またはTet3は野生型Tet1、Tet2、および／またはTet3カウンターパートと比較してN末端短縮型であり、触媒的に活性である。いくつかの態様では、Tet1、Tet2、および／またはTet3はTet1、Tet2、および／またはTet3の触媒ドメインのみを含む。いくつかの態様では、Tet1、Tet2、および／またはTet3は、Tet1、Tet2、Tet3、またはそれらのいずれかの組み合わせの触媒ドメインを含む。機能的な短縮型Tet1の限定しない例はHrit et al., Elife. 2018 Oct l6;7. pii: e34870に見出され得る。
細胞リプログラミングを促進するためにOCT4、SOX2、および／またはKLF4を代替する追加の方法は当分野において公知である。例えば、Heng et al., Cell Stem Cell 6, 167－174 (2010)；Eguchi et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 113, E8257－E8266 (2016)；Gao et al., Cell Stem Cell 12, 453－469 (2013)；Long et al., Cell Res. 25, 1171－1174 (2015)；Hou et al., Science 341, 651－654 (2013)；Redmer et al., EMBO Rep. 12, 720－726 (2011)；Tan et al., J. Biol. Chem. 290, 4500－4511 (2014)；Anokye－Danso et al., Cell Stem Cell 8, 376－388 (2011)；Miyoshi et al., Cell Stem Cell 8, 633－638 (2011)；Shu et al., Cell 153, 963－975 (2013)；Yu, J. et al., Science 318, 1917－1920 (2007）を参照のこと。
いくつかの態様では、化学的因子がOCT4、SOX2、および／またはKLF4を代替する（例えば、細胞リプログラミングを促進するために他の2つの転写因子と併せて、OCT4、SOX2、および／またはKLF4の代わりに用いられ得る）。いくつかの態様では、化学的因子がOCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせを代替する（例えば、細胞リプログラミングを促進するために他の2つの転写因子と併せて、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせの代わりに用いられ得る）。例えば、SOX2はCHIR、FSK、または616452によって代替され得る。OCT4はDZNepによって代替され得る。Sall4は上で言及されている通りOCT4を代替するために用いられ得るので、Sall4を代替するいずれかの化合物もまたOCT4を代替するために用いられ得る。例えば、CHIR、FSK、および616452はSall4を代替するために用いられ得る。Nanogは2i培地によって代替され得る。例えばHou et al., Science. 2013 Aug 9;341(6146):651－4を参照のこと。例えばZhao et al., Cell. 2015 Dec 17;163(7): 1678－91をもまた参照のこと。
いくつかの態様では、化学的リプログラミングは、リプログラミングを誘導する化学的因子の毒性を縮減する化学物質を用いることを含む。化学的リプログラミングの毒性を縮減する化学物質の限定しない例は、ROCK阻害剤（例えば、Y27632およびFasudil）およびP38 MAPK阻害剤（例えば、SB203580およびBIRB796）を包含する。例えばLi et al., Cell Stem Cell. 2015 Aug 6;l7(2):l95－203を参照のこと。
OCT4、KLF4、SOX2、代替物、またはそれらのいずれかの組み合わせは、リプログラミングの強化因子を活性化することおよび／またはリプログラミングのバリアを阻害することとの組み合わせで活性化され得る（例えば、発現が誘導され得る）。リプログラミングの強化因子は、当分野において公知のいずれかの好適な方法を用いて活性化され得る。強化因子の過剰発現、強化因子をコードする内因性の遺伝子の発現を増大させること（例えば、CRISPRテクノロジーを用いる）、強化因子の生物活性を増大させるための化学的因子および／または抗体の使用、ならびに強化因子の発現を促進するための化学的因子および／または抗体の使用を包含する。リプログラミングのバリアは当分野において公知のいずれかの好適な方法を用いて阻害され得る。阻害剤の発現をノックダウンすること（例えば、siRNA、miRNA、shRNAによる）、阻害剤の内因性のコピーをノックアウトすること（例えば、CRISPRテクノロジー、TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼなどを用いる）、阻害剤の生物活性を減少させるために化学的因子および／または抗体を用いること、ならびに阻害剤の発現を減少させるために化学的因子および／または抗体を用いることを包含する。
リプログラミングの強化因子およびバリアの限定しない例は表2によって提供される。例えば、この目的でその全体が参照によって組み込まれるEbrahimi, Cell Regen (Lond). 2015 Nov 11;4: 10をもまた参照のこと。
表2．リプログラミングを強化するための戦略の限定しない例
Figure 2022511373000003
OCT4、KLF4、SOX2、それらの代替物、またはそれらのいずれかの組み合わせとの組み合わせで活性化され得る追加のリプログラミング強化因子は、ヒストンリジンデメチラーゼを包含する（例えば、KDM2、KDM3、およびKDM4）。ヒストンリジンデメチラーゼは細胞、組織、臓器、および／または対象において過剰発現されることによって活性化され得る。ヒストンリジンデメチラーゼの化学的活性化因子もまた本開示によって包摂される。例えば、ビタミンCはKDM3および／またはKDM4を活性化するために用いられ得る。
いくつかの態様では、OCT4、SOX2、KLF4、それらの代替物、またはそれらのいずれかの組み合わせが、C/EBRαおよびTfcp2l1の活性化と併せて活性化される。特定の理論によって拘束されることなしに、C/EBRαおよびTfcp2l1は、Klf4と一緒になって、リプログラミングの間にTet2によって媒介されるエンハンサー脱メチル化および活性化を駆動し得る。
いくつかの態様では、OCT4、SOX2、KLF4、それらの代替物、またはそれらのいずれかの組み合わせが、細胞、組織、臓器、および／または対象において、リプログラミングを容易化するサイトカインとの組み合わせで活性化される。IL6はサイトカインの限定しない例である。例えばMosteiro et al., Science. 2016 Nov 25;354(6315）を参照のこと。これはその全体がこの目的で参照によってここに組み込まれる。
いくつかの態様では、OCT4、SOX2、KLF4、それらの代替物、またはそれらのいずれかの組み合わせは、細胞、組織、臓器、および／または対象において、miRNAの活性化（例えば、miRNAの投与および／またはmiRNAの発現）との組み合わせで活性化される。例えば、細胞周期進行を促進するmiRNAが細胞、組織、臓器、および／または対象に導入され得る。細胞周期進行を促進するmiRNAの限定しない例はmiR302－367、miR371－373、miR－200b、miR－200c、miR－205、miR290－295、miR－93、miR－106、およびmiR135bを包含する。
限定しない例として、OCT4、SOX2、KLF4、それらの代替物、またはそれらのいずれかの組み合わせの活性化を強化因子の活性化と組み合わせることによって、神経再生が強化され得る。強化因子の限定しない活性化は、KLFファミリーのメンバー（例えばKLF7）の過剰発現、c－Mycの過剰発現、STAT3活性化、SOX11過剰発現、Lin28の過剰発現、インスリン様成長因子1（IGF1）およびオステオポンチン（OPN）をコードする可溶性蛋白質の過剰発現または送達、ならびにB－RAFの活性化（例えば、機能獲得型変異の導入）を包含する。例えば、Blackmore et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 May 8;109(19):7517－22；Belin et al., Neuron. 2015 May 20;86(4): 1000－1014；Bareyre et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2011 Apr 12;108(15):6282－7；Norsworthy et al., Neuron. 2017 Jun 21;94(6):1112－1120.e4；Wang et al., Cell Rep. 2018 Sep 4;24(10):2540－2552.e6；Liu et al., Neuron. 2017 Aug 16;95(4):817－833；O’Donovan et al., J Exp Med, 2014. 211(5): p. 801－14をもまた参照のこと。これはその全体がこの目的で参照によってここにそれぞれ組み込まれる。
いくつかの態様では、OCT4、SOX2、KLF4、それらの代替物、またはそれらのいずれかの組み合わせは、細胞、組織、臓器、および／または対象において、リプログラミングバリアの抑制またはノックダウンとの組み合わせで活性化される。リプログラミングバリアの限定しない例はChaf1a、Chaf1b、Ube2i、sumo2、および／またはNudt21を包含する。例えばBrumbaugh et al., Cell. 2018 Jan 11;172(1－2):106－l20.e21；Cheloufi et al., Nature. 2015 Dec 10;528(7581):218－24；およびBorkent et al., Stem Cell Reports, 2016. 6(5): p. 704－716を参照のこと。これはその全体がこの目的で参照によってここにそれぞれ組み込まれる。
限定しない例として、リプログラミングバリアはおそらくDNAメチルトランスフェラーゼ（DNMT）であり得、DNMTが阻害されて、組織、細胞、および／または臓器のリプログラミングを促進し得る。ほとんどのDNAメチルトランスフェラーゼはS－アデノシル－L－メチオニンをメチルドナーとして用いる。DNMTはいずれかの種からであり得る。メチルトランスフェラーゼの少なくとも3つの異なる型がある。m6AメチルトランスフェラーゼはDNA上のアデニンのc－6位置のアミノ基をメチル化することができる（例えば、Enzyme Commission (EC) No. 2.1.1.72）。m4CメチルトランスフェラーゼはN4－メチルシトシンを作り出すことができる（例えば、Enzyme Commission (EC) No. 2.1.1.113）。M5CメチルトランスフェラーゼはC5－メチルシトシンを作り出すことができる（例えば、Enzyme Commission (EC) No.2.1.1.37）。
哺乳類DNAメチルトランスフェラーゼ（DNMT）の限定しない例は、DNMT1ならびにそのアイソフォームDNMT1bおよびDNMT1o（卵子特異的）、DNMT3a、DNMT3b、DNMT3Lを包含する。GenBankアクセッションNo.NM_001130823.3（アイソフォームa）、NM_001318730.1（アイソフォームc）、NM_001318731.1（アイソフォームd）、およびNM_001379.3（アイソフォームb）は、ヒトDNMT1をコードするヌクレオチド配列の限定しない例である。DNMT1をコードする核酸は、GenBankアクセッションNo.NM_001130823.3（アイソフォームa）、NM_001318730.1（アイソフォームc）、NM_001318731.1（アイソフォームd）、および／またはNM_001379.3（アイソフォームb）によって提出される配列と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含み得る。GenBankアクセッションNo.NP_001124295.1（アイソフォームa）、NP_001305659.1（アイソフォームc）、NP_001305660.1（アイソフォームd）、およびNP_001370.1（アイソフォームb）は、ヒトDNMT1をコードするアミノ酸配列の限定しない例である。DNMT1をコードするアミノ酸配列は、GenBankアクセッションNo.NP_001124295.1（アイソフォームa）、NP_001305659.1（アイソフォームc）、NP_001305660.1（アイソフォームd）、および／またはNP_001370.1（アイソフォームb）によって提出される配列と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含み得る。ヒトDNMT3Aをコードする核酸はGenBankアクセッションNo.NM_001320892.1、NM_001320893.1、NM_022552.4、NM_153759.3、NM_l75629.2、およびNM_175630.1を包含する。DNMT3Aをコードする核酸は、GenBankアクセッションNo.NM_001320892.1、NM_001320893.1、NM_022552.4、NM_153759.3、NM_l75629.2、および／またはNM_l75630.1によって提出される配列と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一であり得る。ヒトDNMT3Aをコードするアミノ酸配列は、GenBankアクセッションNo.NP_001307821.1、NP_001307822.1、NP_072046.2、NP_715640.2、NP_783328.1、およびNP_783329.1を包含する。DNMT3Aをコードするアミノ酸配列は、GenBankアクセッションNo.NP_00l307821.1、NP_00l307822.1、NP_072046.2、NP_7l5640.2、NP_783328.1、および／またはNP_783329.1によって提出される配列と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一であり得る。ヒトDNMT3Bをコードする核酸はGenBankアクセッションNo.NM_001207055.1、NM_001207056.1、NM_006892.3、NM_175848.1、NM_175849.1、およびNM_175850.2を包含する。DNMT3Bをコードする核酸は、GenBankアクセッションNo.NM_001207055.1、NM_001207056.1、NM_006892.3、NM_175848.1、NM_175849.1、および／またはNM_175850.2によって提出される配列と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一であり得る。ヒトDNMT3Bをコードするアミノ酸配列は、GenBankアクセッションNo.NP_001193984.1、NP_001193985.1、NP_008823.1、NP_787044.1、NP_787045.1、およびNP_787046.1を包含する。DNMT3Bをコードするアミノ酸配列は、GenBankアクセッションNo.NP_001193984.1、NP_001193985.1、NP_008823.1、NP_787044.1、NP_787045.1、および／またはNP_787046.1によって提出される配列と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一であり得る。ヒトDNMT3Lをコードする核酸はGenBankアクセッションNo.NM_013369.3およびNM_175867.2を包含する。DNMT3Lをコードする核酸は、GenBankアクセッションNo.NM_013369.3および／またはNM_175867.2によって提出される配列と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一であり得る。ヒトDNMT3Lをコードするアミノ酸配列はGenBankアクセッションNo.NP_037501.2およびNP_787063.1を包含する。DNMT3Lをコードするアミノ酸配列は、GenBankアクセッションNo.NP_037501.2および／またはNP_787063.1によって提出される配列と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一であり得る。
DNMTは当分野において公知のいずれかの好適な方法を用いて阻害され得る。好適な方法は、DNMT mRNAのノックダウン、DNMTを遺伝子ノックアウトすること、およびDNMT阻害剤（例えば化学的阻害剤）の使用を包含する。DNMT阻害剤は米国などにおいて治験（例えば、第III相治験）によって取り調べられつつある。DNMT阻害剤の限定しない例は、VIDAZA（商標）（アザシチジン）（例えば、骨髄異形成症候群の処置および急性骨髄性白血病（AML）の処置のため）、DACOGEN（商標）（デシタビン）（例えば、AMLの処置および慢性骨髄性白血病（CML）の処置のため）、およびグアデシタビン（SGI－110）（例えば、AMLの処置のため）を包含する。2012年に、欧州連合はDACOGEN（商標）（デシタビン）をAMLを有する患者への使用について認可した。
DNMTは、DNMT安定化因子を阻害することによって阻害され得る。DNMT安定化因子を阻害する好適な方法は、安定化因子をコードするmRNAのノックダウン、安定化因子をコードする遺伝子を遺伝子ノックアウトすること、および阻害剤（例えば化学的阻害剤）の使用を包含する。限定しない例として、Lsd1またはAof2ともまた言われるKDM1aはDNMT1の安定化因子である。例えばWang et al., Nat Genet. 2009 Jan;41(1):125－9を参照のこと。いくつかの態様では、KDM1a発現は本願において開示されるかまたは当分野において公知のshRNAを用いてノックダウンされる。いくつかの態様では、KDM1aが阻害されて、DNMTからの高メチル化によって誘導される傷害を防止する。これはリプログラミングを促進することに有用であり得る。
いくつかの態様では、ヒストンメチルトランスフェラーゼがリプログラミングバリアであり、細胞、組織、および／または臓器のリプログラミングを容易化するために阻害される。ヒストンメチルトランスフェラーゼは、化学的阻害剤の使用を包含するいずれかの好適な方法によって阻害され得る。例えば、3－デアザネプラノシンA（Dznep）、epz004777、およびBIX－01294がヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤の例である。
いくつかの態様では、リプログラミングバリアはヒストンデアセチラーゼ（HDAC）であり、HDACは細胞、組織、および／または臓器のリプログラミングを容易化するために阻害される。HDAC阻害剤の限定しない例は、バルプロ酸（VPA）、トリコスタチンA（TSA）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（SAHA）、酪酸ナトリウム（SB）、ベリノスタット（PXD101）、パノビノスタット（LBH589）、キジノスタット（JNJ－26481585）、アベキジノスタット（PCI－24781）、ジビノスタット（ITF2357）、レスミノスタット（4SC－201）、フェニル酪酸（PBA）、デプシペプチド（ロミデプシン）、エンチノスタット（MS－275）、モセチノスタット（MGCD0103）、およびツバスタチンA（TBA）を包含する。
いくつかの態様では、リプログラミングバリアはNF－κBであり、それが阻害されて、細胞、組織、および／または臓器のリプログラミングを容易化する。NF－κB阻害剤の限定しない例はBAY11－7082、TPCA1、およびp65 siRNAを包含する。例えば、AbcamによってまとめられているNF－κB低分子ガイドを参照のこと。これはAbcamウェブサイト上で利用可能である（www.abcam.com/reagents/nf－kb－small－molecule－guide）。
いくつかの態様では、リプログラミング（repogramming）バリアは老化細胞から分泌されるサイトカインであり、これにおいてサイトカインが阻害されて、細胞、組織、および／または臓器のリプログラミングを容易化する。サイトカインの阻害剤の限定しない例は、抗TNFα（Mahmoudi et al., Biorxiv, 2018）およびNavitoclaxを包含する老化細胞を殺す薬物を包含する。
いくつかの態様では、リプログラミングバリアはマイクロRNA（miRNA）であり、マイクロRNAが阻害されて、細胞、組織、および／または臓器のリプログラミングを容易化する。リプログラミングバリアであるマイクロRNAの限定しない例はmiR Let－7およびmiR－34を包含する。特定の理論によって拘束されることなしに、miR Let－7は細胞周期を阻害するので、miR Let－7の阻害はリプログラミングの効率を増大させ得、miR－34はp53の翻訳を阻害するので、miR－34の阻害はリプログラミングを容易化し得る。
いくつかの態様では、OCT4、SOX2、KLF4、それらの代替物、またはそれらのいずれかの組み合わせが、細胞、組織、臓器、および／または対象において、PTEN、SOCS3、RhoA、および／またはROCKの阻害との組み合わせで活性化されて、神経再生を強化する。いくつかの態様では、細胞、組織、臓器、および／または対象において、PTENが欠失するか、SOCS3が欠失するか、RhoAがノックダウンされるか、および／またはROCKがノックダウンされる。PTEN、SOCS3、RhoA、および／またはROCKの阻害の記載については、例えば、Park et al., Science. 2008 Nov 7;322(5903):963－6；Smith et al., Neuron. 2009 Dec 10;64(5):617－23；Koch et al., Front Cell Neurosci. 2014 Sep 5;8:273；Koch et al., Cell Death Dis. 2014 May 15;5:e1225を参照のこと。各参照はその全体がこの目的で参照によってここに組み込まれる。
いくつかの態様では、OCT4、SOX2、KLF4、それらの代替物、またはそれらのいずれかの組み合わせが、細胞、組織、臓器、および／または対象において、神経電気刺激（例えば、高コントラスト視覚刺激）との組み合わせで活性化されて、神経再生を促進する。高コントラスト視覚刺激の記載については、例えばLim et al., Nat Neurosci. 2016 Aug; 19(8): 1073－84を参照のこと。この参照はその全体がこの目的で参照によってここに組み込まれる。
いくつかの態様では、OCT4、SOX2、KLF4、それらの代替物、またはそれらのいずれかの組み合わせが、細胞、組織、臓器、および／または対象において、ガンマ帯域光刺激との組み合わせで活性化されて、神経再生を促進する。ガンマ帯域光刺激の記載については、例えばMcDermott et al., J Alzheimers Dis. 2018; 65(2): 363－392を参照のこと。この参照はその全体がこの目的で参照によってここに組み込まれる。
操作された細胞
操作された細胞および操作された細胞を生ずる方法もまた本開示によって包摂される。操作された細胞は例えば細胞に基づく治療（例えば幹細胞治療）に有用であり得る。幹細胞治療は現在治験中であるが（例えばDavid Cyranoski, Nature 557, 619－620 (2018)を参照のこと）、毒性（例えば、オフターゲット毒性）が懸念である。特定の理論によって拘束されることなしに、本開示の操作された細胞（例えば、OCT4、KLF4、および／またはSOX2、ならびに／あるいは誘導因子をコードするAAVベクターを用いて操作された細胞）は、より低い毒性を有し得る。なぜなら、AAVはホスト細胞のゲノムにインテグレーションせず（is does not）、かつOCT4、KLF4、および／またはSOX2の発現をコントロールするための本願に記載される誘導系の使用は、遺伝子発現の精密なコントロール（例えば、量およびタイミング）を許し得るからである。
OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、本願に記載される操作された蛋白質、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは本願に記載される組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、単独でまたは組み合わせで、ホスト細胞、ホスト組織、または臓器に導入されて、操作された細胞、操作された組織、または操作された臓器を生じ得る。OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、本願に記載される操作された蛋白質、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは本願に記載される組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、単独でまたは組み合わせで、ホスト細胞、ホスト組織、または臓器に導入されて、操作された細胞、操作された組織、または操作された臓器を生じ得る。いくつかの態様では、誘導因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）、誘導因子をコードする操作された蛋白質、誘導因子の活性を調節する（例えば、活性化または阻害する）ことができる化学的因子、および／または誘導因子をコードする組み換えウイルスもまたホスト細胞、ホスト組織、または臓器に導入されて、操作された細胞、操作された組織、または操作された臓器を生ずる。
いくつかの態様では、操作された細胞は人工多能性幹細胞（iPSC）である。
いくつかの態様では、ウイルスベクター（例えばAAVベクター。OCT4、KLF4、およびSOX2をコードする核酸に作動可能に連結されたTREプロモーターを有するベクターを包含する）が、AAV－DJカプシドによってウイルスへとパッケージングされる。いくつかの態様では、AAV－DJカプシドは、AAV－DJカプシドなしの細胞と比較して培養細胞への形質導入効率を増大させる。いくつかの態様では、OSKをコードするAAVウイルスは細胞に投与される。いくつかの態様では、誘導因子をコードするAAVウイルス（例えば、AAV－DJウイルス）または誘導因子をコードする蛋白質が同じ細胞に投与される。いくつかの態様では、この系は操作された細胞（例えば、人工多能性幹細胞）を生ずる。いくつかの態様では、操作された細胞はさらに分化させられる（例えば、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸細胞に分化させられる）。いくつかの態様では、分化した細胞は移植目的に用いられる。いくつかの態様では、操作された細胞が培養されて、操作された組織を作出する。いくつかの態様では、操作された細胞が培養されて、操作された臓器を作出する。いくつかの態様では、操作された細胞は網膜色素上皮細胞、ニューロン細胞、膵臓ベータ細胞、または心臓細胞である。
組成物
本開示の組成物は、本願に記載されるOCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された蛋白質、操作された細胞、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかの少なくとも１つを、単独でまたは組み合わせで含み得る。ある種の態様では、本開示の組成物は、本願に記載されるOCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された蛋白質、操作された細胞、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかの少なくとも１つを、単独でまたは組み合わせで含む。いくつかの態様では、組成物は、OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはより多くの異なる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、OCT4、KLF4、および／またはSOX2をコードする発現ベクター）を含む。いくつかの態様では、組成物は、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を誘導することができる1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはより多くの異なる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする発現ベクター）を含む。いくつかの態様では、組成物は、それぞれが1つ以上の異なるトランスジーンを有する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはより多くの異なるウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）を含む。いくつかの態様では、組成物は、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはより多くの異なる化学的因子を含む。いくつかの態様では、組成物は、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはより多くの異なる化学的因子を含む。いくつかの態様では、組成物は、さらに、誘導因子をコードする1つ以上の核酸（例えば、操作された核酸）、誘導因子をコードする1つ以上の操作された蛋白質、誘導因子の活性を調節する（例えば、活性化または阻害する）ことができる1つ以上の化学的因子、および／または誘導因子をコードする1つ以上の組み換えウイルスを含む。いくつかの態様では、組成物は操作された細胞（例えば、人工多能性幹細胞および／または分化した細胞）を含む。いくつかの態様では、組成物はOCT4、SOX2、および／またはKLF4をコードする操作された蛋白質を含む。いくつかの態様では、組成物は、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする操作された蛋白質を含む。いくつかの態様では、組成物は、さらに、誘導因子をコードする操作された蛋白質を含む。
いくつかの態様では、組成物はさらに薬学的に許容される担体を含む。OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、操作された蛋白質、操作された細胞、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）などが導かれる適応症から判断して、好適な担体は当業者によって難なく選択され得る。OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、操作された蛋白質、操作された細胞、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）などが導かれる適応症から判断して、好適な担体は当業者によって難なく選択され得る。誘導因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）、誘導因子をコードする操作された蛋白質、誘導因子の活性を調節する（例えば、活性化または阻害する）ことができる化学的因子、ならびに／あるいは誘導因子を含む組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）などが導かれる適応症からもまた判断して、好適な担体は当業者によって難なく選択され得る。例えば、1つの好適な担体は生理食塩水を包含し、これは種々の緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）によって製剤され得る。他の例示的な担体は無菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、胡麻油、および水を包含する。担体の選択は本開示の限定ではない。
任意に、本開示の組成物は、OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を含む操作された細胞、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）など、ならびに担体（単数または複数）に加えて、他の医薬成分、例えば保存料、あるいは化学的安定化因子を含み得る。任意に、本開示の組成物は、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを含む操作された細胞、操作された蛋白質、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）など、ならびに担体（単数または複数）に加えて、他の医薬成分、例えば保存料、あるいは化学的安定化因子を含み得る。好適な例示的な保存料は、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールを包含する。好適な化学的安定化因子はゼラチンおよびアルブミンを包含する。本開示の組成物は、さらに、誘導因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）、誘導因子をコードする操作された蛋白質、誘導因子の活性を調節する（例えば、活性化または阻害する）ことができる化学的因子、および／または誘導因子をコードする組み換えウイルスを含み得る。
本願に記載されるOCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された細胞、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする操作された蛋白質、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいはそれをコードする組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）は、所望の組織（例えば、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸組織）の細胞をトランスフェクションするための、かつ不当な有害効果なしに十分なレベルの遺伝子移入および発現を提供するための十分量で投与される。誘導因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）、誘導因子をコードする操作された蛋白質、誘導因子の活性を調節する（例えば、活性化または阻害する）ことができる化学的因子、および／または誘導因子をコードする組み換えウイルスのいずれかは、所望の組織（例えば、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸組織）の細胞をトランスフェクションするための、かつ不当な有害効果なしに十分なレベルの遺伝子移入および発現を提供するための十分量で投与される。薬学的に許容される投与経路の例は、選択された臓器への直接送達（例えば、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸への直接送達）を包含するが、これらに限定されない。本願に記載されるOCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された細胞、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、静脈内に、皮内に、動脈内に、病巣内に、腫瘍内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、鼻腔内に、硝子体内に、腟内に、直腸内に、外用的に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下、膀胱内に（intravesicularlly）、粘膜的に、心膜内に、臍帯内に、眼内に（intraocularally）、経口的に、外用的に、局所的に、全身的に、注射、輸液、連続的輸液、直接的に標的細胞を浸す限局的な灌流、カテーテルによって、クリームによって、脂質組成物（例えばリポソーム）によって、または当業者に公知であろう他の方法もしくは前述のいずれかの組み合わせによって、送達され得る。本願に記載されるOCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された細胞、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、操作された蛋白質、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、静脈内に、皮内に、動脈内に、病巣内に、腫瘍内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、鼻腔内に、硝子体内に、腟内に、直腸内に、外用的に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下、膀胱内に（intravesicularlly）、粘膜的に、心膜内に、臍帯内に、眼内に（intraocularally）、経口的に、外用的に、局所的に、全身的に、注射、輸液、連続的輸液、直接的に標的細胞を浸す限局的な灌流、カテーテルによって、クリームによって、脂質組成物（例えば、リポソーム）によって、または当業者には公知であろう他の方法もしくは前述のいずれかの組み合わせによって、送達され得る。誘導因子をコードする核酸、誘導因子の活性を調節することができる化学的因子、誘導因子をコードする操作された蛋白質、および／または誘導因子をコードする組み換えウイルスのいずれかは、静脈内に、皮内に、動脈内に、病巣内に、腫瘍内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、鼻腔内に、硝子体内に、腟内に、直腸内に、外用的に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下、膀胱内に（intravesicularlly）、粘膜的に、心膜内に、臍帯内に、眼内に（intraocularally）、経口的に、外用的に、局所的に、全身的に、注射、輸液、連続的輸液、直接的に標的細胞を浸す限局的な灌流、カテーテルによって、クリームによって、脂質組成物（例えばリポソーム）によって、または当業者に公知であろう他の方法もしくは前述のいずれかの組み合わせによって、送達され得る。投与経路は所望の場合には組み合わせられ得る。
いくつかの態様では、核酸は非ウイルス的に（例えば、ウイルスベクター上ではなくおよび／またはウイルスによってではなく）送達される。いくつかの態様では、OCT4、SOX2、および／またはKLF4、ならびに／あるいは誘導因子をコードする核酸（例えば、RNAまたはDNA）は、リポソームによって投与される。いくつかの態様では、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせ、ならびに／あるいは誘導因子をコードする核酸（例えば、RNAまたはDNA）は、リポソームによって投与される。いくつかの態様では、OCT4、SOX2、および／またはKLF4、ならびに／あるいは誘導因子をコードする核酸（例えば、RNAまたはDNA）は、粒子によって投与される。いくつかの態様では、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせ、ならびに／あるいは誘導因子をコードする核酸（例えば、RNAまたはDNA）は、粒子によって投与される。いくつかの態様では、核酸はRNA（例えば、mRNA）である。
いくつかの態様では、OCT4、KLF4、および／またはSOX2をコードする発現ベクターを含む医薬組成物または発現ベクターを持っているウイルスを含む医薬組成物が、細胞、組織、臓器、または対象に投与される。いくつかの態様では、誘導因子をコードする発現ベクターを含む医薬組成物または発現ベクターを持っているウイルスを含む医薬組成物が、細胞、組織、臓器、または対象に投与される。いくつかの態様では、OCT4、KLF4、および／またはSOX2をコードするウイルスおよび／または発現ベクターは全身投与される。いくつかの態様では、誘導因子をコードするウイルスおよび／または発現ベクターは全身投与される。いくつかの態様では、OCT4、KLF4、および／またはSOX2をコードするウイルスおよび／または発現ベクターは局所投与される（例えば、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸を包含する目当ての組織または臓器に直接的に）。いくつかの態様では、誘導因子をコードするウイルスおよび／または発現ベクターは局所投与される（例えば、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸を包含する目当ての組織または臓器に直接的に）。いくつかの態様では、誘導因子（例えば、誘導因子をコードする核酸、誘導因子をコードする蛋白質、または誘導因子をコードするウイルス）および／または誘導因子の活性を調節する（例えば、活性化または阻害する）ことができる化学的因子は、OCT4、KLF4、および／またはSOX2（例えば、OCT4、KLF4、および／またはSOX2をコードする核酸）と同じ投与経路を用いて投与される。いくつかの態様では、誘導因子（例えば、誘導因子をコードする核酸、誘導因子をコードする蛋白質、または誘導因子をコードするウイルス）および／または誘導因子の活性を調節する（例えば、活性化または阻害する）ことができる化学的因子は、OCT4、KLF4、および／またはSOX2（例えば、OCT4、KLF4、および／またはSOX2をコードする核酸）のような異なる投与経路によって投与される。
いくつかの態様では、OCT4；KLF4；SOX2；もしくはそれらのいずれかの組み合わせをコードする発現ベクターを含む医薬組成物、または発現ベクターを持っているウイルスを含む医薬組成物が、細胞、組織、臓器、または対象に投与される。いくつかの態様では、誘導因子をコードする発現ベクターを含む医薬組成物または発現ベクターを持っているウイルスを含む医薬組成物が、細胞、組織、臓器、または対象に投与される。いくつかの態様では、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせをコードするウイルスおよび／または発現ベクターは全身投与される。いくつかの態様では、誘導因子をコードするウイルスおよび／または発現ベクターは全身投与される。いくつかの態様では、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせをコードするウイルスおよび／または発現ベクターは局所投与される（例えば、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸を包含する目当ての組織または臓器に直接的に）。いくつかの態様では、誘導因子をコードするウイルスおよび／または発現ベクターは局所投与される（例えば、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸を包含する目当ての組織または臓器に直接的に）。いくつかの態様では、誘導因子（例えば、誘導因子をコードする核酸、誘導因子をコードする蛋白質、または誘導因子をコードするウイルス）および／または誘導因子の活性を調節する（例えば、活性化または阻害する）ことができる化学的因子は、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせ（例えば、OCT4；KLF4；SOX2；OCT4およびSOX2；OCT4およびKLF4；KLF4およびSOX2；またはKLF4、OCT4、およびSOX2をコードする核酸）と同じ投与経路を用いて投与される。いくつかの態様では、誘導因子（例えば、誘導因子をコードする核酸、誘導因子をコードする蛋白質、または誘導因子をコードするウイルス）および／または誘導因子の活性を調節する（例えば、活性化または阻害する）ことができる化学的因子は、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせ（例えば、OCT4をコードする核酸；KLF4；SOX2；OCT4およびSOX2；OCT4およびKLF4；KLF4およびSOX2；またはKLF4、OCT4、およびSOX2をコードする核酸）のような異なる投与経路によって投与される。
いくつかの態様では、発現ベクターは誘導性ベクターであり、その上では、OCT4、KLF4、および／またはSOX2、ならびに／あるいは誘導因子をコードする核酸が誘導性TREプロモーター（例えば、TRE3G、TRE2、またはPtight）に作動可能に連結されている。いくつかの態様では、発現ベクターは誘導性ベクターであり、その上では、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせ、ならびに／あるいは誘導因子をコードする核酸が誘導性TREプロモーター（例えば、TRE3G、TRE2、またはPtight）に作動可能に連結されている。いくつかの態様では、ウイルスおよび／または誘導性ベクターはテトラサイクリン（例えばドキシサイクリン）と共に投与される。いくつかの態様では、TREプロモーターを含むウイルスおよび／または発現ベクターはテトラサイクリン（例えばドキシサイクリン）とは別個に投与される。例えば、本願に記載されるTREプロモーターを含むウイルスおよび／または発現ベクターのいずれかが全身投与され得、テトラサイクリンが（例えば、目当ての臓器または組織に）局所投与され得る。いくつかの態様では、本願に記載されるTREプロモーターを含むウイルスおよび／または発現ベクターのいずれかが（例えば、直接的に、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸を包含する目当ての組織または臓器に）局所投与され得、テトラサイクリンが全身投与され得る。限定しない例として、TREプロモーターを含むウイルスおよび／または発現ベクターが直接的に対象の眼に投与され（例えば注射され）、テトラサイクリン（例えばドキシサイクリン）が全身投与される（例えば、丸剤として経口的に）。
いくつかの態様では、テトラサイクリンは、静脈内に、皮内に、動脈内に、病巣内に、腫瘍内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、鼻腔内に、硝子体内に、腟内に、直腸内に、外用的に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下、膀胱内に（intravesicularlly）、粘膜的に、心膜内に、臍帯内に、眼内に（intraocularally）、経口的に、外用的に、局所的に、全身的に、注射、輸液、連続的輸液、直接的に標的細胞を浸す限局的な灌流、カテーテルによって、クリームによって、または脂質組成物によって投与される。いくつかの態様では、テトラサイクリンは直接的に細胞、臓器、および／または組織に投与される。限定しない例として、テトラサイクリンは、テトラサイクリンを含む点眼液、持続放出デバイス（例えば、マイクロポンプ、粒子、および／またはデポ剤）、およびテトラサイクリンを含む治療用コンタクトレンズを包含するいずれかの好適な方法によって対象の眼に投与され得る。いくつかの態様では、テトラサイクリンは対象に（例えば、飲料水または静脈注射によって）全身投与される。テトラサイクリンは外用的に（例えば、クリームによって）または皮下ポンプによって（例えば、テトラサイクリンを特定の組織に送達するために）投与され得る。
例として、特定の治療効果を達成するために要求される組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）ビリオンのドーズ、例えばゲノムコピーのドーズの単位／体重のキログラムあたり（GC/kg）は、いくつかの因子に基づいて変わるであろう：組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）ビリオン投与経路、治療効果を達成するために要求される遺伝子またはRNA発現のレベル、処置されようとする特定の疾患または障害、および遺伝子またはRNA産物の安定性を包含するが、これらに限定されない。当業者は、上述の因子および他の因子に基づいて、特定の疾患または障害を有する患者を処置するための組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAVビリオン）ドーズ範囲を難なく決定し得る。
組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）の有効量は、動物を標的化・感染、所望の組織を標的化するために十分な量である。いくつかの態様では、組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）の有効量は、安定な体細胞トランスジェニック動物モデルを生ずるために十分な量である。有効量は、主として、対象の種、年齢、重量、健康、および標的化されるべき組織などの因子に依存するであろう。それゆえに、動物および組織の間で変わり得る。例えば、組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）の有効量は、一般的には、約109から1016ゲノムコピーを含有する約1mlから約100mlの溶液の範囲である。いくつかのケースでは、約1011から1013組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）ゲノムコピーの間の用量が適当である。ある種の態様では、1010または1011組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）ゲノムコピーが、眼組織（例えば網膜組織）を標的化するためには有効である。いくつかのケースでは、安定なトランスジェニック動物が複数ドーズの組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、またはAAV）によって生ずる。
いくつかの態様では、1ドーズの組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、またはAAV）は、暦日（例えば、24時間の期間）あたりせいぜい1回対象に投与される。いくつかの態様では、1ドーズの組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）は、2、3、4、5、6、または7暦日あたりせいぜい1回対象に投与される。いくつかの態様では、1ドーズの組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）は、暦週（例えば7暦日）あたりせいぜい1回対象に投与される。いくつかの態様では、1ドーズの組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）は、せいぜい二週毎に（例えば、2暦週の期間に1回）対象に投与される。いくつかの態様では、1ドーズの組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）は、暦月あたりせいぜい1回（例えば、30暦日に1回）対象に投与される。いくつかの態様では、1ドーズの組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）は、6暦月あたりせいぜい1回対象に投与される。いくつかの態様では、1ドーズの組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）は、暦年（例えば、365日、または閏年には366日）あたりせいぜい1回対象に投与される。
いくつかの態様では、特に、高い組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）濃度が存在する（例えば、～1013GC/ml以上）ところでは、組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）組成物は、組成物中のAAV粒子の凝集を縮減するように製剤される。例えば界面活性剤の追加、pH調整、塩濃度調整などを包含する凝集を縮減するための適当な方法が用いられ得る（例えばWright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171－178を参照のこと。これの内容は参照によって本願に組み込まれる）。
限定しない例として、AAVによるトランスジーンの送達はヒトにおいて有望かつ無毒であることが示されている。例えば、AAVは眼に送達され得る。例えばSmalley Nat Biotechnol. 2017 Nov 9;35(11):998－999を参照のこと。
薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の製剤は当業者に周知であり、本願に記載される特定の組成物を種々の処置レジメンに用いるための好適な投薬および処置レジメンの開発も同様である。典型的には、これらの製剤は少なくとも約0.1％以上の活性化合物を含有し得るが、活性成分（単数または複数）のパーセンテージは当然のことながら変えられ得、便利には、トータルの製剤の重量または体積の約1もしくは2％および約70％もしくは80％の間、またはより多くであり得る。自然に、各治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、好適な用量が化合物のいずれかの所与のユニットドーズによって得られるようなやり方で（is）調製され得る。可溶性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品の品質保持期限、および他の薬学的考慮などの因子が、かかる医薬製剤を調製する分野の業者によって企図されるであろう。そのため、種々の用量および処置レジメンが望ましくあり得る。
いくつかの態様では、OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を含む操作された細胞、Oct4、KLF4、および／またはSOX2をコードする操作された蛋白質、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）は、例えば本願において開示される好適に製剤された医薬組成物によって、直接的に標的組織に、例えば直接的に目当ての組織（例えば、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸）に送達される。
いくつかの態様では、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを含む操作された細胞、Oct4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせをコードする操作された蛋白質、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）は、例えば本願において開示される好適に製剤された医薬組成物によって、直接的に標的組織に、例えば直接的に目当ての組織（例えば、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸）に送達される。
いくつかの態様では、誘導因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）（例えば発現ベクター）、誘導因子を含む操作された細胞、誘導因子をコードする操作された蛋白質、誘導因子の活性を調節することができる化学的因子、および／または誘導因子をコードする組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）は、例えば本願において開示される好適に製剤された医薬組成物によって、直接的に標的組織に、例えば直接的に目当ての組織（例えば、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸）に送達される。
しかしながら、ある種の状況では、別個にまたは加えて、OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、ならびに／あるいは誘導因子をコードする核酸、OCT4、KLF4、および／または誘導因子をコードする核酸から選択される転写因子の組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）、操作された細胞、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、およびSOX2から選択される転写因子の組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、誘導因子の活性を調節する（例えば、阻害または活性化する）ことができる化学的因子、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかを、別の経路によって、例えば皮下に、膵臓内に（intraopancreatically）、鼻腔内に、非経腸的に、静脈内に、筋肉内に、髄腔内に、あるいは経口的に、腹腔内に、または吸入によって、送達することが望ましくあり得る。いくつかの態様では、U.S.Pat.No.5,543,158；5,641,515、および5,399,363（それぞれは特にその全体が参照によって本願に組み込まれる）に記載されている投与モダリティが、組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）を送達するために用いられ得る。いくつかの態様では、好ましい投与モードは角膜実質内注射によってである。
いくつかの態様では、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする核酸（例えばmRNA）はポリプレックスによってナノ製剤され、これは例えば肺（例えば肺上皮）への核酸の非侵襲的エアロゾル吸入および送達にとって有用であり得る。例えば、ナノ製剤されたmRNAポリプレックスの記載についてはPatel et al., Adv Mater. 2019 Jan 4:e1805116. doi:10.1002/adma.20l805116を参照のこと。これはその全体がこの目的で参照によってここに組み込まれる。
注射用の使用のための好適な医薬形態は、無菌の水溶液または分散液、および無菌の注射用の溶液または分散液の即席調製のための無菌粉末を包含する。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物によって、ならびに油によってもまた調製され得る。保管および使用のありふれた条件下では、これらの調製物は微生物の成長を防止するための保存料を含有する。多くのケースでは、形態は無菌であり、かつ容易な注射可能性（syringability）が存在する程度に流動性である。それは製造および保管の条件下において安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物のコンタミネーション作用から守られなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、および同類）、それらの好適な混合物、および／または野菜油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液のケースでは要求される粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、および同類によって成し遂げられ得る。多くのケースでは、等張化剤、例えば砂糖または塩化ナトリウムを包含することが好ましくあり得る。注射用組成物の遷延した吸収が、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物への使用によって成し遂げられ得る。
注射用の水溶液の投与のためには、例えば、溶液は必要な場合には好適に緩衝化され得、液体希釈剤は第1に十分な生理食塩水またはグルコースによって等張にされる。これらの特定の水溶液は静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与にとって特に好適である。このつながりでは、好適な無菌の水系媒体が使用され得る。例えば、1用量が1mlの等張NaCl溶液中に溶解され得、1000mlの皮下注入液に追加されるかまたは提案される輸液部位において注射されるかどちらかであり得る（例えば"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, 1035－1038および1570－1580ページを参照のこと）。用量の何らかの変動がホストの状態に依存して必然的に起こるであろう。いずれにせよ、投与の担当者が個々のホストについて適当なドーズを決定するであろう。
無菌の注射用の溶液は、OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された細胞、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、および／または活性な組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）などを、要求される量で、要求される本願において挙げられる種々の他の成分と共に適当な溶媒中に組み込むこと、次に濾過滅菌によって調製される。無菌の注射用の溶液は、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された細胞、操作された蛋白質、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、および／または活性な組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）などを、要求される量で、要求される本願において挙げられる種々の他の成分と共に適当な溶媒中に組み込むこと、次に濾過滅菌によって調製される。ある種の態様では、無菌の注射用の溶液は、誘導因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）、誘導因子をコードする操作された蛋白質、誘導因子の活性を調節することができる化学的因子、および／または誘導因子をコードする活性な組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）などを、要求される量で、要求される本願において挙げられる種々の他の成分と共に適当な溶媒中に組み込むこと、次に濾過滅菌によって調製される。一般的に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、上で挙げられているものからの基本的な分散媒体と要求される他の成分とを含有する無菌の基剤中に組み込むことによって調製される。無菌の注射用溶液の調製のための無菌粉末のケースでは、調製の好ましい方法は、活性成分プラスいずれかの追加の所望の成分の粉末をその先に滅菌濾過された溶液から産する真空乾燥および凍結乾燥技術である。
本願において開示されるOCT4、KLF4、および／またはSOX2をコードする核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された細胞、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）を含む組成物は、中性のまたは塩の形態でもまた製剤され得る。本願において開示されるOCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された細胞、操作された蛋白質、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）を含む組成物は、中性のまたは塩の形態でもまた製剤され得る。組成物は、誘導因子（例えば、誘導因子をコードする核酸もしくは誘導因子をコードする蛋白質、および／または誘導因子をコードする組み換えウイルス）および／または誘導因子の活性を調節することができる化学的因子を含み得る。薬学的に許容される塩は、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸、および同類などの有機酸によって形成される酸付加塩（蛋白質の自由なアミノ基によって形成される）を包含する。自由なカルボキシル基によって形成される塩もまた、例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインおよび同類などの有機塩基に由来し得る。製剤後に、溶液は、剤形（dosage formulation）と適合する様式でかつ治療上有効であるような量で投与されるであろう。製剤は、種々の剤形、例えば注射用の溶液、薬物放出カプセル、および同類によって容易に投与される。
担体は、いずれかおよび全ての溶媒、分散媒、基剤、コーティング、希釈剤、抗細菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイド、および同類を包含する。医薬活性物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は当分野において周知である。補助的な活性成分もまた組成物に組み込まれ得る。
リポソーム、ナノカプセル、マイクロ粒子、マイクロスフェア、脂質粒子、ベシクル、および同類などの送達基剤が、好適なホスト細胞への本開示の組成物の導入のために用いられ得る。特に、OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）のいずれか、操作された蛋白質のいずれか、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子のいずれか、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体のいずれか、操作された細胞、ならびに／あるいは組み換えウイルスのいずれか（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフェア、もしくはナノ粒子、または同類に内包され得る。いくつかの態様では、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）のいずれか、操作された蛋白質のいずれか、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子のいずれか、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体のいずれか、操作された細胞、ならびに／あるいは組み換えウイルスのいずれか（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフェア、もしくはナノ粒子、または同類に内包され得る。誘導因子（例えば、誘導因子をコードする核酸もしくは誘導因子をコードする蛋白質、および／または誘導因子をコードする組み換えウイルス）および／または誘導因子の活性を調節することができる化学的因子は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフェア、もしくはナノ粒子、または同類に内包され得る。
いくつかの態様では、送達基剤はカーゴを標的化する。例えば、本願に記載される核酸、操作された蛋白質、化学的因子、抗体、および／または組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、カーゴをある種の組織または細胞型に送達するナノ粒子によって送達され得る。例えばガラクトースポリマーによってコーティングされたナノ粒子は、それらの内因性のベータガラクトシダーゼ活性の結果として、それらのカーゴを老化細胞内において放出することが公知である。例えばLozano－Torres et al., J Am Chem Soc. 2017 Jul 5;139(26):8808－8811を参照のこと。
いくつかの態様では、核酸、操作された蛋白質、化学的因子、抗体、および／または組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、ポリ（グリコアミドアミン）ブラシナノ粒子によって製剤される。例えばDong et al., Nano Lett. 2016 Feb 10;16(2):842－8を参照のこと。
いくつかの態様では、核酸、操作された蛋白質、化学的因子、抗体、および／または組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、脂質ナノ粒子によって製剤される。例えばCullis and Hope Mol Ther. 2017 Jul 5;25(7):1467－1475を参照のこと。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、プラスミドを直接的に細胞質に送達する1つ以上の膜融合蛋白質を含むか、あるいは因子OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせが、ナノ粒子内包ありまたはなしで直接的に標的化蛋白質に融合され得る。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子はFusogenix脂質ナノ粒子である。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は「ラップドリポソーム」（WL）である。例えばYamauchi et al., Biochim Biophys Acta. 2006 Jan;1758(1):90－7を参照のこと。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、PEG化リポソーム（例えば、DOXIL（商標））（例えば、Allen & Hansen, Biochim Biophys Acta. 1991 Jul 1;1066(1):29－36）、1,2－ジオレオイル－sn－グリセロール－3ホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、中性ヘルパー脂質ホスファチジルエタノールアミン（PE）、またはそれらの組み合わせである（例えば、Farhood et al., Biochim Biophys Acta. 1995 May 4;l235(2):289－95；Zhou & Huang, Biochim Biophys Acta. 1994 Jan 19;1 189(2): 195－203）。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子または融合蛋白質は、高分子の細胞内送達のためにウイルスによって使用される方法をミミックするための分子または蛋白質を含む／使用する（例えば、Kobayashi et al., Bioconjug Chem. 2009 May 20;20(5):953－9）。例えば、種々のpH感受性ペプチド、例えば水泡口炎ウイルス蛋白質（VSVG）、ファージコート蛋白質および／またはshGALA、および／または融合関連小膜貫通（FAST）蛋白質、例えば鳥類レオウイルス（ARV）、ネルソンベイレオウイルス（NBV）およびヒヒレオウイルス（BBV）、アクアレオウイルスレオウイルス（AQV）および爬虫類レオウイルス（RRV）、および／またはBombesin標的化ペプチドを用いる。例えば、Peisajovich et al., Eur J Biochem. 2002 Sep;269(l7):4342－50；Sakurai et al., 2011を参照のこと。Nesbitt, Targeted Intracellular Therapeutic Delivery Using Liposomes Formulated with Multifunctional FAST Proteins, Western University Thesis, 2012. https://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=14&ved=2ahUKEwiX－YW5puzfAhXGTd8KHUmCAT0QFjANegQIAhAB&url=http％3A％2F％2Fir.lib.uwo.ca％2Fcgi％2Fviewcontent.cgi％3Farticle％3D1571％26context％3Detd&usg=AOvVaw3A20aOefHfJIJSZRR_－kPDをもまた参照のこと。
いくつかの態様では、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせをコードする核酸（例えば、RNAまたはDNA。プラスミドを包含する）がFusogenix脂質ナノ粒子に内包される。いくつかの態様では、誘導因子（例えば、rtTAまたはtTA）をコードする核酸はFusogenix脂質ナノ粒子に内包される。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子はウイルス膜蛋白質を含む。特定の理論によって拘束されることなしに、それはウイルス膜融合蛋白質ではない膜融合蛋白質を含むので、脂質ナノ粒子は無毒であり得る。膜融合蛋白質の限定しない例は、U.S.特許No.7,851,595、U.S.特許No.8,252,901、国際出願公開No.WO2012/040825、および国際出願公開No.WO2002/044206において開示されている膜融合蛋白質を包含する。
いくつかの態様では、本開示の組成物（例えば、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせをコードする核酸を含む）は非ウイルス的に送達される。核酸の非ウイルス的送達の方法は、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック法、ウイロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質核酸コンジュゲート、裸の核酸（例えば、RNAまたはDNA）、人工的なビリオン、および核酸（例えば、RNAまたはDNA）の薬剤によって強化された取り込みを包含する。
いくつかの態様では、カチオン性脂質が核酸を送達するために用いられる。カチオン性脂質は、生理的なpHにおいてカチオン性のまたは正の電荷を有する脂質である。カチオン性脂質は、リポソームまたはミセルを包含するがこれらに限定されない種々の形態を取り得る。本開示のある種の側面に有用なカチオン性脂質は当分野において公知であり、一般的には、極性および非極性ドメイン両方を含み、核酸分子または負に超荷電した蛋白質などのポリアニオンに結合し、典型的には、細胞内への核酸の送達を容易化することが公知である。有用なカチオン性脂質の例は、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン（PAMAM）スターバーストデンドリマー、Lipofectin（DOTMAおよびDOPEの組み合わせ。例えばU.S.Pat.No.5,049,386、4,946,787；および4,897,355を参照のこと）、Lipofectase、LIPOFECTAMINE（登録商標）（例えば、LIPOFECTAMINE（登録商標）2000、LIPOFECTAMINE（登録商標）3000、LIPOFECTAMINE（登録商標）RNAiMAX、LIPOFECTAMINE（登録商標）LTX）、SAINT－RED（Synvolux Therapeutics、フローニンゲン、オランダ）、DOPE、Cytofectin（Gilead Sciences、フォスターシティ、Calif.）、およびEufectin（JBL、サンルイスオビスポ、Calif.）を包含する。例示的なカチオン性リポソームは、N－[1－(2,3－ジオレオロキシ)－プロピル]－N,N,N－トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、N－[1－(2,3－ジオレオロキシ)－プロピル]－N,N,N－トリメチルアンモニウムメチルスルファート（DOTAP）、3β－[N－(N',N'－ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール（DC－Chol）、2,3,－ジオレイルオキシ－N－[2(スペルミンカルボキサミド)エチル]－N,N－ジメチル－1－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（DOSPA）、1,2－ジミリスチルオキシプロピル－3－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド；およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）から作られ得る。カチオン性脂質は当分野において核酸分子を細胞に送達するために用いられている（例えばU.S.Pat.No.5,855,910；5,851,548；5,830,430；5,780,053；5,767,099；8,569,256；8,691,750；8,748,667；8,758,810；8,759,104；8,771,728；Lewis et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3176；Hope et al. 1998. Molecular Membrane Biology 15:1を参照のこと）。
加えて、他の脂質組成物もまた当分野において公知であり、例えば、U.S.Pat.No.4,235,871；U.S.Pat.No.4,501,728；U.S.Pat.No.4,837,028；U.S.Pat.No.4,737,323において教示されているものを包含する。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適であるカチオン性および中性脂質は、Feigner, WO91/17424；WO91/16024のものを包含する。送達は細胞（例えば、インビトロまたはエクスビボ投与）または標的組織（例えば、インビボ投与）にであり得る。
免疫脂質複合体などの標的化されたリポソームを包含する脂質核酸複合体の調製は当業者に周知である（例えば、Crystal, Science 270:404－410 (1995)；Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291－297 (1995)；Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382－389 (1994)；Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647－654 (1994)；Gao et al., Gene Therapy 2:710－722 (1995)；Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817－4820 (1992)；U.S.Pat.No.4,186,183、4,217,344, 4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028、および4,946,787を参照のこと）。
ポリマーに基づく送達系もまた核酸を送達するために用いられ得る。ポリエチレンイミン（PEI）、キトサン、ポリ（DL－ラクチド）（PLA）およびポリ（DL－ラクチド－co－グリコシド）（PLGA）、デンドリマー（dedrimer）、ならびにポリメタクリレートを包含するポリマーが用いられ得る。例えばYang et al., Macromol Biosci. 2012 Dec;12(12):1600－14；Ramamoorth et al., J Clin Diagn Res. 2015 Jan; 9(1): GE01－GE06を参照のこと。限定しない例として、カチオン性ポリマーが用いられ得る。カチオン性ポリマーは正味の正電荷を有するポリマーである。カチオン性ポリマーは当分野において周知であり、Samal et al., Cationic polymers and their therapeutic potential. Chem Soc Rev. 2012 Nov 7;41(21):7147－94；公開U.S.特許出願U.S.2014/0141487A1、U.S.2014/0141094A1、U.S.2014/0044793A1、U.S.2014/0018404A1、U.S.2014/0005269A1、およびU.S.2013/0344117A1；ならびにU.S.Pat.No.8,709,466；8,728,526；8,759,103；および8,790,664に記載されているものを包含する；それぞれの内容全体は参照によって本願に組み込まれる。例示的なカチオン性ポリマーは、ポリアリルアミン（PAH）；ポリエチレンイミン（PEI）；ポリ（L－リジン）（PLL）；ポリ（L－アルギニン）（PLA）；ポリビニルアミンホモまたはコポリマー；ポリ（ビニルベンジル－トリ－C1－C4－アルキルアンモニウム塩）；脂肪族またはアリール脂肪族ジハロゲン化物および脂肪族N,N,N',N'－テトラ－C1－C4－アルキル－アルキレンジアミンのポリマー；ポリ（ビニルピリジン）またはポリ（ビニルピリジニウム塩）；ポリ（N,N－ジアリル－N,N－ジ－C1－C4－アルキル－アンモニウムハロゲン化物）；第四級化ジ－C1－C4－アルキル－アミノエチルアクリレートまたはメタクリレートのホモまたはコポリマー；POLYQUAD（商標）；ポリアミノアミド；ならびに同類を包含するが、これらに限定されない。
かかる製剤は、本願において開示される核酸、操作された蛋白質、化学的因子、抗体、および／または組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかの薬学的に許容される製剤の導入にとって好ましくあり得る。リポソームの形成および使用は一般的に当業者に公知である。最近、改善された血清中安定性および循環中半減期（half－time）を有するリポソームが開発された（U.S.Pat.No.5,741,516）。さらに、あり得る薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の種々の方法が記載されている（U.S.Pat.No.5,567,434；5,552,157；5,565,213；5,738,868；および5,795,587）。
リポソームは、他の手続きによるトランスフェクションに対して正常では抵抗性であるいくつもの細胞型に首尾良く用いられている。加えて、リポソームはウイルスに基づく送達系に典型的であるDNA長の制約から自由である。リポソームは、遺伝子、薬物、放射線療法薬、ウイルス、転写因子、およびアロステリックエフェクターを種々の培養細胞株および動物に導入するために有効に用いられている。加えて、リポソームによって媒介される薬物送達の有効性を調べるいくつかの首尾良い治験が完了している。
リポソームはリン脂質から形成される。これらは水系媒体中に分散され、自然発生的に同心のマルチラメラ二重層ベシクルを形成する（マルチラメラベシクル（MLV）ともまた称される。MLVは一般的に25nmから4μmの直径を有する。MLVのソニケーションは、コアに水溶液を含有する200から500.ANG.の範囲の直径を有する小さいユニラメラベシクル（SUV）の形成をもたらす。
代替的には、組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のナノカプセル製剤が用いられ得る。一般的に、ナノカプセルは安定なかつ再現性あるやり方で物質をトラップし得る。細胞内のポリマーオーバーローディングを原因とする副作用を回避するために、（大体0.1μmのサイズの）かかる超微粒子はインビボで分解されることができるポリマーを用いて設計されるべきである。これらの要求を満たす生分解性ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子が使用を企図される。
キットおよび関連する組成物
本願に記載される核酸、操作された蛋白質、化学的因子、抗体、および／または組み換えウイルスのいずれかは、いくつかの態様では、治療、診断、または研究適用におけるそれらの使用を容易化するための医薬または診断または研究キットへとアセンブリされ得る。キットは本開示のコンポーネントを収容する1つ以上の容器および使用説明書を包含し得る。具体的には、かかるキットは、本願に記載される1つ以上の薬剤を、これらの薬剤の意図される適用および適切な使用を記載する説明書と併せて包含し得る。ある種の態様では、キット中の薬剤は、特定の適用および薬剤の投与方法にとって好適な医薬製剤および用量であり得る。研究目的のためのキットは、種々の実験を実行することにとって適当な濃度または数量でコンポーネントを含有し得る。
いくつかの態様では、本開示は、組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）および／または操作された細胞を生ずるためのキットに関し、キットは、OCT4、KLF4、SOX2、もしくはそれらの組み合わせをコードする操作された核酸（例えば、操作された核酸）、および／またはホスト細胞を収容する容器を含む。いくつかの態様では、キットは、さらに、組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）を生ずるための説明書および／または操作された細胞を生ずるための説明書を含む。いくつかの態様では、キットは、さらに、組み換えAAVベクターを収容する少なくとも１つの容器を含み、組み換えAAVベクターはトランスジーン（例えば、角膜疾患などの眼疾患に関連する遺伝子）を含む。
いくつかの態様では、本開示は、本願に記載される操作された核酸（例えば、発現ベクター）、化学的因子、抗体、操作された細胞、または組み換えウイルスのいずれかを収容する容器を含むキットに関する。例えば、KLF4、SOX2、OCT4、またはそれらの組み合わせをコードする発現ベクターまたは組み換えウイルスは、配列番号16、配列番号105、または配列番号121と少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％）同一である配列を含み得る。いくつかの態様では、KLF4、SOX2、OCT4、またはそれらの組み合わせをコードする発現ベクターまたは組み換えウイルスは配列番号16、配列番号105、または配列番号121を含む。いくつかの態様では、これらの3つの転写因子をコードする発現ベクターは配列番号16、配列番号105、または配列番号121からなる。キットは、さらに、誘導因子をコードする発現ベクターまたは組み換えウイルスを含み得る。いくつかの態様では、誘導因子をコードする発現ベクターは配列番号17、配列番号31、または配列番号32を含む。いくつかの態様では、誘導因子をコードする発現ベクターは配列番号17、配列番号31、または配列番号32からなる。例えば、MUTANT REVERSE TETRACYCLINE TRANSACTIVATORS FOR EXPRESSION OF GENESと題するU.S.仮出願No.62/738,894を参照のこと。これは2018年9月28日に代理人整理番号H0824.70300US00で出願されており、その全体は参照によって本願に組み込まれる。
キットは、研究者による本願に記載される方法の使用を容易化するように設計され得、多くの形態を取り得る。キットの組成物のそれぞれは、適用可能なところでは、液体形態（例えば溶液）または固体形態（例えば乾燥粉末）で提供され得る。ある種のケースでは、組成物のいくつかは、（例えば、活性形態へと）水戻し可能または別様に加工可能であり得る。例えば、キットによって提供され得るかまたはされずにあり得る好適な溶媒または他の種（例えば、水または細胞培養培地）の追加による。本願において用いられる「説明書」は、説明書および／または販促のコンポーネントを定義し得、典型的には、本開示のパッケージング上にあるかまたはそれに随伴する説明書きが関わり得る。説明書は、説明書がキットに関連するはずであるということをユーザが明瞭に認識するようないずれかの様式、例えば、オーディオビジュアル（例えば、ビデオテープ、DVDなど）、インターネット、および／またはウェブに基づく通信などによって提供されるいずれかの口述のまたは電子的な説明書をもまた包含し得る。説明書きは、医薬品または生物学的産物の製造、使用、または販売を規制する政府当局によって定められた形態であり得、これらの説明書は動物投与についての製造、使用、または販売の当局による認可をもまた反映し得る。
キットは、本願に記載されるコンポーネントのいずれか1つ以上を1つ以上の容器内に含有し得る。例として、1つの態様では、キットは、キットの1つ以上のコンポーネントを混合することおよび／またはサンプルを単離および混合することならびに対象に適用することについての説明書を包含し得る。キットは本願に記載される薬剤を収容する容器を包含し得る。薬剤は液体、ゲル、または固体（粉末）の形態であり得る。薬剤は無菌的に調製され、シリンジとしてパッケージングされ、冷凍出荷され得る。代替的には、それは保管のためのバイアルまたは他の容器内に収容され得る。第2の容器が無菌調製された他の薬剤を含み得る。代替的には、キットは、シリンジ、バイアル、チューブ、または他の容器内の予め混合および出荷される活性薬剤を包含し得る。特に、特定の体細胞動物モデルを生ずるためのキットのケースでは、キットは、シリンジ、外用デバイス、またはivチューブ針およびバッグなどの、薬剤を動物に投与するために要求されるコンポーネントの1つ以上または全てを有し得る。
キットは、付属品がパウチ、1つ以上のチューブ、容器、箱、またはバッグ内にゆるくパックされた、ブリスターパウチ、収縮包装パウチ、真空密封型パウチ、密封型熱成形トレー、または類似のパウチもしくはトレー形態などの種々の形態を有し得る。キットは付属品が追加された後に滅菌され得、それによって、容器内の個々の付属品が別様に開封されることを許す。キットは、放射線滅菌、熱滅菌、または当分野において公知の他の滅菌方法などのいずれかの適当な滅菌技術を用いて滅菌され得る。キットは、特定の適用に依存して、他のコンポーネント、例えば、容器、細胞培地、塩、緩衝液、試薬、シリンジ、針、殺菌剤を適用または除去するためのガーゼなどのファブリック、使い捨て手袋、投与に先立つエージェントのサポートなどをもまた包含し得る。
キットに包含される説明書には、細胞内の潜在AAVを検出するための方法が関わり得る。加えて、本開示のキットは、説明書、負のおよび／または正のコントロール、容器、サンプルのための希釈剤および緩衝液、サンプル調製チューブ、ならびに配列比較のための参照AAV配列の印刷されたまたは電子的な表を包含し得る。
治療適用
本願に記載されるOCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された細胞、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、細胞リプログラミングを制御すること（例えば、誘導することまたは誘導および停止すること）、組織修復、組織再生、臓器再生、加齢を逆行させること、疾患を処置すること、またはそれらのいずれかの組み合わせのために用いられ得る。本願に記載されるOCT4、KLF4、およびSOX2から選択される転写因子の組み合わせ（例えば、OCT4およびKLF4、OCT4およびSOX2、SOX2およびKLF4、またはKLF4、OCT4、およびSOX2）の発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）、操作された細胞、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、およびSOX2から選択される転写因子の組み合わせ（例えば、OCT4およびKLF4、OCT4およびSOX2、SOX2およびKLF4、またはKLF4、OCT4、およびSOX2）を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、およびSOX2から選択される転写因子の組み合わせ（例えば、OCT4およびKLF4、OCT4およびSOX2、SOX2およびKLF4、またはKLF4、OCT4、およびSOX2）を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、細胞リプログラミングを制御すること（例えば、誘導することまたは誘導および停止すること）、組織修復、組織再生、臓器再生、加齢を逆行させること、疾患を処置すること、またはそれらのいずれかの組み合わせのために用いられ得る。いくつかの態様では、OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）のいずれか、操作された細胞のいずれか、操作された蛋白質のいずれか、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子のいずれか、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体のいずれか、ならびに／あるいは組み換えウイルスのいずれか（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）は、細胞リプログラミング、組織修復、組織生存、組織再生、組織成長、組織機能、臓器再生、臓器生存、臓器機能、またはそれらのいずれかの組み合わせを制御することに有用であり得（任意に、制御することは、細胞リプログラミングを誘導すること、加齢を逆行させること、組織機能を改善すること、臓器機能、組織修復、組織生存、組織再生、組織成長、血管新生、瘢痕形成、加齢の外見、臓器再生、臓器生存を改善すること、動物に由来する農産物の味および品質を変改すること、疾患を処置すること、またはそれらのいずれかの組み合わせを、インビボでまたはインビトロで含む）、インビボ（例えば、対象の一部）である細胞、組織、もしくは臓器に投与され得るか、またはエクスビボで細胞、組織、もしくは臓器に投与され得る。いくつかの態様では、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）のいずれか、操作された細胞のいずれか、操作された蛋白質のいずれか、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子のいずれか、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体のいずれか、ならびに／あるいは組み換えウイルスのいずれか（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）は、細胞リプログラミング、組織修復、組織生存、組織再生、組織成長、組織機能、臓器再生、臓器生存、臓器機能、またはそれらのいずれかの組み合わせを制御することに有用であり得（任意に、制御することは、細胞リプログラミングを誘導すること、加齢を逆行させること、組織機能を改善すること、臓器機能、組織修復、組織生存、組織再生、組織成長、血管新生、瘢痕形成、加齢の外見、臓器再生、臓器生存を改善すること、動物に由来する農産物の味および品質を変改すること、疾患を処置すること、またはそれらのいずれかの組み合わせを、インビボでまたはインビトロで含む）、インビボ（例えば、対象の一部）である細胞、組織、もしくは臓器に投与され得るか、またはエクスビボで細胞、組織、もしくは臓器に投与され得る。本願において用いられる制御することは、調節のいずれかの型を言い得、誘導することまたは促進すること、阻害すること、および／または停止することを包含する。血管新生は毛細血管を包含する新たな血管の成長を言う。
いくつかの場合には、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはAAVベクター）は、組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、またはAAV）によって投与される。特定の理論によって拘束されることなしに、OCT4、SOX2、およびKLF4の一過的発現は細胞の部分的なリプログラミングをもたらし得る。例えば、部分的なリプログラミングは、完全に分化した細胞が若返りかつ多能性を獲得することを誘導し得る。いくつかの態様では、OCT4、SOX2、および／またはKLF4の一過的発現は幹細胞マーカー（例えばNanog）の発現を誘導しない。
いくつかの態様では、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらの組み合わせの一過的発現は幹細胞マーカー（例えばNanog）の発現を誘導しない。いずれかの特定の理論によって拘束されることなしに、Nanog活性化はテラトーマを誘導し得、ホストの死亡を引き起こし得る。いくつかの態様では、方法はテラトーマ形成を誘導しない。いくつかの態様では、方法は不要の細胞増殖を誘導しない。いくつかの態様では、方法は悪性の細胞成長を誘導しない。いくつかの態様では、方法は癌を誘導しない。いくつかの態様では、方法は緑内障を誘導しない。いくつかの態様では、一過的発現は最高でも1時間、5時間、24時間、2日、3日、4日、5日、または1週である。いくつかの場合には、OCT4、SOX2、およびKLF4の遷延した発現（例えば、少なくとも5日、少なくとも1週、または少なくとも1ヶ月に渡る継続的発現）は、細胞の完全なリプログラミングをもたらす。例えば、細胞は多能性細胞（例えば、人工多能性細胞）へと完全にリプログラミングされ得る。いくつかの場合には、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらの組み合わせの遷延した発現（例えば、少なくとも5日、少なくとも1週、または少なくとも1ヶ月に渡る継続的発現）は、細胞の完全なリプログラミングをもたらす。例えば、細胞は多能性細胞（例えば、人工多能性細胞）へと完全にリプログラミングされ得る。
特定の理論によって拘束されることなしに、OCT4、SOX2、およびKLF4は部分的なリプログラミングを誘導するので、OCT4、SOX2、およびKLF4の発現は、細胞リプログラミングを促進し得るか、組織再生を促進し得るか、臓器再生を促進し得るか、加齢を逆行させ得るか、疾患を処置し得るか、またはそれらのいずれかの組み合わせである。本願において用いられる細胞の部分的なまたは不完全なリプログラミングは、幹細胞ではないが若々しい性質を有する細胞を言う。いくつかの態様では、若々しい性質は、若い細胞に類似であるエピゲノムである。いくつかの態様では、幹細胞は幹細胞ではない細胞と比較して高いレベルのNanog発現を示す。いくつかの態様では、若々しい性質は、細胞アイデンティティを変化させることなしの細胞の若返りを言う。例えば、ヒストンおよびChaf（クロマチンアセンブリ因子）遺伝子の発現が、若いマウスからのものと比較して加齢したマウス（12ヶ月または15ヶ月）からの耳線維芽細胞においては加齢の間に衰えるという図16に示されている、短期のOSKM（3日）またはOSK発現（5日）誘導は、細胞を幹細胞にすることなしにそれらの遺伝子発現レベルを若い状態にリセットし得る（例えば、Nanog発現はこれらの細胞においては誘導されない）ということを参照のこと。
この態様を行うために、有効量のOCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、細胞、組織、臓器、および／または対象に投与される。いくつかの態様では、有効量のOCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、細胞、組織、臓器、および／または対象に投与される。操作された細胞がいずれかの組織、臓器、および／または対象に投与され得る。発現ベクターが誘導性プロモーター（例えば、TRE3G、TRE2、またはPtightを包含するTREプロモーター）を含むときには、誘導因子もまた細胞に導入され得る（例えば、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする1つ以上の核酸（例えば、操作された核酸）と同時にまたは続けて）。1つの態様では、OCT4、SOX2、およびKLF4は、誘導因子をコードする発現ベクターとは別個である1つの発現ベクターによってコードされる。いくつかの場合には、誘導因子は、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする同じ発現ベクターによってコードされる。
いくつかの場合には、誘導因子（例えば、誘導因子をコードする核酸、誘導因子をコードする操作された蛋白質、または誘導因子をコードするウイルス）および／または誘導因子の活性を調節する（例えば、活性化または阻害する）ことができる化学的因子（例えば、テトラサイクリン）もまた、細胞、組織、臓器、および／または対象に導入される。ある種の態様では、細胞、組織、対象、および／または臓器は、誘導因子の活性を調節することができる化学的因子（例えば、ドキシサイクリンを包含するテトラサイクリン）の存在または不在下においてさらに培養される。Tet－On系では、誘導因子はrtTA（例えば、rtTA3またはrtTA4）であり得、誘導因子はテトラサイクリンの存在下においてOCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を促進する。Tet－Off系では、誘導因子はtTAであり得、誘導因子はテトラサイクリンの不在下においてOCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を促進する。
本願に記載される転写因子をコードする発現ベクターと、いくつかのケースでは誘導因子（例えば、誘導因子をコードする核酸（例えば、操作された核酸）、または蛋白質としての誘導因子）および／または誘導因子の活性を調節することができる化学的因子との投与は、発現のための好適な条件下において、トランスジーンの発現を少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、少なくとも500％、少なくとも500％、少なくとも600％、少なくとも700％、少なくとも800％、少なくとも900％、または少なくとも1,000％だけ細胞において増大させ得る。遺伝子発現は、酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）、ウエスタンブロット、およびRNAの定量（例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）を包含する慣例的な方法によって決定され得る。
いくつかの態様では、OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、本願に記載される操作された蛋白質、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは本願に記載される組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、単独でまたは組み合わせで、組織、細胞、または臓器にエクスビボで（例えば、対象内においてではなく）導入され得、組織、細胞、および／または臓器はさらにエクスビボで培養され得る。いくつかの態様では、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、本願に記載される操作された蛋白質、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは本願に記載される組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、単独でまたは組み合わせで、組織、細胞、または臓器にエクスビボで（例えば、対象内においてではなく）導入され得、組織、細胞、および／または臓器はさらにエクスビボで培養され得る。いくつかの場合には、誘導因子および／または誘導因子の活性を調節することができる化学的因子が組織、細胞、および／または臓器にエクスビボで導入され、組織、細胞、および／または臓器はさらにエクスビボで培養され得る。いくつかの態様では、操作された細胞が培養されて操作された組織を生ずる。いくつかの態様では、操作された細胞が培養されて操作された臓器を生ずる。いくつかの態様では、操作された組織が培養されて操作された臓器を生ずる。これらの方法は、操作された（例えば、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸）細胞、操作された（例えば、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸）組織、または臓器（例えば、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸）を、対象への移植のために生ずることに有用であり得る。いくつかの態様では、操作された細胞、組織、および／または臓器は対象に移植される。
いくつかの態様では、操作されるべき細胞、組織、臓器、またはそれらのいずれかの組み合わせは対象にとって自家であり、例えばその必要がある対象から得られる。自家細胞、自家組織、自家臓器、またはそれらのいずれかの組み合わせの投与は、非自家細胞、非自家組織、および／または非自家臓器の投与と比較して、細胞、組織、臓器、またはそれらのいずれかの組み合わせの縮減された拒絶をもたらし得る。代替的には、操作されるべき細胞、組織、または臓器は同種細胞、同種組織、または同種臓器であり得る。例えば、同種細胞、同種組織、同種臓器、またはそれらのいずれかの組み合わせはドナー（例えば、特定の種から）に由来し得、ドナーとは異なるレシピエント（例えば、同じ種から）に投与され得る。いくつかの態様では、同種細胞、同種組織、同種臓器、またはそれらのいずれかの組み合わせは特定の種からのドナー対象に由来し得、ドナーとは異なる種からのレシピエント対象に投与され得る。
いくつかの態様では、操作された細胞はナイーブ型iPSCを包含する幹細胞（iPSC）であり、これは3つの胚葉に分化し得る。いくつかの態様では、iPSCはさらに別の細胞型に分化させられる（例えば、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸）。iPSCは当分野において公知の方法を用いてさらに分化させられ得る（例えばエクスビボで）。
いくつかの態様では、操作された細胞は1つよりも多くの細胞型を含む（例えば、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸）。
限定しない例として、OCT4、KLF4、およびSOX2をコードする操作された核酸（例えば、裸の核酸、または送達基剤によって製剤された核酸。ウイルスベクターおよび／またはナノ粒子を包含する）のいずれかは、細胞（例えば、分化した細胞）に送達されて、人工多能性幹細胞を生じ得る。いくつかの態様では、人工多能性幹細胞はさらに分化させられる（例えば、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸細胞に分化させられる）。いくつかの態様では、細胞がエクスビボで操作され、その必要がある対象に投与される。いくつかの態様では、臓器または組織がiPSCを用いてインビトロで再生され得、臓器または組織は個体に移植される。
限定しない例として、本願に記載される方法は、操作された皮膚、操作された肝臓、操作された眼、操作された肝臓、いずれかの操作された細胞、いずれかの操作された臓器、またはいずれかの操作された組織をエクスビボで生ずるために用いられ得る。操作された臓器、操作された組織、操作された臓器、またはそれらのいずれかの組み合わせは対象に投与され得る。いくつかの態様では、操作された細胞、操作された組織、操作された臓器、またはそれらの組み合わせの投与は、対象の生存を改善する（例えば、操作された細胞、組織、または臓器を受けないことに対して相対的に対象のライフスパンを増大させる）。
本願に記載される医薬組成物はその必要がある対象に投与され得る。対象の限定しない例はいずれかの動物を包含する（例えば、ヒトを包含する哺乳動物）。対象は状態を有することを疑われ得るか、そのリスクがあり得るか、またはそれを有し得る。例えば、状態は傷害または疾患であり得、状態はいずれかの組織を冒し得る（例えば、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸）。状態、疾患、および障害の限定しない例は、急性傷害、神経変性疾患、慢性疾患、増殖性疾患、心血管疾患、遺伝子疾患、炎症性疾患、自己免疫（autoimmunue）疾患、神経学的疾患、血液学的疾患、有痛状態、精神障害、代謝障害、癌、加齢、加齢性疾患、および対象のいずれかの組織を冒す疾患を包含する。いくつかの態様では、疾患は眼疾患である。
ある種の態様では、OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、本願に記載される操作された蛋白質、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは本願に記載される組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、単独でまたは組み合わせで、疾患の発症に先立つ対象に導入され得る（例えば、疾患を防止するために、または細胞、組織、もしくは臓器のダメージを防止するために）。ある種の態様では、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、本願に記載される操作された蛋白質、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは本願に記載される組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、単独でまたは組み合わせで、疾患の発症に先立つ対象に導入され得る（例えば、疾患を防止するために、または細胞、組織、もしくは臓器のダメージを防止するために）。ある種の態様では、誘導因子および／または誘導因子の活性を調節することができる化学的因子は、疾患の発症に先立つ対象に導入され得る。いくつかの態様では、対象は健康な対象であり得る。ある種の態様では、OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、本願に記載される操作された蛋白質、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは本願に記載される組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、単独でまたは組み合わせで、疾患の発症後の対象に導入され得る（例えば、疾患に関連するダメージまたは症状を軽減するために）。ある種の態様では、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現の発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）、本願に記載される操作された蛋白質、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは本願に記載される組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、単独でまたは組み合わせで、疾患の発症後の対象に導入され得る（例えば、疾患に関連するダメージまたは症状を軽減するために）。いくつかの態様では、OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現は疾患の発症に先立って誘導される。いくつかの態様では、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現は疾患の発症に先立って誘導される。いくつかの態様では、OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現は疾患の発症後に誘導される。いくつかの態様では、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現は、疾患の発症後に誘導される。いくつかの態様では、OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現は、若い対象、若い細胞、若い組織、および／または若い臓器において誘導される。いくつかの態様では、OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現は、加齢した対象、加齢した細胞、加齢した組織、および／または加齢した臓器において誘導される。いくつかの態様では、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現は、若い対象、若い細胞、若い組織、および／または若い臓器において誘導される。いくつかの態様では、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現は、加齢した対象、加齢した細胞、加齢した組織、および／または加齢した臓器において誘導される。ある種の態様では、誘導因子および／または誘導因子の活性を調節することができる化学的因子が、疾患の発症後の対象に導入され得る。
ある種の態様では、組織は、健康だが、現在のまたは将来の条件における（例えば、疾患処置、有毒な治療、日光暴露、または地球の大気圏外の旅行を包含する農業または有害条件における）性能または生存にとって最適ではないと考慮され得る。
ある種の態様では、状態は加齢である。全ての動物は、典型的には、成長および成熟の期間、次に漸進的かつ不可逆的な生理学的衰えの期間を通過し、死亡で終わる。誕生から死亡までの時間の長さは生物のライフスパンとして公知であり、各生物は特徴的な平均ライフスパンを有する。加齢は、平均ライフスパンのパーセントによって測定される時間経過の裏にある変化の身体的顕れである。
いくつかのケースでは、加齢の性質は極めて自明であり得る。例えば、より老いたヒトの性質は、皮膚のシワ、白髪化、禿頭症、および白内障、ならびにハイパーメラノーシス、骨粗鬆症、大脳皮質萎縮、リンパ枯渇、胸腺萎縮、糖尿病II型の増大した発生率、アテローム性動脈硬化、癌、および心臓病を包含する。Nehlin et al. (2000), Annals NY Acad Sci 980: 176－79。哺乳類加齢の他の側面は、体重損失、前後彎増強（脊柱後弯症）、精力の不在、リンパ萎縮、減少した骨密度、皮膚肥厚、および皮下脂肪組織、ストレス（熱または低温、創傷、感覚脱失、および造血前駆細胞除去を包含する）を忍容する減少した能力、肝臓病理、腸絨毛の萎縮、皮膚潰瘍化、アミロイド沈着、および関節疾患を包含する。Tyner et al. (2002), Nature 415:45－53。
当業者は、加齢プロセスが細胞レベルにおいておよびミトコンドリアにおいてもまた顕れるということを認識するであろう。細胞加齢は、倍化能力の損失、アポトーシスの増大したレベル、分化した表現型の変化、および代謝の変化、例えば蛋白質合成およびターンオーバーの減少したレベルに顕れる。
細胞および生物の加齢のプログラミングされた性格からして、加齢と相関する表現型上の性質という手段によって細胞または生物の「生物学的年齢」を評価することが可能である。例えば、生物学的年齢は、遺伝子発現のパターン、ストレス（例えば、酸化または遺伝毒性ストレス）に対する抵抗性、細胞増殖の速度、および細胞の代謝的な性質（例えば、蛋白質合成およびターンオーバーの速度、ミトコンドリア機能、ユビキノン生合成、コレステロール生合成、細胞内のATPレベル、細胞内のクレブス回路中間体のレベル、グルコース代謝、核酸（例えば、操作された核酸）代謝、リボソーム翻訳速度など）から演繹され得る。本願において用いられる「生物学的年齢」は、細胞または生物の分子的性質に基づく細胞または生物の年齢の尺度である。生物学的年齢は、日、月、および年によって測定される細胞または生物の年齢を言う「時間的年齢」とは別である。
生物、例えば無脊椎動物（例えば、線虫またはハエ）または脊椎動物（例えば齧歯類、例えばマウス）の加齢の速度は種々の方法によって決定され得る。例えば：a）細胞または生物のライフスパンを査定すること；（b）生物学的年齢依存的な発現パターンを有する細胞または生物の遺伝子転写物または遺伝子産物の存在または存在量を査定すること；（c）ストレス、例えば遺伝毒性ストレス（例えば、エトポシド、UV照射、変異原に対する暴露など）または酸化ストレスに対する細胞または生物の抵抗性を評価すること；（d）細胞または生物の1つ以上の代謝パラメータを評価すること；（e）生物に存在する細胞または細胞のセットの増殖能力を評価すること；および（f）細胞または生物の身体的外見または挙動を評価することの1つ以上による。1つの例では、加齢の速度を評価することは、動物の群（例えば、遺伝学的にマッチした動物の群）の平均ライフスパンを直接的に測定することと、もたらされる平均を動物のコントロール群（例えば、試験化合物を受けなかったが、試験化合物を実際に受けた動物の群と遺伝学的にマッチした動物の群）の平均ライフスパンと比較することとを包含する。代替的には、生物の加齢の速度は加齢性パラメータを測定することによって決定され得る。加齢性パラメータの例は：外見、例えば年齢の可視的徴候；1つ以上の遺伝子または蛋白質（例えば、加齢性の発現パターンを有する遺伝子または蛋白質）の発現；酸化ストレスに対する抵抗性；代謝パラメータ（例えば、蛋白質合成または分解、ユビキノン生合成、コレステロール生合成、ATPレベル、グルコース代謝、核酸（例えば、操作された核酸）代謝、リボソーム翻訳速度など）；および細胞増殖（例えば、網膜細胞、骨細胞、白血球などの）を包含する。
加齢は、バイオマーカーの変化率によってもまた決定され得る（例えば、ゲノム上のCpGアイランドのDNAメチル化レベルを包含するエピジェネティックなマーク（「Horvath時計」として公知）、細胞の中のベータガラクトシダーゼ陽性細胞、遺伝子発現変化、または血流中の分子の存在量のある種の変化）。例は、血液バイオマーカーに基づいて「体内年齢（InnerAge）」を決定するSegterra Inc.からのアルゴリズムである（InsideTracker.comを参照のこと）。
本願の例に示されている通り、OCT4、KLF4、およびSOX2をコードする組み換えウイルス（例えばAAV）は軸索の再生を促進した。これは、多くの場合に加齢に関連する神経変性を防止または軽減するために用いられ得る。方法は関連する神経変性および末梢ニューロパチーを防止または軽減するために用いられ得る。神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋萎縮性（amniotropic）筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ハンチントン病、および筋ジストロフィーを包含する。神経変性は当分野において公知のいずれかの方法を用いて定量され得る。例えば、個体の実行機能が決定され得る（Moreira et al., Front Aging Neurosci. 2017 Nov 9;9:369）。
いくつかの態様では、本願に記載されるOCT4、SOX2、KFF4、またはそれらの組み合わせの発現、誘導、または活性化は、コントロールに対して相対的に、組織、臓器、または対象の神経あたりの軸索数を増大させる。いくつかの態様では、本願に記載される方法は、神経あたりの軸索数を、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、または少なくとも100倍だけ、コントロールに対して相対的に増大させる。いくつかの態様では、コントロールは、OCT4、SOX2、KFF4、またはそれらの組み合わせの発現、誘導、または活性化に先立つ組織、臓器、または対象の神経あたりの軸索数である。
処置され得る追加の加齢性状態は、心不全、脳卒中、糖尿病、肝臓疾患、線維性疾患、骨粗鬆症、関節炎、難聴（部分的または全聾）、眼に関連する状態（例えば、眼のかすみ、網膜疾患、いずれかの眼疾患（例えば、眼を冒すいずれかの状態））、緑内障、筋肉疾患（例えば、サルコペニアおよび筋ジストロフィー）、フレイル、早老症候群（例えば、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群）、および癌を包含する。ある種の態様では、疾患は網膜疾患である（例えば黄斑変性）。
いくつかの態様では、ニューロンにおけるOCT4、SOX2、KLF4、またはそれらの組み合わせの発現、誘導、または活性化は、ニューロンの神経突起面積を、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、または少なくとも100倍だけ、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらの組み合わせの発現、誘導、または活性化なしのニューロンに対して相対的に増大させる。
いくつかの態様では、本願に記載されるOCT4、SOX2、KLF4、またはそれらの組み合わせの発現、誘導、または活性化は、組織、臓器、または対象の軸索密度をコントロールに対して相対的に増大させる。いくつかの態様では、本願に記載される方法は、軸索密度を、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、または少なくとも100倍だけ、コントロールに対して相対的に増大させる。いくつかの態様では、コントロールは、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらの組み合わせの発現、誘導、または活性化に先立つ組織、臓器、または対象の軸索密度である。
いくつかの態様では、対象におけるOCT4、SOX2、KLF4、またはそれらの組み合わせの発現、誘導、または活性化は、対象の視力をコントロールに対して相対的に増大させる。いくつかの態様では、本願に記載される方法は、対象の視力を、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、または少なくとも100倍だけ、コントロールに対して相対的に増大させる。いくつかの態様では、コントロールは、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらの組み合わせの発現、誘導、または活性化に先立つ対象の視力である。いくつかの態様では、視力は視運動視力によって測定される。いくつかの態様では、視力はパターン網膜電図応答を用いて測定される。いくつかの態様（emboidments）では、視力は距離視力検査を用いて測定され、これはスネレン視標またはEチャートの使用を包含し得る。例えばMarsden et al., Community Eye Health. 2014; 27(85): 16および下の実施例を参照のこと。
いくつかの態様では、対象におけるOCT4、SOX2、KLF4、またはそれらの組み合わせの発現、誘導、または活性化は、対象の眼圧をコントロールに対して相対的に減少させる。いくつかの態様では、本願に記載される方法は、対象の眼圧を、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、または少なくとも100倍だけ、コントロールに対して相対的に減少させる。いくつかの態様では、コントロールは、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらの組み合わせの発現、誘導、または活性化に先立つ対象の眼圧である。例えば下の実施例を参照のこと。
いくつかの態様では、本願に記載されるOCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された細胞、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、本願に記載される疾患のいずれかを処置および／または防止するために用いられ得る。いくつかの態様では、誘導因子および／または誘導因子の活性を調節することができる化学的因子もまた用いられる。
限定しない例として、本開示の操作された細胞は、その必要がある対象の機能異常の細胞を置換するために用いられ得る。別の限定しない例として、OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、OCT4、KLF4、およびSOX2から選択される少なくとも2つの（例えば、少なくとも3つの）転写因子の組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、およびSOX2から選択される少なくとも2つの（例えば、少なくとも3つの）転写因子の組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、OCT4、KLF4、およびSOX2から選択される少なくとも2つの（例えば、少なくとも3つの）転写因子の組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、インビボまたはインビトロの細胞を（例えば、不完全にまたは完全に）リプログラミングするために用いられ得る。いくつかの態様では、誘導因子および／または誘導因子の活性を調節することができる化学的因子もまた用いられる。例えば、OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、操作された細胞（例えば、人工多能性幹細胞）を生ずるために用いられ得る。例えば、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、操作された細胞（例えば、人工多能性幹細胞）を生ずるために用いられ得る。それから、操作された細胞（例えば、人工多能性幹細胞）はその必要がある対象に投与され得る。いくつかの態様では、操作された細胞は、誘導因子および／または誘導因子の活性を調節することができる化学的因子の存在下において培養される。いくつかの態様では、誘導因子および／または誘導因子の活性を調節することができる化学的因子もまた対象に投与される。
OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、OCT4、KLF4、およびSOX2から選択される少なくとも2つの（例えば、少なくとも3つの）転写因子の組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、およびSOX2から選択される少なくとも2つの（例えば、少なくとも3つの）転写因子の組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、操作された細胞、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、OCT4、KLF4、およびSOX2から選択される少なくとも2つの（例えば、少なくとも3つの）転写因子の組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）の限定しない使用は、創傷治癒、出血、傷害、骨折、銃創、切創、手術（例えば、帝王切開）の間の瘢痕化を包含する。いくつかの態様では、誘導因子および／または誘導因子の活性を調節することができる化学的因子もまた用いられる。
いくつかの態様では、OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、OCT4、KLF4、およびSOX2から選択される少なくとも2つの（例えば、少なくとも3つの）転写因子の組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された細胞、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、およびSOX2から選択される少なくとも2つの（例えば、少なくとも3つの）転写因子の組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、OCT4、KLF4、およびSOX2から選択される少なくとも2つの（例えば、少なくとも3つの）転写因子の組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかが、非ヒト対象を冒す疾患（例えば、家畜、家庭内ペット、および／または他の非ヒト動物を冒す疾患）を処置するために用いられる。いくつかの態様では、誘導因子および／または誘導因子の活性を調節することができる化学的因子もまた用いられる。例えば、疾患は、牛の疾患、霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザル）の疾患、商業的に該当する動物、例えば牛、豚、ウマ、羊、ヤギ、ネコ、および／またはイヌ）を冒す疾患、および／または鳥（例えば、商業的に該当する鳥、例えばニワトリ、カモ、ガチョウ、および／または七面鳥）を冒す疾患であり得る。
いくつかの態様では、本願に記載されるOCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、OCT4、KLF4、およびSOX2から選択される少なくとも2つの（例えば、少なくとも3つの）転写因子の組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された細胞、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、およびSOX2から選択される少なくとも2つの（例えば、少なくとも3つの）転写因子の組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、OCT4、KLF4、およびSOX2から選択される少なくとも2つの（例えば、少なくとも3つの）転写因子の組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、創傷治癒を（例えば切創について）促進する、傷害（例えば、骨折、出血、射撃の傷害、および／または手術の間の瘢痕化を縮減する）を処置するために用いられる。いくつかの態様では、手術は帝王切開を包含する。いくつかの態様では、誘導因子および／または誘導因子の活性を調節することができる化学的因子もまた用いられる。
いくつかの態様では、本願に記載されるOCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、OCT4、KLF4、およびSOX2から選択される少なくとも2つの（例えば、少なくとも3つの）転写因子の組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された細胞、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、およびSOX2から選択される少なくとも2つの（例えば、少なくとも3つの）転写因子の組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、OCT4、KLF4、およびSOX2から選択される少なくとも2つの（例えば、少なくとも3つの）転写因子の組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、傷害および／または炎症を治癒させることに有用である。いくつかの態様では、誘導因子および／または誘導因子の活性を調節することができる化学的因子もまた用いられる。いくつかの態様では、炎症は過剰炎症であり、これは加齢の副作用であり得る。いくつかの態様では、過剰炎症はインフラメージングである。
いくつかの態様では、本願に記載されるOCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された細胞、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、および／またはSOX2を活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、治癒能力を提供する。
いくつかの態様では、本願に記載されるOCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された細胞、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、治癒能力を提供する。
いくつかの態様では、本願に記載されるOCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された細胞、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、最適なまたは最適ではない臓器を強化することまたは若返らせることに有用である。限定しない例として、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせをコードする本願に記載される組成物（例えば、組み換えAAVウイルスを包含する組み換えウイルス）のいずれかは、移植に用いられる最適ではない臓器（例えば、より老いた個体からの）を強化もしくは若返らせることに、または輸送中の臓器生存を促進するために、または対象への臓器の再埋植後の臓器生存を促進するために有用であり得る。
本願に記載されるOCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された細胞、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、移植に用いられる細胞（例えば、造血幹細胞、T細胞など）を若返らせるかまたはその生存および寿命を増大させるために用いられ得る。いくつかの態様では、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせをコードする組み換えウイルス（例えばAAVウイルス）は、移植に用いられる細胞（例えば、造血幹細胞、T細胞など）を若返らせることまたはその生存および寿命を増大させることに有用である。
いくつかの態様では、本願に記載されるOCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された細胞、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、対象の毒素および／または薬物（例えば化学療法）の副作用を防止または緩和するために用いられる。副作用の限定しない例は脱毛および末梢ニューロパチーを包含する。化学療法はビンクリスチン（VCS）を包含する。例えば例15を参照のこと。ある種の態様では、SOX2、KLF4、OCT4、またはそれらの組み合わせをコードする組み換えウイルス（例えば、AAVウイルス）を含む組成物は、毒素および／またはダメージを与える薬物治療（例えば、VCSを包含する化学療法薬物）によって誘導される副作用を処置（例えば、それから回復させる）または防止するために投与される。
いくつかの態様では、本願に記載されるOCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された細胞、操作された蛋白質、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、毒素および／または薬物（例えば化学療法）の副作用を防止または緩和するために対象に投与される。
いくつかの態様では、本願に記載されるOCT4、KLF4、SOX2、またはそれらの組み合わせの発現を誘導することができる核酸（例えば、操作された核酸）（例えば、発現ベクター）、操作された細胞、操作された蛋白質、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）化学的因子、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせを活性化する（例えば、その発現を誘導する）抗体、ならびに／あるいは組み換えウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはAAV）のいずれかは、対象の組織、臓器、および／または体全体を放射線から保護する（例えば、放射線のダメージを与える効果を防止する）ために対象に投与される。ある種の態様では、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせをコードするAAVが、対象の組織、臓器、および／または体全体を放射線から保護する（例えば、放射線のダメージを与える効果を防止する）ために対象に投与される。
状態を有することを疑われる対象を同定するための方法は、身体検査、対象の家族の医学的既往、対象の医学的既往、バイオプシー、遺伝子検査、病原体もしくはマイクロバイオームのDNAシーケンシング、プロテオミクス、またはいくつものイメージングテクノロジー、例えば超音波検査、コンピュータ断層撮影、磁気共鳴イメージング、磁気共鳴分光法、もしくは陽電子放出断層撮影を包含し得る。
操作された核酸（例えば発現ベクター。ウイルスベクターを包含する）、ウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、もしくはAAV）、またはそれらの組成物の有効量は、当業者によって認識される通り、投与経路、賦形剤の使い方、および他の活性薬剤との併用に依存して変わる。投与されるべき数量は、例えば対象の年齢、状態の重大さ、対象の重量、標的化されるべき対象、細胞、組織、もしくは臓器の遺伝学、またはそれらのいずれかの組み合わせを包含する処置されるべき対象に依存する。
本開示の1つ以上の転写因子（例えば、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせ）の発現は、細胞のリプログラミング、組織修復、組織再生、血流増大、臓器再生、改善された免疫、加齢の逆行、老化対抗、またはそれらのいずれかの組み合わせをもたらし得る。細胞リプログラミングは細胞の分化の程度を決定することによって決定され得る（例えば、OCT4、KLF4、SOX2、NANOG、ESRRB、NR4A2、およびC/EBPαを包含する1つ以上の系譜マーカーまたは多能性マーカーの発現を決定することによる）。細胞の分化ポテンシャルもまた慣例的な分化アッセイまたは遺伝子発現パターンを用いて決定され得る。組織修復は組織置換および組織再生アッセイによって決定され得る。例えば、組織置換アッセイは細胞培養またはマウスにおける創傷治癒アッセイを包含する。組織再生は、OCT4、KLF4、およびSOX2の発現前と比較して、1つ以上の転写因子の発現後の特定の細胞型を定量することによって決定され得る（例えば、下で提供される実施例を参照のこと）。組織再生は、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現前と比較して、1つ以上の転写因子の発現後の特定の細胞型を定量することによって決定され得る。いくつかの場合には、本願に記載される方法は臓器再生を促進する（例えば、肝臓再生、または肝臓線維化の逆行、および再成長）。いくつかの場合には、本願に記載される方法は組織および細胞生存を促進する。有害事象およびダメージに直面した細胞生存は、当分野において標準的である細胞生存性のアッセイ（例えば、Promega corp.からのnano－glo生細胞アッセイによって神経生存を試験すること）を用いて決定され得る。いくつかの場合には、本願に記載される方法は軸索またはワーラー変性を防止し得る。これは、神経細胞培養を用いてインビトロでまたは当業者に公知のラットおよびマウス神経挫滅モデルにおいて神経挫滅後の軸索変性率を定量することによって決定され得る。
いくつかの態様では、本願に記載される方法はテラトーマ形成を誘導しない。いくつかの態様では、対象、組織、または臓器におけるOCT4、SOX2、KLF4、もしくはそれらの組み合わせの発現またはOCT4、SOX2、KLF4、もしくはそれらの組み合わせの活性化は、対象、組織、または臓器におけるOCT4、SOX2、KLF4、もしくはそれらの組み合わせおよびc－MYCの発現またはOCT4、SOX2、KLF4、もしくはそれらの組み合わせおよびc－MYCの活性化と比較して、テラトーマ形成の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも100％の縮減をもたらす。いくつかの態様では、対象、組織、または臓器におけるOCT4、SOX2、およびKLF4の発現またはOCT4、SOX2、およびKLF4の活性化は、対象、組織、または臓器におけるOCT4、SOX2、およびKLF4、およびc－MYCの発現またはOCT4、SOX2、KLF4、およびc－MYCの活性化と比較して、テラトーマ形成の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも100％の縮減をもたらす。いくつかの態様では、対象、組織、または臓器におけるテラトーマの数またはテラトーマのサイズは、対象、組織、または臓器におけるOCT4、SOX2、KLF4、もしくはそれらの組み合わせの発現またはOCT4、SOX2、KLF4、もしくはそれらの組み合わせの活性化後に、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらの組み合わせの活性化または発現に先立つ対象、組織、または臓器におけるテラトーマの数またはテラトーマのサイズと比較して、同じであるかまたは縮減される。
いくつかの態様では、本願に記載される方法は不要の増殖を誘導しない。いくつかの態様では、不要の細胞増殖は異状な細胞増殖であり、これは良性または癌性であり得る。いくつかの態様では、対象、組織、または臓器におけるOCT4、SOX2、KLF4、もしくはそれらの組み合わせの発現またはOCT4、SOX2、KLF4、もしくはそれらの組み合わせの活性化は、対象、組織、または臓器における不要の細胞増殖を、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも100％だけ、c－Myc発現または活性化ありの同じ方法と比較して縮減する。いくつかの態様では、対象、組織、または臓器における不要の細胞増殖は、対象、組織、または臓器におけるOCT4、SOX2、KLF4、もしくはそれらの組み合わせの発現またはOCT4、SOX2、KLF4、もしくはそれらの組み合わせの活性化後に、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらの組み合わせの活性化または発現に先立つ対象、組織、または臓器の不要の細胞増殖の量と比較して、同じであるかまたは縮減される。
いくつかの態様では、本願に記載される方法は腫瘍形成または腫瘍成長を誘導しない。いくつかの態様では、対象、組織、または臓器におけるOCT4、SOX2、KLF4、もしくはそれらの組み合わせの発現またはOCT4、SOX2、KLF4、もしくはそれらの組み合わせの活性化は、対象、組織、または臓器における腫瘍の数または腫瘍のサイズを、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも100％だけ、c－Myc発現または活性化ありの同じ方法と比較して縮減する。いくつかの態様では、対象、組織、または臓器における腫瘍の数または腫瘍のサイズは、対象、組織、または臓器におけるOCT4、SOX2、KLF4、もしくはそれらの組み合わせの発現またはOCT4、SOX2、KLF4、もしくはそれらの組み合わせの活性化後に、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらの組み合わせの活性化または発現に先立つ対象、組織、または臓器の腫瘍の数または腫瘍のサイズと比較して、同じであるかまたは縮減される。いくつかの態様では、本願に記載される方法は癌を誘導しない。いくつかの態様では、本願に記載される方法は緑内障を誘導しない。
リプログラミングの方法もまた本願において提供される。いくつかの態様では、本願に記載されるリプログラミングの方法は、細胞、組織、臓器、または対象のエピジェネティックな時計を逆行させることまたは若返らせることを含む。いくつかの態様では、エピジェネティックな時計は部分的にまたは完全に逆行させられ得る。いくつかの態様では、細胞、組織、臓器、または対象のエピジェネティックな時計はDNAメチル化に基づく年齢（DNAmAGEまたはDNAm年齢）を用いて測定される。いくつかの態様では、本願に記載される方法は、細胞のDNAmAge年齢を1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または100％だけ縮減する。
いくつかの態様では、本願に記載されるリプログラミングの方法は、加齢に関連する1つ以上の遺伝子の発現を変改することを含む。いくつかの態様では、遺伝子の発現は、少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも100％だけ増大する。いくつかの態様では、遺伝子の発現は、少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも100％だけ縮減される。いくつかの態様では、方法の実施後の1つ以上の遺伝子の発現が、方法の実施に先立つ1つ以上の遺伝子の発現に対して相対的に決定される。いくつかの態様では、1つ以上の遺伝子の発現は、若い細胞、若い対象、若い組織、若い臓器、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける1つ以上の遺伝子の発現に対して相対的に決定される。いくつかの態様では、1つ以上の遺伝子の発現は、老いた細胞、老いた対象、老いた組織、老いた臓器、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける1つ以上の遺伝子の発現に対して相対的に決定される。
加齢に関連する遺伝子は、その発現が、若いカウンターパートと比較して、老いたもの、老いた組織、老いた臓器、老いた対象、またはそれらのいずれかの組み合わせにおいて変改されている遺伝子であり得る。いくつかの態様では、加齢に関連する遺伝子は、1700031P21Rik、1810053B23Rik、2900045020Rik、2900060B14Rik、4921504E06Rik、4930402F11Rik、4930453C13Rik、4930455B14Rik、4930500H12Rik、4930549P19Rik、4930555B11Rik、4930556J02Rik、4932442E05Rik、4933431K23Rik、4933438K21Rik、6720475M21Rik、9830132P13Rik、A430010J10Rik、A530064D06Rik、A530065N20Rik、Abcb5、Abhd17c、AC116759.2、AC131705.1、AC166779.3、Acotl2、Adig、Akrlc1、Ankrd1、Asb15、Atp2c2、AU018091、AW822073、Btn11O、C130093G08Rik、C730027H18Rik、Ccdc162、Chi16、Col26a1、Corin、Crls1、Cybrd1、Cyp2d12、Cyp7a1、D830005E20Rik、Dlx3、Dnah14、Dsc3、Dthd1、Eid2、Eps811、EU599041、Fam90ala、Fancf、Fau－ps2、Fezf1、Gja5、Gm10248、Gm10513、Gm10635、Gm10638、Gm10718、Gm10722、Gm10800、Gm10801、Gm11228、Gm11251、Gm11264、Gm11337、Gm11368、Gm11485、Gm11693、Gm12793、Gm13050、Gm13066、Gm13323、Gm13339、Gm13346、Gm13857、Gm14387、Gm14770、Gm15638、Gm16072、Gm16161、Gm16181、Gm17200、Gm1779l、Gm18025、Gm18757、Gm18795、Gm18848、Gm19719、Gm20121、Gm20356、Gm2093、Gm2l738、Gm2l940、Gm22933、Gm24000、Gm24119、Gm25394、Gm26555、Gm27047、Gm28262、Gm28530、Gm29295、Gm29825、Gm29844、Gm3081、Gm32051、Gm32l22、Gm33056、Gm33680、Gm34354、Gm34643、Gm3551、Gm36660、Gm36948、Gm37052、Gm37142、Gm37262、Gm37535、Gm37569、Gm37589、Gm37647、Gm37648、Gm37762、Gm38058、Gm38069、Gm38137、Gm38218、Gm39139、Gm42535、Gm42680、Gm42895、Gm42994、Gm43027、Gm43158、Gm43288、Gm43366、Gm44044、Gm44081、Gm44187、Gm44280、Gm44535、Gm45338、Gm45644、Gm45740、Gm46555、Gm46565、Gm4742、Gm47485、Gm47853、Gm47992、Gm48225、Gm48314、Gm48383、Gm48673、Gm48804、Gm48832、Gm4994、Gm5487、Gm5724、Gm595、Gm6012、Gm6024、Gm7669、Gm7730、Gm8043、Gm8953、Gm9348、Gm9369、Gm9495、H2a12a、Ido2、Igfbp1、Kif7、Klhl31、Lrrc31、Mc5r、Mgam、Msh4、Mucl2、Mug1、Myb12、Myh15、Nek1O、Neurod6、Nr1h5、Olfr1042、Olfr1043、Olfr1082、Olfr1090、Olfr1124、Olfr1167、Olfr1205、Olfr1206、Olfr1223、Olfr1263、Olfr1264、Olfr1269、Olfr127、0lfr1291－ps1、Olfr1406、Olfr1469、Olfr215、Olfr273、Olfr328、Olfr355、Olfr372、Olfr390、Olfr427、Olfr456、Olfr466、Olfr481、Olfr522、Olfr6、Olfr601、Olfr603、Olfr706、Olfr727、Olfr728、Olfr741、Olfr801、Olfr8l2、Olfr8l6、Olfr822、Olfr860、Olfr890、Olfr923、Olfr943、Otog1、Pi15、Pkhd1、Pkhd111、Platr6、Pou3f4、Prr9、Pvalb、Rhag、Savl、Serpinb9b、Skint1、Skint3、Skint5、Slc10a5、Slc6a4、Smok2a、Tcaf3、Tomm201、Trcgl、Trdn、Ugt1a6a、Usp171a、Vmnlr178、Vmn1r179、Vmn1r33、Vmn1r74、Vmn1r87、Vmn2rl02、Vmn2r113、Vmn2r17、Vmn2r52、Vmn2r66、Vmn2r68、Vmn2r76、Vmn2r78、Wnt16、0610040J0lRik、1700080N15Rik、2900064F13Rik、4833417C18Rik、4921522P10Rik、4930447C04Rik、4930488N15Rik、Ace、Ackr1、Acot1O、Acvr1、Adamts17、Adra1b、AI504432、Best3、Boc、Cadm3、Cand2、Cc19、Cd14、Cd36、Cfh、Chrm3、Chrna4、Cntn4、Cracr2b、Cryaa、CT573017.2、Cyp26a1、Cyp27a1、D330050G23Rik、D930007P13Rik、Ddo、Dgkg、Dlk2、Dnaja1－ps、Drd2、Dse1、Dytn、Ecscr、Edn1、Ednrb、Efemp1、Elfn2、Epha1O、Ephx1、Erbb4、Fam20a、Fbxw21、Ffar4、Flt4、Fmod、Foxp4、Fzd7、Gabrd、Galnt15、Galnt18、Gfra2、Ggt1、Gm10416、Gm14964、Gm17634、Gm2065、Gm32352、Gm33172、Gm34280、Gm35853、Gm36298、Gm36356、Gm36937、Gm3898、Gm42303、Gm42484、Gm42537、Gm42743、Gm43151、Gm43843、Gm44545、Gm44722、Gm45516、Gm45532、Gm47494、Gm47982、Gm47989、Gm48398、Gm48495、Gm48593、Gm48958、Gm49089、Gm49326、Gm49331、Gm49760、Gm5796、Gm6374、Gm7276、Gm8237、Gm9796、Gm9954、Gpr75、Gprc5c、Grid2ip、Gsg112、Hapln4、Hcn3、Hcn4、Hhat1、Hs6st2、Htr3a、Illrap、Illrap12、Inka1、Kbtbd12、Kcnj11、Kcnk4、Kdelc2、Klhl33、Lamc3、Lilra5、Lmanll、Lrfn2、Lrrc38、Lrrn4cl、Ltc4s、Manscl、Mir344c、Msr1、Mycbpap、Myoc、Ngfr、Nipa12、Olfr1372－ps1、Otop3、P2rx5、P2ry12、P4ha2、Pcdha12、Pcdha2、Pcdhac2、Pcdhb18、Pcdhb5、Pcsk2os1、Pcsk6、Perp、Pkp1、Plxna4、Prickle2、Qsox1、Rapgef4os2、Rbp4、Rcn3、Sec1415、Sel113、Serpinh1、Sgpp2、Shisa6、Siah3、Siglech、Slc12a4、Slc24a2、Slc2a5、Slc4a4、Slitrk3、Smagp、Smoc2、Speer4b、Spon2、Sstr2、Sstr3、St3ga13、Stc1、Stc2、Syndig1、Syt1O、Thsd7a、Tlr8、Tmem132a、Tmem132d、Tmem200a、Tmem44、Trpc4、Trpv4、Unc5b、Vgf、Vmnlr90、Vwc21、Wfikkn2、Wnt11、Wnt6、Zeb2os、Zfp608、Zfp976、またはそれらのいずれかの組み合わせである。いくつかの態様では、遺伝子は感覚遺伝子である。
いくつかの態様では、本願に記載される方法は、0610040J0lRik、1700080N15Rik、2900064F13Rik、4833417C18Rik、4921522P10Rik、4930447C04Rik、4930488N15Rik、Ace、Ackr1、Acot1O、Acvr1、Adamts17、Adra1b、AI504432、Best3、Boc、Cadm3、Cand2、Cc19、Cd14、Cd36、Cfh、Chrm3、Chrna4、Cntn4、Cracr2b、Cryaa、CT573017.2、Cyp26a1、Cyp27a1、D330050G23Rik、D930007P13Rik、Ddo、Dgkg、Dlk2、Dnaja1－ps、Drd2、Dse1、Dytn、Ecscr、Edn1、Ednrb、Efemp1、Elfn2、Epha1O、Ephx1、Erbb4、Fam20a、Fbxw21、Ffar4、Flt4、Fmod、Foxp4、Fzd7、Gabrd、Galnt15、Galnt18、Gfra2、Ggt1、Gm10416、Gm14964、Gm17634、Gm2065、Gm32352、Gm33172、Gm34280、Gm35853、Gm36298、Gm36356、Gm36937、Gm3898、Gm42303、Gm42484、Gm42537、Gm42743、Gm43151、Gm43843、Gm44545、Gm44722、Gm45516、Gm45532、Gm47494、Gm47982、Gm47989、Gm48398、Gm48495、Gm48593、Gm48958、Gm49089、Gm49326、Gm49331、Gm49760、Gm5796、Gm6374、Gm7276、Gm8237、Gm9796、Gm9954、Gpr75、Gprc5c、Grid2ip、Gsg112、Hapln4、Hcn3、Hcn4、Hhat1、Hs6st2、Htr3a、Illrap、Illrap12、Inka1、Kbtbd12、Kcnj11、Kcnk4、Kdelc2、Klhl33、Lamc3、Lilra5、Lmanll、Lrfn2、Lrrc38、Lrrn4cl、Ltc4s、Manscl、Mir344c、Msr1、Mycbpap、Myoc、Ngfr、Nipa12、Olfr1372－ps1、Otop3、P2rx5、P2ry12、P4ha2、Pcdha12、Pcdha2、Pcdhac2、Pcdhb18、Pcdhb5、Pcsk2os1、Pcsk6、Perp、Pkp1、Plxna4、Prickle2、Qsox1、Rapgef4os2、Rbp4、Rcn3、Sec1415、Sel113、Serpinh1、Sgpp2、Shisa6、Siah3、Siglech、Slc12a4、Slc24a2、Slc2a5、Slc4a4、Slitrk3、Smagp、Smoc2、Speer4b、Spon2、Sstr2、Sstr3、St3ga13、Stc1、Stc2、Syndig1、Syt1O、Thsd7a、Tlr8、Tmem132a、Tmem132d、Tmem200a、Tmem44、Trpc4、Trpv4、Unc5b、Vgf、Vmnlr90、Vwc21、Wfikkn2、Wnt11、Wnt6、Zeb2os、Zfp608、Zfp976、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を縮減する。加齢に関連する遺伝子については例えば表5を参照のこと。
いくつかの態様では、本願に記載される方法は、1700031P21Rik、1810053B23Rik、2900045020Rik、2900060B14Rik、4921504E06Rik、4930402F11Rik、4930453C13Rik、4930455B14Rik、4930500H12Rik、4930549P19Rik、4930555B11Rik、4930556J02Rik、4932442E05Rik、4933431K23Rik、4933438K21Rik、6720475M21Rik、9830132P13Rik、A430010J10Rik、A530064D06Rik、A530065N20Rik、Abcb5、Abhd17c、AC116759.2、AC131705.1、AC166779.3、Acotl2、Adig、Akrlc1、Ankrd1、Asb15、Atp2c2、AU018091、AW822073、Btn11O、C130093G08Rik、C730027H18Rik、Ccdc162、Chi16、Col26a1、Corin、Crls1、Cybrd1、Cyp2d12、Cyp7a1、D830005E20Rik、Dlx3、Dnah14、Dsc3、Dthd1、Eid2、Eps811、EU599041、Fam90ala、Fancf、Fau－ps2、Fezf1、Gja5、Gm10248、Gm10513、Gm10635、Gm10638、Gm10718、Gm10722、Gm10800、Gm10801、Gm11228、Gm11251、Gm11264、Gm11337、Gm11368、Gm11485、Gm11693、Gm12793、Gm13050、Gm13066、Gm13323、Gm13339、Gm13346、Gm13857、Gm14387、Gm14770、Gm15638、Gm16072、Gm16161、Gm16181、Gm17200、Gm1779l、Gm18025、Gm18757、Gm18795、Gm18848、Gm19719、Gm20121、Gm20356、Gm2093、Gm2l738、Gm2l940、Gm22933、Gm24000、Gm24119、Gm25394、Gm26555、Gm27047、Gm28262、Gm28530、Gm29295、Gm29825、Gm29844、Gm3081、Gm32051、Gm32l22、Gm33056、Gm33680、Gm34354、Gm34643、Gm3551、Gm36660、Gm36948、Gm37052、Gm37142、Gm37262、Gm37535、Gm37569、Gm37589、Gm37647、Gm37648、Gm37762、Gm38058、Gm38069、Gm38137、Gm38218、Gm39139、Gm42535、Gm42680、Gm42895、Gm42994、Gm43027、Gm43158、Gm43288、Gm43366、Gm44044、Gm44081、Gm44187、Gm44280、Gm44535、Gm45338、Gm45644、Gm45740、Gm46555、Gm46565、Gm4742、Gm47485、Gm47853、Gm47992、Gm48225、Gm48314、Gm48383、Gm48673、Gm48804、Gm48832、Gm4994、Gm5487、Gm5724、Gm595、Gm6012、Gm6024、Gm7669、Gm7730、Gm8043、Gm8953、Gm9348、Gm9369、Gm9495、H2a12a、Ido2、Igfbp1、Kif7、Klhl31、Lrrc31、Mc5r、Mgam、Msh4、Mucl2、Mug1、Myb12、Myh15、Nek1O、Neurod6、Nr1h5、Olfr1042、Olfr1043、Olfr1082、Olfr1090、Olfr1124、Olfr1167、Olfr1205、Olfr1206、Olfr1223、Olfr1263、Olfr1264、Olfr1269、Olfr127、0lfr1291－ps1、Olfr1406、Olfr1469、Olfr215、Olfr273、Olfr328、Olfr355、Olfr372、Olfr390、Olfr427、Olfr456、Olfr466、Olfr481、Olfr522、Olfr6、Olfr601、Olfr603、Olfr706、Olfr727、Olfr728、Olfr741、Olfr801、Olfr8l2、Olfr8l6、Olfr822、Olfr860、Olfr890、Olfr923、Olfr943、Otog1、Pi15、Pkhd1、Pkhd111、Platr6、Pou3f4、Prr9、Pvalb、Rhag、Savl、Serpinb9b、Skint1、Skint3、Skint5、Slc10a5、Slc6a4、Smok2a、Tcaf3、Tomm201、Trcgl、Trdn、Ugt1a6a、Usp171a、Vmnlr178、Vmn1r179、Vmn1r33、Vmn1r74、Vmn1r87、Vmn2rl02、Vmn2r113、Vmn2r17、Vmn2r52、Vmn2r66、Vmn2r68、Vmn2r76、Vmn2r78、Wnt16、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を増大させる。
本開示の側面は、老いた細胞、老いた臓器、老いた組織、および／またはそれらのいずれかの組み合わせの転写プロファイルをインビトロでリセットすることを含む方法に関する。本開示の側面は、老いた細胞、老いた臓器、老いた組織、老いた対象、および／またはそれらのいずれかの組み合わせの転写プロファイルをインビボでリセットすることを含む方法に関する。いくつかの態様では、老いた細胞、老いた臓器、老いた組織、老いた対象、および／またはそれらのいずれかの組み合わせの転写プロファイルをリセットすることは、加齢に関連する1つ以上の遺伝子の遺伝子発現を変改することを含む。いくつかの態様では、老いた細胞、老いた臓器、老いた組織、老いた対象、および／またはそれらのいずれかの組み合わせの転写プロファイルをリセットすることは、エピジェネティックな時計を逆行させることを含む。いくつかの態様では、老いた細胞の転写プロファイルはリセットされる。いくつかの態様では、老いた細胞、老いた臓器、老いた組織、老いた対象、またはそれらのいずれかの組み合わせの転写プロファイルは、若い細胞、若い組織、若い臓器、若い対象、またはそれらのいずれかの組み合わせのものにリセットされる。いくつかの態様では、本願に記載される方法は、老いた細胞、老いた臓器、老いた組織、老いた対象、またはそれらのいずれかの組み合わせとコントロールとの間において検出される遺伝子発現の1つ以上の変化を逆行させる。いくつかの態様では、コントロールは若い細胞、若い臓器、若い組織、若い対象、またはそれらのいずれかの組み合わせである。いくつかの態様では、老いた細胞、老いた臓器、老いた組織、老いた対象、またはそれらのいずれかの組み合わせの転写プロファイルは、若いカウンターパートから変化している。いくつかの態様では、本願に記載される方法は、老いた細胞、老いた臓器、老いた組織、老いた対象、またはそれらのいずれかの組み合わせにおいて、遺伝子発現変化の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または100％を、若いレベルにリセットする。いくつかの態様では、感覚遺伝子は感覚受容体遺伝子である。特定の理論によって拘束されることなしに、加齢した細胞の感覚（sensor）受容体遺伝子発現レベルを若いレベルにリセットすることは、網膜神経節細胞機能の改善を指示し得る。
いくつかの側面では、本願に記載される細胞リプログラミング方法は細胞の分化転換を促進するために用いられ得、これは疾患の処置に有用であり得る。いくつかの態様では、本願に記載される方法は分化転換の既存の方法の効率（efficieny）を改善し得る。例えば、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらの組み合わせが、1つの細胞型において、細胞運命に影響する遺伝子の1つ以上の撹乱と併せて活性化されて（例えば発現されて）、系譜リプログラミングまたは別の細胞型への変換を促進し得る。いくつかの態様では、撹乱は系譜決定因子の発現を縮減することである。いくつかの態様では、撹乱は系譜決定因子の発現である。いくつかの態様では、系譜決定因子は系譜転写因子である。
限定しない例として、夜盲症は桿体の死によって引き起こされ、昼盲症は錐体の死によって引き起こされる。錐体、桿体、およびミュラー細胞を包含する細胞型は、視覚を復元するために必要とされる別の細胞型へとリプログラミングされ得る。例えば、Nrlの損失は成体の桿体から錐体細胞への分化転換を促進する。例えばMontana et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Jan 29; 110(5): 1732－7を参照のこと。いくつかの態様では、桿体細胞運命を促進する転写因子はOtx2、Crx、およびNrlを包含する。限定しない例として、ミュラーグリア（MG）は、β－カテニン、Otx2、Crx、およびNrlを発現することによって桿体細胞へとリプログラミングされ得る。例えばYao et al., Nature. 2018 Aug;560(77l9):484－488を参照のこと。
別の限定しない例として、膵臓アルファは、自己免疫疾患および糖尿病を処置するためにベータ細胞へとリプログラミングされ得る。Pdx1およびMafAを包含する転写因子が、マウスアルファ細胞をベータ細胞へとリプログラミングするために用いられ得る。例えばXiao et al., Cell Stem Cell. 2018 Jan 4;22(l):78－90.e4を参照のこと。
種々の細胞型の生成のための分化転換誘導因子の追加の限定しない例は、Cieslar－Pobuda et al., Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 2017 Jul;1864(7):1359－1369に見出され得る。これはその全体が参照によって本願に組み込まれる。例えば、Cieslar－Pobuda et al., Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 2017 Jul;1864(7):1359－1369の表4を参照のこと。
OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらの組み合わせの誘導は、細胞の分化転換（trandifferentiation）の効率を、少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、少なくとも500％、少なくとも600％、少なくとも700％、少なくとも800％、少なくとも900％、または少なくとも1000％だけ、コントロールと比較して増大させ得、その間の全ての値を包含する。分化転換の効率は、いずれかの好適な方法によって測定され得る。OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらの組み合わせが活性化されなかったコントロール細胞と比較して、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらの組み合わせが活性化されたときの分化転換された細胞のパーセンテージを比較することを包含する。
本発明のこれらのおよび他の側面は次の実施例の考慮によってさらに了解されるであろう。これらは、本発明のある種の特定の態様を例解することを意図されるが、請求項によって定義されるその範囲を限定することを意図されない。
本開示がより完全に理解され得るために、次の例を提出する。本願に記載される合成のおよび生物学の例は本願において提供される化合物、医薬組成物、および方法を例解するために差し出されており、決してそれらの範囲を限定すると解釈されるべきではない。
例1：哺乳類細胞におけるOCT4、SOX2、およびKLF4（OSK）の誘導性発現のためのアデノウイルス随伴ウイルス（AAV）ベクターの開発．
OCT4、SOX2、およびKLF4を哺乳類細胞において発現することができるAAVベクターを、本願に記載される通り開発した。図1に示されている通り、かかるベクターは、TRE3Gプロモーター（配列番号7）、OCT4、SOX2、KLF4をコードする核酸（例えば、操作された核酸）、およびSV40ポリA（SV40pA）ターミネーター配列（配列番号8）を含む。このベクターはTRE3G－OSK－SV40pAと言う。自己切断ペプチド（T2A、2Aペプチド、配列番号9）をコードする核酸（例えば、操作された核酸）配列を用いて、OCT4、SOX2、およびKLF4をコードする核酸（例えば、操作された核酸）を分離した。図2に示されている通り、ベクター全体は長さが7,408塩基対であり、2つの末端逆向きリピート（ITR）がOSK配列をフランキングする。ベクター上の制限酵素消化部位が図3に図示されている。図4A～4ALのベクターマップに示されているフィーチャーをベクターの核酸（例えば、操作された核酸）配列上にマッピングする模式図が図2～3に示されている。制限酵素切断部位が下の表3に示されている。図5A～5Dに示されている通り、OSKをコードするオープンリーディングフレーム（ORFフレーム3）および介在する2Aペプチド（T2Aペプチド）は3,610塩基対である。
表3．TRE3G－OSK－SV40pAベクターの制限酵素切断部位
Figure 2022511373000004
図3および4A～4ALに示されているベクターを慣例的な方法を用いてクローニングした。手短には、ClonetechからのTRE3Gプロモーター配列（配列番号7）を、フランキングする制限部位を用いて合成し、OSKをTetO－FUW－OSKMプラスミドからクローニングするためのプライマーを設計し、停止コドンを追加した。ベクターをより短くするために、フランキングする制限切断部位によって短いSV40配列を合成した。OSKをコードする従来のAAVベクターはAAVのパッケージング限界を超えており、低い力価を有するAAV9カプシドへとパッケージングされ得るのみであり（ウイルスプレップあたり2×1012粒子未満）、図17に示されている通り、可能な短縮を原因として、低力価ウイルスは機能的ではない。一方、図3および4A～4ALに図示されているベクターは、プレップあたり2×1012ウイルス粒子（partial）またはmLあたり1×1013よりも多くを有するウイルスを生じた（データは示さない）。
OSKベクターが哺乳類細胞における誘導性OSK発現に用いられ得るかどうかを決定するために、OSKベクターを慣例的な方法を用いてAAVウイルスの異なる血清型（AAV9（図6A）、AAV2（図6B）、およびAAV.PhP.b（図6C））へとパッケージングした（and was）。rtTA3をコードするベクターを有するAAV9およびAAV.PHP.bウイルス（Tet－On系）ならびにtTAをコードするベクターを有するAAV2ウイルス（Tet－Off系）の追加のバッチを生じた。それから、哺乳類293T細胞をrtTA3またはtTAウイルスの同じ血清型と併せてOSKウイルスに重複感染させた。爾後に、細胞をドキシサイクリン（DOX）ありまたはなしで処置し、OCT4、KLF4、およびローディングコントロールH3の発現をOCT4、KLF4、およびH3に対する抗体によるウエスタンブロットによって決定した。
図6AのTet－On系によって示されている通り、ドキシサイクリン処置は、OSKおよびrtTA3をコードするAAV9ウイルスに感染した293T細胞におけるOCT4およびKLF4発現を増大させた。OSK発現はTet－Off系によってもまたコントロールされ得た。DOX処置は、OSK AAV2および恒常的CAGプロモーター下のtTA発現を駆動するベクターを有するAAV2に感染した293T細胞におけるOCT4およびKLF4発現を減少させた（図6B）。さらにその上、OSK発現はトランスジーン発現の刺激後であっても密にコントロールされ得た。図6Cの第4のレーンに示されている通り、1日のDOX処置は、TRE3G－OSK－SV40pA AAV.PHP.bウイルスおよびUbc－rTtA3－p2a－mkate AAV.PHP.bウイルスに感染した293T細胞におけるOCT4およびKLF4発現を増大させるために十分である。しかしながら、1日のDOX処置後の3日に渡るDOXの除去は、OCT4およびKLF4発現を未誘導のレベルに再度戻す（図6Cの最後のレーン）。Ubc－rtTA3－p2a－mkateベクターは、rtTA3、自己切断2Aペプチド、および遠赤色蛍光蛋白質（mKate）の発現を駆動する恒常的Ubcプロモーターを含む。
よって、哺乳類細胞における（例えばインビボの）OSKのコントロールされた発現を許すAAVベクターが開発された。さらにその上、AAVベクターは異なるAAV血清型へとパッケージングされ、これらは機能的なベクターを293T細胞に首尾良く送達した。
例2：OSKをコードするAAVは神経挫滅後の網膜神経節細胞（RGC）神経の視神経再生および生存を誘導性の様式で促進した．
OSKがAAVによって送達およびインビボで誘導的に発現され得るかどうかを決定するために、TRE－OSK－SV40ベクターを有するAAVウイルスおよびCAG恒常的プロモーター下のtTAをコードするAAVウイルスを慣例的な方法によって生じ、マウスの網膜に注射した。次に、光干渉断層撮影（OCT）切片を、網膜神経節細胞（RGC）を同定するためのRBPMSに対する抗体およびKLF4発現を検出するためのKLF4に対する抗体によって染色した。図7Aに示されている通り、KLF4はRGC（RBPMS陽性細胞）において発現されていた。これはベクターが機能的であるということを示唆した。
系の誘導性をインビボでもまた試験した。DOX処置の不在下では、OCT4およびKLF4は網膜ホールマウント染色によって決定される通りマウス網膜において発現された（図7B上）。しかしながら、4日のDOX処置後には、OCT4およびKLF4染色は有意に縮減されており、TRE－OSK－SV40ベクターからの発現がOffにされるということを指示した（図7B下側）。よって、OSKベクター発現は密にコントロールされ得た。
誘導性のOSK発現が神経ダメージ後に部分的なリプログラミングを誘導および再生を促進し得るかどうかを決定するために、TRE－OSK－SV40ベクターを有するAAVウイルスおよびCAG恒常的プロモーター下のtTAをコードするAAVウイルスを、図7Cに提供されている実験のタイムラインに示されている通り4週齢マウスの網膜に注射した（n=6）。コントロールとして、マウスの別個のコホート（n=2）にはOSKウイルスのみを注射した。ウイルス注射の2週後の両方のコホートにおいて、視神経挫滅によって、機械的ダメージを誘導した。視神経の蛍光顕微鏡法によって軸索再生をトレースするために、蛍光標識されたコレラ毒素βサブユニット（CTB）をマウスに眼内注射し、灌流をCTB注射の2日後に実施した。軸索再生および軸索生存分析を爾後に行った。
神経あたりの軸索数を推定することによって、軸索再生を決定した。図7Dに示されている通り、OSKおよびtTAウイルスの共投与は、OSKウイルス単独の投与と比較して、視神経挫滅部位から離れた視神経再生を有意に促進した。この効果は、OSKおよびtTAウイルス両方を受けたマウスからの視神経の蛍光強度をOSKウイルス単独を受けたマウスと比較したときにもまた視覚的に明らかであった。両方のウイルスを受けたマウスからの視神経の蛍光強度はOSKウイルス単独を受けたマウスのものよりも高く、神経再生が組み合わせ処置でより高いということを指示した（図7E～7F）。
挫滅傷害後の観察された軸索再生がOSKによって特異的に媒介されるということを示すために、軸索再生実験を行って、（1）DOX処置なしのTRE－OSKウイルス、（2）DOX処置なしのTRE－d2EGFPウイルス、および（3）DOX処置ありのTRE－OSKウイルスとの組み合わせで、tTAウイルスの効果を比較した。処置（1）～（3）の実験のタイムラインがそれぞれ図8B、8D、および8Fに指示されている。蛍光標識されたCTBを用いて軸索を視覚化した。図8Aおよび8Gに示されている通り、OSK発現が誘導されたマウス（DOXの不在下のOSKおよびtTAウイルスを受けたマウス）における視神経再生の程度は、挫滅部位から200μmおよび500μmにおいて非常に有意であった。対照的に、d2EGFP発現が誘導されたときであっても（DOXの不在下のd2EGFPおよびtTAウイルスを受けたマウス）、最小限の再生が観察された（図8Aおよび図8C）。とりわけ、軸索再生はOSK発現の誘導に依存的であった。マウスが図8Dに輪郭化されている通りOSK発現を阻害するためのDOXによって処置されたときには、tTAおよびOSKウイルスの投与は軸索再生を誘導しなかった（図8A）。これらのDOX処置されたマウスにおけるCTB標識された軸索の強度は、コントロールd2EGFPウイルスを受けたマウスに類似であった（図8Eを図8Cと比較せよ）。よって、AAVに基づく誘導性OSK発現系の投与は、視神経ダメージ後の再生を促進するために用いられ得る。
網膜神経節細胞（RGC）の生存率に対するOSKの効果をもまた査定した。図9A～9Dに示されている通り、OSKはRGC生存率を有意に増大させる。示されている視神経挫滅後のOSKおよびtTAウイルスに感染した（緑色）または両方に未感染の（赤色）RGC（RBPMS陽性細胞）では、OSK感染RGCは、OSK感染なしの細胞と比較して挫滅後における3倍高い生存率（54％対18％）、示されているような一連の像からの定量を有した（図9A）。よって、KLF4を発現するRBPMS陽性細胞（OSK感染細胞）のパーセンテージは挫滅前には40％よりも低かったが、そのより高い生存率を原因として、視神経挫滅後には大体70％まで有意に増大した。一方、d2EGFP感染細胞のパーセンテージは挫滅後に35～40％に維持された。これはOSK発現からの強い細胞保護効果を指示する（図9B）。図9Cに示されている通り、d2EGFPまたはOSKプラスCAG－tTA（配列番号32）AAV感染した網膜において、未挫滅では（without uncrushed）、RGC数（RBPMS陽性）の有意な差はないが、挫滅後には、それらがOSKおよびCAG－tTAに感染しているときには、d2EGFPおよびCAG－tTAに感染したものと比較して、明瞭に多くの生存RGCがある。図9Dは各群からの生存RGC数の定量を示す。40％よりも低い細胞がOSKおよびCAG－tTA AAV両方に感染しているが、それはトータルの生存RGC数をd2EGFPと比較して増大させる（323と比較して542）。
mTOR活性化は視神経再生の経路として報告されている（Parker et al., Science, 322(5903), 963－966 Nov. 2008）。OSK発現がmTOR経路を活性化するかどうかを決定するために、ダメージの不在下において（未挫滅）およびダメージ後に（挫滅）、RBPMSおよびリン酸化S6（pS6）に対する抗体を用いて、コントロールおよびOSKウイルス感染細胞をイメージングした。染色の代表的画像が図10Aに示されている。図10Bで定量されている通り、pS6陽性細胞のパーセンテージは視神経挫滅後のコントロール細胞およびOSK感染細胞の間において有意には異ならなかった。
例3．AAV Tet－On系は、神経挫滅後の網膜細胞においてAAV Tet－Off系と比較してより速い遺伝子発現を誘導する．
AAVに基づくTet－OnおよびTet－Off系の間で遺伝子発現の速度を比較するために、TRE－d2EGFPウイルスおよび（1）tTAをコードするウイルス（Tet－Off）または（2）rtTAをコードするウイルス（Tet－On）を4週齢マウスの網膜に投与した。Tet－Off系では、マウスはウイルス注射から開始してDOXを与えられ、DOXは3日、5日、または8日に渡って除去された（図11A）。コントロールとして、Tet－Off系の1つのマウスのコホートはDOXを与えられなかった。Tet－Off系においてDOX処置なしと同じレベルのGFP発現を誘導するためには、およそ8日のDOX除去が必要とされた（図11B）。Tet－On系では、マウスは図11Cに指示されている通り処置された。Tet－On系において、2日のみのDOX処置後にGFP発現が観察された（図11D）。よって、AAVに基づくTet－On系に感染したマウス網膜においてトランスジーン発現を誘導するためには、AAVに基づくTet－Off系による感染と比較して時間の短い期間が必要とされた。
例4：変異体のリバーステトラサイクリントランス活性化因子（rtTA）をコードするAAVベクターはマウスの肝臓における低い漏れおよび低い毒性を示した．
図13A～13Cに示されている通り、AAV9送達によるOCT4、SOX2、およびKFF4（UBC－rtTA4を有するTRE－OSK）は、DOX処置によってマウスの肝臓において首尾良く誘導され得る。ウエスタンブロットおよび免疫染色両方によって示された。OCT4、SOX2、KLF4のトランスジーンを有するマウスは、腸上皮の全般性の細胞学的およびアーキテクチャ的異形成を原因としてドキシサイクリン水からの2日の誘導後に死んだが（図14）、本願に記載されるOCT4、SOX2、およびKLF4 AAVの発現は、それらの飲料水中のドキシサイクリン投与による連続的発現によってであっても毒性またはテラトーマをインビボで引き起こさなかった。これらの3つの転写因子をコードするAAV9がマウスの体全体に送達されたときに、テラトーマまたは体重損失は3ヶ月に渡って検出されなかった（図14）。
例5：OCT4、SOX2、およびKLF4の発現はマウスにおいて部分的なリプログラミングを誘導した．
図15A～15Bは、ヒストンおよびChaf（クロマチンアセンブリ因子）遺伝子の発現が、加齢したマウス（12ヶ月または15ヶ月）からの耳線維芽細胞においては、若いマウスからのものと比較して加齢の間に衰えたということを示している。短期のOSKM（3日）またはOSK発現（5日）誘導は、それらを幹細胞にすることなしにそれらの遺伝子発現レベルを若い状態へとリセットした（例えば、NanogはOnにされなかった）。
OSKをコードする従来のAAVベクターはAAVのパッケージング限界を超えており（例えば4.7Kb）、低い力価を有するAAV9カプシドへとパッケージングされ得るのみであり（ウイルスプレップあたり2×1012粒子未満）、図16に示されている通り、可能な短縮を原因として、低力価ウイルスは機能的ではない（例えば、OCT4またはKLF4の過剰発現は検出されなかった）。
例6：変異体のリバーステトラサイクリントランス活性化因子（rtTA）をコードするAAVベクターはマウスの肝臓における低い漏れを示した．
rtTA4（配列番号13）を含むTet－On系をもまた組み換えAAV9ウイルスを用いてインビボで試験した。図13Bに示されているコンポーネントを含む2つのAAVベクターを用いた。UBCプロモーターに作動可能に連結されたrtTA4をコードするAAVウイルス（pAAV－UBC－rtTA4－WPRE3－SV40pAベクターは配列番号17として提供され、配列番号17の例示的なベクターマップは図12によって提供される）および図3に図示されているベクターマップを有するAAV TRE3G－OSK－SV40pAベクター（配列番号16）をコードするAAVウイルスを、マウスに投与した。マウスをドキシサイクリンなしでまたはドキシサイクリンありで処置し、肝臓サンプルを収集した。図13Aの免疫蛍光画像に示されている通り、ドキシサイクリンの不在下において、KLF4発現は肝臓には検出可能でなかった。マウスがそれらの飲料水中のドキシサイクリンによって処置されたときには、KLF4発現が肝臓に検出された（図13A）。これらの結果は、OCT4、KLF4、およびSOX2に対する抗体を用いてこれらの蛋白質の発現を決定するウエスタンブロットによってもまた明白であった（図13C）。アクチンをローディングコントロールとして用いた（図13C）。OCT4、KLF4、およびSOX2はマウスがドキシサイクリンによって処置されたときにのみ肝臓に検出された（図13C）。
例7．OCT4、SOX2、およびKLF4（OSK）をコードする修飾mRNAはマウス線維芽細胞においてOSKの発現を誘導した．
マウス線維芽細胞をOCT4、SOX2、KLF4、およびc－MYC（OSKM）をコードする修飾mRNAによって首尾良くトランスフェクションした。InvitrogenからのLipofectamine（商標）メッセンジャーMAX（商標）トランスフェクション試薬を用いて、修飾mRNAをトランスフェクションした。修飾は、5－メチルシチジン（5mC）によるシチジンまたはシュードウリジン（psi）によるウリジンどちらかの完全な置換であった。例えばWarren et al., Cell Stem Cell. 2010 Nov 5 ;7(5):618－30；Mandal et al., Nat Protoc. 2013 Mar; 8(3):568－82を参照のこと。用いられた各RNAのドーズが下の表4に提供されている。表4の第1のカラムの番号1～5は図17の番号1～5に対応する。
表4．投与されたmRNAのドーズ
Figure 2022511373000005
ウエスタンブロットを用いて、修飾mRNAの投与がマウス線維芽細胞において蛋白質の発現を誘導するということを確認した。図17に示されている通り、マウス線維芽細胞へのOSK修飾mRNAのトランスフェクションは、OCT4、KLF4、およびSOX2蛋白質の発現を誘導する（to induce）（NDGおよびzsGreenはトランスフェクションの効率を指示するための緑色蛍光蛋白質を発現する修飾mRNAである）。
この例は、マウス細胞へのOCT4、KLF4、およびSOX2をコードするRNA（例えば、mRNA、修飾RNA、修飾mRNAなど）の送達が有望であるということを示している。これらの知見はOCT4、KLF4、およびSOX2をコードするmRNAのインビボ送達へと伸展させられ得る。例として、インビボの筋肉送達では、エレクトロポレーションが用いられる。例として、肝臓および他の内臓送達のために、OCT4、KLF4、およびSOX2をコードするRNAを含むナノ粒子のナノ粒子が用いられる。例えばDong et al., Nano Lett. 2016 Feb 10;16(2):842－8を参照のこと。
例8．細胞の化学的リプログラミング．
マウス胎児線維芽細胞を人工多能性幹細胞へと化学的にリプログラミングするためのプロトコールの限定しないものが下で提供される。類似のプロトコールがZhao et al., Cell. 2015 Dec 17;163(7): 1678－91に見出され得る。図21は下で提供されるプロトコールを用いた後の結果を示す。
ステージ1
100ng/ml bFGF、
0.5mM VPA、
20μM CHIR99021、
10μM 616452、
5μMトラニルシプロミン、
50μMフォルスコリン、
0.05μM AM580、
5μM EPZ004777
第12日に、細胞をトリプシン処理し、収穫し、それから6ウェルプレートのウェルあたり50,000～200,000細胞で再プレーティングした（1:10～15）。
第12～16日の間に、bFGF、CHIR、およびフォルスコリンの濃度はそれぞれ25ng/ml、10μM、および10μMまで縮減された。
第16日に、XEN様の上皮コロニーが形成され、培養をステージ2培地に変更した。
ステージ2
25ng/ml bFGF、
0.5mM VPA、
10μM CHIR99021、
10μM 616452、
5μMトラニルシプロミン、
10μMフォルスコリン、
0.05μM AM580、
0.05μM DZNep、
0.5μM 5－アザ－dC、
5μM SGC0946
第28日に、培養をステージ3培地に移入した。
ステージ3
N2B27－2iL培地、
3μM CHIR99021、
1μM PD0325901、
1,000U/ml LIF
別の8～12日後に、2iコンピテントな、ESC様の、かつGFP陽性の（pOct4－GFPレポーターを用いる場合）CiPSCコロニーが出現し、それから、拡大培養およびキャラクタリゼーションのために拾われた。
例9．OCT4、SOX2、およびKLF4の発現は視神経挫滅傷害後の成体のおよび加齢したマウスにおける軸索再生を改善した．
図22上側パネルに図示されているTet－Off系を用いて、TRE－OSK－SV40をコードするベクター（配列番号16）が成体の（3月齢）および加齢した（12月齢）マウスにおける視神経軸索再生を促進するために用いられ得るかどうかを決定した。
TRE－OSK－SV40ベクターを有するAAV2ウイルスおよびCAG恒常的プロモーター下のtTAをコードするAAV2ウイルスを、図7Cで提供されている実験のタイムラインに類似に、1月齢、3月齢、または12月齢マウスの網膜に注射した（n=5～9）。コントロールとして、1月齢マウスの別個のコホート（n=5～6）に、AAV2ベクターTRE－d2EGFP－SV40を有するAAV2ウイルスおよびtTAをコードするAAV2ウイルスを注射した。ウイルス注射の2週後の両方のコホートにおいて、視神経挫滅によって機械的ダメージを誘導した。視神経の蛍光顕微鏡法によって軸索再生をトレースするために、蛍光標識されたコレラ毒素βサブユニット（CTB）を視神経挫滅傷害の2週後にマウスに眼内注射し、灌流をCTB注射の2日後に実施した。軸索再生分析を爾後に行った。
図23A～23Bに示されている通り、OSKをコードするAAV2ウイルスの投与は、d2EGFPをコードするコントロールウイルスの投与に対して相対的に、1月齢（若い）、3月齢（成体）、および12月齢（加齢）マウスにおける神経あたりの推定される軸索数を増大させた。さらにその上、TRE－OSKウイルスは、成体の（3月齢）および加齢した（12月齢）マウスにおいて、コントロールGFPと比較して視神経傷害後のRGCの生存をもまた増大させた（図23C）。よって、驚くべきことに、OSK発現は若い、成体の、および加齢したマウスにおいて神経挫滅傷害後の軸索再生およびRGC生存を促進した。
次に、加齢したマウスの軸索再生に対するOSK発現の時間の長さのインパクトを決定した。マウスにtTAウイルスおよびTRE－OSKウイルスまたはTRE－GFPウイルスどちらかを視神経挫滅に2週先立って投与した。それから、蛍光標識されたコレラ毒素βサブユニット（CTB）をマウスに眼内注射した。これらは視神経挫滅傷害の2週の代わりに5週後であった。図24A～24Bに示されている通り、傷害後OSK発現の時間の長さを5週に増大させることは、図23Bの傷害の2週後のOSK発現と比較して、12月齢マウスにおける神経あたりの推定される軸索数を増大させた。対照的に、傷害後GFP発現の時間の長さを増大させることは軸索再生に対する効果を有さなかった（図24A～24BのGFPによる結果を図23A～23Bに示されているものと比較せよ）。よって、データは、より長い時間のOSK発現が、加齢したマウスにおける神経挫滅傷害後の軸索再生およびRGC生存を促進することに有益であり得るということを示唆する。
例10．視神経挫滅傷害後のOSK発現の誘導はマウスにおいて軸索再生およびRGC生存を増大させた．
視神経挫滅傷害後のOSK発現の誘導が軸索再生およびRGC生存を促進するかどうかをもまた決定した。図22のパネルに図示されているTet－OnおよびTet－Off系両方を用いた。Tet－On系では、TRE－OSK－SV40ベクターを有するAAVウイルスおよびCMV恒常的プロモーター下のrtTAをコードするAAVウイルスを慣例的な方法によって生じ、マウスの網膜に注射した。図25Aに図示されている通り、Tet－On系（上側パネル）では、OSK発現は、視神経挫滅傷害に先立ってまたは視神経挫滅傷害後にどちらかでマウスにドキシサイクリンを与えることによって誘導された。マウスの1つのコホートはコントロールとしてドキシサイクリンによって処置しなかった（誘導なし）。Tet－Off系では、TRE－OSK－SV40ベクターを有するAAVウイルスおよびCAG恒常的プロモーター下のtTAをコードするAAVウイルスを慣例的な方法によって生じ、マウスの網膜に注射した。図25Aに図示されている通り、Tet－Off系では（下側パネル）、OSK発現は視神経挫滅傷害後に抑制された。蛍光標識されたコレラ毒素βサブユニット（CTB）注射を用いて軸索を視覚化した。
図25Bに示されている通り、Tet－On系による傷害後のOSK発現の誘導は、OSKの誘導なしまたはTet－OnもしくはTet－Off系どちらかによる傷害に先立ってのみの（傷害前）OSKの誘導と比較して、神経あたりの推定される軸索数を有意に増大させた。さらにその上、傷害後のOSK発現の誘導は、OSK発現の誘導なしと比較してまたはTet－OnもしくはTet－Off系どちらかによる傷害前のみのOSK誘導と比較して、RBPMS+細胞の生存を有意に増大させた（図25C）。よって、図25A上側パネルに図示されているTet－On系はOSK発現の時間的コントロールを許し、視神経挫滅傷害後のOSKの誘導は軸索再生およびRGC生存を促進した。特定の理論によって拘束されることなしに、傷害からの回復がOCT4、KLF4、および／またはSOX2の直ちの発現を要求しないときには、傷害後のTet－Off系を用いるOCT4、KLF4、およびSOX2発現の誘導は再生を促進し得る。
例11．個々の転写物と比較した、軸索再生を促進することにおける単一転写物からのOCT4、SOX2、およびKLF4（OSK）発現の優れた効果．
この例は、別個のプロモーター下のOCT4、SOX2、KLF4の単独でまたは組み合わせでの発現と比較して、1つのプロモーター下においてOCT4、SOX2、およびKLF4を発現することの効果を探究した。CAG恒常的プロモーター下のtTAをコードするAAVウイルス、ならびに（1）TREプロモーター下のOCT4、（2）TREプロモーター下のSOX2、（3）TREプロモーター下のKLF4、（4）1つのTREプロモーター下のOCT4およびSOX2、（5）それぞれが別個のプロモーター下のOCT4、SOX2、およびKLF4、または（6）同じプロモーター下のOCT4、SOX2、およびKLF4をコードするAAVウイルス（単数または複数）を、マウスの網膜に注射した。この研究に用いられた種々のベクターを示す模式図が図26Aに示されている。視神経挫滅傷害をウイルス投与の2週後に誘導した。視神経挫滅の2週後の蛍光標識されたコレラ毒素βサブユニット（CTB）注射を用いて、軸索をイメージングした。
図26Bに示されている通り、全ての3つの転写因子（OSK）が1つのプロモーター下で発現されたときには、OCT4、SOX2、およびKLF4がそれぞれが別個のプロモーター下で発現されたときよりも、神経あたりの推定される軸索数は少なくとも4倍高かった（例えば、OCT4、SOX2、KLF4（5）、およびOCT4－SOX2－KLF4（6）の結果を比較せよ）。類似に、神経あたりの推定される軸索数は、OSKが単一転写物上で発現されたときには、OCT4、SOX2、およびKLF4発現単独のときよりもまた少なくとも4倍高かった（図26B）（例えば、OCT4（1）、SOX2（2）、およびKLF4（3）をOCT4－SOX2－KLF4（6）の結果と比較せよ）。蓋然的には、軸索再生の増大は1つのプロモーター下における全ての3つの転写因子（OSK）の発現に帰せられた。なぜなら、1つのプロモーター下におけるOCT4およびSOX2の発現は、各転写因子単独の発現に対して相対的に、神経あたりの推定される軸索数を有意には増大させなかったからである（図26B）（例えば、OCT4－SOX2（4）をOCT4－SOX2－KLF4（6）の結果と比較せよ）。
RBPMS+細胞を定量することによって、網膜神経節細胞（RGC）生存の分析を行った。図26Cに示されている通り、1つのプロモーターからのOSKの発現は、OCT4、SOX2、またはKLF4単独の発現に対して相対的におよび1つのプロモーター下におけるOCT4およびSOX2の発現に対して相対的に、RBPMS+細胞の生存を増大させた。1つのプロモーターからのOSKの発現は、別個のウイルスによる別個のベクターからのOCT4、SOX2、またはKLF4の発現に対してもまた相対的に、RBPMS+細胞の生存を増大させた。
図26Dに図示されている蛍光染色によって示されている通り、別個のウイルスの別個のベクターによるOCT4、SOX2、およびKFF4の発現はRGCの不均質な集団をもたらした。いくつかの細胞はOCT4、SOX2、またはKFF4のみを発現した。いくつかの細胞が3つの転写因子のうち2つのみの組み合わせを発現し、数個のみの3因子陽性RGCが検出された（図26Dの上側左パネルの下側右角の白色の細胞）。対照的に、図26Eに示されている通り、単一のベクターからのOCT4、SOX2、およびKFF4の発現はより均質な集団をもたらした。細胞の全てはOSK転写因子の全ての3つを発現した（上側左パネルの白色の細胞）。純白ではない細胞であっても、全ての3つの転写因子の発現が図26Eに示されている通り検出され、結果は3つの転写因子の染色強度の差を原因とするということを示唆した。
よって、この例は、1つのプロモーターを用いるOCT4、SOX2、およびKFF4の発現が、各転写因子単独の発現、別個のプロモーター下における全ての3つの転写因子の発現、または1つのプロモーター下における転写因子のうちの2つのみの発現（例えば、OCT4およびSOX2）と比較して、多大な治療効果（例えば、網膜神経節細胞の増大した軸索再生およびより多大な生存）を有したということを示す。
例12．Tet1またはTet2のノックダウンは視神経挫滅傷害後のOSKによって誘導される軸索再生をなくした．
この例は、OSKによって誘導される軸索再生に対して、DNAデメチラーゼTet1およびTet2をノックダウンすることの効果を決定した。Tet－Off系を用いた。CAG－tTA+TRE－OSK－SV4のAAV2を、U6－shRNAのAAV2と一緒に、挫滅の2週前の硝子体注射によってマウスに注射した。マウスは1月齢であり、各群に4匹のマウスを有した。
shRNA配列をコードするAddgene AAVプラスミドを用いた。コントロールshRNAは配列5'－GTTCAGATGTGCGGCGAGT－3'を含んだ（Addgeneからのプラスミド#85741）。mTET1（Tet1 shRNA）は配列5'－GCTCATGGAGACTAGGTTTGG－3'を含んだ（Addgeneからのプラスミド#85742）。mTet2（Tet2 shRNA）は配列5'－GGATGTAAGTTTGCCAGAAGC－3'を含んだ（Addgeneからのプラスミド#85743）。
図27に示されている通り、Tet1またはTet2どちらかのノックダウンは、コントロールヘアピン（sh－cntl）と比較して、OSKウイルスによってもまた処置されかつ視神経挫滅傷害に付された動物における神経あたりの推定される軸索数を有意に縮減した。
これらの結果は、Tet DNAメチラーゼがOSKによって誘導される軸索再生に関わり得、Tet（例えば、Tet1またはTet2）の過剰発現が単独でまたはOSK発現との組み合わせで再生を促進し得るということを示唆する。
限定しない例として、配列5'－GCTCCAACGAGAAGCTATTTG－3'を含むmTet3（Addgeneからのプラスミド#85740）がTet3をノックダウンするために用いられ得る。
例13．OSKの発現は視力の加齢性の衰えを逆行させ、網膜神経節細胞（RGC）機能の加齢性の衰えを逆行させた．
加齢性の視力損失がOSK発現によって逆行させられ得るかどうかを決定するために、視運動反応（OMR）アッセイを成体マウス（3月齢マウス）および加齢したマウス（12月齢および18月齢マウス）について行った。OMRは視力を査定するために用いられる反射的頭部運動である。OMRを誘導するためには、個々のマウスは、縞模様を呈示するコンピュータモニターによって取り囲まれたアリーナの中央のプラットフォーム上に置かれる。縞模様パターンの回転は反射的頸部運動による同じ方向のマウス頭部トラッキングを誘起する。トラッキングは2人の独立したマスクした観察者によってモニタリングされる。視力は、OMRが誘起され得なくなるまで縞模様の空間周波数を増大させることによって定量される。
マウスにドキシサイクリンの不在下においてtTAをコードするAAVウイルスおよびTRE－OSKをコードするAAVウイルスを網膜注射した（OSK誘導条件）。このTet－Off系では、OSKはドキシサイクリンの不在下において単一のプロモーターから発現される。コントロールとして、年齢マッチしたマウスにドキシサイクリンの不在下においてrtTAをコードするウイルスおよびウイルスTRE－OSKをコードするウイルスを投与した（未誘導のコントロールctl）。コントロールTet－On系では、OSK発現はドキシサイクリン処置を要求する。成体マウス（3月齢（3m））をもまたコントロールとして用いた。OMR研究を行って、ウイルス注射の1ヶ月後に空間周波数閾値を測定した。
図28に示されている通り、OSK発現の不在下では（コントロール（ctl）条件）、加齢したマウス（12月齢および18月齢マウス）は成体のマウス（3月齢マウス）と比較して失明を有した。3月齢マウスに対して相対的な加齢したマウスの空間周波数閾値の減少は、OSK発現の不在下における失明を指示した。しかしながら、OSKが発現されたときには、平均の空間周波数閾値は12月齢および18月齢マウスではOSK発現なしに対して相対的に増大した。さらにその上、OSK発現による12月齢および18月齢マウスの空間周波数閾値は、OSK発現の存在および不在下における3月齢コントロールマウスのものに類似であった。これらの結果は、OSK発現の誘導がマウスにおける加齢性の失明を逆行させたということを実証している。
網膜神経節細胞（RGC）機能の加齢性の衰えもまたOSK処置によって逆行させられ得るかどうかを決定するために、RGCからの電気的な波をパターン網膜電図を用いて測定した（パターンERGまたはpERG）。pERGアッセイでは、格子縞の明暗パターン刺激が、種々の年齢のマウス（3月齢、12月齢、または18月齢マウス）の角膜に置かれた電極から投射される。コントラスト反転パターンが輝度の総体的変化なしに呈示される。それから、RGCから作り出された電気的な波が測定される。
マウスにドキシサイクリンの不在下において、tTAをコードするAAVウイルスおよびTRE－OSKをコードするAAVウイルスを網膜注射した（OSK誘導条件）。このTet－Off系では、OSKはドキシサイクリンの不在下において単一のプロモーターから発現される。コントロールとして、年齢マッチしたマウスにドキシサイクリンの不在下において、rtTAをコードするウイルスおよびウイルスTRE－OSKをコードするウイルスを投与した（未誘導のコントロールctl）。コントロールTet－On系では、OSK発現はドキシサイクリン処置を要求する。成体マウス（3月齢（3m））をもまたコントロールとして用いた。pERG研究を行って、ウイルス注射の1ヶ月後に、パターン刺激後のRGCの電気的な波の振幅を測定した。
図29に示されている通り、RGCから作り出される電気的な波はOSK発現の不在下における（ctl条件）加齢したマウスでは衰えた（3月齢マウスを12月齢および18月齢マウスと比較）。対照的に、ドキシサイクリンの不在下におけるtTAをコードするAAVウイルスおよびTRE－OSKをコードするAAVウイルスの投与は（OSK誘導条件）、12月齢マウスにおいてRGCの電気的な波を復元した。しかしながら、18月齢マウスでは、は蓋然的には、角膜混濁がパターン刺激をブロックしたので、RGC機能復元されなかった。これらの結果は、OSKの発現が加齢した（12月齢）マウスにおけるRGC機能を改善したということを示唆する。
よって、この例は、OSK発現の誘導が加齢によって引き起こされる視力およびRGC機能を改善し得るということを実証している。
例14．OSKの発現は、視力の緑内障によって誘導される衰えを逆行させ、網膜神経節細胞（RGC）機能の緑内障によって誘導される衰えを逆行させた．
OSK発現が視力およびRGC機能の緑内障によって誘導される衰えを逆行させるために用いられるかどうかを決定するために、緑内障のマウスモデルを用いた。ポリスチレンマイクロビーズを前房に注射することによって、成体C57BL/6Jマウスにおいて、眼圧（IOP）の慢性の上昇を片側に誘導した。IOPを最初の4週に測定した。図30Aに示されている通り、マイクロビーズ注射はIOPをマイクロビーズ注射の4～21日後に増大させた。軸索密度をp－フェニレンジアミン（PPD）染色を用いて定量した（図30B）。図30Cは、Brn3a染色（例えば右に示されている）を用いてRGC細胞密度（左パネル）を定量するチャートを包含する。図30B～30Cは、TRE－OSKをコードするAAVウイルスによって処置されなかった野生型（WT）マウスでは、前眼房へのマイクロビーズ注射の4週後に、軸索密度およびRGC密度の有意な損失があったということを示す。
これらの実験では、緑内障をマイクロビーズ注射によって誘導し、それから、3週後に、OMRおよびpERGアッセイを行った（図30D～30EのAAV注射前の測定）。それから、マウスを2つの処置群に分割した。マウスの1つの群に、テトラサイクリンの不在下においてrtTAをコードするAAVウイルスおよびTRE－OSKをコードするAAVウイルスを（OSK AAV Off）、またはtTAをコードするAAVウイルスおよびTRE－OSKをコードするAAVウイルスを（OSK AAV On）網膜注射した。AAVウイルス注射の4週後に、OMRおよびpERGアッセイを再び行った（図30D～30EのAAVの4w後）測定）。コントロールとして、実験はマイクロビーズの代わりに生理食塩水の注射によってもまた行った（緑内障なしコントロール）。
図30Dに示されている通り、OSK発現の誘導（OSK AAV On）は、OSK発現の誘導なし（OSK AAV Off）と比較して、緑内障を有するマウス（マイクロビーズを注射したマウス）の空間周波数閾値を増大させた。これらの結果は、OSK発現の誘導が緑内障に関連する失明を改善し得るということを示唆する。
図30Eに示されている通り、OSK発現の誘導は、マイクロビーズによって誘導される緑内障を有するマウスの電気的な波の振幅を復元した。これらの結果は、OSK発現の誘導がRGC機能の緑内障に関連する衰えをもまた逆行させ得るということを示唆する。
よって、OSK発現の誘導は緑内障によって誘導される症状を改善し得る。
例15．ヒトOSKの発現はビンクリスチンによって誘導される神経ダメージ後のヒトニューロンの生存および軸索再成長を促進した．
ヒトOCT4、ヒトKLF4、およびヒトSOX2（ヒトOSK）の発現がインビトロでヒト神経細胞を保護および軸索を再生し得るかどうかを決定するために、神経突起再生アッセイを下に記載されている通り行った。ヒト神経芽腫細胞であるSH－SY5Y細胞をニューロンに分化させ、Tet誘導性プロモーター下にヒトOCT4、ヒトKLF4、およびヒトSOX2をコードするAAV.DJベクターによって形質導入した（Tet－Off系を用いた）。OSK Off条件では、OSK発現は細胞に誘導されなかった。OSK On条件では、OSK発現は細胞に誘導された。形質導入の5日後に、ビンクリスチン（VCS）を用いて神経突起変性を誘導した。細胞をVCSによって24時間または48時間に渡って処置した。処置タイムラインの模式図（24時間VCS処置による）が図31Aの左部分に提供されている。VCSは微小管を破壊する化学療法薬物である。それは、多くの場合には、処置がダメージ後の細胞機能（例えば神経機能）を維持および／または促進するかどうかを決定するためにインビトロで用いられる。本願に記載される通り、VCSを用いて、神経生存および軸索再成長に対するOSK処置の効果を決定した。VCS処置後に、細胞を分化培地によって成長させ、神経突起伸長をアッセイした。
図31Aでは、細胞をVCSによって24時間に渡って処置した9日後に、細胞を神経伸長についてアッセイした。OSK発現が誘導された細胞（OSK On条件）は、OSK発現が誘導されなかった細胞（OSK Off条件）に対して相対的に、増大した神経生存および軸索伸長を示した（図31A）。類似に、神経細胞面積の定量は、OSK発現がOSK発現なしと比較してニューロンの細胞面積を少なくとも8倍だけ増大させるということを示した（図31B）。類似の結果が48時間のVCS処置でもまた観察された（図31C）。
これらの結果は、ヒトOSKの発現がVCSによって誘導されるニューロン変性からヒトニューロン細胞を保護したということを示す。
方法
細胞培養および分化プロトコール
SH－SY5Y神経芽腫細胞はアメリカンタイプ（Tissue）カルチャーコレクションから得（ATCC、CRL－2266）、ATCCの推奨に従って維持した。細胞はイーグル最小必須培地（EMEM、ATCC、30－2003）およびF12培地（ThermoFisher Scientific、11765054）の1:1混合物によって培養し、10％ウシ胎児血清（FBS、Sigma、F0926）および1×ペニシリン／ストレプトマイシン（ThermoFisher Scientific、15140122）を補った。細胞は37℃で5％CO2および3％O2によって培養した。細胞は～80％コンフルエンシーで継代した。
SH－SY5Y細胞を、先に記載されている通り（Encinas et al., J Neurochem. 2000 Sep;75(3):991－1003；Shipley et al., J Vis Exp. 2016 Feb 17;(108):53193）、いくつかの改変でもってニューロンへと分化させた。手短には、プレーティングの1日後に、細胞は、2.5％FBS、1×ペニシリン／ストレプトマイシン、および10μM全トランス型レチノイン酸（ATRA、Stemcell Technologies、72264）を含有するEMEM／F12培地（1:1）（分化培地1）によって3日に渡って分化することを開始し、次に、1％FBS、1×ペニシリン／ストレプトマイシン、および10μM ATRAを含有するEMEM／F12（1:1）（分化培地2）によって3日に渡って細胞を処置した。それから、細胞をポリD－リジンによってコーティングされた35mm細胞培養プレート（ThermoFisher Scientific、A3890401）にスプリットした。スプリットの1日後に、ニューロンを、1×Glutamax（ThermoFisher Scientific、35050061）、1×ペニシリン／ストレプトマイシン、および50ng/ml BDNF（Alomone labs）を含有する血清不含neurobasal/B27 plus培養培地（ThermoFisher Scientific、A3653401）（分化培地3）によって少なくとも5日に渡って成熟させた。
神経突起再生アッセイ
SH－SY5Y細胞からの分化したニューロンを細胞あたり106ゲノムコピーでAAV.DJベクターによって形質導入した。形質導入の5日後に、100nMビンクリスチン（Sigma、V8879）を24時間から48時間に渡って細胞に追加して、神経突起変性を誘導した。ビンクリスチン処置後に、ニューロンをPBSによって2回洗浄し、新鮮な分化培地をプレートに再度追加した。ニューロンを神経突起伸長について2週までに渡って追跡した。
例16．エピジェネティックな時計のTet依存的なリセットによる傷害からの回復および視覚の復元．
哺乳類細胞が一生の初期からのエピジェネティックな情報の忠実なコピーを保持し得るかどうかを決定するために、OSKの3遺伝子組み合わせが年齢をリセットするために十分であるかどうかを試験した。3つの遺伝子のOSK組み合わせを老いたマウスからの線維芽細胞に入れ（into）、H2A、H2B、ラミンB1、およびChaf1bなどの年齢によって変改されることが公知の遺伝子のRNAレベルに対するその効果を測定した。老いたマウスからの線維芽細胞のOSK処置は、細胞アイデンティティの明らかな損失またはテラトーマを誘導し得る初期胚転写因子Nanogの誘導なしに、OSKMがすることと類似に若々しい遺伝子発現パターンを復元した（図36A～36C）。
インビボのOSK発現を送達およびコントロールするために、密に制御されるTet－ONおよびTet－OFFアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター系を開発して、全ての3つのリプログラミング遺伝子を1つのウイルス粒子中に収めた（Smalley et al., First AAV gene therapy poised for landmark approval. Nat Biotechnol, 2017. 35(11): p. 998－999; Senis et al., AAV vector－mediated in vivo reprogramming into pluripotency. Nat Commun, 2018. 9(1): p. 2651）（図32A）。第1に、OSK AAVの誘導がインビボの毒性を引き起こすかどうかを試験するために、5月齢C57BL/6JマウスをrtTAおよびTRE－OSK AAV9に感染させ、トランスジェニックマウスのものに匹敵するレベルまで発現を誘導した（図36D）。驚くべきことに、1年超に渡るOSKの連続的誘導は1年超に渡ってマウスに対する識別可能な負の効果を有さなかった（図32Bおよび図36E）。特定の理論によって拘束されることなしに、腸における高レベル発現が回避され（図36F～36H）、それゆえに、Abad et al., Nature 502, 340－345, doi:10.1038/nature12586 (2013)を包含する他の研究で見られた異形成および体重損失を回避したので、表面上はマウスに対する識別可能な負の効果はなかった。
ほぼ全ての種が加齢の間に再生ポテンシャルの衰えを経験する。哺乳動物では、このポテンシャルを失う最初の系の1つは中枢神経系（CNS）である。正典的なCNS細胞型である網膜神経節細胞は軸索を網膜から離れて脳に向かって投射し、視神経を形成する。胚発生の間および新生児において、RGCはダメージを受けた場合には再生し得るが、この能力はじきに失われる（Goldberg et al., Science, 2002. 296(5574): p.1860－4）。経時的に、生物が加齢すると、CNSの総体的な機能およびレジリエンスは衰え続ける（Geoffroy et al., Cell Rep, 2016. 15(2): p.238－46）。初期のエピジェネティックなプロファイルを成体のRGCにおいて復元することが可能であるかどうかを探求するために、種々の年齢の成体マウスの神経挫滅傷害モデルにおいて、OSK発現を誘導した。別個のAAV上にまたは同じAAV上にどちらかでOSKを保有するTet－Off系（Tet－Off tTA－AAV2）を硝子体に注射し、RGCにおける効率的な、選択的な、かつドキシサイクリン応答性の遺伝子発現をもたらした。負のコントロールとして、マウスの1群をドキシサイクリンによってもまた処置して、AAVを抑制した（図32Cおよび図37C）。注射の2週後に、視神経挫滅を実施し、その2週後に、軸索長および視神経密度を計算した（図32D）。
ポリシストロンOSK－AAV2の誘導は、RGC増殖のいずれかの徴候なしに（図38A）、RGC生存および長距離軸索再生の有意な増大を引き起こした（図32Eおよび図37D）。対照的に、別個のAAV上で導入されたときには、OCT4、SOX2、KLF4は再生能力に対する効果を有さなかった（図32E）。表面上は、重複感染のより低い頻度を原因とする（図37Aおよび図37B）。Klf4は軸索成長を抑制し得るので（Moore et al., Science, 2009. 326(5950): p.298－301；Qin et al., Nat Commun, 2013. 4: p.2633）、OCT4、SOX2、およびKLF4をもまた個々に試験し、ならびにOCT4およびSOX2の2重シストロンを試験した。しかしながら、Klf4の不在下では再生効果は観察されなかった。注目すべきことに、ポリシストロンOSKが3ヶ月に渡って誘導された場合には、RGC軸索繊維は交叉まで3mm超の距離をずっと伸展した（図38B）。事実、ポリシストロンOSKが12～16週に渡って誘導されたときには、再生RGC軸索繊維が、視神経が脳に接続する（挫滅部位から5mm離れた）交叉へとさらに伸展した（図38B～38C）。
次に、神経生存および再生を促進するためのOSK発現の要求されるタイミングを試験した。これらの実験では、その急速なOn速度を原因として、Tet－On AAV系を利用した（図37Dおよび図39A～39B）。軸索再生の有意な改善はOSK発現が傷害後に誘導されたときにのみ起こり、より長くOSKが誘導されると、ニューロンはトータルRGC数の増大なしにより多大な距離を伸展した（図33B、33C、および33D）。OSKの共染色および神経カウントを実施することによって、生存率は未感染のまたはGFP感染RGCの2.5～3倍であると推定され（52対17％～20％）（図39Cおよび39D）、OSK効果が細胞固有であるということを示唆した。インビボの神経生存を改善することが先に示されているPten－mTOR－S6K経路は傷害後のOSK感染細胞において活性化されず（図40Aおよび図40B）、新たな経路が関わり得るということを指示した。
神経傷害がエピゲノミックな年齢を進めるかどうか、およびOSKのベネフィットがより若いエピゲノムの保全を原因とするかどうかを決定した。RGCからのゲノムDNAを傷害前にまたは傷害の4日後にOSK誘導の存在または不在下においてFACS単離し、レデューストリプレゼンテーションバイサルファイトシーケンシング（RRBS－Seq）を付した。特定の理論によって拘束されることなしに、rDNAme時計（Wang et al., Genome Res 29, 325－333, doi:10.1101/gr.241745.118 (2019)）は、他の利用可能なマウス時計に対して相対的に最も良好な部位カバー率（70/72 CpG部位）を提供し（Meer et al., Elife 7, doi:l0.7554/eLife.40675 (2018）；Thompson et al., Aging (Albany NY) 10, 2832－2854, doi: 10. l8632/aging.101590 (2018)）、その推定年齢はRGCの暦年齢と高度に相関したままに留まった（図45Aおよび方法）。グローバルなメチル化変化の不在下では、傷害されたRGCはエピジェネティックな時計の加速を経験し、OSK発現はこの効果に逆らった（図33Kおよび図45B）。
神経生存および再生に対するOSKの効果が、より若いエピゲノムを復元することによって起こるかどうかを決定した。そうである場合には、これらの効果はエピジェネティックな時計の逆行に依存的であるはずであり、これは10－11転座（TET）ジオキシゲナーゼの活性によるDNAからのメチル基の除去を要求するであろう。Tet1およびTet2に対する短鎖ヘアピンRNA（sh－Tet1およびsh－Tet2）を発現する先にキャラクタリゼーションされたAAV（Guo et al., Cell 145, 423－434, doi:l0.l0l6/j.cell.2011.03.022 (2011)；Yu et al., Nat Neurosci 18, 836－843, doi:l0.l038/nn.4008 (2015)；Weng et al., Neuron 94, 337－346.e336, doi: 10.1016/j.neuron.20l7.03.034 (2017)）を利用し、インビボの形質導入率およびノックダウン効率を検証した（図40C～40F）。OSK陽性細胞の大体70％を形質導入した（図40Cおよび40D）Tet1またはTet2どちらかのノックダウン（OSK AAVの1/5力価におけるsh－Tet1およびsh－Tet2 AAV2）は、OSKを再生軸索および改善されたRGC生存から効率的にブロックした（図33Eおよび33F）。
OSKによる神経若返りがマウスRGCに特異的であるかどうかを試験するために、軸索再生アッセイをインビトロのヒトニューロンにおいて実施した（図33G）。ヒト神経芽腫SH－SY5Y細胞をニューロンに分化させ、それらをOSKを発現するためのAAV－DJベクターによって形質導入した（図33G、図41A、および図41B）。インビボのマウスRGCに類似に（図38A）、OSKは細胞増殖を誘導しなかった（図41C～41D）。それから、軸索変性を化学療法薬ビンクリスチン（VCS）による24時間処置によって誘導し、それから、細胞が9日に渡って回復することを許した。これらのニューロンのエピジェネティックな時計を皮膚および血液細胞時計を用いて測定した（Horvath and Raj, Nat Rev Genet. 2018 Jun;19(6):371－384）。類似に、DNAメチル化年齢はヒトニューロンにおいてはVCSダメージ後に有意に増大し（図41J）、OSK発現はDNAメチル化年齢のこの増大を防止するのみならず、DNAメチル化のグローバルな縮減なしにより若いDNAメチル化年齢をもまた復元した（図33H下側パネルおよび図45C）。DNAmAgeはOSK処置細胞においてはVCSダメージ後の第9日に実験によって有意に減少するが、OSKによって処置されなかった細胞ではしない（図33H）。ダメージ後の第9日に、神経突起面積は若返ったOSK形質導入細胞ではコントロールよりも15倍多大であり（図41Eおよび図41F）、ダメージからの回復は、高いOSK発現の存在下であっても（図41K）Tet2デメチラーゼに依存的であったが（図33I、図33J、および図41G）、マウス網膜神経節（ganglia）細胞に平行するmTOR－S6K経路には依存的でなかった（図41Hおよび図41I）。それゆえに、ニューロンをリプログラミングおよび軸索成長を促進するOSKの能力は細胞固有であり、哺乳動物において保存されており、DNA脱メチル化によるエピジェネティックな若返りを要求する。このプロセスは本願においてはエピジェネティックなリプログラミングによる情報の回復または略して「REVIVER」と言われる。
最も多くの場合には増大した眼圧を原因として、RGCおよびそれらの軸索の漸進的損失である緑内障は、世界的に加齢性の失明の先導的原因である。いくつかの処置は疾患進行を低速化し得るが、ひとたびそれが失われると、視覚を復元することは現在は可能ではない。急性神経ダメージ後に軸索を再生するOSKの能力からして、我々はREVIVER処置が緑内障のような慢性的背景においてRGCの機能を復元し得るかどうかを試験することに決めた（図34A）。前房へのマイクロビーズの注射によって、上昇した眼圧（IOP）を4～21日に渡って片側に誘導した。それから、OSK AAVまたはPBSを硝子体注射し、緑内障ダメージがRGCおよび軸索密度の有意な減少によって確立された時点で発現させた（図34B、図42A、および図42B）（Krishnan et al., J Immunol, 2016. 197(12): p. 4626－4638）。AAV注射後の4週において、OSK－On処置マウスは、PBSおよびOSK－Off処置マウスと比較されたときに、軸索密度の有意な増大を顕した。観察された増大した軸索密度は生理食塩水のみの非緑内障マウスの軸索密度と同等であり（図34Cおよび34D）、RGCの増殖を随伴しなかった（図42C）。
OSK処置マウスにおいて観察される増大した軸索密度が増大した視覚と符号するかどうかを決定するために、挙動アッセイの視運動反応（OMR）を用いて（図34E）各マウスの視力をトラッキングした。PBSまたはOSK－Off AAVどちらかを受けたマウスと比較して、OSK処置は処置前ベースライン測定に対して相対的に視力を有意に増大させ、失明の半分よりも多くを復元した（図34F）。パターン網膜電図応答（pERG）分析として公知の、反転コントラスト格子縞パターンに応答してRGCによって作り出される電気的な波の読み取りは、処置前のベースライン測定に対して相対的に、かつPBSまたはOSK－Off AAVどちらかによって処置されたマウスと比較して、OSK処置がRGC機能を有意に改善するということを示した（図34GおよびH）。特定の理論によって拘束されることなしに、本願において示されるOSK AAVによる処置は、いずれかの緑内障モデルにおいて失明を逆行させる最初の処置であり得る。とりわけ、OSKは緑内障モデルにおいて失明を逆行させた。
若いマウスにおいて視神経挫滅後に軸索再生を誘導するおよび緑内障ダメージ後に視覚を復元するOSKの能力からして、OSKが加齢したマウスにおいてもまた生理学的加齢に関連する失明を復元し得、視神経傷害後に軸索を再生し得るかどうかを決定した。若いマウスを処置するときに首尾良かった最近報告された網膜桿体光受容体再生アプローチは、より老いたマウスを処置するときには有意に弱まったので、これは特に重要である（Yao, K., et al., Restoration of vision after de novo genesis of rod photoreceptors in mammalian retinas. Nature, 2018. 560(7719): p.484－488）。
OSK AAV処置が加齢マウスにおける軸索再生を誘導し得るかどうかを決定するために、視神経挫滅傷害モデルを、12月齢マウスについて、図32Dと同じプロトコールを用いて、示されている実験の設計によって実施した（図35A）。加齢したマウスでは、傷害後の2週に渡るOSK AAV処置は、若いマウスで観察されるものに類似に、倍化したRGC生存を示した（図43A）。軸索再生は傷害の2週後において若いマウスよりもやや少ないが（図43B）、傷害後の5週に渡る加齢したマウスのOSK AAV処置は、若いマウスで観察されたものに類似に、軸索再生の有意な増大を示した（図35Bおよび35C）。これらのデータは、加齢が、視神経挫滅傷害後の軸索再生を誘導することにおけるOSK AAV処置の有効性を弱めないということを指示している。
OSK処置が生理学的加齢に関連する失明を逆行させ得るかどうかを試験するために、4および12月齢マウスがOSK－OffまたはOSK－On AAVの硝子体注射を受けた。予期された通り、生後1年において、マウスはOMRおよびpERGによって測定される視力およびRGC機能の有意な縮減を示し、これはOSK AAV処置によって復元された（図35Dおよび図43C）。蓋然的には、この年齢において発生した自然発生的な角膜混濁を原因として、かかる復元は18月齢マウスでは観察されず（図43F～43G）（McClellan et al., Am J Pathol 184, 631－643, doi:l0.l0l6/j.ajpath.20l3.11.019 (2014)）、復元効果がAAV感染したRGC層によって特に寄与されるということを示唆した。
次に、OSKによる若々しいトランスクリプトームの復元が若々しいエピゲノムを指示しており、それゆえにTet酵素を要求するであろうかどうかを決定した。注目すべきことに、Tet1またはTet2ノックダウンは、視覚復元のための鍵のプロセスとしてのDNAメチル化と整合して、OMRおよびpERG分析両方によって測定されるOSK－On AAV処置の若返り効果を完全にブロックした（図35Eおよび図35F）。とりわけ、加齢したマウスにおけるOSKによる自明なRGCおよび軸索密度増大はなく（図43Dおよび図43E）、既存のRGCの機能的な改善を示唆する。12月齢マウスからのFACSソーティングされたRGCのrDNAメチル化年齢を測定した。4週に渡るOSK AAV発現はDNAメチル化年齢を有意に減少させ、Tet1およびTet2ノックダウンはかかる若返りをブロックした（図351）。一緒になって、これらの結果は、Tet依存的なインビボリプログラミングが複雑な組織の若々しい遺伝子発現パターンを復元し、DNAメチル化時計を逆行させ、機能および再生能力を復元し得るということを実証している。
Tet2ノックアウトが軸索再生に対するOSKの効果をブロックし得るかどうかをさらに決定するために、マウスOSKおよびTet2条件付きノックアウトマウス（B6;129S－Tet2tm1.11aai/J）を用いた。マウスの眼に（1）AAV－CRE（Tet2 cKO）；（2）AAV－tTA+AAV－TRE－OSK:OSK（Tet2 WT）；または（3）AAV－tTA+AAV－TRE－OSK+AAV－CRE:OSK（Tet2 cKO）を注射した。2週後に、視神経挫滅を行った。CTBを視神経挫滅の2週後に投与し、マウスをCTB投与の2日後に屠殺して、傷害後の軸索再生の程度を決定した。図46A～46Bに示されている通り、傷害部位から少なくとも500μmまでの神経あたりの軸索数は、OSKを投与されたTet2野生型マウスにおいては、OSKを投与されたTet2ノックアウトマウスと比較して有意に高かった。これらの結果は、OSKによって媒介される軸索再生がTet2依存的であるということを示唆する。
網膜のトランスクリプトームに対するリプログラミングの効果を決定するために、インタクトな老いたマウス（12ヶ月）および空のコントロールAAV（TRE－OSK）またはOSK－On（tTA+TRE－OSK）どちらかによって処置されたものからのFACS精製されたRGCを、ゲノムワイドRNA－seqによって分析した。インタクトな若いマウス（5ヶ月）からのRGCと比較して、加齢の間に差次的に発現され（図35G、図35I、図44A、および表5）かつ空のAAV単独によっては誘導されない464個の遺伝子が同定された。これらのうち、268遺伝子が加齢の間に下方制御された。これらは感覚知覚遺伝子が濃縮されており（図351）、加齢の間のシグナル伝達受容体／感覚機能の衰えを示唆した（図44Bおよび44C）。興味深いことに、これらの遺伝子のうち116個は未キャラクタリゼーションに見え、正式な遺伝子名を欠く。加齢の間にやや上方制御される他の196遺伝子はイオン輸送体遺伝子が濃縮されている（図44D）。
注目すべきことに、OSKがエピゲノミックなランドスケープをリセットすることと整合して、加齢の間に発現が変化する464個の遺伝子の圧倒的大多数（90％、418）は、処置後に若々しいレベルへと復元された（図35Gおよび35H）。一緒になって、これらの結果は、Tet依存的なインビボリプログラミングが網膜ほども複雑な組織の若々しい遺伝子発現パターンを復元し、エピジェネティックな時計を逆行させ、機能を復元し得るということを実証している。
中枢神経系の有糸分裂後ニューロンは、再生するそれらの能力を失う体の最初の細胞のいくつかである。この研究では、加齢したニューロンのインビボリプログラミングが、エピジェネティックな年齢を逆行させ得、それらが再生しかつそれらが再び若いかのように機能することを許し得るということが示された。このプロセスのためのDNAデメチラーゼTet1およびTet2の要求は、時計部位におけるDNAメチル化が単に加齢の指標ではなく、それへの能動的な関与者であるということを指示する。Shannonの観察者が後の時間における失われた情報の回復を保証するための情報を保管する同じやり方で、哺乳類細胞は元々のエピジェネティックな情報のセットを保持するということが結論された（SHANNON, C.E., A Mathematical Theory of Communication. The Bell System Technical Journal, 1948. 27: p.379－423）。いかにして細胞が適当なDNAメチル化部分を見出して除去し、若々しい遺伝子発現パターンを復元することができるのかは、依然として未解決の謎であるが、この知識の不在下であっても、我々のデータは、エピジェネティックな年齢の逆行は、視覚を復元するだけではなく、他の組織に傷害から回復および加齢性の衰えに抵抗する能力を与えるための有効なトランスレーショナル戦略であり得るということを指示する。
表5．マウスRGCの加齢の間に差次的に発現された遺伝子
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 方法
マウス系統
視神経挫滅および緑内障モデル実験のためのC57BL6/J野生型マウスはJackson Laboratoryから購入される（000664）。加齢実験には、NIA加齢齧歯類コロニー（https://www.nia.nih.gov/research/dab/aged-rodent-colonies-handbook）からの雌が用いられる。Collal－tetOP－OKS－mCherry/Rosa26－M2rtTAアレルはBar－Nur et al., Nat Methods, 2014. 11(11): p.1170－6に記載されている。全ての動物作業はHarvard Medical School、ボストン小児病院、Mass Eye and Ear機関内動物実験委員会によって認可された。
AAVの生成
AAV－TRE－OSKのベクターは、Tet応答性エレメント（TRE3Gプロモーター）およびSV40エレメントからなるAAVプラスミドにマウスOct4、Sox2、およびKlf4 cDNAをクローニングすることによって作られた。他のベクターは直接的に化学合成された。それから、表6に列記されている全てのpAAVは血清型2/2または2/9のAAVへとパッケージングされた（力価：ミリリットルあたり>5×1012ゲノムコピー）。アデノ随伴ウイルスはボストン小児病院ウイルスコアによって生じた。
内臓へのAAV9の全身送達
AAV9の後眼窩注射によって、内臓における発現を達成した（3×1011TRE－OSKプラス7×1011UBC－rtTA4）。1mg/mLドキシサイクリンを注射の3週後に連続的に処置して、OSK発現を誘導した。
細胞培養および分化
耳線維芽細胞（EF）はリプログラミング4F（Jackson Laboratory 011011）または3F（Hochedlinger lab）マウスから単離し、37℃でGluta－MAX、非必須アミノ酸、および10％ウシ胎児血清（FBS）を含有するDMEM（Invitrogen）によって培養した。WT 4FおよびWT 3FマウスのEFをP3まで継代し、指示されている時間の期間に渡って培養培地上でドキシサイクリン（2mg/ml）によって処置した。
SH－SY5Y神経芽腫細胞はアメリカンタイプ（Tissue）カルチャーコレクションから得（ATCC、CRL－2266）、ATCCの推奨に従って維持した。基本的に、細胞はイーグル最小必須培地（EMEM、ATCC、30－2003）およびF12培地（ThermoFisher Scientific、11765054）の1:1混合物によって培養し、10％ウシ胎児血清（FBS、Sigma、F0926）および1×ペニシリン／ストレプトマイシン（ThermoFisher Scientific、15140122）を補った。細胞は37℃で5％CO2および3％O2によって培養した。細胞は～80％コンフルエンシーに到達したときに継代した。
SH－SY5Y細胞をいくつかの改変でもって先に記載されている通りニューロンへと分化させた1，2。手短には、プレーティングの1日後に、3日に渡って、2.5％FBS、1×ペニシリン／ストレプトマイシン、および10μM全トランス型レチノイン酸（ATRA、Stemcell Technologies、72264）を含有するEMEM／F12培地（1:1）（分化培地1）によって細胞を分化させることを開始し、次に、3日に渡って、1％FBS、1×ペニシリン／ストレプトマイシン、および10μM ATRAを含有するEMEM／F12（1:1）（分化培地2）によって細胞を処置した。それから、細胞をポリ－D－リジンによってコーティングされた35mm細胞培養プレートにスプリットした（ThermoFisher Scientific、A3890401）。スプリットの1日後に、少なくとも5日に渡って、1×Glutamax（ThermoFisher Scientific、35050061）、1×ペニシリン／ストレプトマイシン、および50ng/ml BDNF（Alomone labs）を含有する血清不含Neurobasal／B27 plus培養培地（ThermoFisher Scientific、A3653401）（分化培地3）によってニューロンを成熟させた。
神経突起再生アッセイ
SH－SY5Y細胞からの分化したニューロンを細胞あたり106ゲノムコピーでAAV.DJベクターによって形質導入した。形質導入の5日後に、100nMビンクリスチン（Sigma、V8879）を24時間に渡って細胞に追加して、神経突起変性を誘導した。ビンクリスチン処置後に、ニューロンをPBSによって2回洗浄し、新鮮な分化培地3をプレートに再度追加した。ニューロンを神経突起伸長について2～3週に渡って追跡した。位相差画像を100×倍率で3から4日毎に撮った。神経突起面積はImageJを用いて定量した。
細胞周期分析
細胞を収穫し、70％冷エタノールによって16時間に渡って4℃で固定した。固定後に、細胞をPBSによって2回洗浄し、次に、50μg/mLヨウ化プロピジウム（Biotium、40017）および100μg/mL RNase A（Omega）を含有するPBSとのインキュベーションを1時間に渡って室温でした。PI染色されたサンプルをBD LSR IIアナライザーによって分析し、単細胞のみを分析のためにゲーティングした。細胞周期プロファイルをFCS Express 6（De Novo Software）を用いて分析した。
ヒトニューロンのメチル化研究およびエピジェネティックな時計
DNAを製造者の説明書に従ってZymo Quick DNAミニプレッププラスキット（D4069）を用いて細胞から抽出し、DNAメチル化レベルを製造者の説明書に従ってIllumina 850 EPICアレイによって測定した。Illumina BeadChip（EPIC）は、バイサルファイト変換に基づく1CpG分解能のDNAmレベルをヒトゲノム上の異なるCpG部位において測定する。これらのデータはIlluminaメチル化アッセイの標準的なプロトコールを踏襲することによって作り出された。これは、メチル化されたおよびメチル化されていないアレルの間の強度の比を用いてβ値によってメチル化レベルを定量する。具体的には、β値は、メチル化された（シグナルAに対応するM）およびメチル化されていない（シグナルBに対応するU）アレルの強度から、蛍光シグナルの比β=Max(M,0)/[Max(M,0)+Max(U,0)+100]として計算される。それゆえに、β値は0（完全にメチル化されていない）から1（完全にメチル化された）の範囲である。我々は「noob」正規化方法を用いた。これは「minfi」Rパッケージに実装されている（Triche et al., NAR 2013, Fortin et al., Bioinformatics 2017）。皮膚&血液時計（391個のCpGに基づく）の裏にある数理アルゴリズムおよび利用可能なソフトウェアはHorvath et al., Aging 2018において提示されている。
AAV2ウイルス硝子体注射
硝子体注射のためには、成体の動物をケタミン／キシラジン（100/10mg/kg）によって麻酔し、それから、プラスチックチューブを用いてハミルトンシリンジに取り付けられた細管ガラスピペットによって、AAV（1～3μL）を輪部の平行な結膜血管のすぐ後ろ側に硝子体注射した。上昇したIOPのモデルでは、マウスはマイクロビーズ注射の3～4週後の間に1μL硝子体注射を受けた。
視神経挫滅
麻酔された動物の視神経挫滅のためには、AAV注射の2週後に、眼窩内の視神経にアクセスし、Dumont #5ピンセット（FST）を用いて挫滅した。Alexaをコンジュゲーションされたコレラ毒素ベータサブユニット（CTB－555、1mg/ml；1～2μl）注射を安楽死の2～3日前に実施して、再生RGC軸索をトレースした。より詳細な手術の方法はPark et al., Science, 2008. 322(5903): p.963－6によって記載されている。
インビボのドキシサイクリン誘導または抑制
網膜におけるTet－On系の誘導またはTet－Off系の抑制は飲料水中のドキシサイクリンヒクラート（2mg/ml）（Sigma）の投与によって実施した。全身のTet－On系の誘導は飲料水中のドキシサイクリン（1mg/ml）（USPグレード、MP Biomedicals、0219895505）の投与によって実施した。
軸索再生定量
視神経の再生軸索数は、先に記載されている通り、挫滅部位からの異なる距離におけるCTB標識された軸索数をカウントすることによって推定した（Park, K.K., et al., Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science, 2008. 322(5903): p.963－6）。
ホールマウント視神経調製
視神経および接続する交叉をメタノール中で5minに渡って脱水し、それからVisikol（登録商標）HISTO－l（商標）と一晩インキュベーションした。次の日に、神経をVisikol（登録商標）HISTO－2（商標）に移入し、それから3hrに渡ってインキュベーションした。最終的に、視神経および接続する交叉をVisikol（登録商標）HISTO－2（商標）によってマウントした。
免疫蛍光
ホールマウント網膜をウマ血清によって4℃一晩ブロッキングし、それから、一次抗体と3日に渡って4℃でインキュベーションした：PBS、BSA（3％）、Triton X－100（0.5％）によって希釈されたマウス抗Oct4（1:100、BD bioscience、611203）、ウサギ抗Sox2（1:100、Cell signaling、14962）、ヤギ抗Klf4（1:100、R&D Systems、AF3158）、ウサギ抗Brn3a（1:200、EMD Millipore、MAB1585）、およびモルモット抗RBPMS（1:400、ペプチドGGKAEKENTPSEANLQEEEVRCに対するRaygeneカスタムオーダーA008712）。それから、組織を、一次抗体と同じブロッキング溶液によって希釈された適当なAlexa Fluorコンジュゲート二次抗体（Alexa 405、488、567、674；Invitrogen）と4℃で一晩インキュベーションした。一般的に1:400最終希釈で用いた。切片染色のためには、4℃で一晩の一次、それから室温で2hに渡る二次であった。切片またはホールマウント網膜をVECTASHIELDアンチフェードマウント媒体によってマウントした。
ウエスタンブロット
SDS－PAGEおよびウエスタンブロット分析は標準的な手続きに従って実施し、ECL検出キットによって検出した。用いた抗体：ウサギ抗Sox2（1:100、EMD Millipore、AB5603）、マウス抗Klf4（1:1000、ReproCell、09－0021）、ウサギ抗p－S6（S240/244）（1:1000、CST、2215）、マウス抗S6（1:1000、CST、2317）、マウス抗β－チューブリン（1:1000、Sigma－Aldrich、05－661）、マウス抗β－アクチン－ペルオキシダーゼ抗体（1:20,000、Sigma－Aldrich、A3854）。
RGC生存およびリン酸化S6シグナル
抗RBPMS抗体によってホールマウント網膜を免疫染色した後に、神経節層のRBPMS陽性細胞を蛍光顕微鏡を用いてカウントした。網膜あたりトータルで4つのランダムなフィールドを計数した。フィールドあたりの平均数を決定し、未傷害の対側の網膜から決定された値を比較することによって、生存可能なRGCのパーセンテージを得た。同じ条件で、リン酸化S6染色後に、未傷害の対側の網膜からの値を比較することによって、リン酸化S6陽性のRGCの密度を得た。
RGC濃縮
網膜を新鮮解剖し、パパインを用いてAMES培地中で解離させ、それから、慎重にトリチュレーションし、Thy1.2－PE－Cy7抗体（Invitrogen 25－0902－81）およびCalcine Blue生死細胞染色剤によって染色し、それから、130μmノズルを用いてBD FACS Ariaによってフローソーティングして、10,000超のThy1.2+およびClacine Blue+細胞を収集した（トータルの事象の1～2％）。凍結した細胞をRNA抽出およびウルトラローインプットRNA－seqシーケンシングのためにGenewizに、またはDNA抽出およびウルトラローインプットRRBSシーケンシングのためにZymo researchに送付した。
古典的なRRBSライブラリー調製
DNAをQuick－DNA Plus Kitミニプレップキットを用いて抽出した。2～10ngの出発インプットゲノムDNAを30単位のMspI（NEB）によって消化した。断片を、Illuminaの規定のガイドラインに従ってシトシンの代わりに5’－メチルシトシンを含有する予めアニーリングされたアダプターにライゲーションした。サイズが>=50bpのアダプターライゲーションされた断片をDNA Clean & Concentrator（商標）－5（Cat#：D4003）を用いて回収した。それから、断片をEZ DNA Methylation－Lightning（商標）キット（Cat#：D5030）を用いてバイサルファイト処置した。調製スケールのPCRを実施し、もたらされた産物は、2×125bp PEを用いるIllumina HiSeqによるシーケンシングのためにDNA Clean & Concentrator（商標）－5（Cat#: D4003）によって精製した。
マウスRGCのDNAメチル化年齢分析
リードをtrim galore v0.4.1を用いてフィルタリングし、Bismark nq.15.0を用いてマウスゲノムGRCm38に対してマッピングした。各CpG部位の両方の位置におけるメチル化カウントを組み合わせた。全てのサンプルでカバーされたCpG部位のみを分析に考慮した。これはトータルで708156部位をもたらした。rDNAメチル化時計のためには、リードをBK000964に対してマッピングし、座標をしかるべく調整した（Wang et al., Genome Res 29, 325－333, doi:10.1101/gr.241745.118 (2019)）。rDNA時計では、全ライフスパン多組織時計の102／435部位（Meer et al., Elife 7, doi:l0.7554/eLife.40675 (2018)）、または2つの全ライフスパン多組織時計の248／582および77,342／193,651部位（リッジ）（Thompson et al., Aging (Albany NY) 10, 2832－2854, doi: 10.18632/aging.101590 (2018)）と比較して、70／72部位がカバーされた。
上昇したIOPのマイクロビーズによって誘導されるマウスモデル
マウスを、プロパラカイン（0.5％；Bausch & Lomb、タンパ、FL）外用によって補ったケタミン（100mg/kg；Ketaset；Fort Dodge Animal Health、フォートドッジ、IA）およびキシラジン（9mg/kg；TranquiVed；Vedco, Inc.、セントジョセフ、MO）の混合物の腹腔内注射によって麻酔した。先に報告された通り、手術用顕微鏡下における各動物の右前眼房へのポリスチレンマイクロビーズ（FluoSpheres；Invitrogen、カールスバッド、CA；15μm直径）の注射によって、IOPの上昇を片側に誘導した（Krishnan et al., J Immunol, 2016. 197(12): p. 4626－4638）。手短には、マイクロビーズを5.0×106ビーズ/mLの濃度で無菌生理食塩水中に調製した。右の角膜を尖ったガラスマイクロピペット（World Precision Instruments Inc.、サラソータ、FL）を用いて中心近くにおいて穏やかに穿孔した。2μL体積のマイクロビーズを予め形成された穴から前房に注射し、次に、ハミルトンシリンジと接続したマイクロピペットによって気泡の注射をした。炎症の徴候（角膜の曇り、角膜浮腫など）を発生したいずれかのマウスは研究から除外した。
IOP（眼圧）測定
IOPは先に記載されている通りTonoLabリバウンドトノメータ（Colonial Medical Supply、エスポー、フィンランド）によって測定した（Krishnan et al., J Immunol, 2016. 197(12): p. 4626－4638；Mukai et al., PLoS One, 2019. 14(1): p. e02087l3）。マウスを、精密気化器によって送達される100％酸素中の3％イソフルラン（誘導）、次に100％酸素中の1.5％イソフルラン（維持）によって麻酔した。IOP測定は足指ピンチ反射または尾ピンチ応答の喪失後の2から3min以内に開始した。麻酔されたマウスをプラットフォーム上に置き、圧力センサーの先端を中心角膜からおよそ1/8インチに置いた。平均IOPは、6つの測定後に、最も高いおよび最も低い値の抹消後に自動的に呈示された。機械によって作り出された平均を1つの読み取りと考慮し、6つの読み取りを各眼について得た。日中のIOPの変動を原因として、全てのIOPは同じ時刻に（10:00および12:00時間の間に）取られた。
視運動反応
視運動反射に基づく空間周波数閾値試験を用いて、マウスの視力を測定した（Gao et al., Am J Pathol, 2016. 186(4): p.985－1005；Sun et al., Glia, 2013. 61(8): p.1218－1235）。マウスは自由に動くことができ、四角形に並べられた4つのコンピュータモニターによって形成される面積の中央に所在する台座上に置かれた。モニターは動く垂直の白黒の正弦格子パターンを呈示した。動くバーの方向を見ることができない目隠しされた観察者がマウスのトラッキング挙動をモニタリングした。バーの方向への頭部の運動（運動反応）または刺激と一致する方向の体の回転があるときには、トラッキングが陽性と考慮された。各眼は格子の回転の方向に依存して別個に試験された。階段法を用いて、出発0.15から0.40サイクル/degの空間周波数を決定した。インターバルは0.05サイクル/degである。回転スピード（12°/s）およびコントラスト（100％）は一定に保った。応答は、動物の群および処置について目隠しされた者によって処置の前および後に測定された。
パターン網膜電図（pERG）
マウスをケタミン／キシラジン（100mg/kgおよび20mg/kg）によって麻酔し、瞳孔を一滴の1％トロピカミド眼用溶液によって散大させた。マウスは体温を37℃に維持するビルトインの加温プレート上に置かれ（Celeris、齧歯類モデルのための全視野およびパターン刺激）、術中は弱い赤色光下に保たれた。1°のチェックサイズを有する白黒の反転格子縞パターンの視覚刺激を、両眼の眼表面に直接的に置かれかつ瞳孔とセンタリングされた光ガイド電極スティミュレータによって呈示した。視覚刺激は98％コントラストおよび50cd/m2という一定の平均輝度、空間周波数：0.05cyc/deg；時間周波数：1Hzで提示した。pERGのトータルで300の完全なコントラスト反転を各眼に2回繰り返し、600サイクルをセグメント化し、平均および記録した。平均したPERGを分析して、ピークからトラフのN1からP1（陽性波）振幅を評価した。
視神経軸索の定量
軸索の定量のためには、視神経を解剖し、カルノブスキー試薬（リン酸緩衝液中に50％）によって一晩固定した。神経の準超薄断面を眼球の1.0mm後ろ側において取り、光学顕微鏡法による評価のために1％ p－フェニレンジアミン（PPD）によって染色した。視神経断面を60×倍率でニコン顕微鏡（Eclipse E800、ニコン、日本国）を用いてDPControllerソフトウェア（オリンパス、日本国）によってイメージングし、6～8つのオーバーラップしない光学顕微鏡写真を撮って、各視神経断面の面積全体をカバーした。ImageJ（バージョン2.0.0－rc－65/1.5lu）を用いて、100μM×100μM正方形を各60×画像上に置き、正方形（0.01mm2）内の全ての軸索を、先に記載されている通りImageJのThresholdおよびAnalyze Particles機能を用いてカウントした（Krishnan et al., J Immunol, 2016. 197(12): p.4626－4638；Mukai et al., PLoS One, 2019. 14(1): p.e02087l3；Gao et al., Am J Pathol, 2016. 186(4): p.985－1005）。ダメージを受けた軸索はPPDによって暗く染色し、カウントしない。6～8画像の平均軸索カウントを用いて、視神経の平方ミリメートルあたりの軸索密度を計算した。実験群について目隠しされた者が全ての軸索カウントを実施した。
網膜神経節細胞の定量
神経節細胞カウントのためには、ホールマウント網膜の画像をLeica TCS SP5共焦点顕微鏡（Leica Microsystems）の63×油浸対物を用いて取得した。網膜ホールマウントを4つの四分円に分割し、3から4画像（サイズ248.53μm掛ける248.53μm）を各四分円の中間周辺および周辺領域から取り、トータルで網膜あたり12から16画像を中間周辺および周辺領域から取った（四分円あたり4画像）。画像をzスタック（0.5μm）として得、各画像の神経節細胞層の全てのBrn3a陽性細胞を先に記載されている通り人手でカウントした（Gao et al., Am J Pathol, 2016. 186(4): p. 985－1005）。手短には、Fiji is Just ImageJソフトウェア（ImageJ Fiji、バージョン2.0.0－rc－69/1.52n）の「Cell Counter」プラグイン（fiji.sc/Cell_Counter）を用いて、RGCをカウントした。各画像をFijiにローディングし、各画像（0.025mm2）中の全てのBrn3a染色RGCをマークするようにカラーカウンター型を選んだ。12から16画像の平均RGC数を用いて、網膜の平方ミリメートルあたりのRGC密度を計算した。実験群について目隠しされた2者が全てのRGCカウントを実施した。
トータルRNA抽出およびサンプルQC
トータルRNAをトリゾール試薬ユーザーガイド（Thermo Fisher Scientific）を踏襲して抽出した。1ulの10mg/mlグリコーゲンを上清に追加して、RNA回収を増大させた。RNAをQubit 2.0フルオロメーター（Life Technologies、カールスバッド、CA、USA）を用いて定量し、RNAインテグリティーをTapeStation（Agilent Technologies、パロアルト、CA、USA）によってチェックして、濃度が要求を満たすかどうかを見た。
ウルトラローインプットRNAライブラリー調製およびマルチプレックス化
RNAサンプルをQubit 2.0フルオロメーター（Life Technologies、カールスバッド、CA、USA）を用いて定量し、RNAインテグリティーを2100 TapeStation（Agilent Technologies、パロアルト、CA、USA）によってチェックした。RNAライブラリー調製、シーケンシング反応、および初段のバイオインフォマティクス分析をGENEWIZ, LLC.（サウスプレーンフィールド、NJ、USA）において行った。シーケンシングのためのSMART－Seq v4ウルトラローインプットキットを全長cDNA合成および増幅に用い（Clontech、マウンテンビュー、CA）、Illumina Nextera XTライブラリーをシーケンシングライブラリー調製に用いた。手短には、cDNAを断片化し、トランスポゼースを用いてアダプターを追加し、次に、限定されたサイクルのPCRをして、cDNA断片を濃縮し、インデックスを追加した。最終的なライブラリーはQubit 2.0フルオロメーターおよびAgilent TapeStationによって査定した。
2×150bp PEシーケンシング
シーケンシングライブラリーをマルチプレックス化し、フローセルの2つのレーンにクラスター化した。クラスター化後に、フローセルを製造者の説明書に従ってIllumina HiSeq装置にローディングした。サンプルを2×150ペアエンド（PE）構成を用いてシーケンシングした。画像分析およびベースコールはHiSeq装置上でHiSeqコントロールソフトウェア（HCS）によって行った。Illumina HiSeqから作り出された生の配列データ（.bclファイル）をfastqファイルに変換し、Illumina bcl2fastq v. 2.17プログラムを用いてデマルチプレックス化した。インデックス配列同定のためには、1つのミスマッチを許した。
RNA－seq分析
ペアエンドリードをhisat2 v2.1.0によってEnsembl GRCm38プライマリアセンブリに対してEnsemblリリース84アノテーションからのスプライスジャンクションを用いてアライメントした。ペアードリードカウントをfeatureCounts v1.6.4を用いて定量した。MAPQ>=20を有するリードを用いた。各ペアワイズ比較の差次的に（diffentially）発現された遺伝子をedgeR v3.26によって同定した。少なくとも3つのサンプルにおいて少なくとも0.1カウント・パー・ミリオン（CPM）を有する遺伝子のみを検査した。差次的に発現された遺伝子の遺伝子オントロジー分析をAmiGO v2.5.12によって実施した。年齢に関連した感覚知覚遺伝子を、マウス感覚知覚（G0:0007600）カテゴリー遺伝子オントロジーデータベースから抽出した。12対5月齢マウスにおいて差次的に発現された遺伝子を包含し（q<=0.05）、コントロールウイルス単独によって誘導された遺伝子は除外した（q<=0.1）。
表6．例16に用いられたAAVベクター
Figure 2022511373000013
 表7．プライマー
Figure 2022511373000014
 表8．RT－PCRに用いられたプライマー
Figure 2022511373000015
 例17．配列の限定しない例
Mus musculus OCT4（停止コドンなし）をコードするヌクレオチド配列（配列番号1）：
Figure 2022511373000016
Mus musculus OCT4をコードするアミノ酸配列（配列番号2）：
Figure 2022511373000017
Figure 2022511373000018
Mus musculus SOX2（停止コドンなし）をコードするヌクレオチド配列（配列番号3）：
Figure 2022511373000019
Mus musculus SOX2（翻訳）をコードするアミノ酸配列（配列番号4）：
Figure 2022511373000020
Mus musculus KLF4（停止コドンなし）をコードするヌクレオチド配列（配列番号5）：
Figure 2022511373000021
Mus musculus KLF4（翻訳）をコードするアミノ酸配列（配列番号6）：
Figure 2022511373000022
Figure 2022511373000023
TRE3Gプロモーター配列（TREプロモーターの限定しない例）（配列番号7）：
Figure 2022511373000024
SV40由来のターミネーター配列（配列番号8）：
Figure 2022511373000025
T2A配列（配列番号9）：GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
rtTA3（3'末端に2つのVP16ドメインを有する）をコードするヌクレオチド配列（配列番号10）：
Figure 2022511373000026
Figure 2022511373000027
rtTA3をコードするアミノ酸配列（配列番号11）：
Figure 2022511373000028
rtTA4（3'末端に3つのVP16ドメインを有する）をコードするヌクレオチド配列（配列番号12）：
Figure 2022511373000029
rtTA4をコードするアミノ酸配列（配列番号13）：
Figure 2022511373000030
Figure 2022511373000031
M2－rtTAをコードするヌクレオチド配列（配列番号14）：
Figure 2022511373000032
M2－rtTAをコードするアミノ酸配列（配列番号15）：
Figure 2022511373000033
Figure 2022511373000034
pAAV－TRE3G－OSK－SV40pA、TRE－OSK－SV40、またはTRE3G－OSK－SV40pAベクターの核酸配列（配列番号16）：
Figure 2022511373000035
Figure 2022511373000036
Figure 2022511373000037
Figure 2022511373000038
Figure 2022511373000039
pAAV－UBC－rtTA4－WPRE3－SV40pAベクターの核酸配列（配列番号17）：
Figure 2022511373000040
Figure 2022511373000041
Figure 2022511373000042
Figure 2022511373000043
UBCプロモーター配列（配列番号18）：
Figure 2022511373000044
Figure 2022511373000045
Tet－O配列（配列番号19）：TCCCTATCAGTGATAGAGA
最小CMVプロモーターをコードする核酸配列（配列番号20）：
Figure 2022511373000046
WPREをコードする核酸配列（配列番号21）：
Figure 2022511373000047
末端逆向きリピート配列をコードする核酸配列（配列番号22）：
Figure 2022511373000048
TRE2プロモーター（TREプロモーターの限定しない例）の核酸配列（配列番号23）：
Figure 2022511373000049
Ptightプロモーター（TREプロモーターの限定しない例）の核酸配列（配列番号24）：
Figure 2022511373000050
TetRをコードする核酸配列（配列番号25）：
Figure 2022511373000051
TetRをコードするアミノ酸配列（配列番号26）：
Figure 2022511373000052
TetR－Krabをコードする核酸配列（配列番号27）：
Figure 2022511373000053
Figure 2022511373000054
TetR－KRABをコードするアミノ酸配列（配列番号28）：
Figure 2022511373000055
Desminプロモーター（配列番号29）：
Figure 2022511373000056
Figure 2022511373000057
Desmin－rtTA4ベクター（配列番号30）：
Figure 2022511373000058
Figure 2022511373000059
Figure 2022511373000060
Figure 2022511373000061
pAAV2_CMV_rtTA（V16）（配列番号31）：
Figure 2022511373000062
Figure 2022511373000063
Figure 2022511373000064
Figure 2022511373000065
CAG－tTA（配列番号32）：
Figure 2022511373000066
Figure 2022511373000067
Figure 2022511373000068
Figure 2022511373000069
pAAV－Tet－O－OSK－SV40LpA（またはpAAV－TRE2－OSK－SV40LpA）（配列番号33）：
Figure 2022511373000070
Figure 2022511373000071
Figure 2022511373000072
Figure 2022511373000073
Figure 2022511373000074
VP64、4リピートのVP16（配列番号34）（トランス活性化ドメインの限定しない例）：
Figure 2022511373000075
P65（配列番号35）（トランス活性化ドメインの限定しない例）：
Figure 2022511373000076
Figure 2022511373000077
RTA（配列番号36）（トランス活性化ドメインの限定しない例）：
Figure 2022511373000078
MPH MS2－P65－HSF1（配列番号37）（トランス活性化ドメインの限定しない例）：
Figure 2022511373000079
Figure 2022511373000080
OCT4－2A－SOX2－2A－KLF4（それぞれが2Aペプチドによって分離されたヒトOCT4、ヒトSOX2、およびヒトKLF4をコードする核酸配列の限定しない例）（配列番号38）：
Figure 2022511373000081
Figure 2022511373000082
Figure 2022511373000083
OCT4－2A－SOX2－2A－KLF4（それぞれが2Aペプチドによって分離されたヒトOCT4、ヒトSOX2、およびヒトKLF4をコードするアミノ酸配列の限定しない例）（配列番号39）：
Figure 2022511373000084
Figure 2022511373000085
ヒトOCT4核酸配列（ヒトOCT4をコードする核酸配列の限定しない例）（配列番号40）：
Figure 2022511373000086
ヒトOCT4アミノ酸配列（ヒトOCT4をコードするアミノ酸配列の限定しない例）（配列番号41）：
Figure 2022511373000087
ヒトSOX2核酸配列（ヒトSOX2をコードする核酸配列の限定しない例）（配列番号42）：
Figure 2022511373000088
ヒトSOX2アミノ酸配列（ヒトSOX2をコードするアミノ酸配列の限定しない例）（配列番号43）：
Figure 2022511373000089
ヒトKLF4（ヒトKLF4をコードするヌクレオチド配列の限定しない例）（配列番号44）：
Figure 2022511373000090
Figure 2022511373000091
ヒトKLF4（ヒトKLF4をコードするアミノ酸配列の限定しない例）（配列番号45）：
Figure 2022511373000092
ヒトRCVRN（recoverin）プロモーター（ヒトRCVRN（recoverin）プロモーターの限定しない例）（配列番号46）：
Figure 2022511373000093
RSVプロモーター（RSVプロモーターの限定しない例）（配列番号47）：
Figure 2022511373000094
CMVプロモーター（CMVプロモーターの限定しない例）（配列番号48）：
Figure 2022511373000095
Figure 2022511373000096
EFSプロモーター（EFSプロモーターの限定しない例）（配列番号49）：
Figure 2022511373000097
ヒトGRK1（ロドプシンキナーゼ）プロモーター（ヒトプロモーターの限定しない例）（配列番号50）：
Figure 2022511373000098
ヒトCRX（錐体桿体ホメオボックス転写因子）プロモーター（ヒトCRXプロモーターの限定しない例）（配列番号51）：
Figure 2022511373000099
ヒトNRLプロモーター（ヒトTK末端プロモーターの上流の神経網膜ロイシンジッパー転写因子エンハンサー）（ヒトNRLプロモーターの限定しない例）（配列番号52）：
Figure 2022511373000100
ヒト赤色オプシンプロモーター（hredプロモーター）（配列番号101）：
Figure 2022511373000101
ヒトロドプシンプロモーター（rhoプロモーター）（配列番号102）：
Figure 2022511373000102
マウス錐体アレスチンプロモーター（mcarプロモーター）（配列番号103）：
Figure 2022511373000103
Figure 2022511373000104
ヒトロドプシンキナーゼプロモーター（hrkプロモーター）（配列番号104）：
Figure 2022511373000105
TRE－ヒトOSK－SV40（配列番号105）：
Figure 2022511373000106
Figure 2022511373000107
Figure 2022511373000108
Figure 2022511373000109
Figure 2022511373000110
EFS－ヒトOSK－SV40（配列番号106）：
Figure 2022511373000111
Figure 2022511373000112
Figure 2022511373000113
Figure 2022511373000114
Figure 2022511373000115
TRE－Fluc－SV40（配列番号107）：
Figure 2022511373000116
Figure 2022511373000117
Figure 2022511373000118
Figure 2022511373000119
マウスKDM1aに対するshRNA（配列番号108）：
Figure 2022511373000120
ヒトTet1－1に対するshRNA（配列番号109）：
Figure 2022511373000121
ヒトTet1－2に対するshRNA（配列番号110）：
Figure 2022511373000122
ヒトTet3－1に対するshRNA（配列番号111）：
Figure 2022511373000123
ヒトTet3－2に対するshRNA（配列番号112）：
Figure 2022511373000124
マウスTet1－2に対するshRNA（配列番号113）：
Figure 2022511373000125
マウスTet1－1に対するshRNA（配列番号114）：
Figure 2022511373000126
マウスおよびヒトTet2両方に対するshRNA（配列番号115）：
Figure 2022511373000127
マウスTet3に対するshRNA（配列番号116）：
Figure 2022511373000128
スクランブル配列に対するshRNA（ゲノム上に標的なし）（配列番号117）：
Figure 2022511373000129
P2Aをコードするアミノ酸配列（配列番号118）：
Figure 2022511373000130
P2Aをコードする核酸配列（配列番号119）：
Figure 2022511373000131
T2Aをコードする核酸配列（配列番号120）：
Figure 2022511373000132
配列番号121：
Figure 2022511373000133
Figure 2022511373000134
Figure 2022511373000135
Figure 2022511373000136
Figure 2022511373000137
Thy1.2プロモーター（RGC特異的）（配列番号122）：
Figure 2022511373000138
Figure 2022511373000139
Figure 2022511373000140
Figure 2022511373000141
Figure 2022511373000142
 追加の態様
態様1．方法であって、細胞、組織、臓器および／または対象において：
（i）OCT4発現；
（ii）SOX2発現；および
（iii）KLF4発現；
を誘導することを、c－MYC発現を誘導することの不在下において含む。
態様2．態様1の方法であって、OCT4発現は：
（i）OCT4をコードするかまたはOct4の内因性の座位のプロモーターもしくはエンハンサーを標的化するCas9融合蛋白質（CRISPR活性化因子）およびガイドRNA配列をコードする、第1の操作された核酸（任意に、第1の核酸（例えば、操作された核酸）はRNAおよび／またはDNAを含む）；
（ii）OCT4発現を誘導する化学的因子；
（iii）OCT4発現を誘導する抗体；または
（iv）OCT4をコードする操作された蛋白質、
を投与することによって誘導され、
任意に、OCT4は、配列番号2または配列番号41と少なくとも70％同一である配列を含む。
態様3．態様1～2のいずれか1つの方法であって、SOX2発現は：
（v）SOX2をコードする、SOX2の内因性の座位のプロモーターまたはエンハンサーを標的化するCas9融合蛋白質（CRISPR活性化因子）およびガイドRNA配列をコードする、第2の操作された核酸（第2の操作された核酸はRNAおよび／またはDNAを含む）；
（vi）SOX2発現を誘導する化学的因子；
（vii）SOX2発現を誘導する抗体；または
（viii）SOX2をコードする操作された蛋白質、
を投与することを含み、
任意に、SOX2は、配列番号4または配列番号43と少なくとも70％同一である配列を含む。
態様4．態様1～3のいずれか1つの方法であって、KLF4発現は：
（ix）KLF4をコードする、KLF4の内因性の座位のプロモーターまたはエンハンサーを標的化するCas9融合蛋白質（CRISPR活性化因子）およびガイドRNA配列をコードする、第3の操作された核酸（第3の核酸（例えば、操作された核酸）はRNAおよび／またはDNAを含む）；
（ix）KLF4発現を誘導する化学的因子；
（xi）KLF4発現を誘導する抗体；または
（xii）KLF4をコードする操作された蛋白質、
を投与することを含み、
任意に、KLF4は、配列番号6または配列番号45と少なくとも70％同一である配列を含む。
態様5．態様2～4のいずれか1つの方法であって、前記の第1、第2、第3の操作された核酸、またはそれらの組み合わせは発現ベクター上に存在するかまたは発現ベクター上に存在せず、任意に、第1、第2、第3の操作された核酸はmRNAまたはプラスミドDNAである。
態様6．態様5の方法であって、前記の第1、第2、および第3の操作された核酸の2つまたは3つは同じ発現ベクター上に存在する。
態様7．態様1～5のいずれか1つの方法であって、前記の第1、第2、および第3の操作された核酸は別個の発現ベクター上に存在する。
態様8．態様5～7のいずれか1つの方法であって、前記の発現ベクター（単数または複数）は、第1、第2、第3の操作された核酸、またはそれらの組み合わせに作動可能に連結された誘導性プロモーターを包含し、任意に、前記の方法はさらに誘導因子を投与することを含む。
態様9．態様8の方法であって、前記のプロモーターはテトラサイクリン応答性エレメント（TRE）を含む。
態様10．態様9の方法であって、誘導因子の投与は、誘導因子をコードする蛋白質または第4の操作された核酸を投与することを含み、任意に、第4の操作された核酸は第1、第2、および第3の操作された核酸と同時に導入される。
態様11．態様10の方法であって、第4の操作された核酸は、第1、第2、および第3の操作された核酸とは別個の発現ベクター上に存在する。
態様12．態様10の方法であって、第4の操作された核酸は、第1、第2、および第3の操作された核酸の少なくとも１つと同じ発現ベクター上に存在する。
態様13．態様9～12のいずれか1つの方法であって、誘導因子は、テトラサイクリンの存在下において誘導性プロモーターからの第1、第2、第3の操作された核酸、またはそれらの組み合わせの発現を誘導することができ、方法はさらにテトラサイクリンを投与することおよび／またはテトラサイクリンを除去することを含み、任意に、テトラサイクリンはドキシサイクリンである。
態様14．態様13の方法であって、誘導因子はリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（rtTA）である。
態様15．態様14の方法であって、rtTAはM2－rtTAまたはrtTA3である。
態様16．態様15の方法であって、M2－rtTAが配列番号15と少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはrtTA3が配列番号11と少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を含む。
態様17．態様9～12のいずれか1つの方法であって、誘導因子は、テトラサイクリンの不在下において誘導性プロモーターからの第1、第2、第3の操作された核酸、またはそれらの組み合わせの発現を誘導することができ、任意に、テトラサイクリンはドキシサイクリンである。
態様18．態様17の方法であって、誘導因子は温度、化学物質、pH、核酸、蛋白質であり、任意に、蛋白質はテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（tTA）である。
態様19．態様11または13～18のいずれか1つの方法であって、第1、第2、および第3の操作された核酸は第1の発現ベクター上に存在し、第4の操作された核酸は第2の発現ベクター上に存在する。
態様20．態様9～19のいずれか1つの方法であって、プロモーターはTRE3G、TRE2プロモーター、またはPtightプロモーターであり、任意に、プロモーターは配列番号7と少なくとも70％同一である操作された核酸配列を含み、任意に、プロモーターは配列番号23と少なくとも70％同一である操作された核酸配列を含み、任意に、プロモーターは配列番号24と少なくとも70％同一である配列を含む。
態様21．態様1～7または10～20のいずれか1つの方法であって、前記の発現ベクター（単数または複数）は、第1、第2、第3、第4の操作された核酸、またはそれらのいずれかの組み合わせに作動可能に連結された恒常的プロモーターを含む。
態様22．態様21の方法であって、恒常的プロモーターは、第1、第2、または第3の操作された核酸ではなく第4の操作された核酸に作動可能に連結され、任意に、恒常的プロモーターはCP1、CMV、EF1アルファ、SV40、PGK1、Ubc、ヒトベータアクチン、CAG、Ac5、ポリヘドリン、TEF1、GDS、CaM35S、Ubi、H1、およびU6プロモーター、または組織特異的なプロモーターである。
態様23．態様19～22の方法であって、第1の発現ベクターは配列番号16によって提供される配列を含み、任意に、第2の発現ベクターは配列番号31または配列番号32によって提供される配列を含む。
態様24．態様2～23のいずれか1つの方法であって、（i）～（xii）の少なくとも１つはウイルスベクターによって送達されるかまたはウイルスベクターなしで送達され、ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターからなる群から選択され、任意に、ウイルスベクターなしの送達は、裸の核酸の投与、エレクトロポレーション、ナノ粒子の使用、またはリポソームの使用を含む。
態様25．態様19～24のいずれか1つの方法であって、第1の発現ベクターは第1のウイルスベクターであり、第2の発現ベクターはウイルスベクターであり、任意に、第１および第2のウイルスベクターはAAVベクターである。
態様26．態様1～25のいずれか1つの方法であって、少なくとも１つの操作された核酸は、配列番号8と少なくとも70％同一である配列を包含するSV40由来の配列を含む。
態様27．態様1～26のいずれか1つの方法であって、OCT4、KLF4、またはSOX2は哺乳類蛋白質である。
態様28．態様1～27のいずれか1つの方法であって、細胞または組織は対象内にあり、対象は状態を有するか、状態を有することを疑われるか、または状態のリスクがあり、任意に、状態は眼疾患、加齢、癌、筋骨格系疾患、加齢性疾患、非ヒト動物を冒す疾患、および神経変性疾患からなる群から選択される。
態様29．態様1～28のいずれか1つの方法であって、方法は、さらに：細胞リプログラミング、組織修復、組織生存、組織再生、組織成長、組織機能、臓器再生、臓器生存、臓器機能、疾患、またはそれらのいずれかの組み合わせを制御することを含み、任意に、制御することは、細胞リプログラミングを誘導すること、加齢を逆行させること、組織機能を改善すること、臓器機能を改善すること、組織修復、組織生存、組織再生、組織成長、血管新生を促進すること、疾患を処置すること、瘢痕形成を縮減すること、加齢の外見を縮減すること、臓器再生を促進すること、臓器生存を促進すること、動物に由来する農産物の味および品質を変改すること、疾患を処置すること、またはそれらのいずれかの組み合わせを、エクスビボでまたはインビトロで含み、任意に、疾患を処置することは、疾患の発症に先立ってOCT4、KLF4、および／またはSOX2の発現を誘導することを含むか、または疾患を処置することは、疾患の発症後にOCT4、KLF4、および／またはSOX2の発現を誘導することを含む。
態様30．態様29の方法であって、細胞または組織は、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸からであり、任意に、組織はダメージを受けるか、または組織は、健康だが、現在のまたは将来の条件における性能もしくは生存にとって最適ではないと考慮され得る。
態様31．態様1～30のいずれか1つの方法であって、操作された核酸はさらに自己切断ペプチドを含み、任意に、自己切断ペプチドは配列番号9と少なくとも70％同一である2Aペプチドである。
態様32．態様1～31のいずれか1つの方法であって、操作された核酸は、さらに、第1の核酸、第2の核酸、第3の核酸、またはそれらの組み合わせをフランキングする末端逆向きリピート（ITR）を含み、任意に、ITR間の距離は4.7kb以下である。
態様33．発現ベクターであって：
（i）OCT4をコードする第1の操作された核酸；
（ii）SOX2をコードする第2の操作された核酸；および
（iii）KLF4をコードする第3の操作された核酸、
を、c－MYCを発現することができる操作された核酸の不在下に含む。
態様34．態様33の発現ベクターであって、OCT4蛋白質は、配列番号2または配列番号41と少なくとも70％同一である配列を含む。
態様35．態様33～34のいずれか1つの発現ベクターであって、SOX2蛋白質は、配列番号4または配列番号43と少なくとも70％同一である配列を含む。
態様36．態様33～35のいずれか1つの発現ベクターであって、KLF4蛋白質は、配列番号6または配列番号45と少なくとも70％同一である配列を含む。
態様37．態様33～36のいずれか1つの発現ベクターであって、さらに、第1、第2、第3の操作された核酸、またはそれらのいずれかの組み合わせに作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む。
態様38．態様37の発現ベクターであって、誘導因子が、テトラサイクリンの存在下において誘導性プロモーターからの第1、第2、第3の操作された核酸、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を誘導することができ、任意に、テトラサイクリンはドキシサイクリンである。
態様39．態様38の発現ベクターであって、誘導因子はリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（rtTA）である。
態様40．態様39の発現ベクターであって、rtTAはM2－rtTAまたはrtTA3である。
態様41．態様40の発現ベクターであって、M2－rtTAは配列番号15と少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはrtTA3は配列番号11と少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を含む。
態様42．態様38～41のいずれか1つの発現ベクターであって、誘導因子は、テトラサイクリンの不在下において誘導性プロモーターからの第1、第2、第3の操作された核酸、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を誘導することができ、任意に、テトラサイクリンはドキシサイクリンである。
態様43．態様42の発現ベクターであって、誘導因子はテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（tTA）である。
態様44．態様37～43のいずれか1つの発現ベクターであって、誘導性プロモーターはテトラサイクリン応答性エレメント（TRE）を含み、任意に、プロモーターは、配列番号7と少なくとも70％同一である操作された核酸配列を含むTRE3Gプロモーターであり、任意に、プロモーターは配列番号23と少なくとも70％同一である操作された核酸配列を含み、任意に、プロモーターは配列番号24と少なくとも70％同一である配列を含む。
態様45．態様33～36のいずれか1つの発現ベクターであって、前記の発現ベクター（単数または複数）は、第1、第2、第3の操作された核酸、またはそれらの組み合わせに作動可能に連結された恒常的プロモーターを含む。
態様46．態様33～44のいずれか1つの発現ベクターであって、発現ベクターは配列番号16によって提供される配列を含む。
態様47．態様33～46のいずれか1つの発現ベクターであって、発現ベクターはウイルスベクターであり、ウイルスベクターは、レンチウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターからなる群から選択される。
態様48．態様33～47のいずれか1つの発現ベクターであって、少なくとも１つの操作された核酸は、配列番号8と少なくとも70％同一である配列を包含するSV40由来の配列を含む。
態様49．態様33～48のいずれか1つの発現ベクターであって、OCT4、KLF4、またはSOX2は哺乳類蛋白質である。
態様50．態様33～49のいずれか1つの発現ベクターであって、発現ベクターはさらに自己切断ペプチドを含み、任意に、自己切断ペプチドは2Aペプチドであり、任意に、2Aペプチドは配列番号9と少なくとも70％同一である配列を含む。
態様51．態様37～44および46～50のいずれか1つの発現ベクターであって、発現ベクターは1つの誘導性プロモーターを含む。
態様52．態様45～50のいずれか1つの発現ベクターであって、発現ベクターは1つの恒常的プロモーターを含む。
態様53．態様33～52のいずれか1つの発現ベクターであって、操作された核酸は、さらに、第1の核酸、第2の核酸、第3の核酸、またはそれらの組み合わせをフランキングする末端逆向きリピート（ITR）を含む。
態様54．態様32の発現ベクターであって、ITR間の距離は4.7kb以下である。
態様55．態様47～54のいずれか1つの発現ベクターを含む組み換えウイルスであって、任意に、組み換えウイルスはレトロウイルス、アデノウイルス、AAV、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、またはレンチウイルスである。
態様56．態様1～32、63～66、70～75、81、および85～87の方法のいずれか1つによって生ずる操作された細胞であって、任意に、操作された細胞は態様33～54のいずれか1つの発現ベクターを含む。
態様57．組成物であって、態様33～54のいずれか1つの発現ベクター、態様55の組み換えウイルス、態様56の操作された細胞、OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる化学的因子、OCT4、KLF4、および／またはSOX2からなる群から選択される操作された蛋白質、OCT4、KLF4、および／またはSOX2の発現を誘導することができる抗体を含み、任意に、組成物は薬学的に許容される担体を含む。
態様58．態様57の組成物であって、さらに、誘導因子をコードする第2の発現ベクター、誘導因子をコードする第2の蛋白質、または誘導因子をコードする第2の組み換えウイルスを含み、任意に、第2の発現ベクターはAAVベクターであるか、および／または第2の組み換えウイルスはAAVである。
態様59．態様58の組成物であって、誘導因子はリバーステトラサイクリントランス活性化因子（rtTA）またはテトラサイクリントランス活性化因子（tTA）である。
態様60．態様58～59のいずれか1つの組成物であって、誘導因子はウイルスベクターによってコードされ、任意に、ウイルスベクターはレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターからなる群から選択される。
態様61．態様60の組成物であって、誘導因子をコードするウイルスベクターは、配列番号31または配列番号32によって提出される配列を含む。
態様62．キットであって、態様33～54のいずれか1つの発現ベクター、態様55の組み換えウイルス、態様56の操作された細胞、OCT4、KLF4、および／またはSOX2発現を誘導することができる化学的因子、OCT4、KLF4、および／またはSOX2からなる群から選択される操作された蛋白質、OCT4、KLF4、および／またはSOX2の発現を誘導することができる抗体、あるいは態様56～61のいずれか1つの組成物を含む。
態様63．操作された細胞を生ずる方法であって、態様1～32のいずれか1つの方法を含み、それによって、操作された細胞を生ずる。
態様64．態様63の方法であって、操作された細胞は人工多能性幹細胞である。
態様65．態様63～64のいずれか1つの方法であって、操作された細胞は態様56の細胞である。
態様66．操作された細胞を生ずる方法であって、態様1～32および63～65のいずれか1つの方法を含み、操作された細胞はエクスビボで生ずる。
態様67．態様63～66のいずれか1つの方法であって、さらに、操作された組織または操作された臓器を作り出すことを含む。
態様68．態様66～67のいずれか1つの方法であって、さらに、操作された細胞、操作された組織、および／または操作された臓器をその必要がある対象に投与することを含み、任意に、細胞、組織、および／または臓器は、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸細胞からである。
態様69．態様63～68のいずれか1つの方法であって、方法はさらに疾患を処置することを含み、任意に、疾患は、急性傷害、神経変性疾患、慢性疾患、増殖性疾患、眼疾患、心血管疾患、遺伝子疾患、炎症性疾患、自己免疫（autoimmunue）疾患、神経学的疾患、血液学的疾患、有痛状態、精神障害、代謝障害、慢性疾患、癌、加齢、加齢性疾患、および対象のいずれかの組織を冒す疾患からなる群から選択され、任意に、疾患は眼疾患である。
態様70．方法であって、c－Mycを活性化することの不在下で、細胞、組織、臓器、および／または対象において：
（i）OCT4を活性化すること；
（ii）SOX2を活性化すること；および
（iii）KLF4を活性化すること；
を含む。
態様71．態様71の方法であって、（i）～（iii）のいずれか1つの活性化することは、抗体、蛋白質、核酸、または化学的因子を投与することを含む。
態様72．態様72のいずれか1つの方法であって、核酸、抗体、蛋白質、および／または化学的因子はOCT4、SOX2、および／またはKLF4を代替する。
態様73．態様72の方法であって、代替することは、細胞リプログラミングを促進することを含む。
態様74．態様70～73のいずれか1つの方法であって、（i）～（iii）のいずれか1つの活性化することは、OCT4、SOX2、および／またはKLF4を代替することを含み、抗体、蛋白質、核酸、および化学的因子からなる群から選択される。
態様75．態様74の方法であって、OCT4、SOX2、および／またはKLF4を代替することは、Tet1、NR5A－2、Sall4、E－カドヘリン、NKX3－1、NANOG、および／またはTet2をコードする核酸および／または蛋白質を投与することを含む。
態様76．態様1～32および70～75のいずれか1つの方法であって、対象は健康である。
態様77．態様1～32および70～76のいずれか1つの方法であって、対象は小児科の対象である。
態様78．態様1～32および70～76のいずれか1つの方法であって、対象は成人対象である。
態様79．態様28～32および70～78のいずれか1つの方法であって、対象は、緑内障を有するか、それを有することを疑われるか、またはそのリスクがある。
態様80．態様28～32および70～79のいずれか1つの方法であって、対象は、視力および／または網膜機能の加齢性の衰えを有するか、それを有することを疑われるか、またはそのリスクがある。
態様81．方法であって、Tet1またはTet2をコードする核酸および／または蛋白質を細胞、組織、臓器、および／または対象に投与することを含む。
態様82．態様81の方法であって、対象は疾患を有する。
態様83．態様82の方法であって、疾患は、急性傷害、神経変性疾患、慢性疾患、増殖性疾患、眼疾患、心血管疾患、遺伝子疾患、炎症性疾患、自己免疫（autoimmunue）疾患、神経学的疾患、血液学的疾患、有痛状態、精神障害、代謝障害、慢性疾患、癌、加齢、加齢性疾患、および対象のいずれかの組織を冒す疾患から選択される。
態様84．態様83の方法であって、疾患は眼疾患である。
態様85．態様1～32および63～84のいずれか1つの方法であって、さらに、細胞、組織、臓器および／または対象のリプログラミングの強化因子を活性化することを含む。
態様86．態様1～32および63～85のいずれか1つの方法であって、さらに、細胞、組織、臓器および／または対象のリプログラミングのバリアを阻害することを含む。
態様87．態様86の方法であって、リプログラミングのバリアは、細胞、組織、臓器および／または対象のDNAメチルトランスフェラーゼ（DNMT）である。
態様88．方法であって、対象において：
（i）OCT4発現；
（ii）SOX2発現；および
（iii）KLF4発現、
を誘導することを、c－MYC発現を誘導することの不在下において含み、
対象は化学療法薬物によって処置されている。
態様89．態様89の方法であって、化学療法薬物はビンクリスチン（VCS）である。
態様90．方法であって、細胞、組織、臓器、および／または対象において：
（i）OCT4発現；
（ii）SOX2発現；および
（iii）KLF4発現、
を誘導することを含み；
OCT4、SOX2、およびKLF4は核酸によってコードされ、OCT4、SOX2、および／またはKLF4の発現は単一のプロモーターから誘導される。
態様91．方法であって、細胞、組織、臓器および／または対象において：
（i）OCT4発現；
（ii）SOX2発現；
（iii）KLF4発現；または
（iv）（i）～（iii）のいずれかの組み合わせ、
を誘導することを、c－MYC発現を誘導することの不在下において含む。
態様92．態様91の方法であって、（i）～（iii）の組み合わせは、（i）および（ii）；（i）および（iii）；（ii）および（iii）；または（i）、（ii）、および（iii）を含む。
態様93．発現ベクターであって：
（i）OCT4をコードする第1の操作された核酸；
（ii）SOX2をコードする第2の操作された核酸；
（iii）KLF4をコードする第3の操作された核酸；または
（iv）（i）～（iii）のいずれかの組み合わせ、
を、c－MYC発現を誘導することができる操作された核酸の不在下において含む。
態様94．態様93の発現ベクターであって、（i）～（iii）の組み合わせは、（i）および（ii）；（i）および（iii）；（ii）および（iii）；または（i）、（ii）、および（iii）を含む。
態様95．態様47～54および93～94のいずれか1つの発現ベクターを含む組み換えウイルスであって、任意に、組み換えウイルスはレトロウイルス、アデノウイルス、AAV、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、またはレンチウイルスである。
態様96．態様1～32、63～66、70～75、81、85～87、および91～92の方法のいずれか1つによって生ずる操作された細胞であって、任意に、操作された細胞は態様33～54および93～94のいずれか1つの発現ベクターを含む。
態様97．組成物であって、態様33～54および93～94のいずれか1つの発現ベクター、態様55または態様95の組み換えウイルス、態様56または96の操作された細胞、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を誘導することができる化学的因子、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される操作された蛋白質、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を誘導することができる抗体を含み、任意に、組成物は薬学的に許容される担体を含む。
態様98．キットであって、態様33～54および93～94のいずれか1つの発現ベクター、態様55または95の組み換えウイルス、態様56または96の操作された細胞、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を誘導することができる化学的因子、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される操作された蛋白質、OCT4；KLF4；SOX2；またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を誘導することができる抗体、あるいは態様56～61または97のいずれか1つの組成物を含む。
態様99．操作された細胞を生ずる方法であって、態様1～32および91～92のいずれか1つの方法を含み、それによって、操作された細胞を生ずる。
態様100．操作された細胞を生ずる方法であって、態様1～32、63～65、91～92、および99のいずれか1つの方法を含み、操作された細胞はインビボで生ずる。
態様101．操作された細胞を生ずる方法であって、態様1～32、63～65、91～92、および99のいずれか1つの方法を含み、操作された細胞はエクスビボで生ずる。
態様102．方法であって：
細胞、組織、臓器、対象、またはそれらのいずれかの組み合わせにおいて、かつc－Mycを内因性のレベルよりも上に活性化することの不在下において、
（i）OCT4を活性化すること；
（ii）SOX2を活性化すること；
（iii）KLF4を活性化すること；または
（iv）（i）～（iii）のいずれかの組み合わせ、
を含む。
態様103．態様102の方法であって、（i）～（iii）の組み合わせは、（i）および（ii）；（i）および（iii）；（ii）および（iii）；または（i）、（ii）、および（iii）を含む。
態様104．方法であって、対象において：
（i）OCT4発現；
（ii）SOX2発現；
（iii）KLF4発現；または
（iv）（i）～（iii）のいずれかの組み合わせ、
を誘導することを、c－MYC発現を誘導することの不在下において含み、
対象は化学療法薬物によって処置されている。
態様105．態様104の方法であって、（i）～（iii）の組み合わせは、（i）および（ii）；（i）および（iii）；（ii）および（iii）；または（i）、（ii）、および（iii）を含む。
態様106．方法であって、細胞、組織、臓器、対象、またはそれらのいずれかの組み合わせにおいて：
（i）OCT4発現；
（ii）SOX2発現；
（iii）KLF4発現；または
（iv）（i）～（iii）のいずれかの組み合わせ、
を誘導することを含み、
OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせは核酸によってコードされ、OCT4、SOX2、KLF4、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現は単一のプロモーターから誘導される。
態様107．態様106の方法であって、（i）～（iii）の組み合わせは、（i）および（ii）；（i）および（iii）；（ii）および（iii）；または（i）、（ii）、および（iii）を含む。
態様108．態様1～32、68～92、または102～107のいずれか1つの方法であって、対象はヒトである。
態様109．態様1～32、68～92、または102～108のいずれか1つの方法であって、方法はテラトーマ形成を誘導しない。
態様110．態様1～32、68～92、または102～109のいずれか1つの方法であって、方法は腫瘍形成または腫瘍成長を誘導しない。
態様111．態様110の方法であって、方法は腫瘍形成または腫瘍成長を縮減する。
態様112．態様1～32、68～92、または102～111のいずれか1つの方法であって、方法は対象の視力を増大させる。
態様113．態様1～32、68～92、または102～112のいずれか1つの方法であって、方法は癌を誘導しない。
態様114．態様1～32、68～92、または102～113のいずれか1つの方法であって、方法は緑内障を誘導しない。
態様115．態様1～32、68～92、または102～114のいずれか1つの方法であって、方法は、細胞、組織、臓器、対象、またはそれらのいずれかの組み合わせのエピジェネティックな時計を逆行させる。
態様116．態様115の方法であって、エピジェネティックな時計は、DNA
メチル化に基づく（DNAm）年齢推定器を用いて決定される。
態様117．態様1～32、68～92、または102～116のいずれか1つの方法であって、方法は加齢に関連する1つ以上の遺伝子の発現を変改する。
態様118．態様117の方法であって、方法は加齢に関連する1つ以上の遺伝子の発現を縮減する。
態様119．態様118の方法であって、方法は、0610040J0lRik、1700080N15Rik、2900064F13Rik、4833417C18Rik、4921522P10Rik、4930447C04Rik、4930488N15Rik、Ace、Ackr1、Acot1O、Acvr1、Adamts17、Adra1b、AI504432、Best3、Boc、Cadm3、Cand2、Cc19、Cd14、Cd36、Cfh、Chrm3、Chrna4、Cntn4、Cracr2b、Cryaa、CT573017.2、Cyp26a1、Cyp27a1、D330050G23Rik、D930007P13Rik、Ddo、Dgkg、Dlk2、Dnaja1－ps、Drd2、Dse1、Dytn、Ecscr、Edn1、Ednrb、Efemp1、Elfn2、Epha1O、Ephx1、Erbb4、Fam20a、Fbxw21、Ffar4、Flt4、Fmod、Foxp4、Fzd7、Gabrd、Galnt15、Galnt18、Gfra2、Ggt1、Gm10416、Gm14964、Gm17634、Gm2065、Gm32352、Gm33172、Gm34280、Gm35853、Gm36298、Gm36356、Gm36937、Gm3898、Gm42303、Gm42484、Gm42537、Gm42743、Gm43151、Gm43843、Gm44545、Gm44722、Gm45516、Gm45532、Gm47494、Gm47982、Gm47989、Gm48398、Gm48495、Gm48593、Gm48958、Gm49089、Gm49326、Gm49331、Gm49760、Gm5796、Gm6374、Gm7276、Gm8237、Gm9796、Gm9954、Gpr75、Gprc5c、Grid2ip、Gsg112、Hapln4、Hcn3、Hcn4、Hhat1、Hs6st2、Htr3a、Illrap、Illrap12、Inka1、Kbtbd12、Kcnj11、Kcnk4、Kdelc2、Klhl33、Lamc3、Lilra5、Lmanll、Lrfn2、Lrrc38、Lrrn4cl、Ltc4s、Manscl、Mir344c、Msr1、Mycbpap、Myoc、Ngfr、Nipa12、Olfr1372－ps1、Otop3、P2rx5、P2ry12、P4ha2、Pcdha12、Pcdha2、Pcdhac2、Pcdhb18、Pcdhb5、Pcsk2os1、Pcsk6、Perp、Pkp1、Plxna4、Prickle2、Qsox1、Rapgef4os2、Rbp4、Rcn3、Sec1415、Sel113、Serpinh1、Sgpp2、Shisa6、Siah3、Siglech、Slc12a4、Slc24a2、Slc2a5、Slc4a4、Slitrk3、Smagp、Smoc2、Speer4b、Spon2、Sstr2、Sstr3、St3ga13、Stc1、Stc2、Syndig1、Syt1O、Thsd7a、Tlr8、Tmem132a、Tmem132d、Tmem200a、Tmem44、Trpc4、Trpv4、Unc5b、Vgf、Vmnlr90、Vwc21、Wfikkn2、Wnt11、Wnt6、Zeb2os、Zfp608、Zfp976、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を縮減する。
態様120．態様119の方法であって、遺伝子は感覚遺伝子である。
態様121．態様118～120のいずれか1つの方法であって、遺伝子はAce、Kcnk4、Lamc3、Edn1、Syt10、Ngfr、Gprc5c、Cd36、Chrna4、Ednrb、Drd2、またはそれらの組み合わせである。
態様122．態様117の方法であって、方法は加齢に関連する1つ以上の遺伝子の発現を増大させる。
態様123．態様1～32、68～92、102～122のいずれか1つの方法であって、方法は、1700031P21Rik、1810053B23Rik、2900045020Rik、2900060B14Rik、4921504E06Rik、4930402F11Rik、4930453C13Rik、4930455B14Rik、4930500H12Rik、4930549P19Rik、4930555B11Rik、4930556J02Rik、4932442E05Rik、4933431K23Rik、4933438K21Rik、6720475M21Rik、9830132P13Rik、A430010J10Rik、A530064D06Rik、A530065N20Rik、Abcb5、Abhd17c、AC116759.2、AC131705.1、AC166779.3、Acotl2、Adig、Akrlc1、Ankrd1、Asb15、Atp2c2、AU018091、AW822073、Btn11O、C130093G08Rik、C730027H18Rik、Ccdc162、Chi16、Col26a1、Corin、Crls1、Cybrd1、Cyp2d12、Cyp7a1、D830005E20Rik、Dlx3、Dnah14、Dsc3、Dthd1、Eid2、Eps811、EU599041、Fam90ala、Fancf、Fau－ps2、Fezf1、Gja5、Gm10248、Gm10513、Gm10635、Gm10638、Gm10718、Gm10722、Gm10800、Gm10801、Gm11228、Gm11251、Gm11264、Gm11337、Gm11368、Gm11485、Gm11693、Gm12793、Gm13050、Gm13066、Gm13323、Gm13339、Gm13346、Gm13857、Gm14387、Gm14770、Gm15638、Gm16072、Gm16161、Gm16181、Gm17200、Gm1779l、Gm18025、Gm18757、Gm18795、Gm18848、Gm19719、Gm20121、Gm20356、Gm2093、Gm2l738、Gm2l940、Gm22933、Gm24000、Gm24119、Gm25394、Gm26555、Gm27047、Gm28262、Gm28530、Gm29295、Gm29825、Gm29844、Gm3081、Gm32051、Gm32l22、Gm33056、Gm33680、Gm34354、Gm34643、Gm3551、Gm36660、Gm36948、Gm37052、Gm37142、Gm37262、Gm37535、Gm37569、Gm37589、Gm37647、Gm37648、Gm37762、Gm38058、Gm38069、Gm38137、Gm38218、Gm39139、Gm42535、Gm42680、Gm42895、Gm42994、Gm43027、Gm43158、Gm43288、Gm43366、Gm44044、Gm44081、Gm44187、Gm44280、Gm44535、Gm45338、Gm45644、Gm45740、Gm46555、Gm46565、Gm4742、Gm47485、Gm47853、Gm47992、Gm48225、Gm48314、Gm48383、Gm48673、Gm48804、Gm48832、Gm4994、Gm5487、Gm5724、Gm595、Gm6012、Gm6024、Gm7669、Gm7730、Gm8043、Gm8953、Gm9348、Gm9369、Gm9495、H2a12a、Ido2、Igfbp1、Kif7、Klhl31、Lrrc31、Mc5r、Mgam、Msh4、Mucl2、Mug1、Myb12、Myh15、Nek1O、Neurod6、Nr1h5、Olfr1042、Olfr1043、Olfr1082、Olfr1090、Olfr1124、Olfr1167、Olfr1205、Olfr1206、Olfr1223、Olfr1263、Olfr1264、Olfr1269、Olfr127、0lfr1291－ps1、Olfr1406、Olfr1469、Olfr215、Olfr273、Olfr328、Olfr355、Olfr372、Olfr390、Olfr427、Olfr456、Olfr466、Olfr481、Olfr522、Olfr6、Olfr601、Olfr603、Olfr706、Olfr727、Olfr728、Olfr741、Olfr801、Olfr8l2、Olfr8l6、Olfr822、Olfr860、Olfr890、Olfr923、Olfr943、Otog1、Pi15、Pkhd1、Pkhd111、Platr6、Pou3f4、Prr9、Pvalb、Rhag、Savl、Serpinb9b、Skint1、Skint3、Skint5、Slc10a5、Slc6a4、Smok2a、Tcaf3、Tomm201、Trcgl、Trdn、Ugt1a6a、Usp171a、Vmnlr178、Vmn1r179、Vmn1r33、Vmn1r74、Vmn1r87、Vmn2rl02、Vmn2r113、Vmn2r17、Vmn2r52、Vmn2r66、Vmn2r68、Vmn2r76、Vmn2r78、Wnt16、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を増大させる。
態様124．態様123の方法であって、方法は、Olfr8l6、Olfr8l2、Olfr1264、Olfr727、Olfr923、Olfr1090、Olfr328、Olfr1124、Olfr522、Olfr1082、Olfr1206、Olfr1167、Olfr706、Olfr6、Pou3f4、Olfr603、Olfrl27、Olfr1263、Olfr1269、Olfr1205、Olfr390、Olfr60l、Olfr860、Olfr2l5、Olfr74l、Olfr1469、Olfr355、Olfr48l、Olfr456、Olfrl042、Olfr728、Olfr372、Olfr80l、Olfrl223、Olfr822、Otogl、Olfr943、Olfrl406、Olfr273、Olfr466、Olfrl043、Olfr427、Olfr890、Rbp4、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を増大させる。
態様125．リプログラミングの方法であって、細胞、組織、臓器、対象、またはそれらのいずれかの組み合わせのエピジェネティックな時計を若返らせることを含む。
態様126．態様125の方法であって、細胞、組織、臓器、対象、またはそれらのいずれかの組み合わせのエピジェネティックな時計を若返らせることは、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらのいずれかの組み合わせを導入すること、活性化すること、および／または発現することを含む。
態様127．態様126のいずれか1つの方法であって、細胞、組織、臓器、対象、またはそれらのいずれかの組み合わせのエピジェネティックな時計は、若い細胞、組織、臓器、対象、またはそれらのいずれかの組み合わせのものへと若返らせられる。
態様128．態様125～127のいずれか1つの方法であって、エピジェネティックな時計を若返らせることは、細胞、組織、臓器、対象、またはそれらの組み合わせの加齢に関連する1つ以上の遺伝子の発現を変改することを含む。
態様129．態様128の方法であって、方法は加齢に関連する1つ以上の遺伝子の発現を縮減することを含む。
態様130．態様129の方法であって、方法は、0610040J0lRik、1700080N15Rik、2900064F13Rik、4833417C18Rik、4921522P10Rik、4930447C04Rik、4930488N15Rik、Ace、Ackr1、Acot1O、Acvr1、Adamts17、Adra1b、AI504432、Best3、Boc、Cadm3、Cand2、Cc19、Cd14、Cd36、Cfh、Chrm3、Chrna4、Cntn4、Cracr2b、Cryaa、CT573017.2、Cyp26a1、Cyp27a1、D330050G23Rik、D930007P13Rik、Ddo、Dgkg、Dlk2、Dnaja1－ps、Drd2、Dse1、Dytn、Ecscr、Edn1、Ednrb、Efemp1、Elfn2、Epha1O、Ephx1、Erbb4、Fam20a、Fbxw21、Ffar4、Flt4、Fmod、Foxp4、Fzd7、Gabrd、Galnt15、Galnt18、Gfra2、Ggt1、Gm10416、Gm14964、Gm17634、Gm2065、Gm32352、Gm33172、Gm34280、Gm35853、Gm36298、Gm36356、Gm36937、Gm3898、Gm42303、Gm42484、Gm42537、Gm42743、Gm43151、Gm43843、Gm44545、Gm44722、Gm45516、Gm45532、Gm47494、Gm47982、Gm47989、Gm48398、Gm48495、Gm48593、Gm48958、Gm49089、Gm49326、Gm49331、Gm49760、Gm5796、Gm6374、Gm7276、Gm8237、Gm9796、Gm9954、Gpr75、Gprc5c、Grid2ip、Gsg112、Hapln4、Hcn3、Hcn4、Hhat1、Hs6st2、Htr3a、Illrap、Illrap12、Inka1、Kbtbd12、Kcnj11、Kcnk4、Kdelc2、Klhl33、Lamc3、Lilra5、Lmanll、Lrfn2、Lrrc38、Lrrn4cl、Ltc4s、Manscl、Mir344c、Msr1、Mycbpap、Myoc、Ngfr、Nipa12、Olfr1372－ps1、Otop3、P2rx5、P2ry12、P4ha2、Pcdha12、Pcdha2、Pcdhac2、Pcdhb18、Pcdhb5、Pcsk2os1、Pcsk6、Perp、Pkp1、Plxna4、Prickle2、Qsox1、Rapgef4os2、Rbp4、Rcn3、Sec1415、Sel113、Serpinh1、Sgpp2、Shisa6、Siah3、Siglech、Slc12a4、Slc24a2、Slc2a5、Slc4a4、Slitrk3、Smagp、Smoc2、Speer4b、Spon2、Sstr2、Sstr3、St3ga13、Stc1、Stc2、Syndig1、Syt1O、Thsd7a、Tlr8、Tmem132a、Tmem132d、Tmem200a、Tmem44、Trpc4、Trpv4、Unc5b、Vgf、Vmnlr90、Vwc21、Wfikkn2、Wnt11、Wnt6、Zeb2os、Zfp608、Zfp976、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を縮減することを含む。
態様131．態様128～130の方法であって、1つ以上の遺伝子は1つ以上の感覚遺伝子である。
態様132．態様128～131のいずれか1つの方法であって、遺伝子はAce、Kcnk4、Lamc3、Edn1、Syt10、Ngfr、Gprc5c、Cd36、Chrna4、Ednrb、Drd2、またはそれらの組み合わせである。
態様133．態様128～132のいずれか1つの方法であって、方法は、加齢に関連する1つ以上の遺伝子の発現を増大させることを含む。
態様134．態様133の方法であって、方法は、1700031P21Rik、1810053B23Rik、2900045020Rik、2900060B14Rik、4921504E06Rik、4930402F11Rik、4930453C13Rik、4930455B14Rik、4930500H12Rik、4930549P19Rik、4930555B11Rik、4930556J02Rik、4932442E05Rik、4933431K23Rik、4933438K21Rik、6720475M21Rik、9830132P13Rik、A430010J10Rik、A530064D06Rik、A530065N20Rik、Abcb5、Abhd17c、AC116759.2、AC131705.1、AC166779.3、Acotl2、Adig、Akrlc1、Ankrd1、Asb15、Atp2c2、AU018091、AW822073、Btn11O、C130093G08Rik、C730027H18Rik、Ccdc162、Chi16、Col26a1、Corin、Crls1、Cybrd1、Cyp2d12、Cyp7a1、D830005E20Rik、Dlx3、Dnah14、Dsc3、Dthd1、Eid2、Eps811、EU599041、Fam90ala、Fancf、Fau－ps2、Fezf1、Gja5、Gm10248、Gm10513、Gm10635、Gm10638、Gm10718、Gm10722、Gm10800、Gm10801、Gm11228、Gm11251、Gm11264、Gm11337、Gm11368、Gm11485、Gm11693、Gm12793、Gm13050、Gm13066、Gm13323、Gm13339、Gm13346、Gm13857、Gm14387、Gm14770、Gm15638、Gm16072、Gm16161、Gm16181、Gm17200、Gm1779l、Gm18025、Gm18757、Gm18795、Gm18848、Gm19719、Gm20121、Gm20356、Gm2093、Gm2l738、Gm2l940、Gm22933、Gm24000、Gm24119、Gm25394、Gm26555、Gm27047、Gm28262、Gm28530、Gm29295、Gm29825、Gm29844、Gm3081、Gm32051、Gm32l22、Gm33056、Gm33680、Gm34354、Gm34643、Gm3551、Gm36660、Gm36948、Gm37052、Gm37142、Gm37262、Gm37535、Gm37569、Gm37589、Gm37647、Gm37648、Gm37762、Gm38058、Gm38069、Gm38137、Gm38218、Gm39139、Gm42535、Gm42680、Gm42895、Gm42994、Gm43027、Gm43158、Gm43288、Gm43366、Gm44044、Gm44081、Gm44187、Gm44280、Gm44535、Gm45338、Gm45644、Gm45740、Gm46555、Gm46565、Gm4742、Gm47485、Gm47853、Gm47992、Gm48225、Gm48314、Gm48383、Gm48673、Gm48804、Gm48832、Gm4994、Gm5487、Gm5724、Gm595、Gm6012、Gm6024、Gm7669、Gm7730、Gm8043、Gm8953、Gm9348、Gm9369、Gm9495、H2a12a、Ido2、Igfbp1、Kif7、Klhl31、Lrrc31、Mc5r、Mgam、Msh4、Mucl2、Mug1、Myb12、Myh15、Nek1O、Neurod6、Nr1h5、Olfr1042、Olfr1043、Olfr1082、Olfr1090、Olfr1124、Olfr1167、Olfr1205、Olfr1206、Olfr1223、Olfr1263、Olfr1264、Olfr1269、Olfr127、0lfr1291－ps1、Olfr1406、Olfr1469、Olfr215、Olfr273、Olfr328、Olfr355、Olfr372、Olfr390、Olfr427、Olfr456、Olfr466、Olfr481、Olfr522、Olfr6、Olfr601、Olfr603、Olfr706、Olfr727、Olfr728、Olfr741、Olfr801、Olfr8l2、Olfr8l6、Olfr822、Olfr860、Olfr890、Olfr923、Olfr943、Otog1、Pi15、Pkhd1、Pkhd111、Platr6、Pou3f4、Prr9、Pvalb、Rhag、Savl、Serpinb9b、Skint1、Skint3、Skint5、Slc10a5、Slc6a4、Smok2a、Tcaf3、Tomm201、Trcgl、Trdn、Ugt1a6a、Usp171a、Vmnlr178、Vmn1r179、Vmn1r33、Vmn1r74、Vmn1r87、Vmn2rl02、Vmn2r113、Vmn2r17、Vmn2r52、Vmn2r66、Vmn2r68、Vmn2r76、Vmn2r78、Wnt16、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を増大させる。
態様135．態様133～134のいずれか1つの方法であって、方法は、Olfr8l6、Olfr8l2、Olfr1264、Olfr727、Olfr923、Olfr1090、Olfr328、Olfr1124、Olfr522、Olfr1082、Olfr1206、Olfr1167、Olfr706、Olfr6、Pou3f4、Olfr603、Olfrl27、Olfr1263、Olfr1269、Olfr1205、Olfr390、Olfr60l、Olfr860、Olfr2l5、Olfr74l、Olfr1469、Olfr355、Olfr48l、Olfr456、Olfrl042、Olfr728、Olfr372、Olfr80l、Olfrl223、Olfr822、Otogl、Olfr943、Olfrl406、Olfr273、Olfr466、Olfrl043、Olfr427、Olfr890、Rbp4、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を増大させることを含む。
態様136．リプログラミングの方法であって、加齢に関連する1つ以上の遺伝子の発現を変改することを含む。
態様137．態様136の方法であって、OCT4、KLF4、SOX2、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を増大させることを含む。
態様138．態様136～137のいずれか1つの方法であって、方法は、細胞、組織、臓器、対象、またはそれらのいずれかの組み合わせのエピジェネティックな時計を若返らせる。
態様139．態様136～138のいずれか1つの方法であって、方法は加齢に関連する1つ以上の遺伝子の発現を縮減することを含む。
態様140．態様139の方法であって、方法は、0610040J0lRik、1700080N15Rik、2900064F13Rik、4833417C18Rik、4921522P10Rik、4930447C04Rik、4930488N15Rik、Ace、Ackr1、Acot1O、Acvr1、Adamts17、Adra1b、AI504432、Best3、Boc、Cadm3、Cand2、Cc19、Cd14、Cd36、Cfh、Chrm3、Chrna4、Cntn4、Cracr2b、Cryaa、CT573017.2、Cyp26a1、Cyp27a1、D330050G23Rik、D930007P13Rik、Ddo、Dgkg、Dlk2、Dnaja1－ps、Drd2、Dse1、Dytn、Ecscr、Edn1、Ednrb、Efemp1、Elfn2、Epha1O、Ephx1、Erbb4、Fam20a、Fbxw21、Ffar4、Flt4、Fmod、Foxp4、Fzd7、Gabrd、Galnt15、Galnt18、Gfra2、Ggt1、Gm10416、Gm14964、Gm17634、Gm2065、Gm32352、Gm33172、Gm34280、Gm35853、Gm36298、Gm36356、Gm36937、Gm3898、Gm42303、Gm42484、Gm42537、Gm42743、Gm43151、Gm43843、Gm44545、Gm44722、Gm45516、Gm45532、Gm47494、Gm47982、Gm47989、Gm48398、Gm48495、Gm48593、Gm48958、Gm49089、Gm49326、Gm49331、Gm49760、Gm5796、Gm6374、Gm7276、Gm8237、Gm9796、Gm9954、Gpr75、Gprc5c、Grid2ip、Gsg112、Hapln4、Hcn3、Hcn4、Hhat1、Hs6st2、Htr3a、Illrap、Illrap12、Inka1、Kbtbd12、Kcnj11、Kcnk4、Kdelc2、Klhl33、Lamc3、Lilra5、Lmanll、Lrfn2、Lrrc38、Lrrn4cl、Ltc4s、Manscl、Mir344c、Msr1、Mycbpap、Myoc、Ngfr、Nipa12、Olfr1372－ps1、Otop3、P2rx5、P2ry12、P4ha2、Pcdha12、Pcdha2、Pcdhac2、Pcdhb18、Pcdhb5、Pcsk2os1、Pcsk6、Perp、Pkp1、Plxna4、Prickle2、Qsox1、Rapgef4os2、Rbp4、Rcn3、Sec1415、Sel113、Serpinh1、Sgpp2、Shisa6、Siah3、Siglech、Slc12a4、Slc24a2、Slc2a5、Slc4a4、Slitrk3、Smagp、Smoc2、Speer4b、Spon2、Sstr2、Sstr3、St3ga13、Stc1、Stc2、Syndig1、Syt1O、Thsd7a、Tlr8、Tmem132a、Tmem132d、Tmem200a、Tmem44、Trpc4、Trpv4、Unc5b、Vgf、Vmnlr90、Vwc21、Wfikkn2、Wnt11、Wnt6、Zeb2os、Zfp608、Zfp976、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を縮減する。
態様141．態様136～140のいずれか1つの方法であって、1つ以上の遺伝子は1つ以上の感覚遺伝子である。
態様142．態様136～140のいずれか1つの方法であって、遺伝子はAce、Kcnk4、Lamc3、Edn1、Syt10、Ngfr、Gprc5c、Cd36、Chrna4、Ednrb、Drd2、またはそれらの組み合わせである。
態様143．態様136～142のいずれか1つの方法であって、方法は、加齢に関連する1つ以上の遺伝子の発現を増大させることを含む。
態様144．態様143の方法であって、方法は、1700031P21Rik、1810053B23Rik、2900045020Rik、2900060B14Rik、4921504E06Rik、4930402F11Rik、4930453C13Rik、4930455B14Rik、4930500H12Rik、4930549P19Rik、4930555B11Rik、4930556J02Rik、4932442E05Rik、4933431K23Rik、4933438K21Rik、6720475M21Rik、9830132P13Rik、A430010J10Rik、A530064D06Rik、A530065N20Rik、Abcb5、Abhd17c、AC116759.2、AC131705.1、AC166779.3、Acotl2、Adig、Akrlc1、Ankrd1、Asb15、Atp2c2、AU018091、AW822073、Btn11O、C130093G08Rik、C730027H18Rik、Ccdc162、Chi16、Col26a1、Corin、Crls1、Cybrd1、Cyp2d12、Cyp7a1、D830005E20Rik、Dlx3、Dnah14、Dsc3、Dthd1、Eid2、Eps811、EU599041、Fam90ala、Fancf、Fau－ps2、Fezf1、Gja5、Gm10248、Gm10513、Gm10635、Gm10638、Gm10718、Gm10722、Gm10800、Gm10801、Gm11228、Gm11251、Gm11264、Gm11337、Gm11368、Gm11485、Gm11693、Gm12793、Gm13050、Gm13066、Gm13323、Gm13339、Gm13346、Gm13857、Gm14387、Gm14770、Gm15638、Gm16072、Gm16161、Gm16181、Gm17200、Gm1779l、Gm18025、Gm18757、Gm18795、Gm18848、Gm19719、Gm20121、Gm20356、Gm2093、Gm2l738、Gm2l940、Gm22933、Gm24000、Gm24119、Gm25394、Gm26555、Gm27047、Gm28262、Gm28530、Gm29295、Gm29825、Gm29844、Gm3081、Gm32051、Gm32l22、Gm33056、Gm33680、Gm34354、Gm34643、Gm3551、Gm36660、Gm36948、Gm37052、Gm37142、Gm37262、Gm37535、Gm37569、Gm37589、Gm37647、Gm37648、Gm37762、Gm38058、Gm38069、Gm38137、Gm38218、Gm39139、Gm42535、Gm42680、Gm42895、Gm42994、Gm43027、Gm43158、Gm43288、Gm43366、Gm44044、Gm44081、Gm44187、Gm44280、Gm44535、Gm45338、Gm45644、Gm45740、Gm46555、Gm46565、Gm4742、Gm47485、Gm47853、Gm47992、Gm48225、Gm48314、Gm48383、Gm48673、Gm48804、Gm48832、Gm4994、Gm5487、Gm5724、Gm595、Gm6012、Gm6024、Gm7669、Gm7730、Gm8043、Gm8953、Gm9348、Gm9369、Gm9495、H2a12a、Ido2、Igfbp1、Kif7、Klhl31、Lrrc31、Mc5r、Mgam、Msh4、Mucl2、Mug1、Myb12、Myh15、Nek1O、Neurod6、Nr1h5、Olfr1042、Olfr1043、Olfr1082、Olfr1090、Olfr1124、Olfr1167、Olfr1205、Olfr1206、Olfr1223、Olfr1263、Olfr1264、Olfr1269、Olfr127、0lfr1291－ps1、Olfr1406、Olfr1469、Olfr215、Olfr273、Olfr328、Olfr355、Olfr372、Olfr390、Olfr427、Olfr456、Olfr466、Olfr481、Olfr522、Olfr6、Olfr601、Olfr603、Olfr706、Olfr727、Olfr728、Olfr741、Olfr801、Olfr8l2、Olfr8l6、Olfr822、Olfr860、Olfr890、Olfr923、Olfr943、Otog1、Pi15、Pkhd1、Pkhd111、Platr6、Pou3f4、Prr9、Pvalb、Rhag、Savl、Serpinb9b、Skint1、Skint3、Skint5、Slc10a5、Slc6a4、Smok2a、Tcaf3、Tomm201、Trcgl、Trdn、Ugt1a6a、Usp171a、Vmnlr178、Vmn1r179、Vmn1r33、Vmn1r74、Vmn1r87、Vmn2rl02、Vmn2r113、Vmn2r17、Vmn2r52、Vmn2r66、Vmn2r68、Vmn2r76、Vmn2r78、Wnt16、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を増大させることを含む。
態様145．態様144の方法であって、方法は、Olfr8l6、Olfr8l2、Olfr1264、Olfr727、Olfr923、Olfr1090、Olfr328、Olfr1124、Olfr522、Olfr1082、Olfr1206、Olfr1167、Olfr706、Olfr6、Pou3f4、Olfr603、Olfrl27、Olfr1263、Olfr1269、Olfr1205、Olfr390、Olfr60l、Olfr860、Olfr2l5、Olfr74l、Olfr1469、Olfr355、Olfr48l、Olfr456、Olfrl042、Olfr728、Olfr372、Olfr80l、Olfrl223、Olfr822、Otogl、Olfr943、Olfrl406、Olfr273、Olfr466、Olfrl043、Olfr427、Olfr890、Rbp4、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を増大させることを含む。
態様146．方法であって、インビトロの老いた細胞の転写プロファイルをリセットすることを含む。
態様147．方法であって、インビボの老いた細胞の転写プロファイルをリセットすることを含む。
態様148．方法であって、対象において：
（i）OCT4発現；
（ii）SOX2発現；および／または
（iii）KLF4発現；
を誘導することを、c－MYC発現を誘導することの不在下において含み、
対象は、状態を有さないコントロール対象のコントロール細胞、コントロール組織、および／または（or of）コントロール臓器と比較して、対象の細胞、組織、および／または臓器のDNAメチル化に基づく年齢を増大させる状態を有するか、そのリスクがあるか、またはそれを有することを疑われる。
態様149．態様148の方法であって、方法は、細胞、組織、臓器、および／または対象のDNAメチル化に基づく年齢を縮減する。
態様150．分化転換の方法であって、細胞の1つの型において：
（i）OCT4発現；
（ii）SOX2発現；
（iii）KLF4発現；および
（iv）系譜決定因子の発現、
を誘導することを含み、
（i）～（iii）は単一のベクターから発現され、それによって、細胞を別の細胞型へと分化転換する。
態様151．分化転換の方法であって、細胞において：
（i）OCT4発現；
（ii）SOX2発現；および
（iii）KLF4発現、
を誘導することと；
系譜決定因子の発現を縮減することと、
を含み、
（i）～（iii）は単一のベクターから発現される。
均等物および範囲
請求項において、「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、反対に指示されないかまたは文脈から別様に明白でない限り、1つまたは1つよりも多くを意味し得る。反対に指示されないかまたは文脈から別様に明白でない限り、「または」を群の1つ以上のメンバー間に包含する請求項または記載は、群のメンバーの1つ、1つよりも多く、または全てが所与の製品またはプロセスに存在するか、使用されるか、または別様に該当する場合には満足されていると考慮される。本開示は、群のメンバーの厳密に1つが所与の製品またはプロセスに存在するか、使用されるか、または別様に該当する態様を包含する。本開示は、群のメンバーの1つよりも多くまたは全てが所与の製品またはプロセスに存在するか、使用されるか、または別様に該当する態様を包含する。
さらにその上、本開示は、列記される請求項の1つ以上からの1つ以上の限定、要素、節、および記述用語が別の請求項に導入される全ての変形、組み合わせ、および順列を包摂する。例えば、別の請求項に従属するいずれかの請求項は、同じ元の請求項に従属するいずれかの他の請求項中に見出される1つ以上の限定を包含するように改変され得る。要素がリストとして例えばマーカッシュ群フォーマットで提示されるところでは、要素の各下位群もまた開示され、いずれかの要素（単数または複数）が群から除去され得る。一般的に、本開示、または本願に記載される側面が、特定の要素および／または特徴を含むと言われるところでは、ある種の本願に記載される態様または本願に記載される側面が、かかる要素および／または特徴からなるか、または本質的になるということは理解されるはずである（It should it be）。単純の目的のために、それらの態様は本願において特に逐語的に提出されてはいない。用語「含む」および「含有する」は開放的であることを意図され、追加の要素またはステップの包含を可能にするということもまた指摘される。範囲が与えられているところでは、エンドポイントが包含される。さらにその上、別様に指示されないかまたは文脈および当業者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表現される値は、文脈が明瞭に別様に記述しない限り、本願に記載される異なる態様においては、申し立てられている範囲内のいずれかの特定の値または部分範囲を、範囲の下限の単位の十分の一までとり得る。
本願は種々の発行済み特許、公開特許出願、雑誌記事、および他の公開物を参照し、これらの全ては参照によって本願に組み込まれる。組み込まれた参照のいずれかおよび本明細書の間に矛盾がある場合には、本明細書が優先される。加えて、従来技術のうちである本開示のいずれかの特定の態様は、請求項のいずれか1つ以上から明示的に除外され得る。かかる態様は当業者には公知であると見なされるので、除外が本願において明示的に提出されない場合であっても、それらは除外され得る。本願に記載されるいずれかの特定の態様は、従来技術の存在に関連するか否かにかかわらず、いずれかの理由でいずれかの請求項から除外され得る。
当業者は本願に記載される特定の態様の多くの均等物を認識するか、またはせいぜい慣例的な実験作業を用いて確かめることができるであろう。本願に記載される本態様の範囲は上の記載に限定されることを意図されず、むしろ、添付の請求項において提出される。当業者は、次の請求項によって定義される本開示の趣旨または範囲から逸脱することなしに、この記載への種々の変化および改変がなされ得るということを了解するであろう。

Claims (57)

  1. a）OCT4発現を誘導する因子；
    b）SOX2発現を誘導する因子；および
    c）KLF4発現を誘導する因子、
    を含む、
    その必要がある対象の少なくとも1つの細胞、組織、または臓器を若返らせることへの使用のための組成物。
  2. a）OCT4発現を誘導する因子；
    b）SOX2発現を誘導する因子；および
    c）KLF4発現を誘導する因子、
    を含む組成物を対象にインビボ投与すること（administration）を含む、
    その必要がある対象の少なくとも1つの細胞、組織、または臓器を若返らせる方法。
  3. 少なくとも1つの細胞を若返らせることが、多能性状態への少なくとも1つの細胞、組織、または臓器のリプログラミングを含まない、請求項1～2のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  4. 組成物が、少なくとも1つの細胞、組織、または臓器を若返らせるためには十分であり、かつ細胞を多能性状態へとリプログラミングするためには不十分である時間の期間に渡って、OCT4発現、SOX2、および／またはKLF4を誘導する、請求項1～3のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  5. 対象への組成物の投与後に、少なくとも1つの若返った細胞、組織、または臓器が少なくとも1つの幹細胞マーカーを発現しない、請求項1～4のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  6. 幹細胞マーカーがEsrrb、Nanog、Lin28、TRA－1－60/TRA－1－81/TRA－2－54、SSEA1、SSEA4、またはそれらのいずれかの組み合わせである、請求項5に記載の組成物または方法。
  7. 対象への組成物の投与後に、少なくとも1つの若返った細胞、組織、または臓器がRBPMS、Brn3a、またはそれらのいずれかの組み合わせを発現する、請求項1～6のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  8. 少なくとも1つの細胞、組織、または臓器を若返らせることが、少なくとも1つの細胞、組織、または臓器のエピジェネティックな情報を復元することを含む、請求項1～7のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  9. 少なくとも1つの細胞、組織、または臓器を若返らせることが、少なくとも1つの細胞、組織、または臓器の加齢、傷害、疾患、またはそれらのいずれかの組み合わせを原因として失われたエピジェネティックな情報を復元することを含む、請求項1～8のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  10. 少なくとも1つの細胞、組織、または臓器を若返らせることが、細胞、組織、または臓器のエピジェネティックな状態（status）を、受精または最終分化後にじきに形成される状態（status）に類似であるエピジェネティックな状態（status）へと再確立することを含む、請求項1～9のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  11. 因子（単数または複数）が核酸、低分子、抗体、またはポリペプチドである、請求項1～10のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  12. 因子（単数または複数）が少なくとも1つのナノ粒子を含む、請求項1～11のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  13. 因子（単数または複数）が少なくとも1つのナノ粒子に内包される、請求項11～12のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  14. 核酸がDNAまたはRNAである、請求項11～13のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  15. DNAがプラスミドDNAである、請求項14に記載の組成物または方法。
  16. RNAがmRNAである、請求項14に記載の組成物または方法。
  17. OCT4発現を誘導する因子がOCT4をコードする操作された核酸である、請求項11～16のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  18. SOX2発現を誘導する因子が、SOX2をコードする操作された核酸である、請求項11～17のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  19. KLF4発現を誘導する因子が、KLF4をコードする操作された核酸である、請求項11～18のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  20. 操作された核酸が1つ以上の（one or more an）発現ベクター上に存在する、請求項17、18、または19に記載の組成物または方法。
  21. 操作された核酸が同じ発現ベクター上に存在する、請求項20に記載の組成物または方法。
  22. 発現ベクター（単数または複数）が、操作された核酸のいずれか1つまたはそれらの組み合わせに作動可能に連結された誘導性プロモーターを包含する、請求項20または21のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  23. プロモーターがTRE3G、TRE2プロモーター、またはPtightプロモーターである、請求項22に記載の組成物または方法。
  24. プロモーターがテトラサイクリン応答性エレメント（TRE）を含む、請求項22または23に記載の組成物または方法。
  25. 発現ベクターが自己切断ペプチドを含む、請求項20～24のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  26. 自己切断ペプチドが2Aペプチドである、請求項25に記載の組成物または方法。
  27. 発現ベクターが、第1の核酸、第2の核酸、第3の核酸、またはそれらの組み合わせをフランキングする末端逆向きリピート（ITR）を含み、ITR間の距離が4.7kb以下である、請求項20～26のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  28. 組成物がさらに誘導因子を含むか、または方法がさらに対象に誘導因子を投与することを含む、請求項1～27のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  29. 誘導因子がテトラサイクリンまたはリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（rtTA）である、請求項28に記載の組成物または方法。
  30. テトラサイクリンがドキシサイクリンである、請求項29に記載の組成物または方法。
  31. rtTAが発現ベクター上に存在する、請求項29または請求項30に記載の組成物または方法。
  32. 発現ベクターが、Oct4、Sox2、および／またはKLF4をコードする操作された核酸と同じ発現ベクターではない、請求項31に記載の組成物または方法。
  33. rtTAがM2－rtTAまたはrtTA3である、請求項29～32のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  34. 発現ベクターがウイルスベクターである、請求項20～33のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  35. ウイルスベクターがレンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、またはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、請求項34に記載の組成物または方法。
  36. AAVベクターがAAV2またはAAV9である、請求項34または請求項35に記載の組成物または方法。
  37. 対象が、眼疾患、加齢、癌、筋骨格系疾患、加齢性疾患、または神経変性疾患を有するか、それを有することを疑われるか、またはそのリスクがある、請求項1～36のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  38. 対象がヒトまたは非ヒト哺乳動物である、請求項1～37のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  39. 細胞、組織、または臓器が、眼、耳、鼻、歯肉および歯根を包含する口、骨、肺、乳部、乳房、膵臓、胃、食道、心筋を包含する筋肉、肝臓、血管、髪を包含する皮膚、心臓、脳、神経組織、腎臓、精巣、前立腺、陰茎、総排泄腔、鰭部、卵巣、または腸からである、請求項1～38のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  40. 投与が組織または臓器への直接投与である、請求項1～39のいずれか1項に記載の組成物または方法。
  41. 次の順序で核酸エレメントを含む、発現ベクター：
    a．第1の末端逆向きリピート配列（ITR）配列；
    b．TRE3Gプロモーター配列；
    c．Oct4配列；
    d．P2A切断配列；
    e．Sox2配列；
    f．T2A切断配列；
    g．Klf4配列；
    h．SV－40由来のターミネーター配列；および
    i．第2の末端逆向きリピート（ITR）配列。
  42. Oct4配列が配列番号40である、請求項41に記載の発現ベクター。
  43. Sox2配列が配列番号42である、請求項41または42に記載の発現ベクター。
  44. Klf4配列がヒトKlf4蛋白質をコードする、請求項41～43のいずれか1項に記載の発現ベクター。
  45. Klf4配列が配列番号44である、請求項41～44のいずれか1項に記載の発現ベクター。
  46. P2A配列が、配列GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号118）を有するポリペプチドをコードする、請求項41～45のいずれか1項に記載の発現ベクター。
  47. P2A配列がGGCAGCGGCGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCT（配列番号119）である、請求項41～46のいずれか1項に記載の発現ベクター。
  48. T2A配列が配列番号9のポリペプチドをコードする、請求項41～47のいずれか1項に記載の発現ベクター。
  49. T2A配列がGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCA（配列番号120）である、請求項41～48のいずれか1項に記載の発現ベクター。
  50. TRE3Gプロモーター配列が配列番号7である、請求項41～49のいずれか1項に記載の発現ベクター。
  51. SV－40由来のターミネーター配列が配列番号8である、請求項41～50のいずれか1項に記載の発現ベクター。
  52. TRE3Gプロモーター配列が少なくとも1つの最小CMVプロモーター配列を含む、請求項41～51のいずれか1項に記載の発現ベクター。
  53. 少なくとも1つの最小CMVプロモーター配列が配列番号20である、請求項41～52のいずれか1項に記載の発現ベクター。
  54. 第1のITR配列が配列番号22である、請求項41～53のいずれか1項に記載の発現ベクター。
  55. コンストラクトが配列番号38を含む、請求項41～54のいずれか1項に記載の発現ベクター。
  56. コンストラクトが配列番号121を含む、請求項41～55のいずれか1項に記載の発現ベクター。
  57. コンストラクトが少なくとも1つのナノ粒子に内包される、請求項41～56のいずれか1項に記載の発現ベクター。
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110628821B (zh) * 2018-06-25 2022-02-18 首都医科大学宣武医院 一种细胞模型及其制备方法、应用
WO2022217142A1 (en) * 2021-04-09 2022-10-13 Washington University Compositions and methods for treatment of crx-linked retinopathies
CN114240934B (zh) * 2022-02-21 2022-05-10 深圳大学 一种基于肢端肥大症的图像数据分析方法及系统
WO2023192876A1 (en) * 2022-03-28 2023-10-05 Reilly Steve E Composition to increase cellular longevity
CN114622020B (zh) * 2022-03-30 2022-09-27 华南农业大学 一种与鸡生长性状相关的klhl31基因分子标记及应用
WO2023196851A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 President And Fellows Of Harvard College Reversing aging of the central nervous system
WO2023200223A1 (ko) * 2022-04-15 2023-10-19 주식회사 로노 노화 세포의 회춘 또는 세포 노화의 지연 또는 방지용 조성물
WO2024012502A1 (zh) * 2022-07-12 2024-01-18 南京瑞初医药有限公司 组合物及其使用方法
WO2024012503A1 (zh) * 2022-07-12 2024-01-18 南京瑞初医药有限公司 组合物及其使用方法
WO2024012504A1 (zh) * 2022-07-12 2024-01-18 南京瑞初医药有限公司 组合物及其使用方法
WO2024020033A2 (en) * 2022-07-19 2024-01-25 Syntax Bio, Inc. Systems for stem cell programming and methods thereof
WO2024073570A1 (en) * 2022-09-28 2024-04-04 Altos Labs, Inc. Expression of regeneration factors in aged/senescent cells
CN116041477B (zh) * 2022-10-13 2023-08-08 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 Tdgf1基因在制备治疗衰老相关疾病或逆转细胞衰老的药物中的应用
CN115607689A (zh) * 2022-10-13 2023-01-17 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 Klf7基因在制备逆转细胞衰老的药物中的应用
CN116970604B (zh) * 2023-04-24 2024-03-08 首都儿科研究所 一种shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用
CN116555432B (zh) * 2023-07-05 2023-09-05 广州凯普医药科技有限公司 一种膀胱癌快速检测试剂盒
CN116898988A (zh) * 2023-08-15 2023-10-20 臻赫医药(杭州)有限公司 皮肤重编程因子制剂、生物材料及用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100190250A1 (en) * 2005-10-14 2010-07-29 Jifan Hu Methods of Rejuvenating Cells In Vitro and In Vivo
US20140093486A1 (en) * 2012-10-01 2014-04-03 Taipei Veterans General Hospital Method for preparing induced pluripotent stem cells and its applications

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4217344A (en) 1976-06-23 1980-08-12 L'oreal Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4186183A (en) 1978-03-29 1980-01-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis
US4261975A (en) 1979-09-19 1981-04-14 Merck & Co., Inc. Viral liposome particle
US4485054A (en) 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4774085A (en) 1985-07-09 1988-09-27 501 Board of Regents, Univ. of Texas Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5549910A (en) 1989-03-31 1996-08-27 The Regents Of The University Of California Preparation of liposome and lipid complex compositions
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1991017424A1 (en) 1990-05-03 1991-11-14 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
JP3218637B2 (ja) 1990-07-26 2001-10-15 大正製薬株式会社 安定なリポソーム水懸濁液
JP2958076B2 (ja) 1990-08-27 1999-10-06 株式会社ビタミン研究所 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法
US5399363A (en) 1991-01-25 1995-03-21 Eastman Kodak Company Surface modified anticancer nanoparticles
US5543158A (en) 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
US5651981A (en) 1994-03-29 1997-07-29 Northwestern University Cationic phospholipids for transfection
US5741516A (en) 1994-06-20 1998-04-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5767099A (en) 1994-12-09 1998-06-16 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles containing amino acid or dervatized amino acid groups for intracellular delivery of therapeutic molecules
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US5830430A (en) 1995-02-21 1998-11-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Cationic lipids and the use thereof
IE80468B1 (en) 1995-04-04 1998-07-29 Elan Corp Plc Controlled release biodegradable nanoparticles containing insulin
US5851548A (en) 1995-06-07 1998-12-22 Gen-Probe Incorporated Liposomes containing cationic lipids and vitamin D
US5738868A (en) 1995-07-18 1998-04-14 Lipogenics Ltd. Liposome compositions and kits therefor
CA2325088A1 (en) 2000-12-01 2002-06-01 Fusogenix Inc. Novel membrane fusion proteins derived from poikilothermic reovirus
ATE520707T1 (de) 2001-11-13 2011-09-15 Univ Pennsylvania Verfahren für den nachweis und/oder die identifikation von sequenzen des adeno- assoziierten virus (aav) sowie isolation von dadurch identifizierten, neuen sequenzen
WO2006023207A2 (en) 2004-08-19 2006-03-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services, Nih Coacervate of anionic and cationic polymer forming microparticles for the sustained release of therapeutic agents
JP2006248978A (ja) 2005-03-10 2006-09-21 Mebiopharm Co Ltd 新規なリポソーム製剤
US8278104B2 (en) * 2005-12-13 2012-10-02 Kyoto University Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2
WO2010026537A1 (en) 2008-09-05 2010-03-11 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Novel multimodular assembly useful for intracellular delivery
US8636884B2 (en) 2008-09-15 2014-01-28 Abbott Diabetes Care Inc. Cationic polymer based wired enzyme formulations for use in analyte sensors
US8734809B2 (en) 2009-05-28 2014-05-27 University Of Massachusetts AAV's and uses thereof
WO2011000106A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Improved cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
WO2011068916A1 (en) 2009-12-01 2011-06-09 Intezyne Technologies, Incorporated Pegylated polyplexes for polynucleotide delivery
GB201008267D0 (en) 2010-05-18 2010-06-30 Univ Edinburgh Cationic lipids
JP5957646B2 (ja) 2010-06-04 2016-07-27 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｉｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． オリゴヌクレオチド送達のための新規な低分子量カチオン性脂質
BR112013006381B1 (pt) 2010-09-20 2024-02-15 Spi Pharma Inc Composição que compreende um material de núcleo tendo um valor de sabor e um revestimento polimérico e formulação farmacêutica
CA2813300A1 (en) 2010-09-29 2012-04-05 Innovascreen Inc. Recombinant polypeptides for membrane fusion and uses thereof
WO2012070031A1 (en) 2010-11-26 2012-05-31 University Of The Witwatersrand, Johannesburg Polymeric matrix of polymer-lipid nanoparticles as a pharmaceutical dosage form
KR101255338B1 (ko) 2010-12-15 2013-04-16 포항공과대학교 산학협력단 표적 세포에 대한 폴리뉴클레오티드 전달체
WO2012083017A2 (en) 2010-12-16 2012-06-21 Celgene Corporation Controlled release oral dosage forms of poorly soluble drugs and uses thereof
US8709466B2 (en) 2011-03-31 2014-04-29 International Business Machines Corporation Cationic polymers for antimicrobial applications and delivery of bioactive materials
CN103562376B (zh) * 2011-04-08 2017-12-29 国家医疗保健研究所 复壮细胞的方法
WO2012148953A1 (en) 2011-04-25 2012-11-01 Stc.Unm Solid compositions for pharmaceutical use
US8691750B2 (en) 2011-05-17 2014-04-08 Axolabs Gmbh Lipids and compositions for intracellular delivery of biologically active compounds
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100190250A1 (en) * 2005-10-14 2010-07-29 Jifan Hu Methods of Rejuvenating Cells In Vitro and In Vivo
US20140093486A1 (en) * 2012-10-01 2014-04-03 Taipei Veterans General Hospital Method for preparing induced pluripotent stem cells and its applications

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