JP7317706B2 - 核酸およびタンパク質ペイロード送達のための方法および組成物 - Google Patents

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Description

相互参照
本出願は、２０１６年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／４３４，３４４号、２０１７年６月９日に出願された米国仮特許出願第６２／５１７，３４６号、２０１７年１月６日に出願された米国仮特許出願第６２／４４３，５６７号、および２０１７年１月６日に出願された米国仮特許出願第６２／４４３，５２２号の利益を主張し、これらの出願は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
テキストファイルとして提供される配列表の参照による組み込み
２０１７年１２月１４日に作成され、５４ＫＢのサイズを有するテキストファイル「ＬＧＤＬ－００３ ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」として、配列表が本明細書と共に提供される。テキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
序論
リガンド標的指向治療薬の分野における最近の進歩にもかかわらず、細胞内活性ペイロード、例えば遺伝子療法用途のための核酸治療薬を送達するための方法は依然として限られている。主な障害は、細胞内活性ペイロードをその適切な細胞内微小環境へと輸送させることを含む、所与の治療用途のためのマッチング標的指向リガンドを作成する能力である。裸の核酸のための高親和性標的指向技術（例えば、肝臓を標的とするためにＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）に共有結合した化学修飾ｓｉＲＮＡ分子）、またはナノ粒子に基づく薬物／遺伝子送達（例えば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的としたドセタキセルナノ粒子）を生み出す目的でいくつかの研究が行われている。しかしながら、現在利用可能な方法は、細胞への核酸、タンパク質、および／またはリボ核タンパク質ペイロードの効果的な標的指向送達に関与する検討事項の多くを考慮に入れていない。本開示は、これらの懸念に対処し、関連する利点を提供する。
概要
核酸、タンパク質、および／またはリボ核タンパク質ペイロードを細胞に送達するための方法および組成物が提供される。タンパク質もしくは核酸ペイロード（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）、または荷電ポリマーポリペプチドドメイン（例えば、９Ｒなどのポリアルギニンもしくは６Ｈなどのポリヒスチジンなど）にコンジュゲートしたペプチド標的指向リガンドを含む送達分子もまた提供される。標的指向リガンドは、（ｉ）細胞表面タンパク質への標的指向された結合、および（ｉｉ）長いエンドソームリサイクリング経路の関与を提供する。したがって、標的指向リガンドが意図される細胞表面タンパク質と係合すると、送達分子は細胞に入る（例えば、エンドサイトーシスを介して）が、リソソーム分解経路から離れる方向に優先的に向けられる。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、細胞表面タンパク質への標的指向された結合を提供するが、長いエンドソームリサイクリング経路の関与を必ずしも提供するわけではない。
標的指向リガンドが荷電ポリマーポリペプチドドメインにコンジュゲートしているいくつかの場合において、荷電ポリマーポリペプチドドメインは、ｓｉＲＮＡ、またはプラスミドＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどの核酸ペイロードと相互作用する（例えば、それと縮合する）。標的指向リガンドが荷電ポリマーポリペプチドドメインにコンジュゲートしているいくつかの場合において、荷電ポリマーポリペプチドドメインは、タンパク質ペイロードと相互作用する（例えば、それと縮合する）。いくつかの場合において、主題の送達分子の荷電ポリマーポリペプチドドメインは、ペイロード（例えば、核酸および／またはタンパク質）と相互作用し、アニオン性ポリマーと共に組成物中に存在する（例えば、送達分子は、ペイロードおよびアニオン性ポリマーの両方と縮合し得る）。
標的指向リガンドが荷電ポリマーポリペプチドドメインにコンジュゲートしているいくつかの場合において、荷電ポリマーポリペプチドドメインは、ナノ粒子の荷電安定化層（シリカ、ペプトイド、ポリシステイン、またはリン酸カルシウムコーティングなど）と相互作用する（例えば、静電的に）。
本発明は、添付の図面と併せて読むと以下の詳細な説明から最もよく理解される。一般的な慣例に従って、図面の種々の特徴は縮尺通りではないことを強調する。それどころか、種々の特徴の寸法は、明確性のために任意に拡大または縮小される。図面には以下の図が含まれる。
（パネルＡ～Ｆ）主題の送達分子の例示的な構成の概略図を提供する。標的指向リガンドは、Ｎ末端またはＣ末端でコンジュゲートし得る（各パネルの左）が、内部位置でもコンジュゲートし得る（各パネルの右）ことに留意されたい。パネルＡ、Ｃ、およびＥにおける分子は、リンカーを含むが、パネルＢ、Ｄ、およびＦの分子は含まない。（パネルＡ～Ｂ）ペイロードにコンジュゲートした標的指向リガンドを含む送達分子。（パネルＣ～Ｄ）ナノ粒子の荷電安定化層と静電的に相互作用している荷電ポリマーポリペプチドドメインにコンジュゲートした標的指向リガンドを含む送達分子。（パネルＥ～Ｆ）核酸ペイロードと縮合している荷電ポリマーポリペプチドドメインにコンジュゲートした標的指向リガンドを含む送達分子。 図１Ａの説明を参照のこと。 図１Ａの説明を参照のこと。 図１Ａの説明を参照のこと。 図１Ａの説明を参照のこと。 図１Ａの説明を参照のこと。 （パネルＡ～Ｄ）主題の送達分子の例示的な構成の概略図を提供する。示された標的指向リガンドは、エキセンディン（Ｓ１１Ｃ置換を有する）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を参照）である。リンカーを伴うおよび伴わない、かつナノ粒子の荷電安定化層（「アニオン性ナノ粒子表面」）と静電的に相互作用している荷電ポリマーポリペプチドドメインへの（リンカーを介した）コンジュゲーションを伴う、異なるコンジュゲーション化学を有する例が示される。図２、パネルＡは、還元的に切断可能なジスルフィド結合を用いて核酸、タンパク質またはリボ核タンパク質にコンジュゲートしたエキセンディン－４（１～３９）［Ｃｙｓ１１］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のコンジュゲーション戦略の例を提供する。図２、パネルＢは、アミン反応性結合を用いて核酸、タンパク質またはリボ核タンパク質にコンジュゲートしたエキセンディン－４（１～３９）［Ｃｙｓ１１］のコンジュゲーション戦略の例を提供する。図２、パネルＣは、（アミン反応性ドメインを介して）核酸、タンパク質またはリボ核タンパク質にコンジュゲートしているリンカーに、還元的に切断可能なジスルフィド結合を介してコンジュゲートしたエキセンディン－４（１～３９）［Ｃｙｓ１１］のコンジュゲーション戦略の例を提供する。図２、パネルＤは、ナノ粒子の荷電安定化層（例えば、シリカ、ペプトイド、ポリシステイン、またはリン酸カルシウムコーティング）と静電的に相互作用することによってナノ粒子表面をコーティングする荷電ポリマーポリペプチドドメイン（９Ｒ配列が示されている）にコンジュゲートしているリンカーに、還元的に切断可能なジスルフィド結合を介してコンジュゲートしたエキセンディン－４（１～３９）［Ｃｙｓ１１］のコンジュゲーション戦略の例を提供する。 図２Ａの説明を参照のこと。 図２Ａの説明を参照のこと。 図２Ａの説明を参照のこと。 例えば、アロステリック／親和性Ｎ末端ドメインおよびオルソステリックエンドソームソーティング／シグナル伝達ドメインへの結合に対して、標的指向リガンドを評価する際に考慮される別々のドメインを強調して、ファミリーＢのＧＰＣＲの概略図を提供する。（図は、Ｓｉｕ，Ｆａｉ Ｙｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４９９．７４５９（２０１３）：４４４～４４９を出典とする）。 図３－１の説明を参照のこと。 親和性が維持され、標的指向リガンドが、核酸放出を促進し、かつ核酸分解を制限する長いエンドソームリサイクリング経路に関与するように、標的指向リガンドに対する挿入および／または置換（例えばシステイン残基で）のための内部アミノ酸位置を同定する例を提供する。この場合、標的指向リガンドは、エキセンディン－４であり、アミノ酸位置１０、１１、および１２は、可能な挿入および／または置換（例えば、システイン残基で、例えば、Ｓ１１Ｃ変異）のための部位として同定された。図は、グルカゴン－ＧＣＧＲ（４ＥＲＳ）およびＧＬＰ１－ＧＬＰ１Ｒ－ＥＣＤ複合体（ＰＤＢ：３ＩＯＬ）の既知の結晶構造に対するシミュレートされたエキセンディン－４［Ｓ１１Ｃ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のアラインメント、および３次元空間で回転させたＰＤＢレンダリングを示す。 図４－１の説明を参照のこと。 三元ＦＧＦ２－ＦＧＦＲ１－ＨＥＰＡＲＩＮ複合体（ＰＤＢ上の１ｆｑ９）の一部としてのｔｂＦＧＦフラグメント（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７９）を示す。ＣＫＮＧＧＦＦＬＲＩＨＰＤＧＲＶＤＧＶＲＥＫＳ（強調）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）は、ＦＧＦＲ１に対する親和性にとって重要であると決定された。 ＦＧＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８０）由来のＨＦＫＤＰＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）がリガンド－受容体オルソステリック活性および親和性に使用され得るペプチドであると決定するために使用されるアラインメントおよびＰＤＢ ３Ｄレンダリングを提供する。 ＦＧＦフラグメント（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８１）由来のＬＥＳＮＮＹＮＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）がリガンド－受容体オルソステリック活性および親和性に使用され得るペプチドであると決定するために使用されるアラインメントおよびＰＤＢ ３Ｄレンダリングを提供する。 ペイロード：ペプチド核酸（ＰＮＡ）結合部位を有するＶＷＦ－ＥＧＦＰ ｐＤＮＡを有するナノ粒子の凝縮曲線を提供する。 ペイロード：ＨＢＢ ｇＲＮＡと複合体を形成したＮＬＳ－ＣＡＳ９－ＮＬＳ ＲＮＰを有するナノ粒子の凝縮曲線を提供する。 図９Ａの説明を参照のこと。 図９Ａの説明を参照のこと。 図９Ａの説明を参照のこと。 ペイロード：ＨＢＢ ｇＲＮＡを有するナノ粒子の凝縮曲線を提供する。 ペイロード：ＨＢＢ ｇＲＮＡを有するナノ粒子の凝縮曲線を提供する。 ペイロード：ＨＢＢ ｇＲＮＡと複合体を形成したＮＬＳ－ＣＡＳ９－ＮＬＳ ＲＮＰを有するナノ粒子の凝縮曲線を提供する。 ペイロード：ペプチド核酸（ＰＮＡ）結合部位を有するＶＷＦ－ＥＧＦＰ ｐＤＮＡを有するナノ粒子の凝縮曲線を提供する。 ペイロード：ペプチド核酸（ＰＮＡ）結合部位を有するＶＷＦ－ＥＧＦＰ ｐＤＮＡを有するナノ粒子の凝縮曲線を提供する。 ペイロード：ＨＢＢ ｇＲＮＡを有するＮＬＳ－ＣＡＳ９－ＮＬＳのＲＮＰを有するナノ粒子の凝縮曲線を提供する。 ペイロード：ペプチド核酸（ＰＮＡ）結合部位を有するＶＷＦ－ＥＧＦＰ ｐＤＮＡを有するナノ粒子の凝縮曲線を提供する。 ペイロード：Ｃｙ５＿ＥＧＦＰ ｍＲＮＡを有するナノ粒子の凝縮曲線を提供する。 ペイロード：ＢＬＯＣＫ－ｉＴ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５ ｓｉＲＮＡを有するナノ粒子の凝縮曲線を提供する。 ペイロード：ＨＢＢ ｇＲＮＡと複合体を形成したＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰ ＲＮＰを有するナノ粒子の凝縮曲線を提供する。 ペイロードとしてＡｌｅｘａ ５５５ Ｂｌｏｃｋ－ＩＴ ｓｉＲＮＡを有するナノ粒子を使用した場合に収集されたデータを提供する。 図２０Ａの説明を参照のこと。 図２０Ａの説明を参照のこと。 ペイロードとしてＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＧＦＰおよびＨＢＢガイドＲＮＡによって形成されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を有するナノ粒子を使用した場合に収集されたデータを提供する。 図２１－１の説明を参照のこと。 図２１－１の説明を参照のこと。 ペイロードとしてＣｙ５ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡを有するナノ粒子を使用した場合に収集されたデータを提供する。 図２１－１の説明を参照のこと。 ペイロード：Ｃｙ５タグ化ペプチド核酸（ＰＮＡ）結合部位を有するＶＷＦ－ＥＧＦＰ ｐＤＮＡを有するナノ粒子を使用した場合に収集されたデータを提供する。 図２３－１の説明を参照のこと。 図２３－１の説明を参照のこと。 ＲＮＰに、カチオン性ポリペプチドＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃを添加し、続いてＰＬＥ１００を添加し、さらにカチオン性ポリペプチドを添加することによる蛍光強度の低下を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイからのデータを提供する。 ｓｉＲＮＡおよびＳＹＢＲ Ｇｏｌｄに、カチオン性ポリペプチドＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃを添加し、続いてＰＬＥ１００を添加し、さらにカチオン性ポリペプチドを添加することによって蛍光強度の変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイからのデータを提供する。 ＨＢＢ ｇＲＮＡおよびＳＹＢＲ Ｇｏｌｄを有するＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰのＲＮＰに、カチオン性ポリペプチドヒストンペプチドＨ２Ａを添加し、続いてＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃを添加し、さらにＰＬＥ１００を添加することによって蛍光強度の変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイからのデータを提供する。 ＨＢＢ ｇＲＮＡおよびＳＹＢＲ Ｇｏｌｄを有するＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰのＲＮＰに、ＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃと一緒にカチオン性ポリペプチドヒストンペプチドＨ４を添加し、さらにＰＬＥ１００を添加することによって蛍光強度の変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイからのデータを提供する。 ｍＲＮＡに、カチオン性ポリペプチドＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃを添加し、さらにＰＬＥ１００を添加することによって蛍光強度の変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイからのデータを提供する。 ｍＲＮＡに、ヒストンＨ４を添加し、さらにＣＤ４５－ｍＳｉｇｌｅｃ－（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿ｃおよびＰＬＥ１００を添加することによって蛍光強度の変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイからのデータを提供する。 ｍＲＮＡに、ヒストンＨ２Ａを添加し、さらにＣＤ４５－ｍＳｉｇｌｅｃ－（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿ｃおよびＰＬＥ１００を添加することによって蛍光強度の変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイからのデータを提供する。 カチオン性ポリペプチドＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃを添加し、続いてＰＬＥ１００を添加することによって蛍光強度の変動を示すＶＷＦ＿ＥＧＦＰ ｐＤＮＡとのインターカレーションからのＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイからのデータを提供する。 ヒストンＨ４を添加し、続いてカチオン性ポリペプチドＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃを添加し、続いてＰＬＥ１００を添加することによって蛍光強度の変動を示すＶＷＦ＿ＥＧＦＰ ｐＤＮＡとのインターカレーションからのＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイからのデータを提供する。 ヒストンＨ４を添加し、続いてカチオン性ポリペプチドＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃを添加し、続いてＰＬＥ１００を添加することによって蛍光強度の変動を示すＶＷＦ＿ＥＧＦＰ ｐＤＮＡとのインターカレーションからのＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイからのデータを提供する。 （パネルＡ～Ｃ）ポリプレックスサイズ分布、シリカコーティングサイズおよびゼータ電位分布、ならびにリガンドコーティング／官能化粒子サイズおよびゼータ電位分布に関するデータを提供する。 図３４Ａの説明を参照のこと。 図３４Ａの説明を参照のこと。 図３４Ａの説明を参照のこと。 図３４Ａの説明を参照のこと。 分岐ヒストンペプチドコンジュゲートパイロット粒子に関するデータを提供する。 プロジェクトＨＳＣ．００１．００１に関するデータを提供する（表４参照）。 図３６－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＨＳＣ．００１．００２に関するデータを提供する（表４参照）。 プロジェクトＨＳＣ．００２．０１（標的指向リガンド－ＥＳＥＬＬｇ＿ｍＥＳＥＬ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ）に関するデータを提供する（表４参照）。 図３８－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＨＳＣ．００２．０２（標的指向リガンド－ＥＳＥＬＬｇ＿ｍＥＳＥＬ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃ）に関するデータを提供する（表４参照）。 図３９－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＨＳＣ．００２．０３（標的指向リガンド－ＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃ）に関するデータを提供する（表４参照）。 図４０－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＨＳＣ．００２．０４（標的指向リガンド－Ｃｙ５ｍＲＮＡ－ＳｉＯ２－ＰＥＧ）に関するデータを提供する（表４参照）。 図４１－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＢＬＯＯＤ．００２．８８（標的指向リガンド－ＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃ）に関するデータを提供する（表４参照）。 図４２－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＢＬＯＯＤ．００２．８９（標的指向リガンド－ＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃ）に関するデータを提供する（表４参照）。 図４３－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＢＬＯＯＤ．００２．９０に関するデータを提供する（表４参照）。 図４４－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＢＬＯＯＤ．００２．９１（ＰＬＲ５０）に関するデータを提供する（表４参照）。 図４５－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＢＬＯＯＤ．００２．９２（標的指向リガンド－ＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃ）に関するデータを提供する（表４参照）。 図４６－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．１に関するデータを提供する（表４参照）。 図４７－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．３に関するデータを提供する（表４参照）。 図４８－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．１３に関するデータを提供する（表４参照）。 図４９－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．１４に関するデータを提供する（表４参照）。 図５０－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．１６に関するデータを提供する（表４参照）。 図５１－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．１８に関するデータを提供する（表４参照）。 図５２－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．２８に関するデータを提供する（表４参照）。 図５３－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．２９に関するデータを提供する（表４参照）。 図５４－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．３１に関するデータを提供する（表４参照）。 図５５－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．３３に関するデータを提供する（表４参照）。 図５６－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．４３に関するデータを提供する（表４参照）。 プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．４４に関するデータを提供する（表４参照）。 図５８－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．４６に関するデータを提供する（表４参照）。 図５９－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．４８に関するデータを提供する（表４参照）。 図６０－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．５８に関するデータを提供する（表４参照）。 図６１－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．５９に関するデータを提供する（表４参照）。 図６２－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＣＹＮＯＢＭ．００２．８２に関するデータを提供する（表４参照）。 図６３－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＣＹＮＯＢＭ．００２．８３に関するデータを提供する（表４参照）。 図６４－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＣＹＮＯＢＭ．００２．８４に関するデータを提供する（表４参照）。 図６５－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＣＹＮＯＢＭ．００２．８５に関するデータを提供する（表４参照）。 図６６－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＣＹＮＯＢＭ．００２．８６に関するデータを提供する（表４参照）。 図６７－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＣＹＮＯＢＭ．００２．７６に関するデータを提供する（表４参照）。 図６８－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＣＹＮＯＢＭ．００２．７７に関するデータを提供する（表４参照）。 プロジェクトＣＹＮＯＢＭ．００２．７８に関するデータを提供する（表４参照）。 図７０－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＣＹＮＯＢＭ．００２．７９に関するデータを提供する（表４参照）。 プロジェクトＣＹＮＯＢＭ．００２．８０に関するデータを提供する（表４参照）。 ＣｙｎｏＢＭ．００２試料についてのトランスフェクションされていない対照に関するデータを提供する。 図７３－１の説明を参照のこと。 図７３－１の説明を参照のこと。 図７３－１の説明を参照のこと。 ＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰ ＢＣＬ１１ａ ｇＲＮＡ ＲＮＰのリポフェクタミンＣＲＩＳＰＲＭＡＸ送達に関するデータを提供する。 図７４－１の説明を参照のこと。 図７４－１の説明を参照のこと。 図７４－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２ ＲＮＰ－Ｏｎｌｙ対照に関するデータを提供する（表４参照）。 図７５－１の説明を参照のこと。 図７５－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２．８２に関するデータを提供する（表４参照）。 図７６－１の説明を参照のこと。 図７６－１の説明を参照のこと。 図７６－１の説明を参照のこと。 図７６－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２．８３に関するデータを提供する（表４参照）。 図７７－１の説明を参照のこと。 図７７－１の説明を参照のこと。 図７７－１の説明を参照のこと。 図７７－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＣＹＮＯＢＭ．００２．８４に関するデータを提供する（表４参照）。 図７８－１の説明を参照のこと。 図７８－１の説明を参照のこと。 図７８－１の説明を参照のこと。 図７８－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２．８５に関するデータを提供する（表４参照）。 図７９－１の説明を参照のこと。 図７９－１の説明を参照のこと。 図７９－１の説明を参照のこと。 図７９－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２．８６に関するデータを提供する（表４参照）。 図８０－１の説明を参照のこと。 図８０－１の説明を参照のこと。 図８０－１の説明を参照のこと。 図８０－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２．７５に関するデータを提供する（表４参照）。 図８１－１の説明を参照のこと。 図８１－１の説明を参照のこと。 図８１－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２．７６に関するデータを提供する（表４参照）。 図８２－１の説明を参照のこと。 図８２－１の説明を参照のこと。 図８２－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２．７７に関するデータを提供する（表４参照）。 図８３－１の説明を参照のこと。 図８３－１の説明を参照のこと。 図８３－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２．７８に関するデータを提供する（表４参照）。 図８４－１の説明を参照のこと。 図８４－１の説明を参照のこと。 図８４－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２．７９に関するデータを提供する（表４参照）。 図８５－１の説明を参照のこと。 図８５－１の説明を参照のこと。 図８５－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２．８０に関するデータを提供する（表４参照）。 図８６－１の説明を参照のこと。 図８６－１の説明を参照のこと。 図８６－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２．８１に関するデータを提供する（表４参照）。 図８７－１の説明を参照のこと。 図８７－１の説明を参照のこと。 図８７－１の説明を参照のこと。 ＣｙｎｏＢＭ．００２ ＲＮＰ－Ｏｎｌｙ対照の定性的画像を提供する。 プロジェクトＨＳＣ．００４のハイコンテントスクリーニングに関するデータを提供する（表４参照）。 プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１のハイコンテントスクリーニングに関するデータを提供する（表４参照）。 プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１のリポフェクタミンＣＲＩＳＰＲＭＡＸ対照に関するデータを提供する（表４参照）。 プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．１に関するデータを提供する（表４参照）。 プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．２に関するデータを提供する（表４参照）。 プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．３に関するデータを提供する（表４参照）。 図９４－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．４に関するデータを提供する（表４参照）。 図９５－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．５に関するデータを提供する（表４参照）。 図９６－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．６に関するデータを提供する（表４参照）。 図９７－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．７に関するデータを提供する（表４参照）。 図９８－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．８に関するデータを提供する（表４参照）。 図９９－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．９に関するデータを提供する（表４参照）。 図１００－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．１０に関するデータを提供する（表４参照）。 図１０１－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．１１に関するデータを提供する（表４参照）。 図１０２－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．１２に関するデータを提供する（表４参照）。 図１０３－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．１３に関するデータを提供する（表４参照）。 図１０４－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．１４に関するデータを提供する（表４参照）。 図１０５－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．１５に関するデータを提供する（表４参照）。 図１０６－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１についての陰性対照に関するデータを提供する（表４参照）。 プロジェクトＢｌｏｏｄ．００２に関するデータを提供する（表４参照）。 図１０８－１の説明を参照のこと。 図１０８－１の説明を参照のこと。 プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．２７に関するデータを提供する（表４参照）。 タンパク質表面に安定な荷電層を形成するためにアニオン性またはカチオン性ペプチド／材料を添加すべきかどうかを決定することを可能にするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ（可能なペイロード）の電荷密度プロットを示す。 図１１０－１の説明を参照のこと。 タンパク質表面に安定な荷電層を形成するためにアニオン性またはカチオン性ペプチド／材料を添加すべきかどうかを決定することを可能にするＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ（可能なペイロード）の電荷密度プロットを示す。 図１１１－１の説明を参照のこと。 （２ｂ）その後の多層化学の付加、複数の核酸または荷電治療薬の同時送達、または架橋による層安定化の有無を問わず、（２ａ）アンカー－リンカー－リガンドまたは独立型カチオン性アンカーのようなカチオン性アンカーの付加（２）の前にＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ表面上のカチオン性部位に固定する例示的なアニオン性ペプチド（長さ９～１０アミノ酸、直径約１０ｎｍまでのＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ）（１）を示す。 図１１２－１の説明を参照のこと。 Ｃａｓ９ ＲＮＰまたは任意の均一にまたは双性イオン的に帯電した表面を含み得るコアテンプレートに基づく付加順序および静電マトリックス組成物の例を示す。 ＩＬ２Ｒに結合したＩＬ２のモデル化構造を提供する。 図１１４－１の説明を参照のこと。 一本鎖ＣＤ３抗体フラグメントのモデル化構造を提供する。 図１１５－１の説明を参照のこと。 Ｎ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）と複合体を形成したシアロアドヘシンのＮ－末端のモデル化構造を提供する。 幹細胞因子（ＳＣＦ）のモデル化構造を提供する。 ｃＫｉｔ受容体フラグメントの合理的設計中に生成された画像の例を提供する。 ｃＫｉｔ受容体フラグメントの合理的設計中に生成された画像の例を提供する。 ｃＫｉｔ受容体フラグメントの合理的設計中に生成された画像の例を提供する。 合理的に設計されたｃＫｉｔ受容体フラグメントの分析からの円二色性データを提供する。 合理的に設計されたｃＫｉｔ受容体フラグメントの安定化された立体配座のモデリングを示す。 ＨＴＰがカチオン性ポリマー骨格の側鎖にコンジュゲートしている分岐ヒストン構造の例を示す。右側のポリマーは前駆体骨格分子を表し、左側の分子は分岐構造のセグメントの一例である。 図１２３－１の説明を参照のこと。 図１２３－１の説明を参照のこと。 図１２３－１の説明を参照のこと。 図１２３－１の説明を参照のこと。 図１２３－１の説明を参照のこと。
詳細な説明
上記に要約したように、核酸、タンパク質、および／またはリボ核タンパク質ペイロードを細胞に送達するための方法および組成物が提供される。提供される送達分子は、タンパク質もしくは核酸ペイロード（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）、または荷電ポリマーポリペプチドドメイン（例えば、９Ｒなどのポリアルギニンもしくは６Ｈなどのポリヒスチジンなど）にコンジュゲートしたペプチド標的指向リガンドを含む。標的指向リガンドは、（ｉ）細胞表面タンパク質への標的指向された結合、および（ｉｉ）長いエンドソームリサイクリング経路の関与を提供する。
本方法および組成物を説明する前に、本発明は記載された特定の方法または組成物に限定されず、したがって、当然のことながら変化し得ることを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのものであり、限定的であることは意図されないこともまた理解されたい。
値の範囲が提供される場合、文脈上別段に明確に記載していない限り、その範囲の上限と下限の間にある各それぞれの介在値はまた、下限の単位の１０分の１まで、具体的に開示されることは理解される。記載された何らかの値または介在値と、記載された範囲が本発明内に包含される記載された何らかの値または介在値との間にある、より小さな各範囲は、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してこの範囲の中に含まれ得または除外され得、こうした限界のいずれかが、またはいずれもが、より小さな範囲に含まれる各範囲、またはいずれも含まれない各範囲も、本発明の範囲内に包含され、記載された範囲内で何らかの具体的に除外された制限を受ける。述べられる範囲が限界の一方または両方を備える場合、それらの含まれる限界のうちのいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、いくつかの可能性のある好ましい方法および材料をここに記載する。本明細書で言及される全ての公開物は、公開物が引用されるものとの関連で方法および／または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾が存在する限り、組み込まれた公開物のいかなる開示にも優先することが理解される。
本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に説明され例証された個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るか、または組み合わせられ得る個別の要素および特徴を有する。任意の記載された方法は、列挙された事象の順序で、または論理的に可能な他の順序で実施することができる。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「エンドヌクレアーゼ」への言及は、１つ以上のエンドヌクレアーゼおよび当業者に既知のその等価物などへの言及を含む。特許請求の範囲は任意の要素、例えば任意の任意選択の要素を排除するように作成されてもよいことにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の要素の列挙に関連して「専ら」、「唯一の」などのような排他的な用語の使用または「否定的な」制限の使用のための先行基準としての役割を果たすことを意図している。
本明細書に論じられる公開物は専ら、本出願の出願日前のそれらの開示のためだけに提供される。本明細書中のいかなるものも、本発明がそのような公開物に先行する権利がないという承認として解釈されるべきではない。更に、示されている公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、別個に確認する必要がある。
方法および組成物
エンドサイトーシスされると、膜貫通細胞表面タンパク質は、少なくとも２つの異なる経路によって：「短いサイクル」によりソーティングエンドソームから直接的に、または「長いサイクル」を構成する核周囲リサイクリングエンドソームを横断して間接的に、細胞表面に戻り得る。したがって、エンドソーム区画から、異なる目的地に向かう少なくとも３つの多様な経路が分岐する：リソソーム（分解経路）、核周囲リサイクリング区画（「長いサイクル」；または「長い」、「間接的な」、または「遅い」エンドソームリサイクリング経路）、または原形質膜へと直接（「短いサイクル」；または「短い」、「直接的な」、または「速い」エンドソームリサイクリング経路）。効果的な送達、例えば細胞内での核酸の発現を仲介するための適切な標的指向リガンドの選択における、（ａ）結合親和性、（ｂ）シグナル伝達の偏り／機能選択性、および（ｃ）特定のエンドソームソーティング経路の複合的役割にはこれまで注意が向けられていない。
タンパク質もしくは核酸ペイロードにコンジュゲートしているまたは荷電ポリマーポリペプチドドメインにコンジュゲートしているペプチド標的指向リガンドを含む、送達分子が提供される。標的指向リガンドは、（ｉ）細胞表面タンパク質への標的指向された結合、および（ｉｉ）長いエンドソームリサイクリング経路の関与を提供する。標的指向リガンドが荷電ポリマーポリペプチドドメインにコンジュゲートしているいくつかの場合において、荷電ポリマーポリペプチドドメインは、核酸ペイロードと相互作用する（例えば、それと縮合する）。いくつかの場合において、標的指向リガンドは介在リンカーを介してコンジュゲートしている。異なる可能なコンジュゲーション戦略（すなわち、主題の送達分子の構成要素の異なる可能な配置）の例については、図１および図２を参照されたい。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、細胞表面タンパク質への標的指向された結合を提供するが、長いエンドソームリサイクリング経路の関与を必ずしも提供するわけではない。したがって、タンパク質または核酸ペイロードにコンジュゲートしているまたは荷電ポリマーポリペプチドドメインにコンジュゲートしているペプチド標的指向リガンドを含む送達分子も提供され、その標的指向リガンドは細胞表面タンパク質への標的指向された結合を提供する（しかし、長いエンドソームリサイクリング経路の関与を必ずしも提供するわけではない）。
いくつかの場合において、本明細書に開示される送達分子は、（例えば、細胞表面タンパク質への標的指向された結合を提供することによって）核酸またはタンパク質ペイロードがその細胞外標的に到達し、リソソーム内で優先的に破壊されない、または「短い」エンドソームリサイクリングエンドソームに隔離されないように設計されている。代わりに、本開示の送達分子は、エンドソーム逃避および／またはオルガネラとのエンドソーム融合を可能にし得る「長い」（間接的な／遅い）エンドソームリサイクリング経路の関与を提供し得る。
例えば、いくつかの場合において、所望のエンドソームソーティング経路を引き起こす、（例えば、エンドサイトーシス中の）７回膜貫通型ＧＰＣＲ（ＭｃＧｏｖｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｎｄｂ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１４；２１９：３４１－５９；Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９６ Ｏｃｔ ３；３８３（６５９９）：４４７－５０；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９９７ Ｏｃｔ ２４；２７２（４３）：２７００５－１４）および／またはアクチン細胞骨格由来の単一膜貫通型受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の切断を仲介するために、β－アレスチンが係合される。したがって、いくつかの実施形態において、本開示の送達分子の標的指向リガンドは、（例えば、シグナル伝達の偏りを提供し、オルソステリック結合後のエンドサイトーシスによる内在化を促進するために）細胞表面タンパク質への結合時にβ－アレスチンの係合を提供する。
標的指向リガンド
種々の標的指向リガンドを主題の送達分子の一部として使用することができ、多数の異なる標的指向リガンドが想定される。いくつかの実施形態において、標的指向リガンドは、野生型タンパク質の断片（例えば、結合ドメイン）である。例えば、主題の送達分子のペプチド標的指向リガンドは、４～５０アミノ酸（例えば、４～４０、４～３５、４～３０、４～２５、４～２０、４～１５、５～５０、５～４０、５～３５、５～３０、５～２５、５～２０、５～１５、７～５０、７～４０、７～３５、７～３０、７～２５、７～２０、７～１５、８～５０、８～４０、８～３５、８～３０、８～２５、８～２０、または８～１５アミノ酸）の長さを有し得る。標的指向リガンドは、野生型タンパク質の断片であり得るが、いくつかの場合において、野生型アミノ酸配列に対する変異（例えば、挿入、欠失、置換）（すなわち、対応する野生型タンパク質配列に対する変異）を有する。例えば、標的指向リガンドは、標的細胞表面タンパク質との結合親和性を増加または減少させる変異を含み得る。
いくつかの場合において、標的指向リガンドは、システイン残基を付加する変異を含み得、これはリンカー、タンパク質もしくは核酸ペイロード、および／または荷電ポリマーポリペプチドドメインへのコンジュゲーションのための戦略を容易にし得る。例えば、システインは、スルフヒドリル化学的性質（例えば、ジスルフィド結合）および／またはアミン反応性化学的性質を介した核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）およびタンパク質への架橋（コンジュゲーション）のために使用され得る。
いくつかの場合において、標的指向リガンドは、内部システイン残基を含む。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、Ｎ末端および／またはＣ末端にシステイン残基を含む。いくつかの場合において、システイン残基を含めるために、標的指向リガンドは、対応する野生型配列に対して変異している（例えば、挿入または置換）。したがって、本明細書に記載される標的指向リガンドのいずれも、システイン残基を使用した上記の挿入および／または置換（例えば、システイン残基の内部、Ｎ末端、Ｃ末端の挿入または置換）のいずれかで修飾され得る。
「対応する」野生型配列とは、主題の配列が由来したまたは由来した可能性がある野生型配列（例えば、目的の配列に対して高い配列同一性を有する野生型タンパク質配列）を意味する。例えば、１つ以上の変異（例えば、置換、挿入）を有するがそれ以外は野生型配列と非常に類似している標的指向リガンドについては、それが最も類似しているアミノ酸配列は、対応する野生型アミノ酸配列であると考えられ得る。
対応する野生型タンパク質／配列は、１００％同一である必要はない（例えば、８５％以上同一、９０％以上同一、９５％以上同一、９８％以上同一、９９％以上同一など）（修飾された位置（複数可）の外側で）が、標的指向リガンドおよび対応する野生型タンパク質（例えば、野生タンパク質の断片）は意図された細胞表面タンパク質に結合し得、かつ、これが相同であるとみなされ得るのに十分な配列同一性（修飾された領域の外側で）を保持し得る。「対応する」野生型タンパク質配列のアミノ酸配列は、任意の都合のよい方法を使用して（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＭＵＳＣＬＥ、Ｔ－ＣＯＦＦＥＥなどの任意の都合のよい配列比較／アラインメントソフトウェアを使用して）同定／評価され得る。
主題の送達分子の一部として使用され得る標的指向リガンドの例には、表１に列挙されているものが含まれるが、これらに限定されない。主題の送達分子の一部として使用され得る標的指向リガンドの例には、表２に列挙されているものが含まれるが、これらに限定されない（表２に列挙される配列の多くはリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６））を介してカチオン性ポリペプチドドメイン（例えば、９Ｒ、６Ｒなど）にコンジュゲートした標的指向リガンド（例えば、列２のＳＮＲＷＬＤＶＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７２））を含む）。標的指向リガンドに含まれ得るアミノ酸配列の例には、
Figure 0007317706000001
が含まれるが、これらに限定されない。したがって、いくつかの場合において、標的指向リガンドは、
Figure 0007317706000002
と８５％以上（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
（表１）標的指向リガンドの例
Figure 0007317706000003
主題の送達分子の標的指向リガンドは、アミノ酸配列ＲＧＤおよび／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合において、主題の送達分子の標的指向リガンドは、アミノ酸配列ＲＧＤおよび／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、主題の送達分子の標的指向リガンドは、システイン（内部、Ｃ末端、またはＮ末端）を含み得、またアミノ酸配列ＲＧＤおよび／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列も含み得る。
用語「標的」および「標的指向された結合」は、特異的結合を指すために本明細書中で使用される。「特異的結合」、「特異的に結合する」などの用語は、溶液または反応混合物中の他の分子または実体と比較して、分子への優先的な非共有結合または共有結合を指す（例えば、抗体は、他の入手可能なポリペプチドと比較して特定のポリペプチドまたはエピトープに特異的に結合し、リガンドは、他の入手可能な受容体と比較して特定の受容体に特異的に結合する）。いくつかの実施形態において、１つの分子が別の分子に特異的に結合する親和性は、１０－５Ｍ以下（例えば、１０－６Ｍ以下、１０－７Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、１０－９Ｍ以下、１０－１０Ｍ以下、１０－１１Ｍ以下、１０－１２Ｍ以下、１０－１３Ｍ以下、１０－１４Ｍ以下、１０－１５Ｍ以下、または１０－１６Ｍ以下）のＫｄ（解離定数）を特徴とする。「親和性」とは、結合の強度を指し、結合親和性の増加は、より低いＫｄと相関する。
いくつかの場合において、標的指向リガンドは、ファミリーＢのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、細胞表面糖タンパク質、および細胞間接着分子から選択される細胞表面タンパク質への標的指向された結合を提供する。受容体ドッキングの際のリガンドの空間配置の考慮を使用して、例えばリガンドと標的との間の構造機能関係がペイロードまたは荷電ポリマーポリペプチドドメインへの標的指向リガンドのコンジュゲーションにより妨害されないような、適切な所望の機能選択性およびエンドソームソーティングバイアスを達成することができる。例えば、核酸、タンパク質、リボ核タンパク質、または荷電ポリマーポリペプチドドメインへのコンジュゲーションは、潜在的に結合溝（複数可）を妨害し得る。
したがって、いくつかの場合において、そのリガンドに結合した所望の標的（細胞表面タンパク質）の結晶構造が利用可能な場合（またはそのような構造が関連タンパク質に対して利用可能な場合）、リガンドと標的との間の相互作用部位を可視化するために３Ｄ構造モデリングおよびシーケンススレッディングを使用することができる。これは、例えば、（例えば、システイン残基の）置換および／または挿入の配置のための内部部位の選択を容易にし得る。
一例として、いくつかの場合において、標的指向リガンドは、ファミリーＢのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）（「セクレチンファミリー」としても知られる）への結合を提供する。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、ファミリーＢのＧＰＣＲのアロステリック親和性ドメインおよびオルソステリックドメインの両方への結合を提供して、それぞれ標的指向された結合および長いエンドソームリサイクリング経路の関与を提供する（例えば、下記の実施例の節ならびに図３および図４を参照）。
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、それらがＧタンパク質（ヘテロ三量体ＧＴＰアーゼ）と相互作用してサイクリックＡＭＰ、イノシトールリン酸、ジアシルグリセロールおよびカルシウムイオンなどの細胞内セカンドメッセンジャーの合成を調節するという点で共通の分子構造（７つの推定膜貫通セグメントを有する）および共通のシグナル伝達機構を共有する。ＧＰＣＲのファミリーＢ（セクレチン受容体ファミリーまたは「ファミリー２」）は、ポリペプチドホルモンおよび細胞膜で細胞間相互作用を媒介すると考えられる分子に対する受容体を含む、小さいが構造的および機能的に多様な、タンパク質群である（例えば、Ｈａｒｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２００１；２（１２）：ＲＥＶＩＥＷＳ３０１３を参照）。結合リガンドの有無にかかわらず、それらのＮ末端のいくつかの結晶構造の公表を含む、セクレチン受容体ファミリーのメンバーに関する構造生物学において重要な進歩があり、この研究はリガンド結合の理解を拡大し、構造ベースのリガンド設計のための有用なプラットフォームを提供する（例えば、Ｐｏｙｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１２ Ｍａｙ；１６６（１）：１－３を参照）。
例えば、エキセンディン－４リガンドまたはその誘導体を使用して膵臓細胞表面タンパク質ＧＬＰ１Ｒを標的指向するために（例えば、β島を標的指向するために）主題の送達分子を使用することが望ましい場合がある。そのような場合、
Figure 0007317706000004
であるエキセンディン－４アミノ酸配列を、２つの結合溝を妨害させないために架橋複合体が向いていなければならない方向を予想するために３Ｄ空間で回転させることができるＰＤＢ ３次元レンダリングを使用して、グルカゴン－ＧＣＧＲ（４ＥＲＳ）およびＧＬＰ１－ＧＬＰ１Ｒ－ＥＣＤ複合体（ＰＤＢ：３ＩＯＬ）の結晶構造に対して整列させることによって、システインの置換および／または挿入のための（例えば、核酸ペイロードへのコンジュゲーションのための）アミノ酸を同定することができる（例えば、以下の実施例の節ならびに図３および図４を参照）。（ファミリーＢのＧＰＣＲを標的とする）標的指向リガンドの望ましい架橋部位（例えば、システイン残基の置換／挿入のための部位）が対応する受容体の２つの結合溝と十分直交している場合、高親和性結合ならびに同時に長いエンドソームリサイクリング経路の隔離が起こり得る（例えば、最適なペイロード放出のために）。
いくつかの場合において、主題の送達分子は、エキセンディン－４アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対して、８５％以上（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む標的指向リガンドを含む。いくつかのそのような場合において、標的指向リガンドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載のアミノ酸配列のＬ１０、Ｓ１１、およびＫ１２に対応する位置の１つ以上にシステイン置換または挿入を含む。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載のアミノ酸配列のＳ１１に対応する位置でのシステイン置換または挿入を含む。いくつかの場合において、主題の送達分子は、エキセンディン－４アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を有するアミノ酸配列を含む標的指向リガンドを含む。
別の例として、いくつかの場合において、本開示による標的指向リガンドは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体（ＦＧＦＲ）などの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）への結合を提供する。したがって、いくつかの場合において、標的指向リガンドは、ＦＧＦの断片である（すなわち、ＦＧＦのアミノ酸配列を含む）。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、オルソステリック結合の間に占められるＲＴＫのセグメントに結合する（例えば、下記の実施例の節を参照）。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、ＲＴＫのヘパリン親和性ドメインに結合する。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、ＦＧＦ受容体への標的指向された結合を提供し、アミノ酸配列
Figure 0007317706000005
と８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、ＦＧＦ受容体への標的指向された結合を提供し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４として記載されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合において、ＲＴＫのオルソステリック部位を占める小ドメイン（例えば、５～４０アミノ酸長）を使用して、天然の増殖因子リガンドに固有であり得る細胞増殖性および癌原性のシグナル伝達カスケードの関与なしに、ＲＴＫ（例えば、ＦＧＦＲ）の核選別に関係するエンドサイトーシス経路を関与させ得る。例えば、切断型ｂＦＧＦ（ｔｂＦＧＦ）ペプチド（ａａ３０～１１５）は、ｂＦＧＦ受容体結合部位およびヘパリン結合部位の一部を含有し、このペプチドは細胞増殖を刺激することなく細胞表面のＦＧＦＲに効果的に結合し得る。ｔｂＦＧＦの配列は、
Figure 0007317706000006
である（例えば、Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．２０１１ Ａｐｒ １５；４０８（１－２）：１７３－８２を参照）。
いくつかの場合において、標的指向リガンドは、ＦＧＦ受容体への標的指向された結合を提供し、アミノ酸配列ＨＦＫＤＰＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を含む（例えば、下記の実施例の節を参照）。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、ＦＧＦ受容体への標的指向された結合を提供し、アミノ酸配列ＬＥＳＮＮＹＮＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を含む（例えば、以下の実施例の節を参照）。
いくつかの場合において、本開示による標的指向リガンドは、細胞表面糖タンパク質への標的指向された結合を提供する。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、細胞間接着分子への標的指向された結合を提供する。例えば、いくつかの場合において、標的指向リガンドは、細胞間接着因子として機能する細胞表面糖タンパク質であり、（例えば、骨髄の）造血幹細胞上に見られるタンパク質であるＣＤ３４への標的指向された結合を提供する。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、Ｅ－セレクチン、Ｌ－セレクチン、またはＰ－セレクチンなどのセレクチンの断片（例えば、セレクチンの最初の４０アミノ酸に見られるシグナルペプチド）である。いくつかの場合において、主題の標的指向リガンドは、セレクチンのスシドメイン（例えば、Ｅ－セレクチン、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン）を含む。
いくつかの場合において、標的指向リガンドは、アミノ酸配列
Figure 0007317706000007
と８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７として記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、アミノ酸配列
Figure 0007317706000008
と８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８として記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、アミノ酸配列
Figure 0007317706000009
と８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９として記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、アミノ酸配列
Figure 0007317706000010
と８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０として記載されるアミノ酸配列を含む。
主題の標的指向リガンドとして使用され得るセレクチンの断片（例えば、セレクチンの最初の４０アミノ酸に見られるシグナルペプチド）は、いくつかの場合において、特異的に修飾されたシアロムチンへの強い結合を達成し得、例えば、様々なＳｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓｘ修飾／細胞外ＣＤ３４のＯ－シアリル化は、Ｐ－セレクチン、Ｌ－セレクチンおよびＥ－セレクチンの骨髄、リンパ液、脾臓および扁桃腺区画に対する異なる親和性をもたらし得る。逆に、いくつかの場合において、標的指向リガンドは、ＣＤ３４の細胞外部分であり得る。いくつかのそのような場合において、リガンドのシアリル化の修飾を利用して、標的指向リガンドを様々なセレクチンに差次的に標的指向させ得る。
いくつかの場合において、本開示による標的指向リガンドは、トランスフェリン受容体への標的指向された結合を提供する。いくつかのそのような場合において、標的指向リガンドは、アミノ酸配列
Figure 0007317706000011
と８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１として記載されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合において、本開示による標的指向リガンドは、インテグリン（例えば、α５β１インテグリン）への標的指向された結合を提供する。いくつかのそのような場合において、標的指向リガンドは、アミノ酸配列ＲＲＥＴＡＷＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）と８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２として記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、アミノ酸配列ＲＧＤを含む。
一緒に標的指向リガンドを構成する２つの異なるペプチド配列を有する送達分子も提供される。例えば、いくつかの場合において、標的指向リガンドは、二価（例えば、ヘテロ二価）である。いくつかの場合において、細胞透過性ペプチドおよび／またはヘパリン硫酸プロテオグリカン結合リガンドは、本開示の任意の標的指向リガンドと共に、ヘテロ二価エンドサイトーシストリガーとして使用される。ヘテロ二価標的指向リガンドは、標的指向リガンドのうちの１つからの親和性配列および異なる標的指向リガンドからのオルソステリック結合配列（例えば、所望のエンドサイトーシス輸送経路を関与することが知られているもの）を含み得る。
コンジュゲーションパートナー／ペイロード
核酸ペイロード
いくつかの実施形態において、本開示の送達分子の標的指向リガンドは、核酸ペイロードにコンジュゲートしている（例えば、図１、パネルＡ～Ｂを参照）。いくつかの実施形態において、本開示の送達分子は、核酸ペイロードと縮合している（静電的に相互作用している）。核酸ペイロードは、目的の任意の核酸であり得、例えば、核酸ペイロードは、線状または環状であり得、プラスミド、ウイルスゲノム、ＲＮＡ、ＤＮＡなどであり得る。いくつかの場合において、核酸ペイロードは、ＲＮＡｉ剤またはＲＮＡｉ剤をコードするＤＮＡテンプレートであり、ＲＮＡｉ剤は、例えば、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであり得る。いくつかの場合において、核酸ペイロードは、ｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、本開示の送達分子の標的指向リガンドは、タンパク質ペイロードにコンジュゲートし、いくつかの場合において、標的指向リガンドは、リボ核タンパク質複合体にコンジュゲートしている（例えば、複合体のタンパク質成分またはＲＮＡ成分へのコンジュゲーションを介して）。コンジュゲーションは、任意の便利な技術によって達成され得、多くの異なるコンジュゲーション化学が当業者に知られているであろう。いくつかの場合において、コンジュゲーションは、スルフヒドリル化学的性質（例えば、ジスルフィド結合）を介する。いくつかの場合において、コンジュゲーションは、アミン反応性化学的性質を使用して達成される。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、システイン残基を含み、システイン残基を介して核酸ペイロードにコンジュゲートしている。
用語「核酸ペイロード」は、修飾核酸を包含する。同様に、「ＲＮＡｉ剤」および「ｓｉＲＮＡ」という用語は、修飾核酸を包含する。例えば、核酸分子は、模倣物であり得、修飾糖骨格、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合（例えば、１つ以上のホスホロチオエートおよび／またはヘテロ原子ヌクレオシド間結合）、１つ以上の修飾塩基などを含み得る。主題の核酸ペイロード（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、モルホリノバックボーン構造を有し得る。いくつかの場合において、主題の核酸ペイロード（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を有し得る。適切な糖置換基には、メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）、アミノプロポキシ（－Ｏ ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）、－Ｏ－アリル（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）およびフルオロ（Ｆ）が含まれる。２’－糖置換基は、アラビノ（上）位置またはリボ（下）位置にあってもよい。適切な塩基修飾には、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニル（－Ｃ＝Ｃ－ＣＨ３）ウラシルおよびシトシンならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（プソイドウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に、５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－アデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニンならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンなどの合成および天然核酸塩基が含まれる。さらなる修飾核酸塩基には、フェノキサジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド（５，４－（ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド（４，５－ｂ）インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド（３’，２’：４，５）ピロロ（２，３－ｄ）ピリミジン－２－オン）などのＧ－クランプなどの三環式ピリミジンが含まれる。
いくつかの場合において、核酸ペイロードは、コンジュゲート部分（例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布または細胞内取り込みを増強するもの）を含み得る。これらの部分またはコンジュゲートは、一級または二級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合したコンジュゲート基を含み得る。コンジュゲート基には、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的性質を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態学的性質を増強する基が含まれるが、これらに限定されない。好適なコンジュゲート基には、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および染料が含まれるが、これらに限定されない。薬力学的性質を増強する基は、取り込みを改善し、分解に対する抵抗性を増強し、かつ／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。薬物動態学的性質を増強する基は、主題の核酸の取り込み、分布、代謝または排泄を改善する基を含む。
荷電ポリマーポリペプチドドメイン
いくつかの場合において、主題の送達分子の標的指向リガンドは、荷電ポリマーポリペプチドドメイン（カチオン性アンカードメイン）にコンジュゲートしている（例えば、図１、パネルＣ～Ｆを参照）。荷電ポリマーポリペプチドドメインは、反復カチオン性残基（例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン）を含み得る。いくつかの場合において、カチオン性アンカードメインは、３～３０アミノ酸（例えば、３～２８、３～２５、３～２４、３～２０、４～３０、４～２８、４～２５、４～２４、もしくは４～２０アミノ酸；または例えば、４～１５、４～１２、５～３０、５～２８、５～２５、５～２０、５～１５、５～１２アミノ酸）の範囲の長さを有する。いくつかの場合において、カチオン性アンカードメインは、４～２４アミノ酸の範囲の長さを有する。荷電ポリマーポリペプチドドメインの適切な例には、限定されないが、
Figure 0007317706000012
が含まれる。
荷電ポリマーポリペプチドドメイン（カチオン性アンカードメイン）は、任意の都合のよいカチオン性荷電ドメインであり得る。例えば、そのようなドメインは、ヒストンテールペプチド（ＨＴＰ）であり得る。いくつかの場合において、荷電ポリマーポリペプチドドメインは、ヒストンおよび／またはヒストンテールペプチドを含む（例えば、カチオン性ポリペプチドは、ヒストンおよび／またはヒストンテールペプチドであり得る）。いくつかの場合において、荷電ポリマーポリペプチドドメインは、ＮＬＳ含有ペプチドを含む（例えば、カチオン性ポリペプチドは、ＮＬＳ含有ペプチドであり得る）。いくつかの場合において、荷電ポリマーポリペプチドドメインは、ミトコンドリア局在シグナルを含むペプチドを含む（例えば、カチオン性ポリペプチドは、ミトコンドリア局在シグナルを含むペプチドであり得る）。
いくつかの場合において、主題の送達分子の荷電ポリマーポリペプチドドメインは、送達分子がペイロード（例えば、核酸ペイロードおよび／またはタンパク質ペイロードなど）と相互作用する（例えば、静電気的に、例えば縮合のために相互作用する）ための方法として使用される。
いくつかの場合において、例えば標的指向リガンドがナノ粒子を所望の細胞／細胞表面タンパク質に標的指向させるために使用されるように、主題の送達分子の荷電ポリマーポリペプチドドメインをナノ粒子の表面を送達分子でコーティングするためのアンカーとして使用する（例えば、図１、パネルＣ～Ｄを参照）。したがって、いくつかの場合において、荷電ポリマーポリペプチドドメインは、ナノ粒子の荷電安定化層と静電的に相互作用する。例えば、いくつかの場合において、ナノ粒子は、安定化層（例えば、シリカ、ペプトイド、ポリシステイン、またはリン酸カルシウムコーティング）によって囲まれたコア（例えば、核酸、タンパク質、および／またはリボ核タンパク質複合体ペイロードを含む）を含む。いくつかの場合において、安定化層は負電荷を有し、したがって正に荷電したポリマーポリペプチドドメインは安定化層と相互作用することができ、送達分子をナノ粒子に効果的に固定し、ナノ粒子表面を主題の標的指向リガンドでコーティングする（例えば、図１、パネルＣおよびＤを参照）。コンジュゲーションは、任意の便利な技術によって達成され得、多くの異なるコンジュゲーション化学が当業者に知られているであろう。いくつかの場合において、コンジュゲーションは、スルフヒドリル化学的性質（例えば、ジスルフィド結合）を介する。いくつかの場合において、コンジュゲーションは、アミン反応性化学的性質を使用して達成される。いくつかの場合において、標的指向リガンドおよび荷電ポリマーポリペプチドドメインは、同じポリペプチドの一部であることによってコンジュゲートされる。
いくつかの場合において、荷電ポリマーポリペプチドドメイン（カチオン性）は、ポリ（アルギニン）（ＰＲ）、ポリ（リジン）（ＰＫ）、ポリ（ヒスチジン）（ＰＨ）、ポリ（オルニチン）、ポリ（シトルリン）、およびこれらの組み合わせから選択されるポリマーを含み得る。いくつかの場合において、所与のカチオン性アミノ酸ポリマーは、アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン、およびシトルリン残基の混合物を（任意の都合のよい組み合わせで）含み得る。ポリマーは、Ｌ－異性体またはＤ－異性体のポリマーとして存在し得、Ｄ－異性体は、それらが分解するのにより長い時間がかかるので標的細胞中でより安定である。したがって、Ｄ－異性体ポリ（アミノ酸）を含めると、分解（およびその後のペイロード放出）が遅くなる。したがって、ペイロード放出速度は、制御することができ、Ｌ－異性体のポリマーに対するＤ－異性体のポリマーの比に比例し、ここで、Ｌ－異性体に対するＤ－異性体の比率が高いほどペイロード放出の持続時間が長くなる（すなわち、放出速度が低下する）。言い換えれば、Ｄ－異性体とＬ－異性体の相対量は、放出動態および分解に対する分解に対する酵素感受性およびペイロード放出を調節することができる。
いくつかの場合において、カチオン性ポリマーは、カチオン性アミノ酸ポリマー（例えば、ポリ（アルギニン）（ＰＲ）、ポリ（リジン）（ＰＫ）、ポリ（ヒスチジン）（ＰＨ）、ポリ（オルニチン）、ポリ（シトルリン））のＤ－異性体およびＬ－異性体を含む。いくつかの場合において、Ｄ－対Ｌ－異性体の比は、１０：１～１：１０の範囲内（例えば、８：１～１：１０、６：１～１：１０、４：１～１：１０、３：１～１：１０、２：１～１：１０、１：１～１：１０、１０：１～１：８、８：１～１：８、６：１～１：８、４：１～１：８、３：１～１：８、２：１～１：８、１：１～１：８、１０：１～１：６、８：１～１：６、６：１～１：６、４：１～１：６、３：１～１：６、２：１～１：６、１：１～１：６、１０：１～１：４、８：１～１：４、６：１～１：４、４：１～１：４、３：１～１：４、２：１～１：４、１：１～１：４、１０：１～１：３、８：１～１：３、６：１～１：３、４：１～１：３、３：１～１：３、２：１～１：３、１：１～１：３、１０：１～１：２、８：１～１：２、６：１～１：２、４：１～１：２、３：１～１：２、２：１～１：２、１：１～１：２、１０：１～１：１、８：１～１：１、６：１～１：１、４：１～１：１、３：１～１：１、または２：１～１：１）である。
したがって、いくつかの場合において、カチオン性ポリマーは、（例えば、ポリ（Ｄ－アルギニン）、ポリ（Ｄ－リジン）、ポリ（Ｄ－ヒスチジン）、ポリ（Ｄ－オルニチン）、およびポリ（Ｄ－シトルリン）から選択される）Ｄ－異性体のポリマーである第１のカチオン性ポリマー（例えば、アミノ酸ポリマー）を含み、かつ（例えば、ポリ（Ｌ－アルギニン）、ポリ（Ｌ－リジン）、ポリ（Ｌ－ヒスチジン）、ポリ（Ｌ－オルニチン）、およびポリ（Ｌ－シトルリン）から選択される）Ｌ－異性体のポリマーである第２のカチオン性ポリマー（例えば、アミノ酸ポリマー）を含む。いくつかの場合において、第１のカチオン性ポリマー（Ｄ－異性体）対第２のカチオン性ポリマー（Ｌ－異性体）の比は、１０：１～１：１０の範囲内（例えば、８：１～１：１０、６：１～１：１０、４：１～１：１０、３：１～１：１０、２：１～１：１０、１：１～１：１０、１０：１～１：８、８：１～１：８、６：１～１：８、４：１～１：８、３：１～１：８、２：１～１：８、１：１～１：８、１０：１～１：６、８：１～１：６、６：１～１：６、４：１～１：６、３：１～１：６、２：１～１：６、１：１～１：６、１０：１～１：４、８：１～１：４、６：１～１：４、４：１～１：４、３：１～１：４、２：１～１：４、１：１～１：４、１０：１～１：３、８：１～１：３、６：１～１：３、４：１～１：３、３：１～１：３、２：１～１：３、１：１～１：３、１０：１～１：２、８：１～１：２、６：１～１：２、４：１～１：２、３：１～１：２、２：１～１：２、１：１～１：２、１０：１～１：１、８：１～１：１、６：１～１：１、４：１～１：１、３：１～１：１、または２：１～１：１）である。
いくつかの実施形態において、カチオン性ポリマーは、（例えば、カチオン性ポリマーの前述の例のいずれかに加えてまたは代わりに）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（アスパルトアミド）、ポリペプトイド（例えば、コア縮合のための「クモの巣」状分岐を形成する）、電荷官能化ポリエステル、カチオン性多糖、アセチル化アミノ糖、キトサン、またはこれらの任意の組み合わせを含むカチオン性ポリマーを（例えば、直鎖状または分岐状で）含む。
いくつかの実施形態において、カチオン性ポリマーは、１～２００ｋＤａ（例えば、１～１５０、１～１００、１～５０、５～２００、５～１５０、５～１００、５～５０、１０～２００、１０～１５０、１０～１００、１０～５０、１５～２００、１５～１５０、１５～１００、または１５～５０ｋＤａ）の範囲の分子量を有し得る。一例として、いくつかの場合において、カチオン性ポリマーは、例えば、約２９ｋＤａの分子量を有するポリ（Ｌ－アルギニン）を含む。別の例として、いくつかの場合において、カチオン性ポリマーは、約２５ｋＤａの分子量を有する直鎖状ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を含む。別の例として、いくつかの場合において、カチオン性ポリマーは、約１０ｋＤａの分子量を有する分岐状ポリ（エチレンイミン）を含む。別の例として、いくつかの場合において、カチオン性ポリマーは、約７０ｋＤａの分子量を有する分岐状ポリ（エチレンイミン）を含む。いくつかの場合において、カチオン性ポリマーは、ＰＡＭＡＭを含む。
いくつかの場合において、カチオン性アミノ酸ポリマーは、例えば、リンカー、ＮＬＳ、および／またはカチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストンまたはＨＴＰ）へのコンジュゲーションを容易にし得るシステイン残基を含む。例えば、システイン残基は、スルフヒドリル化学的性質（例えば、ジスルフィド結合）および／またはアミン反応性化学的性質を介した架橋（コンジュゲーション）のために使用され得る。したがって、いくつかの実施形態において、カチオン性ポリマー組成の、カチオン性アミノ酸ポリマー（例えば、ポリ（アルギニン）（ＰＲ）、ポリ（リジン）（ＰＫ）、ポリ（ヒスチジン）（ＰＨ）、ポリ（オルニチン）、およびポリ（シトルリン）、ポリ（Ｄ－アルギニン）（ＰＤＲ）、ポリ（Ｄ－リジン）（ＰＤＫ）、ポリ（Ｄ－ヒスチジン）（ＰＤＨ）、ポリ（Ｄ－オルニチン）、およびポリ（Ｄ－シトルリン）、ポリ（Ｌ－アルギニン）（ＰＬＲ）、ポリ（Ｌ－リジン）（ＰＬＫ）、ポリ（Ｌ－ヒスチジン）（ＰＬＨ）、ポリ（Ｌ－オルニチン）、およびポリ（Ｌ－シトルリン））は、システイン残基を含む。いくつかの場合において、カチオン性アミノ酸ポリマーは、Ｎ末端および／またはＣ末端にシステイン残基を含む。いくつかの場合において、カチオン性アミノ酸ポリマーは、内部システイン残基を含む。
いくつかの場合において、カチオン性アミノ酸ポリマーは、核局在シグナル（ＮＬＳ）を含む（かつ／またはそれにコンジュゲートしている）（以下により詳細に記載される）。したがって、いくつかの実施形態において、カチオン性アミノ酸ポリマー（例えば、ポリ（アルギニン）（ＰＲ）、ポリ（リジン）（ＰＫ）、ポリ（ヒスチジン）（ＰＨ）、ポリ（オルニチン）、およびポリ（シトルリン）、ポリ（Ｄ－アルギニン）（ＰＤＲ）、ポリ（Ｄ－リジン）（ＰＤＫ）、ポリ（Ｄ－ヒスチジン）（ＰＤＨ）、ポリ（Ｄ－オルニチン）、およびポリ（Ｄ－シトルリン）、ポリ（Ｌ－アルギニン）（ＰＬＲ）、ポリ（Ｌ－リジン）（ＰＬＫ）、ポリ（Ｌ－ヒスチジン）（ＰＬＨ）、ポリ（Ｌ－オルニチン）、およびポリ（Ｌ－シトルリン））は、１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、または４つ以上）のＮＬＳを含む。いくつかの場合において、カチオン性アミノ酸ポリマーは、Ｎ末端および／またはＣ末端にＮＬＳを含む。いくつかの場合において、カチオン性アミノ酸ポリマーは、内部ＮＬＳを含む。
ヒストンテールペプチド（ＨＴＰ）
いくつかの実施形態において、荷電ポリマーポリペプチドドメインは、ヒストンペプチド、またはＮ末端ヒストンテール（例えば、Ｈ１、Ｈ２（例えば、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ２Ｂ）、Ｈ３、またはＨ４ヒストンタンパク質のヒストンテール）などのヒストンペプチドのフラグメントを含む。ヒストンタンパク質のテールフラグメントは、本明細書においてヒストンテールペプチド（ＨＴＰ）と呼ばれる。そのようなタンパク質（ヒストンおよび／またはＨＴＰ）は、主題の送達分子の一部として核酸ペイロードと凝縮することができるので、１つ以上のヒストンまたはＨＴＰを含む荷電ポリマーポリペプチドドメインは、本明細書においてヌクレオソーム模倣物ドメインと呼ばれることがある。ヒストンおよび／またはＨＴＰもモノマーとして含めることができ、いくつかの場合において、核酸ペイロードを縮合させると、ダイマー、トリマー、テトラマーおよび／またはオクタマーを形成する。いくつかの場合において、ＨＴＰは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ媒介アセチル化の場合のように、様々なヒストン修飾によって脱プロトン化できるだけでなく、コアの成分の効果的な核特異的アンパッケージング（例えば、ペイロードの放出）も仲介し得る。
いくつかの実施形態において、主題の荷電ポリマーポリペプチドドメインは、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、またはＨ４タンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。いくつかの場合において、主題の荷電ポリマーポリペプチドドメインは、ヒストンタンパク質のＮ末端領域に対応するアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。例えば、フラグメント（ＨＴＰ）は、ヒストンタンパク質の最初の５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０のＮ末端アミノ酸を含み得る。いくつかの場合において、主題のＨＴＰは、ヒストンタンパク質のＮ末端領域からの５～５０アミノ酸（例えば、５～４５、５～４０、５～３５、５～３０、５～２５、５～２０、８～５０、８～４５、８～４０、８～３５、８～３０、１０～５０、１０～４５、１０～４０、１０～３５、または１０～３０アミノ酸）を含む。いくつかの場合において、主題のカチオン性ポリペプチドは、５～１５０アミノ酸（例えば、５～１００、５～５０、５～３５、５～３０、５～２５、５～２０、８～１５０、８～１００、８～５０、８～４０、８～３５、８～３０、１０～１５０、１０～１００、１０～５０、１０～４０、１０～３５、または１０～３０アミノ酸）を含む。
いくつかの場合において、荷電ポリマーポリペプチドドメインのカチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストンまたはＨＴＰ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、またはＨ４）は、翻訳後修飾（例えば、いくつかの場合において、１つ以上のヒスチジン、リジン、アルギニン、または他の相補的残基における）を含む。例えば、いくつかの場合において、カチオン性ポリペプチドは、メチル化（および／またはメチル化／脱メチル化を受けやすい）、アセチル化（および／またはアセチル化／脱アセチル化を受けやすい）、クロトニル化（および／またはクロトニル化／脱クロトニル化を受けやすい）、ユビキチン化（および／またはユビキチン化／脱ユビキチン化を受けやすい）、リン酸化（および／またはリン酸化／脱リン酸化を受けやすい）、ＳＵＭＯ化（および／またはＳＵＭＯ化／脱ＳＵＭＯ化を受けやすい）、ファルネシル化（および／またはファルネシル化／脱ファルネシル化を受けやすい）、硫酸化（および／または硫酸化／脱硫酸化を受けやすい）、またはそうでなければ翻訳後修飾される。いくつかの場合において、荷電ポリマーポリペプチドドメインのカチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストンまたはＨＴＰ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、またはＨ４）は、ｐ３００／ＣＢＰ基質である（例えば、下記のＨＴＰの例を参照）。いくつかの場合において、荷電ポリマーポリペプチドドメインのカチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストンまたはＨＴＰ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、またはＨ４）は、硫酸化されているか、または硫酸化を受けやすい（例えば、チオ硫酸スルフトランスフェラーゼ基質として）１つ以上のチオール残基を含む（例えば、システインおよび／またはメチオニン残基を含み得る）。いくつかの場合において、カチオン性ポリペプチドのカチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストンまたはＨＴＰ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、またはＨ４）は、Ｃ末端でアミド化されている。ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４（および／またはＨＴＰ）は、それらのリジンのいずれかにおいてモノメチル化、ジメチル化、またはトリメチル化して、転写活性を促進または抑制し、核特異的放出動態を変えることができる。
カチオン性ポリペプチドは、所望の修飾を用いて合成され得るか、またはインビトロ反応において修飾され得る。あるいは、カチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストンまたはＨＴＰ）を、細胞集団中で発現させることができ、所望の修飾タンパク質を、単離／精製することができる。いくつかの場合において、主題のナノ粒子の荷電ポリマーポリペプチドドメインは、メチル化ＨＴＰを含み、例えば、Ｈ３Ｋ４（Ｍｅ３）のＨＴＰ配列を含む－ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５または８８として記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、荷電ポリマーポリペプチドドメインのカチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストンまたはＨＴＰ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、またはＨ４）は、Ｃ末端アミドを含む。
ヒストンおよびＨＴＰの例
例には、以下の配列が含まれるが、これらに限定されない。
Figure 0007317706000013
Figure 0007317706000014
Figure 0007317706000015
Figure 0007317706000016
したがって、主題の荷電ポリマーポリペプチドドメインのカチオン性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２～１３９のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合において、主題の荷電ポリマーポリペプチドドメインのカチオン性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２～１３９のいずれかに記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、主題の荷電ポリマーポリペプチドドメインのカチオン性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２～１３９のいずれかに記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。カチオン性ポリペプチドは、任意の都合のよい修飾を含み得、多くのそのような企図された修飾、例えば、メチル化、アセチル化、クロトニル化、ユビキチン化、リン酸化、ＳＵＭＯ化、ファルネシル化、硫酸化などが上述されている。
いくつかの場合において、荷電ポリマーポリペプチドドメインのカチオン性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、荷電ポリマーポリペプチドドメインのカチオン性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４に記載のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性（例えば、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、荷電ポリマーポリペプチドドメインのカチオン性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、荷電ポリマーポリペプチドドメインのカチオン性ポリペプチドは、ヒトヒストン３タンパク質の最初の２５アミノ酸を含み、リジン４上でトリメチル化されている（例えば、いくつかの場合において、Ｃ末端でアミド化されている）Ｈ３Ｋ４（Ｍｅ３）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）によって表される配列を含む。
いくつかの実施形態において、荷電ポリマーポリペプチドドメインのカチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストンまたはＨＴＰ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、またはＨ４）は、カチオン性（またはいくつかの場合においてアニオン性）アミノ酸ポリマー、リンカー、ＮＬＳ、および／または他のカチオン性ポリペプチド（例えば、いくつかの場合において分岐ヒストン構造を形成する）へのコンジュゲーションを容易にし得るシステイン残基を含む。例えば、システイン残基は、スルフヒドリル化学的性質（例えば、ジスルフィド結合）および／またはアミン反応性化学的性質を介した架橋（コンジュゲーション）のために使用され得る。いくつかの場合において、システイン残基は、内部にある。いくつかの場合において、システイン残基は、Ｎ末端および／またはＣ末端に位置する。いくつかの場合において、荷電ポリマーポリペプチドドメインのカチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストンまたはＨＴＰ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、またはＨ４）は、システイン残基を付加する変異（例えば、挿入または置換）を含む。システインを含むＨＴＰの例には、以下が含まれるが、これらに限定されない。
Figure 0007317706000017
いくつかの実施形態において、荷電ポリマーポリペプチドドメインのカチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストンまたはＨＴＰ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、またはＨ４）は、カチオン性（および／またはアニオン性）アミノ酸ポリマーにコンジュゲートしている。一例として、ヒストンまたはＨＴＰは、システイン残基を介してカチオン性アミノ酸ポリマー（例えば、ポリ（リジン）を含むもの）にコンジュゲートし得、例えば、ポリマーのリジン（複数可）のピリジルジスルフィド基（複数可）が、ヒストンまたはＨＴＰのシステインへのジスルフィド結合で置換されている。
修正／分岐構造
いくつかの実施形態において、荷電ポリマーポリペプチドドメインは、線状構造を有する。いくつかの実施形態において、荷電ポリマーポリペプチドドメインは、分岐構造を有する。
例えば、いくつかの場合において、カチオン性ポリペプチド（例えば、ＨＴＰ、例えば、システイン残基を有するＨＴＰ）は、カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（Ｌ－アルギニン）、ポリ（Ｄ－リジン）、ポリ（Ｌ－リジン）、ポリ（Ｄ－リジン））の末端に（例えば、そのＣ末端で）コンジュゲートしており、したがって、伸長線状ポリペプチドを形成する。いくつかの場合において、１つ以上（２つ以上、３つ以上など）のカチオン性ポリペプチド（例えば、ＨＴＰ、例えば、システイン残基を有するＨＴＰ）は、カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（Ｌ－アルギニン）、ポリ（Ｄ－リジン）、ポリ（Ｌ－リジン）、ポリ（Ｄ－リジン））の末端（複数可）に（例えば、それらのＣ末端で）コンジュゲートしており、したがって、伸長線状ポリペプチドを形成する。いくつかの場合において、カチオン性ポリマーは、４，５００～１５０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。
別の例として、いくつかの場合において、１つ以上（２つ以上、３つ以上など）のカチオン性ポリペプチド（例えば、ＨＴＰ、例えば、システイン残基を有するＨＴＰ）は、カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（Ｌ－アルギニン）、ポリ（Ｄ－リジン）、ポリ（Ｌ－リジン）、ポリ（Ｄ－リジン））の側鎖に（例えば、それらのＣ末端で）コンジュゲートしており、したがって、分岐構造（分岐ポリペプチド）を形成する。分岐構造の形成は、いくつかの場合において、達成され得る、（例えば、核酸ペイロードの）縮合の量を増加させ得る。したがって、いくつかの場合において、分岐構造を形成する成分を使用することが望ましい。様々な種類の分枝構造が重要であり、（例えば、ＨＴＰ、例えば、システイン残基、ペプトイド、ポリアミドなどを有するＨＴＰなどの主題のカチオン性ポリペプチドを使用して）生成され得る分枝構造の例には、ブラシポリマー、ウェブ（例えば、クモの巣）、グラフトポリマー、星型ポリマー、くし形ポリマー、ポリマーネットワーク、デンドリマーなどが含まれるが、これらに限定されない。
例として、図１２３は、ブラシタイプの分岐構造を示している。いくつかの場合において、分岐構造は、２～３０個のカチオン性ポリペプチド（例えば、ＨＴＰ）（例えば、２～２５、２～２０、２～１５、２～１０、２～５、４～３０、４～２５、４～２０、４～１５、または４～１０個のカチオン性ポリペプチド）を含み、ここで、各々は分岐構造の他のカチオン性ポリペプチドと同じでも異なっていてもよい（例えば、図１２３参照）。いくつかの場合において、カチオン性ポリマーは、４，５００～１５０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。いくつかの場合において、カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（Ｌ－アルギニン）、ポリ（Ｄ－リジン）、ポリ（Ｌ－リジン）、ポリ（Ｄ－リジン））の側鎖の５％以上（例えば、１０％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、４０％以上、または５０％以上）は、主題のカチオン性ポリペプチド（例えば、ＨＴＰ、例えばシステイン残基を有するＨＴＰ）にコンジュゲートしている。いくつかの場合において、カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（Ｌ－アルギニン）、ポリ（Ｄ－リジン）、ポリ（Ｌ－リジン）、ポリ（Ｄ－リジン））の側鎖の最大５０％（例えば、最大４０％、最大３０％、最大２５％、最大２０％、最大１５％、最大１０％、または最大５％）は、主題のカチオン性ポリペプチド（例えば、ＨＴＰ、例えばシステイン残基を有するＨＴＰ）にコンジュゲートしている。したがって、ＨＴＰは、カチオン性アミノ酸ポリマーなどのポリマーの骨格から分岐し得る。
いくつかの場合において、ペプトイド（ポリペプトイド）、ポリアミド、デンドリマーなどの成分を使用して、分岐構造の形成を容易にすることができる。例えば、いくつかの場合において、縮合を容易にし得るウェブ（例えば、クモの巣）構造を生成するために、いくつかの場合において、ペプトイド（例えば、ポリペプトイド）を主題の送達分子と共に組成物の一部として使用する。
本明細書における１つ以上の天然または修飾ポリペプチド配列は、末端または間欠的アルギニン、リジン、またはヒスチジン配列で修飾されてもよい。一実施形態では、各ポリペプチドは、ナノ粒子コア内に等しいアミンモル濃度で含まれる。この実施形態では、各ポリペプチドのＣ末端は、５Ｒ（５アルギニン）で修飾され得る。いくつかの実施形態において、各ポリペプチドのＣ末端は、９Ｒ（９アルギニン）で修飾され得る。いくつかの実施形態において、各ポリペプチドのＮ末端は、５Ｒ（５アルギニン）で修飾され得る。いくつかの実施形態において、各ポリペプチドのＮ末端は、９Ｒ（９アルギニン）で修飾され得る。いくつかの場合において、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３および／またはＨ４ヒストンフラグメント（例えば、ＨＴＰ）は、それぞれＦＫＦＬカテプシンＢタンパク質分解性切断ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８２）またはＲＧＦＦＰカテプシンＤタンパク質分解性切断ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８３）で直列に架橋されている。いくつかの場合において、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３および／またはＨ４ヒストンフラグメント（例えば、ＨＴＰ）は、５Ｒ（５アルギニン）、９Ｒ（９アルギニン）、５Ｋ（５リジン）、９Ｋ（９リジン）、５Ｈ（５ヒスチジン）、または９Ｈ（９ヒスチジン）カチオン性スペーサードメインによって直列に架橋され得る。いくつかの場合において、１つ以上のＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３および／またはＨ４ヒストンフラグメント（例えば、ＨＴＰ）は、それらのＮ末端でプロタミンにジスルフィド結合している。
分岐ヒストン構造をどのように生成するかを説明するために、例示的な調製方法が提供される。そのような方法の一例には、以下が含まれ：等モル比のヒストンＨ２ＡＸ［１３４～１４３］、ヒストンＨ３［１～２１ Ｃｙｓ］、ヒストンＨ３［２３～３４ Ｃｙｓ］、ヒストンＨ４［８～２５ ＷＣ］およびＳＶ４０ Ｔ－Ａｇ由来ＮＬＳの共有結合修飾は、１０％ピリジルジスルフィド修飾ポリ（Ｌ－リジン）との反応で実施され得る［ＭＷ＝５４００、１８０００、または４５０００Ｄａ；ｎ＝３０、１００、または２５０］。典型的な反応では、７００μＭのＣｙｓ修飾ヒストン／ＮＬＳ（２０ｎｍｏｌ）の２９μＬ水溶液を、５７μＬの０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に加えることができる。次に、１４μＬの１００μＭピリジルジスルフィド保護ポリ（リジン）溶液をヒストン溶液に加えて、最終容量を１：２の比のピリジルジスルフィド基対システイン残基を有する１００μＬにすることができる。この反応は室温で３時間実施され得る。反応は４回繰り返され得、コンジュゲーションの程度は３４３ｎｍでのピリジン－２－チオンの吸光度を介して決定され得る。
別の例として、０：１、１：４、１：３、１：２、１：１、１：２、１：３、１：４、または１：０モル比のヒストンＨ３［１～２１ Ｃｙｓ］ペプチドおよびヒストンＨ３［２３～３４ Ｃｙｓ］ペプチドの共有結合修飾は、１０％ピリジルジスルフィド修飾ポリ（Ｌ－リジン）またはポリ（Ｌ－アルギニン）との反応で実施され得る［ＭＷ＝５４００、１８０００、または４５０００Ｄａ；ｎ＝３０、１００、または２５０］。典型的な反応では、７００μＭのＣｙｓ修飾ヒストン（２０ｎｍｏｌ）の２９μＬ水溶液を、５７μＬの０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に加えることができる。次に、１４μＬの１００μＭピリジルジスルフィド保護ポリ（リジン）溶液をヒストン溶液に加えて、最終容量を１：２の比のピリジルジスルフィド基対システイン残基を有する１００μＬにすることができる。この反応は室温で３時間実施され得る。反応は４回繰り返され得、コンジュゲーションの程度は３４３ｎｍでのピリジン－２－チオンの吸光度を介して決定され得る。
いくつかの場合において、荷電ポリマーポリペプチドドメインは、核酸ペイロードと縮合している（例えば、図１、パネルＥ～Ｆを参照）。いくつかの場合において、荷電ポリマーポリペプチドドメインは、タンパク質ペイロードと縮合している。いくつかの場合において、荷電ポリマーポリペプチドドメインをシリカ、塩、および／またはアニオン性ポリマーと共縮合させて、追加のエンドソーム緩衝能、安定性、および例えば任意で持続放出を提供する。上記のように、いくつかの場合において、主題の送達分子の荷電ポリマーポリペプチドドメインは、例えば、長さが約４～２５アミノ酸または長さが４～１５アミノ酸の、一連の反復カチオン性残基（アルギニン、リジン、および／またはヒスチジンなど）である。そのようなドメインは、送達分子がアニオン性放出可能マトリックス（例えば、共縮合アニオン性ポリマー）と静電的に相互作用することを可能にし得る。したがって、いくつかの場合において、主題の送達分子の主題の荷電ポリマーポリペプチドドメインは、アニオン性放出可能マトリックスならびに核酸および／またはタンパク質ペイロードと（例えば、静電的に）相互作用する一連の反復カチオン性残基である。したがって、いくつかの場合において、主題の送達分子は、ペイロード（例えば、核酸および／またはタンパク質）と相互作用し、アニオン性ポリマーと共に組成物の一部として存在する（例えば、ペイロードおよびアニオン性ポリマーと共縮合する）。
アニオン性放出可能マトリックスのアニオン性ポリマー（すなわち、主題の送達分子の荷電ポリマーポリペプチドドメインと相互作用するアニオン性ポリマー）は、任意の都合のよいアニオン性ポリマー／ポリマー組成物であり得る。例には、ポリ（グルタミン酸）（例えば、ポリ（Ｄ－グルタミン酸）［ＰＤＥ］、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）［ＰＬＥ］、様々な所望の比率のＰＤＥとＰＬＥの両方など）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合において、ＰＤＥは、アニオン性放出可能マトリックスとして使用される。いくつかの場合において、ＰＬＥは、アニオン性放出可能マトリックス（アニオン性ポリマー）として使用される。いくつかの場合において、ＰＤＥは、アニオン性放出可能マトリックス（アニオン性ポリマー）として使用される。いくつかの場合において、ＰＬＥとＰＤＥの両方は、例えば、１：１の比率（５０％ＰＤＥ、５０％ＰＬＥ）で、アニオン性放出可能マトリックス（アニオン性ポリマー）として使用される。
アニオン性ポリマー
アニオン性ポリマー組成物は、１つ以上のアニオン性アミノ酸ポリマーを含み得る。例えば、いくつかの場合において、主題のアニオン性ポリマー組成物は、ポリ（グルタミン酸）（ＰＥＡ）、ポリ（アスパラギン酸）（ＰＤＡ）、およびこれらの組み合わせから選択されるポリマーを含む。いくつかの場合において、所与のアニオン性アミノ酸ポリマーは、アスパラギン酸残基とグルタミン酸残基の混合物を含み得る。各ポリマーは、Ｌ－異性体またはＤ－異性体のポリマーとして組成物中に存在し得、Ｄ－異性体は、それらが分解するのにより長い時間がかかるので標的細胞中でより安定である。したがって、Ｄ－異性体ポリ（アミノ酸）を含めると、分解およびその後のペイロード放出が遅くなり得る。したがって、ペイロード放出速度は、制御することができ、Ｌ－異性体のポリマーに対するＤ－異性体のポリマーの比に比例し、ここで、Ｌ－異性体に対するＤ－異性体の比率が高いほどペイロード放出の持続時間が長くなる（すなわち、放出速度が低下する）。言い換えれば、Ｄ－異性体とＬ－異性体の相対量は、ナノ粒子コアの持続放出動態および分解に対する酵素感受性およびペイロード放出を調節することができる。
いくつかの場合において、アニオン性ポリマー組成物は、アニオン性アミノ酸ポリマー（例えば、ポリ（グルタミン酸）（ＰＥＡ）およびポリ（アスパラギン酸）（ＰＤＡ））のＤ－異性体のポリマーおよびＬ－異性体のポリマーを含む。いくつかの場合において、Ｄ－対Ｌ－異性体の比は、１０：１～１：１０の範囲内（例えば、８：１～１：１０、６：１～１：１０、４：１～１：１０、３：１～１：１０、２：１～１：１０、１：１～１：１０、１０：１～１：８、８：１～１：８、６：１～１：８、４：１～１：８、３：１～１：８、２：１～１：８、１：１～１：８、１０：１～１：６、８：１～１：６、６：１～１：６、４：１～１：６、３：１～１：６、２：１～１：６、１：１～１：６、１０：１～１：４、８：１～１：４、６：１～１：４、４：１～１：４、３：１～１：４、２：１～１：４、１：１～１：４、１０：１～１：３、８：１～１：３、６：１～１：３、４：１～１：３、３：１～１：３、２：１～１：３、１：１～１：３、１０：１～１：２、８：１～１：２、６：１～１：２、４：１～１：２、３：１～１：２、２：１～１：２、１：１～１：２、１０：１～１：１、８：１～１：１、６：１～１：１、４：１～１：１、３：１～１：１、または２：１～１：１）である。
したがって、いくつかの場合において、アニオン性ポリマー組成物は、（例えば、ポリ（Ｄ－グルタミン酸）（ＰＤＥＡ）およびポリ（Ｄ－アスパラギン酸）（ＰＤＤＡ）から選択される）Ｄ－異性体のポリマーである第１のアニオン性ポリマー（例えばアミノ酸ポリマー）を含み、かつ（例えば、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）（ＰＬＥＡ）およびポリ（Ｌ－アスパラギン酸）（ＰＬＤＡ）から選択される）Ｌ－異性体のポリマーである第２のアニオン性ポリマー（例えば、アミノ酸ポリマー）を含む。いくつかの場合において、第１のアニオン性ポリマー（Ｄ－異性体）対第２のアニオン性ポリマー（Ｌ－異性体）の比は、１０：１～１：１０の範囲内（例えば、８：１～１：１０、６：１～１：１０、４：１～１：１０、３：１～１：１０、２：１～１：１０、１：１～１：１０、１０：１～１：８、８：１～１：８、６：１～１：８、４：１～１：８、３：１～１：８、２：１～１：８、１：１～１：８、１０：１～１：６、８：１～１：６、６：１～１：６、４：１～１：６、３：１～１：６、２：１～１：６、１：１～１：６、１０：１～１：４、８：１～１：４、６：１～１：４、４：１～１：４、３：１～１：４、２：１～１：４、１：１～１：４、１０：１～１：３、８：１～１：３、６：１～１：３、４：１～１：３、３：１～１：３、２：１～１：３、１：１～１：３、１０：１～１：２、８：１～１：２、６：１～１：２、４：１～１：２、３：１～１：２、２：１～１：２、１：１～１：２、１０：１～１：１、８：１～１：１、６：１～１：１、４：１～１：１、３：１～１：１、または２：１～１：１）である。
いくつかの実施形態において、アニオン性ポリマー組成物は、（例えば、アニオン性ポリマーの前述の例のいずれかに加えてまたは代わりに）グリコサミノグリカン、糖タンパク質、多糖、ポリ（マンヌロン酸）、ポリ（グルロン酸）、ヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン、ケラタン硫酸、アグリカン、ポリ（グルコサミン）、またはこれらの任意の組み合わせを含むアニオン性ポリマーを含む。
いくつかの実施形態において、アニオン性ポリマーは、１～２００ｋＤａ（例えば、１～１５０、１～１００、１～５０、５～２００、５～１５０、５～１００、５～５０、１０～２００、１０～１５０、１０～１００、１０～５０、１５～２００、１５～１５０、１５～１００、または１５～５０ｋＤａ）の範囲の分子量を有し得る。一例として、いくつかの場合において、アニオン性ポリマーは、約１５ｋＤａの分子量を有するポリ（グルタミン酸）を含む。
いくつかの場合において、アニオン性アミノ酸ポリマーは、例えば、リンカー、ＮＬＳ、および／またはカチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストンまたはＨＴＰ）へのコンジュゲーションを容易にし得るシステイン残基を含む。例えば、システイン残基は、スルフヒドリル化学的性質（例えば、ジスルフィド結合）および／またはアミン反応性化学的性質を介した架橋（コンジュゲーション）のために使用され得る。したがって、いくつかの実施形態において、アニオン性ポリマー組成物の、アニオン性アミノ酸ポリマー（例えば、ポリ（グルタミン酸）（ＰＥＡ）、ポリ（アスパラギン酸）（ＰＤＡ）、ポリ（Ｄ－グルタミン酸）（ＰＤＥＡ）、ポリ（Ｄ－アスパラギン酸）（ＰＤＤＡ）、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）（ＰＬＥＡ）、ポリ（Ｌ－アスパラギン酸）（ＰＬＤＡ））は、システイン残基を含む。いくつかの場合において、アニオン性アミノ酸ポリマーは、Ｎ末端および／またはＣ末端にシステイン残基を含む。いくつかの場合において、アニオン性アミノ酸ポリマーは、内部システイン残基を含む。
いくつかの場合において、アニオン性アミノ酸ポリマーは、核局在シグナル（ＮＬＳ）を含む（かつ／またはそれにコンジュゲートしている）（以下により詳細に記載される）。したがって、いくつかの実施形態において、アニオン性ポリマー組成物の、アニオン性アミノ酸ポリマー（例えば、ポリ（グルタミン酸）（ＰＥＡ）、ポリ（アスパラギン酸）（ＰＤＡ）、ポリ（Ｄ－グルタミン酸）（ＰＤＥＡ）、ポリ（Ｄ－アスパラギン酸）（ＰＤＤＡ）、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）（ＰＬＥＡ）、ポリ（Ｌ－アスパラギン酸）（ＰＬＤＡ））は、１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、または４つ以上）のＮＬＳを含む（かつ／またはそれにコンジュゲートしている）。いくつかの場合において、アニオン性アミノ酸ポリマーは、Ｎ末端および／またはＣ末端にＮＬＳを含む。いくつかの場合において、アニオン性アミノ酸ポリマーは、内部ＮＬＳを含む。
いくつかの場合において、アニオン性ポリマーは、標的指向リガンドにコンジュゲートしている。
リンカー
いくつかの実施形態において、本開示による標的指向リガンドは、介在リンカーを介してペイロード（例えば、タンパク質ペイロードまたはｓｉＲＮＡなどの核酸ペイロード）にコンジュゲートしている（例えば、図１および図２を参照）。リンカーは、タンパク質リンカーまたは非タンパク質リンカーであり得る。
標的指向リガンドのリンカーへのコンジュゲーション、リンカーのペイロード（例えば、核酸もしくはタンパク質ペイロード）へのコンジュゲーション、またはリンカーの荷電ポリマーポリペプチドドメインへのコンジュゲーションは、多数の異なる方法で達成され得る。いくつかの場合において、コンジュゲーションは、スルフヒドリル化学的性質を介する（例えば、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合、例えば、図２を参照）。いくつかの場合において、コンジュゲーションは、アミン反応性化学的性質を使用して達成される。いくつかの場合において、標的指向リガンドは、システイン残基を含み、システイン残基を介してリンカーにコンジュゲートしている。いくつかの場合において、リンカーは、ペプチドリンカーであり、システイン残基を含む。いくつかの場合において、標的指向リガンドおよびペプチドリンカーは、同じポリペプチドの一部であることによってコンジュゲートしている。
いくつかの場合において、主題のリンカーは、ポリペプチドであり、ポリペプチドリンカーと呼ばれ得る。ポリペプチドリンカーが企図される一方、非ポリペプチドリンカー（化学的リンカー）がいくつかの場合において使用されることが理解されるべきである。例えば、いくつかの実施形態において、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーである。適切なタンパク質リンカーには、長さが４アミノ酸～４０アミノ酸のポリペプチド（例えば、４～３０、４～２５、４～２０、４～１５、４～１０、６～４０、６～３０、６～２５、６～２０、６～１５、６～１０、８～３０、８～２５、８～２０、または８～１５アミノ酸長）が含まれる。
いくつかの実施形態において、主題のリンカーは剛性である（例えば、１つ以上のプロリン残基を含むリンカー）。剛性リンカーの１つの非限定的な例は、ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）である。いくつかの場合において、ポリペプチドリンカーは、Ｎ末端またはＣ末端にＣ残基を含む。したがって、いくつかの場合において、剛性リンカーは、
Figure 0007317706000018
から選択される。
ある程度の柔軟性を有するペプチドリンカーを使用することができる。したがって、いくつかの場合において、主題のリンカーは、柔軟性がある。柔軟なリンカーは、一般に柔軟なペプチドをもたらす配列を有することを念頭に置いて、連結ペプチドは実質的に任意のアミノ酸配列を有し得る。グリシンおよびアラニンなどの小さなアミノ酸の使用は、柔軟なペプチドを作製するのに有用である。そのような配列の作製は、当業者には日常的である。多種多様なリンカーが市販されており、使用に適していると考えられる。リンカーポリペプチドの例には、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、
Figure 0007317706000019
を含み、ここで、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマーが含まれる。リンカーの例は、限定されないが、
Figure 0007317706000020
などを含むアミノ酸配列を含み得る。当業者は、上記の任意の要素にコンジュゲートしたペプチドの設計が、全体的または部分的に柔軟なリンカーを含み得、その結果リンカーが柔軟なリンカーならびに柔軟性の低い構造を付与する１つ以上の部分を含み得ることを認識するであろう。柔軟なリンカーのさらなる例には、
Figure 0007317706000021
が含まれるが、これらに限定されない。上記のように、いくつかの場合において、ポリペプチドリンカーは、Ｎ末端またはＣ末端にＣ残基を含む。したがって、いくつかの場合において、柔軟なリンカーは、
Figure 0007317706000022
から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合において、主題のポリペプチドリンカーは、エンドソーム分解性である。エンドソーム分解性ポリペプチドリンカーには、ＫＡＬＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）およびＧＡＬＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）が含まれるが、これらに限定されない。上記のように、いくつかの場合において、ポリペプチドリンカーは、Ｎ末端またはＣ末端にＣ残基を含む。したがって、いくつかの場合において、主題のリンカーは、
Figure 0007317706000023
から選択されるアミノ酸配列を含む。
スルフヒドリルカップリング反応の実例
（例えば、スルフヒドリル化学的性質による、例えばシステイン残基を使用した、コンジュゲーションのための）
（例えば、標的指向リガンドをペイロードにコンジュゲートする、標的指向リガンドを荷電ポリマーポリペプチドドメインにコンジュゲートする、標的指向リガンドをリンカーにコンジュゲートする、リンカーをペイロードにコンジュゲートする、リンカーを荷電ポリマーポリペプチドドメインにコンジュゲートするなどのための）
ジスルフィド結合
遊離スルフヒドリル基を含有する還元状態のシステイン残基は、典型的なジスルフィド交換反応において保護チオールと容易にジスルフィド結合を形成する。
Figure 0007317706000024
チオエーテル／チオエステル結合
システインのスルフヒドリル基は、マレイミドおよびハロゲン化アシル基と反応して、それぞれ安定なチオエーテルおよびチオエステル結合を形成する。
マレイミド
Figure 0007317706000025
ハロゲン化アシル
Figure 0007317706000026
アジド－アルキン環状付加
このコンジュゲーションは、アルキン結合を含有するようにシステイン残基を化学的に修飾することによって、または合成ペプチド調製におけるＬ－プロパルギルシステイン（以下に示す）を使用することによって容易になる。次いで、カップリングは、Ｃｕ促進クリックケミストリーによって達成される。
Figure 0007317706000027
送達分子および構成要素の実例
（０ａ）システインコンジュゲーションアンカー１（ＣＣＡ１）
［荷電ポリマーポリペプチドドメイン－リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）－システイン］
Figure 0007317706000028
（０ｂ）システインコンジュゲーションアンカー２（ＣＣＡ２）
［システイン－リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）－荷電ポリマーポリペプチドドメイン］
Figure 0007317706000029
（１ａ）α５β１リガンド
［荷電ポリマーポリペプチドドメイン－リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）－標的指向リガンド］
Figure 0007317706000030
（１ｂ）α５β１リガンド
［標的指向リガンド－リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）－荷電ポリマーポリペプチドドメイン］
Figure 0007317706000031
（１ｃ）α５β１リガンド－Ｃｙｓ左
Figure 0007317706000032
注：これは、スルフヒドリル化学的性質（例えば、ジスルフィド結合）またはアミン反応性化学的性質のいずれかを介して、ＣＣＡ１（上記を参照）または核酸ペイロード（例えば、ｓｉＲＮＡ）にコンジュゲートし得る。
（１ｄ）α５β１リガンド－Ｃｙｓ右
Figure 0007317706000033
注：これは、スルフヒドリル化学的性質（例えば、ジスルフィド結合）またはアミン反応性化学的性質のいずれかを介して、ＣＣＡ２（上記を参照）または核酸ペイロード（例えば、ｓｉＲＮＡ）にコンジュゲートし得る。
（２ａ）ＲＧＤα５β１リガンド
［荷電ポリマーポリペプチドドメイン－リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）－標的指向リガンド］
Figure 0007317706000034
（２ｂ）ＲＧＤ ａ５ｂ１リガンド
［標的指向リガンド－リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）－荷電ポリマーポリペプチドドメイン］
Figure 0007317706000035
（２ｃ）ＲＧＤリガンド－Ｃｙｓ左
ＣＲＧＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）
注：これは、スルフヒドリル化学的性質（例えば、ジスルフィド結合）またはアミン反応性化学的性質のいずれかを介して、ＣＣＡ１（上記を参照）または核酸ペイロード（例えば、ｓｉＲＮＡ）にコンジュゲートし得る。
（２ｄ）ＲＧＤリガンド－Ｃｙｓ右
ＲＧＤＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）
注：これは、スルフヒドリル化学的性質（例えば、ジスルフィド結合）またはアミン反応性化学的性質のいずれかを介して、ＣＣＡ２（上記を参照）または核酸ペイロード（例えば、ｓｉＲＮＡ）にコンジュゲートし得る。
（３ａ）トランスフェリンリガンド
［荷電ポリマーポリペプチドドメイン－リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）－標的指向リガンド］
Figure 0007317706000036
（３ｂ）トランスフェリンリガンド
［標的指向リガンド－リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）－荷電ポリマーポリペプチドドメイン］
Figure 0007317706000037
（３ｃ）トランスフェリンリガンド－Ｃｙｓ左
Figure 0007317706000038
注：これは、スルフヒドリル化学的性質（例えば、ジスルフィド結合）またはアミン反応性化学的性質のいずれかを介して、ＣＣＡ１（上記を参照）または核酸ペイロード（例えば、ｓｉＲＮＡ）にコンジュゲートし得る。
（３ｄ）トランスフェリンリガンド－Ｃｙｓ右
Figure 0007317706000039
注：これは、スルフヒドリル化学的性質（例えば、ジスルフィド結合）またはアミン反応性化学的性質のいずれかを介して、ＣＣＡ２（上記を参照）または核酸ペイロード（例えば、ｓｉＲＮＡ）にコンジュゲートし得る。
（４ａ）Ｅ－セレクチンリガンド［１～２１］
［荷電ポリマーポリペプチドドメイン－リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）－標的指向リガンド］
Figure 0007317706000040
（４ｂ）Ｅ－セレクチンリガンド［１～２１］
［標的指向リガンド－リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）－荷電ポリマーポリペプチドドメイン］
Figure 0007317706000041
（４ｃ）Ｅ－セレクチンリガンド［１～２１］－Ｃｙｓ左
Figure 0007317706000042
注：これは、スルフヒドリル化学的性質（例えば、ジスルフィド結合）またはアミン反応性化学的性質のいずれかを介して、ＣＣＡ１（上記を参照）または核酸ペイロード（例えば、ｓｉＲＮＡ）にコンジュゲートし得る。
（４ｄ）Ｅ－セレクチンリガンド［１～２１］－Ｃｙｓ右
Figure 0007317706000043
注：これは、スルフヒドリル化学的性質（例えば、ジスルフィド結合）またはアミン反応性化学的性質のいずれかを介して、ＣＣＡ２（上記を参照）または核酸ペイロード（例えば、ｓｉＲＮＡ）にコンジュゲートし得る。
（５ａ）ＦＧＦフラグメント［２６～４７］
［荷電ポリマーポリペプチドドメイン－リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）－標的指向リガンド］
Figure 0007317706000044
注：これは、スルフヒドリル化学的性質（例えば、ジスルフィド結合）またはアミン反応性化学的性質のいずれかを介して、ＣＣＡ１（上記を参照）または核酸ペイロード（例えば、ｓｉＲＮＡ）にコンジュゲートし得る。
（５ｂ）ＦＧＦフラグメント［２６～４７］
［標的指向リガンド－リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）－荷電ポリマーポリペプチドドメイン］
Figure 0007317706000045
注：これは、スルフヒドリル化学的性質（例えば、ジスルフィド結合）またはアミン反応性化学的性質のいずれかを介して、ＣＣＡ１（上記を参照）または核酸ペイロード（例えば、ｓｉＲＮＡ）にコンジュゲートし得る。
（５ｃ）ＦＧＦフラグメント［２５～４７］－Ｃｙｓ左
Figure 0007317706000046
注：これは、スルフヒドリル化学的性質（例えば、ジスルフィド結合）またはアミン反応性化学的性質のいずれかを介して、ＣＣＡ１（上記を参照）または核酸ペイロード（例えば、ｓｉＲＮＡ）にコンジュゲートし得る。
（５ｄ）ＦＧＦフラグメント［２６～４７］－Ｃｙｓ右
Figure 0007317706000047
注：これは、スルフヒドリル化学的性質（例えば、ジスルフィド結合）またはアミン反応性化学的性質のいずれかを介して、ＣＣＡ２（上記を参照）または核酸ペイロード（例えば、ｓｉＲＮＡ）にコンジュゲートし得る。
（６ａ）エキセンディン（Ｓ１１Ｃ）［１～３９］
Figure 0007317706000048
注：これは、スルフヒドリル化学的性質（例えば、ジスルフィド結合）またはアミン反応性化学的性質のいずれかを介して、ＣＣＡ１（上記を参照）または核酸ペイロード（例えば、ｓｉＲＮＡ）にコンジュゲートし得る。
多価組成物
いくつかの場合において、主題の組成物は、組成物が多価である（すなわち、例えば、複数の標的指向リガンドを有するために複数の標的を有する）ように送達分子の集団を含む。いくつかの場合において、そのような組成物は、ＣＤ３４およびヘパリン硫酸プロテオグリカンへの標的指向された結合を提供する標的指向リガンドの組み合わせを含む。例えば、ポリ（Ｌ－アルギニン）をそのような組成物の一部として使用して、ヘパリン硫酸プロテオグリカンへの標的指向された結合を提供することができる。多価であり、同じ送達分子の一部として複数の標的指向リガンドを含めることによっても達成される。以下の説明は、両方の状況（組成物が複数の送達分子を含む場合、および送達分子が複数の標的指向リガンドを有する場合）に適用することを意図している。
いくつかの実施形態において、主題の組成物は、（２つ以上の）標的指向リガンドの集団を含み、ここで、第１および第２のリガンドは、異なる標的を有し、したがって主題の組成物は多価である。多価の主題の組成物は、２つ以上の標的指向リガンド（例えば、異なるリガンドを含む２つ以上の送達分子）を含むものである。多量体（この場合は三量体）の主題の組成物の例は、（これはＣＤ１１７としても知られるｃ－Ｋｉｔ受容体を標的とする）標的指向リガンド幹細胞因子（ＳＣＦ）、（ＣＤ２７を標的とする）ＣＤ７０、および（ＣＤ１５０を標的とする）ＳＨ２ドメイン含有タンパク質１Ａ（ＳＨ２Ｄ１Ａ）を含むものである。例えば、いくつかの場合において、造血幹細胞（ＨＳＣ）［ＫＬＳ（ｃ－Ｋｉｔ＋Ｌｉｎ－Ｓｃａ－１＋）およびＣＤ２７＋／ＩＬ－７Ｒａ－／ＣＤ１５０＋／ＣＤ３４－］を標的とするために、主題の組成物は、それぞれｃ－Ｋｉｔ、ＣＤ２７、およびＣＤ１５０を標的とする標的指向リガンドＳＣＦ、ＣＤ７０、およびＳＨ２ドメイン含有タンパク質１Ａ（ＳＨ２Ｄ１Ａ）の組み合わせを含む表面コートを含む（例えば、表１を参照）。いくつかの場合において、そのような組成物は、他のリンパ系前駆細胞および骨髄性前駆細胞よりも、ＨＳＰＣおよび長期ＨＳＣ（ｃ－Ｋｉｔ＋／Ｌｉｎ－／Ｓｃａ－１＋／ＣＤ２７＋／ＩＬ－７Ｒａ－／ＣＤ１５０＋／ＣＤ３４－）を選択的に標的とし得る。
いくつかの例示的な実施形態において、３つ全ての標的指向リガンド（ＳＣＦ、ＣＤ７０、およびＳＨ２Ｄ１Ａ）は、主題の組成物の一部である。例えば、（１）（ｃ－Ｋｉｔ受容体を標的とする）標的指向ポリペプチドＳＣＦは、
Figure 0007317706000049
を含み得、Ｘは、例えば、いくつかの場合において、Ｎ末端および／またはＣ末端に存在し得るか、またはポリペプチド配列内に埋め込まれ得る、荷電ポリマーポリペプチドドメイン（例えば、６Ｈなどのポリヒスチジン、９Ｒなどのポリアルギニンなど）であり、（２）（ＣＤ２７を標的とする）標的指向ポリペプチドＣＤ７０は、
Figure 0007317706000050
を含み得、Ｘは、例えば、いくつかの場合において、Ｎ末端および／またはＣ末端に存在し得るか、またはポリペプチド配列内に埋め込まれ得る、荷電ポリマーポリペプチドドメイン（例えば、６Ｈなどのポリヒスチジン、９Ｒなどのポリアルギニンなど）であり、（３）（ＣＤ１５０を標的とする）標的指向ポリペプチドＳＨ２Ｄ１Ａは、
Figure 0007317706000051
を含み得、Ｘは、例えば、いくつかの場合において、Ｎ末端および／またはＣ末端に存在し得るか、またはポリペプチド配列（例えば、
Figure 0007317706000052
など）内に埋め込まれ得る、荷電ポリマーポリペプチドドメイン（例えば、６Ｈなどのポリヒスチジン、９Ｒなどのポリアルギニンなど）である。
上記のように、本開示の組成物は、所望の細胞型を標的とするために、または細胞型の所望の組み合わせを標的とするために、複数の標的指向リガンドを含み得る。対象となる（マウスおよびヒトの造血細胞系の）標的指向リガンドの様々な組み合わせの例には、［マウス］（ｉ）ＣＤ１５０、（ｉｉ）Ｓｃａ１、ｃＫｉｔ、ＣＤ１５０、（ｉｉｉ）ＣＤ１５０およびＣＤ４９ｂ、（ｉｖ）Ｓｃａ１、ｃＫｉｔ、ＣＤ１５０、およびＣＤ４９ｂ、（ｖ）ＣＤ１５０およびＦｌｔ３、（ｖｉ）Ｓｃａ１、ｃＫｉｔ、ＣＤ１５０、およびＦｌｔ３、（ｖｉｉ）Ｆｌｔ３およびＣＤ３４、（ｖｉｉｉ）Ｆｌｔ３、ＣＤ３４、Ｓｃａ１、およびｃＫｉｔ、（ｉｘ）Ｆｌｔ３およびＣＤ１２７、（ｘ）Ｓｃａ１、ｃＫｉｔ、Ｆｌｔ３、およびＣＤ１２７、（ｘｉ）ＣＤ３４、（ｘｉｉ）ｃＫｉｔおよびＣＤ３４、（ｘｉｉｉ）ＣＤ１６／３２およびＣＤ３４、（ｘｉｖ）ｃＫｉｔ、ＣＤ１６／３２、およびＣＤ３４、（ｘｖ）ｃＫｉｔ、［ヒト］（ｉ）ＣＤ９０およびＣＤ４９ｆ、（ｉｉ）ＣＤ３４、ＣＤ９０、およびＣＤ４９ｆ、（ｉｉｉ）ＣＤ３４、（ｉｖ）ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ１０、（ｖ）ＣＤ３４、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ１０、（ｖｉ）ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ１３５、（ｖｉｉ）ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ１３５、（ｖｉｉｉ）ＣＤ１３５、（ｉｘ）ＣＤ３４、ＣＤ３８、およびＣＤ１３５、ならびに（ｘ）ＣＤ３４およびＣＤ３８が含まれるが、これらに限定されない。したがって、いくつかの場合において、主題の組成物は、［マウス］（ｉ）ＣＤ１５０、（ｉｉ）Ｓｃａ１、ｃＫｉｔ、ＣＤ１５０、（ｉｉｉ）ＣＤ１５０およびＣＤ４９ｂ、（ｉｖ）Ｓｃａ１、ｃＫｉｔ、ＣＤ１５０、およびＣＤ４９ｂ、（ｖ）ＣＤ１５０およびＦｌｔ３、（ｖｉ）Ｓｃａ１、ｃＫｉｔ、ＣＤ１５０、およびＦｌｔ３、（ｖｉｉ）Ｆｌｔ３およびＣＤ３４、（ｖｉｉｉ）Ｆｌｔ３、ＣＤ３４、Ｓｃａ１、およびｃＫｉｔ、（ｉｘ）Ｆｌｔ３およびＣＤ１２７、（ｘ）Ｓｃａ１、ｃＫｉｔ、Ｆｌｔ３、およびＣＤ１２７、（ｘｉ）ＣＤ３４、（ｘｉｉ）ｃＫｉｔおよびＣＤ３４、（ｘｉｉｉ）ＣＤ１６／３２およびＣＤ３４、（ｘｉｖ）ｃＫｉｔ、ＣＤ１６／３２、およびＣＤ３４、（ｘｖ）ｃＫｉｔ、［ヒト］（ｉ）ＣＤ９０およびＣＤ４９ｆ、（ｉｉ）ＣＤ３４、ＣＤ９０、およびＣＤ４９ｆ、（ｉｉｉ）ＣＤ３４、（ｉｖ）ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ１０、（ｖ）ＣＤ３４、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ１０、（ｖｉ）ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ１３５、（ｖｉｉ）ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ１３５、（ｖｉｉｉ）ＣＤ１３５、（ｉｘ）ＣＤ３４、ＣＤ３８、およびＣＤ１３５、ならびに（ｘ）ＣＤ３４およびＣＤ３８から選択される、表面タンパク質または表面タンパク質の組み合わせへの標的指向された結合を提供する１つ以上の標的指向リガンドを含む。主題の組成物は、複数の標的指向リガンドを含む得、いくつかの細胞は重複マーカーを含むので、送達分子および／または標的指向リガンドの組み合わせを使用して複数の異なる細胞型を標的指向し得、例えば、いくつかの場合において、組成物は１つの特定の細胞型を標的指向し得るが、他の場合において、組成物は１つより多い特定の細胞型（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上の細胞型）を標的指向し得る。例えば、造血系統内の細胞の任意の組み合わせを標的指向し得る。実例として、（ＣＤ３４への標的指向された結合を提供する標的指向リガンドを使用して）ＣＤ３４を標的指向することは、造血系統内のいくつかの異なる細胞へのペイロードの送達をもたらし得る。
ペイロード
本開示の送達分子は、ペイロードとコンジュゲートし得、またはいくつかの場合において、ペイロードと静電的に相互作用し（例えば、縮合し）得る。ペイロードは、核酸および／またはタンパク質から作製され得る。例えば、いくつかの場合において、主題の送達分子は、核酸ペイロード（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を送達するために使用される。核酸ペイロードは、対象となる任意の核酸であり得、例えば、核酸ペイロードは、直線状または環状であり得、プラスミド、ウイルスゲノム、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡなどのコーディングＲＮＡまたはガイドＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの非コーディングＲＮＡなど）、ＤＮＡなどであり得る。いくつかの場合において、核酸ペイロードは、ＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）またはＲＮＡｉ剤をコードするＤＮＡテンプレートである。いくつかの場合において、核酸ペイロードは、ｓｉＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡを標的とするもの、ｍｉＲＮＡを標的とするもの）である。いくつかの場合において、核酸ペイロードは、ＬＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡを標的とするもの）である。いくつかの場合において、核酸ペイロードは、ｍｉＲＮＡである。いくつかの場合において、核酸ペイロードは、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡ（例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８などの１つ以上の再プログラミングおよび／または分化転換因子、例えば、（ｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃ；（ｉｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８など；遺伝子編集エンドヌクレアーゼ；治療用タンパク質などの単独、または任意の所望の組み合わせ）を含む。いくつかの場合において、核酸ペイロードは、非コーディングＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ剤、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡなど）および／または非コーディングＲＮＡをコードするＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、核酸ペイロードは、（例えば、標的細胞の挙動または生存を調節するために）ＩＬ２ＲαおよびＩＬ１２Ｒγをコードする核酸（ＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、核酸ペイロードは、（例えば、ＦａｓまたはＴＮＦα受容体の係合による標的細胞のアポトーシスを防止するために）ＢＣＬ－ＸＬをコードする核酸（ＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、核酸ペイロードは、（例えば、標的Ｔ細胞における免疫エフェクター表現型を促進するために）Ｆｏｘｐ３をコードする核酸（ＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、核酸ペイロードは、ＳＣＦをコードする核酸（ＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、核酸ペイロードは、ＨｏｘＢ４をコードする核酸（ＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、核酸ペイロードは、ＳＩＲＴ６をコードする核酸（ＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、核酸ペイロードは、ｍｉＲ－１５５（例えば、ＭｉＲ Ｂａｓｅ登録：ＭＩ００００６８１およびＭＩ００００１７７を参照）などのマイクロＲＮＡを標的とする（その発現を低減させる）核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ＬＮＡなど）を含む。いくつかの実施形態において、核酸ペイロードは、ｋｕ７０を標的とするｓｉＲＮＡおよび／またはｋｕ８０を標的とするｓｉＲＮＡを含む。
用語「核酸ペイロード」は、修飾核酸を包含する。同様に、「ＲＮＡｉ剤」および「ｓｉＲＮＡ」という用語は、修飾核酸を包含する。例えば、核酸分子は、模倣物であり得、修飾糖骨格、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合（例えば、１つ以上のホスホロチオエートおよび／またはヘテロ原子ヌクレオシド間結合）、１つ以上の修飾塩基などを含み得る。いくつかの実施形態において、主題のペイロードは、三重鎖形成ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む（例えば、ＭｃＮｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１３ Ｊｕｎ；２０（６）：６５８－６９を参照）。したがって、いくつかの場合において、主題のコアは、ＰＮＡを含む。いくつかの場合において、主題のコアは、ＰＮＡおよびＤＮＡを含む。
主題の核酸ペイロード（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、モルホリノバックボーン構造を有し得る。いくつかの場合において、主題の核酸ペイロード（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を有し得る。適切な糖置換基には、メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）、アミノプロポキシ（－Ｏ ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）、－Ｏ－アリル（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）およびフルオロ（Ｆ）が含まれる。２’－糖置換基は、アラビノ（上）位置またはリボ（下）位置にあってもよい。適切な塩基修飾には、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニル（－Ｃ＝Ｃ－ＣＨ３）ウラシルおよびシトシンならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（プソイドウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に、５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－アデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニンならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンなどの合成および天然核酸塩基が含まれる。さらなる修飾核酸塩基には、フェノキサジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド（５，４－（ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド（４，５－ｂ）インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド（３’，２’：４，５）ピロロ（２，３－ｄ）ピリミジン－２－オン）などのＧ－クランプなどの三環式ピリミジンが含まれる。
いくつかの場合において、核酸ペイロードは、コンジュゲート部分（例えば、核酸ペイロードの活性、安定性、細胞内分布または細胞内取り込みを増強するもの）を含み得る。これらの部分またはコンジュゲートは、一級または二級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合したコンジュゲート基を含み得る。コンジュゲート基には、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的性質を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態学的性質を増強する基が含まれるが、これらに限定されない。好適なコンジュゲート基には、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および染料が含まれるが、これらに限定されない。薬力学的性質を増強する基は、取り込みを改善し、分解に対する抵抗性を増強し、かつ／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。薬物動態学的性質を増強する基は、主題の核酸の取り込み、分布、代謝または排泄を改善する基を含む。
任意の都合のよいポリヌクレオチドが、主題の核酸ペイロードとして使用され得る。例には、ｍＲＮＡ、ｍ１Ａ修飾ｍＲＮＡ（アデノシンの１位のモノメチル化）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、ｓｈＲＮＡ、ＡＡＶ由来核酸および足場を含むＲＮＡおよびＤＮＡの種、モルホリノＲＮＡ、ペプトイドおよびペプチド、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ折り紙、合成ヌクレオチドを有するＤＮＡおよびＲＮＡ、所定の二次構造を有するＤＮＡおよびＲＮＡ、上記の多量体およびオリゴマー、ならびに発現が望まれる任意のタンパク質またはポリペプチドなどの他の産物をコードすし得る配列のペイロードが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの場合において、主題の送達分子のペイロードは、タンパク質を含む。タンパク質ペイロードの例には、プログラム可能な遺伝子編集タンパク質（例えば転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクター（ＴＡＬＥ）、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ ＡｒｇｏｎａｕｔｅなどのＤＮＡ誘導ポリペプチド（ＮｇＡｇｏ）、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡガイドポリペプチド）；トランスポゾン（例えば、クラスＩまたはクラスＩＩトランスポゾン－例えば、ｐｉｇｇｙｂａｃ、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ、Ｔｏｌ２、ＰＩＦ／ｈａｒｂｉｎｇｅｒ、ｈＡＴ、ｍｕｔａｔｏｒ、ｍｅｒｌｉｎ、ｔｒａｎｓｉｂ、ｈｅｌｉｔｒｏｎ、ｍａｖｅｒｉｃｋ、ｆｒｏｇ ｐｒｉｎｃｅ、ｍｉｎｏｓ、Ｈｉｍａｒ１など）；メガヌクレアーゼ（例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｉ－ＣｈｕＩ、Ｉ－ＤｉｒＩ、Ｉ－ＦｌｍｕＩ、Ｉ－ＦｌｍｕＩＩ、Ｉ－Ａｎｉｌ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＰａｎＩＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＧｐｉＩ、Ｉ－ＧｚｅＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＭｓｏＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩＩ、ＰＩ－ＭｌｅＩ、ＰＩ－ＭｔｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｔｌｉ Ｉ、ＰＩ－Ｔｌｉ ＩＩ、ＰＩ－ＳｃｅＶなど）；ｍｅｇａＴＡＬ（例えば、Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１４ Ｆｅｂ；４２（４）：２５９１－２６０１を参照）；ＳＣＦ；ＢＣＬ－ＸＬ；Ｆｏｘｐ３；ＨｏｘＢ４；およびＳｉＲＴ６が含まれるが、これらに限定されない。上記タンパク質のいずれについても、主題の送達分子のペイロードは、そのタンパク質をコードする核酸（ＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ）を含み得、かつ／または実際のタンパク質を含み得る。
遺伝子編集ツール
いくつかの場合において、核酸ペイロードは、遺伝子編集ツール（すなわち、遺伝子編集システムの構成要素、例えば、プログラム可能遺伝子編集システムなどの部位特異的遺伝子編集システム）を含むか、またはコードする。例えば、核酸ペイロードは、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、（ｉｉｉ）ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ－ＺＦＮ）などのプログラム可能な遺伝子編集タンパク質をコードするＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質（例えば、ヌクレアーゼに融合－ＴＡＬＥＮ）、Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ（ＮｇＡｇｏ）などのＤＮＡ誘導ポリペプチド、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１など）、（ｉｖ）ＤＮＡドナーテンプレート、（ｖ）部位特異的リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｄｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、ＫＤリコンビナーゼ、Ｂ２リコンビナーゼ、Ｂ３リコンビナーゼ、Ｒリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、Ｔｒｅリコンビナーゼ、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、λインテグラーゼ、ＨＫ０２２インテグラーゼ、ＨＰ１インテグラーゼなど）をコードする核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、（ｖｉ）レゾルバーゼおよび／またはインベルターゼ（例えば、Ｇｉｎ、Ｈｉｎ、γδ３、Ｔｎ３、Ｓｉｎ、βなど）をコードするＤＮＡ、ならびに（ｖｉｉ）トランスポゾンおよび／またはトランスポゾン由来のＤＮＡ（例えば、Ｔｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ９０３、Ｔｎ１６８１などの細菌トランスポゾン；Ｔｃ１／マリナースーパーファミリートランスポゾン、ＰｉｇｇｙＢａｃスーパーファミリートランスポゾン、ｈＡＴスーパーファミリートランスポゾン、ＰｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、Ｍｉｎｏｓ、Ｈｉｍａｒ１などの真核生物トランスポゾン）のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの場合において、主題の送達分子を使用して、タンパク質ペイロード、例えば、ＺＦＰ（例えば、ＺＦＮ）、ＴＡＬＥ（例えば、ＴＡＬＥＮ）、Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ（ＮｇＡｇｏ）などのＤＮＡ誘導ポリペプチド、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１など）などの遺伝子編集タンパク質、部位特異的リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｄｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、ＫＤリコンビナーゼ、Ｂ２リコンビナーゼ、Ｂ３リコンビナーゼ、Ｒリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、Ｔｒｅリコンビナーゼ、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、λインテグラーゼ、ＨＫ０２２インテグラーゼ、ＨＰ１インテグラーゼなど）、レゾルバーゼ／インベルターゼ（例えば、Ｇｉｎ、Ｈｉｎ、γδ３、Ｔｎ３、Ｓｉｎ、βなど）、および／またはトランスポザーゼ（例えば、Ｔｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ９０３、Ｔｎ１６８１などの細菌トランスポゾン；またはＴｃ１／マリナースーパーファミリートランスポゾン、ＰｉｇｇｙＢａｃスーパーファミリートランスポゾン、ｈＡＴスーパーファミリートランスポゾン、ＰｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、Ｍｉｎｏｓ、Ｈｉｍａｒ１などの真核生物トランスポゾンなどのトランスポゾンに関連するトランスポザーゼ）を送達する。いくつかの場合において、送達分子は、核酸ペイロードおよびタンパク質ペイロードを送達するために使用され、いくつかのそのような場合において、ペイロードは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を含む。
システムの性質および所望の結果に応じて、遺伝子編集システム（例えば、プログラム可能遺伝子編集システムなどの部位特異的遺伝子編集システム）は、単一の構成要素（例えば、ＺＦＰ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥ、ＴＡＬＥＮ、部位特異的リコンビナーゼ、レゾルバーゼ／インテグラーゼ、転位酵素、トランスポゾンなど）を含み得、または複数の構成要素を含み得る。いくつかの場合において、遺伝子編集システムは、少なくとも２つの構成要素を含む。例えば、いくつかの場合において、遺伝子編集システム（例えば、プログラム可能な遺伝子編集システム）は、（ｉ）ドナーテンプレート核酸、および（ｉｉ）遺伝子編集タンパク質（例えば、ＺＦＰ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥ、ＴＡＬＥＮなどのプログラム可能な遺伝子編集タンパク質、Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ（ＮｇＡｇｏ）などのＤＮＡ誘導ポリペプチド、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、またはＣｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導ポリペプチドなど）、または遺伝子編集タンパク質をコードする核酸分子（例えば、プラスミドまたはｍＲＮＡなどのＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。別の例として、いくつかの場合において、遺伝子編集システム（例えば、プログラム可能な遺伝子編集システム）は、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、および（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ ＲＮＡ誘導ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１など）、またはＲＮＡ誘導ポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、プラスミドまたはｍＲＮＡなどのＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。別の例として、いくつかの場合において、遺伝子編集システム（例えば、プログラム可能な遺伝子編集システム）は、（ｉ）ＮｇＡｇｏ様ガイドＤＮＡ、および（ｉｉ）ＤＮＡ誘導ポリペプチド（例えば、ＮｇＡｇｏ）、またはＤＮＡ誘導ポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、プラスミドまたはｍＲＮＡなどのＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。いくつかの場合において、遺伝子編集システム（例えば、プログラム可能な遺伝子編集システム）は、少なくとも３つの構成要素：（ｉ）ドナーＤＮＡテンプレート、（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、および（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、またはＣｐｆ１）、またはＲＮＡ誘導ポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、プラスミドまたはｍＲＮＡなどのＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。いくつかの場合において、遺伝子編集システム（例えば、プログラム可能な遺伝子編集システム）は、少なくとも３つの構成要素：（ｉ）ドナーＤＮＡテンプレート、（ｉｉ）ＮｇＡｇｏ様ガイドＤＮＡ、またはＮｇＡｇｏ様ガイドＤＮＡをコードするＤＮＡ、および（ｉｉｉ）ＤＮＡ誘導ポリペプチド（例えば、ＮｇＡｇｏ）、またはＤＮＡ誘導ポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、プラスミドまたはｍＲＮＡなどのＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。
いくつかの実施形態において、主題の送達分子は、遺伝子編集ツールを送達するために使用される。言い換えれば、いくつかの場合において、ペイロードは、１つ以上の遺伝子編集ツールを含む。「遺伝子編集ツール」という用語は、本明細書では、遺伝子編集システムの１つ以上の構成要素を指すために使用される。したがって、いくつかの場合において、ペイロードは、遺伝子編集システムを含み、いくつかの場合において、ペイロードは、遺伝子編集システムの１つ以上の構成要素（すなわち、１つ以上の遺伝子編集ツール）を含む。例えば、標的細胞は、すでに遺伝子編集システムの構成要素のうちの１つを含み得、使用者は、残りの構成要素を追加するだけでよい。そのような場合において、主題の送達分子のペイロードは、所与の遺伝子編集システムの全ての構成要素を必ずしも含まない。したがって、いくつかの場合において、ペイロードは、１つ以上の遺伝子編集ツールを含む。
実例として、標的細胞は、すでに遺伝子編集タンパク質（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＤＮＡ誘導ポリペプチド（例えば、ＮｇＡｇｏ）、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導ポリペプチド、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｄｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、ＫＤリコンビナーゼ、Ｂ２リコンビナーゼ、Ｂ３リコンビナーゼ、Ｒリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、Ｔｒｅリコンビナーゼ、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、λインテグラーゼ、ＨＫ０２２インテグラーゼ、ＨＰ１インテグラーゼなどの部位特異的リコンビナーゼ、Ｇｉｎ、Ｈｉｎ、γδ３、Ｔｎ３、Ｓｉｎ、βなどのレゾルバーゼ／インベルターゼ、トランスポザーゼなど）および／またはタンパク質をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡを含み得、したがって、ペイロードは、（ｉ）ドナーテンプレート、および（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、またはＮｇＡｇｏ様ガイドＤＮＡのうちの１つ以上を含み得る。同様に、標的細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡおよび／またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡもしくはＮｇＡｇｏ様ガイドＤＮＡをすでに含み得、ペイロードは、（ｉ）ドナーテンプレート、および（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１など）、またはＲＮＡ誘導ポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、プラスミドまたはｍＲＮＡなどのＤＮＡまたはＲＮＡ）、またはＤＮＡ誘導ポリペプチド（例えば、ＮｇＡｇｏ）、またはＤＮＡ誘導ポリペプチドをコードする核酸分子のうちの１つ以上を含み得る。
当業者によって理解されるように、遺伝子編集システムは、核酸を「編集する」システムである必要はない。例えば、遺伝子編集システムを使用して、標的ＤＮＡ中に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせることなく種々の方法で標的核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を修飾することができることがよく認識されている。例えば、いくつかの場合において、二本鎖標的ＤＮＡにニックが入っており（一方の鎖が切断されている）、いくつかの場合において（例えば、遺伝子編集タンパク質がヌクレアーゼ活性を欠いている、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導ポリペプチドが、触媒性ヌクレアーゼドメイン中に変異を有し得るいくつかの場合には）、標的核酸は全く切断されない。例えば、いくつかの場合において、ヌクレアーゼ活性を伴うまたは伴わないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１）は、異種タンパク質ドメインに融合される。異種タンパク質ドメインは、（ｉ）ＤＮＡ修飾活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性）。リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性）、（ｉｉ）転写調節活性（例えば、転写抑制因子または活性化因子への融合）、または（ｉｉｉ）標的ＤＮＡに関連するタンパク質（例えば、ヒストン）を修飾する活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、誘導体化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性）などの活性を融合タンパク質に提供し得る。したがって、遺伝子編集システムは、標的核酸を切断しないように標的核酸を修飾する用途において使用することができ、標的ＤＮＡからの転写を調節する用途においても使用することができる。
プログラム可能な遺伝子編集ツール（例えば、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、およびＣｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導タンパク質、Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒヌクレアーゼなどのＺｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒタンパク質、ＴＡＬＥＮなどのＴＡＬＥタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡなど）に関連する追加情報については、例えば、Ｄｒｅｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：２９４６６－７８；Ｄｒｅｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０３：４８９－５０２；Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：３８５０－６）；Ｄｒｅｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０：３５５８８－９７；Ｊａｍｉｅｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２：３６１－８；Ｄｕｒａｉ，ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：５９７８－９０；Ｓｅｇａｌ，（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６：７６－８３；Ｐｏｒｔｅｕｓ ａｎｄ Ｃａｒｒｏｌｌ，（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３：９６７－７３；Ｐａｂｏ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７０：３１３－４０；Ｗｏｌｆｅ，ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ ２９：１８３－２１２；Ｓｅｇａｌ ａｎｄ Ｂａｒｂａｓ，（２００１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １２：６３２－７；Ｓｅｇａｌ，ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：２１３７－４８；Ｂｅｅｒｌｉ ａｎｄ Ｂａｒｂａｓ，（２００２）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０：１３５－４１；Ｃａｒｒｏｌｌ，ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １：１３２９；Ｏｒｄｉｚ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１３２９０－５；Ｇｕａｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１３２９６－３０１；Ｓａｎｊａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，７：１７１－１９２（２０１２）；Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｏｃｔ ２２；１６３（３）：７５９－７１；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５ Ｎｏｖ；１３（１１）：７２２－３６；Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｎｏｖ ５；６０（３）：３８５－９７；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ａｕｇ １７；３３７（６０９６）：８１６－２１；Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１３ Ｍａｙ；１０（５）：７２６－３７；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１３；２０１３：２７０８０５；Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３ Ｓｅｐ ２４；１１０（３９）：１５６４４－９；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２０１３；２：ｅ００４７１；Ｐａｔｔａｎａｙａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｓｅｐ；３１（９）：８３９－４３；Ｑｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｆｅｂ ２８；１５２（５）：１１７３－８３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｍａｙ ９；１５３（４）：９１０－８；Ａｕｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１３ Ｏｃｔ ３１；Ｃｈｅｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ １；４１（２０）：ｅ１９；Ｃｈｅｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３ Ｏｃｔ；２３（１０）：１１６３－７１；Ｃｈｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１３ Ｎｏｖ；１９５（３）：１１７７－８０；ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ａｐｒ；４１（７）：４３３６－４３；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｏｃｔ；１０（１０）：１０２８－３４；Ｅｂｉｎａ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１３；３：２５１０；Ｆｕｊｉｉ ｅｔ．ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ １；４１（２０）：ｅ１８７；Ｈｕ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ；２３（１１）：１３２２－５；Ｊｉａｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ １；４１（２０）：ｅ１８８；Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ Ｎｏｖ；８（１１）：２１８０－９６；Ｍａｌｉ ｅｔ．ａｔ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｏｃｔ；１０（１０）：９５７－６３；Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ．２０１３ Ｄｅｃ；５１（１２）：８３５－４３；Ｒａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１－３０８；Ｒａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｓｅｐ １２；１５４（６）：１３８０－９；Ｕｐａｄｈｙａｙ ｅｔ．ａｌ．，Ｇ３ （Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．２０１３ Ｄｅｃ ９；３（１２）：２２３３－８；Ｗａｌｓｈ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３ Ｓｅｐ ２４；１１０（３９）：１５５１４－５；Ｘｉｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２０１３ Ｏｃｔ ９；Ｙａｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｓｅｐ １２；１５４（６）：１３７０－９；Ｂｒｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１４ Ｏｃｔ ２３；５６（２）：３３３－９；Ｂｕｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１６ Ｄｅｃ ２２－Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｊｕｌ ３４（７）：７６８－７３、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２００２／０９９０８４号、同第ＷＯ００／４２２１９号、同第ＷＯ０２／４２４５９号、同第ＷＯ２００３／０６２４５５号、同第ＷＯ０３／０８０８０９号、同第ＷＯ０５／０１４７９１号、同第ＷＯ０５／０８４１９０号、同第ＷＯ０８／０２１２０７号、同第ＷＯ０９／０４２１８６号、同第ＷＯ０９／０５４９８５号、および同第ＷＯ１０／０６５１２３号、米国特許出願公開第２００３／００５９７６７号、同第２００３／０１０８８８０号、同第２０１４／００６８７９７号、同第２０１４／０１７０７５３号、同第２０１４／０１７９００６号、同第２０１４／０１７９７７０号、同第２０１４／０１８６８４３号、同第２０１４／０１８６９１９号、同第２０１４／０１８６９５８号、同第２０１４／０１８９８９６号、同第２０１４／０２２７７８７号、同第２０１４／０２３４９７２号、同第２０１４／０２４２６６４号、同第２０１４／０２４２６９９号、同第２０１４／０２４２７００号、同第２０１４／０２４２７０２号、同第２０１４／０２４８７０２号、同第２０１４／０２５６０４６号、同第２０１４／０２７３０３７号、同第２０１４／０２７３２２６号、同第２０１４／０２７３２３０号、同第２０１４／０２７３２３１号、同第２０１４／０２７３２３２号、同第２０１４／０２７３２３３号、同第２０１４／０２７３２３４号、同第２０１４／０２７３２３５号、同第２０１４／０２８７９３８号、同第２０１４／０２９５５５６号、同第２０１４／０２９５５５７号、同第２０１４／０２９８５４７号、同第２０１４／０３０４８５３号、同第２０１４／０３０９４８７号、同第２０１４／０３１０８２８号、同第２０１４／０３１０８３０号、同第２０１４／０３１５９８５号、同第２０１４／０３３５０６３号、同第２０１４／０３３５６２０号、同第２０１４／０３４２４５６号、同第２０１４／０３４２４５７号、同第２０１４／０３４２４５８号、同第２０１４／０３４９４００号、同第２０１４／０３４９４０５号、同第２０１４／０３５６８６７号、同第２０１４／０３５６９５６号、同第２０１４／０３５６９５８号、同第２０１４／０３５６９５９号、同第２０１４／０３５７５２３号、同第２０１４／０３５７５３０号、同第２０１４／０３６４３３３号、同第２０１４／０３７７８６８号、同第２０１５／０１６６９８３号、および同第２０１６／０２０８２４３号、ならびに米国特許第６，１４０，４６６号、同第６，５１１，８０８号、同第６，４５３，２４２号、同第８，６８５，７３７号、同第８，９０６，６１６号、同第８，８９５，３０８号、同第８，８８９，４１８号、同第８，８８９，３５６号、同第８，８７１，４４５号、同第８，８６５，４０６号、同第８，７９５，９６５号、同第８，７７１，９４５号、および同第８，６９７，３５９号を指し、これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
送達
核酸、タンパク質、またはリボ核タンパク質ペイロードを細胞に送達する方法が提供される。そのような方法は、細胞を主題の送達分子と接触させる工程を含む。細胞は、本開示の送達分子の標的指向リガンドによって標的指向された細胞表面タンパク質を含む任意の細胞であり得る。いくつかの場合において、細胞は、哺乳動物細胞（例えば、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、ウサギ細胞、モルモット細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、ヒト細胞など）である。
そのような方法は、細胞を主題の送達分子と接触させる工程を含み得る。主題の送達分子は、ペイロードを任意の所望の真核生物標的細胞に送達するために使用され得る。いくつかの場合において、標的細胞は、哺乳動物細胞（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、有蹄動物、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ラクダ、ウサギ、イヌ（犬）、ネコ（猫）、霊長類、非ヒト霊長類、またはヒトの細胞）である。任意の細胞型が標的となり得、いくつかの場合において、特定の細胞の特定の標的は、例えば、送達分子の一部としての標的指向リガンドの存在に依存し、標的指向リガンドは、特定の細胞型への標的指向結合を提供する。例えば、標的となり得る細胞には、骨髄細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、長期ＨＳＣ、短期ＨＳＣ、造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄前駆細胞、リンパ球前駆細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、赤血球、巨核球、肥満細胞、好塩基球、好酸球、好中球、マクロファージ、赤血球前駆細胞（例えば、ＨＵＤＥＰ細胞）、巨核球－赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）、骨髄共通前駆細胞（ＣＭＰ）、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、短期ＨＳＣ（ＳＴ－ＨＳＣ）、ＩＴ－ＨＳＣ、長期ＨＳＣ（ＬＴ－ＨＳＣ）、内皮細胞、ニューロン、星状細胞、膵臓細胞、膵臓β島細胞、筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、肝細胞、脂肪細胞、腸細胞、結腸の細胞、および胃の細胞が含まれるが、これらに限定されない。
様々な用途の例（例えば、ニューロン、膵臓の細胞、造血幹細胞および多分化能前駆体などを標的とするためのもの）は、多数ある。例えば、造血幹細胞および多分化能前駆体は、インビボでの遺伝子編集（例えば、挿入）のために標的指向され得る。インビボでの１％の骨髄細胞（約１５０億個の細胞）の編集でさえ、エクスビボでの治療（約１００億個の細胞）よりも多くの細胞を標的とする。別の例として、膵臓細胞（例えば、β島細胞）は、例えば、膵臓がんを治療するため、糖尿病などを治療するために標的指向され得る。別の例として、（例えば、ハンチントン病、パーキンソン病（例えば、ＬＲＲＫ２変異）、およびＡＬＳ（例えば、ＳＯＤ１変異）などの適応症を治療するために）ニューロンなどの脳内の体細胞が標的指向され得る。いくつかの場合において、これは直接の頭蓋内注射によって達成され得る。
別の例として、内皮細胞および造血系の細胞（例えば、巨核球および／または巨核球－赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）、一般的な骨髄前駆細胞（ＣＭＰ）、多分化能前駆体（ＭＰＰ）などの巨核球の上流の任意の前駆細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、短期ＨＳＣ（ＳＴ－ＨＳＣ）、ＩＴ－ＨＳＣ、長期ＨＳＣ（ＬＴ－ＨＳＣ）は、フォンヴィレブランド病を治療するための主題の送達分子で標的指向され得る。例えば、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）をコードする遺伝子に変異を有する細胞（例えば、内皮細胞、巨核球、および／またはＭＥＰ、ＣＭＰ、ＭＰＰなどの巨核球の上流の任意の前駆細胞、ＳＴ－ＨＳＣ、ＩＴ－ＨＳＣ、および／またはＬＴ－ＨＳＣなどのＨＳＣ）は、（例えば、機能的ＶＷＦタンパク質および／または機能的ＶＷＦタンパク質をコードする核酸の送達により）活性タンパク質を導入するために、かつ／または例えば、（例えば、遺伝子編集ツールの送達およびＤＮＡドナーテンプレートの送達により）置換配列を導入することによって変異遺伝子を編集するために、（インビトロ、エクスビボ、インビボにおいて）標的指向され得る。上記の場合のいくつかにおいて、（例えば、フォンヴィレブランド病の治療に関連する場合、ＶＷＦをコードする遺伝子に変異を有する細胞を標的にすることに関連する場合には）、主題の標的指向リガンドは、Ｅ－セレクチンへの標的指向された結合を提供する。
別の例として、幹細胞系統の細胞（例えば、造血系統の幹細胞および／または前駆細胞、例えば、ＧＭＰ、ＭＥＰ、ＣＭＰ、ＭＬＰ、ＭＰＰ、および／またはＨＳＣ）は、細胞内で幹細胞因子（ＳＣＦ）の発現を増加させるために主題の送達分子（または主題のウイルス性もしくは非ウイルス性送達媒体）で標的指向され得、それにより標的細胞の増殖を促進することができる。例えば、主題の送達分子を使用して、ＳＣＦおよび／またはＳＣＦをコードする核酸（ＤＮＡもしくはｍＲＮＡ）を標的細胞に送達することができる。
本開示の方法および組成物は、既知の原因となる変異、例えばゲノム中の変異に関連する任意の疾患を含む、任意の数の疾患を治療するために使用され得る。例えば、本開示の方法および組成物は、鎌状赤血球症、βサラセミア、ＨＩＶ、骨髄異形成症候群、ＪＡＫ２媒介性真性赤血球増加症、ＪＡＫ２媒介性原発性骨髄線維症、ＪＡＫ２媒介性白血病、および様々な血液障害を治療するために使用され得る。さらなる非限定的な例として、本開示の方法および組成物はまた、Ｂ細胞抗体生成、免疫療法（例えば、チェックポイント遮断試薬の送達）、および幹細胞分化適用のために使用され得る。
上記のように、いくつかの実施形態において、標的指向リガンドは、ＫＬＳ ＣＤ２７＋／ＩＬ－７Ｒａ－／ＣＤ１５０＋／ＣＤ３４－造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）への標的指向された結合を提供する。例えば、ＢＣＬ１１ａ転写因子の発現を破壊し、その結果として胎児ヘモグロビンを生成するために、（本明細書の他所に記載の）遺伝子編集ツール（複数可）が導入され得る。別の例として、ベータグロビン（ＨＢＢ）遺伝子は、対応する相同性指向修復ドナーテンプレートを用いて変化したＥ７Ｖ置換を修正するために直接標的指向され得る。一つの実例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１）は、ＨＢＢ遺伝子中の遺伝子座に結合し、ゲノム中に二本鎖または一本鎖の切断を生成し、ゲノム修復を開始するような適切なガイドＲＮＡで送達され得る。いくつかの場合において、ＤＮＡドナーテンプレート（一本鎖または二本鎖）は、（ペイロードの一部として）導入される。いくつかの場合において、ペイロードは、例えば、相同指向修復（ＨＤＲ）を促進し、インデル形成を制限するために使用され得る、ｋｕ７０またはｋｕ８０に対するｓｉＲＮＡを含み得る。いくつかの場合において、ヌクレアーゼ媒介部位特異的切断後のドナー鎖のＨＤＲ駆動挿入を促進するために、ＳＩＲＴ６に対するｍＲＮＡが１４～３０ｄにわたって放出される。
いくつかの実施形態において、標的指向リガンドは、Ｔ細胞受容体を修飾するために、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞、造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）への標的指向された結合を提供する。例えば、（本明細書の他所に記載の）遺伝子編集ツール（複数可）は、Ｔ細胞受容体を修飾するために導入され得る。Ｔ細胞受容体は、直接標的指向され得、新規のＴ細胞受容体のための対応する相同性指向修復ドナーテンプレートで置換され得る。一例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１）は、ＴＣＲ遺伝子中の遺伝子座に結合し、ゲノム中に二本鎖または一本鎖の切断を生成し、ゲノム修復を開始するような適切なガイドＲＮＡで送達され得る。いくつかの場合において、ＤＮＡドナーテンプレート（一本鎖または二本鎖）は、ＨＤＲのために（ペイロードの一部として）導入される。βグロビン、ＣＣＲ５、Ｔ細胞受容体、もしくは任意の他の目的の遺伝子を標的とする他のＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡおよびＨＤＲドナー配列、ならびに／または他の発現ベクターが、本開示に従って使用され得ることは当業者には明らかであろう。
いくつかの場合において、接触は、インビトロであり（例えば、細胞は培養中である）、例えば、細胞は、確立された組織培養細胞株の細胞であり得る。いくつかの場合において、接触は、エクスビボである（例えば、細胞は、個体、例えば患者から単離された初代細胞（または最近の子孫）である）。いくつかの場合において、細胞は、インビボであり、したがって生物（の一部）の内部にある。インビボ接触の例として、いくつかの場合において、接触工程は、送達分子（例えば、核酸またはタンパク質ペイロードにコンジュゲートした標的指向リガンド、主題の標的指向リガンドでコーティングされたナノ粒子、核酸ペイロードと縮合している荷電ポリマーポリペプチドドメインにコンジュゲートした標的指向リガンドなど）の投与を含む。
主題の送達分子は、以下の経路：全身的、局所的、非経口的、皮下（ｓｃ）、静脈内（ｉｖ）、頭蓋内（ｉｃ）、脊髄内、眼内、皮内（ｉｄ）、筋肉内（ｉｍ）、リンパ内（ｉｌ）、または脊髄液中のいずれかを介して対象に導入され得る（すなわち、個体に投与され得る）。主題の送達分子は、注射（例えば、全身注射、直接局所注射、腫瘍内および／または腫瘍切除部位への局所注射など）、カテーテルなどによって導入され得る。局所送達（例えば、腫瘍および／またはがん部位への送達）のための方法の例には、例えば、関節、腫瘍、もしくは臓器、または関節、腫瘍、もしくは臓器の近くへの注射器によるボーラス注射、例えば、対流を伴う、例えばカニューレ挿入による連続注入が含まれる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００７／０２５４８４２号を参照）。
対象への治療の投与数は異なり得る。主題の送達分子を個体に導入することは、一度限りの事象であり得るが、特定の状況では、そのような治療は限られた期間の間改善を引き出し得、継続的な一連の繰り返しの治療を必要とする。他の状況では、効果が観察される前に、主題の送達分子の複数回投与が必要とされ得る。当業者には容易に理解されるように、正確なプロトコルは、疾患または状態、疾患の段階および治療されている個体のパラメータに依存する。
「治療有効用量」または「治療用量」は、所望の臨床結果をもたらす（すなわち、治療有効性を達成する）のに十分な量である。治療有効用量は、１回以上の投与で投与され得る。本開示の目的のために、主題の送達分子の治療有効用量は、個体に投与された場合に、病状／疾患の進行を緩和、改善、安定化、逆転、予防、遅延または遅らせるのに十分な量である。
例示的な治療的介入は、宿主ゲノムに組み込まれている任意のレトロウイルスＤＮＡを除去することに加えて、ＨＩＶ感染に対する耐性を生み出すものである。Ｔ細胞は、ＨＩＶによって直接影響を受けるので、二重誘導ヌクレアーゼを送達するためにＣＤ３４＋およびＣＤ４５＋細胞のためのハイブリッド血液標的指向戦略が探求され得る。ＨＳＣおよびＴ細胞を同時に標的とし、複数の誘導型ヌクレアーゼ（例えば、単一粒子内）を介してＣＣＲ５－Δ３２およびｇａｇ／ｒｅｖ／ｐｏｌ遺伝子にアブレーションを送達することによって、普遍的なＨＩＶ治療法を、患者の生涯を通じて持続的に作り出すことができる。
主題の送達分子は、修飾することができ、例えば、様々な目的のために多種多様な他のオリゴペプチドまたはタンパク質に結合させることができる。例えば、プレニル化、アセチル化、アミド化、カルボキシル化、グリコシル化、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖の共有結合）などによって翻訳後修飾されている。そのような修飾はまた、グリコシル化の修飾、例えば、ポリペプチドの合成および加工の間に、またはさらなる加工工程において、ポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することによって作製されたものを、例えば、哺乳動物のグリコシル化または脱グリコシル化酵素などのグリコシル化に影響を与える酵素に送達分子をさらすことによって、含み得る。いくつかの実施形態において、主題の送達分子は、１つ以上のリン酸化アミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニンを有する。
いくつかの他の実施形態において、本開示の送達分子は、タンパク質分解に対する耐性を改善するため、または溶解性を最適化するため、またはそれを治療薬としてより適切にするために修飾され得る。例えば、本開示の送達分子は、天然に存在するＬ－アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ－アミノ酸または天然に存在しない合成アミノ酸を含有する類似体を含み得る。Ｄ－アミノ酸は、アミノ酸残基のいくつか、または全ての代わりになり得る。
いくつかの場合において、主題の送達分子は、バイオセンシング用途のために、例えば抗体の代わりに、表面上に（例えば、皿／プレート形式で）埋め込まれ得る。いくつかの場合において、主題の送達分子は、ナノダイヤモンドに添加され得る（例えば、ナノダイヤモンドをコーティングするために使用され得る）。
キットもまた本開示の範囲内である。例えば、いくつかの場合において、主題のキットは、（ｉ）標的指向リガンド、（ｉｉ）リンカー、（ｉｉｉ）リンカーにコンジュゲートした標的指向リガンド、（ｉｖ）（例えば、リンカーを用いてまたは用いずに）荷電ポリマーポリペプチドドメインにコンジュゲートした標的指向リガンド、（ｖ）ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡの転写テンプレート、および（ｉｖ）アニオン性ナノ粒子安定化コートとして使用するための物質のうちの１つ以上（任意の組み合わせ）を含み得る。いくつかの場合において、主題のキットは、使用のための説明書を含み得る。キットは、典型的には、キットの内容物の意図された用途を示すラベルを含む。ラベルという用語は、キットの上またはキットと共に供給されるか、そうでなければキットに付随するあらゆる筆記または記録された資料を含む。
本開示の例示的で非限定的な態様
上述の本主題の実施形態を含む態様は、単独で、または１つ以上の他の態様または実施形態と組み合わせて有益であり得る。前述の説明を限定することなく、１～５０（セットＡ）および１～５９（セットＢ）の番号が付けられた本開示の特定の非限定的な態様を以下に提供する。本開示を読むと当業者には明らかとなるように、個々に番号付けされた態様のそれぞれは、前述のまたは後に続く個々に番号付けされた態様のいずれかと一緒に使用または組み合わせてもよい。これは、そのような態様の全ての組み合わせに対するサポートを提供することを意図しており、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに限定されない。
セットＡ
１．タンパク質もしくは核酸ペイロードにコンジュゲートしているまたは荷電ポリマーポリペプチドドメインにコンジュゲートしているペプチド標的指向リガンドを含む送達分子であって、前記標的指向リガンドが、（ｉ）細胞表面タンパク質への標的指向された結合、および（ｉｉ）長いエンドソームリサイクリング経路の関与を提供する、送達分子。
２．前記標的指向リガンドが、内部システイン残基を含む、１に記載の送達分子。
３．前記標的指向リガンドが、対応する野生型アミノ酸配列に対して、１つ以上の内部アミノ酸位置にシステインの置換または挿入を含む、１または２に記載の送達分子。
４．前記標的指向リガンドが、Ｎ末端および／またはＣ末端にシステイン残基を含む、１～３のいずれか一つに記載の送達分子。
５．前記Ｎ末端および／またはＣ末端の前記システイン残基が、対応する野生型アミノ酸配列に対する置換または挿入である、４に記載の送達分子。
６．前記標的指向リガンドが、５～５０アミノ酸長を有する、１～６のいずれか一つに記載の送達分子。
７．前記標的指向リガンドが、野生型タンパク質の断片である、１～６のいずれか一つに記載の送達分子。
８．前記標的指向リガンドが、ファミリーＢのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、細胞表面糖タンパク質、および細胞間接着分子から選択される細胞表面タンパク質への標的指向された結合を提供する、１～７のいずれか一つに記載の送達分子。
９．前記標的指向リガンドが、ファミリーＢのＧＰＣＲのアロステリック親和性ドメインおよびオルソステリックドメインの両方への結合を提供して、それぞれ標的指向された結合および長いエンドソームリサイクリング経路の関与を提供する、８に記載の送達分子。
１０．前記標的指向リガンドが、エキセンディン－４のアミノ酸配列：
Figure 0007317706000053
に対して８５％以上の同一性（例えば、１００％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む、９に記載の送達分子。
１１．前記標的指向リガンドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載のアミノ酸配列のＬ１０、Ｓ１１、およびＫ１２に対応する位置の１つ以上にシステイン置換を含む、１０に記載の送達分子。
１２．前記標的指向リガンドが、アミノ酸配列：
Figure 0007317706000054
を含む、９に記載の送達分子。
１３．前記標的指向リガンドが、ＲＴＫへの標的指向された結合を提供する、８に記載の送達分子。
１４．前記ＲＴＫが、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体である、１３に記載の送達分子。
１５．前記標的指向リガンドが、ＦＧＦの断片である、１４に記載の送達分子。
１６．前記標的指向リガンドが、オルソステリック結合の間に占められる前記ＲＴＫのセグメントに結合する、１４または１５に記載の送達分子。
１７．前記標的指向リガンドが、前記ＲＴＫのヘパリン親和性ドメインに結合する、１３～１６のいずれか一つに記載の送達分子。
１８．前記標的指向リガンドが、ＦＧＦ受容体への標的指向された結合を提供し、前記標的指向リガンドが、アミノ酸配列
Figure 0007317706000055
に対して８５％以上の同一性（例えば、１００％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む、１３～１７のいずれか一つに記載の送達分子。
１９．前記標的指向リガンドが、ＦＧＦ受容体への標的指向された結合を提供し、前記標的指向リガンドが、アミノ酸配列ＨＦＫＤＰＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を含む、１３～１７のいずれか一つに記載の送達分子。
２０．前記標的指向リガンドが、ＦＧＦ受容体への標的指向された結合を提供し、前記標的指向リガンドが、アミノ酸配列ＬＥＳＮＮＹＮＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を含む、１３～１７のいずれか一つに記載の送達分子。
２１．前記標的指向リガンドが、細胞表面糖タンパク質および／または細胞間接着因子への標的指向された結合を提供する、８に記載の送達分子。
２２．前記標的指向リガンドが、Ｅ－セレクチン、Ｌ－セレクチン、またはＰ－セレクチンの断片である、２１に記載の送達分子。
２３．前記標的指向リガンドが、アミノ酸配列
Figure 0007317706000056
に対して８５％以上の同一性（例えば、１００％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む、２１に記載の送達分子。
２４．前記標的指向リガンドが、アミノ酸配列
Figure 0007317706000057
に対して８５％以上の同一性（例えば、１００％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む、２１に記載の送達分子。
２５．前記標的指向リガンドが、細胞間接着分子への標的指向された結合を提供する、８に記載の送達分子。
２６．前記標的指向リガンドが、トランスフェリン受容体への標的指向された結合を提供し、前記標的指向リガンドが、アミノ酸配列
Figure 0007317706000058
に対して８５％以上の同一性（例えば、１００％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む、１～７のいずれか一つに記載の送達分子。
２７．前記標的指向リガンドが、α５β１インテグリンへの標的指向された結合を提供する、１～７のいずれか一つに記載の送達分子。
２８．前記標的指向リガンドが、アミノ酸配列ＲＲＥＴＡＷＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）を含む、２７に記載の送達分子。
２９．前記標的指向リガンドが、アミノ酸配列ＲＧＤを含む、２７に記載の送達分子。
３０．前記標的指向リガンドが、（例えば、シグナル伝達の偏りを提供し、オルソステリック結合後のエンドサイトーシスによる内在化を促進するために）細胞表面タンパク質への結合時にβ－アレスチンの係合を提供する、１～２９のいずれか一つに記載の送達分子。
３１．前記標的指向リガンドが、核酸ペイロードにコンジュゲートしている、１～３０のいずれか一つに記載の送達分子。
３２．前記核酸ペイロードが、ＲＮＡｉ剤である、３１に記載の送達分子。
３３．前記ＲＮＡｉ剤が、ｓｉＲＮＡ分子である、３２に記載の送達分子。
３４．前記標的指向リガンドが、タンパク質ペイロードにコンジュゲートしている、１～３０のいずれか一つに記載の送達分子。
３５．前記ペイロードが、リボ核タンパク質複合体であり、前記標的指向リガンドが、前記複合体の核酸またはタンパク質成分にコンジュゲートしている、１～３０のいずれか一つに記載の送達分子。
３６．前記標的指向リガンドが、荷電ポリマーポリペプチドドメインにコンジュゲートしている、１～３０のいずれか一つに記載の送達分子。
３７．前記荷電ポリマーポリペプチドドメインが、核酸ペイロードと縮合している、３６に記載の送達分子。
３８．前記送達分子の前記荷電ポリマーポリペプチドドメインが、ナノ粒子の荷電安定化層と静電的に相互作用している、３６に記載の送達分子。
３９．前記荷電ポリマーポリペプチドドメインが、
Figure 0007317706000059
から選択されるカチオン性ドメインである、３６～３８のいずれか一つに記載の送達分子。
４０．前記標的指向リガンドが、システイン残基を含み、前記システイン残基を介して前記ペイロードにコンジュゲートしている、１～３９のいずれか一つに記載の送達分子。
４１．前記標的指向リガンドが、スルフヒドリルまたはアミン反応性化学的性質を介して前記ペイロードにコンジュゲートしている、１～４０のいずれか一つに記載の送達分子。
４２．前記標的指向リガンドが、介在リンカーを介して前記ペイロードにコンジュゲートしている、１～４１のいずれか一つに記載の送達分子。
４３．前記標的指向リガンドが、システイン残基を含み、前記システイン残基を介して前記リンカーにコンジュゲートしている、４２に記載の送達分子。
４４．前記リンカーが、スルフヒドリルまたはアミン反応性化学的性質を介して前記標的指向リガンドおよび／または前記ペイロードにコンジュゲートしている、４２または４３に記載の送達分子。
４５．前記リンカーが、剛性である、４２～４４のいずれか一つに記載の送達分子。
４６．前記リンカーが、可撓性である、４２～４４のいずれか一つに記載の送達分子。
４７．前記リンカーが、エンドソーム分解性である、４２～４４のいずれか一つに記載の送達分子。
４８．前記リンカーが、ポリペプチドである、４２～４７のいずれか一つに記載の送達分子。
４９．前記リンカーが、ポリペプチドではない、４２～４７のいずれか一つに記載の送達分子。
５０．核酸、タンパク質、またはリボ核タンパク質ペイロードを細胞に送達する方法であって、細胞を、１～４９のいずれか一つの送達分子と接触させる工程を含む、方法。
５１．前記細胞が、哺乳動物細胞である、５０に記載の方法。
５２．前記細胞が、インビトロまたはエクスビボである、５０または５１に記載の方法。
５３．前記細胞が、インビボである、５０または５１に記載の方法。
セットＢ
１．タンパク質もしくは核酸ペイロードにコンジュゲートしているまたは荷電ポリマーポリペプチドドメインにコンジュゲートしているペプチド標的指向リガンドを含む送達分子であって、前記標的指向リガンドが細胞表面タンパク質への標的指向された結合を提供する、送達分子。
２．前記標的指向リガンドが、内部システイン残基を含む、１に記載の送達分子。
３．前記標的指向リガンドが、対応する野生型アミノ酸配列に対して、１つ以上の内部アミノ酸位置にシステインの置換または挿入を含む、１または２に記載の送達分子。
４．前記標的指向リガンドが、Ｎ末端および／またはＣ末端にシステイン残基を含む、１～３のいずれか一つに記載の送達分子。
５．前記Ｎ末端および／またはＣ末端の前記システイン残基が、対応する野生型アミノ酸配列に対する置換または挿入である、４に記載の送達分子。
６．前記標的指向リガンドが、５～５０アミノ酸長を有する、１～５のいずれか一つに記載の送達分子。
７．前記標的指向リガンドが、野生型タンパク質の断片である、１～６のいずれか一つに記載の送達分子。
８．前記標的指向リガンドが、ファミリーＢのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、細胞表面糖タンパク質、および細胞間接着分子から選択される細胞表面タンパク質への標的指向された結合を提供する、１～７のいずれか一つに記載の送達分子。
９．前記標的指向リガンドが、ファミリーＢのＧＰＣＲのアロステリック親和性ドメインおよびオルソステリックドメインの両方への結合を提供して、それぞれ標的指向された結合および長いエンドソームリサイクリング経路の関与を提供する、８に記載の送達分子。
１０．前記標的指向リガンドが、エキセンディン－４のアミノ酸配列：
Figure 0007317706000060
に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、９に記載の送達分子。
１１．前記標的指向リガンドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載のアミノ酸配列のＬ１０、Ｓ１１、およびＫ１２に対応する位置の１つ以上にシステイン置換を含む、１０に記載の送達分子。
１２．前記標的指向リガンドが、アミノ酸配列：
Figure 0007317706000061
を含む、９に記載の送達分子。
１３．前記標的指向リガンドが、ＲＴＫへの標的指向された結合を提供する、８に記載の送達分子。
１４．前記ＲＴＫが、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体である、１３に記載の送達分子。
１５．前記標的指向リガンドが、ＦＧＦの断片である、１４に記載の送達分子。
１６．前記標的指向リガンドが、オルソステリック結合の間に占められる前記ＲＴＫのセグメントに結合する、１４または１５に記載の送達分子。
１７．前記標的指向リガンドが、前記ＲＴＫのヘパリン親和性ドメインに結合する、１３～１６のいずれか一つに記載の送達分子。
１８．前記標的指向リガンドが、ＦＧＦ受容体への標的指向された結合を提供し、前記標的指向リガンドが、アミノ酸配列
Figure 0007317706000062
に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、１３～１７のいずれか一つに記載の送達分子。
１９．前記標的指向リガンドが、ＦＧＦ受容体への標的指向された結合を提供し、前記標的指向リガンドが、アミノ酸配列ＨＦＫＤＰＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を含む、１３～１７のいずれか一つに記載の送達分子。
２０．前記標的指向リガンドが、ＦＧＦ受容体への標的指向された結合を提供し、前記標的指向リガンドが、アミノ酸配列ＬＥＳＮＮＹＮＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を含む、１３～１７のいずれか一つに記載の送達分子。
２１．前記標的指向リガンドが、細胞表面糖タンパク質および／または細胞間接着因子への標的指向された結合を提供する、８に記載の送達分子。
２２．前記標的指向リガンドが、Ｅ－セレクチン、Ｌ－セレクチン、またはＰ－セレクチンの断片である、２１に記載の送達分子。
２３．前記標的指向リガンドが、アミノ酸配列
Figure 0007317706000063
に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、２１に記載の送達分子。
２４．前記標的指向リガンドが、アミノ酸配列
Figure 0007317706000064
に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、２１に記載の送達分子。
２５．前記標的指向リガンドが、細胞間接着分子への標的指向された結合を提供する、８に記載の送達分子。
２６．前記標的指向リガンドが、トランスフェリン受容体への標的指向された結合を提供し、前記標的指向リガンドが、アミノ酸配列
Figure 0007317706000065
に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、１～７のいずれか一つに記載の送達分子。
２７．前記標的指向リガンドが、α５β１インテグリンへの標的指向された結合を提供する、１～７のいずれか一つに記載の送達分子。
２８．前記標的指向リガンドが、アミノ酸配列ＲＲＥＴＡＷＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）を含む、２７に記載の送達分子。
２９．前記標的指向リガンドが、アミノ酸配列ＲＧＤを含む、２７に記載の送達分子。
３０．前記標的指向リガンドが、前記細胞表面タンパク質への結合時にβ－アレスチンの係合を提供する、１～２９のいずれか一つに記載の送達分子。
３１．前記標的指向リガンドが、核酸ペイロードにコンジュゲートしている、１～３０のいずれか一つに記載の送達分子。
３２．前記核酸ペイロードが、ＲＮＡｉ剤である、３１に記載の送達分子。
３３．前記ＲＮＡｉ剤が、ｓｉＲＮＡ分子である、３２に記載の送達分子。
３４．前記標的指向リガンドが、タンパク質ペイロードにコンジュゲートしている、１～３０のいずれか一つに記載の送達分子。
３５．前記ペイロードが、リボ核タンパク質複合体であり、前記標的指向リガンドが、前記複合体の核酸またはタンパク質成分にコンジュゲートしている、１～３０のいずれか一つに記載の送達分子。
３６．前記標的指向リガンドが、荷電ポリマーポリペプチドドメインにコンジュゲートしている、１～３０のいずれか一つに記載の送達分子。
３７．前記荷電ポリマーポリペプチドドメインが、核酸ペイロードと縮合している、３６に記載の送達分子。
３８．前記荷電ポリマーポリペプチドドメインが、タンパク質ペイロードと静電的に相互作用している、３６または３７に記載の送達分子。
３９．前記送達分子が、アニオン性ポリマーを含む組成物中に存在する、３６～３８のいずれか一つに記載の送達分子。
４０．前記組成物が、ポリ（グルタミン酸）およびポリ（アスパラギン酸）から選択される少なくとも１つのアニオン性ポリマーを含む、３９に記載の送達分子。
４１．前記送達分子の前記荷電ポリマーポリペプチドドメインが、ナノ粒子の荷電安定化層と静電的に相互作用している、３６に記載の送達分子。
４２．前記荷電ポリマーポリペプチドドメインが、
Figure 0007317706000066
から選択されるカチオン性ドメインである、３６～４１のいずれか一つに記載の送達分子。
４３．前記荷電ポリマーポリペプチドドメインが、ヒストンテールペプチド（ＨＴＰ）を含む、３６～４２のいずれか一つに記載の送達分子。
４４．前記標的指向リガンドが、システイン残基を含み、前記システイン残基を介して前記ペイロードにコンジュゲートしている、１～４３のいずれか一つに記載の送達分子。
４５．前記標的指向リガンドが、スルフヒドリルまたはアミン反応性化学的性質を介して前記ペイロードにコンジュゲートしている、１～４４のいずれか一つに記載の送達分子。
４６．前記標的指向リガンドが、介在リンカーを介して前記ペイロードにコンジュゲートしている、１～４５のいずれか一つに記載の送達分子。
４７．前記標的指向リガンドが、システイン残基を含み、前記システイン残基を介して前記リンカーにコンジュゲートしている、４６に記載の送達分子。
４８．前記リンカーが、スルフヒドリルまたはアミン反応性化学的性質を介して前記標的指向リガンドおよび／または前記ペイロードにコンジュゲートしている、４６または４７に記載の送達分子。
４９．前記リンカーが、剛性である、４６～４８のいずれか一つに記載の送達分子。
５０．前記リンカーが、可撓性である、４６～４８のいずれか一つに記載の送達分子。
５１．前記リンカーが、エンドソーム分解性である、４６～４８のいずれか一つに記載の送達分子。
５２．前記リンカーが、ポリペプチドである、４６～５１のいずれか一つに記載の送達分子。
５３．前記リンカーが、ポリペプチドではない、４６～５１のいずれか一つに記載の送達分子。
５４．前記標的指向リガンドが、長いエンドソームリサイクリング経路の関与を提供する、１～５３のいずれか一つに記載の送達分子。
５５．核酸、タンパク質、またはリボ核タンパク質ペイロードを細胞に送達する方法であって、
細胞を、１～５４のいずれか一つに記載の送達分子と接触させる工程を含む、方法。
５６．前記細胞が、哺乳動物細胞である、５５に記載の方法。
５７．前記細胞が、インビトロまたはエクスビボである、５５または５６に記載の方法。
５８．前記細胞が、インビボである、５５または５６に記載の方法。
５９．前記細胞が、Ｔ細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、骨髄細胞、および血球から選択される細胞である、５５～５８のいずれか一つに記載の方法。
本発明の精神または範囲から逸脱することなく様々な変更および修正を行うことができることは当業者には明らかであろう。
実験
以下の実施例は、当業者に本発明の製造方法および使用方法の完全な開示および説明を提供するように記載されており、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、また以下の実験が実施された全てまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用された数字（例えば、量、温度など）に関する精度を確保する努力を行ったが、ある程度の実験誤差および偏差が考慮されるべきである。別段の指示がない限り、部分は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧か、またはそれに近い。
本明細書で引用した全ての刊行物および特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、本発明の実施のための好ましい様式を含むことが見出されるか、または提案された特定の実施形態に関して説明された。本開示に照らして、例示された特定の実施形態において本発明の意図された範囲から逸脱することなく多数の修正および変更を行うことができることは当業者には理解されるであろう。例えば、コドンの重複性により、タンパク質配列に影響を与えることなく基礎となるＤＮＡ配列に変更を加えることができる。さらに、生物学的機能等価性の考慮により、生物学的作用の種類または量に影響を与えることなくタンパク質構造に変更を加えることができる。全てのそのような修正は、添付の請求項の範囲内に含まれることが意図されている。
実施例１：ファミリーＢのＧＰＣＲへの標的指向された結合を提供する標的指向リガンド
図３は、例えば、アロステリック／親和性Ｎ末端ドメインおよびオルソステリックエンドソームソーティング／シグナル伝達ドメインへの結合に対して、標的指向リガンドを評価する際に考慮すべき別々のドメインを強調して、ファミリーＢのＧＰＣＲの残基１７０～４３２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７８）の概略図を提供する。（図は、Ｓｉｕ，Ｆａｉ Ｙｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４９９．７４５９（２０１３）：４４４～４４９を出典とする）。そのようなドメインは、システイン置換のために標的指向リガンドエキセンディン－４内の部位を選択するときに考慮した。
図４において、システイン１１置換（Ｓ１１Ｃ）は、親和性を維持し、また核酸の放出を促進し、核酸の分解を制限する長いエンドソームリサイクリング経路に関与するような、エキセンディン－４をｓｉＲＮＡ、タンパク質、または荷電ポリマーポリペプチドドメインにコンジュゲートするための１つの可能なアミノ酸修飾として同定された。模擬エキセンディン－４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のグルカゴン－ＧＣＧＲ（４ＥＲＳ）およびＧＬＰ１－ＧＬＰ１Ｒ－ＥＣＤ複合体（ＰＤＢ：３ＩＯＬ）の既知の結晶構造へのアラインメント後、２つの結合溝を妨害しないようにするために、架橋複合体が向いていなければならない方向を予想するために、ＰＤＢレンダリングを３次元空間で回転させた。セクレチンファミリーリガンドの架橋部位が、対応するセクレチンファミリー受容体の２つの結合溝と十分直交している場合に、最適なペイロード放出のための付随する長いエンドソームリサイクリング経路の隔離と同様に、高親和性結合が起こり得ることが決定された。この技術を使用して、エキセンディン－４のアミノ酸位置１０、１１、および１２は、システイン残基の挿入または置換のための位置として同定された。
実施例２：ＲＴＫへの標的指向された結合を提供する標的指向リガンド
図５は、三元ＦＧＦ２－ＦＧＦＲ１－ＨＥＰＡＲＩＮ複合体（ＰＤＢ上の１ｆｑ９）の一部としてのｔｂＦＧＦフラグメントを示す。
Figure 0007317706000067
（強調）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）は、ＦＧＦＲ１に対する親和性にとって重要であると決定された。図６は、ＨＦＫＤＰＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）がリガンド－受容体オルソステリック活性および親和性に使用するためのペプチドとして決定されたことを示す。図７は、ＬＥＳＮＮＹＮＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）もまたリガンド－受容体オルソステリック活性および親和性に使用するためのペプチドとして決定されたことを示す。
実施例３
表２～表４は、以下の実験に使用される構成要素（例えば、縮合データ、生理化学的データ、ならびにフローサイトメトリーおよび画像化データ）のためのガイドを提供する。
（表２）以下の実験で使用される送達分子の特徴。標的指向リガンド名／命名形式：Ａ＿Ｂ＿Ｃ＿Ｄ＿Ｅ＿Ｆ、ここで、Ａ＝受容体名：リガンドが標的指向している受容体の名前、Ｂ＝標的指向リガンド供給源：受容体を標的指向しているリガンドの名前（リガンドが野生型でない場合は修飾の接頭辞「ｍ」または「ｒｍ」）、Ｃ＝リンカー名、Ｄ＝荷電ポリペプチド名、Ｅ＝Ｂに基づくリンカー末端、およびＦ＝バージョン番号（同じＷＴに由来するがＡＡ配列が異なる２つの修飾標的指向リガンドを区別するため）。
Figure 0007317706000068
Figure 0007317706000069
（表３）以下の実験で使用されたペイロード
Figure 0007317706000070
（表４）以下の実験で使用される構成要素のためのガイドキー。キー：Ｎ＝「ナノ粒子」、ｃａｔ．＝「カチオン」、ａｎ．＝「アニオン」、ｓｐｅｃ．＝「種」、ｃ：ｐ＝「カルボキシル：ホスフェート」、
Figure 0007317706000071
Figure 0007317706000072
Figure 0007317706000073
Figure 0007317706000074
＊ナノ粒子製剤に使用される細胞内輸送ペプチドは、特定のペイロードにコンジュゲートした核局在化シグナルペプチドであった（例えば、「ＮＬＳ＿Ｃａｓ９…」）。
＊ナノ粒子製剤に使用されるカチオン種は、アミノ酸長９（９Ｒ）のポリ（アルギニン）鎖として標的指向リガンド（ＴＬ）にコンジュゲートした。標的指向リガンドを含まないナノ粒子は、長さ１０の非コンジュゲートカチオン種ポリ（アルギニン）ＡＡ鎖（ＰＬＲ１０）または１０のＡＡ鎖長を有するＰＥＧ化ポリ（リジン）を含有した。表中の全てのカチオン種は、１：０のＬ：Ｄ異性体比を有する。
＊ＨＳＣ＝造血幹細胞、ＢＭ＝骨髄細胞、Ｔｃｅｌｌ＝Ｔ細胞、ｂｌｏｏｄ＝全血、ｃｙｎｏＢＭ＝カニクイザル骨髄
材料および方法
リガンド合成
大部分の標的指向リガンド配列は、社内で設計されており、第三者の商業的提供者によって特注製造されている。ペプチドリガンドは、天然のポリペプチド配列に由来し、いくつかの場合において、結合親和性を改善するために変異させた。結合速度論の計算分析および最適な変異の決定は、Ｒｏｓｅｔｔａソフトウェアの使用を通して達成された。標的指向リガンドが社内で製造される場合、方法および材料は以下の通りであった：
標準的なＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用してペプチドを合成した。Ｒｉｎｋ－アミドＡＭ樹脂上でペプチドを合成した。アミノ酸カップリングは、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のＯ－（１Ｈ－６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）カップリング剤およびＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）を用いて行った。ペプチドの脱保護および開裂は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、および水を用いて行った。粗ペプチド混合物を、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって精製した。純粋なペプチド画分を、凍結および凍結乾燥して精製ペプチドを得た。
ナノ粒子合成
ナノ粒子を、カチオン性成分とアニオン性成分との間で、室温、３７℃または３７℃と室温の差で合成した。カチオン性成分とアニオン性成分の混合中に天然静電相互作用を利用して、水溶液を水性緩衝液中で調製した。開始時に、アニオン成分をトリス緩衝液（３０ｍＭ～６０ｍＭ；ｐＨ＝７．４～９）またはＨＥＰＥＳ緩衝液（３０ｍＭ、ｐＨ＝５．５）に溶解し、一方でカチオン性成分をＨＥＰＥＳ緩衝液（３０ｍＭ～６０ｍＭ、ｐＨ＝５～６．５）に溶解した。
具体的には、ペイロード（例えば、遺伝物質（ＲＮＡまたはＤＮＡ）、遺伝物質－タンパク質－核局在化シグナルポリペプチド複合体（リボ核タンパク質）、またはポリペプチド）を、塩基性、中性または酸性緩衝液中で再構成した。分析目的のために、ペイロードは、発蛍光団で共有結合的にタグ付けされるか、またはそれを遺伝的にコードするように製造された。ｐＤＮＡペイロードと共に、ＴＡＴＡＴＡタンデムリピートに特異的なＣｙ５タグ化ペプチド核酸（ＰＮＡ）を使用して、蛍光レポーターベクターおよび蛍光レポーター治療用遺伝子ベクターを蛍光標識した。負に帯電した縮合種（例えば、ポリ（グルタミン酸））としても機能し得る持続放出成分もまた、塩基性、中性または酸性緩衝液中で再構成した。リンカー－アンカー配列にコンジュゲートした野生型由来または野生型変異標的ペプチドを有する標的指向リガンドを酸性緩衝液中で再構成した。追加の縮合種または核局在化シグナルペプチドがナノ粒子に含まれていた場合、これらもまた緩衝液中でカチオン種については０．０３％ｗ／ｖの作業溶液として、アニオン種については０．０１５％ｗ／ｖとして再構成した。実験もまた、カチオン種については０．１％ｗ／ｖの作業溶液、アニオン種については０．１％ｗ／ｖで行った。遺伝物質と複合体を形成するものを除く全てのポリペプチドを、可溶化を改善するために１０分間超音波処理した。
次いで、ナノ粒子のそれぞれ別々に再構成された成分を、調査された添加の順序で混合した。調査された添加の異なる順序は、以下を含む。
１）ペイロード＜カチオン種
２）ペイロード＜カチオン種（アンカー）＜カチオン種（アンカー－リンカー－リガンド）
３）ペイロード＜アニオン種＜カチオン種
４）ペイロード＜カチオン種＜アニオン種
５）ペイロード＜カチオン種（アンカー）＜カチオン種（アンカー－リンカー－リガンド）＜アニオン種
６）ペイロード＜アニオン種＜カチオン種（アンカー）＋カチオン種（アンカー－リンカー－リガンド）
７）ペイロード＋アニオン種＜カチオン種（アンカー）＋カチオン種（アンカー－リンカー－リガンド）
８）ペイロード１（リボ核タンパク質または他の遺伝的／タンパク質材料）＜カチオン種（ヒストンフラグメント、ＮＬＳまたはリンカー－リガンドを含まない荷電ポリペプチドアンカー）＜アニオン種
９）ペイロード１（リボ核タンパク質または他の遺伝的／タンパク質材料）＜カチオン種（ヒストンフラグメント、ＮＬＳまたはリンカー－リガンドを含まない荷電ポリペプチドアンカー）＜アニオン種＜カチオン種（ヒストンフラグメント、ＮＬＳ、またはリンカー－リガンドを含むまたは含まない荷電ポリペプチドアンカー）
１０）ペイロード１（リボ核タンパク質または他の遺伝的／タンパク質材料）＜カチオン種（ヒストンフラグメント、ＮＬＳまたはリンカー－リガンドを含まない荷電ポリペプチドアンカー）＜ペイロード２／３／４（１つ以上のペイロード）＜カチオン種（ヒストンフラグメント、ＮＬＳ、またはリンカー－リガンドを含むまたは含まない荷電ポリペプチドアンカー）
１１）ペイロード１（リボ核タンパク質または他の遺伝的／タンパク質材料）＜カチオン種（ヒストンフラグメント、ＮＬＳまたはリンカー－リガンドを含まない荷電ポリペプチドアンカー）＜ペイロード２／３／４（１つ以上のペイロード）＋アニオン種＜カチオン種（ヒストンフラグメント、ＮＬＳ、またはリンカー－リガンドを含むまたは含まない荷電ポリペプチドアンカー）
１２）ペイロード１／２／３／４（１つ以上のリボ核タンパク質、タンパク質または核酸ペイロード）＋アニオン種＜カチオン種（ヒストンフラグメント、ＮＬＳ、またはリンカー－リガンドを含むまたは含まない荷電ポリペプチドアンカー）
１３）ペイロード１／２／３／４（１つ以上のリボ核タンパク質、タンパク質または核酸ペイロード）＜カチオン種（ヒストンフラグメント、ＮＬＳ、またはリンカー－リガンドを含むまたは含まない荷電ポリペプチドアンカー）
細胞培養
Ｔ細胞
トランスフェクションの２４時間前に、２０Ｍヒト初代Ｐａｎ－Ｔ細胞（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ＃７００２４）を含有するクライオバイアルを解凍し、４×９６ウェルプレートの４×６６ウェルに２００μｌおよび７５，０００細胞／ウェル（１．５Ｅ６細胞／ｍｌ）で播種した。細胞を、１０％ＦＢＳおよびＬ－グルタミンを補充した抗生物質を含まないＲＰＭＩ １６４０培地（サーモフィッシャー＃１１８７５１１９）中で培養し、２日毎に培地を交換することによって維持した。
造血幹細胞（ＨＳＣ）
トランスフェクションの２４時間前に、５００ｋのヒト初代ＣＤ３４＋細胞（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ＃７０００２）を含有するクライオバイアルを解凍し、９６ウェルプレートの４８ウェルに２００μｌおよび１０～１２ｋ細胞／ウェルで播種した。培地は、１０％ＦＢＳ、２５ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯ、５０ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ－３リガンド、および５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦを補充したＳｔｅｍｓｐａｎ ＳＦＥＭ ＩＩ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ＃０９６０５）からなり、細胞は、２日毎に培地を交換することによって維持した。
カニクイザル骨髄（ＨＳＣ）
トランスフェクションの４８時間前に、１．２５Ｍカニクイザル骨髄細胞（ＩＱ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃ＩＱＢ－ＭｎＢＭ１）を含有するクライオバイアルを解凍し、丸底９６ウェルプレートの４８ウェルに２００μｌおよび～３０ｋ細胞／ウェルで播種した。細胞を、１２％ＦＢＳを補充した抗生物質を含まないＲＰＭＩ １６４０培地中で培養し、２日毎に培地を交換することによって維持する。
ヒトの全血
５ｍＬの全血を静脈穿刺により採取した。１ｍＬを１４ｍＬのＰＢＳと混合した。ナノ粒子を１５ｍＬチューブに直接トランスフェクトするか、またはナノ粒子トランスフェクションの前に１００μｌの血液を９６ウェルプレートの各ウェルに滴定した。
トランスフェクション
ナノ粒子のストック溶液を形成した後、９６ウェルプレートの１ウェルあたり１０μｌのナノ粒子を添加し、細胞培養条件の変更または培地の補充をせずにインキュベートした（表５を参照）。生細胞イメージング中、ＢｉｏＴｅｋ Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５により、ＣＯ２および温度制御環境下で９６ウェルプレートを維持した。
（表５）
Figure 0007317706000075
分析
凝縮曲線および包含曲線
０．００４４ｕｇ／μｌのヘモグロビンサブユニットベータ（ＨＢＢ）ｇＲＮＡまたはフォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）－ＥＧＦＰ－ｐＤＮＡを含有する５０μｌの溶液を、ｐＤＮＡ結合部位またはｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡと、３０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ＝７．４～８．５）に懸濁した１μｌのＳＹＢＲ０．４ｘとを混合することによって凝縮曲線を作成した。ＨＢＢ ｇＲＮＡは、ＲＮＰ中に複合体として存在していた。インターカレートされたＳＹＢＲ Ｇｏｌｄからの蛍光発光を、ＰＬＥ２０、ＰＬＥ３５、ＰＬＥ１００、またはＰＬＥ１００：ＰＤＥ１００（１：１のＤ：Ｌ比）の単回添加の前後でモニターし、カルボキシレート対ホスフェート（Ｃ：Ｐ）の比は１～１５０の範囲であった。その後、所望のアミン対ホスフェート（Ｎ：Ｐ）またはアミン対ホスフェート＋カルボキシレート［Ｎ：（Ｐ＋Ｃ）］の比に達するようにカチオン種を添加した。代表的なカチオン種には、ＰＬＲ１０、ＰＬＲ５０、ＰＬＲ１５０、アンカー－リンカーペプチド、荷電ポリ（アルギニン）鎖にコンジュゲートした
Figure 0007317706000076
リンカーにコンジュゲートした種々の変異標的指向リガンド（すなわち内部名：ＳＣＦ＿ｍｃＫｉｔ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃ）、Ｈｉｓｔｏｎｅ＿Ｈ３Ｋ４（Ｍｅ３）ペプチド［１～２２］（ｍＨ３＿Ｋ４Ｍｅ３＿１）、Ｈｉｓｔｏｎｅ＿Ｈ４Ｋ１６（Ａｃ）ペプチド［１～２０］（ｍＨ４＿Ｋ１６Ａｃ＿１）、Ｈｉｓｔｏｎｅ＿Ｈ２Ａペプチド［１～２０］（ｍＨ２Ａ＿１）が含まれ、正電荷と負電荷の比率（ＣＲ）が異なる。いくつかの実験では、上記の指示に従って、カチオン種をアニオン種の前に添加した。
異なるナノ粒子製剤中に封入された既知量（１００～６００ｎｇ）のＶＷＦ－ＥＧＦＰ－ｐＤＮＡ、ｇＲＮＡ ＨＢＢ、Ａｌｅｘａ ５５５ Ｂｌｏｃｋ－ＩＴ－ｓｉＲＮＡを含有する６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝５．５）溶液に懸濁したナノ粒子に、３０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ＝７．４）で希釈したＳＹＢＲ ＧＯＬＤ ０．２ｘを複数回添加した後、包含曲線を得た。
ＧＦＰチャネル中のインターカレートされたＳＹＢＲ Ｇｏｌｄからの蛍光発光を、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２ハイブリッドマルチモードリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ，ＵＳＡ）またはＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅリーダー（ＢＭＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して平底半領域９６ウェルプレートで記録した。
ナノ粒子追跡分析（ゼータ）
ナノ粒子製剤の流体力学的直径およびゼータ電位は、ＺｅｔａＶｉｅｗ機器（Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｍｅｔｒｉｘ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してナノ粒子追跡分析によって調べた。機器に注入する前に、試料をＰＢＳ（１：１２）で１：１００に希釈する。測定値を得るために、分析前にカメラ設定を最適な感度および粒子／フレーム（約１００～１５０）に調整する。
蛍光顕微鏡－ＢｉｏＴｅｋ Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５
フローサイトメトリーによる評価の前に、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５ハイコンテントスクリーニング生細胞イメージング顕微鏡（ＢｉｏＴｅｋ、ＵＳＡ）を利用して、トランスフェクション効率をイメージングした。簡単に説明すると、ＧＦＰおよび／またはＣｙ５チャンネルならびに１０倍対物レンズ下で明視野を利用して、トランスフェクションの前に、トランスフェクション後４時間で１５分ずつ、その後１２時間で２時間ずつ細胞をイメージングした。続いて、画像を、連続的な動態または離散的な１～１８、２４、３６、もしくは４８時間の時点の代表として集めた。
フローサイトメトリー
洗浄工程を行って細胞培地を除去し、続いて細胞を、ＰＢＳに溶解したＺｏｍｂｉｅ ＮＩＲ生存率キット染色および／またはＣｅｌｌＥｖｅｎｔ（商標）Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）と共に室温で３０分間インキュベートする、細胞標識実験を行った。生存率標識混合物の総容量は、ウェルあたり２５μｌであった。次いで、蛍光一次抗体のパネルを混合物に添加し（ウェルあたり各抗体０．２５μｌ）、１５分間インキュベートしたままにした。ＵｌｔｒａＣｏｍｐ ｅＢｅａｄｓ Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ ＢｅａｄｓおよびＮｅｇａｔｉｖｅ Ｂｅａｄｓまたは生細胞のＣｙ５核染色を利用して、陽性対照およびネガティブシングルチャンネル対照を作成した。全てのインキュベーション工程は、ロータリーシェーカー上および暗所で行った。異なるチャンネル間で適切な補正を適用した後、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）を使用して、生細胞に対してＡｔｔｕｎｅマルチパラメトリックフローサイトメトリー測定を行った。代表的な細胞集団は、前方および側方散乱強度の適切なゲートの選択によって選ばれた。細胞蛍光の検出は、少なくとも１００００の事象が収集されるまで続けた。
結果／データ
図８～図３３：凝縮データ
図８．（ａ）最初にＳＹＢＲ ＧｏｌｄとインターカレートしたＰＮＡペイロードを有するＶＷＦ－ＥＧＦＰ ｐＤＮＡを含有するナノ粒子における正電荷対負電荷比（ＣＲ）の関数としての蛍光強度変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイ。凡例に示されているカルボキシレート対ホスフェート（Ｃ：Ｐ）の比は、ペイロードの遺伝物質上のリン酸基に対するアニオン性ポリペプチド種（ＰＬＥ１００）上のカルボン酸基のナノ粒子の比率に基づいている。
カチオン性ＰＬＲ１５０を段階的に添加することによってＣＲを増加させた。観察された蛍光の減少は、ＰＬＲ１５０の添加によってＣＲを増加させると、粒子が凝縮するにつれてＳＹＢＲがペイロードから置き換えられることを示す。さらに、凝縮は、様々なｃ：ｐ比にわたって一貫したままである。空のソリューションには、ペイロードがない場合はＳＹＢＲ Ｇｏｌｄが含まれる。（ｂ）ＰＬＥ１００なしのナノ粒子における正電荷対負電荷比（ＣＲ）の関数としての蛍光強度変動。
図９．最初にＳＹＢＲ ＧｏｌｄとインターカレートしたＮＬＳ－ＣＡＳ９－ＮＬＳ ＲＮＰとｗ／ＨＢＢ ｇＲＮＡペイロードの複合体を含有するナノ粒子における正電荷対負電荷比（ＣＲ＊）の関数としての蛍光強度変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイ。さらに、ＣＲ＊の決定は、ｃａｓ９との複合体形成によって遮蔽されたｇＲＮＡの負に帯電した部分を含まない。凡例に示されているカルボキシレート対ホスフェート（Ｃ：Ｐ）の比は、ペイロードの遺伝物質上のリン酸基に対するアニオン性ポリペプチド種（ＰＬＥ１００）上のカルボン酸基のナノ粒子の比率に基づいている。
カチオン性ＰＬＲ１５０を段階的に添加することによってＣＲを増加させた。空のソリューションには、ペイロードがない場合はＳＹＢＲ Ｇｏｌｄが含まれる。観察された蛍光の減少は、ＰＬＲ１５０の添加によってＣＲを増加させると、粒子が凝縮するにつれてＳＹＢＲがペイロードから置き換えられることを示す。さらに、凝縮は、様々なｃ：ｐ比にわたって一貫したままである。
図１０．最初にＳＹＢＲ ＧｏｌｄとインターカレートしたｇＲＮＡ ＨＢＢペイロードを含有するナノ粒子における正電荷対負電荷比（ＣＲ）の関数としての蛍光強度変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイ。凡例に示されているカルボキシレート対ホスフェート（Ｃ：Ｐ）の比は、ペイロードの遺伝物質上のリン酸基に対するアニオン性ポリペプチド種（ＰＬＥ１００）上のカルボン酸基のナノ粒子の比率に基づいている。
ＰＬＲ１５０を段階的に添加することによってＣＲを増加させた。空のソリューションには、ペイロードがない場合はＳＹＢＲ Ｇｏｌｄが含まれる。観察された蛍光の減少は、ＰＬＲ１５０の添加によってＣＲを増加させると、粒子が凝縮するにつれてＳＹＢＲがペイロードから置き換えられることを示す。さらに、ＣＲに関する凝縮は、様々なＣ：Ｐ比にわたって一貫したままである。
（表６）いくつかの製剤についての流体力学的直径およびゼータ電位を凝縮終点で測定し、以下の表に報告する。
Figure 0007317706000077
図１１～図１３：カチオン性物質としてのペプチドＳＣＦ＿ｒｍＡｃ－ｃＫｉｔ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃの凝縮曲線
図１１．（ａ）（ｂ）最初にＳＹＢＲ ＧｏｌｄとインターカレートしたＨＢＢ ｇＲＮＡペイロードを含有するナノ粒子における正電荷対負電荷比（ＣＲ）の関数としての蛍光強度変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイ。凡例に示されているカルボキシレート対ホスフェート（Ｃ：Ｐ）の比は、ペイロードの遺伝物質上のリン酸基に対するアニオン性ポリペプチド種（ＰＬＥ１００）上のカルボン酸基のナノ粒子の比率に基づいている。
ＣＲは、正に荷電したポリ（アルギニン）にコンジュゲートした（ＧＧＧＳ）２リンカーにコンジュゲートしたカチオン性変異ｃＫｉｔ標的指向リガンド（内部リガンド名：ＳＣＦ＿ｒｍＡｃ－ｃＫｉｔ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃ）の段階的添加により増加した。観察された蛍光の減少は、ＳＣＦ＿ｒｍＡｃ－ｃＫｉｔ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃの添加によってＣＲを増加させると、粒子が凝縮するにつれてＳＹＢＲがペイロードから置き換えられることを示す。さらに、凝縮は、様々なｃ：ｐ比にわたって一貫したままである。空のソリューションには、ペイロードがない場合はＳＹＢＲ Ｇｏｌｄが含まれる。
図１２．（ａ）（ｂ）最初にＳＹＢＲ ＧｏｌｄとインターカレートしたＮＬＳ－ＣＡＳ９－ＮＬＳ ＲＮＰとｗ／ＨＢＢ ｇＲＮＡペイロードの複合体を含有するナノ粒子における正電荷対負電荷比（ＣＲ）の関数としての蛍光強度変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイ。凡例に示されているカルボキシレート対ホスフェート（Ｃ：Ｐ）の比は、ペイロードの遺伝物質上のリン酸基に対するアニオン性ポリペプチド種（ＰＬＥ１００）上のカルボン酸基のナノ粒子の比率に基づいている。
ＣＲは、正に荷電したポリ（アルギニン）にコンジュゲートした（ＧＧＧＳ）２リンカーにコンジュゲートしたカチオン性変異ｃＫｉｔ標的指向リガンド（内部リガンド名：ＳＣＦ＿ｒｍＡｃ－ｃＫｉｔ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃ）の段階的添加により増加した。観察された蛍光の減少は、ＳＣＦ＿ｒｍＡｃ－ｃＫｉｔ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃの添加によってＣＲを増加させると、粒子が凝縮するにつれてＳＹＢＲがペイロードから置き換えられることを示す。さらに、凝縮は、様々なｃ：ｐ比にわたって一貫したままである。空のソリューションには、ペイロードがない場合はＳＹＢＲ Ｇｏｌｄが含まれる。
図１３．（ａ）（ｂ）最初にＳＹＢＲ ＧｏｌｄとインターカレートしたＰＮＡペイロードを有するＶＷＦ－ＥＧＦＰ ｐＤＮＡを含有するナノ粒子における正電荷対負電荷比（ＣＲ）の関数としての蛍光強度変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイ。凡例に示されているカルボキシレート対ホスフェート（Ｃ：Ｐ）の比は、ペイロードの遺伝物質上のリン酸基に対するアニオン性ポリペプチド種（ＰＬＥ１００）上のカルボン酸基のナノ粒子の比率に基づいている。
ＣＲは、正に荷電したポリ（アルギニン）にコンジュゲートした（ＧＧＧＳ）２リンカーにコンジュゲートしたカチオン性変異ｃＫｉｔ標的指向リガンド（内部リガンド名：ＳＣＦ＿ｒｍＡｃ－ｃＫｉｔ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃ）の段階的添加により増加した。観察された蛍光の減少は、ＳＣＦ＿ｒｍＡｃ－ｃＫｉｔ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃの添加によってＣＲを増加させると、粒子が凝縮するにつれてＳＹＢＲがペイロードから置き換えられることを示す。さらに、凝縮は、様々なｃ：ｐ比にわたって一貫したままである。空のソリューションには、ペイロードがない場合はＳＹＢＲ Ｇｏｌｄが含まれる。
図１４～図１５：カチオン性物質としてのヒストンＨ３Ｋ４Ｍｅの凝縮曲線
図１４．最初にＳＹＢＲ ＧｏｌｄとインターカレートしたＰＮＡペイロードを有するＶＷＦ－ＥＧＦＰ ｐＤＮＡを含有するナノ粒子における正電荷対負電荷比（ＣＲ）の関数としての蛍光強度変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイ。凡例に示されているカルボキシレート対ホスフェート（Ｃ：Ｐ）の比は、ペイロードの遺伝物質上のリン酸基に対するアニオン性ポリペプチド種（ＰＬＥ１００）上のカルボン酸基のナノ粒子の比率に基づいている。カチオン性変異ヒストン＿Ｈ３Ｋ４（Ｍｅ３）ペプチド［１～２２］（内部ペプチド名ｍＨ３＿Ｋ４Ｍｅ３＿１）の段階的添加により、ＣＲを増加させた。観察された蛍光変化は、ＰＬＥ１００の存在下でｍＨ３＿Ｋ４Ｍｅ３＿１を添加することによってＣＲを増加させることが、ＳＹＢＲをペイロードから十分に置き換えることができないことを示す。空のソリューションには、ペイロードがない場合はＳＹＢＲ Ｇｏｌｄが含まれる。
図１５．（ａ）最初にＳＹＢＲ ＧｏｌｄとインターカレートしたＮＬＳ－ＣＡＳ９－ＮＬＳ ＲＮＰとｗ／ＨＢＢ ｇＲＮＡペイロードの複合体を含有するナノ粒子における正電荷対負電荷比（ＣＲ）の関数としての蛍光強度変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイ。凡例に示されているカルボキシレート対ホスフェート（Ｃ：Ｐ）の比は、ペイロードの遺伝物質上のリン酸基に対するアニオン性ポリペプチド種（ＰＬＥ１００）上のカルボン酸基のナノ粒子の比率に基づいている。カチオン性変異ヒストン＿Ｈ３Ｋ４（Ｍｅ３）ペプチド［１～２２］（内部ペプチド名ｍＨ３＿Ｋ４Ｍｅ３＿１）の段階的添加により、ＣＲを増加させた。観察された蛍光変化は、ＰＬＥ１００の存在下でｍＨ３＿Ｋ４Ｍｅ３＿１を添加することによってＣＲを増加させることが、一貫してＳＹＢＲをペイロードから置き換えることができないことを示す。しかしながら、ヒストン＿Ｈ３Ｋ４（Ｍｅ３）は、アニオン性ポリペプチドの不在下で、ＣＲ≦８：１で有効な縮合剤であることが示されている。
図１６～図１９：カチオン性物質としてのペプチドＣＤ４５＿ａＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃの凝縮曲線
図１６．最初にＳＹＢＲ ＧｏｌｄとインターカレートしたＰＮＡペイロードを有するＶＷＦ－ＥＧＦＰ ｐＤＮＡを含有するナノ粒子における正電荷対負電荷比（ＣＲ）の関数としての蛍光強度変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイ。凡例に示されているカルボキシレート対ホスフェート（Ｃ：Ｐ）の比は、ペイロードの遺伝物質上のリン酸基に対するアニオン性ポリペプチド種（ＰＬＥ１００）上のカルボン酸基のナノ粒子の比率に基づいている。
ＣＲは、正に荷電したポリ（アルギニン）にコンジュゲートした（ＧＧＧＳ）２リンカーにコンジュゲートしたカチオン性変異ＣＤ４５受容体標的指向リガンド（内部リガンド名：ＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃ）の段階的添加により増加した。空のシンボルは、ペイロードがない場合のＳＹＢＲ Ｇｏｌｄを含有する空のソリューションを表す。
観察された蛍光の減少は、ＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃの添加によってＣＲを増加させると、粒子が凝縮するにつれてＳＹＢＲがペイロードから置き換えられることを示す。さらに、凝縮は、様々なＣ：Ｐ比にわたって一貫したままである。
図１７．最初にＳＹＢＲ ＧｏｌｄとインターカレートしたＣｙ５－ＥＧＦＰ ｍＲＮＡペイロードを含有するナノ粒子における正電荷対負電荷比（ＣＲ）の関数としての蛍光強度変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイ。凡例に示されているカルボキシレート対ホスフェート（Ｃ：Ｐ）の比は、ペイロードの遺伝物質上のリン酸基に対するアニオン性ポリペプチド種（ＰＬＥ１００）上のカルボン酸基のナノ粒子の比率に基づいている。
ＣＲは、正に荷電したポリ（アルギニン）にコンジュゲートした（ＧＧＧＳ）２リンカーにコンジュゲートしたカチオン性変異ＣＤ４５受容体標的指向リガンド（内部リガンド名：ＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃ）の段階的添加により増加した。観察された蛍光の減少は、ＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃの添加によってＣＲを増加させると、粒子が凝縮するにつれてＳＹＢＲがペイロードから置き換えられることを示す。さらに、凝縮は、様々なｃ：ｐ比にわたって一貫したままである。
図１８．最初にＳＹＢＲ ＧｏｌｄとインターカレートしたＢＬＯＣＫ－ｉＴ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５ ｓｉＲＮＡペイロードを含有するナノ粒子における正電荷対負電荷比（ＣＲ）の関数としての蛍光強度変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイ。凡例に示されているカルボキシレート対ホスフェート（Ｃ：Ｐ）の比は、ペイロードの遺伝物質上のリン酸基に対するアニオン性ポリペプチド種（ＰＬＥ１００）上のカルボン酸基のナノ粒子の比率に基づいている。ＣＲは、正に荷電したポリ（アルギニン）にコンジュゲートした（ＧＧＧＳ）２リンカーにコンジュゲートしたカチオン性変異ＣＤ４５受容体標的指向リガンド（内部リガンド名：ＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃ）の段階的添加により増加した。観察された蛍光の減少は、ＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃの添加によってＣＲを増加させると、粒子が凝縮するにつれてＳＹＢＲがペイロードから置き換えられることを示す。さらに、凝縮は、様々なＣ：Ｐ比にわたって一貫したままである。
図１９．（ａ）最初にＳＹＢＲ ＧｏｌｄとインターカレートしたＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰ ＲＮＰとＨＢＢ ｇＲＮＡペイロードの複合体を含有するナノ粒子における正電荷対負電荷比（ＣＲ）の関数としての蛍光強度変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイ。凡例に示されているカルボキシレート対ホスフェート（Ｃ：Ｐ）の比は、ペイロードの遺伝物質上のリン酸基に対するアニオン性ポリペプチド種（ＰＬＥ１００）上のカルボン酸基のナノ粒子の比率に基づいている。
ＣＲは、正に荷電したポリ（アルギニン）にコンジュゲートした（ＧＧＧＳ）２リンカーにコンジュゲートしたカチオン性変異ＣＤ４５受容体標的指向リガンド（内部リガンド名：ＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃ）の段階的添加により増加した。塗りつぶしのシンボルは、ペイロードがない場合のＳＹＢＲ Ｇｏｌｄを含有する空のソリューションを表す。
観察された蛍光の減少は、ＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃの添加によってＣＲを増加させると、粒子が凝縮するにつれてＳＹＢＲがペイロードから置き換えられることを示す。さらに、凝縮は、様々なｃ：ｐ比にわたって一貫したままである。
（ｂ）ＰＬＥを含まず、電荷比＝２２を有するナノ粒子の流体力学的直径分布の代表的な画像。平均直径は、＜ｄ＞＝１３４ｎｍ±６５である。
（表７）いくつかの製剤についての流体力学的直径およびゼータ電位を凝縮終点で測定し、以下の表に報告する。
Figure 0007317706000078
図２０～図２３：包含曲線
図２０．１５０ｎｇのＢＬＯＣＫ－ｉＴ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５ ｓｉＲＮＡペイロードを全て含有する異なるナノ粒子製剤への段階的なＳＹＢＲ添加の関数としての蛍光強度変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ包含アッセイ。０μｌ～５０μｌのＳＹＢＲの蛍光のデルタ変化は、ナノ粒子製剤の安定性を示す。製剤の安定性が低いほど、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄは遺伝子ペイロードとインターカレートする可能性が高くなる。リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸを、ここで陽性対照として使用する。表２～４。
図２１．３００ｎｇのＨＢＢ ｇＲＮＡペイロードを全て含有する異なるナノ粒子製剤への段階的なＳＹＢＲ添加の関数としての蛍光強度変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ包含アッセイ。０μｌ～５０μｌのＳＹＢＲの蛍光のデルタ変化は、ナノ粒子製剤の安定性を示す。製剤の安定性が低いほど、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄは遺伝子ペイロードとインターカレートする可能性が高くなる。リポフェクタミンＣＲＩＳＰＲＭＡＸを、ここで陽性対照として使用する。表２～４。
図２２．Ｃｙ５ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡペイロードを全て含有する異なるナノ粒子製剤への段階的なＳＹＢＲ添加の関数としての蛍光強度変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ包含アッセイ。０μｌ～５０μｌのＳＹＢＲの蛍光のデルタ変化は、ナノ粒子製剤の安定性を示す。製剤の安定性が低いほど、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄは遺伝子ペイロードとインターカレートする可能性が高くなる。リポフェクタミンメッセンジャーＭＡＸを、ここで陽性対照として使用する。表２～４。
図２３．６００ｎｇのＣｙ５タグ化ペプチド核酸（ＰＮＡ）結合部位を有するＶＷＦ－ＥＧＦＰ ｐＤＮＡペイロードを全て含有する異なるナノ粒子製剤への段階的なＳＹＢＲ添加の関数としての蛍光強度変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ包含アッセイ。０μｌ～５０μｌのＳＹＢＲの蛍光のデルタ変化は、ナノ粒子製剤の安定性を示す。製剤の安定性が低いほど、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄは遺伝子ペイロードとインターカレートする可能性が高くなる。リポフェクタミン３０００を、ここで陽性対照として使用する。表２～４。
図２４～図３３：ＴＣ．００１に関するＳＹＢＲ排除／凝縮アッセイ（表２～４を参照）
これらのデータは、実験ＴＣ．００１において使用された製剤が安定であることを示し、さらにそれらは、Ｈ３とは異なり、Ｈ２ＡおよびＨ４ヒストンテールペプチドが全ての列挙されたペイロードに対してそれ自体有効な縮合剤であることを示す。それはまた、Ｈ２ＡおよびＨ４が、アンカー－リンカー－リガンドとさらに組み合わされ得ることを示す。最後に、アニオン性ポリマーに添加する前の核酸またはリボ核タンパク質ペイロードにコンジュゲートした様々なアンカー－リンカー－リガンドペプチドに関するサイズおよびゼータ電位測定を通して実証されるように、その後のアニオン性ポリマー（この実施形態では、ＰＬＥ１００）の添加は粒子安定性に影響を及ぼさないか、または安定性を高めるという証拠が提示される。
図２４．ＲＮＰに、カチオン性ポリペプチドＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃを添加し、続いてＰＬＥ１００を添加し、さらにカチオン性ポリペプチドを添加することによる蛍光強度の低下を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイ。蛍光バックグラウンドシグナルは、ＲＮＰからのＧＦＰ蛍光によるものである。
図２５．ｓｉＲＮＡおよびＳＹＢＲ Ｇｏｌｄに、カチオン性ポリペプチドＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃを添加し、続いてＰＬＥ１００を添加し、さらにカチオン性ポリペプチドを添加することによって蛍光強度の変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイ。
図２６．ＨＢＢ ｇＲＮＡおよびＳＹＢＲ Ｇｏｌｄを有するＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰのＲＮＰに、カチオン性ポリペプチドヒストンペプチドＨ２Ａを添加し、続いてＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃを添加し、さらにＰＬＥ１００を添加することによって蛍光強度の変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイ。
図２７．ＨＢＢ ｇＲＮＡおよびＳＹＢＲ Ｇｏｌｄを有するＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰのＲＮＰに、ＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃと一緒にカチオン性ポリペプチドヒストンペプチドＨ４を添加し、さらにＰＬＥ１００を添加することによって蛍光強度の変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイ。
図２８．ｍＲＮＡに、カチオン性ポリペプチドＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃを添加し、さらにＰＬＥ１００を添加することによって蛍光強度の変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイ。
図２９．ｍＲＮＡに、ヒストンＨ４を添加し、さらにＣＤ４５－ｍＳｉｇｌｅｃ－（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿ｃおよびＰＬＥ１００を添加することによって蛍光強度の変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイ。
図３０．ｍＲＮＡに、ヒストンＨ２Ａを添加し、さらにＣＤ４５－ｍＳｉｇｌｅｃ－（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿ｃおよびＰＬＥ１００を添加することによって蛍光強度の変動を示すＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイ。
図３１．カチオン性ポリペプチドＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃを添加し、続いてＰＬＥ１００を添加することによって蛍光強度の変動を示すＶＷＦ＿ＥＧＦＰ ｐＤＮＡとのインターカレーションからのＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイ。
図３２．ヒストンＨ４を添加し、続いてカチオン性ポリペプチドＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃを添加し、続いてＰＬＥ１００を添加することによって蛍光強度の変動を示すＶＷＦ＿ＥＧＦＰ ｐＤＮＡとのインターカレーションからのＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイ。
図３３．ヒストンＨ４を添加し、続いてカチオン性ポリペプチドＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃを添加し、続いてＰＬＥ１００を添加することによって蛍光強度の変動を示すＶＷＦ＿ＥＧＦＰ ｐＤＮＡとのインターカレーションからのＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ排除アッセイ。
図３４～図７２：物理化学的データ
粒子サイズおよびゼータ電位は、コロイド状ナノ材料のキャラクタリゼーションに使用される日常的な測定値である。これらの測定値は、主に、ＤＬＳ（動的光散乱）などの光散乱技術を通して得られる。ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）は、レーザー散乱顕微鏡法および画像分析を利用して、高解像度で粒子サイズおよびゼータ電位の測定値を得る。
分析
分散性は、試料の不均一性の尺度であり、分布によって決定され、ここで、低い標準偏差および単一ピークは、粒子の均一性を示す。
リガンド、（ＧＧＧＧＳ）２リンカー、および静電アンカードメインを有するポリペプチドからなる標的指向リガンドを固相ペプチド合成によって合成し、ｐＥＧＦＰ－Ｎ１プラスミドＤＮＡペイロードを担持する粒子のシリカ表面（脱落可能層）を官能化するために使用した。得られた粒子サイズおよびゼータ電位分布は、ＺｅｔａＶＩＥＷ装置（Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｍｅｔｒｉｘ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してナノ粒子追跡分析によって得られた。
図３４．（Ａ）Ｈ３Ｋ４（Ｍｅ３）およびポリ（Ｌ－アルギニン）と複合体化したｐＥＧＦＰ－Ｎ１プラスミド（２９ｋＤ、ｎ＝１５０）からなるコアポリプレックスサイズ分布。（Ｂ）特徴的な負のゼータ電位および１２４ｎｍの平均粒径を示すシリカ脱落可能層を有する図３４Ａのポリプレックス。（Ｃ）図３４Ｂに示される粒子上にコーティングされたＮ末端アンカーおよびグリシン－セリンリンカー（（ＧＧＧＧＳ）２）を有するＥセレクチンリガンド。
図３５．分岐ヒストンペプチドコンジュゲートパイロット粒子Ｃ末端システインを有するヒストンＨ３ペプチドを、１０％の側鎖チオール置換を有する４８ｋＤのポリ（Ｌ－リジン）にコンジュゲートした。遠心ろ過および分子量排除により精製した最終生成物を使用して、プラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ－Ｎ１）を複合体化した。図３５に示す測定結果は、狭いサイズ分布を示している。プラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ－Ｎ１）と複合体を形成しているＨ３－ポリ（Ｌ－リジン）コンジュゲートのサイズ分布
図３６～７２では、データは実験番号（プロジェクトコード）によって索引付けされている。多くの場合、これは表４のプロジェクトコードと相互参照され得る（ＨＳＣ＝造血幹細胞、ＢＭ＝骨髄細胞、Ｔｃｅｌｌ＝Ｔ細胞、ｂｌｏｏｄ＝全血、ｃｙｎｏＢＭ＝カニクイザル骨髄）。
図３６は、プロジェクトＨＳＣ．００１．００１に関するデータを提供する。
図３７は、ＰＮＡタグ付きｐＤＮＡおよびＥ－セレクチン標的指向ペプチド（ＥＳＥＬＬｇ＿ｍＥＳＥＬ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ）と複合体を形成したＨ３－ポリ（Ｌ－リジン）コンジュゲートを使用したプロジェクトＨＳＣ．００１．００２に関するデータを提供する。
図３８～図４１は、シリカコーティング粒子およびシリカコーティングナノダイヤモンド上に種々の標的指向リガンドまたはステルス分子をコーティングした実験のデータを提供する（蛍光増感用途の診断のため）。サイズおよびゼータ電位分布は、関連する統計と共に提示される。標的指向リガンドは、それぞれＥＳＥＬＬｇ＿ｍＥＳＥＬ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ、ＥＳＥＬＬｇ＿ｍＥＳＥＬ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃ、ＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃ、およびＣｙ５ｍＲＮＡ－ＳｉＯ２－ＰＥＧであった。
ナノ製剤および標的指向リガンドの性能は全てのデータにおいて有意に改善され、シリカ層を除去し、荷電アニオン性脱落可能ポリペプチドマトリックスと交換すると、さまざまなペイロードおよびリガンド標的指向アプローチを用いた、全ての製剤にわたってナノ粒子のトランスフェクション効率が大幅に向上した。しかしながら、上記のデータで使用された多層化技術、ならびに分岐ヒストン複合体との増強された縮合およびそれに続くペプチドマトリックス工学（実施例は、Ｔｃｅｌｌ．００１、ＨＳＣ．００４、ＣＹＮＯＢＭ．００２、およびＢｌｏｏｄ．００２に提示される）は、技術（例えば多層化）およびコア生体材料（例えば、開示全体およびその後の実験を参照）の柔軟性を実証する。本明細書に記載されている全ての技術は、診断用または治療用にかかわらず、任意の粒子コア、ならびに自己組織化材料に適用され得る。例えば、分岐ヒストンは、リンカー－リガンドドメインにコンジュゲートされ得るか、または複数の実施形態およびその使用と共縮合され得る。
図４２～図４６は、脱落可能ポリ（グルタミン酸）表面マトリックスおよびＣＤ４５リガンドと複合体を形成したＣｙ５－ＥＧＦＰ ｍＲＮＡペイロードを担持する粒子を示す。この配合を使用して製造されたナノ粒子は、粒子サイズおよびゼータ電位において非常に均一であった。ＳＩＧＬＥＣ由来のペプチドとｍＲＮＡとの会合後にポリグルタミン酸を添加した粒子は、ＳＩＧＬＥＣ由来のｍＲＮＡおよびポリ（グルタミン酸）との会合前にポリ（グルタミン酸）を添加した粒子よりも安定で単分散であり（ＢＬＯＯＤ．００２．８８）、これは特定の添加順序がより安定な粒子を形成するのに役立ち得ることを示す。さらに、リン酸含有核酸なしでＳＩＧＬＥＣ由来ペプチドと複合体を形成したポリ（グルタミン酸）から形成された粒子は、非常にアニオン性の単分散であった（ＢＬＯＯＤ．００２．９２）。ｍＲＮＡとのＰＬＲ会合後にＰＬＥ１００を添加してＰＬＲ５０から形成された粒子は、非常に安定で、単分散でカチオン性であった（ＢＬＯＯＤ．００２．９１）。対照的に、ＰＬＥ１００添加前のｍＲＮＡとのＰＬＫ－ＰＥＧの会合は、不均一電荷分布を有する非常に小さい粒子をもたらした。これらの添加順序およびＳＩＧＬＥＣ誘導体ペプタイドの有効性は、ＰＥＧ化対照と同様のトランスフェクション効率にもかかわらず、リガンドに標的指向されたＳＩＧＬＥＣ誘導体粒子が全血球においてほぼ２桁大きいＣｙ５強度をもたらすフローサイトメトリーデータによって実証された。
図４２は、ＢＬＯＯＤ．００２．８８からのデータを提供する。ナノ粒子は、－３．３２±０．２９ｍＶのゼータ電位を有し、９０％が１８０ｎｍ未満の直径を有していた。これらのナノ粒子は、フローサイトメトリーデータによると、全血において５８．６％の効率的なＣｙ５＿ＥＧＦＰ＿ｍＲＮＡの取り込みをもたらした。狭くて一様なピークは、優れた電荷分布の例であり、ＴＣＥＬＬ．００１．１８において正味のアニオン性粒子を形成するのに再現性があった。これは、全身送達のためのＳＩＧＬＥＣ由来標的指向ペプチドの広範な適用性を実証する（例えば、以下のフローサイトメトリーおよび画像データを参照）。
図４３は、ＢＬＯＯＤ．００２．８９からのデータを提供する。ナノ粒子は－０．２５±０．１２ｍＶのゼータ電位を有し、９０％が１７６ｎｍ未満の直径を有していた。これらのナノ粒子は、フローサイトメトリーデータによると、全血においてそれぞれ５８．６％の効率的なＣｙ５＿ＥＧＦＰ＿ｍＲＮＡの取り込みをもたらした。これは、全身送達のためのＳｉｇｌｅｃ由来標的指向ペプチドの広範な適用性を実証する（例えば、以下のフローサイトメトリーおよび画像データを参照）。
図４４は、ＢＬＯＯＤ．００２．９０からのデータを提供する。ナノ粒子は、２．５４±０．０３ｍＶのゼータ電位を有し、９０％が９９ｎｍ未満の直径を有していた。これらのナノ粒子は、フローサイトメトリーデータによると、全血においてそれぞれ７９．９％の効率的なＣｙ５＿ＥＧＦＰ＿ｍＲＮＡの取り込みをもたらした（例えば、以下のフローサイトメトリーおよび画像データを参照）。
図４５は、ＢＬＯＯＤ．００２．９１からのデータを提供する。ナノ粒子は、２７．１０ ＦＷＨＭ １８．４０ｍＶのゼータ電位を有し、９０％が１３０ｎｍ未満の直径を有していた。これらのナノ粒子は、フローサイトメトリーデータによると、全血においてそれぞれ９６．７％の効率的なＣｙ５＿ＥＧＦＰ＿ｍＲＮＡの取り込みをもたらした（例えば、以下のフローサイトメトリーおよび画像データを参照）。強く正に帯電したゼータ電位は、全血球上での高い効率および強度のＣｙ５＋シグナルをもたらした。簡潔には、この実施形態では、より高用量のＰＬＲ５０（１５μｌのＰＬＲ５０ ０．１％ｗ／ｖ溶液）を、２．５μｇのＣｙ５ ｍＲＮＡを含む１００μｌのｐＨ５．５ ３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＴｒｉＬｉｎｋ）に添加した。３７℃で５分後、１．５μｌの０．１％ＰＬＥ１００を溶液に添加した。対照的に、他の実験では、より大きな相対容量（全溶液容量の５～２０％）のＰＬＥ１００を、あらかじめ形成されたカチオン性ポリマー＋アニオン性材料コアに添加することが含まれた。
図４６は、ＢＬＯＯＤ．００２．９２からのデータを提供する。ナノ粒子は、－２２．１６ ＦＷＨＭ １８．４０ｍＶのゼータ電位を有し、９０％が１３０ｎｍ未満の直径を有していた。これらのナノ粒子は、それらがフルオロフォアで標識されなかったので、フローサイトメトリーデータによれば、全血における検出可能なＣｙ５＿ＥＧＦＰ＿ｍＲＮＡの取り込みをもたらさなかった（例えば、以下のフローサイトメトリーおよび画像データを参照）。ペイロード（ビヒクル）なしでこれらのナノ粒子を効果的に凝縮させることは、荷電ポリマーの小分子または化学療法剤へのコンジュゲーションなど、非遺伝物質ペイロード送達にも影響を与える。
図４７～図６２は、ＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質（ＲＮＰ）（ＴＣＥＬＬ．００１．０１～ＴＣＥＬＬ．００１．１５）、ｍＲＮＡ（ＴＣＥＬＬ．００１．１６～ＴＣＥＬＬ．００１．３０）、プラスミドＤＮＡ（ＴＣＥＬＬ．００１．３１～ＴＣＥＬＬ００１．４５）およびｓｉＲＮＡ（ＴＣＥＬＬ．００１．４６～ＴＣＥＬＬ．００１．６０）を含有し、対応する群の同一のリガンドでパターン化された代表的な粒子を特徴付けるために行われた実験からの結果を示す。
図４７は、ＴＣＥＬＬ．００１．１からのデータを提供する。ナノ粒子は、－３．２４±０．３２ｍＶのゼータ電位を有し、９０％が７７ｎｍ未満の直径を有していた。これらのナノ粒子は、フローサイトメトリーデータによれば、生存ＣＤ４＋およびＣＤ８ａ＋ｐａｎＴ細胞において、それぞれ９９．１６％および９８．４７％の効率的なＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰ－ＲＮＰの取り込みをもたらした（例えば、以下のフローサイトメトリーおよび画像データを参照）。これらの製剤はまた、全てのＣＹＮＯＢＭ．００２．７５の物理化学的性質、ならびにその後のＣＹＮＯＢＭ．００２．８２～ＣＹＮＯＢＭ．００２．８５の層状化のための基材として働くコアを反映しており、ここで、ＰＬＲ１０コーティング粒子は、１つ以上のアニオン性ポリペプチド、核酸、および／またはＤ：Ｌ比、分子量、および組成の範囲の荷電高分子のアニオン性脱落可能コートと複合体を形成した。続いてＴＣＥＬＬ．００１．１をＰＬＥ１００＋ｍＲＮＡでコーティングした後、ＣＹＮＯＢＭ．００２．８２～ＣＹＮＯＢＭ．００２．８５において荷電ポリマーまたは荷電アンカー－リンカー－リガンドを添加した。
図４８は、ＴＣＥＬＬ．００１．３からのデータを提供する。ナノ粒子は、－０．９８±０．０８ｍＶのゼータ電位を有し、９０％が６５ｎｍ未満の直径を有していた。理想的なサイズ範囲にもかかわらず、フローサイトメトリーデータによれば、これらのナノ粒子は、同じ細胞集団で約９９％の効率を達成したＴＣＥＬＬ．００１．１における強いアニオン性の同じサイズの粒子とは対照的に、生存ＣＤ４＋およびＣＤ８ａ＋ｐａｎＴ細胞においてそれぞれ１１．６％および１３．２％の効率的なＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰ－ＲＮＰの取り込みをもたらした。粒子サイズと安定な負のゼータ電位との関係およびその方法および使用は、本明細書に記載の実験を通じて予測可能な制約であることが示されている。理想的なナノ粒子は、＜－５ｍＶのゼータ電位を有する＜７０ｎｍの粒子の大部分を有し、本明細書に記載のアニオン性脱落可能コーティング方法およびＣＹＮＯＢＭ．００２に記載の同時送達のための多段階積層脱落可能マトリックスは、ヒトおよびカニクイザルの血液、骨髄、ならびに上記の範囲内の特定の細胞からの敏感な一次細胞の安定かつ極めて効率的なトランスフェクションを達成する。ＴＣＥＬＬ．００１．３の効率の低下は、同じリガンドが、この特定のＣＲＩＳＰＲ製剤に使用されるものよりも変更されたアミン対ホスフェート対カルボキシレート比でｍＲＮＡの安定な縮合を達成したＴＣＥＬＬ．０１．２７の結果とは著しく対照的である（例えば、以下のフローサイトメトリーおよび画像データを参照）。
図４９は、ＴＣＥＬＬ．００１．１３からのデータを提供する。ナノ粒子は、２．１９±０．０８ｍＶのゼータ電位を有し、９０％が１０１ｎｍ未満の直径を有していた。生存ＣＤ４＋およびＣＤ８ａ＋ｐａｎ Ｔ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰ－ＲＮＰの取り込みの効率については、以下のフローサイトメトリー／画像データを参照されたい。
図５０は、ＴＣＥＬＬ．００１．１４からのデータを提供する。ナノ粒子は、－９．３７±０．１６ｍＶのゼータ電位を有し、９０％が１１１ｎｍ未満の直径を有していた。これらのナノ粒子は、フローサイトメトリーデータによれば、生存ＣＤ４＋およびＣＤ８ａ＋ｐａｎＴ細胞において、それぞれ２５．７％および２８．６％の効率的なＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰ－ＲＮＰの取り込みをもたらした。（例えば、以下のフローサイトメトリーおよび画像データを参照）。
図５１は、ＴＣＥＬＬ．００１．１６からのデータを提供する。
図５２は、ＴＣＥＬＬ．００１．１８からのデータを提供する。これらの粒子のサイズおよびゼータ電位は、－２０．２６±０．１５ｍＶのゼータ電位で、９０％の粒子が３９．２～１２９．８ｎｍの直径を有する、８０．９ｎｍの平均粒径を示し、１．３５のカルボキシレート対ホスフェート（Ｃ：Ｐ）および０．８５のアミン対ホスフェート比で強い粒子安定性を示し、ここでカチオン性アンカー－リンカー－リガンドを含有させた後にポリ（グルタミン酸）を添加した。高効率一次細胞トランスフェクションの達成に関連した追加の一般的パターン、工学的制約、観察および経験的測定については、ＴＣＥＬＬ．００１．２、ＴＣＥＬＬ．００１．１８、およびＣＹＮＯＢＭ．００２の全てのゼータ電位、サイズ、フローサイトメトリーおよび顕微鏡データを参照されたい（例えば、以下の表４およびフローサイトメトリーおよび画像データを参照）。
図５３は、ＴＣＥＬＬ．００１．２８からのデータを提供する。図５４は、ＴＣＥＬＬ．００１．２９からのデータを提供する。図５５は、ＴＣＥＬＬ．００１．３１からのデータを提供する。図５６は、ＴＣＥＬＬ．００１．３３からのデータを提供する。図５７は、ＴＣＥＬＬ．００１．４３からのデータを提供する。図５８は、ＴＣＥＬＬ．００１．４４からのデータを提供する。図５９は、ＴＣＥＬＬ．００１．４６からのデータを提供する。図６０は、ＴＣＥＬＬ．００１．４８からのデータを提供する。図６１は、ＴＣＥＬＬ．００１．５８からのデータを提供する。図６２は、ＴＣＥＬＬ．００１．５９からのデータを提供する。
図６３～図７２は、カニクイザル骨髄細胞に使用された製剤を特徴付ける結果を示す。
図６３は、ＣＹＮＯＢＭ．００２．８２からのデータを提供する。３％の生細胞における胎児ヘモグロビンタンパク質発現によって証明されるように、粒子は、全骨髄赤血球前駆細胞におけるＢＣＬ１１ａ赤血球エンハンサーを首尾よく削除した。ＣＹＮＯＢＭ．００２．８２ナノ粒子は、２．９６±０．１４ｍＶのゼータ電位を有し、９０％が１３２ｎｍ未満の直径を有し、粒子の５０％が３０ｎｍ未満の直径を有する。これらのナノ粒子は、フローサイトメトリーデータによれば、わずか１１．４％の全骨髄生存サブ集団標的指向にもかかわらず、生存ＣＤ３＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ３４＋骨髄亜集団における、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰおよびＣｙ５ ｍＲＮＡの、それぞれ、約４８％、約５３％、および約９７％の効率的なＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰ－ＲＮＰ＋Ｃｙ５＿ＥＧＦＰ＿ｍＲＮＡ共局在的取り込みをもたらした。
対照的に、ＰＬＲ１０、ＰＬＥ１００、ＰＤＥ１００、およびＣａｓ９ ＲＮＰからなる同一のコアテンプレートを有するが、ｍＲＮＡ共送達成分またはＰＬＲ５０のさらなる層を含まないＣＹＮＯＢＭ．００２．７５は、生存ＣＤ３＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ３４＋骨髄亜集団において、それぞれ、約２０％、約１４％、および約１００％の効率的なＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰ－ＲＮＰの取り込み、およびフローサイトメトリーデータによる１８．０％の全骨髄生存サブ集団標的指向を示した。
これらのデータを用いて、混合骨髄一次集団内での全体的なトランスフェクション効率においてわずかな増強が見られた場合でさえ、より大きな粒子は選択的標的指向にあまり適していない可能性があると推論することができる。一次細胞培養トランスフェクションに対する粒子の二峰性分布の影響は決定されていないままである。以前の研究では、骨芽細胞は、１５０～２００ｎｍの粒子を高効率でエンドサイトーシスすることが見出された。驚くべきことに、ＣＹＮＯＢＭ．００２．８２を有する粒子の集団の大部分は、ＴＣＥＬＬ．００１．１と同様に８５ｎｍピークを下回っていたが、ＰＬＥ、ＰＤＥ、ｍＲＮＡおよびＣａｓ９ ＲＮＰの基礎となるポリペプチド－リボ核タンパク質－ｍＲＮＡ－タンパク質マトリックスを取り囲むＰＬＲ５０の正電荷陽性マトリックスを有した。
さらに、全生存細胞の３．０％が胎児ヘモグロビン陽性であり、これらの細胞はいずれもＣＤ３４＋ではなく、ＣＤ３４－赤血球前駆細胞内のＢＣＬ１１ａ赤血球前駆細胞ノックアウト集団のクローン増殖が成功したことを示唆している。（例えば、以下のフローサイトメトリーおよび画像データを参照）。結果はまた、内皮細胞、骨芽細胞、破骨細胞、および骨髄の他の細胞における標的指向の成功を意味し得る。
図６４は、ＣＹＮＯＢＭ．００２．８３からのデータを提供する。これらの細胞のいずれもＣＤ３４＋ではない１．９％の生細胞における胎児ヘモグロビンタンパク質発現によって証明されるように、粒子は、全骨髄赤血球前駆細胞におけるＢＣＬ１１ａ赤血球エンハンサーを首尾よく削除した。ナノ粒子は、－２．４７±０．３３ｍＶのゼータ電位を有し、９０％が２０６ｎｍ未満の直径を有し、同じＩＬ２－模倣ペプチドコーティングでのＣＹＮＯＢＭ．００２．０３に対して改善したトランスフェクション効率をもたらした。約－５０ｍＶおよび＋２５ｍＶのテールを有する大きな電荷分布は、ＣＹＮＯＢＭ．００２．８３と同様に、また他のＣＲＩＳＰＲ＋ｍＲＮＡ共送達粒子群（ＣＹＮＯＢＭ．００２．８２～ＣＹＮＯＢＭ．００２．８５）と比較して、安定な陰イオン性単一ピークゼータ電位－１８ｍＶおよび対応する細胞生存率の増加を有するＣＹＮＯＢＭ．００２．８４とは対照的に、粒子安定性の分散を有する多分散粒子集団を示していた。カニクイザル骨髄共送達全体に関して次善のナノ粒子群は、ＣＹＮＯＢＭ．００２．８６であり、これは－２０ｍＶの同様の高い正味負帯電ゼータ電位および対応する高効率のトランスフェクション、ＣＤ３４クローン拡大、およびＢＣＬ１１ａ赤血球エンハンサーノックアウトからの胎児ヘモグロビン産生を実証した。これらのナノ粒子は、フローサイトメトリーデータによれば、混合細胞集団、ならびに８．１％の全骨髄生存亜集団内で、生存ＣＤ３４＋骨髄細胞において、約１００％の効率的なＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰ－ＲＮＰ＋Ｃｙ５＿ＥＧＦＰ＿ｍＲＮＡの取り込みをもたらした。フローサイトメトリーデータは、カニクイザル骨髄細胞における選択的ＣＤ３４＋増殖の誘導を示し、ＣＤ３４－赤血球前駆細胞内のＢＣＬ１１ａ赤血球前駆細胞ノックアウト集団の成功したクローン拡大を示唆している。（例えば、以下のフローサイトメトリーおよび画像データを参照）。結果はまた、内皮細胞、骨芽細胞、破骨細胞、および／または骨髄の他の細胞における標的指向の成功を意味する。
図６５は、ＣＹＮＯＢＭ．００２．８４からのデータを提供する。各選択的亜集団におけるＣｙ５－ｍＲＮＡ＋およびＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰ－ＲＮＰ＋ゲートにより測定された中等度のトランスフェクション効率にもかかわらず、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５またはＣＤ３＋亜集団における９．５％の生全骨髄細胞における胎児ヘモグロビンタンパク質発現および陽性ではない胎児ヘモグロビン測定によって証明されるように、粒子は、全骨髄赤血球前駆細胞におけるＢＣＬ１１ａ赤血球エンハンサーを首尾よく削除した。ＣＹＮＯＢＭ．００２．８４ナノ粒子は、－１８．０７±０．７１ｍＶのゼータ電位を有し、９０％が２０５ｎｍ未満の直径を有していた。高い正味負電荷は、安定した粒子形成を示す。これらのナノ粒子は、フローサイトメトリーデータによれば、生存ＣＤ３＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ３４＋骨髄細胞において、それぞれ７６．５％、７１％、および約１００％の効率的なＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰ－ＲＮＰ＋Ｃｙ５＿ＥＧＦＰ＿ｍＲＮＡの取り込み、ならびに２５．５％の全骨髄生存亜集団をもたらした。さらに、全生存細胞の９．５％が胎児ヘモグロビン陽性であり、これらの細胞はいずれもＣＤ３４＋ではなく、ＣＤ３４－赤血球前駆細胞内のＢＣＬ１１ａ赤血球前駆細胞ノックアウト集団のクローン増殖が成功したことを示唆している。（例えば、以下のフローサイトメトリーおよび画像データを参照）。結果はまた、内皮細胞、骨芽細胞、破骨細胞、および／または骨髄の他の細胞における標的指向の成功を意味する。
図６６は、ＣＹＮＯＢＭ．００２．８５からのデータを提供する。ナノ粒子は、－１２．５４±０．２５ｍＶのゼータ電位を有し、９０％が１８６ｎｍ未満の直径を有していた。フローサイトメトリーデータによれば、これらのナノ粒子は、生存ＣＤ３＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ３４＋骨髄細胞において、それぞれ約３３％、約２３％、および約１００％の効率的なＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰ－ＲＮＰ＋Ｃｙ５＿ＥＧＦＰ＿ｍＲＮＡの取り込みをもたらした。（例えば、以下のフローサイトメトリーおよび画像データを参照）。結果は、内皮細胞、骨芽細胞、破骨細胞、および骨髄の他の細胞における標的指向の成功を意味し得る。粒子サイズおよび電荷分布は、その後のＣＹＮＯＢＭ．００２グループおよびカニクイザル骨髄ＣＲＩＳＰＲおよび／またはｍＲＮＡ送達におけるそれらの予想される生物学的性能と一致していた。
図６７は、ＣＹＮＯＢＭ．００２．８６からのデータを提供する。ナノ粒子は、－２０．０２±０．１０ｍＶのゼータ電位を有し、９０％が１２０ｎｍ未満の直径を有していた。これらのナノ粒子は、フローサイトメトリーデータによると、それぞれ約６８％、７０％、および約９７％の効率のＣＤ３＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ３４＋の標的指向で、生存カニクイザル骨髄におけるＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰ－ＲＮＰ＋Ｃｙ５＿ＥＧＦＰ＿ｍＲＮＡの２０．１％の効率的共送達をもたらした。（例えば、以下のフローサイトメトリーおよび画像データを参照）。結果は、内皮細胞、骨芽細胞、破骨細胞、および骨髄の他の細胞における標的指向の成功を意味し得る。非常に負に帯電したゼータ電位および粒子数の９０％が＜２００ｎｍであることは、高い効率を予測する。
図６８は、ＣＹＮＯＢＭ．００２．７６からのデータを提供する。ナノ粒子は、－１２．０２±０．５９ｍＶのゼータ電位を有し、９０％が１３５ｎｍ未満の直径を有していた。これらのナノ粒子は、フローサイトメトリーデータによれば、生存ＣＤ３＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ３４＋骨髄細胞において、それぞれ１８．４％、１０．３％、および約１００％の効率的なＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰ－ＲＮＰの取り込みをもたらした（例えば、以下のフローサイトメトリーおよび画像データを参照）。さらに、約５００ｎｍに大きな体積ピークを追加することで、同様のゼータ電位分布およびサイズを示す、ＣＹＮＯＢＭ．００２．７８に見られるように、大きな凝集体のない、非常に負のゼータ電位１０～５０パーセンタイル粒径２５．８～８０．６ｎｍのヒストン様粒子から予想されるように、粒子の毒性は限られている。
図６９は、ＣＹＮＯＢＭ．００２．７７からのデータを提供する。ナノ粒子は、９０％が２５４ｎｍ未満の直径であり、大部分は１７１～２５４ｎｍの範囲にあった。（例えば、以下のフローサイトメトリーおよび画像データを参照）。さらに、数による１０～５０パーセンタイル粒子は７０～１７２ｎｍであり、この集団内での合理的なサイズ分布を示している。＞２００ｎｍの多数の粒子が溶液中に存在する、かつ／または大きな分布ゼータ電位および／もしくは非アニオン性ゼータ電位を有する他の研究と一致して、これらの粒子は著しい細胞死をもたらす。これらのナノ粒子は全体として高い取り込み率をもたらしたが、多数の細胞（＞９０％）が死滅した。最終的に、粒子は、フローサイトメトリーデータによれば、生存ＣＤ３＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ３４＋骨髄細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰ－ＲＮＰの検出限界でのごくわずかな取り込み、および全骨髄生存サブ集団内の３．８％のＣＲＩＳＰＲ取り込みをもたらした。対照的に、同じ表面コーティングを有するＣＹＮＯＢＭ．００２．８３（ＣＲＩＳＰＲ＆ｍＲＮＡ共送達変異体）粒子の９０％は、２００ｎｍ未満であり、数平均は１２１ｎｍであった。同様の処方でＴＣＥＬＬ．００１．０１～ＴＣＥＬＬ．００１．１５の粒子とは異なる方法で製造されたＣＹＮＯＢＭ．００２．７５～ＣＹＮＯＢＭ．００２．８１の他の粒子は、より好ましいサイズおよびゼータ電位分布を有し、生存ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８ａ＋Ｔ細胞において高いトランスフェクション効率（最大９９％）をもたらした。
図７０は、ＣＹＮＯＢＭ．００２．７８からのデータを提供する。ナノ粒子は、－１１．７２±０．７９ｍＶのゼータ電位を有し、９０％が２２３ｎｍ未満の直径を有していた。（例えば、以下のフローサイトメトリーおよび画像データを参照）。ＣＹＮＯＢＭ．００２．８４のゼータ電位は有意により負であるが（－１８．０７ｍＶ対－１１．７２ｍＶ）、同じ表面コーティングを有するＣＹＮＯＢＭ．００２．８４（ＣＲＩＳＰＲ＆ｍＲＮＡ共送達変異体）粒子の９０％は２００ｎｍ未満であり、数平均は１２５ｎｍであり、これは、ＰＬＲ１０によるＣａｓ９ ＲＮＰ電荷の均質化およびそれに続くリガンドまたは場合によっては分子量をずらしたポリマーまたはポリペプチドでのコーティングの中間のアニオン性脱落可能中間層工程による安定性の向上を示す。これらの単一送達対同時送達（または中間層対ＲＮＰへのリガンドの直接結合）ナノ粒子およびそれらのそれぞれのサイズ範囲の異なる物理化学的性質は、トランスフェクション効率および毒性と強く相関している。
図７１は、ＣＹＮＯＢＭ．００２．７９からのデータを提供する。ナノ粒子は、２００ｎｍ未満の直径を有していた。これらのナノ粒子は、骨髄全体で非常に低い（３．７％）ＧＦＰ－ＲＮＰ取り込みをもたらしたが、細胞は、培養物中で非常に優れた生存率（陰性対照について７０．０％対７１．６％）を保持した。全体的な取り込みが非常に低いにもかかわらず、フローサイトメトリーデータによれば、粒子は、約９．０％の生存ＣＤ３＋細胞、４．４％の生存ＣＤ４５＋細胞、および約１００％の生存ＣＤ３４＋細胞について選択的取り込みを示し、これはＣＤ３４＋サブ集団の細胞数の検出限界にある。（例えば、以下のフローサイトメトリーおよび画像データを参照）。結果は、混合細胞集団内のＣＤ３４＋造血幹細胞の特異的標的指向を意味する。
図７２は、ＣＹＮＯＢＭ．００２．８０からのデータを提供する。ナノ粒子は、１．３６±１．６９ｍＶのゼータ電位を有していた。これらのナノ粒子は、フローサイトメトリーデータによれば、生存ＣＤ３４＋骨髄細胞において８％のトランスフェクション効率および約１００％の効率的なＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰ－ＲＮＰ取り込みをもたらし、これは細胞数の検出限界にある。（例えば、以下のフローサイトメトリーおよび画像データを参照）。結果は、内皮細胞、骨芽細胞、破骨細胞、および骨髄の他の細胞における標的指向の成功を意味し得る。広い表面を有する約０ｍＶでの均一なピークは、双性イオン粒子表面を示している。高度な細胞生存率は、粒子がこのサイズで十分に許容されたこと、およびｃ－Ｋｉｔ受容体由来の粒子表面が細胞間相互作用の間に骨髄内の天然幹細胞集団表面マーカーの提示を模倣する可能性が高いことを示す。
図７３～図１０９：フローサイトメトリーおよび画像データ
図７３．カニクイザル骨髄におけるＣｙｎｏＢＭ．００２試料のための非トランスフェクト対照。
顕微鏡画像－上：デジタル位相差、中央：ＧＦＰ、下：マージ。フローサイトメトリーデータ－生存率、ＣＤ３４、ＣＤ３、およびＣＤ４５染色。
図７４．ＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰ ＢＣＬ１１ａ ｇＲＮＡ ＲＮＰのリポフェクタミンＣＲＩＳＰＲＭＡＸ送達は、生存細胞において２．５％のトランスフェクション効率を達成し、カニクイザル骨髄における陰性対照と比較してＣＤ４５およびＣＤ３相対亜集団の割合が有意に低下して有意な毒性を引き起こす。リポフェクタミンＣＲＩＳＰＲＭＡＸは、残りのＣＤ３＋細胞ならびに無視できる残りのＣＤ４５＋およびＣＤ３４＋細胞集団の７．４％の効率的標的指向によって例示されるように、細胞選択性を示さない。顕微鏡画像－上：デジタル位相差、真ん中：ＧＦＰ、下：マージ。
図７５．ＣｙｎｏＢＭ．００２ ＲＮＰ－Ｏｎｌｙ対照は、デリバリーベクターなしでカニクイザル骨髄において無視できるトランスフェクション効率を達成するが、両方のペイロードがトランスフェクションの前に組み合わされた、ＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰ ＢＣＬ１１ａ ｇＲＮＡ ＲＮＰを示す。送達ベクターがなく、最小限の事象にもかかわらず高度の共局在化は、リボ核タンパク質複合体とｍＲＮＡとの会合、およびＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰのアニオン性官能化の例示を示す。（この例では、ｍＲＮＡは、ＲＮＰ用の緩やかに会合した脱落可能コートとして作用し、さらにカチオン性材料を上に重ねることができる）。共局在化係数の計算
Ｘ：生細胞におけるＣＲＩＳＰＲの取り込み％
Ｙ：生細胞におけるｍＲＮＡの取り込み％
Ｃ：ＣＲＩＳＰＲおよびｍＲＮＡのある細胞の割合（％）
Ｚ：ＸまたはＹのいずれか大きい方の値
共局在化係数＝Ｃ／Ｚ
Ｃａｓ９－ｍＲＮＡ共局在係数：９２．２％
図７６．ＣｙｎｏＢＭ．００２．８２は、非特異的に標的指向されたＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰが、カニクイザル骨髄への１１．３％の効率的ｍＲＮＡ送達および１１．４％の効率的なＣＲＩＳＰＲ送達を９８．９％の共局在化係数で達成することを実証した。細胞内局在化は、非特異的に標的指向されたＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰ ＢＣＬ１１ａ ｇＲＮＡ ＲＮＰがＣｙ５ ｍＲＮＡと共局在化し、高いトランスフェクション効率を達成することを実証した。高度の共局在化により、離散粒子に両方のペイロードがロードされていることがわかる。さらに、Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡとは別の区画にきちんと局在していることがわかり、ここでｍＲＮＡは核関連Ｃａｓ９の周囲に環状構造を形成している。これは、２つのペイロードの細胞質ゾル（ｍＲＮＡ）対核（ＣＲＩＳＰＲ）局在化を示す。顕微鏡画像－上：デジタル位相差、中央：Ｃｙ５ ｍＲＮＡ、下：マージ、そして上：Ｃａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＰ、下：Ｃａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＰと共局在したＣｙ５ ｍＲＮＡ。
物理化学的パラメータおよび追加の観察については上記のデータを参照されたい。
ＣＹＮＯＢＭ．００２．８２は、２．９６±０．１４ｍＶのゼータ電位を有し、９０％が１３２ｎｍ未満の直径を有し、粒子の５０％が３０ｎｍ未満の直径を有する。これらのナノ粒子は、わずか１１．４％の全骨髄生存サブ集団標的指向にもかかわらず、生存ＣＤ３＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ３４＋骨髄亜集団において、それぞれ４５．５％、５６．０％、および９７．３％の効率的なＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰ－ＲＮＰ＋Ｃｙ５＿ＥＧＦＰ＿ｍＲＮＡの取り込みをもたらした。Ｃａｓ９－ｍＲＮＡ共局在化係数：９４．８％。生存ＣＤ３４＋およびＣＲＩＳＰＲ＋：９７．２％の生存ＣＤ３４＋。胎児ヘモグロビン陽性：３．０２２％の生存細胞。
図７７．ＣｙｎｏＢＭ．００２．８３は、カニクイザル骨髄への８．１％の効率的なｍＲＮＡ送達および８．１％の効率的なＣＲＩＳＰＲ送達を９３．０％の共局在化係数で達成する。細胞内局在化は、ＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰ ＢＣＬ１１ａ ｇＲＮＡ ＲＮＰと会合したホモ標的指向されたＩＬ２由来ペプチドがＣｙ５ ｍＲＮＡと共局在化し、高いトランスフェクション効率を達成することを実証した。高度の共局在化により、離散粒子に両方のペイロードがロードされていることがわかる。さらに、Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡとは別の区画にきちんと局在していることがわかり、ここでｍＲＮＡは核関連Ｃａｓ９の周囲に環状構造を形成している。これは、２つのペイロードの細胞質ゾル（ｍＲＮＡ）対核（ＣＲＩＳＰＲ）局在化を示す。顕微鏡画像－上：デジタル位相差、中央：Ｃｙ５ ｍＲＮＡ、下：マージ、そして上：Ｃａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＰ、下：Ｃａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＰと共局在したＣｙ５ ｍＲＮＡ。
物理化学的パラメータおよび追加の観察については上記のデータを参照されたい。
これらのナノ粒子は、生存ＣＤ３＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ３４＋骨髄細胞において、それぞれ約２７％、４１％、および約１００％の効率的なＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰ－ＲＮＰ＋Ｃｙ５＿ＥＧＦＰ＿ｍＲＮＡの取り込みをもたらした。Ｃａｓ９－ｍＲＮＡ共局在化係数：９３．０％。胎児ヘモグロビン陽性：１．９％の生存細胞。
図７８．各選択的亜集団におけるＣｙ５－ｍＲＮＡ＋およびＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰ－ＲＮＰ＋ゲートにより測定された中等度のトランスフェクション効率にもかかわらず、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５またはＣＤ３＋亜集団における９．５％の生全骨髄細胞における胎児ヘモグロビンタンパク質発現および陽性ではない胎児ヘモグロビン測定によって証明されるように、ＣＹＮＯＢＭ．００２．８４粒子は、全骨髄赤血球前駆細胞におけるＢＣＬ１１ａ赤血球エンハンサーを首尾よく削除する。細胞内局在化は、ＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰ ＢＣＬ１１ａ ｇＲＮＡ ＲＮＰと会合したホモ標的指向されたＥ－セレクチン由来ペプチドがＣｙ５ ｍＲＮＡと共局在化し、高いトランスフェクション効率を達成することを実証した。高度の共局在化により、離散粒子に両方のペイロードがロードされていることがわかる。さらに、Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡとは別の区画にきちんと局在していることがわかり、ここでｍＲＮＡは核関連Ｃａｓ９の周囲に環状構造を形成している。これは、２つのペイロードの細胞質ゾル（ｍＲＮＡ）対核（ＣＲＩＳＰＲ）局在化を示す。顕微鏡画像－上：デジタル位相差、中央：Ｃｙ５ ｍＲＮＡ、下：マージ、そして上：Ｃａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＰ、下：Ｃａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＰと共局在したＣｙ５ ｍＲＮＡ。
物理化学的パラメータおよび追加の観察については上記のデータを参照されたい。
これらのナノ粒子は、フローサイトメトリーデータによれば、生存ＣＤ３＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ３４＋骨髄細胞において、それぞれ７６．５％、７１％、および約１００％の効率的な共局在したＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰ－ＲＮＰ＋Ｃｙ５＿ＥＧＦＰ＿ｍＲＮＡの取り込み、ならびに約２５．５％の全骨髄生存亜集団をもたらした。さらに、全生存細胞の９．５％が胎児ヘモグロビン陽性であり、これらの細胞はいずれもＣＤ３４＋、ＣＤ３＋、またはＣＤ４５＋ではなく、ＣＤ３４－赤血球前駆細胞内のＢＣＬ１１ａ赤血球前駆細胞ノックアウト集団のクローン増殖が成功したことを示唆している。Ｃａｓ９－ｍＲＮＡ共局在化係数：９７．１％。胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）陽性：９．５％の生存細胞。
１４％のＣＤ３４＋細胞；０％共局在ＣＤ３４＋およびＨｂＦ＋
図７９．ＣｙｎｏＢＭ．００２．８５は、カニクイザル骨髄への５．２％の効率的なｍＲＮＡ送達および５．３％の効率的なＣＲＩＳＰＲ送達を８７．２％の共局在化係数で達成した。生存細胞への５．３％の効率的なＣＲＩＳＰＲ送達にもかかわらず、ＣｙｎｏＢＭ．００２．８５は、他の共送達実施形態において見られるように、胎児ヘモグロビン陽性細胞において付随する増加をもたらさなかった。細胞内局在化は、ＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰ ＢＣＬ１１ａ ｇＲＮＡ ＲＮＰと会合したホモ標的指向されたＳＣＦ由来ペプチドがＣｙ５ ｍＲＮＡと共局在化し、高いトランスフェクション効率を達成することを実証した。高度の共局在化により、離散粒子に両方のペイロードがロードされていることがわかった。さらに、Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡとは別の区画にきちんと局在していることがわかり、ここでｍＲＮＡは核関連Ｃａｓ９の周囲に環状構造を形成している。これは、２つのペイロードの細胞質ゾル（ｍＲＮＡ）対核（ＣＲＩＳＰＲ）局在化を示す。顕微鏡画像－上：デジタル位相差、中央：Ｃｙ５ ｍＲＮＡ、下：マージ、そして上：Ｃａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＰ、下：Ｃａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＰと共局在したＣｙ５ ｍＲＮＡ。
追加の物理化学的特性については上記のデータを参照されたい。これらのナノ粒子は、生存ＣＤ３＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ３４＋骨髄細胞において、それぞれ約３３％、約２３％、および約１００％の効率的なＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰ－ＲＮＰ＋Ｃｙ５＿ＥＧＦＰ＿ｍＲＮＡの取り込みをもたらした。Ｃａｓ９－ｍＲＮＡ共局在化係数：８７．２％。胎児ヘモグロビン陽性：０．９％の生存細胞。
図８０．ＣｙｎｏＢＭ．００２．８６は、カニクイザル骨髄への２０．１％の効率的なｍＲＮＡ送達および２１．８％の効率的なＣＲＩＳＰＲ送達を９８．６％の共局在化係数で達成した。細胞内局在化は、ヘテロ三価標的ＩＬ２－、Ｅ－セレクチンおよびＳＣＦ由来ＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰ ＢＣＬ１１ａ ｇＲＮＡ ＲＮＰがＣｙ５ ｍＲＮＡと共局在化し、高いトランスフェクション効率を達成することを実証した。高度の共局在化により、離散粒子に両方のペイロードがロードされていることがわかった。さらに、Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡとは別の区画にきちんと局在していることがわかり、ここでｍＲＮＡは核関連Ｃａｓ９の周囲に環状構造を形成している。これは、２つのペイロードの細胞質ゾル（ｍＲＮＡ）対核（ＣＲＩＳＰＲ）局在化を示す。顕微鏡画像－上：デジタル位相差、中央：Ｃｙ５ ｍＲＮＡ、下：マージ、そして上：Ｃａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＰ、下：Ｃａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＰと共局在したＣｙ５ ｍＲＮＡ。
追加の物理化学的特性については上記のデータを参照されたい。Ｃａｓ９－ｍＲＮＡ共局在化係数：９１．３％。胎児ヘモグロビン陽性：７．６％の生存細胞。
図８１．ＣｙｎｏＢＭ．００２．７５は、切断可能なアニオン性ポリペプチドコートを有する非特異的に標的指向されたＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰ ＢＣＬ１１ａ ｇＲＮＡ ＲＮＰが、生存カニクイザル骨髄において１８．０％のトランスフェクション効率を達成することを実証した。全体として、本明細書中の混合集団カニクイザル骨髄培養モデルでは、生存ＣＤ３＋Ｔ細胞の２０％がＣＲＩＳＰＲ＋であったのに対して、ヒト初代ＰａｎＴ細胞中の生存ＣＤ４およびＣＤ８ａＴ細胞の９７～９９％がＴＣＥＬＬ．００１においてＣＲＩＳＰＲ＋であった。同一処方の粒径は、手ではなく流体ハンドリングロボットを介して合成されたＴＣＥＬＬ１においてより小さく、より均一であった。追加の定性的および定量的解説およびデータ比較については上記のデータを参照されたい。上：デジタル位相差、中央：ＧＦＰ、下：マージ。
図８２．ＣｙｎｏＢＭ．００２．７６は、カニクイザル骨髄において、二重ヒストン断片に会合しかつ非特異的に標的指向されたＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰ ＢＣＬ１１ａ ｇＲＮＡ ＲＮＰが１３．１％のトランスフェクション効率および限定的な毒性対陰性対照を達成することを実証した。ＣＤ３＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ３４＋の生存可能亜集団の１８％、１０％、および０％がＣＲＩＳＰＲ＋であった。追加の物理化学的特性および観察については上記のデータを参照されたい。上：デジタル位相差、中央：ＧＦＰ、下：マージ。
図８３．ＣｙｎｏＢＭ．００２．７７は、カニクイザル骨髄において、ＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰ ＢＣＬ１１ａ ｇＲＮＡ ＲＮＰと結合したホモ標的指向されたＩＬ２由来ペプチドが、３．８％のトランスフェクション効率および陰性対照を超える生存率の向上を達成することを実証した。トランスフェクトした細胞の約９０％が死滅した。最終的に、粒子は、生存ＣＤ３＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ３４＋骨髄細胞においてＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰ－ＲＮＰの検出限界でのごくわずかな取り込みをもたらし、これは生ＣＲＩＳＰＲ＋細胞の残りの３．８％がそれらの亜集団由来ではないことを示している。サイズデータは、大きな粒子の多分散性および約９９９ｎｍの９０容量パーセンタイル粒子サイズにおける毒性の原因となる役割を裏付けている。追加の物理化学的性質については上記のデータを参照されたい。上：デジタル位相差、中央：ＧＦＰ、下：マージ。
図８４．ＣｙｎｏＢＭ．００２．７８は、ＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰ ＢＣＬ１１ａ ｇＲＮＡ ＲＮＰと結合したホモ標的指向されたＥ－セレクチン由来ペプチドが全体で（死細胞を含む）約７１％のトランスフェクション効率を達成することを示し、カニクイザル骨髄中のトランスフェクトされたままの生細胞はわずか４．５％であった。これは、粒子毒性の指標であり、数による粒子の５０％が３３．１～１１３．１ｎｍであるにもかかわらず大きいサイズ分布と相関し得る。溶液中の粒子の質量と体積の大部分を占める＞２５０ｎｍの粒子は、おそらくこの実験の生存率の低下をもたらした。この実施形態においても、ＣＤ４５＋およびＣＤ３＋亜集団密度は、多大に減少した。同じトランスフェクションからのナノ粒子群を比較したより詳細な物理化学的特性および定性的観察については上記のデータを参照されたい。
上：デジタル位相差、中央：ＧＦＰ、下：マージ。
図８５．ＣｙｎｏＢＭ．００２．７９は、カニクイザル骨髄において、ＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰ ＢＣＬ１１ａ ｇＲＮＡ ＲＮＰと結合したホモ標的指向されたＳＣＦ由来ペプチドが、３．７％のトランスフェクション効率および陰性対照を超える優れた生存率を達成することを実証した。これらのナノ粒子は、骨髄全体で非常に低い（３．７％）ＧＦＰ－ＲＮＰ取り込みをもたらしたが、細胞は、培養物中で非常に優れた生存率（陰性対照について６９．０％対７１．６％）を保持した。全体的な取り込みが非常に低いにもかかわらず、粒子は、約５％の生存ＣＤ３＋細胞、約４％の生存ＣＤ４５＋細胞、および約１００％の生存ＣＤ３４＋細胞（後者は検出限界にあった）に対して選択的取り込みを示した。強力な負のゼータ電位および他の群よりも有意に多くのＣＤ４５＋細胞と相まって、高度な細胞生存率は、幹細胞ニッチ標的指向および増殖および／または生存技術の確立におけるＳＣＦ模倣粒子表面の多因子的役割に関与している。追加の物理化学的パラメータについては上記のデータを参照されたい。
上：デジタル位相差、中央：ＧＦＰ、下：マージ。
図８６．ＣｙｎｏＢＭ．００２．８０は、ＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰ ＢＣＬ１１ａ ｇＲＮＡ ＲＮＰと会合したホモ標的指向されたｃ－Ｋｉｔ－（ＣＤ１１７）由来ペプチドが８．０９７％のトランスフェクション効率を達成することを実証した。トランスフェクション効率は、ＣＤ３＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ３４＋の生存可能亜集団について、それぞれ３．３％、２．４％、および検出限界であり、これはＣＤ３＋およびＣＤ４５＋細胞についての低い選択性を示している。より定量的および定性的なデータについては上記のデータを参照されたい。
上：デジタル位相差、中央：ＧＦＰ、下：マージ。（ｃｏｎｔ．）：フローサイトメトリーデータ。
図８７．ＣｙｎｏＢＭ．００２．８１は、細胞のわずか０．４８％がＣＤ３４＋であるにもかかわらず、カニクイザル骨髄において、ヘテロ三価標的ＩＬ２、Ｅ－セレクチン、およびＳＣＦ由来のＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰ ＢＣＬ１１ａ ｇＲＮＡ ＲＮＰが５％のトランスフェクション効率を達成し、トランスフェクションされた細胞の約１０％が生ＣＤ３４＋細胞であることを実証した。これは、ＣＤ３４＋細胞のほぼ１００％の効率的な選択的トランスフェクションを示している。上：デジタル位相差、中央：ＧＦＰ、下：マージ。
図８８．ＣｙｎｏＢＭ．００２ ＲＮＰ－Ｏｎｌｙ対照の定性的画像は、ＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰ ＢＣＬ１１ａ ｇＲＮＡ ＲＮＰが、送達ベクターなしでカニクイザル骨髄において軽度の陽性シグナルを達成していることを示す。上：デジタル位相差、中央：ＧＦＰ、下：マージ。
図８９．ＨＳＣ．００４（ナノ粒子６９～７４、表４参照）ハイコンテントスクリーニング。初代ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞におけるトランスフェクションの１２～１５時間後のＨＳＣ．００４ Ｃｙ５ ｍＲＮＡ送達の蛍光顕微鏡画像（Ｃｙ５ ｍＲＮＡ）。ｍＲＮＡ製剤のこの特定の実施形態では、ＳＣＦペプチドおよびＥ－セレクチンによるヘテロ二価標的指向、ならびにＳＣＦペプチドではないＥ－セレクチンによるホモ標的指向は、リポフェクタミンメッセンジャーＭＡＸよりも高いトランスフェクション効率を達成する。ＨＳＣ．００１．６９：Ａ１～Ａ６、ＨＳＣ．００１．７０：Ｂ１～Ｂ６、ＨＳＣ．００１．７１：Ｃ１～Ｃ６、ＨＳＣ．００１．７２：Ｄ１～Ｄ６、ＨＳＣ．００１．７３：Ｅ１～Ｅ６、ＨＳＣ．００１．７４：Ｆ１～Ｆ６、ＨＳＣ．００４リポフェクタミンメッセンジャーＭＡＸ投与１：Ｇ１～Ｇ２およびＧ４～Ｇ５、ＴＣ．００１リポフェクタミンメッセンジャーＭＡＸ投与２：Ｈ１～Ｈ２およびＨ４～Ｈ５、ＴＣ．００１陰性：Ｇ３、Ｇ６、Ｈ３、Ｈ６。
図９０．ＴＣＥＬＬ．００１（ナノ粒子１～１５、表４参照）ハイコンテントスクリーニング。４つのペイロード（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｐＤＮＡ）にわたる１５のリガンドに相当する、ＴＣ．００１．１～ＴＣ．００１．６０についてロボット製剤を実施した。Ｔ細胞ＣＲＩＳＰＲ送達および定性的トランスフェクション効率－初代ヒトＰａｎ Ｔ細胞へのＴＣＥＬＬ．００１ ＣＲＩＳＰＲ－ＥＧＦＰ ＲＮＰ送達の１２～１５時間後のトランスフェクション複合顕微鏡のサムネイル画像の実施形態が示されている。
プレートレイアウト：ＴＣ．００１．１：Ａ１～Ｃ１、ＴＣ．００１．３：Ｄ１～Ｆ１、ＴＣ．００１．４：Ａ２～Ｃ２、ＴＣ．００１．５：Ｄ２～Ｆ２、ＴＣ．００１．６：Ａ３～Ｃ３、ＴＣ．００１．７：Ｄ３～Ｆ３、ＴＣ．００１．８：Ａ４～Ｃ４、ＴＣ．００１．９：Ｄ４～Ｆ４、ＴＣ．００１．１０：Ａ５～Ｃ５、ＴＣ．００１．１１：Ｄ５～Ｆ５、ＴＣ．００１．１２：Ａ６～Ｃ６、ＴＣ．００１．１３：Ｄ６～Ｆ６、ＴＣ．００１．１４：Ａ７～Ａ９、ＴＣ．００１．１５：Ｂ７～Ｂ９、ＴＣ．００１．２：Ａ１０～Ａ１２、ＴＣ．００１リポフェクタミンＣＲＩＳＰＲＭＡＸ投与１：Ｂ１０～Ｂ１２、ＴＣ．００１リポフェクタミンＣＲＩＳＰＲＭＡＸ投与２：Ｃ７～Ｃ９、ＴＣ．００１ ＲＮＰのみ：Ｃ１０～Ｃ１２、ＴＣ．００１陰性：Ｄ７～Ｅ１２。
図９１．ＴＣＥＬＬ．００１リポフェクタミンＣＲＩＳＰＲＭＡＸ。リポフェクタミンＣＲＩＳＰＲＭＡＸは、トランスフェクションの２４時間後に、ヒト初代ＰａｎＴ細胞の、生存ＣＤ４＋およびＣＤ８ａ＋亜集団において、それぞれ４．７％および４．８％の効率的なＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰ ＲＮＰの送達を達成した。全体として、ＣＲＩＳＰＲ＋細胞の１２．５％および全体の細胞の６５．９％が生存していた。
図９２：ＴＣｅｌｌ．００１．１は、トランスフェクションの２４時間後に、ヒト初代Ｐａｎ Ｔ細胞の、生存ＣＤ４＋およびＣＤ８ａ＋亜集団において、それぞれ９９．１６３％および９８．４４７％の効率的な非特異的に標的指向されたＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰリボ核タンパク質の取り込みを実証した。全体として、ＣＲＩＳＰＲ＋細胞の６０．２％および全体の細胞の５７．２％が生存していた。
図９３．ＴＣｅｌｌ．００１．２、非特異的に標的指向されたＰＥＧ化対照は、トランスフェクションの２４時間後に、ヒト初代Ｐａｎ Ｔ細胞の、生存ＣＤ４＋およびＣＤ８ａ＋亜集団において、それぞれ５．５％および６．９％の効率的なＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰリボ核タンパク質の取り込みを実証した。全体として、ＣＲＩＳＰＲ＋細胞の５．６％および全体の細胞の４０．５％が生存していた。
図９４．ＴＣｅｌｌ．００１．３は、ＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰリボ核タンパク質に結合したホモ標的指向されたシアロアドヘシン由来ペプチドが、トランスフェクションの２４時間後に、ヒト初代Ｐａｎ Ｔ細胞の、生存ＣＤ４＋およびＣＤ８ａ＋亜集団において、それぞれ１１．６％および１３．２％の効率的な取り込みを生じることを実証した。全体として、ＣＲＩＳＰＲ＋細胞の４０．０％および全体の細胞の７９．２％が生存していた。
図９５．ＴＣｅｌｌ．００１．４は、ＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰリボ核タンパク質に結合したホモ標的指向されたＣＤ８０由来ペプチドが、トランスフェクションの２４時間後に、ヒト初代Ｐａｎ Ｔ細胞の、生存ＣＤ４＋およびＣＤ８ａ＋亜集団において、それぞれ６．８％および８．８％の効率的な取り込みを生じることを実証した。全体として、ＣＲＩＳＰＲ＋細胞の１２．９％および全体の細胞の６０．２％が生存していた。
図９６．ＴＣｅｌｌ．００１．５は、ＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰリボ核タンパク質に結合したホモ標的指向されたＣＤ８０由来ペプチドが、トランスフェクションの２４時間後に、ヒト初代Ｐａｎ Ｔ細胞の、生存ＣＤ４＋およびＣＤ８ａ＋亜集団において、それぞれ１０．３％および１０．９％の効率的なＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰリボ核タンパク質の取り込みを生じることを実証した。全体として、ＣＲＩＳＰＲ＋細胞の４８．３％および全体の細胞の８５．１％が生存していた。陰性対照（ＴＣＥＬＬ．００１フローサイトメトリーについてｎ＝３ネガティブ）の９ウェルにわたって、生存率は８１．４％、８４．７％、および８２．５％であったことに留意されたく、これはＣ末端に固定されたＣＤ８０由来のＣＤ２８標的指向ペプチドが培養液中の非トランスフェクト細胞に対して軽度の生存促進効果を及ぼし得ることを実証した。対照的に、ＴＣｅｌｌ００１．４、同一のＮ末端アンカーペプチドは、ＣＤ２８膜貫通受容体に対して異なるアロステリズムを有するＣＤ８０由来の断片でもある、ＴＣ．００１．６およびＴＣ．００１．７と同様に著しい毒性を示した。
図９７．ＴＣｅｌｌ．００１．６は、ＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰリボ核タンパク質に結合したホモ標的指向されたＣＤ８６由来ペプチドが、トランスフェクションの２４時間後に、ヒト初代Ｐａｎ Ｔ細胞の、生存ＣＤ４＋およびＣＤ８ａ＋亜集団において、それぞれ１．７％および２．９％の効率的な取り込みを生じることを実証した。全体として、ＣＲＩＳＰＲ＋細胞の６．８％および全体の細胞の６９．１％が生存していた。
図９８．ＴＣｅｌｌ．００１．７は、ＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰリボ核タンパク質に結合したホモ標的指向されたＣＤ８６由来ペプチドが、トランスフェクションの２４時間後に、ヒト初代Ｐａｎ Ｔ細胞の、生存ＣＤ４＋およびＣＤ８ａ＋亜集団において、それぞれ１．６％および２．１％の効率的な取り込みを生じることを実証した。全体として、ＣＲＩＳＰＲ＋細胞の１０．３％および全体の細胞の７６．４％が生存していた。
図９９．ＴＣｅｌｌ．００１．８は、ＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰリボ核タンパク質に結合したホモ標的指向されたＣＤ８６由来ペプチドが、トランスフェクションの２４時間後に、ヒト初代Ｐａｎ Ｔ細胞の、生存ＣＤ４＋およびＣＤ８ａ＋亜集団において、それぞれ１４．５％および１６．０％の効率的な取り込みを生じることを実証した。全体として、ＣＲＩＳＰＲ＋細胞の３９．１％および全体の細胞の７６．３％が生存していた。
図１００．ＴＣｅｌｌ．００１．９は、ＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰリボ核タンパク質に結合したホモ標的指向された４－１ＢＢ由来ペプチドが、トランスフェクションの２４時間後に、ヒト初代Ｐａｎ Ｔ細胞の、生存ＣＤ４＋およびＣＤ８ａ＋亜集団において、それぞれ３．６％および３．２％の効率的な取り込みを生じることを実証した。全体として、ＣＲＩＳＰＲ＋細胞の２７．５％および全体の細胞の８７．８％が生存していた。陰性対照（ＴＣＥＬＬ．００１フローサイトメトリーについてｎ＝３ネガティブ）の９ウェルにわたって、生存率は８１．４％、８４．７％、および８２．５％であったことに留意されたく、これはＣ末端に固定された、Ｔ細胞との生来の生存シグナル伝達を有する、４－１ＢＢ由来のＣＤ１３７標的指向ペプチドが培養液中の非トランスフェクト細胞に対して軽度の生存促進効果を及ぼすことを実証した。
図１０１．ＴＣｅｌｌ．００１．１０は、ＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰリボ核タンパク質に結合したホモ標的指向された４－１ＢＢ由来ペプチドが、トランスフェクションの２４時間後に、ヒト初代Ｐａｎ Ｔ細胞の、生存ＣＤ４＋およびＣＤ８ａ＋亜集団において、それぞれ５．８％および５．４％の効率的な取り込みを生じることを実証した。全体として、ＣＲＩＳＰＲ＋細胞の３０．８％および全体の細胞の８４．２％が生存していた。陰性対照（ＴＣＥＬＬ．００１フローサイトメトリーについてｎ＝３ネガティブ）の９ウェルにわたって、生存率は８１．４％、８４．７％、および８２．５％であったことに留意されたく、これはＣ末端に固定された、Ｔ細胞との生来の生存シグナル伝達を有する、４－１ＢＢ由来のＣＤ１３７標的指向ペプチドが培養液中で全体的な毒性を示さないことを実証した。
図１０２．ＴＣｅｌｌ．００１．１１は、ＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰリボ核タンパク質に結合したホモ標的指向されたＣＤ３－Ａｂ由来ペプチドが、トランスフェクションの２４時間後に、ヒト初代Ｐａｎ Ｔ細胞の、生存ＣＤ４＋およびＣＤ８ａ＋亜集団において、それぞれ１２．９％および１２．４％の効率的な取り込みを生じることを実証した。全体として、ＣＲＩＳＰＲ＋細胞の５０．０％および全体の細胞の７７．６％が生存していた。
図１０３．ＴＣｅｌｌ．００１．１２は、ＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰリボ核タンパク質に結合したホモ標的指向されたＣＤ３－Ａｂ由来ペプチドが、トランスフェクションの２４時間後に、ヒト初代Ｐａｎ Ｔ細胞の、生存ＣＤ４＋およびＣＤ８ａ＋亜集団において、それぞれ９．０％および９．５％の効率的な取り込みを生じることを実証した。全体として、ＣＲＩＳＰＲ＋細胞の３８．９％および全体の細胞の８０．７％が生存していた。
図１０４．ＴＣｅｌｌ．００１．１３は、ＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰリボ核タンパク質に結合したホモ標的指向されたＩＬ２由来ペプチドが、トランスフェクションの２４時間後に、ヒト初代Ｐａｎ Ｔ細胞の、生存ＣＤ４＋およびＣＤ８ａ＋亜集団において、それぞれ２５．７％および２８．６％の効率的な取り込みを生じることを実証した。全体として、ＣＲＩＳＰＲ＋細胞の４０．３％および全体の細胞の６８．１％が生存していた。
図１０５．ＴＣｅｌｌ．００１．１４は、ＣＲＩＳＰＲ－ＧＦＰリボ核タンパク質に結合したホモ標的指向されたＩＬ２由来ペプチドが、トランスフェクションの２４時間後に、ヒト初代Ｐａｎ Ｔ細胞の、生存ＣＤ４＋およびＣＤ８ａ＋亜集団において、それぞれ２４．９％および２５．８％の効率的な取り込みを生じることを実証した。全体として、ＣＲＩＳＰＲ＋細胞の４５．９％および全体の細胞の７０．１％が生存していた。
図１０６．十二価に標的指向された１２リガンド変異体であるＴＣｅｌｌ．００１．１５は、エンドサイトーシスによる取り込みまたはＣＲＩＳＰＲ送達をもたらさない。全体として、全細胞の５９．８％が生存していた。
図１０７．ＴＣＥＬＬ．００１陰性対照。陰性（トランスフェクトされていない）対照の９ウェルのうちの１つからの代表的な結果。全体として、全細胞の８１．４％、８４．７％、および８２．５％が、細胞播種の５２時間後（トランスフェクションの２４時間後）に生存していた。
図１０８．Ｂｌｏｏｄ．００２は、グリコシル化された細胞表面マーカーの標的指向にＳＩＧＬＥＣ誘導体を利用することにより、全ヒト血液のリンパ球ゲートにおいて６０％～９７％のｍＲＮＡ送達効率を達成する；示されているのは、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターによってアッセイされたＣｙ５タグ付きＥＧＦＰ ｍＲＮＡである。リガンド標的指向は、PEG化対照に対して細胞シグナルの有意な増強剤である。ナノ粒子の挙動を予測する追加の物理化学的性質については上記のデータを参照されたい。Ｂｌｏｏｄ．００２対照：トランスフェクトされていない。Ｂｌｏｏｄ．００２．８８：ＣＤ４５およびＮｅｕ５Ａｃに標的指向されたＳＩＧＬＥＣ誘導体（アニオン性ポリマーの前に添加されるカチオン性アンカー－リンカー－リガンドペプチド）。Ｂｌｏｏｄ．００２．８９：ＣＤ４５およびＮｅｕ５Ａｃに標的指向されたＳＩＧＬＥＣ誘導体（アニオン性ポリマーの後に添加されるカチオン性アンカー－リンカー－リガンドペプチド）。Ｂｌｏｏｄ．００２．９０：ＰＥＧ化対照（アニオン性ポリマーの前に添加されるカチオン性アンカー－ＰＥＧ）。Ｂｌｏｏｄ．００２．９１：非特異的標的変異体。Ｂｌｏｏｄ．００２．９２：ペイロードを含まないＣＤ４５およびＮｅｕ５Ａｃに標的指向されたＳＩＧＬＥＣ誘導体（アンカー－リンカー－リガンドはアニオン性ポリマーに直接コンジュゲートしている、陰性蛍光対照）。
図１０９．ＴＣｅｌｌ．００１．２７は、フローサイトメトリーで測定したところ、トランスフェクションの５時間後に、ヒト初代Ｐａｎ Ｔ細胞の生存ＣＤ８ａ＋およびＣＤ４＋亜集団において、ホモ標的指向されたＳＩＧＬＥＣ由来ペプチドが４５％の効率的なＣｙ５ ｍＲＮＡ取り込みを指示することを実証した。これらの粒子のサイズおよびゼータ電位は、－２５．５±０．１５ｍＶのゼータ電位で１７１ｎｍの平均粒径を示し、これは１．３５カルボキシレート対ホスフェート（Ｃ：Ｐ）および０．８５アミン対ホスフェートの比で強い粒子安定性を示しており、ここでポリ（グルタミン酸）は、カチオン性アンカー－リンカー－リガンドを含めた後に添加される。ゼータ電位およびサイズデータ、ＴＣｅｌｌ．００１．２およびＴＣｅｌｌ．００１．１８については上記のデータを参照されたい。追加の定量的詳細については上記のデータを参照されたい。右上：明視野、右中央：Ｃｙ５ ｍＲＮＡ、右下：マージ、上：陰性対照の明視野、下：陰性対照のＣｙ５チャンネル。
実施例４
図１１０．リボ核タンパク質およびタンパク質送達の根拠ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰの電荷密度プロットは、タンパク質表面に安定な荷電層を形成するためにアニオン性またはカチオン性ペプチド／材料を添加すべきかどうかを決定することを可能にする。一実施形態では、露出した核酸（アニオン性）およびアニオン性電荷ポケットは、荷電アニオンを付加する前の荷電カチオンのための強力な静電固定部位として、またはそれら自身のリガンド－リンカーアニオン性アンカーとして役立つ。スケールバー：電荷
図１１１．リボ核タンパク質およびタンパク質送達の根拠Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓの電荷密度プロットは、タンパク質表面に安定な荷電層を形成するためにアニオン性またはカチオン性ペプチド／材料を添加すべきかどうかを決定することを可能にする。別の実施形態では、カチオン性電荷ポケットは、それら自身のリガンド－リンカーアニオン性アンカードメインとして、または荷電カチオンの付加前に、荷電アニオンのための強力な静電固定部位として機能する。スケールバー：電荷
図１１２．（２ｂ）その後の多層化学の付加、複数の核酸または荷電治療薬の同時送達、または架橋による層安定化の有無を問わず、（２ａ）アンカー－リンカー－リガンドまたは独立型カチオン性アンカーのようなカチオン性アンカーの付加（２）の前にＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ表面上のカチオン性部位に固定する例示的なアニオン性ペプチド（長さ９～１０アミノ酸、直径約１０ｎｍまでのＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ）（１）
テキストを左から右へ描画する際の手書き文字：「カチオン性アンカー」。「スペーサー」。「リガンド」。「および／または」。「２ｄ」。「カチオン性ポリマーおよび／またはポリペプチド」。「２ｂ、続いて層間化学」。
図１１３．荷電タンパク質コアテンプレートを用いたペイロード共送達の根拠。Ｃａｓ９ ＲＮＰまたは任意の均一にまたは双性イオン的に帯電した表面を含み得るコアテンプレートに基づく付加順序および静電マトリックス組成物の例。様々なポリマーを利用して双性イオン表面の電荷を均質化する方法が示されている。ｇＲＮＡに結合したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＲＮＰからなる約１０ｎｍのコア粒子は、双性イオンドメインで示されている。手短に言えば、カチオン性ポリマーまたはアニオン性ポリマーを添加して、反対に荷電したポリマーを添加する前に表面電荷を均質化することができる。アニオン性成分の分子量をずらすことで、ＣＹＮＯＢＭ．００２．８２～ＣＹＮＯＢＭ．００２－８６対ＣＹＮＯＢＭ．００２．７５～ＣＹＮＯＢＭ．００２．８１の単一ペイロード送達変異体において、ＲＮＰコアを有する粒子およびさまざまな表面コーティングを有するｍＲＮＡ－ＰＬＥ中間層を有する粒子のトランスフェクション効率および遺伝子編集効率が向上することが実証されている。荷電コアテンプレートの実施形態は、荷電デンドリマーまたはオリゴ糖－デンドリマー、組換えまたは合成ヒストン二量体／三量体／四量体／八量体、ナノダイヤモンド、金ナノ粒子、量子ドット、ＭＲＩ造影剤、またはこれらと上記の組合せを含む任意の荷電表面を包含する。
テキストを左から右へ描画する際の手書き文字：「負に帯電したコーティングは、カチオン性ポリマーまたはアンカー－リンカー－リガンドを上に重ねてもよく、ここでアンカーは、カチオン性である。」「アミノ糖」。「荷電グリコサミノグリカン」。「ｐＤＮＡ」。「共送達」。「露出したｇＲＮＡ」。「正味の陰性放出可能ポリマーコート」。「グリカン」「ｃａｓ９上のカチオン性タンパク質ドメイン」。「約１０ｎｍのｃａｓ９ ＲＮＰ」。「ｃａｓ９上のカチオン性タンパク質ドメイン」。「ＰＬＲ」。「ＰＤＥ（５～１００）」。「ＰＬＥ（５～１００）」。「ｃａｓ９上のアニオン性タンパク質ドメイン」。「ｍＲＮＡ」。「糖ペプチド上の分岐カチオン性ポリマー」。「ヒストン」。「ｓｉＲＮＡ」。負に帯電したコーティングはまた、アニオン性アンカー－リンカー－リガンドのドメインまたは独立型アニオン性マトリックス組成物であり得る。一貫したポリマーの互い違いの分子量は、コロイド安定性および遺伝子編集効率を高める。
実施例５
図１１４．ペプチド工学－ＩＬ２Ｒ標的指向のための新規なＩＬ２模倣フラグメント。インターロイキン２受容体（右）に結合したインターロイキン２（左）（ＰＤＢ：１Ｚ９２）
配列ＡＳＮ（３３）－ＰＲＯ（３４）－ＬＹＳ（３５）－ＬＥＵ（３６）－ＴＨＲ（３７）－ＡＲＧ（３８）－ＭＥＴ（３９）－ＬＥＵ（４０）－ＴＨＲ（４１）－ＰＨＥ（４２）－ＬＹＳ（４３）－ＰＨＥ（４４）－ＴＹＲ（４５）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７３）は、ＩＬ２（ＰＤＢ １Ｚ９２）から選択され、ＩＬ２受容体α鎖への活性結合の領域と相関する。ＩＬ２ＲとＩＬ２の相互作用モチーフを選択することによる相補的結合の操作：ここで、配列ＣＹＳ（３）－ＡＳＰ（４）－ＡＳＰ（５）－ＡＳＰ（６）－ＭＥＴ（２５）－ＬＥＵ（２６）－ＡＳＮ（２７）－ＣＹＳ（２８）－ＧＬＵ（２９）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８４）は、ＩＬ２受容体からの２つの結合モチーフについて選択される。
図１１５：ペプチド工学－ＣＤ３を用いた新しい抗体由来の「アクティブバインディングポケット」エンジニアリング概念実証。配列ＴＨＲ（３０）－ＧＬＹ（３１）－ＡＳＮ（５２）－ＰＲＯ（５３）－ＴＹＲ（５４）－ＬＹＳ（５５）－ＧＬＹ（５６）－ＶＡＬ（５７）－ＳＥＲ（５８）－ＴＨＲ（５９）－ＴＹＲ（１０１）－ＴＹＲ（１０２）－ＧＬＹ（１０３）－ＡＳＰ（１０４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８５）はＣＤ３抗体（ＰＤＢ １ＸＩＷ）から選択され、ＣＤ３イプシロンおよびデルタ鎖への活性結合の領域と相関する。アミノ酸の順序は、より大きいタンパク質によって維持されている三次構造をもはや持たない結合ポケット内のペプチドの二次元平面の結合動力学を反映するために再配列される。この寸法減少は以下の結果をもたらす：ＴＨＲ（５９）－ＳＥＲ（５８）－ＶＡＬ（５７）－ＧＬＹ（５６）－ＬＹＳ（５５）－ＴＹＲ（５４）－ＰＲＯ（５３）－ＡＳＮ（５２）－ＴＨＲ（３０）－ＧＬＹ（３１）－ＴＹＲ（１０１）－ＴＹＲ（１０２）－ＧＬＹ（１０３）－ＡＳＰ（１０４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７４）。
図１１６：ペプチド工学－ＣＤ４５グリコシル化標的指向のための新規なＳＩＧＬＥＣ誘導体。Ｎ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）との複合体中のシアロアドヘシンＮ末端のＰＤＢレンダリング（ＲＣＳ ＰＤＢ １ＯＤＡ）。レンダリングにおいてシアロアドヘシンに近いシアロアドヘシンフラグメントを、グリコシル化ＣＤ４５および他の複雑な細胞表面糖タンパク質を標的とするために利用した。ＴＣＥＬＬ．００１．３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ、ならびにＢＬＯＯＤ．００２．１～ＢＬＯＯＤ．００２．２の全血リンパ球ゲートのｍＲＮＡでＴ細胞の標的指向に成功した。リガンドの配列は、ＳＮＲＷＬＤＶＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７２）である。
図１１７：ペプチド工学－ｃ－Ｋｉｔ標的指向のための新規なＳＣＦフラグメント。破線の丸－幹細胞因子のシグナルペプチドドメイン（ＲＣＳ ＰＤＢ １ＳＣＦ）は、ｃ－Ｋｉｔ活性に必要な二量体ドメインを表す。特定のナノ粒子表面サイズ＋ＳＣＦコーティング密度による細胞取り込みに対するリガンド提示の効果は、ＣｙｎｏＢＭ．００２．７９（約５％の効率）とＣｙｎｏＢＭ．００２．８５（約５６％の効率）との間で比較対照することができる。さらに、Ｅ－セレクチン＋ＳＣＦフラグメント（ＨＳＣ．００４．７３）は高い効率を達成するが、ＳＣＦフラグメントはそれ自体では達成しない（ＨＳＣ．００４．７４）、コントラストがヒトＣＤ３４＋造血幹細胞トランスフェクションの定性的画像と共に表示される。挙動の著しい相違は、エンドサイトーシスの合図を生じさせ、続いて核酸および／またはリボ核タンパク質材料を核内標的指向する際の二量体ペプチドの特定の役割を示唆している。リガンドの配列は、
Figure 0007317706000079
である。
図１１８：ペプチド工学－膜結合ＳＣＦ標的指向のための新規ｃＫｉｔ受容体フラグメント。内皮細胞および骨髄細胞上での造血幹細胞ローリング挙動の挙動を模倣し、全身的トランスフェクション効率を高めるための、ｃ－Ｋｉｔ由来の幹細胞因子標的指向ペプチドの合理的設計（ＣｙｎｏＢＭ．００２．８０を参照）。折り畳みについて評価した配列：名称ＳＣＦＮ、配列：
Figure 0007317706000080
。ＲｏｓｅｔｔａおよびＮＡＭＤシミュレーションパッケージを用いて配列を評価した。Ｒｏｓｅｔｔａ結果：ａｂ ｉｎｉｔｉｏ折り畳みのために短縮配列をＲｏｓｅｔｔａに入れた
Figure 0007317706000081
。
図１１９：ペプチド工学－ｃＫｉｔ受容体フラグメント（続き）。ナノ粒子表面に提示されるであろうエントロピー的に好ましい立体配座をシミュレートすることを可能にするために適所に保持されたアンカー－リンカー－リガンドのアンカーセグメントを有する分子動力学シミュレーション。各結果には同じスコア係数が含まれているため、これらの構造のいずれかが優先されるかどうかを判断するのは困難である。Ｒｏｓｅｔｔａも折り畳み動力学をしないので、これらの配列がらせん状構造に折り畳まれない可能性が高い。
ＮＡＭＤの結果：Ｒｏｓｅｔｔａは折り畳みの動力学していないので、完全な配列が素早く二次構造に折り畳まれるかどうかをチェックした。３００～５００Ｋの間の１６個または３２個のレプリカに対してレプリカ交換分子動力学（ＲＥＭＤ）を用いてＮＡＭＤでシミュレーションを行い、各レプリカについて１０ｎｓまでシミュレーションした。アンカー部分（ポリ－Ｒ）は、粒子に結合したタンパク質をシミュレートするために線形として固定された。最低エネルギーのスナップショットが表示される。
ＫＩＴから派生した配列のさらなる分析は、それはおそらく多くの固有の順序を有さないということを示した。オレンジ色の漫画セクションは、最初にＫＩＴから選択された配列に属する。
図１２０：ペプチド工学－ｃＫｉｔ受容体フラグメント（続き）。アミノイソ酪酸による重要な疎水性ドメインの修飾による効果的なリガンド提示のための安定な螺旋状ペプチドへの強いリガンド－リンカー自己折畳みを有するランダムコイル状ペプチドの安定化。
青い鎖は、残基７１～９４：
Figure 0007317706000082
の範囲の、ＫＩＴ中に存在するより規則的ならせんを表した。アンカーおよびリンカーを有するＫＩＴ残基７１～９４のＮＡＭＤシミュレーション：
Figure 0007317706000083
鎖がリンカー残基と強く相互作用する構造に収束した。残基７１～９４については、ＫＩＴ中の他の２つのヘリックスと相互作用することによってヘリックスを安定化させる疎水性残基がある。疎水性残基は、赤（下線）で示されている：
Figure 0007317706000084
。疎水性残基を除去するために配列を変更し、らせん状の折り畳みを誘導するのを助けるアミノイソ酪酸（Ａｉｂ）で置き換えて、以下の配列に到達した：
Figure 0007317706000085
。Ａｉｂを含む配列をＲｉｎｋ樹脂上で合成し、遊離アミンおよびアシル化アミン（Ａｃ）で単離した。二次構造は円二色性によって調べた。
図１２１：ペプチド工学－ｃＫｉｔ受容体フラグメント（続き）
ＳＣＦ＿ｍｃＫｉｔ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿ＮおよびＳＣＦ＿ｍｃＫｉｔ（Ａｃ）＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎの円二色性リガンド末端のアセチル化は、荷電ポリペプチド末端の電荷を中和するために利用され得る。上：ＫＩＴ７１９４＿ＡＩＢ１のＣＤは、アルファヘリックスおよびＡｉｂ単位を含むヘリックスの二次構造と一致して、２２２付近でわずかに落ち込み、２０８付近で大きな落ち込みを示している。下：ＫＩＴ７１９４＿ＡＩＢ１＿Ａｃは、ＫＩＴ７１９４＿ＡＩＢ１と同じＣＤを示している。時々アシル化は折りたたみを助け得るが、それは必要ではないようである。アセチル化はまた、末端アミンが荷電よりもむしろ中性である必要があるリガンド相互作用を助け得る。完全アンカー－リンカー－ＫＩＴ７１９４＿ＡＩＢ１構築物：
Figure 0007317706000086
。
図１２２：ペプチド工学－ｃＫｉｔ受容体フラグメントアミノイソ酪酸による重要な疎水性残基の修飾後のＳＣＦ＿ｍｃＫｉｔ（Ａｃ）＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎの安定な立体配座

Claims (7)

  1. ファミリーＢのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に特異的に結合する標的指向リガンドを含む送達分子であって、
    該標的指向リガンドが、タンパク質ペイロード、核酸ペイロード、および／または荷電ポリマーポリペプチドドメインにコンジュゲートしており、
    該標的指向リガンドが、該ファミリーＢのＧＰＣＲのアロステリック親和性ドメインおよびオルソステリックドメインの両方への結合を提供して、それぞれ、標的指向された結合および長いエンドソームリサイクリング経路の関与を提供し、
    該標的指向リガンドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載のアミノ酸配列を含み、かつ
    該標的指向リガンドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載のアミノ酸配列のＬ１０、Ｓ１１、およびＫ１２に対応する位置の１つ以上にシステイン置換を含む、
    送達分子。
  2. 前記標的指向リガンドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の送達分子。
  3. 前記標的指向リガンドが、核酸ペイロードにコンジュゲートしており、かつ該核酸ペイロードがＲＮＡｉ剤であり、任意で、該ＲＮＡｉ剤がｓｉＲＮＡ分子である、請求項１または２に記載の送達分子。
  4. 前記標的指向リガンドが、リンカーを介してタンパク質ペイロード、核酸ペイロード、および／または荷電ポリマーポリペプチドドメインにコンジュゲートしている、請求項１または２に記載の送達分子。
  5. 前記リンカーが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の送達分子。
  6. 前記標的指向リガンドが、荷電ポリマーポリペプチドドメインにコンジュゲートしており、かつ該荷電ポリマーポリペプチドドメインが、核酸ペイロードと縮合している、請求項１または２に記載の送達分子。
  7. 前記荷電ポリマーポリペプチドドメインが、ポリアルギニンおよびポリヒスチジンからなる群より選択される、請求項１または２に記載の送達分子。
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