KR20230010036A - 변형된 미니-뉴클레오솜 코어 단백질 및 핵산 전달에서의 용도 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 및/또는 핵산의 전달과 관련한 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 본 개시내용은 그 중에서도, 핵산의 전달을 위한 비바이러스 단백질성 비히클을 포함한다. 다양한 구현예에서, 본원에 제공된 비바이러스 단백질성 비히클은 (a) 핵산 결합 도메인; (b) 표적화 도메인; (c) 핵산 방출 도메인; 및, 선택적으로 (d) 안정성 도메인, 올리고머화 도메인, 및/또는 링커 도메인 중 하나 이상을 포함하는 추가 도메인을 포함한다. 다양한 구현예에서, 단백질성 비히클은 하나 이상의 변형된 잔기를 포함한다.

Description

변형된 미니-뉴클레오솜 코어 단백질 및 핵산 전달에서의 용도

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2020년 4월 13일 출원된 미국 가출원 번호 제63/009,124호의 우선권을 주장하며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

AAV 벡터는 현재 유전자 요법의 최적 표준으로 간주되며 예를 들어, 간, CNS, 및/또는 다른 조직에서 망막 유전자 요법 및 전신 유전자 요법에 대한 임상 시험을 포함하여 다양한 임상 시험에서 가능성을 제시하였다. 적어도 3 가지 상이한 유전자 요법의 규제 승인에 따라, 관련 분야에서는 더 많은 준비를 하고 있어서, 환자는 이러한 삶을 바꾸는 치료에 접근할 수 있다. 그러나, 업계의 최적 표준임에도 불구하고, AAV 벡터는 특정 제한이 있다. 개선되고/되거나 대안적인 핵산 전달 기술이 필요하다.

본 개시내용은 그 중에서도, 핵산 분자와 회합할 수 있는 폴리펩티드와 관련된 조성물 및 방법을 제공하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 적어도 하나의 변형된 아미노산을 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드는 예를 들어, 유전자 요법이 필요한 대상체에게 핵산 분자를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 그 중에서도, 핵산 분자와 회합할 수 있는 변형된 폴리펩티드, 뿐만 아니라 회합된 핵산 분자와 함께 본원에 개시된 변형된 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 포함한다. 본 개시내용은, 임의의 특정 과학적 이론에 얽매이기를 바라지 않고, 본원에 개시된 변형된 폴리펩티드와 핵산 분자의 회합이 핵산을 표적 세포, 대상체, 또는 다른 시스템으로 전달하는 것을 용이하게 할 수 있다는 것을 고려한다.

특히, 본 개시내용은 그 중에서도, 핵산의 전달을 위한 "변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질"을 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 개시내용의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 (a) 핵산 결합 도메인("NABD"); (b) 핵산 방출 도메인; 및 선택적으로 (c) 예를 들어, 표적화 도메인, 안정성 도메인, 올리고머화 도메인 및/또는 링커 도메인 중 하나 이상을 포함하는 추가 도메인을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 개시내용의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 (a) 핵산 결합 도메인("NABD"); (b) 핵산 방출 도메인; (c) 표적화 도메인; 및, 선택적으로, (d) 안정성 도메인, 올리고머화 도메인 및/또는 링커 도메인 중 하나 이상을 포함하는 추가 도메인을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 개시내용의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 (a) 핵산 결합 도메인("NABD"); (b) 핵산 방출 도메인; (c) 변형된 아미노산 잔기; 및, 선택적으로, (d) 예를 들어, 표적화 도메인, 안정성 도메인, 올리고머화 도메인 및/또는 링커 도메인 중 하나 이상을 포함하는 추가 도메인을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 개시내용의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 (a) 핵산 결합 도메인("NABD"); (b) 핵산 방출 도메인; (c) 표적화 도메인; (d) 변형된 아미노산 잔기; 및 선택적으로 (e) 안정성 도메인, 올리고머화 도메인 및/또는 링커 도메인 중 하나 이상을 포함하는 추가 도메인을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 및/또는 적어도 하나의 변형된 아미노산 잔기를 갖는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이거나 이를 포함하는 단백질로서 언급 및/또는 기재될 수 있다. 따라서, 명확성을 위해, 본 개시내용에서 "미니 뉴클레오솜 코어 단백질"에 대한 표현 또는 암시된 모든 참조는 본 개시내용의 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함하고 아우른다. 핵산 운반체(cargo)와 관련된 하나 이상의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 "로딩된 미니 뉴클레오솜"으로 지칭될 수 있다. 표적에 핵산을 전달하기 위한 로딩된 미니 뉴클레오솜은 비바이러스이기 때문에, 미니 뉴클레오솜은 핵산 전달을 위한 비바이러스 비히클의 예이다.

특히, 본 개시내용은 그 중에서도, 핵산의 전달을 위한 "변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질"을 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 개시내용의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 (a) 핵산 결합 도메인("NABD"); (b) 표적화 도메인; 및, 선택적으로, (c) 예를 들어, 핵산 방출 도메인, 안정성 도메인, 올리고머화 도메인 및/또는 링커 도메인 중 하나 이상을 포함하는 추가 도메인을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 개시내용의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 (a) 핵산 결합 도메인("NABD"); (b) 표적화 도메인; (c) 핵산 방출 도메인; 및, 선택적으로, (d) 예를 들어, 안정성 도메인, 올리고머화 도메인 및/또는 링커 도메인 중 하나 이상을 포함하는 추가 도메인을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 개시내용의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 (a) 핵산 결합 도메인("NABD"); (b) 표적화 도메인; (c) 변형된 아미노산 잔기; 및, 선택적으로, (d) 예를 들어, 핵산 방출 도메인, 안정성 도메인, 올리고머화 도메인 및/또는 링커 도메인 중 하나 이상을 포함하는 추가 도메인을 포함하는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질로 변형될 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 개시내용의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 (a) 핵산 결합 도메인("NABD"); (b) 표적화 도메인; (c) 핵산 방출 도메인; (d) 변형된 아미노산 잔기; 및 선택적으로 (e) 예를 들어, 안정성 도메인, 올리고머화 도메인 및/또는 링커 도메인 중 하나 이상을 포함하는 추가 도메인을 포함하는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질로 변형될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 및/또는 적어도 하나의 변형된 아미노산 잔기를 갖는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이거나 이를 포함하는 단백질로서 언급 및/또는 기재될 수 있다. 산 잔류물. 따라서, 명확성을 위해, 본 개시내용에서 "미니 뉴클레오솜 코어 단백질"에 대한 표현 또는 암시된 모든 참조는 본 개시내용의 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함하고 아우른다. 핵산 운반체와 관련된 하나 이상의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 "로딩된 미니 뉴클레오솜"으로 지칭될 수 있다. 표적에 핵산을 전달하기 위한 로딩된 미니 뉴클레오솜은 비바이러스이기 때문에, 미니 뉴클레오솜은 핵산 전달을 위한 비바이러스 비히클의 예이다.

본 개시내용은 본 개시내용의 적어도 일부 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 증가된 생체이용률; 증가된 반감기; 증가된 안정성; 감소된 저하; 예를 들어, 표적 세포에 대한 증가된 결합 친화도; 예를 들어, 표적 세포에 의한 증가된 흡수; 개선된 혈뇌 장벽 침투; 예를 들어, 표적 세포 또는 조직에서 감소된 축적; 감소된 응집; 감소된 축척; 감소된 열변성; 및/또는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 감소된 동역학적 변성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 유리한 특성을 갖는다는 인식을 포함한다.

본 개시내용은 본원에 기재된 적어도 특정 조성물 및 방법이 다음을 포함하는 AAV 벡터와 관련된 하나 이상의 결함을 바로잡는다는 인식을 포함한다:

1) AAV는 4.5 kb DNA 길이의 적하 제한과 관련되어 있으며, 제한은 전형적으로 4kb 초과의 핵산에 의해 암호화된 유전자 산물의 발현에서 결핍에 의해 적어도 부분적으로 야기된 질환의 치료에서 AAV의 사용을 방지한다(예를 들어 CFTR, HTT, F8, DMD, ABCA4 등과 같은 유전자는 AAV 벡터에 맞지 않을 수 있음)(Lai Y. 등, 2010).

2) AAV는 낮은 백분율 및/또는 부위 비특이적 방식으로 통합되는 것으로 알려져 있다(Smith R.H., 2008). 무작위 또는 부위 비특이적 통합은 통합이 종양 억제 유전자 또는 세포 기능에 중요한 유전자를 파괴할 수 있거나 또는 파괴하는 경우 해로울 수 있다.

3) AAV의 혈청형에 따라, 인간의 25-70%는 AAV에 대한 기존 중화 항체를 가지고 있으며 이는 AAV 요법에 이익이 될 가능성이 적다는 것을 의미한다(Fitzpatrick Z., 등 2018).

4) AAV를 사용한 다중 치료는 일단 환자에게 주입되면, 환자가 바이러스에 대한 많은 수의 항체를 생성하기 때문에 효과적일 가능성이 매우 적다. 세포 교체율이 높은 일부 질환의 경우(예를 들어, 간 세포 또는 기도 상피 세포의 교체율에서) 다중 치료가 필요할 수 있다. 따라서, 첫번째 치료 후 AAV에 대한 항체 증가로 인해, 동일한 벡터가 후속 치료 또는 용량에 유용하지 않을 수 있다.

5) 일부 질환의 효과적인 치료는 생체 내에서 세포를 형질도입하기 위해 정맥내 주사에 의해 투여되는 수많은 적하 입자를 전달할 필요가 있을 수 있다. 고용량의 AAV는 자체 독성이 있으며, 이는 잘 문서화되어 있다(Hinderer C. 등, 2018).

6) 대부분의 질환은 또한 다기관 결함과 관련되어 있으며 AAV는 동일한 신체의 다양한 기관에 적용되지 않을 수 있다. 하나의 부위에 하나의 적용은 항체를 증가시킬 것이며 따라서 후속 치료 또는 용량으로 주입될 때 신체의 다른 위치에서 형질도입을 차단할 수 있다.

적어도 부분적으로 상기 논의된 AAV의 결합으로 인해, AAV에 대한 대안이 시급하게 필요하다. 적어도 특정 구현예에서, 본원에 개시된 비바이러스 벡터는 상기 논의된 AAV의 결함 중 하나 이상을 극복한다.

더욱이, 이전 비바이러스 벡터는 또한 다음을 포함하는 치료 효능에 대한 여러 장벽과 관련된다: i) 낮은 형질감염/형질도입 효율(Guerra-Crespo M 등, 2003) ii) 혈액, 체액 및 다른 조직에서 낮은 입자 안정성(Barua and Mitragotri, 2014); iii) 수용체-매개 세포내이입 또는 세포 융합을 통한 낮은 세포 진입; iv) 엔도솜 및 리소솜 구획에서 낮은 안정성, 및 이로부터 낮은 탈출; v) 세포질에서 낮은 확산율; vi) 낮은 핵 기공 통과; 및 vii) 핵에서 생물학적 기능을 허용하는 DNA의 낮은 방출(Zabner J. 등, 1995). 여러 간행물은 유사분열 후 세포를 형질감염시키는 이전 비바이러스 벡터의 무능 또는 낮은 효율을 문서화하였다(Wilke M. 등, 1996). 특정 이전 비바이러스 벡터는 발현의 수명이 부족하고/하거나 충분히 치료적이지 않고 효율적인 방식으로 특이적 세포 유형에 표적화될 수 없는 적은 양의 단백질을 생성한다.

따라서, 비바이러스 벡터 분야의 최첨단 연구에도 불구하고, 많은 이전 비바이러스 벡터는 임상 용도에 최적이 아니다. 그 중에서도, 임상 유용성에 기여하는 본원에 개시된 적어도 특정 구현예의 특정 특징은 다음을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다:

크기 및 분자량: DNA 분자를 운반하는 많은 이전 비바이러스 벡터는 크기가 10-200nm 직경이다(Konstan M.W. 등, 2004). 이의 분자량은 300 kDa 초과 또는 500kDa 초과일 수 있다. 본 개시내용은 그 중에서도, 직경이 20nm 미만이고 분자량이 500kDa 미만인 비바이러스 단백질성 비히클, 및/또는 로딩된 미니 뉴클레오솜을 제공한다. 특정 구현예에서, 전형적인 핵 기공은 20nm 미만 크기를 통과시킬 수 있도록 직경이 단지 20nm이기 때문에, 본원에 개시된 비바이러스 단백질성 비히클, 및/또는 로딩된 미니 뉴클레오솜은 아마도 수동 확산에 의해 적어도 부분적으로 더 효율적으로 핵 내로 통과할 수 있다.

체액 내 안정성: 많은 이전 비바이러스 벡터는 혈액 또는 CSF와 같은 체액에서 분해된 후 표적 세포로 전달될 수 있다(Barua and Mitragotri, 2014). 본 개시내용은 그 중에서도, 생리학적으로 안정되고/되거나 표적 세포로 진입할 때까지 및 진입한 후 혈액 및/또는 다른 체액에서 안정되게 하는 특성을 갖는 비바이러스 단백질성 비히클, 및/또는 로딩된 미니 뉴클레오솜을 제공한다. 이들 입자에 대한 적어도 하나의 목표는 원하는 세포의 핵에 안전하게 도달하는 것이다.

핵에서 입자의 방출: 많은 이전 비바이러스 벡터는 대부분이 표적 세포에 들어가기 전에 회합된 핵산을 방출하고, 나머지는 세포질에서 회합된 핵산을 방출하기 때문에 수명이 매우 짧으며, 여기서 전달된 DNA는 DNA를 파괴하는 뉴클레아제와 직면한다(Zabner, J. 등, 1995). 세포 핵으로 들어가고 발현 수준을 제공하는 특정 이전 벡터는 발현하는 경우에도 매우 적다. 본 개시내용은 또한 그 중에서도, 회합된 핵산을 한번에 방출하는 대신 느린 속도로 방출하는 것이 유익할 수 있으며, 이는 발현이 오래 지속되게 할 수 있다는 것으로 인식한다.

세포 유형 특이성: 이전 비바이러스 벡터는 특이적 세포 유형을 표적화하지 않아서 감소된 수준의 형질도입 및 따라서 감소된 발현과 관련된다. 본 개시내용은 그 중에서도, 세포 유형 특이성에 대해 최적화된 비바이러스 벡터를 제공한다. 세포 유형 특이성을 조작하는 특정 수단이 예를 들어, Templeton and Senzer, 2011에 기재되어 있다.

종합해 보면, 원하는 지속기간 동안 효과적인 발현 수준을 제공하고, 비면역원성 및 무독성이고, 덜 제한된 적하 능력을 갖는 핵산 전달 기술에 대한 엄청난 필요성이 있다. 더욱이, 헌팅턴(Huntington), 스타르가르트(Stargardt), 뒤시엔느(Duchenne) 근이영양증, 낭포성 섬유증, 및 유전자 요법에 의해 치료가능한 다른 병태의 수백만 명의 환자에 대한 필요성은 이들 환자를 치료하는 데 도움이 될 수 있는 기술에 대한 필요성을 분명히 제시한다.

본 개시내용은 핵산의 전달을 위한 안전하고 효과적인 비바이러스성 단백질성 비히클("미니 뉴클레오솜 코어 단백질"), 및 로딩된 미니 뉴클레오솜을 제공한다. 본 개시내용은 적어도 일부 경우에 본 개시내용의 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 증가된 생체이용률; 증가된 반감기; 증가된 안정성; 감소된 저하; 예를 들어, 표적 세포에 대한 증가된 결합 친화도; 예를 들어, 표적 세포에 의한 증가된 흡수; 개선된 혈뇌 장벽 침투; 예를 들어, 표적 세포 또는 조직에서 감소된 축적; 감소된 응집; 감소된 침전; 감소된 열변성; 및/또는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 감소된 동역학적 변성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 유리한 특성을 갖는다는 것을 추가로 인식한다.

다양한 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 하나 이상의 핵산과 회합된다. 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 핵산과 회합된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 "로딩된 미니 뉴클레오솜"으로 지칭될 수 있다.

다양한 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 하나 이상의 특이적 세포 유형에서 또는 하나 이상의 특이적 세포 유형에 유전자와 같은 핵산의 전달 및/또는 표적화된 발현을 위해 로딩된 미니 뉴클레오솜을 하나 이상의 특이적 세포 유형에 표적화하는 핵산 방출 도메인을 포함한다.

다양한 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 조성물(예를 들어, 하나 이상의 로딩된 미니 뉴클레오솜을 포함하는 조성물)은 필요에 따라 1 회 또는 반복적으로 적정 및/또는 투여될 수 있다. 또한, 다양한 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 또는 미니 뉴클레오솜 조성물(예를 들어, 하나 이상의 로딩된 미니 뉴클레오솜을 포함하는 조성물)은 비면역원성 및 무독성이다.

본원에 개시된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 특정 구현예에서 거대분자 흡수, 세포 내로 바이러스 진입, 진핵 세포에서 뉴클레오솜 형성, 세포의 특정 위치에서 특정 단백질의 절단 등에 적용가능한 원리를 활용할 수 있다.

본원에 제공된 조성물 및 방법의 다양한 구현예는 향상된 안정성, 특이적 세포 유형에 대한 표적화, 및 느린 핵산 방출에 의한 향상된 발현의 오랜 지속성 중 하나 이상을 용이하게 하는 도메인을 포함한다.

다양한 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 및/또는 미니 뉴클레오솜은 체액에서 안정되고/되거나 핵에서 또는 핵으로의 방출을 허용하고/하거나 표적으로 하는 도메인을 포함한다. 적어도 제1 측면에서, 본 개시내용은 핵산 결합 도메인 및 핵산 방출 도메인을 포함하는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 상기 조작된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산은 변형된 아미노산이고, 선택적으로 상기 변형은 (i) 인산화; (ii) 황산화; (iii) 글리코실화; (iv) 프레닐화; (v) 메틸화; (vi) 시알화; (vii) 지질화 및/또는 리포일화; (viii) 아세틸화; (ix)수산화; (x) 팔미토일화; (xi) 만노실화; (xii) 미리스토일화; (xiii) 푸코실화; (xiv) 페길화; 및/또는 (xv) 이의 임의의 조합 중 적어도 하나를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 조작된 폴리펩티드는 표적화 도메인을 포함한다.

적어도 추가 측면에서, 본 개시내용은 핵산 결합 도메인 및 표적화 도메인을 포함하는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 상기 조작된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산은 변형된 아미노산이고, 선택적으로 상기 변형은: (i) 인산화; (ii) 황산화; (iii) 글리코실화; (iv) 프레닐화; (v) 메틸화; (vi) 시알화; (vii) 지질화 및/또는 리포일화; (viii) 아세틸화; (ix) 수산화; (x) 팔미토일화; (xi) 만노실화; (xii) 미리스토일화; (xiii) 푸코실화; (xiv) 페길화; 및/또는 (xv) 이의 임의의 조합 중 적어도 하나를 포함하고; 여기서 상기 조작된 폴리펩티드는 선택적으로 핵산 방출 도메인을 추가로 포함한다.

본 개시내용의 다양한 측면의 적어도 특정 구현예에서, 조작된 폴리펩티드의 2개 이상의 아미노산 각각은 변형된 아미노산이다. 일부 구현예에서, 변형된 아미노산 중 적어도 하나는 (i) 인산화; (ii) 황산화; (iii) 글리코실화; (iv) 프레닐화; (v) 메틸화; (vi) 시알화; (vii) 지질화 및/또는 리포일화; (viii) 아세틸화; (ix) 수산화; (x) 팔미토일화; (xi) 만노실화; (xii) 미리스토일화; (xiii) 푸코실화; (xiv) 페길화; 및 (xv) 이의 임의의 조합으로부터 선택된 두개 이상의 변형을 포함하는 변형된 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 조작된 폴리펩티드의 안정성, 반감기 및/또는 생체이용률을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 변형은 결합 파트너와의 조작된 폴리펩티드의 친화도 및/또는 결합력을 증가시키고, 선택적으로 상기 결합 파트너는 수용체, 세포 또는 세포막이다. 일부 구현예에서, 상기 변형은 조작된 폴리펩티드와 핵산의 친화도 또는 결합력을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 상기 변형은 조작된 폴리펩티드의 침전 및/또는 응집을 감소시킨다.

본 개시내용의 다양한 측면의 적어도 특정 구현예에서, 핵산 결합 도메인은 히스톤 폴리펩티드 서열로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 핵산 결합 도메인이 아미노산 서열 KRHRK이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산 결합 도메인이 KRHRK, RRRRR, RRLARR, KKAKAAAKPKK, KKDGKKRKR, KKKLK, KKRIRK, RKKSK, KKPKK, 또는 이의 조합을 포함하는 아미노산 서열이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산 결합 도메인이 핵산 결합 도메인이 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함한다는 점에서 변형된 핵산 결합 도메인이다.

본 개시내용의 다양한 측면의 적어도 특정 구현예에서, 표적화 도메인은 서열번호: 397-422 중 임의의 어느 하나의 서열을 갖는 표적화 도메인이고, 여기서 상기 표적화 도메인은 인산화된다. 본 개시내용의 다양한 측면의 적어도 특정 구현예에서, 표적화 도메인은 서열번호: 423-428 중 임의의 어느 하나의 서열을 갖는 표적화 도메인이고, 여기서 상기 표적화 도메인은 황산화된다. 본 개시내용의 다양한 측면의 적어도 특정 구현예에서, 표적화 도메인은 서열번호: 429-434 중 임의의 어느 하나의 서열을 갖는 표적화 도메인이고, 여기서 상기 표적화 도메인은 글리코실화된다.

본 개시내용의 다양한 측면의 적어도 특정 구현예에서, 표적화 도메인은 서열번호: 435-440 중 임의의 어느 하나의 서열을 갖는 표적화 도메인이며, 여기서 상기 표적화 도메인은 프레닐화된다. 본 개시내용의 다양한 측면의 적어도 특정 구현예에서, 표적화 도메인은 서열번호: 441-446 중 임의의 어느 하나의 서열을 갖는 표적화 도메인이고, 여기서 상기 표적화 도메인은 메틸화된다. 본 개시내용의 다양한 측면의 적어도 특정 구현예에서, 표적화 도메인은 서열번호: 447-459 중 임의의 어느 하나의 서열을 갖는 표적화 도메인이고, 여기서 상기 표적화 도메인은 시알화된다. 본 개시내용의 다양한 측면의 적어도 특정 구현예에서, 표적화 도메인은 세포 부착 표적화 도메인, 베타 갈락토스 결합 도메인, 푸코스 결합 도메인, 헤파린 결합 도메인, 시알산 결합 도메인, 당단백질 결합 도메인, 탄수화물 결합 도메인, 리소포스파티딘산 결합 도메인, cAMP 결합 도메인, 히알루로난 결합 도메인, 콘드로이틴 술페이트 결합 도메인, 인테그린 결합 도메인, 뉴클레올린 결합 도메인, 콜라겐 결합 도메인, 클라트린 결합 도메인, Fc 수용체 결합 도메인, 액틴 결합 도메인, 세포내이입 모티프, 핵 국소화 신호, 또는 이의 조합이다.

본 개시내용의 다양한 측면의 적어도 특정 구현예에서, 표적화 도메인은 세포 부착 표적화 도메인이다. 일부 구현예에서, 상기 세포 부착 표적화 도메인은 WGREERQ, NTQIH, WNNKTPH, TPH, VNRWS, XBBBXXBX, ARKKAAKA, QRR, SRR, WEPSRPFPVD, HRRTRKAPKRIRLPHIR, KRTGQYKLGSKTGPGQK, KKTK, KLRSQLVKK, RRRCGQKKK, BX(7)B, RIQNLLKITNLRIKFVK, KKEKDIMKKTI, KGE, RGD, RGDS, TTVVNPKYEGK, ERMSQIKRLLS, WRHRARS, GFOGER, LFDLM, WGREERQ, QSTEKRG, LPNTG, 또는 이의 조합을 포함하는 아미노산 서열이거나 이를 포함한다.

본 개시내용의 다양한 측면의 적어도 특정 구현예에서, 표적화 도메인은 내재화 도메인이다. 일부 구현예에서, 상기 내재화 도메인은 FXDXF, PPSY, FEDNFVP, YIRV, YADW, YTQV, KKRPKP, SSDDE, RRASS, (YXXL)2, LPLTG, LAFTG 또는 이의 조합을 포함하는 아미노산 서열이거나 이를 포함한다.

본 개시내용의 다양한 측면의 적어도 특정 구현예에서, 표적화 도메인은 세포-유형 특이적 표적화 도메인이다. 일부 구현예에서, 상기 세포-유형 특이적 표적화 ASSLNIA, KKEEEKKEEEKKEEE, LIFHKEQ, KFNKPFVFLI, QPEHSST, EYHHYNK, NGR, GEKGEP, KTKKK, KALKKK, KGKKK, CSVTCG, LRE, YKYNLNGRES, YRSL, KGGK₇, KKKQYTSIHHG, KDEL, LADQDYTKTA, 또는 이의 조합를 포함하는 아미노산 서열이거나 이를 포함한다.

본 개시내용의 다양한 측면의 적어도 특정 구현예에서, 표적화 도메인은 상기 표적화 도메인이 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함하는 변형된 표적화 도메인이다. 일부 구현예에서, 상기 핵산 방출 도메인은 GRKKRRQRRRPQ, KRH, KSVKKRSVSEIQ, NRRKKRAL, KFERQ, VRGP, NKDS, NRDN, ANNR, 또는 이의 조합을 포함하는 아미노산 서열이거나 이를 포함한다.

본 개시내용의 다양한 측면의 적어도 특정 구현예에서, 핵산 방출 도메인은 핵산 방출 도메인이 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함한다는 점에서 변형된 핵산 방출 도메인이다.

본 개시내용의 다양한 측면의 적어도 특정 구현예에서, 조작된 폴리펩티드는 폴리-아르기닌 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리-아르기닌 도메인은 상기 폴리-아르기닌 도메인이 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함한다는 점에서 변형된 폴리-아르기닌 도메인이다.

본 개시내용의 다양한 측면의 적어도 특정 구현예에서, 조작된 폴리펩티드는 핵 내재화 신호 또는 핵 유입 기구 결합 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 핵 내재화 신호 또는 핵 유입 기구 결합 도메인은 KKKYKLK, KKRKLE, TRSK, HRKRKR, NKRKRK, AEKSKKK, RKSK, KRVK, KRK, LQQTPLHLAVI, RRPR, PRPR, RPPP, RKKRKGK, PAAKRVKLD, KLKIKRPVK, PKKKRKV, QRKRQK, DSPE, FQVT, QSTEKRG, RQGLID, 환형 RKKH, 또는 이의 조합을 포함하는 아미노산 서열이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵 내재화 신호 또는 핵 유입 기구 결합 도메인은 핵 내재화 신호 또는 핵 유입 기구 결합 도메인이 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함하는 변형된 핵 내재화 신호 또는 핵 유입 기구 결합 도메인이다.

본 개시내용의 다양한 측면의 적어도 특정 구현예에서, 조작된 폴리펩티드는 안정성 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 안정성 도메인은 YTRF, GDAY, LLEE, RKKRRQRRR, YKSL, YENF, FQDL, YIGSR, IKVAV, 또는 이의 조합을 포함하는 아미노산 서열이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 안정성 도메인은 상기 안정성 도메인이 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함하는 변형된 안정성 도메인이다.

본 개시내용의 다양한 측면의 적어도 특정 구현예에서, 조작된 폴리펩티드는 올리고머화 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머화 도메인은 표 11의 올리고머화 도메인으로부터 선택되며, 선택적으로 상기 올리고머화 도메인은 조작된 폴리펩티드의 C-말단에 위치한다. 일부 구현예에서, 올리고머화 도메인은 상기 올리고머화 도메인이 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함하는 변형된 올리고머화 도메인이다.

본 개시내용의 다양한 측면의 적어도 특정 구현예에서, 조작된 폴리펩티드는 링커를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 서열번호: 154-250 중 어느 하나에 따른 링커이다. 일부 구현예에서, 링커는 링커가 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함하는 변형된 링커이다.

일부 구현예에서, 조작된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산은 인산화된 아미노산이다. 일부 구현예에서, 상기 인산화된 아미노산은 세린, 트레오닌 또는 티로신 아미노산이다. 일부 구현예에서, 상기 인산화된 아미노산은 링커 도메인 또는 표적화 도메인에 존재한다.

일부 구현예에서, 조작된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산은 황산화 아미노산이다. 일부 구현예에서, 상기 황산화 아미노산은 세린, 트레오닌 또는 티로신 아미노산이다. 일부 구현예에서, 황산화 아미노산은 링커 도메인 또는 표적화 도메인에 존재한다.

일부 구현예에서, 조작된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산은 아세틸화된 아미노산이다. 일부 구현예에서, 상기 아세틸화 아미노산은 리신 아미노산이다. 일부 구현예에서, 상기 아세틸화된 아미노산은 링커 도메인 또는 표적화 도메인에 존재한다.

일부 구현예에서, 조작된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산은 만노실화된 아미노산이다. 일부 구현예에서, 상기 만노실화된 아미노산은 세린 아미노산이다. 일부 구현예에서, 상기 만노실화된 아미노산은 링커 도메인 또는 표적화 도메인에 존재한다.

적어도 하나의 추가 측면에서, 본 개시내용은 예컨대, DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드와 같은 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 적어도 하나의 추가 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 적어도 하나의 추가 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드 또는 본 개시내용의 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.

적어도 하나의 추가 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드를 세포에서 발현시키는 것을 포함하는, 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 조작된 폴리펩티드를 세포로부터 단리하는 것을 추가로 포함한다.

적어도 하나의 추가 측면에서, 본 개시내용은 (i) 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 및 (ii) 본 개시내용의 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드가 DNA 또는 RNA이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드가 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드가 mRNA이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드가 억제 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 억제 RNA가 gRNA, siRNA, miRNA, 또는 shRNA이다. 일부 구현예에서, 조성물은 본 개시내용의 적어도 2개의 조작된 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 본 개시내용의 첫번째 조작된 폴리펩티드는 본 개시내용의 두번째 조작된 폴리펩티드와 올리고머화할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 대 상기 조작된 폴리펩티드의 비는 1:1 내지 1:2,000이다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 대 상기 조작된 폴리펩티드의 비가 1:1 내지 1:1,000, 1:1 내지 1:500, 1:1 내지 1:200, 1:1 내지 1:100, 1:1 내지 1:50, 1:3 내지 1:1,000, 1:3 내지 1:500, 1:3 내지 1:200, 1:3 내지 1:100, 또는 1:3 내지 1:50이다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 대 상기 조작된 폴리펩티드의 비가 1:200 내지 1:2,000, 1:200 내지 1:1000, 또는 1:200 내지 1:500이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약제학적 담체를 포함한다.

적어도 하나의 추가 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 조성물을 시스템에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 시스템은 세포, 조직, 또는 대상체이다. 일부 구현예에서, 투여 후, 변형이 시스템에서 조성물의 안정성, 반감기 및/또는 생체이용률을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 투여 후, 변형은 시스템에서 결합 파트너와의 조성물의 친화도 또는 결합활성을 증가시키고, 선택적으로 상기 결합 파트너가 수용체, 세포 또는 세포막이다. 일부 구현예에서, 투여 후, 변형이 시스템에서 조성물의 침전 및/또는 응집을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 투여 후, 변형은 조성물이 시스템의 하나 이상의 세포에 들어가는 속도를 증가시킨다. 일부 구현예에서, 투여 후, 변형이 시스템의 하나 이상의 세포로의 조성물의 전달을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 투여 후, 변형이 시스템의 하나 이상의 세포로의 조성물의 핵산 전달을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 상기 시스템은 포유동물 대상체이고, 투여 후, 상기 변형이 간에서 조성물의 축적을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 시스템이 포유동물 대상체이고, 투여 후, 상기 변형이 혈뇌 장벽을 가로지르는 조성물의 양을 증가시킨다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 및 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 포함하는 본 개시내용의 조성물을 세포, 조직, 또는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 조작된 폴리펩티드는 인산화된 아미노산이다. 일부 구현예에서, 상기 인산화된 아미노산은 세린, 트레오닌 또는 티로신 아미노산이다. 일부 구현예에서, 상기 인산화된 아미노산은 링커 도메인 또는 표적화 도메인에 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 중추신경계(CNS)의 세포에 전달된다.

일부 구현예에서, 조성물은 CNS 뉴런에 전달된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물이 CNS 성상교세포, 미세아교세포, 희소돌기아교세포 또는 신경교에 전달된다. 일부 구현예에서, 조성물이 척수 세포에 전달되고, 선택적으로 척수 세포가 척수 뉴런 또는 척수 신경교 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드가 조성물이 전달되는 세포에서 발현되는 발현 생성물을 암호화한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 포유동물 대상체이고 투여가 척추강내, 두개내 또는 대수조내이다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 및 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 포함하는 본 개시내용의 조성물을 세포, 조직, 또는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 조작된 폴리펩티드는 황산화 아미노산이다. 일부 구현예에서, 상기 황산화 아미노산은 세린, 트레오닌 또는 티로신 아미노산이다. 일부 구현예에서, 상기 황산화 아미노산은 링커 도메인 또는 표적화 도메인에 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 중추 신경계(CNS)의 세포로 전달된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 CNS 뉴런에 전달된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 CNS 성상교세포, 미세아교세포, 희소돌기아교세포 또는 신경교에 전달된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 척수 세포에 전달되고, 선택적으로 상기 척수 세포는 척수 뉴런 또는 척수 신경교 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 조성물이 전달되는 세포에서 발현되는 발현 생성물을 암호화한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 포유동물 대상체이고 투여는 척추강내, 두개내 또는 대수조내이다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 및 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 포함하는 본 개시내용의 조성물을 세포, 조직 또는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 조작된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산은 아세틸화된 아미노산이다. 일부 구현예에서, 상기 아세틸화 아미노산은 리신 아미노산이다. 일부 구현예에서, 상기 아세틸화 아미노산은 링커 도메인 또는 표적화 도메인에 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물이 CNS 뉴런에 전달된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물이 망막 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, 조성물이 망막 뉴런에 전달되고, 선택적으로 망막 뉴런은 광수용체, 양극성 세포, 망막 신경절 세포, 수평 세포, 및 무축삭 세포 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물이 광수용체 세포에 전달되고, 선택적으로 광수용체 세포가 간상체 및 원추체 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드가 조성물이 전달되는 세포에서 발현되는 발현 생성물을 암호화한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체가 포유동물 대상체이고 투여는 유리체내, 맥락막상 또는 망막하이다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 및 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 포함하는 본 개시내용의 조성물을 세포, 조직 또는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 조작된 폴리펩티드는 만노실화된 아미노산이다. 일부 구현예에서, 상기 만노실화된 아미노산이 세린 아미노산이다. 일부 구현예에서, 상기 만노실화된 아미노산은 링커 도메인 또는 표적화 도메인에 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물이 CNS 뉴런에 전달된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물이 망막 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물이 망막 뉴런에 전달되고, 선택적으로 망막 뉴런이 광수용체, 양극성 세포, 망막 신경절 세포, 수평 세포, 및 무축삭 세포 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 간상체 및 원추체 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 광수용체 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드가 조성물이 전달되는 세포에서 발현되는 발현 생성물을 암호화한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체가 포유동물 대상체이고 투여가 유리체내, 맥락막상 또는 망막하이다.

적어도 하나의 추가 측면에서, 본 개시내용은 폴리뉴클레오티드를 본 개시내용의 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 축합시키는 방법을 제공한다.

적어도 하나의 추가 측면에서, 본 개시내용은 폴리뉴클레오티드를 본 개시내용의 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 폴리뉴클레오티드의 전하를 중화시키는 방법을 제공한다.

하나 이상의 추가 측면에서, 본 개시내용은 조작된 폴리펩티드 및 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 조작된 폴리펩티드는 핵산 결합 도메인, 표적화 도메인, 및 핵산 방출 도메인을 포함하고, 여기서 상기 조작된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산은 변형된 아미노산이며, 선택적으로 상기 변형은 (i) 인산화; (ii) 황산화; (iii) 글리코실화; (iv) 프레닐화; (v) 메틸화; (vi) 시알화; (vii) 지질화 및/또는 리포일화; (viii) 아세틸화; (ix) 수산화; (x) 팔미토일화; (xi) 만노실화; (xii) 미리스토일화; (xiii) 푸코실화; (xiv) 페길화; 및/또는 (xv) 이의 임의의 조합 중 적어도 하나를 포함하고; 선택적으로 조성물은 대상체 또는 시스템에 핵산을 전달하는 데 사용하기 위한 것이다.

하나 이상의 추가 측면에서, 본 개시내용은 조작된 폴리펩티드 및 적어도 하나의 핵산을 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 조작된 폴리펩티드는 핵산 결합 도메인 및 표적화 도메인을 포함하고, 여기서 상기 조작된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산은 변형된 아미노산이며, 선택적으로 상기 변형은 (i) 인산화; (ii) 황산화; (iii) 글리코실화; (iv) 프레닐화; (v) 메틸화; (vi) 시알화; (vii) 지질화 및/또는 리포일화; (viii) 아세틸화; (ix) 수산화; (x) 팔미토일화; (xi) 만노실화; (xii) 미리스토일화; (xiii) 푸코실화; (xiv) 페길화; 및/또는 (xv) 이의 임의의 조합 중 적어도 하나를 포함하고; 선택적으로 상기 조성물은 대상체 또는 시스템에 핵산을 전달하는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 폴리펩티드는 표적화 도메인을 포함한다.

적어도 하나의 측면에서, 본 개시내용은 핵산 결합 도메인 및 표적화 도메인을 포함하는 조작된 폴리펩티드를 제공하며, 조작된 폴리펩티드는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질일 수 있다. 로딩된 미니 뉴클레오솜은 본원에 기재된 바와 같은 조작된 폴리펩티드(예를 들어, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질) 및 본원에 제공되거나 또는 달리 당업계에 알려진 바와 같은 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 비바이러스 벡터일 수 있거나 또는 이를 제공한다.

일부 구현예에서, 조작된 폴리펩티드(예를 들어, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질)은 히스톤 폴리펩티드 서열로부터 유래된 핵산 결합 도메인이고/이거나 아미노산 서열 KRHRK이거나 또는 이를 포함하는 핵산 결합 도메인이거나 또는 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드는 KRHRK, RRRRR, RRLARR, KKAKAAAKPKK, KKDGKKRKR, KKKLK, KKRIRK, RKKSK, KKPKK, 또는 이의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 아미노산 서열이거나 또는 이를 포함하는 핵산 결합 도메인을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드는 임의의 히스톤 단백질 서열 또는 표 3에 기재된 것들 또는 본원에 기재된 서열의 조합으로부터 유래된 핵산 결합 도메인을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이들 핵산 결합 도메인은 다양한 인간 단백질 또는 다른 유기체로부터 유래될 수 있다. 당업자는 아미노산 서열을 변경하여 "NABD"를 변형시키거나 또는 조작하는 것을 고려할 수 있다. 당업자는 또한 "NABD"를 역 서열에 배치하거나 또는 도메인 내의 아미노산 위치를 전환하거나 또는 아미노산에 번역후 변형을 부가함으로써 고려될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드는 세포 부착 표적화 도메인, 베타 갈락토스 결합 도메인, 푸코스 결합 도메인, 헤파린 결합 도메인, 시알산 결합 도메인, 당단백질 결합 도메인, 탄수화물 결합 도메인, 리소포스파티드산 결합 도메인, cAMP 결합 도메인, 히알루로난 결합 도메인, 콘드로이틴 술페이트 결합 도메인, 인테그린 결합 도메인, 뉴클레올린 결합 도메인, 콜라겐 결합 도메인, 클라트린 결합 도메인, Fc 수용체 결합 도메인, 액틴 결합 도메인, 세포내이입 모티프, 핵 국소화 신호, 또는 이의 조합인 표적화 도메인을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 도메인의 일부 예는 표 5에 기재되어 있으나 이에 제한되지 않는다. 이들 도메인은 임의의 인간 단백질 또는 다른 유기체로부터 유래될 수 있다. 당업자는 아미노산 서열을 변경하여 표적화 도메인을 변형시키거나 또는 조작하는 것을 고려할 수 있다. 당업자는 또한 표적화 도메인을 역 서열에 배치하거나 또는 도메인 내의 아미노산 위치를 전환하거나 또는 아미노산에 번역후 변형을 부가하는 것을 고려할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드는 내재화 도메인인 표적화 도메인을 포함하며 여기서 내재화 도메인은 FXDXF, PPSY, FEDNFVP, YIRV, YADW, YTQV, KKRPKP, SSDDE, RRASS, (YXXL)2, LPLTG, LAFTG, 또는 이의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 아미노산 서열이거나 또는 이를 포함한다. 이들 도메인은 인간 단백질 또는 다른 유기체로부터 유래될 수 있다. 당업자는 아미노산 서열을 변경하여 내재화 도메인을 변형시키거나 또는 조작하는 것을 고려할 수 있다. 당업자는 또한 내재화 도메인을 역 서열에 배치하거나 또는 도메인 내의 아미노산 위치를 전환하거나 또는 아미노산에 번역후 변형을 부가하는 것을 고려할 수 있다.

당업자는 본 명세서 전반에 걸쳐 단백질 서열에서 사용되는 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한 "X"가 임의의 아미노산을 지칭할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 달리 명시되지 않는 한, "X"는 단일 아미노산에 대한 자리 표시자이며, 위치는 당업자에게 알려진 임의의 단일 아미노산에 의해 채워질 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드는 WGREERQ, NTQIH, WNNKTPH, TPH, VNRWS, XBBBXXBX, ARKKAAKA, QRR, SRR, WEPSRPFPVD, HRRTRKAPKRIRLPHIR, KRTGQYKLGSKTGPGQK, KKTK, KLRSQLVKK, RRRCGQKKK, BX(7)B, RIQNLLKITNLRIKFVK, KKEKDIMKKTI, KGE, RGD, RGDS, TTVVNPKYEGK, ERMSQIKRLLS, WRHRARS, GFOGER, LFDLM, WGREERQ, QSTEKRG, LPNTG, 및 이의 조합으로부터 선택지만 이에 제한되지 않는 아미노산 서열이거나 또는 이를 포함하는 세포 부착 표적화 도메인을 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드는 내재화 도메인 세포 유형 특이적 표적화 도메인인 표적화 도메인을 포함하며 여기서 세포 유형 특이적 표적화 도메인은 ASSLNIA, KKEEEKKEEEKKEEE, LIFHKEQ, KFNKPFVFLI, QPEHSST, EYHHYNK, NGR, GEKGEP, KTKKK, KALKKK, KGKKK, CSVTCG, LRE, YKYNLNGRES, YRSL, KGGK₇, KKKQYTSIHHG, KDEL, LADQDYTKTA, 또는 이의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 아미노산 서열이거나 또는 이를 포함한다. 이들 도메인은 인간 단백질 또는 다른 유기체로부터 유래될 수 있다. 당업자는 아미노산 서열을 변경하여 표적화 도메인을 변형시키거나 또는 조작하는 것을 고려할 수 있다. 당업자는 또한 표적화 도메인을 역 서열에 배치하거나 도메인 내의 아미노산 위치를 전환하거나 또는 아미노산에 번역후 변형을 부가하는 것을 고려할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드는 폴리펩티드 서열 전체에 걸쳐 다양한 길이의 폴리-아르기닌 도메인 또는 다중 폴리-아르기닌 도메인을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드는 핵 내재화 신호 또는 핵 유입 기구 결합 도메인을 포함한다. 조작된 폴리펩티드, 핵 내재화 신호 또는 핵 유입 기구 결합 도메인은 KKKYKLK, KKRKLE, TRSK, HRKRKR, NKRKRK, AEKSKKK, RKSK, KRVK, KRK, LQQTPLHLAVI, RRPR, PRPR, RPPP, RKKRKGK, PAAKRVKLD, KLKIKRPVK, PKKKRKV, QRKRQK, DSPE, FQVT, QSTEKRG, RQGLID, 환형 RKKH, 또는 이의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 아미노산 서열일 수 있거나 또는 이를 포함한다. 이들 도메인은 인간 단백질 또는 다른 유기체로부터 유래될 수 있다. 당업자는 아미노산 서열을 변경하여 핵 내재화 신호를 변형시키거나 또는 조작하는 것을 고려할 수 있다. 당업자는 또한 핵 내재화 신호를 역 서열에 배치하거나 또는 도메인 내의 아미노산 위치를 전환하거나 또는 아미노산에 번역후 변형을 부가하는 것을 고려할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드는 핵산 방출 도메인을 포함한다. 핵산 방출 도메인은 GRKKRRQRRRPQ, KRH, KSVKKRSVSEIQ, NRRKKRAL, KFERQ, VRGP, NKDS, NRDN, ANNR, 또는 이의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 아미노산 서열이거나 또는 이를 포함한다. 이들 도메인은 인간 또는 다른 유기체에서 발견되는 펩티다제, 효소 또는 다른 단백질의 기질인 다양한 단백질로부터 유래될 수 있다. 일부 핵산 방출 도메인은 또한 다양한 단백질의 자가용해 부위로부터 유래될 수 있다. 당업자는 아미노산 서열을 변경하여 핵산 방출 도메인을 변형시키거나 또는 조작하는 것을 고려할 수 있다. 당업자는 또한 핵산 방출 신호를 역 서열에 배치하거나 또는 도메인 내의 아미노산 위치를 전환하거나 또는 아미노산에 번역후 변형을 부가하는 것을 고려할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드는 안정성 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드는 YTRF, GDAY, LLEE, RKKRRQRRR, YKSL, YENF, FQDL, YIGSR, IKVAV, 또는 이의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 아미노산 서열이거나 또는 이를 포함하는 안정성 도메인을 포함할 수 있다. 이들 도메인은 인간 단백질 또는 다른 유기체로부터 유래될 수 있다. 당업자는 아미노산 서열을 변경하여 안정성 도메인을 변형시키거나 또는 조작하는 것을 고려할 수 있다. 당업자는 또한 안정성 도메인을 역 서열에 배치하거나 또는 도메인 내의 아미노산 위치를 전환하거나 또는 아미노산에 번역후 변형을 부가하는 것을 고려할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드는 올리고머화 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드는 표 11의 올리고머화 도메인으로부터 선택된 올리고머화 도메인을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 올리고머화 도메인의 위치는 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드의 C-말단 또는 임의의 다른 위치에 위치한다. 이들 도메인은 인간 단백질 또는 다른 유기체로부터 유래될 수 있다. 당업자는 아미노산 서열을 변경하여 올리고머화 도메인을 변형시키거나 또는 조작하는 것을 고려할 수 있다. 당업자는 또한 올리고머화 도메인을 역 서열에 배치하거나 또는 도메인 내의 아미노산 위치를 전환하거나 또는 아미노산에 번역후 변형을 부가하는 것을 고려할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드는 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드는 표 12의 예시적인 도메인으로부터 선택되지만 이에 제한되지 않는 링커를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드에서 링커의 위치는 다른 도메인 및 임의의 다른 위치 사이에 있을 수 있다. 이들 링커는 인간 단백질 또는 다른 유기체로부터 유래될 수 있다. 당업자는 아미노산 서열을 변경하여 링커 도메인을 변형시키거나 또는 조작하는 것을 포함할 수 있다. 당업자는 또한 링커 도메인을 역 서열에 배치하거나 또는 도메인 내의 아미노산 위치를 전환하거나 또는 아미노산에 번역후 변형을 부가하는 것을 고려할 수 있다.

다양한 구현예에서, 본 개시내용의 2 개 이상의 조작된 폴리펩티드는 올리고머화될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드와 함께 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드(예를 들어, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질)를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 억제 RNA이거나 또는 이를 포함하며, 여기서 억제 RNA는 gRNA, siRNA, miRNA, 또는 shRNA이다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드(들) 및 폴리뉴클레오티드(들)는 회합되지 않지만 조성물, 예를 들어, 키트 또는 용액에 함께 존재한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드(들) 및 폴리뉴클레오티드(들)는 회합되어, 예를 들어 축합되어, 예를 들어 로딩된 미니 뉴클레오솜을 형성한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 대 조작된 폴리펩티드의 비는 1:1 내지 1: 2,000 또는 1:3 내지 1:2,000이다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 대 조작된 폴리펩티드는 1:1 내지 1:2,000이다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 대 조작된 폴리펩티드는 1:1 내지 1:1,000, 1:1 내지 1:500, 1:1 내지 1:200, 1:1 내지 1:100, 1:1 내지 1:50이다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 대 조작된 폴리펩티드 비는 1:3 내지 1: 1,000, 1:3 내지 1:500, 1:3 내지 1:200, 1:3 내지 1: 100, 또는 1:3 내지 1:50이다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 대 조작된 폴리펩티드의 비는 1:200 내지 1:2,000, 1:200 내지 1:1000, 또는 1:200 내지 1:500이다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 대 조작된 폴리펩티드는 1:1 내지 1:50, 1:1 내지 1:40, 1:1 내지 1:30, 1:1 내지 1:20, 1:1 내지 1:10, 1:1 내자 1:5, 1:1 내지 1:4, 1:1 내지 1:3, 또는 1:1 내지 1:2이다. 당업자는 또한 DNA 또는 RNA 분자에 대한 화학적 변형을 고려할 수 있다.

일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 및/또는 로딩된 미니 뉴클레오솜)을 포함하는 본원에 제공된 조성물은 세포, 조직, 또는 대상체에 투여되거나 또는 이와 접촉될 수 있다. 적용 조건은 시험관내, 생체외 또는 생체내일 수 있다. 이러한 조작된 세포는 예를 들어, 인간 신체의 다양한 부분 예를 들어 임의의 제한 없이 뇌, 망막, 장, 췌장, 폐 등에 치료 물질(예를 들어, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 및/또는 로딩된 미니 뉴클레오솜을 포함하는 본원에 제공된 조성물)의 전달에 사용될 수 있거나, 또는 이와 호환가능하 약제학적 담체를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드를 축합하는 방법은 폴리뉴클레오티드를 본원에 기재된 바와 같은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 방법은 폴리뉴클레오티드를 본원에 기재된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 접촉시키는 것을 포함하여, 폴리뉴클레오티드의 전하를 중화하거나 또는 폴리뉴클레오티드를 나노 크기 입자로 축합하는 과정을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 분지형 펩티드 또는 환형 펩티드일 수 있으나 이들 특징으로 제한되지 않는다. 당업자는 다양한 세포 유형에 대한 향상된 향성을 수득하기 위해 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 특징을 변경하는 것을 고려할 수 있다.

본 개시내용은 본원에 제공된 바와 같은 조작된 폴리펩티드(예를 들어, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 조작된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 RNA 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용은 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 바와 같은 조작된 폴리펩티드(예를 들어, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하거나, 또는 이러한 폴리뉴클레오티드의 서열을 포함하는 세포를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드는 하나 이상의 이러한 세포로부터 단리될 수 있다.

다양한 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산은 서열번호: 336-388로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는다(예를 들어, 서열번호: 336-388로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성).

다양한 구현예에서, 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드(예를 들어, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질)의 하나 이상의 아미노산은 페길화, 아세틸화, 메틸화, 글리코실화, 인산화, 수모일화, 아미드화, 지질화, 프레닐화, 리포일화, 알킬화, 아실화, 당화, 니트로실화, 술페이트화, 카바밀화, 카보닐화, 네딜화, 비오티닐화 또는 리보실화된다.

정의

약: 용어 "약"은 값과 관련하여 본원에 사용될 때 참조된 값의 맥락에서 유사한 값을 지칭한다. 일반적으로, 맥락에 익숙한 당업자는 해당 맥락에서 "약"에 의해 포함된 관련 변화 정도를 인식할 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 용어 "약"은 참조된 값의 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 이하 내에서 값의 범위를 포함할 수 있다.

투여: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투여"는 전형적으로 조성물이거나, 또는 이에 포함된 제제의 전달을 달성하기 위해 대상체 또는 시스템에 조성물을 투여하는 것을 지칭한다. 당업자는 적절한 상황에서 대상체, 예를 들어 인간에게 투여하기 위해 활용될 수 있는 다양한 경로를 알고 있을 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 투여는 안구, 경구, 비경구, 국소 등일 수 있다. 일부 특정 구현예에서, 투여는 기관지(예를 들어, 기관지 주입에 의해), 협측, 진피(예를 들어, 진피, 피내, 피부사이, 경피 등에 하나 이상의 국소일 수 있거나 또는 이를 포함함), 장관, 동맥내, 피내, 위내, 척수내, 근육내, 비강내, 복강내, 척추강내, 정맥내, 심실내, 특이적 기관 내(예를 들어 간내), 점막, 비강, 경구, 직장, 피하, 설하, 국소, 기관(예를 들어, 기관내 주입에 의해), 질, 유리체 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 단일 용량만을 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 고정된 용량 수의 적용을 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 간헐적(예를 들어, 시간에 따라 분리된 복수의 용량)인 투약 및/또는 주기적(예를 들어, 공통 기간으로 분리된 개별 용량) 투약을 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 적어도 선택된 기간 동안 연속 투약(예를 들어, 관류)을 수반할 수 있다.

와 관련된: 2 개의 이벤트 또는 독립체는 해당 용어가 본원에 사용될 때 하나의 존재, 수준 및/또는 형태가 다른 것과 상관관계가 있는 경우 서로 "관련된"다. 예를 들어, 특정 독립체(예를 들어, 폴리펩티드, 유전자 서명, 대사물, 미생물 등)는 존재, 수준 및/또는 형태가 질환, 장애, 또는 병태(예를 들어, 관련 집단에 걸쳐)에 대한 발병률 및/또는 감수성과 상관관계가 있는 경우, 특정 질환, 장애, 또는 병태와 관련된 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 2 개 이상의 독립체는 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 경우 서로 물리적으로 "관련되"어, 서로 물리적으로 근접하게 있고/있거나 유지되도록 한다. 일부 구현예에서, 서로 물리적으로 관련된 2 개 이상의 독립체는 서로 공유적으로 연결되며; 일부 구현예에서, 서로 물리적으로 관련된 2 개 이상의 독립체는 서로 공유적으로 연결되지 않지만 예를 들어 수소 결합, 반 데르 발스(van der Waals) 상호작용, 소수성 상호작용, 자기작용, 및 이의 조합에 의해 비공유적으로 관련된다.

제제: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "제제"는 예를 들어, 소분자, 폴리펩티드, 핵산, 사카라이드, 지질, 금속, 또는 이의 조합 또는 복합체를 포함하는 임의의 화학적 부류의 화합물, 분자, 또는 독립체를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "제제"는 중합체를 포함하는 화합물, 분자, 또는 독립체를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 용어는 하나 이상의 중합체 모이어티를 포함하는 화합물 또는 독립체를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "제제"는 특정 중합체 또는 중합체 모이어티가 실질적으로 없는 화합물, 분자, 또는 독립체를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 용어는 임의의 중합체 또는 중합체 모이어티가 결여되거나 또는 실질적으로 없는 화합물, 분자, 또는 독립체를 지칭한다.

아미노산: 가장 넓은 의미에서, 본원에 사용된 바와 같이, "아미노산"은 예를 들어, 하나 이상의 펩티드 결합 형성을 통해 폴리펩티드 쇄에 혼입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 아미노산은 일반적인 구조 H₂N-C(H)(R)-COOH를 갖는다. 일부 구현예에서, 아미노산은 자연 발생 아미노산이다. 일부 구현예에서, 아미노산은 비천연 아미노산이며; 일부 구현예에서, 아미노산은 D-아미노산이고; 일부 구현예에서, 아미노산은 L-아미노산이다. "표준 아미노산"은 자연 발생 펩티드에서 통상적으로 발견되는 임의의 20 개의 표준 L-아미노산을 지칭한다. "비표준 아미노산"은 합성적으로 제조되었는지 또는 자연 공급원으로부터 수득되었는지에 관계 없이 표준 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지칭한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드의 카복시- 및/또는 아미노-말단 아미노산을 포함하는 아미노산은 상기 일반적인 구조와 비교하여 구조적 변형을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 아미노산은 일반적인 구조와 비교하여 메틸화, 아미드화, 아세틸화, 페길화, 글리코실화, 인산화, 및/또는 (예를 들어, 아미노기, 카복실산 기, 하나 이상의 양성자, 및/또는 하이드록실기의) 치환에 의해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 변형은 예를 들어, 달리 동일한 비변형된 아미노산을 함유하는 것과 비교하여 변형된 아미노산을 함유하는 폴리펩티드의 순환 반감기를 변경할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 변형은 달리 동일한 비변형된 아미노산을 함유하는 것과 비교하여, 변형된 아미노산을 함유하는 폴리펩티드의 관련 활성을 유의하게 변경하지 않는다. 맥락으로부터 명맥한 바와 같이, 일부 구현예에서, 용어 "아미노산"은 유리 아미노산을 지칭하기 위해 사용될 수 있으며; 일부 구현예에서 폴리펩티드의 아미노산 잔기를 지칭하기 위해 사용될 수 있다.

사이: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "사이"는 경계를 포함하여 나타낸 상한 및 하한, 또는 제1 및 제2 경계 사이에 속하는 내용물을 지칭한다.

에 상응하는: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "에 상응하는"은 적절한 참조 화합물 또는 조성물과의 비교를 통해 화합물 또는 조성물의 구조적 요소의 위치/동일성을 지정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 중합체의 단량체 잔기(예를 들어, 폴리펩티드의 아미노산 잔기 또는 폴리뉴클레오티드의 핵산 잔기)는 적절한 참조 중합체의 잔기"에 상응하는" 것으로 식별될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 단순성을 위해, 폴리펩티드의 잔기가 종종 참조 관련 폴리펩티드를 기반으로 하는 표준 넘버링 시스템을 사용하여 지정되어, 예를 들어 위치 190에서 잔기"에 상응하는" 아미노산이 실제로 특정 아미노산 쇄의 190번째 아미노산일 필요 없이 오히려 참조 폴리펩티드의 190에서 발견된 잔기에 상응하도록 한다는 것을 이해할 것이며; 당업자는 "상응하는" 아미노산을 식별하는 방법을 용이하게 인식한다. 예를 들어, 당업자는 예를 들어, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드 및/또는 핵산에서 "상응하는" 잔기를 식별하기 위해 활용될 수 있는 예를 들어, BLAST, CS-BLAST, CUDASW++, DIAMOND, FASTA, GGSEARCH/GLSEARCH, Genoogle, HMMER, HHpred/HHsearch, IDF, Infernal, KLAST, USEARCH, parasail, PSI-BLAST, PSI-Search, ScalaBLAST, Sequilab, SAM, SSEARCH, SWAPHI, SWAPHI-LS, SWIMM, 또는 SWIPE와 같은 소프트웨어 프로그램을 포함하여 다양한 서열 정렬 전략은 알고 있을 것이다.

도메인: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "도메인"은 독립체의 섹션 또는 일부를 지칭한다. 일부 구현예에서, "도메인"은 도메인이 모체 독립체의 나머지로부터 물리적으로 분리될 때, 실질적으로 또는 전체적으로 특정 구조적 및/또는 기능적 특징을 유지하도록 하는 독립체의 특정 구조적 및/또는 기능적 특징와 관련된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 도메인은 (모체) 독립체로부터 분리되고 상이한 (수용자) 독립체와 연결될 때, 모체 독립체에서 특징으로 하는 하나 이상의 구조적 및/또는 기능적 특징을 실질적으로 유지하고/하거나 수용자 독립체에게 부여하는 독립체의 일부일 수 있거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 도메인은 분자(예를 들어, 소분자, 탄수화물, 지질, 핵산, 또는 폴리펩티드)의 섹션 또는 일부이다. 일부 구현예에서, 도메인은 폴리펩티드의 섹션이며; 일부 이러한 구현예에서, 도메인은 특정 구조적 요소(예를 들어, 특정 아미노산 서열 또는 서열 모티프, α-헬릭스 특징, β-시트 특징, 코일형-코일 특징, 무작위 코일 특징 등), 및/또는 특정 기능적 특성(예를 들어, 결합 활성, 효소적 활성, 폴딩 활성, 신호전달 활성 등)을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 도메인은 특징적 부분 또는 특징적 서열 요소이거나 또는 이를 포함한다.

조작된: 일반적으로, 용어 "조작된"은 사람의 손에 의해 조작되는 측면을 지칭한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 자연에서 그 순서로 함께 연결되지 않은 2 개 이상의 서열이 조작된 폴리뉴클레오티드에서 서로 직접 연결되도록 사람의 손에 의해 조작될 때 "조작된" 것으로 간주된다. 당업자는 "조작된" 핵산 또는 아미노산 서열이 재조합 핵산 또는 아미노산 서열일 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 구현예에서, 조작된 폴리뉴클레오티드는 제1 서열과의 작동적 관련성으로 자연에서 발견되지만 제2 서열과 작동적 관련성이 없는 도메인-암호화 서열 조절 서열을 포함하며, 제2 서열과 작동적으로 관련되도록 사람의 손에 의해 연결된다. 비교가능하게, 세포 또는 유기체는 유전자 정보가 변경되도록 조작되는 경우 "조작된" 것으로 간주된다(예를 들어, 이전에 존재하지 않은 새로운 유전 물질은 예를 들어 형질전환, 교배, 체세포 혼성화, 형질감염, 형질도입, 또는 다른 메커니즘에 의해 도입되었거나, 또는 이전에 존재하는 유전 물질은 예를 들어 치환 또는 결실 돌연변이에 의해, 또는 교배 프로토콜에 의해 변경 또는 제거됨). 통상적인 관행이고 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 조작된 폴리뉴클레오티드 또는 세포의 자손은 전형적으로 실제 조작이 이전 독립체에서 수행되었음에도 불구하고 여전히 "조작된" 것으로 지칭된다.

유전자: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자"는 생성물(예를 들어, RNA 생성물 및/또는 폴리펩티드 생성물)을 암호화하는 DNA 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 유전자는 코딩 서열(즉, 특정 생성물을 암호화하는 서열)을 포함하며; 일부 구현예에서, 유전자는 비코딩 서열을 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 유전자는 코딩(예를 들어, 엑손) 및 비코딩(예를 들어, 인트론) 서열을 모두 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자는 예를 들어, 유전자 발현의 하나 이상의 측면(예를 들어, 프로모터)을 제어하거나 또는 영향을 줄 수 있는 하나 이상의 조절 요소를 포함할 수 있다. 유전자는 특정 맥락, 예를 들어, 세포에서 내인성 또는 비내인성일 수 있다. 유전자는 이식유전자일 수 있다.

유전자 산물 또는 발현 산물: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 산물" 또는 "발현 산물"은 일반적으로 유전자(처리전 및/또는 처리후)로부터 전사된 RNA 또는 유전자로부터 전사된 RNA에 의해 암호화된 폴리펩티드(변형전 및/또는 변형후)를 지칭한다.

"개선하다," "증가하다," "억제하다," 또는 "감소하다": 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "개선하다," "증가하다," "억제하다," "감소하다," 또는 이의 문법적 등가물은 기준선 또는 다른 참조 측정과 관련된 값을 나타낸다. 일부 구현예에서, 적절한 참조 측정은 특정 제제 또는 치료제의 존재(예를 들어, 이전 및/또는 이후)가 부재하는 달리 비슷한 조건 하에 또는 적절한 비슷한 참조 제제의 존재 하에 특정 시스템에서(예를 들어, 단일 개체에서)의 측정일 수 있거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 적절한 참조 측정은 관련 또는 치료제의 존재 하에 특정 방식에 반응할 것으로 예상되거나 또는 알려진 비슷한 시스템에서의 측정일 수 있거나 또는 이를 포함한다.

증가 및 감소: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증가", "감소" 및 이들의 문법적 등가물은 기준과의 정성적 또는 양적 차이를 나타낸다.

핵산: 본원에 사용된 바와 같이, 가장 넓은 의미에서, "핵산"은 올리고뉴클레오티드 쇄에 혼입되거나 또는 혼입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 핵산은 포스포디에스테르 연결을 통해 올리고뉴클레오티드 쇄로 혼입되거나 또는 혼입될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 맥락으로부터 명맥한 바와 같이, 일부 구현예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기(예를 들어, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭하며; 일부 구현예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 쇄를 지칭한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 RNA이거나 또는 이를 포함하며; 일부 구현예에서, "핵산"은 DNA이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 천연 핵산 잔기이거나, 이를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 핵산 유사체이거나, 이를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 핵산 유사체는 포스포디에스테르 백본을 활용하지 않는다는 점에서 핵산과 상이하다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 핵산은 당업계에 알려져 있고 백본에서 포스포디에스테르 결합 대신에 팹티드 결합을 갖는 하나 이상의 "펩티드 핵산"이거나, 이를 포함하거나, 또는 이로 이루어지며, 본 개시내용의 범위 내에서 간주된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, 핵산은 포스포디에스테르 결합보다는 하나 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 5'-N-포스포라미디트 연결을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 천연 뉴클레오시드(예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시 구아노신, 및 데옥시시티딘)이거나, 이를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3 -메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5 -프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, 0(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 메틸화 염기, 삽입된 염기, 및 이의 조합)이거나, 이를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 핵산은 천연 핵산의 것들과 비교하여 하나 이상의 변형된 당(예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스, 및 헥소스)을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 RNA 또는 단백질과 같은 기능성 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 천연 공급원으로부터의 단리, 상보적 주형(생체내 또는 시험관내)에 기초한 중합에 의한 효소적 합성, 재조합 세포 또는 시스템에서의 재생, 및 화학적 합성 중 하나 이상에 의해 제조된다. 일부 구현예에서, 핵산은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 개 이상의 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, 핵산은 부분적으로 또는 전체적으로 단일 가닥이며; 일부 구현예에서, 핵산은 부분적으로 또는 전체적으로 이중 가닥이다. 일부 구현예에서 핵산은 폴리펩티드를 암호화하거나, 또는 암호화하는 서열의 보체인 적어도 하나의 요소를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 효소적 활성을 갖는다.

작동가능하게 연결된: 본원에 사용된 바와 같이, "작동가능하게 연결된"은 기재된 구성요소가 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 근접위치를 지칭한다. 예를 들어, 기능성 요소에 "작동가능하게 연결된" 제어 요소는 기능성 요소의 발현 및/또는 활성이 제어 요소와 호환되는 조건 하에 달성되는 방식으로 회합된다. 일부 구현예에서, "작동가능하게 연결된" 제어 요소는 관심 코딩 요소와 인접하며(예를 들어, 공유적으로 연결됨); 일부 구현예에서, 제어 요소는 관심 기능성 요소에 트랜스로 또는 이로부터 달리 작용한다.

약제학적 조성물: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물"은 활성제가 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화되는 조성물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 활성제는 관련 집단에 투여될 때 미리결정된 치료 효과를 달성할 통계적으로 유의한 확률을 나타내는 치료 레지멘으로 투여하기에 적절한 단위 투여량으로 존재한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 다음에 적합한 것들을 포함하여 고체 또는 액체 형태로 투여하기 위해 특별하게 제형화될 수 있다: 경구 투여, 예를 들어, 음약(drench)(수용액 또는 비수용액 또는 현탁액), 정제, 예를 들어, 협측, 설하, 및 전신 흡수를 목표로 하는 것들, 볼루스, 분말, 과립, 혀에 적용하기 위한 페이스트; 예를 들어 멸균 용액 또는 현탁액, 또는 지속-방출 제형으로서 예를 들어 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주사에 의한 비경구 투여; 예를 들어, 크림, 연고, 또는 지효성 패치 또는 스프레이로 피부, 폐, 또는 구강에 적용되는 국소 적용; 예를 들어, 페서리, 크림, 폼으로서 질내 또는 직장내; 설하; 안구; 경피; 또는 비강, 폐, 및 다른 점막 표면.

폴리펩티드: 본원에 사용된 바와 같이, "폴리펩티드"는 아미노산의 임의의 중합체 쇄를 지칭한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 자연에서 발생하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 자연에서 발생하지 않는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 인간 손의 작용을 통해 설계 및/또는 생산된다는 점에서 조작된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 또는 둘 다를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 천연 아미노산만 또는 비천연 아미노산만을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 D-아미노산, L-아미노산, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 D-아미노산만을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 L-아미노산만을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 펜던트 기 또는 다른 변형, 예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단, 폴리펩티드의 C-말단, 또는 이의 임의의 조합에서 하나 이상의 아미노산 측쇄를 변형시키거나 또는 이에 부착된 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 펜던트 기 또는 변형은 이의 조합을 포함하여 아세틸화, 아미드화, 지질화, 메틸화, 인산화, 글리코실화, 당화, 황산화, 만노실화, 니트로실화, 아실화, 팔미토일화, 프레닐화, 페길화 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 환형일 수 있고/있거나, 환형 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 환형이 아니고/아니거나 임의의 환형 부분을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 선형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 봉합된 폴리펩티드일 수 있거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 용어 "폴리펩티드"는 참조 폴리펩티드, 활성, 또는 구조의 이름에 첨부될 수 있으며; 이러한 경우, 본원에서 관련 활성 또는 구조를 공유하는 폴리펩티드를 지칭하기 위해 사용되고 따라서 폴리펩티드의 동일한 부류 또는 계열의 구성원인 것으로 간주될 수 있다. 각각의 이러한 부류에 대해, 본 명세서는 아미노산 서열 및/또는 기능이 알려진 부류 내의 예시적인 폴리펩티드를 제공하고/하거나 당업자는 이를 알고 있을 것이며; 일부 구현예에서, 이러한 예시적인 폴리펩티드는 폴리펩티드 부류 또는 계열에 대한 참조 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 부류 또는 계열의 구성원은 부류의 참조 폴리펩티드; 일부 구현예에서, 부류 내의 모든 폴리펩티드)와 유의한 서열 유사성(예를 들어, 상동성) 또는 동일성을 나타내고/내거나, 이와 공통 서열 모티프(예를 들어, 특징적 서열 요소)를 공유하고/하거나, 이와 공통 활성(일부 구현예에서 비슷한 수준에서 또는 지정된 범위 내에서)을 공유한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 구성원 폴리펩티드는 적어도 약 30-40%이고, 종종 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상보다 더 큰 참조 폴리펩티드와의 전반적인 정도의 서열 유사성(예를 들어, 상동성) 또는 동일성을 나타내고/내거나 종종 90% 초과 또는 심지어 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 매우 높은 서열 동일성을 나타내는 적어도 하나의 영역(예를 들어, 일부 구현예에서 특징적 서열 요소일 수 있거나 또는 이를 포함하는 보존된 영역)을 포함한다. 이러한 보존된 영역은 일반적으로 적어도 3-4 개 및 종종 최대 20 개 이상의 아미노산을 포함하며; 일부 구현예에서, 보존된 영역은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 개 이상의 인접 아미노산의 적어도 하나의 스트레치를 포함한다. 일부 구현예에서, 유용한 폴리펩티드는 모체 폴리펩티드의 단편을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 유용한 폴리펩티드는 복수의 단편을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있으며, 각각은 관심 폴리펩티드가 모체 폴리펩티드의 유도체이도록 관심 폴리펩티드에서 발견되는 것과는 다른 상이한 공간적 배열의 동일한 모체 폴리펩티드에서 발견된다(예를 들어, 모체에서 직접 연결된 단편은 관심 폴리펩티드에서 공간적으로 분리될 수 있거나 또는 그 반대의 경우도 가능하고/하거나, 단편은 모체에서와는 다른 관심 폴리펩티드에서 상이한 순서로 존재할 수 있다).

예방하다 또는 예방: 본원에 사용된 바와 같이, "예방하다" 또는 "예방"은 질환, 장애, 및/또는 병태의 발생과 관련하여 사용될 때, 질환, 장애 및/또는 병태가 발생할 위험을 줄이고/줄이거나 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 특징 또는 증상의 발병을 지연시키는 것을 지칭한다. 예방은 질환, 장애 또는 병태의 발병이 미리정의된 기간 동안 지연되었을 때 완료된 것으로 간주될 수 있다.

프로모터: 본원에 사용된 바와 같이, "프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 코딩 서열의 전사 개시 및/또는 진행성에 직접적으로 또는 간접적으로 (예를 들어, 프로모터-결합된 단백질 또는 물질을 통해) 참여하는 DNA 조절 영역일 수 있다. 프로모터는 적합한 조건 하에 하나 이상의 전사 인자 및/또는 조절 모이어티와 프로모터의 결합 시 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있다. 코딩 서열의 전사 개시에 참여하는 프로모터는 코딩 서열에 "작동가능하게 연결"될 수 있다. 특정 경우에, 프로모터는 그렇게 지정된 서열이 전사 이벤트를 개시하는 데 필요한 최소 수의 염기 또는 요소 중 하나 또는 둘 다를 포함하도록 전사 개시 부위(3' 말단)에서 상류(5' 방향) 위치로 확장되는 DNA 조절 영역일 수 있거나 또는 이를 포함한다. 프로모터는 증진인자 및 억제인자 서열과 같은 발현 제어 서열일 수 있거나, 이를 포함하거나, 또는 이와 작동가능하게 회합될 수 있거나 또는 이에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 유도성일 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터 구성적 프로모터일 수 있다. 일부 구현예에서, 조건부(예를 들어, 유도성) 프로모터는 단방향성 또는 양방향성일 수 있다. 프로모터는 특정 종의 게놈에서 발생하는 것으로 알려진 서열과 동일한 서열일 수 있거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 하이브리드 프로모터일 수 있거나 또는 이를 포함하며, 여기서 전사 조절 영역을 함유하는 서열은 하나의 공급원으로부터 수득될 수 있고 전사 개시 영역을 함유하는 서열은 제2 공급원으로부터 수득될 수 있다. 제어 요소를 이식유전자 내의 코딩 서열에 연결하기 위한 시스템은 당업계에 잘 알려져 있다(일반적인 분자 생물학 및 재조합 DNA 기술은 Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989에 기재되어 있다).

재조합: 본원에 사용된 바와 같이, "재조합"은 숙주 세포에 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 폴리펩티드; 재조합, 조합 인간 폴리펩티드 라이브러리로부터 단리된 폴리펩티드; 유전자 또는 유전자들, 또는 폴리펩티드 또는 이의 하나 이상의 구성요소(들), 부분(들), 요소(들), 또는 도메인(들)의 발현을 암호화 및/또는 지시하는 유전자 구성요소를 발현하기 위해 유전자이식되거나 또는 달리 조작된 동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 양, 어류 등)로부터 단리된 폴리펩티드; 및/또는 선택된 핵산 서열 요소를 서로 스플라이싱 또는 결찰하고/하거나, 선택된 서열 요소를 화학적으로 합성하고/하거나, 달리 폴리펩티드 또는 이의 하나 이상의 구성요소(들), 부분(들), 요소(들), 또는 도메인(들)의 발현을 암호화하고/하거나 지시하는 핵산을 생성하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 폴리펩티드와 같이, 재조합 수단에 의해 설계, 조작, 제조, 발현, 생성, 제작, 및/또는 단리된 폴리펩티드를 지칭하는 것으로 의도된다. 일부 구현예에서, 이러한 선택된 서열 요소 중 하나 이상은 자연에서 발견된다. 일부 구현예에서, 이러한 선택된 서열 요소 중 하나 이상은 인실리코(in silico) 설계된다. 일부 구현예에서, 이러한 선택된 서열 요소 중 하나 이상은 알려진 서열 요소의 돌연변이유발(예를 들어, 생체내 또는 시험관내), 예를 들어, 관심 공급원 유기체(예를 들어, 인간, 마우스 등)의 생신선에서와 같이 예를 들어 천연 또는 합성 공급원으로부터 발생한다.

참조: 본원에 사용된 바와 같이 비교를 수행하는 것과 관련하여 표준 또는 대조군을 기재한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 관심 제제, 동물, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값은 참조 또는 대조군 제제, 동물, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값과 비교된다. 일부 구현예에서, 참조 또는 대조군은 관심 테스트 또는 결정과 실질적으로 동시에 시험 및/또는 결정된다. 일부 구현예에서, 참조 또는 대조군은 선택적으로 유형의 매체에서 구현된 역사적 참조 또는 대조군이다. 전형적으로, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 참조 또는 대조군은 평가 중인 것들과 비슷한 조건 또는 환경 하에 결정되거나 또는 특징화된다. 당업자는 충분한 유사성이 존재할 때 특정 가능한 참조 또는 대조군에 대한 의존성 및/또는 비교를 정당화하도록 인식할 것이다.

대상체: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 유기체, 전형적으로 포유동물(예를 들어, 일부 구현예에서 태아기 인간 형태를 포함하는 인간)을 지칭한다. 일부 구현예에서, 대상체는 관련 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애, 또는 병태에 걸리기 쉽다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 나타낸다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애, 또는 병태의 임의의 증상 또는 특징을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애, 또는 병태에 대한 감수성 또는 위험의 특징인 하나 이상의 특성이 있는 사람이다. 일부 구현예에서, 대상체는 환자이다. 일부 구현예에서, 대상체는 진단 및/또는 요법이 투여되고/되거나 투여된 개체이다.

실질적인 서열 유사성: 어구 "실질적인 서열 유사성"은 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 비교를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.　 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 2 개의 서열은 일반적으로 이들이 상응하는 위치에 보존적 아미노산 치환을 함유하는 경우 "실질적으로 유사한" 것으로 간주된다.　 보존적 치환은 아미노산이 적절하게 유사한 구조적 및/또는 기능적 특징을 갖는 동일하지 않은 잔기에 의해 대체된 것이다.　 예를 들어, 당업자에 의해 잘 알려진 바와 같이, 특정 아미노산은 전형적으로 "소수성" 또는 "친수성" 아미노산으로 분류되고/되거나, "극성" 또는 "비극성" 측쇄를 갖는 것으로 분류된다.　 하나의 아미노산의 동일한 유형의 또 다른 아미노산으로의 치환은 종종 보존적 치환으로 간주될 수 있다.　 전형적인 아미노산 범주화는 하기 표 1 및 2에 요약되어 있다:

표 1

표 2

당업계에 잘 알려진 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오티드 서열의 경우 BLASTN 및 아미노산 서열의 경우 BLASTP, 갭 BLAST, 및 PSI-BLAST와 같은 상업용 컴퓨터 프로그램에서 이용가능한 것들을 포함하여 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 비교될 수 있다.　 예시적인 이러한 프로그램은 Altschul, 등, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, 등, Methods in Enzymology; Altschul, 등, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs," 　Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, 등, Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; 및 Misener, 등, (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999에 기재되어 있다.　 유사한 서열을 식별하는 것 외에도, 상기 언급된 프로그램은 전형적으로 유사성 정도를 표시한다.　 일부 구현예에서, 2 개의 서열은 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 상응하는 잔기가 잔기의 관련 스트레치에 걸쳐 유사하고/하거나 동일한 경우 실질적으로 유사한 것으로 간주된다.　 일부 구현예에서, 관련 스트레치는 완전한 서열이다.　 일부 구현예에서, 관련 스트레치는 적어도 10 개, 적어도 15 개, 적어도 20 개, 적어도 25 개, 적어도 30 개, 적어도 35 개, 적어도 40 개, 적어도 45 개, 적어도 50 개, 적어도 55 개, 적어도 60 개, 적어도 65 개, 적어도 70 개, 적어도 75 개, 적어도 80 개, 적어도 85 개, 적어도 90 개, 적어도 95 개, 적어도 100 개, 적어도 125 개, 적어도 150 개, 적어도 175 개, 적어도 200 개, 적어도 225 개, 적어도 250 개, 적어도 275 개, 적어도 300 개, 적어도 325 개, 적어도 350 개, 적어도 375 개, 적어도 400 개, 적어도 425 개, 적어도 450 개, 적어도 475 개, 적어도 500 개 이상의 잔기이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 실질적인 서열 유사성을 갖는 서열은 서로 상동체일 수 있다.

실질적인 서열 동일성: 본원에 사용된 바와 같이, 어구 "실질적인 서열 동일성"은 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 비교를 지칭한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 2 개의 서열은 일반적으로 이들이 상응하는 위치에 동일한 잔기를 함유하는 경우 "실질적으로 동일한" 것으로 간주된다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오티드 서열의 경우 BLASTN 및 아미노산 서열의 경우 BLASTP, 갭 BLAST, 및 PSI-BLAST와 같은 상업용 컴퓨터 프로그램에서 이용가능한 것들을 포함하여 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 비교될 수 있다. 예시적인 이러한 프로그램은 Altschul 등, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul 등, Methods in Enzymology; Altschul 등, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis 등, Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; 및 Misener, 등, (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999에 기재되어 있다. 동일한 서열을 식별하는 것 외에도, 상기 언급된 프로그램은 전형적으로 동일성 정도를 표시한다. 일부 구현예에서, 2 개의 서열은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 상응하는 잔기가 잔기의 관련 스트레치에 걸쳐 동일한 경우 실질적으로 동일한 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 관련 스트레치는 완전한 서열이다. 일부 구현예에서, 관련 스트레치는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 개 이상의 잔기이다.

치료제: 본원에 사용된 바와 같이, 어구 "치료제"는 일반적으로 유기체에게 투여될 때 원하는 약리학적 효과를 도출하는 임의의 제제를 지칭한다.　 일부 구현예에서, 제제는 적절한 집단에 걸쳐 통계적으로 유의한 효과를 입증하는 경우 치료제인 것으로 간주된다.　 일부 구현예에서, 적절한 집단은 모델 유기체 집단일 수 있다. 일부 구현예에서, 적절한 집단은 특정 연령군, 성별, 유전적 배경, 기존 임상 상태 등과 같은 다양한 기준에 의해 정의될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료제는 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특성의 발병을 경감, 개선, 완화, 억제, 예방, 지연시키고/시키거나, 이의 중증도를 줄이고/줄이거나, 이의 발생을 줄이는 데 사용될 수 있는 물질이다.　 일부 구현예에서, "치료제"는 인간에게 투여하기 위해 판매될 수 있기 전에 정부 기관에 의해 승인되었거나 또는 승인되어야 하는 제제이다.　 일부 구현예에서, "치료제"는 인간에게 투여하기 위해 의학적 처방이 필요한 제제이다.

치료 레지멘: 본원에 사용된 용어로서 "치료 레지멘"은 관련 집단에 걸친 투여가 원하거나 또는 유익한 치료 결과와 상관관계가 있을 수 있는 투약 레지멘을 지칭한다.

치료 유효량: 본원에 사용된 바와 같이, 투여되는 경우 원하는 효과를 생성하는 양을 의미한다. 일부 구현예에서, 용어는 치료 투약 레지멘에 따라 질환, 장애, 및/또는 병태를 앓고 있거나 또는 이에 걸리기 쉬운 집단에게 투여될 때 질환, 장애, 및/또는 병태를 치료하는 데 충분한 양을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료 유효량은 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상의 발생 및/또는 이의 중증도를 줄이고/줄이거나, 이의 발병을 지연시키는 양이다. 당업자는 용어 "치료 유효량"이 사실 특정 개체에서 성공적인 치료를 달성할 것을 요구하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 오히려, 치료 유효량은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 때 유의한 수의 대상체에서 특정 원하는 약리학적 반응을 제공하는 해당 양일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료 유효량에 대한 언급은 하나 이상의 특이적 조직(예를 들어, 질환, 장애 또는 병태에 의해 영향을 받은 조직) 또는 체액(예를 들어, 혈액, 타액, 혈청, 땀, 눈물, 소변 등)에서 측정된 양에 대한 언급일 수 있다. 당업자는 일부 구현예에서 치료 유효량의 특정 제제 또는 요법이 단일 용량으로 제형화 및/또는 투여될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 치료적으로 효과적인 제제는 예를 들어, 투약 레지멘의 일부로서 복수의 용량으로 제형화 및/또는 투여될 수 있다.

치료: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료"(또한 "치료하다" 또는 "치료하는")는 특정 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특성, 및/또는 원인의 발병을 부분적으로 또는 완전히 경감, 개선, 완화, 억제, 지연시키고/시키거나, 이의 중증도를 줄이고/줄이거나, 이의 발생을 줄이는 요법의 임의의 투여를 지칭한다. 일부 구현예에서, 이러한 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 징후를 나타내지 않는 대상체 및/또는 질환, 장애, 및/또는 병태의 초기 징후만을 나타내는 대상체의 치료일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 이러한 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 확립된 징후를 나타내는 대상체의 치료일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 관련 질환, 장애, 및/또는 병태를 앓고 있는 것으로 진단된 대상체의 치료일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 관련 질환, 장애, 및/또는 병태의 발생 위험 증가와 통계적으로 상관관계가 있는 하나 이상의 감수성 인자를 갖는 것으로 알려진 대상체의 치료일 수 있다.

변이체: 분자, 예를 들어, 핵산, 단백질, 또는 소분자의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변이체"는 참조 분자와 유의한 구조적 동일성을 나타내지만 예를 들어, 참조 독립체와 비교하여 하나 이상의 화학적 모이어티의 존재 또는 부재 하에 또는 이의 수준에서 참조 분자와 구조적으로 상이한 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 변이체는 또한 참조 분자와 기능적으로 상이하다. 일반적으로, 특정 분자가 참조 분자의 "변이체"인 것으로 적절하게 간주되는지 여부는 참조 분자와의 구조적 동일성 정도에 기초한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 임의의 생물학적 또는 화학적 참조 분자는 특정한 특징적 구조적 요소를 갖는다. 정의에 의해 변이체는 하나 이상의 이러한 특징적 구조적 요소를 공유하지만 참조 분자와 적어도 하나의 측면에서 상이한 별개의 분자이다. 몇 가지 예를 들면, 폴리펩티드는 선형 또는 3차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖고/갖거나 특정 구조적 모티프 및/또는 생물학적 기능에 기여하는 복수의 아미노산에 포함된 특징적 서열 요소를 가질 수 있으며; 핵산은 선형 또는 3차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖는 복수의 뉴클레오티드 잔기에 포함된 특징적 서열 요소를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 변이 폴리펩티드 또는 핵산은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 차이 및/또는 폴리펩티드 또는 핵산의 공유적 구성요소인(예를 들어, 폴리펩티드 또는 핵산 백본에 부착된) 화학적 모이어티(예를 들어, 탄수화물, 지질, 포스페이트 기)에서 하나 이상의 차이의 결과로서 참조 폴리펩티드 또는 핵산과 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 변이 폴리펩티드 또는 핵산은 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 또는 99%인 참조 폴리펩티드 또는 핵산과의 전반적인 서열 동일성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 변이 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산과 적어도 하나의 특징적 서열 요소를 공유하지 않는다. 일부 구현예에서, 참조 폴리펩티드 또는 핵산은 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변이 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산의 생물학적 활성 중 하나 이상을 공유한다. 일부 구현예에서, 변이 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산의 생물학적 활성 중 하나 이상이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변이 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산에 비해 감소된 수준의 하나 이상의 생물학적 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 관심 폴리펩티드 또는 핵산은 참조의 폴리펩티드 또는 핵산과 동일하지만 특정한 위치에서 적은 수의 서열에 대한 변경이 있는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 갖는 경우 참조 폴리펩티드 또는 핵산의 "변이체"인 것으로 간주된다. 전형적으로, 참조에 비해 변이체에서 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 또는 약 2% 미만의 잔기가 치환, 삽입, 또는 결실되어 있다. 일부 구현예에서, 변이 폴리펩티드 또는 핵산은 참조에 비해 약 10 개, 약 9 개, 약 8 개, 약 7 개, 약 6 개, 약 5 개, 약 4 개, 약 3 개, 약 2 개, 또는 약 1 개의 치환된 잔기를 포함한다. 종종, 변이 폴리펩티드 또는 핵산은 참조에 비해 매우 적은 수(예를 들어, 약 5 개, 약 4 개, 약 3 개, 약 2 개, 또는 약 1 개 미만) 수의 치환, 삽입, 또는 결실된 기능성 잔기(즉, 특정한 생물학적 활성에 참여하는 잔기)를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 폴리펩티드 또는 핵산은 참조에 비해, 약 5 개, 약 4 개, 약 3 개, 약 2 개, 또는 약 1 개 이하의 부가 또는 결실을 포함하고, 일부 구현예에서 부가 또는 결실을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 변이 폴리펩티드 또는 핵산은 참조에 비해 약 25 개, 약 20 개, 약 19 개, 약 18 개, 약 17 개, 약 16 개, 약 15 개, 약 14 개, 약 13 개, 약 10 개, 약 9 개, 약 8 개, 약 7 개, 약 6 개 미만, 및 통상적으로 약 5 개, 약 4 개, 약 3 개, 또는 약 2 개 미만의 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 참조 폴리펩티드 또는 핵산은 자연에서 발견된 것이다. 일부 구현예에서, 참조 폴리펩티드 또는 핵산은 인간 폴리펩티드 또는 핵산이다.

도 1은 패널 A 및 패널 B를 포함한다. 패널 A는 리신 잔기에서 패널 B에 나타낸 PEG12로 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 DNA 분자와 축합 반응을 거쳐 로딩된 미니 뉴클레오솜을 생성할 수 있는 방법을 개략적으로 제시한다. 각각의 핵산 분자는 로딩된 미니 뉴클레오솜을 형성하기 위해 DNA의 음전하를 중화하도록 여러(1 내지 1000 개) 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 필요할 수 있다. 도식은 밑그림 다이어그램으로만 의도되고, 로딩된 미니 뉴클레오솜이 코어 단백질과 회합된 핵산을 포함하는 정도를 제외하고 로딩된 미니 뉴클레오솜의 실제 구조를 나타내는 것으로 의도되지 않는다.
도 2는 서열의 첫번째 리신 잔기에서 PEG12로 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 형성 후 질량 분석법으로 수득된 데이터를 나타내는 차트이다.
도 3은 리신 잔기에서 1kDa PEG로 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 DNA 분자와의 축합 반응을 거쳐 로딩된 미니 뉴클레오솜을 생성할 수 있는 방법을 개략적으로 제시한다. 도 3은 패널 A 및 패널 B를 포함한다. 패널 A는 리신 잔기에서 패널 B에 나타낸 1kDa PEG로 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 DNA 분자와의 축합 반응을 거쳐 로딩된 미니 뉴클레오솜을 생성할 수 있는 방법을 개략적으로 제시한다. 각각의 핵산 분자는 로딩된 미니 뉴클레오솜을 형성하기 위해 DNA의 음전하는 중화하도록 여러(1 내지 1000 개) 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 필요할 수 있다. 도식은 밑그림 다이어그램으로만 의도되고, 로딩된 미니 뉴클레오솜이 코어 단백질과 회합된 핵산을 포함하는 정도를 제외하고 로딩된 미니 뉴클레오솜의 실제 구조를 나타내는 것으로 의도되지 않는다.
도 4는 패널 A 및 패널 B를 포함한다. 패널 A는 리신 잔기에서 패널 B에 나타낸 2kDa PEG로 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 DNA 분자와의 축합 반응을 거쳐 로딩된 미니 뉴클레오솜을 생성할 수 있는 방법을 개략적으로 제시한다. 각각의 핵산 분자는 로딩된 미니 뉴클레오솜을 형성하기 위해 DNA의 음전하를 중화하도록 여러(1 내지 1000 개) 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 필요할 수 있다. 도식은 밑그림 다이어그램으로만 의도되고, 로딩된 미니 뉴클레오솜이 코어 단백질과 회합된 핵산을 포함하는 정도를 제외하고 로딩된 미니 뉴클레오솜의 실제 구조를 나타내는 것으로 의도되지 않는다.
도 5는 패널 A 및 패널 B를 포함한다. 패널 A는 리신 잔기에서 패널 B에 나타낸 5kDa PEG로 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 DNA 분자와의 축합 반응을 거쳐 로딩된 미니 뉴클레오솜을 생성할 수 있는 방법을 개략적으로 제시한다. 각각의 핵산 분자는 로딩된 미니 뉴클레오솜을 형성하기 위해 DNA의 음전하를 중화하도록 여러(1 내지 1000 개) 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 필요할 수 있다. 도식은 밑그림 다이어그램으로만 의도되고, 로딩된 미니 뉴클레오솜이 코어 단백질과 회합된 핵산을 포함하는 정도를 제외하고 로딩된 미니 뉴클레오솜의 실제 구조를 나타내는 것으로 의도되지 않는다.
도 6은 패널 A 및 패널 B를 포함한다. 패널 A는 리신 잔기에서 패널 B에 나타낸 10kDa PEG로 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 DNA 분자와의 축합 반응을 거쳐 로딩된 미니 뉴클레오솜을 생성할 수 있는 방법을 개략적으로 제시한다. 각각의 핵산 분자는 로딩된 미니 뉴클레오솜을 형성하기 위해 DNA의 음전하를 중화하도록 여러(1 내지 1000 개) 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 필요할 수 있다. 도식은 밑그림 다이어그램으로만 의도되고, 로딩된 미니 뉴클레오솜이 코어 단백질과 회합된 핵산을 포함하는 정도를 제외하고 로딩된 미니 뉴클레오솜의 실제 구조를 나타내는 것으로 의도되지 않는다.
도 7은 패널 A, B, 및 C를 포함하는 이미지 세트이며, 각각은 로딩된 미니 뉴클레오솜의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지를 제시한다.
도 8은 Elisa에 의해 측정된 바와 같은 발현된 인자 8 단백질의 농도를 나타내는 그래프이다.
도 9는 패널 A, B, 및 C를 포함하는 이미지 세트이며, 각각은 로딩된 미니 뉴클레오솜에 존재하는 핵산에 의해 암호화된 단백질의 간 조직에서의 유전자 발현을 예시하는 형광 현미경 이미지이다.
도 10은 패널 A, B, C 및 D를 포함하는 이미지 세트이며 각각은 로딩된 미니 뉴클레오솜에 존재하는 핵산에 의해 암호화된 단백질의 마우스 RPE 조직에서의 유전자 발현을 예시하는 형광 현미경 이미지이다. 패널 A는 RPE 특이적 발현을 보여주는 망막 절편이다. 패널 B는 RPE 특이적 발현을 보여주는 RPE 온조직 표본이다. 패널 B 및 D는 각각 망막 절편 및 RPE 온조직 표본의 미처리 대조군 샘플을 나타낸다.
도 11은 패널 A, B, C 및 D를 포함하는 이미지 세트이며 각각은 로딩된 미니 뉴클레오솜에 존재하는 핵산에 의해 암호화된 단백질의 래트 망막 조직에서의 유전자 발현을 예시하는 형광 현미경 이미지이다. 패널 A 및 C는 RPE 특이적 발현을 보여주는 망막 절편이고 패널 B 및 D는 플라스미드 주입된 대조군 샘플을 제시한다.
도 12는 패널 A, B, C 및 D를 포함하는 이미지 세트이며 각각은 로딩된 미니 뉴클레오솜에 존재하는 핵산에 의해 암호화된 단백질의 마우스 망막 조직에서의 유전자 발현을 예시하는 형광 현미경 이미지이다. 패널 A는 망막 뉴런에서 GFP 발현을 보여주는 망막 절편이다. 패널 C는 망막 광수용체에서 GFP 발현을 보여주는 망막 온조직 표본이다. 패널 B 및 D는 각각 망막 절편 및 RPE 온조직 표본의 미처리 대조군 샘플을 나타낸다.
도 13은 패널 A, B 및 C를 포함하는 이미지 세트이며 각각은 로딩된 미니 뉴클레오솜에 존재하는 핵산에 의해 암호화된 단백질의 마우스 폐에서의 유전자 발현을 예시하는 형광 현미경 이미지이다. 패널 A는 폐포 및 세기관지에서 GFP 발현을 보여준다. 패널 B는 CFTR 염색을 보여준다. 패널 C는 GFP 및 CFTR 염색의 공국소화를 보여주는 패널 A 및 B의 병합이다.
도 14는 패널 A, B 및 C를 포함하는 이미지 세트이며 각각은 로딩된 미니 뉴클레오솜에 존재하는 핵산에 의해 암호화된 단백질의 마우스 폐 상피에서의 유전자 발현을 예시하는 고배율 형광 현미경 이미지이다. 패널 A는 폐포 및 세기관지에서 GFP 발현을 보여준다. 패널 B는 CFTR 염색을 보여준다. 패널 C는 DAPI 염색을 포함하여 GFP 및 CFTR의 공국소화를 보여주는 패널 A 및 B의 병합이다.
도 15는 로딩된 미니 뉴클레오솜에 존재하는 핵산에 의해 암호화된 단백질의 마우스 전체 폐 조직에서의 유전자 발현을 예시하는 이미지 세트이다.
도 16은 로딩된 미니 뉴클레오솜에 존재하는 핵산에 의해 암호화된 단백질의 마우스 뇌, 장 및 췌장에서의 유전자 발현을 예시하는 패널 A, B 및 C를 포함하는 이미지 세트이다. 패널 A는 후각 뉴런에서의 발현 패턴을 보여준다. 패널 B 및 이의 아래 삽도는 소장에서의 발현 패턴을 보여준다. 패널 C 및 이의 아래 삽도는 췌장에서의 발현 패턴을 보여준다.
도 17은 로딩된 미니 뉴클레오솜에 존재하는 핵산에 의해 암호화된 단백질의 마우스 기관 조직에서의 유전자 발현을 예시하는 패널 A, B 및 C를 포함하는 이미지 세트이다. 패널 A는 기관 상피 및 내부 기관 근육에서의 GFP 발현을 보여준다. 패널 B는 내부 및 외부 기관 근육의 발현에서 디스트로핀 염색 패턴을 보여준다. 패널 C는 내부 기관 근육 세포에서 디스트로핀 염색 패턴과 GFP의 공국소화를 보여주는 패널 A 및 B의 병합이다.
도 18은 로딩된 미니 뉴클레오솜에 존재하는 핵산에 의해 암호화된 단백질의 마우스 근육 조직에서의 유전자 발현을 예시하는 패널 A, B 및 C를 포함하는 이미지 세트이다. 패널 A는 마우스 근육 세포에서의 GFP 발현을 보여준다. 패널 B는 마우스 근육 세포의 발현에서 디스트로핀 염색 패턴을 보여준다. 패널 C는 마우스 근육 세포에서 디스트로핀 염색 패턴과 GFP의 공국소화를 보여주는 패널 A 및 B의 병합이다.
도 19는 중화 효과의 결여 또는 다시 말해서 중화 항체 활성의 결여를 시사하는 제1 용량 및 제2 용량 후 Elisa에 의해 측정된 바와 같은 발현된 인자 8 단백질의 농도 증가를 나타내는 그래프이다.
도 20은 패널 A, B, C 및 D를 포함한다. 패널 A는 비변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 개략도이다. 패널 B는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 개략도로서, 여기서 아스파라긴 잔기(N)가 GlcNac, GlcNac 및 시알산을 포함하는 비분지형 변형 사슬로 변형된다. 패널 C는 변형된 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 개략도로서, 여기서 아스파라긴 잔기(N)가 GlcNac를 포함하는 줄기(trunk), GlcNac 및 시알산을 포함하는 분지, 및 푸코스를 포함하는 분지를 포함하는 분지형 변형 사슬로 변형된다. 패널 D는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 개략도로서, 여기서 아스파라긴 잔기(N)가 GlcNac를 포함하는 줄기, 푸코오스를 포함하는 분지, 및 GlcNac, 시알산을 포함하는 2차 분지, 및 만노스를 포함하는 2차 분지를 포함하는 2차 줄기를 포함하는 분지를 포함하는 분지형 변형 사슬로 변형된다.
도 21은 패널 A, B, C, D, E, F 및 G를 포함한다. 패널 A는 예를 들어, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에서 아스파라긴 잔기를 변형시킬 수 있는 GlcNac 및 만노스를 포함하는 비분지형 변형 사슬(C₁₄0₁₀N₁H₂₃)의 개략도이다. 패널 B는 예를 들어 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에서 아스파라긴 잔기를 변형할 수 있는 GlcNac, 만노스 및 푸코스를 포함하는 비분지형 변형 사슬(C₂₅0₁₈N₂H₄₀)의 개략도이다. 패널 C는 GlcNac, GlcNac 및 만노스를 포함하는 줄기와 각각 만노스를 포함하는 2개의 가지를 포함하는 이중-안테나 분지형 변형 사슬(C₃₄0₂₅N₂H₅₆)의 개략도이며, 이 변형 사슬은 예를 들어 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에서 아스파라긴 잔기를 변형할 수 있다. 이러한 구조를 갖는 변형 사슬은 낮은 만노스로 지칭될 수 있다. 패널 D는 GlcNac를 포함하는 줄기, 푸코스를 포함하는 분지, 및 GlcNac 및 만노스를 포함하는 2차 줄기를 포함하는 분지 및 각각 3개의 만노스 변형을 포함하는 2개의 2차 분지를 포함하는 이중 안테나 분지형 변형 사슬(C₆₄0₄₉N₄H₁₀₆)의 개략도이고, 이 변형 사슬은 예를 들어 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에서 아스파라긴 잔기를 변형할 수 있다. 이러한 구조를 갖는 변형 사슬은 높은 만노오스로 지칭될 수 있다. 패널 E는 GlcNac를 포함하는 줄기, 푸코스를 포함하는 분지, 및 GlcNac 및 만노스를 포함하는 2차 줄기를 포함하는 분지, 각각 만노스, GlcNac, 만노스 및 푸코스를 포함하는 2개의 2차 분지를 포함하는 이중 안테나 실릴화 및 푸코실화 분지형 변형 사슬(C₉₀0₆₅N₆H₁₄₆)의 개략도이고, 이 변형 사슬은 예를 들어 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에서 아스파라긴 잔기를 변형할 수 있다. 패널 F는 GlcNac를 포함하는 줄기, 푸코스를 포함하는 분지, 2차 분지를 갖는 GlcNac 및 만노스를 포함하는 2차 줄기를 포함하는 삼중 안테나 실릴화 및 푸코실화 분지형 변형 사슬(C₁₁₅0₈₃N₈H₁₈₆)의 개략도이다. 2차 분지 중 하나는 만노스, GlcNac, 만노스 및 푸코스를 포함하고, 다른 하나는 만노스를 포함하는 3차 줄기 및 각각 GlcNac, 만노스 및 푸코스를 포함하는 2개의 3차 분지를 포함한다. 분지된 변형 사슬은 예를 들어 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에서 아스파라긴 잔기를 변형할 수 있다. 패널 G는 GlcNac를 포함하는 줄기, 푸코스를 포함하는 분지, 및 2개의 2차 분지를 갖는 GlcNac 및 만노스를 포함하는 2차 줄기를 포함하는 사중 안테나 시릴화 및 푸코실화 분지형 변형 사슬(C₁₄₀0₁₀₁N₁₀H₂₂₆)의 개략도이다. 각각의 2차 분지는 만노스를 포함하는 3차 줄기와, 각각 GlcNac, 만노스 및 푸코스를 포함하는 2개의 3차 분지를 포함한다. 분지형 변형 사슬은 예를 들어 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에서 아스파라긴 잔기를 변형할 수 있다.
도 22는 패널 A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J를 포함한다. 패널 A는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 세린 잔기를 변형할 수 있는 GlcNac 변형의 개략도이다. 패널 B는 GalNac 및 갈락토스를 포함하는 비분지형 글리칸 변형 사슬의 개략도이다. 패널 C는 GalNac 줄기, GlcNac 분지 및 갈락토스 분지를 포함하는 이중 안테나 분지형 글리칸 변형의 개략도이며, 이 분지형 변형은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 세린 잔기를 변형할 수 있다. 패널 D는 만노스, GlcNac, 갈락토스 및 NeuAc를 포함하는 비분지형 변형의 개략도이며, 이 분지형 변형은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 세린 잔기를 변형할 수 있다. 패널 E는 푸코스, GlcNac, 갈락토스 및 시알산을 포함하는 비분지형 변형의 개략도이며, 이 분지형 변형은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 세린 잔기를 변형할 수 있다. 패널 F는 GalNac 줄기, 갈락토스 분지 및 GlcNac, 갈락토스, GlcNac, 갈락토스 및 NeuAc를 포함하는 분지를 포함하는 이중 안테나 분지형 변형의 개략도이며, 이 분지형 변형은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 세린 잔기를 변형할 수 있다. 패널 G는 GalNac 줄기, 갈락토스 분지 및 GlcNac, 갈락토스, GlcNac를 포함하는 2차 줄기 및 푸코스 2차 분지 및 NeuAc 2차 분지를 갖는 갈락토스를 포함하는 분지를 포함하는 이중 안테나 분지형 변형의 개략도이고, 이 분지형 변형은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 세린 잔기를 변형할 수 있다. 패널 H는 세린 또는 트레오닌을 변형할 수 있는 단일 당 첨가의 개략도이며, 단일 당 변형은 예를 들어 갈락오스, 글루코스, 만노스, 푸코스 또는 시알산일 수 있다. 패널 I은 변형되지 않은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 개략도이다. 패널 J는 세린 잔기가 GalNac, GalNac 및 갈락토스를 포함한 비분지형 글리칸 변형으로 변형된 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 개략도이다.
도 23은 패널 A, B, C, D, 및 E를 포함한다. 패널 A는 비변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 개략도이다. 패널 B는 리신 잔기(K)가 아세틸기로 변형된 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 개략도이다. 패널 C는 2개의 리신 잔기(K)가 각각 아세틸기로 변형된 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 개략도이다. 패널 D는 리신 잔기(K)와 발린(V)이 각각 아세틸기로 변형된 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 개략도이다. 패널 E는 리신 잔기(K) 및 알라닌(A) 잔기 각각이 아세틸기로 변형된 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 개략도이다
도 24는 아세틸화 리신의 개략도이다
도 25는 패널 A, B, 및 C를 포함한다. 패널 A는 비변형 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 개략도이다. 패널 B는 티로신 잔기(Y)가 황산염기로 변형된 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 개략도이다. 패널 C는 황산화 티로신의 개략도이다
도 26은 패널 A, B, C, 및 D를 포함한다. 패널 A는 비변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 개략도이다. 패널 B는 시스테인 잔기(C)가 프레닐기로 변형된 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 개략도이다. 패널 C는 폴리펩티드와 연결된 파르네실기의 개략도이다. 패널 D는 폴리펩티드와 연결된 제라닐제라닐기의 개략도이다.
도 27은 패널 A, B, C, D, E 및 F를 포함한다. 패널 A는 비변형 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 개략도이다. 패널 B는 세린 잔기(S)가 포스포기로 변형된 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 개략도이다. 패널 C는 포스포티로신의 개략도이다. 패널 D는 포스포세린의 개략도이다. 패널 E는 포스포트레오닌의 개략도이다. 패널 F는 비스-포스포히스티딘의 개략도이다
도 28은 패널 A, B, C, D, 및 E를 포함한다. 패널 A는 비변형 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 개략도이다. 패널 B는 리신 잔기(K)가 메틸화된 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 서열의 개략도이다. 패널 C는 모노-메틸 리신의 개략도이다. 패널 D는 디-메틸 리신의 개략도이다. 패널 E는 트리-메틸 리신의 개략도이다.
도 29는 패널 A, B, C 및 D를 포함한다. 패널 A는 비변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 개략도이다. 패널 B는 프롤린 잔기(P)가 수산화된 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 개략도이다. 패널 C는 4-수산화 프롤린의 개략도이다. 패널 D는 3-수산화 프롤린의 개략도이다.
도 30은 패널 A, B, C, D 및 E를 포함한다. 패널 A는 비변형 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 개략도이다. 패널 B는 리신 잔기(K)가 지질화 및/또는 리포일화되는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 개략도이다. 패널 C는 S-미리스토일화 글리신의 개략도이다. 패널 D는 S-팔미토일화 시스테인의 개략도이다. 패널 E는 O-팔미토일화 시스테인의 개략도이다.
도 31은 패널 A 및 B를 포함한다. 패널 A는 대표적인 발현 생성물로서 루시퍼라제를 암호화하는 유전자를 포함하는 핵산 페이로드가 로딩된 서열번호: 399에 따른 비변형 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 투여된 마우스의 IVIS® 스펙트럼 생체내 이미징 시스템(IVIS) 이미지이다. 패널 B는 대표적인 발현 생성물로서 루시퍼라제를 암호화하는 유전자를 포함하는 핵산 페이로드가 로딩된 서열번호: 399에 따른 인산화된 미니 뉴클레오솜을 투여한 마우스의 IVIS® 스펙트럼 생체내 이미징 시스템(IVIS) 이미지이다. 패널 B는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 아닌 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은, 뉴런을 포함하는 중추 신경계 세포를 포함하는 특정 조직 및 척수 세포 및 뇌 뉴런을 포함하는 특정 조직에서 대표적인 핵산 페이로드 암호화된 발현 생성물(여기서, 루시퍼라제)의 강력한 발현을 초래한다는 것을 보여준다.
도 32는 패널 A 및 B를 포함한다. 패널 A는 대표적인 발현 생성물로서 루시퍼라제를 암호화하는 유전자를 포함하는 핵산 페이로드가 로딩된 서열번호: 388에 따른 비변형 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 투여된 마우스의 IVIS® 스펙트럼 생체내 이미징 시스템(IVIS) 이미지이다. 패널 B는 대표적인 발현 생성물로서 루시페라제를 암호화하는 유전자를 포함하는 핵산 페이로드가 로딩된 서열번호: 388에 따른 황산화된 미니 뉴클레오솜을 투여한 마우스의 IVIS® 스펙트럼 생체내 이미징 시스템(IVIS) 이미지이다. 패널 B는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 아닌 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은, 뉴런을 포함하는 중추 신경계 세포를 포함하는 특정 조직 및 척수 세포 및 뇌 뉴런을 포함하는 특정 조직에서 대표적인 핵산 페이로드 암호화된 발현 생성물(여기서, 루시페라제)의 강력한 발현을 초래한다는 것을 보여준다.
도 33은 패널 A, B, C, D 및 E를 포함한다. 패널 A는 대표적인 발현 생성물로서 루시퍼라제를 암호화하는 유전자를 포함하는 핵산 페이로드가 로딩된 서열번호:388에 따른 황산화 미니 뉴클레오솜이 투여된 마우스의 IVIS®스펙트럼 생체내 이미징 시스템(IVIS) 이미지이다. 패널 A는 뉴런을 포함하는 중추신경계 세포를 포함하는 특정 조직 및 척수 세포 및 뇌 뉴런을 포함하는 특정 조직에서 높은 발현도를 나타낸다. 패널 B, C, D 및 E는 도 A(왼쪽)에 표시된 동물의 뇌에서 대표적인 조직 섹션의 이미지이며, 각각은 다른 이미징 또는 오버레이를 나타낸다. 패널 B는 루시페라제 염색을 보여준다. 패널 C는 항-NeuN(뉴런 마커) 항체 염색을 보여준다. 패널 D는 D-DAPI(핵) 염색을 보여준다. 패널 E는 루시페라제, 항-NeuN 항체 및 D-DAPI 염색의 오버레이를 보여준다. 이미지는 미니 뉴클레오솜이 황산화되지만 미니 뉴클레오솜이 변형되지 않은 경우가 아닌 뇌 세포, 특히 뇌 뉴런을 포함한 뇌 세포에서 대표적인 핵산 페이로드 암호화된 발현 생성물(여기서, 루시퍼라제)의 강력한 발현을 보여준다.
도 34는 각각 망막 온조직 표본을 나타내는 패널 A, B, C, D, E 및 F를 포함한다. 패널 A, B 및 C는 대표적인 발현생성물로서 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 유전자를 포함하는 핵산 페이로드가 로딩된 서열번호: 401에 따른 비변형 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 투여된 마우스의 대표적인 망막 온조직 표본을 보여준다. 패널 A는 천연 GFP 형광을 보여준다. 패널 B는 항-GFP 항체 염색을 보여준다. 패널 C는 천연 GFP 형광 및 항-GFP 항체 염색의 오버레이를 보여준다. 패널 D, E 및 F는 대표적인 발현 생성물로서 GFP를 암호화하는 유전자를 포함하는 핵산 페이로드가 로딩된 서열번호: 401에 따른 아세틸화된 미니 뉴클레오솜을 투여한 마우스로부터의 대표적인 망막 온조직 표본를 보여준다. 패널 D는 천연 GFP 형광을 보여준다. 패널 E는 항-GFP 항체 염색을 보여준다. 패널 F는 천연 GFP 형광 및 항-GFP 항체 염색의 오버레이를 보여준다. 이미지는 미니 뉴클레오솜이 아세틸화되지만 미니 뉴클레오솜이 변형되지 않은 경우가 아닌 망막 세포, 특히 광수용기에서 대표적인 핵산 페이로드 암호화된 발현 생성물(여기서, GFP)의 강력한 발현을 보여준다.
도 35는 패널 A, B, C 및 D를 포함하며, 이들 각각은 대표적인 발현 생성물로서 GFP를 암호화하는 유전자를 포함하는 핵산 페이로드가 로딩된 서열번호:447에 따른 만노실화 미니 뉴클레오솜이 투여된 마우스의 대표적인 망막 온조직 표본의 이미지이다. 패널 A는 천연 GFP 형광을 보여준다. 패널 B는 항-GFP 항체 염색을 보여준다. 패널 C는 땅콩 응집소(PNA; 광수용체 마커) 염색을 보여준다. 패널 D는 천연 GFP 형광, 항-GFP 항체 염색 및 PNA 염색의 오버레이를 보여준다. 이미지는, 미니 뉴클레오솜이 만노실화될 때 망막 세포, 특히 광수용체에서 대표적인 핵산 페이로드 암호화된 발현 생성물(여기서, GFP)의 강력한 발현을 보여준다. 동일한 핵산 페이로드로 로딩된 변형되지 않은 대조군은 망막 세포 또는 광수용체에서 강력하게 발현되지 않았다.

본 개시내용은, 그 중에서도, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 관련한 방법 및 조성물 및 이의 용도를 제공한다. 본원에 개시된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은, 그 중에서도, (a) 핵산 결합 도메인(NABD), (b) 표적화 도메인 및/또는 (c) 핵산 방출 도메인, 및/또는 안정성 도메인, 및 /또는 올리고머화 도메인, 및/또는 링커 도메인을 포함한다. 본원에 개시된 특정 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 (a) 핵산 결합 도메인(NABD); (b) 표적화 도메인; (c) 핵산 방출 도메인; 및, 선택적으로, (d) 예를 들어, 안정성 도메인, 올리고머화 도메인 및/또는 링커 도메인 중 하나 이상을 포함하는 추가 도메인을 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 개시내용의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이고, 즉 본원에 제공된 변형을 포함하도록 변형된 아미노산 잔기와 같은 하나 이상의 변형된 아미노산 잔기를 포함한다는 점에서 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이고, (i) 인산화; (ii) 황산화; (iii) 글리코실화(예를 들어, N-글리코실화, C-글리코실화, 및/또는 O-글리코실화); (iv) 프레닐화(예: 게라닐화 및/또는 파르네실화); (v) 메틸화; (vi) 시알화; (vii) 지질화 및/또는 리포일화; (viii) 아세틸화; (ix) 수산화; (x) 팔미토일화; (xi) 만노실화; (xii) 미리스토일화; (xiii) 푸코실화; (xiv) 페길화; 및/또는 (xv) 예를 들어 분지형 또는 비분지형 변형 사슬에서 임의의 수의 하나 이상의 변형 또는 이의 변이체를 포함하는 이의 임의의 조합 중 하나 이상을 제한없이 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 개시내용의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 (a) 핵산 결합 도메인("NABD"); (b) 표적화 도메인; (c) 변형된 아미노산 잔기; 및, 선택적으로, (d) 예를 들어, 핵산 방출 도메인, 안정성 도메인, 올리고머화 도메인 및/또는 링커 도메인 중 하나 이상을 포함하는 추가 도메인을 포함하는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질일 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 개시내용의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 (a) 핵산 결합 도메인("NABD"); (b) 표적화 도메인; (c) 핵산 방출 도메인; (d) 변형된 아미노산 잔기; 및 선택적으로 (e) 안정성 도메인, 예를 들어, 올리고머화 도메인 및/또는 링커 도메인 중 하나 이상을 포함하는 추가 도메인을 포함하는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질일 수 있다. 다양한 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 하나 이상의 핵산 분자와 회합되어 로딩된 미니 뉴클레오솜을 형성하고, 이에 의해 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(미니 뉴클레오솜 코어 단백질 및 회합된 핵산 분자는 또한 본 원에서 함께 로딩된 미니 뉴클레오솜으로 지칭됨)을 형성할 수 있다. 다양한 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 2개 이상의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 및 하나 이상의 핵산 분자를 포함한다. 다양한 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.

폴리뉴클레오티드 쇄는 전형적으로 음전하를 가진 포스페이트를 운반한다. 따라서, 히스톤과 같은 단백질의 양전하는 핵산을 축합하는 데 도움이 된다. 본 개시내용은 예를 들어 히스톤으로부터 유래된 핵산 결합 도메인이 비바이러스 단백질성 벡터로서 인공적으로 구축된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에서 활용될 수 있다는 것을 인식한다.

대부분의 포유류 세포는 바이러스 및 박테리아와 같은 분자 또는 독립체를 인식하고(및/또는 이에 의해 인식되고), 결합하고, 내재화하는 세포 표면 결합 모이어티 또는 수용체를 보유한다. 본원에 개시된 다양한 조성물 및 방법은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에서 핵산 결합 도메인 및 폴리-아르기닌 도메인과 조합하여 이러한 세포 표면 결합 모티프를 사용하게 한다. 다양한 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 하나 이상의 핵산을 축합하거나, 또는 이의 축합에 참여하거나 또는 용이하게 할 수 있다. 다양한 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 예를 들어, 세포내이입 또는 다른 세포 진입 메커니즘을 통해 예를 들어 로딩된 미니 뉴클레오솜에서 회합된 핵산의 특이적 세포 유형으로의 내재화를 용이하게 한다. 따라서, 다양한 구현예에서, 본 개시내용은 시스템, 예를 들어, 인간인 시스템의 세포에 자연적으로 존재하는 세포 표면 모이어티 또는 수용체와 결합할 수 있는 표적화 모이어티를 혼입하는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함하며, 여기서 세포 표면 모이어티 또는 수용체는 세포 진입 메커니즘을 제공한다. 다양한 경우에, 세포 표면 모이어티 또는 수용체는 세포 유형 특이적이고 따라서 선택된 세포 유형에 핵산의 특이적 전달을 용이하게 한다.

핵산 분자는 큰 음전하를 가질 수 있고, 예를 들어, 대상체에 투여한 후, 체액에서의 분해에 취약하고, 간단한 주사 또는 세포에 대한 노출을 통해 세포에 진입할 수 없다. 해당 큰 음전하는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함하는 미니 뉴클레오솜 코어-단백질에 의해 중화되어 특정 모양, 크기, 및 전하의 로딩된 미니 뉴클레오솜을 형성하고/하거나 수동 확산 또는 능동 수송에 의해 세포로 들어갈 수 있다. 본원에 기재된 다양한 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 핵산의 적절한 결합, 축합 및 표적화를 허용한다. 본원에 기재된 이들 도메인은 인간 단백질 또는 다른 유기체로부터 유래될 수 있다. 당업자는 예를 들어, 세포 부착, 내재화 등과 같은 특정 기능을 향상시키기 위해 아미노산 서열을 변경하여 본원에 기재된 도메인 및/또는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 변형시키거나 또는 조작하는 것을 고려할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 당업자는 또한 도메인을 역 서열에 배치하거나 또는 도메인 내의 아미노산 위치를 전환하거나 또는 아세틸화, 당화 등과 같은 다양한 번역후 변형을 아미노산에 추가하는 것을 고려할 수 있지만 이제 제한되지 않는다. 본원에 기재된 다양한 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 적어도 하나의 변형된 아미노산 잔기를 포함한다.

핵산 결합 도메인

본 개시내용은 양으로 하전된 도메인이 핵산과 회합한다는 인식을 포함한다. 본 개시내용은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 포함될 수 있는 핵산 결합 도메인, 예를 들어, DNA 및 RNA 결합 도메인을 제공한다. 일부 경우에, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 존재하는 DNA 결합 도메인은 본원에 개시된 DNA 결합 도메인이다. 일부 경우에, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 존재하는 RNA 결합 도메인은 본원에 개시된 RNA 결합 도메인이다.

일부 특정 경우에, 본원에 개시된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 존재하는 DNA 결합 도메인인 NABD는 히스톤 폴리펩티드 서열로부터 유래될 수 있다. 유전자 전달을 위해 DNA를 더 작은 입자로 압축하도록 폴리-리신 펩티드를 활용하는 DNA 나노입자와 같은 비바이러스 벡터(Liu G. 등, 2003)가 적어도 일부 경우에 사용되었으며, 질환의 치료에서 성공적이거나 또는 유의한 반응은 없었다(Konstan M.W. 등, 2004). 본 개시내용은 다양한 구현예에서, 히스톤의 DNA 결합 도메인, 예를 들어 아미노산 서열 KRHRK의 사용을 포함하는 유의하게 상이한 접근법을 제공한다. 이 아미노산 서열은 다음 2 가지 목적을 제공하는 데, 첫째로 핵산과 회합하는 데 필요한 많은 양전하를 제공하며, 둘째로, 또한 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 구조에 대한 안정성을 제공한다. 셋째로, 이 NABD에서 아미노산 서열 KRH는 또한 전단백질 전환효소에 대한 절단 부위여서 세포에서 유전적 운반체를 효율적으로 방출하게 한다.

NABD의 다른 예는 표 3에 제공되어 있다.

RRRRR과 같은 폴리-아르기닌 구역은 핵산 결합을 증가시킬 뿐만 아니라 조성물의 양전하 및/또는 세포 침투 능력을 향상시키기 위해 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 포함될 수 있다. 폴리-아르기닌 구역은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 및/또는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜에 의해 세포의 침투를 용이하게 하기에 적합한 위치에서 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 존재할 수 있다. 당업자는 이러한 위치를 결정하게 하는 방법 및 기술을 알고 있을 것이다. 아르기닌은 인지질과 상호작용하여 하나 초과의 지질 헤드의 포스페이트와의 동시 회합으로부터 두자리 또는 여러자리 수소 결합을 형성하여 단일 지질 헤드기 상의 포스페이트와 상호작용한다. 이후, 아르기닌만이 두자리 수소 결합을 형성할 수 있으므로, 폴리-아르기닌은 더 많은 양쪽성 이온 및 음이온성 지질과 결합할 수 있어서 윤곽 길이에 따라 양의 곡률을 생성하여, 음의 가우스(Gaussian) 곡률을 생성한다(Rothbard, J.B., 등 2005). 폴리-아르기닌 구역은 또한 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 안정성을 개선하기 위해 하나 이상의 히스티딘(H) 아미노산(또는 임의의 다른 아미노산)을 구체적으로 포함하도록 변형될 수 있다. 히스티딘(또는 임의의 다른 아미노산)은 표 3에 제시된 바와 같은 폴리-아르기닌 구역에서 임의의 위치에 삽입될 수 있다. ANTP Penetratin, 및 TAT와 같은 다른 아르기닌-풍부 펩티드가 또한 세포 침투에 유사한 영향을 미치는 것으로 나타났다.

본 개시내용은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에서 리신의 아세틸화에 의해 핵의 진정염색질 영역에 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 국소화가 용이하게 될 수 있다는 인식을 포함한다. 이 안정화 메커니즘은 번역후 변형된 히스톤을 안정화하는 메커니즘과 적어도 부분적으로 관련될 수 있다. 메틸화된 히스톤은 더 단단하게 채운다. 히스톤 메틸화는 동적일 수 있다. 적용될 수 있는 다른 번역후 변형은 다음과 같다: 인산화, 글리코실화, 프레닐화, 리포일화, 알킬화, 아실화, 당화, 니트로실화, 황산화, 카바밀화, 카보닐화, 수모일화, 네딜화, 비오티닐화, 리보실화 등. 변형은 여기에 언급된 것으로 제한되지 않는다. 다른 변형은 보조인자, 조효소, 소수성 기, 친수성 기, 더 작은 화학 기, 더 작은 펩티드 등의 부착을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 또한 본원에 기재된 이러한 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 아미노산에 적용될 수 있다. 본원에 언급된 핵산 결합 도메인은 표 3에서 임의의 위치의 폴리펩티드에 혼입되어 표 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11 및 12에 제공된 다른 도메인과 조합하여 핵산 결합을 향상시킬 수 있다.

표 3:

의심의 여지를 없애기 위해, 본 개시내용은 핵산 결합 도메인의 적어도 하나의 아미노산이 본원에 개시된 변형을 포함하는 본 개시내용의 핵산 결합 도메인을 제한 없이 포함하는 변형된 핵산 결합 도메인을 포함한다.

표적화 도메인

본원에 개시된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 미니 뉴클레오솜을 하나 이상의 세포 또는 세포 유형에 표적화하는 표적화 도메인을 포함한다.

일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 표적화 도메인은 하나 이상의 세포 또는 세포 유형에 부착하고 진입하게 하는 아미노산 도메인이다. 표적화 도메인은 특정 세포 유형에 특이적일 수 있지만 또한 일반적으로 세포로의 진입을 용이하게 하는 도메인을 포함할 수 있다는 것으로 이해되어야 한다. 일반적으로, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 표적화 도메인은 부착, 세포 유형 특이적 결합, 및 내재화 중 하나 이상에 기여할 수 있다. 표적화 도메인은 예를 들어, 세포 부착 표적화 도메인, 베타 갈락토스 결합 도메인, 푸코스 결합 도메인, 헤파린 결합 도메인, 시알산 결합 도메인, 당단백질 결합 도메인, 탄수화물 결합 도메인, 리소포스파티드산 결합, cAMP 결합 도메인, 히알루로난 결합 도메인, 콘드로이틴 술페이트 결합 도메인, 인테그린 결합 도메인, 뉴클레올린 결합 도메인, 콜라겐 결합 도메인, 클라트린 결합 도메인, Fc 수용체 결합 도메인, 액틴 결합 도메인, 세포내이입 모티프 또는 핵 국소화 신호일 수 있다. 일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 표적화 도메인은 하나 이상의 세포 또는 세포 유형으로의 결합 및 진입을 허용하고 포유동물, 바이러스, 바이러스 입자, 프리온, 박테리아 또는 진균 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 도메인이다.

의심의 여지를 없애기 위해, 본 개시내용은 표적화 도메인의 적어도 하나의 아미노산이 본원에 개시된 변형을 포함하는 본 개시내용의 표적화 도메인을 제한 없이 포함하는 변형된 표적화 도메인을 포함한다.

세포 부착 표적화 도메인:

세포 부착은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 로딩된 미니 뉴클레오솜이 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함하고, 세포에 부착될 수 있고, 다양한 경우에 세포로의 진입을 용이하게 하는 수단이다. 다양한 바이러스는 숙주 세포에 결합하게 하고 그들로의 진입을 향상시키는 접착 분자 또는 도메인을 갖는다. 예를 들어, 독감 바이러스는 세포 표면 상의 시알산에 결합시키는 표면 상의 헤마글루티닌을 갖는다. 본 개시내용은 그 중에서도, 시알산, 갈락토스, 푸코스, 히알루론산, 및 콘드로이틴 술페이트에 대한 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 결합을 허용하는 여러 이러한 도메인, 뿐만 아니라 내재화를 위한 세포 부착을 향상시키는 당단백질을 제공한다. 본원에 개시된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 하나 이상의 세포 부착 표적화 도메인을 포함할 수 있다. 세포 부착 표적화 도메인은 표 4에 제시된 도메인을 포함한다. 본 개시내용의 세포 부착 표적화 도메인은 임의의 위치에서 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 및/또는 예를 들어, 표 3, 5, 6, 7 8, 9, 10, 11 및 12에서 본원에 제공된 임의의 하나 이상의 다른 도메인과 조합하여 존재할 수 있다.

표 4:

세포 부착은 또한 RGD, RGDS 등과 같은 도메인에 의해 달성될 수 있다. (D'Souza SE 등, 1991). 인테그린, 뉴클레올린, 콜라겐, 클라트린, Fc 수용체와 같은 세포 표면 단백질에 대한 결합은 또한 바이러스 및 다른 입자가 세포로 진입하는 것을 돕는다. 본 개시내용은 그 중에서도, 세포 흡수를 증가시키기 위해 인테그린, 뉴클레올린, 콜라겐, 클라트린, Fc 수용체에 결합시키는 도메인을 제공한다. 세포 부착 도메인은 표 5에 제시된 도메인을 포함한다. 표 5에 제공된 세포 부착 표적화 도메인은 임의의 위치에서 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 및/또는 예를 들어, 표 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12에서 본원에 제공된 임의의 하나 이상의 다른 도메인과 조합하여 존재할 수 있다.

표 5:

의심의 여지를 없애기 위해, 본 개시내용은 세포 부착 표적화 도메인의 적어도 하나의 아미노산이 본원에 개시된 변형을 포함하는 본 개시내용의 세포 부착 표적화 도메인을 제한 없이 포함하는 변형된 세포 부착 표적화 도메인을 포함한다.

내재화 표적화 도메인:

바이러스 및 포유류 단백질의 특정 도메인은 세포 내재화에 직접적으로 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 특정 단백질의 도메인, 및 순차적 배열은 Oleson 등, 2008에 기재되어 있다. 예를 들어, PPxY-모티프는 아데노바이러스를 세포로 진입하는 데 필요하며(Wodrich 등, 2010), 여기서 x는 임의의 아미노산일 수 있다. 내재화 표적화 도메인의 또 다른 예는 GTALL 모티프인 5 개 아미노산 잔기 도메인이며, 루틴화 호르몬(LH) 수용체의 카복실-말단 꼬리에서 리간드-수용체 복합체를 분해 경로에서 재순환 경로로 지시한다(Pandey, 2009). GTALL 모티프는 또한 카복실-말단 테트라펩티드 서열 모티프 DSLL에 서열 상동성을 나타내며, 이는 β-아드레날린 작용성 수용체의 내재화에 참여하는 것으로 제안되었다. Pandey는 또한 클라트린-의존적 운반체가 일반적으로 어댑터 단백질-2(AP-2)에 의해 인식되는 YXXQ(여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있음)와 같은 짧은 서열 모티프를 함유하고 보조 클라트린 어댑터 단백질에 의해 인식되는 Asn-Pro-X-Tyr 서열(NPXY) 모티프를 함유할 수 있다는 것을 논의한다. 트랜스페린. NPXY 모티프는 또한 Kirchhausen, 1999에 의해 논의되었다. NPTY는 또한 APP의 세포내이입 모티프이다. 내재화를 허용하는 클라트린 결합 도메인의 또 다른 예는 FXDXF(여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있음)이다(Lene E. Oleson. 2008). 내재화 표적화 도메인은 표 6에 제공된 도메인을 포함한다.

본 개시내용에 의해 제공된 다른 특성은 하나 이상의 류신 및 이소류신 잔기를 포함하며, 이 잔기는 자연에서 매우 소수성이다. 사실, 류신은 두번째로 가장 소수성인 아미노산이다. 다양한 구현예에서, 류신 잔기는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 조성물에서 다중 기능을 제공할 수 있다. 첫째로, 양친매성 분자의 비극성면의 소수성은 펩티드 2차 구조를 안정화하는 데 중요한 역할을 한다(Chen Y. 등, 2007). 둘째로, 디류신-유형의 신호 모티프는 막 수용체 및 막 단백질을 세포하 구획으로 내재화 및 트래피킹(trafficking)하는데 필수적인 것으로 제시되었다. 예를 들어, GLUT4(글루코스 수송체 4), LDL(저밀도 지단백질); LH(루틴화 호르몬), TGN(트랜스-골지 네트워크)은 모두 세포로의 내재화를 돕는 디류신 모티프를 가지고 있다. Fc 수용체 디류신 모티프는 또한 세포내이입을 위한 신호를 전달한다(Wu Z. and Simister N.E., 2001). 표 4에 제공된 내재화 표적화 도메인은 임의의 위치에서 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 및/또는 예를 들어, 표 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11 및 12에서 본원에 제공된 임의의 하나 이상의 다른 도메인과 조합하여 존재할 수 있다.

표 6:

의심의 여지를 없애기 위해, 본 개시내용은 내재화 표적화 도메인의 적어도 하나의 아미노산이 본원에 개시된 변형을 포함하는 본 개시내용의 내재화 표적화 도메인을 제한 없이 포함하는 변형된 내재화 표적화 도메인을 포함한다.

핵 표적화 도메인

다양한 구현예에서, 세포 진입 후, 핵산 운반체가 핵에 도달하는 것이 중요하다. 핵 내재화 신호 또는 핵 유입 기구에 대한 결합은 핵 국소화의 핵심이다. 기능성 진핵 핵 국소화 신호는 박테리오파지의 말단 단백질에 널리 퍼져있다(Redrejo-Rodriguez 등, 2012). Chan 및 Jans는 폴리리신 자체가 핵 국소화 신호로서 기능하지 않는다는 것을 제시하였다. 따라서, 핵 표적화 신호를 첨가하여 비바이러스 유전자 전달을 향상시키는 것은 논리적인 접근법이다(Chan and Jans, 1999). 폴리펩티드에서 NLS의 위치는 또한 기능의 핵심이다. 본 발명자들은 향상된 핵 진입을 위해 표 7에 NLS 서열을 나열하고 표 13에 효율적인 핵 진입을 위한 미니 뉴클레오솜 단백질 내에서 NLS 신호의 특정 선호 위치를 제공하였다. 표 7에서 본원에 언급된 도메인은 임의의 위치에서 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 혼입되어 표 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 및 12에 제공된 다른 도메인과 조합하여 핵산 결합을 향상시킬 수 있다.

표: 7

의심의 여지를 없애기 위해, 본 개시내용은 핵 표적화 도메인의 적어도 하나의 아미노산이 본원에 개시된 변형을 포함하는 본 개시내용의 핵 표적화 도메인을 제한 없이 포함하는 변형된 핵 표적화 도메인을 포함한다.

세포 유형 특이적 표적화 도메인:

다양한 구현예에서, 더 큰 농도의 입자를 원하는 세포 유형으로 회귀시키는 것이 가장 바람직하다. 이는 흡수를 증가시키고 발현을 증가시키는 2 가지 유리한 유전자 요법 결과를 허용한다. 문헌에서, 이러한 속성에 대해 발견된 모티프는 거의 없다. 이들 대부분은 상이한 캡시드와는 상이하게 되는 바이러스 향성을 나타내는 실험에서 비롯된다. 본 개시내용은, 다양한 구현예에서, 정의된 모티프 중 일부를 사용하여, 뉴런, 근육, 간, 폐, 신장, 내피 세포 또는 종양 부위에서 발현을 향상시키는 것을 포함한다. 세포 유형 특이적 표적화 도메인은 표 8에 제시된 도메인을 포함한다. 표 8의 세포 유형 특이적 표적화 도메인은 임의의 위치에서 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 및/또는 예를 들어, 표 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11 및 12에서 본원에 제공된 임의의 하나 이상의 다른 모티프와 조합하여 존재할 수 있다.

표: 8

의심의 여지를 없애기 위해, 본 개시내용은 세포-유형 특이적 표적화 도메인의 적어도 하나의 아미노산이 본원에 개시된 변형을 포함하는 본 개시내용의 세포-유형 특이적 표적화 도메인을 제한 없이 포함하는 변형된 세포-유형 특이적 표적화 도메인을 포함한다.

핵산 방출 도메인:

일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜의 "핵산 방출 도메인"("NARD")은 로딩된 미니 뉴클레오솜의 핵산 운반체의 방출을 유발하거나 촉진하는 아미노산이다(예를 들어, 로딩된 미니 뉴클레오솜의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 관련된 하나 이상의 핵산의 방출). 다양한 구현예에서, 핵산 운반체가 방출되는 조건을 제어 또는 조절함으로써, 핵산 방출 도메인은 세포, 예를 들어 세포의 세포질 또는 핵으로의 핵산 운반체 전달을 개선할 수 있다.

로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(예를 들어, 대상체 또는 시스템에 전달될 때)과 관련된 핵산이 로딩된 미니 뉴클레오솜이 세포(예를 들어, 대상체의 세포 또는 시스템)에 진입하기 전에 로딩된 미니 뉴클레오솜으로부터 방출되지 않는 것이 매우 바람직하다. 세포 내에서, 세포질 또는 핵에서 핵산 운반체의 방출이 바람직할 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 프로테아제 및 엔도펩티다제는 세포 내부에 로딩된 미니 뉴클레오솜의 하나 이상의 핵산의 방출을 일으키거나 촉진할 수 있다, 예를 들어, 로딩된 미니 뉴클레오솜의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질로부터 로딩된 미니 뉴클레오솜의 하나 이상의 핵산의 해리를 유발하거나 촉진하는 단계. 전단백질 전환효소 및 엔도펩티다제는 특정 아미노산 도메인에서 폴리펩티드를 절단하는 예시적인 작용제이며, 이러한 현상은 세포(예를 들어, 대상체의 세포 또는 시스템), 예를 들어 세포의 세포질 또는 핵으로 전달시에 관련된 핵산 운반체를 방출할 수 있는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 제공하기 위해 본원에서 이용된다.

KRH는 핵산 방출 도메인으로서 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 포함될 수 있는 예시적인 절단 도메인이다. KRH는 Pcsk1 및 Pcsk2의 절단 부위이다. KRH 절단 부위의 하나의 비제한적인 예를 제공하기 위해, 프로글루카곤은 Pcsk1 또는 Pcsk2에 의해 췌장 A 세포 및 장 세포에서 조직-특이적 방식으로 번역후 처리된다.

NRRKKRAL은 핵산 방출 도메인으로서 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 포함될 수 있는 예시적인 절단 도메인이다. NRRKKRAL 절단 도메인의 하나의 비제한적인 예를 제공하기 위해, NRRKKRAL은 TGFB1에 대한 푸린 절단 부위이다. 또 다른 예시적인 절단 도메인은 부갑상선 호르몬의 푸린 절단 부위인 KSVKKRSVSEIQ이다.

다양한 다른 절단 도메인이 당업계에 공지되어 있고 핵산 방출 도메인으로서 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 포함될 수 있다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 절단 부위는 Expasy, OmicX, PROSPERous, Prop1.0, SignalP-5.0, MEROPS, CutDB, Peptide Cutter 등과 같은 생물정보학 플랫폼을 사용하여 인 실리코로 예측될 수 있다.

본 개시내용은 본 개시내용의 절단 도메인이 세포(예를 들어, 대상체의 세포 또는 시스템), 예를 들어, 세포질또는 핵에서 로딩된 미니 뉴클레오솜의 핵산 운반체의 방출을 야기하거나 촉진하기 위해 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 포함될 수 있다. 표 9에 제공된 도메인을 포함하여 본원에 제공된 도메인은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 내의 임의의 위치에서 본 개시내용의 미니 뉴클레오솜코어 단백질(예를 들어, 변형된 미니 뉴클레오솜코어 단백질)에 존재할 수 있다. 의심의 여지를 없애기 위해, 본 개시내용의 핵산 방출 도메인은 표 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11 및 12에 제공된 것을 제한 없이 포함하는 본원에 제공된 다른 도메인과 조합하여 미니 뉴클레오솜코어 단백질에 존재할 수 있다. 본 개시내용의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 내에 임의의 곳에 존재할 때, 본 개시내용의 핵산 방출 도메인은 로딩된 미니 뉴클레오솜의 핵산 운반체의 방출을 향상시킬 수 있다.

표: 9

의심의 여지를 없애기 위해, 본 개시내용은 핵산 방출 도메인의 적어도 하나의 아미노산이 본원에 개시된 변형을 포함하는 본 개시내용의 핵산 방출 도메인을 제한 없이 포함하는 변형된 핵산 방출 도메인을 포함한다.

안정성 도메인:

일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜의 "안정성 도메인"은 로딩된 미니 뉴클레오솜이 체액, 세포질 및 핵에서 안정하게 유지되게 하는 아민노산 도메인이다.

입자 안정성은 세포로의 안전한 통과 및 발현의 오랜 지속성에 중요하다. 입자가 안정성을 상실하는 여러 이유가 있다. 첫째로, 입자는 혈액 및 다른 체액에서 안정되어야 한다. 둘째로, 입자는 엔도솜 진입을 안전하게 횡단하여 안전하게 탈출하여 세포질로 빠져 나가야 한다. 바이러스 입자 또는 재순환된 수용체는 여러 도메인을 사용하여 엔도솜으로 들어가고 이를 탈출한다. 본 발명자들은 엔도솜 진입 및 탈출 도메인을 혼입하여 안정성을 증가시키는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 예를 제공한다. 표 10에서 본원에 언급된 도메인은 바람직하게는 C-말단에서 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 혼입될 뿐만 아니라 표 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 및 12에 제공된 다른 도메인과 조합될 때 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 안정성을 향상시키기 위해 임의의 위치에 혼입될 수 있다. 당업자는 또한 단백질 안정성을 증가시키는, 향상된 어셈블리 등의 수단을 제공하고 리간드-수용체 상호작용을 강화하기 위해 펩티드에서 소수성 아미노산의 불소화를 고려할 수 있다. 당업자는 또한 단백질 안정성을 증가시키는, 향상된 어셈블리 등의 수단을 제공하고 리간드-수용체 상호작용을 강화하기 위해 펩티드에서 아미노산에 대한 다른 번역후 변형을 고려할 수 있다.

표: 10

의심의 여지를 없애기 위해, 본 개시내용은 핵산 방출 도메인의 적어도 하나의 아미노산이 본원에 개시된 변형을 포함하는 본 개시내용의 핵산 방출 도메인을 제한 없이 포함하는 변형된 핵산 방출 도메인을 포함한다.

올리고머화 도메인:

올리고머화는 단량체가 회합하여 이량체 및 고차 거대분자 복합체를 포함하는 다량체를 형성하는 화학적 과정이다. 단백질성 분자의 올리고머화는 종종 단량체의 회합을 촉진하는 도메인에 의해 용이하게 된다.

일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜의 "올리고머화 도메인"은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 또는 로딩된 미니 뉴클레오솜이 동종이량체, 이종이량체, 사량체, 팔량체와 같은 고차 구조 또는 다른 고차 구조와 회합하게 하는 아미노산 도메인이다. 올리고머화는 로딩된 미니 뉴클레오솜의 크기를 줄일 수 있다. 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 다량체는 2 개 이상의 동일한 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(예를 들어, 동일한 아미노산 서열을 갖는 2 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질)을 포함할 수 있고/있거나 2 개의 더욱 뚜렷한 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(예를 들어, 상이한 아미노산 서열을 갖는 2 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질)을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 올리고머화 도메인의 예는 어떠한 방식으로도 제한되지 않으며 당업자는 이러한 도메인이 효모-2 하이브리드 스크리닝, 질량 분석법에 결합된 친화성 정제, 텍스트 마이닝(text mining)을 포함한 다양한 방법에 의해, 또는 인공 지능 및 기계 학습에 의해 인식되거나 또는 식별될 수 있다는 것을 이해할 수 있다. 당업자는 또한 유도성 동종이량체화 시스템 및/또는 화학적으로 유도된 이량체화를 사용하여 로딩된 미니 뉴클레오솜을 형성하는 유도성 시스템을 생성할 수 있다.

일부 구현예에서, 올리고머화 도메인은 3 개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어 표 11에서 본원에 개시된 올리고머화 도메인은 예를 들어, 표 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10 및 12에서 예를 들어 본원에 제공된 다른 도메인과 조합하여 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 임의의 위치에서 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 혼입될 수 있다. 특정한 특정 구현예에서, 올리고머화 도메인은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 C-말단에 위치한다.

표: 11

의심의 여지를 없애기 위해, 본 개시내용은 올리고머화 도메인의 적어도 하나의 아미노산이 본원에 개시된 변형을 포함하는 본 개시내용의 올리고머화 도메인을 제한 없이 포함하는 변형된 올리고머화 도메인을 포함한다.

링커:

단백질이 일부 경우에 링커의 포함으로부터 이익을 얻을 수 있는 융합 단백질을 생성하는 것이 당업계에 알려져 있다. 본 개시내용은 예를 들어, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 2 개의 도메인 사이에 하나 이상의 링커를 포함하는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함한다. 링커는 단백질 구조 안정성에 기여할 수 있다. 일부 경우에, 링커는 도메인 사이를 분리하고 다른 경우에 이들은 단백질의 기능에 직접적으로 영향을 미칠 수 있다. 일부 링커는 강성을 증가시켜 단백질 도메인을 효과적으로 분리시킨다. 링커는 또한 절단 부위를 도입하도록 구현될 수 있다. 링커는 단백질 공학 분야에서 이러한 이유로 사용되었다. 그러나, 비바이러스 유전자 전달의 맥락에서 이 전략은 활용되지 않았다. 여기서 본 발명자들은 링커가 원하는 세포 유형에서 선택적 형질도입, 유전자 전달 및 이식유전자 발현과 같은 기능성 목적을 위해 도메인을 조작하는 데 성공적으로 사용될 수 있다는 것을 제시한다(도 10). 일부 경우에, 링커는 도메인을 분리하고 당업자는 기능성 도메인 사이의 비기능성 아미노산이 당업계에서 스페이서로 지칭되었음을 이해할 것이다. 의심의 여지를 없애기 위해, 본원에서 사용된 용어 링커는 스페이서를 포함한다.

일부 구현예에서, 링커 서열은 1 개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 표 12에서 본원에 개시된 링커 아미노산 서열은 서열번호: 238-335에 제시된 바와 같이 도메인 사이의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 혼입될 수 있으며, 여기서 링커는 표 1 및 12에 제공된 아미노산 또는 아미노산 서열 중 임의의 것을 갖는 링커일 수 있다. 링커는 표 12에 제공된 것들에 제한되지 않는 다른 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 링커 서열은 또한 사용자 선택 입력을 사용하여 링커 서열의 데이터베이스를 검색하고 기준에 맞는 링커 서열 결과를 생성하는 LINKER라고 부르는 프로그램을 통해 생성될 수 있다. 트레오닌, 세린, 글리신, 프롤린, 아르기닌 및 알라닌이 천연 링커 및 따라서 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에서 바람직한 잔기이다.

표 12.

의심의 여지를 없애기 위해, 본 개시내용은 링커의 적어도 하나의 아미노산이 본원에 개시된 변형을 포함하는 본 개시내용의 링커를 제한 없이 포함하는 변형된 링커를 포함한다.

미니 뉴클레오솜 코어 단백질

미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 본원에 제공된 하나 이상의 도메인을 포함할 수 있다.

본원에 개시된 미니 뉴클레오솜 단백질은 핵산 결합 도메인, 표적화 도메인 및/또는 핵산 방출 도메인 및/또는 안정성 도메인을 함유하는 적어도 양으로 하전된 아미노산 서열을 포함한다. 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 예를 들어, 서열번호: 336-388 중 임의의 것에 제시된 바와 같은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열일 수 있다. 다양한 구체예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 서열번호: 388-394, 399, 401 또는 447 중 하나에 제시된 제시된 바와 같은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다.

일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 10 내지 100 개 아미노산의 아미노산 서열 길이를 함유할 수 있다. 아미노산, 예를 들어, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 55, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 개 아미노산. 특정 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 예를 들어, 15 내지 90 개 아미노산, 20 내지 80 개 아미노산, 20 내지 70 개 아미노산, 20 내지 60 개 아미노산, 또는 30 내지 40 개 아미노산의 길이를 가질 수 있다.

특정 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 본원에 개시된 하나 이상의 도메인 및 본원에 개시된 도메인에 존재하지 않는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 특정 경우에, 본원에 개시된 도메인의 N-말단 또는 C-말단인 본원에 개시된 도메인에 존재하지 않는 아미노산은 "인접 아미노산"으로 지칭될 수 있고, 본원에 개시된 임의의 도메인에 존재하지 않는 미니 뉴클레오솜에 존재하는 모든 아미노산의 합은 "비도메인 아미노산"으로 지칭될 수 있다.

다양한 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비도메인 아미노산은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 전하에 기여하는 서열을 가질 수 있다. 다양한 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비도메인 아미노산은 적어도 10% 양으로 하전된 아미노산, 예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% 양으로 하전된 아미노산을 포함한다.

일부 구현예에서, pH7에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 10 내지 100의 총 양전하를 가질 수 있다.

일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 아미노산 서열의 임의의 위치에 배치된 하나 이상의 핵산 결합 도메인을 함유할 수 있다. 일부 경우에, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 핵산 결합 도메인만을 함유할 수 있다. 일부 경우에, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 핵산 결합 도메인 및 폴리-아르기닌 도메인 상에 함유될 수 있다. 일부 경우에, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 핵산 결합 도메인 및 표적화 도메인 상에 함유될 수 있다. 일부 경우에, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 폴리-아르기닌 도메인 및 표적화 도메인 만을 함유할 수 있다. 일부 경우에, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 폴리-아르기닌 도메인, 핵산 방출 도메인 및 표적화 도메인 만을 함유할 수 있다.

일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 아미노산 서열의 임의의 위치에 배치된 하나 이상의 폴리-아르기닌을 함유할 수 있다. 폴리-아르기닌 서열은 4-30 개의 아르기닌을 함유할 수 있다.

일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 하나 이상의 표적화 도메인을 함유할 수 있다. 표적화 도메인은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 아미노산 서열에서 임의의 위치에 배치될 수 있다.

일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 하나 이상의 핵산 방출 도메인을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 핵산 방출 도메인은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 아미노산 서열의 중간에 배치된다. 바람직하게는, 핵산 방출 도메인은 N-말단으로부터 6 개 아미노산 후 또는 C-말단으로부터 6 개 아미노산 전에 배치된다.

일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 하나 이상의 안정성 도메인을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 안정성 도메인은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 아미노산 서열의 C-말단에 배치된다. 일부 경우에, 안정성 도메인은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 아미노산 서열의 N-말단에 배치된다.

일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 하나 이상의 올리고머화 도메인을 포함할 수 있다. 특정한 특정 구현예에서, 올리고머화 도메인은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 아미노산 서열의 C-말단에 위치한다. 일부 경우에, 올리고머화 도메인은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 아미노산 서열의 N-말단에 위치한다.

따라서, 의심의 여지를 없애기 위해, 본원에 제시된 바와 같은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 (a) 핵산 결합 도메인(NABD), 및 (b) 표적화 도메인, 및 일부 구현예에서, (a) 핵산 결합 도메인(NABD), (b) 표적화 도메인, 및 (c) 핵산 방출 도메인을 포함할 수 있다. 당업자는 이들 구성요소를 포함하는 폴리펩티드가 본원에 개시된 바와 같은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 구성하여, 선택적으로 본원에 제시되고/되거나 본원에 제공되거나 또는 달리 당업계에 알려진 하나 이상의 추가 도메인을 포함하나 이에 제한되지 않는 추가 제한에 적용될 것임을 본 개시내용으로부터 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 서열번호: 1-28 중 임의의 것에 제시된 바와 같은(예를 들어, 표 3에 제시된 바와 같은) 핵산 결합 도메인과 적어도 65% 서열 동일성, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%를 갖는 핵산 결합 도메인을 포함할 수 있고/있거나, 2 개 이하의 아미노산 변화(예를 들어, 결실, 부가, 또는 치환, 예를 들어, 보존적 치환) 또는 1 개 이하의 아미노산 변화에 의해 서열번호: 1-28 중 임의의 것에 제시된 바와 같은 핵산 결합 도메인과 상이하다. 일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 서열번호: 29-53 중 임의의 것에 제시된 바와 같은(예를 들어, 표 4에 제시된 바와 같은) 세포 부착 표적화 도메인과 적어도 65% 서열 동일성, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%를 갖는 세포 부착 표적화 도메인이고/이거나, 2 개 이하의 아미노산 변화(예를 들어, 결실, 부가, 또는 치환, 예를 들어, 보존적 치환) 또는 1 개 이하의 아미노산 변화에 의해 서열번호: 29-53 중 임의의 것에 제시된 바와 같은 세포 부착 표적화 도메인과 상이한 표적화 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 서열번호: 54-81 중 임의의 것에 제시된 바와 같은(예를 들어, 표 5에 제시된 바와 같은) 세포 부착 표적화 도메인과 적어도 65% 서열 동일성, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%를 갖는 세포 부착 표적화 도메인이고/이거나, 2 개 이하의 아미노산 변화(예를 들어, 결실, 부가, 또는 치환, 예를 들어, 보존적 치환) 또는 1 개 이하의 아미노산 변화에 의해 서열번호: 54-81 중 임의의 것에 제시된 바와 같은 세포 부착 표적화 도메인과 상이한 표적화 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 서열번호: 82-115 중 임의의 것에 제시된 바와 같은(예를 들어, 표 6에 제시된 바와 같은) 내재화 표적화 도메인과 적어도 65% 서열 동일성, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%를 갖는 내재화 표적화 도메인이고/이거나, 2 개 이하의 아미노산 변화(예를 들어, 결실, 부가, 또는 치환, 예를 들어, 보존적 치환) 또는 1 개 이하의 아미노산 변화에 의해 서열번호: 82-115 중 임의의 것에 제시된 바와 같은 내재화 표적화 도메인과 상이한 표적화 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 서열번호: 116-139 중 임의의 것에 제시된 바와 같은(예를 들어, 표 7에 제시된 바와 같은) 핵 표적화 도메인과 적어도 65% 서열 동일성, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%를 갖는 핵 표적화 도메인이고/이거나, 2 개 이하의 아미노산 변화(예를 들어, 결실, 부가, 또는 치환, 예를 들어, 보존적 치환) 또는 1 개 이하의 아미노산 변화에 의해 서열번호: 116-139 중 임의의 것에 제시된 바와 같은 핵 표적화 도메인과 상이한 표적화 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 서열번호: 140-164 중 임의의 것에 제시된 바와 같은(예를 들어, 표 8에 제시된 바와 같은) 세포 유형 특이적 표적화 도메인과 적어도 65% 서열 동일성, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%를 갖는 세포 유형 특이적 표적화 도메인이고/이거나, 2 개 이하의 아미노산 변화(예를 들어, 결실, 부가, 또는 치환, 예를 들어, 보존적 치환) 또는 1 개 이하의 아미노산 변화에 의해 서열번호: 140-164 중 임의의 것에 제시된 바와 같은 세포 유형 특이적 표적화 도메인과 상이한 표적화 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 서열번호: 165-208 중 임의의 것에 제시된 바와 같은(예를 들어, 표 9에 제시된 바와 같은) 핵산 방출 도메인과 적어도 65% 서열 동일성, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%를 갖는 핵산 방출 도메인을 포함할 수 있고/있거나, 2 개 이하의 아미노산 변화(예를 들어, 결실, 부가, 또는 치환, 예를 들어, 보존적 치환) 또는 1 개 이하의 아미노산 변화에 의해 서열번호: 165-208 중 임의의 것에 제시된 바와 같은 핵산 방출 도메인과 상이하다. 일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 서열번호: 209-219 중 임의의 것에 제시된 바와 같은(예를 들어, 표 10에 제시된 바와 같은) 안정성 도메인과 적어도 65% 서열 동일성, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%를 갖는 안정성 도메인을 포함할 수 있고/있거나, 2 개 이하의 아미노산 변화(예를 들어, 결실, 부가, 또는 치환, 예를 들어, 보존적 치환) 또는 1 개 이하의 아미노산 변화에 의해 서열번호: 209-219 중 임의의 것에 제시된 바와 같은 안정성 도메인과 상이하다. 일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 서열번호: 220-237 중 임의의 것에 제시된 바와 같은(예를 들어, 표 11에 제시된 바와 같은) 올리고머화 도메인과 적어도 65% 서열 동일성, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%를 갖는 올리고머화 도메인을 포함할 수 있고/있거나, 2 개 이하의 아미노산 변화(예를 들어, 결실, 부가, 또는 치환, 예를 들어, 보존적 치환) 또는 1 개 이하의 아미노산 변화에 의해 서열번호: 220-237 중 임의의 것에 제시된 바와 같은 올리고머화 도메인과 상이하다. 일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 서열번호: 238-335 중 임의의 것에 제시된 바와 같은(예를 들어, 표 12에 제시된 바와 같은) 링커 도메인과 적어도 65% 서열 동일성, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%를 갖는 링커 도메인을 포함할 수 있고/있거나, 2 개 이하의 아미노산 변화(예를 들어, 결실, 부가, 또는 치환, 예를 들어, 보존적 치환) 또는 1 개 이하의 아미노산 변화에 의해 서열번호: 238-335 중 임의의 것에 제시된 바와 같은 링커 도메인과 상이하다.

당업자는 본원에 제공된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 도메인을 본원에 제공된 바와 같은 임의의 순서, 배향, 또는 서열로 배열할 수 있거나 또는 당업자에 의해 본 개시내용으로부터 달리 이해될 것이다. 예를 들어, 당업자는 본원에 구체적으로 개시되지 않은 하나 이상의 개입 아미노산이 있거나 또는 없이 임의의 도메인 쌍 사이 또는 임의의 도메인에 인접하여 개별적으로 또는 탠덤 복수로 포함될 수 있는 임의적인 서열로서 링커의 의도된 사용을 인식할 것이다. 따라서, 예를 들어, NABD는 표적화 도메인의 C-말단 또는 N-말단일 수 있다. 추가의 NABD 또는 추가의 표적화 도메인을 포함하나 제한되지 않는 본원에 제공된 추가의 도메인은 NABD의 C-말단 또는 N-말단 및 표적화 도메인의 C-말단 또는 N-말단일 수 있다. 더욱이, 링커를 포함하는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 존재하는 각각의 도메인의 경우, 하나 이상의 링커 도메인은 도메인의 C-말단 또는 도메인의 N-말단에 포함될 수 있다. 예시적인 미니 뉴클레오솜 단백질이 본원에 제공된다. 본 개시내용으로부터 당업자에게 용이하게 명백한 바와 같이, 본원에 제공된 도메인은 모듈식이고 임의의 순서로 의도된 기능과 함께 포함될 수 있고/있거나 이에 의해 이들이 존재하는 순서에 관계없이 의도된 유용성 또는 기능성을 갖는 미니 뉴클레오솜을 제공한다.

당업자는 본 개시내용의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 당업계에 알려진 임의의 수 또는 유형의 변형(예를 들어, 번역후 변형)을 포함할 수 있다는 것을 추가로 인식할 것이다. 이러한 변형은 페길화, 아세틸화, 메틸화, 글리코실화, 인산화, 수모일화, 아미드화, 지질화, 및/또는 메틸화를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다양한 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 페길화될 수 있다.

일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 회합에 의해 변형된다. PEG는 비이온성, 무독성, 생체적합성 및 매우 친수성 중합체이다. PEG는 주로 생물학적 거대분자 및 표면의 공유 변형에 사용된다. PEG 접합은 폴리펩티드의 겉보기 크기를 증가시켜, 신장 여과를 감소시키고 생체분포를 변경한다. 펩티드의 페길화는 용해도 증가(소수성 펩티드의 경우), 감소된 신장 청소율을 통한 반감기 연장, 및 숙주에서 최소 면역 반응에 대한 항원성 차폐로 인해 치료적 특성을 향상시킬 수 있다. 다양한 PEG 쇄 길이의 PEG는 5-40 kDa 범위의 분자량을 갖는 FDA 승인된 약물에 사용되었다. 도 1, 3, 4, 5 및 6에서, 본 발명자들은 다양한 PEG 쇄 길이의 PEG가 다양한 크기의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 제공하기 위해 활용될 수 있는 방법의 개략도를 나타낸다.

많은 현재 입자는 크기가 10kDa 이상인 PEG를 사용하지만, 더 큰 PEG 크기를 사용하는 것의 단점은 또한 입자 크기를 증가시킨다는 점이다. (Feuz L. 등 2007). 본 개시내용은, 그 중에서도, 다양한 크기, 바람직하게는 직경이 20nm 미만인 미니 뉴클레오솜을 제형화하기 위해 다양한 PEG 길이를 갖는 입자를 제공한다. 도 1에서, 본 발명자들은 12 개 쇄의 최소 PEG 길이 및 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에서 아미노산을 변형하기 위해 이를 활용할 수 있는 방법을 나타낸다. 로딩된 미니 뉴클레오솜의 최종 크기는 또한 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 변형시키는 데 사용되는 PEG 크기에 따라 달라진다. 도 2는 PEG12를 부착함으로써, 펩티드의 분자량이 이에 따라 증가하지만, 펩티드의 용해도와 같은 물리적 특징은 변하지 않는다는 것을 나타낸다.

일부 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 1700g/mol 내지 20000 g/mol, 예를 들어, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 10500, 11000, 11500, 또는 20000 g/mol의 총 분자량을 가질 수 있다. 다양한 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 100Kda 내지 10,000 kDa, 예를 들어, 100, 200, 500, 1000, 2,000, 3000, 5000, 8000, 및 10000 kDa의 총 분자량을 가질 수 있다.

아미노산 서열은 역순 또는 임의의 순서로 사용될 수 있다. 또한 도메인의 동일한 전하 또는 다른 속성을 수득하기 위해 도메인에서 하나 또는 비필수 아미노산을 변경하는 것도 고려할 수 있다. 의심의 여지를 없애기 위해, 하기 표 13에 제공된 예시적인 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함하여, 본원에 제공된 임의의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 임의의 아미노산에서 및/또는 본원에 제공된 변형 중 임의의 하나 이상으로 변형될 수 있다.

표 13.

의심의 여지를 없애기 위해, 본 개시내용은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 적어도 하나의 아미노산이 본원에 개시된 변형을 포함하는 본 개시내용의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 제한 없이 포함하는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함한다.

변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질

본 개시내용은 그 중에서도, 적어도 하나의 변형된 아미노산 잔기를 포함하는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 제공한다. 본 개시내용 전반에 걸쳐 다양한 변형 및 그의 특정 이점이 제공된다. 의심의 여지를 없애기 위해, 본 개시내용은 임의 및/또는 모든 도메인의 임의 및/또는 모든 잔기, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 본원에 제공된 기타 폴리펩티드, 및/또는 임의의 부분(들)의 임의 및 모든 잔기가 그 변형의 본 개시에 따라 변형될 수 있다. 더욱이, 본원에 개시된 바와 같은 임의의 이러한 아미노산 변형으로부터 야기되는 다양한 이점은 도메인, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 변형된 다른 폴리펩티드 내의 특정 잔기, 및/또는 도메인, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 또는 다른 폴리펩티드 내의 이의 위치에 의존하지 않는다. 다양한 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 임의의 이러한 아미노산 변형으로부터 야기되는 다양한 이점은 본 개시내용에 따른 도메인, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 다른 폴리펩티드의 임의의 하나 이상의 잔기에서의 변형을 포함할 때 실현된다.

다양한 구현예에서, 도메인, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 다른 폴리펩티드에 존재하는 아미노산의 변형은 다음 중 어느 하나일 수 있다:

(i) 인산화;

(ii) 황산화;

(iii) 글리코실화(예를 들어, N-글리코실화, C-글리코실화, 및/또는 O-글리코실화);

(iv) 프레닐화(예: 게라닐화 및/또는 파르네실화);

(v) 메틸화;

(vi) 시알화;

(vii) 지질화 및/또는 리포일화;

(viii) 아세틸화;

(ix) 수산화;

(x) 팔미토일화;

(xi) 만노실화;

(xii) 미리스토일화;

(xiii) 푸코실화;

(xiv) 페길화; 및/또는

(xv) 예를 들어 분지형 또는 비분지형 변형 사슬에서 임의의 수의 하나 이상의 변형 또는 이의 변이체를 포함하는 이의 임의의 조합.

변형 및 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 예는 예를 들어 도 20-31에서 볼 수 있다. 당업자는 변형과 아미노산 사이, 또는 변형 사슬의 두 변형 사이의 임의의 주어진 화학적 결합의 원자에 대한 명시적인 공개가 없더라도 이러한 결합이 아미노산 및 아미노산 변형의 분야에서 잘 알려져 있음을 이해할 것이다.

인산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질

인산화는 일반적으로 세린, 트레오닌, 티로신 및/또는 히스티딘 잔기(S, Y, T 및/또는 H; 예를 들어, 도 27 참조)에서 발생한다. 인산화는 예컨대, 세린 잔기의 하이드록실 측쇄, 트레오닌 잔기의 하이드록실 측쇄, 또는 티로신 잔기의 페놀 측쇄와 같은 아미노산 잔기에 대한 포스페이트 기의 공유 결합을 포함한다. 인산화는 표적 결합, 세포 국소화 및 효소 활성을 비롯한 단백질 기능을 매개하는 것으로 알려져 있다. 본 개시내용은 하나 이상의 트레오닌, 티로신 및/또는 히스티딘 잔기가 인산화, 예를 들어 모노-인산화 또는 비스-인산화 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 폴리펩티드 합성 동안 보호된 인-아미노산의 혼입에 의해 인산화된다. 일부 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 잔기, 예를 들어, 세린, 트레오닌 또는 티로신 잔기의 합성 후 인산화에 의해 인산화된다. 일반적으로, 인산화의 적어도 특정 이점은 예를 들어 Kobayashi 등. 1996 (ATF-1의 인산화가 증가된 DNA 결합 능력을 나타냄), Robin 등, 2003 (GSTA4-4의 인산화가 미토콘드리아 표면 단백질과의 상호작용에 의해 미토콘드리아에 대한 GSTA4-4의 표적화 증가를 나타냄), Rossetto D 등 2012 (링커 히스톤인 뉴클레오솜 외 히스톤 H1의 인산화가 뉴클레오솜의 안정화를 증가시킴을 보여줌) 및 Anai 등, 2007 (WW 도메인에 대한 결합 친화도 및 선택성이 증가된 비스-인산화 펩티드를 보여줌)에 설명되었다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 인산화는 하나 이상의 인산화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 안정성을 증가시킨다. 다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 인산화는 하나 이상의 인산화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 반감기 및/또는 생체이용률을 증가시킨다. 다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 인산화는 하나 이상의 인산화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 표적 세포 또는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 다른 결합 파트너, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과의 친화도 또는 결합력을 증가시킨다. 다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 인산화는 하나 이상의 인산화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 하나 이상의 표적 세포에 진입하는 속도를 증가시킨다(즉, 표적 세포의 세포막을 통과함). 다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 인산화는 하나 이상의 인산화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 하나 이상의 핵산 운반체와의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 친화도 또는 결합력을 증가시킨다. 따라서, 일부 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 인산화는 표적 세포, 조직 또는 기관으로의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 핵산 운반체의 전달을 증가시킨다.

본 개시내용의 특정 특정 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 인산화는 하나 이상의 인산화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 간에서의 축적을 감소시킨다. 이것은 정맥 주사된 아데노 관련 바이러스를 포함하여 대부분의 분자 및 의약품이 간 세포에 축적된다는 경험적 관찰의 관점에서 특히 유리하다. 따라서, 본 개시내용의 인산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 유리하게는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 및/또는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 간 축적을 감소시키는 핵산 전달 수단을 제공한다.

본 개시내용의 특정 특정 구현예에서, 예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 표적화 도메인의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 포함에 의해, 인산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 표적, 표적 세포, 또는 표적 조직에 표적화하는 것은, 하나 이상의 인산화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 친화도, 결합력 또는 속도가 증가한다. 예를 들어, 인산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 및 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은, 예를 들어 뉴런 표적화를 위한 표적화 도메인의 포함에 의해, 뉴런을 표적으로 하여 하나 이상의 인산화 변형을 포함하지 않는 참조 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 증가된 친화도, 결합력, 또는 속도로 핵산 운반체를 뉴런에 전달할 수 있다.

미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 포함될 수 있고, 하나 이상의 잔기에서 인산화에 의해 선택적으로 변형될 수 있는 예시적인 도메인은 하기 표 14-16에 제공된다.

표 14는 뉴런을 표적화하고 하나 이상의 밑줄친 세린, 트레오닌 및/또는 티로신 잔기에서 인산화될 때 더 큰 친화도, 결합력 또는 속도로 뉴런을 표적화하는 예시적인 표적화 도메인을 포함한다.

표 15는 근육 세포를 표적으로 하고, 하나 이상의 밑줄친 세린, 트레오닌 및/또는 티로신 잔기에서 인산화될 때 근육 세포를 더 큰 친화도, 결합력 또는 속도로 표적화하는 예시적인 표적화 도메인을 포함한다.

표 16은 내피 세포를 표적화하고, 하나 이상의 밑줄친 세린, 트레오닌 및/또는 티로신 잔기에서 인산화될 때 내피 세포를 더 큰 친화도, 결합력 또는 속도로 표적화하는 예시적인 표적화 도메인을 포함한다.

표 14:

표 15:

표 16:

황산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질

설페이트화는 티로신(Y) 잔기에 대한 설페이트의 공유 결합을 지칭한다(예를 들어, 도 25 참조). 특정 구현예에서, 폴리펩티드에서 황산화 티로신의 바로 N-말단의 아미노산은 E, N, S, H, V, 및 D로부터 선택되는 아미노산이고/이거나, 폴리펩티드에서 황산화 티로신의 바로 C-말단의 아미노산은 E, L, D, Q, P, T, R 및 Y에서 선택된 아미노산이다. 일반적으로, 황산화는 단백질-단백질 상호작용의 친화도 및/또는 결합력을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 황산화는 내피 세포로의 증가된 업데이트를 위해 셀렉틴 결합을 증가시킬 것으로 예측되고, Farzan 등 1999은 CCR5의 황산화가 HIV 진입을 촉진한다는 것을 입증했다. 황산화를 겪는 것으로 알려진 단백질에는 G-단백질 결합 수용체, 접착 분자, 호르몬 및 세포외 기질 단백질이 포함된다. 황산화는 L- 및 P-셀렉틴 매개 호중구 모집 및 백혈구 롤링에 기여하는 것으로 알려져 있다(Somers 등, 2003).

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 황산화는 하나 이상의 황산화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 표적 세포 또는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 다른 결합 파트너, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 단백질과의 친화도 또는 결합력을 증가시킨다. 다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 황산화는 하나 이상의 황산화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 표적 수용체, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과의 결합의 친화도 또는 결합력을 증가시킨다. 따라서, 일부 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 황산화는 표적 세포, 조직 또는 기관으로의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 핵산 운반체의 전달을 증가시킨다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 황산화는 하나 이상의 황산화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 하나 이상의 표적 세포에 진입하는 속도를 증가시킨다(즉, 표적 세포의 세포막을 통과함).

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 황산화는 하나 이상의 황산화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 의한 혈뇌 장벽 침투를 증가시킨다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 황산화는 하나 이상의 황산화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 표적 수용체에 대한 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 선택성 및/또는 수용체 결합 후 내재화의 선택성을 증가시킨다.

표 17은 내피 세포 표면 마커에 대한 결합을 향상시키고/시키거나 내피 세포에 의한 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 및/또는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 업데이트를 증가시키는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 포함하기 위한 예시적인 황산화 도메인을 포함한다

표 17:

글리코실화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질

글리코실화는 그 중에서도, N-글리코실화, O-글리코실화 및 C-글리코실화를 포함한다. N 글리코실화는 아미노산 측쇄의 질소 원자, 전형적으로 아스파라긴(N) 잔기의 아미드 질소에 대한 글리칸의 공유 결합을 지칭한다. N 글리코실화의 예는 GlcNAc-β-Asn, GlcNac-α-Asn 및 Glc-Asn을 포함한다. O-글리코실화는 아미노산의 하이드록실 측쇄의 산소 원자, 전형적으로 세린(S) 또는 트레오닌(T) 잔기의 하이드록실 측쇄의 산소 원자에 대한 글리칸의 공유 결합을 지칭한다. O-글리코실화의 예는 GlcNac-β-Ser/Thr 및 GalNac-α-Ser/Thr을 포함한다. C-글리코실화는 아미노산 측쇄의 탄소 원자, 전형적으로 트립토판(W) 잔기의 탄소 원자에 대한 만노스의 공유 결합을 지칭한다. C-글리코실화의 예는 α-만노실 트립토판이다. 따라서, 다양한 구현예에서, 글리코실화는 하나 이상의 변형을 지칭할 수 있고, 각각의 변형은 N-글리코실화, C-글리코실화 또는 O-글리코실화 중 임의의 것일 수 있다. 글리코실화 변형의 알려진 기능에는 단백질 폴딩 및 세포 신호전달에 대한 기여가 포함된다. 일반적으로 글리코실화는 단백질 안정성을 향상시키고 결합 파트너와의 회합을 위한 에피토프 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 글리코실화는 하나 이상의 글리코실화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 안정성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 글리코실화는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 물리적 특성이라는 점에서변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 안정성을 증가시키고, 단백질 구조 및 단백질 전하를 포함하여, 예를 들어, 대상체에게 투여된 후 장기간 동안 유지 및/또는 유지된다. 일부 구현예에서, 글리코실화는 하나 이상의 글리코실화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 열적 및/또는 동역학적 변성의 발생 또는 속도를 감소시킨다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 글리코실화는 하나 이상의 글리코실화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 반감기 및/또는 생체이용률을 증가시킨다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 글리코실화는 하나 이상의 글리코실화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 표적 세포 또는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 다른 결합 파트너, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과의 친화도 또는 결합력을 증가시킨다. 다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 글리코실화는 하나 이상의 글리코실화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 표적 수용체, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과의 결합의 친화도 또는 결합력을 증가시킨다. 따라서, 일부 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 글리코실화는 표적 세포, 조직 또는 기관으로의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 핵산 운반체의 전달을 증가시킨다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 글리코실화는 하나 이상의 글리코실화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 하나 이상의 표적 세포에 진입하는(즉, 표적 세포의 세포막을 통과하는) 속도를 증가시킨다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 하나 이상의 글리코실화는 글리코실화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 침전 및/또는 응집을 감소시킨다.

표 18은 예시적인 글리코실화 도메인, 특히 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 간으로 표적화하는 갈락토스-변형된 표적화 도메인을 포함한다.

표 18:

프레닐화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질

프레닐화는 전형적으로 시스테인 잔기에서 발생한다(예를 들어, 프레닐화된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 예에 대해서는 도 26 참조). 프레닐화는 시스테인 잔기의 유리 티올기에 대한 지질 사슬 파르네실(C15) 또는 게라닐게라닐(C20) 이소프레노이드 부분의 공유 결합을 포함한다. 따라서, 프레닐화에는 파르네실화, 게라닐화 및 게라닐게라닐화를 포함하는 변형이 포함된다. 프레닐화는 종종 폴리펩티드의 C-말단 잔기에서 발견되고, 포유류에서, 단백질의 약 2%는 C-말단 잔기에서 프레닐화된다. 예컨대, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 같은 폴리펩티드의 프레닐화는 폴리펩티드의 소수성에 상당한 영향을 미친다. 최소한 이러한 이유로, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 프레닐화는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 원형질막 사이의 상호작용 강도(예를들어, 친화도 또는 결합력)를 증가시켜 효율적인 세포 흡수를 촉진한다. 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 같은 폴리펩티드의 프레닐화는 또한 세포 투과 능력 및/또는 표적 세포에 의한 흡수를 증가시킨다(예: Ochocki JD 등, 2011 참조). 프레닐화는 또한 단백질-단백질 상호작용을 강화(예를 들어, 친화도 또는 결합력 증가)하는 것으로 보고되었다(예를 들어, 예컨대 Ras, Rho, Rab 등과 같은 단백질의 단백질-단백질 및 단백질-막 상호작용 촉진. Gelb 등, 1998에 의해 보고됨). 단백질의 프레닐화는 또한 표적 세포 내 국소화로의 귀환을 촉진하는 것으로 알려져 있다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 프레닐화는 하나 이상의 프레닐화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 단백질과 비교하여 표적 세포 또는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 다른 결합 파트너, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과의 친화도 또는 결합력을 증가시킨다. 다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 프레닐화는 하나 이상의 프레닐화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 표적 수용체, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과의 결합의 친화도 또는 결합력을 증가시킨다. 따라서, 일부 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 프레닐화는 표적 세포, 조직 또는 기관으로의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 핵산 운반체의 전달을 증가시킨다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 프레닐화는 하나 이상의 프레닐화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 세포막과의 회합 강도(예를 들어, 친화도 또는 결합력)를 증가시킨다 다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 프레닐화는 하나 이상의 프레닐화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 세포막을 침투하는 속도를 증가시킨다. 다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 프레닐화는 하나 이상의 프레닐화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 하나 이상의 표적 세포에 진입하는(즉, 표적 세포의 세포막을 통과하는) 속도를 증가시킨다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 프레닐화는 하나 이상의 프레닐와 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 표적 세포 내 국소화를 유도하는 속도를 증가시킨다.

표 19는 예시적인 프레닐화된 도메인, 특히 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 간 세포 및 다른 세포 유형으로 표적화하는 프레닐화된 표적화 도메인을 포함한다.

표 19:

메틸화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질

메틸화는 전형적으로 리신(K) 및 아르기닌(R) 잔기에서 발생한다(예를 들어, 도 28 참조). 메틸화 잔기는 특히 모노-메틸화된 잔기, 디-메틸화된 잔기 및 트리-메틸화된 잔기를 포함한다. 특히, 리신 잔기는 전형적으로 모노-메틸화, 디-메틸화 또는 트리-메틸화되고, 아르기닌 잔기는 전형적으로 모노-메틸화 또는 디-메틸화된다. 연구에 따르면 특정 잔기에서 메틸화된 히스톤은 유전자 발현의 후성 유전적 조절을 유발 및/또는 기여한다. 메틸화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 같은 폴리펩티드의 메틸화는 폴리펩티드의 핵으로의 표적화를 증가시킨다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 메틸화는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 표적 세포의 핵, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질으로의 전달 속도를 증가시킨다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 메틸화 변형을 포함하지 않는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함하는 참조 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 핵산 운반체의 전달과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 메틸화는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 핵산 운반체의 표적 세포의 핵으로의 전달 속도를 증가시킨다. 다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 메틸화는 하나 이상의 메틸화 변형을 포함하지 않는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함하는 참조 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 핵산 운반체의 코딩 서열의 발현과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 핵산 운반체의 코딩 서열의 표적 세포에서의 발현을 증가시킨다.

표 20은 예시적인 메틸화 도메인, 특히 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 세포 핵으로 표적화하고/하거나 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 포함될 때 핵산 운반체의 발현을 증가시키는 메틸화된 표적화 도메인을 포함한다.

표 20:

시알화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질

시알화는 당단백질 올리고당 사슬의 말단에 시알산의 공유 첨가를 지칭한다. 예를 들어, 아스파라긴(N) 및 세린(S) 잔기에서 시알화가 발생할 수 있다. 시알화는 내피 세포 표적화 및/또는 혈뇌 장벽 침투를 증가시킬 수 있다. 일부 경우에, 내피 세포 표적화는 혈뇌 장벽 침투를 증가시키는 수단을 제공한다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 시알화는 하나 이상의 시알화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 의한 혈뇌 장벽 침투를 증가시킨다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 시알화는 하나 이상의 시알화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 세포막(예를 들어, 내피 세포막), 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜과의 회합 강도(예를 들어, 친화도 또는 결합력)를 증가시킨다. 다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 시알화는 하나 이상의 시알화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 세포막(예를 들어, 내피 세포막)을 침투하는 속도를 증가시킨다. 다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 시알화는 하나 이상의 시알화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 예컨대 내피 세포와 같은 하나 이상의 표적 세포에 진입하는(즉, 표적 세포의 세포막을 통과하는) 속도를 증가시킨다.

표 21은 예시적인 시알화 도메인, 특히 미니 클레오솜 코어 단백질에 포함될 때 내피 세포 표적화 및/또는 혈 뇌 장벽 침투를 증가시키는 시알화 표적화 도메인을 포함한다

표 21:

지질화 및/또는 리포일화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질

아미노산은 지방산, 이소프레노이드 및 콜레스테롤을 포함하는 다양한 지질에 대한 연결에 의해 공유적으로 변형될 수 있다(예를 들어, 도 30 참조). 지질화 및/또는 리포일화를 위해 아미노산 잔기에 연결될 수 있는 지방산에는 카프릴산(C8), 카프르산(C10), 라우르산(C12), 미리스트산(C14), 팔미트산(C16) 또는 스테아르산( C18)을 포함한다. 지방산은 폴리펩티드의 N-말단 또는 리신 잔기의 측쇄에 접합될 수 있다. 시스테인 잔기는 또한 지방산에 공유적으로 연결될 수 있다. 리포일화는 아미노산을 리포에이트(C8) 작용기에 연결하는 것을 포함하는 아실화의 한 형태이다. 예를 들어, 리신 잔기에서 리포일화가 일어날 수 있다. 일부 경우에, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 같은 폴리펩티드는 콜레스테롤에 공유적으로 연결될 수 있다. 콜레스테롤은 N-말단 잔기 또는 C-말단 잔기 및/또는 시스테인 잔기에서 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 접합될 수 있다.

지질화 및/또는 리포일화는 폴리펩티드 국소화 및 기능에 기여할 수 있다. 지질화 및/또는 리포일화는 예를 들어 순환 반감기를 증가시키기 위해 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 같은 폴리펩티드의 약동학적 특성을 개선할 수 있다. 예를 들어 장쇄 지방산을 사용한 지질화 및/또는 리포일화는 또한 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 같은 폴리펩티드의 표적화를 증가시킬 수 있다(예를 들어, Hossieni 등, 2019 참조, 팔미토일화가 Wnt 트래피킹에서 표적화를 상당히 개선할 수 있음을 입증함). 콜레스테롤에 대한 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 연결은 막 고정을 증가시켜 표적 세포로의 전달을 증가시킬 수 있다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 지질화 및/또는 리포일화는 하나 이상의 지질화 및/또는 리포일화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 표적 세포 또는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 다른 결합 파트너, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜과의 친화도 또는 결합력을 증가시킨다. 다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 지질화 및/또는 리포일화는 하나 이상의 지질화 및/또는 리포일화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 표적 수용체, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과의 결합의 친화도 또는 결합력을 증가시킨다. 따라서, 일부 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 지질화 및/또는 리포일화는 표적 세포, 조직 또는 기관으로의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 미니 뉴클레오솜 코어의 핵산 운반체의 전달을 증가시킨다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 지질화 및/또는 리포일화는 하나 이상의 지질화 및/또는 리포일화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 반감기 및/또는 생체이용률을 증가시킨다.

아세틸화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질

아세틸화는 예를 들어 알라닌(A), 발린(V) 및/또는 리신(K) 잔기에서 발생할 수 있다. 아세틸기는 폴리펩티드의 N-말단의 α-아미노기 또는 리신 잔기의 ε-아미노기에 공유적으로 연결될 수 있다(예를 들어, 도 23 및 24 참조). 아세틸화는 예컨대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 같은 폴리펩티드의 잔기에서 수소가 아세틸기로 치환되는 것을 지칭한다. 아세틸화는 예컨대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 같은 폴리펩티드의 안정성 및/또는 생물학적 활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 아세틸화는 N-말단 분해를 방지함으로써 변형된 폴리펩티드의 안정성을 증가시킬 수 있다. 아세틸화는 가역적 변형이다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 아세틸화는 하나 이상의 아세틸화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 안정성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 아세틸화는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 물리적 특성이라는 점에서 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 안정성을 증가시키고, 단백질 구조 및 단백질 전하를 포함하여, 예를 들어, 대상체에게 투여된 후 장기간 동안 유지 및/또는 유지된다. 일부 구현예에서, 아세틸화는 하나 이상의 아세틸화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 열적 및/또는 동역학적 변성의 발생 또는 속도를 감소시킨다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 아세틸화는 하나 이상의 아세틸화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 반감기 및/또는 생체이용률을 증가시킨다.

수산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질

수산화는, 예를 들어, 프롤린(P) 및 리신(K) 잔기, 뿐만 아니라 제한 없이 아스파라긴, 아스파르테이트 및 히스티딘을 포함하는 다른 아미노산 상에서 일어날 수 있다(예를 들어, 도 29 참조). 프롤린 및/또는 리신 수산화는 특정 분자 및/또는 특정 병리학적 상태의 과정을 포함하는 다양한 생리학적 분자 및/또는 과정과 연관된다. 예를 들어, 프롤린 수산화는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 같은 폴리펩티드의 안정성을 증가시킬 수 있다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기, 예를 들어, 하나 이상의 프롤린 잔기의 수산화는 하나 이상의 수산화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 안정성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 잔기, 예를 들어, 하나 이상의 프롤린 잔기의 수산화는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 단백질의 물리적 특성이라는 점에서 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 안정성을 증가시키고, 단백질 구조 및 단백질 전하를 포함하여, 예를 들어 대상체에게 투여된 후 더 오랜 기간 동안 유지 및/또는 유지된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 잔기, 예를 들어, 하나 이상의 프롤린 잔기의 수산화는 하나 이상의 수산화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 열적 및/또는 동역학적 변성의 발생 또는 속도를 감소시킨다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기, 예를 들어, 하나 이상의 프롤린 잔기의 수산화는 하나 이상의 수산화 변형을 포함하지 않은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 반감기 및/또는 생체이용률을 증가시킨다.

팔미토일화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질

팔미토일화는 전형적으로 시스테인 잔기에서 발생하는 지질 변형이며, 예를 들어 세린(S) 및 트레오닌(T) 잔기에서도 발생할 수 있다. 팔미토일화는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 같은 폴리펩티드의 잔기에 팔미트산과 같은 지방산의 공유 부착을 포함한다. 팔미토일화는 예를 들어 막 단백질의 잔기에 존재할 수 있다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 팔미토일화는 하나 이상의 팔미토일화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 세포막(예를 들어, 내피 세포막)과의 회합 강도(예를 들어, 친화도 또는 결합력)를 증가시킨다. 다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 팔미토일화는 하나 이상의 팔미토일화 변형을 포함하지 않은 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 세포막(예를 들어, 내피 세포막)을 침투하는 속도를 증가시킨다. 다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 팔미토일화는 하나 이상의 팔미토일화 변형을 포함하지 않은 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 예컨대 내피 세포와 같은 하나 이상의 표적 세포에 진입하는(즉, 표적 세포의 세포막을 통과하는) 속도를 증가시킨다.

만노실화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질

만노실화는 만노스 글리코시드를 포함하도록 아미노산의 변형을 지칭할 수 있다. 만노실화는 예를 들어, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 같은 폴리펩티드의 트레오닌(T) 잔기에서 발생할 수 있다. 하나의 특정 예를 제공하기 위해, 모노-O-만노실 글리칸은 억제성 GABA성 뉴런에 농축되고, 본 개시내용은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 GABA성 뉴런으로 표적화하기 위한 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 모노-O-만노실화를 포함한다.

미리스토일화된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질

미리스토일화는 아미노산, 예를 들어 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 같은 폴리펩티드의 잔기와 미리스토일기의 공유 결합을 포함하는 지질 변형이다. 미리스토일화는 예를 들어 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 같은 폴리펩티드의 글리신(G) 잔기에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 단백질 N-미리스토일화는 N-말단 글리신 잔기의 알파-아미노기에 존재할 수 있는 지질 변형이다. 미리스토일화는 세포 신호, 단백질-단백질 상호작용, 내막 및 원형질막 시스템에 대한 단백질 표적화에 기여할 수 있다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 미리스토일화는 하나 이상의 미리스토일화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 표적 세포 또는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 다른 결합 파트너, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과의 친화도 또는 결합력을 증가시킨다. 다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 미리스토일화는 하나 이상의 미리스토일화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 표적 수용체, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과의 결합의 친화도 또는 결합력을 증가시킨다. 따라서, 일부 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 미리스토일화는 표적 세포, 조직 또는 기관으로의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 핵산 페이로드의 전달을 증가시킨다.

다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 미리스토일화는 하나 이상의미리스토일화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 세포막(예를 들어, 내피 세포막), 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과의 회합 강도(예를 들어, 친화도 또는 결합력)를 증가시킨다. 다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 미리스토일화는 하나 이상의 미리스토일화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 세포막(예를 들어, 내피 세포막)을 침투하는 속도를 증가시킨다. 다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 하나 이상의 잔기의 미리스토일화는 하나 이상의 미리스토일화 변형을 포함하지 않는 참조 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 비교하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 또는 이를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 하나 이상의 예컨대, 내피 세포와 같은 표적 세포에 진입하는(즉, 표적 세포의 세포막을 통과하는) 속도를 증가시킨다.

푸코실화된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질

푸코실화는 푸코스를 아미노산, 예를 들어 트레오닌(T) 잔기에 첨가하는 것을 지칭하는 글리코실화의 한 형태이다. 푸코실화에는 N-글리칸, O-글리칸 및 당지질에 대한 푸코스 잔기의 부착이 포함된다.

페길화된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질

페길화(때때로 PEG화로 표기됨)는 비독성, 비면역원성 중합체인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과의 공유 접합에 의한 생물학적 분자의 변형을 포함한다. PEG는 일반적으로 생체적합성 및/또는 면역원성, 항원성 및/또는 독성이 없는 것으로 이해된다. PEG는 물 및 기타 유기 용제에 용해되며 체내에서 쉽게 제거되며 용액에서 이동성이 높다. 페길화는 예컨대 형태, 정전기적 결합 및 소수성과 같은 특성을 포함하여 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 같은 폴리펩티드의 물리적 및 화학적 특성에 영향을 미칠 수 있다. 페길화는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 같은 폴리펩티드의 약동학적 거동을 개선할 수 있다. 페길화는 약물 용해도를 개선하고 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 같은 폴리펩티드의 면역원성을 감소시킬 수 있다. PEG화는 혈액 내 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 같은 폴리펩티드의 약물 안정성 및/또는 체류 시간을 증가시킬 수 있다. 페길화는 미니뉴클레오솜 코어 단백질과 같은 단백질 분해 및/또는 신장 배설 폴리펩티드를 감소시킬 수 있으며, 이는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 같은 폴리펩티드의 치료학적 유효량을 감소시킬 수 있다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 폴리펩티드 제제와 조합하여 PEG 및 페길화를 사용하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 본 개시내용은 페길화 아미노산 단독으로 또는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 동일 아미노산 또는 다른 아미노산의 다른 변형과 조합하여 포함하는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

다중 및/또는 분지 변형이 있는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질

당업자는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 같은 폴리펩티드가 각각 본원에 제공된 하나 이상의 변형을 포함하는 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 각각 동일한 변형을 포함하는 복수의 변형된 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 적어도 두개의 상이한 변형을 포함하는 복수의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 더욱이, 당업자가 추가로 이해하는 바와 같이, 일부 구현예에서 단일 변형된 아미노산은 2개 이상의 변형을 포함할 수 있다(예를 들어, 도 20-22 참조). 일부 구현예에서, 단일 변형된 아미노산은 2개 이상의 변형을 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 변형은 이의 상이한 위치에서 아미노산의 표준 코어 구조에 공유적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 단일 변형된 아미노산은 2개 이상의 변형을 포함할 수 있으며, 여기서 2개 이상의 변형은 변형 사슬에 존재한다(즉, 2개 이상의 공유 결합된 변형을 포함하는 모이어티이며, 이는 그 자체가 아미노산의 표준 코어 구조의 원자에 공유적으로 연결된다). 따라서, 본 원에 개시된 바와 같이, 아미노산은 아미노산의 표준 코어 구조가 변형에 직접 공유적으로 연결된 경우 및/또는 아미노산의 표준 코어 구조가 변형에 간접 공유적으로 연결된 경우, 예를 들어 변형이 변형 사슬에 존재하고 아미노산의 표준 코어 구조의 원자에 직접 연결되지 않은 경우 특정 변형에 의해 변형된 것으로 지칭될 수 있다.

본 개시내용의 변형 사슬은 복수의 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형 사슬은 복수의 선형 연관된 변형을 포함하며, 이러한 변형은 단일 선형 사슬에서 직접 또는 간접적으로 공유적으로 연결된다. 직접 또는 간접적으로 연결된 변형의 단일 공유 연결된 선형 사슬을 포함하는 변형 사슬은 "비분지형" 변형 사슬로 지칭될 수 있다. 본 개시내용의 변형 사슬은 "분지형"일 수 있으며, 예를 들어 변형 사슬은 아미노산의 표준 코어 구조의 원자에 공유적으로 연결된 "줄기"를 포함하고, 이 줄기는 2개 이상의 공유 연결된 원자의 가지, 각각의 가지에는 하나 이상의 변형이 포함될 수 있다. 이러한 분지형 변형 사슬에서, 줄기 및 2개 이상의 가지는 공유 결합된 단일 선형 사슬을 형성하지 않는다. 본원에 제공된 바와 같이, 줄기 또는 비분지형 변형 사슬은 본원에 제공된 임의의 수의 변형, 예를 들어 본원에 제공된 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 변형을 포함할 수 있으며, 이들 중 임의의 것은 줄기 또는 사슬의 다른 것과 동일한 변형이거나 줄기 또는 사슬의 다른 것과 다른 변형일 수 있다. 본원에 제공된 바와 같이, 분지는 본원에 제공된 임의의 수의 변형, 예를 들어 본원에 제공된 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 변형을 포함할 수 있으며, 이들 중 임의의 것은 줄기 또는 사슬의 다른 것과 동일한 변형이거나 줄기 또는 사슬의 다른 것과 다른 변형일 수 있다. 다른 변형과 다를 수 있다.

따라서, 의심의 여지를 없애기 위해, 본원에 기재된 바와 같은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 (a) 핵산 결합 도메인(NABD), 및 (b) 표적화 도메인을 포함할 수 있고, 일부 구현예에서 (a) 핵산 결합 도메인(NABD), (b) 표적화 도메인, 및 (c) 핵산 방출 도메인을 포함할 수 있고, 여기서 본원에 제공된 다양한 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 중 임의의 것이 선택적으로 하나 이상의 변형된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

핵산 운반체

본원에 개시된 로딩된 미니 뉴클레오솜은 핵산 운반체 즉, 예를 들어, RNA, DNA, 또는 이의 핵산 유사체로 로딩될 수 있다. 핵산 운반체는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 운반체는 선형 또는 원형일 수 있다. 핵산 운반체는 단백질, RNA, shRNA, miRNA, 항체, 나노바디(nanobody), 다르핀, 안키린 반복부, 또는 폴리펩티드 각각의 하나 이상을 암호화할 수 있다. 예를 들어, 핵산 운반체는 적어도 하나의 기능성 단백질을 암호화하는 cDNA 분자일 수 있다. 다양한 구현예에서, 핵산 운반체는 억제 RNA, 예를 들어, gRNA, siRNA, miRNA, 또는 shRNA일 수 있다.

핵산 운반체는 임의의 세포의 핵에 전달될 때 예를 들어, RNA, 단백질, 폴리펩티드, 항체, 나노바디, miRNA, shRNA, gRNA, Cas9, 비코딩 RNA를 암호화할 수 있다. 발현은 본원에 언급된 독립체로 제한되지 않을 수 있다.

로딩된 미니 뉴클레오솜

본 개시내용의 로딩된 미니 뉴클레오솜은 본 개시내용의 하나 이상의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 및 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 당업자는 이러한 로딩된 미니 뉴클레오솜이 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 및 폴리뉴클레오티드를 다양한 방식으로 조합함으로써 생성될 수 있다는 것을 본 개시내용으로부터 인식할 것이다. 당업자는 적어도 하나의 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜 어셈블리가 예를 들어, 표준 온도에서 및 예를 들어, 표준 속도로 볼텍싱하면서 용액, 예를 들어, 제한없이 수용액에 본원에 제공된 하나 이상의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 및 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함할 때 간단히 발생한다는 것을 이해할 것이다. 따라서 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 생성하는 방법은 본원에 제공된 접근법 및 당업자에게 명백하게 될 다른 방법을 포함한다. 당업자는 적어도 하나의 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜 어셈블리가 예를 들어, 핵산의 축합을 향상시키는 데 도움이 되는 촉매의 존재 하에 표준 온도에서 용액, 예를 들어, 제한없이 수용액에 본원에 제공된 하나 이상의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 및 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함할 때 발생한다는 것을 이해할 것이다.

본 개시내용의 로딩된 미니 뉴클레오솜은 비축합 상태 및 축합 상태로 있을 수 있다. 로딩된 미니 뉴클레오솜은 핵산 분자 내 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 음전하가 중화된 경우 축합 상태에 있다. 로딩된 미니 뉴클레오솜은 핵산 분자 내 90% 미만의 음전하가 중화된 경우 비축합 상태로 간주된다. 명시되지 않는 한, 본 개시내용에서 미니 뉴클레오솜에 대한 언급은 적어도 축합 및 비축합 상태를 포함하고, 적용가능한 경우 이의 특징을 포함한다.

미니 뉴클레오솜은 예를 들어, 1 내지 10,000 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함할 수 있다. 미니 뉴클레오솜은 예를 들어, 1 내지 100 개의 핵산 운반체 분자를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 직경이 0.5 내지 50 나노미터 크기일 수 있다. 미니 뉴클레오솜은 0.5 내지 50nm의 작은 직경을 유지하면서 최대 50kb의 길이를 가질 수 있는 핵산 운반체 분자를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 100 내지 10000kDa, 예를 들어, 100, 200, 500, 1000, 3000, 5,000, 8000, 10000 kDa의 분자량을 가질 수 있다.

다양한 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 -100 내지 100의 순전하를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜 제형의 제타 전위는 -10 밀리볼트 내지 100 밀리볼트 범위일 수 있다. 일부 예에서, 핵산 운반체 및 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 복합체는 미니 뉴클레오솜 입자를 구축하는 데 사용되는 핵산 분자 및 폴리펩티드 분자에 비해 최소 크기로 축합된다. 최종 양전하 대 음전하 비는 대략적으로 1:1이며, 이에 의해 비하전된, 약간 양으로 하전된 또는 약간 음으로 하전된 분자를 형성한다. 최종 입자는 막대형, 구형 또는 원형을 포함하나 이에 제한되지 않는 여러 모양으로 형성될 수 있다.

다양한 구현예에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 5 달톤 내지 20 kDa의 분자량의 폴리에틸렌 글리콜의 하나 이상의 분자로 변형될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티는 폴리펩티드의 임의의 아미노산 잔기에 부착될 수 있다.

특정 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 1:1 내지 1:2,000 또는 1:3 내지 1:2,000인 핵산 분자 대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비율을 포함한다. 특정 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 1:1 내지 1:2,000인 핵산 분자 대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비율을 포함한다. 특정 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 1:1 내지 1:1,000, 1:1 내지 1:500, 1:1 내지 1:200, 1:1 내지 1:100, 1:1 내지 1:50 인 핵산 분자 대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비율을 포함한다. 특정 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 1:3 내지 1:1,000, 1:3 내지 1:500, 1:3 내지 1:200, 1:3 내지 1:100 또는 1:3 내지 1:50인 핵산 분자 대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비율을 포함한다. 특정 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 1:200 내지 1:2,000, 1:200 내지 1:1000, 또는 1:200 내지 1:500인 핵산 분자 대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비율을 포함한다. 특정 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 1:1 내지 1:50, 1:1 내지 1:40, 1:1 내지 1:30, 1:1 내지 1:20, 1:1 내지 1:10, 1:1 내지 1:5, 1:1 내지 1:4, 1:1 내지 1:3, 또는 1:1 내지 1:2인 핵산 분자 대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비율을 포함한다.

다양한 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 1 개의 핵산 분자 대 3 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:3) 및 1 개의 핵산 분자 대 3,000 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:3,000) 사이, 또는 그 사이의 임의의 범위 내에 있는 핵산 분자 대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비를 포함한다.

다양한 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 1 개의 핵산 분자 대 3 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:3) 및 1 개의 핵산 분자 대 2,000 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:2,000) 사이에 있는 핵산 분자 대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비를 포함한다.

다양한 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 1 개의 핵산 분자 대 3 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:3) 및 1 개의 핵산 분자 대 1,000 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:1,000) 사이에 있는 핵산 분자 대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비를 포함한다.

다양한 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 1 개의 핵산 분자 대 3 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:3) 및 1 개의 핵산 분자 대 500 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:500) 사이에 있는 핵산 분자 대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비를 포함한다.

다양한 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 1 개의 핵산 분자 대 3 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:3) 및 1 개의 핵산 분자 대 200 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:200) 사이에 있는 핵산 분자 대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비를 포함한다.

다양한 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 1 개의 핵산 분자 대 3 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:3) 및 1 개의 핵산 분자 대 100 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:100) 사이에 있는 핵산 분자 대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비를 포함한다.

다양한 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 1 개의 핵산 분자 대 3 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:3) 및 1 개의 핵산 분자 대 50 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:50) 사이에 있는 핵산 분자 대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비를 포함한다.

다양한 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 1 개의 핵산 분자 대 50 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:50) 및 1 개의 핵산 분자 대 2,000 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:2,000) 사이에 있는 핵산 분자 대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비를 포함한다.

다양한 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 1 개의 핵산 분자 대 50 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:50) 및 1 개의 핵산 분자 대 1,000 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:1,000) 사이에 있는 핵산 분자 대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비를 포함한다.

다양한 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 1 개의 핵산 분자 대 50 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:50) 및 1 개의 핵산 분자 대 500 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:500) 사이에 있는 핵산 분자 대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비를 포함한다.

다양한 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 1 개의 핵산 분자 대 50 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:50) 및 1 개의 핵산 분자 대 200 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:200) 사이에 있는 핵산 분자 대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비를 포함한다.

다양한 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 1 개의 핵산 분자 대 50 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:50) 및 1 개의 핵산 분자 대 100 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:100) 사이에 있는 핵산 분자 대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비를 포함한다.

다양한 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 1 개의 핵산 분자 대 200 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:200) 및 1 개의 핵산 분자 대 2,000 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:2,000) 사이에 있는 핵산 분자 대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비를 포함한다.

다양한 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 1 개의 핵산 분자 대 200 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:200) 및 1 개의 핵산 분자 대 1,000 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:1,000) 사이에 있는 핵산 분자 대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비를 포함한다.

다양한 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 1 개의 핵산 분자 대 200 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:200) 및 1 개의 핵산 분자 대 500 개의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(1:500) 사이에 있는 핵산 분자 대 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 비를 포함한다.

당업자는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 분자가 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 비카보네이트, 및 염화물을 포함하는 여러 상이한 염 조건을 포함하나 이에 제한되지 않고 다양한 수단에 의해 생성 및/또는 구성될 수 있음을 이해할 것이다. 로딩된 미니 뉴클레오솜의 최종 제형은 생리식염수, 물 또는 임의의 다른 약제학적으로 허용되는 완충액으로 구성될 수 있다.

표적 세포 또는 조직에 로딩된 미니 뉴클레오솜 전달

특정 구현예에서, 미니 뉴클레오솜은 표적 세포가 망막 색소 상피(RPE)인 경우 핵산을 전달할 수 있다. 효율적인 유전자 요법을 위해, 일부 구현예는 DNA 또는 RNA와 같은 많은 카피 수의 유전적 운반체를 하나의 세포 유형으로 전달하는 것을 포함한다. 예를 들어, 습성 나이 관련 황반 변성에서, RPE에서 항-VEGF를 발현하면 내피 세포 증식 및 혈관 누출을 억제하는 데 필요한 단백질을 치료 수준으로 제공할 수 있다. 본 발명자들은 본원에서 RPE로의 흡수를 향상시키는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(서열번호. 392)의 예를 제공한다(도 10, 11).

특정 구현예에서, 미니 뉴클레오솜은 표적 세포가 망막의 뉴런인 경우 핵산을 전달할 수 있다. 아미노산 도메인 LRE(서열번호. 156)는 향상된 뉴런 부착을 위해 사용될 수 있는 것으로 기재되었다(Dale D, 등, 1989). 본 발명자들은 망막에서 뉴런 세포를 표적으로 하기 위해 GFP 작제물(서열번호. 395)과 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(서열번호. 394)을 사용하여 비바이러스 벡터에서 이러한 도메인을 사용하여 GFP를 발현하였다(도 12). 이는 망막 뉴런에서 발현된 유전자의 유전적 돌연변이에 의해 야기된 망막 변성을 치료하기 위해 DNA 또는 RNA를 전달하는 데 특히 유용할 수 있다.

다양한 구현예에서, 미니 뉴클레오솜은 표적 세포가 예를 들어 근육 세포, 간 세포, 내피 세포, 조혈 줄기 세포, 폐 상피, 세포, 혈관주위세포, 베타 세포, 장 상피 세포, 소교 세포, 대식 세포, 신경 세포, 피부 세포, 혈액 세포 등이지만 이에 제한되지 않는 경우 핵산을 전달할 수 있다. 본원에 기재된 도메인의 다양한 조합(표 3-12)은 뇌, 망막, 장, 간, 폐, 신장, 근육, 췌장을 포함하나 이에 제한되지 않는 신체의 다른 부위에서 치료 효과를 위해 로딩된 미니 뉴클레오솜을 특정 표적 세포 유형으로 전달할 수 있다.

약제학적 조성물

본 개시내용은 로딩된 미니 뉴클레오솜 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 "로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제"를 고려한다. 약제학적으로 허용되는 담체 용액의 제형은 적합한 투약 및 치료 레리멘의 개발과 같이 당업자에게 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이들 제형은 10² 게놈 카피 이상의 원하는 이식유전자를 함유할 수 있다. 용해도, 생체이용률, 반감기, 저장 수명과 같은 다른 인자가 당업자에 의해 고려될 것이다. 이와 같이, 다양한 용량 및 치료 레지멘이 바람직할 수 있다. 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제를 사용하여 망막, 간, CNS, 장 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 인간 신체의 다양한 세포 유형, 조직 유형 또는 기관에 뉴클레오티드를 전달할 수 있다.

로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제는 세포 또는 동물에게 투여하기 위해 약제학적으로 허용되도록 제형화될 수 있다. 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제는 시험관내, 생체외 또는 생체내 투여될 수 있다. 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제는 단독으로 또는 또는 하나 이상의 다른 치료 방식, 예를 들어, 항체, 스테로이드, 비타민, AAV 등과 조합하여 대상체에게 투여될 수 있다.

특정 경우에, 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제는 각각 또는 함께 하나 이상의 별개의 발현 산물을 암호화하는 하나 이상의 핵산 운반체를 포함할 수 있다.

특정 상황에서, 피하, 안구내, 유리체내, 비경구, 정맥내, 근육내, 척추강내, 국소, 경구, 복강내 주사에 의해, 또는 비강 흡입에 의해서지만 이들 기술에 제한되지 않는 본원에 개시된 적합하게 제형화된 약제학적 조성물에서 로딩된 미니 뉴클레오솜 제형을 전달하는 것이 바람직할 것이다. 로딩된 미니 뉴클레오솜 제형의 용액은 멸균수, 멸균 염수에서 제조될 수 있고 또한 플루론산과 같은 하나 이상의 계면활성제와 적절하게 혼합될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이의 혼합물에서 제조될 수 있다. 저장 제제는 미생물의 성장을 방지하는 방부제를 함유할 수 있다.

로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제의 적절한 투여 수단은 치료될 병태 또는 질환에 기초하여 대상체의 연령 및 상태에 따라 선택될 수 있다. 투여량 및 방법은 환자의 체중, 연령, 상태 등에 따라 달라질 수 있고, 당업자에 의해 필요에 따라 적절하게 선택될 수 있다.

다양한 경우에, 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하도록 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 생리학적으로 호환되는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 염, 예를 들어, 산 부가 염 또는 염기 부가 염을 포함할 수 있다.

다양한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제, 예를 들어, 주사용 멸균 제형을 포함하는 조성물은 비히클로서 주사용 증류수를 사용하여 통상적인 약제학적 관행에 따라 제형화될 수 있다. 예를 들어, 글루코스 및 D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 및 염화 나트륨과 같은 다른 보충제를 함유하는 생리 식염수 또는 등장성 용액은 선택적으로 적합한 가용화제, 예를 들어, 에탄올과 같은 알코올 및 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알코올, 및 폴리소르베이트 80™, HCO-50 등과 같은 비이온성 계면활성제와 조합하여 주사용 수용액으로 사용될 수 있다.

본원에 개시된 바와 같이, 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제 조성물은 당업계에 알려진 임의의 형태일 수 있다. 이러한 형태는 예를 들어, 액체, 반고체 및 고체 투여 형태, 예컨대 액체 용액(예를 들어, 주사용 및 주입용 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 알약, 분말, 리포솜 및 좌제를 포함한다.

임의의 특정 형태의 선택 또는 사용은 부분적으로 의도된 투여 방식 및 치료적 적용에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 전신 또는 국소 전달을 위해 의도된 조성물을 함유하는 조성물은 주사용 또는 주입용 용액 형태일 수 있다. 따라서, 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제 조성물은 비경구 방식에 의한 투여(예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 또는 근육내 주사)를 위해 제형화될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 비경구 투여는 일반적으로 주사에 의한 장관 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 지칭하고, 정맥내, 비강내, 안구내, 폐, 근육내, 동맥내, 척추강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 폐내, 복강내, 기관경, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외, 대뇌내, 두개내, 경동맥내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

비경구 투여 경로는 예를 들어, 주사에 의한 투여, 경비강 투여, 경폐 투여, 또는 경피 투여일 수 있다. 투여는 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사에 의한 전신 또는 국소 투여일 수 있다.

다양한 구현예에서, 본 발명의 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포솜, 또는 고농도에서 안정한 저장에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 본원에 기재된 조성물을 필요한 양으로 혼입한 후, 필터 멸균처리하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들에서 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 본원에 기재된 조성물을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 본원에 기재된 조성물 및 이의 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 임의의 추가의 원하는 성분(하기 참조)의 분말을 산출하는 진공 건조 및 동결 건조를 포함한다. 용액의 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기 유지에 의해, 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사용 조성물의 장기적인 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염, 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 야기될 수 있다.

로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제 조성물은 물 또는 또 다른 약제학적으로 허용되는 액체에 멸균 용액 또는 현탁액을 포함하는 주사용 제형의 형태로 비경구로 투여될 수 있다. 예를 들어, 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제 조성물은 멸균수 및 생리 식염수, 식물성 오일, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정화제, 향미 부형제, 희석제, 비히클, 방부제, 결합제와 같은 약제학적으로 허용되는 비히클 또는 매질과 치료 분자를 적절하게 조합한 후, 일반적으로 허용되는 약제학적 관행에 필요한 단위 투여 형태로 혼합함으로써 제형화될 수 있다. 약제학적 제제에 포함된 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제의 양은 지정된 범위 내에서 적절한 용량이 제공되도록 하는 양이다. 유성 액체의 비제한적인 예는 참깨유 및 대두유를 포함하고, 이는 가용화제로서 벤질 벤조에이트 또는 벤질 알코올과 조합될 수 있다. 포함될 수 있는 다른 항목은 포스페이트 완충제, 또는 나트륨 아세테이트 완충제와 같은 완충제, 프로카인 하이드로클로라이드와 같은 진정제, 벤질 알코올 또는 페놀과 같은 안정화제, 및 산화방지제이다. 제형화된 주사는 적합한 앰플에 포장될 수 있다.

일부 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제 조성물은 0℃ 미만(예를 들어, -20℃ 또는 -80℃)의 온도에서 저장하기 위해 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 2-8℃(예를 들어, 4℃)에서 최대 2 년(예를 들어, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 1 년, 11/2 년, 또는 2 년) 동안 저장하기 위해 제형화된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 2-8℃(예를 들어, 4℃)에서 적어도 1 년 동안 저장 시 안정하다.

특정 경우에, 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제 조성물은 용액으로 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 예를 들어, 적합한 농도에서 완충 용액으로 제형화되고 2-8℃(예를 들어, 4℃)에서 저장하기에 적합할 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제를 포함하는 조성물은 면역리포솜 조성물로 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 당업계에 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 순환 시간이 향상된 리포솜은 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,013,556호에 개시되어 있다.

특정 구현예에서, 조성물은 이식물 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 지효성 제형과 같은 빠른 방출로부터 화합물을 보호할 담체와 함께 제형화될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 많은 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, J. R. Robinson(1978) "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems," Marcel Dekker, Inc., New York 참조.

일부 구현예에서, 조성물은 인간과 같은 포유동물에게 폐내 투여(예를 들어 흡입기 또는 분무기를 통한 투여)에 적합한 조성물로 제형화될 수 있다. 이러한 조성물을 제형화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 건조 분말 흡입기 제형 및 제형의 투여에 적합한 시스템이 또한 당업계에 알려져 있다. 폐 투여는 경구 및/또는 비강 투여일 수 있다. 폐 전달을 위한 약제학적 장치의 예는 계량된 흡입기, 건조 분말 흡입기(DPI), 및 분무기를 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 조성물은 건조 분말 흡입기 방식으로 대상체의 폐에 투여될 수 있다. 이들 흡입기는 분산가능하고 안정된 건조 분말 제형을 폐에 전달하는 추진체가 없는 장치이다. 건조 분말 흡입기는 의학 분야에 잘 알려져 있으며 TURBOHALER®(AstraZeneca; 영국 런던 소재) AIR® 흡입기(ALKERMES®; 매사추세츠주 캠브리지 소재); ROTAHALER®(GlaxoSmithKline; 영국 런던 소재); 및 ECLIPSETM(Sanofi-Aventis; 프랑스 파리 소재)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 04/026380, WO 04/024156, 및 WO 01/78693 참조. DPI 장치는 인슐린 및 성장 호르몬과 같은 폴리펩티드의 폐 투여에 사용되었다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 계량된 흡입기 방식으로 폐내 투여될 수 있다. 이들 흡입기는 개별 용량의 화합물을 폐에 전달하기 위해 추진체에 의존한다. 추가의 장치 및 폐내 투여 방법은 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제20050271660호 및 제20090110679호에 제시되어 있으며, 각각의 개시내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다.

일부 구현예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제 조성물은 눈에 전달하기 위해, 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 용액, 현탁액 또는 연고 형태로 제형화될 수 있다. 눈을 치료하는 데 사용하기 위한 제제는 방부제, 완충제, 긴장제, 산화방지제 및 안정화제, 비이온성 습윤제 또는 정화제, 및 점도 증가제와 같으나 이에 제한되지 않는 추가의 성분을 함유하는 멸균 수용액 형태일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 제제는 통상적인 방법에 의해, 예를 들어, 점적 형태로, 또는 하나 이상의 조성물을 함유하는 치료 용액에 안구를 입욕시켜 치료를 필요로 하는 대상체(예를 들어, AMD를 앓고 있는 대상체)의 눈에 국소로 투여될 수 있다.

눈의 유리체 강에 약물을 도입하기 위한 다양한 장치가 특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물의 투여에 적절할 수 있다. 예를 들어, 미국 공개 번호 제2002/0026176호는 유리체강으로 돌출되어 약제학적 제제를 유리체강으로 전달하도록 공막을 통해 삽입될 수 있는 약제학적 제제 함유 플러그를 기재한다. 또 다른 예에서, 미국 특허 번호 제5,443,505호는 눈의 내부로 약물을 지속 방출하기 위해 맥락막상 공간 또는 무혈관 영역으로 도입하기 위한 이식형 장치를 기재한다. 미국 특허 번호 제5,773,019호 및 제6,001,386호는 각각 눈의 공막 표면에 부착가능한 이식형 약물 전달 장치를 개시한다. 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제를 눈에 전달하기 위한 추가의 방법 및 장치(예를 들어, 경공막 패치 및 콘택트 렌즈를 통한 전달)는 예를 들어, Ambati and Adamis (2002) Prog Retin Eye Res 21(2):145-151; Ranta and Urtti (2006) Adv Drug Delivery Rev 58(11):1164-1181; Barocas and Balachandran (2008) Expert Opin Drug Delivery 5(1):1-10(10); Gulsen and Chauhan (2004) Invest Opthalmol Vis Sci 45:2342-2347; Kim 등 (2007) Ophthalmic Res 39:244-254; 및 PCT 공개 번호 WO 04/073551에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다.

다양한 구현예에서, 피하 투여는 주사기, 사전 충전된 주사기, 자동 주입기(예를 들어, 일회용 또는 재사용), 펜 주입기, 패치 주입기, 착용형 주입기, 피하 주입 세트가 있는 보행용 주사기 주입 펌프와 같은 장치, 또는 피하 주사용 다른 장치로 달성될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제 조성물은 국소 투여 방식으로 대상체에게 치료적으로 전달될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "국소 투여" 또는 "국소 전달"은 혈관계를 통해 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제 조성물 또는 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제를 이의 의도된 표적 조직 또는 부위로의 수송에 의존하지 않는 전달을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제 조성물은 조성물 또는 제제의 주사 또는 이식에 의해 또는 조성물 또는 제제를 함유하는 장치의 주사 또는 이식에 의해 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 조직 또는 부위 부근에 국소 투여 후, 조성물 또는 제제, 또는 이의 하나 이상의 구성요소는 투여 부위가 아닌 의도된 표적 조직 또는 부위로 확산될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 조성물은 단위 투여 형태로 존재하며, 단위 투여 형태는 자가-투여에 적합할 수 있다. 이러한 단위 투여 형태는 전형적으로 용기, 예를 들어, 바이알, 카트리지, 사전 충전된 주사기 또는 일회용 펜 내에 제공될 수 있다. 미국 특허 번호 제6,302,855호에 기재된 도저(doser) 장치와 같은 도저가 또한 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 주사 시스템과 함께 사용될 수 있다.

대상체에서 장애를 치료 또는 예방할 수 있는 용량인 본원에 기재된 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제 조성물의 적합한 용량은 예를 들어, 치료될 대상체의 연령, 성별, 및 체중, 치료될 병태 또는 질환, 및 사용된 특정 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 대상체에게 투여되는 용량에 영향을 미치는 다른 인자는 예를 들어, 병태 또는 질환의 유형 또는 중증도를 포함한다. 다른 인자는 예를 들어, 대상체에게 동시에 또는 이전에 영향을 미치는 다른 의학적 장애, 대상체의 일반적인 건강, 대상체의 유전적 성향, 식이요법, 투여 시간, 배출 속도, 약물 조합, 및 대상체에게 투여되는 임의의 다른 추가의 치료제를 포함할 수 있다. 또한, 임의의 특정 대상체에 대한 특이적 투여량 및 치료 레지멘이 또한 의사의 판단에 따라 조정될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제 용액은 치료 유효량의 본원에 기재된 조성물을 포함할 수 있다. 이러한 유효량은 부분적으로 투여된 조성물의 효과, 또는 하나 초과의 제제가 사용되는 경우 조성물 및 하나 이상의 추가 활성제의 조합 효과에 기초하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 치료 유효량은 조성물의 임의의 독성 또는 유해한 효과가 치료적으로 유익한 효과를 능가하는 양일 수 있다.

주사에 적합한 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료 제형의 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액을 포함할 수 있다. 제형은 멸균될 수 있고 주사기 안팎으로 절절하게 흐르도록 유체여야 한다. 제형은 또한 제조 및 저장 조건 하에 안정될 수 있다. 담체는 예를 들어, 물 및 염수 또는 완충 수용액을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 바람직하게는, 등장성 제제, 예를 들어, 당 또는 염화 나트륨이 제형에 사용될 수 있다. 인간 투여의 경우, 최종 제제 및 조성물은 US FDA 및 EU 규체 표준에서 요구하는만큼 멸균성, 발열원성, 및 일반적인 내독소 수준, 안전성 및 순도 표준을 충족해야 한다. 온도 및 다른 단백질에 대한 노출은 로딩된 미니 뉴클레오솜의 특성을 변경시킬 수 있다. 최종 제제 및 조성물은 적절한 온도, 바람직하게는 섭씨 2-8 도 또는 실온(섭씨 20-25 도)에서 저장되어야 한다.

게다가, 당업자는 또한 전기천공법, 초음파치료, 골내 주사 방법을 통해 또는 유전자 총을 사용할 수 있는 추가의 전달 방법을 고려할 수 있다. 벡터는 또한 마이크로칩, 나노칩 또는 나노입자에 이식될 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 키트로 제형화될 수 있다. 이러한 키트는 치료 또는 진단 목적으로 사용될 수 있다. 본 개시내용은 그 중에서도, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 및 핵산으로 이루어진 조성물의 제형, 및 본원에 기재된 하나 이상의 질환에 대해 포유동물, 및 특히 인간에게 투여하기 위한 치료제의 제조에서 이용될 수 있으므로, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 희석제, 애쥬번트(adjuvants), 및/또는 다른 구성요소와 함께 하나 이상의 조성물을 제공한다. 특히, 이러한 키트는 포유동물의 다양한 장애를 치료하는 데 핵산을 사용하기 위한 지침과 조합하여 개시된 미니 뉴클레오소 코어 단백질 조성물 중 하나 이상을 포함할 수 있고, 전형적으로 편리한 상업적 포장을 위해 제조된 용기를 포함할 수 있다.

본원에 기재된 조성물은 포유동물, 예를 들어, 인간인 동물에게 투여될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 또한 관심 상업용 동물, 가축, 및 개 및 고양이와 같은 애완 동물에게 적용가능하다. 키트의 조성물은 단독으로 또는 치료 또는 진단 용도를 위한 하나 이상의 다른 성분 또는 약물과 조합하여 부분적으로 또는 상당히 정제된 로딩된 미니 뉴클레오솜을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 적어도 하나의 로딩된 미니 뉴클레오솜 구성요소 기반 유전자 요법 조성물 및 치료제로서 조성물을 사용하기 위한 지침을 포함하는 치료 키트가 또한 제조될 수 있다. 이러한 키트를 위한 용기 수단은 전형적으로 적어도 하나의 바이알, 테스트 튜브, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 용기 수단을 포함할 수 있으며, 이에 개시된 미니 뉴클레오솜 조성물(들)이 배치되고, 바람직하게는 적절하게 분취될 수 있다.

적용

본원에 제공된 미니 뉴클레오솜은 다양한 구현예에서, 작은 크기, 수용체 매개 또는 수동 확산 과정에 의해 세포에 들어가는 능력, 유전자 발현 위치의 정밀도, 유전자 발현 지속기간의 정밀도, 및/또는 표적 세포의 핵의 세포질에서 핵산 방출까지 체류를 특징으로 할 수 있다. 미니 뉴클레오솜 기술의 원하는 적용 중 일부가 본원에 기재되어 있다.

본 개시내용은 본 개시내용의 변형된 미니 뉴클레오솜이 특정 세포 또는 조직으로의 핵산 페이로드의 전달을 표적화하고/하거나 하나 이상의 특정 세포 또는 조직에서 핵산 페이로드에 의해 암호화된 발현 생성물의 발현을 달성할 수 있다는 인식을 추가로 포함한다. 본 개시내용으로부터 용이하게 명백한 바와 같이, 특정 세포 또는 조직에서 핵산 페이로드의 전달 및/또는 발현은 특정 표적 세포 또는 조직의 특정 발현 생성물(예를 들어, 특정 단백질)의 존재로부터 이익을 얻는 다양한 방법 및 조성물에서 유용할 수 있다.

특정 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 미니 뉴클레오솜은 하나 이상의 인산화 잔기(예를 들어, 인산화 잔기의 하나 이상 또는 전부가 세린, 트레오닌, 또는 티로신 잔기로부터 선택됨)를 포함한다. 본 개시내용은 인산화 잔기의 특정 수 또는 위치보다는 존재가 특정 세포 또는 조직으로의 핵산 페이로드의 전달을 표적화하고/하거나 하나 이상의 특정 세포 또는 조직에서 핵산 페이로드에 의해 암호화된 발현 생성물의 발현을 달성할 수 있다는 인식을 포함한다. 임의의 특정 과학적 이론에 얽매이지 않고, 본 개시내용은 인산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(예를 들어, 특정 세포 또는 조직의 표적화)을 특징짓는 적어도 특정 이점이 표적 세포의 세포 표면 수용체와 변형의 상호작용으로부터 초래된다는 것을 포함하고, 따라서 임의의 변형된 잔기의 위치에 대해 서열 특이적이지 않거나 특이적이다. 본 개시내용은 구체적으로 인산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 중추신경계(CNS)의 세포인 표적 세포에 핵산 페이로드를 전달할 수 있고/있거나 핵산 페이로드의 발현을 유발할 수 있다는 인식을 포함한다. 특정 구현예에서, 인산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 CNS 뉴런에 핵산 페이로드를 전달할 수 있고/있거나 CNS 뉴런에서 핵산 페이로드의 발현을 유발할 수 있다. 특정 구현예에서, 인산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 CNS 성상교세포, 미세아교세포, 희돌기아교세포 또는 신경교에 핵산 페이로드를 전달할 수 있고/있거나 핵산 페이로드의 발현을 유발할 수 있다. 특정 구현예에서, 인산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 척수 세포, 예를 들어, 척수 뉴런 또는 척수 신경교 세포에 핵산 페이로드를 전달할 수 있고/있거나 핵산 페이로드의 발현을 유발할 수 있다. 다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(예를 들어, 로딩된 미니 뉴클레오솜에서 인산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질)과 연관된 핵산 페이로드에 의해 암호화되는 발현 생성물의 발현은 참조(예를 들어, 비변형된) 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 사용하여 참조(예를 들어, 동일하거나 유사한) 조건에서 달성된 발현에 비해 증가된다. 본 개시내용은 다양한 이러한 표적 세포 유형에서의 발현이 표적 세포 유형, 예를 들어 CNS의 질병에 영향을 미치거나 영향을 받는 것인 특정 상태의 치료에 중요하다는 것을 인식한다.

특정 구현예에서, 표적 세포에서 핵산 페이로드의 전달 및/또는 핵산 페이로드의 발현은 특정 전달 경로에 의해 촉진된다. 인산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 본원에 개시된 하나 이상의 표적 세포, 세포 유형 또는 조직에 핵산 페이로드를 전달하고/하거나 핵산 페이로드의 발현을 야기하는 다양한 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 중추 신경계의 세포로의 전달을 달성하는 경로에 의한 것이다. 인산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 본원에 개시된 하나 이상의 표적 세포, 세포 유형 또는 조직에 핵산 페이로드를 전달하고/하거나 핵산 페이로드의 발현을 야기하는 다양한 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 CNS 뉴런으로의 전달을 달성하는 경로에 의한 것이다. 인산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 본원에 개시된 하나 이상의 표적 세포, 세포 유형 또는 조직에 핵산 페이로드를 전달하고/하거나 핵산 페이로드의 발현을 야기하는 다양한 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 CNS 성상교세포, 미세아교세포, 희돌기아교세포 또는 신경교로의 전달을 달성하는 경로에 의한 것이다. 인산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 본원에 개시된 하나 이상의 표적 세포, 세포 유형 또는 조직에 핵산 페이로드를 전달하고/하거나 핵산 페이로드의 발현을 야기하는 다양한 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 척수 세포, 예를 들어 척수 뉴런 또는 척수 신경교 세포로의 전달을 달성하는 경로에 의한 것이다. 당업자는 특정 세포, 세포 유형 및 조직으로의 투여 경로에 익숙할 것이다. 특정 특정한 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 주사, 예를 들어 CNS(예를 들어, CNS의 세포 또는 조직)로의 주사에 의한 것이다. 특정 특정한 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 척추강내, 두개내, 또는 대수조내 투여이다. 특정 특정 한구현예에서, 대상체에 대한 투여는 경막내이다.

다양한 구현예에서, 인산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 다중 인산화 잔기, 예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의 인산화 잔기를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 인산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 인산화가 아닌 본원에 개시된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 단일 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 존재하는 상이한 변형의 조합을 포함한다. 변형된 미니 뉴클레오솜의 인산화 아미노산은 변형된 미니 뉴클레오솜의 임의의 도메인 또는 임의의 아미노산 위치에 존재할 수 있다. 변형된 미니 뉴클레오솜의 인산화 아미노산은 제한 없이 링커 도메인 또는 표적화 도메인에 존재할 수 있다.

특정 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 미니 뉴클레오솜은 하나 이상의 황산화 잔기(예를 들어, 황산화 잔기의 하나 이상 또는 전부가 세린, 트레오닌, 또는 티로신 잔기로부터 선택됨)를 포함한다. 본 개시내용은 황산화 잔기의 특정 수 또는 위치보다 존재가 특정 세포 또는 조직으로의 핵산 페이로드의 전달을 표적화하고/하거나 하나 이상의 특정 세포 또는 조직에서 핵산 페이로드에 의해 암호화된 발현 생성물을 달성하는 인식을 포함한다. 임의의 특정 과학적 이론에 얽매이지 않고, 본 개시내용은 황산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(예를 들어, 특정 세포 또는 조직의 표적화)을 특징짓는 적어도 특정 이점이 표적의 세포 표면 수용체와 변형의 상호작용으로부터 초래된다는 것을 포함하고, 따라서 임의의 변형된 잔기의 위치에 대해 서열 특이적이지 않거나 특이적이다. 본 개시내용은 구체적으로 황산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 중추신경계의 세포인 표적 세포에 핵산 페이로드를 전달할 수 있고/있거나 표적 세포에서 핵산 페이로드의 발현을 유발할 수 있다는 인식을 포함한다. 특정 구현예에서, 황산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 CNS 뉴런에 핵산 페이로드를 전달할 수 있고/있거나 핵산 페이로드의 발현을 유발할 수 있다. 특정 구현예에서, 황산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 CNS 성상세포, 미세아교세포, 희소돌기아교세포 또는 신경교에 핵산 페이로드를 전달할 수 있고/있거나 핵산 페이로드의 발현을 유발할 수 있다. 특정 구현예에서, 황산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 척수 세포, 예를 들어, 척수 뉴런 또는 척수 신경교 세포에 핵산 페이로드를 전달할 수 있고/있거나 핵산 페이로드의 발현을 유발할 수 있다. 다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(예를 들어, 로딩된 미니 뉴클레오솜에서 황산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질)과 관련된 핵산 페이로드에 의해 암호화되는 발현 생성물의 발현은 참조(예를 들어, 비변형된) 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 사용하여 참조(예를 들어, 동일하거나 유사한) 조건에서 달성된 발현에 비해 증가된다. 본 개시내용은 다양한 이러한 표적 세포 유형에서의 발현이 표적 세포 유형, 예를 들어 CNS의 질병에 영향을 미치거나 영향을 받는 것인 특정 상태의 치료에 중요하다는 것을 인식한다.

특정 구현예에서, 표적 세포에서 핵산 페이로드의 전달 및/또는 핵산 페이로드의 발현은 특정 전달 경로에 의해 촉진된다. 황산화된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 본원에 개시된 하나 이상의 표적 세포, 세포 유형 또는 조직에 핵산 페이로드를 전달하고/하거나 핵산 페이로드의 발현을 야기하는 다양한 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 중추 신경계의 세포로의 전달을 달성하는 경로에 의한 것이다. 황산화된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 본원에 개시된 하나 이상의 표적 세포, 세포 유형 또는 조직에 핵산 페이로드를 전달하고/하거나 핵산 페이로드의 발현을 야기하는 다양한 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 CNS 뉴런으로의 전달을 달성하는 경로에 의한 것이다. 황산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 본원에 개시된 하나 이상의 표적 세포, 세포 유형 또는 조직에 핵산 페이로드를 전달하고/하거나 핵산 페이로드의 발현을 야기하는 다양한 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 CNS 성상교세포, 미세아교세포, 희돌기아교세포 또는 신경교로의 전달을 달성하는 경로에 의한 것이다. 황산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 본원에 개시된 하나 이상의 표적 세포, 세포 유형 또는 조직에 핵산 페이로드를 전달하고/하거나 핵산 페이로드의 발현을 야기하는 다양한 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 척수 세포, 예를 들어 척수 뉴런 또는 척수 신경교 세포로의 전달을 달성하는 경로에 의한 것이다. 당업자는 특정 세포, 세포 유형 및 조직으로의 투여 경로에 익숙할 것이다. 특정 특정 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 주사, 예를 들어 CNS(예를 들어, CNS의 세포 또는 조직)로의 주사에 의한 것이다. 특정 특정 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 척추강내, 두개내, 또는 대수조내 투여이다. 특정 특정 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 경막내이다.

다양한 구현예에서, 황산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 다중 황산화 잔기, 예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 황산화 잔기를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 황산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 황산화가 아닌 본원에 개시된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 단일 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 존재하는 상이한 변형의 조합을 포함한다. 변형된 미니 뉴클레오솜의 황산화 아미노산은 변형된 미니 뉴클레오솜의 임의의 도메인 또는 임의의 아미노산 위치에 존재할 수 있다. 변형된 미니 뉴클레오솜의 황산화 아미노산은 제한 없이 링커 도메인 또는 표적화 도메인에 존재할 수 있다.

특정 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 미니 뉴클레오솜은 하나 이상의 아세틸화 잔기(예를 들어, 아세틸화 잔기의 하나 이상 또는 전부가 리신 잔기인 경우)를 포함한다. 본 개시내용은 아세틸화 잔기의 특정 수 또는 위치보다 존재가 특정 세포 또는 조직으로 핵산 페이로드의 전달을 표적화하고/하거나 하나 이상의 특정 세포 또는 조직에서 핵산 페이로드에 의해 암호화된 발현 생성물의 발현을 달성하는 변형된 미니 뉴클레오솜의 능력을 매개한다는 인식을 포함한다. 임의의 특정 과학적 이론에 얽매이지 않고, 본 개시내용은 아세틸화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(예를 들어, 특정 세포 또는 조직의 표적화)을 특징짓는 적어도 특정 이점이 표적의 세포 표면 수용체와 변형의 상호작용으로부터 초래된다는 것을 포함하고, 따라서 변형된 잔기의 위치에 대해 서열 특이적이거나 특이적이지 않다. 본 개시내용은 구체적으로 아세틸화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 CNS 뉴런 및/또는 망막 세포인 표적 세포에 핵산 페이로드를 전달할 수 있고/있거나 표적 세포에서 핵산 페이로드의 발현을 유발할 수 있다는 인식을 포함한다. 특정 구현예에서, 아세틸화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 CNS 뉴런에 핵산 페이로드를 전달할 수 있고/있거나 핵산 페이로드의 발현을 유발할 수 있다. 특정 구현예에서, 아세틸화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 핵산 페이로드를 망막 세포, 예를 들어 광수용체, 양극성 세포, 망막 신경절 세포, 수평 세포 및 무축삭 세포 중 하나 이상을 포함하는 망막 뉴런에 전달하고/하거나 핵산 페이로드의 발현을 유발할 수 있다. 특정 구현예에서, 아세틸화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 광수용체 세포(예를 들어, 간상체 및/또는 원추체)에 핵산 페이로드를 전달할 수 있고/있거나 핵산 페이로드의 발현을 유발할 수 있다. 다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(예를 들어, 로딩된 미니 뉴클레오솜에서 아세틸화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질)과 관련된 핵산 페이로드에 의해 암호화된 발현 생성물의 발현은 참조(예를 들어, 비변형된) 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 사용하여 참조(예를 들어, 동일하거나 유사한) 조건에서 달성된 발현에 비해 증가된다. 본 개시내용은 다양한 이러한 표적 세포 유형에서의 발현이 표적 세포 유형, 예를 들어 망막의 질병(예를 들어, 색소성 망막염 및/또는 스타가르트병)을 포함하는 CNS의 질병에 영향을 미치거나 이에 의해 영향을 받는 특정 상태의 치료에 중요하다는 것을 인식한다.

특정 구현예에서, 표적 세포에서 핵산 페이로드의 전달 및/또는 핵산 페이로드의 발현은 특정 전달 경로에 의해 촉진된다. 아세틸화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 본원에 개시된 하나 이상의 표적 세포, 세포 유형 또는 조직에 핵산 페이로드를 전달하고/하거나 핵산 페이로드의 발현을 야기하는 다양한 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 CNS 뉴런 및/또는 망막 세포로의 전달을 달성하는 경로에 의한 것이다. 아세틸화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 본원에 개시된 하나 이상의 표적 세포, 세포 유형 또는 조직에 핵산 페이로드를 전달하고/하거나 핵산 페이로드의 발현을 야기하는 다양한 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 CNS 뉴런으로의 전달을 달성하는 경로에 의한 것이다. 아세틸화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 본원에 개시된 하나 이상의 표적 세포, 세포 유형 또는 조직에 핵산 페이로드를 전달하고/하거나 핵산 페이로드의 발현을 야기하는 다양한 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 망막 세포, 예를 들어 하나 이상의 광수용체, 양극성 세포, 망막 신경절 세포, 수평 세포 및 무축삭 세포를 포함하는 망막 뉴런으로의 전달을 달성하는 경로에 의한 것이다. 아세틸화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 본원에 개시된 하나 이상의 표적 세포, 세포 유형 또는 조직에 핵산 페이로드를 전달하고/하거나 핵산 페이로드의 발현을 야기하는 다양한 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 광수용체 세포(예를 들어, 간상체 및/또는 원추체)로의 전달을 달성하는 경로에 의한 것이다. 당업자는 특정 세포, 세포 유형 및 조직으로의 투여 경로에 익숙할 것이다. 특정 특정 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 주사, 예를 들어 눈(예를 들어, 눈의 세포 또는 조직)으로의 주사에 의한 것이다. 특정 특정 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 유리체내, 맥락막상, 또는 망막하이다.

다양한 구현예에서, 아세틸화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 다중 아세틸화 잔기, 예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의 아세틸화 잔기를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 아세틸화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 아세틸화가 아닌 본원에 개시된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 단일 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 존재하는 상이한 변형의 조합을 포함한다. 변형된 미니 뉴클레오솜의 아세틸화 아미노산은 변형된 미니 뉴클레오솜의 임의의 도메인 또는 임의의 아미노산 위치에 존재할 수 있다. 변형된 미니 뉴클레오솜의 아세틸화 아미노산은 제한 없이 링커 도메인 또는 표적화 도메인에 존재할 수 있다.

특정 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 미니 뉴클레오솜은 하나 이상의 만노실화 잔기(예를 들어, 만노실화 잔기 중 하나 이상 또는 전부가 세린 잔기인 경우)를 포함한다. 본 개시내용은 만노실화 잔기의 특정 수 또는 위치보다 존재가 특정 세포 또는 조직으로의 핵산 페이로드의 전달을 표적화하고/하거나 하나 이상의 특정 세포 또는 조직에서 핵산 페이로드에 의해 암호화된 발현 생성물의 발현을 달성하는 변형된 미니 뉴클레오솜의 능력을 매개한다는 인식을 포함한다. 임의의 특정 과학적 이론에 얽매이지 않고, 본 개시내용은 만노실화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(예를 들어, 특정 세포 또는 조직의 표적화)을 특징짓는 적어도 특정 이점이 표적의 세포 표면 수용체와 변형의 상호작용으로부터 초래된다는 것을 포함하고, 따라서 변형된 잔기의 위치에 대해 서열 특이적이거나 특이적이지 않다. 본 개시내용은 구체적으로 만노실화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 CNS 뉴런 및/또는 망막 세포인 표적 세포에 핵산 페이로드를 전달할 수 있고/있거나 표적 세포에서 핵산 페이로드의 발현을 유발할 수 있다는 인식을 포함한다. 특정 구현예에서, 만노실화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 CNS 뉴런에 핵산 페이로드를 전달할 수 있고/있거나 핵산 페이로드의 발현을 유발할 수 있다. 특정 구현예에서, 만노실화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 핵산 페이로드를 망막 세포, 예를 들어 광수용체, 양극성 세포, 망막 신경절 세포, 수평 세포 및 무축삭 세포 중 하나 이상을 포함하는 망막 뉴런에 전달할 수 있고/있거나 핵산 페이로드의 발현을 유발할 수 있다). 특정 구현예에서, 만노실화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 광수용체 세포(예를 들어, 간상체 및/또는 원추체)에 핵산 페이로드를 전달하고/하거나 핵산 페이로드의 발현을 유발할 수 있다. 다양한 구현예에서, 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(예를 들어, 로딩된 미니 뉴클레오솜에서 만노실화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질)과 관련된 핵산 페이로드에 의해 암호화되는 발현 생성물의 발현은 참조(예를 들어, 비변형된) 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 사용하여 참조(예를 들어, 동일하거나 유사한) 조건에서 달성된 발현에 비해 증가된다. 본 개시내용은 다양한 이러한 표적 세포 유형에서의 발현이 표적 세포 유형, 예를 들어 망막의 질병(예를 들어, 색소성 망막염 및/또는 스타가르트병을 포함하는 CNS의 질병에 영향을 미치거나 이에 의해 영향을 받는 특정 상태의 치료에 중요하다는 것을 인식한다.

특정 구현예에서, 표적 세포에서 핵산 페이로드의 전달 및/또는 핵산 페이로드의 발현은 특정 전달 경로에 의해 촉진된다. 만노실화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 본원에 개시된 하나 이상의 표적 세포, 세포 유형 또는 조직에 핵산 페이로드를 전달하고/하거나 핵산 페이로드의 발현을 야기하는 다양한 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 CNS 뉴런 및/또는 망막 세포로의 전달을 달성하는 경로에 의한 것이다. 만노실화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 본원에 개시된 하나 이상의 표적 세포, 세포 유형 또는 조직에 핵산 페이로드를 전달하고/하거나 핵산 페이로드의 발현을 야기하는 다양한 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 CNS 뉴런으로의 전달을 달성하는 경로에 의한 것이다. 만노실화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 본원에 개시된 하나 이상의 표적 세포, 세포 유형 또는 조직에 핵산 페이로드를 전달하고/하거나 핵산 페이로드의 발현을 야기하는 다양한 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 망막 세포, 예를 들어 하나 이상의 광수용체, 양극성 세포, 망막 신경절 세포, 수평 세포 및 무축삭 세포를 포함하는 망막 뉴런으로의 전달을 달성하는 경로에 의해. 만노실화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 본원에 개시된 하나 이상의 표적 세포, 세포 유형 또는 조직에 핵산 페이로드를 전달하고/하거나 핵산 페이로드의 발현을 야기하는 다양한 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 광수용체 세포(예를 들어, 간상체 및/또는 원추체)로의 전달을 달성하는 경로에 의한 것이다. 당업자는 특정 세포, 세포 유형 및 조직으로의 투여 경로에 익숙할 것이다. 특정 특정 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 주사, 예를 들어 눈(예를 들어, 눈의 세포 또는 조직)으로의 주사에 의한 것이다. 특정 특정 구현예에서, 대상체에 대한 투여는 유리체내, 맥락막상, 또는 망막하이다.

다양한 구현예에서, 만노실화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 다중 만노실화 잔기, 예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의 만노실화 잔기를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 만노실화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 만노실화가 아닌 본원에 개시된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 단일 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 존재하는 상이한 변형의 조합을 포함한다. 변형된 미니 뉴클레오솜의 만노실화 아미노산은 변형된 미니 뉴클레오솜의 임의의 도메인 또는 임의의 아미노산 위치에 존재할 수 있다. 변형된 미니 뉴클레오솜의 만노실화 아미노산은 제한 없이 링커 도메인 또는 표적화 도메인에 존재할 수 있다.

유전자 요법

다양한 구현예에서, 본원에 제공된 미니 뉴클레오솜은 유전자 요법의 방법에 사용될 수 있다. 유전자 요법의 일반적인 원리는 당업계에 잘 알려져 있고 폴리뉴클레오티드를 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하여 치료 가치가 있는 발현 산물(예를 들어, mRNA, 단백질, 또는 억제 RNA)을 제공하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 요법은 유전자 또는 단백질 대체 요법(예를 들어, 효소 대체 요법), 증대, 또는 표적 억제를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 본원에 제공된 미니 뉴클레오솜은 낭포성 섬유증, 뒤시엔느 근이영양증, 스타르가르트 질환, 연령 관련 황반 변성, 헌팅턴, 혈우병 A, 척수근위축증, 어셔 증후군 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 질환을 야기하는 임의의 돌연변이의 유해한 효과를 구제하기 위해 적용될 수 있다. 이러한 질환에서, 유전적 돌연변이는 유전자가 기능하지 않거나 또는 이용가능하지 않게 만든다. 이러한 경우에, 돌연변이된 유전자를 기능적 카피로 대체하는 것은 환자에게 이익일 수 있다. 기능적 cDNA 또는 전체 유전자를 로딩된 미니 뉴클레오솜에 혼입하고, 이를 원하는 세포 또는 조직으로 전달함으로써, 다양한 구현예에서, 치료적 이익을 받을 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 미니 뉴클레오솜은 상향조절되고 질환을 야기하는 유전자를 억제하기 위해 적용될 수 있다. 예를 들어, P53 과발현은 다양한 질환에서 기재되었다. 일부 경우에, 염증, 저산소증 등을 야기하는 유전자를 하향조절하여 치료 효과를 갖도록 특이적 세포 또는 조직에서 유전자를 녹다운(knock down)하는 것이 유리하다.

생체외 조작된 세포

본 개시내용의 미니 뉴클레오솜은 생체외에서 세포를 조작하는 데 사용될 수 있다. 세포는 다양한 방식으로 치료제를 발현하도록 조작될 수 있다. 이러한 세포 중 하나는 면역 세포, 예를 들어, T 세포이다. 면역 세포는 사멸 또는 청소율에 대해 암성 세포 또는 다른 해로운 세포 유형의 면역 인식을 허용할 수 있는 새로운 단백질 또는 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 이러한 유전적 조작은 생체외에서 수행될 수 있다. 다양한 구현예에서, 본원에 제공된 미니 뉴클레오솜은 생체외에서 세포를 유전적으로 조작하는 방법에 사용될 수 있다. 본원에 제공된 도메인의 조합은 로딩된 미니 뉴클레오솜을 다양한 T 세포에 진입하게 하고 유전적 운반체를 이러한 세포의 핵으로 전달시킬 수 있다. 유전적 운반체는 키메라 수용체의 발현, 유전자의 녹다운 또는 다른 치료 독립체를 암호화하고/하거나 허용할 수 있다. 그 다음에 이러한 세포는 요법을 위해 환자에게 주입될 수 있다. 당업자는 면역요법에 사용하기 위한 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR T 세포)를 생성하기 위해 로딩된 미니 뉴클레오솜을 사용하는 것을 고려할 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 미니 뉴클레오솜은 치료 목적을 위해 새로운 단백질 또는 수용체를 발현하도록 생체외에서 줄기 세포를 조작하는 데 적용될 수 있다. 본원에 제공된 도메인의 조합은 로딩된 미니 뉴클레오솜을 다양한 줄기 세포에 집입하게 하여 유전적 운반체를 이러한 세포의 핵/세포질로 전달할 수 있다. 유전적 운반체는 키메라 수용체의 발현, 유전자의 녹다운 또는 다른 치료 독립체를 허용할 수 있다. 그 다음에 이러한 세포는 요법을 위해 환자에게 주입될 수 있다. 당업자는 면역요법에서 사용하기 위한 키메라 줄기 세포 또는 키메라 조혈 줄기 세포를 생성하기 위해 로딩된 미니 뉴클레오솜을 사용하는 것을 고려할 수 있다.

유전자 편집 및 염기 절단 수리

유전자 편집, 염기 편집 및 조작은 또한 본원에 기재된 이러한 미니 뉴클레오솜 기술에 적용가능한 영역이다. 유전자 편집 및 염기 절단 수리는 DNA 또는 RNA 수준에서 유전적 돌연변이를 교정하거나 또는 유전자를 편집하게 하는 최첨단 기술이다. 이 적용을 위해, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 gRNA, sgRNA, spCas9, saCas9, dCas9, 시티딘 데아미나제 및 DNA를 절단하거나 또는 하나의 염기를 또 다른 염기로 전환하는 데 도움이 되는 여러 다른 효소를 암호화하는 핵산을 혼입할 수 있다. 당업자는 다중 gRNA 및 Cas9 또는 유사한 편집 효소를 AAV에 혼입하는 것이 번거롭고 종종 비효율적인 과정이라는 것을 이해할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하면, 로딩된 미니 뉴클레오솜 상에 핵산의 용이한 압축을 가능하게 하고 여러 gRNA를 혼입하고 심지어 가장 큰 Cas9 유전자를 원하는 세포로 전달하게 한다.

항체 전달

항체는 전 세계적으로 수백만 명 환자의 삶을 변화시킨 약물 부류이다. 그러나, 이 요법의 한 가지 큰 단점은 환자, 의사 및 간병인에게 막대한 부담을 주는 반복 투여가 필요하다는 점이다. 당업자는 DNA 분자를 사용하여 항체를 발현할 수 있다는 것을 이해할 수 있다. 본원에 기재된 미니 뉴클레오솜 기술은 항체를 벡터화하고 환자에서 원하는 세포에 전달하여 신체에서 장기 저장소를 생성하여 다중 투여의 부담을 줄이는 기회를 제공한다. 항체 도메인의 일부 또는 전체를 발현하는 이들 DNA 분자는 로딩된 미니 뉴클레오솜에 혼입되어 항체 약물을 복용하는 환자에 대해 장기 치료 옵션을 생성할 수 있다. 당업자는 또한 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 사용하여 나노바디, 항체 모방체, 융합 펩티드, 항체 단편, 낙타과 또는 낙타과 단일-도메인 항체 단편과 같은 다른 항체 유사 분자를 벡터화하고 전달할 수 있다.

백신 전달

유전적으로 조작된 DNA 또는 RNA는 항원을 생성하여 보호 면역학적 반응을 제공할 수 있다. 핵산 백신은 통상적인 백신에 비해 광범위한 면역학적 반응과 같은 여러 잠재적인 이점을 갖는다. 본원에 기재된 미니 뉴클레오솜 기술은 이러한 DNA 또는 RNA 작제물을 인간을 포함한 동물의 원하는 세포 또는 조직에 혼입 및 전달하여 여러 바이러스, 박테리아 또는 기생충 감염으로부터 보호할 수 있다.

화장품

유전적으로 조작된 DNA 또는 RNA는 예를 들어 근육량 향상, 화상 피해자의 피부 복구, 체중 감소, 면역 기능 개선, 노화 지연 및 많은 다른 적용을 위한 여러 화장품 적용을 위해 개발될 수 있다. 본원에 기재된 미니 뉴클레오솜 기술은 적용가능한 DNA 또는 RNA 작제물을 원하는 화장품 효과를 위해 인간을 포함한 동물의 원하는 세포 또는 조직에 혼입 및 전달할 수 있다.

다양한 구현예에서, 본 개시내용은 인간 또는 다른 동물에서 질환을 예방 또는 치료하는 것과 관련한 벡터를 추가로 제공한다. 예방 또는 치료 유효량의 조성물은 정맥내, 근육내, 비강내, 복강내, 피하, 대뇌내, 망막하, 유리체내를 통해, 요추 천자, 국소, 직장, 또는 국소 기관 또는 종양으로의 직접 전달을 통해 투여될 수 있지만 이들 기술에 제한되지 않는다. 조성물은 핵산 복합체를 포함하며, 각각의 복합체는 본질적으로 단일 또는 그 이상의 핵산 분자 및 하나 이상의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 분자로 이루어진다.

본 개시내용은 중에서도, 특정 질환을 치료하고 하거나 화장품 적용을 위해 인간 세포에 효율적으로 전달하기 위한 DNA, RNA 및 이의 유사체 등을 축합하는 개선된 방법을 제공한다. 전달된 핵산은 또한 백신을 전달하기 위한 적용을 가질 수 있다.

실시예

실시예 1: 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 설계 및 합성

이 실시예는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 관련한 방법 및 조성물을 대표한다. 이 실시예에서, 펩티드의 아미노산 서열(핵산을 로딩된 미니 뉴클레오솜으로 축합할 수 있음) 및 이의 합성 과정이 기재되어 있다.

본 실시예의 로딩된 미니 뉴클레오솜은 로딩된 핵산 운반체를 다양한 세포 유형으로 효율적으로 유전자 전달하고 방출하기 위해 생성된다. 본 실시예의 로딩된 미니 뉴클레오솜은 세포 표면 단백질에 대한 결합을 통해 세포 표면과 능동적으로 관계를 맺고, 세포에서 세포질/핵으로 전위되고, 핵산 운반체의 방출을 허용하도록 설계된다. 이들 특징은 구조화된 단백질/DNA 상호작용에 기초하여 설계된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 및 로딩된 미니 뉴클레오솜에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 본 실시예는 세포 부착, 향상된 흡수, 향상된 안정성, 표적 세포의 핵으로의 능동 수송, 및 펩티다제를 통한 방출 중 하나 이상을 향상시키는 하나 이상의 아미노산 도메인을 포함하는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함한다.

본 실시예에서, 합성된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 서열번호: 389-394 중 어느 하나에 따른 서열, 또는 표 3-12에 개시된 도메인으로부터 유래된 다른 서열, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 실시예의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 pH 7에서 8 초과의 순 양전하 및 9 초과의 등전점을 갖는 펩티드이다. 예를 들어, 서열번호: 394는 다중 뉴런 부착 도메인(LRE) 및 폴리-아르기닌 도메인(RRRRR)과 조합된 다중 DNA 결합 도메인(KRHRK)을 포함하는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 서열이다. 이 동일한 작제물에서, 류신(L)은 폴리-아르기닌 도메인을 둘러싸고 하전된 도메인을 소수성 아미노산으로 분리하여, 세포 부착 표적화 도메인이 세포 표면에 결합하게 한다. 이 작제물에서, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(서열번호: 394)은 LRE 도메인을 통해 뉴런에 대한 부착을 향상시키기 위해 설계되는 반면 폴리-아르기닌 도메인은 세포 진입을 도울 것이다. 본 실시예는 또한 특정 도메인 사이에 위치하는 다양한 링커를 갖는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함하고, 링커의 예는 서열번호: 389-394에 제공된 것들을 포함한다. 설계에 따라, 서열번호: 394에서의 KRH는 또한 핵산 방출을 향상시키기 위한 PCSK1의 절단 부위로서 역할을 한다. 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 포함될 수 있는 다른 핵산 방출 도메인 또는 절단 도메인은 표 9에 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 포함하기 위한 도메인은 또한 표 9의 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 펩티다제에 대해 유래될 수 있다.

서열번호: 389-394에 따른 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함하는 본 실시예의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 핵산 분자와의 효율적인 축합 및 원하는 세포 유형, 예를 들어 동물 세포 및 조직으로 로딩된 미니 뉴클레오솜의 전달을 허용하는 서열 특징의 다양한 조합을 포함한다. 본 실시예의 특정 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에서, 올리고머화 도메인은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 핵산 운반체의 회합에 의해 형성된 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 야기하여 참조 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 비해, 예를 들어 올리고머화 도메인(들)이 부족하지만 달리 아미노산 서열에서 동일한 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜에 비해 상대적으로 더 작은 크기를 갖도록 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 포함된다. 예시적인 올리고머화 도메인은 표 11에 제공된 것들을 포함한다. 유사하게, 엔도솜 진입 및 탈출 신호는 또한 향상된 안정성 및 방출을 위해 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 포함될 수 있다.

본 실시예의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 다양한 방법에 의해 합성될 수 있다. 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 합성하는 한 가지 방법은 펩티드 합성이다. 펩티드 합성은 아미드 결합을 통해 아미노산의 연결을 허용한다. 예를 들어, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 서열 순서로 하나의 아미노산의 카복실 기와 다음 원하는 아미노산의 아미노 기 사이의 축합 반응을 통해 화학적으로 합성될 수 있다. 확립된 펩티드 합성 방법은 고체 상 펩티드 합성으로 당업계에 알려져 있다.

여러 전략이 본 개시내용의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 아미노-말단(N-말단) 및 카복시-말단(C-말단)을 보호하기 위해 선택적으로 적용될 수 있다. 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 동결건조되는 경우, 동결건조된 펩티드는 합성 과정 동안 사용되는 미량의 염을 함유할 수 있다. 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 생성의 다른 방법은 세포 시스템 또는 생체내에서 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 발현하여 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 암호화하는 DNA 작제물을 형성하는 것을 포함한다. 생성된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 여러 수지가 과정 동안 활용될 수 있다. 본 실시예의 다양한 경우에, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 90% 초과로 순수하다. 그러나, 90% 미만으로 덜 순수한 코어 단백질을 사용하여 또한 로딩된 미니 뉴클레오솜을 형성할 수 있다. 본 실시예의 다양한 경우에, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 PEG와 90% 초과 접합된다. 그러나, 덜 접합된(90% 미만) 또는 접합되지 않은 코어 단백질을 사용하여 또한 로딩된 미니 뉴클레오솜을 형성할 수 있다. 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 순도는 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 질량 분석법에 의해 최소한으로 확인된 동일성에 의해 결정될 수 있다.

실시예 2. 로딩된 미니 뉴클레오솜의 생성

이 실시예는 실시예 1의 로딩된 미니 뉴클레오솜을 포함하나 이에 제한되지 않는 로딩된 미니 뉴클레오솜의 생성과 관련한 기술을 기재한다. 본 실시예의 로딩된 미니 뉴클레오솜은 순 양전하를 갖는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 축합된 핵산 운반체(DNA 또는 RNA)를 포함한다. 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 순 양전하는 핵산 운반체의 음전하를 중화하여, 나노미터 크기의 입자를 생성한다. 상기 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 및 DNA 또는 RNA의 접합은 소량 또는 다량으로 발생할 수 있다. 모든 염기와 회합된 2 개의 음전하를 의미하는 2 개의 포스페이트가 있다. 본 실시예는 적어도 90%의 DNA 음전하가 뉴클레오솜 코어 단백질 양전하에 의해 중화된다는 것을 제시한다. 예를 들어, DNA 음전하의 90-95 퍼센트는 핵산과 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 효율적인 축합을 위해 중화되어야 한다. 본 실시예의 다양한 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 세포 부착, 세포 흡수, 단백질 안정성, 표적 세포의 핵으로의 능동 수송, 및 핵산 운반체 방출 중 하나 이상을 향상시키는 아미노산 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 특정 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 특정 맥락에서 특히 유용할 수 있다. 핵산 및 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 혼합하여 로딩된 미니 뉴클레오솜을 생성하는 과정 동안, 핵산 및 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 혼합물이 혼합되거나 또는 100rpm 내지 4000rpm으로 볼텍싱될 수 있다. 핵산의 접합 과정에서, 축합 반응을 향상시키는 NaOH 및 스페르미딘과 같읕 특정 촉매가 첨가될 수 있다. 이들 촉매는 폴리펩티드 및 핵산을 첨가하기 전에 반응기에 첨가될 수 있다. 핵산은 0.1 마이크로그램/마이크로리터 내지 100그램/리터 범위의 농도로 첨가될 수 있다. 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 0.1 마이크로그램/마이크로리터 내지 100그램/리터의 농도로 첨가될 수 있다. 핵산은 한 번에 첨가될 수 있거나 또는 점진적으로, 예를 들어, 꾸준히 또는 연속하여 한방울씩 볼텍싱 용액에 첨가될 수 있다. 혼합이 끝나면, 축합된 물질, 즉, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 정제 전에 몇 분 내지 몇 시간의 기간, 예를 들어, 2 분 내지 6 시간의 기간 동안 평형을 이루게 될 수 있다. 이 단계에서 불순물을 제거하고 완충액을 교환하기 위해 투석이 수행될 수 있다. 로딩된 미니 뉴클레오솜은 여러 기술을 사용하여 정제될 수 있다. 이러한 기술 중 한 가지는 1킬로달톤 이상의 분자량 컷오프 매개변수로 칼럼에서 고속으로 입자를 원심분리하는 것이다. 원심분리 속도는 샘플 부피에 따라 7000 xg 내지 10,000 xg 범위일 수 있다. 유사하게, 원심분리 기간은 샘플 부피에 따라 실온에서 20 분 내지 1 시간으로 달라질 수 있다. 미니 뉴클레오솜을 정제하는 데 이용가능한 또 다른 기술은 투석이다. 정제 기술은 이들 두 기술에 제한되지 않을 수 있고 당업자는 단백질/핵산 복합체를 정제하는 데 사용될 수 있는 문헌으로부터의 다양한 추가 정제 기술을 알 것이다. 마지막으로, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 내독소가 없는 물, 생리식염수 또는 임의의 다른 완충 용액에서 용출되거나 또는 수집될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. DNA의 예상된 회수율은 ~30-70%이다. 로딩된 미니 뉴클레오솜은 또한 분자량 컷오프 칼럼에서 추가의 원심분리를 겪어 용액에서 벡터 게놈의 양을 추가로 농축할 수 있다. 본 실시예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 내독소의 존재를 최소화하도록 제형화된다. 내독소의 전형적인 공급원은 플라스미드, 펩티드 합성, 또는 제조에 사용되는 물질을 포함하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 내독소가 없는 플라스미드가 사용될 수 있고, 이 실시예에 기재된 제조 동안 내독소가 제거된 물질 및 장비가 사용될 수 있다.

또한 생물반응기를 사용하여 핵산 및 펩티드의 일관된 혼합을 위해 로딩된 미니 뉴클레오솜을 제형화하여 상업적 및 임상적 용도를 위한 입자를 생성할 수 있다.

실시예 3: 로딩된 미니 뉴클레오솜에 유리한 모양/크기 및 제형

이 실시예에는 세포 및 포유류 대상체, 예를 들어, 인간에게 투여하기에 유용한 제형을 포함하여 다양한 제형으로 로딩된 미니 뉴클레오솜을 생성하는 기술이 제공된다. 로딩된 미니 뉴클레오솜은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 아미노산 서열 및 합성이 발생하는 완충 조건에 기초하여 상이한 모양 및/또는 크기 매개변수로 제형화될 수 있다. 로딩된 미니 뉴클레오솜은 상이한 조건, 예를 들어, 치료 용도에 적합한 용해도로 제형화될 수 있다. 물 및/또는 생리식염수에서 로딩된 미니 뉴클레오솜의 용해도는 환자에게 투여하기 위한 조성물의 무독성 제형을 허용하고, 환자에게 전달을 용이하게 하는 하나의 수단이다. 도 7에 나타낸 로딩된 미니 뉴클레오솜을 형성하기 위해, 트리플루오로아세테이트 완충액을 사용하여 고체 상 합성에 의해 코어 단백질을 합성하였다. 200 마이크로그램의 DNA(서열번호: 396)를 1 밀리그램의 동결건조된 코어 단백질에 첨가하고 함께 볼텍싱하고, 정제하여 로딩된 미니 뉴클레오솜을 생성하였다(도 7). 완충액 교환을 수행하고 미니 뉴클레오솜의 최종 제형을 멸균된 내독소가 없는 물에서 제조하였다. 1 마이크로그램의 각 종류의 미니 뉴클레오솜을 물에 희석한 다음 2 분 동안 메탄올 용액 중 0.75% 우라닐 아세테이트에서 새로 제조되어 염색된 격자 위에 배치하였다. 격자를 100% 에탄올에 담근 다음 렌즈 흡수 종이 위에 블롯팅하였다. 그 다음에 격자를 필름 면을 위로 하여 몇 분 동안 공기 건조시키고 Hammatsu ORCA HR 카메라로 영상을 찍었다(도 7). 폴리뉴클레오티드는 루시퍼라제를 암호화하는 플라스미드로서 본 개시내용의 로딩된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 생성하는 데 활용되었지만, 당업자는 본 실시예가 폴리뉴클레오티드와 회합하고 로딩된 미니 뉴클레오솜을 형성하기 위해 본 개시내용의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 일반적인 능력을 광범위하게 입증한다는 것을 이해할 것이다. 루시퍼라제 플라스미드는 일반적으로, 모든 종류의 플라스미드, 선형 핵산, RNA 및 DNA를 포함하나 이에 제한되지 않는 핵산을 대표한다. 다른 경우에, 예를 들어, 다른 서열 또는 구조의 RNA 또는 DNA가 로딩된 미니 뉴클레오솜을 생성하는 데 사용될 수 있었다. 서열번호: 393의 코어 단백질과 축합된 루시퍼라제 플라스미드는 나선형/나선 모양 로딩된 미니 뉴클레오솜을 야기한다(도 7a). 서열번호: 390의 코어 단백질로 축합된 루시퍼라제 플라스미드는 막대형/소엽 모양 로딩된 미니 뉴클레오솜을 야기한다(도 7b). 원형 및 막대형 분자의 혼합물이 루시퍼라제 플라스미드와 코어 단백질 서열번호: 391의 축합에 의해 생성된 로딩된 미니 뉴클레오솜에 대해 관찰되었다(도 7c). 구형 또는 원형 로딩된 미니 뉴클레오솜을 생성할 수 있는 다양한 전하 및 등전점이 있는 다른 완충 조건 및 아미노산 서열이 있다. 상이한 모양 및 크기의 분자는 특정 세포 유형에 대한 향성을 향상시킬 수 있다. 상이한 모양의 바이러스는 상이한 세포 유형을 보다 효과적으로 형질도입한다. 예를 들어, 담배 식물 세포를 형질도입하는 담배 모자이크 바이러스는 막대/나선 모양 뉴클레오캡시드 구조이고, 백혈구를 감염시키는 HIV는 원형 또는 공 모양이고, 간 세포를 효과적으로 형질도입하는 AAV2는 이십면체 모양이다. 본 발명자들은 근육 세포에서 막대 모양 미니 뉴클레오솜에 비해 나선 모양 미니 뉴클레오솜의 더 나은 형질도입 향성을 관찰하였다(도 18). 본 발명자들은 본원에 기재된 바와 같은 상이한 모양의 로딩된 미니 뉴클레오솜을 제형화할 수 있었다. 별개의 미니 뉴클레오솜은 또한 고유한 모양 및 크기에 기초하여 정제될 수 있다.

실시예 4: 투여 경로-정맥내(전신) 및 혈우병 A과 같은 전신 질환에 적용.

이 실시예는 로딩된 미니 뉴클레오솜이 정맥내 경로에 의해 전달되어 간 및 다른 기관에서 단백질을 발현할 수 있다는 것을 입증한다. Balb/c 마우스를 표준 기술을 사용하여 억제하고 인슐린 주사기를 사용하여 로딩된 미니 뉴클레오솜 및 플라스미드 대조군을 꼬리 동맥 주사를 통해 전달하였다. F8 발현 플라스미드 작제물("F8 플라스미드"; 예를 들어, MN #1 및 MN #2, 도 8 참조)을 각각 서열번호: 390 및 서열번호: 391과 F8 플라스미드 DNA(서열번호: 460)의 축합에 의해 제조하였다. GFP 발현 작제물에 대한 플라스미드 서열은 서열번호: 8에 제공된다. 본 실시예에서, 로딩된 미니 뉴클레오솜을 간 세포로 표적화하기 위해, 본 발명자들은 2 개의 NGR 아미노산 도메인을 핵산 결합 도메인(서열번호: 3)과 함께 혼입하였다. AAV2의 NGR 도메인은 αVβ5 인테그린 결합을 촉진시키는 것으로 나타났다. NGR 도메인은 AAV2에 대한 수용체로 알려진 헤파란 술페이트 결합에 연루되어 있다. AAV2는 간 향성이 높은 것으로 알려져 있다. 이들 코어 단백질에 혼입된 KRH 아미노산 모티프는 또한 핵산의 향상된 방출을 위해 PCSK1에 대한 절단 부위로 역할을 한다. 다중 KRH 아미노 서열의 포함은 로딩된 미니 뉴클레오솜의 방출을 향상시켜야 한다. 각각의 마우스는 40 마이크로그램 용량의 MN #1, MN #2 또는 네이키드 플라스미드 F8(서열번호: 460)을 받았다. F8 단백질의 발현을 테스트하기 위해, ~150μl 혈액을 처리 전(1 일 전) 및 처리 후(처리 후 - 3 일, 1 주, 2 주, 1 개월, 3 개월 및 4 개월) 볼 채혈 기술에 의해 수집하였다. 혈청을 표준 기술을 사용하여 혈액으로부터 준비하였다. F8 Elisa(Aviva Systems Biology)를 1:6 혈청 희석을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수행하였다. 로딩된 미니 뉴클레오솜 #1(MN #1은 서열번호: 390 + F8 플라스미드 포함) 및 MN #2(MN #2는 서열번호: 391 + F8 플라스미드 포함)는 처리전 샘플에서 ELISA에 의해 검출된 F8 수준에 비해 대략 6 배 더 많은 F8을 발현하였다. MN #1은 로딩된 미니 뉴클레오솜의 단일 주사 후 3 개월 및 4 개월에 상당히 상승된 수준의 발현을 유지하였다(도 8). F8을 암호화하는 네이키드 플라스미드(미니 뉴클레오솜 코어 단백질과 복합체화되지 않음)로 처리된 대조군 마우스는 어느 시점에서도 F8 발현의 유의한 증가를 입증하지 않았다(도 8).

또 다른 실험에서, GFP 발현 플라스미드(서열번호: 390 + GFP 플라스미드, 서열번호: 395)를 운반하는 로딩된 미니 뉴클레오솜의 정맥내 주사를 겪은 마우스로부터 수집된 조직에서 직접 GFP 형광을 관찰하였다(도 9). 간단히 말해서, 마우스를 1x PBS로 관류하고 희생시켰다. 절개 후 전체 간을 수집하였다. 간 조직을 4% 파라포름알데히드에서 밤새 고정시킨 다음 1xPBS로 세척하고, 15% 수크로스에 몇 시간 동안 담근 다음 동결보존을 위해 30% 수크로스 용액에 밤새 담궜다. 그 다음에 조직을 플라스틱 바이알에 배치하고 절편화를 위해 OCT 화합물을 사용하여 동결시켰다. 10-미크론 두께의 조직 절편을 동결절편기(cryotome)를 사용하여 수득하였다. 간 절편을 DAPI가 있거나 없는 봉입 매질을 사용하여 봉입하고, 커버슬립을 적용하고 밀봉하였다. Leica SP5 공초점 및 에피-형광 스코프에 의해 영상을 획득하였다.

결과는 정맥내 경로에 의해 전달될 때, 미니 뉴클레오솜이 간에 성공적으로 도달하였고 미니 뉴클레오솜 운반체-암호화된 유전자가 간 세포에서 발현되었다는 것을 입증하였다(도 9). 다중 간 세포 유형에서 발현을 관찰하였다. 본 실시예의 관찰은 로딩된 미니 뉴클레오솜을 간으로 전달하는 것이 표적화 도메인에 의존하지 않음을 시사한다. 당업자는 본 실시예에 제공된 데이터의 관점에서, 간과 마찬가지로 이들 기관이 예를 들어 약물의 청소율에서 정상적으로 기능하므로, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 정맥내 전달을 통해 신장 및 비장의 세포로 전달될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본 개시내용의 관점에서 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제의 사용에 의해 치료될 수 있는 병태의 하나의 예는 혈우병 A이다. 혈우병 A는 응고 인자인 인자 8의 돌연변이에 의해 야기된 심각한 출혈 장애이다. 이는 X-선 열성 방식으로 유전된다. 5,000 명의 정상 출산 중 대략 1 명에서 발생한다. 가장 심각한 영향은 사망으로 이어질 수 있는 내부 출혈이다. 중증도는 신체에서 순환하는 F8의 양에 따라 달라진다. 혈우병 환자의 75%는 요법으로 재조합 F8 생성물을 복용한다. F8 요법을 받는 대상체는 반복적으로 정맥내로 주입되어, 시간 경과에 따라 환자, 의사, 및 간병인에게 큰 부담을 야기한다. 현재, AAV를 통해 F8의 장기 발현을 전달하기 위한 유전자 요법 시험이 진행중이다. 그러나, F8은 AAV에 완전히 혼입될 수 없는 큰 유전자이다. 따라서, 미니-F8은 이 질환을 치료하기 위해 F8의 기능적 도메인을 전달하는 데 활용되었다. 미니-F8은 전장 F8과 동일한 기능적 능력 및 안정성을 갖지 않는 것으로 잘 알려져 있다. 더욱이, 집단의 20-40%는 이미 AAV에 대한 중화 항체를 가지고 있어서 혈우병 환자의 대규모 집단이 AAV-기반 의약품을 받을 수 없게 만들 것이다. 또한, AAV 치료 과정을 처음 중단한 후 추가의 치료가 필요하게 된 경우, AAV 벡터는 면역원성으로 인해 재투여될 수 없었다. F8 유전자의 전체 크기를 전달가능하게 되고(도 8) 재투여가능한 속성으로 인해(도 17), 로딩된 미니 뉴클레오솜은 AAV 유전자 요법의 이러한 2 가지 문제를 해결한다. 따라서, 본 개시내용은 혈우병 A가 예시적인 많은 조건에서 사용하기 위해, 정맥내 전달 방식을 사용하여 간, 신장, 비장 등과 같은 전신 공간에서 로딩된 미니 뉴클레오솜을 상이한 세포 유형으로 전달하는 기술을 제공한다.

분비된 단백질의 결함으로 종종 기인하는 다른 전신 질환은 또한 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제를 사용하여 치료될 수 있다. 본 실시예(도 8)는 정맥내로 전달된(전신 투여) 로딩된-미니 뉴클레오솜이 다양한 임상 시험에 의해 결정된 내인성 수준의 대략 10%인 치료 역치보다 더 높은 수준에서 단백질을 생성함을 입증하였으며, 그 중에서도, 분비된 단백질이 다양한 세포 유형에 의해 발현될 수 있는 경우 예를 들어, 전신 질환의 치료를 위한 치료제로서 미니 뉴클레오솜의 치료 잠재력을 입증하였다. 일부 경우에, 발현은 세포 유형 특이적 프로모터를 사용함으로써 특정 세포 유형으로 제한될 수 있다. 당업자는 또한 뇌, 심장, 근육 등과 같은 다른 조직이 또한 정맥내 전달을 통해 평가되고 형질도입될 수 있다는 것을 본 개시내용으로부터 이해할 것이다. 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 들어가 있는 표적화 메커니즘이 해당 맥락에서 도움이 될 것이다.

정맥내로 주사된 경우, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 kg 당 1e5 초과의 게놈 카피 용량 및 체중 kg 당 1e25 카피 용량(예를 들어, 체중 kg 당 약 1e5, 1e6, 1e7, 1e8, 1e9, 1e10, 1e15, 1e20, 또는 1e25 카피, 또는 그 사이의 임의의 범위)으로 전달될 수 있다. 물질의 부피는 1 - 900 밀리리터(예를 들어, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 밀리리터) 범위일 수 있다. 로딩된 미니 뉴클레오솜은 또한 반복적으로 투여될 수 있다(예를 들어, 선택된 부피 및/또는 게놈 카피 수는 여러 번 투여되거나 또는 2 개 이상의 용량으로 분할될 수 있음).

실시예 5: 투여 경로- 안구내

이 실시예는 로딩된 미니 뉴클레오솜이 안구내 경로에 의해 전달되어 망막 색소 상피(RPE) 또는 광수용체, 양극성 세포 및 신경절 세포와 같은 다른 망막 뉴런에서 단백질을 발현할 수 있다는 것을 입증한다. 본 실시예에서, Balb/c 마우스를 케타민/크실라진(90-100 mg/kg + 10 mg/kg)으로 IP 주사에 의해 마취시키고 현미경 아래에 위치시켰다. 마우스 눈을 국소 트로피카미드(1%)로 확장시키고 1ul의 로딩된 미니 뉴클레오솜(마우스에서 총 용량 1.5 마이크로그램)을 각막 가장자리 아래에 25-게이지 바늘로 만든 절개부를 통과하는 32 게이지 무딘 바늘을 사용하여 유리체 강에 주입하였다. 다양한 시점에서, 마우스에 10ml의 1xPBS를 관류한 다음, 표준 기술을 사용하여 희생시켰다. 마우스를 적출하고 아이컵(eyecup)을 수집하고 4% 파라포름알데히드에서 밤새 배양하였다. 아이컵을 1xPBS로 세척한 다음, 15% 수크로스에 몇 분 동안 담근 다음 동결보존을 위해 30% 수크로스 용액에 밤새 담궜다. 그 다음에 아이컵을 플라스틱 바이알에 배치하고 동결 절편을 위해 OCT 화합물을 사용하여 동결시켰다. 염색을 위해 10-미크론 두께의 조직 절편을 수득하였다. 망막 절편을 DAPI가 있거나 없는 봉입 매질로 봉입하고 커버슬립을 적용하고 밀봉하였다. Leica SP5에 의해 영상을 획득하였다. 온조직 표본 영상을 위해, 아이컵을 4% 파라포름알데히드에서 밤새 고정시켰다. 아이컵을 1xPBS로 세척하고, 망막을 제거하고 남아있는 아이컵 또는 RPE 온조직 표본을 염색 처리하였다. RPE 조직을 봉입 매질로 온조직 표본화하고 커버슬립을 적용하고 밀봉하였다. Leica SP5에 의해 영상을 획득하였다. 망막 및 RPE 세포에서 고유 GFP 형광을 관찰하였다(도 10, 11 및 12).

RPE 세포를 표적하기 위해, 본 실시예는 MERTK와 같은 식세포 단백질에 결합할 수 있는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(서열번호: 392)을 활용하였다. RPE는 식세포이며, 미세융모를 광수용체 내부/외부 세그먼트 접합부까지 연장한다. MERTK는 이러한 미세융모에서 발현된다. 서열번호: 392에서, 본 발명자들은 표 8에 기재된 바와 같이 "나를 먹으라(eat me)"는 신호를 혼입하였다. 문헌에서, "나를 먹으라"는 신호는 식세포 작용을 위해 준비된 세포 파편에 노출된 도메인으로 기재되어 있다(Wei Li, Journal of Cell physiology, 2016, 본원에 참조로 포함됨). 본 발명자들이 알고 있는 한, 이러한 "나를 먹으라"는 신호는 이전에 비바이러스 벡터의 맥락에서 활용된 적이 없었다. 이러한 "나를 먹으라"는 신호는 RPE 세포를 표적으로 하는 비바이러스 벡터에 이전에 적용되지 않았다.

광수용체를 선택적으로 형질도입하기 위해, 본 실시예는 서열번호:394의 것과 같은 코어 단백질을 활용하였다. 서열번호:394은 본원에서 표 8에 기재된 뉴런 부착 요소(LRE)를 포함하였으며, 이는 망막 내 모든 뉴런인 신경절 세포, 양극성 세포 및 광수용체로의 형질도입을 허용할 수 있다(도 12). 이 뉴런 부착 도메인은 뉴런을 표적으로 하는 비바이러스 벡터에 이전에 적용된 적이 없었다. 본 개시내용은 이 뉴런 표적화된 벡터가 국소 또는 전신 투여를 통해 뇌의 뉴런에 형질도입될 수 있다는 것을 제공한다. 본 개시내용은 흡수를 향상시키기 위해 광수용체 세포외 기질 매트릭스에 부착하기 위한 미니 뉴클레오솜에 렉틴 결합 도메인(표 4에 기재됨)을 혼입함으로써 광수용체 결합 및 내재화를 표적화하는 것을 추가로 제공한다. 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(서열번호: 390)에 혼입된 인테그린 결합 도메인은 또한 안구내로 전달될 때 배타적으로 래트 눈에 RPE 세포를 형질도입할 수 있다(도 11). 더욱이, 하나 초과의 도메인을 활용하여 복수의 다양한 세포 유형을 선택적으로 형질도입할 수 있다. 인테그린 결합 속성을 갖는 이 코어 단백질(서열번호: 390)은 또한 높은 수준의 αVβ5 인테그린을 발현하는 다른 세포 유형에 핵산을 전달하기 위해 활용될 수 있다. 본 개시내용은 광수용체, RPE, 뮐러 세포 또는 망막 내 다른 세포 유형을 표적으로 하기 위해 망막하, 맥락막상, 전방내, 또는 국소 투여와 같은 다른 안구내 주사 기술의 사용을 추가로 제공한다.

본원에는 유리체내, 맥락막상 또는 막망하 전달 방식을 사용하여 망막에서 상이한 세포 유형으로 로딩된 미니 뉴클레오솜을 전달하는 기술이 제공된다. 망막 변성과 같은 질환은 주로 광수용체에서 발현된 유전자의 돌연변이에 의해 야기된다. 연령 관련 황반 변성(AMD)은 망막 색소 상피(RPE) 및 맥락막모세혈관 질환이며, 1000만 명 초과의 미국인 및 전 세계 1억 명 초과의 사람들에게 영향을 미치며, 현재, 광수용체 및 RPE에 유전자 요법 벡터를 전달하는 주요 기술은 바이러스를 망막에 망막하로 주입하는 외과적 기술이다. 그러나, 막망하 절차는 훈련된 안과 전문의가 수술실에서 수행하는 복잡한 수술이다. 적어도 미국에서는 이 수술을 수행하도록 훈련된 외과의가 몇 안된다는 점에서 요구가 충족되지 않았다. 환자 및 의사의 부담을 줄이는 한 가지 방식은 망막을 통과하여 광수용체 및 RPE를 형질도입할 수 있는 유리체내로 주입될 수 있는 벡터를 개발하는 것이다. 유리체내 주사는 입원 환자 방문 시 모든 안과의에 의해 수행될 수 있다. 로딩된 미니 뉴클레오솜 요법은 유리체내 주사가 광수용체 및 RPE를 선택적으로 형질도입할 수 있으므로 이 문제를 해결한다(도 10, 11 및 12). 이는 미니 뉴클레오솜을 유전적 결함이 있는 대부분의 망막 질환을 치료하는 데 매우 적합하게 만든다.

안구내 주입될 때, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 눈 당 1e5 초과의 게놈 카피 용량 및 눈 당 최대 1e25 카피 용량(예를 들어, 당 약 1e5, 1e6, 1e7, 1e8, 1e9, 1e10, 1e15, 1e20, 또는 1e25 카피, 또는 그 사이의 임의의 범위)으로 전달될 수 있다. 물질의 부피는 막망하로 주입될 때 10-500 마이크로리터(예를 들어, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 마이크로리터) 및 유리체내, 맥락막상, 또는 전방내 주사일 때 10-250 마이크로리터(예를 들어, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 또는 250 마이크로리터) 범위일 수 있다. 로딩된 미니 뉴클레오솜 치료제는 또한 반복적으로 투여될 수 있다(예를 들어, 선택된 부피 및/또는 게놈 카피 수는 여러 번 투여될 수 있거나 또는 2 개 이상의 용량으로 나눠질 수 있음).

실시예 6: 투여 경로- 비강내

이 실시예는 로딩된 미니 뉴클레오솜이 비강내 경로에 의해 전달되어 폐, 기관, 및 장 세포에서 단백질을 발현할 수 있다는 것을 입증한다. 본 실시예에서, 폐 상피에서 상피 세포를 표적화하기 위해, 2 개의 NGR 아미노산 도메인이 핵산 결합 도메인과 함께 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에 포함되었다(NGR 아미노산 도메인 서열번호: 390의 사용 참조). 본 발명자들이 알고 있는 한, NGR 도메인은 본원에 개시된 바와 같이 비바이러스 DNA/단백질 복합체를 생성하고 망막 세포에 전달하도록 활용된 적이 없었다. AAV2의 NGR 도메인은 αVβ5 인테그린 결합을 촉진시키는 것으로 나타났다. NGR 도메인은 AAV2에 대한 수용체로 알려진 헤파란 술페이트 결합에 연루되어 있다.

본 실시예에서, Balb/c 마우스를 케타민/크실라진(90-100 mg/kg + 10 mg/kg)으로 IP 주사에 의해 마취시키고 마취된 마우스를 비강내 전달을 위한 비강 영역의 시각화를 위해 현미경 아래에 위치시켰다. 1ul의 로딩된 미니 뉴클레오솜(서열번호: 390 + GFP 플라스미드) 용액을 12 마이크로리터가 각각의 비강 측으로 전달될 때까지 몇 초마다 비강으로 전달하였다. 총 25 마이크로그램 용량을 전달하였다. 희생시킨 후, 마우스 폐를 처리하여 10미크론 두께 절편을 수득하였다. 절편을 PBS로 세척하고 차단 완충액(0.1% TritonX-100, 1% BSA, 3% 당나귀 혈청)에서 1 시간 동안 배양한 다음 CFTR 항체(차단 완충액에서 제조됨) 차단 완충액에서 밤새 섭씨 4 도에서 배양하였다. 다음 날 PBS 3x5 분으로 세척하고 RT에서 1시간 동안 차단 완충액 중 AlexaFlour-555(당나귀 항-토끼 IgG 2차)에서 배양하고 PBS 3x5 분으로 세척하였다. 봉입 매질을 첨가하고 커버슬립을 적용하고 밀봉하였다. GFP의 고유 형광을 486-nm 파장에서 Leica SP5 스코프의 486nm 채널에서 수득하고 CFTR 발현을 555-nm 채널에서 수득하였다. 본 발명자들은 빠르면 3 일 및 또한 PI-3 개월에 로딩된 미니 뉴클레오솜 발현을 관찰하였다(도 13). 본 발명자들은 CFTR 염색과 함께 선명한 녹색 형광으로 도시된 폐포 및 세기관지 둘 다의 상피(도 13a 및 13c)에서 발현을 관찰하였다. CFTR 및 GFP의 공국소화(도 13c)는 폐 상피에서 미니 뉴클레오솜에 의해 암호화된 유전자의 발현을 입증한다. 폐포 고리를 촬영한 고배율 영상(도 14 a, b 및 c)은 또한 CFTR 염색된 세포에서 적색 형광과 함께 상피에서 GFP 형광의 밝은 녹색 고리를 명확하게 나타낸다.

본 실시예에서, 전체 폐 조직 및 미니 뉴클레오솜을 통한 생체분포를 또한 평가하였다(도 15). 전체 폐 조직은 관류 및 희생 후 마우스에서 추출된 형태였다. 폐 조직을 4% PFA에 고정시키고 1xPBS로 세척하였다. GFP 고유 형광을 검출하기 위해 전체 조직을 Odyssey 영상기에 배치하였다. 비주입 대조군은 어떠한 형광도 나타내지 않았다(도 15). GFP를 암호화하는 플라스미드 핵산 운반체를 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜은 주사 후 5 주 샘플의 전체 폐 조직에서 GFP 형광을 입증하였다(도 15).

본원에는 비강내 전달 방식을 사용하여 폐 상피, 및/또는 기관과 같은 폐 공간의 조직에서 로딩된 미니 뉴클레오솜을 상이한 세포 유형으로 전달하는 기술을 제공한다. 낭포성 섬유증과 같은 유전적 질환은 폐 및 다른 기관에 영향을 미친다. 유전자를 폐에 전달하기 위해, 선택 경로 중 하나는 비강내이다. 본 발명자들은 로딩된-미니 뉴클레오솜이 비강내로 전달될 때 폐포 및 세기관지에서 단백질을 발현한다는 것을 관찰하였다(도 13). 이들은 낭포성 섬유증에 연루된 CFTR 단백질을 정상적으로 발현할 수 있는 조직이다. 다른 질환에서, 이 투여 경로를 사용하여 다른 질환을 완화할 수 있는 치료 단백질을 생성할 수 있다. 비강내 경로는 또한 장 및 뇌와 같은 다른 기관으로의 접근을 제공할 수 있다(도 16). 미니 뉴클레오솜 코어 단백질(서열번호: 390)에 NGR 도메인을 포함하여 높은 수준의 지속적인 발현을 위해 핵으로 DNA 분자의 흡수 및 방출을 향상시켰다. 이는 로딩된-미니 뉴클레오솜에서 관찰된 밝은 녹색 형광 대 처리후 5 주에 미처리된 동물(도 16의 첫번째 행의 폐 영상)에서 이러한 패턴이 없는 것에 의해 도 16에서 입증된다. 본 발명자들은 또한 로딩된 미니 뉴클레오솜의 비강내 전달 후 기관 상피 및 기관 근육에서 GFP 발현의 형질도입을 관찰하였다(도 17).

비강내로 주입될 때, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 kg 당 1e5 초과의 게놈 카피 용량 및 체중 kg 당 최대 1e25 카피 용량(예를 들어, 체중 kg 당 약 1e5, 1e6, 1e7, 1e8, 1e9, 1e10, 1e15, 1e20, 또는 1e25 카피, 또는 그 사이의 임의의 범위)으로 전달될 수 있다. 물질의 부피는 1- 200 밀리리터(예를 들어, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 또는 200 밀리리터) 범위일 수 있다. 로딩된 미니 뉴클레오솜은 또한 반복적으로 투여될 수 있다. 로딩된 미니 뉴클레오솜은 또한 장, 췌장 등에 접근하기 위해 경구로 전달될 수 있다.

실시예 7: 투여 경로- 근육내

이 실시예는 로딩된 미니 뉴클레오솜이 근육내 경로에 의해 전달되어 근육 세포에서 단백질을 발현할 수 있다는 것을 입증한다. Balb/c 마우스를 케타민/크실라진(90-100 mg/kg + 10 mg/kg)으로 IP 주사에 의해 마취시키고 여러 로딩된 미니 뉴클레오솜을 인슐린 주사기를 사용하여 다리 당 17.5ug 용량으로 양쪽 다리 근육에 주입하였다(마우스 당 총 35 마이크로그램 용량). 마우스를 다양한 시점에 희생시키고 조직 절편을 위해 다리 근육을 수득하였다. 폴리리신(서열번호: 393) 또는 다른 도메인 조합이 있는 미니 뉴클레오솜(서열번호: 389)과 같은 코어 단백질이 함유된 작제물은 3-개월 시점에서 GFP 형광을 나타내지 않았다. 놀랍게도, 주사후 3-개월에 수득된 근육 조직 절편에서, 본 발명자들은 서열번호: 391에 제시된 바와 같이 갈락토스 및 푸코스 결합 도메인을 함유하는 로딩된 미니 뉴클레오솜이 주입된 골격근 세포에서 선명한 녹색 형광을 관찰하였다(도 18 a, b 및 c). 이는 일부 도메인이 근육 세포로의 부착 및 내재화 경향이 더 높고 근육 세포로의 효율적인 유전자 전달을 위해 활용될 수 있다는 것을 입증한다. 당업자는 근육 향성에 대해 알려진 다른 도메인과 이러한 도메인을 조합하는 것을 고려할 수 있다.

핵산 운반체에 의해 암호화된 유전자 발현의 근육 특이성을 검증하기 위해, 본 발명자들은 내인성 2차 마커로서 디스트로핀 면역표지화를 활용하였다. 디스트로핀 염색의 적색 형광(패널 B; 패널 C에 병합)에 의해 둘러싸인 선명한 녹색 형광(패널 A) 영역은 근육내로 주입된 로딩된 미니 뉴클레오솜이 유전자를 근육 세포로 전달할 수 있다는 것을 분명하게 입증한다(도 18). GFP의 고유 형광은 Leica SP5 스코프의 486-nm 채널에서 수득하였다. 적색의 디스트로핀은 RFP 채널(555-nm)이다. 도면에서 형질도입되지 않은 근육 세포는 또한 GFP 신호 및 자가형광 사이를 구별하기 위한 내부 대조군으로 역할을 한다.

본원에는 근육내 전달 방식에 의해 로딩된 미니 뉴클레오솜을 근육 세포로 전달하는 기술이 제공된다. 많은 유전적 근이양증은 근육 세포의 위축으로 이어진다. 기능적 유전자를 이들 근육 세포로 전달하기 위해, 근육내 경로는 직접 투여 경로를 제공한다. 본 발명자들은 골격근 세포에서 유전자를 발현하는 로딩된-미니 뉴클레오솜의 근육 향성 및 능력을 입증하였다(도 18). 전달 후 빠르면 2 일에 근육 세포에서 발현을 관찰하였다. 본원에는 벡터 흡수 및 유전자 발현을 향상시킬 수 있는 근육-향성 도메인이 제공되지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명자들은 또한 근육내 경로를 통해 전달된 나선형 모양의 로딩된 미니 뉴클레오솜이 소엽 모양의 분자에 비해(데이터는 제시되지 않음) 이러한 3 개월 경우에 근육 세포를 효과적으로 및 더 긴 기간 동안 형질도입한다는 것을 관찰하였다(도 18). 벡터 모양은 유전자를 근육 세포로 전달하는 맥락에서 이전에 기재된 적이 없었다. 당업자는 근육 세포에 대한 세포 향성을 증가시키기 위해 다른 구조를 활용하는 것을 고려할 수 있다. 전반적으로, 디스트로핀 발현 근육 세포에서 GFP의 발현은 뒤시엔느 근이영양증 또는 다른 근이영양증과 같은 질환을 구제하는 로딩된 미니 뉴클레오솜의 능력을 입증한다. 근육 향성은 또한 표 4에 기재된 바와 같은 다른 도메인을 포함함으로써 향상될 수 있다. 근육 향성은 또한 정맥내 전달에 의해 달성될 수 있다.

근육내 경로를 통해 주입될 때, 로딩된 미니 뉴클레오솜은 kg 당 1e5 초과의 게놈 카피 용량 및 체중 kg 당 최대 1e25 카피 용량(예를 들어, 체중 kg 당 약 1e5, 1e6, 1e7, 1e8, 1e9, 1e10, 1e15, 1e20, 또는 1e25 카피, 또는 그 사이의 임의의 범위)으로 전달될 수 있다. 물질의 부피는 1- 900 밀리리터(예를 들어, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 밀리리터) 범위일 수 있다. 로딩된 미니 뉴클레오솜은 또한 반복적으로 투여될 수 있다(예를 들어, 선택된 부피 및/또는 게놈 카피 수는 여러 번 투여될 수 있거나 또는 2 개 이상의 용량을 나눠질 수 있음). 로딩된 미니 뉴클레오솜은 또한 근육 세포에 접근하기 위해 정맥내로 투여될 수 있다.

실시예 8: 로딩된 미니 뉴클레오솜은 재투약할 수 있다

이 실시예는 미니 뉴클레오솜이 단백질 발현에 대한 어떠한 중화 효과 없이 재투여될 수 있다는 것을 입증한다(도 19). Balb/c 마우스를 표준 억제 기술을 사용하여 간단히 억제하였고 인슐린 주사기를 사용하여 꼬리 동맥 주사를 통해 로딩된 미니 뉴클레오솜 MN #1(서열번호: 390 + F8 플라스미드), 및 MN #2(서열번호: 391 + F8 플라스미드, 서열번호: 393)를 전달하였다. 각각의 마우스는 1차 용량 20 마이크로그램 및 2차 용량 40 마이크로그램(1차 용량 후 30 일)을 받았다. 1차 및 2차 용량 후 3 일에 볼 채혈 기술에 의해 혈청을 수집하였다. ~150ul 혈액을 각 시점에 수집하였고 혈청을 표준 기술을 사용하여 혈액에서 수집하였다. F8 Elisa를 수행하여 로딩된 미니 뉴클레오솜의 정맥내 전달 후 Balb/c 마우스의 혈청에서 F8 발현 수준을 결정하였다. F8 Elisa는 제조업체(Aviva Systems Biology)의 지침에 따라 수행하였다. 모든 검정에 대해 1:6 혈청 희석을 수행하였다. 본 발명자들은 두번째로 전달되었을 때, F8의 단백질 수준의 증가로 입증된 바와 같이, 발현 수준에서 중화 효과가 없었다는 것을 관찰하였다(도 19).

본원에는 원하는 단백질의 발현 수준을 높이기 위해 반복적으로 전달될 수 있는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 및 로딩된 미니 뉴클레오솜의 예가 제공된다. 재투약성은 반복 투여가 필요할 수 있는 임의의 약물에 대한 매우 중요한 특징이다. 유전자 요법에서, 현재 바이러스 벡터의 가장 바람직하지 않은 특징 중 하나는 의약품을 재투여할 수 없다는 점이다. 바이러스 벡터가 일단 환자에게 주입되면 중화 항체 형성을 초래한다. 이들이 두번째로 투여될 때 이는 면역원성 및 비발현성을 야기한다. 본 발명자들은 여기에서 미니 뉴클레오솜 매개 유전자 전달이 이 문제를 해결한다는 것을 보여준다. 미니 뉴클레오솜의 비면역원성 속성은 자가-펩티드 또는 인간 유래 아미노산 서열을 조합하고 페길화에 의해 향상되는 설계에 의해 조작된다. 문헌에서, 페길화된 단백질은 면역계를 회피하는 것으로 제시되었다. 이 경우, 마우스에서 인공 인간 유래 코어 단백질에 대한 면역원성 결여는 페길화 사례를 추가로 검증한다. 이 재투약성 특징은 필요할 때 환자에게 다중 치료를 허용할 것이다. 시간 경과에 따라 발현 수준이 감소하는 경우, 이 재투약성 특징은 원하는 수준으로 발현을 높이기 위해 반복 치료를 허용할 것이다. 이 데이터 조각은 또한 다중 기관 주사가 필요한 일부 환자에서 미니 뉴클레오솜 매개 유전자 전달이 가장 바람직하다는 것을 나타낸다. 당업자는 또한 국소, 경구, 질, 복강내, 안구내, 척추강내, 대뇌내, 피하 등과 같은 많은 다른 투여 경로를 통해 또는 리포솜 또는 다른 합성 물질에서의 캡슐화를 통한 반복 투약을 고려할 수 있다.

반복 용량은 kg 당 1e5 초과의 게놈 카피 농도 및 체중 kg 당 최대 1e25 카피 용량(예를 들어, 체중 kg 당 약 1e5, 1e6, 1e7, 1e8, 1e9, 1e10, 1e15, 1e20, 또는 1e25 카피, 또는 그 사이의 임의의 범위)으로 전달될 수 있다. 물질의 부피는 1- 900 밀리리터(예를 들어, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 밀리리터) 범위일 수 있다. 로딩된 미니 뉴클레오솜은 또한 반복적으로 투여될 수 있다(예를 들어, 선택된 부피 및/또는 게놈 카피 수는 여러 번 투여될 수 있거나 2 개 이상의 용량으로 나눠질 수 있음).

실시예 9: 일반적인 기술

이 실시예는 min-뉴클레오솜을 세포로 전달하는 일반적인 클로닝 기술을 기재한다. 이들 벡터를 구축하는 데 적용될 수 있는 클로닝 기술 중 일부는 이식유전자 작제물의 합성, TOPO PCR 클로닝, 무딘 말단 클로닝, 심리스(seamless) 클로닝, 긴 단편 클로닝, 제한 효소 소화 및 결찰을 포함할 수 있으나 이들 기술에 제한되지 않는다. DNA 또는 RNA 분자는 GFP, YFP 및 루시퍼라제와 같은 하나 이상의 발현 마커를 발현할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. DNA 또는 RNA 분자는 하나 이상의 치료 RNA 또는 단백질을 발현할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

로딩된 미니 뉴클레오솜은 기능에 대해 테스트되고 HEK 세포 또는 다른 동물 세포주에서 발현함으로써 시험관 내에서 특성화될 수 있다. 조혈 줄기 세포 또는 분화된 말초 혈액 단핵 세포를 형질도입하도록 합성 및/또는 정제된 로딩된 미니 뉴클레오솜의 능력은 배양물에서 세포를 로딩된 미니 뉴클레오솜에 노출시킴으로써 검정될 수 있다. 로딩된 미니 뉴클레오솜은 또한 미니 뉴클레오솜에 노출에 의해 또는 형질감염 기술, 또는 삽입을 위한 다른 물리적 방법을 통해 시험관 내에서 키메라 T 세포를 형성하는 기능 및 능력에 대해 테스트될 수 있다. 로딩된 미니 뉴클레오솜은 기능에 대해 테스트되고 마우스 또는 임의의 다른 동물 모델이나 이제 제한되지 않고 전달함으로써 생체 내에서 특징화될 수 있다.

실시예 10: 인산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 뉴런 및 중추신경계 세포에 핵산 페이로드를 전달한다

본 실시예는 인산화에 의해 변형된 하나 이상의 잔기를 포함하는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 적어도 특정 세포 또는 조직에서 핵산 페이로드의 발현(즉, 핵산 페이로드에 의해 암호화된 발현 생성물의 발현)에 특히 유리하다는 것을 입증한다. 예를 들어, 인산화에 의해 변형된 하나 이상의 잔기를 포함하는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 뉴런을 포함하는, 특히 척수 세포 및 뇌 뉴런을 포함하는 중추 신경계 세포에서 핵산 페이로드의 발현에 특히 유리할 수 있다.

서열번호: 399에 따른 아미노산 서열을 갖는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 인산화하여 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 제조하였다. 특히, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 11번 위치에 있는 트레오닌 잔기가 인산화되었다. 이 잔기는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 링커 도메인(VT)에 위치한다. 그러나, 본 개시내용은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 내의 변형의 특정 위치보다는 변형의 존재가 본원에 개시된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 특성을 결정한다는 것을 제공한다. 임의의 특정 과학적 이론에 얽매이지 않고, 본 실시예는 본 실시예에 따른 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 변형이 세포 표면 수용체와 상호작용하여 특정 표적 세포로 로딩된 미니 뉴클레오솜의 전달을 개선할 수 있다는 인식을 포함한다. 따라서, 본 개시내용은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 특히 세린, 트레오닌 또는 티로신의 임의의 아미노산 잔기(들)의 인산화가 본 실시예에서 변형된 특정 미니 뉴클레오솜의 특정 잔기의 인산화와 동등한 이점 및 특성을 제공할 것임을 제공한다. 동일한 아미노산 서열에 따른 비변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질도 대조군으로 본 실시예에 포함되었다.

본 실시예의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 루시퍼라제를 암호화하는 유전자를 포함하는 핵산 페이로드로 로딩되었다. 본 실시예에서, 루시퍼라제는 일반적으로 단백질 발현을 대표하며, 루시페라제의 발현은 임의의 발현 생성물을의 발현을 위한 임의의 핵산 페이로드를 성공적으로 전달하기 위해 본원에 개시되고 본 실시예에서 논의된 바와 같이 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 능력을 나타낸다. 본 실시예의 로딩된 미니 뉴클레오솜을 하나 이상의 9-10주령 Balb/c 마우스(3e10gc/마우스; 10ul 부피)에 경막내 투여되었다.

결과를 도 31에 나타내었다. 투여 후 11일째에, 마우스에 2.5 ml/kg의 복강내(IP) 주사를 통해 150 mg/kg (60 mg/mL)의 루시페린을 투여하였다. 각 루시페린 투여 후(± 5%) ~15분에서, 모든 동물은 IVIS 이미징 세션을 받았다. 도 31의 패널 A는 비변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜을 사용한 결과를 보여주는 반면, 도 31의 패널 B는 인산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜을 사용한 결과를 보여준다. 모든 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에는 루시페라제를 암호화하는 유전자를 포함하는 핵산 페이로드가 로딩되었다. 패널 B는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 아니라 비변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 뉴런을 포함하고 척수 세포 및 뇌 뉴런을 포함하는 중추 신경계 세포를 포함한 특정 조직에서 대표적인 핵산 페이로드-암호화된 발현 생성물(여기서는, 루시페라제)의 강력한 발현을 초래함을 보여준다. 본 실시예에서 관찰된 발현 수준은 매우 예상치 못한 것이었다. IVIS 이미징에 의한 발현의 검출은 매우 높은 수준의 발현을 필요로 하며, 따라서 본 데이터는 세포 흡수 및 페이로드 발현의 놀라운 효율성을 반영한다. 발현 수준은 비바이러스 벡터에 대해 예상되는 수준을 극적으로 초과한다.

실시예 11: 황산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 핵산 페이로드를 뉴런 및 중추 신경계 세포에 전달한다

본 실시예는 황산화에 의해 변형된 하나 이상의 잔기를 포함하는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 특정 세포 또는 조직에서 적어도 핵산 페이로드의 발현(즉, 핵산 페이로드에 의해 암호화된 발현 생성물의 발현)에 특히 유리하다는 것을 입증한다. 예를 들어, 황산화에 의해 변형된 하나 이상의 잔기를 포함하는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 뉴런을 포함하는, 특히 척수 세포 및 뇌 뉴런을 포함하는 중추 신경계 세포에서 핵산 페이로드의 발현에 특히 유리할 수 있다.

서열번호: 388에 따른 아미노산 서열을 갖는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 황산화에 의해 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 제조하였다. 특히, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 38번 위치의 티로신 잔기가 황산화되었다. 이 잔기는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 표적화 도메인(FYQPL)에 위치한다. 그러나, 본 개시내용은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 내의 변형의 특정 위치보다는 변형의 존재가 본원에 개시된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 특성을 결정한다는 것을 제공한다. 임의의 특정 과학적 이론에 얽매이지 않고, 본 실시예는 본 실시예에 따른 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 변형이 세포 표면 수용체와 상호작용하여 특정 표적 세포로 로딩된 미니 뉴클레오솜의 전달을 개선할 수 있다는 인식을 포함한다. 따라서, 본 개시내용은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 특히 세린, 트레오닌 또는 티로신의 임의의 아미노산 잔기(들)의 황산화가 본 실시예에서 변형된 특정 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 특정 잔기의 황산화와 동등한 이점 및 특성을 제공할 것임을 제공한다. 동일한 아미노산 서열에 따른 비변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질도 대조군으로 본 실시예에 포함되었다.

본 실시예의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 루시퍼라제를 암호화는 유전자를 포함하는 핵산 페이로드로 로딩되었다. 본 실시예에서, 루시퍼라제는 일반적으로 단백질 발현을 대표하며, 루시페라제의 발현은 임의의 발현 생성물의 발현을 위한 임의의 핵산 페이로드를 성공적으로 전달하기 위해 본원에 개시되고 본 실시예에서 논의된 바와 같이 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 능력을 나타낸다. 본 실시예의 로딩된 미니 뉴클레오솜을 하나 이상의 9-10주령 Balb/c 마우스(3e10gc/마우스; 10ul 부피)에 경막내 투여하였다.

결과를 도 32 및 33에 나타내었다. 투여 후 11일째에, 마우스에 2.5 ml/kg의 복강내(IP) 주사를 통해 150 mg/kg (60 mg/mL)의 루시페린을 투여하였다. 각 루시페린 투여 후(± 5%) ~15분에서 모든 동물은 IVIS 이미징 세션을 받았다. 도 32의 패널 A는 비변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜을 사용한 결과를 보여주는 반면, 도 32의 패널 B는 황산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜을 사용한 결과를 보여준다. 모든 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에는 루시페라제를 암호화하는 유전자를 포함하는 핵산 페이로드가 로딩되었다. 도 32의 패널 B는 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 아니라 비변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 뉴런을 포함하고 척수 세포 및 뇌 뉴런을 포함하는 중추 신경계 세포를 포함한 특정 조직에서 대표적인 핵산 페이로드-암호화된 발현 생성물(여기서는, 루시페라제)의 강력한 발현을 초래함을 보여준다. 도 33은 루시페라제를 암호화하는 페이로드가 로딩된 황산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 투여된 마우스의 뇌 조직 섹션을 포함하며, 이 마우스는 뉴런을 포함하고, 척수 세포 및 뇌 뉴런(패널 A)를 포함하는 중추 신경계 세포를 포함하는 특정 조직에서 발현의 높은 정도를 보여주었다. 패널 B, C 및 D는 각각 루시퍼라제, 항-NeuN 항체 및 D-DAPI 염색을 보여주며, 패널 E에 표시된 이러한 염색의 오버레이가 있다. 도 33의 이미지는 미니 뉴클레오솜이 황산화될 때, 특히 뇌 뉴런을 포함한 뇌 세포에서 대표적인 핵산 페이로드 암호화된 발현 생성물의 강력한 발현을 보여주지만(여기서는, 루시퍼라제), 미니 뉴클레오솜이 비변형된 경우에는 그렇지 않다. 본 실시예에서 관찰된 발현 수준은 매우 예상치 못한 것이었다. IVIS 이미징에 의한 발현의 검출은 매우 높은 수준의 발현을 필요로 하며, 따라서 본 데이터는 세포 흡수 및 페이로드 발현의 놀라운 효율성을 반영한다. 발현 수준은 비바이러스 벡터에 대해 예상되는 수준을 극적으로 초과한다. 더욱이, 황산염이 특히 뇌 뉴런을 포함한 뇌 세포의 발현을 증가시킬 것이라는 것은 예상치 못한 일이었다.

실시예 12: 아세틸화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 핵산 페이로드를 뉴런 및 중추 신경계 세포에 전달한다

본 실시예는 아세틸화에 의해 변형된 하나 이상의 잔기를 포함하는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 적어도 특정 세포 또는 조직에서 핵산 페이로드의 발현(즉, 핵산 페이로드에 의해 암호화된 발현 생성물의 발현)에 특히 유리하다는 것을 입증한다. 예를 들어, 아세틸화에 의해 변형된 하나 이상의 잔기를 포함하는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 망막 세포, 특히 광수용체에서 핵산 페이로드의 발현에 특히 유리할 수 있다.

서열번호: 401에 따른 아미노산 서열을 갖는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 아세틸화에 의해 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 제조하였다. 특히, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 10번 위치의 리신 잔기가 아세틸화된다. 이 잔기는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 표적화 도메인(KKRPKP)에 위치한다. 그러나, 본 개시내용은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 내의 변형의 특정 위치보다는 변형의 존재가 본원에 개시된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 특성을 결정한다는 것을 제공한다. 임의의 특정 과학적 이론에 얽매이지 않고, 본 실시예는 본 실시예에 따른 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 변형이 세포 표면 수용체와 상호작용하여 특정 표적 세포로 로딩된 미니 뉴클레오솜의 전달을 개선할 수 있다는 인식을 포함한다. 따라서, 본 개시내용은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 특히 리신의 임의의 아미노산 잔기(들)의 아세틸화가 본 실시예에서 변형된 특정 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 특정 잔기의 아세틸화와 동등한 이점 및 특성을 제공할 것임을 제공한다 동일한 아미노산 서열에 따른 비변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질도 대조군으로 본 실시예에 포함되었다.

본 실시예의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 GFP를 암호화하는 유전자를 포함하는 핵산 페이로드로 로딩되었다. 본 실시예에서, GFP의 발현이 임의의 발현 생성물의 발현을 위한 임의의 핵산 페이로드를 성공적으로 전달하기 위해 본원에 개시되고 본 실시예에서 논의된 바와 같이 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 능력을 나타낸다는 점에서 일반적으로 GFP는 단백질 발현을 대표한다. 본 실시예의 로딩된 미니 뉴클레오솜을 하나 이상의 마우스에 유리체내 투여하였다. 유리체내 주사를 위해 마우스를 케타민/자일라진(90-100 mg/kg + 10 mg/kg)으로 IP 주사하여 마취하고, 국소 트로픽아마이드 (1%)를 사용하여 현미경으로 표적 동공을 확장하고, 30-게이지 바늘을 사용하여 윤부 아래 ~ 1mm의 공막에 절개/삽입했다. 로딩된 미니 뉴클레오솜 1μl를 25-게이지 바늘로 만든 절개부를 통과하는 32 게이지 무딘 바늘을 사용하여 유리체에 주입했다.

결과를 도 34에 나타내었다. 주사 후 4주째에 눈을 적출하고 고정을 위해 4% PFA에 넣었다. 렌즈는 절개에 의해 눈에서 제거되었고 망막 온조직은 아이컵에서 절개되었다. 망막 온조직을 1xPBS로 수화되었고, 2% BSA를 사용하여 차단되었고, Alexa-flour 555에 결합된 GFP 항체로 실온에서 1시간 동안 염색되었고, 1xPBS로 각각 5분씩 4회 세척했다. 이미지는 Leica SP5 공초점 현미경을 사용하여 얻었다.

도 34의 패널 A-C는 비변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜을 사용한 결과를 보여주는 반면, 도 34의 패널 D-F는 아세틸화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜을 사용한 결과를 보여준다. 모든 미니 뉴클레오솜 코어 단백질에는 GFP를 암호화하는 유전자를 포함하는 핵산 페이로드가 로딩되었다. 이미지는 미니 뉴클레오솜이 아세틸화될 때, 망막 세포, 특히 광수용체에서 대표적인 핵산 페이로드 암호화된 발현 생성물(여기서는. GFP)의 강력한 발현을 보여주지만 미니 뉴클레오솜이 비변형된 경우에는 그렇지 않다. 본 실시예에서 관찰된 발현 수준은 매우 예상치 못한 것이었다. IVIS 이미징에 의한 발현의 검출은 매우 높은 수준의 발현을 필요로 하며, 따라서 본 데이터는 세포 흡수 및 페이로드 발현의 놀라운 효율성을 반영한다. 발현 수준은 비바이러스 벡터에 대해 예상되는 수준을 극적으로 초과한다. 더욱이, 아세틸화가 망막 세포, 특히 광수용체에서 발현을 증가시킬 것이라는 것은 예상치 못한 일이었다.

실시예 13: 인산화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 핵산 페이로드를 뉴런 및 중추 신경계 세포에 전달한다

본 실시예는 만노실화에 의해 변형된 하나 이상의 잔기를 포함하는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질이 적어도 특정 세포 또는 조직에서 핵산 페이로드의 발현(즉, 핵산 페이로드에 의해 암호화된 발현 생성물의 발현)에 특히 유리하다는 것을 입증한다. 예를 들어, 만노실화에 의해 변형된 하나 이상의 잔기를 포함하는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 망막 세포, 특히 광수용체에서 핵산 페이로드의 발현에 특히 유리할 수 있다.

서열번호:447에 따른 아미노산 서열을 갖는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 만노실화에 의해 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 제조하였다. 특히, 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 9번 위치의 세린 잔기가 만노실화되었다. 이 잔기는 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 링커 도메인(GGS)에 위치한다. 그러나, 본 개시내용은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질 내의 변형의 특정 위치보다는 변형의 존재가 본원에 개시된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 특성을 결정한다는 것을 제공한다. 임의의 특정 과학적 이론에 얽매이지 않고, 본 실시예는 본 실시예에 따른 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 변형이 세포 표면 수용체와 상호작용하여 특정 표적 세포로 로딩된 미니 뉴클레오솜의 전달을 개선할 수 있다는 인식을 포함한다. 따라서, 본 개시내용은 미니 뉴클레오솜 코어 단백질, 특히 세린의 임의의 아미노산 잔기(들)의 만노실화가 본 실시예에서 변형된 특정 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 특정 잔기의 만노실화와 동등한 이점 및 특성을 제공할 것임을 제공한다. 동일한 아미노산 서열에 따른 비변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질도 대조군으로 본 실시예에 포함되었다.

본 실시예의 미니 뉴클레오솜 코어 단백질은 GFP를 암호화하는 유전자를 포함하는 핵산 페이로드로 로딩되었다. 본 실시예에서, GFP의 발현은 임의의 발현 생성물의 발현을 위한 임의의 핵산 페이로드를 성공적으로 전달하기 위해 본원에 개시되고 본 실시예에서 논의된 바와 같이 변형된 미니 뉴클레오솜 코어 단백질의 능력을 나타낸다는 점에서 일반적으로 GFP는 단백질 발현을 대표한다. 본 실시예의 로딩된 미니 뉴클레오솜을 하나 이상의 마우스에 망막하 투여하였다. 망막하 주사를 위해 마우스를 케타민/자일라진 (90-100 mg/kg + 10 mg/kg)으로 IP 주사하여 마취하고 국소 트로픽아마이드 (1%)를 사용하여 현미경으로 표적 동공을 확장하고, 30-게이지 바늘을 사용하여 윤부 아래 ~ 1mm의 공막에 절개/삽입했다. 로당된 미니 뉴클레오솜 1μl를 망막 뒤의 25-게이지 바늘에 의해 만들어진 절개부를 통과하는 32 게이지 무딘 바늘을 사용하여 유리체에 주입했다. 이 절차에는 마이크로 펌프 제어 인젝터가 사용되었다.

결과는 도 35에 제시된다. 눈은 주사 후 2주에 적출되었고 고정을 위해 4% PFA에 두었다. 렌즈는 절개에 의해 눈에서 제거되었고 망막 온조직은 아이컵에서 절개되었다. 망막 온조직을 1xPBS로 수화되었고, 2% BSA를 사용하여 차단되었고, Alexa-flour 555에 결합된 GFP 항체로 실온에서 1시간 동안 염색되었고, 1xPBS로 각각 5분씩 4회 세척했다. 이미지는 Leica SP5 공초점 현미경을 사용하여 얻었다.

도 35의 패널 A-D는 만노실화 미니 뉴클레오솜 코어 단백질을 포함하는 로딩된 미니 뉴클레오솜이 투여된 마우스로부터의 대표적인 망막 온조직을 보여준다. 이미지는 미니 뉴클레오솜이 만노실화될 때 망막 세포, 특히 광수용체에서 대표적인 핵산 페이로드 암호화된 발현 생성물(여기서는, GFP)의 강력한 발현을 보여준다. 동일한 핵산 페이로드로 로딩된 비변형된 대조군은 망막 세포 또는 광수용체에서 강력하게 발현되지 않았다. 본 실시예에서 관찰된 발현 수준은 매우 예상치 못한 것이었다. IVIS 이미징에 의한 발현의 검출은 매우 높은 수준의 발현을 필요로 하며, 따라서 본 데이터는 세포 흡수 및 페이로드 발현의 놀라운 효율성을 반영한다. 발현 수준은 비바이러스 벡터에 대해 예상되는 수준을 극적으로 초과한다.

특정 서열:

서열번호: 394

(여기서 [LINKER]는 표 12에 기재된 임의의 아미노산 서열일 수 있지만 이에 제한되지 않음)

서열번호: 389

(여기서 [LINKER]는 표 12에 기재된 임의의 아미노산 서열일 수 있지만 이에 제한되지 않음)

서열번호: 390

(여기서 [LINKER]는 표 12에 기재된 임의의 아미노산 서열일 수 있지만 이에 제한되지 않음)

서열번호: 391

(여기서 [LINKER]는 표 12에 기재된 임의의 아미노산 서열일 수 있지만 이에 제한되지 않음)

서열번호: 392

(여기서 [LINKER]는 표 12에 기재된 임의의 아미노산 서열일 수 있지만 이에 제한되지 않음)

서열번호: 393

서열번호: 460

CBA-F8 플라스미드

서열번호: 395

CBA-GFP 플라스미드

서열번호: 396

CBA-루시퍼라제 플라스미드

참조에 의한 결합

본 출원에 언급된 간행물 및 특허는 그 전문이 포함되었다.

비특허 문헌:

특허 인용:

SEQUENCE LISTING <110> SUMMATION BIO, INC. <120> MODIFIED MINI-NUCLEOSOME CORE PROTEINS AND USE IN NUCLEIC ACID DELIVERY <130> 2013247-0013 <140> PCT/US2021/026917 <141> 2021-04-12 <150> 63/009,124 <151> 2020-04-13 <160> 477 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Lys Arg His Arg Lys 1 5 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Arg Arg Arg 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Arg Arg Arg Arg 1 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 5 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Arg Arg 1 <210> 6 <211> 6 <212> 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be separated by a linker of unknown length <220> <221> NON_CONS <222> (10)..(11) <223> Residues at these positions can be separated by a linker of unknown length <220> <221> NON_CONS <222> (12)..(13) <223> Residues at these positions can be separated by a linker of unknown length <220> <221> NON_CONS <222> (18)..(19) <223> Residues at these positions can be separated by a linker of unknown length <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 392 Lys Lys Lys Arg Lys Lys Thr Lys Lys Lys Ala Lys Lys Ala Leu Lys 1 5 10 15 Lys Lys Lys Lys Gly Lys Lys Lys Lys Arg Arg Arg Arg Lys Ala Ala 20 25 30 Pro Lys Lys 35 <210> 393 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 393 Cys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 20 25 30 <210> 394 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> NON_CONS <222> (6)..(7) <223> Residues at these positions can be separated by a linker of unknown length <220> <221> NON_CONS <222> (9)..(10) <223> Residues at these positions can be separated by a linker of unknown length <220> <221> NON_CONS <222> (31)..(32) <223> Residues at these positions can be separated by a linker of unknown length <220> <221> NON_CONS <222> (34)..(35) <223> Residues at these positions can be separated by a linker of unknown length <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 394 Lys Lys Arg His Arg Lys Leu Arg Glu Lys Arg His Arg Lys Leu Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Leu Lys Arg His Arg Lys Lys Arg His Arg Lys Leu 20 25 30 Arg Glu Lys 35 <210> 395 <211> 4431 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 395 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc 60 tcccccccct ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg 120 atgggggcgg gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg 180 ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt 240 ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg 300 ggagtcgctg cgacgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc 360 gccccggctc tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc 420 tccgggctgt aattagcgct tggtttaatg acggcttgtt tcttttctgt ggctgcgtga 480 aagccttgag gggctccggg agggcccttt gtgcgggggg gagcggctcg gggggtgcgt 540 gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggcccgcg ctgcccggcg gctgtgagcg 600 ctgcgggcgc ggcgcggggc tttgtgcgct ccgcagtgtg cgcgagggga gcgcggccgg 660 gggcggtgcc ccgcggtgcg gggggggctg cgaggggaac aaaggctgcg tgcggggtgt 720 gtgcgtgggg gggtgagcag ggggtgtggg cgcggcggtc gggctgtaac ccccccctgc 780 acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg tgcggggctc cgtacggggc 840 gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca ggtgggggtg ccgggcgggg 900 cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg cggcggcccc cggagcgccg 960 gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg 1020 cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca 1080 ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg 1140 agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc tctccagcct cggggctgtc 1200 cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg 1260 tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 1320 tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt tggcaaaacc ggtctcgaag 1380 gcctgcaggc ggccgccgcc accgccacca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg 1440 gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt 1500 ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca 1560 ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt 1620 gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg 1680 aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg 1740 ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact 1800 tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg 1860 tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca 1920 acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg 1980 acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag 2040 accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca 2100 ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaat ccatggccca acttgtttat tgcagcttat 2160 aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg 2220 cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg gatctcgtta 2280 actcgaggga tccatcgatg tcgactgcag aggcctgcat gcaagcttgg tgtaatcatg 2340 gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc 2400 cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc 2460 gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat 2520 cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac 2580 tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 2640 aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 2700 gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 2760 ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 2820 ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 2880 gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 2940 ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 3000 cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 3060 cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 3120 gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 3180 aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 3240 tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 3300 gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 3360 tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 3420 gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaagcc caatctgaat 3480 aatgttacaa ccaattaacc aattctgatt agaaaaactc atcgagcatc aaatgaaact 3540 gcaatttatt catatcagga ttatcaatac catatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg 3600 aaggagaaaa ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag atcctggtat cggtctgcga 3660 ttccgactcg tccaacatca atacaaccta ttaatttccc ctcgtcaaaa ataaggttat 3720 caagtgagaa atcaccatga gtgacgactg aatccggtga gaatggcaaa agtttatgca 3780 tttctttcca gacttgttca acaggccagc cattacgctc gtcatcaaaa tcactcgcat 3840 caaccaaacc gttattcatt cgtgattgcg cctgagcgag acgaaatacg cgatcgctgt 3900 taaaaggaca attacaaaca ggaatcgaat gcaaccggcg caggaacact gccagcgcat 3960 caacaatatt ttcacctgaa tcaggatatt cttctaatac ctggaatgct gtttttccgg 4020 ggatcgcagt ggtgagtaac catgcatcat caggagtacg gataaaatgc ttgatggtcg 4080 gaagaggcat aaattccgtc agccagttta gtctgaccat ctcatctgta acatcattgg 4140 caacgctacc tttgccatgt ttcagaaaca actctggcgc atcgggcttc ccatacaagc 4200 gatagattgt cgcacctgat tgcccgacat tatcgcgagc ccatttatac ccatataaat 4260 cagcatccat gttggaattt aatcgcggcc tcgacgtttc ccgttgaata tggctcataa 4320 caccccttgt attactgttt atgtaagcag acagttttat tgttcatgat gatatatttt 4380 tatcttgtgc aatgtaacat cagagatttt gagacacggg ccagagctgc a 4431 <210> 396 <211> 5364 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 396 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc 60 tcccccccct ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg 120 atgggggcgg gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg 180 ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt 240 ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg 300 ggagtcgctg cgacgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc 360 gccccggctc tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc 420 tccgggctgt aattagcgct tggtttaatg acggcttgtt tcttttctgt ggctgcgtga 480 aagccttgag gggctccggg agggcccttt gtgcgggggg gagcggctcg 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1380 gcctgcaggc ggccgccgcc accgccacca tggaagacgc caaaaacata aagaaaggcc 1440 cggcgccatt ctatccgctg gaagatggaa ccgctggaga gcaactgcat aaggctatga 1500 agagatacgc cctggttcct ggaacaattg cttttacaga tgcacatatc gaggtggaca 1560 tcacttacgc tgagtacttc gaaatgtccg ttcggttggc agaagctatg aaacgatatg 1620 ggctgaatac aaatcacaga atcgtcgtat gcagtgaaaa ctctcttcaa ttctttatgc 1680 cggtgttggg cgcgttattt atcggagttg cagttgcgcc cgcgaacgac atttataatg 1740 aacgtgaatt gctcaacagt atgggcattt cgcagcctac cgtggtgttc gtttccaaaa 1800 aggggttgca aaaaattttg aacgtgcaaa aaaagctccc aatcatccaa aaaattatta 1860 tcatggattc taaaacggat taccagggat ttcagtcgat gtacacgttc gtcacatctc 1920 atctacctcc cggttttaat gaatacgatt ttgtgccaga gtccttcgat agggacaaga 1980 caattgcact gatcatgaac tcctctggat ctactggtct gcctaaaggt gtcgctctgc 2040 ctcatagaac tgcctgcgtg agattctcgc atgccagaga tcctattttt ggcaatcaaa 2100 tcattccgga tactgcgatt ttaagtgttg ttccattcca tcacggtttt ggaatgttta 2160 ctacactcgg atatttgata tgtggatttc gagtcgtctt aatgtataga tttgaagaag 2220 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aatccatggc ccaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc 3120 acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc 3180 atcaatgtat cttatcatgt ctggatctcg ttaactcgag ggatccatcg atgtcgactg 3240 cagaggcctg catgcaagct tggtgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg 3300 ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg 3360 tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc 3420 gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 3480 gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 3540 gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 3600 taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 3660 cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 3720 ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 3780 aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 3840 tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 3900 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 408 Lys Lys Arg His Arg Lys Arg Leu Arg Lys Lys Arg Lys Gly Lys Gly 1 5 10 15 Ser Arg Pro Gly Ser Gly Phe Val Lys Lys Thr Lys Gln Arg Arg Arg 20 25 30 Arg Arg <210> 409 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 409 Lys Lys Arg His Arg Lys His Arg Thr Lys Ser Gly Arg Ser Arg Ile 1 5 10 15 Arg Lys Lys Arg Lys Gly Lys Arg His Ala Arg Lys Lys Arg Arg Gln 20 25 30 Arg Arg Arg Pro Pro Ser Tyr 35 <210> 410 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 410 Lys Lys Arg His Arg Lys Lys Pro Val Asn Arg Trp Ser Ala Arg Asn 1 5 10 15 Arg Arg Lys Lys Arg Ala Leu Leu Arg Arg Arg His Tyr Gln Arg Leu 20 25 30 <210> 411 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 411 Lys Lys Arg His Arg Lys Arg Lys Tyr Lys Gln Cys His Lys Lys Gly 1 5 10 15 Gly His Cys Phe Pro Lys Glu Lys Ala Arg Arg Lys Lys Arg Lys Gly 20 25 30 Lys Asn Glu Ile 35 <210> 412 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 412 Lys Lys Arg His Arg Lys Arg Ile Lys Lys Tyr Arg Tyr Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Pro Leu Lys Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Gly Lys Arg His Tyr Leu 20 25 30 Ile Ile Arg 35 <210> 413 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 413 Lys Lys Arg His Arg Lys Asp Arg Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Lys Pro Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Phe Gln 20 25 30 Gln Ile <210> 414 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 414 Lys Lys Arg His Arg Lys Gly Ser Ser Asp Pro Phe Arg Asp Asp Pro 1 5 10 15 Phe His Arg Lys Arg His Arg Lys Lys Arg His Arg Lys Lys Arg His 20 25 30 Arg Gly Arg Arg 35 <210> 415 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 415 Lys Lys Arg His Arg Lys Ala Arg Ser Lys Thr Phe Asn Thr His Pro 1 5 10 15 Gln Ser Thr Pro Tyr Lys Arg His Arg Lys Arg Lys Lys Arg Lys Gly 20 25 30 Lys Lys Arg Pro Lys 35 <210> 416 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 416 Arg Lys Lys Arg Lys Gly Lys Arg Ala Lys Arg His Arg Lys Lys Arg 1 5 10 15 His Arg Lys Lys Pro Lys Asn Met Thr Pro Tyr Arg Ser Pro Pro Pro 20 25 30 Tyr Val Pro Pro 35 <210> 417 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 417 Lys Lys Lys Arg Lys Arg Gly Asp Lys Arg Lys Arg Lys Arg His Arg 1 5 10 15 Lys Lys Lys Arg Arg Arg Arg Leu Ser Ile Pro Pro Lys Ala 20 25 30 <210> 418 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 418 Lys Lys Lys Arg Lys Arg Gly Asp Lys Arg Lys Arg Lys Arg His Arg 1 5 10 15 Lys Lys Lys Arg Arg Arg Arg Phe Gln Thr Pro Pro Gln Leu 20 25 30 <210> 419 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 419 Lys Lys Lys Arg Lys Arg Gly Asp Lys Arg Lys Arg Lys Arg His Arg 1 5 10 15 Lys Lys Lys Arg Arg Arg Arg Leu Thr Pro Ala Thr Ala Ile 20 25 30 <210> 420 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 420 Lys Lys Lys Arg Lys Arg Gly Asp Lys Arg Lys Arg Lys Arg His Arg 1 5 10 15 Lys Lys Lys Arg Arg Arg Arg Ser Ile Gly Tyr Pro Leu Pro 20 25 30 <210> 421 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 421 Lys Lys Lys Arg Lys Arg Gly Asp Lys Arg Lys Arg Lys Arg His Arg 1 5 10 15 Lys Lys Lys Arg Arg Arg Arg Cys Leu Ile Arg Arg 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polypeptide <400> 425 Lys Lys Lys Arg Lys Arg Gly Asp Lys Arg Lys Arg Lys Arg His Arg 1 5 10 15 Lys Lys Lys Arg Arg Arg His Tyr Arg Leu Thr Pro Ala Thr Ala Ile 20 25 30 <210> 426 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 426 Lys Lys Lys Arg Lys Arg Gly Asp Lys Arg Lys Arg Lys Arg His Arg 1 5 10 15 Lys Lys Lys Arg Arg Arg Arg Val Tyr Gln Ser Ile Gly Tyr Pro Leu 20 25 30 Pro <210> 427 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 427 Lys Lys Lys Arg Lys Ser Tyr Arg Arg Gly Asp Lys Arg Lys Arg Lys 1 5 10 15 Arg His Arg Lys Lys Lys Arg Arg Arg Arg Cys Leu Ile Arg Arg Thr 20 25 30 Ser Ile Cys 35 <210> 428 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 428 Lys Lys Lys Arg Lys Glu Tyr Arg Gly Asp Lys Arg Lys Arg Lys Arg 1 5 10 15 His Arg Lys Lys Lys Arg Arg Arg Arg Cys 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 432 Lys Lys Arg His Arg Lys Ser Ser Ser Arg Thr Leu Gln Ala His His 1 5 10 15 Asp Arg Gln Ser Asn Lys Arg Lys Arg Lys Asn Arg Ser Arg Arg Arg 20 25 30 Arg Arg <210> 433 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 433 Lys Lys Arg His Arg Lys Arg Asn Arg Ser Ile His Phe Asn Pro Arg 1 5 10 15 His Arg Arg Arg Arg Arg Arg Asp Val Ala Arg Ala Arg Ala Glu Lys 20 25 30 Ser Lys Lys Lys 35 <210> 434 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 434 Lys Lys Arg His Arg Lys Asn Arg Ser Lys Lys Gln Arg Phe Arg His 1 5 10 15 Arg Asn Arg Lys Gly Tyr Arg Ser Gln Arg Gly His Ser Arg Gly Arg 20 25 30 Asn Gln Asn Ser Arg Arg 35 <210> 435 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 435 Lys Lys Arg 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polypeptide <400> 452 Lys Lys Lys Arg Lys Arg Gly Asp Lys Arg Lys Arg Lys Arg His Arg 1 5 10 15 Lys Lys Lys Arg Arg Arg Arg Phe Gln Thr Pro Pro Gln Leu 20 25 30 <210> 453 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 453 Lys Lys Lys Arg Lys Arg Gly Asp Lys Arg Lys Arg Lys Arg His Arg 1 5 10 15 Lys Lys Lys Arg Arg Arg Arg Asn Arg Ser Leu Thr Pro Ala Thr Ala 20 25 30 Ile <210> 454 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 454 Lys Lys Lys Arg Lys Arg Gly Asp Lys Arg Lys Arg Lys Arg His Arg 1 5 10 15 Lys Lys Lys Arg Arg Arg Arg Ser Ile Gly Tyr Pro Leu Pro 20 25 30 <210> 455 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 455 Lys Lys Lys Arg Lys Arg Gly Asp Lys Arg Lys Arg Lys Arg His Arg 1 5 10 15 Lys Lys Lys Arg Arg Arg Arg Asn Arg Ser Cys Leu Ile Arg Arg Thr 20 25 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Synthetic polypeptide <400> 459 Lys Lys Lys Arg Lys Arg Gly Asp Lys Arg Lys Arg Lys Arg His Arg 1 5 10 15 Lys Lys Lys Arg Arg Arg Arg Val His Pro Lys Gln His Arg Gly Gly 20 25 30 Ser Lys Gly Cys 35 <210> 460 <211> 10664 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 460 tcgcgcgttt cggtgatcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc 60 ccctccccac ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg 120 gcgggggggg ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg 180 gcgaggcgga gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt 240 atggcgaggc ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc 300 gctgcgacgc tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc gcctcgcgcc gcccgccccg 360 gctctgactg accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg gacggccctt ctcctccggg 420 ctgtaattag cgcttggttt aatgacggct tgtttctttt ctgtggctgc gtgaaagcct 480 tgaggggctc cgggagggcc ctttgtgcgg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 540 gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggcc cgcgctgccc ggcggctgtg agcgctgcgg 600 gcgcggcgcg gggctttgtg cgctccgcag tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg 660 tgccccgcgg tgcggggggg gctgcgaggg gaacaaaggc tgcgtgcggg gtgtgtgcgt 720 gggggggtga gcagggggtg tgggcgcggc ggtcgggctg taaccccccc ctgcaccccc 780 ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg 840 cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 900 cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct 960 gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1020 gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 1080 ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc 1140 ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg 1200 gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg 1260 gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1320 gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa aaccggtctc gaaggcctgc 1380 aggcggccgc cgccaccgcc accatgcaaa tagcactctt cgcttgcttc tttctgagcc 1440 ttttcaattt ctgctctagt gccatcagaa gatactacct tggtgcagtg gaattgtcct 1500 ggaactatat tcagagtgat ctgctcagtg tgctgcatac agactcaaga tttcttccta 1560 gaatgtcaac atcttttcca ttcaacacct ccatcatgta taaaaagact gtgtttgtag 1620 agtacaagga ccagcttttc aacattgcca agcccaggcc accctggatg ggtttgctag 1680 gtcctaccat ttggactgag gttcatgaca cagtggtcat tacacttaaa aacatggctt 1740 ctcatcctgt cagtcttcat gctgttggtg tgtcctactg gaaagcttct gagggagatg 1800 aatatgaaga tcagacaagc caaatggaga aggaagatga taaagttttc cctggtgaaa 1860 gtcatactta tgtttggcaa gtcctgaaag agaatggtcc aatggcctct gaccctccat 1920 gtctcactta ctcatatatg tctcatgtgg atctggtgaa agatttgaat tcaggcctca 1980 ttggagctct gctagtatgt aaagaaggca gtctctccaa agaaagaaca cagatgttgt 2040 accaatttgt actgcttttt gctgtatttg atgaagggaa gagctggcac tcagaaacaa 2100 acgactctta tacacagtct atggattctg catctgctag agactggcct aaaatgcaca 2160 cagtcaatgg ctatgtaaac aggtctcttc caggtctgat tggatgccat aggaaatcag 2220 tctactggca cgtgattgga atgggcacca ctcctgaaat acactcaata ttcctcgaag 2280 gtcacacatt ttttgtgagg aaccaccgtc aagcttcatt ggagatatca ccaataactt 2340 tccttactgc tcaaacactc ttgatagatc ttgggcagtt cctactattt tgtcatatct 2400 cttcccataa acatgatggc atggaagctt atgtcaaagt agatagctgc cctgaggaat 2460 cccaatggca aaagaaaaat aataatgagg aaatggaaga ttatgatgat gatctttatt 2520 cagaaatgga tatgttcaca ttggattatg acagctctcc ttttatccaa attcgctcgg 2580 ttgctaaaaa gtaccctaaa acttggatac attatatttc tgctgaggag gaagactggg 2640 actatgcacc ttcagttcct acctcggata atggaagtta taaaagccag tatctgagca 2700 atggtcctca tcggattggt aggaaatata aaaaagtcag atttatagca tacacagatg 2760 aaacctttaa gactcgtgaa actattcagc atgaatcagg actcttggga cctttacttt 2820 atggagaagt tggagacaca ctgttgatta tttttaagaa tcaagcaagc cgaccatata 2880 acatttaccc tcatggaatc actgatgtca gtcctctaca tgcaaggaga ttgccaagag 2940 gtataaagca cgtgaaggat ttgccaattc atccaggaga gatattcaag tacaagtgga 3000 cagttacagt agaagatgga ccaactaaat cagatccacg gtgcctgacc cgctattatt 3060 caagtttcat taaccctgag agagatctag cttcaggact gattggccct cttctcatct 3120 gctacaaaga atctgtagat caaaggggaa accagatgat gtcagacaaa agaaatgtca 3180 tcctgttttc tatatttgat gagaaccaaa gctggtacat cacagagaac atgcaacgct 3240 tcctccccaa tgcagctaaa acacagcccc aggaccctgg gttccaggcc tccaacatca 3300 tgcacagcat caatggctat gtttttgata gcttggagtt gacagtttgt ttgcatgagg 3360 tggcatactg gcacattctc agtgttggag cacagacaga cttcttatct atcttcttct 3420 ctggatatac tttcaaacac aaaatggtct atgaagatac acttaccctg ttcccattct 3480 caggagaaac tgtctttatg tcgatggaaa acccaggtct atgggtcttg gggtgtcata 3540 attcagactt tcggaagaga ggtatgacag cattgctgaa agtttctagt tgtgacaaga 3600 gcactagtga ttattatgaa gaaatatatg aagatattcc aacacagttg gtgaatgaga 3660 acaatgtcat tgatcccaga agcttcttcc agaatacaaa tcatcctaat actaggaaaa 3720 agaaattcaa agattccaca attccaaaaa atgatatgga gaagattgag cctcagtttg 3780 aagagatagc agagatgctt aaagtacaga gtgtctcagt tagtgacatg ttgatgctct 3840 tgggacagag tcatcctact ccacatggct tatttttatc agatggccaa gaagccatct 3900 atgaggctat tcatgatgat cattcaccaa atgcaataga cagcaatgaa ggcccatcta 3960 aagtgaccca actcaggcca gaatcccatc acagtgagaa aatagtattt actcctcagc 4020 ccggcctcca gttaagatcc aataaaagtt tggagacaac tatagaagta aagtggaaga 4080 aacttggttt gcaagtttct agtttgccaa gtaatctaat gactacaaca attctgtcag 4140 acaatttgaa agcaactttt gaaaagacag attcttcagg atttccagat atgccagttc 4200 actctagtag taaattaagt actactgcat ttggtaagaa agcatattcc cttgttgggt 4260 ctcatgtacc tttaaacgtg agtgaagaaa atagtgattc caacatattg gattcaactt 4320 taatgtatag tcaagaaagt ttaccaagag ataatatatt atcaatggag aatgatagat 4380 tactcagaga gaagaggttt catggaattg ctttattgac caaagataat actttattca 4440 aagacaatgt ctccttaatg aaaacaaaca aaacatataa tcattcaaca actaatgaaa 4500 aactacacac tgagagccca acatcaattg agaatagtac aacagacttg caagatgcca 4560 tattaaaggt caatagtgag attcaagaag taacagcttt gattcatgat ggaacacttt 4620 taggcaaaaa ttctacatat ttgagactaa accatatgct aaatagaact acctcaacaa 4680 aaaataaaga catatttcat agaaaagatg aagatcctat tccacaagat gaagagaata 4740 caatcatgcc attttccaag atgttgttct tgtcagaatc ttcaaattgg tttaaaaaga 4800 ccaatggaaa taattccttg aactctgagc aagaacatag tccaaagcaa ttagtatatt 4860 taatgtttaa aaaatatgta aaaaatcaaa gtttcttgtc agagaaaaat aaagtcacag 4920 tagaacagga tggatttaca aagaacatag gacttaaaga catggctttt ccacataata 4980 tgagcatatt tcttaccact ttgtctaacg tacatgaaaa tggtaggcac aatcaagaaa 5040 aaaatattca ggaagagata gagaaggaag cactaattga agagaaagta gttttgcccc 5100 aggtgcacga agcaactggc tctaagaatt tcttgaaaga catattgata ctaggcacta 5160 ggcaaaatat aagtttatat gaagtacatg taccagtact tcaaaacatc acatcaataa 5220 acaattcaac aaatacagta cagattcaca tggagcattt ctttaaaaga aggaaggaca 5280 aggaaacaaa ttcagaaggc ttggtaaata aaaccagaga aatggtaaaa aactatccaa 5340 gccagaagaa tattactact caacgtagta aacgggcttt gggacaattc agactgtcaa 5400 ctcaatggct taaaaccata aactgttcaa cacagtgtat cattaaacag atagaccaca 5460 gcaaggaaat gaaaaagttc attactaaat cttccttatc agattcttct gtgattaaaa 5520 gcaccactca gacaaatagt tctgactcac acattgtaaa aacatcagca tttccaccaa 5580 tagatctcaa aaggagtcca ttccaaaaca aattttctca tgttcaagca tcatcctaca 5640 tttatgactt taagacaaaa agttcaagaa ttcaagaaag caataatttc ttaaaagaaa 5700 ccaaaataaa taacccttct ttagccattc taccatggaa tatgttcata gatcaaggaa 5760 aatttacctc cccagggaaa agtaacacaa actcagtcac atataagaaa cgtgagaaca 5820 ttattttctt gaaaccaact ttgcctgaag aatctggcaa aattgaattg cttcctcaag 5880 tttccattca agaggaagaa attttaccta cagaaactag ccatggatct cctggacact 5940 tgaatctcat gaaagaggtc tttcttcaga aaatacaggg gcctactaaa tggaataaag 6000 caaagaggca tggagaaagt ataaaaggta aaacagagag ctctaaaaat actcgctcaa 6060 aactgctaaa tcatcatgct tgggattatc attatgctgc acagatacca aaagatatgt 6120 ggaaatccaa agagaagtca ccagaaatta tatccattaa gcaagaggac accattttgt 6180 ctctgaggcc tcatggaaac agtcattcaa taggggcaaa tgagaaacaa aattggcctc 6240 aaagagaaac cacttgggta aagcaaggcc aaactcaaag gacatgctct caaatcccac 6300 cagtgttgaa acgacatcaa agggaactta gtgcttttca atcagaacaa gaagcaactg 6360 actatgatga tgccatcacc attgaaacaa tcgaggattt tgacatttac agtgaggaca 6420 taaagcaagg tccccgcagc tttcaacaga aaacaaggca ctattttatt gcagctgtgg 6480 aacgactctg ggactatggg atgagtacat ctcatgttct acgaaatagg tatcaaagtg 6540 acaatgtacc tcagttcaag aaagtagttt tccaggaatt tactgatggc tcctttagtc 6600 agcccttata tcgtggagaa ttaaatgaac acctggggtt gttgggccca tatataagag 6660 cagaagttga agacaacatt atggtaactt tcaaaaacca ggcctcccgt ccctactcct 6720 tctattctag cctcatttct tataaagaag atcagagagg agaagaacct agaagaaact 6780 ttgtcaagcc taatgaaacc aaaatttatt tttggaaagt acaacatcat atggcaccca 6840 cagaagatga gtttgactgc aaggcctggg cttatttctc tgatgttgat cttgaaagag 6900 atatgcactc gggattaatt ggaccccttc tgatttgcca cgcgaacaca ctgaatcctg 6960 ctcatgggag acaagtgtca gtacaggaat ttgctctgct tttcactatc tttgatgaga 7020 ccaagagctg gtacttcact gaaaacgtga aaaggaactg caagacaccc tgcaatttcc 7080 agatggaaga ccccactttg aaagagaatt atcgcttcca tgcaatcaat ggttatgtaa 7140 tggataccct accaggctta gtaatggctc aagatcaaag gattcgatgg tatcttctca 7200 gcatgggcaa caatgagaac atccaatcta ttcatttcag tggacatgtt ttcactgtac 7260 ggaaaaaaga ggagtataaa atggcagtgt acaacctcta cccaggtgtt tttgagactc 7320 tggaaatgat accatccaga gctggaatat ggcgagtaga atgccttatt ggcgagcact 7380 tacaggctgg gatgagcact ctttttctgg tgtacagcaa gcagtgtcag attcctcttg 7440 gaatggcttc tggaagcatc cgtgatttcc agattacagc ttcaggacat tatggacagt 7500 gggccccaaa cctggcaaga cttcattatt ccggatcaat caatgcctgg agtaccaagg 7560 agcccttttc ttggatcaag gtagatctgt tggcaccaat gattgttcat ggcatcaaga 7620 ctcagggtgc tcgtcagaaa ttttccagcc tttatatctc tcaatttatc atcatgtata 7680 gcctggatgg gaagaagtgg ctgagttatc aaggaaattc cactggaacc ttaatggttt 7740 tctttggcaa tgtggactca tctgggatta agcataatag ttttaatcct ccaattattg 7800 ctcgatatat ccgtttgcac cccactcatt ctagcatccg tagtactctt cgcatggagt 7860 tgatgggctg tgatttaaac agttgcagca taccattggg aatggaaagt aaagtaatat 7920 cagatacaca aatcactgcc tcatcctact tcaccaacat gtttgctact tggtctcctt 7980 cacaagctcg acttcacctc cagggaagga ctaatgcctg gcgacctcag gtgaatgatc 8040 caaaacaatg gttgcaagtg gacttacaaa agacaatgaa agtcactgga ataataaccc 8100 agggagtgaa atctctcttt accagcatgt ttgtgaaaga gttccttatt tccagcagtc 8160 aagatggcca tcactggact caaattttat acaatggcaa ggtaaaggtt tttcagggga 8220 atcaggactc atccacacct atgatgaatt ctctagaccc accattactc actcgctatc 8280 ttcgaattca cccccagatc tgggagcacc aaattgctct gaggcttgag attctaggat 8340 gtgaggccca gcagcaatac tgaccatggc ccaacttgtt tattgcagct tataatggtt 8400 acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta 8460 gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctggatctcg ttaactcgag 8520 ggatccatcg atgtcgactg cagaggcctg catgcaagct tggtgtaatc atggtcatag 8580 ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc 8640 ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc 8700 tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 8760 cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg 8820 ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg 8880 ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 8940 gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 9000 gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 9060 taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 9120 accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 9180 tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 9240 cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 9300 agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 9360 gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca 9420 gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 9480 tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 9540 acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 9600 cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc 9660 acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa gcccaatctg aataatgtta 9720 caaccaatta accaattctg attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt 9780 attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga 9840 aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg cgattccgac 9900 tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga 9960 gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagtttat gcatttcttt 10020 ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg catcaaccaa 10080 accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcgc tgttaaaagg 10140 acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg catcaacaat 10200 attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgtttttc cggggatcgc 10260 agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg tcggaagagg 10320 cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat tggcaacgct 10380 acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca agcgatagat 10440 tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata aatcagcatc 10500 catgttggaa tttaatcgcg gcctcgacgt ttcccgttga atatggctca taacacccct 10560 tgtattactg tttatgtaag cagacagttt tattgttcat gatgatatat ttttatcttg 10620 tgcaatgtaa catcagagat tttgagacac gggccagagc tgca 10664 <210> 461 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 461 Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 462 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 462 Asn Arg Asp Asn 1 <210> 463 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 463 Lys Leu Lys Ile Lys Arg Pro Val Lys 1 5 <210> 464 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 464 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 465 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Any amino acid <400> 465 Leu Pro Xaa Thr Gly 1 5 <210> 466 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 466 Gly Thr Ala Leu Leu 1 5 <210> 467 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 467 Asp Ser Leu Leu 1 <210> 468 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 468 Asn Pro Thr Tyr 1 <210> 469 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 469 Lys Ile Leu 1 <210> 470 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 470 Phe Tyr Gln Pro Leu 1 5 <210> 471 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 471 Ile Lys Val Ala Val Ala 1 5 <210> 472 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 472 Lys Arg His Arg Lys Lys Arg His Arg Lys Lys Arg His Arg Lys Lys 1 5 10 15 Arg His Arg Lys 20 <210> 473 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 473 Lys Lys Arg His Arg Lys Gly Gly Ser Leu Leu Arg Gly Asp Lys Glu 1 5 10 15 Leu Lys Arg Pro Pro Arg Arg Arg Arg Arg His Tyr Asn Lys Ser Arg 20 25 30 <210> 474 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 474 Lys Lys Arg His Arg Lys Gly Gly Val Leu Leu Arg Gly Asp Lys Glu 1 5 10 15 Leu Lys Arg Pro Pro Arg Arg Arg Arg Arg His Tyr Asn Lys Ser Arg 20 25 30 <210> 475 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 475 Lys Lys Arg His Arg Lys Gly Gly Ala Leu Leu Arg Gly Asp Lys Glu 1 5 10 15 Leu Lys Arg Pro Pro Arg Arg Arg Arg Arg His Tyr Asn Lys Ser Arg 20 25 30 <210> 476 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 476 Lys Lys Arg His Arg Lys Gly Gly Ser Leu Leu Arg Gly Asp Lys Glu 1 5 10 15 Leu Lys Arg Pro Pro Arg Arg Arg Arg Arg His Tyr Cys Ala Ile Leu 20 25 30 Arg <210> 477 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 477 Lys Lys Arg His Arg Lys Lys Gly Gly Ser Leu Leu Arg Gly Asp Lys 1 5 10 15 Glu Leu Lys Arg Pro Pro Arg Arg Arg Arg Arg His Tyr Asn Lys Ser 20 25 30 Arg

Claims (123)

1. 핵산 결합 도메인 및 핵산 방출 도메인을 포함하는 조작된 폴리펩티드로서,
   상기 조작된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산은 변형된 아미노산이고, 선택적으로 변형은,
   (i) 인산화;
   (ii) 황산화;
   (iii) 글리코실화;
   (iv) 프레닐화;
   (v) 메틸화;
   (vi) 시알화;
   (vii) 지질화 및/또는 리포일화;
   (viii) 아세틸화;
   (ix) 수산화;
   (x) 팔미토일화;
   (xi) 만노실화;
   (xii) 미리스토일화;
   (xiii) 푸코실화;
   (xiv) 페길화; 및/또는
   (xv) 이의 임의의 조합 중 적어도 하나를 포함하는, 조작된 폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서,
   상기 조작된 폴리펩티드가 표적화 도메인을 포함하는 것인 조작된 폴리펩티드.
3. 핵산 결합 도메인 및 표적화 도메인을 포함하는 조작된 폴리펩티드로서,
   상기 조작된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산은 변형된 아미노산이고, 선택적으로 상기 변형은,
   (i) 인산화;
   (ii) 황산화;
   (iii) 글리코실화;
   (iv) 프레닐화;
   (v) 메틸화;
   (vi) 시알화;
   (vii) 지질화 및/또는 리포일화;
   (viii) 아세틸화;
   (ix) 수산화;
   (x) 팔미토일화;
   (xi) 만노실화;
   (xii) 미리스토일화;
   (xiii) 푸코실화;
   (xiv) 페길화; 및/또는
   (xv) 이의 임의의 조합 중 적어도 하나를 포함하며,
   여기서 조작된 폴리펩티드는 선택적으로 핵산 방출 도메인을 추가로 포함하는 것인 조작된 폴리펩티드.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 조작된 폴리펩티드의 2개 이상의 아미노산 각각이 변형된 아미노산인 것인 조작된 폴리펩티드.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 변형된 아미노산 중 적어도 하나는,
   (i) 인산화;
   (ii) 황산화;
   (iii) 글리코실화;
   (iv) 프레닐화;
   (v) 메틸화;
   (vi) 시알화;
   (vii) 지질화 및/또는 리포일화;
   (viii) 아세틸화;
   (ix) 수산화;
   (x) 팔미토일화;
   (xi) 만노실화;
   (xii) 미리스토일화;
   (xiii) 푸코실화;
   (xiv) 페길화; 및
   (xv) 이의 임의의 조합으로부터 선택된 2개 이상의 변형을 포함하는 변형 사슬을 포함하는 조작된 폴리펩티드.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 변형이 조작된 폴리펩티드의 안정성, 반감기 및/또는 생체이용률을 증가시키는 것인 조작된 폴리펩티드.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 변형이 결합 파트너와 함께 조작된 폴리펩티드의 친화도 및/또는 결합력을 증가시키고, 선택적으로 결합 파트너가 수용체, 세포 또는 세포막인 것인 조작된 폴리펩티드.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 변형이 핵산과 함께 조작된 폴리펩티드의 친화도 또는 결합력을 증가시키는 것인 조작된 폴리펩티드.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 변형이 조작된 폴리펩티드의 침전 및/또는 응집을 감소시키는 것인 조작된 폴리펩티드.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 결합 도메인이 히스톤 폴리펩티드 서열로부터 유래된 것인 조작된 폴리펩티드.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 결합 도메인이 아미노산 서열 KRHRK이거나 이를 포함하는 것인 조작된 폴리펩티드.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 결합 도메인이 KRHRK, RRRRR, RRLARR, KKAKAAAKPKK, KKDGKKRKR, KKKLK, KKRIRK, RKKSK, KKPKK, 또는 이의 조합을 포함하는 아미노산 서열이거나 이를 포함하는 것인 조작된 폴리펩티드.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 결합 도메인이 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함한다는 점에서 핵산 결합 도메인이 변형된 핵산 결합 도메인인 조작된 폴리펩티드.
14. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적화 도메인이 서열번호: 397-422 중 임의의 어느 하나의 서열을 갖는 표적화 도메인이고, 상기 표적화 도메인은 인산화된 것인 조작된 폴리펩티드.
15. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적화 도메인이 서열번호: 423-428 중 임의의 어느 하나의 서열을 갖는 표적화 도메인이고, 상기 표적화 도메인은 황산화된 것인 조작된 폴리펩티드.
16. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적화 도메인이 서열번호: 429-434 중 임의의 어느 하나의 서열을 갖는 표적화 도메인이고, 상기 표적화 도메인은 글리코실화된 것인 조작된 폴리펩티드.
17. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적화 도메인이 서열번호: 435-440 중 임의의 어느 하나의 서열을 갖는 표적화 도메인이고, 상기 표적화 도메인은 프레닐화된 것인 조작된 폴리펩티드.
18. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적화 도메인이 서열번호: 441-446 중 임의의 어느 하나의 서열을 갖는 표적화 도메인이고, 상기 표적화 도메인은 메틸화된 것인 조작된 폴리펩티드.
19. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적화 도메인이 서열번호: 447-459 중 임의의 어느 하나의 서열을 갖는 표적화 도메인이고, 상기 표적화 도메인은 시알화된 것인 조작된 폴리펩티드.
20. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적화 도메인이 세포 부착 표적화 도메인, 베타 갈락토스 결합 도메인, 푸코스 결합 도메인, 헤파린 결합 도메인, 시알산 결합 도메인, 당단백질 결합 도메인, 탄수화물 결합 도메인, 리소포스파티드산 결합 도메인, cAMP 결합 도메인, 히알루로난 결합 도메인, 콘드로이틴 술페이트 결합 도메인, 인테그린 결합 도메인, 뉴클레올린 결합 도메인, 콜라겐 결합 도메인, 클라트린 결합 도메인, Fc 수용체 결합 도메인, 액틴 결합 도메인, 세포내이입 모티프, 핵 국소화 신호, 또는 이의 조합인 것인 조작된 폴리펩티드.
21. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적화 도메인이 세포 부착 표적화 도메인인 것인 조작된 폴리펩티드.
22. 제21항에 있어서,
    상기 세포 부착 표적화 도메인이 WGREERQ, NTQIH, WNNKTPH, TPH, VNRWS, XBBBXXBX, ARKKAAKA, QRR, SRR, WEPSRPFPVD, HRRTRKAPKRIRLPHIR, KRTGQYKLGSKTGPGQK, KKTK, KLRSQLVKK, RRRCGQKKK, BX(7)B, RIQNLLKITNLRIKFVK, KKEKDIMKKTI, KGE, RGD, RGDS, TTVVNPKYEGK, ERMSQIKRLLS, WRHRARS, GFOGER, LFDLM, WGREERQ, QSTEKRG, LPNTG 또는 이의 조합을 포함하는 아미노산 이거나 이를 포함하는 것인 조작된 폴리펩티드.
23. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적화 도메인이 내재화 도메인인 조작된 폴리펩티드.
24. 제23항에 있어서,
    상기 내재화 도메인이 FXDXF, PPSY, FEDNFVP, YIRV, YADW, YTQV, KKRPKP, SSDDE, RRASS, (YXXL)2, LPLTG, LAFTG, 또는 이의 조합을 포함하는 아미노산 서열이거나 이를 포함하는 것인 조작된 폴리펩티드.
25. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적화 도메인이 세포-유형 특이적 표적화 도메인인 것인 조작된 폴리펩티드.
26. 제25항에 있어서,
    상기 세포-유형 특이적 표적화 도메인이 ASSLNIA, KKEEEKKEEEKKEEE, LIFHKEQ, KFNKPFVFLI, QPEHSST, EYHHYNK, NGR, GEKGEP, KTKKK, KALKKK, KGKKK, CSVTCG, LRE, YKYNLNGRES, YRSL, KGGK₇, KKKQYTSIHHG, KDEL, LADQDYTKTA, 또는 이의 조합을 포함하는 아미노산 서열이거나 이를 포함하는 것인 조작된 폴리펩티드.
27. 제2항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적화 도메인이 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함한다는 점에서 표적화 도메인이 변형된 표적화 도메인인 것인 조작된 폴리펩티드.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 방출 도메인이 GRKKRRQRRRPQ, KRH, KSVKKRSVSEIQ, NRRKKRAL, KFERQ, VRGP, NKDS, NRDN, ANNR, 또는 이의 조합을 포함하는 아미노산 서열이거나 이를 포함하는 것인 조작된 폴리펩티드.
29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 방출 도메인이 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함한다는 점에서 핵산 방출 도메인이 변형된 핵산 방출 도메인인 것인 조작된 폴리펩티드.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리-아르기닌 도메인을 추가로 포함하는 것인 조작된 폴리펩티드.
31. 제30항에 있어서,
    상기 폴리-아르기닌 도메인이 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함한다는 점에서 폴리-아르기닌 도메인이 변형된 폴리-아르기닌 도메인인 것인 조작된 폴리펩티드.
32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵 내재화 신호 또는 핵 유입 기구 결합 도메인을 추가로 포함하는 것인 조작된 폴리펩티드.
33. 제32항에 있어서,
    상기 핵 내재화 신호 또는 핵 유입 기구 결합 도메인이 KKKYKLK, KKRKLE, TRSK, HRKRKR, NKRKRK, AEKSKKK, RKSK, KRVK, KRK, LQQTPLHLAVI, RRPR, PRPR, RPPP, RKKRKGK, PAAKRVKLD, KLKIKRPVK, PKKKRKV, QRKRQK, DSPE, FQVT, QSTEKRG, RQGLID, 환형 RKKH, 또는 이의 조합을 포함하는 아미노산 서열이거나 이를 포함하는 것인 조작된 폴리펩티드.
34. 제32항 또는 제33항에 있어서,
    상기 핵 내재화 신호 또는 핵 유입 기구 결합 도메인이 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함한다는 점에서 핵 내재화 신호 또는 핵 유입 기구 결합 도메인은 변형된 핵 내재화 신호 또는 핵 유입 기구 결합 도메인인 것인 조작된 폴리펩티드.
35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    안정성 도메인을 추가로 포함하는 것인 조작된 폴리펩티드.
36. 제35항에 있어서,
    상기 안정성 도메인이 YTRF, GDAY, LLEE, RKKRRQRRR, YKSL, YENF, FQDL, YIGSR, IKVAV, 또는 이의 조합을 포함하는 아미노산 서열이거나 이를 포함하는 것인 조작된 폴리펩티드.
37. 제35항 또는 제36항에 있어서,
    상기 안정성 도메인이 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함한다는 점에서 안정성 도메인이 변형된 안정성 도메인인 것인 조작된 폴리펩티드.
38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고머화 도메인을 추가로 포함하는 것인 조작된 폴리펩티드
39. 제38항에 있어서,
    상기 올리고머화 도메인이 표 11의 올리고머화 도메인으로부터 선택되고, 선택적으로 올리고머화 도메인이 조작된 폴리펩티드의 C-말단에 위치하는 것인 조작된 폴리펩티드.
40. 제38항 또는 제39항에 있어서,
    상기 올리고머화 도메인이 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함한다는 점에서 올리고머화 도메인이 변형된 올리고머화 도메인인 것인 조작된 폴리펩티드.
41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 링커를 포함하는 것인 조작된 폴리펩티드.
42. 제41항에 있어서,
    상기 링커가 서열번호: 154-250 중 임의의 어느 하나에 따른 링커인 것인 조작된 폴리펩티드.
43. 제41항 또는 제42항에 있어서,
    상기 링커가 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함한다는 점에서 상기 링커는 변형된 링커인 것인 조작된 폴리펩티드.
44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조작된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산이 인산화된 아미노산인 것인 조작된 폴리펩티드.
45. 제44항에 있어서,
    상기 인산화된 아미노산이 세린, 트레오닌 또는 티로신 아미노산인 것인 조작된 폴리펩티드.
46. 제44항 또는 제45항에 있어서,
    상기 인산화된 아미노산이 링커 도메인 또는 표적화 도메인에 존재하는 것인 조작된 폴리펩티드.
47. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조작된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산이 황산화 아미노산인 것인 조작된 폴리펩티드.
48. 제47항에 있어서,
    상기 황산화 아미노산이 세린, 트레오닌 또는 티로신 아미노산인 것인 조작된 폴리펩티드.
49. 제47항 또는 제48항에 있어서,
    상기 황산화 아미노산이 링커 도메인 또는 표적화 도메인에 존재하는 것인 조작된 폴리펩티드.
50. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조작된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산이 아세틸화된 아미노산인 것인 조작된 폴리펩티드.
51. 제50항에 있어서,
    상기 아세틸화된 아미노산이 리신 아미노산인 조작된 폴리펩티드.
52. 제50항 또는 제51항에 있어서,
    상기 아세틸화된 아미노산이 링커 도메인 또는 표적화 도메인에 존재하는 것인 조작된 폴리펩티드.
53. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조작된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산이 만노실화된 아미노산인 것인 조작된 폴리펩티드.
54. 제53항에 있어서,
    상기 만노실화된 아미노산이 세린 아미노산인 것인 조작된 폴리펩티드.
55. 제53항 또는 제54항에 있어서,
    상기 만노실화된 아미노산이 링커 도메인 또는 표적화 도메인에 존재하는 것인 조작된 폴리펩티드.
56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 조작된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
57. 제56항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드가 DNA 또는 RNA인 것인 폴리뉴클레오티드.
58. 제56항 또는 제57항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
59. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 조작된 폴리펩티드, 제56항 또는 제57항의 폴리뉴클레오티드, 또는 제58항의 벡터를 포함하는 세포.
60. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 조작된 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 상기 방법은 세포에서 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 것을 포함하는 것인 방법.
61. 제60항에 있어서,
    세포로부터 조작된 폴리펩티드를 단리하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
62. (i) 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 및
    (ii) 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드
    를 포함하는 조성물.
63. 제62항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드가 DNA 또는 RNA이거나 이를 포함하는 것인 조성물.
64. 제62항 또는 제63항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드가 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조성물.
65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드가 mRNA이거나 이를 포함하는 것인 조성물.
66. 제62항 또는 제63항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드가 억제 RNA를 포함하는 것인 조성물.
67. 제66항에 있어서,
    상기 억제 RNA가 gRNA, siRNA, miRNA, 또는 shRNA인 것인 조성물.
68. 제62항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 적어도 2개의 조작된 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 첫번째 조작된 폴리펩티드는 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 두번째 조작된 폴리펩티드와 올리고머화할 수 있는 것인 조성물.
69. 제62항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드 대 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 조작된 폴리펩티드의 비가 1:1 내지 1:2,000인 것인 조성물.
70. 제69항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드 대 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 조작된 폴리펩티드의 비가 1:1 내지 1:1,000, 1:1 내지 1:500, 1:1 내지 1:200, 1:1 내지 1:100, 1:1 내지 1:50, 1:3 내지 1:1,000, 1:3 내지 1:500, 1:3 내지 1:200, 1:3 내지 1:100, 또는 1:3 내지 1:50인 것인 조성물.
71. 제62항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드 대 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 조작된 폴리펩티드의 비가 1:200 내지 1:2,000, 1:200 내지 1:1000, 또는 1:200 내지 1:500인것인 조성물.
72. 제62항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제학적 담체를 포함하는 것인 조성물.
73. 제62항 내지 제72항 중 어느 한 항의 조성물을 시스템에 투여하는 것을 포함하는 방법으로서, 상기 시스템은 세포, 조직 또는 대상체인 것인 방법.
74. 제73항에 있어서,
    투여 후, 변형이 시스템에서 조성물의 안정성, 반감기 및/또는 생체이용률을 증가시키는 것인 방법.
75. 제73항 또는 제74항에 있어서,
    투여 후, 변형은 시스템에서 결합 파트너와의 조성물의 친화도 또는 결합활성을 증가시키고, 선택적으로 상기 결합 파트너는 수용체, 세포 또는 세포막인 것인 방법.
76. 제73항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
    투여 후, 변형이 시스템에서 조성물의 침전 및/또는 응집을 감소시키는 것인 방법.
77. 제73항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서,
    투여 후, 변형은 조성물이 시스템의 하나 이상의 세포에 들어가는 속도를 증가시키는 것인 방법.
78. 제73항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    투여 후, 변형이 시스템의 하나 이상의 세포로의 조성물의 전달을 증가시키는 것인 방법.
79. 제73항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서,
    투여 후, 변형이 시스템의 하나 이상의 세포로의 조성물의 핵산 전달을 증가시키는 것인 방법.
80. 제73항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시스템이 포유동물 대상체이고, 투여 후, 상기 변형이 간에서 조성물의 축적을 감소시키는 것인 방법.
81. 제73항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시스템이 포유동물 대상체이고, 투여 후, 상기 변형이 혈뇌 장벽을 가로지르는 조성물의 양을 증가시키는 것인 방법.
82. 제62항 내지 제72항 중 어느 한 항의 조성물을 세포, 조직 또는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법으로서, 상기 조작된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산이 인산화된 아미노산인 것인 방법.
83. 제82항에 있어서,
    상기 인산화된 아미노산이 세린, 트레오닌 또는 티로신 아미노산인 것인 방법.
84. 제82항 또는 제83항에 있어서,
    상기 인산화된 아미노산이 링커 도메인 또는 표적화 도메인에 존재하는 것인 방법.
85. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 중추신경계(CNS)의 세포에 전달되는 것인 방법.
86. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 CNS 뉴런에 전달되는 것인 방법.
87. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 CNS 성상교세포, 미세아교세포, 희돌기아교세포 또는 신경교에 전달되는 것인 방법.
88. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 척수 세포에 전달되고, 선택적으로 척수 세포가 척수 뉴런 또는 척수 신경교 세포인 것인 방법.
89. 제82항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 조성물이 전달되는 세포에서 발현되는 발현 생성물을 암호화하는 것인 방법.
90. 제82항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 포유동물 대상체이고 투여가 척추강내, 두개내, 또는 대수조내인 것인 방법.
91. 제62항 내지 제72항 중 어느 한 항의 조성물을 세포, 조직, 또는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법으로서, 상기 조작된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산이 황산화 아미노산인 것인 방법.
92. 제91항에 있어서,
    상기 황산화 아미노산이 세린, 트레오닌 또는 티로신 아미노산인 것인 방법.
93. 제91항 또는 제92항에 있어서,
    상기 황산화 아미노산이 링커 도메인 또는 표적화 도메인에 존재하는 것인 방법.
94. 제91항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 중추신경계(CNS)의 세포에 전달되는 것인 방법.
95. 제91항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 CNS 뉴런에 전달되는 것인 방법.
96. 제91항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 CNS 성상세포, 미세아교세포, 희돌기아교세포 또는 신경교에 전달되는 것인 방법.
97. 제91항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 척수 세포에 전달되고, 선택적으로 척수 세포가 척수 뉴런 또는 척수 신경교 세포인 것인 방법.
98. 제91항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드가 조성물이 전달되는 세포에서 발현되는 발현 생성물을 암호화하는 것인 방법.
99. 제91항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 포유동물 대상체이고 투여가 척추강내, 두개내, 또는 대수조내인 것인 방법.
100. 제62항 내지 제72항 중 어느 한 항의 조성물을 세포, 조직 또는 대상체에 투여하는 것을 포함하며, 상기 조작된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산이 아세틸화된 아미노산인 것인 방법.
101. 제100항에 있어서,
     상기 아세틸화 아미노산이 리신 아미노산인 것인 방법.
102. 제100항 또는 제101항에 있어서,
     상기 아세틸화 아미노산이 링커 도메인 또는 표적화 도메인에 존재하는 것인 방법.
103. 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서,
     상기 조성물이 CNS 뉴런에 전달되는 것인 방법.
104. 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서,
     상기 조성물이 망막 세포에 전달되는 것인 방법.
105. 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서,
     상기 조성물이 망막 뉴런에 전달되고, 선택적으로 망막 뉴런이 광수용체, 양극성 세포, 망막 신경절 세포, 수평 세포, 및 무축삭 세포 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
106. 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서,
     상기 조성물이 광수용체 세포에 전달되고, 선택적으로 광수용체 세포가 간상체 및 원추체 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 것인 방법.
107. 제100항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서,
     상기 폴리뉴클레오티드가 조성물이 전달되는 세포에서 발현되는 발현 생성물을 암호화하는 것인 방법.
108. 제100항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서,
     상기 대상체가 포유동물 대상체이고 투여가 유리체내, 맥락막상 또는 망막하인 것인 방법.
109. 제62항 내지 제72항 중 어느 한 항의 조성물을 세포, 조직 또는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법으로서, 상기 조작된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산이 만노실화된 아미노산인 것인 방법.
110. 제109항에 있어서,
     상기 만노실화된 아미노산이 세린 아미노산인 것인 방법.
111. 제109항 또는 제110항에 있어서,
     상기 만노실화된 아미노산이 링커 도메인 또는 표적화 도메인에 존재하는 것인 방법.
112. 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서,
     상기 조성물이 CNS 뉴런에 전달되는 것인 방법.
113. 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서,
     상기 조성물이 망막 세포에 전달되는 것인 방법.
114. 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서,
     상기 조성물이 망막 뉴런에 전달되고, 선택적으로 망막 뉴런이 광수용체, 양극성 세포, 망막 신경절 세포, 수평 세포, 및 무축삭 세포 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
115. 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서,
     상기 조성물은 간상체 및 원추체 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 광수용체 세포에 전달되는 것인 방법.
116. 제109항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서,
     상기 폴리뉴클레오티드가 조성물이 전달되는 세포에서 발현되는 발현 생성물을 암호화하는 것인 방법.
117. 제109항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서,
     상기 대상체가 포유동물 대상체이고 투여가 유리체내, 맥락막상 또는 망막하인 것인 방법.
118. 폴리뉴클레오티드를 축합시키는 방법으로서, 상기 폴리뉴클레오티드를 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
119. 폴리뉴클레오티드의 전하를 중화시키는 방법으로서, 상기 폴리뉴클레오티드를 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
120. 조작된 폴리펩티드 및 적어도 하나의 핵산을 포함하는 조성물로서,
     상기 조작된 폴리펩티드는 핵산 결합 도메인 및 핵산 방출 도메인을 포함하고, 여기서 상기 조작된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산은 변형된 아미노산이고, 선택적으로 상기 변형은,
     (i) 인산화;
     (ii) 황산화;
     (iii) 글리코실화;
     (iv) 프레닐화;
     (v) 메틸화;
     (vi) 시알화;
     (vii) 지질화 및/또는 리포일화;
     (viii) 아세틸화;
     (ix) 수산화;
     (x) 팔미토일화;
     (xi) 만노실화;
     (xii) 미리스토일화;
     (xiii) 푸코실화;
     (xiv) 페길화; 및/또는
     (xv) 이의 임의의 조합 중 적어도 하나를 포함하며,
     선택적으로 상기 조성물은 대상체 또는 시스템에 핵산을 전달하는 데 사용하기 위한 것인 조성물.
121. 제120항에 있어서,
     상기 조작된 폴리펩티드가 표적화 도메인을 포함하는 것인 조성물.
122. 조작된 폴리펩티드 및 적어도 하나의 핵산을 포함하는 조성물로서,
     상기 조작된 폴리펩티드는 핵산 결합 도메인 및 표적화 도메인을 포함하고,
     상기 조작된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산은 변형된 아미노산이고, 선택적으로 상기 변형은,
     (i) 인산화;
     (ii) 황산화;
     (iii) 글리코실화;
     (iv) 프레닐화;
     (v) 메틸화;
     (vi) 시알화;
     (vii) 지질화 및/또는 리포일화;
     (viii) 아세틸화;
     (ix) 수산화;
     (x) 팔미토일화;
     (xi) 만노실화;
     (xii) 미리스토일화;
     (xiii) 푸코실화;
     (xiv) 페길화; 및/또는
     (xv) 이의 조합 중 적어도 하나를 포함하며,
     선택적으로 상기 조성물은 대상체 또는 시스템에 핵산을 전달하는 데 사용하기 위한 것인 조성물.
123. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 조작된 폴리펩티드, 제56항 내지 제57항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제58항의 벡터, 제59항의 세포, 제60항 내지 제61항 중 어느 한 항의 방법, 제62항 내지 제72항, 제120항, 제121항 또는 제122항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제73항 내지 제119항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 조작된 폴리펩티드가 서열번호: 336 내지 388로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 것인 조작된 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 방법, 조성물 및 방법.

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