WO2016076761A1 - Плазмидная днк, кодирующая hnp-1, либо hnp-2, либо hnp-3, бактериальный продуцент, анальгетическое средство (варианты) - Google Patents

Плазмидная днк, кодирующая hnp-1, либо hnp-2, либо hnp-3, бактериальный продуцент, анальгетическое средство (варианты) Download PDF

Info

Publication number
WO2016076761A1
WO2016076761A1 PCT/RU2015/000756 RU2015000756W WO2016076761A1 WO 2016076761 A1 WO2016076761 A1 WO 2016076761A1 RU 2015000756 W RU2015000756 W RU 2015000756W WO 2016076761 A1 WO2016076761 A1 WO 2016076761A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hnp
plasmid dna
seq
pain
variants
Prior art date
Application number
PCT/RU2015/000756
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Илья Владимирович ДУХОВЛИНОВ
Антон Иосифович ОРЛОВ
Original Assignee
Илья Владимирович ДУХОВЛИНОВ
Антон Иосифович ОРЛОВ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Илья Владимирович ДУХОВЛИНОВ, Антон Иосифович ОРЛОВ filed Critical Илья Владимирович ДУХОВЛИНОВ
Priority to BR112017009607-2A priority Critical patent/BR112017009607A2/pt
Priority to EP15858310.4A priority patent/EP3219798B1/en
Priority to CN201580072724.XA priority patent/CN107208087A/zh
Priority to EA201790929A priority patent/EA038673B1/ru
Priority to JP2017544270A priority patent/JP2017535288A/ja
Priority to KR1020177015883A priority patent/KR20170077252A/ko
Priority to US15/524,782 priority patent/US20180057837A1/en
Publication of WO2016076761A1 publication Critical patent/WO2016076761A1/ru
Priority to IL25273017A priority patent/IL252730B/en
Priority to HK18103246.6A priority patent/HK1243732A1/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A61K38/1729—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4723—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Definitions

  • the invention (options) relates to medicine, pharmacology, biotechnology, molecular biology, genetic engineering and can be used for analgesia.
  • peptide amides [US4459225 (A)], phenylhydrazone derivatives, as anti-inflammatory or analgesic agents [EP0952159 (B1)], synthetic peptide amides for the prevention and treatment of pain [RU 2500685 C2] is known. It is known to use a family of peptides having analgesic activity, the general formula AB-Tyr-Pro (DPro, dHPro, DdHPro, DLdhPro, Hyp) -CX [WO2008020778 (Al)], a derivative of a peptide administered subcutaneously or orally, having analgesic activity, or anti nociceptive [US2008009448 (A1)].
  • a recombinant plasmid is known, for bacterial expression, containing a homologous regulon or heterologous DNA, the latter can encode a polypeptide with an analgesic effect [SK278170 (B6)].
  • a mono-compound of indole with a new structure is known containing a deep-water macrogenomic gene cluster synthesized in Escherichia coli cells [CN 102477436 (A)].
  • Known polypeptide from anemone Heteractis crispa, with a pronounced analgesic effect [RU 2368621 CI, RU 2404245 C1]
  • a method for its production [RU 2415866 C1].
  • omega-conopeptides TVIA SNX-185) or MVIIA (SNX-111)
  • methods of analgesia using alpha-conotoxins [WO2014023129 (A1), CN102286033 (B), CN102286033 (B66) (A)], conotoxin Lt7b [CN 102628048 (A)].
  • omega-conopeptide for the manufacture of a medicament for inhibiting the progress of neuropathic pain is known [EP1336409 (B1)].
  • scorpion polypeptide having analgesic and antitumor effects [US7592309 (B2), CN101591668 (A)], and a method for its use [US7592309 (B2)] and the preparation of [CN101591668 (A)], Scolopendra subspinipes mutilans - mu-SLPT mutolans - mu-SLPT mutant - possessing an analgesic effect [CN 102977201 (A)].
  • Grammostola spatulata spider venom peptides are known to have analgesic effects [US5776896 (A)], the Chinese peptic bird spider HWAP-I peptide [US6670329 (B2)].
  • Peptide molecules from snake venom and their derivatives, homologues, analogues and mimetics are known that can induce analgesia or pain relief alone or in combination with other analgesic molecules [US6613745 (B1), US7902152 (B2)], as well as the shortened neurotoxin of sea snake Liiemis hard for analgesia [US7294697 (B2)].
  • IL-31 a humanized monoclonal antibody or chimeric antibody [RU 2440130 C2], prostatic acid phosphatase ("PAP”), its active variant, fragment or derivative [WO2009064497 (A1)],
  • neuropathic pain using antibodies against CCR2 [RU 201 1 1 10169 A]
  • a peptide containing the amino acid sequence Thr-Rl-Lue-Ile-Asp-Asn-Asn -Ala-Thr-Glu-Glu-Ile-Leu-Tyr where R1 is D-alanine affecting a neurodegenerative disorder or myelination disorder [RU 2266129 C2]
  • proteins with a zinc finger domain bound to a regulatory domain that are capable of activating or suppress 15 000756
  • neuropathic or central sensitization pain using a sequence of an isolated gene that is regulated in the spinal cord of a mammal in response to mechanically different first and second models of neuropathic or central sensitization pain [US2003108906 (A1), US2003134301 (A1), US2003138803 (A1), US2004058326 (A1)],
  • TORC polypeptides [RU 981 18091 A], histogranin and its chemically stable analogue [CA2219437 (A1)], linear, cyclic histogranin peptides and pseudopeptides based on them [US6566327 (B1)], a hybrid protein containing IL- 10 and IL-4 [WO2013070076 (A1)], IL-10 based polypeptides [US7261882 (B2)],
  • IL-13-binding proteins [RU 2472807 C2], 1L-12 / p40-binding proteins [RU 2012124438 A], IL-12 / p41-binding proteins [RU 2008103312 A ], IL-17 binding proteins [RU 201 1 140335 A], prostoglandin E2 binding proteins [RU 2011 104228 A], immunoglobulins with a double variable domain [RU 2515108 C2], immunoglobulins with a double variable domain against prostoglandin E2 [RU 201 1104348 A], the fight against chronic or acute attacks of pain using the EEZ family of proteins [RU 20041 14989 A],
  • peptides preferably from Lactobacillus rhamnosus [RU 201 1 136454 A].
  • TRPA1 Known methods for reducing pain sensitivity under physiological and pathophysiological conditions (for example, with allodynia and hyperalgesia), especially the perception of pain that is associated or mediated by mechanical sensitivity through TRPA1, using antagonistic antibodies TRPA1, preferably monoclonal antibodies [RU 2430750 C2].
  • Known analgesic / anti-inflammatory agents selected from the following classes of receptor antagonists, receptor agonists and enzyme inhibitors, each class acting on different molecular mechanisms of action on pain and suppression of inflammation: (4) bradykinin receptor antagonists (peptides), mediated peptide antagonists of the calcitonin gene (CGRP) receptor (alpha-COCR- (8-37), (8) antagonists of the interleukin receptor (Lys-D-Pro-Thr) [RU 2180852 C2], beta-cellululin protein (BTC) [JP2000198744 (A)].
  • CGRP mediated peptide antagonists of the calcitonin gene
  • BTC beta-cellululin protein
  • a fusion protein based on a neurotrophic factor of the brain is known, obtained using a prokaryotic soluble protein expression system [CN1978466 (B), WO9942480 (A1)].
  • Known neurotensin type 2 receptor polypeptides for the treatment of pain [US6008050 (A)].
  • a conjugate of neurotensin or its analogues with a therapeutic peptide is known, which can be used to induce hypothermia or analgesia [WO2010063122 (A1)].
  • Conformationally optimized analogues of alpha-melanotropin are known, which have a specific effect on the central nervous system [US4649191 (A)].
  • Known synthetic peptide that modulates the release of a neurotransmitter similar to SNARE [KR20090041066 (A)].
  • analgesia such as peptides with a large number of bridge bonds isolated from Actinomadura namibiensis [RU 2010144778 A], a peptide structure
  • DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD [RU 2508296 C2] a peptide modulator of PT1 purinergic receptors [RU 2422459 C1], dipeptides containing a 2-thioacyl group at the emmesch-terminal amino acid residue [RU] C98, peptide 2298, peptide, ], a polypeptide that improves calcium metabolism [JPH03178993 (A)], as well as prodrug compositions with a high degree of penetration based on peptides and peptide-related compounds [RU 201 1 149796 A].
  • a combined approach to analgesia is known - using a synergistic combination of a selective inhibitor of the neuronal transporter norepinephrine and an analgesic in the therapeutic treatment of vertebrates, including humans, for pain relief or for the prevention or relief of pain [US 8188048 B2].
  • Dynorphin analog peptides are known which, when co-administered with narcotic or analgesic agents, enhance the action of the latter, including enkephalins and beta-endorphin analogues [EP0096592B1].
  • defensin peptide Npr-1 alone or in combination with neuropeptide M, as a therapeutic agent for the prevention and / or treatment of peripheral vascular diseases, including anesthesia, spreading pain, causalgia (burning pain) [WO 2009/043461 A1].
  • RNA interfering agent for the treatment of chronic pain [WO2013126963 (A1)].
  • RNA preparations are quickly destroyed outside the body, and special storage conditions are also required, which puts the industrial applicability of RNA-based drugs into question.
  • a method of long-term analgesia is known, according to which myogenic cells are administered to a patient in which a peptide is activated with the corresponding DNA that activates an opioid receptor or mediates the binding of substance P to the receptor [US7166279 (B2)].
  • a peptide is activated with the corresponding DNA that activates an opioid receptor or mediates the binding of substance P to the receptor [US7166279 (B2)].
  • the agent may be a protein, RNA or DNA [WO2013177484 (A1)].
  • Oncostatin M is known, or its homolog synthesized from a vector for gene transfer: lentivirus, retrovirus, Sendai virus, adenovirus and adeno-associated virus, including for the treatment of pain [JP4803789 (B2)].
  • composition which contains a vector, including plasmid DNA, and a pharmaceutically acceptable excipient or adjuvant, to alleviate, prevent or treat pain
  • the vector contains a nucleotide sequence containing at least one region that modulates the expression of VR1 receptor [ US2006154886 (A1)].
  • analgesia is carried out by blocking the receptor associated with the ion channel - a non-specific conductor of cations.
  • plasmid DNA carrying the gene from which defensin is synthesized in mammalian cells, as a means of inducing analgesia, will also minimize the possibility of the development of pathogens in the body: as a rule, when pain of any etiology worsens and the body's ability to resist infections decreases, as a result, after, for example, surgery, antibiotics can be prescribed, and the use of a natural antimicrobial peptide will allow combining both analgesia and protective effect kt, as a result, it is possible to abandon the use of antibiotics.
  • Close analogues of the invention are the inventions described in patent CN10164801 1 (A) and patent application US2006154886 (A1), which disclose analgesics in the form of plasmid DNA.
  • Plasmid DNA should contain elements essential for the organisms of its maintenance and use, together with the corresponding regulatory sequences. Regulatory sequences are nucleotide sequences that can affect gene expression at the level of transcription and / or translation, as well as mechanisms that ensure the existence and maintenance of plasmid DNA functioning.
  • the origin of replication and the reporter gene are essential for the prokaryotic system. Bacterial elements of plasmid DNA should not adversely affect expression in mammalian cells and cause a side effect of the use of plasmid DNA. There is evidence in the literature that the use of the ampicillin resistance gene as a reporter gene may be undesirable due to the development of the patient's response to ampicillin, however, the authors consider such consequences to be related to the low quality of plasmid DNA purification, but not the element itself.
  • the essential elements of plasmids for use in mammals are the promoter, mRNA leader sequence, and the termination sequence.
  • a promoter is an important component of a plasmid that triggers the expression of a gene of interest.
  • the classic promoters for the plasmid DNA component of the preparations are the human CMV / immediate early or CMV-chicken- ⁇ actin (CAGG) promoter.
  • CMV promoters are used for most DNA vaccines, as they mediate high levels of constitutive expression in a wide range of mammalian tissues [Manthorpe M, Cornefert-Jensen F, Hartikka J, et al. Gene therapy by intramuscular injection of plasmid DNA: studies on firefly luciferase gene expression in mice. Hum. Gene Ther. 1993; 4 (4): 419-431] and do not inhibit downstream reading.
  • An increase in the expression level is observed when the CMV promoter is changed, for example, by turning on the HTLV-1R-U5 downstream from the cytomegalovirus promoter or when using the chimeric SV40-CMV promoter [Williams JA, Carnes AE, Hodgson CP. Plasmid DNA vaccine vector design: impact on efficacy, safety and upstream production. Biotechnol. Adv. 2009; 27 (4): 353-370].
  • CMV promoters An alternative to CMV promoters is tissue-specific host promoters that avoid constitutive expression of antigens in inappropriate tissues, which generally leads to a decrease in immunogenicity [Cazeaux N, Bennasser Y, Vidal PL, Li Z, Paulin D, Bahraoui E. Comparative study of immune responses induced after immunization with plasmids encoding the HlV-1 Nef protein under the control of the CMV-IE or the muscle-specific desmin promoter. Vaccine 2002; 20 (27-28): 3322-3331].
  • the mRNA leader sequence also plays a large role.
  • the Kozak sequence immediately before the ATG start codon allows for increased expression [Kozak M. Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in positions +5 and +6. EMBO J. 1997; 16 (9): 2482-2492].
  • the presence of an intron in the downstream plasmid from the promoter can increase mRNA stability and increase gene expression.
  • Gene expression can be affected by changing the termination sequence, which is necessary to maintain the stability of mRNA, proper termination of transcription and export of mRNA from the nucleus, including shortening it.
  • Many modern DNA vaccines use the bovine growth hormone transcriptional terminator sequence [Montgomery DL, Shiver JW, Leander KR, et al. Heterologous and homologous protection against influenza A by DNA vaccination: optimization of DNA vectors. DNA Cell Biol. 1993; 12 (9): 777-783].
  • Polyadenylation (polyA) is necessary to stabilize the transcript. Changing the sequence of polyA can lead to increased gene expression [Norman JA, Hobart P, Manthorpe M, Feigner P, Wheeler C.
  • the bovine growth hormone terminator region contains a homopurin region that is sensitive to nuclease. It was shown that an alternative polyA sequence can significantly improve plasmid stability to nuclease [Azzoni AR, Ribeiro SC, Monteiro GA, Prazeres DMF. The impact of polyadenylation signals on plasmid nuclease-resistance and transgene expression. J Gene Med. 2007; 9: 392 ⁇ 102]. The introduction of two stop codons can increase the efficiency of the transcription terminator.
  • the optimal plasmid design for prescribing should combine the “bacterial” and “eukaryotic” elements with appropriate regulatory sequences to ensure high copy number during production and a high level of expression in mammals [Saade F, Petrovsky N. Technologies for enhanced efficacy of DNA vaccines. Expert Rev Vaccines. 2012 Feb; 1 1 (2): 189-209. doi: 10.1586 / erv.1 1.188].
  • plasmid DNA can be used that is at least standard for gene delivery and expression in mammals, including humans, and optimized for the above parameters, including those described in detail in Williams et al. 2009 [Williams JA, Carnes AE, Hodgson CP. Plasmid DNA vaccine vector design: impact on efficacy, safety and upstream production. Biotechnol. Adv. 2009; 27 (4): 353-370].
  • the FDA Guide (2007) states that studies of the biodistribution of a substance after it has been introduced into the body can be canceled for DNA vaccines produced by cloning a new gene into a plasmid vector, for which acceptable biodistribution and integration profiles have been previously documented.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or buffer solution for DNA intended for human use, it may be useful to have the final DNA product in a pharmaceutically acceptable carrier or buffer solution.
  • pharmaceutically acceptable carriers or buffers are known in the art and include those described in various texts, such as, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences.
  • a prototype of embodiments of the invention is the invention disclosed in the application for the invention WO 2009/043461 A1: the use of defensin HNP-1 for the treatment of including pain.
  • Defensins constitute a large family of low molecular weight (3-5-kDa) cysteine-rich cationic peptides stabilized by several (usually three) disulfide bonds [Ganz, T. 2002. Immunology: Versatile defensins. Science 298: 977-979, Lehrer, RI and Ganz, T. 2002. Defensins of vertebrate animals. Curr. Opin. Immunol. 14: 96-102.], Which are capable of killing a wide range of pathogens, including a variety of bacteria, fungi, and enveloped viruses. In humans, this family is represented by the ⁇ -subfamily (HNP) and the ⁇ -subfamily (hBD) of defensins.
  • HNP ⁇ -subfamily
  • hBD ⁇ -subfamily
  • HNP-1 and HNP-3 contain only 30 amino acid residues in their composition, these peptides are identical to each other except for the replacement of alanine with asparagine at position 1.
  • HNP-2 is a proteolytic product of HNP-1 and HNP-3, contains 29 amino acid residues (the first amino acid is missing from the ⁇ -terminus).
  • the presence of disulfide bonds ensures the preservation of the resistance of defensin molecules to numerous leukocyte and microbial proteinases and the preservation of antibiotic properties in the focus inflammation and tissue destruction [Levy, O. Antimicrobial proteins and peptides: anti-infective molecules of mammalian leukocytes. J. of Leukocyte Biology. 2004; 76: 909-926]. Obtaining these molecules of the correct spatial structure is a rather difficult task.
  • HNP 1-3 Genes encoding defensins form a cluster at the p22-23 locus on chromosome 8.
  • HNP 1-3 are encoded by two genes HDEFA1 and HDEFA3. Each defensin gene contains several exons that encode a prepropeptide.
  • defensins are synthesized as precursors, as prepropeptides, the length of which is 94 amino acid residues.
  • Prepropeptides contain a signal region (an average of 19 amino acid residues), an anion region (an average of 45 amino acid residues) and the “mature” peptide itself.
  • the signal region is removed and prodefensin is formed (an average of 75 amino acid residues).
  • Subsequent maturation (cleavage of 45 amino acid) residues occurs in mature neutrophil granules.
  • ⁇ -Defensins are also found in NK cells, B-lymphocytes, ⁇ T-lymphocytes, monocytes / macrophages and epithelial cells [A.S. Budikhina, B.V. Pinegin. Defensins are multifunctional human cationic peptides. Immunopathology, allergology, infectology. 2008, ⁇ ° 2: 31-40].
  • the technical result consists in increasing the duration of analgesia and is achieved by the use of plasmid DNA, with which, after introduction into the body, alpha human defensin HNP-1 HNP-2 / HNP-3 is synthesized; as well as the fact that the nucleotide sequence encoding human defensin contains elements that determine the stability of the mRNA and, accordingly, increase the half-life of the mRNA, as a result, protein synthesis from one mRNA molecule is carried out more times, and also the amount of synthesized protein increases; and the fact that the nucleotide sequence of human alpha defensin is codon optimized for expression in mammals, as a result, protein synthesis is more intensive. When introduced into practice, this will significantly reduce the amount of introduced plasmid DNA (10-50 times), compared with the doses currently used in domestic and world practice for gene therapy.
  • the technical result is to increase the safety of analgesia.
  • This technical result is achieved by the fact that the active substance is not a protein to which antibodies can be formed, which, when using a molecule used in the body of its origin, can cause serious side effects, and plasmid DNA, which exists in the form of an episoma and does not integrate into the genome from which human protein is synthesized and then secreted from the cell, as a result, non-immunogenic, safe use of human defensin for analgesia is carried out.
  • the indicated technical result is also achieved by the fact that the protein synthesized in the body with plasmid DNA undergoes natural post-translational processing, and the correct folding of the protein due to cellular chaperones is also ensured.
  • the specified technical result is also achieved due to the fact that the natural mechanisms of metabolism and catabolism of the active substance are used, without the formation of toxic products, due to the natural nature of the plasmid construct and the protein encoded by it, as well as the identity of the formed protein to the endogenous analogue.
  • the specified technical result is also achieved by the fact that plasmid DNA is not replicated after the introduction into the body of a mammal, which allows you to control the amount of synthesized protein, and, respectively, over analgesia.
  • This technical result is achieved due to the presence of regulatory sequences in the plasmid DNA, such as silencer and / or insulator, in one embodiment of the invention, due to which control over the amount of protein synthesized, and, in principle, protein synthesis, as such, is also carried out, and , respectively, over analgesia: if necessary, it is possible to quickly stop or reduce gene expression. In the latter embodiment, the implementation of tissue-specific expression if necessary.
  • the technical result also consists in simplifying and cheapening the production of analgesics by avoiding the difficulties of production and purification of protein preparations in vitro, due to the fact that protein synthesis occurs in vivo.
  • the production, purification and storage of DNA preparations is economically more profitable than protein ones, since the former are more stable, they can be produced in large quantities and at lower cost.
  • Beta-endorphin is a marker of the effectiveness of analgesia in acute pain and chronic pain in cancer patients / 3. V. Pavlova [et al.] // Problems of clinical medicine. — 2007. — N 1. — S. 36-40. — ISSN 1817-8359]. With the administration of the analgesic of the present invention, an increase in serum beta-endorphin level was observed (FIG. 3).
  • Chronic pain can be attributed to chronic pain in a malignant disease (including pain in patients with cancer, HIV / AIDS, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), multiple sclerosis, in the final stage of organ failure, expanded chronic obstructive pulmonary disease, expanded congestive heart failure, parkinsonism ) and chronic pain not associated with malignant disease (chronic musculoskeletal pain, such as back pain or lower back pain, with chronic degenerative arthritis, osteoarthritis, rheumatoid Mr.
  • a malignant disease including pain in patients with cancer, HIV / AIDS, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), multiple sclerosis, in the final stage of organ failure, expanded chronic obstructive pulmonary disease, expanded congestive heart failure, parkinsonism
  • chronic pain not associated with malignant disease chronic musculoskeletal pain, such as back pain or lower back pain, with chronic degenerative arthritis, osteoarthritis, rheumatoid Mr.
  • arthritis myofascial and rheumatic pains, chronic headache, migraine, bone pains
  • neuropathic pains including pain with nerve compression, trauma, pain after nerve damage and amputation), with diabetic neuropathy, complex regional pain syndromes (type I and type II), with skeletal muscle spasms, with postherpetic neuralgia, chronic pain after surgery
  • visceral pain with an extension of the cavity of the intestines and colic
  • chronic pain in sickle cell anemia [WHO Normative Guidelines on Pain Management, Geneva June 2007].
  • a plasmid DNA for transient expression in mammalian cells is proposed, represented by a skeleton containing prokaryotic elements, the origin of replication and the reporter gene, and eukaryotic elements, a strong promoter, leader mRNA sequence, as well as regulatory sequences for these elements, a site, preferably sites, for cloning the gene of interest and site for primer landing, preferably sites for landing primers for analysis, and polynucleotide represented by the secretory sequence y, a fragment encoding human alpha defensin HNP-1, or HNP-2, or HNP-3, codon-optimized for mammals, and the termination sequence.
  • the preproprotein is SEQ ID ⁇ : 1, or SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 8.
  • the polynucleotide is represented by SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: l 1 or SEQ ID NO: 12.
  • Plasmid DNA is most economically advantageous to produce in prokaryotic cells, mainly bacterial cells.
  • the plasmid DNA of the present invention contains elements for maintaining and amplification, mainly in large quantities, in bacterial cells.
  • Such essential elements are bacterial origin of replication, to maintain a medium, preferably high, copy number in the cell, and a reporter gene for selection of the producer strain.
  • a suitable origin of replication is represented by pMl (der.), ColEl (der.) And Fl, pUC and Fl, but is not limited to.
  • a suitable reporter gene is represented by, but not limited to, the antibiotic resistance gene, for example, ampicillin, mainly kanamycin.
  • the plasmid DNA of the present invention contains elements for efficient functioning in mammalian cells.
  • Such an element is a promoter with corresponding regulatory sequences from natural promoters with its own regulatory elements (CaM kinase II, CMV, nestin, L7, BDNF, NF, MBP, NSE, p-globin, GFAP, GAP43, tyrosine hydroxylase, subunit 1 of the kainate receptor and subunit In the glutamate receptor and others), or synthetic promoters with regulatory sequences, to obtain the desired expression (ratio of duration and expression level) of the target gene at the transcription level.
  • the plasmid DNA of the present invention contains from one of the above regulatory sequences, depending on the variant plasmid DNA based on the choice of promoter and the desired expression parameters of the target gene. Based on the current state of the art, on known and obvious variants of such elements and their use, the plasmid DNA of the present invention may contain any combination meeting the above conditions in which alpha defensin HNP-1, or HNP-2, or HNP is synthesized with plasmid DNA -3 in mammalian cells. When using silencer or an insulator within the construct, it is possible to regulate the expression of the target gene, the gene of the described human alpha defensin HNP-1, or HNP-2, or HNP-3 (variants).
  • the plasmid DNA of the present invention in one embodiment further comprises such a regulatory element.
  • the plasmid DNA of the present invention also contains such an important element as the leader mRNA sequence containing the Kozak sequence immediately before the start ATG codon.
  • Plasmid DNA also contains a site, mainly sites, different for cloning a target gene, for the correct orientation of the target gene in plasmid DNA, and a site, mainly sites, for primers to primer for sequencing.
  • Plasmid DNA also contains a termination sequence containing a stop codon in sequence, a 3 "untranslated region with a signal and a polyadenylation site, a stop codon, which maintains mRNA stability, and the transcription is terminated appropriately and mRNA is exported from the nucleus.
  • the termination sequence is represented natively. i.e., inherent to the target gene, or another, stronger one, which is represented, for example, by the termination sequence of bovine growth hormone (BGH), but is not limited to it, and in the second embodiment may contain an additional stop codon in front of the 3 'untranslated region.
  • BGH bovine growth hormone
  • the plasmid DNA of the present invention may contain any termination sequence meeting the above conditions in which alpha is synthesized with plasmid DNA defensin HNP-1, or HNP-2, or HNP-3 in mammalian cells.
  • Plasmid DNA also contains a native or heterologous secretory sequence codon-optimized for mammals.
  • the invention contains, for example, a secretory sequence of TPA (tissue-type plasminogen activator isoform 1 preproprotein [Homo sapiens], NCBI Reference Sequence: NP 000921.1), but is not limited thereto.
  • TPA tissue-type plasminogen activator isoform 1 preproprotein [Homo sapiens], NCBI Reference Sequence: NP 000921.1
  • the advantage of using the secretory sequence of TPA is in the extensive previous clinical experience, as well as in the fact that it shows its high performance in relation to the expression of secreted protein from various target genes.
  • Plasmid DNA also contains a fragment encoding human alpha defensin HNP-1, or HNP-2, or HNP-3, codon-optimized for mammals.
  • Plasmid DNA can also additionally contain starting cDNA for the genes elements causing the stability of the mRNA, such as a termination sequence (W L L netrans iruemaya region containing a polyadenylation signal and site, and transcription termination signal - the stop codon). Accordingly, in this case, the backbone of plasmid DNA is absent or similar elements do not function.
  • Plasmid DNA for the delivery of a gene that causes analgesia combines the properties of a plasmid DNA-based DNA vaccine such as a high level of expression of a gene of interest in mammalian cells and the properties of a vector for gene therapy, such as the lack of immunogenicity and duration of gene expression, however, for example, by increasing the stability of mRNA.
  • a plasmid DNA-based DNA vaccine such as a high level of expression of a gene of interest in mammalian cells
  • a vector for gene therapy such as the lack of immunogenicity and duration of gene expression, however, for example, by increasing the stability of mRNA.
  • Such DNA does not integrate into the genome and does not replicate in mammalian cells.
  • Suitable vectors for expression in mammalian cells are known to those of ordinary skill in the art and described in the literature [Hartikka J, Sawdey M, Cornefert-Jensen F, Margalith M, Bamhart K, Nolasco M, Vahlsing HL, Meek J, Marquet M, Hobart P , Norman J, Manthorpe M. An improved plasmid DNA expression vector for direct injection into skeletal muscle. Hum Gene Ther. 1996 Jun 20; 7 (10): 1205-17 et al.], As well as plasmids that can be created by one of ordinary skill in the art using recommendations on vector elements ["Cloning Vectors", ed.
  • Preferred plasmid DNAs for use in humans are human-verified vectors containing the above described elements with corresponding regulatory sequences, possibly modified to meet the stated criteria, thereby reducing the number of studies required to register the agent. However, it is possible to use other plasmid DNA containing the required described elements.
  • plasmid DNA The sequence of arrangement of the described elements in plasmid DNA is understood by the average person skilled in the art.
  • a producer of plasmid DNA based on a bacterial cell (based on cells, mainly Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus, Pseudomonas, but not limited to) is proposed.
  • a plasmid DNA producer for example, by standard methods, for example, transfection, electroporation or a particle gun.
  • an analgesic agent based on the characterized plasmid DNA, in an effective amount, also containing a pharmaceutically acceptable excipient, for use in mammals, in particular humans.
  • This pharmaceutical composition is for the treatment, relief and / or prevention of pain, in particular acute or chronic pain, sensitivity disorders.
  • FIG. 1 The results of the test "hot plate".
  • the abscissa axis is the latent time of licking the fore and hind legs, the ordinate axis is the time after the administration of the analyte.
  • 1 - negative control (injected with saline.)
  • FIG. 2 The results of the study of various doses of plasmid DNA pVAXlseq3 in the test "hot plate”.
  • the abscissa axis is the latent time of licking the fore and hind legs, the ordinate axis is the time after the administration of the analyte.
  • 1 - negative control saline solution was administered
  • 6 - analgin 50 mg / kg
  • 7 - morphine hydrochloride 10 mg / kg.
  • FIG. 3 The results of a study of changes in the concentration of beta-endorphin in the serum of mice.
  • the abscissa axis is the time after administration of the analyte, the axis ordinate is the concentration of beta-endorphin in serum.
  • 1 - negative control injected saline solution
  • Plasmid DNA was introduced in an amount of 5 mg / kg.
  • Example 1 Obtaining plasmid DNA encoding alpha defensin HNP-1, or HNP-2, or HNP-3.
  • the synthesized genes were cloned into plasmids pVAXl (Invitrogen) and pVR1012 (Vical).
  • the sequence of SEQ ID ⁇ : 1 1 was also cloned into the pcDNA3.1 + vector (Invitrogen) at the restriction sites Nhel (5), Apal (3 ').
  • the pcDNA3.1 + vector, incapable of expressing neomycin was obtained by restriction of the vector with Nsil restriction enzyme in the SV40 region of the promoter (-71 bp).
  • SEQ ID NO: 12 was cloned into the resulting vector at the restriction sites Nhel (5 '), Apal (3').
  • the reaction of ligation was taken 3 ⁇ l of a solution of synthesized DNA, 1 ⁇ l of a solution of the finished vector, 5 ⁇ l of x2 ligation buffer and 1 ⁇ l of T4 ligase. The reaction was carried out at + 20 ° C for 2 hours.
  • the mixture was heated at + 95 ° C for 10 min and purified from salts by dialysis on nitrocellulose filters with a pore diameter of 0.025 ⁇ m (Millipore, USA). Dialysis was performed against a solution containing 0.5 mM EDTA in 10% glycerol for 10 minutes.
  • the following plasmid DNAs were obtained: pVAXl seq3, pVR1012seq4, pVR1012seq5, pVAXl seq6, pVR1012seq9, pVAXlseqlO, pVAXlseql l, pVR1012seql2, pcDNA3.1 + seql.1 seql.
  • E. coli cells of strain DH10B / R (F-mcrA, A (mrr-hsdRMS-mcrBC), (p80dlacZAM 15, AlacX74, deoR, recAl, endAl, araD139, A (ara, leu) 769, galU, galK - were transformed , rpsL, nupG) obtained by plasmid DNA by electroporation using a MicroPulser electroporator (BioRad).
  • This strain does not contain methylase, which allows you to minimize the possibility of mutations in DNA, including the gene cloned in a plasmid supported in this strain.
  • 1 ⁇ l of dialyzed ligase mixture was added, placed between the electrodes of the pore cell and treated with a current pulse.
  • the cells were placed in 1 ml SOC medium (2% bacto-tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCh, 10 mM MgS0 4 , 20 mM glucose) and incubated for 40 min at + 37 ° C.
  • SOC medium 2% bacto-tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCh, 10 mM MgS0 4 , 20 mM glucose
  • Clones of E. coli cells containing the obtained plasmid DNA were detected on a selective medium containing LB-arap, 50 ⁇ g / ml kanamycin, or ampicillin (for plasmid DNA based on pcDNA3.1 +).
  • Plasmid DNA was isolated from the grown clones. Plasmid DNA was isolated using the Wizard Minipreps DNA Purification System kit (Promega, USA). Purified recombinant plasmid DNA was checked by sequencing.
  • a PCR reaction was performed, then the reaction mixture was purified from free labeled ddNTP according to the instructions for the BigDye X-Terminator Purification Kit (Applied Biosystems, USA) and the products of the sequencing reaction were separated using an Applied Biosystems 3500 / 3500xL Genetic Analyzer capillary sequencer (Applied Biosystems, USA ) and the Reagent 3500 / 3500xL Genetic Analyzer Polymer "POP-6 TM" (Applied Biosystems, USA).
  • pVAXlseq3 plasmid DNA was obtained with a concentration of 3.4 mg / ml, pVR1012seq4 - 3.7 mg / ml, pVR1012seq5 - 4 mg / ml, pVAXlseq6 - 3.8 mg / ml, pVR1012seq9 - 4.1 mg / ml, pVAXlseqlO - 4 mg / ml, pVAXlseql l - 4.3 mg / ml, pVR1012seql2 - 4.5 mg / ml, pcDNA3.1 + seql 1 - 4.4 mg / ml, pcDNA3.1 + (var) seql2 - 4.3 mg / ml.
  • the output of plasmid DNA ranged from 3.4 mg to 4.5 mg from 1 l of culture medium.
  • the purity of the obtained plasmid DNA preparation was judged by the ratio of the optical density of the drug, measured at a wavelength of 260 nm, to the optical density of the drug, measured at a wavelength of 280 nm (A 2 bo / A 2 8 °) and the ratio of the optical density of the drug, measured at a wavelength 260 nm to the optical density of the drug, measured at a wavelength of 230 nm (A 26 about / A 2 ZO). Measurements carried out in an aqueous solution, water was used as a control solution without adding a test drug.
  • a 2 6 0 / A 2 80> 1, 80 and A 2 b 0 / A 2 zo> 1, 80 are characteristic.
  • the values determined in the experiment corresponded to the values of the ratios A 26 schreib / ⁇ 28 réelle and ⁇ 260 / ⁇ 3 schreib for pure preparations, for all obtained preparations of plasmid DNA.
  • the sensitivity of the microBCA assay method is 0.5-20 ⁇ g / ml protein.
  • the concentration of total protein in none of the studied plasmid DNA preparations did not exceed the norm (from 0.5 to 12 ⁇ g / mg plasmid DNA).
  • the content of bacterial lipopolysaccharide in plasmid DNA preparations was also determined using a gel thrombus variant of the LAL test with a sensitivity of> 0.25 EU / ml (ToxinSensor, GenScript, USA).
  • the LAL reagent was a limb polyphemus horseshoe crab lysate of amebocytes.
  • the LAL reagent specifically reacts with bacterial endotoxins; as a result of the enzymatic reaction, the reaction mixture changes in proportion to the concentration of endotoxin.
  • the results were evaluated by the presence or absence of a dense blood clot at the bottom of the tube by inverting the tube.
  • a thrombus did not form when examining a sample diluted 10 times for plasmid DNA preparations pVAX l seq3, pVR1012seq4, pVR1012seq5, pcDNA3.1 + (var) seql 2 and 5 times for plasmid DNA preparations pVAXl seq6, pVR101Vseq9, , pVAXl seql l, pVR1012seql2, pcDNA3.1 + seq l 1 i.e. when the sensitivity of the method is 2.5 EU / ml and 1.25 EU / ml, respectively, which, given the concentration of plasmid DNA in the sample, indicates an acceptable rate of purification from endotoxins.
  • Example 3 Determination of the analgesic effect of plasmid DNA encoding alpha-defensin HNP-1, or HNP-2, or HNP-3.
  • Hot Plate Test The analgesic activity of plasmid DNA encoding alpha-defensin HNP-1, or HNP-2, or HNP-3 was investigated using the hot plate test.
  • the Hot plate test was performed to measure the threshold of acute pain sensitivity and the potential analgesic effect of the studied plasmid DNA preparations [Valdman A. V., Ignatov Yu. D. Central mechanisms of pain. - L .: Nauka. - 1976].
  • the test is the basis for the study of analgesic activity, it is used to detect analgesically active compounds.
  • mice Females, weighing 15-22 grams, age 18 weeks.
  • 17 groups of animals were formed, including control groups, in each group 3 mice:
  • Hot plate meter Hotplate Analgesia Meter, Columbus Instruments, USA
  • the test systems Prior to testing, the test systems were allowed to acclimatize in the study room for 10 minutes. The animals were used once, since re-placing the animal on a thermostatic plate causes an immediate reaction to touching the surface. The temperature of the thermostat was set at 55 ° C. After injection of the test substance, the animal was carefully placed on the heating plate and at the same moment the “start” button on the instrument panel was pressed. The latent time of licking the front and hind legs was noted (from the moment the animal was placed on the surface of the device until the first licking). After that, they pressed the “stop” button and removed the animal from a hot surface. Other behavioral reactions were ignored. To reduce the likelihood of thermal damage to the paw pads, the maximum experiment time did not exceed 60 seconds.
  • the latent time of licking the front and hind legs in the control group (saline solution) (point 0) and 2 hours, 12 hours, 24 hours after drug administration in the test groups were measured.
  • the surface of the device was wiped with a cloth moistened with a disinfectant (0.5% chlorhexidine-bigluconate on 70% ethanol) before placing another animal on it [Methodical recommendations for students. Faculty of Pharmacy GOU VPO MMA named after I.M.Sechenova of Roszdrav. — Moscow. — 2006].
  • an ED50 was determined, i.e. the dose necessary for the manifestation of a 50% analgesic activity of the drug.
  • Beta-endorphin is a marker of the effectiveness of analgesia in acute pain and chronic pain syndrome in cancer patients / 3. V. Pavlova [et al.] // Problems of clinical medicine. - 2007. — N1 .— S.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение (варианты) относится к области медицины, фармакологии, биотехнологии, молекулярной биологии, генной инженерии и может быть использовано для анальгезии. Предложена плазмидная ДНК для транзиентной экспрессии в клетках млекопитающих, представленная остовом, содержащим прокариотические и эукариотические элементы, и полинуклеотидом, кодирующим альфа дефенсин человека HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3 (варианты). Также предложен продуцент такой плазмидной ДНК на основе бактериальной клетки (варианты) и анальгетическое средство для применения у млекопитающих, в частности, человека, на его основе (варианты). Технический результат от использования вариантов изобретения выражается в расширении спектра анальгетических средств, в увеличении длительности анальгезии, в увеличении безопасности анальгезии, в упрощении и удешевлении производства анальгетика.

Description

Плазмидная ДНК, кодирующая HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3, бактериальный продуцент, анальгетическое средство (варианты)
Изобретение (варианты) относится к области медицины, фармакологии, биотехнологии, молекулярной биологии, генной инженерии и может быть использовано для анальгезии.
Важно признать, что боль является не просто индикатором основного заболевания или процесса повреждения, а самостоятельной проблемой, наносящей большой урон отдельным людям и обществу в целом. Для улучшения качества жизни облегчение боли как таковой должно стать терапевтической целью. Перспективный подход к лечению боли, к которому переходят в настоящее время, - выявление механизма и осуществление таргетной (нацеленной на конкретные молекулы) фармакологической терапии [WHO Normative Guidelines on Pain Management, Geneva June 2007].
Известно использование пептидных амидов [US4459225 (А)], фенилгидразоновых производных, в качестве противовоспалительных или анальгетических агентов [ЕР0952159 (В1)], синтетических пептидных амидов для профилактики и лечения боли [RU 2500685 С2]. Известно использование семейства пептидов, обладающих анальгетической активностью, общей формулы A-B-Tyr-Pro (DPro, dHPro, DdHPro, DLdhPro, Hyp)-C-X [WO2008020778 (Al)], производного пептида, вводимого подкожно или орально, имеющего анальгетическую активность, либо анти-ноцицепивную [US2008009448 (А1)].
Недостатком химически синтезированных пептидов и их производных является возможность получения смеси искомых веществ с энантиомерами, что может привести к непредсказуемым результатам. Понятие энантиомерии играет важную роль в фармацевтике, поскольку разные энантиомеры лекарственных веществ, как правило, имеют различную биологическую активность. Использование живых систем для получения пептидных молекул позволяет получить молекулы природной структуры, гомогенную смесь.
Известна рекомбинантная плазмида, для бактериальной экспрессии, содержащая гомологичный регулон или гетерологичную ДНК, последняя может кодировать полипептид с анальгетическим эффектом [SK278170 (В6)]. Известно моно соединение индола с новой структурой, содержащее глубоководный макрогеномный кластер генов, синтезируемое в клетках Escherichia coli [CN 102477436 (А)]. Известен полипептид из актинии Heteractis crispa, обладающий выраженным анальгетическим действием [RU 2368621 CI, RU 2404245 С1], и способ его получения [RU 2415866 С1]. Известны пептиды с большим числом мостиковых связей, выделенных их ACTINOMADURA NAMIBIENSIS, для лечения невропатической боли, вызванной воспалением [RU2498995 (С2)]. Однако в связи с тем, что такие молекулы происходят от организмов, далеких от человека, их действие должно быть изучено особо тщательно перед применением в человеке.
Известен гибридный белок на основе конотоксина (яда улитки) MVo А и Тгх, который можно использовать в подготовке обезболивающего для последних стадий рака и СПИДа, пост-операционной боли, ожогов и т.д. [CN 1487085 (А)]. Известен способ получения конотоксина с использованием бакуловируса и клеток насекомых, либо насекомых [CN 102876683 (А)]. Известны способы анальгезии и улучшения опиатной анальгезии введением омега-конопептидов TVIA (SNX-185) или MVIIA (SNX-111) [ЕР0625162 (В1)], способы анальгезии с использованием альфа-конотоксинов [WO2014023129 (А1), CN102286079 (В), CN103374066 (А)], конотоксина Lt7b [CN 102628048 (А)]. Известно использование омега-конопептида для производства медикамента для ингибирования прогресса нейропатической боли [ЕР1336409 (В1)]. Известен полипептид скорпиона, обладающий анальгетическим и противоопухолевым действием [US7592309 (В2), CN101591668 (А)], и способ его применения [US7592309 (В2)] и получения [CN101591668 (А)], сколопендры Scolopendra subspinipes mutilans - mu- SLPTX-Ssm6a, обладающий анальгетическим эффектом [CN 102977201 (А)]. Известны пептиды яда паука Grammostola spatulata, обладающие анальгетическим действием [US5776896 (А)], пептид HWAP-I китайского паука-птицеееда [US6670329 (В2)]. Известны пептидные молекулы из яда змеи и их производные, гомологи, аналоги и миметики, способные индуцировать анальгезию или облегчение боли отдельно или в комбинации с другими анальгетическими молекулами [US6613745 (В1), US7902152 (В2)], а также укороченный нейротоксин морской змеи Lapemis hardwickii для анальгезии [US7294697 (В2)].
Недостатком данной группы изобретений является то, что использование токсинов, даже фармацевтически чистых, все же является риском - при передозировке вплоть до смерти.
Известно использование нового полипептида - субъединицы 9.01 [CN1345751 (А)], субъединицы 12.65 [WO0212310 (А1)], субъединицы 9.46 [WO0204504 (А1)], субъединицы 1 1.44 [CN1352195 (А)] G-белка человека для анальгезии. Известны полипептиды на основе рецептора G-белка HFIA041 [US2001016336 (А1)], HLYAZ61 [ЕР0837128 (А2)], HUVCT36 [US5912335 (А)], Н7ТВА62 [US5955309 (A)], orglO [US2003162945 (Al)], orgl l [WO0200725 (A2)] а также относящиеся к семейству IGS4 [AU779993 (В2), US6998255 (В1)]. Известны варианты сплайсированного рецептора G- белка, индуцированного вирусом Эпштейна-Барр EBI 3 [US5874252 (А)].
Известны способы лечения боли, обусловленной раком кости, остеоартритом, послеоперационной боли путем введения антагониста фактора роста нервов (антитела) [RU2389509 С2, RU2429013 С2, RU 2338555 С2], известны партнеры специфического связывания с данной молекулой [RU 2406728 С2]. Показано, что молекулы, способные ингибировать связывание между NGF и рецептором TrkA, можно использовать в качестве анальгетиков с пролонгированным эффектом [RU 2427387 С2]. Известны и антитела против фактора роста нервов, обладающие повышенной стабильностью in vivo [RU 201 1149263 А], высокой аффинностью к NGF [RU 2473564 С2], и лекарственная форма препарата гуманизированного антитела против фактора роста нервной ткани [RU 2427387 С2].
Известны способы лечения:
- боли и воспаления, с использованием пептида [RU 2011 105280 А], разделением взаимодействия CRMP-2 и CaV2.2, в результате чего не происходит активация кальциевого канала Ν-типа (CaV2.2) [WO2012009075 (Al)], а разделением взаимодействия LI-CAM, анкирина и потенциалзависимых кальциевых каналов лечат повреждение аксонов, ингибируют выброс нейромедиатора и передачу боли и блокируют кальциевую помпу в нейронах [US7737250 (В2)], известен аналог пептидного токсина натриевых каналов Navl.7 для анальгезии [US2013296247 (А1)].
- боли и воспаления в нейронной ткани с применением антагонистов IL-31, гуманизированного моноклонального антитела или химерного антитела [RU 2440130 С2], простатической кислой фосфатазы ("РАР"), ее активного варианта, фрагмента или производного [WO2009064497 (А1)],
- невропатической боли с использованием антител против CCR2 [RU 201 1 1 10169 А], нейропатической боли с применением пептидов, являющихся производными просапонина [RU 2007119313 А], пептида, содержащего аминокислотную последовательность Thr-Rl-Lue-Ile-Asp-Asn-Asn-Ala-Thr-Glu-Glu-Ile-Leu-Tyr, где R1 является D-аланином, оказывающего воздействие на нейродегенеративное нарушение или нарушение миелинизации [RU 2266129 С2], белков с доменом цинковые пальцы, связанным с регуляторным доменом, которые способны активировать, либо подавлять 15 000756
экспрессию целевого гена, связанного с нейропатической болью (VR1, NaV1.8, и TrkA) [US8466267 (В2)].
- невропатической или центральной сенсибилизационной боли, с использованием последовательности выделенного гена, который регулируется в спинном мозге млекопитающего в ответ на механистически различные первую и вторую модели невропатической или центральной сенсибилизационной боли [US2003108906 (А1), US2003134301 (А1), US2003138803 (А1), US2004058326 (А1)],
- хронической боли с использованием полипептидов TORC [RU 981 18091 А], гистогранина и его химически стабильного аналога [СА2219437 (А1)], линейных, циклических гистограниновых пептидов и псевдопептидов на их основе [US6566327 (В1)], гибридного белка, содержащего IL-10 и IL-4 [WO2013070076 (А1)], полипептидов на основе IL-10 [US7261882 (В2)],
- острой и хронической боли (различных форм боли) с использованием IL-13- связывающих белков [RU 2472807 С2], 1Ь-12/р40-связывающих белков [RU 2012124438 A], IL-12/p41 -связывающих белков [RU 2008103312 А], IL-17-связывающих белков [RU 201 1 140335 А], простогландин Е2-связывающих белков [RU 2011 104228 А], иммуноглобулинов с двойным вариабельным доменом [RU 2515108 С2], иммуноглобулинов с двойным вариабельным доменом против простогландина Е2 [RU 201 1104348 А], борьбы с хроническими или острыми приступами боли с использованием ЕЕЗ-семейства белков [RU 20041 14989 А],
висцеральной боли с использованием полипептида, повышающего гуанилатциклазную активность рецепторов [RU2433133 (С2)],
- невропатической боли, остеоартритической боли, воспалительной боли с использованием IL-1 -связывающих белков [RU 2012154210 А], воспалительных процессов артрита и других TNF-a опосредованных нарушений или патофизиологических механизмов, в частности различных форм боли, с применением стабильных и растворимых антител - ингибиторов TNF-a [RU 2415151 С2], боли при артрите, с применением гуманизированного антитела-антагониста CGRP [RU 2467765 С2], боли, индуцированной по меньшей мере одним противораковым агентом, с применением как минимум одного ботулинического токсина или пептида на его основе [RU 2483747 С2], в том числе совместно с опиатным производным [RU 2434637 С2], боли с применением РАМ, ассоциированного с Мус белком [RU 2345785 С2], с применением подобного рецептору галанина GPCR полипептида [US2004053244 (Al), US20030731 15 (Al), WOO 168843 (Al)], контулакина-G и его дегликозилированной формы [US6696408 (Bl), US6525021 (Bl)], с применением пептидных ингибиторов протеинкиназы С [US7939493 (В2)], висцеральной боли путем введения антител-антагонистов, направленных против пептида, связанного с геном кальцитонина [RU 2012106468 А],
- боли в животе, с применением пептидов предпочтительно из Lactobacillus rhamnosus [RU 201 1 136454 А].
Известны способы снижения болевой чувствительности при физиологических и патофизиологических условиях (например, при аллодинии и гипералгезии), особенно восприятия боли, которая связана или опосредована механической чувствительностью через TRPA1, с использованием антагонистических антител TRPA1, предпочтительно моноклональных антител [RU 2430750 С2]. Известны противоболевые/ противовоспалительные агенты, выбранные из следующих классов антагонистов рецепторов, агонистов рецепторов и ингибиторов ферментов, каждый класс, действующий по различным молекулярным механизмам действия на боль и подавления воспаления: (4) антагонисты брадикининового рецептора (пептиды), антагонисты кальцитонин-ген опосредованного пептидного (CGRP) рецептора (альфа-СОКР-(8-37), (8) антагонисты интерлейкинового рецептора (Lys-D-Pro-Thr) [RU 2180852 С2], белка бета-целлюлина (ВТС) [JP2000198744 (А)]. Известны способы уменьшения боли при модулируемом CRF2R расстройстве с использованием агонистов рецептора кортикотропин-рилизинг фактора (CRF 2R) [RU 2385878 С2], лечения боли с использованием пептида, обладающего свойствами амилина [RU 2385878 С2], пептидного агониста NOP [RU 2012106820 А], пептидов, содержащих два и более аминокислотных остатка фрагмента 1 1-28 вазоактивного интестинального пептида (VIP), доставляемых в ЦНС [W09104041 (А1)], производного пептида на основе кальцитонина [US5446026A], полипептидов человека CGRP-RCF [US5710024 (A), WO9803534 (А1)], полипептидов - гуманизированных рецепторов CGRP, в том числе для лечения головной боли, хронической головной боли от напряжения, сильной приступообразной головной боли с периодическими рецидивами, профилактики мигреней [US7193070 (В2)], полипептидов - новых сплайсированных вариантов l lcb человека [US6033872 (А)], агонистов и антагонистов последнего белка [W09928492 (А1)], рецепторов с семью трансмембранными доменами [US5824504 (A), US6277960 (Bl), US6277977 (В1), US5955308 (A), US6221627 (B l), US2002106766 (Al), US5994098 (A), US6174994 (B l ), US6037146 (A), US5874243 (А)], пептида, имеющего фосфодиэстеразную активность [WOO 166716 (Al)], полипептидов - человеческих протеин- киназ hYAK3 и HOACF72 [ЕР0870825 (В1) и US5972606 (А), соответственно].
Известен гибридный белок на основе нейротрофического фактора головного мозга, получаемый с использованием прокариотической системы экспрессии растворимого белка [CN1978466 (В), WO9942480 (А1)]. Известны полипептиды на основе рецептора нейротензина типа 2 для лечения боли [US6008050 (А)]. Известен конъюгат нейротензина или его аналогов с терапевтическим пептидом, который может быть использован для индукции гипотермии или анальгезии [WO2010063122 (А1 )]. Известны конформационно оптимизированные аналоги альфа-меланотропина, оказывающие специфическое воздействие на ЦНС [US4649191 (А)]. Известен синтетический пептид, модулирующий выброс нейротрансмиттера, сходный со SNARE [KR20090041066 (А)].
Известны пептиды, обладающие множеством функций, в том числе анальгезией, такие как пептиды с большим количеством мостиковых связей, выделяемые из Actinomadura namibiensis [RU 2010144778 А], пептид структуры
DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD [RU 2508296 С2], пептидный модулятор пуринергических рецепторов РТ1 [RU 2422459 С1], дипептиды, содержащие на Ν-концевом аминокислотном остатке 2-тиоацильную группу, в качестве ингибиторов вазопептидазы [RU 2298559 С2], тимус-специфический белок [RU 2398776 С2], полипептид, улучшающий метаболизм кальция [JPH03178993 (А)], а также пролекарственные композиции с высокой степенью проникновения на основе пептидов и родственных пептидам соединений [RU 201 1 149796 А].
Известен комбинированный подход к анальгезии - с использованием синергического сочетания селективного ингибитора нейронального транспортера норадреналина и анальгезирующего средства в терапевтическом лечении позвоночных животных, включая человека, для обезболивания или для профилактики или облегчения боли [US 8188048 В2]. Известны пептиды-аналоги динорфина, которые при совместном введении с наркотическими или анальгетическими средствами усиливают действие последних, в том числе энкефалинов и аналогов бета-эндорфина [ЕР0096592В1 ].
Известны способы увеличения фармакологической активности веществ при оральном и парентеральном введении композиций, с использованием пептида Tyr-Gly- Gly-Phe-Met, связанного с группой-переносчиком, формирующего таким образом предшественник лекарства, используемый в том числе для лечения или облегчения боли [AU2002228260 (В2)].
Использование одного высокоэффективного агента для анальгезии, простого и дешевого в производстве, является более выгодным вариантом.
Известно использование пептида дефенсина Нпр-1, одного или в комбинации с нейропептидом М, в качестве терапевтического агента, для профилактики и/или лечения в том числе периферических сосудистых заболеваний, включая анестезию, распространяющуюся боль, каузалгию (жгучая боль) [WO 2009/043461 А1].
Использование молекул белковой природы, которые не задумывались в качестве индукторов иммунного ответа, в том числе антительного, может быть осложнено именно этими последствиями, что может привести к побочным эффектам, например, связанным с формированием аутоантител.
Известно использование малой интерферирующей РНК, а также короткой шпилечной РНК для генного нокдауна субъединицы NR1 подкожного рецептора Ν-метил- D-аспартата для снижения воспалительной боли или невыносимой хронической боли, в особенности клинической хронической боли и боли при ожогах [US8372817 (В2), US8575330 (В2), US8361985 (В2)]. Известен РНК-интерферирующий агент для лечения хронической боли [WO2013126963 (А1)]. Однако препараты РНК довольно быстро разрушаются вне организма, также требуются специальные условия хранения, что ставит промышленную применимость препаратов на основе РНК под вопрос.
Известен способ длительной анальгезии, по которому пациенту вводят миогенные клетки, в которых с соответствующей ДНК синтезируется пептид, активирующий опиоидный рецептор, либо опосредующий связывание субстанции Р с рецептором [US7166279 (В2)]. Однако осуществление данного способа довольно сложное и связано со многими рисками.
Известны методы лечения депрессии и боли, агентом может быть белок, РНК или ДНК [WO2013177484 (А1)]. Известны лентивирусные векторы для лечения боли, содержащие G-белок вируса бешенства [ЕР1425403 (В1)], а также аденовирус, кодирующий IL-24 [CN101518655 (А)], в том числе для облегчения боли при раке. Известен онкостатин М, либо его гомолог, синтезирующиеся с вектора для переноса генов: лентивируса, ретровируса, вируса Сендай, аденовируса и адено-ассоциированного вируса, в том числе для лечения боли [JP4803789 (В2)]. Известно лечение аллодинии, гипералгезии, спонтанных болей и фантомных болей с использованием кометина - полипептида, который может быть доставлен как полипептид, либо введением экспрессионного вектора для экспрессии кометина, клеточная линия, трансформированная, либо трансфецированная данным белком и капсула, содержащая указанные клетки [WO2013034157 (А1)]. Вирусные векторы имеют ряд недостатков, в их числе то, что они дорогостоящи и могут вызывать воспалительную реакцию, что исключает повторное введение вектора. Также вирусные вектора обладают способностью реплицироваться, что снижает степень контроля над экспрессией таргетного белка, что, в свою очередь, не всегда желательно и применимо, в особенности в отношении анальгезии.
Известна рекомбинантная ДНК-вакцина на основе вектора pVAXl , нацеливающегося на опухоль, в том числе для лечения боли при онкологии, содержащего ген, кодирующий циклооксигеназу-2 (СОХ-2), мышиный убиквитин Mubi, а также ISS иммуностимулирующие последовательности ДНК (pVAX l-mUbi-ISS-COX-2-ISS) [CN 101648011 (А)]. Однако данная конструкция нацелена вызвать иммунный ответ на нее, цитотоксический, для чего в нее введены элементы, обуславливающие и усиливающие иммуногенность. Известна в том числе фармацевтическая композиция, в которой содержится вектор, в том числе плазмидная ДНК, и фармацевтически приемлемый эксципиент, либо адъювант, для облегчения, профилактики или лечения боли, вектор содержит нуклеотидную последовательность, содержащую хотя бы одну область, модулирующую экспрессию рецептора VR1 [US2006154886 (А1)]. В данном случае анальгезия осуществляется через блокирование рецептора, связанного с ионным каналом - неспецифическим проводником катионов. Использование плазмидной ДНК, несущей ген, с которого в клетках млекопитающих синтезируется дефенсин, в качестве средства, индуцирующего анальгезию, позволит также минимизировать возможность развития патогенов в организме: как правило, при болях любой этиологии ухудшается самочувствие и уменьшается способность организма противостоять инфекциям, в результате, после, например, оперативного вмешательства, могут назначать антибиотики, а использование природного противомикробного пептида позволит объединить и анальгезию, и защитный эффект, в результате, можно отказаться от приема антибиотиков. Близкими аналогами предлагаемого изобретения являются изобретения, описанные в патенте CN10164801 1 (А) и заявке на изобретение US2006154886 (А1), в которых раскрыты анальгетики в форме плазмидной ДНК.
Показано, что при внутримышечном введении экспрессионного ДНК вектора он поглощается мышечными клетками, и происходит экспрессия белка, закодированного в вводимом векторе [J.A. Wolff et al., Science 247, 1465 (1990); G. Ascadi et al., Nature 352, 815 (1991)]. Показано, что плазмиды поддерживаются в виде эписомы и не реплицируются. Постоянная экспрессия была продемонстрирована после внутримышечной инъекции также в скелетные мышцы крыс, рыб и приматов, а также сердечную мышцу крыс [Н. Lin et al, Circulation 82, 2217 (1990); R.N. Kitsis et al, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 88, 4138 (1991); E. Hansen et. al, FEBS Lett. 290, 73 (1991); S. Jiao et al., Hum. Gene Therapy 3, 21 (1992); J.A. Wolff et al, Human Mol. Genet. 1 ,363 (1992)]. Возможно и использование иных технологий доставки плазмидной ДНК в клетки различных тканей, например, безыгольного шприца, позволяющего осуществить доставку в клетки различных тканей живых животных [Furth et al., Analytical Biochemistry, 205, 365- 368, (1992)].
Показано, что в норме мышечные волокна не экспрессируют антигены МНС, однако при воспалении, связанном с инфекцией, или в присутствии интерферона гамма мышечные волокна способны продуцировать антигены в составе комплекса с МНС первого класса, либо даже второго класса [MECKERT, Р.С, HONTEBEYRIE-JOSKOWICZ, М., СНАМВО, J., LEVIN, М., and LAGUENS, R.P. (1991 ). Trypanosoma cruzi: Aberrant expression of class II major histocompatibility complex molecules in skeletal and heart muscle cells of chronically infected mice. Exp. Parasitol. 72, 8-14; Hohlfeld and ENGEL, A.G. (1984) The immunobiology of muscle. Immunol. Today 15, 269-274.; MANTEGAZZA, R., and BERNASCONI, P. (1994). Cellular aspects of myositis. Curr. Opin. Rheumatol. 6, 568-574, Hartikka J, Sawdey M, Cornefert- Jensen F, Margalith M, Barnhart K, Nolasco M, Vahlsing HL, Meek J, Marquet M, Hobart P, Norman J, Manthorpe M. An improved plasmid DNA expression vector for direct injection into skeletal muscle. Hum Gene Ther. 1996 Jun 20;7(10): 1205-17], в связи с чем предпочтительным является введение плазмидной ДНК, при котором травмирование мышечной ткани минимизировано.
Показано, что даже при иммуногенности в испытаниях на лабораторных животных у человека препараты на основе плазмидной ДНК не являются иммуногенными [Saade F, Petrovsky N. Technologies for enhanced efficacy of DNA vaccines. Expert Rev Vaccines. 2012 Feb; 11(2): 189-209. doi: 10.1586/erv.l 1.188]. Исследователям также не удалось найти доказательства патологических изменений после повторных инъекций ДНК у мышей или кроликов [Parker SE, Borellini F, Wenk ML, et al. Plasmid DNA malaria vaccine: tissue distribution and safety studies in mice and rabbits. Hum. Gene Ther. 1999;10(5):741— 758.]. В 2007 году в руководстве FDA США по ДНК-вакцинам пришли к выводу, что доклинические исследования не требуются для оценки эффекта в отношении аутоиммунных заболеваний.
Плазмидная ДНК должна содержать существенные для организмов ее поддержания и использования элементы, вкупе с соответствующими регуляторными последовательностями. Регуляторные последовательности - нуклеотидные последовательности, способные повлиять на экспрессию гена на уровне транскрипции и/или трансляции, а также на механизмы, обеспечивающие существование и поддержание функционирования плазмидной ДНК.
Существенными для прокариотической системы являются ориджин репликации и репортерный ген. Бактериальные элементы плазмидной ДНК не должны отрицательно влиять на экспрессию в клетках млекопитающих и обуславливать побочный эффект от применения плазмидной ДНК. В литературе имеются данные о том, что использование гена устойчивости к ампициллину в качестве репортерного гена может быть нежелательным в связи с развитием реакции у пациентов на ампициллин, однако авторы считают такие последствия связанными с низким качеством очистки плазмидной ДНК, но не самим элементом.
Существенными элементами плазмид для использования у млекопитающих являются промотор, лидерная последовательность мРНК, терминирующая последовательность.
Промотор является важным компонентом плазмиды, который запускает экспрессию интересующего гена. Классические промоторы для плазмидных ДНК- компонентов препаратов - это CMV человека/ немедленно-ранний или CMV-chicken-β actin (CAGG) промотор. Промоторы CMV используется для большинства ДНК-вакцин, так как они опосредуют высокие уровни конститутивной экспрессии в широком диапазоне тканей млекопитающих [Manthorpe М, Cornefert-Jensen F, Hartikka J, et al. Gene therapy by intramuscular injection of plasmid DNA: studies on firefly luciferase gene expression in mice. Hum. Gene Ther. 1993 ;4(4) :419—431 ] и не подавляют прочитывание downstream. Увеличение уровня экспрессии наблюдают при изменении CMV промотора, например, включением HTLV-1R-U5 downstream от промотора цитомегаловируса или при использовании химерного SV40-CMV промотора [Williams JA, Carnes АЕ, Hodgson СР. Plasmid DNA vaccine vector design: impact on efficacy, safety and upstream production. Biotechnol. Adv. 2009;27(4):353-370]. Альтернативой CMV промоторам служат тканеспецифические промоторы хозяина, которые позволяют избежать конститутивной экспрессии антигенов в неподходящих тканях, что в целом приводит к снижению иммуногенности [Cazeaux N, Bennasser Y, Vidal PL, Li Z, Paulin D, Bahraoui E. Comparative study of immune responses induced after immunization with plasmids encoding the HlV-1 Nef protein under the control of the CMV-IE or the muscle-specific desmin promoter. Vaccine. 2002;20(27-28):3322-3331].
Лидерная последовательность мРНК также играет большую роль. Последовательность Козака непосредственно перед стартовым кодоном ATG позволяет увеличить экспрессию [Kozak М. Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in positions +5 and +6. EMBO J. 1997;16(9):2482-2492]. Наличие интрона в плазмиде downstream от промотора может повысить стабильность мРНК и увеличить экспрессию гена.
Использование видоспецифичных кодонов позволяет увеличить экспрессию гена [Frelin L, Ahlen G, Alheim M, et al. Codon optimization and mRNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis С virus nonstructural 3/4A gene. Gene Ther. 2004;l l(6):522-533].
На экспрессию генов можно повлиять путем изменения терминирующей последовательности, которая необходима для сохранения стабильности мРНК, надлежащего прекращения транскрипции и экспорта мРНК из ядра, в том числе ее укорачиванием. Во многих современных ДНК-вакцинах используют последовательность терминатора транскрипции бычьего гормона роста [Montgomery DL, Shiver JW, Leander KR, et al. Heterologous and homologous protection against influenza A by DNA vaccination: optimization of DNA vectors. DNA Cell Biol. 1993 ; 12(9):777— 783] . Полиаденилирование (полиА) необходимо для стабилизации транскрипта. Изменение последовательности полиА может привести к увеличению уровня экспрессии гена [Norman JA, Hobart Р, Manthorpe М, Feigner Р, Wheeler С. Development of improved vectors for DNA-based immunization and other gene therapy applications. Vaccine. 1997;15(8):801-803]. В плазмиде pVAXl (Invitrogen, Carlsbad, CA) область терминатора бычьего гормона роста содержит область гомопурина, которая чувствительна к нуклеазе. Показано, что альтернативная полиА последовательность может значительно улучшить стабильность плазмиды к нуклеазе [Azzoni AR, Ribeiro SC, Monteiro GA, Prazeres DMF. The impact of polyadenylation signals on plasmid nuclease-resistance and transgene expression. J Gene Med. 2007;9:392^102]. Введение двух стоп-кодонов позволяет увеличить эффективность терминатора транскрипции.
Оптимальная конструкция плазмиды для осуществления назначения должна объединять «бактериальные» и «эукариотические» элементы, с соответствующими регуляторными последовательностями, чтобы обеспечить высокую копийность в процессе производства и высокий уровень экспрессии у млекопитающих [Saade F, Petrovsky N. Technologies for enhanced efficacy of DNA vaccines. Expert Rev Vaccines. 2012 Feb; 1 1 (2): 189-209. doi: 10.1586/erv.1 1.188].
Для создания анальгетического средства по настоящему изобретению можно использовать плазмидную ДНК, как минимум, стандартно применяющуюся для доставки генов и их экспрессии в организме млекопитающего, в том числе человека, а также оптимизированную по вышеперечисленным параметрам, в том числе подробно описанным в статье Williams et al., 2009 [Williams JA, Carnes AE, Hodgson CP. Plasmid DNA vaccine vector design: impact on efficacy, safety and upstream production. Biotechnol. Adv. 2009;27(4):353-370]. В руководстве FDA (2007) заявлено, что исследования биораспределения вещества после его введения в организм могут быть отменены для ДНК-вакцин, производимых клонированием нового гена в плазмидный вектор, в отношении которого ранее документально установлено приемлемые биораспределение и профиль интеграции. В руководстве ВОЗ (2007) заявлено, что исследования биологического распределения и сохранения требуются, если еще не имеется значительный опыт работы с почти идентичным или аналогичным продуктом. В руководстве ЕМЕА (2006) заявлено, что опыт работы с векторной системой позволит оптимизировать и сфокусироваться на доклинических исследованиях. Исследования по безопасности с использованием ДНК-векторов с различными клонированными генами продемонстрировали аналогичное биораспределение [Sheets RL, Stein J, Manetz TS, Duffy C, Nason M, Andrews C, Kong WP, Nabel GJ, Gomez PL. Biodistribution of DNA plasmid vaccines against HIV-1 , Ebola, Severe Acute Respiratory Syndrome, or West Nile virus is similar, without integration, despite differing plasmid backbones or gene inserts. Sheets RL, Stein J, Manetz TS, Duffy C, Nason M, Andrews C, Kong WP, Nabel GJ, Gomez PL.Toxicol Sci. 2006 Jun;91(2):610-9. Epub 2006 Mar 28.] и токсикологию [Sheets RL, Stein J, Manetz TS, Andrews C, Bailer R, Rathmann J, Gomez PL. Toxicological safety evaluation of DNA plasmid vaccines against HIV-1 , Ebola, Severe Acute Respiratory Syndrome, or West Nile virus is similar despite differing plasmid backbones or gene-inserts. Toxicol Sci. 2006 Jun;91(2):620- 30. Epub 2006 Mar 28]. Для плазмидной ДНК для применения у млекопитающих, кроме человека, требования менее строгие, в связи с чем возможно использование более широкого спектра плазмид.
Для ДНК, предназначенной для использования человеком, может быть полезно иметь конечный продукт ДНК в фармацевтически приемлемом носителе или буферном растворе. Фармацевтически приемлемые носители или буферные растворы известны из уровня техники и включают те, которые описаны в различных текстах, таких как, например, Remington's Pharmaceutical Sciences.
Прототипом вариантов изобретения является изобретение, раскрытое в заявке на изобретение WO 2009/043461 А1 : применение дефенсина HNP-1 для лечения в том числе боли.
Дефенсины составляют большое семейство низкомолекулярных (3-5-кДа) цистеин- богатых катионных пептидов, стабилизированных несколькими (как правило, тремя) дисульфидными связями [Ganz, Т. 2002. Immunology: Versatile defensins. Science 298: 977- 979, Lehrer, R.I. and Ganz, T. 2002. Defensins of vertebrate animals. Curr. Opin. Immunol. 14: 96-102.], которые способны к киллингу широкого спектра патогенов, включая разнообразные бактерии, грибы, а также оболочечные вирусы. У человека это семейство представлено α-субсемейством (HNP) и β-субсемейством (hBD) дефенсинов. Альфа- дефенсины наиболее представлены в нейтрофилах и клетках Панета. HNP-1 и HNP-3 содержат в своем составе всего 30 аминокислотных остатков, эти пептиды идентичны друг другу за исключением замены аланина на аспарагин в положении 1. HNP-2 - протеолитический продукт HNP-1 и HNP-3, содержит 29 аминокислотных остатков (отсутствует первая аминокислота с Ν-конца). Наличие дисульфидных связей обеспечивает сохранение устойчивости молекул дефенсинов к многочисленным лейкоцитарным и микробным протеиназам и сохранение антибиотических свойств в очаге воспаления и тканевой деструкции [Levy О. Antimicrobial proteins and peptides: anti- infective molecules of mammalian leukocytes. J. of Leukocyte Biology.2004; 76: 909-926]. Получение данных молекул правильной пространственной структуры является довольно сложной задачей.
Гены, кодирующие дефенсины, образуют кластер в локусе р22-23 на 8 хромосоме. HNP 1-3 кодируются двумя генами HDEFA1 и HDEFA3. Каждый ген дефенсинов содержит несколько экзонов, которые кодируют препропептид.
Вначале дефенсины синтезируются в виде предшественников, как препропептиды, длина которых составляет 94 аминокислотных остатка. Препропептиды содержат сигнальный участок (в среднем 19 аминокислотных остатков), анионный участок (в среднем 45 аминокислотных остатков) и собственно «зрелый» пептид. В результате протеолитического отщепления в эндоплазматическом ретикулуме от препропептида происходит удаление сигнального участка и образование продефенсина (в среднем 75 аминокислотных остатков). Последующее созревание (отщепление 45 аминокислотных) остатков происходит в зрелых гранулах нейтрофилов. α-Дефенсины обнаружены также в NK клетках, В-лимфоцитах, γδ Т-лимфоцитах, моноцитах/макрофагах и эпителиальных клетках [А.С.Будихина, Б.В.Пинегин. Дефенсины - мультифункциональные катионные пептиды человека. Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2008, Ν°2:31-40]. Авторами настоящего изобретения впервые продемонстрировано, что введение плазмидной ДНК, несущей ген, кодирующий ΗΝΡ-1/ ΗΝΡ-2/ ΗΝΡ-3, приводит к анальгезии, причем при этом наблюдали увеличение уровня бета-эндорфина в сыворотке.
Недостатки аналогов и прототипа приведены непосредственно после их описания. Заявленное изобретение (варианты) свободно от этих недостатков.
Технический результат от использования вариантов изобретения выражается, во- первых, в расширении спектра анальгетических средств. При плохой переносимости или непереносимости аналогов представитель предложенных вариантов анальгетика позволит осуществить анальгезию, за счет чего пациент получит возможность осуществить действия, которые не мог, либо не хотел осуществить без анальгезии, например, решиться на требуемую процедуру, а также улучшит качество жизни, например, получит меньше неприятных ощущений, чем без использования анальгетика, либо сможет облегчить острую, либо хроническую боль. Указанный технический результат достигается тем, что используют анальгетик по настоящему изобретению (варианты). Кроме того, технический результат заключается в увеличении длительности анальгезии и достигается тем, что используют плазмидную ДНК, с которой после введения в организм синтезируется альфа дефенсин человека HNP-1 HNP-2/HNP-3; а также тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая дефенсин человека, содержит элементы, обуславливающие стабильность мРНК и, соответственно, увеличивающие время полужизни мРНК, в результате синтез белка с одной молекулы мРНК осуществляется большее количество раз, а также в результате увеличивается количество синтезируемого белка; а также тем, что нуклеотидная последовательность альфа дефенсина человека кодонно оптимизирована для экспрессии в млекопитающих, в результате синтез белка идет интенсивнее. При внедрении в практику это позволит существенно снизить количество вводимой плазмидной ДНК (в 10-50 раз), по сравнению с дозами, используемыми в настоящее время в отечественной и мировой практике при генной терапии.
Помимо этого, технический результат заключается в увеличении безопасности анальгезии. Указанный технический результат достигается тем, что в качестве действующего вещества используется не белок, на который могут образоваться антитела, что при применении молекулы, используемой в организме ее происхождения, может вызвать серьезные побочные эффекты, а плазмидная ДНК, которая существует в виде эписомы и не интегрирует в геном, с которой синтезируется и затем секретируется из клетки белок человека, в результате осуществляется неиммуногенное, безопасное использование дефенсина человека для анальгезии. Указанный технический результат также достигается тем, что синтезируемый в организме с плазмидной ДНК белок подвергается естественному посттрансляционному процессингу, а также обеспечивается правильный фолдинг белка за счет клеточных шаперонов. Данные модификации труднодостижимы при производстве белков, что может драматически сказаться на ряде их функций. Указанный технический результат также достигается за счет того, что используются природные механизмы метаболизма и катаболизма действующего вещества, без образования токсичных продуктов, благодаря естественной природе плазмидной конструкции и кодируемого ею белка, а также идентичности образуемого белка эндогенному аналогу. Указанный технический результат также достигается тем, что плазмидная ДНК не реплицируется после введения в организм млекопитающего, что позволяет осуществлять контроль над количеством синтезируемого белка, и, соответственно, над анальгезией. Указанный технический результат достигается и за счет наличия в плазмидной ДНК таких регуляторных последовательностей, как сайленсер и/или инсулятор, в одном из вариантов изобретения, благодаря чему также осуществляется контроль над количеством синтезируемого белка, и, в принципе, синтезом белка, как таковым, и, соответственно, над анальгезией: при необходимости есть возможность в быстрый срок остановить, либо уменьшить экспрессию гена. В последнем варианте возможно и осуществление тканеспецифической экспрессии при необходимости.
Технический результат также заключается в упрощении и удешевлении производства анальгетика за счет избегания сложностей производства и процессов очистки белковых препаратов in vitro, благодаря тому, что синтез белка происходит in vivo. Производство, очистка и хранение ДНК препаратов экономически выгоднее, чем белковых, так как первые более стабильны, их можно нарабатывать в больших количествах и с меньшими затратами.
Показано, что изменение концентрации бета-эндорфина в плазме крови находится в прямой зависимости от вида болевого синдрома, его интенсивности и эффективности анальгезии, что может служить критерием оценки эффективности обезболивания [Бета- эндорфин - маркер эффективности обезболивания при острой боли и хроническом болевом синдроме у онкологических больных / 3. В. Павлова [и др.] // Проблемы клинической медицины .— 2007 .— N 1 .— С. 36-40 .— ISSN 1817-8359]. При введении анальгетика по настоящему изобретению наблюдали увеличение уровня бета-эндорфина в сыворотке (Фиг.З).
По временным характеристикам можно выделить два типа боли:
- острую боль - новую, недавнюю боль, неразрывно связанную с вызвавшим ее повреждением и, как правило, являющуюся симптомом какого-либо заболевания, исчезает при устранении повреждения [Eddy N.B., Leimbach D. J. // Pharmacol Exp Ther.— Mar; 107(3):385-93.— 1953] (в том числе пред- и послеоперационная, посттравматическая, при ожогах, острая боль во время рождения ребенка, боль, вызванная травмой спинного мозга, острая головная боль, боль при ВИЧ/СПИДе, кризисе серповидных клеток, при невралгии тройничного нерва, панкреатите и других болях в ЖКТ, при инфаркте миокарда и других крупных сердечных событиях, интервенционная боль (при диагностических и терапевтических процедурах), острая при хронической боли [WHO Normative Guidelines on Pain Management, Geneva June 2007], которая длится до 2-3 месяцев, причем может иррадиировать, и
- хроническую боль - продолжающуюся длительный период времени (свыше 2-3 месяцев) даже после устранения причины, ее вызвавшей, часто приобретает статус самостоятельной болезни, например, воспалительного процесса [Eddy N.B., Leimbach D. J. // Pharmacol Exp Ther.— Mar; 107(3):385-93.— 1953], причем наблюдается снижение эффективности анальгетиков. К хронической боли можно отнести хроническую боль при злокачественной болезни (включая боль у больных раком, ВИЧ/СПИД, при боковом амиотрофическом склерозе (ALS), рассеянном склерозе, при конечной стадии отказа органа, расширенной хронической обструктивной болезни легких, расширенной застойной сердечной недостаточности, паркинсонизме) и хроническую боль, не связанную со злокачественной болезнью (хронические скелетно-мышечные боли, такие как спинная боль или боли в пояснице, при хроническом дегенеративном артрите, остеоартрите, ревматоидном артрите, миофасциальная и ревматическая боли, хроническая головная боль, мигрень, боли в костях; невропатические боли (в том числе боли при нервных сжатиях, травмах, боли после повреждения нерва и ампутации), при диабетической невропатии, сложные региональные болевые синдромы (тип I и тип II), при спазмах скелетных мышц, при постгерпетической невралгии, хронические боли после хирургических вмешательств; висцеральная боль (при растяжении полости внутренностей и коликах); и хроническая боль при серповидно-клеточной анемии [WHO Normative Guidelines on Pain Management, Geneva June 2007].
С использованием настоящего анальгетика возможно облегчить и нивелировать оба описанных типа боли. Как видно из уровня техники, плазмидный анальгетик, с которого в клетках млекопитающих синтезируется альфа дефенсин человека, неизвестен. Множественность и характер элементов плазмидной ДНК требуют уточняющих характеристик. Произведенная характеристика изобретения, в части «сущность изобретения», в части «подробное описание изобретение», поясняет «формулу изобретения» и включает подробное описание существенных элементов плазмидной ДНК, что позволяет осуществить изобретение во всех представленных вариантах, за счет чего достигается описанный технический результат. Сущность изобретения
Предложена плазмидная ДНК для транзиентной экспрессии в клетках млекопитающих, представленная остовом, содержащим прокариотические элементы, ориджин репликации и репортерный ген, и эукариотические элементы, сильный промотор, лидерную последовательность мРНК, а также регуляторные последовательности для указанных элементов, сайт, предпочтительно сайты, для клонирования гена интереса и сайт для посадки праймера, предпочтительно, сайты для посадки праймеров, для анализа, и полинуклеотидом, представленным секреторной последовательностью, фрагментом, кодирующим альфа дефенсин человека HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3, кодонно оптимизированными для млекопитающих, и терминирующей последовательностью. В одном из вариантов изобретения препробелок представлен SEQ ID ΝΟ:1, либо SEQ ID NO:2, либо SEQ ID NO:7, либо SEQ ID NO:8. В одном из вариантов изобретения полинуклеотид представлен SEQ ID NO:3, либо SEQ ID NO:4, либо SEQ ID NO:5, либо SEQ ID NO:6, либо SEQ ID NO:9, либо SEQ ID NO: 10, либо SEQ ID NO:l 1, либо SEQ ID NO: 12.
Также предложены продуцент такой плазмидной ДНК на основе бактериальной клетки (варианты) и анальгетическое средство на основе такой плазмидной ДНК в эффективном количестве, также содержащее фармацевтически приемлемый эксципиент, для применения у млекопитающих, в частности, человека (варианты).
Подробное описание изобретения
Плазмидную ДНК экономически наиболее выгодно нарабатывать в прокариотических клетках, преимущественно бактериальных клетках. В связи с этим плазмидная ДНК по настоящему изобретению содержит элементы для поддержания и амплификации, преимущественно в больших количествах, в клетках бактерий. Такими существенными элементами являются бактериальные ориджин репликации, для поддержания в клетке со средней, предпочтительно высокой, копийностью, и репортерный ген для возможности селекции штамма-продуцента. Подходящий ориджин репликации представлен pMl (der.), ColEl (der.) и Fl , pUC и Fl, но не ограничивается ими. Подходящий репортерный ген представлен геном устойчивости к антибиотику, например, ампициллином, премущественно канамицином, но не ограничивается ими.
Плазмидная ДНК по настоящему изобретению содержит элементы для эффективного функционирования в клетках млекопитающих. Таким элементом является промотор с соответствующими регуляторными последовательностями из природных промоторов со своими регуляторными элементами (СаМ kinase II, CMV, nestin, L7, BDNF, NF, MBP, NSE, p-globin, GFAP, GAP43, тирозингидроксилаза, субъединица 1 каинатного рецептора и субъединица В глутаматного рецептора и другие), либо синтетических промоторов с регуляторными последовательностями, для получения необходимого характера экспрессии (соотношения продолжительности и уровня экспрессии) таргетного гена на уровне транскрипции.
Возможные регуляторные последовательности по отношению к промотору:
- энхансер, для увеличения уровня экспрессии через улучшение взаимодействия РНК-полимеразы и ДНК.
- инсулятор, для модулировании функций энхансера,
- сайленсеры, либо их фрагменты, для снижения уровня транскрипции, например, для тканеспецифической экспрессии,
- 5' нетранслируемая область до промотора, включая интрон.
Плазмидная ДНК по настоящему изобретению содержит от одной из вышеприведенных регуляторных последовательностей, в зависимости от варианта плазмидной ДНК, основанного на выборе промотора и желаемых параметрах экспрессии таргетного гена. Опираясь на существующий уровень техники, на известные и очевидные варианты таких элементов и их использования, плазмидная ДНК по настоящему изобретению может содержать любые отвечающие вышеуказанным условиям комбинации, при которых с плазмидной ДНК осуществляется синтез альфа дефенсина HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3 в клетках млекопитающих. При использовании сайленсера, либо инсулятора в составе конструкции возможно регулировать экспрессию таргетного гена, гена описанного альфа дефенсина человека HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3 (вариантов).
Иные регуляторные последовательности:
- нетранслируемая область downstream от промотора, включая интрон, для повышения стабильности мРНК и увеличения экспрессии таргетного гена.
Плазмидная ДНК по настоящему изобретению в одном из вариантов дополнительно содержит такой регуляторный элемент. Плазмидная ДНК по настоящему изобретению содержит и такой важный элемент, как лидерную последовательность мРНК, содержащую последовательность Козака непосредственно перед стартовым кодоном ATG.
Плазмидная ДНК также содержит сайт, преимущественно сайты, разные, для клонирования таргетного гена, для осуществления правильной ориентации таргетного гена в плазмидной ДНК, и сайт, преимущественно сайты, для посадки праймеров для его секвенирования.
Плазмидная ДНК также содержит терминирующую последовательность, содержащую последовательно стоп-кодон, 3" нетранслируемую область с сигналом и сайтом полиаденилирования, стоп-кодон, за счет которой сохраняется стабильность мРНК, и осуществляется надлежащее прекращение траскрипции и экспорт мРНК из ядра. Терминирующая последовательность представлена нативной, т.е. присущей таргетному гену, либо иной, более сильной, которая представлена, например, терминирующей последовательностью бычьего гормона роста (BGH), но ею не ограничивается, и во втором варианте может содержать дополнительный стоп-кодон перед 3' нетранслируемой областью. Опираясь на существующий уровень техники, на известные и очевидные варианты такого элемента, плазмидная ДНК по настоящему изобретению может содержать любую отвечающую вышеуказанным условиям терминирующую последовательность, при которой с плазмидной ДНК осуществляется синтез альфа дефенсина HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3 в клетках млекопитающих.
Плазмидная ДНК также содержит нативную, либо гетерологичную секреторную последовательность, кодонно оптимизированную для млекопитающих. В одном варианте изобретения содержит, например, секреторную последовательность ТРА (tissue-type plasminogen activator isoform 1 preproprotein [Homo sapiens], NCBI Reference Sequence: NP 000921.1), но ею не ограничивается. Преимущество использования секреторной последовательности ТРА - в обширном предшествующем клиническом опыте, а также в том, что показана ее высокая производительность в отношении экспрессии секретируемого белка с различных генов-мишеней.
Плазмидная ДНК содержит и фрагмент, кодирующий альфа дефенсин человека HNP-1 , либо HNP-2, либо HNP-3, кодонно оптимизированный для млекопитающих.
Кодонная оптимизация проведена для увеличения экспрессии таргетного гена за счет увеличения эффективности считывания информации с данной мРНК на рибосомах. Плазмидная ДНК также может дополнительно содержать исходные для кДНК указанных генов элементы, обуславливающие стабильность данной мРНК, такие как терминирующую последовательность (Зл нетранс л ируемая область, содержащая сигнал и сайт полиаденилирования, а также сигнал терминации транскрипции - стоп-кодон). Соответственно, в данном случае в остове плазмидной ДНК отсутствуют, либо не функционируют аналогичные элементы.
Плазмидная ДНК для доставки гена, обуславливающего анальгезию, сочетает в себе такие свойства ДНК-вакцины на основе плазмидной ДНК, как высокий уровень экспрессии гена интереса в клетках млекопитающих, и такие свойства вектора для генной терапии, как отсутствие иммуногенности и длительность экспрессии гена, однако, например, за счет увеличения стабильности мРНК. Такая ДНК не встраивается в геном и не реплицируется в клетках млекопитающих.
Подходящие векторы для экспрессии в клетках млекопитающих представлены известными среднему специалисту в данной области и описанными в литературе [Hartikka J, Sawdey М, Cornefert- Jensen F, Margalith M, Bamhart K, Nolasco M, Vahlsing HL, Meek J, Marquet M, Hobart P, Norman J, Manthorpe M. An improved plasmid DNA expression vector for direct injection into skeletal muscle. Hum Gene Ther. 1996 Jun 20;7(10): 1205-17 и др.], a также плазмидами, которые могут быть созданы средним специалистом в данной области с использованием рекомендаций по элементам векторов ["Cloning Vectors", ed. Pouwls et al., Elsevier, Amsterdam- New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018, Williams JA, Carnes AE, Hodgson CP. Plasmid DNA vaccine vector design: impact on efficacy, safety and upstream production. Biotechnol Adv. 2009 Jul-Aug;27(4):353-70. doi: 10.1016/j.biotechadv.2009.02.003. Epub 2009 Feb 20. Review и др.]. Предпочтительными плазмидными ДНК для использования у человека являются векторы, проверенные на людях, содержащие описанные выше элементы с соответствующими регуляторными последовательностями, возможно, модифицированные для соответствия заявленным критериям, что позволяет уменьшить количество требуемых исследований для регистрации средства. Однако возможно и использование иных плазмидных ДНК, содержащих требуемые описанные элементы.
Последовательность расположения описанных элементов в плазмидной ДНК понятна среднему специалисту в данной области. Предложен продуцент плазмидной ДНК на основе бактериальной клетки (на основе клеток, преимущественно, Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus, Pseudomonas, но не ограничиваясь ими). Среднему специалисту в данной области понятно, что, используя плазмидную ДНК согласно изобретению и бактериальную клетку, например, коммерческую, но ею не ограничиваясь, можно создать продуцент плазмидной ДНК, например, стандартными методами, например, трансфекцией, электропорацией или пушкой с частицами. Для уменьшения вероятности возникновения мутаций благодаря метилированию плазмидной ДНК предпочтительно использовать штамм микроорганизма, не содержащий метилазу в геноме.
Также предложено анальгетическое средство на основе охарактеризованной плазмидной ДНК, в эффективном количестве, также содержащее фармацевтически приемлемый эксципиент, для применения у млекопитающих, в частности, человека. Данная фармацевтическая композиция - для лечения, облегчения и/или профилактики боли, в частности острой или хронической боли, нарушений чувствительности.
Авторами настоящего изобретения проведены лабораторные исследования, подтверждающие возможность реализации группы охарактеризованных изобретений. Полученные результаты исследований проиллюстрированы примерами (1-3) и Фиг.1-3.
Краткое описание чертежей.
Фиг. 1. Результаты теста «горячая пластина». Ось абсцисс - латентное время облизывания передних и задних лап, ось ординат - время после введения исследуемого вещества. Легенда: 1 - отрицательный контроль (вводили физ. раствор), 2 - pVAXlseq3, 3 - pVR1012seq4, 4 - PVR1012seq5, 5 - pVAXl seq6, 6 - pVR1012seq9, 7 - pVAXlseqlO, 8 - pVAXl seql l, 9 - PVR1012seql2, 10 - pcDNA3.1+ seql l, 1 1 - pcDNA3.1+ (var)seql 2, 12 - анальгин (50 мг/кг), 13 - морфин гидрохлорид (10 мг/кг), 14 - pVAXl, 15 - pVR1012, 16 - pcDNA3.1+, 17 - pcDNA3.1+(var). Плазмидные ДНК вводили в количестве 5 мг/кг.
Фиг. 2. Результаты исследования различных доз плазмидной ДНК pVAXlseq3 в тесте «горячая пластина». Ось абсцисс - латентное время облизывания передних и задних лап, ось ординат - время после введения исследуемого вещества. Легенда: 1 - отрицательный контроль (вводили физ. раствор), 2 - pVAXlseq3 1 мг/кг, 3 - pVAXl seq3 5 мг/кг, 4 - pVAXlseq3 10 мг/кг, 6 - анальгин (50 мг/кг), 7 - морфин гидрохлорид (10 мг/кг).
Фиг. 3. Результаты исследования изменения концентрации бета-эндорфина в сыворотке мышей. Ось абсцисс - время после введения исследуемого вещества, ось ординат - концентрация бета-эндорфина в сыворотке. Легенда: 1 - отрицательный контроль (вводили физ. раствор), 2 - pVR1012, 3 - pVR1012seq4. Плазмидные ДНК вводили в количестве 5 мг/кг.
Пример 1. Получение плазмидныж ДНК, кодирующих альфа дефенсин HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3.
Осуществляли химический синтез ДНК, охарактеризованной SEQ ID NO:3 - SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:9 - SEQ ID NO: 12, дополнительно фланкированной сайтами рестрикции, с добавлением последовательности Козака. Для SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO: 10 использовали сайты рестрикции Nhel (5"), BamHI (3'), для SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:9 использовали сайты рестрикции Sail (5'), Kpnl (3Λ), для SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO: 12 использовали сайты рестрикции Sail (5"), BamHI (3 ), для SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO: l 1 использовали сайты рестрикции Nhel (5"), Apal (3Λ).
Осуществляли клонирование синтезированных генов в плазмиды pVAXl (Invitrogen) и pVR1012 (Vical). Также осуществили клонирование последовательности SEQ ID ΝΟ: 1 1 в вектор pcDNA3.1+ (Invitrogen) по сайтам рестрикции Nhel (5 ), Apal (3'). Также получили вектор pcDNA3.1+, неспособный к экспрессии неомицина, за счет рестрикции данного вектора рестриктазой Nsil, в области SV40 промотора (-71 п.о.). В полученный вектор клонировали SEQ ID NO: 12 по сайтам рестрикции Nhel (5'), Apal (3').
На реакцию лигирования брали 3 мкл раствора синтезированной ДНК, 1 мкл раствора готового вектора, 5 мкл буфера для лигирования х2 и 1 мкл Т4-лигазы. Реакцию проводили при +20°С в течение 2 часов.
После этого смесь прогревали при +95°С в течение 10 мин и очищали от солей диализом на нитроцелюлозных фильтрах с диаметром пор 0,025 мкм (Millipore, США). Диализ проводили против раствора, содержащего 0,5 мМ ЭДТА в 10% глицерине, в течение 10 мин.
Получили следующие плазмидные ДНК: pVAXl seq3, pVR1012seq4, pVR1012seq5, pVAXl seq6, pVR1012seq9, pVAXlseqlO, pVAXlseql l, pVR1012seql2, pcDNA3.1+ seql l , pcDNA3.1+ (var)seql2.
Затем трансформировали клетки E.coli штамма DH10B/R (F-mcrA, A(mrr-hsdRMS- mcrBC), (p80dlacZAM 15, AlacX74, deoR, recAl, endAl , araD139, A(ara,leu)769, galU, galK - , rpsL, nupG) полученными плазмидными ДНК методом электропорации с использованием электропоратора MicroPulser (BioRad). Данный штамм не содержит метилазу, что позволяет минимизировать возможность возникновения мутаций в ДНК, в том числе в клонированном в плазмиде, поддерживаемой в данном штамме, гене. К 12 мкл компетентных клеток добавляли 1 мкл диализованной лигазной смеси, помещали между электродами порационной ячейки и обрабатывали импульсом тока.
После трансформации клетки помещали в 1мл SOC-среды (2% бакто-триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2.5 мМ КС1, 10 мМ MgCh, 10 мМ MgS04, 20 мМ глюкоза) и инкубировали в течение 40 мин при +37°С.
Проводили выявление клонов клеток E.coli, содержащих полученную плазмидную ДНК, на селективной среде, содержащей LB-arap, 50 мкг/мл канамицина, либо ампициллина (для плазмидных ДНК на основе pcDNA3.1+).
Из выросших клонов выделяли плазмидную ДНК. Выделение плазмидной ДНК проводили с использованием набора Wizard Minipreps DNA Purification System (Promega, США). Очищенную рекомбинантную плазмидную ДНК проверяли с помощью секвенирования.
Секвенирование клонированных фрагментов проводили по методу Сэнджера с использованием набора Applied Biosystems BigDye® Terminator (BDT) v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) по прилагающейся к нему инструкции. Для мечения продуктов реакции использовали меченные флуоресцентным красителем ddNTP, причем каждому ddNTP соответствовал свой краситель. Для секвенирования использовали немеченные специфические для плазмид праймеры. Проводили ПЦР- реакцию, затем реакционную смесь очищали от свободных меченых ddNTP по инструкции к набору BigDye X-Terminator Purification Kit (Applied Biosystems, США) и разделяли продукты реакции секвенирования с использованием капиллярного секвенатора Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) и реактива 3500/3500xL Genetic Analyzer Polymer "POP-6™" (Applied Biosystems, США).
Результаты разделения продуктов реакции секвенирования регистрировались путем сканирования лазером и детекции четырех флуоресцентных красителей, включенных во все типы ddNTP.
Компьютерный анализ последовательностей ДНК проводили с помощью персонального компьютера с использованием программ Chromas и BioEdit. Нуклеотидные последовательности исследованных фрагментов ДНК были выровнены относительно рассчитанных, была продемонстрирована идентичность синтезированных фрагментов рассчитанным. В результате были отобраны клоны клеток E.coli, содержащие полноразмерные последовательности таргетных генов в составе плазмид последовательности ДНК, кодирующие альфа дефенсин HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3. Пример 2. Наработка плазмидных ДНК, кодирующих альфа дефенсин HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3, для проведения исследования на лабораторных животных.
Отдельную колонию E.coli, выращенную на LB-arape в чашке Петри с добавлением канамицина (либо ампициллина), помещали в 10 мл селективной среды. Клетки растили в течение ночи при +37°С в условиях постоянного перемешивания (250 об/мин.). Полученные клетки собирали центрифугированием при 4000g. Дальнейшее выделение и очистку плазмидной ДНК осуществляли с использованием набора EndoFree Plasmid Mega Kit (Qiagen), позволяющего получить апирогенную ДНК. Выделенную плазмидную ДНК анализировали электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле, измеряли ее концентрацию с помощью флуориметрии.
В качестве контрольного раствора использовали воду без добавления тестируемого препарата. В ячейку для измерения оптической плотности объемом 2 мл вносили 1,950 мл воды и 0,05 мл тестируемого раствора (концентрация 1мг/мл), перемешивали и измеряли оптическую плотность при длине волны 260 нм. Определение концентрации ДНК проводили по формуле:
С(мкг/мл)=40А260К,
где А2бо-оптическая плотность препарата, измеренная при длине волны 260 нм; К(мкг/мл)- для ДНК 50 мкг/мл (50 мкг/мл двухцепочечной ДНК в воде); 40 - разведение тестируемого препарата.
В итоге определили, что получили плазмидную ДНК pVAXlseq3 с концентрацией 3,4 мг/мл, pVR1012seq4 - 3,7 мг/мл, pVR1012seq5 - 4 мг/мл, pVAXlseq6 - 3,8 мг/мл, pVR1012seq9 - 4,1 мг/мл, pVAXlseqlO - 4 мг/мл, pVAXlseql l - 4,3 мг/мл, pVR1012seql2 - 4,5 мг/мл, pcDNA3.1 +seql 1 - 4,4 мг/мл, pcDNA3.1+(var)seql2 - 4,3 мг/мл. Выход плазмидной ДНК составил от 3,4 мг до 4,5 мг из 1 л питательной среды.
О чистоте полученного препарата плазмидной ДНК судили по отношению оптической плотности препарата, измеренной при длине волны 260 нм, к оптической плотности препарата, измеренной при длине волны 280 нм (А2бо/А28о) и отношению оптической плотности препарата, измеренной при длине волны 260 нм к оптической плотности препарата, измеренной при длине волны 230 нм (А26о/А2зо). Измерения проводили в водном растворе, в качестве контрольного раствора использовали воду без добавления тестируемого препарата.
Для чистых препаратов ДНК характерно А260/А280>1 ,80 и А2б0/А2зо>1 ,80. Определенные в эксперименте значения соответствовали значениям отношений А26о/А28о и А260/А 3о для чистых препаратов, для всех полученных препаратов плазмидной ДНК.
Также проводили количественное определение примесей белка в полученных препаратах плазмидных ДНК pVAXl seq3, pVR1012seq4, pVR1012seq5, pVAXl seq6, pVR1012seq9, pVAXlseqlO, pVAXl seql l, pVR1012seql2, pcDNA3.1+seql 1 , pcDNA3.1 +(var)seql2 с помощью microBCA assay [Smith, P.K., et all, Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analyt. Biochem. 150, 76-85 (1985)], измеряя оптическую плотность образующихся окрашенных белковых комплексов с медью и бицинхониновой кислотой при длине волны 562 нм. Чувствительность метода microBCA assay составляет 0.5-20 мкг/мл белка. Концентрация тотального белка ни в одном из исследуемых препаратов плазмидной ДНК не превышала норму (от 0,5 до 12 мкг/мг плазмидной ДНК).
Определяли и содержание бактериального липополисахарида в препаратах плазмидных ДНК, с использованием гель-тромб варианта ЛАЛ-теста, с чувствительностью >0,25 EU/мл (ToxinSensor, GenScript, США). ЛАЛ-реагентом служил лизат амебоцитов подковообразного краба Limulus polyphemus. ЛАЛ-реактив специфически реагирует с бактериальными эндотоксинами, в результате ферментативной реакции происходит изменение реакционной смеси, пропорциональное концентрации эндотоксина. Результаты оценивали по наличию или отсутствию плотного тромба на дне пробирки путем переворачивания пробирки. Гель-тромб не образовался при исследовании образца, разведенного в 10 раз, для препаратов плазмидных ДНК pVAX l seq3, pVR1012seq4, pVR1012seq5, pcDNA3.1+(var)seql 2 и в 5 раз для препаратов плазмидных ДНК pVAXl seq6, pVR1012seq9, pVAXl seqlO, pVAXl seql l , pVR1012seql2, pcDNA3.1+seq l 1 т.е. при чувствительности метода 2,5 EU/мл и 1 ,25 EU/мл, соответственно, что, учитывая концентрацию плазмидной ДНК в образце, говорит о допустимом показателе очистки от эндотоксинов.
Пример 3. Определение анальгетического эффекта плазмидной ДНК, кодирующей альфа дефенсин HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3.
3.1. Тест «Горячая пластина» Проводили исследование анальгетической активности плазмидных ДНК, кодирующих альфа дефенсин HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3, с использованием теста «Горячая пластина» (hot plate).
Тест «Горячая пластина» (Hot plate) проводили для измерения порога острой болевой чувствительности и потенциального анальгезирующего эффекта изучаемых препаратов плазмидной ДНК [Вальдман А. В., Игнатов Ю. Д. Центральные механизмы боли.— Л.: Наука.— 1976]. Тест является базисным для исследования анальгетической активности, его используют для выявления анальгетически активных соединений.
При помещении на горячую поверхность, с достижением порога болевой чувствительности со стороны животного наблюдаются двигательные реакции беспокойства: одергивание лап, облизывание подушечек лап и подпрыгивание. В данном тесте учитывали латентное время с момента помещения животного на горячую поверхность до первого облизывания лап. Данная методика позволяет определять показатели: анальгетическая активность тестируемого объекта, пиковое время анальгезии, длительность анальгезии.
В исследовании использовали мышей линии BALB/C, самок, массой 15-22 грамма, возраста 18 недель. В опыте было сформировано 17 групп животных, включая контрольные группы, в каждой группе по 3 мыши:
1 - отрицательный контроль (вводили физраствор)
2 - pVAXlseq3
3 - pVR1012seq4
4 - pVR1012seq5
5 - pVAXl seq6
6 - pVR1012seq9
7 - pVAXlseqlO
8 - pVAXlseql l
9 - pVR1012seql2
10 - pcDNA3.1+ seql l,
1 1 - pcDNA3.1+ (var)seql2
12 - анальгин (50 мг/кг)
13— морфин гидрохлорид (10 мг/кг)
14 - pVAXl 15 - pVR1012
16 - pcDNA3.1 +
17 - pcDNA3.1+(var)
Вводили no 5 мг/кг плазмидных ДНК.
Использовали прибор Hot plate-метр (Hotplate Analgesia Meter, Columbus Instruments, USA).
До начала испытания в течение 10 минут давали тест-системам акклиматизироваться в комнате для проведения исследования. Животных использовали однократно, так как повторное помещение животного на термостатируемую пластину вызывает незамедлительную реакцию на касание поверхности. Устанавливали температуру термостата 55°С. После инъекции исследуемого вещества животное аккуратно помещали на нагревательную пластину и в тот же момент нажимали кнопку «старт» на панели прибора. Отмечали латентное время облизывания передних и задних лап (с момента помещения животного на поверхность прибора до первого облизывания). После этого нажимали на кнопку «стоп» и убирали животное с горячей поверхности. Иные поведенческие реакции игнорировали. Для уменьшения вероятности теплового повреждения подушечек лап максимальное время эксперимента не превышало 60 сек. Для определения пикового времени анальгетического действия препарата измеряли латентное время облизывания передних и задних лап у контрольной группы (физраствор) (точка 0) и через 2 ч, 12 ч, 24 ч после введения препарата у тестируемых групп. Поверхность прибора протирали салфеткой, смоченной дезинфектантом (0,5% хлоргексидин-биглюконат на 70% этаноле), перед помещением на нее очередного животного [Методические рекомендации для обучаемых. Фармацевтический факультет ГОУ ВПО ММА им. И.М.Сеченова Росздрава.— Москва.— 2006].
Проводили анализ данных определения анальгетической активности препарата. Для плазмидной ДНК, показавшей наилучший результат, определяли ED50, т.е. дозу, необходимую для проявления 50%-й анальгетической активности препарата.
Результаты опыта представлены на Фиг.1. Препараты всех исследуемых плазмидных ДНК, кодирующих дефенсин HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3, проявляют выраженное анальгезирущее действие, не уступающее по эффективности морфину и превышающее анальгетическую активность анальгина. Наблюдали небольшую степень анальгезии через 2 ч после введения плазмид, затем анальгезия усиливалась, и через 12 и 24 ч наблюдали одинаковый высокий уровень анальгезии, что говорит о поддержании эффекта.
В эксперименте с применением различных доз плазмидной ДНК, показавшей наилучший результат в предыдущем опыте (pVAXlseq3), продемонстрирован дозозависимый характер анальгезии в интервале от 1 до 10 мг/кг (Фиг.2). При этом по прошествии 12 часов показатели при использовании плазмидной ДНК pVAXlseq3 в минимальной концентрации 1 мг/кг были практически идентичны показателям в группе использования морфина гидрохлорида 10 мг/кг. Через 24 ч показатель в группе плазмидной ДНК в минимальной концентрации превысил таковой группы использования морфина гидрохлорида 10 мг/кг, практически в 2 раза. Действие анальгина наблюдали только по прошествии 2 ч после введения анальгетика, ответ через 12 ч и 24 ч был аналогичен таковому в контрольной группе. При использовании плазмидной ДНК pVAXlseq3 в концентрации 5 мг/кг и 10 мг/кг наблюдали значительное увеличение (до 15%) латентного периода, по сравнению с группой с минимальной концентрацией плазмидной ДНК, при этом различие между этими двумя группами было небольшое.
3.2. Исследование концентрации бета-эндорфина в сыворотке мышей.
Поскольку изменение концентрации бета-эндорфина в плазме крови может служить критерием оценки эффективности обезболивания [Бета-эндорфин - маркер эффективности обезболивания при острой боли и хроническом болевом синдроме у онкологических больных / 3. В. Павлова [и др.] // Проблемы клинической медицины.— 2007 .— N1 .— С. 36-40 .— ISSN 1817-8359], проводили исследование концентрации бета-эндорфина в сыворотке исследуемых мышей после введения плазмидной ДНК, на примере введения плазмидной ДНК, кодирующей HNP-2, либо HNP-3 (pVR1012seq4), с использованием набора ELISA Kit for Beta-Endorphin (ЬЕР) Mus musculus (Mouse) CEA806Mu (Life science Inc.).
Результаты исследования приведены на Фиг.З. Видно, что уровень бета-эндорфина значительно поднялся при введении плазмидной ДНК pVR1012seq4, при том, что при введении плазмидной ДНК без вставки таргетного гена и в контрольной группе значительное увеличение уровня бета-эндорфина не наблюдали, на протяжении всего эксперимента. Таким образом, продемонстрированы возможность создания различных вариантов плазмидной ДНК, кодирующей HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3, их получения с использованием бактериального продуцента, а также анальгетическое действие такой плазмидной ДНК, в любом из вариантов, соответствующих указанным критериям, причем даже в минимальной концентрации 1 мг/кг (меньше в 10 раз, чем морфина гидрохлорида), а также продемонстрирована безопасность применения такой плазмидной ДНК: животные не погибли, побочные эффекты не наблюдали.

Claims

Плазмидная ДНК, кодирующая HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3, бактериальный продуцент, анальгетическое средство (варианты) Формула изобретения
1. Плазмидная ДНК для транзиентной экспрессии в клетках млекопитающих, представленная остовом, содержащим прокариотические элементы, ориджин репликации и репортерный ген, и эукариотические элементы, сильный промотор, лидерную последовательность мРНК, а также регуляторные последовательности для указанных элементов, сайт, предпочтительно сайты, для клонирования гена интереса и сайт для посадки праймера, предпочтительно, сайты для посадки праймеров, для анализа, и полинуклеотидом, представленным секреторной последовательностью, фрагментом, кодирующим альфа дефенсин человека HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3, кодонно оптимизированными для млекопитающих, и терминирующей последовательностью.
2. Плазмидная ДНК по п.1 , характеризующаяся тем, что препробелок представлен SEQ ID NO: 1 , либо SEQ ID NO:2, либо SEQ ID NO:7, либо SEQ ID NO:8.
3. Плазмидная ДНК по п.1 , либо п.2, характеризующаяся тем, что полинуклеотид представлен SEQ ID NO:3, либо SEQ ID NO:4, либо SEQ ID NO:5, либо SEQ ID NO:6, либо SEQ ID NO:9, либо SEQ ID NO: 10, либо SEQ ID NO: 1 1 , либо SEQ ID NO: 12.
4. Продуцент плазмидной ДНК по п.1, либо п.2, либо п.З, на основе бактериальной клетки.
5. Анальгетическое средство на основе плазмидной ДНК по п.1, либо п.2, либо п.З, в эффективном количестве, также содержащее фармацевтически приемлемый эксципиент, для применения у млекопитающих, в частности, человека.
PCT/RU2015/000756 2014-11-10 2015-11-10 Плазмидная днк, кодирующая hnp-1, либо hnp-2, либо hnp-3, бактериальный продуцент, анальгетическое средство (варианты) WO2016076761A1 (ru)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BR112017009607-2A BR112017009607A2 (pt) 2014-11-10 2015-11-10 dna plasmídico codificando hnp-1 ou hnp-2 ou hnp-3, produtor bacteriano, agente analgésico
EP15858310.4A EP3219798B1 (en) 2014-11-10 2015-11-10 Dna plasmid, coding hnp-1, or hnp-2, or hnp-3, bacterial producer, analgesic agent (variants)
CN201580072724.XA CN107208087A (zh) 2014-11-10 2015-11-10 编码hnp‑1或hnp‑2或hnp‑3的dna质粒、细菌生产者、镇痛剂(变体)
EA201790929A EA038673B1 (ru) 2014-11-10 2015-11-10 Плазмидная днк, кодирующая дефенсин hnp-1, либо hnp-2, либо hnp-3
JP2017544270A JP2017535288A (ja) 2014-11-10 2015-11-10 Ｈｎｐ―１又はｈｎｐ−２又はｈｎｐ−３をコード化するプラスミドｄｎａ、細菌性産生株、鎮痛剤
KR1020177015883A KR20170077252A (ko) 2014-11-10 2015-11-10 Hnp-1 또는 hnp-2 또는 hnp-3을 인코딩하는 플라스미드 dna, 박테리아 제조체, 진통제 (변이체)
US15/524,782 US20180057837A1 (en) 2014-11-10 2015-11-10 Dna plasmid, coding hnp-1, or hnp-2, or hnp-3, bacterial producer, analgesic agent (variants)
IL25273017A IL252730B (en) 2014-11-10 2017-06-06 Plasmid DNA encoding hnp-1 or hnp-2 or hnp-3 its bacterial producer, and an analgesic agent based on it
HK18103246.6A HK1243732A1 (zh) 2014-11-10 2018-03-07 編碼hnp-1或hnp-2或hnp-3的dna質粒、細菌生產者、鎮痛劑(變體)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2014145169/15A RU2597789C2 (ru) 2014-11-10 2014-11-10 Анальгетическое средство на основе плазмидной днк, кодирующей hnp-1, либо hnp-2, либо hnp-3 (варианты)
RU2014145169 2014-11-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016076761A1 true WO2016076761A1 (ru) 2016-05-19

Family

ID=55954714

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2015/000756 WO2016076761A1 (ru) 2014-11-10 2015-11-10 Плазмидная днк, кодирующая hnp-1, либо hnp-2, либо hnp-3, бактериальный продуцент, анальгетическое средство (варианты)

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20180057837A1 (ru)
EP (1) EP3219798B1 (ru)
JP (1) JP2017535288A (ru)
KR (1) KR20170077252A (ru)
CN (1) CN107208087A (ru)
BR (1) BR112017009607A2 (ru)
EA (1) EA038673B1 (ru)
HK (1) HK1243732A1 (ru)
IL (1) IL252730B (ru)
RU (1) RU2597789C2 (ru)
WO (1) WO2016076761A1 (ru)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA036780B1 (ru) * 2017-11-26 2020-12-21 Илья Владимирович ДУХОВЛИНОВ Плазмидная днк, кодирующая бета-эндорфин, бактериальный продуцент, анальгетическое средство
US11358895B2 (en) * 2018-11-15 2022-06-14 Owens-Brockway Glass Container Inc. Batch charger for a melting chamber

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020182703A1 (en) * 1997-08-29 2002-12-05 Genset, S.A. Human defensin polypeptide Def-X, genomic DNA and cDNA, composition containing them and applications to diagnosis and to therapeutic treatment
US20060036083A1 (en) * 2002-02-19 2006-02-16 Joel Moss Modified defensins and their use
WO2006097110A2 (en) * 2005-03-18 2006-09-21 Novozymes A/S Polypeptides having antimicrobial activity and polynucleotides encoding same
WO2009043461A1 (en) * 2007-09-11 2009-04-09 Mondobiotech Laboratories Ag Use of a hnp-1 defensin peptide, alone or in combination with neuropeptide af, as a therapeutic agent
CN101648011A (zh) * 2008-08-11 2010-02-17 同济大学附属上海市肺科医院 一种肿瘤靶向重组dna疫苗及其制备与应用
WO2013151668A2 (en) * 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of secreted proteins

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002238568A (ja) * 2001-02-14 2002-08-27 Jenokkusu Soyaku Kenkyusho:Kk アレルギー性疾患の検査方法
CN101128487B (zh) * 2004-12-02 2012-10-10 杜门蒂斯有限公司 靶向血清白蛋白和glp-1或pyy的双特异性结构域抗体
CN101175770A (zh) * 2005-03-18 2008-05-07 诺维信公司 具有抗微生物活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
CN100445371C (zh) * 2005-10-18 2008-12-24 甘肃亚盛盐化工业集团有限责任公司 一种利用大肠杆菌生产人α防御素1蛋白的方法
CN1904036B (zh) * 2005-10-18 2010-09-01 甘肃亚盛盐化工业集团有限责任公司 基因工程菌混合培养生产三种人α防御素的方法
FR2893619A1 (fr) * 2005-11-21 2007-05-25 Chu Nice Proteine chimere lectine-defensine
CN101280318B (zh) * 2008-05-30 2011-05-11 四川大学 重组人hnp基因脂质体复合物、制备方法及用途
CN102586256A (zh) * 2012-01-16 2012-07-18 华南理工大学 人β-防御素3在酵母菌表达系统中的表达方法
RU2012114261A (ru) * 2012-04-10 2013-10-20 Илья Владимирович Духовлинов Анальгетическое средство на основе плазмидной днк

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020182703A1 (en) * 1997-08-29 2002-12-05 Genset, S.A. Human defensin polypeptide Def-X, genomic DNA and cDNA, composition containing them and applications to diagnosis and to therapeutic treatment
US20060036083A1 (en) * 2002-02-19 2006-02-16 Joel Moss Modified defensins and their use
WO2006097110A2 (en) * 2005-03-18 2006-09-21 Novozymes A/S Polypeptides having antimicrobial activity and polynucleotides encoding same
WO2009043461A1 (en) * 2007-09-11 2009-04-09 Mondobiotech Laboratories Ag Use of a hnp-1 defensin peptide, alone or in combination with neuropeptide af, as a therapeutic agent
CN101648011A (zh) * 2008-08-11 2010-02-17 同济大学附属上海市肺科医院 一种肿瘤靶向重组dna疫苗及其制备与应用
WO2013151668A2 (en) * 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of secreted proteins

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAVID M.HOOVER ET AL.: "DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 30, no. 10, e43, 2002, pages 1 - 7, XP002301503 *
JAMES A WILLIAMS ET AL.: "Plasmid DNA Vaccine vector design: impact on efficacy, safety and upstream production", BIOTECHNOL ADV., vol. 27, no. 4, 2009, pages 353 - 370, XP002594537 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2597789C2 (ru) 2016-09-20
IL252730B (en) 2019-10-31
EA038673B1 (ru) 2021-10-01
IL252730A0 (en) 2017-08-31
HK1243732A1 (zh) 2018-07-20
BR112017009607A2 (pt) 2018-04-03
US20180057837A1 (en) 2018-03-01
EP3219798A4 (en) 2018-04-25
RU2014145169A (ru) 2016-05-27
EP3219798A1 (en) 2017-09-20
KR20170077252A (ko) 2017-07-05
JP2017535288A (ja) 2017-11-30
EP3219798B1 (en) 2019-07-17
EA201790929A1 (ru) 2017-09-29
CN107208087A (zh) 2017-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7464278B2 (ja) インターロイキン－２の部分アゴニスト
US10981964B2 (en) Fusion protein comprising IL-4 and IL-10
CN111132999A (zh) 支架蛋白
JP2017529059A (ja) 代謝障害を治療するための組成物および使用方法
JP5855239B2 (ja) ラクトフェリン融合タンパク質及びその製造方法
CN103140236A (zh) 生长激素多肽及其制备和使用方法
EP2852397A2 (en) Huwentoxin-iv variants and methods of use
JP2015057387A (ja) クロスベータ構造体でのタンパク質の凝集の標的化誘導
RU2597789C2 (ru) Анальгетическое средство на основе плазмидной днк, кодирующей hnp-1, либо hnp-2, либо hnp-3 (варианты)
JP5819439B2 (ja) 修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片及びその製造方法
JP5746191B2 (ja) 修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片及びその製造方法
CN112601454A (zh) 用于治疗杜兴肌营养不良的组合物和方法
US20230137756A1 (en) Synthetic Soluble Receptor Mimics and Methods of Use for Treatment of COVID-19
NL2022982B1 (en) A fusion protein comprising IL13
KR20240023126A (ko) 망막 장애
KR20240023127A (ko) 망막 장애
CN113880947A (zh) 小分子抗体及其编码基因和制备方法及应用和药物组合物
AU2018370765A1 (en) Plasmid DNA encoding beta-endorphin, bacterial producer, analgesic agent

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15858310

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15524782

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017544270

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201790929

Country of ref document: EA

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112017009607

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20177015883

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2015858310

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112017009607

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20170508