JP2002238568A - アレルギー性疾患の検査方法 - Google Patents

アレルギー性疾患の検査方法

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JP2002238568A
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protein
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雄二 杉田
Masayuki Heiji
昌幸 瓶子
Shinji Kagaya
伸治 加賀谷
Yoshimichi Gunji
誉道 郡司
Hirohisa Saito
博久 斎藤
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NATIONAL CHILDREN'S HOSPITAL
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、アレルギー性疾患の検出方法の提
供を課題とする。 【解決手段】アレルギー性疾患の患者と健常者との間で
発現レベルに差が見られる遺伝子defensin 1を見出し
た。末梢血単核球における該遺伝子の発現レベルを指標
とする、アレルギー性疾患の検査方法、および該疾患の
治療のための化合物のスクリーニング方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アレルギー性疾患
の検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アトピー性皮膚炎等のアレルギー性疾患
は、多因子性の病気(multifactorialdiseases)と考えら
れている。これらの病気は多くの異なる遺伝子の発現の
相互作用によって起こり、これらの個々の遺伝子の発現
は、複数の環境要因によって影響を受ける。このため、
特定の病気を起こす特定の遺伝子を解明することは、非
常に困難である。またアレルギー性疾患には、変異や欠
陥を有する遺伝子の発現や、特定の遺伝子の過剰発現や
発現量の減少が関わっていると考えられている。病気に
関して遺伝子発現が果たしている役割を解明するために
は、遺伝子が発症にどのように関わり、薬剤などの外的
な刺激が遺伝子発現をどのように変化させるのかを理解
する必要がある。
【０００３】さて、現在アレルギー性疾患の診断におい
ては、一般に、問診、家族歴、そして本人の既往症の確
認が重要な要素となっている。またアレルギーをより客
観的な情報に基づいて診断するために、血液を試料とす
る試験方法や、アレルゲンに対する患者の免疫学的な応
答を観察する方法も実施されている。前者の例として、
アレルゲン特異的IgE測定、白血球ヒスタミン遊離試
験、あるいはリンパ球幼若化試験等が挙げられる。アレ
ルゲン特異的IgEの存在は、そのアレルゲンに対するア
レルギー反応の証明である。しかし患者によっては、必
ずしもアレルゲン特異的なIgEを検出できるとは限らな
い場合もある。また、その測定原理上、診断に必要なア
レルゲンの全てに対して、試験を実施しなければならな
い。白血球ヒスタミン遊離試験やリンパ球幼若化試験
は、免疫システムのアレルゲンに対する反応をin vitro
で観察する方法である。これらの方法は、操作が煩雑で
ある。
【０００４】一方、患者を実際にアレルゲンに接触させ
たときに観察される免疫応答をアレルギーの診断に役立
てる方法（後者）も公知である。ブリック・テスト、ス
クラッチ・テスト、パッチ・テスト、皮内反応、あるい
は誘発試験等が、この種の試験に含まれる。これらの試
験では、患者のアレルギー反応を直接診断することがで
きる反面、実際に被検者をアレルゲンに曝露する侵襲性
の高い検査であると言うことができる。
【０００５】この他、アレルゲンに関わらず、アレルギ
ー反応の関与を証明するための試験方法も試みられてい
る。たとえば、血清IgE値が高値である場合、その患者
にはアレルギー反応が起きていると推定することができ
る。血清IgE値は、アレルゲン特異IgEの総量に相当する
情報である。アレルゲンの種類に関わらずIgEの総量を
決定することは容易であるが、非アトピー型気管支炎等
の疾患を持つ患者では、IgEが低値となる場合がある。
【０００６】従って、患者に対する危険が少なく、しか
も診断に必要な情報を容易に得ることができるアレルギ
ー性疾患のマーカーが提供されれば有用である。このよ
うなマーカーは、アレルギー性疾患の発症に深く関与し
ていると考えられるので、診断のみならず、アレルギー
症状のコントロールにおいても、重要な標的となる可能
性がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、アレルギー
性疾患の検査を可能とする新しい指標の提供、さらに、
該指標に基づくアレルギー性疾患の検査方法、およびア
レルギー性疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法
の提供を課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意研究を行った結果、アレルギー性疾
患の患者と健常者との間で発現レベルに差が見られる遺
伝子を単離し、アレルギー反応との関連性を明らかにす
ることにより、アレルギー性疾患治療の新たな標的を見
出すことができるものと考えた。
【０００９】このような考えに基づき、本発明者らは、
ステロイド軟膏治療を受けているアトピー性皮膚炎患者
と健常者との間で発現状態の違う遺伝子の探索を行っ
た。一般的にステロイド治療では、その応答としてグル
ココルチコイド受容体の発現変動が見られるが、今回の
被検者においては、この発現変動の大きな差が見られな
いことから、患者と健常者間における遺伝子発現の変動
は、ステロイド治療自体に起因するものではないと考え
られる。また、遺伝子の発現状態を比較する生体試料と
しては、末梢血単核球を選択した。アトピー性疾患の患
者への抗原刺激によって末梢血単核球からのIL-5、IL-6
およびIL10の分泌が知られており、末梢血単核球はアレ
ルギー反応と密接に関係している(Jenmalm M. C. et a
l., Pediatr. Allergy Immunol. 10: 168-177, 1999)。
つまり、末梢血単核球において発現が変動する遺伝子
は、アレルギー反応に深い関連性を有する遺伝子である
と言える。さらに末梢血単核球は、収得するのが容易で
あるため偽陰性をなくすための高収量が期待でき、従っ
て微量な遺伝子の発現を検出することが可能なものと考
えられる。
【００１０】本発明者らは、末梢血単核球における遺伝
子の発現状態を解析した結果、defensin 1遺伝子がアレ
ルギー性疾患の患者の単核球において、発現が増加して
いることを確認した。このdefensin 1遺伝子は、defens
inファミリーに属する既知遺伝子であり、抗微生物（殺
菌）作用を代表として、正常細胞や癌細胞に対する細胞
障害作用、肥満細胞からのヒスタミン放出作用、単球走
化性作用、および抗ACTH（副腎皮質刺激ホルモン）作用
等を有する（Bateman A. et al., J. Biol. Chem. 199
1; 266:7524-30）ことが知られている。しかし、アレル
ギー性疾患との直接的な関連性についてはこれまでのと
ころ知られていない。今回、アレルギー性疾患患者の末
梢血単核球において、該遺伝子の発現レベルに変動が観
察されたという事実は、該遺伝子とアレルギー症状との
深い結びつきを表しているものと言える。以上の知見に
基づいて、本発明者らは、このdefensin 1遺伝子の発現
レベル、あるいは該遺伝子によってコードされる蛋白質
の活性を指標とすることにより、アレルギー性疾患の診
断、および該疾患のための治療薬のスクリーニングをす
ることが可能であることを見出し、本発明を完成させ
た。
【００１１】即ち、本発明はアレルギー性疾患の検査を
可能とする新しい指標の提供、さらに、該指標に基づく
アレルギー性疾患の検査方法、およびアレルギー性疾患
治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関し、より具
体的には、〔１〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の
検査方法、（１）被検者の生体試料におけるdefensin 1
遺伝子の発現レベルを測定する工程、（２）健常者の生
体試料におけるdefensin 1遺伝子の発現レベルと比較す
る工程、〔２〕アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎で
ある、〔１〕に記載の検査方法、〔３〕遺伝子の発現レ
ベルを、cDNAのPCRによって測定する〔１〕に記載の検
査方法、〔４〕遺伝子の発現レベルを、defensin 1遺伝
子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する
〔１〕に記載の検査方法、〔５〕defensin 1遺伝子の塩
基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相
補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有
するオリゴヌクレオチドからなる、アレルギー性疾患検
査用試薬、〔６〕defensin 1蛋白質のアミノ酸配列を含
むペプチドを認識する抗体からなる、アレルギー性疾患
検査用試薬、〔７〕次の工程を含む、アレルギー性疾患
の治療薬のスクリーニング方法、（１）defensin 1遺伝
子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程、
（２）前記遺伝子の発現レベルを測定する工程、（３）
対照と比較して前記遺伝子の発現レベルを低下させる化
合物を選択する工程、〔８〕細胞が株化白血球細胞であ
る〔７〕に記載の方法、
〔９〕defensin 1遺伝子の塩基
配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補
的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有す
るオリゴヌクレオチドと、defensin 1遺伝子を発現する
細胞を含む、アレルギー性疾患の治療薬候補化合物をス
クリーニングするためのキット、〔１０〕defensin 1蛋
白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体と、
defensin 1遺伝子を発現する細胞を含む、アレルギー性
疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキ
ット、〔１１〕defensin 1遺伝子の単核球における発現
強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物か
らなるアレルギー性疾患モデル動物、〔１２〕次の工程
を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方
法、（１）〔１１〕に記載のモデル動物に候補化合物を
投与する工程、（２）前記モデル動物の生体試料におけ
るdefensin 1遺伝子の発現強度を測定する工程、（３）
対照と比較して前記遺伝子の発現レベルを低下させる化
合物を選択する工程、〔１３〕次の工程を含む、アレル
ギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法、（１）defe
nsin 1遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制
御下に発現するレポーター遺伝子とを含むベクターを導
入した細胞と候補物質を接触させる工程、（２）前記レ
ポーター遺伝子の活性を測定する工程、および（３）対
照と比較して前記遺伝子の発現レベルを低下させる化合
物を選択する工程、〔１４〕次の工程を含む、アレルギ
ー性疾患の治療薬のスクリーニング方法、（１）defens
in 1蛋白質と候補物質を接触させる工程、（２）前記蛋
白質の活性を測定する工程、および（３）対照と比較し
て前記蛋白質の活性を低下させる化合物を選択する工
程、〔１５〕〔７〕、〔１２〕、〔１３〕、および〔１
４〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得
ることができる化合物を有効成分として含有する、アレ
ルギー性疾患の治療薬、〔１６〕defensin 1遺伝子、ま
たはその一部のアンチセンスDNAを主成分として含むア
レルギー性疾患の治療薬、〔１７〕defensin 1蛋白質の
アミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体を主成分と
して含む、アレルギー性疾患の治療薬、を提供するもの
である。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明において、アレルギー性疾
患(allergic disease)とはアレルギー反応の関与する疾
患の総称である。より具体的には、アレルゲンが同定さ
れ、アレルゲンへの曝露と病変の発症に深い結びつきが
証明され、その病変に免疫学的な機序が証明されること
と定義することができる。ここで、免疫学的な機序と
は、アレルゲンの刺激によって白血球細胞が免疫応答を
示すことを意味する。アレルゲンとしては、ダニ抗原や
花粉抗原等を例示することができる。
【００１３】代表的なアレルギー性疾患には、気管支喘
息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、花粉症、あ
るいは昆虫アレルギー等を示すことができる。アレルギ
ー素因(allergic diathesis)とは、アレルギー性疾患を
持つ親から子に伝えられる遺伝的な因子である。家族性
に発症するアレルギー性疾患はアトピー性疾患とも呼ば
れ、その原因となる遺伝的に伝えられる因子がアトピー
素因である。アトピー性皮膚炎は、アトピー性疾患のう
ち、特に皮膚炎症状を伴う疾患に対して与えられた総称
である。
【００１４】本発明のアレルギー性疾患の検査方法は、
被検者の生体試料におけるdefensin1遺伝子の発現レベ
ルを測定し、健常者の測定値と比較する工程を含む。両
者の比較の結果、健常者よりも発現が亢進している場合
には、被検者がアレルギー性疾患であると判定される。
【００１５】本発明において、defensin 1遺伝子の発現
レベルとは、該遺伝子のmRNAへの転写、並びに蛋白質へ
の翻訳を含む。従って本発明によるアレルギー性疾患の
検査方法は、defensin 1遺伝子に対応するmRNAの発現強
度、あるいは該遺伝子によってコードされる蛋白質の発
現レベルの比較に基づいて行われる。
【００１６】本発明におけるアレルギー性疾患の検査に
おけるdefensin 1遺伝子の発現レベルの測定は、公知の
遺伝子解析方法にしたがって実施することができる。具
体的には、例えばこの遺伝子にハイブリダイズする核酸
をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、または
本発明の遺伝子にハイブリダイズするDNAをプライマー
とした遺伝子増幅技術等を利用することができる。
【００１７】本発明の検査に用いられるプローブまたは
プライマーは、defensin 1遺伝子の塩基配列に基づいて
設定することができる。defensin 1遺伝子の塩基配列、
および該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は公
知である（GenBank登録番号：M26602）。
【００１８】なお一般に高等動物の遺伝子は、高い頻度
で多型を伴う。また、スプライシングの過程で相互に異
なるアミノ酸配列からなるアイソフォームを生じる分子
も多く存在する。多型やアイソフォームによって塩基配
列が異なる遺伝子であっても、defensin 1遺伝子と同様
の活性を持ち、アレルギーに関与する遺伝子は、いずれ
も本発明のdefensin 1遺伝子に含まれる。
【００１９】プライマーあるいはプローブには、defens
in 1遺伝子の塩基配列からなるポリヌクレオチド、また
はその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含
むポリヌクレオチドを利用することができる。ここで
「相補鎖」とは、A:T（RNAの場合はU）、G:Cの塩基対か
らなる2本鎖DNAの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。ま
た、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレ
オチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少
なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましく
は90%、さらに好ましくは95%以上の塩基配列上の相同性
を有すればよい。塩基配列の相同性は、BLAST等のアル
ゴリズムにより決定することができる。
【００２０】このようなポリヌクレオチドは、defensin
1遺伝子を検出するためのプローブとして、またdefens
in 1遺伝子を増幅するためのプライマーとして利用する
ことができる。プライマーとして用いる場合には、通
常、15bp〜100bp、好ましくは15bp〜35bpの鎖長を有す
る。また、プローブとして用いる場合には、defensin 1
遺伝子（またはその相補鎖）の少なくとも一部若しくは
全部の配列を有し、少なくとも15bpの鎖長のDNAが用い
られる。プライマーとして用いる場合、3'側の領域は相
補的である必要があるが、5'側には制限酵素認識配列や
タグなどを付加することができる。
【００２１】なお、本発明における「ポリヌクレオチ
ド」は、DNAあるいはRNAであることができる。これらポ
リヌクレオチドは、合成されたものでも天然のものでも
よい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブ
DNAは、通常、標識したものが用いられる。標識方法と
しては、例えば次のような方法を示すことができる。な
お用語オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのう
ち、重合度が比較的低いものを意味している。オリゴヌ
クレオチドは、ポリヌクレオチドに含まれる。 ・DNAポリメラーゼIを用いるニックトランスレーション
による標識 ・ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識 ・クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識（Be
rger SL, Kimmel AR. (1987) Guide to Molecular Clon
ing Techniques, Method in Enzymology, Academic Pre
ss; Hames BD, Higgins SJ (1985) Genes Probes: A Pr
actical Approach. IRL Press; Sambrook J, Fritsch E
F, Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: a Laborat
ory Manual, 2nd Edn. Cold Spring Harbor Laboratory
Press） ・RNAポリメラーゼを用いる転写による標識（Melton D
A, Krieg,PA, RebagkiatiMR, Maniatis T, Zinn K, Gre
en MR. (1984) Nucleic Acid Res., 12,7035-7056） ・放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをDNAに取
り込ませる方法（KrickaLJ. (1992) Nonisotopic DNA P
robing Techniques. Academic Press）
【００２２】ハイブリダイゼーション技術を利用したア
レルギー性疾患の検査は、例えば、ノーザンハイブリダ
イゼーション法、ドットブロット法、DNAマイクロアレ
イを用いた方法などを使用して行うことができる。さら
には、RT-PCR法等の遺伝子増幅技術を利用することがで
きる。RT-PCR法においては、遺伝子の増幅過程において
PCR増幅モニター法を用いることにより、本発明の遺伝
子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能
である。
【００２３】PCR遺伝子増幅モニター法においては、両
端に互いの蛍光を打ち消し合う異なった蛍光色素で標識
したプローブを用い、検出対象（DNAもしくはRNAの逆転
写産物）にハイブリダイズさせる。PCR反応が進んでTaq
ポリメラーゼの 5'-3'エクソヌクレアーゼ（exonucleas
e）活性により同プローブが分解されると二つの蛍光色
素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検
出をリアルタイムに行う。検出対象についてコピー数の
明らかな標準試料について同時に測定することにより、
PCR増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出
対象のコピー数を決定する（Holland, P.M. et al., 19
91, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280; Liva
k, K. J. et al., 1995, PCR Methods and Application
s 4(6):357-362; Heid, C. A. et al., Genome Researc
h 6:986-994; Gibson, E. M. U. et al., 1996, Genome
Research 6:995-1001）。PCR増幅モニター法において
は、例えば、ABI PRISM7700（PEバイオシステムズ社）
を用いることができる。
【００２４】また本発明のアレルギー性疾患の検査方法
は、defensin 1遺伝子によりコードされる蛋白質を検出
することにより行うこともできる。このような検査方法
としては、例えば、このdefensin 1蛋白質に結合する抗
体を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降
法、ELISA法などを利用することができる。
【００２５】この検出に用いるdefensin 1蛋白質に結合
する抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることがで
きる。本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、あ
るいはモノクローナル抗体（Milstein C, et al.,1983,
Nature 305(5934): 537-40）であることができる。例
えば、defensin 1蛋白質に対するポリクローナル抗体
は、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血
液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナ
ル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用
することができる。あるいは必要に応じてこの血清から
ポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離することも
できる。また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗
原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫
細胞などと細胞融合させる。こうして得られたハイブリ
ドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収
しモノクローナル抗体とすることができる。
【００２６】defensin 1蛋白質の検出には、これらの抗
体を適宜標識して用いればよい。また、この抗体を標識
せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロ
テインAやプロテインGを標識して間接的に検出すること
もできる。具体的な検出方法としては、例えば、ELISA
法を挙げることができる。
【００２７】抗原に用いる蛋白質もしくはその部分ペプ
チドは、例えばdefensin 1遺伝子もしくはその一部を発
現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入し
て、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み
換え蛋白質を発現させ、発現させた組み換え蛋白質を培
養体または培養上清から精製することにより得ることが
できる。あるいは、該遺伝子によってコードされるアミ
ノ酸配列、あるいは全長cDNAによってコードされるアミ
ノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを
化学的に合成し、免疫原として用いることもできる。
【００２８】更に本発明においては、defensin 1遺伝子
の発現レベルのみならず、生体試料におけるdefensin 1
蛋白質の活性を指標として、アレルギー性疾患の検査を
行うこともできる。defensin 1蛋白質の活性とは、該蛋
白質が備える生物学的な活性を言う。defensin 1蛋白質
の活性の検出は、defensin 1蛋白質の抗体を用いたELIS
A法、またはウェスタンブロット法等の公知の方法に基
づいて行うことができる。
【００２９】本発明の検査方法においては、通常、被検
者の生体試料を試料とする。生体試料としては、血液、
喀痰、鼻粘膜分泌物等を用いることができるが、好まし
くは、末梢血単核球細胞を用いる。末梢血単核球細胞
は、末梢血から公知の方法によって調製することができ
る。例えば、実施例１に示す方法によって調製すること
ができる。調製された単核球を破壊してライセートとす
れば、defensin 1蛋白質の免疫学的な測定のための試料
とすることができる。また、本発明の単核球細胞以外の
生体試料の採取方法についても公知である。
【００３０】上記の生体試料からライセートを調製すれ
ば、defensin 1蛋白質の免疫学的な測定のための試料と
することができる。あるいはこのライセートからmRNAを
抽出すれば、defensin 1遺伝子に対応するmRNAの測定の
ための試料とすることができる。生体試料のライセート
またはmRNAの抽出には、市販のキットを利用すると便利
である。上記試料は、必要に応じて緩衝液等で希釈して
本発明の方法に使用することができる。
【００３１】本発明におけるdefensin 1遺伝子の発現レ
ベルの測定値は、公知の方法によって補正することがで
きる。補正により、細胞における遺伝子の発現レベルの
変化を比較することができる。測定値の補正は、上記生
体試料における各細胞において、発現レベルが大きく変
動しない遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子）の
発現レベルの測定値に基づいて、本発明においてdefens
in 1遺伝子の発現レベルの測定値を補正することによっ
て行われる。発現レベルが大きく変動しない遺伝子の例
としては、β-アクチン、GAPDH等を挙げることができ
る。
【００３２】本発明におけるdefensin 1遺伝子は、健常
者とアトピー性皮膚炎患者との比較において、患者の単
核球で発現量の増加を示した。従って、defensin 1遺伝
子の発現レベルを指標として、アレルギー性疾患の検査
を行うことができる。
【００３３】本発明におけるアレルギー性疾患の検査と
は、たとえば以下のような検査が含まれる。アレルギー
が疑われる症状を示しながら、一般的な検査ではアレル
ギー性疾患と判定できない患者であっても、本発明に基
づく検査を行えばアレルギー性疾患の患者であるか否か
を容易に判定することができる。より具体的には、アレ
ルギー性疾患が疑われる症状を示す患者におけるdefens
in 1遺伝子の発現の上昇は、その症状の原因がアレルギ
ー性疾患である可能性が高いことを示している。
【００３４】あるいは、アレルギー症状が改善に向かっ
ているのかどうかを判断するための検査が可能となる。
つまり、アレルギー性疾患に対する治療効果の判定に有
用である。また、アレルギー性疾患と診断された患者に
おけるdefensin 1遺伝子の発現の上昇は、アレルギー性
疾患がさらに進行している可能性が高いことを示してい
る。
【００３５】また本発明は、defensin 1遺伝子の単核球
細胞における発現レベルを上昇させたトランスジェニッ
ク非ヒト動物のアレルギー性疾患モデル動物に関する。
【００３６】本発明によって、defensin 1遺伝子の単核
球細胞における発現レベルが、アトピー性皮膚炎患者の
単核球において上昇することが明らかとなった。従っ
て、単核球細胞においてdefensin 1遺伝子の発現レベル
を人為的に増強した動物は、アレルギー性疾患のモデル
動物として利用することができる。該アレルギー性疾患
モデル動物は、アレルギーにおける生体内の変化を明ら
かにするために有用である。更に、該アレルギー性疾患
モデル動物を使用することにより、defensin 1遺伝子の
さらなる機能を解明すること、および該遺伝子を標的と
する薬剤を評価することには大きな意義がある。
【００３７】また本発明によるアレルギー性疾患モデル
動物は、後に述べるアレルギー性疾患の治療または予防
のための医薬品のスクリーニングに加えて、アレルギー
性疾患のメカニズムの解明、さらにはスクリーニングさ
れた化合物の安全性の試験に有用である。たとえば本発
明によるアレルギー疾患モデル動物が皮膚炎を発症した
り、何らかのアレルギー性疾患に関連した測定値の変化
を示せば、それを回復させる作用を持った化合物を探索
するスクリーニングシステムが構築できる。
【００３８】本発明において、発現レベルの上昇とは、
目的とする遺伝子が外来遺伝子として導入され強制発現
している状態、あるいは宿主が備える遺伝子の転写と蛋
白質への翻訳が増強されている状態、並びに翻訳産物で
ある蛋白質の分解が抑制された状態のいずれかを意味す
る。遺伝子の発現レベルは、たとえば実施例に示すよう
な定量的なPCRにより確認することができる。また翻訳
産物である蛋白質の活性は、正常な状態と比較すること
により確認することができる。
【００３９】代表的なトランスジェニック動物は、目的
とする遺伝子を導入し強制発現させた動物である。この
他のトランスジェニック動物には、たとえば遺伝子のコ
ード領域に変異を導入し、その活性を増強したり、ある
いは分解されにくいアミノ酸配列に改変した動物などを
示すことができる。アミノ酸配列の変異として、置換、
欠失、挿入、あるいは付加を示すことができる。その
他、遺伝子の転写調節領域を変異させることにより、本
発明の遺伝子の発現そのものを調節することもできる。
【００４０】特定の遺伝子を対象として、トランスジェ
ニック動物を得る方法は公知である。すなわち、遺伝子
と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法や、位
相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子
を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米
国特許第4873191号）、胚性幹細胞（ES細胞）を使用す
る方法などによってトランスジェニック動物を得ること
ができる。その他、レトロウィルスベクターに遺伝子を
挿入し、卵に感染させる方法、また、精子を介して遺伝
子を卵に導入する精子ベクター法等も開発されている。
精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエ
レクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ま
せた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を
導入する遺伝子組換え法である（M. Lavitranoet らCel
l, 57, 717, 1989）。
【００４１】本発明のアレルギー性疾患モデル動物とし
て用いるトランスジェニック動物は、ヒト以外のあらゆ
る脊椎動物を利用して作成することができる。具体的に
は、マウス、ラット、ウサギ、ミニブタ、ヤギ、ヒツ
ジ、あるいはウシ等の脊椎動物において様々な遺伝子の
導入や発現レベルを改変されたトランスジェニック動物
が作り出されている。
【００４２】さらに本発明は、アレルギー性疾患治療薬
候補化合物のスクリーニング方法に関する。本発明にお
いて、defensin 1遺伝子は、アレルギー性疾患を持つ患
者において有意に発現レベルが上昇している。従って、
該遺伝子の発現レベルを低下させることができる化合物
を選択することによって、アレルギー性疾患の治療薬を
得ることができる。本発明において遺伝子の発現レベル
を低下させる化合物とは、遺伝子の転写、翻訳、蛋白質
の活性発現のいずれかのステップに対して阻害的に作用
する作用を持つ化合物である。
【００４３】本発明のアレルギー性疾患治療候補化合物
のスクリーニング方法は、in vivoで行うこともin vitr
oで行うこともできる。このスクリーニングは、例えば
以下のような工程にしたがって実施することができる。 （１）被験動物に、候補化合物を投与する工程、（２）
前記動物の生体試料におけるdefensin 1遺伝子の発現レ
ベルを測定する工程、（３）対照と比較して、defensin
1遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工
程
【００４４】本発明のスクリーニング方法における被験
動物としては、例えばヒトのdefensin 1遺伝子を強制発
現させたトランスジェニック動物からなる本発明の上記
アレルギー性疾患モデル動物を利用することができる。
発現ベクターに使用するプロモーターとして、適当な薬
剤等の物質により転写が調節されるプロモーターを用い
れば、該物質の投与によってトランスジェニック動物に
おける外来性のdefensin 1遺伝子の発現レベルを調整す
ることができる。
【００４５】このようにしてdefensin 1遺伝子を強制発
現させたモデル動物に薬剤候補化合物を投与し、モデル
動物由来の生体試料におけるdefensin 1遺伝子の発現に
対する化合物の作用をモニターすることにより、defens
in 1遺伝子の発現レベルに与える薬剤候補化合物の影響
を検出することができる。被験動物の由来の生体試料に
おけるdefensin 1遺伝子の発現レベルの変動は、前記本
発明の検査方法と同様の手法によってモニターすること
ができる。更にこの検出の結果に基づいて、defensin 1
遺伝子の発現レベルを低下させる薬剤候補化合物を選択
すれば、薬剤候補化合物をスクリーニングすることがで
きる。
【００４６】より具体的には、被験動物から、生体試料
を採取し、defensin 1遺伝子の発現レベルを対照と比較
することにより、本発明によるスクリーニングを実施す
ることができる。生体試料としては、平滑筋細胞、角化
細胞、鼻粘膜上皮細胞、腸上皮細胞、単核球、リンパ
球、マスト細胞、好酸球、好塩基球、あるいは好中球等
を利用することができる。これらの生体試料の採取方
法、および調製方法は公知である。
【００４７】このようなスクリーニングにより、defens
in 1遺伝子の発現に様々な形で関与する薬剤を選択する
ことができる。具体的には、たとえば次のような作用点
を持つ薬剤候補化合物を見出すことができる。 ・defensin 1遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路
の活性化 ・defensin 1遺伝子の転写活性の上昇 ・defensin 1遺伝子の転写産物の安定化もしくは分解の
阻害等
【００４８】また、in vitroでのスクリーニングにおい
ては、例えば、defensin 1遺伝子を発現する細胞に候補
化合物を接触させ、該遺伝子の発現レベルを低下させる
化合物を選択する方法が挙げられる。このスクリーニン
グは、例えば以下のような工程に従って実施することが
できる。 （１）defensin 1遺伝子を発現する細胞に候補化合物を
接触させる工程（２）前記遺伝子の発現レベルを測定す
る工程、（３）対照と比較して、前記遺伝子の発現レベ
ルを低下させる化合物を選択する工程
【００４９】本発明において、defensin 1遺伝子を発現
する細胞は、defensin 1遺伝子を適当な発現ベクターに
挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入することに
より得ることができる。利用できるベクター、および宿
主細胞は、本発明の遺伝子を発現し得るものであればよ
い。宿主−ベクター系における宿主細胞としては、大腸
菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が例示でき、それぞれ
利用できるベクターを適宜選択することができる。
【００５０】ベクターの宿主への導入方法としては、生
物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことが
できる。生物学的方法としては、例えば、ウイルスベク
ターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細
胞融合法（HVJ（センダイウイルス)、ポリエチレングリ
コール（PEG）、電気的細胞融合法、微少核融合法（染
色体移入））が挙げられる。また、物理的方法として
は、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーシ
ョン法、ジーンパーティクルガン（gene gun）を用いる
方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシ
ウム沈殿法、リポソーム法、DEAEデキストラン法、プロ
トプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト
法、マイクロカプセル法が挙げられる。
【００５１】本発明のスクリーニング方法においては、
defensin 1遺伝子を発現する細胞として、末梢血白血球
細胞、白血球由来株化細胞を用いることができる。白血
球細胞としては、単核球細胞、未熟好中球を例示するこ
とができる。この中でも、顆粒球系株化細胞は、本発明
のスクリーニング方法に好適である。
【００５２】スクリーニングの方法は、まず前記株化白
血球細胞に候補化合物を添加する。その後、該株化白血
球細胞におけるdefensin 1遺伝子の発現レベルを測定
し、該遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択す
る。
【００５３】なお本発明のスクリーニング方法におい
て、defensin 1遺伝子の発現レベルは、該遺伝子がコー
ドする蛋白質の発現レベルのみならず、対応するmRNAを
検出することにより比較することもできる。mRNAによっ
て発現レベルの比較を行うには、蛋白質試料の調製工程
に代えて、先に述べたようなmRNA試料の調製工程を実施
する。mRNAや蛋白質の検出は、先に述べたような公知の
方法によって実施することができる。
【００５４】さらに本発明の開示に基づいて本発明の遺
伝子の転写調節領域を取得し、レポーターアッセイ系を
構築することができる。レポーターアッセイ系とは、転
写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量
を指標として、該転写調節領域に作用する転写調節因子
をスクリーニングするアッセイ系をいう。
【００５５】転写調節領域としては、プロモーター、エ
ンハンサー、さらには、通常プロモーター領域に見られ
るCAATボックス、TATAボックス等を例示することができ
る。またレポーター遺伝子としては、CAT(chlorampheni
col acetyltransferase)遺伝子、ルシフェラーゼ(lucif
erase)遺伝子、成長ホルモン遺伝子等を利用することが
できる。本発明におけるdefensin 1遺伝子は、既に転写
調節領域が明らかにされている(Human neutrophil pept
ide-1 gene, complete cds. (accession; L12690))。
【００５６】あるいは本発明におけるdefensin 1遺伝子
の転写調節領域を、次のようにして取得することもでき
る。すなわち、まず本発明で開示したcDNAの塩基配列に
基づいて、BACライブラリー、YACライブラリー等のヒト
ゲノムDNAライブラリーから、PCRまたはハイブリダイゼ
ーションを用いる方法によりスクリーニングを行い、該
cDNAの配列を含むゲノムDNAクローンを得る。得られた
ゲノムDNAの配列を基に、本発明で開示したcDNAの転写
調節領域を推定し、該転写調節領域を取得する。得られ
た転写調節領域を、レポーター遺伝子の上流に位置する
ようにクローニングしてレポーターコンストラクトを構
築する。得られたレポーターコンストラクトを培養細胞
株に導入してスクリーニング用の形質転換体とする。こ
の形質転換体に候補化合物を接触させ、レポーター遺伝
子の発現を制御する化合物のスクリーニングを行うこと
ができる。
【００５７】これらスクリーニングに用いる被験候補化
合物としては、ステロイド誘導体等既存の化学的方法に
より合成された化合物標品、コンビナトリアルケミスト
リーにより合成された化合物標品のほか、動・植物組織
の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む
混合物、またそれらから精製された標品などが挙げられ
る。
【００５８】本発明による各種のスクリーニング方法に
必要な、ポリヌクレオチド、抗体、細胞株、あるいはモ
デル動物は、予め組み合わせてキットとすることができ
る。これらのキットには、標識の検出に用いられる基質
化合物、細胞の培養のための培地や容器、陽性や陰性の
標準試料、更にはキットの使用方法を記載した指示書等
をパッケージしておくこともできる。
【００５９】本発明のスクリーニング方法によって選択
される化合物は、アレルギー性疾患の治療薬として有用
である。あるいは、defensin 1遺伝子の発現を抑制する
ことができるアンチセンスDNAも、アレルギー性疾患の
治療薬として有用である。さらに、defensin 1蛋白質の
アミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体も、アレル
ギー性疾患の治療薬として有用である。defensin 1遺伝
子は、アレルギー性疾患患者の単核球において発現が上
昇する遺伝子である。従って、該遺伝子の発現を抑制す
る、あるいは該遺伝子によってコードされる蛋白質の機
能を抑制することによって、アレルギー性疾患の治療効
果を期待することができる。
【００６０】本発明のアレルギー性疾患の治療薬は、ス
クリーニング方法によって選択された化合物を有効成分
として含み、生理学的に許容される担体、賦形剤、ある
いは希釈剤等と混合することによって製造することがで
きる。本発明のアレルギー性疾患の治療剤は、アレルギ
ー症状の改善を目的として、経口、あるいは非経口的に
投与することができる。
【００６１】経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カ
プセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択
することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射
剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。
【００６２】また、投与すべき化合物がタンパク質から
なる場合には、それをコードする遺伝子を遺伝子治療の
手法を用いて生体に導入することにより、治療効果を達
成することができる。治療効果をもたらすタンパク質を
コードする遺伝子を生体に導入し、発現させることによ
って、疾患を治療する手法は公知である。
【００６３】あるいはアンチセンスDNAは、適当なプロ
モーター配列の下流に組み込み、アンチセンスRNA発現
ベクターとして投与することができる。この発現ベクタ
ーをアレルギー疾患患者の単核球細胞へ導入すれば、こ
れらの遺伝子のアンチセンスを発現し、当該遺伝子の発
現レベルの低下によってアレルギーの治療効果を達成す
ることができる。単核球細胞への発現ベクターの導入と
しては、in vivo、あるいはex vivoで行う方法が公知で
ある。
【００６４】投与量は、患者の年齢、性別、体重および
症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬
組成物に含有される活性成分の種類などにより異なる
が、通常成人一人あたり、一回につき0.1 mgから500 mg
の範囲で、好ましくは0.5 mgから20 mgの範囲で投与す
ることができる。しかし、投与量は種々の条件により変
動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合も
あり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もあ
る。
【００６５】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例に制限されるものではな
い。 ［実施例１］DNAチップを使った候補遺伝子の選択 （１）DNAチップ用のRNAの調製 健常人ボランティア2名（以下、「健常群」と記載）、
ステロイド軟膏治療応答者3名、弱応答者3名（以下、そ
れぞれ「ステロイド応答群」、「ステロイド弱応答群」
と記載。また、両群を合わせて「患者群」と記載）から
ヘパリン採血した。次いで以下の方法により血液を比重
遠心分離して単核球分画を採取し、培養した。
【００６６】全血(ヘパリン抗凝固剤使用、最終濃度50
unit/mL) 40 mLを遠心管に入れた。次いで、等量の3% d
extran/0.9% NaClを加え、静かに数回、転倒混和して室
温に30分静置した。静置後、上清（platelet rich plas
ma）を回収し、1,200 rpm (revolutions per minute、
毎分回転)で5分間、室温で遠心した。上清を除き、ペレ
ットを5 mLのHank's Balanced Salt Solutions (HBSS,
GIBCO BRL)で懸濁後、5 mLのFicol-PaqueTM PLUS(Amers
ham Pharmacia Biotech)に重層し、1,200 rpmで5分間、
室温遠心後、回転数を1,500 rpmに上げ、更に30分間、
室温で遠心した。上清を除いて中間層を回収し、これを
PBSで懸濁後、1,500 rpmで5分間、室温で遠心した。上
清を捨てペレットをPBSで再懸濁し、1,500 rpmで5分
間、室温で遠心した。ペレットをRPMI1640（GIBCO BR
L）/10%FCS(SIGMA) 10 mLに懸濁した。懸濁液20μLを取
り、Trypan Blue Stain 0.4%（GIBCO BRL）で細胞染色
を行い、細胞数を数えた。10 mLのRPMI1640/10%FCS (1.
5×106個/mL)を調製し、37℃、CO2 5％下で24時間培養
を行った。次いで、以下の方法に従って全RNAを抽出し
た。
【００６７】全RNA抽出は、RNA抽出キットISOGEN (ニッ
ポンジーン)を用いてその説明書に従って行った。培養
後の細胞を3 mLのIsogen (4M guanidium thiocyanate,
25mMsodium cyanate, 0.5% Sarcosyl, 0.1M β-メルカ
プトエタノール,pH7.0)に溶解させた。20Gカテラン注射
針付2.5 mL注射器で20〜30回吸出操作を行った。CHCl3
を0.6 mL（Isogenの1/5量）加えて、ミキサーで15秒間
混合させた後、室温で2〜3分間静置させた。4℃で15,00
0 rpm、15分間遠心を行った。上清を新しいチューブに
移し、Ethachinmate (ニッポンジーン)3μL、イソプロ
パノール1.5 mL（Isogenの1/2量）を加え、転倒混和し
て室温に10分間静置させた。4℃で15,000rpm、15分間遠
心を行い、沈殿物に75% エタノール3 mL（Isogenの等
量）を加え、15,000 rpm、4℃で5分間遠心した。沈殿物
を風乾もしくは2〜3分間真空乾燥させた。RNase-free D
Wを10μL加えてRNA溶液とした。
【００６８】（２）DNAチップ用のcDNA合成 全RNA 2-5 μgから、T7-(dT)24 (Amersham Pharmacia B
iotech)をプライマーとして、Affymetrix社のExpressio
n Analysis Technical Manualの方法に従いSuperscript
II Reverse Transcriptase(Life Technologies社)を用
いて逆転写し１本鎖 cDNAを作製した。T7-(dT)24プライ
マーは、以下のようにT7プロモーターの塩基配列にd(T)
24を付加した塩基配列からなる。 T7-(dT)24プライマー： 5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTC
ACTATAGGGAGGCGG-(dT)24-3'（配列番号：１）
【００６９】次に、Expression Analysis Technical Ma
nualに従い、DNA Ligase, DNA polymerase I、およびRN
ase Hを加え、2本鎖cDNAを合成した。cDNAをフェノール
・クロロホルム抽出後、Phase Lock Gelsに通し、エタ
ノール沈澱し精製した。さらに、BioArray High Yield
RNA Transcription Labeling Kitを用い、ビオチンラベ
ルしたcRNAを合成した。RNeasy Spin column (QIAGEN)
を用いてcRNAを精製し、熱処理により断片化した。その
うち12.5 μgのcRNAをExpression Analysis Technical
Manualに従いHybridization Cocktailに加えた。これを
アレイに入れ、45℃で16時間ハイブリダイゼーションし
た。DNAチップとしてはGeneChipR HuGeneFL（Affymetri
x社製）を用いた。GeneChipR HuGeneFLは、およそ5600
種類のヒトcDNAやESTに由来する塩基配列からなるプロ
ーブで構成されている。DNAチップを洗浄した後、Strep
tavidin Phycoerythrinを加え染色した。洗浄後、norma
l ヤギIgGとビオチン化ヤギ抗ストレプトアビジンIgG抗
体の抗体混合液をアレイに加えた。さらに、蛍光強度を
増強する目的で、再度Streptavidin Phycoerythrinを加
え染色した。洗浄後、スキャナーにセットし、DNAチッ
プ解析ソフトにて解析した。
【００７０】（３）DNAチップ解析 DNAチップ解析ソフトであるSuiteを用いて発現蛍光感度
を測定し、データ解析を行った。まず全てのチップにつ
いてAbsolute analysisを行い、用いたサンプル各々の
遺伝子発現量を測定した。
【００７１】1個のチップデータの解析は、プローブセ
ットのパーフェクトマッチとミスマッチの蛍光強度を比
較して、positiveとnegativeを決定した。Positive Fra
ction、Log Avg、Pos/Negの値から判定されるAbsolute
CallであるP(present)、A (absent)、およびM (margina
l)の３区分の判定を行った。用語定義は以下に示した。 Positive Fraction; Positiveなペアの割合 Log Avg; パーフェクトマッチとミスマッチのプローブ
セルの蛍光強度比の対数の平均 Pos/Neg; Positiveペア数とNegativeペア数の比 また、パーフェクトマッチとミスマッチのプローブセル
の蛍光強度の差の平均値であるAverage Difference (Av
g Diff) も計算した。
【００７２】次に２つのデータの比較を行った。比較実
験は基準に対するチップを決め、基準チップの全遺伝子
発現量を基準にComparison Analysisを行った。基準は
健常人1人について、患者群6人のComparison Analysis
を行った。基準となる健常人について発現量の高い遺伝
子は、ソフト内の計算値の一つであるfold change値が-
3以下で、かつ (i) 健常人についての遺伝子発現判断基準Absolute cal
lがP(present)の遺伝子 (ii) 患者においての遺伝子発現判断基準Absolute call
がA(absent)またはM(marginal)の遺伝子は、健常人の発
現判断基準M(marginal)の遺伝子 (i)(ii)どちらかを満たす遺伝子を絞込み、difference
callの値がNC(Not change)、MD(Marginal Decrease)、D
(Decrease)を選んだ。
【００７３】一方、発現量の低い遺伝子については、fo
ld change値が3以上で、かつ (i)患者についてのAbsolute callがP(present)の遺伝子 (ii)健常人においてのAbsolute callがA(absent)または
M(marginal)の遺伝子は、患者の発現判断基準M(margina
l)の遺伝子 (i)(ii)どちらかを満たす遺伝子を絞り込み、differenc
e callの値がNC(Not change)、MI(Marginal Increas
e)、I(Increase)を選んだ。次いで、Avg Diff値のlogス
ケールでのscatter plotsを用いた図から、原点に近い
遺伝子は削除した。
【００７４】解析ソフトSuitで選んだ遺伝子について
は、健常群の遺伝子発現が高い場合では、基準となる二
人の合計12通りの解析結果で選ばれた遺伝子のみを選び
出した。 健常１ 対 応答１、応答２、応答３、弱応答１、弱応答２、弱応答３ 健常２ 対 応答１、応答２、応答３、弱応答１、弱応答２、弱応答３ 上記の12通りの組み合わせで、患者群と健常群で同様な
発現変動が認められる遺伝子を選抜した。
【００７５】Gene Chip Comparison Analysisにより選
出された遺伝子の分類を表１に示す。rawデータ測定値
からfold change3倍以上、1/3倍以下のものを示す。
【００７６】
【表１】
【００７７】ABI7700と相関を付けるために、Absolute
analysisのAvg Diff値を基に各々のβアクチンによる補
正を行い、健常群と患者群で興味深い変動を示した遺伝
子について最終的に選び出した。その結果、患者群で発
現レベルの上昇が見られた遺伝子としてdefensin 1遺伝
子が選抜された。defensin 1遺伝子は、アトピー性皮膚
炎患者において発現レベルが上昇するアトピー性皮膚炎
疾患に密接に関連した遺伝子である。
【００７８】[実施例２] defensin 1遺伝子の末梢血単
核球細胞での発現レベルの確認 実施例１で選択されたdefensin 1遺伝子の発現量を定量
的に確認するために、重症アトピー性皮膚炎患者と健常
者の末梢血より単離した単核球細胞(PBMC; peripheral
blood mononuclear cell)において、defensin 1遺伝子
の発現変動について解析を行った。
【００７９】健常人ボランティア7名（以下、「健常
群」と記載）、ステロイド軟膏治療応答者5名、弱応答
者6名（以下、それぞれ「ステロイド応答群」、「ステ
ロイド弱応答群」と記載。また、両群を合わせて「患者
群」と記載）を被検者とした。実施例において用いる、
遺伝子発現定量のための、PBMC (peripheral blood mon
onuclear cell, 末梢血単核球細胞)分離・培養、RNA抽
出操作は、実施例１(1)に記載の方法に従って行った。
逆転写反応操作、および定量的PCRの方法は以下の通り
である。
【００８０】（１）全RNAのDNase処理 全RNA溶液20μg、10×DNase Buffer 5μL (ニッポンジ
ーン)、RNase inhibitor (Amersham Pharmacia Biotec
h) 25ユニット、DNase I(ニッポンジーン) 1ユニットを
加え、DNase & RNase freeの水で50μLとした。37℃で1
5分間インキュベーションを行い、25μLの水飽和フェノ
ール(pH 8.0)、25μLの CHCl3を加え、転倒混和した。
室温で15,000 rpm、15分間遠心した後、上清に5μLの3M
酢酸ナトリウム (pH5.2)、125μLのエタノール、1μLの
Ethachinmateを加え、-20℃に15分間置いた。4℃で15,
000 rpm、15分間遠心を行い、沈殿物に125μLの80% エ
タノールを加えた。4℃で15,000 rpm、5分間遠心を行
い、沈殿物を風乾もしくは2〜3分間真空乾燥させた。RN
ase-free DWを10μL加えて吸光度を測定しRNA溶液とし
た。
【００８１】（２）逆転写反応 RNA溶液1-5μg、Oligo(dT)12-18プライマー(GIBCO BRL)
500 ng、BSA 1μgを加え、滅菌蒸留水で12μLとした。7
0℃で10分間静置し、氷冷した。5×First Strand Buffe
r (GIBCO BRL) 4μL、1M DTT 2μL、10mM dNTPs 1μL
(N=G、A、T、C)を加え、混和した。42℃で2分間、加温
した後、200ユニットのSuperScriptII(GIBCO BRL)を加
え、42℃で50分間反応させた。70℃で15分間処理し、逆
転写酵素を失活させ、2ユニットのRNaseH (GIBCO BRL)
を加え、37℃20分間加温した。滅菌蒸留水を加えて10ng
/μL濃度のcDNA溶液とし、定量的PCR反応に供した。
【００８２】（３）目的領域のPCR増幅 10×PCR Buffer (100 mM Tris-HCl, pH8.3、500 mM KC
l、15 mM MgCl2) 5μL、2.5 mM dNTPs 4μL (N=G、A、
T、C)、プライマーF 10 pmol/μL、プライマーR 10 pmo
l/μL、5 ng cDNA溶液、1.25ユニットrTaq DNAポリメラ
ーゼ (TaKaRa)を加え、滅菌蒸留水で50μLとした。プラ
イマーは下記の塩基配列を有する。
【００８３】プライマーF： 5'- CCA GGC TCA AGG AAA
AAC ATG -3'（配列番号：２） プライマーR： 5'- AGG TTC CAT AGC GAC GTT CTC -3'
（配列番号：３）
【００８４】95℃、10分間静置後、反応サイクル:95
℃、15秒→60℃、1分を1サイクルとし、40サイクル実施
した。次いで、電気泳動緩衝液1×TAE (50×TAEは1リッ
トル中、Trisベース242g、57.1ml氷酢酸、EDTA 50mM含
有、pH8.0)を用いて、3%アガロースゲル(Agarose-100
0、GIBCO-BRL)/ 5μg/mLエチジウムブロマイドを使用
し、電圧100Vで30分間泳動した。UVランプでPCR産物76
bpのバンドを観察した。
【００８５】（４）DNA断片切り出し 目的PCR産物のゲルからの切り出しは、QIAEX II Agaros
e Gel Extractionキット(QIAGEN)を用いてその説明書に
従って行った。PCR産物の3%アガロースゲルにより分離
した後、目的断片を長波長（316 nm）UVで切り出した。
ゲルを剃刀を用いて細断し、1.5mlチューブ（〜250 mg
gel）に移した。6倍量のBufferQX1（ex.gel 50mgに対し
て300μl）、10μL のQIAEX IIガラスビーズを加え30秒
間vortex mixerを用いてよく攪拌した。50℃で10分間加
温し、この時、数分おきに混和し、混合液が黄色になっ
ていることを確認した。もし混合液がオレンジか紫なら
10μLの3M 酢酸ナトリウム(pH5.0)を加える。室温で12,
000 rpm、30秒間遠心した後、沈殿物に500μLのBufferQ
X1を加え、vortex mixerを用いてよく攪拌し、室温で1
2,000 rpm、30秒間遠心した。次いで、沈殿物に500μL
のPE溶液を加え、室温で12,000 rpm、30秒間遠心した
（操作（Ａ））。操作（Ａ）を2回繰り返し、上清を捨
て、ペレットが白くなるまで乾燥させた。20μLの滅菌
蒸留水を加え、5分間静置した後、室温で12,000 rpm、3
0秒間遠心し、上清を回収した（操作（Ｂ））。操作
（Ｂ）を2回繰り返した後、アガロースゲル電気泳動で
抽出確認を行った。
【００８６】（５）PCR産物のTAクローニング 精製PCR産物のクローニングは、pGEMR-T Easy Vector S
ystem I (Promega) を用いてその説明書に従って行っ
た。2×Rapid Ligation Buffer 5μL、pGEMR-T Easy Ve
ctor(50ng/μL) 1μL、精製PCR産物3μL、T4 DNA Ligas
e(3 weiss units/μl) 1μLを混ぜ、室温で1時間(もし
くは16℃で一昼夜)静置した。ライゲーション反応液2μ
LをCompetent Cell DH5α(GIBCO BRL)50μlに加え、氷
上で20分間静置した。42℃で45〜50秒間の熱ショック処
理を行い、氷上で2分間静置した。SOCmedium (GIBCO BR
L)950μLを加え、37℃で1〜1.5時間、150 rpmで混和し
た後、培養液100μLをLB/amp/IPTG/X-galにプレーティ
ングし、37℃で一晩静置した。
【００８７】（６）plasmid DNA抽出 サブクローンプラスミドDNAはWizard Plus SV Miniprep
s DNA Purification System (Promega) を用いてその説
明書に従って行った。白コロニーをピックアップし、10
0μg/mLアンピシリン-LB培地1〜5mLで37℃で一晩培養
し、3,000 rpmで6分間遠心した。沈殿物に250μLのresu
spended solutionを加え懸濁し、250μLのLysis soluti
onを加え、4回転倒混和した。10μLのAlkaline Proteas
eを加え、4回転倒混和し、5分間室温にて静置した。350
μLのNeutralization solutionを加えて4回転倒混和
し、室温で14,000 rpm、10分間遠心した。次いで、上清
をデカンテーションで添付カラムに移し、室温で14,000
rpm、10分間遠心した。カラム部分（フォロースルーは
捨てる）に700μLのWash solutionを加え、室温で14,00
0 rpm、1分間遠心した。カラム部分（フォロースルーは
捨てる）に250μLのWashsolutionを加え、室温で14,000
rpm、2分間遠心した。カラム部分を新しいチューブに
移し、20μLの滅菌蒸留水を加え、室温で14,000 rpm、1
分間遠心した。溶液をプラスミドDNAとし、吸光度測定
にて濃度を決定した。
【００８８】（７）シークエンス反応 サブクローンプラスミドDNAが目的DNA配列を含んでいる
かを確認するためのシークエンス反応は、Thermo Sequi
nase IIダイターミネーター(Amersham Pharmacia Biote
ch)を用いてその説明書に従って行った。M13 primer 3
pmol、DNA溶液200〜300 ng、TSII Reagent Mix 2μLを
加え、滅菌蒸留水で10μLとした。96℃、1分間静置後、
反応サイクル:96℃、30秒→50℃、15秒→60℃、1分を1
サイクルとし、30サイクル実施し、反応終了後は4℃に
設定した。反応液に1.5M酢酸ナトリウム/250 mM EDTAを
1μL加え、vortex mixerで攪拌した。イソプロパノール
20μLを加えよく混和後、室温で10分間静置した。12,00
0 rpmで20分間遠心を行い、沈殿に70%エタノール150μL
を加え、混和した。12,000 rpmで5分間遠心を行い、沈
殿物を風乾もしくは2〜3分間真空乾燥させた。次いで、
ローディングダイ1.5μLを加え、95℃で2分間熱処理を
行い、氷冷した。ABI377 DNAシークエンサー(Applied B
iosystems)にセットしたLongRangerゲル(LongRanger 5
mL、尿素15 g、10×TBE 5mL、10%APS 250μL、TEMED 35
μL、滅菌蒸留水で50 mLとする)に全量アプライし、泳
動を開始した。目的DNA配列を含んでいることを確認の
後、これを標準サンプルとした。
【００８９】（８）定量的PCR 遺伝子発現定量は、ABI PRISM 7700 Systemを用いたTaq
Manプローブ使用のリアルタイムPCRにより行い、その説
明書に従って行った。反応試薬はTaqMan 1000Reaction
PCR Core reagents (Applied Biosystems)を用い、その
説明書に従って行った。検量線作成のための標準サンプ
ルは最低5段階の濃度勾配、107〜103コピーを作成し
た。1サンプル当りのｎ数は最低2つとした。10×Buffer
A 5μL、25 mM MgCl2 7μL、10mM dNTPs 1μL (N=G、
A、T、C)ずつ、AmpTaqGold 1.25ユニット、UNG 0.5ユニ
ット、プライマーF （配列番号：２）10 pmol、プライ
マーR （配列番号：３）10 pmol、cDNA溶液 5 ng、TaqM
an Probe 5 pmolを加え、滅菌蒸留水で50μLとした。プ
ローブは下記の塩基配列を有する。
【００９０】TaqManプローブ： 5'- (FAM)TTG CAG AAT
ACC AGC CTG GAT TGC(TAMRA) -3'（配列番号：４） FAM: 6-carboxyfluorescein TAMRA: 6-carboxy-tetramethylrhodamine
【００９１】50℃、2分間、95℃、10分間静置後、反応
サイクル:95℃、15秒→60℃、1分を1サイクルとし、50
サイクル実施した。標準サンプルの相対的な初期濃度の
対数値に対してのPCR増幅曲線のCt (threshold cycle
s)値から、検量線が自動的に作成され、これをもとに未
知サンプルの相対的な初期濃度を算出した。
【００９２】また、試料中のcDNA濃度の差を補正するた
め、補正用内部標準としてβ-アクチン(β-actin)遺伝
子、およびグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素(GAP
DH)遺伝子について同様の定量解析を行い、それら遺伝
子のコピー数を基に補正して、目的遺伝子のコピー数を
算出した。βアクチン、あるいはGAPDH測定用のプライ
マーとプローブは、TaqMan β-actin Control Reagents
（Applied Biosystems）に添付のものを用いて行った。
塩基配列は以下の通りである。
【００９３】βアクチンフォーワードプライマー： 5'
- TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACGA -3'（配列番号：
５） βアクチンリバースプライマー： 5'- CAG CGG AAC CG
C TCA TTG CCA ATG G -3'（配列番号：６） βアクチンTaqManプローブ： 5'- (FAM)ATGCCC-T(TAMR
A)-CCCCCATGCCATCCTGCGTp-3'（配列番号：７） GAPDHフォーワードプライマー： 5'- GAAGGTGAAGGTCGG
AGT -3'（配列番号：８） GAPDHリバースプライマー： 5'- GAAGATGGTGATGGGATTT
C -3'（配列番号：９） GAPDH TaqManプローブ： 5'- (FAM)CAAGCTTCCCGTTCTCA
GCC(TAMRA) -3'（配列番号：１０）
【００９４】βアクチンにより補正したdefensin 1遺伝
子の発現量（copy/ng RNA）を図１（上）に、GAPDHによ
り補正したdefensin 1遺伝子の発現量（copy/ng RNA）
を図２（上）に示す。また、実際のデータを表２に示
す。
【００９５】
【表２】
【００９６】（９）統計解析 統計解析は、3群間での比較はFisher分散分析とKruskal
-Walli検定により、また、健常群と患者群、あるいはス
テロイド応答群とステロイド弱応答群の2群間の比較はF
isher分散分析とMann-Whitney検定により行った。結果
を表３、および図１（下）、図２（下）に示す。患者群
においてdefensin1の発現量が有意に高いことが確認さ
れた。以上の結果より、defensin 1遺伝子の発現量差が
重症アトピー性皮膚炎患者と健常人間で認められ、この
発現増加がアトピー性皮膚炎の重症度と関連することが
分かった。
【００９７】
【表３】
【００９８】
【発明の効果】アレルギー性疾患の患者と健常者との間
で発現レベルに差が見られるdefensin1遺伝子が見出さ
れた。該遺伝子の発現レベルを指標とすることにより、
アレルギー性疾患の検査方法、および該疾患の治療のた
めの化合物をスクリーニングする方法が可能となった。
本発明のdefensin 1遺伝子は、その発現亢進が病態と結
びついていることから、それを抑えることがアレルギー
性疾患の治療戦略のターゲットとなるとともに、そのよ
うな新しい治療法におけるモニタリングのための新しい
臨床診断指標としての有用性が期待できる。本発明によ
って提供されたdefensin 1遺伝子は、アレルゲンの種類
に関わらず、簡便にその発現レベルを知ることができ
る。従って、アレルギー反応の病態を総合的に把握する
ことができる。また本発明によるアレルギーの検査方法
は、生体試料を試料としてその発現レベルを解析するこ
とができるので、患者に対する侵襲性が低い。しかも遺
伝子発現解析に関しては、微量サンプルによる高感度な
測定が可能である。遺伝子解析技術は、年々ハイスルー
プット化、低価格化が進行している。従って本発明によ
るアレルギーの検査方法は、近い将来、ベッドサイドに
おける重要な診断方法となることが期待される。この意
味でこのdefensin 1遺伝子の診断的価値は高い。
【００９９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Genox Research, Inc. The President of National Children's Hospital <120> Method for examination for allergosis <130> G1-A0010 <140> <141> <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized T7-d(T)24 primer sequence <400> 1 ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggaggcggt tttttttttt tttttttttt 60 ttt 63 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 2 ccaggctcaa ggaaaaacat g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 3 aggttccata gcgacgttct c 21 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized TaqMan probe sequence <220> <221> misc_binding <222> (1) <223> Label FAM (6-carboxy-fluorescein) <220> <221> misc_binding <222> (24) <223> Label TAMRA (6-carboxy-N,N,N',N'-tetramethylrhodamine) <400> 4 ttgcagaata ccagcctgga ttgc 24 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 5 tcacccacac tgtgcccatc tacga 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 6 cagcggaacc gctcattgcc aatgg 25 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized TaqMan probe sequence <220> <221> misc_binding <222> (1) <223> Label FAM (6-carboxy-fluorescein) <220> <221> misc_binding <222> (7) <223> Label TAMRA (6-carboxy-N,N,N',N'-tetramethylrhodamine) <400> 7 atgccctccc ccatgccatc ctgcgt 26 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 8 gaaggtgaag gtcggagt 18 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 9 gaagatggtg atgggatttc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized TaqMan probe sequence <220> <221> misc_binding <222> (1) <223> Label FAM (6-carboxy-fluorescein) <220> <221> misc_binding <222> (20) <223> Label TAMRA (6-carboxy-N,N,N',N'-tetramethylrhodamine) <400> 10 caagcttccc gttctcagcc 20
【図面の簡単な説明】
【図１】アレルギー性疾患患者および健常者におけるde
fensin 1遺伝子の発現レベルを測定した結果を示すグラ
フ。上のグラフは、各被検者のβ−アクチン遺伝子で補
正した測定値（copy/ng RNA）を示す。下のグラフは、
各群間の統計解析結果を示す。図中、Vは健常者、Rはス
テロイド応答群、Pはステロイド弱応答群を示す。また
数字は、被検者の番号を表す。
【図２】ステロイド応答群、ステロイド弱応答群、およ
び健常者におけるdefensin 1遺伝子の発現レベルを測定
した結果を示すグラフ。上のグラフは、各被検者のGAPD
H遺伝子で補正した測定値（copy/ng RNA）を示す。下の
グラフは、各群間の統計解析結果を示す。図中、Vは健
常者、Rはステロイド応答群、Pはステロイド弱応答群を
示す。また数字は、被検者の番号を表す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｃ０８６ 48/00 Ａ６１Ｐ 37/08 Ａ６１Ｐ 37/08 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｑ // Ｇ０１Ｎ 33/53 (Ｃ１２Ｑ 1/02 (Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 瓶子 昌幸 神奈川県川崎市宮前区野川907 帝京大学 生物工学研究センター内 株式会社ジェノ ックス創薬研究所内 (72)発明者 加賀谷 伸治 神奈川県川崎市宮前区野川907 帝京大学 生物工学研究センター内 株式会社ジェノ ックス創薬研究所内 (72)発明者 郡司 誉道 東京都中央区銀座２−７−12 三共株式会 社臨床研究部 (72)発明者 斎藤 博久 東京都世田谷区太子堂３−35−31 国立小 児病院・小児医療研究センター 免疫アレ ルギー研究部 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB07 BB10 BB20 BB24 BB48 CA25 DA13 DA36 FB02 FB03 FB07 GA01 GC15 4B024 AA11 CA04 CA09 HA09 HA14 HA15 4B063 QA01 QA12 QA18 QA19 QQ02 QQ08 QQ20 QQ52 QQ53 QQ58 QR32 QR40 QR56 QR62 QR80 QR84 QS05 QS14 QS25 QS34 QS39 4C084 AA13 AA17 NA14 ZB132 4C085 AA02 AA08 BB11 CC21 CC32 4C086 AA01 EA16 NA14 ZB13

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次の工程を含む、アレルギー性疾患の検査
    方法。 （１）被検者の生体試料におけるdefensin 1遺伝子の発
    現レベルを測定する工程 （２）健常者の生体試料におけるdefensin 1遺伝子の発
    現レベルと比較する工程
  2. 【請求項２】アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎であ
    る、請求項１に記載の検査方法。
  3. 【請求項３】遺伝子の発現レベルを、cDNAのPCRによっ
    て測定する請求項１に記載の検査方法。
  4. 【請求項４】遺伝子の発現レベルを、defensin 1遺伝子
    によってコードされる蛋白質の検出によって測定する請
    求項１に記載の検査方法。
  5. 【請求項５】defensin 1遺伝子の塩基配列を含むポリヌ
    クレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有
    する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオ
    チドからなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
  6. 【請求項６】defensin 1蛋白質のアミノ酸配列を含むペ
    プチドを認識する抗体からなる、アレルギー性疾患検査
    用試薬。
  7. 【請求項７】次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療
    薬のスクリーニング方法。 （１）defensin 1遺伝子を発現する細胞に候補化合物を
    接触させる工程、（２）前記遺伝子の発現レベルを測定
    する工程、（３）対照と比較して前記遺伝子の発現レベ
    ルを低下させる化合物を選択する工程
  8. 【請求項８】細胞が株化白血球細胞である請求項７に記
    載の方法。
  9. 【請求項９】defensin 1遺伝子の塩基配列を含むポリヌ
    クレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有
    する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオ
    チドと、defensin 1遺伝子を発現する細胞を含む、アレ
    ルギー性疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングする
    ためのキット。
  10. 【請求項１０】defensin 1蛋白質のアミノ酸配列を含む
    ペプチドを認識する抗体と、defensin 1遺伝子を発現す
    る細胞を含む、アレルギー性疾患の治療薬候補化合物を
    スクリーニングするためのキット。
  11. 【請求項１１】defensin 1遺伝子の単核球における発現
    強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物か
    らなるアレルギー性疾患モデル動物。
  12. 【請求項１２】次の工程を含む、アレルギー性疾患の治
    療薬のスクリーニング方法。 （１）請求項１１に記載のモデル動物に候補化合物を投
    与する工程、（２）前記モデル動物の生体試料における
    defensin 1遺伝子の発現強度を測定する工程、（３）対
    照と比較して前記遺伝子の発現レベルを低下させる化合
    物を選択する工程、
  13. 【請求項１３】次の工程を含む、アレルギー性疾患の治
    療薬のスクリーニング方法。 （１）defensin 1遺伝子の転写調節領域と、この転写調
    節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子とを含むベ
    クターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、
    （２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、お
    よび（３）対照と比較して前記遺伝子の発現レベルを低
    下させる化合物を選択する工程
  14. 【請求項１４】次の工程を含む、アレルギー性疾患の治
    療薬のスクリーニング方法。 （１）defensin 1蛋白質と候補物質を接触させる工程、
    （２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および（３）
    対照と比較して前記蛋白質の活性を低下させる化合物を
    選択する工程
  15. 【請求項１５】請求項７、請求項１２、請求項１３、お
    よび請求項１４のいずれかに記載のスクリーニング方法
    によって得ることができる化合物を有効成分として含有
    する、アレルギー性疾患の治療薬。
  16. 【請求項１６】defensin 1遺伝子、またはその一部のア
    ンチセンスDNAを主成分として含むアレルギー性疾患の
    治療薬。
  17. 【請求項１７】defensin 1蛋白質のアミノ酸配列を含む
    ペプチドを認識する抗体を主成分として含む、アレルギ
    ー性疾患の治療薬。
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