JP2002306170A - アレルギー性疾患の検査方法 - Google Patents
アレルギー性疾患の検査方法Info
- Publication number
- JP2002306170A JP2002306170A JP2001108631A JP2001108631A JP2002306170A JP 2002306170 A JP2002306170 A JP 2002306170A JP 2001108631 A JP2001108631 A JP 2001108631A JP 2001108631 A JP2001108631 A JP 2001108631A JP 2002306170 A JP2002306170 A JP 2002306170A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- trail
- expression level
- allergic disease
- screening
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 118
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 title claims abstract description 99
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 222
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 128
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 61
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 39
- 108700012411 TNFSF10 Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 102000046283 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 101100369992 Homo sapiens TNFSF10 gene Proteins 0.000 claims abstract 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 39
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 25
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 23
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 19
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 17
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 16
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 15
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 15
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 14
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 14
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 14
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 13
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 claims description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 claims description 12
- 238000010998 test method Methods 0.000 claims description 12
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 10
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 9
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 abstract description 2
- 101710097160 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Proteins 0.000 abstract 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 44
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 31
- 230000004044 response Effects 0.000 description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 18
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 17
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 17
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 11
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 9
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 7
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 101000830565 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Proteins 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 5
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 5
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 4
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 208000012657 Atopic disease Diseases 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 3
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 101150062031 L gene Proteins 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- CESGKXMBHGUQTB-VONOSFMSSA-N [(1S,2S,6R,10S,11R,13S,14R,15R)-1,6,14-trihydroxy-8-(hydroxymethyl)-4,12,12,15-tetramethyl-5-oxo-13-tetracyclo[8.5.0.02,6.011,13]pentadeca-3,8-dienyl] tetradecanoate Chemical compound C1=C(CO)C[C@]2(O)C(=O)C(C)=C[C@H]2[C@@]2(O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@]3(OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(C)(C)[C@H]3[C@@H]21 CESGKXMBHGUQTB-VONOSFMSSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 2
- 230000035584 blastogenesis Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000003163 cell fusion method Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003617 erythrocyte membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000007233 immunological mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 208000037851 severe atopic dermatitis Diseases 0.000 description 2
- FQZYTYWMLGAPFJ-OQKDUQJOSA-N tamoxifen citrate Chemical compound [H+].[H+].[H+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 FQZYTYWMLGAPFJ-OQKDUQJOSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- OWEFQTXQEHYDEJ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxypropanal diphosphono hydrogen phosphate Chemical compound OCC(O)C=O.OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O OWEFQTXQEHYDEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COCMHKNAGZHBDZ-UHFFFAOYSA-N 4-carboxy-3-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]benzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(C([O-])=O)=CC=C1C(O)=O COCMHKNAGZHBDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102100033029 Carbonic anhydrase-related protein 11 Human genes 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000511343 Chondrostoma nasus Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 206010015995 Eyelid ptosis Diseases 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000003676 Glucocorticoid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000079 Glucocorticoid Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102100036738 Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-11 Human genes 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000867841 Homo sapiens Carbonic anhydrase-related protein 11 Proteins 0.000 description 1
- 101100283445 Homo sapiens GNA11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001075218 Homo sapiens Gastrokine-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000879758 Homo sapiens Sjoegren syndrome nuclear autoantigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 241000208465 Proteaceae Species 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102100037330 Sjoegren syndrome nuclear autoantigen 1 Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000011449 brick Substances 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000002635 electroconvulsive therapy Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012812 general test Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 244000309715 mini pig Species 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 1
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 201000003004 ptosis Diseases 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- ZVCDLGYNFYZZOK-UHFFFAOYSA-M sodium cyanate Chemical compound [Na]OC#N ZVCDLGYNFYZZOK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、アレルギー性疾患の検出方法の提
供を課題とする。 【解決手段】アレルギー性疾患の患者と健常者との間で
発現レベルに差が見られる遺伝子TRAIL (TNF-related a
poptosis inducing ligand)を見出した。TRAIL遺伝子は
患者群において発現が低下する遺伝子である。末梢血単
核球におけるTRAIL遺伝子の発現レベルを指標とする、
アレルギー性疾患の検査方法、および該疾患の治療のた
めの化合物のスクリーニング方法を提供する。
供を課題とする。 【解決手段】アレルギー性疾患の患者と健常者との間で
発現レベルに差が見られる遺伝子TRAIL (TNF-related a
poptosis inducing ligand)を見出した。TRAIL遺伝子は
患者群において発現が低下する遺伝子である。末梢血単
核球におけるTRAIL遺伝子の発現レベルを指標とする、
アレルギー性疾患の検査方法、および該疾患の治療のた
めの化合物のスクリーニング方法を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アレルギー性疾患
の検査方法に関する。
の検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アトピー性皮膚炎等のアレルギー性疾患
は、多因子性の病気(multifactorialdiseases)と考えら
れている。これらの病気は多くの異なる遺伝子の発現の
相互作用によって起こり、これらの個々の遺伝子の発現
は、複数の環境要因によって影響を受ける。このため、
特定の病気を起こす特定の遺伝子を解明することは、非
常に困難である。
は、多因子性の病気(multifactorialdiseases)と考えら
れている。これらの病気は多くの異なる遺伝子の発現の
相互作用によって起こり、これらの個々の遺伝子の発現
は、複数の環境要因によって影響を受ける。このため、
特定の病気を起こす特定の遺伝子を解明することは、非
常に困難である。
【０００３】またアレルギー性疾患には、変異や欠陥を
有する遺伝子の発現や、特定の遺伝子の過剰発現や発現
量の減少が関わっていると考えられている。病気に関し
て遺伝子発現が果たしている役割を解明するためには、
遺伝子が発症にどのように関わり、薬剤などの外的な刺
激が遺伝子発現をどのように変化させるのかを理解する
必要がある。
有する遺伝子の発現や、特定の遺伝子の過剰発現や発現
量の減少が関わっていると考えられている。病気に関し
て遺伝子発現が果たしている役割を解明するためには、
遺伝子が発症にどのように関わり、薬剤などの外的な刺
激が遺伝子発現をどのように変化させるのかを理解する
必要がある。
【０００４】さて、現在アレルギー性疾患の診断におい
ては、一般に、問診、家族歴、そして本人の既往症の確
認が重要な要素となっている。またアレルギーをより客
観的な情報に基づいて診断するために、血液を試料とす
る試験方法や、アレルゲンに対する患者の免疫学的な応
答を観察する方法も実施されている。前者の例として、
アレルゲン特異的IgE測定、白血球ヒスタミン遊離試
験、あるいはリンパ球幼若化試験等が挙げられる。アレ
ルゲン特異的IgEの存在は、そのアレルゲンに対するア
レルギー反応の証明である。しかし患者によっては、必
ずしもアレルゲン特異的なIgEを検出できるとは限らな
い場合もある。また、その測定原理上、診断に必要なア
レルゲンの全てに対して、試験を実施しなければならな
い。白血球ヒスタミン遊離試験やリンパ球幼若化試験
は、免疫システムのアレルゲンに対する反応をin vitro
で観察する方法である。これらの方法は、操作が煩雑で
ある。
ては、一般に、問診、家族歴、そして本人の既往症の確
認が重要な要素となっている。またアレルギーをより客
観的な情報に基づいて診断するために、血液を試料とす
る試験方法や、アレルゲンに対する患者の免疫学的な応
答を観察する方法も実施されている。前者の例として、
アレルゲン特異的IgE測定、白血球ヒスタミン遊離試
験、あるいはリンパ球幼若化試験等が挙げられる。アレ
ルゲン特異的IgEの存在は、そのアレルゲンに対するア
レルギー反応の証明である。しかし患者によっては、必
ずしもアレルゲン特異的なIgEを検出できるとは限らな
い場合もある。また、その測定原理上、診断に必要なア
レルゲンの全てに対して、試験を実施しなければならな
い。白血球ヒスタミン遊離試験やリンパ球幼若化試験
は、免疫システムのアレルゲンに対する反応をin vitro
で観察する方法である。これらの方法は、操作が煩雑で
ある。
【０００５】一方、患者を実際にアレルゲンに接触させ
たときに観察される免疫応答をアレルギーの診断に役立
てる方法（後者）も公知である。ブリック・テスト、ス
クラッチ・テスト、パッチ・テスト、皮内反応、あるい
は誘発試験等が、この種の試験に含まれる。これらの試
験では、患者のアレルギー反応を直接診断することがで
きる反面、実際に被検者をアレルゲンに曝露する侵襲性
の高い検査であると言うことができる。
たときに観察される免疫応答をアレルギーの診断に役立
てる方法（後者）も公知である。ブリック・テスト、ス
クラッチ・テスト、パッチ・テスト、皮内反応、あるい
は誘発試験等が、この種の試験に含まれる。これらの試
験では、患者のアレルギー反応を直接診断することがで
きる反面、実際に被検者をアレルゲンに曝露する侵襲性
の高い検査であると言うことができる。
【０００６】この他、アレルゲンに関わらず、アレルギ
ー反応の関与を証明するための試験方法も試みられてい
る。たとえば、血清IgE値が高値である場合、その患者
にはアレルギー反応が起きていると推定することができ
る。血清IgE値は、アレルゲン特異IgEの総量に相当する
情報である。アレルゲンの種類に関わらずIgEの総量を
決定することは容易であるが、非アトピー型気管支炎喘
息等の疾患を持つ患者では、IgEが低値となる場合があ
る。
ー反応の関与を証明するための試験方法も試みられてい
る。たとえば、血清IgE値が高値である場合、その患者
にはアレルギー反応が起きていると推定することができ
る。血清IgE値は、アレルゲン特異IgEの総量に相当する
情報である。アレルゲンの種類に関わらずIgEの総量を
決定することは容易であるが、非アトピー型気管支炎喘
息等の疾患を持つ患者では、IgEが低値となる場合があ
る。
【０００７】従って、患者に対する危険が少なく、しか
も診断に必要な情報を容易に得ることができるアレルギ
ー性疾患のマーカーが提供されれば有用である。このよ
うなマーカーは、アレルギー性疾患の発症に深く関与し
ていると考えられるので、診断のみならず、アレルギー
症状のコントロールにおいても、重要な標的となる可能
性がある。
も診断に必要な情報を容易に得ることができるアレルギ
ー性疾患のマーカーが提供されれば有用である。このよ
うなマーカーは、アレルギー性疾患の発症に深く関与し
ていると考えられるので、診断のみならず、アレルギー
症状のコントロールにおいても、重要な標的となる可能
性がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、アレルギー
性疾患の検査を可能とする新しい指標の提供、さらに、
該指標に基づくアレルギー性疾患の検査方法、およびア
レルギー性疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法
の提供を課題とする。
性疾患の検査を可能とする新しい指標の提供、さらに、
該指標に基づくアレルギー性疾患の検査方法、およびア
レルギー性疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法
の提供を課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意研究を行った結果、アレルギー性疾
患の患者と健常者との間で発現レベルに差が見られる遺
伝子を単離し、アレルギー反応との関連性を明らかにす
ることにより、アレルギー性疾患治療の新たな標的を見
出すことができるものと考えた。
解決するために鋭意研究を行った結果、アレルギー性疾
患の患者と健常者との間で発現レベルに差が見られる遺
伝子を単離し、アレルギー反応との関連性を明らかにす
ることにより、アレルギー性疾患治療の新たな標的を見
出すことができるものと考えた。
【００１０】このような考えに基づき、本発明者らは、
ステロイド軟膏治療を受けているアトピー性皮膚炎患者
と健常者との間で発現状態の違う遺伝子の探索を行っ
た。一般的にステロイド治療では、その応答としてグル
ココルチコイド受容体の発現変動が見られるが、今回の
被検者においては、この発現変動の大きな差が見られな
かったことから、患者と健常者間における遺伝子発現の
変動は、ステロイド治療自体に起因するものではないと
考えられる。また、遺伝子の発現状態を比較する生体試
料としては、末梢血単核球を選択した。アトピー性疾患
の患者への抗原刺激によって末梢血単核球からのIL-5、
IL-6およびIL10の分泌が知られており、末梢血単核球は
アレルギー反応と密接に関係している(Jenmalm M. C. e
t al., Pediatr. Allergy Immunol. 10: 168-177, 199
9)。つまり、末梢血単核球において発現が変動する遺伝
子は、アレルギー反応に深い関連性を有する遺伝子であ
ると言える。さらに末梢血単核球は、収得するのが容易
であるため偽陰性をなくすための高収量が期待でき、従
って微量な遺伝子の発現を検出することが可能なものと
考えられる。
ステロイド軟膏治療を受けているアトピー性皮膚炎患者
と健常者との間で発現状態の違う遺伝子の探索を行っ
た。一般的にステロイド治療では、その応答としてグル
ココルチコイド受容体の発現変動が見られるが、今回の
被検者においては、この発現変動の大きな差が見られな
かったことから、患者と健常者間における遺伝子発現の
変動は、ステロイド治療自体に起因するものではないと
考えられる。また、遺伝子の発現状態を比較する生体試
料としては、末梢血単核球を選択した。アトピー性疾患
の患者への抗原刺激によって末梢血単核球からのIL-5、
IL-6およびIL10の分泌が知られており、末梢血単核球は
アレルギー反応と密接に関係している(Jenmalm M. C. e
t al., Pediatr. Allergy Immunol. 10: 168-177, 199
9)。つまり、末梢血単核球において発現が変動する遺伝
子は、アレルギー反応に深い関連性を有する遺伝子であ
ると言える。さらに末梢血単核球は、収得するのが容易
であるため偽陰性をなくすための高収量が期待でき、従
って微量な遺伝子の発現を検出することが可能なものと
考えられる。
【００１１】本発明者らは、末梢血単核球における遺伝
子の発現状態を解析した結果、TRAIL (TNF-related apo
ptosis inducing ligand)遺伝子がアレルギー性疾患の
患者の単核球において、発現が低下していることを確認
した。このTRAIL遺伝子は、多くの癌細胞に対しアポト
ーシスを誘導する作用(Pitti R. M. et. al., J. Biol.
Chem. 271: 12687-12690, 1996)があり、多発性硬化症
等の種々の疾患において、発現異常が報告されている(H
uang W-X. et. al., Neurology 55: 928-934,2000)。し
かし、アレルギー性疾患との直接的な関連性については
これまでのところ知られていない。今回、アレルギー性
疾患患者の末梢血単核球において、該遺伝子の発現レベ
ルに変動が観察されたという事実は、該遺伝子とアレル
ギー症状との深い結びつきを表しているものと言える。
以上の知見に基づいて、本発明者らは、このTRAIL遺伝
子の発現レベル、あるいは該遺伝子によってコードされ
る蛋白質の活性を指標とすることにより、アレルギー性
疾患の診断、および該疾患のための治療薬のスクリーニ
ングをすることが可能であることを見出し、本発明を完
成させた。
子の発現状態を解析した結果、TRAIL (TNF-related apo
ptosis inducing ligand)遺伝子がアレルギー性疾患の
患者の単核球において、発現が低下していることを確認
した。このTRAIL遺伝子は、多くの癌細胞に対しアポト
ーシスを誘導する作用(Pitti R. M. et. al., J. Biol.
Chem. 271: 12687-12690, 1996)があり、多発性硬化症
等の種々の疾患において、発現異常が報告されている(H
uang W-X. et. al., Neurology 55: 928-934,2000)。し
かし、アレルギー性疾患との直接的な関連性については
これまでのところ知られていない。今回、アレルギー性
疾患患者の末梢血単核球において、該遺伝子の発現レベ
ルに変動が観察されたという事実は、該遺伝子とアレル
ギー症状との深い結びつきを表しているものと言える。
以上の知見に基づいて、本発明者らは、このTRAIL遺伝
子の発現レベル、あるいは該遺伝子によってコードされ
る蛋白質の活性を指標とすることにより、アレルギー性
疾患の診断、および該疾患のための治療薬のスクリーニ
ングをすることが可能であることを見出し、本発明を完
成させた。
【００１２】即ち、本発明はアレルギー性疾患の検査を
可能とする新しい指標の提供、さらに、該指標に基づく
アレルギー性疾患の検査方法、およびアレルギー性疾患
治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関し、より具
体的には、〔１〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の
検査方法、 （１）被検者の生体試料におけるTRAIL遺伝子の発現レ
ベルを測定する工程 （２）健常者の生体試料におけるTRAIL遺伝子の発現レ
ベルと比較する工程 〔２〕アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎である、
〔１〕に記載の検査方法、〔３〕遺伝子の発現レベル
を、cDNAのPCRによって測定する〔１〕に記載の検査方
法、〔４〕遺伝子の発現レベルを、TRAIL遺伝子によっ
てコードされる蛋白質の検出によって測定する〔１〕に
記載の検査方法、〔５〕TRAIL遺伝子の塩基配列を含む
ポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配
列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌ
クレオチドからなる、アレルギー性疾患検査用試薬、
〔６〕TRAIL蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認
識する抗体からなる、アレルギー性疾患検査用試薬、
〔７〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のス
クリーニング方法、（１）TRAIL遺伝子を発現する細胞
に候補化合物を接触させる工程、（２）前記遺伝子の発
現レベルを測定する工程、（３）対照と比較して前記遺
伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程 〔８〕細胞が株化白血球細胞である〔７〕に記載の方
法、
可能とする新しい指標の提供、さらに、該指標に基づく
アレルギー性疾患の検査方法、およびアレルギー性疾患
治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関し、より具
体的には、〔１〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の
検査方法、 （１）被検者の生体試料におけるTRAIL遺伝子の発現レ
ベルを測定する工程 （２）健常者の生体試料におけるTRAIL遺伝子の発現レ
ベルと比較する工程 〔２〕アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎である、
〔１〕に記載の検査方法、〔３〕遺伝子の発現レベル
を、cDNAのPCRによって測定する〔１〕に記載の検査方
法、〔４〕遺伝子の発現レベルを、TRAIL遺伝子によっ
てコードされる蛋白質の検出によって測定する〔１〕に
記載の検査方法、〔５〕TRAIL遺伝子の塩基配列を含む
ポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配
列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌ
クレオチドからなる、アレルギー性疾患検査用試薬、
〔６〕TRAIL蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認
識する抗体からなる、アレルギー性疾患検査用試薬、
〔７〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のス
クリーニング方法、（１）TRAIL遺伝子を発現する細胞
に候補化合物を接触させる工程、（２）前記遺伝子の発
現レベルを測定する工程、（３）対照と比較して前記遺
伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程 〔８〕細胞が株化白血球細胞である〔７〕に記載の方
法、
〔９〕TRAIL遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオ
チド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少
なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチド
と、TRAIL遺伝子を発現する細胞を含む、アレルギー性
疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキ
ット、〔１０〕TRAIL蛋白質のアミノ酸配列を含むペプ
チドを認識する抗体と、TRAIL遺伝子を発現する細胞を
含む、アレルギー性疾患の治療薬候補化合物をスクリー
ニングするためのキット、〔１１〕TRAIL遺伝子の単核
球における発現強度を低下させたトランスジェニック非
ヒト脊椎動物からなるアレルギー性疾患モデル動物、
〔１２〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬の
スクリーニング方法、（１）被験動物に候補化合物を投
与する工程、（２）前記動物の生体試料におけるTRAIL
遺伝子の発現レベルを測定する工程、（３）対照と比較
して前記遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択
する工程、〔１３〕次の工程を含む、アレルギー性疾患
の治療薬のスクリーニング方法、（１）TRAIL遺伝子の
転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現する
レポーター遺伝子とを含むベクターを導入した細胞と候
補化合物を接触させる工程、（２）前記レポーター遺伝
子の活性を測定する工程、および（３）対照と比較して
前記遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する
工程〔１４〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療
薬のスクリーニング方法、（１）TRAIL蛋白質と候補化
合物を接触させる工程、（２）前記蛋白質の活性を測定
する工程、および（３）対照と比較して前記蛋白質の活
性を上昇させる化合物を選択する工程〔１５〕〔７〕、
〔１２〕、〔１３〕、および〔１４〕のいずれかに記載
のスクリーニング方法によって得ることができる化合物
を有効成分として含有する、アレルギー性疾患の治療
薬、〔１６〕TRAIL遺伝子そのもの、またはTRAIL蛋白質
を有効成分として含有する、アレルギー性疾患の治療
薬、を提供するものである。
チド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少
なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチド
と、TRAIL遺伝子を発現する細胞を含む、アレルギー性
疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキ
ット、〔１０〕TRAIL蛋白質のアミノ酸配列を含むペプ
チドを認識する抗体と、TRAIL遺伝子を発現する細胞を
含む、アレルギー性疾患の治療薬候補化合物をスクリー
ニングするためのキット、〔１１〕TRAIL遺伝子の単核
球における発現強度を低下させたトランスジェニック非
ヒト脊椎動物からなるアレルギー性疾患モデル動物、
〔１２〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬の
スクリーニング方法、（１）被験動物に候補化合物を投
与する工程、（２）前記動物の生体試料におけるTRAIL
遺伝子の発現レベルを測定する工程、（３）対照と比較
して前記遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択
する工程、〔１３〕次の工程を含む、アレルギー性疾患
の治療薬のスクリーニング方法、（１）TRAIL遺伝子の
転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現する
レポーター遺伝子とを含むベクターを導入した細胞と候
補化合物を接触させる工程、（２）前記レポーター遺伝
子の活性を測定する工程、および（３）対照と比較して
前記遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する
工程〔１４〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療
薬のスクリーニング方法、（１）TRAIL蛋白質と候補化
合物を接触させる工程、（２）前記蛋白質の活性を測定
する工程、および（３）対照と比較して前記蛋白質の活
性を上昇させる化合物を選択する工程〔１５〕〔７〕、
〔１２〕、〔１３〕、および〔１４〕のいずれかに記載
のスクリーニング方法によって得ることができる化合物
を有効成分として含有する、アレルギー性疾患の治療
薬、〔１６〕TRAIL遺伝子そのもの、またはTRAIL蛋白質
を有効成分として含有する、アレルギー性疾患の治療
薬、を提供するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明において、アレルギー性疾
患(allergic disease)とはアレルギー反応の関与する疾
患の総称である。より具体的には、アレルゲンが同定さ
れ、アレルゲンへの曝露と病変の発症に深い結びつきが
証明され、その病変に免疫学的な機序が証明されること
と定義することができる。ここで、免疫学的な機序と
は、アレルゲンの刺激によって白血球細胞が免疫応答を
示すことを意味する。アレルゲンとしては、ダニ抗原や
花粉抗原等を例示することができる。
患(allergic disease)とはアレルギー反応の関与する疾
患の総称である。より具体的には、アレルゲンが同定さ
れ、アレルゲンへの曝露と病変の発症に深い結びつきが
証明され、その病変に免疫学的な機序が証明されること
と定義することができる。ここで、免疫学的な機序と
は、アレルゲンの刺激によって白血球細胞が免疫応答を
示すことを意味する。アレルゲンとしては、ダニ抗原や
花粉抗原等を例示することができる。
【００１４】代表的なアレルギー性疾患には、気管支喘
息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、花粉症、あ
るいは昆虫アレルギー等を示すことができる。アレルギ
ー素因(allergic diathesis)とは、アレルギー性疾患を
持つ親から子に伝えられる遺伝的な因子である。家族性
に発症するアレルギー性疾患はアトピー性疾患とも呼ば
れ、その原因となる遺伝的に伝えられる因子がアトピー
素因である。アトピー性皮膚炎は、アトピー性疾患のう
ち、特に皮膚炎症状を伴う疾患に対して与えられた総称
である。
息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、花粉症、あ
るいは昆虫アレルギー等を示すことができる。アレルギ
ー素因(allergic diathesis)とは、アレルギー性疾患を
持つ親から子に伝えられる遺伝的な因子である。家族性
に発症するアレルギー性疾患はアトピー性疾患とも呼ば
れ、その原因となる遺伝的に伝えられる因子がアトピー
素因である。アトピー性皮膚炎は、アトピー性疾患のう
ち、特に皮膚炎症状を伴う疾患に対して与えられた総称
である。
【００１５】本発明のアレルギー性疾患の検査方法は、
被検者の生体試料におけるTRAIL遺伝子の発現レベルを
測定し、健常者の測定値と比較する工程を含む。両者の
比較の結果、健常者よりも発現が低下している場合に
は、被検者がアレルギー性疾患であると判定される。
被検者の生体試料におけるTRAIL遺伝子の発現レベルを
測定し、健常者の測定値と比較する工程を含む。両者の
比較の結果、健常者よりも発現が低下している場合に
は、被検者がアレルギー性疾患であると判定される。
【００１６】本発明において、TRAIL遺伝子の発現レベ
ルとは、該遺伝子のmRNAへの転写、並びに蛋白質への翻
訳を含む。従って本発明によるアレルギー性疾患の検査
方法は、TRAIL遺伝子に対応するmRNAの発現強度、ある
いは該遺伝子によってコードされる蛋白質の発現レベル
の比較に基づいて行われる。
ルとは、該遺伝子のmRNAへの転写、並びに蛋白質への翻
訳を含む。従って本発明によるアレルギー性疾患の検査
方法は、TRAIL遺伝子に対応するmRNAの発現強度、ある
いは該遺伝子によってコードされる蛋白質の発現レベル
の比較に基づいて行われる。
【００１７】本発明におけるアレルギー性疾患の検査に
おけるTRAIL遺伝子の発現レベルの測定は、公知の遺伝
子解析方法にしたがって実施することができる。具体的
には、例えばこの遺伝子にハイブリダイズする核酸をプ
ローブとしたハイブリダイゼーション技術、または本発
明の遺伝子にハイブリダイズするDNAをプライマーとし
た遺伝子増幅技術等を利用することができる。
おけるTRAIL遺伝子の発現レベルの測定は、公知の遺伝
子解析方法にしたがって実施することができる。具体的
には、例えばこの遺伝子にハイブリダイズする核酸をプ
ローブとしたハイブリダイゼーション技術、または本発
明の遺伝子にハイブリダイズするDNAをプライマーとし
た遺伝子増幅技術等を利用することができる。
【００１８】本発明の検査に用いられるプローブまたは
プライマーは、TRAIL遺伝子の塩基配列に基づいて設定
することができる。TRAIL遺伝子の塩基配列、および該
遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は公知であ
る。本発明のTRAIL遺伝子の塩基配列のGenBankアクセシ
ョン番号はU37518である。
プライマーは、TRAIL遺伝子の塩基配列に基づいて設定
することができる。TRAIL遺伝子の塩基配列、および該
遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は公知であ
る。本発明のTRAIL遺伝子の塩基配列のGenBankアクセシ
ョン番号はU37518である。
【００１９】なお一般に高等動物の遺伝子は、高い頻度
で多型を伴う。また、スプライシングの過程で相互に異
なるアミノ酸配列からなるアイソフォームを生じる分子
も多く存在する。多型やアイソフォームによって塩基配
列が異なる遺伝子であっても、TRAIL遺伝子と同様の活
性を持ち、アレルギーに関与する遺伝子は、いずれも本
発明のTRAIL遺伝子に含まれる。
で多型を伴う。また、スプライシングの過程で相互に異
なるアミノ酸配列からなるアイソフォームを生じる分子
も多く存在する。多型やアイソフォームによって塩基配
列が異なる遺伝子であっても、TRAIL遺伝子と同様の活
性を持ち、アレルギーに関与する遺伝子は、いずれも本
発明のTRAIL遺伝子に含まれる。
【００２０】また、本発明において、TRAIL遺伝子は、
ヒトのみならず、他種におけるホモログも含む。従っ
て、ヒト以外の種におけるTRAIL遺伝子とは、特に断ら
ないときには、その種に固有のTRAIL遺伝子のホモロ
グ、あるいはその個体に導入されている外来性のTRAIL
遺伝子を言う。同様に、TRAIL蛋白質とはヒトのみなら
ず、他種におけるホモログも含む。
ヒトのみならず、他種におけるホモログも含む。従っ
て、ヒト以外の種におけるTRAIL遺伝子とは、特に断ら
ないときには、その種に固有のTRAIL遺伝子のホモロ
グ、あるいはその個体に導入されている外来性のTRAIL
遺伝子を言う。同様に、TRAIL蛋白質とはヒトのみなら
ず、他種におけるホモログも含む。
【００２１】本発明においてヒトTRAIL遺伝子のホモロ
グとは、ヒトTRAIL遺伝子をプローブとしてストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズすることができる、ヒ
ト以外の種に由来する遺伝子を言う。ストリンジェント
な条件とは、一般的には以下のような条件を示すことが
できる。すなわち、4×SSC、65℃でハイブリダイゼーシ
ョンさせ、0.1×SSCを用いて65℃で１時間洗浄する。ス
トリンジェンシーを大きく左右するハイブリダイゼーシ
ョンや洗浄の温度条件は、融解温度(Tm)に応じて調整す
ることができる。Tmはハイブリダイズする塩基対に占め
る構成塩基の割合、ハイブリダイゼーション溶液組成
（塩濃度、ホルムアミドやドデシル硫酸ナトリウム濃
度）によって変動する。従って、当業者であればこれら
の条件を考慮して同等のストリンジェンシーを与える条
件を実験または経験的に設定することができる。
グとは、ヒトTRAIL遺伝子をプローブとしてストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズすることができる、ヒ
ト以外の種に由来する遺伝子を言う。ストリンジェント
な条件とは、一般的には以下のような条件を示すことが
できる。すなわち、4×SSC、65℃でハイブリダイゼーシ
ョンさせ、0.1×SSCを用いて65℃で１時間洗浄する。ス
トリンジェンシーを大きく左右するハイブリダイゼーシ
ョンや洗浄の温度条件は、融解温度(Tm)に応じて調整す
ることができる。Tmはハイブリダイズする塩基対に占め
る構成塩基の割合、ハイブリダイゼーション溶液組成
（塩濃度、ホルムアミドやドデシル硫酸ナトリウム濃
度）によって変動する。従って、当業者であればこれら
の条件を考慮して同等のストリンジェンシーを与える条
件を実験または経験的に設定することができる。
【００２２】プライマーあるいはプローブには、TRAIL
遺伝子の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはそ
の相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むポ
リヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補
鎖」とは、A:T（RNAの場合はU）、G:Cの塩基対からなる
2本鎖DNAの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、
「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチ
ド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なく
とも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは90
%、さらに好ましくは95%以上の塩基配列上の相同性を有
すればよい。塩基配列の相同性は、BLAST等のアルゴリ
ズムにより決定することができる。
遺伝子の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはそ
の相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むポ
リヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補
鎖」とは、A:T（RNAの場合はU）、G:Cの塩基対からなる
2本鎖DNAの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、
「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチ
ド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なく
とも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは90
%、さらに好ましくは95%以上の塩基配列上の相同性を有
すればよい。塩基配列の相同性は、BLAST等のアルゴリ
ズムにより決定することができる。
【００２３】このようなポリヌクレオチドは、TRAIL遺
伝子を検出するためのプローブとして、またTRAIL遺伝
子を増幅するためのプライマーとして利用することがで
きる。プライマーとして用いる場合には、通常、15bp〜
100bp、好ましくは15bp〜35bpの鎖長を有する。また、
プローブとして用いる場合には、TRAIL遺伝子（または
その相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有
し、少なくとも15bpの鎖長のDNAが用いられる。プライ
マーとして用いる場合、3'側の領域は相補的である必要
があるが、5'側には制限酵素認識配列やタグなどを付加
することができる。
伝子を検出するためのプローブとして、またTRAIL遺伝
子を増幅するためのプライマーとして利用することがで
きる。プライマーとして用いる場合には、通常、15bp〜
100bp、好ましくは15bp〜35bpの鎖長を有する。また、
プローブとして用いる場合には、TRAIL遺伝子（または
その相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有
し、少なくとも15bpの鎖長のDNAが用いられる。プライ
マーとして用いる場合、3'側の領域は相補的である必要
があるが、5'側には制限酵素認識配列やタグなどを付加
することができる。
【００２４】なお、本発明における「ポリヌクレオチ
ド」は、DNAあるいはRNAであることができる。これらポ
リヌクレオチドは、合成されたものでも天然のものでも
よい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブ
DNAは、通常、標識したものが用いられる。標識方法と
しては、例えば次のような方法を示すことができる。な
お用語オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのう
ち、重合度が比較的低いものを意味している。オリゴヌ
クレオチドは、ポリヌクレオチドに含まれる。
ド」は、DNAあるいはRNAであることができる。これらポ
リヌクレオチドは、合成されたものでも天然のものでも
よい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブ
DNAは、通常、標識したものが用いられる。標識方法と
しては、例えば次のような方法を示すことができる。な
お用語オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのう
ち、重合度が比較的低いものを意味している。オリゴヌ
クレオチドは、ポリヌクレオチドに含まれる。
【００２５】・DNAポリメラーゼIを用いるニックトラン
スレーションによる標識 ・ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識 ・クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識（Be
rger SL, Kimmel AR. (1987) Guide to Molecular Clon
ing Techniques, Method in Enzymology, Academic Pre
ss; Hames BD, Higgins SJ (1985) Genes Probes: A Pr
actical Approach. IRL Press; Sambrook J, Fritsch E
F, Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: a Laborat
ory Manual, 2nd Edn. Cold Spring Harbor Laboratory
Press） ・RNAポリメラーゼを用いる転写による標識（Melton D
A, Krieg,PA, RebagkiatiMR, Maniatis T, Zinn K, Gre
en MR. (1984) Nucleic Acid Res., 12,7035-7056） ・放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをDNAに取
り込ませる方法（KrickaLJ. (1992) Nonisotopic DNA P
robing Techniques. Academic Press）
スレーションによる標識 ・ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識 ・クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識（Be
rger SL, Kimmel AR. (1987) Guide to Molecular Clon
ing Techniques, Method in Enzymology, Academic Pre
ss; Hames BD, Higgins SJ (1985) Genes Probes: A Pr
actical Approach. IRL Press; Sambrook J, Fritsch E
F, Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: a Laborat
ory Manual, 2nd Edn. Cold Spring Harbor Laboratory
Press） ・RNAポリメラーゼを用いる転写による標識（Melton D
A, Krieg,PA, RebagkiatiMR, Maniatis T, Zinn K, Gre
en MR. (1984) Nucleic Acid Res., 12,7035-7056） ・放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをDNAに取
り込ませる方法（KrickaLJ. (1992) Nonisotopic DNA P
robing Techniques. Academic Press）
【００２６】ハイブリダイゼーション技術を利用したア
レルギー性疾患の検査は、例えば、ノーザンハイブリダ
イゼーション法、ドットブロット法、DNAマイクロアレ
イを用いた方法などを使用して行うことができる。さら
には、RT-PCR法等の遺伝子増幅技術を利用することがで
きる。RT-PCR法においては、遺伝子の増幅過程において
PCR増幅モニター法を用いることにより、本発明の遺伝
子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能
である。
レルギー性疾患の検査は、例えば、ノーザンハイブリダ
イゼーション法、ドットブロット法、DNAマイクロアレ
イを用いた方法などを使用して行うことができる。さら
には、RT-PCR法等の遺伝子増幅技術を利用することがで
きる。RT-PCR法においては、遺伝子の増幅過程において
PCR増幅モニター法を用いることにより、本発明の遺伝
子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能
である。
【００２７】PCR遺伝子増幅モニター法においては、両
端に互いの蛍光を打ち消し合う異なった蛍光色素で標識
したプローブを用い、検出対象（DNAもしくはRNAの逆転
写産物）にハイブリダイズさせる。PCR反応が進んでTaq
ポリメラーゼの 5'-3'エキソヌクレアーゼ（exonucleas
e）活性により同プローブが分解されると二つの蛍光色
素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検
出をリアルタイムに行う。検出対象についてコピー数の
明らかな標準試料について同時に測定することにより、
PCR増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出
対象のコピー数を決定する（Holland, P.M. et al., 19
91, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280; Liva
k, K. J. et al., 1995, PCR Methods and Application
s 4(6):357-362; Heid, C. A. et al., Genome Researc
h 6:986-994; Gibson, E. M. U. et al., 1996, Genome
Research 6:995-1001）。PCR増幅モニター法において
は、例えば、ABI PRISM7700（Applied Biosystems社）
を用いることができる。
端に互いの蛍光を打ち消し合う異なった蛍光色素で標識
したプローブを用い、検出対象（DNAもしくはRNAの逆転
写産物）にハイブリダイズさせる。PCR反応が進んでTaq
ポリメラーゼの 5'-3'エキソヌクレアーゼ（exonucleas
e）活性により同プローブが分解されると二つの蛍光色
素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検
出をリアルタイムに行う。検出対象についてコピー数の
明らかな標準試料について同時に測定することにより、
PCR増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出
対象のコピー数を決定する（Holland, P.M. et al., 19
91, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280; Liva
k, K. J. et al., 1995, PCR Methods and Application
s 4(6):357-362; Heid, C. A. et al., Genome Researc
h 6:986-994; Gibson, E. M. U. et al., 1996, Genome
Research 6:995-1001）。PCR増幅モニター法において
は、例えば、ABI PRISM7700（Applied Biosystems社）
を用いることができる。
【００２８】また本発明のアレルギー性疾患の検査方法
は、TRAIL遺伝子によりコードされる蛋白質を検出する
ことにより行うこともできる。このような検査方法とし
ては、例えば、このTRAIL蛋白質に結合する抗体を利用
したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ELISA
法などを利用することができる。
は、TRAIL遺伝子によりコードされる蛋白質を検出する
ことにより行うこともできる。このような検査方法とし
ては、例えば、このTRAIL蛋白質に結合する抗体を利用
したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ELISA
法などを利用することができる。
【００２９】この検出に用いるTRAIL蛋白質に結合する
抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができ
る。本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、ある
いはモノクローナル抗体（Milstein C, et al.,1983, N
ature 305(5934): 537-40）であることができる。例え
ば、TRAIL蛋白質に対するポリクローナル抗体は、抗原
を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公
知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体と
しては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用すること
ができる。あるいは必要に応じてこの血清からポリクロ
ーナル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。
また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作
した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞など
と細胞融合させる。こうして得られたハイブリドーマを
クローニングして、その培養物から抗体を回収しモノク
ローナル抗体とすることができる。
抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができ
る。本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、ある
いはモノクローナル抗体（Milstein C, et al.,1983, N
ature 305(5934): 537-40）であることができる。例え
ば、TRAIL蛋白質に対するポリクローナル抗体は、抗原
を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公
知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体と
しては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用すること
ができる。あるいは必要に応じてこの血清からポリクロ
ーナル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。
また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作
した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞など
と細胞融合させる。こうして得られたハイブリドーマを
クローニングして、その培養物から抗体を回収しモノク
ローナル抗体とすることができる。
【００３０】TRAIL蛋白質の検出には、これらの抗体を
適宜標識して用いればよい。また、この抗体を標識せず
に、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテイ
ンAやプロテインGを標識して間接的に検出することもで
きる。具体的な検出方法としては、例えば、ELISA法を
挙げることができる。
適宜標識して用いればよい。また、この抗体を標識せず
に、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテイ
ンAやプロテインGを標識して間接的に検出することもで
きる。具体的な検出方法としては、例えば、ELISA法を
挙げることができる。
【００３１】抗原に用いる蛋白質もしくはその部分ペプ
チドは、例えばTRAIL遺伝子もしくはその一部を発現ベ
クターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形
質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換え蛋
白質を発現させ、発現させた組み換え蛋白質を培養体ま
たは培養上清から精製することにより得ることができ
る。あるいは、該遺伝子によってコードされるアミノ酸
配列、あるいは全長cDNAによってコードされるアミノ酸
配列の部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを化学
的に合成し、免疫原として用いることもできる。
チドは、例えばTRAIL遺伝子もしくはその一部を発現ベ
クターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形
質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換え蛋
白質を発現させ、発現させた組み換え蛋白質を培養体ま
たは培養上清から精製することにより得ることができ
る。あるいは、該遺伝子によってコードされるアミノ酸
配列、あるいは全長cDNAによってコードされるアミノ酸
配列の部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを化学
的に合成し、免疫原として用いることもできる。
【００３２】更に本発明においては、TRAIL遺伝子の発
現レベルのみならず、生体試料におけるTRAIL蛋白質の
活性を指標として、アレルギー性疾患の検査を行うこと
もできる。TRAIL蛋白質の活性とは、該蛋白質が備える
生物学的な活性を言う。TRAIL蛋白質の活性の検出は、T
RAIL蛋白質の抗体を用いたELISA法、またはウェスタン
ブロット法等の公知の方法に基づいて行うことができ
る。
現レベルのみならず、生体試料におけるTRAIL蛋白質の
活性を指標として、アレルギー性疾患の検査を行うこと
もできる。TRAIL蛋白質の活性とは、該蛋白質が備える
生物学的な活性を言う。TRAIL蛋白質の活性の検出は、T
RAIL蛋白質の抗体を用いたELISA法、またはウェスタン
ブロット法等の公知の方法に基づいて行うことができ
る。
【００３３】本発明の検査方法においては、通常、被検
者の生体試料を試料とする。生体試料としては、血液、
喀痰、鼻粘膜分泌物等を用いることができるが、好まし
くは、末梢血単核球細胞を用いる。単核球を用いること
により、試料の採取が容易となる。そのため、ベッドサ
イドにおける簡便な検査が可能となる。末梢血単核球細
胞は、末梢血から公知の方法によって調製することがで
きる。例えば、実施例１に示す方法によって調製するこ
とができる。調製された単核球を破壊してライセートと
すれば、TRAIL蛋白質の免疫学的な測定のための試料と
することができる。また、本発明の単核球細胞以外の生
体試料の採取方法についても公知である。
者の生体試料を試料とする。生体試料としては、血液、
喀痰、鼻粘膜分泌物等を用いることができるが、好まし
くは、末梢血単核球細胞を用いる。単核球を用いること
により、試料の採取が容易となる。そのため、ベッドサ
イドにおける簡便な検査が可能となる。末梢血単核球細
胞は、末梢血から公知の方法によって調製することがで
きる。例えば、実施例１に示す方法によって調製するこ
とができる。調製された単核球を破壊してライセートと
すれば、TRAIL蛋白質の免疫学的な測定のための試料と
することができる。また、本発明の単核球細胞以外の生
体試料の採取方法についても公知である。
【００３４】上記の生体試料からライセートを調製すれ
ば、TRAIL蛋白質の免疫学的な測定のための試料とする
ことができる。あるいはこのライセートからmRNAを抽出
すれば、TRAIL遺伝子に対応するmRNAの測定のための試
料とすることができる。生体試料のライセートまたはmR
NAの抽出には、市販のキットを利用すると便利である。
上記試料は、必要に応じて緩衝液等で希釈して本発明の
方法に使用することができる。
ば、TRAIL蛋白質の免疫学的な測定のための試料とする
ことができる。あるいはこのライセートからmRNAを抽出
すれば、TRAIL遺伝子に対応するmRNAの測定のための試
料とすることができる。生体試料のライセートまたはmR
NAの抽出には、市販のキットを利用すると便利である。
上記試料は、必要に応じて緩衝液等で希釈して本発明の
方法に使用することができる。
【００３５】本発明におけるTRAIL遺伝子の発現レベル
の測定値は、公知の方法によって補正することができ
る。補正により、細胞における遺伝子の発現レベルの変
化を比較することができる。測定値の補正は、上記生体
試料における各細胞において、発現レベルが大きく変動
しない遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子）の発
現レベルの測定値に基づいて、本発明においてTRAIL遺
伝子の発現レベルの測定値を補正することによって行わ
れる。発現レベルが大きく変動しない遺伝子の例として
は、β-アクチン、GAPDH等を挙げることができる。
の測定値は、公知の方法によって補正することができ
る。補正により、細胞における遺伝子の発現レベルの変
化を比較することができる。測定値の補正は、上記生体
試料における各細胞において、発現レベルが大きく変動
しない遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子）の発
現レベルの測定値に基づいて、本発明においてTRAIL遺
伝子の発現レベルの測定値を補正することによって行わ
れる。発現レベルが大きく変動しない遺伝子の例として
は、β-アクチン、GAPDH等を挙げることができる。
【００３６】本発明におけるTRAIL遺伝子は、健常者と
アトピー性皮膚炎患者との比較において、患者の単核球
で発現量の低下を示した。従って、TRAIL遺伝子の発現
レベルを指標として、アレルギー性疾患の検査を行うこ
とができる。
アトピー性皮膚炎患者との比較において、患者の単核球
で発現量の低下を示した。従って、TRAIL遺伝子の発現
レベルを指標として、アレルギー性疾患の検査を行うこ
とができる。
【００３７】本発明におけるアレルギー性疾患の検査と
は、たとえば以下のような検査が含まれる。アレルギー
が疑われる症状を示しながら、一般的な検査ではアレル
ギー性疾患と判定できない患者であっても、本発明に基
づく検査を行えばアレルギー性疾患の患者であるか否か
を容易に判定することができる。より具体的には、アレ
ルギー性疾患が疑われる症状を示す患者におけるTRAIL
遺伝子の発現の低下は、その症状の原因がアレルギー性
疾患である可能性が高いことを示している。
は、たとえば以下のような検査が含まれる。アレルギー
が疑われる症状を示しながら、一般的な検査ではアレル
ギー性疾患と判定できない患者であっても、本発明に基
づく検査を行えばアレルギー性疾患の患者であるか否か
を容易に判定することができる。より具体的には、アレ
ルギー性疾患が疑われる症状を示す患者におけるTRAIL
遺伝子の発現の低下は、その症状の原因がアレルギー性
疾患である可能性が高いことを示している。
【００３８】あるいは、アレルギー症状が改善に向かっ
ているのかどうかを判断するための検査が可能となる。
つまり、アレルギー性疾患に対する治療効果の判定に有
用である。また、アレルギー性疾患と診断された患者に
おけるTRAIL遺伝子の発現の低下は、アレルギー性疾患
がさらに進行している可能性が高いことを示している。
ているのかどうかを判断するための検査が可能となる。
つまり、アレルギー性疾患に対する治療効果の判定に有
用である。また、アレルギー性疾患と診断された患者に
おけるTRAIL遺伝子の発現の低下は、アレルギー性疾患
がさらに進行している可能性が高いことを示している。
【００３９】また本発明は、TRAIL遺伝子の単核球細胞
における発現レベルを低下させたトランスジェニック非
ヒト動物のアレルギー性疾患モデル動物に関する。
における発現レベルを低下させたトランスジェニック非
ヒト動物のアレルギー性疾患モデル動物に関する。
【００４０】本発明によって、TRAIL遺伝子の単核球細
胞における発現レベルが、アトピー性皮膚炎患者の単核
球において低下することが明らかとなった。従って、単
核球細胞においてTRAIL遺伝子の発現レベルを人為的に
抑制した動物は、アレルギー性疾患のモデル動物として
利用することができる。該アレルギー性疾患モデル動物
は、アレルギーにおける生体内の変化を明らかにするた
めに有用である。更に、該アレルギー性疾患モデル動物
を使用することにより、TRAIL遺伝子のさらなる機能を
解明すること、および該遺伝子を標的とする薬剤を評価
することには大きな意義がある。上記TRAIL遺伝子と
は、前記のようにヒトTRAIL遺伝子に加え、各動物種に
おけるヒトTRAIL遺伝子のホモログを含む。
胞における発現レベルが、アトピー性皮膚炎患者の単核
球において低下することが明らかとなった。従って、単
核球細胞においてTRAIL遺伝子の発現レベルを人為的に
抑制した動物は、アレルギー性疾患のモデル動物として
利用することができる。該アレルギー性疾患モデル動物
は、アレルギーにおける生体内の変化を明らかにするた
めに有用である。更に、該アレルギー性疾患モデル動物
を使用することにより、TRAIL遺伝子のさらなる機能を
解明すること、および該遺伝子を標的とする薬剤を評価
することには大きな意義がある。上記TRAIL遺伝子と
は、前記のようにヒトTRAIL遺伝子に加え、各動物種に
おけるヒトTRAIL遺伝子のホモログを含む。
【００４１】なお単核球における発現レベルの低下と
は、血液細胞全体におけるTRAIL遺伝子の発現レベルの
低下を含む。すなわち、前記TRAIL遺伝子の発現レベル
を低下させるのは単核球である場合のみならず、血液細
胞全体において、あるいは全身性に前記TRAIL遺伝子の
発現レベルが低下している場合を含む。
は、血液細胞全体におけるTRAIL遺伝子の発現レベルの
低下を含む。すなわち、前記TRAIL遺伝子の発現レベル
を低下させるのは単核球である場合のみならず、血液細
胞全体において、あるいは全身性に前記TRAIL遺伝子の
発現レベルが低下している場合を含む。
【００４２】また本発明によるアレルギー性疾患モデル
動物は、後に述べるアレルギー性疾患の治療または予防
のための医薬品のスクリーニングに加えて、アレルギー
性疾患のメカニズムの解明、さらにはスクリーニングさ
れた化合物の安全性の試験に有用である。
動物は、後に述べるアレルギー性疾患の治療または予防
のための医薬品のスクリーニングに加えて、アレルギー
性疾患のメカニズムの解明、さらにはスクリーニングさ
れた化合物の安全性の試験に有用である。
【００４３】たとえば本発明によるアレルギー疾患モデ
ル動物が皮膚炎を発症したり、何らかのアレルギー性疾
患に関連した測定値の変化を示せば、それを回復させる
作用を持った化合物を探索するスクリーニングシステム
が構築できる。
ル動物が皮膚炎を発症したり、何らかのアレルギー性疾
患に関連した測定値の変化を示せば、それを回復させる
作用を持った化合物を探索するスクリーニングシステム
が構築できる。
【００４４】本発明において、発現レベルの低下とは、
宿主が備える遺伝子の転写と蛋白質への翻訳が抑制され
ている状態、並びに翻訳産物である蛋白質の分解が促進
された状態のいずれかを意味する。遺伝子の発現レベル
は、たとえば実施例に示すような定量的なPCRにより確
認することができる。また翻訳産物である蛋白質の活性
は、正常な状態と比較することにより確認することがで
きる。
宿主が備える遺伝子の転写と蛋白質への翻訳が抑制され
ている状態、並びに翻訳産物である蛋白質の分解が促進
された状態のいずれかを意味する。遺伝子の発現レベル
は、たとえば実施例に示すような定量的なPCRにより確
認することができる。また翻訳産物である蛋白質の活性
は、正常な状態と比較することにより確認することがで
きる。
【００４５】代表的なトランスジェニック動物は、TRAI
L遺伝子をノックアウトした動物、他の遺伝子と置換
（ノックイン）した動物等を示すことができる。また、
TRAIL遺伝子に対するアンチセンスDNA、リボザイムをコ
ードするDNA、あるいはデコイ核酸として機能するDNA等
を導入したトランスジェニック動物も、本発明における
トランスジェニック動物として用いることができる。そ
の他、例えばTRAIL遺伝子のコード領域に変異を導入
し、その活性を抑制したり、あるいは分解されやすいア
ミノ酸配列に改変した動物などを示すことができる。ア
ミノ酸配列の変異には、置換、欠失、挿入、あるいは付
加を示すことができる。その他、遺伝子の転写調節領域
を変異させることにより、本発明のTRAIL遺伝子の発現
そのものを調節することもできる。
L遺伝子をノックアウトした動物、他の遺伝子と置換
（ノックイン）した動物等を示すことができる。また、
TRAIL遺伝子に対するアンチセンスDNA、リボザイムをコ
ードするDNA、あるいはデコイ核酸として機能するDNA等
を導入したトランスジェニック動物も、本発明における
トランスジェニック動物として用いることができる。そ
の他、例えばTRAIL遺伝子のコード領域に変異を導入
し、その活性を抑制したり、あるいは分解されやすいア
ミノ酸配列に改変した動物などを示すことができる。ア
ミノ酸配列の変異には、置換、欠失、挿入、あるいは付
加を示すことができる。その他、遺伝子の転写調節領域
を変異させることにより、本発明のTRAIL遺伝子の発現
そのものを調節することもできる。
【００４６】特定の遺伝子を対象として、トランスジェ
ニック動物を得る方法は公知である。すなわち、遺伝子
と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法や、位
相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子
を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米
国特許第4873191号）、胚性幹細胞（ES細胞）を使用す
る方法などによってトランスジェニック動物を得ること
ができる。その他、レトロウィルスベクターに遺伝子を
挿入し、卵に感染させる方法、また、精子を介して遺伝
子を卵に導入する精子ベクター法等も開発されている。
精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエ
レクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ま
せた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を
導入する遺伝子組換え法である（M. LavitranoetらCel
l, 57, 717, 1989）。
ニック動物を得る方法は公知である。すなわち、遺伝子
と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法や、位
相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子
を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米
国特許第4873191号）、胚性幹細胞（ES細胞）を使用す
る方法などによってトランスジェニック動物を得ること
ができる。その他、レトロウィルスベクターに遺伝子を
挿入し、卵に感染させる方法、また、精子を介して遺伝
子を卵に導入する精子ベクター法等も開発されている。
精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエ
レクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ま
せた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を
導入する遺伝子組換え法である（M. LavitranoetらCel
l, 57, 717, 1989）。
【００４７】本発明のアレルギー性疾患モデル動物とし
て用いるトランスジェニック動物は、ヒト以外のあらゆ
る脊椎動物を利用して作成することができる。具体的に
は、マウス、ラット、ウサギ、ミニブタ、ヤギ、ヒツ
ジ、あるいはウシ等の脊椎動物において様々な遺伝子の
導入や発現レベルを改変されたトランスジェニック動物
が作り出されている。
て用いるトランスジェニック動物は、ヒト以外のあらゆ
る脊椎動物を利用して作成することができる。具体的に
は、マウス、ラット、ウサギ、ミニブタ、ヤギ、ヒツ
ジ、あるいはウシ等の脊椎動物において様々な遺伝子の
導入や発現レベルを改変されたトランスジェニック動物
が作り出されている。
【００４８】さらに本発明は、アレルギー性疾患治療薬
候補化合物のスクリーニング方法に関する。本発明にお
いて、TRAIL遺伝子は、アレルギー性疾患を持つ患者に
おいて有意に発現レベルが低下している。従って、該遺
伝子の発現レベルを上昇させることができる化合物を選
択することによって、アレルギー性疾患の治療薬を得る
ことができる。本発明において遺伝子の発現レベルを上
昇させる化合物とは、遺伝子の転写、翻訳、蛋白質の活
性発現のいずれかのステップに対して促進的に作用する
機能を持つ化合物である。
候補化合物のスクリーニング方法に関する。本発明にお
いて、TRAIL遺伝子は、アレルギー性疾患を持つ患者に
おいて有意に発現レベルが低下している。従って、該遺
伝子の発現レベルを上昇させることができる化合物を選
択することによって、アレルギー性疾患の治療薬を得る
ことができる。本発明において遺伝子の発現レベルを上
昇させる化合物とは、遺伝子の転写、翻訳、蛋白質の活
性発現のいずれかのステップに対して促進的に作用する
機能を持つ化合物である。
【００４９】本発明のアレルギー性疾患治療候補化合物
のスクリーニング方法は、in vivoで行うこともin vitr
oで行うこともできる。このスクリーニングは、例えば
以下のような工程にしたがって実施することができる。 （１）被験動物に、候補化合物を投与する工程、（２）
前記動物の生体試料におけるTRAIL遺伝子の発現レベル
を測定する工程、（３）対照と比較して、前記遺伝子の
発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
のスクリーニング方法は、in vivoで行うこともin vitr
oで行うこともできる。このスクリーニングは、例えば
以下のような工程にしたがって実施することができる。 （１）被験動物に、候補化合物を投与する工程、（２）
前記動物の生体試料におけるTRAIL遺伝子の発現レベル
を測定する工程、（３）対照と比較して、前記遺伝子の
発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
【００５０】本発明のスクリーニング方法における被験
動物としては、例えば、正常なTRAIL遺伝子を有する非
ヒト脊椎動物、TRAIL遺伝子の発現が低下した非ヒト脊
椎動物、およびヒトのTRAIL遺伝子を強制発現させたト
ランスジェニック動物等を利用することができる。これ
らの動物におけるTRAIL遺伝子の発現レベルを、対照と
比較して上昇させる化合物を選択することにより、アレ
ルギー性疾患の治療薬をスクリーニングすることができ
る。対照とは該被験動物に化合物が投与されない場合を
指す。
動物としては、例えば、正常なTRAIL遺伝子を有する非
ヒト脊椎動物、TRAIL遺伝子の発現が低下した非ヒト脊
椎動物、およびヒトのTRAIL遺伝子を強制発現させたト
ランスジェニック動物等を利用することができる。これ
らの動物におけるTRAIL遺伝子の発現レベルを、対照と
比較して上昇させる化合物を選択することにより、アレ
ルギー性疾患の治療薬をスクリーニングすることができ
る。対照とは該被験動物に化合物が投与されない場合を
指す。
【００５１】本発明の発現ベクターに使用するプロモー
ターとして、適当な薬剤等の化合物により転写が調節さ
れるプロモーターを用いれば、該化合物の投与によって
トランスジェニック動物における外来性のTRAIL遺伝子
の発現レベルを調整することができる。
ターとして、適当な薬剤等の化合物により転写が調節さ
れるプロモーターを用いれば、該化合物の投与によって
トランスジェニック動物における外来性のTRAIL遺伝子
の発現レベルを調整することができる。
【００５２】このようにしてTRAIL遺伝子を強制発現さ
せたモデル動物に薬剤候補化合物を投与し、モデル動物
由来の生体試料におけるTRAIL遺伝子の発現に対する化
合物の作用をモニターすることにより、TRAIL遺伝子の
発現レベルに与える薬剤候補化合物の影響を検出するこ
とができる。被験動物由来の生体試料におけるTRAIL遺
伝子の発現レベルの変動は、前記本発明の検査方法と同
様の手法によってモニターすることができる。更にこの
検出の結果に基づいて、TRAIL遺伝子の発現レベルを上
昇させる薬剤候補化合物を選択すれば、薬剤候補化合物
をスクリーニングすることができる。
せたモデル動物に薬剤候補化合物を投与し、モデル動物
由来の生体試料におけるTRAIL遺伝子の発現に対する化
合物の作用をモニターすることにより、TRAIL遺伝子の
発現レベルに与える薬剤候補化合物の影響を検出するこ
とができる。被験動物由来の生体試料におけるTRAIL遺
伝子の発現レベルの変動は、前記本発明の検査方法と同
様の手法によってモニターすることができる。更にこの
検出の結果に基づいて、TRAIL遺伝子の発現レベルを上
昇させる薬剤候補化合物を選択すれば、薬剤候補化合物
をスクリーニングすることができる。
【００５３】より具体的には、被験動物から、生体試料
を採取し、TRAIL遺伝子の発現レベルを対照と比較する
ことにより、本発明によるスクリーニングを実施するこ
とができる。生体試料としては、平滑筋細胞、角化細
胞、鼻粘膜上皮細胞、腸上皮細胞、単核球、リンパ球、
マスト細胞、好酸球、好塩基球、あるいは好中球等を利
用することができる。これらの生体試料の採取方法、お
よび調製方法は公知である。
を採取し、TRAIL遺伝子の発現レベルを対照と比較する
ことにより、本発明によるスクリーニングを実施するこ
とができる。生体試料としては、平滑筋細胞、角化細
胞、鼻粘膜上皮細胞、腸上皮細胞、単核球、リンパ球、
マスト細胞、好酸球、好塩基球、あるいは好中球等を利
用することができる。これらの生体試料の採取方法、お
よび調製方法は公知である。
【００５４】このようなスクリーニングにより、TRAIL
遺伝子の発現に様々な形で関与する薬剤を選択すること
ができる。具体的には、例えば次のような作用を持つ薬
剤候補化合物を見出すことができる。 ・TRAIL遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路の促
進 ・TRAIL遺伝子の転写活性の促進 ・TRAIL遺伝子の転写産物の安定化もしくは分解の抑制
等
遺伝子の発現に様々な形で関与する薬剤を選択すること
ができる。具体的には、例えば次のような作用を持つ薬
剤候補化合物を見出すことができる。 ・TRAIL遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路の促
進 ・TRAIL遺伝子の転写活性の促進 ・TRAIL遺伝子の転写産物の安定化もしくは分解の抑制
等
【００５５】また、in vitroでのスクリーニングにおい
ては、例えば、TRAIL遺伝子を発現する細胞に候補化合
物を接触させ、該遺伝子の発現レベルを上昇させる化合
物を選択する方法が挙げられる。このスクリーニング
は、例えば以下のような工程に従って実施することがで
きる。 （１）TRAIL遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触
させる工程 （２）前記遺伝子の発現レベルを測定する工程、 （３）対照と比較して、前記遺伝子の発現レベルを上昇
させる化合物を選択する工程
ては、例えば、TRAIL遺伝子を発現する細胞に候補化合
物を接触させ、該遺伝子の発現レベルを上昇させる化合
物を選択する方法が挙げられる。このスクリーニング
は、例えば以下のような工程に従って実施することがで
きる。 （１）TRAIL遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触
させる工程 （２）前記遺伝子の発現レベルを測定する工程、 （３）対照と比較して、前記遺伝子の発現レベルを上昇
させる化合物を選択する工程
【００５６】本発明において、TRAIL遺伝子を発現する
細胞は、TRAIL遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、
該ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得る
ことができる。利用できるベクター、および宿主細胞
は、本発明の遺伝子を発現し得るものであればよい。宿
主−ベクター系における宿主細胞としては、大腸菌、酵
母、昆虫細胞、動物細胞等が例示でき、それぞれ利用で
きるベクターを適宜選択することができる。
細胞は、TRAIL遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、
該ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得る
ことができる。利用できるベクター、および宿主細胞
は、本発明の遺伝子を発現し得るものであればよい。宿
主−ベクター系における宿主細胞としては、大腸菌、酵
母、昆虫細胞、動物細胞等が例示でき、それぞれ利用で
きるベクターを適宜選択することができる。
【００５７】ベクターの宿主への導入方法としては、生
物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことが
できる。生物学的方法としては、例えば、ウイルスベク
ターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細
胞融合法（HVJ（センダイウイルス)、ポリエチレングリ
コール（PEG）、電気的細胞融合法、微少核融合法（染
色体移入））が挙げられる。また、物理的方法として
は、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーシ
ョン法、ジーンパーティクルガン（gene gun）を用いる
方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシ
ウム沈殿法、リポソーム法、DEAEデキストラン法、プロ
トプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト
法、マイクロカプセル法が挙げられる。
物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことが
できる。生物学的方法としては、例えば、ウイルスベク
ターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細
胞融合法（HVJ（センダイウイルス)、ポリエチレングリ
コール（PEG）、電気的細胞融合法、微少核融合法（染
色体移入））が挙げられる。また、物理的方法として
は、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーシ
ョン法、ジーンパーティクルガン（gene gun）を用いる
方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシ
ウム沈殿法、リポソーム法、DEAEデキストラン法、プロ
トプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト
法、マイクロカプセル法が挙げられる。
【００５８】本発明のスクリーニング方法においては、
TRAIL遺伝子を発現する細胞として、末梢血白血球細
胞、白血球由来株化細胞を用いることができる。白血球
細胞としては、単核球細胞、未熟好中球を例示すること
ができる。この中でも、リンパ球系株化細胞は、本発明
のスクリーニング方法に好適である。
TRAIL遺伝子を発現する細胞として、末梢血白血球細
胞、白血球由来株化細胞を用いることができる。白血球
細胞としては、単核球細胞、未熟好中球を例示すること
ができる。この中でも、リンパ球系株化細胞は、本発明
のスクリーニング方法に好適である。
【００５９】スクリーニングの方法は、まず前記株化リ
ンパ球細胞に候補化合物を添加する。その後、該株化白
血球細胞におけるTRAIL遺伝子の発現レベルを測定し、
該遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する。
ンパ球細胞に候補化合物を添加する。その後、該株化白
血球細胞におけるTRAIL遺伝子の発現レベルを測定し、
該遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する。
【００６０】なお本発明のスクリーニング方法におい
て、TRAIL遺伝子の発現レベルは、該遺伝子がコードす
る蛋白質の発現レベルのみならず、対応するmRNAを検出
することにより比較することもできる。mRNAによって発
現レベルの比較を行うには、蛋白質試料の調製工程に代
えて、先に述べたようなmRNA試料の調製工程を実施す
る。mRNAや蛋白質の検出は、先に述べたような公知の方
法によって実施することができる。上記スクリーニング
方法における「対照」とは、細胞に被験化合物を接触さ
せない場合をさす。
て、TRAIL遺伝子の発現レベルは、該遺伝子がコードす
る蛋白質の発現レベルのみならず、対応するmRNAを検出
することにより比較することもできる。mRNAによって発
現レベルの比較を行うには、蛋白質試料の調製工程に代
えて、先に述べたようなmRNA試料の調製工程を実施す
る。mRNAや蛋白質の検出は、先に述べたような公知の方
法によって実施することができる。上記スクリーニング
方法における「対照」とは、細胞に被験化合物を接触さ
せない場合をさす。
【００６１】さらに本発明の開示に基づいて本発明の遺
伝子の転写調節領域を取得し、レポーターアッセイ系を
構築することができる。レポーターアッセイ系とは、転
写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量
を指標として、該転写調節領域に作用する転写調節因子
をスクリーニングするアッセイ系をいう。
伝子の転写調節領域を取得し、レポーターアッセイ系を
構築することができる。レポーターアッセイ系とは、転
写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量
を指標として、該転写調節領域に作用する転写調節因子
をスクリーニングするアッセイ系をいう。
【００６２】転写調節領域としては、プロモーター、エ
ンハンサー、さらには、通常プロモーター領域に見られ
るCAATボックス、TATAボックス等を例示することができ
る。またレポーター遺伝子としては、CAT(chlorampheni
col acetyltransferase)遺伝子、ルシフェラーゼ(lucif
erase)遺伝子、成長ホルモン遺伝子等を利用することが
できる。本発明におけるTRAIL遺伝子は、既に転写調節
領域が明らかにされている(Gong B. and Almasan A. Bi
ochem. Biophys. Res. Commun., 278: 747-752, 200
0)。
ンハンサー、さらには、通常プロモーター領域に見られ
るCAATボックス、TATAボックス等を例示することができ
る。またレポーター遺伝子としては、CAT(chlorampheni
col acetyltransferase)遺伝子、ルシフェラーゼ(lucif
erase)遺伝子、成長ホルモン遺伝子等を利用することが
できる。本発明におけるTRAIL遺伝子は、既に転写調節
領域が明らかにされている(Gong B. and Almasan A. Bi
ochem. Biophys. Res. Commun., 278: 747-752, 200
0)。
【００６３】あるいは本発明におけるTRAIL遺伝子の転
写調節領域を、次のようにして取得することもできる。
すなわち、まず本発明で開示したcDNAの塩基配列に基づ
いて、BACライブラリー、YACライブラリー等のヒトゲノ
ムDNAライブラリーから、PCRまたはハイブリダイゼーシ
ョンを用いる方法によりスクリーニングを行い、該cDNA
の配列を含むゲノムDNAクローンを得る。得られたゲノ
ムDNAの配列を基に、本発明で開示したcDNAの転写調節
領域を推定し、該転写調節領域を取得する。得られた転
写調節領域を、レポーター遺伝子の上流に位置するよう
にクローニングしてレポーターコンストラクトを構築す
る。得られたレポーターコンストラクトを培養細胞株に
導入してスクリーニング用の形質転換体とする。この形
質転換体に候補化合物を接触させ、レポーター遺伝子の
発現を制御する化合物のスクリーニングを行うことがで
きる。
写調節領域を、次のようにして取得することもできる。
すなわち、まず本発明で開示したcDNAの塩基配列に基づ
いて、BACライブラリー、YACライブラリー等のヒトゲノ
ムDNAライブラリーから、PCRまたはハイブリダイゼーシ
ョンを用いる方法によりスクリーニングを行い、該cDNA
の配列を含むゲノムDNAクローンを得る。得られたゲノ
ムDNAの配列を基に、本発明で開示したcDNAの転写調節
領域を推定し、該転写調節領域を取得する。得られた転
写調節領域を、レポーター遺伝子の上流に位置するよう
にクローニングしてレポーターコンストラクトを構築す
る。得られたレポーターコンストラクトを培養細胞株に
導入してスクリーニング用の形質転換体とする。この形
質転換体に候補化合物を接触させ、レポーター遺伝子の
発現を制御する化合物のスクリーニングを行うことがで
きる。
【００６４】これらスクリーニングに用いる被験候補化
合物としては、ステロイド誘導体等既存の化学的方法に
より合成された化合物標品、コンビナトリアルケミスト
リーにより合成された化合物標品のほか、動・植物組織
の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む
混合物、またそれらから精製された標品などが挙げられ
る。
合物としては、ステロイド誘導体等既存の化学的方法に
より合成された化合物標品、コンビナトリアルケミスト
リーにより合成された化合物標品のほか、動・植物組織
の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む
混合物、またそれらから精製された標品などが挙げられ
る。
【００６５】本発明による各種のスクリーニング方法に
必要な、ポリヌクレオチド、抗体、細胞株、あるいはモ
デル動物は、予め組み合わせてキットとすることができ
る。より具体的には、例えばTRAIL遺伝子を発現する細
胞と、これらのTRAIL遺伝子の発現レベルを測定するた
めの試薬とで構成される。TRAIL遺伝子の発現レベルを
測定するための試薬としては、例えば少なくとも１つの
TRAIL遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、若し
くはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも
１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドが用いられ
る。あるいは、少なくとも１つのTRAIL蛋白質のアミノ
酸配列を含むペプチドを認識する抗体を試薬として用い
ることができる。これらのキットには、標識の検出に用
いられる基質化合物、細胞の培養のための培地や容器、
陽性や陰性の標準試料、更にはキットの使用方法を記載
した指示書等をパッケージしておくこともできる。
必要な、ポリヌクレオチド、抗体、細胞株、あるいはモ
デル動物は、予め組み合わせてキットとすることができ
る。より具体的には、例えばTRAIL遺伝子を発現する細
胞と、これらのTRAIL遺伝子の発現レベルを測定するた
めの試薬とで構成される。TRAIL遺伝子の発現レベルを
測定するための試薬としては、例えば少なくとも１つの
TRAIL遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、若し
くはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも
１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドが用いられ
る。あるいは、少なくとも１つのTRAIL蛋白質のアミノ
酸配列を含むペプチドを認識する抗体を試薬として用い
ることができる。これらのキットには、標識の検出に用
いられる基質化合物、細胞の培養のための培地や容器、
陽性や陰性の標準試料、更にはキットの使用方法を記載
した指示書等をパッケージしておくこともできる。
【００６６】本発明のスクリーニング方法によって選択
される化合物は、アレルギー性疾患の治療薬として有用
である。あるいは、TRAIL遺伝子もしくは該遺伝子によ
ってコードされる蛋白質は、アレルギー性疾患の治療薬
として有用である。
される化合物は、アレルギー性疾患の治療薬として有用
である。あるいは、TRAIL遺伝子もしくは該遺伝子によ
ってコードされる蛋白質は、アレルギー性疾患の治療薬
として有用である。
【００６７】本発明のアレルギー性疾患の治療薬は、本
発明のスクリーニング方法によって選択された化合物、
またはTRAIL遺伝子もしくは該遺伝子によってコードさ
れる蛋白質を有効成分として含み、生理学的に許容され
る担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合することによ
って製造することができる。本発明のアレルギー性疾患
の治療剤は、アレルギー症状の改善を目的として、経
口、あるいは非経口的に投与することができる。
発明のスクリーニング方法によって選択された化合物、
またはTRAIL遺伝子もしくは該遺伝子によってコードさ
れる蛋白質を有効成分として含み、生理学的に許容され
る担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合することによ
って製造することができる。本発明のアレルギー性疾患
の治療剤は、アレルギー症状の改善を目的として、経
口、あるいは非経口的に投与することができる。
【００６８】経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カ
プセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択
することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射
剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。
プセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択
することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射
剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。
【００６９】また、投与すべき化合物が蛋白質からなる
場合には、それをコードする遺伝子を遺伝子治療の手法
を用いて生体に導入することにより、治療効果を達成す
ることができる。治療効果をもたらす蛋白質をコードす
る遺伝子を生体に導入し、発現させることによって、疾
患を治療する手法は公知である。
場合には、それをコードする遺伝子を遺伝子治療の手法
を用いて生体に導入することにより、治療効果を達成す
ることができる。治療効果をもたらす蛋白質をコードす
る遺伝子を生体に導入し、発現させることによって、疾
患を治療する手法は公知である。
【００７０】投与量は、患者の年齢、性別、体重および
症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬
組成物に含有される活性成分の種類などにより異なる
が、通常成人一人あたり、一回につき0.1 mgから500 mg
の範囲で、好ましくは0.5 mgから20 mgの範囲で投与す
ることができる。しかし、投与量は種々の条件により変
動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合も
あり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もあ
る。
症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬
組成物に含有される活性成分の種類などにより異なる
が、通常成人一人あたり、一回につき0.1 mgから500 mg
の範囲で、好ましくは0.5 mgから20 mgの範囲で投与す
ることができる。しかし、投与量は種々の条件により変
動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合も
あり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もあ
る。
【００７１】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例に制限されるものではな
い。 ［実施例１］DNAチップを使った候補遺伝子の選択 （１）DNAチップ用のRNAの調製 健常人ボランティア2名（以下、「健常群」と記載）、
ステロイド軟膏治療応答者3名、弱応答者3名（以下、そ
れぞれ「ステロイド応答群」、「ステロイド弱応答群」
と記載。また、両群を合わせて「患者群」と記載）から
ヘパリン採血した。次いで以下の方法により血液を比重
遠心分離して単核球分画を採取し、培養した。
るが、本発明はこれら実施例に制限されるものではな
い。 ［実施例１］DNAチップを使った候補遺伝子の選択 （１）DNAチップ用のRNAの調製 健常人ボランティア2名（以下、「健常群」と記載）、
ステロイド軟膏治療応答者3名、弱応答者3名（以下、そ
れぞれ「ステロイド応答群」、「ステロイド弱応答群」
と記載。また、両群を合わせて「患者群」と記載）から
ヘパリン採血した。次いで以下の方法により血液を比重
遠心分離して単核球分画を採取し、培養した。
【００７２】全血(ヘパリン抗凝固剤使用、最終濃度50
unit/mL) 40 mLを遠心管に入れた。次いで、等量の3% d
extran/0.9% NaClを加え、静かに数回、転倒混和して室
温に30分静置した。静置後、上清（platelet rich plas
ma）を回収し、1,200 rpm (revolutions per minute、
毎分回転)で5分間、室温で遠心した。上清を除き、ペレ
ットを5 mLのHank's Balanced Salt Solutions (HBSS,
GIBCO BRL)で懸濁後、5 mLのFicol-PaqueTM PLUS(Amers
ham Pharmacia Biotech)に重層し、1,200 rpmで5分間、
室温遠心後、回転数を1,500 rpmに上げ、更に30分間、
室温で遠心した。上清を除いて中間層を回収し、これを
PBSで懸濁後、1,500 rpmで5分間、室温で遠心した。上
清を捨てペレットをPBSで再懸濁し、1,500 rpmで5分
間、室温で遠心した。ペレットをRPMI1640（GIBCO BR
L）/10%FCS(SIGMA) 10 mLに懸濁した。懸濁液20μLを取
り、Trypan Blue Stain 0.4%（GIBCO BRL）で細胞染色
を行い、細胞数を数えた。
unit/mL) 40 mLを遠心管に入れた。次いで、等量の3% d
extran/0.9% NaClを加え、静かに数回、転倒混和して室
温に30分静置した。静置後、上清（platelet rich plas
ma）を回収し、1,200 rpm (revolutions per minute、
毎分回転)で5分間、室温で遠心した。上清を除き、ペレ
ットを5 mLのHank's Balanced Salt Solutions (HBSS,
GIBCO BRL)で懸濁後、5 mLのFicol-PaqueTM PLUS(Amers
ham Pharmacia Biotech)に重層し、1,200 rpmで5分間、
室温遠心後、回転数を1,500 rpmに上げ、更に30分間、
室温で遠心した。上清を除いて中間層を回収し、これを
PBSで懸濁後、1,500 rpmで5分間、室温で遠心した。上
清を捨てペレットをPBSで再懸濁し、1,500 rpmで5分
間、室温で遠心した。ペレットをRPMI1640（GIBCO BR
L）/10%FCS(SIGMA) 10 mLに懸濁した。懸濁液20μLを取
り、Trypan Blue Stain 0.4%（GIBCO BRL）で細胞染色
を行い、細胞数を数えた。
【００７３】T細胞の機能研究を行う場合、細胞をin vi
troで非特異的に活性化することが必要となる。そこ
で、T細胞分裂促進因子として知られるPHA (phytohaema
gglutinin、レクチン)、PMA (phorbol myristate aceta
te、ホルボールエステル)を用いて、次のようにT細胞を
刺激した。単核球を培養液(RPMI1640/10%FCS)10 mLに懸
濁し(1.5×106個/mL)、PHA (phytohaemagglutinin, 終
濃度5μg/mL, SIGMA)/PMA (phorbol myristate acetat
e, 終濃度10 ng/ml, SIGMA)を添加し、37℃、CO25％下
で24時間培養を行った。次いで、TRAIL (TNF-related a
poptosis inducing ligand) mRNAを定量するために、以
下の方法に従って全RNAを抽出した。
troで非特異的に活性化することが必要となる。そこ
で、T細胞分裂促進因子として知られるPHA (phytohaema
gglutinin、レクチン)、PMA (phorbol myristate aceta
te、ホルボールエステル)を用いて、次のようにT細胞を
刺激した。単核球を培養液(RPMI1640/10%FCS)10 mLに懸
濁し(1.5×106個/mL)、PHA (phytohaemagglutinin, 終
濃度5μg/mL, SIGMA)/PMA (phorbol myristate acetat
e, 終濃度10 ng/ml, SIGMA)を添加し、37℃、CO25％下
で24時間培養を行った。次いで、TRAIL (TNF-related a
poptosis inducing ligand) mRNAを定量するために、以
下の方法に従って全RNAを抽出した。
【００７４】全RNA抽出は、RNA抽出キットISOGEN (ニッ
ポンジーン)を用いてその説明書に従って行った。培養
後の細胞を3 mLのIsogen (4M guanidium thiocyanate,
25mMsodium cyanate, 0.5% Sarcosyl, 0.1M β-メルカ
プトエタノール,pH7.0)に溶解させた。20Gカテラン注射
針付2.5 mL注射器で20〜30回吸出操作を行った。CHCl3
を0.6 mL（Isogenの1/5量）加えて、ミキサーで15秒間
混合させた後、室温で2〜3分間静置させた。4℃で15,00
0 rpm、15分間遠心を行った。上清を新しいチューブに
移し、Ethachinmate (ニッポンジーン)3μL、イソプロ
パノール1.5 mL（Isogenの1/2量）を加え、転倒混和し
て室温に10分間静置させた。4℃で15,000rpm、15分間遠
心を行い、沈殿物に75% エタノール3 mL（Isogenの等
量）を加え、15,000 rpm、4℃で5分間遠心した。沈殿物
を風乾もしくは2〜3分間真空乾燥させた。RNase-free D
Wを10μL加えてRNA溶液とした。
ポンジーン)を用いてその説明書に従って行った。培養
後の細胞を3 mLのIsogen (4M guanidium thiocyanate,
25mMsodium cyanate, 0.5% Sarcosyl, 0.1M β-メルカ
プトエタノール,pH7.0)に溶解させた。20Gカテラン注射
針付2.5 mL注射器で20〜30回吸出操作を行った。CHCl3
を0.6 mL（Isogenの1/5量）加えて、ミキサーで15秒間
混合させた後、室温で2〜3分間静置させた。4℃で15,00
0 rpm、15分間遠心を行った。上清を新しいチューブに
移し、Ethachinmate (ニッポンジーン)3μL、イソプロ
パノール1.5 mL（Isogenの1/2量）を加え、転倒混和し
て室温に10分間静置させた。4℃で15,000rpm、15分間遠
心を行い、沈殿物に75% エタノール3 mL（Isogenの等
量）を加え、15,000 rpm、4℃で5分間遠心した。沈殿物
を風乾もしくは2〜3分間真空乾燥させた。RNase-free D
Wを10μL加えてRNA溶液とした。
【００７５】（２）DNAチップ用のcDNA合成 全RNA 2-5 μgから、T7-(dT)24 (Amersham Pharmacia B
iotech)をプライマーとして、Affymetrix社のExpressio
n Analysis Technical Manualの方法に従いSuperscript
II Reverse Transcriptase(Life Technologies社)を用
いて逆転写し１本鎖 cDNAを作製した。T7-(dT)24プライ
マーは、以下のようにT7プロモーターの塩基配列にd(T)
24を付加した塩基配列からなる。T7-(dT)24プライマ
ー： 5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-
(dT)24-3'（配列番号：１）
iotech)をプライマーとして、Affymetrix社のExpressio
n Analysis Technical Manualの方法に従いSuperscript
II Reverse Transcriptase(Life Technologies社)を用
いて逆転写し１本鎖 cDNAを作製した。T7-(dT)24プライ
マーは、以下のようにT7プロモーターの塩基配列にd(T)
24を付加した塩基配列からなる。T7-(dT)24プライマ
ー： 5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-
(dT)24-3'（配列番号：１）
【００７６】次に、Expression Analysis Technical Ma
nualに従い、DNA Ligase, DNA polymerase I、およびRN
ase Hを加え、2本鎖cDNAを合成した。cDNAをフェノール
・クロロホルム抽出後、Phase Lock Gelsに通し、エタ
ノール沈澱し精製した。
nualに従い、DNA Ligase, DNA polymerase I、およびRN
ase Hを加え、2本鎖cDNAを合成した。cDNAをフェノール
・クロロホルム抽出後、Phase Lock Gelsに通し、エタ
ノール沈澱し精製した。
【００７７】さらに、BioArray High Yield RNA Transc
ription Labeling Kitを用い、ビオチンラベルしたcRNA
を合成した。RNeasy Spin column (QIAGEN)を用いてcRN
Aを精製し、熱処理により断片化した。
ription Labeling Kitを用い、ビオチンラベルしたcRNA
を合成した。RNeasy Spin column (QIAGEN)を用いてcRN
Aを精製し、熱処理により断片化した。
【００７８】そのうち12.5 μgのcRNAをExpression Ana
lysis Technical Manualに従いHybridization Cocktail
に加えた。これをアレイに入れ、45℃で16時間ハイブリ
ダイゼーションした。DNAチップとしてはGeneChipR HuG
eneFL（Affymetrix社製）を用いた。GeneChipR HuGeneF
Lは、およそ5600種類のヒトcDNAやESTに由来する塩基配
列からなるプローブで構成されている。
lysis Technical Manualに従いHybridization Cocktail
に加えた。これをアレイに入れ、45℃で16時間ハイブリ
ダイゼーションした。DNAチップとしてはGeneChipR HuG
eneFL（Affymetrix社製）を用いた。GeneChipR HuGeneF
Lは、およそ5600種類のヒトcDNAやESTに由来する塩基配
列からなるプローブで構成されている。
【００７９】DNAチップを洗浄した後、Streptavidin Ph
ycoerythrinを加え染色した。洗浄後、normal ヤギIgG
とビオチン化ヤギ抗ストレプトアビジンIgG抗体の抗体
混合液をアレイに加えた。さらに、蛍光強度を増強する
目的で、再度Streptavidin Phycoerythrinを加え染色し
た。洗浄後、スキャナーにセットし、DNAチップ解析ソ
フトにて解析した。
ycoerythrinを加え染色した。洗浄後、normal ヤギIgG
とビオチン化ヤギ抗ストレプトアビジンIgG抗体の抗体
混合液をアレイに加えた。さらに、蛍光強度を増強する
目的で、再度Streptavidin Phycoerythrinを加え染色し
た。洗浄後、スキャナーにセットし、DNAチップ解析ソ
フトにて解析した。
【００８０】（３）DNAチップ解析 DNAチップ解析ソフトであるSuiteを用いて発現蛍光感度
を測定し、データ解析を行った。まず全てのチップにつ
いてAbsolute analysisを行い、用いたサンプル各々の
遺伝子発現量を測定した。
を測定し、データ解析を行った。まず全てのチップにつ
いてAbsolute analysisを行い、用いたサンプル各々の
遺伝子発現量を測定した。
【００８１】1個のチップデータの解析は、プローブセ
ットのパーフェクトマッチとミスマッチの蛍光強度を比
較して、positiveとnegativeを決定した。Positive Fra
ction、Log Avg、Pos/Negの値から判定されるAbsolute
CallであるP(present)、A (absent)、およびM (margina
l)の３区分の判定を行った。用語定義は以下に示した。 Positive Fraction; Positiveなペアの割合 Log Avg; パーフェクトマッチとミスマッチのプローブ
セルの蛍光強度比の対数の平均 Pos/Neg; Positiveペア数とNegativeペア数の比
ットのパーフェクトマッチとミスマッチの蛍光強度を比
較して、positiveとnegativeを決定した。Positive Fra
ction、Log Avg、Pos/Negの値から判定されるAbsolute
CallであるP(present)、A (absent)、およびM (margina
l)の３区分の判定を行った。用語定義は以下に示した。 Positive Fraction; Positiveなペアの割合 Log Avg; パーフェクトマッチとミスマッチのプローブ
セルの蛍光強度比の対数の平均 Pos/Neg; Positiveペア数とNegativeペア数の比
【００８２】また、パーフェクトマッチとミスマッチの
プローブセルの蛍光強度の差の平均値であるAverage Di
fference (Avg Diff) も計算した。
プローブセルの蛍光強度の差の平均値であるAverage Di
fference (Avg Diff) も計算した。
【００８３】次に２つのデータの比較を行った。比較実
験は基準に対するチップを決め、基準チップの全遺伝子
発現量を基準にComparison Analysisを行った。基準は
健常人1人について、患者群6人のComparison Analysis
を行った。基準となる健常人について発現量の高い遺伝
子は、ソフト内の計算値の一つであるfold change値が-
3以下で、かつ (i) 健常人についての遺伝子発現判断基準Absolute cal
lがP(present)の遺伝子 (ii) 患者においての遺伝子発現判断基準Absolute call
がA(absent)またはM(marginal)の遺伝子は、健常人の発
現判断基準M(marginal)の遺伝子 (i)(ii)どちらかを満たす遺伝子を絞込み、difference
callの値がNC(Not change)、MD(Marginal Decrease)、D
(Decrease)を選んだ。
験は基準に対するチップを決め、基準チップの全遺伝子
発現量を基準にComparison Analysisを行った。基準は
健常人1人について、患者群6人のComparison Analysis
を行った。基準となる健常人について発現量の高い遺伝
子は、ソフト内の計算値の一つであるfold change値が-
3以下で、かつ (i) 健常人についての遺伝子発現判断基準Absolute cal
lがP(present)の遺伝子 (ii) 患者においての遺伝子発現判断基準Absolute call
がA(absent)またはM(marginal)の遺伝子は、健常人の発
現判断基準M(marginal)の遺伝子 (i)(ii)どちらかを満たす遺伝子を絞込み、difference
callの値がNC(Not change)、MD(Marginal Decrease)、D
(Decrease)を選んだ。
【００８４】一方、発現量の低い遺伝子については、fo
ld change値が3以上で、かつ (i)患者についてのAbsolute callがP(present)の遺伝子 (ii)健常人においてのAbsolute callがA(absent)または
M(marginal)の遺伝子は、患者の発現判断基準M(margina
l)の遺伝子 (i)(ii)どちらかを満たす遺伝子を絞り込み、differenc
e callの値がNC(Not change)、MI(Marginal Increas
e)、I(Increase)を選んだ。次いで、Avg Diff値のlogス
ケールでのscatter plotsを用いた図から、原点に近い
遺伝子は削除した。
ld change値が3以上で、かつ (i)患者についてのAbsolute callがP(present)の遺伝子 (ii)健常人においてのAbsolute callがA(absent)または
M(marginal)の遺伝子は、患者の発現判断基準M(margina
l)の遺伝子 (i)(ii)どちらかを満たす遺伝子を絞り込み、differenc
e callの値がNC(Not change)、MI(Marginal Increas
e)、I(Increase)を選んだ。次いで、Avg Diff値のlogス
ケールでのscatter plotsを用いた図から、原点に近い
遺伝子は削除した。
【００８５】解析ソフトSuiteで選んだ遺伝子について
は、健常群の遺伝子発現が高い場合では、基準となる二
人の合計12通りの解析結果で選ばれた遺伝子のみを選び
出した。 健常１ 対 応答１、応答２、応答３、弱応答１、弱応
答２、弱応答３ 健常２ 対 応答１、応答２、応答３、弱応答１、弱応
答２、弱応答３
は、健常群の遺伝子発現が高い場合では、基準となる二
人の合計12通りの解析結果で選ばれた遺伝子のみを選び
出した。 健常１ 対 応答１、応答２、応答３、弱応答１、弱応
答２、弱応答３ 健常２ 対 応答１、応答２、応答３、弱応答１、弱応
答２、弱応答３
【００８６】上記の12通りの組み合わせで、患者群と健
常群で同様な発現変動が認められる遺伝子を選抜した。
常群で同様な発現変動が認められる遺伝子を選抜した。
【００８７】Gene Chip Comparison Analysisにより選
出された遺伝子の分類を表１に示す。rawデータ測定値
からfold change3倍以上、1/3倍以下のものを示す。
出された遺伝子の分類を表１に示す。rawデータ測定値
からfold change3倍以上、1/3倍以下のものを示す。
【００８８】
【表１】
【００８９】ABI7700と相関を付けるために、Absolute
analysisのAvg Diff値を基に各々のβアクチンによる補
正を行い、健常群と患者群で興味深い変動を示した遺伝
子について最終的に選び出した。
analysisのAvg Diff値を基に各々のβアクチンによる補
正を行い、健常群と患者群で興味深い変動を示した遺伝
子について最終的に選び出した。
【００９０】その結果、患者群で発現レベルの低下が見
られた遺伝子としてTRAIL遺伝子が選抜された。TRAIL遺
伝子は、アトピー性皮膚炎患者において発現レベルが低
下するアトピー性皮膚炎疾患に密接に関連した遺伝子で
ある。
られた遺伝子としてTRAIL遺伝子が選抜された。TRAIL遺
伝子は、アトピー性皮膚炎患者において発現レベルが低
下するアトピー性皮膚炎疾患に密接に関連した遺伝子で
ある。
【００９１】[実施例２] TRAIL遺伝子の末梢血単核球
細胞での発現レベルの確認 実施例１で選択されたTRAIL遺伝子の発現量を定量的に
確認するために、重症アトピー性皮膚炎患者と健常者の
末梢血より単離した単核球細胞(PBMC; peripheral bloo
d mononuclear cell)において、TRAIL遺伝子の発現変動
について解析を行った。
細胞での発現レベルの確認 実施例１で選択されたTRAIL遺伝子の発現量を定量的に
確認するために、重症アトピー性皮膚炎患者と健常者の
末梢血より単離した単核球細胞(PBMC; peripheral bloo
d mononuclear cell)において、TRAIL遺伝子の発現変動
について解析を行った。
【００９２】健常人ボランティア7名（以下、「健常
群」と記載）、ステロイド軟膏治療応答者5名、弱応答
者6名（以下、それぞれ「ステロイド応答群」、「ステ
ロイド弱応答群」と記載。また、両群を合わせて「患者
群」と記載）を被検者とした。実施例において用いる、
遺伝子発現定量のための、PBMC (peripheral blood mon
onuclear cell, 末梢血単核球細胞)分離・培養、RNA抽
出操作は、実施例１(1)に記載の方法に従って行った。
逆転写反応操作、および定量的PCRの方法は以下の通り
である。
群」と記載）、ステロイド軟膏治療応答者5名、弱応答
者6名（以下、それぞれ「ステロイド応答群」、「ステ
ロイド弱応答群」と記載。また、両群を合わせて「患者
群」と記載）を被検者とした。実施例において用いる、
遺伝子発現定量のための、PBMC (peripheral blood mon
onuclear cell, 末梢血単核球細胞)分離・培養、RNA抽
出操作は、実施例１(1)に記載の方法に従って行った。
逆転写反応操作、および定量的PCRの方法は以下の通り
である。
【００９３】（１）全RNAのDNase処理 全RNA溶液20μg、10×DNase Buffer 5μL (ニッポンジ
ーン)、RNase inhibitor (Amersham Pharmacia Biotec
h) 25ユニット、DNase I(ニッポンジーン) 1ユニットを
加え、DNase & RNase freeの水で50μLとした。37℃で1
5分間インキュベーションを行い、25μLの水飽和フェノ
ール(pH 8.0)、25μLの CHCl3を加え、転倒混和した。
室温で15,000 rpm、15分間遠心した後、上清に5μLの3M
酢酸ナトリウム (pH5.2)、125μLのエタノール、1μLの
Ethachinmateを加え、-20℃に15分間置いた。4℃で15,
000 rpm、15分間遠心を行い、沈殿物に125μLの80% エ
タノールを加えた。4℃で15,000 rpm、5分間遠心を行
い、沈殿物を風乾もしくは2〜3分間真空乾燥させた。RN
ase-free DWを10μL加えて吸光度を測定しRNA溶液とし
た。
ーン)、RNase inhibitor (Amersham Pharmacia Biotec
h) 25ユニット、DNase I(ニッポンジーン) 1ユニットを
加え、DNase & RNase freeの水で50μLとした。37℃で1
5分間インキュベーションを行い、25μLの水飽和フェノ
ール(pH 8.0)、25μLの CHCl3を加え、転倒混和した。
室温で15,000 rpm、15分間遠心した後、上清に5μLの3M
酢酸ナトリウム (pH5.2)、125μLのエタノール、1μLの
Ethachinmateを加え、-20℃に15分間置いた。4℃で15,
000 rpm、15分間遠心を行い、沈殿物に125μLの80% エ
タノールを加えた。4℃で15,000 rpm、5分間遠心を行
い、沈殿物を風乾もしくは2〜3分間真空乾燥させた。RN
ase-free DWを10μL加えて吸光度を測定しRNA溶液とし
た。
【００９４】（２）逆転写反応 RNA溶液1-5μg、Oligo(dT)12-18プライマー(GIBCO BRL)
500 ng、BSA 1μgを加え、滅菌蒸留水で12μLとした。7
0℃で10分間静置し、氷冷した。5×First Strand Buffe
r (GIBCO BRL) 4μL、1M DTT 2μL、10mM dNTPs 1μL
(N=G、A、T、C)を加え、混和した。42℃で2分間、加温
した後、200ユニットのSuperScriptII(GIBCO BRL)を加
え、42℃で50分間反応させた。70℃で15分間処理し、逆
転写酵素を失活させ、2ユニットのRNaseH (GIBCO BRL)
を加え、37℃20分間加温した。滅菌蒸留水を加えて10ng
/μL濃度のcDNA溶液とし、定量的PCR反応に供した。
500 ng、BSA 1μgを加え、滅菌蒸留水で12μLとした。7
0℃で10分間静置し、氷冷した。5×First Strand Buffe
r (GIBCO BRL) 4μL、1M DTT 2μL、10mM dNTPs 1μL
(N=G、A、T、C)を加え、混和した。42℃で2分間、加温
した後、200ユニットのSuperScriptII(GIBCO BRL)を加
え、42℃で50分間反応させた。70℃で15分間処理し、逆
転写酵素を失活させ、2ユニットのRNaseH (GIBCO BRL)
を加え、37℃20分間加温した。滅菌蒸留水を加えて10ng
/μL濃度のcDNA溶液とし、定量的PCR反応に供した。
【００９５】（３）目的領域のPCR増幅 10×PCR Buffer (100 mM Tris-HCl, pH8.3、500 mM KC
l、15 mM MgCl2) 5μL、2.5 mM dNTPs 4μL (N=G、A、
T、C)、プライマーF 10 pmol/μL、プライマーR 10 pmo
l/μL、5 ng cDNA溶液、1.25ユニットrTaq DNAポリメラ
ーゼ (TaKaRa)を加え、滅菌蒸留水で50μLとした。プラ
イマーは下記の塩基配列を有する。 プライマーF： 5'- AAG AAT GAA AAG GCT CTG GGC -3'
（配列番号：２） プライマーR： 5'- GTG CAA GTT GCT CAG GAA TGA -3'
（配列番号：３）
l、15 mM MgCl2) 5μL、2.5 mM dNTPs 4μL (N=G、A、
T、C)、プライマーF 10 pmol/μL、プライマーR 10 pmo
l/μL、5 ng cDNA溶液、1.25ユニットrTaq DNAポリメラ
ーゼ (TaKaRa)を加え、滅菌蒸留水で50μLとした。プラ
イマーは下記の塩基配列を有する。 プライマーF： 5'- AAG AAT GAA AAG GCT CTG GGC -3'
（配列番号：２） プライマーR： 5'- GTG CAA GTT GCT CAG GAA TGA -3'
（配列番号：３）
【００９６】95℃、10分間静置後、反応サイクル:95
℃、15秒→60℃、1分を1サイクルとし、40サイクル実施
した。次いで、電気泳動緩衝液1×TAE (50×TAEは1リッ
トル中、Trisベース242g、57.1ml氷酢酸、EDTA 50mM含
有、pH8.0)を用いて、3%アガロースゲル(Agarose-100
0、GIBCO-BRL)/ 5μg/mLエチジウムブロマイドを使用
し、電圧100Vで30分間泳動した。UVランプでPCR産物81
bpのバンドを観察した。
℃、15秒→60℃、1分を1サイクルとし、40サイクル実施
した。次いで、電気泳動緩衝液1×TAE (50×TAEは1リッ
トル中、Trisベース242g、57.1ml氷酢酸、EDTA 50mM含
有、pH8.0)を用いて、3%アガロースゲル(Agarose-100
0、GIBCO-BRL)/ 5μg/mLエチジウムブロマイドを使用
し、電圧100Vで30分間泳動した。UVランプでPCR産物81
bpのバンドを観察した。
【００９７】（４）DNA断片切り出し 目的PCR産物のゲルからの切り出しは、QIAEX II Agaros
e Gel Extractionキット(QIAGEN)を用いてその説明書に
従って行った。PCR産物の3%アガロースゲルにより分離
した後、目的断片を長波長（316 nm）UVで切り出した。
ゲルを剃刀を用いて細断し、1.5mlチューブ（〜250 mg
gel）に移した。6倍量のBufferQX1（ex.gel 50mgに対し
て300μl）、10μL のQIAEX IIガラスビーズを加え30秒
間vortex mixerを用いてよく攪拌した。50℃で10分間加
温し、この時、数分おきに混和し、混合液が黄色になっ
ていることを確認した。もし混合液がオレンジか紫なら
10μLの3M 酢酸ナトリウム(pH5.0)を加える。室温で12,
000 rpm、30秒間遠心した後、沈殿物に500μLのBufferQ
X1を加え、vortex mixerを用いてよく攪拌し、室温で1
2,000 rpm、30秒間遠心した。次いで、沈殿物に500μL
のPE溶液を加え、室温で12,000 rpm、30秒間遠心した
（操作（Ａ））。操作（Ａ）を2回繰り返し、上清を捨
て、ペレットが白くなるまで乾燥させた。20μLの滅菌
蒸留水を加え、5分間静置した後、室温で12,000 rpm、3
0秒間遠心し、上清を回収した（操作（Ｂ））。操作
（Ｂ）を2回繰り返した後、アガロースゲル電気泳動で
抽出確認を行った。
e Gel Extractionキット(QIAGEN)を用いてその説明書に
従って行った。PCR産物の3%アガロースゲルにより分離
した後、目的断片を長波長（316 nm）UVで切り出した。
ゲルを剃刀を用いて細断し、1.5mlチューブ（〜250 mg
gel）に移した。6倍量のBufferQX1（ex.gel 50mgに対し
て300μl）、10μL のQIAEX IIガラスビーズを加え30秒
間vortex mixerを用いてよく攪拌した。50℃で10分間加
温し、この時、数分おきに混和し、混合液が黄色になっ
ていることを確認した。もし混合液がオレンジか紫なら
10μLの3M 酢酸ナトリウム(pH5.0)を加える。室温で12,
000 rpm、30秒間遠心した後、沈殿物に500μLのBufferQ
X1を加え、vortex mixerを用いてよく攪拌し、室温で1
2,000 rpm、30秒間遠心した。次いで、沈殿物に500μL
のPE溶液を加え、室温で12,000 rpm、30秒間遠心した
（操作（Ａ））。操作（Ａ）を2回繰り返し、上清を捨
て、ペレットが白くなるまで乾燥させた。20μLの滅菌
蒸留水を加え、5分間静置した後、室温で12,000 rpm、3
0秒間遠心し、上清を回収した（操作（Ｂ））。操作
（Ｂ）を2回繰り返した後、アガロースゲル電気泳動で
抽出確認を行った。
【００９８】（５）PCR産物のTAクローニング 精製PCR産物のクローニングは、pGEMR-T Easy Vector S
ystem I (Promega) を用いてその説明書に従って行っ
た。2×Rapid Ligation Buffer 5μL、pGEMR-T Easy Ve
ctor(50ng/μL) 1μL、精製PCR産物3μL、T4 DNA Ligas
e(3 weiss units/μl) 1μLを混ぜ、室温で1時間(もし
くは16℃で一昼夜)静置した。ライゲーション反応液2μ
LをCompetent Cell DH5α(GIBCO BRL)50μlに加え、氷
上で20分間静置した。42℃で45〜50秒間の熱ショック処
理を行い、氷上で2分間静置した。SOCmedium (GIBCO BR
L)950μLを加え、37℃で1〜1.5時間、150 rpmで混和し
た後、培養液100μLをLB/amp/IPTG/X-galにプレーティ
ングし、37℃で一晩静置した。
ystem I (Promega) を用いてその説明書に従って行っ
た。2×Rapid Ligation Buffer 5μL、pGEMR-T Easy Ve
ctor(50ng/μL) 1μL、精製PCR産物3μL、T4 DNA Ligas
e(3 weiss units/μl) 1μLを混ぜ、室温で1時間(もし
くは16℃で一昼夜)静置した。ライゲーション反応液2μ
LをCompetent Cell DH5α(GIBCO BRL)50μlに加え、氷
上で20分間静置した。42℃で45〜50秒間の熱ショック処
理を行い、氷上で2分間静置した。SOCmedium (GIBCO BR
L)950μLを加え、37℃で1〜1.5時間、150 rpmで混和し
た後、培養液100μLをLB/amp/IPTG/X-galにプレーティ
ングし、37℃で一晩静置した。
【００９９】（６）plasmid DNA抽出 サブクローンプラスミドDNAはWizard Plus SV Miniprep
s DNA Purification System (Promega) を用いてその説
明書に従って行った。白コロニーをピックアップし、10
0μg/mLアンピシリン-LB培地1〜5mLで37℃で一晩培養
し、3,000 rpmで6分間遠心した。沈殿物に250μLのresu
spended solutionを加え懸濁し、250μLのLysis soluti
onを加え、4回転倒混和した。10μLのAlkaline Proteas
eを加え、4回転倒混和し、5分間室温にて静置した。350
μLのNeutralization solutionを加えて4回転倒混和
し、室温で14,000 rpm、10分間遠心した。次いで、上清
をデカンテーションで添付カラムに移し、室温で14,000
rpm、10分間遠心した。カラム部分（フォロースルーは
捨てる）に700μLのWash solutionを加え、室温で14,00
0 rpm、1分間遠心した。カラム部分（フォロースルーは
捨てる）に250μLのWashsolutionを加え、室温で14,000
rpm、2分間遠心した。カラム部分を新しいチューブに
移し、20μLの滅菌蒸留水を加え、室温で14,000 rpm、1
分間遠心した。溶液をプラスミドDNAとし、吸光度測定
にて濃度を決定した。
s DNA Purification System (Promega) を用いてその説
明書に従って行った。白コロニーをピックアップし、10
0μg/mLアンピシリン-LB培地1〜5mLで37℃で一晩培養
し、3,000 rpmで6分間遠心した。沈殿物に250μLのresu
spended solutionを加え懸濁し、250μLのLysis soluti
onを加え、4回転倒混和した。10μLのAlkaline Proteas
eを加え、4回転倒混和し、5分間室温にて静置した。350
μLのNeutralization solutionを加えて4回転倒混和
し、室温で14,000 rpm、10分間遠心した。次いで、上清
をデカンテーションで添付カラムに移し、室温で14,000
rpm、10分間遠心した。カラム部分（フォロースルーは
捨てる）に700μLのWash solutionを加え、室温で14,00
0 rpm、1分間遠心した。カラム部分（フォロースルーは
捨てる）に250μLのWashsolutionを加え、室温で14,000
rpm、2分間遠心した。カラム部分を新しいチューブに
移し、20μLの滅菌蒸留水を加え、室温で14,000 rpm、1
分間遠心した。溶液をプラスミドDNAとし、吸光度測定
にて濃度を決定した。
【０１００】（７）シークエンス反応 サブクローンプラスミドDNAが目的DNA配列を含んでいる
かを確認するためのシークエンス反応は、Thermo Sequi
nase IIダイターミネーター(Amersham Pharmacia Biote
ch)を用いてその説明書に従って行った。M13 primer 3
pmol、DNA溶液200〜300 ng、TSII Reagent Mix 2μLを
加え、滅菌蒸留水で10μLとした。96℃、1分間静置後、
反応サイクル:96℃、30秒→50℃、15秒→60℃、1分を1
サイクルとし、30サイクル実施し、反応終了後は4℃に
設定した。反応液に1.5M酢酸ナトリウム/250 mM EDTAを
1μL加え、vortex mixerで攪拌した。イソプロパノール
20μLを加えよく混和後、室温で10分間静置した。12,00
0 rpmで20分間遠心を行い、沈殿に70%エタノール150μL
を加え、混和した。12,000 rpmで5分間遠心を行い、沈
殿物を風乾もしくは2〜3分間真空乾燥させた。次いで、
ローディングダイ1.5μLを加え、95℃で2分間熱処理を
行い、氷冷した。ABI377 DNAシークエンサー(Applied B
iosystems)にセットしたLongRangerゲル(LongRanger 5
mL、尿素15 g、10×TBE 5mL、10%APS 250μL、TEMED 35
μL、滅菌蒸留水で50 mLとする)に全量アプライし、泳
動を開始した。目的DNA配列を含んでいることを確認の
後、これを標準サンプルとした。
かを確認するためのシークエンス反応は、Thermo Sequi
nase IIダイターミネーター(Amersham Pharmacia Biote
ch)を用いてその説明書に従って行った。M13 primer 3
pmol、DNA溶液200〜300 ng、TSII Reagent Mix 2μLを
加え、滅菌蒸留水で10μLとした。96℃、1分間静置後、
反応サイクル:96℃、30秒→50℃、15秒→60℃、1分を1
サイクルとし、30サイクル実施し、反応終了後は4℃に
設定した。反応液に1.5M酢酸ナトリウム/250 mM EDTAを
1μL加え、vortex mixerで攪拌した。イソプロパノール
20μLを加えよく混和後、室温で10分間静置した。12,00
0 rpmで20分間遠心を行い、沈殿に70%エタノール150μL
を加え、混和した。12,000 rpmで5分間遠心を行い、沈
殿物を風乾もしくは2〜3分間真空乾燥させた。次いで、
ローディングダイ1.5μLを加え、95℃で2分間熱処理を
行い、氷冷した。ABI377 DNAシークエンサー(Applied B
iosystems)にセットしたLongRangerゲル(LongRanger 5
mL、尿素15 g、10×TBE 5mL、10%APS 250μL、TEMED 35
μL、滅菌蒸留水で50 mLとする)に全量アプライし、泳
動を開始した。目的DNA配列を含んでいることを確認の
後、これを標準サンプルとした。
【０１０１】（８）定量的PCR 遺伝子発現定量は、ABI PRISM 7700 Systemを用いたTaq
Manプローブ使用のリアルタイムPCRにより行い、その説
明書に従って行った。反応試薬はTaqMan 1000Reaction
PCR Core reagents (Applied Biosystems)を用い、その
説明書に従って行った。検量線作成のための標準サンプ
ルは最低5段階の濃度勾配、107〜103コピーを作成し
た。1サンプル当りのｎ数は最低2つとした。10×Buffer
A 5μL、25 mM MgCl2 7μL、10mM dNTPs 1μL (N=G、
A、T、C)ずつ、AmpTaqGold 1.25ユニット、UNG 0.5ユニ
ット、プライマーF （配列番号：２）10 pmol、プライ
マーR （配列番号：３）10 pmol、cDNA溶液 5 ng、TaqM
an Probe 5 pmolを加え、滅菌蒸留水で50μLとした。プ
ローブは下記の塩基配列を有する。 TaqManプローブ： 5'- (FAM) ATA AAC TCC TGG GAA TC
A TCA AGG AGT GGG (TAMRA) -3'（配列番号：４） FAM: 6-carboxyfluorescein TAMRA: 6-carboxy-tetramethylrhodamine
Manプローブ使用のリアルタイムPCRにより行い、その説
明書に従って行った。反応試薬はTaqMan 1000Reaction
PCR Core reagents (Applied Biosystems)を用い、その
説明書に従って行った。検量線作成のための標準サンプ
ルは最低5段階の濃度勾配、107〜103コピーを作成し
た。1サンプル当りのｎ数は最低2つとした。10×Buffer
A 5μL、25 mM MgCl2 7μL、10mM dNTPs 1μL (N=G、
A、T、C)ずつ、AmpTaqGold 1.25ユニット、UNG 0.5ユニ
ット、プライマーF （配列番号：２）10 pmol、プライ
マーR （配列番号：３）10 pmol、cDNA溶液 5 ng、TaqM
an Probe 5 pmolを加え、滅菌蒸留水で50μLとした。プ
ローブは下記の塩基配列を有する。 TaqManプローブ： 5'- (FAM) ATA AAC TCC TGG GAA TC
A TCA AGG AGT GGG (TAMRA) -3'（配列番号：４） FAM: 6-carboxyfluorescein TAMRA: 6-carboxy-tetramethylrhodamine
【０１０２】50℃、2分間、95℃、10分間静置後、反応
サイクル:95℃、15秒→60℃、1分を1サイクルとし、50
サイクル実施した。標準サンプルの相対的な初期濃度の
対数値に対してのPCR増幅曲線のCt (threshold cycles)
値から、検量線が自動的に作成され、これをもとに未知
サンプルの相対的な初期濃度を算出した。
サイクル:95℃、15秒→60℃、1分を1サイクルとし、50
サイクル実施した。標準サンプルの相対的な初期濃度の
対数値に対してのPCR増幅曲線のCt (threshold cycles)
値から、検量線が自動的に作成され、これをもとに未知
サンプルの相対的な初期濃度を算出した。
【０１０３】また、試料中のcDNA濃度の差を補正するた
め、補正用内部標準としてβ-アクチン(β-actin)遺伝
子、およびグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素(GAP
DH)遺伝子について同様の定量解析を行い、それら遺伝
子のコピー数を基に補正して、目的遺伝子のコピー数を
算出した。
め、補正用内部標準としてβ-アクチン(β-actin)遺伝
子、およびグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素(GAP
DH)遺伝子について同様の定量解析を行い、それら遺伝
子のコピー数を基に補正して、目的遺伝子のコピー数を
算出した。
【０１０４】βアクチン、あるいはGAPDH測定用のプラ
イマーとプローブは、TaqMan β-actin Control Reagen
ts（Applied Biosystems）に添付のものを用いて行っ
た。塩基配列は以下の通りである。 βアクチンフォーワードプライマー： 5'- TCA CCC AC
A CTG TGC CCA TCT ACGA -3'（配列番号：５） βアクチンリバースプライマー： 5'- CAG CGG AAC CG
C TCA TTG CCA ATG G -3'（配列番号：６） βアクチンTaqManプローブ： 5'- (FAM)ATGCCC-T(TAMR
A)-CCCCCATGCCATCCTGCGTp-3'（配列番号：７） GAPDHフォーワードプライマー： 5'- GAAGGTGAAGGTCGG
AGT -3'（配列番号：８） GAPDHリバースプライマー： 5'- GAAGATGGTGATGGGATTT
C -3'（配列番号：９） GAPDH TaqManプローブ： 5'- (FAM)CAAGCTTCCCGTTCTCA
GCC(TAMRA) -3'（配列番号：１０）
イマーとプローブは、TaqMan β-actin Control Reagen
ts（Applied Biosystems）に添付のものを用いて行っ
た。塩基配列は以下の通りである。 βアクチンフォーワードプライマー： 5'- TCA CCC AC
A CTG TGC CCA TCT ACGA -3'（配列番号：５） βアクチンリバースプライマー： 5'- CAG CGG AAC CG
C TCA TTG CCA ATG G -3'（配列番号：６） βアクチンTaqManプローブ： 5'- (FAM)ATGCCC-T(TAMR
A)-CCCCCATGCCATCCTGCGTp-3'（配列番号：７） GAPDHフォーワードプライマー： 5'- GAAGGTGAAGGTCGG
AGT -3'（配列番号：８） GAPDHリバースプライマー： 5'- GAAGATGGTGATGGGATTT
C -3'（配列番号：９） GAPDH TaqManプローブ： 5'- (FAM)CAAGCTTCCCGTTCTCA
GCC(TAMRA) -3'（配列番号：１０）
【０１０５】βアクチンにより補正したPHA/PMA刺激時
のTRAIL遺伝子の発現量（copy/ng RNA）を図１に示す。
また、GAPDHにより補正したPHA/PMA刺激時のTRAIL遺伝
子の発現量（copy/ng RNA）を図２に示す。また、実際
のデータを表２に示す。
のTRAIL遺伝子の発現量（copy/ng RNA）を図１に示す。
また、GAPDHにより補正したPHA/PMA刺激時のTRAIL遺伝
子の発現量（copy/ng RNA）を図２に示す。また、実際
のデータを表２に示す。
【０１０６】
【表２】
【０１０７】（９）統計解析 統計解析は、3群間での比較はFisher分散分析とKruskal
-Walli検定により、また、健常群と患者群、あるいはス
テロイド応答群とステロイド弱応答群の2群間の比較はF
isher分散分析とMann-Whitney検定により行った。
-Walli検定により、また、健常群と患者群、あるいはス
テロイド応答群とステロイド弱応答群の2群間の比較はF
isher分散分析とMann-Whitney検定により行った。
【０１０８】結果を表３、図１および図２に示す。患者
群においてTRAILの発現量が有意に低いことが確認され
た。以上の結果より、TRAIL遺伝子の発現量差が重症ア
トピー性皮膚炎患者と健常人間で認められ、この発現低
下がアトピー性皮膚炎の重症度と関連することが分かっ
た。
群においてTRAILの発現量が有意に低いことが確認され
た。以上の結果より、TRAIL遺伝子の発現量差が重症ア
トピー性皮膚炎患者と健常人間で認められ、この発現低
下がアトピー性皮膚炎の重症度と関連することが分かっ
た。
【０１０９】
【表３】
【０１１０】
【発明の効果】本発明により、アレルギー性疾患の患者
と健常者との間で発現レベルに差が見られるTRAIL遺伝
子が見出された。該遺伝子の発現レベルを指標とするこ
とにより、アレルギー性疾患の検査方法、および該疾患
の治療のための化合物をスクリーニングする方法が可能
となった。
と健常者との間で発現レベルに差が見られるTRAIL遺伝
子が見出された。該遺伝子の発現レベルを指標とするこ
とにより、アレルギー性疾患の検査方法、および該疾患
の治療のための化合物をスクリーニングする方法が可能
となった。
【０１１１】本発明のTRAIL遺伝子は、その発現低下が
病態と結びついていることから、該遺伝子の発現を上昇
させることがアレルギー性疾患の治療戦略のターゲット
となるとともに、そのような新しい治療法におけるモニ
タリングのための新しい臨床診断指標としての有用性が
期待できる。
病態と結びついていることから、該遺伝子の発現を上昇
させることがアレルギー性疾患の治療戦略のターゲット
となるとともに、そのような新しい治療法におけるモニ
タリングのための新しい臨床診断指標としての有用性が
期待できる。
【０１１２】本発明によって提供されたTRAIL遺伝子
は、アレルゲンの種類に関わらず、簡便にその発現レベ
ルを知ることができる。従って、アレルギー反応の病態
を総合的に把握することができる。
は、アレルゲンの種類に関わらず、簡便にその発現レベ
ルを知ることができる。従って、アレルギー反応の病態
を総合的に把握することができる。
【０１１３】また本発明によるアレルギーの検査方法
は、生体試料を試料としてその発現レベルを解析するこ
とができるので、患者に対する侵襲性が低い。しかも遺
伝子発現解析に関しては、微量サンプルによる高感度な
測定が可能である。遺伝子解析技術は、年々ハイスルー
プット化、低価格化が進行している。従って本発明によ
るアレルギーの検査方法は、近い将来、ベッドサイドに
おける重要な診断方法となることが期待される。この意
味でこのTRAIL遺伝子の診断的価値は高い。
は、生体試料を試料としてその発現レベルを解析するこ
とができるので、患者に対する侵襲性が低い。しかも遺
伝子発現解析に関しては、微量サンプルによる高感度な
測定が可能である。遺伝子解析技術は、年々ハイスルー
プット化、低価格化が進行している。従って本発明によ
るアレルギーの検査方法は、近い将来、ベッドサイドに
おける重要な診断方法となることが期待される。この意
味でこのTRAIL遺伝子の診断的価値は高い。
【０１１４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Genox Research, Inc. The President of National Children's Hospital <120> Method for examination for allergosis <130> G1-A0011 <140> <141> <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized T7-d(T)24 primer sequence <400> 1 ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggaggcggt tttttttttt tttttttttt 60 ttt 63 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 2 aagaatgaaa aggctctggg c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 3 gtgcaagttg ctcaggaatg a 21 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized TaqMan probe sequence <220> <221> misc_binding <222> (1) <223> Label FAM (6-carboxy-fluorescein) <220> <221> misc_binding <222> (30) <223> Label TAMRA (6-carboxy-N,N,N',N'-tetramethylrhodamine) <400> 4 ataaactcct gggaatcatc aaggagtggg 30 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 5 tcacccacac tgtgcccatc tacga 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 6 cagcggaacc gctcattgcc aatgg 25 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized TaqMan probe sequence <220> <221> misc_binding <222> (1) <223> Label FAM (6-carboxy-fluorescein) <220> <221> misc_binding <222> (7) <223> Label TAMRA (6-carboxy-N,N,N',N'-tetramethylrhodamine) <400> 7 atgccctccc ccatgccatc ctgcgt 26 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 8 gaaggtgaag gtcggagt 18 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 9 gaagatggtg atgggatttc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized TaqMan probe sequence <220> <221> misc_binding <222> (1) <223> Label FAM (6-carboxy-fluorescein) <220> <221> misc_binding <222> (20) <223> Label TAMRA (6-carboxy-N,N,N',N'-tetramethylrhodamine) <400> 10 caagcttccc gttctcagcc 20
【図１】アレルギー性疾患患者および健常者におけるPH
A/PMA刺激時のTRAIL遺伝子の発現レベルを測定した結果
を示すグラフ。上のグラフは、各被検者のβ−アクチン
遺伝子で補正した測定値（copy/ng RNA）を示す。下の
グラフは、各群間の統計解析結果を示す。図中、Vは健
常者、Rはステロイド応答群、Pはステロイド弱応答群を
示す。また数字は、被検者の番号を表す。
A/PMA刺激時のTRAIL遺伝子の発現レベルを測定した結果
を示すグラフ。上のグラフは、各被検者のβ−アクチン
遺伝子で補正した測定値（copy/ng RNA）を示す。下の
グラフは、各群間の統計解析結果を示す。図中、Vは健
常者、Rはステロイド応答群、Pはステロイド弱応答群を
示す。また数字は、被検者の番号を表す。
【図２】ステロイド応答群、ステロイド弱応答群、およ
び健常者におけるPHA/PMA刺激時のTRAIL遺伝子の発現レ
ベルを測定した結果を示すグラフ。上のグラフは、各被
検者のGAPDH遺伝子で補正した測定値（copy/ng RNA）を
示す。下のグラフは、各群間の統計解析結果を示す。図
中、Vは健常者、Rはステロイド応答群、Pはステロイド
弱応答群を示す。また数字は、被検者の番号を表す。
び健常者におけるPHA/PMA刺激時のTRAIL遺伝子の発現レ
ベルを測定した結果を示すグラフ。上のグラフは、各被
検者のGAPDH遺伝子で補正した測定値（copy/ng RNA）を
示す。下のグラフは、各群間の統計解析結果を示す。図
中、Vは健常者、Rはステロイド応答群、Pはステロイド
弱応答群を示す。また数字は、被検者の番号を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/68 33/50 Ｃ１２Ｒ 1:91 33/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 瓶子 昌幸 神奈川県川崎市宮前区野川907 帝京大学 生物工学研究センター内 株式会社ジェノ ックス創薬研究所内 (72)発明者 加賀谷 伸治 神奈川県川崎市宮前区野川907 帝京大学 生物工学研究センター内 株式会社ジェノ ックス創薬研究所内 (72)発明者 郡司 誉道 東京都中央区銀座２−７−12 三共株式会 社臨床研究部 (72)発明者 辻本 豪三 東京都世田谷区太子堂３−35−31 国立小 児病院小児医療研究センター内 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 CA11 DA36 FB03 4B024 AA01 AA11 BA28 CA04 DA02 EA02 GA11 HA14 HA15 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QQ08 QQ20 QQ42 QQ52 QR56 QR62 QR77 QR80 QR82 QS24 QS25 QS28 QS34 4C084 AA02 AA07 AA13 AA17 BA19 BA20 MA52 MA55 NA14 ZB131 ZC781
Claims (16)
- 【請求項１】次の工程を含む、アレルギー性疾患の検査
方法。 （１）被検者の生体試料におけるTRAIL遺伝子の発現レ
ベルを測定する工程 （２）健常者の生体試料におけるTRAIL遺伝子の発現レ
ベルと比較する工程 - 【請求項２】アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎であ
る、請求項１に記載の検査方法。 - 【請求項３】遺伝子の発現レベルを、cDNAのPCRによっ
て測定する請求項１に記載の検査方法。 - 【請求項４】遺伝子の発現レベルを、TRAIL遺伝子によ
ってコードされる蛋白質の検出によって測定する請求項
１に記載の検査方法。 - 【請求項５】TRAIL遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレ
オチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する
少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチド
からなる、アレルギー性疾患検査用試薬。 - 【請求項６】TRAIL蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチ
ドを認識する抗体からなる、アレルギー性疾患検査用試
薬。 - 【請求項７】次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療
薬のスクリーニング方法。 （１）TRAIL遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触
させる工程、（２）前記遺伝子の発現レベルを測定する
工程、（３）対照と比較して前記遺伝子の発現レベルを
上昇させる化合物を選択する工程 - 【請求項８】細胞が株化白血球細胞である請求項７に記
載の方法。 - 【請求項９】TRAIL遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレ
オチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する
少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチド
と、TRAIL遺伝子を発現する細胞を含む、アレルギー性
疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキ
ット。 - 【請求項１０】TRAIL蛋白質のアミノ酸配列を含むペプ
チドを認識する抗体と、TRAIL遺伝子を発現する細胞を
含む、アレルギー性疾患の治療薬候補化合物をスクリー
ニングするためのキット。 - 【請求項１１】TRAIL遺伝子の単核球における発現強度
を低下させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物からな
るアレルギー性疾患モデル動物。 - 【請求項１２】次の工程を含む、アレルギー性疾患の治
療薬のスクリーニング方法。 （１）被験動物に候補化合物を投与する工程、（２）前
記動物の生体試料におけるTRAIL遺伝子の発現レベルを
測定する工程、（３）対照と比較して前記遺伝子の発現
レベルを上昇させる化合物を選択する工程、 - 【請求項１３】次の工程を含む、アレルギー性疾患の治
療薬のスクリーニング方法。 （１）TRAIL遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領
域の制御下に発現するレポーター遺伝子とを含むベクタ
ーを導入した細胞と候補化合物を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、お
よび（３）対照と比較して前記遺伝子の発現レベルを上
昇させる化合物を選択する工程 - 【請求項１４】次の工程を含む、アレルギー性疾患の治
療薬のスクリーニング方法。 （１）TRAIL蛋白質と候補化合物を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および（３）
対照と比較して前記蛋白質の活性を上昇させる化合物を
選択する工程 - 【請求項１５】請求項７、請求項１２、請求項１３、お
よび請求項１４のいずれかに記載のスクリーニング方法
によって得ることができる化合物を有効成分として含有
する、アレルギー性疾患の治療薬。 - 【請求項１６】TRAIL遺伝子そのもの、またはTRAIL蛋白
質を有効成分として含有する、アレルギー性疾患の治療
薬。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001108631A JP2002306170A (ja) | 2001-04-06 | 2001-04-06 | アレルギー性疾患の検査方法 |
| PCT/JP2002/001914 WO2002083946A1 (en) | 2001-04-06 | 2002-03-01 | Method of examining allergic disease |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001108631A JP2002306170A (ja) | 2001-04-06 | 2001-04-06 | アレルギー性疾患の検査方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002306170A true JP2002306170A (ja) | 2002-10-22 |
Family
ID=18960731
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001108631A Pending JP2002306170A (ja) | 2001-04-06 | 2001-04-06 | アレルギー性疾患の検査方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002306170A (ja) |
| WO (1) | WO2002083946A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014193155A (ja) * | 2013-02-28 | 2014-10-09 | Rohto Pharmaceut Co Ltd | アトピー性疾患の発症又は重症化リスクの評価法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2003083139A1 (ja) * | 2002-04-03 | 2005-08-04 | 株式会社ジェノックス創薬研究所 | アレルギー性疾患の検査方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6030945A (en) * | 1996-01-09 | 2000-02-29 | Genentech, Inc. | Apo-2 ligand |
-
2001
- 2001-04-06 JP JP2001108631A patent/JP2002306170A/ja active Pending
-
2002
- 2002-03-01 WO PCT/JP2002/001914 patent/WO2002083946A1/ja active Application Filing
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014193155A (ja) * | 2013-02-28 | 2014-10-09 | Rohto Pharmaceut Co Ltd | アトピー性疾患の発症又は重症化リスクの評価法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2002083946A1 (en) | 2002-10-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1394274A2 (en) | Methods of testing for bronchial asthma or chronic obstructive pulmonary disease | |
| JP4185862B2 (ja) | 気管支喘息の検査方法 | |
| JP4155561B2 (ja) | アレルギー性疾患検査方法 | |
| US20030180743A1 (en) | Method of examining allergic diseases | |
| US20040197786A1 (en) | Method of examining steroid resnponsiveness | |
| US7172867B2 (en) | Methods of testing for allergic diseases, and therapeutic agents for treating same | |
| JP2002306170A (ja) | アレルギー性疾患の検査方法 | |
| US20040234969A1 (en) | Mehtod for examining steroid-responsiveness | |
| JP2002238568A (ja) | アレルギー性疾患の検査方法 | |
| JP2002277456A (ja) | アレルギー性疾患の検査方法 | |
| JP2002303623A (ja) | ステロイド応答性の検査方法 | |
| JP2002095500A (ja) | アレルギー性疾患の検査方法 | |
| JP2002291485A (ja) | ステロイド応答性の検査方法 | |
| JP2002191398A (ja) | アレルギー性疾患検査方法 | |
| JP2002119281A (ja) | アレルギー性疾患の検査方法 | |
| US20040023263A1 (en) | Method of testing for allergic diseases | |
| US20030219796A1 (en) | Method of testing for allergic disease | |
| US20040053282A1 (en) | Method of examining allergic disease | |
| US6986990B1 (en) | Pollen allergy-related gene 513 | |
| US20030224423A1 (en) | Method of testing for allergic diseases | |
| JP2003125775A (ja) | 花粉症関連遺伝子、３７３ | |
| JPWO2003054231A1 (ja) | アレルギー性疾患の検査方法 | |
| JPWO2003010310A1 (ja) | アレルギー性疾患の検査方法 | |
| JP2003125777A (ja) | 花粉症関連遺伝子、５８１ | |
| WO2004016783A1 (ja) | アトピー性皮膚炎の検査方法 |