JPWO2003010310A1 - アレルギー性疾患の検査方法 - Google Patents
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Abstract
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をダニアレルゲンで刺激したときに、このＰＢＭＣに含まれるＴ細胞において有意に発現レベルが上昇する遺伝子としてＭＡＬを同定した。本発明者らは、この遺伝子をアレルギー性疾患の検査、および治療薬のスクリーニングに使用できることを見出した。本発明により、アレルギー性疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングすることができる。
Description
技術分野
本発明は、アレルギー性疾患の検査方法に関する。
背景技術
アレルギー性疾患は、多因子性の病気（ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ）と考えられている。つまり気管支喘息やアトピー性皮膚炎は多くの異なる遺伝子の発現の相互作用によって起こり、これらの個々の遺伝子の発現は、複数の環境要因によって影響を受ける。このため、アレルギー性疾患を起こす特定の遺伝子を解明することは、非常に困難であった。
アレルギー性疾患には、変異や欠損を有する遺伝子の発現や、特定の遺伝子の過剰発現や発現量の減少が関わっていると考えられている。病気に関して遺伝子発現が果たしている役割を解明するためには、遺伝子が発症にどのように関わり、薬剤などの外的な刺激が遺伝子発現をどのように変化させるのかを理解する必要がある。
さて、現在アレルギー性疾患の診断においては、一般に、問診、家族歴、そして本人の既往症の確認が重要な要素となっている。またアレルギーをより客観的な情報に基づいて診断するために、血液を試料とする試験方法や、アレルゲンに対する患者の免疫学的な応答を観察する方法も実施されている。前者の例として、アレルゲン特異的ＩｇＥ測定、白血球ヒスタミン遊離試験、あるいはリンパ球幼若化試験等が挙げられる。アレルゲン特異的ＩｇＥの存在は、そのアレルゲンに対するアレルギー反応の証明である。しかし患者によっては、必ずしもアレルゲン特異的なＩｇＥを検出できるとは限らない場合もある。また、その測定原理上、診断に必要なアレルゲンの全てに対して、試験を実施しなければならない。白血球ヒスタミン遊離試験やリンパ球幼若化試験は、免疫システムのアレルゲンに対する反応をｉｎ ｖｉｔｒｏで観察する方法である。これらの方法は、操作が煩雑である。
一方、患者を実際にアレルゲンに接触させたときに観察される免疫応答をアレルギーの診断に役立てる方法（後者）も公知である。プリック・テスト、スクラッチ・テスト、パッチ・テスト、皮内反応、あるいは誘発試験等が、この種の試験に含まれる。これらの試験では、患者のアレルギー反応を直接診断することができる反面、実際に被検者をアレルゲンに曝露する侵襲性の高い検査であると言うことができる。
この他、アレルゲンに関わらず、アレルギー反応の関与を証明するための試験方法も試みられている。たとえば、血清ＩｇＥ値が高値である場合、その患者にはアレルギー反応が起きていると推定することができる。血清ＩｇＥ値は、アレルゲン特異ＩｇＥの総量に相当する情報である。アレルゲンの種類に関わらずＩｇＥの総量を決定することは容易であるが、非アトピー型気管支炎等の疾患を持つ患者では、ＩｇＥが低値となる場合がある。
したがって、患者に対する侵襲が少なく、しかも診断に必要な情報を容易に得ることができる、アレルギー性疾患のマーカーが提供されれば有用である。このようなマーカーは、アレルギー性疾患の発症に深く関与していると考えられるので、診断のみならず、アレルギー症状のコントロールにおいても、重要な標的となる可能性がある。
発明の開示
本発明は、特にアレルギー性疾患の検査を可能とする指標遺伝子の提供を課題とする。さらに、本発明は該指標に基づく、アレルギー性疾患の検査方法およびアレルギー性疾患治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
免疫応答には、各種の血液細胞が密接に関連している。たとえばダニ抗原に対する免疫応答は、以下のようにして進行する。まず単球がダニ抗原を貪食し、その分解物を抗原としてＴ細胞に提示する。提示されたダニ抗原のペプチドを認識できるＴ細胞だけが、抗原提示に反応する。抗原提示に反応したＴ細胞は、以後の免疫反応（アレルギー反応）の方向性を決定する各種のサイトカインを産生する。このとき産生されるサイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−γなどの、アレルギー反応に密接に関連するサイトカインである。このようなＴ細胞の活動の結果として、たとえばＢ細胞ではＴ細胞との相互作用とＩＬ−４による刺激によってダニ抗原特異的なＩｇＥの産生が始まる。
本発明者らは、このような免疫応答システムを支える血液細胞における遺伝子発現の変化を観察することによって、アレルギー反応に関連する遺伝子を単離することができると考えた。本出願人は、このような考えかたに基づいて、花粉症患者の末梢血の血液細胞において発現レベルが変化している次の遺伝子の単離に成功し、特許出願している。
花粉症関連遺伝子３７３（ＷＯ００／６５０４６）
花粉症関連遺伝子４１９（ＷＯ００／６５０４５）
花粉症関連遺伝子５１３（ＷＯ００／６５０４９）
花粉症関連遺伝子５８１（ＷＯ００／６５０４８）
花粉症関連遺伝子７９５（ＷＯ００／６５０５０）
花粉症関連遺伝子６２７（ＷＯ００／６５０５１）
花粉症関連遺伝子４４１（ＷＯ００／７３４３５）
花粉症関連遺伝子４６５（ＷＯ００／７３４３９）
花粉症関連遺伝子７８７（ＷＯ００／７３４４０）
これらの遺伝子は、末梢血から分離した細胞において発現レベルに差が見られた遺伝子である。このような発現はスポンテイニアス（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）な発現と呼ばれる。このようなアプローチに対して、本発明者らは、末梢血から分離した細胞を、アレルギー性疾患の患者の局所に近い条件に置くために研究を重ねた。
一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアレルギー反応を観察するための手法として、末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；以下ＰＢＭＣと省略する）をアレルゲンで刺激する手法が公知である。本発明者らは、この手法に更に改良を加え、アレルゲンの処理後に特にＴ細胞において発現レベルが変化する遺伝子の探索を行った。先に述べたように、Ｔ細胞は免疫応答を決定している細胞である。したがって、アレルゲンに対してアレルギー性の応答が起きるときに、Ｔ細胞において発現レベルが変動する遺伝子には、重要な役割が予測される。
このような解析によって、本発明者らはＭＡＬ遺伝子がアレルギー性の免疫応答にともなって発現レベルが有意に上昇することを明らかにした。これらの知見に基づいて、本発明者らは、ＭＡＬ遺伝子を指標としてアレルギー性疾患の検査、あるいはアレルギー性疾患の治療薬のスクリーニングが可能となることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下のアレルギーの検査方法、アレルギー性疾患の治療薬、そのスクリーニング方法、アレルギー性疾患のモデル動物、並びにこれらの方法のためのキットに関する。
〔１〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の検査方法であって、指標遺伝子がＭＡＬである方法。
ａ）被検者の生体試料における、指標遺伝子の発現レベルを測定する工程
ｂ）健常者の生体試料における指標遺伝子の発現レベルと比較する工程
〔２〕アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎および／または気管支喘息である、〔１〕に記載の検査方法。
〔３〕遺伝子の発現レベルを、ｃＤＮＡのＰＣＲによって測定する〔１〕に記載の検査方法。
〔４〕遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する〔１〕に記載の検査方法。
〔５〕生体試料が末梢血Ｔ細胞を含む試料である〔１〕に記載の方法。
〔６〕末梢血単核球細胞をアレルゲンで刺激した後に、指標遺伝子の発現レベルを測定する〔１〕に記載の方法。
〔７〕ＭＡＬ遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
〔８〕ＭＡＬ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
〔９〕更にアレルゲンを含む〔７〕または〔８〕に記載のアレルギー性疾患検査用試薬。
〔１０〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＭＡＬまたはＭＡＬ遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１１〕細胞がＴ細胞である〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＭＡＬまたはＭＡＬ遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）被験動物に候補化合物を投与する工程、
（２）被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現強度を測定する工程、および
（３）対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１３〕工程（１）の前、または後に被検動物をアレルゲンで刺激する工程を含む〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＭＡＬまたはＭＡＬ遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）対照と比較して前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１５〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＭＡＬまたはＭＡＬ遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補物質を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）対照と比較して前記蛋白質の活性を低下させる化合物を選択する工程
〔１６〕〔１０〕、〔１２〕、〔１４〕、および〔１５〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、アレルギー性疾患の治療薬。
〔１７〕指標遺伝子、またはその一部のアンチセンスＤＮＡを主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬であって、指標遺伝子がＭＡＬまたはＭＡＬと機能的に同等な遺伝子である治療薬。
〔１８〕指標遺伝子によってコードされる蛋白質に結合する抗体を主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬であって、指標遺伝子がＭＡＬ遺伝子またはＭＡＬと機能的に同等な遺伝子である治療薬。
〔１９〕指標遺伝子のＴ細胞における発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物からなるアレルギー性疾患のモデル動物であって、指標遺伝子がＭＡＬまたはＭＡＬと機能的に同等な遺伝子であるアレルギー性疾患のモデル動物。
〔２０〕非ヒト脊椎動物のＴ細胞における指標遺伝子の発現強度を上昇させる工程を含む、アレルギー性疾患のモデル動物の製造方法であって、指標遺伝子がＭＡＬであるアレルギー性疾患のモデル動物の製造方法。
〔２１〕指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドと、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がＭＡＬ遺伝子またはＭＡＬと機能的に同等な遺伝子であるキット。
〔２２〕指標遺伝子によってコードされるアミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体と、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がＭＡＬ遺伝子またはＭＡＬと機能的に同等な遺伝子であるキット。
〔２３〕更にアレルゲンを含む〔２１〕または〔２２〕に記載のキット。
加えて本発明は、以下に記載のいずれかの化合物を投与する工程を含む、アレルギー性疾患の治療方法に関する。また本発明は、以下に記載のいずれかの化合物の、アレルギー性疾患の治療薬の製造における使用に関する。
−〔１０〕、〔１２〕、〔１４〕、および〔１５〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物、
−ＭＡＬまたはＭＡＬと機能的に同等な遺伝子、またはその一部のアンチセンスＤＮＡ
−ＭＡＬ遺伝子によってコードされる蛋白質に結合する抗体
本発明において指標遺伝子とするＭＡＬ遺伝子の構造は既に明らかにされている。ＭＡＬ遺伝子はＴ細胞からクローニングされ、Ｔ細胞分化の中期、後期に発現し、Ｔ細胞の分化になんらかの役割をはたしていると推測されている（Ｍｉｇｕｅｌ Ａ．Ａｌｏｎｓｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ Ｍ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ（１９８７）．ＣＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＭＡＬ，ａ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：１９９７−２００１；Ｃａｒｍｅｎ Ｒａｎｃａｎｏ，Ｔｅｒｅｓａ Ｒｕｂｉｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＭＡＬ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｘｏｎ／ｉｎｔｒｏｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２１：４４７−４５０）。ヒトではＴ細胞以外に中枢神経系と大脳皮質の灰白質や甲状腺に発現することが報告されている（Ｊａｎｅ Ａ．Ｗａｋｅｍａｎ，Ｐａｕｌ Ｒ．Ｈｅａｔｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＭＡＬ ｍＲＮＡ ｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｉｓ ａｌｓｏ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．６２：９７−１０５；Ｆｅｒｎａｎｄｏ Ｍａｒｔｉｎ−Ｂｅｌｍｏｎｔｅ，Ｌｅｏｎｏｒ Ｋｒｅｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＭＡＬ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｙｒｏｉｄ：ｔｈｅ ＭＡＬ ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ，ａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，ｉｓ ａｐｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｉｎ ｔｈｙｒｏｉｄ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１３９：２０７７−２０８４）。ＭＡＬは蛋白輸送に関与する膜小胞の成分として、蛋白の仕分け、膜への輸送、膜微小構造体の形成、安定化、維持に関与すると考えられている（Ｍａｒｃｕｓ Ｆｒａｎｋ．（２０００）ＭＡＬ，ａ ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ ｉｎ ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｙｅｌ ｉｎ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６０：５３１−５４４）。
また、中枢神経系ではミエリン蛋白のミエリン膜への輸送にＭＡＬが関与する可能性や、上皮細胞ではＧＰＩ−アンカー型蛋白（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ（ＧＰＩ）−ａｎｃｈｏｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を含む種々の蛋白のアピカル膜への輸送にＭＡＬが関与する可能性も報告されている（Ｆｅｒｎａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ−Ｂｅｌｍｏｎｔｅ，Ｒｏｓａ Ｐｕｅｒｔｏｌｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｈａ ＭＡＬ Ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ Ｉｓ Ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｏｖｅｒａｌｌ Ａｐｉｃａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ ａｎｄ Ｆｉｓｈｅｒ Ｒａｔ Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ １１：２０３３−２０４５．）。
ＭＡＬ蛋白はヒトＴ細胞膜のＧｌｙｃｏｌｉｐｉｄ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＧＥＭ）ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎｓに存在する。ＧＥＭがシグナル伝達へ関与すること、さらに抗ＭＡＬ抗体によってシグナル伝達に関わるＣＤ５９やチロシンキナーゼＬｃｋが共沈することから、ＭＡＬもシグナル伝達に関与する可能性が推測されている（Ｊａｉｍｅ Ｍｉｌｌａｎ，Ｒｏｓａ Ｐｕｅｒｔｏｌｌａｎｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）．Ｔｈｅ ＭＡＬ ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ ｉｓ ａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｕｂｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２１：２４７−２５２；Ｊａｉｍｅ Ｍｉｌｌａｎ ａｎｄ Ｍｉｇｕｅｌ Ａ．Ａｌｏｎｓｏ（１９９８）．ＭＡＬ，ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｇｌｙｃｏｓ ｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｓｒｃ−ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３６７５−３６８４）。その他Ｔ細胞活性化との関連性を指摘する報告（ＷＯ８８／０７５４９）もあるが、その中では関連性の根拠は述べられていない。更に、ＭＡＬとがんとの関連性を指摘する報告（ＷＯ９７／３３５５１）もある。
しかし、Ｔ細胞ではシグナル伝達への関与を含めＭＡＬの具体的な機能を示した報告はない。更に、免疫反応やアレルギー反応における関連性を示した報告、アレルギー反応の成立に必須であるＴｈ２細胞への分化における関連性を示唆する報告もまったく存在しない。
本発明において、アレルギー性疾患（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）とはアレルギー反応の関与する疾患の総称である。より具体的には、アレルゲンが同定され、アレルゲンへの曝露と病変の発症に深い結びつきが証明され、その病変に免疫学的な機序が証明されることと定義することができる。ここで、免疫学的な機序とは、アレルゲンの刺激によって白血球細胞が免疫応答を示すことを意味する。アレルゲンとしては、ダニ抗原や花粉抗原等を例示することができる。
代表的なアレルギー性疾患には、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、花粉症、あるいは昆虫アレルギー等を示すことができる。アレルギー素因（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉａｔｈｅｓｉｓ）とは、アレルギー性疾患を持つ親から子に伝えられる遺伝的な因子である。家族性に発症するアレルギー性疾患はアトピー性疾患とも呼ばれ、その原因となる遺伝的に伝えられる因子がアトピー素因である。喘息は、アトピー性疾患のうち、特に呼吸器症状を伴う疾患に対して与えられた総称である。
本発明のアレルギー性疾患の検査方法は、被検者の生体試料におけるＭＡＬ遺伝子の発現レベルを測定し、健常者の測定値と比較する工程を含む。両者の比較の結果、健常者よりも発現が亢進している場合には、被検者がアレルギー性疾患であると判定される。本発明において、アレルギー性疾患の指標とすることができるＭＡＬ遺伝子を指標遺伝子と言う。
指標遺伝子は、ＭＡＬのみならず、他のアレルギー性疾患の指標となる遺伝子と組み合わせることもできる。指標遺伝子として複数の遺伝子を組み合わせて測定することによって検査精度を高めることができる。気管支喘息患者等のアレルギー性疾患患者は、ヘテロジーニアス（不均一）な集団なので、複数の遺伝子を指標とすることにより、より確実な診断を行うことができる。
本発明において、指標遺伝子の発現レベルとは、遺伝子のｍＲＮＡへの転写、並びに蛋白質への翻訳を含む。したがって本発明によるアレルギー性疾患の検査方法は、前記指標遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現強度、あるいは前記指標遺伝子によってコードされる蛋白質の発現レベルの比較に基づいて行われる。
本発明におけるアレルギー性疾患の検査における指標遺伝子の発現レベルの測定は、公知の遺伝子解析方法にしたがって実施することができる。具体的には、たとえばこの遺伝子にハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、または本発明の遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとした遺伝子増幅技術等を利用することができる。
本発明の検査に用いられるプローブまたはプライマーは、前記指標遺伝子の塩基配列に基づいて設定することができる。たとえばヒトＭＡＬ遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ７６２２３として公知である。
なお一般に高等動物の遺伝子は、高い頻度で多型を伴う。また、スプライシングの過程で相互に異なるアミノ酸配列からなるアイソフォームを生じる分子も多く存在する。多型やアイソフォームによって塩基配列に変異を含む遺伝子であっても、前記指標遺伝子と同様の活性を持ち、アレルギーに関与する遺伝子は、いずれも本発明の指標遺伝子に含まれる。
プライマーあるいはプローブには、前記指標遺伝子の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。塩基配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
このようなポリヌクレオチドは、指標遺伝子を検出するためのプローブとして、また指標遺伝子を増幅するためのプライマーとして利用することができる。プライマーとして用いる場合には、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、指標遺伝子（またはその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のＤＮＡが用いられる。プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的である必要があるが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
なお、本発明における「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができる。これらポリヌクレオチドは、合成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブＤＮＡは、通常、標識したものが用いられる。標識方法としては、例えば次のような方法を示すことができる。なお用語オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのうち、重合度が比較的低いものを意味している。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに含まれる。
・ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーションによる標識
・ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識
・クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識（Ｂｅｒｇｅｒ ＳＬ，Ｋｉｍｍｅｌ ＡＲ．（１９８７）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｍｅｓ ＢＤ，Ｈｉｇｇｉｎｓ ＳＪ（１９８５）Ｇｅｎｅｓ Ｐｒｏｂｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）
・ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写による標識（Ｍｅｌｔｏｎ ＤＡ，Ｋｒｉｅｇ，ＰＡ，Ｒｅｂａｇｋｉａｔｉ ＭＲ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ，Ｚｉｎｎ Ｋ，Ｇｒｅｅｎ ＭＲ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１２，７０３５−７０５６）
・放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをＤＮＡに取り込ませる方法（Ｋｒｉｃｋａ ＬＪ．（１９９２）Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）
ハイブリダイゼーション技術を利用したアレルギー性疾患の検査は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法などを使用して行うことができる。さらには、ＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター法を用いることにより、本発明の遺伝子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能である。
ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法においては、両端を互いの蛍光を打ち消し合う異なった蛍光色素で標識したプローブを用い、検出対象（ＤＮＡもしくはＲＮＡの逆転写産物）にハイブリダイズさせる。ＰＣＲ反応が進んでＴａｑポリメラーゼの５’−３’エクソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）活性により同プローブが分解されると二つの蛍光色素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムに行う。検出対象についてコピー数の明らかな標準試料について同時に測定することにより、ＰＣＲ増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピー数を決定する（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６−７２８０；Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ４（６）：３５７−３６２；Ｈｅｉｄ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９８６−９９４；Ｇｉｂｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．Ｕ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９９５−１００１）。ＰＣＲ増幅モニター法においては、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることができる。
また本発明のアレルギー性疾患の検査方法は、前記指標遺伝子によりコードされる蛋白質を検出することにより行うこともできる。以下、本明細書において、前記指標遺伝子によりコードされる蛋白質を指標蛋白質と記載する。このような検査方法としては、例えば、これら指標蛋白質に結合する抗体を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法などを利用することができる。
この検出に用いる前記指標蛋白質に結合する抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０５（５９３４）：５３７−４０）であることができる。例えば、指標蛋白質に対するポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。あるいは必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させる。こうして得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることができる。
指標蛋白質の検出には、これらの抗体を適宜標識して用いればよい。また、この抗体を標識せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテインＡやプロテインＧを標識して間接的に検出することもできる。具体的な検出方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法を挙げることができる。
抗原に用いる蛋白質もしくはその部分ペプチドは、例えば該遺伝子もしくはその一部を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換え蛋白質を発現させ、発現させた組み換え蛋白質を培養体または培養上清から精製することにより得ることができる。あるいは、これらの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、あるいは全長ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを化学的に合成し、免疫原として用いることもできる。
更に本発明においては、指標遺伝子の発現レベルのみならず、生体試料における指標蛋白質の活性を指標として、アレルギー性疾患の検査を行うこともできる。指標蛋白質の活性とは、各蛋白質が備える生物学的な活性を言う。前記指標蛋白質の活性の検出は、公知の方法に基づいて行うことができる。
本発明の検査方法においては、通常、被検者の生体試料を試料とする。生体試料としては、末梢血Ｔ細胞等を用いることができる。末梢血からＴ細胞を得る方法は公知である。すなわち、末梢血を希釈してフィコールを利用して遠心分離することによりＰＢＭＣを分取することができる。分離したＰＢＭＣを試料として指標遺伝子あるいは指標蛋白質を測定することにより、本発明の検査方法を実施することができる。ＰＢＭＣには、リンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）や単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）が含まれる。しかし、実施例にも示すように、これらの血液細胞においては、指標遺伝子はＴ細胞で高い発現が見られる。したがって、他の細胞の存在は指標遺伝子や指標蛋白質の測定結果にほとんど影響を与えない。あるいは抗ＣＤ３抗体を固定したマイクロビーズでＴ細胞を特異的に吸着し分離することもできる。
本発明においては、ＰＢＭＣをアレルゲンで刺激した後に指標遺伝子の測定を行うことができる。ＰＢＭＣをアレルゲンで刺激後、ＰＢＭＣに含まれるＴ細胞における指標遺伝子の蛋白産生量や遺伝子転写量を測定することによって、実際にアレルギー性免疫応答が起こるかどうか、さらにその強弱を判定することができる。それによって、添加した抗原がアレルゲンであることの確認や疾患の重篤度を推測することができる。
本発明に用いることができるアレルゲンとしては、公知のアレルゲン性の物質を用いることができる。具体的には、ダニ、ハウスダスト、植物の花粉、あるいは各種の食品由来のタンパク質等がアレルゲン性物質として公知である。これらのアレルゲンは、天然に由来するものであっても良いし、遺伝子組換えなどの手法によって合成されたものであっても良い。またアレルゲンは、タンパク質の断片であることもできる。精製アレルゲンの調製方法も公知である。
ＰＢＭＣをｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてアレルゲンで刺激する方法は、公知である。たとえば実施例にも記載したように、単離したＰＢＭＣ等にアレルゲンを加えることにより、刺激することができる。アレルゲンによる刺激は、単球による貪食と抗原提示を介してこの抗原を認識するＴ細胞に伝わり、免疫応答が始まる。
Ｔ細胞における指標遺伝子の発現レベルの測定値は、公知の方法によって補正することができる。補正により、細胞における遺伝子の発現レベルの変化を比較することができる。測定値の補正は、Ｔ細胞に発現し、かつ細胞の状態に関わらず発現レベルが大きく変動しない遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）の発現レベルの測定値に基づいて、本発明において指標とすべき遺伝子の発現レベルの測定値を補正することによって行われる。
更に本発明は、本発明の検査方法のための試薬を提供する。すなわち本発明は、指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、気管支喘息発作の検査用試薬に関する。あるいは本発明は、指標蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、気管支喘息発作の検査用試薬に関する。本発明の試薬を構成するオリゴヌクレオチドや抗体は、アッセイフォーマットに応じて適当な標識を結合することができる。あるいは本発明の試薬を構成するオリゴヌクレオチドや抗体は、アッセイフォーマットに応じて適当な支持体に固定化しておくこともできる。また本発明の試薬は、前記オリゴヌクレオチドまたは前記抗体の他に、検査や保存に必要な付加的な要素と組み合せて検査用キットとすることもできる。キットを構成することができる付加的な要素を、以下に示す。これらの要素は、必要に応じて予め混合しておくこともできる。また、必要に応じて、保存剤や防腐剤を各要素に加えることができる。
試薬や生体試料を希釈するための緩衝液
Ｔ細胞を刺激するためのアレルゲン
陽性対照
陰性対照
標識を測定するための基質
反応容器
アッセイプロトコルを記載した指示書
本発明における指標遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＢＭＣをアレルゲンで刺激したときに、このＰＢＭＣに含まれるＴ細胞において発現量の増加を示した。従って、指標遺伝子の発現レベルを指標として、気管支喘息やアトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患の検査を行うことができる。
本発明におけるアレルギー性疾患の検査とは、たとえば以下のような検査が含まれる。気管支喘息の症状を示しながら、一般的な検査ではアレルギー性疾患と判定できない患者であっても、本発明に基づく検査を行えばアレルギー性疾患の患者であることが容易に判定できる。より具体的には、アレルギー性疾患が疑われる症状を示す患者における指標遺伝子の発現の上昇は、その症状の原因がアレルギー性疾患である可能性が高いことを示している。気管支喘息には、アレルギー反応が原因となっているものと、そうでないものがある。両者の治療方法はまったく異なるので、いずれの原因によって気管支喘息の症状がもたらされているのかを診断することは、治療上、たいへん重要な工程である。本発明の検査方法は、気管支喘息の原因の特定において、きわめて重要な情報を提供することができる。
あるいは、アレルギー症状が改善に向かっているのかどうかを判断するための検査が可能となる。本発明の指標遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＢＭＣをアレルゲンで刺激したときに、このＰＢＭＣに含まれるＴ細胞において発現量の増加を示した。Ｔ細胞は免疫応答において司令塔としての役割を果たす細胞である。したがって、アレルゲンによって刺激されたＰＢＭＣにおいて、その免疫応答を掌るＴ細胞で発現が変動する遺伝子は、治療効果の判定に有用である。より具体的には、アレルギー性疾患と診断された患者における指標遺伝子の発現の上昇は、アレルギーの症状が進行している可能性が高いことを示している。
また本発明は、指標遺伝子のＴ細胞における発現レベルを上昇させたトランスジェニック非ヒト動物のアレルギー性疾患モデル動物としての使用に関する。アレルギー性疾患モデル動物は、気管支喘息における生体内の変化を明らかにするために有用である。更に、本発明のアレルギー性疾患モデル動物は、アレルギー性の気管支喘息の治療薬の評価に有用である。
本発明によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＢＭＣをアレルゲンで刺激したときに、このＰＢＭＣに含まれるＴ細胞において前記指標遺伝子の発現レベルが、上昇することが明らかとなった。したがって、Ｔ細胞においてＭＡＬ遺伝子、またはＭＡＬ遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現レベルを人為的に増強した動物は、アレルギー性疾患のモデル動物として利用することができる。なおＴ細胞における発現レベルの上昇とは、血液細胞全体における標的遺伝子の発現レベルの上昇を含む。すなわち、前記遺伝子の発現レベルを上昇させるのはＴ細胞のみである場合のみならず、血液細胞全体において、あるいは全身性に前記遺伝子の発現レベルが上昇している場合を含む。
本発明において機能的に同等な遺伝子とは、指標遺伝子によってコードされる蛋白質において明らかにされている活性と同様の活性を備えた蛋白質をコードする遺伝子である。機能的に同等な遺伝子の代表的なものとしては、トランスジェニック動物が本来備えている、その動物種における指標遺伝子のカウンターパートを挙げることができる。
あるいはヒトＭＡＬタンパク質のアミノ酸配列に対して、たとえば９０％以上、望ましくは９５％以上、更に望ましくは９９％以上の相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、ＭＡＬ遺伝子と機能的に同等な遺伝子として示すことができる。また、実施例において用いた配列番号：１と配列番号：２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅することができる遺伝子であって、アレルゲンによる刺激にともなってＰＢＭＣ中のＴ細胞において発現が増大する遺伝子も、機能的に同等な遺伝子である。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＢＭＣをアレルゲンで刺激したときに、このＰＢＭＣに含まれるＴ細胞において発現が増加する遺伝子は、アレルギー性の免疫応答の経路上にある遺伝子と言うことができる。言いかえれば、アレルゲンの刺激が、これらの遺伝子の発現の増強を通じて、アレルギー症状となって表れていると考えられる。つまり、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＢＭＣをアレルゲンで刺激したときに、このＰＢＭＣに含まれるＴ細胞において発現が増加する遺伝子は、ＰＢＭＣにおけるアレルギー性の免疫応答において重要な役割を果たす遺伝子と言える。したがって、この遺伝子の発現を抑制したり、あるいは活性を阻害する薬剤は、アレルギーの治療において、単にアレルギー症状を改善するのみならず、アレルギーの病態形成の本質的な原因を取り除く作用が期待できる。
以上のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＢＭＣをアレルゲンで刺激したときに、このＰＢＭＣに含まれるＴ細胞において発現が増加する遺伝子には重要な意味がある。そのため、この遺伝子の発現レベルを上昇させることによって得ることができるトランスジェニック動物をアレルギー性疾患モデル動物として使用し、遺伝子の役割や、遺伝子を標的とする薬剤を評価することには大きな意義がある。
また本発明によるアレルギー性疾患モデル動物は、後に述べるアレルギー性疾患の治療または予防のための医薬品のスクリーニングに加えて、アレルギー性疾患のメカニズムの解明、さらにはスクリーニングされた化合物の安全性の試験に有用である。
たとえば本発明によるアレルギー疾患モデル動物が気管支喘息を発症したり、何らかのアレルギー性疾患に関連した測定値の変化を示せば、それを回復させる作用を持った化合物を探索するスクリーニングシステムが構築できる。
本発明において、発現レベルの上昇とは、目的とする遺伝子が外来遺伝子として導入され強制発現している状態、あるいは宿主が備える遺伝子の転写と蛋白質への翻訳が増強されている状態、並びに翻訳産物である蛋白質の分解が抑制された状態のいずれかを意味する。遺伝子の発現レベルは、たとえば実施例に示すような定量的なＰＣＲにより確認することができる。また翻訳産物であるタンパク質の活性は、正常な状態と比較することにより確認することができる。
代表的なトランスジェニック動物は、目的とする遺伝子を導入し強制発現させた動物である。この他のトランスジェニック動物には、たとえば遺伝子のコード領域に変異を導入し、その活性を増強したり、あるいは分解されにくいアミノ酸配列に改変した動物などを示すことができる。アミノ酸配列の変異には、置換、欠失、挿入、あるいは付加を示すことができる。その他、遺伝子の転写調節領域を変異させることにより、本発明の遺伝子の発現そのものを調節することもできる。
特定の遺伝子を対象として、トランスジェニック動物を得る方法は公知である。すなわち、遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法や、位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第４８７３１９１号）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を使用する方法などによってトランスジェニック動物を得ることができる。その他、レトロウィルスベクターに遺伝子を挿入し、卵に感染させる方法、また、精子を介して遺伝子を卵に導入する精子ベクター法等も開発されている。精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（Ｍ．ＬａｖｉｔｒａｎｏｅｔらＣｅｌｌ，５７，７１７，１９８９）。
本発明のアレルギー性疾患モデル動物として用いるトランスジェニック動物は、ヒト以外のあらゆる脊椎動物を利用して作成することができる。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、あるいはウシ等の脊椎動物において様々な遺伝子の導入や発現レベルを改変されたトランスジェニック動物が作り出されている。
更に本発明は、アレルギー性疾患治療薬のスクリーニング方法に関する。本発明において、指標遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＢＭＣをアレルゲンで刺激したときに、このＰＢＭＣに含まれるＴ細胞において有意に発現レベルが上昇している。したがって、これらの遺伝子の発現レベルを低下させることができる化合物を選択することによって、アレルギー性疾患の治療薬を得ることができる。本発明において遺伝子の発現レベルを低下させる化合物とは、遺伝子の転写、翻訳、タンパク質の活性発現のいずれかのステップに対して阻害的に作用する作用を持つ化合物である。
本発明のアレルギー性疾患治療薬のスクリーニング方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで行なうこともｉｎ ｖｉｔｒｏで行うこともできる。このスクリーニングは、たとえば以下のような工程にしたがって実施することができる。なお本発明のスクリーニング方法における指標遺伝子とは、ＭＡＬ遺伝子に加え、ＭＡＬ遺伝子と機能的に同等ないずれかの遺伝子を含む。
（１）被験動物に、候補化合物を投与する工程、
（２）前記動物の生体試料における指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（３）候補物質を投与しない対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
本発明において機能的に同等な遺伝子とは、各指標遺伝子によってコードされる蛋白質において明らかにされている活性と同様の活性を備えた蛋白質をコードする遺伝子である。機能的に同等な遺伝子の代表的なものとしては、被験動物が本来備えている、その動物種における指標遺伝子のカウンターパートを挙げることができる。
本発明のスクリーニング方法における被験動物としては、例えばアレルギー性疾患モデル動物を利用することができる。アレルギー性疾患モデル動物は公知である。たとえば人間のアトピー性皮膚炎に近いモデルとして、ＮＣ／Ｎｇａマウスを用いた皮膚炎自然発症モデルが報告されている。このマウスの耳介にダニ抗原（５μｇ／耳）を２−３日間隔で計８回投与すると、２週間以降にはヒトのアトピー性皮膚炎に酷似した症状を誘発することができる。この系に候補化合物を投与し、本発明の指標遺伝子の発現レベルの変化を追跡することによって本発明によるスクリーニングを実施することができる。
このようにして被験動物に薬剤候補化合物を投与し、被験動物由来の生体試料における指標遺伝子の発現に対する化合物の作用をモニターすることにより、指標遺伝子の発現レベルに与える薬剤候補化合物の影響を評価することができる。被験動物の由来の生体試料における指標遺伝子の発現レベルの変動は、前記本発明の検査方法と同様の手法によってモニターすることができる。更にこの評価の結果に基づいて、指標遺伝子の発現レベルを低下させる薬剤候補化合物を選択すれば、薬剤候補化合物をスクリーニングすることができる。
より具体的には、被験動物から、生体試料を採取し、前記指標遺伝子の発現レベルを対照と比較することにより、本発明によるスクリーニングを実施することができる。生体試料としては、全血、ＰＢＭＣ、あるいはＴ細胞等を利用することができる。これらの生体試料の採取方法、および調製方法は公知である。
このようなスクリーニングにより、指標遺伝子の発現に様々な形で関与する薬剤を選択することができる。具体的には、たとえば次のような作用を持つ薬剤候補化合物を見出すことができる。
・指標遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路の抑制
・指標遺伝子の転写活性の抑制
・指標遺伝子の転写産物の安定化阻害もしくは分解の促進等
また本発明は、前記スクリーニング方法において、候補化合物の投与前および／または投与後に、被験動物をアレルゲンで刺激する工程を含むスクリーニング方法に関する。候補化合物の投与前にアレルゲンで刺激した場合には、候補化合物の、アレルゲン刺激後の免疫応答を抑制する作用を検出することができる。このようなスクリーニングによって得ることができる化合物には、アレルギー性疾患の治療効果を期待できる。また候補化合物の投与後にアレルゲンで刺激した場合には、候補化合物の、アレルゲン刺激による免疫応答の開始を抑制する作用を検出することができる。このようなスクリーニングによって得ることができる化合物には、アレルギー性疾患の予防効果を期待できる。本発明のスクリーニング方法に用いることができるアレルゲンとしては、先に述べたようなアレルゲンが挙げられる。
また、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのスクリーニングにおいては、例えば、指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させ、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する方法が挙げられる。このスクリーニングは、たとえば以下のような工程にしたがって実施することができる。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
指標遺伝子を発現する細胞として、たとえばヒト急性白血病Ｔ細胞Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ ＴＩＢ−１５２）は、本発明のスクリーニング方法に好適である。この細胞は、ＡＴＣＣより購入することができる。
本発明のスクリーニングの方法は、まず前記細胞株に候補化合物を添加する。その後、該細胞株における指標遺伝子の発現レベルを測定し、該遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する。
なお本発明のスクリーニング方法において、指標遺伝子の発現レベルは、これらの遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルのみならず、対応するｍＲＮＡを検出することにより比較することもできる。ｍＲＮＡによって発現レベルの比較を行うには、タンパク質試料の調製工程に代えて、先に述べたようなｍＲＮＡ試料の調製工程を実施する。ｍＲＮＡやタンパク質の検出は、先に述べたような公知の方法によって実施することができる。
さらに本発明の開示に基づいて本発明の指標遺伝子の転写調節領域を取得し、レポーターアッセイ系を構築することができる。レポーターアッセイ系とは、転写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量を指標として、該転写調節領域に作用する転写調節因子をスクリーニングするアッセイ系をいう。
ＭＡＬ遺伝子の転写開始点より上流約６００ｂｐの領域については、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として用いて転写活性が検討されている。その結果ＳＰ１などの転写因子認識領域が転写に重要な働きをしていることが報告されている（Ｔｕｇｏｒｅｓ Ａ ｅｔ ａｌ．１９９７，ＤＮＡ ＡＮＤ ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ １６，２４５−２５５．Ａ Ｔａｎｄｅｍ Ａｒｒａｙ ｏｆ Ｓｐ−１ ａｎｄ ａ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ａｒｅ Ｂｏｔｈ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｓｙｎｅｒｇｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ−Ｃｅｌｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＭＡＬ Ｇｅｎｅ）。しかし、本発明のスクリーニング方法に用いる転写調節領域は、その活性が明らかにされている６００ｂｐの領域に限定されない。更に上流にあって、ＭＡＬ遺伝子の転写を調節している領域が明らかになれば、その領域も本発明に利用することができる。このように、十分な範囲を有する転写調節領域を用いて、レポーターアッセイ系を作製し、本発明のスクリーニングを行うことができる。
転写調節領域としては、プロモーター、エンハンサー、さらには、通常プロモーター領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス等を例示することができる。またレポーター遺伝子としては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、成長ホルモン遺伝子等を利用することができる。
既に述べたように、ＭＡＬでは転写開始点より約６００ｂｐの領域が転写調節領域として解析されている。その他に、たとえば、本発明のスクリーニングに用いる転写調節領域を次のようにして取得することもできる。すなわち、まず本発明で開示した指標遺伝子の塩基配列に基づいて、ＢＡＣライブラリー、ＹＡＣライブラリー等のヒトゲノムＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションを用いる方法によりスクリーニングを行い、該ｃＤＮＡの配列を含むゲノムＤＮＡクローンを得る。得られたゲノムＤＮＡの配列を基に、本発明で開示したｃＤＮＡの転写調節領域を推定し、該転写調節領域を取得する。得られた転写調節領域を、レポーター遺伝子の上流に位置するようにクローニングしてレポーターコンストラクトを構築する。得られたレポーターコンストラクトを培養細胞株に導入してスクリーニング用の形質転換体とする。この形質転換体に候補化合物を接触させ、レポーター遺伝子の発現を制御する化合物のスクリーニングを行うことができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの本発明によるスクリーニング方法として、指標蛋白質の活性に基づくスクリーニング方法を利用することもできる。すなわち本発明は、次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＭＡＬまたはＭＡＬ遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法に関する。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補物質を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）対照と比較して前記蛋白質の活性を低下させる化合物を選択する工程
本発明における指標蛋白質であるＭＡＬには、たとえばＴ細胞の分化への関与、ミエリン蛋白のミエリン膜への輸送にＭＡＬが関与する可能性や、上皮細胞ではＧＰＩ−アンカー型蛋白を含む種々の蛋白のアピカル膜への輸送との関連性、あるいはＣＤ５９やチロシンキナーゼＬｃｋとの関連性等が推測されている。これらの活性を指標として、その活性を阻害する活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。このようにして得ることができる化合物は、ＭＡＬの働きを抑制する。その結果、Ｔ細胞において発現が誘導された指標蛋白質の阻害を通じて、アレルギー性の免疫応答を制御することができる。
本発明による各種のスクリーニング方法に必要な、ポリヌクレオチド、抗体、細胞株、あるいはモデル動物は、予め組み合わせてキットとすることができる。より具体的には、たとえば指標遺伝子を発現する細胞と、これらの指標遺伝子の発現レベルを測定するための試薬とで構成される。指標遺伝子の発現レベルを測定するための試薬としては、たとえば少なくとも１つの指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、若しくはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドが用いられる。あるいは、少なくとも１つの指標蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体を試薬として用いることができる。これらのキットには、標識の検出に用いられる基質化合物、細胞の培養のための培地や容器、陽性や陰性の標準試料、更にはキットの使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。
これらスクリーニングに用いる被検候補化合物としては、ステロイド誘導体等既存の化学的方法により合成された化合物標品、コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物標品のほか、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品などが挙げられる。
本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。あるいは、ＭＡＬ遺伝子の発現を抑制することができる、アンチセンスＤＮＡも、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。更に、ＭＡＬ遺伝子によってコードされる蛋白質を認識する抗体が、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。本発明のアレルギー性疾患の治療薬は、前記スクリーニング方法によって選択された化合物を有効成分として含み、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合することによって製造することができる。本発明のアレルギー性疾患の治療剤は、アレルギー症状の改善を目的として、経口、あるいは非経口的に投与することができる。
経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。
また、投与すべき化合物がタンパク質からなる場合には、それをコードする遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導入することにより、治療効果を達成することができる。治療効果をもたらすタンパク質をコードする遺伝子を生体に導入し、発現させることによって、疾患を治療する手法は公知である。
あるいはアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーター配列の下流に組み込み、アンチセンスＲＮＡ発現ベクターとして投与することができる。この発現ベクターをアレルギー疾患患者のＴ細胞へ導入すれば、これらの遺伝子のアンチセンスを発現し、当該遺伝子の発現レベルの低下によってアレルギーの治療効果を達成することができる。Ｔ細胞への発現ベクターの導入としては、ｉｎ ｖｉｖｏ、あるいはｅｘ ｖｉｖｏで行う方法が公知である。
投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人一人あたり、一回につき０．１ｍｇから５００ｍｇの範囲で、好ましくは０．５ｍｇから２０ｍｇの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕患者および健常者からの血液採取
アレルギー性疾患特異的に発現が異なる遺伝子を単離する目的で、症例を解析し、選出された患者および健常者から血液を採取した。健常者として１８名、気管支喘息患者群として８名、アトピー性皮膚炎患者群として６名、並びに気管支喘息およびアトピー性皮膚炎を有する患者として５名から血液を採取した。これらの血液試料の一部を用いて、ダニ抗原特異的ＩｇＥの量を測定した。
特異的ＩｇＥの測定はペーパーディスクを固相とするＲＡＳＴ法を改良したＣＡＰ ＲＡＳＴ法により行った。Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製の標準の抗体価を含む血清を基準とし、それぞれの検体のＩｇＥ抗体価を決定した。得られた値をスコアで示した。
被検者のダニ特異的ＩｇＥ抗体価のスコアを表２に示す。表２に示されるように、健常者では、半数以上がスコアが２以下であった。一方、患者群では高いスコアが見られ、ダニ抗原に対するアレルギーを持つことが示された。
〔実施例２〕血液試料からのリンパ球画分の調製
血液１０ｍｌから、以下のようにしてＰＢＭＣを調製した。まずノボ社製等のヘパリン１ｍｌで注射筒壁を万遍なく処理し、最終濃度５０ｕｎｉｔ／ｍｌのヘパリンを含む１０ｍｌ注射筒に採血した。このとき一人の採血に２２Ｇ針を２本準備した。注射針をはずし、５０ｍｌの遠心チューブ（ポリプロピレン製）に移した。１５００ｒｐｍ、室温で５分間遠心し、できるだけ表面近くから１．１ｍｌを採取し、１５０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心して上清１ｍｌを血漿（ｐｌａｓｍａ）として回収した。血漿を回収した残りに３％のデキストラン（ナカライ社製）を含む０．９％ ＮａＣｌを等量（９ｍｌ）加え、静かに数回転倒させて混和した。その後３０分間室温で静置した。ＰＲＰ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ、血小板に富む血漿）を別の１５ｍｌ遠心チューブに移し、１２００ｒｐｍ（トミー社製の遠心機で１５０×ｇに相当する）で５分間、室温で遠心した。遠心後、血小板は上清にあった。沈殿した細胞をギブコ社等から入手したＣａ、Ｍｇ不含のＨＢＳＳ ５ｍｌに懸濁した。これを、パスツールピペットを用いてＦｉｃｏｌ Ｐａｑｕｅ（ファルマシア社製）が５ｍｌが入ったチューブ（ファルコンチューブ：２００６または２０５９；ポリプロピレン製）１本に上層した。１２００ｒｐｍで５分間遠心後、１５００ｒｐｍ（Ｔｏｍｙ社製の遠心機で４００×ｇに相当する）で３０分間室温で遠心した。その結果、顆粒細胞（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）が沈殿し、フィコール層を挟んで中間層にリンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）が含まれた。中間層を分取してＰＢＭＣとした。
〔実施例３〕ダニ抗原で刺激したＰＢＭＣにおけるＴ細胞のＧｅｎｅＣｈｉｐによる遺伝子発現解析
ダニ抗原は代表的なアレルゲンである。ダニ抗原刺激に応答するようなアレルギー性疾患関連遺伝子を見出す目的で、アレルギー性疾患患者と健常者由来のＰＢＭＣをそれぞれダニ抗原蛋白で刺激し、両者で異なる発現変動を示す遺伝子を探索した。
アレルギー性慢性気管支喘息患者と健常者それぞれ１名の末梢血１００ｍＬから、実施例２に記載の方法に準じてＰＢＭＣを調製した。得られたＰＢＭＣを、ダニ抽出物（Ｍｉｔｅ Ｅｘｔｒａｃｔ ＤｆとＭｉｔｅ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｄｐそれぞれ５μｇ／ｍｌ、ＬＳＬ社）存在下、ダニ抽出物およびデキサメタゾン（１００ｎＭ）存在下、あるいは未添加コントロールの３つの条件で培養した。１０％牛胎児血清、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。１２時間、４０時間培養後にＰＢＭＣを回収し、その中のＴ細胞（ＣＤ３陽性細胞）および単球（ＣＤ１４陽性細胞）を分離した。Ｔ細胞と単球は、抗ＣＤ３抗体磁気ビーズ、抗ＣＤ１４抗体磁気ビーズで順に標識し、磁気細胞分離装置（Ｍｉｌｔｅｎｉ、Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いて分離した。得られた細胞からＲＮＡを抽出し、オリゴヌクレオチドアレイＧｅｎｅＣｈｉｐ ＨｕＧｅｎｅ ＦＬ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いて遺伝子の発現解析を行った。またこのとき回収した培養上清中に含まれるＩＬ−４をＥＬＩＳＡによって測定した（実施例５）。
その結果、Ｘ７６２２３遺伝子の発現が抗原刺激後１２時間および４０時間の喘息患者のＴ細胞で健常者よりも上昇することが明らかとなった（図１）。また、ステロイド系の治療薬であるデキサメサソンの作用によりＭＡＬの発現上昇は抑制されていた。Ｘ７６２２３はオリゴヌクレオチドアレイ上でＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＭＡＬ ｇｅｎｅ ｅｘｏｎ４として登録されていた。
〔実施例４〕ダニ抗原刺激ＰＢＭＣにおけるＭＡＬ発現定量実験
ＤＮＡチップ実験の結果を確認するために、表２に示した被験者の末梢血から調製したＰＢＭＣを用いてダニ抗原刺激を行い、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によってＭＡＬの発現量を測定した。刺激は上記と同じ方法で行い、回収したＰＢＭＣ全体からＲＮＡを調製し、培養上清を保存した。ＲＮＡから常法によりｃＤＮＡを作製後、ＭＡＬおよびＩＬ−４受容体α鎖についてそれぞれに特異的なプライマー、プローブを用いてＡＢＩ７７００（アプライドバイオシステムズ社）により定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。チップに登録されているＭＡＬ配列を基にプライマーとプローブを設計した。
ＭＡＬプライマー
ＭＡＬプローブ
ＩＬ−４受容体α鎖プライマー
ＩＬ−４受容体α鎖プローブ
ＭＡＬ、あるいはＩＬ−４受容体α鎖定量用プローブは、いずれもその５’末端がＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）で、また３’末端がＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）で標識されている。ＭＡＬについては、プライマーで増幅する１５１ｂｐの配列をクローニングしたプラスミドをコピー数の標準として用いた。ＩＬ−４受容体α鎖については、プライマーで増幅する１３５ｂｐの配列をクローニングしたプラスミドをコピー数の標準として用いた。ＰＣＲ増幅のモニタリングのための反応液の組成は表１に示した。また定量結果を表２に示した。ダニ刺激の有無によるＭＡＬの発現レベルの変化は図２に示した。
ＭＡＬの発現は、ＰＢＭＣをダニ抗原で刺激したときに特異的ダニＩｇＥ陽性者由来の試料において特異的に発現が上昇することが確認された。患者の大部分は特異的ダニＩｇＥ抗体が陽性である。特異的ダニＩｇＥ陰性群と陽性群にわけて反復測定分散分析を行った結果、有意差が認められた（ｐ＝０．００１９）。ＩＬ−４受容体α鎖の発現様式はＭＡＬの発現と酷似していた（図３）。反復測定分散分析を行った結果、特異的ダニＩｇＥ陰性群と陽性群とで有意差が認められた（ｐ＝０．００４０）。０）。両遺伝子の発現変化量は非常に高い相関を示した（相関係数＝０．９５）。
〔実施例５〕ダニ抗原刺激ＰＢＭＣによるＩＬ−４の産生
培養上清中に産生分泌されたＩＬ−４量をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定した。ダニ特異的ＩｇＥ陽性者ではほとんどの場合抗原刺激した時にＩＬ−４産生が認められた。同時にこれらの試料ではＭＡＬの発現も上昇していた（図４）。
〔実施例６〕種々の白血球種におけるＭＡＬの発現定量
健常者５名の末梢血から調製したＴ細胞、Ｂ細胞、単球、好中球、好酸球における発現を定量した。被験者から採取した全血に３％デキストラン溶液を加えて３０分室温放置し、赤血球を沈降させた。上層の白血球画分を回収し、フィコール溶液（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ；アマシャムファルマシアバイオテク）の上に載せて１５００ｒｐｍ、３０分室温で遠心した。下層に回収された顆粒球画分をＣＤ１６抗体磁気ビーズと４℃で３０分反応させ、ＭＡＣＳを用いた分離でトラップされずに溶出する細胞を好酸球として実験に用いた。好中球（Ｎ）は好酸球を溶出させた後、ＣＤ１６抗体磁気ビーズでトラップされた細胞を磁界から外して溶出、回収して調製した。一方、フィコール遠心分離で中間層に回収される単核球画分を、ＭＡＣＳ ＣＤ３抗体磁気ビーズにより溶出画分（Ｍ：ｍｏｎｏｃｙｔｅとＢ ｃｅｌｌの混合物）とトラップされる画分（Ｔ ｃｅｌｌ画分）に分離した。次に、溶出画分をＭＡＣＳ ＣＤ１４抗体磁気ビーズにより、溶出画分（Ｂ ｃｅｌｌ画分）とトラップされる画分（ｍｏｏｃｙｔｅ画分）に分け、それぞれを精製Ｔ細胞、精製Ｂ細胞、そして精製単球とした。
好酸球はＩｓｏｇｅｎ、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、そして単球はＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて可溶化し、全ＲＮＡ抽出、ＤＮａｓｅ処理後（方法は前述の通り）遺伝子発現解析に供した。用いたプライマー、プローブ等は上記と同一である。測定結果を図５に示した。この結果から、ＭＡＬは特にＴ細胞で高い発現が認められた。
〔実施例７〕末梢血由来培養Ｔ細胞でのＩＬ−４による発現誘導実験
ＭＡＬの発現レベルに及ぼす各種サイトカインの影響を調べた。健常者末梢血から実施例６に示した方法でＴ細胞を分離し、抗ＣＤ３抗体で刺激し増殖させた。すなわち、抗ＣＤ３抗体で表面処理した培養プレートを用いて、５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２）により分離Ｔ細胞を５ｘ１０５細胞／ｍＬの密度で５日間培養した。増殖したＴ細胞を同じ組成の培地で５ｘ１０５細胞／ｍＬの密度に希釈し、表面処理していないプレートでさらに３日間培養した。得られた細胞をＩＬ−２を含まない培地で洗浄し、刺激するサイトカインを添加した培地（ＩＬ−２非含有）に１ｘ１０６の細胞密度で浮遊させ、所定の時間刺激培養して、細胞を回収しＲＮＡを調製した。用いたサイトカインを次に示す。
ＩＬ−４：２ｎｇ／ｍＬ
ＩＬ−１２：２ｎｇ／ｍＬ
ＩＦＮ−γ：２００ｎｇ／ｍＬ
ＩＦＮ−α：１００ＩＵ／ｍＬ
培地には実施例３に記載したものと同じ培地を用いた。０〜４８時間の培養中、ＩＬ−４で刺激した場合にはＭＡＬのｍＲＮＡが誘導された。この作用はＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２では認められなかった（図６）。ＭＡＬはＩＬ−４によって発現が誘導されることから、アレルギー性疾患におけるＩＬ−４の作用に関連している可能性がある。例えば、Ｔ細胞のＴｈ２への分化の過程に働いている可能性や、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０の産生への関与も考えられる。
〔実施例８〕Ｊｕｒｋａｔ細胞株でのＩＬ−４によるＭＡＬ蛋白の発現誘導
ＩＬ−４（２ｎｇ／ｍｌ）で３２時間刺激したＪｕｒｋａｔ細胞から細胞溶解液を調製し、
Ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｏｖｅｒａｌｌ Ａｐｉｃａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｒａｔ Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ １１，２０３３−２０４５，Ｊｕｎｅ ２０００）に従って、スクロース密度勾配遠心を行い、ラフト画分（画分４、５、６）を分離した。各画分の蛋白をＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、ＭＡＬペプチドに対する抗体またはＬＡＴ（ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ）に対する抗体を用いてウェスタンブロティングを行った。ＬＡＴはラフトに存在することが判明している蛋白であり、ラフト画分のマーカーとなる。その結果、ラフトにおいてＭＡＬ蛋白の発現が増加していることが明らかとなった（図７）。
〔実施例９〕ヒト末梢血Ｔ細胞でのＩＬ−４によるＭＡＬ蛋白の発現誘導
培養増殖させたヒト末梢血Ｔ細胞を実施例７と同様にＩＬ−４（２ｎｇ／ｍｌ）で４１時間刺激し、ラフト画分（画分４）におけるＭＡＬ蛋白の発現をウェスタンブロットによって調べた。その結果、ヒト末梢血Ｔ細胞においても、ラフトにおけるＭＡＬ蛋白のＩＬ−４による誘導が確認された（図８）。
以上の結果から、ｍＲＮＡレベルだけでなく、蛋白レベルでもＭＡＬの発現がＩＬ−４によって誘導されることがＪｕｒｋａｔ細胞株、さらにヒト末梢血Ｔ細胞でも明らかとなった。ラフトというシグナル伝達に重要な場所でＭＡＬ蛋白の増加が確認できたことはＴ細胞のラフトにおいてＭＡＬ蛋白が機能を有することを示唆した。
産業上の利用の可能性
本発明により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＢＭＣをアレルゲンで刺激したときに、このＰＢＭＣに含まれるＴ細胞において有意に発現レベルが上昇する遺伝子ＭＡＬが提供された。本発明の指標遺伝子に基づいて、アレルギー性疾患の検査、および治療薬のスクリーニングを行うことが可能となった。
本発明によって提供されたアレルギー疾患関連遺伝子は、アレルゲンの種類に関わらず、簡便にその発現レベルを知ることができる。したがって、アレルギー反応の病態を総合的に把握することができる。
また本発明によるアレルギーの検査方法は、末梢血白血球を試料としてその発現レベルを解析することができるので、患者に対する侵襲性が低い。しかも遺伝子発現解析に関しては、たとえばＥＣＰなどの蛋白質測定と異なって、微量サンプルによる高感度な測定が可能である。遺伝子解析技術は、年々ハイスループット化、低価格化が進行している。したがって本発明によるアレルギーの検査方法は、近い将来、ベッドサイドにおける重要な診断方法となることが期待される。この意味でこれらの病態関連遺伝子の診断的価値は高い。
更に、本発明のスクリーニング方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＢＭＣをアレルゲンで刺激したときに、このＰＢＭＣに含まれるＴ細胞において有意に発現レベルが上昇する遺伝子を指標として実施される。Ｔ細胞は、アレルゲンに対するアレルギー性の免疫応答をコントロールしている細胞である。したがって、このスクリーニング方法によって見出すことができる化合物は、幅広いアレルギーの病態制御に有用であると期待できる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、ダニ抗原刺激後のＴ細胞におけるＭＡＬの発現レベルの変化を示す図。図中、縦軸はパーフェクトマッチとミスマッチのプローブセルの蛍光強度の差の平均値であるＡｖｅｒａｇｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ａｖｇ Ｄｉｆｆ）を、横軸は試料と培養時間を示す。図中、Ｃ：未刺激コントロール、Ｍ：ダニ抗原刺激処理、Ｄ：ダニ抗原およびデキサメタゾン処理を示す。
図２は、ダニ抗原刺激におけるＭＡＬの発現レベルの変化を示す図。各試料における、ＰＢＭＣのＲＮＡ １ｎｇ当たりのＭＡＬのｍＲＮＡのコピー数を示す。図中、健：健常者、患：患者、スコア：ダニ特異的ＩｇＥスコアを示す。
図３は、ダニ抗原刺激におけるＩＬ−４受容体αの発現レベルの変化を示す図。各試料における、ＰＢＭＣのＲＮＡ １ｎｇ当たりのＩＬ−４受容体αのｍＲＮＡのコピー数を示す。図中、健：健常者、患：患者、スコア：ダニ特異的ＩｇＥスコアを示す。
図４は、ダニ抗原刺激ＰＢＭＣの培養上清中に含まれるＩＬ−４濃度の測定結果を示す図。各試料における、培養液中のＩＬ−４濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。図中、健：健常者、患：患者、スコア：ダニ特異的ＩｇＥスコアを示す。
図５は、各種末梢血白血球におけるＭＡＬの発現レベルの比較結果を示す図。縦軸は、ＲＮＡ １ｎｇ当たりのＭＡＬのｍＲＮＡのコピー数を、横軸は白血球細胞の種類を示す。
図６は、末梢血培養Ｔ細胞のＩＬ−４刺激によるＭＡＬの上昇を示す図。縦軸は、ＲＮＡ １ｎｇ当たりのＭＡＬのｍＲＮＡのコピー数を、横軸はサイトカイン刺激時間を示す。
図７は、ＩＬ−４で刺激したＪｕｒｋａｔ細胞におけるＭＡＬ蛋白質の発現レベルを、ウエスタブロッティングで調べた結果を示す写真。抗体には、抗ＬＡＴ抗体（上）、または抗ＭＡＬ抗体（下）を用い、それぞれＩＬ−４刺激の無い場合と比較した。
図８は、ＩＬ−４で刺激した末梢血培養Ｔ細胞におけるＭＡＬ蛋白質の発現レベルを、ウエスタブロッティングで調べた結果を示す写真。抗体には、抗ＬＡＴ抗体（上）、または抗ＭＡＬ抗体（下）を用い、それぞれＩＬ−４刺激の無い場合と比較した。
本発明は、アレルギー性疾患の検査方法に関する。
背景技術
アレルギー性疾患は、多因子性の病気（ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ）と考えられている。つまり気管支喘息やアトピー性皮膚炎は多くの異なる遺伝子の発現の相互作用によって起こり、これらの個々の遺伝子の発現は、複数の環境要因によって影響を受ける。このため、アレルギー性疾患を起こす特定の遺伝子を解明することは、非常に困難であった。
アレルギー性疾患には、変異や欠損を有する遺伝子の発現や、特定の遺伝子の過剰発現や発現量の減少が関わっていると考えられている。病気に関して遺伝子発現が果たしている役割を解明するためには、遺伝子が発症にどのように関わり、薬剤などの外的な刺激が遺伝子発現をどのように変化させるのかを理解する必要がある。
さて、現在アレルギー性疾患の診断においては、一般に、問診、家族歴、そして本人の既往症の確認が重要な要素となっている。またアレルギーをより客観的な情報に基づいて診断するために、血液を試料とする試験方法や、アレルゲンに対する患者の免疫学的な応答を観察する方法も実施されている。前者の例として、アレルゲン特異的ＩｇＥ測定、白血球ヒスタミン遊離試験、あるいはリンパ球幼若化試験等が挙げられる。アレルゲン特異的ＩｇＥの存在は、そのアレルゲンに対するアレルギー反応の証明である。しかし患者によっては、必ずしもアレルゲン特異的なＩｇＥを検出できるとは限らない場合もある。また、その測定原理上、診断に必要なアレルゲンの全てに対して、試験を実施しなければならない。白血球ヒスタミン遊離試験やリンパ球幼若化試験は、免疫システムのアレルゲンに対する反応をｉｎ ｖｉｔｒｏで観察する方法である。これらの方法は、操作が煩雑である。
一方、患者を実際にアレルゲンに接触させたときに観察される免疫応答をアレルギーの診断に役立てる方法（後者）も公知である。プリック・テスト、スクラッチ・テスト、パッチ・テスト、皮内反応、あるいは誘発試験等が、この種の試験に含まれる。これらの試験では、患者のアレルギー反応を直接診断することができる反面、実際に被検者をアレルゲンに曝露する侵襲性の高い検査であると言うことができる。
この他、アレルゲンに関わらず、アレルギー反応の関与を証明するための試験方法も試みられている。たとえば、血清ＩｇＥ値が高値である場合、その患者にはアレルギー反応が起きていると推定することができる。血清ＩｇＥ値は、アレルゲン特異ＩｇＥの総量に相当する情報である。アレルゲンの種類に関わらずＩｇＥの総量を決定することは容易であるが、非アトピー型気管支炎等の疾患を持つ患者では、ＩｇＥが低値となる場合がある。
したがって、患者に対する侵襲が少なく、しかも診断に必要な情報を容易に得ることができる、アレルギー性疾患のマーカーが提供されれば有用である。このようなマーカーは、アレルギー性疾患の発症に深く関与していると考えられるので、診断のみならず、アレルギー症状のコントロールにおいても、重要な標的となる可能性がある。
発明の開示
本発明は、特にアレルギー性疾患の検査を可能とする指標遺伝子の提供を課題とする。さらに、本発明は該指標に基づく、アレルギー性疾患の検査方法およびアレルギー性疾患治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
免疫応答には、各種の血液細胞が密接に関連している。たとえばダニ抗原に対する免疫応答は、以下のようにして進行する。まず単球がダニ抗原を貪食し、その分解物を抗原としてＴ細胞に提示する。提示されたダニ抗原のペプチドを認識できるＴ細胞だけが、抗原提示に反応する。抗原提示に反応したＴ細胞は、以後の免疫反応（アレルギー反応）の方向性を決定する各種のサイトカインを産生する。このとき産生されるサイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−γなどの、アレルギー反応に密接に関連するサイトカインである。このようなＴ細胞の活動の結果として、たとえばＢ細胞ではＴ細胞との相互作用とＩＬ−４による刺激によってダニ抗原特異的なＩｇＥの産生が始まる。
本発明者らは、このような免疫応答システムを支える血液細胞における遺伝子発現の変化を観察することによって、アレルギー反応に関連する遺伝子を単離することができると考えた。本出願人は、このような考えかたに基づいて、花粉症患者の末梢血の血液細胞において発現レベルが変化している次の遺伝子の単離に成功し、特許出願している。
花粉症関連遺伝子３７３（ＷＯ００／６５０４６）
花粉症関連遺伝子４１９（ＷＯ００／６５０４５）
花粉症関連遺伝子５１３（ＷＯ００／６５０４９）
花粉症関連遺伝子５８１（ＷＯ００／６５０４８）
花粉症関連遺伝子７９５（ＷＯ００／６５０５０）
花粉症関連遺伝子６２７（ＷＯ００／６５０５１）
花粉症関連遺伝子４４１（ＷＯ００／７３４３５）
花粉症関連遺伝子４６５（ＷＯ００／７３４３９）
花粉症関連遺伝子７８７（ＷＯ００／７３４４０）
これらの遺伝子は、末梢血から分離した細胞において発現レベルに差が見られた遺伝子である。このような発現はスポンテイニアス（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）な発現と呼ばれる。このようなアプローチに対して、本発明者らは、末梢血から分離した細胞を、アレルギー性疾患の患者の局所に近い条件に置くために研究を重ねた。
一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアレルギー反応を観察するための手法として、末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；以下ＰＢＭＣと省略する）をアレルゲンで刺激する手法が公知である。本発明者らは、この手法に更に改良を加え、アレルゲンの処理後に特にＴ細胞において発現レベルが変化する遺伝子の探索を行った。先に述べたように、Ｔ細胞は免疫応答を決定している細胞である。したがって、アレルゲンに対してアレルギー性の応答が起きるときに、Ｔ細胞において発現レベルが変動する遺伝子には、重要な役割が予測される。
このような解析によって、本発明者らはＭＡＬ遺伝子がアレルギー性の免疫応答にともなって発現レベルが有意に上昇することを明らかにした。これらの知見に基づいて、本発明者らは、ＭＡＬ遺伝子を指標としてアレルギー性疾患の検査、あるいはアレルギー性疾患の治療薬のスクリーニングが可能となることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下のアレルギーの検査方法、アレルギー性疾患の治療薬、そのスクリーニング方法、アレルギー性疾患のモデル動物、並びにこれらの方法のためのキットに関する。
〔１〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の検査方法であって、指標遺伝子がＭＡＬである方法。
ａ）被検者の生体試料における、指標遺伝子の発現レベルを測定する工程
ｂ）健常者の生体試料における指標遺伝子の発現レベルと比較する工程
〔２〕アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎および／または気管支喘息である、〔１〕に記載の検査方法。
〔３〕遺伝子の発現レベルを、ｃＤＮＡのＰＣＲによって測定する〔１〕に記載の検査方法。
〔４〕遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する〔１〕に記載の検査方法。
〔５〕生体試料が末梢血Ｔ細胞を含む試料である〔１〕に記載の方法。
〔６〕末梢血単核球細胞をアレルゲンで刺激した後に、指標遺伝子の発現レベルを測定する〔１〕に記載の方法。
〔７〕ＭＡＬ遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
〔８〕ＭＡＬ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
〔９〕更にアレルゲンを含む〔７〕または〔８〕に記載のアレルギー性疾患検査用試薬。
〔１０〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＭＡＬまたはＭＡＬ遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１１〕細胞がＴ細胞である〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＭＡＬまたはＭＡＬ遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）被験動物に候補化合物を投与する工程、
（２）被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現強度を測定する工程、および
（３）対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１３〕工程（１）の前、または後に被検動物をアレルゲンで刺激する工程を含む〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＭＡＬまたはＭＡＬ遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）対照と比較して前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１５〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＭＡＬまたはＭＡＬ遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補物質を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）対照と比較して前記蛋白質の活性を低下させる化合物を選択する工程
〔１６〕〔１０〕、〔１２〕、〔１４〕、および〔１５〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、アレルギー性疾患の治療薬。
〔１７〕指標遺伝子、またはその一部のアンチセンスＤＮＡを主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬であって、指標遺伝子がＭＡＬまたはＭＡＬと機能的に同等な遺伝子である治療薬。
〔１８〕指標遺伝子によってコードされる蛋白質に結合する抗体を主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬であって、指標遺伝子がＭＡＬ遺伝子またはＭＡＬと機能的に同等な遺伝子である治療薬。
〔１９〕指標遺伝子のＴ細胞における発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物からなるアレルギー性疾患のモデル動物であって、指標遺伝子がＭＡＬまたはＭＡＬと機能的に同等な遺伝子であるアレルギー性疾患のモデル動物。
〔２０〕非ヒト脊椎動物のＴ細胞における指標遺伝子の発現強度を上昇させる工程を含む、アレルギー性疾患のモデル動物の製造方法であって、指標遺伝子がＭＡＬであるアレルギー性疾患のモデル動物の製造方法。
〔２１〕指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドと、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がＭＡＬ遺伝子またはＭＡＬと機能的に同等な遺伝子であるキット。
〔２２〕指標遺伝子によってコードされるアミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体と、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がＭＡＬ遺伝子またはＭＡＬと機能的に同等な遺伝子であるキット。
〔２３〕更にアレルゲンを含む〔２１〕または〔２２〕に記載のキット。
加えて本発明は、以下に記載のいずれかの化合物を投与する工程を含む、アレルギー性疾患の治療方法に関する。また本発明は、以下に記載のいずれかの化合物の、アレルギー性疾患の治療薬の製造における使用に関する。
−〔１０〕、〔１２〕、〔１４〕、および〔１５〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物、
−ＭＡＬまたはＭＡＬと機能的に同等な遺伝子、またはその一部のアンチセンスＤＮＡ
−ＭＡＬ遺伝子によってコードされる蛋白質に結合する抗体
本発明において指標遺伝子とするＭＡＬ遺伝子の構造は既に明らかにされている。ＭＡＬ遺伝子はＴ細胞からクローニングされ、Ｔ細胞分化の中期、後期に発現し、Ｔ細胞の分化になんらかの役割をはたしていると推測されている（Ｍｉｇｕｅｌ Ａ．Ａｌｏｎｓｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ Ｍ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ（１９８７）．ＣＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＭＡＬ，ａ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：１９９７−２００１；Ｃａｒｍｅｎ Ｒａｎｃａｎｏ，Ｔｅｒｅｓａ Ｒｕｂｉｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＭＡＬ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｘｏｎ／ｉｎｔｒｏｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２１：４４７−４５０）。ヒトではＴ細胞以外に中枢神経系と大脳皮質の灰白質や甲状腺に発現することが報告されている（Ｊａｎｅ Ａ．Ｗａｋｅｍａｎ，Ｐａｕｌ Ｒ．Ｈｅａｔｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＭＡＬ ｍＲＮＡ ｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｉｓ ａｌｓｏ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．６２：９７−１０５；Ｆｅｒｎａｎｄｏ Ｍａｒｔｉｎ−Ｂｅｌｍｏｎｔｅ，Ｌｅｏｎｏｒ Ｋｒｅｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＭＡＬ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｙｒｏｉｄ：ｔｈｅ ＭＡＬ ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ，ａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，ｉｓ ａｐｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｉｎ ｔｈｙｒｏｉｄ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１３９：２０７７−２０８４）。ＭＡＬは蛋白輸送に関与する膜小胞の成分として、蛋白の仕分け、膜への輸送、膜微小構造体の形成、安定化、維持に関与すると考えられている（Ｍａｒｃｕｓ Ｆｒａｎｋ．（２０００）ＭＡＬ，ａ ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ ｉｎ ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｙｅｌ ｉｎ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６０：５３１−５４４）。
また、中枢神経系ではミエリン蛋白のミエリン膜への輸送にＭＡＬが関与する可能性や、上皮細胞ではＧＰＩ−アンカー型蛋白（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ（ＧＰＩ）−ａｎｃｈｏｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を含む種々の蛋白のアピカル膜への輸送にＭＡＬが関与する可能性も報告されている（Ｆｅｒｎａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ−Ｂｅｌｍｏｎｔｅ，Ｒｏｓａ Ｐｕｅｒｔｏｌｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｈａ ＭＡＬ Ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ Ｉｓ Ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｏｖｅｒａｌｌ Ａｐｉｃａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ ａｎｄ Ｆｉｓｈｅｒ Ｒａｔ Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ １１：２０３３−２０４５．）。
ＭＡＬ蛋白はヒトＴ細胞膜のＧｌｙｃｏｌｉｐｉｄ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＧＥＭ）ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎｓに存在する。ＧＥＭがシグナル伝達へ関与すること、さらに抗ＭＡＬ抗体によってシグナル伝達に関わるＣＤ５９やチロシンキナーゼＬｃｋが共沈することから、ＭＡＬもシグナル伝達に関与する可能性が推測されている（Ｊａｉｍｅ Ｍｉｌｌａｎ，Ｒｏｓａ Ｐｕｅｒｔｏｌｌａｎｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）．Ｔｈｅ ＭＡＬ ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ ｉｓ ａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｕｂｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２１：２４７−２５２；Ｊａｉｍｅ Ｍｉｌｌａｎ ａｎｄ Ｍｉｇｕｅｌ Ａ．Ａｌｏｎｓｏ（１９９８）．ＭＡＬ，ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｇｌｙｃｏｓ ｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｓｒｃ−ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３６７５−３６８４）。その他Ｔ細胞活性化との関連性を指摘する報告（ＷＯ８８／０７５４９）もあるが、その中では関連性の根拠は述べられていない。更に、ＭＡＬとがんとの関連性を指摘する報告（ＷＯ９７／３３５５１）もある。
しかし、Ｔ細胞ではシグナル伝達への関与を含めＭＡＬの具体的な機能を示した報告はない。更に、免疫反応やアレルギー反応における関連性を示した報告、アレルギー反応の成立に必須であるＴｈ２細胞への分化における関連性を示唆する報告もまったく存在しない。
本発明において、アレルギー性疾患（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）とはアレルギー反応の関与する疾患の総称である。より具体的には、アレルゲンが同定され、アレルゲンへの曝露と病変の発症に深い結びつきが証明され、その病変に免疫学的な機序が証明されることと定義することができる。ここで、免疫学的な機序とは、アレルゲンの刺激によって白血球細胞が免疫応答を示すことを意味する。アレルゲンとしては、ダニ抗原や花粉抗原等を例示することができる。
代表的なアレルギー性疾患には、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、花粉症、あるいは昆虫アレルギー等を示すことができる。アレルギー素因（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉａｔｈｅｓｉｓ）とは、アレルギー性疾患を持つ親から子に伝えられる遺伝的な因子である。家族性に発症するアレルギー性疾患はアトピー性疾患とも呼ばれ、その原因となる遺伝的に伝えられる因子がアトピー素因である。喘息は、アトピー性疾患のうち、特に呼吸器症状を伴う疾患に対して与えられた総称である。
本発明のアレルギー性疾患の検査方法は、被検者の生体試料におけるＭＡＬ遺伝子の発現レベルを測定し、健常者の測定値と比較する工程を含む。両者の比較の結果、健常者よりも発現が亢進している場合には、被検者がアレルギー性疾患であると判定される。本発明において、アレルギー性疾患の指標とすることができるＭＡＬ遺伝子を指標遺伝子と言う。
指標遺伝子は、ＭＡＬのみならず、他のアレルギー性疾患の指標となる遺伝子と組み合わせることもできる。指標遺伝子として複数の遺伝子を組み合わせて測定することによって検査精度を高めることができる。気管支喘息患者等のアレルギー性疾患患者は、ヘテロジーニアス（不均一）な集団なので、複数の遺伝子を指標とすることにより、より確実な診断を行うことができる。
本発明において、指標遺伝子の発現レベルとは、遺伝子のｍＲＮＡへの転写、並びに蛋白質への翻訳を含む。したがって本発明によるアレルギー性疾患の検査方法は、前記指標遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現強度、あるいは前記指標遺伝子によってコードされる蛋白質の発現レベルの比較に基づいて行われる。
本発明におけるアレルギー性疾患の検査における指標遺伝子の発現レベルの測定は、公知の遺伝子解析方法にしたがって実施することができる。具体的には、たとえばこの遺伝子にハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、または本発明の遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとした遺伝子増幅技術等を利用することができる。
本発明の検査に用いられるプローブまたはプライマーは、前記指標遺伝子の塩基配列に基づいて設定することができる。たとえばヒトＭＡＬ遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ７６２２３として公知である。
なお一般に高等動物の遺伝子は、高い頻度で多型を伴う。また、スプライシングの過程で相互に異なるアミノ酸配列からなるアイソフォームを生じる分子も多く存在する。多型やアイソフォームによって塩基配列に変異を含む遺伝子であっても、前記指標遺伝子と同様の活性を持ち、アレルギーに関与する遺伝子は、いずれも本発明の指標遺伝子に含まれる。
プライマーあるいはプローブには、前記指標遺伝子の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。塩基配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
このようなポリヌクレオチドは、指標遺伝子を検出するためのプローブとして、また指標遺伝子を増幅するためのプライマーとして利用することができる。プライマーとして用いる場合には、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、指標遺伝子（またはその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のＤＮＡが用いられる。プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的である必要があるが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
なお、本発明における「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができる。これらポリヌクレオチドは、合成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブＤＮＡは、通常、標識したものが用いられる。標識方法としては、例えば次のような方法を示すことができる。なお用語オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのうち、重合度が比較的低いものを意味している。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに含まれる。
・ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーションによる標識
・ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識
・クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識（Ｂｅｒｇｅｒ ＳＬ，Ｋｉｍｍｅｌ ＡＲ．（１９８７）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｍｅｓ ＢＤ，Ｈｉｇｇｉｎｓ ＳＪ（１９８５）Ｇｅｎｅｓ Ｐｒｏｂｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）
・ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写による標識（Ｍｅｌｔｏｎ ＤＡ，Ｋｒｉｅｇ，ＰＡ，Ｒｅｂａｇｋｉａｔｉ ＭＲ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ，Ｚｉｎｎ Ｋ，Ｇｒｅｅｎ ＭＲ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１２，７０３５−７０５６）
・放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをＤＮＡに取り込ませる方法（Ｋｒｉｃｋａ ＬＪ．（１９９２）Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）
ハイブリダイゼーション技術を利用したアレルギー性疾患の検査は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法などを使用して行うことができる。さらには、ＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター法を用いることにより、本発明の遺伝子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能である。
ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法においては、両端を互いの蛍光を打ち消し合う異なった蛍光色素で標識したプローブを用い、検出対象（ＤＮＡもしくはＲＮＡの逆転写産物）にハイブリダイズさせる。ＰＣＲ反応が進んでＴａｑポリメラーゼの５’−３’エクソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）活性により同プローブが分解されると二つの蛍光色素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムに行う。検出対象についてコピー数の明らかな標準試料について同時に測定することにより、ＰＣＲ増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピー数を決定する（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６−７２８０；Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ４（６）：３５７−３６２；Ｈｅｉｄ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９８６−９９４；Ｇｉｂｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．Ｕ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９９５−１００１）。ＰＣＲ増幅モニター法においては、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることができる。
また本発明のアレルギー性疾患の検査方法は、前記指標遺伝子によりコードされる蛋白質を検出することにより行うこともできる。以下、本明細書において、前記指標遺伝子によりコードされる蛋白質を指標蛋白質と記載する。このような検査方法としては、例えば、これら指標蛋白質に結合する抗体を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法などを利用することができる。
この検出に用いる前記指標蛋白質に結合する抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０５（５９３４）：５３７−４０）であることができる。例えば、指標蛋白質に対するポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。あるいは必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させる。こうして得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることができる。
指標蛋白質の検出には、これらの抗体を適宜標識して用いればよい。また、この抗体を標識せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテインＡやプロテインＧを標識して間接的に検出することもできる。具体的な検出方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法を挙げることができる。
抗原に用いる蛋白質もしくはその部分ペプチドは、例えば該遺伝子もしくはその一部を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換え蛋白質を発現させ、発現させた組み換え蛋白質を培養体または培養上清から精製することにより得ることができる。あるいは、これらの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、あるいは全長ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを化学的に合成し、免疫原として用いることもできる。
更に本発明においては、指標遺伝子の発現レベルのみならず、生体試料における指標蛋白質の活性を指標として、アレルギー性疾患の検査を行うこともできる。指標蛋白質の活性とは、各蛋白質が備える生物学的な活性を言う。前記指標蛋白質の活性の検出は、公知の方法に基づいて行うことができる。
本発明の検査方法においては、通常、被検者の生体試料を試料とする。生体試料としては、末梢血Ｔ細胞等を用いることができる。末梢血からＴ細胞を得る方法は公知である。すなわち、末梢血を希釈してフィコールを利用して遠心分離することによりＰＢＭＣを分取することができる。分離したＰＢＭＣを試料として指標遺伝子あるいは指標蛋白質を測定することにより、本発明の検査方法を実施することができる。ＰＢＭＣには、リンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）や単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）が含まれる。しかし、実施例にも示すように、これらの血液細胞においては、指標遺伝子はＴ細胞で高い発現が見られる。したがって、他の細胞の存在は指標遺伝子や指標蛋白質の測定結果にほとんど影響を与えない。あるいは抗ＣＤ３抗体を固定したマイクロビーズでＴ細胞を特異的に吸着し分離することもできる。
本発明においては、ＰＢＭＣをアレルゲンで刺激した後に指標遺伝子の測定を行うことができる。ＰＢＭＣをアレルゲンで刺激後、ＰＢＭＣに含まれるＴ細胞における指標遺伝子の蛋白産生量や遺伝子転写量を測定することによって、実際にアレルギー性免疫応答が起こるかどうか、さらにその強弱を判定することができる。それによって、添加した抗原がアレルゲンであることの確認や疾患の重篤度を推測することができる。
本発明に用いることができるアレルゲンとしては、公知のアレルゲン性の物質を用いることができる。具体的には、ダニ、ハウスダスト、植物の花粉、あるいは各種の食品由来のタンパク質等がアレルゲン性物質として公知である。これらのアレルゲンは、天然に由来するものであっても良いし、遺伝子組換えなどの手法によって合成されたものであっても良い。またアレルゲンは、タンパク質の断片であることもできる。精製アレルゲンの調製方法も公知である。
ＰＢＭＣをｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてアレルゲンで刺激する方法は、公知である。たとえば実施例にも記載したように、単離したＰＢＭＣ等にアレルゲンを加えることにより、刺激することができる。アレルゲンによる刺激は、単球による貪食と抗原提示を介してこの抗原を認識するＴ細胞に伝わり、免疫応答が始まる。
Ｔ細胞における指標遺伝子の発現レベルの測定値は、公知の方法によって補正することができる。補正により、細胞における遺伝子の発現レベルの変化を比較することができる。測定値の補正は、Ｔ細胞に発現し、かつ細胞の状態に関わらず発現レベルが大きく変動しない遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）の発現レベルの測定値に基づいて、本発明において指標とすべき遺伝子の発現レベルの測定値を補正することによって行われる。
更に本発明は、本発明の検査方法のための試薬を提供する。すなわち本発明は、指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、気管支喘息発作の検査用試薬に関する。あるいは本発明は、指標蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、気管支喘息発作の検査用試薬に関する。本発明の試薬を構成するオリゴヌクレオチドや抗体は、アッセイフォーマットに応じて適当な標識を結合することができる。あるいは本発明の試薬を構成するオリゴヌクレオチドや抗体は、アッセイフォーマットに応じて適当な支持体に固定化しておくこともできる。また本発明の試薬は、前記オリゴヌクレオチドまたは前記抗体の他に、検査や保存に必要な付加的な要素と組み合せて検査用キットとすることもできる。キットを構成することができる付加的な要素を、以下に示す。これらの要素は、必要に応じて予め混合しておくこともできる。また、必要に応じて、保存剤や防腐剤を各要素に加えることができる。
試薬や生体試料を希釈するための緩衝液
Ｔ細胞を刺激するためのアレルゲン
陽性対照
陰性対照
標識を測定するための基質
反応容器
アッセイプロトコルを記載した指示書
本発明における指標遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＢＭＣをアレルゲンで刺激したときに、このＰＢＭＣに含まれるＴ細胞において発現量の増加を示した。従って、指標遺伝子の発現レベルを指標として、気管支喘息やアトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患の検査を行うことができる。
本発明におけるアレルギー性疾患の検査とは、たとえば以下のような検査が含まれる。気管支喘息の症状を示しながら、一般的な検査ではアレルギー性疾患と判定できない患者であっても、本発明に基づく検査を行えばアレルギー性疾患の患者であることが容易に判定できる。より具体的には、アレルギー性疾患が疑われる症状を示す患者における指標遺伝子の発現の上昇は、その症状の原因がアレルギー性疾患である可能性が高いことを示している。気管支喘息には、アレルギー反応が原因となっているものと、そうでないものがある。両者の治療方法はまったく異なるので、いずれの原因によって気管支喘息の症状がもたらされているのかを診断することは、治療上、たいへん重要な工程である。本発明の検査方法は、気管支喘息の原因の特定において、きわめて重要な情報を提供することができる。
あるいは、アレルギー症状が改善に向かっているのかどうかを判断するための検査が可能となる。本発明の指標遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＢＭＣをアレルゲンで刺激したときに、このＰＢＭＣに含まれるＴ細胞において発現量の増加を示した。Ｔ細胞は免疫応答において司令塔としての役割を果たす細胞である。したがって、アレルゲンによって刺激されたＰＢＭＣにおいて、その免疫応答を掌るＴ細胞で発現が変動する遺伝子は、治療効果の判定に有用である。より具体的には、アレルギー性疾患と診断された患者における指標遺伝子の発現の上昇は、アレルギーの症状が進行している可能性が高いことを示している。
また本発明は、指標遺伝子のＴ細胞における発現レベルを上昇させたトランスジェニック非ヒト動物のアレルギー性疾患モデル動物としての使用に関する。アレルギー性疾患モデル動物は、気管支喘息における生体内の変化を明らかにするために有用である。更に、本発明のアレルギー性疾患モデル動物は、アレルギー性の気管支喘息の治療薬の評価に有用である。
本発明によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＢＭＣをアレルゲンで刺激したときに、このＰＢＭＣに含まれるＴ細胞において前記指標遺伝子の発現レベルが、上昇することが明らかとなった。したがって、Ｔ細胞においてＭＡＬ遺伝子、またはＭＡＬ遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現レベルを人為的に増強した動物は、アレルギー性疾患のモデル動物として利用することができる。なおＴ細胞における発現レベルの上昇とは、血液細胞全体における標的遺伝子の発現レベルの上昇を含む。すなわち、前記遺伝子の発現レベルを上昇させるのはＴ細胞のみである場合のみならず、血液細胞全体において、あるいは全身性に前記遺伝子の発現レベルが上昇している場合を含む。
本発明において機能的に同等な遺伝子とは、指標遺伝子によってコードされる蛋白質において明らかにされている活性と同様の活性を備えた蛋白質をコードする遺伝子である。機能的に同等な遺伝子の代表的なものとしては、トランスジェニック動物が本来備えている、その動物種における指標遺伝子のカウンターパートを挙げることができる。
あるいはヒトＭＡＬタンパク質のアミノ酸配列に対して、たとえば９０％以上、望ましくは９５％以上、更に望ましくは９９％以上の相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、ＭＡＬ遺伝子と機能的に同等な遺伝子として示すことができる。また、実施例において用いた配列番号：１と配列番号：２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅することができる遺伝子であって、アレルゲンによる刺激にともなってＰＢＭＣ中のＴ細胞において発現が増大する遺伝子も、機能的に同等な遺伝子である。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＢＭＣをアレルゲンで刺激したときに、このＰＢＭＣに含まれるＴ細胞において発現が増加する遺伝子は、アレルギー性の免疫応答の経路上にある遺伝子と言うことができる。言いかえれば、アレルゲンの刺激が、これらの遺伝子の発現の増強を通じて、アレルギー症状となって表れていると考えられる。つまり、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＢＭＣをアレルゲンで刺激したときに、このＰＢＭＣに含まれるＴ細胞において発現が増加する遺伝子は、ＰＢＭＣにおけるアレルギー性の免疫応答において重要な役割を果たす遺伝子と言える。したがって、この遺伝子の発現を抑制したり、あるいは活性を阻害する薬剤は、アレルギーの治療において、単にアレルギー症状を改善するのみならず、アレルギーの病態形成の本質的な原因を取り除く作用が期待できる。
以上のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＢＭＣをアレルゲンで刺激したときに、このＰＢＭＣに含まれるＴ細胞において発現が増加する遺伝子には重要な意味がある。そのため、この遺伝子の発現レベルを上昇させることによって得ることができるトランスジェニック動物をアレルギー性疾患モデル動物として使用し、遺伝子の役割や、遺伝子を標的とする薬剤を評価することには大きな意義がある。
また本発明によるアレルギー性疾患モデル動物は、後に述べるアレルギー性疾患の治療または予防のための医薬品のスクリーニングに加えて、アレルギー性疾患のメカニズムの解明、さらにはスクリーニングされた化合物の安全性の試験に有用である。
たとえば本発明によるアレルギー疾患モデル動物が気管支喘息を発症したり、何らかのアレルギー性疾患に関連した測定値の変化を示せば、それを回復させる作用を持った化合物を探索するスクリーニングシステムが構築できる。
本発明において、発現レベルの上昇とは、目的とする遺伝子が外来遺伝子として導入され強制発現している状態、あるいは宿主が備える遺伝子の転写と蛋白質への翻訳が増強されている状態、並びに翻訳産物である蛋白質の分解が抑制された状態のいずれかを意味する。遺伝子の発現レベルは、たとえば実施例に示すような定量的なＰＣＲにより確認することができる。また翻訳産物であるタンパク質の活性は、正常な状態と比較することにより確認することができる。
代表的なトランスジェニック動物は、目的とする遺伝子を導入し強制発現させた動物である。この他のトランスジェニック動物には、たとえば遺伝子のコード領域に変異を導入し、その活性を増強したり、あるいは分解されにくいアミノ酸配列に改変した動物などを示すことができる。アミノ酸配列の変異には、置換、欠失、挿入、あるいは付加を示すことができる。その他、遺伝子の転写調節領域を変異させることにより、本発明の遺伝子の発現そのものを調節することもできる。
特定の遺伝子を対象として、トランスジェニック動物を得る方法は公知である。すなわち、遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法や、位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第４８７３１９１号）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を使用する方法などによってトランスジェニック動物を得ることができる。その他、レトロウィルスベクターに遺伝子を挿入し、卵に感染させる方法、また、精子を介して遺伝子を卵に導入する精子ベクター法等も開発されている。精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（Ｍ．ＬａｖｉｔｒａｎｏｅｔらＣｅｌｌ，５７，７１７，１９８９）。
本発明のアレルギー性疾患モデル動物として用いるトランスジェニック動物は、ヒト以外のあらゆる脊椎動物を利用して作成することができる。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、あるいはウシ等の脊椎動物において様々な遺伝子の導入や発現レベルを改変されたトランスジェニック動物が作り出されている。
更に本発明は、アレルギー性疾患治療薬のスクリーニング方法に関する。本発明において、指標遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＢＭＣをアレルゲンで刺激したときに、このＰＢＭＣに含まれるＴ細胞において有意に発現レベルが上昇している。したがって、これらの遺伝子の発現レベルを低下させることができる化合物を選択することによって、アレルギー性疾患の治療薬を得ることができる。本発明において遺伝子の発現レベルを低下させる化合物とは、遺伝子の転写、翻訳、タンパク質の活性発現のいずれかのステップに対して阻害的に作用する作用を持つ化合物である。
本発明のアレルギー性疾患治療薬のスクリーニング方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで行なうこともｉｎ ｖｉｔｒｏで行うこともできる。このスクリーニングは、たとえば以下のような工程にしたがって実施することができる。なお本発明のスクリーニング方法における指標遺伝子とは、ＭＡＬ遺伝子に加え、ＭＡＬ遺伝子と機能的に同等ないずれかの遺伝子を含む。
（１）被験動物に、候補化合物を投与する工程、
（２）前記動物の生体試料における指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（３）候補物質を投与しない対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
本発明において機能的に同等な遺伝子とは、各指標遺伝子によってコードされる蛋白質において明らかにされている活性と同様の活性を備えた蛋白質をコードする遺伝子である。機能的に同等な遺伝子の代表的なものとしては、被験動物が本来備えている、その動物種における指標遺伝子のカウンターパートを挙げることができる。
本発明のスクリーニング方法における被験動物としては、例えばアレルギー性疾患モデル動物を利用することができる。アレルギー性疾患モデル動物は公知である。たとえば人間のアトピー性皮膚炎に近いモデルとして、ＮＣ／Ｎｇａマウスを用いた皮膚炎自然発症モデルが報告されている。このマウスの耳介にダニ抗原（５μｇ／耳）を２−３日間隔で計８回投与すると、２週間以降にはヒトのアトピー性皮膚炎に酷似した症状を誘発することができる。この系に候補化合物を投与し、本発明の指標遺伝子の発現レベルの変化を追跡することによって本発明によるスクリーニングを実施することができる。
このようにして被験動物に薬剤候補化合物を投与し、被験動物由来の生体試料における指標遺伝子の発現に対する化合物の作用をモニターすることにより、指標遺伝子の発現レベルに与える薬剤候補化合物の影響を評価することができる。被験動物の由来の生体試料における指標遺伝子の発現レベルの変動は、前記本発明の検査方法と同様の手法によってモニターすることができる。更にこの評価の結果に基づいて、指標遺伝子の発現レベルを低下させる薬剤候補化合物を選択すれば、薬剤候補化合物をスクリーニングすることができる。
より具体的には、被験動物から、生体試料を採取し、前記指標遺伝子の発現レベルを対照と比較することにより、本発明によるスクリーニングを実施することができる。生体試料としては、全血、ＰＢＭＣ、あるいはＴ細胞等を利用することができる。これらの生体試料の採取方法、および調製方法は公知である。
このようなスクリーニングにより、指標遺伝子の発現に様々な形で関与する薬剤を選択することができる。具体的には、たとえば次のような作用を持つ薬剤候補化合物を見出すことができる。
・指標遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路の抑制
・指標遺伝子の転写活性の抑制
・指標遺伝子の転写産物の安定化阻害もしくは分解の促進等
また本発明は、前記スクリーニング方法において、候補化合物の投与前および／または投与後に、被験動物をアレルゲンで刺激する工程を含むスクリーニング方法に関する。候補化合物の投与前にアレルゲンで刺激した場合には、候補化合物の、アレルゲン刺激後の免疫応答を抑制する作用を検出することができる。このようなスクリーニングによって得ることができる化合物には、アレルギー性疾患の治療効果を期待できる。また候補化合物の投与後にアレルゲンで刺激した場合には、候補化合物の、アレルゲン刺激による免疫応答の開始を抑制する作用を検出することができる。このようなスクリーニングによって得ることができる化合物には、アレルギー性疾患の予防効果を期待できる。本発明のスクリーニング方法に用いることができるアレルゲンとしては、先に述べたようなアレルゲンが挙げられる。
また、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのスクリーニングにおいては、例えば、指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させ、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する方法が挙げられる。このスクリーニングは、たとえば以下のような工程にしたがって実施することができる。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
指標遺伝子を発現する細胞として、たとえばヒト急性白血病Ｔ細胞Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ ＴＩＢ−１５２）は、本発明のスクリーニング方法に好適である。この細胞は、ＡＴＣＣより購入することができる。
本発明のスクリーニングの方法は、まず前記細胞株に候補化合物を添加する。その後、該細胞株における指標遺伝子の発現レベルを測定し、該遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する。
なお本発明のスクリーニング方法において、指標遺伝子の発現レベルは、これらの遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルのみならず、対応するｍＲＮＡを検出することにより比較することもできる。ｍＲＮＡによって発現レベルの比較を行うには、タンパク質試料の調製工程に代えて、先に述べたようなｍＲＮＡ試料の調製工程を実施する。ｍＲＮＡやタンパク質の検出は、先に述べたような公知の方法によって実施することができる。
さらに本発明の開示に基づいて本発明の指標遺伝子の転写調節領域を取得し、レポーターアッセイ系を構築することができる。レポーターアッセイ系とは、転写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量を指標として、該転写調節領域に作用する転写調節因子をスクリーニングするアッセイ系をいう。
ＭＡＬ遺伝子の転写開始点より上流約６００ｂｐの領域については、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として用いて転写活性が検討されている。その結果ＳＰ１などの転写因子認識領域が転写に重要な働きをしていることが報告されている（Ｔｕｇｏｒｅｓ Ａ ｅｔ ａｌ．１９９７，ＤＮＡ ＡＮＤ ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ １６，２４５−２５５．Ａ Ｔａｎｄｅｍ Ａｒｒａｙ ｏｆ Ｓｐ−１ ａｎｄ ａ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ａｒｅ Ｂｏｔｈ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｓｙｎｅｒｇｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ−Ｃｅｌｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＭＡＬ Ｇｅｎｅ）。しかし、本発明のスクリーニング方法に用いる転写調節領域は、その活性が明らかにされている６００ｂｐの領域に限定されない。更に上流にあって、ＭＡＬ遺伝子の転写を調節している領域が明らかになれば、その領域も本発明に利用することができる。このように、十分な範囲を有する転写調節領域を用いて、レポーターアッセイ系を作製し、本発明のスクリーニングを行うことができる。
転写調節領域としては、プロモーター、エンハンサー、さらには、通常プロモーター領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス等を例示することができる。またレポーター遺伝子としては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、成長ホルモン遺伝子等を利用することができる。
既に述べたように、ＭＡＬでは転写開始点より約６００ｂｐの領域が転写調節領域として解析されている。その他に、たとえば、本発明のスクリーニングに用いる転写調節領域を次のようにして取得することもできる。すなわち、まず本発明で開示した指標遺伝子の塩基配列に基づいて、ＢＡＣライブラリー、ＹＡＣライブラリー等のヒトゲノムＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションを用いる方法によりスクリーニングを行い、該ｃＤＮＡの配列を含むゲノムＤＮＡクローンを得る。得られたゲノムＤＮＡの配列を基に、本発明で開示したｃＤＮＡの転写調節領域を推定し、該転写調節領域を取得する。得られた転写調節領域を、レポーター遺伝子の上流に位置するようにクローニングしてレポーターコンストラクトを構築する。得られたレポーターコンストラクトを培養細胞株に導入してスクリーニング用の形質転換体とする。この形質転換体に候補化合物を接触させ、レポーター遺伝子の発現を制御する化合物のスクリーニングを行うことができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの本発明によるスクリーニング方法として、指標蛋白質の活性に基づくスクリーニング方法を利用することもできる。すなわち本発明は、次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＭＡＬまたはＭＡＬ遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法に関する。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補物質を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）対照と比較して前記蛋白質の活性を低下させる化合物を選択する工程
本発明における指標蛋白質であるＭＡＬには、たとえばＴ細胞の分化への関与、ミエリン蛋白のミエリン膜への輸送にＭＡＬが関与する可能性や、上皮細胞ではＧＰＩ−アンカー型蛋白を含む種々の蛋白のアピカル膜への輸送との関連性、あるいはＣＤ５９やチロシンキナーゼＬｃｋとの関連性等が推測されている。これらの活性を指標として、その活性を阻害する活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。このようにして得ることができる化合物は、ＭＡＬの働きを抑制する。その結果、Ｔ細胞において発現が誘導された指標蛋白質の阻害を通じて、アレルギー性の免疫応答を制御することができる。
本発明による各種のスクリーニング方法に必要な、ポリヌクレオチド、抗体、細胞株、あるいはモデル動物は、予め組み合わせてキットとすることができる。より具体的には、たとえば指標遺伝子を発現する細胞と、これらの指標遺伝子の発現レベルを測定するための試薬とで構成される。指標遺伝子の発現レベルを測定するための試薬としては、たとえば少なくとも１つの指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、若しくはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドが用いられる。あるいは、少なくとも１つの指標蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体を試薬として用いることができる。これらのキットには、標識の検出に用いられる基質化合物、細胞の培養のための培地や容器、陽性や陰性の標準試料、更にはキットの使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。
これらスクリーニングに用いる被検候補化合物としては、ステロイド誘導体等既存の化学的方法により合成された化合物標品、コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物標品のほか、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品などが挙げられる。
本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。あるいは、ＭＡＬ遺伝子の発現を抑制することができる、アンチセンスＤＮＡも、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。更に、ＭＡＬ遺伝子によってコードされる蛋白質を認識する抗体が、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。本発明のアレルギー性疾患の治療薬は、前記スクリーニング方法によって選択された化合物を有効成分として含み、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合することによって製造することができる。本発明のアレルギー性疾患の治療剤は、アレルギー症状の改善を目的として、経口、あるいは非経口的に投与することができる。
経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。
また、投与すべき化合物がタンパク質からなる場合には、それをコードする遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導入することにより、治療効果を達成することができる。治療効果をもたらすタンパク質をコードする遺伝子を生体に導入し、発現させることによって、疾患を治療する手法は公知である。
あるいはアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーター配列の下流に組み込み、アンチセンスＲＮＡ発現ベクターとして投与することができる。この発現ベクターをアレルギー疾患患者のＴ細胞へ導入すれば、これらの遺伝子のアンチセンスを発現し、当該遺伝子の発現レベルの低下によってアレルギーの治療効果を達成することができる。Ｔ細胞への発現ベクターの導入としては、ｉｎ ｖｉｖｏ、あるいはｅｘ ｖｉｖｏで行う方法が公知である。
投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人一人あたり、一回につき０．１ｍｇから５００ｍｇの範囲で、好ましくは０．５ｍｇから２０ｍｇの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕患者および健常者からの血液採取
アレルギー性疾患特異的に発現が異なる遺伝子を単離する目的で、症例を解析し、選出された患者および健常者から血液を採取した。健常者として１８名、気管支喘息患者群として８名、アトピー性皮膚炎患者群として６名、並びに気管支喘息およびアトピー性皮膚炎を有する患者として５名から血液を採取した。これらの血液試料の一部を用いて、ダニ抗原特異的ＩｇＥの量を測定した。
特異的ＩｇＥの測定はペーパーディスクを固相とするＲＡＳＴ法を改良したＣＡＰ ＲＡＳＴ法により行った。Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製の標準の抗体価を含む血清を基準とし、それぞれの検体のＩｇＥ抗体価を決定した。得られた値をスコアで示した。
被検者のダニ特異的ＩｇＥ抗体価のスコアを表２に示す。表２に示されるように、健常者では、半数以上がスコアが２以下であった。一方、患者群では高いスコアが見られ、ダニ抗原に対するアレルギーを持つことが示された。
〔実施例２〕血液試料からのリンパ球画分の調製
血液１０ｍｌから、以下のようにしてＰＢＭＣを調製した。まずノボ社製等のヘパリン１ｍｌで注射筒壁を万遍なく処理し、最終濃度５０ｕｎｉｔ／ｍｌのヘパリンを含む１０ｍｌ注射筒に採血した。このとき一人の採血に２２Ｇ針を２本準備した。注射針をはずし、５０ｍｌの遠心チューブ（ポリプロピレン製）に移した。１５００ｒｐｍ、室温で５分間遠心し、できるだけ表面近くから１．１ｍｌを採取し、１５０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心して上清１ｍｌを血漿（ｐｌａｓｍａ）として回収した。血漿を回収した残りに３％のデキストラン（ナカライ社製）を含む０．９％ ＮａＣｌを等量（９ｍｌ）加え、静かに数回転倒させて混和した。その後３０分間室温で静置した。ＰＲＰ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ、血小板に富む血漿）を別の１５ｍｌ遠心チューブに移し、１２００ｒｐｍ（トミー社製の遠心機で１５０×ｇに相当する）で５分間、室温で遠心した。遠心後、血小板は上清にあった。沈殿した細胞をギブコ社等から入手したＣａ、Ｍｇ不含のＨＢＳＳ ５ｍｌに懸濁した。これを、パスツールピペットを用いてＦｉｃｏｌ Ｐａｑｕｅ（ファルマシア社製）が５ｍｌが入ったチューブ（ファルコンチューブ：２００６または２０５９；ポリプロピレン製）１本に上層した。１２００ｒｐｍで５分間遠心後、１５００ｒｐｍ（Ｔｏｍｙ社製の遠心機で４００×ｇに相当する）で３０分間室温で遠心した。その結果、顆粒細胞（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）が沈殿し、フィコール層を挟んで中間層にリンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）が含まれた。中間層を分取してＰＢＭＣとした。
〔実施例３〕ダニ抗原で刺激したＰＢＭＣにおけるＴ細胞のＧｅｎｅＣｈｉｐによる遺伝子発現解析
ダニ抗原は代表的なアレルゲンである。ダニ抗原刺激に応答するようなアレルギー性疾患関連遺伝子を見出す目的で、アレルギー性疾患患者と健常者由来のＰＢＭＣをそれぞれダニ抗原蛋白で刺激し、両者で異なる発現変動を示す遺伝子を探索した。
アレルギー性慢性気管支喘息患者と健常者それぞれ１名の末梢血１００ｍＬから、実施例２に記載の方法に準じてＰＢＭＣを調製した。得られたＰＢＭＣを、ダニ抽出物（Ｍｉｔｅ Ｅｘｔｒａｃｔ ＤｆとＭｉｔｅ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｄｐそれぞれ５μｇ／ｍｌ、ＬＳＬ社）存在下、ダニ抽出物およびデキサメタゾン（１００ｎＭ）存在下、あるいは未添加コントロールの３つの条件で培養した。１０％牛胎児血清、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。１２時間、４０時間培養後にＰＢＭＣを回収し、その中のＴ細胞（ＣＤ３陽性細胞）および単球（ＣＤ１４陽性細胞）を分離した。Ｔ細胞と単球は、抗ＣＤ３抗体磁気ビーズ、抗ＣＤ１４抗体磁気ビーズで順に標識し、磁気細胞分離装置（Ｍｉｌｔｅｎｉ、Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いて分離した。得られた細胞からＲＮＡを抽出し、オリゴヌクレオチドアレイＧｅｎｅＣｈｉｐ ＨｕＧｅｎｅ ＦＬ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いて遺伝子の発現解析を行った。またこのとき回収した培養上清中に含まれるＩＬ−４をＥＬＩＳＡによって測定した（実施例５）。
その結果、Ｘ７６２２３遺伝子の発現が抗原刺激後１２時間および４０時間の喘息患者のＴ細胞で健常者よりも上昇することが明らかとなった（図１）。また、ステロイド系の治療薬であるデキサメサソンの作用によりＭＡＬの発現上昇は抑制されていた。Ｘ７６２２３はオリゴヌクレオチドアレイ上でＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＭＡＬ ｇｅｎｅ ｅｘｏｎ４として登録されていた。
〔実施例４〕ダニ抗原刺激ＰＢＭＣにおけるＭＡＬ発現定量実験
ＤＮＡチップ実験の結果を確認するために、表２に示した被験者の末梢血から調製したＰＢＭＣを用いてダニ抗原刺激を行い、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によってＭＡＬの発現量を測定した。刺激は上記と同じ方法で行い、回収したＰＢＭＣ全体からＲＮＡを調製し、培養上清を保存した。ＲＮＡから常法によりｃＤＮＡを作製後、ＭＡＬおよびＩＬ−４受容体α鎖についてそれぞれに特異的なプライマー、プローブを用いてＡＢＩ７７００（アプライドバイオシステムズ社）により定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。チップに登録されているＭＡＬ配列を基にプライマーとプローブを設計した。
ＭＡＬプライマー
〔実施例５〕ダニ抗原刺激ＰＢＭＣによるＩＬ−４の産生
培養上清中に産生分泌されたＩＬ−４量をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定した。ダニ特異的ＩｇＥ陽性者ではほとんどの場合抗原刺激した時にＩＬ−４産生が認められた。同時にこれらの試料ではＭＡＬの発現も上昇していた（図４）。
〔実施例６〕種々の白血球種におけるＭＡＬの発現定量
健常者５名の末梢血から調製したＴ細胞、Ｂ細胞、単球、好中球、好酸球における発現を定量した。被験者から採取した全血に３％デキストラン溶液を加えて３０分室温放置し、赤血球を沈降させた。上層の白血球画分を回収し、フィコール溶液（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ；アマシャムファルマシアバイオテク）の上に載せて１５００ｒｐｍ、３０分室温で遠心した。下層に回収された顆粒球画分をＣＤ１６抗体磁気ビーズと４℃で３０分反応させ、ＭＡＣＳを用いた分離でトラップされずに溶出する細胞を好酸球として実験に用いた。好中球（Ｎ）は好酸球を溶出させた後、ＣＤ１６抗体磁気ビーズでトラップされた細胞を磁界から外して溶出、回収して調製した。一方、フィコール遠心分離で中間層に回収される単核球画分を、ＭＡＣＳ ＣＤ３抗体磁気ビーズにより溶出画分（Ｍ：ｍｏｎｏｃｙｔｅとＢ ｃｅｌｌの混合物）とトラップされる画分（Ｔ ｃｅｌｌ画分）に分離した。次に、溶出画分をＭＡＣＳ ＣＤ１４抗体磁気ビーズにより、溶出画分（Ｂ ｃｅｌｌ画分）とトラップされる画分（ｍｏｏｃｙｔｅ画分）に分け、それぞれを精製Ｔ細胞、精製Ｂ細胞、そして精製単球とした。
好酸球はＩｓｏｇｅｎ、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、そして単球はＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて可溶化し、全ＲＮＡ抽出、ＤＮａｓｅ処理後（方法は前述の通り）遺伝子発現解析に供した。用いたプライマー、プローブ等は上記と同一である。測定結果を図５に示した。この結果から、ＭＡＬは特にＴ細胞で高い発現が認められた。
〔実施例７〕末梢血由来培養Ｔ細胞でのＩＬ−４による発現誘導実験
ＭＡＬの発現レベルに及ぼす各種サイトカインの影響を調べた。健常者末梢血から実施例６に示した方法でＴ細胞を分離し、抗ＣＤ３抗体で刺激し増殖させた。すなわち、抗ＣＤ３抗体で表面処理した培養プレートを用いて、５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２）により分離Ｔ細胞を５ｘ１０５細胞／ｍＬの密度で５日間培養した。増殖したＴ細胞を同じ組成の培地で５ｘ１０５細胞／ｍＬの密度に希釈し、表面処理していないプレートでさらに３日間培養した。得られた細胞をＩＬ−２を含まない培地で洗浄し、刺激するサイトカインを添加した培地（ＩＬ−２非含有）に１ｘ１０６の細胞密度で浮遊させ、所定の時間刺激培養して、細胞を回収しＲＮＡを調製した。用いたサイトカインを次に示す。
ＩＬ−４：２ｎｇ／ｍＬ
ＩＬ−１２：２ｎｇ／ｍＬ
ＩＦＮ−γ：２００ｎｇ／ｍＬ
ＩＦＮ−α：１００ＩＵ／ｍＬ
培地には実施例３に記載したものと同じ培地を用いた。０〜４８時間の培養中、ＩＬ−４で刺激した場合にはＭＡＬのｍＲＮＡが誘導された。この作用はＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２では認められなかった（図６）。ＭＡＬはＩＬ−４によって発現が誘導されることから、アレルギー性疾患におけるＩＬ−４の作用に関連している可能性がある。例えば、Ｔ細胞のＴｈ２への分化の過程に働いている可能性や、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０の産生への関与も考えられる。
〔実施例８〕Ｊｕｒｋａｔ細胞株でのＩＬ−４によるＭＡＬ蛋白の発現誘導
ＩＬ−４（２ｎｇ／ｍｌ）で３２時間刺激したＪｕｒｋａｔ細胞から細胞溶解液を調製し、
〔実施例９〕ヒト末梢血Ｔ細胞でのＩＬ−４によるＭＡＬ蛋白の発現誘導
培養増殖させたヒト末梢血Ｔ細胞を実施例７と同様にＩＬ−４（２ｎｇ／ｍｌ）で４１時間刺激し、ラフト画分（画分４）におけるＭＡＬ蛋白の発現をウェスタンブロットによって調べた。その結果、ヒト末梢血Ｔ細胞においても、ラフトにおけるＭＡＬ蛋白のＩＬ−４による誘導が確認された（図８）。
以上の結果から、ｍＲＮＡレベルだけでなく、蛋白レベルでもＭＡＬの発現がＩＬ−４によって誘導されることがＪｕｒｋａｔ細胞株、さらにヒト末梢血Ｔ細胞でも明らかとなった。ラフトというシグナル伝達に重要な場所でＭＡＬ蛋白の増加が確認できたことはＴ細胞のラフトにおいてＭＡＬ蛋白が機能を有することを示唆した。
産業上の利用の可能性
本発明により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＢＭＣをアレルゲンで刺激したときに、このＰＢＭＣに含まれるＴ細胞において有意に発現レベルが上昇する遺伝子ＭＡＬが提供された。本発明の指標遺伝子に基づいて、アレルギー性疾患の検査、および治療薬のスクリーニングを行うことが可能となった。
本発明によって提供されたアレルギー疾患関連遺伝子は、アレルゲンの種類に関わらず、簡便にその発現レベルを知ることができる。したがって、アレルギー反応の病態を総合的に把握することができる。
また本発明によるアレルギーの検査方法は、末梢血白血球を試料としてその発現レベルを解析することができるので、患者に対する侵襲性が低い。しかも遺伝子発現解析に関しては、たとえばＥＣＰなどの蛋白質測定と異なって、微量サンプルによる高感度な測定が可能である。遺伝子解析技術は、年々ハイスループット化、低価格化が進行している。したがって本発明によるアレルギーの検査方法は、近い将来、ベッドサイドにおける重要な診断方法となることが期待される。この意味でこれらの病態関連遺伝子の診断的価値は高い。
更に、本発明のスクリーニング方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＢＭＣをアレルゲンで刺激したときに、このＰＢＭＣに含まれるＴ細胞において有意に発現レベルが上昇する遺伝子を指標として実施される。Ｔ細胞は、アレルゲンに対するアレルギー性の免疫応答をコントロールしている細胞である。したがって、このスクリーニング方法によって見出すことができる化合物は、幅広いアレルギーの病態制御に有用であると期待できる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、ダニ抗原刺激後のＴ細胞におけるＭＡＬの発現レベルの変化を示す図。図中、縦軸はパーフェクトマッチとミスマッチのプローブセルの蛍光強度の差の平均値であるＡｖｅｒａｇｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ａｖｇ Ｄｉｆｆ）を、横軸は試料と培養時間を示す。図中、Ｃ：未刺激コントロール、Ｍ：ダニ抗原刺激処理、Ｄ：ダニ抗原およびデキサメタゾン処理を示す。
図２は、ダニ抗原刺激におけるＭＡＬの発現レベルの変化を示す図。各試料における、ＰＢＭＣのＲＮＡ １ｎｇ当たりのＭＡＬのｍＲＮＡのコピー数を示す。図中、健：健常者、患：患者、スコア：ダニ特異的ＩｇＥスコアを示す。
図３は、ダニ抗原刺激におけるＩＬ−４受容体αの発現レベルの変化を示す図。各試料における、ＰＢＭＣのＲＮＡ １ｎｇ当たりのＩＬ−４受容体αのｍＲＮＡのコピー数を示す。図中、健：健常者、患：患者、スコア：ダニ特異的ＩｇＥスコアを示す。
図４は、ダニ抗原刺激ＰＢＭＣの培養上清中に含まれるＩＬ−４濃度の測定結果を示す図。各試料における、培養液中のＩＬ−４濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。図中、健：健常者、患：患者、スコア：ダニ特異的ＩｇＥスコアを示す。
図５は、各種末梢血白血球におけるＭＡＬの発現レベルの比較結果を示す図。縦軸は、ＲＮＡ １ｎｇ当たりのＭＡＬのｍＲＮＡのコピー数を、横軸は白血球細胞の種類を示す。
図６は、末梢血培養Ｔ細胞のＩＬ−４刺激によるＭＡＬの上昇を示す図。縦軸は、ＲＮＡ １ｎｇ当たりのＭＡＬのｍＲＮＡのコピー数を、横軸はサイトカイン刺激時間を示す。
図７は、ＩＬ−４で刺激したＪｕｒｋａｔ細胞におけるＭＡＬ蛋白質の発現レベルを、ウエスタブロッティングで調べた結果を示す写真。抗体には、抗ＬＡＴ抗体（上）、または抗ＭＡＬ抗体（下）を用い、それぞれＩＬ−４刺激の無い場合と比較した。
図８は、ＩＬ−４で刺激した末梢血培養Ｔ細胞におけるＭＡＬ蛋白質の発現レベルを、ウエスタブロッティングで調べた結果を示す写真。抗体には、抗ＬＡＴ抗体（上）、または抗ＭＡＬ抗体（下）を用い、それぞれＩＬ−４刺激の無い場合と比較した。
Claims (23)
- 次の工程を含む、アレルギー性疾患の検査方法であって、指標遺伝子がＭＡＬである方法。
ａ）被検者の生体試料における、指標遺伝子の発現レベルを測定する工程
ｂ）健常者の生体試料における指標遺伝子の発現レベルと比較する工程 - アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎および／または気管支喘息である、請求項１に記載の検査方法。
- 遺伝子の発現レベルを、ｃＤＮＡのＰＣＲによって測定する請求項１に記載の検査方法。
- 遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する請求項１に記載の検査方法。
- 生体試料が末梢血Ｔ細胞を含む試料である請求項１に記載の方法。
- 末梢血単核球細胞をアレルゲンで刺激した後に、指標遺伝子の発現レベルを測定する請求項１に記載の方法。
- ＭＡＬ遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
- ＭＡＬ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
- 更にアレルゲンを含む請求項７または請求項８に記載のアレルギー性疾患検査用試薬。
- 次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＭＡＬまたはＭＡＬ遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程 - 細胞がＴ細胞である請求項１０に記載の方法。
- 次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＭＡＬまたはＭＡＬ遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）被験動物に候補化合物を投与する工程、
（２）被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現強度を測定する工程、
および
（３）対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程 - 工程（１）の前、または後に被検動物をアレルゲンで刺激する工程を含む請求項１２に記載の方法。
- 次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＭＡＬまたはＭＡＬ遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）対照と比較して前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程 - 次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＭＡＬまたはＭＡＬ遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補物質を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）対照と比較して前記蛋白質の活性を低下させる化合物を選択する工程 - 請求項１０、請求項１２、請求項１４、および請求項１５のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、アレルギー性疾患の治療薬。
- 指標遺伝子、またはその一部のアンチセンスＤＮＡを主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬であって、指標遺伝子がＭＡＬまたはＭＡＬと機能的に同等な遺伝子である治療薬。
- 指標遺伝子によってコードされる蛋白質に結合する抗体を主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬であって、指標遺伝子がＭＡＬ遺伝子またはＭＡＬと機能的に同等な遺伝子である治療薬。
- 指標遺伝子のＴ細胞における発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物からなるアレルギー性疾患のモデル動物であって、指標遺伝子がＭＡＬまたはＭＡＬと機能的に同等な遺伝子であるアレルギー性疾患のモデル動物。
- 非ヒト脊椎動物のＴ細胞における指標遺伝子の発現強度を上昇させる工程を含む、アレルギー性疾患のモデル動物の製造方法であって、指標遺伝子がＭＡＬであるアレルギー性疾患のモデル動物の製造方法。
- 指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドと、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がＭＡＬ遺伝子またはＭＡＬと機能的に同等な遺伝子であるキット。
- 指標遺伝子によってコードされるアミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体と、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がＭＡＬ遺伝子またはＭＡＬと機能的に同等な遺伝子であるキット。
- 更にアレルゲンを含む請求項２１または請求項２２に記載のキット。
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