JPWO2003072778A1 - アレルギー性疾患の検査方法 - Google Patents
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Abstract
アトピー性疾患の患者のＴ細胞において、健常者よりも発現レベルが有意に高い遺伝子としてＳＯＣＳ３を同定した。本発明者らは、この遺伝子をアレルギー性疾患の検査、および治療薬のスクリーニングに使用できることを見出した。本発明により、アレルギー性疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングすることができる。
Description
技術分野
本発明は、アレルギー性疾患の検査方法に関する。
背景技術
アレルギー性疾患は、多因子性の病気（ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ）と考えられている。つまり気管支喘息やアトピー性皮膚炎は多くの異なる遺伝子の発現の相互作用によって起こり、これらの個々の遺伝子の発現は、複数の環境要因によって影響を受ける。このため、アレルギー性疾患を起こす特定の遺伝子を解明することは、非常に困難であった。
アレルギー性疾患には、変異や欠損を有する遺伝子の発現や、特定の遺伝子の過剰発現や発現量の減少が関わっていると考えられている。病気に関して遺伝子発現が果たしている役割を解明するためには、遺伝子が発症にどのように関わり、薬剤などの外的な刺激が遺伝子発現をどのように変化させるのかを理解する必要がある。
さて、現在アレルギー性疾患の診断においては、一般に、問診、家族歴、そして本人の既往症の確認が重要な要素となっている。またアレルギーをより客観的な情報に基づいて診断するために、血液を試料とする試験方法や、アレルゲンに対する患者の免疫学的な応答を観察する方法も実施されている。前者の例として、アレルゲン特異的ＩｇＥ測定、白血球ヒスタミン遊離試験、あるいはリンパ球幼若化試験等が挙げられる。アレルゲン特異的ＩｇＥの存在は、そのアレルゲンに対するアレルギー反応の証明である。しかし患者によっては、必ずしもアレルゲン特異的なＩｇＥを検出できるとは限らない場合もある。また、その測定原理上、診断に必要なアレルゲンの全てに対して、試験を実施しなければならない。白血球ヒスタミン遊離試験やリンパ球幼若化試験は、免疫システムのアレルゲンに対する反応をｉｎ ｖｉｔｒｏで観察する方法である。これらの方法は、操作が煩雑である。
一方、患者を実際にアレルゲンに接触させたときに観察される免疫応答をアレルギーの診断に役立てる方法（後者）も公知である。プリック・テスト、スクラッチ・テスト、パッチ・テスト、皮内反応、あるいは誘発試験等が、この種の試験に含まれる。これらの試験では、患者のアレルギー反応を直接診断することができる反面、実際に被検者をアレルゲンに曝露する侵襲性の高い検査であると言うことができる。
この他、アレルゲンに関わらず、アレルギー反応の関与を証明するための試験方法も試みられている。たとえば、血清ＩｇＥ値が高値である場合、その患者にはアレルギー反応が起きていると推定することができる。血清ＩｇＥ値は、アレルゲン特異ＩｇＥの総量に相当する情報である。アレルゲンの種類に関わらずＩｇＥの総量を決定することは容易であるが、非アトピー型気管支炎等の疾患を持つ患者では、ＩｇＥが低値となる場合がある。
したがって、患者に対する侵襲が少なく、しかも診断に必要な情報を容易に得ることができる、アレルギー性疾患のマーカーが提供されれば有用である。このようなマーカーは、アレルギー性疾患の発症に深く関与していると考えられるので、診断のみならず、アレルギー症状のコントロールにおいても、重要な標的となる可能性がある。
発明の開示
本発明は、特にアレルギー性疾患の検査を可能とする指標遺伝子の提供を課題とする。さらに、本発明は該指標に基づく、アレルギー性疾患の検査方法およびアレルギー性疾患治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、アレルギー性疾患の患者と健常者との間で発現レベルに差が見られる遺伝子を単離し、アレルギー反応との関連性を明らかにすることにより、アレルギー性疾患治療の新たな標的を見出すことができるものと考えた。
このような考えに基づき、本発明者らは、アトピー性皮膚炎患者と健常者との間で発現レベルの異なる遺伝子の探索を行った。また、遺伝子の発現状態を比較する生体試料としては、末梢血単核球を選択した。アトピー性疾患の患者への抗原刺激によって末梢血単核球からのＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の分泌が知られており、末梢血単核球はアレルギー反応と密接に関係している（Ｊｅｎｍａｌｍ Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１６８−１７７，１９９９）。つまり、末梢血単核球において発現レベルの異なる遺伝子は、アレルギー反応に深い関連性を有する遺伝子であると言える。さらに末梢血単核球は、収得するのが容易であるため偽陰性をなくすための高収量が期待でき、従って微量な遺伝子の発現を検出することが可能なものと考えられる。
本発明者らは、このような免疫応答システムを支える血液細胞における遺伝子発現の変化を観察することによって、アレルギー反応に関連する遺伝子を単離することができると考えた。本出願人は、このような考えかたに基づいて、花粉症患者の末梢血の血液細胞において発現レベルが変化している次の遺伝子の単離に成功し、特許出願している。
あるいは本出願人は、アレルギー性疾患の患者末梢血Ｔ細胞において、健常者と比較して発現レベルに差の見られる遺伝子としてＢ１１５３を単離し、特許出願した（ＷＯ０２／５０２６９）。Ｂ１１５３はアレルギー性疾患と健常者の試料を用いたディファレンシャルディスプレイ法によって単離された遺伝子である。
更に本発明者らは、アトピー性皮膚炎患者の末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；以下ＰＢＭＣと省略する）、特にＴ細胞において発現レベルが異なる遺伝子の探索を行った。
Ｔ細胞は免疫応答を決定している細胞である。したがって、アレルギー性疾患患者のＴ細胞において発現レベルが高い遺伝子には、重要な役割が予測される。
免疫反応や炎症反応はインターロイキンやインターフェロンを含む多数のサイトカインによって制御される。サイトカインはその受容体、さらにその下流のＪａｎｕｓ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ（ＪＡＫ）やｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｃｅｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＳＴＡＴ）を活性化することによって、作用を示す。Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（ＳＯＣＳ）はこのサイトカインシグナル経路を負に制御する因子として不可欠である。
本発明者らはＳＯＣＳファミリー分子がアトピー性皮膚炎において果たす役割を検討するために、末梢血Ｔ細胞におけるｍＲＮＡ発現を測定し、ＳＯＣＳ３遺伝子がアトピー性皮膚炎患者のＴ細胞において、健常者よりも発現レベルが有意に高いことを明らかにした。これらの知見に基づいて、本発明者らは、ＳＯＣＳ３遺伝子を指標としてアレルギー性疾患の検査、あるいはアレルギー性疾患の治療薬のスクリーニングが可能となることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下のアレルギーの検査方法、アレルギー性疾患の治療薬、そのスクリーニング方法、アレルギー性疾患のモデル動物、並びにこれらの方法のためのキットに関する。
〔１〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の検査方法であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３である方法。
（ａ）被検者の生体試料における、指標遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｂ）該発現レベルを、健常者の生体試料における該指標遺伝子の発現レベルと比較する工程
（ｃ）該被検者の生体試料における該指標遺伝子の発現レベルの有意な上昇が観察された場合に被検者がアレルギー性疾患を有すると判定する工程
〔２〕アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎である、〔１〕に記載の検査方法。
〔３〕遺伝子の発現レベルを、ｃＤＮＡのＰＣＲによって測定する〔１〕に記載の検査方法。
〔４〕遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する〔１〕に記載の検査方法。
〔５〕生体試料が末梢血Ｔ細胞を含む試料である〔１〕に記載の方法。
〔６〕ＳＯＣＳ３遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
〔７〕ＳＯＣＳ３遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
〔８〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔９〕細胞がＴ細胞である〔８〕に記載の方法。
〔１０〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）被験動物に候補化合物を投与する工程、
（２）被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現強度を測定する工程、および
（３）候補化合物を投与しない対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１１〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物と接触させない対照と比較して前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１２〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補物質を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物と接触させない対照と比較して前記蛋白質の活性を低下させる化合物を選択する工程
〔１３〕〔８〕、〔１０〕、〔１１〕、〔１２〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、アレルギー性疾患の治療薬。
〔１４〕指標遺伝子のセンス鎖の塩基配列の連続する少なくとも１５塩基の配列に対して相補的な配列を含むアンチセンスＤＮＡを主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３と機能的に同等な遺伝子である治療薬。
〔１５〕指標遺伝子によってコードされる蛋白質に結合する抗体を主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３遺伝子またはＳＯＣＳ３と機能的に同等な遺伝子である治療薬。
〔１６〕指標遺伝子のＴ細胞における発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物のアレルギー性疾患のモデル動物としての使用であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３と機能的に同等な遺伝子である使用。
〔１７〕指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドと、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３と機能的に同等な遺伝子であるキット。
〔１８〕指標遺伝子によってコードされるアミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体と、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３と機能的に同等な遺伝子であるキット。
また本発明は、以下の（Ａ）−（Ｃ）のいずれかに示す化合物を投与する工程を含む、アレルギー性疾患の治療方法に関する。あるいは本発明は、以下の（Ａ）−（Ｃ）のいずれかに示す化合物のアレルギー性疾患の治療薬の製造における使用に関する。
（Ａ）〔８〕、〔１０〕、〔１１〕、および〔１２〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物
（Ｂ）ＳＯＣＳ３のセンス鎖の塩基配列の連続する少なくとも１５塩基の配列に対して相補的な配列を含むアンチセンスＤＮＡ
（Ｃ）ＳＯＣＳ３遺伝子によってコードされる蛋白質に結合する抗体
更に本発明は、非ヒト脊椎動物におけるＴ細胞のＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３と機能的に同等な遺伝子の発現強度を上昇させる工程を含む、アレルギー性疾患のモデル動物の製造方法に関する。あるいは本発明は、ＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３と機能的に同等な遺伝子の発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物のアレルギー性疾患のモデル動物としての使用に関する。
本発明において指標遺伝子とするＳＯＣＳ３遺伝子の構造は既に明らかにされている。本発明の指標遺伝子であるＳＯＣＳ３は、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γのような炎症性サイトカイン、あるいはＩＬ−１０のような抗炎症性サイトカインによって誘導され、それらサイトカインの作用を負に制御することが報告されている（Ｙａｓｕｋａｗａ Ｈ．，Ｓａｓａｋｉ Ａ．ａｎｄ Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ａ．２０００．Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１４３−１６４．）。
アレルギー反応においては、ＩＬ−４やＩＬ−５を産生するＴｈ２に分化したＴ細胞が重要な要因となっている。発明者の一人である久保らは、ＳＯＣＳ３がＴｈ２細胞特異的に発現していることを見出した。さらに、ＳＯＣＳ３のトランスジェニックマウスを作製し、Ｔ細胞の機能分化を観察したところＴｈ１分化が顕著に抑制され、これに呼応してＴｈ２分化が促進していた。そのメカニズムとしては、ＩＬ−４によって誘導されたＳＯＣＳ３がＴｈ１への分化を促すＩＬ−１２受容体のシグナル伝達を抑制していることが原因と考えられた。
実際に、ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞またはＴｈ２細胞への分化には特定のＳＯＣＳ分子の優位な発現が伴う。Ｔｈ１細胞ではＳＯＣＳ１の発現が，Ｔｈ２細胞ではＳＯＣＳ３の発現の亢進が認められる。Ｔｈ１細胞ではＩＬ−４／ＳＴＡＴ６のシグナル伝達が，またＴｈ２細胞ではＩＬ−１２／ＳＴＡＴ４のシグナル伝達が抑制されていると考えられる（Ｅｇｗｕａｇｕ ＣＥ，Ｙｕ ＣＲ，Ｚｈａｎｇ Ｍ，Ｍａｈｄｉ ＲＭ，Ｋｉｍ ＳＪ，Ｇｅｒｙ Ｉ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２ Ａｐｒ １；１６８（７）：３１８１−７，Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｔｈ１ ａｎｄ Ｔｈ２ ｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔｈ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ．）。
以上のことから、ヒトの末梢血Ｔ細胞におけるＳＯＣＳ３の発現上昇によってＴｈ２細胞への分化が促進されることがアレルギー発症の一因となっていると考えられた。
ＳＯＣＳ３に関しての特許はいくつか報告されている。しかし、いずれもサイトカインシグナルを抑制するという一般的な機能の報告に留まり、アレルギー性疾患における役割を示すデータは示されていない。以下に代表的な特許を示した。
・ＷＯ２００１２９１７８−Ａ２，ＥＰ０８７７０３０Ａ２（ＳＭＩＴＨＫＬＩＮＥ ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）
ＥＰＯ ｐｒｉｍａｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｇｅｎｅ １（ＥＰＲＧ１）
Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎを増殖に必要とするヒト培養細胞株から分離された遺伝子が記載されている。血液疾患に関連する多くの疾患との関連性を指摘しているが、いずれの疾患についても、この遺伝子との関連性を裏付けるデータは無い。
・ＷＯ０９９２３２２０−Ａ１（ＩＮＣＹＴＥ ＰＨＥＲＭ ＩＮＣ．）
Ｈｕｍａｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（ＨＳＣＳ−１）
遺伝子の塩基配列情報が記載されている。幅広い疾患との関連性が述べられているが、特定の疾患との関連性を裏付けるデータは無い。
・ＷＯ９８２００２３−Ａ１（ＨＡＬＬ ＩＮＳＴ ＭＥＤＩＣＡＬ ＲＥＳ ＷＡＬＴＥＲ ＆ ＥＬＩＺＡ）
Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＯＣＳ）。癌、傷病、免疫関連疾患、高血圧についての記載がある。しかし、やはりこれらの疾患との関連性を裏付けるデータを伴っていない。
更に、アトピー性皮膚炎患者末梢血Ｔ細胞におけるＣＩＳ−１，ＳＯＣＳ１，ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ５のｍＲＮＡ発現を測定した結果、ＳＯＣＳ３は患者群において有意に発現が高く，ＳＯＣＳ３の発現量は血中ＩｇＥ値とも高い相関性が認められた（長田直子，押田忠弘，関陽一，杉田雄二，斎藤博久，久保允人第３２回（２００２年１２月）日本免疫学会講演要旨集Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３２，２００２ ＩＳＳＮ０９１９−１９８４ ｐａｇｅ １９８，「アレルギー性疾患患者におけるＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ−３（ＳＯＣＳ３）分子の高発現」）。この知見は、特許出願後に本発明者らによって発表された。
本発明において、アレルギー性疾患（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）とはアレルギー反応の関与する疾患の総称である。より具体的には、アレルゲンが同定され、アレルゲンへの曝露と病変の発症に深い結びつきが証明され、その病変に免疫学的な機序が証明されることと定義することができる。ここで、免疫学的な機序とは、アレルゲンの刺激によって白血球細胞が免疫応答を示すことを意味する。アレルゲンとしては、ダニ抗原や花粉抗原等を例示することができる。
代表的なアレルギー性疾患には、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、花粉症、あるいは昆虫アレルギー等を示すことができる。アレルギー素因（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉａｔｈｅｓｉｓ）とは、アレルギー性疾患を持つ親から子に伝えられる遺伝的な因子である。家族性に発症するアレルギー性疾患はアトピー性疾患とも呼ばれ、その原因となる遺伝的に伝えられる因子がアトピー素因である。アトピー性皮膚炎は、アトピー性疾患のうち、特に皮膚炎症状を伴う疾患に対して与えられた総称である。
本発明においてＳＯＣＳ３遺伝子とは、本実施例において同定されたヒトＳＯＣＳ３遺伝子およびそれと同一の遺伝子座または他生物において相同の遺伝子座にある遺伝子を言う。例えば本発明においてＳＯＣＳ３遺伝子は、本実施例において同定されたヒトＳＯＣＳ３遺伝子と同じまたは相同の遺伝子座にある任意の対立遺伝子が含まれる。本発明においてＳＯＣＳ３遺伝子には、具体的には、本実施例において同定されたヒトＳＯＣＳ３遺伝子、その多型（ＳＮＰを含む）、変異体、スプライシングバリアント、および他生物のホモログを含む。これらの遺伝子は、ヒトＳＯＣＳ３遺伝子と実質的に同一または類似の発現制御を受けていると考えられることから、それらの発現を検出することにより、本発明のアレルギー性疾患の検査を行うことが可能である。
具体的には、本発明においてＳＯＣＳ３遺伝子は、以下の核酸からなる内在性遺伝子と実質的に同一の遺伝子である。内在性遺伝子とは、自然界の生物が元来保持している、人の手により改変されていない遺伝子を言い、それと同一の塩基配列からなる遺伝子は、内在性遺伝子と実質的に同一の遺伝子である。また「遺伝子」とは、ここでは転写産物またはそれをコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を言う。
（ａ）ＳＯＣＳ３遺伝子の塩基配列から選択された塩基配列を含む核酸。
（ｂ）ＳＯＣＳ３遺伝子のコード配列の塩基配列において、１または複数の塩基が置換、欠失、および／または挿入した塩基配列を含む核酸。
（ｃ）ＳＯＣＳ３蛋白質のアミノ酸配列の連続した少なくとも１５アミノ酸をコードする核酸。
（ｄ）ＳＯＣＳ３蛋白質のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入したアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする核酸。
（ｅ）ＳＯＣＳ３遺伝子の連続した少なくとも５０塩基を含み、ＳＯＣＳ３遺伝子の塩基配列以外の配列を含まない核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸。
（ａ）に記載の核酸には、好ましくはＳＯＣＳ３遺伝子（より好ましくはそのコード配列）に記載の塩基配列の連続した少なくとも４０塩基、より好ましくは６０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上、より好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上、より好ましくは１０００塩基以上、最も好ましくは全長を含む核酸が含まれる。このような核酸には、主に同一種内の遺伝子の多型、変異体、およびスプライシングバリアントが含まれ得る。また（ａ）に記載の核酸としては、ＳＯＣＳ３遺伝子の塩基配列の連続した少なくとも３０塩基、より好ましくは３５塩基以上、より好ましくは４０塩基以上、より好ましくは４５塩基以上、より好ましくは５０塩基以上の塩基配列を含む核酸が挙げられる。塩基配列は、ＳＯＣＳ３遺伝子のコード配列から選択することが好ましい。塩基配列は、任意の数を選択することができる。複数の塩基配列を選択する場合には、オーバーラップしないように２箇所以上、好ましくは３箇所以上、より好ましくは４箇所以上、より好ましくは５箇所以上の連続した塩基配列を含む核酸がより好ましい。
（ｂ）に記載の核酸には、好ましくはＳＯＣＳ３遺伝子のコード配列において、全塩基数の１５％以内、より好ましくは１０％以内、より好ましくは８％以内、より好ましくは５％以内、より好ましくは１％以内の塩基が置換、欠失、および／または挿入した塩基配列を含む核酸が含まれる。このような核酸には、近縁の他種生物のカウンターパートの遺伝子、その多型、その変異体、およびそのスプライシングバリアントなどが含まれ得る。このような核酸は、好ましくは配列番号：１のコード配列と８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸である。
塩基配列またはアミノ酸配列の同一性は、例えばＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）を用いて決定することができる。具体的には、塩基配列の同一性を決定するにはｂｌａｓｔｎプログラム、アミノ酸配列の同一性を決定するにはｂｌａｓｔｐプログラムを用い、例えばＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｈｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴのウェブサイトにおいてＬｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙを含むフィルターは全てＯＦＦにして、デフォルトのパラメータを用いて検索を行う（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆ Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６）。例えば２つの配列の比較を行うｂｌａｓｔ２ｓｅｑｕｅｎｃｅｓプログラム（Ｔａｔｉａｎａ Ａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。ギャップはミスマッチと同様に扱い、ＳＯＣＳ３遺伝子のコード配列全体に対する同一性の値を計算する。
（ｃ）に記載の核酸には、好ましくはＳＯＣＳ３蛋白質のアミノ酸配列の連続した少なくとも２０アミノ酸、より好ましくは３０アミノ酸以上、より好ましくは５０アミノ酸以上、より好ましくは１００アミノ酸以上、より好ましくは３００アミノ酸以上、より好ましくは５００アミノ酸以上、最も好ましくは全長をコードする核酸が含まれる。このような核酸には、上記の（ａ）と同様に、主に同一種内の遺伝子の多型、変異体、およびスプライシングバリアントが含まれ得る。また（ｃ）に記載の核酸としては、ＳＯＣＳ３蛋白質の塩基配列の連続した少なくとも８アミノ酸、より好ましくは１０アミノ酸以上、より好ましくは１５アミノ酸以上、より好ましくは２０アミノ酸以上、より好ましくは２５アミノ酸以上のアミノ酸配列をコードする塩基配列部分を、オーバーラップしないように２箇所以上、好ましくは３箇所以上、より好ましくは４箇所以上、より好ましくは５箇所以上含む核酸がより好ましい。
（ｄ）に記載の核酸には、好ましくはＳＯＣＳ３蛋白質のアミノ酸配列において、全アミノ酸数の１５％以内、より好ましくは１０％以内、より好ましくは８％以内、より好ましくは５％以内、より好ましくは１％以内のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入したアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする核酸が含まれる。この核酸は、非翻訳配列を含んでいてよい。このような核酸には、近縁の他種生物のカウンターパートの遺伝子、その多型、その変異体、およびそのスプライシングバリアントなどが含まれ得る。このような核酸は、好ましくはＳＯＣＳ３蛋白質のアミノ酸配列と８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする核酸である。ギャップはミスマッチと同様に扱い、ＳＯＣＳ３蛋白質のアミノ酸配列全体に対する同一性の値を計算する。アミノ酸配列の同一性は上記に従って決定することができる。
（ｅ）に記載の核酸には、好ましくはＳＯＣＳ３遺伝子（より好ましくはコード配列）に記載の連続した少なくとも８０塩基、より好ましくは１００塩基以上、より好ましくは１２０塩基以上、より好ましくは２００塩基以上を含み、ＳＯＣＳ３遺伝子（より好ましくはコード配列）に記載した塩基配列以外の配列を実質的に含まない核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸が含まれる。このような核酸は、例えばＳＯＣＳ３遺伝子の塩基配列を含む核酸を鋳型にして作製されたプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であってよい。５０塩基から数百塩基の長さのプローブは、例えばＤＮＡ合成により合成することもできるし、あるいはランダムプライム法、ニックトランスレーション、またはＰＣＲ法などにより作製することができる。
（ｅ）に記載の核酸における、ストリンジェントな条件とは、好ましくは０．５〜０．９Ｍ程度のＮａＣｌを含むハイブリダイゼーション溶液中、６０℃、好ましくは６２℃、より好ましくは６５℃でハイブリダイゼーションを行い、その後ハイブリダイゼーションと同じ温度で１×ＳＳＣ中、好ましくは０．５×ＳＳＣ中、より好ましくは０．２×ＳＳＣ中、より好ましくは０．１×ＳＳＣ中で、１時間洗浄する条件である。但し、ストリンジェンシーを大きく左右するハイブリダイゼーションや洗浄の温度条件は、プローブの融解温度（Ｔｍ）に応じて調整することができる。Ｔｍはハイブリダイズする塩基対に占める構成塩基の割合、プローブの鎖長、ハイブリダイゼーション溶液組成（塩濃度およびホルムアミド濃度）によって変動する。したがって、当業者であればこれらの条件を考慮して同等のストリンジェンシーを与える条件を経験的に設定することができる。ハイブリダイゼーション溶液としては、例えば４×ＳＳＣ、または好ましくはＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（登録商標）Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）などを用いることができる。
本発明のアレルギー性疾患の検査方法は、被検者の生体試料におけるＳＯＣＳ３遺伝子の発現レベルを測定し、健常者の測定値と比較する工程を含む。両者の比較の結果、健常者よりも発現が亢進している場合には、被検者がアレルギー性疾患であると判定される。発現レベルの比較のためには、通常、たとえば健常者における前記指標遺伝子の発現レベルに基づいて、標準値が設定される。この標準値をもとに、たとえば±２Ｓ．Ｄ．の範囲が許容範囲とされる。指標遺伝子の測定値に基づいて、標準値や許容範囲を設定する手法は公知である。被検者における指標遺伝子の発現レベルが許容範囲よりも高ければ、その被検者はアレルギー性疾患を有すると判定される。またその発現レベルが許容範囲内であれば、アレルギー性疾患を有する可能性は低いと予想される。本発明において、アレルギー性疾患の指標とすることができるＳＯＣＳ３遺伝子を指標遺伝子と言う。
指標遺伝子は、ＳＯＣＳ３のみならず、他のアレルギー性疾患の指標となる遺伝子と組み合わせることもできる。指標遺伝子として複数の遺伝子を組み合わせて測定することによって検査精度を高めることができる。アトピー性皮膚炎患者等のアレルギー性疾患患者は、ヘテロジーニアス（不均一）な集団なので、複数の遺伝子を指標とすることにより、より確実な診断を行うことができる。
本発明において、指標遺伝子の発現レベルとは、遺伝子のｍＲＮＡへの転写、並びに蛋白質への翻訳を含む。したがって本発明によるアレルギー性疾患の検査方法は、前記指標遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現強度、あるいは前記指標遺伝子によってコードされる蛋白質の発現レベルの比較に基づいて行われる。
本発明におけるアレルギー性疾患の検査における指標遺伝子の発現レベルの測定は、公知の遺伝子解析方法にしたがって実施することができる。具体的には、たとえばこの遺伝子にハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、または本発明の遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとした遺伝子増幅技術等を利用することができる。
本発明の検査に用いられるプローブまたはプライマーは、前記指標遺伝子の塩基配列に基づいて設定することができる。たとえばヒトＳＯＣＳ３遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＢ００６９６７として公知である。ＳＯＣＳ３遺伝子の塩基配列を配列番号：１に、またこの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号：２に示した。
なお一般に高等動物の遺伝子は、高い頻度で多型を伴う。また、スプライシングの過程で相互に異なるアミノ酸配列からなるアイソフォームを生じる分子も多く存在する。多型やアイソフォームによって塩基配列に変異を含む遺伝子であっても、前記指標遺伝子と同様の活性を持ち、アレルギーに関与する遺伝子は、いずれも本発明の指標遺伝子に含まれる。
プライマーあるいはプローブには、前記指標遺伝子の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。塩基配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
このようなポリヌクレオチドは、指標遺伝子を検出するためのプローブとして、また指標遺伝子を増幅するためのプライマーとして利用することができる。プライマーとして用いる場合には、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、指標遺伝子（またはその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のＤＮＡが用いられる。プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的である必要があるが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
なお、本発明における「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができる。これらポリヌクレオチドは、合成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブＤＮＡは、通常、標識したものが用いられる。標識方法としては、例えば次のような方法を示すことができる。なお用語オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのうち、重合度が比較的低いものを意味している。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに含まれる。
・ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーションによる標識
・ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識
・クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識（Ｂｅｒｇｅｒ ＳＬ，Ｋｉｍｍｅｌ ＡＲ．（１９８７）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｍｅｓ ＢＤ，Ｈｉｇｇｉｎｓ ＳＪ（１９８５）Ｇｅｎｅｓ Ｐｒｏｂｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）
・ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写による標識（Ｍｅｌｔｏｎ ＤＡ，Ｋｒｉｅｇ，ＰＡ，Ｒｅｂａｇｋｉａｔｉ ＭＲ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ，Ｚｉｎｎ Ｋ，Ｇｒｅｅｎ ＭＲ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１２，７０３５−７０５６）
・放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをＤＮＡに取り込ませる方法（Ｋｒｉｃｋａ ＬＪ．（１９９２）Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）
ハイブリダイゼーション技術を利用したアレルギー性疾患の検査は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法などを使用して行うことができる。さらには、ＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター法を用いることにより、本発明の遺伝子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能である。
ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法においては、両端を互いの蛍光を打ち消し合う異なった蛍光色素で標識したプローブを用い、検出対象（ＤＮＡもしくはＲＮＡの逆転写産物）にハイブリダイズさせる。ＰＣＲ反応が進んでＴａｑポリメラーゼの５’−３’エクソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）活性により同プローブが分解されると二つの蛍光色素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムに行う。検出対象についてコピー数の明らかな標準試料について同時に測定することにより、ＰＣＲ増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピー数を決定する（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６−７２８０；Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ４（６）：３５７−３６２；Ｈｅｉｄ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９８６−９９４；Ｇｉｂｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．Ｕ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９９５−１００１）。ＰＣＲ増幅モニター法においては、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることができる。
また本発明のアレルギー性疾患の検査方法は、前記指標遺伝子によりコードされる蛋白質を検出することにより行うこともできる。以下、本明細書において、前記指標遺伝子によりコードされる蛋白質を指標蛋白質と記載する。このような検査方法としては、例えば、これら指標蛋白質に結合する抗体を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法などを利用することができる。
この検出に用いる前記指標蛋白質に結合する抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０５（５９３４）：５３７−４０）であることができる。例えば、指標蛋白質に対するポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。あるいは必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させる。こうして得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることができる。
指標蛋白質の検出には、これらの抗体を適宜標識して用いればよい。また、この抗体を標識せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテインＡやプロテインＧを標識して間接的に検出することもできる。具体的な検出方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法を挙げることができる。
抗原に用いる蛋白質もしくはその部分ペプチドは、例えば該遺伝子もしくはその一部を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換え蛋白質を発現させ、発現させた組み換え蛋白質を培養体または培養上清から精製することにより得ることができる。あるいは、これらの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、あるいは全長ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを化学的に合成し、免疫原として用いることもできる。
更に本発明においては、指標遺伝子の発現レベルのみならず、生体試料における指標蛋白質の活性を指標として、アレルギー性疾患の検査を行うこともできる。指標蛋白質の活性とは、各蛋白質が備える生物学的な活性を言う。前記指標蛋白質の活性は、公知の方法に基づいて検出することができる。
本発明の検査方法においては、通常、被検者の生体試料を試料とする。生体試料としては、末梢血Ｔ細胞等を用いることができる。末梢血からＴ細胞を得る方法は公知である。すなわち、末梢血を希釈してフィコールを利用して遠心分離することによりＰＢＭＣを分取することができる。分離したＰＢＭＣを試料として指標遺伝子あるいは指標蛋白質を測定することにより、本発明の検査方法を実施することができる。ＰＢＭＣには、リンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）や単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）が含まれる。しかし、実施例にも示すように、これらの血液細胞においては、指標遺伝子はＴ細胞で高い発現が見られる。したがって、他の細胞の存在は指標遺伝子や指標蛋白質の測定結果にほとんど影響を与えない。あるいは抗ＣＤ３抗体を固定したマイクロビーズでＴ細胞を特異的に吸着し分離することもできる。
血液細胞を破壊し、細胞中の指標遺伝子のｍＲＮＡ、あるいは指標蛋白質を測定することができる。また血中に存在する指標蛋白質を測定することもできる。Ｔ細胞のライセートやｍＲＮＡの抽出には、市販のキットを利用すると便利である。例えば、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ製）またはＩＳＯＧＥＮ（登録商標）（ニッポンジーン）等を用いることができる。
Ｔ細胞における指標遺伝子の発現レベルの測定値は、公知の方法によって補正することができる。補正により、細胞における遺伝子の発現レベルの変化を比較することができる。測定値の補正は、Ｔ細胞に発現し、かつ細胞の状態に関わらず発現レベルが大きく変動しない遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）の発現レベルの測定値に基づいて、本発明において指標とすべき遺伝子の発現レベルの測定値を補正することによって行われる。このような遺伝子としては、β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子、およびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子が挙げられる。
本発明における指標遺伝子は、健常者とアトピー性皮膚炎患者との比較において、患者のＴ細胞で高い発現量を示した。従って、指標遺伝子の発現レベルを指標として、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患の検査を行うことができる。
本発明におけるアレルギー性疾患の検査とは、たとえば以下のような検査が含まれる。アトピー性皮膚炎の症状を示しながら、一般的な検査ではアレルギー性疾患と判定できない患者であっても、本発明に基づく検査を行えばアレルギー性疾患の患者であることが容易に判定できる。より具体的には、アレルギー性疾患が疑われる症状を示す患者における指標遺伝子の発現の上昇は、その症状の原因がアレルギー性疾患である可能性が高いことを示している。皮膚炎症状には、アレルギー反応が原因となっているものと、そうでないものがある。両者の治療方法はまったく異なるので、いずれの原因によって皮膚炎の症状がもたらされているのかを診断することは、治療上、たいへん重要な工程である。本発明の検査方法は、皮膚炎の原因の特定において、きわめて重要な情報を提供することができる。
あるいは、アレルギー症状が改善に向かっているのかどうかを判断するための検査が可能となる。本発明の指標遺伝子は、アレルギー性疾患患者のＴ細胞において発現量の増加を示した。Ｔ細胞は免疫応答において司令塔としての役割を果たす細胞である。したがって、免疫応答を掌るＴ細胞で発現が高まる遺伝子は、治療効果の判定に有用である。より具体的には、アレルギー性疾患と診断された患者における指標遺伝子の発現の上昇は、アレルギーの症状が進行している可能性が高いことを示している。
また本発明は、Ｔ細胞における、指標遺伝子ＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現レベルを上昇させたトランスジェニック非ヒト動物のアレルギー性疾患モデル動物としての使用に関する。アレルギー性疾患モデル動物は、アレルギーにおける生体内の変化を明らかにするために有用である。更に、本発明のアレルギー性疾患モデル動物は、アレルギー性疾患の治療薬の評価に有用である。
本発明によって、Ｔ細胞において前記指標遺伝子の発現レベルが、上昇することが明らかとなった。したがって、Ｔ細胞においてＳＯＣＳ３遺伝子、またはＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現レベルを人為的に増強した動物は、アレルギー性疾患のモデル動物として利用することができる。本発明においてトランスジェニック動物とは、ゲノムＤＮＡにおける１または複数のヌクレオチドの挿入、置換、および／または欠失を伴う、遺伝的に改変された動物（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｉｍａｌｓ）を言う。このアレルギー性疾患モデル動物は、アレルギーにおける生体内の変化を明らかにするために有用である。更に、本発明のアレルギー性疾患モデル動物は、アレルギー性疾患の治療薬の評価およびスクリーニングに有用である。なおＴ細胞における発現レベルの上昇とは、血液細胞全体における指標遺伝子の発現レベルの上昇を含む。すなわち、前記指標遺伝子の発現レベルを上昇させるのはＴ細胞のみである場合のみならず、血液細胞全体において、あるいは全身性に前記遺伝子の発現レベルが上昇している場合を含む。
本発明においてＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子とは、指標遺伝子ＳＯＣＳ３によってコードされる蛋白質（指標蛋白質）の活性と同等の活性を備えた蛋白質をコードする遺伝子である。このような遺伝子としては、ヒトＳＯＣＳ３遺伝子または他の生物のそのカウンターパートの人為的な改変体などが含まれる。例えば、ある遺伝子を発現ベクターに挿入する場合には、Ｎ末端またはＣ末端の数アミノ酸を欠失させたり、タグペプチドの配列または発現ベクター由来の他のアミノ酸配列を付加することが頻繁に行われる。このような蛋白質は天然の細胞が持つ内在性蛋白質とアミノ酸配列が異なるが、その活性は実質的に内因性蛋白質と同等である。本発明においてこのような蛋白質をコードする遺伝子は、内因性遺伝子と機能的に同等な遺伝子と称する。
本発明における指標蛋白質の活性としてはＪＡＫ阻害活性が挙げられる。例えばヒトＳＯＣＳ３蛋白質の１または複数のアミノ酸を欠失、挿入、および／または置換した蛋白質であって、ＪＡＫ阻害活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を、本発明のトランスジェニックモデル動物の作製のために用いることができる。このような改変体蛋白質は、ヒトＳＯＣＳ３蛋白質のアミノ酸配列に対して、たとえば９０％以上、望ましくは９５％以上、更に望ましくは９９％以上の相同性を有する蛋白質である。また、ＳＯＣＳ３遺伝子の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む遺伝子であって、ＪＡＫ阻害活性を有する蛋白質をコードする遺伝子も、ＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子として用いることができる。
あるいはヒトＳＯＣＳ３タンパク質のアミノ酸配列に対して、たとえば９０％以上、望ましくは９５％以上、更に望ましくは９９％以上の相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、ＳＯＣＳ３遺伝子と機能的な遺伝子として示すことができる。また、実施例において用いた配列番号：１と配列番号：２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅することができる遺伝子であって、Ｔ細胞において発現が増大する遺伝子も、機能的に同等な遺伝子である。
本発明のモデル動物は、例えば（ａ）該モデル動物の表現型を検出する工程、および（ｂ）該モデル動物と比べＴ細胞における該指標遺伝子の発現レベルが低い動物（対照）の対応する表現型に対する違いをアレルギー疾患と関連付ける工程により、アレルギー疾患のモデルとして使用することができる。対照の動物としては、該モデル動物と同じ遺伝背景を持つ非トランスジェニック動物、または空のベクターを導入したトランスジェニック動物などが挙げられる。表現型としては、例えば皮膚炎、鼻炎、または喘息等のアレルギー症状、あるいは免疫系細胞の活性化または遺伝子発現の変化などを含む、所望の表現型が挙げられる。
本発明において、指標遺伝子ＳＯＣＳ３のＴ細胞における発現レベルを上昇させることによって得ることができるトランスジェニック動物をアレルギー性疾患モデル動物として使用し、この遺伝子の役割や、この遺伝子を標的とする薬剤を評価することには大きな意義がある。また本発明によるアレルギー性疾患モデル動物は、後に述べるアレルギー性疾患の治療または予防のための医薬品のスクリーニングに有用であると同時に、アレルギー性疾患のメカニズムの解明、さらにはスクリーニングされた化合物の安全性の試験にも有用である。たとえば本発明によるアレルギー性疾患モデル動物がアトピー性皮膚炎またはアレルギー性喘息を発症したり、何らかのアレルギー性疾患に関連した測定値の変化を示せば、それを回復させる作用を持った化合物を探索するスクリーニングシステムが構築できる。
本発明において、発現レベルの上昇とは、目的とする遺伝子が外来遺伝子として導入され強制発現している状態、宿主が備える遺伝子の転写および／または蛋白質への翻訳が増強されている状態、並びに翻訳産物である蛋白質の分解が抑制された状態のいずれかを意味する。遺伝子の発現レベルは、たとえば実施例に示すような定量的なＰＣＲにより確認することができる。また翻訳産物である蛋白質の発現量または活性は、正常な状態と比較することにより確認することができる。
代表的なトランスジェニック動物は、目的とする遺伝子を導入し強制発現させた動物である。この他のトランスジェニック動物には、たとえばｍＲＮＡの非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列などからＲＮＡ不安定化の要因となる配列を除去してｍＲＮＡの半減期を伸ばしたりすることができる。また、指標遺伝子のコード領域に変異を導入し、その活性を増強したり、あるいは分解されにくいアミノ酸配列に改変することなどを示すことができる。アミノ酸配列の変異には、置換、欠失、挿入、あるいは付加を示すことができる。その他、遺伝子の転写調節領域を変異させることにより、指標遺伝子の発現そのものを上昇させることもできる。
特定の遺伝子を対象として、トランスジェニック動物を得る方法は公知である。すなわち、遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法や、位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第４８７３１９１号）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に遺伝子を導入する方法などによってトランスジェニック動物を得ることができる。その他、レトロウィルスベクターに遺伝子を挿入し、卵に感染させる方法、および、精子を介して遺伝子を卵に導入する精子ベクター法等も開発されている。精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、この精子を卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（Ｍ．Ｌａｖｉｔｒａｎｏｅｔら，Ｃｅｌｌ，５７，７１７，１９８９）。
本発明のアレルギー性疾患モデル動物として用いるトランスジェニック動物は、ヒト以外のあらゆる脊椎動物を利用して作成することができる。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、サル、あるいはウシ等の脊椎動物において様々な遺伝子の導入や発現レベルを改変されたトランスジェニック動物が作り出されている。
更に本発明は、アレルギー性疾患治療薬のスクリーニング方法に関する。本発明において、指標遺伝子は、アレルギー性疾患患者のＴ細胞において有意に発現レベルが上昇している。したがって、これらの遺伝子の発現レベルを低下させることができる化合物を選択することによって、アレルギー性疾患の治療薬を得ることができる。本発明において遺伝子の発現レベルを低下させる化合物とは、遺伝子の転写、翻訳、タンパク質の活性発現のいずれかのステップに対して阻害的に作用する作用を持つ化合物である。
本発明のアレルギー性疾患治療薬のスクリーニング方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで行なうこともｉｎ ｖｉｔｒｏで行うこともできる。このスクリーニングは、たとえば以下のような工程にしたがって実施することができる。なお本発明のスクリーニング方法における指標遺伝子とは、ＳＯＣＳ３遺伝子に加え、ＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等ないずれかの遺伝子を含む。
（１）被験動物に、候補化合物を投与する工程、
（２）被験動物の生体試料における前記指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）候補化合物を投与しない対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
本発明のスクリーニング方法における被験動物としては、たとえばアレルギー性疾患モデル動物を利用することができる。アレルギー性疾患モデル動物は公知である。たとえば人間のアトピー性皮膚炎に近いモデルとして、ＮＣ／Ｎｇａマウスを用いた皮膚炎自然発症モデルが報告されている。このマウスの耳介にダニ抗原（５μｇ／耳）を２−３日間隔で計８回投与すると、２週間以降にはヒトのアトピー性皮膚炎に酷似した症状を誘発することができる。この系に候補化合物を投与し、本発明の指標遺伝子の発現レベルの変化を追跡することによって本発明によるスクリーニングを実施することができる。
このようにして被験動物に薬剤候補化合物を投与し、被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現に対する化合物の作用をモニターすることにより、指標遺伝子の発現レベルに与える薬剤候補化合物の影響を検出することができる。被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現レベルの変動は、前記本発明の検査方法と同様の手法によってモニターすることができる。更にこの検出の結果に基づいて、指標遺伝子の発現レベルを低下させる薬剤候補化合物を選択すれば、薬剤候補化合物をスクリーニングすることができる。
より具体的には、被験動物から、生体試料を採取し、前記指標遺伝子の発現レベルを候補化合物を投与しない対照と比較することにより、本発明によるスクリーニングを実施することができる。生体試料としては、全血、ＰＢＭＣ、あるいはＴ細胞等を利用することができる。これらの生体試料の採取方法、および調製方法は公知である。
このようなスクリーニングにより、指標遺伝子の発現に様々な形で関与する薬剤を選択することができる。具体的には、たとえば次のような作用を持つ薬剤候補化合物を見出すことができる。
指標遺伝子の転写活性を低下させる作用、
指標遺伝子の転写産物からの翻訳を低下させる作用、
指標遺伝子の翻訳産物の活性を阻害する作用、
指標遺伝子の転写産物の安定化を低下もしくは分解を促進する作用等、
また前記スクリーニング方法において、候補化合物の投与前および／または投与後に、被験動物をアレルゲンで刺激する工程を含む方法も本発明に含まれる。候補化合物の投与前にアレルゲンで刺激した場合には、候補化合物の、アレルゲン刺激後の免疫応答を抑制する作用を検出することができる。このようなスクリーニングによって得ることができる化合物には、アレルギー性疾患の治療効果を期待できる。また候補化合物の投与後にアレルゲンで刺激した場合には、候補化合物の、アレルゲン刺激による免疫応答の開始を抑制する作用を検出することができる。このようなスクリーニングによって得ることができる化合物には、アレルギー性疾患の予防効果を期待できる。本発明のスクリーニング方法に用いることができるアレルゲンとしては、公知のアレルゲン性の物質を用いることができる。具体的には、ダニ、ハウスダスト、植物の花粉、あるいは各種の食品由来のタンパク質等がアレルゲン性物質として公知である。これらのアレルゲンは、天然に由来するものであっても良いし、遺伝子組換えなどの手法によって合成されたものであっても良い。またアレルゲンは、タンパク質の断片であることもできる。精製アレルゲンの調製方法も公知である。
また、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのスクリーニングにおいては、例えば、指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させ、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する方法が挙げられる。このスクリーニングは、たとえば以下のような工程にしたがって実施することができる。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
本発明において、指標遺伝子を発現する細胞は、指標遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得ることができる。利用できるベクター、および宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現し得るものであればよい。宿主−ベクター系における宿主細胞としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が例示でき、それぞれ利用できるベクターを適宜選択することができる。
ベクターの宿主への導入方法としては、生物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことができる。生物学的方法としては、例えば、ウイルスベクターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法（ＨＶＪ（センダイウイルス）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、電気的細胞融合法、微少核融合法（染色体移入））が挙げられる。また、物理的方法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ジーンパーティクルガン（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）を用いる方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、プロトプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト法、マイクロカプセル法が挙げられる。
指標遺伝子を発現する細胞として、たとえば株化Ｔ細胞Ｍｏｌｔ４、あるいはヒト急性白血病Ｔ細胞Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ ＴＩＢ−１５２）は、本発明のスクリーニング方法に好適である。この細胞は、ＡＴＣＣより購入することができる。
本発明のスクリーニングの方法は、まず前記細胞株に候補化合物を添加する。その後、該細胞株における指標遺伝子の発現レベルを測定し、該遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する。
なお本発明のスクリーニング方法において、指標遺伝子の発現レベルは、これらの遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルのみならず、対応するｍＲＮＡを検出することにより比較することもできる。ｍＲＮＡによって発現レベルの比較を行うには、タンパク質試料の調製工程に代えて、先に述べたようなｍＲＮＡ試料の調製工程を実施する。ｍＲＮＡやタンパク質の検出は、先に述べたような公知の方法によって実施することができる。
さらに本発明の開示に基づいて本発明の指標遺伝子の転写調節領域を取得し、レポーターアッセイ系を構築することができる。レポーターアッセイ系とは、転写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量を指標として、該転写調節領域に作用する転写調節因子をスクリーニングするアッセイ系をいう。
すなわち本発明は、次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が、ＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３と機能的に同等な遺伝子である方法に関する。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補化合物を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較してレポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
転写調節領域としては、プロモーター、エンハンサー、さらには、通常プロモーター領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス等を例示することができる。またレポーター遺伝子としては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、成長ホルモン遺伝子等を利用することができる。
マウスやラットＳＯＣＳ３遺伝子の転写調節領域についての報告（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９９ Ｊｕｎ ８；９６（１２）：６９６４−９，Ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｈ ＳＯＣＳ−３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ＳＯＣＳ−３ ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ａｕｅｒｎｈａｍｍｅｒ ＣＪ，Ｂｏｕｓｑｕｅｔ Ｃ，Ｍｅｌｍｅｄ Ｓ．；Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０００ Ｏｃｔ；２６７（１９）：５８４９−５７，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ ＳＯＣＳ−３ ｇｅｎｅ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ａｎｄ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ｍＲＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｐａｕｌ Ｃ，Ｓｅｉｌｉｅｚ Ｉ，Ｔｈｉｓｓｅｎ ＪＰ，Ｌｅ Ｃａｍ Ａ．；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００２ Ｊａｎ １８；２７７（３）：２３４５−５２，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｃｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＧＦＩ−１Ｂ：ｔｗｏ ｒｏｕｔｅｓ ｆｏｒ ＳＴＡＴ５ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．Ｊｅｇａｌｉａｎ ＡＧ，Ｗｕ Ｈ．）では、その転写が成長ホルモンやＩＬ−６によって誘導されること、転写調節領域にはＳＴＡＴ−１／ＳＴＡＴ−３結合配列や、特徴的なシスエレメントが存在することが報告されている。ヒトにおいても同様な実験が可能である。つまり、ＳＯＣＳ３の転写調節領域の下流にルシフェラーゼやＣＡＴなどのレポーター遺伝子を結合し、ＳＯＣＳ３の発現量を測定するアッセイ系を構築することができる。
たとえば、本発明のスクリーニングに用いる転写調節領域は、次のようにして取得することもできる。すなわち、まず本発明で開示した指標遺伝子の塩基配列に基づいて、ＢＡＣライブラリー、ＹＡＣライブラリー等のヒトゲノムＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションを用いる方法によりスクリーニングを行い、該ｃＤＮＡの配列を含むゲノムＤＮＡクローンを得る。得られたゲノムＤＮＡの配列を基に、本発明で開示したｃＤＮＡの転写調節領域を推定し、該転写調節領域を取得する。得られた転写調節領域を、レポーター遺伝子の上流に位置するようにクローニングしてレポーターコンストラクトを構築する。得られたレポーターコンストラクトを培養細胞株に導入してスクリーニング用の形質転換体とする。この形質転換体に候補化合物を接触させ、レポーター遺伝子の発現を制御する化合物のスクリーニングを行うことができる。
また、指標遺伝子の転写調節領域の制御下に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞は、いわゆるノックイン動物の細胞であってもよい。ノックイン動物とは、内在性標的遺伝子の蛋白質コード領域に他の外来遺伝子が挿入された遺伝子改変動物を言う。ノックインされたこの外来遺伝子は、標的遺伝子の転写調節領域の下流に挿入されるため、内在性標的遺伝子と同様の発現制御を受けて発現する。ノックイン遺伝子としてレポーター遺伝子を用い、得られたノックイン動物またはその動物から得た細胞を使ってスクリーニングを行うことができる。ノックイン動物を用いてスクリーニングを行う方法は、（ａ）指標遺伝子部位にレポーター遺伝子がノックインされた動物に候補化合物を投与する工程、（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、および（ｃ）該候補化合物を投与しない対照と比較して該レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程、を含む。例えば候補化合物を投与した場合および投与しない場合で、該ノックイン動物の白血球好ましくはＴ細胞における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定し、その発現を低下させる化合物を選択する。またノックイン動物からの細胞を用いたスクリーニングは、（ａ）指標遺伝子部位にレポーター遺伝子がノックインされた動物からの細胞に候補化合物を接触させる工程、（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、および（ｃ）該候補化合物を接触させない対照と比較して該レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程、を含む。例えば候補化合物の存在下または非存在下でノックイン動物から得た白血球好ましくはＴ細胞における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定し、該発現レベルを低下させる化合物を選択する。これらのスクリーニングは本発明の方法に含まれる。特に個体を用いたスクリーニングにおいては、指標遺伝子本来の機能を完全に欠損させないように、片方のアレルは正常のままにして指標遺伝子が発現するようにして、もう片方のアレルにレポーター遺伝子がノックインされているヘテロノックイン接合体を用いてスクリーニングを行うことが好ましい。
ＳＯＣＳ３の発現阻害剤として、たとえばドミナントネガティブ（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ）を利用することができる。具体的には、ＳＯＣＳ３のＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｇｉｏｎ（ＫＩＲ）領域に点突然変異を有する遺伝子は、ドミナントネガティブとして働き、ＳＯＣＳ３の発現を阻害することがよく知られている。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの本発明によるスクリーニング方法として、指標蛋白質の活性に基づくスクリーニング方法を利用することもできる。すなわち本発明は、次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法に関する。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補物質を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して前記蛋白質の活性を低下させる化合物を選択する工程
ここで指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子としては、上記のように内在性ＳＯＣＳ３遺伝子の人為的な改変体などが含まれる。
このようなスクリーニングは、例えば指標遺伝子を外来的に細胞で発現させ、その細胞内における指標蛋白質の活性を測定することにより実施することができる。このためには、指標遺伝子を発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な哺乳動物細胞などに導入する。ベクターの宿主への導入方法としては、生物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことができる。生物学的方法としては、例えば、ウイルスベクターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法（ＨＶＪ（センダイウイルス）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、電気的細胞融合法、微少核融合法（染色体移入））が挙げられる。また、物理的方法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ジーンパーティクルガン（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）を用いる方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、プロトプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト法、マイクロカプセル法が挙げられる。
本発明における指標蛋白質であるＳＯＣＳ３には、たとえばＩＬ−１０のような抗炎症性サイトカインの作用を負に制御することが報告されている（Ｙａｓｕｋａｗａ Ｈ．，Ｓａｓａｋｉ Ａ．ａｎｄ Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ａ．２０００．Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１４３−１６４．）。あるいはＳＯＣＳ３は、Ｔ細胞のＴｈ２への分化を誘導する機能を有する。
その他、ＳＯＣＳ３はレセプター自身、あるいはその下流の因子であるＪａｎｕｓ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＪＡＫ）と結合することによってレセプターからのシグナルを阻害する活性を有する。したがって、ＳＯＣＳ３とレセプターとの結合、またはＪＡＫ蛋白との結合を指標として、ＳＯＣＳ３の阻害活性を測定することができる。また、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ系においては、キナーゼであるＪＡＫのキナーゼ活性、または転写因子であるＳＴＡＴの転写活性を指標としてＳＯＣＳ３の活性を測定することができる。
例えば、Ｔｈ１の分化に重要なＩＬ−１２レセプターの下流では、ＪＡＫ２とＳＴＡＴ４が働いている。ＳＯＣＳ３はＪＡＫ２と結合してＪＡＫ２のキナーゼ活性を阻害する（Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １９９９ Ｊｕｎ；４（６）：３３９−５１ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＳＨ２ ｐｒｏｔｅｉｎ−３（ＣＩＳ３／ＳＯＣＳ３）ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｊａｎｕｓ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｂｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｇｉｏｎ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ＳＨ２ ｄｏｍａｉｎ．Ｓａｓａｋｉ Ａ，Ｙａｓｕｋａｗａ Ｈ，Ｓｕｚｕｋｉ Ａ，Ｋａｍｉｚｏｎｏ Ｓ，Ｓｙｏｄａ Ｔ，Ｋｉｎｊｙｏ Ｉ，Ｓａｓａｋｉ Ｍ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＪＡ，Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ Ａ．）。従って、ＳＯＣＳ３とＪＡＫ２との結合を測定する、または、ＪＡＫ２のキナーゼ活性を測定すれば、ＳＯＣＳ３の働きを測定することができる。また、ＪＡＫ２の活性阻害の結果としてＳＴＡＴ４が持つ転写活性の阻害が起こる。ＳＴＡＴ４が持つ転写活性の測定はＳＴＡＴ４レスポンシブエレメントをプローモーターとしてもちいたレポーターアッセイ系を用いれば、容易である。以上のような方法でＩＬ−１２下流のシグナルを阻害するＳＯＣＳ３の活性を測定できる。
これらの活性を指標として、その活性を阻害する活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。このようにして得ることができる化合物は、ＳＯＣＳ３の働きを抑制する。その結果、Ｔ細胞において発現が誘導された指標蛋白質の阻害を通じて、アレルギー性の免疫応答を制御することができる。
これらスクリーニングに用いる被験候補化合物としては、ステロイド誘導体等既存の化学的方法により合成された化合物標品、コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物標品のほか、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品などが挙げられる。
本発明による各種のスクリーニング方法に必要な、ポリヌクレオチド、抗体、細胞株、あるいはモデル動物は、予め組み合わせてキットとすることができる。より具体的には、たとえば指標遺伝子を発現する細胞と、これらの指標遺伝子の発現レベルを測定するための試薬とで構成される。指標遺伝子の発現レベルを測定するための試薬としては、たとえば少なくとも１つの指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、若しくはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドが用いられる。あるいは、少なくとも１つの指標蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体を試薬として用いることができる。これらのキットには、標識の検出に用いられる基質化合物、細胞の培養のための培地や容器、陽性や陰性の標準試料、更にはキットの使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。
本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。あるいは、本発明における指標遺伝子の発現を抑制することができるアンチセンスＤＮＡも、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。好ましくはこのようなアンチセンスＤＮＡは、本発明における指標遺伝子のセンス鎖の塩基配列の連続する少なくとも２０塩基、より好ましくは２５塩基以上、より好ましくは３０塩基以上、より好ましくは４０塩基以上、より好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上の配列に対して相補的な配列を含むアンチセンスＤＮＡである。アンチセンス領域としては、指標遺伝子の転写産物（プロセッシング前、中間産物、またはプロセッシング後のいずれの転写産物でもよい）の任意の部位のアンチセンスであってもよい。このような部位としては、例えば翻訳開始コドンを含む領域などが挙げられる。更に、本発明における指標遺伝子によってコードされる蛋白質に結合する抗体は、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。本発明の治療薬として有用な好ましい抗体として、例えばＪＡＫとの相互作用ドメインに結合する抗体などを示すことができる。本発明のアレルギー性疾患の治療薬は、前記スクリーニング方法によって選択された化合物、該アンチセンスＤＮＡ、または該抗体を少なくとも１つの主成分として含み、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合することによって製造することができる。本発明のアレルギー性疾患の治療剤は、アレルギー症状の改善を目的として、経口、あるいは非経口的に投与することができる。
経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。
また、投与すべき化合物がタンパク質からなる場合には、それをコードする遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導入することにより、治療効果を達成することができる。治療効果をもたらすタンパク質をコードする遺伝子を生体に導入し、発現させることによって、疾患を治療する手法は公知である。
あるいはアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーター配列の下流に組み込み、アンチセンスＲＮＡ発現ベクターとして投与することができる。この発現ベクターをアレルギー疾患患者のＴ細胞へ導入すれば、これらの遺伝子のアンチセンスを発現し、当該遺伝子の発現レベルの低下によってアレルギーの治療効果を達成することができる。Ｔ細胞への発現ベクターの導入としては、ｉｎ ｖｉｖｏ、あるいはｅｘ ｖｉｖｏで行う方法が公知である。
投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人一人あたり、一回につき０．１ｍｇから５００ｍｇの範囲で、好ましくは０．５ｍｇから２０ｍｇの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕患者および健常者からの血液採取
アレルギー性疾患特異的に発現が異なる遺伝子を単離する目的で、症例を解析し、選出された患者および健常者から血液を採取した。健常者として１０名、アトピー性皮膚炎軽症患者として７名、アトピー性皮膚炎中等症患者として１０名、アトピー性皮膚炎重症患者として１２名から血液を採取した。
〔実施例２〕血液試料からのリンパ球画分の調製
血液１０ｍｌから、以下のようにしてＴ細胞を調製した。まずノボ社製等のヘパリン１ｍｌで注射筒壁を万遍なく処理し、最終濃度５０ｕｎｉｔ／ｍｌのヘパリンを含む１０ｍｌ注射筒に採血した。このとき一人の採血に２２Ｇ針を２本準備した。注射針をはずし、５０ｍｌの遠心チューブ（ポリプロピレン製）に移した。１５００ｒｐｍ、室温で５分間遠心し、できるだけ表面近くから１．１ｍｌを採取し、１５０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心して上清１ｍｌを血漿（ｐｌａｓｍａ）として回収した。血漿を回収した残りに３％のデキストラン（ナカライ社製）を含む０．９％ ＮａＣｌを等量（９ｍｌ）加え、静かに数回転倒させて混和した。その後３０分間室温で静置した。
ＰＲＰ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ，血小板に富む血漿）を別の１５ｍｌ遠心チューブに移し、１２００ｒｐｍ（トミー社製の遠心機で１５０×ｇに相当する）で５分間、室温で遠心した。遠心後、血小板は上清にあった。沈殿した細胞をギブコ社等から入手したＣａ、Ｍｇ不含のＨＢＳＳ ５ｍｌに懸濁した。これを、パスツールピペットを用いてＦｉｃｏｌ Ｐａｑｕｅ（ファルマシア社製）が５ｍｌが入ったチューブ（ファルコンチューブ：２００６または２０５９；ポリプロピレン製）１本に上層した。１２００ｒｐｍで５分間遠心後、１５００ｒｐｍ（Ｔｏｍｙ社製の遠心機で４００×ｇに相当する）で３０分間室温で遠心した。その結果、顆粒細胞（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）が沈殿し、フィコール層を挟んで中間層にリンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）が含まれた。
パスツールピペットで中間層を回収し、２〜３倍の容量のＢＳＡ／ＰＢＳ（０．５％ ＢＳＡ，２ｍＭ ＥＤＴＡ ｉｎ ＰＢＳ，ｐＨ７．２；使用直前に脱気した）を添加し、１２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。沈殿を回収し、ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄した。２回目の洗浄後、細胞を５ｍｌに懸濁し、その一部をトリパンブルーで２倍に希釈して細胞数を測定した。全細胞数は約１×１０７であった。これをリンパ球画分とした。
〔実施例３〕リンパ球画分からのＴ細胞の分離
実施例２で得たリンパ球画分を１２００ｒｐｍで４℃、５分間遠心し、１００μｌあたり１０８になるようにＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁した。容量は約２０μｌになった。これをエッペンドルフチューブ（１．５ｍｌ）に移し、ＣＤ３マイクロビーズ液を添加した。その後、３０分間４〜１０℃に放置した（このとき氷上には置かなかった）。この試料をマグネチックセルソーター（ＭＡＣＳ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．製）で以下のように処理した。
ＭＳ＋／ＲＳ＋カラムをＭｉｎｉ ＭＡＣＳまたはＶａｒｉｏ ＭＡＣＳセパレーションユニットに装着した（針は付けなかった）。５００μｌのＢＳＡ／ＰＢＳをカラムに静かにアプライし、バッファーは流し出した。次にＣＤ３マイクロビーズ標識した細胞をカラムにアプライした。カラムを５００μｌで３回洗浄した（Ｂ細胞画分）。カラムをセパレーションユニットからはずし、溶出液を集めるチューブ上に置いた。１ｍｌのＢＳＡ／ＰＢＳをカラムにアプライし、カラム添付のプランジャーを用いポジティブ細胞を急速に流し出した。これをＴ細胞画分とした。
得られたＴ細胞画分について、１２００ｒｐｍ、５分間４℃で遠心した。沈殿をＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄した。２回目の洗浄後、細胞を１ｍｌに懸濁し、その一部をトリパンブルーで２倍に希釈して細胞数を測定した。全細胞数は約４×１０６であった。
〔実施例４〕Ｔ細胞からの全ＲＮＡの調製
Ｔ細胞からの全ＲＮＡの調製はＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用い、原則として添付のマニュアルに従い行った。操作はすべて手袋を着用して、室温で行った。またウォッシュバッファーＲＰＥに４倍量のエタノールを加えた。リシスバッファーＲＬＴには１０μｌ／ｍｌの２−メルカプトエタノールを加えた。
細胞浮遊液を１０００〜１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清をアスピレーションで除いた。沈殿に３５０μｌのリシスバッファーＲＬＴ（２−メルカプトエタノールを含む）溶液を加えた。この段階で、ＲＬＴバッファー中の細胞のライセートは、−７０℃で保存可能であった。細胞のライセートを冷凍保存していた場合は、３７℃で１０〜１５分間インキュベートして、不溶物が見えるようなら最大速度で３分間遠心し、上清のみを回収した。このライセートを２０Ｇのカテラン針を付けた注射筒でホモゲナイズ後、キアシュレッダー（ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ）で処理した。すなわち、ピペットマンを用いて３５０μｌの細胞のライセートをキアシュレッダーユニットにアプライした。これを１５００ｒｐｍで２分間遠心し、流出液を回収した。３５０μｌの７０％エタノールを加え、ピペッティングしてよく混ぜた。
ＲＮｅａｓｙスピンカラムを添付の２ｍｌチューブに装着し、細胞のライセート混合物をアプライし、８０００×ｇ（１１５００ｒｐｍ）で１分間遠心し、流出液は捨てた。ウォッシュバッファーＲＷ１７００μｌをカラムにアプライし、５分間フタをした形で立てた。１１５００ｒｐｍで１５秒間遠心し、流出液は捨てた。カラムを新しい２ｍｌチューブに装着し、ウォッシュバッファーＲＰＥ（エタノールを含む）５００μｌをカラムにアプライした後、１１５００ｒｐｍで１５秒間遠心し、流出液は捨てた。ウォッシュバッファーＲＰＥ５００μｌをカラムにアプライし、最大速度で２分間遠心した。カラムを新しい１．５ｍｌチューブに装着し、ＤＥＰＣ処理した水３０μｌをアプライし、フタをして１０分間立てた。１１５００ｒｐｍで１０分間遠心し、全ＲＮＡを得た。濃度を測定し、量が少ないようなら、再度カラムを新しい１．５ｍｌチューブに装着し、ＤＥＰＣ処理した水３０μｌをアプライし、フタをして１０分間立て、１１５００ｒｐｍで１０分間遠心した。
〔実施例５〕全ＲＮＡのＤＮａｓｅ処理
Ｔ細胞から調製した全ＲＮＡからＤＮＡを除くため、ＤＮａｓｅ処理を行った。反応は２ユニットのＤＮａｓｅ（ニッポンジーン社）および５０ユニットのＲＮａｓｅインヒビター（ファルマシア社）を含む１００μｌの１×ＤＮａｓｅバッファー（ニッポンジーン社）中で行った。これを３７℃１５分間インキュベートした後、等量のＰＣＩ（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）を加え、ボルテックスした。１２０００ｒｐｍで室温、１０分間遠心し、上層（水層）を新しい１．５ｍｌチューブに移した。１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を加え、２．５倍量の１００％エタノールおよびエタ沈メイト１μｌを加えて、転倒混和させた。−２０℃で１５分間静置させた後、１２０００ｒｐｍで４℃、１５分間遠心し、上清を除去し、７０％エタノールを加えた。沈殿がはがれる程度にタッピングした後、上清をきれいに除去した。３分間乾燥させ、１０〜２０μｌのＤＤＷ（ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ不含）に溶解させた。濃度を測定し、使用まで−８０℃に保存した。
〔実施例６〕ＡＢＩ７７００による発現量の定量
上記Ｔ細胞より調製した全ＲＮＡ試料の一部を、ＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ７７００を用いるＴａｑＭａｎ法による遺伝子発現定量ＲＴ−ＰＣＲに使用した。このＴａｑＭａｎ法は、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ鎖を蛍光色素を用いてリアルタイムに定量検出するシステムである。
各ＳＯＣＳ遺伝子の塩基配列を基にして作製したプライマーセットを使用した（表１）。また、ＴａｑＭａｎプローブは５’端をＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）で、３’端をＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）で蛍光標識して用いた。使用したプライマーセット、およびＴａｑＭａｎプローブの塩基配列を以下に示す。
ＣＩＳ１プライマー
ＣＩＳ１プローブ
ＳＯＣＳ１プライマー
ＳＯＣＳ１プローブ
ＳＯＣＳ３プライマー
ＳＯＣＳ３プローブ
ＳＯＣＳ５プライマー
ＳＯＣＳ５プローブ
ＰＣＲ増幅のモニタリングのための反応液の組成は表１に示した。各遺伝子のコピー数の標準として、以下に示すプラスミドを用いた。各プラスミドには、上記プライマーによって増幅される断片が挿入されている。増幅される断片のサイズを（）内に記載した。
ＣＩＳ１／ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ（１２０ｂｐ）
ＳＯＣＳ１／ｐＣＲ２（１２０ｂｐ）
ＳＯＣＳ３／ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ（１０２ｂｐ）
ＳＯＣＳ５／ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ（７６ｂｐ）
ＳＯＣＳファミリーの遺伝子発現量を表２および図１に示す。
以上の結果から明らかなように、ＳＯＣＳファミリーのうち、ＳＯＣＳ３のみが患者試料で有意に高い発現を示した。健常と中等症間、健常と重症間、さらに軽症と中等症間、軽症と重症間でも有意差が認められた。
〔実施例７〕ＮＣ／Ｎｇａダニ抗原誘発皮膚炎モデルマウス耳介におけるＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの定量
人間のアトピー性皮膚炎に近いモデルとして、ＮＣ／Ｎｇａマウスを用いた皮膚炎自然発症モデルが報告されている。このモデル動物におけるＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの発現レベルの変化を観察した。
（１）ＮＣ／Ｎｇａマウスを用いたダニ抗原誘発皮膚炎モデルマウスの作製
１．皮膚炎モデル作製物質
皮膚炎を作製するための感作物質としてダニ抽出物−Ｄｐ（ＬＳＬ社、Ｌｏｔ Ｎｏ．７５６１１２）を使用した。ダニ抽出物−Ｄｐはヤケヒョウダニ（チリダニ科）の成虫から抽出した凍結乾燥粉末である。ダニ抽出−Ｄｐは注射用水（大塚製薬工業、Ｌｏｔ Ｎｏ．１Ｆ７６Ｎ）を用いて５ｍｇ／ｍｌ濃度に調整した。
２．被験物質
作製した皮膚炎モデルに対する既存薬の効果を確認するために、プレドニゾロン軟膏０．５％（大正薬品工業、Ｌｏｔ Ｎｏ．Ｐ７１５，Ｐ３１７，ＰＥ１５）を使用した。
３．その他の薬物
ＲＮＡ抽出の前処理にＩＳＯＧＥＮ（和光純薬工業、Ｌｏｔ Ｎｏ．７８００１Ｉ，７８００１Ｈ，８０００１Ｉ）および麻酔薬としてジエチルエーテル（和光純薬工業、Ｌｏｔ Ｎｏ．ＤＭＫ２１３７）を使用した。
［使用動物］
試験には、５週齢のＮＣ／Ｎｇａ雄性マウス（日本チャールス・リバー）を６５匹購入し、６週齢で使用した。マウスは室温２０〜２６℃（実測値２０．０〜２５．１℃）、湿度４０〜７０％（実測値３５．８〜７３．６％）、照明時間１２時間・日（７時〜１９時）に設定した飼育室で飼育し、固形飼料Ｆ−２（船橋農場）と水道水をそれぞれ自由摂取させた。試験には入荷時より６日間以上予備飼育した後、一般状態の良好なものを使用した。
［試験群構成］
試験は、３群構成で行った（非感作対照群、感作対照群、プレドニゾロン投与群）。ダニ抗原投与開始から１４日後、２８日後に各群１０匹ずつを解剖した。
［試験方法］
１．皮膚炎モデルの作製
マウスを１群１０匹として使用した。感作対照群およびプレドニゾロン投与群は、左右の耳介および予め毛刈した背部２箇所（計４箇所）にダニ抗原５μｇ／ｓｉｔｅ（１μｌ／ｓｉｔｅ）を３日間隔で皮内投与した（ダニ抗原投与開始１４日後解剖：計５回投与、ダニ抗原投与開始２８日後解剖：計９回投与）。本実施例の皮膚炎モデルの作製スケジュールを図２に示す。
２．プレドニゾロン軟膏の投与
プレドニゾロン投与群の動物に対して、ダニ抗原投与開始９日後よりプレドニゾロン軟膏を経皮投与した。プレドニゾロン軟膏の投与量は各ダニ抗原投与部位について３０ｍｇ（３０ｍｇ×４箇所、１２０ｍｇ／匹／回）とした。投与スケジュールを図２に示した。
３．耳浮腫の測定
試験期間中全群について、週１回ｄｉａｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｇａｕｇｅを用いて左右の耳の厚さを測定した。測定スケジュールを図２に示した。
４．背部皮膚（ダニ抗原投与部位）の症状観察
試験期間中全群について、週１回ダニ抗原投与部位の症状観察を行った。観察はヒトアトピー性皮膚炎の臨床症状の評価基準を参考にスコア化した。観察スケジュールを図２に示した。
評価項目：▲１▼掻痒症、▲２▼発赤・出血、▲３▼浮腫、▲４▼擦傷・組織欠損、▲５▼乾燥
スコア：０＝無症状、１＝軽度、２＝中等度、３＝高度
それぞれの項目についてスコア化して、その総和を個体のスコアとした。
５．血中Ｔｏｔａｌ ＩｇＥ濃度の測定
ダニ抗原感作２８日後解剖の動物について、ダニ抗原投与前、投与開始１４日（眼窩静脈より採血）および２８日後（腹部大静脈より採血）に採血し、遠心分離した後、血清を−８０℃で保存した。保存した血清はマウスＩｇＥ測定キット（ヤマサＥＩＡ，Ｌｏｔ Ｎｏ．Ｐ１０２：ヤマサ醤油（株））を用いて血中Ｔｏｔａｌ ＩｇＥ濃度を測定した。測定スケジュールを図２に示した。
６．病理組織学的検査
ダニ抗原投与開始１４日に屠殺（エーテル麻酔下に脱血屠殺）してダニ抗原投与部位（左右の耳介および背中の皮膚２箇所）、胸腺、脾臓およびリンパ節を摘出した。耳介および背中の皮膚のそれぞれ１箇所および胸腺、脾臓、リンパ節はＲＮＡ抽出用とした。残り耳介および皮膚（各１箇所）は、１０％中性緩衝ホルマリン液で固定した後、定法に従ってパラフィンブロックを作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色、トルイジンブルー染色およびコンゴーレッド染色を施して光学顕微鏡的に検査した。検査スケジュールを図２に示した。
７．ＲＮＡ抽出の前処理
摘出した耳介および背部皮膚のそれぞれ１個所（約１平方センチメートル）および胸腺、脾臓、リンパ節を１５ｍＬのファルコンチューブに入れた。次いでＩＳＯＧＥＮ ５ｍＬを注入し、ホモジナイザー（ＮＳ−３１０Ｅ；（株）日音医理科器械製作所）を用いて氷冷下にホモジナイズした。ホモジナイズ終了後液体窒素に浸し、凍結した。サンプルはＲＮＡ抽出まで−８０℃で保管した。
［試験結果］
１．耳浮腫の測定
ダニ抗原感作期間中における、皮膚炎モデルマウスの耳浮腫の変化を測定した結果を図３に示す。ダニ抗原投与１４日後解剖（図３上）および２８日後解剖（図３下）のいずれの試験においても、非感作対照群では、耳浮腫は認められなかった。感作対照群では、ダニ抗原投与１週間後より明らかな耳の肥厚を示し、２週間後以降高値を持続した。プレドニゾロン投与群では、ダニ抗原投与１週間後より明らかな耳の肥厚を示し、２週以降の耳浮腫の増加を抑制した。
２．背部皮膚の症状観察
ダニ抗原投与１４日後解剖および２８日後解剖のいずれの試験においても、ダニ抗原投与２週間後より皮膚炎の症状を緩める個体が出現した。
３．血中Ｔｏｔａｌ ＩｇＥ濃度の測定
図４にＴｏｔａｌ ＩｇＥ濃度の測定結果を示す。血中ダニ抗原を投与している感作対照群およびプレドニゾロン投与群では、ダニ抗原投与２週間後より血中Ｔｏｔａｌ ＩｇＥ濃度の上昇が認められた。
４．耳介皮膚の病理組織学的検査
ダニ抗原投与１４日後解剖
非感作対照群では、１／１０例で表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤（主にリンパ球）、浮腫および結合組織の増生が認められたが、いずれも軽度な変化であった。残り９／１０例には異常所見は認められなかった。感作対照群では、表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤（好中球、好酸球、組織球ならびにリンパ球等）、浮腫、結合組織の増生および肥満細胞の脱顆粒が軽度〜中等度で観察された。また６／１０例では潰瘍形成を伴っていた。
プレドニゾロン投与群では、表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤（好中球、好酸球、組織球ならびにリンパ球等）、浮腫、結合組織の増生および肥満細胞の脱顆粒が軽度〜中等度の変化で観察された。なお、６／１０例では潰瘍形成を伴っていた。
ダニ抗原投与２８日後解剖
非感作対照群では、表皮、真皮および皮下組織において異常所見は認められなかった。感作対照群では、表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤（好中球、好酸球、組織球ならびにリンパ球等）、浮腫、結合組織の増生および肥満細胞の脱顆粒等が軽度〜中等度の変化で観察された。さらに、９／１０例では潰瘍形成を伴っていた。
プレドニゾロン投与群では、表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤（好中球、好酸球、組織球ならびにリンパ球等）、浮腫、結合組織の増生および肥満細胞の脱顆粒等が軽度〜中等度の変化で観察され、いずれも潰瘍形成を伴っていた。
５．背部皮膚の病理組織学的検査
ダニ抗原投与１４日後解剖
非感作対照群では、異常所見は認められなかった。感作対照群では、表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤（好中球、好酸球、組織球ならびにリンパ球等）、浮腫、結合組織の増生および肥満細胞の脱顆粒が、観察された。なお、３／１０例は潰瘍形成を伴っていた。
プレドニゾロン投与群では、表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤（好中球、好酸球、組織球ならびにリンパ球等）、浮腫、結合組織の増生および肥満細胞の脱顆粒等が観察された。なお、１／１０例で潰瘍形成を伴っていた。
ダニ抗原投与２８日後解剖
非感作対照群では、異常所見は認められなかった。感作対照群では、ダニ抗原投与１４日後解剖と同程度の変化が認められた。
プレドニゾロン投与群では、ダニ抗原投与１４日後と同程度の変化が観察された。
（２）ＮＣ／Ｎｇａダニ抗原誘発皮膚炎モデルマウス耳介におけるＳＯＣＳ３ ｍＲＮＡ定量上記（１）で作製したＮＣ／Ｎｇａモデルマウスにおける、ＳＯＣＳ３のｍＲＮＡを定量した。ダニ抗原投与１４日後解剖および２８日後に解剖したマウスの耳介をＩＳＯＧＥＮで凍結し、サンプルとした。
耳介組織からのｃＤＮＡ合成
ＩＳＯＧＥＮ凍結サンプルを氷上で融解し、２０Ｇカテラン注射針（テルモ）にてホモジナイズした。得られたホモジネート５ｍＬのうち６００μＬを１．５ｍＬ ｔｕｂｅに分取し、ＩＳＯＧＥＮ製品プロトコルに従い、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡについて、ＲＮｅａｓｙカラム（ＱＵＩＡＧＥＮ）処理を製品プロトコルに従って行った。次いで、ＤＮａｓｅ（ＲＴグレード、ニッポンジーン）処理を製品プロトコルに従って行った。得られたＴｏｔａｌ ＲＮＡの１μｇにつき、Ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒｓ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ），Ｓｕｐｅｒ ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製品プロトコルに従ってｃＤＮＡ合成後、ＲＮａｓｅ Ｈ処理を行った。
ｍＲＮＡ定量
マウス試験群各１０匹分のｃＤＮＡを同濃度ずつ混合した。混合ｃＤＮＡ ５ｎｇにつき、ＡＢＩ７７００を用いてマウスＳＯＣＳ３のｍＲＮＡ定量を行った。定量値について、マウスβ−ａｃｔｉｎの定量値を内部標準として補正を行った。定量実験に用いたプライマーおよびプローブの塩基配列を以下に示す。
マウスＳＯＣＳ３（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ８８３２８）
マウスβ−ａｃｔｉｎ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ０３６７２）
ＮＣ／Ｎｇａダニ抗原誘発皮膚炎モデルマウス耳介におけるＳＯＣＳ３のｍＲＮＡ発現を定量した結果を図５に示した。ＮＣ／Ｎｇａダニ抗原誘発皮膚炎モデルマウス耳介において、ダニ抗原刺激開始１４日後、２８日後のいずれの時点においてもＳＯＣＳ３ ｍＲＮＡ発現は非感作対照群と比較して感作対照群、プレドニゾロン投与群において高い値を示した。プレドニゾロン塗布による明らかな発現変化は認められなかったが、プレドニゾロン投与群の血中Ｔｏｔａｌ ＩｇＥ濃度は感作群と同程度に高値を示しており、また病理組織学的知見においてもプレドニゾロン塗布によるダニ抗原誘発皮膚炎症状の改善も認められていないことより、ＳＯＣＳ３ ｍＲＮＡ発現は皮膚炎症状を反映しているものと考えることができる。
以上の結果より、ヒト末梢血Ｔ細胞におけるＳＯＣＳ３ ｍＲＮＡ発現が皮膚炎患者で有意に高いことがマウス皮膚炎モデルにおいても確認されたと考えることができる。
産業上の利用の可能性
本発明により、アトピー性皮膚炎患者のＴ細胞において有意に発現レベルが上昇する遺伝子ＳＯＣＳ３が提供された。本発明の指標遺伝子に基づいて、アレルギー性疾患の検査、および治療薬のスクリーニングを行うことが可能となった。
本発明によって提供されたアレルギー疾患関連遺伝子は、アレルゲンの種類に関わらず、簡便にその発現レベルを知ることができる。したがって、アレルギー反応の病態を総合的に把握することができる。
また本発明によるアレルギーの検査方法は、末梢血単核球を試料としてその発現レベルを解析することができるので、患者に対する侵襲性が低い。しかも遺伝子発現解析に関しては、たとえばＥＣＰなどの蛋白質測定と異なって、微量サンプルによる高感度な測定が可能である。遺伝子解析技術は、年々ハイスループット化、低価格化が進行している。したがって本発明によるアレルギーの検査方法は、近い将来、ベッドサイドにおける重要な診断方法となることが期待される。この意味でこれらの病態関連遺伝子の診断的価値は高い。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、健常人、及びアトピー性皮膚炎軽症、中等症、重症患者のＴ細胞におけるＳＯＣＳファミリー（ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ５、ＣＩＳ１）遺伝子の発現レベルを示す図。縦軸は、Ｔ細胞のＲＮＡ １ｎｇ当たりの各ＳＯＣＳのｍＲＮＡのコピー数を、横軸は試料を示す。＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１
図２は、皮膚炎モデルマウスの作製、並びにプレドニゾロン軟膏の投与のスケジュールである。
図３は、ダニ抗原感作期間中における、皮膚炎モデルマウスの耳浮腫の変化を測定した結果である。上は感作１４日後解剖分、下は感作２８日後解剖分の結果である。縦軸は耳浮腫率（％）を、横軸は感作期間（週）を示す（ｎ＝１０，Ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．）。
耳浮腫率（％）＝（感作後の耳の厚さ／感作前の耳の厚さ）
図４は、皮膚炎モデルマウスにおけるＴｏｔａｌ ＩｇＥ濃度の測定結果を示す（ｎ＝１０，Ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．）。縦軸は、血中の総ＩｇＥ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を、横軸は感作期間（週）を示す。各カラムは左から順に非感作対照群、感作対照群、およびプレドニゾロン投与群の測定結果に対応している。
図５は、ＮＣ／Ｎｇａダニ抗原誘発皮膚炎モデルマウス耳介におけるＳＯＣＳ３のｍＲＮＡ発現レベルを定量した結果を示す。縦軸は、ｍＲＮＡの発現レベル（ｃｏｐｙ／ｎｇ ＲＮＡ）、横軸はダニ抗原感作開始後の日数を示す。各カラムは左から順に非感作対照群、感作対照群、およびプレドニゾロン投与群の測定結果に対応している。
本発明は、アレルギー性疾患の検査方法に関する。
背景技術
アレルギー性疾患は、多因子性の病気（ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ）と考えられている。つまり気管支喘息やアトピー性皮膚炎は多くの異なる遺伝子の発現の相互作用によって起こり、これらの個々の遺伝子の発現は、複数の環境要因によって影響を受ける。このため、アレルギー性疾患を起こす特定の遺伝子を解明することは、非常に困難であった。
アレルギー性疾患には、変異や欠損を有する遺伝子の発現や、特定の遺伝子の過剰発現や発現量の減少が関わっていると考えられている。病気に関して遺伝子発現が果たしている役割を解明するためには、遺伝子が発症にどのように関わり、薬剤などの外的な刺激が遺伝子発現をどのように変化させるのかを理解する必要がある。
さて、現在アレルギー性疾患の診断においては、一般に、問診、家族歴、そして本人の既往症の確認が重要な要素となっている。またアレルギーをより客観的な情報に基づいて診断するために、血液を試料とする試験方法や、アレルゲンに対する患者の免疫学的な応答を観察する方法も実施されている。前者の例として、アレルゲン特異的ＩｇＥ測定、白血球ヒスタミン遊離試験、あるいはリンパ球幼若化試験等が挙げられる。アレルゲン特異的ＩｇＥの存在は、そのアレルゲンに対するアレルギー反応の証明である。しかし患者によっては、必ずしもアレルゲン特異的なＩｇＥを検出できるとは限らない場合もある。また、その測定原理上、診断に必要なアレルゲンの全てに対して、試験を実施しなければならない。白血球ヒスタミン遊離試験やリンパ球幼若化試験は、免疫システムのアレルゲンに対する反応をｉｎ ｖｉｔｒｏで観察する方法である。これらの方法は、操作が煩雑である。
一方、患者を実際にアレルゲンに接触させたときに観察される免疫応答をアレルギーの診断に役立てる方法（後者）も公知である。プリック・テスト、スクラッチ・テスト、パッチ・テスト、皮内反応、あるいは誘発試験等が、この種の試験に含まれる。これらの試験では、患者のアレルギー反応を直接診断することができる反面、実際に被検者をアレルゲンに曝露する侵襲性の高い検査であると言うことができる。
この他、アレルゲンに関わらず、アレルギー反応の関与を証明するための試験方法も試みられている。たとえば、血清ＩｇＥ値が高値である場合、その患者にはアレルギー反応が起きていると推定することができる。血清ＩｇＥ値は、アレルゲン特異ＩｇＥの総量に相当する情報である。アレルゲンの種類に関わらずＩｇＥの総量を決定することは容易であるが、非アトピー型気管支炎等の疾患を持つ患者では、ＩｇＥが低値となる場合がある。
したがって、患者に対する侵襲が少なく、しかも診断に必要な情報を容易に得ることができる、アレルギー性疾患のマーカーが提供されれば有用である。このようなマーカーは、アレルギー性疾患の発症に深く関与していると考えられるので、診断のみならず、アレルギー症状のコントロールにおいても、重要な標的となる可能性がある。
発明の開示
本発明は、特にアレルギー性疾患の検査を可能とする指標遺伝子の提供を課題とする。さらに、本発明は該指標に基づく、アレルギー性疾患の検査方法およびアレルギー性疾患治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、アレルギー性疾患の患者と健常者との間で発現レベルに差が見られる遺伝子を単離し、アレルギー反応との関連性を明らかにすることにより、アレルギー性疾患治療の新たな標的を見出すことができるものと考えた。
このような考えに基づき、本発明者らは、アトピー性皮膚炎患者と健常者との間で発現レベルの異なる遺伝子の探索を行った。また、遺伝子の発現状態を比較する生体試料としては、末梢血単核球を選択した。アトピー性疾患の患者への抗原刺激によって末梢血単核球からのＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の分泌が知られており、末梢血単核球はアレルギー反応と密接に関係している（Ｊｅｎｍａｌｍ Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１６８−１７７，１９９９）。つまり、末梢血単核球において発現レベルの異なる遺伝子は、アレルギー反応に深い関連性を有する遺伝子であると言える。さらに末梢血単核球は、収得するのが容易であるため偽陰性をなくすための高収量が期待でき、従って微量な遺伝子の発現を検出することが可能なものと考えられる。
本発明者らは、このような免疫応答システムを支える血液細胞における遺伝子発現の変化を観察することによって、アレルギー反応に関連する遺伝子を単離することができると考えた。本出願人は、このような考えかたに基づいて、花粉症患者の末梢血の血液細胞において発現レベルが変化している次の遺伝子の単離に成功し、特許出願している。
更に本発明者らは、アトピー性皮膚炎患者の末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；以下ＰＢＭＣと省略する）、特にＴ細胞において発現レベルが異なる遺伝子の探索を行った。
Ｔ細胞は免疫応答を決定している細胞である。したがって、アレルギー性疾患患者のＴ細胞において発現レベルが高い遺伝子には、重要な役割が予測される。
免疫反応や炎症反応はインターロイキンやインターフェロンを含む多数のサイトカインによって制御される。サイトカインはその受容体、さらにその下流のＪａｎｕｓ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ（ＪＡＫ）やｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｃｅｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＳＴＡＴ）を活性化することによって、作用を示す。Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（ＳＯＣＳ）はこのサイトカインシグナル経路を負に制御する因子として不可欠である。
本発明者らはＳＯＣＳファミリー分子がアトピー性皮膚炎において果たす役割を検討するために、末梢血Ｔ細胞におけるｍＲＮＡ発現を測定し、ＳＯＣＳ３遺伝子がアトピー性皮膚炎患者のＴ細胞において、健常者よりも発現レベルが有意に高いことを明らかにした。これらの知見に基づいて、本発明者らは、ＳＯＣＳ３遺伝子を指標としてアレルギー性疾患の検査、あるいはアレルギー性疾患の治療薬のスクリーニングが可能となることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下のアレルギーの検査方法、アレルギー性疾患の治療薬、そのスクリーニング方法、アレルギー性疾患のモデル動物、並びにこれらの方法のためのキットに関する。
〔１〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の検査方法であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３である方法。
（ａ）被検者の生体試料における、指標遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｂ）該発現レベルを、健常者の生体試料における該指標遺伝子の発現レベルと比較する工程
（ｃ）該被検者の生体試料における該指標遺伝子の発現レベルの有意な上昇が観察された場合に被検者がアレルギー性疾患を有すると判定する工程
〔２〕アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎である、〔１〕に記載の検査方法。
〔３〕遺伝子の発現レベルを、ｃＤＮＡのＰＣＲによって測定する〔１〕に記載の検査方法。
〔４〕遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する〔１〕に記載の検査方法。
〔５〕生体試料が末梢血Ｔ細胞を含む試料である〔１〕に記載の方法。
〔６〕ＳＯＣＳ３遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
〔７〕ＳＯＣＳ３遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
〔８〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔９〕細胞がＴ細胞である〔８〕に記載の方法。
〔１０〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）被験動物に候補化合物を投与する工程、
（２）被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現強度を測定する工程、および
（３）候補化合物を投与しない対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１１〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物と接触させない対照と比較して前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１２〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補物質を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物と接触させない対照と比較して前記蛋白質の活性を低下させる化合物を選択する工程
〔１３〕〔８〕、〔１０〕、〔１１〕、〔１２〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、アレルギー性疾患の治療薬。
〔１４〕指標遺伝子のセンス鎖の塩基配列の連続する少なくとも１５塩基の配列に対して相補的な配列を含むアンチセンスＤＮＡを主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３と機能的に同等な遺伝子である治療薬。
〔１５〕指標遺伝子によってコードされる蛋白質に結合する抗体を主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３遺伝子またはＳＯＣＳ３と機能的に同等な遺伝子である治療薬。
〔１６〕指標遺伝子のＴ細胞における発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物のアレルギー性疾患のモデル動物としての使用であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３と機能的に同等な遺伝子である使用。
〔１７〕指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドと、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３と機能的に同等な遺伝子であるキット。
〔１８〕指標遺伝子によってコードされるアミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体と、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３と機能的に同等な遺伝子であるキット。
また本発明は、以下の（Ａ）−（Ｃ）のいずれかに示す化合物を投与する工程を含む、アレルギー性疾患の治療方法に関する。あるいは本発明は、以下の（Ａ）−（Ｃ）のいずれかに示す化合物のアレルギー性疾患の治療薬の製造における使用に関する。
（Ａ）〔８〕、〔１０〕、〔１１〕、および〔１２〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物
（Ｂ）ＳＯＣＳ３のセンス鎖の塩基配列の連続する少なくとも１５塩基の配列に対して相補的な配列を含むアンチセンスＤＮＡ
（Ｃ）ＳＯＣＳ３遺伝子によってコードされる蛋白質に結合する抗体
更に本発明は、非ヒト脊椎動物におけるＴ細胞のＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３と機能的に同等な遺伝子の発現強度を上昇させる工程を含む、アレルギー性疾患のモデル動物の製造方法に関する。あるいは本発明は、ＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３と機能的に同等な遺伝子の発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物のアレルギー性疾患のモデル動物としての使用に関する。
本発明において指標遺伝子とするＳＯＣＳ３遺伝子の構造は既に明らかにされている。本発明の指標遺伝子であるＳＯＣＳ３は、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γのような炎症性サイトカイン、あるいはＩＬ−１０のような抗炎症性サイトカインによって誘導され、それらサイトカインの作用を負に制御することが報告されている（Ｙａｓｕｋａｗａ Ｈ．，Ｓａｓａｋｉ Ａ．ａｎｄ Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ａ．２０００．Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１４３−１６４．）。
アレルギー反応においては、ＩＬ−４やＩＬ−５を産生するＴｈ２に分化したＴ細胞が重要な要因となっている。発明者の一人である久保らは、ＳＯＣＳ３がＴｈ２細胞特異的に発現していることを見出した。さらに、ＳＯＣＳ３のトランスジェニックマウスを作製し、Ｔ細胞の機能分化を観察したところＴｈ１分化が顕著に抑制され、これに呼応してＴｈ２分化が促進していた。そのメカニズムとしては、ＩＬ−４によって誘導されたＳＯＣＳ３がＴｈ１への分化を促すＩＬ−１２受容体のシグナル伝達を抑制していることが原因と考えられた。
実際に、ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞またはＴｈ２細胞への分化には特定のＳＯＣＳ分子の優位な発現が伴う。Ｔｈ１細胞ではＳＯＣＳ１の発現が，Ｔｈ２細胞ではＳＯＣＳ３の発現の亢進が認められる。Ｔｈ１細胞ではＩＬ−４／ＳＴＡＴ６のシグナル伝達が，またＴｈ２細胞ではＩＬ−１２／ＳＴＡＴ４のシグナル伝達が抑制されていると考えられる（Ｅｇｗｕａｇｕ ＣＥ，Ｙｕ ＣＲ，Ｚｈａｎｇ Ｍ，Ｍａｈｄｉ ＲＭ，Ｋｉｍ ＳＪ，Ｇｅｒｙ Ｉ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２ Ａｐｒ １；１６８（７）：３１８１−７，Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｔｈ１ ａｎｄ Ｔｈ２ ｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔｈ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ．）。
以上のことから、ヒトの末梢血Ｔ細胞におけるＳＯＣＳ３の発現上昇によってＴｈ２細胞への分化が促進されることがアレルギー発症の一因となっていると考えられた。
ＳＯＣＳ３に関しての特許はいくつか報告されている。しかし、いずれもサイトカインシグナルを抑制するという一般的な機能の報告に留まり、アレルギー性疾患における役割を示すデータは示されていない。以下に代表的な特許を示した。
・ＷＯ２００１２９１７８−Ａ２，ＥＰ０８７７０３０Ａ２（ＳＭＩＴＨＫＬＩＮＥ ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）
ＥＰＯ ｐｒｉｍａｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｇｅｎｅ １（ＥＰＲＧ１）
Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎを増殖に必要とするヒト培養細胞株から分離された遺伝子が記載されている。血液疾患に関連する多くの疾患との関連性を指摘しているが、いずれの疾患についても、この遺伝子との関連性を裏付けるデータは無い。
・ＷＯ０９９２３２２０−Ａ１（ＩＮＣＹＴＥ ＰＨＥＲＭ ＩＮＣ．）
Ｈｕｍａｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（ＨＳＣＳ−１）
遺伝子の塩基配列情報が記載されている。幅広い疾患との関連性が述べられているが、特定の疾患との関連性を裏付けるデータは無い。
・ＷＯ９８２００２３−Ａ１（ＨＡＬＬ ＩＮＳＴ ＭＥＤＩＣＡＬ ＲＥＳ ＷＡＬＴＥＲ ＆ ＥＬＩＺＡ）
Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＯＣＳ）。癌、傷病、免疫関連疾患、高血圧についての記載がある。しかし、やはりこれらの疾患との関連性を裏付けるデータを伴っていない。
更に、アトピー性皮膚炎患者末梢血Ｔ細胞におけるＣＩＳ−１，ＳＯＣＳ１，ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ５のｍＲＮＡ発現を測定した結果、ＳＯＣＳ３は患者群において有意に発現が高く，ＳＯＣＳ３の発現量は血中ＩｇＥ値とも高い相関性が認められた（長田直子，押田忠弘，関陽一，杉田雄二，斎藤博久，久保允人第３２回（２００２年１２月）日本免疫学会講演要旨集Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３２，２００２ ＩＳＳＮ０９１９−１９８４ ｐａｇｅ １９８，「アレルギー性疾患患者におけるＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ−３（ＳＯＣＳ３）分子の高発現」）。この知見は、特許出願後に本発明者らによって発表された。
本発明において、アレルギー性疾患（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）とはアレルギー反応の関与する疾患の総称である。より具体的には、アレルゲンが同定され、アレルゲンへの曝露と病変の発症に深い結びつきが証明され、その病変に免疫学的な機序が証明されることと定義することができる。ここで、免疫学的な機序とは、アレルゲンの刺激によって白血球細胞が免疫応答を示すことを意味する。アレルゲンとしては、ダニ抗原や花粉抗原等を例示することができる。
代表的なアレルギー性疾患には、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、花粉症、あるいは昆虫アレルギー等を示すことができる。アレルギー素因（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉａｔｈｅｓｉｓ）とは、アレルギー性疾患を持つ親から子に伝えられる遺伝的な因子である。家族性に発症するアレルギー性疾患はアトピー性疾患とも呼ばれ、その原因となる遺伝的に伝えられる因子がアトピー素因である。アトピー性皮膚炎は、アトピー性疾患のうち、特に皮膚炎症状を伴う疾患に対して与えられた総称である。
本発明においてＳＯＣＳ３遺伝子とは、本実施例において同定されたヒトＳＯＣＳ３遺伝子およびそれと同一の遺伝子座または他生物において相同の遺伝子座にある遺伝子を言う。例えば本発明においてＳＯＣＳ３遺伝子は、本実施例において同定されたヒトＳＯＣＳ３遺伝子と同じまたは相同の遺伝子座にある任意の対立遺伝子が含まれる。本発明においてＳＯＣＳ３遺伝子には、具体的には、本実施例において同定されたヒトＳＯＣＳ３遺伝子、その多型（ＳＮＰを含む）、変異体、スプライシングバリアント、および他生物のホモログを含む。これらの遺伝子は、ヒトＳＯＣＳ３遺伝子と実質的に同一または類似の発現制御を受けていると考えられることから、それらの発現を検出することにより、本発明のアレルギー性疾患の検査を行うことが可能である。
具体的には、本発明においてＳＯＣＳ３遺伝子は、以下の核酸からなる内在性遺伝子と実質的に同一の遺伝子である。内在性遺伝子とは、自然界の生物が元来保持している、人の手により改変されていない遺伝子を言い、それと同一の塩基配列からなる遺伝子は、内在性遺伝子と実質的に同一の遺伝子である。また「遺伝子」とは、ここでは転写産物またはそれをコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を言う。
（ａ）ＳＯＣＳ３遺伝子の塩基配列から選択された塩基配列を含む核酸。
（ｂ）ＳＯＣＳ３遺伝子のコード配列の塩基配列において、１または複数の塩基が置換、欠失、および／または挿入した塩基配列を含む核酸。
（ｃ）ＳＯＣＳ３蛋白質のアミノ酸配列の連続した少なくとも１５アミノ酸をコードする核酸。
（ｄ）ＳＯＣＳ３蛋白質のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入したアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする核酸。
（ｅ）ＳＯＣＳ３遺伝子の連続した少なくとも５０塩基を含み、ＳＯＣＳ３遺伝子の塩基配列以外の配列を含まない核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸。
（ａ）に記載の核酸には、好ましくはＳＯＣＳ３遺伝子（より好ましくはそのコード配列）に記載の塩基配列の連続した少なくとも４０塩基、より好ましくは６０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上、より好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上、より好ましくは１０００塩基以上、最も好ましくは全長を含む核酸が含まれる。このような核酸には、主に同一種内の遺伝子の多型、変異体、およびスプライシングバリアントが含まれ得る。また（ａ）に記載の核酸としては、ＳＯＣＳ３遺伝子の塩基配列の連続した少なくとも３０塩基、より好ましくは３５塩基以上、より好ましくは４０塩基以上、より好ましくは４５塩基以上、より好ましくは５０塩基以上の塩基配列を含む核酸が挙げられる。塩基配列は、ＳＯＣＳ３遺伝子のコード配列から選択することが好ましい。塩基配列は、任意の数を選択することができる。複数の塩基配列を選択する場合には、オーバーラップしないように２箇所以上、好ましくは３箇所以上、より好ましくは４箇所以上、より好ましくは５箇所以上の連続した塩基配列を含む核酸がより好ましい。
（ｂ）に記載の核酸には、好ましくはＳＯＣＳ３遺伝子のコード配列において、全塩基数の１５％以内、より好ましくは１０％以内、より好ましくは８％以内、より好ましくは５％以内、より好ましくは１％以内の塩基が置換、欠失、および／または挿入した塩基配列を含む核酸が含まれる。このような核酸には、近縁の他種生物のカウンターパートの遺伝子、その多型、その変異体、およびそのスプライシングバリアントなどが含まれ得る。このような核酸は、好ましくは配列番号：１のコード配列と８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸である。
塩基配列またはアミノ酸配列の同一性は、例えばＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）を用いて決定することができる。具体的には、塩基配列の同一性を決定するにはｂｌａｓｔｎプログラム、アミノ酸配列の同一性を決定するにはｂｌａｓｔｐプログラムを用い、例えばＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｈｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴのウェブサイトにおいてＬｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙを含むフィルターは全てＯＦＦにして、デフォルトのパラメータを用いて検索を行う（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆ Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６）。例えば２つの配列の比較を行うｂｌａｓｔ２ｓｅｑｕｅｎｃｅｓプログラム（Ｔａｔｉａｎａ Ａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。ギャップはミスマッチと同様に扱い、ＳＯＣＳ３遺伝子のコード配列全体に対する同一性の値を計算する。
（ｃ）に記載の核酸には、好ましくはＳＯＣＳ３蛋白質のアミノ酸配列の連続した少なくとも２０アミノ酸、より好ましくは３０アミノ酸以上、より好ましくは５０アミノ酸以上、より好ましくは１００アミノ酸以上、より好ましくは３００アミノ酸以上、より好ましくは５００アミノ酸以上、最も好ましくは全長をコードする核酸が含まれる。このような核酸には、上記の（ａ）と同様に、主に同一種内の遺伝子の多型、変異体、およびスプライシングバリアントが含まれ得る。また（ｃ）に記載の核酸としては、ＳＯＣＳ３蛋白質の塩基配列の連続した少なくとも８アミノ酸、より好ましくは１０アミノ酸以上、より好ましくは１５アミノ酸以上、より好ましくは２０アミノ酸以上、より好ましくは２５アミノ酸以上のアミノ酸配列をコードする塩基配列部分を、オーバーラップしないように２箇所以上、好ましくは３箇所以上、より好ましくは４箇所以上、より好ましくは５箇所以上含む核酸がより好ましい。
（ｄ）に記載の核酸には、好ましくはＳＯＣＳ３蛋白質のアミノ酸配列において、全アミノ酸数の１５％以内、より好ましくは１０％以内、より好ましくは８％以内、より好ましくは５％以内、より好ましくは１％以内のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入したアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする核酸が含まれる。この核酸は、非翻訳配列を含んでいてよい。このような核酸には、近縁の他種生物のカウンターパートの遺伝子、その多型、その変異体、およびそのスプライシングバリアントなどが含まれ得る。このような核酸は、好ましくはＳＯＣＳ３蛋白質のアミノ酸配列と８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする核酸である。ギャップはミスマッチと同様に扱い、ＳＯＣＳ３蛋白質のアミノ酸配列全体に対する同一性の値を計算する。アミノ酸配列の同一性は上記に従って決定することができる。
（ｅ）に記載の核酸には、好ましくはＳＯＣＳ３遺伝子（より好ましくはコード配列）に記載の連続した少なくとも８０塩基、より好ましくは１００塩基以上、より好ましくは１２０塩基以上、より好ましくは２００塩基以上を含み、ＳＯＣＳ３遺伝子（より好ましくはコード配列）に記載した塩基配列以外の配列を実質的に含まない核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸が含まれる。このような核酸は、例えばＳＯＣＳ３遺伝子の塩基配列を含む核酸を鋳型にして作製されたプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であってよい。５０塩基から数百塩基の長さのプローブは、例えばＤＮＡ合成により合成することもできるし、あるいはランダムプライム法、ニックトランスレーション、またはＰＣＲ法などにより作製することができる。
（ｅ）に記載の核酸における、ストリンジェントな条件とは、好ましくは０．５〜０．９Ｍ程度のＮａＣｌを含むハイブリダイゼーション溶液中、６０℃、好ましくは６２℃、より好ましくは６５℃でハイブリダイゼーションを行い、その後ハイブリダイゼーションと同じ温度で１×ＳＳＣ中、好ましくは０．５×ＳＳＣ中、より好ましくは０．２×ＳＳＣ中、より好ましくは０．１×ＳＳＣ中で、１時間洗浄する条件である。但し、ストリンジェンシーを大きく左右するハイブリダイゼーションや洗浄の温度条件は、プローブの融解温度（Ｔｍ）に応じて調整することができる。Ｔｍはハイブリダイズする塩基対に占める構成塩基の割合、プローブの鎖長、ハイブリダイゼーション溶液組成（塩濃度およびホルムアミド濃度）によって変動する。したがって、当業者であればこれらの条件を考慮して同等のストリンジェンシーを与える条件を経験的に設定することができる。ハイブリダイゼーション溶液としては、例えば４×ＳＳＣ、または好ましくはＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（登録商標）Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）などを用いることができる。
本発明のアレルギー性疾患の検査方法は、被検者の生体試料におけるＳＯＣＳ３遺伝子の発現レベルを測定し、健常者の測定値と比較する工程を含む。両者の比較の結果、健常者よりも発現が亢進している場合には、被検者がアレルギー性疾患であると判定される。発現レベルの比較のためには、通常、たとえば健常者における前記指標遺伝子の発現レベルに基づいて、標準値が設定される。この標準値をもとに、たとえば±２Ｓ．Ｄ．の範囲が許容範囲とされる。指標遺伝子の測定値に基づいて、標準値や許容範囲を設定する手法は公知である。被検者における指標遺伝子の発現レベルが許容範囲よりも高ければ、その被検者はアレルギー性疾患を有すると判定される。またその発現レベルが許容範囲内であれば、アレルギー性疾患を有する可能性は低いと予想される。本発明において、アレルギー性疾患の指標とすることができるＳＯＣＳ３遺伝子を指標遺伝子と言う。
指標遺伝子は、ＳＯＣＳ３のみならず、他のアレルギー性疾患の指標となる遺伝子と組み合わせることもできる。指標遺伝子として複数の遺伝子を組み合わせて測定することによって検査精度を高めることができる。アトピー性皮膚炎患者等のアレルギー性疾患患者は、ヘテロジーニアス（不均一）な集団なので、複数の遺伝子を指標とすることにより、より確実な診断を行うことができる。
本発明において、指標遺伝子の発現レベルとは、遺伝子のｍＲＮＡへの転写、並びに蛋白質への翻訳を含む。したがって本発明によるアレルギー性疾患の検査方法は、前記指標遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現強度、あるいは前記指標遺伝子によってコードされる蛋白質の発現レベルの比較に基づいて行われる。
本発明におけるアレルギー性疾患の検査における指標遺伝子の発現レベルの測定は、公知の遺伝子解析方法にしたがって実施することができる。具体的には、たとえばこの遺伝子にハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、または本発明の遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとした遺伝子増幅技術等を利用することができる。
本発明の検査に用いられるプローブまたはプライマーは、前記指標遺伝子の塩基配列に基づいて設定することができる。たとえばヒトＳＯＣＳ３遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＢ００６９６７として公知である。ＳＯＣＳ３遺伝子の塩基配列を配列番号：１に、またこの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号：２に示した。
なお一般に高等動物の遺伝子は、高い頻度で多型を伴う。また、スプライシングの過程で相互に異なるアミノ酸配列からなるアイソフォームを生じる分子も多く存在する。多型やアイソフォームによって塩基配列に変異を含む遺伝子であっても、前記指標遺伝子と同様の活性を持ち、アレルギーに関与する遺伝子は、いずれも本発明の指標遺伝子に含まれる。
プライマーあるいはプローブには、前記指標遺伝子の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。塩基配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
このようなポリヌクレオチドは、指標遺伝子を検出するためのプローブとして、また指標遺伝子を増幅するためのプライマーとして利用することができる。プライマーとして用いる場合には、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、指標遺伝子（またはその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のＤＮＡが用いられる。プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的である必要があるが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
なお、本発明における「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができる。これらポリヌクレオチドは、合成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブＤＮＡは、通常、標識したものが用いられる。標識方法としては、例えば次のような方法を示すことができる。なお用語オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのうち、重合度が比較的低いものを意味している。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに含まれる。
・ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーションによる標識
・ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識
・クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識（Ｂｅｒｇｅｒ ＳＬ，Ｋｉｍｍｅｌ ＡＲ．（１９８７）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｍｅｓ ＢＤ，Ｈｉｇｇｉｎｓ ＳＪ（１９８５）Ｇｅｎｅｓ Ｐｒｏｂｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）
・ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写による標識（Ｍｅｌｔｏｎ ＤＡ，Ｋｒｉｅｇ，ＰＡ，Ｒｅｂａｇｋｉａｔｉ ＭＲ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ，Ｚｉｎｎ Ｋ，Ｇｒｅｅｎ ＭＲ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１２，７０３５−７０５６）
・放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをＤＮＡに取り込ませる方法（Ｋｒｉｃｋａ ＬＪ．（１９９２）Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）
ハイブリダイゼーション技術を利用したアレルギー性疾患の検査は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法などを使用して行うことができる。さらには、ＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター法を用いることにより、本発明の遺伝子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能である。
ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法においては、両端を互いの蛍光を打ち消し合う異なった蛍光色素で標識したプローブを用い、検出対象（ＤＮＡもしくはＲＮＡの逆転写産物）にハイブリダイズさせる。ＰＣＲ反応が進んでＴａｑポリメラーゼの５’−３’エクソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）活性により同プローブが分解されると二つの蛍光色素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムに行う。検出対象についてコピー数の明らかな標準試料について同時に測定することにより、ＰＣＲ増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピー数を決定する（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６−７２８０；Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ４（６）：３５７−３６２；Ｈｅｉｄ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９８６−９９４；Ｇｉｂｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．Ｕ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９９５−１００１）。ＰＣＲ増幅モニター法においては、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることができる。
また本発明のアレルギー性疾患の検査方法は、前記指標遺伝子によりコードされる蛋白質を検出することにより行うこともできる。以下、本明細書において、前記指標遺伝子によりコードされる蛋白質を指標蛋白質と記載する。このような検査方法としては、例えば、これら指標蛋白質に結合する抗体を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法などを利用することができる。
この検出に用いる前記指標蛋白質に結合する抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０５（５９３４）：５３７−４０）であることができる。例えば、指標蛋白質に対するポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。あるいは必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させる。こうして得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることができる。
指標蛋白質の検出には、これらの抗体を適宜標識して用いればよい。また、この抗体を標識せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテインＡやプロテインＧを標識して間接的に検出することもできる。具体的な検出方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法を挙げることができる。
抗原に用いる蛋白質もしくはその部分ペプチドは、例えば該遺伝子もしくはその一部を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換え蛋白質を発現させ、発現させた組み換え蛋白質を培養体または培養上清から精製することにより得ることができる。あるいは、これらの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、あるいは全長ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを化学的に合成し、免疫原として用いることもできる。
更に本発明においては、指標遺伝子の発現レベルのみならず、生体試料における指標蛋白質の活性を指標として、アレルギー性疾患の検査を行うこともできる。指標蛋白質の活性とは、各蛋白質が備える生物学的な活性を言う。前記指標蛋白質の活性は、公知の方法に基づいて検出することができる。
本発明の検査方法においては、通常、被検者の生体試料を試料とする。生体試料としては、末梢血Ｔ細胞等を用いることができる。末梢血からＴ細胞を得る方法は公知である。すなわち、末梢血を希釈してフィコールを利用して遠心分離することによりＰＢＭＣを分取することができる。分離したＰＢＭＣを試料として指標遺伝子あるいは指標蛋白質を測定することにより、本発明の検査方法を実施することができる。ＰＢＭＣには、リンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）や単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）が含まれる。しかし、実施例にも示すように、これらの血液細胞においては、指標遺伝子はＴ細胞で高い発現が見られる。したがって、他の細胞の存在は指標遺伝子や指標蛋白質の測定結果にほとんど影響を与えない。あるいは抗ＣＤ３抗体を固定したマイクロビーズでＴ細胞を特異的に吸着し分離することもできる。
血液細胞を破壊し、細胞中の指標遺伝子のｍＲＮＡ、あるいは指標蛋白質を測定することができる。また血中に存在する指標蛋白質を測定することもできる。Ｔ細胞のライセートやｍＲＮＡの抽出には、市販のキットを利用すると便利である。例えば、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ製）またはＩＳＯＧＥＮ（登録商標）（ニッポンジーン）等を用いることができる。
Ｔ細胞における指標遺伝子の発現レベルの測定値は、公知の方法によって補正することができる。補正により、細胞における遺伝子の発現レベルの変化を比較することができる。測定値の補正は、Ｔ細胞に発現し、かつ細胞の状態に関わらず発現レベルが大きく変動しない遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）の発現レベルの測定値に基づいて、本発明において指標とすべき遺伝子の発現レベルの測定値を補正することによって行われる。このような遺伝子としては、β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子、およびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子が挙げられる。
本発明における指標遺伝子は、健常者とアトピー性皮膚炎患者との比較において、患者のＴ細胞で高い発現量を示した。従って、指標遺伝子の発現レベルを指標として、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患の検査を行うことができる。
本発明におけるアレルギー性疾患の検査とは、たとえば以下のような検査が含まれる。アトピー性皮膚炎の症状を示しながら、一般的な検査ではアレルギー性疾患と判定できない患者であっても、本発明に基づく検査を行えばアレルギー性疾患の患者であることが容易に判定できる。より具体的には、アレルギー性疾患が疑われる症状を示す患者における指標遺伝子の発現の上昇は、その症状の原因がアレルギー性疾患である可能性が高いことを示している。皮膚炎症状には、アレルギー反応が原因となっているものと、そうでないものがある。両者の治療方法はまったく異なるので、いずれの原因によって皮膚炎の症状がもたらされているのかを診断することは、治療上、たいへん重要な工程である。本発明の検査方法は、皮膚炎の原因の特定において、きわめて重要な情報を提供することができる。
あるいは、アレルギー症状が改善に向かっているのかどうかを判断するための検査が可能となる。本発明の指標遺伝子は、アレルギー性疾患患者のＴ細胞において発現量の増加を示した。Ｔ細胞は免疫応答において司令塔としての役割を果たす細胞である。したがって、免疫応答を掌るＴ細胞で発現が高まる遺伝子は、治療効果の判定に有用である。より具体的には、アレルギー性疾患と診断された患者における指標遺伝子の発現の上昇は、アレルギーの症状が進行している可能性が高いことを示している。
また本発明は、Ｔ細胞における、指標遺伝子ＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現レベルを上昇させたトランスジェニック非ヒト動物のアレルギー性疾患モデル動物としての使用に関する。アレルギー性疾患モデル動物は、アレルギーにおける生体内の変化を明らかにするために有用である。更に、本発明のアレルギー性疾患モデル動物は、アレルギー性疾患の治療薬の評価に有用である。
本発明によって、Ｔ細胞において前記指標遺伝子の発現レベルが、上昇することが明らかとなった。したがって、Ｔ細胞においてＳＯＣＳ３遺伝子、またはＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現レベルを人為的に増強した動物は、アレルギー性疾患のモデル動物として利用することができる。本発明においてトランスジェニック動物とは、ゲノムＤＮＡにおける１または複数のヌクレオチドの挿入、置換、および／または欠失を伴う、遺伝的に改変された動物（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｉｍａｌｓ）を言う。このアレルギー性疾患モデル動物は、アレルギーにおける生体内の変化を明らかにするために有用である。更に、本発明のアレルギー性疾患モデル動物は、アレルギー性疾患の治療薬の評価およびスクリーニングに有用である。なおＴ細胞における発現レベルの上昇とは、血液細胞全体における指標遺伝子の発現レベルの上昇を含む。すなわち、前記指標遺伝子の発現レベルを上昇させるのはＴ細胞のみである場合のみならず、血液細胞全体において、あるいは全身性に前記遺伝子の発現レベルが上昇している場合を含む。
本発明においてＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子とは、指標遺伝子ＳＯＣＳ３によってコードされる蛋白質（指標蛋白質）の活性と同等の活性を備えた蛋白質をコードする遺伝子である。このような遺伝子としては、ヒトＳＯＣＳ３遺伝子または他の生物のそのカウンターパートの人為的な改変体などが含まれる。例えば、ある遺伝子を発現ベクターに挿入する場合には、Ｎ末端またはＣ末端の数アミノ酸を欠失させたり、タグペプチドの配列または発現ベクター由来の他のアミノ酸配列を付加することが頻繁に行われる。このような蛋白質は天然の細胞が持つ内在性蛋白質とアミノ酸配列が異なるが、その活性は実質的に内因性蛋白質と同等である。本発明においてこのような蛋白質をコードする遺伝子は、内因性遺伝子と機能的に同等な遺伝子と称する。
本発明における指標蛋白質の活性としてはＪＡＫ阻害活性が挙げられる。例えばヒトＳＯＣＳ３蛋白質の１または複数のアミノ酸を欠失、挿入、および／または置換した蛋白質であって、ＪＡＫ阻害活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を、本発明のトランスジェニックモデル動物の作製のために用いることができる。このような改変体蛋白質は、ヒトＳＯＣＳ３蛋白質のアミノ酸配列に対して、たとえば９０％以上、望ましくは９５％以上、更に望ましくは９９％以上の相同性を有する蛋白質である。また、ＳＯＣＳ３遺伝子の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む遺伝子であって、ＪＡＫ阻害活性を有する蛋白質をコードする遺伝子も、ＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子として用いることができる。
あるいはヒトＳＯＣＳ３タンパク質のアミノ酸配列に対して、たとえば９０％以上、望ましくは９５％以上、更に望ましくは９９％以上の相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、ＳＯＣＳ３遺伝子と機能的な遺伝子として示すことができる。また、実施例において用いた配列番号：１と配列番号：２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅することができる遺伝子であって、Ｔ細胞において発現が増大する遺伝子も、機能的に同等な遺伝子である。
本発明のモデル動物は、例えば（ａ）該モデル動物の表現型を検出する工程、および（ｂ）該モデル動物と比べＴ細胞における該指標遺伝子の発現レベルが低い動物（対照）の対応する表現型に対する違いをアレルギー疾患と関連付ける工程により、アレルギー疾患のモデルとして使用することができる。対照の動物としては、該モデル動物と同じ遺伝背景を持つ非トランスジェニック動物、または空のベクターを導入したトランスジェニック動物などが挙げられる。表現型としては、例えば皮膚炎、鼻炎、または喘息等のアレルギー症状、あるいは免疫系細胞の活性化または遺伝子発現の変化などを含む、所望の表現型が挙げられる。
本発明において、指標遺伝子ＳＯＣＳ３のＴ細胞における発現レベルを上昇させることによって得ることができるトランスジェニック動物をアレルギー性疾患モデル動物として使用し、この遺伝子の役割や、この遺伝子を標的とする薬剤を評価することには大きな意義がある。また本発明によるアレルギー性疾患モデル動物は、後に述べるアレルギー性疾患の治療または予防のための医薬品のスクリーニングに有用であると同時に、アレルギー性疾患のメカニズムの解明、さらにはスクリーニングされた化合物の安全性の試験にも有用である。たとえば本発明によるアレルギー性疾患モデル動物がアトピー性皮膚炎またはアレルギー性喘息を発症したり、何らかのアレルギー性疾患に関連した測定値の変化を示せば、それを回復させる作用を持った化合物を探索するスクリーニングシステムが構築できる。
本発明において、発現レベルの上昇とは、目的とする遺伝子が外来遺伝子として導入され強制発現している状態、宿主が備える遺伝子の転写および／または蛋白質への翻訳が増強されている状態、並びに翻訳産物である蛋白質の分解が抑制された状態のいずれかを意味する。遺伝子の発現レベルは、たとえば実施例に示すような定量的なＰＣＲにより確認することができる。また翻訳産物である蛋白質の発現量または活性は、正常な状態と比較することにより確認することができる。
代表的なトランスジェニック動物は、目的とする遺伝子を導入し強制発現させた動物である。この他のトランスジェニック動物には、たとえばｍＲＮＡの非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列などからＲＮＡ不安定化の要因となる配列を除去してｍＲＮＡの半減期を伸ばしたりすることができる。また、指標遺伝子のコード領域に変異を導入し、その活性を増強したり、あるいは分解されにくいアミノ酸配列に改変することなどを示すことができる。アミノ酸配列の変異には、置換、欠失、挿入、あるいは付加を示すことができる。その他、遺伝子の転写調節領域を変異させることにより、指標遺伝子の発現そのものを上昇させることもできる。
特定の遺伝子を対象として、トランスジェニック動物を得る方法は公知である。すなわち、遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法や、位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第４８７３１９１号）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に遺伝子を導入する方法などによってトランスジェニック動物を得ることができる。その他、レトロウィルスベクターに遺伝子を挿入し、卵に感染させる方法、および、精子を介して遺伝子を卵に導入する精子ベクター法等も開発されている。精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、この精子を卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（Ｍ．Ｌａｖｉｔｒａｎｏｅｔら，Ｃｅｌｌ，５７，７１７，１９８９）。
本発明のアレルギー性疾患モデル動物として用いるトランスジェニック動物は、ヒト以外のあらゆる脊椎動物を利用して作成することができる。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、サル、あるいはウシ等の脊椎動物において様々な遺伝子の導入や発現レベルを改変されたトランスジェニック動物が作り出されている。
更に本発明は、アレルギー性疾患治療薬のスクリーニング方法に関する。本発明において、指標遺伝子は、アレルギー性疾患患者のＴ細胞において有意に発現レベルが上昇している。したがって、これらの遺伝子の発現レベルを低下させることができる化合物を選択することによって、アレルギー性疾患の治療薬を得ることができる。本発明において遺伝子の発現レベルを低下させる化合物とは、遺伝子の転写、翻訳、タンパク質の活性発現のいずれかのステップに対して阻害的に作用する作用を持つ化合物である。
本発明のアレルギー性疾患治療薬のスクリーニング方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで行なうこともｉｎ ｖｉｔｒｏで行うこともできる。このスクリーニングは、たとえば以下のような工程にしたがって実施することができる。なお本発明のスクリーニング方法における指標遺伝子とは、ＳＯＣＳ３遺伝子に加え、ＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等ないずれかの遺伝子を含む。
（１）被験動物に、候補化合物を投与する工程、
（２）被験動物の生体試料における前記指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）候補化合物を投与しない対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
本発明のスクリーニング方法における被験動物としては、たとえばアレルギー性疾患モデル動物を利用することができる。アレルギー性疾患モデル動物は公知である。たとえば人間のアトピー性皮膚炎に近いモデルとして、ＮＣ／Ｎｇａマウスを用いた皮膚炎自然発症モデルが報告されている。このマウスの耳介にダニ抗原（５μｇ／耳）を２−３日間隔で計８回投与すると、２週間以降にはヒトのアトピー性皮膚炎に酷似した症状を誘発することができる。この系に候補化合物を投与し、本発明の指標遺伝子の発現レベルの変化を追跡することによって本発明によるスクリーニングを実施することができる。
このようにして被験動物に薬剤候補化合物を投与し、被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現に対する化合物の作用をモニターすることにより、指標遺伝子の発現レベルに与える薬剤候補化合物の影響を検出することができる。被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現レベルの変動は、前記本発明の検査方法と同様の手法によってモニターすることができる。更にこの検出の結果に基づいて、指標遺伝子の発現レベルを低下させる薬剤候補化合物を選択すれば、薬剤候補化合物をスクリーニングすることができる。
より具体的には、被験動物から、生体試料を採取し、前記指標遺伝子の発現レベルを候補化合物を投与しない対照と比較することにより、本発明によるスクリーニングを実施することができる。生体試料としては、全血、ＰＢＭＣ、あるいはＴ細胞等を利用することができる。これらの生体試料の採取方法、および調製方法は公知である。
このようなスクリーニングにより、指標遺伝子の発現に様々な形で関与する薬剤を選択することができる。具体的には、たとえば次のような作用を持つ薬剤候補化合物を見出すことができる。
指標遺伝子の転写活性を低下させる作用、
指標遺伝子の転写産物からの翻訳を低下させる作用、
指標遺伝子の翻訳産物の活性を阻害する作用、
指標遺伝子の転写産物の安定化を低下もしくは分解を促進する作用等、
また前記スクリーニング方法において、候補化合物の投与前および／または投与後に、被験動物をアレルゲンで刺激する工程を含む方法も本発明に含まれる。候補化合物の投与前にアレルゲンで刺激した場合には、候補化合物の、アレルゲン刺激後の免疫応答を抑制する作用を検出することができる。このようなスクリーニングによって得ることができる化合物には、アレルギー性疾患の治療効果を期待できる。また候補化合物の投与後にアレルゲンで刺激した場合には、候補化合物の、アレルゲン刺激による免疫応答の開始を抑制する作用を検出することができる。このようなスクリーニングによって得ることができる化合物には、アレルギー性疾患の予防効果を期待できる。本発明のスクリーニング方法に用いることができるアレルゲンとしては、公知のアレルゲン性の物質を用いることができる。具体的には、ダニ、ハウスダスト、植物の花粉、あるいは各種の食品由来のタンパク質等がアレルゲン性物質として公知である。これらのアレルゲンは、天然に由来するものであっても良いし、遺伝子組換えなどの手法によって合成されたものであっても良い。またアレルゲンは、タンパク質の断片であることもできる。精製アレルゲンの調製方法も公知である。
また、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのスクリーニングにおいては、例えば、指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させ、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する方法が挙げられる。このスクリーニングは、たとえば以下のような工程にしたがって実施することができる。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
本発明において、指標遺伝子を発現する細胞は、指標遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得ることができる。利用できるベクター、および宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現し得るものであればよい。宿主−ベクター系における宿主細胞としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が例示でき、それぞれ利用できるベクターを適宜選択することができる。
ベクターの宿主への導入方法としては、生物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことができる。生物学的方法としては、例えば、ウイルスベクターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法（ＨＶＪ（センダイウイルス）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、電気的細胞融合法、微少核融合法（染色体移入））が挙げられる。また、物理的方法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ジーンパーティクルガン（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）を用いる方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、プロトプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト法、マイクロカプセル法が挙げられる。
指標遺伝子を発現する細胞として、たとえば株化Ｔ細胞Ｍｏｌｔ４、あるいはヒト急性白血病Ｔ細胞Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ ＴＩＢ−１５２）は、本発明のスクリーニング方法に好適である。この細胞は、ＡＴＣＣより購入することができる。
本発明のスクリーニングの方法は、まず前記細胞株に候補化合物を添加する。その後、該細胞株における指標遺伝子の発現レベルを測定し、該遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する。
なお本発明のスクリーニング方法において、指標遺伝子の発現レベルは、これらの遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルのみならず、対応するｍＲＮＡを検出することにより比較することもできる。ｍＲＮＡによって発現レベルの比較を行うには、タンパク質試料の調製工程に代えて、先に述べたようなｍＲＮＡ試料の調製工程を実施する。ｍＲＮＡやタンパク質の検出は、先に述べたような公知の方法によって実施することができる。
さらに本発明の開示に基づいて本発明の指標遺伝子の転写調節領域を取得し、レポーターアッセイ系を構築することができる。レポーターアッセイ系とは、転写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量を指標として、該転写調節領域に作用する転写調節因子をスクリーニングするアッセイ系をいう。
すなわち本発明は、次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が、ＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３と機能的に同等な遺伝子である方法に関する。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補化合物を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較してレポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
転写調節領域としては、プロモーター、エンハンサー、さらには、通常プロモーター領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス等を例示することができる。またレポーター遺伝子としては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、成長ホルモン遺伝子等を利用することができる。
マウスやラットＳＯＣＳ３遺伝子の転写調節領域についての報告（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９９ Ｊｕｎ ８；９６（１２）：６９６４−９，Ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｈ ＳＯＣＳ−３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ＳＯＣＳ−３ ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ａｕｅｒｎｈａｍｍｅｒ ＣＪ，Ｂｏｕｓｑｕｅｔ Ｃ，Ｍｅｌｍｅｄ Ｓ．；Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０００ Ｏｃｔ；２６７（１９）：５８４９−５７，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ ＳＯＣＳ−３ ｇｅｎｅ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ａｎｄ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ｍＲＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｐａｕｌ Ｃ，Ｓｅｉｌｉｅｚ Ｉ，Ｔｈｉｓｓｅｎ ＪＰ，Ｌｅ Ｃａｍ Ａ．；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００２ Ｊａｎ １８；２７７（３）：２３４５−５２，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｃｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＧＦＩ−１Ｂ：ｔｗｏ ｒｏｕｔｅｓ ｆｏｒ ＳＴＡＴ５ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．Ｊｅｇａｌｉａｎ ＡＧ，Ｗｕ Ｈ．）では、その転写が成長ホルモンやＩＬ−６によって誘導されること、転写調節領域にはＳＴＡＴ−１／ＳＴＡＴ−３結合配列や、特徴的なシスエレメントが存在することが報告されている。ヒトにおいても同様な実験が可能である。つまり、ＳＯＣＳ３の転写調節領域の下流にルシフェラーゼやＣＡＴなどのレポーター遺伝子を結合し、ＳＯＣＳ３の発現量を測定するアッセイ系を構築することができる。
たとえば、本発明のスクリーニングに用いる転写調節領域は、次のようにして取得することもできる。すなわち、まず本発明で開示した指標遺伝子の塩基配列に基づいて、ＢＡＣライブラリー、ＹＡＣライブラリー等のヒトゲノムＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションを用いる方法によりスクリーニングを行い、該ｃＤＮＡの配列を含むゲノムＤＮＡクローンを得る。得られたゲノムＤＮＡの配列を基に、本発明で開示したｃＤＮＡの転写調節領域を推定し、該転写調節領域を取得する。得られた転写調節領域を、レポーター遺伝子の上流に位置するようにクローニングしてレポーターコンストラクトを構築する。得られたレポーターコンストラクトを培養細胞株に導入してスクリーニング用の形質転換体とする。この形質転換体に候補化合物を接触させ、レポーター遺伝子の発現を制御する化合物のスクリーニングを行うことができる。
また、指標遺伝子の転写調節領域の制御下に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞は、いわゆるノックイン動物の細胞であってもよい。ノックイン動物とは、内在性標的遺伝子の蛋白質コード領域に他の外来遺伝子が挿入された遺伝子改変動物を言う。ノックインされたこの外来遺伝子は、標的遺伝子の転写調節領域の下流に挿入されるため、内在性標的遺伝子と同様の発現制御を受けて発現する。ノックイン遺伝子としてレポーター遺伝子を用い、得られたノックイン動物またはその動物から得た細胞を使ってスクリーニングを行うことができる。ノックイン動物を用いてスクリーニングを行う方法は、（ａ）指標遺伝子部位にレポーター遺伝子がノックインされた動物に候補化合物を投与する工程、（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、および（ｃ）該候補化合物を投与しない対照と比較して該レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程、を含む。例えば候補化合物を投与した場合および投与しない場合で、該ノックイン動物の白血球好ましくはＴ細胞における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定し、その発現を低下させる化合物を選択する。またノックイン動物からの細胞を用いたスクリーニングは、（ａ）指標遺伝子部位にレポーター遺伝子がノックインされた動物からの細胞に候補化合物を接触させる工程、（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、および（ｃ）該候補化合物を接触させない対照と比較して該レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程、を含む。例えば候補化合物の存在下または非存在下でノックイン動物から得た白血球好ましくはＴ細胞における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定し、該発現レベルを低下させる化合物を選択する。これらのスクリーニングは本発明の方法に含まれる。特に個体を用いたスクリーニングにおいては、指標遺伝子本来の機能を完全に欠損させないように、片方のアレルは正常のままにして指標遺伝子が発現するようにして、もう片方のアレルにレポーター遺伝子がノックインされているヘテロノックイン接合体を用いてスクリーニングを行うことが好ましい。
ＳＯＣＳ３の発現阻害剤として、たとえばドミナントネガティブ（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ）を利用することができる。具体的には、ＳＯＣＳ３のＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｇｉｏｎ（ＫＩＲ）領域に点突然変異を有する遺伝子は、ドミナントネガティブとして働き、ＳＯＣＳ３の発現を阻害することがよく知られている。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの本発明によるスクリーニング方法として、指標蛋白質の活性に基づくスクリーニング方法を利用することもできる。すなわち本発明は、次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法に関する。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補物質を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して前記蛋白質の活性を低下させる化合物を選択する工程
ここで指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子としては、上記のように内在性ＳＯＣＳ３遺伝子の人為的な改変体などが含まれる。
このようなスクリーニングは、例えば指標遺伝子を外来的に細胞で発現させ、その細胞内における指標蛋白質の活性を測定することにより実施することができる。このためには、指標遺伝子を発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な哺乳動物細胞などに導入する。ベクターの宿主への導入方法としては、生物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことができる。生物学的方法としては、例えば、ウイルスベクターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法（ＨＶＪ（センダイウイルス）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、電気的細胞融合法、微少核融合法（染色体移入））が挙げられる。また、物理的方法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ジーンパーティクルガン（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）を用いる方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、プロトプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト法、マイクロカプセル法が挙げられる。
本発明における指標蛋白質であるＳＯＣＳ３には、たとえばＩＬ−１０のような抗炎症性サイトカインの作用を負に制御することが報告されている（Ｙａｓｕｋａｗａ Ｈ．，Ｓａｓａｋｉ Ａ．ａｎｄ Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ａ．２０００．Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１４３−１６４．）。あるいはＳＯＣＳ３は、Ｔ細胞のＴｈ２への分化を誘導する機能を有する。
その他、ＳＯＣＳ３はレセプター自身、あるいはその下流の因子であるＪａｎｕｓ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＪＡＫ）と結合することによってレセプターからのシグナルを阻害する活性を有する。したがって、ＳＯＣＳ３とレセプターとの結合、またはＪＡＫ蛋白との結合を指標として、ＳＯＣＳ３の阻害活性を測定することができる。また、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ系においては、キナーゼであるＪＡＫのキナーゼ活性、または転写因子であるＳＴＡＴの転写活性を指標としてＳＯＣＳ３の活性を測定することができる。
例えば、Ｔｈ１の分化に重要なＩＬ−１２レセプターの下流では、ＪＡＫ２とＳＴＡＴ４が働いている。ＳＯＣＳ３はＪＡＫ２と結合してＪＡＫ２のキナーゼ活性を阻害する（Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １９９９ Ｊｕｎ；４（６）：３３９−５１ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＳＨ２ ｐｒｏｔｅｉｎ−３（ＣＩＳ３／ＳＯＣＳ３）ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｊａｎｕｓ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｂｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｇｉｏｎ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ＳＨ２ ｄｏｍａｉｎ．Ｓａｓａｋｉ Ａ，Ｙａｓｕｋａｗａ Ｈ，Ｓｕｚｕｋｉ Ａ，Ｋａｍｉｚｏｎｏ Ｓ，Ｓｙｏｄａ Ｔ，Ｋｉｎｊｙｏ Ｉ，Ｓａｓａｋｉ Ｍ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＪＡ，Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ Ａ．）。従って、ＳＯＣＳ３とＪＡＫ２との結合を測定する、または、ＪＡＫ２のキナーゼ活性を測定すれば、ＳＯＣＳ３の働きを測定することができる。また、ＪＡＫ２の活性阻害の結果としてＳＴＡＴ４が持つ転写活性の阻害が起こる。ＳＴＡＴ４が持つ転写活性の測定はＳＴＡＴ４レスポンシブエレメントをプローモーターとしてもちいたレポーターアッセイ系を用いれば、容易である。以上のような方法でＩＬ−１２下流のシグナルを阻害するＳＯＣＳ３の活性を測定できる。
これらの活性を指標として、その活性を阻害する活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。このようにして得ることができる化合物は、ＳＯＣＳ３の働きを抑制する。その結果、Ｔ細胞において発現が誘導された指標蛋白質の阻害を通じて、アレルギー性の免疫応答を制御することができる。
これらスクリーニングに用いる被験候補化合物としては、ステロイド誘導体等既存の化学的方法により合成された化合物標品、コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物標品のほか、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品などが挙げられる。
本発明による各種のスクリーニング方法に必要な、ポリヌクレオチド、抗体、細胞株、あるいはモデル動物は、予め組み合わせてキットとすることができる。より具体的には、たとえば指標遺伝子を発現する細胞と、これらの指標遺伝子の発現レベルを測定するための試薬とで構成される。指標遺伝子の発現レベルを測定するための試薬としては、たとえば少なくとも１つの指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、若しくはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドが用いられる。あるいは、少なくとも１つの指標蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体を試薬として用いることができる。これらのキットには、標識の検出に用いられる基質化合物、細胞の培養のための培地や容器、陽性や陰性の標準試料、更にはキットの使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。
本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。あるいは、本発明における指標遺伝子の発現を抑制することができるアンチセンスＤＮＡも、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。好ましくはこのようなアンチセンスＤＮＡは、本発明における指標遺伝子のセンス鎖の塩基配列の連続する少なくとも２０塩基、より好ましくは２５塩基以上、より好ましくは３０塩基以上、より好ましくは４０塩基以上、より好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上の配列に対して相補的な配列を含むアンチセンスＤＮＡである。アンチセンス領域としては、指標遺伝子の転写産物（プロセッシング前、中間産物、またはプロセッシング後のいずれの転写産物でもよい）の任意の部位のアンチセンスであってもよい。このような部位としては、例えば翻訳開始コドンを含む領域などが挙げられる。更に、本発明における指標遺伝子によってコードされる蛋白質に結合する抗体は、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。本発明の治療薬として有用な好ましい抗体として、例えばＪＡＫとの相互作用ドメインに結合する抗体などを示すことができる。本発明のアレルギー性疾患の治療薬は、前記スクリーニング方法によって選択された化合物、該アンチセンスＤＮＡ、または該抗体を少なくとも１つの主成分として含み、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合することによって製造することができる。本発明のアレルギー性疾患の治療剤は、アレルギー症状の改善を目的として、経口、あるいは非経口的に投与することができる。
経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。
また、投与すべき化合物がタンパク質からなる場合には、それをコードする遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導入することにより、治療効果を達成することができる。治療効果をもたらすタンパク質をコードする遺伝子を生体に導入し、発現させることによって、疾患を治療する手法は公知である。
あるいはアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーター配列の下流に組み込み、アンチセンスＲＮＡ発現ベクターとして投与することができる。この発現ベクターをアレルギー疾患患者のＴ細胞へ導入すれば、これらの遺伝子のアンチセンスを発現し、当該遺伝子の発現レベルの低下によってアレルギーの治療効果を達成することができる。Ｔ細胞への発現ベクターの導入としては、ｉｎ ｖｉｖｏ、あるいはｅｘ ｖｉｖｏで行う方法が公知である。
投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人一人あたり、一回につき０．１ｍｇから５００ｍｇの範囲で、好ましくは０．５ｍｇから２０ｍｇの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕患者および健常者からの血液採取
アレルギー性疾患特異的に発現が異なる遺伝子を単離する目的で、症例を解析し、選出された患者および健常者から血液を採取した。健常者として１０名、アトピー性皮膚炎軽症患者として７名、アトピー性皮膚炎中等症患者として１０名、アトピー性皮膚炎重症患者として１２名から血液を採取した。
〔実施例２〕血液試料からのリンパ球画分の調製
血液１０ｍｌから、以下のようにしてＴ細胞を調製した。まずノボ社製等のヘパリン１ｍｌで注射筒壁を万遍なく処理し、最終濃度５０ｕｎｉｔ／ｍｌのヘパリンを含む１０ｍｌ注射筒に採血した。このとき一人の採血に２２Ｇ針を２本準備した。注射針をはずし、５０ｍｌの遠心チューブ（ポリプロピレン製）に移した。１５００ｒｐｍ、室温で５分間遠心し、できるだけ表面近くから１．１ｍｌを採取し、１５０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心して上清１ｍｌを血漿（ｐｌａｓｍａ）として回収した。血漿を回収した残りに３％のデキストラン（ナカライ社製）を含む０．９％ ＮａＣｌを等量（９ｍｌ）加え、静かに数回転倒させて混和した。その後３０分間室温で静置した。
ＰＲＰ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ，血小板に富む血漿）を別の１５ｍｌ遠心チューブに移し、１２００ｒｐｍ（トミー社製の遠心機で１５０×ｇに相当する）で５分間、室温で遠心した。遠心後、血小板は上清にあった。沈殿した細胞をギブコ社等から入手したＣａ、Ｍｇ不含のＨＢＳＳ ５ｍｌに懸濁した。これを、パスツールピペットを用いてＦｉｃｏｌ Ｐａｑｕｅ（ファルマシア社製）が５ｍｌが入ったチューブ（ファルコンチューブ：２００６または２０５９；ポリプロピレン製）１本に上層した。１２００ｒｐｍで５分間遠心後、１５００ｒｐｍ（Ｔｏｍｙ社製の遠心機で４００×ｇに相当する）で３０分間室温で遠心した。その結果、顆粒細胞（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）が沈殿し、フィコール層を挟んで中間層にリンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）が含まれた。
パスツールピペットで中間層を回収し、２〜３倍の容量のＢＳＡ／ＰＢＳ（０．５％ ＢＳＡ，２ｍＭ ＥＤＴＡ ｉｎ ＰＢＳ，ｐＨ７．２；使用直前に脱気した）を添加し、１２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。沈殿を回収し、ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄した。２回目の洗浄後、細胞を５ｍｌに懸濁し、その一部をトリパンブルーで２倍に希釈して細胞数を測定した。全細胞数は約１×１０７であった。これをリンパ球画分とした。
〔実施例３〕リンパ球画分からのＴ細胞の分離
実施例２で得たリンパ球画分を１２００ｒｐｍで４℃、５分間遠心し、１００μｌあたり１０８になるようにＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁した。容量は約２０μｌになった。これをエッペンドルフチューブ（１．５ｍｌ）に移し、ＣＤ３マイクロビーズ液を添加した。その後、３０分間４〜１０℃に放置した（このとき氷上には置かなかった）。この試料をマグネチックセルソーター（ＭＡＣＳ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．製）で以下のように処理した。
ＭＳ＋／ＲＳ＋カラムをＭｉｎｉ ＭＡＣＳまたはＶａｒｉｏ ＭＡＣＳセパレーションユニットに装着した（針は付けなかった）。５００μｌのＢＳＡ／ＰＢＳをカラムに静かにアプライし、バッファーは流し出した。次にＣＤ３マイクロビーズ標識した細胞をカラムにアプライした。カラムを５００μｌで３回洗浄した（Ｂ細胞画分）。カラムをセパレーションユニットからはずし、溶出液を集めるチューブ上に置いた。１ｍｌのＢＳＡ／ＰＢＳをカラムにアプライし、カラム添付のプランジャーを用いポジティブ細胞を急速に流し出した。これをＴ細胞画分とした。
得られたＴ細胞画分について、１２００ｒｐｍ、５分間４℃で遠心した。沈殿をＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄した。２回目の洗浄後、細胞を１ｍｌに懸濁し、その一部をトリパンブルーで２倍に希釈して細胞数を測定した。全細胞数は約４×１０６であった。
〔実施例４〕Ｔ細胞からの全ＲＮＡの調製
Ｔ細胞からの全ＲＮＡの調製はＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用い、原則として添付のマニュアルに従い行った。操作はすべて手袋を着用して、室温で行った。またウォッシュバッファーＲＰＥに４倍量のエタノールを加えた。リシスバッファーＲＬＴには１０μｌ／ｍｌの２−メルカプトエタノールを加えた。
細胞浮遊液を１０００〜１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清をアスピレーションで除いた。沈殿に３５０μｌのリシスバッファーＲＬＴ（２−メルカプトエタノールを含む）溶液を加えた。この段階で、ＲＬＴバッファー中の細胞のライセートは、−７０℃で保存可能であった。細胞のライセートを冷凍保存していた場合は、３７℃で１０〜１５分間インキュベートして、不溶物が見えるようなら最大速度で３分間遠心し、上清のみを回収した。このライセートを２０Ｇのカテラン針を付けた注射筒でホモゲナイズ後、キアシュレッダー（ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ）で処理した。すなわち、ピペットマンを用いて３５０μｌの細胞のライセートをキアシュレッダーユニットにアプライした。これを１５００ｒｐｍで２分間遠心し、流出液を回収した。３５０μｌの７０％エタノールを加え、ピペッティングしてよく混ぜた。
ＲＮｅａｓｙスピンカラムを添付の２ｍｌチューブに装着し、細胞のライセート混合物をアプライし、８０００×ｇ（１１５００ｒｐｍ）で１分間遠心し、流出液は捨てた。ウォッシュバッファーＲＷ１７００μｌをカラムにアプライし、５分間フタをした形で立てた。１１５００ｒｐｍで１５秒間遠心し、流出液は捨てた。カラムを新しい２ｍｌチューブに装着し、ウォッシュバッファーＲＰＥ（エタノールを含む）５００μｌをカラムにアプライした後、１１５００ｒｐｍで１５秒間遠心し、流出液は捨てた。ウォッシュバッファーＲＰＥ５００μｌをカラムにアプライし、最大速度で２分間遠心した。カラムを新しい１．５ｍｌチューブに装着し、ＤＥＰＣ処理した水３０μｌをアプライし、フタをして１０分間立てた。１１５００ｒｐｍで１０分間遠心し、全ＲＮＡを得た。濃度を測定し、量が少ないようなら、再度カラムを新しい１．５ｍｌチューブに装着し、ＤＥＰＣ処理した水３０μｌをアプライし、フタをして１０分間立て、１１５００ｒｐｍで１０分間遠心した。
〔実施例５〕全ＲＮＡのＤＮａｓｅ処理
Ｔ細胞から調製した全ＲＮＡからＤＮＡを除くため、ＤＮａｓｅ処理を行った。反応は２ユニットのＤＮａｓｅ（ニッポンジーン社）および５０ユニットのＲＮａｓｅインヒビター（ファルマシア社）を含む１００μｌの１×ＤＮａｓｅバッファー（ニッポンジーン社）中で行った。これを３７℃１５分間インキュベートした後、等量のＰＣＩ（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）を加え、ボルテックスした。１２０００ｒｐｍで室温、１０分間遠心し、上層（水層）を新しい１．５ｍｌチューブに移した。１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を加え、２．５倍量の１００％エタノールおよびエタ沈メイト１μｌを加えて、転倒混和させた。−２０℃で１５分間静置させた後、１２０００ｒｐｍで４℃、１５分間遠心し、上清を除去し、７０％エタノールを加えた。沈殿がはがれる程度にタッピングした後、上清をきれいに除去した。３分間乾燥させ、１０〜２０μｌのＤＤＷ（ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ不含）に溶解させた。濃度を測定し、使用まで−８０℃に保存した。
〔実施例６〕ＡＢＩ７７００による発現量の定量
上記Ｔ細胞より調製した全ＲＮＡ試料の一部を、ＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ７７００を用いるＴａｑＭａｎ法による遺伝子発現定量ＲＴ−ＰＣＲに使用した。このＴａｑＭａｎ法は、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ鎖を蛍光色素を用いてリアルタイムに定量検出するシステムである。
各ＳＯＣＳ遺伝子の塩基配列を基にして作製したプライマーセットを使用した（表１）。また、ＴａｑＭａｎプローブは５’端をＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）で、３’端をＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）で蛍光標識して用いた。使用したプライマーセット、およびＴａｑＭａｎプローブの塩基配列を以下に示す。
ＣＩＳ１プライマー
ＣＩＳ１／ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ（１２０ｂｐ）
ＳＯＣＳ１／ｐＣＲ２（１２０ｂｐ）
ＳＯＣＳ３／ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ（１０２ｂｐ）
ＳＯＣＳ５／ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ（７６ｂｐ）
〔実施例７〕ＮＣ／Ｎｇａダニ抗原誘発皮膚炎モデルマウス耳介におけるＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの定量
人間のアトピー性皮膚炎に近いモデルとして、ＮＣ／Ｎｇａマウスを用いた皮膚炎自然発症モデルが報告されている。このモデル動物におけるＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの発現レベルの変化を観察した。
（１）ＮＣ／Ｎｇａマウスを用いたダニ抗原誘発皮膚炎モデルマウスの作製
１．皮膚炎モデル作製物質
皮膚炎を作製するための感作物質としてダニ抽出物−Ｄｐ（ＬＳＬ社、Ｌｏｔ Ｎｏ．７５６１１２）を使用した。ダニ抽出物−Ｄｐはヤケヒョウダニ（チリダニ科）の成虫から抽出した凍結乾燥粉末である。ダニ抽出−Ｄｐは注射用水（大塚製薬工業、Ｌｏｔ Ｎｏ．１Ｆ７６Ｎ）を用いて５ｍｇ／ｍｌ濃度に調整した。
２．被験物質
作製した皮膚炎モデルに対する既存薬の効果を確認するために、プレドニゾロン軟膏０．５％（大正薬品工業、Ｌｏｔ Ｎｏ．Ｐ７１５，Ｐ３１７，ＰＥ１５）を使用した。
３．その他の薬物
ＲＮＡ抽出の前処理にＩＳＯＧＥＮ（和光純薬工業、Ｌｏｔ Ｎｏ．７８００１Ｉ，７８００１Ｈ，８０００１Ｉ）および麻酔薬としてジエチルエーテル（和光純薬工業、Ｌｏｔ Ｎｏ．ＤＭＫ２１３７）を使用した。
［使用動物］
試験には、５週齢のＮＣ／Ｎｇａ雄性マウス（日本チャールス・リバー）を６５匹購入し、６週齢で使用した。マウスは室温２０〜２６℃（実測値２０．０〜２５．１℃）、湿度４０〜７０％（実測値３５．８〜７３．６％）、照明時間１２時間・日（７時〜１９時）に設定した飼育室で飼育し、固形飼料Ｆ−２（船橋農場）と水道水をそれぞれ自由摂取させた。試験には入荷時より６日間以上予備飼育した後、一般状態の良好なものを使用した。
［試験群構成］
試験は、３群構成で行った（非感作対照群、感作対照群、プレドニゾロン投与群）。ダニ抗原投与開始から１４日後、２８日後に各群１０匹ずつを解剖した。
［試験方法］
１．皮膚炎モデルの作製
マウスを１群１０匹として使用した。感作対照群およびプレドニゾロン投与群は、左右の耳介および予め毛刈した背部２箇所（計４箇所）にダニ抗原５μｇ／ｓｉｔｅ（１μｌ／ｓｉｔｅ）を３日間隔で皮内投与した（ダニ抗原投与開始１４日後解剖：計５回投与、ダニ抗原投与開始２８日後解剖：計９回投与）。本実施例の皮膚炎モデルの作製スケジュールを図２に示す。
２．プレドニゾロン軟膏の投与
プレドニゾロン投与群の動物に対して、ダニ抗原投与開始９日後よりプレドニゾロン軟膏を経皮投与した。プレドニゾロン軟膏の投与量は各ダニ抗原投与部位について３０ｍｇ（３０ｍｇ×４箇所、１２０ｍｇ／匹／回）とした。投与スケジュールを図２に示した。
３．耳浮腫の測定
試験期間中全群について、週１回ｄｉａｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｇａｕｇｅを用いて左右の耳の厚さを測定した。測定スケジュールを図２に示した。
４．背部皮膚（ダニ抗原投与部位）の症状観察
試験期間中全群について、週１回ダニ抗原投与部位の症状観察を行った。観察はヒトアトピー性皮膚炎の臨床症状の評価基準を参考にスコア化した。観察スケジュールを図２に示した。
評価項目：▲１▼掻痒症、▲２▼発赤・出血、▲３▼浮腫、▲４▼擦傷・組織欠損、▲５▼乾燥
スコア：０＝無症状、１＝軽度、２＝中等度、３＝高度
それぞれの項目についてスコア化して、その総和を個体のスコアとした。
５．血中Ｔｏｔａｌ ＩｇＥ濃度の測定
ダニ抗原感作２８日後解剖の動物について、ダニ抗原投与前、投与開始１４日（眼窩静脈より採血）および２８日後（腹部大静脈より採血）に採血し、遠心分離した後、血清を−８０℃で保存した。保存した血清はマウスＩｇＥ測定キット（ヤマサＥＩＡ，Ｌｏｔ Ｎｏ．Ｐ１０２：ヤマサ醤油（株））を用いて血中Ｔｏｔａｌ ＩｇＥ濃度を測定した。測定スケジュールを図２に示した。
６．病理組織学的検査
ダニ抗原投与開始１４日に屠殺（エーテル麻酔下に脱血屠殺）してダニ抗原投与部位（左右の耳介および背中の皮膚２箇所）、胸腺、脾臓およびリンパ節を摘出した。耳介および背中の皮膚のそれぞれ１箇所および胸腺、脾臓、リンパ節はＲＮＡ抽出用とした。残り耳介および皮膚（各１箇所）は、１０％中性緩衝ホルマリン液で固定した後、定法に従ってパラフィンブロックを作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色、トルイジンブルー染色およびコンゴーレッド染色を施して光学顕微鏡的に検査した。検査スケジュールを図２に示した。
７．ＲＮＡ抽出の前処理
摘出した耳介および背部皮膚のそれぞれ１個所（約１平方センチメートル）および胸腺、脾臓、リンパ節を１５ｍＬのファルコンチューブに入れた。次いでＩＳＯＧＥＮ ５ｍＬを注入し、ホモジナイザー（ＮＳ−３１０Ｅ；（株）日音医理科器械製作所）を用いて氷冷下にホモジナイズした。ホモジナイズ終了後液体窒素に浸し、凍結した。サンプルはＲＮＡ抽出まで−８０℃で保管した。
［試験結果］
１．耳浮腫の測定
ダニ抗原感作期間中における、皮膚炎モデルマウスの耳浮腫の変化を測定した結果を図３に示す。ダニ抗原投与１４日後解剖（図３上）および２８日後解剖（図３下）のいずれの試験においても、非感作対照群では、耳浮腫は認められなかった。感作対照群では、ダニ抗原投与１週間後より明らかな耳の肥厚を示し、２週間後以降高値を持続した。プレドニゾロン投与群では、ダニ抗原投与１週間後より明らかな耳の肥厚を示し、２週以降の耳浮腫の増加を抑制した。
２．背部皮膚の症状観察
ダニ抗原投与１４日後解剖および２８日後解剖のいずれの試験においても、ダニ抗原投与２週間後より皮膚炎の症状を緩める個体が出現した。
３．血中Ｔｏｔａｌ ＩｇＥ濃度の測定
図４にＴｏｔａｌ ＩｇＥ濃度の測定結果を示す。血中ダニ抗原を投与している感作対照群およびプレドニゾロン投与群では、ダニ抗原投与２週間後より血中Ｔｏｔａｌ ＩｇＥ濃度の上昇が認められた。
４．耳介皮膚の病理組織学的検査
ダニ抗原投与１４日後解剖
非感作対照群では、１／１０例で表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤（主にリンパ球）、浮腫および結合組織の増生が認められたが、いずれも軽度な変化であった。残り９／１０例には異常所見は認められなかった。感作対照群では、表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤（好中球、好酸球、組織球ならびにリンパ球等）、浮腫、結合組織の増生および肥満細胞の脱顆粒が軽度〜中等度で観察された。また６／１０例では潰瘍形成を伴っていた。
プレドニゾロン投与群では、表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤（好中球、好酸球、組織球ならびにリンパ球等）、浮腫、結合組織の増生および肥満細胞の脱顆粒が軽度〜中等度の変化で観察された。なお、６／１０例では潰瘍形成を伴っていた。
ダニ抗原投与２８日後解剖
非感作対照群では、表皮、真皮および皮下組織において異常所見は認められなかった。感作対照群では、表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤（好中球、好酸球、組織球ならびにリンパ球等）、浮腫、結合組織の増生および肥満細胞の脱顆粒等が軽度〜中等度の変化で観察された。さらに、９／１０例では潰瘍形成を伴っていた。
プレドニゾロン投与群では、表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤（好中球、好酸球、組織球ならびにリンパ球等）、浮腫、結合組織の増生および肥満細胞の脱顆粒等が軽度〜中等度の変化で観察され、いずれも潰瘍形成を伴っていた。
５．背部皮膚の病理組織学的検査
ダニ抗原投与１４日後解剖
非感作対照群では、異常所見は認められなかった。感作対照群では、表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤（好中球、好酸球、組織球ならびにリンパ球等）、浮腫、結合組織の増生および肥満細胞の脱顆粒が、観察された。なお、３／１０例は潰瘍形成を伴っていた。
プレドニゾロン投与群では、表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤（好中球、好酸球、組織球ならびにリンパ球等）、浮腫、結合組織の増生および肥満細胞の脱顆粒等が観察された。なお、１／１０例で潰瘍形成を伴っていた。
ダニ抗原投与２８日後解剖
非感作対照群では、異常所見は認められなかった。感作対照群では、ダニ抗原投与１４日後解剖と同程度の変化が認められた。
プレドニゾロン投与群では、ダニ抗原投与１４日後と同程度の変化が観察された。
（２）ＮＣ／Ｎｇａダニ抗原誘発皮膚炎モデルマウス耳介におけるＳＯＣＳ３ ｍＲＮＡ定量上記（１）で作製したＮＣ／Ｎｇａモデルマウスにおける、ＳＯＣＳ３のｍＲＮＡを定量した。ダニ抗原投与１４日後解剖および２８日後に解剖したマウスの耳介をＩＳＯＧＥＮで凍結し、サンプルとした。
耳介組織からのｃＤＮＡ合成
ＩＳＯＧＥＮ凍結サンプルを氷上で融解し、２０Ｇカテラン注射針（テルモ）にてホモジナイズした。得られたホモジネート５ｍＬのうち６００μＬを１．５ｍＬ ｔｕｂｅに分取し、ＩＳＯＧＥＮ製品プロトコルに従い、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡについて、ＲＮｅａｓｙカラム（ＱＵＩＡＧＥＮ）処理を製品プロトコルに従って行った。次いで、ＤＮａｓｅ（ＲＴグレード、ニッポンジーン）処理を製品プロトコルに従って行った。得られたＴｏｔａｌ ＲＮＡの１μｇにつき、Ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒｓ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ），Ｓｕｐｅｒ ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製品プロトコルに従ってｃＤＮＡ合成後、ＲＮａｓｅ Ｈ処理を行った。
ｍＲＮＡ定量
マウス試験群各１０匹分のｃＤＮＡを同濃度ずつ混合した。混合ｃＤＮＡ ５ｎｇにつき、ＡＢＩ７７００を用いてマウスＳＯＣＳ３のｍＲＮＡ定量を行った。定量値について、マウスβ−ａｃｔｉｎの定量値を内部標準として補正を行った。定量実験に用いたプライマーおよびプローブの塩基配列を以下に示す。
マウスＳＯＣＳ３（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ８８３２８）
以上の結果より、ヒト末梢血Ｔ細胞におけるＳＯＣＳ３ ｍＲＮＡ発現が皮膚炎患者で有意に高いことがマウス皮膚炎モデルにおいても確認されたと考えることができる。
産業上の利用の可能性
本発明により、アトピー性皮膚炎患者のＴ細胞において有意に発現レベルが上昇する遺伝子ＳＯＣＳ３が提供された。本発明の指標遺伝子に基づいて、アレルギー性疾患の検査、および治療薬のスクリーニングを行うことが可能となった。
本発明によって提供されたアレルギー疾患関連遺伝子は、アレルゲンの種類に関わらず、簡便にその発現レベルを知ることができる。したがって、アレルギー反応の病態を総合的に把握することができる。
また本発明によるアレルギーの検査方法は、末梢血単核球を試料としてその発現レベルを解析することができるので、患者に対する侵襲性が低い。しかも遺伝子発現解析に関しては、たとえばＥＣＰなどの蛋白質測定と異なって、微量サンプルによる高感度な測定が可能である。遺伝子解析技術は、年々ハイスループット化、低価格化が進行している。したがって本発明によるアレルギーの検査方法は、近い将来、ベッドサイドにおける重要な診断方法となることが期待される。この意味でこれらの病態関連遺伝子の診断的価値は高い。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、健常人、及びアトピー性皮膚炎軽症、中等症、重症患者のＴ細胞におけるＳＯＣＳファミリー（ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ５、ＣＩＳ１）遺伝子の発現レベルを示す図。縦軸は、Ｔ細胞のＲＮＡ １ｎｇ当たりの各ＳＯＣＳのｍＲＮＡのコピー数を、横軸は試料を示す。＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１
図２は、皮膚炎モデルマウスの作製、並びにプレドニゾロン軟膏の投与のスケジュールである。
図３は、ダニ抗原感作期間中における、皮膚炎モデルマウスの耳浮腫の変化を測定した結果である。上は感作１４日後解剖分、下は感作２８日後解剖分の結果である。縦軸は耳浮腫率（％）を、横軸は感作期間（週）を示す（ｎ＝１０，Ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．）。
耳浮腫率（％）＝（感作後の耳の厚さ／感作前の耳の厚さ）
図４は、皮膚炎モデルマウスにおけるＴｏｔａｌ ＩｇＥ濃度の測定結果を示す（ｎ＝１０，Ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．）。縦軸は、血中の総ＩｇＥ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を、横軸は感作期間（週）を示す。各カラムは左から順に非感作対照群、感作対照群、およびプレドニゾロン投与群の測定結果に対応している。
図５は、ＮＣ／Ｎｇａダニ抗原誘発皮膚炎モデルマウス耳介におけるＳＯＣＳ３のｍＲＮＡ発現レベルを定量した結果を示す。縦軸は、ｍＲＮＡの発現レベル（ｃｏｐｙ／ｎｇ ＲＮＡ）、横軸はダニ抗原感作開始後の日数を示す。各カラムは左から順に非感作対照群、感作対照群、およびプレドニゾロン投与群の測定結果に対応している。
Claims (18)
- 次の工程を含む、アレルギー性疾患の検査方法であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３である方法。
（ａ）被検者の生体試料における、指標遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｂ）該発現レベルを、健常者の生体試料における該指標遺伝子の発現レベルと比較する工程
（ｃ）該被検者の生体試料における該指標遺伝子の発現レベルの有意な上昇が観察された場合に被検者がアレルギー性疾患を有すると判定する工程 - アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎である、請求項１に記載の検査方法。
- 遺伝子の発現レベルを、ｃＤＮＡのＰＣＲによって測定する請求項１に記載の検査方法。
- 遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する請求項１に記載の検査方法。
- 生体試料が末梢血Ｔ細胞を含む試料である請求項１に記載の方法。
- ＳＯＣＳ３遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
- ＳＯＣＳ３遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
- 次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程 - 細胞がＴ細胞である請求項８に記載の方法。
- 次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）被験動物に候補化合物を投与する工程、
（２）被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現強度を測定する工程、および
（３）候補化合物を投与しない対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程 - 次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物と接触させない対照と比較して前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程 - 次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補物質を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物と接触させない対照と比較して前記蛋白質の活性を低下させる化合物を選択する工程 - 請求項８、１０、１１、１２のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、アレルギー性疾患の治療薬。
- 指標遺伝子のセンス鎖の塩基配列の連続する少なくとも１５塩基の配列に対して相補的な配列を含むアンチセンスＤＮＡを主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３と機能的に同等な遺伝子である治療薬。
- 指標遺伝子によってコードされる蛋白質に結合する抗体を主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３遺伝子またはＳＯＣＳ３と機能的に同等な遺伝子である治療薬。
- 指標遺伝子のＴ細胞における発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物のアレルギー性疾患のモデル動物としての使用であって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３と機能的に同等な遺伝子である使用。
- 指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドと、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３と機能的に同等な遺伝子であるキット。
- 指標遺伝子によってコードされるアミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体と、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がＳＯＣＳ３またはＳＯＣＳ３と機能的に同等な遺伝子であるキット。
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