CN107208087A

CN107208087A - 编码hnp‑1或hnp‑2或hnp‑3的dna质粒、细菌生产者、镇痛剂(变体)

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Publication number: CN107208087A
Application number: CN201580072724.XA
Authority: CN
Inventors: I·V·杜克浩林夫; A·I·奥尔洛夫
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-11-10
Filing date: 2015-11-10
Publication date: 2017-09-26
Also published as: EA201790929A1; US20180057837A1; IL252730B; EA038673B1; RU2014145169A; BR112017009607A2; HK1243732A1; KR20170077252A; EP3219798B1; EP3219798A4; IL252730A0; EP3219798A1; WO2016076761A1; RU2597789C2; JP2017535288A

Abstract

本发明(变体)涉及医学、药学、生物技术、分子生物学、遗传工程领域，并且可以被用于镇痛。提出的用于在哺乳动物细胞中瞬时表达的质粒DNA由框架组成，所述框架包含原核和真核元件，和编码人α防御素HNP‑1或HNP‑2或HNP‑3的多核苷酸(变体)。另外提出的是这样的DNA质粒的生产者，所述生产者基于细菌细胞(变体)，以及基于其的应用于哺乳动物，并且特别是人的镇痛剂(变体)。来自使用本发明的变体的技术结果表现在拓宽镇痛剂的谱系、增加镇痛的持续时间、增加镇痛的安全性、和简化和降低生产镇痛剂的成本。

Description

编码HNP-1或HNP-2或HNP-3的DNA质粒、细菌生产者、镇痛剂 (变体)

本发明(实施方式)涉及医学、药学、生物技术、分子生物学、遗传工程领域，并且可以被用于镇痛。

重要的是认识到疼痛不仅仅是隐晦的疾病或损伤过程的指示，其是独立的问题，对个体和整个社会造成重大危害。为了提高生活质量，疼痛缓解因此应当是治疗目标。治疗疼痛的有希望的途径——其在当前继续执行，是识别靶向的(针对特定分子)药理学疗法的机制和实施[WHO疼痛管理规范指南(Normative Guidelines on Pain Management)，日内瓦，2007年6月]。

肽酰胺类[US4459225(A)]、苯腙衍生物已知被用作抗炎剂或镇痛剂[EP0952159(B1)]，合成肽酰胺类——用于预防和治疗疼痛[RU2500685C2]。已知使用肽类家族，其具备镇痛活性，通式为A-B-Tyr-Pro(DPro、dHPro、DdHPro、DLdhPro、Hyp)-C-X[WO2008020778(A1)]，已知使用衍生的肽，其被皮下或口服施用，具备镇痛或抗伤害活性[US2008009448(A1)]。

化学合成的肽类和其衍生物的缺点是获得期望的化合物与对映体的混合物的能力，其可能导致不可预测的结果。对映体的概念在药物学中起到重要的作用，这是因为药物物质的不同对映体通常具有不同的生物学活性。使用用于获得肽分子的现有系统允许获得天然结构的分子——均质混合物。

已知包含同源调节子或异源DNA的重组质粒用于细菌表达，最少可以编码具有镇痛作用的多肽[SK278170(B6)]。已知在大肠杆菌(Escherichia coli)细胞中合成的包含深的大基因组(macrogenomic)基因簇的吲哚与新结构的单偶联[CN102477436(A)]。已知来自海葵——紫点海葵(Heteractis crispa)——的多肽，其具有很强的镇痛作用[RU2368621C1、RU2404245C1]；和其制备方法[RU2415866C1]。已知具有大量的桥接结(bridging tie)，分离自纳米比亚马杜拉放线菌属(ACTINOMADURA NAMIBIENSIS)的肽类，其用于治疗由炎症引起的神经性疼痛[RU2498995C2]。但是，由于这些分子源自与人远缘的生物体的事实，在将它们在人中使用之前，其作用必须被非常仔细地研究。

基于食鱼螺毒素(蜗牛毒(snail poison))的杂合蛋白MVóA和Trx是已知的，其可以被用于制备疼痛药物，用于晚期的癌症和AIDS、手术后疼痛、烧伤等[CN1487085(A)]。使用杆状病毒和昆虫细胞或昆虫获得食鱼螺毒素的方法是已知的[CN102876683(A)]。已知具有ω-芋螺肽(conopeptide)的镇痛和改善的阿片剂镇痛引入——TVIA(SNX-185)或MVIIA(SNX-111)引入——的方法[EP0625162(B1)]，使用α食鱼螺毒素[WO2014023129(A1)、CN102286079(B)、CN103374066(A)]、Lt7b食鱼螺毒素[CN102628048(A)]的镇痛方法。已知使用ω-芋螺肽用于生产抑制神经性疼痛的进展的药物[EP1336409(B1)]。已知蝎属多肽具有镇痛和抗肿瘤活性[US7592309(B2)、CN101591668(A)]，和其应用方法[US7592309(B2)和CN101591668(A)]，蜈蚣属少棘蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans)，一种-mu-SLPTX-Ssm6a-，具有镇痛作用[CN102977201(A)]。已知具有镇痛作用的蜘蛛智利塔兰图蛛(Grammostola spatulata)的毒液的肽类[US5776896(A)]、中国狼蛛的肽HWAP-I[US6670329(B2)]。来自蛇毒液的肽分子和其衍生物、同系物、类似物和模拟物已知单独或与其它镇痛分子组合能够诱导镇痛或减轻疼痛[US6613745(B1)、US7902152(B2)]，并且也已知海蛇平颏海蛇(Lapemis hardwickii)的缩短的(shortened)神经毒素用于镇痛[US7294697(B2)]。

那组发明的缺点是使用毒素，其即使是药学上纯的，仍然存在风险——如果超剂量最高会导致死亡。

已知使用新的多肽用于镇痛——人G蛋白的亚基9.01[CN1345751(A)]、亚基12.65[WO0212310(A1)]、亚基9.46[WO0204504(A1)]、亚基11.44[CN1352195(A)]。已知基于G蛋白受体的多肽类，HFIAO41[US2001016336(A1)]、HLYAZ61[EP0837128(A2)]、HUVCT36[US5912335(A)]、H7TBA62[US5955309(A)]、org10[US2003162945(A1)]、org11[WO0200725(A2)]，并且其也属于IGS4家族[AU779993(B2)、US6998255(B1)]。已知由爱泼斯坦-巴尔EBI3诱导的剪接的G蛋白受体的变体[US5874252(A)]。

通过施用神经生长因子(抗体)的拮抗剂治疗由骨癌、骨关节炎、手术后疼痛引起的疼痛的方法是已知的[RU2389509C2、RU2429013、RU2338555C2]，与该分子特异性结合的配偶体是已知的[RU2406728C2]。已知能够抑制TrkA受体和NGF之间的结合的分子可以用作具有延长作用的镇痛剂[RU2427387C2]。针对神经生长因子的抗体已知具有增加的体内稳定性[RU2011149263A]、对NGF的高亲和力[RU2473564C2]，并且针对神经组织的生长因子的人源化抗体的剂型是已知的[RU2427387C2]。

治疗如下的已知方法：

-疼痛和炎症-使用肽[RU2011105280A]，通过分离CRMP-2和CaV2.2之间的相互作用，导致不存在N型钙通道(CaV2.2)的活化[WO2012009075(A1)]，并且通过分离LI-CAM、锚蛋白和电压依赖性钙通道的相互作用，治疗轴突的损伤，抑制神经递质释放和疼痛传递，并且阻断神经元中的钙泵[US7737250(B2)]，用于镇痛的Nav1.7钠通道的肽毒素的类似物是已知的[US2013296247(A1)]。

-神经元组织中的疼痛和炎症，使用IL-31的拮抗剂，单克隆人源化抗体或嵌合抗体[RU2440130C2]，前列腺酸性磷酸酶(“PAP”)或其活性变体、片段或衍生物[WO2009064497(A1)]，

-神经性疼痛，使用针对CCR2的抗体[RU2011110169A]，神经性疼痛借助于衍生自鞘脂激活蛋白原(prosaposin)的肽类[RU2007119313A]，包含氨基酸序列Thr-R1-Lue-Ile-Asp-Asn-Asn-Ala-Thr-Glu-Glu-Ile-Leu-Tyr的肽，其中R1是D-丙氨酸，影响神经变性紊乱或髓鞘形成的宽度[RU2266129C2]，具有与调节结构域相关联的锌指结构域的蛋白质，其可以活化或抑制与神经性疼痛相关联的靶基因的表达(VR1、NaV1.8和TrkA)[US8466267(B2)]。

-神经性或中枢性敏化疼痛，使用分离的基因的序列，响应于神经性或中枢性敏化疼痛的机械地不同的第一和第二模型，其在哺乳动物的脊髓中被调控[US2003108906(A1)、US2003134301(A1)、US2003138803(A1)、US2004058326(A1)]，

-慢性疼痛，借助于TORC多肽[RU98118091A]，histogran和其化学稳定的类似物[CA2219437(A1)]，线性的、环状的histogranic肽类和基于它们的假肽类[US6566327(B1)]，包含IL-10和IL-4的杂合蛋白[WO2013070076(A1)]，基于IL-10的多肽类[US7261882(B2)]，

-急性和慢性疼痛(不同形式的疼痛)，使用IL-13结合蛋白[RU2472807C2]、IL-12/p40结合蛋白[RU2012124438A]、IL-12/p41结合蛋白[RU2008103312A]、IL-17结合蛋白[RU2011140335A]、前列腺素E2结合蛋白[RU2011104228A]、具有双可变结构域的免疫球蛋白[RU2515108C2]、具有针对前列腺素E2的双可变结构域的免疫球蛋白[RU2011104348A]、借助于EE3家族蛋白与慢性或急性疼痛斗争[RU2004114989A]，

-内脏疼痛，使用增加受体的鸟苷酸环化酶活性的多肽[RU2433133(C2)]，

-神经性疼痛、骨关节炎疼痛、炎性疼痛，使用IL-1结合蛋白[RU2012154210 A]；关节炎和其它TNF-a介导的紊乱或病理生理学机制的炎性过程，具体而言各种形式的疼痛，借助于稳定的和可溶的抗体-TNF-a的抑制剂[RU2415151C2]；关节炎疼痛，借助于人源化抗体-CGRP的拮抗剂[RU2467765C2]；由至少一种抗癌剂诱导的疼痛，借助于至少一种肉毒杆菌毒素或基于它的肽[RU2483747C2]，包括连同阿片样物质衍生物[RU2434637C2]；疼痛，借助于与Myc蛋白相关联的PAM[RU2345785C2]，借助于甘丙肽受体样GPCR多肽[US2004053244(A1)、US2003073115(A1)、WO0168843(A1)]、kontulakin-G和其去糖基化形式[US6696408(B1)、US6525021(B1)]，借助于蛋白激酶C的肽抑制剂[US7939493(B2)]；内脏疼痛，通过施用针对与降钙素基因相关联的肽的抗体-拮抗剂[RU2012106468 A]，

-腹部疼痛，借助于肽，优选地来自鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)[RU2011136454 A]。

已知使用TRPA1拮抗的抗体，优选地单克隆抗体，减轻生理学和病理生理学状况(例如，在异常性疼痛和痛觉过敏中)中的疼痛敏感性，尤其是与经由TRPA1的机械敏感性相关联或由其介导的疼痛感的方法[RU2430750 C2]。镇痛剂/抗炎剂已知选自下列种类：受体拮抗剂、受体激动剂和酶抑制剂，每个种类通过作用于疼痛和炎症抑制的不同分子机制起作用：(4)舒缓激肽(bradikinin)受体拮抗剂(肽类)、降钙素基因介导肽(CGRP)受体的拮抗剂(α-CGRP-(8-37))，(8)白介素受体的拮抗剂(Lys-D-Pro-Thr)[RU2180852 C2]、β-动物纤维素(BTC)蛋白的拮抗剂[JP2000198744(A)]。已知如此方法：使用促肾上腺皮质素释放因子(CRF 2R)受体的拮抗剂降低CRF2R调制的紊乱的疼痛[RU2385878C2]；借助于下列治疗疼痛：具有苯胺(amilin)性质的肽[RU2385878C2]，NOP肽激动剂[RU2012106820A]，包含血管活性肠肽(VIP)——其在CNS中递送——的片段11-28的两个或更多个氨基酸残基的肽类[WO9104041(A1)]，基于降钙素的衍生的肽[US5446026A]，人多肽CGRP-RCF[US5710024(A)、WO9803534(A1)]，多肽类——人源化CGRP受体，包括用于治疗头痛、慢性紧张性头痛、周期性复发的严重的阵发性头痛，预防偏头痛[US7193070(B2)]，肽类——人11cb的新剪接的选项(option)[US6033872(A)]，后面蛋白的激动剂和拮抗剂[WO9928492(A1)]，具有七个跨膜结构的受体[US5824504(A)、US6277960(B1)、US6277977(B1)、US5955308(A)、US6221627(B1)、US2002106766(A1)、US5994098(A)、US6174994(B1)、US6037146(A)、US5874243(A)]，具有磷酸二酯酶活性的肽[WO0166716(A1)]，多肽类——人蛋白激酶hYAK3和HOACF72[分别地，EP0870825(B1)和US5972606(A)]。

基于脑神经营养因子的杂合蛋白已知使用原核的可溶蛋白表达系统产生[CN1978466(B)、WO9942480(A1)]。基于2型神经降压素的受体的多肽类已知用于治疗疼痛[US6008050(A)]。神经降压素或其类似物与治疗肽的缀合物是已知的，其可以被用于引起降温或镇痛[WO2010063122(A1)]。α-促黑激素的构象优化的类似物是已知的，其对CNS具有特异性作用[US4649191(A)]。与SNARE类似的用于调制神经递质释放的合成肽是已知的[KR20090041066(A)]。

肽类已知具有多种功能，包括镇痛，比如具有许多桥接的肽类——其提取自纳米比亚马杜拉放线菌属[RU2010144778A]，结构DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD的肽[RU2508296C2]，嘌呤能受体PT1的肽调制剂[RU2422459C1]，作为血管肽酶抑制剂的在N末端氨基酸残基上含有2-硫代酰基的二肽类[RU2298559C2]，胸腺-特异性蛋白[RU2398776C2]，改善钙代谢的多肽[JPH03178993(A)]以及基于肽类和与肽相关的化合物的具有高度渗透性的前体药物组合物[RU2011149796 A]。

在脊椎动物包括人的治疗性处理中，已知使用神经元去甲肾上腺素转运蛋白的选择性抑制剂和镇痛剂的协同组合用于镇痛或用于预防或缓解疼痛的镇痛的组合途径[US8188048 B2]。已知强啡肽的肽类-类似物当与麻醉剂或镇痛剂共同施用时，加强后者，其包括脑啡肽和β-内啡肽类似物[EP0096592B1]。

利用口服和肠胃外施用组合物，借助于与载体基团结合的肽Tyr-Gly-Gly-Phe-Met，从而形成在治疗或缓解疼痛中使用的药物的前体来增加物质的药理学活性的方法是已知的[AU2002228260(B2)]。

使用一种高效的药剂用于镇痛，其生产简单且廉价，是更加成本有效的选择。

防御素肽Hnp-1的用途是已知的，其单独地或与神经肽M组合，作为用于预防和/或治疗包括周围血管疾病的治疗剂，所述周围血管疾病包括麻醉、扩散性疼痛、灼痛(烧痛)[WO 2009/043461 A1]。

包括抗体在内的不被认为是免疫应答诱导物的蛋白质分子性质的用途可以通过这些作用复杂化，其可能导致副作用，例如与自体抗体的形成相关联。

小干扰RNA和短发夹RNA的用途是已知的，用于N-甲基-D-天冬氨酸皮下受体的NR1亚基的基因敲落以降低炎性疼痛或无法忍受的慢性疼痛，尤其是慢性临床疼痛和由烧伤引起的疼痛[US8372817(B2)、US8575330(B2)、US8361985(B2)]。RNA干扰剂已知用于治疗慢性疼痛[WO2013126963(A1)]。但是，RNA的制品在身体外被快速破坏，需要特殊的储存条件，其使得基于RNA的药物的工业适用性成为问题。

长期镇痛的方法是已知的，其中患者注射有肌源细胞，在所述肌源细胞中从相应DNA合成肽，其活化阿片样物质受体或介导物质P与受体的结合[US7166279(B2)]。但是，该方法的实施是相当复杂的并且与许多风险相关联。

已知治疗抑郁和疼痛的方法，药剂可以是蛋白质、RNA或DNA[WO2013177484(A1)]。已知用于治疗疼痛的慢病毒载体——其包含狂犬病病毒的G蛋白[EP1425403(B1)]、编码IL-24的腺病毒[CN101518655(A)]，包括用于癌症时的疼痛缓解。已知制癌蛋白M或其同系物，其合成自用于转移基因的载体：慢病毒、逆转录病毒、仙台病毒、腺病毒和腺伴随病毒，包括用于治疗疼痛[JP4803789(B2)]。已知使用kometin——多肽——治疗异常性疼痛、痛觉增敏、自发性疼痛和幻痛，其可以作为多肽递送，或通过引入用于表达kometin的表达载体、细胞系——其转化或转染有蛋白质和包含细胞的被膜[WO2013034157(A1)]。病毒载体具有缺点，包括如下事实：它们是昂贵的并且可能引起妨碍载体重复施用的炎性反应。病毒载体可以复制，其降低对靶蛋白表达的控制程度，其又不总是期望的和可适用的，特别是关于镇痛。

已知基于pVAX1载体的重组DNA疫苗——其靶向肿瘤，包括用于治疗肿瘤学中的疼痛，其包含编码环氧合酶-2(COX-2)的基因、鼠泛素Mubi以及DNA的ISS免疫刺激序列(pVAX1-mUbi-ISS-COX-2-ISS)[CN101648011(A)]。但是，该设计的目的是诱导免疫应答，因为引入导致和增加免疫原性的元件，是细胞毒性的。已知如此药物组合物，其包含载体——包括质粒DNA，和药学上可接受的赋形剂或佐剂，以减轻、预防或治疗疼痛，该载体包含含有调制VR1受体表达的至少一个区域的核苷酸序列[US2006154886(A1)]。在该情况下，镇痛是经由阻断与离子通道相关联的受体——一种非特异性阳离子导体。携带基因——在哺乳动物细胞中防御素由该基因合成——的质粒DNA作为诱导镇痛的手段的用途也将有助于使身体中病原体发展的可能性最小化：通常当任何病因学的疼痛时，健康状态恶化，并且身体抵抗感染的能力减弱，并且结果，在例如外科手术之后，可以开抗生素的处方，并且天然抗菌肽的使用将使得结合镇痛和保护性作用，结果，可能拒绝服用抗生素。

本发明的紧密类似物是在专利CN101648011(A)和发明申请US2006154886(A1)中描述的发明，其公开了质粒DNA形式的镇痛剂。

示出了当肌肉内注射DNA时，表达载体由肌肉细胞吸收，并且进行在输入载体中的编码基因的表达[J.A.Wolff et al.,Science 247,1465(1990)；G.Ascadi et al.,Nature352,815(1991)]。示出了质粒被维持为游离基因并且不复制。也已经证明在肌肉内注射之后，在大鼠、鱼和灵长类的骨骼肌中和大鼠的心肌中的恒定表达[H.Lin et al,Circulation 82,2217(1990)；R.N.Kitsis et al,Proc.Natl Acad.Sci.(USA)88,4138(1991)；E.Hansen et.al,FEBS Lett.290,73(1991)；S.Jiao et al.,Hum.Gene Therapy3,21(1992)；J.A.Wolff et al,Human Mol.Genet.1,363(1992)]。将质粒DNA递送入各种组织的细胞的其它技术的使用是已知的，例如，无针注射器，其使得能够递送入活体动物的各种组织的细胞[Furth et al.,Analytical Biochemistry,205,365-368,(1992)]。

示出了正常肌纤维不表达MHC抗原，但是在伴随感染的炎症期间，或者在干扰素γ存在的情况下，肌纤维能够产生与第一类MHC或甚至第二类复合的抗原[MECKERT,P.C,HONTEBEYRIE-JOSKOWICZ,M.,CHAMBO,J.,LEVIN,M.,and LAGUENS,R.P.(1991).Trypanosoma cruzi:Aberrant expression of class II major histocompatibilitycomplex molecules in skeletal and heart muscle cells of chronically infectedmice.Exp.Parasitol.72,8-14；Hohlfeld and ENGEL,A.G.(1984)The immunobiology ofmuscle.Immunol.Today 15,269-274.；MANTEGAZZA,R.&BERNASCONI,P.(1994).Cellularaspects of myositis.Curr.Opin.Rheumatol.6,568-574,Hartikka J,Sawdey M,Cornefert-Jensen F,Margalith M,Barnhart K,Nolasco M,Vahlsing HL,Meek J,Marquet M,Hobart P,Norman J,Manthorpe M.An improved plasmid DNA expressionvector for direct injection into skeletal muscle.Hum Gene Ther.1996 Jun 20；7(10):1205-17]，在这一点上，引入质粒DNA——其中对肌肉的伤害最小化——是优选的。

示出了即使在对实验室动物的试验中是免疫原性的，但是在人中，基于质粒DNA的制剂不是免疫原性的[Saade F,Petrovsky N.Technologies for enhanced efficacy ofDNA vaccines.Expert Rev Vaccines.2012 Feb；11(2):189-209.doi:10.1586/erv.11.188]。研究者也没能发现在小鼠或兔中重复注射DNA之后病理学改变的证据[Parker SE,Borellini F,Wenk ML,et al.Plasmid DNA malaria vaccine:tissuedistribution and safety studies in mice and rabbits.Hum.Gene Ther.1999；10(5):741-758.]。在2007年，DNA疫苗的美国FDA指南中得出结论：临床前研究院不需要评估对自身免疫疾病的作用。

质粒DNA应当包含对于其维持和使用生物体必需的元件，连同适合的调控序列。调控序列是如此核苷酸序列：其可以影响转录和/或翻译的水平下的基因表达，以及确保质粒DNA功能的存在和维持的机制。

对于原核系统，复制起点和报告基因是必需的。质粒DNA的细菌元件没有消极地影响哺乳动物细胞中的表达，并且引起由于使用质粒DNA引起的副作用。在文献中，存在如下证据：使用对氨苄青霉素具有抗性的基因作为报告基因可能是不期望的，这与患者中对氨苄青霉素的反应的发展有关，但是作者考虑这种作用与质粒DNA的低品质的纯化相关联，而不是由于元件自身。

用于哺乳动物的质粒的必需元件是启动子、mRNA前导序列、终止序列。

启动子是质粒的重要组分，其触发感兴趣的基因的表达。质粒DNA——药物的组分——的经典启动子是人CMV/即刻早期或CMV-鸡-β肌动蛋白(CAGG)启动子。CMV启动子被用于大多数DNA疫苗，因为它们在广泛范围的哺乳动物组织中介导高水平的组成型表达[Manthorpe M,Cornefert-Jensen F,Hartikka J,et al.Gene therapy byintramuscular injection of plasmid DNA:studies on firefly luciferase geneexpression in mice.Hum.Gene Ther.1993；4(4):419-431]并且不抑制下游阅读。当改变CMV启动子时——例如通过在巨细胞病毒启动子的下游包含HTLV-1R-U5或使用嵌合SV40-CMV启动子，观察到表达水平的增加[Williams JA,Carnes AE,Hodgson CP.Plasmid DNAvaccine vector design:impact on efficacy,safety and upstreamproduction.Biotechnol.Adv.2009；27(4):353-370]。组织特异性宿主启动子充当CMV启动子的替代物，它们使得避免抗原在不适当的组织中的组成型表达——其通常导致较低的免疫原性[Cazeaux N,Bennasser Y,Vidal PL,Li Z,Paulin D,Bahraoui E.Comparativestudy of immune responses induced after immunization with plasmids encodingthe HIV-1 Nef protein under the control of the CMV-IE or the muscle-specificdesmin promoter.Vaccine.2002；20(27-28):3322-3331]。

前导mRNA序列也起很大的作用。直接地在起始密码子ATG之前的Kozak序列使得表达增加[Kozak M.Recognition of AUG and alternative initiator codons isaugmented by G in position+4 but is not generally affected by the nucleotidesin positions+5 and+6.EMBO J.1997；16(9):2482-2492]。在启动子的下游，在质粒中存在内含子可以增加mRNA的稳定性并且增强基因表达。

使用物种特异性密码子使得增加基因的表达[Frelin L,Ahlen G,Alheim M,etal.Codon optimization and mRNA amplification effectively enhances theimmunogenicity of the hepatitis C virus nonstructural 3/4A gene.GeneTher.2004；11(6):522-533]。

通过改变终止序列可以影响基因表达，其需要保留mRNA的稳定性，用于合适的转录终止和从细胞核输出mRNA，包括其缩短。许多现今的DNA疫苗使用牛生长激素的转录终止子的序列[Montgomery DL,Shiver JW,Leander KR,et al.Heterologous and homologousprotection against influenza A by DNA vaccination:optimization of DNAvectors.DNA Cell Biol.1993；12(9):777-783]。为了转录物的稳定，需要聚腺苷酸化(polyA)。改变polyA序列可以导致基因表达水平的增加[Norman JA,Hobart P,ManthorpeM,Felgner P,Wheeler C.Development of improved vectors for DNA-basedimmunization and other gene therapy applications.Vaccine.1997；15(8):801-803]。在pVAX1(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，牛生长激素的终止区包含同型嘌呤片段，其对核酸酶是敏感的。示出了可选的polyA序列可以显著地提高质粒对核酸酶的稳定性[Azzoni AR,Ribeiro SC,Monteiro GA,Prazeres DMF.The impact of polyadenylation signals onplasmid nucleases-resistance and transgene expression.J Gene Med.2007；9:392-402]。两种终止密码子的引入使得增加转录终止子的效率。

用于实施功能的最佳质粒设计应当组合“细菌”和“真核”元件与适合的调控序列以确保在生产过程期间高数目的拷贝/细胞和哺乳动物中高水平的表达[Saade F,Petrovsky N.Technologies for enhanced efficacy of DNA vaccines.Expert RevVaccines.2012 Feb；11(2):189-209.doi:10.1586/erv.11.188]。

为了制造根据本发明的镇痛剂，可能使用质粒DNA，最低限度地，标准地用于哺乳动物包括人中的基因递送和表达，并且还对上述参数进行优化，包括在Williams等，2009中详细描述的那些[Williams JA,Carnes AE,Hodgson CP.Plasmid DNA vaccine vectordesign:impact on efficacy,safety and upstream production.Biotechnol.Adv.2009；27(4):353-370]。在FDA指南(2007)中，陈述了对于通过将新基因克隆入质粒载体产生的DNA疫苗，可以搁置(waive)在将物质引入体内之后该物质的生物分布的研究，这是由于可接受的生物分布和整合概况先前被记录了。在WHO指南(2007)中，陈述了如果不存在利用几乎相同的或类似的产品的相当多的工作经验，则需要对生物学分布和保存的研究。在EMEA指南(2006)中，陈述了利用载体系统的工作经验将使得对临床前研究进行优化和集中在临床前研究。借助于具有不同克隆基因的DNA载体的安全性研究示出了类似的生物分布[Sheets RL,Stein J,Manetz TS,Duffy C,Nason M,Andrews C,Kong WP,Nabel GJ GomezPL.Biodistribution of DNA plasmid vaccines against HIV-1,Ebola,Severe AcuteRespiratory Syndrome,or West Nile virus is similar,without integration,despite differing plasmid backbones or gene inserts.Sheets RL,Stein J,ManetzTS,Duffy C,Nason M,Andrews C,Kong WP,Nabel GJ Gomez PL.Toxicol Sci.2006 Jun；91(2):610-9.Epub 2006 Mar 28.]和毒理学[Sheets RL,Stein J,Manetz TS,Andrews C,Bailer R,Rathmann J,Gomez PL.Toxicological safety evaluation of DNA plasmidvaccines against HIV-1,Ebola,Severe Acute Respiratory Syndrome,or West Nilevirus is similar despite differing plasmid backbones or gene-inserts.ToxicolSci.2006 Jun；91(2):620-30.Epub 2006 Mar 28]。对于用于除了人之外的哺乳动物中的质粒DNA，要求是较不严格的，因此可能使用更广泛范围的质粒。

对于预期用于人用途的DNA，可能有用的是在药学上可接受的载体或缓冲溶液中具有最终DNA产物。药学上可接受的载体或缓冲溶液在本领域中是已知的并且包括在多个文本比如Remington's Pharmaceutical Sciences中描述的那些。

本发明的实施方式的原型是在公布为WO 2009/043461 A1:application ofdefensin HNP-1 for the treatment including pain的专利申请中公开的发明。

防御素组成了低分子量(3-5-kDa)的通过数个(通常三个)二硫键稳定的富含半胱氨酸的阳离子肽类的大家族[Ganz,T.2002.Immunology:Versatile defensins.Science298:977-979,Lehrer,R.I.and Ganz,T.2002.Defensins of vertebrateanimals.Curr.Opin.Immunol.14:96-102.]，其能够杀死广谱的病原体，包括多种细菌、真菌和有包膜病毒。在人中，该家族由防御素的α-亚家族(HNP)和β-亚家族(hBD)代表。α-防御素主要地在中性粒细胞和帕内特细胞中表现。HNP-1和HNP-3包含总共30个氨基酸残基，除了在位置1中用丙氨酸置换天冬酰胺之外，这些肽是彼此相同的。HNP-2是HNP-1和HNP-3的蛋白水解产物，包含29个氨基酸残基(失去自N末端的第一氨基酸)。二硫键的存在确保挽救防御素分子对众多白细胞和微生物蛋白酶的稳定性，并且挽救炎症和组织破坏中心的抗菌性[O.Levy Antimicrobial proteins and peptides:anti-infective molecules ofmammalian leukocytes.J.of Leukocyte Biology.2004；76:909-926]。以正确的空间结构获得这些分子是十分挑战性的。

编码防御素的基因在8号染色体上的基因座P22-23处形成簇。HNP 1-3由两种基因HDEFA1和HDEFA3编码。每种防御素基因包含编码前肽原(prepropeptide)的数种外显子。

首先，防御素以前体的形式合成，作为前肽原，其长度是94个氨基酸残基。前肽原包含信号片段(平均19个氨基酸残基)、阴离子片段(平均45个氨基酸残基)和“成熟”肽。在来自前肽原的内质网中蛋白酶切割的结果中，进行信号片段的去除和前防御素(prodefensin)形成(平均75个氨基酸残基)。在成熟中性粒细胞颗粒体中发生随后的成熟(45个氨基酸残基的切割)。α-防御素也在NK细胞、B淋巴细胞、γδT淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞和上皮细胞中发现[A.S.Budikhina,B.V.Pinegin.Defensins-multifunctionalcationic peptides of the person.Immunopathology,Allergology,Infectology.2008,No.2:31-40]。本发明的作者首先证明了引入携带编码HNP-1/HNP-2/HNP-3的基因的质粒DNA导致镇痛，而且，在这种情况下，观察到β-内啡肽在血清中的水平增加。

类似物和原型的缺点就在它们的描述之后示出。要求保护的发明(实施方式)不含有这些缺点。

来自使用本发明的实施方式的技术结果首先表现在扩展镇痛剂的谱系。当类似物具有差的耐受性或不耐受时，代表性的提议的镇痛剂的形式(version)将允许镇痛，由于此，患者将具有采取他不能或不想在没有镇痛的情况下进行的行动的机会，例如，以敢于需要的程序，以及改善生活质量，例如，与不使用镇痛剂相比将获得较少的不适，或者将能够缓解急性或慢性疼痛。该技术结果通过使用根据本发明(实施方式)的镇痛剂实现。

此外，技术结果是增加镇痛的持续时间并且通过下述实现：质粒DNA使用，在引入体内之后，从该质粒DNA合成α人防御素HNP-1/HNP-2/HNP-3；并且通过事实：编码人防御素的核苷酸序列包含导致mRNA稳定性的元件，并且因此增加mRNA的半衰期，结果，从mRNA的一个分子的蛋白质合成被进行更多次，并且还结果，合成的蛋白质的量增加；并且也通过事实：人α防御素的核苷酸序列被密码子优化用于在哺乳动物中表达，结果，蛋白质合成是更加强的。在付诸实践期间，这将使得显著地降低引入的质粒DNA的量(10-50倍)——与在基因疗法中在本土(blighty)和世界实践中当前使用的剂量相比。

此外，技术结果是增加镇痛的安全性。该技术结果通过如下事实实现：活性成分不是可以形成抗体的蛋白质——当使用原始生物体的分子时，其可以引起严重的副作用，而是质粒DNA，其作为游离基因存在并且不整合入基因组——人蛋白从基因组合成并且然后被分泌，并且结果，无免疫原性的、安全的使用人防御素用于镇痛被进行。该技术结果也通过如下事实实现：在生物体中由质粒DNA合成的蛋白质经历自然的翻译后加工，并且由于细胞分子伴侣，蛋白质的正确折叠也被确保。这些修饰在蛋白质的生产期间是难以实现的，其可以显著地影响许多其功能。该技术结果也由于如下事实实现：活性物质的新陈代谢和分解代谢的天然机制被使用，而不形成有毒产物，这是由于质粒构建体和编码的蛋白质的性质，以及形成的蛋白质与内源性类似物的同一性。该技术结果也通过如下事实实现：质粒DNA在引入哺乳动物生物体之后不复制，其使得控制合成的蛋白质的量，并且因此控制镇痛。该技术结果也通过在质粒DNA中存在调控序列如沉默基因和/或绝缘子而实现，在本发明的一个实施方式中，其也允许控制合成的蛋白质的量，并且基本上，控制蛋白质的合成，并且因此分别地控制镇痛：如果必要，在短时期中存在停止或降低基因表达的机会。在后者变体中，也可能在必要时进行组织特异性表达。

技术结果也是通过避免生产的复杂性和体外蛋白制品纯化的过程来简化和降低生产镇痛剂的成本，这是由于蛋白合成在体内发生的事实。DNA制品的生产、纯化和储存与蛋白质制品相比是更加经济上有益的，这是因为前者是更稳定的，它们可以以大数量和以较低的成本生产。

示出了血浆中β-内啡肽的浓度的改变直接地依赖于疼痛综合征的类型、其强度和镇痛功效，其可以充当用于评估镇痛效力的标准[Beta-endorphin-an analgesiceffectiveness marker for acute pain and chronic pain syndrome in cancerPatients/ZV Pavlova[and others]//Problems of Clinical Medicine.-2007.-N1.-P.36-40.-ISSN 1817-8359]。当本发明的镇痛剂被施用时，观察到血清β-内啡肽水平的增加(图3)。

根据时间特征，两种类型的疼痛可以被区分：

-急性疼痛-与已经引起疼痛的损伤紧密地结合的新的、最近的疼痛，并且通常来说，是疾病的症状，当损伤消除时其消失[Eddy N.B.,Leimbach D.J.//PharmacolExpTher.-Mar；107(3):385-93.-1953](包括手术前和手术后的、受伤后的、烧伤、分娩期间的急性疼痛、由脊髓创伤引起的疼痛、急性头痛、HIV/AIDS中的疼痛、镰状细胞危象、三叉神经痛、胰腺炎和消化道中的其它疼痛、以及心肌梗死和其它主要的心脏事件、介入性疼痛(在诊断和治疗程序期间)、慢性疼痛中急性[WHO Normative Guidelines onPain Management,Geneva June 2007]，其持续多达2-3个月，并且可以照射(irradiate)，和

-慢性疼痛-甚至在诱因已经消除之后，持续长的时间段(超过2-3个月)，常常获得独立疾病的状态，例如，炎性过程[Eddy N.B.,Leimbach D.J.//Pharmacol Exp Ther.-Mar；107(3):385-93.-1953]，其中观察到镇痛剂的效力降低。慢性疼痛可以是恶性疾病中的慢性疼痛(包括如下中的疼痛：癌症患者、HIV/AIDS、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、多发性硬化、器官衰竭的末期、扩展性慢性阻塞性肺疾患、增强的充血性心力衰竭、帕金森症)和与恶性疾病没有关联的慢性疼痛(慢性肌肉骨骼痛，比如背痛或下背痛、慢性退行性关节炎、骨关节炎、风湿性关节炎、肌筋膜和风湿性疼痛、慢性头痛、偏头痛、骨疼痛；神经性疼痛(包括神经压迫中的疼痛、伤痛、神经损伤和截肢后的疼痛)、糖尿病性神经病、复杂性区域疼痛综合征(I型和II型)和骨骼肌的痉挛、疱疹后神经痛，外科手术介入后的慢性疼痛；内脏疼痛(如果牵张中空脏器和绞痛)；和镰状细胞贫血中的慢性疼痛[WHO Normative Guidelineson Pain Management,Geneva June 2007]。

借助于该镇痛剂，两种描述类型的疼痛都可以被减轻并且消除。如从现有技术可见的，质粒镇痛剂是未知的，在哺乳动物细胞中，人α防御素由质粒镇痛剂合成。质粒DNA元件的多样性和性质要求净化特性。本发明的描述，在“发明内容”部分中，在“发明的详细描述”部分中，解释了“本发明的配方”并且包括质粒DNA的必要元件的详细描述，其允许利用所有其实施方式实施本发明，从而实现描述的技术结果。

发明内容

质粒DNA被提出用于在哺乳动物中瞬时表达，其由包含如下的框架(skeleton)代表：原核元件、复制起点和报告基因、和真核元件、强启动子、前导mRNA序列和这些元件的调控序列、克隆感兴趣的基因的至少一个位点和用于至少一个引物退火以分析质粒DNA的内含物的至少一个位点、和由分泌序列代表的多核苷酸、编码人α防御素HNP-1或HNP-2或HNP-3的片段、在哺乳动物细胞中被优化用于表达的密码子、和终止序列。在本发明的一个实施方式中，前蛋白原由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8表示。在本发明的一个实施方式中，多核苷酸由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12表示。

而且，这样的质粒DNA的生产者基于细菌细胞(实施方式)给出并且镇痛剂基于有效量的这样的质粒DNA，还包含药学上可接受的赋形剂，用于哺乳动物，特别是人(实施方式)。

发明的详细描述

质粒DNA在原核细胞主要是细菌细胞中最具经济有利地产生。就这一点而言，根据本发明的质粒DNA包含用于维持和扩增的元件，主要是以大数量在细菌细胞中。这样的必要元件是具有培养基的情况下用于在细胞中维持的细菌的复制起点，优选地高数目的拷贝/细胞，和用于选择生产者菌株的报告基因。合格的复制起点是pM1(der.)、ColE1(der.)和F1、F1和pUC，但是不限于它们。合格的报告基因是对抗生素具有抗性的基因，例如抗生素主要是氨苄青霉素、卡那霉素，但是不限于它们。

根据本发明的质粒DNA包含用于在哺乳动物细胞中有效起作用的元件。

这样的元件是具有对应调控序列的启动子：具有它们的调控元件的天然启动子(CaM激酶II、CMV、巢蛋白、L7、BDNF、NF、MBP、NSE、p-球蛋白、GFAP、GAP43、酪氨酸羟化酶、红藻氨酸受体的亚基1和谷氨酸受体的亚基B等)；或具有调控序列的合成启动子，以在转录水平下获得靶基因的期望的表达模式(长度的比值和表达水平)。

相对于启动子的可能的调控序列：

-增强子，以经由提高RNA聚合酶和DNA之间的相互作用来增加表达水平，

-绝缘子，用于调制增强子的功能，

-沉默基因或其片段，以降低转录水平，例如，用于组织特异性表达，

-启动子上游的5’非编码区，其包括内含子。

根据本发明的质粒DNA包含上面提及的调控序列中的至少一种，这取决于质粒DNA的变体，基于启动子的选择和期望的靶基因表达的参数。基于现有技术水平，和这样的元件的已知的和显而易见的变体及它们的用途，根据本发明的质粒DNA可以包含满足上面提及的条件的任何组合，其中在哺乳动物细胞中进行从质粒DNA合成α防御素HNP-1或HNP-2或HNP-3。当沉默基因被使用时，或绝缘子作为设计的一部分，可能调控靶基因——描述的人α防御素HNP-1或HNP-2或HNP-3(实施方式)的基因——的表达。

其它调控序列：

-启动子下游的非编码区，其包括内含子，以增加mRNA的稳定性和靶基因的表达。

在一个实施方式中，根据本发明的质粒DNA进一步包括这样的调控元件。

根据本发明的质粒DNA包含这样的重要元件作为前导mRNA序列，其就在起始密码子ATG之前包含Kozak序列。

质粒DNA也包含对于克隆靶基因、对于靶基因在质粒DNA中的正确取向不同的位点(优选地多个位点)，以及用于其测序的引物退火的位点(优选地多个位点)。

质粒DNA也包含终止序列，其顺序地包含终止密码子、具有信号和聚腺苷酸化位点的3’非编码区、终止密码子，借助于其mRNA保持稳定，并且进行转录的适当终止和mRNA从细胞核的输出。终止序列是天然序列，即固有于靶基因，或其它更强大的序列，其例如由牛生长激素(BGH)的终止序列代表，但是不限于此，并且在第二实施方式中，可以在3’非编码区之前包含另外的终止密码子。基于现有技术水平，和这样的元件的已知的和显而易见的变体，根据本发明的质粒DNA可以包含满足上面条件的任何终止序列，在其存在下，在哺乳动物细胞中从质粒DNA进行α防御素HNP-1或HNP-2或HNP-3的合成。

质粒DNA也包含天然或异源分泌序列，其被密码子优化用于哺乳动物。在本发明的一个实施方式中，其包含，例如，TPA(组织型血纤维蛋白溶酶原活化因子同种型1前蛋白原[智人]，NCBI参考序列：NP_000921.1)分泌序列，但不限于此。使用TPA分泌序列的优势是巨大的先前的临床经验，并且其高性能关于从多种靶基因表达分泌蛋白来证明。

质粒DNA也包含编码人α防御素HNP-1或HNP-2或HNP-3的片段，其被密码子优化用于在哺乳动物中表达。

密码子优化被进行以通过增加在核糖体上阅读来自mRNA的信息的效率来增加靶基因的表达。

质粒DNA可以另外地包括有助于该mRNA稳定的这些基因元件的cDNA的初始，比如终止序列(3’非编码区，其包含聚腺苷酸化的信号和位点，还包括转录终止的信号——终止密码子)。因此，在该情况下，质粒DNA的框架中的类似元件不存在或者不起作用。

但是，用于递送引起镇痛的基因的质粒DNA例如通过增加mRNA稳定性组合DNA疫苗的这样的性质——基于质粒DNA，例如在哺乳动物细胞中高水平表达感兴趣的基因，和用于基因疗法的载体的这样的性质，例如缺乏免疫原性和基因表达的持续。这样的DNA不整合入基因组并且不在哺乳动物细胞中复制。

用于在哺乳动物细胞中表达的适合的载体由对本领域一般技术人员已知的表示并且在文献中描述[Hartikka J,Sawdey M,Cornefert-Jensen F,Margalith M,BarnhartK,Nolasco M,Vahlsing HL,Meek J,Marquet M,Hobart P,Norman J,Manthorpe M.Animproved plasmid DNA expression vector for direct injection into skeletalmuscle.Hum Gene Ther.1996 Jun 20；7(10):1205-17etc.]，以及质粒，其可以由本领域一般技术人员使用关于载体元件的指南进行制造[“Cloning Vectors”,ed.Pouwls et al.,Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985,ISBN 0 444 904018,Williams JA,CarnesAE,Hodgson CP.Plasmid DNA vaccine vector design:impact on efficacy,safety andupstream production.Biotechnol Adv.2009 Jul-Aug；27(4):353-70.doi:10.1016/j.biotechadv.2009.02.003.Epub 2009 Feb 20.Review and others]。用于人的优选的质粒DNA是对人测试的载体，其包含上面描述的元件以及相应的调控序列，其便于被修饰以匹配陈述的标准，其使得降低对于药物注册所要求的研究的数目。但是，包含要求的描述的元件的其它质粒DNA的使用是可能的。

在质粒DNA中描述的元件的序列对于该领域中的专家是可理解的。

质粒DNA的生产者基于细菌细胞给出(基于主要为大肠杆菌、链霉菌属、杆菌属、假单胞菌属的细胞，但是不限于此)。对于本领域技术人员清楚的是，使用根据本发明的质粒DNA和细菌细胞——例如商业的，但是不限于此，可能例如通过标准方法例如转染、电穿孔或粒子枪制造质粒DNA的生产者。为了降低由于质粒DNA的甲基化造成的突变的可能性，优选的是使用在基因组中不包含甲基化酶的微生物的菌株。

而且，镇痛剂基于描述的质粒DNA以有效量给予，还包含药学上可接受的赋形剂，用于哺乳动物，特别地用于人。该药物组合物是为了治疗、缓解和/或预防疼痛，具体而言，急性或慢性疼痛、敏感性的紊乱。

本发明的作者进行了实验室测试，确认了实施描述的发明的组的可能性。获得的结果由实施例(1-3)和图1-3阐明。

附图说明

图1.测试“加热板”的结果。x轴是舔舐(lick)前腿和后腿的等待时间，纵轴是施用测试物质之后的时间。图例：1-阴性对照(注射盐水)、2-pVAX1seq3、3-pVR1012seq4、4-pVR1012seq5、5-pVAX1seq6、6-pVR1012seq9、7-pVAX1seq10、8-pVAX1seq11、9-pVR1012seq12、10-pcDNA3.1+seq11、11-pcDNA3.1+(var)seq12、12–安乃近(50mg/kg)、13–盐酸吗啡(10mg/kg)、14–pVAX1、15-pVR1012、16-pcDNA3.1+、17-pcDNA3.1+(var)。质粒DNA以5mg/kg的量注射。

图2.测试“加热板”中不同剂量的质粒DNA pVAX1seq3的研究结果。x轴是舔舐前腿和后腿的等待时间，纵轴是施用测试物质之后的时间。图例：1-阴性对照(注射盐水)、2-pVAX1seq3 1mg/kg、3-pVAX1seq3 5mg/kg、4-pVAX1seq3 10mg/kg、6-安乃近(50mg/kg)、7–盐酸吗啡(10mg/kg)。

图3.小鼠的血清中β-内啡肽的浓度改变的研究结果。x轴是施用测试物质之后的时间，纵轴是血清中β-内啡肽的浓度。图例：1-阴性对照(注射盐水)、2-pVR1012、3-pVR1012seq4。质粒DNA以5mg/kg的量注射。

实施例1.获得编码α防御素HNP-1或HNP-2或HNP-3的质粒DNA

1.1.进行DNA的化学合成，所述DNA如下表征：SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:9-SEQ ID NO:12，任选地侧接限制位点，加入Kozak序列。对于SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:10限制位点，使用NheI(5’)、BamHI(3’)，对于SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:9限制位点，使用SalI(5’)、KpnI(3’)，对于SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:12限制位点，使用SalI(5’)、BamHI(3’)，对于SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:11限制位点，使用NheI(5’)、ApaI(3’)。

1.2.进行将合成的基因克隆入pVAX1质粒(Invitrogen)和pVR1012(Vical)。也在载体pcDNA3.1+(Invitrogen)中在限制位点NheI(5’)、ApaI(3’)处进行序列SEQ ID NO:11的克隆。而且，不能够表达新霉素的载体pcDNA3.1+被接受，这是由于在SV40启动子(-71bp)的区域中该载体具有NsiI限制酶(restrictase)的限制。SEQ ID NO:12在限制位点NheI(5’)、ApaI(3’)处克隆在得到的载体中。

1.3.对于连接反应，3μl的合成的DNA溶液、1μl的制备的载体溶液、5μl的连接缓冲液×2和1μl的T4-连接酶被采用。反应在+20℃下进行2小时。

其后，混合物在+95℃下被加热10min，并且使用具有0.025μm孔径的硝化纤维素滤器(Millipore,USA)通过透析从盐中纯化。透析针对包含10％甘油中的0.5mM EDTA的溶液进行，持续10min。

获得下列质粒DNA：pVAX1seq3、pVR1012seq4、pVR1012seq5、pVAX1seq6、pVR1012seq9、pVAX1seq10、pVAX1seq11、pVR1012seq12、pcDNA3.1+seq11、pcDNA3.1+(var)seq12。

1.4.然后，大肠杆菌菌株DH10B/R(F-mcrA,Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)、15,ΔlacX74,deoR,recA1,endA1,araD139,Δ(ara,leu)769,galU,galKλ-,rpsL,nupG)的细胞通过使用电穿孔器MicroPulser(BioRad)的电穿孔方法转化有获得的质粒DNA。该菌株不包含甲基化酶，其有助于最小化在DNA——包括在该菌株中维持的克隆入质粒的基因——中发生突变的可能性。1μl的透析的连接酶混合物被加入到12μl的感受态细胞并且被放置在poration单元的电极之间，并且用电流脉冲处理。

在转化之后，将细胞放置在1ml的SOC培养基(2％细菌用胰蛋白胨(bacto-tripton)、0.5％酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl₂、10mM MgSO₄、20mM葡萄糖)中并且在+37℃下培育40min。

1.5.在包含LB-琼脂、50μg/ml的卡那霉素或氨苄青霉素的选择培养基(对于基于pcDNA3.1+的质粒DNA)上进行包含质粒DNA的大肠杆菌细胞的克隆的鉴定。

质粒DNA从生长的克隆分离。质粒DNA的分离使用Wizard Minipreps DNA纯化系统(Promega,USA)进行。纯化的重组质粒DNA通过测序验证。

1.6.通过Sanger的方法使用一组Applied Biosystems终止子(BDT)v3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems,USA)根据所附说明书进行克隆片段的测序。为了标记反应产物，使用荧光染料标记的ddNTP，每种ddNTP对应于染料。为了测序，使用未标记的质粒特异性引物。进行PCR反应，然后使用试剂盒BigDye X-终止子纯化试剂盒(AppliedBiosystems,USA)中的说明书从游离的标记的ddNTP纯化反应混合物，并且测序反应产物使用毛细管测序仪Applied Biosystems 3500/3500xL基因分析仪(Applied Biosystems,USA)和试剂3500/3500xL基因分析仪聚合物“POP-6^TM”(Applied Biosystems,USA)进行分离。

测序的反应产物的分离结果通过利用激光扫描和检测包含在所有类型的ddNTP中的四种荧光染料来记录。

1.7.DNA序列的计算机分析使用个人计算机利用程序Chromas和BioEdit进行。调查的DNA片段的核苷酸序列与所设计的进行比对，合成的片段与计算的片段的同一性被证明。结果，选择大肠杆菌细胞的克隆，其包含质粒中的靶基因的全序列——编码α防御素HNP-1或HNP-2或HNP-3的DNA序列。

实施例2.生产编码α防御素HNP-1或HNP-2或HNP-3的质粒DNA，以对实验室动物进行研究。

将在培养皿中加入卡那霉素(或氨苄青霉素)的LB-琼脂上生长的大肠杆菌的集落放置在10ml的选择培养基中。细胞在恒定搅拌(250rpm)下在+37℃下生长过夜。所得到的细胞通过在4000g下离心收集。质粒DNA的进一步分离和纯化使用EndoFree质粒大型试剂盒(Qiagen)进行，其允许获得无热原DNA。分离的质粒DNA利用在0.8％琼脂糖凝胶中电泳进行分析，其浓度使用荧光测定法测量。

作为对照溶液，使用不加入测试制品的水。1,950ml的水和0.05ml的测试溶液(浓度1mg/ml)被加入到小室(cell)，用于测量混合的2ml体积的光学密度，并且该光学密度在260nm的波长下测量。DNA浓度的测定根据下式进行：

C(μg/ml)＝40А₂₆₀К，

其中А₂₆₀-在260nm的波长下测量的制品的光学密度；K(μg/ml)-对于DNA 50μg/ml(在水中的50μg/ml双链DNA)；40-测试制品的稀释度。

最后，确定利用3.4mg/ml的浓度获得质粒DNA pVAX1seq3，pVR1012seq4–3.7mg/ml、pVR1012seq5–4mg/ml、pVAX1seq6–3,8mg/ml、pVR1012seq9–4,1mg/ml、pVAX1seq10–4mg/ml、pVAX1seq11–4.3mg/ml、pVR1012seq12–4.5mg/ml、pcDNA3.1+seq11–4.4mg/ml、pcDNA3.1+(var)seq12-4.3mg/ml。从1L培养基，质粒DNA的产量范围为3.4mg到4.5mg。

获得的质粒DNA制品的纯度通过在260nm的波长下测量的制品的光学密度与在280nm的波长下测量的制品的光学密度的比值(А₂₆₀/А₂₈₀)和在260nm的波长下测量的制品的光学密度与在230nm的波长下测量的制品的光学密度的比值(А₂₆₀/А₂₃₀)来判断。测量在水溶液中进行，不加入测试制品的水被用作参比溶液。

对于DNA的纯制品，А₂₆₀/А₂₈₀＞1.80和А₂₆₀/А₂₃₀＞1.80是特征性的。对于接受的所有质粒DNA的制品，在实验中限定的值对应于纯制品的关系А₂₆₀/А₂₈和А₂₆₀/А₂₃₀的值。

蛋白质杂质的定量测定使用microBCA测定[Smith,P.K.,et all,Measurement ofprotein using bicinchoninic acid.Analyt.Biochem.150,76-85(1985)]在获得的质粒DNA制品pVAX1seq3、pVR1012seq4、pVR1012seq5、pVAX1seq6、pVR1012seq9、pVAX1seq10、pVAX1seq11、pVR1012seq12、pcDNA3.1+seq11、pcDNA3.1+(var)seq12中进行，测量具有铜和二喹啉甲酸的所获得的着色蛋白质复合物在562nm的波长下的光学密度。方法microBCA测定的灵敏度为0.5-20μg/ml蛋白质。在质粒DNA的任何研究制品中的总蛋白质的浓度不超过标准(0.5至12μg/mg的质粒DNA)。

使用凝胶-血栓版本的LAL测试——其具有>0,25EU/ml的灵敏度(ToxinSensor,GenScript,USA)，也在质粒DNA的制品中测定细菌脂多糖类的含量。鲎——美洲鲎——阿米巴状细胞的溶胞产物充当LAL-试剂。LAL-试剂特异性地与细菌内毒素反应，酶促反应的结果是在反应混合物中存在改变，这与内毒素的浓度成比例。通过转动管，该结果根据在管的底部存在或不存在密集血栓来评价。凝胶-血栓在稀释的样品的研究期间不形成，对于质粒DNA制品pVAX1seq3、pVR1012seq4、pVR1012seq5、pcDNA3.1+(var)seq12，稀释10倍，对于质粒DNA制品pVAX1seq6、pVR1012seq9、pVAX1seq10、pVAX1seq11、pVR1012seq12、pcDNA3.1+seq11，稀释5倍，即，分别在2.5EU/ml和1.25EU/ml的方法灵敏度下，考虑到样品中质粒DNA的浓度，其确认了从内毒素纯化的有效指示。

实施例3.测定编码α防御素HNP-1或HNP-2或HNP-3的质粒DNA的镇痛作用

3.1.测试“加热板”

使用测试“加热板”(热板)，进行编码α防御素HNP-1或HNP-2或HNP-3的质粒DNA的镇痛活性的研究。

进行测试“加热板”(热板)以测量急性疼痛敏感度的阈值和研究的质粒DNA制品的潜在镇痛作用[Valdman A.V.,Ignatov,Yu.D.Central mechanisms of pain.—L.:Nauka.—1976]。该测试对于镇痛活性的研究是重要的，其被用于鉴定有镇痛活性的化合物。

当被放置在热表面上时，在动物达到疼痛敏感度的阈值时，观察到焦虑的运动应答：爪子的弹开、爪子的舔舐和跳跃。在该测试中，考虑从将动物放置在热表面上至第一次舔舐爪子的等待时间。该方法使得能够测定参数：测试目标的镇痛活性、镇痛的峰值时间、镇痛的持续时间。

在研究中使用BALB/C系的小鼠，雌性，重15-22克，18周龄。在研究中形成包括对照组的17组动物，每个组由3只小鼠组成：

1-阴性对照(注射盐水)

2-pVAX1seq3

3-pVR1012seq4

4-pVR1012seq5

5-pVAX1seq6

6-pVR1012seq9

7-pVAX1seq10

8-pVAX1seq11

9-pVR1012seq12

10-pcDNA3.1+seq11,

11-pcDNA3.1+(var)seq12

12-安乃近(50mg/kg)

13-盐酸吗啡(10mg/kg)

14–pVAX1

15-pVR1012

16-pcDNA3.1+

17-pcDNA3.1+(var)

注射5mg/kg的质粒DNA。

使用器械加热板-计量仪(Hotplate Analgesia Meter,Columbus Instruments,USA)。

在研究之前，给予测试系统10分钟以适应在室内研究进行。动物仅使用一次，这是因为第二次安置动物在恒温板上诱导对表面接触的即时反应。恒温器温度设置为55℃。在注射测试物质之后，将动物轻轻地放置在加热的板上，并且同时按下控制面板上的“启动”按钮。记录舔舐前腿和后腿的等待时间(从将动物放置在设备的表面上到第一次舔舐之前)。在那之后，按下“停止”按钮，并且将动物从热表面移走。忽略其它行为响应。为了降低爪垫的热损伤的可能性，实验的最大时间不超过60秒。为了测定制品的镇痛作用的峰值时间，在对照组(盐水)(时间0)中，和在测试组中制品施用后2h、12h、24h测量舔舐前爪和后爪的等待时间。器械的表面使用被消毒剂(70％乙醇中0.5％洗必泰-双葡萄糖酸盐)弄湿的布擦拭，然后在其上安置下一个动物[Methodical recommendations for the students.Thepharmaceutical faculty of GOU VPO MMA im.I.M.Sechenovof the Russian MinistryOf Health.—Moscow.—2006]。

进行制品的镇痛活性测定数据的分析。对于已经显示了最佳结果的质粒DNA，测定ED50，即证明达到制品的50％镇痛活性需要的剂量。

实验的结果在图1中示出。所有分析的编码防御素HNP-1或HNP-2或HNP-3的质粒DNA的制品展现了显著的镇痛作用，在效力上不比吗啡差并且超过了安乃近的镇痛活性。在注射质粒之后2h内观察到小程度的镇痛，然后镇痛得到加强，并且在12和24h内观察到相同高水平的镇痛，这表明作用的维持。

在应用多种剂量的质粒DNA(pVAX1seq3)——其在先前的实验中已经显示了最佳结果——的实验中，证明了在1到10mg/kg范围内镇痛的剂量依赖性性质(图2)。其中在12小时之后，指标——当使用1mg/kg的最低浓度的质粒DNA pVAX1seq3时——几乎与使用10mg/kg的盐酸吗啡组中的那些相同。在24h之后，最低浓度的质粒DNA的组中的指标超过了使用10mg/kg盐酸吗啡组中的指标，几乎是其2倍。在施用镇痛剂之后，仅在2h后才观察到安乃近的作用，12h和24h后的响应与对照组中的响应类似。当使用5mg/kg和10mg/kg的浓度的质粒DNA pVAX1seq3时，与使用最低浓度的质粒DNA的组相比，观察到等待时期的显著增加(多达15％)，其中这两个组之间的差别是小的。

3.2.小鼠血清中β-内啡肽浓度的研究。

由于血浆中β-内啡肽的浓度改变可以充当用于评估镇痛效力的标准[Beta-endorphin is a marker of the effectiveness of analgesia for acute pain andchronic pain syndrome in cancer patients/Z.V.Pavlova[and others]//Problems ofclinical medicine.—2007.—N1.—S.36-40.—ISSN 1817-8359]，因此使用用于β-内啡肽(bEP)小家鼠(小鼠)CEA806Mu的试剂盒ELISA Kit(Life science Inc.)，进行注射质粒DNA后小鼠血清中β-内啡肽浓度的研究，同时引入编码HNP-2或HNP-3的质粒DNA(pVR1012seq4)作为实例。

研究的结果在图3中示出。可见引入质粒DNA pVR1012seq4，β-内啡肽的水平显著地增加，尽管事实：引入该质粒DNA之后不插入靶基因，并且在对照组中贯穿整个实验没有观察到β-内啡肽水平的显著增加。

因而，证明了创建编码HNP-1或HNP-2或HNP-3的质粒DNA的不同变体的可能性、借助于细菌生产者获得它们、和这样的质粒DNA的镇痛作用——在匹配规定标准的任何变体中，甚至在1mg/kg的最低浓度下(比盐酸吗啡低10倍)，并且也证明了使用这样的质粒的安全性：动物存活，没有观察到副作用。

序列表

<110> I·V·杜克浩林夫，A·I·奥尔洛夫

<120> 编码HNP-1或HNP-2或HNP-3的DNA质粒、细菌生产者、镇痛剂(变体)

<130>

<150> RU 2014145169

<151> 2014-11-10

<160> 12

<210> 1

<211> 94

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 中性粒细胞防御素1前蛋白原

<400> 1

Met Arg Thr Leu Ala Ile Leu Ala Ala Ile Leu Leu Val Ala Leu Gln

1 5 10 15

Ala Gln Ala Glu Pro Leu Gln Ala Arg Ala Asp Glu Val Ala Ala Ala

20 25 30

Pro Glu Gln Ile Ala Ala Asp Ile Pro Glu Val Val Val Ser Leu Ala

35 40 45

Trp Asp Glu Ser Leu Ala Pro Lys His Pro Gly Ser Arg Lys Asn Met

50 55 60

Ala Cys Tyr Cys Arg Ile Pro Ala Cys Ile Ala Gly Glu Arg Arg Tyr

65 70 75 80

Gly Thr Cys Ile Tyr Gln Gly Arg Leu Trp Ala Phe Cys Cys

85 90

<210> 2

<211> 94

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 中性粒细胞防御素3前蛋白原

<400> 2

Met Arg Thr Leu Ala Ile Leu Ala Ala Ile Leu Leu Val Ala Leu Gln

1 5 10 15

Ala Gln Ala Glu Pro Leu Gln Ala Arg Ala Asp Glu Val Ala Ala Ala

20 25 30

Pro Glu Gln Ile Ala Ala Asp Ile Pro Glu Val Val Val Ser Leu Ala

35 40 45

Trp Asp Glu Ser Leu Ala Pro Lys His Pro Gly Ser Arg Lys Asn Met

50 55 60

Asp Cys Tyr Cys Arg Ile Pro Ala Cys Ile Ala Gly Glu Arg Arg Tyr

65 70 75 80

Gly Thr Cys Ile Tyr Gln Gly Arg Leu Trp Ala Phe Cys Cys

85 90

<210> 3

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码中性粒细胞防御素1前蛋白原的DNA [智人] 被优化在哺乳动物中表达的密码子，天然终止序列

<400> 3

atgagaaccc tggccatcct ggccgccatc ctgctggtgg ccctgcaggc ccaggccgag 60

cccctgcagg ccagagccga cgaggtggcc gccgcccccg agcagatcgc cgccgacatc 120

cccgaggtgg tggtgagcct ggcctgggac gagagcctgg cccccaagca ccccggcagc 180

agaaagaaca tggcctgcta ctgcagaatc cccgcctgca tcgccggcga gagaagatac 240

ggcacctgca tctaccaggg cagactgtgg gccttctgct gctgagcttg cagaaaaaga 300

aaaatgagct caaaatttgc tttgagagct acagggaatt gctattactc ctgtaccttc 360

tgctcaattt cctttcctca tcccaaataa atgccttgaa aaaaaaaaaa aaaatga 417

<210> 4

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码中性粒细胞防御素3前蛋白原的DNA [智人] 被优化在哺乳动物中表达的密码子，天然终止序列

<400> 4

ATGAGAACCC TGGCCATCCT GGCCGCCATC CTGCTGGTGG CCCTGCAGGC CCAGGCCGAG 60

CCCCTGCAGG CCAGAGCCGA CGAGGTGGCC GCCGCCCCCG AGCAGATCGC CGCCGACATC 120

CCCGAGGTGG TGGTGAGCCT GGCCTGGGAC GAGAGCCTGG CCCCCAAGCA CCCCGGCAGC 180

AGAAAGAACA TGGACTGCTA CTGCAGAATC CCCGCCTGCA TCGCCGGCGA GAGAAGATAC 240

GGCACCTGCA TCTACCAGGG CAGACTGTGG GCCTTCTGCT GCTGAGCTTG CAGAAAAAGA 300

AAAATGAGCT CAAAATTTGC TTTGAGAGCT ACAGGGAATT GCTATTACTC CTGTACCTTC 360

TGCTCAATTT CCTTTCCTCA TCTCAAATAA ATGCCTTGTT ACAAAAAAAA AAAATGA 417

<210> 5

<211> 288

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码中性粒细胞防御素1前蛋白原的DNA [智人] 被优化在哺乳动物中表达的密码子，终止密码子

<400> 5

atgagaaccc tggccatcct ggccgccatc ctgctggtgg ccctgcaggc ccaggccgag 60

cccctgcagg ccagagccga cgaggtggcc gccgcccccg agcagatcgc cgccgacatc 120

cccgaggtgg tggtgagcct ggcctgggac gagagcctgg cccccaagca ccccggcagc 180

agaaagaaca tggcctgcta ctgcagaatc cccgcctgca tcgccggcga gagaagatac 240

ggcacctgca tctaccaggg cagactgtgg gccttctgct gctgataa 288

<210> 6

<211> 288

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码中性粒细胞防御素3前蛋白原的DNA [智人] 被优化在哺乳动物中表达的密码子，终止密码子

<400> 6

atgagaaccc tggccatcct ggccgccatc ctgctggtgg ccctgcaggc ccaggccgag 60

cccctgcagg ccagagccga cgaggtggcc gccgcccccg agcagatcgc cgccgacatc 120

cccgaggtgg tggtgagcct ggcctgggac gagagcctgg cccccaagca ccccggcagc 180

agaaagaaca tggactgcta ctgcagaatc cccgcctgca tcgccggcga gagaagatac 240

ggcacctgca tctaccaggg cagactgtgg gccttctgct gctgataa 288

<210> 7

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 中性粒细胞防御素1蛋白原 [智人]，其具有TPA信号序列

<400> 7

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Glu Pro Leu Gln Ala Arg Ala Asp Glu

20 25 30

Val Ala Ala Ala Pro Glu Gln Ile Ala Ala Asp Ile Pro Glu Val Val

35 40 45

Val Ser Leu Ala Trp Asp Glu Ser Leu Ala Pro Lys His Pro Gly Ser

50 55 60

Arg Lys Asn Met Ala Cys Tyr Cys Arg Ile Pro Ala Cys Ile Ala Gly

65 70 75 80

Glu Arg Arg Tyr Gly Thr Cys Ile Tyr Gln Gly Arg Leu Trp Ala Phe

85 90 95

Cys Cys

<210> 8

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 中性粒细胞防御素3蛋白原 [智人]，其具有TPA信号序列

<400> 8

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Glu Pro Leu Gln Ala Arg Ala Asp Glu

20 25 30

Val Ala Ala Ala Pro Glu Gln Ile Ala Ala Asp Ile Pro Glu Val Val

35 40 45

Val Ser Leu Ala Trp Asp Glu Ser Leu Ala Pro Lys His Pro Gly Ser

50 55 60

Arg Lys Asn Met Asp Cys Tyr Cys Arg Ile Pro Ala Cys Ile Ala Gly

65 70 75 80

Glu Arg Arg Tyr Gly Thr Cys Ile Tyr Gln Gly Arg Leu Trp Ala Phe

85 90 95

Cys Cys

<210> 9

<211> 429

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码中性粒细胞防御素1蛋白原的DNA [智人]，其具有TPA信号序列，被优化在哺乳动物中表达的密码子，天然终止序列

<400> 9

atggacgcca tgaagagagg cctgtgctgc gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg 60

agccccagcg agcccctgca ggccagagcc gacgaggtgg ccgccgcccc cgagcagatc 120

gccgccgaca tccccgaggt ggtggtgagc ctggcctggg acgagagcct ggcccccaag 180

caccccggca gcagaaagaa catggcctgc tactgcagaa tccccgcctg catcgccggc 240

gagagaagat acggcacctg catctaccag ggcagactgt gggccttctg ctgctgagct 300

tgcagaaaaa gaaaaatgag ctcaaaattt gctttgagag ctacagggaa ttgctattac 360

tcctgtacct tctgctcaat ttcctttcct catcccaaat aaatgccttg aaaaaaaaaa 420

aaaaaatga 429

<210> 10

<211> 429

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码中性粒细胞防御素3蛋白原的DNA [智人]，其具有TPA信号序列，被优化在哺乳动物中表达的密码子，天然终止序列

<400> 10

ATGGACGCCA TGAAGAGAGG CCTGTGCTGC GTGCTGCTGC TGTGCGGCGC CGTGTTCGTG 60

AGCCCCAGCG AGCCCCTGCA GGCCAGAGCC GACGAGGTGG CCGCCGCCCC CGAGCAGATC 120

GCCGCCGACA TCCCCGAGGT GGTGGTGAGC CTGGCCTGGG ACGAGAGCCT GGCCCCCAAG 180

CACCCCGGCA GCAGAAAGAA CATGGACTGC TACTGCAGAA TCCCCGCCTG CATCGCCGGC 240

GAGAGAAGAT ACGGCACCTG CATCTACCAG GGCAGACTGT GGGCCTTCTG CTGCTGAGCT 300

TGCAGAAAAA GAAAAATGAG CTCAAAATTT GCTTTGAGAG CTACAGGGAA TTGCTATTAC 360

TCCTGTACCT TCTGCTCAAT TTCCTTTCCT CATCTCAAAT AAATGCCTTG TTACAAAAAA 420

AAAAAATGA 429

<210> 11

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码中性粒细胞防御素1蛋白原的DNA [智人]，其具有TPA信号序列，被优化在哺乳动物中表达的密码子，终止密码子

<400> 11

atggacgcca tgaagagagg cctgtgctgc gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg 60

agccccagcg agcccctgca ggccagagcc gacgaggtgg ccgccgcccc cgagcagatc 120

gccgccgaca tccccgaggt ggtggtgagc ctggcctggg acgagagcct ggcccccaag 180

caccccggca gcagaaagaa catggcctgc tactgcagaa tccccgcctg catcgccggc 240

gagagaagat acggcacctg catctaccag ggcagactgt gggccttctg ctgctgataa 300

<210> 12

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码中性粒细胞防御素3蛋白原的DNA [智人]，其具有TPA信号序列，被优化在哺乳动物中表达的密码子，终止密码子

<400> 12

atggacgcca tgaagagagg cctgtgctgc gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg 60

agccccagcg agcccctgca ggccagagcc gacgaggtgg ccgccgcccc cgagcagatc 120

gccgccgaca tccccgaggt ggtggtgagc ctggcctggg acgagagcct ggcccccaag 180

caccccggca gcagaaagaa catggactgc tactgcagaa tccccgcctg catcgccggc 240

gagagaagat acggcacctg catctaccag ggcagactgt gggccttctg ctgctgataa 300

1

Claims

1.一种用于在哺乳动物细胞中瞬时表达的质粒DNA，其由包含如下的框架代表：原核元件、复制起点和报告基因、和真核元件、强启动子、mRNA的前导序列、和所提及的元件的调控序列、克隆感兴趣的基因的至少一个位点和退火至少一个引物以分析所述质粒DNA的组成的至少一个位点、和由分泌序列代表的多核苷酸、编码人α防御素HNP-1或HNP-2或HNP-3的片段、被优化用于在哺乳动物细胞中表达的密码子、和终止序列。

2.根据权利要求1所述的质粒DNA，其特征在于前蛋白原由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8表示。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的质粒DNA，其特征在于所述多核苷酸由SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10或SEQID NO:11或SEQ ID NO:12表示。

4.根据权利要求1或权利要求2或权利要求3所述的质粒DNA的生产者，其基于细菌细胞。

5.用于哺乳动物的镇痛剂，其基于有效量的根据权利要求1或权利要求2或权利要求3所述的质粒DNA，还包含药学上可接受的赋形剂。