CN103732239A - 利用θ-防御素的炎性蛋白酶的阻断 - Google Patents

Abstract

用于治疗一种或多种炎性状况的药物组合物可包括θ-防御素、其类似物或衍生物中至少一种。发明方法包括研究θ-防御素、其类似物或衍生物关于它们抗炎作用的效力，并为了治疗炎性状况的目的将这样的组合物提供给市场。具有特别意义的是药物组合物有效产生肿瘤坏死因子α(TNF-α)-转化酶(TACE)或其它促炎蛋白酶和/或脱落酶，如RTD-1-27、RTD-1-28或RTD-1-29的临床相关的抑制。考虑优选的组合物可用于治疗类风湿性关节炎、炎性肠病和其它慢性炎性疾病、自身免疫疾病、癌症和阿尔茨海默氏病、骨关节炎、炎症相关的神经变性和其它炎症相关的疾病。

Description

利用θ-防御素的炎性蛋白酶的阻断

本申请要求2011年6月2日提交的美国临时专利申请系列号61/492753的优先权权益。 

发明领域

本发明涉及调节细胞因子活性——包括信号转导和炎症途径——的环状肽在多种疾病中的应用。更具体地，环状肽具有至此未知的生物学活性，如脱落酶（sheddase）和其它相关蛋白酶（金属蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶）的抑制，具有跨疾病——其中这些蛋白酶的活性与疾病的发病相关——的应用。 

背景

在此所有的出版物通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指出以通过引用并入的相同。以下描述包括可用于理解发明主题的信息。不承认任何本文提供的信息是现有技术或与目前要求保护的发明相关，或任何具体或隐含提到的出版物是现有技术。 

本文描述的环状肽是最近发现的治疗剂，其靶向已知临床意义的促炎酶促途径，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)-转化酶(“TACE”，也称作ADAM17)和病理炎症、组织分解和促进癌细胞增殖的生长因子动员中牵涉的其它金属酶(例如，脱落酶和基质金属蛋白酶(“MMPs”))。 

金属蛋白酶调节多种生物学过程，范围有发育程序、响应组织损伤或感染、瘢痕重塑和细胞分裂的刺激(3)。金属蛋白酶活性的调节对细胞和组织稳态是关键性的。许多疾病状态与金属酶活性的过度表达相关。例如，受类风湿和其它形式关节炎影响的关节具有提高水平的MMPs以 及TNF-α——其通过TACE从TNF-α原（pro-TNF-α）表达细胞的细胞表面释放(7,8,13,16)。已证明用单克隆抗体阻断TNF-α在相当一部分具有类风湿关节炎(RA)的患者——其对第一线药物如低剂量甲氨蝶呤无反应——的类风湿关节炎(RA)治疗中有效。因为对RA的TNF-α阻断不是在所有情况中都有效，和因为在患者亚群中存在与TNF-α阻断剂相关的严重副作用，所以正在继续努力开发可选的抗炎策略。从这一点上，很多制药公司已将药物开发计划集中于TACE抑制剂的发现(17)，但是没有TACE抑制剂已被FDA批准。 

θ-防御素是在恒河猴、狒狒和其它旧大陆猴（Old World monkey）组织中表达的天然存在的环状肽。它们不在人类或其它类人动物中表达。天然存在的θ-防御素由18个氨基酸的环组成，该环由三个在所有已知θ-防御素中都保守的二硫键稳定(9，21-23,25)。如同其它防御素，θ-防御素最初基于肽的抗微生物性质而被发现。然而，发明人已发现到此为止未知的θ-防御素的第二性质，作为有效的抗炎因子。如本文所进一步描述的，θ-防御素的天然和修饰的结构能够先体外后体内和在体内下调炎症。更重要地，发现θ-防御素和源自θ-防御素结构的肽(例如，环状肽)能够抑制TACE——TNF-α炎症中的关键因子。该全新的发现——θ-防御素是天然的TACE抑制剂——现在为能通过存在于对象的内源性细胞因子相关途径调节炎症的分子提供重要来源。这些肽只是已知的在动物中表达的天然产物，其是TACE的可溶性调节子。因此，环状肽可用作跨由功能失常的细胞因子活性产生的多种疾病状态或状况如自身免疫和其它炎性疾病的治疗剂，并且人类中多种炎性疾病和/或状况可由于灵长类进化中θ-防御素表达的丧失而产生。 

另外，因子如TACE是称作脱落酶的较宽种类的分子的成员，其具有分裂胞外蛋白结构域的生物学活性。该分裂活性已提供加强某些治疗——如用于乳腺癌的通过抑制脱落酶ADAM10的曲妥珠单抗(赫赛汀)——效力的治疗途径。通常，Her2的ADAM10脱落酶的分裂导致具有组成型激酶活性的Her2片段，和增殖细胞的不依赖配体的生长以及存活信号。然而，该过程的有害作用可通过脱落酶抑制而被妨碍。因此，具有脱落酶抑制活性的环状肽为甚至更多种疾病和/或状况提供治疗方法，包 括那些这样的疾病和/或状况，其中金属蛋白酶结构、表达和/或功能的改变与疾病和/或状况的发病机制相关。 

在超过十二年间，制药公司已寻求开发TACE抑制剂(14,17)。虽然几个小分子(大部分氧肟酸盐)显示在RA动物模型中有效，但是由于在人类中不能接受的毒性，这些化合物都没有被批准(14,17)。实际上，所有存在的TNF拮抗剂都具有黑框警告——美国食品和药物管理局(FDA)的最严厉的警告：药物可出售并仍然保持在美国市场上。 

因此，在疾病如RA中有效的无毒TACE抑制剂的出现将是对RA、相关的自身免疫和炎性疾病，以及涉及金属蛋白酶活性的其它疾病，如癌症的治疗方法的有价值的增加。在更一般的方面，仍然存在对治疗炎症和炎症相关状况，尤其是慢性炎症状况的药物，以及制造、销售和施用这样的药物的方法的需要。 

发明概述

本发明主题提供装置、系统和方法，其中包括θ-防御素、其类似物或衍生物的药物组合物被研究和推向市场以治疗炎性状况。 

到本申请日时止，优选的组合物包括RTD-1-27、RTD-1-28和RTD-1-29的至少一种。 

在发明主题的研究方面考虑毒性、效力和剂量反应研究。任何这样的研究可由制药或其它公司在其自己的实验室直接进行，或通过附属机构或甚至不相关的公司间接进行，所有这些应在本文被理解为包括在测定药物组合物效力的概念中。 

本文考虑的抗炎作用应被理解广泛地包括炎症相关化合物的所有临床相关的抑制，包括例如，肿瘤坏死因子α(TNF-α)转化酶(TACE)、组织蛋白酶C、或其它促炎蛋白酶、金属蛋白酶ADAMs家族和其它脱落酶的抑制。 

将药物组合物提供给市场的步骤在本文应被理解为制造或已制造、或监督、控制或以任何其它方式指导制造商业数量的药物组合物。考虑的最小商业数量包括在任何给定的一年期间在一个或多个生产设备中总 计1千克、10千克、100千克和1000千克。 

考虑的θ-防御素、其类似物或衍生物的一个有意思的方面是这些化合物中的许多对酸和蛋白酶高度稳定和可以口服制剂施用。 

至少部分因为考虑的治疗组合物可影响TACE和/或脱落酶，考虑可治疗多种不同的炎性状况，包括例如，类风湿性关节炎、炎性肠疾病和其它慢性炎性疾病、自身免疫疾病、急性菌血症（acute bactermia）、败血症、囊性纤维化、癌症、阿尔茨海默氏病、骨关节炎、炎症相关的神经变性和其它炎症相关的疾病。特别考虑的是，本文考虑的方法和组合物可被有利地推向市场以治疗是对抗TNF-α治疗无应答者的人。 

同样考虑的是药物和制造施用给人或非人动物的药物的方法，其中药物包括在本文或在优先权申请中公开的新的θ-防御素、其类似物或衍生物的至少一个，其被推向市场以治疗炎性状况。其中特别感兴趣的是RTD-1-27、RTD-1-28和RTD-1-29。 

本发明主题的多种目的、特征、方面和优势根据以下优选实施方式的详细描述将变得更明显。 

附图简述 

图1.θ-防御素生物合成和结构。将取代的九肽(颜色标记的)切除和拼接以产生成熟的肽RTD-1(来自(21))。 

图2.前θ-防御素原的比对。A.将从cDNA预测的BTD-a至-d氨基酸序列与RTD l a至-c和人θ-防御素假基因(HTDp)进行手动比对。比对序列中的点表示与BTD-α中相同的氨基酸，星号符号表示末端密码子的位置，和#符号表示过早地终止翻译的终止密码子。B.10个推论的BTD肽——源自cDNA序列——的环状结构。 

图3.RTD-1减少小鼠多菌性败血症中的致死率。成年的Balb/c小鼠在T=0接受盲肠结扎和刺穿(CLP)。小鼠在CLP之后4h接受单次150μl生理盐水的注射(●，n=10)或在CLP手术之后4h(▲，n=l1)或24h(■，n=5)接受含有5mg/kg RTD-1的盐水。 

图4.θ-防御素的抗TNF活性。A.RTD1-6(23)的共价结构，颜色编 码显示组成的九肽的衍生物(23)。B.在0-10μl/mlθ-防御素RTD-1和两种人α-防御素(HNP-2和HNP-4)存在的情况下，将人全血(1：10)与100CFU/ml活的大肠杆菌（E.coli）温育4h，并通过ELISA定量TNF-α。C.检测RTDs1-5对从人全血释放的如在图B中TNF-α的作用；通过ELISA定量TNF-α。未检测只以痕量存在于PMNs中的RTD-6。 

图5.θ-防御素抑制由多种TLR激动剂诱导的促炎细胞因子/趋化因子。将RPMI1640+5%人血浆中人外周血细胞(5×10⁵细胞/ml)与单独的10μg/ml RTD-1(没有激动剂对照)或肽溶剂(0.01%HOAc)或同时与TLR激动剂于37℃在5%CO₂中轻摇温育4h。通过离心收获上清，并且利用Milliplex细胞因子/趋化因子组，通过Luminex xMAP分析定量细胞因子/趋化因子水平。激动剂：TLR2-1×10⁸个热杀死的产单核细胞李斯特氏菌（L.monocytogenes）；TLR4-3.3ng/ml大肠杆菌K12LPS；TLR5-30ng/ml鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）鞭毛蛋白；TLR8-0.9μg/ml ssRNA40。 

图6.θ-防御素是TACE的竞争性抑制剂。A.将重组TACE(rTACE)与指示浓度的肽+TACE特异的底物(Mca-PLAQAV-Dpa-RSSSR-NH₂)温育，并且荧光测定地测量酶活性。B.分析RTDs1-5对如图A中的TACE的抑制。C.以0、50、100和150ng/ml的肽浓度的rTACE的RTD-1抑制的Lineweaver-Burke分析。D.RTD-1和“天然”无环类似物(S-7)结构的比较。E.RTD-1和RTD-1-S7类似物的rTACE的相对抑制。F.RTD-1引起的TACE对静息或LPS-预处理(2h)的THP-1细胞的抑制(1)。 

图7.θ-防御素是ADAM10的有效抑制剂。将重组ADAM10和底物(Mca-PLAQAV-Dpa-RSSSR-NH₂;0.05μg/ml)与RTD1-3于37℃温育60min，并且荧光测定地测量酶活性。 

图8.微小θ-防御素的体内效力和抗TNFa和TACE阻断活性。A.微小θ-防御素的共价结构。B.微小θ-防御素在CLP败血症中的效力。CLP手术在T=0时在BALB/c小鼠上进行。手术后四小时，将小鼠用静脉注射PBS(假性对照)或PBS中5mg/kg指示的微小θ-防御素治疗。当存活达15天时监测治疗的效力。C.评价微小θ-防御素对从人全血释放的TNFα的效力。将EDTA抗凝全血在RPMI1640中1：10稀释并与活的大肠杆 菌细胞温育4h，包括0-10g/ml RTD-1(天然的θ-防御素)或所述指示的三种微小θ-防御素。D.测定RTD-1和三种微小θ-防御素对TACE活性的作用，如图5所述。 

图9.RTD-1在大鼠降植烷诱导的关节炎(PIA)中的作用。如文本中所描述的，PIA在DA大鼠中被诱导，并被随机化以接受每天静脉注射盐水(Ν=10)或5mg/kg RTD-1(N=11)。评价和评分宏观病理学(20)。每个符号代表个体动物的宏观病理学得分。在所有情况中，RTD-1治疗引起关节疾病的消除，其伴随正常移动的恢复。 

详细描述

本文引用的所有参考以其全部通过引用被并入，好像完全列出。除非另外定义，本文所用的技术和科学术语具有与发明主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同意思。Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology3^rd ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY 2001);March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure5^th ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY2001);和Sambrook and Russel,Molecular Cloning:A Laboratory Manual3rd ed..Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,NY2001)；提供给本领域技术人员本申请中使用的许多术语的一般指导。 

本领域技术人员将认识到与本文描述的方法和材料相似或相等的许多方法和材料可用于要求保护的发明的实施。实际上，本发明主题不应被解释为限于所描述的方法和材料。为了本目的，下面定义以下术语。 

除非上下文指示相反，本文列出的所有范围应被解释为包括它们的端点，并且开放式的范围应被解释为包括商业上实用的值。相似地，值的所有列出应被认为包括中间值，除非上下文指示相反。 

如本文所用，术语或"θ-防御素"包括防御素蛋白的θ-防御素家族成员，如在多种灵长类物种，如旧大陆猴和猿类(实例是恒河猴、东非狒狒（olive baboon）、合趾猿和猩猩)中所发现的，其中θ-防御素前体被转录地表达和通过翻译后修饰加工成θ-防御素。这进一步包括在类人猿(实例 是人、黑猩猩、倭黑猩猩和大猩猩)中发现的假基因，其中θ-防御素假基因的遗传修饰可根据本领域容易知道的技术来改变，以允许在哺乳动物细胞中表达θ-防御素蛋白。这还包括根据本领域容易知道的技术，如描述核酸和/或氨基酸序列比较窗中序列同源性或保守结构的计算机模建技术、或利用核酸探针识别同源θ-防御素的选择性杂交技术，可在相同或不同物种中鉴定的θ-防御素蛋白。θ-防御素可从内源的来源分离，在自体或异种细胞系中产生，通过肽合成或根据本领域技术人员已知的任何可用的方法产生。θ-防御素的实例包括RTD-1、RTD-2、RTD-3、RTD-4、RTD-5、RTD-6、BTD-1、BTD-2、BTD-3、BTD-4、BTD-5、BTD-6、BTD-7、BTD-8、BTD-9、BTD-10或HTDp。 

“脱落酶”，如本文所用，包括分裂跨膜蛋白的胞外部分的酶蛋白。实例包括解联蛋白和金属蛋白酶蛋白家族(ADAM)、天冬氨酸蛋白酶(BACE)蛋白家族的成员等。 

是脱落酶的ADAM蛋白的实例包括ADAM2、ADAM7、ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM11、ADAM12、ADAM15、ADAM17、ADAM18(也称作ADAM27)、ADAM19、ADAM20、ADAM21(也称作ADAM31)、ADAM22、ADAM23、ADAM28、ADAM29、ADAM30和ADAM33。 

术语“类似物”，如本文用于θ-防御素，是含有源自防御素，如θ-防御素的核心结构的多肽和肽，其能够调节细胞因子活性、抑制蛋白水解的脱落酶活性、改变与细胞表面受体相关的酶功能、和/或具有抗微生物活性。实例包括含有跨多个半胱氨酸残基的一、二、三、四或更多个二硫键或基本上相似的取代基的环状肽，其中类似物长度范围可以是8-24个氨基酸，并含有净正电荷。 

防御素是小的富含半胱氨酸的阳离子蛋白质，其在进化上高度保守，如在脊椎动物、无脊椎动物以及植物中所发现的。这些蛋白质具有抗广谱生物体如细菌、真菌和多种有包膜和无包膜病毒的生物学活性。一般，防御素由18-45个氨基酸组成，包括6(在脊椎动物中)至8个保守的半胱氨酸残基。多种免疫细胞，如中性粒细胞和几乎所有上皮细胞，含有这些肽作为宿主细胞，主要功能是杀死吞噬的或胞外微生物。许多防御素 通过结合到微生物细胞膜起作用，并且，一旦被包入，就形成孔样膜缺陷，其允许必要的离子和营养素流出以破坏微生物完整性。然而，如本文所进一步描述的，防御素蛋白的某些成员，包括θ-防御素，也通过宿主细胞免疫功能的调节而起作用。这包括细胞因子相关的炎性途径如TNF-α。 

通常的防御素。防御素是阳离子的、含有三个二硫化物的抗微生物肽，其由白细胞和多种上皮产生。它们被再分成α-、β-、θ-防御素亚家族——其通过肽大小和不同的二硫化物基序区分。在人类中，四种α-防御素(HNP-1至HNP-4)已从嗜中性粒细胞分离，两种肠α-防御素(HD-5和HD-6)在小肠隐窝中由帕内特细胞表达。HD-5的表达也已在女性泌尿生殖道中被检测到。三种人β-防御素(hBD-1至hBD-3)已从多种器官的上皮和非上皮细胞类型中分离，并且几种其它防御素的表达已通过cDNA分析或从人基因组的分析而推论出。许多证据提示防御素在皮肤、呼吸上皮、泌尿生殖道和多种白细胞(即，嗜中性粒细胞、单核细胞和NK细胞)中提供抗微生物效应器作用。此外，防御素激活在先天和适应性免疫应答中涉及的细胞，提示它们在免疫的两个分支内起作用和连接免疫的两个分支。 

大环θ-防御素。θ-防御素是环状十八肽，其通过源自76-氨基酸α-防御素相关的前体的两个九肽的翻译后剪接而形成。人类不表达θ-防御素肽，因为由于在肽前体中引入未成熟终止密码子的突变，θ-防御素的表达在接近进化中猩猩出现的时间停止了。 

θ-防御素可利用源自θ-防御素前体的两个9-氨基酸序列的头尾剪接而被生物合成，θ-防御素首先在恒河猴的嗜中性粒细胞和单核细胞中被鉴定，随后的系统发生研究揭示θ-防御素基因在其它旧大陆猴和两种猿(合趾猿和猩猩)中的存在，但是θ-防御素在新大陆猴或原猴中的存在尚未被报道。人类、黑猩猩、倭黑猩猩和大猩猩表达θ-防御素假基因，其中前体mRNA含有在信号序列中产生终止密码子的突变，因此阻止θ-防御素前体的翻译。恒河猴θ-防御素-l(RTD-1)从两个θ-防御素前体——proRTDla和proRTDlb——的杂二聚体剪接产生。包括proRTDla和proRTDlb的同型二聚体切除/连接反应由RTD-2和RTD-3的分离显示。 RTD-1、-2和-3具有有效的抗细菌和真菌的杀微生物活性，并已知具有抗人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)和单纯疱疹病毒(HSV)的抗病毒活性。 

我们基于具有抗细菌和抗病毒活性的天然θ-防御素的序列产生了合成的θ-防御素设计。此外，据报道θ-防御素结合和灭活来自炭疽杆菌（Bacillus anthracis）的致死毒素。θ-防御素在存在生理学浓度的盐、二价阳离子和血清的情况下是杀微生物的。相反地，α-和β-防御素的抗微生物活性在存在盐和二价阳离子的情况下明显降低。无环RTD-1在生理盐水中对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是无活性的，而天然的环状形式的肽在这些条件下保持有效的杀伤活性。这些数据表明θ-防御素的环状主链结构赋予盐不敏感性，同时提供能在生理学相关的条件下能够保持有效生物学活性的稳定分子。 

θ-防御素的抗微生物活性。原型的θ-防御素肽是恒河猴θ-防御素-1(RTD-1)，18-氨基酸的大环肽(22)。如所描述的，成熟的肽通过独特的过程产生，借此源自截短的α-防御素样前体的两个9-氨基酸肽被头尾剪接，形成由三个二硫化物稳定的大环分子(图1)。产生成熟大环θ-防御素的生物合成途径是新的。恒河猴(22,23,25)和东非狒狒(9)分别表达3和4种θ-防御素前体。每种前体贡献独特的九肽，在所有二元组合中该九肽与相同(同型二聚体剪接)或不同(杂二聚体剪接)九肽配对。这使得能够产生6种独特的短尾猴θ-防御素和10种狒狒θ-防御素。本发明人已分离了所有六种预测的短尾猴肽(23)和已分离了七种狒狒中预测的那些(9)。 

与其它防御素，如α-防御素相似，θ-防御素被包装进短尾猴和狒狒嗜中性粒细胞的初级颗粒中并还在单核细胞中表达(23)。当微生物被嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞吞噬时，防御素被动员到吞噬体，它们在那里作为杀微生物剂参与细胞内杀伤。θ-防御素在微摩尔浓度是针对革兰阳性细菌、真菌的杀微生物剂(9,22,25)并抑制细胞摄取HIV-1(5,6,27,28)。利用特异性中和抗体，发明人已证明θ-防御素是形成体外抵抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌（C.albicans）(23)的短尾猴嗜中性粒细胞的多数颗粒来源的抗微生物活性的原因。而且，θ-防御素显示是形成与来自人嗜中性颗粒(23)提取物相比短尾猴PMN颗粒提取物优良杀伤活性的原因。在人类全身炎症(例如，败血症)期间，α-防御素以定向和/ 或偶然的方式被释放到胞外空间(2,18)。狒狒θ-防御素(22)被相似地释放到菌血症动物的血浆中。进一步，胞外θ-防御素显示具有通过在从啮齿类到人类范围的物种中有效的抗炎机制调节炎症的能力，如本文所进一步描述的。因此，θ-防御素和源自θ-防御素结构的肽代表重要的一类免疫功能调节剂。 

TNF-α和炎症。肿瘤坏死因子α(“TNF-α”，也称作恶病质或恶病质素)是参与全身炎症的细胞因子并且是刺激急性期反应的一群细胞因子的成员。 

TNF-α在免疫细胞的调节中发挥主要作用，包括凋亡细胞死亡的诱导、炎症的促进、肿瘤发生和病毒复制的抑制。已知TNF-α活性的宽范围作用，不令人惊讶地发现TNF-α表达、产生和发信号的调节异常已牵涉许多种人类疾病，包括类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病、结核病、克罗恩氏病等等。 

TNF-α信号转导首先被产生为26kDa、212-氨基酸-长的II型跨膜蛋白，该跨膜蛋白在成熟期间插入细胞膜中。在细胞表面，膜结合的TNF-α(“pro-TNF-α”)是生物学上有活性的，并能通过邻分泌细胞间信号转导而引起免疫应答。然而，pro-TNF-α可在其Ala76-Val77酰胺键处通过金属蛋白酶TNF-α转化酶(“TACE”，也称作ADAM17)进行蛋白水解分裂。从该细胞膜整合形式，可溶的17kDa胞外结构域(胞外结构域)——通常称作TNF-α——被释放，这在旁分泌信号转导中具有关键的重要性。 

一般，现存的靶向TNF-α活性的治疗策略已集中于提供抗可溶的和/或跨膜结合形式的TNF-α的抗体以阻止受体结合，或产生可溶的杂合融合受体以中和循环TNF-α水平。尽管这些治疗方法具有重要益处，但是几乎1/3的患者不响应任何形式的抗TNF-α治疗，同时已报道几种不良作用，包括免疫原性、感染、迟发的超敏反应型反应和自身免疫疾病如药物引起的狼疮和脱髓鞘。 

TACE和脱落酶活性。如所描述的，TNF-α信号活性中的关键步骤是膜结合形式的蛋白质释放成可溶形式的循环TNF-α，如TACE所催化的，称作"脱落"的过程。TACE——由824个氨基酸组成的70-kDa蛋白质——属于解联蛋白和金属蛋白酶（A Distintegrin And Metalloproteinase） 的ADAM蛋白家族。ADAM蛋白家族成员具有进化上保守的结构和可溶的胞外结构域从膜结合的蛋白原（pro-protein）分裂和释放的功能性能力。假定TNF-α在炎症过程中作为有效和重要介质的作用，作为TACE抑制剂起作用的环状肽将提供对目前抗TNF-α剂的重要替代物，如抗体或基于可溶性受体的组合物。 

另外，TNF-α和TACE只代表几种潜在的环状肽治疗活性的治疗靶中的两种，假定跨几种不同蛋白质的“脱落”活性的宽度和多样性，如许多不同疾病状态和/或状况中所牵涉的。TACE和其它ADAM家族分子组成更大的“脱落酶”家族的大多数成员。然而，其它脱落酶包括天冬氨酸蛋白酶(BACE)蛋白家族的成员。除了脱落酶类型的宽度，脱落酶活性的功能与以下方面不同：通过跨膜蛋白受体胞外结构域(例如，Her2)的分裂的信号激活，或跟随结合受体的激动剂以允许释放的激动剂进一步刺激另一受体(例如，EGFR)。由于在赋予和传播信号功能中的这种重要作用，脱落酶活性的抑制提供重要的治疗策略，打开新的治疗途径，还使现存药物治疗的效力加强。例如，Her2的ADAM10脱落酶分裂导致具有组成型激酶活性的Her2片段，和给增殖细胞的不依赖配体的生长和存活信号。该过程的有害作用可通过曲妥珠单抗(赫赛汀)施用和ADAM10脱落酶活性的抑制而阻止(30,31)。因此，环状肽可用于限制与免疫功能相关的有害的细胞因子活性，同时打开对疾病如癌症、或涉及脱落酶功能失调的其它疾病和/或状况的甚至更宽的治疗机会。θ-防御素——具有内源的脱落酶抑制活性——的该方面可解释人类对象中许多自身免疫、炎性疾病和其它疾病状况，这是由于灵长类进化期间θ-防御素表达的丧失。因此，θ-防御素和源自多种θ-防御素结构的环状肽可用作遭受与金属蛋白酶调节异常相关的疾病和状况痛苦的人类对象中的相容性治疗剂。 

在各种实施方式中，本发明主题提供环状肽。在一类实施方式中，环状肽是防御素、其类似物或衍生物。在另一类实施方式中，环状肽是α-防御素、β-防御素、θ-防御素、其类似物或衍生物。在另一类实施方式中，环状肽是θ-防御素、其类似物或衍生物。 

在另一类实施方式中，θ-防御素是在灵长类中内源地表达。在另一类 实施方式中，θ-防御素在恒河猴中内源地表达。在另一类实施方式中，θ-防御素是RTD-1、RTD-2、RTD-3、RTD-4、RTD-5或RTD-6。在另一类实施方式中，θ-防御素在东非狒狒中内源地表达。在另一类实施方式中，θ-防御素是BTD-1、BTD-2、BTD-3、BTD-4、BTD-5、BTD-6、BTD-7、BTD-8、BTD-9或BTD-10。在另一类实施方式中，θ-防御素在人类中内源地表达。在另一类实施方式中，θ-防御素是人θ-防御素假基因(HTDp)。在另一类实施方式中，θ-防御素在合趾猿或猩猩中表达。 

在另一类实施方式中，θ-防御素从哺乳动物分离。在另一类实施方式中，θ-防御素从灵长类分离。在另一类实施方式中，θ-防御素从人类分离。在另一类实施方式中，θ-防御素从获自哺乳动物的生物样品纯化。在另一类实施方式中，θ-防御素从获自灵长类的生物样品纯化。在另一类实施方式中，θ-防御素从获自人类的生物样品纯化。 

在另一类实施方式中，环状肽的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个氨基酸。在另一类实施方式中，环状肽的长度超过24个氨基酸。在具体实施方式中，环状肽的长度是14个氨基酸。在另一类实施方式中，环状肽含有至少2个形成一个二硫键的半胱氨酸残基。在另一类实施方式中，环状肽含有4个形成2个二硫键的半胱氨酸残基。在另一类实施方式中，环状肽含有6个形成3个二硫键的半胱氨酸残基。在另一类实施方式中，环状肽包括合成的氨基酸。在另一类实施方式中，环状肽具有净正电荷。在另一类实施方式中，环状肽可由与SEQ.NO.1、SEQ.NO.2、SEQ.NO.3、SEQ.NO.4、SEQ.NO.5、SEQ.NO.6和/或SEQ.NO.7具有小于约20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或更多百分比同一性的多核苷酸编码。本领域普通技术人员可根据本领域已知的方法建立百分比同一性，包括建立参考序列和第二多核苷酸序列之间的比较窗，以建立百分比同一性的程度。 

在另一类实施方式中，环状肽调节炎症。在另一类实施方式中，环状肽调节细胞因子和/或趋化因子的活性。在另一类实施方式中，环状肽调节TNF-α的活性。在另一类实施方式中，环状肽通过与解联蛋白和金属蛋白酶家族成员的竞争性抑制来调节TNF-α的活性。在另一类实施方 式中，解联蛋白和金属蛋白家族的成员是脱落酶。在另一类实施方式中，脱落酶是TACE。在另一类实施方式中，脱落酶是ADAM10。在另一类实施方式中，环状肽能调节蛋白水解酶活性。在另一类实施方式中，环状肽能抗微生物杀伤。 

在各种实施方式中，本发明主题提供利用环状肽治疗炎性疾病和/或状况的方法，包括以下步骤：提供大量环状肽；将该量的环状肽施用给需要治疗炎性疾病和/或状况的对象，其中环状肽能调节炎症，由此治疗对象。在另一类实施方式中，环状肽是θ-防御素、其类似物或衍生物。在另一类实施方式中，θ-防御素是RTD-1、RTD-2、RTD-3、RTD-4、RTD-5、RTD-6、BTD-1、BTD-2、BTD-3、BTD-4、BTD-5、BTD-6、BTD-7、BTD-8、BTD-9或BTD-10。在另一类实施方式中，环状肽的长度是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个氨基酸。在另一类实施方式中，环状肽的长度超过24个氨基酸。在另一类实施方式中，环状肽的长度是14个氨基酸。在另一类实施方式中，环状肽含有至少2个形成一个二硫键的半胱氨酸残基。在另一类实施方式中，环状肽含有至少4个形成两个或更多个二硫键的半胱氨酸残基。在另一类实施方式中，施用的环状肽的量是环状肽的治疗有效量。在另一类实施方式中，对象是哺乳动物。在另一类实施方式中，对象是人。 

在各种实施方式中，炎性疾病和/或状况是急性或慢性炎症或自身免疫疾病。在另一类实施方式中，炎性疾病和/或状况涉及细胞因子或趋化因子的活性。在另一类实施方式中，炎性疾病和/或状况涉及TNF-α的活性。在另一类实施方式中，炎性疾病和/或状况是类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、炎性肠疾病、溃疡性结肠炎、小肠结肠炎、银屑病、牛皮癣关节炎、克罗恩氏病、贝赫切特氏病、狼疮、化脓性汗腺炎、难治性哮喘、结肠炎、皮炎、憩室炎、肝炎、肾炎、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、充血性心脏病、动脉粥样硬化、葡萄膜炎和变态反应。 

在各种实施方式中，本发明主题进一步提供利用环状肽提高炎性疾病和/或状况治疗效力的方法，包括以下步骤：提供大量环状肽；将该量的环状肽施用给接受炎性疾病和/或状况治疗的对象，其中环状肽能提高炎性疾病和/或状况治疗的效力，由此提高治疗的效力。在另一类实施方 式中，环状肽与能治疗炎性疾病和/或状况的组合物同时施用。在另一类实施方式中，环状肽与能治疗炎性疾病和/或状况的组合物的施用相继施用、在能治疗炎性疾病和/或状况的组合物的施用之前或之后施用。在另一类实施方式中，对象是哺乳动物。在另一类实施方式中，对象是人。 

在各种实施方式中，本发明主题进一步提供利用环状肽治疗对象中疾病和/或状况的方法。在另一类实施方式中，疾病和/或状况是癌症或神经变性疾病。在各种实施方式中，本发明主题进一步提供利用环状肽提高疾病和/或状况治疗效力的方法。在另一类实施方式中，环状肽与能治疗疾病和/或状况的组合物同时施用。在另一类实施方式中，环状肽与能治疗疾病和/或状况的组合物的施用相继施用、在能治疗疾病和/或状况的组合物的施用之前或之后施用。在优选实施方式中，对象是哺乳动物，并且在特别优选的实施方式中，对象是人。 

在各种实施方式中，本发明主题进一步提供药物组合物。在另一类实施方式中，药物组合物包括环状肽和药学上可接受的载体。在另一类实施方式中，环状肽是θ-防御素、其类似物或衍生物。在另一类实施方式中，θ-防御素是RTD-1、RTD-2、RTD-3、RTD-4、RTD-5、RTD-6、BTD-1、BTD-2、BTD-3、BTD-4、BTD-5、BTD-6、BTD-7、BTD-8、BTD-9或BTD-10。在另一类实施方式中，环状肽的长度是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个氨基酸。在另一类实施方式中，环状肽的长度是14个氨基酸。在另一类实施方式中，环状肽的长度超过24个氨基酸。在另一类实施方式中，环状肽含有至少2个形成一个二硫键的半胱氨酸残基。在另一类实施方式中，环状肽含有至少4个形成两个或更多二硫键的半胱氨酸残基。在另一类实施方式中，药物组合物中的环状肽包括治疗有效量的细胞周期蛋白肽。在另一类实施方式中，药物组合物包括一种或多种环状肽和药学上可接受的载体。 

在各种实施方式中，本发明主题进一步提供制造环状肽的方法。在另一类实施方式中，该制造方法包括以下步骤：提供一个或多个编码环状肽的多核苷酸；在宿主细胞中表达一个或多个多核苷酸和从宿主细胞提取环状肽。在另一类实施方式中，制造方法包括以下步骤：在宿主细胞中表达一个或多个多核苷酸和从宿主细胞提取环状肽。在另一类实施 方式中，一个或多个多核苷酸包括SEQ.NO.1、SEQ.NO.2和/或SEQ.NO.3。在另一类实施方式中，一个或多个多核苷酸包括SEQ.NO.4、SEQ.NO.5、SEQ.NO.6和/或SEQ.NO.7。 

在另一类实施方式中，环状肽是θ-防御素、其类似物或衍生物。在另一类实施方式中，θ-防御素是RTD-1、RTD-2、RTD-3、RTD-4、RTD-5、RTD-6、BTD-1、BTD-2、BTD-3、BTD-4、BTD-5、BTD-6、BTD-7、BTD-8、BTD-9或BTD-10。在另一类实施方式中，环状肽的长度是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个氨基酸。在另一类实施方式中，环状肽的长度是14个氨基酸。在另一类实施方式中，环状肽含有至少2个形成一个二硫键的半胱氨酸残基。在另一类实施方式中，环状肽含有至少4个形成两个或更多二硫键的半胱氨酸残基。在另一个实施方式中，制造方法包括利用液相合成或固相合成的肽合成步骤。在另一类实施方式中，固相合成是Fmoc或BOC合成。 

本文考虑的组合物的制造可以任何合适的方式实现，包括例如利用表达载体。本领域普通技术人员可选择合适的表达载体，并将认识到存在大量的选择。这些载体中的许多利用病毒启动子。细胞系的许多选择适合宿主细胞，包括例如，细菌、酵母、昆虫细胞和植物。 

实施例

实施例1-多效的θ-防御素的独特性质和抗炎性质

θ-防御素通过在介导其自己摄取的细胞包膜中产生小孔而杀死大肠杆菌细胞(24)。在该研究中，发明人作出了值得注意的发现，与许多α-和β-防御素不同，θ-防御素对宿主细胞无毒(24)并且可通过多种途径施用给小鼠(29)。从这一点上，小鼠容易耐受至少80mg/kg剂量的三种不同θ-防御素的静脉注射施用。发明人还以渐升的静脉注射剂量(3mg/kg最大值)将RTD-1施用给两只成年黑猩猩。在所有注射后，在任何点都未观察到临床毒性，并且所有的临床化学和血液学实验室值都在正常范围内。动物都没有产生对RTD-1的抗体，由此显示显著缺少毒性和跨不同哺乳动物物种的免疫原性。基于这些和其它数据，测试RTD-1在盲肠结扎和刺穿(CLP)引起的严重败血症模型中的效力(12)。如图2所示，当肽在CLP 手术之后4或24h施用时，单次注射RTD-1(5mg/kg)显著减少BALB/c小鼠的死亡(P<0.01，在第4和第7天)。存活者在第7天到第15天——在此时间将它们处死——在临床上是正常的。θ-防御素在CLP-败血症中的该治疗作用是高度可再现的(N=5次实验)。然而，θ-防御素的高度有效性提示RTD-1在该模型中的效力不是主要由抗菌作用介导的，因为多菌败血症中的微生物是巨大的。相反，认为显示的治疗作用的效力将通过抗炎机制进一步介导。为了探究这种可能性，发明人进行了另外的实验，其中CLP小鼠的RTD-1治疗伴随多种血清促炎细胞因子，包括TNF-α、IL-6和MIF的显著减少。 

其它研究已证明天然的(10,15)或设计的(11)AMPs在啮齿动物败血症模型中是有效的。在每种情况中，明显的保护机制是肽与细菌LPS的结合，由此防止与宿主细胞蛋白(LPS结合蛋白)或受体(TLR-4、CD14)的相互作用。从这一点上，几乎所有分析的AMPs已显示结合和中和LPS，支持这是介导它们抗败血症活性的主要机制的结论(19)。 

然而，θ-防御素在直接中和LPS中的有效性较小，活力较在中和内毒素中的多粘菌素B小100倍。相反，如下面所讨论的，研究显示θ-防御素具有几种有用的能力，包括通过与宿主细胞相互作用调节炎症的主要方法。该发现与较早的研究——其中评价RTD-1在SARS-冠状病毒(SARS-CoV)肺炎的小鼠模型中的效力(29)。在该研究中，发明人发现RTD-1的鼻内施用在防止病毒感染的小鼠死亡中100%有效。重要地，RTD-1不是针对SARS-CoV杀病毒的。然而，肽施用减少肺部炎症和几种促炎细胞因子的表达，由此提示治疗作用是通过RTD-1的抗炎性质介导。不受任何具体理论的束缚，本发明人的θ-防御素调节宿主对促炎刺激的反应的信念通过进一步实验验证，该实验显示RTD-1在大鼠中降植烷诱发的关节炎(图9；下面讨论)和胶原诱发的关节炎中是治疗有效的。 

实施例2-RTD-1活性通过宿主细胞相互作用而不是抗微生物作用介导。 

几行数据显示原型的θ-防御素，RTD-1，通过与宿主细胞相互作用而 不是通过抗微生物作用发挥其抗炎作用(29)。这些发现导致进一步的实验——通过用大肠杆菌或金黄色葡萄球菌刺激的人全血评价RTDs对TNF-α产生的作用。代表性的实验，图4(B&C)中所示，显示RTDs1-5(图4A)抑制大肠杆菌引起的TNF-α释放；注意，即使在不同θ-防御素之中，在它们之间存在显著不同的抑制效力。在用金黄色葡萄球菌的实验中获得相似的结果。在对照实验中，基于显示肽不改变ELISA标准曲线和免疫测定只检测有活性的三聚体TNF-α的结果，发明人发现与许多其它防御素不同，θ-防御素不直接与TNF-α蛋白相互作用。这些和其它实验的结果提示RTD-1在CLP败血症中的保护作用(图3)是由于免疫调节活性而不是抗微生物作用。遵循该结果，发明人用针对TLRs1-9的激动剂刺激人外周血白细胞(PBL)4h，同时添加或没有添加10μg/ml RTD-1。如图5所示，PBLs与RTD-1的共同温育显著降低由针对TLR2、4、5和8的激动剂引起的TNF-α释放。此外，RTD-1还抑制每种激动剂刺激的IL-Ιβ和IL-6的释放，并且IL-8在除了存在TLR2激动剂的情况外的所有诱导中被强烈抑制。RTD-1基本上对未刺激的细胞没有作用(图5，上面的左图)。RTD-1治疗对MCP-1水平的作用不同。发明人在分析中包括该趋化因子，因为在鼠SARS肺炎中，RTD-1显著减少肺MCP-1水平(29)。这与RTD-1对用病毒ssRNA刺激的PBLs的作用一致(图5,)。最后，发明人进一步发现RTD-1以剂量依赖的方式抑制用产生肠毒素的金黄色葡萄球菌先体外后体内刺激的人PBMCs的IL-17A的表达(>85%减少)。 

实施例3-θ-防御引起的TACE抑制

由于这些结果显示θ-防御素介导的对由细菌(图4)、多种TLR激动剂(图5)和动物中测量的TLR激动剂(参见上面)引起的TNF-α的抑制，一个可能的作用机制是TNF-α转化酶的活性可被θ-防御素拮抗。该TNF-α转化酶(“TACE”，也称作ADAM17，ADAM(解联蛋白和金属蛋白酶)家族的成员)，是形成膜结合的TNF-α释放的释放原因的脱落酶。令人惊讶地，发明人发现RTD-1是重组TACE(rTACE)的有效的抑制剂，具有～0.1μg/ml(48nM)的IC50。注意，人α-防御素(HNP-2、HNP-4)都不抑制rTACE(图6A)，使θ-防御素的活性在防御素之中独特。测试天然θ-防御素(RTD1-5； 图4A中的结构)的相对抑制活性并发现在IC50值的～10倍范围内变化(图6B)。注意，RTD1-5引起的TACE抑制的分层与人血中的肽引起的TNF-α抑制非常相关(图4C)。RTD-1引起的TACE抑制没有被与TACE的15min预温育增强，该发现提示迅速结合和竞争性抑制。这通过酶动力学数据的双倒数图分析证实(图6C)，指示RTD-1充当TACE的假底物。测试RTD-1的开链类似物(S-7；图6D)的TACE抑制并发现具有小于约20%的RTD-1活性，指示环状构造对于有效的TACE抑制是必要的(图6E)。 

TACE的抑制在基于细胞的试验中被进一步证实。利用改良的Alvarez-Iglesias等描述的分析(1)，显示RTD-1抑制在静息和LPS刺激的THΡ-1细胞中表达的TACE(图6F)。基于细胞的试验中对RTD-1获得的IC50是～15μg/ml(7.4μΜ)。这有利地与对THP-1细胞的TACE阻断的研究中小分子TACE抑制剂GM6001的IC50(5.5+/-3μΜ)进行比较(1)。 

实施例4-θ-防御素抑制ADAM10

多种ADAMs已作为释放锚定膜的生长因子、细胞因子和受体的调节性脱落酶被牵涉(3)。因为ADAMs在包括炎症和癌症的调节在内的许多关键生物过程中被牵涉，ADAM抑制剂的鉴定是激烈的研究领域。发明人确定天然的θ-防御素RTD1-3抑制ADAM10(图7)，具有与TACE抑制观察到的大约相同的IC50(参见图6)。因此，θ-防御素是至少两种ADAMs的金属蛋白酶抑制剂。 

实施例5-通过微小θ-防御素的抗-TNF-α和TACE抑制

天然和修饰的θ-防御素的结构-活性分析提示预测介导这些肽的抗炎作用的某些序列特征。作为实例，三种十四肽(微小-θ-防御素)被设计含有认为对天然θ-防御素的抗炎性质重要的特征。将这些并入到图8A显示的肽的序列中。评价每种肽在鼠CLP败血症中的效力。如图8B所示，与PBS假治疗相比，所有三种微小θ-防御素减少小鼠的致死率。发明人进一步评价每种微小6-防御素对来自刺激的人血的TNF-α释放的作用(图8C)和其对TACE的抑制活性(图8D)。如图8中的数据所示，微小θ-防御素具有与CLP试验(与图3比较)、TNF-α抑制试验(图8C)或TACE抑制 试验(图8D)中的RTD-1相似或更好的活性。 

成熟的θ-防御素肽RTD-1是两股β-片层，其如同α-和β-防御素，由三个二硫化物稳定。然而，RTD-1二硫化物排列的平行定位允许围绕其短轴的基本的灵活性。与α-和β-防御素不同，RTD-1缺少两亲的拓扑学，不受任何理论束缚，这和其它相似的结构差异可解释与θ-防御素相比独特的免疫调节能力。 

实施例6-θ-防御素在大鼠降植烷诱导的关节炎(PIA)中的效力

如果θ-防御素对TNF的体外或先体外后体内阻断对肽的抗炎作用是重要的，那么发明人认为它应当调节已知由TNF-α驱动的疾病过程。发明人继续测试RTD-1对具有确定的PIA的大鼠的作用。在代表性的实验(N=3)中，用0.3ml降植烷在0天皮下注射成年Dark Agouti(DA；OlaHsd品系)大鼠(N=21)，如Vingsbo等所描述的(26)。在临床疾病的第一征兆(14-21天；基于Brand等参考(4)的宏观病理学等级，动物交替地分配到盐水(N=10)或RTD-1治疗(N=11)组。盐水(0.2-0.25ml)或RTD-1(在0.2-0.25ml盐水中5mg/kg)的盲法施用每天通过尾静脉注射进行，持续达14天，除非关节炎严重性(三个观察者每天盲法评分，持续达36天)回到更早的零(在盐水组中N=1；在RTD-1组中N=8)。RTD-1处理的动物在第7天开始具有统计学上显著的(通过不成对双尾学生T检验，*=p≤0.05)关节病理学减少；图9。该模型还通过相同的RTD=1剂量和制剂的皮下注射来证明效力。治疗停止之后，在至少45天没有疾病复发的迹象。 

实施例7-θ-防御素是高度稳定的

将θ-防御素RTD-1在室温以50μg/ml在人血浆、人血清或50mg/ml人血清白蛋白中温育72小时。进行定量HPLC分析，其显示超过95%的肽在每种测试条件下都未改变。而且，θ-防御素对在低(～pH2.5)或中性(pH7.4)条件下长时间储存是稳定的。 

总之，θ-防御素具有抗炎性质，其通过阻断促炎蛋白酶如TACE和其它金属蛋白酶介导。它们在传染性和非传染性炎性疾病的动物模型中是有效的，当全身施用时被良好耐受，并且不产生免疫性。此外，与其它抗炎剂不同，θ-防御素物是非免疫抑制的。 

药物组合物、剂量、剂量形式和施用途径

根据本发明主题的组合物可利用多种途径施用，包括经口、肠胃外、吸入、局部、经直肠、经鼻或通过植入的药盒，其中术语“肠胃外”如本文所用包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、鞘内、肝内、病灶内（intralesional）和颅内施用(通常注射或输注)。优选，组合物经口、皮下、腹膜内或静脉内施用。 

例如，考虑的化合物的无菌可注射形式可以是水溶液或油状悬浮液。这些悬浮液可根据本领域已知的技术利用合适的分散或湿润剂和悬浮剂来配制。无菌可注射的制剂还可作为无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为1,3-丁二醇中的溶液，而被制备。在其它可接受的载体和溶剂之中，特别考虑的液体包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的、不挥发性油可用作共溶剂或悬浮介质(例如，天然或合成的一脂酰甘油酯或二脂酰甘油酯)。还可利用脂肪酸，合适的脂肪酸包括油酸和它的甘油酯衍生物、橄榄油、蓖麻油，特别是以它们的聚氧乙烯化形式。这样的油性溶液或悬浮液可进一步含有长链醇稀释剂或分散剂。 

在另一个实例中，考虑的化合物可以以任何经口可接受的剂型——包括胶囊、片剂、水混悬液或溶液——经口施用。在用于口服的片剂的情况中，所有药学上可接受的载体(例如，乳糖、玉米淀粉等)被认为是合适的。相似地，可加入多种润滑剂(例如，硬脂酸镁)。对于以胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当需要水混悬液口服时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，还可加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。 

考虑本发明主题的药物组合物可局部施用，特别是当治疗的靶包括局部施用容易进入的区域或器官，包括眼、皮肤、下部肠道的疾病，或 外科手术期间暴露的区域。存在许多本领域已知的局部制剂，并且所有这样的制剂都被认为适合用于本文。 

对于局部应用，期望的组合物可在合适的软膏——含有悬浮或溶解于一种或多种载体的活性成分——中配制。用于本发明主题的化合物的局部施用的载体包括矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。可选地，药物组合物可在合适的洗剂或膏剂——含有悬浮或溶解于一种或多种药学上可接受的载体的活性成分——中配制。合适的载体包括矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇（cetearyl alcohol）、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。 

根据本发明主题的药物组合物还可通过鼻气雾剂或吸入剂施用。利用苯甲醇或其它合适的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂、氟碳化合物和/或其它常规的增溶剂或分散剂，这样的组合物根据药物制剂领域熟知的技术来制备并且可作为盐水中的溶液被制备。 

关于组合物中考虑的化合物的量，应当认识到具体的量将通常取决于特定的制剂、活性成分和期望的目的。因此，应当认识到考虑的化合物的量将显著变化。然而，通常优选，化合物以最低有效量存在以递送治疗作用和/或体外和/或体内可看见。 

因此，在大多数优选的液体制剂中，考虑的化合物将以约20mg/ml至约30mg/ml的量，更通常地以约24mg/ml至约26mg/ml，和最通常地约25mg/ml的量存在。其中制剂是固体或凝胶，考虑的化合物将以约1mg/g至约100mg/g的量存在。关于剂量单位，通常考虑，所考虑的化合物以有效获得期望的治疗作用的剂量或以有效提供体外和/或体内可视化的剂量施用。 

对于人和非人哺乳动物，考虑的化合物的合适的剂量应是约1-10mg/kg的范围。 

在炎性疾病的治疗和/或预防中，通常优选，根据本发明主题的化合物或组合物以药学上可接受的方式配制。合适的制剂将优选包括用于注射进眼前房和/或眼后房，或用于注射进半规管、耳蜗和/或颞骨的骨迷路的液体制剂。可选地或另外，可植入的载体(例如，生物可降解的/溶解的) 可被配制以便载体包括治疗有效量的化合物或组合物，并且载体可以以控制的和预设的方式释放化合物或组合物。其它合适的载体之中，释放可以是时间依赖的和/或通过用一个或多个波长的光辐照而开始。 

考虑根据本发明主题的药物组合物包括至少一种考虑的化合物(例如，RTD-1-27、RTD-1-28和RTD-1-29中的一种或多种)和药学上可接受的载体。根据具体应用，应当认识到，制剂、途径和/或施用时间表可相当大地发生变化，并且通常考虑，特定的制剂、途径和/或施用不限于本发明主题。 

然而，应当理解，药物组合物的施用剂量将相当大地变化，并且具体剂量将至少部分取决于(a)有效获得期望的治疗反应的活性成分的量，(b)考虑的化合物制剂，(c)施用途径，(d)具体化合物的药物代谢动力学和药效性质，和(e)其它因素，包括正被治疗的患者的年龄、性别、重量、一般健康和先前的医疗史。本领域普通技术人员可容易确定和规定需要的药物组合物的有效量。例如，内科医师可开始以比期望的治疗作用正常需要的低的水平开始给患者服药，然后增加剂量直到获得期望的作用。 

通常考虑根据本发明主题的化合物可以用于肠胃外应用的制剂制备，并且特别考虑的肠胃外制剂将是用于注射的液体制剂。因此，适当的制剂将通常包括药学上可接受的溶剂(例如，无菌等渗水性或非水溶液)，和可作为分散相、悬浮液或乳状液而制备。可选地，肠胃外制剂还可作为试剂盒提供，该试剂盒包括考虑的化合物和在使用之前可重构成液体产品的其它组分。在进一步考虑的方面，根据本发明主题的化合物还可作为重组核酸以允许化合物在宿主细胞中表达的方式而被施用。例如，重组核酸可通过腺病毒载体、利用脂质或脂质体的转染、电穿孔或本领域熟知的其它方式提供给靶组织。 

可用于药物组合物的合适的水性和非水载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、和其合适的混合物、植物油、和可注射的有机酯，如油酸乙酯。适当的流动性可被保持，例如，通过使用涂覆材料，如卵磷脂，在分散相的情况种通过需要的粒度的保持，和通过表面活化剂的使用。最通常，合适的流体是无菌的和被缓冲以保持对活性成分的稳定性和注射部位或其它应用适当的pH。 

考虑的化合物可被制备为药学上可接受的盐(一种或多种)，其特别包括可存在于所考虑的化合物的酸性或碱性基团的盐。例如，天然是碱性的考虑的化合物可与多种无机和有机酸形成许多种盐。合适的酸将提供药学上可接受的阴离子，包括氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐（gentisinate）、延胡索酸盐、葡糖酸盐、葡糖二酸盐（glucaronate）、糖质酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、p-甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐（pamoate）[1,1-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐)]阴离子。相似地，天然是酸性的化合物可与多种药学上可接受的阳离子形成碱性盐，并且特别合适的阳离子包括碱金属或碱土金属离子(例如，钠和钾阳离子)。 

仍然进一步特别考虑，根据本发明主题的化合物还可被制备为前药，并且认为所有已知方式和类型的前药适合用于本文，只要这样的前药将增加在靶器官或靶细胞的药物(或前药的代谢产物)浓度。 

例如，其中化合物具有游离的氨基、酰氨基、羟基、硫代基或羧基，考虑这样的基团可用于共价地和可释放地结合将药物转化成前药的部分。因此，前药特别包括这样的那些，其中考虑的化合物与另一个可分裂的部分形成酯、酰胺或二硫键。这样的部分可辅助器官或细胞特异的药物递送。例如，羧基可被衍生以形成酰胺或烷基酯，其可包括醚、胺-和/或羧酸基团。利用半琥珀酸酯、磷酸酯、二甲基氨基乙酸盐和磷酰基氧甲氧羰基（phosphoryloxymethyloxycarbonyl），游离的羟基可被衍生，如D.Fieisher,R.Bong,B.H.Stewart,Advanced Drug Deliver40Reviews(1996)19,115所描述的。羟基和氨基的氨基甲酸盐前药也被包括，其是碳酸盐前药和羟基的硫酸酯。作为(酰氧基)甲基和(酰氧基)乙醚——其中酰基可以是烷基酯(任选地取代的)，或其中酰基是氨基酸酯——的羟基的衍生也是期望的(该类型的前药在R.P.Robinson et al.,J.Medicinal Chemistry(1996)39:p.l0中被描述)。 

仍然进一步，还应当认识到考虑的化合物可在细胞或细胞外区室中代谢，并且这样的代谢产物可显示相同或不同的药理学作用。例如，考 虑的化合物可被磷酸化并因此较母体化合物更有活性。另一方面，还原或糖基化可影响考虑的化合物的生物利用度。因此，考虑的化合物将不仅包括上面描述的那些，还包括其代谢产物。 

杂项

上面描述的各种方法和技术提供实现涉及本发明主题的方法的许多途径。当然，将理解，不必描述的所有目的或优势都可根据本文描述的任何具体的实施方式而获得。因此，例如，本领域技术人员将理解，方法可以以获得或优化如本文所教导的一个优势或一组优势的方式进行，而不必获得如可被本文教导或提示的其它目的或优势。本文提到许多种有利和不利的替代物。将理解，一些优选实施方式特别地包括一个、另一个或几个有利的特征，而其它实施方式特别地排除一个、另一个或几个不利的特征，而仍然其它实施方式通过包括一个、另一个或几个有利的特征而特别地减轻目前不利的特征。 

此外，技术人员将认识到来自不同实施方式的多种特征的适用性。相似地，上面讨论的各种要素、特征和步骤，以及对每个这样的要素、特征和步骤的其它已知等价形式可被本领域普通技术人员混合和匹配，以进行根据本文描述的原理的方法。各种要素、特征和步骤之中，在不同实施方式中一些将被特别包括，其它的被特别排除。 

虽然本发明主题已在某些实施方式和实施例的上下文中公开，但是本领域技术人员将理解，本发明主题的实施方式超过特别公开的实施方式延伸到其它可选的实施方式和/或应用和其修改和等价形式。 

许多变化和可选的要素已在本发明主题的实施方式中被公开。仍然进一步的变化和可选的要素对本领域技术人员将是明显的。这些变化，没有限制地是环状肽的来源，包括θ-防御素；制备、分离或纯化θ-防御素、其类似物和衍生物的方法；利用θ-防御素、其类似物和衍生物治疗多种疾病和/或状况的方法；本文使用的解决方案的技术和组合及应用；和通过本文的教导产生的产物的具体应用。各种实施方式可特别包括或排除这些变化或要素中的任何一个。 

在一些实施方式中，用于描述和要求保护某些实施方式的表达成分、性质如浓度、反应条件等的量的数将被理解为在一些实例中由术语"约"修饰。相应地，在一些实施方式中，书面的描述和所附权利要求中列出的数值参数是近似值，其可根据试图由具体实施方式获得的期望的性质而改变。在一些实施方式中，数值参数应根据报道的有效数字的数和通过应用普通的舍入技术而被解释。虽然列出一些实施方式的宽范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实施例中列出的数值被报道精确可用的。一些实施方式中呈现的可数值含有某些误差，其必然地由在它们各自的测试测量中发现的标准偏差产生。 

如本文描述和遍及所附的权利要求所用，“一(a)”、“一(an)”、“所述(the)”包括复数的指示物，除非上下文另外清楚地指示。同样，如本文描述所用，"in（在……中）"包括"in"和"on（在……上）"，除非上下文另外清楚地指示。 

本文的值的范围的描述仅意图充当个别地提到落进该范围的每个单独的值的速记法。除非部位另外指出，每个个体值被并入说明书，如同它在本文被个别描述。本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文另外指出或另外同上下文明显矛盾。本文关于某些实施方式提供的任何和所有实施例或示例性的语言(例如"如")的使用只是意欲更好地说明本发明主题，并不是对要求保护的发明的范围提出限制。说明书中没有语言应被解释为指示对要求保护的发明的实施必要的任何不要求保护的要素。 

本文公开的本发明主题的可选要素或实施方式的分组不被解释为限制。每组成员可被个别地提到和要求保护或与组的其它成员或本文发现的其它组分任意组合。为了方便和/或专利性的原因，组的一个或多个成员可包括在组中或从组中删除。当任何这样的包含或删除发生时，说明书在这里被认为含有如所修改的组，因此实现用于所附权利要求的马库什组的书面描述。 

本文描述了本发明主题的优选实施方式，包括本发明人已知的实现要求保护的发明的最好方式。读过前面的描述之后，那些优选实施方式的变化对本领域普通技术人员将是明显的。考虑技术人员可酌情利用这 样的变化，并且除了本文具体描述的，要求保护的发明可被另外实施。相应地，要求保护的发明被解释为包括描述的主题的所有修改和等价形式，如可适用的法律所允许的。而且，上面描述的要素以所有其可能变化的任何组合包括在相应的要求保护的发明里，除非本文另外指出或另外同上下文明显矛盾。 

此外，遍及本说明书，已对专利和印刷的出版物作出了很多参考。上面提到的参考和印刷的出版物中的每个以其全部通过引用被个别地并入本文。 

应当理解，本文公开的实施方式是示例性说明本发明主题的原理。因此，通过实例，但没有限制，本发明主题的可选的配置可根据本文的教导被利用。相应地，本发明主题的实施方式不被限制到如所精确显示和描述的那些。 

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.使药物组合物推向市场的方法，其中所述药物组合物包括θ-防御素、其类似物或衍生物，所述方法包括：

测定所述药物组合物关于在人类中的抗炎作用的效力；和

将所述药物组合物提供给市场以治疗炎性状况。

2.权利要求1所述的方法，其中所述药物组合物是RTD-1-27。

3.权利要求1所述的方法，其中所述药物组合物是RTD-1-28。

4.权利要求1所述的方法，其中所述药物组合物是RTD-1-29。

5.权利要求1所述的方法，其中测定效力的步骤包括发起关于药物组合物的毒性研究、效力研究和剂量-反应研究中的至少一个。

6.权利要求1所述的方法，其中测定效力的步骤包括依赖关于所述药物组合物的毒性研究、效力研究和剂量反应研究中的至少一个的另一个产生的数据。

7.权利要求1所述的方法，其中所述抗炎作用包括促炎蛋白酶的临床相关的抑制。

8.权利要求7所述的方法，其中所述促炎蛋白酶是肿瘤坏死因子α(TNF-α)-转化酶(TACE)。

9.权利要求1所述的方法，其中所述抗炎作用包括促炎蛋白酶的临床相关的抑制。

10.权利要求1所述的方法，其中所述抗炎作用包括脱落酶的临床相关的抑制。

11.权利要求1所述的方法，其中所述抗炎作用包括组织蛋白酶C的临床相关的抑制。

12.权利要求1所述的方法，其中所述将所述药物组合物提供给所述市场的步骤包括生产出售至少一千克所述药物组合物。

13.权利要求12所述的方法，其中生产步骤包括制造所述至少一千克所述药物组合物。

14.权利要求1所述的方法，进一步包括包装在口服制剂中的所述药物组合物。

15.权利要求1所述的方法，其中所述炎性状况是蛋白水解介导的疾病。

16.权利要求1所述的方法，其中所述炎性状况包括类风湿性关节炎。

17.权利要求1所述的方法，其中所述炎性状况包括自身免疫疾病。

18.权利要求1所述的方法，进一步包括将所述药物组合物作为癌症的治疗推向市场。

19.权利要求1所述的方法，进一步包括将所述药物组合物作为神经变性疾病的治疗推向市场。

20.权利要求1所述的方法，进一步包括将所述药物组合物作为炎性肠病的治疗推向市场。

21.权利要求1所述的方法，进一步包括将所述药物组合物作为阿尔茨海默氏病的治疗推向市场。

22.权利要求1所述的方法，进一步包括将所述药物组合物作为骨关节炎的治疗推向市场。

23.权利要求1所述的方法，进一步包括将所述药物组合物推向市场以治疗对抗TNF-α治疗无反应者的人。

24.制造施用给动物以治疗慢性炎性状况的药物的方法，其中所述所述药物包括θ-防御素、其类似物或衍生物中至少一个。

25.权利要求24所述的方法，其中所述药物包括RTD-1-27、RTD-1-28和RTD-1-29中至少一个。

26.权利要求24所述的方法，其中所述药物有效产生促炎蛋白酶的临床相关的抑制。

27.权利要求26所述的方法，其中所述促炎蛋白酶是肿瘤坏死因子α(TNF-α)-转化酶(TACE)。

28.权利要求25所述的方法，其中所述药物有效产生促炎蛋白酶的临床相关的抑制。

29.权利要求24所述的方法，其中所述药物有效产生脱落酶的临床相关的抑制。

30.权利要求24所述的方法，其中所述炎性状况包括风湿性关节炎。

31.权利要求24所述的方法，其中所述炎性状况包括自身免疫疾病。

32.权利要求24所述的方法，进一步包括将所述药物组合物作为癌症的治疗推向市场。

33.权利要求24所述的方法，进一步包括将所述药物组合物作为神经变性疾病的治疗推向市场。

Claims (29)

1.使药物组合物推向市场的方法，其中所述药物组合物包括θ-防御素、其类似物或衍生物，所述方法包括：

测定所述药物组合物关于在人类中的抗炎作用的效力；和

将所述药物组合物提供给市场以治疗炎性状况。

2.权利要求1所述的方法，其中所述药物组合物是RTD-1-27。

3.权利要求1所述的方法，其中所述药物组合物是RTD-1-28。

4.权利要求1所述的方法，其中所述药物组合物是RTD-1-29。

5.权利要求1所述的方法，其中测定效力的步骤包括发起关于药物组合物的毒性研究、效力研究和剂量-反应研究中的至少一个。

6.权利要求1所述的方法，其中测定效力的步骤包括依赖关于所述药物组合物的毒性研究、效力研究和剂量反应研究中的至少一个的另一个产生的数据。

7.权利要求1所述的方法，其中所述抗炎作用包括促炎蛋白酶的临床相关的抑制。

8.权利要求7所述的方法，其中所述促炎蛋白酶是肿瘤坏死因子α(TNF-α)-转化酶(TACE)。

9.权利要求1所述的方法，其中所述抗炎作用包括促炎蛋白酶的临床相关的抑制。

10.权利要求1所述的方法，其中所述抗炎作用包括脱落酶的临床相关的抑制。

11.权利要求1所述的方法，其中所述抗炎作用包括组织蛋白酶C的临床相关的抑制。

12.权利要求1所述的方法，其中所述将所述药物组合物提供给所述市场的步骤包括生产出售至少一千克所述药物组合物。

13.权利要求12所述的方法，其中生产步骤包括制造所述至少一千克所述药物组合物。

14.权利要求1所述的方法，进一步包括包装在口服制剂中的所述药物组合物。

15.权利要求1所述的方法，其中所述炎性状况包括慢性炎性疾病。

16.权利要求1所述的方法，其中所述炎性状况包括类风湿性关节炎。

17.权利要求1所述的方法，其中所述炎性状况包括自身免疫疾病。

18.权利要求1所述的方法，进一步包括将所述药物组合物作为癌症的治疗推向市场。

19.权利要求1所述的方法，进一步包括将所述药物组合物作为神经变性疾病的治疗推向市场。

20.权利要求1所述的方法，进一步包括将所述药物组合物作为炎性肠病的治疗推向市场。

21.权利要求1所述的方法，进一步包括将所述药物组合物作为阿尔茨海默氏病的治疗推向市场。

22.权利要求1所述的方法，进一步包括将所述药物组合物作为骨关节炎的治疗推向市场。

23.权利要求1所述的方法，进一步包括将所述药物组合物推向市场以治疗对抗TNF-α治疗无反应者的人。

24.制造施用给动物以治疗炎性状况的药物的方法，其中所述所述药物包括θ-防御素、其类似物或衍生物中至少一个。

25.权利要求24所述的方法，其中所述药物包括RTD-1-27、RTD-1-28和RTD-1-29中至少一个。

26.权利要求24所述的方法，其中所述药物有效产生促炎蛋白酶的临床相关的抑制。

27.权利要求26所述的方法，其中所述促炎蛋白酶是肿瘤坏死因子α(TNF-α)-转化酶(TACE)。

28.权利要求24所述的方法，其中所述药物有效产生促炎蛋白酶的临床相关的抑制。

29.权利要求24所述的方法，其中所述药物有效产生脱落酶的临床相关的抑制。

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