CN108660120A - 抗真菌肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗真菌肽及其在抑制真菌生长方面的用途。

Description

抗真菌肽及其用途
技术领域
本发明涉及一种抗真菌肽及其在抑制真菌生长方面的用途。
背景技术
抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是一类广泛存在于整个生物界的多肽。本领域已知的是，抗菌肽可作为植物、昆虫或哺乳动物免疫系统的一部分，抵抗病原微生物的入侵。抗菌肽具有抗菌谱广、分子量小、热稳定性和水溶性好、不易产生耐药性等特点。在许多致病菌对现有的抗生素产生明显耐药性的情况下，抗菌肽的发现和研究为开发新的抗菌药物提供了可能。
虽然近年来抗真菌肽的研究取得了很大的进展。然而，由于真菌与真核细胞结构的相似性，一些抗真菌肽(例如植物防御素)在抑制真菌生长的同时对包括哺乳动物细胞在内的一些真核细胞也会产生毒性。因此，本领域仍存在提供安全有效的抗真菌肽的需求。
发明内容
本发明的发明人在研究酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DNA损伤信号的细胞间传递中发现，一个短肽介导凋亡过程中酵母细胞间信号的传递。进而，借助高分辨液质联用质谱分析和生物信息学技术分析发现，该短肽具有如SEQ ID NO：1所示的序列。实验证明，该短肽能够杀死真菌或抑制真菌生长，且不影响哺乳动物细胞的正常功能，因此具有作为抗真菌药物的潜力。
在第一方面，本发明提供了具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的抗真菌肽、其功能片段、功能变体或衍生物。
在第二方面，本发明提供了一种抗真菌组合物，所述抗真菌组合物包含第一方面所述的抗真菌肽。
在第三方面，本发明提供了如第一方面所述的抗真菌肽或如第二方面所述的抗真菌组合物在杀死真菌和抑制真菌生长方面的用途；或者，如第一方面所述的抗真菌肽或如第二方面所述的抗真菌组合物在制备用于预防或治疗受试者中的真菌感染的药物方面的用途。
在第四方面，本发明涉及将如第一方面所述的抗真菌肽或如第二方面所述的抗真菌组合物用于预防和/或治疗真菌感染。
附图说明
图1为根据实验例1，加入不同浓度的SP肽培养24h后的新生隐球菌培养液的OD600。误差棒表示三个独立样品测试结果的标准差。
图2为根据实验例2，利用CK肽(4μM)和SP肽(4μM)对新生隐球菌进行处理后的PI染色的流式细胞术统计结果。误差棒表示三次独立实验结果的标准差。PI染色％为PI阳性细胞的百分比。***表示P<0.001。
图3为根据实验例3，经Cytofix/CytopermTM、SP肽或CK肽处理的哺乳动物细胞流式细胞术的分析结果。
图4为根据实验例4，溶血度随SP肽浓度变化的结果。
图5示出根据实施例3建立的Tdh1和Yca1复合物的结构。其中，CAA89343对应于Tdh1，NP_014840对应于简化的Yca1。
图6示出根据实施例3，对全长的Tdh1的生物信息学分析的结果。下划线标记氨基酸为Yca1作用于Tdh1的位点。
具体实施方式
抗真菌肽
本发明的抗真菌肽(以下简称为SP肽)具有如下的氨基酸序列：
IRIAINGFGRIGRLVLRLALQRKDIEVVA(SEQ ID NO：1)。
生物信息学分析表明，SP肽的功能片段可具有如下的任一种序列：
IRIAINGFGR (SEQ ID NO：2)；
IRIAINGFGRIGR (SEQ ID NO：3)；
IRIAINGFGRIGRLVLR (SEQ ID NO：4)；
IRIAINGFGRIGRLVLRLALQR (SEQ ID NO：5)；
IRIAINGFGRIGRLVLRLALQRKDIEVV (SEQ ID NO：6)。
SP肽是位于酿酒酵母p3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)同工酶1 (Tdh1p)N端的第1-29位氨基酸。本领域已知的是，在酿酒酵母细胞中，GAPDH是类胱天蛋白酶(metacaspase)的天然底物，在刺激信号(例如高NO水平)下，类胱天蛋白酶靶向并水解GAPDH，诱导细胞凋亡。digestome实验显示，诱导YCA1过表达细胞凋亡后检测到GAPDH同工酶2(Tdh2p)和GAPDH同工酶3(Tdh3p)被类胱天蛋白酶水解的片段，然而并未检测到Tdh1p的片段(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)is a specific substrate of yeast metacaspase，Biochimica et Biophysica Acta 1813(12)：2044-9)。此外，现有技术还未发现水解后的片段具有何种功能，或其是否也参与凋亡通路。本发明的发明人在实验中发现，SP肽介导了酿酒酵母DNA损伤信号的细胞间传递，导致细胞群体性凋亡。实验证实，SP肽对于其它真菌(例如隐球菌)也具有杀伤作用。
在一些实施方式中，本发明提供了具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的抗真菌肽、其功能片段、功能变体或衍生物。
本文使用的术语“功能部分”或“功能片段”是抗真菌肽的一部分，该部分具有与完整抗真菌肽相同的作用(例如抑制真菌生长或杀死真菌)。在一些实施方式中，SP肽的功能片段包含SEQ ID NO：2所示的序列。在优选的实施方式中，SP肽的功能片段具有SEQ ID NO：2-6中任一项所示的氨基酸序列。
本文使用的术语“变体”涉及序列的改变，而不考虑所述改变是否使所述蛋白的功能发生变化(如，增加、减少、赋予新的功能)，或者所述改变是否对蛋白的功能不产生影响(例如，突变或变异是沉默的)。
本文使用的术语“衍生物”是指经化学修饰的蛋白或多肽，例如，通过泛素化、标记、聚乙二醇化(用聚乙二醇进行的衍生化)或其它分子的添加进行。当分子包含通常不是该分子的一部分的附加化学部分时，该分子也是另一分子的“衍生物”。此类部分可改善分子的溶解度、吸收、生物半衰期等。或者，所述部分可降低分子的毒性、或者消除或减弱该分子的不希望的副作用等。能够介导此类效果的部分公开于Remington’s PharmaceuticalSciences(第21版，Tory著，Lippincott Williams&Wilkins，Baltimore，MD，2006年)。
当与“衍生物”或“变体”结合使用时，术语“功能”或“功能性”是指一种蛋白分子的衍生物或变体具有与该蛋白分子相似的生物活性。在这样的上下文中，“基本上相似”意味着生物活性(例如，肽的杀菌性)为对照(例如，全长的抗菌肽)活性的至少50％，例如，至少60％、70％、80％、90％、95％、100％或甚至更高(例如，相比于SP肽，变体或衍生物具有更高的活性)，例如，110％、120％以上，包括端值。
在一些实施方式中，SP肽的功能变体或衍生物包含SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6中任一项所示的氨基酸序列，且具有SP肽的功能。在一些实施方式中，SP肽的功能变体或衍生物包含与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6中任一项具有80％以上同源性的氨基酸序列，且具有SP肽的功能。
不希望被理论所限地，就利用本发明的抗真菌肽在对受试者进行治疗的用途而言，考虑到外源肽可能引起免疫反应，可用于本发明的抗真菌肽具有的序列选自于由如下氨基酸序列所组成的组：
SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6，或与上述序列至少80％同源性的功能变体。
术语“同源性”、“一致性”和“相似性”是指两个肽之间或两个最佳比对的核酸分子之间序列相似的程度。同源性和一致性可通过比对各序列中的位置来确定。本文使用的术语“同源性”表示当进行最佳比对和比较(例如使用具有用于比对的默认参数的BLAST)时，两个多肽、或其指定序列(具有适当的氨基酸插入或删除)中至少80％的氨基酸(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％的氨基酸)是相同的。
本发明的SP肽衍生物还包括如下的肽：其氨基酸序列为在SEQ ID NO：1-SEQ IDNO：6中存在一个或多个保守置换突变的序列。本文所使用的术语“保守的”或“保守置换突变”是指一个氨基酸被置换为另一具有相似性质的氨基酸的突变，从而本技术人员将预期到所述多肽的二级结构、化学性质和/或亲水性基本不变。如下各组内氨基酸的彼此取代曾报道为保守置换：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、try、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；以及(5)phe、tyr、trp、his。其它普遍认可的保守置换列于下表：
残基 保守置换 残基 保守置换
Ala Ser Leu Ile；Val
Arg Lys Lys Arg；Gln
Asn Gln；His Met Leu；Ile
Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr
Gln Asn Ser Thr；Gly
Cys Ser Thr Ser；Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp；Phe
His Asn；Gln Val Ile；Leu
Ile Leu；Val
不希望被理论所限地，就本发明的抗真菌肽对环境进行处理的用途而言，本发明的抗真菌肽、其功能片段、功能变体或衍生物除具有上述序列外，还可带有便于表达和纯化的标签序列、或者便于从环境中回收的功能序列。所述纯化标签例如为多组氨酸标签、谷胱甘肽-S-转移酶标签、血凝素标签、FLAG标签、myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签。所述功能序列例如为链霉亲和素或卵亲和素，从而能够用生物素化的磁珠对所述抗真菌肽进行回收。
本领域知晓合成本发明所述的各肽的方法。例如通过化学合成，或者通过原核或真核表达体系表达并纯化。
本发明的抗真菌肽、其功能片段、功能变体和/或衍生物对子囊菌门(Ascomycetes)、担子菌门(Basidiomycetes)、半知菌门(Deuteromycetes)和接合菌门(Zygomycota)的真菌具有广谱的杀菌和抑菌作用。例如，本发明的抗真菌肽、其功能片段、功能变体和/或衍生物所能抑制的真菌的实例包括但不限于隐球菌(Cryptcooccus)、假丝酵母(Candida sp.)、酵母属(Saccharomyces sp.)、马拉色霉菌属(Malassezia)、曲霉属(Aspergillus sp.)、球孢子菌属(Coccidioides)、副球孢子菌属(Paracoccidioides)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、芽生菌属(Blastomyces)和粗糙链孢霉(Neurospora crassa)等。特别地，本发明的抗真菌肽具有抑制如下真菌的生长或将其杀灭的能力：
新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、格特隐球菌(Cryptococcus gattii)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、白色念珠菌(Candida albicans)、克柔假丝酵母(Candida krusei)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosi)、白吉利毛孢子菌(Trichosporonbeigelii)和糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)。
本文所述的抗真菌肽能够以任意适宜的剂量给予受试者，而并不受到任何限制。例如，可以基于期望的给药效果和受试者的状况等，由掌握本领域普通知识的技术人员通过常规实验确定和/或调整上述剂量。
包含抗真菌肽的抗真菌组合物和抗真菌药物
在一些实施方式中，本发明提供了一种抗真菌组合物，所述抗真菌组合物以有效的浓度包含第一方面所述的抗真菌肽。
本文所使用的术语“有效的浓度”是指与未经处理的样品相比，当给予受试者该浓度的抗真菌肽物，或者以该浓度的抗真菌肽对环境样品进行处理时，能够将样品/受试者中的存活的真菌数量降低50％以上(例如60％、70％、80％、90％或上至100％)，或者能够使得样品/受试者中的真菌的生长率下降50％以上(例如60％、70％、80％、90％或上至100％)。
在优选的实施方式中，所述抗真菌肽以不低于4μM的浓度被包含于抗真菌组合物中。
在一些实施方式中，所述抗真菌组合物以治疗有效的浓度包含第一方面所述的抗真菌肽。本文所使用的术语“治疗有效的浓度”意味着在临床治疗学方面能够减缓或抑制真菌的生长，并因此治疗或减缓真菌导致疾病的进展速度的浓度。针对待处理受试者的年龄、性别、健康状况、疾病严重程度、饮食等，临床医师能够确定并调整抗真菌肽的治疗有效的浓度，并且能够基于可预期的临床益处而将所述抗真菌组合物或药物与其它已知的任意药物或辅料组合使用。
本发明的抗真菌组合物可进一步包含至少一种药学上可接受的载体。载体的实例包括但不限于、赋形剂、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、润湿剂、乳剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、增塑剂、胶凝剂、增稠剂、硬化剂、凝固剂、悬浮剂、表面活性剂、保湿剂、载体、稳定剂以及它们的组合；例如，水、聚乙二醇、淀粉、糖、微晶纤维素、滑石粉、聚维酮(PVP)等。
在一些实施方式中，还可将本发明的抗真菌肽与本领域已知的其它抗真菌剂联用制成药物组合物，或者通过共同给药实现更快或更强的真菌抑制效果。能够与本发明的抗真菌肽共用的抗真菌剂包括但不限于：5-氟胞嘧啶、两性霉素B、阿尼芬净、联苯苄唑、布康唑、卡泊芬净、氯登妥因、氯苯甘醚、环吡酮胺、克霉唑、依柏康唑、益康唑、氟康唑、氟曲马唑、艾沙康唑、异康唑、伊曲康唑、酮康唑、米卡芬净、咪康唑、硝基醛肟、泊沙康唑、噻康唑、特康唑、十一烯酸，以及上述抗真菌剂的药学上可接受的盐或酯。
本文所述的抗真菌肽、抗真菌组合物和抗真菌药物能够直接给予或者可以被配制成本领域已知的任何剂型，例如但不限于：片剂、胶囊剂、注射剂、粉剂、颗粒剂、气雾剂、滴丸剂、丸剂、栓剂、酊剂、锭剂、糖浆剂、悬液剂、纳米制剂等。
本文所述的抗真菌肽、抗真菌组合物和抗真菌药物能够在一段时间内连续给予或者以恒定或者变化的间隔给予，例如可以每天一次、每天两次、每周一次、每周两次、每月一次、每隔1个月一次给予，或者以每隔1个月和每隔2个月的交替顺序给予上述物质。
抗真菌肽作为预防或治疗剂的用途
本发明的术语“预防”和“治疗”是指防止性或治疗性处理，其目的是消除、减缓或减轻症状。有益的或期望的临床结果包括但不限于：消除症状、缓解症状、减轻病症程度、稳定(即，不恶化)病症状态、延迟或减缓病症进展。
在一些实施方式中，本发明的抗真菌肽可通过任何途径给药，例如，经由静脉内给药、真皮内给药、肌内给药、动脉内给药、病灶内给药、经皮给药、或皮下给药、腹膜内给药、脑室内给药、或通过气溶胶给药。在一些实施方式中，给药为治疗性给药或预防性给药。
本发明的抗真菌肽、其功能片段、功能变体和衍生物能够预防和/或治疗受试者中的真菌感染。所述受试者优选为脊椎动物，包括人、非人灵长类动物(如，黑猩猩、猕猴、蜘蛛猴等)、小鼠、大鼠、豚鼠、家鼠、狗、猫、猪、马、羊或牛、鱼类(例如斑马鱼等)或者禽类(例如鸡、鸸鹋等)，但是并不限于这些实例。此外，本发明的包含抗真菌肽、其衍生物、功能变体、功能片段的组合物也可用于对上述动物，例如狗、猫、猪等中的真菌感染进行预防和/或治疗。
抗真菌肽作为非治疗用途的处理剂的用途
本发明的包含抗真菌肽、其衍生物、功能变体、功能片段的组合物也可用于对样品进行杀菌处理。优选地，所述样品选自于由如下环境源获得或来自如下环境源的样品：食物加工品(例如饮料、乳制品)、农产品、农作物、家禽、家畜、肉类、鱼类、饮料、乳制品、水(包括废水)、池塘、河流、水库、游泳池、土壤、食品加工和/或包装场所、屠宰场所、农业场所、养殖场和种植场(包括水培食品种植场)、药物制造工厂，或上述环境源的任意组合。
本文所述各方面的实施方式可由如下编号的段落说明：
1.一种抗真菌肽，其中，所述抗真菌肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
2.一种抗真菌肽，所述抗真菌肽为段落1所述的抗真菌肽的功能片段，其中，所述功能片段包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
3.如段落2所述的抗真菌肽，其中，所述功能片段具有SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列中的任一种的氨基酸序列。
4.如段落1-3中任一项所述的抗真菌肽，其中，所述抗真菌肽进一步包含表达和纯化的标签序列和/或便于从环境中回收的功能序列。
5.如段落4所述的抗真菌肽，其中，所述纯化标签选自于由如下标签所组成的组：
多组氨酸标签、谷胱甘肽-S-转移酶标签、血凝素标签、FLAG标签、myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签；
其中，所述功能序列为链霉亲和素或卵亲和素。
6.一种抗真菌组合物，其中，所述抗真菌组合物包含如段落1-5中任一项所述的抗真菌肽。
7.如段落6所述的组合物，其中，所述抗真菌肽以不低于4μM的浓度包含于所述组合物中。
8.如段落6或7中任一项所述的抗真菌组合物，其中，所述抗真菌组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载体。
9.如段落6-8中任一项所述的抗真菌组合物，其中，所述抗真菌组合物进一步包含至少一种选自于由如下的化合物所组成的组中的化合物：
5-氟胞嘧啶、两性霉素B、阿尼芬净、联苯苄唑、布康唑、卡泊芬净、氯登妥因、氯苯甘醚、环吡酮胺、克霉唑、依柏康唑、益康唑、氟康唑、氟曲马唑、艾沙康唑、异康唑、伊曲康唑、酮康唑、米卡芬净、咪康唑、硝基醛肟、泊沙康唑、噻康唑、特康唑、十一烯酸，以及上述化合物的药学上可接受的盐或酯。
10.段落1-5中任一项所述的抗真菌肽或段落6-9中任一项所述的抗真菌组合物在抑制或杀灭环境样品中的真菌方面的用途。
11.如段落10所述的用途，其中，所述环境样品选自于由如下环境源获得或来自如下环境源的样品：食物加工品(例如饮料、乳制品)、农产品、农作物、家禽、家畜、肉类、鱼类、水、池塘、河流、水库、游泳池、土壤、食品加工和/或包装场所、农业场所、屠宰场所、养殖场和种植场(包括水培食品种植场)、药物制造工厂，或上述环境源的任意组合。
12.段落1-5中任一项所述的抗真菌肽或段落6-9中任一项所述的抗真菌组合物在制备用于预防或治疗受试者中的真菌感染的药物方面的用途。
13.如段落12所述的用途，其中，所述受试者为脊椎动物。
14.如段落13所述的用途，其中，所述受试者为人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、豚鼠、家鼠、狗、猪、猫、马、羊或牛、鱼类或者禽类。
15.如段落10-14中任一项所述的用途，其中，所述真菌选自于由如下真菌所组成的组：
隐球菌、假丝酵母、酵母属、马拉色霉菌属、曲霉属、球孢子菌属、副球孢子菌属、组织胞浆菌属、芽生菌属和粗糙链孢霉。
16.如段落15所述的用途，其中，所述真菌选自于由如下真菌所组成的组：
新生隐球菌、酿酒酵母、格特隐球菌、光滑假丝酵母、白色念珠菌、克柔假丝酵母、热带假丝酵母、近平滑假丝酵母、白吉利毛孢子菌和糠秕马拉色菌。
实施例
下列实施例阐明了本发明的一些实施方式和方面。对相关领域技术人员来说显而易见的是，可以在不改变本发明的精神或范围的情况下进行各种修改、增加、替换等，这些修改和变化都涵盖于所附权利要求书中所限定的本发明的范围之内。下述实施例不以任何方式对本发明进行限制。
本发明实施例1-3使用的SP肽具有SEQ ID NO：1所示的序列，该肽为由吉尔生化上海有限公司化学合成得到。SP肽的水溶液用灭菌双蒸水稀释得到。
作为阴性对照的CK肽由相同途径获得，其序列为QMQKSASQIERWGHDFIK(SEQ IDNO：7)。
实施例1：SP肽对酿酒酵母的抑制作用
本实施例中作为测试对象的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为BY4741(invitrogen)，基因型为MATαura3Δmet15Δleu2Δhis3Δ。
在YPD培养基(10g酵母提取物、20g蛋白胨溶于水中，121℃高压灭菌20min，冷却后加入100mL 10×葡萄糖储液)中将酿酒酵母培养至对数期。随后，加入终浓度为6μM的SP肽，处理2h。经过流式细胞仪(BECKMAN MoFlo XDP)检测，发现有大量的细胞碎片产生。对酵母细胞进行碘化丙啶(PI)染色发现，大量酵母细胞呈PI阳性，表明SP对酿酒酵母细胞具有强烈的杀伤作用。平板菌落计数结果显示，70％的酿酒酵母细胞能够被6μM的SP肽杀死。
实施例2：SP肽对隐球菌的抑制作用
隐球菌病是主要由新生隐球菌、格特隐球菌等引起的人畜共患的感染性真菌病。随着两性霉素B等抗生素药物的出现，隐球菌病被认为是人类可控制范围内的疾病。然而，随着侵入性操作的广泛应用和免疫抑制剂的大量使用，特别是AIDS患者的不断增加，不但隐球菌病感染率持续升高，且出现了死亡率高、免疫力正常者感染率升高等新特点(Bielska和May，2016)。2016年世界卫生组织的数据表明，约625,000人死于隐球菌性脑膜炎，非洲的东部和南部，以及亚洲南部为主要发病区(Pamphlet，2016)。
目前治疗隐球菌临床上常用的抗隐球菌药物为多烯类、氟胞嘧啶和唑类等药物(Coelho和Casadevall，2016)。然而，上述药物的副作用较为明显，可能对人体的正常细胞和器官造成损伤。此外，隐球菌极易产生对上述药物的耐药性。临床实践中，使用现有药物并不能对某些病人进行有效治疗。鉴于隐球菌病死亡率高、流行病学特征改变和出现耐药菌株，存在寻找能够替代传统抗生素的新型药物的需求。因此，在本实施例的实验例1-4中，我们研究了SP肽对新生隐球菌的杀伤作用。
本实施例中作为测试对象的新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)JEC21来自中科院微生物研究所真菌学国家重点实验室王淋琪研究员课题组。
RPMI1640培养基：RPMI-1640(sigma公司)中加入0.165M/L mops(sigma公司)，过滤除菌。实验例1SP肽的最小抑菌浓度
根据Chen等，2005；Levengood等，2009；Makovitzki等，2006描述的方法，采用微量肉汤稀释法(M27-A2)测定SP肽的最小抑菌浓度。
将新生隐球菌培养于RPMI1640培养基中至对数期，用新鲜RPMI1640培养基稀释至OD600为0.1后，将稀释后的新生隐球菌培养液加入96孔板，在各孔中分别加入SP肽溶液，使其终浓度分别为0μM、2μM、4μM、8μM、16μM和32μM，每个样品的总体积为100μl。每个浓度设置三个重复孔。以不加入隐球菌稀释液作为空白对照，排除实验中真菌污染造成的影响。将96孔板在37℃培养24h，测OD600值(全自动生长曲线分析仪，芬兰Bioscreen)，测定重复取样三次求平均值。图1显示出SP肽的浓度对新生隐球菌OD600的影响。
将新生隐球菌培养24h后，OD600的增长值低于初始OD600的50％所需要的最低小肽浓度定义为最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。根据该算法，在本实施例中，SP肽的最小抑菌浓度为使得24h后新生隐球菌的OD600小于0.15的浓度。从图1可以得出，SP肽的最小抑菌浓度为4μM。
从第一个抗菌肽cecrppins的发现开始，人们陆续发现抗菌肽能够抗细菌、真菌、寄生虫、病毒，甚至存在抗肿瘤的功能(Eckert，2011)。Li等发现的抗真菌肽APP对隐球菌的最小抑菌浓度为16μM(Li等，2016)。Datta等发现的抗真菌肽VG16KRKP的最小抑菌浓度为10μM(Datta等，2016)。相比较而言，本发明的SP肽具有显著更低的最小抑菌浓度，其抗真菌效果更为显著。
实验例2SP肽杀菌效果的碘化丙啶(PI)染色测定
根据Hernlem和Hua，2010所述的方法，利用PI染色方法对SP肽的杀菌效果进行定量检测。利用新鲜的RPMI1640培养基将处于对数期的隐球菌稀释至1×106个/ml，加入终浓度为4μM的SP肽或CK肽(无功能阴性对照)，在37℃培养30分钟，加入终浓度为5μg/ml的PI(amresco公司)后放置暗处15分钟，用流式细胞仪(BECKMAN MoFlo XDP)统计PI染色呈阳性的真菌数量。统计的细胞总量为50,000个。
图2显示利用CK肽(4μM)和SP肽(4μM)对新生隐球菌进行处理后的PI染色的流式细胞术统计结果。由于PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色，PI染色比例高表明杀伤效果显著。从图2可以看出，SP肽对新生隐球菌具有显著的杀伤效果。
实验例3SP肽对哺乳动物细胞的影响
在5％CO2、37℃培养箱中，利用DMEM高糖培养基(sigma公司)对Hela细胞(来自中科院微生物研究所方敏研究员实验室)进行培养。实验组和阴性对照分别将终浓度为6μM的SP肽和CK肽(无功能阴性对照)加入细胞培养物中，处理6小时(Conti等，2013)。阳性对照为每毫升细胞培养物加入50μl的Cytofix/CytopermTM(BD公司，货号：554714)，对细胞处理15min。吸去上清液后进行PI(amresco公司，终浓度20μg/ml)染色。用流式细胞仪(BECKMANMoFlo XDP)统计PI染色为阳性的真菌数量。统计的细胞总量为10,000个。
流式细胞仪统计结果如图3所示。R4比例为被裂解的细胞的比例。可以看出，本发明的抗真菌SP肽对哺乳动物细胞不产生杀伤作用。
实验例4SP肽的溶血毒性
本实施例中作为测试对象的血样来源于C57BL小鼠。
溶血度是待测样品对红细胞破坏程度的一个重要指标，血红蛋白含量越高，则溶血度越高，表示红细胞的破坏程度越高。通过检测上清中血红蛋白含量的高低，来表示红细胞的破坏程度。为了进一步探究SP肽是否造成哺乳动物溶血，我们根据Sung等2007的方法，对加入不同浓度的SP肽处理4h后的血样的溶血度进行测定。利用酶标仪(美国伯腾SynergyH4)测定540nm波长下的吸光度作为血红蛋白的相对含量的表征。将加入纯水4h后的血样(即，红细胞完全裂解)的吸光度定义为溶血度100％。
如图4所示，在4μM时，加入SP肽样品的相对溶血度仅为6％左右，认为在该浓度下SP肽对哺乳动物无溶血毒性。
可见，本发明的SP肽不仅对隐球菌等具有强烈的杀伤作用，并且对哺乳动物细胞无影响，也不会产生溶血反应。本发明的SP肽具备开发成为预防或治疗真菌性感染引起的疾病的药物的潜力。
参考文献
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实施例3SP肽功能片段的生物信息学分析
首先用I-Tasser(Roy等，2010；Yang等，2015；Zhang，2008)根据Tdh3的结晶结构作为模板，预测出Tdh1(NCBI登录号：CAA89343)的结构。然后用zdock(Pierce等，2014)将Tdh1和Yca1(NCBI登录号：NP_014840)进行分子对接得到两者的复合物结构(图5)，最后利用PDBePISA(Krissinel和Henrick，2007)对复合物的结合界面进行分析。考虑到SP肽为Tdh1被Yca1水解获得的肽，认为处于两者结合界面处的氨基酸残基为对抗真菌功能而言关键的残基。
图6示出对Tdh1全长的生物信息学分析的结果。下划线标记氨基酸为Yca1作用于Tdh1的位点。Yca1可以作用于Tdh1N端Arg2和Val29位点。Yca1作用于Tdh1的酶切位点主要集中在N端区域。因此，认为SP肽的功能片段至少包含SEQ ID NO：2所示的序列，例如为SEQID NO：2-SEQ ID NO：6中任一项所示的序列。
参考文献
Krissinel,E.,and Henrick,K.(2007).Inference of macromolecularassemblies from crystalline state.Journal of molecular biology 372,774-797.
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Zhang,Y.(2008).I-TASSER server for protein 3D structureprediction.BMC bioinformatics 9,40。
SEQUENCE LISTING
<110> 中科院微生物研究所
<120> 抗真菌肽及其用途
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ile Arg Ile Ala Ile Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Leu Val Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ala Leu Gln Arg Lys Asp Ile Glu Val Val Ala
20 25
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ile Arg Ile Ala Ile Asn Gly Phe Gly Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ile Arg Ile Ala Ile Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Ile Arg Ile Ala Ile Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Leu Val Leu
1 5 10 15
Arg
<210> 5
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Ile Arg Ile Ala Ile Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Leu Val Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ala Leu Gln Arg
20
<210> 6
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Ile Arg Ile Ala Ile Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Leu Val Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ala Leu Gln Arg Lys Asp Ile Glu Val Val
20 25
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Gln Met Gln Lys Ser Ala Ser Gln Ile Glu Arg Trp Gly His Asp Phe
1 5 10 15
Ile Lys

Claims (7)

1.一种抗真菌肽，其中，所述抗真菌肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
2.一种抗真菌肽，所述抗真菌肽为权利要求1所述的抗真菌肽的功能片段，其中，所述功能片段包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
优选地，所述功能片段具有SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列中的任一种的氨基酸序列。
3.如权利要求1-4中任一项所述的抗真菌肽，其中，所述抗真菌肽进一步包含表达和纯化的标签序列和/或便于从环境中回收的功能序列；
优选地，所述纯化标签选自于由如下标签所组成的组：
多组氨酸标签、谷胱甘肽-S-转移酶标签、血凝素标签、FLAG标签、myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签；
优选地，所述功能序列为链霉亲和素或卵亲和素。
4.一种抗真菌组合物，其中，所述抗真菌组合物包含如权利要求1-3中任一项所述的抗真菌肽；
优选地，所述抗真菌肽以不低于4μM的浓度包含于所述组合物中；
优选地，所述抗真菌组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载体；
优选地，所述抗真菌组合物进一步包含至少一种选自于由如下的化合物所组成的组中的化合物：
5-氟胞嘧啶、两性霉素B、阿尼芬净、联苯苄唑、布康唑、卡泊芬净、氯登妥因、氯苯甘醚、环吡酮胺、克霉唑、依柏康唑、益康唑、氟康唑、氟曲马唑、艾沙康唑、异康唑、伊曲康唑、酮康唑、米卡芬净、咪康唑、硝基醛肟、泊沙康唑、噻康唑、特康唑、十一烯酸，以及上述化合物的药学上可接受的盐或酯。
5.权利要求1-3中任一项所述的抗真菌肽或权利要求4所述的抗真菌组合物在抑制或杀灭环境样品中的真菌方面的用途；
优选地，所述环境样品选自于由如下环境源获得或来自如下环境源的样品：食物加工品(例如饮料、乳制品)、农产品、农作物、家禽、家畜、肉类、鱼类、水、池塘、河流、水库、游泳池、土壤、食品加工和/或包装场所、农业场所、屠宰场所、养殖场和种植场(包括水培食品种植场)、药物制造工厂，或上述环境源的任意组合。
6.权利要求1-3中任一项所述的抗真菌肽或权利要求4所述的抗真菌组合物在制备用于预防或治疗受试者中的真菌感染的药物方面的用途；
优选地，所述受试者为脊椎动物；优选地，所述受试者为人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、豚鼠、家鼠、狗、猪、猫、马、羊或牛、鱼类或者禽类。
7.如权利要求5或6所述的用途，其中，所述真菌选自于由如下真菌所组成的组：
隐球菌、假丝酵母、酵母属、马拉色霉菌属、曲霉属、球孢子菌属、副球孢子菌属、组织胞浆菌属、芽生菌属和粗糙链孢霉；
优选地，所述真菌选自于由如下真菌所组成的组：
新生隐球菌、酿酒酵母、格特隐球菌、光滑假丝酵母、白色念珠菌、克柔假丝酵母、热带假丝酵母、近平滑假丝酵母、白吉利毛孢子菌和糠秕马拉色菌。
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