KR20170072291A - 치료 방법 - Google Patents

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Abstract

본 개시는 인간 및 동물에서 등면 및 말단 지골을 덮고 있는 뿔 유사 외피 및 동물에서 관련 대뇌 돌출부 뿐 아니라 인간 및 동물 표면상 케라틴 포함 물질의 진균 감염의 제어에 관한 것이다. 또한, 상기 외피 및 관련 돌출부 및 케라틴 포함 물질의 진균 감염의 제어에 유용한 제제 및 천연 및 합성 제제 및 추출물이 본 개시에 포함된다. 한 실시양태에서, 본 개시는 손발톱의 진균 감염, 특히 인간에서 손발톱 진균증의 치료를 교시한다.

Description

치료 방법{A METHOD OF TREATMENT}
출원 자료
본 출원은 2014년 10월 21일에 출원한 "치료 방법"이라는 명칭의 미국 특허 가출원 62/066,808호와 관련되며 이의 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
<기술 분야>
본 개시는 인간 및 동물에서 등면 및 말단 지골을 덮고 있는 뿔 유사 외피, 동물에서 관련 대뇌 돌출부 뿐 아니라 인간 및 동물의 표면상 케라틴 포함 물질의 진균감염의 제어에 관한 것이다. 또한, 상기 외피 및 관련 돌출부 및 케라틴 포함 물질의 진균 감염의 제어에 유용한 제제 및 천연 및 합성 제제 및 추출물이 본 개시에 포함된다. 한 실시양태에서, 본 개시는 손발톱의 진균 감염, 특히 인간에서 손발톱 진균증의 치료를 교시한다.
본 명세서에서 저자가 참고하는 간행물의 서지 세부사항은 설명의 끝 부분에 알파벳순으로 정리한다.
본 명세서에서 임의의 선행 기술의 언급은 이 선행 기술이 임의의 국가에서 보편적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것 또는 시사하는 어떤 형태가 아니며, 그렇게 간주해서는 안 된다.
침입(infestation)을 포함한 진균 감염은 인간 및 동물에서 건강상 심각한 문제를 유발할 수 있다.
화학 살진균제는 인간 의학 및 수의학에서 성공적이긴 하였지만, 진균 감염을 제어하는 화학 제제의 지속적인 사용에 대해 다양한 환경 및 규제 문제가 존재한다. 상기 제제의 사용 증가는 또한 진균 종에서 내성의 발생에 대해 선택적인 압력을 가하고 있다. 진균 병원체에 의한 인간 및 동물에서 감염을 제어하는 대안적인 기전의 개발이 명백하게 요구되고 있다.
특히 고질적인 병태는 피부 사상균의 손발톱 진균증 및 조갑백선으로도 알려진 손발톱 진균증이다(Rapini et al.(2007) Dermatology:2-volume set, St. Louis: Mosby). 이는 인간 및 동물에서 손발톱, 및 등면 및 말단 지골을 덮고 있는 기타 뿔 유사 외피의 진균 감염이다. 특히, 기질, 바닥, 또는 판을 포함한 손발톱 단위의 임의의 구성요소와 관련한 발톱 또는 손톱의 감염이다. 인간에서 질환은 흔하지만 감염성 진균이 손발톱 안과 아래에 매몰되어 있어서 치료가 어려울 수 있다. 손발톱 진균증은 생명을 위협하지는 않지만, 통증, 불편함, 미관손상을 주며, 물리적 심리적 피해를 줄 수 있다. 손발톱 진균증의 영향은 광범위하며 삶의 질에 상당한 영향을 준다.
손발톱 진균증을 일으키는 주요 병원체는 피부 사상균 트리코피톤 루브럼 (Trychophyton rubrum ) 및 트리코피톤 멘타그로피트 ( Trychophyton mentagrophytes)이며, 티. 루브럼(T. rubrum)이 사례의 90%를 차지한다(Sotiriou et al.(2010) Acta Derm - Venereol 9(2):216-217).
손발톱 진균증의 치료는 임상 아형, 발병한 손발톱의 개수, 및 손발톱 병발의 중증도에 따라 결정된다. 경구 약물이 가장 효과적이긴 하지만, 이들의 사용을 방해하는 많은 인자가 존재한다. 대부분의 경구 항진균제에 전신 노출과 관련된 간세포 독성을 포함한 부작용으로 경구약은 주목받지 못하고 있다. 게다가, 인구 통계학적으로 손발톱 진균증에 걸린 노인이 많으며, 동시에 빈번하게 사용되는 의약으로 인한 바라지 않는 약물-약물 상호작용은 경구약의 사용을 불가능하게 한다. 이로써 손발톱 진균증을 치료하는 국소 요법의 개발의 중요성이 강조된다. 대부분의 치료는 국소 또는 경구 항진균 제제를 수반한다(Westerberg et al.(2013) American Family Physician 88(11):762-770). 경구약은 테르비나핀, 인트라코나졸 및 플루코나졸을 포함한다(Westerberg et al.(2013) 상기 문헌). 이들 치료는 단지 사례의 14-38% 감염만을 치유하며 고위험의 간 손상이 따른다. 국소약은 시클로피록스, 클로트리마졸, 아모롤핀, 에피나코나졸, 타바보롤 및 부테나핀을 포함한다. 이들 치료는 5 내지 17%의 치유율을 보이며 적어도 48주간 매일 적용되어야 한다. 이런 낮은 치유율은 손발톱을 통한 활성 성분의 낮은 침투율과 진균 세포를 사멸시키기보다는 진균 성장을 억제하기만 하여 진균 보유체가 손발톱에 잔류하여 손발톱을 재감염시키는 정진균(fungistatic) 작용 방식의 결과이다. 또한, 긴 치료 용법은 많은 환자가 잘 따르지 못하게 된다. 이들 치료는 완전히 효과적이지 못하며 병태가 오랜 기간 지속될 수 있다.
국소 손발톱 진균증 치료가 감염 부위에 도달하기 위해서, 항진균제는 손발톱에 침투할 수 있어야만 한다. 여러 모델의 항진균제에 의한 인간 손발톱 판 및 소 발굽으로부터 케라틴 막의 침투 연구는 손발톱 침투성이 분자량 증가에 따라 감소된다는 것을 보였다(Mertin and Lippold(1997) J Pharm Pharmacol 49:866-872; Kobayashi et al(2004) Eur J Pharm Sci 21:471-477). 시험된 각 모델 약물은 분자량이 1000 미만이었다. 이들 연구는 MW > 5000인 분자가 손발톱에 침투할 수 없다는 것을 시사한다.
문제의 또 다른 병태는 모발(hair) 및 모발과 모낭 사이의 경계면을 포함한 기타 케라틴 포함 물질의 진균 감염이다. 상기 병태는 때로는 머리 백선 또는 두피 백선으로 알려져 있다. 치료는 그리세오풀빈, 테르비나핀 및 인트라코나졸을 포함한 경구약의 형태일 수 있다. 국소 치료는 케토코나졸, 시클로피록스, 피록톤 및 징크 피리치온과 같은 항진균제를 함유하는 샴푸를 포함한다. 또한, 두피 및 피부의 진균 감염은 지루성 피부염 및 비듬과 같은 병태를 유발하는 피부 박리 및 자극을 일으킬 수 있다. 항진균제 함유 샴푸는 진균 감염에 의해 유발된 비듬을 치료하는데 사용될 수 있다.
식물 디펜신은 4 내지 5개의 이황화 결합을 가진 작은(45-54개 아미노산) 염기성 단백질이다(Janssen et al.(2003) Biochemistry 42(27):8214-8222). 이들은 통상적인 이황화 결합 양상 및 보편적인 구조적 접힘을 공유하여, 3중 가닥, 역평행 β-시트가 3개의 이황화 결합에 의해 α-나선에 묶여 시스테인에 의해 안정화된 αβ 모티프를 형성한다. 또한, 4번째 이황화 결합은 N-말단과 C-말단을 연결하여 매우 안정한 구조를 유도한다. 식물 디펜신은 항균 활성, 단백질 합성 억제, α-아밀라제 및 프로테아제 억제, 꽃 발생 및 꽃가루 감지에서의 기능 및 항진균 활성을 포함한 많은 생물학적 기능을 가질 수 있다(Colilla et al.(1990) FEBS Lett 270(1-2):191-194; Bloch and Richardson(1991) FEBS Lett 279(1):101-104; van der Weerden et al(2013) Fungal Biol Rev 26:121-131).
디펜신의 구조는 시스테인 잔기 사이에 영역으로 정의된 7개의 '루프'로 이루어진다. 루프 1은 첫째 β-가닥(1A)뿐 아니라 이 β-가닥을 처음 2개의 불변 시스테인 잔기 사이에서 α-나선(1B)에 연결하는 대부분의 가요성 영역을 포함한다. 루프 2, 3 및 루프 4의 시작 부분(4A)은 α-나선을 구성하지만, 나머지 루프(4B - 7)는 β-가닥 2 및 3 및 이들을 연결하는 가요성 영역(β-헤어핀 영역)을 구성한다(van der Weerden et al.(2013) Cell Mol Life Sci 70(19): 3545-3570). 식물 디펜신의 루프 5는 항진균 활성에 필수적이며 이들 단백질의 작용 기전에 중요한 결정인자로 알려져 있다(Sagaram et al.,(2011) PLoS One 6.4: e18550).
식물 디펜신은 일반적으로 완전히 보존된 8개의 시스테인 잔기를 공유한다. 이들의 존재, 위치 및 연결성이 디펜신 사이에서 보존되기 때문에 이들 잔기는 통상적으로 "불변 시스테인 잔기"로 언급된다. 서열 유사성을 기초로 하여, 식물 디펜신은 다양한 군으로 분류될 수 있다. 각 군 내에서, 서열 상동성은 비교적 높지만 군 사이에서 아미노산 유사성은 낮다(van der Weerden et al.(2013) Fungal Biol Rev 26:121-131). 상이한 군에 속하는 식물 디펜신은 일반적으로 상이한 생물학적 활성 또는 동일한 생물학적 활성에 대해 상이한 기전을 갖는다. 예를 들어, 무(radish) 펩티드 RsAFP2 군에 속하는 식물 디펜신은 세포벽 내 스핑고지질에 결합하여 진균 성장을 억제한다(Thevissen et al.(2012) Mol Microbiol 84(1):166-180). 반면, 니코티아나(Nicotiana ) 디펜신 NaD1 군에 속하는 식물 디펜신은 진균 세포에 진입하고 반응성 산소 종(ROS: reactive oxygen species)의 생산을 유도하여 세포 용해를 일으켜 진균 성장을 억제한다(Hayes et al.(2013) Antimicrob Agents Ch 57(8)3667-3675).
두 가지 주요 부류의 식물 디펜신이 존재한다. I형 디펜신은 소포체(ER: endoplasmic reticulum) 신호 서열에 이어 성숙 디펜신 도메인으로 이루어진다. II형 디펜신은 약 33개 아미노산의 C-말단 프로-도메인 또는 프로-펩티드(CTPP)를 갖는 더 큰 전구체로 생산된다. 지금까지 확인된 대부분의 II형 디펜신은 솔라내슈 스(Solanaceous) 식물 종에서 발견되었다.
인간 및 동물에서 진균 감염, 특히 인간에서 손발톱 진균증을 더 효과적으로 다루기 위한 프로토콜의 개발이 요구되며, 본 발명의 출현으로 안전하고 효과적인 치료가 가능해졌다. 일부 디펜신은 항진균 특성을 갖지만, 다양한 진균 병원체에 걸친 이들의 활성은 상당히 다양하며 증명된 활성의 대부분은 식물 진균 병원체에 대한 것이었다. 또한, 이들의 크기(MW > 5000Da)는 손발톱으로의 이들의 침투성을 제한하는 것으로 보인다.
요약
아미노산 서열은 서열 식별 번호(서열 번호)로 나타낸다. 서열 번호는 서열 식별자 <400>1(서열 번호 1), <400>2(서열 번호 2) 등에 숫자에 해당한다. 서열 식별자는 표 1에 요약한다. 서열 목록은 청구항 뒤에 제공한다.
본 개시는 부분적으로 일부 디펜신이, 이들의 크기에 불구하고, 손발톱에 효과적으로 침투하고 진균 감염을 치료할 수 있다는 놀라운 발견에 근거한다. 또한, 식물 진균 병원체를 표적화하도록 진화되었지만, 일부 식물 디펜신은 포유동물 세포에서 트리 코피톤 루브럼과 같은 손발톱 진균증을 일으키는 진균 병원체에 대해 표적 이탈(off-target) 활성 없이 강력한 활성을 갖는다. 더 놀랍게도, 일부 식물 디펜신은 접촉시 진균 세포를 사멸시킬 수 있도록 하는 살진균 작용 방식을 갖는다. 따라서, 본 개시는 피험체에서 등면 및 말단 지골을 덮고 있는 뿔 유사 외피 또는 관련 대뇌 돌출부 또는 피험체에서 케라틴 포함 물질에서 또는 위에서 진균 병원체에 의한 감염의 억제 방법으로서, 외피 또는 돌출부 또는 케라틴 포함 물질을 유효량의 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체, 서열 번호 24에 개시된 공통 아미노산 서열을 갖는 식물 디펜신, 유도체 또는 변이체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 교시한다. 한 실시양태에서, 디펜신은 HXL008(서열 번호 1), HXL035(서열 번호 2) 및 HXL036(서열 번호 3)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본원에서 고려되는 다른 디펜신은 HXL001(서열 번호 4), HXL002(서열 번호 5), HXL003(서열 번호 6), HXL004(서열 번호 7), HXL005(서열 번호 8), HXL009(서열 번호 9), HXL012(서열 번호 10), HXL013(서열 번호 11), HXL015(서열 번호 12), HXL032(서열 번호 13), HXL033(서열 번호 14), HXL034(서열 번호 15), NsD1(서열 번호 16), NsD2(서열 번호 17), NaD1(서열 번호 18), NoD173(서열 번호 19) DmAMP1(서열 번호 20), HXP4(서열 번호 21); HXP34(서열 번호 22), HXP35(서열 번호 23), 및 N-말단 알라닌 잔기가 첨가된 상기(각각, 서열 번호 25 내지 47) 중 어느 하나, 및 최적 정렬 후 서열 번호 1 내지 47중 어느 하나와 적어도 약 80% 아미노산 서열 유사성을 갖는 식물 디펜신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 디펜신은 일반적으로 진균 성장을 근절하거나 그 외 제어하기 충분한 시간과 조건하에서 뿔 유사 외피 또는 케라틴 포함 물질과 국소 적용에 의해 접촉된다. 외피는 손톱 및 발톱뿐 아니라 동물의 발톱, 발굽 및 뿔을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 개시는 피험체에서 손발톱 진균증 또는 관련 병태의 치료 방법으로서, 유효량의 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체, 서열 번호 24에 개시된 공통 아미노산 서열을 갖는 식물 디펜신 또는 변이체를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 가능하게 한다. 한 실시양태에서, 디펜신은 서열 번호 1 내지 3 또는 서열 번호 4 내지 47중 어느 하나 또는 서열 번호 1 내지 47중 어느 하나와 적어도 약 80% 유사성을 갖는 디펜신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 디펜신은 HXL008(서열 번호 1), HXL035(서열 번호 2) 또는 HXL036(서열 번호 3) 또는 N-말단 알라닌 잔기를 포함하는 디펜신(각각, 서열 번호 25 내지 27)을 포함한 이의 기능적 천연 또는 합성 변이체중 어느 하나이다.
또 다른 실시양태에서, 케라틴 포함 물질은 모발 또는 털(fur)이다. 본 실시양태에서, 본 개시는 피험체에서 모발 또는 털의 진균 감염의 치료 방법으로서, 유효량의 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체, 서열 번호 24에 개시된 공통 아미노산 서열을 갖는 선택된 식물 디펜신 또는 변이체를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 가능하게 한다. 한 실시양태에서, 디펜신은 서열 번호 1 내지 3 또는 서열 번호 4 내지 47중 어느 하나 또는 서열 번호 1 내지 47중 어느 하나와 적어도 약 80% 유사성을 갖는 디펜신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 디펜신은 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3 또는 N-말단 알라닌 잔기를 포함하는 디펜신(각각, 서열 번호 25 내지 27)을 포함하는 이의 기능적 천연 또는 합성 변이체로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 케라틴 포함 물질은 피부이다. 본 실시양태에서, 본 개시는 피험체에서 피부의 진균 감염의 치료 방법으로서, 유효량의 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체, 서열 번호 24에 개시된 공통 아미노산 서열을 갖는 선택된 식물 디펜신 또는 변이체를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 가능하게 한다. 한 실시양태에서, 디펜신은 서열 번호 1 내지 3 또는 서열 번호 4 내지 47중 어느 하나 또는 서열 번호 1 내지 47중 어느 하나와 적어도 약 80% 유사성을 갖는 디펜신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 디펜신은 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3 또는 N-말단 알라닌 잔기를 포함하는 디펜신(각각, 서열 번호 25 내지 27)을 포함하는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체로 정의된다.
치료 프로토콜에 사용하기 위해 고려되는 디펜신은 도 2에 열거된 것뿐 아니라 최적 정렬 후 표 2에 열거된 디펜신중 어느 하나와 적어도 80% 유사성을 갖는 디펜신이다. 간략하게 하게 하기 위해서, "서열 번호 1 내지 47"의 언급은 이후에 서열 번호 1 내지 47중 어느 하나와 적어도 80% 유사성을 갖는 디펜신을 포함한다. 한 실시양태에서, 디펜신은 침투성 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체이다. 합성 변이체의 예는 솔라내슈스 II형 디펜신의 루프 1B를 I형 디펜신의 루프 1B로 대체한 것을 포함한다. 이들은 HXP4, HXP34, 및 HXP35이다. 기타 변이체 또는 유도체는 표 2에 열거된 디펜신 또는 표 2에 열거된 디펜신과 적어도 80% 유사성을 가지며, 이의 N-말단에서 알라닌 잔기를 포함하는 디펜신(즉, 서열 번호 25 내지 47)을 포함한다. 디펜신의 N-말단에 알라닌의 첨가는 펩티드가 STE13 프로테아제 부위를 필요로 하지 않으면서 피키아 파스토리스(Pichia pastoris ) 발현 시스템에서 재조합적으로 생산될 수 있도록 한다. STE13 부위는 정상적으로 KEX2에 의해 α-교배 인자 분비 신호의 효율적인 프로세싱을 가능하게 한다. 그러나 발현량이 많을 때, STE13 프로테아제 절단이 비효율적이어서 Glu-Ala 반복체가 펩티드의 N-말단에 잔존하도록 만들 수 있다. 상기 반복체에 의해 부여되는 추가적인 음전하는 식물 디펜신의 활성에 해가 될 수 있다. STE13 프로테아제 부위는 불완전한 프로세싱을 방지하기 위해 알라닌으로 대체될 수 있다(Cabral et al.,(2003) Protein Expres Purif 31(1):115-122). 또한, N-말단 알라닌의 존재는 디펜신이 적혈구를 용해하는 능력을 감소시킬 수 있다(WO 2011/16074호).
한 실시양태에서, 표 2에 열거된 디펜신(서열 번호 1 내지 47)은 펩티드의 안정성을 향상시키도록 변형된다. 추가의 실시양태에서, 이는 아스파라긴 및 글루타민과 같이 탈아미드화되기 쉬운 아미노산, 또는 아스파르트산과 같이 이성질체화되기 쉬운 아미노산을 변형되기 쉽지 않은 아미노산으로 대체하여 달성된다. 특정 실시양태에서, 디펜신 HXL008, HXL035 또는 HXL036은 위치 18, 36 또는 42에서 변형된다.
한 실시양태에서, 표 2에 열거된 디펜신(서열 번호 1 내지 47)은 펩티드의 양전하를 증가시키도록 변형된다. 양전하는 식물 디펜신을 포함하여 항균 펩티드의 활성에 중요한 것으로 알려져 있다(Sagaram et al.,(2011) PLoS One 6.4: e18550). 한 실시양태에서, 양전하의 증가는 글루탐산 또는 아스파르트산과 같은 음하전된 잔기를 중성 아미노산으로 대체하여 달성된다. 한 실시양태에서, 중성 아미노산은 알라닌 또는 글리신이다. 또 다른 실시양태에서, 양전하의 증가는 중성 아미노산을 리신 또는 아르기닌과 같은 양하전된 잔기로 대체하여 달성된다.
보존적인 아미노산 변화가 또한 본원에서 고려된다.
한 실시양태에서, 치료는 비-디펜신 펩티드, 프로테이나제 억제제, 또 다른 디펜신 또는 단백질성 또는 비-단백질성(즉, 화학적) 살진균제와 조합된 디펜신을 포함한다.
진균 병원체는 피험체에서 손톱 또는 발톱, 동물의 발톱, 발굽 또는 뿔에서 손발톱 진균증 또는 관련 병태의 원인이 되는 것이다.
"손발톱"의 언급은 인간 및 동물에서 등면 및 말단 지골을 덮고 있는 임의의 뿔 유사 외피 및 동물에서 관련 대뇌 돌출부(즉, 뿔)를 포함한다. "손발톱 진균증-관련 병태"는 인간, 비인간 영장류 또는 동물의 손발톱의 주변 큐티클에서의 감염 또는 동물에서 발톱, 발굽, 뿔, 또는 뿔 유사 돌출부에서 또는 위에서 감염이다. 관련 병태의 예는 백선이다.
진균 병원체는 피부 사상균, 효모 및 피부 사상균 이외의 사상균을 포함한다. 피부 사상균은 트리코피톤 루브럼, 트리코피톤 멘타그로피트 , 트리코피톤 인터 디지탈(Trichophyton interdigitale ), 트리코피톤 비올라슘 ( Trichophyton violaceum), 트리코피톤 톤수란스 ( Trichophyton tonsurans ) 및 트리코피톤 수다넨 스(Trichophyton soudanense )를 포함한 트리코피톤 종, 마이크로스포룸 풀 범(Microsporum fulvum ), 에피더모피톤 플로코숨 ( Epidermophyton floccosum ) 및 마 이크로스포룸 집슘(Microsporum gypseum)을 포함한다. 효모는 칸디다 알비칸 스(Candida albicans ) 및 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)를 포함한 칸디다(Candida) 종을 포함한다.
한 실시양태에서, 디펜신은 감염된 영역에 국소 적용되어 손발톱 또는 뿔 유사 구조에 침투하여 감염 부위에 축적된다. 놀랍게도, HXL008(서열 번호 1), HXL035(서열 번호 2) 및 HXL036(서열 번호 3)과 같은(그러나 이에 제한되지는 않음) 일부 디펜신이 손발톱을 통한 높은 수준의 침투성을 보이며, 피부 사상균 병원체, 및 피부 사상균 이외의 사상균의 강력한 살진균성 억제제이어서, 손발톱 진균증과 같은 병태의 치료에서 매우 효과적이라는 것을 밝힌다. 한 실시양태에서, 디펜신은 포유동물 또는 세균 세포에 표적 이탈 효과를 보이지 않는다. 포유 동물 세포에 대한 활성은 피부 자극 및 기타 부작용의 가능성을 증가시킬 것이다. 세균 세포에 대한 활성은 그 부분에 자연의 유익한 미생물상(microflora)을 파괴할 수 있다. 고유한 미생물상은 진균 감염을 예방하는데 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있다(Reid et al.,(2011) Nature Reviews Microbiology 9: 27-38).
또한, 본원에서 서열 번호 1 내지 47로부터 선택된 식물 디펜신을 포함하는 식물 추출물 또는 효모 추출물(예를 들어, 디펜신을 생산하도록 유전자 변형된 피키아의 추출물)을 포함하는 제제 또는 추출물을 교시한다. 제제 또는 추출물은 또 다른 활성제, 또는 제제 또는 추출물의 조합을 더 포함하며, 여기서 적어도 하나의 제제 또는 추출물은 본원에 정의된 디펜신을 포함하며, 이는 사용 전에 혼합되거나 어느 순서로든 순차적으로 사용된다. 본원에 정의된 식물 디펜신 또는 상기를 포함하는 추출물은 예를 들어 음약(drench)을 포함하여 허브 제제 및 천연의 신체 또는 손발톱 세정제 및 샴푸의 형태와 같이 사용될 수 있다. 디펜신은 일발적으로 표적 부위(예를 들어, 손발톱 또는 피부 또는 모발 또는 털 가닥)로 침투가 가능하도록 제제화된다.
피험체에서 등면 및 말단 지골을 덮고 있는 뿔 유사 외피 또는 관련 대뇌 돌출부의 진균 감염의 치료 또는 예방을 위한 의약 제조에 서열 번호 1 내지 47로 정의된 식물 디페신의 용도를 본원에서 가능하게 한다. 또한, 피험체에서 등면 및 말단 지골을 덮고 있는 뿔 유사 외피 또는 관련 대뇌 돌출부의 진균 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 서열 번호 1 내지 47로 정의된 식물 디펜신을 본원에서 교시한다. 피험체에서 케라틴 포함 물질의 진균 감염의 치료 또는 예방을 위한 의약 제조에 서열 번호 1 내지 47로 정의된 식물 디페신의 용도를 본원에서 가능하게 한다. 또한, 본원에서 서열 번호 1 내지 47로 정의된 식물 디펜신을 교시한다. 특정 실시양태에서, 디펜신은 공통 서열, 서열 번호 24 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 변이체로 정의된다. 예는 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3으로 정의된 디펜신뿐 아니라 N-말단 알라닌 잔기를 포함하는 디펜신(각각, 서열 번호 25 내지 27)을 포함한다.
한 실시양태에서, 진균 감염은 손발톱 진균증 또는 관련 병태를 유발한다.
일반적으로, 치료받는 피험체는 손발톱 진균증 또는 손톱 또는 발톱의 관련 병태를 가진 인간이다. 그러나 본 발명은 또한, 예를 들어 비인간 영장류, 가축 및 뿔 달린 동물에서, 동물 손톱 및 발톱, 동물 발톱, 및, 적용 가능한 경우, 뿔을 치료하는 것에 관한 것이다.
또한, 본원에서 미생물을 포함하는 조성물의 제조에 사용하기 위한 본원에 정의된 디펜신을 발현하도록 조작된 단리된 미생물이 고려된다. 미생물의 예는 피키아이다. 상기 조성물은 인간 및 동물의 치료에 유용하다. 별법으로, 디펜신은 식물 추출물 또는 미생물 추출물을 포함하는 세포 추출물로서 제공된다.
또한, 본원에서 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체, 서열 번호 1 내지 47로 이루어진 목록으로부터 선택된 식물 디펜신 또는 변이체를 포함하는 구획화된 형태의 진균 감염 치료용 키트를 교시한다. 임의의 실시양태에서, 또 다른 구획은 제2 활성제와, 경우에 따라 추가의 구획 내에 분리 가능하게 또는 기존의 구획 내에 함께 있는 약학적 또는 수의학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함한다. 한 실시양태에서, 디펜신은 서열 번호 24에 개시된 공통 아미노산 서열로 정의된다. 예는 HXL008(서열 번호 1), HXL035(서열 번호 2) 및 HXL036(서열 번호 3)을 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에서 사용하기 위해 고려되는 디펜신은 N-말단 알라닌 잔기를 포함할 수도 포함하지 않을 수도 있다. 이는 특히 N-말단 알라닌 잔기를 포함하는 일부 재조합 디펜신을 이용한 경우이다. N-말단 알라닌을 갖는 서열 번호 1 내지 23, 즉 서열 번호 25 내지 47중 어느 하나가 본원에서 "디펜신"의 정의에 포함된다. 공통 아미노산 서열, 서열 번호 24는 경우에 따라 말단 알라닌 잔기를 갖는다.
[표 1]
Figure pct00001
Figure pct00002
HXL 단백질의 아미노산 서열은 미국 특허 제 6,911,577호 및 관련 특허군의 일원에 나열된다.
[표 2]
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
[도 1(a) 내지 (e)]는 본원에 포함된 다양한 디펜신의 아미노산의 정렬을 나타낸다.
[도 2(a) 내지 (d)]는 시험관 내에서 트리코피톤 루브럼의 4가지 임상 단리체의 성장에 대한 식물 디펜신 NaD1(파선) 및 HXL008(실선)의 효과를 보여주는 그래프를 나타낸다. 진균 성장은 성장 배지에 접종 후 72시간에 달성된 595 nm(A595)에서 광학 밀도의 증가로 측정하였으며 단백질 농도(μg/mL, 가로축)에 대해 비-단백질 대조군에 상대적인 성장률(세로축)로 플롯팅한다.
[도 3(a) 내지(e)]는 100 μM HXL008로 72 h 처리 후 한천 플레이트에서 배양된 티. 루브럼의 생존 콜로니를 사진으로 나타낸다. 패널(a) 내지 (d)는 각각 임상 단리체 14-01, 14-02, 14-03 및 13-04를 나타낸다. 생존 콜로니는 검정 직사각형으로 표시된다. 패널(e)는 HXL008로 처리되지 않는 티. 루브럼의 성장을 나타낸다.
[도 4(a) 내지 (c)]는 HXL008로 매일 투여 후 티. 루브럼의 생존 콜로니를 나타낸다. [도 4a]는 0 μg/mL(왼쪽 패널), 10 μg/mL(중간 패널) 또는 50 μg/mL(우측 패널) HXL008로 매일 처리 후 ½ 사부로 덱스트로스 한천(SDA: Sabouraud dextrose agar)에서 생존하는 콜로니의 사진이다. 24 h(위 패널), 14 d(중간 패널) 또는 25 d(아래 패널) 동안 처리된 배양물의 플레이트이다. [도 4b]는 HXL008(50 μg/mL/일)로 매일 처리 후 100 μL의 배양에서 생존한 콜로니 개수를 그래프로 나타낸다. [도 4c]는 HXL008가 없을 때(왼쪽) 또는 10 μg/mL(중간) 또는 50 μg/mL(오른쪽)의 HXL008가 있을 때 배양물의 사진이다.
[ 도 5]는 손발톱 아래에 수용 용액으로서 작용하는 젖은 면봉으로 된 손발톱 어댑터 시스템을 이용하여 HXL008(검정 삼각형, 검정 실선), NaD1(검정 별, 검정 실선), HXL004(점무늬 원, 검정 파선), HXL012(회색 정사각형, 회색 파선), 타바보롤(검정 마름모, 검정 파선), 시클로피록스(점무늬 정사각형, 검정 실선) 및 에피나코나졸(회색 원, 회색 실선)에 의한 발톱 침투를 나타낸다.
[도 6]은 식물 디펜신 NaD1(◆ 점선), HXL004(● 파선) 및 HXL008(▲ 파선)의 다양한 농도가 존재할 때 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli ) 의 성장을 나타낸다. 인간 항균 펩티드 LL37(■ 점선)은 대조군으로서 사용하였다
[도 7]은 rNaD1, HXP4, HXL001, HXL002, HXL004, HXL005, HXL008, HXL009, HXL012 및 HXL013(10 μM)에 의해 인간 U937 세포의 침투를 나타낸다. 침투는 형광 염료 요오드화프로피디움(PI: propidium iodide)의 흡수를 모니터하여 측정하였다.
[도 8]은 물 대조군과 비교하여 측정된 HXL008, HXL004 및 NaD1에 의해 유도된 적혈구의 용해를 나타낸다.
[도 9]는 다양한 제제, 물(검정 막대) 50mM 시트레이트 완충액 pH 4.0(줄무늬 막대) 및 50mM 시트레이트 완충액 pH 4.0, 20% 에탄올, 0.5mM EDTA(회색 막대) 중에 HXL008에 의한 시간 경과에 따른 발톱 침투를 나타낸다.
[도 10(a) 내지 (c)]는 정제된 HXL008+ala의 SDS-PAGE, RP-HPLC 및 질량 분광분석을 나타낸다. [도 10(a)]는 정제된 HXL008+ala의 SDS-PAGE 겔이다. 레인 1, 2 및 14는 분자량 마커(시블루® 플러스 2(SeeBlue® Plus 2))이다. 레인 3 및 4는 HXL008+ala 표준(5 μg)이다. 레인 5 내지 12는 수집된 크기 배제 분획의 시료이다. [도 10(b)]는 수집된 용출액의 RP-HPLC 추적이다. 단일 피크는 ~7.1분에서 관찰된다. [도 10(c)]는 4 kDa 내지 20 kDa의 MALDI-TOF 질량 분광분석 추적이다.
[도 11]은 HXL008, HXL035 및 HXL036의 아미노산 정렬과 정렬에 의해 생성된 공통 서열을 나타낸다. 동일한 아미노산은 검정으로 표시하고, 보존 아미노산은 회색으로 표시한다.
본 명세서 전체에서, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함한다" 또는 이의 변형, 예를 들어, "포함하고" 또는 "포함하는"은 언급된 요소 또는 정수 또는 방법 단계, 또는 요소들 또는 정수들 또는 방법 단계들의 군의 내포를 나타내지만 임의의 요소 또는 정수 또는 방법 단계, 또는 요소들 또는 정수들 또는 방법 단계들의 군의 배제를 나타내지 않는다는 것을 이해할 것이다.
본 출원 명세서에서 사용된 단수 형태 "하나"("a", "an", 및 "the")는, 문맥에서 달리 명시되지 않는다면, 복수 측면을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "하나의 디펜신"의 언급은 단일 디펜신뿐만 아니라 2개 이상의 디펜신도 포함하고; "하나의 제제"는 단일 제제뿐만 아니라 두 가지 이상의 제제도 포함하고; "개시"의 언급은 개시에 교시되는 단일 및 다수의 측면을 포함한다. 등등. 본원에서 교시되고 가능하게 되는 측면은 용어 "발명"에 포함된다. 이러한 모든 측면은 본 발명의 범위 내에서 가능하게 된다. 모든 변이체 및 유도체 또는 다양한 측면은 본 발명의 용어 "형태"에 포함된다.
"디펜신"의 언급은 항진균 활성을 보유하는 하기 식물 디펜신 중 하나를 의미한다:
(i) 서열 번호 24에 개시된 공통 아미노산 서열을 갖는 디펜신;
(ii) HXL008(서열 번호 1), HXL035(서열 번호 2) 및 HXL036(서열 번호 3)으로 이루어진 군으로부터 선택된 디펜신;
(iii) HXL001(서열 번호 4), HXL002(서열 번호 5), HXP35(서열 번호 3), HXL003(서열 번호 6), HXL004(서열 번호 7), HXL005(서열 번호 8), HXL009(서열 번호 9), HXL012(서열 번호 10), HXL013(서열 번호 11), HXL015(서열 번호 12), HXL032(서열 번호 13), HXL033(서열 번호 14), HXL034(서열 번호 15), NsD1(서열 번호 16), NsD2(서열 번호 17), NaD1(서열 번호 18), NoD173(서열 번호 19), DmAMP1(서열 번호 20), HXP4(서열 번호 21), HXP34(서열 번호 22) 및 HXP35(서열 번호 23)로 이루어진 군으로부터 선택된 디펜신;
(iv) 서열 번호 1 내지 47중 어느 하나의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체;
(v) 최적 정렬 후 서열 번호 1 내지 47중 어느 하나와 적어도 80% 유사성을 갖는 디펜신;
(vi) N-말단 알라닌 잔기를 포함하는 서열 번호 1 내지 47중 어느 하나(즉, 서열 번호 25 내지 47); 및/또는
(vii) 최적 정렬 후 서열 번호 1 내지 3중 어느 하나와 적어도 80% 유사성을 갖는 디펜신. 편리상, 상기 디펜신은 서열 번호 24에 개시된 공통 아미노산 서열 내에 포함된다.
한 실시양태에서, 디펜신은 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3, 또는 최적 정렬 후 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3중 어느 하나와 적어도 80% 유사성의 아미노산 서열과 함께 항진균 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체로 정의된다.
제2 디펜신이 제1 디펜신과 함께 사용될 때, 제2 디펜신은 임의의 디펜신일 수 있다.
인간 및 동물 피험체에서 특정 해부학적 부위에서 침입을 포함한 진균 감염의 관리를 용이하게 하는데 사용되는 프로토콜이 본원에서 기재된다. 프로토콜은 인간 및 동물에서 등면 또는 말단 지골을 덮고 있는 뿔 유사 외피 및 뿔 달린 동물에서 관련 대뇌 돌출부에서 또는 위에서 진균 병원체의 성장을 억제하거나 그 외 제어하는 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체의 용도를 포함한다. 한 실시양태에서, 외피는 손톱 또는 발톱, 동물 발톱 또는 발굽이고 대뇌 돌출부는 뿔이다. 한 실시양태에서, 진균 감염은 손발톱 진균증을 일으킨다. 한 실시양태에서, 디펜신은 트리코피톤 루브럼에 대한 강한 살진균 활성을 가지며 포유동물 또는 세균 세포에 대한 활성을 가지지 않거나 의학적으로 허용 가능한 최소 활성을 갖는다. 한 실시양태에서, 디펜신은 서열 번호 24에 개시된 공통 아미노산 서열을 갖는 디펜신과 같이 손발톱에 우수한 침투성을 갖는다. 예는 HXL008(서열 번호 1), HXL035(서열 번호 2) 및 HXL036(서열 번호 3) 또는 N-말단 알라닌 잔기를 갖는 상기 디펜신(각각, 서열 번호 25, 서열 번호 26 및 서열 번호 27)을 포함한다. 임의의 실시양태에서, 디펜신은 또 다른 항진균제와 상승작용적 조합으로 사용된다. 상기 또 다른 항진균제는 비-디펜신 펩티드, 프로테이나제 억제제, 또 다른 디펜신, 및 항진균 특성을 갖는 단백질성 또는 비-단백질성(화학) 제제를 포함한다. 또한, 프로토콜은 케라틴 포함 물질 예를 들어 피부, 모발 및 털뿐 아니라 모발 및 털의 모낭의 진균 감염 치료에 확장된다.
피험체에서 등면 또는 말단 지골을 덮고 있는 뿔 유사 외피 또는 관련 대뇌 돌출부에서 또는 위에서 진균 병원체에 의한 감염의 억제 방법으로서, 외피를 유효량의 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 본원에서 가능하게 한다. 한 실시양태에서, 외피는 손발톱, 동물 발톱 또는 발굽이다. 따라서, 손톱 또는 발톱에서 또는 그 위, 동물 발톱 또는 발굽 위에서 진균 병원체의 성장의 억제 방법으로서, 손발톱 또는 동물 발톱 또는 발굽을 유효량의 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 변이체 또는 유도체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 본원에서 교시한다. 일반적으로, 접촉은 진균 병원체의 성장을 억제하기에 충분한 시간 및 조건하에 있다.
피험체에서 케라틴 포함 물질에서 또는 위에서 진균 병원체에 의한 감염의 억제 방법으로서, 물질을 유효량의 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 본원에서 교시한다. 한 실시양태에서, 케라틴 포함 물질은 모발 또는 털이다. 따라서, 모발 또는 털 또는 모발 또는 털의 모낭에서 또는 위에서 진균 병원체의 성장의 억제 방법으로서, 모발 또는 털 또는 모발 또는 털의 모낭을 유효량의 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 변이체 또는 유도체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 본원에서 교시한다. 일반적으로, 접촉은 진균 병원체의 성장을 억제하기에 충분한 시간 및 조건하에 있다.
한 실시양태에서, 케라틴 포함 물질은 피부이다. 따라서, 피부에서 또는 위에서 진균 병원체의 성장의 억제 방법으로서, 피부를 유효량의 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 변이체 또는 유도체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 본원에서 교시한다. 일반적으로, 접촉은 진균 병원체의 성장을 억제하기에 충분한 시간 및 조건하에 있다.
"진균 억제"는 대조군과 비교하여 진균 성장의 감소(또는 생존능의 소실)에 의해 측정된 살진균 및 정진균 활성 둘 다를 포함한다. 진균 성장은 진균에 따라 당 업계에 공지된 다양한 많은 방법에 의해 측정될 수 있다. 통상적으로 사용되는 사상균(filamentous fungus)의 성장 측정 방법은, 예를 들어, 적합한 성장 배지에서 포자를 발아시키는 단계, 성장을 측정 가능하도록 충분한 시간 인큐베이션하는 단계, 및 명시된 배양 시간 후에 배양물의 광학 밀도의 증가를 측정하는 단계를 수반한다. 광학 밀도는 성장이 증가함에 따라 높아진다. 전형적으로, 진균 성장은 발병기전에 필수적이다. 그러므로 병원체 성장의 억제는 진균 질환으로부터 보호에 대해 적합한 지표를 제공한다. 즉, 억제가 커질수록 보호가 효과적이다. 게다가, 살진균 또는 정진균 활성의 효과는 손발톱, 동물 발톱, 발굽 또는 뿔 또는 모발 또는 털 또는 모발 또는 털의 모낭의 육안 검사에 의해 결정될 수 있다.
손발톱 진균증의 성공적인 치료에 대해 명백하게 정의된 바 없다. 진균학적 치유는 대개 KOH 및 배양 시험 두 가지 모두에 대해 음성 결과로서 정의된다(Elewski et al.(2012) Fungal diseases In: Bolognia, Jorizzo, Schaffer eds, Dermatology 3rd ed. Philadelphia, PA; Elsevier Saunders; chapter 77).
치료 프로토콜은 위험에 있는 피험체에서 감염의 예방(즉, 방지)을 포함한다. "위험에 있는" 피험체는 열대성 기후에 있는 피험체일 수 있다. 따라서, 본 맥락에서 "감염 예방"은 인간 또는 동물 숙주가 디펜신으로 치료받아, 디펜신에 노출되지 않은 숙주와 비교할 때 숙주-진균 상호작용의 자연적 결과인 진균 감염 또는 그와 관련된 질환 증상을 회피하거나, 진균 감염 또는 그와 관련된 질환 증상을 감소 또는 최소화하거나 그 빈도를 낮춘다는 것을 의미한다. 다시 말해서, 진균 병원체 감염이 질환 및/또는 관련 질환 증상(즉, 손발톱 진균증)을 유발하는 것을 예방 또는 감소시키는 것이다. 감염 및/또는 증상이 본원에 교시된 프로토콜로 치료받지 않은 숙주에 비해 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50, 60%, 70% 또는 80% 이상 감소된다. 감소율은 숙주 및 진균 병원체에 적합한 임의의 편리한 방법에 의해 결정될 수 있다.
따라서, 디펜신의 작용은 기타 억제 활성들 중에서 진균 병원체 성장, 복제, 감염 및/또는 유지를 억제하고/거나 진균 감염 또는 침입의 증상의 개선을 유도하는 것이다.
한 실시양태에서, 진균 감염은 손발톱 진균증 또는 관련된 병태를 일으키거나 그와 관련된다.
따라서, 피험체에서 손발톱 진균증 또는 관련 병태의 치료 또는 예방 방법으로서, 손발톱 진균증의 증상을 개선하기 충분한 시간 및 조건하에서 피험체의 감염 부위를 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 본원에서 가능하게 한다.
"손발톱 진균증"의 언급은 원위 손발톱 밑 손발톱 진균증, 백색 표재형 손발톱 진균증, 근위 손발톱 밑 손발톱 진균증 및 칸디다 손발톱 진균증을 포함한다. "손발톱 진균증과 관련된 병태"의 언급은 손발톱, 동물 발톱, 발굽 또는 뿔을 둘러싸는 큐티클 조직의 백선 및 감염을 포함한다.
한 실시양태에서, 진균 감염은 머리 백선, 비듬 또는 지루성 피부염이다.
따라서, 피험체에서 머리 백선, 비듬, 지루성 피부염 또는 관련 병태의 치료 또는 예방 방법으로서, 진균 감염의 증상을 개선하기에 충분한 시간 및 조건하에서 피험체의 물질을 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 본원에서 가능하게 한다.
한 실시양태에서, 진균 감염은 케라틴 포함 물질의 감염이다.
따라서, 피험체에서 케라틴 포함 물질의 진균 감염의 치료 또는 예방 방법으로서, 진균 감염의 증상을 개선하기에 충분한 시간 및 조건하에서 피험체의 물질을 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 본원에서 가능하게 한다.
마지막의 실시양태와 관련하여, 케라틴 포함 물질은 피부, 모발 또는 털이거나 모발 또는 털의 모낭이다.
따라서, 인간의 모발 또는 털 또는 모발 또는 털의 모낭의 진균 감염의 치료 또는 예방 방법으로서, 진균 감염의 증상을 개선하기에 충분한 시간 및 조건하에서 피험체의 모발 또는 털 또는 모발 또는 털의 모낭을 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 본원에서 교시한다.
"접촉"은 인간 또는 동물 피험체에 국소 투여 또는 적용 후 진균 병원체의 디펜신에 노출을 포함한다. 접촉은 정제된 식물 디펜신 또는 상기를 포함하는 제제, 또는 천연적으로 디펜신을 포함하거나 디펜신을 생산하도록 조작된 식물 추출물과의 접촉일 수 있다. 제제는 허브 제제 및 추출물 예를 들어 손발톱 광택제 및 손발톱 세정제를 포함한다. 추출물은 식물 또는 효모(예를 들어, 피키아)와 같은 미생물로부터 유래할 수 있다. 따라서, 디펜신은 인간 또는 동물 피험체의 표면 영역에 국소 도포된다. "접촉"의 언급은 피험체에게 또는 피험체의 감염 부위에 투여하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 디펜신은 국소 제제, 손발톱, 동물 발톱, 발굽 또는 뿔 제제 또는 신체 또는 모발 세정액으로 제제화된다. 디펜신을 포함하는 미생물 또는 세포 추출물이 또한 적용될 수 있다. 한 예는 피키아-유래 추출물이다. 국소 제제는 수용액, 액제, 용액, 음약, 토닉, 세정제, 스프레이, 페인트, 분말, 분산제, 분무 제제(atomized formulation), 크림, 연고, 립스틱, 겔, 슬러지, 페이스트, 패치, 함침 붕대 등을 포함한다. 또한, 디펜신을 포함하는 하나의 식물 추출물을 포함하여 디펜신을 포함하는 식물 추출물들도 고려된다. 일반적으로, 디펜신은 표적 부위(예를 들어, 손발톱, 동물 발톱, 발굽, 뿔 또는 모발 또는 털 입자)에 침투되도록 제제화된다. 한 실시양태에서, 디펜신은 이의 침투성을 기준으로 선택된다.
인간 또는 동물 피험체에서 등면 또는 말단 지골을 덮고 있는 뿔 유사 외피 또는 관련 대뇌 돌출부 안 또는 위에 진균 병원체에 의한 감염을 억제하는데 사용하기 위한 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체를 포함하는 제제를 본원에서 가능하게 한다.
또한, 인간 또는 동물 피험체에서 손발톱, 동물 발톱, 발굽 또는 뿔에 진균 병원체에 의한 감염을 억제하는데 사용하기 위한 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체를 포함하는 제제를 본원에서 가능하게 한다.
또한, 인간 피험체에서 손발톱 진균증과 관련된 진균 병원체에 의한 감염을 억제하는데 사용하기 위한 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체를 포함하는 제제를 본원에서 가능하게 한다.
인간 또는 동물 피험체에서 케라틴 포함 물질의 진균 병원체에 의한 감염을 억제하는데 사용하기 위한 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체를 포함하는 제제를 본원에서 가능하게 한다.
또한, 인간 또는 동물 피험체에서 모발 또는 털 또는 모발 또는 털의 모낭의 진균 병원체에 의한 감염을 억제하는데 사용하기 위한 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체를 포함하는 제제를 본원에서 가능하게 한다.
인간 또는 동물 피험체에서 머리 백선, 비듬 또는 지루성 피부염과 관련된 진균 병원체에 의한 감염을 억제하는데 사용하기 위한 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체를 포함하는 제제를 본원에서 가능하게 한다.
한 실시양태에서, 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체를 포함하는 구획을 포함하거나 구획 형태의 치료 키트를 본원에서 교시한다. 제2 또는 추가의 구획은 기타 항균제를 포함한 기타 제제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 각 구획의 내용물은 사용 전에 혼합되거나 임의의 순서로 순차적으로 사용될 수 있다. 기타 항진균제는 비-디펜신 펩티드, 프로테이나제 억제제, 또 다른 디펜신 또는 단백질성 또는 화학(비-단백질성) 항진균제를 포함한다. 식물 디펜신과 함께 사용될 수 있는 기타 항진균제의 예는 그리세오풀빈, 테르비나핀, 아모롤핀, 시클로피록스, 에피나코나졸, 타바보롤 및 트리아졸을 포함한다.
"식물 디펜신"의 언급은 표 2와 관련하여 본원에 정의된 것들을 의미한다. 또한, 표 2의 디펜신은 손발톱, 동물 발톱, 발굽 또는 뿔에의 이의 침투성을 기준으로 하여 선택될 수 있다. 또한, 표 2의 디펜신은 티. 루브럼에 대한 이의 강한 살진균 활성 및 포유동물 및 세균 세포에 대한 활성의 결여 또는 의학적으로 허용 가능한 최소한의 활성을 기준으로 하여 선택될 수 있다. 본원에서 정의된 디펜신은 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3중 어느 하나 또는 서열 번호 4 내지 47중 어느 하나를 포함하여 서열 번호 24와 적어도 약 80% 유사성을 갖는 디펜신을 포함한다. 80% 유사성은 최적의 정렬 후, 필요한 경우 정렬을 최적화하기 위해 적절한 공간을 사용한 후에 결정된다. "적어도 80%" 또는 "적어도 약 80%"는 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 및 100%를 포함한다. 본 발명을 실시하는데 유용한 디펜신은 손발톱에 쉽게 침투하는 디펜신이다. 구체적인 예는 HXL008(서열 번호 1), HXL035(서열 번호 2) 및 HXL036(서열 번호 3) 및 N-말단 알라닌 잔기를 갖는 이의 변이체(각각, 서열 번호 25, 서열 번호 26 및 서열 번호 27)을 포함한다.
따라서, 피험체에서 등면 또는 말단 지골을 덮고 있는 뿔 유사 외피 또는 관련 대뇌 돌출부 또는 케라틴 포함 물질 또는 케라틴 포함 물질의 모낭에 진균 병원체의 감염의 억제 방법으로서, 감염의 증상을 개선하기에 충분한 시간 및 조건하에서 외피 또는 돌출부 또는 케라틴 포함 물질을 서열 번호 1 내지 47로부터 선택된 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체, 또는 최적의 정렬 후 서열 번호 1 내지 47중 어느 하나와 적어도 80% 유사성을 갖는 디펜신, 또는 N-말단 알라닌 잔기를 갖는 서열 번호 25 내지 47로부터 선택된 디펜신의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 본원에서 교시한다.
또한, 피험체에서 등면 또는 말단 지골을 덮고 있는 뿔 유사 외피 또는 관련 대뇌 돌출부 또는 케라틴 포함 물질 또는 케라틴 포함 물질의 모낭에 진균 병원체의 감염의 억제 방법으로서, 감염의 증상을 개선하기에 충분한 시간 및 조건하에서 외피 또는 돌출부 또는 케라틴 포함 물질을 서열 번호 24에 개시된 공통 아미노산 서열을 갖는 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체, 또는 서열 번호 24와 적어도 80% 유사성을 갖고 경우에 따라 N-말단 알라닌 잔기를 갖는 디펜신의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 본원에서 가능하게 한다.
또한, 손발톱 진균증을 치료하기 위한 HXL008(서열 번호 1), HXL035(서열 번호 2) 또는 HXL036(서열 번호 3)의 용도를 본원에서 교시한다. 또한, 손발톱 진균증을 치료하기 위한 서열 번호 25, 서열 번호 26 또는 서열 번호 27로 정의된 디펜신의 용도를 교시한다.
본원에서 사용되는 용어 "유사성"은 아미노산 수준에서 비교되는 서열 사이에 정확한 동일성을 포함한다. 아미노산 수준에서 비동일성이 존재하는 경우, "유사성"은, 그럼에도, 구조, 기능, 생화학 및/또는 입체구조적인 수준에서 서로 관련된 아미노산을 포함한다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열 비교는 유사성보다는 동일성의 수준에서 이루어진다.
두 개 이상의 폴리펩티드 사이의 서열 관계를 설명하는데 사용되는 용어는 "기준 서열", "비교 창", "서열 유사성", "서열 동일성", "퍼센트 서열 유사성", "퍼센트 서열 동일성", "실질적으로 유사한" 및 "실질적인 동일성"을 포함한다. "기준 서열"은 적어도 12개, 그러나 빈번하게 15 내지 18개, 그리고 대개 적어도 25개 이상, 예를 들어 30개 아미노산 잔기 길이이다. 두 개의 폴리펩티드는 각각 (1) 두 개의 폴리펩티드 사이에 유사한 서열(즉, 전체 아미노산 서열의 단지 일부분) 및 (2) 두 개의 폴리펩티드 사이에 다른 서열을 포함할 수 있기 때문에, 두 개(이상) 폴리펩티드 사이에 서열 비교는 전형적으로 국소 영역의 서열 유사성을 확인하고 비교하는 "비교 창"에 대해 두 개의 폴리펩티드의 서열을 비교하여 수행된다. "비교 창"은 전형적으로 기준 서열과 비교되는 12개 연속 잔기의 개념적인 분절을 언급한다. 비교 창은 두 개의 서열의 최적의 정렬을 위해 기준 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 약 20% 이하의 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교 창을 정렬하기 위한 서열의 최적의 정렬은 컴퓨터로 알고리즘(GAP, BESTFIT, FASTA, Clustal W2 및 TFASTA(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA))의 실시, 또는 조사 및 선택된 임의의 다양한 방법에 의해 생성된 최선의 정렬(즉, 결과적으로 비교 창에 대해 최고의 퍼센트 상동성을 얻음)에 의해 수행될 수 있다. 또한, 예를 들어 문헌(Altschul et al.(1997) Nucl . Acids. Res. 25(17):3389-3402)에 개시된 프로그램중 BLAST 패밀리를 참고할 수 있다. 서열 분석에 대한 상세한 논의는 문헌(Ausubel et al.(1994-1998) In: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc)의 19.3 단원에서 찾아볼 수 있다. 기타 정렬 소프트웨어는 BWA(Li and Durbin(2010) Bioinformatics 26:589-595) 및 Bowtie(Langmead et al(2009) Genome Biol 10:R25) 및 BLAT(Kent(2002) Genome Res 12:656-664)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "서열 유사성" 및 "서열 동일성"은 서열이 비교 창에 대해 아미노산 대 아미노산 기준으로 동일하거나 기능적 또는 구조적으로 유사한 정도를 언급한다. 따라서, "서열 동일성의 퍼센트"는, 예를 들어, 비교 창에 대해 최적으로 정렬된 두 개의 서열을 비교하고, 동일한 아미노산 잔기(예를 들어, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 두 서열 모두에서 발생하는 위치의 개수를 결정하여일치된 위치의 개수를 얻고, 일치된 위치의 개수를 비교 창 내 전체 위치 개수(즉, 창 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 퍼센트를 얻어 계산된다. 본 발명을 위해서, "서열 동일성"은 소프트웨어를 수반하는 기준 매뉴얼에 사용되는 표준 디폴트를 이용하여 임의의 적합한 방법 또는 컴퓨터 알고리즘에 의해 계산된 "일치 퍼센트"를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 유사한 설명이 서열 유사성과 관련하여 적용된다.
본원에서 사용되는 일부 디펜신은 본원에서 그의 출처에 따라 "천연" 디펜신, "변형된" 디펜신, "변이체" 디펜신, "돌연변이된" 디펜신, "합성 유도체 또는 변이체", 또는 "키메라" 디펜신으로 언급될 수 있다. 본 발명을 실시하기 위해서, 상기 디펜신은 항진균 활성을 보유한다.
한 실시양태에서, 디펜신은 II형 솔라내슈스 디펜신이다. 한 실시양태에서, 디펜신은 디펜신의 N-말단 끝 부분에 첫째 β-가닥(β-가닥 1)과 α-나선 사이 루프 영역에서 변형된다. 한 실시양태에서, 루프 영역은 둘째 불변 시스테인 잔기 또는 그의 등가물의 N-말단 6개 아미노산을 포함한다. 이 영역은 "루프 1B"로 정의된다. II형 솔라내슈스 디펜신은 성숙 도메인의 비교적 보존된 C-말단 끝 부분에 의해 다른 디펜신과 구별된다.
변형된 II형 솔라내슈스 디펜신 골격을 포함하는 인공적으로 생성된 디펜신의 용도로서, N-말단 끝 부분에 β-가닥 1과 α-나선 사이 루프 영역이 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실에 의해 변형되어 항병원체 활성을 갖는 변이체 디펜신을 생성하는 것인 용도를 본원에서 포함한다. 한 실시양태에서, 루프 영역은 둘째 불변 시스테인 잔기에 N-말단 6개 아미노산 잔기로 정의된 루프 1B이다. 임의의 디펜신 내 그의 등가 영역이 본원에서 고려된다. 한 실시양태에서, 인공적으로 생성된 디펜신은 변형된 II형 디펜신을 포함한다. 본 프로토콜은 그의 천연 아미노산 서열을 포함하는 NaD1의 용도에 확장되지 않는다.
적합한 디펜신의 예는 표 1에 열거된 것들을 포함한다. 이들은 HXP4(서열 번호 21), HXP34(서열 번호 22) 및 HXP35(서열 번호 23)와 같은 합성 디펜신 변이체를 포함한다. 또한, 본원에서 N-말단 알라닌 잔기를 갖는 마지막 3가지 디펜신(즉, 각각 서열 번호 45 내지 47)이 포함된다. 유용한 디펜신은 HXL008(서열 번호 1), HXL035(서열 번호 2) 및 HXL036(서열 번호 3) 또는 서열 번호 25, 서열 번호 26 및 서열 번호 27을 포함하는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체이다.
손발톱, 동물 발톱, 발굽 또는 뿔에서 또는 위에서 진균 병원체에 의한 감염의 억제 방법으로서, 손발톱, 동물 발톱, 발굽 또는 뿔을 유효량의 본원에서 표 1에 제시된 목록으로부터 선택된 식물 디펜신 또는 이의 유도체 또는 변이체를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 본원에서 교시한다. 일반적으로, 디펜신은 감염의 증상을 개선하기에 충분한 시간 및 조건하에 적용된다. 한 실시양태에서, 증상은 손발톱 진균증 또는 관련 병태와 관련된다.
손발톱, 동물 발톱, 발굽 또는 뿔에서 또는 위에서 진균 병원체에 의한 감염의 억제 방법으로서, 손발톱, 동물 발톱, 발굽 또는 뿔을 유효량의 본원에서 표 2에 제시된 목록으로부터 선택된 식물 디펜신 또는 이의 유도체 또는 변이체를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 본원에서 교시한다. 디펜신은 0.1% 내지 10% w/v의 농도로, 1일 1회, 1일 2회, 2일 1회, 1주 1회, 2주 1회 또는 1개월 1회의 빈도로, 4주, 2주, 1주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월 또는 최대 12개월 기간에 적용될 수 있다. 한 실시양태에서, 증상은 손발톱 진균증 또는 관련 병태와 관련된다.
피부, 모발 또는 털에서 또는 위에서 진균 병원체에 의한 감염의 억제 방법으로서, 피부, 모발 또는 털, 또는 모발 또는 털의 모낭을 유효량의 본원에서 표 1에 제시된 목록으로부터 선택된 식물 디펜신 또는 이의 유도체 또는 변이체를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 본원에서 교시한다. 디펜신은 감염의 증상을 개선하기에 충분한 시간 및 조건하에 적용된다. 한 실시양태에서, 증상은 진균 감염과 관련된다.
피부, 모발 또는 털에서 또는 위에서 진균 병원체에 의한 감염의 억제 방법으로서, 피부, 모발 또는 털, 또는 모발 또는 털의 모낭을 유효량의 본원에서 표 1에 제시된 목록으로부터 선택된 식물 디펜신 또는 이의 유도체 또는 변이체를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 본원에서 교시한다. 디펜신은 0.1% 내지 10% w/v의 농도로, 1일 1회, 1일 2회, 2일 1회, 1주 1회, 2주 1회 또는 1개월 1회의 빈도로, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월 또는 최대 12개월 기간에 적용될 수 있다. 한 실시양태에서, 증상은 진균 감염과 관련된다.
임의의 실시양태에서, 디펜신 또는 이의 유도체 또는 변이체는 항진균제와 같은 또 다른 제제와 함께 사용된다. 디펜신과 펩티드가 상승적으로 작용한다고 제안된다. 기타 제제의 예는 비-디펜신 항균 펩티드, 프로테이나제 억제제, 또 다른 디펜신 또는 단백질성 또는 비-단백질성 화학 살진균제를 포함한다.
본 출원의 디펜신과 함께 사용하기 위한 화학 항진균제는 테르비나핀, 인트라코나졸, 플루코나졸, 시클로피록스, 클로트리마졸, 아모롤핀, 부테나핀, 타바보롤, 에피나코나졸, AN2718 및 NP213을 포함한다.
상승작용의 언급은 주어진 디펜신 또는 기타 제제 단독의 억제 효과가 단독으로 사용된 어느 하나에 비해 둘 다 함께 사용될 때 더 크다는 것을 의미한다. 그레코 연구자들(Greco et al.(1995) Pharmacol Rev. 47:331-385)은 두 제제의 병용이 각각이 단독으로 분석될 때 상가 효과에 비해 더 큰 활성을 갖는다는 것을 기준으로 상승작용의 범주를 정의한다. 따라서, 본원에서 채택된 정의는 함께 작용하는 두 가지 제제의 병용 효과가 단독으로 작용하는 각 제제의 합보다 더 클 때, 이 같은 모든 상황을 포함한다. 게다가, 제제의 병용은 함께 작용하는 제제의 병용 효과가 단독으로 작용하는 개별 성분의 합보다 큰 일련의 조건(농도를 포함하나 이에 제한되지 않음)이 존재하는 경우, 용어는 본원에서 의도되는 바와 같이 상승적이라고 여긴다. 리처(Richer(1987) Pestic Sci 19:309-315)는 상승작용을 입증하는 수학적 접근법을 기재하고 있다. 본 접근법은 두 가지 억제제, X와 Y가 함께 존재할 때 관찰된 억제 수준(Io)을 이들의 병용 효과를 측정하는데 사용되는 동일한 각각의 농도로 별개로 작용하는 각 X 또는 Y로부터 얻은 예상 상가 효과(Ee)와 비교하는 림펠(Limpel) 식을 이용한다. 상가적인 억제율, Ee는 X + Y - XY/100으로 계산된다. 여기서, X 및 Y는 억제율로 나타낸다. 상승작용은 Io > Ee일 때 존재한다.
상승작용은 상승작용 척도로 표현될 수 있다. 한 실시양태에서, 14까지의 값, 예를 들어 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14는 유의한 상승작용을 나타내지 않는다; 15 내지 29까지의 값, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 29는 낮은 상승작용을 나타낸다; 30 내지 60의 값, 예를 들어 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 또는 60은 중간 상승작용을 나타낸다; 60 초과 값은 높은 정도의 상승작용을 보인다. "60 초과"는 61, 70, 80, 90 및 100 및 그 사이의 임의의 값을 포함하여 61 내지 100을 포함한다.
본 방법은 등면 또는 말단 지골을 덮고 있는 뿔 유사 외피 또는 관련 대뇌 돌출부의 또는 케라틴 포함 물질 예를 들어 피부, 모발 또는 털의 진균 병원체에 의해 감염되거나 침입받은 피험체의 치료 또는 예방에 유용하다. 용어 "피험체"는 모든 나이의 인간 또는 동물, 예를 들어 가축(예를 들어, 양, 돼지, 말, 소, 당나귀, 낙타, 라마, 알파카) 또는 가금(예를 들어, 닭, 오리, 칠면조, 꿩, 공작), 반려동물(예를 들어, 개 또는 고양이), 실험실 실험동물(예를 들어, 생쥐, 쥐, 토끼, 기니피그 또는 햄스터) 또는 가두어진 야생 동물(예를 들어, 야생 염소)을 포함한다. "인간" 또는 "동물"은 이들의 일부분 예를 들어 발톱, 손톱, 동물 발톱, 발굽, 뿔, 피부, 모발 또는 털을 포함한다.
"진균"의 언급은 피부 사상균, 효모 및 피부 사상균 이외의 사상균(비-피부 사상균)을 포함한다. 피부 사상균은 트리코피톤 루브럼, 트리코피톤 인터디지탈, 트리코피톤 비올라슘, 트리코피톤 톤수란스 , 트리코피톤 수다넨스 , 및 트리코피톤 멘타그로피트를 포함한 트리코피톤 종, 마이크로스포룸 풀범, 에피더모피톤 플로코숨 및 마이크로스포룸 집슘을 포함한다. 효모는 칸디다 알비칸스 및 칸디다 글라브 라타를 포함한 칸디다 종을 포함한다. 진균은 무좀과 같은 백선, 비듬 또는 피부염을 일으킬 수 있다.
본원에 교시된 또 다른 측면은 하나 이상의 약학적으로 또는 수의학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체를 포함하는, 손발톱 진균증 또는 관련 병태를 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 조성물이다. 임의의 실시양태에서, 식물 디펜신은 디펜신 및 또 다른 항진균제와 함께 사용된다. 한 실시양태에서, 조성물은 스프레이, 미스트, 마이크로입자 또는 나노입자, 수용액, 음약, 세정제, 토닉, 분산제, 분무 제제, 립스틱, 슬러지, 분말, 크림, 연고, 겔, 패치, 함침 붕대, 액체, 제제, 페인트 또는 국소 형태의 조성물을 포함하는 기타 적합한 분산 매질의 형태이다. 디펜신은 손발톱, 동물 발톱, 발굽 또는 뿔 또는 모발 또는 털 입자에 침투를 용이하게 하도록 특별히 제제화될 수 있다.
유용한 용도는 손발톱, 동물 발톱, 발굽 또는 뿔의 또는 모발 또는 털의 진균 감염용 용액, 페인트, 크림, 분말, 점적제, 연고, 샴푸 및 음약을 포함한다.
디펜신과 경우에 따라 본원에 기재된 또 다른 항진균제를 포함하는 조성물은 일반적으로 담체, 부형제, 희석제, 보존제, 안정제 및/또는 고체 또는 액체의 첨가제를 포함한다. 또한, 디펜신을 포함하는 추출물이 사용될 수 있다. 제제는 신체 세정제 또는 샴푸 또는 음약을 포함한다.
조성물은 의도하는 투여 방법에 따라 매우 다양한 형태를 취할 수 있다. 일반적으로, 배타적으로는 아니나, 국소 조성물은 인간 또는 동물 피험체에 사용된다. 조성물을 제조할 때, 예를 들어 물, 유기산, 예를 들어 시트르산 또는 아세트산, 글리콜, 예를 들어 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜, 오일, 알코올, 예를 들어 에탄올, 메탄올, 또는 이소프로판올, 보존제 및/또는 착색제와 같은 통상의 매질이 이용될 수 있다. 조성물은 예를 들어 현탁액, 엘릭시르제 및 용액과 같은 액체 제제 형태를 취할 수 있다. 또한, 전분, 당, 미세결정 셀룰로스, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등과 같은 담체가 사용될 수 있다. 또한, 조성물은 페인트, 분말, 분산제, 연고, 크림 및 세정제의 형태일 수 있다.
조성물은 하나 이상의 허용 가능한 부형제, 예를 들어 에틸렌 디아민테트라아세트산, 시클로메티콘, 히드록시프로필 셀룰로스, 카복시메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 키토산, 폴리비닐피롤리돈, 에틸 아세테이트, 디이소프로필 아디페이트, 이소프로필 미리스테이트 및 미리스틸 락테이트를 포함할 수 있다.
디펜신은 일반적으로 감염의 증상을 개선하기에 충분한 시간 및 조건하에서 감염 부위에 직접 투여된다. 이는 손발톱 진균증 또는 관련 병태의 증상의 개선을 포함한다.
한 실시양태에서, 디펜신은 0.1% 내지 10% w/v의 농도로, 1일 1회, 1일 2회, 2일 1회, 1주 1회, 2주 1회 또는 1개월 1회의 빈도로, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월 또는 최대 12개월 기간에 감염 부위에 직접 투여된다.
에어로졸 또는 스프레이로 투여될 때, 조성물은 약학 제제의 기술 분야에 잘 알려진 기술에 따라 제조되며 벤질 알코올 또는 기타 적합한 보존제, 생체 이용률을 상승시키기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 기타 당 업계에 공지된 가용화제 또는 분산제를 이용하여 염류 용액으로서 제조될 수 있다.
디펜신의 유효 투여량은 단독 또는 특정 조합으로 사용되는지 여부, 투여 방식, 치료되는 진균 병원체, 및 진균 병원체 침입의 중증도에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 디펜신을 이용하는 투여 용법은 유형, 종, 나이, 체중, 성별 및 피험체의 의학적 소인; 치료되는 병태의 중증도; 투여 방식; 및 이용되는 특정 디펜신에 따라 선택된다. 통상의 기술을 가진 의사, 임상의 또는 수의사는 진균 병원체 침입의 진행을 방지, 반대작용, 또는 저지하는데 필요한 디펜신의 유효량을 결정하고 처방할 수 있다. 또한, 서방형 제제가 본원에서 고려된다. 한 실시양태에서, 조성물은 디펜신의 감염 부위로 진입을 용이하게 하는 침투제를 포함한다.
한 실시양태에서, 조성물은 손발톱을 통한 침투를 증가시키는 분자를 포함한다. 손발톱 침투를 증가시키는 분자는 무기 염, 머캅탄, 글리신, 시스테인, 요소, 과산화물, 산 예를 들어 인산 또는 티오클리콜산, 알칼리, 예를 들어 수산화나트륨또는 수산화칼륨, 환원제(티올, 아황산염), 디메틸설폭시드, 폴리 글리콜, 글리세린, C2-5 알코올, C2-8 폴리올, C6-24 지방산 트리글리세리드, C6-24 지방알코올, C6-24 알킬 설페이트, C6-24 지방산; 비이온계 계면활성제 또는 이들의 혼합물을 포함한다(Murthy et al.(2009) J Pharm Sci 98(11):4264-4271; Nair et al.(2009) J Pharm Pharmacol 61(4):413-417; Malhotra and Zatz(2002) J Pharm Sci 91(2):312-323; Khengar et al.(2007) Pharm Res 24(12):2207-2212; Murdan(2008) Expert Opin Drug Deliv 5(11):1267-1282; Reeves 미국 특허 제6,391,879호; Willers et al. 유럽 특허 제264327호).
또 다른 측면은 진균 병원체에 감염되거나 침입받은 인간 피험체와 같은 포유동물을 포함하는 동물의 치료 또는 예방 프로토콜 또는 방법으로서, 등면 또는 말단 지골을 덮고 있는 뿔 유사 외피 또는 관련 대뇌 돌출부 또는 케라틴 포함 물질인 부위에서 식물 디펜신을 포함하는 조성물의 항진균 병원체에 유효량을 피험체에게 적용하는 단계를 포함하는 프로토콜 또는 방법을 제공한다.
또 다른 측면은 피부, 모발 또는 털의 손발톱 진균증 또는 진균 감염의 치료또는 예방 프로토콜 또는 방법으로서, 식물 디펜신과 경우에 따라 또 다른 항진균제를 포함하는 조성물의 항진균 병원체에 유효량을 손발톱, 동물 발톱, 발굽, 뿔 또는 모발 또는 털 입자, 또는 모발 또는 털의 모낭에 적용하는 단계를 포함하는 프로토콜 또는 방법을 제공한다. 마지막 것은 비-디펜신 항균 펩티드, 프로테이나제 억제제, 또 다른 디펜신 및 단백질성 또는 비-단백질성 화학 항진균제를 포함한다.
용어 "적용"은 한 부위에 접촉 및 노출뿐 아니라 투여를 포함한다. 한 실시양태에서, 적용은 손발톱, 동물 발톱, 발굽 또는 뿔에 침투시키는 행위 또는 모발 또는 털 입자 또는 모발 또는 털의 모낭에 침투시키는 행위를 포함한다.
디펜신은 뿔 유사 외피 및 관련 대뇌 돌출부, 예를 들어 손발톱, 동물 발톱, 발굽 및 뿔의, 또는 케라틴 포함 물질, 예를 들어 모발 또는 털의 진균 질환 또는 감염을 방지하는데 유용하다. 한 실시양태에서, 본 출원 명세서는 손발톱 진균증 또는 관련 병태의 치료 또는 예방을 위한 프로토콜을 교시한다. 한 실시양태에서, 본 출원 명세서는 머리 백선, 비듬 및 지루성 피부염, 또는 관련 병태의 치료 또는 예방을 위한 프로토콜을 교시한다. 프로토콜은 인간 및 동물에 적용된다.
본 디펜신은 이의 아미노산 서열을 기초로 하여, 예를 들어 펩티드 또는 단백질 합성기를 이용하는 하나 이상의 아미노산 잔기의 표준의 단계적인 첨가를 이용하여 제조할 수 있다. 별법으로, 디펜신은 재조합 방법에 의해 제조된다. 재조합 디펜신은 이의 N-말단에 추가의 알라닌 잔기를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 고려되는 디펜신은 N-말단 알라닌 잔기를 포함할 수 있다.
본원에서 교시되는 또 다른 측면은 식물 디펜신의 재조합 제조 방법이다.　 한 실시양태에서, 식물 디펜신은 미생물 발현 시스템을 이용하여 제조된다. 추가의 실시양태에서, 발현 시스템은 효모 기반의 발현 시스템, 예를 들어 피키아 파스토리스이다. 바람직한 실시양태에서, 식물 디펜신은 세포 밖으로 단백질을 표적화하는 분비 신호를 갖는 융합 단백질로서 발현된다. 그 후 분비 신호는 효소에 의해 제거되어 성숙 식물 디펜신을 발현 배지로 분비한다. 그 후 식물 디펜신은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된다. 바람직한 실시양태에서, 식물 디펜신은 SP-세파로스(Sepharose)와 같은 수지를 이용하는 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된다. 그 후, 식물 디펜신은 슈퍼덱스(Superdex) 30과 같은 작은 단백질에 적합한 매질을 이용하는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제된다.
또한, 디펜신은 화학 변형을 거쳐 디펜신을 화학 유사체로 만들 수 있다. 이러한 디펜신 유사체는 조직과 접촉 시에 더 큰 안정성 또는 더 긴 반감기를 보일 수 있다.
본원에서 고려되는 유사체는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 합성, 가교 결합제의 사용 및 디펜신 분자 상에 입체구조적 제약을 주는 기타 방법 중에 비천연 아미노산 및/또는 이들의 유도체를 편입시키는 측쇄 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 용어는 또한 디펜신의 변형, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등을 배제하지 않는다. 예를 들어 하나 이상의 아미노산 유사체(예를 들어 비천연 아미노산 포함)를 포함하는 디펜신, 또는 치환된 결합을 갖는 디펜신이 본 정의 내에 포함된다. 이러한 유사체는 안정성 및/또는 침투성을 향상시킬 수 있다.
본 출원에 의해 고려되는 측쇄 변형의 예는 아미노기의 변형, 예를 들어 알데히드와의 반응에 의한 환원적 알킬화에 이어 NaBH4와의 환원; 메틸아세티미데이트와의 아미드화; 아세트산 무수물과의 아실화; 아미노기의 시아네이트와의 카바모일화; 아미노기의 2, 4, 6-트리니트로벤젠 설폰산(TNBS)과의 트리니트로벤질화; 아미노기의 숙신산 무수물 및 테트라히드로프탈산 무수물과의 아실화; 및 리신의 피리독살-5-포스페이트와의 피리독실화 이어서 NaBH4와의 환원에 의한 아미노기의 변형을 포함한다.
아르기닌 잔기의 구아니딘 기는 2,3-부탄디온, 페닐글리옥살 및 글리옥살과 같은 시약과의 헤테로시클릭 축합 산물의 형성에 의해 변형될 수 있다.
카복실 기는 O-아실이소우레아 형성을 통한 카보디이미드 활성화, 이어서 예를 들어 상응하는 아미드로의 후속적인 유도체화에 의해 변형될 수 있다.
설프히드릴 기는 방법, 예를 들어 요오도아세트산 또는 요오도아세트아미드와의 카복시메틸화; 시스테산으로의 과산화포름산 산화; 기타 티올 화합물과의 혼합된 디설파이드의 형성; 말레이미드, 말레산 무수물 또는 기타 치환된 말레이미드와의 반응; 4-클로로머큐리벤조에이트, 4-클로로머큐리페닐설폰산, 페닐머큐리 클로라이드, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀 및 기타 수은제를 이용한 수은 유도체의 형성; 알칼리 pH에서 시아네이트와의 카바모일화에 의해 변형될 수 있다.
트립토판 잔기는 예를 들어 N-브로모숙신이미드와의 산화 또는 2-히드록시-5-니트로페닐 브로마이드 또는 설페닐 할라이드와의 인돌 고리의 알킬화에 의해 변형될 수 있다. 한편 티로신 잔기는 테트라니트로메탄과의 니트로화에 의해 변경되어 3-니트로티로신 유도체를 형성할 수 있다.
히스티딘 잔기의 이미다졸 고리의 변형은 요오도아세트산 유도체와의 알킬화 또는 디에틸 피로카보네이트와의 N-카베톡실화에 의해 수행될 수 있다.
펩티드 합성과정에서 비천연 아미노산 및 유도체 편입의 예는 노르류신, 4-아미노 부티르산, 4-아미노-3-히드록시-5-페닐펜탄산, 6-아미노헥산산, t-부틸글리신, 노르발린, 페닐글리신, 오르니틴, 사코신, 4-아미노-3-히드록시-6-메틸헵탄산, 2-티에닐 알라닌 및/또는 D-이성체 아미노산의 사용을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이작용성 가교 결합제, 예를 들어 (CH2)n 스페이서 기(n = 1 내지 n = 6)를 갖는 이작용성 이미도 에스테르, 글루타르알데히드, N-히드록시숙시니미드 에스테르, 및 대개 N-히드록시숙시니미드와 같은 아미노 반응성 모이어티와 말레이미도 또는 디티오 모이어티(SH) 또는 카보디이미드(COOH)와 같은 또 다른 기 특이 반응성 모이어티를 포함하는 헤테로-이작용성 시약이 사용될 수 있다. 또한, 펩티드는 예를 들어 Cα 및 N α-메틸아미노산의 편입, 아미노산의 Cα와 Cβ 원자 사이에 이중 결합의 도입, 및 N과 C 말단 사이, 두 측쇄 사이 또는 측쇄와 N 또는 C 말단 사이에 아미드 결합 형성과 같은 공유 결합을 도입함으로써 시클릭 펩티드 또는 유사체의 형성에 의해 입체구조적으로 제약받을 수 있다.
모방체는 디펜신 유사체의 또 다른 유용한 군이다. 용어는 디펜신과 약간의 화학적 유사성을 가지며 이의 항진균 활성을 모방하는 물질을 언급하고자 한다. 펩티드 모방체는 단백질 2차 구조의 요소를 모방하는 펩티드 함유 분자일 수 있다(Johnson et al., Peptide Turn Mimetics in Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto et al., Eds., Chapman and Hall, New York, 1993). 펩티드 모방체 사용 뒤에 기본 원리는 단백질의 펩티드 골격이 주로 활성 작용을 촉진하도록 하는 방식으로 아미노산 측쇄를 향하도록 존재한다는 것이다.
또 다른 측면은 인간 손발톱에 진균 감염 또는 침입의 감소 또는 제어 방법으로서, 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체와 경우에 따라 또 다른 항진균제를 인간에서 잠재적으로 감염된 부분에 국소 적용하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 의약은 용액, 분말, 스프레이, 분무기, 나노입자, 겔, 페이스트, 함침 붕대, 페인트, 에어로졸, 음약 또는 기타 액체 형태이다. 항진균 제제는 또한 서방형 조성물일 수 있다.
또 다른 측면은 인간 모발에 진균 감염 또는 침입의 감소 또는 제어 방법으로서, 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체와 경우에 따라 또 다른 항진균제를 인간에서 잠재적으로 감염된 부분에 국소 적용하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 의약은 용액, 분말, 스프레이, 분무기, 나노입자, 겔, 페이스트, 함침 붕대, 페인트, 에어로졸, 음약 또는 기타 액체 형태이다. 항진균 제제는 또한 서방형 조성물일 수 있다.
본원에서 사용되는 "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)," "함유하는(containing)" 또는 "특징을 갖는(chracterized by)"과 동의어이며, 포괄적 또는 개방적이며 나열되지 않은 추가의 요소 또는 방법의 단계를 배제하지 않는다. 본원에서 사용되는 "~로 이루어진(consisiting of)"은 청구된 요소에서 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원에서 사용되는 "~로 필수적으로 이루어진(essentially consisting of)"은 청구항의 기본 및 신규 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다. 특히 조성물의 성분의 설명에서, 또는 장치의 요소의 설명에서 용어 "포함하는(comprising)"의 본원에서 임의의 설명은 나열된 성분 또는 요소로 필수적으로 이루어진 조성물 및 방법, 및 이들로 이루어진 조성물 및 방법을 포함하는 것으로 이해된다. 본원에서 예시적으로 기재된 본 개시는 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제약 또는 제약들 없이도 적합하게 실시될 수 있다.
마쿠쉬 군 또는 기타 군이 본원에서 사용될 때, 군의 모든 개별 일원 및 그 군의 모든 조합 및 부분 조합은 본 개시에 개별적으로 포함하고자 한다.
범위가 본원에서 나열될 때, 언급된 범위 내의 모든 부분 범위, 및 언급된 범위 내의 모든 정수 값은 마치 각각의 부분 범위 및 정수 값이 나열된 것처럼 의도하고자 한다.
실시예
본원에서 개시되고 가능해지는 측면은 이제 하기 비제한적인 실시예에서 기재한다.
방법
피키아 파스토리스로부터 디펜신의 정제
pPINK-디펜신 피. 파스토리스 피키아핑크(PichiaPink)(등록상표) 균주 1 단일 콜로니를 사용하여 250 mL 플라스크 내 25 mL의 BMG 배지(인비트로젠(Invitrogen) 피키아 발현 매뉴얼에 기재됨)에 접종하고 30℃ 진탕 인큐베이터(140 rpm)에서 2-3일간 인큐베이션한다. 배양물을 사용하여 30℃ 진탕 인큐베이터(140 rpm)에 하룻밤 둔 1 L 배플(baffled) 플라스크 내 200 mL의 BMG에 접종한다. 세포를 원심분리(1,500 x g, 10분, 4℃)하여 수거하고 5 L 배플 플라스크 내 1 L의 BMM 배지에 재현탁하고 28℃ 진탕 인큐베이터에서 3일간(NaD1의 경우 2일) 인큐베이션한다. 배양물은 t=24 및 48h에 유도한다. 발현 배지는 원심분리(6000 rpm, 20분, 4℃)에 의해 세포와 분리한다. 배지는 pH 3.0으로 조정한 후 100mM 인산칼륨 완충액, pH 6.0으로 미리 평형화된 SP 세파로스 컬럼(1 cm x 1 cm, Amersham Biosciences)에 적용한다. 그 후, 컬럼은 100 mL의 100mM 인산칼륨 완충액, pH 6.0으로 세척한다(HXL004의 경우 세척 x 2). 결합된 단백질은 10x10 mL의 500 mM NaCl 함유 100mM 인산칼륨 완충액으로 용출한다. 닷 블롯을 실시하여 용출된 단백질 중 최고 농도를 가진 분획을 확인하고 그 분획을 원심분리 컬럼을 이용하여 1 mL로 농축하고 멸균 밀리 Q 초순수(milli Q ultrapure water)를 이용하여 5x 세척한다. 피키아에서 발현된 디펜신의 단백질 농도는 단백질 표준으로서 소 혈청 알부민(BSA)을 이용한 비신코닌산(BCA) 단백질 분석(Pierce Chemical Co.)을 이용하여 결정한다.
본원에서 사용하기 위해 고려되는 디펜신은 표 1 및 2에 열거하며 최적 정렬 후 열거된 디펜신 중 어느 하나와 적어도 80% 유사성을 갖는 디펜신을 포함한다.
[도 1(a) 내지 (e)]는 아미노산 서열 사이의 유사성을 나타내는 정렬이다(정의에 대해서 표 1을 참조한다). [도 11]은 HXL008(서열 번호 1), HXL035(서열 번호 2) 및 HXL036(서열 번호 3)의 아미노산 서열의 정렬을 제공한다. 이 정렬을 이용하여 서열 번호 24에 개시된 공통 아미노산 서열을 얻는다. 이들 중 임의의 서열은 임의로 N-말단 알라닌 잔기를 포함할 수 있다.
실시예 1
식물 디펜신의 존재하에서 트리코피톤 루브럼 및 마이크로스포룸 풀범의 성장의 억제
식물 디펜신은 솔라내슈스 II형 디펜신(NaD1) 및 I형 디펜신(HXL001, HXL002, HXL004, HXL005, HXL008, HXL009, HXL012, HXL013, HXL015, NaD2)을 포함한다. 서열 식별자에 대해 표 1 및 2를 참조한다.
트리코피톤 루브럼 , 티. 인터디지탈 , 마이크로스포룸 풀범 및 씨. 알비칸스(여성 및 아동 병원의 남부 호주 병리학 교실, 국립 진균학 연구소(National Mycology Reference Centre, South Australia Pathology at the Women's and Children's Hospital, Adelaide, Australia)로부터 얻음)의 성장에 대한 식물 디펜신의 억제 효과는 기본적으로 문헌(Broekaert et al.(1990) FEMS Microbiol Lett 69:55-59)에 기재된 바와 같이 측정한다.
티. 루브럼, 티. 인터디지탈 및 엠. 풀범의 포자를 ½ 농도의 사부로 덱스트로스 한천(SDA)에서 성장한 포자형성 진균으로부터 단리한다. 포자는 ½ 농도의 감자 덱스트로스 액체 배지(PDB: potato dextrose broth)를 첨가하여 플레이트로부터 제거하였다. 씨. 알비칸스 세포는 효모 펩톤 액체 배지(YPD: Yeast Peptone Broth)에서 16 h 동안 배양한다. 포자 및 세포 농도는 혈구계를 이용하여 측정한다.
항진균 분석은 기본적으로 본원에 기재된 바와 같이 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 수행한다. 웰에 20 ㎕의 필터 여과된(0.22 μm 주사기 필터(Millipore)) 디펜신(각각의 최종 농도에 대해 10x 저장액) 또는 물, 및 80 ㎕의 ½ 농도 PDB 중 5 x 104 포자/mL(티. 루브럼 , 티. 인터디지탈 , 엠. 풀범) 또는 5,000 세포/mL(씨. 알비칸스)를 로딩한다. 플레이트는 30℃에서 인큐베이션한다. 진균 성장은 마이크로타이터 플레이터 판독기(SpectraMax Pro M2; Molecular Devices)를 이용하여 595nm(A595)에서 광학 밀도를 측정하여 분석한다. 시험 디펜신이 전혀 없을 때 진균의 광학 밀도(OD)가 OD 0.2에 도달할 때까지 성장을 진행시킨다. 각 시험은 중복하여 실시한다.
72 h 인큐베이션 후에, 100 g/mL HXL008과 인큐베이션된 티. 루브럼의 임상 단리체를 포함하는 웰의 배지를 신선한 사부로 덱스트로스 한천에 평판 배양하였다. 플레이트는 30℃에서 5일간 인큐베이션하여 콜로니가 성장하도록 한 후 사진 촬영하였다.
억제 분석 결과는 표 3에 나타낸다. HXL005, HXL008 및 HXL035가 진균 병원체 범위에 걸쳐 가장 효과적인 식물 디펜신이다. HXL001 및 HXL009는 시험된 농도에서 활성을 전혀 나타내지 않았다. HXL002 및 NaD2는 엠. 풀범 및 씨. 알비칸스의 매우 불량한 억제제이다. HXL004, HXL012, HXL013 및 HXL015는 병원체 범위에 걸쳐 중간 활성을 나타낸다.
HXL008(실선) 및 NaD1(파선)에 의한 티. 루브럼의 임상 단리체의 억제 결과는 [도 2(a) 내지 2(d)]에 나타낸다. 두 펩티드 모두는 20 μg/mL 미만의 IC50으로 낮은 농도에서 4가지 임상 단리체에 대해 진균 성장을 억제하였다. 그러나 모든 경우에 HXL008은 NaD1보나 더 낮은 농도에서 성장을 억제하였다.
티. 루브럼의 임상 단리체에 대한 세포 생존 분석의 결과는 [도 3(a) 내지 3(e)]에 나타낸다. 식물 디펜신과 인큐베이션되지 않은 세포로 접종된 플레이트는 거의 완전하게 성장으로 덮였다. 반면, HXL008의 존재하에서 72 h 인큐베이션된 세포로 접종된 플레이트는 1-3개 콜로니만을 보였으며 모든 세포가 사멸된 것을 나타냈다.
[표 3]
Figure pct00006
실시예 2
HXL008의 존재하에서 28일에 걸친 트로코피톤 루프럼의 성장의 억제
트리코피톤 루브럼(여성 및 아동 병원의 남부 호주 병리학 교실, 국립 진균학 연구소(Adelaide, Australia)로부터 얻음)의 성장에 대한 HXL008의 억제 효과를 28일에 걸쳐 모니터하였다.
티. 루브럼의 포자를 ½ 농도의 사부로 덱스트로스 한천에서 성장한 포자형성 진균으로부터 단리한다. 포자는 ½ 농도의 감자 덱스트로스 액체 배지(PDB)를 첨가하여 플레이트로부터 제거한다. 포자 및 세포 농도는 혈구계를 이용하여 측정한다.
포자는 0, 10 또는 50 μg/mL HXL008을 함유하는 ½ PBD(2 mL) 중에 5 x 104 포자/mL 농도로 희석하였다. 배양물은 진탕 없이 30℃에서 인큐베이션한다. 24 h 후, 100 μL의 각 배양물을 추출하고 ½ SDA 플레이트에 평판 배양한다. 그 후 0, 20, 또는 100 μg의 HLX008을 함유하는 추가의 100 ㎕의 ½ PDB를 첨가한다. 그 후 SDA 플레이트를 30℃에서 5일간 인큐베이션한다. 이 과정을 매 24 h 마다 28일간 반복한다. 15일 후, HXL008을 함유하지 않는 배양물은 너무 진해 피펫팅을 할 수 없게 되어 분석에 더이상 사용하지 않는다.
억제 분석의 결과는 [도 4]에 나타낸다. 10 μg/mL 또는 50 μg/mL으로 처리한 배양물은 분석 기간에 걸쳐 티. 루브럼의 눈에 보이는 성장을 전혀 나타내지 않았다. 24 h 내에, 50 μg/mL에서 HXL008은 HXL008이 없을 때 ½ SDA에서 평판 배양될 때에 보이는 바와 같은 티. 루브럼 세포의 80% 이상을 사멸시켰다. 다음 19일에 걸쳐 생존하는 콜로니 개수는 계속하여 감소하였다. 처리 20일 후에, 플레이트는 0 또는 단지 1개의 콜로니만을 보이며, 세포의 99.5%이상이 사멸된 것을 나타냈다.
실시예 3
인간 손발톱을 통한 식물 디펜신의 침투
인간 손발톱을 통한 NaD1의 침투는 문헌(Hui et al.(2002) J Pharm Sci 91(1):189-195)의 방법에 따라 측정하였다. 인간 발톱은 사이언스캐어(ScienceCare(USA))로부터 얻어 인산 완충 식염수(상세설명, PBS)로 세척한 후 3 h 동안 PBS에 적신 킴와이프(kimwipe)에 놓고 발톱을 다시 수화시켰다. 그 후 발톱은 0.5 x 0.5 cm(Permagear, USA)의 투약 영역을 가진 플라스틱 발톱 어댑터에 놓고 75 ㎕의 PBS로 적신 면봉을 발톱의 아래쪽과 접촉하여 수용 챔버에 놓았다.
단백질(10-30 ㎕의 5-10 mg/mL 용액)은 매 24 h 마다 4일간 발톱 위에 적용하였다. 발톱 아래쪽과 접촉된 면봉은 24 h 후, 그리고 뒤이어 매 24 h 마다 제거하였다. 발톱을 통과한 단백질은 500 ㎕의 0.1% v/v 트리플루오로아세트산으로 2회 세척하여 면봉으로부터 회수하였다. 회수한 단백질은 RP-HPLC를 이용하여 정량하였다.
발톱 침투 분석 결과는 표 4와 [도 5]에 나타낸다. 발톱 표면에 매일 적용될 때, 식물 디펜신 HXL008, NaD1 및 HXL004는 현재 국소 손발톱 진균증 치료법(타바보롤, 에피나코나졸 및 시클로피록스)의 활성 성분보다 더 빠르고 더 효과적으로 발톱을 침투할 수 있었다. NaD1 또는 HXL004보다 더 많은 HXL008이 발톱을 통과해 들어간 것으로 검출되었다. 식물 디펜신 HXL012는 발톱에 침투하지 못했다.
[표 4]
Figure pct00007
실시예 4
식물 디펜신의 존재하에서 에쉐리키아 콜라이의 성장의 억제
단일 이 . 콜라이 콜로니를 사용하여 5 ml의 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 배지에 접종하고 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 배양물의 광학 밀도를 측정하고 이. 콜라이를 600 nm(OD600)에서 광학 밀도가 0.01이 되도록 뮐러-힌튼(Mueller-Hinton) 액체 배지에 희석하였다. 희석된 이. 콜라이를 10 μM, 5 μM, 2.5 μM, 1.25 μM, 0.625 μM, 0.3125 μM 또는 0.1625 μM의 농도의 디펜신을 포함한 96웰 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 OD595에서 판독하여 0시간 데이터 지점을 얻었다. 플레이트를 37℃에서 18시간 인큐베이션한 후 OD595에서 판독하여 이. 콜라이 성장의 양을 평가하였다.
이. 콜라이의 억제 결과는 [도 7]에 나타낸다. HXL004는 LL37 대조군과 유사하게 농도 의존적인 방식으로 이. 콜라이의 성장을 억제하였다. NaD1 및 HXL008은 시험된 농도에서 이. 콜라이의 성장을 억제하지 않았다.
실시예 5
식물 디펜신의 존재하에서 포유동물 세포의 생존
인간 단핵구 림프종(U937) 세포는 RPMI-1640 배지에서 배양한다. 모든 배양 배지는 5-10% v/v 소 태아 혈청, 100 U/ml의 페니실린, 및 100 μg/ml의 스트렙토마이신을 보충한다. 세포주는 5% v/v CO2를 함유하는 가습된 대기 중에 37℃에서 배양한다. 부착 세포 주는 0.25% v/v 트립신과 0.5 μM EDTA를 함유하는 혼합물을 첨가하여 플라스크로부터 유리시킨다.
유세포 분석법 기반 요오드화프로피듐(PI) 흡수 분석을 실시하여 식물 디펜신의 (기본적으로 문헌(Poon et al, 2014)에 기재된 바와 같이) U937 세포 침투능을 분석한다. 간략하게, 세포를 0.1% v/v BSA/RPMI-1640중에 1 x 106 세포/ml로 현탁하고, 식물 디펜신(10 μM)과 37℃에서 30분간 인큐베이션한다. 시료를 최종 농도 1 μg/ml PI를 함유하는 PBS에 첨가하고 얼음에 둔다. 그 후 시료는 BD FACSCanto II 유세포 분석기 및 BD FACSDiva 소프트웨어 v6.1.1을 이용하여 바로 분석한다. 결과로 얻은 유세포 분석 데이터를 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 v8.8.6을 이용하여 분석한다. 세포는 정방 산란 및 측방 산란을 기본으로 하여 적절하게 통과시키고 세포 침투는 PI-양성 염색으로 정의한다.
PI-흡수 분석의 결과는 [도 7]에 나타낸다. 식물 디펜신 NaD1 및 HXL005는 시험된 조건하에서 포유동물 세포에 독성을 보인다. NaD1은 33%의 세포에 침투하였지만, HXL005는 거의 25%에 침투하였다. 식물 디펜신 HXP4, HXL004 및 HXL013은 단지 13%(HXP4 및 HXL004) 또는 5%(HXL013)의 세포에 침투하여 포유동물 세포에 대해 낮은 독성을 보였다. 반면, HXL001, HXL002, HXL008, HXL009 및 HXL012는 2% 미만의 세포에 침투하여 시험된 조건하에서 포유동물 세포에 유의한 독성을 보이지 않았다.
실시예 6
식물 디펜신의 존재하에서 인간 적혈구 세포 용해
인간 적혈구(RBC)를 전혈로부터 수집하고 1 x PBS로 세척하고 1000 x g에서 10분간 펠렛을 형성하였다. RBC는 1/10로 희석하고 식물 디펜신(100 μM)으로 처리하여 5% v/v CO2/95% v/v 대기의 가습 분위기하에 하룻밤 인큐베이션하였다. 24 h 인큐베이션 후, 세포를 2000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상등액을 1x PBS로 1/100 희석하였다. 그 후 RBC의 용해를 나타내는 헤모글로빈 방출을 412 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 결과는 물로 처리된 RBC(100% 용해로 나타냄)에 대해 정규화하였다.
적혈구 용해 분석의 결과는 [도 8]에 나타낸다. 100 μM에서, 식물 디펜신 NaD1 및 HXL004는 각각 1.47 및 1.09 퍼센트 용해시켰지만, HXL008은 단지 0.42 퍼센트 용해시켰다. 오류 막대는 표준 편차를 나타낸다.
실시예 7
인간 손발톱을 통한 HXL008의 침투에 대한 제제 성분의 효과
HXL008은 물, 50 mM 시트레이트 완충액 pH 4.0, 또는 20% v/v 에탄올과 0.5 mM EDTA를 함유하는 50 mM 시트레이트 완충액 pH 4.0 중 어느 하나에 10 mg/mL의 농도로 용해시켰다. 인간 손발톱을 통한 각 제제 중 HXL008의 침투는 상기 문헌(Hui et al.(2002))의 방법에 따라 측정하였다. 인간 발톱은 사이언스캐어(USA)로부터 얻어 인산 완충 식염수(PBS)로 세척한 후 3 h 동안 PBS에 적신 킴와이프에 놓고 발톱을 다시 수화시켰다. 그 후 발톱은 0.5 x 0.5 cm(Permagear, USA)의 투약 영역을 가진 플라스틱 발톱 어댑터에 놓고 75 ㎕의 PBS로 적신 면봉을 발톱의 아래쪽과 접촉하여 수용 챔버에 놓았다.
제제 내 단백질(10 ㎕의 10 mg/mL 용액)은 매 24 h 마다 2-3일간 발톱 위에 적용하였다. 발톱 아래쪽과 접촉된 면봉은 24 h 후, 그리고 뒤이어 매 24 h 마다 제거하였다. 발톱을 통과한 단백질은 500 ㎕의 0.1% v/v 트리플루오로아세트산으로 2회 세척하여 면봉으로부터 회수하였다. 회수한 단백질은 RP-HPLC를 이용하여 정량하였다.
침투 분석 결과는 표 6 및 [도 9]에 나타낸다. 발톱 표면에 매일 적용될 때, 발톱을 통한 HXL008의 침투는 에탄올 및 EDTA의 첨가 또는 무첨가된 50mM 시트레이트 완충액 pH4.0이 존재할 때 향상된다.
[표 6]
Figure pct00008
실시예 8
피. 파스토리스를 이용한 식물 디펜신의 재조합 발현
식물 디펜신 HXL008, HXL008+ala, HXL004 및 NaD1은 방법에 기재된 바와 같이 피키아 파스토리스에서 발현하였다.
피. 파스토리스에서 재조합 발현으로부터 다양한 식물 디펜신의 수율은 표 7에 나타낸다. HXL008+ala가 7.5 mg/L의 수율로 가장 높이 발현된 단백질이었다.
[표 7]
Figure pct00009
실시예 9
HXL008 +ala의 대규모 발현 및 정제
HXL008+ala의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 피키아 발현 벡터 pPIC9에 클로닝한다. ORF는 α-인자 분비 신호와 인프레임으로 KEX2 절단 부위의 바로 하류에 삽입한다. 그 후 플라스미드는 제한 효소 SalI을 이용하여 HIS4 선별 카세트에 선형화하고 전기천공 적격(electrocompetent) GS115 피키아 파스토리스 세포에 형질전환 시킨다. 양성 콜로니는 히스티딘 결여 배지를 이용하여 선별한다. 양성 콜로니를 사용하여 5mL의 YPD에 접종하고 진탕 인큐베이터에 30℃에서 25 h 동안 인큐베이션한다. 배양물 내 세포를 20% 글리세롤과 혼합하고, 급속 냉동하여 -80℃에서 보관한다.
글리세롤 보존액으로부터 세포를 YPD 플레이트에 획선 도말하고 30℃에서 48 h 동안 배양하도록 한다. 그 후 플레이트를 4℃에 2주까지 보관한다.
YPD 플레이트의 세포(pPIC9-디펜신, GS115)를 사용하여 2.5 L 내 500 mL의 BMG 배지(인비트로젠 피키아 발현 매뉴얼에 기재됨)에 접종하고 배양물을 28℃ 진탕 인큐베이터(120 rpm)에서 2일간 인큐베이션한다. 48 h 후, 배양물을 사용하여 30 L B 브라운 발효기(Braun Fermenter) 내 20 L의 발효 기본 염 배지(Fermentation Basal Salts Media)에 접종한다. 온도는 발효 기간에 걸쳐 28℃로 유지한다. pH의 어떤 감소에 대하여 25% 암모니아 용액을 첨가하여 pH는 발효 기간에 걸쳐 5.0으로 유지한다. 용존 산소(DO: Dissolved oxygen)는 교반(최소 500 rpm)을 증가시키거나 흐름 또는 산소를 증가시켜 발효 기간에 30%로 유지한다.
20 L 배양물에 3.6 mL/분의 속도로 멸균 100% 글리세롤을 공급하다가 세포 밀도가 250 - 300 g/L에 도달할 때, 글리세롤 공급을 멈추고, DO에서 스파이크에 의해 증명되는 바와 같이, 모든 글리세롤이 소비될 때까지 배양을 진행하도록 한다. 그 후, 배양물에 12 mL/L 미량 금속을 함유하는 멸균 100% v/v 메탄올을 공급한다. 공급속도는 0.2에서 2.18 mL/분으로 8 h에 걸쳐 가속시킨다. 그 후 2.18 mL/분의 공급 속도를 추가 48 h 동안 지속한다.
발현 배지를 수거하고 원심분리(6000 rpm, 20분 4℃)하여 세포와 분리한다. 배지는 0.22 μm 막을 통해 여과하여 맑게 하였다. 배지는 50 mM 아세테이트 완충액 pH 5.3에 1/5로 희석한다. 그 후 희석된 배지는 50 mM 아세테이트 완충액 pH 5.3으로 미리 평형화된 SP-세파로스 컬럼(고성능)에 적용한다. 그 후 컬럼은 20배 컬럼 부피의 50 mM 아세테이트 완충액 pH 5.3으로 세척한다. 결합된 HXL008은 1 M NaCl을 함유하는 0-100% v/v 50 mM 아세테이트 완충액 pH 5.3의 선형 구배를 이용하여 용출한다. 단백질 함유 분획(280 nm에서 흡광도로 확인됨)을 모아 200 mL로 농축한 후 크기 배제 크로마토그래피를 거친다. 단백질은 1800 mL 슈퍼덱스 30 컬럼(5cm x 92cm XK50/100 컬럼)에 로딩하고 50 mM 인산나트륨 완충액, 150 mM NaCl, pH 7.2를 이용하여, 15 mL/분으로 용출한다. 공극 용적에 용출되는 단백질은 버리고 HXL008+ala를 함유하는 분획은 질량 분광분석법을 이용하여 확인한다. HXL008을 함유하는 분획을 모은 후 멸균 밀리Q 물 안으로 탈염시키고 3000 MWCO 스핀 컬럼을 이용하여 농축한다.
결과로 얻은 펩티드 용액은 SDS-PAGE, RP-HPLC 및 질량 분광분석법에 의해 분석하였다. 최종 수율은 BCA 분석을 이용하여 펩티드 농도를 측정함으로써 결정하였다. 총 1.436 g의 HXL008+ala를 생산하고 99% 이상의 순도로 정제한다.
정제 결과는 [도 10]에 나타낸다. [도 10A]는 정제된 HXL008+ala의 SDS-PAGE 겔이다. 레인 1, 2 및 14는 분자량 마커이다(시블루[등록 상표] 플러스 2). 레인 3 및 4는 HXL008+ala 표준(5 μg)이다. 레인 5 내지 12는 크기 배제 분획을 모은 시료이다. [도 10B]는 모은 용출액의 RP-HPLC 추적이다. 단일 피크는 ~7.1 분에 관찰되며, 이는 HXL008+ala의 예상 체류 시간과 일치한다. [도 10C]는 4 kDa 내지 20 kDa의 MALDI-TOF 질량 분광분석 추적이다. 관찰된 질량(5477 Da)은 모두 4개의 디설피드 결합이 형성된 HXL008+ala의 예상 질량에 해당한다.
당 업자는 본원에 기재된 개시가 구체적으로 기재된 것 이외에 변이 및 변형을 거치기 쉽다는 것을 알 것이다. 본 개시는 그러한 모든 변이 및 변형을 고려하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 개시는 본 명세서에서 개별적으로 또는 종합적으로 언급되거나 명시된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 두 개 이상의 임의의 단계 또는 특징 또는 조성물 또는 화합물의 모든 조합을 가능하게 한다.
참고문헌
Figure pct00010
Figure pct00011
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Claims (34)

  1. 피험체에서 등면 또는 말단 지골을 덮고 있는 뿔 유사 외피 또는 관련 대뇌 돌출부 또는 케라틴 포함 물질 또는 케라틴 포함 물질의 모낭에서의 진균 병원체 감염의 억제 방법으로서, 감염의 증상을 개선하기에 충분한 시간 및 조건하에서 외피 또는 돌출부 또는 케라틴 포함 물질을, 외피 또는 돌출부 또는 케라틴 포함 물질에 침투하는 서열 번호 1 내지 47로부터 선택된 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체, 또는 최적의 정렬 후 서열 번호 1 내지 47 중 어느 하나와 적어도 80% 유사성을 갖는 디펜신, 또는 N-말단 알라닌 잔기를 갖는 서열 번호 1 내지 23(서열 번호 25 내지 47)으로부터 선택된 디펜신, 또는 외피 또는 돌출부 또는 케라틴 포함 물질에 침투하도록 제제화된 디펜신의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 외피가 발톱 또는 손톱, 동물 발톱 또는 발굽이고 관련 대뇌 돌출부가 뿔인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 감염이 손발톱 진균증 또는 관련 병태와 관련되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 관련 병태가 손발톱, 동물 발톱, 발굽 또는 뿔을 둘러싸는 큐티클 조직의 백선 또는 감염인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 케라틴 포함 물질이 모발, 털 또는 피부인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 디펜신이 서열 번호 24에 개시된 공통 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 디펜신이 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 디펜신이 서열 번호 4 내지 23 및 서열 번호 25 내지 47로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 디펜신 변이체가 I형 디펜신의 루프 1B를, 솔라내슈스(Solanaceous) II형 디펜신의 상응하는 루프 1B를 대체하여 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 디펜신 변이체가 HXP4, HXP34 및 HXP35로 이루어진 목록으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 디펜신이 항진균제와 상승작용적 조합으로 사용되는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 항진균제가 약 0.4 내지 약 12 kDa의 펩티드 또는 프로테이나제 억제제인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 항진균제가 테르비나핀, 인트라코나졸, 플루코나졸, 시클로피록스, 클로트리마졸, 아모롤핀 및 부테나핀으로부터 선택된 화학 살진균제인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 진균 병원체가 피부 사상균, 칸디다(Candida) 속균 및 비-피부 사상균으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 피부 사상균이 트리코피톤 루브럼(Trychophyton rubrum), 트리코피톤 인터디지탈(Trichophyton interdigitale), 트리코피톤 비올라슘(Trichophyton violaceum), 트리코피톤 톤수란스(Trichophyton tonsurans), 트리코피톤 수다넨스(Trichophyton soudanense), 트리코피톤 멘타그로피트(Trychophyton mentagrophytes)를 포함한 트리코피톤 속균, 마이크로스포룸 풀범(Microsporum fulvum), 에피더모피톤 플로코숨(Epidermophyton floccosum) 또는 마이크로스포룸 집슘(Microsporum gypseum)인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 비-피부 사상균이 네오사이탈리듐(Neoscytalidium), 스코풀라리옵시스(Scopulariopsis), 아크레모늄(Acremonium), 및 사이탈리듐(Scytalidium) 속의 종인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 비-피부 사상균이 네오사이탈리듐 및 스코풀라리옵시스 속의 종을 포함하는 것인 방법.
  18. 감염의 증상을 개선하기에 충분한 시간 및 조건하에서 서열 번호 1 내지 47로부터 선택된 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체, 또는 최적의 정렬 후 서열 번호 1 내지 47 중 어느 하나와 적어도 80% 유사성을 갖는 디펜신, 또는 N-말단 알라닌 잔기를 갖는 서열 번호 1 내지 23(서열 번호 25 내지 47)으로부터 선택된 디펜신, 및 하나 이상의 약학적으로 또는 수의학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는, 손발톱 진균증 또는 관련 병태의 치료에 사용하기 위한 국소 제제 또는 세포 또는 식물 추출물.
  19. 제18항에 있어서, 관련 병태가 백선인 제제 또는 세포 또는 식물 추출물.
  20. 감염의 증상을 개선하기에 충분한 시간 및 조건하에서 서열 번호 1 내지 47로부터 선택된 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체, 또는 최적의 정렬 후 서열 번호 1 내지 47 중 어느 하나와 적어도 80% 유사성을 갖는 디펜신, 또는 N-말단 알라닌 잔기를 갖는 서열 번호 1 내지 23(서열 번호 25 내지 47)으로부터 선택된 디펜신, 및 하나 이상의 약학적으로 또는 수의학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는, 케라틴 포함 물질의 감염 치료에 사용하기 위한 국소 제제 또는 세포 또는 식물 추출물.
  21. 제20항에 있어서, 케라틴 포함 물질이 모발, 털 또는 피부인 제제 또는 세포 또는 식물 추출물.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 신체 또는 모발 세정제 또는 페인트, 스프레이, 점적제, 크림 또는 로션 어플리케이터인 제제 또는 세포 또는 식물 추출물.
  23. 제18항 또는 제20항에 있어서, 디펜신이 공통 아미노산 서열인 서열 번호 24로 정의되는 것인 제제 또는 세포 또는 식물 추출물.
  24. 제23항에 있어서, 디펜신이 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제제 또는 세포 또는 식물 추출물.
  25. 인간 또는 동물 피험체에서 손발톱 진균증 또는 관련 병태의 치료 또는 예방을 위한 의약 제조에 있어서의 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항의 제제 또는 세포 또는 식물 추출물의 용도.
  26. 인간 또는 동물 피험체에서 케라틴 포함 물질의 치료 또는 예방을 위한 의약 제조에 있어서의 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항의 제제 또는 세포 또는 식물 추출물의 용도.
  27. 제26항에 있어서, 케라틴 포함 물질이 모발, 털 또는 피부인 용도.
  28. 손발톱, 동물 발톱, 발굽 또는 뿔에서 진균 병원체의 감염의 억제 방법으로서, 증상을 개선하기에 충분한 시간 및 조건하에서, 손발톱, 동물 발톱, 발굽 또는 뿔을, 손발톱, 동물 발톱, 발굽 또는 뿔에 침투하는 서열 번호 1 내지 47로부터 선택된 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체, 또는 최적의 정렬 후 서열 번호 1 내지 47 중 어느 하나와 적어도 80% 유사성을 갖는 디펜신, 또는 N-말단 알라닌 잔기를 갖는 서열 번호 1 내지 23(서열 번호 25 내지 47)으로부터 선택된 디펜신, 또는 감염의 증상을 개선하기에 충분한 시간 및 조건하에서 손발톱, 동물 발톱, 발굽 또는 뿔에 침투하도록 제제화된 디펜신의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 증상이 손발톱 진균증 또는 관련 병태와 관련되는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 관련 병태가 손발톱, 동물 발톱, 발굽 또는 뿔을 둘러싸는 큐티클에서 백선 또는 감염인 방법.
  31. 케라틴 포함 물질을 감염시키는 진균 병원체의 감염의 억제 방법으로서, 증상을 개선하기에 충분한 시간 및 조건하에서, 상기 물질을, 케라틴에 침투하는 서열 번호 1 내지 47로부터 선택된 식물 디펜신 또는 이의 기능적 천연 또는 합성 유도체 또는 변이체, 또는 최적의 정렬 후 서열 번호 1 내지 47 중 어느 하나와 적어도 80% 유사성을 갖는 디펜신, 또는 N-말단 알라닌 잔기를 갖는 서열 번호 1 내지 23(서열 번호 25 내지 47)으로부터 선택된 디펜신, 또는 감염의 증상을 개선하기에 충분한 시간 및 조건하에서 케라틴에 침투하도록 제제화된 디펜신의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 케라틴 포함 물질이 모발, 털 또는 피부인 방법.
  33. 제28항 또는 제31항에 있어서, 디펜신이 공통 아미노산 서열인 서열 번호 24로 정의되는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 디펜신이 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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