CN116133669A - 用于抑制包括冠状病毒感染的病毒感染的材料和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于抑制病毒感染的组合物和方法。本发明的优选实施方式提供药物组合物及其使用方法，其包含发酵乳杆菌细菌菌株或其生物活性提取物。

Description

用于抑制包括冠状病毒感染的病毒感染的材料和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年6月6日提交的美国临时专利申请序列号63/035,733的优先权；其通过引用整体并入本文。

序列表

该申请的序列表标记为“SeqList-05Jun20-ST25.txt”，创建于2020年6月5日，大小为3KB。序列表通过引用整体并入本文。

背景技术

从1960年代开始，已经发现了多种感染人类的冠状病毒。从冠状病毒科开始，这些病毒主要感染上呼吸道和胃肠道。虽然许多此类感染是轻微的并且通常包括例如普通感冒，但也存在更具致病性和潜在致命性的毒株，包括SARS、MERS和2019年爆发的SARS-CoV-2毒株(2019-nCov或COVID-19)。

SARS(严重急性呼吸综合征)、MERS(中东呼吸综合征)和SARS-CoV-2(SARS相关冠状病毒2)都是高致病性人类冠状病毒，可导致呼吸、肝脏、胃肠和神经系统的急性和慢性疾病。一般认为，每种病毒都是从动物宿主中出现并转移到人类，从而导致人类流行病，2002年SARS爆发，2012年MERS爆发，2019年底SARS-CoV-2爆发。

冠状病毒是一种包被的单链RNA病毒，因其由刺突(S)、包膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)蛋白组成的冠状表面结构而得名。刺突蛋白尤其负责进入宿主细胞的作用，其中冠状病毒能够转录其RNA以进行胞质内复制。事实上，冠状病毒具有在巨噬细胞的细胞内空间中复制和存活的独特能力，由此多种编码的干扰素拮抗剂被认为会阻碍I型干扰素(IFN)和干扰素刺激基因(ISG)的激活，从而抑制宿主免疫反应并促成由此导致的病毒的发病机制(Rose等人，2010，Journal of Virology 84(11)：5656-5669)。

一旦基因组复制且多蛋白形成，病毒组装并从受感染的细胞中释放以进一步传播。宿主之间的传播被认为主要是通过接触感染了此类病毒颗粒的呼吸道飞沫而发生的，这些飞沫是通过打喷嚏和咳嗽产生的(CDC.gov，2020)。

冠状病毒可以从动物宿主中出现并在人类中引起重大流行病，例如2002-2003年的严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)(其被认为是一种在2012年出现的病毒)，它们中的每一个的每次相应爆发导致8000多例感染和774例死亡，以及2500例感染和862例死亡(WHO，2020)。世界卫生组织(WHO)宣布全球紧急情况，新发现并迅速传播的SARS-CoV-2与SARS-CoV具有约70％的遗传相似性，很可能具有相似的流行病学特征，因此提出了关于医疗保健问题的紧迫的领域。至关重要的是，目前还没有适合预防或治疗人类冠状病毒感染的疫苗或抗病毒药物(Habibzadeh&Stoneman2020,Int J Occup Environ Med 11(2):65-71)。

SARS-CoV-2卫生紧急情况表明缺乏有效的病毒特异性治疗或疫苗，因此导致高的且未能得到满足的对高危人群(包括老年人、医护人员和处于SARS-CoV-2的院内传播的严重危险中或在其他密闭空间内(例如在隔离环境中)的患者)的保护需求。

由于目前没有批准任何此类可行的抗病毒药物或疫苗，因此特别需要一种安全有效的方法来治疗或预防由冠状病毒(尤其是与SARS-CoV-2相关的那些冠状病毒)引起的感染或其症状。

当自由漂浮的浮游细菌锚定在生物或惰性表面(例如留置医疗器材)上时，生物膜就开始形成。附着的细菌从单层状态繁殖并发展为微菌落，然后发展到临界数量，此时细菌串扰发生，引发被称为群体感应的现象，其导致生物膜表型。群体感应可以开启在浮游细菌中不表达的生物膜生成基因。细菌共同响应，以表达针对生物膜表型的表达因子，从而导致胞外多糖(EPS)基质的分泌，从而确定生物膜表型。

生物膜表型的形态学特征是微生物塔的形成，微生物塔由具有介入水通道的嵌入的活细菌层组成。在适当的环境条件下，自由漂浮的细菌从生物膜中释放出来，循环在其他表面继续。

发明内容

本发明提供了用于抑制包括冠状病毒感染的病毒感染的组合物和方法。本发明的优选实施方式提供了药物组合物及其使用方法。在优选的实施方式中，本发明的组合物通过先天免疫系统的免疫调节抑制病毒进入细胞和/或病毒在细胞间传播。

有利地，本文提供的优选组合物和治疗方法有效抑制病毒感染，包括在一些实施方式中通过诱导保护性先天免疫。在一些实施方式中，病毒抑制活性也可以通过组合物的组分与ACE2受体结合从而阻止病毒进入细胞来实现。

在某些实施方式中，本发明的组合物可以有效地用于治疗急性和慢性病毒感染。在特定的实施方式中，受试者感染了冠状病毒或有感染冠状病毒的风险。例如，此类冠状病毒包括严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)和2019年底发现的SARS-CoV-2病毒。

一方面，本发明提供了用于治疗病毒感染的治疗组合物，其包含细菌菌株或来自其的生物活性提取物，以及药学上可接受的赋形剂。在其他实施方式中，本发明提供了用于预防病毒感染发作或传播的预防性组合物。

在某些实施方式中，组合物包含发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)菌株或其生物活性提取物。在优选的实施方式中，当细菌生长为生物膜时获得细菌的提取物。本发明还提供了包含冻干、冷冻干燥和/或裂解物形式的发酵乳杆菌或其生物活性提取物的组合物。

在一些实施方式中，细菌菌株是发酵乳杆菌Qi6，在本文中也称为LfQi6。在一个实施方式中，本发明提供了LfQi6的分离的或生物学纯培养物。在另一个实施方式中，本发明提供了生长为生物膜的LfQi6的生物学纯培养物。本文具体教导的是用于诱导和鉴定生物膜表型的方法。本文进一步提供了利用生物膜表型以及生物膜表型的提取物及其裂解物的方法。在优选的实施方式中，药物组合物包含LfQi6生物膜的生物活性提取物。在一个实施方式中，该提取物被命名为Qi601S。

在进一步的实施方式中，本发明提供了抗病毒蛋白。在特定的实施方式中，本发明提供了“Qi611S”，一种具有根据SEQ ID NO.1的氨基酸序列的蛋白质。在某些实施方式中，本发明还提供“Qi611S蛋白质”，其包括Qi611S及其生物活性片段和变体。

在一些实施方式中，Qi611S蛋白质可由细胞产生，优选由细菌细胞产生。因此，在特定的实施方式中，本发明提供了用于产生Qi611S蛋白质的方法，该方法包括在有利于蛋白质表达的条件下培养细胞，所述细胞具有编码SEQ ID NO.1全部或部分的核苷酸序列或其变体或片段。在优选的实施方式中，核苷酸序列是Qi611s(SEQ ID NO.2)。任选地，可以从培养物中纯化蛋白质。

在一个实施方式中，该方法利用具有Qi611s核苷酸序列(SEQ ID NO.2)的微生物，例如发酵乳杆菌Qi6。Qi611s编码根据SEQ ID NO.1的氨基酸序列(Qi611S)。

在另一个实施方式中，细胞是已经被重组改变以具有表达Qi611S蛋白质的能力的微生物。在特定的实施方式中，该微生物拥有全部或部分的Qi611s基因。因此，在某些实施方式中，本发明提供了重组细胞，其具有根据SEQ ID NO.2的DNA序列的全部或部分，和/或能够表达具有根据SEQ ID NO.1的氨基酸序列或SEQ ID NO.1的片段或变体的蛋白质。在一个示例性实施方式中，重组细胞是大肠杆菌BL21或大肠杆菌C43。

这种细胞转化可以使用微生物领域技术人员熟知的技术来完成。在一个实施方式中，可以修饰核苷酸序列以优化Qi611S蛋白质的表达。

在优选的实施方式中，本发明提供了组合物，其包含Qi611S蛋白质和/或包含根据SEQ ID NO.2的DNA序列的全部或部分的细胞，以及任选地药学上可接受的载体。

药学上可接受的载体可以包括用于根据特定途径将组合物施用给受试者的物质，特定途径包括例如口服施用、吸入、滴眼剂、注射(例如，皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、鞘内和/或皮下)和/或局部施用(例如，通过皮肤吸收)。在某些实施方式中，组合物可以配制成食品、胶囊、丸剂、口服液、洗剂、乳膏、乳剂、软膏、油、凝胶、血清、气雾剂、雾剂、蒸气和/或其组合。

在一些实施方式中，可以在配制到组合物中之前从细胞培养物中提取蛋白质并且任选地纯化蛋白质。在一些实施方式中，组合物包含能够产生Qi611S蛋白质的细胞。在一个实施方式中，细胞处于冻干、冷冻干燥和/或裂解物形式。在一个实施方式中，该组合物包含处于生物膜状态的细胞培养物。

另一方面，本发明提供了一种抑制病毒感染的方法，包括向受试者施用有效量的组合物，其中组合物优选包含LfQi6生物膜的一种或多种生物活性提取物。

在一个实施方式中，本发明提供了一种自净化表面，其中已将本发明的蛋白质或细胞应用于该表面。蛋白质可以是例如Qi611S蛋白质。优选地，该表面具有抗病毒特性。表面可以是例如布、纺织品、金属、陶瓷、木材、皮肤、液体、塑料或玻璃。

附图说明

图1示出了Lf Qi6培养步骤。步骤1：在MRS琼脂平板上培养Lf Qi6；步骤2：Lf Qi6在5ml MRS肉汤中37℃下培养24小时；步骤3：将0.1ml培养物转移到含有25ml MRS肉汤的T-150组织培养板中；步骤4：每48小时更换25ml MRS培养基，生物膜Lf Qi6在底部生长为菌苔；步骤5：培养物生长7天，以获得底部的厚的生物膜层；步骤6：刮出生物膜层并将其悬浮在新鲜培养基中。冷冻原液可用甘油制成并储存在-80°。

图2说明了Lf Qi6扩大培养步骤。步骤1：生物膜表型Lf Qi6在10ml新鲜MRS培养基中在37°下培养24小时；步骤2：取10ml培养物接种到具有500g无菌玻璃棉的25L MRS培养基中；步骤3：在37℃在静态条件下培养72小时。每24小时轻轻摇动以混合培养物；步骤4：收获培养基和玻璃棉。超声处理玻璃棉以分离生物膜细胞；步骤5：离心细胞以浓缩生物膜LfQi6。悬浮在无菌水中。

图3说明了在扩大培养中基板中的Lf Qi6生物膜生长。

图4说明了Lf Qi6下游处理的示例。步骤1：将50g生物膜表型Lf Qi6悬浮于1L无菌水中；步骤2：悬浮液在室温下轻轻混合24小时，以被动释放生物活性物质；步骤3：然后使用OmniSonic Ruptor 400将混合物超声处理30分钟(50KHz，200瓦)，成为均匀的裂解物；步骤4：冷冻超声处理裂解物；步骤5：将冷冻的裂解物冻干成细粉。

图5说明了SDS带，该带示出了从Lf Qi6生物膜表型制备的生物提取物中的独特蛋白质。箭头示出了与浮游生物表型相比的生物膜表型中的独特蛋白质。

图6说明了尺寸排阻HPLC，示出了从Lf Qi6生物膜表型制备的生物提取物中的独特蛋白质。

图7说明了尺寸排阻HPLC，示出了从Lf Qi6生物膜表型制备的生物提取物中的独特蛋白质。

图8示出了一种银染SDS-PAGE凝胶，用于确定重组大肠杆菌菌株合成的Qi611S的存在。SDS-PAGE凝胶载有从重组大肠杆菌BL21释放的蛋白质的样品，其由凝胶右侧的粗箭头标识。利用Qi611s基因通过pET-15b表达载体转化大肠杆菌菌株。

图9示出了根据本发明的实施方式使用的pET-15b载体的图谱。

图10示出了由T7 RNA聚合酶转录的编码链的pET-15b克隆/表达区。

图11-15示出了不同浓度的本发明组合物对PRCB的控制。60小时后实现了基本完全抑制，没有细胞毒性。24小时后获得了类似的结果。

序列说明

SEQ ID NO:1是命名为“Qi611S”的蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2是Qi611s，编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO:3是根据本发明有用的正向引物“Lacto F”。

SEQ ID NO:4是根据本发明有用的反向引物“Lacto R”。

SEQ ID NO:5是pET-15b载体的克隆/表达区的核苷酸序列。

SEQ ID NO:6是由pET-15b载体的克隆/表达区编码的组氨酸标签重组蛋白质的氨基酸序列。

具体实施方式

本发明提供了用于抑制病毒感染和/或其症状的组合物和方法。本发明的优选实施方式提供药物组合物及其使用方法，其包含发酵乳杆菌菌株和/或其一种或多种生物活性提取物。本发明还提供了包含冻干、冷冻干燥和/或裂解物形式的发酵乳杆菌和/或其生物活性提取物的组合物。

有利地，本文提供的优选组合物和治疗方法(包括在一些实施方式中通过诱导保护性先天免疫)有效抑制病毒感染。在某些实施方式中，本发明的组合物可以有效地用于治疗急性和慢性病毒感染。在特定的实施方式中，受试者感染了冠状病毒或有感染冠状病毒的风险。例如，此类冠状病毒包括严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)和2019年底发现的SARS-CoV-2病毒。

一方面，本发明提供了一种用于抑制病毒感染的药物组合物，其包含分离的细菌菌株和/或其生物活性提取物以及任选的一种或多种药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，分离的和/或生物学纯的菌株是发酵乳杆菌Qi6，下文也称为Lf Qi6。在优选的实施方式中，本文提供的药物组合物包含在Lf Qi6成长为生物膜表型后获得的Lf Qi6的一种或多种生物活性提取物。生长生物膜的方法在本领域中是已知的并且在例如WO 2012/118535(其通过引用其整体并入本文，包括在该参考文献中引用的出版物，例如在第26-31页引用的那些)中有所描述。

本文提供的药物组合物还可以包括本领域技术人员已知的其他药学上可接受的成分，包括但不限于药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂、稀释剂、填充剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂(例如润湿剂)、掩蔽剂和着色剂。该制剂还可包含其他活性剂，包括例如其他治疗剂或预防剂。

另一方面，本发明提供了一种通过免疫调节或其他方式抑制病毒感染的方法。该方法优选地包括向受试者施用治疗有效量的药物组合物，该组合物优选地包含Lf Qi6生物膜的一种或多种生物活性提取物。

在优选的实施方式中，本发明的组合物通过先天免疫系统发挥其病毒抑制活性。具体地，通过作用于参与炎症和/或其他免疫反应的信号通路(包括例如细胞因子和受体)，本发明的组合物可以抑制病毒进入细胞和/或从一个细胞传播到另一个细胞的能力。在一个实施方式中，免疫调节通过PPAR激动作用的参与来进行。在优选的实施方式中，先天系统因此可以准备好更有效地抵抗相同或相关病毒的未来感染。病毒抑制活性也可以通过组合物的组分与ACE2受体的结合来实现，从而阻止病毒进入细胞。

选定的定义

如本文所用，提及“分离的”微生物是指已经从与它一起存在于自然界的材料中移除的微生物。微生物可以从例如土壤、血液、粘液或牛奶中分离出来，这样它就可以从这些材料中移除，并且不再与这些材料以在自然界中的程度混合或以其他方式相关联。这种分离可用于赋予微生物显著不同的特性，例如产生与微生物在其自然状态下表现出的相比的不同化合物或不同量的化合物。

如本文所用，“生物学纯培养物”是指已从其他生物活性材料(包括可能在自然界中与之相关的任何材料)中分离出来的培养物。在优选的实施方式中，培养物已与所有其他活细胞分离。在进一步优选的实施方式中，相比可能存在于自然界中的相同微生物物种的培养物，生物学纯培养物具有有利的特征。有利的特征可以是例如一种或多种所需生长副产物的增加生产。

在某些实施方式中，纯化的化合物是目标化合物的至少60wt％。优选地，制剂是目标化合物的至少75wt％，更优选地至少90wt％，并且最优选地至少99wt％。例如，纯化的化合物优选为所需化合物的至少90wt％、91wt％、92wt％、93wt％、94wt％、95wt％、98wt％、99wt％或100wt％(w/w)。纯度通过任何合适的标准方法测量，例如通过柱色谱法、薄层色谱法或高效液相色谱法(HPLC)分析。

如本文所用，术语“提取物”是指通过处理培养物获得的组合物。该处理可以涉及例如物理和/或化学处理。物理和/或化学处理可以包括例如过滤、离心、超声作用、压力处理、辐射处理、裂解、用溶剂或其他化学品处理以及这些处理的组合。提取物可以是例如通过离心产生的上清液的形式。提取物还可以包括通过离心获得的细胞团。细胞可以是完整的或不完整的、存活的或未存活的。提取物可包含细胞膜组分和/或细胞内组分。在某些实施方式中，提取物是至少80wt％、85wt％、90wt％或95wt％的细胞团。在某些实施方式中，至少95％的完整细胞是不能存活的。在某些实施方式中，提取物中少于10％的细胞团是完整细胞。

“Qi611S”是指具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质。单数或复数形式的“Qi611S蛋白质”是指Qi611S，以及611S的生物活性片段和变体。

如本文所用，“基因”是指能够表达多肽和/或氨基酸链的DNA片段或核苷酸序列。在某些实施方式中，基因包括在编码区之前和/或之后的区域，例如启动子区域。

如本文所用，“分离的”或“纯化的”化合物基本上不含在自然界中与之相关的其他化合物，例如细胞物质。纯化或分离的多核苷酸(核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))不含在其天然存在的状态下位于其两侧的序列。纯化或分离的多肽不含例如在自然界中与之相关的其他细胞物质。在微生物菌株的上下文中，“分离”意味着该菌株已从其在自然界中存在的环境中分离。因此，分离的菌株可以作为例如生物学纯培养物或作为与载体关联的孢子(或其他形式的菌株)存在。

如本文所提供，“药学上可接受的”是指被联邦或州政府的监管机构批准或可批准，或列于美国药典或其他公认的用于包括人类的动物的药典中。

“药学上可接受的赋形剂、载体或佐剂”是指可以与活性成分一起施用给受试者的赋形剂、载体或佐剂，并且当以足以递送治疗量的本文提供的组合物的剂量施用时，其不破坏其药理活性并且无毒。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则可以预期其在本发明的治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可以结合到组合物中。

适用于药物组合物的载体的例子是本领域已知的，并且此类实施方式在本发明的范围内。药学上可接受的载体和赋形剂，包括但不限于，水性载体、水溶性载体、非水性载体、稳定剂、增溶剂、等渗剂、缓冲剂、悬浮和分散剂、润湿或乳化剂、络合剂、多价螯合剂或螯合剂、冷冻保护剂、冻干保护剂、增稠剂、pH调节剂和惰性气体。其他合适的赋形剂或载体，包括但不限于，葡聚糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖醇、木糖醇、果糖、蔗糖和海藻糖。

“浮游生物的”是指对在液体介质中自由漂浮的微生物(细菌、真菌和/或原生动物，以及相关的噬菌体和其他病毒)典型的表型。

在一些实施方式中，Lf Qi6可以以生物膜表型生长。如本文所用，“生物膜”是微生物(例如细菌)的复杂聚集体，其中细胞使用通常由多糖物质组成(但不限于此)的基质彼此粘附。与同一生物体的浮游生物细胞相比，生物膜中的细胞具有生理学上不同的特性，浮游生物的细胞是单细胞，可以在液体或气体介质中漂浮或游动，或驻留在固体或半固体表面之上或之中。

出于本发明的目的，缩写cfu应表示“菌落形成单位”，其定义为琼脂板上微生物计数显示的细菌细胞数。

如本文所用，术语“治疗”或其任何语法变体包括但不限于，对受试者应用或施用(或对来自受试者的细胞或组织应用或施用)，以延迟、减缓、稳定、治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、减少恶化、改善、改进或影响感染、感染症状或感染风险(或易感性)。术语“治疗”是指任何成功治疗或改善病状或状况的迹象，包括任何客观或主观参数，例如减轻；缓解；降低恶化的速度；降低疾病的严重程度；使症状稳定、减轻症状或使受试者更能忍受病状或状况；或改善受试者的身心健康。

如本文所用，术语“预防”或其任何语法变体包括但不限于，至少降低获得感染的风险(或易感性)的可能性(例如，使得疾病的至少一种临床症状不会在患者中发展，该患者可能暴露于或易患该疾病但尚未经历或显示该疾病症状)。术语“预防”可以指避免、延迟、预先阻止或最小化与感染相关的一种或多种不期望的特征，和/或完全或几乎完全防止感染和/或其症状的发展。预防还可以包括(但不要求)绝对或完全预防，这意味着状况可能仍会在稍后时间发展和/或具有比没有预防措施时更轻的严重程度。预防可包括降低疾病或障碍发作的严重程度，和/或抑制其进展。

“抑制”包括针对病毒的直接抗病毒活性，以及直接或间接降低病毒进入细胞的能力和/或降低病毒从一个细胞传播到另一个细胞的能力。间接活性可以通过例如免疫调节来实现。

如本发明所考虑的，“免疫调节”优选涉及先天免疫的刺激。这可以包括，例如，调节细胞因子的产生和/或活性，以及在某些实施方式中调节细胞代谢以不利于病毒进入或复制。细胞代谢的调节可以通过例如将线粒体代谢从基于糖的代谢转移到例如基于脂质的代谢来实现。

如本文所用，术语“受试者”是指动物。动物可以是例如人、猪、马、山羊、猫、小鼠、大鼠、狗、猿、鱼、黑猩猩、猩猩、豚鼠、仓鼠、牛、绵羊、鸟(包括鸡)，以及任何其他脊椎动物或无脊椎动物。

在本发明的上下文中，优选的受试者是任何年龄和/或性别的人。在一些实施方式中，受试者患有健康状况、疾病或障碍，而在一些实施方式中，受试者处于良好健康状态(例如，没有受伤或疾病)但希望增强健康和/或特定器官、组织或身体系统的机能。

本文提供的药物组合物的施用优选地是“治疗有效量”，这是足以导致被治疗的细胞、组织、系统、动物或人的生物学或医学反应的量。实际施用量、施用速率和时间过程将取决于所治疗感染的性质和严重程度以及受试者。治疗处方(例如决定剂量等)由全科医生和其他医生负责，通常会考虑待治疗的障碍、个体患者的状况、递送部位、施用方法以及从业者已知的其他因素。

本文提供的范围被理解为该范围内所有值的简写。例如，1到20的范围被理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20组成的组的任何数字、数字的组合或子范围，以及上述整数之间的所有中间小数值，例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，特别考虑从范围的任一端点延伸的“嵌套子范围”。例如，1到50的示例性范围的嵌套子范围可以在一个方向上包括1到10、1到20、1到30和1到40，或者在另一个方向包括50到40、50到30、50到20和50到10。

如本文所用，“重组”细胞通过引入异源核酸或改变天然核酸而被修饰。因此，例如，重组细胞可以表达在细胞的天然(非重组)形式中不存在的基因，或者表达以其它方式异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。

如本文所用，“减少”是指负变化，术语“增加”是指正变化，每个至少为1％、5％、10％、25％、50％、75％或100％。

如本文所用，“参考”是指标准或对照条件。

与“包括”或“含有”同义的过渡术语“包含”是包容性的或开放式的，并且不排除未列举的其它要素或方法步骤。相比之下，过渡短语“由...组成”排除了权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分。过渡短语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制在特定材料或步骤“以及那些不会实质性影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的”，例如，排除细菌生长的能力。术语“包含”的使用考虑了由所列举的组分“组成”和“基本上组成”的实施方式。

除非特别说明或从上下文中显而易见，如本文所用，术语“或”被理解为包容性的。除非特别说明或从上下文中显而易见，如本文所用，术语“一个”和“该”被理解为单数或复数。

除非特别说明或从上下文中显而易见，如本文所用，术语“约”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均值的2个标准偏差内。术语“约”可以理解为在规定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％之内。

乳酸杆菌属和Qi601S裂解物

乳酸杆菌属是革兰氏阳性杆菌，常见于奶酪等发酵食品中。许多菌株被鉴定为益生菌，因为这些细菌是非致病性的，并且可以抑制致病菌在受试者体内的增殖，并降低胆固醇。

在一些实施方式中，细菌菌株是发酵乳杆菌Qi6，在本文中也称为LfQi6。发酵乳杆菌是革兰氏阳性杆菌。发酵乳杆菌Qi6(Lf Qi6)可在37℃的MRS培养基中生长。在一个实施方式中，本发明提供了LfQi6的分离的或生物学纯培养物。在另一个实施方式中，本发明提供了作为生物膜生长的LfQi6的生物学纯培养物。本文具体教导的是用于诱导和鉴定生物膜表型的方法。本文进一步提供了利用生物膜表型以及生物膜表型的提取物(包括其裂解物)的方法。在优选的实施方式中，药物组合物包含LfQi6生物膜的生物活性提取物。

发酵乳杆菌微生物的培养物已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(美国弗吉尼亚州马纳萨斯市大学道10801，邮编20110-2209)。该保藏已由保藏库分配登录号ATCC号PTA-122195，并于2015年6月10日保藏。

主题培养物已经进行了保藏，保藏条件可确保在本专利申请待审期间，由根据37CFR 1.14和35 U.S.C 122享有权利的专利商标局局长确定的人可获取该培养物。保藏可根据本申请的对应申请或其后续申请提交的国家的外国专利法的要求获得。然而，应该理解的是，获取保藏并不构成损害政府行为授予的专利权的实施本发明的许可。

此外，主题培养物保藏物将根据《微生物保藏布达佩斯条约》的规定进行储存和向公众开放，即，储存时会采取一切必要措施，使其在最近的提供保藏样品的要求后至少五年的一段时间内，且在任何情况下，保藏之日后至少30年的一段时间内或在公开了该培养物的可能授权的任何专利的可实施期内，保持存活和不受污染。如果保藏机构因保藏状况而无法在要求时提供样品，则保藏人承认有义务更换保藏。在公开它的专利授权后，公众获得主题培养物保藏的所有限制将不可撤销地取消。

发酵乳杆菌Qi6(Lf Qi6)可在37℃的MRS培养基中生长。Lf Qi6是专有菌株。LfQi6培养物可用于当前提出的公开内容，或生物活性裂解物可直接从Lf Qi6培养物分离并用于抗病毒方法和组合物。

此外，Lf Qi6可以在生物膜表型中生长。Lf Qi6培养物可用于当前提出的公开内容，或生物活性裂解物可从Lf Qi6生物膜培养物中分离并用于抗菌或其他屏障增强/产生方法和组合物中。

培养培养物以形成生物膜的一种方法是，可将培养物在5ml MRS肉汤中于37℃培养24小时。然后可以将1ml培养物转移到具有25ml MRS肉汤的T-150组织培养板中。然后每48小时更换25ml MRS培养基，使Lf Qi6的生物膜在培养板底部长成菌苔。然后培养物可以生长7天以产生厚的生物膜层。随后可将生长的生物膜层刮出并悬浮在新鲜培养基中。冷冻原液可以用甘油制成并储存在-80℃。

冷冻原液中Lf Qi6的生物膜表型可在10ml新鲜MRS培养基中于37℃培养24小时。可以将10毫升培养物接种到含有500克无菌玻璃棉的25L MRS培养基中。然后生物膜可以在37℃的静态条件下培养72小时。培养物可以每24小时轻轻摇动以进行混合，之后可以收获培养基和玻璃棉。随后可以通过超声处理将生物膜细胞从玻璃棉上分离。细胞可以进一步离心以浓缩Lf Qi6的生物膜，然后将其悬浮在无菌水中。这种扩大产生浓度为2g/L的生物膜培养物。

Qi611S蛋白质和编码611S蛋白质的多核苷酸序列

在优选的实施方式中，本发明提供了一种蛋白质及其片段和变体，可用于抑制病毒感染。本发明还提供了编码该蛋白质及其片段和变体的核苷酸序列。

在某些特定实施方式中，本发明的蛋白质，称为“Qi611S”，具有约8.0kDA的分子量。“Qi611S蛋白质”，包括Qi611S及其生物活性片段和变体，可以根据几个参数进行表征，包括生物活性，例如：抗病毒活性和增强先天免疫功能。

在某些实施方式中，Qi611S蛋白质可以直接或间接地诱导选自以下中的一种或多种分子的表达或作为其激动剂：例如过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)(例如，PPARα、PPARβ/δ和/或PPARγ)；细胞外信号调节激酶(ERK 1/2)；和糖皮质激素受体(GR)。

PPAR、ERK和GR的调节可以具有下游免疫调节作用。因此，在某些实施方式中，本发明的组合物可用于通过调节涉及PPAR、ERK和/或GR的一种或多种生物途径来抑制病毒感染。

Qi611S蛋白质可以进一步通过其氨基酸序列来定义。在一个特定实施方式(Qi611S)中，该蛋白质具有如SEQ ID NO:1所示的74个氨基酸序列。

在某些实施方式中，还可以基于与某些抗体的免疫反应性以及下文描述的其他方法来鉴定本文提供的蛋白质。

在某些实施方式中，在使用实验室生长条件迫使生长进入生物膜表型时，Qi611S蛋白质由发酵乳杆菌Qi6细菌菌株产生。在优选的实施方式中，该细菌菌株具有Qi611S DNA序列(SEQ ID NO:2)，其能够在生物膜表型条件下表达具有SEQ ID NO:1的蛋白质。

在进一步的实施方式中，编码Qi611S蛋白质的多核苷酸可以通过例如与某些示例性探针和引物(例如，SEQ ID NO:3-4)杂交或被其扩增的能力来定义。

在某些实施方式中，本发明提供了编码Qi611S蛋白质的分离的多核苷酸序列或基因。此外，在一些实施方式中，本发明提供用于使用多核苷酸序列生产表达Qi611S蛋白质的重组宿主的方法。

在某些实施方式中，多核苷酸序列为Qi611S，其为222个碱基对且编码Qi611S；然而，在某些实施方式中，因为例如遗传密码的冗余，不同的DNA序列可以编码本文公开的氨基酸序列。创建这些编码Qi611S蛋白质的替代DNA序列完全在技术人员的技能范围内。

如本文所用，蛋白质的“变体”是指具有一种或多种氨基酸取代、缺失、添加或插入的序列。在优选的实施方式中，这些取代、删除、添加或插入不会对Qi611S的治疗和/或美容活性产生实质性不利影响。保留Qi611S的一种或多种生物活性的变体在本发明的范围内。优选地，一种或多种生物活性选自抗病毒活性和增强先天免疫功能。

Qi611S及其变体的“片段”也属于Qi611S蛋白质的范围，只要该片段保留了Qi611S的一种或多种生物学特性。优选地，一种或多种生物活性选自抗病毒活性和增强先天免疫功能。优选地，该片段是Qi611S全长的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。该片段可包含例如Qi611S或变体的一个或多个亲水结构域。这些结构域可能与去除的中间氨基酸直接相连。使用本领域已知的标准程序可以容易地鉴定亲水结构域。

本发明进一步考虑了融合构建体，其中Qi611S蛋白质直接或间接(例如通过接头)连接到可以是例如靶向部分(例如配体、抗体或适配体)、载体、标记或活性增强剂的另一个部分。

本发明进一步考虑针对Qi611S蛋白质的抗体(例如，多克隆的、单克隆的、嵌合的和人源化的)。掌握本文提供的教导的本领域普通技术人员可以容易地制备这些抗体。这些抗体可用于例如治疗、诊断和蛋白质纯化。

在某些实施方式中，编码Qi611S蛋白质的多核苷酸可被分离、扩增并连接到载体中。“载体”、“质粒”或“质粒载体”是一种DNA分子，用于将DNA转移到细胞，通常是从一个细胞转移到另一个细胞(宿主细胞)。载体可以在宿主细胞中复制；或者，载体可以是将DNA结合到细胞(或从细胞中去除DNA)的手段。可以使用多种手段将载体引入宿主细胞。除了将载体置于细胞培养物中之外，一些细胞无需本领域技术人员的任何操作即可摄取载体。其他的则需要化学修饰。无论细胞可以采用何种手段摄取载体，一旦宿主细胞有能力这么做，它现在就是一个“感受态”细胞。

市售载体的一个示例是pET-15b，其中，本领域技术人员使用限制酶消化可以产生携带Qi611S或编码Qi611S蛋白质的其他多核苷酸的载体。pET-15b载体携带一个N末端His·

序列，然后是一个凝血酶位点和三个克隆位点(SEQ ID NO.6)。独特的位点示出在图9中描绘的圆形图谱上。T7 RNA聚合酶转录的编码链的克隆/表达区如图10所示(SEQID NO.5)。

在某些实施方式中，本发明涉及宿主细胞的遗传转化，以便为这些细胞提供产生Qi611S蛋白质的能力。例如，可以将具有Qi611S(或编码Qi611S蛋白质的其他多核苷酸)的载体转化为宿主细胞(例如，微生物、植物、真菌和/或动物细胞)，从而允许使用重组细胞用于Qi611S蛋白质的生产。

在优选的实施方式中，宿主细胞是大肠杆菌菌株，例如大肠杆菌BL21或大肠杆菌C43。可替代地，将大肠杆菌以外的细胞转化成感受态细胞的能力在本领域中是众所周知的，这包括基于例如它们的转化能力、异源蛋白质表达的能力和效率、蛋白质在宿主内的稳定性、辅助遗传能力的存在、无哺乳动物毒性、易于杀灭和固定而不损坏蛋白质、易于培养和/或配制、易于处理、经济、储存稳定性等选择的细胞。

本发明还提供了通过在允许多肽表达和任选地回收表达的多肽的条件下培养用本发明的多核苷酸(例如，SEQ ID NO:2)转化的宿主细胞来产生Qi611S蛋白质的方法。

在某些实施方式中，宿主细胞被转化以表达增强量的多肽。例如，DNA载体可包括正在待克隆基因之前的强转录启动子序列。在某些实施方式中，强启动子是trp操纵子、lac操纵子、T7启动子和/或pL启动子。

本领域技术人员将认识到，本发明的DNA序列可由于遗传密码的简并性和密码子使用而变化。考虑了编码Qi611S蛋白质的所有DNA序列。因此，编码Qi611S蛋白质的所有多核苷酸序列都包括在本发明中，包括编码SEQ ID NO:1的DNA(任选地包括编码区之前的ATG)。本发明还包括具有被优化以在宿主细胞(包括本文提及的任何特定类型的细胞)内表达的密码子的多核苷酸。用于创建优化序列的各种技术在本领域中是已知的。

此外，本领域技术人员将认识到，等位基因变异可发生在DNA序列中，其不会显著改变DNA序列编码的肽的氨基酸序列的活性。所有这些变体DNA序列都包括在本发明的范围内。

技术人员将理解示例性序列可用于鉴定、产生和使用编码Qi611S蛋白质的附加的核苷酸序列。与所述DNA序列具有至少90％或至少95％同一性并编码Qi611S蛋白质的变体DNA序列包括在本发明中。下面提供了变体多核苷酸和氨基酸序列的其他数值范围(例如，50-99％)。遵循本文的教导并使用本领域熟知的知识和技术，技术人员将能够在不使用过度实验的情况下做出具有变体DNA序列的大量可操作实施方式。具体考虑的是来自其他菌株或物种的同系物。

本发明的多核苷酸和氨基酸序列的片段和突变、插入和缺失变体可以以与示例性序列相同的方式使用，只要片段和变体与原始序列具有基本的序列相似性即可。如本文所用，基本序列相似性是指核苷酸或氨基酸序列相似性的程度，其足以使变体或片段序列能够作为原始序列发挥作用。优选地，该相似性大于50％；更优选地，该相似性大于75％；并且最优选地，该相似性大于90％。变体发挥其预期能力所需的相似度将取决于序列的预期用途。旨在改善序列功能或以其他方式提供方法优势的突变、插入和缺失突变的进行完全在本领域受过训练的人员的技能范围内。同一性和/或相似性也可以是与本文例示的序列相比的49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

氨基酸同一性/相似性和/或同源性通常在蛋白质的关键区域最高，所述关键区域决定生物活性和/或参与确定最终决定生物活性的三维构型。在这方面，某些氨基酸取代是可接受的并且可以预期的，只要这些取代位于对活性不重要的区域或者是不影响分子三维构型的保守氨基酸取代。例如，氨基酸可分为以下类别：非极性、非荷电极性、碱性和酸性。保守取代，即一类氨基酸被另一种相同类型的氨基酸取代，只要取代不实质改变化合物的生物活性，就属于本发明的范围。以下(表1)是属于每一类的氨基酸示例的列表。

表1.基于物理性质的氨基酸分类。

在某些情况下，也可以进行非保守取代。关键因素是这些取代不能显著降低蛋白质的生物活性。

病毒和治疗的疾病

在一个实施方式中，本发明的组合物和方法可用于抑制由例如RNA病毒(包括逆转录病毒(例如，慢病毒，如HIV)和冠状病毒(例如，导致COVID-19的病毒))引起的病毒感染。RNA病毒的示例包括但不限于，正黏病毒、腺病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、寨卡病毒、导致COVID-19的病毒、登革热、埃博拉病毒、甲型/乙型/丙型流感病毒、脊髓灰质炎麻疹病毒、灵长类泡沫病毒、HIV、SARS-CoV(严重急性呼吸综合征冠状病毒)、CoV MERS(中东呼吸综合征病毒)、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-HKU1、成人T细胞白血病病毒(ATLV)、人类T细胞嗜淋巴细胞病毒1型(HTLV-1)和II型(HTLV-2)。此外，本发明包括对源自上述病毒的突变和/或截短病毒的抑制。

SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2都是高致病性人类冠状病毒，可引起呼吸、肝脏、胃肠和神经系统等的急性和慢性疾病。可想到的是，本发明的组合物的施用可用于治疗和/或预防由任何冠状病毒引起的任何感染。

在特定实施方式中，冠状病毒可以是SARS-CoV。在另一个实施方式中，冠状病毒可以是MERS-CoV。在一个优选实施方式中，冠状病毒可以是SARS-CoV-2。

其他病毒包括，例如，禽白血病病毒、禽肉瘤病毒、禽网状内皮增生症病毒、鼠类乳腺癌病毒、鼠类白血病病毒、鼠类肉瘤病毒、豚鼠C型病毒、仓鼠C型病毒、大鼠白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒、猫C型病毒、绵羊白血病病毒、牛白血病病毒、猪C型病毒、猴白血病病毒、梅森辉瑞病毒、猴肉瘤病毒、猴T淋巴细胞病毒、狒狒C型病毒、绵羊髓鞘脱落病毒、EIAV、泡沫病毒、绵羊进行性肺炎病毒、绵羊梅迪病病毒、猴T淋巴细胞病毒III型(STLV-III)、马传染性贫血病毒、牛免疫缺陷病毒(BIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫冠状病毒(FCoV)和小鼠肝炎病毒(MHV-LUC)。

在一个实施方式中，本发明提供了用于预防和/或治疗由例如逆转录病毒或冠状病毒的病毒引起的疾病或疾病症状的方法。该方法包括将本发明的组合物施用给需要这种预防和/或治疗的受试者。

在一个实施方式中，该疾病可以是例如寨卡病毒、埃博拉病毒、丙型肝炎、流感、COVID-19、MERS、SARS、AIDS、成人T细胞淋巴瘤(ATL)、登革热和持续性全身性淋巴腺病(PGL)。优选地，该疾病是COVID-19。

本发明的药物组合物

本发明的组合物可以单独地或与其他治疗组合施用，同时或依次施用取决于待治疗的状况。本文提供的药物组合物可以溶解、悬浮于一种或多种其他药学上可接受的成分中或与之混合。组合物也可以存在于脂质体或其他微粒中。

本文提供的药物组合物可含有单一(单位)剂量的细菌或其裂解物或提取物。合适剂量的细菌(完整的、裂解的或提取的)可以在104至1012cfu的范围内，例如104至1010、104至108、106至1012、106至1010或106至108cfu之一。在一些实施方式中，剂量可以每天施用一次或两次。在一些实施方式中，按照重量，根据本发明的供使用的组合物可包含至少约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.5％、约2.0％、约3.0％、约4.0％、约5.0％、约6.0％、约7.0％、约8.0％、约9.0％、约10.0％、约11.0％、约12.0％、约13.0％、约14.0％、约15.0％、约16.0％、约17.0％、约18.0％、约19.0％、约20.0％、约25.0％、约30.0％、约35.0％、约40.0％、约45.0％、约50.0％的Lf Qi6提取物。在一些实施方式中，按照重量，组合物可包含至少约0.01％至约30％、约0.01％至约20％、约0.01％至约5％、约0.1％至约30％、约0.1％至约20％、约0.1％至约15％、约0.1％至约10％、约0.1％至约5％、约0.2％至约5％、约0.3％至约5％、约0.4％至约5％、约0.5％至约5％或约1％至约5％的Lf Qi6提取物。

优选地将组合物配制成合适的药物制剂，例如用于口服施用的气雾剂、吸入剂、片剂、胶囊或酏剂，或用于肠胃外给药的无菌溶液或悬浮液。

在一个实施方式中，根据本发明的组合物与常规佐剂、载体或稀释剂一起，因此可以制成包括丸剂、含片、片剂、胶囊、锭剂、填充胶囊、粉末和小球形式的固体形式，以及水性或非水性溶液剂、悬浮液、乳液、酏剂以及填充有它们的胶囊等的液体形式。该组合物可以进一步包含常规比例的常规成分，有或没有另外的活性化合物。

片剂、含片、丸剂、胶囊等还可以含有一种或多种以下成分：粘合剂，例如黄芪胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；磷酸二钙等的赋形剂；玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等的崩解剂；如硬脂酸镁的润滑剂；和如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜等的甜味剂；可以添加如胡椒薄荷、冬青、樱桃调味剂等的调味剂。各种其他材料可以作为包衣存在或用于以其他方式改变固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用明胶、蜡、虫胶或糖等包衣。

适用于注射或输注的药物剂型可包括包含基于生物聚合物的水凝胶纳米颗粒和微粒的无菌水溶液或分散体或无菌粉末。优选地，最终剂型在制造和储存条件下应该是无菌的、流体的和稳定的。液体载体可以是溶剂或液体分散介质，包括例如水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯和其合适的混合物。

用于局部施用的药物组合物可以配制成软膏、乳膏、洗剂、凝胶或透皮贴剂。此类透皮贴剂可包含渗透增强剂，例如芳樟醇、香芹酚、百里酚、柠檬醛、薄荷醇、t-茴香脑等。软膏和乳膏可以例如包含水性或油性基质，并添加合适的增稠剂、胶凝剂、着色剂等。洗剂和乳膏可以包括水性或油性基质，并且通常还包含一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂等。凝胶优选包含水性载体基质并包含胶凝剂，如交联聚丙烯酸聚合物、衍生多糖(例如，羧甲基纤维素)等。

适用于鼻内施用的药物组合物也包括在本发明中。此类鼻内组合物包含载体中的活性组合物和用于递送液体喷雾、可分散粉末或滴剂的合适的施用装置。滴剂可以用还包含一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂的水性或非水性基质配制。液体喷雾可方便地从加压包、吹入器、雾化器或输送气溶胶的其他方便装置输送。活性组合物可与惰性粉末状载体组合并由受试者吸入或吹入。

通过吸入或吹入给药的药物组合物可以干粉组合物和合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)的形式提供。这种粉末组合物可以单位剂量形式(例如，胶囊、药筒、明胶包装或泡罩包装)提供，可以借助吸入器或吹入器施用来自其中的粉末。在优选的实施方式中，组合物以吸入剂形式施用。

在一个实施方式中，该组合物根据常规步骤配制为适于对人局部施用的药物组合物。通常，用于局部施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，该组合物还可包括增溶剂和如利多卡因的局部麻醉剂，以减轻注射部位的疼痛。通常，成分以单位剂量形式单独或混合在一起供应为例如干燥冻干粉或在不透气密封的容器(如指示活性剂的量的安瓿或小袋中)中的无水浓缩物。当组合物通过注射施用时，可以提供装有无菌注射用水或盐水的安瓿，以便可以在施用前混合成分。

在一些实施方式中，组合物可以经由包含多个针的微针装置以皮内注射施用。在另一个实施方式中，多个微针可以线、正方形、圆形、网格或阵列布置。在其他实施方式中，微针装置可包括每平方厘米2至2000个微针，例如每平方厘米4至1500个微针，每平方厘米10至1000个微针。在另一个实施方式中，微针的长度可以在2和2000微米之间，例如在20和1000微米之间，或50和500微米之间，或100和400微米之间。

在一些实施方式中，微针是实心的。在其他实施方式中，微针是中空的。在进一步的实施方式中，微针可以被配置为皮内递送组合物，任选地其中所述免疫调节剂被递送至淋巴管。在又一个实施方式中，可以将组合物涂覆到微针的至少一部分上或嵌入微针的至少一部分内，任选地其中微针被植入皮肤或可从皮肤移除。优选地，所述涂层或微针在与皮肤接触时是可溶解的。

施用方法

在某些实施方式中，本发明的组合物可以通过吸入、口服、鼻内、局部、肌肉内、皮下、鞘内、静脉内或腹膜内通过输注或注射施用。

在本发明的一些实施方式中，组合物可以通过一次性预填充注射器施用。在其他实施方式中，组合物可以通过自动、多用途或一次性筒式喷射注射器(例如“Tropis ID”(WHO批准用于脊髓灰质炎)和“Stratis”装置(其被FDA批准用于流感)(两者都是Pharmajet的))施用。

在本发明的一些实施方式中，组合物可以与一种或多种其他抗病毒疗法联合施用，以治疗或预防由病毒引起的感染。此类抗病毒疗法可包括施用磷酸奥司他韦

扎那米韦

帕拉米韦

巴洛沙韦玛波西酯

或洛匹那韦/利托那韦

此类抗病毒疗法可以与主题组合物同时、分别或依次施用。在另一个实施方式中，抗病毒疗法通过与主题组合物相同或不同的施用途径施用。

特定的施用方式和给药方案将由主治临床医生选择，同时考虑病例的具体情况(例如，受试者、疾病、所涉及的疾病状态，以及治疗是否是预防性的)。治疗可能涉及在数天至数月或甚至数年的时间段内每日或多日的化合物剂量。

然而，一般来说，合适的剂量将在每天约0.001至约100mg/kg体重的范围内，优选每天约0.01至约100mg/kg体重，更优选每天约0.1至约50mg/kg体重，或甚至更优选，每天约1至约10mg/kg体重的范围内。例如，合适的剂量可以是每天约1mg/kg体重、10mg/kg体重或50mg/kg体重。

组合物可以单位剂量形式方便地施用，每单位剂量形式含有例如约0.05至约10000mg、约0.5至约10000mg、约5至约1000mg或约50至约500mg的活性成分。

组合物可以方便地以单一剂量或以适当间隔施用的分剂量存在，例如，作为每天一剂或每天二、三、四或更多次亚剂量。亚剂量本身可以进一步划分，例如，划分成许多离散的松散间隔的投药。

该组合物可用于一般人群的预防，也可用于病毒感染高危人群(包括医护人员和与感染患者有过密切接触的人，以及老年人)的预防。这种预防可以通过改变免疫监视状态和疾病轨迹来实现。还设想，本发明的免疫调节组合物可用作已感染患者的共同治疗。

任选地，本发明的药物组合物可以包括一种或多种其他治疗剂，例如，作为联合治疗。如通过医学和药学领域众所周知的常规方法所确定的，额外的治疗剂将在治疗有用和有效的浓度范围内包括在组合物中。任何特定的附加治疗剂的浓度可以在与该药剂作为单一疗法的典型用途相同的范围内，或者如果存在协同作用，则该浓度可以低于典型的单一疗法浓度。

本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物均通过引用整体并入，包括所有图和表，只要它们不与本说明书的明确教导不一致。

材料和方法

Lf Qi6生物膜培养

图1示出了Lf Qi6培养物的播种步骤。分离和鉴定后，于MRS琼脂板中培养Lf Qi6。然后将培养物在5ml MRS肉汤中于37℃培养24小时。将1ml培养物转移到具有25ml MRS肉汤的T-150组织培养板中。每48小时更换25ml MRS培养基，使Lf Qi6的生物膜在培养板底部成长为菌苔。然后培养物生长7天以产生厚的生物膜层。生长的生物膜层随后被刮出并悬浮在新鲜培养基中。冷冻原液用甘油制成并储存在-80°。

Lf Qi6生物膜的扩大生产如图2所示。冷冻原液中Lf Qi6的生物膜表型在10ml新鲜MRS培养基中于37°培养24小时。将10毫升培养物接种到具有500克无菌玻璃棉的25升MRS培养基中。然后将生物膜在37℃的静态条件下培养72小时。培养物每24小时轻轻摇动以混合，然后收获培养基和玻璃棉。随后通过超声处理将生物膜细胞与玻璃棉分离。进一步离心细胞以浓缩Lf Qi6的生物膜，然后将其悬浮在无菌水中。这种扩大产生了浓度为50g/25L的生物膜培养物。Lf Qi6生物膜的生长在图3中进一步说明，其中生物膜是在本文所述的扩大培养物中在基质上培养的。

Lf Qi6生物膜下游加工

Lf Qi6生物膜的下游处理如图4所示。将50g Lf Qi6的生物膜表型悬浮在1L无菌水中。悬浮液在室温下轻轻混合24小时，以被动释放多种生物活性物质。然后使用OmniSonic Ruptor 400将混合物超声处理30分钟(50KHz，200瓦)，成为均匀的裂解物。然后将超声处理的裂解物冷冻并冻干成细粉。

从益生菌制备Lf Qi6

发酵乳杆菌Qi6使用专有培养方法在MRS培养基中生长。然后再次使用专有培养方法将细菌在500ml MRS培养基中传代培养另一段时间。对细菌进行超声处理(RelianceSonic 550，STERIS Corporation，美国俄亥俄州门托市)，以10000g离心，将细胞团块分散在无菌水中，收获的细胞裂解(Sonic Ruptor 400，OMNI International，美国佐治亚州肯内索市)并以10000g再次离心，可溶性部分离心(50kDa Amicon Ultra膜过滤器，EMDMillipore Corporation，德国达姆施塔特，Cat#UFC905008)。将所得部分分配成0.5ml等分试样，在液氮中快速冷冻并储存在-80℃。

以下是说明实施本发明的步骤的示例。这些示例不应被解释为限制性的。

实施例1–Lf Qi6生物膜表型不同于浮游生物表型

产物提取和蛋白质估计表明生物膜和浮游生物表型之间的不同的蛋白质水平，如下表2所示。图5中的SDS数据进一步证实了这种差异，如浮游生物表型中不存在的Lf Qi6生物膜表型中表达的额外的带所示，表明生物膜的生物提取物中存在独特的蛋白质。图6和图7中的尺寸排阻HPLC数据说明了从Lf Qi6生物膜和浮游生物表型制备的生物提取物中的蛋白质之间的分子量差异。

实施例2—分离Qi611S基因并转化为大肠杆菌BL21

可以从发酵乳杆菌Qi6中分离出编码Qi611S的基因Qi611S，并转化为大肠杆菌BL21。如图8所示，大肠杆菌BL21能够合成Qi611S蛋白质。

用于从LF Qi6扩增Qi611S的引物可用于确认大肠杆菌细胞中Qi611S的存在。用于将Qi611S克隆到pET-15b载体中的引物列于表3(也参见图9-图10)。这些专门设计的引物获自Integrated DNA Technologies(IDT)(爱荷华州科勒尔维尔)。

表3.用于克隆Qi611S以转化为大肠杆菌BL21的引物。

使用表3中的引物从编码Qi611S的Lf Qi6染色体分离和扩增DNA。该引物允许使用两种限制酶NdeI和BamHI，以对扩增的Qi611S基因和pET-15b载体的多克隆位点进行限制酶消化。

使用限制酶消化扩增的DNA和载体后，Qi611S基因就会连接到载体中。然后可以将该载体转化为大肠杆菌BL21。

转化后的大肠杆菌培养物在37℃下过夜生长，并使用PCR检测单个菌落是否存在Qi611S。一旦鉴定出阳性菌落，就可以生长细菌以确定Qi611S是否成功编码Qi611S的合成。

Qi611S蛋白质可以通过在SDS-PAGE凝胶上进行银染来检测。SDS-PAGE凝胶上载有自表达Qi611S的大肠杆菌BL21释放的蛋白质样品。pET-15b载体编码多组氨酸标签，无需Qi611S特异性抗体即可鉴定合成蛋白质。此外，pET-15b编码凝血酶蛋白酶切割位点(Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser)以去除多组氨酸标签。

实施例3–针对猪呼吸冠状病毒的抗病毒活性

猪呼吸冠状病毒(PRCV)是冠状病毒科的一种单链负义RNA病毒。1984年在比利时首次发现。PRCV是肠道冠状病毒传染性胃肠炎病毒(TGEV)的缺失突变体，与猫肠道冠状病毒和犬冠状病毒也有密切关系。

PRCV通过猪之间的气溶胶和直接接触传播。这通常发生在断奶后，此时母源抗体介导的保护开始下降。当引入未感染PRCV的猪时，传播也可能发生在生长猪/育成猪中。

测试了来自于LfQi6的生物膜表型提取物(命名为Qi601S)针对PRCV的活性。这些测试是在猪支持(ST)细胞中进行的。如图11-15所示，在猪支持细胞(ST)中共培养高接种剂量的PRCV后60小时，显示出使用5％Qi601S约100％的保护，未受PRCV攻击的细胞中没有毒性。

应当理解，本文所描述的示例和实施方式仅用于说明性目的，并且将向本领域技术人员建议根据其的各种改进或变化，这些改进或变化将被包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。

参考文献

1.Irvine AD,McLean WH,Leung DY.Filaggrin mutations associated withskin and allergic diseases.N Engl J Med 2011:365:1315-1327.

2.Leung DY,Bieber T.Atopic dermatitis.Lancet 2003:361:151–160.

3.Malajian D,Guttman-Yassky E.New pathogenic and therapeuticparadigms in atopic dermatitis.Cytokine 2014年12月23日:pii:S1043-4666(14)00606-1.

4.Leung DY,Guttman-Yassky E.Deciphering the complexities of atopicdermatitis:shifting paradigms in treatment approaches.J Allergy Clin Immunol2014:134(4):769-779.

5.Peng W,Novak N.Pathogenesis of atopic dermatitis.Clin ExpAllerg2015:45(3):566-574.

6.Boguniewicz M,Leung DYM.Atopic Dermatitis:a disease of altered skinbarrier and immune dysregulation.Immunol Rev 2011年7月:242(1):233–246.

7.Seguchi T,Chang-Yi C,Kusuda S等人.Decreased expression of filaggrinin atopic dermatitis.Arch Dermatol Res 1996:288:442-446.

8.Thyssen JP.Atopic dermatitis,filaggrin mutations and irritantcontact dermatitis.Br J Dermatol 2013:168:233-234.

9.Howell MD,Kim BE,Gao P等人.Cytokine modulation of atopic dermatitisfilaggrin skin expression.J Allergy Clin Immunol 2007:120:150–155.

10.Niebuhr M,Heratizadeh A,Wickmann K等人.Intrinsic alterations ofpro-inflammatory mediators in unstimulated and TLR-2stimulated keratinocytesfrom atopic dermatitis patients.Exp Dermatol 2011:20:468-472.

11.Leung DY,Harbeck R,Bina P等人.Presence of IgE antibodies tostaphylococcal exotoxins on the skin of patients with atopic dermatitis.JClinInvest 1993:92:1374–1380.

12.Boguniewicz M.New strategies for dealing with Staphylococcusaureus colonization and the emerging methicillin-resistant Staphylococcusaureus epidemic in atopic dermatitis.Chem Immunol Allergy 2012:96:113-119.

13.Suh L,Coffin S,Leckerman KH等人.Methicillin-resistantStaphylococcus aureus colonization in children with atopic dermatitis.PediatrDermatol 2008:25(5):528-534.

14.Findley K,Grice E A.The Skin microbiome:a focus on pathogens andtheir association with skin disease.PLoS Pathog 2014:10(11):e1004436.doi:10.1371/journal.ppat.1004436.

15.Higaki S,Morohashi M,Yamagishi T等人.Comparative study ofstaphylococci from the skin of atopic dermatitis patients and from healthysubjects.Int J Dermatol 1999:38:265–269.

16.van Drongelen V,Haisma E M,Out-Luiting J J等人.Reduced filaggrinexpression is accompanied by increased Staphylococcus aureus colonization ofepidermal skin models.Clin Exp Allergy 2014:44(12):1515–1524.

17.Ong PY,Ohtake T,Brandt C等人.Endogenous antimicrobial peptides andskin infections in atopic dermatitis.N Eng J Med 2002:347:1151–1160.

18.Zeeuwen P L,Boekhorst J,van den Bogaard E H等人.Microbiomedynamics of human epidermis following skin barrier disruption.Genome Biol2012:13(11):R101.

19.Oh J,Byrd AL,Deming C等人.Biogeography and individuality shapefunction in the human skin metagenome.Nature 2014:514(7520):59-64.

20.Belkaid Y,Segre JA.Dialogue between skin microbiota andimmunity.Science 2014:346(6212):954.

21.Baviera G,Leoni M C,Capra L等人.Microbiota in healthy skin and inatopic eczema.Biomed Res Int 2014:436921.

22.Kong HH,Oh J,Deming C等人.Temporal shifts in the skin microbiomeassociated with disease flares and treatment in children with atopicdermatitis.Genome Res 2012:22:850-859.

23.Felten A,Grandry B,Lagrange PH等人.Evaluation of Three Techniquesfor Detection of Low-Level Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus(MRSA):a Disk Diffusion Method with Cefoxitin and Moxalactam,the Vitek 2System,andthe MRSA-Screen Latex Agglutination Test.J Clin Microbiol 2002:40(8):2766-2771.

24.Subhadra B,Krier J,Hofstee K等人.Draft whole-genome sequence ofLactobacillus fermentum LfQi6,derived from the human microbiome.GenomeAnnounc 2015:3(3):e00423-15.doi:10.1128/genomeA.00423-15.

25.Conlan S,Mijares LA,NISC Comparative Sequencing Program等.Staphylococcus epidermidis pan-genome sequence analysis reveals diversity ofskin commensal and hospital infection-associated isolates.Genome Biol2012:13(7):R6

26.Sugimoto S,Iwase T,F.Sato F等人.Cloning,expression andpurification of extracellular serine protease Esp,a biofilm-degrading enzyme,from Staphylococcus epidermidis.J Appl Microbiol 2011:111:1406–1415.

27.Hochstim CJ,Choi JY,Lowe D等人.Biofilm detection with hematoxylin-eosin staining.Arch Otolaryngol Head Neck Surg.2010:136(5):453-456

28.Tuominen VJ,

S,Viitanen A等人.ImmunoRatio:a publiclyavailable web application for quantitative image analysis of estrogenreceptor(ER),progesterone receptor(PR),and Ki-67.Breast Cancer Res 2010:12(4):R56.

29.Williams R E,Gibson A G,Aitchison T C等人.Assessment of acontact-plate sampling technique and subsequent quantitative bacterial studies inatopic dermatitis.Br J Dermatol 1990:123(4):493–501.

30.Goh C-L,Goh,Wong JS等人.Skin colonization of Staphylococcus aureusin atopic dermatitis patients seen at the National Skin Centre,Singapore.IntJ Dermatol 1997:36(9):653–657.

31.Travers JB,Kozman A,Mousdicas N等人.Infected Atopic DermatitisLesions Contain Pharmacologic Amounts of Lipoteichoic Acid.JAllergy ClinImmunol 2010January:125(1):146.

32.Michelsen K S,Aicher A,Mohaupt M等人.The role of toll-likereceptors(TLRs)in bacteria-induced maturation of murine dendritic cells(DCS).Peptidoglycan and lipoteichoic acid are inducers of DC maturation andrequire TLR2.J Biol Chem 2001:276:25680–25686

33.Lemjabbar H,Basbaum C.Platelet-activating factor receptor andADAM10 mediate responses to Staphylococcus aureus in epithelial cells.NatureMed 2002:8:41–46.

34.Zhang Q,Mousdicas N,Yi Q等人.Staphylococcal lipoteichoic acidinhibits delayed-type hypersensitivity reactions via the platelet-activatingfactor receptor.J Clin Invest 2005:115:2855–2861.

35.Hattar K,Grandel U,Moeller A等人.Lipoteichoic acid(LTA)fromStaphylococcus aureus stimulates human neutrophil cytokine release by a CD14-dependent,Toll-like-receptor-independent mechanism:Autocrine role of tumornecrosis factor-[alpha]in mediating LTA-induced interleukin-8generation.CritCare Med 2006:34(3):835–841.

36.Heinemann C,van Hylckama Vlieg J E,Janssen D B等人.Purificationand characterization of a surface-binding protein from Lactobacillusfermentum RC-14that inhibits adhesion of Enterococcus faecalis 1131.FEMSMicrobiol Lett 2000:190(1):177-180.

37.de la 

C,Reffuveille F,Haney E F等人.Broad-spectrumanti-biofilm peptide that targets a cellular stress response.PLoS Pathog2014:10(5):e1004152.

38.Haney E F,Mansour S C,Hilchie A L等人.High throughput screeningmethods for assessing antibiofilm and immunomodulatory activities ofsynthetic peptides.Peptides 2015:S0196-9781(15):00073-X.

39.Kim M S,Kim J E,Yoon Y S等人.Improvement of atopic dermatitis-likeskin lesions by IL-4inhibition of P14 protein isolated from Lactobacilluscasei in NC/Nga mice.Appl Microbiol Biotechnol 2015[Epub ahead of print]

40.Iwase T,Uehara Y,Shinji H等人.Staphylococcus epidermidis Espinhibits Staphylococcus aureus biofilm formation and nasalcolonization.Nature 2010:465(7296):346-349.doi:10.1038/nature09074.

41.Sugimoto S,Iwamoto T,Takada K等人.Staphylococcus epidermidis Espdegrades specific proteins associated with Staphylococcus aureus biofilmformation and host-pathogen interaction.J Bacteriol 2013:195(8):1645-1655.

42.Li D,Lei H,Li Z等人.A novel lipopeptide from skin commensalactivates TLR2/CD36-p38 MAPK signaling to increase antibacterial defenseagainst bacterial infection.PLoS One 2013:8(3):e58288.

43.Lai Y,Cogen AL,Radek KA等人.Activation of TLR2 by a small moleculeproduced by Staphylococcus epidermidis increases antimicrobial defenseagainst bacterial skin infections.J Invest Dermatol 2010:130(9):2211-2221.

44.Wang Y,Kuo S,Shu M等人.Staphylococcus epidermidis in the humanskin microbiome mediates fermentation to inhibit the growth ofPropionibacterium acnes:implications of probiotics in acne vulgaris.ApplMicrobiol Biotechnol 2014:98(1):411-424.doi:10.1007/s00253013-5394-8.nature09074.

45.Naik S,Bouladoux N,Wilhelm C等人.Compartmentalized control of skinimmunity by resident commensals.Science 2012:337(6098):1115-1119.doi:10.1126/science.1225152.

46.Krishnan A,Nair SA,Pillai MR,Biology of PPAR gamma in cancer:acritical review on existing lacunae.Curr Mol Med 2007:7(6):532–40.doi:10.2174/156652407781695765.PMID 17896990.

序列表

<110> 群体创新有限责任公司

尼古拉斯·T·蒙苏尔

埃瓦·A·贝尔克斯

弗雷德里克·T·勃姆

廖育贤

<120> 用于抑制包括冠状病毒感染的病毒感染的材料和方法

<130> QBR.106P

<160> 6

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 74

<212> PRT

<213> 发酵乳杆菌

<400> 1

Met Asp Asn Arg Ile Phe Phe Asn Pro Gly Asp Ser Ile Ala Asn Ile

1               5                   10                  15

His Asp Tyr Asn Glu Ala Val Arg Lys Gly Gln Ile Phe Lys Lys Glu

            20                  25                  30

Gln Gln Ala Gly Asp Leu Val Ile Ala Lys Gly Pro Asp Asp Glu Glu

        35                  40                  45

Tyr Ala Ile Phe Tyr Ala Asn Asp Ala Leu Pro Ala Asp His Glu Gln

    50                  55                  60

Ser Gln Pro Tyr Glu Ile Lys Lys Asn Leu

65                  70

<210> 2

<211> 225

<212> DNA

<213> 发酵乳杆菌

<400> 2

atggataacc ggattttctt caaccccggc gactcgatcg ccaacatcca cgactacaac 60

gaagccgtcc gcaagggcca aatcttcaaa aaggaacagc aggccggcga cctcgtgatc 120

gctaagggtc ccgatgacga agaatacgcc atcttctacg ccaacgatgc cctgcccgcc 180

gaccacgagc aatcccaacc ctacgagatt aagaaaaacc tctaa 225

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 发酵乳杆菌

<400> 3

catatggata accggatttt cttca 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 发酵乳杆菌

<400> 4

ggatccttag aggtttttct taatc 25

<210> 5

<211> 287

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 60

ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atataccatg ggcagcagcc 120

atcatcatca tcatcacagc agcggcctgg tgccgcgcgg cagccatatg ctcgaggatc 180

cggctgctaa caaagcccga aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac 240

tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttg 287

<210> 6

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1               5                   10                  15

Arg Gly Ser His Met Leu Glu Asp Pro Ala Ala Asn Lys Ala Arg Lys

            20                  25                  30

Glu Ala Glu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Glu Gln

        35                  40

Claims (22)

1.一种抑制受试者体内病毒感染的方法，其中所述方法包括向受试者施用有效量的：

A）包含选自以下的氨基酸序列的蛋白质：

i） SEQ ID NO: 1；

ii） SEQ ID NO: 1的变体；和

iii） i）或 ii）的片段

其中所述变体或片段具有病毒抑制活性；或者

组合物，其包含生长为生物膜的分离的生物活性发酵乳杆菌细菌菌株，和/或包含所述生物膜的病毒抑制提取物；和/或

B）组合物，其包含生长为生物膜的分离的生物活性发酵乳杆菌细菌菌株，和/或包含所述生物膜的病毒抑制提取物。

2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质包含SEQ ID NO：1，或者是与SEQ IDNO：1具有至少75％序列同一性的SEQ ID NO：1的变体，或者是SEQ ID NO：1的片段或者是所述变体的片段，其中所述片段的长度为SEQ ID NO：1长度的至少20％。

3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质包含SEQ ID NO：1。

4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质具有SEQ ID NO：1。

5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质包含SEQ ID NO：1的至少70％的片段。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述细菌菌株是登录号为PTA-122195的发酵乳杆菌Qi6。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒是RNA病毒。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述病毒是冠状病毒。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述冠状病毒是SARS-CoV-2。

10.根据权利要求7所述的方法，其中所述冠状病毒是SARS-CoV。

11.根据权利要求7所述的方法，其中所述冠状病毒是MERS-CoV。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物通过肠胃外、口服、舌下、鼻或肺部途径施用。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述肠胃外途径选自皮下、皮内、真皮下、腹膜内和静脉内注射。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述肠胃外途径是皮内注射。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物与一种或多种其他抗病毒疗法联合施用。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒进入细胞或传播到新细胞的能力受到抑制。

17.根据权利要求1所述的方法，其中病毒抑制活性是通过先天免疫系统实现的。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人。

19.根据权利要求1所述的方法，还包括给受试者施用附加的抗病毒剂。

20.根据权利要求6所述的方法，包括向受试者施用所述细菌菌株的提取物。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物通过呼吸机施用。

22.一种具有抗病毒特性的自净化表面，其中所述表面包含：

A）包含选自以下的氨基酸序列的蛋白质：

i）SEQ ID NO: 1；

ii）SEQ ID NO: 1的变体；和

iii） i）或ii）的片段

其中所述变体或片段具有病毒抑制活性；或者

组合物，其包含生长为生物膜的分离的生物活性发酵乳杆菌细菌菌株，和/或包含所述生物膜的病毒抑制提取物；和/或

B）组合物，其包含生长为生物膜的分离的生物活性发酵乳杆菌细菌菌株，和/或包含所述生物膜的病毒抑制提取物。

Images