PL206441B1 - Przeciwbakteryjne białko, zawierająca je kompozycja przeciwbakteryjna, preparat terapeutyczny, polinukleotydy, wyizolowany organizm, szczepy, zastosowanie białka - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są przeciwbakteryjne białko, zawierająca je kompozycja przeciwbakteryjna, preparat terapeutyczny, polinukleotydy, wyizolowany organizm, szczepy, zastosowanie białka.

Wynalazek dotyczy lantybiotyków, organizmów wytwarzających takie lantybiotyki oraz zastosowania zarówno organizmów jak i wytwarzanych przez nie lantybiotyków.

Infekcja bakteryjna u ludzi jest istotnym problemem zarówno osobistym, jak również lecznictwa z ekonomicznego punktu widzenia.

Infekcje paciorkowcami szczególnie często powodują niedomagania począwszy od ubytków w zębach i drobnych infekcji gardł a, po poważ ne choroby, takie jak pł onica, gorą czka reumatoidalna i ostre zapalenie kłębuszków nerkowych.

Aby ograniczyć przypadki infekcji paciorkowcami pożądane jest kontrolowanie lub nie dopuszczanie do wzrostu bakterii chorobotwórczych. Jednym sposobem osiągnięcia tego jest dostarczenie bakteriocyn i im podobnych substancji (włącznie z lantybiotykami) aktywnych przeciw paciorkowcom, oraz organizmów zdolnych do wytwarzania takich substancji, odpowiednich do zastosowania w celu kontrolowania lub zapobiegania wzrostowi chorobotwórczych paciorkowców.

Znanych jest szereg bakteriocyn. Przykłady bakteriocyn pochodzących z bakterii gram dodatnich podano w Tagg i wsp., (1976), Bacteriol. Rev. vol. 40 str. 722-756. Dalszymi przykładami takich bakteriocyn są laktycyna 481 z Lactobacillus lactis (Piard i wsp., (1992) Applied and Environmental Microbiology vol. 58 str. 279-284), wariacyna z Micrococcus varians (US 5,981,261) i bakteriocyny ze Streptococcus thermophilus opisane w EP 0643136.

W Kalmokoff i wsp. (1999) Applied and Environmental Microbiology, vol. 65, nr 5, str. 2128-2135 opisano lantybiotyk butryrivibriocynę OR79A.

Również od dawna wiadomo, że Streptococcus salivarius wytwarza lantybiotyk w dużym zakresie (Dempster RP i wsp., (1982) Arch. Oral. Biol. 27:151). Pewnym lantybiotykiem, który został scharakteryzowany z S. salivarius jest saliwarycyna A (Ross i wsp., (1993) Appl. Envir. Microbiol. 59:2014). Jednak, choć wykazano aktywność hamującą względem szeregu gatunków paciorkowców to aktywność ta była raczej bakteriostatyczna niż bakteriobójcza. Co za tym idzie saliwarycyna A i wytwarzające ją mikroorganizmy nie dostarczają pełnego rozwiązania problemu kontrolowania infekcji paciorkowcami.

Zgłaszający zidentyfikowali obecnie dalsze białko z S. salivarius o aktywności przeciwbakteryjnej. Białko to, odnośnie którego stwierdzono, że ma raczej działanie bakteriobójcze niż po prostu bakteriostatyczne jest głównym przedmiotem obecnego wynalazku.

Wynalazek dotyczy przeciwbakteryjnego białka o sekwencji Sekw. Id. Nr: 3.

W zakres wynalazku wchodzi również przeciwbakteryjne białko o sekwencji aminokwasowej różniącej się od podanej w SEK NR ID: 3 wstawieniem, delecją albo substytucją od jednego do trzech aminokwasów.

Korzystnie powyższe białka są bakteriobójcze.

Bardziej korzystnie bakteriobójcze względem Streptococcus pyogenes.

Wynalazek dotyczy też przeciwbakteryjnej kompozycji obejmującej białko według wynalazku albo organizm, który może wyrażać białko według wynalazku.

W zakres wynalazku wchodzi również preparat terapeutyczny obejmują cy:

(i) białko według wynalazku; albo (ii) organizm, który może wyrażać białko według wynalazku w kombinacji z rozcieńczalnikiem, nośnikiem i/albo zaróbką.

Korzystnie preparat zawiera białko według wynalazku w kombinacji z rozcieńczalnikiem, nośnikiem i/albo zaróbką.

Korzystnie preparat terapeutyczny zawiera organizm, który może wyrażać białko według wynalazku w kombinacji z rozcieńczalnikiem, nośnikiem i/albo zaróbką.

Korzystnie preparat terapeutyczny jest lekiem podawanym doustnie.

Bardziej korzystnie syropem, płukanką do ust, płukanką do gardła, pastą do zębów albo aerozolem do ust.

Korzystnie jest w postaci pojedynczych dawek.

Korzystnie lek jest w postaci pastylki do ssania albo kapsułki zawierającej jednostkową dawkę organizmu zdolnego do wyrażania białka według wynalazku.

Korzystnie białko albo organizm są włączone do pokarmu albo napoju.

Bardziej korzystnie pokarmem albo napojem jest pokarm albo napój oparty na nabiale.

PL 206 441 B1

Najbardziej korzystnie białko albo organizm są włączone do mleka w proszku, herbatników mlecznych, mleka, jogurtu albo sera, lub są zawarte w mleku smakowym.

Korzystnie białko albo organizm zawarte są w wyrobie cukierniczym.

Bardziej korzystnie wyrobem cukierniczym jest guma do żucia.

Korzystnie preparat zawiera ponadto jeden albo więcej drugorzędnych czynników przeciwbakteryjnych.

Bardziej korzystnie drugorzędny czynnik(i) przeciwbakteryjny wybrany jest spośród inhibitorów typu bakteriocyn (BLIS).

Korzystnie preparat ponadto zawiera jedną albo obie Saliwarycyny A, organizm, który może wyrażać Saliwarycynę A, Saliwarycynę A2 lub organizm, który wyraża Saliwarycynę A2.

W zakres wynalazku wchodzi również polinukleotyd kodujący białko według wynalazku.

Wynalazek dotyczy również polinukleotydu zawierającego sekwencję kodującą SEK NR ID: 2.

W zakres wynalazku wchodzi również wyizolowany organizm, zawierający polinukleotyd wedł ug wynalazku i wyrażający białko przeciwbakteryjne według wynalazku.

Korzystnie polinukleotyd jest heterologiczny.

Korzystnie organizmem jest S. salivarius.

Wynalazek dotyczy też szczepu S. salivarius K12, który jest zdeponowany w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Niemcy pod numerem dostępu DSM 13084.

Ponadto wynalazek dotyczy też szczepu S. salivarius K12, który jest zdeponowany w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Niemcy pod numerem dostępu DSM 13085.

W zakres wynalazku wchodzi również preparat terapeutyczny, który zawiera szczep S. salivarius K12 albo szczep S. salivarius K30 określone powyżej.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania białka według wynalazku do wytwarzania preparatu terapeutycznego do co najmniej zahamowania wzrostu szkodliwych paciorkowców w górnych drogach oddechowych, przy czym preparat terapeutyczny jest sformułowany do podawania doustnego.

Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku preparat terapeutyczny jest preparatem terapeutycznym według wynalazku.

Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku efekt hamujący jest spowodowany przez zasiedlenie przynajmniej części górnych dróg oddechowych osobnika żywotnym organizmem wyrażającym białko.

Korzystnie organizm tworzy część leku, pokarmu albo napoju albo wyrobu cukierniczego.

Bardziej korzystnie organizmem jest S. salivarius, wybrany spośród szczepów K12 i K30.

Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku preparat terapeutyczny jest przeznaczony do podawania osobnikowi, który jest wstępnie traktowany w celu przynajmniej ograniczenia populacji bakterii występującej w górnych drogach oddechowych.

Bardziej korzystnie wstępne traktowanie obejmuje etap doustnego podania antybiotyku osobnikowi, korzystnie erytromycyny.

W zakres wynalazku wchodzi też preparat terapeutyczny, który zawiera białko przeciwbakteryjne według wynalazku i białko przeciwbakteryjne Saliwarycynę A2.

Ponadto wynalazek dotyczy preparatu terapeutycznego, który zawiera przynajmniej jeden organizm S. salivarius wytwarzający białko przeciwbakteryjne według wynalazku i przynajmniej jeden inny organizm S. salivarius wyrażający białko przeciwbakteryjne Saliwarycynę A2.

W jednym z wykonań obecnego wynalazku moż e być ogólnie określone białko o działaniu bakteriobójczym, które może być izolowane ze szczepów S. salivarius K12 i K30, o masie cząsteczkowej około 2733 Da, co określono przez spektrometrię mas z rozpylanymi jonami, i N-końcowej sekwencji aminokwasowej Gly-Gly-Gly-Val-Ile-Gln, lub jego fragment przeciwbakteryjny lub wariant, który ma większą niż 80% homologię sekwencji aminokwasowej z tym białkiem.

Białko według wynalazku zostało nazwane przez zgłaszających „saliwarycyna B”, a kodującą go pełną sekwencję nukleotydową i sekwencje aminokwasowe podano na Fig. 2 wraz z sekwencjami fragmentu peptydu liderowego.

Saliwarycyna B jest dogodnie otrzymywana przez ekspresję kodującej ją sekwencji DNA w komórkach gospodarza lub przez hodowanie wytwarzających ją szczepów S. salivarius K12 lub K30.

W dalszym wykonaniu wynalazek dotyczy kompozycji bakteriobójczej obejmującej zdefiniowane powyżej białko lub organizm, który może wyrażać białko określone powyżej.

PL 206 441 B1

W kolejnym wykonaniu wynalazek dotyczy preparatu terapeutycznego zawierają cego saliwarycynę B określoną powyżej lub fragment o właściwościach przeciwbakteryjnych lub jej wariant w kombinacji z rozcieńczalnikiem, nośnikiem i/lub zaróbką.

W kolejnym wykonaniu wynalazek dotyczy preparatu terapeutycznego zawierają cego organizm zdolny do wyrażania, jak to opisano powyżej, saliwarycyny B lub jej fragmentu lub wariantu o działaniu przeciwbakteryjnym w kombinacji z rozcieńczalnikiem, nośnikiem i/lub zaróbką.

Korzystnie organizm jest zdolny do ekspresji samej saliwarycyny B lub w kombinacji z innym czynnikiem przeciwbakteryjnym.

Korzystniej wyżej wymieniony drugorzędowy czynnik przeciwbakteryjny jest BLIS, najkorzystniej saliwarycyna A2. Pełna sekwencja nukleotydowa i sekwencje aminokwasowe saliwarycyny A2 są podane na Fig. 3 wraz z sekwencjami peptydu liderowego.

Korzystnie, organizm jest wybrany spośród szczepów S. salivarius K12 i K30.

W szczególnie korzystnej postaci wykonania preparaty terapeutyczne s ą w postaci pokarmów lub napojów, najkorzystniej w postaci nabiału lub napojów mlecznych.

Alternatywnymi postaciami wykonania są leki i wyroby cukiernicze.

W dalszym wykonaniu wynalazek dotyczy organizmu, który wyraż a saliwarycynę B.

Korzystnie organizm jest wybrany ze szczepów K12 i K30 S. salivarius.

Choć wynalazek jest zasadniczo taki jak opisano powyżej to powinno być dostrzeżone przez specjalistów w dziedzinie, że wynalazek nie jest ograniczony do tej postaci, lecz obejmuje również postacie podane przykładowo poniżej wraz z aspektami w pełni określonymi w załączonym zestawie zastrzeżeń.

Opis rysunków.

Mogą być dokonane odniesienia do załączonych rysunków, w których:

Na Fig. 1 przedstawiono strukturalne właściwości saliwarycyny B;

Na Fig. 2 przedstawiono nukleotydową i aminokwasową sekwencję saliwarycyny B, w tym część peptydu liderowego; i

Na Fig. 3 przedstawiono nukleotydowe i aminokwasową sekwencję saliwarycyny A2, włącznie z peptydem liderowym.

BLIS (inhibitory typu bakteriocyn, ang. bacteriocin-like inhibitory substances) są zewnątrzkomórkowo uwalnianymi peptydami bakteryjnymi lub białkami, które są zdolne w niskim stężeniu zabijać inne, określone, blisko spokrewnione bakterie z wykorzystaniem mechanizmu, przeciw któremu komórka producenta wykazuje pewien, specyficzny stopień odporności.

Określenie lantybiotyki jest określeniem pochodzącym od określenia antybiotyki zawierające lantioninę (Schnell i wsp., Nature 333:276, 1988). Lantybiotyki są kategorią BLIS. Syntetyzowane przez rybosom lantybiotyki są prelantybiotykami o N-końcowej sekwencji (peptyd liderowy), która jest odcinana przez procesujące enzymy, podczas tworzenia dojrzałej (postać biologicznie aktywna) cząsteczki. Cechą charakterystyczną jest to, że są one policyklicznymi polipeptydami zawierającymi lantioninę i/lub β-metylolantioninę tworzącą mostki tioeterowe w łańcuchu peptydowym. Obecnie zaproponowano podział lantybiotyków na dwa typy A i B, Jung w Angewandte Chemie 30:1051-1192, 1991.

Wstępne badania określiły szereg szczepów Streptococcus salivarius wytwarzających BLIS aktywnych przeciw pewnym innym paciorkowcom. Wyizolowano BLIS wytwarzany przez jeden szczep (szczep 20P3), oczyszczono go częściowo i wstępnie scharakteryzowano. Wstępna charakterystyka wykazała, że wytwarzany BLIS jest białkiem względnie termostabilnym o masie cząsteczkowej w zakresie 3500 do 8000 Da. BLIS otrzymał nazwę SAL 20P3.

Dalsze badania określiły sekwencję aminokwasową SAL 20P3 wraz z jego masą cząsteczkową. Konkretnie zidentyfikowany lantybiotyk został przemianowany na saliwarycyna A (Ross i wsp., Appl. Envir. Microbiol. 59:2014).

BLIS z obecnego wynalazku jest inny niż saliwarycyna A. Różnica ta dotyczy zarówno masy cząsteczkowej (2733 Da w porównaniu z 2316 Da dla saliwarycyny A) i w kategoriach sekwencji aminokwasowej co przedstawiono na Fig. 2. Saliwarycyny A i B są również odmienne pod względem ich aktywności inhibitorowej. Konkretnie, podczas gdy stwierdzono, że saliwarycyna A jest skuteczna jako bakteriostatyk względem większości szczepów Streptococcus pyogenes, to dowiedziono, że saliwarycyna B jest bakteriobójcza. Co ważniejsze, do tej pory nie wykryto szczepów S. pyogenes odpornych na saliwarycyn ę B.

Saliwarycyna B jest wyrażana przez szczepy K12 i K30 S. salivarius. Szczepy K12 i K30 S. salivarius zdeponowano 8 października 1999 roku w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und

PL 206 441 B1

Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Niemcy. Szczep K12 oznaczono numerem dostępu DSM 13084, podczas gdy szczep K30 oznaczono numerem dostępu DSM 13085.

Zatem, w pierwszym aspekcie wynalazek dotyczy przeciwbakteryjnego białka, saliwarycyny B. Wynalazek dotyczy również fragmentów lub wariantów saliwarycyny B, które ujawniają równoważne właściwości funkcjonalne.

Ponadto, powinno być docenione, że natywna sekwencja aminokwasowa obu białek i ich aktywnych fragmentów może być zmodyfikowana i nadal zasadniczo zachowają one swoją aktywność biologiczną. Takie modyfikacje natywnej sekwencji aminokwasowej prowadzące do wstawienia, substytucji lub delecji jednego, dwóch lub trzech aminokwasów są szczególnie objęte zakresem wynalazku, pod warunkiem, że warianty białek są, lub zawierają, sekwencje o większej niż 80% homologii z sekwencją aminokwasowa natywnej saliwarycyny B.

Oczywiście, powinno być zrozumiane, że możliwe jest wiele substytucji aminokwasów, które nadal spełniają te warunki. Konserwatywne substytucje są opisane w zgłoszeniach patentowych, przykładowo w US nr 5,264,258 lub 5,487,983. Tak więc oczekuje się, że przykładowo możliwymi będą wymiany między niepolarnymi alifatycznymi obojętnymi aminokwasami, glicyną, alaniną, proliną, waliną i izoleucyną. Podobnie, możliwe są substytucje pomiędzy obojętnymi polarnymi alifatycznymi, aminokwasami, seryną, treoniną, metionina, asparaginą i glutaminianem. Prawdopodobnie mogą być dokonane substytucje między posiadającymi ładunek kwaśnymi aminokwasami, kwasem asparaginowym i kwasem glutaminowym jak również substytucje między posiadającymi ładunek zasadowymi aminokwasami lizyną i argininą. Również przypuszczalnie możliwe są substytucje pomiędzy aminokwasami aromatycznymi obejmującymi fenyloalaninę, histydynę, tryptofan i tyrozynę. Te rodzaje substytucji i zamian są dobrze znane specjalistom w dziedzinie. Możliwe mogą być również inne substytucje. Oczywiście, oczekuje się również, że im bardziej wyrażona w procentach homologia, tj. podobieństwo sekwencji zmienionego białka z białkiem występującym w naturze, przekracza 80%, w tym większym stopniu zachowana jest jego aktywność.

Białka według wynalazku i ich fragmenty mogą być przygotowane różnymi sposobami. Przykładowo, przez izolację ze źródeł naturalnych (tak jak S. salivarius szczepy K12 i/lub K30), przez syntezę przy pomocy dowolnych przydatnych, znanych sposobów (takich jakie opisali dla syntezy nizyny Wakamiya i wsp., (1991) w „Nisin and Novel Lantibiotics” wyd. G. Jung i G. Shal, 189-203, Escom, Leiden, lub przez syntezę na fazie stałej jak opisano przez Merrifield (1964) J. Am. Chem. Assoc. 85, 2149-2154, lub przez syntezę w roztworach jednorodnych jak opisano przez Houbenwycl (1987), Methods of Organic Chemistry, vol l i II) lub przez zastosowanie technik rekombinacji DNA, takich jak opisane przez Sambrook i wsp. (1989), Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nowy Jork, USA.

Warianty zarówno naturalnego białka jak i jego aktywnych fragmentów mogą być podobnie sporządzone dowolnym z tych, znanych w dziedzinie sposobów. Przykładowo, warianty mogą być przygotowane przez miejscowo specyficzną mutagenezę DNA kodującego naturalną sekwencję aminokwasowa jaką opisali Adelman i wsp., DNA 2, 183 (1983).

Gdy użyte są sposoby rekombinowania do wytworzenia BLIS jest niezbędnym uzyskanie w pierwszym etapie DNA kodującego żądany produkt. Taki DNA stanowi również przedmiot tego wynalazku.

Sekwencję nukleotydową polinukleotydu kodującego saliwarycynę B przedstawiono na Fig. 2.

DNA polinukleotydy według wynalazku może kodować naturalne białko lub jego aktywny fragment.

DNA może być przykładowo wyizolowany ze szczepów K12 i K30 S. salivarius przy pomocy sond i/lub starterów dla amplifikacji zaprojektowanych na podstawie określonej sekwencji nukleotydowej saliwarycyny B. Tak zidentyfikowany DNA może być wytworzony tradycyjnymi sposobami jako cDNA bez intronów. DNA może być również wytworzony w postaci syntetycznych oligonukleotydów, gdzie wielkość aktywnych fragmentów pozwala na uzyskanie ich metodą fosfotioestrową Matteucci i wsp., J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981. Dalej DNA może być wytworzony przy pomocy odpowiedniego, komercyjnie dostępnego syntetyzera DNA, takiego jak syntetyzer DNA Applied BioSystems.

Wynalazek dotyczy również wariantów białka i jego fragmentów różniących się od naturalnych sekwencji aminokwasowych z wynalazku substytucją lub delecją jednego lub większej liczby aminokwasów. Gdy pożądane są takie warianty sekwencja nukleotydową naturalnego DNA jest odpowiednio zmieniona. Zmiany te mogą być dokonane przez wybiórczą syntezę DNA lub przez modyfikację naturalnego DNA, przykładowo przez miejscowo specyficzną mutagenezę lub mutagenezę kasetą.

Korzystnie, gdy części cDNA lub genomowy DNA wymagają modyfikacji sekwencji, użyta jest miejscowo specyficzna mutageneza zależna od startera. Technika ta jest obecnie typową w dziedzinie.

PL 206 441 B1

Gdy otrzyma się zmodyfikowane DNA, to traktuje się go tak, aby był użyteczny dla rekombinowania do odpowiedniego wektora dla klonowania i/lub ekspresji. Na koniec DNA jest cięty, dobudowywane są mu jednoniciowe końce i jak jest to wymagane rekombinowany przez ligację.

Cięcie jest wykonane przez działanie enzymami restrykcyjnymi w dogodnym buforze. Użyty może być którykolwiek z wielu komercyjnie dostępnych enzymów restrykcyjnych w sposób określony przez producenta. Po cięciu kwas nukleinowy jest odzyskiwany, przykładowo przez wytrącanie etanolem.

Dobudowywanie końców do przeciętego DNA wykonuje się przy pomocy tradycyjnych sposobów. Przykładowo, jeśli wymagane są tępe końce DNA może być poddany działaniu DNA polimerazy I (Klenow), ekstrakcję fenolem i chloroformem i wytrącenie etanolem.

Ponowną ligację można przeprowadzić przez dostarczenie w przybliżeniu równych molowo ilości żądanych składników, odpowiednie dobudowanie końców dla ich poprawnego parowania i działanie odpowiednią ligazą (np. ligaza DNA z T4).

Tak uzyskana cząsteczka DNA jest wbudowana do wektora do klonowania w miejscu pozwalającym na wytwarzanie kodowanego przez nią białka.

Odpowiednie wektory do klonowania mogą być skonstruowane zgodnie ze znanymi sposobami lub mogą być wybrane spośród wielu dostępnych w dziedzinie wektorów dla klonowania. Podczas gdy wektor dla klonowania może się zmieniać zależnie od komórki gospodarza, która ma być użyta do ekspresji DNA kodującego BLIS to przydatne do klonowania wektory będą ogólnie miały poniższe właściwości:

(i) zdolność do autoreplikacji.

(ii) pojedyncze miejsce dla dowolnej szczególnej endonukleazy restrykcyjnej i (iii) pożądane jest aby niosły geny dla prostych znaczników selekcyjnych, takich jak odporność na antybiotyki.

Dwoma głównymi typami wektorów do klonowania posiadających wymienione powyżej właściwości są plazmidy i wirusy bakteryjne (bakteriofagi lub fagi). Przykłady odpowiednich wektorów do klonowania obejmują pUC18, Mp18, Mp19, pRB322, pMB9, ColE1 i pCR1 z E. coli; szeroką gamę gospodarzy plazmidów włącznie z RP4, DNA faga, takiego jak lambda i M13 i wektory wahadłowe, takie jak pSA3 i pAT28.

Dla ekspresji DNA kodującego BLIS w komórce gospodarza wektor do klonowania musi zawierać również sekwencję kontrolującą ekspresję. Typowa sekwencja kontrolująca ekspresję może być opisana w kategoriach pięciu elementów. W kolejności występowania w genie elementami tymi są:

(a) region promotora;

(b) 5' region nie ulegający translacji (sekwencja sygnałowa lub liderowa);

(c) sekwencja kodująca białko;

(d) 3' region nie ulegający translacji i (e) region terminacji transkrypcji.

Funkcja każdego z tych elementów jest dobrze poznana. Może być użyty szeroki zakres takich sekwencji kontrolujących, na przykład, te z genu dla lipoproteiny, genu dla β-galaktozydazy, genu dla tryptofanu, genu dla β-laktamazy i faga lambda.

Jako element (c) sekwencja DNA kodująca lantybiotyk jest wbudowana do sekwencji kontrolującej ekspresję w wektorze do klonowania w podanym powyżej sposób.

Następnie jest wybrana odpowiednia komórka gospodarza, do której wprowadzony będzie wektor dla klonowania. Potencjalnie użyteczne komórki gospodarza obejmują bakterie, drożdże, grzyby, owady, komórki zwierzęce i roślinne. W obecnym wynalazku ogólnie korzystne są komórki gospodarzy prokariotycznych. Szczególnie korzystne jako gospodarze są bakterie nie powodujące choroby.

Bakteryjni gospodarze są ogólnie wybrani spośród bakterii gram dodatnich. W obecnym wynalazku korzystne dla użycia są komórki gospodarzy Streptococcus.

Powinno być docenione, że w selekcyjnym systemie gospodarza użyte są wektory plazmidowe zawierające miejsca inicjacji replikacji i sekwencje kontrolujące pochodzące z gatunków zgodnych z gospodarzem.

Utworzony jak podano powyżej wektor do klonowania jest użyty do transformacji gospodarza podlegającego selekcji z zastosowaniem sposobów dobrze znanych w dziedzinie, na przykład, działanie chlorkiem wapnia jak to opisał Cohen, S.N. Proc. Nat. Acad. Sei. 69, 2110, 1972.

Po transformacji wybranego gospodarza wektorem do klonowania przez hodowanie komórek gospodarza, może być wytworzone kodowane przez niego białko lub jego fragment, potencjalnie jako białko fuzyjne. Następnie izolowane są wytwarzane egzogenne produkty białkowe lub ich fragmenty,

PL 206 441 B1 przy pomocy rutynowych sposobów obejmujących wytrącanie siarczanem amonu, chromatografię na kolumnie (np. chromatografię jonowymienną filtrację w żelu, chromatografię powinowactwa, itp.), elektroforezę i ostatecznie krystalizację (patrz ogólnie „Enzyme Purification and Related Techniques”. Methods in Enzymology, 22, 233-577 (1971)). Jeśli jest to niezbędne to oczyszczanie jest wykonane przy pomocy tradycyjnych sposobów.

Gdy zastosowana jest technika rekombinowania, to DNA z wynalazku może również kodować białko fuzyjne zawierające białko o właściwościach antybakteryjnych lub jego fragment i białko wektora ułatwiające izolację i oczyszczanie. Ogólnie, to białko wektora może być odcięte chemicznie lub enzymatycznie od białka o właściwościach antybakteryjnych lub jego fragmentu, przy pomocy znanych sposobów.

Zastosować można również chimerową postać białka. Sekwencja DNA kodująca każde całe białko lub część białka może być połączona z, na przykład, sekwencją kodującą inny BLIS, taki jak saliwarycyna A2, tak, że ekspresja sekwencji DNA wytwarza chimerowe białko o zwiększonym spektrum aktywności przeciwbakteryjnej.

Gdy białko zostanie oczyszczone to jest ono dostępne do zastosowania. Zastosowania takie obejmują ogólnie wykorzystanie czynników przeciwbakteryjnych (np. jako prezerwantów w żywności) jak również zastosowania terapeutyczne. W tym kontekście powinno być dostrzeżone, że „terapeutyczne” obejmuje działanie profilaktyczne.

Zatem, w dalszym aspekcie obecny wynalazek dotyczy preparatów terapeutycznych odpowiednich do zastosowania w leczeniu lub zapobieganiu zakażeniom mikroorganizmami, szczególnie zakażeniom paciorkowcami. Preparaty są szczególnie użyteczne do zastosowania przeciw S. pyogenes i S. sobrinus. Takie preparaty lecznicze obejmują saliwarycynę B lub jej fragment lub wariant w kombinacji z rozcieńczalnikiem, nośnikiem lub zaróbką, takimi jakie są znane w dziedzinie. Przykłady preparatów terapeutycznych, w których zastosowana może być saliwarycyna B obejmują leki dla podania doustnego, takie jak kapsułki, pastylki do ssania, syropy, płukanki do ust, płukanki do gardła, pasty do zębów i aerozole do ust, ale nie są do nich ograniczone. Ponadto, przykłady obejmują preparaty do podania miejscowego, takie jak kremy nawilżające i kosmetyki do zwalczania wzrostu bakterii na skórze.

W dalszej postaci obecny wynalazek dotyczy preparatów terapeutycznych zawierających ż ywe organizmy niewywołujące chorób, zdolne do kolonizowania górnych dróg oddechowych lub ich części i ekspresji lantybiotyku według wynalazku w kombinacji z nośnikiem, rozpuszczalnikiem i/lub zaróbką.

W pewnej postaci organizm jest stransformowanym organizmem gospodarza wytworzonym zgodnie z wynalazkiem. Jednak, jest korzystne aby organizm był jednym z wytwarzających saliwarycynę B jako produkt natywny. Przykładami takich organizmów są szczepy K12 i K30 S. salivarius.

Szczepy K12 i K30 S. salivarius określono jako wyrażające nie tylko saliwarycynę B lecz również saliwarycynę A2. Saliwarycyna A2 jest pokrewna, lecz nie identyczna z saliwarycyna A. Pełne sekwencje (polinukleotydowa i aminokwasowa) dla saliwarycyny A2 przedstawiono na Fig. 3.

W tej postaci jest korzystnym aby preparaty terapeutyczne wedł ug wynalazku miał y formę pożywienia, produktu cukierniczego lub napoju. Jest szczególnie korzystnym aby pokarm lub napój był produktem w oparciu o nabiał, przykładowo jogurtem, serem, mlekiem, herbatnikiem mlecznym i mlekiem smakowym. W przypadku wyrobów cukierniczych preparat terapeutyczny może być gumą do żucia, taką jak guma do żucia opisana w WO 00/05972.

Szczególnie korzystnym preparatem są liofilizowane szczepy S. salivarius wytwarzające saliwarycynę B zawarte w preparatach mleka w proszku, tak jak to wcześniej podano dla przygotowania bifidofilnego mleka w proszku (Nagawa i wsp., (1988); J. Dairy Sci. 71:1777-1782). Różne aspekty wynalazku będą obecnie zilustrowane, nie ograniczając wynalazku przez podaną niżej część doświadczalną.

Część doświadczalna

Ekstrahowanie saliwarycyny

Saliwarycyna B została oczyszczona z hodowli murawkowych testowanych szczepów K12 i K30 S. salivarius hodowanych przez 18 godzin w 37°C w atmosferze z 5% ditlenkiem węgla na pożywce M17 uzupełnionej 0,5% agar Davis'a, 0,5% sacharoza, 0,5% ludzka surowica i 0,1% węglan wapnia. Hodowle murawkowe zaszczepiano przez rozmaz wacikiem na powierzchni pożywki z agarem z 18 godzinnej hodowli w 37°C szczepu produkującego na pożywce Todd Hewitt. Ekstrahowanie saliwarycyny B dokonuje się przez zamrożenie płytek z agarem w -70°C, a następnie rozmrożenie w temperaturze pokojowej, co powoduje zniszczenie struktury żelu agarowego, a następnie wirowanie dla skla8

PL 206 441 B1 rowania ekstraktu. Zazwyczaj miano aktywności hamującej w tych ekstraktach zamrożonych/rozmrożonych wynosi na ogół 2-4 AU/ml.

Miareczkowanie aktywności saliwarycyny

Aktywność saliwarycyny miareczkuje się przy pomocy oznaczenia na powierzchni agaru. Krople (20 μΐ) z serii dwukrotnych rozcieńczeń próbki są oznaczone względem Micrococcus luteus T-18 na zasadowym agarze Columbia. Odwrotność największego rozcieńczenia dającego określoną strefę zahamowania wzrostu murawki bakterii jest miarą arbitralnych jednostek na ml (Au/ml) aktywności saliwarycyny.

Oczyszczanie saliwarycyny B

Dwa litry ekstraktu zamrożonego/rozmrożonego naniesiono na kolumnę XAD-2 (średnica 5,0 cm, objętość złoża 150 ml; Serva) i płukano siedmioma objętościami 50% (obj/obj) metanolu. Aktywność saliwarycyny wymywano pięcioma objętościami złoża 90% (obj/obj) metanolu (o pH 2 ustalonym przy pomocy 11,6 M CH1) i zatężono przez odparowywanie w 50°C przy obniżonym ciśnieniu. Próbki (1 ml) tego materiału naniesiono na kolumnę odwróconej fazy Brownlee C8 (Aquapore RP 300; średnica porów 7 μm; 30 na 4,6 mm; Applied Biosystems Inc.), zrównoważoną 0,1% kwasem trifluorooctowym (TFA). Frakcjonowanie tego materiału osiągnięto stosując system Pharmacia szybkiej chromatografii białka w cieczy (FPLC), przy przepływie 1 ml/minutę wykorzystując 10 minutowy gradient (0-28% acetonitryl zawierający 0,085% TFA), a następnie 80 minutowe izokratyczne wymywanie (28% acetonitryl). Podczas tego izokratycznego wymywania uzyskane jest rozdzielenie faz zawierających saliwarycynę A (wymywana począwszy od około 40 minuty) i saliwarycynę B (począwszy od około 60 minuty). Każdą z 1 ml frakcji sprawdzano pod względem zdolności do hamowania M. luteus T18. Frakcje mające aktywności odpowiadające saliwarycynie A i saliwarycynie B pulowano oddzielnie co dało częściowo oczyszczone preparaty bakteriocyn. Każdą z pul liofilizowano i następnie rozpuszczono w 0,1% TFA. Objętości każdego z tych preparatów naniesiono następnie na kolumnę C18 o odwróconej fazie dla wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) (Alltech, Nucleosil C18; 10 μm; 250,0 x 4,6 mm) zrównoważonej 0,1% TFA i frakcjonowano dalej stosując system HPLC Waters/Millipore, przy zastosowaniu odpowiednich gradientów acetonitrylu. Saliwarycyna A2 była wymywana jako jednorodna frakcja przy stężeniu acetonitrylu 34-35%, a saliwarycyna B przy stężeniu acetonitrylu 38-40%. Absorbancję monitorowano przy 214 mm i frakcje odpowiadające różnym maksimom absorbancji zbierano ręcznie. Aktywność hamującą wykrywano przez oznaczenie dyfuzji plamki z wykorzystaniem jako wskaźnika M. luteus T-18. Frakcje aktywne z każdego rozdziału pulowano, następnie liofilizowano i zawieszano w 1 ml wody oczyszczonej przez Milli Q™ wody zawierającej 0,1% TFA. Frakcje zawierające aktywność hamującą (oczyszczona saliwarycyna) łączono i przechowywano w -20°C.

Spektrometria masowa z rozpylonymi jonami wykazała, że masa cząsteczkowa saliwarycyny B wynosi 2733 Da. Analiza Erdmana oczyszczonej saliwarycyny B ujawniła N-końcową sekwencję Gly-Gly-Gly-Val-Ile-Gln.

Klonowanie saliwarycyny B

Sekwencja aminokwasowa uzyskana przez oczyszczanie i sekwencjonowanie peptydu umożliwia zaprojektowanie, na podstawie kodu genetycznego, zdegenerowanych oligonukleotydowych sond DNA. Użyta konkretna sonda (CF481) zaprojektowana została na podstawie sekwencji: S W Q F L F T. Odpowiadająca jej sekwencja nukleotydowa była TCNTGGCAATTTTTRTTTACT.

Chromosomowy DNA wyizolowano z Streptococcus salivarius szczepu Min 5, za pomocą metody Spanier i Cleary (1983). (Virology 130:514-522). Przeprowadzono trawienie enzymami restrykcyjnymi zarówno EcoRI jak i Hindlll i następnie przecięty DNA rozdzielono w 1% żelu agarozowym prowadząc elektroforezę przez 18 godzin przy 40 V/cm (Sambrook i wsp. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 1989). Metodą Southern blot przeniesiono DNA na filtr nylonowy postępując zgodnie z instrukcjami użycia filtrów Hybond-N+ (Amersham Pharmacia). Sonda CF481 była wyznakowana gamma P³² ATP przy pomocy kinazy polinukleotydowej z bakteriofaga T4. Hybrydyzację z sondą CF481 przeprowadzono w rurce do hybrydyzacji przez 18 godzin w 38°C. Błonę płukano dwukrotnie przez 5 minut w 5 x SSC, 0,5% SDS i następnie dwukrotnie przez 20 minut w 2 x SSC, 0,2% SDS. Następnie błonę eksponowano przez 18 godzin w -70°C wobec filmu rentgenowskiego.

Obszar żelu odpowiadający miejscu hybrydyzacji CF481 na filtrze następnie wycięto z żelu i DNA wyekstrahowano przy pomocy zestawu Qiagen Qiaquick Gel Extraction Kit. Dla reakcji ligacji 1 μl wektora pUC19, który wycięto enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Hindlll zmieszano z 15 μl oczyszczonych

PL 206 441 B1 fragmentów DNA Min5, 2 μΐ buforu do ligacji i 1 μΐ ligazy DNA z bakteriofaga T4 (Roche). Inkubację prowadzono przez 18 godzin w 15°C.

Do transformacji przez elektroporację z poddanym ligacji pUC19 użyto E. coli szczepu DH10e. Stransformowane komórki hodowano przez 1 godzinę w 1 ml pożywki Luria, a następnie wyszczepiono na szalki z agarem odżywczym Luria z dodatkiem ampicyliny (100 μΙ/ml) i X-gal 20 mg/ml. Po całonocnej inkubacji w 37°C wybierano białe kolonie, które hodowano i badano przy pomocy sondy CF481. Przeszukiwanie przeprowadzono przez lizę kolonii E. coli w 5% SDS, 10% roztworze glicerolu w 65°C przez 30 minut. Uzyskany z kolonii DNA był następnie rozdzielany w żelu agarozowym poddany analizie Southern biot gdzie związany z filtrem DNA hybrydyzowano z sondą CF481 w sposób jaki opisano powyżej. Następnie pozytywne kolonie hodowano na pożywce Luria z ampicyliną o stężeniu 100 μg/ml przez 18 godzin w 37°C z wytrząsaniem. Następnie plazmid pUC19 ekstrahowano przy pomocy zestawu Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) i sekwencjonowano przy pomocy starterów pUC19 „do przodu” i „do tyłu”.

Wyniki przedstawiono na Fig.2.

Przeciwbakteryjna aktywność saliwarycyny B Część 1

Szczepy S. salivarius, takie jak 20P3 i 5, które wytwarzają saliwarycynę A (lecz nie saliwarycynę B) hamują wszystkie dziewięć standardowych bakterii wskaźnikowych poza bakterią wskaźnikową 3. Ten wzór hamowania w formie zakodowanej jest znany jako wytwarzanie (P) typu 677. Przeciwnie, szczepy K12 i K30 wytwarzające zarówno saliwarycynę A2 jak i saliwarycynę B hamują wzrost wszystkich standardowych wskaźników, aktywność określana jako P typu 777. Testy określające typ P po pierwsze wymagają wzrostu badanego szczepu na krwawym agarze, na pasku stanowiącym średnicę płytki. Po usunięciu paska, wraz z rosnącymi na nim bakteriami, powierzchnia agaru jest sterylizowana parami chloroformu, napowietrzana i następnie 9 standardowych bakterii wskaźnikowych (włącznie z czterema szczepami Streptococcus pyogenes) jest wyszczepianych w poprzek obszaru, na którym znajdował się pasek z wyszczepionym badanym szczepem. Po inkubacji zaburzenie wzrostu szczepów wskaźnikowych w sąsiedztwie obszaru, na który naniesiono pasek z badanym szczepem, jest traktowane jako dowód na aktywność bakteriocyny. W przypadku szczepów 20P3 i 5 (wytwarzających saliwarycynę A) aktywność inhibitorowa może być pokazana jako bakteriostatyczna, bowiem komórki wskaźnikowe mogą być, w znacznej ilości, odzyskane ze strefy zahamowania przez pobranie z tej strefy próbki wacikiem i przeniesienie komórek na świeżą (nie zawierającą bakteriocyny) pożywkę z agarem. Przeciwnie, efekt szczepów o P typu 777 (przedstawionych jako wytwarzające saliwarycynę B) jest bakteriobójczy względem standardowych szczepów wskaźnikowych, bowiem nie można odzyskać komórek ze strefy zahamowania w testach różnicujących antagonizm. Ponadto, testy wykorzystujące oczyszczone preparaty saliwarycyny A i saliwarycyny B (dane nie przedstawione) potwierdziły, że działanie saliwarycyny A przeciw S. pyogenes jest bakteriostatyczne, podczas gdy saliwarycyny B jest bakteriobójcze.

Część 2

Hamującą aktywność saliwarycyn określono przez pomiar zmniejszającej się w czasie liczby jednostek tworzących kolonie (CFU) w zawiesinie wrażliwych wskaźnikowych paciorkowców (Streptococcus pyogenes szczep FF22) po zmieszaniu komórek z preparatem saliwarycyny. Dwukrotnie przepłukane komórki wskaźnikowych paciorkowców pochodzące z hodowli na pożywce Todd Hewitt zawieszono w 0,067 M buforze fosforanowym (pH 6,5) w ilości odpowiadającej wyjściowej hodowli. Porcje częściowo oczyszczonej saliwarycyny (miano 16 Au/ml) lub buforu fosforanowego (kontrola) mieszano z równą objętością zawiesiny komórkowej i kontynuowano inkubację w 37°C. Przeżywalność określano w odstępach czasu przez wyszczepianie dogodnie dziesięciokrotnego rozcieńczenia (w zimnej pożywce Todd Hewitt) mieszaniny badanej i kontrolnej na szalkę z agarem Columbia i inkubację, przez 24 godz. w 37°C. Liczbę żywych komórek określano jako liczbę CFU na ml.

Stwierdzono, że preparaty częściowo oczyszczonej saliwarycyny B o mianie 16 miały działanie letalne na ponad 99% CFU z wykładniczej hodowli S. pyogenes szczepu FF22 na pożywce Todd Hewitta, po 4 godz. hodowli w 37°C. Przeciwnie, częściowo oczyszczone preparaty saliwarycyny A2 o mianie 16, gdy były badane w tych samych warunkach zabijały mniej niż 10% komórek szczepu FF22. Ponadto, badanie spektrum hamowania częściowo oczyszczonych preparatów saliwarycyny A2 i saliwarycyny B przeprowadzono za pomocą opisanego powyżej oznaczenia na powierzchni agaru. Krople (20μΟ preparatu o mianie 16 Ua/ml nakroplono na murawkę badanych szczepów, które świeżo zaszczepiono przez rozmaz na powierzchni szalek z agarem Columbia 1/100 rozcieńczenia w solance 18 godz.

PL 206 441 B1 hodowli tego szczepu na pożywce Todd Hewitt. Wytwarzanie określonej strefy zahamowania wzrostu szczepu po inkubacji opisanych płytek w 37°C przez 18 godz. traktowano jako wskazówkę wrażliwości szczepu na saliwarycynę.

Wyniki przedstawiono w Tabeli 1.

T a b e l a 1:

Aktywność inhibitorowa

Gatunki	Liczba Badanych	Wrażliwe na Sal A2	Wrażliwe na Sal B
Streptococcus pyogenes	15	15	15
Streptococcus equisimilis	5	5	5
Streptococcus agalactiae	5	0	2
Streptococcus pneumoniae	4	1	2
Streptococcus sanguis	6	0	6
Streptococcus mutans	6	0	0
Streptococcus sobrinus	4	0	3
Corynebacterium diphtheriae	4	0	4
Lactobacillus casei	2	1	2
Stomatococcus mucilagenosus	4	0	3
Staphylococcus aureus	4	0	0
Branhamella catarrhalis	1	0	1
Escherichia coli	2	0	0

Zastosowania przemysłowe

Powyższe wyniki pokazują hamujące i bakteriobójcze działanie saliwarycyny B i organizmów wytwarzających ten BLIS. Saliwarycyna B i/lub organizmy ją wytwarzające mogą być co za tym idzie wykorzystane w zastosowaniach do wytwarzania preparatu terapeutycznego do leczenia osobników przeciw szkodliwym skutkom zarażenia paciorkowcem górnych dróg oddechowych, włącznie z jamą ustną. Preparat terapeutyczny może być podawany w stanach, takich jak wywołane przez paciorkowce nadżerki w gardle (powodowane głównie przez S. pyogenes) i ubytki w zębach (powodowane częściowo przez S. sobrinus).

Obecnie preferowanymi podawanymi doustnie postaciami są mieszanki liofilizowanych szczepów S. salivarius w mleku w proszku lub im podobne, którym nadano aromat dla poprawienia smaku.

Dostępne w chwili obecnej dane dowodzą, że postaci te są skuteczne gdy są rekonstytuowane przez dodanie wody i popijane trzy do cztery razy dziennie tak, aby skonsumowane zostało łącznie 50 ml aromatyzowanego produktu (zawierającego około 2 x 10⁷ komórek/ml liofilizowanej S. salivarius).

Gdy liofilizowane szczepy S. salivarius są wybrane z K12 i K30 to dodatkową zaletą jest to, że wraz z saliwarycyną A2 wyrażana jest saliwarycyną B. Równoczesne wyrażanie tych dwóch BLIS czyni postać szczególnie bakteriobójczą względem S. pyogenes i S. sobrinus jak również względem szeregu innych bakterii.

Powinno być docenione, że powyższy opis jest dostarczony jedynie dla przykładowego zobrazowania i że mogą być użyte warianty zarówno materiałów jak i sposobów znanych specjalistom w dziedzinie. Zakres ochrony jest ograniczony jedynie poniższymi zastrzeżeniami.

PL 206 441 B1

LISTA SEKWENCJI <110> University of Otago

BLIS Technologies Limited <120> Lantybiotyk <130> 26504 MRB <140>

<141>

<150> NZ 500261 <151> 1999-10-12 <160> 5 <170> Patentln Wersja 2.1 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Streptococcus salivarius <400> 1

Gly Gly Gly Val Ile Gin 1 5 <210> 2 <211> 111 <212> DNA <213> Streptococcus salivarius <220>

<221> CDS <222> (37)..(111) <400> 2 ttgactcttg aagaacttga taacgttctt ggtgct ggt ggt gga gta atc caa 54 Gly Gly Gly Val Ile Gin

5

acc

att

tca

cac

gaa

tgt

cgt

atg

aac

tca

tgg

cag

ttc

ttg

ttt

act

102

Thr

Ile

Ser

His

Glu

Cys

Arg

Met

Asn

Ser

Trp

Gin

Phe

Leu

Phe

Thr

10

15

20

tgt tgc tct 111

Cys Cys Ser <210> 3 <211> 25 <212> PRT <213> Streptococcus salivarius <400> 3

Gly Gly Gly Val Ile Gin Thr Ile Ser His Glu Cys Arg Met Asn Ser 15 10 15

PL 206 441 B1

Trp Gin Phe Leu Phe Thr Cys Cys Ser 20 25 <210> 4 <211> 153 <212> DNA <213> Streptococcus salivarius <220>

<221> CDS <222> (88) . . (153) <400> 4 atgattgcca tgaaaaactc aaaagatatt ttgaacaatg ctatcgaaga agtttctgaa 60 aaagaactta tggaagtagc tggtggt aaa aga ggt aca ggt tgg ttt gca act 114 Lys Arg Gly Thr Gly Trp Phe Ala Thr

5

att

act

gat

gac

tgt

cca aac

tea

gta

ttc

gtt

tgt

tgt

153

Ile

Thr

Asp

Asp

Cys

Pro Asn

Ser

Val

Phe

Val

Cys

Cys

10

15

20

<210>	5
<211>	22
<212>	PRT
<213>	Streptococcus	salivarius
<400>	5
Lys Arg Gly	Thr	Gly	Trp Phe Ala Thr	Ile Thr Asp Asp Cys	Pro Asn
1			5		10	15
Ser Val Phe	Val	Cys	Cys
		20

Zastrzeżenia patentowe

Claims (40)

1. Przeciwbakteryjne białko o sekwencji Sekw. Id. Nr: 3.

2. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że jest bakteriobójcze.

3. Białko według zastrz. 2, znamienne tym, że jest bakteriobójcze względem Streptococcus pyogenes.

4. Przeciwbakteryjne białko o sekwencji aminokwasowej różniącej się od podanej w SEK NR ID: 3 wstawieniem, delecją albo substytucją od jednego do trzech aminokwasów.

5. Białko według zastrz. 4, znamienne tym, że jest bakteriobójcze.

6. Białko według zastrz. 5, znamienne tym, że jest bakteriobójcze względem Streptococcus pyogenes.

7. Przeciwbakteryjna kompozycja, znamienna tym, że obejmuje białko określone w zastrz. 1-6 albo organizm, który może wyrażać białko określone w zastrz. 1-6.

8. Preparat terapeutyczny, znamienny tym, że obejmuje:

(i) białko określone w zastrz. 1-6; albo (ii) organizm który może wyrażać białko określone w zastrz. 1-6 w kombinacji z rozcieńczalnikiem, nośnikiem i/albo zaróbką.

PL 206 441 B1

9. Preparat terapeutyczny wedł ug zastrz. 8, znamienny tym, ż e zawiera biał ko okreś lone w zastrz. 1-6 w kombinacji z rozcieńczalnikiem, nośnikiem i/albo zaróbką.

10. Preparat terapeutyczny według zastrz. 8, znamienny tym, że obejmuje organizm, który może wyrażać białko określone w zastrz. 1-6, w kombinacji z rozcieńczalnikiem, nośnikiem i/albo zaróbką.

11. Preparat terapeutyczny według zastrz. 8-9, znamienny tym, że jest lekiem podawanym doustnie.

12. Preparat terapeutyczny według zastrz. 11, znamienny tym, że jest syropem, płukanką do ust, płukanką do gardła, pastą do zębów albo aerozolem do ust.

13. Preparat terapeutyczny według zastrz. 11, znamienny tym, że jest w postaci pojedynczych dawek.

14. Preparat terapeutyczny według zastrz. 12, znamienny tym, że jest w postaci pastylki do ssania albo kapsułki zawierającej jednostkową dawkę organizmu zdolnego do wyrażania białka określonego w zastrz. 1-6.

15. Preparat terapeutyczny według zastrz. 10-11, znamienny tym, że białko albo organizm jest włączony do pokarmu albo napoju.

16. Preparat terapeutyczny według zastrz. 15, znamienny tym, że pokarm albo napój jest oparty na nabiale.

17. Preparat terapeutyczny według zastrz. 16, znamienny tym, że białko albo organizm jest włączony do mleka w proszku, herbatników mlecznych, mleka, jogurtu albo sera.

18. Preparat terapeutyczny według zastrz. 16, znamienny tym, że białko albo organizm jest zawarty w mleku smakowym.

19. Preparat terapeutyczny według zastrz. 8-10, znamienny tym, że białko albo organizm zawarty jest w wyrobie cukierniczym.

20. Preparat terapeutyczny według zastrz. 19, znamienny tym, że wyrobem cukierniczym jest guma do żucia.

21. Preparat terapeutyczny według zastrz. 9-20, znamienny tym, że zawiera ponadto jeden albo więcej drugorzędnych czynników przeciwbakteryjnych.

22. Preparat terapeutyczny według zastrz. 21, znamienny tym, że drugorzędny czynnik(i) przeciwbakteryjny wybrany jest spośród inhibitorów typu bakteriocyn (BLIS).

23. Preparat terapeutyczny według zastrz. 20, znamienny tym, że ponadto zawiera jedną albo obie Saliwarycyny A, organizm który może wyrażać Saliwarycynę A, Saliwarycynę A2 lub organizm, który wyraża Saliwarycynę A2.

24. Polinukleotyd kodujący białko określone w zastrz. 1-6.

25. Polinukleotyd zawierający sekwencję kodującą SEK NR ID: 2.

26. Wyizolowany organizm, znamienny tym, że zawiera polinukleotyd określony w zastrz. 24 lub 25 i wyraża białko przeciwbakteryjne określone w zastrz. 1-6.

27. Organizm według zastrz. 26, znamienny tym, że polinukleotyd jest heterologiczny.

28. Organizm według zastrz. 26, znamienny tym, że jest organizmem S. salivarius.

29. Szczep S. salivarius K12, zdeponowany w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Niemcy pod numerem dostępu DSM 13084.

30. Szczep S. salivarius K30, zdeponowany w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Niemcy pod numerem dostępu DSM 13085.

31. Preparat terapeutyczny, znamienny tym, że zawiera S. salivarius szczep K12 albo S. salivarius szczep K30 określone w zastrz. 29 albo zastrz. 30.

32. Zastosowanie białka jak określone w zastrz. 1-6 lub organizmu wyrażającego to białko do wytwarzania preparatu terapeutycznego do co najmniej zahamowania wzrostu szkodliwych paciorkowców w górnych drogach oddechowych w postaci do podawania doustnego.

33. Zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, że preparat terapeutyczny jest preparatem terapeutycznym określonym w zastrz. 8-23 i 31.

34. Zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, że efekt hamujący jest spowodowany przez zasiedlenie przynajmniej części górnych dróg oddechowych osobnika żywotnym organizmem wyrażającym białko.

35. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że organizm tworzy część leku, pokarmu albo napoju albo wyrobu cukierniczego.

36. Zastosowanie według zastrz. 34 lub 35, znamienne tym, że organizmem jest S. salivarius wybrany spośród szczepów K12 i K30.

PL 206 441 B1

37. Zastosowanie według zastrz. 30-34, znamienne tym, że preparat terapeutyczny jest przeznaczony do podawania osobnikowi, który jest wstępnie leczony w celu przynajmniej ograniczenia populacji bakterii występującej w górnych drogach oddechowych.

38. Zastosowanie według zastrz. 35, znamienne tym, że wstępne leczenie obejmuje etap doustnego podania osobnikowi antybiotyku.

39. Preparat terapeutyczny, znamienny tym, że zawiera białko przeciwbakteryjne określone w zastrz. 1-6 i białko przeciwbakteryjne Saliwarycynę A 2.

40. Preparat terapeutyczny, znamienny tym, że zawiera przynajmniej jeden organizm S. salivarius wytwarzający białko przeciwbakteryjne określone w zastrz. 1-6 i przynajmniej jeden inny organizm S. salivarius wyrażający białko przeciwbakteryjne Saliwarycynę A 2.