SE463349B - Farmaceutiskt preparat foer profylax mot och/eller behandling av beta-streptokockinducerad tonsillit - Google Patents

Description

463 349 2 lintolerans hos B-streptokockgruppen A.

Det är känt att bakteriell interferens bland de i halsfloran förekommande bakterierna kan spela en viktig roll vid tonsillit. Man har visat att vissa streptokock- stammar hämmar tillväxten av vanliga infektionsinduce- rande B-streptokocker. Detta gäller särskilt vissa a-strep- tokocker. Personer som drabbats av ovannämnda, åter- kommande infektioner saknar ofta hämmande a-streptokocker i sin normala halsflora, medan personer som är innehavare av dessa a-streptokocker sällan drabbas av tonsillit.

Sanders et. al. (Sanders, C., Nelsen, G., Sanders, E.: Bacterial interference, II. Epidemiological deter- minants of the antagonistic activity of the normal throat flora against group A streptococci. Infection and Immunity 1977, l6:599-603) har visat att vissa Streptococcus viridans-stammar inhiberar tillväxten av grupp A-strepto- kocker (GAS). Sanders påvisade också en inhiberande förmåga hos normalt förekommande a-streptokocker mot GAS hos infekterade barn. a-streptokockernas skyddande roll i svalget mot B-streptokockinducerade infektioner har också visats av Grahn och Holm (Grahn, E., Holm, S.E.: Bacterial interference in the throat flora during a streptococcal tonsillitis outbreak in an apartment house area. Zentral- blatt für Bakteriologie Mikrobiologie und Hygiene A 1983, 256:72-79) och Roos et. al.

E., Holm, S.E.: Evaluations of betalactamase activity (Roos, K., Grahn, and microbial interference in treatment failures of acute streptococcal tonsillitis. Scandinavian Journal l8:3l3-19). lagt att frånvaron av interfererande a-streptokocker of Infections Diseases 1986, Dessa har klar- är ett av huvudskälen till den ofta ineffektiva behand- lingen av streptokockinducerad tonsillit.

Vidare har Beck (Interference by an a-hemolytic streptococcus of B-hemolytic pathogenic streptococci, Inflammation, 3:463-465, 1979) funnit en Streptococcus viridans-stam med hög inhiberande förmåga mot GAS och 465 549 3 föreslagit "implantation" av denna stam hos personer som drabbats av återkommande, streptokockinducerad ton- sillit. En liknande rapport har tidigare presenterats av Sprunt et. al. (Sprunt K., Leidy G., Redman W.: Abnor- mal colonisation of neonates in an ICU: Conversion to normal colonisation by pharyngeal implantation of alpha- -hemolytic streptococcus strain 215. Pediatr Res l4:308- -313, 1980), som implanterade en d-streptokockstam i nasofarynx hos 22 barn som befarades vara i riskzonen för infektion. Denna implantation visade sig vara fram- gångsrik hos 16 av barnen och orsakade övergång till normalfloran hos 7 av barnen i det att den implanterade stammen var den enda påträffade a-streptokockstammen 4-18 dagar efter implantationen.

Bakterierna i normalfloran hämmar invaderande bak- terier på olika sätt, och de faktorer som ligger bakom är t ex konkurrens om viktiga tillväxtfaktorer, pH-va- riationer, ackumulation av avfallsprodukter, bildning av peroxid, bakteriella toxiner och enzymer, samt även produktion av s k bakteriociner. De kända bakteriocinerna påminner mycket om antibiotika, men skiljer sig i det att de har en mycket selektiv effekt och inte rubbar den mycket viktiga anaeroba bakteriefloran. u-strepto- kockernas inhiberande verkan på B-streptokocker har i hög grad visat sig bero på närvaron av från u-strepto- kockerna bildade bakteriociner. Det föreligger ett behov av ett verksamt farmaceutiskt preparat för profylax mot och behandling av B-streptokockinducerad tonsillit.

Beskrivning av uppfinningen I en aspekt av uppfinningen âstadkoms ett-farmaceu- tiskt preparat för profylax mot och/eller behandling av B-streptokockinducerad tonsillit, vilket preparat kännetecknas av att det inbegriper minst en viabel mikro- organismstam vald ur den grupp som utgörs av Streptococcus sanguis II-stammarna med depositionsnumren NCIB 40104, NCIB 40105 och NCIB 40106, Streptococcus mitis-stammen med depositionsnumret NCIB 40107 och streptokock-stammar 463 549 4 med väsentligen samma förmåga att inhibera B-streptokocker som dessa deponerade stammar, i ett farmaceutiskt accep- tabelt medium i vilket mikroorganismerna bibehåller sin viabilitet.

I en annan aspekt av föreliggande uppfinning används ovannämnda preparat för profylax mot och/eller behandling av tonsillit, eventuellt efter en penicillinkur. Andra kännetecken hos uppfinningen framgår av de efterföljande patentkraven.

Det farmaceutiska preparatet enligt föreliggande uppfinning har visat sig vara särskilt verksamt vid profylax mot och behandling av B-streptokockinducerad tonsillit. I nedan beskrivna försök har preparatet enligt uppfinningen i en föredragen utföringsform, där samtliga 4 olika a-streptokockstammar närvarar samtidigt, visat sig slå ut 95-98% av B-streptokocker isolerade på 3 platser i Sverige. Kombinationer av olika många av nämnda mikroorganismstammar är också verksamma, men den avgjort bästa verkan som hittills erhållits fås då samtliga fyra olika stammar närvarar. Särskilt stammen NCIB 40104 är mycket verksam ensam, medan de övriga 3 stammarna var för sig inte är lika verksamma.

Det farmaceutiskt acceptabla mediet utgörs före- trädesvis av NaC1, skummjölk eller Nutramigen® (regist- rerat varumärke 13 mars 1981, reg. nr: 175 669, inneha- Ina. USA) , men även andra farmaceutiskt acceptabla medier, i vilka vare: Mead Johnson & Company, Evansville, mikroorganismernas viabilitet bibehålls, kan användas.

Var och en av mikroorganismerna i preparatet närvarar i en koncentration i nämnda medium av 104-1010 CFU/ml (kolonbildade enheter/ml), företrädesvis 105-109 CFU/ml.

Motsvarigheter till de fyra mikroorganismstammarna, av vilka tre tillhör släktet Streptococcus sanguis II (i det följande benämnda a89a, a502 och u505) och den fjärde släktet Streptococcus mitis (i det följande benämnd a72l3) finns i den normala halsfloran hos de flesta människor. Stammen a89a motsvarar NCIB 40104 och stammarna 465 349 d502, a505 och d72l3 motsvarar NCIB 40105, NCIB 40106 resp NCIB 40107. 1Mikroorganismerna enligt uppfinningen De 4 ovannämnda stammarna i preparatet enligt upp- finningen isolerades enligt följande. Från ca 200 personer isoleraues vardera 5 stycken d-streptokockstammar med olika koloniutseende, dvs totalt ca 1000 stammar. Dessa stammar testades mot olika typer av B-streptokocker in vitro på följande sätt.

Alla u-streptokockstammarna odlades först i TY-me- dium, tvättades och späddes till en optisk täthet av 0,3 vid 500 nm (Viatron). Detta motsvarade 104-105 CFU/ml.

Minidroppar av dessa stammar (innehållande 10-100 CFU) överfördes till blodagarplattor (25 stammar på varje platta) med hjälp av Steer's steel pin replicator (se Steers E., Foltz E.L., Graves B.S., Riden J.: An inocula replicating apparatus for routine testing of bacterial susceptibility to antibiotics. Antibiot Chemother 9:307- -311, 1959) och fick torka under 10-l5 min. De använda agarplattorna var tillverkade av BBL Columbia Agar Base (Div. Becton Dickinson & Co., Cockeysville, MD 21030, USA) med 5% sterilt defibrinerat hästblod. pH var 7,49- -7,57.

Olika B-streptokockstammar anbringades omedelbart intill var och en av d-streptokockstammarna och plattorna inhuberades i 5% C02 vid 37°C. Vissa plattor inkuberades vid anaeroba betingelser för undvikande av H202-bildning.

Därefter registrerades den av a-stammarna inhiberande verkan på B-streptokocker genom studier av de särskilda tillväxthämmande mönstren, som kunde avläsas på-agar- plattorna.

De bäst hämmande stammarna undersöktes vidare i olika kombinationer med avseende på B-streptokockinter- ferens och de fyra mest verksamma valdes ut. Därefter odlades dessa fyra stammar, dvs d89a, d502, a505 och d72l3, separat i TY-näringsbuljong med O,2% glukos vid 37'C över natten, tvättades och suspenderades i salt- 465 349 6 lösning. De fyra utvalda stammarna testades sedan mot 100 stycken olika B-streptokockstammar från Umeå, Uppsala och Göteborg, och 80%, 92% resp 89% av nämnda stammar hämmades.

De fyra mikroorganismstammarna i preparatet enligt uppfinningen kan i suspenderat tillstånd i det farma- ceutiskt acceptabla mediet frysas till -20°C eller frys- torkas för förvaring. Vid administrering till en patient används lämpligen en pumpsprayflaska, med hjälp av vilken det då upptinade, vätskeformiga preparatet enligt upp- finningen kan administreras oralt och/eller nasalt.

Mikroorganismstammarna i preparatet enligt upp- finningen är deponerade hos the National Collection of Industrial & Marine Bacteria Ltd (NCIMB), Torry Re- search Station, PO Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Storbritannien, den 3 februari 1989, och har depositionsnumren NCIB 40104, NCIB 40105, NCIB 40106 och NCIB 40107. Nämnda mikroorganismstammar är typade eller klassificerade enligt API 20-systemet (API-System - La Balme les Grottes - 38390 Montalieu - Vercieu, France). Typningstabellen och resultaten av typningen presenteras i det följande. 465 349 7 3 .

Hflpl 20 Sïßçp TYPNINGSTABELL RESULTAT TESTER SUBSTRAT REAKTIÛNER/ENZYMER NEGATIVT PUSITIVT VP l + VP 2/vänta till 10 min VP Pyruvat Acetoínbildníng färglös rosa-röd NIN/vänta till l0 min HIP Hippurat Hydrolys färglös/blekblå mörkblå/violett 4 h 211 h 4 h 24 h färglös färglös grå svart ESC Eskulin ß-glukosidas blekgul blekgul svart ljusgrå ZYM A + zvM B/lo min (1) avfärga med intensivt ljus vid behov Pyrrolídonyl- Pyrrolídonylaryl- färglös eller mycket PYRA 2-naftylamíd amidas blekorgange orange é-bromo-Z-naftyl- OL-D-galakto- _ _, __ _ GBAL pyranosíd oegalaktosldas farglos vlolett naftol-AS-BI- BGUR B-D-glukuronat B-glukuronídas färglös blå 2-naftyl-B-D- färglös eller mycket BGAL galaktopyrangsid B-galaktosidas blekviolett violett färglös eller mycket PAL Z-naftylfosfat Alkaliskt fosfatas blekviolett violett L-leucín-2-naf- LAP tylamid Leucinarylamidas färglös organge Egg Argínin- Argínindihydroles gul röd 4h 24h 4h 24h Elg Ribos Surgöring röd orange/röd orange/gul gul 555 L-arabínos Surgöring röd orange/röd orange/gul gul flïi Mannitol Surgöring röd orange/röd orange/gul gul ägg Sorbitol Surgöring röd orange/röd orange/gul gul Egg Laktos Surgöring röd orange/röd orange/gul gul Ißg Trehalos Surgöring röd orange/röd orange/gul gul }1¶¿ Inulín Surgöring röd orange/röd orange/gul gul R_AF Raffínos Surgöring röd orange/röd orange/gul- gul Egg Stärkelse (2) Surgöring röd orange/röd orange/gul gul GLYG Glykogen Surgöring röd eller orange ljusgul (1) Under en andra avläsning efter 24 h inkubering kan en fällning noteras i de rör där reagensen ZYM A och ZYM B har tillsatts. Detta fenomen är normalt och kan ignoreras. (2) Surgörning av stärkelse är ofta svagare än den av andra sockerarter. 465 3 49 8 RESULTAT VID TYPNING Av sTREPTococcUssTAMn/:AR Test a89a on502 oz505 on72l3 TRE (+) - - å + + + + + + I GLY G - - - - hemolys - - - alla har oL-herrnolys (grön he- molys) S. sanguis II S. sanguis II S. sanguis II S. mitis 465 349 Försök Syftet med följande försök var att rekolonisera patienter med återkommande tonsillit genom användning av ett preparat enligt uppfinningen innehållande de fyra a-streptokockstammarna, vilket preparat inhiberar patienternas GAS, och att analysera den nya florans skyddande förmåga mot återkommande GAS-inducerad ton- sillit.

Familj A (far, mor och tre barn) hade genomgått omgångar av akut tonsillit under loppet av 3,5 månader i slutskedet av 1986. Upprepade odlingar av svalgprover hade avslöjat närvaro av B-streptokocken GAS T-typ 12 hos samtliga familjemedlemmar. Hela familjen hade under tiden tilldelats fenoximetylpenicillin (l2,5 mg/kg kropps- vikt 2 gånger dagligen under 10 dagar) och erytromycin (20 mg/kroppsvikt 2 gånger dagligen under l0 dagar), men endast en temporär förbättring hade inträtt.

Familj B (far, mor och två barn) hade genomgått ll omgångar av akut, streptokockinducerad tonsillit (GAS T-typ 12) under loppet av 3 månader i slutet av 1986.

Samtliga familjemedlemmar hade också behandlats med fenoximetylpenicillin och erytromycin-såsom familj A.

Vissa B-streptokockisolat från familj B var resistenta mot erytromycin (MIC (minsta hämmande koncentration) större än 8 mg/1). Förekomsten av streptokockinducerad tonsillit hos de två familjerna framgår av tabell 1. d-streptokocker som isolerats från de sammanlagt nio patienterna i de båda familjerna saknade samtliga tillväxtinhiberande förmåga mot patienternas egna GAS.

Den metod som användes för att visa tillväxtinhibering, dvs bakteriell interferens, mot GAS har beskrivits av Grahn et. al. (Grahn, E., Holm, S.E., Roos, K., Ekedahl, C: Interference of alpha-haemolytic streptococci isolated from tonsillar surface, on beta-haemolytic streptococci, Streptococcus pyogenes - a methodological study. Zentral- blatt für Bakteriologie Mikrobiologie und Hygiene A 1983, 254:459-468). 463 349 I februari 1987 behandlades samtliga medlemmar i de två familjerna med preparatet enligt föreliggande uppfinning, vilket preparat med en mängd av ca 107 CFU/ml för var och en av de 4 d-streptokockerna i det farma- ceutiskt acceptabla mediet sprayades genom näsan till epifarynx och genom munnen till den faryngotonsillara regionen hos de nio patienterna. Detta förfarande upp- repades en gång per dag under fyra dagar, därefter en gång i veckan under en månads tid, och sedan en gång i månaden under ytterligare två/tre månader. Patienterna kontrollerades genom odling av svalgprover upprepade gånger under loppet av åtta månader från behandlingens inledning. Vid starten av rekoloniseringen med de utvalda d-streptokockerna i preparatet enligt uppfinningen saknade alltså alla nio patienterna interfererande a~streptokocker mot sina egna GAS. I familj A var alla medlemmar bärare av GAS före behandlingen, medan däremot ingen i familj B var bärare av GAS. Ingen i varken familj A eller B uppvisade några kliniska tecken på infektion. Fyra månader efter den sista behandlingsperioden var endast en patient fortfarande bärare av den ursprungliga GAS-stammen, och denna person saknade också inhiberande d-strepto- kocker. Hos alla övriga patienter påträffades kraftig tillväxt av de administrerade d-streptokockerna. Denna tillväxt bekräftades genom a-streptokockernas typiska tillväxtinhiberande mönster gentemot olika GAS-stammar och genom deras biokemiska reaktioner. Såsom framgår av tabell 2, som visar behandlingsfrekvens och mikrobiella resultat efter administreringen av de GAS-inhiberande a-streptokockerna, exponerades barnen i familj B för GAS på sitt daghem, blev bärare av nämnda bakterier, men drabbades inte av infektion. Föräldrarna i samma familj blev under nämnda period inte ens bärare.

Tabell 3 visar förekomsten av streptokockinducerad tonsillit före och efter rekolonisering med d-strepto- kocker. Efter rekoloniseringen med de GAS-inhiberande d-streptokockerna och under en uppföljningsperiod på 465 349 ll åtta månader visade ingen av patienterna i de båda fa- miljerna kliniska tecken på streptokockinducerad ton- sillit. Visserligen blev några av familjemedlemmarna under tiden bärare av GAS, men drabbades inte av ton- sillit.

Såsom framgår av försöket kan preparatet enligt föreliggande uppfinning mycket framgångsrikt användas för både profylax mot och behandling av streptokock- inducerad tcnsillit. Nämnda preparat kan användas sam- tidigt med att en optimalt doserad penicillinkur avslutats om en mycket verksam och effektiv behandling av tonsillit erfordras. 465 349 12 Tabell 1 Förekomst av streptokockinducerad tonsillit. M anger manligt kön och K kvinnligt.

Kön/Ålder Familj A M 30 f f ~ f K 1* -r i r i» -p f M f' I f i i + g M * * -r i- f f q K * * i f f i -A- f Familj B M 36 , K i i 'I 'I I M w K i f -p jun jul aug sep okt nov dec jan 1986 Tabell 2 Behandlingsfrekvens och mikrobiella resultat efter admi- nistrering av preparatet enligt uppfinningen innehållande GAS-inhiberande a-streptokocker. + anger närvaro av GAS.

Kön/Ålder Familj A M 30 +++ + - - - - - - K27 +++ ---- + - - M +-- ---- - - - M ++- - - - - - - - K +++ - - - - - - - Familj B M 36 --- - - - - - - K 33 --- - - - - - - M --- - + + K l --- + + + + - - feb mar apr maj----sep 1987 A% Zu Åu ßæmfi n% ßxølnllnwu cow omv >0c uxo flmwm møm Hflfl ¥¥ »m »m k. ¥¥¥ *å ¥ ¥¥¥¥¥ .<. um B ¥ « * ¥ « « ¥¥¥¥¥ k. »m ¥¥¥¥¥¥ »w mcfiuwmflcofioxwu Hwuwm mcfiuwwflcofloxmu wnmm mæmfi :Sw ß ßm om M M 2 hå 2 :E M Hw©H<\QwM m fififiamm 4 fififlamm .mcflccflummß wøcmmmflflmumm ßmfificm uwumummmum fl mcuwxooxoßmwnumnö wwš mcflummflcofioxmu nwßww zoo mnæu wflfififlmcou ©øHw0ø©øflx0oxoummHum|@ >m umäoxmnmm m Hfiwnmä

Claims (7)

463 549 10 15 20 25 30 14 PATENTKRAV

1. l. Farmaceutiskt preparat för profylax mot och/eller behandling av B-streptokockinducerad tonsillit, k ä n - n e t e c k n a t därav, att det inbegriper minst en viabel mikroorganismstam vald ur den grupp som utgörs av Streptococcus sanguis II-stammarna med depositions- beteckningarna NCIB 40104, NCIB 40105 och NCIB 40106, Streptococcus mitis-stammen med depositionsbeteckningen NCIB 40107 och streptokock-stammar med väsentligen samma förmåga att inhibera B-streptokocker som dessa deponerade stammar, i ett farmaceutiskt acceptabelt medium i vilket mikroorganismerna bibehåller sin viabilitet.

2. Farmaceutiskt preparat enligt kravet 1, k ä n - n e t e c k n a t därav, att varje streptokockstam i preparatet närvarar i en koncentration av 104-1010 CFU/ml, företrädesvis 105-109 CFU/ml.

3. Farmaceutiskt preparat enligt kravet l eller 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att det farmaceutiskt acceptabla mediet är NaCl, skummjölk eller Nutramigen®.

4. Farmaceutiskt preparat enligt något av föregående krav, k ä n n e t e c k n a t därav, att det föreligger i sprayform för nasal och/eller oral administrering.

5. Farmaceutiskt preparat enligt något av föregående krav, k ä n n e t e c k n a t därav, att det omfattar samtliga fyra mikroorganismstammar.

6. Användning av ett farmaceutiskt preparat som inbegriper minst en viabel mikroorganismstam vald ur den grupp som utgörs av Streptococcus sanguis II-stam- marna med depositionsbeteckningarna NCIB 40104, NCIB 40105 och NCIB 40106, Streptococcus mitis-stammen med depo- sitionsbeteckningen NCIB 40107 och streptokock-stammar med väsentligen samma förmåga att inhibera 6-streptokocker som dessa deponerade stammar, i ett farmaceutiskt accep- tabelt medium i vilket mikroorganismerna bibehåller 'v 463 549 15 sin viabilitet, för profylax mot och/eller behandling av B-streptokockinducerad tonsillit.

7. Användning enligt kravet 6, k ä n n e t e c k - n a t därav, att denna sker vid avslutning av en peni- cillinkur.