NO178883B - Fremgangsmåte for fremstilling av et farmasöytisk preparat for behandling av tonsillitt - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk preparat for bruk i profy-lakse mot og/eller behandling av p<->streptokokk-tonsillitt.

Tonsillitt som er en betennelse i mandlene, er et utbredt helseproblem. Det anslås at det i Sverige hvert år er ca. 300.000 mennesker som angripes av akutt tonsillitt. Omkring 30-50$ av disse tilfellene er forårsaket av 3-streptokokker. Tonsillitt blir vanligvis behandlet med penicillin, for eksempel fenoksymetylpenicillin, men i 10-25$ av tilfellene er behandlingen ineffektiv og pasienten angripes av tilbakevendende tonsillitt. Tonsillitt er spesielt vanlig i barnehager, i skoler og også innen familier hvor mennesker er i nær kontakt med hverandre og flere muligheter for infeksjon forekommer. Følgene er periodisk medisinsk behandling, sykerapporter og penicillinbehandling, som ikke bare er et stort helseproblem, men også et økonomisk problem.

Grunnene for den relativt høye frekvens av ineffektive behandlinger antas å, avhenge av, bortsett fra lokale ufullkommenheter i pasientens immunoforsvar og generelle immunologiske ufullkommenheter, utilstrekkelig antibiotisk aktivitet ved infeksjonsstedet. Sistnevnte innbefatter slike faktorer som pasientens føyelighet overfor medikeringen, den spesielle dose av penicillinen, antall doser og forringet absorpsjon av legemidlet. Inaktivering av penicillin av e-laktamaseproduserende bakterier som resulterer i en utilstrekkelig penicillinkonsentrasjon ved infeksjonsstedet, har også vært nevnt. Andre faktorer som er forbundet med ineffektive behandlinger av P-streptokokk-tonsillitt er forstyrrelser i den normale flora som resulterer i en forøket mottagelighet for streptokokk-infeksjoner og penicillin-toleranse for gruppe A p<->streptokokker.

Det er kjent at bakteriell forstyrrelse blant bakteriene i floraen i halsen kan spille en viktig rolle ved tonsillitt. Det har blitt vist at visse stammer av streptokokker inhiberer veksten av vanlig infeksjonsproduserende p-streptokokker. Dette gjelder spesielt visse a-streptokokker. Mennesker som har de ovennevnte tilbakevendende infeksjoner mangler ofte inhiberende a-streptokokker i deres normale halsflora, mens mennesker som har disse a-streptokokkene sjelden blir angrepet av tonsillitt.

Sanders et al. (Sanders, C, Nelsen, G., Sanders, E.: Bacterial interference, II. Epidemiological determinants of the antagonistic activity of the normal throat flora against group A streptococci. Infection and Imminity 1977, 16:599-603) har vist at visse stammer av Streptococcus viridans inhiberer veksten av gruppe A streptokokker (GAS). Sanders viste også en inhiberende effekt av normalt forekommende a-streptokokker mot GAS i infiserte barn.

Den beskyttende rollen i halsen til a-streptokokker mot P-streptokokkinfeksjoner har også blitt vist av Grahn og Holm (Grahn, E., Holm, S.E.: Bacterial interference in the throat flora during a streptococcal tonsillitis outbreak in an apartment house area. Zentralblatt fiir Bakter iologie Mikrobiologie und Hygiene A 1983, 256:72-79) og Roos et al.

(Roos, K. , Grahn, E., Holm, S.E.: Evaluations of betalacta-mase activity and microbial interference in treatment failures of acute streptococcal tonsilittis. Scandinavian Journal of Infectious Diseases 1986, 18:313-19). De har klarlagt at mangelen på forstyrrende p<->streptokokker er en av hovedgrunnene til den ofte ineffektive behandling av streptokokk-tonsillitt.

Videre har Beck (Interference by an a-hemolytic streptococcus of p-hemolytic pathogenic streptococci, Inflammation, 3:463-465, 1979) funnet en stamme av Streptococcus viridans med en høy inhiberende evne mot gass og han har foreslått "implan-tering" av denne stammen i mennesker med tilbakevendende streptokokk-tonsillitt. En lignende rapport har tidligere blitt presentert av Sprunt et al. (Sprunt K. , Leidy G. , Redman W. : Abnormal colonisation of neonates in an ICU: Conversion to normal colonisation by pharyngeal implantation of alpha-hemolytic streptococcus strain 215. Pedriatr Res 14:308-313, 1980), som implanterte en stamme av a-streptokokker i nesesvelget til 22 barn som man fryktet var i fare for infeksjon. Implanteringen ga et vellykket resultat hos 16 av barna og forårsaket en endring i den normale flora hos 7 av barna med det resultat at den implanterte stammen var den eneste stammen av a-streptokokker som kunne finnes 4-18 dager etter implanteringen.

Bakteriene i den normale floraen inhiberer invanderende bakterier på forskjellige måter og faktorene bak er for eksempel konkurranse for viktige vekstfaktorer, pH-varia-sjoner, akkumulering av avfallsprodukter, dannelse av peroksyd, bakterielle toksiner og enzymer, og også produksjon av stoffer som er kjent som bakteriociner. De kjente bakteriocinene er meget lik antibiotika, men adskiller seg ved at de har en meget selektiv effekt og ikke forstyrrer den meget viktige anaerobe bakterielle flora. Den inhiberende effekten til a-streptokokkene på p-streptokokkene har i høy grad blitt vist å være avhengige av tilstedeværelsen av bakteriociner som produseres av a-streptokokker. Det foreligger et behov for et effektivt farmasøytisk preparat i profylaksen mot og behandlingen av p-streptokokk-tonsillitt.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk preparat for profylaksen mot og/eller behandlingen av p<->streptokokk-tonsillitt, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at minst en levedyktig mikroorganismestamme valgt fra gruppen bestående av Streptococcus sanguis Il-stammer med deponeringsnummere NCIB 40104, NCIB 40105 og NCIB 40106, Streptococcus mitis-stammen med deponeringsnummer NCIB 40107 og stammer av Streptococcus sanguis og mitis med vesentlig samme evne til å inhibere p-streptokokker som de deponerte stammene, tilsettes til et farmasøytisk akseptabelt medium hvori mikroorganismene bibeholder sin levedyktighet slik at hver streptokokkstamme i preparatet er tilstede i en konsentrasjon på 10<4->1010 CFU/ml.

Profylaksen mot og/eller behandlingen av tonsillitt kan eventuelt foretas etter en penicillinkur.

Det fremstilte farmasøytiske preparatet har blitt funnet å være særlig effektivt i profylaksen mot og behandlingen av p-streptokokk-tonsillitt. I de nedenfor beskrevne forsøk har foreliggende preparat i en foretrukken utførelse hvor alle de fire forskjellige stammene av a-streptokokker er tilstede samtidig, blitt funnet å eliminere 95-99$ p<->streptokokker isolert på 3 steder i Sverige. Kombinasjoner av forskjellige antall av de ovennevnte mikroorganismestammer er også effektive, men den avgjort beste effekten som hittil har blitt oppnådd er når alle fire stammene er tilstede. Spesielt er stammen NCIB 40104 meget effektiv alene, mens de gjenværende tre stammer hver for seg ikke er så effektive som NCIB 40104.

Det farmasøytisk akseptable medium består fortrinnsvis av NaCl, skummet melk eller Nutramigen<R> (registrert varemerke 13.3.1981, registreringsnummer 175 669, eier Mead Johnson & Company, Evansville, Ind. USA), men også andre farmasøytisk akseptable medier hvori mikroorganismenes levedyktighet bibeholdes, kan anvendes. I en utførelse av oppfinnelsen anvendes fysiologisk saltoppløsningsbuffer som er beregnet for å gi en isoton sammensetning med en nøytral pH-verdi.

Hver av mikroorganismene i preparatet er som nevnt tilstede i en konsentrasjon i mediet på IO<4> - 10<10> CFU/ml (kolonidan-nende enheter/ml), og konsentrasjonen er fortrinnsvis 10<5->10<9> CFU/ml.

Motstykker til de fire mikroorganismestammene, hvorav tre tilhører slekten Streptococcus sanguis II (i det følgende betegnet a89a, a502 og a505) og den fjerde slekten Streptococcus mitis (i det følgende betegnet a7213) finnes i den normale floraen i halsen til de fleste mennesker. Stammen oc89a tilsvarer NCIB 40104 og stammene a502, oc505 og a7213 tilsvarer henholdsvis NCIB 40105, NCIB 40106 og NCIB 40107.

Mikroorganismene som benyttes i foreliggende fremgangsmåte De ovennevnte 4 stammene ble isolert i overensstemmelse med følgende fremgangsmåte. Fra hver av ca. 200 mennesker ble det isolert 5 stammer av a-streptokker med forskjellig koloniutseende, dvs. ca. 1000 stammer totalt. Disse stammene ble testet mot forskjellige typer av p<->streptokokker in vitro på følgende måte.

Alle stammene av a-streptokokker ble først dyrket i TY-medium, vasket og fortynnet til en optisk densitet på 0,3 ved 500 nm (Viatron). Dette tilsvarte IO<4> - IO<5> CFU/ml. Minidråper av disse stammene (inneholdende 10-100 CFU) ble overført til blodagarplater (25 stammer på hver plate) ved hjelp av en Steer-nålreplikator (se Steers E. , Foltz E.L. , Graves B.S., Riden J.: Aninocula replicating apparatus for routine testing of bacterial susceptibility to antibiotics. Antibiot Chemother 9:307-311, 1959) og fikk tørke i 10-15 minutter. Agarplatene som ble benyttet i dette forsøket var produsert av BBL Colombia Agar Base (Div. Becton Dickinson & Co., Cockeysville, MD 21030, USA) med 5$ sterilt defibrinert hesteblod. pE-verdien var 7,49-7,57.

Forskjellig stammer av p<->streptokokker ble straks påført i nærheten av hver av a-streptokokkstammene og platene ble inkubert i 5$ C02 ved 37° C. Noen plater ble inkubert under anaerobe betingelser for å eliminere peroksydproduksjon. Deretter ble den inhiberende effekten til a-stammene på P-streptokokkene registrert ved å studere de spesielle vekstinhiberende mønstrene som kunne leses på agarplatene.

De beste inhiberende stammene ble ytterligere undersøkt i forskjellige kombinasjoner med henblikk på P-streptokokk-angrep og de fire som var mest effektive ble valgt. Disse fire stammene, dvs. cx89a, cx502, a505 og a7213, ble deretter dyrket separat i TY-medium inneholdende 0,2$ glukose ved 37<0>C natten over, vasket og suspendert i saltoppløsning. De fire utvalgte stammene ble deretter testet mot 100 forskjellige stammer av p<->streptokokker fra Umeå, Uppsala og Gøteborg, og henholdsvis 80$, 92$ og 89$ av disse stammene ble inhibert.

De fire stammene av mikroorganismer i foreliggende preparat kan, når de er suspendert i det farmasøytisk akseptable mediet, fryses til -20°C eller frysetørkes for å oppbevares. Ved administrasjon til en pasient kan en spraypumpe hensikts-messig benyttes, ved hjelp av hvilken det opptinte flytende preparatet kan administreres oralt og/eller nasalt.

I en utførelse av oppfinnelsen kan nevnte spray inneholde en suspensjon av a-streptokokker IO<9> CFU/ml i 5 ml fysiologisk saltoppløsning. Hver spraydose gir IO<7> CFU tilsvarende ca. 0,01 ml.

Mikroorganismestammene som anvendes i foreliggende fremgangsmåte ble deponert hos National Collection of Industrial & Marine Bacteria Ltd (NCIMB), Torry Research Station, PO Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Storbritannia, den 3. februar 1989, og har deponeringsnummerene NCIB 40104, NCIB 40105, NCIB 40106 og NCIB 4017. De nevnte organismestammene er tolket eller klassifisert ifølge API 20-systemet (API-system -La Balme les Grottes - 38390 Montalieu - Vercieu, Frankrike). Fortolkningstabellen og resultatene av for-tolkningen er angitt i det følgende.

Forsøk

Formålet med følgende forsøk var å rekolonisere pasienter med tilbakevendende tonsillitt ved anvendelse av et preparat fremstilt ifølge oppfinnelsen inneholdende de fire a-streptokokkstammene, hvilket preparat inhiberer GAS hos pasientene, og analysere den beskyttende evnen mot tilbakevendende GAS-tonsillitt i den nye floraen.

Familie A (foreldre og tre barn) hadde hatt 25 akutte tonsilitt-tilfeller i løpet av de siste 3,5 månedene i 1986. Gjentatte dyrkninger av prøver fra svelget hadde vist tilstedeværelsen av P-streptococcus GAS T-type 12 fra alle familiens medlemmer. De hadde vekselsvis blitt gitt fenoksymetylpenicllin (12,5 mg/kg kroppsvekt to ganger om dagen i 10 dager) og erytromycin (20 mg/kg kroppsvekt to ganger om dagen i 10 dager), men dette ga bare en midlertidig forbedring.

Familie B (foreldre og to barn) hadde hatt akutt streptokokk-tonsillitt (GAS T-type 12) i de siste tre månedene i 1986. Som i tilfellet for familie A ble alle familiemedlemmene behandlet med fénoksymetylpenicillin og erytromycin. Visse p<->streptokokk-isolater fra familie B var resistente mot erytromycin [MIC (minimum inhiberende konsentrasjon) over 8 mg/l]. Forekomsten av streptokokk-tonsillitt med de to familiene er angitt i tabell 1.

De isolerte a-streptokokkene fra de totalt ni pasientene i de to familiene manglet alle vekstinhiberende evne mot deres egen GAS. Metoden som ble benyttet for å demonstrere vekstinhibering, dvs. bakteriell forstyrrelse, mot GAS har blitt beskrevet av Grahn et al. (Grahn, E., Holm, S.E., Roos, K., Ekedahl, C: Interference of alfa-haemolytic streptococci isolated from tonsillar surface, on beta-haemolytic streptococci, Streptococcus pyogenes - a methodological study. Zentralblatt flir Bakteriologie Mikrobiologie und Hygiene A 1983, 254:459-468).

I februar 1987 ble alle medlemmene i de to familiene behandlet med preparatet fremstilt ifølge oppfinnelsen. Preparatet i en mengde på ca. IO<7> CFU/ml for hver av de 4 a-streptokokkene i det farmasøytisk akseptable mediet, ble sprayet gjennom nesen til epifarynks og gjennom munnen til det faryngotonisillare området hos de ni pasientene. Denne prosessen ble gjentatt en gang om dagen i fire dager, deretter en gang om uken i en måned, og deretter en gang i måneden i to/tre ytterligere måneder. Pasientene ble kontrollert ved dyrking av svelgprøver gjentatte ganger i 8 måneder fra starten av behandlingen. Ved starten av rekoloniseringen med de valgte a-streptokokkene i preparatet manglet alle ni pasientene forstyrrende a-streptokokker mot deres egen GAS. I familie A var alle medlemmene bærere av GAS før behandling, mens på den annen side var ingen i familie B bærer av GAS. Ingen av familiene A eller B viste noen kliniske tegn på infeksjon. Fire måneder etter den siste behandlingsperioden var bare en pasient fremdeles bærer av den opprinnelige GAS-stammen, og denne personen manglet også inhiberende a-streptokokker. Hos alle de andre pasientene ble det funnet en sterk vekst av de administrerte a-streptokokkene. Denne veksten ble bekreftet av det typiske vekstinhiberende mønsteret mot forskjellige GAS-stammer og av deres biokjemiske reaksjoner. Som det fremgår fra tabell 2, som viser behandlingshyppigheten og mikrobielle resultater etter administrasjon av de GAS-inhiberende a-streptokokkene, ble barna i familie B eksponert for GAS ved deres dagsenter og ble bærere av nevnte bakterier, men ble ikke angrepet av infeksjon. Foreldrene i den samme familien ble i løpet av den samme perioden ikke en gang bærere.

Tabell 3 viser forekomsten av streptokokk-tonsillitt før og etter rekolonisering med a-streptokokker. Etter rekolonisering med de GAS-inhiberende a-streptokokkene og i løpet av en oppfølgingsperiode på åtte måneder så viste ingen av pasientene i de to familiene kliniske tegn på streptokokk-tonsillitt. Det er riktignok slik at noen av familiemedlemmene i løpet av denne tiden var bærere av GAS, men ingen ble angrepet av tonsillitt.

Som dette forsøker viser så kan det fremstilte preparatet på vellykket måte anvendes både i profylaksen mot og i behandlingen av streptokokk-tonsillitt. Preparatet kan benyttes samtidig med avslutningen av en optimalt dosert penicillinkur i det tilfellet hvor en meget sterk og effektiv behandling av tonsillitt er nødvendig.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk preparat for profylaksen mot og/eller behandlingen av p<->streptokokk-tonsillitt, karakterisert ved at minst en levedyktig mikroorganismestamme valgt fra gruppen bestående av Streptococcus sanguis II-stammer med deponeringsnummere NCIB 40104, NCIB 40105 og NCIB 40106, Streptococcus mitis-stammen med deponeringsnummer NCIB 40107 og stammer av Streptococcus sanguis og mitis med vesentlig samme evne til å inhibere p<->streptokokker som de deponerte stammene, tilsettes til et farmasøytisk akseptabelt medium hvori mikroorganismene bibeholder sin levedyktighet slik at hver streptokokkstamme i preparatet er tilstede i en konsentrasjon på 10<4->10<10> CFU/ml.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at hver streptokokkstamme som anvendes i preparatet er tilstede i en konsentrasjon på 10<5->10<9> CFU/ml.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som farmasøytisk akseptabelt medium anvendes en fysiologisk saltoppløsning.